RS63416B1

RS63416B1 - Sistem višestrukih vektora i njegove primene

Info

Publication number: RS63416B1
Application number: RS20220591A
Authority: RS
Inventors: Pasqualina Colella; Alberto Auricchio; Ivana Trapani
Original assignee: Fond Telethon
Priority date: 2015-03-03
Filing date: 2016-03-03
Publication date: 2022-08-31
Also published as: JP2018512125A; PL3265571T3; EP4089172A3; MX2017011255A; JP7182873B2; EP3265571A1; AU2016227668A1; AU2016227668B2; SMT202200269T1; HRP20220776T1; BR112017018728A2; PT3265571T; MX2023004479A; JP2022174192A; EP4089172A2; US20180327779A1; KR20170140185A; WO2016139321A1; CA2979120A1; CN107466325A

Description

Opis

OBLAST TEHNIKE

[0001] Predmetni pronalazak se odnosi na konstrukte, vektore, odgovarajuće ćelije domaćine i farmaceutske kompozicije koje omogućavaju delotvornu gensku terapiju, naročito gena većih od 5 Kb.

POZADINA PRONALASKA

[0002] Terapija za vraćanje vida za brojne nasledne degeneracije mrežnjače (inherited retinal degeneration, IRD) i dalje predstavlja značajnu neispunjenu medicinsku potrebu. Genska terapija adenoasociranim virusnim (AAV) vektorima predstavlja, do danas, najperspektivniji pristup lečenju brojnih IRD. Zaista, godine pretkliničkog ispitivanja i brojna klinička ispitivanja za različite IRD definisali su sposobnost AAV da efikasno isporuče terapeutske gene do obolelih slojeva mrežnjače [fotoreceptori (PR) i retinalni pigmentni epitel (RPE)]<1,2>i potvrđuju njihov izuzetni profil bezbednosti i efikasnosti kod ljudi<3-7>. Uprkos tome, jedna od najvećih prepreka za širenje ovog uspeha na druga stanja koja dovode do slepila je kapacitet AAV vektora za pakovanje (~5 kb). To je postao ograničavajući faktor za razvoj terapije zamene gene za uobičajene IRD usled mutacije gena sa kodirajućom sekvencom (coding sequence, CDS) većom od 5 kb (ovde se nazivaju i veliki geni).

[0003] Stoga je u prethodnim godinama veliko interesovanje usmereno na identifikaciju strategija za povećanje kapaciteta nošenja AAV. Dvojni AAV vektori su, zahvaljujući sposobnosti AAV genoma da se konkatamerizuje putem intermolekulske rekombinacije, uspešno iskorišćeni za rešavanje ovog problema<14-16>. Dvojni AAV vektori se dobijaju deljenjem ekspresione kasete velikog transgena na dve zasebne polovine, od kojih je svaka upakovana u jedan AAV vektor normalne veličine (normal size, NS; < 5 kb).

Rekonstituisanje ekspresione kasete kompletne dužine se postiže nakon koinfekcije iste ćelije putem oba dvojna AAV vektora, nakon čega sledi jedno od: i) konkatamerizacije repa sa glavom dva vektorska genoma posredovane invertovanim terminalnim ponavljanjem (ITR) nakon čega sledi spajanje (trans-spajanje dvojnog AAV, TS)<15>, ii) homologne rekombinacije preklapajućih regiona koji su sadržani u dva vektorska genoma (preklapanje (overlapping, OV) dvojnog AAV)<15>, iii) kombinacije prethodnog (dvojni AAV hibrid)<16>. Drugi istraživači i predmetni pronalazači su nedavno pokazali potencijal dvojnih AAV vektora u mrežnjači<14, 17-19>. Najčešće korišćeni rekombinogeni regioni u kontekstu dvojnih AAV hibridnih vektora dobijaju se od sekvence od 872 bp iz srednje trećine kDNK humane alkalne fosfataze za koju se pokazalo da daje velike nivoe rekonstitucije dvojnih AAV hibridnih vektora<16>. Predmetni pronalazači su pokazali da dvojni AAV hibridni vektori koji sadrže AK sekvencu imaju bolji učinak od onih koji sadrže sens region glave alkalne fosfataze<14>, koje su pronalazači stvorili na osnovu opisa datog u Ghosh et al<22>. Dodatne studije su pokazale da glava ili rep ovog regiona alkalne fosfataze daju nivoe rekonstitucije transgena koji su slični nivoima koji se postižu sa srednjom trećinom kDNK alkalne fosfataze kompletne dužine<22>. Predmetni pronalazači su otkrili da dvojni AAV trans-spajajući i hibridni AK vektori (koji sadrže kratku AK rekombinogenu sekvencu iz F1 faga) delotvorno transdukuju mrežnjaču miša i svinje i mišje modele spasa kod Stargartove bolesti (STGD) i Ašerovog simptoma 1B (USH1B)<14,19>. Nivoi transdukcije PR koji su ostvareni sa dvojnim AAV TS i hibridnim AK vektorima doveli su do značajnog poboljšanja retinalnog fenotipa mišjih modela IRD, i mogu biti delotvorni za lečenje naslednih stanja koja dovode do slepila. Nadalje, vektori sa heterolognim ITR iz serotipa 2 i 5 (ITR2, odnosno ITR5), koji su u velikoj meri divergentni (58% homologosti 23), pokazuju smanjenu sposobnost da grade kružne monomere i povećanu konkatamerizaciju u smeru od repa ka glavi nego vektori sa homolognim ITR<24>. Na osnovu prethodnog, Yan et al su pokazali da dvojni AAV vektori sa heterolognim ITR2 i ITR5 rekonstituišu ekspresiju transgena efikasnije nego dvojni AAV vektori sa homolognim ITR<24,25>.

[0004] Iako su ove studije istakle potencijal dvojnih AAV vektora za rekonstituciju velikih gena u tkivu od interesa, kao što je mrežnjača, one su takođe ukazale na kritične probleme koji se moraju otkloniti pre nego što se uzme u razmatranje dalja klinička adaptacija ove strategije.

[0005] Proizvodnja skraćenih proteinskih proizvoda iz 5'-polovine vektora koji sadrži promotersku sekvencu i/ili iz vektora 3'-polovine usled male promoterske aktivnosti ITR<14, 17, 20, 21>i dalje ostaje značajan problem povezan sa upotrebom dvojnih vektora. Za sada nisu sprovedene formalne studije toksičnosti za procenu potencijalnih štetnih dejstava tih skraćenih proizvoda in vivo, što dovodi do bezbednosnih nedoumica. Stoga, smanjenje ili ukidanje njihove proizvodnje je veoma poželjno. Predmetni pronalazak je tako usmeren na rešavanje ovog značajnog problema povezanog sa upotrebom sistema dvojnih vektora.

SAŽETAK PRONALASKA

[0006] Predmetni pronalazak se odnosi na konstrukte, vektore, odgovarajuće ćelije domaćine i farmaceutske kompozicije koje omogućavaju delotvornu gensku terapiju, naročito gena većih od 5Kb. Veći geni uključuju, između ostalog:

[0007] Stargartova bolest (STGD1; MIM br.248200) najčešći je oblik nasledne degeneracije makule koja je uzrokovana mutacijama u ABCA4 (CDS: 6822 bp), koji kodira sve-trans transretinalni transporter specifičan za fotoreceptore<8, 9>. Distrofija čepića-štapića tipa 3, fundus flavimaculatus, senilna degeneracija makule tipa 2, rana teška retinalna distrofija i retinitis pigmentosa tip 19 takođe su povezani sa mutacijama ABCA4 (bolesti povezane sa ABCA4). Ašerov sindrom tipa IB (USH1B; MIM br.276900) najteži je kombinovani oblik retinitis pigmentose i gluvoće uzrokovan mutacijama u MYO7A (CDS: 6648 bp)<10>, koji kodira motorni neuron na bazi aktina koji se eksprimira i u PR i RPE u mrežnjači<11-13>.

[0008] Nadalje, mnoge druge genetske bolesti, koje ne izazivaju nužno retinalne simptome, posledica su mutacija velikih gena. One uključuju, između ostalog: Dišenovu mišićnu distrofiju usled mutacija u DMD, cističnu fibrozu usled mutacija u CFTR, hemofiliju A usled mutacija u F8 i disferlinopatije usled mutacija u DYSF genu.

[0009] Predmetni pronalazak je naročito usmeren na smanjenje ekspresije skraćenog proteinskog proizvoda koji je povezan sa višestrukim AAV vektorskim sistemima, putem upotrebe signala koji posreduju u razgradnji proteina ili izbegavanja njihove translacije (nadalje signali za razgradnju). Signali za razgradnju nikada nisu korišćeni u kontekstu višestrukih virusnih vektora. U predmetnom pronalasku je iznenađujuće otkriveno da, kada je signal za razgradnju prisutan u najmanje jednom vektoru sistema višestrukih vektora, ekspresija proteina u skraćenom obliku je značajno smanjena, što dovodi do većeg prinosa proteina kompletne dužine

[0010] Stoga, u prvom aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje AAV sistem višestrukih vektora koji će eksprimirati kodirajuću sekvencu gena od interesa u ćeliji, pri čemu pomenuta kodirajuća sekvenca sadrži prvi deo i drugi deo, i pomenuti sistem vektora sadrži:

a) prvi vektor koji sadrži:

o pomenuti prvi deo pomenute kodirajuće sekvence (CDS1),

o prvu sekvencu za rekonstituciju; i

b) drugi vektor koji sadrži:

o pomenuti drugi deo pomenute kodirajuće sekvence (CDS2),

o drugu sekvencu za rekonstituciju,

pri čemu su pomenuta prva i druga sekvenca za rekonstituciju izabrane iz grupe od: i] prve sekvence za rekonstituciju koja se sastoji od 3' kraja pomenutog prvog dela kodirajuće sekvence i druge sekvence za rekonstituciju koja se sastoji od 5' kraja pomenutog drugog dela kodirajuće sekvence, pri čemu su pomenuta prva i druga sekvenca za rekonstituciju preklapajuće sekvence; ili

ii] prve sekvence za rekonstituciju koja sadrži donorski signal za spajanje (SD) i druge sekvence za rekonstituciju koja sadrži akceptorski signal za spajanje (SA), opciono pri čemu i prva i druga sekvenca za rekonstituciju dalje sadrži rekombinogenu sekvencu, okarakterisano time da jedan ili oba od prvog i drugog vektora dalje sadrži nukleotidnu sekvencu signala za razgradnju, pri čemu se pomenuta sekvenca nalazi, u slučaju i) na 3' kraju CDS1 i/ili na 5' kraju CDS2, a u slučaju ii) na 3' poziciji u odnosu na SD i/ili 5' poziciji u odnosu na SA, pri čemu

rekombinogena sekvenca je izabrana iz grupe koja se sastoji od:

GGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTT AACAAAAATTT AACGCGAATTTTAACAAAAT (SEQ ID NO.22, AK) ili GGGATTTTTCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTA ACAAAAATTT AACGCGAATTTTAACAAAAT (SEQ ID NO.23, AK), SEQ ID NO.24 (AP1), SEQ ID NO.25 (AP2) i SEQ ID NO.26 (AP) i nukleotidna sekvenca signala za razgradnju sadrži ili se sastoji od sekvence koja kodira SEQ ID No.1 (CL1), SEQ ID No.2 (CL2), SEQ ID No.3 (CL6), SEQ ID No.

4 (CL9), SEQ ID No.5 (CL10), SEQ ID No.6 (CL11), SEQ ID No.7 (CL12), SEQ ID No.8 (CL15), SEQ ID No.9 (CL16), ili nukleotidna sekvenca signala za razgradnju sadrži ili se sastoji od SEQ ID No.16.

[0011] Poželjno, i prvi i drugi vektor dalje sadrže pomenutu nukleotidnu sekvencu signala za razgradnju, pri čemu je nukleotidna sekvenca signala za razgradnju u prvom vektoru identična sekvenci u drugom vektoru ili se od nje razlikuje.

[0012] Poželjno, prva sekvenca za rekonstituciju sadrži donorski signal za spajanje (SD) i rekombinogeni region na 3' poziciji u odnosu na pomenuti SD, druga sekvenca za rekonstituciju sadrži akceptorski signal za spajanje (SA) i rekombinogenu sekvencu na 5' poziciji u odnosu na SA; pri čemu se pomenuta nukleotidna sekvenca signala za razgradnju nalazi na 5' kraju i/ili na 3' kraju nukleotidne sekvence rekombinogenog regiona jednog od prvog i drugog vektora, ili oba.

[0013] Poželjno, prvi vektor dalje sadrži promotersku sekvencu koja je operativno povezana sa 5' krajem pomenutog prvog dela kodirajuće sekvence (CDS1).

[0014] Poželjno, i prvi vektor i drugi vektor dalje poželjno sadrže nukleotidnu sekvencu 5'-terminalnog ponavljanja (5'-TR) i nukleotidnu sekvencu 3'-terminalnog ponavljanja (3'-TR), poželjno, 5'-TR je nukleotidna sekvenca 5'-invertovanog terminalnog ponavljanja (5'-ITR), a 3'-TR je nukleotidna sekvenca 3'-invertovanog terminalnog ponavljanja (3'-ITR), pri čemu su ITR poželjno poreklom od istog virusnog serotipa ili različitih virusnih serotipova.

[0015] Poželjno, kodirajuća sekvenca je podeljena na prvi deo i drugi deo na prirodnom spoju egzon-egzon.

[0016] Poželjno, donorski signal za spajanje sadrži ili se suštinski sastoji od sekvence koja je najmanje 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ili 100% identična sa

[0017] Poželjno, akceptorski signal za spajanje sadrži ili se suštinski sastoji od sekvence koja je najmanje 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ili 100% identična sa GATAGGCACCTATTGGTCTTACTGACATCCACTTTGCCTTTCTCTCCACAG (SEQ ID No.28)

[0018] Poželjno, prvi vektor dalje sadrži najmanje jednu nukleotidnu sekvencu pojačivača, operativno povezanu sa kodirajućom sekvencom.

[0019] Poželjno, kodirajuća sekvenca kodira protein koji može da koriguje degeneraciju mrežnjače. Poželjno, kodirajuća sekvenca kodira protein koji može da koriguje Dišenovu mišićnu distrofiju, cističnu fibrozu, hemofiliju A i disferlinopatije.

[0020] U slučaju degradacije mrežnjače, kodirajuća sekvenca je poželjno kodirajuća sekvenca gena izabranog iz grupe koja se sastoji od: ABCA4, MYO7A, CEP290, CDH23, EYS, PCDH15, CACNA1, SNRNP200, RP1, PRPF8, RP1L1, ALMS1, USH2A, GPR98, HMCN1.

[0021] U slučaju Dišenove mišićne distrofije, cistične fibroze, hemofilije A i disferlinopatija, kodirajuća sekvenca je poželjno kodirajuća sekvenca gena izabranog iz grupe koja se sastoji od: DMD, CFTR, F8 i DYSF,

[0022] Poželjno, prvi vektor ne sadrži nukleotidnu sekvencu signala za poliadenilaciju.

[0023] Poželjno, sistem vektora sadrži:

a) prvi vektor koji sadrži, u smeru 5'-3':

o sekvencu 5'-invertovanog terminalnog ponavljanja (5'-ITR);

o promotersku sekvencu;

o 5' deo kodirajuće sekvence gena od interesa (CDS1), pri čemu je pomenuti 5' deo operativno povezan sa pomenutim promoterom i pod njegovom je kontrolom;

o nukleotidnu sekvencu donorskog signala za spajanje;

o nukleotidnu sekvencu rekombinogenog regiona; i

o sekvencu 3'-invertovanog terminalnog ponavljanja (3'-ITR); i

b) drugi vektor koji sadrži, u smeru 5'-3':

o sekvencu 5'-invertovanog terminalnog ponavljanja (5'-ITR);

o nukleotidnu sekvencu rekombinogenog regiona;

o nukleotidnu sekvencu akceptorskog signala za spajanje;

o 3' kraj kodirajuće sekvence (CDS2);

o nukleotidnu sekvencu signala za poliadenilaciju; i

o sekvencu 3'-invertovanog terminalnog ponavljanja (3'-ITR), okarakterisano time što dalje sadrži nukleotidnu sekvencu signala za razgradnju, pri čemu se pomenuta sekvenca nalazi na 5' kraju ili 3' kraju nukleotidne sekvence rekombinogenog regiona jednog od prvog i drugog vektora, ili oba

pri čemu

rekombinogena sekvenca je izabrana iz grupe koja se sastoji od:

GGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATG

AGCTGATTTAACAAAAATTT

AACGCGAATTTTAACAAAAT (SEQ ID NO.22, AK) ili GGGATTTTTCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGA

GCTGATTTAACAAAAATTT

AACGCGAATTTTAACAAAAT (SEQ ID NO.23, AK), SEQ ID NO.24 (AP1), SEQ ID NO 25 (AP2) i SEQ ID NO.26 (AP) i

nukleotidna sekvenca signala za razgradnju sadrži ili se sastoji od sekvence koja kodira SEQ ID No.1 (CL1), SEQ ID No.2 (CL2), SEQ ID No.3 (CL6), SEQ ID No.4 (CL9), SEQ ID No.5 (CL10), SEQ ID No. 6 (CL11), SEQ ID No.7 (CL12), SEQ ID No.8 (CL15), SEQ ID No. 9 (CL16), ili nukleotidna sekvenca signala za razgradnju sadrži ili se sastoji od SEQ ID No.16.

[0024] Poželjno, pomenuti prvi i drugi adenoasocirani virusni (AAV) vektori izabrani su od istog ili različitih AAV serotipova. Poželjno, adenoasocirani virus je izabran od serotipa 2, serotipa 8, serotipa 5, serotipa 7 ili serotipa 9.

[0025] Poželjno, sistem vektora iz pronalaska dalje sadrži treći vektor koji sadrži treći deo pomenute kodirajuće sekvence (CDS3) i sekvencu za rekonstituciju, pri čemu drugi vektor sadrži dve sekvence za rekonstituciju, i obe sekvence za rekonstituciju se nalaze na svakom kraju CDS2.

[0026] Poželjno, sekvenca za rekonstituciju iz prvog vektora sastoji se od 3' kraja CDS1, dve sekvence za rekonstituciju iz drugog vektora sastoje se od 5' kraja, odnosno 3' kraja CDS2, a sekvenca za rekonstituciju iz trećeg vektora sastoji se od 5' kraja CDS3;

pri čemu su pomenuta sekvenca za rekonstituciju iz prvog vektora i pomenuta sekvenca za rekonstituciju iz drugog vektora koja se sastoji od 5' kraja CDS2 preklapajuće sekvence, i

pri čemu su pomenuta sekvenca za rekonstituciju iz drugog vektora koja se sastoji od 3' kraja CDS2 i pomenuta sekvenca za rekonstituciju iz pomenutog trećeg vektora preklapajuće sekvence;

pri čemu pomenuti drugi vektor dalje sadrži signal za razgradnju, pri čemu se pomenuti signal za razgradnju nalazi na 5' kraju i/ili na 3' kraju CDS2.

[0027] Poželjno, treći vektor dalje sadrži najmanje jednu nukleotidnu sekvencu signala za razgradnju.

[0028] Poželjno, drugi vektor dalje sadrži nukleotidnu sekvencu signala za poliadenilaciju povezanu sa 3' delom pomenute kodirajuće sekvence (CDS2).

[0029] Predmetni pronalazak obezbeđuje ćeliju domaćina transformisanu sistemom vektora kako je prethodno definisano. Poželjno, sistem vektora ili ćelija domaćin iz pronalaska su za medicinsku upotrebu. Poželjno za upotrebu u genskoj terapiji. Poželjno za upotrebu u lečenju i/ili prevenciji patologije ili bolesti okarakterisanih degeneracijom mrežnjače ili za upotrebu u prevenciji i/ili lečenju Dišenove mišićne distrofije, cistične fibroze, hemofilije A i disferlinopatija.

[0030] Poželjno, degeneracija mrežnjače je nasledna.

[0031] Poželjno, patologija ili bolest su izabrani iz grupe koja se sastoji od: retinitis pigmentose (RP), Leberove kongenitalne amauroze (LCA), Stargartove bolesti (STGD), Ašerove bolesti (USH), Alstromovog sindroma, kongenitalnog stacionarnog noćnog slepila (CSNB), makularne distrofije, okultne makularne distrofije, bolesti uzrokovane mutacijom u genu ABCA4.

[0032] Pronalazak obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja sadrži sistem vektora ili ćeliju domaćina, kako su prethodno definisani, i farmaceutski prihvatljiv vehikulum.

1

[0033] Pronalazak obezbeđuje nukleotidnu sekvencu signala za razgradnju koja sadrži ili se sastoji od sekvence koja kodira SEQ ID No.1 (CL1), SEQ ID No.2 (CL2), SEQ ID No.3 (CL6), SEQ ID No.4 (CL9), SEQ ID No.5 (CL10), SEQ ID No.6 (CL11), SEQ ID No.7 (CL12), SEQ ID No.8 (CL15), SEQ ID No.9 (CL16), ili sadrži ili se sastoji od SEQ ID No.

16 u sistemu višestrukih AAV vektora za upotrebu u postupku za smanjenje ekspresije proteina u skraćenom obliku ili za upotrebu u postupku za smanjenje ekspresije proteina u skraćenom obliku obuhvatajući inserciju pomenute nukleotidne sekvence signala za razgradnju u jedan ili više vektora sistema višestrukih AAV vektora.

[0034] Prema poželjnim otelotvorenjima pronalaska, sistem vektora koji eksprimira kodirajuću sekvencu gena od interesa u ćeliji sadrži dva vektora, pri čemu svaki vektor sadrži različiti deo pomenute kodirajuće sekvence i sekvencu za rekonstituciju. Poželjno, sekvenca za rekonstituciju iz prvog vektora je sekvenca koja sadrži donor za spajanje, dok je sekvenca za rekonstituciju iz drugog vektora sekvenca koja sadrži akceptor za spajanje.

[0035] Prema dalje poželjnim otelotvorenjima pronalaska, sistem vektora koji eksprimira kodirajuću sekvencu gena od interesa u ćeliji sadrži tri vektora, pri čemu svaki vektor sadrži različiti deo pomenute kodirajuće sekvence i najmanje jednu sekvencu za rekonstituciju. Poželjno, prvi vektor sadrži sekvencu za rekonstituciju koja sadrži donor za spajanje na 3' poziciji u odnosu na prvi deo kodirajuće sekvence, drugi vektor sadrži sekvencu za rekonstituciju koja sadrži akceptor za spajanje na 5' poziciji u odnosu na drugi deo kodirajuće sekvence i sekvencu za rekonstituciju koja sadrži donor za spajanje na 3' poziciji u odnosu na drugi deo kodirajuće sekvence, a treći vektor sadrži sekvencu za rekonstituciju koja sadrži akceptor za spajanje na 5' poziciji u odnosu na treći deo kodirajuće sekvence. Poželjno, sekvence za rekonstituciju iz prvog i drugog vektora ili sekvence za rekonstituciju iz prvog, drugog i trećeg vektora dalje sadrže rekombinogeni region, poželjno na 3' poziciji u odnosu na donor za spajanje i na 5' poziciji u odnosu na akceptor za spajanje.

[0036] Poželjno, svi vektori iz sistema vektora iz pronalaska dalje sadrže nukleotidnu sekvencu signala za razgradnju.

[0037] Prema poželjnim otelotvorenjima pronalaska, kada vektori sadrže sekvence za rekonstituciju koje sadrže rekombinogeni region, signali za razgradnju se nalaze na 5' kraju ili na 3' kraju sekvence pomenutog rekombinogenog regiona. Prema poželjnim otelotvorenjima pronalaska, sistem vektora koji eksprimira kodirajuću sekvencu gena od interesa u ćeliji sadrži dva vektora; prvi vektor sistema vektora sadrži u 5'-3' smeru:

5' deo kodirajuće sekvence gena od interesa,

sekvencu nukleinske kiseline donorskog signala za spajanje,

sekvencu nukleinske kiseline rekombinogenog regiona, i

sekvencu nukleinske kiseline signala za razgradnju.

[0038] Prema poželjnim otelotvorenjima pronalaska, sistem vektora koji eksprimira kodirajuću sekvencu gena od interesa u ćeliji sadrži dva vektora; drugi vektor sistema vektora sadrži u 5'-3' smeru:

sekvencu nukleinske kiseline rekombinogenog regiona,

sekvencu nukleinske kiseline signala za razgradnju,

sekvencu nukleinske kiseline akceptorskog signala za spajanje, i

3' deo kodirajuće sekvence gena od interesa

pri čemu

rekombinogena sekvenca je izabrana iz grupe koja se sastoji od:

GGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTT AACAAAAATTT AACGCGAATTTTAACAAAAT (SEQ ID No.22, AK) ili GGGATTTTTCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTA ACAAAAATTT AACGCGAATTTTAACAAAAT (SEQ ID NO.23, AK), SEQ ID NO.24 (AP1), SEQ ID NO 25 (AP2) i SEQ ID NO.26 (AP) i nukleotidna sekvenca signala za razgradnju sadrži ili se sastoji od sekvence koja kodira SEQ ID No.1 (CL1), SEQ ID No.2 (CL2), SEQ ID No.3 (CL6), SEQ ID No.

[0039] Poželjno, prvi vektor sistema vektora prema pronalasku dalje sadrži promotersku sekvencu, poželjnije, pomenuta promoterska sekvenca je operativno povezana sa 5' krajem prvog dela kodirajuće sekvence gena od interesa.

[0040] Poželjno, drugi vektor sistema vektora koji se sastoji od dva vektora dalje sadrži sekvencu nukleinske kiseline signala za poliadenilaciju, poželjnije, pomenuta sekvenca nukleinske kiseline signala za poliadenilaciju je povezana sa 3' krajem drugog dela kodirajuće sekvence gena od interesa. Poželjno, prvi vektor sistema vektora prema pronalasku ne sadrži sekvencu nukleinske kiseline signala za poliadenilaciju.

[0041] Poželjno, treći vektor sistema vektora koji se sastoji od tri vektora dalje sadrži sekvencu nukleinske kiseline signala za poliadenilaciju, poželjnije, pomenuta sekvenca nukleinske kiseline signala za poliadenilaciju je povezana sa 3' krajem trećeg dela kodirajuće sekvence gena od interesa.

[0042] Poželjno, najmanje jedan vektor sistema vektora iz pronalaska, poželjnije, prvi vektor sistema vektora iz pronalaska, sadrži signal za razgradnju sekvence koja sadrži ili se sastoji od sekvence koja kodira CL1 SEQ ID No.1; poželjno, pomenuta sekvenca koja kodira CL1 SEQ ID No.1 sadrži ili se sastoji od SEQ ID No.16.

[0043] Prema poželjnom otelotvorenju pronalaska, sistem vektora sadrži:

a) prvi vektor koji sadrži, u smeru 5'-3':

o sekvencu 5'-invertovanog terminalnog ponavljanja (5'-ITR);

o promotersku sekvencu;

o prvi deo kodirajuće sekvence gena od interesa, što je poželjno 5' kraj pomenute kodirajuće sekvence, pri čemu je pomenuti prvi deo poželjno operativno povezan sa pomenutim promoterom i pod njegovom je kontrolom; o sekvencu nukleinske kiseline donorskog signala za spajanje;

o sekvencu nukleinske kiseline rekombinogenog regiona; i

o sekvencu 3'-invertovanog terminalnog ponavljanja (3'-ITR); i

b) drugi vektor koji sadrži, u smeru 5'-3':

o sekvencu 5'-invertovanog terminalnog ponavljanja (5'-ITR);

o sekvencu nukleinske kiseline rekombinogenog regiona;

o sekvencu nukleinske kiseline akceptorskog signala za spajanje;

o drugi deo kodirajuće sekvence gena od interesa, što je poželjno 3' kraj pomenute kodirajuće sekvence;

o sekvencu nukleotidne kiseline signala za poliadenilaciju; i

o sekvencu 3'-invertovanog terminalnog ponavljanja (3'-ITR),

1

pomenuti prvi i/ili drugi vektor dalje sadrži sekvencu nukleinske kiseline signala za razgradnju, pri čemu se pomenuta sekvenca nalazi na 5' kraju ili 3' kraju sekvence nukleinske kiseline rekombinogenog regiona, pri čemu o rekombinogena sekvenca je izabrana iz grupe koja se sastoji od:

GGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTG ATTTAACAAAAATTT AACGCGAATTTTAACAAAAT (SEQ ID No. 22, AK) ili GGGATTTTTCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTG ATTTAACAAAAATTT AACGCGAATTTTAACAAAAT (SEQ ID NO. 23, AK), SEQ ID NO.24 (AP1), SEQ ID NO.25 (AP2) i SEQ ID NO. 26 (AP) i

o nukleotidna sekvenca signala za razgradnju sadrži ili se sastoji od sekvence koja kodira SEQ ID No.1 (CL1), SEQ ID No.2 (CL2), SEQ ID No.3 (CL6), SEQ ID No 4 (CL9), SEQ ID No.5 (CL10), SEQ ID No.6 (CL11), SEQ ID No. 7 (CL12), SEQ ID No.8 (CL15), SEQ ID No.9 (CL16), ili nukleotidna sekvenca signala za razgradnju sadrži ili se sastoji od SEQ ID No.16.

[0044] Prema dalje poželjnom otelotvorenju pronalaska, sistem vektora sadrži:

a) prvi vektor koji sadrži, u smeru 5'-3':

o sekvencu 5'-invertovanog terminalnog ponavljanja (5'-ITR);

o promotersku sekvencu;

o prvi deo kodirajuće sekvence gena od interesa koji je poželjno operativno povezan sa pomenutim promoterom i pod njegovom je kontrolom;

o sekvencu nukleinske kiseline donorskog signala za spajanje;

o sekvencu nukleinske kiseline rekombinogenog regiona; i

o sekvencu 3'-invertovanog terminalnog ponavljanja (3'-ITR);

b) drugi vektor koji sadrži, u smeru 5'-3':

o sekvencu 5'-invertovanog terminalnog ponavljanja (5'-ITR);

o sekvencu nukleinske kiseline rekombinogenog regiona;

o sekvencu nukleinske kiseline akceptorskog signala za spajanje;

o drugi deo kodirajuće sekvence gena od interesa;

o sekvencu nukleinske kiseline donorskog signala za spajanje;

o - sekvencu nukleinske kiseline rekombinogenog regiona;

o sekvencu 3'-invertovanog terminalnog ponavljanja (3'-ITR); i

c) treći vektor koji sadrži, u smeru 5'-3':

o sekvencu 5'-invertovanog terminalnog ponavljanja (5'-ITR);

o sekvencu nukleinske kiseline rekombinogenog regiona;

o sekvencu nukleinske kiseline akceptorskog signala za spajanje;

o treći deo kodirajuće sekvence gena od interesa;

o sekvencu nukleotidne kiseline signala za poliadenilaciju; i

o sekvencu 3'-invertovanog terminalnog ponavljanja (3'-ITR),

pomenuti prvi i/ili drugi i/ili treći vektor dalje sadrži sekvencu nukleinske kiseline signala za razgradnju, pri čemu se pomenuta sekvenca nalazi na 5' kraju ili 3' kraju sekvence nukleinske kiseline rekombinogenog regiona

pri čemu

rekombinogena sekvenca je izabrana iz grupe koja se sastoji od:

GGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATG

AGCTGATTTAACAAAAATTT

AACGCGAATTTTAACAAAAT(SEQ ID No.22, AK) ili GGGATTTTTCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGA

GCTGATTTAACAAAAATTT

AACGCGAATTTTAACAAAAT (SEQ 10 NO.23, AK), SEQ ID NO.24 (AP1), SEQ ID NO.25 (AP2) i SEQ ID NO.26 (AP) i

nukleotidna sekvenca signala za razgradnju sadrži ili se sastoji od sekvence koja kodira SEQ ID No.1 (CL1), SEQ ID No.2 (CL2), SEQ ID No.3 (CL6), SEQ ID No.4 (CL9), SEQ ID No.5 (CL10), SEQ ID No. 6 (CL11), SEQ ID No.7 (CL12), SEQ ID No.8 (CL15), SEQ ID No. 9 (CL16), ili nukleotidna sekvenca signala za razgradnju sadrži ili se sastoji od SEQ ID No 16.

[0045] Poželjno, patologija ili bolest su izabrani od: Ašerovog sindroma tipa IF (USH1F), kongenitalnog stacionarnog noćnog slepila (CSNB2), autozomski dominantne (ad) i/ili autozomski recesivne (ar) retinitis pigmentose (RP), USH1B, STGD1, Leberove kongenitalne amauroze tipa 10 (LCA10), RP, Ašerovog sindroma tipa 1D (USH1D), Ašerovog sindroma tipa 2A (USH2A), autozomski dominantne makularne distrofije, Ašerovog sindroma tipa 2C (USH2C), okultne makularne distrofije, Alstromovog sindroma.

1

[0046] U predmetnom pronalasku, sistem vektora znači sistem konstrukta, sistem plazmida, kao i virusne čestice.

[0047] U predmetnom pronalasku, sistem konstrukta ili vektora može da sadrži više od dva vektora.

[0048] Konkretno, sistem konstrukta može da sadrži treći vektor koji sadrži treći deo sekvence od interesa.

[0049] U predmetnom pronalasku, kodirajuća sekvenca kompletne dužine se ponovo gradi ili dobija kada se različiti vektori (2, 3 ili više) uvedu u ćeliju.

[0050] Kodirajuća sekvenca može da se podeli na dva dela. Delovi mogu biti iste ili različite dužine. Kodirajuća sekvenca kompletne dužine se dobija kada se vektori iz sistema vektora uvedu u ćeliju. Prvi deo može biti 5' deo kodirajuće sekvence. Drugi deo može biti 3' deo kodirajuće sekvence. Dalje, kodirajuća sekvenca može da se podeli na tri dela. Delovi mogu biti iste ili različite dužine. Kodirajuća sekvenca kompletne dužine se dobija kada se vektori iz sistema vektora uvedu u ćeliju. Prvi deo je 5' deo kodirajuće sekvence, drugi deo je srednji deo kodirajuće sekvence, a treći deo je 3' deo kodirajuće sekvence.

[0051] U predmetnom pronalasku, ćelija je poželjno ćelija sisara, poželjno humana ćelija.

[0052] U predmetnom pronalasku, prisustvo jednog signala za razgradnju u bilo kom vektoru je dovoljno za smanjenje proizvodnje proteina u skraćenom obliku.

[0053] Termin „signal za razgradnju“ označava sekvencu (nukleotidnu ili aminokiselinsku), koja može da posreduje u razgradnji iRNK/proteina u kome je prisutna.

[0054] Termin „protein u skraćenom obliku“ ili „skraćeni protein“ je protein koji se ne proizvodi u obliku kompletne dužine, pošto ima delecije u rasponu od jedne do više aminokiselina (na primer, recimo od 1 do 10, 1 do 20, 1 do 50, 100, 200, itd.).

1

[0055] U predmetnom pronalasku, „sekvenca za rekonstituciju“ je sekvenca koja omogućava rekonstituciju kodirajuće sekvence kompletne dužine sa odgovarajućim okvirom, čime se omogućava ekspresija funkcionalnog proteina.

[0056] Termin „donorski/akceptorski signal za spajanje“ označava nukleotidne sekvence koje učestvuju u spajanju iRNK.

[0057] U predmetnom pronalasku, može da se koristi svaka sekvenca donorskog ili akceptorskog signala za spajanje iz bilo kog introna. Stručnjak zna da prepozna i izabere odgovarajuću sekvencu donorskog ili akceptorskog signala za spajanje putem rutinskih eksperimenata.

[0058] U predmetnom pronalasku, dve sekvence se preklapaju kada je barem deo svake od pomenutih sekvenci međusobno homolog. Sekvence mogu da se preklapaju u najmanje 1, najmanje 2, najmanje 5, najmanje 10, najmanje 20, najmanje 50, najmanje 100, najmanje 200 nukleotida.

[0059] Termin „rekombinogeni region ili sekvenca“ označava sekvencu koja posreduje u rekombinovanju dve različite sekvence. „Rekombinogeni region ili sekvenca“ i „region homologosti“ ovde se koriste kao sinonimi.

[0060] Termin „terminalno ponavljanje“ označava sekvence koje se ponavljaju na oba kraja nukleotidne sekvence.

[0061] Termin „invertovano terminalno ponavljanje“ označava sekvence koje se ponavljaju na oba kraja nukleotidne sekvence sa suprotnom orijentacijom (reversna komplementarnost).

[0062] Signal za ubikvitinaciju proteina je signal koji posreduje u razgradnji proteina putem proteozoma. U predmetnom pronalasku, kada signal za razgradnju sadrži ponovljene sekvence, što može biti ista sekvenca ili različite sekvence, pomenute ponovljene sekvence su poželjno vezane linkerom koji se sastoji od najmanje 1 nukleotida.

[0063] Veštački zaustavni kodon je nukleotidna sekvenca koja je ciljno uključena u transkript kako bi se indukovala prevremena terminacija translacije proteina.

1

[0064] Sekvenca pojačivača je sekvenca koja povećava transkripciju gena. Signali za razgradnju mogu da uključuju: (i) kratki degron CL1, C-terminalni destabilišući peptid koji ima strukturne sličnosti sa pogrešno savijenim proteinima, te ga tako prepoznaje sistem za ubikvitinaciju<31, 32>, (ii) ubikvitin, čija fuzija na N-terminusu donorskog proteina posreduje u direktnoj razgradnji proteina ili razgradnji puta pravila N-kraja<33, 34>i (iii) N-terminalni PB29 degron koji je peptid dužine 9 aminokiselina i za koji se, slično CL1 degronu, predviđa da se presavija u strukture koje su prepoznate od strane enzima puta ubikvitinacije<35>. Predmetni pronalazači su otkrili da uključivanje sekvenci ili signala za razgradnju u sisteme višestrukih vektora smanjuje ekspresiju skraćenih proteina. U jednom slučaju, pronalazači su otkrili da uključivanje CL1 signala za razgradnju dovodi do selektivne razgradnje skraćenih proteina od 5'-polovine, bez uticaja na proizvodnju proteina kompletne dužine in vitro i u mrežnjači velikih svinja.

[0065] Pored toga, veštački zaustavni kodoni mogu da se ubace radi izazivanja rane terminacije iRNK. Ciljne sekvence mikroRNK (miR), veštački zaustavni kodoni ili signali za ubikvitinaciju proteina mogu da se koriste za posredovanje u razgradnji skraćenih proteinskih proizvoda. Sekvenca signala za razgradnju može da sadrži ponovljene sekvence, recimo više od jedne ciljne sekvence mikroRNK (miR), veštački zaustavni kodon ili signal za ubikvitinaciju proteina, pri čemu su ponovljene sekvence ista sekvenca ili različite sekvence ponovljene najmanje dva puta. Poželjno, ponovljene sekvence su vezane linkerom koji sadrži najmanje 1 nukleotid.

[0066] Od miR koje su eksprimirane u mrežnjači, miR-let7b ili -26a se eksprimiraju na visokim nivoima<26-29>dok je za miR-204 i -124 pokazano da ograničavaju ekspresiju transgena posredovanu putem AAV na RPE ili fotoreceptore<30>. Karali et al<30>su testirali efikasnost ciljnih mesta miR u modulaciji ekspresije gena uključenog u jednom AAV vektoru u specifičnoj vrsti ćelija. Kod Karali et al, ciljna mesta miR su uključena u kanonsku ekspresionu kasetu (koja kodira ceo reporterski gen), nishodno od kodirajuće sekvence i pre signala poliadenilacije (polyA). Karali et al su koristili ciljna mesta miR za miR-204 ili miR-124 i koristili su 4 tandemske kopije svake miR. miR mogu biti i imitatori miR (Xiao, et al. J Cell Physiol 212:285-292, 2007; Wang Z Methods Mol Biol 676:211-223, 2011). Po prvi put, pronalazači su primenili te strategije na konstrukte višestrukih vektora i uspeli su da utišaju ekspresiju skraćenih proteina proizvedenih iz takvih vektora.

1

[0067] Tokom prethodne decenije, genska terapija je primenjena na lečenje bolesti u stotinama kliničkih ispitivanja. Različiti alati su razvijeni za isporuku gena u humane ćelije. Vehikulumi za isporuku mogu da se primene na pacijentu. Stručnjak može da odredi odgovarajući dozni raspon. Termin „primenjen“ obuhvata isporuku virusnim i nevirusnim tehnikama. Mehanizmi nevirusne isporuke uključuju, ali nisu ograničeni na, transfekciju posredovanu lipidom, lipozome, imunolipozome, lipofektin, katjonske facijalne amfifile (CFA) i kombinacije prethodnog. Kada se radi o virusnoj isporuci, virusi dobijeni genetskim inženjeringom, uključujući adenoasocirane viruse, trenutno su među najpopularnijim alatom za isporuku gena. Koncept isporuke gena na bazi virusa obuhvata inženjering virusa tako da on može da eksprimira gen(e) od interesa ili regulatorne sekvence kao što su promoteri i introni. U zavisnosti od specifične primene i vrste virusa, većina virusnih vektora sadrži mutacije koje umanjuju njihovu sposobnost da se slobodno repliciraju u domaćinu kao virusi divljeg tipa. Virusi iz nekoliko različitih familija su modifikovani radi dobijanja virusnih vektora za isporuku gena. Ti virusi uključuju retroviruse, lentiviruse, adenoviruse, adenoasocirane viruse, viruse herpesa, bakuloviruse, pikornaviruse i alfaviruse. Predmetni pronalazak koristi adenoasocirane viruse. Većina sistema sadrži vektore koji su sposobni da obuhvate gene od interesa i pomoćničke ćelije koje mogu da obezbede virusne strukturne proteine i enzime koji omogućavaju stvaranje infektivnih virusnih čestica koje sadrže vektor. Adenoasocirani virusi su familija virusa koji se razlikuju po nukleotidnoj i aminokiselinskoj sekvenci, genomskoj strukturi, patogenosti i rasponu domaćina. Ova raznovrsnost pruža prilike za korišćenje virusa sa različitim biološkim karakteristikama za razvoj različitih terapeutskih primena. Kao i kod svakog alata za isporuku, efikasnost, sposobnost za ciljanje određene vrste tkiva ili ćelija, ekspresija gena od interesa i bezbednost sistema na bazi adenoasociranih virusa značajni su za uspešnu primenu genske terapije. Značajni napori su posvećeni tim oblastima istraživanja u prethodnim godinama. Načinjene su različite modifikacije vektora na bazi adenoasociranih virusa i pomoćničkih ćelija kako bi se izmenila ekspresija gena, ciljna isporuka, poboljšali virusni titri i povećala bezbednost. Predmetni pronalazak predstavlja poboljšanje u ovom postupku konstruisanja po tome što pruža efikasnu isporuku gena od interesa u takve virusne vektore.

[0068] Idealni vektor za isporuku gena na bazi adenoasociranih virusa mora biti efikasan, specifičan za ćeliju, regulisan i bezbedan. Efikasnost isporuke je važna jer ona može da odredi efikasnost terapije. Napori su trenutno usmereni na postizanje infekcije specifične za

1

vrstu ćelija i ekspresije gena sa adenoasociranim virusnim vektorima. Pored toga, adenoasocirani virusni vektori se razvijaju za regulisanje ekspresije gena od interesa, pošto terapija može zahtevati dugotrajnu ili regulisanu ekspresiju. Bezbednost je značajan problem za virusnu isporuku gena, pošto je većina virusa patogena ili ima patogeni potencijal. Važno je da prilikom isporuke gena pacijent nenamerno ne primi patogeni virus koji ima puni replikacioni potencijal.

[0069] Adenoasocirani virus (AAV) je mali virus koji inficira ljude i neke druge vrste primata. Trenutno nije poznato da AAV uzrokuje bolest, te stoga virus izaziva veoma blag imunski odgovor. Vektori za gensku terapiju koji koriste AAV mogu da inficiraju i ćelije koje se dele i neaktivne ćelije, i zadržavaju se u ekstrahromozomskom stanju bez integrisanja u genom ćelije domaćina. Te karakteristike čine AAV veoma privlačnim kandidatom za kreiranje virusnih vektora za gensku terapiju, i za kreiranje izogenih humanih modela bolesti.

[0070] AAV divljeg tipa je privukao pažnju istraživača u polju genske terapije usled brojnih pogodnosti. Glavna od njih je što virus očigledno nije patogen. Takođe može da inficira ćelije koje se ne dele, i može stabilno da se integriše u genom ćelije domaćina na specifičnom mestu (koje se naziva AAVS1) u ljudskom hromozomu 19. Ova osobina ga čini malo predvidljivijim od retrovirusa, koji nose rizik od nasumične insercije i mutageneze, što je ponekad praćeno nastankom kancera. AAV genom se najčešće integriše na pomenutom mestu, dok se nasumična inkorporacija u genom javlja sa zanemarljivom učestalošću. Razvoj AAV kao vektora za gensku terapiju, međutim, eliminisao je taj integrativni kapacitet putem uklanjanja rep i cap iz DNK vektora. Željeni gen je zajedno sa promoterom za pokretanje transkripcije gena umetnut između ITR koja pomažu u nastanku konkatamera u nukleusu nakon što je jednolančana vektorska DNK putem kompleksa DNK polimeraze ćelije domaćina konvertovana u dvolančanu DNK. Vektori za gensku terapiju na bazi AAV grade epizomske konkatamere u nukleusu ćelije domaćina. U ćelijama koje se ne dele, ti konkatameri ostaju netaknuti do kraja životnog veka ćelije domaćina. U ćelijama koje se dele, DNK AAV se gubi tokom ćelijske deobe, pošto se epizomska DNK ne replicira zajedno sa DNK ćelije domaćina. Nasumična integracija DNK AAV u genom domaćina može da se detektuje, ali se javlja sa veoma malom učestalošću. AAV takođe imaju malu imunogenost, koja je izgleda ograničena na stvaranje neutralizujućih antitela, pri čemu ona ne indukuju jasno definisan citotoksični odgovor. Ova karakteristika, zajedno sa sposobnošću antitela da

2

inficira neaktivne ćelije, daje im prednost u odnosu na adenoviruse kao vektore za humanu gensku terapiju.

AAV genom, transkriptom i proteom

[0071] AAV genom je izgrađen od jednolančane dezoksiribonukleinske kiseline (ssDNK), bilo sa pozitivnim ili negativnim smislom, koja je dužine oko 4,7 kilobaza. Genom sadrži invertovana terminalna ponavljanja (ITR) na oba kraja lanca DNK, i dva otvorena okvira za čitanje (ORF): rep i cap. Prvi je sačinjen od četiri preklapajuća gena koji kodiraju Rep proteine koji su potrebni za životni ciklus AAV, dok drugi sadrži preklapajuće nukleotidne sekvence proteina kapsida: VP1, VP2 i VP3, koji međusobno interaguju kako bi se dobio kapsid sa ikosaedarskom simetrijom.

Sekvence ITR

[0072] Sekvence invertovanog terminalnog ponavljanja (ITR) dobile su ime na osnovu svoje simetrije, za koju se pokazalo da je neophodna za efikasnu multiplikaciju AAV genoma. Još jedno svojstvo ovih sekvenci je njihova sposobnost da grade ukosnicu , što doprinosi takozvanom samostalnom prajmingu koji omogućava sintezu drugog lanca DNK nezavisnu od primaze. Takođe se pokazalo da su ITR potrebni i za integraciju DNK AAV u genom ćelije domaćina (19. hromozom kod ljudi) i za izolovanje iz njega, kao i za efikasnu enkapsidaciju DNK AAV u kombinaciji sa stvaranjem u potpunosti sastavljenih AAV čestica otpornih na dezoksiribonukleazu.

[0073] Što se tiče genske terapije, čini se da su ITR jedine sekvence koje su potrebne in cis pored terapeutskog gena: strukturni (cap) i pakujući (rep) geni mogu da se isporuče in trans. Polazeći od ove pretpostavke, razvijeni su brojni postupci za efikasnu proizvodnju vektora rekombinantnog AAV (rAAV) koji sadrže reporter ili terapeutski gen. Međutim, takođe je objavljeno da ITR nisu jedini element koji je potreban in cis za efektivnu replikaciju i enkapsidaciju.

[0074] Nekoliko istraživačkih grupa je identifikovalo sekvencu nazvanu element koji deluje kao cis koji zavisi od rep (CARE) u okviru kodirajuće sekvence rep gena. Pokazalo se da CARE uvećava replikaciju i enkapsidaciju kada je prisutan in cis.

[0075] Zaključno sa 2006. godinom, opisano je 11 serotipova AAV, pri čemu je 11. opisan 2004. Svi poznati serotipovi mogu da inficiraju ćelije brojnih različitih vrsta tkiva.

Specifičnost tkiva određena je serotipom kapsida, i pseudotipizacija AAV vektora radi izmene raspona njihovog tropizma verovatno će biti važna za njihovo korišćenje u terapiji.

[0076] Sekvence invertovanog terminalnog ponavljanja (ITR) koje su korišćene u AAV sistemu vektora iz predmetnog pronalaska mogu biti bilo koja ITR AAV. ITR koja se koriste u AAV vektoru mogu biti ista ili različita. Na primer, vektor može da sadrži ITR AAV serotipa 2 i ITR AAV serotipa 5. U jednom otelotvorenju vektora iz pronalaska, ITR je iz AAV serotipa 2, 4, 5 ili 8. U predmetnom pronalasku, poželjni su ITR AAV serotipa 2 i serotipa 5. Sekvence ITR AAV su dobro poznate u struci (na primer, za ITR2 vidite GenBank pristupni br. AF043303.1; NC_001401.2; J01901.1; JN898962.1; za ITR5 vidite GenBank pristupni br. NC_006152.1).

Serotip 2

[0077] Serotip 2 (AAV2) najopsežnije je ispitan do danas. AAV2 predstavlja prirodni tropizam za skeletne mišiće, neurone, vaskularne ćelije glatkih mišića i hepatocite.

[0078] Opisana su tri ćelijska receptora za AAV2: heparan sulfat proteoglikan (HSPG), avβ5integrin i receptor faktora rasta fibroblasta 1 (FGFR-1). Prvi ima funkciju primarnog receptora, dok druga dva imaju aktivnost koreceptora i omogućavaju AAV da uđe u ćeliju putem endocitoze posredovane receptorom. Ove studijske rezultate su osporili Qiu, Handa, et al.. HSPG ima funkciju primarnog receptora, zahvaljujući svom izobilju u ekstracelularnoj matrici može da čisti čestice AAV i umanji efikasnost infekcije.

Serotip 2 i kancer

[0079] Studije su pokazale da serotip 2 virusa (AAV-2) naizgled ubija ćelije kancera bez oštećivanja zdravih ćelija. „Naši rezultati ukazuju na to da adenoasocirani virus tipa 2, koji inficira veći deo populacije ali nema poznata štetna dejstva, ubija brojne vrste ćelija kancera, a nema uticaj na zdrave ćelije“, rekao je Kreg Majers, profesor imunologije i mikrobiologije na Pen Stejt koledžu medicine u Pensilvaniji. Ovo bi moglo da dovede do novog agensa protiv kancera.

Drugi serotipovi

[0080] Iako je AAV2 najpopularniji serotip u različitim istraživanjima na bazi AAV, pokazalo se da drugi serotipovi mogu biti efikasniji kao vektori za isporuku gena. Na primer, izgleda da je AAV6 mnogo bolji u inficiranju epitelnih ćelija disajnih puteva, AAV7 ima veoma visoku stopu transdukcije mišjih skeletnih mišićnih ćelija (slično kao AAV1 i AAV5), AAV8 je izuzetan u transdukciji hepatocita i fotoreceptora, a za AAV1 i 5 se pokazalo da su veoma efikasni za isporuku gena u vaskularne endotelne ćelije. U mozgu, većina serotipova AAV pokazuje neuronski tropizam, dok AAV5 takođe transdukuje astrocite. AAV6, hibrid AAV1 i AAV2, takođe pokazuje manju imunogenost od AAV2.

[0081] Serotipovi mogu da se razlikuju u pogledu receptora za koje se vezuju. Na primer, transdukcija AAV4 i AAV5 može da se inhibira rastvorljivim sijalinskim kiselinama (različitog oblika za svaki od serotipova), i pokazano je da AAV5 ulazi u ćelije putem receptora faktora rasta dobijenog od trombocita. Predmetni pronalazak se takođe bavi sistemom virusnih vektora koji sadrži polinukleotid, ekspresioni konstrukt ili vektorski konstrukt iz pronalaska. U jednom otelotvorenju, sistem virusnih vektora je sistem AAV. Postupci za pripremu virusa i viriona koji sadrže heterologni polinukleotid ili konstrukt su poznati u struci. U slučaju AAV, ćelije mogu biti koinficirane ili transficirane adenovirusom ili polinukleotidnim konstruktima koji sadrže gene adenovirusa koji su pogodni za pomoćničku funkciju AAV. Primeri za materijale i postupke su opisani, na primer, u U.S. patentima br.8,137,962 i 6,967,018. AAV virus ili AAV vektor iz pronalaska mogu biti bilo kog serotipa AAV, uključujući, bez ograničenja, serotip AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10 i AAV11. U specifičnom otelotvorenju, koristi se serotip AAV2 ili AAV5 ili AAV7 ili AAV8 ili AAV9. U jednom otelotvorenju, serotip AAV obezbeđuje jednu ili više mutacija tirozina u fenilalanin (Y-F) na površini kapsida. U specifičnom otelotvorenju, AAV je serotip AAV8 koji ima mutaciju tirozina u fenilalanin na poziciji 733 (Y733F).

[0082] Isporuka jednog ili više terapeutskih gena ili regulatornih sekvenci kao što su promoteri ili introni pomoću sistema vektora prema predmetnom pronalasku može da se koristi samostalno ili u kombinaciji sa drugim lečenjima ili komponentama lečenja.

[0083] Predmetni pronalazak se takođe bavi ćelijom domaćinom koja sadrži sistem konstrukta ili sistem virusnog vektora iz pronalaska. Ćelija domaćin može biti uzgajana ćelija ili primarna ćelija, tj. izolovana direktno iz organizma, npr. čoveka. Ćelija domaćin može biti

2

učvršćena ćelija ili suspendovana ćelija, tj. ćelija koja raste u suspenziji. Pogodne ćelije domaćini su poznate u struci i uključuju, na primer, DH5α, ćelije E. coli, ćelije jajnika kineskog hrčka, VERO ćelije majmuna, COS ćelije, HEK293 ćelije, i slično. Ćelija može biti ćelija čoveka ili ćelija druge životinje. U jednom otelotvorenju, ćelija je fotoreceptorska ćelija ili ćelija RPE. U jednom specifičnom otelotvorenju, ćelija je ćelija čepića. Ćelija takođe može biti mišićna ćelija, naročito ćelija skeletnog mišića, ćelija pluća, ćelija pankreasa, ćelija jetre, ćelija bubrega, ćelija creva, ćelija krvi. U jednom specifičnom otelotvorenju, ćelija je humana ćelija čepića ili ćelija štapića. Smatra se da odabir odgovarajućeg domaćina može da obavi stručnjak za ovu oblast na osnovu ovde datih razmatranja. Poželjno, pomenuta ćelija domaćin je životinjska ćelija, a najpoželjnije humana ćelija. Ćelija može da eksprimira nukleotidnu sekvencu datu u sistemu virusnih vektora iz pronalaska.

[0084] Stručnjaku za ovu oblast su dobro poznati standardni postupci za inkorporaciju polinukleotida ili vektora u ćeliju domaćina, na primer, transfekcija, lipofekcija, elektroporacija, mikroinjekcija, virusna infekcija, termalni šok, transformacija nakon hemijske permeabilizacije membrane ili ćelijska fuzija. Sistem konstrukta ili vektora iz pronalaska takođe može da se uvede in vivo kao gola DNK koristeći postupke koji su poznati u struci, kao što su transfekcija, mikroinjekcija, elektroporacija, taloženje kalcijum fosfata, i putem biolističkih postupaka.

[0085] Kako se ovde koristi, termin „ćelija domaćin ili ćelija domaćin podvrgnuta genetskom inženjerstvu“ odnosi se na ćeliju domaćina koja je transdukovana, transformisana ili transficirana sistemom konstrukta ili sistemom virusnih vektora iz pronalaska

[0086] Kako se ovde koriste, termini „nukleinska kiselina“ i „polinukleotidna sekvenca“ i „konstrukt“ odnose se na dezoksiribonukleotidni ili ribonukleotidni polimer u jednolančanom ili dvolančanom obliku.

[0087] Predmetni pronalazak se takođe bavi sistemom konstrukta koji može da obuhvata regulatorne elemente koji su funkcionalni u predviđenoj ćeliji domaćinu u kojoj će konstrukt da se eksprimira. Osoba sa uobičajenim znanjem i veštinama u oblasti može da izabere regulatorne elemente za upotrebu u odgovarajućim ćelijama domaćinima, na primer, sisarskim ili humanim ćelijama domaćinima. Regulatorni elementi uključuju, na primer, promotere, sekvence za terminaciju transkripcije, sekvence za terminaciju translacije, pojačivače, signalne peptide, signale za razgradnju i poliadenilacione elemente. Konstrukt iz pronalaska može da sadrži promotersku sekvencu koja je operativno vezana za nukleotidnu sekvencu koja kodira željeni polipeptid.

[0088] Promoteri koji su razmatrani za upotrebu u predmetnom pronalasku uključuju, ali nisu ograničeni na, promotere nativnih gena, promoter citomegalovirusa (CMV) (KF853603.1, bp 149-735), promoter himernog CMV/kokošjeg beta-aktina (CBA) i skraćeni oblik promotera CBA (smCBA) (US8298818 i Light-Driven Cone Arrestin Translocation in Cones of Postnatal Guanylate Cyclase-1 Knockout Mouse Retina Treated with AAVGC1), promoter rodopsina (NG_009115, bp 4205-5010), promoter interfotoreceptorskog retinoid vezujućeg proteina (NG_029718.1, bp 4777-5011), promoter viteliformne makularne distrofije 2 (NG_009033.1, bp 4870-5470), receptorsku kinazu 1 vezanu sa humanim G proteinom specifičnu za PR (hGRK1; AY327580.1 bp1793-2087 ili bp 1793-1991) (Haire et al.2006; U.S. patent br.8,298,818). Međutim, može se koristiti bilo koji odgovarajući promoter koji je poznat u struci. U jednom specifičnom otelotvorenju, promoter je promoter CMV ili hGRK1. U jednom otelotvorenju, promoter je promoter specifičan za tkivo koji pokazuje selektivnu aktivnost u jednom tkivu ili u grupi tkiva, ali je manje aktivan ili je neaktivan u drugom tkivu. U jednom otelotvorenju, promoter je promoter specifičan za fotoreceptor. U daljem otelotvorenju, promoter je promoter specifičan za ćelije čepića i/ili specifičan za ćelije štapića.

[0089] Poželjni promoteri su promoteri CMV, GRK1, CBA i IRBP. Još poželjniji promoteri su hibridni promoteri koji kombinuju regulatorne elemente različitih promotera (na primer, himerni CBA promoter koji kombinuje pojačivač iz promotera CMV, promoter CBA i Sv40 himerni intron, ovde se naziva CBA hibridni promoter.

[0090] Promoteri takođe mogu biti ugrađeni u konstrukt koristeći standardne tehnike koje su poznate u struci. Višestruke kopije promotera ili višestruki promoteri mogu da se koriste u vektoru iz pronalaska. U jednom otelotvorenju, promoter može biti pozicioniran na približno istoj udaljenosti od mesta početka transkripcije kao od mesta početka transkripcije u svom prirodnom genetskom okruženju. Dozvoljene su određene varijacije ove udaljenosti bez značajnog smanjenja aktivnosti promotera. U sistemu iz pronalaska, mesto početka transkripcije je obično uključeno u 5' konstrukt ali ne i u 3' konstrukt. U daljem otelotvorenju,

2

mesto početka transkripcije može biti uključeno u 3' konstrukt ushodno od signala za razgradnju.

[0091] Konstrukt iz pronalaska može opciono da sadrži sekvencu za terminaciju transkripcije, sekvencu za terminaciju translacije, sekvencu signalnog peptida, interna ribozomska mesta ulaska (IRIS), elemente pojačivača i/ili posttranskripcione regulatorne elemente kao što je posttranskripcioni regulatorni element hepatitis virusa mrmota (WHV), (WPRE). Regioni za terminaciju transkripcije obično se mogu dobiti od 3' netranslatovanog regiona eukariotske ili virusne genske sekvence. Sekvence za terminaciju transkripcije mogu biti locirane nishodno od kodirajuće sekvence kako bi se omogućila efikasna terminacija. U sistemu iz pronalaska, mesto terminacije transkripcije je obično uključeno u 3' konstrukt, ali ne i u 5' konstrukt.

[0092] Sekvenca signalnog peptida je aminoterminalna sekvenca koja kodira informacije koje su odgovorne za relokaciju operativno vezanog polipeptida u široki raspon posttranslacionih ćelijskih destinacija, u rasponu od specifičnog odeljka organele do mesta delovanja proteina i vanćelijskog okruženja. Pojačivači su cis-delujući elementi koji povećavaju transkripciju gena i takođe mogu biti uključeni u vektor. Pojačivački elementi su poznati u struci, i uključuju, ali nisu ograničeni na, CaMV 35S pojačivački element, pojačivački element ranog promotera citomegalovirusa (CMV) i pojačivački element SV40. Sekvence DNK koje usmeravaju poliadenilaciju mRNK kodirane strukturnim genom takođe mogu biti uključene u vektor. Poželjno, u predmetnom pronalasku, kodirajuća sekvenca je podeljena na prvi i drugi fragment ili deo (5' krajnji deo i 3' krajnji deo) na prirodnom spoju egzon-egzon. Poželjno, svaki fragment ili deo kodirajuće sekvence ne bi trebalo da premaši veličinu od 60 kb, poželjno, svaki fragment ili deo kodirajuće sekvence ne bi trebalo da premaši veličinu od 50 Kb, 40 Kb, 30 Kb, 20 Kb, 10 Kb. Poželjno, svaki fragment ili deo kodirajuće sekvence može biti veličine oko 2 Kb, 2,5 Kb, 3 Kb, 3,5 Kb, 4 Kb, 4,5 Kb, 5 Kb, 5,5 Kb, 6 Kb, 6,5 Kb, 7 kb, 7,5 Kb, 8 Kb, 8,5 Kb, 9 Kb, 9,5 Kb ili manji.

[0093] Splajsozomski introni se često nalaze unutar sekvence eukariotskih gena koji kodiraju protein. U intronu su za spajanje potrebni donorsko mesto (5' kraj introna), mesto grananja (blizu 3' kraja introna) i akceptorsko mesto (3' kraj introna). Donorsko mesto za spajanje uključuje skoro nepromenljivu sekvencu GU na 5' kraju introna, unutar većeg, slabije očuvanog regiona. Akceptorsko mesto za spajanje na 3' kraju introna prekida intron sa skoro nepromenljivom sekvencom AG. Ushodno (u smeru ka 5') od AG nalazi se region sa velikim

2

sadržajem pirimidina (C i U) ili polipirimidinski trakt. Ushodno od polipirimidinskog trakta nalazi se tačka grananja, koja uključuje adeninski nukleotid. Stručnjak takođe može izabrati akceptorski signal za spajanje i donorski signal za spajanje od sekvenci koje su poznate u struci.

[0094] Signali koji posreduju u razgradnji proteina i koji nikada ranije nisu korišćeni u kontekstu sistema višestrukih virusa uključuju, ali nisu ograničeni na: kratke degrone kao što su CL1, CL2, CL6, CL9, CL10, CL11, CL12, CL15, CL16, SL17, C-terminalni destabilizujući peptid koji deli strukturne sličnosti sa pogrešno savijenim proteinima, te ga tako prepoznaje sistem za ubikvitinaciju, ubikvitin, čija fuzija na N-terminalu donorskog proteina posreduje u direktnoj razgradnji proteina i u razgradnji putem pravila N-kraja, N-terminalni PB29 degron koji je peptid dužine 9 aminokiselina koji se, slično kao CL1 degron, presavija u strukture koje su prepoznate od strane enzima puta ubikvitinacije, veštačke zaustavne kodone koji uzrokuju ranu terminaciju iRNK, ciljne sekvence mikroRNK (miR).

[0095] Kao što je poznato stručnjacima, mogu postojati brojne varijante sekvenci proteina koje se mogu naći u prirodi, pored onih varijanti koje stručnjak može stvoriti veštačkim putem u laboratoriji. Otkriće dalje uključuje nukleotidne sekvence koje kodiraju ovde otkrivene polipeptide. Stručnjaci sa znanjem o proteinima i aminokiselinskim sekvencama koje su ovde date mogu lako da konstruišu te nukleotidne sekvence. Kao što će biti jasno stručnjaku, degeneracija genetskog koda omogućava stručnjaku da konstruiše različite nukleotidne sekvence koje kodiraju određeni polipeptid ili protein. Odabir konkretne nukleotidne sekvence može da zavisi, na primer, od korišćenja kodona konkretnog ekspresionog sistema ili ćelije domaćina. Na primer, neprirodne aminokiseline mogu da supstituišu aminokiseline polipeptida sve dok polipeptid koji ima supstituisane aminokiseline zadržava suštinski istu aktivnost kao polipeptid u kome aminokiseline nisu supstituisane. Primeri za neprirodne aminokiseline uključuju, ali nisu ograničeni na, ornitin, citrulin, hidroksiprolin, homoserin, fenilglicin, taurin, jodtirozin, 2,4-diaminobuternu kiselinu, aamino izobuternu kiselinu, 4-aminobuternu kiselinu, 2-amino buternu kiselinu, γ-amino buternu kiselinu, ε-amino heksansku kiselinu, 6-amino heksansku kiselinu, 2-amino izobuternu kiselinu, 3-amino propionsku kiselinu, norleucin, norvalin, sarkozin, homocitrulin, cisteinsku kiselinu, τ-butilglicin, τ-butilalanin, fenilglicin, cikloheksilalanin, β-alanin, fluoraminokiseline, konstruisane aminokiseline kao što su β-metil aminokiseline, C-metil aminokiseline, N-metil aminokiseline, i uopšteno analozi aminokiselina. Neprirodne

2

aminokiseline takođe uključuju aminokiseline koje imaju derivatizovane bočne grupe.

Nadalje, svaka aminokiselina u proteinu može biti D (dekstrorotatornog) oblika ili L (levorotatornog) oblika. Aminokiseline generalno mogu da se kategorizuju u sledeće klase: nepolarne, nenaelektrisane polarne, bazne i kisele. Konzervativne supstitucije kod kojih se u polipeptidu aminokiselina jedne klase zamenjuje drugom aminokiselinom iste klase su ovde otkrivene sve dok polipeptid u kome je izvršena supstitucija i dalje zadržava suštinski istu biološku aktivnost kao polipeptid u kome nema supstitucije. Tabela 1 daje spisak primera aminokiselina za svaku klasu.

Polinukleotidi koji su ovde opisani takođe mogu da se definišu u pogledu konkretnijeg identiteta i/ili raspona sličnosti sa ovde datim primerima. Identičnost sekvence će obično biti veća od 60%, poželjno veća od 75%, poželjnije veća od 80%, još poželjnije veća od 90%, i može biti veća od 95%. Identičnost i/ili sličnost sekvence može biti 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91 , 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, ili 99% ili veća u poređenju sa ovde datim primerom sekvence. Ako nije drugačije naznačeno, kako se ovde koristi, procenat identičnosti sekvence i/ili sličnost između dve sekvence može da se utvrdi koristeći algoritam čiji su autori Karlin i Altschul (1990), izmenjen kao u Karlin i Altschul (1993). Takav algoritam je obuhvaćen programima NBLAST i XBLAST autora Altschul et al. (1990). BLAST pretrage mogu da se obave pomoću programa NBLAST, rezultat = 100, dužina reči = 12, kako bi se dobile sekvence sa željenim procentom identičnosti sekvence. Kako bi se dobila poravnanja sa prazninama za svrhe poređenja, Gapped BLAST može da se koristi kako je opisano u Altschul et al. (1997). Kada se koriste programi BLAST i Gapped BLAST, mogu se koristiti podrazumevani parametri datih programa (NBLAST i XBLAST). Vidite veb stranicu NCBI/N1H.

2

[0096] Predmetni pronalazak se takođe bavi farmaceutskim kompozicijama koje sadrže sistem vektora ili sistem virusnih vektora ili ćelije domaćine iz pronalaska, opciono u kombinaciji sa farmaceutski prihvatljivim nosačem, razblaživačem, ekscipijensom ili adjuvansom. Odabir farmaceutskog nosača, ekscipijensa ili razblaživača može da se izvrši imajući u vidu nameravani način primene i standardnu farmaceutsku praksu. Farmaceutska kompozicija može da sadrži, ili da sadrži kao dodatak nosaču, ekscipijensu ili razblaživaču bilo koje odgovarajuće vezivače, lubrikanse, suspendujuće agense, premaze, solubilizatore i druge noseće agense koji mogu pospešiti ili povećati prolaz virusa na ciljno mesto (kao što je, na primer, lipidni sistem za isporuku). Konstrukt ili vektor mogu da se primenjuju in vivo ili ex vivo.

[0097] Farmaceutske kompozicije prilagođene za topikalnu ili parenteralnu primenu, koje sadrže određenu količinu jedinjenja, čine poželjno otelotvorenje pronalaska. Za parenteralnu primenu, kompozicije najbolje mogu da se koriste u obliku sterilnog vodenog rastvora koji može da sadrži druge supstance, na primer dovoljno soli ili monosaharida da rastvor učine izotoničnim sa krvlju. Farmaceutske kompozicije iz predmetnog pronalaska mogu da se isporuče u mrežnjaču poželjno putem subretinalne injekcije, ili takođe mogu da se pripreme u obliku injektabilne suspenzije, losiona za oči ili očne masti koja može da se isporuči u mrežnjaču neinvazivnim postupkom.

[0098] Doza koja se primenjuje na pacijentu, naročito na čoveku, u kontekstu predmetnog pronalaska treba da bude dovoljna za postizanje terapeutskog odgovora kod pacijenta u razumnom vremenskom periodu, bez smrtonosne toksičnosti, i poželjno ne izaziva više od prihvatljivog nivoa neželjenih dejstava ili morbiditeta. Stručnjaku će biti jasno da doza zavisi od različitih faktora, uključujući stanje (zdravlje) ispitanika, telesnu težinu ispitanika, vrstu pratećeg lečenja, ako postoji, učestalost lečenja, terapeutski odnos, kao i težinu i stadijum patološkog stanja.

[0099] Postupci koji su ovde opisani mogu da se koriste na ljudima i drugim životinjama. Kako se ovde koriste, termini „pacijent“ i „ispitanik“ koriste se kao sinonimi, i obuhvataju ljude i nehumane vrste. Slično tome, in vitro postupci mogu da se vrše na ćelijama kao što su ćelije čoveka i nehumanih vrsta.

2

[0100] Otkriće se takođe bavi kompletima koji sadrže sistem konstrukta ili sistem vektora ili ćelije domaćina iz pronalaska u jednoj ili više ambalaža. Kompleti opciono mogu da sadrže farmaceutski prihvatljive nosače i/ili razblaživače. U jednom otelotvorenju, komplet sadrži jednu ili više drugih komponenata, dodataka ili adjuvansa, kao što je ovde opisano. U jednom otelotvorenju, komplet sadrži uputstvo ili pakovni materijal koji opisuje kako se primenjuje sistem vektora iz kompleta. Ambalaža kompleta može biti od bilo kog odgovarajućeg materijala, npr. stakla, plastike, metala, itd., i bilo koje odgovarajuće veličine, oblika ili sastava. U jednom otelotvorenju, sistem konstrukta ili sistem virusnih vektora ili ćelije domaćini iz pronalaska dati su u kompletu kao čvrsta supstanca. U drugom otelotvorenju, sistem konstrukta ili sistem virusnih vektora ili ćelije domaćini iz pronalaska dati su u kompletu kao tečnost ili rastvor. U jednom otelotvorenju, komplet sadrži ampulu ili špric koji sadrže sistem konstrukta ili sistem virusnih vektora ili ćelije domaćine iz pronalaska u obliku tečnosti ili rastvora.

[0101] Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju za lečenje pojedinca genskom terapijom, pri čemu kompozicija sadrži terapeutski delotvornu količinu sistema vektora ili sistema virusnih vektora ili ćelija domaćina iz predmetnog pronalaska koja sadrži jedan ili više terapeutskih i/ili dijagnostičkih transgena koji mogu da se isporuče ili virusnih čestica koje oni proizvode ili su dobijene od njih. Farmaceutska kompozicija može biti za primenu na ljudima ili na životinjama. Klinički lekar sa uobičajenim znanjem i veštinama će obično odrediti stvarnu dozu koja će biti najpogodnija za pojedinačnog ispitanika i ona će se menjati u zavisnosti od starosti, težine i odgovora konkretnog pojedinca i načina primene. Očekuje se da će kod ljudi biti delotvoran dozni raspon od 1x10e10 do 1×10e15 genomskih kopija svakog vektora/kg, poželjno od 1x10e11 do 1x10e13 genomskih kopija svakog vektora/kg. Očekuje se da će za očnu primenu biti delotvoran dozni raspon od 1x10e10 do 1x10e15 genomskih kopija svakog vektora/oku, poželjno od 1x10e10 do 1x10e13.

[0102] Klinički lekar sa uobičajenim znanjem i veštinama može da odredi dozne režime i delotvorne količine koje će se primenjivati. Primena može biti u obliku pojedinačne doze ili više doza. Opšti postupci za obavljanje genske terapije koristeći polinukleotide, ekspresione konstrukte i vektore poznati su u struci (vidite, na primer, Gene Therapy: Principles and Applications, Springer Verlag 1999; i U.S. patente br.6,461 ,606; 6,204,251 i 6,106,826).2. otkriće se takođe bavi postupcima za ekspresiju izabranog polipeptida u ćeliji. U jednom otelotvorenju, postupak obuhvata inkorporisanje u ćeliji sistema vektora iz pronalaska koji sadrži polinukleotidne sekvence koje kodiraju izabrani polipeptid i eksprimiraju polinukleotidne sekvence u ćeliji. Izabrani polipeptid može biti polipeptid koji je heterolog sa ćelijom. U specifičnom otelotvorenju, ćelija je ćelija sisara. U jednom otelotvorenju, ćelija je ćelija čoveka. U jednom otelotvorenju, ćelija je fotoreceptorska ćelija ili ćelija RPE. Ćelija takođe može biti mišićna ćelija, naročito ćelija skeletnog mišića, ćelija pluća, ćelija pankreasa, ćelija jetre, ćelija bubrega, ćelija creva, ćelija krvi. U jednom specifičnom otelotvorenju, ćelija je ćelija čepića ili ćelija štapića. U jednom specifičnom otelotvorenju, ćelija je humana ćelija čepića ili ćelija štapića.

SEKVENCE

[0103]

AP1 (SEQ ID No.24)

AP2 (SEQ ID No.25)

AK seqA (SEQ ID No.22)

AK seqB (SEQ ID No.23)

AP (SEQ ID No.26)

Levo ITR2 (SEQ ID No.29)

Desno ITR2 (SEQ ID No.30)

Levo ITR5 (SEQ ID No.31)

Desno ITR5 (SEQ ID No.32)

CMV CMV pojačivač (SEQ ID No.33)

CMV promoter (SEQ ID No.34)

Himerni intron (SV40 intron) (SEQ ID No.35)

hGRK1 promoter (SEQ ID No.36)

CBA hibridni promoter

CMV pojačivač (SEQ ID No.37)

CBA promoter (SEQ ID No.38)

IRBP (SEQ ID No.39)

Donorski signal za spajanje (SEQ ID No.27)

miR-let 7b signal za razgradnju (SEQ ID No.40)

4xmiR-let 7b signal za razgradnju (SEQ ID No.41)

miR-26a signal za razgradnju (SEQ ID No.13)

1

4xmiR-26a signal za razgradnju (SEQ ID No.18)

miR-204 signal za razgradnju (SEQ ID No.11)

miR-124 signal za razgradnju (SEQ ID No.12)

3xmiR-204+3xmiR-124 signal za razgradnju (SEQ ID No.17) CL1 signal za razgradnju (degron)

Nukleotidna sekvenca: (SEQ ID No.16)

Aminokiselinska sekvenca: (SEQ ID No.1)

CL2 signal za razgradnju (degron)

Nukleotidna sekvenca: (SEQ ID No.42)

Aminokiselinska sekvenca: (SEQ ID No.2)

CL6 signal za razgradnju (degron)

Nukleotidna sekvenca: (SEQ ID No.43)

Aminokiselinska sekvenca: (SEQ ID No.3)

CL9 signal za razgradnju (degron)

Nukleotidna sekvenca: (SEQ ID No.44)

Aminokiselinska sekvenca: (SEQ ID No.4)

CL10 signal za razgradnju (degron)

Nukleotidna sekvenca: (SEQ ID No.45)

Aminokiselinska sekvenca: (SEQ ID No.5)

CL11 signal za razgradnju (degron)

Nukleotidna sekvenca: (SEQ ID No.46)

Aminokiselinska sekvenca: (SEQ ID No.6)

CL12 signal za razgradnju (degron)

Nukleotidna sekvenca: (SEQ ID No.47)

Aminokiselinska sekvenca: (SEQ ID No.7)

CL15 signal za razgradnju (degron)

Nukleotidna sekvenca: (SEQ ID No.48)

Aminokiselinska sekvenca: (SEQ ID No.8)

CL16 signal za razgradnju (degron)

Nukleotidna sekvenca: (SEQ ID No.49)

Aminokiselinska sekvenca: (SEQ ID No.9)

SL17 signal za razgradnju (degron)

Nukleotidna sekvenca: (SEQ ID No.50)

Aminokiselinska sekvenca: (SEQ ID No.10)

2

PB29 signal za razgradnju (degron)

Nukleotidna sekvenca: (SEQ ID No.19)

Aminokiselinska sekvenca: (SEQ ID No.15)

Kratki PB29 signal za razgradnju (degron)

Nukleotidna sekvenca: (SEQ ID No.20)

Aminokiselinska sekvenca: (SEQ ID No.14)

3x PB29 signal za razgradnju (degron) (SEQ ID No.21)

Veštački zaustavni kodoni (SEQ ID No.51)

Akceptorski signal za spajanje (SEQ ID No.28)

SV40 Poly A (SEQ ID No.52)

ABCA4 5' (SEQ ID No.53)

hGRK1-5' ABCA4+AK+CL1 sekvenca kompletne dužine (SEQ ID No.54)

�

[0104] Predmetni pronalazak će sada biti ilustrovan putem neograničavajućih primera vezanih za sledeće crteže.

[0105] Slika 1. Šematski prikaz strategija sa višestrukim vektorima iz primera iz predmetnog pronalaska. ITR: invertovana terminalna ponavljanja; Prom: promoter; CDS, kodirajuća sekvenca; SD, donorski signal za spajanje; RR: rekombinogeni regioni, AK ili od alkalne

fosfataze (AP1, AP2 i AP); Deg Sig; signali za razgradnju (vidite Tabelu 2); SA, akceptorski signal za spajanje; pA, signal za poliadenilaciju. A i C: strategija sa (dvostrukim i trostrukim) hibridnim vektorom, uključujući trans-spajanje i rekombinogene regione, prema poželjnom otelotvorenju pronalaska B i D: strategija sa (dvostrukim ili trostrukim) preklapajućim vektorima. Za dodatne primere, vidite sl.12-14.

[0106] Slika 2. Efikasna ekspresija proteina ABCA4 koristeći AK, AP1 i AP2 regione homologije (a, c) Reprezentativna vestern blot analiza (a) HEK293 ćelija (50 mikrograma/traci) inficiranih dvojnim AAV2/2 (AAV serotip 2 sa homolognim ITR iz AAV2) vektorima ili (c) C57BL/6 mrežnjača (lizati celih mrežnjača) injektovanih dvojnim AAV2/8 (AAV serotip 8 sa homolognim ITR iz AAV2) vektorima koji kodiraju ABCA4. Strelice pokazuju proteine kompletne dužine, skala molekulske mase je prikazana levo. (b) Kvantifikacija traka proteina ABCA4 iz vestern blot analize pod (a). Intenzitet traka ABCA4 pod (a) je podeljen intenzitetom traka filamina A. Histogrami pokazuju ekspresiju proteina kao procenat u odnosu na dvojne AAV hibridne AK vektore, srednja vrednost je prikazana iznad odgovarajućeg stupca. Vrednosti su prikazane kao: srednja vrednost ± s.e.m.

(standardna greška srednje vrednosti).<∗>pANOVA < 0,05; zvezdica ukazuje na značajne razlike sa AK, AP1 i AP2. (a-c) AK: ćelije koje su inficirane ili oči u koje su injektovani dvojni AAV hibridni AK vektori; AP1: ćelije koje su inficirane ili oči u koje su injektovani dvojni AAV hibridni AP1 vektori; AP2: ćelije koje su inficirane ili oči u koje su injektovani dvojni AAV hibridni AP2 vektori; AP: ćelije koje su inficirane ili oči u koje su injektovani AAV hibridni AP vektori; neg: ćelije koje su inficirane ili oči u koje su injektovani 3'-poluvektori ili vektori koji eksprimiraju EGFP, kao negativna kontrola. α-3xflag: vestern blot sa anti-3xflag antitelima; α-filamin A, vestern blot sa anti-filamin A antitelima, korišćen kao kontrola opterećenja; α-disferlin, vestern blot sa anti-disferlin antitelima, korišćen kao kontrola opterećenja.

[0107] Slika 3. Genom i transdukciona efikasnost vektora sa heterolognim ITR2 i ITR5. (a) Alkalna sautern blot analiza DNK ekstrahovane iz 3 × 1010 GC 5'- i 3'-ABCA4-poluvektora sa homolognim (2:2) ili heterolognim (5:2 ili 2:5) ITR, i kontrolnog AAV preparata sa homolognim ITR2 (CTRL). Očekivana veličina svakog genoma prikazana je ispod svake trake. Marker molekulske mase (kb) prikazan je levo 5': 5'-poluvektor; 3': 3'-poluvektor, (b-d) Reprezentativna vestern blot analiza i kvantifikacija HEK293 ćelija inficiranih dvojnim AAV2/2 hibridnim ABCA4 vektorima sa heterolognim ITR2 i ITR5 ili homolognim ITR2 sa m.o.i. na bazi titra ITR2 (b i c) ili transgena (b i d). Vestern blot snimci (b) reprezentativni su za n = 3 nezavisna eksperimenta; kvantifikacije (c i d) su iz n = 3 nezavisna eksperimenta. (b) Gornja strelica ukazuje na ABCA4 protein kompletne dužine, donja strelica ukazuje na skraćene proteine; skala molekulske mase je prikazana levo. Mikrogrami nanetih proteina su prikazani ispod slike. α-3×flag: vestern blot sa anti-3×flag antitelima; α-filamin A: vestern blot sa anti-filamin A antitelima, koristi se kao kontrola opterećenja. (c i d) Kvantifikacija traka ABCA4 kompletnih i skraćenih proteina iz vestern blot analize ćelija koje su inficirane dozom vektora na bazi titra ITR2 (c) ili transgena (d). Histogrami pokazuju intenzitet traka kompletnog i skraćenog proteina podeljen intenzitetom traka filamina A, ili intenzitet traka proteina kompletne dužine podeljen intenzitetom traka skraćenog proteina u odgovarajućoj koloni. Reprezentativna vestern blot analiza i kvantifikacija HEK293 ćelija inficiranih dvojnim AAV2 (AAV serotip 2) hibridnim vektorima sa heterolognim ITR2 i ITR5 ili homolognim ITR2 koji kodiraju MYO7A (e, f). Vestern blot snimci (e) predstavljaju i kvantifikacije (f) su iz n = 3 nezavisna eksperimenta. (e) Gornja strelica ukazuje na proteine kompletne dužine, donja strelica ukazuje na skraćene proteine; skala molekulske mase je prikazana levo. Mikrogrami konvertovanih proteina su prikazani ispod slike. (f) Kvantifikacija traka proteina MYO7A iz vestern blot analize.

[0108] Srednja vrednost je prikazana iznad odgovarajuće trake. Vrednosti su prikazane kao: srednja vrednost ± s.e.m.<∗>p Studentovog t testa ≤ 0,05.

[0109] 2:22:2: ćelija inficiranih dvojnim AAV hibridnim vektorima sa homolognim ITR iz AAV2; 5:22:5: ćelija inficiranih dvojnim AAV hibridnim vektorima sa heterolognim ITR iz AAV2 i AAV5; neg: ćelije inficirane vektorima koji eksprimiraju EGFP, kao negativna kontrola.

[0110] Slika 4. Inkluzija ciljnih mesta miR u 5'-poluvektore ne dovodi do značajnog smanjenja skraćenih proteinskih proizvoda

Reprezentativna vestern blot analiza HEK293 ćelija inficiranih dvojnim AAV2/2 (AAV serotip 2) hibridnim vektorima koji kodiraju ABCA4, koje sadrže ciljna mesta miR za miR-let7b (levi panel), miR-204+124 (centralni panel) ili miR-26a (desni panel). Gornja strelica ukazuje na ABCA4 proteine kompletne dužine, donja strelica ukazuje na skraćene proteine; skala molekulske mase je prikazana levo. Mikrogrami konvertovanih proteina su prikazani ispod slike.5'+3': ćelije koinficirane 5'-poluvektorima bez ciljnih mesta miR i 3'poluvektorima; 5'+3'+mešavina: ćelije koinficirane 5'-poluvektorima bez ciljnih mesta miR i 3'-poluvektorima u prisustvu mešavine imitatora miR; 5'mir+3': ćelije koinficirane 5'-poluvektorima koji sadrže ciljna mesta miR i 3'-poluvektorima; 5'mir+3'+ mešavina: ćelije koinficirane 5'-poluvektorima koji sadrže ciljna mesta miR i 3'-poluvektorima u prisustvu mešavine imitatora miR; 5'mir+3'+imitator let7b: ćelije koinficirane 5'-poluvektorima koji sadrže ciljna mesta miR i 3'-poluvektorima u prisustvu imitatora mir-let7b; 5': ćelije inficirane 5'-poluvektorima bez ciljnih mesta miR; 5'mir: ćelije inficirane 5'-poluvektorima koji sadrže ciljna mesta miR u prisustvu mešavine imitatora miR; 5'mir+imitator let7b: ćelije inficirane 5'-poluvektorima koji sadrže ciljna mesta miR u prisustvu imitatora mir-let7b; neg: kontrolne ćelije inficirane 3'-poluvektorima ili vektorima koji eksprimiraju EGFP;

5'mir+3'imitator 204+124: ćelije koinficirane 5'-poluvektorima koji sadrže ciljna mesta miR i 3'-poluvektorima u prisustvu imitatora mir-204 i 124; 5'imitator 204+124: ćelije inficirane 5'-polu vektorima koji sadrže ciljna mesta miR u prisustvu imitatora mir-204 i 124;

5'mir+3'+imitator 26a: ćelije koinficirane 5'-poluvektorima koji sadrže ciljna mesta miR i 3'-poluvektorima u prisustvu imitatora mir-26a; 5'mir+imitator 26a: ćelije inficirane 5'-poluvektorima koji sadrže ciljna mesta miR u prisustvu imitatora mir-26a. α-3xflag: vestern blot sa anti-3xflag antitelima; α-filamin A, vestern blot sa anti-filamin A antitelima, koristi se kao kontrola opterećenja

[0111] Pomešana sekvenca odgovara sekvenci različite miRNK, na primer, u eksperimentu sa imitatorom mir-let7b, pomešana sekvenca je bila sekvenca miR26a.

[0112] Slika 5. Inkluzija signala za razgradnju CL1 u 5'-poluvektore dovodi do značajnog smanjenja proizvoda skraćenih proteina

Reprezentativna vestern blot analiza bilo (a) HEK293 ćelija inficiranih dvojnim AAV2/2 (AAV serotip 2, sa homolognim ITR iz AAV2) hibridnim vektorima ili (b) svinjskih očiju (RPE+mrežnjača) mesec dana nakon injekcije dvojnih AAV2/8 (AAV serotip 8, sa homolognim ITR iz AAV2) hibridnih vektora koji kodiraju ABCA4 i sadrže ili ne sadrže signal za razgradnju. Gornja strelica ukazuje na ABCA4 protein kompletne dužine, donja strelica ukazuje na skraćeni protein iz 5'-poluvektora; skala molekulske mase je prikazana levo. Mikrogrami konvertovanih proteina su prikazani ispod svake slike.5'+3': ćelije koinficirane ili oči koinjektovane 5'-poluvektorima bez CL1 i 3'-poluvektorima; 5'-CL1+3': ćelije koinficirane ili oči koinjektovane 5'-poluvektorima koji sadrže CL1 i 3'-poluvektorima; 5': ćelije inficirane 5'-poluvektorima bez CL1; 5'-CL1: ćelije inficirane 5'-poluvektorima koji

4

sadrže CL1; neg: kontrolne ćelije inficirane ili kontrolne oči injektovane 3'-poluvektorima ili vektorima koji eksprimiraju EGFP, kao negativna kontrola; α-3xflag: vestern blot sa anti-3xflag antitelima; α-filamin A: vestern blot sa anti-filamin A antitelima, koristi se kao kontrola opterećenja; α-disferlin: Vestern blot sa anti-disferlin antitelima, koristi se kao kontrola opterećenja, (a) vestern blot snimak je reprezentativan za n = 3 nezavisna eksperimenta, (b) vestern blot snimak je reprezentativan za n = 5 očiju u koje su injektovani 5'+3' vektori, n=2 oka u koje su injektovani 5'-CL1+3' vektori i n=5 očiju u koje su injektovani 3'-poluvektori ili vektori koji eksprimiraju EGFP kao negativna kontrola.

[0113] Slika 6. Inkluzija signala za razgradnju u 3'-poluvektore dovodi do blagog smanjenja proizvoda skraćenih proteina

Reprezentativna vestern blot analiza HEK239 ćelija koje su inficirane dvojnim AAV2/2 hibridnim vektorima koji kodiraju ABCA4 i sadrže različite signale za razgradnju. Gornja strelica ukazuje na ABCA4 protein kompletne dužine, donja strelica ukazuje na skraćene proteinske proizvode; skala molekulske mase je prikazana levo. Mikrogrami konvertovanih proteina su prikazani ispod svake slike.5'+3': ćelije koinficirane 5'- i 3'-poluvektorima bez signala za razgradnju; 5': ćelije inficirane 5'-poluvektorima; 3' (bez oznake): ćelije inficirane 3'-poluvektorima bez signala za razgradnju; stop: ćelije inficirane 3'-poluvektorima koji sadrže zaustavne kodone; PB29: ćelije inficirane 3'-poluvektorima koji sadrže PB29 signal za razgradnju; 3xPB29: ćelije inficirane 3'-poluvektorima koji sadrže 3 tandemske kopije PB29 signala za razgradnju; Ubikvitin: ćelije inficirane 3'-poluvektorima koje sadrže signal za razgradnju ubikvitina. α-3xflag: vestern blot sa anti-3xflag antitelima; α-filamin A: vestern blot sa anti-filamin A antitelima, koristi se kao kontrola opterećenja.

[0114] Slika 7: Šematski prikaz AP, AP1 i AP2 regiona homologosti dobijenih od ALPP (placentalna alkalna fosfataza) koji se koriste u poželjnim otelotvorenjima predmetnog pronalaska. CDS: kodirajuća sekvenca

[0115] Slika 8: Subretinalna isporuka poboljšanih dvojnih AAV vektora dovodi do ekspresije ABCA4 u mišjim fotoreceptorima i značajnog smanjenja taloženja lipofuscina u Abca4-/-mrežnjači miša. (a) Reprezentativna vestern blot analiza C57BL/6 mrežnjača (lizati celih mrežnjača) u koje su injektovani dvojni AAV2/8 hibridni ABCA4 vektori (5' 3') ili negativne kontrole (neg). Strelica pokazuju proteine kompletne dužine, skala molekulske mase je prikazana levo. α-3×flag: vestern blot sa anti-3×flag antitelima; α-disferlin: vestern blot sa anti-disferlin antitelima, koristi se kao kontrola opterećenja. (b i c) Reprezentativne slike (b) i kvantifikacija (c) autofluorescencije lipofuscina (crveni signal) u mrežnjačama (RPE ili RPE OS) pigmentiranih Abca4+/- miševa kojima nije injektovan ili je injektovan AAV kao kontrola (Abca4+/-) ili pigmentiranih Abca4-/- miševa kojima nisu injektovani (Abca4-/-) ili su injektovani dvojni AAV hibridni ABCA4 vektori (Abca4-/- AAV5'+3'). (b) Skala za razmeru (75 µm) prikazana je na slici. RPE: retinalni pigmentni epitel; ONL: spoljašnji nuklearni sloj; INL: unutrašnji nuklearni sloj; GCL: sloj ganglionskih ćelija.

Strelice označavaju signal lipofuscina. (c) Srednja vrednost autofluorescencije lipofuscina na temporalnoj strani tri sekcije za svaki uzorak. Srednja vrednost autofluorescencije za svaku sekciju je normalizovana za dužinu postojećeg RPE. Srednja vrednost je prikazana iznad odgovarajuće trake. Vrednosti su prikazane kao srednja vrednost ± s.e.m.<∗∗∗>p ANOVA < 0,0001. n = 4 oka za svaku grupu. (d) Srednji broj RPE granula lipofuscina je izbrojan u najmanje 40 polja (25 µm2)/mrežnjači albino Abca4+/+ miševa koji nisu primili injekciju(Abca4+/+ bez inj.) ili su primili injekciju PBS (Abca4+/+ PBS), i albino Abca4-/-miševa koji su primili injekciju PBS (Abca4-/- PBS) ili dvojnih AAV hibridnih ABCA4 vektora (Abca4-/- AAV5'+3'). Srednja vrednost je prikazana iznad odgovarajuće trake.

Vrednosti su prikazane kao srednja vrednost ± s.e.m.<∗>pANOVA ≤ 0,05;<∗∗>pANOVA ≤0,01. n = 4 oka Abca4+/+ bez inj.; n = 4 oka Abca4+/+ PBS; n = 3 oka Abca4-/- PBS; n = 3 oka Abca4-/- AAV5'+ 3'.

[0116] Slika 9: Slična električna aktivnost između negativne kontrole ili očiju miševa i svinja tretiranih poboljšanim dvojnim AAV. (a) Srednje amplitude a-talasa (levi panel) i b-talasa (desni panel) C57BL/6 miševa 1 mesec nakon injekcije dvojnih AAV hibridnih ABCA4 vektora (AAV5'+ 3') ili negativnih kontrola (tj. AAV vektori ili PBS za negativnu kontrolu; neg). Podaci su prikazani kao srednja vrednost ± s.e.m.; n pokazuje broj analiziranih očiju. (b) Srednje amplitude b-talasa (µV) u ERG testovima skotopije, maksimalnog odgovora, fotopije i treperenja kod svinja 1 mesec posle injekcije dvojnih AAV hibridnih ABCA4 vektora (AAV5'+ 3') ili PBS. n = 5 očiju u koje su injektovani dvojni AAV hibridni ABCA4 vektori; n = 4 u koje je injektovan PBS;<∗>: n = 2.

[0117] Slika 10: Ekspresija EGFP proteina iz IRBP i GRK1 promotera u svinjskim fotoreceptorima štapićima i čepićima. Tri meseca starim velikim belim svinjama / miševima subretinalno je injektovano 1×10<11>GC/oku AAV2/8-IRBP- ili AAV2/8-GRK1-EGFP vektora. Kriosekcije mrežnjače su dobijene 4 nedelje nakon injekcije, i EGFP je analiziran koristeći fluorescentnu mikroskopiju. (a-b) Reprezentativne slike (a) i kvantifikacija (b) intenziteta fluorescencije u PR sloju. Intenzitet fluorescencije je kvantifikovan za svaku grupu životinja na kriosekcijama (šest različitih polja/oku; uvećanje 20x), (c-d) Reprezentativne slike (c) i kvantifikacija (d) efikasnosti transdukcije čepića. Efikasnost transdukcije čepića je ispitana na kriosekcijama (šest različitih polja/oku; uvećanje 63x) koji su imunološki obojeni anti-LUMIf-hCAR antitelom, i izražena je kao broj čepića koji eksprimiraju EGFP (EGFP+/CAR+) po ukupnom broju čepića (CAR+) u svakom polju. (a, c) Skala za razmeru je prikazana na slici. (b-d) n=3 oka u koja su injektovani AAV2/8-IRBP-EGFP vektori; n=3 oka u koja su injektovani AAV2/8-GRK1-EGFP vektori. Vrednosti su prikazane kao srednja vrednost ± s.e.m. Koristeći Studentov t test, nisu uočene značajne razlike. OS: spoljašnji segmenti; ONL: spoljašnji nuklearni sloj; EGFP: nativna fluorescencija EGFP; CAR; bojenje arestinom na čepiće; DAPI: bojenje 4',6'-diamidino-2-fenilindolom. Strelica pokazuje transdukovane čepiće.

[0118] Slika 11: Subretinalna isporuka poboljšanih dvojnih AAV vektora dovodi do značajnog smanjenja taloženja lipofuscina u Abca4-/- mrežnjači miša. Montaža slika temporalne (injektovane) strane retinalnih preseka koja pokazuje autofluorescenciju lipofuscina (crveni signal) u mrežnjačama (RPE ili RPE+OS) pigmentiranih Abca4+/- miševa kojima nije injektovan ili je injektovan AAV kao kontrola (Abca4+/-) ili pigmentiranih Abca4-/- miševa kojima nisu injektovani (Abca4-/-) ili su injektovani dvojni AAV hibridni ABCA4 vektori (Abca4-/- AAV5'+3'). n= 4 oka za svaku grupu. T: temporalna strana; N: nazalna strana.

[0119] Slika 12: Slična električna aktivnost između negativne kontrole ili očiju miševa i svinja tretiranih poboljšanim dvojnim AAV. (a) Reprezentativni ERG tragovi C57BL/6 miševa jedan mesec nakon injekcije dvojnih AAV hibridnih ABCA4 vektora (AAV5'+3') ili negativnih kontrola (tj. AAV vektori ili PBS za negativnu kontrolu; neg). (b) Reprezentativni tragovi u ERG testovima skotopije, maksimalnog odgovora, fotopije i treperenja kod svinja jedan mesec nakon injekcije dvojnih AAV hibridnih ABCA4 vektora (AAV5'+3') ili PBS.

[0120] Slika 13. Šematski prikaz strategija sistema vektora, u skladu sa primerima iz pronalaska. (A) Šematski prikaz sistema vektora koji se sastoji od dva vektora, u skladu sa poželjnim otelotvorenjima pronalaska: prvi vektor sadrži prvi deo kodirajuće sekvence

4

(CDS1 deo), a drugi vektor sadrži drugi deo (CDS2 deo) kodirajuće sekvence. (A1) sekvence za rekonstituciju sistema vektora sastoje se od preklapajućih krajeva delova kodirajuće sekvence. (A2) sekvence za rekonstituciju prvog i drugog vektora sastoje se od donorske, odnosno akceptorske sekvence za spajanje. (A3) svaka sekvenca za rekonstituciju sadrži donor/akceptor za spajanje, raspoređene kao u A2 i dalje sadrži rekombinogeni region. Signal za razgradnju je sadržan u najmanje jednom vektoru. Slika za svaki vektor prikazuje sve moguće pozicije jednog ili više signala za razgradnju u sistemu vektora, u skladu sa poželjnim neograničavajućim otelotvorenjima pronalaska.

(B) Šematski prikaz sistema vektora koji se sastoji od tri vektora, u skladu sa poželjnim otelotvorenjima pronalaska: prvi vektor sadrži prvi deo (CDS1 deo) kodirajuće sekvence, drugi vektor sadrži drugi deo (CDS2 deo) kodirajuće sekvence, a treći vektor sadrži treći deo (CDS3 deo) kodirajuće sekvence. (B1) sekvence za rekonstituciju sistema vektora sastoje se od preklapajućih krajeva delova kodirajuće sekvence (3' kraj CDS1 se preklapa sa 5' krajem CDS2; 3' kraj CDS2 se preklapa sa 5' krajem CDS3). (B2) sekvenca za rekonstituciju prvog vektora sadržana je u donoru za spajanje, sekvenca za rekonstituciju prvog vektora sadržana je u donoru za spajanje; drugi vektor sadrži prvu sekvencu za rekonstituciju na 5' kraju CDS2 i drugu sekvencu za rekonstituciju na 3' kraju CDS2, prva sekvencu za rekonstituciju je akceptor za spajanje, a druga je donor za spajanje; sekvenca za rekonstituciju trećeg vektora sadržana je u akceptoru za spajanje. (B3) svaka sekvenca za rekonstituciju sadrži donor/akceptor za spajanje, raspoređene kao u B2 i dalje sadrži rekombinogeni region. Signal za razgradnju je sadržan u najmanje jednom vektoru. Slika za svaki vektor prikazuje sve moguće pozicije jednog ili više signala za razgradnju u sistemu vektora, u skladu sa poželjnim neograničavajućim otelotvorenjima pronalaska.

[0121] CDS, kodirajuća sekvenca; SD, donorski signal za spajanje; RR: rekombinogeni regioni; Deg Sig; signali za razgradnju (vidite Tabelu 2); SA, akceptorski signal za spajanje.

[0122] Slika 14. Šematski prikaz strategija na bazi višestrukih vektora za transdukciju velikih gena iz prethodnog stanja tehnike. CDS: kodirajuća sekvenca; pA: signal za poliadenilaciju; SD: donorski signal za spajanje; SA: akceptorski signal za spajanje; AP: rekombinogeni region alkalne fosfataze; AK: rekombinogeni region F1 faga. Isprekidane linije prikazuju spajanje do koga dolazi između SD i SA, linije sa strelicama prikazuju preklapajuće regione koji su dostupni za homolognu rekombinaciju. Plazmidi AAV vektora normalne veličine i velikih AAV vektora sadržali su ekspresione kasete kompletne dužine uključujući promoter, CDS transgena kompletne dužine i signal za poliadenilaciju (pA). Dva zasebna plazmida AAV vektora (5' i 3') koja su potrebna za stvaranje dvojnih AAV vektora sadržala su promoter nakon koga sledi N-terminalni deo CDS transgena (5' plazmid) ili C-terminalni deo CDS transgena nakon koga sledi pA signal (3' plazmid).

DETALJAN OPIS PRONALASKA SUPSTANCE I POSTUPCI

Stvaranje plazmida

[0123] Svi plazmidi korišćeni za proizvodnju AAV vektora su dobijeni od plazmida dvojnih hibridnih AK vektora koji kodiraju humani ABCA4, humani MYO7A ili EGFP reporterski protein koji sadrži invertovana terminalna ponavljanja (ITR) AAV serotipa 2<14>.

[0124] Rekombinogena sekvenca AK<14>sadržana u plazmidima vektora koji kodiraju ABCA4 zamenjena je sa tri različite rekombinogene sekvence dobijene od gena alkalne fosfataze: AP (NM_001632, bp 823-1100,<14>); AP1 (XM_005246439.2, bp1802-1516<20>); AP2 (XM_005246439.2, bp 1225-938<20>).

[0125] Plazmidi dvojnih AAV vektora koji imaju heterologne ITR AAV serotipa 2 (ITR2) i ITR AAV serotipa 5 (ITR5) u konfiguraciji 5:2-2:5 dobijeni su zamenom levog ITR2 u plazmidu 5'-poluvektoru, odnosno desnog ITR2 u plazmidima 3'-poluvektora sa ITR5 (NC_006152.1, bp 1-175). Plazmidi dvojnih AAV vektora koji imaju heterologne ITR2 i ITR5 u konfiguraciji 2:5 ili 5:2 dobijeni su zamenom desnog ili levog ITR2 sa ITR5. pAAV5/2 plazmid za pakovanje koji sadrži Rep5 (NC_006152.1, bp 171-2206) i AAV2 Cap (AF043303 bp2203-2208) gene (Rep5Cap2) dobijen je od pAAV2/2 plazmida za pakovanje koji sadrži Rep (AF043303 bp321-1993) i Cap (AF043303 bp2203-2208) gene iz AAV2 (Rep2Cap2), zamenom Rep2 gena Rep5 otvorenim okvirom za čitanje iz AAV5 (NC_006152.1, bp 171-2206).

[0126] pZac5:5-CMV-EGFP plazmid koji sadrži ekspresionu kasetu EGFP sa ITR5 dobijen je od pAAV2.1-CMV-EGFP plazmida koji sadrži ITR2 koji je bočno pored ekspresione kasete EGFP<45>.

[0127] Signali za razgradnju su klonirani u dvojnim AAV hibridnim AK vektorima koji kodiraju ABCA4 na sledeći način: u plazmide 5'-poluvektora između sekvence AK i desne

4

ITR2; u plazmide 3'-poluvektora između sekvence AK i akceptorskog signala za spajanje. Detalji o sekvencama signala za razgradnju mogu se naći u Tabeli 2.

Tabela 2. Signali za razgradnju korišćeni u ovoj studiji

[0128] Podvučene sekvence odgovaraju signalima za razgradnju; za signale za razgradnju koji obuhvataju ponovljene sekvence, prikazani su nepodvučeni nukleotidi koji su obuhvaćeni između ponovljenih sekvenci za svrhe kloniranja.

[0129] ABCA4 protein koji je eksprimiran iz dvojnih vektora AAV je obeležen sa 3xflag na N- (aminokiselinska pozicija 590) i C-terminusu za eksperimente koji su prikazani na Sl.3 i 4 i Sl.6, i samo na C-terminusu za eksperimente na Sl.2 i 8a.

4

[0130] Kompleti dvojnih hibridnih vektora AAV koji kodiraju ABCA4 i koji su korišćeni u ovoj studiji obuhvatali su bilo sveprisutne promotere CMV<46>ili receptorske kinaze 1 kuplovane sa humanim G proteinom specifične za PR (GRK1)<47>, dok su dvojni hibridni vektori AAV koji kodiraju MYO7A obuhvatali sveprisutni promoter CBA<39>.

Proizvodnja i karakterizacija vektora AAV

[0131] Veliki preparati vektora AAV su proizvedeni pomoću TIGEM AAV Vector Core putem trostruke transfekcije HEK293 ćelija, nakon čega su usledila dva kruga prečišćavanja sa CsC12. Vektori AAV koji nose homologni ITR2 dobijeni su kao što je prethodno opisano<48>.

[0132] Kako bi se dobili vektori AAV koji nose heterologni ITR2 i ITR5, suspenzija 1,1×10<9>HEK293 sa malim presejavanje četvorostruko je transficirana kalcijum fosfatom sa 500 µg pomoćnog plazmida pDeltaF6 koji sadrži Ad pomoćne gene<49>, 260 µg pAAV cis-plazmida i različitim količinama konstrukta za pakovanje Rep2Cap2 i Rep5. Količina konstrukta za pakovanje Rep2Cap2 i Rep5 bila je sledeća:

(i) PROTOKOL A: po 130 µg Rep5 i Rep2Cap2 (odnos 1:1)

(ii) PROTOKOL B: 90 µg Rep5 i 260 µg Rep2Cap2 (odnos 1:3)

(iii) PROTOKOL C: 26 µg Rep5 i 260 µg Rep2Cap2 (odnos 1:10)

[0133] Svaki preparat AAV je zatim prečišćen u skladu sa objavljenim protokolom<48>.

[0134] Protokoli opisani u nastavku korišćeni su za eksperimente Rep konkurentnosti:

1- za procenu takmičenja Rep5 sa Rep2 u proizvodnji vektora AAV sa ITR2, HEK293 ćelije su četvorostruko transficirane kalcijum fosfatom sa pDeltaF6, pAAV2.1-CMV-EGFP cis, Rep2Cap2 i Rep5Cap2 konstruktima u masenom odnosu 2:1:1,5:1,5 ili, za kontrolu, četvorostruko transficirane sa pDeltaF6, pAAV2.1-CMV-EGFP, Rep2Cap2 konstruktom za pakovanje i plazmidom koji nije značajan za kontrolu u masenom odnosu 2:1:1,5:1,5;

2- za procenu takmičenja Rep2 sa Rep5 u proizvodnji vektora AAV sa ITR5, HEK293 ćelije su četvorostruko transficirane kalcijum fosfatom sa pDeltaF6, pZac5:5-CMV-EGFP, Rep5Cap2 i Rep2Cap2 konstruktima u masenom odnosu 2:1:1,5:1,5 ili, za kontrolu, četvorostruko transficirane sa pDeltaF6, pZac5:5-CMV-EGFP, Rep5

4

konstruktom za pakovanje i plazmidom koji nije značajan za kontrolu u masenom odnosu 2:1:1,5:1,5.

[0135] Za preparate vektora AAV velikog obima, fizički titri [genomske kopije (GC)/ml] određeni su uprosečavanjem titra koji je postignut PCR kvantifikacijom koristeći TaqMan (Applied Biosystems, Carlsbad, CA, SAD)<48>sa sondom koja se komplementarno vezuje za ITR2 i koji je postignut tačkastom blot analizom<50>sa sondom koja se komplementarno vezuje u okviru od 1 kb od ITR2. Za preparate vektora AAV velikog obima koji su proizvedeni sa različitim masenim odnosima Rep5:Rep2Cap2, fizički titri [genomske kopije (GC)/ml] određeni su pomoću PCR kvantifikacije koristeći TaqMan sa sondom koja se komplementarno vezuje za ITR2. Za preparate vektora AAV koji su korišćeni u eksperimentima konkurentnosti, fizički titri [genomske kopije (GC)] određeni su pomoću PCR kvantifikacije koristeći TaqMan sa sondom koja se komplementarno vezuje za signal za poliadenilaciju goveđeg hormona rasta (BGH), sadržan u ekspresionoj kaseti EGFP koja je upakovana u vektore AAV.

Infekcija HEK293 ćelija putem AAV

[0136] Infekcija HEK293 ćelija putem AAV je obavljena kao što je prethodno opisano<14>. Vektori AAV2 koji nose heterologne ITR2 i ITR5 i proizvedeni su prema Protokolu C korišćeni su za inficiranje HEK293 ćelija sa multiplicitetom infekcije (m.o.i.) 1×10<4>GC/ćeliji svakog vektora (2×10<4>ukupno GC/ćeliji kada su pronalazači koristili dvojne vektore AAV u odnosu 1:1) koji je izračunat uzimajući najmanji titar ostvaren za svaki virusni preparat. Infekcije sa AAV2/2 koji imaju rekombinogene regione i signale za razgradnju obavljene su sa m.o.i. od 5×10<4>GC/ćeliji svakog vektora (1×10<5>ukupno GC/ćeliji u slučaju dvojnih vektora AAV u odnosu 1:1) koji je izračunat uzimajući prosečni titar iz TaqMan i tačkastog blota.

[0137] Za eksperimente koji koriste 5'-poluvektore koji sadrži ciljna mesta miR, ćelije su transficirane koristeći kalcijum fosfat 4 sata pre infekcije odgovarajućim imitatorima miR (50 nM; miRIDIAN microRNK imitator hsa-let-7b-5p, hsa-miR-204-5p, hsa-miR-124-3p i hsamiR-26a-5p; Dharmacon, Lafayette, CO, SAD).

Subretinalno injektovanje vektora AAV u miševe i svinje

4

[0138] Miševi su čuvani u odgajalištu Instituta za genetiku i biofiziku (Napulj, Italija), držani u 12-h ciklusu svetlosti/mraka (10-50 luksa izloženosti tokom faze svetlosti). C57BL/6 miševi su kupljeni od kompanije Harlan Italy SRL (Udine, Italija). Pigmentirani Abca4-/-miševi su dobijeni uzastopnim ukrštanjem albino Abca4-/- miševa<14>sa Sv129 miševima i održavani su međusobnim ukrštanjem. Parenje je vršeno ukrštanjem heterozigotnih miševa sa homozigotnim miševima. Albino Abca4-/- miševi su dobijeni uzastopnim ukrštanjem i povratnim ukrštanjem BALB/c miševa (homozigotni za Rpe65 Leu450) i održavani su međusobnim ukrštanjem. Parenje je vršeno ukrštanjem heterozigotnih miševa sa homozigotnim miševima. C57BL/6 (stari 5 nedelja), pigmentirani Abca4-/- (stari 5,5 meseci) i albino Abca4-/- (stari 2,5-3 meseca) miševi anestezirani su kao što je prethodno opisano<61>, zatim je 1 µl PBS ili AAV2/8 vektora subretinalno isporučen u temporalnu stranu mrežnjače putem trans-skleralnog transhoroidnog pristupa, kako je opisano u Liang et al<62>. AAV2/5-VMD2-humana tirozinaza<63>(doza: 2×10<8>GC/oku) dodata je u rastvor vektora AAV2/8 koji je subretinalno isporučen albino Abca4-/- miševima (Sl.8d). To nam je omogućilo da obeležimo RPE u transdukovanom delu očne čašice, koja je zatim disekcirana i analizirana.

[0139] Ženke velikih belih svinja koje su korišćene u ovoj studiji su registrovane kao čistokrvne u LW knjizi krda Italijanskog nacionalnog udruženja uzgajivača svinja. Svinje su čuvane u odgajalištu bolnice Cardarelli (Napulj, Italija) i držane su u 12-časovnom ciklusu svetlosti/mraka (10-50 luksa izloženosti tokom faze svetlosti). Ova studija je sprovedena u skladu sa Izjavom udruženja za istraživanje na polju vida i oftalmologije za upotrebu životinja u oftalmološkim i istraživanjima vida i sa propisima za procedure na životinjama Ministarstva zdravlja Italije. Sve procedure su poslate Ministarstvu zdravlja Italije, Odsek za javno zdravlje, zdravlje životinja, ishranu i bezbednost hrane. Hirurški zahvat je obavljen pod anestezijom i načinjeni su svi mogući napori da se patnja minimalizuje. Životinje su žrtvovane kao što je prethodno opisano<39>. Subretinalna isporuka vektora AAV svinjama starim 3 meseca je obavljena kao što je prethodno opisano<39>. Sve oči su tretirane sa 100 µl PBS ili rastvora vektora AAV2/8. Doza AAV2/8 je bila 1×10<11>GC svakog vektora/oku, te je zajednička injekcija dvojnih vektora AAV u odnosu 1:1 dala ukupnu dozu od 2×10<11>GC/oku.

[0140] Za studije na životinjama koje su prikazane na Slici 2c, 5b, 8, 9, 10, 11 i 12, desno i levo oko su nasumično raspoređeni u različite eksperimentalne grupe i istraživačima koji sprovode i kvantifikuju eksperimente nije bilo poznato lečenje koje su životinje dobijale.

4

Vestern blot analiza

[0141] Za vestern blot analizu, HEK239 ćelije, mrežnjače miševa i svinja lizirani su u RIPA puferu (50 mM Tris-HCl pH 8,0, 150 mM NaCl, 1% NP40, 0,5% Na-dezoksiholat, 1 mM EDTA pH 8,0, 0,1% SDS). Puferi za lizu su bili dopunjeni inhibitorima proteaze (tablete potpunog koktela inhibitora proteaze; Roche) i 1 mM fenilmetilsulfonilom. Nakon lize, uzorci ćelija koji su sadržali MYO7A su denaturisani na 99°C tokom 5 minuta u 1X Laemli puferu za uzorkovanje. Uzorci koji su sadržali ABCA4 su denaturisani na 37°C tokom 15 min u 1X Laemli puferu za uzorkovanje sa dodatkom 4 M uree. Lizati su razdvojeni pomoću 6-7% (uzorci sa ABCA4, odnosno MYO7A) ili 8% (WB na Sl.5b) SDS-poliakrilamidne gel elektroforeze. Antitela koja su korišćena za imunobloting su sledeća: anti-3×flag (1:1000, A8592; Sigma-Aldrich); anti-MYO7A (1:500, poliklonsko; Primm Srl, Milan, Italija) dobijena koristeći peptid koji odgovara aminokiselinama 941-1070 humanog MYO7A proteina; anti-filamin A (1:1000, kataloški br.4762; Cell Signaling Technology, Danvers, MA, SAD); anti-disferlin (1:500, disferlin, klon Ham1/ 7B6, MONX10795; Tebu-bio, Le Perray-en-Yveline, Francuska). Kvantifikacija traka ABCA4 i MYO7A koje su detektovane vestern blotom obavljena je koristeći softver ImageJ (besplatno preuzimanje dostupno na http://rsbweb.nih.gov/ij/). Za in vitro eksperimente koji su obavljeni sa AAV koji imaju heterologne ITR2 i ITR5, intenzitet traka ABCA4 i MYO7A kompletne dužine normalizovan je na intenzitet skraćenih proteinskih proizvoda u odgovarajućoj koloni ili na intenzitet traka filamina A, dok je intenzitet kraćih traka proteina ABCA4 i MYO7A normalizovan na intenzitet traka filamina A. Intenzitet traka ABCA4 koji je ostvaren sa vektorima AAV koji imaju signal za razgradnju ili regione homologosti normalizovan je na intenzitet traka filamina A za in vitro eksperimente ili na intenzitet traka disferlina za in vivo eksperimente. Kvantifikacija vestern blot eksperimenata je obavljena na sledeći način:

Sl. 2a-b: intenzitet traka ABCA4 je normalizovan na intenzitet traka filamina A u odgovarajućoj koloni. Normalizovana ekspresija ABCA4 je zatim izražena kao procenat u odnosu na dvojne AAV hibridne AK vektore;

Sl. 2c: intenzitet trake ABCA4 (a.u.) izračunat je kao procentualno smanjenje u odnosu na srednji intenzitet koji je izmeren na istom nivou u kolonama za negativnu kontrolu svakog gela (merenje uzorka za negativnu kontrolu u koloni 7 donjeg levog panela je isključeno iz analize usled izuzetno velikog pozadinskog signala). Vrednosti za svaku grupu su date kao srednja vrednost ± standardna greška srednje vrednosti (s.e.m.);

Sl. 3b-d: intenziteti traka ABCA4 kompletne dužine i skraćenog proteina podeljeni su intenzitetom traka filamina A, ili je intenzitet traka proteina ABCA4 kompletne dužine podeljen intenzitetom traka skraćenog proteina u odgovarajućoj koloni.

Vrednosti su prikazane kao srednja vrednost ± s.e.m.;

Tabela 5: intenziteti traka ABCA4 kompletne dužine i skraćenog proteina izmereni su u ćelijama koje su koinficirane 5'- i 3'-poluvektorima. Izračunat je odnos između intenziteta traka ABCA4 kompletne dužine i skraćenog proteina u prisustvu odgovarajućeg imitatora ili pomešanog imitatora. Vrednosti predstavljaju srednju vrednost ± s.e.m. odnosa iz tri nezavisna eksperimenta;

Tabela 6: intenziteti traka ABCA4 kompletne dužine i skraćenog proteina izmereni su u ćelijama koje su koinficirane 5'- i 3'-poluvektorima. Izračunat je odnos između intenziteta traka ABCA4 kompletne dužine i skraćenih traka iz vektora sa signalima za razgradnju ili bez njih. Vrednosti predstavljaju srednju vrednost ± s.e.m. odnosa iz tri nezavisna eksperimenta.

Sl. 8A: intenzitet trake ABCA4 (a.u.) izračunat je kao procentualno povećanje u odnosu na srednji pozadinski intenzitet izmeren u kolonama za negativnu kontrolu odgovarajućeg gela. Vrednosti su izražene kao srednja vrednost ± s.e.m.

Sautern blot analiza

[0142] Tri ×10<10>GC virusne DNK je ekstrahovan iz čestica AAV. Kako bi se digestovali neotpakovani genomi, vektorski rastvor je ponovo suspendovan u 240 µl PBS pH 7,419 (GIBCO; Invitrogen S.R.L., Milan, Italija) i zatim inkubiran sa 1 U/ul DNase I (Roche) u ukupnoj zapremini 300 µl sa 40 mM TRIS-HCl, 10 mM NaCl, 6 mM MgC12, 1 mM CaC12 pH 7,9 tokom 2 h na 37°C. DNaza I je zatim inaktivirana sa 50 mM EDTA, pa je usledila inkubirana sa proteinazom K i 2,5% rastvorom N-lauroil-sarkozila na 50°C tokom 45 min radi lize kapsida. DNK je dva puta ekstrahovana fenol-hloroformom i taložena sa dve zapremine etanola 100 i 10% natrijum acetata (3 M, pH 7). Gel elektroforeza na alkalnoj agarozi i bloting su obavljeni kao što je prethodno opisano (Sambrook i Russell, 2001 Molecular Cloning). Deset mikrolitara 1 kb DNK lestvice (N3232L; New England Biolabs, Ipswich, MA, SAD) naneto je kao marker molekulske mase. Dva različita fragmenta dvolančane DNK su obeležena pomoću digoksigenin-dUTP koristeći DIG high prime početni komplet za obeležavanje i detekciju DNK (Roche) i korišćeni su kao sonde.5' sonda (768 bp) dobijena je dvostrukom digestijom pZac2.1-CMV-ABCA4_5' plazmida sa SpeI i NotI; 3' sonda (974 bp) dobijena je dvostrukom digestijom pZac2.1-ABCA4_3'_3xflag_SV40

1

plazmida sa ClaI i MfeI. Prethibridizacija i hibridizacija su obavljene na 65°C u Čerčovom puferu (Sambrook i Russel, 2001 Molecular cloning) tokom 1 h, odnosno preko noći.

Membrana (Whatman Nytran N, naelektrisana najlonska membrana; Sigma-Aldrich, Milano, Italija) zatim je prvo isprana tokom 30 min u SSC 29-0,1% SDS, zatim tokom 30 min u SSC 0,59-0,1% SDS na 65°C, a zatim tokom 30 min u SSC 0,19-0,1% SDS na 37°C. Membrana je zatim analizirana detekcijom hemiluminescencije enzimskim imunotestom koristeći DIG komplet za obeležavanje i detekciju DNK (Roche).

Histološka analiza

[0143] Miševi su eutanazirani, i njihove očne jabučice su zatim sakupljene i fiksirane preko noći potapanjem u 4% paraformaldehid (PFA). Pre sakupljanja očnih jabučica, temporalni deo beonjače je obeležen kauterizacijom, kako bi se znala orijentacija očiju u pogledu mesta injekcije u trenutku inkluzije. Očne jabučice su isečene tako da sočivo i staklasto telo mogu da se uklone, pri čemu očna čašica ostaje netaknuta. Očne čašice miševa su infiltrirane sa 30% saharoze radi krioprezervacije i ubačene u medijum za zamrzavanje tkiva (O.C.T. matrix; Kaltek, Padova, Italija). Za svako oko, 150-200 uzastopnih sekcija (debljine 10 µm) načinjeno je duž horizontalne ravni, i sekcije su progresivno raspoređene na 10 pločica, tako da svaka pločica sadrži 15 do 20 sekcija, od kojih svaka predstavlja celo oko na različitim nivoima. Preseci su obojeni 4',6'-diamidino-2-fenilindolom (Vectashield; Vector Lab, Peterborough, Ujedinjeno Kraljevstvo) i praćeni su pomoću Zeiss Axiocam (Carl Zeiss, Oberkochen, Nemačka) pri različitim uvećanjima.

[0144] Svinje su žrtvovane, i njihove očne jabučice su sakupljene i fiksirane preko noći potapanjem u 4% PFA. Očne jabučice su isečene tako da sočivo i staklasto telo mogu da se uklone, dok očne čašice ostaju na mestu. Očne čašice su postepeno dehidrirane progresivnom infiltracijom sa 10%, 20%, i 30% saharoze. Obavljeno je ubacivanje u medijum za zamrzavanje tkiva (O.C.T. matrica; Kaltek). Pre ugrađivanja, očne jabučice svinja su analizirane fluorescentnim stereomikroskopom (Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Nemačka) da bi se lokalizovao transdukovani region kad god je primenjen vektor koji kodira EGFP. Za svako oko, 200-300 uzastopnih sekcija (debljine 12 µm) načinjeno je duž horizontalne ravni, i sekcije su progresivno raspoređene na staklene pločice, tako da svaka pločica sadrži 6-10 sekcija. Bojenje sekcija i pravljenje snimaka su obavljeni kao što je opisano za miševe.

2

Imunofluorescentno bojenje čepića

[0145] Zamrznute sekcije mrežnjače su jednom isprane PBS-om i zatim permeabilizovane tokom 1 h u PBS-u koji sadrži 0,1% Triton X-100. Blokirajući rastvor koji sadrži 10% normalnog kozjeg seruma (Sigma-Aldrich) primenjen je tokom 1 h. Primarno antitelo [antihumani CAR<66,67>, koji takođe prepoznaje i CAR svinje ("Luminaire founders"-hCAR, 1:10.000; dobijeno ljubaznošću dr Čeril M. Kraft, Očni institut Doheni, Los Anđeles, CA)] razblaženo je u PBS-u i inkubirano preko noći na 4°C. Sekundarno antitelo (Alexa Fluor 594, antizečje, 1:1.000; Molecular Probes, Invitrogen, Carlsbad, CA) inkubirano je tokom 45 min. Sekcije obojene anti-CAR antitelima su analizirane pri uvećanju od 63x koristeći Leica sistem laserskog konfokalnog mikroskopa (Leica Microsystems GmbH), kao što je prethodno opisano<64>. Ukratko, za svako oko je uzeto šest različitih z-snopova iz šest različitih transdukovanih regiona. Za svaki z-snop, snimci pojedinačnih ravni su korišćeni za prebrojavanje CAR+ /EGFP ćelija. Tom prilikom, pronalazači su se pažljivo kretali duž Z-ose kako bi razlikovali pojedinačne ćelije i tako izbegli da dva puta broje istu ćeliju. Za svaku mrežnjaču, pronalazači su prebrojali CAR pozitivne (CAR+)/EGFP pozitivne (EGFP+) ćelije od ukupno pozitivnih CAR+ ćelija. Pronalazači su zatim izračunali prosečan broj CAR+ / EGFP+ ćelija za tri oka iz svake eksperimentalne grupe.

Kvantifikacija EGFP

[0146] Intenzitet fluorescencije kod PR je veoma pažljivo i reproduktivno kvantifikovan, na nepristrasan način, kao što je prethodno opisano<64>. Snimci pojedinačnih kanala boja su napravljeni koristeći Leica mikroskop (Leica Microsystems GmbH). TIFF snimci su gradirani sivom bojom koristeći softver za analizu snimka (LAS AF lite; Leica Microsystems GmbH). Šest snimaka svakog oka je analizirano pri uvećanju od 20x od strane maskiranog posmatrača. PR (spoljašnji nuklearni sloj OS) selektivno su iscrtani na svakom snimku, i ukupna fluorescencija obuhvaćene oblasti je izračunata na nepristrasan način koristeći softver za analizu snimaka. Fluorescencija kod PR je zatim uprosečena sa šest snimaka koji su sakupljeni od zasebnih sekcija mrežnjače iz svakog oka. Pronalazači su zatim izračunali prosečnu fluorescenciju tri oka iz svake eksperimentalne grupe.

Kvantifikacija lipofuscinske autofluorescencije

[0147] Za analizu lipofuscinske fluorescencije, oči su sakupljene od pigmentiranih Abca4+/- i Abca4-/- miševa 3 meseca nakon injekcije AAV. Miševi su prilagođeni na mrak tokom noći i žrtvovani pod prigušenim crvenim svetlom. Za svako oko, načinjene su četiri preklapajuće slike temporalne strane tri sekcije iz različitih regiona oka koristeći mikroskop Leica DM5000B opremljen TX2 filterom (ekscitacija: 560±40 nm; emisija: 645±75)<71-75>i pod 20X objektivom. Četiri snimka za svaku sekciju su zatim kombinovana u jednu montažu koja je korišćena za dalju analizu fluorescencije. Intenzitet lipofuscinske fluorescencije (crveni signal) u svakoj sekciji automatski je izračunat koristeći softver ImageJ, i zatim je normalizovan za dužinu RPE ispod oblasti fluorescencije.

Transmisiona elektronska mikroskopija

[0148] Za analizu elektronskom mikroskopijom, oči su sakupljene od albino Abca4-/- i Abca4+/+ miševa 3 meseca nakon injekcije AAV. Oči su fiksirane u 0,2% glutaraldehidu-2% paraformaldehidu u 0,1 M PHEM puferu pH 6,9 (240 mM PIPES, 100 mM HEPES, 8 mM MgC12, 40 mM EGTA) preko noći i zatim isprane u 0,1 M PHEM puferu. Oči su zatim disecirane pod svetlosnim mikroskopom kako bi se izabrali delovi očnih čašica pozitivni na tirozinazu. Transdukovani delovi očnih čašica je zatim ubačen u 12% želatin, primenjena je infuzija 2,3 M saharozom, i zamrznuti su u tečnom azotu. Kriosekcije (50 nm) načinjene su koristeći Leica Ultramicrotome EM FC7 (Leica Microsystems) i cilije koje povezuju PR su izuzetno pažljivo poravnate po dužini. Kako bi se izbegla pristrasnost pri dodeljivanju morfoloških podataka različitim eksperimentalnim grupama, prebrojavanje granula lipofuscina je obavio maskirani operater (dr Roman Polishchuk) koristeći softver iTEM (Olympus SYS, Hamburg, Nemačka). „Touch count“ modul softvera iTEM je korišćen da se prebroje granule lipofuscina u oblastima od 25 µm<2>(najmanje 40) koje su nasumično raspoređene duž sloja RPE. Gustina granula je izražena kao broj granula po 25 µm<2>.

Rezultati elektroretinograma

[0149] Elektrofiziološka snimanja kod miševa i svinja su obavljena kako je prikazano u (68), odnosno (69).

Statistička analiza

[0150] p-vrednosti ≤ 0,05 smatrane su statistički značajnim. Jednostrana ANOVA (R statistički softver) sa naknadnom procedurom višestrukog poređenja korišćena je da se uporede podaci koji su prikazani na Slici 2b (pANOVA=1,2 × 10<-6>), 2c (pANOVA= 0,326), 8c (pANOVA=1,5 × 10<-10>), 8d (pANOVA= 0,034) i 9a (pANOVA a-talas: 0,5; pANOVA btalas: 0,8) i u Tabeli 6 (pANOVA= 0,0135). Pošto su brojevi granula lipofuscina (Sl.8d) izraženi kao diskretni brojevi, oni su analizirani na osnovu odstupanja od linearnih modela

4

dobijenih od negativnog binoma<65>. Statistički značajne razlike između grupa koje su određene pomoću naknadne procedure višestrukog poređenja su sledeće: Sl.2b: AP u odnosu na AK: 1,08 × 10<-5>; AP1 u odnosu na AK: 0,05; AP2 u odnosu na AK: 0,17; AP1 u odnosu na AP: 1,8 × 10<-6>; AP2 u odnosu na AP: 2,8 × 10<-6>; AP2 u odnosu na AP1: 0,82. Sl.8c: Abca4+/- bez inj. u odnosu na Abca4-/- bez inj.: 0,00; Abca4-/- bez inj. u odnosu na Abca4-/- AAV5'+3': 9,3 × 10<-5>; Abca4+/- bez inj, u odnosu na Abca4-/- AAV5'+3': 4 × 10<-6>. Sl.8d: Abca4-/- PBS u odnosu na Abca4-/- AAV5'+3': 0,01; Abca4+/+ PBS u odnosu na Abca4-/- AAV5'+3': 0,37; Abca4+/+ bez inj. u odnosu na Abca4-/- AAV5'+3': 0,53; Abca4+/+ PBS u odnosu na Abca4-/- PBS: 0,05; Abca4+/+ bez inj. u odnosu na Abca4-/- PBS: 0,03; Abca4+/+ bez inj. u odnosu na Abca4+/+ PBS: 0,76. Tabela 6: 3xSTOP u odnosu na izostanak signala za razgradnju: 0,97; 3xSTOP u odnosu na PB29: 1,0; 3xSTOP u odnosu na 3xPB29: 0,15; 3xSTOP u odnosu na ubikvitin: 0,10; PB29 u odnosu na izostanak signala za razgradnju: 1,0; PB29 u odnosu na 3xPB29: 0,1; PB29 u odnosu na ubikvitin: 0,07; 3xPB29 u odnosu na izostanak signala za razgradnju: 0,06; 3xPB29 u odnosu na ubikvitin: 1,0; ubikvitin u odnosu na izostanak signala za razgradnju: 0,04.

[0151] Studentov t-test je korišćen za poređenje podataka koji su prikazani na Slici 3c, d i f.

REZULTATI

Dvojni AAV hibridni vektori koji sadrže AP1, AP2 ili AK rekombinogene regione pokazuju efikasnu transdukciju

[0152] Pronalazači su ispitali nekoliko strategija višestrukih vektora, kako je prikazano na Sl.

1 i 13.

[0153] Konkretno, paralelno su ispitali transdukcionu efikasnost dvojnih hibridnih vektora AAV sa različitim regionima homologije. U tu svrhu, pronalazači su stvorili dvojne hibridne vektore AAV2/2 koji sadrže ABCA4-3xflag kodirajuću sekvencu, pod kontrolom sveprisutnog CMV promotera, i AK<14>, AP<14>, AP1 ili AP2<20>regione homologije (Sl.7). Pronalazači su koristili te vektore da inficiraju HEK293 ćelije [multiplicitet infekcije, m.o.i.: 5×10<4>genomskih kopija (GC)/ćeliji svakog vektora]. Ćelijski lizati su analizirani putem vestern blota sa anti-3xflag antitelima radi detekcije ABCA4-3xflag (Sl.2). Svaki od skupova dvojnih hibridnih vektora AAV doveo je do ekspresije proteina kompletne dužine i očekivane veličine koji nisu detektovani u kolonama u koje su nanete negativne kontrole (Sl.2a).

Kvantifikacija ekspresije ABCA4 (Sl.2b) pokazala je da je infekcija sa dvojnim hibridnim AP1 i AP2 vektorima AAV dovela do malo nižih nivoa ekspresije transgena nego sa dvojnim hibridnim AK vektorima AAV, i svi su se pokazali značajno bolje od dvojnih hibridnih AP vektora AAV<14>. Predmetni pronalazači su prethodno otkrili da je efikasnost dvojnih vektora AAV koja zavisi od homologne rekombinacije manja kod terminalno diferenciranih ćelija kao PR nego u ćelijskoj kulturi<14>. Predmetni pronalazači su stoga ispitali nivoe transdukcije specifične za PR kod C57BL/6 miševa nakon subretinalne primene dvojnih AAV, AK, AP1 i AP2 vektora koji sadrže promoter receptorske kinaze 1 kuplovane sa humanim G proteinom specifične za PR (GRK1) (doza svakog vektora/oku: 1,9x10<9>GC; Sl.2c). Mesec dana nakon primene vektora, pronalazači su detektovali ekspresiju proteina ABCA4 koja je konzistentnija u mrežnjačama koje su tretirane dvojnim AAV hibridnim AK nego AP1 ili AP2 vektorima (Sl.2c).

Uključivanje heterolognih ITR u vektore AAV imala je uticaj na njihov obim proizvodnje i ne smanjuje nivoe skraćenih proteinskih proizvoda

[0154] Kako bi se testiralo da li upotreba heterolognih ITR poboljšava proizvodnu usmerenu konkatamerizaciju dvojnih vektora AAV, pronalazači su stvorili dvojne hibridne AK vektore AAV2/2 koji sadrže ABCA4-3xflag ili MYO7A-HA kodirajuće sekvence sa heterolognim ITR2 i ITR5 u konfiguraciji 5:2 (levo ITR iz AAV5 i desno ITR iz AAV2) ili 2:5 (levo ITR iz AAV2 i desno ITR izAAV5) (Sl.1). Proizvodnja dvojnih vektora AAV koji imaju heterologne ITR2 i ITR5 zahteva istovremenu ekspresiju Rep proteina iz AAV serotipova 2 i 5 koji ne mogu biti unakrsno komplementni za replikaciju virusa<23>. Zaista, pokazalo se da Rep2 i Rep5 mogu naizmenično da se vezuju za ITR2 ili ITR5, mada manje efikasno nego za homologni ITR, međutim, ne mogu da otcepe terminalna mesta rezolucije ITR drugog serotipa<36>. Stoga, pre stvaranja dvojnih hibridnih AK vektora AAV sa heterolognim ITR2 i ITR5, pronalazači su ispitali potencijalno takmičenje (i) Rep5 sa Rep2 u proizvodnji AAV2/2-CMV-EGFP vektora (tj. vektora sa homolognim ITR2) i (ii) Rep2 sa Rep5 u proizvodnji AAV5/2-CMV-EGFP vektora (tj. vektora sa homolognim ITR5), koristeći istu količinu Rep5Cap2 i Rep2Cap2 konstrukta za pakovanje (odnos 1:1). Zaista, kada je Rep5Cap2 konstrukt za pakovanje obezbeđen zajedno sa Rep2Cap2, ukupni prinosi AAV2/2-CMV-EGFP vektora su smanjeni na 42% prinosa kontrolnih preparata koji su dobijeni kada je samo Rep2Cap2 obezbeđen kao konstrukt za pakovanje (prosek 4 nezavisna preparata svake vrste, p Studentov t-test <0,05). Nasuprot tome, nisu uočene značajne razlike u ukupnim prinosima AAV5/2-CMV-EGFP preparata koji su dobijeni kada je Rep2Cap2 dodat u Rep5Cap2, što je bilo 83% prinosa dobijenih kada je Rep5Cap2 bio jedini konstrukt za pakovanje koji je transficiran (prosek 4 nezavisna preparata svake vrste, nisu uočene značajne razlike koristeći Studentov t-test). Imajući u vidu takmičenje Rep5 sa Rep2 u proizvodnji vektora sa ITR2, pronalazači su testirali tri različita odnosa između Rep5 i Rep2Cap2 konstrukta za pakovanje u proizvodnji AAV sa heterolognim ITR2 i ITR5 (protokol A sa odnosom Rep5/Rep2Cap2 1:1, protokol B sa 1:3 i protokol C sa 1:10). Kao što je prikazano u Tabeli 3, virusni titri određeni PCR kvantifikacijom koristeći sondu koja se komplementarno vezuje za ITR2 progresivno su rasli kada je količina Rep5 smanjivana, pri čemu je najbolji titar dobijen sa protokolom C.

Tabela 3. Prinosi AAV5:2/2 vektora u prisustvu različitih odnosa konstrukta Rep5 i Rep2 pakovanja

ID: identifikacioni broj AAV5:2/2 vektora; GC: genomske kopije.

[0155] Ovi rezultati su potvrdili da se Rep5 i Rep2 takmiče tokom proizvodnje vektora sa ITR2 i doveli su do toga da sledimo protokol C za proizvodnju AAV vektora sa heterolognim ITR2 i ITR5. Međutim, nekoliko AAV preparata koji su dobijeni ovom strategijom pokazalo je: (i) do 6-struko manje titre određene na ITR2 nego titri određeni na transgenoj sekvenci između ITR (Tabela 4), što bi ukazalo na to da je integritet ITR2 kompromitovan i (ii) oko 6-struko srednje smanjenje ukupnog prinosa vektora AAV sa heterolognim ITR2 i ITR5 u poređenju sa vektorima koji sadrže homologni ITR2 (Tabela 4).

Tabela 4. Mali prinosi i razlike između titra ITR2 i transgena AAV2 sa heterologim ITR2 i ITR5

ID: identifikacioni broj vektora AAV; GC: genomske kopije.<a>Vrednosti predstavljaju srednju vrednost±SEM.

[0156] Međutim, sautern blot analiza preparata AAV sa heterolognim ITR nije pokazala uočljivu izmenu integriteta genoma (Sl.3a).

[0157] Kako bi se testiralo da li je uključivanje heterolognog ITR u dvojne AAV hibridne AK vektore poboljšalo nastanak proizvodnih konkatamera glava-rep i transdukciju proteina kompletne dužine uz smanjenje proizvodnje skraćenih proteina, pronalazači su inficirali HEK293 ćelije dvojnim hibridnim vektorima AAV koji kodiraju ABCA4 ili MYO7A sa heterolognim ITR2 i ITR5 (u konfiguraciji 5:2/2:5) ili homolognim ITR2 (Sl.3b, 3e).

[0158] Imajući u vidu razliku između ITR2 i transgenih titara za vektore sa heterolognim ali ne i homolognim ITR (Tabela 4), pronalazači su inficirali ćelije sa 10<4>genomskih kopija (GC)/ćeliji svakog vektora na osnovu ITR2 ili transgenih titra. Vestern blot analiza HEK293 ćelija inficiranih dvojnim vektorima AAV na osnovu ITR2 titra, koristeći anti-3×flag (za detekciju ABCA4-3xflag, Sl.3b) ili anti-Myo7a (Sl.3e) antitela, pokazala je da je uključivanje heterolognih ITR2 i ITR5 dovelo do viših nivoa proteina kompletne dužine i skraćenih proteina nego homologni ITR2 (Sl.3b, c, d, f). Međutim, ovo nije uočeno kada su HEK293 ćelije inficirane preparatima istih dvojnih AAV vektora na osnovu titra transgena (Sl. 3b, d). Dakle, odnos ekspresije proteina kompletne dužine i skraćenog proteina bio je sličan bez obzira na ITR uključene u vektore (Sl.3 c, d, f) i vektorski titar koji je korišćen za doziranje ćelija (Sl.3b, c, d).

CL1 degron u 5'-poluvektoru smanjuje proizvodnju skraćenih proteinskih proizvoda [0159] Kako bi se selektivno smanjili nivoi skraćenih proteinskih proizvoda koje proizvode 5'- i 3'-polovina dvojnih hibridnih vektora AAV<14>, pronalazači su ubacili pretpostavljene sekvence razgradnje u 5'-polovinu vektora nakon donorskog signala za spajanje između AK i desnog ITR, i u 3'-polovinu vektora između AK i akceptorskog signala za spajanje (Sl.1). Signal za razgradnju će tako biti uključen u skraćeni protein ali ne i u protein kompletne dužine, što je posledica spajanja iRNK. Kao signale za razgradnju u 5'-polovini vektora, pronalazači su uključili: (i) CL1 degron (CL1), (ii) 4 kopije ciljnog mesta miR-let7b (4xLet7b), (iii) 4 kopije ciljnog mesta miR-26a (4x26a) ili (iv) kombinaciju po 3 kopije ciljnih mesta miR-204 i miR-124 (3x204+3x124) (Tabela 2). Kao signale za razgradnju u 3'-polovini vektora, pronalazači su uključili: (i) 3 zaustavna kodona (STOP), (ii) PB29 kao pojedinačnu (PB29) ili tri tandemske kopije (3xPB29) ili (iii) ubikvitin (Tabela 2).

Pronalazači su stvorili dvojne hibridne AK vektore AAV2/2 koji kodiraju ABCA4 i sadrže različite signale za razgradnju, i procenili su njihovu efikasnost nakon inficiranja HEK293 ćelija [m.o.i.: 5 × 10<4>genomskih kopija (GC)/ćeliji svakog vektora]. Pošto su miRlet7b, miR-26a, miR-204 i miR-124 slabo eksprimirani ili u potpunosti odsutni iz HEK293 ćelija (Ambion miRNA Research Guide i<37>), kako bi se testiralo utišavanje konstrukta koji sadrži ciljna mesta za te miR, pronalazači su transficirali ćelije imitatorima miR (tj. malim, hemijski modifikovanim dvolančanim RNK koje oponašaju endogenu miR<38>) pre inficiranja vektorima AAV2/2 koji sadrže odgovarajuća ciljna mesta. Kako bi se definisala koncentracija imitatora miR koja je potrebna da se postigne utišavanje gena koji sadrži odgovarajuća ciljna mesta miR, pronalazači su koristili plazmid koji kodira reporterski EGFP protein i sadrži ciljna mesta miR pre signala za poliadenilaciju (podaci nisu prikazani). Iste eksperimentalne postavke su korišćene za dalje ispitivanje ciljnih mesta miR u kontekstu dvojnih hibridnih AK vektora AAV. Pronalazači su otkrili da je uključivanje ciljnih sekvenci miR-204+124 i 26a u 5'-polovinu dvojnih hibridnih AK vektora AAV smanjilo, mada nije i ukinulo, ekspresiju skraćenih proteinskih proizvoda bez uticaja na ekspresiju proteina kompletne dužine (Sl.4). Za razliku od toga, uključivanje ciljnih mesta miR-let7b nije bilo efikasno za smanjenje ekspresije skraćenih proteina (Sl.4).

[0160] Ono što je značajno, kao što je prikazano na slici 5a, pronalazači su otkrili da uključivanje CL1 signala za razgradnju u 5'-polovinu vektora smanjuje ekspresiju skraćenog proteina na nivoe koji se ne mogu detektovati, a pritom ne utiče na ekspresiju proteina kompletne dužine (Sl.5a). Pošto razlike u ovoj ekspresiji enzima specifičnoj za tkivo puta ubikvitinacije koji posreduju razgradnju CL1<31>mogu da objasne razlike u efikasnosti CL1, pronalazači su dalje procenili efikasnost CL1 degrona u mrežnjači svinje, koja ima veličinu i strukturu sličnu ljudskoj<19, 30, 39, 40>i stoga je izvrstan pretklinički model velike životinje za procenu bezbednosti i efikasnosti vektora.

[0161] U tu svrhu, pronalazači su subretinalno u velike bele svinje injektovali dvojne hibridne AK vektore AAV2/8 (čija 5'-polovina vektora je uključivala ili nije uključivala sekvencu CL1) koji kodiraju ABCA4 (doza svakog vektora/oku: 1 × 10<11>GC). Ono što je značajno, pronalazači su otkrili da je uključivanje CL1 signala za razgradnju u 5'-polovinu vektora dovelo do značajnog smanjenja ekspresije skraćenih proteina ispod granice detekcije vestern blot analize bez uticaja na ekspresiju proteina kompletne dužine (Sl.5b). Među signalima za razgradnju koji su testirani u 3'-polovini vektora, pronalazači su otkrili da STOP kodoni nisu uticali na proizvodnju skraćenih proteina. Za razliku od toga, PB29 (pojedinačno ili sa tri tandemske kopije) i ubikvitin bili su efikasni u smanjenju ekspresije skraćenih proteina. Međutim, dok je ubikvitin ukinuo i ekspresiju proteina kompletne dužine, PB29 je uticao na proizvodnju proteina kompletne dužine u manjoj meri (Sl.6).

[0162] Među signalima za razgradnju koji su testirani u 3'-polovini vektora, pronalazači su identifikovali tri (PB29, 3xPB29 i ubikvitin) koji smanjuju i nivoe skraćenih proteinskih proizvoda i proteina kompletne dužine (Sl.6 i Tabele 5 i 6).

Tabela 5. Kvantifikacija ABCA4 kompletne dužine u odnosu na ekspresiju skraćenih proteina na osnovu vestern blot analize HEK293 ćelija koje su inficirane dvojnim hibridnim vektorima AAV koji sadrže mesta za ciljanje miR u 5'-polovini vektora.

Tabela 6: Kvantifikacija ABCA4 kompletne dužine i ekspresije skraćenih proteina na osnovu vestern blot analize HEK293 ćelija koje su inficirane dvojnim hibridnim vektorima AAV koji sadrže signale za razgradnju u 3'-polovini vektora.

Subretinalna primena poboljšanih dvojnih vektora AAV smanjuje taloženja lipofuscina u Abca4-/- mrežnjači

[0163] Na osnovu naših otkrića, poboljšani dvojni hibridni-ABCA4 vektori AAV treba da uključuju homologni ITR2, AK region homologosti i CL1. Pošto se ABCA4 eksprimira i u fotoreceptorima štapića i čepića kod ljudi<70>, pronalazači su identifikovali odgovarajući promoter za isporuku ABCA4 putem poređenja svojstava transdukcije PR pojedinačnih vektora AAV2/8 koji kodiraju EGFP iz humanih GRK1 (receptorska kinaza 1 kuplovana sa G proteinom specifična za PR) ili IRBP (interfotocereptorski retinoidni vezujući protein) promotera, pri čemu je za oba opisano da podstiču visoke nivoe kombinovane transdukcije

1

PR štapića i čepića kod različitih vrsta<53-55>. Koristeći strukturu mrežnjače svinje, koja uključuje region nalik traci sa čepićima:štapićima = 1:3<56>slično mrežnjači čoveka, pronalazači su subretinalno injektovali 1×10<11>GC/oku AAV2/8-GRK1- ili IRBP-EGFP vektora velikim belim svinjama starim 3 meseca. Četiri nedelje nakon injekcije, pronalazači su analizirali odgovarajuće kriosekcije mrežnjače pod fluorescentnim mikroskopom.

Kvantifikacija EGFP fluorescencije u sloju PR ćelija (Sl.10a-b) pokazala je da oba promotera uzrokuju uporedive nivoe transdukcije PR (pretežno štapića u ovom regionu). Međutim, kada su istraživači prebrojali broj čepića obeleženih antitelom nastalim na arestin čepića (CAR)<57>koji su takođe EGFP pozitivni, otkrili su veće, mada ne i statistički značajne, nivoe transdukcije PR čepića sa GRK1 promoterom (Materijal, Sl.10c-d). Na osnovu toga, pronalazači su uključili GRK1 promoter u naše poboljšane dvojne hibridne ABCA4 vektore AAV, i istraživali su njihovu sposobnost da eksprimiraju ABCA4 i smanjuju abnormalni sadržaj autofluorescentne lipofuscinske supstance koja sadrži A2E u RPE Abca4-/- miševa. Pronalazači su prvobitno subretinalno injektovali jednomesečnim C57/BL6 miševima poboljšane dvojne vektore AAV (doza svakog vektora/oku: 2×10<9>GC) i otkrili su da je 12 od 24 (50%) očiju sa injekcijom imalo detektabilne, mada varijabilne, nivoe proteina ABCA4 kompletne dužine na osnovu vestern blota [Sl.8a; nivoi proteina ABCA4 u očima koje su ABCA4 pozitivne: 2,8 ± 0,7 a.u. (srednja vrednost ± standardna greška srednje vrednosti)].

[0164] To je slično našem prethodnom otkriću da je različita verzija dvojne platforme AAV dovela do toga da 50% očiju eksprimira ABCA4<14>. Pronalazači su zatim 5,5 meseci starim pigmentiranim Abca4-/- miševima subretinalno u temporalni region oka injektovali poboljšane dvojne vektore AAV (doza svakog vektora/oku: 1,8×10<9>GC). Tri meseca kasnije, pronalazači su sakupili oči i izmerili nivoe fluorescencije lipofuscina (ekscitacija: 560±40 nm; emisija: 645±75) na kriosekcijama mrežnjače [samo u RPE ili u RPE spoljni segmenti (OS)] u temporalnom regionu oka (Sl.8b-c i Sl.11). Pronalazači su otkrili da je intenzitet fluorescencije lipofuscina u ovom regionu oka značajno veći kod netretiranih Abca4-/- nego kod Abca4+/- i -/- miševa kojima su injektovani dvojni hibridni ABCA4 vektori AAV (Sl.8b, c i Sl.11). Pronalazači su zatim prebrojali RPE lipofuscinske granule, koristeći transmisionu elektronsku mikroskopiju. Njih je bilo više kod 5,5-6 meseci starih albino Abca4-/- miševa kojima je injektovan PBS u poređenju sa Abca4+/+ kontrolama odgovarajuće starosti (Sl. 8d), pri nivoima koji su slični onima koje su pronalazači nezavisno izmerili kod Abca4-/-miševa kojima je injektovan ili nije injektovan kontrolni vektor AAV (podaci nisu prikazani). Broj granula lipofuscina u Abca4-/- RPE bio je normalizovan 3 meseca nakon subretinalne

2

injekcije poboljšanih dvojnih hibridnih ABCA4 vektora AAV (doza svakog vektora/oku: 1×10<9>GC, Sl.8d).

Poboljšani dvojni vektori AAV su bezbedni nakon subretinalne primene u mrežnjaču miša i svinje

[0165] Radi ispitivanja bezbednosti poboljšanih dvojnih hibridnih ABCA4 vektora AAV2/8, pronalazači su ih subretinalno injektovali u C57BL/6 miševe divljeg tipa i velike bele svinje (doza svakog vektora/oku: 3×10<9>, odnosno 1×10<11>GC). Mesec dana nakon injekcije, pronalazači su izmerili električnu aktivnost mrežnjače pomoću Gancfeldovog elektroretinograma (ERG) i otkrili su da amplitude a- i b-talasa nisu bile značajno različite kod očiju miševa u koje su injektovani dvojni hibridni ABCA4 vektori AAV i očiju u koje su injektovani vektori AAV za negativnu kontrolu ili PBS (Sl.9a i Materijal, Sl.12a). Slično tome, amplituda b-talasa u ERG testovima skopije, fotopije, maksimalnog odgovora i treperenja bila je uporediva u očima svinja u koje su injektovani dvojni hibridni ABCA4 vektori AAV sa očima za kontrolu u koje je injektovan PBS (Sl.9b i Materijal, Sl.12b).

OBRAZLOŽENJE

[0166] Ograničeni kapacitet za pakovanje AAV predstavlja jednu od glavnih prepreka za širu primenu AAV u genskoj terapiji IRD. Međutim, u skorije vreme, nekoliko grupa je nezavisno objavilo da dvojni vektori AAV efikasno proširuju teretni kapacitet AAV u mrežnjačama miševa i svinja<14, 17, 19, 41>čime se povećava primenljivost AAV na IRD, usled mutacija u genima koje ne bi stale u jedan kanonski vektor AAV. Pronalazači su ovde naumili da prevaziđu neka ograničenja koja su povezana sa upotrebom dvojnih vektora AAV, poimence njihovu relativno malu efikasnost u poređenju sa pojedinačnim vektorom, i proizvodnju skraćenih proteina koja može dovesti do određenih bezbednosnih briga.

[0167] Strategije usmerene na povećanje konkatamerizacije rep-glava dvojnog genoma AAV u teoriji treba da povećaju nivoe proteina kompletne dužine i da smanje nivo skraćenih proteina iz slobodnih pojedinačnih poluvektora. Pronalazači su naumili da poboljšaju konkatamerizaciju rep-glava dvojnog hibridnog genoma AAV putem uključivanja optimalnih regiona homologosti ili heterolognog ITR. U paralelnoj proceni prethodno opisanih regiona homologosti, pronalazači su otkrili da sekvence AP1 i AP2 koje su nedavno objavili Lostal et al.<20>i sekvence AK iz F1 faga<14>podstiču ukupno slične nivoe ekspresije proteina in vitro, pri čemu dvojni hibridni AK vektori AAV dovode do konzistentnije ekspresije ABCA4 u mrežnjači miša. Nezavisno od toga, dostupnost različitih regiona homologosti je korisna za usmeravanje odgovarajuće konkatamerizacije trostrukih vektora AAV za dalje proširenje teretnog kapaciteta AAV<20, 42>. Heterologni ITR2 i ITR5 su uspešno uključeni u dvojne i<24, 25>i trostruke<42>vektore AAV. Pronalazači su otkrili da su prinosi vektora AAV sa heterolognim ITR2 i ITR5 manji nego sa homolognim ITR2. Pronalazači su takođe detektovali manje vektorskih genoma sa heterolognim ITR kada pronalazači sondiraju ITR2, nego kad pronalazači sondiraju drugi region genoma. Kao što pronalazači pokazuju, Rep5 ometa proizvodnju vektora sa ITR2, što ukazuje na anomalije na nivou ITR2 uključene u vektore AAV sa heterolognim ITR, koji se proizvode u prisustvu Rep5, ali ne i u vektorima AAV sa homolognim ITR2, koji se proizvode samo u prisustvu Rep2 i pokazali su slične titre, bez obzira na to da li su pronalazači sondirali ITR2 ili drugi region genoma. Ovi rezultati se delimično razlikuju od onih koji su objavljeni kada su dvojni vektori AAV sa heterolognim ITR2 i ITR5 imali veću efikasnost transdukcije nego vektori sa homolognim ITR, i očigledno nisu imali problema sa proizvodnjom<24, 25>. Osim različitih konstrukta za pakovanje i protokola proizvodnje, pronalazači su u ovoj studiji koristili dvojne hibridne vektore AAV koji su uključivali regione homologosti između dva poluvektora, nasuprot trans-spajajujućem sistemu koji je korišćen u prethodnim izveštajima koji se oslanja na ITR za konkatamerizaciju<24, 25>. Kao i kod dvojnih hibridnih vektora AAV, rekonstitucija gena kompletne dužine je prvenstveno posredovana putem regiona homologosti koji je uključen u vektore<16>koji usmeravaju nastanak konkatamera, što može objasniti manji porast ekspresije transgena koji su pronalazači uočili kod vektora sa heterolognim ITR nasuprot prethodnim studijama koje su koristile trans-spajajujuće vektore<24, 25>. Pored toga, pronalazači su možda precenili efikasnost vektora sa heterolognim ITR, pošto su ih pronalazači koristili na osnovu titra koji je izračunat na ITR2 koji je 3-6-struko manji nego titar izračunat na transgenoj sekvenci za vektore koji eksprimiraju MYO7A, odnosno ABCA4. Pošto su titri izračunati na ITR2 i na transgenoj sekvenci slični između odgovarajućih dvojnih vektora AAV sa homolognim ITR2, pronalazači su ih koristili sa 3-6-struko manjom zapreminom nego vektore sa heterolognim ITR2 i ITR5. To može da objasni uočene veće nivoe kompletnih i skraćenih proteinskih proizvoda iz dvojnog vektora AAV sa heterolognim nego sa homolognim ITR.

[0168] U prethodnim studijama koje su sproveli, pronalazači nisu uočili znake lokalne toksičnosti do 8 meseci nakon subretinalne primene dvojnih vektora AAV<14>. Međutim,

4

proizvodnja skraćenih proteinskih proizvoda iz pojedinačnih poluvektora dvojnog AAV može dovesti do bezbednosnih problema.

[0169] Pokazalo se da je uključivanje ciljnih mesta miR u transkript gena delotvorna strategija za ograničavanje ekspresije transgena u različitim tkivima, uključujući i mrežnjaču<30>. Međutim, pronalazači su in vitro postigli delimično smanjenje proizvodnje skraćenih proteina samo kada su uključili ciljna mesta za miR-204+124 i 26a. Zaista, svojstva iRNK eksterne za ciljna mesta miR mogu da utiču na efikasnost utišavanja<43, 44>. Shodno tome, pošto su skraćeni proteinski proizvodi poreklom iz 5'-polovine proizvedeni iz vektora koji nema kanonski signal za poliadenilaciju, može biti moguće da dobijena iRNK ne može biti podvrgnuta efikasnom utišavanju posredovanom putem miR. Ono što je značajno, pronalazači su postigli potpunu razgradnju skraćenih proteinskih proizvoda iz 5'-poluvektora putem uključivanja CL1 degrona. Pronalazači su pokazali da je ovaj signal efikasan i in vitro i u mrežnjači svinje, što ukazuje na to da se enzimi puta razgradnje koji su potrebni za aktivnost CL1 eksprimiraju u različitim vrstama ćelija. Pošto je skraćeni proteinski proizvod iz 3'-poluvektora manje zastupljen nego onaj koji proizvodi 5'-poluvektor (Sl.6), njegovo prisustvo bi dovelo do manjih bezbednosnih problema. Podaci koji su ovde prikazani za mrežnjaču miša i svinje govore u korist bezbednosti poboljšanih dvojnih vektora AAV.

[0170] Ono što je značajno, pronalazači su otkrili da subretinalna primena poboljšanih dvojnih vektora AAV, pod kontrolom GRK1 promotera, koji obezbeđuje velike nivoe kombinovane transdukcije štapića i čepića, dovodi do efikasne isporuke ABCA4 kod miševa, mada na promenljivim nivoima. To bi moglo da bude posledica urođene varijabilnosti subretinalne injekcije u male oči miša i ukupne manje efikasnosti dvojnog sistema AAV u poređenju sa pojedinačnim vektorom AAV<14>.

[0171] Uprkos varijabilnosti, pronalazači su otkrili da isporuka ABCA4 posredovana dvojnim AAV dovodi do značajnog smanjenja lipofuscina u Abca4-/- mrežnjači, što ukazuje na to da širok raspon nivoa ekspresije transgena može na sličan način doprineti terapeutskoj efikasnosti. To je uočeno koristeći dve nezavisne tehnike, međutim, izraženije poboljšanje fenotipa je uočeno kada su pronalazači disecirali i analizirali površinu mrežnjače transdukovanu sa AAV koja je zaista pokazala normalizaciju broja granula lipofuscina. Da zaključimo, pronalazak obezbeđuje višestruke vektore sa poboljšanim svojstvima pogodnim za kliničku primenu, naročito za lečenje bolesti mrežnjače. Pored toga, pronalazak poboljšava bezbednost i efikasnost višestrukih vektora, što dalje povećava teretni kapacitet<20, 42>.

REFERENCE

[0172]

1. Trapani, I, et al (2014). Progress in retinal and eye research 43: 108-128.

2. Boye, SE, Boye, SL, Lewin, AS, i Hauswirth, WW (2013). Molecular therapy: the journal of the American Society of Gene Therapy 21: 509-519.

3. Bainbridge, JW, et al. (2008). The New England journal of medicine 358: 2231-2239.

4. Maguire, AM, et al. (2009). Lancet 374: 1597-1605.

5. Maguire, AM, et al. (2008). The New England journal of medicine 358: 2240-2248. 6. Cideciyan, AV, et al. (2009). Human gene therapy 20: 999-1004.

7. Simonelli, F, et al. (2010). Molecular therapy: the journal of the American Society of Gene Therapy 18: 643-650.

8. Allikmets, R, et al. (1997). Nature genetics 15: 236-246.

9. Molday, RS, i Zhang, K (2010). Progress in lipid research 49: 476-492.

10. Millan, JM, et al. (2011). Journal of ophthalmology 2011: 417217.

11. Hasson, T, et al. (1995). PNAS 92: 9815-9819.

12. Liu, X, Ondek, B, i Williams, DS (1998). Nature genetics 19: 117-118.

13. Gibbs, D, et al. (2010). Investigative ophthalmology & visual science 51: 1130-1135.

14. Trapani, I, Colella, P, Sommella, A, Iodice, C, Cesi, G, de Simone, S, et al. (2014).

Effective delivery of large genes to the retina by dual AAV vectors. EMBO molecular medicine 6: 194-211.

15. Duan, D, Yue, Y, i Engelhardt, JF (2001). Molecular therapy: the journal of the American Society of Gene Therapy 4: 383-391.

16. Ghosh, A, Yue, Y, Lai, Y, i Duan, D (2008). Molecular therapy: the journal of the American Society of Gene Therapy 16: 124-130.

17. Dyka, FM, et al., (2014). Human gene therapy methods 25: 166-177.

18. Lopes, VS, et al. (2013). Gene Ther.

19. Colella, P, et al. (2014). Gene Ther 21: 450-456.

20. Lostal, W, Kodippili, K, Yue, Y, i Duan, D (2014). Human gene therapy 25: 552-562.

21. Flotte, TR, et al. (1993). The Journal of biological chemistry 268: 3781-3790.

22. Ghosh, A, Yue, Y, i Duan, D (2011). Human gene therapy 22: 77-83.

23. Chiorini, JA, et al., (1999). Journal of virology 73: 1309-1319.

Yan, Z, Zak, R, Zhang, Y, i Engelhardt, JF (2005). Journal of virology 79: 364-379. Yan, Z, et al. (2007). Human gene therapy 18: 81-87.

Karali, et al. (2010). BMC genomics 11: 715.

Kutty, RK, et al. (2010). Molecular vision 16: 1475-1486.

Ragusa, M, et al. (2013). Molecular vision 19: 430-440.

Sundermeier, TR, i Palczewski, K (2012). Cellular and molecular life sciences: CMLS 69: 2739-2750.

Karali, M, et al. (2011). PloS one 6: e22166.

Gilon, T, Chomsky, O, i Kulka, RG (1998). The EMBO journal 17: 2759-2766. Bence, NF, Sampat, RM, i Kopito, RR (2001). Science 292: 1552-1555.

Bachmair, A, Finley, D, i Varshavsky, A (1986). Science 234: 179-186.

Johnson, ES, et al., (1992). The EMBO journal 11: 497-505.

Sadis, S, et al., (1995). Molecular and cellular biology 15: 4086-4094.

Chiorini, JA, Afione, S, i Kotin, RM (1999). Journal of virology 73: 4293-4298. Tian, W, et al. (2012). PloS one 7: e29551.

Wang, Z (2011). Methods in molecular biology 676: 211-223.

Mussolino, C, et al. (2011). Gene Ther 18: 637-645.

Hendrickson, A, i Hicks, D (2002). Experimental eye research 74: 435-444.

Reich, SJ, et al. (2003). Human gene therapy 14: 37-44.

Koo, T, et al., (2014). Human gene therapy 25: 98-108.

Walters, RW, Bradrick, SS, i Gromeier, M (2010). Rna 16: 239-250.

Ricci, EP, et al. (2011). Nucleic acids research 39: 5215-5231.

Auricchio, et al. (2001). Human molecular genetics 10: 3075-3081.

Gao, G, et al. (2000). Human gene therapy 11: 2079-2091.

Young, JE, et al., (2003). Investigative ophthalmology & visual science 44: 4076-4085.

Doria, M, et al., (2013). Human gene therapy methods 24: 392-398.

Zhang, Y, et al., (2000). Journal of virology 74: 8003-8010.

Drittanti, L, et al., (2000). Gene Ther 7: 924-929.

Gargiulo, S, et al. (2012). ILAR journal / National Research Council, Institute of Laboratory Animal Resources 53: E70-81.

Liang, FQ, et al., (2001). Methods in molecular medicine 47: 125-139.

Beltran, et al. (2012) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 109, 2132-2137.

Boye, S.E., et al. (2012) Hum. Gene Ther., 23, 1101-1115.

55. Khani, S.C., et al., (2007) Invest. Ophthalmol. Vis. Sci., 48, 3954-3961.

56. Chandler, M.J., et al., (1999) Vet. Ophthalmol., 2, 179-184.

57. Li, A., Zhu, X. i Craft, C.M. (2002) Invest. Ophthalmol. Vis. Sci., 43, 1375-1383. 58. Allocca, M., et al. (2008) J. Clin. Invest., 118, 1955-1964.

59. Parish, C.A., et al., (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 95, 14609-14613.

60. Ben-Shabat, S., et al., (2002) J. Biol. Chem., 277, 7183-7190.

61. Gargiulo, S., et al., (2012) ILAR J, 53, E70-81.

62. Liang, F.Q., et al., (2001) Methods Mol. Med., 47, 125-139.

63. Gargiulo, A., et al. (2009) Mol. Ther., 17, 1347-1354.

64. Manfredi, A., et al. (2013) Hum. Gene Ther., 24, 982-992.

65. Venables VN i Ripley BD. (2002) Modern Applied Statistics with S. Springer Science+Business Media, New York, USA.

66. Li, A., Zhu, X., Brown, B. i Craft, C.M. (2003) Adv. Exp. Med. Biol., 533, 361-368.

67. Li, A., et al. (2003) Invest. Ophthalmol. Vis. Sci., 44, 996-1007.

68. Allocca, M., et al. (2011) Invest. Ophthalmol. Vis. Sci., 52, 5713-5719.

69. Testa, F., et al. (2011) Invest. Ophthalmol. Vis. Sci., 52, 5618-5624.

70. Molday, L.L., Rabin, A.R. i Molday, R.S. (2000) Nat. Genet., 25, 257-258.

71. Sparrow, J.R., Wu, Y., Nagasaki, T., Yoon, K.D., Yamamoto, K. i Zhou, J. (2010) Photochem Photobiol Sci, 9, 1480-1489.

72. Sparrow, J.R. i Duncker, T. (2014) J Clin Med, 3, 1302-1321.

73. Finnemann, S.C., Leung, L.W. i Rodriguez-Boulan, E. (2002) Proc. Natl. Acad. Sci.

U. S. A., 99, 3842-3847.

74. Secondi, R., Kong, J., Blonska, A.M., Staurenghi, G. i Sparrow, J.R. (2012) Invest.

Ophthalmol. Vis. Sci., 53, 5190-5197.

75. Delori, F.C., Dorey, C.K., Staurenghi, G., Arend, O., Goger, D.G. i Weiter, J.J. (1995) Invest. Ophthalmol. Vis. Sci., 36, 718-729.

1

2

4

1

2

4

1

�

4

�

11

12

�

14

1

�

1

�

11

12

��

12

��

1

11

��

1

��

1

�

1

�

��

14

Claims

Patentni zahtevi

1. AAV sistem višestrukih vektora za ekspresiju kodirajuće sekvence gena od interesa u ćeliji, pri čemu pomenuta kodirajuća sekvenca sadrži prvi deo i drugi deo, i pomenuti sistem vektora sadrži:

a) prvi vektor koji sadrži:

- pomenuti prvi deo pomenute kodirajuće sekvence (CDS1),

- prvu sekvencu za rekonstituciju; i

b) drugi vektor koji sadrži:

- pomenuti drugi deo pomenute kodirajuće sekvence (CDS2),

- drugu sekvencu za rekonstituciju,

ii] prve sekvence za rekonstituciju koja sadrži donorski signal za spajanje (SD) i druge sekvence za rekonstituciju koja sadrži akceptorski signal za spajanje (SA), opciono pri čemu i prva i druga sekvenca za rekonstituciju dalje sadrži rekombinogenu sekvencu,

okarakterisano činjenicom da bilo jedan ili oba od prvog i drugog vektora dalje sadrži nukleotidnu sekvencu signala za razgradnju, pri čemu se pomenuta sekvenca nalazi u slučaju i) na 3' kraju CDS1 i/ili na 5' kraju CDS2, a u slučaju ii) na 3' poziciji u odnosu na SD i/ili 5' poziciji u odnosu na SA, pri čemu

- rekombinogena sekvenca je izabrana iz grupe koja se sastoji od:

GGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAA AAATTT AACGCGAATTTTAACAAAAT (SEQ ID No.22, AK) ili GGGATTTTTCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAA

AAATTT AACGCGAATTTTAACAAAAT (SEQ ID NO.23, AK), SEQ ID NO.24

(AP1), SEQ ID NO.25 (AP2) i SEQ ID NO.26 (AP) i

- nukleotidna sekvenca signala za razgradnju sadrži ili se sastoji od sekvence koja kodira SEQ ID No.1 (CL1), SEQ ID No.2 (CL2), SEQ ID No.3 (CL6), SEQ ID No.

2. AAV sistem višestrukih vektora prema zahtevu 1, pri čemu i prvi i drugi vektor dalje sadrže pomenutu nukleotidnu sekvencu signala za razgradnju, pri čemu je nukleotidna sekvenca signala za razgradnju u prvom vektoru identična sekvenci u drugom vektoru ili se od nje razlikuje, ili pri čemu prva sekvenca za rekonstituciju sadrži donorski signal za spajanje (SD) i rekombinogeni region na poziciji 3' u odnosu na pomenuti SD, druga sekvenca za rekonstituciju sadrži akceptorski signal za spajanje (SA) i rekombinogenu sekvencu na 5' poziciji u odnosu na SA; pri čemu se pomenuta nukleotidna sekvenca signala za razgradnju nalazi na 5' kraju i/ili na 3' kraju nukleotidne sekvence rekombinogenog regiona jednog ili oba od prvog i drugog vektora.

3. AAV sistem višestrukih vektora prema bilo kom od prethodnih zahteva, pri čemu prvi vektor dalje sadrži promotersku sekvencu koja je operativno vezana sa 5' krajnjim delom pomenutog prvog dela kodirajuće sekvence (CDS1).

4. AAV sistem višestrukih vektora prema bilo kom od prethodnih zahteva, pri čemu i prvi vektor i drugi vektor dalje sadrže nukleotidnu sekvencu 5'-terminalnog ponavljanja (5'-TR) i nukleotidnu sekvencu 3'-terminalnog ponavljanja (3'-TR), poželjno, 5'-TR je nukleotidna sekvenca 5'-invertovanog terminalnog ponavljanja (5'-ITR), a 3'-TR je nukleotidna sekvenca 3'-invertovanog terminalnog ponavljanja (3'-ITR), pri čemu ITR poželjno potiču od istog virusnog serotipa ili od različitih virusnih serotipova.

5. AAV sistem višestrukih vektora prema bilo kom od prethodnih zahteva, pri čemu donorski signal za spajanje sadrži ili se sastoji od sekvence koja je najmanje 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ili 100% identična sa

GTAAGTATCAAGGTTACAAGACAGGTTTAAGGAGACCAATAGAAACTGG

GCTTGTC GAGACAGAGAAGACTCTTGCGTTTCT (SEQ ID No.27), ili pri čemu akceptorski signal za spajanje sadrži ili se sastoji od sekvence koja je najmanje 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ili 100% identična sa

GATAGGCACCTATTGGTCTTACTGACATCCACTTTGCCTTTCTCTCCACAG

(SEQ ID No.28)

14

6. AAV sistem višestrukih vektora prema bilo kom od prethodnih zahteva, pri čemu, kodirajuća sekvenca je kodirajuća sekvenca gena izabranog iz grupe koja se sastoji od: ABCA4, MYO7A, CEP290, CDH23, EYS, PCDH15, CACNA1, SNRNP200, RP1, PRPF8, RP1L1, ALMS1, USH2A, GPR98, HMCN1, poželjno, kodirajuća sekvenca je kodirajuća sekvenca gena izabranog iz grupe koja se sastoji od: DMD, CFTR, F8 i DYSF.

7. AAV sistem višestrukih vektora prema bilo kom od prethodnih zahteva, pri čemu prvi vektor ne sadrži nukleotidnu sekvencu signala za poliadenilaciju.

8. AAV sistem višestrukih vektora prema bilo kom od prethodnih zahteva koji sadrži:

a) prvi vektor koji sadrži, u smeru 5'-3':

- sekvencu 5'-invertovanog terminalnog ponavljanja (5'-ITR);

- promotersku sekvencu;

- 5' deo kodirajuće sekvence gena od interesa (CDS1), pri čemu je pomenuti 5' deo operativno vezan sa pomenutim promoterom i pod njegovom je kontrolom;

- nukleotidnu sekvencu donorskog signala za spajanje;

- nukleotidnu sekvencu rekombinogenog regiona; i

- sekvencu 3'-invertovanog terminalnog ponavljanja (3'-ITR); i

b) drugi vektor koji sadrži, u smeru 5'-3':

- sekvencu 5'-invertovanog terminalnog ponavljanja (5'-ITR);

- nukleotidnu sekvencu rekombinogenog regiona;

- nukleotidnu sekvencu akceptorskog signala za spajanje;

- 3' kraj kodirajuće sekvence (CDS2);

- nukleotidnu sekvencu signala za poliadenilaciju; i

- sekvencu 3'-invertovanog terminalnog ponavljanja (3'-ITR),

okarakterisano time što dalje sadrži nukleotidnu sekvencu signala za razgradnju, pri čemu se pomenuta sekvenca nalazi na 5' kraju ili 3' kraju nukleotidne sekvence rekombinogenog regiona jednog ili oba od prvog i drugog vektora, pri čemu

- rekombinogena sekvenca je izabrana iz grupe koja se sastoji od:

GGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAA AAATTT AACGCGAATTTTAACAAAAT (SEQ ID No.22, AK) ili

1

GGGATTTTTCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAA

AAATTT AACGCGAATTTTAACAAAAT (SEQ ID NO.23, AK), SEQ ID NO.24

(AP1), SEQ ID NO.25 (AP2) i SEQ ID NO.26 (AP) i

9. AAV sistem višestrukih vektora prema bilo kom od prethodnih zahteva koji dalje sadrži treći vektor koji sadrži treći deo pomenute kodirajuće sekvence (CDS3) i sekvencu za rekonstituciju, pri čemu drugi vektor sadrži dve sekvence za rekonstituciju, i svaka sekvenca za rekonstituciju se nalazi na jednom kraju CDS2, treći vektor poželjno sadrži najmanje jednu nukleotidnu sekvencu signala za razgradnju, drugi vektor poželjno dalje sadrži nukleotidnu sekvencu signala za poliadenilaciju vezanu sa 3' krajem pomenute kodirajuće sekvence (CDS2).

10. Ćelija domaćin koja sadrži AAV sistem višestrukih vektora prema bilo kom od prethodnih zahteva.

11. AAV sistem višestrukih vektora prema bilo kom od zahteva 1 do 9 ili ćelija domaćin prema zahtevu 10 za medicinsku upotrebu, poželjno za upotrebu u genskoj terapiji, poželjno za upotrebu u lečenju i/ili prevenciji patologije ili bolesti okarakterisane degeneracijom mrežnjače, pri čemu je degeneracija mrežnjače poželjno nasledna, patologija ili bolest je poželjno izabrana iz grupe koja se sastoji od: retinitis pigmentoze (RP), Leberove kongenitalne amauroze (LCA), Stargartove bolesti (STGD), Ašerove bolesti (USH), Alstromovog sindroma, kongenitalnog stacionarnog noćnog slepila (CSNB), makularne distrofije, okultne makularne distrofije, bolesti uzrokovane mutacijom u genu ABCA4, poželjno za upotrebu u prevenciji i/ili lečenju Dišenove mišićne distrofije, cistične fibroze, hemofilije A i disferlinopatija.

12. Farmaceutska kompozicija koja sadrži AAV sistem višestrukih vektora prema bilo kom od zahteva 1 do 9 ili ćeliju domaćina prema zahtevu 10 i farmaceutski prihvatljiv vehikulum.

1 1

13. Nukleotidna sekvenca signala za razgradnju koja sadrži ili se sastoji od sekvence koja kodira SEQ ID No.1 (CL1), SEQ ID No.2 (CL2), SEQ ID No.3 (CL6), SEQ ID No.4 (CL9), SEQ ID No.5 (CL10), SEQ ID No.6 (CL11), SEQ ID No.7 (CL12), SEQ ID No.8 (CL15), SEQ ID No.9 (CL16), ili sadrži ili se sastoji od SEQ ID No.16 u sistemu višestrukih AAV vektora za upotrebu u postupku za smanjenje ekspresije proteina u skraćenom obliku ili za upotrebu u postupku za smanjenje ekspresije proteina u skraćenom obliku što obuhvata inserciju pomenute nukleotidne sekvence signala za razgradnju u jedan ili više vektora sistema višestrukih AAV vektora.

1 2