RS62641B1 - Farmaceutski preparat ugljenih hidrata za terapeutsku upotrebu - Google Patents

Description

Opis

UNAKRSNE REFERENCE KOJE UPUĆUJU NA POVEZANE PRIJAVE

[0001] Ova prijava se poziva na U.S. privremenu prijavu br.61/878,591, koja je podneta 16. septembra 2013. godine.

OBLAST

[0002] Ovaj pronalazak se odnosi na kompozicije koje sadrže ugljene hidrate enkapsulirane u lipidnoj čestici za dostavu u unutrašnjost ćelije, postupke dostave enkapsuliranih ugljenih hidrata u unutrašnjost ćelija, i postupke upotrebe takvih kompozicija za lečenje bolesti i poremećaja, kao što su urođeni poremećaji glikozilacije (CDG). Na primer, ovaj pronalazak se odnosi na postupke za pripremu ugljenih hidrata i glikolipida za farmaceutsku dostavu u unutrašnjost ćelije, endoplazmatski retikulum (ER), i Golgi.

POZADINA

[0003] Glikozilacija, enzimsko pričvršćivanje ugljenih hidrata (glikana) za proteine i lipide predstavlja kontranslacionu i post-translacionu modifikaciju (PTM) koja je uobičajenija od bilo koje druge PTM jer se odnosi na većinu proteina sintetisanih u grubom endoplazmatskom retikulumu (ER). Glikozilacija igra kritičnu ulogu u raznim biološkim procesima membrane i izlučenih proteina. U ER, glikozilacija definiše strukturu proteina i savijanja i dejstvuje kao mehanizam kontrole kvaliteta koji diktira izvoz pravilno savijenih proteina u Golgi ili cilja nepravilno savijene proteine zbog degradacije. Glikanske grupe takođe mogu da dejstvuju kao ligandi za receptore ćelijskih površina kako bi se posredovalo u pričvršćivanju ćelija ili kako bi se stimulisali putevi prenosa signala. Urođeni poremećaji glikozilacije, takođe poznati kao CDG sindromi, su grupa retkih genetskih bolesti, pri čemu proteini tkiva i/ili lipidi nose defektivnu glikozilaciju i/ili im nedostaje glikozilacija. Ove bolesti su povezane sa brojnim enzimskim nedostacima i često uzrokuju ozbiljna, ponekad fatalna, oštećenja nervnog sistema, mišića, i nekoliko drugih sistema organa.

[0004] Uobičajeni klinički simptomi kod dece sa CDG uključuju hipotoniju, zastoj u razvoju, nenapredovanje, hepatičku disfunkciju, koagulopatiju, hipotiroidizam, ezotropiju, obrazac abnormalne debljine i obrnute bradavice, hipoglikemiju, napad, cerebralnu hipoplaziju, i epizode poput infarkta kod dece sa zastojem u razvoju. U starijem uzrastu, u adolescenciji, i odraslom dobu, prezentacija može da uključuje ataksiju, kognitivno oštećenje, i odsustvo puberteta kod žena, male testise kod muškaraca, retinitis pigmentosa, skoliozu, kontrakture zglobova, i perifernu neuropatiju.

[0005] CDG mogu biti klasifikovani u dve grupe: CDG tip I i CDG tip II. CDG tip I karakterišu nedostaci u početnim fazama glikolizacije N-vezanih proteina, tj., biosinteze oligosaharida povezanog sa dolihol pirofosfatom (DLO), koja se javlja kod ER, ili transfera DLO na ostatke aspargina novonastalih polipeptida. CDG tip II uključuje nedostatke u daljoj obradi (sintetički ili hidrolitički) proteinski-vezanog glikana. Trenutno su identifikovane dvadeset dve varijante CDG tipa i četrnaest varijanti tipa II. Jedan od najuobičajenijih podtipova CDG je CDG-Ia (približno 70% svih CDG slučajeva), kojeg karakteriše gubitak ili smanjenje dejstva fosfomanomutaze 2 (PMM) što dovodi do nedostatka ili insuficijencije intracelularne N-glikozilacije (Jaeken et al. J. of Inherit. Met. Disease.2008, 31: 669-672). PMM je odgovoran za konverziju manoza-6-fosfata u manoza-1-fosfat.

[0006] Iako je istraženo nekoliko različitih pristupa terapijama u razvoju za CDG, istraživači nastavljaju svoju potragu za pogodnim lekom ili terapijom za ublažavanje same bolesti. Postojeće terapije za manifestacije uključuju, na primer, dodatke ishrani, ishranu preko sonde, i širok opseg terapija kojima pokušavaju da se leče gastroezofagealni refluks, zastoji u razvoju, očne abnormalnosti, i hipotiridizam. Pacijenti takođe zahtevaju intravensku (IV) hidrataciju i fizičku terapiju za epizode poput infarkta.

Odraslima sa ortopedskim simptomima često su potrebna kolica, sredstva za prenos, i hirurško lečenje skolioze (Sparks et al., Disorders of Glycosylation Overview.2005 In: Pagon RA, Adam MP, Bird TD, et al., editors. GeneReviews™. Seattle (WA): University of Washington, Seattle; 1993-2013).

[0007] Trenutno CDG-Ib je jedini poznati CDG za koji je dostupno relativno efektivno lečenje, naime oralno davanje D-manoze. Međutim, takva terapija možda neće biti efikasna u lečenju pacijenata sa CDG-Ia i trenutno postoje ograničene opcije lečenja za druge CDG I tip podtipove i CDG tip II bolesti. Jedan od razloga za nedostatak utvrđene terapije za CDG-I poremećaje može biti usled oblija heterogenih kliničkih fenotipova predstavljenih tako da ne pokazuju direktnu korelaciju sa dejstvom PMM enzima.

[0008] Pacijenti koji pate od smanjenja PMM dejstva su smanjili proizvodnju manoza-1-fosfata (Man-1-P), povezanu sa simptomima multivisceralnih oštećenja. Kako bi se prevazišao deficit PMM proizvodnje, važno je da se nizvodni enzimi snabdevaju potrebnim supstratom (tj., Man-1-P). Međutim, dostava i održavanje takvog sistemskog snabdevanja Man-1-P je problematično, budući da ekstracelularni enzimi unutar telesnih tečnosti degradiraju Man-1-P kada se egzogeno dostavljaju oralnom ili intravenskom primenom. Drugi problem sa egzogeno dostavljenim Man-1-P je taj što njegov visoki polaritet sprečava Man-1-P da prodire u unutrašnjost ćelije (tj., citozol) i samim tim da se leči deficit proizvodnje PMM.

[0009] Derivati polarnog Man-1-P mogu biti sintetisani kako bi se Man-1-P učinio propusnijim za ćelije (US patenta objava br.2009/0054353). Ovaj pristup, međutim, je takođe problematičan, jer se ćelijski propusan Man-1 derivat pokazao kao ili nestabilan za kliničku upotrebu ili citotoksičan putem sporednih proizvoda Man-1-P derivata (Eklund et al., Glycobiology 2005, 15: 1084-1093; Rutschow et al. Bioorg Med Chem 2002, 10: 4043-4049; i Hardre et al., Bioorg Med Chem Lett 2007, 17: 152-155).

[0010] Druge potencijalne terapije su fokusirane na inhibiranje enzima koji katabolizuju manoza-6-fosfat (Man-6-P), prekursor Man-1-P, putem inhibicije izomeraza fosfomanoze (PMI). Ovaj pristup se fokusira na prisiljavanje reakcije ka optimizovanju homeostaze, koja bi uz upotrebu PMI inhibitora, skrenula ka proizvodnji Man-6-P. Ovi pristupi, međutim, nisu efektivni kao opcije za kliničko lečenje zbog svoje povezane toksičnosti, neželjenih reakcija, i slabe selektivne penetracije u tkivo.

[0011] Shodno tome, neispunjene potrebe postoje zbog poboljšanih kompozicija i postupaka za dostavu ugljenih hidrata, kao što je Man-1-P, u unutrašnjost ćelija da bi se lečili poremećaji, kao što su urođeni poremećaj glikozilacije (CDG), u subjektima (uključujući, na primer, ljude) kojima je potrebno takvo lečenje.

KRATAK SADRŽAJ

[0012] Ovo otkrivanje ispunjava gore opisane nezadovoljene potrebe obezbeđivanjem ugljenih hidrata koje enkapsuliraju nanonosači koji se bave problemima citotoksičnosti i stabilnosti povezanih sa ili prodirućim ćelijama ili pomoću derivata ugljenih hidrata. Takvi ugljeni hidrati mogu biti endogeni ugljeni hidrati, uključujući, na primer, manoza-1-fosfat. Upotrebom endocitotičnih puteva, nanonosači mogu da uđu u unutrašnjost ćelije i da dostave ugljeni hidrat u citozol ćelije. Ova primena nanonosača koji enkapsuliraju ugljene hidrate, olakšava istovremeno lakoću terapije, čime se omogućava da veće doze ugljenih hidrata dostignu put biohemijske glikozilacije, kao i potencijalno olakšanje prilikom primene. U nekim aspektima, ovo otkrivanje obezbeđuje postupke za pripremu ugljenih hidrata i glikolipida pomoću nanonosača za farmaceutsku dostavu u unutrašnjost ćelije, endoplazmatski retikulum, i Golgi. Ovo otkrivanje obezbeđuje zamenske terapije ugljenih hidrata za, ali bez ograničenja na, lečenje bolesti CDG tip I i II.

[0013] Ovo otkrivanje se takođe bavi nezadovoljenim potrebama povezanim sa efektivnim terapeuticima za bolesti, kao što su bolesti CDG, kao i problemima koji su povezani sa dostavom takvih terapeutika. U nekim aspektima, ovo otkrivanje obezbeđuje postupak dostave ugljenih hidrata kao što je manoza-1-fosfat u citozol ćelija. Bez želje za vezivanjem za bilo koju teoriju, veruje se da bi takav postupak dostave ugljenih hidrata (npr., kao deo leka) zaobišao rad genetski defektnih citozolnih enzima, naime fosfomanomutaze (PMM) i fosfomanoza izomeraze (PMI), za koje se smatra da prevladavaju kod CDG I poremećaja.

[0014] U nekim načinima ostvarivanja, kompozicije ovog otkrivanja mogu da uključuju dostavu, na primer, manoza-1-fosfata u citozol ćelija pomoću nanonosača. Određenije, biodegradabilne i biokompatiblne lipid-sterol-vaoda lamelarne nanostrukture mogu da se koriste za enkapsuliranje ugljenog hidrata. Otkriveni lek predstavlja najpotentniju i najvijabilniju opciju lečenja za poremećaje, kao što je CDG Ia poremećaj.

[0015] U određenim načinima ostvarivanja, ovo otkrivanje obezbeđuje kompozicije koje sadrže lipidnu česticu i ugljene hidrate, kao što su endogeni ugljeni hidrati, enkapsulirani u lipidnoj čestici, i postupke koji koriste takve kompozicije kako bi se ugljeni hidrat dostavio u unutrašnjost ćelija i da bi se lečile bolesti i poremećaji, kao što su urođeni poremećaji glikozilacije (CDG).

[0016] U nekim načinima ostvarivanja, ovde opisane kompozicije su lekovi. Takve kompozicije (npr., lekovi) mogu da uključuju vodenu suspenziju lipozoma koja obuhvata, na primer, manoza-1-fosfat. Lipozomi mogu da se naprave od lipida koji obrazuju vezikule, kao što je ali bez ograničenja na fosfatidilholin (PC). Lipozom takođe može biti pripremljen u vezi sa sterolom, naime holesterolom. Puni lipozom može biti obogaćen polietilen glikolom (PEG), ili PEGilisan, kako bi se pojačala cirkulacija i zadržavanje sa telesnim tečnostima nakon primene, kao i kako bi se zaštitio lipozom od prevremene razgradnje i izlučivanja leka iz tela subjekta kojem je potrebno takvo lečenje.

[0017] Shodno tome, kompozicija ovog pronalaska obuhvata lipidnu česticu i endogeni ugljeni hidrat enkapsuliran u lipidnoj čestici, kako je definisano u patentnim zahtevima, pri čemu lipidna čestica sadrži molekul koji je sposoban da minimizuje degradaciju lipidne čestice i/ili ojača zadržavanje lipidne čestice kada se daje subjektu, i/ili čini lipidnu česticu imunotolerantnom kada se daje subjektu, pri čemu je molekul polietilen glikol (PEG).

[0018] Drugi aspekti ovog otkrivanja se odnose na kompoziciju koja sadrži lipidnu česticu koja sadrži polietilen glikol (PEG) i ugljeni hidrat enkapsuliran u lipidnoj čestici. Drugi aspekti ovog otkrivanja se odnose na kompoziciju koja sadrži lipidnu česticu; i ugljeni hidrat enkapsuliran u lipidnoj čestici, pri čemu ta lipidna čestica sadrži holin, etanolamin, glicerol, inositol, ili bilo koju njihovu kombinaciju. U nekim načinima ostvarivanja, lipidna čestica dalje uključuje molekul, kao što je postojani molekul, koji je sposoban da minimizuje degradaciju lipidne čestice i/ili ojača zadržavanje lipidne čestice kada se daje subjektu, i/ili čini lipidnu česticu imunotolerantnom kada se daje subjektu. U nekim načinima ostvarivanja, lipidna čestica je odabrana iz grupe koju čine lipozom, miscela, čvrsta lipidna nanočestica, i niozom. U nekim načinima ostvarivanja, lipidna čestica je lipozom. U nekim načinima ostvarivanja, lipozom je postojani lipozom koji može biti imunotolerantan. Endogeni ugljeni hidrat je odabran iz grupe koju čine manoza, fosforilisana manoza, manofuranoza, fosforilisana manofuranoza, manopiranoza, fosforilisana manopiranoza, i manoza-1-fosfat. U nekim načinima ostvarivanja, endogeni ugljeni hidrat je manoza-1-fosfat.

[0019] Drugi aspekti ovog otkrivanja se odnose na kompoziciju koja sadrži lipozom; i manoza-1-fosfat enkapsuliran u lipozomu, pri čemu lipozom obuhvata holesterol i fosfatidiletanolamin (PE) pričvršćen za polietilen glikol (PEG).

[0020] Drugi aspekti ovog otkrivanja se odnose na farmaceutsku kompoziciju koja sadrži kompoziciju bilo kog od prethodnih načina ostvarivanja, i farmaceutski prihvatljiv nosač.

[0021] Drugi aspekti ovog otkrivanja se odnose na komplet koji sadrži kompoziciju bilo kog od prethodnih načina ostvarivanja za upotrebu u bilo kom od ovde opisanih postupaka.

[0022] Drugi aspekti ovog otkrivanja se odnose na postupak za dostavu ugljenog hidrata subjektu kome je to potrebno, davanjem kompozicije tom subjektu bilo kog od prethodnih načina ostvarivanja. U nekim načinima ostvarivanja, kompozicija se primenjuje oralno, topikalno, dermalno, nazalno, intravenski, intramuskularno, intraperitonealno, intracerebrospinalno, intrakranijalno, intraspinalno, subkutano, intra-artikularno, intrasinovijalno, ili intratekalno.

[0023] Drugi aspekti ovog otkrivanja se odnose na postupak za dostavu ugljenog hidrata u unutrašnjost ćelije subjekta kome je to potrebno, davanjem tom subjektu kompozicije prema bilo kom od prethodnih načina ostvarivanja. U nekim načinima ostvarivanja, kompozicija se primenjuje oralno, topikalno, dermalno, nazalno, intravenski, intramuskularno, intraperitonealno, intracerebrospinalno, intrakranijalno, intraspinalno, subkutano, intra-artikularno, intrasinovijalno, ili intratekalno.

[0024] Drugi aspekti ovog otkrivanja se odnose na postupak za lečenje urođenog poremećaja glikozilacije (CDG) kod subjekta kome je to potrebno, davanjem kompozicije tom subjektu bilo kog od prethodnih načina ostvarivanja. U nekim načinima ostvarivanja, urođeni poremećaj glikozilacije (CDG) je odabran iz grupe koju čine poremećaj CDG tip I, CDG-Ia poremećaj, CDG tip II poremećaj, CDG-IIc poremećaj, i CDG-IIf poremećaj. U nekim načinima ostvarivanja, urođeni poremećaj glikozilacije (CDG) je CDG-Ia poremećaj. U nekim načinima ostvarivanja, kompozicija se primenjuje oralno, topikalno, dermalno, nazalno, intravenski, intramuskularno, intraperitonealno, intracerebrospinalno, intrakranijalno, intraspinalno, subkutano, intra-artikularno, intrasinovijalno, ili intratekalno.

OPIS CRTEŽA

[0025] Sledeći numerisani načini ostvarivanja predstavljaju neke aspekte ovog pronalaska.

FIG.1A prikazuje primer strukture manoza-1-fosfat (M1P). FIG.1B prikazuje primer strukture polietilen glikola (PEG). FIG.1C prikazuje primer strukture fosfatidiletanolamina (PE) pričvršćenog za PEG. FIG.1D prikazuje primer strukture fosfatidilholina (PC).

FIG.2 prikazuje primer strukture kompozicije lipozoma koja sadrži ugljeni hidrat enkapsuliran unutar jezgra lipozoma.

DETALJAN OPIS

[0026] Ovde su obezbeđeni farmaceutski nanonosači ugljenih hidrata kako je definisano u patentnim zahtevima (npr., lipidne kompozicije koje sadrže lipidnu česticu i jedan ili više ugljenih hidrata) koji su sposobni za dostavu ugljenih hidrata u unutrašnjost ćelije uključujući, bez ograničenja, citoplazmu, endoplazmatski retikulum, i Golgi. Pogodni nanonosači uključuju, ali bez ograničenja na, lipozome, miscele, čvrste lipidne nanočestice, i niozome.

[0027] Kako je ovde otkriveno, kompozicija pogodnih nanonosača nije ograničena na bilo koju klasu i molekulsku masu lipida, polietilen glikol, ili njihove derivate. U nekim načinima ostvarivanja, ovo otkrivanje se konkretnije odnosi na, ali nije ograničeno na, lipozomalne preparate manoza-1-fosfata.

[0028] Kako je ovde otkriveno u nekim načinima ostvarivanja, ugljeni hidrati ovog otkrivanja mogu biti integrisani u lipozome dizajnirane za konkretno ciljanje unutrašnjosti ćelije, ER, ili Golgi. Može biti iskorišćen hemoenzimski pristup sintezi oligosaharida povezanog sa dolihol pirofosfatom (Wang Z. et al., Science, 2013, 341, 379-383 i Weerapana E. et al., J. Am. Chem. Soc., 2005, 127, 13766-13767). U nekim načinima ostvarivanja, lipozomalni preparati mogu biti optimizovani za svaki ciljani odeljak ćelije kako je opisano u Torchilin V. et al., Curr. Protein Pept. Sci., 2003, 4, 133-140; Pollock S. et al., FASEB, 2010, 24, 1866-1878; Fujiwara T. et al., Int. J. Pharm., 2010, 386, 122-130; i WO 2009/118658 A2.

[0029] U drugim načinima ostvarivanja, gradivna modifikacija u lipozom može da uključuje, ali bez ograničenja na, lance holesteril hemisukcinata (CH) i polietilen glikola (PEG). Kako je ovde otkriveno, takve modifikacije mogu da štite grupe ugljenih hidrata prilagođene nanočestice od degradiranja i pojačaće cirkulaciju i/ili retenciono vreme farmaceutskog preparata u telu.

[0030] Shodno tome, ovo otkrivanje obezbeđuje lipid kompozicije koje sadrže lipidnu česticu i jedan ili više ugljenih hidrata, kao što su endogeni ugljeni hidrati, enkapsulirani u lipidnoj čestici kako je definisano u patentnim zahtevima, pri čemu su lipidne kompozicije sposobne da dostavljaju ugljeni hidrat u u unutrašnjost ćelije. U nekim načinima ostvarivanja, takve lipidne kompozicije koje nose ugljene hidrate su korisne za lečenje, sprečavanje, ili smanjenje rizika od urođenog poremećaja glikozilacije (CDG) kod subjekta kome je to potrebno. U nekim načinima ostvarivanja, lipidna čestica može biti lipozom, miscela, čvrsta lipidna nanočestica, ili noizom. U nekim načinima ostvarivanja, jedan ili više ugljenih hidrata može biti manoza-1-fosfat. U nekim načinima ostvarivanja, lipidna čestica sadrži molekul koji je sposoban da minimizuje degradiranje lipidne čestice i/ili ojača zadržavanje lipidne čestice kada se daje subjektu, i/ili učini lipidnu česticu imunotolerantnom kada se daje subjektu. Kako je ovde otkriveno, takvi modeli mogu da štite, ili na drugi način zaštite, lipidnu česticu i enkapsulirani ugljeni hidrat ovog otkrivanja od degradiranja, i takođe mogu da pojačaju ćelijsku propusnost, cirkulaciju i/ili retenciono vreme lipidne čestice kada se lipidna čestica daje subjektu kome je to potrebno. Pored toga, takvi molekuli mogu da omoguće da lipidna čestica izbegne detekciju od strane imunog sistema subjekta kojem je potrebna a kojem se daje lipidna čestica, i kao takvi se smatraju postojanim molekulima.

Shodno tome, u nekim načinima ostvarivanja, molekul predstavlja postojani molekul koji je sposoban za indukovanje imunotolerancije kada se daje subjektu kojem je to potrebno. Pogodni molekul je polietilen glikol (PEG).

[0031] Tako, u određenim aspektima, ovo otkrivanje obezbeđuje kompoziciju koja sadrži lipidnu česticu; i endogeni ugljeni hidrat enkapsuliran u lipidnoj čestici, pri čemu lipidna čestica sadrži molekul koji je sposoban da minimizuje degradiranje lipidne čestice i/ili ojača zadržavanje lipidne čestice kada se daje subjektu, i/ili učini lipidnu česticu imunotolerantnom kada se daje subjektu. Molekul je polietilen glikol (PEG).

[0032] U nekim načinima ostvarivanja, lipidna čestica sadrži molekul koji je sposoban da minimizuje degradiranje lipidne čestice i/ili ojača zadržavanje lipidne čestice kada se daje subjektu, i/ili učini lipidnu česticu imunotolerantnom kada se daje subjektu. Molekul je, polietilen glikol (PEG).

[0033] U određenim aspektima, ovo otkrivanje obezbeđuje kompoziciju koja sadrži lipozom; i manoza-1-fosfat enkapsuliran u lipozomu, pri čemu lipozom obuhvata holesterol i fosfatidiletanolamin (PE) pričvršćen za polietilen glikol (PEG).

[0034] Pored toga, obezbeđene su farmaceutske kompozicije koje sadrže lipidnu kompoziciju koja sadrži ugljeni hidrat ovog otkrivanja u kombinaciji sa farmaceutski prihvatljivim nosačima. Ovo otkrivanje takođe obezbeđuje komplet koji sadrži lipidnu kompoziciju koja sadrži ugljeni hidrat ovog otkrivanja za upotrebu u bilo kom od ovde opisanih postupaka.

[0035] Ovo otkrivanje dalje obezbeđuje postupke upotrebe lipidne kompozicije koje sadrže ugljeni hidrat ovog otkrivanja za dostavu ugljenog hidrata subjektu kome je to potrebno. Ovo otkrivanje dalje obezbeđuje postupke upotrebe lipidne kompozicije koje sadrže ugljeni hidrat ovog otkrivanja za dostavu ugljenog hidrata u unutrašnjost ćelije subjekta kom je to potrebno. Ovo otkrivanje dalje obezbeđuje postupke upotrebe lipidne kompozicije koje sadrže ugljeni hidrat ovog otkrivanja za lečenje, sprečavanje, ili smanjenje rizika od urođenog poremećaja glikozilacije (CDG) kod subjekta kome je to potrebno.

Lipidne čestice

[0036] Određeni aspekti ovog otkrivanja se odnose na kompozicije koje sadrže lipidne čestice koje sadrže ugljene hidrate enkapsulirane unutar lipidne čestice.

[0037] Kako se ovde upotrebljava, pojam "lipidna čestica" se odnosi na čestice koje formiraju lipidi u vodenom rastvoru. Pogodni primeri lipidnih čestica uključuju, bez ograničenja, lipozome, miscele, čvrste lipidne nanočestice, niozome, liposfere, emulzome, i emulzije.

[0038] Kako se ovde upotrebljava, ugljeni hidrat koji je "enkapsuliran' u lipidnoj čestici, se odnosi na lipidnu česticu koja obezbeđuje aktivni agens ili terapeutski agens, kao što je ugljeni hidrat ovog otkrivanja, sa punom enkapsulacijom, delimičnom enkapsulacijom, ili oba. Kod nekih varijacija, najmanje deo ugljenog hidrata može biti "enkapsuliran' od strane lipidne čestice i lokalizovan unutar jezgra lipidne čestice i/ili unutar unutrašnje površine (npr., membrane) lipidne čestice. Alternativno, kod drugih varijacija, ceo ugljeni hidrat može biti "enkapsuliran' lipidnom česticom i lokalizovan unutar jezgra lipidne čestice i/ili unutar unutrašnje površine (npr., membrane) lipidne čestice.

[0039] Može da se koristi bilo koja lipidna čestica poznata u tehnici pogodna za dostavu enkapsuliranog ugljenog hidrata ovog otkrivanja u unutrašnjost ćelije. Primeri pogodnih lipidnih čestica uključuju, bez ograničenja, lipozome, miscele, čvrste lipidne nanočestice, i niozome.

[0040] U nekim načinima ostvarivanja, lipidne čestice ovog otkrivanja imaju prosečnu veličinu čestica koja je u opsegu od oko 0,02 mikrona u prečniku do oko 0,5 mikrona u prečniku. U određenim načinima ostvarivanja, lipidne čestice ovog otkrivanja imaju prosečnu veličinu čestica od oko 0,02 mikrona u prečniku, oko 0,03 mikrona u prečniku, oko 0,04 mikrona u prečniku, oko 0,05 mikrona u prečniku, oko 0,06 mikrona u prečniku, oko 0,07 mikrona u prečniku, oko 0,08 mikrona u prečniku, oko 0,09 mikrona u prečniku, oko 0,10 mikrona u prečniku, oko 0,15 mikrona u prečniku, oko 0,20 mikrona u prečniku, oko 0,25 mikrona u prečniku, oko 0,30 mikrona u prečniku, oko 0,35 mikrona u prečniku, oko 0,40 mikrona u prečniku, oko 0,45 mikrona u prečniku, ili oko 0,50 mikrona u prečniku.

[0041] U nekim načinima ostvarivanja, lipidne čestice ovog otkrivanja su sposobne za dostavu ugljenog hidrata ovog otkrivanja u unutrašnjost ćelije, kao što je citoplazmu, endoplazmatski retikulum, ili Golgi.

[0042] U nekim načinima ostvarivanja, lipidne čestice ovog otkrivanja mogu biti optimizovane radi ciljanja određenih organela unutar ćelije, uključujući bez ograničenja, endoplazmatski retikulum (ER), Golgi, i lizozom. U nekim načinima ostvarivanja, lipidne čestice ovog otkrivanja mogu biti optimizovane radi ciljanja određenih tkiva i/ili organa u subjektu. Postupci optimizovanja lipidnih čestica za ciljanje konkretnih organela, tkiva, i organa su dobro poznati u tehnici (npr., Torchilin V. et al., Curr. Protein Pept. Sci., 2003, 4, 133-140; Torchilin V. et al., J. Drug Target., 2011, 19, 606-614; Huwyler J. et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 1997, 282: 1541-1546; Pollock S. et al., FASEB, 2010, 24, 1866-1878; Fujiwara T. et al., Int. J. Pharm., 2010, 386, 122-130; i WO 2009/118658).

[0043] U nekim načinima ostvarivanja, lipidne čestice ovog otkrivanja sadrže ugljeni hidrat ovog otkrivanja, koji kada se dostavi u unutrašnjost ćelije subjekta (uključujući, na primer, čoveka) kome je to potrebno može da izazove najmanje 0,05-struko do najmanje 10-struko povećanje u ćelijskoj proizvodnji oligosaharida višeg reda vezanih za lipide, u poređenju sa ćelijskom proizvodnjom oligosaharida višeg reda vezanih za lipide u odsustvu lipidnih čestica ovog otkrivanja koje sadrže ugljeni hidrat ovog otkrivanja. U nekim načinima ostvarivanja, ovde obezbeđene lipidne čestice, kada se daju subjektu (uključujući, na primer, čoveka) kome je to potrebno, mogu da izazovu najmanje 0,05-struko, najmanje 0,1-struko, najmanje 0,2-struko, najmanje 0,3-struko, najmanje 0,4-struko, najmanje 0,5-struko, najmanje 0,6-struko, najmanje 0,7-struko, najmanje 0,8-struko, najmanje 0,9-struko, najmanje 1-struko, najmanje 1,5-struko, najmanje 2-struko, najmanje 2,5-struko, najmanje 3-struko, najmanje 3,5-struko, najmanje 4-struko, najmanje 4,5-struko, najmanje 5-struko, najmanje 5,5-struko, najmanje 6-struko, najmanje 6,5-struko, najmanje 7-struko, najmanje 7,5-struko, najmanje 8-struko, najmanje 8,5-struko, najmanje 9-struko, najmanje 9,5-struko, ili najmanje 10-struko povećanje u ćelijskoj proizvodnji oligosaharida višeg reda vezanih za lipide kod tog subjekta, u poređenju sa ćelijskom proizvodnjom oligosaharida višeg reda vezanih za lipide kod tog subjekta bez davanja takvih lipidnih čestica tom subjektu.

[0044] Kako se ovde upotrebljava "oligosaharid višeg reda vezan za lipide " se odnosi na oligosaharid sa najmanje pet monosaharidnih podjedinica i koji je povezan u lipid. Na primer, oligosaharid višeg reda vezan za lipide može da se odnosi na oligosaharid koji sadrži najmanje četiri manozne podjedinice (Man4), pet manoznih podjedinica (Man5), [est manoznih podjedinica (Man6), sedam manoznih podjedinica (Man7), osam manoznih podjedinica (Man8), ili devet manoznih podjedinica (Man9) i N-acetilglukozamin disaharid (GlcNAc2), pri čemu je oligosaharid povezan u dolihol. U nekim načinima ostvarivanja, oligosaharidi višeg reda vezan za lipide mogu da uključuju deo oligosaharida koji uključuje Man4GlcNAc2, Man5GlcNAc2, Man6GlcNAc2, Man7GlcNAc2, Man8GlcNAc2, Man8GlcNAc2, ili bilo koju njihovu kombinaciju.

Lipozomi

[0045] U nekim načinima ostvarivanja, lipidna čestica ovog otkrivanja može biti lipozom. Kako se ovde upotrebljava, "lipozom" se odnosi na vezikulu koja se sastoji od lipidnog dvostrukog sloja lamelarne faze. Može da se koristi bilo koji pogodan lipozom poznat u tehnici. U nekim načinima ostvarivanja, lipozom ima lemelarnu nanostrukturu. Kako se ovde upotrebljava, pojam "lamelarna nanostruktura" se odnosi na nanostrukturu, kao što je lipidna čestica, koja uključuje paralelne amfifilne dvostruke slojeve razdvojene lumenom.

[0046] Lipozomi ovog otkrivanja mogu biti pripremljeni bilo kojim pogodnim postupkom poznatim u tehnici i otkrivenim ovde. Primeri pogodnih postupaka za pripremu lipozoma uključuju, bez ograničenja, isprekidane biološke membrane, kao što je mehanička disperzija uključujući sonikaciju, hidrataciju tankim filmom, emulzije, francusku presu, ekstruziju, i rekonstituisanje suvih vezikula; disperziju rastvarača uključujući injekciju etanola, injekciju etra, dvostruku emulziju, reverznu fazu, i vaporizaciju; i postupke za uklanjanje deterdženta.

[0047] U određenim načinima ostvarivanja, lipozom predstavlja postojani lipozom koji može biti imunotolerantan. Kako se ovde upotrebljava, pojam "postojani lipozom" se odnosi na lipozome koji su sposobni da izbegavaju detekciju od strane imunog sistema subjekta. Kao takav, postojani lipozom može biti imunotolerantan. Na primer, taj subjekat može biti čovek.

Miscele

[0048] U nekim načinima ostvarivanja, lipidna čestica ovog otkrivanja može biti miscela. Kako se ovde upotrebljava, "miscela" se odnosi na agregat molekula surfaktanta (npr., sapuna, deterdženata, masnih kiselina, lipida, fosfolipida, itd.) koji su dispergovani u tečnom koloidu. Miscela u vodenom rastvoru može da obrazuje agregat sa regionima hidrofilne glave u kontaktu sa rastvaračem koji je okružuje, čime

1

se sekvestiraju hidrofobni repni regioni u unutrašnjosti miscele. Može da se koristi bilo koja pogodna miscela poznata u tehnici. U nekim načinima ostvarivanja, miscele mogu biti sferične. Miscele ovog otkrivanja mogu biti pripremljene bilo kojim pogodnim postupkom poznatim u tehnici. Primeri pogodnih postupaka za pripremu miscela uključuju, bez ograničenja, direktno rastvaranje, i direktnu ili mikroemulsifikacionu dijalizu, koja može da obuhvata pripremu deterdžentom ili postupcima za uklanjane deterdženta rastvaračem koji se meša sa vodom.

Čvrste lipidne nanočestice

[0049] U nekim načinima ostvarivanja, lipidna čestica ovog otkrivanja može biti čvrsta lipidna nanočestica. Kako se ovde upotrebljava, "čvrsta lipidna nanočestica" (SLN) se odnosi na lipid u vodenim emulzijama koje se sastoje lipida koji su generalno čvrsti na temperaturama od najmanje 50°C, i obično sadrže matricu čvrstog lipidnog jezgra koje može solibilizuje liofilne molekule. Kod nekih varijacija, čvrste lipidne nanočestice imaju prečnik u opsegu od 10 do 1000 nanometara. Čvrste lipidne nanočestice mogu da zaštite inkorporisana aktivna jedinjenja, kao što su ugljeni hidrati ovog otkrivanja, od hemijskog degradiranja i takođe mogu da ispolje fleksibilnost u modulisanju otpuštanja takvih jedinjenja. Lipidno jezgro čvrstih lipidnih nanočestica može biti stabilizovano surfaktantima (npr., emulgatorima). Lipid obično može da uključuje trigliceride, digliceride, monogliceride, masne kiseline, steroide, i/ili voskove. Može da se koristi bilo koja pogodna čvrsta lipidna nanočestica poznata u tehnici. Čvrste lipidne nanočestice ovog otkrivanja mogu biti pripremljene bilo kojim pogodnim postupkom poznatim u tehnici. Primeri pogodnih postupaka za pripremu čvrstih lipidnih nanočestica uključuju, bez ograničenja, mikroemulsifikaciju, homogenizaciju pod visokim pritiskom, precipitaciju, i film ultrazvučnu disperziju.

Niozomi

[0050] U nekim načinima ostvarivanja, lipidna čestica ovog otkrivanja može biti niozom. Kako se ovde upotrebljava, "niozom" se odnosi na vezikularnu strukturu formiranu od dvostrukog sloja molekula nejonskog surfaktanta i koja sadrži vodeno jezgro. Niozomi su strukturno slični lipozomima u tome što imaju lamelarnu strukturu, međutim, materijali koji se koriste da pripreme nizozome ih čine stabilnijim protiv hidrolitičke degradacije. Primeri pogodnih materijala za pripremu niozoma uključuju, bez ograničenja, sterole i jedan ili više nejonskih surfaktanata. Može da se koristi bilo koji pogodan niozom poznat u tehnici. Niozomi ovog otkrivanja mogu biti pripremljeni bilo kojim pogodnim postupkom poznatim u tehnici. Primeri pogodnih postupaka za pripremu miscela uključuju, bez ograničenja, injekciju etra, agitaciju, postupak stvaranja mehurića, uparavanje obrnute faze, sonikaciju, višestruku membransku ekstruziju, i mikrofluidigaciju.

Komponente lipidnih čestica

[0051] Lipidne čestice ovog otkrivanja (npr., lipozomi, miscele, čvrste lipidne nanočestice, i niozomi) sadrže jedan ili više lipida. Kako se ovde upotrebljava, pojam "lipid" se odnosi na supstancu biološkog ili sintetičkog porekla koja je rastvorljiva ili delimično rastvorljiva u organskim rastvaračima ili koja se deli u hidrofobnom okruženju kada je prisutan u vodenoj fazi. Kod nekih varijacija, lipidi mogu biti podeljeni u najmanje tri klase: (1) "jednostavni lipidi," koji uključuju, bez ograničenja, masti, ulja, i voskove; (2) "lipide jedinjenja," koji uključuju, bez ograničenja, fosfolipide i glikolipide; i (3) "izvedene lipide," koji uključuju, bez ograničenja, steroide.

[0052] Kod nekih varijacija, lipid može biti neutralni lipid ili amfifilični lipid. Kako se ovde upotrebljava, pojam "neutralni lipid" se odnosi na lipid koji postoji ili u nenaelektrisanom ili neutralnom cviterjonskom obliku pri odabranoj pH. Pri fiziološkoj pH, takvi lipidi mogu da uključuju, na primer, diacilfosfatidilholin, diacilfosfatidiletanolamin, ceramid, sfingomielin, cefalin, holesterol, cerebrosid, i diacilgliceroli. Kako se ovde upotrebljava, pojam "amfifilični lipid" se odnosi na lipid koji sadrži i polarne, grupe rastvorljive u vodi i nepolarne, grupe nerastvorljive u vodi.

[0053] Primeri pogodnih lipida uključuju, bez ograničenja, dvoslojne lipide, ne-dvoslojne lipide, amfifilične lipide, lipide koji se prirodno javljaju, fosfolipide, glicerolipide, sfingolipide, fosfatidilglicerol, fosfatidinska kiselina, lizo-lipide, masne kiseline, sfingomielin, glikosfingolipide, glukolipide, glikolipide, sulfatide, lipide sa etrom povezanim i estrom povezanim masnim kiselinama, lipide koji mogu da se polimerizuju, sintetičke lipide, i polusintetičke lipide. Sintetički ili polusintetički lipidi mogu biti proizvedeni deacilacijom ili reacilacijom prirodnih lipida. Pogodne karakteristike sintetičkih i polusintetičkih lipida uključuju, bez ograničenja, miristoil, palmitoil, i masne kiseline stearoila. U nekim načinima ostvarivanja, lipidne čestice ovog otkrivanja mogu da sadrže mešavinu dva ili više vrsta lipida. Takva mešavina može biti prisutna u bilo kom odnosu koji je pogodan za enkapsuliranje ugljenog hidrata ovog otkrivanja i dostavljanje takvog ugljenog hidrata u unutrašnjost ćelije. U nekim načinima ostvarivanja, lipidne čestice ovog otkrivanja mogu da sadrže lipid odabran iz grupe koju čine fosfolipid, glicerolipid, sfingolipid, i bilo koju njihovu kombinaciju. Kako je ovde otkriveno, takav lipid ima polarnu glavnu grupu i rep masne kiseline koji može biti povezan, na primer, estarskom vezom ili etarskom vezom.

[0054] U nekim načinima ostvarivanja, lipidne čestice ovog otkrivanja (npr., lipozomi, miscele, čvrste lipidne nanočestice, i niozomi) mogu da sadrže jedan ili više lipida sa polarnim glavnim grupama. Lipidi mogu da sadrže bilo koju pogodnu glavnu grupu poznatu u tehnici. Primeri pogodnih polarnih glavnih grupa uključuju, bez ograničenja, holin, etaranolamin, serin, glicerol, inositol, i bilo koju njihovu kombinaciju.

[0055] U nekim načinima ostvarivanja, lipidne čestice ovog otkrivanja (npr., lipozomi, miscele, čvrste lipidne nanočestice, i niozomi) mogu biti, bez ograničenja, lamelarne nanostrukture koje sadrže amfifilični lipid. Primeri pogodnih amfifiličnih lipida uključuju, bez ograničenja, fosfolipide, holesterol, glikolipide, masne kiseline, žučne kiseline, saponine, i surfaktante.

[0056] Lipidne čestice ovog otkrivanja (npr., lipozomi, miscele, čvrste lipidne nanočestice, i niozomi) sadrže fosfatidilholin (PC) i fosfatidiletanolamin (PE) i dalje mogu da sadrže jedan ili više fosfolipida. Lipidne čestice ovog otkrivanja mogu da sadrže bilo koji pogodan fosfolipid poznat u tehnici. Primeri pogodnih fosfolipida uključuju, bez ograničenja, fosfatidilholin (PC), fosfatidiletanolamin (PE), fosfatidilserin (PS), fosfatidilglicerol (PG), fosfatidilinositol (PI), i bilo koju njihovu kombinaciju.

[0057] U nekim načinima ostvarivanja, vrste fosfolipida ovog otkrivanja mogu biti prisutne u lipidnoj čestici ovog otkrivanja (npr., lipozomi, miscele, čvrste lipidne nanočestice, i niozomi) u koncentraciji do 80 molarnih procenata. U određenim načinima ostvarivanja, fosfolipid ovog otkrivanja može biti prisutan u lipidnoj čestici ovog otkrivanja u koncentraciji do 5 molarnih procenata, do 10 molarnih procenata, do 20 molarnih procenata, do 30 molarnih procenata, do 40 molarnih procenata, do 50 molarnih procenata, do 60 molarnih procenata, do 70 molarnih procenata, ili do 80 molarnih procenata. U određenim načinima ostvarivanja, fosfolipid ovog otkrivanja može biti prisutan u lipidnoj čestici ovog otkrivanja u koncentraciji od oko 70 molarnih procenata.

[0058] U nekim načinima ostvarivanja, lipidna čestica ovog otkrivanja (npr., lipozomi, miscele, čvrste lipidne nanočestice, i niozomi) može biti modifikovana u, na primer, molekul, kao što je postojani molekul, koji brani, ili na drugi način štiti, enkapsulirani ugljeni hidrat ovog otkrivanja od degradiranja, i koji pojačava ćelijsku propusnost, cirkulaciju, i/ili retenciono vreme kompozicije koje sadrže ugljeni hidrat unutar ćelije, tkiva, organa i/ili tela subjekta kojem se daje lipidna kompozicija koja sadrži ugljeni hidrat. Bez želje za vezivanjem za bilo koju teoriju, lipidna čestica ovog otkrivanja dramatično pojačava ćelijsku propusnost ugljenih hidrata, koji su inače nesposobni da pređu plazmatsku membranu. Shodno tome, u nekim načinima ostvarivanja, lipidna čestica ovog otkrivanja uključuje molekul koji je sposoban da minimizuje degradaciju lipidne čestice i/ili ojača zadržavanje lipidne čestice kada se daje subjektu, i/ili učini lipidnu česticu imunotolerantnom kada se daje subjektu. Molekul je polietilen glikol (PEG).

[0059] Kako se ovde upotrebljavaju, pojmovi "etilenoksid," "oksiran," "epoksietan," "dimetilenoksid," i "oksaciklopropan" mogu da se koriste naizmenično i odnose se na ciklični etar formule C2H4O.

[0060] Kako se ovde upotrebljavaju, pojmovi "polietilen glikol," "PEG," "polietilenoksid," "PEO," "polioksietilen," i "POE" mogu da se koriste naizmenično i odnose se na jedinjenje polietra koje se sastoji od dva ili više podjedinica etilenoksida. "Polietilen glikol" može biti sastavljen od oligomera etilenoksida (npr., od dva do devet monomernih podjedinica etilenoksida) ili polimera etilenoksida (npr., sa deset ili više devet monomernih podjedinica etilenoksida).

[0061] Lipidna čestica ovog otkrivanja je modifikovana da uključi jedan ili više lipida konjugovanih u polietilen glikol (PEG) kako bi se omogućilo da se izbegne detekcija lipidne čestice od strane imunog sistema subjekta kojem se daje lipidna čestica. U nekim načinima ostvarivanja, lipidna čestica ovog

1

otkrivanja (npr., lipozomi, miscele, čvrste lipidne nanočestice, i niozomi) povećava ćelijsku propusnost za hidrofobne ugljene hidrate, kao što su endogeni ugljeni hidrati ovog otkrivanja, koji drugačije ne mogu samostalno da prođu kroz ćelijsku membranu.

[0062] Lipidne čestice ovog otkrivanja sadrže polietilen glikol (PEG) konjugovan za fosfolipid. Bez želje za vezivanjem za bilo koju teoriju, takve modifikacije mogu da zaštite lipidne čestice od opsonizacije.

[0063] U nekim načinima ostvarivanja, polietilen glikol (PEG) može biti prisutan u lipidnoj čestici ovog otkrivanja (npr., lipozomi, miscele, čvrste lipidne nanočestice, i niozomi) u koncentraciji koja je u opsegu od oko 0,5 molarnih procenata do oko 20 molarnih procenata. U nekim načinima ostvarivanja, PEG može biti prisutan u lipidnoj čestici ovog otkrivanja (npr., lipozomi, miscele, čvrste lipidne nanočestice, i niozomi) u koncentraciji od oko 0,5 molarnih procenata, oko 1 molarnih procenata, oko 2 molarnih procenata, oko 3 molarna procenta, oko 4 molarnih procenata, oko 5 molarnih procenata, oko 6 molarnih procenata, oko 7 molarnih procenata, oko 8 molarnih procenata, oko 9 molarnih procenata, oko 10 molarnih procenata, oko 11 molarnih procenata, oko 12 molarnih procenata, oko 13 molarna procenta, oko 14 molarnih procenata, oko 15 molarnih procenata, oko 16 molarnih procenata, oko 17 molarnih procenata, oko 18 molarnih procenata, oko 19 molarnih procenata, ili oko 20 molarnih procenata.

[0064] U nekim načinima ostvarivanja, polietilen glikol (PEG) može biti prisutan u lipidnoj čestici ovog otkrivanja (npr., lipozomi, miscele, čvrste lipidne nanočestice, i niozomi) u koncentraciji molekulske mase koja je u opsegu od oko 200 Da do oko 10,000 Da. U nekim načinima ostvarivanja, polietilen glikol (PEG) može biti prisutan u lipidnoj čestici ovog otkrivanja (npr., lipozomi, miscele, čvrste lipidne nanočestice, i niozomi) u koncentraciji molekulske mase od oko 200 Da, oko 300 Da, oko 400 Da, oko 500 Da, oko 600 Da, oko 700 Da, oko 800 Da, oko 900 Da, oko 1,000 Da, oko 1,500 Da, oko 2,000 Da, oko 2,500 Da, oko 3,000 Da, oko 3,500 Da, oko 4,000 Da, oko 4,500 Da, oko 5,000 Da, oko 5,500 Da, oko 6,000 Da, oko 6,500 Da, oko 7,000 Da, oko 7,500 Da, oko 8,000 Da, oko 8,500 Da, oko 9,000 Da, oko 9,500 Da, ili oko 10,000 Da.

[0065] Lipidne čestice ovog otkrivanja (npr., lipozomi, miscele, čvrste lipidne nanočestice, i niozomi) sadrže PEG konjugovan za fosfolipid ovog otkrivanja. Taj PEG može biti konjugovan za jedan ili više od fosfatidilholina (PC), fosfatidiletanolamina (PE), fosfatidilserina (PS), fosfatidilglicerola (PG), fosfatidilinositola (PI), i bilo koju njihovu kombinaciju. U određenim načinima ostvarivanja, lipidne čestice ovog otkrivanja mogu da sadrže PEG konjugovan za fosfatidilholin (PC). U određenim načinima ostvarivanja, lipidne čestice ovog otkrivanja mogu da sadrže PEG konjugovan za fosfatidiletanolamin (PE).

[0066] U nekim načinima ostvarivanja, fosfolipid konjugovan za polietilen glikol (PEG) može biti prisutan u lipidnoj čestici ovog otkrivanja (npr., lipozomi, miscele, čvrste lipidne nanočestice, i niozomi) u koncentraciji koja je u opsegu od oko 0,5 molarnih procenata do oko 20 molarnih procenata. U nekim načinima ostvarivanja, a fosfolipid konjugovan za polietilen glikol (PEG) može biti prisutan u lipidnoj čestici ovog otkrivanja (npr., lipozomi, miscele, čvrste lipidne nanočestice, i niozomi) u koncentraciji od oko 0,5 molarnih procenata, oko 1 molarnih procenata, oko 2 molarnih procenata, oko 3 molarna procenta, oko 4 molarnih procenata, oko 5 molarnih procenata, oko 6 molarnih procenata, oko 7 molarnih procenata, oko 8 molarnih procenata, oko 9 molarnih procenata, oko 10 molarnih procenata, oko 11 molarnih procenata, oko 12 molarnih procenata, oko 13 molarna procenta, oko 14 molarnih procenata, oko 15 molarnih procenata, oko 16 molarnih procenata, oko 17 molarnih procenata, oko 18 molarnih procenata, oko 19 molarnih procenata, ili oko 20 molarnih procenata. U određenim načinima ostvarivanja, a fosfolipid konjugovan za polietilen glikol (PEG) može biti prisutan u lipidnoj čestici ovog otkrivanja u koncentraciji od oko 2 molarnih procenata.

[0067] U nekim načinima ostvarivanja, lipidne čestice ovog otkrivanja (npr., lipozomi, miscele, čvrste lipidne nanočestice, i niozomi) mogu da sadrže jedan ili više sterola. Primeri pogodnih jedinjenja uključuju, bez ograničenja, holesterol i holesteril hemisukcinat (CH), dicetil fosfat, i Solulan C24.

[0068] U nekim načinima ostvarivanja, sterol ovog otkrivanja, kao što je holesterol, može biti prisutan u lipidnoj čestici ovog otkrivanja (npr., lipozomi, miscele, čvrste lipidne nanočestice, i niozomi) u koncentraciji do 40 molarnih procenata. U nekim načinima ostvarivanja, sterol ovog otkrivanja, kao što je holesterol, može biti prisutan u lipidnoj čestici ovog otkrivanja (npr., lipozomi, miscele, čvrste lipidne nanočestice, i niozomi) u koncentraciji do 5 molarnih procenata, do 10 molarnih procenata, do 15 molarnih procenata, do 20 molarnih procenata, do 30 molarnih procenata, ili do 40 molarnih procenata. U određenim načinima ostvarivanja, sterol ovog otkrivanja, kao što je holesterol, može biti prisutan u lipidnoj čestici ovog otkrivanja u koncentraciji od najviše 15 molarnih procenata. U nekim načinima ostvarivanja, sterol ovog otkrivanja, kao što je holesterol, može biti prisutan u lipidnoj čestici ovog otkrivanja (npr., lipozomi, miscele, čvrste lipidne nanočestice, i niozomi) u molarnom odnosu od 1:1 ili 2:1.

[0069] U nekim načinima ostvarivanja, lipidne čestice ovog otkrivanja (npr., lipozomi, miscele, čvrste lipidne nanočestice, i niozomi) mogu da sadrže jednu ili više masnih kiselina. U nekim načinima ostvarivanja, masne kiseline ovog otkrivanja mogu da imaju lanac ugljenika koji je u opsegu od dužina od oko 14 atoma ugljenika do oko 18 atoma ugljenika.

[0070] U nekim načinima ostvarivanja, lipidne čestice ovog otkrivanja (npr., lipozomi, miscele, čvrste lipidne nanočestice, i niozomi) mogu da sadrže jedan ili više neutralnih lipida. U određenim načinima ostvarivanja, neutralni lipid ovog otkrivanja može biti PEGilisan (tj., konjugovan za PEG). U nekim načinima ostvarivanja, PEGilisan neutralni lipid ovog otkrivanja može biti prisutan u lipidnoj čestici ovog otkrivanja u koncentraciji koja je u opsegu od oko 0,2 molarnih procenata do oko 20 molarnih procenata. U nekim načinima ostvarivanja, neutralni lipid ovog otkrivanja može biti PEGilisan (tj., konjugovan za PEG). U nekim načinima ostvarivanja, PEGilisan neutralni lipid ovog otkrivanja može biti

1

prisutan u lipidnoj čestici ovog otkrivanja u koncentraciji od oko 0,5 molarnih procenata, oko 1 molarnih procenata, oko 2 molarnih procenata, oko 3 molarna procenta, oko 4 molarnih procenata, oko 5 molarnih procenata, oko 6 molarnih procenata, oko 7 molarnih procenata, oko 8 molarnih procenata, oko 9 molarnih procenata, oko 10 molarnih procenata, oko 11 molarnih procenata, oko 12 molarnih procenata, oko 13 molarna procenta, oko 14 molarnih procenata, oko 15 molarnih procenata, oko 16 molarnih procenata, oko 17 molarnih procenata, oko 18 molarnih procenata, oko 19 molarnih procenata, ili oko 20 molarnih procenata.

[0071] U nekim načinima ostvarivanja, lipidne čestice ovog otkrivanja (npr., lipozomi, miscele, čvrste lipidne nanočestice, i niozomi) mogu biti modifikovane kako bi se ciljale konkretne organele i/ili tkiva. Bilo koji pogodan postupak poznat u tehnici može da se koristi za ciljanje lipidne čestice na organelu i/ili tkivo. Pogodni primeri uključuju, bez ograničenja, modifikaciju materijala koji se koristi za pripremu same lipidne čestice (npr., upotrebom mešavina i molarnih odnosa fosfolipida kao što su PC, PS, PI, i PE), kovalentnog pričvršćenja linkera (npr., peptidnih lanaca kao što su lanci poli-arginina i oktadecilrodamina B) za površinu lipidne čestice, ili modifikaciju antitela. Na primer, modifikacija oktadecilrodamina B može da cilja lipidnu česticu na lizozom ćelija. U nekim načinima ostvarivanja, lipidne čestice ovog otkrivanja (npr., lipozomi, miscele, čvrste lipidne nanočestice, i niozomi) mogu biti antitelokonjugovani lipozomi, ili imunolipozomi, koji mogu da se koriste da se usmere enkapsulirani ugljeni hidrati ovog otkrivanja na obolela tkiva i/ili organe.

Ugljeni hidrati

[0072] Drugi aspekti ovog otkrivanja se odnose na kompozicije koje sadrže ugljene hidrate kako je definisano u patentnim zahtevima enkapsulirane u lipidnu česticu ovog otkrivanja (npr., lipozome, miscele, čvrste lipidne nanočestice, i niozome).

[0073] U nekim načinima ostvarivanja, ugljeni hidrat može biti prisutan unutar lipidne čestice ovog otkrivanja u koncentraciji koja je u opsegu od oko 0,10 mg po mL lipidne čestice do oko 10 mg po mL lipidne čestice. U nekim načinima ostvarivanja, ugljeni hidrat može biti prisutan unutar lipidne čestice ovog otkrivanja u koncentraciji od oko 0,10 mg po mL lipidne čestice, oko 0,20 mg po mL lipidne čestice, oko 0,30 mg po mL lipidne čestice, oko 0,40 mg po mL lipidne čestice, oko 0,50 mg po mL lipidne čestice, oko 0,60 mg po mL lipidne čestice, oko 0,70 mg po mL lipidne čestice, oko 0,80 mg po mL lipidne čestice, oko 0,90 mg po mL lipidne čestice, oko 1 mg po mL lipidne čestice, oko 1,50 mg po mL lipidne čestice, oko 2 mg po mL lipidne čestice, oko 2,50 mg po mL lipidne čestice, oko 3 mg po mL lipidne čestice, oko 3,50 mg po mL lipidne čestice, oko 4 mg po mL lipidne čestice, oko 4,50 mg po mL lipidne čestice, oko 5 mg po mL lipidne čestice, 5,50 mg po mL lipidne čestice, oko 6 mg po mL lipidne čestice, 6,50 mg po mL lipidne čestice, oko 7 mg po mL lipidne čestice, 7,50 mg po mL lipidne čestice, oko 8 mg po mL lipidne čestice, 8,50 mg po mL lipidne čestice, oko 9 mg po mL lipidne čestice, oko 9,50 mg po mL lipidne

1

čestice, ili oko 10 mg po mL lipidne čestice. U određenim načinima ostvarivanja, ugljeni hidrat ovog otkrivanja može biti prisutan unutar lipidne čestice ovog otkrivanja u koncentraciji od oko 1 mg po mL lipidne čestice.

[0074] U nekim načinima ostvarivanja, ugljeni hidrat ovog otkrivanja je endogeni ugljeni hidrat. Kako se ovde upotrebljava, "endogeni ugljeni hidrat" se odnosi na ugljeni hidrat koji se pronalazi kao prirodni proizvod u subjektu (uključujući, na primer, čoveka). Trebalo bi imati u vidu, međutim, da endogeni ugljeni hidrat može biti ili (i) prirodno proizveden od strane subjekta (uključujući, na primer, čoveka) i ekstrahovan iz živih ćelija takvog subjekta, ili (ii) sintetički napravljen. U nekim načinima ostvarivanja, endogeni ugljeni hidrat proizvodi subjekat in vivo (uključujući, na primer, čoveka). U drugim načinima ostvarivanja, endogeni ugljeni hidrat prirodno proizvodi ćelija dobijena od subjekta (uključujući, na primer, čoveka), kao što je kultivisana ćelijska linija. Stoga, izvor takvih endogenih ugljenih hidrata može da uključuje, bez ograničenja, sintetički izvor (npr., hemijsku sintezu) ili prirodni izvor (npr., ekstrakciju, izolaciju, ili prečišćavanje iz subjekta ili ćelije koja prirodno proizvodi endogeni ugljeni hidrat ili rekombinantnu ćeliju, kao što je bakterijska ćelija, koja je genetski projektovana da bi se proizveo endogeni ugljeni hidrat). Primeri endogenih ugljenih hidrata mogu da uključuju, bez ograničenja, ugljene hidrate uključene u glikozilaciju proteina i lipida.

[0075] Primeri pogodnih endogenih ugljenih hidrata uključuju manozu, fosforilisanu manozu, manofuranozu, fosforilisanu manofuranozu, manopiranozu, fosforilisanu manopiranozu, i manoza-1-fosfat.

[0076] U nekim načinima ostvarivanja, ugljeni hidrati ovog otkrivanja mogu biti integrisani u lipidne čestice ovog otkrivanja, kao što su lipozomi, koji mogu biti dizajnirani za konkretno ciljanje na unutrašnjost ćelije, ER ćelije, ili Golgi ćelije.

Farmaceutske kompozicije

[0077] Kompozicije ovog otkrivanja koje sadrži lipidnu česticu ovog otkrivanja i ugljeni hidrat ovog otkrivanja enkapsuliran u lipidnoj čestici mogu biti inkorporisani u razne formulacije za terapeutsku upotrebu (npr., primenom) ili u proizvodnji leka (npr., za dostavu ugljenog hidrata ovog otkrivanja subjektu kome je to potrebno i/ili u unutrašnjost ćelije subjekta kome je to potrebno i/ili za lečenje ili sprečavanje bolesti ili poremećaja kao što je urođeni poremećaj glikozilacije (CDG) kod subjekta kome je to potrebno) kombinovanjem kompozicije sa odgovarajućim nosačima (uključujući, na primer, farmaceutski prihvatljive nosače ili razblaživače), i može biti formulisana, bez ograničenja, u preparate u tečnim, aerosolizovanim, polučvrstim, ili praškastim oblicima.

[0078] "Nosači" kako se ovde upotrebljava uključuju farmaceutski prihvatljive nosače, ekscipijense, ili stabilizatore koji nisu toksični po ćeliju ili subjekta koji im je izložen u dozama i koncentracijama koje se koriste. Često je fiziološki prihvatljiv nosač vodeni pH puferisani rastvor. Primeri fiziološki prihvatljivih

1

nosača uključuju, bez ograničenja, pufere kao što je fosfat, citrat, i druge organske kiseline; antioksidanse uključujući askorbinsku kiselinu; polipeptid male molekulske mase (manje od oko 10 ostataka); proteine, kao što je serum albumin, želatin, ili imunoglobuline; hidrofolne polimere kao što je polivinilpirolidon; aminokiseline kao što je glicin, glutamin, asparagin, arginin ili lizin; monosaharide, disaharide, i druge ugljene hidrate uključujući glukozu, manozu, ili dekstrine; helatne agense kao što je EDTA; šećerne alkohole kao što je manitol ili sorbitol; kontrajone koji obrazuju soli kao što je natrijum; i/ili nejonske surfaktante kao što je TWEEN™, polietilen glikol (PEG), i PLURONICS™.

[0079] Primeri pogodnih formulacija uključuju, bez ograničenja, rastvore, injekcije, sredstva za udisanje, mikrosfere, aerosoli, gelove, masti, kremove, losione, praškove, suve vezikulrane praškove, tablete, i kapsule. Farmaceutske kompozicije mogu da uključuju, u zavisnosti od željene formulacije, farmaceutski prihvatljive, netoksične nosače razblaživača, koji predstavljaju vehikulume koji se uobičajeno koriste kako bi se formulisale farmaceutske kompozicije za primenu kod životinja ili ljudi. Razblaživač je izabran tako da ne utiče na biološko dejstvo kombinacije. Primeri takvih razblaživača uključuju, bez ograničenja, destilovanu vodu, puferisanu vodu, fiziološki slani rastvor, PBS, Ringerov rastvor, rastvor dekstroze, i Hankov rastvor. Farmaceutska kompozicija ili formulacija ovog otkrivanja dalje može da uključuje, bez ograničenja, druge nosače ili netoksične, neterapeutske, neimunogenske stabilizatore, i ekscipijense. Kompozicije takođe mogu da uključuju dodatne supstance za postizanje fizioloških uslova, kao što su agensi za podešavanje pH i puferisanje, agensi za podešavanje toksičnosti, ovlaživači i deterdženti. Farmaceutska kompozicija ovog otkrivanja takođe može da uključuje bilo koji od raznih stabilizatora, kao što je antioksidans na primer.

[0080] Za oralno davanje, aktivni sastojak može da se daje u čvrstim doznim oblicima, kao što su kapsule, tablete, i praškovi, ili u tečnim doznim oblicima, kao što su eliksiri, sirupi, i suspenzije. Aktivna komponenta(e) može biti enkapsulirana u želatinastim kapsulama zajedno sa neaktivnim sastojcima i praškastim nosačima, kao što su glukoza, laktoza, saharoza, manitol, skrob, celuloza ili derivati celuloze, magnezijumstearat, stearinska kiselina, natrijumsaharin, talkum, magnezijumkarbonat. Primeri dodatnih neaktivnih sastojaka koji mogu da se dodaju kako bi se obezbedila željena boja, ukus, stabilnost, kapacitet puferisanja, disperzija ili druge poznate poželjne karakteristike, su crveni gvožđeoksid, gel silicijumdioksida, natrijumlaurilsulfat, titandioksid, i jestivo belo mastilo. Slični razblaživači mogu da se koriste kako bi se napravile komprimovane tablete. I tablete i kapsule mogu biti proizvedene kao proizvodi sa odloženim oslobađanjem kako bi se obezbedilo kontinuirano oslobađanje leka tokom perioda sati. Komprimovane tablete mogu biti obložene šećerom ili filmom kako bi se zamaskirao neprijatan ukus i zaštitila tableta od atmosfere, ili sa enteričnim omotačem zbog selektivne dezintegracije u gastrointestinalnom traktu. Tečni dozni oblici za oralnu primenu mogu da sadrže boju i aromu kako bi se povećalo prihvatanje pacijenta.

1

[0081] Formulacije pogodne za parenteralno davanje uključuju vodene i nevodene, izotonične sterilne injekcione rastvore, koji mogu da sadrže antioksidanse, pufere, bakteriostate, i solute koji daju formulaciju izotoničnu sa krvlju primaoca, i nevodene sterilne suspenzije koje mogu da uključuju agense za suspendovanje, solubilizatore, agense za zgušnjavanje, stabilizatore, i konzervanse.

[0082] Komponente koje se koriste da bi se formulisale farmaceutske kompozicije su poželjno velike čistoće i suštinski ne sadrže potencijalno štetne kontaminante (npr., najmanje reda Nacionalne hrane (NF), generalno najmanje analitičkog reda, i uobičajenije najmanje farmaceutskog reda). Štaviše, kompozicije predviđene za in vivo upotrebu su obično sterilne. Do mere da dato jedinjenje mora biti sintetisano pre upotrebe, dobijeni proizvod obično suštinski ne sadrži bilo kakve potencijalno toksične agense, naročito bilo koje endotoksine, koji mogu biti prisutni tokom postupka sinteze ili prečišćavanja. Kompozicije za parentalnu primenu su takođe sterilne, suštinski izotone i prave se u GMP uslovima.

Farmaceutske doze

[0083] Farmaceutske kompozicije ovog otkrivanja koje sadrže kompoziciju koja sadrži lipidnu česticu ovog otkrivanja i ugljeni hidrat ovog otkrivanja enkapsuliran lipidnom česticom može da se koristi (npr., daje se subjektu kojem je lečenje potrebno sa ugljenim hidratom ovog otkrivanja, kao što je čovek) u skladu sa poznatim postupcima, kao što je oralno davanje, intravensko davanje kao što je bolus ili kontinuiranom infuzijom tokom nekog vremenskog perioda, intramuskularno, intraperitonealno, intracerobrospinalno, intrakranijalno, intraspinalno, subkutano, intra-artikularno, intrasinovijalno, intratekalno, oralno, topikalno, ili putem udisanja.

[0084] Doze i željena koncentracija farmaceutske kompozicije ovog otkrivanja mogu da variraju u zavisnosti od određene predviđene upotrebe. Određivanje odgovarajuće doze ili načina primene je dobro poznato svakom stručnjaku. Eksperimenti na životinjama pružaju pouzdane smernice za određivanje efektivnih doza za humanu terapiju. Skaliranje međuvrsta efektivnih doza može da se izvede u skladu sa principima opisanim u Mordenti, J. i Chappell, W. "The Use of Interspecies Scaling in Toxicokinetics," In Toxicokinetics and New Drug Development, Yacobi et al., Eds, Pergamon Press, New York 1989, pp.42-46.

[0085] Za in vivo primenu bilo kojih kompozicija ovog otkrivanja koje sadrže lipidnu česticu ovog otkrivanja i ugljeni hidrat ovog otkrivanja koji je enkapsuliran lipidnom česticom, normalne dozne količine mogu da variraju od 10 ng/kg do 100 mg/kg telesne mase subjekta dnevno.

[0086] Davanje kompozicije ovog otkrivanja koja sadrži lipidnu česticu ovog otkrivanja i ugljeni hidrat ovog otkrivanja enkapsuliran lipidnom česticom može biti kontinuirano ili isprekidano, u zavisnosti od, na primer, fiziološkog stanja primaoca, da li je svrha primene terapeutska ili profilaktička, i drugih faktora poznatih stručnjacima.

1

[0087] U okviru ovog otkrivanja je da će različite formulacije biti efektivne za različite terapije i različite poremećaje, i da primena koja je predviđena da leči konkretan organ ili tkivo može nužno da zahteva dostavu koja je različita od one u drugi organ ili tkivo. Štaviše, doze mogu da se daju putem jedne ili više odvojenih primena, ili kontinuiranom infuzijom. Za ponovljene primene tokom nekoliko dana ili duže, u zavisnosti od stanja, lečenje je odloženo dok se ne pojave željeni simptomi suzbijanja bolesti ne pojave. Međutim, drugi dozni režimi mogu biti korisni. Napredak ove terapije se lako prati konvencionalnim tehnikama i ispitivanjima.

[0088] Stoga kod nekih varijacija, ovde obezbeđene kompozicije mogu hronično ili isprekidano da se daju subjektu (uključujući, na primer, čoveka) kome je to potrebno. "Hronično" davanje se odnosi na davanje leka(ova) kontinuirano nasuprot akutnog, tako da se održava početni terapeutski efekat (dejstvo) duži vremenski period. "Isprekidano" davanje se odnosi na lečenje koje se ne radi konsekutivno već ciklično.

Terapeutske upotrebe

[0089] Ovo otkrivanje obezbeđuje kompozicije koje sadrže lipidnu česticu ovog otkrivanja i ugljeni hidrat ovog otkrivanja enkapsuliran lipidnom česticom koja može da dostavlja ugljeni hidrat u unutrašnjost ćelije. Ove kompozicije su korisne za dostavu ugljenih hidrata ovog otkrivanja subjektu kojem su potrebni takvi ugljeni hidrati.

[0090] Kako se ovde upotrebljava, pojam "subjekat" se odnosi na sisara, kao što je čovek, domaća životinja, kao što je mačiji ili pseći subjekat, životinja sa farme (npr., govedo, konj, koza, ovca, i svinja), divlja životinja (bilo u divljini ili zoološkom vrtu), životinja koja se koristi za istraživanje, kao što je miš, pacov, zec, koza, ovca, svinja, pas, i mačka, i ptice. U jednom načinu ostvarivanja, subjekat je čovek.

[0091] Kod nekih varijacija, subjekat može biti u riziku. Na primer, u jednoj varijaciji, subjekat koji je u riziku je čovek. Kako se ovde upotrebljava, subjekat "u riziku" od razvijanja određene bolesti, poremećaja, ili stanja, kao što je urođeni poremećaj glikozilacije, može ili ne mora da ima bolest ili simptome bolesti koji mogu da se detektuju, i mogu i ne moraju da ispolje bolest ili simptome bolesti koji mogu da se detektuju pre ovde opisanih postupaka lečenja. "U riziku" označava da pojedinac ima faktore rizika, koji predstavljaju parametre koji mogu da se izmere koji su u korelaciji sa razvojem određene bolesti, poremećaja, ili stanja, kao što su poznata u tehnici. Subjekat sa jednim ili više faktora rizika ima veću verovatnoću od razvoja određene bolesti, poremećaja, ili stanja kao što je urođeni poremećaj glikozilacije, od subjekta bez jednog ili više od ovih faktora rizika.

[0092] U nekim načinima ostvarivanja, kompozicije koje sadrže lipidnu česticu ovog otkrivanja i ugljeni hidrat ovog otkrivanja enkapsuliran lipidnom česticom takođe mogu da se koriste za dostavu ugljenih hidrata ovog otkrivanja u unutrašnjost ćelije subjekta kome je to potrebno. U određenim načinima ostvarivanja, kompozicije koje sadrže lipidnu česticu ovog otkrivanja i ugljeni hidrat ovog otkrivanja

2

enkapsuliran lipidnom česticom može da se koriste za sprečavanje, smanjenje rizika, ili lečenje bolesti ili poremećaja, kao što je urođeni poremećaj glikozilacije (CDG) kod subjekta kome je to potrebno.

[0093] Shodno tome, kako je ovde otkriveno, kompozicije ovog otkrivanja koja sadrži lipidnu česticu ovog otkrivanja i ugljeni hidrat ovog otkrivanja enkapsuliran lipidnom česticom može da se koristi za dostavu ugljenog hidrata ovog otkrivanja subjektu kome je to potrebno, za dostavu ugljenog hidrata ovog otkrivanja u unutrašnjost ćelije subjekta kome je to potrebno, i za lečenje, sprečavanje, ili smanjenje rizika od bolesti ili poremećaja, kao što je urođeni poremećaj glikozilacije (CDG) kod subjekta kome je to potrebno. U nekim načinima ostvarivanja, subjekat ima takvu bolest ili poremećaj. U nekim načinima ostvarivanja, subjekat je čovek sa takvom bolešću ili poremećajem.

[0094] Kako se ovde upotrebljava, pojam "urođeni poremećaji glikozilacije" (CDG) se odnosi na grupu genetskih poremećaja koji dovode do grešaka u metabolizmu u kojem glikozilacija raznih proteina iz tkiva i/ili lipida je deficitarna ili defektna. Urođeni poremećaji glikozilacije takođe mogu biti poznati kao CDG sindromi. CDG sindromi često mogu da izazovu ozbiljnu, povremeno fatalnu smetnju kod nekoliko različitih sistema organa, kao što je nervni sistem, mozak, mišići, i creva, kod pogođenih novorođenčadi. Manifestacije CDG sindroma mogu biti u opsegu od ozbiljnih zastoja u razvoju i hipotonije u koja počinje u periodu prve godine života, do hipoglikemije i enteropatije prilikom koje se gube proteini sa normalnim razvojem. Zastoj u razvoju može biti uobičajena početna indikacija za dijagnozu CDG. Jedan od najuobičajenijih podtipova CDG sindroma je CDG-Ia (takođe poznat kao PMM2-CDG) pri čemu genetski nedostatak vodi do gubitka fosfomanomutaze 2, koji predstavlja enzim odgovoran za konverziju manoza-6-fosfata u manoza-1-fosfat.

[0095] CDG sindromi mogu biti klasifikovani kao tip I (CDG-I) i tip II (CDG-II). Takva klasifikacija može da zavisi od prirode i položaja biohemijskog nedostatka u metaboličkom putu u odnosu na dejstvo oligosahariltransferaze. Postupci za skrinovanje CDG podtipa mogu da uključuju analizu statusa glikolizacije transferina, na primer, izoelektričnim fokusiranjem ili ESI-MS. Primeri CDG tipa I uključuju, bez ograničenja, Ia (PMM2-CDG), Ib (MPI-CDG), Ic (ALG6-CDG), Id (ALG3-CDG), Ie (DPM1-CDG), If (MPDU1-CDG), Ig (ALG12-CDG), Ih (ALG8-CDG), Ii (ALG2-CDG), Ij (DPAGT1-CDG), Ik (ALG1-CDG), 1L (ALG9-CDG), Im (DOLK-CDG), In (RFT1-CDG), Io (DPM3-CDG), Ip (ALG11-CDG), Iq (SRD5A3-CDG), Ir (DDOST-CDG), DPM2-CDG, TUSC3-CDG, MAGT1-CDG, DHDDS-CDG, i I/IIx. Primeri CDG tipa II uključuju, bez ograničenja, IIa (MGAT2-CDG), IIb (GCS1-CDG), IIc (SLC335C1-CDG), lid (B4GALT1-CDG), IIe (COG7-CDG), IIf (SLC35A1-CDG), IIg (COG1-CDG), IIh (COG8-CDG), IIi (COG5-CDG), IIj (COG4-CDG), IIL (COG6-CDG), ATP6V0A2-CDG, MAN1B1-CDG, i ST3GAL3-CDG.

[0096] Urođeni poremećaji glikozilacije (CDG) koji mogu da se leče kompozicijama ovog otkrivanja koje sadrže lipidnu česticu ovog otkrivanja i ugljeni hidrat ovog otkrivanja enkapsuliran lipidnom česticom uključuju, bez ograničenja, Ia (PMM2-CDG), Ib (MPI-CDG), Ic (ALG6-CDG), Id (ALG3-CDG), Ie (DPM1-CDG), If(MPDU1-CDG), Ig (ALG12-CDG), Ih (ALG8-CDG), Ii (ALG2-CDG), Ij (DPAGT1-CDG), Ik (ALG1-CDG), 1L (ALG9-CDG), Im (DOLK-CDG), In (RFT1-CDG), Io (DPM3-CDG), Ip (ALG11-CDG), Iq (SRD5A3-CDG), Ir (DDOST-CDG), DPM2-CDG, TUSC3-CDG, MAGT1-CDG, DHDDS-CDG, I/IIx, IIa (MGAT2-CDG), IIb (GCS1-CDG), IIc (SLC335C1-CDG), lid (B4GALT1-CDG), IIe (COG7-CDG), IIf (SLC35A1-CDG), IIg (COG1-CDG), IIh (COG8-CDG), IIi (COG5-CDG), IIj (COG4-CDG), IIL (COG6-CDG), ATP6V0A2-CDG, MAN1B1-CDG, i ST3GAL3-CDG.

[0097] Shodno tome, kompozicije ovog otkrivanja koje sadrže lipidnu česticu ovog otkrivanja i ugljeni hidrat ovog otkrivanja enkapsuliran lipidnom česticom mogu da se koriste za lečenje, sprečavanje, ili poboljšanje jednog ili više simptoma urođenog poremećaja glikozilacije (CDG) ovog otkrivanja. U nekim načinima ostvarivanja, ovo otkrivanje obezbeđuje postupke lečenja, sprečavanja, ili poboljšanja jednog ili više simptoma kod subjekata sa urođenim poremećajem glikozilacije (CDG) poremećajem ovog otkrivanja davanjem kompozicije tom subjektu ovog otkrivanja koja sadrži lipidnu česticu ovog otkrivanja i ugljeni hidrat ovog otkrivanja enkapsuliran lipidnom česticom za, na primer, isporučivanje ugljenog hidrata tom subjektu kako bi se ispravila, ili kako bi se na drugi način poboljšala glikozilacija proteina i/ili lipida kod tog subjekta.

[0098] U nekim načinima ostvarivanja, ovo otkrivanje obezbeđuje postupke za lečenje, sprečavanje, ili poboljšanje jednog ili više simptoma urođenog poremećaja glikozilacije (CDG) subjektu kome je to potrebno, davanjem tom subjektu terapeutski efektivne količine kompozicije koja obuhvata lipidnu česticu; i endogeni ugljeni hidrat enkapsuliran u lipidnoj čestici. U nekim načinima ostvarivanja, ovo otkrivanje obezbeđuje postupke za lečenje, sprečavanje, ili poboljšanje jednog ili više simptoma urođenog poremećaja glikozilacije (CDG) subjektu kome je to potrebno, davanjem tom subjektu terapeutski efektivne količine kompozicije koja obuhvata lipidnu česticu koja obuhvata etilenoksid; i ugljeni hidrat enkapsuliran u lipidnoj čestici. U nekim načinima ostvarivanja, ovo otkrivanje obezbeđuje postupke za lečenje, sprečavanje, ili poboljšanje jednog ili više simptoma urođenog poremećaja glikozilacije (CDG) subjektu kome je to potrebno, davanjem tom subjektu terapeutski efektivne količine kompozicije koja obuhvata lipidnu česticu; i ugljeni hidrat enkapsuliran u lipidnoj čestici, pri čemu ta lipidna čestica obuhvata holin, etanolamin, glicerol, inositol, ili bilo koju njihovu kombinaciju. U nekim načinima ostvarivanja, ovo otkrivanje obezbeđuje postupke za lečenje, sprečavanje, ili poboljšanje jednog ili više simptoma urođenog poremećaja glikozilacije (CDG) subjektu kome je to potrebno, davanjem tom subjektu terapeutski efektivne količine kompozicije koja obuhvata lipozom; i manoza-1-fosfat enkapsuliran u lipozomu, pri čemu lipozom obuhvata holesterol i fosfatidiletanolamin (PE) pričvršćen za polietilen glikol (PEG). U nekim načinima ostvarivanja, urođeni poremećaj glikozilacije (CDG) može biti CDG tip I poremećaj, CDG-Ia poremećaj, CDG tip II poremećaj, CDG-IIc poremećaj, ili CDG-IIf poremećaj. U određenim načinima ostvarivanja, urođeni poremećaj glikozilacije (CDG) je CDG-Ia poremećaj. U nekim načinima ostvarivanja, kompozicija se primenjuje oralno, dermalno, nazalno, ili intravenski.

[0099] Kako se ovde upotrebljava, pojam "lečenje" ili "koji se leči" predstavlja pristup za dobijanje korisnih ili željenih rezultata uključujući kliničke rezultate. Korisni ili željeni klinički rezultati mogu da uključuju jedan ili više od sledećih: a) inhibiranje bolesti ili stanja (npr., smanjenje jednog ili više simptoma bolest ili stanja, i/ili umanjenje stepena bolesti ili stanja); b) usporavanje ili zaustavljanje razvoja jednog ili više kliničkih simptoma povezanih sa bolešću ili stanjem (npr., stabilizovanje bolesti ili stanja, sprečavanje ili odlaganje pogoršanja ili napredovanje bolesti ili stanja, i/ili sprečavanje ili odlaganje širenja bolesti ili stanja); i/ili c) ublažavanje bolesti, odnosno, uzrokovanje regresije kliničkih simptoma (npr., ublažavanje stanja bolesti, čime se obezbeđuje delimična ili potpuna remisija bolesti ili stanja, pojačavanje efekta drugog leka ,odlaganje progresije bolesti, poboljšanja kvaliteta života, produžavanje preživljavanja.

[0100] Kako se ovde upotrebljava, pojam "sprečavanje" ili "koji sprečava" se odnosi na bilo koje lečenje bolesti ili stanja koje uzrokuje kliničke simptome bolesti ili stanja koje se neće razviti. Jedinjenja mogu, u nekim načinima ostvarivanja, da se daju subjektu (uključujući čoveka) koji je u riziku ili ima porodičnu anamnezu te bolesti ili stanja.

[0101] "Efektivna količina" se odnosi na najmanju efektivnu količinu, u dozama i za vremenske periode neophodne, za postizanje željenog terapeutskog ili profilaktičkog rezultata. Efektivna količina može biti podeljena na jedno ili više davanja.

[0102] "Terapeutski efektivna količina" je najmanje minimalna koncentracija potrebna da bi se videlo poboljšanje određene bolesti, poremećaja ili stanja koje može da se izmeri, kao što je urođeni poremećaj glikozilacije. Ovde data terapeutski efektivna količina može da varira prema faktorima kao što su stanje bolesti, uzrast, pol, i telesna masa subjekta, i mogućnost lipidnih kompozicija ovog otkrivanja da izvuku željeni odgovor kod tog subjekta. Terapeutski efektivna količina je takođe ona u kojoj terapeutsku korisni efekti nadmašuju bilo koje toksične ili škodljive efekte lipidnih kompozicija ovog otkrivanja.

[0103] U drugim aspektima ovog otkrivanja, kompozicije ovog otkrivanja koja sadrži lipidnu česticu ovog otkrivanja i ugljeni hidrat ovog otkrivanja enkapsuliran lipidnom česticom mog uda se koriste za dostavu ugljenog hidrata subjektu kome je to potrebno. Shodno tome, u nekim načinima ostvarivanja, ovo otkrivanje obezbeđuje postupke za dostavu ugljenog hidrata subjektu kome je to potrebno, davanjem tom subjektu terapeutski efektivne količine kompozicije koja obuhvata lipidnu česticu; i endogeni ugljeni hidrat enkapsuliran u lipidnoj čestici. U nekim načinima ostvarivanja, ovo otkrivanje obezbeđuje postupke za dostavu ugljenog hidrata subjektu kome je to potrebno, davanjem tom subjektu a terapeutski efektivne količine kompozicije koja obuhvata lipozom; i manoza-1-fosfat enkapsuliran u lipozomu, pri čemu je lipozom obuhvata holesterol i fosfatidiletanolamin (PE) pričvršćen za polietilen glikol (PEG). U nekim načinima ostvarivanja, subjekat ima urođeni poremećaj glikozilacije (CDG). U nekim načinima ostvarivanja, urođeni poremećaj glikozilacije (CDG) može biti poremećaj CDG tipa I,

2

CDG-Ia poremećaj, poremećaj CDG tipa II, CDG-IIc poremećaj, i CDG-IIf poremećaj. U određenim načinima ostvarivanja, urođeni poremećaj glikozilacije (CDG) je CDG-Ia poremećaj.

[0104] U drugim aspektima ovog otkrivanja, kompozicije ovog otkrivanja koje sadrže lipidnu česticu ovog otkrivanja i ugljeni hidrat ovog otkrivanja enkapsuliran lipidnom česticom mogu da se koriste za dostavu ugljenog hidrata u unutrašnjost ćelije subjekta kome je to potrebno. Shodno tome, u nekim načinima ostvarivanja, ovo otkrivanje obezbeđuje postupke za dostavu ugljenog hidrata u unutrašnjost ćelije subjekta kome je to potrebno, davanjem tom subjektu terapeutski efektivne količine kompozicije koja obuhvata lipidnu česticu; i endogeni ugljeni hidrat enkapsuliran u lipidnoj čestici, pri čemu kompozicija koja se primenjuje prolazi kroz membranu ćelijske plazme i time se ugljeni hidrat dostavlja u unutrašnjost ćelije. U nekim načinima ostvarivanja, ovo otkrivanje obezbeđuje postupke za dostavu ugljenog hidrata u unutrašnjost ćelije subjekta kome je to potrebno, davanjem tom subjektu terapeutski efektivne količine kompozicije koja obuhvata lipozom; i manoza-1-fosfat enkapsuliran u lipozomu, pri čemu lipozom obuhvata holesterol i fosfatidiletanolamin (PE) pričvršćen za polietilen glikol (PEG), i pri čemu kompozicija koja se primenjuje prolazi kroz membranu ćelijske plazme čime se ugljeni hidrat dostavlja u unutrašnjost ćelije. U nekim načinima ostvarivanja, subjekat ima urođeni poremećaj glikozilacije (CDG). U nekim načinima ostvarivanja, urođeni poremećaj glikozilacije (CDG) može biti CDG tip I poremećaj, CDG-Ia poremećaj, CDG tip II poremećaj, CDG-IIc poremećaj, i CDG-IIf poremećaj. U određenim načinima ostvarivanja, urođeni poremećaj glikozilacije (CDG) je CDG-Ia poremećaj. U nekim načinima ostvarivanja, davanje kompozicije indukuje najmanje 0.05-struko do najmanje 2-struko povećanje u ćelijskoj proizvodnji oligosaharida višeg reda vezanih za lipide kod tog subjekta, u poređenju sa ćelijskom proizvodnjom oligosaharida višeg reda vezanih za lipide kod tog subjekta u odsustvu kompozicije. U određenim načinima ostvarivanja, oligosaharidi višeg reda vezani za lipide obuhvataju Man4GlcNAc2, Man5GlcNAc2, Man6GlcNAc2, Man7GlcNAc2, Man8GlcNAc2, Man9GlcNAc2, ili bilo koju njihovu kombinaciju. U nekim načinima ostvarivanja, kompozicija se primenjuje oralno, topikalno, dermalno, nazalno, intravenski, intramuskularno, intraperitonealno, intracerebrospinalno, intrakranijalno, intraspinalno, subkutano, intra-artikularno, intrasinovijalno, ili intratekalno.

Predmeti proizvodnje i kompleta

[0105] Ovo otkrivanje takođe obezbeđuje predmete proizvodnje i/ili kompleta koji sadrže kompoziciju ovog otkrivanja koja sadrži lipidnu česticu ovog otkrivanja i ugljeni hidrat ovog otkrivanja enkapsuliran lipidnom česticom. Predmeti proizvodnje i/ili kompleta ovog otkrivanja mogu da uključuju jedan ili više kontejnera koji obuhvataju prečišćenu kompoziciju ovog otkrivanja. Pogodni kontejneri mogu da uključuju, bez ograničenja, boce, fiole, špriceve, i kese za IV rastvore. Kontejneri mogu biti formirani od raznih materijala kao što je staklo ili plastika. U nekim načinima ostvarivanja, delovi proizvodnje i/ili kompleta dalje uključuju uputstva za upotrebu u skladu sa bilo kojim od postupaka ovog otkrivanja. U nekim načinima ostvarivanja, ova uputstva obuhvataju opis davanja kompozicije koja sadrži lipidnu česticu ovog otkrivanja i ugljeni hidrat ovog otkrivanja enkapsuliran lipidnom česticom kako bi se ugljeni hidrat dostavio subjektu kome je to potrebno, kako bi se ugljeni hidrat dostavio u unutrašnjost ćelije subjekta kome je to potrebno, ili da bi se lečio urođeni poremećaj glikozilacije (CDG) subjektu kome je to potrebno, prema postupcima ovog otkrivanja. U nekim načinima ostvarivanja, ta uputstva obuhvataju opis kako da se detektuje urođeni poremećaj glikozilacije (CDG), na primer kod subjekta, u uzorku tkiva, ili u ćeliji. Predmet proizvodnje i/ili kompleta dalje može da obuhvata opis odabira subjekta pogodnog za lečenje bazirano na identifikovanju da li taj subjekat ima tu bolest i faze te bolesti.

[0106] Uputstva generalno uključuju informacija o dozi, rasporedu doziranja, i put primene za predviđenu terapiju. Kontejneri mogu biti jedinične doze, pakovanja u rasutom stanju (npr., višedozna pakovanja) ili podjedinične doze. Uputstva iz delova proizvodnje i/ili kompleta ovog otkrivanja su obično napisana uputstva na etiketi ili uputstvu za lek u pakovanju (npr., listu papira koji čini deo proizvodnje i/ili kompleta), ili uputstva koja je moguće očitati pomoću uređaja (npr., uputstva koja se nalaze na magnetnom ili optičkom disku za čuvanje) su takođe prihvatljiva.

[0107] Etiketa ili uputstvo u pakovanju označavaju da se kompozicija koristi za dostavu ugljenog hidrata i/ili lečenje, npr., urođenog poremećaja glikozilacije (CDG). Uputstva mogu biti obezbeđena radi praktikovanja ovde opisanih postupaka.

[0108] Predmeti proizvodnje i/ili kompleta ovog otkrivanja mogu biti u pogodnom pakovanju. Pogodno pakovanje uključuje, bez ograničenja, fiole, boce, tegle, i fleksibilno pakovanje (npr., zaptivene Mylar ili plastične vreće). U razmatranje se takođe uzimaju i pakovanja za upotrebu u kombinaciji sa konkretnim uređajem, kao što je inhalator, uređaj za nazalnu primenu (npr., raspršivač) ili uređaj za infuziju kao što je mini pumpa. Predmet proizvodnje i/ili komplet može da ima ulaz za sterilni pristup (na primer kontejner može biti kesa za intravenski rastvor ili fiola sa zatvaračem koji može da se probuši hipodermijskom iglom za injekciju). Kontejner takođe može da ima sterilni pristupni ulaz (npr., kontejner može biti kesa za intravenski rastvor ili fiola sa zatvaračem koji može da se probuši iglom za hipodermijsku injekciju). Najmanje jedan aktivni agens u kompoziciji je ugljeni hidrat sposoban da leči urođeni poremećaj glikozilacije (CDG) i/ili poboljša jedan ili više njegovih simptoma. Kontejner može dalje da obuhvata drugi farmaceutski aktivni agens.

[0109] Predmeti proizvodnje i/ili kompleta mogu opciono da obezbede dodatne komponente kao što su puferi i interpretativne informacije. Normalno, predmet proizvodnje i/ili kompleta obuhvata kontejner i etiketu ili uputstvo(a) o ili povezano sa kontejnerom.

[0110] Ukoliko nije drugačije definisano, za sve naučne i tehničke pojmove se smatra da imaju isto značenje koje se uobičajeno koristi u tehnici a na koje se odnose. U svrhu ovog otkrivanja, definisani su sledeći pojmovi.

2

[0111] Pojam "oko" kako se ovde upotrebljava se odnosi na uobičajeni opseg greške za odgovarajuću vrednost koja je poznata stručnjaku u ovoj tehničkoj oblasti. Pozivanje na vrednost ili parametar “oko" uključuje (i opisuje) načine ostvarivanja koji su usmereni na tu vrednost ili parametar sam po sebi. Na primer, "oko x" uključuje i opisuje "x" samo po sebi. U nekim načinima ostvarivanja, pojam "oko" kada se koristi u vezi sa merom, ili kada se koristi da se modifikuje vrednost, jedinica, konstanta, ili opseg vrednosti, se odnosi na varijacije od /- 2%.

[0112] Kako se ovde upotrebljava i u priloženim patentnim zahtevima, oblici jednine "jedan," "neki," i "taj" uključuju i množinu osim ukoliko kontekst jasno ne nalaže drugačije. Na primer, pozivanje na "lipidnu česticu" predstavlja oznaku od jedan do mnogo lipidnih čestica.

PRIMERI

[0113] Ovaj pronalazak će biti razumljiviji uz pozivanje na sledeće primere. Oni međutim, ne bi trebalo da se tumače kao ograničavajući obim ovog pronalaska.

Skraćenice

[0114] "PC" odgovara fosfatidilholinu.

[0115] "PE" odgovara fosfatidiletanolaminu.

[0116] "PEG" odgovara 1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamin-N-[amino(polietilen glikol)-2000] ili samo Poli-etilen-glikolu.

[0117] "M1P" odgovara manoza-1-fosfatu.

[0118] "PBS" odgovara fosfatom puferisanom slanom rastvoru.

[0119] "MWCO" odgovara graničnoj molekulskoj masi.

Materijali i postupci

Lipozomi

[0120] Materijali za pripremu lipozoma (PC, PE, i PE-PEG) su nabavljeni od Avanti Polar Lipide.

Ćelijske linije

[0121] CDG-Ia humani dermalni fibroblasti i humani dermalni fibroblasti divljeg tipa su nabavljeni od Coriell Institute.

Podloge za kulture

[0122] Dulbekova min. Iglove podloge su nabavljene od Mediatech.

[0123] Alfa-minimalna suštinska podloga je nabavljena od Mediatech.

[0124] Glutamin i penicilin-streptomicin su nabavljeni od Omega Scientific.

2

[0125] FBS je nabavljen od Thermo.

Primer 1: Priprema lipozoma manoza-1-fosfata

[0126] Sledeći primer pokazuje pripremu lipozoma koja sadrži manoza-1-fosfat (M1P-lipozomi).

Struktura manoza-1-fosfata (M1P) je prikazana na FIG.1A. Dok je konkretan izomer prikazan na FIG. 1A, trebalo bi imati u vidu da ugljeni hidrati koji se koriste u kompozicijama i ovde dati postupci mogu biti bilo kog izomernog oblika, pod uslovom da takvi ugljeni hidrati predstavljaju endogene ugljene hidrate za dati subjekat.

Postupak pripreme lipozoma

[0127] Lipozomi su pripremljeni hidratacijom na tankom filmu od fosfatidilholina (PC), holesterola, i fosfatidiletanolamina (PE) konjugovanih za poli-etilen-glikol (PEG). Struktura PEG je prikazana na FIG.

1B. Na FIG.1B, u jednoj varijaciji, n može biti u opsegu od 800-5000. U drugim varijacijama, vrednost n može biti 2000. opet u drugim varijacijama, PEG može biti modifikovan ili meleimidom ili NHS-estromu zavisnosti od toga za šta će PEG biti konjugovan. Struktura fosfatidiletanolamina pričvršćenog za PEG (PEG-PE) je prikazana na FIG.1C. Struktura fosfatidilholina (PC) je prikazana na FIG.1D.

[0128] Rasuti rastvarač iz lipidnog filma PC i holesterola je uklonjen rotirajućim upravanjem tokom 30 minuta, nakon čega je usledilo sušenje zamrzavanjem tokom 4 sata kako bi se uklonile količine rastvarača u tragovima. Nakon ovoga, lipozomi prvo rehidrirani rastvorom manoza -1-fosfata (M1P) u 1X fosfatom puferisanom slanom rastvoru pH 7.4 (PBS) pri koncentraciji M1P od 10 mg/mL. Zatim, PBS je dalje dodat kako bi se postigla koncentracija lipida od 20 mg/mL. Lipozomi su zatim zagrejani do 39°C i dimenzionirani ili ektrudirani kroz veličinu sita od 200 a zatim polikarbonatne membrane veličine 100 nm pomoću mini ručnog ekstrudera. Lipozomi su zatim dijalizovani nasuprot PBS pomoću 2 kDa granične molekulske mase (MWCO).

[0129] Nakon ove faze, 1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamin-N-[amino(polietilen glikol)-2000] (PEG) je dodat post-insertovanjem. Ukratko, tanak film PEG je dobijen sušenjem rastvarala pomoću toka N2gasa i sušenja zamrzavanjem kako je prethodno pomenuto. Ovaj film je zatim rehidriran pomoću pripremljenog M1P-ispunjenog lipozomalnog rastvora. Nakon mešanja u mešalici tokom 5 minuta, rastvor je inkubiran na 37°C tokom noći kako bi se omogućilo post-insertovanje PEG u jezgro nanočestica. Struktura lipozoma napunjenih manoza-1-fosfatom je prikazana na FIG.2.

Tabela 1

2

[0130] U tabeli 1, konačna zapremina formulacije lipozoma je iznosila 1 mL.

Primer 2: Merenje sadržaja M1P u lipozomima

[0131] CDG-Ia poremećaj je poremećaj glikozilacije kojeg karakteriše nedostatak ili abnormlnosti povezane sa enzimom fosfomanomutaze (PMM). Ovaj poremećaje je dijagnostikovan ispitivanjem glikoproteina u serumu hepatičkog porekla (transferin je klinički ispitan protein), koji su uobičajeno nedovoljno glikozilovani. Transferin se obično ocenjuje pomoću izoelektričnog fokusiranja, koje bi naglasilo dramatično smanjenje PMM dejstva (PMM dejstvo kod CDG-Ia pacijenata je približno 0,29 nM/min/mg, u odnosu na normalno PMM dejstvo od približno 2,97 nM/min/mg). PMM enzim je odgovoran za katalizovanje konverzije manoza-6-fosfata u manoza-1-fosfat, koji za uzvrat predstavlja prekursor za krajnju sintezu G3M9Gn2-P-P-Dolihaol, koji za uzvrat predstavlja prekursor lipid-povezanogoligosaharida (LLO). Ovo je prikazano sledećim šematskim prikazom puta metaboličke glikozilacije: glukoza → glukoza-6-fosfat → fruktoza-6-fosfat → manoza → manoza-6-fosfat → manoza-1-fosfat → GDP-manoza → peptidna N-glikozilacija.

[0132] Tipični LLO oligosaharidi uključuju podjedinice manoze (M) povezane sa N-acetilglukozamin disaharidom (Gn2). Smanjenje PMM aktivnosti samim tim usporava puno sazrevanje LLO oligosaharida, koji su obično u opsegu od M5Gn2do M9Gn2. Dobijeni nezreli LLO oligosaharidi nisu u potpunosti funkcionalni LLo i obično su okrnjeni. Nezreli LLO oligosaharidi obično imaju veličine M2Gn2i M3Gn2.

[0133] Analiza sintetisanih lanaca oligosaharida se obično izvodi inkubacijom fibroblasta sa radioobeležnom manozom kako bi se verifikovalo bilo kakvo odstupanje od utvrđenih obrazaca sazrevanja oligosaharida. Ovo se obično postiže obeležavanjem novosintetisanih oligosaharida unutar humanih fibroblasta sa [2-<3>H]manozom. Nakon inkubacije obeleženom manozom, ćelijski lizati su svareni kako bi se dalje analizirali obeleženi šećeri hromatografijom. Međutim, stabilno snabdevanje manozom je neophodno kako bi se osigurala kontinuirana proizvodnja saharidnog lanca. (S. Catherine Hubbard i Phillips W. Robbins. Journal of Biological Chemistry (1980) 255: 11782-11793). Problem sa pristupom sistematskog snabdevanja manozom unutar tela kako bi se lečili poremećaji, kao što je CDG-Ia, je nemogućnost manoze da prođe kroz plazmatsku membranu. Samim tim razni derivati manoze su procenjeni zbog svoje mogućnosti da se akumuliraju unutar citozola ćelija. Međutim, ovaj pristup je problematičan zbog toksičnosti i nestabilnosti takvih derivata.

2

[0134] Sledeći primer pokazuje kapacitet M1P-lipozoma da vode biosintezu i potpuno sazrevanje raznih LLO oligosaharida. Ovaj pristup zaobilazi potrebu ili da se permeabilizuju ćelije ili da se koristi derivat manoze.

Priprema tečnog uzorka

[0135] Lipidi su taloženi sa 10% Triton X-100 upotrebom odnosa od 1:1 lipozom:deterdžent, tim redom. Talog lipida je uklonjen centrifugiranjem. Izolovani M1P je tretiran sa HCl u konačnoj koncentraciji od 0,1 N; 1-fosfo veza je hidrolizovana tokom 15 min na 100°C. Uzorci su osušeni u vakuumu brzine tokom pripreme za obeležavanje sa fluorforom za detekciju i kvantitaciju kako je opisano kod Alwael et al. (Anal. Postupci, 2011, 3, 62). Koncentracija M1P u lipozomima je bila 1,0 mg po mililitru formulacije ekvivalentne 5% ukupne koncentracije lipida.

Terapeutik/Ispitivanja

[0136] Procenjene su ćelijska internalizacija i naknadna integracija M1P-lipozoma (kako je pripremljeno u primeru 1) in vitro pomoću primarnih humanih dermalnih fibrobalsta dobijenih od pacijenata sa CDG-Ia poremećajem (CDG-Ia fibroblasti) i humanih dermalnih fibroblasta divljeg tipa. Za procenu mogućnosti M1P-lipozoma da se koriguju nedostaci defekata proteinske glikozilacije, M1P-lipozomi su dostavljeni u CDG Tip I primarne fibroblaste dobijene od pacijenata sa CDG-Ia poremećajem. Mogućnost da se vodi glikozilacija je procenjena poređenjem strukture glikoprotein N-glikana pre i posle lečenja. Takvo poređenje je zahtevalo analizu N-glikana pomoću hromatografije normalne faze.

[0137] Upotrebom endocitotičnih puteva, M1P-lipozomi mogu da uđu u unutrašnjost ćelije i da otpuste svoj kargo u citozolu. Usled mogućnosti da se dostavi nemodifikovana manoza-1-fosfat u citozolu, analiza je izvedena na sklopu LLO oligosaharida kod fibroblasta divljeg tipa i fibroblasta dobijenih od pacijenta sa CDG-Ia (CDG-Ia fibroblasti). LLO strukture su izolovane od fibroblasta divljeg tipa (sa 100% PMM dejstvom) kao i iz CDG-Ia fibroblasta (sa 10% PMM dejstva) i količine LLO struktura su upoređene pomoću hromatografskih postupaka.

[0138] CDG-Ia dermalni fibroblasti prave seriju okrnjenih vrsta lipidom povezanih oligosaharida (LLO) u opsegu veličina od M2Gn2do M5Gn2sa M2Gn2i M3Gn2koji preovladavaju. M1P lipozomi iz primera 1 su ispitivani kako bi se procenio kapacitet da se normalizuje distribucija raznih LLO oligosaharida. CDG-Ia fibroblasti kultivisani u DMEM podlogama niske glukoze su inkubirani sa 300 µM čistog M1P (M1P) i 300 µM M1P-lipozoma (M1PL). Nakon lečenja, ćelije su sakupljene i LLO oligosaharidi su oporavljeni, hidrolizovani, modifikovani fluorforom, i analizirani hromatografijom normalne faze kako je opisano kod Gao et al. (Methods in Enzymology, 2006, 415, 3-20) i Bones et al. (Anal. Chem, 2011, 83 (13), 5344-52). Površina pika svakog LLO je normalizovana do sadržaja proteina pre izračunavanja procenta obilja.

2

[0139] Rezultati su prikazani u tabeli 2. Raspodela raznih LLO oligosaharida iz fibroblasta divljeg tipa koji su u opsegu od M2Gn2do M7Gn2. Lečenje CDG-Ia fibroblasta M1P-lipozomima je inhibiralo sintezu okrnjenih LLO oligosaharida M2Gn2i M3Gn2, i skrenulo je proizvodnju ka većim vrstama LLO oligosaharida čime se uzrokuje povećanje u ekspresiji M5Gn2-M7Gn2struktura (tabela 2). Količina M5Gn2LLO proizvedena nakon lečenja CDG-Ia fibroblasta M1P-lipozomima je tri puta veća od količine kod netretiranih CDG-Ia fibroblasta, i dva puta veća od količine kod CDG-Ia fibroblasta lečenih čistim M1P (tabela 2). Pored toga, veći red LLO oligosaharida (npr., M6Gn2i M7Gn2) je primećen kod CDG-Ia fibroblasta nakon lečenja M1P-lipozomima (tabela 2). Takav viši red LLO oligosaharida nije primećen kod CDG-Ia fibroblasta pre lečenja M1P-lipozomima. Štaviše, količina M6Gn2i M7Gn2LLO oligosaharida u CDG-Ia fibroblastima nakon lečenja M1P-lipozomima je uporediva sa količinom fibroblasta divljeg tipa (tabela 2).

[0140] Potpuna normalizacija nije primećena u svim slučajevima, budući da je analitički pristup koji je korišćen detektovao i novosintetisane LLO oligosaharide i LLO oligosaharide prethodno proizvedene u ćeliji.

Tabela 2

[0141] Tabela 2 prikazuje analize hromatografije normalne faze raspodele LLO oligosaharida (izražene kao procenat, %) kod fibroblasta divljeg tipa i CDG-Ia fibroblasta. LLO oligosaharidi sadrže dve ili više podjedinica manoze (Man) i N-acetilglukosamin disaharid (GlcNAc2). U tabeli 2, "M2Gn2" odgovara Man2GlcNAc2, "M3Gn2" odgovara Man3GlcNAc2, "M4Gn2" odgovara Man4GlcNAc2, "M5Gn2" odgovara Man5GlcNAc2, "M6Gnc2" odgovara Man6GlcNAc2, i "M7Gn2" odgovara Man7GlcNAc2.

Claims (14)

Patentni zahtevi

1. Kompozicija koja obuhvata:

a) lipidnu česticu, pri čemu ta lipidna čestica obuhvata fosfatidiletanolamin (PE), fosfatidilholin (PC), i

molekul sposoban da minimizuje degradaciju lipidne čestice, ojača zadržavanje lipidne čestice, i/ili učini lipidnu česticu imunotolerantnom kada se daje subjektu kome je to potrebno, pri čemu je pomenuti molekul polietilen glikol (PEG), i

pri čemu je PEG konjugovan za fosfolipid; i

b) endogeni ugljeni hidrat odabran iz grupe koju čine manoza, fosforilisana manoza, manofuranoza, fosforilisana manofuranoza, manopiranoza, fosforilisana manopiranoza, i manoza-1-fosfat,

pri čemu je endogeni ugljeni hidrat enkapsuliran u lipidnoj čestici.

2. Kompozicija prema zahtevu 1, pri čemu je PE prisutan u koncentraciji do 50 molarnih procenata.

3. Kompozicija prema zahtevu 1 ili 2, pri čemu je PC prisutan u koncentraciji do 50 molarnih procenata.

4. Kompozicija prema bilo kom od zahteva 1 do 3, pri čemu je ta lipidna čestica lipozom, a fosfolipid je 1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamin (DSPE).

5. Kompozicija prema bilo kom od zahteva 1 do 4, pri čemu je fosfolipid prisutan u koncentraciji od oko 3 molarna procenta.

6. Kompozicija prema bilo kom od zahteva 1 do 5, pri čemu je endogeni ugljeni hidrat manoza-1-fosfat.

7. Kompozicija prema bilo kom od zahteva 1 do 6, pri čemu kompozicija, kada se daje subjektu kome je to potrebno, indukuje najmanje 0.05-struko do najmanje 3-struko povećanje u ćelijskoj proizvodnji oligosaharida višeg reda vezanih za lipide kod tog subjekta, u poređenju sa ćelijskom proizvodnjom oligosaharida višeg reda vezanih za lipide kod tog subjekta bez davanja ove kompozicije tom subjektu.

8. Farmaceutska kompozicija koja obuhvata kompoziciju prema bilo kom od zahteva 1 do 7, i farmaceutski prihvatljiv nosač.

9. Kompozicija prema bilo kom od zahteva 1 do 7 za upotrebu u postupku za in vivo dostavu ugljenog hidrata u unutrašnjost ćelije, koji obuhvata primenu kompozicije na ćeliji, pri čemu kompozicija koja se primenjuje prolazi kroz membranu ćelijske plazme kako bi se ugljeni hidrat dostavio u unutrašnjost ćelije.

10. Postupak za in vitro dostavu ugljenog hidrata u unutrašnjost ćelije, koji obuhvata primenu kompozicije na ćeliji prema bilo kom od zahteva 1 do 7, pri čemu kompozicija koja se primenjuje prolazi kroz membranu ćelijske plazme kako bi se ugljeni hidrat dostavio u unutrašnjost ćelije.

11. Kompozicija prema bilo kom od zahteva 1 do 7 za upotrebu u postupku za dostavu ugljenog hidrata subjektu kome je to potrebno, koji obuhvata davanje kompozicije tom subjektu.

12. Kompozicija prema bilo kom od zahteva 1 do 7 za upotrebu u lečenju urođenog poremećaja glikozilacije (CDG) kod subjekta kome je to potrebno, koji obuhvata davanje kompozicije tom subjektu.

13. Kompozicija za upotrebu prema zahtevu 12, pri čemu urođeni poremećaj glikozilacije (CDG) predstavlja CDG-Ia poremećaj.

14. Postupak prema zahtevu 10 ili kompozicija za upotrebu prema bilo kom od zahteva 9, i 11 do 13, pri čemu primena kompozicije indukuje najmanje 0.05-struko do najmanje 3-struko povećanje u ćelijskoj proizvodnji oligosaharida višeg reda vezanih za lipide u unutrašnjosti ćelije, u poređenju sa ćelijskom proizvodnjom oligosaharida višeg reda vezanih za lipide u unutrašnjosti ćelije bez primene ove kompozicije u unutrašnjost ćelije.