RS63533B1 - Postupci za povećanje produktivnosti antitela u kulturi sisarskih ćelija i smanjenje agregacije tokom nishodne obrade, postupci formulacije i rezultujuće stabilne formulacije antitela - Google Patents

Description

Opis

Osnov pronalaska

[0001] Razvoj ushodne, nishodne obrade i formulacije često može da bude korak koji ograničava brzinu u ranom uvođenju biofarmaceutika u klinička ispitivanja. Na primer, denga groznica je najvažnija virusna bolest koju prenose komarci koja pogađa ljude. Polovina svetske populacije živi u područjima sa rizikom od denga groznice, što dovodi do procenjenih 390 miliona infekcija godišnje širom sveta. Trenutno nema odobrenih antivirusnih agenasa za lečenje denga groznice, a nedavna ispitivanja vakcine nisu ispunila očekivanja. Vodeći kandidat za vakcinu je nedavno pokazao ograničenu efikasnost, procenjenu na između 30% - 60%, sa ograničenom do beznačajnom zaštitom protiv DENV-2. Nedavno je identifikovan ne-imunodominantni, ali funkcionalno relevantan epitop u domenu III E proteina, a zatim je razvijeno konstruisano antitelo, Ab513 koje pokazuje vezivanje visokog afiniteta i široku neutralizaciju više genotipova unutar sva četiri serotipa. (videti Ram Sasisekharan et al Cell 162, 1-12, July 30, 2015; Samir Bhatt et al, Nature, 2013 April 25; 496 7446: 504-507). Dakle, uzimajući u obzir globalnu medicinsku potražnju za monoklonskim antitelom protiv virusa denge, nedavne procene pokazuju da se do 390 miliona infekcija virusom denge dogodi svake godine širom sveta, sa >90 miliona obolelih, što DENV čini velikom globalnom pretnjom. Ako pretpostavimo da 30% od 16 miliona dijagnostikovanih slučajeva denga groznice ide u bolnicu, onda će za oko 5 miliona ljudi biti potrebno pomenuto monoklonsko antitelo protiv virusa denge, što implicira da "prečišćeno antitelo" iznad 4 g/L postaje preduslov da se zadovolji globalna potražnja za takvim antitelom koje spašava živote. Nadalje, opterećenje denga bolešću je visoko u zemljama u razvoju u kojima su dostupnost električne energije i hlađenja često neadekvatni i stoga stabilnost antitela pri variranju temperature ima veću važnost za ove regione.

[0002] Zaista, kada bi bilo moguće imati platformu postupka koja bi mogla da se koristi za proizvodnju i formulisanje svih kandidata za monoklonska antitela (mAb), to bi u velikoj meri smanjilo vreme i resurse potrebne za razvoj postupka. Ovo može da ima značajan uticaj na broj kliničkih kandidata koji mogu da se uvedu u klinička ispitivanja. Takođe, postupci razvijeni za klinička ispitivanja u ranoj fazi, uključujući i one razvijene pomoću platforme, mogu da ne budu optimalni u pogledu ekonomičnosti postupka, prinosa, zapremina pulova, propusne sposobnosti postupka, i mogu da ne budu pogodni za proizvodnju količina potrebnih za kasnu fazu ispitivanja ili komercijalne kampanje. Još jedno važno pitanje je brzina razvoja postupka s obzirom na to da do razvoja postupka treba da dođe pre uvođenja terapeutskog kandidata u klinička ispitivanja. (videti Abhinav A. Shukla et al Journal of Chromatography B, 848 (2007) 28-39).

[0003] Obično se medijum za kulturu sisarskih ćelija zasniva na komercijalno dostupnim formulacijama medijuma, uključujući, na primer, DMEM ili Hamov F12. Često formulacije medija nisu dovoljno obogaćene da podrže povećanje oba, i rasta ćelija i ekspresije bioloških proteina. Ostaje potreba za poboljšanim medijumima za ćelijsku kulturu, suplementima i postupcima kultivacije ćelija za poboljšanu proizvodnju proteina. Ranije su objavljena povećanja titra antitela ćelijske kulture na >2 g/L. Videti F. Wurm, Nat. Biotechnol. 22 (2004) 1393. Dalje, u perfuzionim reaktorima, ćelije mogu da dostignu mnogo veću ćelijsku gustinu nego u konvencionalnim šaržnim ili dolivno-šaržnim reaktorima. (videti Sven Sommerfeld et al Chemical Engineering and Processing 44 (2005) 1123-1137). Međutim, postupci zasnovani na perfuziji su složeni, skupi i takođe mogu da dovedu do problema sa sterilnošću i neželjene heterogenosti u obrascu glikozilacije. Dodavanje hidrolizata bez životinjskih komponenti (Bacto TC Yeastolate, Phytone Peptone) u hemijski definisane medijume je uobičajen pristup za povećanje gustine ćelija, vijabilnosti kulture i produktivnosti na blagovremen način. Hidrolizati su proizvodi proteinske digestije sastavljeni od aminokiselina, malih peptida, ugljenih hidrata, vitamina i minerala koji obezbeđuju hranljive dodatke medijumu. Hidrolizati koji nisu životinjskog porekla iz soje, pšenice i kvasca se obično koriste u medijumima ćelijske kulture i prehrani za poboljšanje titra antitela (videti US9284371). Međutim, zbog svoje složenosti sastava, varijacija od serije do serije, nepoželjne osobine da kulturu čine viskoznom, ekstrakt i hidrolizati kvasca mogu da predstavljaju značajan izvor varijabilnosti medijuma. Zbog složenosti proizvoda antitela koji uključuju izoforme i mikro-heterogenosti, performanse postupka kultivacije ćelija mogu da imaju značajne efekte na kvalitet i potentnost proizvoda, posebno u pogledu glikozilacije, post-transkripcionih modifikacija i profila nečistoća.

[0004] Pri višim koncentracijama, proteini, posebno antitela često ispoljavaju karakteristične probleme uključujući agregaciju, precipitaciju, geliranje, smanjenu stabilnost, i/ili povećan viskozitet.

[0005] Poznato je da antitela poseduju karakteristike koje dovode do formiranja agregata i čestica u rastvoru kako podležu razgradnji ili agregaciji ili denaturaciji ili hemijskim modifikacijama koje rezultuju gubitkom biološke aktivnosti tokom postupka proizvodnje i/ili skladištenja tokom vremena. Agregati antitela mogu da se formiraju tokom ekspresije u ćelijskoj kulturi, nishodnog prečišćavanja, formulacije i skladištenja. Berba ćelijske kulture obično sadrži najviši nivo agregata u postupku (videti Deqiang Yu Journal of Chromatography A, 1457 (2016) 66-75). Putevi degradacije proteina mogu da uključuju hemijsku nestabilnost (npr. bilo koji proces koji uključuje modifikaciju proteina formiranjem ili cepanjem veze što dovodi do novog hemijskog entiteta) ili fizičku nestabilnost (npr. promene u strukturi višeg reda proteina). Tri najčešća puta degradacije proteina su agregacija proteina, deamidacija i oksidacija. Cleland et al Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 10(4): 307-377 (1993). Dalje, proteini su takođe osetljivi na, na primer, pH, jonsku jačinu, termički stres, smicanje i naprezanje na međufaznoj površini, što sve može da dovede do agregacije i rezultuje nestabilnošću. Da bi protein ostao biološki aktivan, formulacija stoga mora da sačuva netaknuti konformacioni integritet najmanje jezgarne sekvence aminokiselina proteina, dok istovremeno štiti višestruke funkcionalne grupe proteina od degradacije.

[0006] Glavni problem uzrokovan stvaranjem agregata je to što tokom primene formulacija može da blokira špriceve ili pumpe i da tako postane nebezbedna za pacijente. Takve modifikacije proteina takođe mogu da ih učine imunogenim, što dovodi do stvaranja antitela protiv leka kod pacijenta, što može da smanji dostupnost leka tokom narednih injekcija, ili još gore da izazove autoimunu reakciju. Glavni cilj u razvoju formulacija antitela je održavanje rastvorljivosti, stabilnosti i bioaktivnosti proteina.

[0007] Rani predlozi o tome kako da se reše problemi nestabilnosti formulacija proteinskih terapeutika uključivali su liofilizaciju leka, praćenu rekonstitucijom neposredno ili kratko pre primene. Međutim, liofilizovane formulacije antitela imaju niz ograničenja, uključujući produženi postupak liofilizacije i rezultirajuću visoku cenu proizvodnje. Pored toga, liofilizovanu formulaciju pre davanja pacijentima moraju da rekonstituišu aseptično i precizno zdravstveni radnici. Sam korak rekonstitucije zahteva određene specifične procedure, tj. (1) sterilni razblaživač (tj. voda za intravensku primenu i 5% dekstroze u vodi za intramuskularnu primenu) se dodaje u bočicu koja sadrži liofilizovano antitelo, polako i aseptično, a bočica mora vrlo nežno da se meša 30 sekundi da bi se izbeglo stvaranje pene; (2) rekonstituisano antitelo će možda morati da odstoji na sobnoj temperaturi najmanje 20 minuta dok se rastvor ne razbistri; i (3) rekonstituisani preparat se mora primeniti u roku od šest (6) sati nakon rekonstitucije. Takav postupak rekonstitucije je zahtevan, a vremensko ograničenje nakon rekonstitucije može da prouzrokuje velike neprijatnosti u davanju formulacije pacijentima, što dovodi do značajnog gubitka, ako se ne rekonstituiše kako treba, ili ako se rekonstituisana doza ne upotrebi u roku od šest (6) sati i mora da bude odbačena. Zbog toga je tečna formulacija poželjna zbog faktora pogodnosti za kliničku primenu i primenu kod pacijenta, kao i zbog lakoće proizvodnje. Međutim, tečne farmaceutske formulacije proteinskih terapeutika, odnosno antitela treba da budu dugoročno stabilne, da sadrže bezbednu i efikasnu količinu farmaceutskog jedinjenja.

[0008] Uklanjanje agregata je teže od uklanjanja nečistoća povezanih sa postupkom zbog biofizičkih sličnosti između agregata i monomera, višestrukih izvora i tipova agregata i slabijeg razumevanja mehanizma agregacije.

[0009] Jedan od novijih izazova koji se susreću tokom razvoja formulacije doznih oblika monoklonskih antitela visoke koncentracije je formiranje proteinskih nevidljivih i vidljivih čestica tokom proizvodnje i dugotrajnog skladištenja. Nivo proteinskih i neproteinskih čestica u formulacijama IgG je deo razvoja prečišćavanja i formulacije koji postaje sve važniji. (videti Klaus Wuchner et al Journal of Pharmaceutical Sciences, vol. 99, no. 8, august 2010). Nadalje, tečna formulacija treba da bude stabilna na različitim temperaturama, odnosno temperaturama 2-8 °C, 25 °C, 40 °C i 55 °C.

[0010] Mnogi preparati antitela namenjeni za ljudsku upotrebu zahtevaju stabilizatore kako bi se sprečila denaturacija, agregacija i druge promene na proteinima pre upotrebe preparata. Prethodno objavljene tečne formulacije antitela (Lucentis, Avastin) su imale manitol, trehalozu kao stabilizatore. (videti Susumu Uchiyama et al Biochimica Biophysica Acta 1844 (2014) 2041-2052; US20160137727; WO2009120684; US8568720). Međutim, trehaloza je skupa i nije primenljiva kod postupaka velikih obima iz ekonomskih razloga.

[0011] Takođe, IV primena antitela se obično obavlja kao infuzija, a ne bolus, i stoga zahteva razblaživanje formulacije monoklonskih antitela koja uključuje ekscipijense u odgovarajućim tečnostima pogodnim za IV primenu. Time dolazi do razblaživanja ekscipijenasa, posebno surfaktanata, koji mogu da se razrede ispod koncentracije potrebne za sprečavanje agregacije tokom mućkanja, dovodi do stvaranja agregata i čestica ispod granice vidljivosti nakon laganog mućkanja posle razblaživanja u PVC i PO IV kesama koje sadrže 0,9% fiziološkog rastvora.

[0012] Hromatografija hidrofobne interakcije, keramički hidroksiapatit i katjonske izmenjivačke smole su korišćene za uklanjanje agregata, ali nijedan postupak nije idealan. Većina prethodno objavljenih postupaka prečišćavanja antitela u velikoj meri se oslanjala na upotrebu hromatografije hidrofobne interakcije u kombinaciji sa hromatografijom na proteinu A, anjon-izmenjivačkom hromatografijom, katjon-izmenjivačkom hromatografijom, u vidu postupka u tri ili četiri koraka (videti WO2010141039, WO 2014/207763, WO2013066707, WO2015099165, WO2014102814, WO2015038888, WO2004087761). Međutim, smole za hromatografiju hidrofobne interakcije zahtevaju velike količine soli koje su skupe, pokazuju nizak kapacitet vezivanja, teško ih je odložiti i mogu da ne budu kompatibilne sa materijalima konstrukcije rezervoara za skladištenje pufera i proizvoda. Osim toga, razlika u gustini između pufera koji se koriste za korak HIC može da izazove probleme sa stabilnošću sloja. Keramički hidroksiapatit takođe može da se koristi za odvajanje agregata od monomera, ali može da bude veoma teško raspakovati keramičku smolu, a da se ona ne ošteti. Stoga, skladištenje smole izvan kolone za ponovnu upotrebu u narednoj proizvodnoj kampanji možda neće biti moguće (videti Suzanne Aldington Journal of Chromatography B, 848 (2007) 64-78).

[0013] Utvrđeno je da trofazne kombinacije katjon-izmenjivačke hromatografije, anjonizmenjivačke protočne hromatografije, hromatografije hidrofobne interakcije i katjonizmenjivačke hromatografije u mešovitom režimu daju adekvatan klirens proteinskih kontaminanata ćelije-domaćina za monoklonsko antitelo poreklom iz CHO. Međutim, takve šeme prečišćavanja uglavnom nisu našle primenu u komercijalnim nishodnim operacijama zbog potrebe da se sekvenca prečišćavanja posebno dizajnira za svako monoklonsko antitelo.

[0014] WO 2015/122995 A1 otkriva antitelo D88 protiv virusa denge koje sadrži VHi VLdomene. WO 2006/084006 A1 otkriva antitelo 17C7 na virus besnila kao i njegovu proizvodnju. WO 2017/165736 A1 otkriva različite formulacije antitela protiv virusa denge.

[0015] Dakle, postoji hitna nezadovoljena potreba za efikasnom platformom postupka za proizvodnju i formulaciju antitela koja ispunjava više kriterijuma, uključujući robusnost, pouzdanost i skalabilnost, posebno platformom koja obezbeđuje i) titar antitela od najmanje 2 g/L; ii) minimalnu agregaciju/formiranje čestica u postupku kultivacije ćelija, prečišćavanja i formulacije; iii) poboljšano prečišćavanje koje pokazuje optimalan procenat oporavka, visok sadržaj monomera i minimalne nivoe nečistoća; i iv) formulaciju antitela visoke koncentracije koja pokazuje nizak viskozitet, odsustvo agregacije i čestica ispod granice vidljivosti; i na taj način pokazuje dugoročnu stabilnost.

Izlaganje suštine pronalaska

Podnosilac prijave je iznenađujuće našao

[0016]

a) Sastav hranljivog rastvora i strategiju ishrane koja uzima u obzir potrošnju nutrijenata, akumulaciju sporednih proizvoda i ravnotežu između podsticanja rasta u odnosu na volumetrijsku produktivnost, pri čemu je nađeno da posebno parametri postupka kultivacije sisarskih ćelija, kao što je upotreba određenog osnovnog medijuma, upotreba koncentrovanog osnovnog medijuma kao hranljivog rastvora, upotreba različitih hranljivih rastvora zajedno sa određenom strategijom ishrane, održavanje nižih koncentracija laktata i amonijaka, poboljšavaju rast ćelija, dugovečnost ćelija i ekspresiju proteina; što dovodi do povećanja titra antitela.

b) Specifičnu koncentraciju soli u sastavu pufera tokom koraka afinitetne hromatografije na proteinu A i katjon-izmenjivačke hromatografije koja minimizira agregaciju; čime se postiže sadržaj monomera veći od 99% sa oporavkom većim od 80%.

c) Tečne formulacije antitela bez čestica koje sadrže saharozu u kombinaciji sa histidinom, argininom, polisorbatom-80, natrijum hloridom, koje daju veću potentnost i stabilnost, smanjuju viskozitet visokokoncentrovanih rastvora antitela na 2-8 °C tokom najmanje 9 meseci, na 25 °C najmanje 1 mesec, na 40 °C najmanje 42 dana, na 55 °C najmanje 2 dana, u poređenju sa formulacijom bez saharoze.

[0017] Prvi aspekt predmetnog otkrića odnosi se na postupak proizvodnje farmaceutskog antigenvezujućeg proteina sa visokim prinosom i minimalnom agregacijom, u kome je antigen-vezujući protein monoklonsko antitelo protiv virusa denge prema SEQ ID 1 i SEQ ID 2 ili je antigenvezujući protein monoklonsko antitelo protiv virusa besnila prema SEQ ID 3 i SEQ ID 4, pri čemu postupak obuhvata sledeće korake: a) kultivisanje sisarskih ćelija koje eksprimiraju antigenvezujući protein u medijumu za proizvodnju ćelijske kulture u velikom obimu, pri čemu korak kultivisanja efikasno održava broj ćelija u opsegu od 10 x 10<6>- 20 x 10<6>ćelija/ml i rezultuje prinosom od najmanje 2 g/L pri čemu je ćelijska linija sisarskih ćelija CHO-K1 SV GS-KO, kada je antigen-vezujući protein monoklonsko antitelo protiv virusa denge, a ćelijska linija sisarskih ćelija je GS-CHO, kada je antigen-vezujući protein monoklonsko antitelo protiv virusa besnila; pri čemu korak kultivacije uključuje upotrebu osnovnog medijuma, upotrebu koncentrovanog osnovnog medijuma kao hranljivog rastvora, upotrebu hranljivih rastvora zajedno sa određenom strategijom hranjenja, što rezultuje pojačanim rastom ćelija, održavanjem nižih koncentracija laktata i amonijaka i efektivnim održavanjem broja ćelija, čime se povećava dugovečnost ćelija i postiže visok prinos; b) prečišćavanje antigen-vezujućeg proteina iz sakupljenog supernatanta dobijenog u koraku (a), pri čemu prečišćavanje rezultuje oporavkom od najmanje 80% i čistoćom od najmanje 99%; i gde prečišćavanje obuhvata afinitetnu hromatografiju, inaktivaciju virusa na niskom pH, katjon-izmenjivačku hromatografiju, anjon-izmenjivačku hromatografiju, nanofiltraciju, filtraciju tangencijalnim protokom/ultrafiltraciju; na sekvencijalni način; pri čemu je matrica afinitetne hromatografije protein A; pri čemu je koncentracija soli pufera korišćenih u prečišćavanju u opsegu od 30 mM - 500 mM; i c) priprema stabilne formulacije koja sadrži antigen-vezujući protein, pri čemu je osmolalnost formulacije u opsegu od 300 - 400 mOsm/Kg i viskozitet formulacije manji od 2,5 mPa-S, pri čemu formulacija sadrži najmanje jedan antigenvezujući protein, najmanje jedan stabilizator, najmanje jedan puferski agens, najmanje jedan agens za podešavanje toničnosti i najmanje jedan surfaktant; pri čemu formulacija sadrži: (i) 1 - 100 mg/ml antigen-vezujućeg proteina; (ii) 20 - 40 mM histidina; (iii) 50 - 100 mM arginina; (iv) 0,002 - 0,02% polisorbata 80 (tež./zapr.); (v) 50 - 150 mM NaCl; i (vi) 0,1 - 2,5% saharoze tež./zapr.; pri čemu je pH formulacije 6,5 ± 0,5; i pri čemu je rezultujuća formulacija stabilna na 2-8 °C najmanje 9 meseci, na 25 °C najmanje 1 mesec, na 40 °C najmanje 40 dana, na 50 °C najmanje 2 dana.

[0018] Drugi aspekt predmetnog otkrića odnosi se na farmaceutsku formulaciju koja sadrži: 1 -100 mg/ml najmanje jednog antigen-vezujućeg proteina, pri čemu je antigen-vezujući protein monoklonsko antitelo protiv virusa denge prema SEQ ID 1 i SEQ ID 2 ili gde je antigen-vezujući protein monoklonsko antitelo protiv virusa besnila prema SEQ ID 3 i SEQ ID 4; 20 - 40 mM histidina; 50 - 100 mM arginina; 0,002 – 0,02% polisorbata 80 (tež./zapr.); 50-150 mM NaCl; 0,1 – 2,5% saharoze tež./zapr.; pri čemu je pH formulacije 6,5 ± 0,5, pri čemu je osmolalnost formulacije 300 - 450 mOsmol/kg a viskozitet manji od 2,5 mPa-S i navedena formulacija je stabilna na 2-8 °C najmanje 9 meseci, na 25 °C najmanje 1 mesec, na 40 °C najmanje 40 dana, na 50 °C najmanje 2 dana.

[0019] Treći aspekt predmetnog otkrića odnosi se na farmaceutsku formulaciju prema predmetnom otkriću za upotrebu u lečenju, sprečavanju ili dijagnostici virusa denge ili virusa besnila.

[0020] Ostali ciljevi i svojstva predmetnog otkrića biće očigledni iz opisa koji sledi, sa slika, kao i iz priloženih patentnih zahteva.

Lista slika:

[0021]

1. Slika 1: Dijagram – Nishodna obrada za prečišćavanje monoklonskog antitela

2. Slika 2: Dijagram – Postupak formulacije za monoklonsko antitelo

Opis

[0022] Prvi aspekt predmetnog otkrića odnosi se na postupak proizvodnje farmaceutskog antigenvezujućeg proteina sa visokim prinosom i minimalnom agregacijom, u kome je antigen-vezujući protein monoklonsko antitelo protiv virusa denge prema SEQ ID 1 i SEQ ID 2 ili je antigenvezujući protein monoklonsko antitelo protiv virusa besnila prema SEQ ID 3 i SEQ ID 4, pri čemu postupak obuhvata sledeće korake: a) kultivisanje sisarskih ćelija koje eksprimiraju antigenvezujući protein u medijumu za proizvodnju ćelijske kulture u velikom obimu, pri čemu korak kultivisanja efikasno održava broj ćelija u opsegu od 10 x 10<6>- 20 x 10<6>ćelija/ml i rezultuje prinosom od najmanje 2 g/L pri čemu je ćelijska linija sisarskih ćelija CHO-K1 SV GS-KO kada je antigen-vezujući protein monoklonsko antitelo protiv virusa denge, a ćelijska linija sisarskih ćelija je GS-CHO kada je antigen-vezujući protein monoklonsko antitelo protiv virusa besnila; pri čemu korak kultivacije uključuje upotrebu osnovnog medijuma, upotrebu koncentrovanog osnovnog medijuma kao hranljivog rastvora, upotrebu hranljivih rastvora zajedno sa određenom strategijom hranjenja, što rezultuje pojačanim rastom ćelija, održavanjem nižih koncentracija laktata i amonijaka i efektivnim održavanjem broja ćelija, čime se povećava dugovečnost ćelija i postiže visok prinos; b) prečišćavanje antigen-vezujućeg proteina iz sakupljenog supernatanta dobijenog u koraku (a), pri čemu prečišćavanje rezultuje oporavkom od najmanje 80% i čistoćom od najmanje 99%; i gde prečišćavanje obuhvata afinitetnu hromatografiju, inaktivaciju virusa na niskom pH, katjon-izmenjivačku hromatografiju, anjon-izmenjivačku hromatografiju, nanofiltraciju, filtraciju tangencijalnim protokom/ultrafiltraciju; na sekvencijalni način; pri čemu je matrica afinitetne hromatografije protein A; pri čemu je koncentracija soli pufera korišćenih u prečišćavanju u opsegu od 30 mM - 500 mM; i c) priprema stabilne formulacije koja sadrži antigen-vezujući protein, pri čemu je osmolalnost formulacije u opsegu od 300 - 400 mOsm/Kg i viskozitet formulacije manji od 2,5 mPa-S, pri čemu formulacija sadrži najmanje jedan antigenvezujući protein, najmanje jedan stabilizator, najmanje jedan puferski agens, najmanje jedan agens za podešavanje toničnosti i najmanje jedan surfaktant; pri čemu formulacija sadrži: 1 - 100 mg/ml antigen-vezujućeg proteina; 20 - 40 mM histidina; 50 - 100 mM arginina; 0,002 - 0,02% polisorbata 80 (tež./zapr.); 50 - 150 mM NaCl; i 0,1 - 2,5% saharoze tež./zapr.; pri čemu je pH formulacije 6,5 ± 0,5; i pri čemu je rezultujuća formulacija stabilna na 2-8 °C najmanje 9 meseci, na 25 °C najmanje 1 mesec, na 40 °C najmanje 40 dana, na 50 °C najmanje 2 dana.

[0023] Antigen-vezujući protein ima afinitet vezivanja prema epitopima prisutnim na virusu denge ili virusu besnila.

[0024] Izoelektrična tačka (pI) navedenog antigen-vezujućeg proteina može da bude 7,5 – 8,5, poželjnije 7,8 do 8,2, najpoželjnije 8,12.

[0025] Ćelijska linija koja se koristi za ekspresiju antigen-vezujućih proteina je linija ćelija jajnika kineskog hrčka; konkretnije sisarska ćelijska linija je CHOK1SV GS-KO, kada je antigen-vezujući protein monoklonsko antitelo protiv virusa denge, a sisarska ćelijska linija je GS-CHO, kada je antigen-vezujući protein monoklonsko antitelo protiv virusa besnila.

[0026] Prema jednom primeru izvođenja, medijum za ćelijsku kulturu dopunjava se jednim ili većim brojem drugih nutrijenata, najmanje jednom tokom koraka kultivisanja.

[0027] Prema drugom primeru izvođenja, medijumu za proizvodnju ćelijske kulture dopunjava se prema rasporedu koji obuhvata suplementaciju koja je kontinuirana, dnevna, svakog drugog dana, svaka dva dana, ili njihovu kombinaciju.

[0028] Prema sledećem primeru izvođenja, ćelije se kultivišu u šaržnom, dolivno-šaržnom, kontinuiranom režimu, perfuzionom režimu; tačnije u dolivno-šaržnom režimu. Poznato je da stručnjak u oblasti može da modulira ovaj postupak prema raspoloživim postrojenjima i individualnim potrebama. Preciznije, postupak kultivacije ćelija može da se sprovodi u dolivnošaržnom režimu obezbeđujući poboljšan rast ćelija, dugovečnost ćelija i povećanu ekspresiju proteina, tj. obezbeđujući prinos od najmanje 2 g/L, poželjno u opsegu od 3 g/L do 6 g/L.

[0029] Ćelijska kultura može da je gaji u boci, bioreaktoru, bioreaktoru sa rezervoarom, bioreaktoru sa kesom ili bioreaktoru za jednokratnu upotrebu. Poželjno, pomenuti bioreaktor je izabran iz grupe bioreaktora sa rezervoarom sa mešanjem, bioreaktora sa barbotirajućom kolonom, bioreaktora sa air-lift kolonom, bioreaktora sa fluidizovanim slojem ili bioreaktora sa pakovanim slojem; i pomenuti bioreaktor ima zapreminu izabranu između 1L, 2L, 3L, 5L, 10L, 20L, 100L, 200L, 250L, 350L, 500 L, 1000L, 1500L, 3000L, 5000L, 10000L, 20000L i 30.000 litara.

[0030] Medijum i postupci za kultivaciju ćelija mogu da se upotrebe za povećanje prinosa antitela za 5%, 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 180%, ili 200% , najpoželjnije 40% do 60% mereno tokom dve nedelje. Vremenski period trajanja dolivno-šaržnog postupka može da bude 12 do 20 dana; 15 do 20 dana ili 15 do 18 dana.

[0031] Medijum za ćelijsku kulturu može da bude odabran iz grupe koja sadrži jedno ili više od CD CHO, CD OptiCHO™, CD FortiCHO™ (Life Technologies); Ex-Cell™ CD CHO (Sigma Aldrich); ProCHO™5 (Lonza); BalanCD™ CHO Growth A (Irvine Scientific); CDM4Mab(Hyclone); Cellvento™ CHO-100 (EMD Millipore); Cell vento 200 (Merck Millipore); Cell vento 220 (Merck Millipore); Actipro (Hyclone); i njihove kombinacije. Poželjno, medijum za ćelijsku kulturu je odabran od Cell Vento 220 (Merck), ACTIPRO (HyClone/GE), ili Gibco™ Dynamis™ Medium (Thermo Fisher).

[0032] Medijum za ćelijsku kulturu može dodatno da se dopuni glukozom i drugim hranljivim rastvorima kako bi se povećao rast ćelija, dugovečnost ćelija, ekspresija proteina i prinos. U struci je veoma dobro poznato da dopunjavanje hranljivim rastvorima može da se ostvaruje u vidu brzog bolusa ili postepenim ukapavanjem.

[0033] Prema jednom primeru, dopunjavanje medijuma za ćelijsku kulturu hranljivim rastvorom se obavlja prema strategiji ishrane koja obuhvata:

- Početno hranjenje hranljivim rastvorom A, u zapremini od 0,05% do 0,5% zapremine reaktora, poželjno 0,1% do 0,2% zapremine reaktora, od 4. dana;

- Hranjenje hranljivim rastvorom A, u zapremini od 0,1% do 0,5% zapremine reaktora 6, 8, 10, 11. i 13. dana;

- Hranljivi rastvor B u zapremini od manje od 8% zapremine reaktora, od 2. do 14. dana, na naizmenične dane ili kontinuirano;

- Hranjenje hranljivim rastvorom C u zapremini od manje od 8% zapremine reaktora tokom najmanje 2 uzastopna dana počevši od 2. ili 3. dana, sa prekidima od 2 uzastopna dana, do 12. ili 14. dana ili 15. ili 16. dana ili 18. dana.

- Hranjenje hranljivim rastvorom D u zapremini od manje od 0,5% zapremine reaktora najmanje 2 uzastopna dana počevši od 4. ili 5. dana, na naizmenične dane ili na kontinuiran način ili sa prekidima od 2 uzastopna dana, do 12. dana ili 14. dana ili 15. dana ili 16. dana ili 18. dana. Opciono uvođenje najmanje jednog hranljivog rastvora izabranog od EfficientFeed™ A, EfficientFeed™ B, EfficientFeed™ C i agensa protiv stvaranja pene C Dow corning.

[0034] Poželjno, navedeni hranljivi rastvor A, hranljivi rastvor B, hranljivi rastvor C, hranljivi rastvor D je odabran od jednog ili više elemenata grupe koja sadrži glukozu, suplement Cell Boost™ 5 (Hyclone), EX-CELL 293 (Sigma Aldrich), suplement Cell Boost 7a i 7b (Hyclone), 3X Actipro (Hyclone/GE), Cell Vento 220 (1X medium), EX-CELL® Advanced™ CHO Feed 1, EfficientFeed™ A, EfficientFeed™ B, i EfficientFeed™ C, i njihovu kombinaciju.

[0035] Poželjnije, navedeni hranljivi rastvor A je suplement Cell Boost™ 5 (Hyclone); hranljivi rastvor B je EX-CELL 293 (Sigma Aldrich), hranljivi rastvor C je suplement Cell Boost 7a (Hyclone), hranljivi rastvor D je suplement Cell Boost 7b (Hyclone). Dalje, medijum za ćelijsku kulturu se dopunjava sa 10% "3X Actipro" (Hyclone) 3. dana i 8% Cell Vento 220 (1X medijum) 7. dana kultivacije ćelija. Stručnjaku u ovoj oblasti je jasno da sva dodavanja hranljivih rastvora mogu da variraju za ± 1% i ± 1 dan.

[0036] Uslovi kultivacije ćelija mogu da se koriste za povećanje ćelijskog rasta i dugovečnosti i ekspresije proteina. Sledeći uslovi kultivacije ćelija koji se koriste tokom postupka uključuju, ali nisu ograničeni na:

- pH medijuma za ćelijsku kulturu je u rasponu od 6,5 do 7,5;

- Osmolalnost medijuma kulture je u rasponu od 250 - 500 mOsm/kg; poželjnije 400 - 500 mOsm/kg.

- Rastvoreni kiseonik je u rasponu od 10 - 60%; poželjno 20-40%; poželjno 30%.

- Temperatura ćelijske kulture je u rasponu od 30 °C do 38 °C; prva temperatura poželjno je 36 -37 °C i opciono druga temperatura poželjno je 30 - 35 °C.

- Koncentracija glukoze se održava ispod 7%; poželjno između 4% i 5%.

- Berba ćelijske kulture obavlja se kada je vitalnost smanjena na 80%;

pri čemu se uslovi kultivacije ćelija održavaju na takav način da koncentracija sekundarnih metabolita kao što je laktata nije veća od 5 g/L; a koncentracija amonijaka nije veća od 5 mMol/L.

[0037] Prema jednom primeru izvođenja, medijum za ćelijsku kulturu ima osmolalnost u opsegu od 250 - 500 mOsm/Kg; pH u opsegu od 6,5 - 7,5; rastvoreni kiseonik se održava u opsegu od 10 - 60%; temperatura ćelijske kulture je u opsegu od 30 °C do 38 °C; prva temperatura poželjno 36 - 37 °C i opciono druga temperatura poželjno 30 - 35 °C; koncentracija glukoze se održava ispod 7%; poželjno između 4% i 5%; sakupljanje ćelijske kulture kada je vitalnost smanjena na 80%; pri čemu se uslovi ćelijske kulture održavaju na način da sekundarni metaboliti kao što je koncentracija laktata nije veća od 5 g/L; a koncentracija amonijaka nije veća od 5 mMol/L. Poželjno, osmolalnost fermentacionog medijuma je 400 - 500 mOsm/kg.

[0038] U drugom primeru izvođenja, rastvoreni kiseonik u medijumu za fermentaciju održava se u opsegu od 20 - 40%.

[0039] Antigen-vezujući protein dobijen iz berbe ćelijske kulture se podvrgava postupku prečišćavanja koji obuhvata afinitetnu hromatografiju, virusnu inaktivaciju primenom niskog pH, katjon-izmenjivačku hromatografiju, anjon-izmenjivačku hromatografiju, nanofiltraciju, filtraciju tangencijalnim protokom/ultrafiltraciju; na sekvencijalni način; pri čemu je matrica afinitetne hromatografije protein A; pri čemu je koncentracija soli pufera korišćenih u prečišćavanju u opsegu od 30 mM - 500 mM.

[0040] Prema specifičnom primeru izvođenja, koncentracija soli pufera koji se koriste u prečišćavanju je u opsegu od 50 mM - 300 mM.

[0041] Prečišćavanje rezultuje obnavljanjem od najmanje 80% i čistoćom od najmanje 99%. Nečistoće uključujući zaostalu ćelijsku DNK, rezidualni ćelijski protein i rezidualni protein A u konačnom prečišćenom terapeutskom proteinu čine manje od 1%.

[0042] Problemi agregacije antigen-vezujućeg proteina tokom nishodne obrade proteina mogu da se ublaže korišćenjem i) soli u koraku pranja afinitetne hromatografije i ii) linearnog gradijenta rastvora soli za eluiranje u koraku hromatografije koji podrazumeva izmenu jona. Poželjno, koncentracija soli pufera koji se koriste u prečišćavanju je u opsegu od 30 mM - 500 mM, poželjnije koncentracija soli pufera koji se koriste u prečišćavanju je u opsegu od 50 mM - 300 mM.

[0043] Korišćena afinitetna hromatografija je hromatografija na proteinu A.

[0044] Smola koja se koristi za hromatografiju na proteinu A može da bude odabrana iz grupe koja sadrži jedno ili više od Eshmuno A, KanCapATM, MabSelect SuRe™, MabSelect SuRe LX, MabSelect Xtra, rProtein A Sepharose Fast Flow, Poros<®>MabCapture A, Amsphere™ Protein A JWT203, ProSep HC, ProSep Ultra, i ProSep Ultra Plus. Poželjno, smola koja se koristi za hromatografiju na proteinu A je MabSelect SuRe™, Eshmuno A, Kancap A ili Poros MabCapture. Poželjnije, smola koja se koristi za hromatografiju na proteinu A je MabSelect SuRe™.

[0045] Pufer za pranje koji se koristi za hromatografiju na proteinu A može da bude izabran iz grupe koja sadrži jedno ili više od

- 10 - 30 mM fosfatnog pufera, poželjno 20 mM fosfatnog pufera; 100 - 150 mM NaCl, poželjno 150 mM NaCl; 0,05% polisorbata 80; pH 7,0 ± 0,2;

- 10 - 30 mM fosfatni pufer, poželjno 20 mM fosfatni pufer; 250 mM - 1 M NaCl, poželjno 1M NaCl; 0,05% polisorbata 80; pH 7,0 ± 0,2;

- 1-30 mM fosfatni pufer, poželjno 10 mM fosfatni pufer; 100-150 mM NaCl, poželjno 125 mM NaCl; 0,05% polisorbata 80; pH 7,0 ± 0,2.

[0046] Pufer za eluiranje koji se koristi za hromatografiju na proteinu A može da sadrži 10 - 30 mM citratnog pufera; pH 3,0 ± 0,5; i opciono 0,01 - 0,05% (tež./zapr.) polisorbata 80; poželjno je da pufer za eluiranje sadrži 20 mM citratnog pufera; pH 3,0 ± 0,2; i opciono 0,025% (tež./zapr.) polisorbata 80.

[0047] Prema jednom primeru izvođenja, hromatografija na proteinu A sadrži: a) Pufer za ekvilibraciju: 20 mM fosfatni pufer; 100 - 150 mM NaCl; 0,05% polisorbat 80; pH 7,0 ± 0,2; b) Punjenje: klarifikovana berba; c) Pufer za pranje I: 20 mM fosfatni pufer; 100 - 150 mM NaCl, tačnije 150 mM; 0,05% polisorbat 80; pH 7,0 ± 0,2; d) Pufer za pranje II: 20 mM fosfatni pufer; 250 mM - 1 M NaCl, tačnije 1M; 0,05% polisorbat 80; pH 7,0 ± 0,2; e) Pufer za pranje III: 10 mM fosfatni pufer; 100 - 150 mM NaCl, tačnije 125 mM; 0,05% polisorbat 80; pH 7,0 ± 0,2; f) Pufer za eluiranje: 20 mM citratni pufer; pH 3,0 ± 0,2; i opciono 0,025 % (tež./zapr.) polisorbata 80; g) CIP pufer: 0,1 M NaOH; h) vreme zadržavanja: 4,00 – 8,00 minuta; i) korišćena kolona: XK26; j) linearni protok je 10 - 500 cm/h, tačnije 100-150 cm/h.

[0048] Eluat dobijen iz koraka afinitetne hromatografije podvrgava se virusnoj inaktivaciji na niskom pH. U struci je veoma dobro poznato da se virusna inaktivacija i redukcija u eluatu mogu izvršiti postupkom koji je odabran pojedinačno ili u kombinaciji iz grupe koja obuhvata pH tretman, tretman deterdžentom, toplotnu obradu i filtraciju za redukciju virusa.

[0049] Prema jednom primeru izvođenja, virusna inaktivacija eluata dobijenog afinitetnom hromatografijom na proteinu A se postiže držanjem eluata na pH 3,3 - 3,5 tokom 50 - 100 minuta.

[0050] pH vrednost eluata može da se neutrališe podvrgavanjem eluata puferu za neutralizaciju, tj. 1 M Tris/citratni pufer pH 7,0 ± 0,2. U struci je veoma dobro poznato da se bilo koji drugi kompatibilni pufer može koristiti alternativno za efikasnu neutralizaciju pH eluata.

[0051] Eluat sa inaktivisanim virusom se podvrgava katjon-izmenjivačkoj i anjon-izmenjivačkoj hromatografiji. Ova hromatografija se može izvesti u režimu "vezivanje i eluiranje" ili u režimu "protoka". Poželjno, katjon-izmenjivačka hromatografija i anjon-izmenjivačka hromatografija se sprovode bilo kojim redosledom. Smola za hromatografiju može da bude multimodalna smola poput Capto MMC smole (GE Healthcare).

[0052] Prema jednom primeru izvođenja, katjon-izmenjivačka hromatografija se sprovodi korišćenjem smole izabrane iz grupe koja sadrži jednu ili više od grupe na bazi sulfonata; grupe na bazi sulfoetila; grupe na bazi sulfopropila; grupe na bazi sulfoizobutila; grupe na bazi sulfoksi etila, grupe na bazi karboksimetila; grupa na bazi sulfonske i karboksilne kiseline; grupe na bazi karboksilne kiseline; grupe na bazi sulfonske kiseline; i grupe na bazi ortofosfata.

[0053] Poželjno, parametri katjonske hromatografije, uključujući hromatografsku smolu i puferske uslove, biraju se na takav način da se pozitivno naelektrisani protein vezuje za hromatografsku smolu, dok negativno naelektrisani molekuli ulaze u protočnu frakciju, dalje se proteini podvrgavaju eluiranju pomoću gradijenta soli.

[0054] Poželjno, smola katjon-izmenjivačke hromatografije se bira iz grupe koja sadrži jedno ili više od grupe na bazi sulfonata (npr., MonoS, MiniS, Source 15S i 30S, SP SEPHAROSE<®>Fast Flow, SP SEPHAROSE<®>High Performance kompanije GE Healthcare, TOYOPEARL<®>SP-650S i SP-650M kompanije Tosoh, MACRO-PREP<®>High S kompanije BioRad, Ceramic HyperD S, TRISACRYL<®>M i LS SP i Spherodex LS SP kompanije Pall Technologies); grupe na bazi sulfoetila (npr., FRACTOGEL<®>SE, kompanije EMD, POROS<®>S-10 i S-20 kompanije Applied Biosystems); grupe na bazi sulfopropila (npr., TSK Gel SP 5PW i SP-5PW- HR kompanije Tosoh, POROS<®>HS-20, HS 50, i POROS<®>XS kompanije Life Technologies); grupe na bazi sulfoizobutila (npr., FRACTOGEL<®>EMD S03 " kompanije EMD); grupe na bazi sulfoksi etila (npr., SE52, SE53 i Express-Ion S kompanije Whatman), grupe na bazi carboksimetila (npr., CM SEPHAROSE<®>Fast Flow kompanije GE Healthcare, Hydrocell CM kompanije Biochrom Labs Inc., MACRO-PREP® CM kompanije BioRad, Ceramic HyperD CM, TRISACRYL<®>M CM, TRISACRYL<®>LS CM, kompanije Pall Technologies, Matrex CELLUFINE<®>C500 i C200 kompanije Millipore, CM52, CM32, CM23 i Express-Ion C kompanije Whatman, TOYOPEARL<®>CM-650S, CM-650M i CM-650C kompanije Tosoh); grupa na bazi sulfonske i karboksilne kiseline (npr., BAKERBOND<®>Carboxy-Sulfon kompanije J.T. Baker); grupe na bazi karboksilne kiseline (npr., WP CBX kompanije J.T Baker, DOWEX<®>MAC-3 kompanije Dow Liquid Separations, AMBERLITE<®>Weak Cation Exchangers, DOWEX<®>Weak Cation Exchanger, i DIAION<®>Weak Cation Exchangers kompanije Sigma-Aldrich i FRACTOGEL<®>EMD COO-kompanije EMD); grupe na bazi sulfonske kiseline (npr., Hydrocell SP kompanije Biochrom Labs Inc., DOWEX<®>Fine Mesh Strong Acid Cation Resin kompanije Dow Liquid Separations, UNOsphere S, WP Sulfonic kompanije J.T. Baker, SARTOBIND<®>S membrane kompanije Sartorius, AMBERLITE<®>Strong Cation Exchangers, DOWEX<®>Strong Cation i DIAION<®>Strong Cation Exchanger kompanije Sigma-Aldrich); i grupe na bazi ortofosfata (npr., PI 1 kompanije Whatman).

[0055] Poželjnije, smola koja se koristi za katjon-izmenjivačku hromatografiju je Fractogel<®>EMD SO3-, Fractogel<®>EMD SE Hicap (Merck), CMM HyperCel™ (Pall Corporation), Capto S ImpAct.

[0056] Parametri postupka za katjon-izmenjivačku hromatografiju uključuju, ali nisu ograničeni na Pufer za prethodnu ekvilibraciju [200 mM citratni pufer; pH 6,0 ± 0,2]; Pufer za ekvilibraciju [10 mM citratni pufer; polisorbat 80 (0,025% (tež./zapr.)); pH 6,0 ± 0,2]; Održavanje niskog pH za neutralizaciju; Pufer za pranje A [10 mM citratni pufer; pH 6,0 ± 0,2]; Pufer za pranje B [20 mM citratni pufer; 300 - 500 mM NaCl; pH 6,0 ± 0,2]; CIP pufer [0,5M NaOH]; Vreme zadržavanja [4,00 – 7,00 minuta]; Korišćena kolona [XK26].

[0057] Dakle, prema jednom primeru izvođenja, katjon-izmenjivačka hromatografija obuhvata a) pufer za prethodnu ekvilibraciju: 200 mM citratni pufer; pH 6,0 ± 0,2; b) Pufer za ekvilibraciju: 10 mM citratni pufer; 0,025% (tež./zapr.) polisorbat 80; pH 6,0 ± 0,2; c) Pufer za pranje A: 10 mM citratni pufer; pH 6,0 ± 0,2; d) Pufer za pranje B: 20 mM citratni pufer; 300 – 500 mM NaCl; pH 6,0 ± 0,2; e) CIP pufer: 0,5 M NaOH; f) Vreme zadržavanja: 4,00 – 7,00 minuta; g) Korišćena kolona: XK26.

[0058] Eluat sa inaktivisanim virusom se takođe podvrgava anjon-izmenjivačkoj hromatografiji. Poželjno, parametri anjonske hromatografije, uključujući hromatografsku smolu i puferske uslove, biraju se na takav način da se sve negativno naelektrisane nečistoće vezuju za membranu dok terapeutski protein eluira u protočnoj frakciji.

[0059] Poželjno, smola anjon-izmenjivačke hromatografije izabrana je iz grupe koja sadrži jedno ili više od DEAE celuloze, POROS<®>PI 20, PI 50, HQ 10, HQ 20, HQ 50, D 50 kompanije Applied Biosystems, SARTOBIND<®>Q kompanije Sartorius, MonoQ, MiniQ, Source 15Q i 30Q, Q, DEAE i ANX SEPHAROSE<®>Fast Flow, Q SEPHAROSE, Q SEPHAROSE<®>High Performance, QAE SEPHADEX<®>i FAST Q SEPHAROSE<®>(GE Healthcare),WP PEI, WP DEAM, WP QUAT kompanije J.T. Baker, Hydrocell DEAE i Hydrocell QA kompanije Biochrom Labs Inc., U Osphere Q, MACRO-PREP<®>DEAE i MACRO-PREP<®>High Q kompanije Biorad, Ceramic HyperD Q, ceramic HyperD DEAE, TRISACRYL<®>M i LS DEAE, Spherodex LS DEAE, QMA SPHEROSIL<®>LS, QMA SPHEROSIL<®>M i MUSTANG<®>Q kompanije Pall Technologies, DOWEX<®>Fine Mesh Strong Base Type I and Type II Anion Resins i DOWEX<®>MONOSPHER E 77, anjon slabe kiseline kompanije Dow Liquid Separations, INTERCEPT<®>Q membrane, Matrex CELLUFINE<®>A200, A500, Q500, i Q800, kompanije Millipore, FRACTOGEL<®>EMD TMAE, FRACTOGEL<®>EMD DEAE i FRACTOGEL<®>EMD DMAE kompanije EMD, AMBERLITE<®>slabih i jakih anjonskih izmenjivača tipa I i II, DOWEX<®>slabih i jakih anjonskih izmenjivača tipa I i II, DIAION<®>slabih i jakih anjonskih izmenjivača tipa I i II, DUOLITE<®>kompanije Sigma-Aldrich, TSK gel Q i DEAE 5PW i 5PW-HR, TOYOPEARL<®>SuperQ-650S, 650M i 650C, QAE-550C i 650S, DEAE-650M i 650C kompanije Tosoh, QA52, DE23, DE32, DE51, DE52, DE53, Express-Ion D i Express-Ion Q kompanije Whatman; poželjnije, smola anjonizmenjivačke hromatografije izabrana je od Sartobind Q (Sartorius), Eshmuno Q (Merck), MUSTANG<®>Q (Pall Corporation) i Poros X (Thermo).

[0060] Parametri postupka za anjon-izmenjivačku hromatografiju uključuju, ali nisu ograničeni na Pufer za čišćenje [0,5M NaOH]; Pufer za prethodnu ekvilibraciju [200 mM citratni pufer; pH 6,0 ± 0,2]; Pufer za ekvilibraciju [20 mM citratni pufer; pH 6,0 ± 0,2; i opciono 0,025% polisorbata 80]; Pufer za skladištenje [0,1M NaOH]; Brzina linearnog protoka [10 - 500 cm/h, konkretno 100-150 cm/h]; Korišćena kolona [XK26].

[0061] Prema tome, prema jednom primeru izvođenja, anjon-izmenjivačka hromatografija obuhvata a) Pufer za čišćenje: 0,5M NaOH; b) Pufer za prethodnu ekvilibraciju: 200 mM citratni pufer; pH 6,0 ± 0,2; c) Pufer za ekvilibraciju: 20 mM citratni pufer; pH 6,0 ± 0,2; i opciono 0,025% polisorbata 80; d) Pufer za skladištenje: 0,1M NaOH; e) Brzina linearnog protoka je 10 - 500 cm/h, konkretno 100-150 cm/h; f) Korišćena kolona: XK26.

[0062] Prema još jednom primeru izvođenja, anjon-izmenjivačka hromatografija je "režim protoka i ispiranja" ili "režim vezivanja i eluiranja".

[0063] Prema jednom primeru izvođenja, postupak prema predmetnom otkriću može dalje da obuhvata dodatni hromatografski korak odabran iz grupe koja sadrži jedno ili više od hromatografije hidrofobne interakcije, hidrofobne hromatografije sa indukcijom naelektrisanja, hromatografije na keramičkom hidroksiapatitu, multimodalne hromatografije (Capto MMC i Capto Adhere), membranske hromatografije (Q membrane uključujući Intercept™ (Millipore), Mustang<®>(Pall Corporation) i Sartobind™ (Sartorius)).

[0064] U postupku prema predmetnom otkriću, virusne čestice mogu da se uklone upotrebom filtera od 20 nm.

[0065] Prema jednom primeru izvođenja, uklanjanje virusnih čestica postiže se nanofiltracijom korišćenjem filtera koji zadržava virus. Filter koji zadržava virus može da bude odabran iz grupe Viresolve PRO (Merck), Planova 20N (Asahi Kasei), Bio EXL PALL PEGASUS PRIME, PEGASUS SV4 (Pall Life Sciences), i Virosart (Sartorius), Virosart CPV filtera kompanije Sartorius, Virosolve kompanije Millipore, Ultipor DV20 ili DV50 kompanije Pall, Planova 20N i 50N ili BioEx kompanije Asahi. Dobro je poznato u tehnici da bilo koji drugi filter koji ima kapacitet da zadržava viruse može da se koristi u ovom koraku. Poželjno, filter upotrebljen za uklanjanje virusnih čestica odabran je od Viresolve PRO (Merck), Bio EXL PALL PEGASUS PRIME, PEGASUS SV4 (Pall Life Sciences), i Virosart (Sartorius).

[0066] Terapeutski protein se koncentruje do željene koncentracije i pufer se zamenjuje puferom za formulaciju. Pufer se zamenjuje u sistemu za filtraciju tangencijalnim protokom ili u sistemu za ultrafiltraciju.

[0067] Prema jednom primeru izvođenja, antigen-vezujući protein de koncentruje upotrebom filtracije tangencijalnim protokom (TFF).

[0068] Prema drugom primeru izvođenja, TFF se izvodi upotrebom membrane od 30 kDa.

[0069] Parametri filtracije tangencijalnim protokom obuhvataju jedan ili više elemenata odabranih od dijafiltracije korišćenjem pufera za dijafiltraciju [25 mM histidinski pufer; 75 mM argininski pufer; 50 - 150 mM NaCl; pH 6,50 ± 0,5]; pufera za čišćenje [0,5M NaOH]; pufera za skladištenje [0,1 M NaOH]; ekvilibracije korišćenjem 5 - 10 X zapremina membrane; koncentrovanja i dijafiltracije korišćenjem 10-20 zapremina dijafiltracije; pranja vodom za injekcije (WFI) korišćenjem 3-5 zapremina membrane; čišćenja korišćenjem 0,5 – 1,0 M NaOH; skladištenja [0,1M NaOH]. Poželjno, filtracija tangencijalnim protokom se izvodi korišćenjem membrane sa graničnom vrednošću molekulske težine (MWCO) od 30 kDa odabrane iz grupe koja sadrži jednu ili više od PES membrane Centramate T serije (Pall Corporation), Hydrosart (Sartorius), i Pelicon 3 (Merck).

[0070] Prema specifičnom primeru izvođenja, postupak filtracije tangencijalnim protokom obuhvata a) Dijafiltraciju korišćenjem pufera za dijafiltraciju: 25 mM histidinski pufer; 75 mM argininski pufer; 50 -150 mM NaCl; pH 6,50 ± 0,5; b) Pufer za čišćenje: 0,5M NaOH; c) Pufer za skladištenje: 0,1M NaOH; d) Ekvilibraciju korišćenjem 5 - 10 X zapremina membrane; e) Koncentrovanje i dijafiltraciju korišćenjem 10-20 zapremina dijafiltracije; f) pranje vodom za injekcije (WFI) korišćenjem 3-5 zapremina membrane; g) Čišćenje korišćenjem 0,5 – 1,0 M. Postupak prema predmetnom otkriću obuhvata korak c) pripreme stabilne formulacije koja sadrži antigen-vezujući protein, pri čemu je osmolalnost formulacije u opsegu od 300 - 400 mOsm/Kg i viskozitet formulacije je manji od 2,5 mPa-S, pri čemu formulacija sadrži najmanje jedan antigenvezujući protein, najmanje jedan stabilizator, najmanje jedan puferski agens, najmanje jedan agens za podešavanje toničnosti i najmanje jedan surfaktant. Formulacija sadrži 1 - 100 mg/ml antigenvezujućeg proteina; 20 - 40 mM histidina; 50 - 100 mM arginina; 0,002 - 0,02% polisorbata 80 (tež./zapr.); 50 - 150 mM NaCl; i 0,1 - 2,5% saharoze tež./zapr.; pri čemu je pH formulacije 6,5 ± 0,5; i gde je rezultujuća formulacija stabilna na 2-8 °C najmanje 9 meseci, na 25 °C najmanje 1 mesec, na 40 °C najmanje 40 dana, na 50 °C najmanje 2 dana.

[0071] Prema jednom primeru izvođenja postupka prema predmetnom otkriću, preparat prečišćenog terapeutskog proteina sadrži ne više od 2% agregata, poželjno manje od 1% agregata.

[0072] Prema drugom primeru izvođenja postupka prema predmetnom otkriću, stabilna formulacija antigen-vezujućeg proteina sadrži 1 mg/ml do 100 mg/ml antigen-vezujućeg proteina.

[0073] Prema još jednom primeru izvođenja postupka prema predmetnom otkriću, antigenvezujući protein formulacija antigen-vezujućeg proteina sadrži ne više od 3% agregacije, minimalnu količinu čestica ispod granice vidljivosti i poboljšanu potentnost.

[0074] Prema sledećem primeru izvođenja postupka prema predmetnom otkriću, koncentracija monomera antigen-vezujućeg proteina u formulaciji veća od 99%; količina rezidualne DNK CHO nije veća od 2 pg/mg antigen-vezujućeg proteina, tačnije nije veća od 0,1 pg/mg antigen-vezujućeg proteina; rezidualnog CHO proteina nije veća od 100 ng/mg antigen-vezujućeg proteina, tačnije nije veća od 10 ng/mg antigen-vezujućeg proteina; rezidualnog proteina-A nije veća od 10 ng/mg antigen-vezujućeg proteina, tačnije nije veća od 1,5 ng/mg antigen-vezujućeg proteina; endotoksina nije veća od 0,1 EU/mg antigen-vezujućeg proteina.

[0075] Prema sledećem primeru izvođenja postupka prema predmetnom otkriću, formulacija sadrži <1% (tež./zapr.), najpoželjnije 0,5% (tež./zapr.), saharoze; 25 mM, histidina; 75 mM, arginina; 100 - 145 mM, natrijum hlorida; 0,02% (tež./zapr.), polisorbata 80; i 1 mg/ml do 50 mg/ml, antigen-vezujućeg proteina.

[0076] U drugom aspektu, predmetno otkriće se odnosi na farmaceutsku formulaciju koja sadrži a) 1 - 100 mg/ml najmanje jednog antigen-vezujućeg proteina, pri čemu je antigen-vezujući protein monoklonsko antitelo protiv virusa denge prema SEQ ID 1 i SEQ ID 2 ili je antigen-vezujući protein monoklonsko antitelo protiv virusa besnila prema SEQ ID 3 i SEQ ID 4; b) 20 - 40 mM histidina; c) 50 - 100 mM arginina; d) 0,002 - 0,02% polisorbata 80 (tež./zapr.); e) 50 - 150 mM NaCl; f) 0,1 - 2,5% saharoze tež./zapr.; pri čemu je pH formulacije 6,5 ± 0,5, pri čemu je osmolalnost formulacije 300 - 450 mOsmol/kg i viskozitet manji od 2,5 mPa-S i navedena formulacija je stabilna na 2-8 °C najmanje 9 meseci, na 25 °C najmanje 1 mesec, na 40 °C najmanje 40 dana, na 50 °C najmanje 2 dana.

[0077] Prema jednom primeru izvođenja, farmaceutska formulacija sadrži 2 - 80 mg/ml najmanje jednog antigen-vezujućeg proteina; 25 mM histidina; 75 mM arginina; 101 mM NaCl; 0,02% polisorbata 80 (tež./zapr.); i 0,5% (tež./zapr.) saharoze; pri čemu je pH formulacije 6,5 ± 0,5.

[0078] Osmolalnost formulacije je 380 mOsmol/kg.

[0079] Prema jednom primeru izvođenja, farmaceutska formulacija sadrži 2-80 mg/ml antigenvezujućeg proteina; 25 mM histidina; 75 mM arginina; 101 mM NaCl; 0,02% polisorbata 80 (tež./zapr.); i 0,5% saharoze tež./zapr.; pri čemu je pH formulacije 6,5 ± 0,5 osmolalnost 380 mOsm/Kg, viskozitet manji od 2,5 mPa-S.

[0080] Prema jednom primeru izvođenja, farmaceutska formulacija sadrži 25 mg/ml antigenvezujućeg proteina; 25 mM histidina; 75 mM arginina; 101 mM NaCl; 0,02% polisorbata 80 (tež./zapr.); i 0,5% saharoze tež./zapr.; pri čemu je pH formulacije 6,5 ± 0,5 osmolalnost 380 mOsm/Kg, viskozitet manji od 2,5 mPa-S.

[0081] Prema jednom primeru izvođenja, farmaceutska formulacija sadrži 50 mg/ml antigenvezujućeg proteina; 25 mM histidina; 75 mM arginina; 101 mM NaCl; 0,02% polisorbata 80 (tež./zapr.); i 0,5% saharoze tež./zapr.; pri čemu je pH formulacije 6,5 ± 0,5 osmolalnost 380 mOsm/Kg, viskozitet manji od 2,5 mPa-S.

[0082] Prema drugom primeru izvođenja, formulacija je tečna formulacija.

[0083] Prečišćeni antigen-vezujući protein može da bude formulisan sa farmaceutskim ekscipijensima.

[0084] Prema tome, formulacija antigen-vezujućeg proteina sadrži najmanje jedan antigenvezujući protein, najmanje jedan stabilizator (saharoza), najmanje jedan puferski agens (histidin i arginin), najmanje jedan agens za podešavanje toničnosti (natrijum hlorid, NaCl), i najmanje jedan surfaktant (polisorbat 80). Opciono, formulacija sadrži konzervans.

[0085] Formulacija može da sadrži dodatni stabilizator odabran iz grupe koja sadrži jedno ili više od sorbitola, trehaloze, manitola, dekstrana, inozitola, glukoze, fruktoze, laktoze, ksiloze, manoze, maltoze, rafinoze i njihove kombinacije. Poželjno, formulacija sadrži <1% saharoze tež./zapr.

[0086] Formulacija može da sadrži dodatni puferski agens odabran iz grupe koja sadrži jedno ili više od glicina, natrijum citrata, natrijum fosfata, limunske kiseline, HEPES, kalijum acetata, kalijum citrata, kalijum fosfata, natrijum acetata, natrijum bikarbonata, Tris baze, ili Tris-HCI, i njihove kombinacije. Puferski agens obezbeđuje pH od 6,0 do 7,0. Puferski agens obezbeđuje pH od 6,0 do 7,0, poželjno 6,3 do 6,8, ili 6,5.

[0087] Poželjno, formulacija sadrži histidin u koncentraciji od 25 mM.

[0088] Poželjno, formulacija sadrži arginin u koncentraciji od 70 do 80 mM.

[0089] Formulacija može da sadrži dodatni agens za podešavanje toničnosti odabran iz grupe koja sadrži jedno ili više od dekstroze, glicerina, manitola, i kalijum hlorida. Poželjno, formulacija sadrži NaCl u koncentraciji od 100 - 145 mM.

[0090] Formulacija može da sadrži dodatni surfaktant odabran iz grupe koja sadrži jedno ili više od polisorbata (npr. polisorbat- 20); poloksamera (npr. poloksamer 188); Tritona; natrijum dodecil sulfata (SDS); natrijum laurel sulfata; natrijum oktil glikozida; lauril-, miristil-, linoleil-, ili stearilsulfobetaina; lauril-, miristil-, linoleil- ili stearil-sarkozina; linoleil-, miristil-, ili cetil-betaina; lauroamidopropil-, kokamidopropil-, linoleamidopropil-, miristamidopropil-, palmidopropil-, ili izostearamidopropil-betaina (npr. lauroamidopropil); miristamidopropil-, palmidopropil-, ili izostearamidopropil-dimetilamina; natrijum metil kokoil-, ili dinatrijum metil oleil-taurata; i serija MON-AQUAT<®>(Mona Industries, Inc., Paterson, N.J.), polietil glikola, polipropil glikola, i kopolimera etilen i propilen glikola (npr. Pluronics, PF68 itd). Poželjno, formulacija sadrži polisorbat 80 u koncentraciji od 0,02% (tež./zapr.).

[0091] Poželjno, formulacija sadrži antigen-vezujući protein u koncentraciji od 1 mg/L do 50 mg/L, 20 mg/L do 40 mg/L. Najpoželjnije, formulacija sadrži antigen-vezujući protein u koncentraciji od 1 mg/L do 50 mg/L.

[0092] Formulacija može dodatno da sadrži konzervans. Konzervans može da bude izabran iz grupe koja sadrži benzil alkohol, m-krezol i fenol.

[0093] Prema jednom primeru, farmaceutska formulacija sadrži 2 - 80 mg/ml monoklonskog antitela protiv virusa denge; 25 mM histidina; 75 mM arginina; 101 mM NaCl; 0,02% polisorbata 80 (tež./zapr.); i 0,5% saharoze tež./zapr.; pri čemu je pH formulacije 6,5 ± 0,5 osmolalnost 380 mOsm/Kg, viskozitet manji od 2,5 mPa-S.

[0094] Prema drugom primeru, farmaceutska formulacija sadrži 25 mg/ml monoklonskog antitela protiv virusa denge; 25 mM histidina; 75 mM arginina; 101 mM NaCl; 0,02% polisorbata 80 (tež./zapr.); i 0,5% saharoze tež./zapr.; pri čemu je pH formulacije 6,5 ± 0,5 osmolalnost 380 mOsm/Kg, viskozitet manji od 2,5 mPa-S.

[0095] Prema još jednom primeru, farmaceutska formulacija sadrži 50 mg/ml monoklonskog antitela protiv virusa denge; 25 mM histidina; 75 mM arginina; 101 mM NaCl; 0,02% polisorbata 80 (tež./zapr.); i 0,5% saharoze tež./zapr.; pri čemu je pH formulacije 6,5 ± 0,5 osmolalnost 380 mOsm/Kg, viskozitet manji od 2,5 mPa-S.

[0096] Prema sledećem primeru, farmaceutska formulacija sadrži 2 - 80 mg/ml monoklonskog antitela protiv virusa besnila; 25 mM histidina; 75 mM arginina; 101 mM NaCl; 0,02% polisorbata 80 (tež./zapr.); i 0,5% saharoze tež./zapr.; pri čemu je pH formulacije 6,5 ± 0,5 osmolalnost 380 mOsm/Kg, viskozitet manji od 2,5 mPa-S.

[0097] Prema još jednom primeru, farmaceutska formulacija sadrži 25 mg/ml monoklonskog antitela protiv virusa besnila; 25 mM histidina; 75 mM arginina; 101 mM NaCl; 0,02% polisorbata 80 (tež./zapr.); i 0,5% saharoze tež./zapr.; pri čemu je pH formulacije 6,5 ± 0,5 osmolalnost 380 mOsm/Kg, viskozitet manji od 2,5 mPa-S.

[0098] Prema jednom primeru, farmaceutska formulacija sadrži 50 mg/ml monoklonskog antitela protiv virusa besnila; 25 mM histidina; 75 mM arginina; 101 mM NaCl; 0,02% polisorbata 80 (tež./zapr.); i 0,5% saharoze tež./zapr.; pri čemu je pH formulacije 6,5 ± 0,5 osmolalnost 380 mOsm/Kg, viskozitet manji od 2,5 mPa-S.

[0099] Farmaceutska formulacija može da bude liofilizovana formulacija.

[0100] Afinitet i potentnost antigen-vezujućeg proteina može da se meri pomoću jednog ili više od ELISA testa ili protočne citometrije. Poželjno, postupak na bazi indirektnog ELISA testa se koristi za kvantifikaciju vezivanja antigen-vezujućeg proteina za specifični antigen. Poželjno, formulacija monoklonskih antitela protiv virusa denge se ispituje na sve serotipove virusa denge i određuje se količina monoklonskih antitela protiv virusa denge. Potentnost antigen-vezujućeg proteina se prikazuje kao % aktivnosti u odnosu na referentni standard. Jasno je da bilo koji drugi sličan postupak može da se koristi za demonstriranje potentnosti i afiniteta terapeutskog proteina.

[0101] Test neutralizacije putem smanjenja formiranja fokusa (PRNT/FRNT) ili srodan test može da se sprovede za procenu neutralizacije virusne aktivnosti antigen-vezujućim proteinom. Poželjno, formulacija monoklonskih antitela protiv virusa denge se ispituje na sve serotipove virusa denge i izračunavaju se EC50 vrednosti za neutralizaciju virusa denge. Jasno je da bilo koji drugi sličan postupak može da se koristi za demonstriranje neutralizacione aktivnosti terapeutskog proteina. Za procenu prisustva agregata u formulaciji terapeutskog proteina može da se koristi ekskluziona hromatografija zasnovana na HPLC metodi. Poželjno, kolona Phenomenex Bio-Sec-S 3000 se koristi za demonstriranje procenta agregata i monomera u formulaciji monoklonskih antitela protiv virusa denge. Jasno je da bilo koji drugi sličan postupak može da se koristi za procenu prisustva agregata u formulaciji terapeutskog proteina.

[0102] Formulacija može da se skladišti u pogodnom kontejneru. Kontejner može da bude odabran od boce, bočice, ampule, IV kese, prenosivog injektora, bolus injektora, šprica, pen šprica, pumpe, višedoznog šprica sa iglom, višedoznog pen šprica, injektora, sirete, autoinjektora, napunjenog šprica ili njihove kombinacije.

[0103] Najmanje jedna komponenta primarne ambalaže može da sadrži zatvarač kontejnera odabran od polipropilena (PP), polietilen tereftalata (PETG), polietilena visoke gustine (HDPE), polietilen tereftalata (PET), polipentafluorostirena (PFS), polikarbonata, polivinil hlorida (PVC), policiklopentana (CZ.RTM.), cikličnog olefinskog kopolimera (COC), poliolefina i njihovih kombinacija ili kopolimera.

[0104] Formulacije antitela protiv virusa denge ili antitela protiv virusa besnila koje su ovde opisane mogu da se koriste (same ili u kombinaciji sa drugim agensima ili terapeutskim modalitetima) za lečenje, prevenciju i/ili dijagnostikovanje virusa denge ili besnila. Na primer, kombinovana terapija može da uključuje molekul antitela protiv virusa denge ko-formulisan sa, i/ili primenjen zajedno sa, jednim ili više terapeutskih agenasa, npr., antivirusnim agensima (uključujući druga antitela protiv denge), vakcinama (uključujući vakcine protiv virusa denge), ili agensima koji poboljšavaju imunski odgovor. U drugim primerima izvođenja, molekuli antitela se primenjuju u kombinaciji sa drugim modalitetima terapeutskog tretmana, kao što su intravenska hidratacija, agensi za snižavanje temperature (kao što je acetaminofen) ili transfuzija krvi. Takve kombinovane terapije mogu povoljno da koriste niže doze primenjenih terapeutskih agenasa, čime se izbegavaju moguće toksičnosti ili komplikacije povezane sa različitim monoterapijama.

[0105] U trećem aspektu, predmetno otkriće se odnosi na farmaceutsku formulaciju prema predmetnom otkriću za upotrebu u lečenju, prevenciji ili dijagnostici virusa denge ili besnila.

[0106] Prema jednom primeru izvođenja, formulacija je sadržana u kontejneru odabranom od boce, bočice, ampule, IV kese, prenosivog injektora, bolus injektora, šprica, pen šprica, pumpe, višedoznog šprica sa iglom, višedoznog pen šprica, injektora, sirete, autoinjektora, napunjenog šprica ili njihove kombinacije.

[0107] Prema još jednom primeru izvođenja, najmanje jedna komponenta primarne ambalaže sadrži zatvarač kontejnera odabran od polipropilena (PP), polietilen tereftalata (PETG), polietilena visoke gustine (HDPE), polietilen tereftalata (PET), polipentafluorostirena (PFS), polikarbonata, polivinil hlorida (PVC), policiklopentana (CZ.RTM.), cikličnog olefinskog kopolimera (COC), poliolefina i njihovih kombinacija ili kopolimera.

Primeri:

Primer 1: Ushodni postupak za kultivaciju ćelija i ekspresiju terapeutskog proteina tj. monoklonskog antitela protiv virusa denge (VIS513)

Protokol:

[0108] Kultivacija ćelija obima 10 L sprovedena je u režimu napojne šarže korišćenjem dole navedenih parametara tokom fermentacije/ushodnog postupka.

[0109] Monoklonsko antitelo protiv virusa denge eksprimirano je u ćelijskoj liniji "CHO - K1 SV GS-KO" nabavljenoj kod Visterra Inc. USA.

• Medijum za ćelijsku kulturu upotrebljen za rast ćelija i ekspresiju terapeutskog proteina tj. monoklonskog antitela protiv virusa denge bio je tečni medijum 1X Cellvento™ CHO-220. • Za dopunu hranljivim rastvorom upotrebljen je hranljivi rastvor A, hranljivi rastvor B, hranljivi rastvor C, hranljivi rastvor D odabran iz grupe koja sadrži glukozu, suplement Cell Boost™ 5 (Hyclone), EX-CELL 293 (Sigma Aldrich), suplemente Cell Boost 7a i 7b (Hyclone), 3X Actipro (Hyclone), Cell Vento 220 (3X medijum), EX-CELL<®>Advanced™ CHO Feed 1.

• pH fermentacionog medijuma održavan je na 6,7 do 7,5.

• Osmolalnost fermentacionog medijuma održavana je na <490 mOsm/Kg.

• Rastvoreni kiseonik fermentacionog medijuma održavan je na oko 20% do oko 40%.

• Temperatura fermentacionog medijuma je održavana na 36,5 ± 0,5.

• Kultura je obrana nakon pada broja ćelija na 60%

[0110] Dopuna hranljivim rastvorom je vršena postepeno, kap po kap prema sledećoj tabeli 1:

Tabela 1

Rezultati i zaključak:

[0111] Broj vijabilnih kolonija i prinos dobijen tokom postupka fermentacije bio je sledeći: Tabela 2 : Broj vijabilnih kolonija i prinos dobijen tokom postupka fermentacije

[0112] Podnosilac prijave je otkrio da se korišćenjem postupka za kultivaciju ćelija koji obuhvata osnovni medijum, koncentrovani osnovni medijum kao hranljivi rastvor, upotrebom hranljivih rastvora, uz određenu strategiju ishrane, može postići pojačan rast ćelija, niže koncentracije laktata i amonijaka, čime se efikasno održava broj ćelija i postiže povećana dugovečnosti ćelija i povećan prinos. Prinos veći od 4 g/L dobijen je u procesu fermentacije. Dobijena berba je dalje podvrgnuta prečišćavanju/nishodnoj obradi.

Primer 2:

[0113] Ćelijska kultura dobijena u primeru 1 je sakupljena i kasnije podvrgnuta protokolu za prečišćavanje monoklonskog antitela protiv virusa denge (VIS513) kao što je prikazano na slici 1

[0114] Detaljan postupak koji je korišćen bio je sledeći:

Afinitetna hromatografija na proteinu A:

U ovom koraku ciljano monoklonsko antitelo je odvojeno od komponenti medijuma u obranom supernatantu.

Kalrifikovani supernatant je propušten kroz hromatografsku kolonu i zatim eluiran korišćenjem kompatibilnih elucionih pufera.

[0115] Upotrebljeni materijali:

Smola (Matrica): Mab Select Sure/Eshmuno A (afinitet vezivanja sa proteinom A) Vreme zadržavanja: 4,0-8,0 minuta

Korišćena kolona: XK 26

Pufer za ekvilibraciju: 20 mM fosfatni pufer 150 mM NaCl 0,05 % (tež./zapr.) polisorbat 80, pH 7,0 ± 0,2.

Pufer za pranje I: 20 mM fosfatni pufer 150 mM NaCl 0,05% (tež./zapr.) polisorbat 80, pH 7,0 ± 0,2.

Pufer za pranje II: 20 mM fosfatni pufer 1M NaCl 0,05% (tež./zapr.) polisorbat 80, pH 7,0 ± 0,2.

Pufer za pranje III: 10 mM fosfatni pufer 125 mM NaCl 0,025% (tež./zapr.) polisorbat 80, pH 6,0 ± 0,2.

Pufer za eluiranje: 20 mM citratni pufer 0,025% (tež./zapr.) polisorbat 80, pH 3,0 ± 0,2.

CIP pufer: 0,1 M NaOH

Korišćeni parametri postupka:

[0116]

Tabela 3:

1. Inaktivacija virusa na niskom pH

[0117]

i. Eluat afinitetne hromatografije na proteinu A podvrgnut je niskom pH tj.3,5 ± 0,1 tokom 60 ± 10 minuta kako bi se virusne čestice inaktivisale.

ii. Nakon držanja na niskom pH, eluat je neutralizovan upotrebom pufera za neutralizaciju tj.1 M Tris/citratnog pufera koji ima pH 7,0 ± 0,2.

iii. Provodljivost neutralizovanog eluata je podešena korišćenjem WFI sa 0,025% (tež./zapr.) polisorbata 80.

2. Katjon-izmenjivačka hromatografija

[0118] Pozitivno naelektrisani molekuli antitela vezuju se za kolonu, dok negativno naelektrisani molekuli izlaze sa protočnom fazom. Molekuli antitela vezani za kolonu eluiraju se upotrebom gradijenta soli.

Upotrebljeni materijali:

[0119]

Korišćena smola: Fractogel SO3-/ Fractogel SE Hicap (Merck)

Vreme zadržavanja: 4,00-7,00 minuta

Korišćena kolona: XK 26

Prethodna ekvilibracija: 200 mM citratni pufer pH 6,0 ± 0,2.

Ekvilibracija: 10 mM citratni pufer 0,025% (tež./zapr.) polisorbat 80, pH 6,0 ± 0,2. Punjenje: Neutralizovano nakon držanja na niskom pH.

Pufer za pranje A: 10 mM citratni pufer, pH 6,0 ± 0,2.

Pufer za pranje B: 20 mM citratni pufer 300 mM NaCl, pH 6,0 ± 0,2.

CIP pufer: 0,5 M NaOH

Pufer za skladištenje: 0,1 M NaOH

Parametri postupka:

Tabela 4:

Sakupljanje frakcija tokom proticanja gradijenta

[0120]

Tabela 5:

Anjon-izmenjivačka hromatografija:

[0121] Sve negativno naelektrisane nečistoće se vezuju za membranu, dok se antitelo nalazi u protočnoj fazi.

[0122] Upotrebljeni materijali:

Upotrebljena membrana/Smola: Sartobind Q single Sep mini (Sartorius)/Eshmuno Q Zapremina punjenja: 150 mg/mL-1000 mg/mL

Korišćena kolona: XK 26

Pufer za čišćenje: 0,5 M NaOH

Pre-Pufer za ekvilibraciju: 200 mM citratni pufer, pH 6,0 ± 0,2.

Pufer za ekvilibraciju: 20 mM citratni pufer pH 6,0 ± 0,2; i opciono 0,025% PS-80 pH 6,0 ± 0,2

Pufer za skladištenje: 0,1 M NaOH

Parametri postupka:

[0123]

Tabela 6:

3. Nano-filtracija:

[0124] Nanofilter od 20 nm tj. Viresolve PRO (Merck), je upotrebljen za uklanjanje bilo kakvih virusnih čestica prisutnih u terapeutskom proteinu.

4. Filtracija tangencijalnim protokom/Ultrafiltracija:

[0125] Antitelo je koncentrovano do željene koncentracije i pufer je izmenjen u jedan od tri pufera za formulaciju.

Upotrebljeni materijal:

Pufer za formulaciju:

[0126]

• Pufer 1: 25 mM histidinski pufer 75 mM argininski pufer 75 mM NaCl , pH 6,50 ± 0,25;

• Pufer 2: 25 mM histidina, 75 mM arginina, 101mM NaCl;

• Pufer 3: 25mM histidina, 75 mM arginina, 75mM do 101mM NaCl, polisorbat-80 0,002% tež./zapr.

• Pufer za čišćenje: 0,5 M NaOH

Pufer za skladištenje: 0,1 M NaOH

Korišćena membrana: PALL Centramate T serije, PES membrana sa graničnom vrednošću molekulske mase (MWCO) od: 30 kDa

Parametri postupka:

[0127]

Tabela 7

Sterilna filtracija

[0128] Stabilizator je dodat u rastvor antitela i rastvor je sterilno filtriran kroz filter od 0,2 µm. Rezultati:

[0129] Oporavak po stadijumima različitih koraka koji se koriste u postupku prečišćavanja.

Tabela 8:

[0130] Nađeno je da je ukupni oporavak u postupku ~ 80% i nađeno je da je ukupna čistoća >99%.

Tabela 9: Podaci o nečistoćama

Tabela 10 : Oporavak i čistoća po serijama

Primer 3:

[0131] Prečišćeno monoklonsko antitelo protiv virusa denge (VIS513) formulisano je na sledeći način:

Ekscipijensi tj. arginin, histidin, NaCl, saharoza i polisorbat-80 su dodati i dobro promešani pomoću magnetne mešalice na 50-60 o/min da bi se obrazovala smeša ekscipijenasa. Ova smeša je zatim postepeno dodata u berbu monoklonskih antitela protiv denge posle TFF uz mešanje brzinom od 50-60 o/min. Proveren je pH (pH 6,5) i po potrebi podešen puferom histidin-arginin. Finalna formulacija je filtrirana kroz filter od 0,2 µM i razlivena u finalni kontejner.

[0132] Koncentracija svake komponente u finalnoj formulaciji bila je:

Tabela 11:

[0133] U ovim formulacijama je dalje ispitivana čistoća, stabilnost, efikasnost i potentnost tokom 9 meseci.

Primer 4:

[0134] Efekat prisustva saharoze u formulaciji antitela protiv virusa denge VIS513 je proučavan pri ispitivanju potentnosti ELISA testom na proteinu EDIII DV1. Ispitivanja formulacije su urađena za temp. 2 - 8 °C, 25 °C i 40 °C.

Rezultati :

1. Formulaciji antitela protiv virusa denge VIS513 bez saharoze

[0135]

Tabela 12:

2. Formulaciji antitela protiv virusa denge VIS513 sa saharozom

[0136]

Tabela 13:

Sastav referentne standardne formulacije:

[0137] Zaključak: Dodavanje 0,5% tež./zapr. saharoze poboljšava stabilnost u poređenju sa odgovarajućom tačkom uzorkovanja bez saharoze.

Primer 5:

[0138] Formulacija antitela VIS513 je skladištena na 40 °C tokom 20 dana, nakon čega je ELISA testom procenjena potentnost VIS513. Efekat povećanja koncentracije saharoze ispitivan je na formulaciji antitela VIS513 na 40 °C, pri čemu je ocenjivana koncentracija saharoze od 0,1, 0,2 i 0,5%.

Rezultati:

[0139]

Tabela 14:

Tabela 15:

Tabela 16:

Tabela 17

Sastav referentne standardne kompozicije:

[0140] Zaključak: Najveća stabilnost je zapažena kod formulacije koja sadrži 0,5% saharoze.

Primer 6:

[0141] Analitički test za čistoću, stabilnost, efikasnost i potentnost formulacije monoklonskih antitela protiv virusa denge (VIS513) sa skladištenjem na

• 2-8 °C tokom perioda od 0 meseci, 3 meseca, 6 meseci i 9 meseci.

• 25 °C tokom perioda od 0 dana i 30 dana

• 40 °C tokom perioda od 0 dana, 7 dana, 14 dana, 28 dana, 35 dana i 42 dana.

6.1 : Potentnost formulacije antitela VIS513 ispitivana je indirektnim ELISA testom.

[0142] Indirektna ELISA metoda je korišćena za kvantifikaciju vezivanja monoklonskih antitela protiv virusa denge (VIS513) za protein EDIII DV1 antigena. Protein EDIII je imobilisan na ploči. Nevezani antigen je uklonjen pranjem. U sledećem koraku su dodati standardni i test uzorci, ostavljeni da se vežu za antigen. Da bi se odredila količina vezanog Dv-Mab, korišćen je mišji anti-humani IgG Fc-HRP, specifičan za Dv-Mab (Fc fragment humanog imunoglobulina), da bi se prepoznalo prisustvo Dv-Mab. Test je razvijen sa TMB Microwell Peroxidase Substrate System koji kvantifikuje stepen vezivanja putem količine boje koja se formira na 450 nm. Softver za analizu podataka je generisao krivu vezivanja za svaki uzorak koristeći četvoroparametarski model prilagođavanja krive i uporedio krivu vezivanja ispitivanog uzorka sa standardnom krivom izračunavanjem relativne potentnosti. Potentnost ispitivanog uzorka je prikazana kao % aktivnosti u odnosu na referentni standard (relativna potentnost puta 100).

Rezultati:

[0143]

Tabela 18: Potentnost (%) Mab protiv virusa denge (VIS513) indirektnim ELISA testom za formulaciju skladištenu na 2 - 8 °C.

Tabela 19: Potentnost (%) Mab protiv virusa denge (VIS513) indirektnim ELISA testom za formulaciju skladištenu na 25 °C.

Tabela 20: Potentnost (%) Mab protiv virusa denge (VIS513) indirektnim ELISA testom za formulaciju skladištenu na 40 °C.

[0144] Formulacija monoklonskih antitela protiv virusa denge (VIS513) nije pokazala nikakav vremenski zavisan gubitak afiniteta vezivanja.

6.2 : PRNT test za određivanje EC50

[0145] Test uključuje prethodno mešanje serijski razblaženog antitela sa virusom da bi se omogućilo vezivanje antitela, neutralizaciju, zatim prebacivanje smeše na monosloj Vero ćelija, prekrivanje viskoznim medijumom, inkubaciju (~3-7 dana, u zavisnosti od serotipa virusa) da bi se omogućila ograničena replikacija i širenje virusa, praćeno detekcijom plaka. Neutralizacija je praćena putem smanjenja formiranja plaka. Robusna detekcija je postignuta metodama imunološkog bojenja, korišćenjem mišjeg 4G2 anti-denga antitela i HRP-označenog kozjeg antimišjeg antitela sa supstratom peroksidaze.

[0146] Uzorci formulacije monoklonskih antitela protiv virusa denge (VIS513) su testirani na sva četiri serotipa virusa denge tj. DV1, DV2, DV3 i DV4. EC50 vrednost je izračunata za neutralizaciju virusa denge. EC50 vrednost predstavlja 50% efektivne koncentracije koja je potrebna za efektivnu neutralizaciju virusa denge i EC50 vrednost je izračunata iz broja plaka prisutnih u kontrolnim bunarčićima za virus i broja plaka u bunarčićima u koje su dodati inkubirani uzorci monoklonska antitela-virus.

Rezultati:

[0147]

Tabela 21: Vrednost EC50 (ng/ml) za mAb protiv virusa denge (VIS513) određena PRNT testom za formulaciju skladištenu na 2 - 8 °C.

Tabela 22: Vrednost EC50 (ng/ml) za mAb protiv virusa denge (VIS513) određena PRNT testom za formulaciju skladištenu na 25 °C.

Tabela 23: Vrednost EC50 (ng/ml) za mAb protiv virusa denge (VIS513) određena PRNT testom za formulaciju skladištenu na 40 °C.

[0148] Formulacija monoklonskih antitela protiv virusa denge (VIS513) nije pokazala nikakav vremenski zavisan gubitak efikasnosti neutralizacije virusa na 2-8 °C i 25 °C. Formulacija VIS513 ne gubi sposobnost da neutralizuje virus denge, čak ni ako se drži na 40 °C.

6.3 : Analiza agregacije i čistoće

[0149] Ekskluziona hromatografija na bazi HPLC metode (HPLC-SEC) upotrebljena je za ocenu agregata u balku i finalnoj formulaciji DV Mab. U ovom postupku upotrebljena je kolona phenomenex Bio-Sec-S 3000 za određivanje procenata agregata i monomera monoklonskih antitela protiv virusa denge (VIS513) ubrizgavanjem ~50 µg ukupnog antitela i analiziranjem pri protoku od 1 ml/minut tokom 35 minuta. Kao mobilna faza upotrebljen je fosfatno puferisani fiziološki rastvor (PBS), pH 6,5.

Rezultati: SEC-HPLC (Opseg prihvatanja je – ne niže od 90%)

[0150]

Tabela 24: SEC-HPLC analiza formulacije skladištene na 2 - 8 °C

Tabela 25: SEC-HPLC analiza formulacije skladištene na 25 °C

Tabela 26: SEC-HPLC analiza formulacije skladištene na 40 °C

[0151] Formulacija monoklonskih antitela protiv virusa denge (VIS513) nije pokazala nikakvu značajnu vremenski zavisnu agregaciju; i nađeno je da je čistoća/sadržaj monomera >98%.

Primer 7:

[0152] Efekat koncentracija surfaktanta u formulacijama:

Efekat koncentracije surfaktanta ocenjivan je analizom čestica ispod granice vidljivosti. Pripremljene su koncentracije sa različitim koncentracijama polisorbata-80 i u njima su analizirane čestice ispod granice vidljivosti.

Tabela 27

Zaključak:

[0153] U formulaciji koja sadrži 0,005% tež./zapr. polisorbata-80 zapažen je minimum čestica ispod granice vidljivosti. U zavisnosti od doze, ako formulacija zahteva razblaživanje, finalno usvojena koncentracija polisorbata 80 bila je 0,02% tež./zapr. sa 4-strukom marginom.

Primer 8: Studija za određivanje minimalne upotrebljene koncentracije stabilizatora

[0154] Iz dostupne literature utvrđena je minimalna potrebna snaga pufera (10-30 mM). Da bi se odredila minimalna količina arginina (koji se koristi kao sredstvo za rastvaranje i sredstvo za smanjenje viskoziteta) u uzorku monoklonskih antitela pufer je zamenjen normalnim fiziološkim rastvorom i postepeno je dodan štok rastvor arginina (300 mM). Agregacija u rastvoru je praćena merenjem OD na 350 nm. Slani rastvor sa 75 mM arginina dao je najniži OD, pa je finalno usvojena koncentracija arginina od 75 mM.

Primer 8

Ispitivanje viskoziteta formulacije antitela protiv virusa denge (VIS513)

[0155] Viskozitet uzoraka monoklonskih antitela protiv DV meren je pomoću mikroprocesorskog viskozimetra, model: microVISCTM (proizvođač: RheoSense, CA USA) prema proceduri datoj u uputstvu za upotrebu uređaja.

Tabela 28

Zaključak:

[0156] Nikakvo povećanje viskoziteta zavisno od vremena nije zapaženo u formulaciji monoklonskih antitela skladištenoj na 2-8 °C tokom 90 dana, kao ni u uzorku držanom na 25 °C tokom 1 meseca, prvenstveno zbog ekscipijensa - arginina 75 mM. Nađeno je da viskozitet formulacije podnosioca prijave iznosi 1,1 do 1,2 mPa-S/cP, što je niže nego kod ostalih formulacija na tržištu koje imaju viskozitet između 11-50 mPa-S/cP.

Primer 9: Ispitivanje postupka prečišćavanja monoklonskih antitela protiv virusa denge (VIS513) sa dodavanjem virusa

[0157] Validaciono ispitivanje virusa sprovedeno je za stvarni proizvodni postupak, kako bi se ispitala efektivnost uklanjanja virusa filtracijom u postupku proizvodnje monoklonskog antitela.

[0158] Kao model organizmi korišćeni su virus leukemije miša (MuLV) i minutni virus miša (MMV/MVM). Autori ovog pronalaska uporedili su delotvornost inventivnog postupka za prečišćavanje prema pronalasku sa onom kod opšteg i dobro ustanovljenog postupka za prečišćavanje monoklonskog antitela.

[0159] Opšti i dobro ustanovljeni postupak za prečišćavanje monoklonskog antitela koji obuhvata hromatografiju na proteinu A (smola GE); tretman na niskom pH; hromatografiju Sartobind Q (anjon-izmenjivačka membrana, Sartorius, za jednokratnu upotrebu); hromatografija sa fenilnom fazom Sartobind (membranska hromatografija, Sartorius, za jednokratnu upotrebu); filtracija kroz filter Viresolve Pro (nanofiltracija, Merck).

Tabela 29:

Rezultati:

[0160] Postupak prečišćavanja SIIPL bio je visoko efikasan u uklanjanju virusa, sa dostignutim ukupnim LRV u skladu sa ICH smernicama. (LRV standardnog postupka - 12,64, inventivnog postupka SIIPL – 23,74) Nađeno je da je antitelo protiv virusa denge koje je prečišćeno upotrebom inventivnog postupka pogodno za humana klinička ispitivanja bez ikakvog rizika od zaražavanja virusom.

Primer 10: Ushodni postupak za kultivaciju ćelija i ekspresiju terapeutskog proteina tj. monoklonskog antitela protiv virusa besnila

Protokol:

[0161] Kultivacija ćelija obima 2 L sprovedena je u dolivno-šaržnom režimu upotrebom dole navedenih parametara tokom postupka fermentacije/ushodnog postupka.

• Monoklonsko antitelo protiv virusa besnila eksprimirano je u ćelijskoj liniji "GS - CHO".

• Medijum za ćelijsku kulturu korišćen za rast ćelija i ekspresiju terapeutskog proteina tj. monoklonskog antitela protiv virusa besnila bio je "1X Cellvento™ CHO-220 Liquid Medium" ili "Actipro 1x (Hyclone)"

• Za dopunu hranljivim rastvorom upotrebljen je hranljivi rastvor A, hranljivi rastvor B, hranljivi rastvor C, hranljivi rastvor D odabran iz grupe koja sadrži glukozu, suplement Cell Boost™ 5 (Hyclone), EX-CELL 293 (Sigma Aldrich), suplemente Cell Boost 7a i 7b (Hyclone), 3X Actipro (Hyclone), Cell Vento 220 (3X medijum), EX-CELL<®>Advanced™ CHO Feed.

• pH fermentacionog medijuma održavan je na 6,5 do 7,5.

• Osmolalnost fermentacionog medijuma održavana je između 270 - 450 mOsm/Kg. • Rastvoreni kiseonik fermentacionog medijuma održavan je na oko 20% do oko 60%. • Temperatura fermentacionog medijuma održavana je na 36,5 ± 1.

[0162] Suplementacija hrane je vršena postepeno, kap po kap prema sledećoj tabeli:

Tabela 30:

[0163] Ćelijska kultura je obrana nakon pada OD do 60%

Rezultati i zaključak:

[0164] Dobijen je prinos postupka fermentacije od 3 - 5 g/L. Dobijena berba je dalje podvrgnuta prečišćavanju/nishodnoj obradi.

Primer 11:

[0165] Ćelijska kultura dobijena prema primeru 9 je obrana i kasnije podvrgnuta protokolu za prečišćavanje monoklonskog antitela protiv virusa besnila kao na slici 1.

[0166] Detaljan postupak koji je korišćen bio je sledeći:

Afinitetna hromatografija na proteinu A:

U ovom koraku ciljano monoklonsko antitelo je odvojeno od komponenti medijuma u obranom supernatantu.

Kalrifikovani supernatant je propušten kroz hromatografsku kolonu i zatim eluiran korišćenjem kompatibilnih elucionih pufera.

[0167] Upotrebljeni materijali:

Smola (Matrica): Mab Select Sure/Eshmuno A (afinitet vezivanja sa proteinom A) Vreme zadržavanja: 4,0-8,0 minuta

Korišćena kolona: XK 26

Pufer za ekvilibraciju: 20 mM fosfatni pufer 150 mM NaCl 0,05% (tež./zapr.) polisorbat 80, pH 7,0 ± 0,2.

Pufer za pranje I: 20 mM fosfatni pufer 150mM NaCl 0,05% (tež./zapr.) polisorbat 80, pH 7,0 ± 0,2.

Pufer za pranje II: 20 mM fosfatni pufer 1M NaCl 0,05% (tež./zapr.) polisorbat 80, pH 7,0 ± 0,2.

Pufer za pranje III: 10 mM fosfatni pufer 125 mM NaCl 0,025% (tež./zapr.) polisorbat 80, pH 6,0 ± 0,2.

Pufer za eluiranje: 20 mM citratni pufer 0,025% (tež./zapr.) polisorbat 80, pH 3,0 ± 0,2.

CIP pufer: 0,1 M NaOH

Korišćeni parametri postupka:

[0168]

Tabela 31

1. Inaktivacija virusa na niskom pH

[0169]

i. Eluat afinitetne hromatografije na proteinu A podvrgnut je niskom pH tj.3,5 ± 0,1 tokom 60 ± 10 minuta kako bi se virusne čestice inaktivisale.

ii. Nakon držanja na niskom pH, eluat je neutralizovan upotrebom pufera za neutralizaciju tj.1 M Tris/citratnog pufera koji ima pH 7,0 ± 0,2. Nakon toga, neutralizovani rastvor je filtriran upotrebom filtera od 0,8/0,45 µm ili 0,8/0,2 µm.

iii. Provodljivost neutralizovanog eluata je podešena korišćenjem WFI sa 0,025% (tež./zapr.) polisorbata 80.

2. Katjon-izmenjivačka hromatografija

[0170] Pozitivno naelektrisani molekuli antitela vezuju se za kolonu, dok negativno naelektrisani molekuli izlaze sa protočnom fazom. Molekuli antitela vezani za kolonu eluiraju se upotrebom gradijenta soli.

Upotrebljeni materijali:

[0171]

Korišćena smola: Fractogel SO3-/Fractogel SE Hicap (Merck)

Vreme zadržavanja: 4,00-7,00 minuta

Korišćena kolona: XK 26

Prethodna ekvilibracija: 200 mM citratni pufer pH 6,0 ± 0,2.

Ekvilibracija: 10 mM citratni pufer 0,025% (tež./zapr.) polisorbat 80, pH 6,0 ± 0,2.

Punjenje: Neutralizovano nakon držanja na niskom pH.

Pufer za pranje A: 10 mM citratni pufer, pH 6,0 ± 0,2.

Pufer za pranje B: 20 mM citratni pufer 300 mM NaCl, pH 6,0 ± 0,2.

CIP pufer: 0,5 M NaOH

Pufer za skladištenje: 20% etanol 150 mM NaCl

Tabela 32: Parametri postupka:

Tabela 33: Sakupljanje frakcija tokom proticanja gradijenta

Anjon-izmenjivačka hromatografija:

[0172] Sve negativno naelektrisane nečistoće se vezuju za membranu, dok se antitelo nalazi u protočnoj fazi.

[0173] Upotrebljeni materijali:

Korišćena membrana/Smola: Sartobind Q single Sep mini (Sartorius)/Eshmuno Q Zapremina punjenja: 150 mg/mL-1000 mg/mL

Korišćena kolona: XK 26

Pufer za čišćenje: 0,5 M NaOH

Pufer za prethodnu ekvilibraciju: 200 mM citratni pufer, pH 6,0 ± 0,2.

Pufer za ekvilibraciju: 20 mM citratni pufer pH 6,0 ± 0,2; i opciono 0,025% PS-80 pH 6,0 ± 0,2

Pufer za skladištenje: 20% etanol 150 mM NaCl ili 0,1 M NaOH

Tabela 34: Parametri postupka

3. Nanofiltracija:

[0174] Nanofilter od 20 nm tj. Viresolve PRO (Merck), upotrebljen je za uklanjanje bilo kakvih virusnih čestica prisutnih u terapeutskom proteinu.

4. Filtracija tangencijalnim protokom/Ultrafiltracija:

[0175] Antitelo je koncentrovano do željene koncentracije i pufer je zamenjen jednim od tri pufera za formulaciju.

Upotrebljeni materijal:

Pufer za formulaciju:

[0176]

• Pufer 1: 25 mM histidinski pufer 75 mM argininski pufer 75 mM NaCl , pH 6,50 ± 0,25;

• Pufer 2: 25 mM histidin, 75 mM arginin, 101 mM NaCl;

• Pufer 3: 25 mM histidin, 75 mM arginin, 75 mM do 101 mM NaCl, polisorbat-80 0,002% tež./zapr.

• Pufer za čišćenje: 0,5 M NaOH

Pufer za skladištenje: 20% etanol 150 mM NaCl ili 0,1 M NaOH

Korišćena membrana: PALL Centramate T serije, PES membrana sa graničnom vrednošću molekulske mase (MWCO) od: 30 kDa

[0177]

Tabela 35: Parametri postupka:

Sterilna filtracija

[0178] Stabilizator je dodat rastvoru antitela i rastvor je sterilno filtriran kroz filter od 0,2 µm. Rezultati:

[0179]

Tabela 36: Oporavak po stadijumima u različitim koracima korišćenim u postupku prečišćavanja.

[0180] Nađeno je da je ukupni oporavak postupka > 80%.

Tabela 37: Podaci o nečistoćama

Tabela 38 : Oporavak i čistoća po serijama

[0181] Nađeno je da je ukupna čistoća monoklonskog antitela protiv virusa besnila posle prečišćavanja >99% i nađeno je da je ukupni oporavak >80%.

Primer 12:

[0182] Prečišćeno monoklonsko antitelo protiv virusa besnila formulisano je kao što je prikazano na dijagramu datom na slici 2.

[0183] Ekscipijensi tj. arginin, histidin, NaCl, saharoza i polisorbat-80 dodati su i dobro promešani pomoću magnetne mešalice na 50-60 o/min da bi se formirala smeša ekscipijenasa. Ova smeša je zatim postepeno dodata u monoklonsko antitelo protiv virusa sakupljeno posle TFF pri brzini mešanja od 50-60 o/min. Proveren je pH (pH 6,5) i po potrebi podešen puferom histidin-arginin. Finalna formulacija je filtrirana kroz filter od 0,2 µM filter i razlivena u finalni kontejner.

[0184] Koncentracija svake komponente u finalnoj formulaciji bila je sledeća:

Tabela 39:

[0185] U ovim formulacijama dalje je ispitana čistoća, stabilnost, efikasnost i potentnost tokom 9 meseci.

[0186] Primer 13: Analitički test za čistoću i stabilnost formulacije monoklonskog antitela protiv virusa besnila pri skladištenju na 2-8, 25 i 40 °C tokom perioda od 0 meseci, 1 meseca, 3 meseca i 6 meseci.

13.1 Analiza agregacije i čistoće

[0187] Ekskluziona hromatografija na bazi HPLC metode (HPLC-SEC) upotrebljena je za ocenu agregata u balku i finalnoj formulaciji monoklonskih antitela protiv DV. U ovom postupku korišćena je kolona phenomenex Bio-Sec-S 3000 da bi se pokazao procenat agregata i monomera kod monoklonskih antitela protiv virusa besnila ubrizgavanjem ~50 ug ukupnog antitela i analiziranjem pri protoku od 1 ml/minut tokom 35 minuta. Kao mobilna faza korišćen je fosfatno puferisani fiziološki rastvor (PBS), pH 6,5.

Rezultati:

[0188]

Tabela 40: Rezultati SE- HPLC (%)

[0189] Formulacija monoklonskog antitela protiv virusa besnila nije pokazala nikakvu agregaciju zavisnu od vremena, a nađeno je da čistoća/sadržaj monomera iznosi >99%.

13.2 Analiza SDS Page Serija 1 – ispitivani uzorak na 2-8 °C

[0190]

Tabela 41:

Ispitivani uzorak na 25 °C

[0191]

[0192] Zaključak: Formulacija monoklonskog antitela protiv virusa besnila nije pokazala nikakve značajne vremenski zavisne promene u agregaciji i promenu u molekulskoj težini. Stoga je nađeno da je formulacija stabilna na 2 - 8 °C, 25 °C i 40 °C.

Seq ID 1: Aminokiselinska sekvenca VH VIS513 (Monoklonsko antitelo protiv virusa denge)

Seq ID 2: Aminokiselinska sekvenca VL VIS513 (Monoklonsko antitelo protiv virusa denge)

Seq ID 3: Aminokiselinska sekvenca teškog lanca SII RmAb (RAB1)(17C7)

Seq ID 4: Aminokiselinska sekvenca lakog lanca SII RMAb (RAB1)(17C7)

Ċ

Claims (33)

Patentni zahtevi

1. Postupak proizvodnje farmaceutskog antigen-vezujućeg proteina sa visokim prinosom i minimalnom agregacijom, naznačen time, što je antigen-vezujući protein monoklonsko antitelo protiv virusa denge prema SEQ ID 1 i SEQ ID 2 ili je antigen-vezujući protein monoklonsko antitelo protiv virusa besnila prema SEQ ID 3 i SEQ ID 4, pri čemu postupak obuhvata sledeće korake:

a) kultivisanje sisarskih ćelija koje eksprimiraju antigen-vezujući protein u medijumu za proizvodnju ćelijske kulture u velikom obimu, pri čemu korak kultivisanja efikasno održava broj ćelija u opsegu od 10 x 10<6>- 20 x 10<6>ćelija/ml i rezultuje prinosom od najmanje 2 g/L pri čemu je ćelijska linija sisarskih ćelija CHO-K1 SV GS-KO kada je antigen-vezujući protein monoklonsko antitelo protiv virusa denge, a ćelijska linija sisarskih ćelija je GS-CHO kada je antigen-vezujući protein monoklonsko antitelo protiv virusa besnila; pri čemu korak kultivacije uključuje upotrebu osnovnog medijuma, upotrebu koncentrovanog osnovnog medijuma kao hranljivog rastvora, upotrebu hranljivih rastvora zajedno sa određenom strategijom ishrane, što rezultuje pojačanim rastom ćelija, održavanjem nižih koncentracija laktata i amonijaka i efektivnim održavanjem broja ćelija, čime se povećava dugovečnost ćelija i postiže povećan prinos;

b) prečišćavanje antigen-vezujućeg proteina iz sakupljenog supernatanta dobijenog u koraku (a), pri čemu prečišćavanje rezultuje oporavkom od najmanje 80% i čistoćom od najmanje 99%; i gde prečišćavanje obuhvata afinitetnu hromatografiju, inaktivaciju virusa na niskom pH, katjon-izmenjivačku hromatografiju, anjon-izmenjivačku hromatografiju, nanofiltraciju, filtraciju tangencijalnim protokom/ultrafiltraciju; na sekvencijalni način; pri čemu je matrica afinitetne hromatografije protein A; pri čemu je koncentracija soli pufera korišćenih u prečišćavanju u opsegu od 30 mM - 500 mM; i

c) priprema stabilne formulacije koja sadrži antigen-vezujući protein, pri čemu je osmolalnost formulacije u opsegu od 300 - 400 mOsm/Kg i viskozitet formulacije manji od 2,5 mPa-S, pri čemu formulacija sadrži najmanje jedan antigen-vezujući protein, najmanje jedan stabilizator, najmanje jedan puferski agens, najmanje jedan agens za podešavanje toničnosti i najmanje jedan surfaktant;

pri čemu formulacija sadrži:

(i) 1 - 100 mg/ml antigen-vezujućeg proteina;

(ii) 20 - 40 mM histidina;

(iii) 50 - 100 mM arginina;

(iv) 0,002 - 0,02% polisorbata 80 (tež./zapr.);

(v) 50 - 150 mM NaCl; i

(vi) 0,1 - 2,5% saharoze tež./zapr.; pri čemu je pH formulacije 6,5 ± 0,5;

i gde je rezultujuća formulacija stabilna na 2-8 °C najmanje 9 meseci, na 25 °C najmanje 1 mesec, na 40 °C najmanje 40 dana, na 50 °C najmanje 2 dana.

2. Postupak prema zahtevu 1, naznačen time što se medijum za ćelijsku kulturu dopunjava jednim ili većim brojem drugih nutrijenata, najmanje jednom tokom koraka kultivisanja.

3. Postupak prema zahtevu 1, naznačen time što se medijum za proizvodnju ćelijske kulture dopunjava prema rasporedu koji obuhvata suplementaciju koja je kontinuirana, dnevna, svakog drugog dana, svaka dva dana, ili njihovu kombinaciju.

4. Postupak prema zahtevu 1, naznačen time što medijum za ćelijsku kulturu ima osmolalnost u opsegu od 250 - 500mOsm/Kg; pH u opsegu od 6,5 - 7,5; rastvoreni kiseonik se održava u opsegu od 10 - 60%; temperatura ćelijske kulture je u opsegu od 30 °C do 38 °C; prva temperatura poželjno je 36 - 37 °C i opciono druga temperatura poželjno je 30 - 35 °C; koncentracija glukoze se održava ispod 7%; poželjno između 4% i 5%; ćelijska kultura se sakuplja kada je vijabilnost smanjena na 80%; pri čemu se uslovi ćelijske kulture održavaju na način da koncentracija sekundarnih metabolita kao što je laktat nije veća od 5g/L; a koncentracija amonijaka nije veća od 5 mMol/L.

5. Postupak prema zahtevu 4, naznačen time što je osmolalnost medijuma za fermentaciju 400 -500 mOsm/kg.

6. Postupak prema zahtevu 1, naznačen time što se rastvoreni kiseonik u medijumu za fermentaciju održava u opsegu od 20 - 40%.

7. Postupak prema zahtevu 1, naznačen time što se ćelije kultivišu u šaržnom, dolivno-šaržnom, kontinuiranom režimu, perfuzionom režimu; tačnije u dolivno-šaržnom režimu.

8. Postupak prema zahtevu 1, naznačen time što je koncentracija soli pufera korišćenih u prečišćavanju u opsegu od 50 mM - 300 mM.

9. Postupak prema zahtevu 1, koji dalje obuhvata dodatni korak hromatografije izabran iz grupe koja sadrži jednu ili više od hromatografije hidrofobne interakcije, hidrofobne hromatografije sa indukcijom naelektrisanja, hromatografije na keramičkom hidroksiapatitu, multimodalne hromatografije, membranske hromatografije.

10. Postupak prema zahtevu 1, naznačen time što hromatografija na proteinu A obuhvata:

a) Pufer za ekvilibraciju: 20 mM fosfatni pufer; 100 - 150 mM NaCl; 0,05% polisorbat 80; pH 7,0 ± 0,2

b) Punjenje: klarifikovana berba

c) Pufer za pranje I: 20 mM fosfatni pufer; 100 - 150 mM NaCl, tačnije 150mM; 0,05% polisorbat 80; pH 7,0 ± 0,2

d) Pufer za pranje II: 20 mM fosfatni pufer; 250 mM - 1 M NaCl, tačnije 1M; 0,05% polisorbat 80; pH 7,0 ± 0,2

e) Pufer za pranje III: 10 mM fosfatni pufer; 100 - 150 mM NaCl, tačnije 125mM; 0,05% polisorbat 80; pH 7,0 ± 0,2

f) Pufer za eluiranje: 20 mM citratni pufer; pH 3,0 ± 0,2; i opciono 0,025 % (tež./zapr.) polisorbata 80

g) CIP pufer: 0,1 M NaOH

h) Vreme zadržavanja: 4,00 – 8,00 minuta

i) Korišćena kolona: XK26

j) Linearni protok je 10 - 500 cm/h, tačnije 100-150 cm/h.

11. Postupak prema zahtevu 1, naznačen time što se virusna inaktivacija eluata iz afinitetne hromatografije na proteinu A postiže držanjem eluata na pH 3,3 - 3,5 tokom perioda od 50 - 100 minuta.

12. Postupak prema zahtevu 1, naznačen time što se katjon-izmenjivačka hromatografija izvodi korišćenjem smole izabrane iz grupe koja sadrži jedno ili više od grupe na bazi sulfonata; grupe na bazi sulfoetila; grupe na bazi sulfopropila; grupe na bazi sulfoizobutila; grupe na bazi sulfoksi etila, grupe na bazi karboksimetila; grupa na bazi sulfonske i karboksilne kiseline; grupe na bazi karboksilne kiseline; grupe na bazi sulfonske kiseline; i grupe na bazi ortofosfata.

13. Postupak prema zahtevu 1, naznačen time što katjon-izmenjivačka hromatografija obuhvata:

a) Pufer za prethodnu ekvilibraciju: 200 mM citratni pufer; pH 6,0 ± 0,2

b) Pufer za ekvilibraciju: 10 mM citratni pufer; 0,025 % (tež./zapr.) polisorbat 80; pH 6,0 ± 0,2

c) Pufer za pranje A: 10 mM citratni pufer; pH 6,0 ± 0,2

d) Pufer za pranje B: 20 mM citratni pufer; 300 - 500 mM NaCl; pH 6,0 ± 0,2

e) CIP pufer: 0,5 M NaOH

f) Vreme zadržavanja: 4,00 – 7,00 minuta

g) Korišćena kolona: XK26.

14. Postupak prema zahtevu 1, naznačen time što anjon-izmenjivačka hromatografija obuhvata:

a) Pufer za čišćenje: 0,5M NaOH

b) Pufer za prethodnu ekvilibraciju: 200 mM citratni pufer; pH 6,0 ± 0,2

c) Pufer za ekvilibraciju: 20 mM citratni pufer; pH 6,0 ± 0,2; i opciono 0,025% polisorbat 80

d) Pufer za skladištenje: 0,1M NaOH

e) Linearni protok je 10 - 500 cm/h, tačnije 100-150 cm/h

f) Korišćena kolona: XK26.

15. Postupak prema zahtevu 1, naznačen time što anjon-izmenjivačka hromatografija predstavlja "režim protoka i ispiranja" ili "režim vezivanja i eluiranja".

16. Postupak prema zahtevu 1, naznačen time što se uklanjanje virusnih čestica postiže nanofiltracijom korišćenjem filtera koji zadržava virus.

17. Postupak prema zahtevu 1, naznačen time što se antigen-vezujući protein koncentruje korišćenjem filtracije tangencijalnim protokom (TFF).

18. Postupak prema zahtevu 17, naznačen time, što se TFF izvodi korišćenjem membrane od 30 kDa.

19. Postupak prema zahtevu 17, naznačen time što postupak filtracije tangencijalnim protokom obuhvata:

a) Dijafiltraciju korišćenjem dijafiltracionog pufera: 25 mM histidinski pufer; 75 mM argininski pufer; 50 - 150 mM NaCl; pH 6,50 ± 0,5

b) Pufer za čišćenje: 0,5M NaOH

c) Pufer za skladištenje: 0,1M NaOH

d) Ekvilibracija korišćenjem 5 - 10 X zapremina membrane

e) Koncentrovanje i dijafiltracija korišćenjem 10-20 zapremina dijafiltracije

f) Pranje vodom za injekcije korišćenjem 3 - 5 zapremina membrane

g) Čišćenje korišćenjem 0,5 - 1,0 M NaOH

h) Skladištenje 0,1M NaOH.

20. Postupak prema zahtevu 1, naznačen time što preparat prečišćenog terapeutskog proteina sadrži ne više od 2% agregata, poželjno manje od 1% agregata.

21. Postupak prema zahtevu 1, naznačen time što stabilna formulacija antigen-vezujućeg proteina sadrži 1 mg/ml do 100 mg/ml antigen-vezujućeg proteina.

22. Postupak prema bilo kom od prethodnih zahteva, naznačen time što formulacija antigenvezujućeg proteina sadrži ne više od 3% agregacije, minimalnu količinu čestica ispod granice vidljivosti i poboljšanu potentnost.

23. Postupak prema zahtevu 1, naznačen time što je koncentracija monomera antigen-vezujućeg proteina u formulaciji veća od 99%; količina rezidualne DNK CHO nije veća od 2 pg/mg antigenvezujućeg proteina, tačnije nije veća od 0,1 pg/mg antigen-vezujućeg proteina; rezidualnog CHO proteina nije veća od 100 ng/mg antigen-vezujućeg proteina, tačnije nije veća od 10 ng/mg antigenvezujućeg proteina; rezidualnog proteina-A nije veća od 10 ng/mg antigen-vezujućeg proteina, tačnije nije veća od 1,5 ng/mg antigen-vezujućeg proteina; endotoksina nije veća od 0,1 EU/mg antigen-vezujućeg proteina.

24. Postupak prema zahtevu 1, naznačen time što formulacija sadrži:

- <1% (tež./zapr.), najpoželjnije 0,5% (tež./zapr.), saharoze;

- 25 mM, histidina;

- 75 mM, arginina;

- 100 - 145 mM, natrijum hlorida;

- 0,02% (tež./zapr.), polisorbata 80; i

- 1 mg/ml do 50 mg/ml, antigen-vezujućeg proteina.

25. Farmaceutska formulacija koja sadrži:

a) 1 - 100 mg/ml najmanje jednog antigen-vezujućeg proteina, pri čemu je antigen-vezujući protein monoklonsko antitelo protiv virusa denge prema SEQ ID 1 i SEQ ID 2 ili je antigen-vezujući protein monoklonsko antitelo protiv virusa besnila prema SEQ ID 3 i SEQ ID 4;

b) 20 - 40 mM histidina;

c) 50 - 100 mM arginina;

d) 0,002 - 0,02% polisorbata 80 (tež./zapr.);

e) 50 - 150 mM NaCl;

f) 0,1 - 2,5% saharoze tež./zapr.; pri čemu je pH formulacije 6,5 ± 0,5,

pri čemu je osmolalnost formulacije 300 - 450 mOsmol/kg i viskozitet manji od 2,5 mPa-S i navedena formulacija je stabilna na 2-8 °C najmanje 9 meseci, na 25 °C najmanje 1 mesec, na 40 °C najmanje 40 dana, na 50 °C najmanje 2 dana.

26. Farmaceutska formulacija prema zahtevu 25, naznačena time što sadrži 2 - 80 mg/ml najmanje jednog antigen-vezujućeg proteina; 25 mM histidina; 75 mM arginina; 101 mM NaCl; 0,02% polisorbata 80 (tež./zapr.); i 0,5% (tež./zapr.) saharoze; pri čemu je pH formulacije 6,5 ± 0,5.

27. Farmaceutska formulacija prema zahtevu 25 ili 26, naznačena time što je osmolalnost formulacije 380 mOsmol/kg.

28. Farmaceutska formulacija prema bilo kom od zahteva 25 do 27, naznačena time što sadrži 2-80 mg/ml antigen-vezujućeg proteina; 25 mM histidina; 75 mM arginina; 101 mM NaCl; 0,02% polisorbata 80 (tež./zapr.); i 0,5% saharoze tež./zapr.; pri čemu je pH formulacije 6,5 ± 0,5 osmolalnost 380 mOsm/Kg, viskozitet manji od 2,5 mPa-S.

29. Farmaceutska formulacija prema bilo kom od zahteva 25 do 28, naznačena time što sadrži 25 mg/ml antigen-vezujućeg proteina; 25 mM histidina; 75 mM arginina; 101 mM NaCl; 0,02% polisorbata 80 (tež./zapr.); i 0,5% saharoze tež./zapr.; pri čemu je pH formulacije 6,5 ± 0,5 osmolalnost 380 mOsm/Kg, viskozitet manji od 2,5 mPa-S.

30. Farmaceutska formulacija prema bilo kom od zahteva 25 do 28, naznačena time što sadrži 50 mg/ml antigen-vezujućeg proteina; 25 mM histidina; 75 mM arginina; 101 mM NaCl; 0,02% polisorbata 80 (tež./zapr.); i 0,5% saharoze tež./zapr.; pri čemu je pH formulacije 6,5 ± 0,5 osmolalnost 380 mOsm/Kg, viskozitet manji od 2,5 mPa-S.

31. Farmaceutska formulacija prema bilo kom od zahteva 25 do 30 za upotrebu u lečenju, prevenciji ili dijagnostici virusa denge ili besnila.

32. Farmaceutska formulacija za upotrebu prema zahtevu 31, naznačena time što je formulacija sadržana u kontejneru odabranom od boce, bočice, ampule, IV kese, prenosivog injektora, bolus injektora, šprica, pen šprica, pumpe, višedoznog šprica sa iglom, višedoznog pen šprica, injektora, sirete, autoinjektora, napunjenog šprica ili njihove kombinacije.

33. Farmaceutska formulacija za upotrebu prema zahtevu 32, naznačena time što najmanje jedna komponenta primarne ambalaže sadrži zatvarač kontejnera odabran od polipropilena (PP), polietilen tereftalata (PETG), polietilena visoke gustine (HDPE), polietilen tereftalata (PET), polipentafluorostirena (PFS), polikarbonata, polivinil hlorida (PVC), policiklopentana (CZ.RTM.), cikličnog olefinskog kopolimera (COC), poliolefina i njihovih kombinacija ili kopolimera.