RS62644B1

RS62644B1 - Terapija bakteriofagima

Info

Publication number: RS62644B1
Application number: RS20211339A
Authority: RS
Inventors: Pascal Danglas; Laurent Debarbieux
Original assignee: Ferring Bv; Pasteur Institut
Priority date: 2013-04-30
Filing date: 2014-04-30
Publication date: 2021-12-31
Also published as: JP2016519126A; TR201910955T4; EA201591979A1; BR112015027269B1; JP6543615B2; HUE056968T2; CN105407872B; CA2910539C; PL3563837T3; HK1221164A1; MX2015015092A; PL2991633T3; SG11201508897QA; ES2740124T3; EP3563837B9; HRP20211860T2; RS62644B9; ES2902599T3; SI2991633T1; US20210386805A1

Description

Opis

OBLAST PRONALASKA

[0001] Ovaj pronalazak pripada oblasti terapije bakteriofagima za upotrebu u lečenju zapaljenjskih bolesti creva, kao što je dalje definisano u patentnim zahtevima.

POZADINA

[0002] Bakteriofagi su virusi koji inficiraju bakterije specifičnom interakcijom.

[0003] Kronova bolest (CD), takođe poznata i kao regionalni enteritis, predstavlja zapaljensku bolest creva koje može uticati na bilo koji deo gastrointestinalnog trakta od usta do anusa, što dovodi do različitih simptoma. Prvenstveno dovodi do bola u abdomenu, dijareje, povraćanja ili gubitka težine, ali takođe može dovesti do komplikacija izvan gastrointestinalnog trakta, poput osipa na koži, artritisa, zapaljenja oka, umora i nedostatka koncentracije.

[0004] Iako tačan uzrok CD još uvek nije poznat, čini se da kombinacija faktora sredine i genetske predispozicije prouzrokuje ovu bolest. Smatra se da je CD autoimuna bolest, tokom koje telesni imuni sistem napada gastrointestinalni trakt, što dovodi do zapaljenja; klasifikuje se kao tip zapaljenjske bolesti creva (IBD).

[0005] Kod CD pacijenata, abnormalna ekspresija karcinoembrionalnog molekula 6 ćelijske adhezije povezanog sa antigenom (CEACAM6) uočava se na apikalnoj površini ilealnog epitela, a patogena adherentno-invazivna Escherichia coli (AIEC) kolonizuje ilealne lezije CD.

[0006] Ne postoji poznat farmaceutski ili hirurški lek za Kronovu bolest. Određenije, ni IBD uopšteno rečeno ni CD određenije ne mogu se lečiti antibioticima (što ima za cilj borbu protiv patogene E. coli). Opcije za lečenje ograničene su na kontrolisanje simptoma, održavanje remisije i sprečavanje recidiva.

[0007] Maura et al, Environmental Microbiol, vol.14, no.8, Sp. Iss. SI, August 2012, p.1844-1854 opisuje izolaciju bakteriofaga CLB_P2.

[0008] Belgin et al., Inflammatory Bowel Diseases, Jan 2013, vol.19, no.1, p.141-150 opisuje lečenje Kronove bolesti antibioticima koji su efektivni protiv AIEC.

SAŽETAK PRONALASKA

[0009] Predmet ovog pronalaska obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja obuhvata: kombinaciju dva sledeća soja ili više njih i opciono farmaceutski prihvatljiv nosač; za lečenje zapaljenjske bolesti creva (IBD), i

njenu upotrebu u postupku za lečenje zapaljenjske bolesti creva koji obuhvata davanje subjektu kojem je to potrebno navedene kombinacije sojeva bakteriofaga koji mogu da proizvedu litičku infekciju u adherentno-invazivnom soju Escherichia coli čime se subjekti leče:

soj bakteriofaga P1 koji je u Francuskoj nacionalnoj zbirci mikroorganizama u Institutu Paster deponovan pod pristupnim brojem CNCM 1-4694 ili njegovu varijantu, pri čemu ta varijanta ima istu litičku aktivnost i iste fenotipske karakteristike kao i navedeni soj bakteriofaga;

soj bakteriofaga P2 koji je u Francuskoj nacionalnoj zbirci mikroorganizama u Institutu Paster deponovan pod pristupnim brojem CNCM I-4695 ili njegovu varijantu, pri čemu ta varijanta ima istu litičku aktivnost i iste fenotipske karakteristike kao i navedeni soj bakteriofaga;

soj bakteriofaga P3 koji je u Francuskoj nacionalnoj zbirci mikroorganizama u Institutu Paster deponovan pod pristupnim brojem CNCM I-4696 ili njegovu varijantu, pri čemu ta varijanta ima istu litičku aktivnost i iste fenotipske karakteristike kao i navedeni soj bakteriofaga;

soj bakteriofaga P4 koji je u Francuskoj nacionalnoj zbirci mikroorganizama u Institutu Paster deponovan pod pristupnim brojem CNCM I-4697 ili njegovu varijantu, pri čemu ta varijanta ima istu litičku aktivnost i iste fenotipske karakteristike kao i navedeni soj bakteriofaga;

soj bakteriofaga P5 koji je u Francuskoj nacionalnoj zbirci mikroorganizama u Institutu Paster deponovan pod pristupnim brojem CNCM I-4698 ili njegovu varijantu, pri čemu ta varijanta ima istu litičku aktivnost i iste fenotipske karakteristike kao i navedeni soj bakteriofaga;

soj bakteriofaga P6 koji je u Francuskoj nacionalnoj zbirci mikroorganizama u Institutu Paster deponovan pod pristupnim brojem CNCM I-4699 ili njegovu varijantu, pri čemu ta varijanta ima istu litičku aktivnost i iste fenotipske karakteristike kao i navedeni soj bakteriofaga;

soj bakteriofaga P8 koji je u Francuskoj nacionalnoj zbirci mikroorganizama u Institutu Paster deponovan pod pristupnim brojem CNCM I-4700 ili njegovu varijantu, pri čemu ta varijanta ima istu litičku aktivnost i iste fenotipske karakteristike kao i navedeni soj bakteriofaga; i

soj bakteriofaga CLB_P2 koji je u Francuskoj nacionalnoj zbirci mikroorganizama u Institutu Paster deponovan pod pristupnim brojem CNCM I-4675 ili njegovu varijantu, pri čemu ta varijanta ima istu litičku aktivnost i iste fenotipske karakteristike kao i navedeni soj bakteriofaga.

[0010] Za potrebe ovog pronalaska, smatra se da varijanta soja bakteriofaga ima istu litičku aktivnost kao navedeni soj bakteriofaga ako deluje najmanje „+“ protiv najmanje jednog od AIEC sojeva LF82, 07081, 07082, 07076 i 06075 u „In vitro analizi infektivnosti bakteriofaga u AIEC sojevima“ opisanoj u Primeru 3 u nastavku. U poželjnom načinu ostvarivanja, smatra se da varijanta ima istu litičku aktivnost ako deluje najmanje „+“ protiv svih pet AIEC sojeva LF 82, LF 06075, LF 07076, LF 07081 i LF 07082 (AIEC sojevi LF 06075, LF 07076, LF 07081 i LF 07082 ovde se takođe skraćuju kao 06075, 07076, 07081 i 07082, respektivno). Ovi AIEC sojevi deponovani su u Université Lille 2 - Droit et Santé, 42 Rue Paul Duez, 59000 Lille (Francuska) pri Francuskoj nacionalnoj zbirci u Institutu Paster pod pristupnim brojevima CNCM 1-4712 (LF 82), CNCM 1-4713 (LF 06075), CNCM 1-4714 (LF 07076), CNCM 1-4715 (LF 07081) i CNCM 1-4716 (LF 07082).

[0011] Za potrebe ovog pronalaska, smatra se da varijanta jednog od sojeva bakteriofaga P1 do P6, P8 i CLB_P2 ima iste fenotipske karakteristike kao navedeni soj bakteriofaga ako ima najmanje 80% identiteta sekvence na najmanje 70% dužine, poželjno najmanje 90% identiteta sekvence na najmanje 80% dužine i još poželjnije kompletan identitet sekvence na najmanje 90% dužine (kao što se utvrđuje BLAST algoritmom) sa velikim kapsidnim proteinom bakteriofaga wV8 (za varijante od P1 do P6) ili bakteriofaga RB69 (za varijante od P8) ili bakteriofaga JS98 (za varijante od CLB_P2), kao što je opisano u nastavku u odeljku „Identifikacija velikih kapsidnih proteina“.

[0012] Varijanta bakteriofaga ima istu litičku aktivnost i iste fenotipske karakteristike kao bakteriofag.

DETALJAN OPIS PRONALASKA

[0013] Predmet ovog pronalaska obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja obuhvata: gorenavedenu kombinaciju i farmaceutski prihvatljiv nosač; za lečenje zapaljenjske bolesti creva.

[0014] Pojam „adherentno-invazivni soj Escherichia coli (AIEC)“ kako je ovde upotrebljen treba shvatiti kao da se odnosi na soj E. coli čiji je srednji invazivni potencijal jednak ili veći od 0,1% u ćelijskoj kulturi crevne ćelijske linije I-407. Drugim rečima, soj AIEC može da napadne crevnu ćelijsku kulturu I-407 uz invazivni indeks jednak ili veći od 0,1% originalnog inokuluma (uzeto kao 100%), prilikom testiranja u skladu sa analizom invazivnosti opisanoj u nastavku u odeljku „Analiza invazivnosti“ (vidi takođe Darfeuille-Michaud et al. (2004), Gastroenterology 127:412-421).

[0015] Neograničavajući primeri sojeva AIEC su LF82, LF82SK (koji je deponovan u Université d'Auvergne, 49 Boulevard François Mitterand, 63001 Clermont-Ferrand (Francuska) pri Francuskoj nacionalnoj zbirci u Institutu Paster pod pristupnim brojem CNCM I-4723), sojevi navedeni u Tabeli 1 u nastavku i sojevi navedeni u sledećem nabrajanju (cf. Darfeuille-Michaud et al. (2004), Gastroenterology 127:412-421, naročito stranica 417, Tabela 2): LF31, LF71, LF123, LF138, LF9, LF15, LF28, LF50, LF65, LF119, LF128, LF130, LF73, LF100, LF110, LF134, LF105, LF49-2, LB11 i LF45-2. U jednom načinu ostvarivanja, adherentno-invazivni soj Escherichia coli je LF82, 07081, 07082, 07076 ili 06075, određenije LF82.

[0016] U jednom načinu ostvarivanja, adherentno-invazivni soj Escherichia coli prisutan je u debelom crevu subjekta. U drugom načinu ostvarivanja, adherentno-invazivni soj Escherichia coli prisutan je u ileumu subjekta. U drugom načinu ostvarivanja, adherentno-invazivni soj Escherichia coli prisutan je u jednom delu (tankog i/ili debelog) creva subjekta ili više njih.

[0017] U jednom načinu ostvarivanja, soj bakteriofaga je P1 koji može biti deo kombinacije i koji je u Francuskoj nacionalnoj zbirci mikroorganizama u Institutu Paster deponovan pod pristupnim brojem CNCM I-4694 ili njegova varijanta, pri čemu ta varijanta ima istu litičku aktivnost i iste fenotipske karakteristike kao navedeni soj bakteriofaga.

[0018] U jednom načinu ostvarivanja, soj bakteriofaga je P2 koji može biti deo kombinacije i koji je u Francuskoj nacionalnoj zbirci mikroorganizama u Institutu Paster deponovan pod pristupnim brojem CNCM I-4695 ili njegova varijanta, pri čemu ta varijanta ima istu litičku aktivnost i iste fenotipske karakteristike kao navedeni soj bakteriofaga.

[0019] U jednom načinu ostvarivanja, soj bakteriofaga je P3 koji može biti deo kombinacije i koji je u Francuskoj nacionalnoj zbirci mikroorganizama u Institutu Paster deponovan pod pristupnim [0020] Brojem CNCM I-4696 ili njegova varijanta, pri čemu ta varijanta ima istu litičku aktivnost i iste fenotipske karakteristike kao navedeni soj bakteriofaga.

[0021] U jednom načinu ostvarivanja, soj bakteriofaga je P4 koji može biti deo kombinacije i koji je u Francuskoj nacionalnoj zbirci mikroorganizama u Institutu Paster deponovan pod pristupnim brojem CNCM I-4697 ili njegova varijanta, pri čemu ta varijanta ima istu litičku aktivnost i iste fenotipske karakteristike kao navedeni soj bakteriofaga.

[0022] U jednom načinu ostvarivanja, soj bakteriofaga je P5 koji može biti deo kombinacije i koji je u Francuskoj nacionalnoj zbirci mikroorganizama u Institutu Paster deponovan pod pristupnim brojem CNCM I-4698 ili njegova varijanta, pri čemu ta varijanta ima istu litičku aktivnost i iste fenotipske karakteristike kao navedeni soj bakteriofaga.

[0023] U jednom načinu ostvarivanja, soj bakteriofaga je P6 koji može biti deo kombinacije i koji je u Francuskoj nacionalnoj zbirci mikroorganizama u Institutu Paster deponovan pod pristupnim brojem CNCM I-4699 ili njegova varijanta, pri čemu ta varijanta ima istu litičku aktivnost i iste fenotipske karakteristike kao navedeni soj bakteriofaga.

[0024] U jednom načinu ostvarivanja, soj bakteriofaga je P8 koji može biti deo kombinacije i koji je u Francuskoj nacionalnoj zbirci mikroorganizama u Institutu Paster deponovan pod pristupnim brojem CNCM I-4700 ili njegova varijanta, pri čemu ta varijanta ima istu litičku aktivnost i iste fenotipske karakteristike kao navedeni soj bakteriofaga.

[0025] U jednom načinu ostvarivanja, soj bakteriofaga je CLB_P2 koji može biti deo kombinacije i koji je u Francuskoj nacionalnoj zbirci mikroorganizama u Institutu Paster deponovan pod pristupnim brojem CNCM I-4675 ili njegova varijanta, pri čemu ta varijanta ima istu litičku aktivnost i iste fenotipske karakteristike kao navedeni soj bakteriofaga.

[0026] U jednom aspektu, predviđeno je da farmaceutska kompozicija obuhvata više od jednog soja bakteriofaga, što se takođe naziva i „koktel bakteriofaga“. Koktel bakteriofaga ovog pronalaska obuhvata bilo koju kombinaciju dva ili više od P1, P2, P3, P4, P5, P6, P8 i CLB_P2 i njihove varijante koje imaju istu litičku aktivnost, poželjno istu litičku aktivnost i iste fenotipske karakteristike. Poželjno, bakteriofagi u koktelu bakteriofaga predviđenom za lečenje konkretnog subjekta ili grupe subjekata biće odabrani na osnovu soja AIEC ili sojeva AIEC identifikovanih i odabranih za borbu protiv bolesti.

[0027] Neograničavajući primeri zapaljenjskih bolesti creva su Kronova bolest (CD), ulcerozni kolitis (UC), hronična zapaljenjska bolest creva (hronični IBD) poput, ali bez ograničenja na mikroskopski kolitis, celijačnu bolest i vaskulitis. U jednom načinu ostvarivanja, IBD je CD ili UC. U drugom načinu ostvarivanja, zapaljenjska bolest creva predstavlja ponovno javljanje ilealnih lezija nakon operacije (poput operacije radi uklanjanja najmanje jednog dela tankog creva kod CD pacijenata). Ponovno javljanje može se izmeriti Rutgeertsovim skorom.

[0028] U jednom načinu ostvarivanja, IBD nije prouzrokovan bakterijskom infekcijom. Ovaj način ostvarivanja zasnovan je na zapažanju da IBD predstavlja autoimunu bolest koje se generalno ne smatra bakterijskom bolešću. Umesto toga, bakterijska infekcija može biti konkomitantna sa IBD, ali nije nužno kauzativni agens. Ovo zapažanje je dodatak iznenađujućem otkriću ovog pronalaska, to jest primeni terapije bakteriofagima za lečenje bolesti koja nije prouzrokovana bakterijama.

[0029] Iz tog razloga, mogu postojati - primera radi - sojevi AIEC kod članova porodice subjekata obolelih od IBD, iako ti članovi porodice ne boluju od ove bolesti. Slično tome, sojevi AIEC se takođe mogu naći kod subjekata koji niti boluju od IBD niti su u srodstvu sa subjektima obolelim od IBD, što se takođe može videti iz Tabele 1 u nastavku.

[0030] „Lečenje“ kako je ovde upotrebljeno treba shvatiti tako da obuhvata smanjenje jednog simptoma karakterističnog za ovu bolest ili više njih; smanjenje stope progresije bolesti; oporavak od bolesti, izlečenje od bolesti, održavanje remisije i profilaksu poput sprečavanja recidiva.

[0031] „Subjekat“ kako je ovde upotrebljeno može biti muški ili ženski subjekat. Subjekat može biti ljudsko biće ili bilo koji drugi sisar.

[0032] Doza i režim davanja farmaceutske kompozicije ovog pronalaska nužno će zavisiti od terapeutskog dejstva koje treba postići (npr. lečenje IBD) i može se razlikovati kod određenih sojeva bakteriofaga u kompoziciji, načinu davanja i starosti i stanja pojedinačnog subjekta kom treba davati lek.

[0033] Doza za ljude će verovatno sadržati dozu bakteriofaga između 10<4>i 10<11>jedinica za formiranje plaka (pfu). Željena doza može se dati kao jedna doza po danu ili kao više poddoza koje se daju u odgovarajućim intervalima.

[0034] U kontekstu ovog pronalaska, pojam „farmaceutski prihvatljiv nosač“ odnosi se na farmaceutski prihvatljive, netoksične nosače, punioce ili razblaživače, koji se definišu kao prenosnici koji se uobičajeno koriste za formulisanje farmaceutskih kompozicija za davanje životinjama ili ljudima.

[0035] Farmaceutske kompozicije ovog pronalaska mogu dalje obuhvatati farmaceutski prihvatljive pomoćne agense i opciono druge terapeutske agense. Pomoćni agensi, koji se takođe nazivaju dodatni sastojci, obuhvataju agense koji su konvencionalni u tehnici poput, ali bez ograničenja na agense koji formiraju matricu, sredstva za zgušnjavanje, vezivna sredstva, lubrikante, agense za podešavanje pH vrednosti, agense za zaštitu, pojačivače viskoznosti, agense za apsorpciju, dezintegrante, uključujući nepenušave i penušave dezintegrante, surfaktante, antioksidanse, agense vlaženja, kolorante, agense za dodavanje arome, agense za maskiranje ukusa, zaslađivače, konzervanse i tako dalje. Pored farmaceutske prihvatljivosti, pomoćni agensi moraju biti „prihvatljivi“ u smislu da su kompatibilni sa drugim sastojcima kompozicije, uključujući bakteriofage.

[0036] Farmaceutske kompozicije i načini davanja uključuju one koji su pogodni za ili putem oralnog (uključujući bukalno, sublingvalno i intraorbitalno), rektalnog, nazalnog, topikalnog (uključujući transdermalno), okularnog, otičkog, vaginalnog, bronhijalnog, pulmonarnog ili parenteralnog (uključujući supkutano, intramuskularno, intravensko, intradermalno, intraperitonealno, intrapleuralno, intravezikularno i intratekalno) davanja ili davanja preko implantata. Farmaceutska kompozicija ili način davanja može se prilagoditi tako da obezbedi ciljano dejstvo soja bakteriofaga ovog pronalaska. U konkretnom načinu ostvarivanja, farmaceutska kompozicija ovog pronalaska daje se oralno. Kompozicije se mogu pripremiti bilo kojim postupkom dobro poznatim u tehnici farmacije. Takvi postupci uključuju fazu spajanja soja bakteriofaga ovog pronalaska sa farmaceutski prihvatljivim nosačem i opciono jednim pomoćnim agensom ili više njih.

[0037] Farmaceutske kompozicije pogodne za oralno davanje mogu biti u obliku diskretnih doznih jedinica (doznih oblika) poput pilula, tableta, dražeja ili kapsula, ili kao prah ili granule, ili kao rastvor ili suspenzija. Farmaceutska kompozicija može biti i u obliku bolusa ili paste. Kompozicije se mogu dalje obrađivati u supozitoriju ili klizmu za rektalno davanje.

[0038] Za parenteralno davanje, pogodne kompozicije uključuju vodene i nevodene sterilne injekcije. Kompozicije mogu biti u kontejnerima za jediničnu ili višestruku dozu, na primer u zaptivenim fiolicama i ampulama, i mogu se skladištiti u liofilizovanom stanju (osušene zamrzavanjem), što zahteva jedino dodavanje sterilnog tečnog nosača, na primer vode, pre upotrebe.

[0039] Za transdermalno davanje, mogu biti razmatrani npr. gelovi, flasteri ili sprejovi.

[0040] Kompozicije ili formulacije pogodne za pulmonarno davanje, npr. nazalnom inhalacijom, uključuju fine prašine ili magle koje se mogu generisati pomoću aerosolova pod pritiskom sa izmerenom dozom, raspršivača ili insuflatora.

[0041] Ova specifikacija uključuje komplet koji obuhvata farmaceutsku kompoziciju ovog pronalaska i uputstvo za upotrebu kompozicije za prethodno navedenu upotrebu, opciono zajedno sa materijalom za pakovanje.

[0042] Ova specifikacija dalje obezbeđuje soj bakteriofaga P1 koji je u Francuskoj nacionalnoj zbirci mikroorganizama u Institutu Paster deponovan pod pristupnim brojem CNCM I-4694 ili njegovu varijantu, pri čemu ta varijanta ima istu litičku aktivnost, poželjno istu litičku aktivnost i iste fenotipske karakteristike kao navedeni soj bakteriofaga.

[0043] Ova specifikacija dalje obezbeđuje soj bakteriofaga P2 koji je u Francuskoj nacionalnoj zbirci mikroorganizama u Institutu Paster deponovan pod pristupnim brojem CNCM I-4695 ili njegovu varijantu, pri čemu ta varijanta ima istu litičku aktivnost, poželjno istu litičku aktivnost i iste fenotipske karakteristike kao navedeni soj bakteriofaga.

[0044] Ova specifikacija dalje obezbeđuje soj bakteriofaga P3 koji je u Francuskoj nacionalnoj zbirci mikroorganizama u Institutu Paster deponovan pod pristupnim brojem CNCM I-4696 ili njegovu varijantu, pri čemu ta varijanta ima istu litičku aktivnost, poželjno istu litičku aktivnost i iste fenotipske karakteristike kao navedeni soj bakteriofaga.

[0045] Ova specifikacija dalje obezbeđuje soj bakteriofaga P4 koji je u Francuskoj nacionalnoj zbirci mikroorganizama u Institutu Paster deponovan pod pristupnim brojem CNCM I-4697 ili njegovu varijantu, pri čemu ta varijanta ima istu litičku aktivnost, poželjno istu litičku aktivnost i iste fenotipske karakteristike kao navedeni soj bakteriofaga.

[0046] Ova specifikacija dalje obezbeđuje soj bakteriofaga P5 koji je u Francuskoj nacionalnoj zbirci mikroorganizama u Institutu Paster deponovan pod pristupnim brojem CNCM I-4698 ili njegovu varijantu, pri čemu ta varijanta ima istu litičku aktivnost, poželjno istu litičku aktivnost i iste fenotipske karakteristike kao navedeni soj bakteriofaga.

[0047] Ova specifikacija dalje obezbeđuje soj bakteriofaga P6 koji je u Francuskoj nacionalnoj zbirci mikroorganizama u Institutu Paster deponovan pod pristupnim brojem CNCM I-4699 ili njegovu varijantu, pri čemu ta varijanta ima istu litičku aktivnost, poželjno istu litičku aktivnost i iste fenotipske karakteristike kao navedeni soj bakteriofaga.

[0048] Ova specifikacija dalje obezbeđuje soj bakteriofaga P8 koji je u Francuskoj nacionalnoj zbirci mikroorganizama u Institutu Paster deponovan pod pristupnim brojem CNCM I-4700 ili njegovu varijantu, pri čemu ta varijanta ima istu litičku aktivnost i iste fenotipske karakteristike kao navedeni soj bakteriofaga.

PRIMERI

[0049] Ovaj pronalazak je dalje opisan u sledećim primerima, koji ni na koji način nisu predviđeni da ograniče obim ovog pronalaska za koji se traži zaštita.

POSTUPCI

ANALIZA INVAZIVNOSTI

[0050] Crevna-407 (I-407) ćelijska linija izvedena iz ljudskog embrionalnog jejunuma i ileuma upotrebljena je kao model nediferenciranih crevnih epitelnih ćelija. Nabavljena je u Flow Laboratories (Flow Laboratories Inc., Mc Lean, VA).

[0051] Crevne-407 ćelije su zasejane u pločicama za kultivisanje sa 24 bazenčića (Polylabo, Strazbur, Francuska) pri gustini od 4,105 ćelija/bazenčić i inkubirane tokom 20 sati. Ćelijski monoslojevi su isprani dva puta pomoću PBS (pH 7,2). Bakterijska invazivnost epitelnih ćelija izmerena je pomoću analize zaštite od gentamicina (Falkow et al. (1987), Rev. Infect. Dis.9 (Suppl.5):S450-455). Svaki monosloj je inokuliran u 1 mL podloge za kultivisanje ćelija bez antibiotika uz višestrukost infekcije od 10 bakterija po epitelnoj ćeliji. Nakon perioda inkubacije od 3 sata na 37°C uz 5% CO2, monoslojevi su isprani 3 puta pomoću PBS. Sveža podloga za kultivisanje ćelija koja sadrži 100 µg/mL gentamicina (Sigma, St. Louis, MO) dodavana je tokom 1 sata radi ubijanja ekstracelularnih bakterija pre lize monoslojeva pomoću 1% Triton X-100 (Sigma) u dejonizovanoj vodi. Ova koncentracija Triton X-100 nije imala dejstvo na bakterijsku vijabilnost tokom najmanje 30 minuta. Uzorci su razblaženi i stavljeni na Mueller-Hinton agar ploče kako bi se utvrdio broj jedinica koje formiraju kolonije. Svi rezultati invazivne sposobnosti E. coli sa crevnom-407 ćelijskom linijom izraženi su kao procenat intracelularnih bakterija u poređenju sa početnim inokulumom, uzeto kao 100%. Sve analize sprovedene su najmanje 3 puta u zasebnim eksperimentima.

IDENTIFIKACIJA VELIKIH KAPSIDNIH PROTEINA

[0052] Proteini viriona su dobijeni ključanjem 60 µl suspenzije od 10<11>pfu/ml svakog bakteriofaga tokom 10 min.20 µl suspenzije naneto je na prethodno izliveni 4-12% poliakrilamidni gel. Taj gel je obojen kumasijem i isečene su velike trake, podvrgnute digestiji tripsina i analizirane postupkom masene spektrometrije u objektu za mikrosekvenciranje pri Institutu Paster.

[0053] Dobijene mase peptida upoređene su sa informacijama u bazama podataka proteina, čime se omogućava identifikacija najbližeg poznatog proteina, tj. wV8 za P1 do P6 i RB69 za P8 i JS98 za CLB_P2 (vidi A. Villegas et al, Virology Journal 2009, 6:41 za karakterizaciju wV8 i S. Zuber et al., Journal of Bacteriology 2007, 189:22, 8206 za karakterizaciju RB69 i JS 98).

[0054] Poravnavanje velikih kapsidnih proteina bakteriofaga wV8 sa peptidima dobijenim iz postupka masene spektrometrije velikih kapsidnih proteina bakteriofaga P1 do P6:

1

[0055] Poravnavanje velikog kapsidnog proteina bakteriofaga RB69 sa peptidima dobijenim iz postupka masene spektrometrije velikog kapsidnog proteina bakteriofaga P8:

[0056] Poravnavanje velikog kapsidnog proteina bakteriofaga JS98 sa peptidima dobijenim iz postupka masene spektrometrije velikog kapsidnog proteina bakteriofaga CLB_P2.

PRIMER 1

Izolacija sojeva AIEC

[0057] Sto šezdeset šest (166) adherentno-invazivnih sojeva Escherichia coli (E. coli), uključujući soj E. coli LF82 (Tabela 1), izolovano je na sledeći način: Sojevi AIEC izolovani su iz svežeg fecesa CD pacijenata, članova njihove porodice i kontrolnih subjekata. Feces je razblažen u desetostrukom razblaživanju do -9. Svako razblaživanje je postavljeno na različite podloge. Nakon inkubacije, kolonije su supkultivisane, identifikovane, a sojevi su testirani na kapacitet invazivnosti.

[0058] Određenije, odmah nakon emisije, svež feces je uveden u sterilni kontejner. Atmosfera je učinjena anaerobnom dodavanjem vlažnog Anaerocult®. Uzorci su tretirani na dan uzorkovanja. Oko 1 g fecesa uvedeno je u 9 mL cisteinovanog 1⁄4 snage Ringerovog rastvora u prethodno izmerene epruvete; ponovo su izmerene nakon uvođenja uzorka kako bi se utvrdila njihova tačna težina (prvo desetostruko razređivanje). Sprovedeno je osam sledećih desetostrukih razređivanja i 0,1 mL svakog razređivanja je postavljeno na različite neselektivne i selektivne podloge inkubirane u odgovarajućim uslovima: kolumbija krvni agar (CS) i CSH agar inkubirani su tokom jedne nedelje u anaerobnim uslovima, MRS podloga je inkubirana tokom 48h u atmosferi obogaćenoj CO2, McConkey agar i agar sa cetrimidom su inkubirani tokom 48h u vazduhu. Sve inkubacije su izvedene na 37°C. Nakon inkubacije, kolonije su izbrojane, supkultivisane i identifikovane prema utvrđenim fenotipskim kriterijumima.

[0059] Kontrolni subjekat je odabran vis-à-vis CD pacijenta tako da je kontrolni subjekat istog pola i starosti kao i CD pacijent i ima porodicu slične brojnosti kao i CD pacijent (radi uzimanja u obzir varijacije mikroflore unutar porodice).

[0060] Protokol je odobrio lokalni etički odbor 2000. godine. Pacijenti su praćeni prema EPIMAD registru, koji je organizovan prema sporazumu između Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM) i Institut National de Veille Sanitaire (InVS), a podržava ga i François Aupetit Association, Lion's Club of Northwestern France, Ferring Laboratories, the Société Nationale Française de Gastroentérologie i Lille University Hospital.

Tabela 1 - sojevi AIEC

1

[0061] Podloga za kultivisanje CS ana ima sledeći sastav (po litru podloge):

- 39 g baze kolumbija krvnog agara (Oxoid)

1

- 5 g glukoze

- 0,3 g cistein hlorohidrata

- 5 g agara

- pH 7,0 ± 0,2

[0062] Mešavina je sterilisana tokom 15 minuta na 121°C. Neposredno pre zasejavanja na pločama, dodato je 5% konjske krvi.

[0063] Podloga za kultivisanje CSH ima sledeći sastav (po litru podloge):

- 39 g baze kolumbija krvnog agara (Oxoid)

- 3 g cistein hlorohidrata

- pH 6,8 ± 0,2

[0064] Mešavina je sterilisana tokom 15 minuta na 121°C. Neposredno pre zasejavanja na pločama, dodato je 2 ml sterilnog rastvora amonijum citrata (0,25 g/10 ml vode). Nakon inkubacije, bakterije koje koriste cistein (i oslobađaju sulfid) dovode do stvaranja crnih kolonija na ovoj podlozi.

PRIMER 2

Izolacija faga

[0065] Fagi su izolovani iz otpadne vode na sledeći način: otpadna voda je filtrirana na 0,2 µm i pomešana sa jednakom zapreminom 2X Luria-Bertani (LB) podloge. Ova mešavina je inokulirana svežom kulturom soja LF82 i inkubirana u tresilici na 37°C tokom noći. U flask je dodat Hloroform (1/10 zapremine) i stavljen na tresilicu tokom jednog sata. Podloga je centrifugirana na 10,000 g tokom 10 min. Sakupljen je 1 ml supernatanta i dodata je 1/10 zapremine hloroforma. Nakon kratkog mešanja u vorteksu, Ependorf epruveta je centrifugirana na 7,500 g tokom 5 min. Za utvrđivanje prisustva faga u ovom ekstraktu, kap (10 µl) supernatanta stavljena je na LB agar ploču i ostavljena je da se osuši.

Pomoću platinaste žice, ploča je zasejana iz kapi na ostatak ploče kako bi se izolovali pojedinačni fagi. Stavljen je 1 ml rastuće kulture soja LF82 kako bi se pokrila celokupna ploča; višak je uklonjen i ploča je inkubirana na 37°C tokom noći. Jedan plak ili dva plaka su sakupljeni i resuspendovani u 200 µl SM pufera (10 mM TrisHCl pH7, NaCl 200 mM, želatin 0,03%). Dodato je 20 µl hloroforma u svaku epruvetu i epruvete su nakratko promešane u vorteksu i centrifugirane na 7,500 g tokom 5 min. Stavljeno je 10 µl supernatanta na LB ploču i ostavljeno je da se osuši, a prethodni postupak je ponovljen najmanje tri puta. Kada je većina izolovanih plakova postala homogena, 10 µl poslednjeg resuspendovanog plaka dodato je u 1 ml rastuće kulture soja LF82 na OD 0,1 na 600 nm. Ova epruveta za kultivisanje inkubirana

2

je na 37°C tokom 2 do 4 sata do lize. Nakon dodavanja 1/10 zapremine hloroforma, kultura je prebačena u Ependorf epruvetu, centrifugirana na 7,500 g tokom 5 min i ohlađena na 4°C, čime je dobijen primarni zapat. Nekoliko razblaživanja ovog zapata sačuvano je na 4°C i upotrebljeno radi inficiranja veće količine kulture u cilju pripreme većih količina faga. Sedam (7) faga je dobijeno na sledeći način:

• vB_EcoM_LF82_P1 (ovde gore i u nastavku, P1) koji je u Francuskoj nacionalnoj zbirci mikroorganizama u Institutu Paster deponovan pod pristupnim brojem CNCM I-4694;

• vB_EcoM_LF82_P2 (ovde gore i u nastavku, P2) koji je u Francuskoj nacionalnoj zbirci mikroorganizama u Institutu Paster deponovan pod pristupnim brojem CNCM I-4695;

• vB_EcoM_LF82_P3 (ovde gore i u nastavku, P3) koji je u Francuskoj nacionalnoj zbirci mikroorganizama u Institutu Paster deponovan pod pristupnim brojem CNCM I-4696;

• vB_EcoM_LF82_P4 (ovde gore i u nastavku, P4) koji je u Francuskoj nacionalnoj zbirci mikroorganizama u Institutu Paster deponovan pod pristupnim brojem CNCM I-4697;

• vB_EcoM_LF82_P5 (ovde gore i u nastavku, P5) koji je u Francuskoj nacionalnoj zbirci mikroorganizama u Institutu Paster deponovan pod pristupnim brojem CNCM I-4698;

• vB_EcoM_LF82_P6 (ovde gore i u nastavku, P6) koji je u Francuskoj nacionalnoj zbirci mikroorganizama u Institutu Paster deponovan pod pristupnim brojem CNCM I-4699; i

• vB_EcoM_LF82_P8 (ovde gore i u nastavku, P8) koji je u Francuskoj nacionalnoj zbirci mikroorganizama u Institutu Paster deponovan pod pristupnim brojem CNCM I-4700.

[0066] CLB_P2, koji je u Francuskoj nacionalnoj zbirci mikroorganizama u Institutu Paster deponovan pod pristupnim brojem CNCM I-4675, i njegova izolacija detaljno je opisana u Maura et al.

Environmental Microbiology (2012) 14(8), 1844-1854.

[0067] Fagi P1 do P6 pripadaju wV8 porodici bakteriofaga.

[0068] P8 pripada RB69 porodici bakteriofaga.

[0069] CLB_P2 pripada JS98 porodici bakteriofaga.

[0070] Klasifikacija u wV8, RB69 i JS98 porodice bakteriofaga sprovedena je na osnovu sekvence velikog kapsidnog proteina.

PRIMER 3

In vitro analize infektivnosti bakteriofaga u sojevima AIEC

[0071] Analiza plaka sprovedena je kontaktom serijskih razblaživanja rastvora bakteriofaga (od nerazblaženih do 10<-8>razblaženja) sa Petrijevom šoljom čija je površina pokrivena jednom bakterijom. Nakon inkubacije tokom noći na 37°C, plakovi su prebrojani. Kada je testirana bakterija bila bakterija domaćin (referentni domaćin) upotrebljena za izolaciju bakteriofaga, smatralo se da je analiza plaka pokazala efikasnost od 100%. Kada testirana bakterija nije bila prvobitni domaćin, rezultati su izraženi poređenjem sa referentnim domaćinom. Rezultat veći od 80% (+++) znači da je bakterija veoma efikasan domaćin u poređenju sa referentnim domaćinom, dok rezultat između 0,1 i 80% (++) znači da je bakterija efikasan domaćin, a rezultat ispod 0,1% (+), ali iznad 0 znači da je bakterija umereno efikasan domaćin, i na kraju 0 (-) znači da je bakterija u potpunosti otporna.

Rezultati

[0072] Tabela 2 prikazuje rezultat spektra domaćina 8 faga (izolovanih/identifikovanih u Primeru 2) na 38 sojeva (od 166 sojeva izolovanih u Primeru 1, Tabela 1)

Table 2 Testirani sojevi i efektivna efikasnost zasejavanja na pločama (EOP) dobijena za svaki bakteriofag

Tabela 3 broj sojeva inficiranih fagovima:

2

Brojevi označavaju broj sojeva

inficiranih jednim bakteriofagom

PRIMER 4

In vivo replikacija bakteriofaga u utrobi miševa

[0073] In vivo replikacija bakteriofaga u utrobi miševa procenjena je na sledeći način:

Prvo, soj LF82 je projektovan da prenosi dva antibiotska otporna gena koja respektivno daju otpornost na Streptomicin i Kanamicin. Ovaj novi soj bakterija nazvan je LF82SK, dok su njegove invazivne karakteristike proverene kako bi bile slične prvobitnom soju LF82.

[0074] Tri (3) grupe od po dva (2) miša:

Grupa 1: nekolonizovani miševi fagi

Grupa 2: LF82SK kolonizovani miševi

Grupa 3: LF82SK kolonizovani miševi fagi

[0075] Streptomicin (5 g/L) je dodat u vodu za piće svih životinja 3 dana pre dana 0 i održavan je tokom eksperimenta.

[0076] Dana 0, LF82SK je dat Grupama 2 i 3 kako bi se omogućilo da soj kolonizuje utrobu miševa.

[0077] Dana 4, 200 µl koktela od P2 P6 bakteriofaga dato je Grupama 1 i 3 (rastvor u kateteru 10<8>pfu/ml) jednom ujutru i jednom popodne. P2+P6 bakteriofagi su takođe dodati u vodu za piće (10<8>pfu/ml). Dana 5 ujutru, miševi su žrtvovani radi procene broja bakterija i bakteriofaga u ileumu i fecesu.

Rezultati:

Bakterije (E. coli):

[0078]

Grupa 1: bez bakterija;

Grupa 2: u ileumu - 10<6>cfu/g organ; u fecesu - 10<8>cfu/organ;

Grupa 3: u ileumu i fecesu: sve bakterije su lizovane od strane faga.

Fagi:

[0079]

Grupa 1: u ileumu - 10<6>pfu/g organa; u fecesu - 10<7>pfu/organ;

Grupa 2: bez faga

Grupa 3: u ileumu - 10<6>pfu/g organa; u fecesu - 10<10>pfu/organ;

[0080] U fecesu je bilo 100 puta više faga u Grupi 3 nego u Grupi 1, što prikazuje multiplikaciju faga in vivo.

PRIMER 5

In vivo replikacija bakteriofaga u utrobi miševa

[0081] In vivo replikacija bakteriofaga u utrobi miševa procenjena je na sledeći način:

12 miševa je podeljeno u tri (3) grupe od po četiri (4) miša:

Grupa 1: nekolonizovani miševi fagi

Grupa 2: LF82SK-kolonizovani miševi

Grupa 3: LF82SK-kolonizovani miševi fagi

[0082] Streptomicin (5 g/L) je dodat u vodu za piće svih životinja 3 dana pre dana 0 i održavan je tokom eksperimenta.

[0083] Dana 0, LF82SK je dat miševima u Grupama 2 i 3 kako bi se omogućilo da soj kolonizuje utrobu miševa.

[0084] Dana 4, bakteriofagi (koktel od P2+P6+P8 na 10<8>pfu/mL svaki) su dodati u vodu za piće u Grupama 1 i 3.

[0085] Dana 5, miševi su žrtvovani radi procene broja bakterija i bakteriofaga u ileumu i fecesu. Uzeto je 100 µl ilealnih homogenata iz tri grupe radi ekstrakcije celokupnog DNK pomoću Maxwell® 16 Tissue DNK kompleta za prečišćavanje iz Promega.

Rezultati:

2

Bakterije (E. coli):

[0086]

Grupa 1: bez bakterija;

Grupa 2: u ileumu - 3,2·10<6>cfu/g organa; u fecesu - 1,2·10<9>cfu/g fecesa;

Grupa 3: u ileumu i fecesu: bakterije su lizovane od strane faga.

Fagi:

[0087]

Grupa 1: u ileumu - 1,4·10<6>pfu/g organa; u fecesu - 5,2·10<6>pfu/g fecesa;

Grupa 2: bez faga

Grupa 3: u ileumu - 2,6·10<6>pfu/g organa; u fecesu - 1,0·10<9>pfu/g fecesa;

[0088] U fecesu je bilo 200 puta više faga u Grupi 3 nego u Grupi 1, što prikazuje multiplikaciju faga in vivo.

[0089] DNK ekstrahovan iz ilealnih delova upotrebljen je za sprovođenje kvantitativnog PCR pomoću dva seta prajmera. Jedan set prajmera (SEQ ID NO: 30-31) služio je da amplifikuje DNK iz „svih bakterija“ prisutnih u uzorku, dok je drugi set (SEQ ID NO: 32-33) upotrebljen da amplifikuje konkretno DNK iz „E. coli“ bakterija. Nakon normalizacije, rezultati su izraženi kao odnos E. coli i svih bakterija.

[0090] Grupa 1: qPCR amplifikacije su bile uspešne kod svih prajmera bakterija, ali ne kod E. coli prajmera. Ovaj odnos se nije mogao izračunati.

[0091] Grupa 2: qPCR amplifikacije su bile uspešne kod oba seta prajmera. Prosečan odnos bio je 0,6 (60% svih bakterija bile su E. coli bakterije).

[0092] Grupa 3: qPCR amplifikacije su bile uspešne kod oba seta prajmera. Prosečan odnos bio je 0,1 (10% svih bakterija bile su E. coli bakterije). Treba zapaziti da je kod jednog miša prikazan odnos od 0,4, dok su kod ostala tri bile prikazane mnogo niže vrednosti (0,06; 0,0002; 0,002).

[0093] Posledica ovoga bila je da su bakteriofagi bili u mogućnosti da smanje nivo ilealne kolonizacije bakterija LF82 najmanje jednim redom veličine kod tri od četiri miša.

PRIMER 6

In vivo analiza infektivnosti bakteriofaga

2

[0094] Dva koktela faga su odabrana za testiranje divljeg tipa (WT) miševa i CEACAM6 miševa inficiranih sojem LF82 E. coli izolovanim iz CD pacijenata. I kod WT miševa i kod CEACAM6 miševa inficiranih sojem LF82 E. coli izolovanim iz CD pacijenata, bakteriofagi se daju miševima oralno kateterom u CMC. Ova vrsta davanja ima mnogo prednosti: poznata količina davanja bakteriofaga i neposredna neutralizacija kiselosti želuca. Fagi se daju miševima na dnevnom nivou tokom celokupne studije.

- Miševi su žrtvovani 5 dana nakon davanja LF82.

- Glavni kriterijumi: kvantifikacija LF82 u ilealnoj i crevnoj adherentnoj flori miševa.

- Sporedni kriterijumi:

∘ Procena težine

∘ Konzistentnost stolice.

∘ Prisustvo krvi u stolici (makro i bio)

- Luminalna flora (konvencionalna flora LF82 fagi)

∘ Pri žrtvovanju: Makroskopska i histološka ispitivanja, adherentna ilealna i crevna flora LF82 fagi,

∘ Pri žrtvovanju: Makroskopska i histološka ispitivanja, adherentna ilealna i crevna flora LF82 fagi.

[0095] Prate se biološki parametri zapaljenja, a traži se translokacija bakteriofaga u mezenterijalnim limfnim čvorovima (MLN), jetri i slezini.

[0096] Prate se zapaljenjski markeri (MPO, prozapaljenjski citokini IL-6, IL-12 i antizapaljenjski citokini IL-10). Traži se translokacija bakteriofaga i AIEC u MLN, jetri i slezini.

[0097] Nastavak eliminacije bakteriofaga odvija se u stolicama miševa koji primaju koktel bakteriofaga bez soja LF82.

PRIMER 7

In vivo analiza koktela faga na soju LF82.

[0098] In vivo replikacija bakteriofaga (koktel od P2+P6+P8+CLB P2) u utrobi miševa procenjena je na sledeći način:

20 miševa je podeljeno u dve (2) grupe od po deset (10) miševa u svakoj:

2

Grupa 1: LF82SK-kolonizovani miševi

Grupa 2: LF82SK-kolonizovani miševi fagi

[0099] Streptomicin (5 g/L) je dodat u vodu za piće svih životinja 3 dana pre dana 0 i održavan je tokom eksperimenta.

[0100] Dana 0, LF82SK je dat miševima u obe grupe kako bi se omogućilo da soj kolonizuje utrobu miševa.

[0101] Dana 3, bakteriofagi (koktel od P2+P6+P8+CLB_P2 na 10<8>pfu/mL svaki) su dati miševima u Grupi 2 preko katetera.

[0102] Dana 4 i 7, 5 miševa u svakoj grupi žrtvovano je radi procene broja bakterija i bakteriofaga u ileumu, debelom crevu i fecesu. Uzeto je 100 µl ilealnih i crevnih homogenata iz dve grupe radi ekstrahovanja celokupnog DNK pomoću Maxwell® 16 Tissue DNK kompleta za prečišćavanje iz Promega.

Rezultati:

Nivo LF82 u stolicama:

[0103] Dana 4 i 7, nivoi LF82 su bili:

u grupi 1: 710<9>; 110<9>cfu/g

u grupi 2: 810<7>; 510<8>cfu/g

Nivoi faga u stolicama:

[0104] Dana 4 i 7, nivoi faga su bili:

u grupi 1: nijedan

u grupi 2: 510<9>; 610<9>pfu/g

[0105] U prisustvu koktela faga nivo LF82 u stolici bio je značajno niži nego u njihovom odsustvu, što pokazuje da je koktel faga mogao da inficira LF82 u utrobi miševa.

Nivo LF82 u organima:

[0106] dana 4, nivoi LF82 su bili:

2

u ileumu grupe 1: 100% bakterija su E. coli (LF82)

u ileumu grupe 2: 20% bakterija su E. coli (LF82)

u debelom crevu grupe 1: 40% bakterija su E. coli (LF82)

u debelom crevu grupe 2: 2% bakterija su E. coli (LF82)

[0107] dana 7, nivoi LF82 su bili:

u ileumu grupe 1: 100% bakterija su E. coli (LF82)

u ileumu grupe 2: 50% bakterija su E. coli (LF82)

u debelom crevu grupe 1: 25% bakterija su E. coli (LF82)

u debelom crevu grupe 2: 10% bakterija su E. coli (LF82)

Nivo faga u organima:

[0108] dana 4, nivoi faga su bili:

u ileumu grupe 1: nijedan

u ileumu grupe 2: 710<8>pfu/g

u debelom crevu grupe 1: nijedan

u debelom crevu grupe 2: 510<10>pfu/g

[0109] dana 7, nivoi LF82 su bili:

u ileumu grupe 1: nijedan

u ileumu grupe 2: 710<8>pfu/g

u debelom crevu grupe 1: nijedan

u debelom crevu grupe 4: 210<8>pfu/g

[0110] Dana 2 i 5, nivo LF82 je smanjen i u ileumu i u debelom crevu u grupi tretiranoj fagima. Ovo pokazuje da fagi inficiraju LF82 u delovima utrobe, a ne samo u stolicama. Konkomitantno, nivo faga dana 7 ostaje podjednako visok kao i dana 2, što pokazuje da fagi mogu trajati nekoliko dana u utrobi nakon jedinstvenog početnog davanja.

PRIMER 8

2

In vivo analiza infektivnosti bakteriofaga

[0111] In vivo analiza infektivnosti bakteriofaga (koktel od P2+P6+P8) kod CEACAM6 miševa inficiranih sa LF82SK procenjena je na sledeći način:

48 miševa je podeljeno u četiri (4) grupe na sledeći način:

Grupa 1: nekolonizovani miševi (8 miševa)

Grupa 2: nekolonizovani miševi fagi (12 miševa)

Grupa 3: LF82SK-kolonizovani miševi (16 miševa)

Grupa 4: LF82SK-kolonizovani miševi fagi (12 miševa)

[0112] DSS (dekstran sulfat) 0,25% je uveden u vodu za piće 3 dana pre dana 0 i čuvan tokom eksperimenta.

[0113] Streptomicin (5mg) je dat oralno putem katetera svim životinjama 1 dan pre dana 0.

[0114] Dana 0, LF82SK je dat miševima u Grupama 3 i 4 kako bi se omogućilo da soj kolonizuje utrobu miševa.

[0115] Dana 1, fagi (koktel od P2+P6+P8 na 10<7>pfu/mL svaki) su jednom dati svakom mišu u Grupama 2 i 4 oralno putem katetera u CMC. Ova vrsta davanja ima mnogo prednosti: poznata količina davanja bakteriofaga i neposredna neutralizacija kiselosti želuca.

[0116] Dana 1, 4 miša u Grupi 3 su žrtvovana radi procene broja bakterija u ileumu, u debelom crevu i u fecesu pre davanja faga.

[0117] Dana 2, respektivno 4, 6, 6 i 6 miševa u Grupama 1, 2, 3 i 4 žrtvovano je radi procene broja bakterija i bakteriofaga u ileumu, u crevu i u fecesu.

[0118] Dana 5, respektivno 4, 6, 6 i 6 miševa u Grupama 1, 2, 3 i 4 žrtvovano je radi procene broja bakterija i bakteriofaga u ileumu, u crevu i u fecesu.

[0119] Uzeto je 100 µl ilealnih, crevnih i homogenata fecesa iz četiri grupe radi ekstrahovanja celokupnog DNK pomoću Maxwell® 16 Tissue DNK kompleta za prečišćavanje iz Promega. Težina, konzistentnost stolice i prisustvo krvi u stolici praćeni su na dnevnom nivou.

[0120] DNK ekstrahovan iz ilealnih delova upotrebljen je za sprovođenje kvantitativnog PCR pomoću jednog seta prajmera (SEQ ID NO: 44-45) radi amplifikovanja specifičnog gena (pMT1) iz LF82. Rezultati su izraženi kao broj kopija ovog gena po gramu tkiva.

LF82 pMT1 F (SEQ ID NO:44) CCATTCATGCAGCAGCTCTTT

LF82 pMT1 R (SEQ ID NO:45) ATCGGACAACATTAGCGGTGT

Rezultati:

[0121] Vrednosti predstavljaju srednje vrednosti dobijene za svaku grupu miševa.

[0122] U grupi 1, ni LF82 ni fagi nisu detektovani tokom eksperimenta.

Nivo LF82 u stolicama:

[0123]

Dana 1: nivo LF82 u Grupama 3 i 4 bio je 510<9>i 610<9>cfu/g respektivno.

Dana 2, 3 i 5 nivoi LF82 su bili:

u grupi 3: 310<9>; 510<8>; 510<7>cfu/g

u grupi 4: 510<5>; 510<5>; 510<3>cfu/g

Nivo faga u stolicama:

[0124] Dana 2, 3 i 5, nivoi faga su bili:

u grupi 2: 510<5>pfu/g; nije detektovano; nije detektovano

u grupi 4: 110<9>; 110<7>; 510<6>pfu/g

[0125] U prisustvu faga nivo LF82 u stolicama bio je značajno niži nego u njihovom odsustvu.

Konkomitantno, nivo faga je bio značajno viši kod miševa kolonizovanih od strane LF82 nego kod miševa bez LF82. Oba podatka su potvrdila da fagi mogu inficirati LF82 u utrobi.

Nivo LF82 u organima:

[0126]

dana 2, nivoi LF82 su bili:

u ileumu grupe 3: 210<6>kopija pMT1/g

u ileumu grupe 4: 810<4>kopija pMT1/g

u debelom crevu grupe 3: 210<7>kopija pMT1/g

u debelom crevu grupe 4: 110<5>kopija pMT1/g

1

dana 5, nivoi LF82 su bili:

u ileumu grupe 3: 510<4>kopija pMT1/g

u ileumu grupe 4: 810<4>kopija pMT1/g

u debelom crevu grupe 3: 610<6>kopija pMT1/g

u debelom crevu grupe 4: 210<5>kopija pMT1/g

Nivo faga u organima:

[0127]

dana 2, nivoi faga su bili:

u ileumu grupe 2: nije detektovano

u ileumu grupe 4: 810<5>pfu/g

u debelom crevu grupe 2: 510<4>pfu/g

u debelom crevu grupe 4: 510<6>pfu/g

dana 5, nivoi LF82 su bili:

u ileumu grupe 2: nije detektovano

u ileumu grupe 4: nije detektovano

u debelom crevu grupe 2: nije detektovano

u debelom crevu grupe 4: 210<4>pfu/g

[0128] Dana 2, nivo LF82 je smanjen i u ileumu i u crevu u grupi tretiranoj fagima. Ovo pokazuje da su fagi inficirali LF82 u delovima utrobe, a ne samo u stolicama. Konkomitantno, nivo faga je bio značajno viši kod miševa kolonizovanih od strane LF82 nego kod miševa bez LF82.

[0129] Dana 5, nivo LF82 u ileumu je bio previše slab da bi se videla razlika između dve grupe, dok je kod uzoraka u debelom crevu nivo LF82 bio i dalje smanjen u grupi koja je primila fage u poređenju sa grupama koje nisu. Konkomitantno, mogli su se detektovati isključivo fagi u debelom crevu miševa kolonizovanih od strane LF82. Ovo pokazuje da dejstvo faga u smanjenju LF82 može trajati nekoliko dana nakon početnog davanja.

[0130] Uprkos visokom nivou kolonizacije LF82 uočenom u ovom eksperimentu, nije uočen nikakav znak kolitisa u bilo kojoj grupi.

2

4

�

4

1

2

Claims

Patentni zahtevi

1. Farmaceutska kompozicija koja obuhvata kombinaciju dva ili više od sledećih:

- soj bakteriofaga P1 koji je u Francuskoj nacionalnoj zbirci mikroorganizama u Institutu Paster deponovan pod pristupnim brojem CNCM I-4694 ili njegova varijanta, pri čemu ta varijanta ima istu litičku aktivnost i iste fenotipske karakteristike kao i navedeni soj bakteriofaga P1;

- soj bakteriofaga P2 koji je u Francuskoj nacionalnoj zbirci mikroorganizama u Institutu Paster deponovan pod pristupnim brojem CNCM I-4695 ili njegova varijanta, pri čemu ta varijanta ima istu litičku aktivnost i iste fenotipske karakteristike kao i navedeni soj bakteriofaga P2;

- soj bakteriofaga P3 koji je u Francuskoj nacionalnoj zbirci mikroorganizama u Institutu Paster deponovan pod pristupnim brojem CNCM I-4696 ili njegova varijanta, pri čemu ta varijanta ima istu litičku aktivnost i iste fenotipske karakteristike kao i navedeni soj bakteriofaga P3;

- soj bakteriofaga P4 koji je u Francuskoj nacionalnoj zbirci mikroorganizama u Institutu Paster deponovan pod pristupnim brojem CNCM I-4697 ili njegova varijanta, pri čemu ta varijanta ima istu litičku aktivnost i iste fenotipske karakteristike kao i navedeni soj bakteriofaga P4;

- soj bakteriofaga P5 koji je u Francuskoj nacionalnoj zbirci mikroorganizama u Institutu Paster deponovan pod pristupnim brojem CNCM I-4698 ili njegova varijanta, pri čemu ta varijanta ima istu litičku aktivnost i iste fenotipske karakteristike kao i navedeni soj bakteriofaga P5;

- soj bakteriofaga P6 koji je u Francuskoj nacionalnoj zbirci mikroorganizama u Institutu Paster deponovan pod pristupnim brojem CNCM I-4699 ili njegova varijanta, pri čemu ta varijanta ima istu litičku aktivnost i iste fenotipske karakteristike kao i navedeni soj bakteriofaga P6;

- soj bakteriofaga P8 koji je u Francuskoj nacionalnoj zbirci mikroorganizama u Institutu Paster deponovan pod pristupnim brojem CNCM 1-4700 ili njegova varijanta, pri čemu ta varijanta ima istu litičku aktivnost i iste fenotipske karakteristike kao i navedeni soj bakteriofaga P8;

- soj bakteriofaga CLB_P2 koji je u Francuskoj nacionalnoj zbirci mikroorganizama u Institutu Paster deponovan pod pristupnim brojem CNCM I-4675 ili njegova varijanta, pri čemu ta varijanta ima istu litičku aktivnost i iste fenotipske karakteristike kao i navedeni soj bakteriofaga CLB_P2.

2. Farmaceutska kompozicija prema zahtevu 1 koja obuhvata:

4

- soj bakteriofaga P2 koji je u Francuskoj nacionalnoj zbirci mikroorganizama u Institutu Paster deponovan pod pristupnim brojem CNCM I-4695 ili njegovu varijantu, pri čemu ta varijanta ima istu litičku aktivnost i iste fenotipske karakteristike kao i navedeni soj bakteriofaga P2;

- soj bakteriofaga P8 koji je u Francuskoj nacionalnoj zbirci mikroorganizama u Institutu Paster deponovan pod pristupnim brojem CNCM 1-4700 ili njegovu varijantu, pri čemu ta varijanta ima istu litičku aktivnost i iste fenotipske karakteristike kao i navedeni soj bakteriofaga P8; i - soj bakteriofaga CLB_P2 koji je u Francuskoj nacionalnoj zbirci mikroorganizama u Institutu Paster deponovan pod pristupnim brojem CNCM I-4675 ili njegovu varijantu, pri čemu ta varijanta ima istu litičku aktivnost i iste fenotipske karakteristike kao i navedeni soj bakteriofaga CLB_P2.

3. Farmaceutska kompozicija prema bilo kom od zahteva 1 ili 2, pri čemu je navedena farmaceutska kompozicija namenjena za upotrebu u lečenju zapaljenjske bolesti creva.

4. Farmaceutska kompozicija prema bilo kom od zahteva 1 ili 2 ili farmaceutska kompozicija za upotrebu prema zahtevu 3, pri čemu navedena farmaceutska kompozicija obuhvata farmaceutski prihvatljiv nosač.

5. Farmaceutska kompozicija za upotrebu prema bilo kom od zahteva 3 ili 4, pri čemu zapaljenjsku bolest creva predstavlja Kronova bolest.

6. Farmaceutska kompozicija za upotrebu prema bilo kom od zahteva 3 do 5, pri čemu je farmaceutska kompozicija namenjena za oralno davanje.

Izdaje i štampa: Zavod za intelektualnu svojinu, Beograd, Kneginje Ljubice 5