RS63523B1 - Novi glp-1 analozi - Google Patents

Description

Opis

OBLAST PRONALASKA

[0001] Ovaj pronalazak se odnosi na nove analoge peptida poput glukagona-1 (GLP-1) (7-38) koji imaju aminokiselinsku sekvencu sa Leu ili Ile na C-terminalu. Novi analozi su snažni GLP-1 agonisti sa smanjenim štetnim dejstvom i poboljšanim trajanjem delovanja. Ovo otkriće se dalje odnosi na acilirane derivate novih analoga, koji su dodatno poboljšali potenciju i trajanje delovanja i pogodni su za oralnu primenu. Analozi koji su ovde otkriveni su acilovani sa produžeńim delovima i koji tako produžavaju trajanje aktivnosti jedinjenja. Analozi koji su ovde otkriveni mogu biti korisni u lečenju dijabetesa i gojaznosti.

POZADINA PRONALASKA

[0002] Glukagonu sličan peptid-1 (GLP-1) je hormon koji se uglavnom proizvodi u enteroendokrinim L ćelijama creva i izlučuje se u krvotok kada hrana koja sadrži masti, proteinski hidrolizat i/ili glukozu uđe u duodenum. GLP-1 je izveden iz ćelijske specifične post-translacione obrade preproglukagon gena. U početku je peptid GLP-1(1-37) identifikovan iz takve obrade, ali su to bila dva N-terminalno skraćena proizvoda, GLP-1(7-37) (SEK ID BR: 1) i GLP-1(7 -36) amida, za koje je utvrđeno da prepoznaju receptor pankreasa i za koje je utvrđeno da su in vivo aktivna vrsta. Utvrđeno je da GLP-1 stimuliše lučenje insulina, uzrokujući na taj način unos glukoze u ćelije i smanjenje nivoa glukoze u serumu. GLP-1 agonisti su dostupni za lečenje dijabetes melitusa tipa 2 (T2DM) kao omiljeni lekovi jer nemaju hipoglikemiju i imaju pozitivnu korist od gubitka težine. Endogena supstanca, GLP-1(7-37) i GLP-1(7-36)amid, se cepaju peptidazama i usled toga imaju veoma kratko vreme poluraspada. Uloženi su napori da se poboljša učinak razvijanjem GLP-1 analoga sa poboljšanim poluživotom. Prvi lek odobren 2005. godine je bio Exenatide koji je bio sa dozom dva puta dnevno u dozi od 10 mcg i utvrđeno je da pokazuje značajno poboljšanje HbAlc markera kontrole glukoze. Dalje, Novo Nordisk je razvio Liraglutide (Patent Sjedinjenih Američkih Država br.

6,268,343) (SEK ID BR: 2) sa dozom od 1,8 mg, s.c./dnevno i to jednom dnevno i odobren je 2010. Dalja istraživanja i razvoj su jednom doveli do nedeljne proizvodnje proizvoda kao što je Albiglutide koji je razvijen od strane GSK i Dulaglutide koji je razvio Eli Lilly. Nedavno je USFDA (SAD Uprava za hranu i lekove) odobrila Semaglutid (Međunarodna objava br. WO 2006/097537 A2), analog GLP-1. Semaglutid (SEK ID BR: 3) se prodaje pod robnom markom Ozempic®. Primenjuje se kao potkožna injekcija jednom sedmično.

[0003] Mnogi pokušaji da se naprave analozi GLP-1 koji imaju poboljšanu potenciju i trajanje delovanja su prijavljeni u literaturi. Patent Sjedinjenih Država br. 7,291,594 B2 (patent US '594) otkriva derivate GLP-1 (7-35) koji su dodali nekoliko ostataka arginina i/ili lizina na njihov C-terminus da bi se obezbedila visoka biodostupnost preko sluzokože. Patent US '594 dalje otkriva da se ovim derivatima može dati otpornost na dipeptidil peptidazu IV (DPPIV) zamenom aminokiseline 8 u njenoj GLP-1 amino kiselinskoj sekvenci sa Ser, ili sa otpornošću na tripsin zamenom amino kiselina 26 i 34 sa Gln i Asn, respektivno.

[0004] Patent Sjedinjenih Država br. 7,893,017 B2 (US '017 patent) otkriva acilovani GLP-1 analog u kome je GLP-1 analog stabilizovan u odnosu na DPP-IV modifikacijom najmanje jednog aminokiselinskog ostatka na pozicijama 7 i 8 u odnosu na sekvencu GLP-1 (7-37) i gde je pomenuta acilacija dijakiselina vezana direktno za C-terminalni aminokiselinski ostatak pomenutog GLP-1 analoga.

[0005] Patent SAD br. 8,951,959 B2 (patent US'959) otkriva analog GLP-1 (7-37) otporan na DPP-IV koji ima ne-proteogeni aminokiselinski ostatak koji sadrži trifluorometil grupu na poziciji 8 u odnosu na sekvencu GLP1, i aciluje se sa ostatkom koji sadrži dve kisele grupe do ostatka lizina na poziciji 26.

[0006] Patent Sjedinjenih Država br.7,084,243 B2 (US '243 patent) otkriva analoge GLP-1 (7-37) koji imaju Val ili Gli na poziciji 8 u odnosu na sekvencu GLP-1 (7-37) kao DPP-IV otporni peptidi.

[0007] Međunarodna objava br. WO 2017/149070 A1 (WO '070) otkriva analoge GLP-1 koji imaju Trp na poziciji koja odgovara poziciji 8 GLP-1 (7-37) i pokazalo se da su ova jedinjenja Trp8 veoma stabilan protiv degradacije od strane DPP-IV.

[0008] Međunarodna objava br. WO 2004/103390A2 (WO '390) otkriva da modifikacija na poziciji P'1 (koja odgovara poziciji 9 u slučaju GLP-1 (7-37)) može da proizvede analoge GLP-1 sa značajno smanjenom osetljivošcú na cepanje posredovano enzimima (kao što je DPP-IV) u odnosu na nativni supstrat, ali zadržavaju biološku aktivnost prirodnog supstrata. WO '390 dalje otkriva analoge GLP-1 (7-37) koji imaju amino kiselinu sa tetrasupstituisani Cß ugljenik (kao što je tert-leucin) na poziciji 9 obezbeđuje GLP-analoge otporne na razgradnjuDPP-IV.

[0009] Međunarodna objava br. WO 2015/086686 A2 (objava WO '686) otkriva da je utvrđeno da inkorporacija alfa-metilfunkcionalizovanih amino kiselina direktno u glavni lanac analoga GLP-1 proizvodi otpornost na proteazu (uključuje peptidi otporni na DPP-IV.

[0010] Različiti drugi GLP-1 agonisti otporni na DPP-IV su otkriveni u objavama patenata kao što su Međunarodne publikacije br. WO 2007/030519 A2, WO 2004/078777 A2, WO 2007/039140 A1, WO 2010102, WO 2010102, WO 2010182 /016419

A1, WO 2017/211922 A2, WO 2016/198544 A1 i WO 2013/051938 A2.

[0011] Različite patentne prijave otkrivaju produžene analoge GLP-1 sa C-terminalnošću i sa povećanom stabilnošću i dužim trajanjima dejstva. Na primer, patenti Sjedinjenih Država br.7,482,321 B2, 9,498,534 B2 i 7,897,566 B2.

[0012] Razne patentne prijave otkrivaju acilirane analoge GLP-1 gde su analozi GLP-1 vezani za lipofilni supstituent opciono preko linkera da bi se obezbedilo duže trajanje delovanja.

[0013] Patent Sjedinjenih Država br. 8,603,972 B2 (US ’972) otkriva monoacilirane derivate GLP-1 analoga pri čemu je Lis ostatak na poziciji 37 ili 38 analoga GLP-1 acilovan.

[0014] Patent Sjedinjenih Država br. 8,648,041 B2, 9,758,560 B2, 9,006,178 B2, 9,266,940 B2, 9,708,383 B2 i SAD objave patentnih prijava država br. US 2015/0152157 A1, US 2015/0133374 A1 otkrivaju di-acilirane derivate analoga GLP-1.

[0015] Objava prijave patenta Sjedinjenih Država br. US 2016/0200791 A1 otkriva triacilirane derivate GLP1 analog.

[0016] Međunarodne objave br. WO 2016/083499 A1, WO 2016/097108 A1 i WO 2014/202727 A1 otkrivaju acilovani GLP-1 analoge pri čemu je Lis ostatak analoga GLP-1 vezan za dva otegnuta ostatka preko razgranatog linkera.

[0017] Međunarodne objave br. WO 2009/030771 A1 i WO 2018/083335 A1 otkrivaju različite acilirajuće agense (bočni lanac) koji se može vezati za Lis ostatak analoga GLP-1 da bi se obezbedilo duže trajanje delovanja.

[0018] Međunarodna objava br. WO 2013/186240 A2 otkriva analoge eksendin-4 peptida koji imaju Gli, Ser ili funkcionalizovan Ser, npr. Ser (OCH3), D-Ser ili funkcionalizovan D-Ser, npr. D-Ser(OCH3), Aib, Ala ili D-Ala na poziciji 2 sekvence aminokiselina eksendin-4.

[0019] Različiti drugi analozi GLP-1 su otkriveni u patentnim prijavama kao što su Međunarodne objave br. WO 2005/027978 A2, WO 1998/008871 A1, WO 1999/043705 A1, WO 1999/043706 A19, WO 1999/043706 A19, WO 1999/043706 A19 WO 1999/043708 A1, WO 2000/034331 A2, WO 2009/030771 A1, WO 2011/080103 A1, WO 2012/140117 A1, WO 2012/140117 A1, WO 2012/034331 A2, WO 2012/0162, WO 2012/0162, WO 2012/0162, WO 2012/0162, WO 2012/0162 /202727 A1, WO 2015/000942 A1, WO 2015/022400 A1, WO 2016/083499 A1, WO 2016/097108 A1 i WO 2017/149070 A1.

[0020] Ipak, postoji potreba da se razviju analozi GLP-1 koji imaju optimalna željena svojstva u smislu stabilnosti i trajanje dejstva.

REZIME PRONALASKA

[0021] Jedan aspekt ovog pronalaska obezbedjuje polipeptid koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu:

pri čemu

X2 je Ser, Ser(OMe), D-Ser, D-Ser(OMe), Ala or Aib, ;

X3 je odsutan ili je Gln;

X4 je Glu;

X16 je Glu;

X24 je Ile;

X33 je Leu, -D-Leu, D-Ile or Ile;

X34 je odsutan i

X21 je Lys pri čemu je amino (• amino) grupa Lys acilirana sa ostatkom:

{-Q-T-U-W-Y-Z

pri čemu su Q i T odsutni;

U je odsutan ili -C(O)-CH2-O-(CH2)2-O-((CH2)2-NH-} pri čemu } je tačka vezivanja sa grupom W;

W je odsutan ili je izabrano iz grupe koja se sastoji od -C(O)-CH2-O-(CH2)2-O-(CH2)2-NH-], -C(O)-NH-(CH2)3-4-NH-], -C(O)-C(CH3)2-NH-] i

pri čemu ] je tačka vezivanja sa grupom Y;

Y je-C(O)-(CH2)2-CH(COOH)NH--i -- je tačka vezivanja sa grupom Z;

Z je -C(O)-(CH2)n-COOH ili -C(O)-(CH2)n-CH3 pri čemu je n okrugli broj od 14 to 20.

[0022] Polipeptidi iz ovog pronalaska su moćni GLP-1 agonisti sa manje neželjenih efekata. Dalje, polipeptidi prema ovom pronalasku su stabilni i imaju dugotrajno delovanja i pogodni su za oralnu primenu.

OPIS SLIKA

[0023]

Slika 1A ilustruje pripremu ostatka A-OSu (Intermedijer 3).

Slika 1B ilustruje pripremu ostatka A-OSu (srednji 3).

Slika 2 ilustruje pripremu ostatka C-OSu.

Slika 3 ilustruje pripremu ostatka D-OSu.

Slika 4 ilustruje pripremu ostatka E-OSu.

Slika 5 ilustruje pripremu ostatka F-OSu.

Slike 6A i 6B ilustruju rezultate oralnog testa tolerancije glukoze (OGTT) za Jedinjenje 1 kod pacova; jedna injekcija; 1mg/kg AUC glukoze 0-120 min (slika 6A=posle 22 sata, slika 6B=posle 46 sati).

Slika 7 ilustruje smanjenje nivoa glukoze u krvi kod db/db miševa sa dijabetesom tipa 2 nakon hroničnog tretmana sa Jedinjenjem 1.

Slika 8 ilustruje smanjenje unosa hrane kod db/db miševa nakon tretmana sa Jedinjenjem 1.

Slika 9 ilustruje efikasnost Jedinjenja 1 kod db/db miševa u smanjenju telesne težine.

Slika 10 ilustruje smanjenje HblAc kod db/db miševa nakon tretmana sa Jedinjenjem 1.

SKRAĆENICE

[0024]

Aib: 2-aminoizobuterna kiselina

ADO: 8-amino-3,6-diokso-oktanska kiselina

OGTT: Oralni test tolerancije glukoze

DIPEA: N,N’-Di-izopropiletilamin

HOBt: 1-hidroksibenztriazol

DIPC: N,N’-Di-izopropilkarbodiimid

HOSu: N-hidroksisukcinimid

IBCF: Izobutil hloroformat

NMM: N-metilmorfolin

THF: tetrahidrofuran

DCM: Dihlorometan

DMAP: 4-dimetilaminopiridin

DCC: Dicikloheksil karbodiimid

DMAc: Dimetilacetamid

OPIS PRONALASKA

[0025] Ovaj pronalazak obezbeđuje stabilan analog GLP-1 dugog dejstva, koji ne zahteva često subkutano doziranje i takođe je pogodan za oralnu primenu. Kao iznenađujuće je otkriveno da je dodavanje dodatnog Leu na C terminalu sekvence proizvelo peptide sa značajno poboljšanom potencijom i trajanjem delovanja u poređenju sa roditeljskim peptidom. Peptidi sa dodatnim Ile su takođe pokazali sličan efekat poboljšane potencije i trajanja delovanja u poređenju sa roditeljskim peptidom. Dodatno, pronalazak ovde pokazuje delove koji se mogu dodati peptidima koji su analozi GLP-1(7-37) reakcijom acilacije da bi se dobila jedinjenja sa značajno poboljšanom potencijom i dužim trajanjem delovanja. Produženi delovi otkrivenih jedinjenja imaju stabilnije veze, koje su manje podložne cepanju biološkim enzimima. Prema tome, jedinjenja koja su ovde otkrivena su stabilnija i zahtevaju ređu primenu, što doprinosi saglasnosti pacijenata. Shodno tome, u nekim realizacijama, pronalazak obezbeđuje polipeptid koji sadrži sekvencu aminokiselina:

pri čemu je X2 Ser, Ser(OMe), D-Ser, D-Ser(OMe), Ala ili Aib, ;

X3 je odsutan ili je Gln;

X4 je Glu;

X16 je Glu;

X24 je Ile;

X33 je Leu, D-Leu, D-Ile ili Ile;

X34 je odsutan

X21 je Lys pri čemu je bočni lanac (Ƹ amino) grupe od Lys acilisan.

[0026] U nekim realizacijama, X21 se može acilirati sa isprvavanim delovima koji su prijavljeni u BOS-u Sjedinjenih Država.

6,268,343, 8,268,343 B2, 8.683.959 B2, 8.648.042 B2, 9.648.041 B2, 9,006,178 B2, 9.268.385 B2, 9.268.383 B2, 9.268.383 B2, 9.268.383 B2 i Sjedinjene Države br. US 2015/0152157 A1 i US 2015/0133374 A1; Međunarodne publikacije br. WO 2009/030771 A1, WO 2006/097537 A2 i WO 2018/083335 A1.

[0027] U nekim realizacijama, X21 Lys je acilovan na svom bočnom lancu amino (Ƹamino) grupi sa ostatkom koji sadrži grupu masnih kiselina. Grupa masnih kiselina može biti vezana za X21 Lys preko veznika. Shodno tome, u nekim realizacijama, ovo otkriće obezbeđuje polipeptid koji sadrži sekvencu amino kiselina:

gde je X2 Ser, Ser(OMe), D-Ser, D-Ser(OMe), Ala ili Aib;

X3 je odsutan ili Gln;

X4 je Glu;

X16 je Glu;

X24 je Ile;

X33 je Leu, D-Leu, D-Ile ili Ile;

X34 je odsutan i

X21 je Lys gde bočni lanac amino (Ƹ amino) grupa LYs je acilirana sa ostatkom:

{-Q-T-U-W-Y-Z

pri čemu su Q i T odsutni;

U je odsutan ili -C(O)-CH2-O-(CH2)2-O-(CH2)2-NH-} gde je } tačka vezivanja sa grupom W;

W je odsutan ili je izabrano iz grupe koju čine -C(O)-CH2-O-(CH2)2-O-(CH2)2-NH-], -C(O)-NH-(CH2)3-4 -NH-],

-C(O)-C(CH3)2-NH-] i

gde je ] tačka vezanja sa grupom Y;

Y je -C(O)-((CH2)2-CH(COOH)NH-, gde je - tačka vezanja sa grupom Z;

Z je -C(O)-(CH2)n-COOH ili -C(O)-(CH2)n-CH3 gde je n ceo broj od 14 do 20.

[0028] U nekim izvedbama, aminokiselina na X2 je odabrana između Ser, Ser(OMe), D-Ser, D-Ser(OMe), Ala ili Aib.

[0029] U nekim izvedbama X2 je Aib.

[0030] U nekim izvedbama, X3 je odsutan.

[0031] U nekim izvedbama, X33 je Leu.

[0032] U nekim izvedbama, X33 je Ile.

[0033] U nekim izvedbama, X21 je Lys i pri čemu je amino (Ƹamino) grupa bočnog lanca Lys acilirana s ostatkom: {-Q-T-U-W-Y-Z, gde je W odabran iz skupine koju čine -C(O)-NH-(CH2)3-4-NH-], -C(O)-C(CH3)2-NH-] i

[0034] U nekim izvedbama, X21 je Lys pri čemu je amino (Ƹ amino) grupa bočnog lanca Lys acilirana sa ostatkom:

{-Q-T-U-W-Y-Z

gde su U i W odsutno i Z je -C(O)-(CH2)n-CH3 gde je n ceo broj 14.

[0035] U nekim izvedbama, X21 je Lys pri čemu je amino (Ƹ amino) grupa bočnog lanca Lys acilirana sa ostatkom:

{-Q-T-U-W-Y-Z

gde W je -C(O)-CH2-0-(CH2)2-0-(CH2)2-NH-].

[0036] U nekim izvedbama, X21 je Lys gde je amino (Ƹ amino) grupa bočnog lanca Lys acilirana sa ostatkom:

{-Q-T-U-W-Y-Z

gde W je -C(O)-C(CH3)2-NH-].

[0037] U nekim izvedbama, X21 je Lys gde je amino (Ƹ amino) grupa bočnog lanca Lys acilirana sa ostatkom:

{-Q-T-U-W-Y-Z ,

gde W je -C(O)-NH-(CH2)4-NH-].

[0038] U nekim izvedbama, X21 je Lys gde je amino (Ƹ amino) grupa bočnog lanca Lys acilirana sa ostatkom:

{-Q-T-U-W-Y-Z,

gde W je -C(O)-NH-(CH2)3-NH-].

[0039] U nekim izvedbama, X21 je Lys pri čemu je amino (Ƹ amino) grupa bočnog lanca Lys acilirana s ostatkom:

{-Q-T-U-W-Y-Z ,

pri čemu je W

[0040] U nekim izvedbama, X21 je Lys pri čemu je amino (Ƹ amino) grupa bočnog lanca Lys acilirana s ostatkom:

{-Q-T-U-W-Y-Z

gde je Z -C(O)-(CH2)n-COOH, pri čemu je n ceo broj 16.

[0041] U nekim izvedbama, X21 je Lys pri čemu je amino (Ƹ amino) grupa bočnog lanca Lys acilirana s ostatkom:

{-Q-T-U-W-Y-Z

gde je Z i -C(O)-(CH2)n-CH3 i pri čemu je n ceo broj 14.

[0042] U nekim izvedbama, X2 je Ala ili Aib;

X3 je odsutan;

X33 je Leu;

U je odsutan;

W je odsutan;

Y je -C(O)-(CH2)2-CH(COOH)NH-, gde je - tačka vezanja sa grupom Z;

Z je -C(O)-(CH2)n-CH3 gde je n ceo broj 14.

[0043] U nekim izvedbama, ovaj pronalazak osigurava polipeptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu:

gde X2 je Aib;

X3 je odsutan;

X4 je Glu;

X16 je Glu;

X24 je Ile;

X33 je Leu;

X34 je odsutan i

X21 je Lys pri čemu je amino (Ƹ amino) grupa bočnog lanca Lys acilirana sa ostatkom:

{-Q-T-U-W-Y-Z

gde su Q i T odsutni;

U je -C(O)-CH2-0-(CH2)2-0-(CH2)2-NH-} gde je} tačka vezanja sa grupom W;

W je -C(O)-CH2-0-(CH2)2-0-(CH2)2-NH-], gde je] tačka vezanja skupine Y;

Y je -C(O)-(CH2)2-CH(COOH)NH-, gde je - tačka vezanja sa grupom Z;

Z je -C(O)-(CH2)n-COOH gde je n ceo broj 16

[0044] U nekim izvedbama, ovo otkriće osigurava polipeptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu:

gde X2 je Aib;

X3 je odsutan;

X4 je Glu;

X16 je Glu;

X24 je Ile;

X33 je Leu;

X34 je odsutan i

X21 je Lys pri čemu je amino (Ƹ amino) grupa bočnog lanca Lys acilirana s ostatkom:

{-Q-T-U-W-Y-Z

gde su Q i T odsutni;

U je -C(O)-CH2-0-(CH2)2-0-(CH2)2-NH-} gde je} tačka vezanja sa grupom W;

W je -C(O)-C(CH3)2-NH-] gde je] tačka vezanja sa grupom Y;

Y je -C(O)-(CH2)2-CH(COOH)NH-, gde je - tačka vezanja sa grupom Z;

Z je -C(O)-(CH2)2-COOH gde je n ceo broj 16.

[0045] U nekim izvedbama, ovo otkriće osigurava polipeptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu:

gde X2 je Aib,;

X3 je odsutan;

X4 je Glu;

X16 je Glu;

X24 je Ile;

X33 je Leu;

X34 je odsutan i

X21 je Lys pri čemu je amino (Ƹ amino) grupa bočnog lanca Lys acilirana s ostatkom:

{-Q-T-U-W-Y-Z

gde su Q i T odsutni;

U je -C(O)-CH2-0-(CH2)2-0-(CH2)2-NH-} gde je} tačka vezanja sa grupom W;

W je -C(O)-NH-(CH2)3-4-NH-] gde je] tačka vezanja sa grupom Y;

Y je -C(O)-(CH2)2-CH(COOH)NH-, gde je - tačka vezanja sa grupom Z;

Z je -C(O)-(CH2)n-COOH gde je n ceo broj 16.

[0046] U nekim izbedbama X21 je Lys pri čemu je amino (Ƹ amino) grupa bočnog lanca Lys acilirana s ostatkom:

{-Q-T-U-W-Y-Z

gdje W je -C(O)-NH-(CH2)4-NH-].

[0047] U nekim izbedbama X21 je Lys pri čemu je amino (Ƹ amino) grupa bočnog lanca Lys acilirana s ostatkom:

{-Q-T-U-W-Y-Z

gdje W je -C(O)-NH-(CH2)3-NH-].

[0048] U nekim izvedbama, otkriće osigurava polipeptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu:

gde X2 je Aib,;

X3 je odsutan;

X4 je Glu;

X16 je Glu;

X24 je Ile;

X33 je Leu;

X34 je odsutan i

X21 je Lys pri čemu je amino (Ƹ amino) grupa bočnog lanca Lys acilirana s ostatkom:

{-Q-T-U-W-Y-Z

gdje su Q i T odsutni;

U je -C(O)-CH2-0-(CH2)2-0-(CH2)2-NH-} gdje je} tačka vezanja sa grupom W;

W je -C(O)-NH-(CH2)4-NH-], gdje je] tačka vezanja skupine Y;

Y je -C(O)-(CH2)2-CH(COOH)NH-, gdje je - tačka vezanja sa grupom Z;

Z je -C(O)-(CH2)n-COOH ili -C(O)-(CH2)n-CH3 gdje je n cijeli broj od 14 do 20.

[0049] U nekim izvedbama, X21 je Lys pri čemu je amino (Ƹ amino) grupa bočnog lanca Lys acilirana s ostatkom::

{-Q-T-U-W-Y-Z

gdje je Z -C(O)-(CH2)n-COOH gdje je n celi broj 16.

[0050] U nekim izvedbama, X21 je Lys gde je bočni lanac amino (Ƹ amino) grupa Lys je acilirana ostatkom:

{-Q-T-U-W-Y-Z

gde je Z -C(O)-(CH2)n-CH3, gde je n celi broj 14.

[0051] U nekim izvedbama, ovo otkriće osigurava polipeptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu:

gde X2 je Aib,;

X3 je odsutan;

X4 je Glu;

X16 je Glu;

X24 je Ile;

X33 je Leu;

X34 je odsutan i

X21 je Lys pri čemu je amino (Ƹ amino) grupa bočnog lanca Lys acilirana ostatkom:

{-Q-T-U-W-Y-Z

gdje su Q i T odsutni;

U je -C(O)-CH2-0-(CH2)2-0-((CH2)2-NH-} gdje je} tačka vezanja sa grupom W;

W je

gde je ] tačka vezanja sa grupom Y;

Y je -C(O)-(CH2)2-CH(COOH)NH-, gdje je - tačka vezanja sa grupom Z;

Z je -C(O)-(CH2)n-COOH gde je n celi broj 16.

[0052] U nekim izvedbama, ovo otkriće osigurava polipeptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu:

gdje X2 je Ser, Ser(OMe), D-Ser, D-Ser(OMe);

X3 je odsutan;

X4 je Glu;

X16 je Glu;

X24 je Ile;

X33 je Leu;

X34 je odsutan i

X21 je Lys gdje je bočni lanac amino (Ƹ amino) grupa Lys acilirana ostatkom:

{-Q-T-U-W-Y-Z

gde su Q i T odsutni;

U je -C(O)-CH2-0-(CH2)2-0-(CH2)2-NH-} gdje je} tačka vezanja sa grupom W;

W je -C(O)-CH2-O-(CH2)2-O-(CH2)2-NH-, -C(O)-NH-(CH2)3-4-NH-], -C(O )-C((CH3)2-NH-], gdje je ] tačka vezivanja sa grupom Y;

Y je -C(O)-(CH2)2-CH(COOH)NH-, gde je - tačka vezanja sa grupom Z; i

Z je -C(O)-(CH2)n-COOH ili -C(O)-(CH2)n-CH3 gde je n celi broj od 14 do 20.

[0053] U nekim izvedbama, X21 je Lys gdje je amino (Ƹ amino) grupa bočnog lanca Lys acilirana s ostatkom:

{-Q-T-U-W-Y-Z

gde W je -C(O)-NH-(CH2)3-4-NH-].

[0054] U nekim izvedbama, X21 je Lys pri čemu je amino (Ƹ amino) grupa bočnog lanca Lys acilirana s ostatkom:

{-Q-T-U-W-Y-Z

gde W je -C(0)-CH2-0-(CH2)2-0-(CH2)2-NH-;

[0055] U nekim izvedbama, X21 je Lys gdje je amino (Ƹ amino) grupa bočnog lanca Lys acilirana s ostatkom:

{-Q-T-U-W-Y-Z

gde je W -C(O)-C(CH3)2-NH-]

[0056] U nekim izvedbama, X21 je lipid modifikovani Lys gde je spomenuti lanac amino (Ƹ amino) grupe Lys aciliran sa ostatkom

{-Q-T-U-W-Y-Z

koji je predstavljen u tabeli ostataka, Tabele 1

Tabela 1: Representativni ostaci grupe {-Q-T-U-W-Y-Z

[0022] Polipeptidi ovog pronalaska su moćni GLP-1 agonisti sa manje neželjenih efekata. Dalje, polipeptidi prema ovom pronalasku su stabilni i imaju dugotrajna delovanja i pogodni su za oralnu primenu.

Tabela 2: Reprezentativna polipeptidna jedinjenja ovog pronalaska

[0058] Osim ako nije drugačije navedeno, pronalazak ima za cilj da pokrije i L i D izomere aminokiselina u sekvenci.

[0059] Ser(OMe) kako je ovde opisano u pronalasku je amino kiselina serin sa metiliranom hidroksilnom grupom i ima sledeću strukturu:

[0060] Polipeptidne sekvence pomenute u pronalasku su predstavljene jednoslovnim kodom amino kiseline koje je odobrio IUPAC.

[0061] Q, T, U, W, Y i Z kako se ovde koriste za definisanje acilirajuće grupe u realizaciji ovog pronalaska se razlikuju od jednoslovnog koda aminokiseline koja se koristi za označavanje polipeptidne sekvence.

[0062] Polipeptidi ovog pronalaska su iznenađujuće pokazali značajno smanjenje glukoze u krvi kada se podvrgnuti oralnom testu tolerancije glukoze (OGTT) kod SD pacova. Procenat smanjenja glukoze u krvi kod SD pacova kada je izazvan oralglukozom bio je da je značajan nivo odgovarajućih polipeptida kojima je nedostajao dodatni Leu ili Ile na poziciji Ks33.

[0063] Ovaj pronalazak je dalje detaljno ilustrovan pozivanjem na sledeće primere. Poželjno je da se primer u svakom pogledu smatra ilustrativnim i da nema nameru da ograniči obim pronalaska za koji se traži zaštita.

PRIMERI:

Opšti način pripreme:

[0064] Polipeptidno jedinjenje prema ovom pronalasku može se dobiti metodama opisanim u nastavku. Proces uključuje dva koraka, koji uključuju pripremu matičnog linearnog peptida i naknadno vezivanje lanca masnih kiselina za roditeljski peptid.

[0065] Peptidi opisani ovde mogu biti pripremljeni hemijskom sintezom korišćenjem tehnika čvrste faze kao što su one opisane u G. Barani i R. B. Merrifield, "Peptidi: analiza, sinteza, biologija"; Tom 2-"Specijalne metode u sintezi peptida, deo A", str. 3284, E. Gross i J. Meienhofer, ur., Academic Press, Nev Iork, 1980; i u J. M. Stevart i J. D. Ioung, "Solid-Phase Peptide Synthesis", 2nd Ed., Pierce Chemical Co., Rockford, Ill., 1984. Željena strategija je zasnovana na Fmoc (9-Fluorenilmetiloksikarbonil) grupi za privremenu zaštitu α--amino grupa, u kombinaciji sa zaštitnim grupama kao što su terc-butil (-tBu), tert-butiloksikarbonil (-Boc), tritil (-Trt) grupe za privremenu zaštitu bočnih lanaca aminokiselina (vidi na primer E. Atherton i R.C. Sheppard, "Fluorenilmetoksikarbonil zaštitna grupa aminokiselina", u "Peptidi: analiza, sinteza, biologija"; tom 9-"Specijalne metode u sintezi peptida, deo C", str. 1-38, S. Undenfriend i J. Meienhofer, Eds., Academic Press, San Diego,1987).

[0066] Peptidi se mogu sintetizovati postepeno na nerastvorljivom polimernom nosaču (koji se takođe naziva "smola") počevši od C-terminusa peptida. Sinteza se započinje dodavanjem C-terminalne aminokiseline peptida na smolu kroz formiranje amidne ili estarske veze. Ovo omogućava eventualno oslobađanje rezultujućeg peptida kao C-terminalnog amida ili karboksilne kiseline, respektivno.

[0067] C-terminalna amino kiselina i sve druge aminokiseline koje se koriste u sintezi moraju imati svoje α--amino grupe i funkcije bočnog lanca (ako su prisutne) različito zaštićene tako da α--amino zaštitna grupa može biti selektivno uklonjena tokom sinteza. Kuplovanje aminokiseline se vrši aktivacijom njene karboksilne grupe kao aktivnog estra i njenom reakcijom sa neblokiranom α---amino grupom N-terminalne amino kiseline koja je pridodata smoli. Sekvenca uklanjanja zaštite α--amino grupe i spajanja se ponavlja sve dok se cela peptidna sekvenca ne sastavi. Peptid se zatim oslobađa iz smole uz istovremenu deprotekciju funkcionalnosti bočnog lanca, obično u prisustvu odgovarajućih prečistača da bi se ograničile sporedne reakcije. Dobijeni peptid je konačno prečišćen pomoću HPLC reverzne faze.

[0068] Roditeljski peptid se zatim može spojiti na lanac masnih kiselina kuplovanjem aktiviranog lanca masnih kiselina sa roditeljskim peptidom. Lanac masnih kiselina se može napraviti metodama dobro poznatim u organskoj hemiji. Na primer, lanac masnih kiselina može da se napravi korišćenjem sintetičkih metoda čvrste faze što omogućava pripremu linearnih lanaca masnih kiselina.

[0069] Sintetizovani linearni peptidi su prečišćeni preparativnom HPLC procedurom kao što je navedeno u nastavku:

Preparativna HPLC: VODE 2555 Kvaternarni gradijent modul (maksimalni ukupan protok: 300 mL/min, maksimalni pritisak: 3000 psi) ili

Shimadzu LC-8A (maksimalni ukupan protok: 150 mL: maksimalni pritisak: 20 Mpa)

Kolona: C18, 10 μ

Protok: 75 mL/min

Mobilna faza: Za prvo prečišćavanje

Mobilna faza A: pH 7,5 Fosfatni pufer

Mobilna faza B: acetonitril

Gradijent: 10 do 40% Mobilna faza-B za 300 min.

Za drugo prečišćavanje:

Mobilna faza A: 1% sirćetne kiseline u vodi

Mobilna faza B: 1% sircétne kiseline u acetonitrilu:n-propanolu (50:50)

Gradijent: 15 do 45% Mobilna faza-B za 300 min

[0070] Konačna jedinjenja ovog otkrića su prečišćena preparativnom HPLC postupkom kao što je navedeno u nastavku:

Preparativna HPLC: VODE 2555 kvaternarni gradijent modul (maksimalni ukupan protok: 300 mL/min, maksimalni pritisak: 3000 psi) ili Shimadzu LC-8A (maksimalni ukupan protok: 150 mL, maksimalni pritisak: 20 Mpa)

Kolona: C18, 10 μ

Protok: 75mL/min

Mobilna faza:

[0071] Čistoća jedinjenja ovog otkrića je analizirana RP-HPLC metodom kao što je navedeno u nastavku:

HPLC metoda B1:

Kolona: IMC Pack-Ph (4,6 mm Ks 150 mm 3m)

Eluent: Mobilna faza A: 0,1 % trifluorosirćetne kiseline u vodi

Mobilna faza B: 0,1 % trifluorosirćetne kiseline u acetonitrilu

Brzina protoka: 1,5 mL/min

Detekcija: UV detekcija na 210 nm

Temperatura kolone: 50°C

Trajanje: 50 min.

Gradijent:

HPLC metoda B2:

Kolona: IMC-Pack Pro C18 (4 mm k 250 mm, 3m)

Eluent: Mobilna faza A: Pufer: acetonitril (900:100)

Mobilna faza B: Pufer: acetonitril (300:700

Pufer: Kalijum dihidrogen ortofosfat u vodi, pH podešen na 3.060.1 ortofosfornom kiselinom Brzina protoka: 1,0 mL/min

Detekcija: UV detekcija na 210 nm

Temperatura kolone: 50 °C

Temperatura posude za uzorke: 8 °C

Trajanje: 38 min.

HPLC metoda B3:

Kolona: Vaters Ks-Select CSH-C18 (150 mm Ks 4,6 mm; 2,5 m)

Eluent: Mobilna faza A: Pufer: acetonitril (900:100)

Mobilna faza B: Pufer: acetonitril (300:700

Pufer: Kalijum dihidrogen ortofosfat u vodi, pH podešen na 1.560.1 ortofosfornom kiselinom Brzina protoka: 0,9 mL/min

Detekcija: UV detekcija na 210 nm

Temperatura kolone: 40 °C

Temperatura posude za uzorke: 5 °C

Trajanje: 100 min.

[0072] Jedinjenja ovog otkrića su analizirana pomoću LCMS kao što je dole navedeno: Maseni spektri su snimljeni na LCMS korišćenjem Vaters Ackuiti® KDa®, Vaters Micromass Kuattro Micro API ili Thermo science LCK Fleet™. Ispitni rastvor je pripremljen rastvaranjem odgovarajuće količine analita u razblaživaču sa konačnom koncentracijom od 1 mg/ml do 50 mg/ml u zavisnosti od jonizacije analita. Test rastvor je infundiran brzinom od oko 10 ml do 50 ml u minuti u LCMS tokom 1 min i maseni spektri su snimljeni u pozitivnom ili negativnom režimu elektrosprej jonizacije (ESI) i u odgovarajućem opsegu mase.

Primer 1: Priprema bočnih lanaca aktiviranih masnih kiselina:

1. Priprema 18-[[(1S)-1-karboksi-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2,5-dioksopirolidin-1-il)oksi-2 -okso-etoksi]etoksi]etilamino]-2-okso-etoksi]etoksi]etilamino]-4-oksobutil]amino]-18-okso-oktadekanska kiselina (Deo A-OSu, Intermedijer-3)

[0073] Aktivirani bočni lanac masne kiseline, Deo A-OSu je pripremljen sintezom u čvrstoj fazi korišćenjem 2-hlorotritil hloridne smole kao što je šematski prikazano na Slici 1A. 2-[2-(2-Fmoc-aminoetoksi)etoksi] sirćetna kiselina (Intermedijer 1) je vezana za smolu 2-hlorotritil hlorida u prisustvu N,N'-di-izopropiletilamina (DIPEA) koji je dao 2-[2-(2Fmoc - aminoetoksi)etoksi] sirćetna kiselina-2-Cl-Trt-smola. Intermedijer-slabak se priprema kuplovanjem 2-[2-(2-amino etoksi)-etoksi] sirćetne kiseline sa Fmoc N-hidroksisukcinimid estrom. Alternativno, intermedijer-1 je dostupan komercijalno i može se nabaviti kao takav. Fmoc zaštitna grupa je uklonjena selektivnim deblokiranjem amino grupe 2-[2-(2-Fmoc-aminoetoksi)etoksi] sirćetne kiseline-2-Cl-Trtsmole korišćenjem piperidina i slobodna amino grupa je zatim spojena na 2-[2-(2-Fmoc-aminoetoksi)etoksi] sirćetne kiseline korišćenjem 1-hidroksibenztriazola (HOBt) i N,N'-di-izopropilkarbodiimida (DIPC) koji je dao 2-[2-[2-[[2-[ 2-(2-Fmocaminoetoksi)etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]sirćetna kiselina-2-ClTrt-Smola. Fmoc grupa je zatim uklonjena selektivnim deblokiranjem amino grupe 2-[2-[2-[[2-[2-(2-Fmoc-aminoetoksi) etoksi]acetil] amino]etoksi]etoksi]sirćetne kiseline- 2-Cl-Trt-Resin korišćenjem piperidina i slobodne amino grupe je zatim spojen sa Fmoc-Glu-OtBu korišćenjem HOBt i DIPC da bi se dobio 2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[( 4S)-4-Fmoc-amino-5-terc-butoksi-5okso-pentanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi] sirćetna kiselina-2-Cl-Trt-smola. Dobijeni 2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-Fmoc-amino-5-terc-butoksi-5-okso-pentanoil]amino]etoksi]etoksi] acetil]amino]etoksi]etoksi]sirćetna kiselina-2-Cl-Trt-Smola je selektivno deblokirana korišćenjem piperidina, a zatim spojena sa mono terc-butil estrom oktadekandiojeve kiseline da bi se dobio intermedijer-2, naime [2-[2-[2-[ [2-[2-[2-[[(4S)-5-terc-butoksi-4-[(18-terc-butoksi-18-okso-oktadekanoil)amino]-5-okso-pentanoil]amino]etoksi] etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi] sirćetna kiselina]-2Cl-Trt-smola. Intermedijer 2 je zatim odcepljen od 2-Cl-Trt-smole korišćenjem trifluoroetanola:DCM (1:1). Dobijeno jedinjenje je zatim reagovalo sa N-hidroksisukcinimidom (HOSu) u prisustvu izobutil hloroformiata (IBCF) i Nmetilmorfolina (NMM), nakon čega je usledila de-protekcija sa trifluorosirćetnom kiselinom da bi se dobilo jedinjenje iz naslova (Deo A-OSu, intermedijer-3). Ceo proces se takođe može prikazati kao šematski prikazan na slici 1B.

2. Priprema N-palmitoil-L-y-glutamil sukcinimid estra (Deo B-OSu)

[0074]

Ostatak B-OSu

[0075] L-Glutaminska kiselina alfa-terc-butil estar (H-Glu-OtBu) je reagovao sa palmitinskom kiselinom u prisustvu IBCF i NMM da bi se dobio CH3-(CH2)14-C(O)-Glu-OtBu, koji je zatim reagovao sa HOSu u prisustvu IBCF i NMM da bi se dobio CH3-(CH2)14-C(O)-Glu(OSu)-OtBu, koji je zatim uklonjen sa trifluorosirćetnom kiselinom da bi se dobio ostatak B-OSu.

3. Priprema 18-[[(1S)-1-karboksi-4-[4-[2-[2-[2-(2,5-dioksopirolidin-1-il)oksi-2-okso-etoksi]etoksi ] etilkarbamoilamino]butilamino]-4-okso-butil]amino]-18-okso-oktadekanska kiselina (Osoba C-OSu)

[0076] Aktivirani bočni lanac masnih kiselina, deo C-OSu je pripremljen korišćenjem čvrste faze sinteze korišćenjem 2-hlorotritil hlorid smole kao što je šematski prikazano na slici 2. 2-[2-(2-Fmoc-aminoetoksi)etoksi] sirćetna kiselina je vezan za 2-hlorotritil hlorid smolu u prisustvu DIPEA da bi se dobila 2-[2-(2-Fmoc-aminoetoksi)etoksi] sirćetna kiselina-2-Cl-Trt-smola. Fmoc zaštitna grupa je uklonjena selektivnim deblokiranjem amino grupe korišćenjem piperidina, a slobodna amino grupa je zatim aktivirana korišćenjem p-nitrofenilhloformata u THF i DIPEA, nakon čega je usledila reakcija sa Fmoc-amino butilamin hidrohloridnom soli u THF: DMAc i DIPEA, koja daje 2-[2-[2-(4-Fmoc-aminobutilkarbamoilamino)etoksi]etoksi] sirćetnu kiselinu-2-Cl-Trt-smolu. Fmoc grupa je uklonjena selektivnim deblokiranjem korišćenjem piperidina, a slobodna amino grupa je zatim spojena sa Fmoc-Glu-OtBu korišćenjem HOBt i DIPC, što je dalo 2-[2-[2-[4-[[(4S) 4-Fmoc-amino-5-terc-butoksi-5-okso pentanoil]amino]butilkarbamoilamino]etoksi]etoksi]sirćetna kiselina-2-Cl-Trt-smola. Dobijeni 2-[2-[2-[4-[[(4S)-4-Fmoc-amino-5-terc-butoksi-5-okso-pentanoil]amino]-butilkarbamoilamino]etoksi]etoksi]sirćetna kiselina-2 -Cl-Trt-Smola je selektivno deblokirana upotrebom piperidina, a zatim spojena sa mono terc-butil estrom oktadekandiojeve kiseline da bi se dobio intermedijer2-[2-[2-[4-[[(4S)-5-terc-butoksi-4-[(18-terc-butoksi-18-okso-oktadekanoil)amino]-5-okso-pentanoil] amino]butilkarbamoilamino]etoksi]etoksi]sirćetna kiselina-2-Cl-Trt-smola. Intermedijer je zatim odvojen od 2-Cl-Trt-smole korišćenjem trifluoroetanola:DCM (1:1) da bi se dobio 2-[2-[2-[4-[[(4S)-5-tert-butoksi-4-[ (18terc-butoksi-18-oksooktadekanoil)amino]-5-okso-pentanoil]amino] butilkarbamoilamino] etoksi]etoksi] sirćetna kiselina (LCMS = m/z: 814,56 (M+H+)). Dobijeno jedinjenje je zatim reagovalo sa HOSu u prisustvu dicikloheksil karbodiimida (DCC) da bi se dobio intermedijer zaštićen sukcinimidom, koji je uklonjen sa trifluorosirćetnom kiselinom da bi se dobilo jedinjenje iz naslova (Deo C-OSu).

4. Priprema 18-[[(1S)-1-karboksi-4-[[2-[2-[2-[2-(2,5-dioksopirolidin-1-il)oksi-2-okso-etoksi] etoksi]etilamino]-1,1-dimetil-2-okso-etil]amino]-4-okso-butil]amino]-18-okso-oktadekanska kiselina (D-OSu)

[0077] Bočni lanac masnih kiselina je pripremljen korišćenjem čvrste faze sinteze korišćenjem 2-hlorotritil hlorid smole kao što je šematski predstavljeno na slici 3. 2-[2-(2-Fmoc-aminoetoksi)etoksi] sirćetna kiselina je vezana za 2-hlorotritil hlorid smola u prisustvu DIPEA da bi se dobila 2-[2-(2-Fmoc-aminoetoksi)etoksi] sirćetna kiselina-2-Cl-Trt-smola. Fmoc štiti grupa je uklonjena selektivnim deblokiranjem amino grupe korišćenjem piperidina nakon čega je usledilo kuplovanje sa Fmoc-Aib-OH u THF: DMAc korišćenjem DIPC i HOBt koji je dao 2-[2-[2-[(2-Fmoc-amino-2-metil-propanoil)amino] etoksi]etoksi]sirćetna kiselina-2-Cl-Trtsmola. Fmoc grupa je uklonjena selektivnim deblokiranjem korišćenjem piperidina a slobodna amino grupa je spojena sa Fmoc-Glu-OtBu korišćenjem HOBt i DIPC da bi se dobio 2-[2-[2-[[2-[[(4S)-4-Fmocamino- 5-terc-butoksi-5-okso-pentanoil]amino]-2-metil-propanoil] amino] etoksi]etoksi] sirćetna kiselina-2-Cl-Trt-smola. Fmoc grupa dobijenog jedinjenja je selektivno deblokirana korišćenjem piperidina, a zatim je slobodna amino grupa spojeno sa mono terc butil estrom oktadekandijeve kiseline da bi se dobio 2-[2-[2-[[2-[[(4S)-5-terc-butoksi-4-[(18-terc-butoksi-18-oksooktadekanoil)amino] -5-oksopentanoil]amino]-2-metil-propanoil]-amino]etoksi]etoksi]sirćetna kiselina-2-Cl-Trt-smola. Intermedijer je zatim odcepljen od 2-Cl-Trt-smole korišćenjem trifluoroetanola:DCM (1:1) da bi se dobio 2-[2-[2-[[2-[[(4S)-5tert-butoksi-4-[(18-terc-butoksi-18-oksooktadekanoil)amino]-5-okso-pentanoil]amino]-2-metil-propanoil]amino] etoksi]etoksi]sirćetna kiselina (LCMS = m/z: 786,39 (M+H+)). Dobijeno jedinjenje je zatim reagovalo sa HOSu u prisustvo DCC da bi se dobio intermedijer zaštićen sukcinimidom, koji je uklonjen sa trifluorosirćetnom kiselinom da bi se dobio naslovljeno jedinjenje (Ostatak D-OSu).

5. Priprema 18-[[(1S)-1-karboksi-4-[3-[2-[2-[2-(2,5-dioksopirolidin-1-il)oksi-2-okso-etoksi]etoksi ]etilkarbamoilamino]propilamino]-4-okso-butil]amino]-18-okso-oktadekanska kiselina (E-OSu)

[0078] Bočni lanac masnih kiselina je pripremljen korišcénjem čvrste faze sinteze korišćenjem 2-hlorotritil hlorid smole kao što je šematskipredstavljeno na slici 4.2-[2-(2-Fmoc-aminoetoksi)etoksi] sirćetna kiselina je vezana za 2-hlorotritil hlorid smolu u prisustvu DIPEA da bi se dobio 2-[2-(2-Fmoc-aminoetoksi)etoksi] sirćetna kiselina kiselina-2-Cl-Trt-Smola. Fmoc zaštitna grupa je uklonjena selektivnim deblokiranjem amino grupe korišćenjem piperidina, a slobodna amino grupa je zatim aktivirana korišćenjem p-nitrofenilhloroformiata u THF i DIPEA nakon čega je usledila reakcija sa 1,3-diaminopropanom u THF: DMAc u prisustvu DIPEA koristeći HOBt da bi se formirao NH2-(CH2)3-NH-C(O)-{(2-(2-amino-etoksi)-etoksi}-sirćetna kiselina-2-Cl-Trt smola. Slobodna amino grupa je zatim spojena do Fmoc-Glu-OtBu korišćenjem HOBt i DIPC, što je dalo 2-[2-[2-[3-[[(4S)-4Fmocamino-5-terc-butoksi-5-okso-pentanoil]amino] propilkarbamoilamino] etoksi]etoksi]sirćetna kiselina-2-Cl-Trt-smola Dobijeni 2-[2-[2-[3-[[(4S)-4-Fmoc-amino-5-terc-butoksi-5-okso- pentanoil]amino]propilkarbamoilamino]etoksi]etoksi]sirćetna kiselina-2-Cl-Trt-Smola je selektivno deblokirana korišćenjem piperidina, a zatim spojena sa mono terc butil estrom oktadekandiojeve kiseline da bi se dobio 2-[2-[2-[3-[[(4S)-5-terc-butoksi-4-[(18-terc-butoksi-18-okso-oktadekanoil)amino]-5-oksopentanoil]amino]-propil karbamoilamino]etoksi]etoksi] sirćetna kiselina-2-Cl- T rt-Resin. Intermedijer je zatim odcepljen od 2-Cl-Trt-smole korišćenjem trifluoroetanola: DCM (1:1) da bi se dobio 2-[2-[2-[3-[[(4S)-5-tert-butoksi-4-[ (18-terc-butoksi-18-oksooktadekanoil)amino]-5-okso-pentanoil]amino]propilkarbamoilamino]etoksi]etoksi]sirćetna kiselina (LCMS= m/z: 801,41 (M+H+)). Dobijeno jedinjenje je zatim reagovalo sa HOSu u prisustvu dicikloheksil karbodiimida (DCC) da bi se dobio intermedijer zaštićen sukcinimidom, koji je uklonjen sa trifluorosirćetnom kiselinom da bi se dobilo jedinjenje iz naslova (Deo E-OSu).

6. Priprema 18-[[(1S)-1-karboksi-4-[4-[2-[2-[2-(2,5-dioksopirolidin-1-il)oksi-2-okso-etoksi]etoksi ]etilkarbamoilamino]-1-piperidil]-4-okso-butil]amino]-18-okso-oktadekanska kiselina (Deo F-OSu)

[0079] Bočni lanac masnih kiselina je pripremljen korišćenjem čvrste faze sinteze korišćenjem 2-hlorotritil hlorid smole kao što je šematski predstavljeno na slici 5. 2-[2-(2-Fmoc-amino etoksi)etoksi] sirćetna kiselina je vezana za 2-hlorotritil hlorid smola u prisustvu DIPEA da bi se dobila 2-[2-(2-Fmoc-aminoetoksi)etoksi] sirćetna kiselina-2-Cl-Trt-smola. Fmoc zaštitna grupa je uklonjena selektivnim deblokiranjem amino grupe korišćenjem piperidina i slobodna amino grupa je zatim aktivirana korišćenjem p-nitrofenilhloroformiata u THF i DIPEA nakon čega sledi reakcija sa 4-amino-Boc-piperidinom u THF: DMAc u prisustvo DIPEA koristeći HOBt koji je dao (2-[2-[2-(4-Boc-piperidilkarbamoilamino) etoksi]etoksi] sirćetnu kiselinu -2Cl- Trt-Resin. Dobijeno jedinjenje pri cepanju upotrebom trifluorosirćetne kiseline dalo je 2-[2-[2-(4-piperidilkarbamoilamino) etoksi] etoksi]sirćetna kiselina koja je daljom reakcijom sa Fmoc-OSu u prisustvu trietilamina (TEA) dala 2-[2-[2-(4-Fmocpiperidilkarbamoilamino)etoksi]etoksi] sirćetna kiselina. Dobijeno jedinjenje je zatim dodatno vezano do 2-hlorotritil hlorid smole u prisustvu DIPEA, a da bi se dobio 2-[2-[2-(4-Fmoc-piperidilkarbamoilamino)etoksi]etoksi] sirc ́etna kiselina acid-2-Cl-Trt-Resin. Fmoc grupa je uklonjena selektivnim deblokiranjem korišćenjem piperidina i slobodne amino grupe je zatim spojen sa Fmoc-Glu-OtBu koristeći HOBt i DIPC, što je dalo 2-[2-[2-[[1-[(4S)-4-amino-5-tert-butoksi-5okso- pentanoil]-4-piperidil]karbamoilamino]etoksi]etoksi] sirćetna kiselina-2-Cl-Trt-smola. Dobijeno jedinjenje je selektivno deblokiran korišćenjem piperidina i zatim spojen sa mono terc-butil estrom oktadekandiojeve kiseline da se dobije 2-[2-[2-[[1-[(4S)-5-tercbutoksi-4-[(18-terc-butoksi-18-okso-oktadekanoil)amino]-5-okso-pentanoil]-4 -piperidil] karbamoilamino] etoksi]etoksi]sirćetna kiselina-2-Cl-Trt-smola. Intermedijer je zatim odcepljen od 2-Cl-Trt-smole korišćenjem trifluoroetanola: DCM (1:1) za dobijanje 2-[2-[2-[[1-[(4S)-5-terc-butoksi-4-[(18-terc-butoksi-18-okso-oktadekanoil)amino]-5 -okspentanoil] -4-piperidil] karbamoilamino] etoksi]etoksi]sirćetna kiselina (LCMS= m/z: 827,40 (M+H+)). Dobijeno jedinjenje je zatim reagovao sa HOSu u prisustvu DCC da bi se dobio intermedijer zaštićen sukcinimidom, koji je de- zaštićen korišćenjem trifluorosirćetne kiseline da bi se dobilo jedinjenje iz naslova, deo F-OSu.

Primer 2: Sinteza jedinjenja 1: N-•26-[2-(2-[2-(2-[2-(2-[4-(17-karboksiheptadekanoilamino)-4(S)karboksibutirilamino] etoksi)etoksi]acetilamino)etoksi]etoksi)acetil][(Aib8, Arg34, Leu38 GLP-1(7-38) peptid

Deo A. Sinteza matičnog linearnog peptida Aib8, Arg34, Leu38 GLP-1(7-38)

[0080] Roditeljski peptid je sintetiziran metodom krute faze. Početna smola korištena za sintezu bila je Wang smola. Fmoc zaštićeni leucin korišten je za spajanje s Wang smolom. Spajanje je izvedeno upotrebom diizopropilkarbodiimida, N-hidroksibenzotriazola (DIC-HOBt) kao reagensa za spajanje u prisutnosti 4-dimetilaminopiridina (DMAP) što je dalo Fmoc-Leu-Wang smolu. Selektivno deblokiranje amino skupine Fmoc-Leu-Wang smole upotrebom piperidina pracéno spajanjem s Fmoc-Gly-OH upotrebom HOBt i DIPC dalo je Fmoc-Gly-Leu-Wang smolu. Time je završen jedan ciklus. Anhidrid octene kiseline i diizopropiletil amin/piridin korišteni su za prekidanje nevezanih amino grupa pri svakom spajanju aminokiselina.

[0081] Gornja 2 koraka, tj. selektivno deblokiranje Fmoc-zaštite aminokiseline vezane na smolu i spajanje sledećeg aminokiselinskog ostatka u nizu s Fmoc-zaštićenom amino grupom ponovljena su za preostalih 30 aminokiselinskih ostataka. Selektivno deblokiranje, tj. deprotekcija Fmoc skupine učinjeno je upotrebom piperidina, a spajanje sa sljedećom Fmoc zaštićenom amino kiselinom učinjeno je upotrebom HOBt/DIPC. Bočni lanac Fmoc-zaštićenih aminokiselina zaštićen je ortogonalno, npr. hidroksilna grupa serina, tirozina ili treonina zaštićena je tert-butil(-tBu) grupom, amino i gvanido grupa lizina i arginina zaštićene su tert-butiloksikarbonilom (-Boc) odnosno 2,2,4,6,7-pentametildihidrobenzofuran-5-sulfonil (-Pbf) skupine, imidazol histidina zaštićen je tritilom (-Trt), a skupine karboksilne kiseline asparaginske kiseline ili glutaminske kiseline su zaštićen s -tBu grupom. Gore navedena dva koraka, tj. selektivno deblokiranje, a zatim spajanje sa sledećom Fmoc zaštićenom aminokiselinom, izvedena su da se dobije FmocHis(Trt)-Aib-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser (tBu)-Asp(OtBu)-Val-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Gly-Leu-smola.

[0082] Deblokiranje Fmoc-His(Trt)-Aib-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Val-Ser(tBu))-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-ValArg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Gly-Leu-Resin korištenjem piperidina praćeno cijepanjem i uklanjanjem zaštite korištenjem trifluoroctene kiseline s etan-1,2-ditiolom rezultiralo je sirovim H-His-Aib-Glu-Gly-Thr-Phe -Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-AlaAla-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly-Leu -OH(Aib8, Arg34, Leu38 GLP-1 (7-38) peptid) koji je pročišćen pomoću HPLC.

Deo B:

[0083] Cepanje aktiviranog lanca masne kiseline, ostatak A-OSu preko pročišćenog (linearnog peptida) H-His-Aib-Glu-Gly-Thr-PheThr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu- Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly-Leu-OH dobijen u delu A, u acetonitrilu pri pH oko 10 rezultirao je sirovim naslovom peptid koji je pročišćen preparativnom HPLC. Karakterizacija jedinjenja data je u tablici 3.

Primer 3: Priprema jedinjenja 2, 3, 5, 9, 10 i 12

[0084] Linearni peptidi jedinjenja 2, 3, 5, 9, 10 i 12 su pripremljeni metodom čvrste faze prema analognom postupku datom za Primer 1, deo A. Kalemljenje aktiviranog lanca masnih kiselina, deo A-OSu praćenjem procesa iz Primera 1, Deo B preko odgovarajućih linearnih peptida dao je jedinjenje 2, 3, 5, 9, 10 i 12.

Primer 4: Priprema jedinjenja 4 i 11:

[0085] Linearni peptidi jedinjenja 4 i 11 su pripremljeni metodom čvrste faze prema analognom postupku datom za Primer 2, deo A, osim što je ovde Fmoc zaštićeni D-leucin prvo spojen sa Vang smolom, a zatim su sekvencijalno ostale aminokiseline. spregnuti. Kalemljenje aktiviranog lanca masnih kiselina, dela A-OSu preko odgovarajućeg linearnog peptida, praćenjem procesa iz Primera 2, Deo B, dalo je jedinjenje 4 i 11.

Primer 5: Priprema jedinjenja 8

[0086] Linearni peptid je pripremljen metodom čvrste faze prema analognom postupku datom za Primer 2, Deo A, osim što je ovde Fmoc zaštićen izoleucin prvo uparen sa Vang smolom, a zatim su sekvencijalno spregnute druge amino kiseline. Presađivanjem aktiviranog lanca masnih kiselina, grupe A-OSu preko linearnog peptida, prateći proces iz Primera 2, Deo B, dobijeno je Jedinjenje 8.

Primer 6: Priprema jedinjenja 6

[0087] Linearni peptid je pripremljen metodom čvrste faze prema analognom postupku datom za Primer 2, Deo A. Kalemljenje aktiviranog lanca masnih kiselina, Deo B-OSu preko linearnog peptida sledeći analogni proces Primera 2, Deo B je dao jedinjenje 6.

Primer 7: Priprema jedinjenja 7

[0088] Kalemljenje aktiviranog lanca masnih kiselina, dela B-OSu preko linearnog peptida Primera 2, Deo A, sledeći analogni proces Primera 2, Deo B dalo je Jedinjenje 7.

Primer 8: Priprema jedinjenja 13

[0089] Kalemljenje aktiviranog lanca masnih kiselina, dela C-OSu preko linearnog peptida Primera 1, Deo A, sledeći analogni proces Primera 1, Deo B dalo je Jedinjenje 13.

Primer 9: Priprema jedinjenja 14

[0090] Linearni peptid je pripremljen metodom čvrste faze prema analognom postupku datom za Primer 2, Deo A. Kalemljenje aktiviranog lanca masnih kiselina, Deo C-OSu preko linearnog peptida sledeći analogni proces Primera 2, Deo B je dao jedinjenje 14.

Primer 10: Priprema jedinjenja 15

[0091] Linearni peptid je pripremljen metodom čvrste faze prema analognom postupku datom za Primer 2, Deo A, počevši od Fmoc zaštićenog izoleucina, prvo je spojen sa Vang smolom, a zatim su sekvencijalno spregnute druge amino kiseline. Presađivanjem aktiviranog lanca masnih kiselina, dela C-OSu preko linearnog peptida, sledeći analogni postupak iz Primera 2, Deo B, dobijeno je Jedinjenje 15.

Primer 11: Priprema jedinjenja 16

[0092] Kalemljenje aktiviranog lanca masnih kiselina, deo D-OSu preko linearnog peptida Primera 2, Deo A, sledeći analogni proces Primera 2, Deo B, dao je Jedinjenje 16.

Primer 12: Priprema jedinjenja 17

[0093] Kalemljenje aktiviranog lanca masnih kiselina, dela E-OSu preko linearnog peptida Primera 2, Deo A, sledeći analogni proces Primera 2, Deo B dalo je Jedinjenje 17.

Primer 13: Priprema jedinjenja 18

[0094] Presađivanje aktiviranog lanca masnih kiselina, grupe F-OSu preko linearnog peptida iz Primera 2, Deo A, pomoću sleda analogno procesu Primera 2, Deo B je dao Jedinjenje 18.

[0095] Podaci o karakterizaciji sintetizovanih jedinjenja ovog otkrića su dati u nastavku u nastavku Tabela 3.

Tabela 3: Podaci o karakteristikama reprezentativnih jedinjenja ovog pronalaska

Primer 14: Oralni test tolerancije glukoze (OGTT) kod pacova; Jedna/sing injekcija; 1mg/kg

[0096] Životinje su podeljene u tri grupe - normalnu kontrolnu grupu, test grupu i treću semaglutidnu grupu, sa po 4 životinje u svakoj grupi. Životinje su gladovane 12 sati pre početka OGTT. Životinjama test grupe, jedinjenje 1 je ubrizgano subkutano u dozi od 1 mg/kg. Grupi koja je primala semaglutid, subkutano je ubrizgana doza od 1 mg/kg. Nakon 22 sata, 166 sati i 334 sata subkutane injekcije ispitivanog leka ili semaglutida, glukoza u krvi je izmerena meračem glukoze u krvi (merenja vremena 0). Svim životinjama je zatim oralno dato 2 g/kg rastvora glukoze. Glukoza u krvi je merena 20, 40, 60, 90 i 120 minuta nakon izazivanja glukoze. Beležena je telesna težina i unos hrane. Podaci o glukozi u krvi su analizirani korišćenjem dvosmerne ANOVA praćene Bonferonijevim post-testovima korišćenjem PRISM-a (Graph Pad verzija 5.03). Podaci o AUC0-120 min glukoze u krvi analizirani su pomoću t testa.

[0097] Polipeptidi ovog otkrića su pokazali značajan efekat na snižavanje glukoze u poređenju sa kontrolnom grupom kada su proučavani u Oralnom testu tolerancije glukoze (OGTT) kod pacova. Na primer, Slika 6 prikazuje promenu nivoa glukoze u krvi od vremena 0 do 120 min posle 22 sata i 46 sati u test grupi kojoj je primenjeno Jedinjenje 1 i grupi koja je tretirana semaglutidom. 22 sata nakon jednokratnog doziranja, jedinjenje 1 je pokazalo statistički značajno smanjenje nivoa glukoze u krvi sa p<0,001 u odnosu na normalnu kontrolu u ANOVA praćenom Bonferonijevim posttestovima. Efekat snižavanja glukoze jedinjenja 1 bio je superiorniji od efekta snižavanja glukoze primećenog kod semaglutida (videti sliku 6A). Superiornost efekta na snižavanje glukoze jedinjenja 1 primećena je čak i nakon 46 sati potkožne primene (Slika 6B). Dalje, i jedinjenje 1 i semaglutid su pokazali statistički značajno smanjenje unosa hrane u poređenju sa kontrolom kada su posmatrani na dan 2, kao i na dan 4 (videtiTabela 4 i 5). Smanjeni unos hrane prikazan Jedinjenjem 1, 4-og dana bio je veći od Semaglutida (videti tabelu 5). Što se tiče smanjenja telesne težine, samo je testno jedinjenje pokazalo značajno smanjenje telesne težine 4-og dana.

Tabela 4: Uticaj tretmana na unos hrane i telesnu težinu na dan 2.

Tabela 5: Uticaj tretmana na unos hrane i telesnu težinu na dan 4.

[0098] Iznenađujuće je otkriveno da su jedinjenja koja imaju X33 kao Leu i Ile pokazala značajno smanjenje glukoze u krvi u datim studijama, dok su jedinjenja sa drugim amino kiselinama osim Leu i Ile imala značajno manji efekat na snižavanje glukoze u krvi. Polipeptid prema ovom pronalasku je pokazao značajno smanjenje glukoze u krvi u poređenju sa kontrolnom grupom. Takođe su testirana jedinjenja koja imaju druge amino kiseline osim Leu ili Ile na X33 pozicijama. Na primer, Leu na 32. poziciji u Jedinjenju 1 (SEK ID BR: 05) je zamenjen sa Lis i Ser da bi se dobila jedinjenja Std-1 i Std-2, respektivno. Std-1 i Std-2 su pokazali samo oko 35 i 15 % smanjenje AUC0-120 min glukoze u krvi (Tabela 6).

Tabela 6: Procentualno smanjenje AUC0-120min glukoze u krvi u OGTT testu pri dozi od 1 mg/Kg nakon 24 sata.

[0099] Slično tome, jedinjenje 6 koje se razlikuje od liraglutida po tome što ima dodatni Leu na 32. poziciji i jedinjenje 7 koje se razlikuje od liraglutida po tome što je 2. aminokiselina Ala zamenjena sa Aib i ima Leu kao dodatnu 32. amino kiselinu, pokazalo je nivo glukoze u krvi. snižavajući efekat na 24 sata koji je bio značajno veći od liraglutida (Tabela 6).

[0100] Kada je utvrđeno da je jedinjenje 1 značajno bolje u smislu smanjenja glukoze, unosa hrane i smanjenja telesne težine, sprovedeni su eksperimenti da se odredi trajanje delovanja jedinjenja iz ovog pronalaska. Efekat reprezentativnih jedinjenja iz ovog pronalaska (jedinjenje 1, 13 i 16) posle 166 sati (7 dana) i 334 sata (14 dana) je proučavan i upoređen sa efektom semaglutida. Jedinjenja su testirana prema dole navedenoj metodi:

Životinje su podeljene u tri grupe - normalnu kontrolnu grupu, test grupu i treću semaglutidnu grupu, sa po 4 životinje u svakoj grupi. Životinje su gladovane 12 sati pre početka OGTT. Životinjama test grupe, jedinjenje 1, jedinjenje 13 i jedinjenje 16 su ubrizgani subkutano u dozi od 1 mg/kg. Grupi koja je primala semaglutid, subkutano je ubrizgana doza od 1 mg/kg. Posle 22 sata, 166 sati i 334 sata subkutane injekcije test jedinjenja ili semaglutida, glukoza u krvi je merena meračem glukoze u krv i (merenja vremena 0). Svim životinjama je zatim oralno dato 2 g/kg rastvora glukoze. Glukoza u krvi je merena 20, 40, 60, 90 i 120 minuta nakon izazivanja glukoze. Beležena je telesna težina i unos hrane. Podaci o glukozi u krvi su analizirani korišćenjem dvosmerne ANOVA praćene Bonferoni posttestovima korišćenjem PRISM-a (Graph Pad verzija 5.03). Podaci o AUC0-120 min glukoze u krvi analizirani su pomoću t testa.

[0101] Tabela 7 daje smanjenje AUC glukoze u krvi za reprezentativna jedinjenja ovog pronalaska (Jedinjenje 1, 13 i 16) u poređenju sa kontrolnom grupom posle 1 dana, 7 dana i 14 dana primene.

Tabela 7: Procentualno smanjenje AUC0-120min glukoze u krvi u OGTT testu pri dozi od 1 mg/Kg.

[0102] Jedinjenja 1 i 13 su proučavana i upoređena sa Semaglutidom u jednom eksperimentu (Prikaz 1), a Jedinjenje 16 je proučavano i upoređeno sa semaglutidom u posebnom eksperimentu (Prikaz 2). Posle 168 sati injekcije, jedinjenje 1, 13 i 16 ovog pronalaska pokazalo je oko 60% smanjenje AUC glukoze u krvi u poređenju sa nultim nivoom glukoze u krvi. S druge strane, semaglutid je pokazao samo oko 25% smanjenje nivoa glukoze u krvi u odnosu na nulti nivo glukoze u krvi.

[0103] Slična zapažanja su napravljena u količini konzumirane hrane i promeni telesne težine. Kao što se može videti u tabeli 8 ispod, životinje kojima je davana reprezentativna jedinjenja (jedinjenje 1, 13 i 16) su konzumirale značajno manje hrane u poređenju sa životinjama kojima je davan semaglutid. Jedinjenje 16 je pokazalo značajno smanjenje telesne težine demonstrirajući potencijalnu korisnost za lečenje gojaznosti.

Tabela 8: Uticaj unosa hrane i telesna težina u OGTT testu pri dozi od 1 mg/Kg

Primer 15: Smanjenje HbAlc kod db/db miševa sa dijabetesom tipa 2 nakon hroničnog lečenja

[0104] Ova studija je urađena na dijabetičkom mišjem modelu. Životinje su podeljene u tri grupe za lečenje - kontrolnu grupu za dijabetičare, grupu za testiranje i grupu za lečenje Semaglutidom. Jedinjenje iz ovog otkrića je ubrizgano subkutano u dozi od 0,3 mg/kg jednom dnevno tokom 3 dana (kd*3), nakon čega je sledila doza od 0,1 mg/kg svakog alternativnog dana tokom 7 doza (k2d•7) praćena dozom od 0,1 mg/kg jednom svaka četiri dana za dva ciklusa doze (k4d*2). Isti režim doziranja je primenjen u grupi koja je tretirana semaglutidom. Merenja nivoa glukoze u krvi i telesne težine vršena su svakodnevno. %HbA1c je meren 0, 7, 14. i 27. dana hromatografijom na koloni. Kumulativni unos hrane je izračunat 27. dana. %HbA1C podaci su analizirani dvosmernom ANOVA-om praćenom Bonferonijevim posttestovima korišćenjem PRISM-a (Graph Pad verzija 5.03).

[0105] Životinje test grupe kojima je dato Jedinjenje 1 pokazale su statistički značajno smanjenje nivoa glukoze u krvi u poređenju sa kontrolnom grupom dijabetičara (videti Sliku 7), a efekat je bio superiorniji u odnosu na grupu koja je tretirana semaglutidom u poslednjoj fazi studije. Životinje test grupe kojima je dato jedinjenje 1 pokazale su značajno smanjenje unosa hrane kao što se može videti u rezultatima datim na Slici 8. Slika 8 daje kumulativni unos hrane od 0 do 27. dana kod kontrolnih i db/db miševa tretiranih test jedinjenjem. I test jedinjenje i semaglutid su pokazali statistički značajno smanjenje unosa hrane u poređenju sa kontrolnom grupom dijabetičara. Dalje, test jedinjenje je pokazalo značajno manji unos hrane u poređenju sa semaglutidom. U istoj studiji, jedinjenje 1 je takođe pokazalo značajno smanjenje telesne težine u poređenju sa kontrolnom grupom dijabetičara. Slika 9 daje rezultat % promene telesne težine za kontrolnu i test grupu od dana 0 do dana 27. Test jedinjenje 1 pokazalo je značajno smanjenje od -16% u poređenju sa -8% uočeno u grupi tretiranoj semaglutidom (videti sliku 09).

[0106] Kod dijabetes melitusa, vecé količine HbAlc, što ukazuje na lošiju kontrolu nivoa glukoze u krvi, povezane su sa kardiovaskularnim oboljenjima, nefropatijom, neuropatijom i retinopatijom. U studiji od 27 dana, jedinjenje 1 pokazalo je statistički značajno smanjenje nivoa HbA1 kod db/db miševa sa dijabetesom tipa 2 nakon hroničnog lečenja. Tabela 9 ispod i Slika 10 daju nivo HbAlc na 0 i 27 dana u kontrolnoj grupi sa dijabetesom i grupi nakon hroničnog tretmana jedinjenjem 1. Efekat je bio statistički značajan čak i u poređenju sa semaglutidom.

Tabela 9: Uticaj tretmana na nivoe % HbAlc kod db/db miševa

[0107] U odvojenoj studiji, ispitivano jedinjenje 1, 13 i 16 je proučavano i upoređeno sa semaglutidom za njihov efekat na nivo HbAlc i insulina i kumulativnu potrošnju hrane, promenu telesne težine i AUC glukoze u krvi. Studija je izvedena na sličan način kao gore na modelu miša sa dijabetesom. Životinje su podeljene u tri grupe za lečenje - kontrolnu grupu za dijabetes, grupu za testiranje i grupu koja je tretirana semaglutidom. Reprezentativna jedinjenja ovog otkrića, Jedinjenje 1, Jedinjenje 13 i Jedinjenje 16, su ubrizgana subkutano u dozi od 3,04 ili 6,078 nM (svakog alternativnog dana do 28. dana (k2d*15). Isti režim doziranja je davan u grupi koja je tretirana semaglutidom Merenja nivoa glukoze u krvi i telesne težine vršena su svakodnevno. %HbA1c, insulin je meren 0. dana, 14. i 29. dana. Kumulativni unos hrane i promena telesne težine izračunati su 14. i 29. dana. %HbA1c, podaci o insulinu su analizirano dvosmernom ANOVA-om praćenom Bonferonijevim posttestovima korišćenjem PRISM-a (Graph Pad verzija 5.03). Dok su podaci o AUC-u glukoze u krvi, promeni telesne težine i kumulativnom unosu hrane analizirani jednosmernom ANOVA-om praćenom Bonferonijevim posttestovima korišćenjem PRISM-a (Graph Pad verzija 5.03). Od 29. do 45. dana životinje su držane u periodu oporavka tokom kojeg nije davan nikakav lek. Tokom ovog perioda merena je glukoza u krvi i telesna težina.45. dana, Promene telesne težine, % HbA1c, insulin je bio meru. siguran.

[0108] Rezultati su dati u tabelama 10, 11 i 12 ispod.

Tabela 12: Kumulativno unos hrane, Glukoza u krvi AUC(mg/dL* dani) i Promena telesne težine:

Jedinjenje 1 (6.078nM), Jedinjenje 13 (3.04 & 6.078nM), Jedinjenje 16 (3.04 & 6.078nM); (q2d*15)

[0109] Reprezentativna jedinjenja ovog pronalaska (jedinjenje 1, 13 i 16) u dozi od oko 3 nM i 6 nM pokazala su značajno smanjenje HbA1c, glukoze u krvi, potrošnje hrane i telesne težine u poređenju sa kontrolom (Tabela 12). Smanjenje je bilo uporedivo sa onim koje je pokazao semaglutid u dozi od oko 12 nM. Štaviše, efekat je primećen čak i nakon 29 dana (Tabele 13 i 14) što pokazuje potencijal jedinjenja iz ovog pronalaska za razvoj leka dugog dejstva koji ne zahteva čestu primenu i samim tim povećava saglasnost pacijenta.

Tabela 13: Recovery study-Blood Glucose AUC (mg/dL*dani)

Tabela 14: Studija oporavka-%HbA1C and Insulin (ng/mL)

[0110] Ovi rezultati pokazuju da jedinjenje iz ovog pronalaska može naći potencijalnu upotrebu za lečenje dijabetes i gojaznost.

Claims (10)

1. Patentni zahtevi 1. Polipeptid obuhvatajuću aminokiselinsku sekvencu:

   pri čemu X2 je Ser, Ser(OMe), D-Ser, D-Ser(OMe), Ala or Aib, ; X3 je odsutan ili je Gln; X4 je Glu; X16 je Glu; X24 je Ile; X33 je Leu, -D-Leu, D-Ile or Ile; X34 je odsutan i X21 je Lys pri čemu je amino ( εamino) grupa Lys acilirana sa ostatkom: {-Q-T-U-W-Y-Z pri čemu su Q i T odsutni; U je odsutan ili -C(O)-CH2-O-(CH2)2-O-(CH2)2-NH-} pri čemu } je tačka vezivanja sa grupom W; W je odsutan ili je izabrano iz grupe koja se sastoji od -C(O)-CH2-O-(CH2)2-O-(CH2)2-NH-], -C(O)-NH-(CH2)3-4-NH-], -C(O)-C(CH3)2-NH-] i

   pri čemu ] je tačka vezivanja sa grupom Y; Y je-C(O)-(CH2)2-CH(COOH)NH--i -- je tačka vezivanja sa grupom Z; Z je -C(O)-(CH2)n-COOH ili -C(O)-(CH2)n-CH3 pri čemu je n okrugli broj od 14 do 20.
2. 2. Polipeptid prema patentnom zahtevu 1 pri čemu X2 jeste Aib; X3 je odsutan; X33 je Leu; U je -C(O)-CH2-O-(CH2)2-O-(CH2)2-NH-}; W je -C(O)-CH2-O-(CH2)2-O-(CH2)2-NH-] i Z je -C(O)-(CH2)n-COOH pri čemu je n okrugli broj 16.
3. 3. Polipeptid prema patentnom zahtevu 1, pri čemu X2 jeste Aib; X3 je odsutan; X33 je Leu; U je -C(O)-CH2-O-(CH2)2-O-(CH2)2-NH-}; W je -C(O)-C(CH3)2-NH-] i Z je -C(O)-(CH2)n-COOH pri čemu je n okrugli broj 16.
4. 4. Polipeptid prema patentnom zahtevu 1, pri čemu X2 jeste Aib; X3 je odsutan; X33 je Leu; U je -C(O)-CH2-O-(CH2)2-O-(CH2)2-NH-}; W je -C(O)-NH-(CH2)4-NH-] i Z je -C(O)-(CH2)n-COOH pri čemu je n okrugli broj 16.
5. 5. Polipeptid prema patentnom zahtevu 1, pri čemu X2 jeste Aib; X3 is absent; X33 is Leu; U is -C(O)-CH2-O-(CH2)2-O-(CH2)2-NH-}; W je

   i Z je -C(O)-(CH2)n-COOH pri čemu je n okrugli broj 16.
6. 6. Polipeptid prema patentnom zahtevu 1, pri čemu X2 jeste Aib; X3 je odsutan; X33 je Leu; U je -C(O)-CH2-O-(CH2)2-O-(CH2)2-NH-}; W je -C(O)-NH-(CH2)3-NH-] and Z je -C(O)-(CH2)n-COOH pri čemu je n okrugli broj 16.
7. 7. Polipeptid prema patentnom zahtevu 1, pri čemu X2 je Ser, Ser(OMe), D-Ser, D-Ser(OMe); X3 je odsutan; X33 je Leu; U je -C(O)-CH2-O-(CH2)2-O-(CH2)2-NH-}; W je -C(O)-CH2-O-(CH2)2-O-(CH2)2-NH-], -C(O)-NH-(CH2)3-4-NH-], -C(O)-C(CH3)2-NH-] and Z je -C(O)-(CH2)n-COOH ili -C(O)-(CH2)n-CH3 pri čemu je n okrugli broj od 14 do 20.
8. 8. Polipeptid prema patentnom zahtevu 1, pri čemu je W odabrano iz grupe koja se sastoji od -C(O)-NH-(CH2)3-4-NH-], -C(O)-C(CH3)2-NH-] i
9. 9. Polipeptid prema patentnom zahtevu 1, pri čemu X2 jeste Ala; X3 je odsutan; X33 je Leu; W je odsutan; Z is -C(O)-(CH2)n-CH3 pri čemu je n okrugli broj 14.
10. 10. Polipeptid prema patentnom zahtevu 1, pri čemu X2 jeste Aib; X3 je odsutan; X33 je Leu; W je odsutan; Z je -C(O)-(CH2)n-CH3 pri čemu je n okrugli broj 14.