RS62984B1 - Prolekovi supstituisanih derivata triazola i njihova upotreba - Google Patents

Description

Opis

[0001] Predmetni pronalazak se odnosi na prolekove 3-({3-(4-hlorofenil)-5-okso-4-[(2S)-3,3,3-trifluoro-2-hidroksipropil]-4,5-dihidro-1H-1,2,4-triazol-1-il}metil)-1-[3-(trifluorometil)piridin-2-il]-1H-1,2,4-triazol-5-karboksamida, 3-({3-(4-hlorofenil)-5-okso-4-[(2S)-3,3,3-trifluoro-2-hidroksipropil]-4,5-dihidro-1H-1,2,4-triazol-1-il}metil)-1-[2-(trifluorometil)fenil]-1H-1,2,4-triazol-5-karboksamida i 3-({3-(4-hlorofenil)-5-okso-4-[(2S)-3,3,3-trifluoro-2-hidroksipropil]-4,5-dihidro-1H-1,2,4-triazol-1-il}metil)-1-(3-hloropiridin-2-il)-1H-1,2,4-triazol-5-karboksamida, na postupke za dobijanje takvih jedinjenja, na farmaceutske sastave koji sadrže takva jedinjenja, i na takva jedinjenja ili sastave za upotrebu u lečenju i/ili prevenciji bolesti, posebno za lečenje i/ili prevenciju bubrežnih i kardiovaskularnih bolesti.

[0002] Prolekovi su derivati aktivnog sastojka koji prolaze in vivo enzimskoj i/ili hemijskoj biotransformaciji u jednoj ili više faza pre nego što se stvarni aktivni sastojak oslobodi. Ostatak proleka se obično koristi da bi se poboljšao profil svojstava osnovnog aktivnog sastojka [P. Ettmayer i dr., J. Med. Chem.47, 2393 (2004)]. Da bi se postigao optimalan profil efekata, neophodno je s tim u vezi da dizajn ostatka proleka, kao i željeni mehanizam oslobađanja, budu veoma precizno u skladu sa pojedinačnim aktivnim sastojkom, indikacijom, mestom delovanja i primenom. ruta. Veliki broj lekova se primenjuje kao prolekovi koji pokazuju poboljšanu bioraspoloživost u poređenju sa osnovnim aktivnim sastojkom, na primer postignutu poboljšanjem fizičko-hemijskog profila, posebno rastvorljivosti, aktivnih ili pasivnih svojstava apsorpcije ili tkivno specifične distribucije. Primer koji se može pomenuti iz široke literature o prolekovima je: H. Bundgaard (Ed.), Design of Prodrugs: Bioreversible derivatives for various functional groups and chemical entities, Elsevier Science Publishers B.V., 1985.3-({3-(4-hlorofenil)-5-okso-4-[(2S)-3,3,3-trifluoro-2-hidroksipropil]-4,5-dihidro-1H-1,2,4-triazol-1-il}metil)-1-[3-(trifluorometil)piridin-2-il]-1H-1,2,4-triazol-5-karboksamida (Primer 4A), 3-({3-(4-hlorofenil)-5-okso-4-[(2S)-3,3,3-trifluoro-2-hidroksipropil]-4,5-dihidro-1H-1,2,4-triazol-1-il}metil)-1-[2-(trifluorometil)fenil]-1H-1,2,4-triazol-5-karboksamida (Primer 6A) i 3-({3-(4-hlorofenil)-5-okso-4-[(2S)-3,3,3-trifluoro-2-hidroksipropil]-4,5-dihidro-1H-1,2,4-triazol-1-il}metil)-1-(3-hloropiridin-2-il)-1H-1,2,4-triazol-5-karboksamida (Primer 8A) su veoma moćni i selektivni antagonisti V1a receptora, kao što je obelodanjeno u WO 2017/191102-A1 (primeri 1 i 2) i WO 2017/191107-A1 (primer 1).

[0003] Vazopresin je neurohormon koji u osnovi reguliše homeostazu vode i vaskularni tonus. Proizvodi se u specijalizovanim endokrinim neuronima u Nucleus supraopticus i N. paraventricularis u zidu treće komore (hipotalamus) i odatle se transportuje duž nervnih procesa u zadnje režnjeve hipofize (neurohipofiza). Tamo se hormon oslobađa u krvotok kao odgovor na različite fiziološke i patofiziološke stimuluse. Poremećena neurohormonska regulacija se u suštini manifestuje u povišenju tonusa simpatikusa i neodgovarajućoj aktivaciji renin-angiotenzin-aldosteronskog sistema (RAAS). Dok je inhibicija ovih komponenti blokatorima beta-receptora s jedne strane ACE inhibitorima ili blokatorima angiotenzin-receptora s druge strane sada inherentni deo farmakološkog lečenja kardiovaskularnih bolesti, neodgovarajuće povećanje sekrecije vazopresina trenutno još uvek nije adekvatno izlečiv.

[0004] Vazopresin ostvaruje svoje dejstvo uglavnom vezivanjem za tri receptora, koji su klasifikovani kao V1a, V1b i V2 receptori i koji pripadaju porodici receptora vezanih za G protein.

[0005] V2 receptori se nalaze u distalnom tubularnom epitelu i epitelu sabirnih tubula u bubregu. Njihova aktivacija čini ove epitele propusnim za vodu. Ovaj fenomen je posledica inkorporacije akvaporina (posebnih vodenih kanala) u luminalnu membranu epitelnih ćelija.

Shodno tome, farmakološka inhibicija delovanja vazopresina na V2 receptor dovodi do povećanog izlučivanja urina. Stoga se lekovi sa V2 antagonističkim delovanjem čine posebno pogodnim za lečenje svih bolesnih stanja koja su povezana sa preopterećenjem tela vodom.

[0006] V1b receptori (takođe nazvani V3 receptori) se uglavnom mogu detektovati u centralnom nervnom sistemu. Zajedno sa kortikotropin-oslobađajućim hormonom (CRH), vazopresin reguliše bazalnu i stresom izazvanu sekreciju adrenokortikotropnog hormona (ACTH) preko V1b receptora.

[0007] V1a receptori se uglavnom nalaze na vaskularnim glatkim mišićnim ćelijama (VSMC), ali i na kardiomiocitima, fibroblastima i specijalizovanim bubrežnim ćelijama poput glomerularnih mezangijskih ćelija ili ćelija macula densa koje kontrolišu oslobađanje renina [Wasilewski MA, Myers VD, Recchia FA, Feldman AM, Tilley DG, Cell Signal., 28(3), 224-233, (2016)]. Aktivacija VSMC V1a receptora vazopresinom dovodi do intracelularnog oslobađanja kalcijuma i prema vazokonstrikcije. Stoga, stimulacija VSMC V1a receptora izaziva povećanu vaskularnu rezistenciju i povećano opterećenje srca.

Vazokonstrikcija koju posreduje V1a negativno utiče na minutni volumen srca. Povećanje naknadnog opterećenja i direktna stimulacija V1a receptora na kardiomiocitima može dovesti do srčane hipertrofije i remodeliranja uključujući fibrozu. Miševi sa prekomernom ekspresijom V1a receptora specifičnom za srce razvijaju hipertrofiju srca koja dovodi do dilatacije i disfunkcije leve komore, što ukazuje na suštinsku ulogu V1a receptora u razvoju srčane insuficijencije [Li X, Chan TO, Myers V, Chowdhury I, Zhang XQ, Song J, Zhang J, Andrel J, Funakoshi H, Robbins J, Koch WJ, Hyslop T, Cheung JY, Feldman AM, Circulation.; 124, 572-581 (2011)].

[0008] V1a receptor je takođe eksprimiran u renalnoj kortikalnoj i medularnoj vaskulaturi, gde posreduje vazokonstrikciju bubrežnih sudova i utiče na ukupan protok krvi u bubregu. Dakle, aktivacija V1a receptora može smanjiti renalni medularni protok krvi izazivajući dalje patološke procese kao što su hipoksija tkiva, smanjeno snabdevanje kiseonikom i, shodno tome, snabdevanje energijom za tubularne transportne procese, kao i direktna oštećenja mezangijskih i macula densa ćelija. Pokazano je da aktivacija mezangijskog V1a receptora posreduje u TGFβ signalizaciji i izaziva povećanje proizvodnje kolagena IV. Dok ova signalizacija doprinosi akumulaciji i remodeliranju ekstracelularnog matriksa u bubrezima, veruje se da se slični signalni putevi javljaju u srčanim ćelijama, posebno nakon infarkta miokarda, što naglašava centralnu ulogu V1a receptora u razvoju hipertrofičnih i fibroznih procesa kao odgovor na patofiziološko povišene vrednosti nivoa vazopresina [Wasilewski MA, Myers VD, Recchia FA, Feldman AM, Tilley DG. Signalizacija receptora arginin vazopresina i funkcionalni ishodi kod srčane insuficijencije. Cell Signal., 28(3), 224-233 (2016)].

[0009] Pošto su receptori V1a uglavnom eksprimirani na VSMC i time učestvuju u vaskularnoj funkciji, moguća je veza sa vaskularnim bolestima kao što je bolest perifernih arterija (PAD), uključujući klaudikaciju i kritičnu ishemiju ekstremiteta, kao i koronarnu mikrovaskularnu disfunkciju (CMD).

[0010] Osim toga, V1a receptori se takođe eksprimiraju na ljudskim trombocitima i u jetri. ačenje V1a receptora trombocita nije u potpunosti shvaćeno iako vazopresin indukuje agregaciju ljudskih trombocita preko V1a receptora u visokim koncentracijama ex vivo. Prema tome, inhibicija vazopresinom indukovane agregacije trombocita antagonistima V1a receptora je koristan farmakološki ex vivo test koji koristi ljudsko tkivo koje endogeno eksprimira V1a receptor [Thibonnier M, Roberts JM, J Clin Invest.; 76:1857-1864, (1985)].

[0011] Vazopresin stimuliše glukoneogenezu i glikogenolizu putem aktivacije jetrenog V1a receptora. Ispitivanja na životinjama su pokazale da vazopresin narušava toleranciju glukoze koju bi mogao inhibirati antagonist V1a receptora, čime se obezbeđuje veza vazopresinskog receptora V1a sa dijabetes melitusom. [Taveau C, Chollet C, Waeckel L, Desposito D, Bichet DG, Arthus MF, Magnan C, Philippe E, Paradis V, Foufelle F, Hainault I, Enhorning S, Velho G, Roussel R, Bankir L, Melander O, Bouby N. Vasopressin and hydration play a major role in the development of glucose intolerance and hepatic steatosis in obese rats. Diabetologia, 58(5), 1081-1090, (2015)]. Pokazalo se da vazopresin doprinosi razvoju albuminurije i nefropatiji izazvanoj dijabetesom na životinjskim modelima, što je u skladu sa epidemiološkim nalazima kod ljudi.

[0012] Nedavno je otkriveno da izgleda da vazopresin takođe igra uzročnu ulogu u razvoju preeklampsije. Hronična infuzija vazopresina tokom trudnoće kod miševa je dovoljna da izazove sve glavne fenotipove majke i fetusa povezane sa preeklampsijom kod ljudi, uključujući hipertenziju specifičnu za trudnoću [Santillan MK, Santillan DA, Scroggins SM, Min JY, Sandgren JA, Pearson NA, Leslie KK, Hunter SK, Zamba GK, Gibson-Corley KN, Grobe JL. Vazopresin u preeklampsiji: novi biomarker veoma rane ljudske trudnoće i klinički relevantan model miša. Hypertension. 64(4), 852-859, (2014)].

[0013] Nivo vazopresina može biti povišen kod žena sa dismenorejom (ginekološki poremećaj koji se karakteriše cikličnim grčevitim bolom u karlici) tokom menstruacije, što izgleda da povećava kontrakciju glatkih mišića miometrijuma. Nedavno je otkriveno da selektivni antagonist receptora vazopresina V1a (relkovaptan/SR-49059) može smanjiti intrauterine kontrakcije izazvane vazopresinom.

[0014] Iz ovih razloga, sredstva koja inhibiraju dejstvo vazopresina na V1a receptor izgledaju pogodni za lečenje nekoliko kardiovaskularnih bolesti. Posebno, sredstva koja inhibiraju dejstvo vazopresina selektivno na V1a receptor nude posebno idealan profil za lečenje inače normovolemičnih pacijenata, tj. onih koji nisu podobni za dekongestiju npr. visoke doze diuretika petlje ili V2 antagonista, i gde indukovana akvareza putem inhibicije V2 može biti nepoželjna.

[0015] Određeni derivati 4-fenil-1,2,4-triazol-3-il su opisani u WO 2005/063754-A1 i WO 2005/105779-A1 da deluju kao antagonisti receptora vazopresina V1a koji su korisni za lečenje ginekoloških poremećaja, posebno menstrualnih poremećaja kao što je dismenoreja.

[0016] U WO 2011/104322-A1, posebna grupa 1,2,4-triazol-3-ona vezanih za bis-aril, uključujući 5 fenil-1,2,4-triazol-3-il i 1-fenil-1,2,3-triazol-4 njihovi -il derivati, obelodanjeni su kao antagonisti receptora vazopresina V2 i/ili V1a korisni za lečenje i/ili prevenciju kardiovaskularnih bolesti. Međutim, opisana jedinjenja ne pokazuju dovoljnu selektivnost prema V1a receptoru i uglavnom pokazuju kombinovanu aktivnost na vazopresin V1a i V2 receptorima. Ipak, kao što je iznad navedeno, visok afinitet kao i selektivnost za V1a receptor je poželjan preduslov za lečenje bolesnih stanja gde dekongestija nije poželjna i može dovesti do neregulisane homeostaze telesnih tečnosti uključujući smanjen osmolalnost krvne plazme kod inače normovolemičnih fizička lica.

[0017] U WO 2016/071212-A1 otkriveni su određeni derivati 5-(hidroksialkil)-1-fenil-1,2,4-triazola, koji deluju kao moćni antagonisti i receptora vazopresina V1a i V2 i, pored toga, pokazuju značajno pojačano akvaretska potencija in vivo nakon oralne primene. Jedinjenja su opisana kao korisna za lečenje i/ili prevenciju kardiovaskularnih i bubrežnih bolesti. Ipak, kao što je iznad navedeno, visok afinitet kao i selektivnost za V1a receptor je poželjan preduslov za lečenje bolesnih stanja gde dekongestija nije poželjna i može dovesti do neregulisane homeostaze telesnih tečnosti uključujući smanjen osmolalnost krvne plazme kod inače normovolemičnih fizička lica.

[0018] U WO 2017/191107-A1 i WO 2017/191102-A1 određeni derivati 5-(karboksamid)-1-fenil-1,2,4-triazola kao i u WO 2017/191114-A1 opisani su specifični derivati 5-(hidroksialkil)-1-heteroaril-1,2,4-triazola koji predstavljaju visoko potentne i selektivne antagoniste V1a receptora i posebno su korisni za lečenje i/ili prevenciju bubrežnih i kardiovaskularnih bolesti kod ispitanika koji ne pate od preopterećenja tečnošću i kojima stoga ne treba dekongestivan.

[0019] Dalji novi derivati 1,2,4-triazola supstituisani 5-(karboksamidom), 5-(fluoroalkil) supstituisani i 3-(hidroksialkil) supstituisani kao antagonisti receptora vazopresina V2 i/ili V1a u WO 2017/191105-A1, WO 2017/191112-A1, WO 2017/191115-A1 i WO 2018/073144-A1.

[0020] Profil aktivnosti sa visokom selektivnošću za V1a receptor ima nizak potencijal da izazove neželjene efekte van cilja, a takođe bi pomogao u smanjenju količine supstance koja će biti potrebna za postizanje i održavanje željenog terapeutskog efekta, tako ograničavanje potencijala za neprihvatljive neželjene efekte i/ili neželjene interakcije lek-lek tokom lečenja pacijenata koji već mogu biti pod visokim rizikom, kao što su, na primer, akutne ili hronične bolesti srca i bubrega.

[0021] Jedan tehnički problem koji treba rešiti u skladu sa predmetnim pronalaskom se stoga može videti u identifikaciji i obezbeđivanju novih jedinjenja koja deluju kao moćni antagonisti receptora vazopresina V1a. Dalji cilj pronalaska je da identifikuje i obezbedi nova jedinjenja sa visokim afinitetom i selektivnošću u odnosu na receptor vazopresina V1a.

Jedinjenja su namenjena da izbegnu izazivanje akvareze putem V2 inhibicije. Dalje je predviđeno da jedinjenja imaju sličan ili poboljšan terapeutski profil u poređenju sa jedinjenjima poznatim iz prethodnog stanja tehnike, na primer u pogledu njihovih in vivo svojstava, na primer njihovih farmakokinetičkih i farmakodinamičkih karakteristika i/ili njihovog metaboličkog profila i/ili njihovog odnos doza-aktivnost.

[0022] Međutim, jedinjenja Primera 4A, Primera 6A i Primera 8A koja su visoko potentni i selektivni antagonisti V1a receptora imaju ograničenu rastvorljivost u vodi i fiziološkom medijumu, čineći na primer intravensku primenu jedinjenja Primera 4A, Primera 6A i Primera 8A teško. Štaviše, biodostupnost jedinjenja posle oralne primene jedinjenja treba da se poboljša. Stoga je još jedan cilj predmetnog pronalaska bio da se identifikuju derivati ili prolekovi jedinjenja iz Primera 4A, Primera 6A i Primera 8A koji imaju poboljšanu rastvorljivost u pomenutim medijumima i, u isto vreme, omogućavaju kontrolisano oslobađanje jedinjenja iz Primera 4A, Primer 6A i Primer 8A u telu pacijenta posle primene i/ili koji imaju dobru bioraspoloživost posle oralne primene.

[0023] Iznenađujuće, sada je otkriveno da određeni prolekovi jedinjenja iz Primera 4A, Primera 6A i Primera 8A imaju ovaj specifičan profil i čine jedinjenja predmetnog pronalaska korisnim za lečenje i/ili prevenciju bolesti, koje su povezane sa V1a aktivacija receptora. Jedinjenja iz predmetnog pronalaska su posebno korisna za lečenje i/ili prevenciju bubrežnih i kardiovaskularnih bolesti kod subjekata koji ne pate od preopterećenja tečnošću i koji zbog toga ne bi trebalo da budu dekongestivni.

[0024] Pronalazak obezbeđuje jedinjenja opšte formule (I)

u kojem

R<1>

predstavlja grupu formule

u kojem

# predstavlja tačku vezivanja za 1,2,4-triazolil prsten,

i njihove farmaceutski prihvatljive soli, njihovi solvati i solvati njihovih soli.

[0025] Termini koji se pominju u ovom tekstu imaju sledeća značenja:

Termin "sastoji" kada se koristi u specifikaciji uključuje "sastoji se iz".

[0026] U formulama grupe koje predstavljaju R<1>, krajnja tačka linije označena sa # ne predstavlja atom ugljenika ili CH2grupu, već je deo veze sa atomom za koji je R<1>vezan.

[0027] Moguće je da jedinjenja opšte formule (I) postoje kao izotopske varijante.

[0028] Termin "izotopska varijanta" jedinjenja ili reagensa je definisan kao jedinjenje koje pokazuje neprirodnu proporciju jednog ili više izotopa koji čine takvo jedinjenje.

[0029] Termin "izotopska varijanta jedinjenja opšte formule (I)" je definisan kao jedinjenje opšte formule (I) koje pokazuje neprirodnu proporciju jednog ili više izotopa koji čine takvo jedinjenje.

[0030] Termin "neprirodna proporcija" označava udeo takvog izotopa koji je veći od njegovog prirodnog obilja. Prirodne količine izotopa koje treba primeniti u ovom kontekstu su opisane u "Isotopic Compositions of the Elements 1997", Pure Appl. Chem., 70(1), 217-235, 1998. Primeri takvih izotopa uključuju stabilne i radioaktivne izotope vodonika, ugljenika, azota, kiseonika, fosfora, sumpora, fluora, hlora, broma i joda, kao što su<2>H (deuterijum),<3>H

(tricijum),<11>C,<13>C,<14>C,<15>N,<17>O,<18>O,<32>P,<33>P,<33>S,<34>S,<35>S,<36>S,<18>F,<36>Cl,<82>Br,<123>I,<124>I,<125>I,<12 9>I i<131>I, respektivno.

[0031] U pogledu lečenja i/ili prevencije ovde navedenih poremećaja, izotopska varijanta(e) jedinjenja opšte formule (I) poželjno sadrži deuterijum („jedinjenja opšte formule (I) koja sadrže deuterijum“). Izotopske varijante jedinjenja opšte formule (I) u koje je ugrađen jedan ili više radioaktivnih izotopa, kao što su<3>H ili<14>C, su korisne, npr. u studijama distribucije leka i/ili supstrata u tkivu. Ovi izotopi su posebno poželjni zbog lakoće njihove inkorporacije i mogućnosti detekcije. Izotopi koji emituju pozitron kao što su<18>F ili<11>C mogu da se ugrade u jedinjenje opšte formule (I). Ove izotopske varijante jedinjenja opšte formule (I) su korisne za in vivo aplikacije za snimanje. Jedinjenja opšte formule (I) koja sadrže deuterijum i<13>C mogu se koristiti u analizama masene spektrometrije (H. J. Leis i dr., Curr. Org. Chem., 1998, 2, 131) u kontekstu predkliničkih ili kliničkih ispitivanja.

[0032] Izotopske varijante jedinjenja opšte formule (I) se generalno mogu pripremiti metodama poznatim stručnjacima, kao što su oni opisani u šemama i/ili primerima ovde, zamenom reagensa za izotopsku varijantu navedenog reagensa , poželjno za reagens koji sadrži deuterijum. U zavisnosti od željenih mesta deuteracije, u nekim slučajevima deuterijum iz D2O se može ugraditi ili direktno u jedinjenja ili u reagense koji su korisni za sintezu takvih jedinjenja (Esaki i dr., Tetrahedron, 2006, 62, 10954; Esaki i dr., Chem. Eur. J., 2007, 13, 4052). Gas deuterijuma je takođe koristan reagens za ugradnju deuterijuma u molekule. Katalitička deuteracija olefinskih veza (H. J. Leis i dr., Curr. Org. Chem., 1998, 2, 131; J. R. Morandi i dr., J. Org. Chem., 1969, 34 (6), 1889) i acetilenske veze (N. H. Khan, J. Am. Chem. Soc., 1952, 74 (12), 3018; S. Chandrasekhar i dr., Tetrahedron Letters, 2011, 52, 3865) je direktan put za ugradnju deuterijuma. Metalni katalizatori (tj. Pd, Pt i Rh) u prisustvu gasa deuterijuma mogu se koristiti za direktnu zamenu deuterijuma za vodonik u funkcionalnim grupama koje sadrže ugljovodonike (J. G. Atkinson i dr., Patent SAD,3966781). Različiti deuterisani reagensi i sintetički gradivni blokovi su komercijalno dostupni od kompanija kao što su na primer C/D/N Isotopes, Kvebek, Kanada; Cambridge Isotop Laboratories Inc., Andover, MA, SAD; i CombiPhos Catalists, Inc., Princeton, NJ, SAD. Dodatne informacije o stanju tehnike u pogledu razmene deuterijum-vodonik date su na primer u Hanzlik i dr., J. Org. Chem.55, 3992-3997, 1990; R. P. Hanzlik i dr., Biochem. Biophys. Res. Commun. 160, 844, 1989; P. J. Reider i dr., J. Org. Chem.52, 3326-3334, 1987; M. Jarman i dr., Carcinogenesis 16(4), 683-688, 1995; J. Atzrodt i dr., Angew. Chem., Int. Ed.2007, 46, 7744; K. Matoishi i dr., Chem. Commun. 2000, 1519-1520; K. Kassahun i dr., WO2012/112363.

[0033] Termin „jedinjenje opšte formule (I) koje sadrži deuterijum“ je definisano kao jedinjenje opšte formule (I), u kome je jedan ili više atoma vodonika zamenjeno jednim ili više atoma deuterijuma i u kojoj je zastupljenost deuterijuma na svakom deuterisanom položaju jedinjenja opšte formule (I) veća od prirodne zastupljenosti deuterijuma, koja iznosi oko 0,015%. Konkretno, u jedinjenju opšte formule (I) koje sadrži deuterijum, sadržaj deuterijuma na svakom deuterisanom položaju jedinjenja opšte formule (I) je veći od 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60 %, 70% ili 80%, poželjno više od 90%, 95%, 96% ili 97%, još poželjnije više od 98% ili 99% na pomenutim pozicijama. Podrazumeva se da je količina deuterijuma na svakom deuterisanom položaju nezavisno od količine deuterijuma na drugim

1

deuterisanim pozicijama.

[0034] Selektivno uključivanje jednog ili više atoma deuterijuma u jedinjenje opšte formule (I) može promeniti fizičko-hemijska svojstva (kao što je na primer kiselost [C. L. Perrin, i dr., J. Am. Chem. Soc., 2007, 129, 4490; A. Streitwieser i dr., J. Am. Chem. Soc., 1963, 85, 2759;], basicity [C. L. Perrin i dr., J. Am. Chem. Soc., 2005, 127, 9641; C. L. Perrin, i dr., J. Am. Chem. Soc., 2003, 125, 15008; C. L. Perrin in Advances in Physical Organic Chemistry, 44, 144], lipofilnost [B. Testa i dr., Int. J. Pharm., 1984, 19(3), 271]) i/ili metaboličkog profila molekula i može dovesti do promena u odnosu matičnog jedinjenja prema metabolitima ili u količinama formiranih metabolita. Takve promene mogu rezultirati određenim terapeutskim prednostima i stoga mogu biti poželjnije u nekim okolnostima.

Prijavljene su smanjene stope metabolizma i metaboličke promene, gde je odnos metabolita promenjen (A. E. Mutlib i dr., Toxicol. prijava. Pharmacol., 2000, 169, 102; D. J. Kushner i dr., Can. J. Physiol. Pharmacol., 1999, 77, 79). Ove promene u izloženosti matičnom leku i metabolitima mogu imati važne posledice u pogledu farmakodinamike, podnošljivosti i efikasnosti jedinjenja opšte formule (I) koje sadrži deuterijum. U nekim slučajevima supstitucija deuterijumom smanjuje ili eliminiše stvaranje neželjenog ili toksičnog metabolita i pojačava formiranje željenog metabolita (npr. Nevirapine: A. M. Sharma i dr., Chem. Res. Toxicol., 2013, 26, 410; Efavirenz: A. E. Mutlib i dr., Toxicol. prijava. Pharmacol., 2000, 169, 102). U drugim slučajevima, glavni efekat deuteracije je smanjenje stope sistemskog klirensa. Kao rezultat, biološki polu-raspad jedinjenja se povećava. Potencijalne kliničke koristi bi uključivale mogućnost održavanja slične sistemske izloženosti sa smanjenim vršnim nivoima i povećanim najnižim nivoima. Ovo bi moglo da dovede do nižih neželjenih efekata i poboljšane efikasnosti, u zavisnosti od farmakokinetičkog/farmakodinamičkog odnosa određenog jedinjenja. ML-337 (C. J. Wenthur i dr., J. Med. Chem., 2013, 56, 5208) i Odanakatib (K. Kassahun i dr., WO2012/112363) su primeri za ovaj efekat deuterijuma. Prijavljeni su i drugi slučajevi u kojima smanjena brzina metabolizma dovodi do povećanja izloženosti leku bez promene stope sistemskog klirensa (npr. Rofecoxib: F. Schneider i dr., Arzneim. Forsch./Drug. Res., 2006, 56, 295; Telaprevir: F. Maltais i dr., J. Med. Chem., 2009, 52, 7993). Lekovi sa deuteracijom koji pokazuju ovaj efekat mogu imati smanjene potrebe za doziranjem (npr. manji broj doza ili niže doze da bi se postigao željeni efekat) i/ili mogu proizvesti niže opterećenje metabolita.

[0035] Jedinjenje opšte formule (I) može imati višestruka potencijalna mesta napada za metabolizam. Da bi se optimizovali iznad opisani efekti na fizičko-hemijske osobine i metabolički profil, mogu se izabrati jedinjenja koja sadrže deuterijum opšte formule (I) koja imaju određeni obrazac jedne ili više razmene deuterijum-vodonik. Posebno, atom(i) deuterijuma jedinjenja koje sadrže deuterijum opšte formule (I) su vezani za atom ugljenika i/ili se nalaze na tim pozicijama jedinjenja opšte formule (I), koji su mesta napada za metabolizam enzima kao što su npr. citohrom P450.

[0036] Kada se ovde koristi oblik množine reči jedinjenja, soli, polimorfi, hidrati, solvati i slično, ovo se takođe podrazumeva da znači jedno jedinjenje, so, polimorf, izomer, hidrat, solvat ili slično.

[0037] Pod "stabilnim jedinjenjem" ili "stabilnom strukturom" se podrazumeva jedinjenje koje je dovoljno robusno da preživi izolaciju do korisnog stepena čistoće iz reakcione smeše i formulaciju u efikasno terapeutsko sredstvo.

[0038] Prolekovi su derivati aktivnog sastojka. Termini "osnovni aktivni sastojak", "osnovni odgovarajući lek" i "odgovarajući lek" se koriste kao sinonimi u predmetnom pronalasku.

[0039] Jedinjenja iz predmetnog pronalaska opciono sadrže jedan asimetrični centar, u zavisnosti od lokacije i prirode različitih željenih supstituenata. Moguće je da je jedan asimetrični atom ugljenika prisutan u (R) ili (S) konfiguraciji, što može rezultirati racemskim smešama. U određenim slučajevima, moguće je da asimetrija takođe bude prisutna zbog ograničene rotacije oko date veze, na primer, centralna veza koja spaja dva supstituisana aromatična prstena navedenih jedinjenja. Poželjna jedinjenja su ona koja proizvode poželjniju biološku aktivnost. Odvojeni, čisti ili delimično prečišćeni izomeri i stereoizomeri ili racemske mešavine jedinjenja iz predmetnog pronalaska su takođe uključeni u obim predmetnog pronalaska. Prečišćavanje i odvajanje takvih materijala može se postići standardnim tehnikama poznatim u tehnici.

[0040] Optički izomeri se mogu dobiti razdvajanjem racemskih smeša u skladu sa konvencionalnim procesima, na primer, formiranjem dijastereoizomernih soli korišćenjem optički aktivne kiseline ili baze ili formiranjem kovalentnih dijastereomera. Primeri odgovarajućih kiselina su vinska, diacetilvinska, ditoluoilvinska i kamforsulfonska kiselina. Smeše dijastereoizomera se mogu razdvojiti u njihove pojedinačne dijastereomere na osnovu njihovih fizičkih i/ili hemijskih razlika metodama poznatim u tehnici, na primer, hromatografijom ili frakcionom kristalizacijom. Optički aktivne baze ili kiseline se zatim oslobađaju iz odvojenih dijastereomernih soli. Različiti proces za razdvajanje optičkih izomera uključuje upotrebu hiralne hromatografije (npr., HPLC kolone koje koriste hiralnu fazu), sa ili bez konvencionalne derivatizacije, optimalno odabrane da maksimizira razdvajanje enantiomera. Odgovarajuće HPLC kolone koje koriste hiralnu fazu su komercijalno dostupne, kao što su one koje proizvodi Daicel, npr., Chiracel OD i Chiracel OJ, na primer, između mnogih drugih, koje se sve rutinski biraju. Enzimske separacije, sa ili bez derivatizacije, su takođe korisne. Optički aktivna jedinjenja ovog pronalaska se takođe mogu dobiti hiralnim sintezama korišćenjem optički aktivnih početnih materijala. U cilju razlikovanja različitih tipova izomera jedan od drugog, upućuje se na odeljak E IUPAC pravila (Pure Appl Chem 45, 11-30, 1976).

[0041] Predmetni pronalazak obuhvata sve moguće stereoizomere jedinjenja iz predmetnog pronalaska kao pojedinačne stereoizomere, ili kao bilo koju mešavinu navedenih stereoizomera, npr. (R)- ili (S)- izomeri, u bilo kom odnosu. Izolacija jednog stereoizomera, npr. jedan enantiomer ili jedan dijastereomer jedinjenja iz predmetnog pronalaska se postiže bilo kojim pogodnim postupkom stanja tehnike, kao što je hromatografija, posebno hiralna hromatografija, na primer.

[0042] U kontekstu predmetnog pronalaska, termin "enantiomerno čist" treba shvatiti tako da znači da je jedinjenje u pitanju u odnosu na apsolutnu konfiguraciju hiralnog centra prisutno u enantiomernom višku od više od 95%, poželjno više od 97%. Enantiomerni višak, ee, se ovde izračunava procenom odgovarajućeg HPLC hromatograma na hiralnoj fazi koristeći formulu ispod:

(E<A>: glavni enantiomer, E<B>: manji enantiomer)

[0043] Predmetni pronalazak takođe pokriva korisne oblike jedinjenja iz predmetnog pronalaska, kao što su hidrati, solvati, soli, posebno farmaceutski prihvatljive soli, i/ili koprecipitati.

[0044] Jedinjenja iz predmetnog pronalaska mogu postojati kao hidrati ili kao solvati, pri

1

čemu jedinjenja iz predmetnog pronalaska sadrže polarne rastvarače, posebno vodu, metanol ili etanol na primer, kao strukturni element kristalne rešetke jedinjenja. Moguće je da količina polarnih rastvarača, posebno vode, postoji u stehiometrijskom ili nestehiometrijskom odnosu. U slučaju stehiometrijskih solvata, npr. mogući su hidrat, hemi-, (polu-), mono-, seskvi-, di-, tri-, tetra-, penta- itd. solvati ili hidrati. Predmetni pronalazak obuhvata sve takve hidrate ili solvate. Hidrati, posebno hemihidrati (polu-hidrati), su poželjni solvati u kontekstu predmetnog pronalaska.

[0045] Dalje, moguće je da jedinjenja iz predmetnog pronalaska postoje u slobodnom obliku, npr. kao slobodna baza, ili kao slobodna kiselina, ili kao cviterjon, ili da postoji u obliku soli. Navedena so može biti bilo koja so, bilo organska ili neorganska adiciona so, posebno bilo koja farmaceutski prihvatljiva organska ili neorganska adiciona so, koja se obično koristi u farmaciji, ili koja se koristi, na primer, za izolovanje ili prečišćavanje jedinjenja predmetnog pronalaska.

[0046] Termin "farmaceutski prihvatljiva so" odnosi se na neorgansku ili organsku adicionu so jedinjenja iz predmetnog pronalaska. Na primer, videti S. M. Berge, i dr. "Pharmaceutical Salts," J. Pharm. Sci.1977, 66, 1-19.

[0047] Pogodna farmaceutski prihvatljiva so jedinjenja iz ovog pronalaska koja je dovoljno kisela je so alkalnog metala, na primer natrijumova so, kalijumova so ili litijumova so, so zemnoalkalnog metala, ili na primer so kalcijuma, soli magnezijuma ili soli stroncijuma, ili soli aluminijuma ili soli cinka, ili soli amonijuma izvedene iz amonijaka ili iz organskog primarnog, sekundarnog ili tercijarnog amina koji ima 1 do 20 atoma ugljenika, kao što je etilamin, dietilamin , trietilamin, etildiizopropilamin, monoetanolamin, dietanolamin, trietanolamin, dicikloheksilamin, dimetilaminoetanol, dietilaminoetanol, tris(hidroksimetil)aminometan, prokain, dibenzilamin, N-metilmorfolin, arginin, lizin, 1,2-etilendiamin, N-metilpiperidin, N-metil-glukamin, N,N-dimetil-glukamin, N-etil-glukamin, 1,6-heksandiamin, glukozamin, serinol, 2-amino-1,3-propandiol, 3-amino-1,2-propandiol, 4-amino-1,2,3-butantriol, ili so sa kvarternim amonijum jonom koji ima 1 do 20 atoma ugljenika, kao što su tetrametilamonijum, tetraetilamonijum, tetra(n-propil)amonijum, tetra(n-butil)amonijum, N-benzil-N,N,N-trimetilamonijum, holin ili benzalkonijum. Prednost se daje natrijumovoj soli, kalijumovoj soli, litijumovoj soli, kalcijumovoj soli ili magnezijumovoj soli, najpoželjnija je kalijumova so.

[0048] Soli alkalnih i zemnoalkalnih metala kiselih jedinjenja ovog pronalaska dobijaju se reakcijom jedinjenja iz predmetnog pronalaska sa odgovarajućom bazom putem raznih poznatih metoda.

[0049] Predmetni pronalazak obuhvata sve moguće soli jedinjenja iz predmetnog pronalaska kao pojedinačne soli, ili kao bilo koju mešavinu navedenih soli, u bilo kom odnosu.

[0050] U ovom tekstu, posebno u eksperimentalnom delu, za sintezu intermedijera i primera ovog pronalaska, kada se jedinjenje pominje kao oblik soli sa odgovarajućom bazom ili kiselinom, tačan stehiometrijski sastav pomenutog oblika soli, kao što je dobijeno odgovarajućim procesom pripreme i/ili prečišćavanja, u većini slučajeva je nepoznato.

[0051] Osim ako nije drugačije naznačeno, sufiksi za hemijske nazive ili strukturne formule koje se odnose na soli, kao što su „natrijumova so“, „kalijumova so“ ili „x Na<+>“, „x K<+>“, na primer, označavaju oblik soli, čija stehiometrija oblik soli nije naveden.

[0052] Ovo se analogno primenjuje na slučajeve u kojima su dobijeni intermedijeri sinteze ili primeri jedinjenja ili njihove soli, opisanim procesima pripreme i/ili prečišćavanja, kao solvati, kao što su hidrati, sa (ako je definisan) nepoznatim stehiometrijskim sastavom.

[0053] Štaviše, predmetni pronalazak uključuje sve moguće kristalne oblike, ili polimorfe, jedinjenja iz predmetnog pronalaska, bilo kao pojedinačni polimorf, ili kao mešavina više od jednog polimorfa, u bilo kom odnosu.

[0054] Prednost se daje jedinjenjima opšte formule (I) u kojoj

R<1>

predstavlja grupu formule

u kojem

# predstavlja tačku vezivanja za 1,2,4-triazolil prsten.

[0055] Prednost se takođe daje (2S)-3-[1-({5-karbamoil-1-[3-(trifluorometil)piridin-2-il]-1H-

1

1,2,4-triazol-3-il}metil)-3-(4-hlorofenil)-5-okso-1,5-dihidro-4H-1,2,4-triazol-4-il]-1,1,1-trifluoropropan-2-il dihidrogen fosfat koji formula ispod

ili njihove farmaceutski prihvatljive soli, njihovi solvati i solvati njihovih soli.

ili njihove farmaceutski prihvatljive soli, njihovi solvati i solvati njihovih soli.

[0056] Prednost se takođe daje (2S)-3-[1-({5-karbamoil-1-[3-(trifluorometil)piridin-2-il]-1H-1,2,4-triazol-3-il}metil)-3-(4-hlorofenil)-5-okso-1,5-dihidro-4H-1,2,4-triazol-4-il]-1,1,1-trifluoropropan-2-il dihidrogen fosfat koji formula ispod

ili njihove farmaceutski prihvatljive soli, njihovi solvati i solvati njihovih soli.

[0057] Predmetni pronalazak pokriva jedinjenja opšte formule (I) koja su otkrivena u odeljku primera ovog teksta.

[0058] Pronalazak dalje obezbeđuje postupak za dobijanje jedinjenja opšte formule (I), ili njihovih farmaceutski prihvatljivih soli, njihovih solvata ili solvata njihovih soli, pri čemu [A] jedinjenja formule

1

u kojima

R<1>ima značenje kako je definisano za jedinjenja opšte formule (I) date iznad, reaguju u prvom koraku sa fosfornim oksihloridom i u drugom koraku hidrolizuju dajući jedinjenja opšte formule (I),

ili

[B] jedinjenja formule

u kojima

R<1>ima značenje kako je definisano za jedinjenja opšte formule (I) date iznad, reaguju u prvom koraku sa tetrabenzil difosfatom, a u drugom koraku benzil grupe se uklanjaju pod redukcionim uslovima da bi se dobila jedinjenja opšte formule (I), opciono praćena, gde je prikladno, pretvaranjem jedinjenja opšte formule (I) u njihove odgovarajuće farmaceutski prihvatljive soli, njihove solvate ili solvate njihovih soli tretmanom sa odgovarajućim rastvaračima i/ili bazama.

[0059] Prvi korak u reakciji [A] se generalno izvodi reakcijom jedinjenja formule (II) sa fosfor oksihloridom u inertnom rastvaraču u prisustvu baze, opciono u prisustvu aditiva, poželjno u temperaturnom opsegu od -10°C do 50°C, poželjnije na 0°C do 30°C. Reakcije se mogu izvoditi na atmosferskom, povišenom ili sniženom pritisku (na primer, od 0,5 do 5 bara); generalno, reakcije se odvijaju na atmosferskom pritisku.

[0060] Inertni rastvarači su, na primer, halogenovani ugljovodonici kao što su dihlorometan ili trihlorometan, etar kao što je dietil etar ili metil terc-butil etar, ugljovodonici kao što su benzen ili toluen, ili drugi rastvarači kao što su dioksan, dimetilformamid ili tetrahidrofuran.

1

Takođe je moguće koristiti mešavine rastvarača. Prednost se daje tetrahidrofuranu.

[0061] Pogodne baze su, na primer, organske baze kao što su trialkilamini, na primer trietilamin ili diizopropiletilamin, ili piridin. Prednost se daje trietilaminu.

[0062] Pogodni aditivi su, na primer, 4-N,N-dimetilaminopiridin.

[0063] Drugi korak u reakciji [A] se generalno izvodi dodavanjem baze ili vode, poželjno u temperaturnom opsegu od -10°C do 50°C, poželjnije na 0°C do 30°C. Reakcije se mogu izvoditi na atmosferskom, povišenom ili sniženom pritisku (na primer, od 0,5 do 5 bara); generalno, reakcije se odvijaju na atmosferskom pritisku.

[0064] Pogodne baze su, na primer, vodeni rastvori hidroksida alkalnih metala kao što je vodeni rastvor natrijum hidroksida, vodeni rastvor litijum hidroksida ili vodeni rastvor kalijum hidroksida, ili vodeni rastvor hidrogenkarbonata alkalnih metala kao što je vodeni rastvor natrijum hidrogenkarbonata ili vodeni rastvor kalijum hidrogenkarbonata, ili vodeni rastvor alkalnog metala ili hidrogenkarbonata u vodi karbonat ili vodeni rastvor kalijum karbonata. Prednost se daje vodenom rastvoru natrijum hidrogenkarbonata.

[0065] Prvi korak u reakciji [B] se generalno izvodi reakcijom jedinjenja formule (II) sa tetrabenzil difosfatom u inertnom rastvaraču u prisustvu baze, poželjno u temperaturnom opsegu od -10°C do 50° C, poželjnije na 0°C do 30°C. Reakcije se mogu izvoditi na atmosferskom, povišenom ili sniženom pritisku (na primer, od 0,5 do 5 bara); generalno, reakcije se odvijaju na atmosferskom pritisku.

[0066] Inertni rastvarači su, na primer, halogenovani ugljovodonici kao što su dihlorometan ili trihlorometan, etar kao što je dietil etar ili metil terc-butil etar, ili drugi rastvarači kao što su dioksan, dimetilformamid ili tetrahidrofuran. Takođe je moguće koristiti mešavine rastvarača. Prednost se daje tetrahidrofuranu.

[0067] Pogodne baze su, na primer, kalijum terc-butoksid ili natrijum terc-butoksid, natrijum hidrid, N-butillitijum, litijum diizopropilamid, bis(trimetilsilil)natrijum amid ili bis(trimetilsilil)-litijum amid, prednost se daje bisili(trimetil) litijum amid.

1

[0068] Drugi korak u reakciji [B] se generalno izvodi sa redukcionim agensom u inertnom rastvaraču, poželjno u temperaturnom opsegu od -10°C do 50°C, poželjnije na 0°C do 30°C. Reakcije se mogu izvoditi na atmosferskom, povišenom ili sniženom pritisku (na primer, od 0,5 do 5 bara); generalno, reakcije se odvijaju na atmosferskom pritisku.

[0069] Inertni rastvarači su, na primer, etanol, ili mešavine dioksana i vode ili tetrahidrofurana i vode. Prednost se daje etanolu.

[0070] Redukcioni agensi su, na primer, paladijum na ugljeniku i vodoniku, paladijum dihidroksid, kalaj dihlorid, titan trihlorid ili amonijum format. Prednost se daje paladijumu na ugljeniku i vodoniku.

[0071] Jedinjenja formule (II) su ili komercijalno dostupna, poznata iz literature, ili se mogu dobiti od lako dostupnih početnih materijala prilagođavanjem standardnih metoda opisanih u literaturi. Detaljne procedure i literaturne reference za pripremu polaznih materijala takođe se mogu naći u Eksperimentalnom delu u odeljku o pripremi polaznih materijala i međuproizvoda.

[0072] Predmetni pronalazak pokriva postupke za dobijanje jedinjenja iz predmetnog pronalaska opšte formule (I), pri čemu pomenuti postupci obuhvataju korake opisane u eksperimentalnom delu.

[0073] Šeme i procedure opisane u nastavku ilustruju sintetičke puteve do jedinjenja opšte formule (I) pronalaska i nije predviđeno da budu ograničavajuće.

[0074] Priprema jedinjenja pronalaska može se ilustrovati pomoću sledeće sintetičke šeme:

1

[0075] Jedinjenja opšte formule (I) ovog pronalaska mogu se konvertovati u bilo koju so, poželjno farmaceutski prihvatljive soli, kao što je ovde opisano, bilo kojim postupkom koji je poznat stručnjaku. Slično, bilo koja so jedinjenja opšte formule (I) predmetnog pronalaska može se konvertovati u slobodno jedinjenje, bilo kojim metodom koji je poznat stručnjaku.

[0076] Jedinjenja predmetnog pronalaska imaju vredna farmakološka svojstva i mogu se koristiti za prevenciju i/ili lečenje različitih bolesti i stanja izazvanih bolestima kod ljudi i drugih sisara. Jedinjenja opšte formule (I) predmetnog pronalaska pokazuju vredan farmakološki spektar delovanja i farmakokinetički profil. Iznenađujuće je nađeno da jedinjenja iz predmetnog pronalaska efikasno inhibiraju receptor vazopresina V1a i stoga je moguće da se navedena jedinjenja koriste za lečenje i/ili prevenciju bolesti, poželjno bubrežnih i kardiovaskularnih bolesti kod ljudi i životinja.

[0077] U kontekstu predmetnog pronalaska, termin "lečenje" ili "lečenje" uključuje inhibiciju, odlaganje, ublažavanje, ublažavanje, zaustavljanje, smanjenje ili izazivanje regresije bolesti, poremećaja, stanja ili stanja, razvoja i/ili njegovo napredovanje, i/ili njegove simptome. Termin "prevencija" ili "sprečavanje" uključuje smanjenje rizika od obolijevanja, zaraze ili doživljavanja bolesti, poremećaja, stanja ili stanja, njihovog razvoja i/ili progresije i/ili simptoma. Termin prevencija uključuje profilaksu. Lečenje ili prevencija poremećaja, bolesti, stanja ili stanja može biti delimično ili potpuno.

[0078] Jedinjenja predmetnog pronalaska su veoma moćni i posebno selektivni antagonisti vazopresin V1a receptora. Stoga se očekuje da su jedinjenja pronalaska veoma vredna kao terapeutska sredstva za lečenje i/ili prevenciju bolesti, posebno za lečenje i/ili prevenciju bubrežnih i kardiovaskularnih bolesti.

[0079] Kako se ovde koristi, termin "antagonist receptora vazopresina V1a" odnosi se na jedinjenje koje funkcioniše tako što inhibira (delimično ili potpuno) ili blokira receptor vazopresina V1a, čime se sprečava aktivacija receptora vazopresinom.

[0080] U jednom otelotvorenju, odgovarajući lekovi jedinjenja koja su ovde opisana su aktivni na V1a receptoru. U drugom otelotvorenju, odgovarajući lekovi jedinjenja opisanih ovde pokazuju inhibiciju V1a receptora prema ispitivanju u B-4 sa IC50< 100 nM. U drugom otelotvorenju, odgovarajući lekovi jedinjenja opisanih ovde pokazuju inhibiciju V1a

2

receptora prema ispitivanju u B-4 sa IC50< 20 nM. U drugom otelotvorenju, odgovarajući lekovi jedinjenja opisanih ovde pokazuju inhibiciju V1a receptora prema ispitivanju u B-4 sa IC50< 10 nM. U drugom otelotvorenju, odgovarajući lekovi jedinjenja opisanih ovde pokazuju inhibiciju V1a receptora prema ispitivanju u B-4 sa IC50< 5 nM.

[0081] U sledećem otelotvorenju, odgovarajući lekovi koji su u osnovi ovde opisanih jedinjenja su selektivno aktivni na V1a receptoru, i manje su aktivni, značajno manje aktivni i/ili neaktivni na drugim vazopresin receptorima, kao što su V1b i/ili V2 podtipovi. U drugom otelotvorenju, odgovarajući lekovi jedinjenja opisanih ovde su najmanje 10 puta selektivni za V1a receptor u poređenju sa V2 receptorom kako je utvrđeno prema ispitivanju u B-4. U drugom otelotvorenju, odgovarajući lekovi jedinjenja opisanih ovde su najmanje 15 puta selektivni za V1a receptor u poređenju sa V2 receptorom kako je utvrđeno prema ispitivanju u B-4. U drugom otelotvorenju, odgovarajući lekovi jedinjenja opisanih ovde su najmanje 20 puta selektivni za V1a receptor u poređenju sa V2 receptorom kako je utvrđeno prema ispitivanju u B-4. U drugom otelotvorenju, odgovarajući lekovi jedinjenja opisanih ovde su najmanje 30 puta selektivni za V1a receptor u poređenju sa V2 receptorom kako je utvrđeno prema ispitivanju u B-4.

[0082] Jedinjenja prema pronalasku su pogodna za lečenje i/ili prevenciju bubrežnih oboljenja, posebno akutnih i hroničnih bolesti bubrega, dijabetesnih bolesti bubrega i akutne i hronične bubrežne insuficijencije. Opšti termini „bolest bubrega“ ili „bolest bubrega“ opisuju klasu stanja u kojima bubrezi ne uspevaju da filtriraju i uklone otpadne proizvode iz krvi. Postoje dva glavna oblika bolesti bubrega: akutna bolest bubrega (akutna povreda bubrega, AKI) i hronična bolest bubrega (CKD). Jedinjenja prema pronalasku mogu dalje da se koriste za lečenje i/ili prevenciju posledica akutne povrede bubrega koje proističu iz višestrukih uvreda kao što su ishemija-reperfuziona povreda, primena radiokontrasta, kardiopulmonalna bajpas operacija, šok i sepsa. U smislu predmetnog pronalaska, izraz bubrežna insuficijencija ili bubrežna insuficijencija obuhvata i akutne i hronične manifestacije bubrežne insuficijencije, kao i osnovne ili srodne bolesti bubrega kao što su hipoperfuzija bubrega, intradijalitička hipotenzija, opstruktivna uropatija, glomerulopatija, IgA nefropatija, IgA nefropatija, akutni glomerulonefritis, glomeruloskleroza, tubulointersticijalne bolesti, nefropatske bolesti kao što su primarna i urođena bolest bubrega, nefritis, Alportov sindrom, zapaljenje bubrega, imunološka oboljenja bubrega kao što je odbacivanje transplantacije bubrega, imunološki kompleks bubrega toksičnih supstanci u srednje indukovana nefropatija; glomerulonefritis minimalne promene (lipoid); Membranski glomerulonefritis; fokalna segmentna glomeruloskleroza (FSGS); hemolitičko-uremijski sindrom (HUS), amiloidoza, Gudpastureov sindrom, Vegenerova granulomatoza, purpura Šenlajn-Henoh, dijabetička i nedijabetička nefropatija, pijelonefritis, bubrežne ciste, nefroskleroza, hipertenzivna nefroskleroza, dijagnoza, hipertenzivna nefroskleroza, na primer. abnormalno smanjeno izlučivanje kreatinina i/ili vode, abnormalno povećane koncentracije uree, azota, kalijuma i/ili kreatinina u krvi, izmenjena aktivnost enzima bubrega kao što je, na primer, glutamil sintetaza, izmenjen osmolarnost urina ili zapremina urina, povećana mikroalbuminurija, makroalbuminurija lezije glomerula i arteriola, tubularna dilatacija, hiperfosfatemija i/ili potreba za dijalizom. Predmetni pronalazak takođe obuhvata upotrebu jedinjenja prema pronalasku za lečenje i/ili prevenciju posledica bubrežne insuficijencije, na primer plućnog edema, srčane insuficijencije, uremije, anemije, poremećaja elektrolita (npr. hiperkalemije, hiponatremije) i poremećaja u metabolizam kostiju i ugljenih hidrata. Jedinjenja prema pronalasku su takođe pogodna za lečenje i/ili prevenciju bolesti policističnih bubrega (PCKD) i sindroma neadekvatne sekrecije ADH (SIADH).

[0083] Kardiovaskularne bolesti u ovom kontekstu koje se mogu lečiti i/ili sprečiti jedinjenjima pronalaska uključuju, ali nisu ograničene na, sledeće: akutna i hronična srčana insuficijencija uključujući pogoršanje hronične srčane insuficijencije (ili hospitalizaciju zbog srčane insuficijencije) i uključujući kongestivnu srčanu insuficijenciju, arterijsku hipertenziju, otpornu hipertenziju, arterijsku plućnu hipertenziju, koronarnu bolest srca, stabilnu i nestabilnu anginu pektoris, atrijalne i ventrikularne aritmije, poremećaji atrijalnog i ventrikularnog ritma i poremećaji provodljivosti, na primer atrioventrikularni blokovi stepena I-III (AVB I-III), supraventrikularna tahiaritmija, atrijalna fibrilacija, atrijalno treperenje, ventrikularna fibrilacija, ventrikularno treperenje, ventrikularna tahiaritmija-tahijadatahikardija, atrijalni i ventrikularni ekstrasistoli, ekstrasistoli AV spojnice, sindrom bolesnog sinusa, sinkope, Tahikardija ponovnog ulaska u AV čvor i Wolff-Parkinson-White sindrom, akutni koronarni sindrom (ACS), autoimune bolesti srca (perikarditis, endokarditis, valvulitis, aortitis, kardiomiopatije), šok kao što je kardiogeni šok, septički šok i anafilaktički šok, aneurizme, bokserska kardiomiopatija (preuranjena ventrikularna kontrakcija), nadalje tromboembolijske bolesti i ishemije kao što su poremećaji periferne perfuzije, reperfuzione povrede, arterijske i venske tromboze, miokardna insuficijencija i mikrofunkcija miokarda, oštećenje endomakrovalikularne funkcije za prevenciju restenoza kao što su posle terapije trombolizom, perkutana transluminalna angioplastika (PTA), perkutana transluminalna koronarna angioplastika (PTCA), transplantacija srca i operacije bajpasa, arterioskleroza, poremećaji metabolizma lipida, hiperlipoproteinemije, dislipidemije, hipertrigliceridemije, hiperlipidemijemije, kombinovane hiperlipidemijemijemije i hiperlipidemijemiasa, Tangerova bolest, adipociti, gojaznost, metabolički sindrom, prolazni i ishemijski napadi, moždani udar, inflamatorne kardiovaskularne bolesti, periferna i srčana vaskularna oboljenja, poremećaji periferne cirkulacije, grčevi koronarnih arterija i perifernih arterija i edemi kao što je npr., cerebralni edem, edem bubrega i edem povezan sa srčanom insuficijencijom.

[0084] U smislu ovog pronalaska, izraz srčana insuficijencija takođe uključuje specifičnije ili srodne oblike bolesti kao što su zatajenje desnog srca, zatajenje levog srca, globalna insuficijencija, ishemijska kardiomiopatija, dilatativna kardiomiopatija, urođene srčane mane, defekti srčanih zalistaka, srčana insuficijencija sa defekti srčanih zalistaka, stenoza mitralne valvule, insuficijencija mitralne valvule, stenoza aortne valvule, insuficijencija aortne valvule, trikuspidalna stenoza, trikuspidalna insuficijencija, stenoza plućnih zalistaka, insuficijencija plućnih zalistaka, kombinovani defekti srčanih zalistaka, zapaljenje srčanog mišića (miokarditis), hronični miokarditis, akutni miokarditis, virusni miokarditis, dijabetička srčana insuficijencija, kardiomiopatija toksična za alkohol, srčana insuficijencija, srčana insuficijencija sa očuvanom ejekcionom frakcijom (HFpEF ili dijastolna srčana insuficijencija), i srčana insuficijencija sa smanjenom ejekcionom frakcijom (HFrEF ili sistolna srčana insuficijencija).

[0085] Jedinjenja iz predmetnog pronalaska mogu biti posebno korisna za lečenje i/ili prevenciju kardiorenalnog sindroma (CRS) i njegovih različitih podtipova. Ovaj termin obuhvata određene poremećaje srca i bubrega pri čemu akutna ili hronična disfunkcija u jednom organu može izazvati akutnu ili hroničnu disfunkciju drugog.

[0086] Štaviše, jedinjenja prema pronalasku mogu se koristiti za lečenje i/ili prevenciju bolesti perifernih arterija (PAD) uključujući klaudikaciju i uključujući kritičnu ishemiju ekstremiteta, kao i koronarnu mikrovaskularnu disfunkciju (CMD) uključujući CMD tip 1-4, primarnu i sekundarni Rainaudov fenomen, poremećaji mikrocirkulacije, klaudikacija, periferne i autonomne neuropatije, dijabetičke mikroangiopatije, dijabetička retinopatija, dijabetički ulkusi udova, gangrena, CREST sindrom, eritematozni poremećaji, reumatske bolesti i za proling.

2

[0087] Štaviše, jedinjenja pronalaska su pogodna za lečenje uroloških bolesti i bolesti muškog i ženskog urogenitalnog sistema, kao što su, na primer, benigni sindrom prostate (BPS), benigna hiperplazija prostate (BPH), benigno uvećanje prostate (BPE), bešika opstrukcija izlaza (BOO), sindromi donjeg urinarnog trakta (LUTS), neurogena prekomerno aktivna bešika (OAB), intersticijski cistitis (IC), urinarna inkontinencija (UI) kao što je, na primer, mešana inkontinencija, nagon, stres i inkontinencija prelivanja (MUI, UUI , SUI, OUI), karlični bolovi, erektilna disfunkcija, dismenoreja i endometrioza.

[0088] Jedinjenja prema pronalasku se takođe mogu koristiti za lečenje i/ili prevenciju inflamatornih bolesti, astmatičnih bolesti, hronične opstruktivne plućne bolesti (COPD), sindroma akutnog respiratornog distresa (ARDS), akutne povrede pluća (ALI), alfa-1 -nedostatak antitripsina (AATD), plućna fibroza, plućni emfizem (npr. emfizem pluća izazvan pušenjem) i cistična fibroza (CF). Pored toga, jedinjenja pronalaska se mogu koristiti za lečenje i/ili prevenciju plućne arterijske hipertenzije (PAH) i drugih oblika plućne hipertenzije (PH), uključujući plućnu hipertenziju povezanu sa bolešću leve komore, HIV infekcijom, anemijom srpastih ćelija, tromboembolija (CTEPH), sarkoidoza, hronična opstruktivna bolest pluća (COPD) ili plućna fibroza.

[0089] Dodatno, jedinjenja prema pronalasku se mogu koristiti za lečenje i/ili prevenciju ciroze jetre, ascitesa, dijabetes melitusa i dijabetičkih komplikacija kao što su, na primer, neuropatija i nefropatija.

[0090] Dalje, jedinjenja pronalaska su pogodna za lečenje i/ili prevenciju poremećaja centralnog nervnog sistema kao što su anksiozna stanja, depresija, glaukom, kancer kao što su posebno plućni tumori, i neusklađenost cirkadijalnog ritma kao što je džetleg i rad u smenama.

[0091] Štaviše, jedinjenja prema pronalasku mogu biti korisna za lečenje i/ili prevenciju stanja bola, bolesti nadbubrežne žlezde kao što su, na primer, feohromocitom i apopleksija nadbubrežne žlezde, bolesti creva kao što je, na primer, Kronova bolest i dijareja, menstrualni poremećaji kao što su, na primer, dismenoreja, endometrioza, prevremeni porođaj i tokoliza.

[0092] Zbog njihove aktivnosti i profila selektivnosti, veruje se da su jedinjenja ovog pronalaska posebno pogodna za lečenje i/ili prevenciju akutnih i hroničnih bolesti bubrega uključujući dijabetičku nefropatiju, akutnu i hroničnu srčanu insuficijenciju, preeklampsiju, bolest perifernih arterija (PAD), koronarna mikrovaskularna disfunkcija (CMD), Rejonov sindrom i dismenoreja.

[0093] Iznad pomenute bolesti su dobro okarakterisane kod ljudi, ali takođe postoje sa uporedivom etiologijom kod drugih sisara, i kod onih se mogu lečiti jedinjenjima i postupcima iz predmetnog pronalaska.

[0094] Predmetni pronalazak se dalje odnosi na upotrebu jedinjenja prema pronalasku za pripremu farmaceutskog sastava za lečenje i/ili prevenciju bolesti, posebno iznad navedenih bolesti.

[0095] Predmetni pronalazak se dalje odnosi na upotrebu jedinjenja prema pronalasku u postupku za lečenje i/ili prevenciju bolesti, posebno iznad navedenih bolesti.

[0096] U skladu sa drugim aspektom, predmetni pronalazak pokriva farmaceutske kombinacije, posebno lekove, koji sadrže najmanje jedno jedinjenje opšte formule (I) ovog pronalaska i najmanje jedan ili više daljih aktivnih sastojaka, posebno za lečenje i/ili prevenciju bolesti, posebno navedenih bolesti.

[0097] Posebno, predmetni pronalazak pokriva farmaceutsku kombinaciju, koja sadrži:

• jedan ili više prvih aktivnih sastojaka, posebno jedinjenja opšte formule (I) kao što je iznad pomenuto, i

• jedan ili više daljih aktivnih sastojaka, posebno za lečenje i/ili prevenciju bolesti, posebno od iznad navedenih bolesti.

[0098] Termin "kombinacija" u predmetnom pronalasku se koristi kao što je poznato stručnjacima u ovoj oblasti, pri čemu je moguće da navedena kombinacija bude fiksna kombinacija, nefiksna kombinacija ili komplet delova.

[0099] "Fiksna kombinacija" u predmetnom pronalasku se koristi kao što je poznato stručnjacima u ovoj oblasti i definisana je kao kombinacija u kojoj je, na primer, prvi aktivni sastojak, kao što je jedno ili više jedinjenja opšte formule (I) iz predmetnog pronalaska, i dalji aktivni sastojak su prisutni zajedno u jednoj jediničnoj dozi ili u jednom pojedinačnom entitetu. Jedan primer "fiksne kombinacije" je farmaceutski sastav u kojem su prvi aktivni

2

sastojak i drugi aktivni sastojak prisutni u smeši za istovremenu primenu, kao što je u formulaciji. Drugi primer "fiksne kombinacije" je farmaceutski sastav u kojoj su prvi aktivni sastojak i drugi aktivni sastojak prisutni u jednoj jedinici bez mešanja.

[0100] Nefiksna kombinacija ili "komplet delova" u ovom pronalasku se koristi kao što je poznato stručnjacima u ovoj oblasti i definisana je kao kombinacija u kojoj su prvi aktivni sastojak i drugi aktivni sastojak prisutni u više od jedne jedinice. Jedan primer nefiksne kombinacije ili kompleta delova je kombinacija u kojoj su prvi aktivni sastojak i dalji aktivni sastojak prisutni odvojeno. Moguće je da se komponente nefiksne kombinacije ili kompleta delova daju odvojeno, uzastopno, simultano, paralelno ili hronološki poređane.

[0101] Jedinjenja iz predmetnog pronalaska se mogu davati kao jedini farmaceutski agens ili u kombinaciji sa jednim ili više drugih farmaceutski aktivnih sastojaka gde kombinacija ne izaziva neprihvatljive neželjene efekte. Predmetni pronalazak takođe pokriva takve farmaceutske kombinacije. Na primer, jedinjenja iz predmetnog pronalaska mogu se kombinovati sa poznatim sredstvima za lečenje i/ili prevenciju bolesti, posebno iznad navedenih bolesti.

[0102] Posebno, jedinjenja iz predmetnog pronalaska se mogu koristiti u fiksnoj ili odvojenoj kombinaciji sa

• antitrombotična sredstva, na primer i poželjno iz grupe inhibitora agregacije trombocita, antikoagulansa i profibrinolitičkih supstanci;

• sredstva za snižavanje krvnog pritiska, na primer i poželjno iz grupe antagonista kalcijuma, angiotenzina Svi antagonisti, ACE inhibitori, NEP inhibitori, inhibitori vazopeptidaze, antagonisti endotelina, inhibitori renina, alfa-blokatori, beta-blokatori, antagonisti mineralokortikoidnih receptora i diuretici;

• antidijabetički agensi (hipoglikemični ili antihiperglikemični agensi), kao što su na primer i poželjno insulin i derivati, sulfoniluree, bigvanidi, tiazolidindioni, akarboza, DPP4 inhibitori, GLP-1 analozi ili SGLT inhibitori (gliflozini);

• organski nitrati i NO-donori, na primer natrijum nitroprusid, nitroglicerin, izosorbid mononitrat, izosorbid dinitrat, molsidomin ili SIN-1, i inhalacioni NO;

• jedinjenja koja inhibiraju razgradnju cikličnog gvanozin monofosfata (cGMP), na primer inhibitore fosfodiesteraze (PDE) 1, 2, 5 i/ili 9, posebno inhibitore PDE-5 kao što su sildenafil, vardenafil, tadalafil, udenafil, dasantafil, avanafil , mirodenafil,

2

lodenafil, CTP-499 ili PF-00489791;

pozitivno-inotropna sredstva, kao što su na primer srčani glikozidi (digoksin) i betaadrenergički i dopaminergični agonisti kao što su izoproterenol, adrenalin, noradrenalin, dopamin ili dobut-amin;

natriuretski peptidi, kao što je na primer atrijalni natriuretski peptid (ANP, anaritid), natriuretski peptid B-tipa ili natriuretski peptid mozga (BNP, nesiritid), C-tip natriuretski peptid (CNP) ili urodilatin;

senzibilizatori kalcijuma, kao što je na primer i poželjno levosimendan;

NO- i hem-nezavisni aktivatori rastvorljive gvanilat ciklaze (sGC), na primer i poželjnije jedinjenja opisana u WO 01/19355, WO 01/19776, WO 01/19778, WO 01/19780, WO 02/070462 i WO 02/070510;

NO-nezavisni, ali hem zavisni stimulatori gvanilat ciklaze (sGC), na primer i poželjno jedinjenja opisana u WO 00/06568, WO 00/06569, WO 02/42301, WO 03/095451, WO 2011/147809, WO 2012/004258, WO 2012/028647 i WO 2012/059549;

sredstva, koji stimulišu sintezu cGMP, na primer i sa poželjnim sGC modulatorima, na primer i sa prednostom riociguat, cinaciguat, vericiguat ili BAY 1101042; inhibitori humane neutrofilne elastaze (HNE), kao što je na primer sivelestat ili DX-890 (reltran);

jedinjenja koja inhibiraju kaskadu transdukcije signala, posebno inhibitori tirozina i/ili serin/treonin kinaze, kao što su na primer nintedanib, dasatinib, nilotinib, bosutinib, regorafenib, sorafenib, sunitinib, cediranib, aksitinib, panizo telatinib, gefitinib, erlotinib, lapatinib, kanertinib, lestaurtinib, pelitinib, semaksanib ili tandutinib; jedinjenja koja utiču na energetski metabolizam srca, kao što su, na primer, i poželjno etomoksir, dihloroacetat, ranolazin ili trimetazidin, ili potpuni ili delimični agonisti receptora adenozina A1 kao GS-9667 (ranije poznat kao CVT-3619), kapadenozon i neladenozon bialanat (BAY 1067197);

jedinjenja koja utiču na srčanu frekvenciju, kao što je na primer i poželjno ivabradin; srčani aktivatori miozina, kao što je na primer i poželjno omecamtiv mecarbil (CK-1827452);

antiinflamatorni lekovi kao što su nesteroidni antiinflamatorni lekovi (NSAID) uključujući acetilsalicilnu kiselinu (aspirin), ibuprofen i naproksen, glukokortikoide kao što su na primer i poželjno prednizon, prednizolon, metilprednizolon, triamcinolon, deksametazon, beflumetazon, bectalometazon, budezonid ili flutikazon,

2

ili derivati 5-aminosalicilne kiseline, antagonisti leukotriena, inhibitori TNF-alfa i antagonisti receptora hemokina kao što su inhibitori CCR1, 2 i/ili 5;

• agensi koji menjaju metabolizam masti, na primer i poželjno iz grupe agonista tiroidnih receptora, inhibitora sinteze holesterola, kao što su na primer i poželjno inhibitori sinteze HMG-CoA-reduktaze ili skvalena, ACAT inhibitori, CETP inhibitori, MTP inhibitori, PPAR-alfa, PPAR-gama i/ili PPAR-delta agonisti, inhibitori apsorpcije holesterola, inhibitori lipaze, polimerni apsorberi žučne kiseline, inhibitori reapsorpcije žučne kiseline i antagonisti lipoproteina(a).

[0103] Poželjno je da se pod antitrombotičkim agensima podrazumevaju jedinjenja iz grupe inhibitora agregacije trombocita, antikoagulansa i profibrinolitičkih supstanci.

[0104] U poželjnom otelotvorenju pronalaska, jedinjenja prema pronalasku se primenjuju u kombinaciji sa inhibitorom agregacije trombocita, na primer i poželjno aspirinom, klopidogrelom, tiklopidinom ili dipiridamolom.

[0105] U poželjnom otelotvorenju pronalaska, jedinjenja prema pronalasku se primenjuju u kombinaciji sa inhibitorom trombina, na primer i poželjno ksimelagatranom, dabigatranom, melagatranom, bivalirudinom ili enoksaparinom.

[0106] U poželjnom otelotvorenju pronalaska, jedinjenja prema pronalasku se primenjuju u kombinaciji sa GPIIb/IIIa antagonistom, na primer i poželjno tirofibanom ili abciksimabom.

[0107] U poželjnom otelotvorenju pronalaska, jedinjenja prema pronalasku se daju u kombinaciji sa inhibitorom faktora Xa, na primer, a poželjno je rivaroksaban, apiksaban, otamiksaban, fideksaban, razaksaban, fondaparinuks, idraparinuks, DU-176b, PMD-3112, YM-150, KFA-1982, EMD-503982, MCM-17, MLN-1021, DX 9065a, DPC 906, JTV 803, SSR-126512 ili SSR-128428.

[0108] U poželjnom otelotvorenju pronalaska, jedinjenja prema pronalasku se daju u kombinaciji sa heparinom ili derivatom heparina niske molekulske mase (LMW).

[0109] U poželjnom otelotvorenju pronalaska, jedinjenja prema pronalasku se daju u kombinaciji sa antagonistom vitamina K, na primer i poželjno kumarinom.

2

[0110] Sredstva za snižavanje krvnog pritiska poželjno je razumeti kao jedinjenja iz grupe antagonista kalcijuma, angiotenzina, svih antagonista, ACE inhibitora, NEP inhibitora, inhibitora vazopeptidaze, antagonista endotelina, inhibitora renina, alfa-blokatora, betablokatora, antagonista mineralokortikoidnih receptora i diuretici.

[0111] U poželjnom otelotvorenju pronalaska, jedinjenja prema pronalasku se daju u kombinaciji sa antagonistom kalcijuma, na primer i poželjno nifedipinom, amlodipinom, verapamilom ili diltiazemom.

[0112] U poželjnom otelotvorenju pronalaska, jedinjenja prema pronalasku se primenjuju u kombinaciji sa blokatorom alfa-1-receptora, na primer i poželjno prazosinom ili tamsulozinom.

[0113] U poželjnom otelotvorenju pronalaska, jedinjenja prema pronalasku se daju u kombinaciji sa beta-blokatorom, na primer i poželjno propranolol, atenolol, timolol, pindolol, alprenolol, okprenolol, penbutolol, bupranolol, metipranolol, nadolol, mepinol karazolol, sotalol, metoprolol, betaksolol, celiprolol, bisoprolol, karteolol, esmolol, labetalol, karvedilol, adaprolol, landiolol, nebivolol, epanolol ili bucindolol.

[0114] U poželjnom otelotvorenju pronalaska, jedinjenja prema pronalasku se primenjuju u kombinaciji sa antagonistom svih angiotenzinskih receptora, na primer i poželjno losartanom, kandesartanom, valsartanom, telmisartanom, irbesartanom, olmesartanom, eprosartanom, embursartanom ili azilsartanom.

[0115] U poželjnom otelotvorenju pronalaska, jedinjenja prema pronalasku se primenjuju u kombinaciji sa inhibitorom vazopeptidaze ili inhibitorom neutralne endopeptidaze (NEP), kao što je na primer i poželjno sakubitril, omapatrilat ili AVE-7688.

[0116] U poželjnom otelotvorenju pronalaska, jedinjenja prema pronalasku se primenjuju u kombinaciji sa dvostrukim antagonistom svih receptora angiotenzina/inhibitorom NEP (ARNI), na primer i poželjno LCZ696.

[0117] U poželjnom otelotvorenju pronalaska, jedinjenja prema pronalasku se primenjuju u kombinaciji sa ACE inhibitorom, na primer, a poželjno je enalaprilom, kaptoprilom,

2

lizinoprilom, ramiprilom, delaprilom, fozinoprilom, hinoprilom, perindoprilom, benazeprilom ili trandoprilom.

[0118] U poželjnom otelotvorenju pronalaska, jedinjenja prema pronalasku se primenjuju u kombinaciji sa antagonistom endotelina, na primer i poželjno bosentanom, darusentanom, ambrisentanom, tezosentanom, sitaksentanom, avosentanom, macitentanom ili atrasentanom.

[0119] U poželjnom otelotvorenju pronalaska, jedinjenja prema pronalasku se primenjuju u kombinaciji sa inhibitorom renina, na primer i poželjno aliskirenom, SPP-600 ili SPP-800.

[0120] U poželjnom otelotvorenju pronalaska, jedinjenja prema pronalasku se daju u kombinaciji sa antagonistom mineralokortikoidnih receptora, na primer i poželjno finerenonom, spironolaktonom, kanrenonom, kalijum kanrenoatom, eplerenonom, esakserenonom (CS-3150) ili apararenonom (MT-3995), CS-3150 ili MT-3995.

[0121] U poželjnom otelotvorenju pronalaska, jedinjenja prema pronalasku se daju u kombinaciji sa diureticima, kao što su na primer i poželjno furosemid, bumetanid, piretanid, torsemid, bendroflumetiazid, hlorotiazid, hidrohlorotiazid, ksipamid, indapamid, hidroflumetiazid, hidroflumetiazid politiazid, trihlorometiazid, hlorotalidon, metolazon, kinetazon, acetazolamid, dihlorofenamid, metazolamid, glicerin, izosorbid, manitol, amilorid ili triamteren.

[0122] Poželjno je da se pod sredstvima koji menjaju metabolizam masti podrazumevaju jedinjenja iz grupe CETP inhibitora, agonista tiroidnih receptora, inhibitora sinteze holesterola kao što su inhibitori sinteze HMG-CoA-reduktaze ili skvalena, ACAT inhibitori, MTP inhibitori, PPAR-alfa, PPAR-gama i/ili PPAR-delta agonisti, inhibitori apsorpcije holesterola, polimerni adsorberi žučne kiseline, inhibitori reapsorpcije žučne kiseline, inhibitori lipaze i lipoprotein(a) antagonisti.

[0123] U poželjnom otelotvorenju pronalaska, jedinjenja prema pronalasku se primenjuju u kombinaciji sa CETP inhibitorom, na primer i poželjno dalcetrapibom, anacetrapibom, BAY 60-5521 ili CETP-vakcinom (Avant).

[0124] U poželjnom otelotvorenju pronalaska, jedinjenja prema pronalasku se daju u kombinaciji sa agonistom tiroidnih receptora, na primer i poželjno D-tiroksinom, 3,5,3'-trijodotironinom (T3), CGS 23425 ili aksitiromom (CGS 26214).

[0125] U poželjnom otelotvorenju pronalaska, jedinjenja prema pronalasku se primenjuju u kombinaciji sa inhibitorom HMG-CoA-reduktaze iz klase statina, na primer i poželjno lovastatin, simvastatin, pravastatin, fluvastatin, atorvastatin, rosuvastatin ili pitavastatin.

[0126] U poželjnom otelotvorenju pronalaska, jedinjenja prema pronalasku se primenjuju u kombinaciji sa inhibitorom sinteze skvalena, na primer i poželjno BMS-188494 ili TAK-475.

[0127] U poželjnom otelotvorenju pronalaska, jedinjenja prema pronalasku se primenjuju u kombinaciji sa ACAT inhibitorom, na primer i poželjno avasimibom, melinamidom, paktimibom, eflucimibom ili SMP-797.

[0128] U poželjnom otelotvorenju pronalaska, jedinjenja prema pronalasku se primenjuju u kombinaciji sa inhibitorom MTP, na primer i poželjno implitapidom, R-103757, BMS-201038 ili JTT-130.

[0129] U poželjnom otelotvorenju pronalaska, jedinjenja prema pronalasku se primenjuju u kombinaciji sa PPAR-gama agonistom, na primer i poželjno pioglitazonom ili rosiglitazonom.

[0130] U poželjnom otelotvorenju pronalaska, jedinjenja prema pronalasku se primenjuju u kombinaciji sa PPAR-delta agonistom, na primer i poželjno GW 501516 ili BAI 68-5042.

[0131] U poželjnom otelotvorenju pronalaska, jedinjenja prema pronalasku se daju u kombinaciji sa inhibitorom apsorpcije holesterola, na primer i poželjno ezetimibom, tikvezidom ili pamakevidom.

[0132] U poželjnom otelotvorenju pronalaska, jedinjenja prema pronalasku se primenjuju u kombinaciji sa inhibitorom lipaze, na primer i poželjno orlistatom.

[0133] U poželjnom otelotvorenju pronalaska, jedinjenja prema pronalasku se primenjuju u kombinaciji sa polimernim adsorberom žučne kiseline, na primer i poželjno holestiraminom,

1

kolestipolom, kolesolvamom, holestagelom ili kolestimidom.

[0134] U poželjnom otelotvorenju pronalaska, jedinjenja prema pronalasku se daju u kombinaciji sa inhibitorom reapsorpcije žučne kiseline, na primer i poželjno ASBT (= IBAT) inhibitorima kao što su AZD-7806, S-8921, AK-105, BARI -1741, SC-435 ili SC-635.

[0135] U poželjnom otelotvorenju pronalaska, jedinjenja prema pronalasku se primenjuju u kombinaciji sa antagonistom lipoproteina(a), na primer i poželjno gemkaben kalcijumom (CI-1027) ili nikotinskom kiselinom.

[0136] U poželjnom otelotvorenju pronalaska, jedinjenja prema pronalasku se primenjuju u kombinaciji sa antagonistom TGFbeta, kao primer i sa poželjnim pirfenidonom ili fresolimumabom.

[0137] U poželjnom otelotvorenju pronalaska, jedinjenja prema pronalasku se primenjuju u kombinaciji sa HIF-PH inhibitorima, na primer i sa poželjnim molidustatom ili roksadustatom.

[0138] U poželjnom otelotvorenju pronalaska, jedinjenja prema pronalasku se daju u kombinaciji sa CCR2 antagonistom, kao primer i sa prednostom CCX-140.

[0139] U poželjnom otelotvorenju pronalaska, jedinjenja prema pronalasku se daju u kombinaciji sa antagonistom TNFalfa, kao primer i sa poželjnim adalimumabom.

[0140] U poželjnom otelotvorenju pronalaska, jedinjenja prema pronalasku se daju u kombinaciji sa inhibitorom galektin-3, kao primer i sa poželjnim GCS-100.

[0141] U poželjnom otelotvorenju pronalaska, jedinjenja prema pronalasku se daju u kombinaciji sa BMP-7 agonistom, kao primer i sa prednostom THR-184.

[0142] U poželjnom otelotvorenju pronalaska, jedinjenja prema pronalasku se daju u kombinaciji sa p53 modulatorom, kao primer i sa prednostom QPI-1002.

[0143] U poželjnom otelotvorenju pronalaska, jedinjenja prema pronalasku se daju u

2

kombinaciji sa inhibitorom NOX1/4, kao primer i sa poželjnim GKT-137831.

[0144] U poželjnom otelotvorenju pronalaska, jedinjenja prema pronalasku se daju u kombinaciji sa lekom koji utiče na metabolizam vitamina D, na primer i sa poželjnim holekalciferolom ili parakalcitolom.

[0145] U poželjnom otelotvorenju pronalaska, jedinjenja prema pronalasku se daju u kombinaciji sa citostatičkim sredstvom, kao primer i preferirano ciklofosfamidom.

[0146] U poželjnom otelotvorenju pronalaska, jedinjenja prema pronalasku se daju u kombinaciji sa imunosupresivnim sredstvom, kao primer i sa poželjnim ciklosporinom.

[0147] U poželjnom otelotvorenju pronalaska, jedinjenja prema pronalasku se primenjuju u kombinaciji sa vezivom fosfata, kao primer i sa poželjnim sevelamerom ili lantan karbonatom.

[0148] U poželjnom otelotvorenju pronalaska, jedinjenja prema pronalasku se primenjuju u kombinaciji sa kalcimimetikom za terapiju hiperparatiroidizma.

[0149] U poželjnom otelotvorenju pronalaska, jedinjenja prema pronalasku se primenjuju u kombinaciji sa sredstvima za terapiju deficita gvožđa, kao primer i sa preferiranim proizvodima gvožđa.

[0150] U poželjnom otelotvorenju pronalaska, jedinjenja prema pronalasku se primenjuju u kombinaciji sa sredstvimaza terapiju hiperurikemije, kao primer i sa poželjnim alopurinolom ili rasburikazom.

[0151] U poželjnom otelotvorenju pronalaska, jedinjenja prema pronalasku se primenjuju u kombinaciji sa glikoproteinskim hormonom za terapiju anemije, kao primer i sa poželjnim eritropoetinom.

[0152] U poželjnom otelotvorenju pronalaska, jedinjenja prema pronalasku se primenjuju u kombinaciji sa biološkim lekovima za imunoterapiju, kao primer i sa poželjnim abataceptom, rituksimabom, ekulizumabom ili belimumabom.

[0153] U poželjnom otelotvorenju pronalaska, jedinjenja prema pronalasku se daju u kombinaciji sa Jak inhibitorima, kao primer i sa poželjnim ruksolitinibom, tofacitinibom, baricitinibom, CYT387, GSK2586184, lestaurtinibom, pakritinibom (TSB15101) ili SB15183.

[0154] U poželjnom otelotvorenju pronalaska, jedinjenja prema pronalasku se primenjuju u kombinaciji sa analozima prostaciklina za terapiju mikrotromba.

[0155] U poželjnom otelotvorenju pronalaska, jedinjenja prema pronalasku se primenjuju u kombinaciji sa alkalnom terapijom, kao primer i sa poželjnim natrijum bikarbonatom.

[0156] U poželjnom otelotvorenju pronalaska, jedinjenja prema pronalasku se daju u kombinaciji sa mTOR inhibitorom, kao primer i sa poželjnim everolimusom ili rapamicinom.

[0157] U poželjnom otelotvorenju pronalaska, jedinjenja prema pronalasku se daju u kombinaciji sa inhibitorom NHE3, kao primer i sa poželjnim AZD1722.

[0158] U poželjnom otelotvorenju pronalaska, jedinjenja prema pronalasku se daju u kombinaciji sa eNOS modulatorom, kao primer i sa poželjnim sapropterinom.

[0159] U poželjnom otelotvorenju pronalaska, jedinjenja prema pronalasku se daju u kombinaciji sa CTGF inhibitorom, kao primer i sa poželjnim FG-3019.

[0160] U poželjnom otelotvorenju pronalaska, jedinjenja prema pronalasku se daju u kombinaciji sa antidijabeticima (hipoglikemijskim ili antihiperglikemijskim agensima), kao što su na primer i poželjno insulin i derivati, sulfoniluree kao što su tolbutamid, karbutamid, acetoheksamid, glipizipropamid, gliklazid, glibenklamid, gliburid, glibornurid, glikvidon, glisoksepid, gliklopiramid, glimepirid, JB253 i JB558, meglitinidi kao što su repaglinid i nateglinid, bigvanidi kao što su metformin i buformin, tiazolidindioni kao što su rosiglitazon i pioglitazon, inhibitori alfa-glukozidaze i inhibitori alfa-glukozidaze kao što su inhibitori midagliglitinasa, kao što je midagliglipatin sa inhibitori DPP , linagliptin, alogliptin, septagliptin i teneligliptin, analozi GLP-1 kao što su eksenatid (takođe eksendin-4, liraglutid, liksisenatid i taspoglutid, ili SGLT inhibitori (gliflozini) kao što su kanagliflozin,

4

dapagliflozin i empagliflozin.

[0161] U posebno poželjnom otelotvorenju, jedinjenja predmetnog pronalaska se daju u kombinaciji sa jednim ili više dodatnih terapeutskih agenasa izabranih iz grupe koju čine diuretici, svi antagonisti angiotenzina, ACE inhibitori, blokatori beta-receptora, antagonisti mineralokortikoidnih receptora, antidijabetici, organski nitrati i donori NO, aktivatori i stimulatori rastvorljive gvanilat ciklaze (sGC) i pozitivno-inotropna sredstva.

[0162] U sledećem posebno poželjnom otelotvorenju, jedinjenja predmetnog pronalaska se daju u kombinaciji sa jednim ili više dodatnih terapeutskih sredstava izabranih iz grupe koju čine diuretici, svi antagonisti angiotenzina, ACE inhibitori, blokatori beta-receptora, antagonisti mineralokortikoidnih receptora, antidijabetici, organski nitrati i donori NO, aktivatori i stimulatori rastvorljive gvanilat ciklaze (sGC), pozitivno-inotropna sredstva, antiinflamatorni agensi, imunosupresivni agensi, fosfatna veziva i/ili jedinjenja koja moduliraju metabolizam vitamina D.

[0163] Prema tome, u sledećem otelotvorenju, predmetni pronalazak se odnosi na farmaceutske sastave koji sadrže najmanje jedno od jedinjenja prema pronalasku i jedan ili više dodatnih terapeutskih sredstava za lečenje i/ili prevenciju bolesti, posebno iznad navedenih bolesti.

[0164] Štaviše, jedinjenja predmetnog pronalaska mogu se koristiti, kao takva ili u sastavima, u istraživanju i dijagnostici, ili kao analitički referentni standardi i slično, koji su dobro poznati u tehnici.

[0165] Kada se jedinjenja iz predmetnog pronalaska daju kao farmaceutski proizvodi, ljudima i drugim sisarima, mogu se davati per se ili kao farmaceutski sastav koji sadrži, na primer, 0,1% do 99,5% (poželjnije, 0,5% do 90%) aktivni sastojak u kombinaciji sa jednim ili više farmaceutski prihvatljivih ekscipijenasa.

[0166] Dakle, u drugom aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na farmaceutske sastave koji sadrže najmanje jedno od jedinjenja prema pronalasku, konvencionalno zajedno sa jednim ili više inertnih, netoksičnih, farmaceutski prihvatljivih ekscipijenasa, i na njihovu upotrebu za lečenje i/ili prevenciju bolesti, posebno navedenih bolesti.

[0167] Moguće je da jedinjenja prema pronalasku imaju sistemsku i/ili lokalnu aktivnost. U tu svrhu, mogu se davati na odgovarajući način, kao što je, na primer, oralnim, parenteralnim, plućnim, nazalnim, sublingvalnim, lingvalnim, bukalnim, rektalnim, vaginalnim, dermalnim, transdermalnim, konjuktivalnim, otičnim putem ili kao implantat ili stent.

[0168] Za ove puteve davanja, moguće je da se jedinjenja prema pronalasku daju u odgovarajućim oblicima primene.

[0169] Za oralnu primenu, moguće je formulisati jedinjenja prema pronalasku u dozne oblike koji su poznati u tehnici koji daju jedinjenja pronalaska brzo i/ili na modifikovan način, kao što su, na primer, tablete (neobložene ili obložene tablete na primer sa prevlakama za entero ili kontrolisano oslobađanje koje se rastvaraju sa zakašnjenjem ili su nerastvorljive), tablete za oralno raspadanje, filmove/vafere, filmove/liofilizate, kapsule (na primer tvrde ili meke želatinske kapsule), tablete obložene šećerom, granule, pelete, praškovi, emulzije, suspenzije, aerosoli ili rastvori. Moguće je ugraditi jedinjenja prema pronalasku u kristalnom i/ili amorfnom i/ili rastvorenom obliku u navedene oblike doziranja.

[0170] Parenteralna primena se može izvršiti izbegavanjem koraka apsorpcije (na primer intravenozno, intraarterijsko, intrakardijalno, intraspinalno ili intralumbalno) ili uključivanjem apsorpcije (na primer intramuskularne, subkutane, intrakutane, perkutane ili intraperitonealne). Oblici primene koji su pogodni za parenteralnu primenu su, između ostalog, preparati za injekcije i infuzije u obliku rastvora, suspenzija, emulzija, liofilizata ili sterilnih praškova.

[0171] Primeri koji su pogodni za druge puteve davanja su farmaceutski oblici za inhalaciju [između ostalog inhalatori praha, nebulizatori], kapi za nos, rastvori za nos, nazalni sprejevi; tablete/filmovi/vafle/kapsule za lingvalnu, sublingvalnu ili bukalnu primenu; supozitorije; kapi za oči, masti za oči, kupke za oči, umeci za oči, kapi za uši, sprejevi za uši, puderi za uši, sredstva za ispiranje ušiju, tamponi za uši; vaginalne kapsule, vodene suspenzije (losioni, mikturae agitandae), lipofilne suspenzije, emulzije, masti, kreme, transdermalni terapijski sistemi (kao što su, na primer, flasteri), mleko, paste, pene, praškovi za prah, implantati ili stentovi.

[0172] Jedinjenja prema pronalasku se mogu ugraditi u navedene oblike davanja. Ovo se može postići na način poznat sam po sebi mešanjem sa farmaceutski pogodnim ekscipijensima. Farmaceutski pogodni ekscipijensi uključuju, između ostalog,

• punila i nosači (na primer celuloza, mikrokristalna celuloza (kao što je, na primer, Avicel®), laktoza, manitol, skrob, kalcijum fosfat (kao što je, na primer, Di-Cafos®)), • baze za masti (na primer vazelin, parafini, trigliceridi, voskovi, vuneni vosak, alkoholi od vunenog voska, lanolin, hidrofilna mast, polietilen glikoli),

• baze za supozitorije (na primer polietilen glikoli, kakao puter, tvrda mast),

• rastvarači (na primer voda, etanol, izo-propanol, glicerol, propilen glikol, trigliceridi srednje dužine lanca masna ulja, tečni polietilen glikoli, parafini),

• surfaktanti, emulgatori, disperzanti ili ovlaživači (na primer natrijum dodecil sulfat), lecitin, fosfolipidi, masni alkoholi (kao što je, na primer, Lanette®), estri sorbitan masnih kiselina (kao što je, na primer, Span®), polioksietilen sorbitan masni kiseli estri (kao što je, na primer, Tween®), gliceridi polioksietilena masnih kiselina (kao što je, na primer, Cremophor®), estri polioksetilena masnih kiselina, etri polioksietilen masnog alkohola, estri glicerola masnih kiselina, poloksameri (kao npr., Pluronic®),

• puferi, kiseline i baze (na primer fosfati, karbonati, limunska kiselina, sirćetna kiselina, hlorovodonična kiselina, rastvor natrijum hidroksida, amonijum karbonat, trometamol, trietanolamin),

• sredstva za izotoničnost (na primer glukoza, natrijum hlorid),

• adsorbenti (na primer visokodisperzni silicijum dioksid),

• sredstva za povećanje viskoziteta, sredstva za formiranje gela, zgušnjivači i/ili veziva (na primer polivinilpirolidon, metilceluloza, hidroksipropilmetilceluloza, hidroksipropilceluloza, karboksimetilceluloza-natrijum, skrob, karbomeri, poliakrilne kiseline, kao što je, na primer, Carbopol®); alginati, želatin),

• dezintegranti (na primer modifikovan skrob, karboksimetilceluloza-natrijum, natrijum skrob glikolat (kao što je, na primer, Explotab®), umreženi polivinilpirolidon, kroskarmeloza-natrijum (kao što je, na primer, AcDiSol®)),

• regulatori protoka, maziva, klizna sredstva i sredstva za otpuštanje kalupa (na primer magnezijum stearat, stearinska kiselina, talk, visokodisperzni silicijum dioksid (kao što je, na primer, Aerosil®)),

• materijali za oblaganje (na primer šećer, šelak) i sredstva za formiranje filmova za filmove ili difuzione membrane koji se brzo ili na modifikovan način rastvaraju (na primer polivinilpirolidoni (kao što je, na primer, Kollidon®), polivinil alkohol, hidroksipropilmetilceluloza, hidroksipropilceluloza, etil-propilceluloza, hidroksipropilceluloza, etil-propilceluloza, ftalat, acetat celuloze, ftalat acetat celuloze, poliakrilati, polimetakrilati kao što je, na primer, Eudragit®)),

• materijali za kapsule (na primer želatin, hidroksipropilmetilceluloza),

• sintetički polimeri (na primer polilaktidi, poliglikolidi, poliakrilati, polimetakrilati (kao što je, na primer, Eudragit®), polivinilpirolidoni (kao što je, na primer, Kollidon®), polivinil alkoholi, polivinil acetati, polietilen oksidi i njihovi kopolietilen oksidi, blok-kopolimeri),

• plastifikatori (na primer polietilen glikoli, propilen glikol, glicerol, triacetin, triacetil citrat, dibutil ftalat),

• pojačivači penetracije,

• stabilizatori (na primer antioksidansi kao što su, na primer, askorbinska kiselina, askorbil palmitat, natrijum askorbat, butilhidroksianizol, butilhidroksitoluen, propil galat),

• konzervansi (na primer parabeni, sorbinska kiselina, tiomersal, benzalkonijum hlorid, hlorheksidin acetat, natrijum benzoat),

• boje (na primer neorganski pigmenti kao što su, na primer, oksidi gvožđa, titanijum dioksid),

• arome, zaslađivači, sredstva za maskiranje ukusa i/ili mirisa.

[0173] Predmetni pronalazak se dalje odnosi na farmaceutski sastav koji sadrži najmanje jedno jedinjenje prema pronalasku, konvencionalno zajedno sa jednim ili više farmaceutski pogodnih ekscipijenasa, i na njihovu upotrebu u skladu sa predmetnim pronalaskom.

[0174] Zasnovano na standardnim laboratorijskim tehnikama za koje je poznato da procenjuju jedinjenja korisna za lečenje kardiovaskularnih i bubrežnih poremećaja, standardnim testovima toksičnosti i standardnim farmakološkim testovima za određivanje tretmana gore identifikovanih stanja kod sisara, i poređenjem ovih rezultata sa rezultatima od poznatih aktivnih sastojaka ili lekova koji se koriste za lečenje ovih stanja, efikasna doza jedinjenja iz ovog pronalaska može se lako odrediti za lečenje svake željene indikacije. Količina aktivnog sastojka koja se primenjuje u lečenju jednog od ovih stanja može da varira u velikoj meri u zavisnosti od razmatranja kao što su određeno jedinjenje i jedinica doze koja se koristi, način primene, period lečenja, starost i pol pacijenta. lečenog, kao i prirodu i obim lečenog stanja.

[0175] Ukupna količina aktivnog sastojka koji se primenjuje će se generalno kretati od oko 0,001 mg/kg do oko 200 mg/kg telesne mase dnevno, a poželjno od oko 0,01 mg/kg do oko 20 mg/kg telesne mase dnevno. Klinički korisni rasporedi doziranja će se kretati od doziranja jednom do tri puta dnevno do doziranja jednom u četiri nedelje. Pored toga, moguće je da „odmor za lekove”, u kojem se pacijentu ne dozira lek u određenom vremenskom periodu, bude od koristi za ukupnu ravnotežu između farmakološkog efekta i podnošljivosti. Moguće je da jedinična doza sadrži od oko 0,5 mg do oko 1500 mg aktivnog sastojka, i može se primenjivati jednom ili više puta dnevno ili manje od jednom dnevno. Prosečna dnevna doza za primenu injekcijom, uključujući intravenske, intramuskularne, subkutane i parenteralne injekcije, i upotrebu tehnika infuzije će poželjno biti od 0,01 do 200 mg/kg ukupne telesne mase. Ilustrativno, jedinjenje iz ovog pronalaska se može primeniti parenteralno u dozi od oko 0,001 mg/kg do oko 10 mg/kg, poželjno od oko 0,01 mg/kg do oko 1 mg/kg telesne mase. U oralnoj primeni, primerni opseg doze je oko 0,01 do 100 mg/kg, poželjno oko 0,01 do 20 mg/kg, a poželjnije oko 0,1 do 10 mg/kg telesne mase. Opsezi između iznad navedenih vrednosti takođe su predviđeni da budu deo pronalaska.

[0176] Naravno, specifični početni i kontinuirani režim doziranja za svakog pacijenta će varirati u zavisnosti od prirode i težine stanja koje odredi dijagnostičar koji prisustvuje, aktivnosti specifičnog jedinjenja koje se koristi, starosti i opšteg stanja pacijenta, vremena primene, način primene, brzina izlučivanja leka, kombinacije lekova i slično. Željeni način lečenja i broj doza jedinjenja iz predmetnog pronalaska ili njegove farmaceutski prihvatljive soli ili estra ili sastavi mogu da utvrde stručnjaci u ovoj oblasti koristeći konvencionalne testove tretmana.

[0177] Sledeći primeri otelotvorenja ilustruju pronalazak. Pronalazak nije ograničen na primere.

[0178] Procenti u sledećim testovima i primerima su, osim ako nije drugačije navedeno, maseni; delovi su po masi. Odnosi rastvarača, odnosi razblaženja i koncentracije za tečne/tečne rastvore su zasnovane na zapremini.

EKSPERIMENTALNI ODELJAK

EKSPERIMENTALNI ODELJAK - OPŠTI DEO

[0179] Oblici NMR pikova su navedeni onako kako se pojavljuju u spektrima, mogući efekti višeg reda nisu uzeti u obzir.

[0180] Hemijska imena su generisana korišćenjem softvera ACD/Name iz ACD/Labs. U nekim slučajevima korišćeni su opšteprihvaćeni nazivi komercijalno dostupnih reagenasa umesto imena generisanih ACD/Name.

[0181] Sledeća tabela 1 navodi skraćenice korišćene u ovom paragrafu i u odeljku Primeri ukoliko nisu objašnjene u tekstu. Druge skraćenice imaju svoja značenja koja su uobičajena sam po sebi za veštu osobu.

Tabela 1: Skraćenice

[0182] U sledećoj tabeli su navedene skraćenice korišćene ovde.

4

[0183] Različiti aspekti pronalaska opisani u ovoj prijavi su ilustrovani sledećim primerima koji nemaju za cilj da ograniče pronalazak ni na koji način.

[0184] Ovde opisani eksperimenti testiranja primera služe da ilustruju predmetni pronalazak i pronalazak nije ograničen na date primere.

[0185] Svi reagensi, za koje sinteza nije opisana u eksperimentalnom delu, su ili komercijalno dostupni, ili su poznata jedinjenja ili se mogu formirati od poznatih jedinjenja poznatim postupcima od strane stručnjaka.

[0186] Jedinjenja i intermedijeri proizvedeni prema postupcima pronalaska mogu zahtevati prečišćavanje. Prečišćavanje organskih jedinjenja je dobro poznato stručnjaku u ovoj oblasti i može postojati nekoliko načina prečišćavanja istog jedinjenja. U nekim slučajevima prečišćavanje možda neće biti potrebno. U nekim slučajevima, jedinjenja se mogu prečistiti kristalizacijom. U nekim slučajevima, nečistoće se mogu izmešati korišćenjem odgovarajućeg rastvarača. U nekim slučajevima, jedinjenja se mogu prečistiti hromatografijom, posebno fleš hromatografijom na koloni, koristeći na primer prethodno upakovane kertridže od silika gela, npr. Biotage SNAP kertridži KP-Sil® ili KP-NH® u kombinaciji sa Biotage sistemom za auto prečišćavanje (SP4® ili Isolera Four®) i eluensima kao što su gradijenti heksan/etil acetat ili DCM/metanol. U nekim slučajevima, jedinjenja se mogu prečistiti preparativnom HPLC korišćenjem, na primer, Vaters autoprečišćivača opremljenog detektorom diodnog niza i/ili on-lajn elektrosprej jonizacionim masenim spektrometrom u kombinaciji sa odgovarajućom prethodno upakovanom kolonom reverzne faze i eluentima kao što su gradijenti vode i acetonitril koji može da sadrži aditive kao što je trifluorosirćetna kiselina, mravlja kiselina ili vodeni rastvor amonijaka.

[0187] U nekim slučajevima, postupci prečišćavanja kao što su iznad opisane mogu da obezbede ona jedinjenja predmetnog pronalaska koja poseduju dovoljno bazičnu ili kiselu funkcionalnost u obliku soli, kao što je, u slučaju jedinjenja iz ovog pronalaska koje je dovoljno bazno, na primer, trifluoracetatnu ili formatnu so, ili, u slučaju jedinjenja iz ovog pronalaska koje je dovoljno kiselo, na primer so amonijuma. So ovog tipa može se ili transformisati u formu slobodne baze ili slobodne kiseline, respektivno, različitim postupcima poznatim stručnjacima, ili se koristiti kao soli u narednim biološkim testovima. Podrazumeva se da specifični oblik (npr. so, slobodna baza itd.) jedinjenja iz ovog pronalaska kao što je izolovano i kako je ovde opisano nije nužno jedini oblik u kome se navedeno jedinjenje može primeniti na biološki test kako bi se da se kvantifikuje specifična biološka aktivnost.

[0188] U slučaju međuproizvoda sinteze i radnih primera pronalaska opisanih u daljem tekstu, svako jedinjenje navedeno u obliku soli odgovarajuće baze ili kiseline je generalno so nepoznatog tačnog stehiometrijskog sastava, kao što je dobijeno odgovarajućim pripremanjem i/ili proces prečišćavanja. Osim ako nije detaljnije navedeno, dodaci nazivima i strukturnim formulama, kao što su „hidrohlorid“, „trifluoracetat“, „natrijumova so“, „kalijumova so“, „dikalijumova so“, „vodonik-fosfat“, „fosfat“ ili „x HCl", "x CF3COOH", "x Na<+>", "x K<+>", "x Ca<2+>", "x Mg<2+>" stoga ne treba shvatiti u stehiometrijskom smislu u slučaju takvih soli, već imaju samo opisni karakter u pogledu komponente koje stvaraju soli prisutne u njemu.

[0189] Ovo se shodno tome primenjuje ako su intermedijeri sinteze ili njihovi radni primeri ili soli dobijeni u obliku solvata, na primer hidrata, nepoznatog stehiometrijskog sastava (ako su definisanog tipa) opisanim procesima pripreme i/ili prečišćavanja.

HPLC i LC-MS postupci:

Postupak 1 (LC-MS)

[0190] Instrument: Waters ACQUITY SQD UPLC System; Kolona: Waters Acquity UPLC HSS T31,8 µ 50 × 1 mm; eluent A: 1 l vode 0,25 ml 99% mravlje kiseline, eluent B: 1 l acetonitrila 0,25 ml 99% mravlje kiseline; gradijent: 0,0 min 90% A → 1,2 min 5% A → 2,0 min 5% A; rerna: 50°C; protok: 0,40 ml/min; UV detekcija: 208-400 nm.

Postupak 2 (LC-MS):

[0191] Instrument MS: Thermo Scientific FT-MS; Tip instrumenta UHPLC+: Thermo Scientific UltiMate 3000; Kolona: Waters, HSST3, 2,1 × 75 mm, C181,8 µm; eluent A: 11 vode 0,01% mravlje kiseline; eluent B: 11 acetonitrila 0,01% mravlje kiseline; gradijent: 0,0 min 10% B → 2,5 min 95% B → 3,5 min 95% B; rerna: 50°C; protok: 0,90 ml/min; UV detekcija: 210 nm/ optimalni put integracije 210-300 nm.

Postupak 3 (LC-MS):

[0192] Instrument: Agilent MS Quad 6150; HPLC: Agilent 1290; Kolona: Waters Acquity UPLC HSS T31,8 µ 50 × 2,1 mm; eluent A: 1 l vode 0,25 ml 99% mravlje kiseline, eluent B: 1 l acetonitrila 0,25 ml 99% mravlje kiseline; gradijent: 0,0 min 90% A → 0,3 min 90% A → 1,7 min 5% A → 3,0 min 5% A; rerna: 50°C; protok: 1,20 ml/min; UV- detekcija: 205 -305 nm.

Postupak 4 (preparativna HPLC):

[0193] Kolona: Chromatorex ili Reprosil C1810 µm, 125 × 30 mm; eluent A: voda 0,1% mravlje kiseline, eluent B: acetonitril 0,1% mravlje kiseline; gradijent: 3 min 10% B, 17,5 min 95% B, 19,5 min 100% B, 20 min 10% B; protok: 75 ml/min; Vreme trajanja: 20 min; detekcija na 210 nm.

Postupak 5 (LC-MS):

[0194] Instrument: Waters Single Quad MS System; Instrument Waters UPLC Acquity; Kolona: Waters BEH C181,7 µm 50 × 2,1 mm; eluent A: 1 l vode 1,0 ml (vodeni rastvor amonijaka, 25%)/1, eluent B: 1 l acetonitrila; gradijent: 0,0 min 92% A → 0,1 min 92% A → 1,8 min 5% A → 3,5 min 5% A; rerna: 50°C; protok: 0,45 ml/min; UV-detekcija: 210 nm (208-400 nm).

Mikrotalasni

[0195] Korišćeni mikrotalasni reaktor je bio Initiator<+>mikrotalasni sistem sa robotom

4

šezdeset iz Biotage®.

Difraktometrija rendgenskim zračenjem

[0196] Transmisioni difraktometar PANalytical X'Pert PRO sa PIXcel brojačem

(višekanalni):

Termogravimetrija

[0197] TGA 7 Termogravimetrijski analizator; proizvođač: Perkin-Elmer; stope grejanja: 10 Kmin<-1>; gas za prečišćavanje: azot, 20-30 ml/min; lonac: otvoreni aluminijumski lonac; pripremanje uzorka: nema.

Infracrveni spektri

[0198] Bruker Tensor 37 spektrometar; spektralna rezolucija 2 cm<-1>; broj pojedinačnih merenja 64; opseg talasnog broja 4000-550 cm<-1>; pripremanje uzorka: nema.

EKSPERIMENTALNI ODELJAK - POČETNI MATERIJALI I MEĐUJEDINJENJA

Primer 1A

[0199] {3-(4-Hlorofenil)-5-okso-4-[(2S)-3,3,3-trifluoro-2-hidroksipropil]-4,5-dihidro-1H-1,2,4-triazol-1-il}acetonitril

[0200] U reakcionom sudu od 2 l, 100 g (273 mmol) {3-(4-hlorofenil)-5-okso-4-[(2S)-3,3,3-trifluoro-2-hidroksipropil]-4,5-dihidro-1H-1,2,4-triazol-1-il}sirćetne kiseline (sinteza opisana kao Primer 8A u WO 2010/105770-A1), 43,3 g (547 mmol) piridina i 33 mg (0,3 mmol) 4dimetilaminopiridina je rastvoreno u 300 ml THF. Dobijeni rastvor je tretiran na 5°C sa 52,8 g (438 mmol) 2,2-dimetilpropanoilhlorida tokom 15 minuta i dobijena smeša je mešana na sobnoj temperaturi 2,5 sata. Posle hlađenja na 0°C, 183 ml 28% vodenog rastvora amonijaka je dodato tokom 1 h dok je temperatura rastvora održavana između 10°C i 20°C i dobijena smeša je zatim mešana na 5°C tokom dodatnog vremenskog perioda od 1 h. Zatim je dodato 500 ml metil terc-butiletra i 300 ml 20% vodenog rastvora limunske kiseline uz održavanje unutrašnje temperature između 10°C i 20°C. Faze su razdvojene i organska faza je isprana sa 300 ml 20% vodenog rastvora limunske kiseline, zatim sa 300 ml zasićenog vodenog rastvora natrijum hidrogenkarbonata i na kraju sa 300 ml 10% vodenog rastvora natrijum hlorida. Organska faza je isparena na 60°C pod redukovanim pritiskom dok se ne dobije uljani ostatak. Zatim je dodato 300 ml THF i rastvor je ponovo isparen dok se ne dobije uljani rastvor. Ova operacija je ponovljena drugi put. Ostatak ulja je ponovo uzet u 360 ml THF i tretiran sa 172 g (820 mmol) anhidrida trifluorosirćetne kiseline tokom 20 minuta na temperaturi između 10°C i 20°C. Dobijeni rastvor je zatim mešan na sobnoj temperaturi 1 h. Dodato je 720 ml 4-metil-2-pentanona i 650 ml 7,5% vodenog rastvora natrijum hidroksida na temperaturi između 10°C i 20°C. Konačno, pH vrednost je podešena na pH = 9,5 korišćenjem 7,5% vodenog rastvora natrijum hidroksida. Posle razdvajanja faza, organska faza je dva puta isprana sa 450 ml 10% vodenog rastvora natrijum hlorida. Organska faza je uparena na temperaturi od 80°C pod redukovanim pritiskom dok je dodato 1200 ml nheptana. Formirana suspenzija je ohlađena na 20°C i formirana čvrsta supstanca je filtrirana i isprana sa 200 ml n-heptana i zatim osušena pod sniženim pritiskom (50°C, 30 mbar) dajući 88 g (93% prema teoriji) {3-(4-hlorofenil)-5-okso-4-[(2S)-3,3,3-trifluoro-2-hidroksipropil]-4,5-dihidro-1H-1,2,4-triazol-1-il}acetonitril kao čvrsta supstanca.

1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ [ppm] = 7,78 (d, 2H), 7,55 (d, 2H), 6,91 (d, 1H), 5,17 (s, 2 H), 4,34-4,23 (m, 1 H), 3,98 (dd, 1H), 3,81 (dd, 1H).

Primer 2A

Metil {3-(4-hlorofenil)-5-okso-4-[(2S)-3,3,3-trifluoro-2-hidroksipropil]-4,5-dihidro-1H-1,2,4-triazol-1-il}etanimidat

[0201]

4

[0202] U reakcionom sudu od 4 l, 200 g (576,9 mmol) {3-(4-hlorofenil)-5-okso-4-[(2S)-3,3,3-trifluoro-2-hidroksipropil]-4,5 -dihidro-1H-1,2,4-triazol-1-il}acetonitril (Primer 1A) u 1600 ml metanola je tretiran sa 5,2 g (28 mmol) natrijum metanolata (30% u metanolu) i dobijena smeša je mešana na 50°C tokom 2,5 sata. Rastvor je zatim uparen na 50°C pod redukovanim pritiskom dok se ne dobije uljani rastvor. Dodato je 2000 ml metil tercbutiletera i rastvor je koncentrovan dok se ne postigne zapremina od 800 ml. Zatim je dodato 3000 ml n-heptana i formirana je suspenzija. Posle hlađenja na 20°C, čvrsta supstanca je filtrirana i isprana sa 500 ml n-heptana, a zatim osušena pod redukovanim pritiskom (50°C, 30 mbar) dajući 175 g (80% p.t.) metil 2-{3-(4-hlorofenil)-5-okso-4-[(2S)-3,3,3-trifluoro-2-hidroksipropil]-4,5-dihidro-1H-1,2,4-triazol-1-il}etanimidat kao čvrsta supstanca.

1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ [ppm] = 8,01 (s, 1H), 7,78 (d, 2H), 7,62 (d, 2H), 6,93 (br. s, 1H), 4,50 (s, 2 H), 4,35-4,23 (m, 1 H), 3,96 (dd, 1H), 3,81 (dd, 1H), 3,67 (s, 3 H)..

Primer 3A

Metil 3-({3-(4-hlorofenil)-5-okso-4-[(2S)-3,3,3-trifluoro-2-hidroksipropil] -4,5-dihidro-1H-1,2,4-triazol-1-il}metil)-1-[3-(trifluorometil)piridin-2-il]-1H-1,2,4-triazol-5-karboksilat

[0203]

[0204] Rastvor 1,0 g metil 2-{3-(4-hlorofenil)-5-okso-4-[(2S)-3,3,3-trifluoro-2-hidroksipropil]-4,5-dihidro-1H- 1,2,4-triazol-1-il}etanimidata (Primer 2A, 2,64 mmol) u 20 ml 1,4-dioksana je ohlađen na 10°C i zatim tretiran sa 388 mg (3,17 mmol) metil

4

hlorooksoacetata i 0,55 ml (3,18 mmol) N,N-diizopropiletilamina. Dobijena smeša je zatim mešana 30 min. Prethodno mešani rastvor 1,10 g (3,17 mmol) 2-hidrazino-3-(trifluorometil)piridin 4-metilbenzensulfonatne soli (1:1), 0,65 ml (3,72 mmol) N,N-diizopropiletilamina i 506 mg (3,19 mmol) vodenog bakar (II) sulfata u 10 ml 1,4-dioksana je dodat u reakcionu smešu i dobijena smeša je zatim mešana preko noći na sobnoj temperaturi. Zatim je dodata voda i vodena faza je ekstrahovana etil acetatom, kombinovane organske faze su isprane vodenim rastvorom natrijum hlorida, osušene iznad magnezijum sulfata i isparene in vacuo dajući 777 mg (50% p.t..) jedinjenja iz naslova kao čvrstu supstancu.

LC-MS (Postupak 1): Rt= 1,00 min; MS (ESIpos): m/z = 592,6 [M+H]+

<1>H-NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ [ppm] = 8,93 (d, 1H), 8,60 (dd, 1H), 7,98 (dd, 1H), 7,75 (d, 2H), 7,67-7,57 (m, 2H), 6,91 (d, 1H), 5,22 (s, 2H), 4,37-4,22 (m, 1H), 4,10-3,97 (m, 1H), 3,85 (dd, 1H), 3,77 (s, 3H).

Primer 4A

3-({3-(4-Hlorofenil)-5-okso-4-[(2S)-3,3,3-trifluoro-2-hidroksipropil]-4,5-dihidro-1H-1,2,4-triazol-1-il}metil)-1-[3-(trifluorometil)piridin-2-il]-1H-1,2,4-triazol-5-karboksamid [0205]

[0206] 1,80 g Metil 3-({3-(4-hlorofenil)-5-okso-4-[(2S)-3,3,3-trifluoro-2-hidroksipropil]-4,5-dihidro-1H-1,2,4-triazol-1-il}metil)-1-[3-(trifluorometil)piridin-2-il]-1H-1,2,4-triazol-5-karboksilata (Primer 3A, 3,04 mmol) je rastvoren u 10,0 ml rastvora amonijaka (7N u metanolu, 70,0 mmol). Dobijena smeša je mešana 1 h na sobnoj temperaturi. Rastvarač je uklonjen in vacuo i sirovi proizvod je prečišćen preparativnom HPLC (Postupak 4).

Liofilizacija frakcija koje sadrže proizvod dala je 1,49 g (85% p.t.) jedinjenja iz naslova kao čvrstu supstancu.

LC-MS (Postupak 3): Rt= 1,20 min; MS (ESIpos): m/z = 577 [M+H]+

<1>H-NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ [ppm] = 8,87 (d, 1H), 8,51 (d, 1H), 8,39 (s, 1H), 7,99 (s, 1H), 7,90 (dd, 1H), 7,82-7,68 (m, 2H), 7,63 (d, 2H), 6,90 (s, 1H), 5,22-5,07 (m, 2H), 4,29 (br s, 1H), 4,16-3,94 (m, 1H), 3,85 (dd, 1H).

4

Primer 5A

Metil 3-({3-(4-hlorofenil)-5-okso-4-[(2S)-3,3,3-trifluoro-2-hidroksipropil]-4,5-dihidro-1H-1,2,4-triazol-1-il}metil)-1-[2-(trifluorometil)fenil]-1H-1,2,4-triazol-5-karboksilat [0207]

[0208] Pod argonom, rastvor od 150 mg (0,40 mmol) metil-2-{3-(4-hlorofenil)-5-okso-4-[(2S)-3,3,3-trifluoro-2-hidroksipropil]-4,5-dihidro-1H-1,2,4-triazol-1-il}etanimidata (Primer 2A) u 3 ml bezvodnog THF je tretiran na 0°C sa 75 µl (0,44 mmol) N,N-diizopropiletilamina i 40 µl (0,44 mmol) metil hlorooksoacetata i smeša je zatim mešana na 0°C tokom 30 minuta. Zatim je dodato 93 mg (0,44 mmol) [2-(trifluorometil)fenil]hidrazina, a zatim 145 µl (0,83 mmol) N,N-diizopropiletilamina. Dobijena smeša je mešana 2 h na sobnoj temperaturi, a zatim 1 h na 120°C u mikrotalasnoj pećnici i zatim isparena. Dobijeni ostatak je prečišćen preparativnom HPLC (Postupak 4) dajući 75 mg (32% p.t.) jedinjenja iz naslova.

LC-MS (Postupak 2): Rt= 2,01 min; MS (ESIpos): m/z = 591,1 [M+H]+

<1>H-NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ [ppm] = 8,07-7,56 (m, 8H), 6,91 (d, 1H), 5,17 (d, 2H), 4,37-4,21 (m, 1H), 4,09-3,80 (m, 2H), 3,74 (s, 3H).

Primer 6A

3-({3-(4-Hlorofenil)-5-okso-4-[(2S)-3,3,3-trifluoro-2-hidroksipropil]-4,5-dihidro-1H-1,2,4-triazol-1-il}metil)-1-[2-(trifluorometil)fenil]-1H-1,2,4-triazol-5-karboksamid [0209]

4

[0210] Smeša od 55 mg (0,093 mmol) metil 3-({3-(4-hlorofenil)-5-okso-4-[(2S)-3,3,3-trifluoro-2-hidroksipropil]-4,5-dihidro-1H-1,2,4-triazol-1-il}metil)-1-[2-(trifluorometil)fenil]-1H-1,2,4-triazol-5-karboksilata (Primer 5A) u rastvoru amonijaka (7N u metanolu, 0,8 ml, 5,6 mmol) je mešana preko noći na sobnoj temperaturi i smeša je zatim isparena. Dobijeni ostatak je prečišćen preparativnom HPLC (Postupak 4) dajući 55 mg (kvant.) jedinjenja iz naslova.

LC-MS (Postupak 2): Rt= 1,77 min; MS (ESIpos): m/z = 576,1 [M+H]+

<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ [ppm] = 8,23 (s, 1H), 8,00-7,55 (m, 9H), 6,90 (d, 1H), 5,22-5,01 (m, 2H), 4,40-4,18 (m, 1H), 4,10-3,76 (m, 2H).

Primer 7A

Metil 3-({3-(4-hlorofenil)-5-okso-4-[(2S)-3,3,3-trifluoro-2-hidroksipropil]-4,5-dihidro-1H-1,2,4-triazol-1-il}metil)-1-(3-hloropiridin-2-il)-1H-1,2,4-triazol-5-karboksilat [0211]

[0212] Rastvor 150 mg metil -2-{3-(4-hlorofenil)-5-okso-4-[(2S)-3,3,3-trifluoro-2-hidroksipropil]-4,5-dihidro-1H- 1,2,4-triazol-1-il}etanimidata (Primer 2A, 26,4 mmol) u 3 ml THF je ohlađen na 0°C i zatim tretiran sa 58,2 mg (0,48 mmol) metil hlorooksoacetata i 275 µl (1,58 mmol) N,N-diizopropiletilamina. Dobijena smeša je zagrejana do sobne temperature i mešana 1 h i ponovo ohlađena na 0°C. Zatim je dodato 62,6 mg (0,436 mmol) 3-hloro-2-hidrazinopiridina i reakciona smeša je zagrejana do sobne temperature i zatim mešana 1 h, a zatim 1 h na 120°C u zatvorenoj bočici pod mikrotalasnim zračenjem. Sirovi proizvod je prečišćen preparativnom HPLC (Postupak 4). Liofilizacija frakcija koje sadrže proizvod dala je 25,3 mg (11% p.t.) jedinjenja iz naslova.

LC-MS (Postupak 2): Rt= 1,82 min; MS (ESIpos): m/z = 558,1[M+H]+

<1>H-NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ [ppm] = 8,70-8,24 (m, 2H), 7,89-7,56 (m, 5H), 6,92 (d, 1H), 5,22 (s, 2H), 4,46-4,20 (m, 1H), 3,79 (s, 5H).

4

Primer 8A

3-({3-(4-Hlorofenil)-5-okso-4-[(2S)-3,3,3-trifluoro-2-hidroksipropil]-4,5-dihidro-1H-1,2,4-triazol-1-il}metil)-1-(3-hloropiridin-2-il)-1H-1,2,4-triazol-5-karboksamid [0213]

[0214] 5,1 g Metil 3-({3-(4-hlorofenil)-5-okso-4-[(2S)-3,3,3-trifluoro-2-hidroksipropil]-4,5-dihidro-1H-1,2,4-triazol-1-il}metil)-1-(3-hloropiridn-2-il)-1H-1,2,4-triazol-5-karboksilata (Primer 7A, 9,134 mmol) je rastvoren u 42,5 ml rastvora amonijaka (7N u metanolu, 297 mmol). Dobijena smeša je mešana 2 h na sobnoj temperaturi. Rastvor je zatim izliven na led i smeša je mešana 10 min. Talog je filtriran i ispran vodom, što je dalo 3,5 g sirovog proizvoda. Vodena faza je ekstrahovana etil acetatom. Organska faza je osušena preko magnezijum sulfata, filtrirana i rastvarač je uklonjen u vakuumu. Sirovi proizvod je prečišćen fleš hromatografijom (silika gel, dihlorometan/metanol, 97/3), dajući 4,00 g (81% p.t.) jedinjenja iz naslova kao čvrstu supstancu.

LC-MS (Postupak 2): Rt= 1,62 min; MS (ESIpos): m/z = 543,1 [M+H]+

<1>H-NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ [ppm] = 8,55 (dd, 1H), 8,39 (s, 1H), 8,25 (dd, 1H), 8,00 (s, 1H), 7,76 (d, 2H), 7,69 (dd, 1H), 7,62 (d, 2H), 6,90 (d, 1H), 5,18 (d, 2H), 4,36-4,23 (m, 1H), 4,06-3,97 (m, 1H), 3,85 (dd, 1H).

EKSPERIMENTALNI ODELJAK - PRIMERI

Primer 1

[0215] (2S)-3-[1-({5-Karbamoil-1-[3-(trifluorometil)piridin-2-il]-1H-1,2,4-triazol-3-il}metil)-3-(4-hlorofenil)-5-okso-1,5-dihidro-4H-1,2,4-triazol-4-il]-1,1,1-trifluoropropan-2-il dihidrogen fosfat

[0216] Na 0°C, rastvor 3-({3-(4-hlorofenil)-5-okso-4-[(2S)-3,3,3-trifluoro-2-hidroksipropil]-4,5-dihidro- 1H-1,2,4-triazol-1-il}metil)-1-[3-(trifluorometil)piridin-2-il]-1H-1,2,4-triazol-5-karboksamid (Primer 4A, 2,00 g, 3,47 mmol) u tetrahidrofuranu (40 ml, 490 mmol) je tretirano sa 4-N,N-dimetilaminopiridinom (635 mg, 5,20 mmol) i trietilaminom (720 µl, 5,2 mmol). Zatim je u kapima dodat fosfor oksihlorid (480 µl, 5,2 mmol). Dobijena smeša je mešana 40 min na 0°C, a zatim 50 min na sobnoj temperaturi. Zatim su dodata voda (4,0 ml) i zasićeni vodeni rastvor natrijum hidrogen karbonata (24 ml) i dobijena smeša je mešana preko noći na sobnoj temperaturi. Tetrahidrofuran je zatim isparen na sobnoj temperaturi. Dobijeni rastvor je razblažen vodom i ekstrahovan etil acetatom. Vodena faza je dovedena do pH = 1 rastvorom hlorovodonične kiseline (1N), razblažena zasićenim vodenim rastvorom natrijum hlorida i ekstrahovana etil acetatom. Kombinovani organski slojevi su isprani zasićenim vodenim rastvorom natrijum hlorida, osušeni preko magnezijum sulfata i ispareni. Ostatak je prečišćen preparativnom HPLC (Postupak 4) dajući 1,32 g (58% p.t.) jedinjenja iz naslova.

LC-MS (Postupak 3): Rt= 0,94 min; MS (ESIpos): m/z = 657,0 [M+H]+

<1>H-NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ [ppm] = 8,86 (d, 1H), 8,58-8,29 (m, 2H), 8,07-7,82 (m, 2H), 7,79-7,45 (m, 4H), 5,33-5,00 (m, 2H), 4,95 - 4,77 (br m, 1H), 4,29-3,89 (m, 2H), 3,36 (br s, 2H, preklapajući se sa HDO maksimumom).

Primer 1-1

(2S)-3-[1-({5-Karbamoil-1-[3-(trifluorometil)piridin-2-il]-1H-1,2,4-triazol-3-il}metil)-3-(4-hlorofenil)-5-okso-1,5-dihidro-4H-1,2,4-triazol-4-il]-1,1,1-trifluoropropan-2-il dihidrogen fosfat hemihidrat

[0217]

[0218] Suspenzija (2S)-3-[1-({5-karbamoil-1-[3-(trifluorometil)piridin-2-il]-1H-1,2,4-triazol-3-il}metil)-3-(4-hlorofenil)-5-okso-1,5-dihidro-4H-1,2,4-triazol-4-il]-1,1,1 trifluoropropan-2-

1

il dihidrogen fosfat (4,46 g, 6,79 mmol ) u 446 ml toluena je mešano na 25°C tokom sedam dana. Čvrsta supstanca je filtrirana i filtrat je isparen. Čvrsta supstanca i ostatak dobijen iz filtrata su pomešani zajedno i suspendovani u smeši dihlorometana/n-heptana (200 ml, 55:45). Dobijena smeša je mešana na 40 °C tokom osam dana. Čvrsti materijal je odfiltriran i ispitan difraktometrijom X-zraka i odgovara naslovnom jedinjenju kao kristalni materijal (forma hemihidrata).

Tabela 2: Rendgenska difraktometrija praha jedinjenja dobijenog kao kristalni materijal u primeru 1-1

Tabela 3: Infracrveni spektar jedinjenja dobijenog kao kristalni materijal u primeru 1-1

2

[0219] Opsezi označene sa<∗>su specifični za slobodnu kiselinu.

Primer 2

[0220] Kalijum (2S)-3-[1-({5-karbamoil-1-[3-(trifluorometil)piridin-2-il]-1H-1,2,4-triazol-3-il}metil)-3-(4-hlorofenil)-5-okso-1,5-dihidro-4H-1,2,4-triazol-4-il]-1,1,1-trifluoropropan-2-il hidrogen fosfat

[0221] Rastvor (2S)-3-[1-({5-karbamoil-1-[3-(trifluorometil)piridin-2-il]-1H-1,2,4-triazol-3-il}metil)-3-(4-hlorofenil)-5-okso-1,5-dihidro-4H-1,2,4-triazol-4-il]-1,1,1 trifluoropropan-2-il dihidrogen fosfat (Primer 1, 104 mg , 158 umol) u vodi (3,0 ml) je tretirano sa kalijum hidrogen karbonatom (31,6 mg, 316 umol), zatim mešano 15 min na sobnoj temperaturi i liofilizovano dajući 124 mg (kvant.) jedinjenja iz naslova.

LC-MS (Postupak 1): Rt= 0,67 min; MS (ESIpos): m/z = 657,0 [M+H]+

<1>H-NMR (500 MHz, D2O): δ [ppm] = 8,87-8,80 (m, 1H), 8,52 (d, 1H), 7,95 (dd, 1H), 7,72-7,57 (m, 4H), 5,45-5,36 (m, 1H), 5,35-5,26 (m, 1H), 4,99-4,55 (m, 1H, preklapajući se sa HDO maksimumom), 4,20-4,07 (m, 2H).

Primer 3

Kalijum (2S)-3-[1-({5-karbamoil-1-[3-(trifluorometil)piridin-2-il]-1H-1,2,4-triazol-3-il}metil)-3-(4-hlorofenil)-5-okso-1,5-dihidro-4H-1,2,4-triazol-4-il]-1,1,1-trifluoropropan-2-il hidrogen fosfat

[0222]

[0223] Rastvor (2S)-3-[1-({5-karbamoil-1-[3-(trifluorometil)piridin-2-il]-1H-1,2,4-triazol-3-il}metil)- 3-(4-hlorofenil)-5-okso-1,5-dihidro-4H-1,2,4-triazol-4-il]-1,1,1 trifluoropropan-2-il dihidrogen fosfat (Primer 1, 35,0 mg , 53,3 umol) u vodi (1,0 ml) je tretirano sa kalijum hidrogen karbonatom (5,33 mg, 53,3 umol), zatim mešano 15 minuta na sobnoj temperaturi i

4

liofilizovano dajući 39,5 mg (kvant.) jedinjenja iz naslova.

LC-MS (Postupak 1): Rt= 0,67 min; MS (ESIpos): m/z = 657,0 [M+H]+

<1>H-NMR (500 MHz, D2O): δ [ppm] = 8,87-8,80 (m, 1H), 8,54-8,48 (m, 1H), 7,97-7,91 (m, 1H), 7,71-7,57 (m, 4H), 5,43-5,37 (m, 1H), 5,35-5,28 (m, 1H), 4,90-4,64 (m, 1H, preklapajući se sa HDO maksimumom), 4,23-4,10 (m, 2H).

Primer 4

Natrijum (2S)-3-[1-({5-karbamoil-1-[3-(trifluorometil)piridin-2-il]-1H-1,2,4-triazol-3-il}metil)-3-(4-hlorofenil)-5-okso-1,5-dihidro-4H-1,2,4-triazol-4-il]-1,1,1-trifluoropropan-2-il hidrogen fosfat

[0224]

[0225] 53,3 µmol rastvora (2S)-3-[1-({5-karbamoil-1-[3-(trifluorometil)piridin-2-il]-1H-1,2,4-triazol-3-il}metil)-3-(4-hlorofenil)-5-okso-1,5-dihidro-4H-1,2,4-triazol-4-il]-1,1,1 trifluoropropan-2-il dihidrogen fosfata (Primer 1, 35,0 mg, µmol) u vodi (1,0 ml) je tretirano sa dinatrijum karbonatom (5,65 mg, 53,3 µmol), zatim mešano 15 min na sobnoj temperaturi i liofilizovano dajući 41,2 mg (kvant.) jedinjenja iz naslova.

LC-MS (Postupak 1): Rt= 0,68 min; MS (ESIpos): m/z = 657,0 [M+H]+

<1>H-NMR (500 MHz, D2O): δ [ppm] = 8,86-8,82 (m, 1H), 8,54-8,49 (m, 1H), 7,98-7,92 (m, 1H), 7,72-7,58 (m, 4H), 5,43-5,37 (m, 1H), 5,34-5,28 (m, 1H), 4,88-4,65 (m, 1H, preklapajući se sa HDO maksimumom), 4,20-4,06 (m, 2H).

Primer 5

Natrijum (2S)-3-[1-({5-karbamoil-1-[3-(trifluorometil)piridin-2-il]-1H-1,2,4-triazol-3-il}metil)-3-(4-hlorofenil)-5-okso-1,5-dihidro-4H-1,2,4-triazol-4-il]-1,1,1-trifluoropropan-2-il hidrogen fosfat

[0226]

[0227] Rastvor (2S)-3-[1-({5-karbamoil-1-[3-(trifluorometil)piridin-2-il]-1H-1,2,4-triazol-3-il}metil)- 3-(4-hlorofenil)-5-okso-1,5-dihidro-4H-1,2,4-triazol-4-il]-1,1,1 trifluoropropan-2-il dihidrogen fosfat (Primer 1, 35,0 mg , 53,3 µmol) u vodi (1,0 ml) je tretirano sa natrijum hidrogen karbonatom (4,48 mg, 53,3 umol), zatim mešano 15 minuta na sobnoj temperaturi i liofilizovano dajući 38,6 mg (kvant.) jedinjenja iz naslova.

LC-MS (Postupak 1): Rt= 0,68 min; MS (ESIpos): m/z = 657 [M+H]+

<1>H-NMR (500 MHz, D2O): δ [ppm] = 8,86-8,81 (m, 1H), 8,53-8,48 (m, 1H), 7,97-7,92 (m, 1H), 7,71-7,58 (m, 4H), 5,42-5,36 (m, 1H), 5,34-5,27 (m, 1H), 4,68 (s, 1H, preklapajući se sa HDO maksimumom), 4,22-4,10 (m, 2H).

Primer 6

Litijum (2S)-3-[1-({5-karbamoil-1-[3-(trifluorometil)piridin-2-il]-1H-1,2,4-triazol-3-il}metil)-3-(4-hlorofenil)-5-okso-1,5-dihidro-4H-1,2,4-triazol-4-il]-1,1,1-trifluoropropan-2-il hidrogen fosfat

[0228]

[0229] Rastvor (2S)-3-[1-({5-karbamoil-1-[3-(trifluorometil)piridin-2-il]-1H-1,2,4-triazol-3-il}metil)- 3-(4-hlorofenil)-5-okso-1,5-dihidro-4H-1,2,4-triazol-4-il]-1,1,1 trifluoropropan-2-il dihidrogen fosfat (Primer 1, 35,0 mg , 53,3 µmol) u vodi (1,0 ml) je tretirano sa litijum hidroksid hidratom (1:1) (4,47 mg, 107 µmol), zatim mešano 15 minuta na sobnoj temperaturi i liofilizovano dajući 38,7 mg (kvant.) jedinjenja iz naslova.

LC-MS (Postupak 1): Rt= 0,67 min; MS (ESIpos): m/z = 657,0 [M+H]+

<1>H-NMR (500 MHz, D2O): δ [ppm] = 8,86-8,82 (m, 1H), 8,54-8,49 (m, 1H), 7,98-7,91 (m, 1H), 7,72-7,58 (m, 4H), 5,43-5,37 (m, 1H), 5,34-5,28 (m, 1H), 4,90-4,68 (m, 1H, preklapajući se sa HDO maksimumom), 4,21-4,06 (m, 2H).

Primer 7

Litijum (2S)-3-[1-({5-karbamoil-1-[3-(trifluorometil)piridin-2-il]-1H-1,2,4-triazol-3-il}metil)-3-(4-hlorofenil)-5-okso-1,5-dihidro-4H-1,2,4-triazol-4-il]-1,1,1-trifluoropropan-2-il hidrogen fosfat

[0230]

[0231] Rastvor (2S)-3-[1-({5-karbamoil-1-[3-(trifluorometil)piridin-2-il]-1H-1,2,4-triazol-3-il}metil)- 3-(4-hlorofenil)-5-okso-1,5-dihidro-4H-1,2,4-triazol-4-il]-1,1,1 trifluoropropan-2-il dihidrogen fosfat (Primer 1, 35,0 mg , 53,3 µmol) u vodi (1,0 ml) je tretirano sa litijum hidroksid hidratom (1:1) (2,24 mg, 53,3 µmol), zatim mešano 15 minuta na sobnoj temperaturi i liofilizovano dajući 38,3 mg (kvant.) jedinjenja iz naslova.

LC-MS (Postupak 1): Rt= 0,67 min; MS (ESIpos): m/z = 657,0 [M+H]+

<1>H-NMR (500 MHz, D2O): δ [ppm] = 8,83 (d, 1H), 8,51 (d, 1H), 7,94 (dd, 1H), 7,71-7,58 (m, 4H), 5,42-5,37 (m, 1H), 5,34-5,28 (m, 1H), 4,89-4,65 (m, 1H, preklapajući se sa HDO maksimumom), 4,22-4,10 (m, 2H).

Primer 8

Kalcijum (2S)-3-[1-({5-karbamoil-1-[3-(trifluorometil)piridin-2-il]-1H-1,2,4-triazol-3-il}metil)-3-(4-hlorofenil)-5-okso-1,5-dihidro-4H-1,2,4-triazol-4-il]-1,1,1-trifluoropropan-2-il fosfat

[0232]

[0233] 53,3 µmol rastvora (2S)-3-[1-({5-karbamoil-1-[3-(trifluorometil)piridin-2-il]-1H-1,2,4-triazol-3-il}metil)-3-(4-hlorofenil)-5-okso-1,5-dihidro-4H-1,2,4-triazol-4-il]-1,1,1 trifluoropropan-2-il dihidrogen fosfata (Primer 1, 152 mg, µmol) u vodi (1 l) je tretirano sa kalcijum karbonatom (15,2 mg, 152 µmol), zatim mešano 15 min na sobnoj temperaturi i liofilizovano dajući 93,9 mg (kvant.) jedinjenja iz naslova.

LC-MS (Postupak 1): Rt= 0,69 min; MS (ESIpos): m/z = 657,1 [M+H]+

<1>H-NMR (500 MHz, D2O): δ [ppm] = 8,86-8,82 (m, 1H), 8,54-8,49 (m, 1H), 7,98-7,92 (m, 1H), 7,72-7,57 (m, 4H), 5,45-5,37 (m, 1H), 5,35-5,28 (m, 1H), 4,91-4,66 (m, 1H, preklapajući se sa HDO maksimumom), 4,21-4,09 (m, 2H).

Primer 9

Magnezijum (2S)-3-[1-({5-karbamoil-1-[3-(trifluorometil)piridin-2-il]-1H-1,2,4-triazol-3-il}metil)-3-(4-hlorofenil)-5-okso-1,5-dihidro-4H-1,2,4-triazol-4-il]-1,1,1-trifluoropropan-2-il fosfat

[0234]

[0235] Rastvor (2S)-3-[1-({5-karbamoil-1-[3-(trifluorometil)piridin-2-il]-1H-1,2,4-triazol-3-il}metil)-3-(4-hlorofenil)-5-okso-1,5-dihidro-4H-1,2,4-triazol-4-il]-1,1,1 trifluoropropan-2-il dihidrogen fosfat (Primer 1, 35,0 mg, 53,3 µmol) u vodi (1,0 ml) je tretirano sa magnezijum karbonatom (4,49 mg, 53,3 µmol), zatim mešano 15 min na sobnoj temperaturi i liofilizovano dajući 40,1 mg (kvant.) jedinjenja iz naslova.

LC-MS (Postupak 1): Rt= 0,68 min; MS (ESIpos): m/z = 657,0 [M+H]+

<1>H-NMR (500 MHz, D2O): δ [ppm] = 8,87-8,81 (m, 1H), 8,54-8,48 (m, 1H), 7,98-7,91 (m, 1H), 7,73-7,58 (m, 4H), 5,43-5,37 (m, 1H), 5,35-5,27 (m, 1H), 4,92-4,60 (m, 1H, preklapajući se sa HDO maksimumom), 4,20-4,06 (m, 2H).

Primer 10

(2S)-3-[1-({5-Karbamoil-1-[2-(trifluorometil)piridin-2-il]-1H-1,2,4-triazol-3-il}metil)-3-(4-hlorofenil)-5-okso-1,5-dihidro-4H-1,2,4-triazol-4-il]-1,1,1-trifluoropropan-2-il dihidrogen fosfat

[0236]

[0237] Na 0°C, rastvor 3-({3-(4-hlorofenil)-5-okso-4-[(2S)-3,3,3-trifluoro-2-hidroksipropil]-4,5-dihidro- 1H-1,2,4-triazol-1-il}metil)-1-[2-(trifluorometil)fenil]-1H-1,2,4-triazol-5-karboksamida (Primer 6A, 1000 mg, 1,74 mmol ) u tetrahidrofuranu (20 ml, 250 mmol) je tretiran sa 4-N,N-dimetilaminopiridinom (318 mg, 2,60 mmol) i trietilaminom (360 µl, 2,6 mmol). U kapima je dodat fosfor oksihlorid (240 µl, 2,6 mmol). Dobijena smeša je mešana 40 min na 0°C, a zatim 50 min na sobnoj temperaturi. Zatim su dodata voda (2,0 ml) i zasićeni vodeni rastvor natrijum hidrogen karbonata (12 ml) i dobijena smeša je mešana preko noći na sobnoj temperaturi. Tetrahidrofuran je zatim isparen na sobnoj temperaturi. Dobijeni rastvor je razblažen vodom i ekstrahovan etil acetatom. Vodena faza je dovedena do pH = 1 rastvorom hlorovodonične kiseline (1N), razblažena zasićenim vodenim rastvorom natrijum hlorida i ekstrahovana etil acetatom. Kombinovani organski slojevi su isprani zasićenim rastvorom natrijum hlorida, osušeni preko magnezijum sulfata i ispareni. Ostatak je prečišćen preparativnom HPLC (Postupak 4) dajući 876 mg (77% p.t.) jedinjenja iz naslova.

LC-MS (Postupak 1): Rt= 0,74 min; MS (ESIpos): m/z = 656,0 [M+H]+

<1>H-NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ [ppm] = 8,30 (br s, 1H), 7,96-7,50 (m, 8H), 5,25-4,96 (m, 2H), 4,97 - 4,74 (br m, 1H), 4,26-3,91 (m, 2H), 3,57 (br s, 2H, preklapajući se sa HDO maksimumom).

Primer 11

Kalijum (2S)-3-[1-({5-karbamoil-1-[2-(trifluorometil)fenil]-1H-1,2,4-triazol-3-il}metil)-3-(4-hlorofenil)-5-okso-1,5-dihidro-4H-1,2,4-triazol-4-il] -1,1,1-trifluoropropan-2-il vodonik fosfat

[0238]

[0239] Rastvor (2S)-3-[1-({5-karbamoil-1-[2-(trifluorometil)fenil]-1H-1,2,4-triazol-3-il}metil)-3-(4 -hlorofenil)-5-okso-1,5-dihidro-4H-1,2,4-triazol-4-il]-1,1,1-trifluoropropan-2-il dihidrogen fosfata (Primer 10, 35,0 mg, 53,4 µmol) u vodi (1,0 ml) je tretiran sa kalijum hidrogen karbonatom (10,7 mg, 107 µmol), zatim mešan 15 minuta na sobnoj temperaturi i liofilizovan dajući 40,4 mg (kvant.) jedinjenja iz naslova.

LC-MS (Postupak 1): Rt= 0,73 min; MS (ESIpos): m/z = 656,0 [M+H]+

<1>H-NMR (500 MHz, D2O): δ [ppm] = 7,97-7,93 (m, 1H), 7,87-7,79 (m, 2H), 7,73-7,59 (m, 5H), 5,38-5,33 (m, 1H), 5,30-5,24 (m, 1H), 4,88-4,66 (m, 1H, preklapajući se sa HDO maksimumom), 4,20-4,06 (m, 2H).

Primer 12

Kalijum (2S)-3-[1-({5-karbamoil-1-[2-(trifluorometil)fenil]-1H-1,2,4-triazol-3-il}metil)-3-(4-hlorofenil)-5-okso-1,5-dihidro-4H-1,2,4-triazol-4-il] -1,1,1-trifluoropropan-2-il vodonik fosfat

[0240]

[0241] Rastvor (2S)-3-[1-({5-karbamoil-1-[2-(trifluorometil)fenil]-1H-1,2,4-triazol-3-il}metil)-3-(4 -hlorofenil)-5-okso-1,5-dihidro-4H-1,2,4-triazol-4-il]-1,1,1-trifluoropropan-2-il dihidrogen fosfata (Primer 10, 35,0 mg, 53,4 µmol) u vodi (1,0 ml) je tretiran sa kalijum hidrogen karbonatom (5,34 mg, 53,4 µmol), zatim mešan 15 minuta na sobnoj temperaturi i liofilizovan dajući 36,3 mg (kvant.) jedinjenja iz naslova.

LC-MS (Postupak 1): Rt= 0,73 min; MS (ESIpos): m/z = 656,0 [M+H]+

<1>H-NMR (500 MHz, D2O): δ [ppm] = 7,97-7,93 (m, 1H), 7,88-7,79 (m, 2H), 7,71-7,58 (m, 5H), 5,39-5,24 (m, 2H), 4,90-4,67 (m, 1H, preklapati sa HDO vrhom), 4,19-4,09 (m, 2H). Primer 13

Natrijum (2S)-3-[1-({5-karbamoil-1-[2-(trifluorometil)fenil]-1H-1,2,4-triazol-3-il}metil)-3-(4-hlorofenil)-5-okso-1,5-dihidro-4H-1,2,4-triazol-4-iyl] -1,1,1-trifluoropropan-2-il vodonik fosfat

[0242]

[0243] Rastvor (2S)-3-[1-({5-karbamoil-1-[2-(trifluorometil)fenil]-1H-1,2,4-triazol-3-il}metil)-3-(4-hlorofenil)-5-okso-1,5-dihidro-4H-1,2,4-triazol-4-il]-1,1,1-trifluoropropan-2-il dihidrogen fosfat (Primer 10, 35,0 mg, 53,4 µmol) u vodi (1,0 ml) je tretiran sa dinatrijum karbonatom (5,66 mg, 53,4 µmol), zatim mešan 15 minuta na sobnoj temperaturi i liofilizovan dajući 37,9 mg (kvant.) jedinjenja iz naslova.

1

LC-MS (Postupak 1): Rt= 0,74 min; MS (ESIpos): m/z = 656,1 [M+H]+

<1>H-NMR (500 MHz, D2O): δ [ppm] = 7,97-7,93 (m, 1H), 7,89-7,78 (m, 2H), 7,74-7,57 (m, 5H), 5,40-5,22 (m, 2H), 4,92-4,64 (m, 1H, preklapati sa HDO vrhom), 4,22-4,04 (m, 2H). Primer 14

Natrijum (2S)-3-[1-({5-karbamoil-1-[2-(trifluorometil)fenil]-1H-1,2,4-triazol-3-il}metil)-3-(4-hlorofenil)-5-okso-1,5-dihidro-4H-1,2,4-triazol-4-iyl] -1,1,1-trifluoropropan-2-il vodonik fosfat

[0244]

[0245] Rastvor (2S)-3-[1-({5-karbamoil-1-[2-(trifluorometil)fenil]-1H-1,2,4-triazol-3-il}metil)-3-(4 -hlorofenil)-5-okso-1,5-dihidro-4H-1,2,4-triazol-4-il]-1,1,1-trifluoropropan-2-il dihidrogen fosfata (Primer 10, 35,0 mg, 53,4 µmol) u vodi (1,0 ml) je tretiran sa natrijum hidrogen karbonatom (4,48 mg, 53,4 µmol), zatim mešan 15 minuta na sobnoj temperaturi i liofilizovan dajući 36,2 mg (kvant.) jedinjenja iz naslova.

LC-MS (Postupak 1): Rt= 0,47 min; MS (ESIpos): m/z = 656,0 [M+H]+

<1>H-NMR (500 MHz, D2O): δ [ppm] = 7,97-7,93 (m, 1H), 7,87-7,79 (m, 2H), 7,72-7,59 (m, 5H), 5,39-5,24 (m, 2H), 4,90-4,65 (m, 1H, preklapati sa HDO vrhom), 4,20-4,09 (m, 2H). Primer 15

Magnezijum (2S)-3-[1-({5-karbamoil-1-[2-(trifluorometil)piridin-2-il]-1H-1,2,4-triazol-3-il}metil)-3-(4-hlorofenil)-5-okso-1,5-dihidro-4H-1,2,4-triazol-4-il]-1,1,1-trifluoropropan-2-il fosfat

[0246]

2

[0247] Rastvor (2S)-3-[1-({5-karbamoil-1-[2-(trifluorometil)fenil]-1H-1,2,4-triazol-3-il}metil)-3-(4 -hlorofenil)-5-okso-1,5-dihidro-4H-1,2,4-triazol-4-il]-1,1,1-trifluoropropan-2-il dihidrogen fosfata (Primer 10, 35,0 mg, 53,4 µmol) u vodi (50 ml) je tretiran magnezijum karbonatom (4,50 mg, 53,4 µmol), zatim mešan 15 minuta na sobnoj temperaturi i liofilizovan dajući 37,3 mg (kvant.) jedinjenja iz naslova.

LC-MS (Postupak 2): Rt= 1,34 min; MS (ESIpos): m/z = 656,1 [M+H]+

<1>H-NMR (500 MHz, D2O): δ [ppm] = 7,97-7,93 (m, 1H), 7,88-7,79 (m, 2H), 7,72-7,58 (m, 5H), 5,39-5,24 (m, 2H), 4,92-4,63 (m, 1H, preklapati sa HDO vrhom), 4,20-4,09 (m, 2H). Primer 16

Kalcijum (2S)-3-[1-({5-karbamoil-1-[2-(trifluorometil)piridin-2-il]-1H-1,2,4-triazol-3-il}metil)-3-(4-hlorofenil)-5-okso-1,5-dihidro-4H-1,2,4-triazol-4-il]-1,1,1-trifluoropropan-2-il fosfat

[0248]

[0249] Rastvor (2S)-3-[1-({5-karbamoil-1-[2-(trifluorometil)fenil]-1H-1,2,4-triazol-3-il}metil)-3-(4 -hlorofenil)-5-okso-1,5-dihidro-4H-1,2,4-triazol-4-il]-1,1,1-trifluoropropan-2-il dihidrogen fosfata (Primer 10, 35,0 mg, 53,4 µmol) u vodi (15 ml) je tretiran sa kalcijum acetat monohidratom (9,40 mg, 53,4 µmol), zatim mešan 15 minuta na sobnoj temperaturi i liofilizovan dajući 37,9 mg (kvant.) jedinjenja iz naslova.

LC-MS (Postupak 2): Rt= 1,33 min; MS (ESIpos): m/z = 656,1 [M+H]+

<1>H-NMR (500 MHz, D2O): δ [ppm] = 8,00-7,91 (m, 1H), 7,89-7,77 (m, 2H), 7,73-7,55 (m, 5H), 5,42-5,22 (m, 2H), 4,99-4,50 (m, 1H, preklapati sa HDO vrhom), 4,27-3,99 (m, 2H). Primer 17

(2S)-3-[1-({5-Karbamoil-1-[3-(trifluorometil)piridin-2-il]-1H-1,2,4-triazol-3-il}metil)-3-(4-hlorofenil)-5-okso-1,5-dihidro-4H-1,2,4-triazol-4-il]-1,1,1-trifluoropropan-2-il dihidrogen fosfat

[0250]

[0251] Na 0°C, rastvor 3-({3-(4-hlorofenil)-5-okso-4-[(2S)-3,3,3-trifluoro-2-hidroksipropil]-4,5-dihidro- 1H-1,2,4-triazol-1-il}metil)-1-(3-hloropiridin-2-il)-1H-1,2,4-triazol-5-karboksamid (Primer 8A, 200 mg, 368 µmol) u tetrahidrofuranu (4,2 ml, 52 mmol) je tretiran sa 4-N,N-dimetilaminopiridinom (67,5 mg, 552 µmol) i trietilaminom (77 µl, 550 µmol). Zatim je u kapima dodat fosfor oksihlorid (52 µl, 0,55 mmol). Dobijena smeša je mešana 40 min na 0°C, a zatim 50 min na sobnoj temperaturi. Zatim su dodata voda (420 µl) i zasićeni vodeni rastvor natrijum hidrogen karbonata (2,5 ml) i dobijena smeša je mešana preko noći na sobnoj temperaturi. Tetrahidrofuran je zatim isparen na sobnoj temperaturi. Dobijeni rastvor je razblažen vodom i ekstrahovan etil acetatom. Vodena faza je dovedena do pH = 1 rastvorom hlorovodonične kiseline (1N), razblažena zasićenim vodenim rastvorom natrijum hlorida i ekstrahovana etil acetatom. Kombinovani organski slojevi su isprani zasićenim rastvorom natrijum hlorida, osušeni preko magnezijum sulfata i ispareni. Ostatak je prečišćen preparativnom HPLC (Postupak 4) dajući 126 mg (55% p.t.) jedinjenja iz naslova.

LC-MS (Postupak 2): Rt= 1,22 min; MS (ESIneg): m/z = 621,0 [M-H]-<1>H-NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ [ppm] = 8,64-8,34 (m, 2H), 8,24 (dd, 1H), 7,96 (s, 1H), 7,80-7,48 (m, 5H), 5,25-5,00 (m, 2H), 4,93 - 4,76 (br m, 1H), 4,20-3,87 (m, 2H), 3,34 (br s, 2H, preklapati sa HDO vrhom).

4

Primer 18

Kalijum (2S)-3-[1-{[5-karbamoil-1-(3-hloropiridin-2-il)-1H-1,2,4-triazol-3-il]metil}-3-(4-hlorofenil)-5-okso-1,5-dihidro-4H-1,2,4-triazol-4-il]-1,1,1-trifluoropropan-2-ilhidrogen fosfat

[0252]

[0253] Rastvor (2S)-3-[1-{[5-karbamoil-1-(3-hloropiridin-2-il)-1H-1,2,4-triazol-3-il]metil}-3-( 4-hlorofenil)-5-okso-1,5-dihidro-4H-1,2,4-triazol-4-il]-1,1,1-trifluoropropan-2-il dihidrogen fosfata (Primer 17, 35,0 mg, 56,2 µmol) u vodi (2,0 ml) je tretirano sa kalijum hidrogen karbonatom (11,2 mg, 112 µmol), zatim mešano 15 minuta na sobnoj temperaturi i liofilizovano dajući 40,2 mg (kvant.) naslovnog jedinjenja.

LC-MS (Postupak 1): Rt= 0,64 min; MS (ESIpos): m/z = 623,0 [M+H]+

<1>H-NMR (500 MHz, D2O): δ [ppm] = 8,54 (dd, 1H), 8,22 (dd, 1H), 7,76-7,58 (m, 5H), 5,42 -5,29 (m, 2H), 4,92-4,63 (m, 1H, preklapati sa HDO vrhom), 4,20-4,07 (m, 2H).

Primer 19

Kalijum (2S)-3-[1-{[5-karbamoil-1-(3-hloropiridin-2-il)-1H-1,2,4-triazol-3-il]metil}-3-(4-hlorofenil)-5-okso-1,5-dihidro-4H-1,2,4-triazol-4-il]-1,1,1-trifluoropropan-2-ilhidrogen fosfat

[0254]

[0255] Rastvor (2S)-3-[1-{[5-karbamoil-1-(3-hloropiridin-2-il)-1H-1,2,4-triazol-3-il]metil}-3-( 4-hlorofenil)-5-okso-1,5-dihidro-4H-1,2,4-triazol-4-il]-1,1,1-trifluoropropan-2-il dihidrogen fosfata (Primer 17, 35,0 mg, 56,2 µmol) u vodi (2,0 ml) je tretirano sa kalijum hidrogen karbonatom (5,62 mg, 56,2 µmol), zatim mešano 15 minuta na sobnoj temperaturi i liofilizovano dajući 37,1 mg (kvant.) jedinjenja iz naslova.

LC-MS (Postupak 1): Rt= 0,65 min; MS (ESIpos): m/z = 623,0 [M+H]+

<1>H-NMR (500 MHz, D2O): δ [ppm] = 8,55-8,51 (m, 1H), 8,23-8,18 (m, 1H), 7,75-7,57 (m, 5H), 5,35 (q, 2H), 4,90-4,63 (m, 1H, preklapati sa HDO vrhom), 4,22-4,10 (m, 2H).

Primer 20

Natrijum (2S)-3-[1-{[5-karbamoil-1-(3-hloropiridin-2-il)-1H-1,2,4-triazol-3-il]metil}-3-(4- hlorofenil)-5-okso-1,5-dihidro-4H-1,2,4-triazol-4-il]-1,1,1-trifluoropropan-2-il hidrogen fosfat

[0256]

[0257] Rastvor (2S)-3-[1-{[5-karbamoil-1-(3-hloropiridin-2-il)-1H-1,2,4-triazol-3-il]metil}-3-( 4-hlorofenil)-5-okso-1,5-dihidro-4H-1,2,4-triazol-4-il]-1,1,1-trifluoropropan-2-il dihidrogen fosfata (Primer 17, 35,0 mg, 56,2 µmol) u vodi (2,0 ml) je tretirano sa dinatrijum karbonatom (5,95 mg, 56,2 µmol), zatim mešano 15 minuta na sobnoj temperaturi i liofilizovano dajući 38,9 mg (kvant.) jedinjenja iz naslova.

LC-MS (Postupak 1): Rt= 0,65 min; MS (ESIpos): m/z = 623,0 [M+H]+

<1>H-NMR (500 MHz, D2O): δ [ppm] = 8,56-8,53 (m, 1H), 8,25-8,20 (m, 1H), 7,75-7,58 (m, 5H), 5,42-5,28 (m, 2H), 4,90-4,64 (m, 1H, preklapati sa HDO vrhom), 4,21-4,06 (m, 2H). Primer 21

Natrijum (2S)-3-[1-{[5-karbamoil-1-(3-hloropiridin-2-il)-1H-1,2,4-triazol-3-il]metil}-3(4- hlorofenil)-5-okso-1,5-dihidro-4H-1,2,4-triazol-4-il]-1,1,1-trifluoropropan-2-il hidrogen fosfat

[0258]

[0259] Rastvor (2S)-3-[1-{[5-karbamoil-1-(3-hloropiridin-2-il)-1H-1,2,4-triazol-3-il]metil}-3-( 4-hlorofenil)-5-okso-1,5-dihidro-4H-1,2,4-triazol-4-il]-1,1,1-trifluoropropan-2-il dihidrogen fosfata (Primer 17, 35,0 mg, 56,2 µmol) u vodi (2,0 ml) je tretirano sa natrijum hidrogen karbonatom (4,72 mg, 56,2 µmol), zatim mešano 15 minuta na sobnoj temperaturi i liofilizovano dajući 36,4 mg (kvant.) jedinjenja iz naslova.

LC-MS (Postupak 1): Rt= 0,64 min; MS (ESIpos): m/z = 623,1 [M+H]+

<1>H-NMR (500 MHz, D2O): δ [ppm] = 8,56-8,51 (m, 1H), 8,24-8,18 (m, 1H), 7,75-7,56 (m, 5H), 5,43-5,28 (m, 2H), 4,92-4,59 (m, 1H, preklapati sa HDO vrhom), 4,25-4,09 (m, 2H). Primer 22

Magnezijum (2S)-3-[1-{[5-karbamoil-1-(3-hloropiridin-2-il)-1H-1,2,4-triazol-3-il]metil}-3-(4- hlorofenil)-5-okso-1,5-dihidro-4H-1,2,4-triazol-4-il]-1,1,1-trifluoropropan-2-ilfosfat [0260]

[0261] Rastvor (2S)-3-[1-{[5-karbamoil-1-(3-hloropiridin-2-il)-1H-1,2,4-triazol-3-il]metil}-3-(4-hlorofenil)-5-okso-1,5-dihidro-4H-1,2,4-triazol-4-il]-1,1,1-trifluoropropan-2-il dihidrogen fosfata (Primer 17, 35,0 mg, 56,2 µmol) u vodi (53 ml) je tretirano magnezijum karbonatom (4,74 mg, 56,2 µmol), zatim mešano 15 minuta na sobnoj temperaturi i liofilizovano dajući 37,8 mg (kvant.) jedinjenja iz naslova.

LC-MS (Postupak 2): Rt= 1,13 min; MS (ESIpos): m/z = 623,0 [M+H]+

<1>H-NMR (500 MHz, D2O): δ [ppm] = 8,57-8,52 (m, 1H), 8,26-8,19 (m, 1H), 7,77-7,58 (m, 5H), 5,43-5,28 (m, 2H), 4,95-4,58 (m, 1H, preklapati sa HDO vrhom), 4,07 (s, 2H).

Primer 23

Kalcijum (2S)-3-[1-{[5-karbamoil-1-(3-hloropiridin-2-il)-1H-1,2,4-triazol-3-il]metil}-3-(4- hlorofenil)-5-okso-1,5-dihidro-4H-1,2,4-triazol-4-il]-1,1,1-trifluoropropan-2-il fosfat [0262]

[0263] Rastvor (2S)-3-[1-{[5-karbamoil-1-(3-hloropiridin-2-il)-1H-1,2,4-triazol-3-il]metil}-3-(4-hlorofenil)-5-okso-1,5-dihidro-4H-1,2,4-triazol-4-il]-1,1,1-trifluoropropan-2-il dihidrogen fosfata (Primer 17, 35,0 mg, 56,2 µmol) u vodi (2,0 ml) je tretirano sa kalcijum acetat monohidratom (1:1) (9,89 mg, 56,2 µmol), zatim mešano 15 minuta na sobnoj temperaturi i liofilizovano dajući 38,5 mg (kvant.) jedinjenja iz naslova.

LC-MS (Postupak 1): Rt= 0,65 min; MS (ESIpos): m/z = 623,0 [M+H]+

<1>H-NMR (500 MHz, D2O): δ [ppm] = 8,56-8,52 (m, 1H), 8,25-8,19 (m, 1H), 7,76-7,58 (m, 5H), 5,42-5,29 (m, 2H), 4,68 (s, 1H, preklapati sa HDO vrhom), 4,23-4,10 (m, 2H).

Primer 24

Dikalijum (2S)-3-[1-({5-karbamoil-1-[3-(trifluorometil)piridin-2-il]-1H-1,2,4-triazol-3-il}metil)-3-(4-hlorofenil)-5-okso-1,5-dihidro-4H-1,2,4-triazol-4-il]-1,1,1-trifluoropropan-2-il fosfat

[0264]

[0265] Na 0°C, rastvor (2S)-3-[1-({5-karbamoil-1-[3-(trifluorometil)piridin-2-il]-1H-1,2,4-triazol-3- il}metil)-3-(4-hlorofenil)-5-okso-1,5-dihidro-4H-1,2,4-triazol-4-il]-1,1,1-trifluoropropan-2-il dihidrogen fosfata (Primer 1, 400 mg, 0,609 mmol) u acetonitrilu (12 ml) je tretiran rastvorom kalijum hidrogen karbonata (1,2 ml, 1 M, 1,2 mmol). Dobijena smeša je mešana 5 minuta na 0°C, 5 min na sobnoj temperaturi i liofilizovana.

[0266] 50 mg liofilizovanog jedinjenja je rastvoreno u 2-propanolu (3 ml). Dobijeni rastvor je polako koncentrovan uz mešanje na sobnoj temperaturi. Posle 3 nedelje, rastvarač je potpuno isparen. Dobijena čvrsta supstanca je ispitana difraktometrijom X-zraka i odgovara naslovnom jedinjenju kao mezomorfni materijal. Stehiometrija kalijuma od 1,9±0,2 je izračunata na osnovu TGA analize (9,9% zaostalog rastvarača u masi) i jonske hromatografije (9,1% kalijuma u masi) prema sledećoj formuli:

LC-MS (Postupak 5): Rt= 0,67 min; MS (ESIpos): m/z = 657,1 [M+H]+

<1>H-NMR (500 MHz, D2O): δ [ppm] = 8,84 (d, 1H), 8,51 (d, 1H), 7,95 (dd, 1H), 7,74-7,56 (m, 4H), 5,47-5,23 (m, 2H), 4,23-4,03 (m, 2H).

Tabela 4: Rendgenska difraktometrija praha jedinjenja dobijenog u primeru 24

Tabela 5: Infracrveni spektar jedinjenja dobijenog u primeru 24

[0267] Opsezi označene sa<∗>su specifični za kaljumovu so.

EKSPERIMENTALNI ODELJAK - BIOLOŠKI TESTOVI

Skraćenice i akronimi:

[0268]

Acc. No.

pristupni broj

AP

alkalna fosfataza

AVP

arginin vazopresin

Bmax

maksimalni kapacitet vezivanja liganda

BSA

goveđi serum albumin

cAMP

ciklični adenozin monofosfat

Cat. No.

kataloški broj

cDNA

komplementarna deoksiribonukleinska kiselina

CHO

jajnik kineskog hrčka

CRE

cAMP element odgovora

Ct

prag ciklusa

DMEM/F12

Dulbekov modifikovani iglov medijum/Hamov F12 medij (1:1) DNK

deoksiribonukleinska kiselina

DMSO

dimetilsulfoksid

DTT

ditiotreitol

EC50

1

pola maksimalne efektivne koncentracije

EDTA

etilendiamin-tetrasirćetna kiselina

FAM

karboksifluorescein sukcinimidil estar

f.c.

konačna koncentracija

FCS

fetalni teleći serum

HEPES

4-(2-hidroksietil)piperazin-1-etansulfonska kiselina IC50

polu-maksimalna inhibitorna koncentracija

Kd

konstanta disocijacije

Ki

konstanta disocijacije inhibitora

mRNK

glasnik ribonukleinske kiseline

PBS

fosfatni pufer s dodatkom soli

PEG

polietilen glikol

p.o.

per os, peroralno

RNA

ribonukleinska kiselina

RTPCR

lančana reakcija polimeraze u realnom vremenu SPA

test scintilacione blizine

TAMRA

karboksitetrametilrodamin

TRIS; Tris

2

2-amino-2-hidroksimetilpropan-1,3-diol

v/v

zapremina/zapremina koncentracija, procentualni rastvor

[0269] Demonstracija aktivnosti jedinjenja iz predmetnog pronalaska može se postići putem in vitro, ex vivo i in vivo testova koji su dobro poznati u tehnici. Na primer, da bi se demonstrirala aktivnost jedinjenja iz predmetnog pronalaska, mogu se koristiti sledeći testovi.

B-1. Ćelijski in vitro test za određivanje aktivnosti receptora vazopresina

[0270] Identifikacija agonista i antagonista V1a i V2 vazopresinskih receptora kod ljudi, pacova i pasa, kao i kvantifikacija aktivnosti jedinjenja pronalaska se sprovodi korišćenjem rekombinantnih ćelijskih linija. Ove ćelijske linije prvobitno potiču iz epitelne ćelije jajnika hrčka (jajnik kineskog hrčka, CHO K1, ATCC: American Type Culture Collection, Manassas, VA 20108, USA). Test ćelijske linije konstitutivno eksprimiraju V1a ili V2 receptore za ljude, pacove ili pse. U slučaju Gaq-spregnutih V1a receptora, ćelije su takođe stabilno transfektovane modifikovanim oblikom fotoproteina osetljivog na kalcijum aekuorin (ljudi i pacov V1a) ili obelin (pas V1a), koji, nakon rekonstitucije sa kofaktorom koelenterazinom, emituju svetlost. kada dođe do povećanja koncentracije slobodnog kalcijuma [Rizzuto R, Simpson AW, Brini M, Pozzan T, Nature 358, 325-327

(1992); Illarionov BA, Bondar VS, Illarionova VA, Vysotski ES, Gene 153 (2), 273-274 (1995)]. Nastale ćelije receptora vazopresina reaguju na stimulaciju rekombinantno eksprimiranih V1a receptora intracelularnim oslobađanjem jona kalcijuma, što se može kvantifikovati rezultujućom luminiscencijom fotoproteina. Gs-spregnuti V2 receptori se stabilno transfektuju u ćelijske linije koje eksprimiraju gen za luciferazu svice pod kontrolom CRE-odgovornog promotera. Aktivacija V2 receptora indukuje aktivaciju promotera koji reaguje na CRE preko povećanja cAMP, indukujući na taj način ekspresiju luciferaze svica. Svetlost koju emituju fotoproteini V1a ćelijskih linija, kao i svetlost koju emituje luciferaza svica iz V2 ćelijskih linija, odgovara aktivaciji ili inhibiciji odgovarajućeg receptora vazopresina. Bioluminiscencija ćelijskih linija se detektuje korišćenjem odgovarajućeg luminometra [Milligan G, Marshall F, Rees S, Trends in Pharmacological Sciences 17, 235-237 (1996)].

Postupak testiranja:

Ćelijske linije receptora vazopresina V1a:

[0271] Dan pre testa, ćelije su postavljene u medijum za kulturu (DMEM/F12, 2% FCS, 2 mM glutamin, 10 mM HEPES, 5 µg/ml koelenterazin) u mikrotitarske ploče sa 384 udubljenja i držane u ćelijskom inkubatoru. (96% vlažnost, 5% v/v CO2, 37°C). Na dan testa, test jedinjenja u različitim koncentracijama su stavljena na 10 minuta u udubljenja mikrotitarske ploče pre nego što je dodat agonist [Arg<8>]-vazopresin u EC50koncentraciji. Dobijeni svetlosni signal se odmah meri u luminometru.

Ćelijske linije receptora vazopresina V2:

[0272] Dan pre testa, ćelije su postavljene u medijum za kulturu (DMEM/F12, 2% FCS, 2 mM glutamin, 10 mM HEPES) u mikrotitarske ploče sa 384 udubljenja i držane u ćelijskom inkubatoru. (96% vlažnost, 5% v/v CO2, 37°C). Na dan testa, testna jedinjenja u različitim koncentracijama i agonist [Arg<8>]-vazopresin u EC50koncentraciji se dodaju zajedno u udubljenja, a ploče su inkubirane 3 sata u ćelijskom inkubatoru. Nakon dodavanja reagensa za lizu ćelija Triton™ i supstrata luciferina, luminescencija luciferaze svica se meri u luminometru.

[0273] Tabela 1A u nastavku navodi pojedinačne IC50vrednosti za jedinjenja pronalaska (uključujući racemske smeše kao i odvojene enantiomere) koja su dobijena iz ćelijskih linija transfektovanih sa humanim V1a ili V2 receptorom. To znači da su ove IC50vrednosti za prolek, a ne za odgovarajući lek, jer je prolek uglavnom stabilan u uslovima analize. Podaci za odgovarajući lek prikazani su u ispod navedenim eksperimentima.

Tabela 1A:

4

B-2. Test radioaktivnog vezivanja

[0274] IC50i Kivrednosti se mogu odrediti u testovima radioaktivnog vezivanja korišćenjem membranskih frakcija rekombinantne ćelijske linije 293 humanog embrionalnog bubrega (HEK293) ili CHO-K1 ćelijskih linija koje eksprimiraju odgovarajuće V1a i V2 receptore humanog vazopresina.

[0275] Humani rekombinantni vazopresin V1a receptori eksprimirani u HEK293 ćelijama se koriste u 50 mM Tris-HCl puferu, pH 7,4, 5 mM MgCl2, 0,1% BSA primenom standardnih tehnika. Alikvoti pripremljenih membrana se inkubiraju sa test jedinjenjima u različitim koncentracijama u duplikatima i 0,03nM [<125>I]fenilacetil-D-Tyr(Me)-Phe-Gln-Asn-Arg-Pro-Arg-Tyr-NH2na 120 minuta na 25°C. Nespecifično vezivanje se procenjuje u prisustvu 1 µM [Arg<8>]vazopresina. Receptori se filtriraju i isperu, filteri se zatim broje da bi se odredilo da je [<125>I]fenilacetil-D-Tyr(Me)-Phe-Gln-Asn-Arg-Pro-Arg-Tyr-NH2posebno vezani.

[0276] CHO-K1 ćelije stabilno transfektovane plazmidom koji kodira humani vazopresin V2 receptor se koriste za pripremu membrana u 50 mM Tris-HCl puferu, pH 7,4, 10 mM MgCl2, 0,1% BSA primenom standardnih tehnika. Alikvoti pripremljene membrane su inkubirani sa test jedinjenjima u različitim koncentracijama u duplikatima i 4 nM [<3>H](Arg<8>)-vazopresina tokom 120 minuta na 25°C. Nespecifično vezivanje se procenjuje u prisustvu 1 µM [Arg<8>]vazopresina. Membrane se filtriraju i operu 3 puta, a filteri se broje da bi se odredilo da je [<3>H](Arg<8>)-vazopresin specifično vezan.

[0277] IC50vrednosti se određuju nelinearnom regresionom analizom najmanjih kvadrata pomoću MathIQTM (ID Business Solutions Ltd., UK). Konstanta inhibicije Kiizračunava se pomoću jednačine Cheng i Prusoff (Cheng, Y., Prusoff, W.H., Biochem. Pharmacol.

22:3099-3108, 1973).

[0278] Da bi se verifikovala konverzija prolekova u odgovarajuće lekove, prolekovi se inkubiraju sa i bez alkalne fosfataze. Cepanje fosfatnog dela alkalnom fosfatazom pretvara prolek u odgovarajući lek [Coleman J. E., Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct.1992, 21, 441-483]. Pošto prolek i odgovarajući lek u osnovi pokazuju različite IC50vrednosti, vrednost proleka posle tretmana alkalnom fosfatazom podseća na IC50odgovarajućeg leka.

B-3. Ćelijski in vitro test za otkrivanje dejstva antagonista receptora vazopresina V1a na regulaciju profibrotičnih gena

[0279] Ćelijska linija H9C2 (American Tipe Culture Collection ATCC br. CRL-1446), opisana kao tip kardiomiocita izolovan iz srčanog tkiva pacova, endogeno eksprimira vazopresin V1a receptor AVPR1A u velikom broju kopija, dok se ekspresija AVPR2 ne može detektovati. Slično, ćelijska linija NRK49F (ATCC br. CRL1570) izolovana iz tkiva bubrega pacova, pokazuje sličan obrazac ekspresije visoke ekspresije AVPR1A mRNK i smanjene ekspresije AVPR2. Za ćelijske testove koji otkrivaju inhibiciju regulacije ekspresije gena zavisne od AVPR1A receptora antagonistima receptora, postupak je sledeći:

Ćelije H9C2 ili NRK49F ćelije su zasejane u mikrotitarske ploče sa 6 udubljenja za ćelijsku kulturu pri gustini ćelija od 50000 ćelija/udubljenju u 2,0 ml Opti-MEM medijuma (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA, SAD, Kat. br.11058-021) i drže se u ćelijskom inkubatoru (96% vlažnost, 8% v/v CO2, 37°C). Posle 24 sata, setovi od tri otvora (tri primerka) su napunjeni rastvorom nosača (negativna kontrola) i rastvorom vazopresina ([Arg8]-vazopresin acetat, Sigma, Kat. br. V9879), ili test jedinjenje (rastvoreno u sredstvu za prenošenje: voda sa 20% v/v etanola) i rastvor vazopresina. U ćelijskoj kulturi, konačna koncentracija vazopresina je 1 nM. Rastvor ispitivanog jedinjenja se dodaje u ćelijsku kulturu u malim količinama, tako da se ne prekorači konačna koncentracija od 0,03% etanola u ćelijskom testu. Posle vremena inkubacije od 5 sati, supernatant kulture se skloni, a prilepljene ćelije se liziraju u 350 µl RLT pufera (Qiagen, Kat. br.79216), a RNK je izolovana iz lizata korišćenjem kompleta RNeasi (Qiagen, Cat. br.74104). Nakon toga sledi varenje DNK-azom (Invitrogen, Cat. br.18068-015), sinteza cDNK (Promaga, ImProm-II sistem reverzne transkripcije, kat. br. A3800) i lančana reakcija polimeraze reverzne transkripcije (RTPCR) (pPCR MasterMix RT-KPQP2X-03-075, Eurogentec, Seraing, Belgija). Svi postupci se odvijaju u skladu sa radnim protokolima proizvođača reagenasa za ispitivanje. Setovi prajmera za RTPCR se biraju na osnovu sekvenci gena mRNK (NCBI GenBank Entrez Nucleotide Data Base) korišćenjem programa Primer3Plus sa 6-FAM TAMRA obeleženim sondama. RTPCR za određivanje relativne ekspresije mRNK u ćelijama različitih serija testa se sprovodi korišćenjem Detektora sekvence Applied Biosystems ABI Prism 7700 u formatu mikrotitarske ploče sa 384 udubljenja u skladu sa uputstvima za upotrebu instrumenta.

Relativna ekspresija gena je predstavljena delta-delta Ct vrednošću [Applied Biosystems, User Bulletin No.2 ABI Prism 7700 SDS, December 11, 1997 (ažurirano 10/2001)] u odnosu na nivo ekspresije gena L-32 ribosomalnog proteina (GenBank prist. br. NM_013226) i graničnu vrednost Ct od Ct = 35.

[0280] Da bi se verifikovala konverzija prolekova u odgovarajuće lekove, prolekovi se inkubiraju sa i bez alkalne fosfataze. Cepanje fosfatnog dela alkalnom fosfatazom pretvara prolek u odgovarajući odgovarajući lek [Coleman J. E., Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct.

1992, 21, 441-483]. Pošto prolek i odgovarajući lek u osnovi pokazuju različite

IC50vrednosti, vrednost proleka posle tretmana alkalnom fosfatazom podseća na

IC50odgovarajućeg leka.

B-4. Ćelijski in vitro test za verifikaciju konverzije prolekova u lek

[0281] Da bi se verifikovala konverzija prolekova u odgovarajuće lekove, prolekovi se inkubiraju sa i bez alkalne fosfataze. Cepanje fosfatnog dela alkalnom fosfatazom pretvara prolek u odgovarajući lek [Coleman J. E., Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct.1992, 21, 441-483]. Pošto prolek i odgovarajući lek u osnovi pokazuju različite IC50vrednosti, vrednost proleka posle tretmana alkalnom fosfatazom podseća na IC50odgovarajućeg leka.

Određivanje IC50vrednosti jedinjenja pronalaska na humanom V1a receptoru se sprovodi korišćenjem rekombinantne ćelijske linije. Ćelijska linija prvobitno potiče od epitelne ćelije jajnika hrčka (jajnik kineskog hrčka, CHO K1, ATCC: American Type Culture Collection, Manassas, VA 20108, USA). Test ćelijska linija konstitutivno eksprimira humani V1a receptor. Ćelije su takođe stabilno transfektovane modifikovanim oblikom fotoproteina ekuorina osetljivog na kalcijum koji, nakon rekonstitucije sa kofaktorom koelenterazinom, emituje svetlost nakon povećanja koncentracije slobodnog kalcijuma [Rizzuto R, Simpson AW, Brini M, Pozzan T, Nature 358, 325-327 (1992); Illarionov BA, Bondar VS, Illarionova VA, Vysotski ES, Gene 153 (2), 273-274 (1995)]. Nastala ćelija receptora vazopresina reaguje na stimulaciju rekombinantno eksprimiranog V1a receptora unutarćelijskim oslobađanjem jona kalcijuma, što se može kvantifikovati rezultujućom luminiscencijom fotoproteina. Bioluminiscencija ćelijskih linija se detektuje korišćenjem odgovarajućeg luminometra [Milligan G, Marshall F, Rees S, Trends in Pharmacological Sciences 17, 235-237 (1996)].

Postupak testiranja:

[0282] Dan pre testa, ćelije su postavljene u medijum za kulturu (DMEM/F12, 2% FCS, 2 mM glutamin, 10 mM HEPES, 5 µg/ml koelenterazin) u mikrotitarske ploče sa 384 udubljenja i držane u ćelijskom inkubatoru. (96% vlažnost, 5% v/v CO2, 37°C). Na dan testa, 100 µl test jedinjenja u koncentraciji od 100 µM se inkubira 15 minuta sa 500 jedinica alkalne fosfataze na 37°C u tirodnom puferu (20 mM HEPES, 130 mM NaCl, 5 mM Km Cl NaHCO3, 2 mM MgCl2, pH 7,4). Posle inkubacije jedinjenja se odmah razblaže i stave na 10 minuta na 37°C na prethodno zasejane V1a ćelije. Za detekciju antagonističke aktivnosti jedinjenja [Arg<8>]-vazopresin u EC50koncentraciji se dodaje i dobijeni svetlosni signal se odmah meri u luminometru.

Izveden je LC-MS uzoraka jedinjenja (Primer 4A i Primer 1) sa i bez alkalne fosfataze (AP).

Postupak 6 (LC-MS):

[0283] Instrument MS: Waters TOF instrument; Tip instrumenta UPLC: Waters Acquity I-CLASS; Kolona: Waters, HSST3, 2,1 × 50 mm, C181,8 µm; eluent A: 11 vode 0,01% mravlje kiseline; eluent B: 1 l acetonitrila 0,01% mravlje kiseline; gradijent: 0,0 min 2% B → 0,5 min 2% B → 7,5 min 95% B → 10,0 min 95% B; Rerna: 50°C; Protok: 1,00 ml/min; UV-Detekcija: 210 nm.

Primer 4A sa AP

[0284]

LC-MS (Postupak 6): Rt= 3,83 min; MS (ESIpos): m/z = 577,1 [M+H]+

Primer 4A bez AP

LC-MS (Postupak 6): Rt= 3,84 min; MS (ESIpos): m/z = 577,1 [M+H]+

Primer 1 sa AP

LC-MS (Postupak 6): Rt= 3,83 min; MS (ESIpos): m/z = 577,1 [M+H]+

Primer 1 bez AP

LC-MS (Postupak 6): Rt= 3,19 min; MS (ESIpos): m/z = 657,1 [M+H]+

Tabela 2A: IC50vrednosti lekova i njihovih odgovarajućih prolekova u prisustvu i odsustvu alkalne fosfataze (AP)

B-5. Inhibicija agregacije ljudskih trombocita izazvana vazopresinom radi verifikacije konverzije proleka u lek

[0285] Ljudski trombociti endogeno eksprimiraju V1a receptor. Utvrđeno je da relativno visoke koncentracije arginin vazopresina (AVP) (oko 50-100 nM) stimulišu agregaciju trombocita ex vivo. Stoga, trombociti obogaćeni ljudskom krvlju mogu poslužiti kao tkivo koje ekspresuje V1a za farmakološka ispitivanja sa antagonistima vazopresina.

[0286] Da bi se verifikovala konverzija prolekova u odgovarajuće lekove, prolekovi se inkubiraju sa i bez alkalne fosfataze. Deljenje fosfatnog dela alkalnom fosfatazom pretvara prolek u lek. Pošto prolek i odgovarajući lek u osnovi pokazuju različite IC50vrednosti, vrednost proleka posle tretmana alkalnom fosfatazom podseća na IC50odgovarajućeg leka.

[0287] 100 µl test jedinjenja u koncentraciji od 100 µM inkubirano je 15 minuta sa 500 jedinica alkalne fosfataze na 37°C u modifikovanom Tirodovom puferu (134 mM NaCl, 12 mM NaH2PO4<∗>H2O, 0,34 mM NaH2PO4<∗>H2O, 2,9 mM KCl, 5 mM HEPES, 5 mM glukoze) i čuvati na 4°C do dalje upotrebe u testu agregacije trombocita.

[0288] Ljudska krv je sakupljena u plastične epruvete koje sadrže 1/10 zapremine 0,106 M trinatrijum citrata venskom punkcijom od zdravih dobrovoljaca nepušača (n=4/grupi) koji su bez lekova najmanje 1 nedelju. Plazma bogata trombocitima (PRP) se dobija centrifugiranjem uzorka krvi na 140 g tokom 20 minuta na sobnoj temperaturi. Dobijeni pelet se odbacuje i PRP se dalje centrifugira (11,000 rpm, 1 min) da bi se proizvela plazma siromašna trombocitima (PPP). Agregacija trombocita se meri turbidimetrijski pomoću agregometra (APACT 4). Reakcija je praćena praćenjem promena u transmisiji svetlosti na alikvotima od 178 µL PRP, uz kontinuirano mešanje na 37°C, u odnosu na PPP kontrolu. Različite koncentracije antagonista vazopresina (u 2 µL) se dodaju u PRP 5 minuta pre dodavanja 20 µL AVP (konačna koncentracija 100 nM). Inhibicijski efekti jedinjenja se određuju merenjem maksimalne amplitude krive agregacije u poređenju sa kontrolnim odgovorom. IC50vrednosti se izračunavaju na osnovu krive inhibicije koncentracije i odgovora pomoću iterativnog programa nelinearne regresije. Sve vrednosti su izražene kao srednje vrednosti (Tabela 3A).

Tabela 3A: Efekti test jedinjenja na agregaciju u ljudskoj plazmi bogatoj trombocitima.

B-6. Efekti na kontrakciju izolovanih prstenova sudova pacova

Izolovana aorta

[0289] Test jedinjenja se mogu istražiti na izolovanim prstenovima aorte od mužjaka Wistar pacova koji endogeno eksprimiraju V1a receptor. Mužjaci Wistar pacova su eutanazirani korišćenjem ugljen-dioksida. Aorta se uklanja i stavlja u ledeno hladan Krebs-Henseleit pufer sledećeg sastava (u mmol/l): NaCl 112, KCl 5,9, CaCl22,0, MgCl21,2, NaH2PO41,2, NaHCO325, glukoza 11,5. Aorta je isečena na prstenove od 3 mm i premeštena u kupke za organe od 20 ml koje sadrže Krebs-Henselajtov rastvor ekvilibrisan sa 95% O2, 5% CO2na 37°C. Za snimanje izometrijske napetosti prstenovi se montiraju između dve kuke. Napon u mirovanju je podešen na 3 g. Nakon perioda ekvilibracije, svaki eksperiment počinje izlaganjem preparata K+ (50 mM) Krebs-Henseleit rastvora. Zatim se aortni prstenovi prethodno kontrahuju korišćenjem 1 nmol/l Arg-vazopresina. Nakon što se uspostavi stabilna kontrakcija, konstruiše se kriva kumulativnog odgovora na dozu test jedinjenja. Stabilizovana kontrakcija izazvana Arg-vazopresinom se definiše kao 100% napetost. Opuštanje se izražava kao procentualna napetost.

Izolovani A. renalis

[0290] Mužjaci Wistar (200-250 g) pacova su eutanazirani korišćenjem ugljen-dioksida. Bubrežna arterija se uklanja i stavlja u ledeno hladan Krebs-Henseleit pufer sledećeg sastava (u mmol/l): NaCl 112, KCl 5,9, CaCl22,0, MgCl21,2, NaH2PO41,2, NaHCO325, glukoza 11,5. Za merenje izometrijske napetosti, segmenti prstena, dužine 2 mm, montiraju se u miograf sa komorom male posude (Danish Myo Technology A/S, Danska) korišćenjem dve volframove žice pričvršćene za montažne čeljusti. Jedna montažna čeljust je pričvršćena za mikrometar, omogućavajući kontrolu obima posude. Druga montažna čeljust je pričvršćena za pretvarač sile za merenje razvoja napetosti. Ceo preparat se čuva u komori sa fiziološkim rastvorom soli na 37°C, sa kiseonikom. Posle perioda ravnoteže od 30 minuta, sudovi se rastežu do svog optimalnog prečnika lumena za razvoj aktivne napetosti koji se određuje na osnovu odnosa napetosti unutrašnjeg obima i zida. Unutrašnji obim je podešen na 90% od onoga što bi sudovi imali ako bi bili izloženi pasivnoj napetosti ekvivalentnoj onoj koju stvara transmuralni pritisak od 100 mmHg.

[0291] Nakon toga, posude su tri puta isprane Krebs-Henseleit puferom i ostavljene da se uravnoteže 30 min. Kontraktilnost se zatim testira dvostrukim izlaganjem rastvoru sa visokim K<+>(50 mmol/l KCl). Posle ispiranja sa Krebs-Henseleit puferom, posude su zatim prethodno kontrahovane korišćenjem 1 nmol/l Arg-vazopresina. Nakon što se uspostavi stabilna kontrakcija, konstruiše se kriva kumulativnog odgovora na dozu test jedinjenja. Stabilizovana kontrakcija izazvana Arg-vazopresinom se definiše kao 100% napetost. Opuštanje se izražava kao procentualna napetost.

[0292] Da bi se verifikovala konverzija prolekova u odgovarajuće lekove, prolekovi se inkubiraju sa i bez alkalne fosfataze. Cepanje fosfatnog dela alkalnom fosfatazom pretvara prolek u odgovarajući lek [Coleman J. E., Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct.1992, 21, 441-483]. Pošto prolek i odgovarajući lek u osnovi pokazuju različite IC50vrednosti, vrednost proleka posle tretmana alkalnom fosfatazom podseća na IC50odgovarajućeg leka.

B-7. In vivo test za otkrivanje kardiovaskularnih efekata: merenje krvnog pritiska kod anesteziranih pacova (model izazova sa vazopresinom)

[0293] Mužjaci Sprague-Dawley pacova (250-350 g telesne mase) se koriste pod injekcijskom anestezijom ketamin/ksilazin/pentobarbital. Polietilenske epruvete (PE-50, Intramedic®), prethodno napunjene sa heparinom (500 IU/ml) izotonični rastvor natrijum hlorida, uvode se u jugularnu venu i femoralnu venu i zatim vezuju. Ubrizgava se Argvazopresin (SIGMA) preko jednog venskog pristupa, uz pomoć šprica; ispitivana supstanca se primenjuje preko drugog venskog pristupa. Za određivanje sistolnog krvnog pritiska, kateter pritiska (Millar SPR-3202F) je vezan za karotidnu arteriju. Arterijski kateter je povezan sa pretvaračem pritiska koji svoje signale prenosi na kompjuter za snimanje opremljen odgovarajućim softverom za snimanje. U tipičnom eksperimentu, eksperimentalnoj životinji se daju 3-4 uzastopne bolus injekcije u intervalima od 10-15

1

minuta sa definisanom količinom Arg-vazopresina (30 ng/kg) u izotoničnom rastvoru natrijum hlorida. Kada krvni pritisak ponovo dostigne početni nivo, ispitivana supstanca se primenjuje kao bolus, uz naknadnu kontinuiranu infuziju, u odgovarajućem rastvaraču.

Nakon toga, u određenim intervalima (10-15 minuta), ponovo se primenjuje ista količina Arg-vazopresina kao na početku. Na osnovu vrednosti krvnog pritiska, utvrđuje se u kojoj meri ispitivana supstanca deluje protiv hipertenzivnog dejstva Arg-vazopresina. Kontrolne životinje dobijaju samo rastvarač umesto ispitivane supstance.

[0294] Posle intravenske primene, jedinjenja pronalaska, u poređenju sa kontrolama rastvarača, dovode do inhibicije povećanja krvnog pritiska izazvanog Arg-vazopresinom. B-8. In vivo test za otkrivanje efekata izazvanih receptorom vazopresina V2: ispitivanja diureze kod svesnih pacova držanih u kavezima za metabolizam

[0295] Wistar pacovi (400-500 g telesne mase) drže se sa slobodnim pristupom hrani (Altromin) i vodi za piće. Tokom eksperimenta, životinje su držane sa slobodnim pristupom vodi za piće 7 sati pojedinačno u metaboličkim kavezima pogodnim za pacove ove težinske kategorije (Tecniplast Deutschland GmbH, D-82383 Hohenpeißenberg). Na početku eksperimenta, životinjama se daje ispitivana supstanca u zapremini od 1 ml/kg telesne mase odgovarajućeg rastvarača (2-hidroksilpropil-beta-ciklodekstrin) intravenskom primenom. Kontrolne životinje dobijaju samo rastvarač. Kontrole i ispitivanja supstanci sprovode se paralelno istog dana. Kontrolne grupe i grupe za dozu supstance se sastoje od po 6 do 8 životinja. Tokom eksperimenta, urin koji izlučuju životinje kontinuirano se sakuplja u prijemniku na dnu kaveza. Količina urina se određuje posebno za svaku životinju. Pre početka ogleda određuje se telesna težina pojedinih životinja.

[0296] Posle intravenske primene, u poređenju sa primenama za kontrolu rastvarača, jedinjenje koje blokira vazopresin V2 receptor bi izazvalo povećano izlučivanje urina, koje se u suštini zasniva na povećanom izlučivanju vode (akvareza).

[0297] Tabela 4A ispod pokazuje uočene promene u izlučivanju urina u odnosu na kontrolu rastvarača (= 100%) za primerna jedinjenja pronalaska i jedinjenja za poređenje u tri različite doze:

2

Tabela 4A:

[0298] Rezultati prikazani u tabeli 4A pokazuju da jedinjenja iz predmetnog pronalaska ne poseduju nikakvu značajnu aktivnost blokiranja V2 zavisnu od doze pri naznačenim dozama in vivo. Ovo je u suprotnosti sa Primerom 82 iz WO2016/071212 koji je doveo do dozno-zavisnog, do četrnaest puta povećanja zapremine urina u odnosu na kontrolnu grupu sa nosačem pri dozi od 3 mg/kg i.v.

B-9. In vivo test za otkrivanje zaštitnih efekata na bubrege: Model akutne ishemije/reperfuzije kod glodara

[0299] Laboratorijski uzgojeni muški miševi C57Bl/6J stari 6-8 nedelja su dobijeni od Taconic Biosciences, mužjaci 6-8 nedelja stari Sprague Dawley® pacovi su dobijeni od Charles River. I pacovi i miševi se održavaju u standardnim laboratorijskim uslovima, ciklusima od 12 sati svetlo-tamni sa pristupom normalnoj hrani i vodi za piće po volji. Za model ishemijske reperfuzijske povrede korišćeno je ukupno 10-12 pacova ili miševa u svakoj kontrolnoj i eksperimentalnoj grupi.

[0300] Životinje se anesteziraju kontinuiranim inhalacionim izofluranom. Desna nefrektomija se izvodi kroz rez na desnom boku 7 dana pre ishemijske procedure u kontralateralnim bubrezima. Za ishemiju bubrega se pravi rez na levom boku. Bubrežni sudovi se otkrivaju disekcijom leve bubrežne pedikule. Ne traumatske vaskularne stezaljke se koriste za zaustavljanje krvotoka (arterija i vena) tokom 45 min (pacovi) ili 25 min (miševi) ishemije. Reperfuzija se uspostavlja uklanjanjem stezaljki. Trbušni zid (mišićni sloj i koža) je zatvoren polipropilenskim šavovima 5,0. Temgesic® (buprenorfin, 0,025 mg/kg s.c.) se primenjuje kao analgetik.

[0301] Urin svake životinje se sakuplja u metaboličke kaveze preko noći pre žrtvovanja 24 sata nakon ishemije. Nakon žrtvovanja, uzorci krvi se uzimaju pod terminalnom anestezijom. Nakon centrifugiranja uzoraka krvi, izoluje se serum. I serumski kreatinin i serumska urea se mere pomoću kliničkog biohemijskog analizatora (Pentra 400). Za procenu biomarkera oštećenja bubrega u serumu i mokraći (lipokalin povezan sa neutrofilnom želatinazom [NGAL], molekul povrede bubrega-1 [KIM-1] i Osteopontin) ELlSA se izvode prema protokolu proizvođača. I kreatinin i albumin u urinu se mere da bi se odredio odnos albumin/kreatinin.

[0302] Ukupna RNK je izolovana iz bubrega. Levi bubrezi su naglo zamrznuti u tečnom azotu pri žrtvovanju. Tkivo bubrega se zatim homogenizuje i dobija se RNK. Ukupna RNK se transkribuje u cDNK. Koristeći TakMan PCR u realnom vremenu, ekspresija mRNK bubrega NGAL, osteopontina, KIM-1, Nephrina i Podocina je analizirana u celom bubrežnom tkivu.

[0303] Razlike između grupa se analiziraju jednosmernom ANOVA-om sa Dunnettovim korekcijama za višestruka poređenja. Statistička značajnost je definisana kao p < 0,05. Sve statističke analize se rade pomoću GraphPad Prism 7.

B-10. In vivo test za otkrivanje kardiovaskularnih efekata: hemodinamika ispitivanja kod anesteziranih pasa

[0304] Mužjaci pasa bigl (Beagle, Marshall BioResources, SAD) mase između 10 i 15 kg anestezirani su pentobarbitalom (30 mg/kg iv, Narcoren®, Merial, Nemačka) za hirurške intervencije i završetak hemodinamskog i funkcionalnog ispitivanja. Pankuronijumbromid (Pancuronium Inresa, Inresa, Nemačka, 2-4 mg/životinji i.v.) služi dodatno kao relaksant mišića. Psi se intubiraju i ventiliraju mešavinom kiseonika/ambijentalnog vazduha (30/70%), oko 2,5-4 L/min. Ventilacija se odvija pomoću ventilatora kompanije GE Healthcare (Avance, Nemačka) i prati se pomoću analizatora ugljen-dioksida (-Datex Ohmeda).

Anestezija se održava kontinuiranom infuzijom pentobarbitala (50 µg/kg/min); fentanil se koristi kao analgetik (10 µg/kg/h).

[0305] U pripremnim intervencijama psima se postavlja srčani pejsmejker. Na početku eksperimenta, srčani pejsmejker kompanije Biotronik (Logos®, Nemačka) se implantira u

4

potkožni kožni džep i dolazi u kontakt sa srcem preko elektrode pejsmejkera (Siello S60®, Biotronik, Nemačka) koja se napreduje kroz spoljašnju jugularnu venu, sa osvetljenjem, u desnu komoru.

[0306] Nakon toga se pristupi uklanjaju i pas se spontano budi iz anestezije. Posle narednih 7 dana aktivira se iznad opisani pejsmejker i srce se stimuliše frekvencijom od 220 otkucaja u minuti.

[0307] Pravi eksperimenti testiranja lekova se odvijaju 28 dana nakon početka stimulacije pejsmejkera, koristeći sledeće instrumente:

• Uvođenje katetera za bešiku za olakšanje bešike i za merenje protoka urina

• Dodavanje elektrokardiografije (EKG) dovodi do ekstremiteta za merenje EKG-a. • Uvođenje introduktora omotača punjenog rastvorom natrijum hlorida u femoralnu arteriju. Ova cev je povezana sa senzorom pritiska (Braun Melsungen, Melsungen, Nemačka) za merenje sistemskog krvnog pritiska

• Uvođenje katetera Millar Tip (tip 350 PC, Millar Instruments, Hjuston, SAD) kroz port osiguran u karotidnoj arteriji, za merenje srčane hemodinamike.

• Uvođenje Swan-Ganz katetera (CCOmbo 7,5F, Edwards, Irvine, SAD) preko jugularne vene u plućnu arteriju, za merenje minutnog volumena srca, zasićenja kiseonikom, plućnog arterijskog pritiska i centralnog venskog pritiska

• Postavljanje venskog katetera u cefaličnu venu, za infuziju pentobarbitala, za zamenu tečnosti i za uzimanje uzoraka krvi (određivanje nivoa supstance u plazmi ili drugih kliničkih vrednosti krvi)

• Postavljanje venskog katetera u safenu venu, za infuziju fentanila i za davanje supstance

• Infuzija vazopresina (Sigma) u rastućoj dozi, do doze od 4 mU/kg/min. Farmakološke supstance se zatim testiraju sa ovom dozom.

[0308] Primarni signali se pojačavaju ako je potrebno (ACK7700, Data Sciences International, SAD ili Edwards-Vigilance-Monitor, Edvards, Irvine, SAD) i zatim se unose u Ponemah sistem (Data Sciences International, SAD) radi evaluacije. Signali se snimaju kontinuirano tokom eksperimentalnog perioda, i dalje se digitalno obrađuju od strane pomenutog softvera i usredsređuju se tokom 30 sekundi.

B-11. Akutni efekti na promene sistemske hemodinamike, bubrežnog krvotoka i oksigenacije izazvane vazopresinom kod anesteziranih pacova

[0309] Eksperimenti su izvedeni na mužjacima Sprague Dawley pacova (Charles River, Deutschland; 350-450 g telesne mase). U pripremi za hirurške procedure pacovi se anesteziraju izofluranom i stavljaju na zagrejani sto da bi se održavala temperatura tela na 37°C, procenjena korišćenjem umetnutog rektalnog termometra. Inhalaciona anestezija sa izofluranom se primenjuje pomoću kalibrisanog isparivača da bi se izazvala i održavala anestezija sa 5 % zap. i 2 % zap. izoflurana, respektivno. PE50 kanila se postavlja u desnu arteriju femoralis za praćenje srednjeg arterijskog pritiska (MAP). Drugi PE50 kateter se ubacuje u venu femoralis za intravensku infuziju. Levi bubreg je otkriven bočnim rezom i odvojen od perirenalnih dodataka. Kapsula bubrega ostaje netaknuta. Tokom operacije i narednih perioda ekvilibracije i kontrole, pacovi primaju intravensku infuziju fiziološkog rastvora (0,9% NaCl) brzinom od 100 µL/min. Bubrežna merenja bubrežnog krvotoka (RBF) se snimaju pomoću laserske dopler sonde za protok krvi (Oxford Optronix, UK) koja je pričvršćena i stabilizovana na površini bubrega. Sonda se ubacuje u korteks bubrega do dubine od 2 mm, a druga u bubrežnu medulu na 4 mm. Protok krvi u bubregu, kiseonik i temperatura mere se kombinovanom senzorskom sondom (Oxford Optronix, UK). MAP, broj otkucaja srca (HR), RBF, temperatura i kiseonik se kontinuirano beleže. Posle operacije i ekvilibracije, osnovna merenja se određuju tokom 20 minuta. Pacovima se zatim intravenozno infundira vazopresin brzinom od 50 ng/kg/min u 100 µL/kg tokom 20 minuta. U trećem periodu se utvrđuje efekat kombinovane infuzije vazopresina i dvostrukog antagonista vazopresinskog receptora (Primer 82 iz WO 2016/071212) ili selektivnog V1a antagonista (Primer 1) ili sredstva za prenošenje koje se primenjuje kao bolus u različitim koncentracijama.

Tabela 5A: Efekti dvostrukog antagonista vazopresinskog receptora Primer 82 iz WO2016/071212 na promene sistemske i renalne hemodinamike kod pacova posredovane vazopresinom (AVP).

Tabela 6A: Efekti selektivnog antagonista vazopresin V1a receptora Primer 4A na vazopresin (AVP) posredovane promene sistemske i renalne hemodinamike kod pacova.

Tabela 7A: Efekti antagonista vazopresin V1a receptora Primer 1 na vazopresin (AVP) posredovane promene sistemske i renalne hemodinamike kod pacova.

B-12. pH stabilnost

[0310] 0,15 mg test jedinjenja je rastvoreno u 0,1 ml dimetilsulfoksida i 0,4 ml acetonitrila. Za potpuno rastvaranje, HPLC bočica sa rastvorom uzorka se protrese i tretira ultrazvučnim zračenjem. Zatim se dodaje 1,0 ml odgovarajućeg puferskog rastvora i uzorak se vorteksira. Rastvor uzorka se analizira pomoću HPLC da bi se odredila količina test jedinjenja u određeno vreme tokom perioda od 24 h na 37 °C. Površine pikova u procentima se koriste za kvantifikaciju.

Puferi

[0311] pH 4,0: Fluka pufer, porudž. br.33643 (11,76 g limunske kiseline, 2,57 g natrijum hlorida i 2,72 g natrijum hidroksida).

[0312] pH 7,4: 90 g natrijum hlorida, 13,61 g kalijum dihidrogen fosfata i 83,35 g 1 M rastvora natrijum hidroksida se dopuni do 1 litra sa Millipore vodom i zatim razblaži 1:10. Podesite fosfornom kiselinom na pH = 7,4.

[0313] pH 10: Fluka pufer, porudž. br.33649 (4,77 g boraksa, 0,73 g natrijum hidroksida).

[0314] Delovi od 15 µl rastvora uzorka su analizirani HPLC u različito vreme (0 h, 1 h, 2 h, 4 h i 24 h) na 37°C. Površine pikova u procentima se koriste za kvantifikaciju.

HPLC postupak

[0315] Eluent: A = 1 ml trifluorosirćetne kiseline/L u vodi; B = 1 ml trifluorosirćetne kiseline/L u acetonitrilu

[0316] Odnosi površine vrha (F) u različitim vremenima u odnosu na površinu vrha u početnoj tački prikazani su u Tabeli 8A za reprezentativne primere:

Tabela 8A:

Primer Pufer % Test edin en e nakon 4 h % Test edin en e nakon 24 h

B-13. Rastvorljivost

Eksperimentalni postupak

[0317] Za svaku supstancu se tačno izmeri 0,5 - 0,6 mg. U svakom slučaju, uzorku se dodaje dovoljna količina medijuma na način da se dobije koncentracija c = 500 µg/ml. Ovaj rastvor uzorka se mućka 24 h na sobnoj temperaturi i 1400 o/min.

[0318] Dodatna masa uzorka od 0,5 - 0,6 mg je potrebna za DMSO kalibracioni rastvor. Ovaj uzorak je napunjen DMSO do koncentracije c = 600 µg/ml. Iz ovog osnovnog rastvora pripremaju se dva rastvora za kalibraciju. U HPLC bočicu od 2 ml, prvo se unese 1000 µl DMSO i pipetira se 34,4 µl osnovnog rastvora (c = 20 µg/ml). 71,4 µl ovog rastvora (c = 20 µg/ml) se stavi u još jednu HPLC bočicu od 2 ml koja sadrži 500 µl DMSO (c = 2,5 µg/ml).

[0319] Posle mućkanja testnih rastvora, 230 µl supernatanta se prebacuje u epruvetu za centrifugiranje i centrifugira na 42000 rpm (223000 g) tokom 30 min. Zatim se uzme 180 µl supernatanta i svaki se razblaži sa DMSO (1:5 uzorak 1; 1:100 uzorak 2) i prebačen u HPLC bočice. Dva rastvora za kalibraciju i rastvori razblaženih uzoraka se analiziraju pomoću HPLC. Kvantifikacija se vrši preko odgovarajućih površina maksimuma.

Rastvarač

[0320] Destilovana voda; trifluorosirćetna kiselina (Merck; 1,08262,0100); acetonitril (HPLC kvaliteta); DMSO (Merck; 8,02912,2500).

Podloga

[0321] Citratni pufer pH4: Fluka pufer, porudž. br.33643 (11,76 g limunske kiseline, 2,57 g natrijum hlorida i 2,72 g natrijum hidroksida).

[0322] Pufer pH7: Fluka pufer, broj narudžbe 33646 (3,52 g kalijum dihidrogenfosfata, 7,26 g natrijum hidrogen fosfata).

[0323] PBS-pufer pH7,4: Rastvor od 6,18 g natrijum hlorida i 3,96 g natrijum dihidrogen fosfata u 1 L destilovane vode, podesiti sa 1M vodenim rastvorom natrijum hidroksida na pH 7,4.

[0324] Tris-pufer pH8,5: 0,6057 g TRIS je rastvoreno u 95 ml vode, pH se podesi na 8,5 vodenim rastvorom hlorovodonične kiseline, napuni se vodom dok se ne postigne zapremina od 100 ml.

HPLC oprema

[0325] Agilent 1100 ili uporedivi aparat sa UV detekcijom, promenljive talasne dužine (z.B. Diode-Niz); ultrazvučna kupka; Vibromix von Janke & Kunkel; Termomikser iz Ependorfa HPLC-Postupak

[0326] Eluent A: 1 ml trifluorosirćetne kiseline/L vode; Eluent B: 1 ml trifluorosirćetne kiseline/L acetonitrila

[0327] Kolona: Zorbax Extend-c18, 50 × 3,0 mm, 3,5 µm; temperatura kolone: 30°C; Protok: 1,5 ml/min; detektor: 214/254 nm; zapremina injekcije: 20µl.

[0328] Rastvorljivost reprezentativnih primera je prikazana u Tabeli 9A.

Tabela 9A:

1

B-14. Određivanje farmakokinetičkih parametara nakon intravenske i oralne primene [0329] Farmakokinetički parametri jedinjenja prema pronalasku su određeni kod mužjaka pacova Wistar, ženki pasa Bigl i ženki Cinomolgus majmuna. Intravenska primena se sprovodi pomoću odgovarajućeg nosača formulacije za odgovarajuću vrstu, kao što je plazma/DMSO formulacija ili fiziološki rastvor (pH4 ili više) za pacove, ili formulacija voda/PEG400/etanol ili fiziološki rastvor (pH4 ili veći) za pse i majmune. Kod svih vrsta, oralna primena rastvorene supstance se vrši putem sonde, korišćenjem odgovarajućeg nosača formulacije, kao što je formula voda/PEG400/etanol ili fiziološki rastvor. Uzimanje krvi od pacova je pojednostavljeno umetanjem odgovarajućeg katetera u desnu Vena jugularis ekterna pre primene supstance. Operacija se izvodi najmanje jedan dan pre eksperimenta uz anesteziju izoflurana i davanje analgetika (atropin/Rimadil (3/1) 0,1 ml s.c.). Krv se uzima (uglavnom najmanje 6 vremenskih tačaka) u vremenskom prozoru uključujući krajnje vremenske tačke od najmanje 7 sati do najviše 72 sata nakon primene supstance. Kada se uzme krv, ona se prenosi u epruvete koje sadrže odgovarajući antikoagulant, poželjno K-EDTA. Zatim se krvna plazma dobija centrifugiranjem i opciono se čuva na -20°C do dalje obrade.

[0330] Interni standard (koji takođe može biti hemijski nepovezana supstanca) se dodaje uzorcima jedinjenja prema pronalasku, kalibracionim uzorcima i kvalifikatorima, a zatim sledi taloženje proteina pomoću viška acetonitrila. Alternativno, interni standard se dodaje acetonitrilu i smeša se zatim dodaje u višku uzorcima jedinjenja prema pronalasku, kalibracionim uzorcima i kvalifikatorima za taloženje proteina. Dodavanje puferskog rastvora

2

u skladu sa uslovima LC, i naknadno mešanje na vorteksu, praćeno je centrifugiranjem na 2800 g. Supernatant je analiziran pomoću LC-MS/MS koristeći C18 ili bifenil kolone sa reverznom fazom i mešavine promenljive mobilne faze. Supstance se kvantifikuju preko visina vrhova ili površina iz ekstrahovanih jonskih hromatograma specifičnih odabranih eksperimenata praćenja jona.

[0331] Određeni grafikoni koncentracije u plazmi/vreme se koriste za izračunavanje farmakokinetičkih parametara kao što su AUC (površina ispod krive), Cmax (maksimalna koncentracija), t1/2 (terminalni poluvreme), F (bioraspoloživost), MRT (srednje vreme zadržavanja) i CL (klirens), koristeći validirani farmakokinetički program za proračun.

[0332] Pošto se kvantifikacija supstance vrši u plazmi, neophodno je utvrditi distribuciju supstance u krvi/plazmi kako bi se farmakokinetički parametri mogli odgovarajuće podesiti. U tu svrhu, određena količina supstance se inkubira u punoj krvi dotične vrste u mešavini valjka za ljuljanje 20 min. Posle centrifugiranja na 2800 g, meri se koncentracija u plazmi (pomoću LC-MS/MS pomoću kolona sa C18 ili bifenilom sa reverznom fazom i mešavina varijabilnih mobilnih faza) i određuje se izračunavanjem odnosa koncentracije u celoj krvi u odnosu na koncentraciju u plazmi (Ckrv/ Cplazma vrednost).

C) Radni primeri farmaceutskih sastava

[0333] Supstance prema pronalasku se mogu pretvoriti u farmaceutske sastave na sledeći način:

Tabletiranje:

Sastav:

[0334] 100 mg jedinjenja iz Primera 1, 50 mg laktoze (monohidrata), 50 mg kukuruznog skroba, 10 mg polivinilpirolidona (PVP 25) (iz BASF, Nemačka) i 2 mg magnezijum stearata. Težina tablete 212 mg. Prečnik 8 mm, poluprečnik zakrivljenosti 12 mm.

Proizvodnja:

[0335] Mešavina jedinjenja iz Primera 1, laktoze i skroba je granulisana sa 5% rastvorom (m/m) PVP u vodi. Nakon sušenja, granule se mešaju sa magnezijum stearatom 5 min. Ova smeša se komprimuje u konvencionalnoj presi za tabletiranje (videti iznad za format tablete).

Oralna suspenzija:

Sastav:

[0336] 1000 mg jedinjenja iz Primera 1, 1000 mg etanola (96%), 400 mg Rhodigela (ksantanska guma) (iz FMC, SAD) i 99 g vode.

[0337] 10 ml oralne suspenzije odgovara jednoj dozi od 100 mg jedinjenja pronalaska.

Proizvodnja:

[0338] Rhodigel je suspendovan u etanolu, a jedinjenje iz Primera 1 je dodato u suspenziju.

[0339] Voda se dodaje uz mešanje. Smeša je mešana oko 6 h dok se Rhodigel ne nabubri. Sterilni i.v. rastvor:

[0340] Jedinjenje prema pronalasku je rastvoreno u koncentraciji ispod rastvorljivosti zasićenja u fiziološki prihvatljivom rastvaraču (na primer izotonični rastvor natrijum hlorida, rastvor glukoze 5% i/ili PEG 400 rastvor 30%). Rastvor se steriliše filtracijom i puni u sterilne injekcione ambalaže bez pirogena.

4

Claims (11)

1. Patentni zahtevi 1. Jedinjenje prema opštoj formuli (I)

   u kom R<1>predstavlja grupu formula

   u kojoj # predstavlja tačku vezivanja za 1,2,4-triazolil prsten, ili jedne od njegovih farmaceutski prihvatljivih soli, njihovih solvata ili solvata njihovih soli.
2. 2. Jedinjenje opšte formule (I) prema patentnom zahtevu 1, naznačeno time da R<1>predstavlja grupu formule

   u kojoj # predstavlja tačku vezivanja za 1,2,4-triazolil prsten.
3. 3. (2S)-3-[1-({5-Karbamoil-1-[3-(trifluorometil)piridin-2-il]-1H-1,2,4-triazol-3-il}metil)-3-(4-hlorofenil)-5-okso-1,5-dihidro-4H-1,2,4-triazol-4-il]-1,1,1-trifluoropropan-2-il dihidrogen fosfat prema patentnom zahtevu 1 formule ispod

   ili jedne od njenih farmaceutski prihvatljivih soli, njenih solvata ili solvata njenih soli.
4. 4. (2S)-3-[1-({5-Karbamoil-1-[3-(trifluorometil)piridin-2-il]-1H-1,2,4-triazol-3-il}metil)-3-(4-hlorofenil)-5-okso-1,5-dihidro-4H-1,2,4-triazol-4-il]-1,1,1-trifluoropropan-2-il dihidrogen fosfat prema patentnom zahtevu 1 formule ispod
5. 5. Postupak za dobijanje jedinjenja opšte formule (I) ili jedne od njenih farmaceutski prihvatljivih soli, njenih solvata ili solvata njenih soli prema patentnom zahtevu 1, naznačen time da [A] jedinjenje formule

   u kom R<1>ima značenje kao što je definisano za jedinjenja opšte formule (I) date u patentnom zahtevu 1, reaguje u prvom koraku sa fosfor oksihloridom i u drugom koraku se hidrolizuje dajući jedinjenje opšte formule (I), ili [B] jedinjenje formule

   u kom R<1>ima značenje kao što je definisano za jedinjenja opšte formule (I) date u patentnom zahtevu 1, reaguje u prvom koraku sa tetrabenzil difosfatom i u drugom koraku se benzil grupe uklanjaju pod redukcionim uslovima da bi se dobilo jedinjenje opšte formule (I), opciono praćeno, gde je prikladno, pretvaranjem jedinjenja opšte formule (I) u njene odgovarajuće farmaceutski prihvatljive soli, njene solvate ili solvate njenih soli tretmanom sa odgovarajućim rastvaračima i/ili bazama.
6. 6. Jedinjenje prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 4 za upotrebu u lečenju i/ili prevenciji bolesti.
7. 7. Jedinjenje prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 4 za upotrebu u lečenju i/ili prevenciji akutnih i hroničnih bolesti bubrega uključujući dijabetičku nefropatiju, akutnu i hroničnu srčanu insuficijenciju, preeklampsiju, bolest perifernih arterija (PAD), koronarnu mikrovaskularnu disfunkciju (CMD), Rejnoov sindrom, dismenoreju, kardiorenalni sindrom, hipervolemijsku i euvolemijsku hiponatremiju, ciroza jetre, ascites, edem i sindrom neadekvatne sekrecije ADH (SIADH).
8. 8. Upotreba jedinjenja prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 4 za proizvodnju farmaceutskog sastava za lečenje i/ili prevenciju akutnih i hroničnih bolesti bubrega uključujući dijabetičku nefropatiju, akutnu i hroničnu srčanu insuficijenciju, preeklampsiju, bolest perifernih arterija (PAD), koronarnu mikrovaskularnu disfunkciju (CMD), dismenoreju, Rejnoov sindrom, kardiorenalni sindrom, hipervolemijsku i euvolemijsku hiponatremiju, cirozu jetre, asciti, edem i sindrom neadekvatne sekrecije ADH (SIADH).
9. 9. Farmaceutski sastav koji sadrži jedinjenje kao što je definisano u bilo kom od patentnih zahteva 1 do 4 i jedan ili više farmaceutski prihvatljivih ekscipijenasa.
10. 10. Farmaceutski sastav prema patentnom zahtevu 9 koji sadrži jedan ili više prvih aktivnih sastojaka, posebno jedinjenja opšte formule (I) prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 4, i jedan ili više daljih aktivnih sastojaka, posebno jedan ili više dodatnih terapeutskih sredstava odabranih iz grupe koju čine diuretici, angiotenzin, svi antagonisti, ACE inhibitori, blokatori beta-receptora, antagonisti mineralokortikoidnih receptora, organski nitrati, donori NO, aktivatori i stimulatori rastvorljive gvanilat ciklaze, i pozitivno-inotropna sredstva, antiinflamatorna sredstva, imunosupresivi, imunosupresivna veziva i/ili jedinjenja koja moduliraju metabolizam vitamina D.
11. 11. Farmaceutski sastav prema patentnom zahtevu 9 ili 10 za upotrebu u lečenju i/ili prevenciji akutnih i hroničnih bolesti bubrega uključujući dijabetičku nefropatiju, akutnu i hroničnu srčanu insuficijenciju, preeklampsiju, bolest perifernih arterija (PAD), koronarnu mikrovaskularnu disfunkciju (CMD), Rejnoov sindrom, dismenoreju, kardiorenalni sindrom, hipervolemijsku i euvolemijsku hiponatremiju, cirozu jetre, asciti, edem i sindrom neadekvatne sekrecije ADH (SIADH). Izdaje i štampa: Zavod za intelektualnu svojinu, Beograd, Kneginje Ljubice 5