RS62334B1 - Postupci i sastavi za inženjering genoma posredovan nukleazom i korekciju kod matičnih ćelija hematopoeze - Google Patents

Description

Opis

TEHNIČKO POLJE

[0001] Predmetno obelodanjenje se odnosi na oblast inženjeringa genoma, posebno ciljanu modifikaciju genoma ćelije hematopoeze.

STANJE TEHNIKE

[0002] Jedan od najperspektivnijih pristupa u genskoj terapiji velikog broja bolesti uključuje upotrebu in vitro genetske modifikacije matičnih ćelija praćenu transplantacijom i ugrađivanjem modifikovanih ćelija kod pacijenta. Posebno je obećavajuće kada uvedene matične ćelije pokazuju dugotrajnu postojanost i diferencijaciju preko više linija. Matične ćelije hematopoeze, najčešće u obliku ćelija obogaćenih na osnovu eksprimiranja CD34 površinskog markera ćelija, posebno su korisne ćelijske populacije, jer se do njih lako može doći i sadrže dugoročne matične ćelije hematopoeze (LT-HSC), koje može da rekonstituišu celu liniju hematopoeze nakon transplantacije.

[0003] Opisani su različiti postupci i sastavi za ciljano razdvajanje genomske DNK. Takvi ciljani događaji razdvajanja mogu se koristiti, na primer, za indukovanje ciljane mutageneze, indukovanje ciljanih brisanja ćelijskih sekvenci DNK i olakšavanje ciljane rekombinacije na unapred određenom hromozomskom lokusu u ćelijama iz bilo kog organizma. Pogledati npr. SAD patente br.9,045,763; 9,005,973; 8,956,828; 8,945,868; 8,586,526; 6,534,261;

6,599,692; 6,503,717; 6,689,558; 7,067,317; 7,262,054; 7,888,121; 7,972,854; 7,914,796; 7,951,925; 8,110,379; 8,409,861; SAD patentne publikacije 20030232410; 20050208489; 20050026157; 20050064474; 20060063231; 20080159996; 201000218264; 20120017290; 20110265198; 20130137104; 20130122591; 20130177983 i 20130177960 i 20150056705 i SAD publikaciju br.14/706,747. Ovi postupci često uključuju upotrebu sintetičkih sistema razdvajanja za indukovanje dvostrukog lanca (DSB) ili zareza u ciljanoj DNK sekvenci, tako da popravka prekida nastalog pogrešnim procesom, poput spajanja na nehomolognom kraju (NHEJ) ili popravka korišćenjem šablona popravke (popravak usmeren na homologiju ili HDR) mogu rezultovati izbacivanjem gena ili umetanjem sekvence od interesa (ciljana integracija). Izabrani put popravke (NHEJ nasuprot HDR, ili oba) obično zavisi od prisustva šablona popravke i aktivnosti nekoliko konkurentskih puteva popravki.

[0004] Uvođenje dvostrukog prekida u odsustvu spoljnog šablona popravke (npr. donora) se obično koristi za inaktivaciju ciljanog gena putem mutacija koje uvodi NHEJ ćelijski put. NHEJ putevi se mogu odvojiti na standardni put zavisan od Ku i alternativni put nezavisan od Ku zasnovan na završnom spajanju posredovanom mikrohomologijom, što koristi kratke tragove direktnih ponavljanja u blizini mesta razdvajanja. Obrasci umetanja i/ili brisanja („indeli“) nakon uređivanja gena putem ova dva NHEJ puta se razlikuju, što može rezultovati razlikama u funkcionalnim posledicama mutacija, u zavisnosti od primene.

[0005] U prisustvu donora koji se spolja isporučuje i koji nosi delove homologije u sekvence uz bok prekida dvostrukog lanca, homologijom usmerena popravka gena (HDR) pomoću donorskih molekula može se koristiti za promenu sekvence jedne baze ili malog dela DNK („korekcija gena“) ili, na drugom ekstremu, za ciljano umetanje čitave kasete eksprimiranja („dodavanje gena“) na unapred određeno genomsko mesto.

[0006] Do razdvajanja može doći korišćenjem specifičnih nukleaza kao što su sintetičke cinkov prst nukleaze (CPN), transkripcijski aktivator poput efektorskih nukleaza (TALEN) ili korišćenjem CRISPR/Cas sistema sa konstruisanom crRNK/tracr RNK ('RNK sa jednim vodičem') da navodi specifično razdvajanje. Pogledati npr. SAD patente br.8,697,359 i 8,932,814 i SAD patentnu publikaciju br.20150056705. Dalje, ciljane nukleaze se razvijaju na osnovu Argonaute sistema (npr., od T. thermophilus, poznat kao „TtAgo“, pogledati Swarts et al (2014) Nature 507(7491): 258-261), koji takođe mogu imati potencijal za upotrebu u uređivanju genoma i genskoj terapiji. WO 2014/036219 obelodanjuje cinkov prst nukleaze za ciljanje ljudskog beta globina.

[0007] Ciljano razdvajanje pomoću jednog od gore pomenutih sistema nukleaza može se iskoristiti za umetanje nukleinske kiseline na određeno ciljano mesto primenom HDR- ili NHEJ-posredovanih procesa. Međutim, isporuka i nukleaznog sistema i donora u ćeliju može biti problematična. Na primer, isporuka donora ili nukleaze transdukcijom plazmida u ćeliju može biti toksična za ćeliju primaoca, posebno za ćeliju koja je primarna ćelija i tako nije robusna kao ćelija iz ćelijske linije.

[0008] CD34+ matične ili progenitore ćelije su heterogeni skup ćelija koje karakteriše njihova sposobnost da se obnavljaju i/ili diferenciraju u ćelije limfoidne linije (npr. T ćelije, B ćelije, NK ćelije) i mijeloidne linije (npr. monociti, eritrociti, eozinofili, bazofili i neutrofili). Njihova heterogena priroda proizilazi iz činjenice da unutar populacije matičnih CD34+ ćelija postoji više podgrupa koje često odražavaju multipotenciju (nezavisno od linije) određene grupe. Na primer, CD34+ ćelije koje su CD38- su primitivnije, nezrele CD34+ progenitorne ćelije, (takođe se nazivaju i dugoročni hematopoetski progenitori), dok su CD34+CD38+ (kratkoročni hematopoetski progenitori) predane linije (pogledati Stella et al (1995) Hematologica 80:367-387). Kada ova populacija dalje napreduje putem diferencijacije, CD34 marker se gubi. CD34+ matične ćelije imaju ogroman potencijal u kliničkoj ćelijskoj terapiji.

[0009] Crvena krvna zrnca (CKZ) ili eritrociti su glavna ćelijska komponenta krvi. U stvari, eritrociti čine jednu četvrtinu ćelija kod čoveka. Zrelim eritrocitima nedostaje jezgro i mnoge druge organele kod ljudi, i prepuni su hemoglobina, metaloproteina koji se nalazi u eritrocitima i koji funkcioniše tako da prenosi kiseonik u tkiva, kao i da prenosi ugljendioksid iz tkiva i nazad u pluća radi uklanjanja. Protein čini približno 97% suve težine eritrocita i povećava sposobnost prenošenja kiseonika u krvi za oko sedamdeset puta.

Hemoglobin je heterotetramer koji se sastoji od dva lanca α-sličnog globina i dva lanca βsličnog globina i 4 heme grupe. Kod odraslih, α2β2 tetramer se naziva Hemoglobin A (HbA) ili odrasli hemoglobin. Tipično, alfa i beta globin lanci se sintetišu u približnom odnosu 1:1 i čini se da je ovaj odnos presudan u pogledu stabilizacije hemoglobina i eritrocita. U stvari, u nekim slučajevima kada je jedan tip gena globina neadekvatno eksprimiran (pogledati u nastavku), smanjujući eksprimiranje (npr. korišćenjem specifične siRNK) druge vrste globina, vraćanje ovog 1:1 odnosa ublažava neke aspekte mutiranog ćelijskog fenotipa (pogledati Voon et al (2008) Haematologica 93(8): 1288). U fetusu u razvoju razvija se drugačiji oblik hemoglobina, fetalni hemoglobin (HbF) koji ima veći afinitet za vezivanje za kiseonik od hemoglobina A, tako da kiseonik može da se isporuči u bebin sistem kroz majčin krvotok. Fetalni hemoglobin takođe sadrži dva lanca α globina, ali umesto odraslih lanaca βglobina ima dva fetalna lanca γ-globina (tj. fetalni hemoglobin je α2γ2). Nakon otprilike 30 nedelja gestacije, sinteza γ globina u fetusu počinje da opada dok se proizvodnja β globina povećava. Do približno 10 meseci starosti, hemoglobin novorođenčeta je gotovo čitav α2β2, iako nešto HbF ostaje u odrasloj dobi (približno 1-3% ukupnog hemoglobina). Regulacija prelaska sa proizvodnje γ na β je prilično složena i prvenstveno uključuje regulaciju eksprimiranja γ globina naniže uz istovremenu regulaciju eksprimiranja β globina naviše.

[0010] Genetski defekti u sekvencama koje kodiraju lance hemoglobina mogu biti odgovorni za brojne bolesti poznate kao hemoglobinopatije, uključujući srpastu anemiju i talasemije. Kod većine pacijenata sa hemoglobinopatijama, geni koji kodiraju γ globin ostaju prisutni, ali je eksprimiranje relativno nisko zbog normalne represije gena koja se dešava oko porođaja, kao što je opisano iznad.

[0011] Procenjuje se da 1 od 5000 ljudi u SAD ima bolest srpastih ćelija (SCD), što se uglavnom javlja kod ljudi poreklom iz podsaharske Afrike. Čini se da heterozigotnost srpastih ćelija ima koristi pri zaštite od malarije, pa je ova osobina možda odabrana tokom vremena, tako da se procenjuje da u podsaharskoj Africi jedna trećina populacije ima osobinu srpastih ćelija. Bolest srpastih ćelija je uzrokovana mutacijom gena β-globina gde je valin supstituisan za glutaminsku kiselinu u aminokiselini #6 (GAG do GTG na nivou DNK), gde se rezultujući hemoglobin naziva „hemoglobin S“ ili „HbS“. Pod uslovima nižeg kiseonika, konformacioni pomak u dezoksi obliku HbS izlaže hidrofobni deo na proteinu između E i F heliksa. Hidrofobni ostaci valina na položaju 6 beta lanca u hemoglobinu mogu da se povežu sa hidrofobnim flasterom, uzrokujući agregaciju HbS i stvaranje vlaknastih taloga. Ovi agregati zauzvrat uzrokuju abnormalnost ili „srpastost” eritrocita, što rezultuje gubitkom fleksibilnosti ćelija. Srpasti eritrociti više nisu u stanju da se stisnu u kapilarne košuljice i mogu rezultovati vazo-okluzivnom krizom kod pacijenata sa srpastim ćelijama. Pored toga, srpasti eritrociti su krhkiji od normalnih eritrocita i teže ka hemolizi, što na kraju dovodi do anemije kod pacijenta.

[0012] Tretman i upravljanje pacijentima sa srpastim ćelijama je doživotno i uključuje tretman antibioticima, tretman bola i transfuzije tokom akutnih epizoda. Jedan od pristupa je upotreba hidroksiuree, koja svoje efekte delimično povećava povećanjem proizvodnje γ globina. Dugotrajni neželjeni efekti terapije hroničnom hidroksiureom još uvek nisu poznati, međutim tretman ima neželjene efekte i može imati različitu efikasnost od pacijenta do pacijenta. Uprkos povećanju efikasnosti tretmana srpastih ćelija, životni vek pacijenata je i dalje tek u srednjim i krajnjim 50-im godinama, i povezani morbiditeti bolesti imaju dubok uticaj na kvalitet života pacijenta.

[0013] Prema tome, ostaje potreba za dodatnim postupcima i sastavima koje se mogu koristiti za uređivanje genoma, za korekciju aberantnog gena ili promenu eksprimiranja drugih, na primer za tretman hemoglobinopatija, poput bolesti srpastih ćelija.

SAŽETAK

[0014] Pronalazak pruža genetski modifikovanu ćeliju koja sadrži: par cinkov prst nukleaza koje se vezuju za SEQ ID NO: 23 i SEQ ID NO: 24 i prave dvolančanu pauzu u endogenom genu ljudskog beta-hemoglobina (Hbb); i genomsku modifikaciju unutar 1-300 baznih parova od SEQ ID NO: 23 ili SEQ ID NO: 24 od Hbb gena nakon dvolančanog prekida parom cinkov prst nukleaza, gde par sadrži proteine cinkovog prsta označene kao 33488 i 33501; 33488 i 47817; 47773 i 33501; ili 47773 i 47817 u Tabeli 1, i gde genomska modifikacija uključuje umetanje i/ili brisanje.

Pronalazak takođe pruža in vitro postupak za pravljenje genetski modifikovane ćelije koji uključuje umetanje i/ili brisanje unutar 1-300 baznih parova od SEQ ID NO: 23 ili SEQ ID NO: 24 od endogenog ljudskog gena beta-hemoglobina (Hbb), gde postupak uključuje pravljenje dvolančanog prekida pomoću para cinkov prst nukleaza koji se vezuju za SEQ ID NO: 23 i SEQ ID NO: 24 i čine dvolančanu pauzu u Hbb genu, gde par sadrži proteine cinkovog prsta označene kao 33488 i 33501; 33488 i 47817; 47773 i 33501; ili 47773 i 47817 u Tabeli 1.

Pronalazak dalje pruža genetski modifikovanu diferenciranu ćeliju koja potiče od genetski modifikovane matične ćelije pronalaska, opciono u kojoj diferencirana ćelija jeste crveno krvno zrnce (CKZ), i genetski modifikovana diferencirana ćelija sadrži: - par cinkov prst nukleaza koje se vezuju za SEQ ID NO: 23 i SEQ ID NO: 24 i napravi dvolančani prekid u Hbb genu; i - genomsku modifikaciju unutar 1-300 baznih parova od SEQ ID NO: 23 ili SEQ ID NO: 24 od Hbb gena nakon dvolančanog prekida parom cinkov prst nukleaza, gde par sadrži proteine cinkovog prsta označene kao 33488 i 33501; 33488 i 47817; 47773 i 33501; ili 47773 i 47817 u Tabeli 1, i gde genomska modifikacija uključuje umetanje i/ili brisanje. Pronalazak pruža farmaceutski sastav koji sadrži genetski modifikovanu ćeliju pronalaska. Pronalazak takođe pruža cinkov prst nukleazu koja sadrži protein cinkovog prsta i domen razdvajanja ili polu-domen razdvajanja, gde protein cinkovog prsta sadrži 5 ili 6 domena cinkovog prsta koji sadrže prepoznatljiv spiralni region, gde protein cinkovog prsta sadrži spiralne regione za prepoznavanje regioni poređane kako je prikazano u proteinima označenim kao 33488, 47773 ili 47817 u Tabeli 1.

Pronalazak dalje pruža fuzioni protein koji sadrži protein cinkovog prsta kako je definisano u cinkov prst nukleazi prema pronalasku i divlji ili sintetički polu-domen razdvajanja.

Pronalazak pruža nukleazu koja sadrži par cinkov prst nukleaza, od kojih svaka cinkov prst nukleaza sadrži protein cinkovog prsta i domen razdvajanja ili polu-domen razdvajanja, gde protein cinkovog prsta sadrži 5 ili 6 domena cinkovog prsta koji sadrže spiralni region prepoznavanja, gde par sadrži proteine cinkovog prsta označene kao 33488 i 33501; 33488 i 47817; 47773 i 33501; ili 47773 i 47817 u Tabeli 1.

Pronalazak takođe pruža polinukleotid koji kodira jednu ili više cinkov prst nukleaza prema pronalasku, fuzioni protein prema pronalasku ili nukleazu prema pronalasku. Pronalazak dalje pruža izolovanu ćeliju koja sadrži par cinkov prst nukleaza, od kojih svaka cinkov prst nukleaza sadrži protein cinkovog prsta i domen razdvajanja ili polu-domen razdvajanja, gde protein cinkovog prsta sadrži 5 ili 6 domena cinkovog prsta koji obuhvataju spiralni region prepoznavanja, gde par sadrži proteine cinkovog prsta označene kao 33488 i 33501; 33488 i 47817; 47773 i 33501; ili 47773 i 47817 u Tabeli 1, opciono gde ćelija jeste crveno krvno zrnce (CKZ) ili prekursorska ćelija (npr. CD4+ hematopoetska matična ćelija).

Pronalazak pruža komplet koji sadrži par cinkov prst nukleaza ili polinukleotid koji kodira par cinkov prst nukleaza, od kojih svaka cinkov prst nukleaza sadrži protein cinkovog prsta i domen razdvajanja ili polu-domen razdvajanja, gde protein cinkovog prsta sadrži 5 ili 6 domena cinkovog prsta koji sadrže spiralni region prepoznavanja, gde par sadrži proteine cinkovog prsta označene kao 33488 i 33501; 33488 i 47817; 47773 i 33501; ili 47773 i 47817 u Tabeli 1.

Pronalazak takođe pruža in vitro postupak promene eksprimiranja Hbb u ćeliji, koji sadrži: uvođenje u ćeliju jednog ili više polinukleotida koji kodiraju par cinkov prst nukleaza, od kojih svaka cinkov prst nukleaza sadrži protein cinkovog prsta i domen razdvajanja ili poludomen razdvajanja, gde protein cinkovog prsta sadrži 5 ili 6 domena cinkovog prsta koji sadrže spiralni region prepoznavanja, gde par sadrži proteine cinkovog prsta označene kao 33488 i 33501; 33488 i 47817; 47773 i 33501; ili 47773 i 47817 u Tabeli 1, pod uslovima koji omogućavaju eksprimiranje jednog ili više proteina i menjanje eksprimiranja Hbb gena, opciono dalje obuhvatajući integrisanje donorske sekvence u genom ćelije.

Pronalazak dalje pruža genetski modifikovanu ćeliju pronalaska za upotrebu u tretmanu hemoglobinopatije, kao što je anemija srpastih ćelija, gde ćelija jeste matična ćelija hematopoeze, prekurskor crvenog krvnog zrnca ili crveno krvno zrnce i ugrađuje se u pacijenta.

Pronalazak pruža genetski modifikovanu ćeliju koja sadrži genomsku modifikaciju unutar 1-300 baznih parova od SEQ ID NO: 23 ili SEQ ID NO: 24 od endogenog ljudskog gena betahemoglobina (Hbb) nakon dvolančanog prekida parom cinkov prst nukleaza, gde par sadrži proteine cinkovog prsta označene kao 33488 i 33501; 33488 i 47817; 47773 i 33501; ili 47773 i 47817, gde genomska modifikacija obuhvata integraciju donorskog polinukleotida koji kodira transgen koji ispravlja mutaciju srpastih ćelija, i gde integracija donorskog polinukleotida uvodi jednu ili više tihih mutacija kao što je prikazano na Slici 4C, koje blokiraju ponovno razdvajanje cinkov prst nukleaze.

[0015] Ovde su otkriveni postupci i sastavi za promenu eksprimiranja ili za korekciju jednog ili više gena koji kodiraju proteine koji su uključeni u genetsku bolest (npr. proizvodnja proteina koji nedostaju, koji su deficitarni ili nepravilni as tom bolesti i/ili proteina koji regulišu ove proteine), poput bolesti srpastih ćelija. Opisani su sastavi i postupci za upotrebu u genskoj terapiji i inženjeringu genoma.

[0016] Promena takvih proteina može rezultovati tretmanom ovih genetskih bolesti.

Konkretno, uređivanje genoma se koristi za korekciju aberantnog gena, umetanje gena divljeg tipa ili promenu eksprimiranja endogenog gena. Jedan pristup uključuje upotrebu korekcije gena gde se cilja defektni endogeni gen β globina i zamenjuje mutantna sekvenca. Jedan pristup dalje uključuje upotrebu modifikacije matične ćelije (npr., hematopoetska matična ćelija ili CKZ prekursor), gde se matična ćelija zatim može koristiti za ugrađivanje u pacijenta, za tretman hemoglobinopatije.

[0017] U jednom aspektu, ovde opisana je genetski modifikovana ćelija ili ćelijska linija, na primer u poređenju sa divljim genomskom sekvencom istog tipa ćelije ili ćelijske linije. U određenim otelotvorenjima, ćelije sadrže genetski modifikovane CKZ prekursore (matične ćelije hematopoeze poznate kao „HSC“). Ćelija ili ćelijska linija mogu biti heterozigotne ili homozigotne za modifikaciju. Izmene mogu sadržati umetanja, brisanja i/ili njihove kombinacije. HSC se mogu modifikovati konstruisanom nukleazom i donorskom nukleinskom kiselinom tako da se gen divljeg tipa (npr., gen globina) umeće i eksprimira i/ili koriguje endogeni aberantni gen. Izmena (npr., umetanje) mogu biti na ili u blizini mesta vezivanja i/ili razdvajanja nukleaze, uključujući, ali bez ograničenja, modifikacije sekvenci unutar 1-300 (ili bilo koji broj baznih parova između) baznih parova uzvodno ili nizvodno od mesta razdvajanja i/ili mesta vezivanja; modifikacije unutar 1-100 baznih parova (ili bilo koji broj baznih parova između) sa bilo koje strane mesta vezivanja i/ili razdvajanja; modifikacije unutar 1 do 50 baznih parova (ili bilo koji broj baznih parova između) sa obe strane mesta vezivanja i/ili razdvajanja; i/ili modifikacije jednog ili više baznih parova mesta vezivanja nukleaze i/ili mesta razdvajanja. Izmena može biti na ili u blizini (npr., 1-300 baznih parova ili bilo koji broj baznih parova između) SEQ ID NO: 23 ili 24. U nekim otelotvorenjima, modifikacija je 1-100 (ili bilo koji broj baznih parova između) baznih parova od SEQ ID NO: 23 ili 24. U određenim otelotvorenjima, modifikacija je unutar SEQ ID NO: 23 i/ili SEQ ID NO: 24, na primer modifikacija 1 ili više baznih parova u SEQ ID NO: 23 ili 24. U nekim slučajevima, sekvenca gena divljeg tipa za umetanje kodira β globin divljeg tipa. U drugim slučajevima, endogeni aberantni gen je gen β globina, na primer jedna ili više genomskih modifikacija koje ispravljaju najmanje jednu mutaciju u endogenom aberantnom ljudskom genu beta-hemoglobina (Hbb). U nekim aspektima, modifikacija gena beta globina omogućava pravilno spajanje transkribovanih RNK. U drugim aspektima, modifikacija gena beta globina ispravlja mutaciju srpastog alela tako da se kodon GTG koji kodira netačnu aminokiselinu valina na šestom položaju u polipeptidnoj sekvenci menja u GAG, kodirajući glutaminsku kiselinu kako je otkriveno kod divljeg tipa polipeptida. Takođe su pružene delimično ili potpuno diferencirane ćelije poreklom iz genetski modifikovanih matičnih ćelija kako je ovde opisano (npr., CKZ ili ćelije CKZ prekursori). Takođe su pruženi sastavi kao što su farmaceutski sastavi koji sadrže genetski modifikovane ćelije kako su ovde opisane.

[0018] U drugom aspektu, ovde opisan je protein cinkovog prsta (PCP) koji se vezuje za ciljano mesto u regionu od interesa (npr., gen β globina) u genomu, gde PCP sadrži jedan ili više sintetičkih domena koji vezuju cinkov prst. PCP može biti cinkov prst nukleaza (CPN) koja razdvaja ciljani genomski region od interesa, gde CPN sadrži jedan ili više sintetičkih domena koji vezuju cinkov prst i domen razdvajanja ili polu-domen razdvajanja nukleaze. Domeni razdvajanja i polu-domeni razdvajanja mogu se dobiti, na primer, iz različitih restrikcionih endonukleaza i/ili homing endonukleaza. U jednom otelotvorenju, polu-domeni razdvajanja su izvedeni iz restrikcione endonukleaze tipa IIS (npr. Fok I). Domen cinkovog prsta može prepoznati ciljano mesto u genu globina ili genu sigurne luke. Na primer, domen cinkovog prsta može sadržati 5 ili 6 domena cinkovog prsta i prepoznati ciljano mesto u genu globina (npr., protein cinkovog prsta koji ima 5 ili 6 prstiju sa spiralnim regionima prepoznavanja prikazanim u Tabeli 1).

[0019] U drugom aspektu, ovde je opisan TALE protein (poput transkripcionog aktivatora) koji se vezuje za ciljano mesto u regionu od interesa (npr., gen β globina) u genomu, gde TALE sadrži jedan ili više sintetičkih domena koji vezuju TALE. U jednom aspektu obelodanjenja, TALE je nukleaza (TALEN) koja razdvaja ciljani genomski region od interesa, gde TALEN sadrži jedan ili više sintetičkih TALE DNK vezujućih domena i domen razdvajanja ili polu-domen razdvajanja nukleaze. Domeni razdvajanja i polu-domeni razdvajanja mogu se dobiti, na primer, iz različitih restrikcionih endonukleaza i/ili homing endonukleaza. Polu-domeni razdvajanja mogu se izvesti iz restrikcione endonukleaze tipa IIS (npr. Fok I).

[0020] U drugom aspektu, ovde je opisan CRISPR/Cas ili TtAgo sistem koji se vezuje za ciljano mesto u regionu od interesa (npr., gen povezan sa bolešću) u genomu, gde sistem CRISPR/Cas sadrži CRIPSR/Cas nukleazu i sintetičku crRNK/tracrRNK (ili RNK sa jednim vodičem). U određenim aspektima obelodanjenja, CRISPR/Cas ili TtAgo sistem prepoznaju cilj u genu globina.

[0021] U nekim otelotvorenjima, nukleaza koja olakšava genomski inženjering ćelije se isporučuje kao peptid, dok se u drugim isporučuje kao nukleinska kiselina koja kodira nukleazu. U nekim otelotvorenjima koristi se više od jedne nukleaze koja se može isporučiti u obliku nukleinske kiseline, obliku proteina ili njihovim kombinacijama. U nekim poželjnim otelotvorenjima, nukleinska kiselina koja kodira nukleazu je mRNK, a u nekim slučajevima je mRNK zaštićena. U daljim poželjnim otelotvorenjima, mRNK može sadržati ARCA kapu i/ili može sadržati smešu modifikovanih i nemodifikovanih nukleotida. U aspektima obelodanjenja, nukleaza može sadržati cinkov prst nukleazu (CPN), TALE-nukleazu (TALEN), TtAgo ili CRISPR/Cas sistem nukleaze ili njihovu kombinaciju. U poželjnom otelotvorenju, nukleinska kiselina koja kodira nukleazu isporučuje se elektroporacijom. U drugom aspektu, ovde opisan je postupak za povećanje ciljane integracije (npr., putem HDR) nakon razdvajanja posredovanog nukleazom u ćeliji. U određenim aspektima obelodanjenja, postupci obuhvataju korake: (i) uvođenja jedne ili više nukleaza (i/ili mRNK ili konstrukti eksprimiranja koji eksprimiraju nukleazu i jednu ili više vodećih RNK po potrebi) zajedno sa jednim ili više donorskih molekula u ćeliju domaćina i (ii) uvođenje jednog ili više faktora koji utiču i/ili povećavaju ekspanziju matičnih ćelija bez gubitka strogosti ili diferencijacije u ćeliji i/ili medijumu za kulturu koji sadrže ćeliju pre, tokom i/ili nakon uvođenja nukleaze. Donor može biti isporučen pre, posle ili zajedno sa nukleinskom kiselinom koja kodira nukleazu.

[0022] Donor se može isporučiti virusnim i/ili nevirusnim postupcima prenosa gena. U

1

drugim otelotvorenjima, donor se isporučuje u ćeliju putem adeno povezanog virusa (AAV). U nekim slučajevima, AAV sadrži LTR koji su heterolognog serotipa u poređenju sa kapsidnim serotipom. U drugim otelotvorenjima, donor se isporučuje u ćeliju putem lentivirusa. U nekim slučajevima, lentivirus je lentivirus sa oštećenjem integraze (IDLV).

[0023] U određenim otelotvorenjima, donorska nukleinska kiselina se integriše pomoću nehomolognih postupaka (npr., NHEJ). Kao što je gore napomenuto, nakon in vivo razdvajanja, donorske sekvence mogu se ciljano integrisati u genom ćelije na mestu DSB. Donorska sekvenca može da uključuje jedno ili više istih ciljanih mesta za jednu ili više nukleaza korišćenih za stvaranje DSB. Prema tome, donorska sekvenca može biti razdvojena jednom ili više istih nukleaza koje se koriste za razdvajanje endogenog gena u kom se želi integracija. U određenim otelotvorenjima, donorska sekvenca uključuje različita ciljana mesta nukleaze od nukleaza korišćenih za indukciju DSB. DSB u genomu ciljane ćelije mogu se stvoriti bilo kojim mehanizmom. DSB može da se stvori od jedne ili više cinkov prst nukleaza (CPN), fuzionim proteinima koji sadrže domen za vezivanje cinkovog prsta, koji je projektovan da vezuje sekvencu unutar regiona od interesa, i domenom razdvajanja ili poludomenom razdvajanja. U drugim aspektima obelodanjenja, DSB je stvoren od jednog ili više TALE DNK-vezujućih domena (koji se javljaju u prirodi ili koji se ne javljaju u prirodi) spojenih sa domenom nukleaze (TALEN). U još daljim aspektima obelodanjenja, DSB je stvoren korišćenjem CRISPR/Cas sistema nukleaze gde se sintetička RNK sa jednim vodičem ili njen funkcionalni ekvivalent koriste za vođenje nukleaze do ciljanog mesta u genomu. U još daljim aspektima obelodanjenja, DSB je stvoren korišćenjem TtAgo sistema.

[0024] U drugom aspektu, opisani su kompleti koji su korisni za povećanje poremećaja gena i/ili ciljane integracije (npr. korekcija gena) nakon razdvajanja genoma ćelije posredovanog nukleazom (npr. CPN, fuzioni proteini nukleaze TAL-efektorskog domena, TtAgo sistem ili sintetičke homing endonukleaze ili sintetički RNK vodiči sa CRISPR/Cas sistemom).

Kompleti obično uključuju jednu ili više nukleaza koje se vezuju za ciljano mesto, jedan ili više faktora koji utiču na ekspanziju i/ili diferencijaciju matičnih ćelija i uputstva za uvođenje u ćelije nukleaza i faktora koji utiču na matične ćelije, tako da su poboljšani poremećaj gena posredovan nukleazom i/ili ciljana integracija. Opciono, ćelije koje sadrže ciljano mesto nukleaze takođe mogu biti uključene u ovde opisane komplete. Kompleti mogu sadržati najmanje jedan konstrukt sa ciljanim genom i poznatom nukleazom sposobnom za razdvajanje unutar ciljanog gena. Takvi kompleti su korisni za optimizaciju uslova razdvajanja kod različitih vrsta ćelija domaćina. Ostali paketi mogu sadržati poznatu nukleazu koja se može razdvajati unutar poznatog ciljanog lokusa u genomu, i mogu dodatno sadržati donorsku nukleinsku kiselinu. U nekim aspektima, donorska DNK može kodirati polipeptid, regulatorni region ili strukturnu nukleinsku kiselinu. U nekim otelotvorenjima, polipeptid je reporter gen (npr. GFP). Takvi kompleti su korisni za optimizaciju uslova za integraciju donora ili za izgradnju specifično modifikovanih ćelija, ćelijskih linija i životinja koje sadrže poremećaje gena ili ciljana umetanja.

[0025] U drugim aspektima, opisani su postupci primene pacijentu genetski modifikovane matične ćelije kako je ovde opisano. Genetski modifikovani prekursori krvnih zrnaca („HSC/PC“), kako su ovde opisani, obično se primenjuju pri transplantaciji koštane srži, i HSC/PC diferencira i sazreva in vivo. U nekim otelotvorenjima, HSC/PC su izolovani nakon mobilizacije indukovane pomoću G-CSF, a u drugima su ćelije izolovane iz ljudske koštane srži ili pupčanih vrpca. U nekim aspektima, HSC/PC se uređuju tretiranjem nukleazom dizajniranom da izbaci određeni gen ili regulatornu sekvencu. U drugim aspektima, HSC/PC su modifikovani konstruisanom nukleazom i donorskom nukleinskom kiselinom tako da se gen divljeg tipa ili drugi gen od interesa umeće i eksprimira i/ili je korigovan endogeni aberantni gen. U nekim otelotvorenjima, modifikovani HSC/PC se primenjuju pacijentu nakon blagog mijeloablativnog predkondicioniranja. U drugim aspektima, HSC/PC se primenjuje nakon pune mijeloablacije, tako da nakon ugrađivanja, 100% hematopoetskih ćelija potiče iz modifikovanog HSC/PC. Dalje, ćelija može biti zaustavljena u G2 fazi ćelijskog ciklusa.

[0026] U nekim otelotvorenjima, transgena HSC/PC ćelija uključuje transgen koji kodira ljudski gen. U nekim slučajevima, transgena životinja sadrži nokaut na endogenom lokusu koji odgovara egzogenom transgenu, omogućavajući tako razvoj in vivo sistema gde se ljudski protein može proučavati izolovano. Takvi transgeni modeli mogu se koristiti u svrhe skrininga za identifikaciju malih molekula ili velikih biomolekula ili drugih entiteta koji mogu da interaguju ili modifikuju ljudski protein od interesa. U nekim aspektima, transgen je integrisan u izabrani lokus (npr., sigurna luka) u matičnu ćeliju (npr., embrionalna matična ćelija, indukovana pluripotentna matična ćelija, hematopoetska matična ćelija, itd.) ili životinjski embrion dobijen bilo kojim od ovde opisanih postupaka, i zatim se embrion implantira tako da se rodi živa životinja. Životinja se potom uzgaja do polne zrelosti i dozvoljava joj se potomstvo u kom barem deo potomstva sadrži uređenu endogenu sekvencu gena ili integrisani transgen.

[0027] Ovi i drugi aspekti će biti lako vidljivi stručnjaku u svetlu obelodanjenja u celini. KRATAK OPIS SLIKA

[0028]

Slike 1A do 1E pokazuju razdvajanje i korekciju na lokusu beta-globina u CD34+ ćelijama koristeći IDLV donora. Slika 1A (SEQ ID NO: 3) prikazuje deo DNK sekvence egzona I beta-globina koji prikazuje CPN ciljana mesta (podvučena) na vrhu početnog kodona (podebljano) i srpaste mutacije (podebljano, kurziv). Slika 1B je gel koji pokazuje ciljano razdvajanje na lokusu beta-globina u CD34+ ćelijama krvi pupčane vrpce čoveka. Ćelije su analizirane tri dana nakon elektroporacije sa in vitro transkribovanom mRNK koja kodira CPN. „Lažno“ predstavlja neobrađene CD34+ ćelije. Strelice označavaju presečene trake nakon PCR amplifikacije i varenja sa Surveyor® nukleazom (Transgenomic®). Slika 1C je šematski prikaz korekcije gena specifične za mesto na srpastoj mutaciji u genu beta globina u odnosu na egzone 1 i 2. Takođe su ilustrovani detalji donorskog konstrukta i rezultujuće genomske DNK nakon razdvajanja CPN i popravke pomoću HDR. Lokacija srpaste mutacije i HhaI RFLP (zvezdica) je naznačena. Lokacije prajmera za geodetske nukleaze i RFLP testove prikazane su ispod. Egzoni na skali; heš oznake pod uglom označavaju regione koja se ne mogu menjati. Slika ID je RFLP gel za ciljanu modifikaciju gena beta-globina u prisustvu CPN i donora. CD34+ ćelije krvi iz pupčane vrpce (CB) su elektroporisane sa in vitro transkribovanom CPN mRNK i/ili transducirane sa donorskim koji sadrži IDLV kako je naznačeno na vrhu gela. Ćelije su sakupljene četiri dana nakon tretmana, PCR je pojačan izvan donorskog regiona, digestiran sa HhaI enzimom, i rastvoren na agaroznom gelu. Strelica prikazuje razdvojeni proizvod, što ukazuje na ugradnju RFLP u genom na ciljanom mestu. Slika 1E je grafikon koji prikazuje procente modifikacije gena u CD34+ ćelijama pod navedenim uslovima. CB CD34+ ćelije su elektroporisane sa in vitro transkribovanom CPN mRNK i transducirane sa donorskim IDLV. Ćelije su sakupljene tri dana nakon tretmana, PCR je pojačan izvan donorske regije i qPCR je dovršen prajmerima dizajniranim da specifično detektuju ugradnju tihe promene baze koja generiše HhaI RFLP i normalizovano je na prajmere koji se vezuju u Egzonu 2 lokusa beta-globina u amplikonu, (n=4 za sve uslove). Modifikacija gena pronađena je u približno 18% ćelija tretiranih i sa CPN i sa donorom.

1

Slike 2A do 2D pokazuju rezultate optimizacije CPN i IDLV doza koje se koriste za transdukciju. Slika 2A, B i C su grafikoni koji prikazuju rezultate nakon titracije CPN mRNK. CD34+ ćelije su elektroporirane sa sve većim količinama in vitro transkribovane CPN mRNK i transducirane sa konstantnom količinom donorskog IDLV. Lažno ukazuje na neobrađene ćelije, uzorak samo CPN se elektroporiše se sa 30 µg/ml svakog od CPN, uzorak samo IDLV se pulsira i transducira sa 2E+07 TU/ml donorskog IDLV. Slika 2A prikazuje stope modifikacije gena tokom 3 dana nakon elektroporacije, kako je određeno pomoću qPCR za RFLP. Slika 2B prikazuje ekspanziju savijanja tokom 1 dana nakon elektroporacije, a Slika 2C prikazuje održivost ćelija 1 dan nakon elektroporacije, kako je određeno bojom za isključivanje tripana, (n=8 za sve uslove). Slika 2D prikazuje šemu donorskog integrativno oštećenog lentivirusnog vektora (IDLV): 1.1kb region beta-globina kloniran je obrnuto u odnosu na promoterske elemente u dugačkom terminalnom ponavljanju (LTR) u lentivirusnoj kičmi u kojoj 3' LTR sadrži samo-inaktivirajuće (SIN) brisanje koja se prenosi tokom obrnute transkripcije na 5' LTR provirusne DNK. UTR: neprevedena regija, RRE: element rev-odgovora, Int: intron.

Slike 3A do 3C su grafikoni koji prikazuju titraciju donorskog IDLV. CD34+ ćelije su elektroporisane sa konstantnom količinom in vitro transkribovane CPN mRNK i transducirane sa sve većim količinama donorskog IDLV. Lažno ukazuje na neobrađene ćelije, uzorak samo CPN elektroporiše se sa 10 µg/ml svakog od CPN, uzorak samo IDLVse pulsira i transducira sa 6E+07 TU/ml donorskog IDLV. Slika 3A pokazuje stope modifikacije gena tokom 3 dana nakon elektroporacije kako je određeno sa qPCR za RFLP. Slika 3B pokazuje ekspanziju savijanja 1 dan nakon elektroporacije, a Slika 3C pokazuje održivost ćelija tokom 1 dana nakon elektroporacije, kako je određeno bojom za isključivanje tripana, (n=6 za sve uslove).

Slike 4A do 4F prikazuju korekciju pomoću CPN para 33488/33501 na lokusu betaglobina u CD34+ ćelijama pomoću donorskog oligonukleotida. Slika 4A prikazuje šemu modifikacije gena usmerenu na oligonukleotide (SEQ ID NO: 4 i 5). Slika 4B je gel od AvrII-digestiranog PCR amplikona od lokusa beta-globina. Fragment sadrži nativno AvrII mesto, čije razdvajanje služi kao unutrašnja kontrola za AvrII digestiju (donja traka na gelu). Strelice označavaju proizvode AvrII razdvajanja. U prisustvu oligodonora i CPN, postoji stopa korekcije gena od 15%. Slika 4C prikazuje šest mogućih mesta tihe mutacije na mestu vezivanja SBS#33501 CPN (SEQ ID NO: 53 za WT i SEQ ID NO: 54 za SMS). Srpasta mutacija u kurzivu, moguća mesta za tihu mutaciju (SMS) su podebljana. Slika 4D pokazuje da su tihe mutacije povećale korekciju gena kod beta-globina. mPB CD34+ ćelije su transficirane sa CPN i naznačenim donorskim oligonukleotidom. Uvođenje relevantne tihe mutacije ispitivano je pomoću visokopropusnog sekvenciranja. Bele trake označavaju umetanja i brisanja (indeli); sive trake, korekciju gena. Slika 4E pokazuje da tihe mutacije blokiraju ponovno razdvajanje CPN. Aleli sa indelima ispitivani su da li postoje dokazi o modifikacijama posredovanim homologijom. Prikazani su procenti alela sa modifikovanim genom koji takođe imaju dokaze o indelima koji su NHEJ-vođeni. Slika 4F pokazuje optimizaciju koncentracije CPN i tipa donora. NHEJ-vođeni indeli (bele trake) i korekcija gena (sive trake) analizirani su visokopropusnim sekvenciranjem DNK. S obzirom na dubinu sekvenciranja DNK sa visokim protokom, očekuje se da će greška u merenju biti vrlo mala. WT: divlji tip; SMS: lokacije sa tihom mutacijom; oligo: oligonukleotid.

Slika 5 pokazuje optimizaciju dužine i žice donora. mPB CD34+ ćelije su transficirane kombinacijama CPN i oligonukleotida dizajniranih da uvedu sekvencu od tri bazna para u lokus beta-globina. Sakupljane su ćelije, i nivoi indela koji su NHEJ-vođeni i ciljana integracija ove kratke sekvence ispitivani su visokopropusnim sekvenciranjem DNK (HTS). Po uzorku je dobijeno približno 4-9.000 očitavanja sekvence.

Slike 6A i 6B prikazuju delimične HDR događaje i obelodanjuju da se sinteza tokom oligo-posredovane modifikacije gena odvija sa leva na desno. Slika 6A prikazuje podatke o sekvenciranju DNK sa visokom propusnošću i SMS124 donora sa Slike 3F koji su analizirani radi dokaza o delimičnim HDR proizvodima (SMS1, SMS12, SMS24 i SMS4 aleli). Od ∼41% modifikacija gena u ovom eksperimentu, 6% modifikacija dolazi iz SMS12 događaja, dok su SMS24 aleli gotovo u potpunosti odsutni (0,03%). Ova asimetrija podrazumeva da se sinteza DNK odvija sa leva na desno. Slika 6B pokazuje to koristeći prosek podataka iz sve tri prikazane koncentracije CPN, sa događajima od 30 i 60 µg/mL uzoraka normalizovanih naviše da odgovaraju ∼41%modifikaciji gena viđenoj u uzorku od 15 µg/mL.

Slike 7A do 7D pokazuju ciljanu analizu razdvajanja na klasteru gena beta-globina.

Slika 7A je ilustracija GFP hvatanja na naredni način: K562 ćelije eritroleukemije su elektroporisane sa in vitro transkribovanom mRNK i transducirane sa IDLV vektorom koji eksprimira GFP. Ćelije su kultivisane 60 dana kako bi se razblažile sve nezarobljene GFP, nakon čega su GFP pozitivne ćelije sortirane korišćenjem

1

sortiranja ćelija aktiviranog fluorescencijom (FACS). Na uzorcima je izvršen nrLAM-PCR i završena je analiza mesta vektorske integracije. Prikazan je pregled najčešćih integracionih mesta na beta-globinu i delta-globinu utvrđenim pomoću klaster analize. HBB: ljudski hemoglobin beta divljeg tipa; HBD: ljudski hemoglobin delta.

Slika 7B prikazuje poravnatje delimičnih sekvenci gena globina na hromozomu 11 u klasteru gena beta-globina oko mesta sečenja CPN (SEQ ID NO: 6 do 11). CPN mesta vezivanja su podvučena, srpasta mutacija je podebljana, u kurzivu. HBB: ljudski hemoglobin beta divljeg tipa; HBD: ljudski hemoglobin delta; HBE1:ljudski hemoglobin epsilon; HBBP1:ljudski hemoglobin beta pseudogen 1; HBG1:ljudski hemoglobin gama A; HBG2: ljudski hemoglobin gama G. Slika 7C je gel koji pokazuje Surveyor® test nukleaze CD34+ ćelija tretiranih sa CPN in vitro transkribovanom mRNK ili netretiranih (Lažno). Svaki od naznačenih klaster gena beta globina pojačan je oko regiona najviše homologije sa ciljanim mestom i razdvojen je sa Surveyor® nukleauom. Rasponi su kvantifikovani denzitometrijom.

Slika 7D je gel koji pokazuje Surveyor® test nukleaze uzoraka koštane srži pacijenta sa SCD kao na Slici 7B. Heterozigotnost polimorfizma jednog nukleotida u gamagenu globina dovela je do pozadinskog razdvajanja, čak i u uzorcima koji nisu bili izloženi CPN (tanke strelice).

Figura 8 je grafikon koji prikazuje potencijal formiranja kolonija za CPN i oligonukleotide modifikovane sa HSPC. mPB CD34+ ćelije su ili lažno transficirane, ili transficirane sa 10 µg/mL CPN ili transficirane sa CPN i donorskim oligonukleotidom pri 3 µM. Posle pet dana kultivisanja, ćelije su stavljene u metilcelulozu i medijum koji sadrži citokine i diferencirane. Posle petnaest dana rasta jedinice za formiranje kolonija (CFU) su prebrojane i morfološki klasifikovane kao eritroid (E), jedinice koje formiraju ispuštanje - eritroid (BFU-E), granulocit/makrofag (GM) ili granulocit/eritroid/makrofag/megakariocit (GEMM). Slike 9A i 9B pokazuju stabilnost modifikovanih ćelija tokom diferencijacije eritroida. Slika 9A pokazuje da su mPB CD34+ ćelije transficirane sa CPN pri 0, 3,75, 7,5, 15 ili 30 µg/mL i donorskim oligonukleotidom pri 3 µM ili transficirane samo sa donorskim oligonukleotidom. Ćelije su indukovane da se diferenciraju u crvena krvna zrnca i alikvoti su uklonjeni nakon 0, 6, 12, 15 i 18 dana. Genomska DNK je pripremljena iz ćelija i učestalost genetski modifikovanih ćelija analizirana je pomoću sekvenciranja velike propusnosti. Dobijeno je približno 10-50.000 očitavanja sekvence po uzorku po vremenskoj tački. Slika 9B prikazuje HPLC analizu proteina

1

globina u sintetičkim ćelijama.

Slike 10A do 10E pokazuju transplantaciju CPN i ćelija tretiranih donorima kod NSG miševa. Slika 10A pokazuje stope modifikacije gena u masi transplantiranih ćelija tretiranih sa CPN+IDLV i kultivisanih in vitro kako je određeno pomoću qPCR za RFLP 7 dana nakon elektroporacije. Lažne ćelije se ne tretiraju (n=3 nezavisna eksperimenta). Slika 10B je grafikon koji prikazuje modifikaciju suštinski srpa procenjenu visokopropusnim sekvenciranjem za CPN+IDLV modifikovane CD34+ ćelije. Rezultati sekvenciranja lokusa beta-globina koji pokazuju procenat ukupnih poravnatih očitavanja koja sadrže izmenjenu podlogu divljeg tipa do srpa (T), kao i umetanja i brisanja (indeli) na mestu sečenja. Isti uzorci kao na Slici 10A.

Promenjena osnova, bela; indeli, sivi. Slika 10C je grafikon koji pokazuje ugrađivanje u perifernu krv transplantiranih miševa pri 5 nedelja i 8 nedelja nakon transplantacije. Ljudska transplantacija određena kao procenat hCD45+ ćelija od ukupnih hCD45+ ćelija i mCD45+ ćelija protočnom citometrijom ćelija miševa koji su primali ili lažne ili CPN+IDLV tretirane ćelije. Lažno, otvoreni dijamanti;

CPN+IDLV, zatvoreni dijamanti. (n=3 nezavisna eksperimenta; lažni n=5, CPN+IDLV n=12). Slika 10D je grafikon koji pokazuje da su CD34+ ćelije elektroporisane sa Oligo, CPN ili CPN+Oligo i kultivisane in vitro pre transplantacije u NSG miševe. Stope modifikacije (n=1) suštinski srpa i indela su prikazane kao na Slici 10C. Slika 10E je grafikon koji pokazuje ugrađivanje u perifernu krv kao na Slici 10C, od ćelija miševa koje primaju Oligo-, CPN- ili CPN+Oligo-tretirane ćelije. Oligo, krugovi; CPN, trouglovi; CPN+Oligo, dijamanti. (Oligo n=8, CPN n=7, CPN+Oligo n=9), n.s.: nije značajno, * p <0,05, ** p <0,01.

Slike 11A i 11B prikazuju analizu linije transplantiranih NSG miševa u nedelji 8. Imunofenotipska analiza periferne krvi NSG miševa transplantiranih sa lažnim i CPN i ćelijama tretiranim ćelijama na 8 nedelja nakon transplantacije. Procenat ljudskih CD45+ ćelija koje su bile pozitivne na markere B-ćelija (CD19), T-ćelija (CD3), hematopoetskih progenitora (CD34), mijeloidnih progenitora (CD33) i prirodnih ćelija ubica (CD56) numerisan je korišćenjem protočne citometrije. Slika 11A je grafikon koji prikazuje ćelije miševa transplantiranih sa lažnim ili CPN+IDLV tretiranim ćelijama (n=3 nezavisna eksperimenta; lažno n=5, CPN+IDLV n=12). Slika 11B je grafikon koji prikazuje ćelije miševa transplantirane sa oligo-, CPN- ili CPN+Oligo-tretiranim ćelijama, (Oligo n=8, CPN n=7, CPN+Oligo n=9). n.s.: nije značajno; zvezdica označava značaj, * p <0,05, ** p <0,01.

1

Slike 12A do 12D pokazuju završno ugrađivanje periferne krvi i analizu linije. Slika 12A je grafikon koji pokazuje ugrađivanje u perifernu krv transplantiranih miševa u nedelji 16 nakon transplantacije. Ljudska transplantacija određena kao procenat hCD45+ ćelija od ukupnih hCD45+ ćelija i mCD45+ protočnom citometrijom ćelija miševa koji su primali ili lažne ili CPN+IDLV tretirane ćelije. Lažno, otvoreni dijamanti; CPN+IDLV, zatvoreni dijamanti. Slika 12B je grafikon koji prikazuje imunofenotipsku analizu periferne krvi transplantiranih NSG miševa u nedelji 16 nakon transplantacije. Procenat hCD45+ ćelija koje su bile pozitivne na markere B-ćelija (CD19), T-ćelija (CD3), hematopoetskih progenitora (CD34), mijeloidnih progenitora (CD33) i prirodnih ćelija ubica (CD56) numerisan je pomoću protočne citometrije ćelija miševa koji su primali ili lažne ili CPN+IDLV tretirane ćelije.

Lažno, otvoreni dijamanti; CPN+IDLV, zatvoreni dijamanti; (n=3 nezavisna eksperimenta; lažni n=5, CPN+IDLV n=12). Slika 12C je grafikon koji prikazuje ugrađivanje u perifernu krv kao na Slici 12A ćelija miševa koji primaju Oligo-, CPN-ili CPN+Oligo-tretirane ćelije. Oligo, krugovi; CPN, trouglovi; CPN+Oligo, dijamanti. Slika 12D je grafikon koji prikazuje analizu linije periferne krvi kao na Slici 12B ćelija miševa koji su primali ili Oligo-, CPN- ili CPN+Oligo-tretirane ćelije. Oligo, krugovi; CPN, trouglovi; CPN+Oligo, dijamanti; (Oligo n=8, CPN n=7, CPN+Oligo n=9). n.s.: nije značajno, * p <0,05.

Slike 13A do 13C pokazuju da ćelije genski modifikovane opstaju kod NSG miševa.

Slika 13A je grafikon koji pokazuje stope modifikacije gena u koštanoj srži i slezini transplantiranih miševa na nedelji 16 u ćelijama od miševa koji su primali ili lažne ili CPN+IDLV tretirane ćelije. Sakupljeno je tkivo, ekstrahovana i pojačana genomska DNK i analiziran qPCR za ugrađeni RFLP. Lažno, otvoreni dijamanti; CPN+IDLV, zatvoreni dijamanti. Slika 13B je grafikon koji prikazuje korekciju srpaste mutacije procenjenu visokim protokom sekvenciranja uzoraka opisanih na Slici 13A. Rezultati sekvenciranja lokusa beta-globina koji pokazuju procenat ukupnih poravnatih očitavanja koja sadrže modifikovanu bazu na srpastoj mutaciji. Lažno, otvoreni dijamanti; CPN+IDLV, zatvoreni dijamanti. (n=3 nezavisna eksperimenta; lažni n=5, CPN+IDLV n=12). Slika 13C je grafikon koji prikazuje korekciju srpaste mutacije u ćelijama miševa koji su primali Oligo-, CPN- ili CPN+Oligo-tretirane ćelije, kao što je opisano na Slici 13B. Oligo, krugovi; CPN, trouglovi; CPN+Oligo, dijamanti. (Oligo n=8, CPN n=7, CPN+Oligo n=9). n.s.: nije značajno; zvezdica označava značaj, * p <0,05, ** p <0,01.

1

Slike 14A do 14D prikazuju završnu transplantaciju koštane srži i analizu linije. Slika 14A je grafikon koji pokazuje ugrađivanje u koštanu srž transplantiranih miševa u nedelji 16 nakon transplantacije. Ljudska transplantacija određena kao procenat hCD45+ ćelija od ukupnih hCD45+ ćelija i mCD45+ protočnom citometrijom ćelija miševa koji su primali ili lažne ili CPN+IDLV tretirane ćelije. Lažno, otvoreni dijamanti; CPN+IDLV, zatvoreni dijamanti. Slika 14B je grafikon koji prikazuje imunofenotipsku analizu koštane srži transplantiranih NSG miševa u nedelji 16 nakon transplantacije. Procenat hCD45+ ćelija koje su bile pozitivne na markere B-ćelija (CD19), T-ćelija (CD3), hematopoetskih progenitora (CD34), mijeloidnih progenitora (CD33) i prirodnih ćelija ubica (CD56) numerisan je pomoću protočne citometrije ćelija miševa koji su primali ili lažne ili CPN+IDLV tretirane ćelije. Lažno, otvoreni dijamanti; CPN+IDLV, zatvoreni dijamanti; (n=3 nezavisna eksperimenta; lažni n=5, CPN+IDLV n=12). Slika 14C je grafikon koji pokazuje ugrađivanje u koštanu srž kao na Slici 14A ćelija miševa koji su primali Oligo-, CPN- ili CPN+Oligo-tretirane ćelije. Oligo, krugovi; CPN, trouglovi; CPN+Oligo, dijamanti. Slika 14D je grafikon koji prikazuje analizu linije koštane srži kao na Slici 14B ćelija miševa koji su primili Oligo-, CPN- ili CPN+Oligo-tretirane ćelije. Oligo, krugovi; CPN, trouglovi;

CPN+Oligo, dijamanti; (Oligo n=8, CPN n=7, CPN+Oligo n=9). n.s.: nije značajno, * p <0,05.

Slike 15A do 15C pokazuju diferencijaciju srpastih CD34+ ćelija koštane srži. Slika 15A je grafikon koji pokazuje ekspanziju savijanja CD34+ ćelija koštane srži pacijenta sa SCD koje su elektroporisane sa in vitro transkribovanaom CPN mRNK i transducirane sa donorskim IDLVm koji nosi WT bazu na mestu srpa i gajen je u uslovima eritroida. Slika 15B je grafikon ukupnih jedinica formiranja kolonija za svaku vrstu hematopoetske kolonije identifikovane na 200 obloženih ćelija. Slika 15C je grafikon koji prikazuje procenat formiranih kolonija u odnosu na ukupan broj obloženih ćelija. CFU: jedinica za formiranje kolonija; BFU: jedinica za formiranje blasta; GEMM: granulocit, eritrocit, monocit i makrofag; E: eritroid, GM: granulocit i makrofag; G: granulocit; M: monociti, zvezdica označava značaj, * p <0,05, ** p <0,01, (n=2 nezavisna eksperimenta; Lažne n=3; samo CPN n=4; samo IDLV n=3, CPN+IDLV n=6).

Slike 16A do 16D pokazuju funkcionalnu korekciju srpastih CD34+ ćelija koštane srži. CD34+ ćelije pacijenata sa bolesti srpastih ćelija koštane srži su elektroporisane in vitro transkribovanom CPN mRNK i transducirane sa donorskim IDLV koji nosi

1

WT bazu na mestu srpa i uzgajane su u uslovima eritroida. Slika 16A je grafikon koji prikazuje stope modifikacije gena kako je je analizirano sa qPCR za ugrađeni RFLP 12 dana nakon elektroporacije. Slika 16B je grafikon koji prikazuje korekciju srpaste mutacije procenjenu visokim protokom sekvenciranja. Rezultati sekvenciranja lokusa beta-globina koji pokazuju procenat ukupnih poravnatih očitavanja koja sadrže korigovanu bazu WT (A) na srpastoj mutaciji, kao i umetanja i brisanja(indeli) na mestu sečenja. Ispravljena osnova, bela; indeli, sivi. Slika 16C prikazuje HPLC analizu diferenciranih eritroidnih ćelija na kraju kulture. Ćelije su peletirane, lizirane i supernatant je analiziran tečnom hromatografijom visokih performansi (HPLC). Na levoj ploči je prikazan SCD lažni uzorak, a na desnoj ploči je prikazan SCD uzorak CPN+IDLV. Senčenje ukazuje na HbA: WT vrh hemoglobina za odrasle. Slika 16D je grafikon kvantifikacije procenta HbA od ukupne površine ispod krive predstavljene glavnim vrhovima. HbA: WT hemoglobin za odrasle, HbF: Fetalni hemoglobin, HbS: srp hemoglobin. n.s.: nije značajno, (n=2 nezavisna eksperimenta; Lažne n=3; samo CPN n=4; samo IDLV n=3, CPN+IDLV n=6).

Slike 17A i 17B pokazuju korekciju na lokusu beta-globina u CD34+ ćelijama pomoću donorskog oligonukleotida i različitih koncentracija u paru cinkovog prst nukleaza 47773/47817. Slika 17A pokazuje učestalost popravljanja DNK NHEJ. Slika 17B pokazuje učestalost popravljanja DNK zavisne od homologije. Pored mutacije srpastih ćelija, donorski oligonukleotid uključuje ili SMS12 mutacije (crne trake) ili SMS012 mutacije (sive trake) prikazane na Slici 4C.

DETALJAN OPIS

[0029] Ovde su obelodanjeni sastavi i postupci za transdukciju ćelije za upotrebu u genskoj terapiji ili inženjeringu genoma. Konkretno, posredstvom nukleaze (tj. CPN, TALEN, TtAgo ili CRISPR/Cas sistem) ciljana integracija egzogene sekvence ili promena genoma ciljanim razdvajanjem efikasno se postiže u ćeliji. Naročito korisni za transdukciju i inženjering HSC/PC, postupci i preparati se takođe mogu koristiti za druge tipove ćelija kako bi se pružile genetski modifikovane ćelije koje sadrže umetanja i/ili brisanja u genu globina.

Konkretno, ovde opisani postupci i sastavi su korisni za uređivanje gena globina korigovanjem alela povezanog sa bolešću, za tretman i prevenciju bolesti srpastih ćelija. Uopšteno

[0030] Izvođenje postupaka, kao i priprema i upotreba ovde opisanih sastava koriste, ukoliko nije drugačije naznačeno, konvencionalne tehnike u molekularnoj biologiji, biohemiji,

2

strukturi i analizi hromatina, računarskoj hemiji, ćelijskoj kulturi, rekombinantnoj DNK i srodnim poljima koja su unutar veština stručnjaka. Ove tehnike su u potpunosti objašnjene u literaturi. Pogledati, na primer, Sambrook et al. MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, Second edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989 i Third edition, 2001; Ausubel et al., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, New York, 1987 i periodična ažuriranja; seriju METHODS IN ENZYMOLOGY, Academic Press, San Diego; Wolffe, CHROMATIN STRUCTURE AND FUNCTION, Third edition, Academic Press, San Diego, 1998; METHODS IN ENZYMOLOGY, Vol.304, „Chromatin“ (P.M. Wassarman and A. P. Wolffe, eds.), Academic Press, San Diego, 1999; i METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, Vol.119, „Chromatin Protocols“ (P.B. Becker, ed.) Humana Press, Totowa, 1999.

Definicije

[0031] Izrazi „nukleinska kiselina“, „polinukleotid“ i „oligonukleotid“ koriste se naizmenično i odnose se na dezoksiribonukleotid ili ribonukleotidni polimer, u linearnoj ili kružnoj konformaciji, ili u jedno- ili dvolančanom obliku. Za potrebe predmetnog obelodanjenja, ove pojmovi ne treba tumačiti kao ograničavajuće u smislu dužine polimera. Pojmovi mogu obuhvatati poznate analoge prirodnih nukleotida, kao i nukleotide koji su modifikovani u baznim, šećernim i/ili fosfatnim delovima (npr., fosforotioatne kičme).

Generalno, analog određenog nukleotida ima istu specifičnost baznog uparivanja; tj. analog A će se bazno upariti sa T.

[0032] Izrazi „polipeptid“, „peptid“ i „protein“ koriste se naizmenično i odnose se na polimer aminokiselinskih ostataka. Izraz se takođe odnosi na aminokiselinske polimere u kojima su jedna ili više aminokiselina hemijski analozi ili modifikovani derivati odgovarajućih aminokiselina koje se javljaju u prirodi.

[0033] „Vezivanje“ se odnosi na sekvencijalno specifičnu, nekovalentnu interakciju između makromolekula (npr., između proteina i nukleinske kiseline). Ne moraju sve komponente interakcije vezivanja biti specifične za sekvence (npr., dodiri sa fosfatnim ostacima u DNK kičmi), sve dok je interakcija u celini specifična za sekvencu. Takve interakcije uglavnom karakteriše konstanta disocijacije (Kd) od 10<-6>M<-1>ili niže. „Afinitet“ se odnosi na snagu vezivanja: povećani afinitet vezivanja je u korelaciji sa nižim Kd.

[0034] „Vezujući protein“ je protein koji je u stanju da se vezuje za drugi molekul. Vezujući protein se može vezati, na primer, za DNK molekul (protein koji vezuje DNK), RNK molekul (protein koji vezuje RNK) i/ili molekul proteina (protein koji vezuje protein). U slučaju proteina koji vezuje protein, on se može vezati za sebe (kako bi formirao homodimere, homotrimere, itd.) i/ili se može vezati za jedan ili više molekula različitih proteina. Vezujući protein može imati više vrsta vezujuće aktivnosti. Na primer, proteini cinkovog prsta deluju na DNK, RNK i protein.

[0035] „Protein koji vezuje DNK cinkovog prsta“ (ili vezujući domen) je protein ili domen unutar većeg proteina, koji vezuje DNK na sekvencijski specifičan način kroz jedan ili više cinkovih prstiju, koji su regioni aminokiselinske sekvence unutar vezujućeg domena čija je struktura stabilizovana koordinacijom jona cinka. Izraz protein koji vezuje DNK cinkovog prsta često se skraćuje kao protein cinkovog prsta ili PCP.

[0036] „TALE DNK vezujući domen“ ili „TALE“ je polipeptid koji sadrži jedan ili više TALE ponovljenih domena/jedinica. Ponovljeni domeni su uključeni u vezivanje TALE za njegovu srodnu ciljanu DNK sekvencu. Jedna „jedinica za ponavljanje“ (takođe se naziva i „ponavljanje“) obično ima dužinu od 33-35 aminokiselina i pokazuje barem određenu homologiju sekvence sa drugim TALE sekvencama ponavljanja u prirodnom TALE proteinu.

[0037] Domeni za vezivanje cinkovog prsta i TALE mogu se „konstruisati“ tako da se vezuju za unapred određenu nukleotidnu sekvencu, na primer, inženjeringom (menjajući jednu ili više aminokiselina) spiralnog regiona prepoznavanja prirodnog cinkovog prsta ili TALE proteina. Prema tome, sintetički proteini koji vezuju DNK (cinkovi prsti ili TALE) su proteini koji se ne javljaju u prirodi. Neograničavajući primeri postupaka za inženjering DNK-vezujućih proteina su dizajn i selekcija. Dizajnirani protein koji vezuje DNK je protein koji se u prirodi ne javlja, a čiji dizajn/sastav proističe uglavnom iz racionalnih kriterijuma.

Racionalni kriterijumi za dizajn uključuju primenu pravila zamene i kompjuterizovanih algoritama za obradu informacija u bazi podataka koja čuva informacije o postojećim PCP i/ili TALE dizajnu i podatke o vezivanju. Pogledati, na primer, SAD patente 6,140,081;

6,453,242; 6,534,261 i 8,586,526; takođe pogledati WO 98/53058; WO 98/53059; WO 98/53060; WO 02/016536 i WO 03/016496.

[0038] „Odabrani“ protein cinkovog prsta ili TALE je protein koji se ne javlja u prirodi čija je proizvodnja prvenstveno rezultat empirijskog procesa kao što je prikaz faga, zamka interakcije ili hibridna selekcija. Pogledati npr., SAD patente br.5,789,538; 5,925,523;

6,007,988; 6,013,453; 6,200,759; 8,586,526; WO 95/19431; WO 96/06166; WO 98/53057; WO 98/54311; WO 00/27878; WO 01/60970 WO 01/88197, WO 02/099084.

[0039] „TtAgo“ je prokariotski Argonaut protein za koji se misli da je uključen u utišavanje gena. TtAgo potiče od bakterije Thermus thermophilus. Pogledati, npr. Swarts et al, ibid, G. Sheng et al., (2013) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 111, 652). „TtAgo sistem“ su sve potrebne komponente uključujući npr. vodič DNK za razdvajanje pomoću TtAgo enzima.

[0040] „Rekombinacija“ se odnosi na proces razmene genetičkih informacija između dva polinukleotida, uključujući, ali ne ograničavajući se na, hvatanje donora nehomolognim spajanjem krajeva (NHEJ) i homolognom rekombinacijom. Za potrebe predmetnog obelodanjenja, „homologna rekombinacija (HR)“ odnosi se na specijalizovani oblik takve razmene koji se dešava, na primer, tokom popravljanja dvolančanih prekida u ćelijama pomoću mehanizama za popravak usmerenih prema homologiji. Ovaj postupak zahteva homologiju nukleotidne sekvence, koristi molekul „donor“ za obnavljanje šablona „ciljanog“ molekula (tj. onaj koji je doživeo dvolančani prekid), i različito je poznat kao „konverzija gena koji nije ukršten“ ili „konverzija gena kratkog trakta“, jer dovodi do prenošenja genetskih informacija od donora do cilja. Bez želje da se veže bilo kojom određenom teorijom, takav prenos može uključivati korekciju neusklađenosti heterodupleks DNK koja nastaje između slomljenog cilja i donora i/ili „žarenje lanca zavisno od sinteze“, gde se donor koristi za ponovnu sintezu genetskih informacija koji će postati deo cilja i/ili srodnih procesa. Takav specijalizovani HR često rezultuje promenom sekvence ciljanog molekula tako da je deo ili cela sekvenca donorskog polinukleotida ugrađen u ciljani polinukleotid.

[0041] U postupcima obelodanjenja, jedna ili više ciljanih nukleaza kako su ovde opisane stvaraju dvolančani prekid (DSB) u ciljanoj sekvenci (npr. ćelijski hromatin) na unapred određenom mestu. DSB može rezultovati brisanjem i/ili umetanjem pomoću popravljanja usmerenog na homologiju ili mehanizmima popravljanja koji nisu usmereni na homologiju. Brisanja mogu sadržati bilo koji broj baznih parova. Slično tome, umetanja mogu da uključuju bilo koji broj baznih parova, uključujući, na primer, integraciju „donorskog“ polinukleotida, koji opciono ima homologiju sa nukleotidnom sekvencom u regionu prekida. Donorska sekvenca može biti fizički integrisana ili, alternativno, donorni polinukleotid se koristi kao obrazac za popravak prekida homolognom rekombinacijom, što rezultuje

2

uvođenjem celokupne ili dela nukleotidne sekvence kao donora u ćelijski hromatin. Prema tome, prva sekvenca u ćelijskom hromatinu može se promeniti i, u određenim otelotvorenjima, može se pretvoriti u sekvencu prisutnu u donorskom polinukleotidu. Prema tome, upotreba izraza „zameniti“ ili „zamena“ može se razumeti da predstavlja zamenu jedne nukleotidne sekvence drugom, (tj., zamena sekvence u informativnom smislu), i ne zahteva nužno fizičku ili hemijsku zamenu jednog polinukleotida drugim.

[0042] U bilo kom od ovde opisanih postupaka, dodatni parovi proteina cinkovog prsta, TALEN, TtAgo i/ili CRIPSR/Cas sistemi mogu se koristiti za dodatno dvolančano razdvajanje dodatnih ciljanih mesta unutar ćelije.

[0043] Bilo koji od ovde opisanih postupaka može se koristiti za umetanje donora bilo koje veličine i/ili delimičnu ili potpunu inaktivaciju jedne ili više ciljanih sekvenci u ćeliji ciljanom integracijom donorske sekvence koja narušava eksprimiranje gena od interesa. Takođe su pružene ćelijske linije sa delimično ili potpuno inaktiviranim genima.

[0044] U bilo kom od ovde opisanih postupaka, egzogena nukleotidna sekvenca („donorska sekvenca“ ili „transgen“) može sadržati sekvence koje su homologne, ali ne i identične genomskim sekvencama u regionu od interesa, stimulišući time homolognu rekombinaciju da ubaci neidentičnu sekvencu u region od interesa. Prema tome, u određenim otelotvorenjima, delovi donorske sekvence koji su homologni sekvencama u regionu od interesa pokazuju između oko 80 do 99% (ili bilo koji ceo broj između) identičnosti sekvence u genomskoj sekvenci koja je zamenjena. U drugim otelotvorenjima, homologija između donora i genomske sekvence je viša od 99%, na primer ako se samo 1 nukleotid razlikuje od donorske i genomske sekvence od preko 100 susednih baznih parova. U određenim slučajevima, nehomologni deo donorske sekvence može sadržati sekvence koje nisu prisutne u regionu od interesa, tako da se nove sekvence uvode u region od interesa. U ovim slučajevima, nehomologni niz je obično okružen sekvencama od 50-1.000 baznih parova (ili bilo koje celobrojne vrednosti između) ili bilo kojim brojem baznih parova većim od 1.000, koji su homologni ili identični sekvencama u regionu od interesa. U drugim otelotvorenjima, donorska sekvenca nije homologna prvoj sekvenci i ubacuje se u genom nehomolognim mehanizmima rekombinacije.

[0045] „Razdvajanje“ se odnosi na prekid kovalentne kičme molekula DNK. Razdvajanje se može započeti različitim postupcima, uključujući, ali ne ograničavajući se na, enzimatsku ili hemijsku hidrolizu fosfodiestarske veze. Moguća su i jednolančana razdvajanja i dvolančana razdvajanja, a dvolančana razdvajanja mogu nastati kao rezultat dva različita događaja jednostrukog razdvajanja. Razdvajanje DNK može rezultovati stvaranjem ili tupih ili postepenih krajeva. U određenim otelotvorenjima, fuzioni polipeptidi se koriste za ciljano razdvajanje dvolančane DNK.

[0046] „Polu-domen razdvajanja“ je polipeptidna sekvenca koja u sprezi sa drugim polipeptidom (bilo identičnim ili različitim) formira kompleks koji ima aktivnost razdvajanja (poželjno aktivnost dvolančanog razdvajanja). Izrazi „prvi i drugi polu-domeni razdvajanja;“ „+ i – polu-domeni razdvajanja“ i „desni i levi polu-domeni razdvajanja“ koriste se naizmenično za upućivanje na parove polu-domena razdvajanja koji se dimerizuju.

[0047] „Sintetički polu-domen razdvajanja“ je polu-domen razdvajanja koji je modifikovan tako da formira obavezne heterodimere sa drugim polu-domenom razdvajanja (npr., još jedan sintetički polu-domen razdvajanja). Takođe pogledati, SAD patente br.7,888,121; 7,914,796; 8,034,598 i 8,823,618.

[0048] Izraz „sekvenca“ odnosi se na nukleotidnu sekvencu bilo koje dužine, koja može biti DNK ili RNK; mogu biti linearne, kružne ili razgranate i mogu biti ili jednolančane ili dvolančane. Izraz „donorska sekvenca“ odnosi se na nukleotidnu sekvencu koja je umetnuta u genom. Donorska sekvenca može biti bilo koje dužine, na primer između 2 i 100.000.000 nukleotida (ili bilo koje celobrojne vrednosti između ili iznad), poželjno između oko 100 i 100.000 nukleotida (ili bilo koji celi broj između), poželjnije između oko 2000 i 20.000 nukleotida dužine (ili bilo koja vrednost između) i još poželjnije, između oko 5 i 15 kb (ili bilo koja vrednost između).

[0049] „Hromatin“ je struktura nukleoproteina koja sadrži ćelijski genom. Ćelijski hromatin sadrži nukleinsku kiselinu, pre svega DNK, i proteine, uključujući histone i ne-histonske hromozomske proteine. Većina eukariotskog ćelijskog hromatina postoji u obliku nukleozoma, gde jezgro nukleozoma sadrži približno 150 baznih parova DNK povezanih sa oktamerom koji sadrže po dva histona H2A, H2B, H3 i H4; i DNK veznik (promenljive dužine u zavisnosti od organizma) proteže se između jezgara nukleozoma. Molekul histona H1 je generalno povezan sa veznik DNK. U svrhu predmetnog obelodanjenja, izraz

2

„hromatin“ podrazumeva da obuhvata sve vrste ćelijskih nukleoproteina, i prokariotske i eukariotske. Ćelijski hromatin uključuje hromozomski i episomalni hromatin.

[0050] „Hromozom“ je hromatinski kompleks koji obuhvata ceo ili deo genoma ćelije. Genom ćelije često karakteriše kariotip, koji predstavlja kolekciju svih hromozoma koji čine genom ćelije. Genom ćelije može sadržati jedan ili više hromozoma.

[0051] „Epizom“ je replicirajuća nukleinska kiselina, kompleks nukleoproteina ili druga struktura koja sadrži nukleinsku kiselinu koja nije deo hromozomskog kariotipa ćelije.

Primeri epizoma uključuju plazmide i određene virusne genome.

[0052] „Pristupni region“ je mesto u ćelijskom hromatinu u kom ciljano mesto prisutno u nukleinskoj kiselini može biti povezano egzogenim molekulom koji prepoznaje ciljano mesto. Bez želje da nas veže neka posebna teorija, veruje se da je pristupni region onaj koji nije upakovan u nukleozomsku strukturu. Izrazita struktura pristupnog regiona često se može otkriti po osetljivosti na hemijske i enzimske sonde, na primer, nukleaze.

[0053] „Ciljano mesto“ ili „ciljana sekvenca“ je sekvenca nukleinske kiseline koja definiše deo nukleinske kiseline za koji će se vezati molekul vezati pod uslovom da postoje dovoljni uslovi za vezivanje.

[0054] „Egzogeni“ molekul je molekul koji obično nije prisutan u ćeliji, ali se može uneti u ćeliju jednom ili više genetskih, biohemijskih ili drugih postupaka. „Normalno prisustvo u ćeliji“ određuje se s obzirom na određeni razvojni stadijum i uslove okoline ćelije. Tako je, na primer, molekul koji je prisutan samo tokom embrionalnog razvoja mišića egzogeni molekul u odnosu na mišićnu ćeliju odrasle osobe. Slično tome, molekul indukovan toplotnim udarom je egzogeni molekul u odnosu na ćeliju koja nije pod toplotnim udarom. Egzogeni molekul može sadržati, na primer, funkcionalnu verziju neispravnog endogenog molekula ili neispravnu verziju normalno funkcionalnog endogenog molekula.

[0055] Egzogeni molekul može biti, između ostalog, mali molekul, kakav nastaje kombinatornim hemijskim postupkom, ili makromolekul kao što su protein, nukleinska kiselina, ugljeni hidrati, lipidi, glikoprotein, lipoprotein, polisaharid, bilo koji modifikovani derivat gore navedenih molekula, ili bilo koji kompleks koji sadrži jedan ili više gore

2

navedenih molekula. Nukleinske kiseline uključuju DNK i RNK, mogu biti jednolančane ili dvolančane; mogu biti linearne, razgranate ili kružne; i mogu biti bilo koje dužine.

Nukleinske kiseline uključuju one koje su sposobne da formiraju duplekse, kao i nukleinske kiseline koje formiraju tripleks. Pogledati, na primer, SAD patente br.5,176,996 i 5,422,251. Proteini uključuju, ali nisu ograničeni na, DNK-vezujuće proteine, faktore transkripcije, faktore preoblikovanja hromatina, metilirane proteine koji vezuju DNK, polimeraze, metilaze, demetilaze, acetilaze, deacetilaze, kinaze, fosfataze, integraze, rekombinaze, ligaze, topoizomeraze, giraze i helikaze.

[0056] Egzogeni molekul može biti ista vrsta molekula kao i endogeni molekul, npr., egzogeni protein ili nukleinska kiselina. Na primer, egzogena nukleinska kiselina može da sadrži zaraženi virusni genom, plazmid ili epizom uvedene u ćeliju ili hromozom koji obično nije prisutan u ćeliji. Postupci za uvođenje egzogenih molekula u ćelije poznati su stručnjacima i uključuju, ali nisu ograničeni na, prenos putem lipida (tj., lipozomi, uključujući neutralne i katjonske lipide), elektroporaciju, direktno injektiranje, fuziju ćelija, bombardovanje česticama, ko-taloženje kalcijum-fosfata, prenos posredstvom DEAE-dekstrana i prenos virusnih vektora. Egzogeni molekul takođe može biti ista vrsta molekula kao i endogeni molekul, ali izveden iz druge vrste nego što je ćelija iz koje potiče. Na primer, sekvenca ljudske nukleinske kiseline može se uvesti u ćelijsku liniju koja je prvobitno izvedena od miša ili hrčka. Postupci uvođenja egzogenih molekula u biljne ćelije poznate su stručnjacima i uključuju, ali nisu ograničeni na, transformaciju protoplasta, silicijum-karbid (npr., WHISKERS™), Agrobacterium-posredovanu transformaciju, prenos posredstvom lipida (tj. lipozomi, uključujući neutralne i katjonske lipide), elektroporaciju, direktno injektiranje, fuziju ćelija, bombardovanje česticama (npr., korišćenjem „genskog pištolja“), ko-taloženje kalcijum-fosfata, prenos posredstvom DEAE-dekstrana i prenos virusnih vektora.

[0057] Suprotno tome, „endogeni“ molekul je onaj koji je normalno prisutan u određenoj ćeliji u određenom razvojnom stadijumu pod određenim uslovima okoline. Na primer, endogena nukleinska kiselina može da sadrži hromozom, genom mitohondriona, hloroplasta ili druge organele ili epizomalnu nukleinsku kiselinu koja se javlja u prirodi. Dodatni endogeni molekuli mogu da uključuju proteine, na primer, faktore transkripcije i enzime.

[0058] Kako se ovde koristi, izraz „proizvod egzogene nukleinske kiseline“ uključuje i

2

polinukleotide i polipeptidne proizvode, na primer, proizvode transkripcije (polinukleotidi kao što je RNK) i proizvode translacije (polipeptidi).

[0059] „Fuzioni“ molekul je molekul u kom su povezana dva ili više molekula podjedinica, poželjno kovalentno. Molekuli podjedinice mogu biti isti hemijski tip molekula, ili mogu biti različiti hemijski tipovi molekula. Primeri prvog tipa fuzionog molekula uključuju, ali nisu ograničeni na, fuzione proteine (na primer, fuziju između PCP ili TALE DNK-vezujućeg domena i jednog ili više aktivacionih domena) i fuzione nukleinske kiseline (na primer, nukleinska kiselina koja kodira opisani fuzioni protein supra). Primeri drugog tipa fuzionog molekula uključuju, ali se ne ograničavaju na, fuziju između nukleinske kiseline koja formira tripleks i polipeptida i fuziju između veziva manjeg žleba i nukleinske kiseline.

[0060] Eksprimiranje fuzionog proteina u ćeliji može rezultovati isporukom fuzionog proteina u ćeliju ili isporukom polinukleotida koji kodira fuzioni protein u ćeliju, gde se polinukleotid transkribuje, a transkript prevodi, kako bi se stvorio fuzioni protein. Transsplajsovanje, razdvajanje polipeptida i ligacija polipeptida takođe mogu biti uključeni u eksprimiranje proteina u ćeliji. Postupci za isporuku polinukleotida i polipeptida do ćelija predstavljeni su na drugom mestu u predmetnom obelodanjenju.

[0061] „Gen“, za potrebe predmetnog obelodanjenja, uključuje DNK region koji kodira genski proizvod (pogledati infra), kao i sve DNK regione koji regulišu proizvodnju genskog proizvoda, bez obzira da li su takve regulatorne sekvence susedne kodirajućim i/ili transkribovanim sekvencama. Shodno tome, gen uključuje, ali nije nužno ograničen na, promoterske sekvence, terminatore, translacione regulatorne sekvence kao što su mesta vezivanja ribozoma i unutrašnja mesta ulaska ribozoma, pojačivači, prigušivači, izolatori, granični elementi, poreklo replikacije, mesta vezivanja matrice i regioni kontrole lokusa.

[0062] „Eksprimiranje gena“ odnosi se na pretvaranje informacija sadržanih u genu u genski proizvod. Genski proizvod može biti proizvod direktne transkripcije gena (npr., mRNK, tRNK, rRNK, antisens RNK, ribozim, strukturna RNK ili bilo koja druga vrsta RNK) ili protein proizveden translacijom mRNK. Genski proizvodi takođe uključuju RNK koje su modifikovane postupcima kao što su zatvaranje, poliadenilacija, metilacija i uređivanje, i proteini modifikovani, na primer, metilacijom, acetilacijom, fosforilacijom, ubikvitinacijom, ADP-ribozilacijom, miristilacijom i glikozilacijom.

2

[0063] „Modulacija“ eksprimiranja gena odnosi se na promenu aktivnosti gena. Modulacija eksprimiranja može da uključuje, ali nije ograničena na, aktivaciju gena i represiju gena. Uređivanje genoma (npr. razdvajanje, promena, inaktivacija, slučajna mutacija) može se koristiti za modulaciju eksprimiranja. Inaktivacija gena odnosi se na svako smanjenje eksprimiranja gena u poređenju sa ćelijom koja ne uključuje PCP, TALE, TtAgo ili CRISPR/Cas sistem kako je ovde opisano. Dakle, inaktivacija gena može biti delimična ili potpuna.

[0064] „Region od interesa“ je bilo koji region ćelijskog hromatina, kao što je, na primer, gen ili nekodirajuća sekvenca unutar gena ili pored njega, u kom je poželjno da veže egzogeni molekul. Vezivanje može biti u svrhe ciljanog razdvajanja DNK i/ili ciljane rekombinacije. Region od interesa može biti prisutan u hromozomu, epizomu, organelarnom genomu (npr., mitohondrijalni, hloroplast) ili virusnom genomu, npr. region od interesa može biti unutar regiona kodiranja gena, unutar transkribovanih nekodirajućih regiona, kao što su, na primer, liderske sekvence, trejlerske sekvence ili introni, ili unutar netranskribiranih regiona, bilo uzvodno ili nizvodno od kodirajućeg regiona. Region od interesa može biti mali kao pojedinačni nukleotidni par ili može biti dugačak do 2.000 nukleotidnih parova, ili bilo koja celobrojna vrednost nukleotidnih parova.

[0065] „Eukariotske“ ćelije uključuju, ali nisu ograničene na, ćelije gljiva (kao što je kvasac), biljne ćelije, životinjske ćelije, ćelije sisara i ćelije čoveka (npr., T-ćelije), uključujući matične ćelije (pluripotentne i multipotentne).

[0066] Pojmovi „operativna veza“ i „operativno povezani“ (ili „operativno vezano“) koriste se naizmenično u odnosu na međusobno suočavanje dve ili više komponenti (kao što su elementi sekvence), u kojima su komponente raspoređene tako da obe komponente funkcionišu normalno i dozvoljavaju mogućnost da bar jedna od komponenti može da posreduje u funkciji koja se vrši na najmanje jednoj od ostalih komponenti. Kao ilustracija, transkripciona regulatorna sekvenca, poput promotera, operativno je povezana sa kodirajućom sekvencom ako transkripciona regulatorna sekvenca kontroliše nivo transkripcije kodirajuće sekvence kao odgovor na prisustvo ili odsustvo jednog ili više transkripcionih regulatornih faktora. Transkripcioni regulatorna sekvenca redovno je operativno povezana u cis sa kodirajućom sekvencom, ali ne mora biti neposredno uz nju. Na

2

primer, pojačivač je regulatorna sekvenca transkripcije koja je operativno povezana sa kodirajućom sekvencom, iako nisu susedne.

[0067] Što se tiče fuzionih polipeptida, izraz „operativno povezan“ može se odnositi na činjenicu da svaka od komponenti vrši istu funkciju u vezi sa drugom komponentom kao i da nisu tako povezane. Na primer, u odnosu na fuzioni polipeptid u kom je PCP, TALE, TtAgo ili Cas DNK-vezujući domen fuzionisan sa aktivacionim domenom, PCP, TALE, TtAgo ili Cas DNK-vezujući domen i aktivacioni domen su u operativnoj vezi ako je u fuzionom polipeptidu deo PCP, TALE, TtAgo ili Cas DNK-vezujućeg domena u mogućnosti da veže svoje ciljano mesto i/ili svoje mesto vezivanja, dok je aktivacioni domen u stanju da poveća eksprimiranje gena. Kada se fuzioni polipeptid u kome se domen koji vezuje PCP, TALE, TtAgo ili Cas fuzioniše sa domenom razdvajanja, PCP, TALE, TtAgo ili Cas DNK-vezujući domen i domen razdvajanja nalaze u operativnoj vezi ako u fuziji polipeptid, deo PCP, TALE, TtAgo ili Cas DNK-vezujućih domena može da veže svoje ciljano mesto i/ili svoje mesto vezivanja, dok domen razdvajanja može da razdvoji DNK u blizini ciljanog mesta.

[0068] „Funkcionalni fragment“ proteina, polipeptida ili nukleinske kiseline je protein, polipeptid ili nukleinska kiselina čija sekvenca nije identična proteinu pune dužine, polipeptidu ili nukleinskoj kiselini, ali zadržava istu funkciju kao protein pune dužine, polipeptid ili nukleinska kiselina. Funkcionalni fragment može da poseduje više, manje ili isti broj ostataka kao odgovarajući nativni molekul, i/ili može da sadrži jednu ili više supstitucija aminokiselina ili nukleotida. Postupci za određivanje funkcije nukleinske kiseline (npr., funkcija kodiranja, sposobnost hibridizacije sa drugom nukleinskom kiselinom) su dobro poznati u struci. Slično tome, postupci za određivanje funkcije proteina su dobro poznate. Na primer, funkcija vezivanja DNK polipeptida može se odrediti, na primer, testovima vezivanja filtera, pomeranjem elektroforetske pokretljivosti ili imunoprecipitacijom. Razdvajanje DNK može se ispitati gel elektroforezom. Pogledati Ausubel et al., supra. Sposobnost proteina da stupi u interakciju sa drugim proteinom može se utvrditi, na primer, koimunoprecipitacijom, dvo-hibridnim ispitivanjima ili komplementacijom, kako genetskom tako i biohemijskom. Pogledati, na primer, Fields et al. (1989) Nature 340:245-246; SAD patent br.5,585,245 i PCT WO 98/44350.

[0069] „Vektor“ je sposoban da prenese genske sekvence u ciljane ćelije. Tipično, „vektorski konstrukt“, „vektor eksprimiranja“ i „vektor prenosa gena“ označavaju bilo koji konstrukt nukleinske kiseline koji je sposoban da usmeri eksprimiranje gena od interesa i koji može preneti genske sekvence u ciljane ćelije. Prema tome, izraz uključuje kloniranje i nosače eksprimiranja, kao i integracione vektore.

[0070] Pojmovi „osoba“ i „pacijent“ koriste se naizmenično i odnose se na sisare kao što su ljudski pacijenti i primati koji nisu ljudi, kao i na eksperimentalne životinje kao što su zečevi, psi, mačke, pacovi, miševi i druge životinje. Shodno tome, izraz „osoba“ ili „pacijent“, kako se ovde koristi, označava bilo kog pacijenta sisara kome se mogu primeniti nukleaze, donori i/ili genetski modifikovane ćelije pronalaska. Pacijenti predmetnog pronalaska uključuju one sa poremećajem.

[0071] „Strogost“ se odnosi na relativnu sposobnost bilo koje ćelije da deluje na način nalik matičnoj ćeliji, tj., stepen toti-, pluri- ili oligo-potencije i proširene ili neodređene samoobnove koju može imati bilo koja određena matična ćelija.

Faktori koji pojačavaju širenje matičnih ćelija

[0072] Bilo koji faktor ili faktori koji pojačavaju ekspanziju i/ili diferencijaciju matičnih ćelija mogu se koristiti u praksi predmetnog pronalaska. Faktori se mogu uvesti direktno u ćeliju (na primer, kao geni koji kodiraju faktore) i/ili mogu biti uvedeni u okolni medijum za kulturu (uključujući hranljive slojeve i druge čvrste podloge) kako bi uticali na ćelije.

Upotreba takvih faktora, na primer u uslovima kulture pre, tokom ili posle indukcije modifikacije posredovane nukleazom, povećava brzinu modifikacije matične ćelije posredovane nukleazom.

[0073] Neograničavajući primeri faktora koji se mogu koristiti uključuju SRI, antagonist aril ugljovodoničnog receptora, dmPGE2, prostaglandin, UM171 i UM729, jedinjenja identifikovana pri pregledu biblioteke (pogledati Pabst et al (2014) NatMeth 11:436-442), rapamicin (pogledati Wang et al (2014) Blood. pii: blood-2013-12-546218), proteini slični angiopoietinu („Angptls“, npr. Notch/delta/ANGPTL5 (pogledati Zhang et al (2008) Blood.

111(7):3415-3423), Angptl2, Angptl3, Angptl5, Angptl7 i Mfap4), bakarni helator tetraetiletepentamin (TEPA, pogledati de Lima et al (2008) Bone Mar Trans 41:771-778), inhibitori histon deacetilaze (HPAC), npr. valproinska kiselina (pogledati Chaurasia et al (2014) J Clin Invest 124:2378-2395), Protein IGF-vezujući protein 2 (IGFBP2), nikotinamid (pogledati Horwitz et al (2014) J. Clin. Invest 124:3121-3128), Tat-mic (pogledati WO2010025421) i tat-Bcl2 (pogledati WO2014015312) fuzioni proteini, MAPK14/p38a

1

Ly2228820 (pogledati Baudet et al (2012) Blood 119(26):6255-6258), proizvodi samoobnavljajućih gena kao što su HOXB4, OCT3/4 krv pupčane vrpce i/ili hranljivi slojevi izvedeni iz MSC ili ex vivo sistem ko-kulture vaskularne niše nazvan E4+EC (pogledati Butler et al (2012) Blood.120(6): 1344-1347), citokini, (na primer neograničavajući primer Stemspan™ CC110, CC100 i/ili H3000 (tehnologije Stemcell™), Flt-3 ligand, SCF, TPO)

[0074] U nekim otelotvorenjima, faktori uključuju StemRegenin (SRI, pogledati, npr. SAD patent br.8,741,640; Boitano et al, (2010) Science 329(5997): 1345-1348), antagonist aril ugljovodoničnog receptora (AhR) koji pospešuje ekspanziju CD34+ ćelija ex vivo se koristi u ovde opisanim postupcima i sastavima. U drugim otelotvorenjima, faktori obuhvataju UM171 (pogledati Fares et al (2013) Blood: 122 (21)), koji je agonist obnove matičnih ćelija. U drugim aspektima, faktor sadrži jedan ili više prostaglandina, na primer, dmPGE2. Pogledati npr. SAD patent br.8,168,428; North et al (2007) Nature 447(7147): 1007-1011). U nekim aspektima, faktor sadrži jedan ili više hormona kao što su proteini slični angiopoietinu („Angptls“, npr. koriste se Angptl2, Angptl3, Angptl5, Angptl7 i Mfap4) i IGF-vezujući protein 2 (IGFBP2). Pogledati npr. SAD patent br.7,807,464; Zhang et al (2008) 111(7): 3415-3423). U drugim aspektima, faktori sadrže jedan ili više proteinskih proizvoda samoobnavljajućih gena kao što su HOXB4 ili OCT. Pogledati npr. SAD patent br.8,735,153; Watts et al (2012) Exp Hematol. 40(3): 187-196). Alternativno, ovi geni mogu biti privremeno eksprimirani u medijumu za kulturu i/ili u matičnim ćelijama.

[0075] Faktori koji utiču na širenje matičnih ćelija takođe mogu obuhvatati postupke ćelijske potpore, uključujući, ali ne ograničavajući se na hranljive slojeve izvedene iz stromalnih ćelija i/ili MSC izvedenih ćelija. Pogledati npr. Breems et al (1998) Blood 91(1): 111-117 i Magin et al., (2009) Stem Cells Dev.2009 Jan-Feb; 18(1):173-86.

[0076] Može se koristiti bilo koja pogodna količina jednog ili više faktora koji pojačavaju ekspanziju matičnih ćelija, sve dok je efikasno za povećanje aktivnosti nukleaze i genomske modifikacije posredovane nukleazom. Određene upotrebljene koncentracije može lako odrediti stručnjak. U određenim otelotvorenjima koristi se između 0,1 nM i 100 µM, na primer između 0,5 µM i 25 µM koncentracije, uključujući bilo koju količinu između (npr., 1 µM do 20 µM, 3 µM do 10 µM, itd.).

Fuzioni molekuli

[0077] Ovde su opisani sastavi, na primer nukleaze, koji su korisni za razdvajanje izabranog

2

ciljanog gena u ćeliji, posebno matičnoj ćeliji. U određenim otelotvorenjima, jedna ili više komponenti fuzionih molekula (npr., nukleaze) se prirodno javljaju. U drugim otelotvorenjima, jedna ili više komponenti fuzionih molekula (npr., nukleaze) nisu prirodne, tj. konstruisana u domenima koji vezuju DNK i/ili domenima razdvajanja. Na primer, domen koji vezuje DNK prirodne nukleaze može se promeniti kako bi se vezao za izabrano ciljano mesto (npr., meganukleaza koja je konstruisana da se vezuje za mesto različito od mesta srodnog vezivanja). Nukleaza može sadržati heterologne domene koji vezuju DNK i razdvajanje (npr., cinkov prst nukleaze; proteini koji vezuju DNK za TAL-efektorski domen; domeni koji vezuju meganukleazu za DNK sa heterolognim domenima razdvajanja).

A. Molekuli koji vezuju DNK

[0078] Sastav i postupci koji su ovde opisani mogu da koriste molekul koji vezuje DNK za meganukleazu (homing endonukleaza) (takođe se naziva i domen koji vezuje DNK) za vezivanje za donorski molekul i/ili za region od interesa u genomu ćelije. Meganukleaze koje se prirodno javljaju prepoznaju 15-40 mesta razdvajanja u baznom paru i obično su grupisane u četiri porodice: LAGLIDADG porodica, GIY-YIG porodica, His-Cyst box porodica i HNH porodica. Primeri homing endonukleaza uključuju I-SceI, I-CeuI, PI-PspI, PI-Sce, I-SceIV, I-CsmI, I-PanI, I-SceII, I-PpoI, I-SceIII, I-CreI, I-TevI, I-TevII i I-TevIII. Poznate su njihove sekvence prepoznavanja. Pogledati takođe SAD patent br.5,420,032; SAD patent br.

6,833,252; Belfort et al.(1997) Nucleic Acids Res. 25:3379-3388; Dujon et al. (1989) Gene 82:115-118; Perler et al.(1994) Nucleic Acids Res. 22, 1125-1127; Jasin (1996) Trends Genet. 12:224-228; Gimble et al. (1996) J. Mol. Biol.263:163-180; Argast et al. (1998) J. Mol. Biol.280:345-353 i New England Biolabs katalog. Pored toga, specifičnost vezivanja DNK za homing endonukleaze i meganukleaze može se konstruisati tako da vezuje neprirodna ciljana mesta. Pogledati, na primer, Chevalier et al. (2002) Molec. Cell 10:895-905; Epinat et al. (2003) Nucleic Acids Res.31:2952-2962; Ashworth et al. (2006) Nature 441:656-659; Paques et al. (2007) Current Gene Therapy 7:49-66; SAD patentnu publikaciju br. 20070117128. DNK-vezujući domeni homing endonukleaza i meganukleaza mogu se izmeniti u kontekstu nukleaze u celini (tj. Tako da nukleaza uključuje srodni domen razdvajanja) ili mogu biti spojeni sa heterolognim domenom razdvajanja.

[0079] U drugim aspektima obelodanjenja, domen koji vezuje DNK jedne ili više nukleaza korišćenih u ovde opisanim postupcima i sastavima obuhvata prirodno nastali ili konstruisani (ne javlja se u prirodi) TAL efektorski DNK vezujući domen. Pogledati npr. SAD patent br.

8,586,526. Za biljne patogene bakterije roda Xanthomonas poznato je da uzrokuju mnoge bolesti u važnim usevima. Patogenost Xanthomonas zavisi od očuvanog sistema sekrecije tipa III (T3S) koji ubrizgava više od 25 različitih efektorskih proteina u biljnu ćeliju. Među ovim ubrizganim proteinima nalaze se efektori slični aktivatoru transkripcije (TAL) koji oponašaju biljne transkripcione aktivatore i manipulišu biljnim transkriptomom (pogledati Kay et al (2007) Science 318:648-651). Ovi proteini sadrže domen za vezivanje DNK i domen za aktivaciju transkripcije. Jedan od najkarakterističnijih TAL-efektora je AvrBs3 iz Xanthomonas campestgris pv. Vesicatoria (pogledati Bonas et al (1989) Mol Gen Genet 218: 127-136 i WO2010079430). TAL-efektori sadrže centralizovani domen tandemskih ponavljanja, i svaki ponovljeni postupak sadrži približno 34 aminokiseline, koje su ključne za DNK specifičnost vezivanja ovih proteina. Pored toga, sadrže nuklearnu lokalizacionu sekvencu i kiseli domen aktivacije transkripcije (za pregled pogledati Schornack S, et al (2006) J Plant Physiol 163(3): 256-272). Pored toga, u fitopatogenim bakterijama Ralstonia solanacearum pronađena su dva gena, označena brg11 i hpx17, koji su homologni sa AvrBs3 porodicom od Xanthomonas u R. solanacearum soju biovar 1 GMI1000 i u soju biovar 4 RS1000 (pogledati Heuer et al (2007) Appl i Envir Micro 73(13): 4379-4384). Ovi geni su međusobno 98,9%,identični u nukleotidnoj sekvenci ali se razlikuju brisanjem 1.575 baznih parova u ponovljenom domenu hpx17. Međutim, oba genska proizvoda imaju manje od 40% identičnosti sekvence sa proteinima porodice AvrBs3 od Xanthomonas. Pogledati npr. SAD patent br.8,586,526.

[0080] Specifičnost ovih TAL efektora zavisi od sekvenci pronađenih u tandemskim ponavljanjima. Ponovljena sekvenca sadrži približno 102 bazna para, i ponavljanja su tipično 91-100% međusobno homologna (Bonas et al, ibid). Polimorfizam ponavljanja se obično nalazi na položajima 12 i 13 i čini se da postoji pojedinačna korespondencija između identičnosti hipervarijabilnih diostataka (RVD) na položajima 12 i 13 sa identičnosti susednih nukleotida u ciljanoj sekvenci TAL-efektora (pogledati Moscou i Bogdanove, (2009) Science 326:1501 i Boch et al (2009) Science 326:1509-1512). Eksperimentalno je utvrđen prirodni kod za prepoznavanje DNK ovih TAL-efektora tako da HD sekvenca na položajima 12 i 13 dovodi do vezivanja za citozin (C), NG se vezuje za T, NI za A, C, G ili T, NN se vezuje za A ili G, i ING se vezuje za T. Ova ponavljanja DNK vezivanja sastavljena su u proteine sa novim kombinacijama i brojem ponavljanja, kako bi se stvorili veštački faktori transkripcije koji su u mogućnosti da interaguju sa novim sekvencama i aktiviraju eksprimiranje neendogenog reporter gena u biljnim ćelijama (Boch et al, ibid). Konstruisani TAL proteini povezani su sa polu-domenom FokI razdvajanja dajući fuziju TAL efektorskog domena

4

nukleaze (TALEN). Pogledati npr. SAD patent br.8,586,526; Christian et al ((2010)<Genetics epub 10.1534/genetics.110.120717). U određenim aspektima obelodanjenja, TALE domen sadrži N-kapu i/ili C-kapu kako je opisano u SAD patentu br.

8,586,526.

[0081] DNK vezujući domen jedne ili više nukleaza za koje se koristi in vivo razdvajanje i/ili ciljano razdvajanje genoma ćelije može sadržati protein cinkovog prsta. Poželjno je da protein cinkovog prsta nije prirodan jer je konstruisan da se vezuje za ciljano mesto po izboru. Pogledati, na primer, Pogledati, na primer, Beerli et al. (2002) Nature Biotechnol.20:135-141; Pabo et al. (2001) Ann. Rev. Biochem.70:313-340; Isalan et al. (2001) Nature Biotechnol.19:656-660; Segal et al. (2001) Curr. Opin. Biotechnol.12:632-637; Choo et al. (2000) Curr. Opin. Struct. Biol.10:411-416; SAD patente br.6,453,242; 6,534,261; 6,599,692; 6,503,717; 6,689,558; 7,030,215; 6,794,136; 7,067,317; 7,262,054; 7,070,934; 7,361,635; 7,253,273; i SAD patentne publikacije br.2005/0064474;

2007/0218528; 2005/0267061.

[0082] Konstruisani domen za vezivanje cinkovih prstiju može imati novu specifičnost vezivanja u poređenju sa prirodnim proteinom cinkovog prsta. Postupci inženjeringa uključuju, ali se ne ograničavaju na, racionalan dizajn i različite vrste izbora. Racionalni dizajn uključuje, na primer, upotrebu baza podataka koje sadrže trostruke (ili četvorostruke) nukleotidne sekvence i pojedinačne aminokiselinske sekvence cinkovog prsta, u kojima je svaka trostruka ili četvorostruka nukleotidna sekvenca povezana sa jednom ili više aminokiselinskih sekvenci cinkovog prsta koje vezuju određenu trostruku ili četvorostruku sekvencu. Pogledati, na primer, SAD patente 6,453,242 i 6,534,261 koji su u suvlasništvu.

[0083] Primerni postupci odabira, uključujući prikaz faga i dvo-hibridne sisteme, obelodanjeni su u SAD patentima 5,789,538; 5,925,523; 6,007,988; 6,013,453; 6,410,248; 6,140,466; 6,200,759; i 6,242,568; kao i WO 98/37186; WO 98/53057; WO 00/27878; WO 01/88197 i GB 2,338,237. Pored toga, opisano je poboljšanje specifičnosti vezivanja za domene vezivanja cinkovog prsta, na primer, u WO 02/077227 koji je u suvlasništvu.

[0084] Pored toga, kao što je obelodanjeno u ovim i drugim referencama, domeni cinkovog prsta i/ili proteini cinkovog prsta sa više prstiju mogu biti povezani zajedno koristeći bilo koje odgovarajuće veznik sekvence, uključujući, na primer, veznike dužine 5 ili više aminokiselina. Takođe pogledati, SAD patente br.6,479,626; 6,903,185; i 7,153,949 za primerne veznik sekvenci dužine 6 ili više aminokiselina. Ovde opisani proteini mogu sadržati bilo koju kombinaciju pogodnih povezivača između pojedinačnih proteina cinkovog prsta.

[0085] Izbor ciljanih mesta i postupaka za dizajniranje i konstruisanje fuzionih proteina (i polinukleotida koji ih kodiraju) poznati su stručnjacima i detaljno opisani u SAD patentima br. 6,140,081; 5,789,538; 6,453,242; 6,534,261; 5,925,523; 6,007,988; 6,013,453; 6,200,759; WO 95/19431; WO 96/06166; WO 98/53057; WO 98/54311; WO 00/27878; WO 01/60970 WO 01/88197; WO 02/099084; WO 98/53058; WO 98/53059; WO 98/53060; WO 02/016536 i WO 03/016496.

[0086] Pored toga, kao što je obelodanjeno u ovim i drugim referencama, domeni cinkovog prsta i/ili proteini cinkovog prsta sa više prstiju mogu biti povezani zajedno koristeći bilo koje odgovarajuće veznik sekvence, uključujući, na primer, veznike dužine 5 ili više aminokiselina. Takođe pogledati, SAD patente br.6,479,626; 6,903,185; i 7,153,949 za primerne veznik sekvence dužine 6 ili više aminokiselina. Ovde opisani proteini mogu sadržati bilo koju kombinaciju pogodnih povezivača između pojedinačnih proteina cinkovog prsta.

[0087] U određenim aspektima obelodanjenja, DNK-vezujući domen je deo CRISPR/Cas sistema nukleaze, uključujući, na primer, RNK sa jednim vodičem (sgRNK). Pogledati npr. SAD patent br.8,697,359 i SAD patentnu publikaciju br.20150056705. CRISPR (pravilno razmaknuta grupisana kratka palindromska ponavljanja) lokus, koji kodira RNK komponente sistema, i cas (CRISPR-povezan) lokus, koji kodira proteine (Jansen et al., 2002. Mol. Microbiol.43: 1565-1575; Makarova et al., 2002. Nucleic Acids Res.30: 482-496; Makarova et al., 2006. Biol. Direct 1:7; Haft et al., 2005. PLoS Comput. Biol.1:e60) čine genske sekvence CRISPR/Cas sistema nukleaze. CRISPR lokusi u mikrobnim domaćinima sadrže kombinaciju gena povezanih sa CRISPR (Cas), kao i nekodirajuće RNK elemente koji su sposobni da programiraju specifičnost CRISPR-posredovanog razdvajanja nukleinske kiseline.

[0088] CRISPR tipa II je jedan od najbolje opisanih sistema i vrši ciljani prekid dvolančane DNK u četiri uzastopna koraka. Prvo se dve nekodirajuće RNK, niz pre-crRNK i tracrRNK, transkribuju iz CRISPR lokusa. Drugo, tracrRNK se hibridizuje u ponovljene regione od precrRNK i posreduje u obradi pre-crRNK u zrele crRNK koje sadrže pojedinačne odstojne sekvence. Treće, zreli kompleks crRNK:tracrRNK usmerava Cas9 do ciljane DNK putem Watson-Crick baznog uparivanja između odstojnika na crRNK i protoodstojnika na ciljanoj DNK pored motiva susednog protoodstojnika (PAM), dodatni zahtev za prepoznavanje cilja. Konačno, Cas9 posreduje u razdvajanju ciljane DNK kako bi stvorio dvolančani prekid unutar protoodstojnika. Aktivnost CRISPR/Cas sistema sastoji se od tri koraka: (i) umetanje strane DNK sekvence u CRISPR niz radi sprečavanja budućih napada, u procesu koji se naziva „adaptacija“, (ii) eksprimiranje relevantnih proteina, kao i eksprimiranje i obrada niza, praćena (iii) RNK posredovanom interferencijom sa stranom nukleinskom kiselinom. Tako je u bakterijskoj ćeliji nekoliko takozvanih „Cas“ proteina uključeno u prirodnu funkciju CRISPR/Cas sistema i imaju ulogu u funkcijama kao što je umetanje strane DNK itd.

[0089] Cas protein može biti „funkcionalni derivat“ prirodnog Cas proteina. „Funkcionalni derivat“ polipeptida nativne sekvence je jedinjenje koje ima kvalitativno biološko svojstvo zajedničko sa polipeptidom nativne sekvence. „Funkcionalni derivati“ uključuju, ali nisu ograničeni na, fragmente nativne sekvence i derivate nativne sekvence polipeptida i njegove fragmente, pod uslovom da imaju biološku aktivnost zajedničku sa odgovarajućim polipeptidom nativne sekvence. Ovde se posmatra biološka aktivnost koja je sposobnost funkcionalnog derivata da hidrolizuje DNK supstrat u fragmente. Izraz „derivat“ obuhvata obe varijante aminokiselinske sekvence polipeptida, kovalentne modifikacije i njihove fuzije. Pogodni derivati Cas polipeptida ili njegovog fragmenta uključuju, ali nisu ograničeni na mutante, fuzije, kovalentne modifikacije Cas proteina ili njegovog fragmenta. Cas protein, koji uključuje Cas protein ili njegov fragment, kao i derivate Cas proteina ili njegovog fragmenta, mogu se dobiti iz ćelije ili sintetisati hemijski ili kombinacijom ove dve procedure. Ćelija može biti ćelija koja prirodno proizvodi Cas protein ili ćelija koja prirodno proizvodi Cas protein i genetski je napravljena da proizvodi endogeni Cas protein na višem nivou eksprimiranja ili da proizvodi Cas protein iz egzogeno uvedene nukleinske kiseline, tačnije nukleinske kiselina koja kodira Cas koji je isti ili se razlikuje od endogenog Cas. U nekim slučajevima, ćelija prirodno ne proizvodi Cas protein i genetski je napravljena da proizvodi Cas protein.

[0090] U nekim aspektima obelodanjenja, domen vezivanja DNK deo je TtAgo sistema (pogledati Swarts et al, ibid; Sheng et al, ibid). Kod eukariota, utišavanje gena posreduje Argonaute (Ago) porodica proteina. U ovoj paradigmi, Ago je vezan za male (19-31 nt) RNK. Ovaj kompleks za utišavanje proteina-RNK prepoznaje ciljane RNK putem Watson-Crick baznog uparivanja između male RNK i cilja i endonukleolitički razdvaja ciljanu RNK (Vogel (2014) Science 344:972-973). Nasuprot tome, prokariotski Ago proteini vezuju se za male jednolančane fragmente DNK i verovatno funkcionišu kako bi detektovali i uklonili stranu (često virusnu) DNK (Yuan et al., (2005) Mol. Cell 19, 405; Olovnikov, et al. (2013) Mol. Cell 51, 594; Swarts et al., ibid). Uzorni prokariotski Ago proteini uključuju one iz Aquifex aeolicus, Rhodobacter sphaeroides, i Thermus thermophilus.

[0091] Jedan od najkarakterističnijih prokariotskih Ago proteina je onaj iz T. thermophilus (TtAgo; Swarts et al. ibid). TtAgo se povezuje sa jednolančanim DNK fragmentima od 15 nt ili 13-25 nt sa 5' fosfatnim grupama. Ovaj „DNK vodič“ koji vezuje TtAgo služi za usmeravanje protein-DNK kompleksa da vezuje Watson-Crick komplementarnu DNK sekvencu u trećem DNK molekulu. Jednom kada informacije o sekvencama u ovim DNK vodičima omoguće identifikaciju ciljane DNK, TtAgo-DNK vodič kompleks razdvaja ciljanu DNK. Takav mehanizam podržava i struktura TtAgo-DNK vodič kompleksa, dok je vezan za ciljanu DNK (G. Sheng et al., ibid). Ago od Rhodobacter sphaeroides (RsAgo) ima slična svojstva (Olivnikov et al. ibid).

[0092] Egzogeni DNK vodiči proizvoljne sekvence DNK mogu se učitati na TtAgo protein (Swarts et al. ibid.). Budući da specifičnost razdvajanja TtAgo usmerava DNK vodič, TtAgo-DNK kompleks formiran sa egzogenim DNK vodičem koji je odredio istražitelj usmeriće TtAgo ciljano razdvajanje DNK na komplementarnu ciljanu DNK koju je odredio istraživač. Na taj način se može stvoriti ciljani dvolančani prekid u DNK. Korišćenje TtAgo-DNK vodič sistema (ili ortološkog Ago-DNK vodič sistema od drugih organizama) omogućava ciljano razdvajanje genomske DNK unutar ćelija. Takvo razdvajanje može biti jedno- ili dvolančano. Za razdvajanje genomske DNK sisara, poželjnije bi bilo koristiti verziju TtAgo kodona optimizovanu za eksprimiranje u ćelijama sisara. Dalje, možda bi bilo poželjno tretirati ćelije formiranim TtAgo-DNK kompleksom in vitro gde je TtAgo protein spojen sa peptidom koji prodire u ćelije. Dalje, možda bi bilo poželjnije koristiti verziju proteina TtAgo koja je izmenjena mutagenezom kako bi imala poboljšanu aktivnost na 37 stepeni Celzijusa.

Razdvajanje DNK posredstvom ago-RNK moglo bi se koristiti da utiče na mnoštvo ishoda, uključujući nokaut gena, ciljano dodavanje gena, korekciju gena, ciljano brisanje gena, koristeći tehnike uobičajene u struci za eksploataciju prekida DNK.

[0093] Dakle, nukleaza sadrži domen koji vezuje DNK, koji se specifično vezuje za ciljano mesto u bilo kom genu u koji se želi ubaciti donor (transgen).

B. Razdvajanje domena

[0094] Bilo koji pogodni domen razdvajanja može se operativno povezati sa domenom koji vezuje DNK kako bi se formirala nukleaza. Na primer, domeni koji se vezuju za PCP DNK spojeni su sa domenima nukleaze kako bi se stvorili CPN - funkcionalni entitet koji je u stanju da prepozna svoj namenjeni cilj nukleinske kiseline putem svog sintetičkog (PCP) DNK vezujućeg domena i dovede do presecanja DNK u blizini PCP mesta vezivanja putem aktivnosti nukleaze, uključujući za upotrebu u modifikaciji genoma kod različitih organizama. Pogledati, na primer, SAD patentne publikacije 20030232410; 20050208489; 20050026157; 20050064474; 20060188987; 20060063231; i Međunarodnu publikaciju WO 07/014275. Slično tome, domeni koji se vezuju za TALE DNK spojeni su sa domenima nukleaze kako bi se stvorili TALEN. Pogledati npr. SAD patent br.8.586,526. Takođe su opisani CRISPR/Cas sistemi nukleaze koji sadrže RNK sa jednim vodičem (sgRNK) koji se vezuju za DNK i povezuju se sa domenima razdvajanja (npr. Cas domeni) da bi indukovali ciljano razdvajanje. Pogledati npr. SAD patente br.8,697,359 i 8,932,814 i SAD patentnu publikaciju br.20150056705.

[0095] Kao što je gore napomenuto, domen razdvajanja može biti heterologan domenu koji vezuje DNK, na primer: domen vezivanja DNK cinkovim prstom i domen razdvajanja od nukleaze; TALEN domen za vezivanje DNK i domen razdvajanja iz nukleaze; sgRNK domen koji vezuje DNK i domen razdvajanja iz nukleaze (CRISPR/Cas); i/ili domen vezivanja DNK meganukleaze i domen razdvajanja iz druge nukleaze. Heterologni domeni razdvajanja mogu se dobiti iz bilo koje endonukleaze ili egzonukleaze. Primeri endonukleaza iz kojih se može izvesti domen razdvajanja uključuju, ali nisu ograničeni na, restrikcione endonukleaze i homing endonukleaze. Poznati su dodatni enzimi koji razdvajaju DNK (npr., S1 Nukleaza; nukleaza mung pasulja; DNaza pankreasa I; mikrokokna nukleaza; kvasac HO endonukleaza. Jedan ili više ovih enzima (ili njihovi funkcionalni fragmenti) mogu se koristiti kao izvor domena razdvajanja i polu-domena razdvajanja.

[0096] Slično tome, polu-domen razdvajanja može se dobiti iz bilo koje nukleaze ili njenog dela, kao što je gore navedeno, koja zahteva dimerizaciju za aktivnost razdvajanja.

Generalno, dva fuziona proteina su potrebna za razdvajanje ako fuzioni proteini sadrže poludomene razdvajanja. Alternativno, može se koristiti jedan protein koji sadrži dva poludomena razdvajanja. Dva polu-domena razdvajanja mogu biti izvedena iz iste endonukleaze (ili njihovih funkcionalnih fragmenata), ili svaki polu-domen razdvajanja može biti izveden iz različite endonukleaze (ili njihovih funkcionalnih fragmenata). Pored toga, ciljana mesta za dva fuziona proteina su poželjno raspoređena jedno prema drugom, tako da vezivanje dva fuziona proteina za njihova ciljana mesta postavlja polu-domene razdvajanja u međusobnu prostornu orijentaciju koja omogućava razdvajanje polu-domena radi formiranja funkcionalnog domena razdvajanja, npr., dimerizacijom. Prema tome, u određenim otelotvorenjima, bliže ivice ciljanih mesta su odvojene sa 5-8 nukleotida ili sa 15-18 nukleotida. Međutim, bilo koji integralni broj nukleotida ili nukleotidnih parova može da interveniše između dva ciljana mesta (npr. od 2 do 50 nukleotidnih parova ili više).

Generalno, mesto razdvajanja leži između ciljanih mesta.

[0097] Restrikcione endonukleaze (restrikcioni enzimi) prisutne su u mnogim vrstama i sposobne su da se specifično vezuju za DNK (na mestu prepoznavanja) i razdvajaju DNK na mestu vezivanja ili blizu njega. Određeni restrikcioni enzimi (npr. Tip IIS) razdvajaju DNK na mestima uklonjenim sa mesta prepoznavanja i imaju odvojene domene vezivanja i razdvajanja. Na primer, enzim tipa IIS Fok I katalizuje dvolančano razdvajanje DNK, na 9 nukleotida sa mesta njegovog prepoznavanja na jednom lancu i 13 nukleotida sa mesta prepoznavanja na drugom. Pogledati, na primer, SAD patentima 5,356,802; 5,436,150 i 5,487,994; kao i Li et al.(1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4275-4279; Li et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2764-2768; Kim et al. (1994a) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:883-887; Kim et al. (1994b) J. Biol. Chem. 269:31,978-31,982. Prema tome, u jednom otelotvorenju, fuzioni proteini sadrže domen razdvajanja (ili polu-domen razdvajanja) iz najmanje jednog restrikcionog enzima tipa IIS i jednog ili više domena koji vezuju cink prste, koji mogu ali ne moraju biti sintetički.

[0098] Primerni restrikcioni enzim tipa IIS, čiji je domen razdvajanja odvojen od vezivnog domena, jeste Fok I. Ovaj određeni enzim je aktivan kao dimer. Bitinaite et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:10,570-10,575. Shodno tome, za potrebe predmetnog obelodanjenja, deo Fok I enzima koji se koristi u obelodanjenim fuzionim proteinima smatra se poludomenom razdvajanja. Dakle, za ciljano dvolančano razdvajanje i/ili ciljanu zamenu ćelijskih sekvenci pomoću cinkov prst-Fok I fuzijA, dva fuziona proteina, od kojih svaki sadrži FokI polu-domen razdvajanje, može se koristiti za rekonstituciju katalitički aktivnog domena

4

razdvajanja. Alternativno, takođe mogu da se koriste jedan molekul polipeptida koji sadrži domen za vezivanje cinkovog prsta i dva Fok I polu-domena razdvajanja. Parametri za ciljano razdvajanje i ciljanu promenu sekvence pomoću cinkovo prst-Fok I fuzije su dati drugde u predmetnom obelodanjenju.

[0099] Domen razdvajanja ili polu-domen razdvajanja može biti bilo koji deo proteina koji zadržava aktivnost razdvajanja ili koji zadržava sposobnost multimerizacije (npr., dimerizuje) kako bi se formirao funkcionalni domen razdvajanja.

[0100] Primeri restrikcionih enzima tipa IIS opisani su u Međunarodnoj publikaciji WO 07/014275. Dodatni restrikcioni enzimi takođe sadrže odvojene domene vezivanja i razdvajanja, i oni su razmatrani u predmetnom obelodanjenju. Pogledati, na primer, Roberts et al. (2003) Nucleic Acids Res. 31:418-420.

[0101] U određenim otelotvorenjima, domen razdvajanja sadrži jedan ili više sintetičkih poludomena razdvajanja (koji se takođe nazivaju mutanti domena dimerizacije) koji minimizuju ili sprečavaju homodimerizaciju, kao što je opisano, na primer, u SAD patentnim publikacijama br.20050064474; 20060188987; 20070305346 i 20080131962. Ostaci aminokiselina na položajima 446, 447, 479, 483, 484, 486, 487, 490, 491, 496, 498, 499, 500, 531, 534, 537 i 538 od FokI su svi ciljevi za uticanje na dimerizaciju FokI polu-domena razdvajanja.

[0102] Domeni razdvajanja sa više od jedne mutacije mogu se koristiti, na primer mutacije na položajima 490 (E→K) i 538 (I→K) u jednom polu-domenu razdvajanja kako bi se proizveo sintetički polu-domen razdvajanja sa oznakom „E490K:I538K“ i mutiranjem položaja 486 (Q→E) i 499 (I→L) u drugom polu-domenu razdvajanja kako bi se proizveo sintetički poludomen razdvajanja označen sa „Q486E: I499L;“ mutacije koje zamenjuju ostatak divljeg tipa Gln (Q) na položaju 486 ostatkom Glu (E), ostatak divljeg tipa Iso (I) na položaju 499 ostatkom Leu (L) i ostatak divljeg tipa Asn (N) na položaju 496 sa Asp (D) ili Glu (E) ostatkom (takođe se nazivaju „ELD“ i „ELE“ domeni, respektivno); konstruisani polu-domen razdvajanja koji sadrži mutacije na položajima 490, 538 i 537 (numerisane u odnosu na divlji tip FokI), na primer mutacije koje zamenjuju ostatak divljeg tipa Glu (E) na položaju 490 sa Lys (K) ostatkom, ostatak divljeg tipa Iso (I) na položaju 538 sa ostatkom Lys (K), i ostatak divljeg tipa His (H) na položaju 537 sa ostatkom Lys (K) ili ostatkom Arg (R) (takođe poznati kao „KKK“ i „KKR“ domeni, respektivno); i/ili konstruisani polu-domen razdvajanja sadrži mutacije na položajima 490 i 537 (numerisane u odnosu na divlji tip FokI), na primer mutacije koje zamenjuju ostatak divljeg tipa Glu (E) na položaju 490 sa Lys (K) ostatkom i His (H) ostatak divljeg tipa na položaju 537 sa ostatkom Lys (K) ili ostatkom Arg (R) (takođe poznati kao „KIK“ i „KIR“ domeni, respektivno). Pogledati npr. SAD patente br.7,914,796; 8,034,598 i 8,623,618. U drugim otelotvorenjima, sintetički polu-domen razdvajanja sadrži mutacije „Sharkey“ i/ili „Sharkey'“ (pogledati Guo et al, (2010) J. Mol. Biol.400(1):96-107).

[0103] Alternativno, nukleaze se mogu sastaviti in vivo na ciljanom mestu nukleinske kiseline koristeći takozvanu tehnologiju „podeljenih enzima“ (pogledati, npr. SAD patentnu publikaciju br.20090068164). Komponente takvih podeljenih enzima mogu se eksprimirati bilo na odvojenim konstruktima eksprimiranja, ili mogu biti povezane u jednom otvorenom okviru za čitanje gde su pojedinačne komponente odvojene, na primer, samo-razdvojivim 2A peptidom ili IRES sekvencom. Komponente mogu biti pojedinačni domeni vezivanja za cink prst ili domeni domena vezivanja nukleinske kiseline meganukleaze.

[0104] Nukleaze se mogu pregledati na aktivnost pre upotrebe, na primer u hromozomskom sistemu na bazi kvasca kako je opisano u SAD patentu br.8,563,314.

[0105] Cas9 srodni CRISPR/Cas sistem sadrži dve RNK nekodirajuće komponente: tracrRNK i pre-crRNK niz koji sadrži vodič sekvence nukleaze (odstojnici) međusobno povezane identičnim direktnim ponavljanjima (DR). Kako bi se CRISPR/Cas sistem koristio za postizanje inženjeringa genoma, moraju biti prisutne obe funkcije ovih RNK (pogledati Cong et al, (2013) Sciencexpress 1/10.1126/science 1231143). U nekim aspektima obelodanjenja, tracrRNK i pre-crRNK se isporučuju putem odvojenih konstrukata eksprimiranja ili kao odvojene RNK. U drugim aspektima obelodanjenja, himerna RNK je konstruisana gde se konstruisana zrela crRNK (koja daje specifičnost cilja) stapa sa tracrRNK (koja pruža interakciju sa Cas9) kako bi se stvorila himerna hibridna crRNK-tracrRNK (koja se takođe naziva i RNK sa jednim vodičem). (pogledati Jinek ibid i Cong, ibid).

Ciljana mesta

[0106] Kao što je detaljno opisano iznad, domeni koji vezuju DNK mogu se konstruisati tako da se vezuju za bilo koju sekvencu po izboru. Konstruisani DNK-vezujući domen može imati novu specifičnost vezivanja, u poređenju sa prirodno nastalim DNK-vezujućim domenom.

[0107] Neograničavajući primeri pogodnih ciljanih gena: geb beta (β) globina (HBB), gen gama (δ) globina (HBG1), gen limfoma B-ćelija/leukemije 11A (BCL11A), gen faktora nalik Kruppelu 1 (KLF1), gen CCR5, gen CXCR4, gen PPP1R12C (AAVS1), gen hipoksantin fosforiboziltransferaze (HPRT), gen albumina, gen faktora VIII, gen faktora IX, gen ponovljene kinaze 2 bogate leucinom (LRRK2), gen za Hantingtona (Htt), gen za rodopsin (RHO), gen za regulaciju transmembranske provodljivosti cistične fibroze (CFTR), gen za surfaktant protein B (SFTPB), gen receptora T-ćelija alfa (TRAC), gen receptora T-ćelija beta (TRBC), gen za programiranu ćelijsku smrt 1 (PD1), gen za citotoksični T-limfocitni antigen 4 (CTLA-4), gen antigena ljudskog leukocita (HLA), gen HLA B, gen HLA C, gen HLA-DPA, gen HLA-DQ, gen HLA-DRA, gen LMP7, gen transportera povezanog sa obradom antigena (TAP) 1, gen TAP2, gen tapasina (TAPBP), gen transaktivatora klase II glavnog kompleksa histokompatibilnosti (CIITA), gen za distrofin (DMD), gen za glukokortikoidni receptor (GR), gen IL2RG, gen Rag-1, gen RFX5, gen FAD2, gen FAD3, gen ZP15, gen KASII, gen MDH i/ili gen EPSPS.

[0108] U određenim aspektima obelodanjenja, nukleaza cilja lokuse „sigurne luke“ kao što su geni AAVS1, HPRT, albumini i CCR5 u ljudskim ćelijama i Rosa26 u ćelijama miševa (pogledati npr. SAD patente br.7,888,121; 7,972,854; 7,914,796; 7,951,925; 8,110,379; 8,409,861; 8,586,526; SAD patentne publikacije 20030232410; 20050208489; 20050026157; 20060063231; 20080159996; 201000218264; 20120017290; 20110265198; 20130137104; 20130122591; 20130177983 i 20130177960) i lokus Zp15 kod biljaka (pogledati SAD patent br. 8,329,986).

Donori

[0109] Predmetno obelodanjenje se odnosi na modifikaciju genoma matične ćelije posredovane nukleazom. Kao što je gore napomenuto, umetanje egzogene sekvence (koja se naziva i „donorska sekvenca“ ili „donor“ ili „transgen“), na primer za brisanje određenog regiona i/ili korekciju mutantnog gena ili za povećano eksprimiranje gena divljeg tipa. Biće lako uočljivo da donorska sekvenca obično nije identična genomskoj sekvenci gde je postavljena. Donorska sekvenca može da sadrži nehomolognu sekvencu koja je okružena sa regiona homologije kako bi se omogućila efikasna HDR na mestu od interesa ili se može integrisati putem mehanizama za popravak koji nisu usmereni na homologiju. Pored toga, donorske sekvence mogu sadržati vektorski molekul koji sadrži sekvence koje nisu homologne regionu od interesa za ćelijski hromatin. Donorski molekul može sadržati nekoliko isprekidanih regiona homologije sa ćelijskim hromatinom. Dalje, za ciljano

4

umetanje sekvenci koje obično nisu prisutne u regionu od interesa, pomenute sekvence mogu biti prisutne u molekulu donorske nukleinske kiseline i okružene regionima homologije za sekvencu u regionu od interesa.

[0110] Kao i kod nukleaza, donori se mogu uvesti u bilo koji oblik. U određenim otelotvorenjima, donori se uvode u mRNK oblik kako bi eliminisali rezidualni virus u modifikovanim ćelijama. U drugim otelotvorenjima, donori se mogu uvesti upotrebom DNK i/ili virusnih vektora postupcima poznatim u struci. Pogledati npr. SAD patentne publikacije br. 20100047805 i 20110207221. Donor se može uvesti u ćeliju u kružnom ili linearnom obliku. Ako se uvedu u linearnom obliku, krajevi donorske sekvence mogu biti zaštićeni (npr., od egzonukleolitičke razgradnje) postupcima poznatim stručnjacima. Na primer, jedan ili više didezoksinukleotidnih ostataka dodaje se na 3' kraj linearnog molekula i/ili se samokomplementarni oligonukleotidi vezuju za jedan ili oba kraja. Pogledati, na primer, Chang et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA84:4959-4963; Nehls et al. (1996) Science272:886-889. Dodatni postupci za zaštitu egzogenih polinukleotida od razgradnje uključuju, ali nisu ograničeni na, dodavanje terminalnih amino grupa i upotrebu modifikovanih internukleotidnih veza kao što su, na primer, fosforotioati, fosforamidati i ostaci O-metil riboze ili dezoksiriboze.

[0111] U određenim otelotvorenjima, donor uključuje sekvence (npr., kodirajuće sekvence, takođe nazvane transgeni) veće od 1 kb, na primer između 2 i 200 kb, između 2 i 10 kb (ili bilo koje vrednosti između). Donor može takođe da uključi najmanje jedno ciljano mesto nukleaze. U određenim otelotvorenjima, donor uključuje najmanje 2 ciljana mesta, na primer za par CPN, TALEN, TtAgo ili CRISPR/Cas nukleaza. Tipično, ciljana mesta nukleaze su izvan sekvenci transgena, na primer 5' i/ili 3' u sekvenci transgena, radi razdvajanja transgena. Mesto razdvajanja nukleaze može biti za bilo koju nukleazu. U određenim otelotvorenjima, ciljana mesta nukleaze sadržana u dvolančanom donoru su za istu nukleazu koja se koriste za razdvajanje endogene mete u koju je razdvojeni donor integrisan postupcima nezavisnim od homologije.

[0112] Donor može biti umetnut tako da njegovo eksprimiranje pokreće endogeni promoter na mestu integracije, naime promoter koji pokreće eksprimiranje endogenog gena u koji je donor umetnut. Međutim, biće očigledno da donor može sadržati promoter i/ili pojačivač, na primer konstitutivni promoter ili inducibilni ili tkivno specifični promoter. Donorski molekul može biti umetnut u endogeni gen tako da se eksprimiraju svi, neki ili nijedan endogeni gen. Dalje, iako nisu potrebne za eksprimiranje, egzogene sekvence mogu takođe da uključuju transkripcione ili translacione regulatorne sekvence, na primer, promotere, pojačivače, izolatore, unutrašnja mesta ulaska u ribozome, sekvence koje kodiraju 2A peptide i/ili signale poliadenilacije.

[0113] Transgeni koji se nose na ovde opisanim donorskim sekvencama mogu se izolovati iz plazmida, ćelija ili drugih izvora koristeći standardne tehnike poznate u struci, kao što je PCR. Donori za upotrebu mogu da uključuju različite tipove topologije, uključujući kružno super-uvijene, kružno opuštene, linearne i slično. Alternativno, mogu se hemijski sintetisati koristeći standardne tehnike sinteze oligonukleotida. Pored toga, donori mogu biti metilirani ili im nedostaje metilacija. Donori mogu biti u obliku veštačkih hromozoma bakterija ili kvasca (BAC ili IAC).

[0114] Ovde opisani donorski polinukleotidi mogu da uključuju jednu ili više neprirodnih baza i/ili okosnica. Konkretno, umetanje donorskih molekula sa metiliranim citozinima može se izvršiti korišćenjem ovde opisanih postupaka kako bi se postiglo stanje mirovanja transkripcije u regionu od interesa.

[0115] Egzogeni (donorski) polinukleotid može sadržati bilo koju sekvencu od interesa (egzogena sekvenca). Primeri egzogenih sekvenci uključuju, ali nisu ograničeni na bilo koju sekvencu koja kodira polipeptid (npr. CDNA), promoterske sekvence, pojačivačke sekvence, epitopske oznake, marker gene, mesta za prepoznavanje enzima razdvajanja i razne vrste konstrukata eksprimiranja. Marker geni uključuju, ali nisu ograničeni na, sekvence koje kodiraju proteine koji posreduju u rezistenciji na antibiotike (npr., rezistencija na ampicilin, rezistencija na neomicin, G418, rezistencija na puromicin), sekvence koje kodiraju obojene ili fluorescentne ili luminiscentne proteine (npr., zeleni fluorescentni protein, pojačani zeleni fluorescentni protein, crveni fluorescentni protein, luciferaza) i proteini koji posreduju u pojačanom ćelijskom rastu i/ili amplifikaciji gena (npr., dihidrofolat reduktaza). Oznake epitopa uključuju, na primer, jednu ili više kopija od FLAG, His, mic, Tap, HA ili bilo koje sekvence aminokiselina koja se može detektovati.

[0116] U nekim otelotvorenjima, donor dalje sadrži polinukleotid koji kodira bilo koji polipeptid čije je eksprimiranje potrebno u ćeliji, uključujući, ali ne ograničavajući se na

4

antitela, antigene, enzime, receptore (ćelijske površine ili nuklearne), hormone, limfokine, citokine, reporter polipeptide, faktore rasta i funkcionalne fragmente bilo čega od navedenog. Kodirajuće sekvence mogu biti, na primer, cDNK.

[0117] U određenim otelotvorenjima, egzogene sekvence mogu sadržati marker gen (opisan iznad), omogućavajući odabir ćelija koje su bile podvrgnute ciljanoj integraciji i povezanu sekvencu koja kodira dodatnu funkcionalnost. Neograničavajući primeri marker gena uključuju GFP, markere za odabir lekova i slično.

[0118] U određenim otelotvorenjima, transgen može da uključuje, na primer, gene divljeg tipa koji zamenjuju mutirane endogene sekvence. Na primer, sekvenca gena divljeg tipa (ili druga funkcionalna) može se umetnuti u genom matične ćelije u kojoj je mutirana endogena kopija gena. Transgen može biti ubačen u endogeni lokus, ili može biti usmeren na lokus sigurne luke.

[0119] Konstrukcija takvih kaseta eksprimiranja, u skladu navodima predmetne specifikacije, koristi metodologije dobro poznate u struci molekularne biologije (pogledati, na primer, Ausubel ili Maniatis). Pre upotrebe kasete eksprimiranja za generisanje transgene životinje, reaktivnost kasete eksprimiranja na induktor stresa povezan sa odabranim kontrolnim elementima može se testirati uvođenjem kasete eksprimiranja u odgovarajuću ćelijsku liniju (npr., primarne ćelije, transformisane ćelije ili besmrtne ćelijske linije).

[0120] Dalje, iako nisu potrebne za eksprimiranje, egzogene sekvence mogu takođe biti transkripcione ili translacione regulatorne sekvence, na primer, promoteri, pojačivači, izolatori, unutrašnja mesta za ulazak u ribozom, sekvence koje kodiraju 2A peptide i/ili signale poliadenilacije. Dalje, kontrolni elementi gena od interesa mogu se operativno povezati sa reporter genima kako bi se stvorili himerni geni (npr., kasete za eksprimiranje reportera). Primerne sekvence prihvatnih mesta za splajsovanje poznate su stručnjacima i uključuju samo kao primer CTGACCTCTTCTCTTCCTCCCACAG, (SEQ ID NO: 1) (iz ljudskog HBB gena) i TTTCTCTCCACAG (SEQ ID NO: 2) (iz ljudskog gena imunoglobulin-gama).

[0121] Takođe se može postići ciljano umetanje nekodirajuće sekvence nukleinske kiseline. Sekvence koje kodiraju antisens RNK, RNKi, shRNK i mikro RNK (miRNK) takođe se

4

mogu koristiti za ciljane umetanja.

[0122] U dodatnim otelotvorenjima, donorska nukleinska kiselina može sadržati nekodirajuće sekvence koje su specifična ciljana mesta za dodatne dizajne nukleaze. Posle toga, dodatne nukleaze mogu da se eksprimiraju u ćelijama tako da se originalni donorski molekul razdvaja i modifikuje umetanjem drugog donorskog molekula od interesa. Na ovaj način mogu se stvoriti ponovljene integracije donorskih molekula, omogućavajući slaganje osobina na određenom lokusu od interesa ili na lokusu sigurne luke.

Ćelije

[0123] Stoga, ovde su pružene genetski modifikovane ćelije, na primer matične ćelije koje sadrže inaktivirani gen i/ili transgen, uključujući ćelije proizvedene ovde opisanim postupcima. Transgen se ciljano integriše u genom ćelije pomoću jedne ili više nukleaza. Za razliku od slučajne integracije, ciljana integracija pruža da se transgen integriše u određeni gen. Transgen može biti integrisan bilo gde u ciljanom genu. Transgen može biti integrisan na ili u blizini mesta vezivanja i/ili mesta razdvajanja, na primer, unutar 1-300 (ili bilo koji broj baznih parova između) baznih parova uzvodno ili nizvodno od mesta razdvajanja i/ili mesta vezivanja, više poželjno unutar 1-100 baznih parova (ili bilo koji broj baznih parova između) sa bilo koje strane razdvajanja i/ili mesta vezivanja, još poželjnije unutar 1 do 50 baznih parova (ili bilo koji broj baznih parova između) sa bilo koje strane mesta razdvajanja i/ili vezivanja. U određenim otelotvorenjima, integrisana sekvenca ne uključuje nijednu vektorsku sekvencu (npr. virusnu vektorsku sekvencu). Ćelije mogu sadržati modifikaciju (npr. umetanje i/ili brisanje) napravljenu nukleazom kako je ovde opisano, tako da je modifikacija unutar egzona gena beta-globina, na primer unutar egzona 1, 2 ili 3. U određenim otelotvorenjima, modifikacija ispravlja mutaciju srpastih ćelija u egzonu 1 gena beta globina. Modifikacija može biti na ili blizu (npr., 1-300 baznih parova ili bilo koji broj baznih parova između) SEQ ID NO: 23 ili 24. U drugim otelotvorenjima, modifikacija je 1-100 (ili bilo koji broj baznih parova između) baznih parova od SEQ ID NO: 23 ili 24. U određenim otelotvorenjima, modifikacija je unutar SEQ ID NO: 23 i/ili SEQ ID NO: 24, na primer modifikacija 1 ili više baznih parova u bilo kojoj SEQ ID NO: 23 ili 24.

[0124] Bilo koji tip ćelije može biti genetski modifikovan kako je ovde opisano da sadrži transgen, uključujući, ali ne ograničavajući se na ćelije i ćelijske linije. Ostali neograničavajući primeri ovde genetski modifikovanih ćelija uključuju T-ćelije (npr., CD4+, CD3 , CD8+, itd.); dendritične ćelije; B-ćelije; autologne (npr., izvedene iz pacijenta). U

4

određenim otelotvorenjima, ćelije su matične ćelije, uključujući heterologne pluripotentne ili multipotentne matične ćelije (npr., CD34+ ćelije, indukovane pluripotentne matične ćelije (iPSC), embrionalne matične ćelije ili slično). U određenim otelotvorenjima, ćelije kako su ovde opisane su matične ćelije izvedene iz pacijenta.

[0125] Ovde opisane ćelije su korisne u tretmanu i/ili prevenciji poremećaja kod pacijenta sa poremećajem, na primer, pomoću ex vivo terapije. Nukleazno modifikovane ćelije mogu se proširiti, i zatim ponovo uvesti u pacijenta pomoću standardnih tehnika. Pogledati npr. Tebas et al (2014) New Eng J Med 370(10):901. U slučaju matičnih ćelija, nakon infuzije kod pacijenta, in vivo dolazi i do diferencijacije ovih prekursora na ćelije koje eksprimiraju funkcionalni protein (od ubačenog donora). Takođe su pruženi farmaceutski sastavi koji sadrže ćelije kako su ovde opisani. Pored toga, ćelije mogu biti krio-konzervirane pre primene pacijentu.

Isporuka

[0126] Nukleaze, polinukleotidi koji kodiraju ove nukleaze, donorski polinukleotidi i sastavi koje sadrže ovde opisane proteine i/ili polinukleotide mogu se isporučiti na bilo koji pogodan način. U određenim otelotvorenjima, nukleaze i/ili donori se isporučuju in vivo. U drugim otelotvorenjima, nukleaze i/ili donori se isporučuju u izolovane ćelije (npr., autologne ili heterologne matične ćelije) za pružanje modifikovanih ćelija korisnih u ex vivo isporuci pacijentima.

[0127] Postupci isporuke nukleaza kako su ovde opisani opisani su, na primer, u SAD patentima br.6,453,242; 6,503,717; 6,534,261; 6,599,692; 6,607,882; 6,689,558; 6,824,978; 6,933,113; 6,979,539; 7,013,219; i 7,163,824.

[0128] Nukleaze i/ili donorski konstrukti kako su ovde opisani mogu se takođe isporučiti koristeći bilo koji mehanizam za isporuku nukleinske kiseline, uključujući golu DNK i/ili RNK (npr., mRNK) i vektori koji sadrže sekvence koje kodiraju jednu ili više komponenti. Mogu se koristiti bilo koji vektorski sistemi, uključujući, ali bez ograničenja na njih, plazmidne vektore, DNK minikrugove, retrovirusne vektore, lentivirusne vektore, adenovirusne vektore, pokvirusne vektore; herpesvirusne vektore i adeno-povezane virusne vektore, itd., i njihove kombinacije. Takođe pogledati, SAD patente br.6,534,261; 6,607,882; 6,824,978; 6,933,113; 6,979,539; 7,013,219; i 7,163,824, i SAD patentnu prijavu br.

14/271,008. Dalje, biće očigledno da bilo koji od ovih sistema može sadržati jednu ili više

4

sekvenci potrebnih za tretman. Prema tome, kada se jedna ili više nukleaza i donorski konstrukt unesu u ćeliju, nukleaze i/ili donorski polinukleotid mogu se prenositi na istom sistemu isporuke ili na različitim mehanizmima isporuke. Kada se koristi više sistema, svaki mehanizam isporuke može sadržati sekvencu koja kodira jednu ili više nukleaza i/ili donorskih konstrukata (npr., mRNK koja kodira jednu ili više nukleaza i/ili mRNK ili AAV koja nosi jednu ili više donorskih konstrukata).

[0129] Uobičajeni postupci prenosa gena zasnovani na virusima i nevirusima mogu se koristiti za uvođenje nukleinskih kiselina koje kodiraju nukleaze i donorske konstrukte u ćelije (npr., ćelije sisara) i ciljana tkiva. Nevirusni vektorski sistemi za isporuku uključuju DNK plazmide, DNK minikrugove, golu nukleinsku kiselinu i nukleinsku kiselinu u kompleksu sa nosačem za isporuku kao što su lipozom, nanočestice lipida, nanočestice polilaktat-glikolne kiseline, poli-aminski kompleksirajući agensi ili poloksamer. Sistemi za isporuku virusnih vektora uključuju DNK i RNK viruse, koji imaju epizomske ili integrisane genome nakon isporuke u ćeliju. Za pregled postupaka genske terapije, pogledati Anderson, Science 256:808-813 (1992); Nabel & Feigner, TIBTECH 11:211-217 (1993); Mitani & Caskey, TIBTECH 11:162-166 (1993); Dillon, TIBTECH 11:167-175 (1993); Miller, Nature 357:455-460 (1992); Van Brunt, Biotechnology 6(10):1149-1154 (1988); Vigne, Restorative Neurology and Neuroscience 8:35-36 (1995); Kremer & Perricaudet, British Medical Bulletin 51(1):31-44 (1995); Haddada et al., in Current Topics in Microbiology and Immunology Doerfler and Böhm (eds.) (1995); I Yu et al., Gene Therapy 1:13-26 (1994).

[0130] Postupci nevirusne isporuke nukleinskih kiselina uključuju elektroporaciju, lipofekciju, mikroinjekciju, biolistiku, vitrozome, lipozome, imunolipozome, polikaciju ili lipide: konjugate nukleinske kiseline, golu DNK, golu RNK, zatvorenu RNK, veštačke virione i unos DNK pojačan agensima. Sonoporacija koristeći, npr., Sonitron 2000 sistem (Rich-Mar) takođe se može koristiti za isporuku nukleinskih kiselina.

[0131] Dodatni primerni sistemi za isporuku nukleinske kiseline uključuju one koje pružaju Amaxa Biosystems (Cologne, Germany), Maxcyte, Inc. (Rockville, Maryland), BTX Molecular Delivery Systems (Holliston, MA) i Copernicus Therapeutics Inc., (pogledati na primer SAD patent br.6,008,336). Lipofekcija je opisana u npr., SAD patentima br.

5,049,386; 4,946,787; i 4,897,355), a reagensi za lipofekciju se prodaju komercijalno (npr. Transfectam™ i Lipofectin™). Katjonski i neutralni lipidi koji su pogodni za efikasnu

4

lipofekciju polinukleotida za prepoznavanje receptora uključuju one od Feigner, WO 91/17424, WO 91/16024.

[0132] Priprema kompleksa lipid:nukleinske kiseline, uključujući ciljane lipozome kao što su imunolipidni kompleksi, dobro je poznata stručnjaku (pogledati, npr. Crystal, Science 270:404-410 (1995); Blaese et al., Cancer Gene Ther.2:291-297 (1995); Behr et al., Bioconjugate Chem. 5:382-389 (1994); Remy et al., Bioconjugate Chem.5:647-654 (1994); Gao et al., Gene Therapy 2:710-722 (1995); Ahmad et al., Cancer Res. 52:4817-4820 (1992); SAD patente br.4,186,183, 4,217,344, 4,235,871, 4,261,975, 4,485,054, 4,501,728, 4,774,085, 4,837,028, i 4,946,787).

[0133] Dodatni načini isporuke uključuju upotrebu ambalaže nukleinskih kiselina za isporuku u EnGeneIC dostavne nosače (EDV). Ovi EDV se posebno isporučuju u ciljana tkiva koristeći bispecifična antitela, gde jedan krak antitela ima specifičnost za ciljano tkivo, a drugi specifičnost za EDV. Antitelo dovodi EDV na površinu ciljane ćelije, a zatim se EDV unosi u ćeliju endocitozom. Jednom u ćeliji, sadržaj se oslobađa (pogledati MacDiarmid et al (2009) Nature Biotechnology 27(7):643).

[0134] Upotreba sistema zasnovanih na RNK ili DNK na virusu za isporuku nukleinskih kiselina koji kodiraju konstruisani CRISPR/Cas sistemi koriste prednosti visoko razvijenih procesa za ciljanje virusa na određene ćelije u telu i promet virusnog paketa u jezgro. Virusni vektori se mogu primeniti direktno pacijentima (in vivo) ili se mogu koristiti za tretman ćelija in vitro, a modifikovane ćelije se primenjuju pacijentima (ex vivo). Konvencionalni virusni sistemi za isporuku CRISPR/Cas sistema uključuju, ali nisu ograničeni na, retrovirusne, lentivirusne, adenovirusne, adeno-povezane, vakcinija i herpes simpleks virusne vektore za prenos gena. Integracija u genom domaćina je moguća sa postupcima prenosa gena za retrovirus, lentivirus i adeno-povezani virus, što često rezultuje dugotrajnim eksprimiranjem umetnutog transgena. Pored toga, primećena je visoka efikasnost transdukcije u mnogim različitim tipovima ćelija i ciljanim tkivima.

[0135] Tropizam retrovirusa može se promeniti uključivanjem proteina strane ovojnice, šireći potencijalnu ciljanu populaciju ciljanih ćelija. Lentivirusni vektori su retrovirusni vektori koji su sposobni da transformišu ili zaraze ćelije koje se ne dele i obično proizvode visoke virusne titre. Izbor sistema za prenos retrovirusnog gena zavisi od ciljanog tkiva. Retrovirusni vektori se sastoje od cis-delujućih dugačkih terminalnih ponavljanja sa kapacitetom pakovanja do 6-10 kb strane sekvence. Minimalni cis-delujući LTR su dovoljni za replikaciju i pakovanje vektora, koji se zatim koriste za integraciju terapijskog gena u ciljanu ćeliju kako bi se pružilo trajno eksprimiranje transgena. Široko korišćeni retrovirusni vektori uključuju one zasnovane na virusu mišje leukemije (MuLV), virusu leukemije gibon majmuna (GaLV), virusu simijanske imunodeficijencije (SIV), virusu ljudske imunodeficijencije (HIV) i njihovim kombinacijama (pogledati npr. Buchscher et al., J. Virol.66:2731-2739 (1992); Johann et al., J. Virol.66:1635-1640 (1992); Sommerfelt et al., Virol.176:58-59 (1990); Wilson et al., J. Virol.63:2374-2378 (1989); Miller et al., J. Virol.65:2220-2224 (1991); PCT/US94/05700).

[0136] U primenama u kojima je poželjno privremeno eksprimiranje, mogu se koristiti sistemi zasnovani na adenovirusima. Adenovirusni vektori su sposobni za vrlo visoku efikasnost transdukcije u mnogim tipovima ćelija i ne zahtevaju deljenje ćelija. Sa takvim vektorima dobijen je visok titar i visok nivo eksprimiranja. Ovaj vektor se može proizvesti u velikim količinama u relativno jednostavnom sistemu. Vektori adeno-povezanih virusa („AAV“) se takođe koriste za transdukciju ćelija ciljanim nukleinskim kiselinama, npr., u in vitro proizvodnji nukleinskih kiselina i peptida i za in vivo i ex vivo postupke genske terapije (pogledati, npr. West et al., Virology 160:38-47 (1987); SAD patent br.4,797,368; WO 93/24641; Kotin, Human Gene Therapy 5:793-801 (1994); Muzyczka, J. Clin. Invest.

94:1351 (1994). Konstrukcija rekombinantnih AAV vektora opisana je u brojnim publikacijama, uključujući SAD patent br.5,173,414; Tratschin et al., Mol. Cell. Biol.

5:3251-3260 (1985); Tratschin, et al., Mol. Cell. Biol.4:2072-2081 (1984); Hermonat & Muzyczka, PNAS 81:6466-6470 (1984); i Samulski et al., J. Virol.63:03822-3828 (1989). Može se koristiti bilo koji AAV serotip, uključujući AAV1, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6 i AAV8, AAV 8.2, AAV9 i AAV rh10 i pseudotipski AAV kao što su AAV2/8, AAV2/5 i AAV2/6.

[0137] Trenutno je dostupno najmanje šest pristupa virusnim vektorima za prenos gena u kliničkim ispitivanjima, koji koriste pristupe koji uključuju komplementaciju defektnih vektora genima umetnutim u pomoćne ćelijske linije za generisanje agensa za transdukciju.

[0138] pLASN i MFG-S su primeri retrovirusnih vektora koji su korišćeni u kliničkim ispitivanjima (Dunbar et al., Blood 85:3048-305 (1995); Kohn et al., Nat. Med.1:1017-102

1

(1995); Malech et al., PNAS 94:2212133-12138 (1997)). PA317/pLASN je prvi terapijski vektor korišćen u ispitivanju genske terapije. (Blaese et al., Science 270:475-480 (1995)). Efikasnost transdukcije od 50% ili više primećena je za vektore upakovane u MFG-S. (Ellem et al., Immunol Immunother.44(1): 10-20 (1997); Dranoff et al., Hum. Gene Ther.1:111-2 (1997).

[0139] Rekombinantni adeno-povezani virusni vektori (rAAV) su perspektivni alternativni sistemi za isporuku gena zasnovani na defektnom i nepatogenom parvovirusnom adenopovezanom virusu tipa 2. Svi vektori su izvedeni iz plazmida koji zadržava AAV 145 bazni par (bp) invertovana terminalna ponavljanja koja okružuju kasetu za eksprimiranje transgena. Efikasan prenos gena i stabilna isporuka transgena zahvaljujući integraciji u genom transducirane ćelije su ključne karakteristike ovog vektorskog sistema. (Wagner et al., Lancet 351:9117 1702-3 (1998), Kearns et al., Gene Ther.9:748-55 (1996)). Ostali AAV serotipovi, uključujući AAV1, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV8, AAV9 i AAVrh10, i sve njihove varijante, takođe se mogu koristiti u skladu sa predmetnim pronalaskom.

[0140] Rekombinantni adenovirusni vektori sa nedostatkom replikacije mogu se proizvesti pri visokom titru i lako inficirati brojne različite tipove ćelija. Većina adenovirusnih vektora je napravljena tako da transgen zamenjuje Ad E1a, E1b i/ili E3 gene; posle toga se replicirani defektni vektor širi u ljudskim 293 ćelijama koje snabdevaju izbrisanu gensku funkciju u trans. Ad vektori mogu da pretvore više vrsta tkiva in vivo, uključujući diferencirane ćelije koje se ne dele, poput onih koje se nalaze u jetri, bubrezima i mišićima. Konvencionalni Ad vektori imaju veliku nosivost. Primer primene Ad vektora u kliničkom ispitivanju obuhvatio je polinukleotidnu terapiju za antitumorsku imunizaciju intramuskularnom injekcijom (Sterman et al., Hum. Gene Ther.7:1083-9 (1998)). Dodatni primeri upotrebe adenovirusnih vektora za prenos gena u kliničkim ispitivanjima uključuju Rosenecker et al., Infection 24:1 5-10 (1996); Sterman et al., Hum. Gene Ther.9:7 1083-1089 (1998); Welsh et al., Hum. Gene Ther.2:205-18 (1995); Alvarez et al., Hum. Gene Ther.5:597-613 (1997); Topf et al., Gene Ther.5:507-513 (1998); Sterman et al., Hum. Gene Ther.7:1083-1089 (1998).

[0141] Ćelije za pakovanje se koriste za formiranje čestica virusa koje su sposobne da zaraze ćeliju domaćina. Takve ćelije uključuju 293 ćelije koje pakuju adenovirus i cells2 ćelije ili PA317 ćelije koje pakuju retrovirus. Virusne vektore koji se koriste u genskoj terapiji obično generiše ćelijska linija proizvođač koja pakuje vektor nukleinske kiseline u virusnu česticu.

2

Vektori obično sadrže minimalne virusne sekvence potrebne za pakovanje i naknadnu integraciju u domaćina (ako je primenljivo), dok se druge virusne sekvence zamenjuju kasetom eksprimiranja koja kodira protein koji treba da se eksprimira. Nedostajuće virusne funkcije su isporučene u trans linijom ćelija za pakovanje. Na primer, AAV vektori koji se koriste u genskoj terapiji obično imaju samo sekvence obrnutog terminalnog ponavljanja (ITR) iz genoma AAV koje su potrebne za pakovanje i integraciju u genom domaćina.

Virusna DNK je upakovana u ćelijsku liniju koja sadrži pomoćni plazmid koji kodira ostale gene AAV, naime rep i kapa, ali bez ITR sekvenci. Ćelijska linija je takođe zaražena adenovirusom kao pomoćnikom. Pomoćni virus promoviše replikaciju AAV vektora i eksprimiranje AAV gena iz pomoćnog plazmida. Pomoćni plazmid nije pakovan u značajnim količinama usled nedostatka ITR sekvenci. Kontaminacija adenovirusom može se smanjiti, npr., termičkom obradom na koju je adenovirus osetljiviji od AAV.

[0142] U mnogim primenama genske terapije poželjno je da se vektor genske terapije isporučuje sa visokim stepenom specifičnosti za određenu vrstu tkiva. Shodno tome, virusni vektor se može modifikovati tako da ima specifičnost za dati tip ćelije eksprimiranjem liganda kao fuzionog proteina sa proteinom virusnog omotača na spoljnoj površini virusa. Ligand je izabran tako da ima afinitet za receptor za koji je poznato da je prisutan na ćelijskoj vrsti koja nas zanima. Na primer, Han et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:9747-9751 (1995), izvestili su da se virus Moloney mišje leukemije može modifikovati tako da eksprimira ljudski heregulin spojen sa gp70, i rekombinantni virus inficira određene ćelije ljudskog raka dojke eksprimirajući receptor ljudskog epidermalnog faktora rasta. Ovaj princip se može proširiti i na druge parove virus-ciljane ćelije, u kojima ciljana ćelija eksprimira receptor, a virus eksprimira fuzioni protein koji sadrži ligand za receptor ćelijske površine. Na primer, filamentozni fag može se konstruisati tako da prikazuje fragmente antitela (npr., FAB ili Fv) koji imaju specifičan afinitet vezivanja za praktično bilo koji izabrani ćelijski receptor. Iako se gornji opis odnosi prvenstveno na virusne vektore, isti principi se mogu primeniti i na nevirusne vektore. Takvi vektori mogu biti sintetički tako da sadrže specifične sekvence usvajanja koje favorizuju apsorpciju određenim ciljanim ćelijama.

[0143] Mogu se isporučiti vektori genske terapije in vivo primenom pojedinačnom pacijentu, obično sistemskom primenom (npr., intravenska, intraperitonealna, intramuskularna, subdermalna ili intrakranijalna infuzija) ili lokalnom primenom, kao što je opisano u nastavku. Alternativno, vektori se mogu dostaviti u ćelije ex vivo, kao što su ćelije eksplantirane od pojedinačnog pacijenta (npr., limfociti, aspirati koštane srži, biopsija tkiva) ili matične ćelije krvotvornih donora, praćene reimplantacijom ćelija u pacijenta, obično nakon izbora za ćelije koje su ugradile vektor.

[0144] Vektori (npr., retrovirusi, adenovirusi, lipozomi, itd.) koji sadrže nukleaze i/ili donorske konstrukte mogu se takođe primeniti direktno u organizam za transdukciju ćelija in vivo. Alternativno, može se primeniti gola DNK. Primena se izvodi na bilo koji način koji se obično koristi za uvođenje molekula u krajnji dodir sa ćelijama krvi ili tkiva, uključujući, ali bez ograničenja, injekciju, infuziju, topikalnu primenu i elektroporaciju. Pogodni postupci za primenu takvih nukleinskih kiselina su dostupni i dobro su poznati stručnjacima, i, iako se više od jednog puta može koristiti za davanje određenog preparata, određeni put često može pružiti neposredniju i efikasniju reakciju od drugiog puta.

[0145] Ovde opisani vektori pogodni za uvođenje polinukleotida uključuju neintegracione lentivirusne vektore (IDLV). Pogledati, na primer, Ory et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA93:11382-11388; Dull et al. (1998) J. Virol.72:8463-8471; Zuffery et al. (1998) J. Virol.

72:9873-9880; Follenzi et al. (2000) Nature Genetics25:217-222; SAD patentna publikacija br. 2009/054985.

[0146] Farmaceutski prihvatljivi nosači se delimično određuju konkretnim sastavom koji se primenjuje, kao i određenim postupkom koji se koristi za primenu smeše. Shodno tome, postoji širok spektar pogodnih formulacija farmaceutskih sastava, kao što je opisano u nastavku (pogledati, npr. Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th ed., 1989).

[0147] Biće očigledno da se sekvence kodiranja nukleaze i donorski konstrukti mogu isporučiti koristeći isti ili različiti sistem. Na primer, donorski polinukleotid može da nosi AAV, dok jednu ili više nukleaza može da nosi mRNK. Dalje, različiti sistemi mogu se primenjivati na isti ili različit način (intramuskularna injekcija, injekcija repne vene, druga intravenska injekcija, intraperitonealna primena i/ili intramuskularna injekcija. Vektori se mogu isporučivati istovremeno ili bilo kojim sekvencijalnim redosledom.

[0148] Formulacije za ex vivo i in vivo primene uključuju suspenzije u tečnim ili emulgovanim tečnostima. Aktivni sastojci se često mešaju sa pomoćnim supstancama koje su farmaceutski prihvatljive i kompatibilne sa aktivnim sastojkom. Pogodni ekscipijensi

4

uključuju, na primer, vodu, fiziološki rastvor, dekstrozu, glicerol, etanol ili slično, i njihove kombinacije. Pored toga, sastav može sadržati manje količine pomoćnih supstanci, kao što su agensi za vlaženje ili emulgovanje, agensi za puferisanje pH, stabilizatori ili drugi reagensi koji poboljšavaju efikasnost farmaceutskih sastava.

Kompleti

[0149] Takođe su priloženi kompleti za izvođenje bilo kog od gore navedenih postupaka. Kompleti obično sadrže polinukleotide koji kodiraju jednu ili više nukleaza, jedan ili više faktora koji utiču na ekspanziju matičnih ćelija i/ili polinukleotide donora kako je ovde opisano, kao i uputstva za primenu faktora koji utiču na matične ćelije u ćelije u koje se uvode nukleaze i/ili donorski polinukleotid (ili su okolni medijum). Kompleti takođe mogu sadržati ćelije, pufere za transformaciju ćelija, medijum za kulturu ćelija i/ili pufere za izvođenje testova. Tipično, kompleti takođe sadrže oznaku koja uključuje bilo koji materijal kao što su uputstva, pakovanje ili reklamni listić koji je pričvršćen za druge komponente kompleta ili je na neki drugi način uz njega.

[0150] Naredni primeri se odnose na primerne aspekte predmetnog obelodanjenja u kojima nukleaza sadrži jedan ili više CPN ili jedan ili više TALEN. Jasno je da je to dato samo radi primera.

PRIMERI

Primer 1: Dizajn, konstrukcija i opšta karakterizacija protein cinkovog prsta nukleaza (CPN)

[0151] Proteini cinkovog prsta su dizajnirani i ugrađeni u plazmide, AAV ili adenovirusne vektore suštinski kako je opisano kod Urnov et al. (2005) Nature 435(7042):646-651, Perez et al (2008) Nature Biotechnology 26(7):808-816, i kao što je opisano u SAD patentu br. 6,534,261 i testirani su za vezivanje. Za CPN i TALEN specifične za lokus ljudskog beta globina, pogledati u SAD patentu br.7,888,121 koji je u suvlasništvu i SAD patentne publikacije br.20130137104 i 20130122591.

Primer 2: Aktivnost CPN specifičnih za globin

[0152] CPN parovi koji ciljaju lokus ljudskog globina korišćeni su za testiranje sposobnosti ovih CPN da indukuju DSB na određenom ciljanom mestu. Aminokiselinske sekvence spiralnog regiona prepoznavanja svakog prsta naznačenih CPN prikazane su u Tabeli 1 u nastavku. Ciljana mesta (DNK ciljana mesta označena velikim slovima; nedodirnuti nukleotidi označeni malim slovima) prikazani su u Tabeli 2.

Tabela 1: Dizajn spirale za prepoznavanje proteina cinkovog prsta za ljudski beta globin

Tabela 2: Ciljana mesta ljudskih cink prstiju specifičnih za beta globin

[0153] Ljudske CD34+ ćelije su dobijene i obrađene na naredni način. Svi uzorci krvi iz pupčane vrpce (CB) dobijeni su u skladu sa smernicama koje je odobrio University of California i smatrani su anonimnim medicinskim otpadom izuzetim od IRB pregleda. Ćelije su obrađene u roku od 48 sati od sakupljanja. Aspirati za koštanu srž (BM) od dobrovoljnih donora sa SCD dobijeni su uz informisani pristanak u skladu sa UCLA IRB protokolom br.

10-001399. Mononuklearne ćelije (MNC) su izolovane iz BM i CB primenom Ficoll Hypaque (Stem Cell Technologies) centrifugiranja gustine. Zatim se upotrebilo imunomagnetno odvajanje kolone za obogaćivanje CD34+ ćelija inkubacijom MNC sa mikro-kuglicama anti-CD34 (Miltenyi Biotec Inc.) na 4°C tokom 30 minuta. Ćelije su zatim poslate kroz magnetnu kolonu i CD34+ ćelije su sakupljene i smeštene u krio-boce sa sredstvom za zamrzavanje (10% dimetil sulfoksida (Sigma Aldrich), 90% FBS) i kriokonzervirane u tečnom azotu. Mobilizirane CD34+ ćelije (mPB) su kupljene od Allcells.

[0154] Kako bi se proizvela mRNK za elektroporaciju, plazmidi koji kodiraju CPN prikazane u Tabeli 1 linearizovani su sa SpeI (New England Biolabs) i prečišćenim fenol:holorformom pre upotrebe kao obrazac za in vitro transkripciju. mMessage mMachine® T7 ULTRA komplet za transkripciju (Life Technologies) korišćen je u skladu sa protokolom proizvođača za proizvodnju in vitro transkribovane mRNK i očišćena je pomoću RNeasy® MinElute® Cleanup kompleta (Qiagen). Za elektroporaciju je praćen naredni protokol: CB CD34+ ćelije su odmrznute na 37°C, isprane u Iscove modifikovanom Dulbecco medijumu (IMDM; Life Technologies) dopunjenom sa 20% fetalnog goveđeg seruma (Gemini Bio-products) i (1 × glutamin, penicilin i streptomicin) i prethodno stimulisani 48 sati u X-VIVO15 (Lonza) medijumu koji sadrži glutamin, penicilin, streptomicin, 50 ng/ml SCF, 50 ng/ml Flt-3 i 50 ng/ml TPO (Peprotech). Za elektroporaciju, 200.000 ćelija po reakciji je obrtano na 90g u trajanju od 15 minuta, resuspendovano u 100 µl BTX pufera sa pritiskom (Harvard Apparatus), pomešani sa naznačenim količinama CPN mRNK i/ili oligonukleotida, prema potrebi, i pulsirani jednom pri 250 V tokom 5 msek u BTX ECM 830 Square Wave elektroporatoru (Harvard Apparatus).

[0155] Nakon elektroporacije, ćelije su se odmarale 10 minuta na sobnoj temperaturi pre dodavanja medijuma za kulturu i prebačene su na ploče pri ukupno 500 ul. Donorski IDLV je bio prisutan u konačnom medijumu za kulturu u koncentracijama opisanim za odgovarajuće uzorke.

[0156] Korekcija gena i poremećaj gena analizirani su na naredni način: Surveyor® Nuclease Assay (Cel-1) je korišćena za određivanje CPN-izazvanog alelnog poremećaja specifičnog za mesto. Region od 410bp koji okružuje CPN vezujuće mesto je PCR amplifikovan sa 200 ng genomske DNK koristeći CellFwd (5'-gacaggtacggctgtcatca-3' SEQ ID NO:25) i CellRev (5'-cagcctaagggtgggaaaat-3' SEQ ID NO:26) koristeći Accuprime Taq Hi-Fi (Life Technologies). Denaturacija, ponovno spajanje, digestija i elektroforetska i denzitometrijska analiza završeni su kako je opisano (npr. Joglekat et al (2013) Mol. Ther: J of the Amer Soc Gene Ther 21:1705-17). Modifikacija gena specifična za određeno mesto otkrivena je koristeći Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP).

[0157] Region od 1,1 kb koji okružuje CPN vezujuće mesto je PCR amplifikovan pomoću prajmera BgloOuterFwd (5'- atgcttagaaccgaggtagagttt-3', SEQ ID NO:27i and BgloOuterRev (5'- cctgagacttccacactgatg-3', SEQ ID NO:28) i Accuprime Taq Hi-Fi (Life Technologies). PCR proizvod je prečišćen pomoću PCR kompleta za čišćenje (Life Technologies) i digestiran upotrebom 10 jedinica HhaI (New England Biolabs) tokom 3,5 sata na 37°C.

Proizvodi za digestiju su odvojeni na 1,0% TBE-agaroznom gelu koji je prethodno obojen sa GelGreen(Biotium) i slikani na Typhoon FLA 9000 Biomolecular Imager (GE Healthcare).

[0158] Kako bi se kvantifikovala modifikacija gena, korišćen je kvantitativni PCR test.

Izvršen je set od dve PCR reakcije korišćenjem 1,1kb PCR proizvoda opisanog iznad kao obrazac. Neprečišćeni PCR obrazac je razblažen 1:5000, od čega je 1 ul korišćeno u svakoj od narednih reakcija od 25 ul. Prvi PCR je izveden za umnožavanje modifikovanih genoma, koristeći prajmere HhaIFwd (5'-gaagtctgccgttactgcg-3', SEQ ID NO:29) i HhaIRev (5'-cccagtttctattggtctcc-3', SEQ ID NO:30). Drugi PCR je izveden za normalizaciju ulaznog predloška pomoću prajmera ExonIIFwd (5'- ctcggtgcctttagtgatgg-3', SEQ ID NO:31) and ExonIIRev (5'- gactcaccctgaagttctc-3', SEQ ID NO:32). Oba ova PCR napravljena su kvantitativno pomoću Power SYBR Green PCR Master Mix (Life Technologies) i dobijena na ViiA7 (Life Technologies). Učestalost modifikacije gena određena je upotrebom razlike Ct (ciklusa do praga) između dve reakcije i standardne krive plazmida. Utvrđeno je da su svi CPN aktivni.

[0159] Globinovi paralozi su PCR-amplifikovani i duboko sekvencirani na Illumina MiSeq mašini kako bi se testirala modifikacija cilja. Primeri koji se koriste za PCR su naredni: HBB: 5'-acacgacgctcttccgatctnnnngggctgggcataaaagtcag-3' (SEQ ID NO:33) i 5'-gacgtgtgctcttccgatcttccacatgcccagtttctatt-3' (SEQ ID NO:34); HBD: 5'-acacgacgctcttccgatctnnnntaaaaggcagggcagagtcga-3' (SEQ ID NO:35) i 5'-gacgtgtgctcttccgatctacatgcccagtttccatttgc-3' (SEQ ID NO:36); HBE1: 5'-acacgacgctc ttccgatctnnnnctgcttccgacacagctgcaa-3' (SEQ ID NO:37) i 5'-gacgtgtgctcttccgatcttcacccttcattcccatgcat-3' (SEQ ID NO:38); HBG1 i HBG2: 5'-acacgacgctcttccgatctnnnnggaacgtctgaggttatcaat-3' (SEQ ID NO:39) i 5'-gacgtgtgctcttcc gatcttccttccctcccttgtcc-3' (SEQ ID NO:40). HBG1 i HBG2 su koamplifikovani i očitavanja sekvenci su dodeljena ili HBG1 ili HBG2 koristeći lokusspecifičan SNP u amplikonu.

Mešovite baze unutar naprednih prajmera omogućavaju dekonvoluciju klastera tokom sekvenciranja.

[0160] CPN su indukovale 35-65% alelnih poremećaja (indela) na lokusu beta-globina u zavisnosti od tipa ćelije, dok je detektovana modifikacija na paralogima beta globina bila manja, kao što je prikazano u Tabeli 3 u nastavku.

Tabela 3: CPN-povezana modifikacija ljudskog beta globina i njegovih paraloga u K562 ili CD34+ ćelijama (33488/33501)

[0161] Elektroporacija in vitro transkribovane mRNK koja kodira CPN u CD34+ izolovan i iz ljudske krvi pupčane vrpce (CB), kao i iz mobilizirane periferne krvi (mPB), rezultovala je efikasnim razdvajanjem ciljanog lokusa, kako je utvrđeno Surveyor Nuclease analizom (Slika 1B).

[0162] Rezultati su pokazali da CPN pokreću visok nivo modifikacije gena na lokusu betaglobina.

Primer 4: CPN vođena korekcija na osnovi srpastih ćelija

[0163] Nakon uspešnog razdvajanja na ciljanom lokusu beta-globina, pokušali smo da utvrdimo da li je korekcija osnove srpa na ovom mestu moguća koristeći homologni donorski šablon. U tom cilju, paralelno su dizajnirane i testirane dve vrste obrazaca za korekciju gena: kratki oligo DNK i IDLV. Donorski šablon fragmenta ljudskog beta-globin gena od 1,1 kb, kloniran u IDLV dizajniran je tako da uključuje korektivnu promenu na srpastoj mutaciji, kao i polimorfizam dužine tihog restrikcionog fragmenta (RFLP) kako bi se stvorilo HhaI restrikciono mesto za surogatnu analizu homolognih rekombinacija (Slika 1C). Donorski šablon isporučio je IDLV (pogledati Sliku 2D), omogućavajući efikasnu transdukciju CD34+ HSPC sa minimalnom citotoksičnošću, privremeno proizvodeći velike brojeve kopija šablona sa minimalnom genomskom integracijom.

[0164] Nivoi modifikacije gena u CD34+ ćelijama tretiranim sa CPN (par 33488/33501) plus IDLV donorom inicijalno su određeni pomoću HhaI RFLP digestije (Slika 1D) i kvantitativnim PCR (qPCR) testom u proseku od 18,0 ± 2,2 % alela (Slika 1E). Izvršene su optimizacije koncentracija CPN mRNK i IDLV donora (Slika 2 i Slika 3) i pokazale su važnost titracije CPN reagensa u tipu ćelije od interesa kako bi se postigla modifikacija na visokom nivou uz održavanje broja ćelija i održivosti.

[0165] Upotreba oligonukleotida kao predloška za modifikaciju/korekciju gena imala bi prednosti brzine, troškova, ponovljivosti i lakoće eksperimentisanja. Početni eksperimenti koji su koristili donorski šablon oligonukleotida u HSPC iz mPB uveli su sekvencu od 3 bazna para dizajniranu da kreiraju AvrII RFLP u genu beta-globina (HBB) i dali 15% modifikacije gena (pogledati Sliku 4).

[0166] Kako bi se poboljšala upotreba oligo-donora, testiran je panel oligonukleotida koji odgovara jednom ili drugom lancu i simetrično je rastuće dužine usredsređen na mesto razdvajanja CPN (pogledati Tabelu 4 u nastavku), gde podebljano označava bazu koja je mutirana u odnosu na sekvencu divljeg tipa. Oligonukleotidi koji su obeleženi sa „s“ sadrže sekvence dizajnirane da uvedu mutaciju srpa u gen divljeg tipa. Kao što je prikazano u tabeli, u koloni označenoj sa „S“, sekvenca divljeg tipa sadrži A na ovom položaju, dok srpasta mutacija sadrži T.

[0167] Korišćenje dužih, reverznih lanaca oligonukleotida dalo je najviši nivo modifikacije gena (pogledati Sliku 5). Budući da modifikacija ili korekcija gena na mestu mutacije SCD neće promeniti redosled ili razmak mesta za vezivanje za CPN, tihe mutacije su dizajnirane u donorski šablon i zajedno uvedene u hromozom kako bi se sprečilo ili smanjilo vezivanje za CPN i ponovno razdvajanje modifikovanih alela. Upotreba donora reverznih lanaca kompatibilna je sa uvođenjem tihih mutacija na 3' mestu vezivanja za CPN (Slika 4C).

[0168] Različite kombinacije tihih mutacija uvedene su u donorski oligo i ispitana je učestalost modifikacije gena. Kombinacija tihih mutacionih mesta (SMS) jednog i dva (SMS12) dala je najviši nivo modifikacije HBB i korišćena je u svim narednim eksperimentima (Slika 4D). Obrnuta povezanost između genski modifikovanih HBB alela i modifikovanih, potom ponovo uklonjenih alela sugeriše da SMS donori zaista služe za blokiranje ponovnog razdvajanja CPN (Slika 4E). Ispitivanjem HBB transkripata u HSPC grupama i u jedinici za formiranje naleta, eritroidnim kolonijama (BFU-E), nisu pronađeni dokazi za promenu splajsovanja mRNK iz bilo kog SMS alela.

[0169] Pri visokim koncentracijama CPN mRNK (par 47773/47817), upotreba donorskog oligonukleotida koji sadrži SMS012 dala je više HBB-modifikovanih alela nego upotreba SMS12 donora (Slika 17B).

[0170] Sveobuhvatna analiza molekularnih ishoda na HBB nakon tretmana CPN i donorskim SMS124 otkrila je samo manje nivoe neočekivanih događaja popravljanja DNK, poput onih iz kombinacije homologijom usmerene i NHEJ-zasnovane modifikacije gena (1,5%) ili od NHEJ-zasnovanog hvatanja oligonukleotida (0,4%) (pogledati Tabelu 5 u nastavku).

Tabela 5: Molekularni ishodi tretmana HSPC sa CPN i donorskim oligonukleotidom

1

[0171] Konačno, prekomerno mnoštvo događaja modifikacije gena usmerenih homologijom (SMS12 nasuprot SMS24) pružilo je snažnu podršku ideji da se nova sinteza DNK tokom modifikacije gena po šablonu oligonukleotida javlja korišćenjem levog 3' jednolančanog kraja reseciranog DSB (pogledati Sliku 6). Optimalne kombinacije CPN, oligonukleotida i HSPC donora omogućile su modifikaciju gena od 30-40% alela (pogledati Sliku 4F).

[0172] Prema tome, CPN mogu da indukuju i visoke nivoe ciljanih DSB, kao i visoke nivoe specifične modifikacije gena specifičnih za mesto u primarnim HSPC kada se isporučuju zajedno sa homolognim donorskim šablonom.

Primer 5: CPN specifičnost

[0173] Budući da beta-globin ima visoku homologiju sa ostalim genima globina (delta-, epsilon-, i gama-, G gama- i pseudo-beta-globin), CPN su dizajnirani da izbegnu razdvajanje u ovim regionima (Slika 6A). Stope razdvajanja na homolognim genima globina korišćenjem para 33488/33501 ispitane su primenom Surveyor testa nukleaze i sekvenciranjem DNK visoke propusnosti. Analiza svakog od ovih regiona otkrila je neciljanu modifikaciju samo visokohomolognog gena delta-globina u mPB, CB i SCD BM CD34+ ćelijama (Slika 6B, Tabela 3). Dopunili smo ove direktne testove razdvajanja CPN van cilja sveobuhvatnijim, nepristrasnim pristupom širom genoma kako bismo identifikovali mesta koja nisu ciljana. Ovaj test zasnovan je na sklonosti nehomolognog IDLV da se uhvati na mestima dvolančanih preloma i koristi nizvodnu grupisanu analizu mesta integracije (CLIS) od integracija u K562 ćelijama odabranih zbog svoje permisivnosti za hvatanje IDLV. Postupak koji je praćen opisan je u nastavku:

[0174] Mesta klastera gena beta-globina su PCR-amplifikovana narednim prajmerima: HBD: 5'-ggttcatttttcattctcaca-3' (SEQ ID NO:41) i 5'-gtaatctgagggtaggaaaac-3' (SEQ ID NO:42); HBBP1: 5'-cacccttgaccaatagattc-3' (SEQ ID NO:52) i 5'- gagactgtgggatagtcata-3'(SEQ ID NO:43); HBE1: 5'-cattatcacaaacttagtgtcc-3' (SEQ ID NO:44) i 5'-agtctatgaaatgacaccatat-3' (SEQ ID NO:45); HBG1: 5'- gcaaaggctataaaaaaaattagc-3' (SEQ ID NO:46) i 5'-gagatcatccaggtgctttg-3' (SEQ ID NO:47); HBG2: 5'-ggcaaaggctataaaaaaaattaagca-3' (SEQ ID NO:48) i 5'-gagatcatccaggtgcttta-3' (SEQ ID NO:49) i analizirana koristeći Surveyor® Nuclease kako je opisano iznad.

[0175] K562 ćelije su elektroporisane sa 15 µg/ml CPN mRNK i transducirane sa 2E+08 T

2

U/mL (MOI=250) od IDLV koji sadrži GFP transgen koji pokreće MND promoter (pogledati Challita, P. M. et al. (1995) J of Virol 69, 748-55) i nedostaje im bilo kakva homologija sa lokusom beta-globina kako bi se osiguralo da je integracija u dvolančanim prekidima nastala usled NHEJ-posredovanog hvatanja (pogledati Sliku 7A). Završene su četiri pojedinačne biološke replike CPN+IDLV kako bi se održala visoka osetljivost na potencijalna mesta van cilja širom genoma, dok su dve kontrole završene kako bi se utvrdio nivo pozadinske integracije. Kontrolne ćelije su primile GFP IDLV, ali ne i CPN mRNK za detektovanje mesta prirodnih DSB koja hvataju IDLV bez delovanja CPN. K562 ćelije su kultivisane u RPMI1640 (Cellgro) sa 10% fetalnog goveđeg seruma (Gemini Bio-products) i 1% Penicillin/Streptomicin/L-glutamin (Gemini Bio-products) tokom 60 dana. Tokom ovog perioda redovno su se izvodile protočne citometrijske analize pozitivnosti na GFP kako bi se osiguralo da se neintegrisani IDLV ispere iz uzoraka. Na dan 60 uzorci su sortirani sortiranjem ćelija aktiviranim fluorescencijom (FACS) kako bi se izolovale GFP+ćelije, ekspandirali su 5 dana, ekstrahovana je genomska DNK i uzorci su pripremljeni za sekvenciranje mesta vektorske integracije koristeći nerestriktivni Linear Amplification Mediated-PCR35. Analiza grupisanog mesta za integraciju (CLIS) izvedena je kako je prethodno navedeno (Gabriel, R., et al (2011) Nat Biotech.29(9):816-23) sa CLIS prozorom od 500 baznih parova koji obelodanjuju mesta CPN razdvajanja. Svi CLIS su analizirani kako bi se utvrdio nivo homologije svakog mesta sa sekvencama CPN para. Procenat homologije definisan je kao broj podudaranja baznih parova na mestu sa svim iteracijama CPN vezivanja (homodimeri i heterodimeri) sa dužinama odstojnika do 20 nukleotida. Najveći procenat homologije za svaki CLIS naveden je u nastavku u Tabeli 6. Za ovu tabelu su navedeni svi identifikovani CLIS sa svojim najvećim procentom homologije sa CPN ciljanim mestom unutar 200 baznih parova njihovog integracionog mesta. Procenjene su sve moguće iteracije CPN vezivanja (heterodimeri i homodimeri) i analizirane su dužine odstojnika do 20nt. Dva CPN mesta razdvajanja istaknuta su podebljanim slovima. Sva ostala krhka mesta koja je identifikovao CLIS su u kurzivu. Chr, hromozom; CLIS, klasterisana integraciona lokacija; L, 'levi' CPN monomer (SBS # 33488); R, 'desni' CPN monomer (SBS # 33501); dok broj u CPN dimeru odgovara veličini odstojnika koji je dao najveći procenat homologije CPN ciljanom mestu. Pomoću ovih postupaka analizirano je 20.000 slučajnih genomskih mesta kako bi se utvrdio pozadinski nivo CPN homologije u genomu.

[0176] Kao što je i predviđeno, CLIS analiza otkrila je zarobljavanje beta-globina i deltaglobina (Slika 7, tabela 6). U CLIS analizi nisu pronađena nijedna druga navodna mesta van cilja koja su imala značajnu homologiju sa CPN vezujućim mestima.

4

[0177] Ovi rezultati pokazuju visok nivo specifičnosti ovog para CPN prema njihovom predviđenom ciljanom mestu na nivou genoma.

Primer 6: In vitro diferencijacija modifikovanih HSPC

[0178] Kako bi se osiguralo da su genetski modifikovani HSPC sposobni za normalan, širok spektar diferencijacije eritroida i mijeloida, tretirane ćelije su analizirane i kao pojedinačne ćelije i u masovnoj kulturi. Pojedinačne ćelije su praćene za potencijal stvaranja kolonija u medijumu metilceluloze koji sadrži citokine koji promovišu diferencijaciju HSPC. Ukratko, jedan dan nakon elektroporacije, 100 i 300 održivih ćelija je postavljeno u posudu sa ćelijskim kulturama od 35 mm u duplikatu u MethoCult™ Optimum medijumu na bazi metilceluloze (Stem Cell Technologies). Za eksperimente sa donorima oligonukleotida, ćelije su postavljene pet dana nakon elektroporacije. Nakon dve nedelje kulture u 5% CO2, 37°C i vlažnoj atmosferi, različiti tipovi kolonija su okarakterisani i popisani na osnovu svoje morfologije. HSPC tretirani samo sa CPN (par 33488/33501) ili tretirani sa CPN i donorskim oligonukleotidom stvorili su sličan broj i obrasce eritroidnih i mijeloidnih klonova.

[0179] In vitro tehnika diferencijacije eritroida za SCD BM uzorke adaptirana je od Giarratana et al. ((2005) Nat Biotech 23:69-74) i opisana kod Romero i Urbinati et al ((2013) J Clin Invest 123(8): 3317-3330). Dan nakon elektroporacije, ćelije su smeštene u kulturu eritroida. Kako bi se dobio veliki broj ćelija za nizvodne analize, ćelije su stavljene u zajedničku kulturu na dan 12 protokola, za razliku od dana 8, kako bi se omogućilo povećano širenje eritroida. Ćelije su sakupljene na dan 22 eksperimenta, peletirane i podvrgnute HPLC analizi (pogledati u nastavku). Test spajanja HBB je takođe izveden pomoću RT-PCR koristeći 5'acatttgcttctgacacaac-3' (egzon 1, SEQ ID NO: 50) i 5'-gaaattggacagcaagaaagc-3' (egzon 3, SEQ ID NO: 51) i nije primećeno preskakanja egzona ili zadržavanje introna.

[0180] Genotipizacija pojedinih eritroidnih kolonija potvrdila je prisustvo predviđenih promena pri očekivanoj učestalosti. Pored toga, HSPC su indukovani da se diferenciraju u crvena krvna zrnca u masovnoj kulturi (Giarratana, M. et al. (2011) Blood 118, 5071-9). Uzorkovane su ćelije tokom diferencijacije crvenih krvnih zrnaca i učestalost modifikovanih ćelija je merena sekvenciranjem DNK visoke propusnosti. U skladu sa našom analizom jednoćelijskih eritroidnih kolonija uzgajanih u metilcelulozi, suštinski nije utvrđena promena učestalosti modifikovanih ćelija tokom diferencijacije na crvena krvna zrnca u masovnoj kulturi, bez obzira na početni nivo modifikacije gena u grupi (Slika 9A).

[0181] Za analizu lanaca globina izvršena je HPLC (Slika 9B). Za uzorke SCD BM, izvršena je HPLC za vrsta hemoglobina (Hb) proizvedenu eritroidnim ćelijama terminalnog stadijuma kako je opisano kod Wilber, A. et al. ((2011) Blood 117:2817-26) sa neznatnim izmenama. Eritroidne ćelije (1-2E+07) su sakupljene po završetku kulture eritroida (22. dan), peletirane i čuvane smrznute na -80°C do lize. Po odmrzavanju, ćelije su ponovo suspendovane u 25 uL hemolizatnog reagensa (Helena Laboratories) i stavljene u frižider preko noći pre centrifugiranja pri 20.800 x g tokom 10 minuta na 4°C kako bi se uklonili ćelijski ostaci. Očišćeni supernatant je korišćen za karakterizaciju proizvodnje Hb pomoću HPLC koristeći kolonu za razmenu katjona (Ultra2 Variant Resolution Analyzer; Primus Diagnostics) i kalibrisani su uzorci za ljudske hemoglobine. Vrhovi koji odgovaraju Hb vrstama identifikovani su na osnovu vremena zadržavanja pomoću softvera koji prati HPLC instrument. Relativni procenat proizvedenog HbA za svaki uzorak izračunat je na osnovu ukupnog zbira površina ispod krive za svaki od primarnih vrhova hemoglobina koji je obuhvatio acetilirani fetalni hemoglobin, HbFAc; fetalni hemoglobin, HbF; divlji tip hemoglobina, HbA; i srpasti hemoglobin, HbS.

[0182] Za uzorke mPB, eritroidne ćelije su sakupljene na dan 18 eritroidne kulture. Ćelije su peletirane i lizirane u vodi tokom 10 minuta na sobnoj temperaturi. Posle centrifugiranja na 20,000g tokom 5 minuta kako bi se uklonili ćelijski ostaci, ćelijski lizati su se čuvali smrznuti na -80°C. Po odmrzavanju, ćelijski lizati su razblaženi u odnosu 1:10 u mobilnoj fazi A i okarakterisani pomoću HPLC (Infinity 1260, Agilent) upotrebom slabe kolone za razmenu katjona (PolyCAT ATM, PolyLCINC.). Referentni materijal FASC (Trinity Biotech) korišćen je za definisanje vremena eluiranja uobičajenih hemoglobina (HbF, HbA, HbS, HbC). Analiza i vršna integracija izvršene su pomoću OpenLAB CDS Chemstation softvera. Relativni procenat proizvedenog HbA za svaki uzorak izračunat je na osnovu ukupnog zbira površina ispod krive za svaki od vrhova hemoglobina koji je obuhvatio acetilirani fetalni hemoglobin, HbFAc; fetalni hemoglobin, HbF; divlji tip hemoglobina, HbA; i srpasti hemoglobin, HbS.

[0183] U paralelnom eksperimentu, pretvorili smo 14% alela HBB u srpasti oblik i pomoću HPLC analizirali lance globina prisutne nakon 18 dana diferencijacije eritroida. Približno 18% hemoglobina koji su proizvele ove ćelije bio je srpasti hemoglobin, što pokazuje uticaj događaja modifikacije gena na nivo proteina (Slika 9B).

Primer 7: Ugrađivanje modifikovanih ćelija u miševe

[0184] Kako bi se utvrdilo da li CPN-modifikovane ćelije zadržavaju svoj kapacitet hematopoetske repopulacije, HSPC tretirani sa CPN i donorima ili lažno tretirani HSPC su ksenograftirani u NSG miševe sa nedostatkom imunog sistema.

[0185] Ukratko, sveže CB CD34+ ćelije od više zdravih osoba prethodno su stimulisane tokom 2 dana pre nego što su elektroporisane sa CPN mRNK i transducirane sa donorskim IDLV (2E+07TU/mL; MOI=50). Korišćen je medijum za predstimulaciju koji uključuje X-VIVO15 medijum (Lonza) koji sadrži glutamin, penicilin, streptomicin, 50 ng/ml SCF, 50 ng/ml Flt-3 i 50 ng/ml TPO (Peprotech). Posle jednog dana oporavka, 1E+06 održive ćelije u PBS (Corning) sa 0,1% BSA (Sigma) transplantirane su injekcijom repne vene u 6- do 8 nedelja stare NSG miševa (The Jackson Laboratory) nakon 250 cGy ukupnog zračenje tela. Korišćeni su kontrolni uzorci CD34+ ćelija koji su kultivisani paralelno, ali nisu bili izloženi mRNK, elektroporaciji ili IDLV (lažno tretirani). Mali alikvoti su kultivisani in vitro za višestruke analize. Uzorci mPB su zamrznuti jedan dan nakon elektroporacije, odmrznuti kasnije i dozvoljen im je jedan dan oporavka kao što je opisano pre transplantacije.

[0186] Ugrađivanje ljudskih ćelija procenjeno je protočnom citometrijom 5 nedelja nakon transplantacije, koristeći V450 konjugovani anti-ljudski CD45 naspram APC-konjugovanog anti-mišjeg CD45. Nakon inkubacije sa antitelima, crvena krvna zrnca su lizirana sa BD FACS-Lising Solution (BD Biosciences). Procenat ugrađivanja definisan je kao%huCD45+/(%huCD45+ %muCD45+). ugrađivanje i distribucija linije u perifernoj krvi i BM procenjeni su protočnom citometrijom nakon 8 nedelja i 16 nedelja nakon transplantacije, koristeći V450-konjugovani anti-ljudski CD45, V500-konjugovani anti-mišji CD45, FITC-konjugovani anti-ljudski CD33, PerCP-konjugovani anti-ljudski CD3, PE-konjugovani anti-ljudski CD56, PE-Cy7-konjugovani anti-ljudski CD19 i APC-konjugovani anti-ljudski CD34 (sva antitela od BD Biosciences).

[0187] Opisna statistika, uključujući srednju vrednost i standardnu devijaciju za promenljive ishoda, izveštavana je i predstavljena grafički. Za kvantitativne ishode koji se odnose na nivo modifikacije gena, ugrađivanje i poreklo, upoređivanje u paru je izvedeno bilo neuparenim ttestom ili u okviru jednosmernog ANOVA ako je bilo više od dve grupe. Analiza dozaodgovor je izvršena kako bi se procenila CPN i optimizacija odnosa donora. Konkretno, koristili smo linearni mešani model, ali smo dozu tretirali kao kontinuirani i fiksni efekat, a eksperiment kao slučajni efekat. Širenje savijanja BM ćelija pacijenta sa SCD tokom vremena procenjeno je ponovljenom merom ANOVA. U našem statističkom istraživanju testiranje hipoteza je bilo dvostrano, i korišćen je prag značajnosti 0,05 za p-vrednost. Sve statističke analize izvršene su korišćenjem SAS verzije 9.3 (SAS Institute Inc. 2012).

[0188] Paralelna kultura ćelija in vitro pokazala je da se stope modifikacije gena kreću od 5% - 20% pomoću qPCR RFLP analize, sa srednjom vrednošću od 14,5 ± 6,4% (Slika 10).

Sekvenciranje sa visokim protokom otkrilo je da 10,5 ± 4,0% alela sadrži izmenjenu bazu na mestu srpa sa umetanjima ili brisanjama (indeli) viđenim kod 32,0 ± 9,9%. Pored toga, hematopoetski potencijal ovih ćelija procenjen je u in vitro testu formiranja kolonije; ćelije su zadržale sposobnost stvaranja kolonija širokog spektra u odnosu na netretirane lažne uzorke u svim linijama koje se mogu analizirati.

[0189] 5 i 8 nedelja nakon injekcije, transplantirani miševi su procenjeni na ugrađivanje ljudskih HSPC, mereno kao procenat ljudskih CD45+ ćelija od ukupnih CD45+ ćelija, kako ljudskih tako i mišjih. Nivoi ugrađivanja HSPC tretiranih sa CPN i IDLV bili su uporedivi sa nivoima netretiranih kontrola sa prosekom od 14,8 ± 11,4% nakon 5 nedelja i porasli su na 45% nakon 8 nedelja (Slika 10C). Analiza linije (CD3 za T ćelije, CD33 za mijeloidne ćelije, CD34 za HSPC, CD19 za B ćelije i CD56 za NK ćelije) periferne krvi miševa bila je očekivana u ovom modelu (Slika 11). Analiza ljudskih ćelija kod miševa koji su primali ćelije tretirane i CPN i donorskim oligonukleotidom otkrila je spektar diferencijacije HSPC sličan onom od HSPC tretiranih sa CPN i IDLV (Slika 10E).

[0190] Miševi su eutanazirani 16 nedelja nakon transplantacije kako bi se omogućila procena ugrađenosti ljudskih ćelija i nivoa modifikacije gena. Za miševe koji su primali ćelije tretirane sa CPN i IDLV, procena periferne krvi otkrila je visok nivo ugrađivanja i očekivanu linijsku distribuciju. Analiza odeljka koštane srži (BM) bila je slična (Slika 12). Slično tome, kod miševa koji su primili ćelije tretirane i CPN i oligonukleotidom, nivoi transplantacije i distribucija linije bili su slični onim viđenim u kohorti miševa koji su primali HSPC tretirane sa CPN i IDLV u perifernoj krvi i BM.

[0191] Kako bi se utvrdilo da li su ljudske ćelije prisutne u miševima zaista one modifikovane pomoću CPN reagensa, genomska DNK je izolovana iz tkiva BM i slezine svakog miša i ispitivan je ljudski gen beta-globina. Analiza HhaI RFLP pomoću qPCR u tkivima miševa koji su primali ćelije tretirane sa CPN i IDLV otkrila je prisustvo modifikacije gena kod ovih miševa, mada niže učestalosti (0,14 ± 0,32% i 0,16 ± 0,18% za BM i slezinu, respektivno) od nivoa modifikacije gena od 10,5% primećenih za ulazne ćelije (Slika 13). Analiza sekvence potvrdila je modifikaciju gena na srpastoj mutaciji u ljudskim ćelijama BM i slezine sa uporedivim prosekom od 0,21 ± 0,39%, odnosno 0,27 ± 0,31% (Slika 13B). Analiza umetanja i brisanja (indela) izazvanih od strane NHEJ na mestu preseka otkrila je više nivoe promena nego HDR, sa 4,8 ± 7,8% svih očitanih sekvenci iz BM koji sadrže indele i 3,8 ± 3,7% u slezinama (Slika 14).

[0192] Genomska analiza BM i slezine miševa koji su primali CPN i ćelije tretirane oligonukleotidom koje su imale 17,3% modifikaciju gena na osnovi srpa i 19,8% indela u glavnoj populaciji pre primene takođe je pokazala održavanje modifikacije gena. DNK iz ovih tkiva je podvrgnuta visokopropusnom sekvenciranju, otrkivajući 0,85 ± 0,81% i 2,11 ± 1,19% ciljane modifikacije gena u BM i slezini, respektivno (Slika 13C). Procena indela u ovim tkivima pokazala je nivo od 3,34 ± 2,65% u BM i 5,86 ± 2,30% u slezini (Slika 14).

[0193] Ovi rezultati pokazuju da su ćelije CD34+ koje su bile podvrgnute razdvajanju DNK specifičnim za mesto od strane CPN i modifikacijom gena usmerenom na homologiju sposobne za ugrađivanje i podvrgavanje multi-linijskoj diferencijaciji.

Primer 8: Korekcija gena u srpastoj koštanoj srži

[0194] Budući da pacijenti sa srpastim ćelijama nisu kandidati za mobilizaciju matičnih ćelija sa G-CSF, dobili smo CxD34+ HSPC od BM aspirata ovih pacijenata. Korekcija gena specifična za određeno mesto izvršena je korišćenjem CPN mRNK i donorskog IDLV. Ćelije su smeštene u medijum za širenje eritroida i naknadno diferencirane pomoću ustaljenih postupaka (Romero et al, ibid, Giarratana et al, ibid). Pored toga, određen je deo ćelija za njihov potencijal formiranja kolonija. Ćelije tretirane sa CPN+IDLV (par 33488/33501) pokazale su umereno nižu (35%) sposobnost formiranja kolonije u poređenju sa lažnim, neelektroporisanim kontrolnim uzorcima (Slika 15).

[0195] Nakon početnog širenja eritroida (ali pre enukleacije) ćelije su sakupljene za genomsku analizu. RFLP analiza pomoću qPCR ovih uzoraka otkrila je nivo modifikacije gena koji je u proseku iznosio 20,1 ± 8,8% (Slika 16A). Ovi rezultati su potvrđeni dubokim sekvenciranjem, pokazujući korekciju mutacije SCD u 18,4 ± 6,7% očitavanja (Slika 16B). Pored toga, sekvenciranje je potvrdilo da većina alela koji sadrže korekciju mutacije SCD takođe sadrže promenu baze na HhaI lokaciji, ukazujući na to da većina HDR-vođenih događaja obuhvata najmanje 22bp rastojanje između te dve baze. Prateći zaključak kulture eritroida, uzorci su prikupljeni za analizu globinskih tetramera pomoću tečne hromatografije pod visokim pritiskom (HPLC) (Slika 16C).

[0196] Prisustvo vrha HbA u eritroidnim ćelijama izvedenim iz uzoraka tretiranih sa CPN i IDLV pokazuje da je korekcija gena dovela do funkcionalne konverzije betaS alela u betaA alel. Takav vrhunac nije primećen u eritrocitima dobijenim iz lažno obrađenih ćelija. HbF vrh pokazao je relativno povećanje usled smanjenja HbS vrha u uzorcima tretiranim sa CPN. Relativna indukcija HbA u uzorcima tretiranim sa CPN i IDLV iznosila je u proseku 5,3 ± 0,02%, sa nivoima korekcije proteina do 10,0% (Slika 16D).

[0197] Ovi rezultati pokazuju sposobnost CPN u kombinaciji sa donorskim IDLV da isprave fenotip od HSPC iz koštane srži bolesnika sa srpastim ćelijama.

[0198] Ovde prikazani rezultati pokazuju visok nivo korekcije gena mutacije bolesti srpastih ćelija u ljudskim hematopoetskim matičnim/progenitornim ćelijama pomoću cinkov prst nukleaza in vitro. U ovoj studiji dizajnirali smo CPN parove za razdvajanje lokusa betaglobina. U kombinaciji sa homolognim donorskim šablonom (isporučuju se kao oligonukleotid ili putem lentivirusnog vektora sa oštećenom integrazom), ovi CPN mogu da indukuju popravku usmerenu homologijom na visokim nivoima u progenitornim ćelijama.

[0199] Analiza mesta razdvajanja CPN otkrila je da se velika većina aktivnosti nukleaze odvijala na ciljanom mestu lokusa beta-globina, sa manjim udelom razdvajanja na homolognom genu delta-globina. Zbog niskog nivoa eksprimiranja delta-globina u odraslim eritroidnim ćelijama (<3,5% ukupnog globina), aktivnost CPN na ovom genu u podskupu ćelija verovatno neće biti štetna. Nepristrasna, procena CPN mesta razdvajanja van cilja širom genoma u K562 ćelijama pomoću IDLV završnog hvatanja pokazala je visoku specifičnost CPN, sa samo pozadinskom integracijom na prirodno krhka mesta.

[0200] Kada su CPN i ćelije tretirane donorima transplantirane u miševe, ugrađivanje i distribucija ćelija bili su ekvivalentni između lažno tretiranih i uzoraka tretiranim sa CPN i donorom. Međutim, uprkos prosečnim nivoima modifikacije gena od 10-20% u in vitro uzorcima pre transplantacije, nivoi korekcije gena u ljudskim ćelijama u slezini i BM miševa 16 nedelja posle ugrađivanja bili su znatno niži. Ovi nalazi su u skladu sa nedavno objavljenim radom (Genovese et al (2014) Nature 510: 235-240) i može implicirati da se dok se zrelije matične ćelije efikasno koriguju, održiva korist (npr. klinička korist) pruža modifikacijom ranijih, primitivnijih hematopoetskih matičnih ćelija.

[0201] Efikasnost korekcije gena usmerenih homologijom u primitivnijim HSPC u poređenju sa efikasnošću prekida gena specifičnog za mesto (pogledati Holt et al (2010) Nat biotech :839-47 u vezi sa CCR5 prekidom) može biti posledica razlike u korišćenju šablona donora koji sadrži korektivne osnove, i koji se isporučuje zajedno, i putevi popravljanja oštećenja ćelijske DNK moraju da reše DSB koristeći HDR, a ne NHEJ. Kako se NHEJ favorizuje u mirnom, primitivnom HSC (pogledati Mohrin et al (2010) Cell stem cell 7:174-85), pristrasnost u izboru puta popravke može ograničiti korekciju gena u primitivnim HSC. Dakle, bez vezivanja za jednu teoriju, moguće je da CPN deluju sa sličnom efikasnošću u zrelim i primitivnim populacijama ćelija, ali se aktivni put popravljanja u svakom tipu ćelija razlikuje tako da je HDR aktivniji u zrelijim ćelijama, a manje aktivan u primitivnim HSC. Konkretno, ćelije presađene miševima održavale su nivo ulaznih vrednosti indela u većoj meri nego što je to bilo zbog modifikacije gena (7,4 i 4,3 puta promena indela u poređenju sa 43,9 i 11,7 puta promenom modifikacije gena za IDLV i oligo eksperimente, respektivno).

[0202] Eksperimenti u BM CD34+ ćelijama kod pacijenata sa bolesti srpastim ćelijama pružaju nadu za kliničku primenu. Nivoi korekcije kanonske srpaste mutacije (barem u eritroidnim progenitornim ćelijama) u proseku su iznosili 18% za ove eksperimente i, nakon diferencijacije, ove ćelije su stvarale korigovani hemoglobin divljeg tipa (HbA). Na osnovu podataka alogenih transplantacija hematopoetskih matičnih ćelija za SCD, himerizam donora od 10-30% može rezultovati značajnim kliničkim poboljšanjem kao rezultat selektivne prednosti normalnih crvenih krvnih zrnaca izvedenih iz donora (pogledati Andreani et al (2011) Chimerism 2(1):21-22 and Walters et al (2001) Am Soc Blood and Marrow Transpl 7:665-73). Pored toga, heterozigoti za SCD mutaciju obično nemaju simptome bolesti. Prema tome, ispravljanje samo jednog alela u svakom HSC može se pokazati dovoljnim za ublažavanje velikog dela simptoma povezanih sa SCD.

[0203] Uprkos nedavnom napretku u genetskoj terapiji hemoglobinopatija zasnovanoj na lentivirusu, a posebno kod SCD (pogledati Romero et al, ibid, i Chandrakasan i Malik (2014) Hematol/oncol Clin of North Amer 28:199-216) potencijalne komplikacije ostaju usled

1

potrebe za dugotrajnim i na odgovarajući način regulisanim eksprimiranjem terapijskog transgena. Korekcija specifična za mesto koristeći ciljane nukleaza srpaste transverzija koja uzrokuje kanonske A do T bolesti kod HSC nudi jedinstvenu sposobnost održavanja eksprimiranja beta-globina pod njegovim endogenim regionom za promociju i kontrolu lokusa. Dalje, reagensima za korekciju genoma je potreban samo jednokratan, prolazan, ex vivo tretman ćelija kako bi rezultovali trajnom korekcijom.

[0204] Uzeto zajedno, ovi podaci podržavaju kontinuirani razvoj modifikacije genoma u HSPC kao potencijalan tretman za SCD.

2

Claims (19)

Patentni zahtevi

1. Genetski modifikovana ćelija koja sadrži:

- par cinkov prst nukleaza koji se vezuju za SEQ ID NO: 23 i SEQ ID NO: 24 i prave dvolančani prekid u endogenom ljudskom genu beta-hemoglobina (Hbb); i

- genomsku modifikacijo unutar 1-300 baznih parova od SEQ ID NO: 23 ili SEQ ID NO: 24 od Hbb gena nakon dvolančanog prekida parom cinkov prst nukleaza, gde par sadrži proteine cinkovog prsta označene kao 33488 i 33501; 33488 i 47817; 47773 i 33501; ili 47773 i 47817 u Tabeli 1, i gde genomska modifikacija uključuje umetanje i/ili brisanje.

2. In vitro postupak izrade genetski modifikovane ćelije koja sadrži umetanje i/ili brisanje unutar 1-300 baznih parova od SEQ ID NO: 23 ili SEQ ID NO: 24 od endogenog ljudskog gena beta-hemoglobina (Hbb), gde postupak sadrži pravljenje dvolančanog prekida pomoću para cinkov prst nukleaza koji se vezuju za SEQ ID NO: 23 i SEQ ID NO: 24 i pravljenje dvolančanog prekida u Hbb genu, gde par sadrži proteine cinkovog prsta označene kao 33488 i 33501; 33488 i 47817; 47773 i 33501; ili 47773 i 47817 u Tabeli 1.

3. Genetski modifikovana ćelija prema patentnom zahtevu 1 ili postupak prema patentnom zahtevu 2, gde je ćelija matična ćelija, kao što je hematopoetska matična ćelija, opciono CD34+ hematopoetska matična ćelija.

4. Genetski modifikovana diferencirana ćelija koja potiče od genetski modifikovane matične ćelije prema patentnom zahtevu 3, opciono gde diferencirana ćelija jeste crveno krvno zrnce (CKZ), gde genetski modifikovana diferencirana ćelija sadrži:

- par cinkov prst nukleaza koji se vezuju za SEQ ID NO: 23 i SEQ ID NO: 24 i prave dvolančani prekid u Hbb genu; i

- genomsku modifikaciju unutar 1-300 baznih parova od SEQ ID NO: 23 ili SEQ ID NO: 24 od Hbb gena nakon dvolančanog prekida parom cinkov prst nukleaza, gde par sadrži proteine cinkovog prsta označene kao 33488 i 33501; 33488 i 47817; 47773 i 33501; ili 47773 i 47817 u Tabeli 1, i gde genomska modifikacija uključuje umetanje i/ili brisanje.

5. Genetski modifikovana ćelija prema bilo kom patentnom zahtevu od 1, 3 ili 4, gde:

(a) par nukleaza obuhvata proteine cinkovog prsta označene kao 33488 i 33501, ili 47773 i 47817 u Tabeli 1; i/ili

(b) jedan ili više polinukleotida kodiraju par nukleaza.

6. Postupak prema bilo kom patentnom zahtevu od 2 ili 3, gde:

(a) par nukleaza obuhvata proteine cinkovog prsta označene kao 33488 i 33501, ili 47773 i 47817 u Tabeli 1; i/ili

(b) jedan ili više polinukleotida koji kodiraju par nukleaza isporučuju se u ćeliju.

7. Genetski modifikovana ćelija prema bilo kom patentnom zahtevu od 1 ili 3-5, ili postupak prema bilo kom patentnom zahtevu od 2, 3 ili 6, gde umetanje uključuje integraciju donorskog polinukleotida koji kodira transgen, opciono gde donorski polinukleotid ispravlja mutaciju srpastih ćelija.

8. Farmaceutski sastav koji sadrži genetski modifikovanu ćeliju prema bilo kom patentnom zahtevu od 1, 3-5 ili 7.

9. Cinkov prst nukleaza koja sadrži protein cinkovog prsta i domen razdvajanja ili poludomen razdvajanja, gde protein cinkovog prsta sadrži 5 ili 6 domena cinkovog prsta koji sadrže spiralni region prepoznavanja, gde protein cinkovog prsta sadrži spiralne regione prepoznavanja raspoređene kako je prikazano u proteinima označenim kao 33488, 47773 ili 47817 u Tabeli 1.

10. Fuzioni protein koji sadrži protein cinkovog prsta kako je definisano u patentnom zahtevu 9 i polu-domen razdvajanja koji je divljeg tipa ili sintetički.

11. Nukleaza koja sadrži par cinkov prst nukleaza, od kojih svaka cinkov prst nukleaza sadrži protein cinkovog prsta i domen razdvajanja ili polu-domen razdvajanja, gde protein cinkovog prsta sadrži 5 ili 6 domena cinkovog prsta koji sadrže spiralni region prepoznavanja, gde par sadrži proteine cinkovog prsta označene kao 33488 i 33501; 33488 i 47817; 47773 i 33501; ili 47773 i 47817 u Tabeli 1.

12. Polinukleotid koji kodira jednu ili više cinkov prst nukleaza prema patentnom zahtevu 9, fuzioni protein prema patentnom zahtevu 10 ili nukleaza prema patentnom zahtevu 11.

4

13. Izolovana ćelija koja sadrži par cinkov prst nukleaza, od kojih svaka cinkov prst nukleaza sadrži protein cinkovog prsta i domen razdvajanja ili polu-domen razdvajanja, gde protein cinkovog prsta sadrži 5 ili 6 domena cinkovog prsta koji sadrže spiralni region prepoznavanja, gde par sadrži proteine cinkovog prsta označene kao 33488 i 33501; 33488 i 47817; 47773 i 33501; ili 47773 i 47817 u Tabeli 1, opciono gde ćelija jeste crveno krvno zrnce (CKZ) ili ćelija prekursor.

14. Komplet koji sadrži par cinkov prst nukleaza ili polinukleotid koji kodira par cinkov prst nukleaza, od kojih svaka cinkov prst nukleaza sadrži protein cinkovog prsta i domen razdvajanja ili polu-domen razdvajanja, gde protein cinkovog prsta sadrži 5 ili 6 domena cinkovog prsta koji sadrže spiralni region prepoznavanja, gde par sadrži proteine cinkovog prsta označene kao 33488 i 33501; 33488 i 47817; 47773 i 33501; ili 47773 i 47817 u Tabeli 1.

15. In vitro postupak promene eksprimiranja Hbb u ćeliji, koja sadrži:

uvođenje u ćeliju jednog ili više polinukleotida koji kodiraju par cinkov prst nukleaza, gde svaka cinkov prst nukleaza sadrži protein cinkovog prsta i domen razdvajanja ili polu-domen razdvajanja, gde protein cinkovog prsta sadrži 5 ili 6 domena cinkovog prsta koji sadrže spiralni region prepoznavanja, gde par sadrži proteine cinkovog prsta označene kao 33488 i 33501; 33488 i 47817; 47773 i 33501; ili 47773 i 47817 u Tabeli 1, pod uslovima koji omogućavaju eksprimiranje jednog ili više proteina i menjanje eksprimiranja Hbb gena, opciono dalje obuhvatajući integrisanje donorske sekvence u genom ćelije.

16. Postupak prema patentnom zahtevu 15, gde donorska sekvenca sadrži oligonukleotid koji koriguje mutaciju koja menja splajsovanje donorskog mesta za mRNK obradu Hbb gena.

17. Genetski modifikovana ćelija prema bilo kom patentnom zahtevu od 1-7 za upotrebu u tretmanu hemoglobinopatije, kao što je anemija srpastih ćelija, gde je ćelija hematopoetska matična ćelija, prekurskor crvenog krvnog zrnca ili crveno krvno zrnce i ugrađuje se u pacijenta.

18. In vitro postupak prema bilo kom patentnom zahtevu od 2, 3, 6 ili 7, gde je ćelija CD34+hematopoetska matična ćelija, gde par cinkov prst nukleaza sadrži proteine cinkovog prsta označene kao 47773 i 47817 u Tabeli 1, i umetanje sadrži integraciju donorskog polinukleotida koji ispravlja mutaciju srpastih ćelija, opciono gde se donorski polinukleotid isporučuje ne-integrišućim lentivirusnim vektorom (IDLV).

19. Genetski modifikovana ćelija koja sadrži genomsku modifikaciju unutar 1-300 baznih parova od SEQ ID NO: 23 ili SEQ ID NO: 24 od endogenog ljudskog gena beta-hemoglobina (Hbb) nakon dvolančanog prekida parom cinkov prst nukleaza, gde par sadrži proteine cinkovog prsta označene kao 33488 i 33501; 33488 i 47817; 47773 i 33501; ili 47773 i 47817 u Tabeli 1, gde genomska modifikacija uključuje integraciju donorskog polinukleotida koji kodira transgen koji ispravlja mutaciju srpastih ćelija, i gde integracija donorskog polinukleotida uvodi jednu ili više tihih mutacija, kao što je prikazano na Slici 4C, koje blokiraju ponovno razdvajanje cinkov prst nukleaze.