RS61892B1

RS61892B1 - Postupci i kompozicije za specifičnu inhibiciju glikolat oksidaze (hao1) pomoću dvolančane rnk

Info

Publication number: RS61892B1
Application number: RS20210652A
Authority: RS
Inventors: Bob D Brown; Henryk T Dudek
Original assignee: Dicerna Pharmaceuticals Inc
Priority date: 2013-12-27
Filing date: 2014-12-26
Publication date: 2021-06-30
Also published as: US10435692B2; HRP20210612T1; ES2875558T3; AU2021201953A1; SMT202100325T1; DK3581654T3; SI3581654T1; HUE055470T2; PL3581654T3; AU2014369850A1; NO2021038I1; JP2020036603A; CY2021022I2; PT3581654T; JP6886818B2; US20210230604A1; US11060093B2; FIC20210025I1; EP3892727A1; FR21C1044I2

Description

Opis

OBLAST PRONALASKA

[0001] Predmetni pronalazak se odnosi na jedinjenja i kompozicije za proučavanje, dijagnozu, i lečenje osobina, bolesti i stanja koja odgovaraju na modulaciju genske ekspresije i/ili aktivnosti glikolat oksidaze (HAO1).

POZADINA PRONALASKA

[0002] Primarna hiperoksalurija tipa 1 ("PHI") je retka autozomno recesivna urođena greška metabolizma glioksilata, uzrokovana nedostatkom specifičnog enzima jetre alanin:glioksilat aminotransferaze. Poremećaj rezultuje prekomernom proizvodnjom i preteranim izlučivanjem oksalata urinom, uzrokujući ponavljajuću urolitijazu i nefrokalcinozu. Kako brzina glomerularne filtracije opada usled progresivnog zahvatanja bubrega, oksalat se akumulira što dovodi do sistemske oksaloze. Dijagnoza se zasniva na kliničkim i sonografskim nalazima, proceni oksalata u urinu, enzimologiji i/ili DNK analizi. Dok je rano konzervativno lečenje usmereno na održavanje bubrežne funkcije, u hroničnim bolestima bubrega u 4. i 5. fazi, najbolji ishodi do danas postignuti su kombinovanom transplantacijom jetre i bubrega (Cochat et al Nephrol Dial Transplant 27: 1729-36).

[0003] PHI je najčešći oblik primarne hiperoksalurije i ima procenu prevalence od 1 do 3 slučaja na 1 milion stanovnika i stopu incidence od približno 1 slučaj na 120000 živorođenih u Evropi godišnje (Cochat et al. Nephrol Dial Transplant 10 (Suppl 8): 3-7; van Woerden et al. Nephrol Dial Transplant 18: 273-9). Ona čini 1 do 2% slučajeva pedijatrijske terminalne bolesti bubrega (ESRD), u skladu sa registrima iz Evrope, Sjedinjenih Država, i Japana (Harambat et al. Clin J Am Soc Nephrol 7: 458-65), ali se čini da više preovladava u zemljama u kojima su česti brakovi između bliskih srodnika (sa prevalencom od 10% ili više u nekim severnoafričkim i bliskoistočnim narodima; Kamoun i Lakhoua Pediatr Nephrol 10: 479-82; videti Cochat i Rums N. Engl J. Med., 369 (7): 649-58).

[0004] Glikolat oksidaza (proizvod HAOI, za "hidroksikiselinska oksidaza 1", gen) je enzim odgovoran za konvertovanje glikolata u glioksilat u putu metabolizma glicina u mitohondrijama/peroksizomima u jetri i pankreasu. Dok je glikolat bezopasan intermedijer puta metabolizma glicina, akumulacija glioksilata (putem, npr. AGTI mutacije) pokreće akumulaciju oksalata, što na kraju rezultuje PHI bolešću.

[0005] Takođe je implicirano da HAO1 igra ulogu u odgovoru na oksidativni stres (Recalcati et al. (2003) Hepatology, 1159-66).

[0006] Dvolančani RNK (dsRNA) agensi koji poseduju dužine lanaca od 25 do 35 nukleotida opisani su kao efikasni inhibitori ekspresije target gena u sisarskim ćelijama (Rossi et al., U.S.

8,084,599 i S.A.D. patentna prijava br. 2005/0277610). Veruje se da se dsRNA agensi takve dužine obrađuju pomoću Dicer enzima puta RNK interferencije (RNAi), što dovodi do toga da se takvi agensi nazivaju "Dicer supstrat siRNA" ("DsiRNA") agensi. Dodatne modifikovane strukture DsiRNA agenasa su prethodno opisane (Rossi et al., S.A.D. patentna prijava br.

2007/0265220). Nedavno su takođe opisani efikasni produženi oblici Dicer supstrata (Brown, US 8,349,809 i US 8,513,207).

KRATAK SAŽETAK PRONALASKA

[0007] Predmetni pronalazak je zasnovan, barem delimično, na identifikaciji HAO1 kao atraktivnog targeta za nokdaun terapije zasnovane na dsRNA. Posebno, ovde su obezbeđeni agensi nukleinske kiseline koji ciljaju i redukuju ekspresiju HAO1. Takve kompozicije sadrže nukleinske kiseline kao što je dvolančana RNK ("dsRNA"), i postupke za njihovu pripremu. Nukleinske kiseline iz pronalaska sposobne su da redukuju ekspresiju target glikolat oksidaza gena u ćeliji, bilo in vitro ili kod subjekta sisara.

[0008] Predmetni pronalazak obezbeđuje dvolančanu (dsDNA) koja sadrži prvi i drugi lanac nukleinske kiseline koji formiraju dupleks strukturu pri čemu je navedeni prvi lanac dužine 15-35 nukleotida i navedeni drugi lanac je dužine 19-35 nukleotida i pri čemu je navedena dsNA komplementarna sa target HAO1 iRNK sekvencom kako je izneto u SEQ ID NO: 1823 duž najmanje 19 uzastopnih nukleotida navedenog drugog lanca i redukuje ekspresiju HAO1 target iRNK kada je uvedena u sisarsku ćeliju koja eksprimira navedenu iRNK in vivo.

[0009] U jednom aspektu, objava obezbeđuje nukleinsku kiselinu koja poseduje oligonukleotidni lanac dužine 15-80 nukleotida, pri čemu je oligonukleotidni lanac dovoljno komplementaran sa target HAO1 iRNK sekvencom SEQ ID NO: 1921-2304 duž najmanje 15 nukleotida dužine oligonukleotidnog lanca kako bi se redukovala ekspresija HAO1 target iRNK kada je nukleinska kiselina uvedena u sisarsku ćeliju.

[0010] Sledeći aspekt objave obezbeđuje nukleinsku kiselinu koja poseduje oligonukleotidni lanac dužine 19-80 nukleotida, gde je oligonukleotidni lanac dovoljno komplementaran sa target HAO1 iRNK sekvencom SEQ ID NO: 1921-2304 duž najmanje 19 nukleotida dužine oligonukleotidnog lanca kako bi se redukovala ekspresija HAO1 target iRNK kada je nukleinska kiselina uvedena u sisarsku ćeliju.

[0011] U jednom primeru izvođenja predmetne objave, oligonukleotidni lanac je dužine 19-35 nukleotida.

[0012] Dopunski aspekt objave obezbeđuje dvolančanu nukleinsku kiselinu (dsNA) koja poseduje prvi i drugi lanac nukleinske kiseline uključujući RNK, gde je prvi lanac dužine 15-66 nukleotida i drugi lanac dsNA je dužine 19-66 nukleotida, gde je drugi oligonukleotidni lanac dovoljno komplementaran sa target HAO1 iRNK sekvencom SEQ ID NO: 1921-2304 duž najmanje 15 nukleotida dužine drugog oligonukleotidnog lanca kako bi se redukovala ekspresija HAO1 target iRNK kada je dvolančana nukleinska kiselina uvedena u sisarsku ćeliju.

[0013] Sledeći aspekt objave obezbeđuje dvolančanu nukleinsku kiselinu (dsNA) koja poseduje prvi i drugi lanac nukleinske kiseline, gde je prvi lanac dužine 15-66 nukleotida i drugi lanac dsNA je dužine 19-66 nukleotida, gde je drugi oligonukleotidni lanac dovoljno komplementaran sa target HAO1 iRNK sekvencom SEQ ID NO: 1921-2304 duž najmanje 19 nukleotida dužine drugog oligonukleotidnog lanca kako bi se redukovala ekspresija HAO1 target iRNK kada je dvolančana nukleinska kiselina uvedena u sisarsku ćeliju.

[0014] Dodatni aspekt objave obezbeđuje dvolančanu nukleinsku kiselinu (dsNA) koja poseduje prvi i drugi lanac nukleinske kiseline, gde je prvi lanac dužine 15-66 nukleotida i drugi lanac dsNA je dužine 19-66 nukleotida, gde je drugi oligonukleotidni lanac dovoljno komplementaran sa target HAO1 iRNK sekvencom SEQ ID NO: 1921-2304 duž najmanje 19 nukleotida dužine drugog oligonukleotidnog lanca kako bi se redukovala ekspresija HAO1 target iRNK, i gde, počevši od 5ʼ kraja HAO1 iRNK sekvence SEQ ID NO: 1921-2304 (pozicija 1), Ago2 sisara iseca iRNK na mestu između pozicija 9 i 10 sekvence, kada je dvolančana nukleinska kiselina uvedena u sisarsku ćeliju.

[0015] Sledeći aspekt objave obezbeđuje dsNA molekul koji se sastoji od: (a) sens regiona i antisens regiona, gde sens region i antisens region zajedno formiraju dupleks region koji se sastoji od 25-66 baznih parova i antisens region uključuje sekvencu koja je komplement sekvence SEQ ID NO: 1921-2304; i (b) od nula do dva regiona 3ʼ visećih krajeva, gde je svaki region visećeg kraja dužine šest ili manje nukleotida, i gde, počevši od 5ʼ kraja HAO1 iRNK sekvence SEQ ID NO: 1921-2304 (pozicija 1), Ago2 sisara iseca iRNK na mestu između pozicija 9 i 10 sekvence, kada je dvolančana nukleinska kiselina uvedena u sisarsku ćeliju.

[0016] Dopunski aspekt objave obezbeđuje dvolančanu nukleinsku kiselinu (dsNA) koja poseduje prvi i drugi lanac nukleinske kiseline i dupleks region od najmanje 25 baznih parova, gde je prvi lanac dužine 25-65 nukleotida i drugi lanac dsNA je dužine 26-66 nukleotida i uključuje 1-5 jednolančanih nukleotida na svom 3ʼ terminusu, gde je drugi oligonukleotidni lanac dovoljno komplementaran sa target HAO1 iRNK sekvencom SEQ ID NO: 1921-2304 duž najmanje 19 nukleotida dužine drugog oligonukleotidnog lanca kako bi se redukovala ekspresija HAO1 target gena kada je dvolančana nukleinska kiselina uvedena u sisarsku ćeliju.

[0017] Sledeći aspekt objave obezbeđuje dvolančanu nukleinsku kiselinu (dsNA) koja poseduje prvi i drugi lanac nukleinske kiseline i dupleks region od najmanje 25 baznih parova, gde je prvi lanac dužine 25-65 nukleotida i drugi lanac dsNA je dužine 26-66 nukleotida i uključuje 1-5 jednolančanih nukleotida na svom 3ʼ terminusu, gde 3ʼ terminus prvog oligonukleotidnog lanca i 5ʼ terminus drugog oligonukleotidnog lanca formiraju tupi kraj, i drugi oligonukleotidni lanac je dovoljno komplementaran sa target HAO1 sekvencom SEQ ID NO: 1921-2304 duž najmanje 19 nukleotida dužine drugog oligonukleotidnog lanca kako bi se redukovala ekspresija HAO1 iRNK kada je dvolančana nukleinska kiselina uvedena u sisarsku ćeliju.

[0018] U jednom primeru izvođenja, prvi lanac je dužine 15-35 nukleotida.

[0019] U sledećem primeru izvođenja, drugi lanac je dužine 19-35 nukleotida.

[0020] U dodatnom primeru izvođenja, dsNA poseduje dupleks region od najmanje 25 baznih parova; 19-21 baznih parova ili 21-25 baznih parova.

[0021] Opciono, drugi oligonukleotidni lanac uključuje 1-5 jednolančanih nukleotida na svom 3ʼ terminusu.

[0022] U jednom primeru izvođenja, drugi oligonukleotidni lanac uključuje 5-35 jednolančanih nukleotida na svom 3ʼ terminusu.

[0023] U sledećem primeru izvođenja, jednolančani nukleotidi uključuju modifikovane nukleotide. Opciono, jednolančani nukleotidi uključuju 2ʼ-O-metil, 2ʼ-metoksietoksi, 2ʼ-fluoro, 2ʼ-alil, 2ʼ-O-[2-(metilamino)-2-oksoetil], 4ʼ-tio, 4ʼ-CH2-O-2ʼ-most, 4ʼ-(CH2)2-O-2ʼ-most, 2ʼ-LNA, 2ʼ-amino i/ili 2ʼ-O-(N-metilkarbamat) modifikovane nukleotide.

[0024] U određenim primerima izvođenja, jednolančani nukleotidi uključuju ribonukleotide. Opciono, jednolančani nukleotidi uključuju dezoksiribonukleotide.

[0025] U određenim primerima izvođenja, 3ʼ kraj prvog lanca i 5ʼ kraj drugog lanca dsNA ili hibridizacionog kompleksa iz pronalaska su spojeni polinukleotidnom sekvencom koja uključuje ribonukleotide, dezoksiribonukleotide ili oba, opciono polinukleotidna sekvenca uključuje tetrapetlja (tetraloop) sekvencu.

[0026] U jednom primeru izvođenja, prvi lanac je dužine 25-35 nukleotida. Opciono, drugi lanac je dužine 25-35 nukleotida.

[0027] U jednom primeru izvođenja, drugi oligonukleotidni lanac je komplementaran sa target HAO1 cDNA sekvencom GenBank pristupnog br. NM_017545.2 duž najviše 27 nukleotida dužine drugog oligonukleotidnog lanca.

[0028] U sledećem primeru izvođenja, počevši od prvog nukleotida (pozicija 1) na 3ʼ terminusu prvog oligonukleotidnog lanca, pozicije 1, 2 i/ili 3 su supstituisane sa modifikovanim nukleotidom.

[0029] Opciono, prvi lanac i 5ʼ terminus drugog lanca formiraju tupi kraj.

[0030] U jednom primeru izvođenja, prvi lanac je dužine 25 nukleotida i drugi lanac je dužine 27 nukleotida.

[0031] U sledećem primeru izvođenja predmetne objave počevši od 5ʼ kraja HAO1 iRNK sekvence SEQ. ID. NO: 1921-2304 (pozicija 1), Ago2 sisara iseca iRNK na mestu između pozicija 9 i 10 sekvence, time redukujući ekspresiju HAO1 target iRNK kada je dvolančana nukleinska kiselina uvedena u sisarsku ćeliju.

[0032] U jednom primeru izvođenja predmetne objave, drugi lanac uključuje sekvencu SEQ. ID. NO: 358-768.

[0033] U dopunskom primeru izvođenja, prvi lanac uključuje sekvencu SEQ. ID. NO: 1-384.

[0034] U sledećem primeru izvođenja predmetne objave, dsNA poseduje par sekvenci prvog lanca/drugog lanca iz Tabele 2.

[0035] Opciono, modifikovani nukleotidni ostatak 3ʼ terminusa prvog lanca je dezoksiribonukleotid, aciklonukleotid ili fluorescentni molekul.

[0036] U jednom primeru izvođenja, pozicija 1 na 3ʼ terminusu prvog oligonukleotidnog lanca je dezoksiribonukleotid.

[0037] U sledećem primeru izvođenja, nukleotidi 1-5 ili 5-35 jednolančanih nukleotida na 3ʼ terminusu drugog lanca sadrže modifikovani nukleotid.

[0038] U jednom primeru izvođenja, modifikovani nukleotid 1-5 ili 5-35 jednolančanih nukleotida na 3ʼ terminusu drugog lanca je 2ʼ-O-metil ribonukleotid.

[0039] U dopunskom primeru izvođenja, svi nukleotidi 1-5 ili 5-35 jednolančanih nukleotida na 3ʼ terminusu drugog lanca su modifikovani nukleotidi.

[0040] U sledećem primeru izvođenja, dsNA uključuje modifikovani nukleotid. Opciono, modifikovani nukleotidni ostatak je 2ʼ-O-metil, 2ʼ-metoksietoksi, 2ʼ-fluoro, 2ʼ-alil, 2ʼ-O-[2-(metilamino)-2-oksoetil], 4ʼ-tio, 4ʼ-CH2-O-2ʼ-most, 4 ʼ-(CH2)2-O-2ʼ-most, 2ʼ-LNA, 2ʼ-amino ili 2ʼ-O-(N-metilkarbamat).

[0041] U jednom primeru izvođenja, 1-5 ili 5-35 jednolančani nukleotidi na 3ʼ terminusu drugog lanca su dužine 1-3 nukleotida, opciono dužine 1-2 nukleotida.

[0042] U sledećem primeru izvođenja, 1-5 ili 5-35 jednolančani nukleotidi na 3ʼ terminusu drugog lanca su dužine dva nukleotida i uključuju 2ʼ-O-metil modifikovani ribonukleotid.

[0043] U jednom primeru izvođenja, drugi oligonukleotidni lanac uključuje obrazac modifikacije AS-M1 do AS-M96 i AS-M1* do AS-M96*.

[0044] U sledećem primeru izvođenja, prvi oligonukleotidni lanac uključuje obrazac modifikacije SM1 do SM119.

[0045] U dopunskom primeru izvođenja, svaki od prvih i drugih lanaca ima dužinu koja je najmanje 26 i najviše 30 nukleotida.

[0046] U jednom primeru izvođenja, dsNA se endogeno iseca u ćeliji pomoću Dicer.

[0047] U sledećem primeru izvođenja, količina nukleinske kiseline dovoljna da redukuje ekspresiju target gena je 1 nanomol ili manje, 200 pikomola ili manje, 100 pikomola ili manje, 50 pikomola ili manje, 20 pikomola ili manje, 10 pikomola ili manje, 5 pikomola ili manje, 2, pikomola ili manje i 1 pikomol ili manje u okruženju ćelije.

[0048] U jednom primeru izvođenja, dsNA poseduje veću potentnost od 21mer siRNA usmerene na identičnih najmanje 19 nukleotida target HAO1 iRNK u redukovanju ekspresije target HAO1 iRNK kada je testirano in vitro u sisarskoj ćeliji pri efikasnoj koncentraciji u okruženju ćelije od 1 nanomola ili manje.

[0049] U dopunskom primeru izvođenja, nukleinska kiselina ili dsNA su dovoljno komplementarne sa target HAO1 iRNK sekvencom kako bi se redukovala ekspresija HAO1 target iRNK za količinu (izraženu u %) od najmanje 10%, najmanje 50%, najmanje 80-90%, najmanje 95%, najmanje 98%, ili najmanje 99% kada je dvolančana nukleinska kiselina uvedena u sisarsku ćeliju.

[0050] U jednom primeru izvođenja, prvi i drugi lanac su spojeni hemijskim linkerom.

[0051] U sledećem primeru izvođenja, 3ʼ terminus prvog lanca i 5ʼ terminus drugog lanca su spojeni hemijskim linkerom.

[0052] U dopunskom primeru izvođenja, nukleotid drugog ili prvog lanca je supstituisan sa modifikovanim nukleotidom koji usmerava orijentaciju Dicer isecanja.

[0053] U jednom primeru izvođenja, nukleinska kiselina, dsNA ili hibridizacioni kompleks poseduju dezoksiribonukleotid, didezoksiribonukleotid, aciklonukleotid, 3ʼ-dezoksiadenozin (kordicepin), 3ʼ-azido-3ʼ-dezoksitimidin (AZT), 2ʼ,3ʼ-didezoksiinozin (ddI), 2ʼ,3ʼ-didezoksi-3ʼ-tiacitidin (3TC), 2ʼ,3ʼ-didehidro-2ʼ,3ʼ-didezoksitimidin (d4T), monofosfatni nukleotid 3ʼ-azido-3ʼ-dezoksitimidina (AZT), 2ʼ,3ʼ-didezoksi-3ʼ-tiacitidin (3TC) i monofosfatni nukleotid 2ʼ,3ʼ-didehidro-2ʼ,3ʼ-didezoksitimidina (d4T), 4-tiouracil, 5-bromouracil, 5-joduracil, 5-(3-aminoalil) -uracil, 2ʼ-O-alkil ribonukleotid, 2ʼ-O-metil ribonukleotid, 2ʼ-amino ribonukleotid, 2ʼ-fluoro ribonukleotid, ili zaključani modifikovani nukleotid nukleinske kiseline.

[0054] U sledećem primeru izvođenja, nukleinska kiselina, dsNA ili hibridizacioni kompleks uključuju fosfonat, fosforotioat ili modifikaciju okosnice fosfotriestar fosfata.

[0055] U jednom primeru izvođenja, nukleinska kiselina, dsNA ili hibridizacioni kompleks uključuju morfolino nukleinsku kiselinu ili peptidnu nukleinsku kiselinu (PNA).

[0056] U dopunskom primeru izvođenja, nukleinska kiselina, dsNA ili hibridizacioni kompleks prikačeni su za dinamički polikonjugat (DPC).

[0057] U jednom primeru izvođenja, nukleinska kiselina, dsNA ili hibridizacioni kompleks primenjuju se sa DPC, gde dsNA i DPC opciono nisu prikačeni.

[0058] U sledećem primeru izvođenja, nukleinska kiselina, dsNA ili hibridizacioni kompleks prikačeni su za GalNAc ostatak, holesterol i/ili ligand koji ciljno deluje na holesterol.

[0059] Sledeći aspekt objave obezbeđuje kompoziciju sledećeg:

dsNA koja poseduje prvi i drugi lanac nukleinske kiseline, gde je prvi lanac dužine 15-35 nukleotida i drugi lanac dsNA je dužine 19-35 nukleotida, gde je drugi oligonukleotidni lanac dovoljno komplementaran sa target HAO1 iRNK sekvencom SEQ ID NO: 1921-2304 duž najmanje 19 nukleotida dužine drugog oligonukleotidnog lanca kako bi se redukovala ekspresija HAO1 target iRNK kada je dvolančana nukleinska kiselina uvedena u sisarsku ćeliju;

dsNA koja poseduje prvi i drugi lanac nukleinske kiseline, gde je prvi lanac dužine 15-35 nukleotida i drugi lanac dsNA je dužine 19-35 nukleotida, gde je drugi oligonukleotidni lanac dovoljno komplementaran sa target HAO1 iRNK sekvencom SEQ ID NO: 1921-2304 duž najmanje 19 nukleotida dužine drugog oligonukleotidnog lanca kako bi se redukovala ekspresija HAO1 target iRNK, i gde, počevši od 5ʼ kraja HAO1 iRNK sekvence SEQ ID NO: 1921-2304 (pozicija 1), Ago2 sisara iseca iRNK na mestu između pozicija 9 i 10 sekvence, kada je dvolančana nukleinska kiselina uvedena u sisarsku ćeliju;

molekul dsNA, koji se sastoji od: (a) sens regiona i antisens regiona, gde sens region i antisens region zajedno formiraju dupleks region koji se sastoji od 25-35 baznih parova i antisens region uključuje sekvencu koja je komplement sekvence SEQ ID NO: 1921-2304; i (b) od nula do dva regiona 3ʼ visećih krajeva, gde je svaki region visećeg kraja dužine šest ili manje nukleotida, i gde, počevši od 5ʼ kraja HAO1 iRNK sekvence SEQ ID NO: 1921-2304 (pozicija 1), Ago2 sisara iseca iRNK na mestu između pozicija 9 i 10 sekvence, kada je dvolančana nukleinska kiselina uvedena u sisarsku ćeliju;

dsNA koja poseduje prvi i drugi lanac nukleinske kiseline i dupleks region od najmanje 25 baznih parova, gde je prvi lanac dužine 25-34 nukleotida i drugi lanac dsNA je dužine 26-35 nukleotida i uključuje 1-5 jednolančanih nukleotida na svom 3ʼ terminusu, gde je drugi oligonukleotidni lanac dovoljno komplementaran sa target HAO1 iRNK sekvencom SEQ ID NO: 1921-2304 duž najmanje 19 nukleotida dužine drugog oligonukleotidnog lanca kako bi se redukovala ekspresija HAO1 target gena kada je dvolančana nukleinska kiselina uvedena u sisarsku ćeliju;

dsNA koja poseduje prvi i drugi lanac nukleinske kiseline i dupleks region od najmanje 25 baznih parova, gde je prvi lanac dužine 25-34 nukleotida i drugi lanac dsNA je dužine 26-35 nukleotida i uključuje 1-5 jednolančanih nukleotida na svom 3ʼ terminusu, gde 3ʼ terminus prvog oligonukleotidnog lanca i 5ʼ terminus drugog oligonukleotidnog lanca formiraju tupi kraj, i drugi oligonukleotidni lanac je dovoljno komplementaran sa target HAO1 sekvencom SEQ ID NO: 1921-2304 duž najmanje 19 nukleotida dužine drugog oligonukleotidnog lanca kako bi se redukovala ekspresija HAO1 iRNK kada je dvolančana nukleinska kiselina uvedena u sisarsku ćeliju;

nukleinska kiselina koja poseduje oligonukleotidni lanac dužine 19-35 nukleotida, gde je oligonukleotidni lanac dovoljno komplementaran sa target HAO1 iRNK sekvencom SEQ ID NO: 1921-2304 duž najmanje 19 nukleotida dužine oligonukleotidnog lanca kako bi se redukovala ekspresija HAO1 target iRNK kada je dvolančana nukleinska kiselina uvedena u sisarsku ćeliju;

nukleinska kiselina koja poseduje oligonukleotidni lanac dužine 15-35 nukleotida, gde oligonukleotidni lanac može da hibridizuje sa target HAO1 iRNK sekvencom SEQ ID NO: 1921-2304 duž najmanje 15 nukleotida dužine oligonukleotidnog lanca;

dsNA koja poseduje prvi i drugi lanac nukleinske kiseline koji poseduju RNK, gde je prvi lanac dužine 15-35 nukleotida i drugi lanac dsNA je dužine 19-35 nukleotida, gde drugi oligonukleotidni lanac može da hibridizuje sa target HAO1 iRNK sekvencom SEQ ID NO: 1921-2304 duž najmanje 15 nukleotida dužine drugog oligonukleotidnog lanca;

dsNA koja poseduje prvi i drugi lanac nukleinske kiseline koji poseduju RNK, gde je prvi lanac dužine 15-35 nukleotida i drugi lanac dsNA je dužine najmanje 35 nukleotida i opciono uključuje sekvencu dužine od najmanje 25 nukleotida iz SEQ ID NO: 385-768, gde je drugi oligonukleotidni lanac dovoljno komplementaran sa target HAO1 iRNK sekvencom SEQ ID NO: 1921-2304 duž najmanje 15 nukleotida dužine drugog oligonukleotidnog lanca kako bi se redukovala ekspresija HAO1 target iRNK kada je dvolančana nukleinska kiselina uvedena u sisarsku ćeliju;

dsNA koja poseduje prvi oligonukleotidni lanac koji ima 5ʼ terminus i 3ʼ terminus i drugi oligonukleotidni lanac koji ima 5ʼ terminus i 3ʼ terminus, gde je prvi lanac dužine 25 do 53 nukleotidnih ostataka, gde počevši od prvog nukleotida (pozicija 1) na 5ʼ terminusu prvog lanca, pozicije 1 do 23 prvog lanca su ribonukleotidi ili modifikovani ribonukleotidi; drugi lanac je dužine 27 do 53 nukleotidnih ostataka i uključuje 23 uzastopna ribonukleotida ili modifikovana ribonukleotida koji se bazno sparuju sa ribonukleotidima ili ribonukleotidima sa pozicija 1 do 23 prvog lanca kako bi formirali dupleks; 5ʼ terminus prvog lanca i 3ʼ terminus drugog lanca formiraju strukturu tupog kraja, 5ʼ viseći kraj od 1-6 nukleotida i 3ʼ viseći kraj od 1-6 nukleotida; 3ʼ terminus prvog lanca i 5ʼ terminus drugog lanca formiraju strukturu tupog kraja, 5ʼ viseći kraj od 1-6 nukleotida i 3ʼ viseći kraj od 1-6 nukleotida; najmanje jedna od pozicija 24 do 3ʼ terminalnog nukleotidnog ostatka prvog lanca je dezoksiribonukleotid ili modifikovani ribonukleotid koji se opciono bazno sparuje sa dezoksiribonukleotidom drugog lanca; i drugi lanac je dovoljno komplementaran sa target HAO1 iRNK sekvencom SEQ ID NO: 1921-2304 duž najmanje 15 nukleotida dužine drugog oligonukleotidnog lanca kako bi se redukovala ekspresija HAO1 target iRNK kada je dvolančana nukleinska kiselina uvedena u sisarsku ćeliju; dsNA koja poseduje prvi oligonukleotidni lanac koji ima 5ʼ terminus i 3ʼ terminus i drugi oligonukleotidni lanac koji ima 5ʼ terminus i 3ʼ terminus, gde je drugi lanac dužine 27 do 53 nukleotidnih ostataka, gde počevši od prvog nukleotida (pozicija 1) na 5ʼ terminusu drugog lanca, pozicije 1 do 23 drugog lanca su ribonukleotidi ili modifikovani ribonukleotidi; prvi lanac je dužine 25 do 53 nukleotidnih ostataka i uključuje 23 uzastopna ribonukleotida ili modifikovana ribonukleotida koji se dovoljno bazno sparuju sa ribonukleotidima sa pozicija 1 do 23 drugog lanca kako bi formirali dupleks; najmanje jedna od pozicija 24 do 3ʼ terminalnog nukleotidnog ostatka drugog lanca je dezoksiribonukleotid ili modifikovani ribonukleotid, opciono koji se bazno sparuje sa dezoksiribonukleotidom ili modifikovanim ribonukleotidom prvog lanca; i drugi lanac je dovoljno komplementaran sa target HAO1 iRNK sekvencom SEQ ID NO: 1921-2304 duž najmanje 15 nukleotida dužine drugog oligonukleotidnog lanca kako bi se redukovala ekspresija HAO1 target iRNK kada je dvolančana nukleinska kiselina uvedena u sisarsku ćeliju;

dsNA koja poseduje prvi oligonukleotidni lanac koji ima 5ʼ terminus i 3ʼ terminus i drugi oligonukleotidni lanac koji ima 5ʼ terminus i 3ʼ terminus, gde svaki od 5ʼ terminusa ima 5ʼ terminalni nukleotid i svaki od 3ʼ terminusa ima 3ʼ terminalni nukleotid, gde je prvi lanac (ili drugi lanac) dužine 25-30 nukleotidnih ostataka, gde počevši od 5ʼ terminalnog nukleotida (pozicija 1) pozicije 1 do 23 prvog lanca (ili drugog lanca) uključuju najmanje 8 ribonukleotida; drugi lanac (ili prvi lanac) je dužine 36-66 nukleotidnih ostataka i, počevši od 3ʼ terminalnog nukleotida, uključuje najmanje 8 ribonukleotida u pozicijama sparenim sa pozicijama 1-23 prvog lanca kako bi se formirao dupleks; gde najmanje 3ʼ terminalni nukleotid drugog lanca (ili prvog lanca) nije sparen sa prvim lancem (ili drugim lancem), i do 6 uzastopnih 3ʼ terminalnih nukleotida nije spareno sa prvim lancem (ili drugim lancem), time formirajući 3ʼ jednolančani viseći kraj od 1-6 nukleotida; gde 5ʼ terminus drugog lanca (ili prvog lanca) uključuje od 10-30 uzastopnih nukleotida koji nisu spareni sa prvim lancem (ili drugim lancem), time formirajući jednolančani 5ʼ viseći kraj od 10-30 nukleotida; gde su najmanje 5ʼ terminalni i 3ʼ terminalni nukleotidi prvog lanca (ili drugog lanca) bazno spareni sa nukleotidima drugog lanca (ili prvog lanca) kada su prvi i drugi lanac poravnati radi maksimalne komplementarnosti, time formirajući

1

znatan dupleks region između prvog i drugog lanca; i drugi lanac je dovoljno komplementaran sa target RNK duž najmanje 19 ribonukleotida dužine drugog lanca kako bi se redukovala ekspresija target gena kada je dvolančana nukleinska kiselina uvedena u sisarsku ćeliju; dsNA koja poseduje prvi oligonukleotidni lanac koji ima 5ʼ terminus i 3ʼ terminus i drugi oligonukleotidni lanac koji ima 5ʼ terminus i 3ʼ terminus, gde svaki od 5ʼ terminusa ima 5ʼ terminalni nukleotid i svaki od 3ʼ terminusa ima 3ʼ terminalni nukleotid, gde je prvi lanac dužine 25-35 nukleotidnih ostataka, gde počevši od 5ʼ terminalnog nukleotida (pozicija 1) pozicije 1 do 25 drugog lanca uključuju najmanje 8 ribonukleotida; drugi lanac je dužine 30-66 nukleotidnih ostataka i, počevši od 3ʼ terminalnog nukleotida, uključuje najmanje 8 ribonukleotida u pozicijama sparenim sa pozicijama 1-25 prvog lanca kako bi se formirao dupleks; gde 5ʼ terminus drugog lanca uključuje 5-35 uzastopnih nukleotida koji nisu spareni sa prvim lancem, time formirajući jednolančani 5ʼ viseći kraj od 5-35 nukleotida; gde su najmanje 5ʼ terminalni i 3ʼ terminalni nukleotidi prvog lanca bazno spareni sa nukleotidima drugog lanca kada su prvi i drugi lanac poravnati radi maksimalne komplementarnosti, time formirajući znatan dupleks region između prvog i drugog lanca; i drugi lanac je dovoljno komplementaran sa target HAO1 iRNK sekvencom SEQ ID NO: 1921-2304 duž najmanje 15 nukleotida dužine drugog oligonukleotidnog lanca kako bi se redukovala ekspresija HAO1 target iRNK kada je dvolančana nukleinska kiselina uvedena u sisarsku ćeliju;

dsNA koja poseduje prvi oligonukleotidni lanac koji ima 5ʼ terminus i 3ʼ terminus i drugi oligonukleotidni lanac koji ima 5ʼ terminus i 3ʼ terminus, gde svaki od 5ʼ terminusa ima 5ʼ terminalni nukleotid i svaki od 3ʼ terminusa ima 3ʼ terminalni nukleotid, gde je drugi lanac dužine 19-30 nukleotidnih ostataka i opciono je dužine 25-30 nukleotidnih ostataka, gde počevši od 5ʼ terminalnih nukleotida (pozicija 1) pozicije 1 do 17 (opciono pozicije 1 do 23) drugog lanca uključuju najmanje 8 ribonukleotida; prvi lanac je dužine 24-66 nukleotidnih ostataka (opciono je dužine 30-66 nukleotidnih ostataka) i, počevši od 3ʼ terminalnog nukleotida, uključuje najmanje 8 ribonukleotida u pozicijama sparenim sa pozicijama 1 do 17 (opciono pozicije 1 do 23) drugog lanca kako bi se formirao dupleks; gde 3ʼ terminus prvog lanca i 5ʼ terminus drugog lanca sadrže strukturu tupog kraja, 3ʼ viseći kraj i 5ʼ viseći kraj, opciono gde je viseći kraj dužine 1-6 nukleotida; gde 5ʼ terminus prvog lanca uključuje 5-35 uzastopnih nukleotida koji nisu spareni sa drugim lancem, time formirajući jednolančani 5ʼ viseći kraj od 5-35 nukleotida; gde su najmanje 5ʼ terminalni i 3ʼ terminalni nukleotidi drugog lanca bazno spareni sa nukleotidima prvog lanca kada su prvi i drugi lanac poravnati radi maksimalne komplementarnosti, time formirajući znatan dupleks region između prvog i drugog lanca; i drugi lanac je dovoljno komplementaran sa target HAO1 iRNK sekvencom SEQ ID NO: 1921-2304 duž najmanje 15 nukleotida dužine drugog oligonukleotidnog lanca kako bi se redukovala ekspresija HAO1 target iRNK kada je dvolančana nukleinska kiselina uvedena u sisarsku ćeliju; dsNA koja poseduje prvi i drugi lanac, gde prvi lanac i drugi lanac formiraju dupleks region dužine 19-25 nukleotida, gde prvi lanac uključuje 3ʼ region koji se proteže izvan dupleks regiona prvog lanca-drugog lanca i uključuje tetrapetlju, i dsNA dodatno uključuje diskontinuitet između 3ʼ terminusa prvog lanca i 5ʼ terminusa drugog lanca, i prvi ili drugi lanac su dovoljno komplementarni sa target HAO1 iRNK sekvencom SEQ ID NO: 1921-2304 duž najmanje 15 nukleotida dužine prvog ili drugog lanca kako bi se redukovala ekspresija HAO1 target iRNK kada je dsNA uvedena u sisarsku ćeliju;

dsNA koja poseduje prvi oligonukleotidni lanac koji ima 5ʼ terminus i 3ʼ terminus i drugi oligonukleotidni lanac koji ima 5ʼ terminus i 3ʼ terminus, gde svaki od 5ʼ terminusa ima 5ʼ terminalni nukleotid i svaki od 3ʼ terminusa ima 3ʼ terminalni nukleotid, gde je prvi oligonukleotidni lanac dužine 25-53 nukleotida i drugi oligonukleotidni lanac je dužine 25-53 nukleotida, i gde je dsNA dovoljno visoko modifikovana da znatno spreči dicer isecanje dsNA, opciono gde se dsNA iseca ne-dicer nukleazama dajući jednu ili više dsNA dužine lanca 19-23 nukleotida koje su sposobne da redukuju ekspresiju LDH iRNK u sisarskoj ćeliji;

in vivo hibridizacioni kompleks unutar ćelije egzogene sekvence nukleinske kiseline i target HAO1 iRNK sekvence SEQ ID NO: 1921-2304; i

in vitro hibridizacioni kompleks unutar ćelije egzogene sekvence nukleinske kiseline i target HAO1 iRNK sekvence SEQ ID NO: 1921-2304.

[0060] U jednom primeru izvođenja, dsNA iz pronalaska poseduje dupleks region od najmanje 25 baznih parova, gde dsNA poseduje veću potentnost od 21mer siRNA usmerene na identičnih najmanje 19 nukleotida target HAO1 iRNK u redukovanju ekspresije target HAO1 iRNK kada je testirano in vitro u sisarskoj ćeliji pri efikasnoj koncentraciji u okruženju ćelije od 1 nanomola ili manje.

[0061] U sledećem primeru izvođenja, dsNA iz pronalaska ima dupleks region od najmanje 25 baznih parova, gde dsNA poseduje veću potentnost od 21mer siRNA usmerene na identičnih najmanje 19 nukleotida target HAO1 iRNK u redukovanju ekspresije target HAO1 iRNK kada je testirano in vitro u sisarskoj ćeliji pri koncentraciji od 1 nanomola, 200 pikomola, 100 pikomola, 50 pikomola, 20 pikomola, 10 pikomola, 5 pikomola, 2, pikomola i 1 pikomola.

[0062] U dopunskom primeru izvođenja, dsNA iz objave poseduje četiri ili manje neusklađenih ostataka nukleinske kiseline u odnosu na target HAO1 iRNK sekvencu duž 15 ili 19 uzastopnih nukleotida od najmanje 15 ili 19 nukleotida drugog oligonukleotidnog lanca kada je 15 ili 19 uzastopnih nukleotida drugog oligonukleotida poravnato radi maksimalne komplementarnosti sa target HAO1 iRNK sekvencom.

[0063] U sledećem primeru izvođenja, dsNA iz objave poseduje tri ili manje neusklađenih ostataka nukleinske kiseline u odnosu na target HAO1 iRNK sekvencu duž 15 ili 19 uzastopnih nukleotida od najmanje 15 ili 19 nukleotida drugog oligonukleotidnog lanca kada je 15 ili 19 uzastopnih nukleotida drugog oligonukleotida poravnato radi maksimalne komplementarnosti sa target HAO1 iRNK sekvencom.

[0064] Opciono, dsNA iz objave poseduje dva ili manje neusklađenih ostataka nukleinske kiseline u odnosu na target HAO1 iRNK sekvencu duž 15 ili 19 uzastopnih nukleotida od najmanje 15 ili 19 nukleotida drugog oligonukleotidnog lanca kada je 15 ili 19 uzastopnih nukleotida drugog oligonukleotida poravnato radi maksimalne komplementarnosti sa target HAO1 iRNK sekvencom.

[0065] U određenim primerima izvođenja, dsNA iz objave poseduje jedan neusklađeni ostatak nukleinske kiseline u odnosu na target HAO1 iRNK sekvencu duž 15 ili 19 uzastopnih nukleotida od najmanje 15 ili 19 nukleotida drugog oligonukleotidnog lanca kada je 15 ili 19 uzastopnih nukleotida drugog oligonukleotida poravnato radi maksimalne komplementarnosti sa target HAO1 iRNK sekvencom.

[0066] U jednom primeru izvođenja, 15 ili 19 uzastopnih nukleotida od najmanje 15 ili 19 nukleotida drugog oligonukleotidnog lanca potpuno su komplementarni sa target HAO1 iRNK sekvencom kada je 15 ili 19 uzastopnih nukleotida drugog oligonukleotida poravnato radi maksimalne komplementarnosti sa target HAO1 iRNK sekvencom.

[0067] Opciono, nukleinska kiselina, dsNA ili hibridizacioni kompleks iz pronalaska su izolovani.

[0068] Sledeći aspekt pronalaska obezbeđuje postupak za redukovanje ekspresije target HAO1 gena u sisarskoj ćeliji koji uključuje dovođenje u kontakt sisarske ćelije in vitro sa nukleinskom kiselinom, dsNA ili hibridizacionim kompleksom iz pronalaska u količini dovoljnoj da redukuje ekspresiju target HAO1 iRNK u ćeliji.

[0069] Opciono, ekspresija target HAO1 iRNK je redukovana za količinu (izraženo u %) od najmanje 10%, najmanje 50% i najmanje 80-90%.

[0070] U jednom primeru izvođenja, nivoi HAO1 iRNK su redukovani za količinu (izraženo u %) od najmanje 90% najmanje 8 dana pošto je ćelija dovedena u kontakt sa dsNA.

[0071] U sledećem primeru izvođenja, nivoi HAO1 iRNK su redukovani za količinu (izraženo u %) od najmanje 70% najmanje 10 dana pošto je ćelija dovedena u kontakt sa dsNA.

[0072] Dodatni aspekt pronalaska obezbeđuje postupak za redukovanje ekspresije target HAO1 iRNK kod sisara koji poseduje primenu sisaru nukleinske kiseline, dsNA ili hibridizacionog

1

kompleksa iz pronalaska u količini dovoljnoj da redukuje ekspresiju target HAO1 iRNK kod sisara.

[0073] U jednom primeru izvođenja predmetne objave, nukleinska kiselina, dsNA ili hibridizacioni kompleks su formulisani u lipidnoj nanočestici (LNP).

[0074] U sledećem primeru izvođenja, nukleinska kiselina, dsNA ili hibridizacioni kompleks se primenjuju u dozi od 1 mikrogram do 5 miligrama po kilogramu sisara dnevno, 100 mikrograma do 0,5 miligrama po kilogramu, 0,001 do 0,25 miligrama po kilogramu, 0,01 do 20 mikrograma po kilogramu, 0,01 do 10 mikrograma po kilogramu, 0,10 do 5 mikrograma po kilogramu, i 0,1 do 2,5 mikrograma po kilogramu.

[0075] U određenim primerima izvođenja, nukleinska kiselina, dsNA ili hibridizacioni kompleks poseduju veću potentnost od 21mer siRNA usmerene na identičnih najmanje 19 nukleotida target HAO1 iRNK u redukovanju ekspresije target HAO1 iRNK kada je testirano in vitro u sisarskoj ćeliji pri efikasnoj koncentraciji u okruženju ćelije od 1 nanomola ili manje.

[0076] U jednom primeru izvođenja, nivoi HAO1 iRNK su redukovani u tkivu sisara za količinu (izraženo u %) od najmanje 70% najmanje 3 dana pošto je dsNA primenjena sisaru.

[0077] Opciono, tkivo je tkivo jetre.

[0078] U određenim primerima izvođenja, korak primene uključuje intravensku injekciju, intramuskularnu injekciju, intraperitonealnu injekciju, infuziju, subkutanu injekciju, transdermalnu, aerosolnu, rektalnu, vaginalnu, topikalnu, oralnu ili inhalacionu isporuku.

[0079] Sledeći aspekt objave obezbeđuje postupak za lečenje ili prevenciju bolesti ili poremećaja kod subjekta koji uključuje primenu subjektu količine nukleinske kiseline, dsNA ili hibridizacionog kompleksa iz objave u količini dovoljnoj za lečenje ili prevenciju bolesti ili poremećaja kod subjekta.

[0080] U jednom primeru izvođenja, bolest ili poremećaj je primarna hiperoksalurija 1 (PHI).

[0081] Opciono, subjekt je čovek.

[0082] Dodatni aspekt pronalaska obezbeđuje formulaciju koja uključuje nukleinsku kiselinu, dsNA ili hibridizacioni kompleks iz pronalaska, gde su nukleinska kiselina, dsNA ili hibridizacioni kompleks prisutni u količini efikasnoj da redukuje nivoe target HAO1 iRNK kada su nukleinska kiselina, dsNA ili hibridizacioni kompleks uvedeni u sisarsku ćeliju in vitro u količini (izraženo u %) od najmanje 10%, najmanje 50% i najmanje 80-90%.

[0083] U jednom primeru izvođenja, efikasna količina je 1 nanomol ili manje, 200 pikomola ili manje, 100 pikomola ili manje, 50 pikomola ili manje, 20 pikomola ili manje, 10 pikomola ili manje, 5 pikomola ili manje, 2, pikomola ili manje i 1 pikomol ili manje u okruženju ćelije.

[0084] U sledećem primeru izvođenja, nukleinska kiselina, dsNA ili hibridizacioni kompleks su prisutni u količini efikasnoj da redukuje nivoe target HAO1 iRNK kada su nukleinska kiselina, dsNA ili hibridizacioni kompleks uvedeni u ćeliju sisarskog subjekta u količini (izraženo u %) od najmanje 10%, najmanje 50% i najmanje 80-90%.

[0085] Opciono, efikasna količina je doza od 1 mikrograma do 5 miligrama po kilogramu subjekta dnevno, 100 mikrograma do 0,5 miligrama po kilogramu, 0,001 do 0,25 miligrama po kilogramu, 0,01 do 20 mikrograma po kilogramu, 0,01 do 10 mikrograma po kilogramu, 0,10 do 5 mikrograma po kilogramu, ili 0,1 do 2,5 mikrograma po kilogramu.

[0086] U sledećem primeru izvođenja, nukleinska kiselina, dsNA ili hibridizacioni kompleks poseduju veću potentnost od 21 mer siRNA usmerene na identičnih najmanje 19 nukleotida target HAO1 iRNK u redukovanju nivoa target HAO1 iRNK kada je testirano in vitro u sisarskoj ćeliji pri efikasnoj koncentraciji u okruženju ćelije od 1 nanomola ili manje.

[0087] Dodatni aspekt objave obezbeđuje sisarsku ćeliju koja sadrži nukleinsku kiselinu, dsNA ili hibridizacioni kompleks iz objave.

[0088] Sledeći aspekt pronalaska obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja uključuje nukleinsku kiselinu, dsNA ili hibridizacioni kompleks iz pronalaska i farmaceutski prihvatljiv nosač.

[0089] Dopunski aspekt objave obezbeđuje komplet koji uključuje nukleinsku kiselinu, dsNA ili hibridizacioni kompleks iz objave i uputstva za njegovu upotrebu.

[0090] Sledeći aspekt pronalaska obezbeđuje kompoziciju koja poseduje HAO1 inhibitornu aktivnost koja se suštinski sastoji od nukleinske kiseline, dsNA ili hibridizacionog kompleksa iz pronalaska.

KRATAK OPIS CRTEŽA

[0091]

Slika 1 pokazuje strukture primera DsiRNA agenasa iz objave koji ciljno deluju na mesto u RNK glikolat oksidaze koje je ovde označeno kao "HAO1-1171" target mesto. VELIKA slova = nemodifikovana RNK, mala slova = DNK, podebljano = neusklađeni bazni par nukleotida; vrhovi strelica ukazuju na predviđena mesta isecanja Dicer enzima; isprekidana linija ukazuje na sekvence sens lanca (gornji lanac) koje odgovaraju projektovanom mestu isecanja Argonaute 2 (Ago2) unutar ciljane sekvence glikolat oksidaze.

Slike 2A do 2F, predstavljaju podatke primarnog pregleda koji pokazuju DsiRNA- posredovani nokdaun glikolat oksidaze čoveka (Slike 2A i 2B pokazuju rezultate za zajedničke DsiRNA čovek-miš, dok Slike 2C i 2D pokazuju rezultate za jedinstvene DsiRNA čoveka) i glikolat

1

oksidaze miša (Slike 2C i 2D) u humanim (HeLa) i mišjim (Hepa1-6) ćelijama, respektivno. Aktivnost u humanim HeLa ćelijama procenjena je upotrebom Psi-Check-HsHAO1 plazmid reporter testa, prateći za nokdaun proizvodnje Renilla luciferaze. Za svaku DsiRNA testiranu u mišjim ćelijama, dva nezavisna qPCR amplikona su testirana (amplikoni "476-611" i "1775-1888").

Slike 3A do 3F pokazuju histograme inhibitorne efikasnosti glikolat oksidaze čoveka i miša uočene za naznačene DsiRNA. "P1" označava fazu 1 (primarni pregled), dok "P2" označava fazu 2. U fazi 1, DsiRNA su testirane pri 1 nM u okruženju HeLa ćelija (testovi na humanim ćelijama; slike 3A i 3B) ili ćelija miša (testovi na Hepa1-6 ćelijama; Slike 3C do 3F). U fazi 2, DsiRNA su testirane pri 1 nM i 0,1 nM (u duplikatu) u okruženju HeLa ćelija ili Hepa1-6 ćelija miša. Pojedinačni barovi predstavljaju prosečne nivoe glikolat oksidaze čoveka (Slike 3A i 3B) ili miša (Slike 3C do 3F) uočene u triplikatu, sa pokazanim standardnim greškama. Nivoi glikolat oksidaze miša normalizovani su na HPRT i Rp123 nivoe.

Slika 4 pokazuje dijagram toka za inicijalne in vivo eksperimente sa miševima, koji su uključivali izazov sa glikolatom.

Slika 5 pokazuje HAO1 nokdaun u jetri miša za životinje kojima je primenjeno 0,1 mg/kg ili 1 mg/kg naznačene HAO1-ciljno delujuće DsiRNA formulisane u LNP (ovde, LNP EnCore 2345).

Slika 6 pokazuje da su uočeni robustni nivoi HAO1 iRNK nokdauna u tkivu jetre miševa koji su tretirani sa 1 mg/kg i čak 0,1 mg/kg količinama HAO1-ciljno delujuće DsiRNA HAO1-1171, uz uočeno robustno trajanje efikasnosti (90% ili veći nivoi nokdauna uočeni su na 120 sati posle primene i za 1 mg/kg i za 0,1 mg/kg životinje).

Slike 7A do 7E predstavljaju dijagrame obrasca modifikacije i histograme koji pokazuju podatke o efikasnosti za 24 nezavisne HAO1-ciljno delujuće DsiRNA sekvence duž četiri različita vodič (antisens) lanca 2ʼ-O-metil obrazaca modifikacija ("M17", "M35", "M48" i "M8", respektivno, kao što je pokazano na Slici 7A i napominjući da su za Slike 7B do 7E obrasci modifikacije navedeni kao putnik lanac obrazac modifikacije (ovde "M107")-vodič lanac obrazac modifikacije, npr. "M107-M17", "M107-M35", "M107-M48" ili "M107-M8") u humanim HeLa ćelijama testiranim pri 0,1 nM (duplikat testovi) i 1 nM (Slike 7B i 7C) i mišjim Hepa 1-6 ćelijama za podskup od 8 dupleksa testiranih pri 0,03 nM, 0,1 nM (duplikat testovi) i 1 nM (Slike 7D i 7E).

1

Slike 8A do 8E predstavljaju dijagrame obrasca modifikacije i histograme koji pokazuju podatke o efikasnosti za 24 nezavisne HAO1-ciljno delujuće DsiRNA sekvence duž četiri različita putnik (sens) lanca 2ʼ-O-metil obrazaca modifikacija ("M107", "M14", "M24" i "M250", respektivno, kao što je pokazano na Slici 8A i napominjući da su za Slike 8B do 8E obrasci modifikacije navedeni kao putnik lanac obrazac modifikacije- vodič (ovde "M48") lanac obrazac modifikacije, npr. "M107-M48", "M14-M48", "M24-M48" ili "M250-M48") u humanim HeLa ćelijama testiranim pri 0,1 nM (duplikat testovi) i 1 nM (Slike 8B i 8C) i mišjim Hepa 1-6 ćelijama za podskup od 8 dupleksa testiranih pri 0,03 nM, 0,1 nM (duplikat testovi) i 1 nM (Slike 8D i 8E).

Slike 9A do 9L predstavljaju dijagrame obrasca modifikacije i histograme koji pokazuju podatke o efikasnosti za 24 nezavisne HAO1-ciljno delujuće DsiRNA sekvence duž naznačenog putnik (sens) i vodič (antisens) lanca 2ʼ-O-metil obrazaca modifikacija (uz napomenu da su obrasci modifikacija navedeni kao putnik lanac obrazac modifikacije-vodič lanac obrazac modifikcije) u humanim HeLa ćelijama (Slike 9E do 9H) ili HEK293-pcDNA HAO1 ćelijama (Slike 9I do 9L), testiranim pri 0,1 nM (duplikat testovi) i 1 nM, koristeći bilo Psi-Check-HsHAO1 plazmid reporter test, prateći za nokdaun proizvodnje Renilla luciferaze (Slike 9E do 9H), ili HEK293 ćelije stabilno transfektovane sa HAO1 (HEK293-pcDNA HAO1 ćelije; Slike 9I do 9L).

Slike 10A do 10O predstavljaju dijagrame obrasca modifikacije i histograme koji pokazuju podatke o efikasnosti za četiri nezavisne HAO1-ciljno delujuće DsiRNA sekvence duž naznačenog putnik (sens) i vodič (antisens) lanca 2ʼ-O-metil obrazaca modifikacija (napominjući, kao iznad, da su obrasci modifikacija navedeni kao: putnik lanac obrazac modifikacije-vodič lanac obrazac modifikacije) u HEK293 ćelijama stabilno transfektovanim sa HAO1 (HEK293-pcDNA HAO1 ćelije), testiranim pri 0,1 nM (duplikat testovi) i 1 nM.

Slike 11A do 11F predstavljaju obrasce modifikacija i sekvence HAO1-1171, HAO1-1315, HAO1-1378 i HAO1-1501 DsiRNA, i pridružene rezultate inhibitorne efikasnosti (histogrami i IC50krive), kada su testirane u HEK293 ćelijama stabilno transfekovanim sa HAO1 (HEK293-pcDNA HAO1 ćelije), pri 0,1 nM, 0,01 nM i 0,001 nM koncentracijama HAO1-ciljno delujućih DsiRNA.

Slike 12A do 12F predstavljaju obrasce modifikacija i sekvence opsežno modifikovanih HAO1-1171 i HAO1-1376 DsiRNA kao što je naznačeno (Slike 12A do 12D), i pridružene rezultate

1

inhibitorne efikasnosti (histogrami na Slikama 12E i 12F), kada su testirane u HEK293 ćelijama stabilno transfektovanim sa HAO1 (HEK293-pcDNA HAO1 ćelije), pri 0,1 nM, 0,01 nM i 0,001 nM koncentracijama HAO1-ciljno delujućih DsiRNA.

Slike 13A do 13L demonstriraju in vivo efikasnost - uključujući kinetiku i trajanje inhibicije -opsežno modifikovanih oblika LNP-formulisanih HAO1-ciljno delujućih dupleksa, i kod miševa (Slike 13A do 13K) i kod ne-humanih primata (Slika 13L).

DETALJAN OPIS PRONALASKA

[0092] Predmetni pronalazak je usmeren na kompozicije koje sadrže nukleinske kiseline, na primer dvolančanu RNK ("dsRNA"), i postupke za njihovu pripremu, koje su sposobne da redukuju nivo i/ili ekspresiju glikolat oksidaza (HAO1) gena in vivo ili in vitro. Jedan od lanaca dsRNA sadrži region nukleotidne sekvence koji ima dužinu u opsegu od 19 do 35 nukleotida koji može usmeriti destrukciju i/ili translacionu inhibiciju ciljanog HAO1 transkripta.

Definicije

[0093] Osim ukoliko nije drugačije definisano, svi ovde upotrebljeni tehnički i naučni termini imaju značenje kao što uobičajeno razume osoba stručna u oblasti kojoj ovaj pronalazak pripada. Sledeće reference obezbeđuju stručnoj osobi opšte definicije mnogih termina upotrebljenih u ovom pronalasku: Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology (2nd ed.

1994); The Cambridge Dictionary of Science and Technology (Walker ed., 1988); The Glossary of Genetics, 5th Ed., R. Rieger et al. (eds.), Springer Verlag (1991); i Hale i Marham, The Harper Collins Dictionary of Biology (1991). Kao što se ovde upotrebljava, sledeći termini imaju značenja koja su im pripisana ispod, osim ukoliko nije drugačije specificirano.

[0094] Predmetni pronalazak ističe jedan ili više DsiRNA molekula koji mogu modulirati (npr. inhibirati) ekspresiju glikolat oksidaze. DsiRNA iz pronalaska se opciono mogu upotrebljavati u kombinaciji sa modulatorima drugih gena i/ili genskih proizvoda povezanih sa održavanjem ili razvojem bolesti ili poremećaja povezanih sa pogrešnom regulacijom glikolat oksidaze (npr. primarna hiperoksalurija 1 (PHI) ili druga bolest ili poremećaj jetre, bubrega, itd.). DsiRNA agensi iz pronalaska moduliraju RNK glikolat oksidaze (hidroksikiselinska oksidaza 1, HAO1) kao što su one koje odgovaraju cDNA sekvencama na koje se pozivaju GenBank pristupni brojevi NM_017545.2 (humana HAO1) i NM_010403.2 (mišja HAO1), koje su ovde generalno označene kao "glikolat oksidaza" ili "hidroksikiselinska oksidaza 1".

1

[0095] Sledeći opis različitih aspekata i primera izvođenja pronalaska obezbeđen je uz pozivanje na primere RNK glikolat oksidaze, koje se ovde generalno označavaju kao glikolat oksidaza. Međutim, takvo pozivanje treba da bude samo kao primer i različiti aspekti i primeri izvođenja pronalaska su takođe usmereni na alternativne RNK glikolat oksidaze, kao što su mutant RNK glikolat oksidaze ili dopunske splajs varijante glikolat oksidaze. Određeni aspekti i primeri izvođenja predmetne objave takođe su usmereni na druge gene koji su uključeni u puteve glikolat oksidaze, uključujući gene čija pogrešna regulacija deluje zajedno sa onom od glikolat oksidaze (ili je pod uticajem ili utiče na regulaciju glikolat oksidaze) kako bi se proizveli fenotipski efekti koji mogu biti ciljani za lečenje (npr. prekomerna proizvodnja glioksilata i/ili oksalata). DAO i AGT su primeri gena koji interaguju sa glikolat oksidazom. Takvi dopunski geni, uključujući one puteva koji deluju u koordinaciji sa glikolat oksidazom, mogu se ciljati upotrebom dsRNA i ovde opisanih postupaka za upotrebu glikolat oksidaza-ciljno delujućih dsRNA. Stoga, inhibicija ili efekti takve inhibicije, ili povećana ekspresija i njeni efekti, drugih gena mogu se izvesti kao što je ovde opisano.

[0096] Termin "glikolat oksidaza" označava sekvence nukleinske kiseline koje kodiraju protein, peptid ili polipeptid glikolat oksidaze (npr. transkripti glikolat oksidaze, kao što su sekvence glikolat oksidaze (HAO1) Genbank pristupni brojevi NM_017545.2 i NM_010403.2). U određenim primerima izvođenja, termin "glikolat oksidaza" takođe podrazumeva da uključuje druge kodirajuće sekvence glikolat oksidaze, kao što su druge izoforme glikolat oksidaze, mutant geni glikolat oksidaze, splajs varijante gena glikolat oksidaze, i polimorfizmi gena glikolat oksidaze. Termin "glikolat oksidaza" se takođe upotrebljava za označavanje polipeptidnog proizvoda gena gena glikolat oksidaze /transkripta, npr. proteina, peptida, ili polipeptida glikolat oksidaze, kao što su oni kodirani glikolat oksidazom (HAO1) Genbank pristupnih brojeva NP_060015.1 i NP_034533.1.

[0097] Kao što se ovde upotrebljava, "bolest ili poremećaj povezan sa glikolat oksidazom" označava bolest ili poremećaj za koji je poznato u struci da je povezan sa izmenjenom ekspresijom, nivoom i/ili aktivnošću glikolat oksidaze. Značajno, "bolest ili poremećaj povezan sa glikolat oksidazom" ili "bolest ili poremećaj povezan sa HAO1" uključuje bolesti ili poremećaje bubrega, jetre, kože, kostiju, oka i drugih organa, uključujući, ali bez ograničenja na, primarnu hiperoksaluriju (PH1).

[0098] U određenim primerima izvođenja procenjuje se dsRNA-posredovana inhibicija target sekvence glikolat oksidaze. U takvim primerima izvođenja, nivoi RNK glikolat oksidaze mogu se proceniti postupcima prepoznatim u struci (npr. RT-PCR, Northern blot, test ekspresije, itd.), opciono putem poređenja nivoa glikolat oksidaze u prisustvu anti-glikolat oksidaza dsRNA iz pronalaska u odnosu na odsustvo takve anti-glikolat oksidaza dsRNA. U određenim primerima

1

izvođenja, nivoi glikolat oksidaze u prisustvu anti-glikolat oksidaza dsRNA porede se sa onima uočenim u prisustvu samo vehikuluma, u prisustvu dsRNA usmerene prema nepovezanoj target RNK, ili u odsustvu bilo kakvog tretmana.

[0099] Takođe je prepoznato da se nivoi proteina glikolat oksidaze mogu proceniti i da su nivoi proteina glikolat oksidaze, pod različitim uslovima, bilo direktno ili indirektno povezani sa nivoima RNK glikolat oksidaze i/ili u meri u kojoj dsRNA inhibira ekspresiju glikolat oksidaze, stoga se postupci za procenu nivoa proteina glikolat oksidaze prepoznati u struci (npr. Western blot, imunoprecipitacija, drugi postupci zasnovani na antitelima, itd.) takođe mogu koristiti za ispitivanje inhibitornog efekta dsRNA iz pronalaska.

[0100] Smatra se da anti-glikolat oksidaza dsRNA iz pronalaska poseduje "inhibitornu aktivnost glikolat oksidaze" ukoliko se uoči statistički značajno redukovanje RNK glikolat oksidaze (ili kada se procenjuje protein glikolat oksidaza, nivoi proteina glikolat oksidaze) kada je antiglikolat oksidaza dsRNA iz pronalaska primenjena na sistem (npr. bezćelijski in vitro sistem), ćeliju, tkivo ili organizam, u poređenju sa odabranom kontrolom. Raspodela eksperimentalnih vrednosti i broj izvedenih replikata testova nastojaće da diktiraju parametre koji nivoi redukovanja RNK glikolat oksidaze (bilo kao % ili u apsolutnim terminima) se smatraju statistički značajnim (kao što se procenjuje standardnim postupcima određivanja statističke značajnosti poznatim u struci). Međutim, u određenim primerima izvođenja, "inhibitorna aktivnost glikolat oksidaze" definisana je na osnovu % ili apsolutnog nivoa redukovanja nivoa glikolat oksidaze u sistemu, ćeliji, tkivu ili organizmu. Za primer objave, u određenim primerima izvođenja, smatra se da dsRNA iz pronalaska poseduje inhibitornu aktivnost glikolat oksidaze ukoliko se uoči najmanje 5% redukovanja ili najmanje 10% redukovanja RNK glikolat oksidaze u prisustvu dsRNA iz pronalaska u odnosu na nivoe glikolat oksidaze koji su primećeni za pogodnu kontrolu. (Na primer, in vivo nivoi glikolat oksidaze u tkivu i/ili subjektu mogu se, u određenim primerima izvođenja, smatrati inhibiranim pomoću dsRNA agensa iz objave ukoliko se, npr. uoči redukovanje nivoa glikolat oksidaze za 5% ili 10% u odnosu na kontrolu.) U određenim drugim primerima izvođenja, smatra se da dsRNA iz pronalaska poseduje inhibitornu aktivnost glikolat oksidaze ukoliko se uoči da su nivoi RNK glikolat oksidaze redukovani za najmanje 15% u odnosu na odabranu kontrolu, za najmanje 20% u odnosu na odabranu kontrolu, za najmanje 25% u odnosu na odabranu kontrolu, za najmanje 30% u odnosu na odabranu kontrolu, za najmanje 35% u odnosu na odabranu kontrolu, za najmanje 40% u odnosu na odabranu kontrolu, za najmanje 45% u odnosu na odabranu kontrolu, za najmanje 50% u odnosu na odabranu kontrolu, za najmanje 55% u odnosu na odabranu kontrolu, za najmanje 60% u odnosu na odabranu kontrolu, za najmanje 65% u odnosu na odabranu kontrolu, za najmanje 70% u odnosu na odabranu kontrolu, za najmanje 75% u odnosu na odabranu kontrolu, za

2

najmanje 80% u odnosu na odabranu kontrolu, za najmanje 85% u odnosu na odabranu kontrolu, za najmanje 90% u odnosu na odabranu kontrolu, za najmanje 95% u odnosu na odabranu kontrolu, za najmanje 96% u odnosu na odabranu kontrolu, za najmanje 97% u odnosu na odabranu kontrolu, za najmanje 98% u odnosu na odabranu kontrolu ili za najmanje 99% u odnosu na odabranu kontrolu. U nekim primerima izvođenja potrebna je potpuna inhibicija glikolat oksidaze da bi se za dsRNA smatralo da poseduje inhibitornu aktivnost glikolat oksidaze. U određenim modelima (npr. ćelijska kultura), smatra se da dsRNA poseduje inhibitornu aktivnost glikolat oksidaze ukoliko se uoči najmanje 50% redukovanja nivoa glikolat oksidaze u odnosu na odgovarajuću kontrolu. U određenim drugim primerima izvođenja, smatra se da dsRNA poseduje inhibitornu aktivnost glikolat oksidaze ukoliko se uoči najmanje 80% redukovanja nivoa glikolat oksidaze u odnosu na odgovarajuću kontrolu.

[0101] Putem specifičnog primera, u Primeru 2 ispod, serija DsiRNA koje ciljno deluju na glikolat oksidazu testirana je na sposobnost da redukuju nivoe iRNK glikolat oksidaze u humanim HeLa ili mišjim Hepa1-6 ćelijama in vitro, pri koncentracijama od 1 nM u okruženju takvih ćelija i u prisustvu agensa za transfekciju (Lipofectamine™ RNAiMAX, Invitrogen). U okviru Primera 2 ispod, inhibitorna aktivnost glikolat oksidaze pripisana je onim DsiRNA za koje je uočeno da daju najmanje 50% redukovanja nivoa iRNK glikolat oksidaze u testnim uslovima. Razmatra se da inhibitorna aktivnost glikolat oksidaze takođe može biti pripisana dsRNA pod bilo više ili manje strogim uslovima od onih koji su korišćeni u Primeru 2 ispod, čak i kada se koriste isti ili slični test i uslovi. Na primer, u određenim primerima izvođenja, smatra se da testirana dsRNA iz pronalaska poseduje inhibitornu aktivnost glikolat oksidaze ukoliko je uočeno najmanje 10% redukovanja, najmanje 20% redukovanja, najmanje 30% redukovanja, najmanje 40% redukovanja, najmanje 50% redukovanja, najmanje 60% redukovanja, najmanje 70% redukovanja, najmanje 75% redukovanja, najmanje 80% redukovanja, najmanje 85% redukovanja, najmanje 90% redukovanja, ili najmanje 95% redukovanja nivoa iRNK glikolat oksidaze u ćelijskoj liniji sisara in vitro pri koncentraciji od 1 nM dsRNA ili nižoj u okruženju ćelije, u odnosu na odgovarajuću kontrolu.

[0102] Takođe se razmatra upotreba drugih krajnjih tačaka za određivanje da li dvolančana RNK iz pronalaska poseduje inhibitornu aktivnost glikolat oksidaze. Specifično, u jednom primeru izvođenja, pored ili kao alternativa proceni nivoa iRNK glikolat oksidaze, procenjena je sposobnost testirane dsRNA da redukuje nivoe proteina glikolat oksidaze (npr. 48 sati posle dovođenja u kontakt sa ćelijom sisara in vitro ili in vivo), i smatra se da testirana dsRNA poseduje inhibitornu aktivnost glikolat oksidaze ukoliko je uočeno najmanje 10% redukovanja, najmanje 20% redukovanja, najmanje 30% redukovanja, najmanje 40% redukovanja, najmanje 50% redukovanja, najmanje 60% redukovanja, najmanje 70% redukovanja, najmanje 75% redukovanja, najmanje 80% redukovanja, najmanje 85% redukovanja, najmanje 90% redukovanja, ili najmanje 95% redukovanja nivoa proteina glikolat oksidaze u sisarskoj ćeliji koja je dovedena u kontakt sa testnom dvolančanom RNK in vitro ili in vivo, u odnosu na odgovarajuću kontrolu. Dopunske krajnje tačke koje se razmatraju uključuju, npr. procenu fenotipa povezanog sa redukovanjem nivoa glikolat oksidaze - npr. redukovanje fenotipova povezanih sa povišenim nivoima depozicija poreklom od glioksilata (npr. depozicije kalcijum oksalata) u celom telu.

[0103] Inhibitorna aktivnost glikolat oksidaze takođe se može proceniti tokom vremena (trajanje) i preko opsega koncentracije (potentnost), uz procenu onoga što čini dsRNA koja poseduje inhibitornu aktivnost glikolat oksidaze prilagođenu u skladu sa primenjenim koncentracijama i vremenskim trajanjem nakon primene. Stoga, u određenim primerima izvođenja, smatra se da dsRNA iz pronalaska poseduje inhibitornu aktivnost glikolat oksidaze ukoliko se najmanje 50% redukovanja aktivnosti glikolat oksidaze uoči/nastavi u vremenskom trajanju od 2 sata, 5 sati, 10 sati, 1 dan, 2 dana, 3 dana, 4 dana, 5 dana, 6 dana, 7 dana, 8 dana, 9 dana, 10 dana ili više posle primene dsRNA ćeliji ili organizmu. U dopunskim primerima izvođenja, dsRNA iz pronalaska se smatra da je potentni inhibitorni agens glikolat oksidaze ukoliko se uoči inhibitorna aktivnost glikolat oksidaze (npr. u određenim primerima izvođenja najmanje 50% inhibicije glikolat oksidaze) u koncentraciji od 1 nM ili manje, 500 pM ili manje, 200 pM ili manje, 100 pM ili manje, 50 pM ili manje, 20 pM ili manje, 10 pM ili manje, 5 pM ili manje, 2 pM ili manje ili čak 1 pM ili manje u okruženju ćelije, na primer, unutar in vitro testa za inhibitornu aktivnost glikolat oksidaze kao što je ovde opisano. U određenim primerima izvođenja, potentna inhibitorna dsRNA glikolat oksidaze iz pronalaska definisana je kao ona koja je sposobna za inhibitornu aktivnost glikolat oksidaze (npr. u određenim primerima izvođenja, najmanje 20% redukovanja nivoa glikolat oksidaze) pri formulisanoj koncentraciji od 10 mg/kg ili manje kada se primenjuje subjektu u efikasnom vehikulumu za isporuku (npr. efikasna formulacija lipidnih nanočestica). Poželjno, potentna inhibitorna dsRNA glikolat oksidaze iz pronalaska definisana je kao ona koja je sposobna za inhibitornu aktivnost glikolat oksidaze (npr. u određenim primerima izvođenja, najmanje 50% redukovanja nivoa glikolat oksidaze) pri formulisanoj koncentraciji od 5 mg/kg ili manje kada se primenjuje subjektu u efikasnom vehikulumu za isporuku. Poželjnije, potentna inhibitorna dsRNA glikolat oksidaze iz pronalaska definisana je kao ona koja je sposobna za inhibitornu aktivnost glikolat oksidaze (npr. u određenim primerima izvođenja, najmanje 50% redukovanja nivoa glikolat oksidaze) pri formulisanoj koncentraciji od 5 mg/kg ili manje kada se primenjuje subjektu u efikasnom vehikulumu za isporuku. Opciono, potentna inhibitorna dsRNA glikolat oksidaze iz pronalaska definisana je kao ona koja je sposobna za inhibitornu aktivnost glikolat oksidaze (npr. u određenim primerima izvođenja, najmanje 50% redukovanja nivoa glikolat oksidaze) pri formulisanoj koncentraciji od 2 mg/kg ili manje, ili čak 1 mg/kg ili manje, kada se primenjuje subjektu u efikasnom vehikulumu za isporuku.

[0104] U određenim primerima izvođenja, potentnost dsRNA iz pronalaska određuje se u odnosu na broj kopija dsRNA prisutnih u citoplazmi target ćelije koji je potreban kako bi se postigao određeni nivo nokdauna target gena. Na primer, u određenim primerima izvođenja, potentna dsRNA je ona koja je sposobna da izazove nokdaun target iRNK od 50% ili više kada je prisutna u citoplazmi target ćelije pri broju kopija od 1000 ili manje antisens lanaca udruženih sa RISC po ćeliji. Poželjnije, potentna dsRNA je ona koja je sposobna da proizvede nokdaun target iRNK od 50% ili više kada je prisutna u citoplazmi target ćelije pri broju kopija od 500 ili manje antisens lanaca udruženih sa RISC po ćeliji. Opcionalno, potentna dsRNA je ona koja je sposobna da proizvede nokdaun target iRNK od 50% ili više kada je prisutna u citoplazmi target ćelije pri broju kopija od 300 ili manje antisens lanaca udruženih sa RISC po ćeliji.

[0105] U dodatnim primerima izvođenja, potentnost DsiRNA iz pronalaska može se definisati u odnosu na 19 do 23mer dsRNA usmerenu na istu target sekvencu unutar istog target gena. Na primer, DsiRNA iz pronalaska koja poseduje poboljšanu potentnost u odnosu na odgovarajuću 19 do 23mer dsRNA može biti DsiRNA koja redukuje target gen za dopunskih 5% ili više, dopunskih 10% ili više, dopunskih 20% ili više, dopunskih 30% ili više, dopunskih 40% ili više, ili dopunskih 50% ili više u poređenju sa odgovarajućom 19 do 23mer dsRNA, kada je testirano u in vitro testu kao što je ovde opisano pri dovoljno niskoj koncentraciji da dozvoli detekciju razlike u potentnosti (npr. koncentracije transfekcije pri ili ispod 1 nM u okruženju ćelije, pri ili ispod 100 pM u okruženju ćelije, pri ili ispod 10 pM u okruženju ćelije, pri ili ispod 1 nM u okruženju ćelije, u in vitro testu kao što je ovde opisano; značajno, prepoznato je da se razlike u potentnosti mogu najbolje detektovati putem izvođenja takvih testova u opsegu koncentracija -npr. 0,1 pM do 10 nM - u svrhu generisanja krive doza-odgovor i identifikovanja IC50vrednosti povezane sa DsiRNA/dsRNA).

[0106] Inhibitorni nivoi glikolat oksidaze i/ili nivoi glikolat oksidaze takođe se mogu proceniti indirektno, npr. merenje redukovanja fenotipa(ova) primarne hiperoksalurije 1 kod subjekta može se upotrebiti za procenu nivoa glikolat oksidaze i/ili inhibitorne efikasnosti glikolat oksidaze dvolančane nukleinskae kiseline iz trenutnog pronalaska.

[0107] U određenim primerima izvođenja, fraza "suštinski se sastoji od" upotrebljava se u pozivanju na anti-glikolat oksidaza dsRNA iz objave. U nekim takvim primerima izvođenja, "suštinski se sastoji od" označava kompoziciju koja sadrži dsRNA iz objave koja poseduje najmanje određeni nivo inhibitorne aktivnosti glikolat oksidaze (npr. najmanje 50% inhibitorne aktivnosti glikolat oksidaze) i koja takođe sadrži jednu ili više dopunskih komponenata i/ili modifikacija koje ne utiču značajno na inhibitornu aktivnost glikolat oksidaze dsRNA. Na

2

primer, u određenim primerima izvođenja, kompozicija se "suštinski sastoji od" dsRNA iz objave gde modifikacije dsRNA iz objave i/ili komponente kompozicije povezane sa dsRNA ne menjaju inhibitornu aktivnost glikolat oksidaze (opciono uključujući potentnost ili trajanje inhibitorne aktivnosti glikolat oksidaze) za više od 3%, više od 5%, više od 10%, više od 15%, više od 20%, više od 25%, više od 30%, više od 35%, više od 40%, više od 45%, ili više od 50% u odnosu na dsRNA iz objave u izolaciji. U određenim primerima izvođenja, smatra se da se kompozicija suštinski sastoji od dsRNA iz objave čak i ukoliko se dogodi dramatičnije redukovanje inhibitorne aktivnosti glikolat oksidaze (npr. 80% redukovanja, 90% redukovanja, itd. efikasnosti, trajanja i/ili potentnosti) u prisustvu dodatnih komponenata ili modifikacija, ali gde inhibitorna aktivnost glikolat oksidaze nije značajno povišena (npr. uočeni nivoi inhibitorne aktivnosti glikolat oksidaze su unutar 10% od onih uočenih za izolovanu dsRNA iz objave) u prisustvu dodatnih komponenata i/ili modifikacija.

[0108] Kao što se ovde upotrebljava, termin "nukleinska kiselina" označava dezoksiribonukleotide, ribonukleotide, ili modifikovane nukleotide i njihove polimere u jednoili dvo-lančanom obliku. Termin obuhvata nukleinske kiseline koje sadrže poznate analoge nukleotida ili modifikovane ostatke ili veze okosnice, koji su sintetički, koji se javljaju u prirodi, i koji se ne javljaju u prirodi, koji imaju slična svojstva vezivanja kao referentna nukleinska kiselina, i koji se metabolišu na način sličan referentnim nukleotidima. Primeri takvih analoga uključuju, bez ograničenja, fosforotioate, fosforamidate, metil fosfonate, hiral-metil fosfonate, 2-O-metil ribonukleotide, peptid-nukleinske kiseline (PNA) i otključane nukleinske kiseline (UNA; videti, npr. Jensen et al. Nucleic Acids Symposium Series 52: 133-4), i njihove derivate.

[0109] Kao što se ovde upotrebljava, "nukleotid" se upotrebljava kao što je prepoznato u struci da uključuje one sa prirodnim bazama (standardnim), i modifikovanim bazama dobro poznatim u struci. Takve baze su generalno locirane na 1ʼ poziciji nukleotidne šećerne grupe. Nukleotidi generalno sadrže bazu, šećer i fosfatnu grupu. Nukleotidi mogu biti nemodifikovani ili modifikovani na šećernoj, fosfatnoj i/ili baznoj grupi, (koje se takođe označavaju naizmenično kao nukleotidni analozi, modifikovani nukleotidi, neprirodni nukleotidi, nestandardni nukleotidi i drugo; videti, npr. Usman i McSwiggen, supra; Eckstein, et al., Međunarodna PCT publikacija br. WO 92/07065; Usman et al, Međunarodna PCT publikacija br. WO 93/15187; Uhlman i Peyman, supra). Postoji nekoliko primera modifikovanih baza nukleinskih kiselina poznatih u struci, koje su saželi Limbach, et al, Nucleic Acids Res. 22: 2183, 1994. Neke od neograničavajućih primera modifikacija baze koje se mogu uvesti u molekule nukleinske kiseline uključuju hipoksantin, purin, piridin-4-on, piridin-2-on, fenil, pseudouracil, 2,4,6-trimetoksi benzen, 3-metil uracil, dihidrouridin, naftil, aminofenil, 5-alkilcitidini (npr. 5-metilcitidin), 5-alkiluridini (npr. ribotimidin), 5-halouridin (npr. 5-bromouridin) ili 6-azapirimidini ili 6alkilpirimidini (npr. 6-metiluridin), propin, i druge (Burgin, et al., Biochemistry 35: 14090, 1996; Uhlman i Peyman, supra). Pod "modifikovanim bazama" u ovom aspektu misli se na nukleotidne baze druge nego adenin, guanin, citozin i uracil na 1ʼ poziciji ili njihovi ekvivalenti.

[0110] Kao što se ovde upotrebljava, "modifikovani nukleotid" označava nukleotid koji ima jednu ili više modifikacija nukleozida, nukleobaze, pentoznog prstena, ili fosfatne grupe. Na primer, modifikovani nukleotidi isključuju ribonukleotide koji sadrže adenozin monofosfat, guanozin monofosfat, uridin monofosfat, i citidin monofosfat i dezoksiribonukleotide koji sadrže dezoksiadenozin monofosfat, dezoksiguanozin monofosfat, dezoksitimidin monofosfat, i dezoksitimidin monofosfat. Modifikacije uključuju one koje se javljaju u prirodi koje rezultuju iz modifikacije enzimima koji modifikuju nukleotide, kao što su metiltransferaze. Modifikovani nukleotidi takođe uključuju sintetičke ili nukleotide koji se ne javljaju u prirodi. Sintetičke ili modifikacije koje se ne javljaju u prirodi u nukleotidima uključuju one sa 2ʼ modifikacijama, npr. 2ʼ-metoksietoksi, 2ʼ-fluoro, 2ʼ-alil, 2ʼ-O-[2-(metilamino)-2-oksoetil], 4ʼ-tio, 4ʼ-CH2-O-2ʼ-most, 4ʼ-(CH2)2-O-2ʼ-most, 2ʼ-LNA ili drugi biciklični ili "premošteni" nukleozidni analog, i 2ʼ-O-(N-metilkarbamat) ili one koje sadrže analoge baza. U vezi sa 2ʼ-modifikovanim nukleotidima kao što je opisano za predmetnu objavu, pod "amino" se misli na 2ʼ-NH2ili 2ʼ-O-NH2, koji mogu biti modifikovani ili nemodifikovani. Takve modifikovane grupe su opisane, npr. u Eckstein et al., S.A.D. patent br.5,672,695 i Matulic-Adamic et al., S.A.D. patent br.6,248,878. "Modifikovani nukleotidi" iz trenutnog pronalaska mogu takođe da uključuju nukleotidne analoge kao što je opisano iznad.

[0111] U pozivanju na molekule nukleinske kiseline iz predmetne objave, modifikacije mogu postojati na ovim agensima u obrascima na jednom ili oba lanca dvolančane ribonukleinske kiseline (dsRNA). Kao što se ovde upotrebljava, "naizmenične pozicije" označavaju obrazac gde je svaki drugi nukleotid modifikovani nukleotid ili postoji nemodifikovani nukleotid (npr. nemodifikovani ribonukleotid) između svakog modifikovanog nukleotida na definisanoj dužini lanca dsRNA (npr.5ʼ-MNMNMN-3ʼ; 3ʼ-MNMNMN-5ʼ; gde je M modifikovani nukleotid i N je nemodifikovani nukleotid). Obrazac modifikacije počinje od pozicije prvog nukleotida bilo na 5ʼ ili 3ʼ terminusu u skladu sa konvencijom o numerisanju pozicija, npr. kao što je ovde opisano (u određenim primerima izvođenja, pozicija 1 je naznačena u pozivanju na terminalni ostatak lanca nakon projektovanog Dicer događaja isecanja DsiRNA agensa iz pronalaska; stoga, pozicija 1 ne predstavlja uvek 3ʼ terminalni ili 5ʼ terminalni ostatak prethodno obrađenog agensa iz pronalaska). Obrazac modifikovanih nukleotida na naizmeničnim pozicijama može se protezati celom dužinom lanca, ali u određenim primerima izvođenja uključuje najmanje 4, 6, 8, 10, 12, 14 nukleotida koji sadrže najmanje 2, 3, 4, 5, 6 ili 7 modifikovanih nukleotida, respektivno. Kao što se ovde upotrebljava, "naizmenični parovi pozicija" označava obrazac gde su dva uzastopna

2

modifikovana nukleotida odvojena sa dva uzastopna nemodifikovana nukleotida na definisanoj dužini lanca dsRNA (npr. 5ʼ-MMNNMMNNMMNN-3ʼ; 3ʼ- MMNNMMNNMMNN-5ʼ; gde je M modifikovani nukleotid i N je nemodifikovani nukleotid). Obrazac modifikacije počinje od pozicije prvog nukleotida bilo na 5ʼ ili 3ʼ terminusu u skladu sa konvencijom o numerisanju pozicija kao što su one ovde opisane. Obrazac modifikovanih nukleotida na naizmeničnim pozicijama može se protezati celom dužinom lanca, ali poželjno uključuje najmanje 8, 12, 16, 20, 24, 28 nukleotida koji sadrže najmanje 4, 6, 8, 10, 12 ili 14 modifikovanih nukleotida, respektivno. Naglašava se da su gornji obrasci modifikacija primer i nisu namenjeni kao ograničenja obima pronalaska.

[0112] Kao što se ovde upotrebljava, "analog baze" označava heterocikličnu grupu koja je locirana na 1ʼ poziciji nukleotidne šećerne grupe u modifikovanom nukleotidu koja se može inkorporisati u dupleks nukleinske kiseline (ili na ekvivalentnoj poziciji u supstituciji nukleotidne šećerne grupe koja se može inkorporisati u dupleks nukleinske kiseline). U dsRNA iz pronalaska, analog baze je generalno bilo purinska ili pirimidinska baza isključujući uobičajene baze guanin (G), citozin (C), adenin (A), timin (T), i uracil (U). Analozi baza mogu da dupleksuju sa drugim bazama ili analozima baza u dsRNA. Analozi baza uključuju one koji su korisni u jedinjenjima i postupcima iz pronalaska, npr. one koji su objavljeni u S.A.D. patentima br.5,432,272 i 6,001,983 za Benner i S.A.D. patentnoj publikaciji br.20080213891 za Manoharan. Neograničavajući primeri baza uključuju hipoksantin (I), ksantin (X), 3-β-D-ribofuranozil-(2,6-diaminopirimidin) (K), 3-β-D-ribofuranozil-(1-metil-pirazolo[4,3-d]pirimidin-5,7(4H,6H)-dion) (P), izo-citozin (izo-C), izo-guanin (izo-G), 1-β-D-ribofuranozil-(5-nitroindol), 1-β-D-ribofuranozil-(3-nitropirol), 5-bromuracil, 2-aminopurin, 4-tio-dT, 7-(2-tienil)-imidazo[4,5-b]piridin (Ds) i pirol-2-karbaldehid (Pa), 2-amino-6-(2-tienil)purin (S), 2-oksopiridin (Y), difluorotolil, 4-fluoro-6-metilbenzimidazol, 4-metilbenzimidazol, 3-metil izokarbostirilil, 5-metil izokarbostirilil, i 3-metil-7-propinil izokarbostirilil, 7-azaindolil, 6-metil-7-azaindolil, imidizopiridinil, 9-metil-imidizopiridinil, pirolopirizinil, izokarbostirilil, 7-propinil izokarbostirilil, propinil-7-azaindolil, 2,4,5-trimetilfenil, 4-metilindolil, 4,6-dimetilindolil, fenil, naftalenil, antracenil, fenantracenil, pirenil, stilbenzil, tetratacenil, pentacenil, i njihove strukturne derivate (Schweitzer et al., J. Org. Chem., 59:7238-7242 (1994); Berger et al., Nucleic Acids Research, 28(15):2911-2914 (2000); Moran et al., J. Am. Chem. Soc., 119:2056-2057 (1997); Morales et al., J. Am. Chem. Soc., 121:2323-2324 (1999); Guckian et al., J. Am. Chem. Soc., 118:8182-8183 (1996); Morales et al., J. Am. Chem. Soc., 122(6):1001-1007 (2000); McMinn et al., J. Am. Chem. Soc., 121:11585-11586 (1999); Guckian et al., J. Org. Chem., 63:9652-9656 (1998); Moran et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 94:10506-10511 (1997); Das et al., J. Chem. Soc., Perkin Trans., 1:197-206 (2002); Shibata et al., J. Chem. Soc., Perkin Trans., 1:

2

1605-1611 (2001); Wu et al., J. Am. Chem. Soc., 122(32):7621-7632 (2000); OʼNeill et al., J. Org. Chem., 67:5869-5875 (2002); Chaudhuri et al., J. Am. Chem. Soc., 117:10434-10442 (1995); i S.A.D. pat. br.6,218,108.). Analozi baza takođe mogu biti univerzalna baza.

[0113] Kao što se ovde upotrebljava, "univerzalna baza" označava heterocikličnu grupu koja je locirana na 1ʼ poziciji nukleotidne šećerne grupe u modifikovanom nukleotidu, ili na ekvivalentnoj poziciji u supstituciji nukleotidne šećerne grupe, koja, kada je prisutna u dupleksu nukleinske kiseline, može biti pozicionirana nasuprot više od jednog tipa baze bez izmene dvostruke spiralne strukture (npr. strukture fosfatne okosnice). Pored toga, univerzalna baza ne uništava sposobnost jednolančane nukleinske kiseline u kojoj se nalazi da dupleksuje sa target nukleinskom kiselinom. Sposobnost jednolančane nukleinske kiseline koja sadrži univerzalnu bazu da dupleksuje target nukleinsku može se testirati postupcima koji su očigledni stručnjaku (npr. UV apsorbanca, cirkularni dihroizam, smicanje gela, osetljivost jednolančane nukleaze, itd.). Pored toga, uslovi pod kojima se uočava formiranje dupleksa mogu se menjati kako bi se odredila stabilnost ili formiranje dupleksa, npr. temperatura, pošto temperatura topljenja (Tm) korelira sa stabilnošću dupleksa nukleinske kiseline. U poređenju sa referentnom jednolančanom nukleinskom kiselinom koja je potpuno komplementarna sa target nukleinskom kiselinom, jednolančana nukleinska kiselina koja sadrži univerzalnu bazu formira dupleks sa target nukleinskom kiselinom koji ima nižu Tm nego dupleks formiran sa komplementarnom nukleinskom kiselinom. Međutim, u poređenju sa referentnom jednolančanom nukleinskom kiselinom u kojoj je univerzalna baza zamenjena sa bazom kako bi se generisala jedna neusklađenost, jednolančana nukleinska kiselina koja sadrži univerzalnu bazu formira dupleks sa target nukleinskom kiselinom koji ima veću Tm nego dupleks formiran sa nukleinskom kiselinom koja ima neusklađenu bazu.

[0114] Neke univerzalne baze sposobne su za bazno sparivanje formiranjem vodoničnih veza između univerzalne baze i svih od baza guanin (G), citozin (C), adenin (A), timin (T), i uracil (U) pod uslovima formiranja baznih parova. Univerzalna baza nije baza koja formira bazni par sa samo jednom komplementarnom bazom. U dupleksu, univerzalna baza možda neće formirati nijednu vodoničnu vezu, može formirati jednu vodoničnu vezu, ili više od jedne vodonične veze sa svakom od G, C, A, T, i U koja joj je naspramna na naspramnom lancu dupleksa. Poželjno, univerzalna baza ne interaguje sa bazom koja joj je naspramna na naspramnom lancu dupleksa. U dupleksu, dolazi do baznog sparivanja između univerzalne baze bez izmene dvostruke spiralne strukture fosfatne okosnice. Univerzalna baza takođe može interagovati sa bazama u susednim nukleotidima na istom lancu nukleinske kiseline pomoću interakcija slaganja. Takve interakcije slaganja stabilizuju dupleks, posebno u situacijama gde univerzalna baza ne formira nikakve vodonične veze sa bazom koja je pozicionirana naspramno na naspramnom lancu dupleksa.

2

Neograničavajući primeri univerzalno-vezujućih nukleotida uključuju inozin, 1-β-D-ribofuranozil-5-nitroindol, i/ili 1-β-D-ribofuranozil-3-nitropirol (S.A.D. pat. prij. pub. br.

20070254362 za Quay et al.; Van Aerschot et al., An acyclic 5-nitroindazole nucleoside analogue as ambiguous nucleoside. Nucleic Acids Res.1995 Nov 11;23(21): 4363-70; Loakes et al., 3-Nitropyrrole and 5-nitroindole as universal bases in primers for DNA sequencing and PCR. Nucleic Acids Res. 1995 Jul 11;23(13):2361-6; Loakes i Brown, 5-Nitroindole as an universal base analogue. Nucleic Acids Res.1994 Okt 11;22(20):4039-43).

[0115] Kao što se ovde upotrebljava, "petlja" označava strukturu formiranu od strane jednog lanca nukleinske kiseline, u kojoj komplementarni regioni koji su uz bok određenog jednolančanog nukleotidnog regiona hibridizuju na način da je jednolančani nukleotidni region između komplementarnih regiona isključen iz formiranja dupleksa ili Votson-Krik (Watson-Crick) baznog sparivanja. Petlja je jednolančani nukleotidni region bilo koje dužine. Primeri petlji uključuju nesparene nukleotide prisutne u takvim strukturama kao što su ukosnice, stem petlje, ili produžene petlje.

[0116] Kao što se ovde upotrebljava, "produžena petlja" u kontekstu dsRNA označava jednolančanu petlju i pored toga 1, 2, 3, 4, 5, 6 ili do 20 baznih parova ili dupleksa koji su bočno od petlje. U produženoj petlji, nukleotidi koji su bočno od petlje na 5ʼ strani formiraju dupleks sa nukleotidima koji su bočno od petlje na 3ʼ strani. Produžena petlja može da formira ukosnicu ili stem petlju.

[0117] Kao što se ovde upotrebljava, "tetrapetlja" u kontekstu dsRNA označava petlju (jednolančani region) koja se sastoji od četiri nukleotida koji formiraju stabilnu sekundarnu strukturu koja doprinosi stabilnosti susednih Votson-Krik hibridizovanih nukleotida. Bez ograničavanja teorijom, tetrapetlja može stabilizovati susedni Votson-Krik bazni par pomoću interakcijaslaganja. Pored toga, interakcije između četiri nukleotida u tetrapetlji uključuju, ali nisu ograničene na ne-Votson-Krik bazno sparivanje, interakcije slaganja, vodonične veze, i kontaktne interakcije (Cheong et al., Nature 1990, Avg 16;346(6285):680-2; Heus i Pardi, Science 1991 Jul 12;253(5016):191-4). Tetrapetlja donosi porast temperature topljenja (Tm) susednog dupleksa koja je viša od očekivane od jednostavnog modela sekvence petlje koja se sastoji od četiri nasumične baze. Na primer, tetrapetlja može doneti temperaturu topljenja od najmanje 55 °C u 10 mM NaHPO4ukosnici koja sadrži dupleks dužine od najmanje 2 bazna para. Tetrapetlja može sadržati ribonukleotide, dezoksiribonukleotide, modifikovane nukleotide, i njihove kombinacije. Primeri RNK tetrapetlji uključuju UNCG porodicu tetrapetlji (npr. UUCG), GNRA porodicu tetrapetlji (npr. GAAA), i CUUG tetrapetlju. (Woese te al., Proc Natl Acad Sci USA. 1990 Nov; 87(21):8467-71; Antao et al., Nucleic Acids Res. 1991 Nov 11;19(21): 5901-5). Primeri DNK tetrapetlji uključuju d(GNNA) porodicu tetrapetlji (npr. D

2

(GTTA), d(GNRA)) porodicu tetrapetlji, d(GNAB) porodicu tetrapetlji, d(CNNG) porodicu tetrapetlji, d(TNCG) porodicu tetrapetlji (npr. d(TTCG)). (Nakano et al. Biochemistry, 41 (48), 14281 -14292, 2002.; SHINJI et al. Nippon Kagakkai Koen Yokoshu VOL.78th; NO.2; PAGE.731 (2000).)

[0118] Kao što se ovde upotrebljava, termin "siRNA" označava dvolančanu nukleinsku kiselinu u kojoj svaki lanac sadrži RNK, RNK analog(e) ili RNK i DNK. siRNA sadrži između 19 i 23 nukleotida ili sadrži 21 nukleotid. siRNA tipično ima 2 bp viseća kraja na 3ʼ krajevima svakog lanca tako da dupleks region u siRNA sadrži 17-21 nukleotida, ili 19 nukleotida. Tipično, antisens lanac siRNA je dovoljno komplementaran sa target sekvencom gena/RNK glikolat oksidaze.

[0119] U određenim primerima izvođenja, anti-glikolat oksidaza DsiRNA iz trenutne objave poseduje dužine lanaca od najmanje 25 nukleotida. U skladu sa tim, u određenim primerima izvođenja, anti-glikolat oksidaza DsiRNA sadrži jednu oligonukleotidnu sekvencu, prvu sekvencu, koja je dužine najmanje 25 nukleotida i nije duža od 35 ili do 50 ili više nukleotida. Ova sekvenca RNK može biti dužine između 26 i 35, 26 i 34, 26 i 33, 26 i 32, 26 i 31, 26 i 30, i 26 i 29 nukleotida. Ova sekvenca može biti dužine 27 ili 28 nukleotida ili dužine 27 nukleotida. Druga sekvenca DsiRNA agensa može biti sekvenca koja se vezuje za prvu sekvencu pod biološkim uslovima, kao što je unutar citoplazme eukariotske ćelije. Generalno, druga oligonukleotidna sekvenca imaće najmanje 19 komplementarnih baznih parova sa prvom oligonukleotidnom sekvencom, tipičnije druga oligonukleotidna sekvenca imaće 21 ili više komplementarnih baznih parova, ili 25 ili više komplementarnih baznih parova sa prvom oligonukleotidnom sekvencom. U jednom primeru izvođenja, druga sekvenca je iste dužine kao prva sekvenca, i DsiRNA agens je tupo završen. U sledećem primeru izvođenja, krajevi DsiRNA agensa imaju jedan ili više visećih krajeva.

[0120] U određenim primerima izvođenja, prve i druge oligonukleotidne sekvence DsiRNA agensa postoje na odvojenim oligonukleotidnim lancima koji mogu biti i tipično su hemijski sintetisani. U nekim primerima izvođenja, oba lanca su dužine između 26 i 35 nukleotida. U drugim primerima izvođenja, oba lanca su dužine između 25 i 30 ili 26 i 30 nukleotida. U jednom primeru izvođenja, oba lanca su dužine 27 nukleotida, potpuno su komplementarni i imaju tupe krajeve. U određenim primerima izvođenja iz trenutnog pronalaska, prve i druge sekvence anti-glikolat oksidaza DsiRNA postoje na odvojenim RNK oligonukleotidima (lancima). U jednom primeru izvođenja, jedan ili oba oligonukleotidna lanca mogu da posluže kao supstrat za Dicer. U drugim primerima izvođenja, prisutna je najmanje jedna modifikacija koja promoviše Dicer da se vezuje za dvolančanu RNK strukturu u orijentaciji koja maksimizuje efikasnost dvolančane RNK strukture u inhibiranju ekspresije gena. U određenim primerima

2

izvođenja trenutnog pronalaska, anti-glikolat oksidaza DsiRNA agens sastoji se od dva oligonukleotidna lanca različitih dužina, s tim da anti-glikolat oksidaza DsiRNA ima tupi kraj na 3ʼ terminusu prvog lanca (sens lanac) i 3ʼ viseći kraj na 3ʼ terminusu drugog lanca (antisens lanac). DsiRNA takođe može da sadrži jednu ili više supstitucija baze dezoksiribonukleinske kiseline (DNK).

[0121] Pogodne DsiRNA kompozicije koje sadrže dva odvojena oligonukleotida mogu se hemijski povezati van svog regiona vezivanja hemijskim vezujućim grupama. Mnoge pogodne hemijske vezujuće grupe su poznate u struci i mogu se upotrebljavati. Pogodne grupe neće blokirati Dicer aktivnost na DsiRNA i neće ometati usmerenu destrukciju RNK transkribovane iz target gena. Alternativno, dva odvojena oligonukleotida mogu se povezati trećim oligonukleotidom tako da se struktura ukosnice stvara nakon vezivanja dva oligonukleotida koji čine DsiRNA kompoziciju. Struktura ukosnice neće blokirati Dicer aktivnost na DsiRNA i neće ometati usmerenu destrukciju target RNK.

[0122] dsRNA molekul može biti dizajniran tako da je svaki ostatak antisens lanca komplementaran sa ostatkom u target molekulu. Alternativno, supstitucije se mogu izvršiti unutar molekula kako bi se povećala stabilnost i/ili poboljšala aktivnost obrade navedenog molekula. Supstitucije se mogu izvršiti unutar lanca ili se mogu izvršiti na ostacima na krajevima lanca. U određenim primerima izvođenja, supstitucije i/ili modifikacije se vrše na specifičnim ostacima unutar DsiRNA agensa. Takve supstitucije i/ili modifikacije mogu da uključuju, npr. dezoksi-modifikacije na jednom ili više ostataka pozicija 1, 2 i 3 kada se numeriše od 3ʼ terminalne pozicije sens lanca DsiRNA agensa; i uvođenje 2ʼ-O-alkil (npr. 2ʼ-O-metil) modifikacija na 3ʼ terminalnom ostatku antisens lanca DsiRNA agensa, s tim što se takve modifikacije takođe izvode i na pozicijama 3ʼ visećeg kraja dela antisens lanca i na naizmeničnim ostacima antisens lanca DsiRNA koji su uključeni u region DsiRNA agensa koji se obrađuje kako bi se formirao aktivni siRNA agens. Prethodne modifikacije su ponuđene kao primer, i nisu namenjene ograničavanju na bilo koji način. Dodatno razmatranje strukture poželjnih DsiRNA agenasa, uključujući dodatni opis modifikacija i supstitucija koje se mogu izvršiti na anti-glikolat oksidaza DsiRNA agensima iz trenutnog pronalaska, može se pronaći ispod.

[0123] Tamo gde se prva sekvenca označava kao "suštinski komplementarna" u odnosu na drugu sekvencu, dve sekvence mogu biti potpuno komplementarne, ili mogu formirati jedan ili više, ali generalno ne više od 4, 3 ili 2 neusklađena bazna para nakon hibridizacije, zadržavajući sposobnost da hibridizuju pod uslovima najrelevantnijim za njihovu krajnju primenu. Međutim, tamo gde su dva oligonukleotida dizajnirana da formiraju, nakon hibridizacije, jedan ili više jednolančanih visećih krajeva, takvi viseći krajevi se neće smatrati neusklađenostima u pogledu određivanja komplementarnosti. Na primer, dsRNA koja sadrži jedan oligonukleotid dužine 21 oligonukleotid i drugi oligonukleotid dužine 23 oligonukleotida, pri čemu duži oligonukleotid sadrži sekvencu od 21 nukleotida koja je potpuno komplementarna sa kraćim oligonukleotidom, mogu se ipak označiti kao "potpuno komplementarne" u svrhe pronalaska.

[0124] Termin "dvolančana RNK" ili "dsRNA", kao što se ovde upotrebljava, označava kompleks molekula ribonukleinske kiseline, koji ima dupleks strukturu koja sadrži dva antiparalelna i suštinski komplementarna, kao što je definisano iznad, lanca nukleinske kiseline. Dva lanca koji formiraju dupleks strukturu mogu biti različiti delovi jednog većeg RNK molekula, ili mogu biti odvojeni RNK molekuli. Tamo gde su odvojeni RNK molekuli, takve dsRNA su često označene kao siRNA ("kratka interferirajuća RNK") ili DsiRNA ("Dicer supstrat siRNA"). Tamo gde su dva lanca deo jednog većeg molekula, i prema tome su povezana neprekinutim lancem nukleotida između 3ʼ kraja jednog lanca i 5ʼ kraja respektivnog drugog lanca formirajući dupleks strukturu, povezujući RNK lanac se označava kao "petlja ukosnica", "kratka RNK sa strukturom ukosnice" ili "shRNA". Tamo gde su dva lanca kovalentno povezana na drugačiji način od neprekinutog lanca nukleotida između 3ʼ kraja jednog lanca i 5ʼ kraja respektivnog drugog lanca formirajući dupleks strukturu, povezujuća struktura se označava kao "linker". RNK lanci mogu imati isti ili različit broj nukleotida. Maksimalan broj baznih parova je broj nukleotida u najkraćem lancu dsRNA umanjen za bilo koje viseće krajeve koji su prisutni u dupleksu. Pored dupleks strukture, dsRNA može sadržati jedan ili više nukleotidnih visećih krajeva. Pored toga, kao što se ovde upotrebljava, "dsRNA" može da uključuje hemijske modifikacije ribonukleotida, internukleozidnih veza, krajnjih grupa, kapa, i konjugovanih grupa, uključujući značajne modifikacije na više nukleotida i uključujući sve tipove modifikacija koje se ovde objavljuju ili su poznate u struci. Sve takve modifikacije, koje se upotrebljavaju u siRNA- ili DsiRNA-tipu molekula, obuhvaćene su pomoću "dsRNA" u svrhe ove specifikacije i patentnih zahteva.

[0125] Fraza "dupleks region" označava region u dva komplementarna ili suštinski komplementarna oligonukleotida koji formiraju bazne parove jedan sa drugim, bilo putem Votson-Krik baznog sparivanja ili na drugi način koji omogućava dupleks između oligonukleotidnih lanaca koji su komplementarni ili suštinski komplementarni. Na primer, oligonukleotidni lanac koji ima 21 nukleotidnu jedinicu može da se bazno spari sa drugim oligonukleotidom od 21 nukleotidne jedinice, ali je samo 19 baza na svakom lancu komplementarno ili suštinski komplementarno, tako da se "dupleks region" sastoji od 19 baznih parova. Preostali bazni parovi mogu, na primer, da postoje kao 5ʼ i 3ʼ viseći krajevi. Dodatno, unutar dupleks regiona nije potrebna 100% komplementarnost; značajna komplementarnost je dozvoljena unutar dupleks regiona. Značajna komplementarnost označava komplementarnost između lanaca tako da su sposobni za vezivanje pod biološkim uslovima. Tehnike za empirijsko

1

određivanje da li su dva lanca sposobna za vezivanje pod biološkim uslovima dobro su poznate u struci. Alternativno, dva lanca mogu da se sintetišu i dodaju zajedno pod biološkim uslovima kako bi se odredilo da li se vezuju jedan za drugi.

[0126] Kaže se da jednolančane nukleinske kiseline koje se bazno sparuju na više baza "hibridizuju". Hibridizacija se tipično određuje pod fiziološkim ili biološki relevantnim uslovima (npr. unutarćelijski: pH 7,2, 140 mM jona kalijuma; vanćelijski pH 7,4, 145 mM jona natrijuma). Uslovi hibridizacije generalno sadrže monovalentni katjon i biološki prihvatljiv pufer i mogu ili ne moraju sadržati dvovalentni katjon, složene anjone, npr. glukonat iz kalijum glukonata, nenaelektrisane vrste kao što je saharoza, i inertne polimere za redukovanje aktivnosti vode u uzorku, npr. PEG. Takvi uslovi uključuju uslove pod kojima se mogu formirati bazni parovi.

[0127] Hibridizacija se meri temperaturom potrebnom za disocijaciju jednolančanih nukleinskih kiselina koje formiraju dupleks, (tj,. temperatura topljenja, Tm). Uslovi hibridizacije su takođe uslovi pod kojima mogu da se formiraju bazni parovi. Za određivanje hibridizacije mogu se upotrebljavati različiti uslovi strogosti (videti, npr. Wahl, G. M. i S. L. Berger (1987) Methods Enzymol. 152:399; Kimmel, A. R. (1987) Methods Enzymol. 152:507). Strogi temperaturni uslovi obično će uključivati temperature od najmanje oko 30 °C, poželjnije od najmanje oko 37 °C, i najpoželjnije od najmanje oko 42 °C. Temperatura hibridizacije za hibride za koje se očekuje da budu kraći od 50 baznih parova treba da bude 5-10 °C manja od temperature topljenja (Tm) hibrida, gde se Tm određuje u skladu sa sledećim jednačinama. Za hibride kraće od 18 baznih parova, Tm (°C) = 2(# A+T baza)+4(# G+C baza). Za hibride dužine između 18 i 49 baznih parova, Tm (°C) = 81,5+16,6 (log 10[Na+])+0,41 (% G+C)-(600/N), gde je N broj baza u hibridu, i [Na+] je koncentracija jona natrijuma u puferu za hibridizaciju ([Na+] za 1xSSC=0,165 M). Na primer, pufer za određivanje hibridizacije je pokazan u Tabeli 1.

Tabela 1.

2

[0128] Korisne varijacije uslova hibridizacije biće lako očigledne iskusnima u struci. Tehnike hibridizacije dobro su poznate iskusnima u struci i opisane su, na primer, u Benton i Davis (Science 196: 180, 1977); Grunstein and Hogness (Proc. Natl. Acad. Sci., USA 72: 3961, 1975); Ausubel et al. (Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience, New York, 2001); Berger i Kimmel (Antisense to Molecular Cloning Techniques, 1987, Academic Press, New York); i Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York.

[0129] Kao što se ovde upotrebljava, "oligonukleotidni lanac" je jednolančani molekul nukleinske kiseline. Oligonukleotid može da sadrži ribonukleotide, dezoksiribonukleotide, modifikovane nukleotide (npr. nukleotide sa 2ʼ modifikacijama, sintetičke analoge baze, itd.) ili njihove kombinacije. Takvi modifikovani oligonukleotidi mogu biti poželjniji u odnosu na nativne oblike zbog svojstava kao što su, na primer, poboljšani ćelijski unos i povećana stabilnost u prisustvu nukleaza.

[0130] Kao što se ovde upotrebljava, termin "ribonukleotid" obuhvata prirodne i sintetičke, nemodifikovane i modifikovane ribonukleotide. Modifikacije uključuju promene na šećernoj grupi, na baznoj grupi i/ili na vezama između ribonukleotida u oligonukleotidu. Kao što se ovde upotrebljava, termin "ribonukleotid" specifično isključuje dezoksiribonukleotid, koji je nukleotid koji poseduje jednu protonsku grupu na 2ʼ poziciji prstena riboze.

[0131] Kao što se ovde upotrebljava, termin "dezoksiribonukleotid" obuhvata prirodne i sintetičke, nemodifikovane i modifikovane dezoksiribonukleotide. Modifikacije uključuju promene na šećernoj grupi, na baznoj grupi i/ili na vezama između dezoksiribonukleotida u oligonukleotidu. Kao što se ovde upotrebljava, termin "dezoksiribonukleotid" takođe uključuje modifikovani ribonukleotid koji ne dozvoljava Dicer isecanje dsRNA agensa, npr. 2ʼ-O-metil ribonukleotid, ribonukleotidni ostatak modifikovan fosforotioatom, itd. koji ne dozvoljava da dođe do Dicer isecanja na vezi takvog ostatka.

[0132] Kao što se ovde upotrebljava, termin "PS-NA" označava nukleotidni ostatak modifikovan fosforotioatom. Termin "PS-NA" prema tome obuhvata i ribonukleotide modifikovane fosforotioatom ("PS-RNK") i dezoksiribonukleotide modifikovane fosforotioatom ("PS-DNK").

[0133] Kao što se ovde upotrebljava, "Dicer" označava endoribonukleazu iz porodice RNaze III koja iseca dsRNA ili molekul koji sadrži dsRNA, npr. dvolančanu RNK (dsRNA) ili premikroRNK (miRNA), na fragmente dvolančane nukleinske kiseline dugačke 19-25 nukleotida, uobičajeno sa visećim krajem od dve baze na 3ʼ kraju. U odnosu na određene dsRNA iz pronalaska (npr. "DsiRNA"), dupleks formiran od dsRNA regiona agensa iz pronalaska je prepoznat od strane Dicer i predstavlja Dicer supstrat na najmanje jednom lancu dupleksa. Dicer katalizuje prvi korak u putu RNK interferencije, što posledično rezultuje degradacijom target RNK. Proteinska sekvenca humanog Dicer obezbeđena je u NCBI bazi podataka pod pristupnim brojem NP_085124.

[0134] Dicer "isecanje" se može odrediti na sledeći način (npr. videti Collingwood et al., Oligonucleotides 18:187-200 (2008)). U testu Dicer isecanja, RNK dupleksi (100 pmol) se inkubiraju u 20 μl 20 mM Tris pH 8,0, 200 mM NaCl, 2,5 mM MgCl2 sa ili bez 1 jedinice rekombinantnog humanog Dicer (Stratagene, La Jolla, CA) na 37 °C tokom 18-24 sata. Uzorci se desalinizuju upotrebom Performa SR ploče sa 96 bunarića (Edge Biosystems, Gaithersburg, MD). Tečna hromatografija masena spektroskopija sa elektrosprej jonizacijom (ESI-LCMS) dupleks RNK pre i posle tretmana sa Dicer urađena je upotrebom Oligo HTCS sistema (Novatia, Princeton, NJ; Hail et al., 2004), koji se sastoji od ThermoFinnigan TSQ7000, Xcalibur data sistema, ProMass softvera za obradu podataka i Paradigm MS4 HPLC (Michrom BioResources, Auburn, CA). U ovom testu, Dicer isecanje se dešava gde se najmanje 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, ili čak 100% Dicer supstrata dsRNA (tj., dsRNA sa 25-30 bp, poželjno dsRNA sa 26-30 bp) iseca na kraću dsRNA (npr. dsRNA sa 19-23 bp, poželjno dsRNA sa 21-23 bp).

[0135] Kao što se ovde upotrebljava, "mesto Dicer isecanja" označava mesta na kojima Dicer iseca dsRNA (npr. dsRNA region DsiRNA agensa iz pronalaska). Dicer sadrži dva domena RNaze III koji tipično isecaju i sens i antisens lance dsRNA. Prosečna udaljenost između domena RNaze III i PAZ domena određuje dužinu kratkih dvolančanih fragmenata nukleinske kiseline koje ona proizvodi i ta udaljenost može da varira (Macrae et al. (2006) Science 311: 195-8). Kao što je pokazano na Slici 1, Dicer je projektovan da iseca određene dvolančane ribonukleinske kiseline iz trenutnog pronalaska koje poseduju antisens lanac koji ima 2 nukleotida 3ʼ visećeg kraja na mestu između 21. i 22. nukleotida udaljenih od 3ʼ terminusa

4

antisens lanca, i na odgovarajućem mestu između 21. i 22. nukleotida udaljenih od 5ʼ terminusa sens lanca. Projektovano i/ili preovlađujuće mesto(a) Dicer isecanja za dsRNA molekule različite od onih prikazanih na Slici 1 mogu se slično identifikovati postupcima prepoznatim u struci, uključujući one opisane u Macrae et al. Dok događaji Dicer isecanja prikazani na Slici 1 generišu siRNA od 21 nukleotida, primećeno je da Dicer isecanje dsRNA (npr. DsiRNA) može rezultovati generisanjem Dicer-obrađene siRNA dužine od 19 do 23 nukleotida. Zaista, u određenim primerima izvođenja, dvolančani DNK region može biti uključen unutar dsRNA u svrhu usmeravanja preovlađujućeg Dicer isecanja tipično nepoželjne 19mer ili 20mer siRNA, pre nego 21mer.

[0136] Kao što se ovde upotrebljava, "viseći kraj" označava nesparene nukleotide, u kontekstu dupleksa koji ima jedan ili više slobodnih krajeva na 5ʼ terminusu ili 3ʼ terminusu dsRNA. U određenim primerima izvođenja, viseći kraj je 3ʼ ili 5ʼ viseći kraj na antisens lancu ili sens lancu. U nekim primerima izvođenja, viseći kraj je 3ʼ viseći kraj koji ima dužinu između jednog i šest nukleotida, opciono jedan do pet, jedan do četiri, jedan do tri, jedan do dva, dva do šest, dva do pet, dva do četiri, dva do tri, tri do šest, tri do pet, tri do četiri, četiri do šest, četiri do pet, pet do šest nukleotida, ili jedan, dva, tri, četiri, pet ili šest nukleotida. "Tupi" ili "tupi kraj" znači da na tom kraju dsRNA nema nesparenih nukleotida, tj., da nema nukleotidnog visećeg kraja. Radi jasnoće, hemijske kape ili ne-nukleotidne hemijske grupe konjugovane za 3ʼ kraj ili 5ʼ kraj siRNA ne uzimaju se u obzir pri određivanju da li siRNA ima viseći kraj ili je tupo završena. U određenim primerima izvođenja, pronalazak obezbeđuje dsRNA molekul za inhibiranje ekspresije target gena glikolat oksidaze u ćeliji ili sisaru, pri čemu dsRNA sadrži antisens lanac koji sadrži region komplementarnosti koji je komplementaran sa najmanje delom iRNK formirane u ekspresiji target gena glikolat oksidaze, i pri čemu je region komplementarnosti kraći od 35 nukleotida, opciono je dužine 19-24 nukleotida ili je dužine 25-30 nukleotida, i pri čemu dsRNA, nakon kontakta sa ćelijom koja eksprimira target gen glikolat oksidaze, inhibira ekspresiju target gena glikolat oksidaze za najmanje 10%, 25%, ili 40%.

[0137] dsRNA iz pronalaska sadrži dva RNK lanca koja su dovoljno komplementarna da hibridizuju kako bi se formirala dupleks struktura. Jedan lanac dsRNA (antisens lanac) sadrži region komplementarnosti koji je suštinski komplementaran, i generalno potpuno komplementaran, sa target sekvencom, poreklom od sekvence iRNK koja je formirana tokom ekspresije target gena glikolat oksidaze, drugi lanac (sens lanac) sadrži region koji je komplementaran antisens lancu, tako da dva lanca hibridizuju i formiraju dupleks strukturu kada su kombinovani pod pogodnim uslovima. Generalno, dupleks struktura iz predmetne objave je dužine između 15 i 80, ili između 15 i 53, ili A između 15 i 35, opciono između 25 i 30, između 26 i 30, između 18 i 25, između 19 i 24, ili između 19 i 21 baznih parova. Slično, region komplementarnosti sa target sekvencom je dužine između 15 i 35, opciono između 18 i 30, između 25 i 30, između 19 i 24, ili između 19 i 21 nukleotida. dsRNA iz pronalaska može dodatno da sadrži jedan ili više jednolančanih nukleotidnih visećih krajeva. Identifikovano je da dsRNA koje sadrže dupleks strukture dužine između 15 i 35 baznih parova mogu biti efikasne u indukovanju RNK interferencije, uključujući DsiRNA (generalno dužine od najmanje 25 baznih parova) i siRNA (u određenim primerima izvođenja, dupleks strukture siRNA su između 20 i 23, i opciono, specifično 21 baznih parova (Elbashir et al., EMBO 20: 6877-6888)). Takođe je identifikovano da dsRNA koje poseduju duplekse kraće od 20 baznih parova takođe mogu biti efikasne (npr. dupleksi sa 15, 16, 17, 18 ili 19 baznih parova). U određenim primerima izvođenja, dsRNA iz pronalaska mogu da sadrže najmanje jedan lanac dužine 19 nukleotida ili više. U određenim primerima izvođenja, može se razumno očekivati da kraće dsRNA koje sadrže sekvencu komplementarnu sa jednom od sekvenci iz Tabela 4, 6, 8 ili 10, umanjenu za samo nekoliko nukleotida na jednom ili oba kraja mogu biti slično efikasne u poređenju sa dsRNA opisanim iznad i u Tabelama 2, 3, 5, 7 i 9. Dakle, u objavi su razmatrane dsRNA koje sadrže delimičnu sekvencu od najmanje 15, 16, 17, 18, 19, 20, ili više uzastopnih nukleotida dovoljno komplementarnu sa jednom od sekvenci iz Tabela 4, 6, 8 ili 10, i razlikuju se u svojoj sposobnosti da inhibiraju ekspresiju target gena glikolat oksidaze u testu kao što je ovde opisano sa ne više od 5, 10, 15, 20, 25, ili 30% inhibicije od dsRNA koja sadrži punu sekvencu. U jednom primeru izvođenja, najmanje jedan kraj dsRNA ima jednolančani nukleotidni viseći kraj od 1 do 5, opciono 1 do 4, u određenim primerima izvođenja 1 ili 2 nukleotida. Određene dsRNA strukture koje imaju najmanje jedan nukleotidni viseći kraj poseduju superiorna inhibitorna svojstva u poređenju sa pandanima koji poseduju tupe krajeve sa sparenim bazama na oba kraja dsRNA molekula.

[0138] Kao što se ovde upotrebljava, termin "RNK obrada" označava aktivnosti obrade koje izvode komponente siRNA, miRNA ili RNaza H puteva (npr. Drosha, Dicer, Argonaute2 ili druge RISC endoribonukleaze, i RNaza H), koje su detaljnije opisane ispod (videti odeljak "RNK obrada" ispod). Termin se eksplicitno razlikuje od post-transkripcionih procesa 5ʼ kapinga RNK i degradacije RNK putem ne-RISC- ili ne-RNaza H-posredovanih procesa. Takva "degradacija" RNK može imati nekoliko oblika, npr. deadenilacija (uklanjanje 3ʼ poli(A) repa), i/ili nukleazna digestija dela ili celog tela RNK jednom ili više od nekoliko endo- ili egzonukleaza (npr. RNaza III, RNaza P, RNaza T1, RNaza A (1, 2, 3, 4/5), oligonukleotidaza, itd.).

[0139] Pod "homolognom sekvencom" se misli na nukleotidnu sekvencu koju dele jedna ili više polinukleotidnih sekvenci, kao što su geni, transkripti gena i/ili nekodirajući polinukleotidi. Na primer, homologna sekvenca može biti nukleotidna sekvenca koju dele dva ili više gena koji kodiraju srodne ali različite proteine, kao što su različiti članovi genske porodice, različiti proteinski epitopi, različite proteinske izoforme ili potpuno divergentni geni, kao što su citokini i njihovi odgovarajući receptori. Homologna sekvenca može biti nukleotidna sekvenca koju dele dva ili više nekodirajućih polinukleotida, kao što su nekodirajuća DNK ili RNK, regulatorne sekvence, introni, i mesta kontrole ili regulacije transkripcije. Homologne sekvence mogu takođe da uključuju regione konzervirane sekvence koje dele više od jedne polinukleotidne sekvence. Homologija ne treba da bude savršena homologija (npr. 100%), pošto se trenutnom objavom razmatraju i delimično homologne sekvence (npr. 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86%, 85%, 84%, 83%, 82%, 81%, 80% itd.). Zaista, dizajn i upotreba dsRNA agenasa iz trenutne objave razmatra mogućnost upotrebe takvih dsRNA agenasa ne samo prema target RNK glikolat oksidaze koja poseduje savršenu komplementarnost sa trenutno opisanim dsRNA agensima, već i prema target RNK glikolat oksidaze koje poseduju sekvence koje su npr. samo 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86%, 85%, 84%, 83%, 82%, 81%, 80% itd. komplementarne sa navedenim dsRNA agensima. Slično, razmatra se da bi ovde opisani dsRNA agensi iz trenutne objave mogli biti lako izmenjeni od strane iskusnog stručnjaka kako bi povećali stepen komplementarnosti između navedenih dsRNA agenasa i target RNK glikolat oksidaze, npr. specifične alelske varijante glikolat oksidaze (npr. alel poboljšanog terapijskog interesa). Zaista, sekvence dsRNA agensa sa insercijama, delecijama, i tačkastim mutacijama u odnosu na sekvencu target glikolat oksidaze takođe mogu biti efikasne za inhibiciju. Alternativno, sekvence dsRNA agensa sa supstitucijama ili insercijama nukleotidnog analoga mogu biti efikasne za inhibiciju.

[0140] Identičnost sekvence može se odrediti poređenjem sekvenci i algoritmima za poravnanje poznatim u struci. Da bi se odredila procentualna identičnost dve sekvence nukleinskih kiselina (ili dve amino-kiselinske sekvence), sekvence se poravnaju za svrhe poređenja (npr. razmaci se mogu uvesti u prvu sekvencu ili drugu sekvencu za optimalno poravnanje). Zatim se porede nukleotidi (ili amino-kiselinski ostaci) na odgovarajućim pozicijama nukleotida (ili aminokiselina). Kada je pozicija u prvoj sekvenci zauzeta istim ostatkom kao i odgovarajuća pozicija u drugoj sekvenci, tada su molekuli identični na toj poziciji. Procenat identičnosti između dve sekvence je funkcija broja identičnih pozicija koje sekvence dele (tj., % homologije = # identičnih pozicija/ukupan # pozicija x 100), opciono penalizujući rezultat za broj uvedenih razmaka i/ili dužinu uvedenih razmaka.

[0141] Poređenje sekvenci i određivanje procentualne identičnosti između dve sekvence može se postići upotrebom matematičkog algoritma. U jednom primeru izvođenja, poravnanje generisano na određenom delu poravnate sekvence koja ima dovoljnu identičnost ali ne i na delovima koji imaju nizak stepen identičnosti (tj. lokalno poravnanje). Poželjni, neograničavajući primer algoritma za lokalno poravnanje koji se koristi za poređenje sekvenci je algoritam od Karlin i Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-68, modifikovan kao u Karlin i Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-77. Takav algoritam je inkorporisan u BLAST programe (verzija 2.0) od Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol.215:403-10.

[0142] U sledećem primeru izvođenja, poravnanju sa razmakom, poravnanje se optimizuje uvođenjem odgovarajućih razmaka, i procenat identičnosti se određuje na dužini poravnanih sekvenci (tj., poravnanje sa razmakom). Da bi se postigla poravnanja sa razmacima za svrhe poređenja, može se koristiti Gapped BLAST kao što je opisano u Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402. U sledećem primeru izvođenja, globalnom poravnanju poravnanje se optimizuje uvođenjem odgovarajućih razmaka, i procenat identičnosti se određuje na celoj dužini poravnanih sekvenci (tj. globalno poravnanje). Poželjni, neograničavajući primer matematičkog algoritma koji se koristi za globalno poređenje sekvenci je algoritam od Myers i Miller, CABIOS (1989). Takav algoritam je inkorporisan u ALIGN program (verzija 2.0) koji je deo softverskog paketa za poravnanje GCG sekvence. Kada se koristi ALIGN program za poređenje amino-kiselinskih sekvenci, može se upotrebljavati PAM120 tabela težine ostataka, penal za dužinu razmaka od 12, i penal za razmak od 4.

[0143] Poželjna je identičnost sekvence veća od 80%, npr. 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili čak 100% identičnosti sekvence, između dsRNA antisens lanca i dela RNK sekvence glikolat oksidaze. Alternativno, dsRNA može biti funkcionalno definisana kao nukleotidna sekvenca (ili oligonukleotidna sekvenca) koja je sposobna za hibridizaciju sa delom RNK glikolat oksidaze (npr. 400 mM NaCl, 40 mM PIPES pH 6,4, 1 mM EDTA, hibridizacija na 50 °C ili 70 °C tokom 12-16 sati; praćeno ispiranjem). Dopunski poželjni uslovi hibridizacije uključuju hibridizaciju na 70 °C u 1xSSC ili 50 °C u 1xSSC, 50% formamida praćeno ispiranjem na 70 °C u 0,3xSSC ili hibridizaciju na 70 °C u 4xSSC ili 50 °C u 4xSSC, 50% formamida praćeno ispiranjem na 67 °C u 1xSSC. Temperatura hibridizacije za hibride za koje se očekuje da budu kraći od 50 baznih parova treba da bude 5-10 °C niža od temperature topljenja (Tm) hibrida, gde je Tm određena u skladu sa sledećim jednačinama. Za hibride kraće od 18 baznih parova, Tm(°C)=2(# A+T baza)+4(# G+C baza). Za hibride dužine između 18 i 49 baznih parova, Tm(°C)=81,5+16,6(log 10[Na+])+0,41 (% G+C)-(600/N), gde je N broj baza u hibridu, i [Na+] je koncentracija jona natrijuma u puferu za hibridizaciju ([Na+] za 1xSSC=0,165 M). Dopunski primeri uslova strogosti za polinukleotidnu hibridizaciju obezbeđeni su u Sambrook, J., E. F. Fritsch, i T. Maniatis, 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, poglavlja 9 i 11, i Current Protocols in Molecular Biology, 1995, F. M. Ausubel et al., eds., John Wiley & Sons, Inc., odeljci 2.10 i 6.3-6.4. Dužina identičnih nukleotidnih sekvenci može biti najmanje 10, 12, 15, 17, 20, 22, 25, 27 ili 30 baza.

[0144] Pod "regionom konzervirane sekvence" se misli da nukleotidna sekvenca jednog ili više regiona u polinukleotidu ne varira značajno između generacija ili od jednog biološkog sistema, subjekta, ili organizma do drugog biološkog sistema, subjekta, ili organizma. Polinukleotid može da uključuje i kodirajuću i nekodirajuću DNK i RNK.

[0145] Pod "sens regionom" misli se na nukleotidnu sekvencu dsRNA molekula koja ima komplementarnost sa antisens regionom dsRNA molekula. Pored toga, sens region dsRNA molekula može da sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja ima homologiju sa sekvencom target nukleinske kiseline.

[0146] Pod "antisens regionom" misli se na nukleotidnu sekvencu dsRNA molekula koja ima komplementarnost sa sekvencom target nukleinske kiseline. Pored toga, antisens region dsRNA molekula sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja ima komplementarnost sa sens regionom dsRNA molekula.

[0147] Kao što se ovde upotrebljava, "antisens lanac" označava molekul jednolančane nukleinske kiseline koji ima sekvencu komplementarnu sa onom od target RNK. Kada antisens lanac sadrži modifikovane nukleotide sa analozima baza, on nije nužno komplementaran na svojoj celoj dužini, ali mora najmanje hibridizovati sa target RNK.

[0148] Kao što se ovde upotrebljava, "sens lanac" označava molekul jednolančane nukleinske kiseline koji ima sekvencu komplementarnu sa onom od antisens lanca. Kada antisens lanac sadrži modifikovane nukleotide sa analozima baza, sens lanac ne mora biti komplementaran na celoj dužini antisens lanaca, ali mora najmanje dupleksovati sa antisens lanacem.

[0149] Kao što se ovde upotrebljava, "vodič lanac" označava molekul jednolančane nukleinske kiseline dsRNA ili molekul koji sadrži dsRNA, koji ima sekvencu koja je dovoljno komplementarna sa onom od target RNK kako bi rezultovala RNK interferencijom. Posle isecanja dsRNA ili molekula koji sadrži dsRNA pomoću Dicer, fragment vodič lanca ostaje povezan sa RISC, vezuje target RNK kao komponentu RISC kompleksa, i promoviše isecanje target RNK pomoću RISC. Kao što se ovde upotrebljava, vodič lanac ne označava nužno kontinuiranu jednolančanu nukleinsku kiselinu i može sadržati diskontinuitet, poželjno na mestu koje je isečeno pomoću Dicer. Vodič lanac je antisens lanac.

[0150] Kao što se ovde upotrebljava, "putnik lanac" označava oligonukleotidni lanac dsRNA ili molekula koji sadrži dsRNA, koji ima sekvencu koja je komplementarna sa onom od vodič lanca. Kao što se ovde upotrebljava, putnik lanac ne označava nužno kontinuiranu jednolančanu nukleinsku kiselinu i može sadržati diskontinuitet, poželjno na mestu koje je isečeno pomoću Dicer. Putnik lanac je sens lanac.

[0151] Pod "target nukleinskom kiselinom" misli se na sekvencu nukleinske kiseline čiju ekspresiju, nivo ili aktivnost treba modulisati. Target nukleinska kiselina može biti DNK ili RNK. Za agense koji ciljaju glikolat oksidazu, u određenim primerima izvođenja, target nukleinska kiselina je RNK glikolat oksidaze (HAO1), npr. u određenim primerima izvođenja, iRNK glikolat oksidaze (HAO1). Target mesta na RNK glikolat oksidaze takođe se mogu naizmenično referencirati odgovarajućim cDNA sekvencama. Nivoi glikolat oksidaze takođe mogu biti ciljani putem ciljanog delovanja uzvodnih efektora glikolat oksidaze, ili se efekti modulisane ili pogrešno regulisane glikolat oksidaze takođe mogu modulisati ciljnim delovanjem molekula nizvodno od glikolat oksidaze u signalnom putu glikolat oksidaze.

[0152] Pod "komplementarnošću" se misli da nukleinska kiselina može da formira vodoničnu vezu(e) sa drugom sekvencom nukleinske kiseline bilo tradicionalnim Votson-Krik ili drugim netradicionalnim tipovima. U pozivanju na nukleinske molekule iz predmetnog pronalaska, slobodna energija vezivanja za molekul nukleinske kiseline sa njenom komplementarnom sekvencom dovoljna je da omogući da se odvija relevantna funkcija nukleinske kiseline, npr. RNAi aktivnost. Određivanje slobodnih energija vezivanja za molekule nukleinske kiseline je dobro poznato u struci (videti, npr. Turner et al., 1987, CSH Symp. Quant. Biol. LII, pp. 123-133; Frier et al., 1986, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 83:9373-9377; Turner et al., 1987, J. Am. Chem. Soc. 109:3783-3785). Procenat komplementarnosti ukazuje na procenat neprekidnih ostataka u molekulu nukleinske kiseline koji mogu formirati vodonične veze (npr. Votson-Krik bazno sparivanje) sa drugom sekvencom nukleinske kiseline (npr.5, 6, 7, 8, 9, ili 10 nukleotida od ukupno 10 nukleotida u prvom oligonukleotidu koji je bazno sparen sa drugom sekvencom nukleinske kiseline koja ima 10 nukleotida predstavlja 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, i 100% komplementarnosti respektivno). "Savršeno komplementaran" znači da će se svi neprekidni ostaci sekvence nukleinske kiseline povezati vodoničnom vezom sa istim brojem neprekidnih ostataka u drugoj sekvenci nukleinske kiseline. U jednom primeru izvođenja, dsRNA molekul iz pronalaska sadrži 19 do 30 (npr. 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, ili 30 ili više) nukleotida koji su komplementarni sa jednim ili više molekula target nukleinske kiseline ili njegovimm delom.

[0153] Kao što je ovde objavljeno, dsNA, npr. DsiRNA ili siRNA, koja ima sekvencu "dovoljno komplementarnu" sa sekvencom target RNK ili cDNA (npr. iRNK glikolat oksidaze (HAO1)) znači da dsNA ima sekvencu dovoljnu da pokrene destrukciju target RNK (gde je cDNA sekvenca navedena, RNK sekvenca koja odgovara navedenoj cDNA sekvenci) pomoću RNAi mašinerije (npr. RISC kompleksa) ili procesa. Na primer, dsNA koja je "dovoljno komplementarna" sa sekvencom target RNK ili cDNK da pokrene destrukciju target RNK pomoću RNAi mašinerije ili procesa može se identifikovati kao dsNA koja uzrokuje detektabilno redukovanje nivoa target RNK u prikladnom testu dsNA aktivnosti (npr. in vitro test kao što je opisano u Primeru 2 ispod), ili, u dodatnim primerima, dsNA koja je dovoljno

4

komplementarna sa sekvencom target RNK ili cDNA da pokrene destrukciju target RNK pomoću RNAi mašinerije ili procesa može se identifikovati kao dsNA koja proizvodi najmanje 5%, najmanje 10%, najmanje 15%, najmanje 20%, najmanje 25%, najmanje 30%, najmanje 35%, najmanje 40%, najmanje 45%, najmanje 50%, najmanje 55%, najmanje 60%, najmanje 65%, najmanje 70%, najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98% ili najmanje 99% redukovanja nivoa target RNK u prikladnom testu dsNA aktivnosti. U dopunskim primerima, dsNA koja je dovoljno komplementarna sa sekvencom target RNK ili cDNA da pokrene destrukciju target RNK pomoću RNAi mašinerije ili procesa može se identifikovati na osnovu procene trajanja određenog nivoa inhibitorne aktivnosti u odnosu na nivoe target RNK ili proteina u ćeliji ili organizmu. Na primer, dsNA koja je dovoljno komplementarna sa sekvencom target RNK ili cDNA da pokrene destrukciju target RNK pomoću RNAi mašinerije ili procesa može se identifikovati kao dsNA sposobna da redukuje nivoe target iRNK za najmanje 20% najmanje 48 sati posle primene navedene dsNA ćeliji ili organizmu. Poželjno, dsNA koja je dovoljno komplementarna sa sekvencom target RNK ili cDNK da pokrene destrukciju target RNK pomoću RNAi mašinerije ili procesa identifikuje se kao dsNA sposobna da redukuje nivoe target iRNK za najmanje 40% najmanje 72 sata posle primene navedene dsNA ćeliji ili organizmu, za najmanje 40% najmanje četiri, pet ili sedam dana posle primene navedene dsNA ćeliji ili organizmu, za najmanje 50% najmanje 48 sati posle primene navedene dsNA ćeliji ili organizmu, za najmanje 50% najmanje 72 sata posle primene navedene dsNA ćeliji ili organizmu, za najmanje 50% najmanje četiri, pet ili sedam dana posle primene navedene dsNA ćeliji ili organizamu, za najmanje 80% najmanje 48 sati posle primene navedene dsNA ćeliji ili organizmu, za najmanje 80% najmanje 72 sata posle primene navedene dsNA ćeliji ili organizmu, ili za najmanje 80% najmanje četiri, pet ili sedam dana posle primene navedene dsNA ćeliji ili organizmu.

[0154] U određenim primerima izvođenja, nukleinska kiselina iz pronalaska (npr. DsiRNA ili siRNA) poseduje sekvencu "dovoljno komplementarnu da hibridizuje" sa sekvencom target RNK ili cDNK, time postižući inhibitorni efekat na target RNK. Hibridizacija, i uslovi dostupni za određivanje da li je jedna nukleinska kiselina dovoljno komplementarna sa drugom nukleinskom kiselinom da omogući da dve sekvence hibridizuju, detaljnije su opisani ispod.

[0155] Kao što će biti jasno prosečnom stručnjaku u ovoj oblasti, "dovoljno komplementarno"(za razliku od, npr. "100% komplementarno") omogućava da postoji jedna ili više neusklađenosti između dsNA iz objave i sekvence target RNK ili cDNK (npr. iRNK glikolat oksidaze (HAO1)), pod uslovom da dsNA poseduje komplementarnost dovoljnu da pokrene destrukciju target RNK pomoću RNAi mašinerije (npr. RISC kompleksa) ili procesa. U određenim primerima izvođenja, "dovoljno komplementarna" dsNA iz objave može da nosi jednu, dve, tri ili čak četiri ili više neusklađenosti između dsNA sekvence i sekvence target RNK ili cDNK (npr. u određenim takvim primerima izvođenja, antisens lanac dsRNA nosi jednu, dve, tri, četiri, pet ili čak šest ili više neusklađenosti kada se poravna sa sekvencom target RNK ili cDNA radi maksimalne komplementarnosti). Dopunsko razmatranje poželjne lokacije takvih neusklađenosti unutar određenih dsRNA iz trenutne objave detaljnije se razmatra ispod.

[0156] U jednom primeru izvođenja, dsRNA molekuli iz objave koji smanjuju ili redukuju ekspresiju gena glikolat oksidaze upotrebljavaju se za lečenje, prevenciju ili redukovanje bolesti ili poremećaja povezanih sa glikolat oksidazom (npr. PHI) kod subjekta ili organizma.

[0157] U jednom primeru izvođenja predmetnog pronalaska, svaka sekvenca DsiRNA molekula iz pronalaska je nezavisno dužine 25 do 35 nukleotida, u specifičnim primerima izvođenja je dužine 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34 ili 35 nukleotida. U sledećem primeru izvođenja, DsiRNA dupleksi iz pronalaska nezavisno sadrže 25 do 30 baznih parova (npr. 25, 26, 27, 28, 29, ili 30). U sledećem primeru izvođenja, jedan ili više lanaca DsiRNA molekula iz pronalaska nezavisno sadrže 19 do 35 nukleotida (npr.19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34 ili 35) koji su komplementarni sa molekulom target (glikolat oksidaza) nukleinske kiseline. U određenim primerima izvođenja, DsiRNA molekul iz objave poseduje dupleksovane nukleotide dužine između 25 i 66 nukleotida, opciono između 25 i 49 nukleotida (dužine npr.25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48 ili 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66 nukleotida; opciono, svi takvi nukleotidi se bazno sparuju sa srodnim nukleotidima naspramnog lanca). U povezanim primerima izvođenja, dsNA iz objave poseduje lance koji su, nezavisno, dužine između 19 i 66 nukleotida, opciono dužine između 25 i 53 nukleotida, npr dužine. 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48 ili 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66 nukleotida. U određenim primerima izvođenja, dužina jednog lanca je 19-35 nukleotida, dok je dužina drugog lanca 30-66 nukleotida i najmanje jedan lanac ima 5ʼ viseći kraj dužine od najmanje 5 nukleotida u odnosu na drugi lanac. U određenim povezanim primerima izvođenja, 3ʼ kraj prvog lanca i 5ʼ kraj drugog lanca formiraju strukturu koja je tupi kraj ili 3ʼ viseći kraj od 1-6 nukleotida, dok 5ʼ kraj prvog lanca formira viseći kraj sa 5-35 nukleotida u odnosu na 3ʼ kraj drugog lanca. Opciono, između jednog i svih nukleotida visećeg kraja sa 5-35 nukleotida su modifikovani nukleotidi (opciono, dezoksiribonukleotidi i/ili modifikovani ribonukleotidi).

[0158] U nekim primerima izvođenja, dsNA iz pronalaska ima prvi ili drugi lanac koja ima najmanje 8 neprekidnih ribonukleotida. U određenim primerima izvođenja, dsNA iz pronalaska ima 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 ili više (npr.24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 26, ili više, do pune dužine lanca) ribonukleotida, opciono uključujući modifikovane ribonukleotide (2ʼ-O-metil ribonukleotide, fosforotioatne veze, itd.). U određenim primerima izvođenja, ribonukleotidi ili modifikovani ribonukleotidi su neprekidni.

[0159] U određenim primerima izvođenja pronalaska, dsNA koje sadrže tetrapetlju i modifikovani nukleotid razmatraju se kao što je opisano, npr. u US 2011/0288147. U određenim takvim primerima izvođenja, dsNA iz pronalaska poseduje prvi lanac i drugi lanac, gde prvi lanac i drugi lanac formiraju dupleks region dužine 19-25 nukleotida, pri čemu prvi lanac sadrži 3ʼ region koji se proteže izvan dupleks regiona prvog lanca-drugog lanca i sadrži tetrapetlju, i dsNA sadrži diskontinuitet između 3ʼ terminusa prvog lanca i 5ʼ terminusa drugog lanca. Opciono, diskontinuitet je pozicioniran na projektovanom mestu Dicer isecanja dsNA koja sadrži tetrapetlju. Razmatra se da, kao i za bilo koji od drugih dupleksovanih oligonukleotida iz pronalaska, dupleksi koji sadrže tetrapetlju iz pronalaska mogu posedovati bilo koji opseg modifikacija koje su ovde objavljene ili na drugi način poznate u struci, uključujući, npr. 2ʼ-O-metil, 2ʼ-fluoro, bazni inverter, GalNAc grupe, itd.

[0160] U određenim primerima izvođenja predmetne objave, dsNA koja sadrži prvi lanac i drugi lanac, svaki lanac, nezavisno, ima 5ʼ terminus i 3ʼ terminus, i imaju, nezavisno, respektivne dužine lanca od 25-53 nukleotida, je dovoljno visoko modifikovana (npr. najmanje 10% ili više, najmanje 20% ili više, najmanje 30% ili više, najmanje 40% ili više, najmanje 50% ili više, najmanje 60% ili više, najmanje 70% ili više, najmanje 80% ili više, najmanje 90% ili više, najmanje 95% ili više ostataka jednog i/ili oba lanca su modifikovani tako da je sprečeno dicer isecanje dsNA (opciono, modifikovani ostaci se javljaju na i/ili su postavljeni bočno od jednog ili svih predviđenih mesta dicer isecanja dsNA). Takve ne-dicer- isečene dsNA zadržavaju aktivnost inhibicije glikolat oksidaze (HAO1) i opciono se isecaju ne-dicer nukleazama da daju, npr. dsNA dužine lanca 15-30, ili u posebnom primerima izvođenja, 19-23 nukleotida sposobne da inhibiraju glikolat oksidazu (HAO1) u sisarskoj ćeliji. U određenim povezanim primerima izvođenja, dsNA koje poseduju dovoljno opsežnu modifikaciju da blokiraju dicer isecanje takvih dsNA opciono poseduju regione nemodifikovanih nukleotidnih ostataka (npr. jedan ili dva ili više uzastopnih nukleotida, koji formiraju "razmak" ili "prozor" u obrascu modifikacije) koji omogućavaju i/ili promovišu isecanje takvih dsNA pomoću ne-Dicer nukleaza. U drugim primerima izvođenja, Dicer-isečene dsNA iz objave mogu uključivati opsežne obrasce modifikacije koji poseduju takve "prozore" ili "razmake" u modifikaciji tako da se Dicer isecanje poželjno javlja na takvim mestima (u poređenju sa opsežno modifikovanim regionima unutar takvih dsNA).

[0161] U određenim primerima izvođenja predmetne objave, obezbeđen je oligonukleotid (opciono, kao slobodni antisens oligonukleotid ili kao oligonukleotid dvolančane ili druge višelančane strukture) koji uključuje sekvencu komplementarnu sa HAO1 ciljem kao što je

4

opisano ovde na drugom mestu i koji je dužine 15 do 80 nukleotida, npr. u specifičnim primerima izvođenja dužine 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79 ili 80 nukleotida.

[0162] U određenim dopunskim primerima izvođenja predmetne objave, svaki oligonukleotid DsiRNA molekula iz objave nezavisno je dužine 25 do 53 nukleotida, u specifičnim primerima izvođenja dužine 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52 ili 53 nukleotida. Za DsiRNA koje poseduju lanac koji premašuje dužinu od 30 nukleotida, dostupne strukture uključuju one gde samo jedan lanac premašuje dužinu od 30 nukleotida (videti, npr. US 8,349,809), ili one gde oba lanca premašuju dužinu od 30 nukleotida (videti, npr. WO 2010/080129). Stabilizujuće modifikacije (npr. 2ʼ-O-metil, fosforotioat, dezoksiribonukleotidi, uključujući dNTP bazne parove, 2ʼ-F, itd.) mogu se inkorporisati unutar bilo koje dvolančane nukleinske kiseline iz pronalaska, i mogu se upotrebiti posebno, i opciono u obilju, naročito unutar DsiRNA koje poseduju jedan ili oba lanca dužine preko 30 nukleotida. Dok vodič lanac dvolančane nukleinske kiseline iz pronalaska mora da poseduje sekvencu od, npr. 15, 16, 17, 18 ili 19 nukleotida koji su komplementarni sa target RNK (npr. iRNK), dopunska sekvenca(e) vodič lanca ne mora biti komplementarna sa target RNK. Krajnje strukture dvolančanih nukleinskih kiselina koje poseduju najmanje dužinu jednog lanca koja premašuje 30 nukleotida mogu takođe da se menjaju dok nastavljaju da daju funkcionalne dsNA- npr. 5ʼ kraj vodič lanca i 3ʼ kraj putnik lanca mogu formirati 5ʼ-viseći kraj, tupi kraj ili 3ʼ viseći kraj (za određene dsNA, npr. "jednolančano produžene" dsNA, dužina takvog 5ʼ ili 3ʼ visećeg kraja može biti 1-4, 1-5, 1-6, 1-10, 1-15, 1-20 ili čak 1-25 ili više nukleotida); slično, 3ʼ kraj vodič lanca i 5ʼ kraj putnik lanca mogu formirati 5ʼ-viseći kraj, tupi kraj ili 3ʼ viseći kraj (za određene dsNA, npr. "jednolančano produžene" dsNA, dužina takvog 5ʼ ili 3ʼ visećeg kraja može biti 1-4, 1-5, 1-6, 1-10, 1-15, 1-20 ili čak 1-25 ili više nukleotida). U određenim primerima izvođenja, 5ʼ kraj putnik lanca uključuje 5ʼ-viseći kraj u odnosu na 3ʼ kraj vodič lanca, tako da postoji produžetak jednog lanca od jedan do petnaest ili više nukleotida. Opciono, takvi produžeci jednog lanca dsNA iz pronalaska (bilo da su prisutni na putnik ili na vodič lancu) mogu se modifikovati, npr. sa fosforotioatom (PS), 2ʼ-F, 2ʼ-O-metilom i/ili drugim oblicima modifikacija koje su ovde razmatrane ili poznate u struci, uključujući konjugaciju za, npr. GalNAc grupe, invertovane abazične ostatke, itd. U nekim primerima izvođenja, vodič lanac jednolančanog produženog dupleksa iz objave je dužine između 35 i 50 nukleotida, dok dupleks predstavlja jednolančani nastavak koji je dužine od sedam do dvadeset nukleotida. U određenim primerima izvođenja, vodič lanac dupleksa je dužine između 37 i 42 nukleotida i dupleks poseduje 5ʼ jednolančani viseći kraj putnik lanca koji je dužine približno pet do petnaest jednolančanih nukleotida (opciono dužine od, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, ili 14 nukleotida). U povezanim primerima izvođenja, putnik lanac dupleksa je dužine oko 25 do oko 30 nukleotida. U određenim primerima izvođenja, produženi region dupleksa može opciono biti opsežno modifikovan, npr. sa jednim ili više od 2ʼ-O-metil, 2ʼ-Fluoro, GalNAc grupama, fosforotioat internukleotidnim vezama, invertovanim abazičnim ostacima, itd. U određenim primerima izvođenja, dužina putnik lanca je 31-49 nukleotida dok je dužina vodič lanca 31-53 nukleotida, opciono dok 5ʼ kraj vodič lanca formira tupi kraj (opciono, bazno sparen tupi kraj) sa 3ʼ krajem putnik lanca, opciono, sa 3ʼ krajem vodič lanca i 5ʼ krajem putnik lanca formirajući 3ʼ viseći kraj dužine 1-4 nukleotida. Primeri struktura "produženih" Dicer supstrata su izneti, npr. u US 2010/01739748,513,207 i US 8,349,809. U određenim primerima izvođenja, jedan ili više lanaca dsNA molekula iz pronalaska nezavisno sadrže 19 do 35 nukleotida (npr.19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34 ili 35) koji su komplementarni sa molekulom target (glikolat oksidaza) nukleinske kiseline. U određenim primerima izvođenja, DsiRNA molekul iz objave poseduje dupleksovane nukleotide dužine između 25 i 49 nukleotida (npr. dužine 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48 ili 49 nukleotida; opciono, svi takvi nukleotidi se bazno sparuju sa srodnim nukleotidima naspramnog lanca).

[0163] U dodatnom primeru izvođenja predmetne objave, svaki oligonukleotid DsiRNA molekula iz objave nezavisno je dužine 19 do 66 nukleotida, u specifičnim primerima izvođenja dužine 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65 ili 66 nukleotida. Za dsNA koje poseduju lanac koji premašuje dužinu od 30 nukleotida, dostupne strukture uključuju one gde samo jedan lanac premašuje dužinu od 30 nukleotida (videti, npr. US 8,349,809, gde primer dvolančane nukleinske kiseline poseduje prvi oligonukleotidni lanac koji ima 5ʼ terminus i 3ʼ terminus i drugi oligonukleotidni lanac koji ima 5ʼ terminus i 3ʼ terminus, gde svaki od 5ʼ terminusa ima 5ʼ terminalni nukleotid i svaki od 3ʼ terminusa ima 3ʼ terminalni nukleotid, gde je prvi lanac (ili drugi lanac) dužine 25-30 nukleotidnih ostataka, gde počevši od 5ʼ terminalnog nukleotida (pozicija 1) pozicije 1 do 23 prvog lanca (ili drugog lanca) uključuju najmanje 8 ribonukleotida; drugi lanac (ili prvi lanac) je dužine 36-66 nukleotidnih ostataka i, počevši od 3ʼ terminalnog nukleotida, uključuje najmanje 8 ribonukleotida u pozicijama sparenim sa pozicijama 1-23 prvog lanca kako bi se formirao dupleks; gde najmanje 3ʼ terminalni nukleotid drugog lanca (ili prvog lanca) nije sparen sa prvim lancem (ili drugim lancem), i do 6 uzastopnih 3ʼ terminalnih nukleotida nije spareno sa prvim lancem (ili drugim lancem), time formirajući 3ʼ jednolančani viseći kraj od 1-6 nukleotida; gde 5ʼ terminus drugog lanca (ili prvog lanca) uključuje 10-30 uzaspopnih nukleotida koji nisu spareni sa prvim lancem (ili drugim lancem), time formirajući jednolančani 5ʼ viseći kraj od 10-30 nukleotidna; gde su

4

najmanje 5ʼ terminalni i 3ʼ terminalni nukleotidi prvog lanca (ili drugog lanca) bazno spareni sa nukleotidima drugog lanca (ili prvog lanca) kada su prvi i drugi lanac poravnati radi maksimalne komplementarnosti, time formirajući suštinski dupleksovan region između prvog i drugog lanca; i drugi lanac je dovoljno komplementaran sa target RNK duž najmanje 19 ribonukleotida dužine drugog lanca da redukuje ekspresiju target gena kada je dvolančana nukleinska kiselina uvedena u sisarsku ćeliju), ili one gde oba lanca premašuju dužinu od 30 nukleotida (videti, npr. US 8,513,207, gde primer dvolančane nukleinske kiseline (dsNA) poseduje prvi oligonukleotidni lanac koji ima 5ʼ terminus i 3ʼ terminus i drugi oligonukleotidni lanac koji ima 5ʼ terminus i 3ʼ terminus, gde je prvi lanac dužine 31 do 49 nukleotidnih ostataka, gde su počevši od prvog nukleotida (pozicija 1) na 5ʼ terminusu prvog lanca, pozicije 1 do 23 prvog lanca ribonukleotidi; drugi lanac je dužine 31 do 53 nukleotidnih ostataka i uključuje 23 uzastopna ribonukleotida koji se bazno sparuju sa ribonukleotidima sa pozicija 1 do 23 prvog lanca kako bi se formirao dupleks; 5ʼ terminus prvog lanca i 3ʼ terminus navedenog drugog lanca formiraju tupi kraj ili 3ʼ viseći kraj od 1-4 nukleotida; 3ʼ terminus prvog lanca i 5ʼ terminus navedenog drugog lanca formiraju dupleksovani tupi kraj, 5ʼ viseći kraj ili 3ʼ viseći kraj; opciono, najmanje jedna od pozicija 24 do 3ʼ terminalnog nukleotidnog ostatka prvog lanca je dezoksiribonukleotid, opciono, koji se bazno sparuje sa dezoksiribonukleotidom navedenog drugog lanca; i drugi lanac je dovoljno komplementaran sa target RNK duž najmanje 19 ribonukleotida dužine drugog lanca da redukuje ekspresiju target gena kada je dvolančana nukleinska kiselina uvedena u sisarsku ćeliju).

[0164] U određenim primerima izvođenja, aktivna dsNA iz objave može da poseduje 5ʼ viseći kraj prvog lanca (opciono, putnik lanca) u odnosu na drugi lanac (opciono, vodič lanac) dužine 2-50 nukleotida (npr.2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50) ili više. U povezanim primerima izvođenja, dupleks region formiran od strane prvog i drugog lanca takve dsNA je dužine 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 ili više baznih parova. "Produženi" region 5ʼ visećeg kraja prvog lanca je opciono modifikovan na jednom ili više ostataka (opciono, na naizmeničnim ostacima, svim ostacima, ili bilo kom drugom izboru ostataka).

[0165] U određenim primerima izvođenja, aktivna dsNA iz objave može da poseduje 3ʼ viseći kraj prvog lanca (opciono, putnik lanca) u odnosu na drugi lanac (opciono, vodič lanac) dužine 2-50 nukleotida (npr.2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50) ili više. U povezanim primerima izvođenja, dupleks region formiran od strane prvog i drugog lanca takve dsNA je dužine 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 ili više baznih parova.

4

"Produženi" region 3ʼ visećeg kraja prvog lanca je opciono modifikovan na jednom ili više ostataka (opciono, na naizmeničnim ostacima, svim ostacima, ili bilo kom drugom izboru ostataka).

[0166] U dopunskim primerima izvođenja, aktivna dsNA iz objave može da poseduje 5ʼ viseći kraj drugog lanca (opciono, vodič lanca) u odnosu na prvi lanac (opciono, putnik lanac) dužine 2-50 nukleotida (npr.2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50) ili više. U povezanim primerima izvođenja, dupleks region formiran od strane prvog i drugog lanca takve dsNA je dužine 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 ili više baznih parova. "Produženi" region 5ʼ visećeg kraja drugog lanca je opciono modifikovan na jednom ili više ostataka (opciono, na naizmeničnim ostacima, svim ostacima, ili bilo kom drugom izboru ostataka).

[0167] U dodatnim primerima izvođenja, aktivna dsNA iz objave može da poseduje 3ʼ viseći kraj drugog lanca (opciono, vodič lanca) u odnosu na prvi lanac (opciono, putnik lanac) dužine 2-50 nukleotida (npr.2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50) ili više. U povezanim primerima izvođenja, dupleks region formiran od strane prvog i drugog lanca takve dsNA je dužine 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 ili više baznih parova. "Produženi" region 3ʼ visećeg kraja drugog lanca je opciono modifikovan na jednom ili više ostataka (opciono, na naizmeničnim ostacima, svim ostacima, ili bilo kom drugom izboru ostataka).

[0168] U sledećem primeru izvođenja predmetnog pronalaska, svaka sekvenca DsiRNA molekula iz pronalaska je nezavisno dužine 25 do 35 nukleotida, u specifičnim primerima izvođenja dužine 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34 ili 35 nukleotida. U sledećem primeru izvođenja, DsiRNA dupleksi iz pronalaska nezavisno sadrže 25 do 30 baznih parova (npr.25, 26, 27, 28, 29, ili 30). U sledećem primeru izvođenja, jedan ili više lanaca DsiRNA molekula iz pronalaska nezavisno sadrže 19 do 35 nukleotida (npr.19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34 ili 35) koji su komplementarni sa molekulom target (HAO1) nukleinske kiseline. U određenim primerima izvođenja, DsiRNA molekul iz pronalaska poseduje dupleksovane nukleotide dužine između 25 i 34 nukleotida (npr. 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33 ili 34 nukleotida; opciono, svi takvi nukleotidi se bazno sparuju sa srodnim nukleotidima naspramnog lanca). (Primeri DsiRNA molekula iz pronalaska pokazani su na Slici 1, i ispod).

[0169] U određenim primerima izvođenja, najmanje 10%, najmanje 20%, najmanje 30%, najmanje 35%, najmanje 40%, najmanje 45%, najmanje 50%, najmanje 55%, najmanje 60%, najmanje 65%, najmanje 70%, najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%,

4

najmanje 95% ili više nukleotidnih ostataka nukleinske kiseline iz trenutnog pronalaska su modifikovani ostaci. Za dsNA iz pronalaska, najmanje 10%, najmanje 20%, najmanje 30%, najmanje 35%, najmanje 40%, najmanje 45%, najmanje 50%, najmanje 55%, najmanje 60%, najmanje 65%, najmanje 70%, najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95% ili više nukleotidnih ostataka prvog lanca su modifikovani ostaci. Dopunski i/ili alternativno za dsNA iz pronalaska, najmanje 10%, najmanje 20%, najmanje 30%, najmanje 35%, najmanje 40%, najmanje 45%, najmanje 50%, najmanje 55 %, najmanje 60%, najmanje 65%, najmanje 70%, najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95% ili više nukleotidnih ostataka drugog lanca su modifikovani ostaci. Za dsNA iz pronalaska razmatraju se modifikacije i dupleksnih (dvolančanih) regiona i regiona visećeg kraja (jednolančanih). Stoga, u određenim primerima izvođenja, najmanje 10%, najmanje 20%, najmanje 30%, najmanje 35%, najmanje 40%, najmanje 45%, najmanje 50%, najmanje 55%, najmanje 60%, najmanje 65%, najmanje 70%, najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95% ili više (npr. svi) nukleotidni ostaci dupleksa su modifikovani ostaci. Dopunski i/ili alternativno, najmanje 10%, najmanje 20%, najmanje 30%, najmanje 35%, najmanje 40%, najmanje 45%, najmanje 50%, najmanje 55%, najmanje 60%, najmanje 65%, najmanje 70%, najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95% ili više (npr. svi) nukleotidni ostaci visećeg kraja jednog ili oba lanca su modifikovani ostaci. Opciono, modifikacije dsNA iz pronalaska ne uključuju invertovanu abazičnu (npr. invertovanu dezoksi abazičnu) ili invertovanu dT kraj-zaštitnu grupu. Alternativno, dsNA iz pronalaska uključuje terminalnu kapa grupu (npr. invertovanu dezoksi abazičnu i/ili invertovanu dT krajzaštitnu grupu). Opciono, takva terminalna kapa grupa je locirana na 5ʼ kraju, na 3ʼ kraju, ili i na 5ʼ kraju i na 3ʼ kraju prvog lanca, drugog lanca, ili i prvog i drugog lanca.

[0170] Kao što se ovde upotrebljava, "ćelija" se upotrebljava u svom uobičajenom biološkom smislu, i ne označava ceo višećelijski organizam, npr. specifično ne označava čoveka. Ćelija može biti prisutna u organizmu, npr. ptica, biljaka i sisara kao što su ljudi, krave, ovce, bezrepi majmuni, majmuni, svinje, psi, i mačke. Ćelija može biti prokariotska (npr. bakterijska ćelija) ili eukariotska (npr. sisarska ili biljna ćelija). Ćelija može biti somatskog ili germinativnog porekla, totipotentna ili pluripotentna, da se deli ili da se ne deli. Ćelija takođe može biti poreklom od ili može sadržati gamet ili embrion, matičnu ćeliju, ili potpuno diferenciranu ćeliju. Unutar određenih aspekata, termin "ćelija" označava specifično sisarske ćelije, kao što su humane ćelije, koje sadrže jedan ili više izolovanih dsRNA molekula iz predmetne objave. U posebnim aspektima, ćelija obrađuje dsRNA ili molekule koji sadrže dsRNA, rezultujući RNK interferencijom target nukleinskih kiselina, i sadrži proteine i proteinske komplekse potrebne za RNAi, npr. Dicer i RISC.

4

[0171] U određenim primerima izvođenja, dsRNA iz pronalaska su Dicer supstrat siRNA ("DsiRNA"). DsiRNA mogu posedovati određene prednosti u poređenju sa inhibitornim nukleinskim kiselinama koje nisu dicer supstrati ("ne-DsiRNA"). Takve prednosti uključuju, ali nisu ograničene na, poboljšano trajanje efekta DsiRNA u odnosu na ne-DsiRNA, kao i poboljšanu inhibitornu aktivnost DsiRNA u poređenju sa ne-DsiRNA (npr. 19-23mer siRNA) kada je svaka inhibitorna nukleinska kiselina pogodno formulisana i procenjena za inhibitornu aktivnost u sisarskoj ćeliji pri istoj koncentraciji (u ovom potonjem scenariju, DsiRNA bi bila identifikovana kao potentnija nego ne-DsiRNA). Detekcija poboljšane potentnosti DsiRNA u odnosu na ne-DsiRNA često se najlakše postiže pri formulisanoj koncentraciji (npr. koncentracija transfekcije dsRNA) koja rezultuje sa DsiRNA koja izaziva približno 30-70% nokdaun aktivnosti na target RNK (npr. iRNK). Za aktivne DsiRNA, takvi nivoi nokdaun aktivnosti se najčešće postižu pri in vitro koncentracijama transfekcije DsiRNA sisarske ćelije od 1 nM ili manje kao što je pogodno formulisana, i u određenim slučajevima se uočava pri koncentracijama transfekcije DsiRNA od 200 pM ili manje, 100 pM ili manje, 50 pM ili manje, 20 pM ili manje, 10 pM ili manje, 5 pM ili manje, ili čak 1 pM ili manje. Zaista, zbog promenljivosti precizne koncentracije među DsiRNA pri kojoj se uočava 30-70% nokdaun target RNK, konstrukcija IC50krive putem procene inhibitorne aktivnosti DsiRNA i ne-DsiRNA u opsegu efikasnih koncentracija je poželjan postupak za detekciju poboljšane potentnosti DsiRNA u odnosu na ne-DsiRNA inhibitorni agens.

[0172] U određenim primerima izvođenja, DsiRNA (u stanju u kakvom je prvobitno formirana, pre dicer isecanja) je potentnija u redukovanju ekspresije target gena glikolat oksidaze u sisarskoj ćeliji od sekvence od 19, 20, 21, 22 ili 23 baznih parova sadržanih unutar nje. U određenim takvim primerima izvođenja, DsiRNA pre dicer isecanja je potentnija od 19-21mer sadržanih unutar nje. Opciono, DsiRNA pre dicer isecanja je potentnija od dupleksa od 19 baznih parova sadržanog unutar nje koji je sintetisan sa simetričnim dTdT visećim krajevima (time formirajući siRNA koja poseduje lance dužine od 21 nukleotida koji imaju dTdT viseće krajeve). U određenim primerima izvođenja, DsiRNA je potentnija od 19-23mer siRNA (npr. dupleks od 19 baznih parova sa dTdT visećim krajevima) koja cilja najmanje 19 nukleotida od target sekvence od 21 nukleotida koja je navedena za DsiRNA iz pronalaska (bez želje da budu vezani teorijom, identitet takvog target mesta za DsiRNA identifikuje se putem identifikacije Ago2 mesta isecanja za DsiRNA; nakon što se za DsiRNA odredi Ago2 mesta isecanja DsiRNA, identifikacija Ago2 mesta isecanja može se izvršiti za bilo koju drugu inhibitornu dsRNA i ta Ago2 mesta isecanja mogu se poravnati, time određujući poravnanje projektovanih target nukleotidnih sekvenci za više dsRNA). U određenim povezanim primerima izvođenja, DsiRNA je potentnija od 19-23mer siRNA koja cilja najmanje 20 nukleotida od target sekvence od 21

4

nukleotida koja je navedena za DsiRNA iz pronalaska. Opciono, DsiRNA je potentnija od 19-23mer siRNA koja cilja istu target sekvencu od 21 nukleotida koja je navedena za DsiRNA iz pronalaska. U određenim primerima izvođenja, DsiRNA je potentnija od bilo koje 21mer siRNA koja cilja istu target sekvencu od 21 nukleotida koja je navedena za DsiRNA iz pronalaska. Opciono, DsiRNA je potentnija od bilo koje 21 ili 22mer siRNA koja cilja istu target sekvencu od 21 nukleotida koja je navedena za DsiRNA iz pronalaska. U određenim primerima izvođenja, DsiRNA je potentnija od bilo koje 21, 22 ili 23mer siRNA koja cilja istu target sekvencu od 21 nukleotida koja je navedena za DsiRNA iz pronalaska. Kao što je napomenuto iznad, takve procene potentnosti se najefikasnije izvode na dsRNA koje su odgovarajuće formulisane (npr. formulisane sa prikladnim reagensom za transfekciju) pri koncentraciji od 1 nM ili manje. Opciono, IC50procena se izvodi kako bi se procenila aktivnost u opsegu efikasnih inhibitornih koncentracija, time omogućavajući robustno poređenje relativnih potentnosti tako testiranih dsRNA.

[0173] dsRNA molekuli iz pronalaska dodaju se direktno, ili mogu biti kompleksovani sa lipidima (npr. katjonskim lipidima), upakovani unutar lipozoma, ili na drugi način isporučeni u target ćelije ili tkiva. Nukleinska kiselina ili kompleksi nukleinske kiseline mogu se lokalno primenjivati u relevantnim tkivima ex vivo, ili in vivo direktnom dermalnom primenom, transdermalnom primenom, ili injekcijom, sa ili bez njihove inkorporacije u biopolimere. U posebnim primerima izvođenja, molekuli nukleinske kiseline iz objave sadrže sekvence pokazane na Slici 1, i dole navedenim primerima struktura. Primeri takvih molekula nukleinske kiseline suštinski se sastoje od sekvenci definisanih na ovim slikama i primerima struktura. Osim toga, tamo gde su takvi agensi modifikovani u skladu sa dole navedenim opisom obrasca modifikacije DsiRNA agenasa, hemijski modifikovani oblici konstrukata opisani na Slici 1, i dole navedeni primeri struktura mogu se upotrebljavati u svim upotrebama opisanim za DsiRNA agense sa Slike 1, i dole navedene primere struktura.

[0174] U sledećem aspektu, objava obezbeđuje sisarske ćelije koje sadrže jedan ili više dsRNA molekula iz ove objave. Jedan ili više dsRNA molekula mogu nezavisno da se ciljaju na ista ili različita mesta.

[0175] Pod "RNK" se misli na molekul koji sadrži najmanje jedan, a poželjno najmanje 4, 8 i 12 ribonukleotidnih ostataka. Najmanje 4, 8 ili 12 RNK ostataka mogu biti neprekidni. Pod "ribonukleotidom" se misli na nukleotid sa hidroksilnom grupom na 2ʼ poziciji β-D-ribofuranozne grupe. Termini uključuju dvolančanu RNK, jednolančanu RNK, izolovanu RNK, kao što su delimično prečišćena RNK, suštinski čista RNK, sintetička RNK, rekombinantno proizvedena RNK, kao i izmenjena RNK koja se razlikuje od RNK koja se javlja u prirodi po adiciji, deleciji, supstituciji i/ili izmeni jednog ili više nukleotida. Takve izmene mogu da uključuju adiciju nenukleotidnog materijala, kao što je na kraj(eve) dsRNA ili unutra, na primer na jednom ili više nukleotida RNK. Nukleotidi u RNK molekulima iz trenutnog pronalaska mogu takođe da sadrže nestandardne nukleotide, kao što su nukleotidi koji se ne javljaju u prirodi ili hemijski sintetisani nukleotidi ili dezoksinukleotidi. Ove izmenjene RNK mogu se označiti kao analozi ili analozi RNK koja se javlja u prirodi.

[0176] Pod "subjektom" se misli na organizam koji je donor ili recipient eksplantiranih ćelija ili samih ćelija. "Subjekt" takođe označava organizam kome se mogu primenjivati dsRNA agensi iz pronalaska. Subjekt može biti sisar ili sisarska ćelija, uključujući čoveka ili humane ćelije.

[0177] Fraza "farmaceutski prihvatljiv nosač" označava nosač za primenu terapijskog agensa. Primeri nosača uključuju fiziološki rastvor, puferisani fiziološki rastvor, dekstrozu, vodu, glicerol, etanol, i njihove kombinacije. Za lekove za oralnu primenu, farmaceutski prihvatljivi nosači uključuju, ali nisu ograničeni na farmaceutski prihvatljive ekscipijense kao što su inertni razblaživači, agensi za dezintegraciju, agensi za vezivanje, agensi za lubrikaciju, zaslađivači, agensi za aromatizaciju, agensi za bojenje i konzervansi. Pogodni inertni razblaživači uključuju natrijum i kalcijum karbonat, natrijum i kalcijum fosfat, i laktozu, dok su kukuruzni skrob i alginska kiselina pogodni agensi za dezintegraciju. Agensi za vezivanje mogu da uključuju skrob i želatin, dok će agens za lubrikaciju, ukoliko je prisutan, generalno biti magnezijum stearat, stearinska kiselina ili talk. Po želji, tablete mogu biti obložene materijalom kao što je gliceril monostearat ili gliceril distearat, kako bi se odložila apsorpcija u gastrointestinalnom traktu. Farmaceutski prihvatljiv nosač objavljenih dsRNA kompozicija može biti micelarne strukture, kao što su lipozomi, kapsidi, kapsoidi, polimerne nanokapsule, ili polimerne mikrokapsule.

[0178] Polimerne nanokapsule ili mikrokapsule olakšavaju transport i oslobađanje kapsulirane ili vezane dsRNA u ćeliju. Oni uključuju polimerne i monomerne materijale, naročito uključujući polibutilcijanoakrilat. Objavljeni su sažetak materijala i postupci izrade (videti Kreuter, 1991). Polimerni materijali koji se formiraju od monomernih i/ili oligomernih prekursora u koraku polimerizacije/generisanja nanočestica su per se poznati iz stanja tehnike, kao i molekulske težine i raspodela molekulske težine polimernog materijala koji osoba stručna u oblasti proizvodnje nanočestica može pogodno odabrati u skladu sa uobičajenom veštinom.

[0179] Različite metodologije iz trenutnog pronalaska uključuju korak koji uključuje poređenje vrednosti, nivoa, svojstva, karakteristike, osobine, itd. sa "pogodnom kontrolom", koja se ovde naizmenično označava kao "odgovarajuća kontrola". "Pogodna kontrola" ili "odgovarajuća kontrola" je kontrola ili standard poznat onom sa prosečnim iskustvom u ovoj struci koji je koristan za svrhe poređenja. U jednom primeru izvođenja, "pogodna kontrola" ili "odgovarajuća kontrola" je vrednost, nivo, svojstvo, karakteristika, osobina, itd. određena pre izvođenja RNAi metodologije, kao što je ovde opisano. Na primer, stopa transkripcije, nivo iRNK, stopa

1

translacije, nivo proteina, biološka aktivnost, ćelijska karakteristika ili osobina, genotip, fenotip, itd. mogu se odrediti pre uvođenja agensa za utišavanje RNK (npr. DsiRNA) iz pronalaska u ćeliju ili organizam. U sledećem primeru izvođenja, "pogodna kontrola" ili "odgovarajuća kontrola" je vrednost, nivo, svojstvo, karakteristika, osobina, itd. određena u ćeliji ili organizmu, npr. kontrolnoj ili normalnoj ćeliji ili organizmu, koja pokazuje, na primer, normalne crte. U još jednom primeru izvođenja, "pogodna kontrola" ili "odgovarajuća kontrola" je predefinisana vrednost, nivo, svojstvo, karakteristika, osobina itd.

[0180] Termin "in vitro" ima svoje značenje prepoznato u struci, npr. uključuje prečišćene reagense ili ekstrakte, npr. ćelijske ekstrakte. Termin "in vivo" takođe ima svoje značenje prepoznato u struci, npr. uključuje žive ćelije, npr. imortalizovane ćelije, primarne ćelije, ćelijske linije, i/ili ćelije u organizmu.

[0181] "Tretman", ili "lečenje" kao što se ovde upotrebljava, definisano je kao aplikacija ili primena terapijskog agensa (npr. dsRNA agensa ili vektora ili transgena koji ga kodira) pacijentu, ili aplikacija ili primena terapijskog agensa na izolovano tkivo ili ćelijsku liniju od pacijenta koji ima poremećaj sa namerom da izleči, zaleči, ublaži, olakša, izmeni, leči, poboljša, popravi ili utiče na bolest ili poremećaj, ili simptome bolesti ili poremećaja. Termin "tretman" ili "lečenje" ovde se takođe upotrebljava u kontekstu profilaktičke primene agenasa. Termin "efikasna doza" ili "efikasno doziranje" definisan je kao količina dovoljna za postizanje ili barem delimično postizanje željenog efekta. Termin "terapijski efikasna doza" je definisan kao količina dovoljna da izleči ili barem delimično zaustavi bolest i njene komplikacije kod pacijenta koji već pati od bolesti. Termin "pacijent" uključuje humane i druge sisarske subjekte koji primeju bilo profilaktički ili terapijski tretman.

Strukture sredstava DsiRNA anti-glikolat oksidaze

[0182] U određenim primerima izvođenja, sredstava DsiRNA anti-glikolat oksidaze prema pronalasku mogu imati sledeće strukture:

U jednom takvom primeru izvođenja, DsiRNA sadrži:

5’-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-3’

3’-YXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-5’

gde je “X”=RNK i “Y” je viseći domen koji se sastoji od 1-4 RNK monomera koji su izborno 2’-O-metil RNK monomeri. U srodnom primeru izvođenja, DsiRNA sadrži:

5’-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXDD-3’

3’-YXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-5’

2

gde je “X”=RNK, “Y” je viseći domen koji se sastoji od 1-4 RNK monomera koji su izborno 2’-O-metil RNK monomeri, i "D"=DNK. U jednom primeru izvođenja, gornji lanac je sens lanac i donji lanac je antisens lanac. Alternativno, donji lanac je sens lanac i gornji lanac antisens lanac.

[0183] DsiRNA prema pronalasku mogu da nose široki opseg modifikacionih obrazaca (npr., 2’-O-metil RNK obrasci, npr., unutar proširenih DsiRNA sredstava). Određeni modifikacioni obrasci drugog lanca DsiRNA prema pronalasku predstavljeni su niže.

[0184] U jednom primeru izvođenja, DsiRNA sadrži:

gde je “X”=RNK, "X"=2’-O-metil RNK, “Y” je viseći domen koji se sastoji od 1-4 RNK monomera koji su izborno 2’-O-metil RNK monomeri i podvučeni ostaci su 2’-O-metil RNK monomeri. U srodnom primeru izvođenja, DsiRNA sadrži:

gde je “X”=RNK, "X"=2’-O-metil RNK, “Y” je viseći domen koji se sastoji od 1-4 RNK monomera koji su izborno 2’-O-metil RNK monomeri i podvučeni ostaci su 2’-O-metil RNK monomeri, i "D"=DNK. Gornji lanac je sens lanac i donji lanac je antisens lanac.

[0185] U sledećem takvom primeru izvođenja, DsiRNA sadrži:

gde je “X”=RNK, "X"=2’-O-metil RNK, “Y” je viseći domen koji se sastoji od 1-4 RNK monomera koji su izborno 2’-O-metil RNK monomeri, podvučeni ostaci su 2’-O-metil RNK monomeri, i "D"=DNK. Gornji lanac je sens lanac i donji lanac je antisens lanac.

[0186] U sledećem takvom primeru izvođenja, DsiRNA sadrži:

gde je “X”=RNK, "X"=2’-O-metil RNK, “Y” je viseći domen koji se sastoji od 1-4 RNK monomera koji su izborno 2’-O-metil RNK monomeri, podvučeni ostaci su 2’-O-metil RNK monomeri i "D"=DNK. Gornji lanac je sens lanac i donji lanac je antisens lanac.

[0187] U dodatnim primerima izvođenja, DsiRNA sadrži:

gde je “X”=RNK, "X"=2’-O-metil RNK, “Y” je viseći domen koji se sastoji od 1-4 RNK monomera koji su izborno 2’-O-metil RNK monomeri, podvučeni ostaci su 2’-O-metil RNK monomeri, i "D"=DNK. Gornji lanac je sens lanac i donji lanac je antisens lanac. U jednom srodnom primeru izvođenja, DsiRNA sadrži:

gde je “X”=RNK i "X"=2’-O-metil RNK. U dodatnom srodnom primeru izvođenja, DsiRNA sadrži:

gde je “X”=RNK, "X"=2’-O-metil RNK, i "D"=DNK. Gornji lanac je sens lanac i donji lanac je antisens lanac. Ovaj modifikacioni obrazac je takođe označen ovde kao “AS-M7” ili “M7” modifikacioni obrazac.

[0188] U dodatnim primerima izvođenja, DsiRNA sadrži:

4

gde je “X”=RNK, "X"=2’-O-metil RNK, “Y” je viseći domen koji se sastoji od 1-4 RNK monomera koji su izborno 2’-O-metil RNK monomeri, podvučeni ostaci su 2’-O-metil RNK monomeri, i "D"=DNK. Gornji lanac je sens lanac i donji lanac je antisens lanac. Gornji lanac je sens lanac i donji lanac je antisens lanac. U sledećem srodnom primeru izvođenja, DsiRNA sadrži:

gde je “X”=RNK i "X"=2’-O-metil RNK. Gornji lanac je sens lanac i donji lanac je antisens lanac. U dodatnom srodnom primeru izvođenja, DsiRNA sadrži:

gde je “X”=RNK, "X"=2’-O-metil RNK, i "D"=DNK. Gornji lanac je sens lanac i donji lanac je antisens lanac. Ovaj modifikacioni obrazac je takođe označen ovde kao "AS-M6" ili "M6" modifikacioni obrazac.

[0189] U drugim primerima izvođenja, DsiRNA sadrži:

gde je “X”=RNK, "X"=2’-O-metil RNK, “Y” je viseći domen koji se sastoji od 1-4 RNK monomera koji su izborno 2’-O-metil RNK monomeri i podvučeni ostaci su 2’-O-metil RNK monomeri. Gornji lanac je sens lanac i donji lanac je antisens lanac. U srodnom primeru izvođenja, DsiRNA sadrži:

5’-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXDD-3’

3’-YXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-5’

gde je “X”=RNK i "X"=2’-O-metil RNK. Gornji lanac je sens lanac i donji lanac je antisens lanac. U sledećem srodnom primeru izvođenja, DsiRNA sadrži:

gde je “X”=RNK, "X"=2’-O-metil RNK, i "D"=DNK. Gornji lanac je sens lanac i donji lanac je antisens lanac. Ovaj modifikacioni obrazac je takođe označen ovde kao "AS-M5" ili "M5" modifikacioni obrazac.

[0190] U dodatnim primerima izvođenja, DsiRNA sadrži:

gde je “X”=RNK, "X"=2’-O-metil RNK, i "D"=DNK. Gornji lanac je sens lanac i donji lanac je antisens lanac. Ovaj modifikacioni obrazac je takođe označen ovde kao "AS-M4" ili "M4" modifikacioni obrazac.

[0191] U dodatnim primerima izvođenja, DsiRNA sadrži:

gde je “X”=RNK, "X"=2’-O-metil RNK, “Y” je viseći domen koji se sastoji od 1-4 RNK monomera koji su izborno 2’-O-metil RNK monomeri, podvučeni ostaci su 2’-O-metil RNK monomeri, i "D"=DNK. Gornji lanac je sens lanac i donji lanac je antisens lanac. U sledećem srodnom primeru izvođenja, DsiRNA sadrži:

gde je “X”=RNK, "X"=2’-O-metil RNK, i "D"=DNK. Gornji lanac je sens lanac i donji lanac je antisens lanac. Ovaj modifikacioni obrazac je takođe označen ovde kao "AS-M8" ili "M8" modifikacioni obrazac.

[0192] U drugim primerima izvođenja, DsiRNA sadrži:

5’-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-3’

3’-YXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-5’

gde je “X”=RNK, "X"=2’-O-metil RNK, “Y” je viseći domen koji se sastoji od 1-4 RNK monomera koji su izborno 2’-O-metil RNK monomeri i podvučeni ostaci su 2’-O-metil RNK monomeri. Gornji lanac je sens lanac i donji lanac je antisens lanac. U jednom srodnom primeru izvođenja, DsiRNA sadrži:

gde je “X”=RNK, "X"=2’-O-metil RNK, i "D"=DNK. Gornji lanac je sens lanac i donji lanac je antisens lanac. Ovaj modifikacioni obrazac je takođe označen ovde kao "AS-M3" ili "M3" modifikacioni obrazac.

[0193] U dodatnim primerima izvođenja, DsiRNA sadrži:

gde je “X”=RNK, "X"=2’-O-metil RNK, i "D"=DNK. Gornji lanac je sens lanac i donji lanac je antisens lanac. Ovaj modifikacioni obrazac je takođe označen ovde kao "AS-M2" ili "M2" modifikacioni obrazac.

[0194] U dodatnim primerima izvođenja, DsiRNA sadrži:

gde je “X”=RNK, "X"=2’-O-metil RNK, i "D"=DNK. Gornji lanac je sens lanac i donji lanac je antisens lanac. Ovaj modifikacioni obrazac je takođe označen ovde kao "AS-M1" ili "M1" modifikacioni obrazac.

[0195] U dodatnim primerima izvođenja, DsiRNA sadrži:

gde je “X”=RNK, "X"=2’-O-metil RNK, i "D"=DNK. Gornji lanac je sens lanac i donji lanac je antisens lanac. Ovaj modifikacioni obrazac je takođe označen ovde kao "AS-M9" ili "M9" modifikacioni obrazac.

[0196] U drugim primerima izvođenja, DsiRNA sadrži:

gde je “X”=RNK, "X"=2’-O-metil RNK, i "D"=DNK. Gornji lanac je sens lanac i donji lanac je antisens lanac. Ovaj modifikacioni obrazac je takođe označen ovde kao "AS-M10" ili "M10" modifikacioni obrazac.

[0197] U dodatnim primerima izvođenja, DsiRNA sadrži:

gde je “X”=RNK, "X"=2’-O-metil RNK, i "D"=DNK. Gornji lanac je sens lanac i donji lanac je antisens lanac. Ovaj modifikacioni obrazac je takođe označen ovde kao "AS-M11" ili "M11" modifikacioni obrazac.

[0198] U dodatnim primerima izvođenja, DsiRNA sadrži:

1

gde je “X”=RNK, "X"=2’-O-metil RNK, i "D"=DNK. Gornji lanac je sens lanac i donji lanac je antisens lanac. Ovaj modifikacioni obrazac je takođe označen ovde kao "AS-M12" ili "M12" modifikacioni obrazac.

[0199] U dodatnim primerima izvođenja, DsiRNA sadrži:

gde je “X”=RNK, "X"=2’-O-metil RNK, i "D"=DNK. Gornji lanac je sens lanac i donji lanac je antisens lanac. Ovaj modifikacioni obrazac je takođe označen ovde kao "AS-M13" ili "M13" modifikacioni obrazac.

[0200] U drugim primerima izvođenja, DsiRNA sadrži:

gde je “X”=RNK, "X"=2’-O-metil RNK, “Y” je viseći domen koji se sastoji od 1-4 RNK monomera koji su izborno 2’-O-metil RNK monomeri i podvučeni ostaci su 2’-O-metil RNK monomeri. Gornji lanac je sens lanac i donji lanac je antisens lanac. U sledećem srodnom primeru izvođenja, DsiRNA sadrži:

2

gde je “X”=RNK, "X"=2’-O-metil RNK, i "D"=DNK. Gornji lanac je sens lanac i donji lanac je antisens lanac. Ovaj modifikacioni obrazac je takođe označen ovde kao "AS-M21" ili "M21" modifikacioni obrazac.

[0201] U dodatnim primerima izvođenja, DsiRNA sadrži:

gde je “X”=RNK, "X"=2’-O-metil RNK, i "D"=DNK. Gornji lanac je sens lanac i donji lanac je antisens lanac. Ovaj modifikacioni obrazac je takođe označen ovde kao "AS-M14" ili "M14" modifikacioni obrazac.

[0202] U dodatnim primerima izvođenja, DsiRNA sadrži:

gde je “X”=RNK, "X"=2’-O-metil RNK, i "D"=DNK. Gornji lanac je sens lanac i donji lanac je antisens lanac. Ovaj modifikacioni obrazac je takođe označen ovde kao "AS-M15" ili "M15" modifikacioni obrazac.

[0203] U dodatnim primerima izvođenja, DsiRNA sadrži:

gde je “X”=RNK, "X"=2’-O-metil RNK, “Y” je viseći domen koji se sastoji od 1-4 RNK monomera koji su izborno 2’-O-metil RNK monomeri, podvučeni ostaci su 2’-O-metil RNK

4

monomeri, i "D"=DNK. Gornji lanac je sens lanac i donji lanac je antisens lanac. U sledećem srodnom primeru izvođenja, DsiRNA sadrži:

gde je “X”=RNK, "X"=2’-O-metil RNK, i "D"=DNK. Gornji lanac je sens lanac i donji lanac je antisens lanac. Ovaj modifikacioni obrazac je takođe označen ovde kao "AS-M16" ili "M16" modifikacioni obrazac.

[0204] U dodatnim primerima izvođenja, DsiRNA sadrži:

gde je “X”=RNK, "X"=2’-O-metil RNK, i "D"=DNK. Gornji lanac je sens lanac i donji lanac je antisens lanac. Ovaj modifikacioni obrazac je takođe označen ovde kao "AS-M17" ili "M17" modifikacioni obrazac.

[0205] U dodatnim primerima izvođenja, DsiRNA sadrži:

gde je “X”=RNK, "X"=2’-O-metil RNK, i "D"=DNK. Gornji lanac je sens lanac i donji lanac je antisens lanac. Ovaj modifikacioni obrazac je takođe označen ovde kao "AS-M18" ili "M18" modifikacioni obrazac.

[0206] U dodatnim primerima izvođenja, DsiRNA sadrži:

gde je “X”=RNK, "X"=2’-O-metil RNK, i "D"=DNK. Gornji lanac je sens lanac i donji lanac je antisens lanac. Ovaj modifikacioni obrazac je takođe označen ovde kao "AS-M19" ili "M19" modifikacioni obrazac.

[0207] U dodatnim primerima izvođenja, DsiRNA sadrži:

gde je “X”=RNK, "X"=2’-O-metil RNK, i "D"=DNK. Gornji lanac je sens lanac i donji lanac je antisens lanac. Ovaj modifikacioni obrazac je takođe označen ovde kao "AS-M20" ili "M20" modifikacioni obrazac.

[0208] U dodatnim primerima izvođenja, DsiRNA sadrži:

gde je “X”=RNK, "X"=2’-O-metil RNK, i "D"=DNK. Gornji lanac je sens lanac i donji lanac je antisens lanac. Ovaj modifikacioni obrazac je takođe označen ovde kao "AS-M22" ili "M22" modifikacioni obrazac.

[0209] U dodatnim primerima izvođenja, DsiRNA sadrži:

gde je “X”=RNK, "X"=2’-O-metil RNK, i "D"=DNK. Gornji lanac je sens lanac i donji lanac je antisens lanac. Ovaj modifikacioni obrazac je takođe označen ovde kao "AS-M24" ili "M24" modifikacioni obrazac.

[0210] U dodatnim primerima izvođenja, DsiRNA sadrži:

gde je “X”=RNK, "X"=2’-O-metil RNK, i "D"=DNK. Gornji lanac je sens lanac i donji lanac je antisens lanac. Ovaj modifikacioni obrazac je takođe označen ovde kao "AS-M25" ili "M25" modifikacioni obrazac.

[0211] U dodatnim primerima izvođenja, DsiRNA sadrži:

gde je “X”=RNK, "X"=2’-O-metil RNK, i "D"=DNK. Gornji lanac je sens lanac i donji lanac je antisens lanac. Ovaj modifikacioni obrazac je takođe označen ovde kao "AS-M26" ili "M26" modifikacioni obrazac.

[0212] U dodatnim primerima izvođenja, DsiRNA sadrži:

gde je “X”=RNK, "X"=2’-O-metil RNK, i "D"=DNK. Gornji lanac je sens lanac i donji lanac je antisens lanac. Ovaj modifikacioni obrazac je takođe označen ovde kao "AS-M27" ili "M27" modifikacioni obrazac.

[0213] U dodatnim primerima izvođenja, DsiRNA sadrži:

gde je “X”=RNK, "X"=2’-O-metil RNK, i "D"=DNK. Gornji lanac je sens lanac i donji lanac je antisens lanac. Ovaj modifikacioni obrazac je takođe označen ovde kao "AS-M28" ili "M28" modifikacioni obrazac.

[0214] U dodatnim primerima izvođenja, DsiRNA sadrži:

1

gde je “X”=RNK, "X"=2’-O-metil RNK, i "D"=DNK. Gornji lanac je sens lanac i donji lanac je antisens lanac. Ovaj modifikacioni obrazac je takođe označen ovde kao "AS-M29" ili "M29" modifikacioni obrazac.

[0215] U dodatnim primerima izvođenja, DsiRNA sadrži:

gde je “X”=RNK, "X"=2’-O-metil RNK, i "D"=DNK. Gornji lanac je sens lanac i donji lanac je antisens lanac. Ovaj modifikacioni obrazac je takođe označen ovde kao "AS-M30" ili "M30" modifikacioni obrazac.

[0216] U dodatnim primerima izvođenja, DsiRNA sadrži:

gde je “X”=RNK, "X"=2’-O-metil RNK, i "D"=DNK. Gornji lanac je sens lanac i donji lanac je antisens lanac. Ovaj modifikacioni obrazac je takođe označen ovde kao "AS-M31" ili "M31" modifikacioni obrazac.

[0217] U dodatnim primerima izvođenja, DsiRNA sadrži:

2

gde je “X”=RNK, "X"=2’-O-metil RNK, i "D"=DNK. Gornji lanac je sens lanac i donji lanac je antisens lanac. Ovaj modifikacioni obrazac je takođe označen ovde kao "AS-M32" ili "M32" modifikacioni obrazac.

[0218] U dodatnim primerima izvođenja, DsiRNA sadrži:

gde je “X”=RNK, "X"=2’-O-metil RNK, i "D"=DNK. Gornji lanac je sens lanac i donji lanac je antisens lanac. Ovaj modifikacioni obrazac je takođe označen ovde kao "AS-M34" ili "M34" modifikacioni obrazac.

[0219] U dodatnim primerima izvođenja, DsiRNA sadrži:

gde je “X”=RNK, "X"=2’-O-metil RNK, i "D"=DNK. Gornji lanac je sens lanac i donji lanac je antisens lanac. Ovaj modifikacioni obrazac je takođe označen ovde kao "AS-M35" ili "M35" modifikacioni obrazac.

[0220] U dodatnim primerima izvođenja, DsiRNA sadrži:

4

gde je “X”=RNK, "X"=2’-O-metil RNK, i "D"=DNK. Gornji lanac je sens lanac i donji lanac je antisens lanac. Ovaj modifikacioni obrazac je takođe označen ovde kao "AS-M37" ili "M37" modifikacioni obrazac.

[0221] U dodatnim primerima izvođenja, DsiRNA sadrži:

gde je “X”=RNK, "X"=2’-O-metil RNK, i "D"=DNK. Gornji lanac je sens lanac i donji lanac je antisens lanac. Ovaj modifikacioni obrazac je takođe označen ovde kao "AS-M38" ili "M38" modifikacioni obrazac.

[0222] U dodatnim primerima izvođenja, DsiRNA sadrži:

gde je “X”=RNK, "X"=2’-O-metil RNK, i "D"=DNK. Gornji lanac je sens lanac i donji lanac je antisens lanac. Ovaj modifikacioni obrazac je takođe označen ovde kao "AS-M40" ili "M40" modifikacioni obrazac.

[0223] U dodatnim primerima izvođenja, DsiRNA sadrži:

gde je “X”=RNK, "X"=2’-O-metil RNK, i "D"=DNK. Gornji lanac je sens lanac i donji lanac je antisens lanac. Ovaj modifikacioni obrazac je takođe označen ovde kao "AS-M41" ili "M41" modifikacioni obrazac.

[0224] U dodatnim primerima izvođenja, DsiRNA sadrži:

gde je “X”=RNK, "X"=2’-O-metil RNK, i "D"=DNK. Gornji lanac je sens lanac i donji lanac je antisens lanac. Ovaj modifikacioni obrazac je takođe označen ovde kao "AS-M36" ili "M36" modifikacioni obrazac.

[0225] U dodatnim primerima izvođenja, DsiRNA sadrži:

gde je “X”=RNK, "X"=2’-O-metil RNK, i "D"=DNK. Gornji lanac je sens lanac i donji lanac je antisens lanac. Ovaj modifikacioni obrazac je takođe označen ovde kao "AS-M42" ili "M42" modifikacioni obrazac.

[0226] U dodatnim primerima izvođenja, DsiRNA sadrži:

gde je “X”=RNK, "X"=2’-O-metil RNK, i "D"=DNK. Gornji lanac je sens lanac i donji lanac je antisens lanac. Ovaj modifikacioni obrazac je takođe označen ovde kao "AS-M43" ili "M43" modifikacioni obrazac.

[0227] U dodatnim primerima izvođenja, DsiRNA sadrži:

gde je “X”=RNK, "X"=2’-O-metil RNK, i "D"=DNK. Gornji lanac je sens lanac i donji lanac je antisens lanac. Ovaj modifikacioni obrazac je takođe označen ovde kao "AS-M44" ili "M44" modifikacioni obrazac.

[0228] U dodatnim primerima izvođenja, DsiRNA sadrži:

gde je “X”=RNK, "X"=2’-O-metil RNK, i "D"=DNK. Gornji lanac je sens lanac i donji lanac je antisens lanac. Ovaj modifikacioni obrazac je takođe označen ovde kao "AS-M45" ili "M45" modifikacioni obrazac.

[0229] U dodatnim primerima izvođenja, DsiRNA sadrži:

gde je “X”=RNK, "X"=2’-O-metil RNK, i "D"=DNK. Gornji lanac je sens lanac i donji lanac je antisens lanac. Ovaj modifikacioni obrazac je takođe označen ovde kao "AS-M46" ili "M46" modifikacioni obrazac.

[0230] U dodatnim primerima izvođenja, DsiRNA sadrži:

gde je “X”=RNK, "X"=2’-O-metil RNK, i "D"=DNK. Gornji lanac je sens lanac i donji lanac je antisens lanac. Ovaj modifikacioni obrazac je takođe označen ovde kao "AS-M47" ili "M47" modifikacioni obrazac.

[0231] U dodatnim primerima izvođenja, DsiRNA sadrži:

1

gde je “X”=RNK, "X"=2’-O-metil RNK, i "D"=DNK. Gornji lanac je sens lanac i donji lanac je antisens lanac. Ovaj modifikacioni obrazac je takođe označen ovde kao "AS-M48" ili "M48" modifikacioni obrazac.

[0232] U dodatnim primerima izvođenja, DsiRNA sadrži:

gde je “X”=RNK, "X"=2’-O-metil RNK, i "D"=DNK. Gornji lanac je sens lanac i donji lanac je antisens lanac. Ovaj modifikacioni obrazac je takođe označen ovde kao "AS-M52" ili "M52" modifikacioni obrazac.

[0233] U dodatnim primerima izvođenja, DsiRNA sadrži:

2

gde je “X”=RNK, "X"=2’-O-metil RNK, i "D"=DNK. Gornji lanac je sens lanac i donji lanac je antisens lanac. Ovaj modifikacioni obrazac je takođe označen ovde kao "AS-M54" ili "M54" modifikacioni obrazac.

[0234] U dodatnim primerima izvođenja, DsiRNA sadrži:

gde je “X”=RNK, "X"=2’-O-metil RNK, i "D"=DNK. Gornji lanac je sens lanac i donji lanac je antisens lanac. Ovaj modifikacioni obrazac je takođe označen ovde kao "AS-M55" ili "M55" modifikacioni obrazac.

[0235] U dodatnim primerima izvođenja, DsiRNA sadrži:

gde je “X”=RNK, "X"=2’-O-metil RNK, i "D"=DNK. Gornji lanac je sens lanac i donji lanac je antisens lanac. Ovaj modifikacioni obrazac je takođe označen ovde kao "AS-M56" ili "M56" modifikacioni obrazac.

[0236] U dodatnim primerima izvođenja, DsiRNA sadrži:

4

gde je “X”=RNK, "X"=2’-O-metil RNK, i "D"=DNK. Gornji lanac je sens lanac i donji lanac je antisens lanac. Ovaj modifikacioni obrazac je takođe označen ovde kao "AS-M57" ili "M57" modifikacioni obrazac.

[0237] U dodatnim primerima izvođenja, DsiRNA sadrži:

gde je “X”=RNK, "X"=2’-O-metil RNK, i "D"=DNK. Gornji lanac je sens lanac i donji lanac je antisens lanac. Ovaj modifikacioni obrazac je takođe označen ovde kao "AS-M58" ili "M58" modifikacioni obrazac.

[0238] U dodatnim primerima izvođenja, DsiRNA sadrži:

gde je “X”=RNK, "X"=2’-O-metil RNK, i "D"=DNK. Gornji lanac je sens lanac i donji lanac je antisens lanac. Ovaj modifikacioni obrazac je takođe označen ovde kao "AS-M59" ili "M59" modifikacioni obrazac.

[0239] U dodatnim primerima izvođenja, DsiRNA sadrži:

gde je “X”=RNK, "X"=2’-O-metil RNK, i "D"=DNK. Gornji lanac je sens lanac i donji lanac je antisens lanac. Ovaj modifikacioni obrazac je takođe označen ovde kao "AS-M60" ili "M60" modifikacioni obrazac.

[0240] U dodatnim primerima izvođenja, DsiRNA sadrži:

gde je “X”=RNK, "X"=2’-O-metil RNK, i "D"=DNK. Gornji lanac je sens lanac i donji lanac je antisens lanac. Ovaj modifikacioni obrazac je takođe označen ovde kao "AS-M61" ili "M61" modifikacioni obrazac.

[0241] U dodatnim primerima izvođenja, DsiRNA sadrži:

gde je “X”=RNK, "X"=2’-O-metil RNK, i "D"=DNK. Gornji lanac je sens lanac i donji lanac je antisens lanac. Ovaj modifikacioni obrazac je takođe označen ovde kao "AS-M62" ili "M62" modifikacioni obrazac.

[0242] U dodatnim primerima izvođenja, DsiRNA sadrži:

gde je “X”=RNK, "X"=2’-O-metil RNK, i "D"=DNK. Gornji lanac je sens lanac i donji lanac je antisens lanac. Ovaj modifikacioni obrazac je takođe označen ovde kao "AS-M63" ili "M63" modifikacioni obrazac.

[0243] U dodatnim primerima izvođenja, DsiRNA sadrži:

gde je “X”=RNK, "X"=2’-O-metil RNK, i "D"=DNK. Gornji lanac je sens lanac i donji lanac je antisens lanac. Ovaj modifikacioni obrazac je takođe označen ovde kao "AS-M64" ili "M64" modifikacioni obrazac.

[0244] U dodatnim primerima izvođenja, DsiRNA sadrži:

gde je “X”=RNK, "X"=2’-O-metil RNK, i "D"=DNK. Gornji lanac je sens lanac i donji lanac je antisens lanac. Ovaj modifikacioni obrazac je takođe označen ovde kao "AS-M65" ili "M65" modifikacioni obrazac.

[0245] U dodatnim primerima izvođenja, DsiRNA sadrži:

gde je “X”=RNK, "X"=2’-O-metil RNK, i "D"=DNK. Gornji lanac je sens lanac i donji lanac je antisens lanac. Ovaj modifikacioni obrazac je takođe označen ovde kao "AS-M66" ili "M66" modifikacioni obrazac.

[0246] U dodatnim primerima izvođenja, DsiRNA sadrži:

gde je “X”=RNK, "X"=2’-O-metil RNK, i "D"=DNK. Gornji lanac je sens lanac i donji lanac je antisens lanac. Ovaj modifikacioni obrazac je takođe označen ovde kao "AS-M67" ili "M67" modifikacioni obrazac.

[0247] U dodatnim primerima izvođenja, DsiRNA sadrži:

1

gde je “X”=RNK, "X"=2’-O-metil RNK, i "D"=DNK. Gornji lanac je sens lanac i donji lanac je antisens lanac. Ovaj modifikacioni obrazac je takođe označen ovde kao "AS-M68" ili "M68" modifikacioni obrazac.

[0248] U dodatnim primerima izvođenja, DsiRNA sadrži:

gde je “X”=RNK, "X"=2’-O-metil RNK, i "D"=DNK. Gornji lanac je sens lanac i donji lanac je antisens lanac. Ovaj modifikacioni obrazac je takođe označen ovde kao "AS-M69" ili "M69" modifikacioni obrazac.

[0249] U dodatnim primerima izvođenja, DsiRNA sadrži:

2

gde je “X”=RNK, "X"=2’-O-metil RNK, i "D"=DNK. Gornji lanac je sens lanac i donji lanac je antisens lanac. Ovaj modifikacioni obrazac je takođe označen ovde kao "AS-M70" ili "M70" modifikacioni obrazac.

[0250] U dodatnim primerima izvođenja, DsiRNA sadrži:

gde je “X”=RNK, "X"=2’-O-metil RNK, i "D"=DNK. Gornji lanac je sens lanac i donji lanac je antisens lanac. Ovaj modifikacioni obrazac je takođe označen ovde kao "AS-M71" ili "M71" modifikacioni obrazac.

[0251] U dodatnim primerima izvođenja, DsiRNA sadrži:

gde je “X”=RNK, "X"=2’-O-metil RNK, i "D"=DNK. Gornji lanac je sens lanac i donji lanac je antisens lanac. Ovaj modifikacioni obrazac je takođe označen ovde kao "AS-M72" ili "M72" modifikacioni obrazac.

[0252] U dodatnim primerima izvođenja, DsiRNA sadrži:

4

gde je “X”=RNK, "X"=2’-O-metil RNK, i "D"=DNK. Gornji lanac je sens lanac i donji lanac je antisens lanac. Ovaj modifikacioni obrazac je takođe označen ovde kao "AS-M73" ili "M73" modifikacioni obrazac.

[0253] U dodatnim primerima izvođenja, DsiRNA sadrži:

gde je “X”=RNK, "X"=2’-O-metil RNK, i "D"=DNK. Gornji lanac je sens lanac i donji lanac je antisens lanac. Ovaj modifikacioni obrazac je takođe označen ovde kao "AS-M7*" ili "M7*" modifikacioni obrazac.

[0254] U dodatnim primerima izvođenja, DsiRNA sadrži:

gde je “X”=RNK, "X"=2’-O-metil RNK, i "D"=DNK. Gornji lanac je sens lanac i donji lanac je antisens lanac. Ovaj modifikacioni obrazac je takođe označen ovde kao "AS-M6*" ili "M6*" modifikacioni obrazac.

[0255] U drugim primerima izvođenja, DsiRNA sadrži:

gde je “X”=RNK, "X"=2’-O-metil RNK, i "D"=DNK. Gornji lanac je sens lanac i donji lanac je antisens lanac. Ovaj modifikacioni obrazac je takođe označen ovde kao "AS-M5*" ili "M5*" modifikacioni obrazac.

[0256] U dodatnim primerima izvođenja, DsiRNA sadrži:

gde je “X”=RNK, "X"=2’-O-metil RNK, i "D"=DNK. Gornji lanac je sens lanac i donji lanac je antisens lanac. Ovaj modifikacioni obrazac je takođe označen ovde kao "AS-M4*" ili "M4*" modifikacioni obrazac.

[0257] U dodatnim primerima izvođenja, DsiRNA sadrži:

gde je “X”=RNK, "X"=2’-O-metil RNK, i "D"=DNK. Gornji lanac je sens lanac i donji lanac je antisens lanac. Ovaj modifikacioni obrazac je takođe označen ovde kao "AS-M8*" ili "M8*" modifikacioni obrazac.

[0258] U dodatnim primerima izvođenja, DsiRNA sadrži:

gde je “X”=RNK, "X"=2’-O-metil RNK, i "D"=DNK. Gornji lanac je sens lanac i donji lanac je antisens lanac. Ovaj modifikacioni obrazac je takođe označen ovde kao "AS-M2*" ili "M2*" modifikacioni obrazac.

[0259] U drugim primerima izvođenja, DsiRNA sadrži:

gde je “X”=RNK, "X"=2’-O-metil RNK, i "D"=DNK. Gornji lanac je sens lanac i donji lanac je antisens lanac. Ovaj modifikacioni obrazac je takođe označen ovde kao "AS-M10*" ili "M10*" modifikacioni obrazac.

[0260] U dodatnim primerima izvođenja, DsiRNA sadrži:

gde je “X”=RNK, "X"=2’-O-metil RNK, i "D"=DNK. Gornji lanac je sens lanac i donji lanac je antisens lanac. Ovaj modifikacioni obrazac je takođe označen ovde kao "AS-M11*" ili "M11*" modifikacioni obrazac.

[0261] U dodatnim primerima izvođenja, DsiRNA sadrži:

gde je “X”=RNK, "X"=2’-O-metil RNK, i "D"=DNK. Gornji lanac je sens lanac i donji lanac je antisens lanac. Ovaj modifikacioni obrazac je takođe označen ovde kao "AS-M13*" ili "M13*" modifikacioni obrazac.

[0262] U dodatnim primerima izvođenja, DsiRNA sadrži:

gde je “X”=RNK, "X"=2’-O-metil RNK, i "D"=DNK. Gornji lanac je sens lanac i donji lanac je antisens lanac. Ovaj modifikacioni obrazac je takođe označen ovde kao "AS-M14*" ili "M14*" modifikacioni obrazac.

[0263] U dodatnim primerima izvođenja, DsiRNA sadrži:

gde je “X”=RNK, "X"=2’-O-metil RNK, i "D"=DNK. Gornji lanac je sens lanac i donji lanac je antisens lanac. Ovaj modifikacioni obrazac je takođe označen ovde kao "AS-M15*" ili "M15*" modifikacioni obrazac.

[0264] U dodatnim primerima izvođenja, DsiRNA sadrži:

gde je “X”=RNK, "X"=2’-O-metil RNK, i "D"=DNK. Gornji lanac je sens lanac i donji lanac je antisens lanac. Ovaj modifikacioni obrazac je takođe označen ovde kao "AS-M16*" ili "M16*" modifikacioni obrazac.

[0265] U dodatnim primerima izvođenja, DsiRNA sadrži:

gde je “X”=RNK, "X"=2’-O-metil RNK, i "D"=DNK. Gornji lanac je sens lanac i donji lanac je antisens lanac. Ovaj modifikacioni obrazac je takođe označen ovde kao "AS-M17*" ili "M17*" modifikacioni obrazac.

[0266] U dodatnim primerima izvođenja, DsiRNA sadrži:

gde je “X”=RNK, "X"=2’-O-metil RNK, i "D"=DNK. Gornji lanac je sens lanac i donji lanac je antisens lanac. Ovaj modifikacioni obrazac je takođe označen ovde kao "AS-M18*" ili "M18*" modifikacioni obrazac.

[0267] U dodatnim primerima izvođenja, DsiRNA sadrži:

gde je “X”=RNK, "X"=2’-O-metil RNK, i "D"=DNK. Gornji lanac je sens lanac i donji lanac je antisens lanac. Ovaj modifikacioni obrazac je takođe označen ovde kao "AS-M19*" ili "M19*" modifikacioni obrazac.

[0268] U dodatnim primerima izvođenja, DsiRNA sadrži:

gde je “X”=RNK, "X"=2’-O-metil RNK, i "D"=DNK. Gornji lanac je sens lanac i donji lanac je antisens lanac. Ovaj modifikacioni obrazac je takođe označen ovde kao "AS-M20*" ili "M20*" modifikacioni obrazac.

[0269] U dodatnim primerima izvođenja, DsiRNA sadrži:

gde je “X”=RNK, "X"=2’-O-metil RNK, i "D"=DNK. Gornji lanac je sens lanac i donji lanac je antisens lanac. Ovaj modifikacioni obrazac je takođe označen ovde kao "AS-M22*" ili "M22*" modifikacioni obrazac.

[0270] U dodatnim primerima izvođenja, DsiRNA sadrži:

gde je “X”=RNK, "X"=2’-O-metil RNK, i "D"=DNK. Gornji lanac je sens lanac i donji lanac je antisens lanac. Ovaj modifikacioni obrazac je takođe označen ovde kao "AS-M24*" ili "M24*" modifikacioni obrazac.

[0271] U dodatnim primerima izvođenja, DsiRNA sadrži:

gde je “X”=RNK, "X"=2’-O-metil RNK, i "D"=DNK. Gornji lanac je sens lanac i donji lanac je antisens lanac. Ovaj modifikacioni obrazac je takođe označen ovde kao "AS-M25*" ili "M25*" modifikacioni obrazac.

[0272] U dodatnim primerima izvođenja, DsiRNA sadrži:

gde je “X”=RNK, "X"=2’-O-metil RNK, i "D"=DNK. Gornji lanac je sens lanac i donji lanac je antisens lanac. Ovaj modifikacioni obrazac je takođe označen ovde kao "AS-M26*" ili "M26*" modifikacioni obrazac.

[0273] U dodatnim primerima izvođenja, DsiRNA sadrži:

1

gde je “X”=RNK, "X"=2’-O-metil RNK, i "D"=DNK. Gornji lanac je sens lanac i donji lanac je antisens lanac. Ovaj modifikacioni obrazac je takođe označen ovde kao "AS-M27*" ili "M27*" modifikacioni obrazac.

[0274] U dodatnim primerima izvođenja, DsiRNA sadrži:

gde je “X”=RNK, "X"=2’-O-metil RNK, i "D"=DNK. Gornji lanac je sens lanac i donji lanac je antisens lanac. Ovaj modifikacioni obrazac je takođe označen ovde kao "AS-M28*" ili "M28*" modifikacioni obrazac.

[0275] U dodatnim primerima izvođenja, DsiRNA sadrži:

gde je “X”=RNK, "X"=2’-O-metil RNK, i "D"=DNK. Gornji lanac je sens lanac i donji lanac je antisens lanac. Ovaj modifikacioni obrazac je takođe označen ovde kao "AS-M29*" ili "M29*" modifikacioni obrazac.

[0276] U dodatnim primerima izvođenja, DsiRNA sadrži:

1 1

gde je “X”=RNK, "X"=2’-O-metil RNK, i "D"=DNK. Gornji lanac je sens lanac i donji lanac je antisens lanac. Ovaj modifikacioni obrazac je takođe označen ovde kao "AS-M34*" ili "M34*" modifikacioni obrazac.

[0277] U dodatnim primerima izvođenja, DsiRNA sadrži:

gde je “X”=RNK, "X"=2’-O-metil RNK, i "D"=DNK. Gornji lanac je sens lanac i donji lanac je antisens lanac. Ovaj modifikacioni obrazac je takođe označen ovde kao "AS-M35*" ili "M35*" modifikacioni obrazac.

[0278] U dodatnim primerima izvođenja, DsiRNA sadrži:

gde je “X”=RNK, "X"=2’-O-metil RNK, i "D"=DNK. Gornji lanac je sens lanac i donji lanac je antisens lanac. Ovaj modifikacioni obrazac je takođe označen ovde kao "AS-M37*" ili "M37*" modifikacioni obrazac.

[0279] U dodatnim primerima izvođenja, DsiRNA sadrži:

gde je “X”=RNK, "X"=2’-O-metil RNK, i "D"=DNK. Gornji lanac je sens lanac i donji lanac je antisens lanac. Ovaj modifikacioni obrazac je takođe označen ovde kao "AS-M38*" ili "M38*" modifikacioni obrazac.

[0280] U dodatnim primerima izvođenja, DsiRNA sadrži:

1 2

gde je “X”=RNK, "X"=2’-O-metil RNK, i "D"=DNK. Gornji lanac je sens lanac i donji lanac je antisens lanac. Ovaj modifikacioni obrazac je takođe označen ovde kao "AS-M40*" ili "M40*" modifikacioni obrazac.

[0281] U dodatnim primerima izvođenja, DsiRNA sadrži:

gde je “X”=RNK, "X"=2’-O-metil RNK, i "D"=DNK. Gornji lanac je sens lanac i donji lanac je antisens lanac. Ovaj modifikacioni obrazac je takođe označen ovde kao "AS-M41*" ili "M41*" modifikacioni obrazac.

[0282] U dodatnim primerima izvođenja, DsiRNA sadrži:

gde je “X”=RNK, "X"=2’-O-metil RNK, i "D"=DNK. Gornji lanac je sens lanac i donji lanac je antisens lanac. Ovaj modifikacioni obrazac je takođe označen ovde kao "AS-M36*" ili "M36*" modifikacioni obrazac.

[0283] U dodatnim primerima izvođenja, DsiRNA sadrži:

1

gde je “X”=RNK, "X"=2’-O-metil RNK, i "D"=DNK. Gornji lanac je sens lanac i donji lanac je antisens lanac. Ovaj modifikacioni obrazac je takođe označen ovde kao "AS-M42*" ili "M42*" modifikacioni obrazac.

[0284] U dodatnim primerima izvođenja, DsiRNA sadrži:

gde je “X”=RNK, "X"=2’-O-metil RNK, i "D"=DNK. Gornji lanac je sens lanac i donji lanac je antisens lanac. Ovaj modifikacioni obrazac je takođe označen ovde kao "AS-M43*" ili "M43*" modifikacioni obrazac.

[0285] U dodatnim primerima izvođenja, DsiRNA sadrži:

gde je “X”=RNK, "X"=2’-O-metil RNK, i "D"=DNK. Gornji lanac je sens lanac i donji lanac je antisens lanac. Ovaj modifikacioni obrazac je takođe označen ovde kao "AS-M44*" ili "M44*" modifikacioni obrazac.

[0286] U dodatnim primerima izvođenja, DsiRNA sadrži:

gde je “X”=RNK, "X"=2’-O-metil RNK, i "D"=DNK. Gornji lanac je sens lanac i donji lanac je antisens lanac. Ovaj modifikacioni obrazac je takođe označen ovde kao "AS-M46*" ili "M46*" modifikacioni obrazac.

[0287] U dodatnim primerima izvođenja, DsiRNA sadrži:

1 4

gde je “X”=RNK, "X"=2’-O-metil RNK, i "D"=DNK. Gornji lanac je sens lanac i donji lanac je antisens lanac. Ovaj modifikacioni obrazac je takođe označen ovde kao "AS-M47*" ili "M47*" modifikacioni obrazac.

[0288] U dodatnim primerima izvođenja, DsiRNA sadrži:

gde je “X”=RNK, "X"=2’-O-metil RNK, i "D"=DNK. Gornji lanac je sens lanac i donji lanac je antisens lanac. Ovaj modifikacioni obrazac je takođe označen ovde kao "AS-M48*" ili "M48*" modifikacioni obrazac.

[0289] U dodatnim primerima izvođenja, DsiRNA sadrži:

gde je “X”=RNK, "X"=2’-O-metil RNK, i "D"=DNK. Gornji lanac je sens lanac i donji lanac je antisens lanac. Ovaj modifikacioni obrazac je takođe označen ovde kao "AS-M52*" ili "M52*" modifikacioni obrazac.

[0290] U dodatnim primerima izvođenja, DsiRNA sadrži:

1

gde je “X”=RNK, "X"=2’-O-metil RNK, i "D"=DNK. Gornji lanac je sens lanac i donji lanac je antisens lanac. Ovaj modifikacioni obrazac je takođe označen ovde kao "AS-M54*" ili "M54*" modifikacioni obrazac.

[0291] U dodatnim primerima izvođenja, DsiRNA sadrži:

gde je “X”=RNK, "X"=2’-O-metil RNK, i "D"=DNK. Gornji lanac je sens lanac i donji lanac je antisens lanac. Ovaj modifikacioni obrazac je takođe označen ovde kao "AS-M55*" ili "M55*" modifikacioni obrazac.

[0292] U dodatnim primerima izvođenja, DsiRNA sadrži:

gde je “X”=RNK, "X"=2’-O-metil RNK, i "D"=DNK. Gornji lanac je sens lanac i donji lanac je antisens lanac. Ovaj modifikacioni obrazac je takođe označen ovde kao "AS-M56*" ili "M56*" modifikacioni obrazac.

[0293] U dodatnim primerima izvođenja, DsiRNA sadrži:

gde je “X”=RNK, "X"=2’-O-metil RNK, i "D"=DNK. Gornji lanac je sens lanac i donji lanac je antisens lanac. Ovaj modifikacioni obrazac je takođe označen ovde kao "AS-M57*" ili "M57*" modifikacioni obrazac.

[0294] U dodatnim primerima izvođenja, DsiRNA sadrži:

1

gde je “X”=RNK, "X"=2’-O-metil RNK, i "D"=DNK. Gornji lanac je sens lanac i donji lanac je antisens lanac. Ovaj modifikacioni obrazac je takođe označen ovde kao "AS-M58*" ili "M58*" modifikacioni obrazac.

[0295] U dodatnim primerima izvođenja, DsiRNA sadrži:

gde je “X”=RNK, "X"=2’-O-metil RNK, i "D"=DNK. Gornji lanac je sens lanac i donji lanac je antisens lanac. Ovaj modifikacioni obrazac je takođe označen ovde kao "AS-M59*" ili "M59*" modifikacioni obrazac.

[0296] U dodatnim primerima izvođenja, DsiRNA sadrži:

gde je “X”=RNK, "X"=2’-O-metil RNK, i "D"=DNK. Gornji lanac je sens lanac i donji lanac je antisens lanac. Ovaj modifikacioni obrazac je takođe označen ovde kao "AS-M60*" ili "M60*" modifikacioni obrazac.

[0297] U dodatnim primerima izvođenja, DsiRNA sadrži:

1

gde je “X”=RNK, "X"=2’-O-metil RNK, i "D"=DNK. Gornji lanac je sens lanac i donji lanac je antisens lanac. Ovaj modifikacioni obrazac je takođe označen ovde kao "AS-M61*" ili "M61*" modifikacioni obrazac.

[0298] U dodatnim primerima izvođenja, DsiRNA sadrži:

gde je “X”=RNK, "X"=2’-O-metil RNK, i "D"=DNK. Gornji lanac je sens lanac i donji lanac je antisens lanac. Ovaj modifikacioni obrazac je takođe označen ovde kao "AS-M62*" ili "M62*" modifikacioni obrazac.

[0299] U dodatnim primerima izvođenja, DsiRNA sadrži:

gde je “X”=RNK, "X"=2’-O-metil RNK, i "D"=DNK. Gornji lanac je sens lanac i donji lanac je antisens lanac. Ovaj modifikacioni obrazac je takođe označen ovde kao "AS-M63*" ili "M63*" modifikacioni obrazac.

[0300] U dodatnim primerima izvođenja, DsiRNA sadrži:

gde je “X”=RNK, "X"=2’-O-metil RNK, i "D"=DNK. Gornji lanac je sens lanac i donji lanac je antisens lanac. Ovaj modifikacioni obrazac je takođe označen ovde kao "AS-M64*" ili "M64*" modifikacioni obrazac.

[0301] U dodatnim primerima izvođenja, DsiRNA sadrži:

1

gde je “X”=RNK, "X"=2’-O-metil RNK, i "D"=DNK. Gornji lanac je sens lanac i donji lanac je antisens lanac. Ovaj modifikacioni obrazac je takođe označen ovde kao "AS-M65*" ili "M65*" modifikacioni obrazac.

[0302] U dodatnim primerima izvođenja, DsiRNA sadrži:

gde je “X”=RNK, "X"=2’-O-metil RNK, i "D"=DNK. Gornji lanac je sens lanac i donji lanac je antisens lanac. Ovaj modifikacioni obrazac je takođe označen ovde kao "AS-M66*" ili "M66*" modifikacioni obrazac.

[0303] U dodatnim primerima izvođenja, DsiRNA sadrži:

gde je “X”=RNK, "X"=2’-O-metil RNK, i "D"=DNK. Gornji lanac je sens lanac i donji lanac je antisens lanac. Ovaj modifikacioni obrazac je takođe označen ovde kao "AS-M67*" ili "M67*" modifikacioni obrazac.

[0304] U dodatnim primerima izvođenja, DsiRNA sadrži:

1

gde je “X”=RNK, "X"=2’-O-metil RNK, i "D"=DNK. Gornji lanac je sens lanac i donji lanac je antisens lanac. Ovaj modifikacioni obrazac je takođe označen ovde kao "AS-M68*" ili "M68*" modifikacioni obrazac.

[0305] U dodatnim primerima izvođenja, DsiRNA sadrži:

gde je “X”=RNK, "X"=2’-O-metil RNK, i "D"=DNK. Gornji lanac je sens lanac i donji lanac je antisens lanac. Ovaj modifikacioni obrazac je takođe označen ovde kao "AS-M69*" ili "M69*" modifikacioni obrazac.

[0306] U dodatnim primerima izvođenja, DsiRNA sadrži:

gde je “X”=RNK, "X"=2’-O-metil RNK, i "D"=DNK. Gornji lanac je sens lanac i donji lanac je antisens lanac. Ovaj modifikacioni obrazac je takođe označen ovde kao "AS-M70*" ili "M70*" modifikacioni obrazac.

[0307] U dodatnim primerima izvođenja, DsiRNA sadrži:

gde je “X”=RNK, "X"=2’-O-metil RNK, i "D"=DNK. Gornji lanac je sens lanac i donji lanac je antisens lanac. Ovaj modifikacioni obrazac je takođe označen ovde kao "AS-M71*" ili "M71*" modifikacioni obrazac.

[0308] U dodatnim primerima izvođenja, DsiRNA sadrži:

11

gde je “X”=RNK, "X"=2’-O-metil RNK, i "D"=DNK. Gornji lanac je sens lanac i donji lanac je antisens lanac. Ovaj modifikacioni obrazac je takođe označen ovde kao "AS-M72*" ili "M72*" modifikacioni obrazac.

[0309] U dodatnim primerima izvođenja, DsiRNA sadrži:

gde je “X”=RNK, "X"=2’-O-metil RNK, i "D"=DNK. Gornji lanac je sens lanac i donji lanac je antisens lanac. Ovaj modifikacioni obrazac je takođe označen ovde kao "AS-M73*" ili "M73*" modifikacioni obrazac.

[0310] Dodatni primeri modifikacija antisens lanca obuhvataju sledeće:

11

gde je "X"=RNK, "X"=2’-O-metil RNK, "D"=DNK, "F"=2’-fluoro NA i "p"=fosforotioatna veza.

[0311] U određenim dodatnim primerima izvođenja, antisens lanac izabranih dsRNA otkrivenog pronalaska je proširen, izborno na 5’ kraju, sa primerom 5’ proširenja osnovnih "AS-M8", "AS-M17" i "AS-M48" modifikacionih obrazaca respektivno predstavljenih kao što sledi:

gde je "X"=RNK; "X"=2’-O-metil RNK; "F"=2’-Fluoro NA i "A" u boldu, italiku označava 2’-fluoro-adenin ostatak.

[0312] U određenim primerima izvođenja, sens lanac DsiRNA prema pronalasku je modifikovan - specifični primeri oblika modifikacija sens lanca su prikazani u daljem tekstu, i razmatrano je da takvi modifikovani sens lanci mogu biti supstituisani za sens lanac bilo koje od DsiRNA prikazanih u prethodnom tekstu da bi se generisala DsiRNA koja sadrži dole prikazani sens lanac koji se spaja sa gore prikazanim antisens lancem. Primeri modifikacionih obrazaca sens lanca obuhvataju:

11

��

[0313] Razmatra se da u određenim primerima izvođenja pronalaska, za sve ovde objavljene 2ʼ-O-metil obrasce modifikacije, bilo koje ili sva mesta 2ʼ-O-metil modifikacije mogu opciono biti zamenjena 2ʼ-Fluoro modifikacijom. Gore navedeni obrasci modifikacije se takođe mogu inkorporisati u, npr. produžene DsiRNA strukture i neusklađene i/ili iskrzane DsiRNA strukture opisane ispod.

[0314] U sledećem primeru izvođenja, DsiRNA sadrži lance koji imaju jednake dužine koji poseduju 1-3 neusklađena ostatka koji služe za orijentaciju Dicer isecanja (specifično, jedna ili više od pozicija 1, 2 ili 3 na prvom lancu DsiRNA, kada su numerisane od 3ʼ-terminalnog ostatka, su neusklađene sa odgovarajućim ostacima 5ʼ-terminalnog regiona na drugom lancu kada su prvi i drugi lanac vezani jedan za drugi). Pokazan je primer 27mer DsiRNA agensa sa dva terminalna neusklađena ostatka:

5ʼ-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX<M>M-3ʼ

3ʼ-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXMM-5ʼ

pri čemu "X"=RNK, "M"=ostaci nukleinske kiseline (RNK, DNK ili neprirodne ili modifikovane nukleinske kiseline) koji se bazno ne sparuju (vodonična veza) sa odgovarajućim "M" ostacima inače komplementarnog lanca kada su lanci vezani. Bilo koji od ostataka takvih agenasa opciono mogu biti 2ʼ-O-metil RNK monomeri - naizmenično pozicioniranje 2ʼ-O-metil RNK monomera koje započinje od 3ʼ-terminalnog ostatka donjeg (drugog) lanca, kao što je pokazano za gore navedene asimetrične agense, takođe se može upotrebljavati u gore navedenom "tupom/iskrzanom" DsiRNA agensu. U jednom primeru izvođenja, gornji lanac je sens lanac, i donji lanac je antisens lanac. Alternativno, donji lanac je sens lanac i gornji lanac je antisens lanac.

[0315] U određenim dopunskim primerima izvođenja, predmetni pronalazak obezbeđuje kompozicije za RNK interferenciju (RNAi) koje poseduju jedan ili više bazno sparenih dezoksiribonukleotida unutar regiona dvolančane ribonukleinske kiseline (dsRNA) koji su pozicionirani 3ʼ od projektovanog mesta Dicer isecanja sens lanca i odgovarajuće 5ʼ od projektovanog mesta Dicer isecanja antisens lanca. Kompozicije iz pronalaska sadrže dsRNA koja je prekursor molekul, tj., dsRNA iz predmetnog pronalaska se obrađuje in vivo kako bi se prizvela aktivna mala interferirajuća nukleinska kiselina (siRNA). dsRNA se obrađuje pomoću Dicer u aktivnu siRNA koja je inkorporisana u RISC.

12

[0316] U određenim primerima izvođenja, DsiRNA agensi iz pronalaska mogu imati sledeće primere strukture (napominjući da bilo koja od sledećih primera struktura može biti kombinovana, npr. sa obrascima modifikacija donjeg lanca gore opisanih struktura - u jednom specifičnom primeru, obrazac modifikacije donjeg lanca pokazan u bilo kojoj od gore navedenih struktura se primenjuje na 27 ostataka koji su najbliži 3ʼ donjeg lanca bilo koje od sledećih struktura; u sledećem specifičnom primeru, obrazac modifikacije donjeg lanca pokazan u bilo kojoj od gore navedenih struktura na 23 ostatka koji su najbliži 3ʼ donjeg lanca primenjuje se na 23 ostatka koji su najbliži 3ʼ donjeg lanca bilo koje od sledećih struktura):

U jednom takvom primeru izvođenja, DsiRNA sadrži sledeće (primer "desno-produžene", "DNK produžene" DsiRNA):

5ʼ-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXN*DNDD-3ʼ

3ʼ-YXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXN*DNXX-5ʼ

pri čemu "X"=RNK, "Y" je opcioni domen visećeg kraja koji se sastoji od 0-10 RNK monomera koji su opciono 2ʼ-O-metil RNK monomeri - u određenim primerima izvođenja, "Y" je domen visećeg kraja koji se sastoji od 1-4 RNK monomera koji su opciono 2ʼ-O-metil RNK monomeri, "D"=DNK, i "N"=1 do 50 ili više, ali je opciono 1-8 ili 1-10. "N*"=0 do 15 ili više, ali je opciono 0, 1, 2, 3, 4, 5 ili 6. U jednom primeru izvođenja, gornji lanac je sens lanac, i donji lanac je antisens lanac. Alternativno, donji lanac je sens lanac i gornji lanac je antisens lanac.

[0317] U povezanom primeru izvođenja, DsiRNA sadrži:

5ʼ-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXN*DNDD-3ʼ

3ʼ-YXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXN*DNDD-5ʼ

[0318] U dopunskom primeru izvođenja, DsiRNA sadrži:

5ʼ-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXN*DNDD-3ʼ

3ʼ-YXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXN*DNZZ-5ʼ

pri čemu "X" = RNK, "X" = 2ʼ-O-metil RNK, ""Y" je opcioni domen visećeg kraja koji se sastoji od 0-10 RNK monomera koji su opciono 2ʼ-O-metil RNK monomeri - u određenim primerima izvođenja, "Y" je domen visećeg kraja koji se sastoji od 1-4 RNK monomera koji su opciono 2ʼ-O-metil RNK monomeri, "D"=DNK, "Z"=DNK ili RNK, i "N"=1 do 50 ili više, ali je opciono 1-8 ili 1-10. "N*"=0 do 15 ili više, ali je opciono 0, 1, 2, 3, 4, 5 ili 6. U jednom primeru izvođenja, gornji lanac je sens lanac, i donji lanac je antisens lanac. Alternativno, donji lanac je sens lanac i gornji lanac je antisens lanac, sa 2ʼ-O-metil RNK monomerima lociranim na naizmeničnim ostacima duž gornjeg lanca, pre nego donjeg lanca kako je sada prikazano u gore navedenoj šemi.

[0319] U sledećem takvom primeru izvođenja, DsiRNA sadrži:

5ʼ-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXN*DNDD-3ʼ

3ʼ-YXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXN*DNZZ-5ʼ

pri čemu "X" = RNK, "X" = 2ʼ-O-metil RNK, "Y" je opcioni domen visećeg kraja koji se sastoji od 0-10 RNK monomera koji su opciono 2ʼ-O-metil RNK monomeri - u određenim primerima izvođenja, "Y" je domen visećeg kraja koji se sastoji od 1-4 RNK monomera koji su opciono 2ʼ-O-metil RNK monomeri, "D"=DNK, "Z"=DNK ili RNK, i "N"=1 do 50 ili više, ali je opciono 1-8 ili 1-10. "N*"=0 do 15 ili više, ali je opciono 0, 1, 2, 3, 4, 5 ili 6. U jednom primeru izvođenja, gornji lanac je sens lanac, i donji lanac je antisens lanac. Alternativno, donji lanac je sens lanac i gornji lanac je antisens lanac, sa 2ʼ-O-metil RNK monomerima lociranim na naizmeničnim ostacima duž gornjeg lanca, pre nego donjeg lanca kako je sada prikazano u gore navedenoj šemi.

[0320] U sledećem takvom primeru izvođenja, DsiRNA sadrži:

5ʼ-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXN*DNDD-3ʼ

3ʼ-YXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXN*DNZZ-5ʼ

pri čemu "X" = RNK, "X" = 2ʼ-O-metil RNK, "Y" je opcioni domen visećeg kraja koji se sastoji od 0-10 RNK monomera koji su opciono 2ʼ-O-metil RNK monomeri - u određenim primerima izvođenja, "Y" je domen visećeg kraja koji se sastoji od 1-4 RNK monomera koji su opciono 2ʼ-O-metil RNK monomeri, "D"=DNK, "Z"=DNK ili RNK, i "N"=1 do 50 ili više, ali je opciono 1-8 ili 1-10. "N*"=0 do 15 ili više, ali je opciono 0, 1, 2, 3, 4, 5 ili 6. U jednom primeru izvođenja, gornji lanac je sens lanac, i donji lanac je antisens lanac. Alternativno, donji lanac je sens lanac i

12

gornji lanac je antisens lanac, sa 2ʼ-O-metil RNK monomerima lociranim na naizmeničnim ostacima duž gornjeg lanca, pre nego donjeg lanca kako je sada prikazano u gore navedenoj šemi.

[0321] U sledećem primeru izvođenja, DsiRNA sadrži:

5ʼ-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXN*[X1/D1]NDD-3ʼ

3ʼ-YXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXN*[X2/D2]NZZ-5ʼ

pri čemu "X" = RNK, "Y" je opcioni domen visećeg kraja koji se sastoji od 0-10 RNK monomera koji su opciono 2ʼ-O-metil RNK monomeri - u određenim primerima izvođenja, "Y" je domen visećeg kraja koji se sastoji od 1-4 RNK monomera koji su opciono 2ʼ-O-metil RNK monomeri, "D"=DNK, "Z"=DNK ili RNK, i "N"=1 do 50 ili više, ali je opciono 1-8 ili 1-10, gde je najmanje jedan D1Nprisutan u gornjem lancu i bazno se sparuje sa odgovarajućim D2Nu donjem lancu. Opciono, D1Ni D1N+1se bazno sparuju sa odgovarajućim D2Ni D2N+1; D1N, D1N+1i D1N+2se bazno sparuju sa odgovarajućim D2N, D2N+1i D2N+2, itd. "N*"=0 do 15 ili više, ali je opciono 0, 1, 2, 3, 4, 5 ili 6. U jednom primeru izvođenja, gornji lanac je sens lanac, i donji lanac je antisens lanac. Alternativno, donji lanac je sens lanac i gornji lanac je antisens lanac, sa 2ʼ-O-metil RNK monomerima lociranim na naizmeničnim ostacima duž gornjeg lanca, pre nego donjeg lanca kako je sada prikazano u gore navedenoj šemi.

[0322] U ovde prikazanim strukturama, 5ʼ kraj bilo sens lanca ili antisens lanca može opciono sadržati fosfatnu grupu.

[0323] U sledećem primeru izvođenja, DNK:DNK produžena DsiRNA sadrži lance koji imaju jednake dužine koji poseduju 1-3 neusklađena ostatka koji služe za orijentaciju Dicer isecanja (specifično, jedna ili više od pozicija 1, 2 ili 3 na prvom lancu DsiRNA, kada su numerisane od 3ʼ-terminalnog ostatka, su neusklađene sa odgovarajućim ostacima 5ʼ-terminalnog regiona na drugom lancu kada su prvi i drugi lanac vezani jedan za drugi). Pokazan je primer DNK:DNK produženog DsiRNA agensa sa dva terminalna neusklađena ostatka:

M-3ʼ

5ʼ-DNXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXM

N*

3ʼ-DNXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXN*MM-5ʼ

pri čemu "X"=RNK, "M"=ostaci nukleinske kiseline (RNK, DNK ili neprirodne ili modifikovane nukleinske kiseline) koji se bazno ne sparuju (vodonična veza) sa odgovarajućim "M" ostacima inače komplementarnog lanca kada su lanci vezani, "D"=DNK i "N"=1 do 50 ili više, ali je opciono 1-15 ili, opciono, 1-8. "N*"=0 do 15 ili više, ali je opciono 0, 1, 2, 3, 4, 5 ili 6. Bilo koji

12

od ostataka takvih agenasa opciono mogu biti 2ʼ-O-metil RNK monomeri - naizmenično pozicioniranje 2ʼ-O-metil RNK monomera koje započinje od 3ʼ-terminalnog ostatka donjeg (drugog) lanca, kao što je pokazano za gore navedene asimetrične agense, takođe se može upotrebljavati u gore navedenom "tupom/iskrzanom" DsiRNA agensu. U jednom primeru izvođenja, gornji lanac (prvi lanac) je sens lanac, i donji lanac (drugi lanac) je antisens lanac. Alternativno, donji lanac je sens lanac i gornji lanac je antisens lanac. Modifikacija i DNK:DNK produžetak obrasci koji su paralelni onima pokazanim iznad za asimetrične/agense sa visećim krajem takođe se mogu inkorporisati u takve "tupe/iskrzane" agense.

[0324] U jednom primeru izvođenja, obezbeđen je DsiRNA agens sa produženom dužinom koji sadrži dezoksiribonukleotide pozicionirane na mestima koja su oblikovana da funkcionišu putem specifičnog usmeravanja Dicer isecanja, ali koji ne zahtevaju prisustvo bazno sparenog dezoksiribonukleotida u dsRNA strukturi. Pokazan je primer strukture za takav molekul:

5ʼ-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXDDXX-3ʼ

3ʼ-YXXXXXXXXXXXXXXXXXDDXXXX-5ʼ

pri čemu "X"=RNK, "Y" je opcioni domen visećeg kraja koji se sastoji od 0-10 RNK monomera koji su opciono 2ʼ-O-metil RNK monomeri - u određenim primerima izvođenja, "Y" je domen visećeg kraja koji se sastoji od 1-4 RNK monomera koji su opciono 2ʼ-O-metil RNK monomeri, i "D"=DNK. U jednom primeru izvođenja, gornji lanac je sens lanac, i donji lanac je antisens lanac. Alternativno, donji lanac je sens lanac i gornji lanac je antisens lanac. Gore navedena struktura je oblikovana tako da primorava Dicer da iseca minimum 21mer dupleks kao svoj primarni oblik posle obrade. U primerima izvođenja gde je donji lanac gore navedene strukture antisens lanac, pozicioniranje dva dezoksiribonukleotidna ostatka na poslednjem i pretposlednjem ostatku 5ʼ kraja antisens lanca pomoći će u redukovanju ne-target efekata (kao što su prethodne studije pokazale 2ʼ-O-metil modifikacija najmanje pretposlednje pozicije sa 5ʼ terminusa antisens lanca radi redukovanja ne-target efekata; videti, npr. US 2007/0223427).

[0325] U jednom primeru izvođenja, DsiRNA sadrži sledeće (primer "levo-produžene", "DNK produžene" DsiRNA):

5ʼ-DNXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXN*Y-3ʼ

3ʼ-DNXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXN*-5ʼ

pri čemu "X"=RNK, "Y" je opcioni domen visećeg kraja koji se sastoji od 0-10 RNK monomera koji su opciono 2ʼ-O-metil RNK monomeri - u određenim primerima izvođenja, "Y" je domen

12

visećeg kraja koji se sastoji od 1-4 RNK monomera koji su opciono 2ʼ-O-metil RNK monomeri, "D"=DNK, i "N"=1 do 50 ili više, ali je opciono 1-8 ili 1-10. "N*"=0 do 15 ili više, ali je opciono 0, 1, 2, 3, 4, 5 ili 6. U jednom primeru izvođenja, gornji lanac je sens lanac, i donji lanac je antisens lanac. Alternativno, donji lanac je sens lanac i gornji lanac je antisens lanac.

[0326] U povezanom primeru izvođenja, DsiRNA sadrži:

5ʼ-DNXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXN*DD-3ʼ

3ʼ-DNXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXN*XX-5ʼ

pri čemu "X"=RNK, opciono 2ʼ-O-metil RNK monomeri "D"=DNK, "N"=1 do 50 ili više, ali je opciono 1-8 ili 1-10. "N*"=0 do 15 ili više, ali je opciono 0, 1, 2, 3, 4, 5 ili 6. U jednom primeru izvođenja, gornji lanac je sens lanac, i donji lanac je antisens lanac. Alternativno, donji lanac je sens lanac i gornji lanac je antisens lanac.

[0327] U dopunskom primeru izvođenja, DsiRNA sadrži:

5ʼ-DNXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXN*DD-3ʼ

3ʼ-DNXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXN*ZZ-5ʼ

pri čemu "X"=RNK, opciono 2ʼ-O-metil RNK monomeri "D"=DNK, "N"=1 do 50 ili više, ali je opciono 1-8 ili 1-10. "N*"=0 do 15 ili više, ali je opciono 0, 1, 2, 3, 4, 5 ili 6. "Z"=DNK ili RNK. U jednom primeru izvođenja, gornji lanac je sens lanac, i donji lanac je antisens lanac. Alternativno, donji lanac je sens lanac i gornji lanac je antisens lanac, sa 2ʼ-O-metil RNK monomerima lociranim na naizmeničnim ostacima duž gornjeg lanca, pre nego donjeg lanca kako je sada prikazano u gore navedenoj šemi.

[0328] U sledećem takvom primeru izvođenja, DsiRNA sadrži:

5ʼ-DNXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXN*DD-3ʼ

3ʼ-DNXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXN*ZZ-5ʼ

12

[0329] U sledećem takvom primeru izvođenja, DsiRNA sadrži:

5ʼ-DNZZXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXN*DD-3ʼ

3ʼ-DNXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXN*ZZ-5ʼ

pri čemu "X"=RNK, "X"=2ʼ-O-metil RNK, "D"=DNK, "Z"= DNK ili RNK, i "N"=1 do 50 ili više, ali je opciono 1-8 ili 1-10. "N*"=0 do 15 ili više, ali je opciono 0, 1, 2, 3, 4, 5 ili 6. U jednom primeru izvođenja, gornji lanac je sens lanac, i donji lanac je antisens lanac. Alternativno, donji lanac je sens lanac i gornji lanac je antisens lanac, sa 2ʼ-O-metil RNK monomerima lociranim na naizmeničnim ostacima duž gornjeg lanca, pre nego donjeg lanca kako je sada prikazano u gore navedenoj šemi.

[0330] U sledećem takvom primeru izvođenja, DsiRNA sadrži:

5ʼ-DNZZXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXN*Y-3ʼ

3ʼ-DNXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXN*-5ʼ

pri čemu "X"=RNK, "X"=2ʼ-O-metil RNK, "D"=DNK, "Z"=DNK ili RNK, i "N"=1 do 50 ili više, ali je opciono 1-8 ili 1-10. "N*"=0 do 15 ili više, ali je opciono 0, 1, 2, 3, 4, 5 ili 6. "Y" je opcioni domen visećeg kraja koji se sastoji od 0-10 RNK monomera koji su opciono 2ʼ-O-metil RNK monomeri - u određenim primerima izvođenja, "Y" je domen visećeg kraja koji se sastoji od 1-4 RNK monomera koji su opciono 2ʼ-O-metil RNK monomeri. U jednom primeru izvođenja, gornji lanac je sens lanac, i donji lanac je antisens lanac. Alternativno, donji lanac je sens lanac i gornji lanac je antisens lanac, sa 2ʼ-O-metil RNK monomerima lociranim na naizmeničnim ostacima duž gornjeg lanca, pre nego donjeg lanca kako je sada prikazano u gore navedenoj šemi.

[0331] U sledećem primeru izvođenja, DsiRNA sadrži:

5ʼ-[X1/D1]NXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXN*DD-3ʼ

3ʼ-[X2/D2]NXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXN*ZZ-5ʼ

pri čemu "X"=RNK, "D"=DNK, "Z"=DNK ili RNK, i "N"=1 do 50 ili više, ali je opciono 1-8 ili 1-10, gde je najmanje jedan D1Nprisutan u gornjem lancu i bazno se sparuje sa odgovarajućim D2Nu donjem lancu. Opciono, D1Ni D1N+1se bazno sparuju sa odgovarajućim D2Ni D2N+1; D1N, D1N+1i D1N+2se bazno sparuju sa odgovarajućim D2N, D2N+1i D2N+2, itd. "N*"=0 do 15 ili više, ali je opciono 0, 1, 2, 3, 4, 5 ili 6. U jednom primeru izvođenja, gornji lanac je sens lanac, i

12

donji lanac je antisens lanac. Alternativno, donji lanac je sens lanac i gornji lanac je antisens lanac, sa 2ʼ-O-metil RNK monomerima lociranim na naizmeničnim ostacima duž gornjeg lanca, pre nego donjeg lanca kako je sada prikazano u gore navedenoj šemi.

[0332] U povezanom primeru izvođenja, DsiRNA sadrži:

5ʼ-[X1/D1]NXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXN*Y-3ʼ

3ʼ-[X2/D2]NXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXN*-5ʼ

pri čemu "X"=RNK, "D"=DNK, "Y" je opcioni domen visećeg kraja koji se sastoji od 0-10 RNK monomera koji su opciono 2ʼ-O-metil RNK monomeri - u određenim primerima izvođenja, "Y" je domen visećeg kraja koji se sastoji od 1-4 RNK monomera koji su opciono 2ʼ-O-metil RNK monomeri, i "N"=1 do 50 ili više, ali je opciono 1-8 ili 1-10, gde je najmanje jedan D1Nprisutan u gornjem lancu i bazno se sparuje sa odgovarajućim D2Nu donjem lancu. Opciono, D1Ni D1N+1se bazno sparuju sa odgovarajućim D2Ni D2N+1; D1N, D1N+1i D1N+2se bazno sparuju sa odgovarajućim D2N, D2N+1i D2N+2, itd. "N*"=0 do 15 ili više, ali je opciono 0, 1, 2, 3, 4, 5 ili 6. U jednom primeru izvođenja, gornji lanac je sens lanac, i donji lanac je antisens lanac. Alternativno, donji lanac je sens lanac i gornji lanac je antisens lanac, sa 2ʼ-O-metil RNK monomerima lociranim na naizmeničnim ostacima duž gornjeg lanca, pre nego donjeg lanca kako je sada prikazano u gore navedenoj šemi.

[0333] U sledećem primeru izvođenja, DNK:DNK produžena DsiRNA sadrži lance koji imaju jednake dužine koji poseduju 1-3 neusklađena ostatka koji služe za orijentaciju Dicer isecanja (specifično, jedna ili više od pozicija 1, 2 ili 3 na prvom lancu DsiRNA, kada su numerisane od 3ʼ-terminalnog ostatka, su neusklađene sa odgovarajućim ostacima 5ʼ-terminalnog regiona na drugom lancu kada su prvi i drugi lanac vezani jedan za drugi). Pokazan je primer DNK:DNK produženog DsiRNA agensa sa dva terminalna neusklađena ostatka:

5ʼ-DNXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXMM-3ʼ

N*

3ʼ-DNXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXN*MM-5ʼ

pri čemu "X"=RNK, "M"=ostaci nukleinske kiseline (RNK, DNK ili neprirodne ili modifikovane nukleinske kiseline) koji se bazno ne sparuju (vodonična veza) sa odgovarajućim "M" ostacima inače komplementarnog lanca kada su lanci vezani, "D"=DNK i "N"=1 do 50 ili više, ali je opciono 1-8 ili 1-10. "N*"=0 do 15 ili više, ali je opciono 0, 1, 2, 3, 4, 5 ili 6. Bilo koji od ostataka takvih agenasa opciono mogu biti 2ʼ-O-metil RNK monomeri - naizmenično pozicioniranje 2ʼ-O-metil RNK monomera koje započinje od 3ʼ-terminalnog ostatka donjeg

1

(drugog) lanca, kao što je pokazano za gore navedene asimetrične agense, takođe se može upotrebljavati u gore navedenom "tupom/iskrzanom" DsiRNA agensu. U jednom primeru izvođenja, gornji lanac (prvi lanac) je sens lanac, i donji lanac (drugi lanac) je antisens lanac. Alternativno, donji lanac je sens lanac i gornji lanac je antisens lanac. Modifikacija i DNK:DNK produžetak obrasci koji su paralelni onima pokazanim iznad za asimetrične/agense sa visećim krajem takođe se mogu inkorporisati u takve "tupe/iskrzane" agense.

[0334] U sledećem primeru izvođenja, obezbeđen je DsiRNA agens sa produženom dužinom koji sadrži dezoksiribonukleotide pozicionirane na mestima koja su oblikovana tako da funkcionišu putem specifičnog usmeravanja Dicer isecanja, ali koji ne zahtevaju prisustvo bazno sparenog dezoksiribonukleotida u dsRNA strukturi. Pokazani su primeri strukture za takav molekul:

5ʼ-XXDDXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXN*Y-3ʼ

3ʼ-DDXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXN*-5ʼ

ili

5ʼ-XDXDXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXN*Y-3ʼ

3ʼ-DXDXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXN*-5ʼ

pri čemu "X"=RNK, "Y" je opcioni domen visećeg kraja koji se sastoji od 0-10 RNK monomera koji su opciono 2ʼ-O-metil RNK monomeri - u određenim primerima izvođenja, "Y" je domen visećeg kraja koji se sastoji od 1-4 RNK monomera koji su opciono 2ʼ-O-metil RNK monomeri, i "D"=DNK. "N*"=0 do 15 ili više, ali je opciono 0, 1, 2, 3, 4, 5 ili 6. U jednom primeru izvođenja, gornji lanac je sens lanac, i donji lanac je antisens lanac. Alternativno, donji lanac je sens lanac i gornji lanac je antisens lanac.

[0335] U bilo kom od gore navedenih primera izvođenja gde je donji lanac gore navedene strukture antisens lanac, pozicioniranje dva dezoksiribonukleotidna ostatka na poslednjem i pretposlednjem ostatku 5ʼ kraja antisens lanca pomoći će u redukovanju ne-target efekata (kao što su prethodne studije pokazale 2ʼ-O-metil modifikacija najmanje pretposlednje pozicije sa 5ʼ terminusa antisens lanca radi redukovanja ne-target efekata; videti, npr. US 2007/0223427).

[0336] U određenim primerima izvođenja, "D" ostaci gore navedenih struktura uključuju najmanje jednu PS-DNK ili PS-RNK. Opciono, "D" ostaci gore navedenih struktura uključuju najmanje jedan modifikovani nukleotid koji inhibira Dicer isecanje.

1 1

[0337] Dok se gore opisani "DNK produženi" DsiRNA agensi mogu kategorizovati bilo kao "levo-produženi " ili "desno-produženi", DsiRNA agensi koji sadrže i levo i desno produžene sekvence koje sadrže DNK unutar jednog agensa (npr. oba boka koji okružuju dsRNA strukturu jezgra su dsDNA produžeci) mogu takođe da se generišu i upotrebljavaju na sličan način onima koji su ovde opisani za "desno-produžene" i "levo-produžene" agense.

[0338] U nekim primerima izvođenja, DsiRNA iz trenutnog pronalaska dodatno sadrži vezujuću grupu ili domen koji spaja sens i antisens lance DNK:DNK produženog DsiRNA agensa. Opciono, takav domen vezujuće grupe spaja 3ʼ kraj sens lanca i 5ʼ kraj antisens lanca. Vezujuća grupa može biti hemijski (nenukleotidni) linker, kao što je oligometilenediol linker, oligoetilen glikol linker, ili neka druga u struci prepoznata linker grupa. Alternativno, linker može biti nukleotidni linker, opciono uključujući produženu petlju i/ili tetrapetlju.

[0339] U jednom primeru izvođenja, DsiRNA agens ima asimetričnu strukturu, pri čemu sens lanac ima dužinu od 25 baznih parova, i antisens lanac ima dužinu od 27 baznih parova sa 3ʼ-visećim krajem od 1-4 baze (npr. 3ʼ-viseći kraj od jedne baze, 3ʼ-viseći kraj od dve baze, 3ʼ-viseći kraj od tri baze ili 3ʼ-viseći kraj od četiri baze). U sledećem primeru izvođenja, ovaj DsiRNA agens ima asimetričnu strukturu koja dodatno sadrži 2 dezoksinukleotida na 3ʼ kraju sens lanca.

[0340] U sledećem primeru izvođenja, DsiRNA agens ima asimetričnu strukturu, pri čemu antisens lanac ima dužinu od 25 baznih parova, i sens lanac ima dužinu od 27 baznih parova sa 3ʼ-visećim krajem od 1-4 baze (npr. 3ʼ-viseći kraj od jedne baze, 3ʼ-viseći kraj od dve baze, 3ʼ-viseći kraj od tri baze ili 3ʼ-viseći kraj od četiri baze). U sledećem primeru izvođenja, ovaj DsiRNA agens ima asimetričnu strukturu koja dodatno sadrži 2 dezoksinukleotida na 3ʼ kraju antisens lanca.

[0341] Primeri DsiRNA agenasa iz pronalaska koji ciljno deluju na glikolat oksidazu, i njihove povezane target sekvence glikolat oksidaze, uključujući sledeće, predstavljene u dole navedenoj seriji tabela:

Broj tabele:

(2) Odabrani humani anti-glikolat oksidaza DsiRNA agensi (asimetrici);

(3) Odabrane humane anti-glikolat oksidaza DsiRNA, nemodifikovani dupleksi (asimetrici);

(4) DsiRNA target sekvence (21mer) u iRNK glikolat oksidaze;

(5) Odabrane humane anti-glikolat oksidaza "tupe/tupe" DsiRNA; i

(6) DsiRNA komponenta target sekvenci od 19 nukleotida u iRNK glikolat oksidaze

1 2

(7) Humane anti-glikolat oksidaza DsiRNA za koje se predviđa da će imati >50% nokdaun efikasnosti (asimetrici);

(8) DsiRNA target sekvence (21mer) humanih anti-glikolat oksidaza DsiRNA za koje se predviđa da će imati >50% nokdaun efikasnosti;

(9) "Tupe/tupe" DsiRNA koje odgovaraju humanim anti-glikolat oksidaza DsiRNA za koje se predviđa da će imati >50% nokdaun efikasnosti; i

(10) DsiRNA komponenta target sekvenci od 19 nukleotida humanih anti-glikolat oksidaza DsiRNA za koje se predviđa da će imati >50% nokdaun efikasnosti.

Tabela 2: Izabrana humana DsiRNA sredstva anti-glikolat oksidaze (asimetričnost)

1

��

�

��

�

11

��

�

��

�

Tabela 3: Izabrane humane DsiRNA anti-glikolat oksidaze, nemodifikovani dupleksi

(asimetričnost)

1

�

11

��

�

��

�

11

��

�

��

�

Tabela 4: Target sekvence DsiRNA (21meri) u iRNK glikolat oksidaze

1

�

11

��

�

��

�

Tabela 5: Izabrane humane „tupe/tupe“ DsiRNA anti-glikolat oksidaze

1

�

11

��

�

��

�

21

22

�

��

�

Tabela 6: Nukleotidne taret sekvence DsiRNA komponente 19 u iRNK likolat oksidaze

2

21

22

�

21

22

�

��

�

��

Tabela 7: Humane DsiRNA anti-glikolat oksidaze za koje je predviđeno da imaju >50% “knockdown” efikasnosti (asimetričnost)

2

21

22

�

��

�

21

22

�

��

�

21

22

�

��

�

21

22

�

��

�

21

22

�

��

�

11

��

�

��

�

21

22

�

��

�

41

42

�

44

�

Tabela 8: Target sekvence DsiRNA (21meri) humanih DsiRNA anti-glikolat oksidaze za koje je predviđeno da imaju >50% „knockdown“ efikasnost

1

2

4

1

2

4

1

2

4

1

2

4

Tabela 9: “Tupe/tupe” DsiRNA koje odgovaraju humanim DsiRNA anti-glikolat oksidaze za koje je predviđeno da imaju >50% “knockdown” efikasnosti

�

41

42

�

44

�

41

42

�

41

42

�

44

�

44

�

41

42

�

44

�

41

42

�

44

�

41

42

�

44

�

41

42

�

44

�

41

42

�

44

�

1

11

12

1

14

1

2

21

22

2

24

2

1

2

4

41

42

4

44

4

1

2

4

1

2

4

1

2

4

1

2

4

1

2

4

1

2

4

1

11

12

1

14

1

2

21

22

2

24

2

1

2

4

DsiRNAmm sens lanac: 5’-XXXXXXXXBXXXXXXXXXXXXXXDD-3’ DsiRNAmm antisens lanac: 3’-XXXXXXXXXXEXXXXXXXXXXXXXXXX-5’

pri čemu "X"=RNK, "D"=DNK i "E"=ostaci nukleinske kiseline (RNK, DNK ili neprirodne ili modifikovane nukleinske kiseline) koji se bazno ne sparuju (vodonična veza) sa odgovarajućim "A" RNK ostacima inače komplementarnog (targat) lanca kada su lanci vezani, ali se opciono bazno sparuju sa odgovarajućim "B" ostacima ("B" ostaci su takođe RNK, DNK ili neprirodne ili modifikovane nukleinske kiseline). Bilo koji od ostataka takvih agenasa opciono mogu biti 2ʼ-O-metil RNK monomeri - naizmenično pozicioniranje 2ʼ-O-metil RNK monomera koje započinje od 3ʼ-terminalnog ostatka donjeg (drugog) lanca, kao što je pokazano iznad, takođe se može upotrebljavati u gore navedenim DsiRNA agensima.

[0360] U određenim primerima izvođenja, vodič lanac dsRNA iz objave koji je dovoljno komplementaran sa target RNK (npr. iRNK) duž najmanje 19 nukleotida target sekvence gena kako bi se redukovala ekspresija target gena nije savršeno komplementaran sa sekvencom target gena dužine najmanje 19 nukleotida. Umesto toga, ceni se da vodič lanac dsRNA iz objave koji je dovoljno komplementaran sa target iRNK duž najmanje 19 nukleotida target RNK sekvence kako bi se redukovala ekspresija target gena može imati jedan, dva, tri ili čak četiri ili više nukleotida koji su neusklađeni sa sekvencom target lanca od 19 nukleotida ili dužom. Stoga, za target RNK sekvencu od 19 nukleotida, vodič lanac dsRNA iz objave može biti dovoljno komplementaran sa target RNK sekvencom kako bi se redukovali nivoi target gena dok poseduje, npr. samo 15/19, 16/19, 17/19 ili 18/19 usklađenih nukleotidnih ostataka između vodič lanca i target RNK sekvence.

[0361] Pored struktura navedenih gore kao primer, dsRNA iz objave takođe mogu da poseduju jedan, dva ili tri dopunska ostatka koji formiraju dodatne neusklađenosti sa target RNK sekvencom glikolat oksidaze. Takve neusklađenosti mogu biti uzastopne, ili mogu biti prošarane sa nukleotidima koji formiraju sparene bazne parove sa target RNK sekvencom glikolat oksidaze. Gde su prošarani sa nukleotidima koji formiraju usklađene bazne parove, neusklađeni ostaci mogu biti razmaknuti jedan od drugog unutar jednog lanca u razmaku od jednog, dva, tri, četiri, pet, šest, sedam ili čak osam bazno sparenih nukleotida između takvih ostataka koji formiraju neusklađenost.

[0362] Što se tiče DsiRNAmm agenasa opisanih iznad, poželjna lokacija unutar dsRNA (npr. dsiRNA) za nukleotide antisens lanca koji formiraju neusklađene bazne parove sa target RNK sekvencom glikolat oksidaze (ali mogu ili ne moraju formirati neusklađenosti sa odgovarajućim nukleotidima sens lanca) je unutar regiona antisens lanca koji je lociran 3ʼ (nizvodno) od sekvence antisens lanca koja je komplementarna sa projektovanim Ago2 mestom preseka DsiRNA (npr. na Slici 1, region antisens lanca koji je 3ʼ od projektovanog Ago2 mesta preseka je poželjan za ostatke koji formiraju neusklađenost i slučajno je lociran na pozicijama 17-23 antisens lanca za 25/27mer agens pokazan na Slici 1). Stoga, u jednom primeru izvođenja, pozicija neusklađenog nukleotida (u odnosu na target RNK sekvencu glikolat oksidaze) antisens lanca DsiRNAmm je nukleotidni ostatak antisens lanca koji je lociran neposredno 3ʼ (nizvodno) unutar sekvence antisens lanca projektovanog Ago2 mesta isecanja odgovarajuće target RNK sekvence glikolat oksidaze. U drugim poželjnim primerima izvođenja, neusklađeni nukleotid antisens lanca DsiRNAmm (u odnosu na target RNK sekvencu glikolat oksidaze) pozicioniran je na nukleotidnom ostatku antisens lanca koji je lociran dva nukleotida 3ʼ (nizvodno) od odgovarajućeg projektovanog Ago2 mesta isecanja, tri nukleotida 3ʼ (nizvodno) od odgovarajućeg projektovanog Ago2 mesta isecanja, četiri nukleotida 3ʼ (nizvodno) od odgovarajućeg projektovanog Ago2 mesta isecanja, pet nukleotida 3ʼ (nizvodno) od odgovarajućeg projektovanog Ago2 mesta isecanja, šest nukleotida 3ʼ (nizvodno) od projektovanog Ago2 mesta isecanja, sedam nukleotida 3ʼ (nizvodno) od projektovanog Ago2 mesta isecanja, osam nukleotida 3ʼ (nizvodno) od projektovanog Ago2 mesta isecanja, ili devet nukleotida 3ʼ (nizvodno) od projektovanog Ago2 mesta isecanja.

[0363] U dsRNA agensima koji poseduju dva nukleotida antisens lanca koji formiraju neusklađenost (gde nukleotidi koji formiraju neusklađenost formiraju neusklađenost u odnosu na target RNK sekvencu glikolat oksidaze), neusklađenosti se mogu javiti uzastopno (npr. na uzastopnim pozicijama duž nukleotidne sekvence antisens lanca). Alternativno, nukleotidi antisens lanca koji formiraju neusklađene bazne parove sa target RNK sekvencom glikolat oksidaze mogu biti prošarani sa nukleotidima koji se bazno sparuju sa target RNK sekvencom glikolat oksidaze (npr. za DsiRNA koja poseduje nukleotide koji formiraju neusklađenost na pozicijama 17 i 20 (počevši od 5ʼ terminusa (pozicija 1) antisens lanca 25/27mer agensa pokazanog na Slici 1), ali ne na pozicijama 18 i 19, neusklađeni ostaci pozicija sens lanca 17 i 20 su prošarani sa dva nukleotida koji formiraju usklađene bazne parove sa odgovarajućim ostacima target RNK sekvence glikolat oksidaze). Na primer, dva ostatka antisens lanca (koji su locirani unutar regiona tolerantnog na neusklađenost antisens lanca) koji formiraju neusklađene bazne parove sa odgovarajućom target RNK sekvencom glikolat oksidaze mogu se javiti sa nula, jednim, dva, tri, četiri ili pet usklađenih baznih parova (u odnosu na target RNK sekvencu glikolat oksidaze) koji su locirani između ovih baznih parova koji formiraju neusklađenost.

[0364] Za određene dsRNA koje poseduju tri bazna para koji formiraju neusklađenost (koji formiraju neusklađenost u odnosu na target RNK sekvencu glikolat oksidaze), nukleotidi koji formiraju neusklađenost mogu se javiti uzastopno (npr. u tripletu duž nukleotidne sekvence antisens lanca). Alternativno, nukleotidi antisens lanca koji formiraju neusklađene bazne parove sa target RNK sekvencom glikolat oksidaze mogu biti prošarani sa nukleotidima koji formiraju usklađene bazne parove sa target RNK sekvencom glikolat oksidaze (npr. za DsiRNA koja poseduje neusklađene nukleotide na pozicijama 17, 18 i 22, ali ne na pozicijama 19, 20 i 21, ostaci koji formiraju neusklađenost na pozicijama antisens lanca 17 i 18 su susedni jedan drugom, dok su ostaci koji formiraju neusklađenost na pozicijama antisens lanca 18 i 22 prošarani sa tri nukleotida koji formiraju usklađene bazne parove sa odgovarajućim ostacima target RNK glikolat oksidaze). Na primer, tri ostatka antisens lanca (koji su locirani unutar regiona tolerantnog na neusklađenost antisens lanca) koji formiraju neusklađene bazne parove sa odgovarajućom target RNK sekvencom glikolat oksidaze mogu se javiti sa nula, jednim, dva, tri ili četiri usklađena bazna para koji su locirani između bilo koja dva od ovih baznih parova koji formiraju neusklađenost.

[0365] Za određene dsRNA koje poseduju četiri bazna para koji formiraju neusklađenost (koji formiraju neusklađenost u odnosu na target RNK sekvencu glikolat oksidaze), nukleotidi koji formiraju neusklađenost mogu se javiti uzastopno (npr. u kvadripletu duž nukleotidne sekvence sens lanca). Alternativno, nukleotidi antisens lanca koji formiraju neusklađene bazne parove sa target RNK sekvencom glikolat oksidaze mogu biti prošarani sa nukleotidima koji formiraju usklađene bazne parove sa target RNK sekvencom glikolat oksidaze (npr. za dsiRNA koja poseduje nukleotide koji formiraju neusklađenost na pozicijama 17, 19, 21 i 22, ali ne na pozicijama 18 i 20, ostaci koji formiraju neusklađenost na pozicijama antisens lanca 21 i 22 su susedni jedan drugom, dok su ostaci koji formiraju neusklađenost na pozicijama antisens lanca 17 i 19 prošarani sa jednim nukleotidom koji formira usklađeni bazni par sa odgovarajućim ostatkom target RNK sekvence glikolat oksidaze - slično, ostaci koji formiraju neusklađenost na pozicijama antisens lanca 19 i 21 takođe su prošarani sa jednim nukleotidom koji formira usklađeni bazni par sa odgovarajućim ostatkom target RNK sekvence glikolat oksidaze). Na primer, četiri ostatka antisens lanca (koji su locirani unutar regiona tolerantnog na neusklađenost antisens lanca) koji formiraju neusklađene bazne parove sa odgovarajućom target RNK sekvencom glikolat oksidaze mogu se javiti sa nula, jednim, dva ili tri usklađena bazna para koji su locirani između bilo koja dva od ovih baznih parova koji formiraju neusklađenost.

[0366] Gore navedene DsiRNAmm i druge dsRNA strukture opisane su kako bi se ilustrovale određene strukture DsiRNAmm i dsRNA agenasa. Dizajn gore navedenih DsiRNAmm i dsRNA struktura može se prilagoditi da generiše, npr. DsiRNAmm oblike drugih DsiRNA struktura pokazanih infra. Kao što je navedeno gore kao primer, dsRNA takođe mogu biti dizajnirane da poseduju pojedinačne neusklađenosti (ili dve, tri ili četiri neusklađenosti) između antisens lanca dsRNA i target sekvence, ali opciono mogu zadržati savršenu komplementarnost između sekvenci sens i antisens lanca dsRNA.

[0367] Dodatno je primećeno da dsRNA agensi pokazani kao primer infra takođe mogu da poseduju strukture insercije/delecije (in/del) unutar svojih dvolančanih i/ili struktura poravnatih sa target RNK glikolat oksidaze. U skladu sa tim, dsRNA iz objave mogu biti dizajnirane da poseduju in/del varijacije, npr. sekvence antisens lanca u poređenju sa target RNK sekvencom glikolat oksidaze i/ili sekvence antisens lanca u poređenju sa sekvencom sens lanca, sa poželjnom lokacijom(ama) za postavljanje takvih in/del nukleotida koji odgovaraju gore opisanim lokacijama za pozicioniranje neusklađenih i/ili baznih parova koji formiraju neusklađenost.

[0368] Takođe je primećeno da DsiRNA iz trenutnog pronalaska mogu tolerisati neusklađenosti unutar 3ʼ-terminalnog regiona sens lanca/5ʼ-terminalnog regiona antisens lanca, pošto je ovaj region oblikovan da bude obrađen pomoću Dicer i oslobođen od sekvence vodič lanca koji se nalazi u RISC. Primeri DsiRNA struktura iz pronalaska koje nose takve neusklađenosti uključuju sledeće:

Target RNK sekvenca: 5’- .. . XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXHXXX. . .-3’ DsiRNA sens lanac: 5’-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXIXDD-3’ DsiRNA antisens lanac: 3’-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXJXXX-5’

Target RNK sekvenca: 5’-. . . XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXHXX.. .-3’ DsiRNA sens lanac: 5’-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXIDD-3’ DsiRNA antisens lanac: 3’-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXJXX-5’

Target RNK sekvenca: 5’-. . . XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXHX .. .-3’ DsiRNA sens lanac: 5’-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXID-3’ DsiRNA antisens lanac: 3’-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXJX-5’

Target RNK sekvenca: 5’-. . . XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXH .. .-3’ DsiRNA sens lanac: 5’-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXDI-3’ DsiRNA antisens lanac: 3’-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXJ-5ʼ

pri čemu "X"=RNK, "D"=DNK i "I" i "J"=ostaci nukleinske kiseline (RNK, DNK ili neprirodne ili modifikovane nukleinske kiseline) koji se bazno ne sparuju (vodonična veza) jedan sa drugim, ali je opciono "J" komplementaran sa nukleotidom "H" target RNK sekvence. Bilo koji od ostataka takvih agenasa opciono mogu biti 2ʼ-O-metil RNK monomeri - naizmenično pozicioniranje 2ʼ-O-metil RNK monomera koje započinje od 3ʼ-terminalnog ostatka donjeg

4

(drugog) lanca, kao što je pokazano iznad - ili bilo koji od gore opisanih obrazaca metilacije -takođe se mogu upotrebljavati u gore navedenim DsiRNA agensima. Gore navedene neusklađenosti takođe se mogu kombinovati unutar DsiRNA iz trenutnog pronalaska.

[0369] U dole navedenim strukturama, takve neusklađenosti su uvedene unutar asimetrične HAO1-1171 DsiRNA (novouvedeni neusklađeni ostaci su u kurzivu):

HAO1-1171 25/27mer DsiRNA, neusklađena pozicija = 19 sens lanca (od 5’-terminusa)

5’-AUAUUUUCCCAUCUGUAU<A>AUUUtt-3’ (SEQ ID NO: 3460)

3’-GUUAUAAAAGGGUAGACAUAAUAAAAA-5’ (SEQ ID NO: 580)

Opciono, neusklađeni ’A’ ostatak pozicije 19 sens lanca je alternativno ’C’ ili ’G’.

HAO1-1171 25/27mer DsiRNA, neusklađena pozicija = 20 sens lanca (od 5’-terminusa)

5’-AUAUUUUCCCAUCUGUAUUUUUtt-3’ (SEQ ID NO: 3461)

3’-GUUAUAAAAGGGUAGACAUAAUAAAAA-5’ (SEQ ID NO: 580)

Opciono, neusklađeni ’U’ ostatak pozicije 20 sens lanca je alternativno ’C’ ili ’G’.

HAO1-1171 25/27mer DsiRNA, neusklađena pozicija = 21 sens lanca (od 5’-terminusa)

5’-AUAUUUUCCCAUCUGUAUUA<A>UUtt-3’ (SEQ ID NO: 3462)

3’-GUUAUAAAAGGGUAGACAUAAUAAAAA-5’ (SEQ ID NO: 580)

Opciono, neusklađeni ’A’ ostatak pozicije 21 sens lanca je alternativno ’C’ ili ’G’.

HAO1-1171 25/27mer DsiRNA, neusklađena pozicija = 22 sens lanca (od 5’-terminusa)

5’-AUAUUUUCCCAUCUGUAUUAU<G>Utt-3’ (SEQ ID NO: 3463)

3’-GUUAUAAAAGGGUAGACAUAAUAAAAA-5’ (SEQ ID NO: 580)

Opciono, neusklađeni ’G’ ostatak pozicije 22 sens lanca je alternativno’A’ ili ’C’.

HAO1-1171 25/27mer DsiRNA, neusklađena pozicija = 23 sens lanca (od 5’-terminusa)

41

5’-AUAUUUUCCCAUCUGUAUUAUU<A>tt-3’ (SEQ ID NO: 3464)

3’-GUUAUAAAAGGGUAGACAUAAUAAAAA-5’ (SEQ ID NO: 580)

Opciono, neusklađeni ’A’ ostatak pozicije 23 sens lanca je alternativno ’C’ ili ’G’.

HAO1-1171 25/27mer DsiRNA, neusklađena pozicija = 24 sens lanca (od 5’-terminusa)

5’-AUAUUUUCCCAUCUGUAUUAUUU<g>t-3’ (SEQ ID NO: 3465)

3’-GUUAUAAAAGGGUAGACAUAAUAAAAA-5’ (SEQ ID NO: 580)

Opciono, neusklađeni ’g’ ostatak pozicije 24 sens lanca je alternativno’a’ ili ’c’.

HAO1-1171 25/27mer DsiRNA, neusklađena pozicija = 25 sens lanca (od 5’-terminusa)

5’-AUAUUUUCCCAUCUGUAUUAUUUt<a>-3’ (SEQ ID NO: 3466)

3’-GUUAUAAAAGGGUAGACAUAAUAAAAA-5’ (SEQ ID NO: 580)

Opciono, neusklađeni ’a’ ostatak pozicije 25 sens lanca je alternativno ’c’ ili ’g’.

HAO1-1171 25/27mer DsiRNA, neusklađena pozicija = 1 antisens lanca (od 5’-terminusa)

5’-AUAUUUUCCCAUCUGUAUUAUUUt<t>-3’ (SEQ ID NO: 196)

3’-GUUAUAAAAGGGUAGACAUAAUAAAAU-5’ (SEQ ID NO: 3467)

Opciono, neusklađeni ’U’ ostatak pozicije 1 antisens lanca je alternativno ’G’ ili ’C’.

HAO1-1171 25/27mer DsiRNA, neusklađena pozicija = 2 antisens lanca (od 5’-terminusa)

5’-AUAUUUUCCCAUCUGUAUUAUUU<t>t-3’ (SEQ ID NO: 196)

3’-GUUAUAAAAGGGUAGACAUAAUAAACA-5’ (SEQ ID NO: 3468)

Opciono, neusklađeni ’C’ ostatak pozicije 2 antisens lanca je alternativno ’U’ ili ’G’.

HAO1-1171 25/27mer DsiRNA, neusklađena pozicija = 3 antisens lanca (od 5’-terminusa)

42

5’-AUAUUUUCCCAUCUGUAUUAUUtt-3’ (SEQ ID NO: 196)

3’-GUUAUAAAAGGGUAGACAUAAUAAUAA-5’ (SEQ ID NO: 3469)

Opciono, neusklađeni ’U’ ostatak pozicije 3 antisens lanca je alternativno ’C’ ili ’G’.

HAO1-1171 25/27mer DsiRNA, neusklađena pozicija = 4 antisens lanca (od 5’-terminusa)

5’-AUAUUUUCCCAUCUGUAUUAUUtt-3’ (SEQ ID NO: 196)

3’-GUUAUAAAAGGGUAGACAUAAUACAAA-5’ (SEQ ID NO: 3470)

Opciono, neusklađeni ’C’ ostatak pozicije 4 antisens lanca je alternativno ’U’ ili ’G’.

HAO1-1171 25/27mer DsiRNA, neusklađena pozicija = 5 antisens lanca (od 5’-terminusa)

5’-AUAUUUUCCCAUCUGUAUUAUUtt-3’ (SEQ ID NO: 196)

3’-GUUAUAAAAGGGUAGACAUAAUUAAAA-5’ (SEQ ID NO: 3471)

Opciono, neusklađeni ’U’ ostatak pozicije 5 antisens lanca je alternativno ’C’ ili ’G’.

HAO1-1171 25/27mer DsiRNA, neusklađena pozicija = 6 antisens lanca (od 5’-terminusa)

5’-AUAUUUUCCCAUCUGUAUU<A>UUUtt-3’ (SEQ ID NO: 196)

3’-GUUAUAAAAGGGUAGACAUAAAAAAAA-5’ (SEQ ID NO: 3472)

Opciono, neusklađeni ’A’ ostatak pozicije 6 antisens lanca je alternativno ’C’ ili ’G’.

HAO1-1171 25/27mer DsiRNA, neusklađena pozicija = 7 antisens lanca (od 5’-terminusa)

5’-AUAUUUUCCCAUCUGUAUAUUUtt-3’ (SEQ ID NO: 196)

3’-GUUAUAAAAGGGUAGACAUAUUAAAAA-5’ (SEQ ID NO: 3473)

Opciono, neusklađeni ’U’ ostatak pozicije 7 antisens lanca je alternativno ’C’ ili ’G’.

4

[0370] Kao sledeći primer, u dole navedenim strukturama, takve neusklađenosti su uvedene unutar asimetrične HAO1-1378 DsiRNA (novouvedeni neusklađeni ostaci su u kurzivu):

HAO1-1378 25/27mer DsiRNA, neusklađena pozicija = 19 sens lanca (od 5’-terminusa)

5’-UGGAAAUAUAUUAACUGU<A>AAAAag-3’ (SEQ ID NO: 3474)

3’-GGACCUUUAUAUAAUUGACAAUUUUUC-5’ (SEQ ID NO: 680)

HAO1-1378 25/27mer DsiRNA, neusklađena pozicija = 20 sens lanca (od 5’-terminusa)

5’-UGGAAAUAUAUUAACUGUUAAAag-3’ (SEQ ID NO: 3475)

3’-GGACCUUUAUAUAAUUGACAAUUUUUC-5’ (SEQ ID NO: 680)

HAO1-1378 25/27mer DsiRNA, neusklađena pozicija = 21 sens lanca (od 5’-terminusa)

5’-UGGAAAUAUAUUAACUGUUAAAag-3’ (SEQ ID NO: 3476)

3’-GGACCUUUAUAUAAUUGACAAUUUUUC-5’ (SEQ ID NO: 680)

Opciono, neusklađeni ’U’ ostatak pozicije 21 sens lanca je alternativno ’G’ ili ’C’.

HAO1-1378 25/27mer DsiRNA, neusklađena pozicija = 22 sens lanca (od 5’-terminusa)

5’-UGGAAAUAUAUUAACUGUUAA<G>Aag-3’ (SEQ ID NO: 3477)

3’-GGACCUUUAUAUAAUUGACAAUUUUUC-5’ (SEQ ID NO: 680)

Opciono, neusklađeni ’G’ ostatak pozicije 22 sens lanca je alternativno’U’ ili ’C’.

HAO1-1378 25/27mer DsiRNA, neusklađena pozicija = 23 sens lanca (od 5’-terminusa)

5’-UGGAAAUAUAUUAACUGUUAAAag-3’ (SEQ ID NO: 3478)

3’-GGACCUUUAUAUAAUUGACAAUUUUUC-5’ (SEQ ID NO: 680)

44

Opciono, neusklađeni ’U’ ostatak pozicije 23 sens lanca je alternativno ’C’ ili ’G’.

HAO1-1378 25/27mer DsiRNA, neusklađena pozicija = 24 sens lanca (od 5’-terminusa)

5’-UGGAAAUAUAUUAACUGUUAAAA<g>g-3’ (SEQ ID NO: 3479)

3’-GGACCUUUAUAUAAUUGACAAUUUUUC-5’ (SEQ ID NO: 680)

Opciono, neusklađeni ’g’ ostatak pozicije 24 sens lanca je alternativno ’t’ ili ’c’.

HAO1-1378 25/27mer DsiRNA, neusklađena pozicija = 25 sens lanca (od 5’-terminusa)

5’-UGGAAAUAUAUUAACUGUUAAAAa<a>-3’ (SEQ ID NO: 3480)

3’-GGACCUUUAUAUAAUUGACAAUUUUUC-5’ (SEQ ID NO: 680)

Opciono, neusklađeni ’a’ ostatak pozicije 25 sens lanca je alternativno ’t’ ili ’c’.

HAO1-1378 25/27mer DsiRNA, neusklađena pozicija = 1 antisens lanca (od 5’-terminusa)

5’-UGGAAAUAUAUUAACUGUUAAAAa<g>-3’ (SEQ ID NO: 296)

3’-GGACCUUUAUAUAAUUGACAAUUUUUU-5’ (SEQ ID NO: 3481)

Opciono, neusklađeni ’U’ ostatak pozicije 1 antisens lanca je alternativno ’A’ ili ’G’.

HAO1-1378 25/27mer DsiRNA, neusklađena pozicija = 2 antisens lanca (od 5’-terminusa)

5’-UGGAAAUAUAUUAACUGUUAAAA<a>g-3’ (SEQ ID NO: 296)

3’-GGACCUUUAUAUAAUUGACAAUUUUCC-5’ (SEQ ID NO: 3482)

Opciono, neusklađeni ’C’ ostatak pozicije 2 antisens lanca je alternativno ’A’ ili ’G’.

HAO1-1378 25/27mer DsiRNA, neusklađena pozicija = 3 antisens lanca (od 5’-terminusa)

5’-UGGAAAUAUAUUAACUGUUAAA<A>ag-3’ (SEQ ID NO: 296)

3’-GGACCUUUAUAUAAUUGACAAUUUAUC-5’ (SEQ ID NO: 3483)

4

Opciono, neusklađeni ’A’ ostatak pozicije 3 antisens lanca je alternativno ’C’ ili ’G’.

HAO1-1378 25/27mer DsiRNA, neusklađena pozicija = 4 antisens lanca (od 5’-terminusa)

5’-UGGAAAUAUAUUAACUGUUAA<A>Aag-3’ (SEQ ID NO: 296)

3’-GGACCUUUAUAUAAUUGACAAUUCUUC-5’ (SEQ ID NO: 3484)

Opciono, neusklađeni ’C’ ostatak pozicije 4 antisens lanca je alternativno ’A’ ili ’G’.

HAO1-1378 25/27mer DsiRNA, neusklađena pozicija = 5 antisens lanca (od 5’-terminusa)

5’-UGGAAAUAUAUUAACUGUUA<A>AAag-3’ (SEQ ID NO: 296)

3’-GGACCUUUAUAUAAUUGACAAUAUUUC-5’ (SEQ ID NO: 3485)

Opciono, neusklađeni ’A’ ostatak pozicije 5 antisens lanca je alternativno ’C’ ili ’G’.

HAO1-1378 25/27mer DsiRNA, neusklađena pozicija = 6 antisens lanca (od 5’-terminusa)

5’-UGGAAAUAUAUUAACUGUU<A>AAAag-3’ (SEQ ID NO: 296)

3’-GGACCUUUAUAUAAUUGACAAAUUUUC-5’ (SEQ ID NO: 3486)

HAO1-1378 25/27mer DsiRNA, neusklađena pozicija = 7 antisens lanca (od 5’-terminusa)

5’-UGGAAAUAUAUUAACUGUAAAAag-3’ (SEQ ID NO: 296)

3’-GGACCUUUAUAUAAUUGACAUUUUUUC-5’ (SEQ ID NO: 3487)

[0371] Za gore navedene sekvence oligonukleotidnog lanca, razmatra se da sekvenca sens lanca jednog prikazanog dupleksa može biti kombinovana sa antisens lancem drugog prikazanog dupleksa, time formirajući jedinstven dupleks - u određenim slučajevima, takvi dupleksi sadrže neusklađeni ostatak u odnosu na target sekvencu transkripta glikolat oksidaze, dok takve

4

sekvence sens i antisens lanca ne predstavljaju neusklađenost na ovom ostatku u odnosu jedna na drugu (npr. dupleksi koji sadrže SEQ ID NO: 3466 i 3467; SEQ ID NO: 3465 i 3468; SEQ ID NO: 3464 i 3469, itd. razmatraju se kao primeri takvih dupleksa).

[0372] Kao što je napomenuto iznad, uvođenje neusklađenosti može se izvesti na bilo kojoj od ovde opisanih DsiRNA.

[0373] Neusklađenosti takvih DsiRNA struktura mogu se kombinovati kako bi se proizvela DsiRNA koja poseduje, npr. dve, tri ili čak četiri neusklađenosti unutar 3ʼ-terminalnih četiri do sedam nukleotida sens lanca/5ʼ-terminalnih četiri do sedam nukleotida antisens lanca.

[0374] Zaista, u pogledu fleksibilnosti sekvenci koje se mogu inkorporisati u DsiRNA na 3ʼ-terminalnim ostacima sens lanca/5ʼ-terminalnim ostacima antisens lanca, u određenim primerima izvođenja, zahtevi sekvence asimetrične DsiRNA iz trenutnog pronalaska mogu biti predstavljeni kao sledeća (minimalistička) struktura (pokazana za HAO1-1171 DsiRNA sekvencu kao primer):

5’-AUAUUUUCCCAUCUGUAUXXXXXX[X]n-3’ (SEQ ID NO: 3488)

3’-GUUAUAAAAGGGUAGACAUAXXXXXX[X]n-5’ (SEQ ID NO: 3489)

gde n = 1 do 5, 1 do 10, 1 do 20, 1 do 30, 1 do 50, ili 1 do 80 ili više.

HAO1-1171 iRNK target: 5’-CAAUAUUUUCCCAUCUGUAUXXXXXXX-3’(SEQ ID NO: 3490).

[0375] Target mesto glikolat oksidaze takođe može biti mesto koje je ciljano pomoću jednog ili više oligonukleotida čija se komplementarna target mesta preklapaju sa navedenim target mestom. Na primer, za HAO 1-1315 DsiRNA kao primer, primećeno je da bi određene DsiRNA koje ciljno deluju na preklapajuće i samo malo pomaknute sekvence glikolat oksidaze mogle da pokazuju nivoe aktivnosti slične onim od HAO1-1315 (npr. HAO1-1314 do HAO1-1317 iz Tabele 2 iznad). Stoga, u određenim primerima izvođenja, naznačeni region target sekvence može biti efikasno ciljan pomoću serije DsiRNA koje poseduju uveliko preklapajuće sekvence. (Npr. ukoliko se razmatraju jedno ili više target mesta DsiRNA od HAO1-1314 do HAO1-1317, sveobuhvatnija target sekvenca transkripta glikolat oksidaze mogla bi se navesti kao, npr. 5’-TTTCATTGCTTTTGACTTTTCAATGGGTGT-3’ (SEQ ID NO: 3491), pri čemu bilo koja data DsiRNA (npr. DsiRNA odabrana od HAO1-1314 do HAO1-1317) samo cilja podsekvencu unutar takvog regiona sekvence, ali se cela sekvenca može smatrati vijabilnim targetom za takvu seriju DsiRNA).

4

[0376] Pored toga i/ili alternativno, neusklađenosti unutar 3’-terminalnih sedam nukleotida sens lanca/5’-terminalnih sedam nukleotida antisens lanca mogu se kombinovati sa neusklađenostima pozicioniranim na drugim pozicijama koje tolerišu neusklađenost, kao što je opisano iznad.

[0377] U pogledu predmetne identifikacije gore opisanih Dicer supstrat agenasa (DsiRNA) kao inhibitora nivoa glikolat oksidaze putem ciljnog delovanja specifičnih sekvenci glikolat oksidaze, takođe je prepoznato da takođe mogu biti sintetisane dsRNA koje imaju strukture slične onima opisanim ovde koje ciljaju druge sekvence unutar sekvence glikolat oksidaze NM_017545.2m, ili unutar njenih varijanti (npr. target sekvence koje poseduju 80% identičnosti, 90% identičnosti, 95% identičnosti, 96% identičnosti, 97% identičnosti, 98% identičnosti, 99% ili više identičnosti sa sekvencom NM_017545.2).

Dizajn/sinteza anti-glikolat oksidaza DsiRNA

[0378] Empirijski je utvrđeno da duže dsRNA vrste od 25 do 35 nukleotida (DsiRNA) i naročito od 25 do 30 nukleotida daju neočekivano efikasne rezultate u pogledu potentnosti i trajanja delovanja, u poređenju sa 19-23mer siRNA agensima. Bez želje da bude vezano za teoriju u osnovi mehanizma obrade dsRNA, smatra se da duže dsRNA vrste služe kao supstrat za Dicer enzim u citoplazmi ćelije. Pored isecanja dsRNA iz pronalaska na kraće segmente, smatra se da Dicer olakšava inkorporaciju jednolančanog proizvoda isecanja poreklom iz isečene dsRNA u RISC kompleks koji je odgovoran za destrukciju citoplazmatske RNK (npr. RNK glikolat oksidaze) ili poreklom iz target gena, glikolat oksidaze (ili drugog gena povezanog sa bolešću ili poremećajem koji je povezan sa glikolat oksidazom). Prethodne studije (Rossi et al., S.A.D. patentna prijava br. 2007/0265220) pokazale su da mogućnost isecanja dsRNA vrsta (specifično, DsiRNA agensa) pomoću Dicer odgovara povećanoj potentnosti i trajanju delovanja dsRNA vrsta.

[0379] Određeni anti-glikolat oksidaza DsiRNA agensi odabrani su iz prethodno pregledane populacije. Dizajn DsiRNA može opciono da uključuje upotrebu algoritama za predviđanje ocena koji izvode in silico procene projektovane aktivnosti/efikasnosti brojnih mogućih DsiRNA agenasa koji obuhvataju region sekvence. Informacije u vezi sa dizajnom takvih algoritama za ocenjivanje mogu se pronaći, npr. u Gong et al. (BMC Bioinformatics 2006, 7:516), iako noviji algoritam "v4.3" predstavlja teorijski poboljšani algoritam u odnosu na algoritme za ocenjivanje siRNA koji su ranije bili dostupni u struci. (Npr. algoritmi za ocenjivanje "v3" i "v4" su algoritmi mašinskog učenja koji se ne oslanjaju na bilo kakve pristrasnosti u humanoj sekvenci. Pored toga, algoritmi "v3" i "v4" su izvedeni iz skupova podataka koji su višestruko veći od onog iz kog je poreklom stariji algoritam "v2" kao što je onaj opisan u Gong et al.)

4

[0380] Nije neophodno da prvi i drugi oligonukleotidi DsiRNA agenasa iz trenutnog pronalaska budu potpuno komplementarni. U stvari, u jednom primeru izvođenja, 3’-terminus sens lanca sadrži jednu ili više neusklađenosti. U jednom aspektu, dve neusklađenosti su inkorporisane na 3’ teminusu sens lanca. U sledećem primeru izvođenja, DsiRNA iz pronalaska je dvolančani RNK molekul koji sadrži dva RNK oligonukleotida od kojih je svaki dužine 27 nukleotida i, kada su vezani jedan za drugi, imaju tupe krajeve i neusklađenost dva nukleotida na 3'-terminusu sens lanca (5'-terminus antisens lanca). Predložena je upotreba neusklađenosti ili smanjene termodinamičke stabilnosti (specifično na poziciji 3'-sens/5'-antisens) kako bi se olakšao ili favorizovao ulazak antisens lanca u RISC (Schwarz et al., 2003, Cell 115: 199-208; Khvorova et al., 2003, Cell 115: 209-216), verovatno utičući na neke korake koji ograničavaju stopu odmotavanja koji se javljaju sa ulaskom siRNA u RISC. Stoga, terminalna bazna kompozicija je uključena u dizajn algoritama za odabir aktivnih 21mer siRNA dupleksa (Ui-Tei et al., 2004, Nucleic Acids Res 32: 936-948; Reynolds et al., 2004, Nat Biotechnol 22: 326-330). Sa Dicer isecanjem dsRNA iz ovog primera izvođenja, mala krajnje-terminalna sekvenca koja sadrži neusklađenosti će ili ostati nesparena sa antisens lancem (postati deo 3ʼ-visećeg kraja) ili će biti potpuno isečena sa konačne 21-mer siRNA. Ove "neusklađenosti", prema tome, ne postoje kao neusklađenosti u krajnjoj RNK komponenti RISC. Nalaz da su bazne neusklađenosti ili destabilizacija segmenata na 3ʼ-kraju sens lanca Dicer supstrata poboljšale potentnost sintetičkih dupleksa u RNAi, verovatno olakšavajući obradu pomoću Dicer, bio je iznenađujući nalaz prošlih radova koji opisuju dizajn i upotrebu 25-30mer dsRNA (ovde se takođe naziva "DsiRNA"; Rossi et al., S.A.D. patentne prijave br. 2005/0277610, 2005/0244858 i 2007/0265220).

Modifikacija anti-glikolat oksidaza dsRNA

[0381] Jedan glavni faktor koji inhibira efekat dvolančanih RNK ("dsRNA") je degradacija dsRNA (npr. siRNA i DsiRNA) nukleazama. 3’-egzonukleaza je primarna aktivnost nukleaze prisutna u serumu i modifikacija 3’-krajeva antisens DNK oligonukleotida je presudna za sprečavanje degradacija (Eder et al., 1991, Antisense Res Dev, 1: 141-151). Identifikovana je nukleaza RNaza-T porodice nazvana ERI-1 koja ima 3ʼ do 5ʼ aktivnost egzonukleaze koja je uključena u regulaciju i degradaciju siRNA (Kennedy et al., 2004, Nature 427: 645-649; Hong et al., 2005, Biochem J, 390: 675-679). Ovaj gen je takođe poznat kao Thex1 (NM_026067) kod miševa ili THEX1 (NM_153332) kod ljudi i uključen je u degradaciju histonske iRNK; takođe posreduje u degradaciji 3’-visećih krajeva u siRNA, ali ne vrši degradaciju dupleks RNK (Yang

4

et al., 2006, JBiol Chem, 281:30447-30454). Prema tome je razumno očekivati da će stabilizacija 3’-kraja dsRNA, uključujući DsiRNA iz trenutnog pronalaska, poboljšati stabilnost.

[0382] XRN1 (NM_019001) je 5ʼ do 3ʼ egzonukleaza koja se nalazi u P-telima i koja je umešana u degradaciju iRNK koja je ciljana pomoću miRNA (Rehwinkel et al., 2005, RNA 11: 1640-1647) i takođe može biti odgovorna za dovršavanje degradacije započete unutrašnjim isecanjem koje je usmereno pomoću siRNA. XRN2 (NM_012255) je jedinstvena 5’ do 3’ egzonukleaza koja je uključena u obradu nukleusne RNK.

[0383] RNaza A je glavna aktivnost endonukleaze kod sisara koja vrši degradaciju RNK. Specifična je za ssRNA i iseca na 3’-kraju pirimidinskih baza. Proizvodi degradacije siRNA u skladu sa RNaza A isecanjem mogu se detektovati masenom spektrometrijom posle inkubacije u serumu (Turner et al., 2007, Mol Biosyst 3: 43-50). 3’-viseći krajevi povećavaju podložnost siRNA na RNaza degradaciju. Iscrpljivanje RNaze A iz seruma redukuje degradaciju siRNA; ova degradacija pokazuje neku preferenciju sekvence i gora je za sekvence koje imaju poli A/U sekvencu na krajevima (Haupenthal et al., 2006 Biochem Pharmacol 71: 702-710). Ovo sugeriše mogućnost da regioni niže stabilnosti dupleksa mogu da "dišu" i ponude prolazne jednolančane vrste dostupne za degradaciju pomoću RNaze A. Inhibitori RNaze A mogu se dodati u serum i poboljšati dugotrajnost i potentnost siRNA (Haupenthal et al., 2007, Int J. Cancer 121: 206-210).

[0384] Kod 21mera, fosforotioat ili boranofosfat modifikacije direktno stabilizuju internukleozidnu fosfatnu vezu. Boranofosfat modifikovane RNK su veoma rezistentne na nukleaze, potentne kao agensi za utišavanje, i relativno su netoksične. Boranofosfat modifikovane RNK ne mogu se proizvesti upotrebom standardnih postupaka hemijske sinteze, već se prave pomoću in vitro transkripcije (IVT) (Hall et al., 2004, Nucleic Acids Res 32: 5991-6000; Hall et al., 2006, Nucleic Acids Res 34: 2773-2781). Fosforotioat (PS) modifikacije mogu se lako smestiti u RNK dupleks na bilo kojoj željenoj poziciji i mogu se napraviti upotrebom standardnih postupaka hemijske sinteze. PS modifikacija pokazuje dozno-zavisnu toksičnost, pa je većina istraživača preporučila ograničenu inkorporaciju u siRNA, favorizujući 3ʼ-krajeve gde je zaštita od nukleaza najvažnija (Harborth et al., 2003, Antisense Nucleic Acid Drug Dev 13: 83-105; Chiu i Rana, 2003, Mol Cell 10: 549-561; Braasch et al., 2003, Biochemistry 42: 7967-7975; Amarzguioui et al., 2003, Nucleic Acids Research 31: 589-595). Opsežnija PS modifikacija može biti kompatibilna sa potentnom RNAi aktivnošću; međutim, upotreba šećernih modifikacija (kao što je 2’-O-metil RNK) može biti superiornija (Choung et al., 2006, Biochem Biophys Res Commun 342: 919-927).

[0385] Raznovrsne supstitucije se mogu postaviti na 2’-poziciju riboze što generalno povećava stabilnost dupleksa (Tm) i može u velikoj meri poboljšati rezistenciju na nukleazu. 2’-O-metil RNK je modifikacija koja se javlja u prirodi koja se nalazi u ribozomskim RNK i transfer RNK sisara. 2’-O-metil modifikacija u siRNA je poznata, ali je precizna pozicija modifikovanih baza unutar dupleksa važna za zadržavanje potentnosti i potpuna supstitucija 2’-O-metil RNK za RNK će inaktivirati siRNA. Na primer, obrazac koji koristi naizmenične 2'-O-metil baze može imati potentnost ekvivalentnu nemodifikovanoj RNK i prilično je stabilan u serumu (Choung et al., 2006, Biochem Biophys Res Commun 342: 919-927; Czauderna et al., 2003, Nucleic Acids Research 31: 2705-2716).

[0386] 2’-fluoro modifikacija je takođe kompatibilna sa dsRNA (npr. siRNA i DsiRNA) funkcijom; najčešće se postavlja na mesta pirimidina (zbog troškova i dostupnosti reagensa) i može se kombinovati sa 2’-O-metil modifikacijom na pozicijama purina; 2’-F purini su dostupni i takođe se mogu upotebljavati. Veoma modifikovani dupleksi ove vrste mogu biti potentni pokretači RNAi in vitro (Allerson et al., 2005, J Med Chem 48: 901-904; Prakash et al., 2005, J Med Chem 48: 4247-4253; Kraynack i Baker, 2006, RNA 12: 163-176) i mogu poboljšati performanse i produžiti trajanje delovanja kada se upotrebljavaju in vivo (Morrissey et al., 2005, Hepatology 41: 1349-1356; Morrissey et al., 2005, Nat Biotechnol 23: 1002 -1007). Veoma potentan, stabilan na nukleazu, tupi 19mer dupleks koji sadrži alternativne 2’-F i 2’-O-Me baze je predstavljen od strane Allerson. U ovom dizajnu, naizmenični 2’-O-Me ostaci su pozicionirani u identičnom obrascu kao onaj koji koristi Czauderna, međutim preostali RNK ostaci su konvertovani u 2’-F modifikovane baze. Veoma potentna siRNA rezistentna na nukleazu koju je koristio Morrissey koristila je veoma potentnu siRNA rezistentnu na nukleazu in vivo. Pored 2’-O-Me RNK i 2’-F RNK, ovaj dupleks uključuje DNK, RNK, invertovane abazične ostatke, i 3’-terminalnu PS internukleozidnu vezu. Dok opsežna modifikacija ima određene prednosti, ograničenija modifikacija dupleksa takođe može poboljšati in vivo performansu i jednostavnija je i jeftinija za proizvodnju. Soutschek et al. (2004, Nature 432: 173-178) koristio je dupleks in vivo i uglavnom je bio RNK sa dve 2’-O-Me RNK baze i ograničenim 3’-terminalnim PS internukleozidnim vezama.

[0387] Zaključane nukleinske kiseline (LNA) su drugačija klasa 2’-modifikacije koja se može upotrebljavati za stabilizaciju dsRNA (npr. siRNA i DsiRNA). Obrasci LNA inkorporacije koji zadržavaju potentnost su ograničeniji od 2'-O-metil ili 2'-F baza, pa je poželjna ograničena modifikacija (Braasch et al., 2003, Biochemistry 42: 7967-7975; Grunweller et al., 2003, Nucleic Acids Res 31: 3185-3193; Elmen et al., 2005, Nucleic Acids Res 33: 439-447). Čak i uz ograničenu inkorporaciju, upotreba LNA modifikacija može poboljšati dsRNA performansu in vivo i takođe može izmeniti ili poboljšati profile ne-target efekta (Mook et al., 2007, Mol Cancer Ther 6: 833-843).

[0388] Sintetičke nukleinske kiseline uvedene u ćelije ili žive životinje mogu se prepoznati kao "strane" i pokrenuti imunski odgovor. Imunska stimulacija predstavlja glavnu klasu ne-target

1

efekata koji mogu dramatično promeniti eksperimentalne rezultate i čak dovesti do ćelijske smrti. Urođeni imunski sistem uključuje kolekciju molekula receptora koji specifično interaguju sa DNK i RNK koje posreduju u tim odgovorima, od kojih su neki locirani u citoplazmi i neki od njih nalaze se u endozomima (Marques i Williams, 2005, Nat Biotechnol 23: 1399- 1405; Schlee et al., 2006, Mol Ther 14: 463-470). Isporuka siRNA pomoću katjonskih lipida ili lipozoma izlaže siRNA i citoplazmatskim i endozomskim kompartmentima, maksimizirajući rizik za pokretanje odgovora interferona tipa 1 (IFN) i in vitro i in vivo (Morrissey et al., 2005, Nat Biotechnol 23: 1002 -1007; Sioud i Sorensen, 2003, Biochem Biophys Res Commun 312: 1220-1225; Sioud, 2005, J Mol Biol 348: 1079-1090; Ma et al., 2005, Biochem Biophys Res Commun 330: 755-759). RNK transkribovane unutar ćelije manje su imunogene (Robbins et al., 2006, Nat Biotechnol 24: 566-571) i sintetičke RNK koje su imunogene kada se isporučuju upotrebom postupaka zasnovanim na lipidima mogu izbeći imunsku stimulaciju kada se mehaničkim putem uvode u ćelije, čak i in vivo (Heidel et al., 2004, Nat Biotechnol 22: 1579-1582). Međutim, postupci isporuke zasnovani na lipidima su pogodni, efikasni, i u širokoj su upotrebi. Potrebna je neka opšta strategija za sprečavanje imunskih odgovora, naročito za in vivo primenu gde su prisutni svi tipovi ćelija i rizik od stvaranja imunskog odgovora je najveći. Upotreba hemijski modifikovanih RNK može rešiti većinu ili čak sve ove probleme.

[0389] U određenim primerima izvođenja, modifikacije se mogu uključiti u anti-glikolat oksidaza dsRNA agense iz predmetnog pronalaska, sve dok modifikacija ne sprečava dsRNA agens da poseduje inhibitornu aktivnost glikolat oksidaze. U jednom primeru izvođenja, napravljena je jedna ili više modifikacija koje poboljšavaju Dicer obradu DsiRNA agensa (test za određivanje Dicer obrade DsiRNA je ovde opisan na drugom mestu). U drugom primeru izvođenja, napravljena je jedna ili više modifikacija koje rezultuju efikasnijom inhibicijom glikolat oksidaze (kao što je ovde opisano, inhibicija glikolat oksidaze/inhibitorna aktivnost glikolat oksidaze dsRNA može se ispitati putem postupaka prepoznatih u struci za određivanje nivoa RNK, ili za određivanje nivoa polipeptida glikolat oksidaze, ukoliko se ti nivoi procenjuju umesto ili pored procene, npr. nivoa iRNK glikolat oksidaze). U trećem primeru izvođenja, napravljena je jedna ili više modifikacija koje podržavaju veću inhibitornu aktivnost glikolat oksidaze (načini za određivanje inhibitorne aktivnosti glikolat oksidaze opisani su supra). U četvrtom primeru izvođenja, napravljena je jedna ili više modifikacija koje rezultuju većom potentnošću inhibitorne aktivnosti glikolat oksidaze po svakom molekulu dsRNA agensa koji se isporučuje u ćeliju (potentnost inhibitorne aktivnosti glikolat oksidaze opisana je supra). Modifikacije se mogu inkorporisati u 3’-terminalni region, 5’- terminalni region, i u 3’-terminalni i u 5’-terminalni region ili u nekim slučajevima na različite pozicije unutar sekvence. Uzimajući u obzir gore navedena ograničenja, brojevi i kombinacije modifikacija mogu se

2

inkorporisati u dsRNA agens. Tamo gde je prisutno više modifikacija, one mogu biti iste ili različite. Razmatraju se modifikacije baza, šećernih grupa, fosfatne okosnice, i njihove kombinacije. Bilo koji 5ʼ-terminus može biti fosforilisan.

[0390] Primeri modifikacija koje su razmatrane za fosfatnu okosnicu uključuju fosfonate, uključujući metilfosfonat, fosforotioat, i fosfotriestar modifikacije kao što su alkilfosfotriestri, i slično. Primeri modifikacija koje su razmatrane za šećernu grupu uključuju 2'-alkil pirimidin, kao što su 2'-O-metil, 2'-fluoro, amino, i dezoksi modifikacije i slično (videti, npr. Amarzguioui et al., 2003, Nucleic Acids Research 31: 589-595). Primeri modifikacija koje su razmatrane za bazne grupe uključuju abazične šećere, 2-O-alkil modifikovane pirimidine, 4-tiouracil, 5-bromouracil, 5-jodouracil, i 5-(3-aminoalil)-uracil i slično. Zaključane nukleinske kiseline, ili LNA, takođe mogu biti inkorpirisane. Mnoge druge modifikacije su poznate i mogu se upotrebljavati sve dok su navedeni kriterijumi zadovoljeni. Primeri modifikacija su takođe objavljeni u S.A.D. pat. brojevima 5,684,143, 5,858,988 i 6,291,438 i u S.A.D. publikovanoj patentnoj prijavi br. 2004/0203145 A1. Druge modifikacije su objavljene u Herdewijn (2000, Antisense Nucleic Acid Drug Dev 10: 297-310), Eckstein (2000, Antisense Nucleic Acid Drug Dev 10: 117-21), Rusckowski et al. (2000, Antisense Nucleic Acid Drug Dev 10: 333-345), Stein et al. (2001, Antisense Nucleic Acid Drug Dev 11: 317-25); Vorobjev et al. (2001, Antisense Nucleic Acid Drug Dev 11: 77-85).

[0391] Jedna ili više modifikacija koje su razmatrane mogu se inkorporisati u bilo koji lanac. Postavljanje modifikacija u dsRNA agens može u velikoj meri uticati na karakteristike dsRNA agensa, uključujući dodeljivanje veće potentnosti i stabilnosti, redukovanje toksičnosti, poboljšanje Dicer obrade, i minimiziranje imunskog odgovora. U jednom primeru izvođenja, antisens lanac ili sens lanac ili oba lanca imaju jedan ili više 2’-O-metil modifikovanih nukleotida. U sledećem primeru izvođenja, antisens lanac sadrži 2’-O-metil modifikovane nukleotide. U sledećem primeru izvođenja, antisens lanac sadrži 3’ viseći kraj koji se sastoji od 2’-O-metil modifikovanih nukleotida. Antisens lanac takođe može da sadrži dopunske 2’-O-metil modifikovane nukleotide.

[0392] U određenim primerima izvođenja, anti-glikolat oksidaza DsiRNA agens iz pronalaska ima nekoliko svojstava koja poboljšavaju njegovu obradu pomoću Dicer. U skladu sa takvim primerima izvođenja, DsiRNA agens ima dovoljnu dužinu tako da bude obrađen pomoću Dicer kako bi proizveo siRNA i najmanje jedno od sledećih svojstava: (i) DsiRNA agens je asimetričan, npr. ima 3ʼ viseći kraj na sens lancu i (ii) DsiRNA agens ima modifikovani 3ʼ kraj na antisens lancu kako bi se usmerila orijentacija Dicer vezivanja i obrada dsRNA u aktivnu siRNA. U skladu sa ovim primerima izvođenja, najduži lanac u DsiRNA agensu sadrži 25-30 nukleotida. U jednom primeru izvođenja, sens lanac sadrži 25-30 nukleotida i antisens lanac sadrži 25-28 nukleotida. Stoga, rezultujuća dsRNA ima viseći kraj na 3’ kraju sens lanca. Viseći kraj je 1-4 nukleotida, kao što je 2 nukleotida. Antisens lanac takođe može imati 5’ fosfat.

[0393] U određenim primerima izvođenja, sens lanac DsiRNA agensa je modifikovan za Dicer obradu pomoću pogodnih modifikatora lociranih na 3’ kraju sens lanca, tj. DsiRNA agens je dizajniran da usmeri orijentaciju Dicer vezivanja i obrade. Pogodni modifikatori uključuju nukleotide kao što su dezoksiribonukleotidi, didezoksiribonukleotidi, aciklonukleotidi i slično i sterički ometene molekule, kao što su fluorescentni molekuli i slično. Aciklonukleotidi supstituišu 2-hidroksietoksimetil grupu za 2’-dezoksiribofuranozil šećer koji je normalno prisutan u dNMP. Drugi nukleotidni modifikatori mogu da uključuju 3’-dezoksiadenozin (kordicepin), 3’-azido-3’-dezoksitimidin (AZT), 2’,3’-didezoksiinozin (ddI), 2’,3’-didezoksi-3’-tiacitidin (3TC), 2’,3’-didehidro-2’,3’-didezoksitimidin (d4T) i monofosfatne nukleotide 3’-azido-3’-dezoksitimidina (AZT), 2’,3’-didezoksi-3’-tiacitidina (3TC) i 2’,3’-didehidro-2’,3’-didezoksitimidina (d4T). U jednom primeru izvođenja, dezoksinukleotidi se upotrebljavaju kao modifikatori. Kada se koriste nukleotidni modifikatori, 1-3 nukleotidna modifikatora, ili 2 nukleotidna modifikatora su supstituisani za ribonukleotide na 3’ kraju sens lanca. Kada se koriste sterički ometeni molekuli, oni su prikačeni za ribonukleotid na 3’ kraju antisens lanca. Stoga, dužina lanca se ne menja inkorporacijom modifikatora. U sledećem primeru izvođenja, pronalazak razmatra supstituciju dve DNK baze u dsRNA kako bi se usmerila orijentacija Dicer obrade. U dodatnom pronalasku, dve terminalne DNK baze su locirane na 3ʼ kraju sens lanca umesto dva ribonukleotida koji formiraju tupi kraj dupleksa na 5’ kraju antisens lanca i 3ʼ kraju sens lanca, i dvo-nukleotidni RNK viseći kraj je lociran na 3'-kraju antisens lanca. Ovo je asimetrična kompozicija sa DNK na tupom kraju i RNK bazama na kraju sa visećim krajem.

[0394] U određenim primerima izvođenja, antisens lanac DsiRNA agensa je modifikovan za Dicer obradu pomoću pogodnih modifikatora lociranih na 3’ kraju antisens lanca, tj. DsiRNA agens je dizajniran da usmeri orijentaciju Dicer vezivanja i obrade. Pogodni modifikatori uključuju nukleotide kao što su dezoksiribonukleotidi, didezoksiribonukleotidi, aciklonukleotidi i slično i sterički ometene molekule, kao što su fluorescentni molekuli i slično. Aciklonukleotidi supstituišu 2-hidroksietoksimetil grupu za 2’-dezoksiribofuranozil šećer koji je normalno prisutan u dNMP. Drugi nukleotidni modifikatori mogu da uključuju 3’-dezoksiadenozin (kordicepin), 3’-azido-3’-dezoksitimidin (AZT), 2’,3’-didezoksiinozin (ddI), 2’,3’-didezoksi-3’-tiacitidin (3TC), 2’,3’-didehidro-2’,3’-didezoksitimidin (d4T) i monofosfatne nukleotide 3’-azido-3’-dezoksitimidina (AZT), 2’,3’-didezoksi-3’-tiacitidina (3TC) i 2’,3’-didehidro-2’,3’-didezoksitimidina (d4T). U jednom primeru izvođenja, dezoksinukleotidi se upotrebljavaju kao modifikatori. Kada se koriste nukleotidni modifikatori, 1-3 nukleotidna modifikatora, ili 2 nukleotidna modifikatora su supstituisani za ribonukleotide na 3’ kraju antisens lanca. Kada se

4

koriste sterički ometeni molekuli, oni su prikačeni za ribonukleotid na 3’ kraju antisens lanca. Stoga, dužina lanca se ne menja inkorporacijom modifikatora. U sledećem primeru izvođenja, pronalazak razmatra supstituciju dve DNK baze u dsRNA kako bi se usmerila orijentacija Dicer obrade. U dodatnom pronalasku, dve terminalne DNK baze su locirane na 3ʼ kraju antisens lanca umesto dva ribonukleotida koji formiraju tupi kraj dupleksa na 5’ kraju sens lanca i 3ʼ kraju antisens lanca, i dvo-nukleotidni RNK viseći kraj je lociran na 3'-kraju sens lanca. Ovo je takođe asimetrična kompozicija sa DNK na tupom kraju i RNK bazama na kraju sa visećim krajem.

[0395] Sens i antisens lanci se vezuju pod biološkim uslovima, kao što su uslovi pronađeni u citoplazmi ćelije. Pored toga, region jedne od sekvenci, posebno antisens lanca, dsRNA ima dužinu sekvence od najmanje 19 nukleotida, pri čemu su ti nukleotidi susedni 3ʼ kraju antisens lanca i dovoljno su komplementarni sa nukleotidnom sekvencom target RNK glikolat oksidaze.

[0396] Pored toga, struktura DsiRNA agensa može se optimizovati kako bi se osiguralo da će segment oligonukleotida generisan iz Dicer isecanja biti deo oligonukleotida koji je najefikasniji u inhibiranju ekspresije gena. Na primer, u jednom primeru izvođenja pronalaska, sintetiše se oligonukleotid od 27-bp od strukture DsiRNA agensa, pri čemu je predviđeni segment od 21 do 22-bp koji će inhibirati ekspresiju gena lociran na 3’-kraju antisens lanca. Preostale baze locirane na 5’-kraju antisens lanca biće isečene pomoću Dicer i biće odbačene. Ovaj isečeni deo može biti homologan (tj., zasnovan na sekvenci target sekvence) ili nehomologan i dodat kako bi se produžio lanac nukleinske kiseline.

[0397] US 2007/0265220 objavljuje da su 27mer DsiRNA pokazale poboljšanu stabilnost u serumu u odnosu na uporedne 21mer siRNA kompozicije, čak u odsustvu hemijske modifikacije. Modifikacije DsiRNA agenasa, kao što je uključivanje 2’-O-metil RNK u antisens lanac, u obrascima kao što je detaljno opisano iznad, u kombinaciji sa dodavanjem 5’ fosfata, može poboljšati stabilnost DsiRNA agenasa. Dodavanje 5’-fosfata svim lancima u sintetičkim RNK dupleksima može biti jeftin i fiziološki postupak koji dodeljuje određeni ograničeni stepen stabilnosti na nukleazu.

[0398] Obrasci hemijske modifikacije dsRNA agenasa iz trenutnog pronalaska dizajnirani su da poboljšaju efikasnost takvih agenasa. U skladu sa tim, takve modifikacije su dizajnirane kako bi se izbeglo redukovanje potentnosti dsRNA agenasa; kako bi se izbeglo ometanje Dicer obrade DsiRNA agenasa; kako bi se poboljšala stabilnost u biološkim fluidima (redukovanje osetljivosti na nukleazu) dsRNA agenasa; ili kako bi se blokirala ili izbegla detekcija od strane urođenog imunskog sistema. Takve modifikacije su takođe dizajnirane kako bi se izbeglo da budu toksične i kako bi se izbeglo povećanje troškova ili uticaj na jednostavnost proizvodnje trenutnih dsRNA agenasa iz pronalaska.

[0399] U određenim primerima izvođenja predmetnog pronalaska, anti-glikolat oksidaza DsiRNA agens ima jedno ili više od sledećih svojstava: (i) DsiRNA agens je asimetričan, npr. ima 3ʼ viseći kraj na antisens lancu i (ii) DsiRNA agens ima modifikovani 3ʼ kraj na sens lancu kako bi se usmerila orijentacija Dicer vezivanja i obrada dsRNA u aktivnu siRNA. U skladu sa ovim primerom izvođenja, najduži lanac u dsRNA sadrži 25-35 nukleotida (npr. 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34 ili 35 nukleotida). U određenim takvim primerima izvođenja, DsiRNA agens je asimetričan tako da sens lanac sadrži 25-34 nukleotida i 3ʼ kraj sens lanca formira tupi kraj sa 5ʼ krajem antisens lanca dok antisens lanac sadrži 26-35 nukleotida i formira viseći kraj na 3ʼ kraju antisens lanca. U jednom primeru izvođenja, DsiRNA agens je asimetričan tako da sens lanac sadrži 25-28 nukleotida i antisens lanac sadrži 25-30 nukleotida. Stoga, rezultujuća dsRNA ima viseći kraj na 3’ kraju antisens lanca. Viseći kraj je 1-4 nukleotida, na primer 2 nukleotida. Sens lanac takođe može imati 5’ fosfat.

[0400] DsiRNA agens takođe može imati jedno ili više od sledećih dopunskih svojstava: (a) antisens lanac ima desni pomak od tipičnog 21mer (npr. DsiRNA sadrži dužinu nukleotida antisens lanca koji se proteže do 5ʼ projektovanog mesta Dicer isecanja unutar DsiRNA, sa nukleotidima takvog antisens lanca bazno sparenim sa odgovarajućim nukleotidima sens lanca koji se proteže 3ʼ od projektovanog mesta Dicer isecanja u sens lancu), (b) lanci možda neće biti potpuno komplementarni, tj. lanci mogu sadržati jednostavne neusklađene bazne parove (u određenim primerima izvođenja, DsiRNA iz pronalaska poseduju 1, 2, 3, 4 ili čak 5 ili više neusklađenih baznih parova, pod uslovom da se inhibitorna aktivnost glikolat oksidaze DsiRNA koja poseduje neusklađene bazne parove zadržava na dovoljnim nivoima (npr. zadržava najmanje 50% inhibitorne aktivnosti glikolat oksidaze ili više, najmanje 60% inhibitorne aktivnosti glikolat oksidaze ili više, najmanje 70% inhibitorne aktivnosti glikolat oksidaze ili više, najmanje 80% inhibitorne aktivnosti glikolat oksidaze ili više, najmanje 90% inhibitorne aktivnosti glikolat oksidaze ili više ili najmanje 95% inhibitorne aktivnosti glikolat oksidaze ili više u poređenju sa odgovarajućom DsiRNA koja ne poseduje neusklađene bazne parove. U određenim primerima izvođenja, postoje neusklađeni bazni parovi između antisens i sens lanaca DsiRNA. U nekim primerima izvođenja, postoje neusklađeni bazni parovi (ili se predviđa da postoje) između antisens lanca i target RNK. U određenim primerima izvođenja, prisustvo neusklađenog(ih) baznih parova između ostatka antisens lanca i odgovarajućeg ostatka unutar target RNK koji je lociran 3ʼ u target RNK sekvenci projektovanog Ago2 mesta isecanja zadržava i može čak poboljšati inhibitornu aktivnost glikolat oksidaze DsiRNA iz pronalaska) i (c) modifikacije baze kao što je jedna ili više zaključana nukleinska kiselina može biti uključena u 5’ kraj sens lanca. "Tipična" 21mer siRNA dizajnirana je upotrebom konvencionalnih tehnika. U jednoj tehnici, različita mesta se uobičajeno testiraju paralelno ili pulovi koji sadrže nekoliko različitih siRNA dupleksa specifičnih za isti target sa nadom da će jedan od reagenasa biti efikasan (Ji et al., 2003, FEBS Lett 552: 247- 252). Druge tehnike upotrebljavaju pravila dizajna i algoritme za povećanje verovatnoće dobijanja aktivnih RNAi efektorskih molekula (Schwarz et al., 2003, Cell 115: 199-208; Khvorova et al., 2003, Cell 115: 209-216; Ui-Tei et al., 2004, Nucleic Acids Res 32: 936-948; Reynolds et al., 2004, Nat Biotechnol 22: 326-330; Krol et al., 2004, J Biol Chem 279: 42230-42239; Yuan et al., 2004, Nucl Acids Res 32 (web server izdanje): W130-134; Boese et al., 2005, Methods Enzymol 392: 73-96). Takođe je razvijena selekcija siRNA velike propusnosti (S.A.D. publikovana patentna prijava br.2005/0042641 A1). Potencijalna tagret mesta se takođe mogu analizirati predviđanjem sekundarne strukture (Heale et al., 2005, Nucleic Acids Res 33(3): e30). Ovaj 21mer se zatim upotrebljava za dizajniranje desnog pomaka kako bi se uključilo 3-9 dopunskih nukleotida na 5’ kraj 21mera. Sekvenca ovih dopunskih nukleotida nije ograničena. U jednom primeru izvođenja, dodati ribonukleotidi se zasnivaju na sekvenci target gena. Čak i u ovom primeru izvođenja nije neophodna potpuna komplementarnost između target sekvence i antisens siRNA.

[0401] Nije neophodno da prvi i drugi oligonukleotidi DsiRNA agensa iz trenutnog pronalaska budu potpuno komplementarni. Oni samo treba da budu dovoljno komplementarni za vezivanje pod biološkim uslovima i da obezbede supstrat za Dicer koji proizvodi siRNA dovoljno komplementarnu sa target sekvencom. Zaključane nukleinske kiseline, ili LNA, su dobro poznate iskusnom stručnjaku (Elmen et al., 2005, Nucleic Acids Res 33: 439-447; Kurreck et al., 2002, Nucleic Acids Res 30: 1911-1918; Crinelli et al., 2002, Nucleic Acids Res 30: 2435-2443; Braasch i Corey, 2001, Chem Biol 8: 1-7; Bondensgaard et al., 2000, Chemistry 6: 2687-2695; Wahlestedt et al., 2000, Proc Natl Acad Sci USA 97: 5633-5638). U jednom primeru izvođenja, LNA je inkorporisana na 5’ terminusu sens lanca. U sledećem primeru izvođenja, LNA je inkorporisana na 5’ terminusu sens lanca u dupleksima dizajniranim da uključuju 3’ viseći kraj na antisens lancu.

[0402] U određenim primerma izvođenja, DsiRNA agens iz trenutnog pronalaska ima asimetričnu strukturu, sa sens lancem koji ima dužinu od 25 baznih parova, i antisens lancem koji ima dužinu od 27 baznih parova sa 3’ visećim krajem od 2 baze. U drugim primerima izvođenja, ovaj DsiRNA agens koji ima asimetričnu strukturu dodatno sadrži 2 dezoksinukleotida na 3’ kraju sens lanca umesto dva od ribonukleotida.

[0403] Određene kompozicije DsiRNA agensa koji sadrži dva odvojena oligonukleotida mogu biti povezani trećom strukturom. Treća struktura neće blokirati Dicer aktivnost na DsiRNA agensu i neće ometati usmerenu destrukciju RNK transkribovane iz target gena. U jednom primeru izvođenja, treća struktura može biti hemijska vezujuća grupa. Mnoge pogodne hemijske vezujuće grupe su poznate u struci i mogu se upotrebljavati. Alternativno, treća struktura može biti oligonukleotid koji povezuje dva oligonukleotida DsiRNA agensa na takav način da se proizvodi struktura ukosnice nakon vezivanja dva oligonukleotida koji čine dsRNA kompoziciju. Struktura ukosnice neće blokirati Dicer aktivnost na DsiRNA agensu i neće ometati usmerenu destrukciju RNK glikolat oksidaze.

cDNA i polipeptidne sekvence glikolat oksidaze

[0404] Poznate cDNA i polipeptidne sekvence glikolat oksidaze čoveka i miša (HAO1) uključuju sledeće: humana hidroksikiselinska oksidaza 1 (HAO1) NM_017545.2 i odgovarajuća polipeptidna sekvenca humane HAO1 GenBank pristupni br. NP_060015.1; i sekvenca mišje HAO1 divljeg tipa GenBank pristupni br. NM_010403.2 (Mus musculus C57BL/6 HAO1) i odgovarajuća sekvenca mišje HAO1 GenBank pristupni br. NP_034533.1.

In vitro test za procenu inhibitorne aktivnosti dsRNA glikolat oksidaze

[0405] In vitro test koji rekapitulira RNAi u bezćelijskom sistemu može se upotrebljavati za procenu dsRNA konstrukata koji ciljno deluju na RNK sekvencu(e) glikolat oksidaze, i stoga procenila inhibitorna aktivnost gena specifičnog za glikolat oksidazu (koja se ovde takođe označava kao inhibitorna aktivnost glikolat oksidaze) dsRNA. Test obuhvata sistem koji su opisali Tuschl et al., 1999, Genes and Development, 13, 3191-3197 i Zamore et al., 2000, Cell, 101, 25-33 prilagođen za upotrebu sa dsRNA (npr. DsiRNA) agensima usmerenim prema RNK glikolat oksidaze. Ekstrakt drozofile (Drosophila) poreklom od sincicijumskog blastoderma upotrebljen je kako bi se rekonstituisala RNAi aktivnost in vitro. Target RNK se generiše putem in vitro transkripcije iz odabranog plazmida koji eksprimira glikolat oksidazu upotrebom T7 RNK polimeraze ili putem hemijske sinteze. Sens i antisens dsRNA lanci (na primer, 20 μM svaki) se vezuju inkubacijom u puferu (kao što je 100 mM kalijum acetat, 30 mM HEPES-KOH, pH 7,4, 2 mM magnezijum acetat) tokom 1 minuta na 90 °C praćeno sa 1 sat na 37 °C, zatim su razblaženi u puferu za lizu (na primer 100 mM kalijum acetat, 30 mM HEPES-KOH pri pH 7,4, 2 mM magnezijum acetat). Vezivanje se može pratiti gel elektroforezom na agaroza gelu u TBE puferu i obojiti etidijum bromidom. Drosophila lizat se priprema upotrebom embriona starih nula do dva sata od Oregon R mušica prikupljenih na melasa kvasnom agaru koji se dehorionišu i liziraju. Lizat se centrifugira i supernatant se izoluje. Test sadrži reakcionu smešu koja sadrži 50% lizata [zapr./zapr.], RNK (10-50 pM krajnja koncentracija), i 10% [zapr./zapr.] pufera za lizu koji sadrži dsRNA (10 nM krajnja koncentracija). Reakciona smeša takođe sadrži 10 mM kreatin fosfat, 10 μg/ml kreatin fosfokinaze, 100 μM GTP, 100 μM UTP, 100 μM CTP, 500 μM ATP, 5 mM DTT, 0,1 U/μl RNasin (Promega) i 100 μM svake amino-kiseline. Krajnja koncentracija kalijum acetata je podešena na 100 mM. Reakcije su preasemblirane na ledu i preinkubirane na 25 °C tokom 10 minuta pre dodavanja RNK, zatim inkubirane na 25 °C tokom dopunskih 60 minuta. Reakcije su ugašene sa 4 zapremine 1,25x pasivnog pufera za lizu (Promega). Isecanje target RNK se testira RT-PCR analizom ili drugim postupcima poznatim u struci i poredi se sa kontrolnim reakcijama u kojima je dsRNA izostavljena iz reakcije.

[0406] Alternativno, interno-obeležena target RNK za test se priprema in vitro transkripcijom u prisustvu [α-<32>P] CTP, propuštena preko G50 Sephadex kolone pomoću spin hromatografije i upotrebljava kao target RNK bez dodatnog prečišćavanja. Opciono, target RNK je obeležena na 5’-kraju sa<32>P upotrebom T4 enzima polinukleotid kinaze. Testovi se izvode kao što je opisano iznad i target RNK i specifični proizvodi RNK isecanja koje generiše RNAi se vizualizuju na autoradiografu gela. Procenat isecanja se određuje PHOSPHOR IMAGER® (autoradiografija) kvantifikacijom traka koje predstavljaju intaktnu kontrolnu RNK ili RNK iz kontrolnih reakcija bez dsRNA i produkte isecanja generisane testom.

[0407] U jednom primeru izvođenja, ovaj test se upotrebljava za određivanje target mesta u target RNK glikolat oksidaze za dsRNA posredovano RNAi isecanje, pri čemu se pregleda mnoštvo dsRNA konstrukata za RNAi posredovano isecanje target RNK glikolat oksidaze, na primer, analizom test reakcija elektroforezom obeležene target RNK, ili nortern blotovanjem, kao i drugom metodologijom dobro poznatom u struci.

[0408] U određenim primerima izvođenja, smatra se da dsRNA iz pronalaska poseduje inhibitornu aktivnost glikolat oksidaze ukoliko se uoči, npr. 50% redukovanja nivoa RNK glikolat oksidaze u sistemu, ćeliji, tkivu ili organizmu, u odnosu na odgovarajuću kontrolu. Dopunske međe i granice za određivanje inhibitorne aktivnosti glikolat oksidaze dsRNA iz pronalaska su opisani supra.

Konjugacija i isporuka anti-glikolat oksidaza dsRNA agenasa

[0409] U određenim primerima izvođenja, predmetni pronalazak se odnosi na postupak za lečenje subjekta koji ima ili je u riziku od razvoja bolesti ili poremećaja za koje se predviđa da inhibicija glikolat oksidaze ima ili je demonstrirano da ima terapijsku vrednost (npr. bolest jetre kao što je primarna hiperoksalurija 1 (PHI)). U takvim primerima izvođenja, dsRNA može delovati kao novi terapijski agens za kontrolu bolesti ili poremećaja za koje se predviđa da inhibicija glikolat oksidaze ima ili je demonstrirano da ima terapijsku vrednost. Postupak sadrži primenu farmaceutske kompozicije iz pronalaska pacijentu (npr. čoveku), tako da se redukuje ekspresija, nivo i/ili aktivnost RNK glikolat oksidaze (HAO1). Ekspresija, nivo i/ili aktivnost polipeptida kodiranog pomoću RNK glikolat oksidaze (HAO1) takođe se mogu redukovati pomoću dsRNA iz trenutnog pronalaska, čak i gde je navedena dsRNA usmerena prema nekodirajućem regionu transkripta glikolat oksidaze (npr. ciljana 5ʼ UTR ili 3ʼ UTR sekvenca). Zbog svoje visoke specifičnosti, dsRNA iz predmetnog pronalaska mogu specifično ciljati sekvence glikolat oksidaze (HAO1) ćelija i tkiva, opciono čak i na način specifičan za alel gde polimorfni aleli postoje unutar pojedinca i/ili populacije.

[0410] U lečenju bolesti ili poremećaja za koje se predviđa da inhibicija glikolat oksidaze ima ili je demonstrirano da ima terapijsku vrednost, dsRNA se može dovesti u kontakt sa ćelijama ili tkivom subjekta, npr. sa ćelijama ili tkivom subjekta koji pokazuje disregulaciju glikolat oksidaze i/ili koji je na drugi način ciljan za redukovanje nivoa glikolat oksidaze. Na primer, dsRNA koja je suštinski identična celoj ili delu RNK sekvence glikolat oksidaze može se dovesti u kontakt sa ili uvesti u takvu ćeliju, bilo in vivo ili in vitro. Slično, dsRNA koja je suštinski identična celoj ili delu RNK sekvence glikolat oksidaze može se primeniti direktno subjektu koji ima ili je u riziku od razvoja bolesti ili poremećaja za koje se predviđa da inhibicija glikolat oksidaze ima ili je demonstrirano da ima terapijsku vrednost.

[0411] Terapijska upotreba dsRNA agenasa iz trenutnog pronalaska može podrazumevati upotrebu formulacija dsRNA agenasa koji sadrže više različitih sekvenci dsRNA agensa. Na primer, dva ili više, tri ili više, četiri ili više, pet ili više, itd. od trenutno opisanih agenasa mogu se kombinovati kako bi se dobila formulacija koja, npr. cilja više različitih regiona RNK glikolat oksidaze, ili koja ne cilja samo RNK glikolat oksidaze, nego takođe cilja, npr. ćelijske target gene povezane sa bolešću ili poremećajem za koje se predviđa da inhibicija glikolat oksidaze ima ili je demonstrirano da ima terapijsku vrednost. dsRNA agens iz trenutnog pronalaska takođe može biti konstruisan tako da bilo koji lanac dsRNA agensa nezavisno cilja dva ili više regiona RNK glikolat oksidaze, ili tako da jedan od lanaca dsRNA agensa cilja ćelijski target gen glikolat oksidaze poznat u struci.

[0412] Upotreba multifunkcionalnih dsRNA molekula koji ciljaju više od jednog regiona target molekula nukleinske kiseline takođe može da obezbedi potentnu inhibiciju nivoa i ekspresije RNK glikolat oksidaze. Na primer, jedan multifunkcionalni dsRNA konstrukt iz objave može istovremeno ciljati i HAO1-1171 i HAO1-1378 mesta; dopunski i/ili alternativno, pojedinačni ili multifunkcionalni agensi iz objave mogu biti dizajnirani da selektivno ciljaju jednu splajs varijantu glikolat oksidaze pre nego drugu.

[0413] Stoga, dsRNA agensi iz trenutnog pronalaska, pojedinačno, ili u kombinaciji ili konjugovani za druge lekove, mogu se upotrebljavati za lečenje, inhibiranje, redukovanje, ili prevenciju bolesti ili poremećaja za koje se predviđa da inhibicija glikolat oksidaze ima ili je demonstrirano da ima terapijsku vrednost. Na primer, dsRNA molekuli mogu da se primenjuju subjektu ili mogu da se primenjuju drugim odgovarajućim ćelijama koje su očigledne onima koji su iskusni u struci, pojedinačno ili u kombinaciji sa jednim ili više lekova pod uslovima pogodnim za lečenje.

[0414] dsRNA molekuli se takođe mogu upotrebljavati u kombinaciji sa drugim poznatim tretmanima za lečenje, inhibiranje, redukovanje, ili prevenciju bolesti ili poremećaja za koje se predviđa da inhibicija glikolat oksidaze ima ili je demonstrirano da ima terapijsku vrednost kod subjekta ili organizma. Na primer, opisani molekuli se mogu upotrebljavati u kombinaciji sa jednim ili više poznatih jedinjenja, tretmana, ili procedura za lečenje, inhibiranje, redukovanje, ili prevenciju bolesti ili poremećaja za koje se predviđa da inhibicija glikolat oksidaze ima ili je demonstrirano da ima terapijsku vrednost kod subjekta ili organizma kao što je poznato u struci.

[0415] dsRNA agens iz pronalaska može biti konjugovan (npr. na svom 5ʼ ili 3ʼ terminusu svog sens ili antisens lanca) ili nekonjugovan za drugu grupu (npr. grupu koja nije nukleinska kiselina kao što je peptid), organsko jedinjenje (npr. boja, holesterol, ili slično). Modifikovanje dsRNA agenasa na ovaj način može poboljšati ćelijski unos ili poboljšati aktivnosti ćelijskog ciljnog delovanja rezultujućeg derivata dsRNA agensa u poređenju sa odgovarajućim nekonjugovanim dsRNA agensom, korisno je za praćenje derivata dsRNA agensa u ćeliji, ili može poboljšati stabilnost derivata dsRNA agensa u poređenju sa odgovarajućim nekonjugovanim dsRNA agensom.

[0416] U određenim primerima izvođenja, razmatraju se specifični primeri oblika dsRNA konjugata. Značajno, RNAi terapije, kao što su dsRNA koje su ovde specifično predstavljene primerom, demonstrirale su posebno dobru sposobnost da budu isporučene ćelijama jetre in vivo (putem, npr. lipidnih nanočestica i/ili konjugata kao što su dinamički polikonjugati ili GalNAc konjugati - u određenim primerima izvođenja, jedna ili više GalNAc grupa mogu biti konjugovane za region 3ʼ- i/ili 5ʼ-visećeg kraja dsNA, opciono za "produženi" region visećeg kraja dsNA (npr. za 5 ili više nukleotida, 8 ili više nukleotida, itd. primer takvog visećeg kraja); dopunski i/ili alternativno, jedna ili više GalNAc grupa mogu biti konjugovane za ds produžene regione dsNA, npr. za dupleks region formiran od strane regiona 5ʼ-kraja vodič/antisens lanca dsNA i odgovarajućeg regiona 3ʼ-kraja putnik/sens lanca dsNA i/ili za dupleks region formiran od strane regiona 3ʼ-kraja vodič/antisens lanca dsNA i odgovarajućeg regiona 5ʼ-kraja putnik/sens lanca dsNA). Stoga, formulisane RNAi terapije, kao što su one opisane ovde, su atraktivni modaliteti za lečenje ili prevenciju bolesti ili poremećaja koji su prisutni u, poreklom od ili na drugi način uključuju jetru.

Postupci uvođenja nukleinskih kiselina, vektora, i ćelije domaćini

1

[0417] dsRNA agensi iz pronalaska mogu se direktno uvesti u ćeliju (tj., unutarćelijski); ili se uvode vanćelijski u šupljinu, prostor intersticijuma, u cirkulaciju organizma, uvode se oralno, ili se mogu uvesti kupanjem ćelije ili organizma u rastvoru koji sadrži nukleinsku kiselinu. Vaskularna ili vanvaskularna cirkulacija, krvni ili limfni sistem, i cerebrospinalna tečnost su mesta gde se nukleinska kiselina može uvesti.

[0418] dsRNA agensi iz pronalaska mogu se uvesti upotrebom postupaka isporuke nukleinske kiseline poznatih u struci, uključujući injektiranje rastvora koji sadrži nukleinsku kiselinu, bombardovanje česticama koje su prekrivene nukleinskom kiselinom, namakanje ćelije ili organizma u rastvoru nukleinske kiseline, ili elektroporaciju ćelijskih membrana u prisustvu nukleinske kiseline. Mogu se upotrebljavati i drugi postupci poznati u struci za uvođenje nukleinskih kiselina u ćelije, kao što je lipidima posredovan transport nosačem, hemijski posredovan transport, i transfekcija katjonskim lipozomima kao što je kalcijum fosfat, i slično. Nukleinska kiselina se može uvesti zajedno sa drugim komponentama koje izvode jednu ili više od sledećih aktivnosti: poboljšavaju unos nukleinske kiseline u ćeliju ili na drugi način povećavaju inhibiciju target RNK glikolat oksidaze.

[0419] Ćelija koja ima target RNK glikolat oksidaze može biti iz germinativne linije ili somatska, totipotentna ili pluripotentna, da se deli ili da se ne deli, parenhimska ili epitelna, imortalizovana ili transformisana, ili slično. Ćelija može biti matična ćelija ili diferencirana ćelija. Tipovi ćelija koji su diferencirani uključuju adipocite, fibroblaste, miocite, kardiomiocite, endotel, neurone, glia, krvne ćelije, megakariocite, limfocite, makrofage, neutrofile, eozinofile, bazofile, mastocite, leukocite, granulocite, keratinocite, hondrocite, osteoblaste, osteoklaste, hepatocite, i ćelije endokrinih ili egzokrinih žlezda.

[0420] U zavisnosti od određene target RNK sekvence glikolat oksidaze i doze isporučenog materijala dsRNA agensa, ovaj postupak može obezbediti delimični ili potpuni gubitak funkcije za RNK glikolat oksidaze. Redukovanje ili gubitak nivoa ili ekspresije RNK (bilo ekspresija RNK glikolat oksidaze ili ekspresija kodiranog polipeptida) u najmanje 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% ili 99% ili više ciljanih ćelija služi kao primer. Inhibicija nivoa ili ekspresije RNK glikolat oksidaze označava odsustvo (ili uočljivo smanjenje) nivoa RNK glikolat oksidaze ili kodiranog proteina od strane RNK glikolat oksidaze. Specifičnost označava sposobnost inhibicije RNK glikolat oksidaze bez ispoljavanja efekata na druge gene ćelije. Posledice inhibicije mogu se potvrditi ispitivanjem spoljašnjih svojstava ćelije ili organizma ili biohemijskim tehnikama kao što su hibridizacija RNK rastvora, zaštita od nukleaze, Northern hibridizacija, reverzna transkripcija, praćenje ekspresije gena mikročipom, vezivanje antitela, enzimski imunosorbentni test (ELISA), Western blot, radioimunski test (RIA), drugi imunski testovi, i fluorescencijom aktivirana analiza ćelije (FACS). Inhibicija target RNK sekvence(i)

2

glikolat oksidaze pomoću dsRNA agenasa iz pronalaska takođe se može meriti na osnovu efekta primene takvih dsRNA agenasa na razvoj/progresiju bolesti ili poremećaja za koje se predviđa da inhibicija glikolat oksidaze ima ili je demonstrirano da ima terapijsku vrednost, npr. primarna hiperoksalurija 1 (PHI) ili druga retka bolest jetre, bilo in vivo ili in vitro. Lečenje i/ili redukovanja kod PHI i/ili druge retke bolesti jetre može uključivati zaustavljanje ili redukovanje oštećenja organa (npr. oštećenje bubrega i/ili jetre) povezano sa PHI ili drugom retkom bolešću jetre (npr. redukovanje oštećenja bubrega, oštećenja jetre, depozicija kalcijum oksalata, sistemske oksaloze, osteolitičkih lezija, epifiziolize (npr. u kostima subjekta), renalne osteopatije, uključujući renalnu kalcifikaciju i/ili kalcifikaciju/depozicije kalcijum oksalata kože, oka ili drugih organa od, npr. 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% ili 99% ili više, i takođe se mogu meriti u logaritamskim terminima, npr. 10-struko, 100-struko, 1000-struko, 105-struko, 106-struko, 107-struko redukovanje oštećenja bubrega, oštećenja jetre, depozicija kalcijum oksalata, sistemske oksaloze, osteolitičkih lezija, epifiziolize (npr. u kostima subjekta), renalne osteopatije, uključujući renalnu kalcifikaciju i/ili kalcifikaciju/depozicije kalcijum oksalata kože, oka ili drugih organa moglo bi se postići putem primene dsRNA agenasa iz pronalaska na ćelije, tkivo ili subjekta).

[0421] Za RNK-posredovanu inhibiciju u ćelijskoj liniji ili celom organizmu, može se meriti ekspresija reporter gena ili gena rezistencije na lek čiji se proteinski proizvod lako testira. Takvi reporter geni uključuju acetohidroksikiselinsku sintazu (AHAS), alkalnu fosfatazu (AP), beta galaktozidazu (LacZ), beta glukoronidazu (GUS), hloramfenikol acetiltransferazu (CAT), zeleni fluorescentni protein (GFP), peroksidazu rena (HRP), luciferazu (Luc), nopalin sintazu (NOS), oktopin sintazu (OCS), i njihove derivate. Na raspolaganju je više markera koji mogu biti odabrani koji dodeljuju rezistenciju na ampicilin, bleomicin, hloramfenikol, gentamicin, higromicin, kanamicin, linkomicin, metotreksat, fosfinotricin, puromicin, i tetraciklin. U zavisnosti od testa, kvantifikacija količine ekspresije gena omogućava određivanje stepena inhibicije koji je veći od 10%, 33%, 50%, 90%, 95% ili 99% u poređenju sa ćelijom koja nije tretirana u skladu sa predmetnim pronalaskom.

[0422] Niže doze injektiranog materijala i duža vremena posle primene agensa za utišavanje RNK mogu rezultirati inhibicijom u manjoj frakciji ćelija (npr. najmanje 10%, 20%, 50%, 75%, 90%, ili 95% ciljanih ćelija). Kvantifikovanje ekspresije gena u ćeliji može pokazati slične količine inhibicije na nivou akumulacije target RNK glikolat oksidaze ili translacije target proteina. Kao primer, efikasnost inhibicije se može odrediti procenom količine genskog proizvoda u ćeliji; RNK se može detektovati hibridizacionom probom koja ima nukleotidnu sekvencu izvan regiona koji se upotrebljava za inhibitornu dsRNA, ili se translatirani polipeptid može detektovati antitelom uzgajenim prema polipeptidnoj sekvenci tog regiona.

[0423] dsRNA agens se može uvesti u količini koja omogućava isporuku najmanje jedne kopije po ćeliji. Veće doze (npr. najmanje 5, 10, 100, 500 ili 1000 kopija po ćeliji) materijala mogu dati efikasniju inhibiciju; niže doze takođe mogu biti korisne za specifične primene.

Biologija glikolat oksidaze

[0424] Glikolat oksidaza (proizvod HAO1 gena) je enzim odgovoran za konvertovanje glikolata u glioksilat u putu metabolizma glicina u mitohondrijama/peroksizomima. Dok je glikolat bezopasan intermedijer puta metabolizma glicina, akumulacija glioksilata (putem, npr. AGT1 mutacije) pokreće akumulaciju oksalata (pošto se kalcijum inicijalno taloži u bubrezima, i kasnije u drugim organima), što na kraju rezultuje PHI bolešću.

Farmaceutske kompozicije

[0425] U određenim primerima izvođenja, predmetni pronalazak obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja sadrži dsRNA agens iz predmetnog pronalaska. Uzorak dsRNA agensa može se pogodno formulisati i uvesti u okruženje ćelije pomoću bilo kog načina koji omogućava da dovoljan deo uzorka uđe u ćeliju kako bi se indukovalo utišavanje gena, ukoliko bi to trebalo da se dogodi. Mnoge formulacije za dsRNA su poznate u struci i mogu se upotrebljavati sve dok dsRNA ostvari ulaz u target ćelije kako bi mogla da deluje. Videti, npr. S.A.D. publikovane patentne prijave br.2004/0203145 A1 i 2005/0054598 A1. Na primer, dsRNA agens iz trenutnog pronalaska može se formulisati u puferskim rastvorima kao što su fosfatom puferisani fiziološki rastvori, lipozomi, micelarne strukture, i kapsidi. Formulacije dsRNA agensa sa katjonskim lipidima mogu se upotrebljavati za olakšavanje transfekcije dsRNA agensa u ćelije. Na primer, mogu se upotrebljavati katjonski lipidi, kao što je lipofektin (S.A.D. pat. br.5,705,188), derivati katjonskog glicerola, i polikatjonski molekuli, kao što je polilizin (publikovana PCT međunarodna prijava WO 97/30731). Pogodni lipidi uključuju Oligofektamin, Lipofektamin (Life Technologies), NC388 (Ribozyme Pharmaceuticals, Inc., Boulder, Colo.), ili FuGene 6 (Roche) koji se svi mogu upotrebljavati u skladu sa uputstvima proizvođača.

[0426] Takve kompozicije tipično uključuju molekul nukleinske kiseline i farmaceutski prihvatljiv nosač. Kao što se ovde upotrebljava u jeziku "farmaceutski prihvatljiv nosač" uključuje fiziološki rastvor, rastvarače, disperzione medijume, obloge, antibakterijske i antifungalne angense, izotonične agense i agense za odlaganje apsorpcije, i slično, kompatibilne sa farmaceutskom primenom. Suplementarna aktivna jedinjenja se takođe mogu inkorporisati u kompozicije.

4

[0427] Farmaceutska kompozicija je formulisana da bude kompatibilna sa predviđenim putem primene. Primeri puteva primene uključuju parenteralnu, npr. intravensku, intradermalnu, subkutanu, oralnu (npr. inhalacija), transdermalnu (topikalna), transmukoznu, i rektalnu primenu. Rastvori ili suspenzije koji se upotrebljavaju za parenteralnu, intradermalnu, ili subkutanu primenu mogu da uključuju sledeće komponente: sterilni razblaživač kao što su voda za injekcije, fiziološki rastvor, fiksirana ulja, polietilen glikoli, glicerin, propilen glikol ili drugi sintetički rastvarači; antibakterijske agense kao što su benzil alkohol ili metil parabeni; antioksidante kao što su askorbinska kiselina ili natrijum bisulfit; cHuh7ting agense kao što je etilendiamintetrasirćetna kiselina; pufere kao što su acetati, citrati ili fosfati i agense za podešavanje toničnosti kao što su natrijum hlorid ili dekstroza. pH se može podesiti kiselinama ili bazama, kao što su hlorovodonična kiselina ili natrijum hidroksid. Parenteralni preparat može biti zatvoren u ampulama, špricevima za jednokratnu upotrebu ili bočice sa više doza od stakla ili plastike.

[0428] Farmaceutske kompozicije pogodne za upotrebu injektiranjem uključuju sterilne vodene rastvore (kada su rastvorljive u vodi) ili disperzije i sterilne praškove za brzu pripremu sterilnih rastvora za injektiranje ili disperziju. Za intravensku primenu, pogodni nosači uključuju fiziološki rastvor, bakteriostatsku vodu, Cremophor EL.TM. (BASF, Parsippany, N.J.) ili fosfatom puferisan fiziološki rastvor (PBS). U svim slučajevima, kompozicija mora biti sterilna i mora biti fluidna do te mere da postoji laka mogućnost ubrizgavanja špricem. Ona treba da bude stabilna pod uslovima proizvodnje i skladištenja i mora biti zaštićena od kontaminirajućeg delovanja mikroorganizama kao što su bakterije i gljivice. Nosač može biti rastvarač ili disperzioni medijum koji sadrži, na primer, vodu, etanol, poliol (na primer, glicerol, propilen glikol, i tečni polietilen glikol, i slično), i njihove odgovarajuće smeše. Odgovarajuća fluidnost se može održavati, na primer, upotrebom obloge kao što je lecitin, održavanjem potrebne veličine čestica u slučaju disperzije i upotrebom surfaktanata. Prevencija delovanja mikroorganizama može se postići različitim antibakterijskim i antifungalnim agensima, na primer, parabenima, hlorobutanolom, fenolom, askorbinskom kiselinom, timerosalom, i slično. U mnogim slučajevima, bilo bi poželjno da se u kompoziciju uključe izotonični agensi, na primer, šećeri, polialkoholi kao što su manitol, sorbitol, natrijum hlorid. Produžena apsorpcija kompozicija za injektiranje može se postići uključivanjem u kompoziciju agensa koji odlaže apsorpciju, na primer, aluminijum monostearata i želatina.

[0429] Sterilni rastvori za injektiranje mogu se pripremiti inkorporisanjem aktivnog jedinjenja u potrebnoj količini u odabrani rastvarač sa jednim ili kombinacijom gore nabrojanih sastojaka, po potrebi, nakon čega sledi sterilizacija filtriranjem. Generalno, disperzije se pripremaju inkorporisanjem aktivnog jedinjenja u sterilni vehikulum, koji sadrži osnovni disperzioni medijum i potrebne druge sastojke od onih gore nabrojanih. U slučaju sterilnih praškova za pripremu sterilnih rastvora za injektiranje, poželjni postupci pripreme su sušenje vakuumom i sušenje zamrzavanjem, čime se dobija prašak aktivnog sastojka plus bilo koji dopunski željeni sastojak iz njegovog prethodno sterilno filtriranog rastvora.

[0430] Oralne kompozicije generalno uključuju inertni razblaživač ili jestivi nosač. U svrhu oralne terapijske primene, aktivno jedinjenje se može inkorporisati sa ekscipijensima i upotrebljavati u obliku tableta, lozengi, ili kapsula, npr. želatinskih kapsula. Oralne kompozicije se takođe mogu pripremiti upotrebom tečnog nosača za upotrebu kao sredstvo za ispiranje usta. Kao deo kompozicije mogu se uključiti farmaceutski kompatibilni vezujući agensi, i/ili adjuvantni materijali. Tablete, pilule, kapsule, lozenge i slično mogu sadržati bilo koji od sledećih sastojaka, ili jedinjenja slične prirode: vezivo kao što su mikrokristalna celuloza, tragakant guma ili želatin; ekscipijens kao što su skrob ili laktoza, agens za dezintegraciju kao što su alginska kiselina, primogel, ili kukuruzni skrob; lubrikant kao što su magnezijum stearat ili steroti; glidant kao što je koloidni silicijum dioksid; agens za zaslađivanje kao što su saharoza ili saharin; ili agens za aromatizaciju kao što su pepermint, metil salicilat, ili aroma pomorandže.

[0431] Za primenu inhalacijom, jedinjenja se isporučuju u obliku aerosolnog spreja iz posude ili dozatora pod pritiskom koji sadrži pogodni propelant, npr. gas kao što je ugljen-dioksid, ili nebulizatora. Takvi postupci uključuju one opisane u S.A.D. pat. br.6,468,798.

[0432] Sistemska primena takođe može biti transmukoznim ili transdermalnim načinima. Za transmukoznu ili transdermalnu primenu, u formulaciji se upotrebljavaju penetranti koji odgovaraju barijeri koju je potrebno proći. Takvi penetranti su opšte poznati u struci, i uključuju, na primer, za transmukoznu primenu, deterdžente, žučne soli, i derivate fuzidne kiseline. Transmukozna primena se može postići upotrebom nazalnih sprejeva ili supozitorija. Za transdermalnu primenu, aktivna jedinjenja su formulisana u mastima, salvama, gelovima, ili kremama kao što je generalno poznato u struci.

[0433] Jedinjenja se takođe mogu pripremiti u obliku supozitorija (npr. sa konvencionalnim bazama za supozitorije kao što su kakao puter i drugi gliceridi) ili retencionih klistira za rektalnu isporuku.

[0434] Jedinjenja se takođe mogu primeniti pomoću transfekcije ili infekcije upotrebom postupaka poznatih u struci, uključujući, ali ne ograničavajući se na postupke opisane u McCaffrey et al. (2002), Nature, 418(6893), 38-9 (hidrodinamička transfekcija); Xia et al. (2002), Nature Biotechnol., 20(10), 1006-10 (isporuka posredovana virusima); ili Putnam (1996), Am. J. Health Syst. Pharm. 53(2), 151-160, erratum u Am. J. Health Syst. Pharm.53(3), 325 (1996).

[0435] Jedinjenja se takođe mogu primeniti postupkom pogodnim za primenu agenasa nukleinske kiseline, kao što je DNK vakcina. Ovi postupci uključuju genske pištolje, bio injektore, i flastere za kožu kao i postupke bez igle kao što su tehnologija mikročestične DNK vakcine objavljena u S.A.D. pat. br. 6,194,389, i sisarska transdermalna vakcinacija bez igle sa vakcinom u obliku praška kao što je objavljeno u S.A.D. pat. br.6,168,587. Pored toga, moguća je intranazalna isporuka, kao što je opisano, između ostalog, u Hamajima et al. (1998), Clin. Immunol. Immunopathol., 88(2), 205-10. Takođe se mogu upotrebljavati lipozomi (npr. kao što je opisano u S.A.D. pat. br. 6,472,375) i mikroinkapsulacija. Takođe se mogu upotrebljavati biorazgradivi sistemi za isporuku mikročestica koji mogu ciljati (npr. kao što je opisano u S.A.D. pat. br.6,471,996).

[0436] U jednom primeru izvođenja, aktivna jedinjenja se pripremaju sa nosačima koji će zaštititi jedinjenje od brze eliminacije iz tela, kao što je formulacija sa kontrolisanim oslobađanjem, uključujući implante i mikroinkapsulirane sisteme za isporuku. Mogu se upotrebljavati biorazgradivi, biokompatibilni polimeri, kao što su etilen vinil acetat, polianhidridi, poliglikolna kiselina, kolagen, poliortoestri, i polilaktična kiselina. Takve formulacije se mogu pripremiti upotrebom standardnih tehnika. Materijali se takođe mogu komercijalno dobiti od Alza Corporation i Nova Pharmaceuticals, Inc. Lipozomske suspenzije (uključujući lipozome ciljane na inficirane ćelije sa monoklonskim antitelima na virusne antigene) takođe se mogu upotrebljavati kao farmaceutski prihvatljivi nosači. Ovi se mogu pripremiti u skladu sa postupcima poznatim onima koji su iskusni u struci, na primer, kao što je opisano u S.A.D. patentu br.4,522,811.

[0437] Toksičnost i terapijska efikasnost takvih jedinjenja mogu se odrediti standardnim farmaceutskim procedurama u ćelijskim kulturama ili eksperimentalnim životinjama, npr. za određivanje LD50(doza letalna za 50% populacije) i ED50(terapijski efikasna doza kod 50% populacije). Dozni odnos između toksičnih i terapijskih efekata je terapijski indeks i može se izraziti kao odnos LD50/ED50. Poželjna su jedinjenja koja pokazuju visoke terapijske indekse. Iako se mogu upotrebljavati jedinjenja koja pokazuju toksične sporedne efekte, treba voditi računa o dizajniranju sistema za isporuku koji cilja takva jedinjenja na mesto pogođenog tkiva kako bi se minimalizovalo potencijalno oštećenje neinficiranih ćelija i, samim tim, smanjili sporedni efekti.

[0438] Podaci dobijeni iz testova ćelijske kulture i studija na životinjama mogu se upotrebljavati za formulisanje opsega doza za upotrebu na ljudima. Doziranje takvih jedinjenja leži poželjno unutar opsega koncentracija u cirkulaciji koje uključuju ED50sa malo ili bez toksičnosti. Doziranje može varirati unutar ovog opsega u zavisnosti od oblika doziranja koji se koristi i puta primene koji se koristi. Za jedinjenje koje se upotrebljava u postupku iz pronalaska, terapijski efikasna doza se u početku može proceniti iz testova ćelijske kulture. Doza se može formulisati na životinjskim modelima kako bi se postigao opseg koncentracije u cirkulišućoj plazmi koji uključuje IC50(tj., koncentraciju testnog jedinjenja koja postiže polovinu maksimalne inhibicije simptoma) kao što je određeno u ćelijskoj kulturi. Takve informacije mogu se upotrebljavati za preciznije određivanje korisnih doza kod ljudi. Nivoi u plazmi se mogu izmeriti, na primer, tečnom hromatografijom visokih performansi.

[0439] Kao što je ovde definisano, terapijski efikasna količina molekula nukleinske kiseline (tj., efikasna doza) zavisi od odabrane nukleinske kiseline. Na primer, mogu se primeniti količine pojedinačne doze dsRNA (ili, npr. konstrukta(ata) koji kodiraju takvu dsRNA) u opsegu od približno 1 pg do 1000 mg; u nekim primerima izvođenja može se primeniti 10, 30, 100, ili 1000 pg, ili 10, 30, 100, ili 1000 ng, ili 10, 30, 100, ili 1000 μg, ili 10, 30, 100, ili 1000 mg. U nekim primerima izvođenja, može se primeniti 1-5 g kompozicija. Kompozicije se mogu primenjivati od jednom ili više puta dnevno do jednom ili više puta nedeljno; uključujući jednom svaki drugi dan. Iskusan u struci će znati da određeni faktori mogu uticati na doziranje i vreme potrebno za efikasno lečenje subjekta, uključujući, ali ne ograničavajući se na težinu bolesti ili poremećaja, prethodne tretmane, opšte zdravstveno stanje i/ili starost subjekta, i druge prisutne bolesti. Osim toga, tretman subjekta terapijski efikasnom količinom nukleinske kiseline (npr. dsRNA), proteina, polipeptida, ili antitela može da uključuje pojedinačni tretman ili, poželjno, može da uključuje seriju tretmana.

[0440] Molekuli nukleinske kiseline iz pronalaska mogu se insertovati u ekspresione konstrukte, npr. virusne vektore, retrovirusne vektore, ekspresione kasete, ili plazmidne virusne vektore, npr. upotrebom postupaka poznatih u struci, uključujući, ali ne ograničavajući se na one opisane u Xia et al., (2002), supra. Ekspresioni konstrukti se mogu isporučiti subjektu, na primer, inhalacijom, oralno, intravenskom injekcijom, lokalnom primenom (videti, S.A.D. pat. br.

5,328,470) ili stereotaktičkom injekcijom (videti npr. Chen et al. (1994), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, 3054-3057). Farmaceutski preparat vektora za isporuku može uključivati vektor u prihvatljivom razblaživaču, ili može sadržati matriks sa sporim oslobađanjem u koji je ugrađen vehikulum za isporuku. Alternativno, gde se kompletan vektor za isporuku može proizvesti intaktno iz rekombinantnih ćelija, npr. retrovirusni vektori, farmaceutski preparat može uključivati jednu ili više ćelija koje proizvode sistem za isporuku gena.

[0441] Ekspresioni konstrukti mogu biti konstrukti pogodni za upotrebu u odgovarajućem ekspresionom sistemu i uključuju, ali se ne ograničavaju na retrovirusne vektore, kasete linearne ekspresije, plazmide i virusne ili vektore poreklom od virusa, kao što je poznato u struci. Takvi ekspresioni konstrukti mogu da uključuju jedan ili više inducibilnih promotora, RNK Pol III promotor sisteme kao što su U6 snRNA promotori ili HI RNK polimeraza III promotori, ili druge promotore poznate u struci. Konstrukti mogu da uključuju jedan ili oba lanca siRNA. Ekspresioni konstrukti koji eksprimiraju oba lanca mogu takođe da uključuju strukture petlje koje povezuju oba lanca, ili se svaki lanac može zasebno transkribovati sa zasebnih promotora unutar istog konstrukta. Svaki lanac se takođe može transkribovati iz zasebnog ekspresionog konstrukta, npr. Tuschl (2002, Nature Biotechnol 20: 500-505).

[0442] Može se uvideti da će postupak uvođenja dsRNA agenasa u okruženje ćelije zavisiti od tipa ćelije i sastava njenog okruženja. Na primer, kada se ćelije nalaze unutar tečnosti, jedna poželjna formulacija je sa lipidnom formulacijom kao što je lipofektamin i dsRNA agensi se mogu dodati direktno u tečno okruženje ćelija. Lipidne formulacije mogu se takođe primenjivati životinjama kao što su intravenska, intramuskularna, ili intraperitonealna injekcija, ili oralno ili inhalacijom ili drugim postupcima kao što je poznato u struci. Kada je formulacija pogodna za primenu u životinje kao što su sisari i specifičnije ljudi, formulacija je takođe farmaceutski prihvatljiva. Farmaceutski prihvatljive formulacije za primenu oligonukleotida su poznate i mogu se upotrebljavati. U nekim slučajevima, može biti poželjno formulisati dsRNA agense u puferu ili fiziološkom rastvoru i direktno injektirati formulisane dsRNA agense u ćelije, kao u studijama sa oocitima. Takođe se može izvršiti direktno injektiranje dupleksa dsRNA agensa. Za pogodne postupke uvođenja dsRNA (npr. DsiRNA agenasa), videti S.A.D. publikovanu patentnu prijavu br.2004/0203145 A1.

[0443] Pogodne količine dsRNA agensa se moraju uvesti i te količine se mogu empirijski odrediti upotrebom standardnih postupaka. Tipično, efikasne koncentracije pojedinih vrsta dsRNA agensa u okruženju ćelije biće 50 nanomola ili manje, 10 nanomola ili manje, ili se mogu upotrebljavati kompozicije u kojima su koncentracije od 1 nanomola ili manje. U sledećem primeru izvođenja, mogu se upotrebljavati u mnogim okolnostima postupci koji koriste koncentraciju od 200 pikomola ili manje, 100 pikomola ili manje, 50 pikomola ili manje, 20 pikomola ili manje, pa čak i koncentraciju od 10 pikomola ili manje, 5 pikomola ili manje, 2 pikomola ili manje ili 1 pikomol ili manje.

[0444] Postupak se može izvesti dodavanjem kompozicija dsRNA agensa u vanćelijski matriks u kom ćelije mogu da žive pod uslovom da je kompozicija dsRNA agensa formulisana tako da dovoljna količina dsRNA agensa može ući u ćeliju kako bi ispoljila svoj efekat. Na primer, postupak je pogodan za upotrebu sa ćelijama prisutnim u tečnosti kao što je tečna kultura ili medijum za rast ćelija, u tkivnim eksplantatima, ili u celim organizmima, uključujući životinje, kao što su sisari i naročito ljudi.

[0445] Nivo ili aktivnost RNK glikolat oksidaze može se odrediti pogodnim postupkom koji je sada poznat u struci ili koji je kasnije razvijen. Može se uvideti da postupak koji se upotrebljava za merenje target RNK i/ili ekspresije target RNK može zavisiti od prirode target RNK. Na primer, gde target RNK sekvenca glikolat oksidaze kodira protein, termin "ekspresija" može označavati protein ili RNK/transkript glikolat oksidaze poreklom od gena glikolat oksidaze (bilo genomskog bilo egzogenog porekla). U takvim slučajevima ekspresija target RNK glikolat oksidaze može se odrediti merenjem količine RNK/transkripta glikolat oksidaze direktno ili merenjem količine proteina glikolat oksidaze. Protein se može izmeriti u testovima proteina kao na primer bojenjem ili imunoblotovanjem, ili ukoliko protein katalizuje reakciju koja se može izmeriti, merenjem stopa reakcije. Svi takvi postupci su poznati u struci i mogu se upotrebljavati. Gde treba da se izmere nivoi target RNK glikolat oksidaze, mogu se upotrebljavati u struci prepoznati postupci za detektovanje nivoa RNK (npr. RT-PCR, Northern blotovanje, itd.). U ciljanju RNK glikolat oksidaze sa dsRNA agensima iz trenutnog pronalaska, takođe se očekuje da se merenje efikasnosti dsRNA agensa u redukovanju nivoa RNK ili proteina glikolat oksidaze u subjektu, tkivu, u ćelijama, bilo in vitro ili in vivo, ili u ekstraktima ćelija takođe može upotrebljavati za određivanje stepena redukovanja fenotipova povezanih sa glikolat oksidazom (npr. bolest ili poremećaji, npr. PHI, biomarkeri i/ili fenotipovi povezani sa PHI, druge retke bolesti jetre i pridruženi biomarkeri i/ili fenotipovi itd.). Gore navedena merenja se mogu izvršiti na ćelijama, ekstraktima ćelija, tkivima, ekstraktima tkiva ili drugom materijalu koji je pogodan kao izvor.

[0446] Određivanje da li je redukovana ekspresija RNK glikolat oksidaze može biti pomoću pogodnog postupka koji može pouzdano da detektuje promene u nivoima RNK. Tipično, određivanje se vrši pomoću uvođenja nedigestovane dsRNA u okruženje ćelije tako da bar deo tog dsRNA agensa uđe u citoplazmu, i zatim merenjem nivoa target RNK. Isto merenje se vrši na identičnim netretiranim ćelijama i porede se rezultati dobijeni svakim merenjem.

[0447] dsRNA agens se može formulisati kao farmaceutska kompozicija koja sadrži farmakološki efikasnu količinu dsRNA agensa i farmaceutski prihvatljiv nosač. Farmakološki ili terapijski efikasna količina označava onu količinu dsRNA agensa koja je efikasna da proizvede željeni farmakološki, terapijski ili preventivni rezultat. Fraze "farmakološki efikasna količina" i "terapijski efikasna količina" ili jednostavno "efikasna količina" označavaju onu količinu RNK koja je efikasna da proizvede predviđeni farmakološki, terapijski ili preventivni rezultat. Na primer, ukoliko se dati klinički tretman smatra efikasnim kada postoji najmanje 20% redukovanja u merljivom parametru povezanom sa bolešću ili poremećajem, terapijski efikasna količina leka za lečenje te bolesti ili poremećaja je količina potrebna kako bi se postiglo najmanje 20% redukovanja tog parametra.

[0448] Pogodno formulisane farmaceutske kompozicije iz ovog pronalaska mogu se primenjivati pomoću načina poznatih u struci kao što je parenteralnim putevima, uključujući intravensku, intramuskularnu, intraperitonealnu, subkutanu, transdermalnu, disajnim putevima (aerosol), rektalnu, vaginalnu i topikalnu (uključujući bukalnu i sublingvalnu) primenu. U nekim primerima izvođenja, farmaceutske kompozicije se primenjuju intravenskom ili intraparenteralnom infuzijom ili injekcijom.

[0449] Generalno, pogodna dozna jedinica dsRNA biće u opsegu od 0,001 do 0,25 miligrama po kilogramu telesne težine primaoca dnevno, ili u opsegu od 0,01 do 20 mikrograma po kilogramu telesne težine dnevno, ili u opsegu od 0,001 do 5 mikrograma po kilogramu telesne težine dnevno, ili u opsegu od 1 do 500 nanograma po kilogramu telesne težine dnevno, ili u opsegu od 0,01 do 10 mikrograma po kilogramu telesne težine dnevno, ili u opsegu od 0,10 do 5 mikrograma po kilogramu telesne težine dnevno, ili u opsegu od 0,1 do 2,5 mikrograma po kilogramu telesne težine dnevno. Farmaceutska kompozicija koja sadrži dsRNA može se primenjivati jednom dnevno. Međutim, terapijski agens se takođe može dozirati u doznim jedinicama koje sadrže dve, tri, četiri, pet, šest ili više pod-doza primenjenih u odgovarajućim intervalima tokom dana. U tom slučaju, dsRNA koja je sadržana u svakoj pod-dozi mora biti odgovarajuće manja kako bi se postigla ukupna dnevna dozna jedinica. Dozna jedinica takođe može biti sastavljena kao jedna doza koja traje nekoliko dana, npr. upotrebljavajući konvencionalnu formulaciju sa neprekidnim oslobađanjem koja obezbeđuje neprekidno i konzistentno oslobađanje dsRNA tokom perioda od nekoliko dana. Formulacije sa neprekidnim oslobađanjem su dobro poznate u struci. U ovom primeru izvođenja, dozna jedinica sadrži odgovarajuće višestruke dnevne doze. Bez obzira na formulaciju, farmaceutska kompozicija mora da sadrži dsRNA u količini dovoljnoj da inhibira ekspresiju target gena kod životinje ili čoveka koji se leče. Kompozicija može biti sastavljena na takav način da zbir višestrukih jedinica dsRNA zajedno sadrži dovoljnu dozu.

[0450] Podaci se mogu dobiti iz testova ćelijske kulture i studija na životinjama kako bi se formulisao pogodan dozni opseg za ljude. Doziranje kompozicija iz pronalaska leži unutar opsega koncentracija u cirkulaciji koje uključuju ED50(kao što je određeno poznatim postupcima) sa malo ili bez toksičnosti. Doziranje može varirati unutar ovog opsega, u zavisnosti od doznog oblika koji se koristi i puta primene koji se koristi. Za jedinjenje koje se upotrebljava u postupku iz pronalaska, terapijski efikasna doza se u početku može proceniti iz testova ćelijske kulture. Doza se može formulisati na životinjskim modelima kako bi se postigao opseg koncentracije jedinjenja u cirkulišućoj plazmi koji uključuje IC50(tj., koncentraciju testnog jedinjenja koja postiže polovinu maksimalne inhibicije simptoma) kao što je određeno u ćelijskoj kulturi. Takve informacije mogu se upotrebljavati za preciznije određivanje korisnih doza kod ljudi. Nivoi dsRNA u plazmi se mogu izmeriti pomoću standardnih postupaka, na primer, tečnom hromatografijom visokih performansi.

1

[0451] Farmaceutske kompozicije mogu biti uključene u komplet, kontejner, pakovanje, ili dozator zajedno sa uputstvima za primenu.

Postupci lečenja

[0452] Predmetni pronalazak obezbeđuje i profilaktičke i terapijske postupke lečenja subjekta koji je u riziku od (ili je podložan) bolesti ili poremećaju koji su izazvani, u celini ili delimično, glikolat oksidazom (npr. normalno funkcionisanje ili pogrešno regulisanje i/ili povišenje HAO1 transkripta i/ili nivoa proteina glikolat oksidaze), ili se mogu lečiti putem selektivnog ciljnog delovanja na glikolat oksidazu.

[0453] "Tretman", ili "lečenje", kao što se ovde upotrebljava, definisano je kao aplikacija ili primena terapijskog agensa (npr. dsRNA agensa ili vektora ili transgena koji ga kodira) pacijentu, ili aplikacija ili primena terapijskog agensa na izolovano tkivo ili ćelijsku liniju od pacijenta, koji ima bolest ili poremećaj, simptom bolesti ili poremećaja ili predispoziciju ka bolesti ili poremećaju, sa namerom da izleči, zaleči, ublaži, olakša, izmeni, leči, poboljša, popravi ili utiče na bolest ili poremećaj, ili simptome bolesti ili poremećaja, ili predispoziciju ka bolesti.

[0454] U jednom aspektu, pronalazak obezbeđuje postupak za prevenciju kod subjekta, bolesti ili poremećaja kao što je opisano iznad (uključujući, npr. prevenciju početka, npr. događaja koji formiraju PH1 u subjektu putem inhibicije ekspresije glikolat oksidaze), pomoću primene subjektu terapijskog agensa (npr. dsRNA agensa ili vektora ili transgena koji ga kodira). Subjekti koji su u riziku od bolesti mogu se identifikovati, na primer, jednim ili kombinacijom dijagnostičkih ili prognostičkih testova kao što je ovde opisano. Primena profilaktičkog agensa može se dogoditi pre detekcije, npr. PHI kod subjekta, ili ispoljavanja simptoma karakterističnih za bolest ili poremećaj, tako da se bolest ili poremećaj sprečava ili se, alternativno, odlaže njeno napredovanje.

[0455] Sledeći aspekt pronalaska se odnosi na postupke terapijskog lečenja subjekata, tj. na izmenu početka simptoma bolesti ili poremećaja. Ovi postupci se mogu izvoditi in vitro (npr. kultivisanjem ćelije sa dsRNA agensom) ili, alternativno, in vivo (npr. primenom dsRNA agensa subjektu).

[0456] Što se tiče i profilaktičkih i terapijskih postupaka lečenja, takva lečenja mogu biti specifično prilagođena ili modifikovana, na osnovu znanja stečenih iz oblasti farmakogenomike. "Farmakogenomika", kao što se ovde upotrebljava, označava primenu genomskih tehnologija kao što su sekvenciranje gena, statistička genetika, i analiza ekspresije gena na lekove u kliničkom razvoju i na tržištu. Specifičnije, termin označava proučavanje kako pacijentovi geni

2

određuju njegov ili njen odgovor na lek (npr. pacijentov "fenotip odgovora na lek", ili "genotip odgovora na lek"). Stoga, sledeći aspekt pronalaska obezbeđuje postupke za prilagođavanje profilaktičkog ili terapijskog lečenja pojedinca bilo sa target HAO1 RNK molekulima iz predmetnog pronalaska ili target HAO1 RNK modulatorima u skladu sa genotipom odgovora na lek pojedinca. Farmakogenomika omogućava lekaru specijalisti ili lekaru opšte prakse da cilja profilaktičko ili terapijsko lečenje na pacijente koji će imati najviše koristi od lečenja i da izbegne lečenje pacijenata koji će doživeti toksične sporedne efekte povezane sa lekovima.

[0457] Terapijski agensi se mogu testirati na odabranom životinjskom modelu. Na primer, dsRNA agens (ili ekspresioni vektor ili transgen koji ga kodira) kao što je ovde opisano može se upotrebljavati u životinjskom modelu kako bi se odredila efikasnost, toksičnost, ili sporedni efekti lečenja navedenim agensom. Alternativno, agens (npr. terapijski agens) se može upotrebljavati u životinjskom modelu kako bi se odredio mehanizam delovanja takvog agensa.

Modeli korisni za procenu smanjenja nivoa i ekspresije HAO1 iRNK

Ćelijska kultura

[0458] dsRNA agensi iz pronalaska mogu se testirati za aktivnost isecanja in vivo, na primer, upotrebom sledeće procedure. Nukleotidne sekvence unutar HAO1 cDNA ciljane pomoću dsRNA agenasa iz pronalaska prikazane su u gore navedenim HAO1 sekvencama.

[0459] dsRNA reagensi iz pronalaska mogu se testirati u ćelijskoj kulturi upotrebom HeLa ili drugih sisarskih ćelija (npr. humanih ćelijskih linija Hep3B, HepG2, DU145, Calu3, SW480, T84, PL45, itd. i mišjih ćelijskih linija Hepa1-6, AML12, Neuro2a, itd.) kako bi se odredio stepen inhibicije HAO1 RNK i/ili proteina glikolat oksidaze. U određenim primerima izvođenja, DsiRNA reagensi (npr. videti Sliku 1, i gore pomenute strukture) izabrani su prema HAO1 targetu kao što je ovde opisano. Inhibicija HAO1 RNK meri se posle isporuke ovih reagenasa pomoću pogodnog agensa za transfekciju, na primer, kultivisanim HeLa ćelijama ili drugim transformisanim ili netransformisanim sisarskim ćelijama u kulturi. Relativne količine target HAO1 RNK mere se reporter testom (npr. kao što je prikazano kao primer ispod) i/ili naspram HPRT1, aktina ili druge odgovarajuće kontrole upotrebom praćenja PCR amplifikacije u realnom vremenu (npr. ABI 7700 TAQMAN®). Napravljeno je poređenje sa aktivnošću oligonukleotidnih sekvenci napravljenih za nesrodne targete ili za nasumičnu DsiRNA kontrolu sa istom ukupnom dužinom i hemijom, ili jednostavno sa odgovarajućim vehikulumomtretiranim ili netretiranim kontrolama. Primarni i sekundarni vodeći reagensi su odabrani za target i izvršena je optimizacija.

TAQMAN® (praćenje PCR amplifikacije u realnom vremenu) i Lightcycler kvantifikacija iRNK

[0460] Za RT-qPCR testove, ukupna RNK se priprema iz ćelija nakon DsiRNA isporuke, na primer, upotrebom Ambion Rnaqueous 4-PCR kompleta za prečišćavanje za ekstrakcije u velikoj razmeri, ili Promega SV96 za testove sa 96 bunarića. Za Taqman analizu, probe sa dvostrukim obeležavanjem se sintetišu sa, na primer, reporter bojama FAM ili VIC kovalentno povezanim na 5’-kraju i gasivom bojom TAMRA konjugovanom za 3’-kraj. PCR amplifikacije se izvode, na primer, na ABI PRISM 7700 detektoru sekvence upotrebom reakcija od 50 μL koje se sastoje od 10 μL ukupne RNK, 100 nM nizvodnog prajmera, 100 mM reverznog prajmera, 100 nM probe, 1xTaqMan PCR reakcionog pufera (PE-Applied Biosystems), 5,5 mM MgCl2, po 100 μM svakog od dATP, dCTP, dGTP i dTTP, 0,2U inhibitora RNaze (Promega), 0,025U AmpliTaq Gold (PE-Applied Biosystems) i 0,2U M-MLV reverzne transkriptaze (Promega). Uslovi termičkog ciklusa mogu se sastojati od 30 minuta na 48 °C, 10 minuta na 95 °C, praćeno sa 40 ciklusa od 15 sekundi na 95 °C i 1 minut na 60 °C. Kvantifikacija nivoa target HAO1 iRNK određuje se u odnosu na standarde generisane iz serijski razblažene ukupne ćelijske RNK (300, 100, 30, 10 ng/rxn) i normalizuje se, na primer, na HPRT1 iRNK u paralelnim ili istim tubama TaqMan reakcija.

Western blotovanje

[0461] Ekstrakti ćelijskih proteina mogu se pripremiti upotrebom standardne tehnike mikro pripreme (na primer upotrebom RIPA pufera). Ekstrakti ćelijskih proteina se kreću na Tris-glicin poliakrilamid gelu i prenose na membrane. Nespecifično vezivanje se može blokirati inkubacijom, na primer, sa 5% nemasnog mleka tokom 1 sata praćeno primarnim antitelom tokom 16 sati na 4 °C. Nakon ispiranja, nanosi se sekundarno antitelo, na primer (razblaženje 1: 10.000) tokom 1 sata na sobnoj temperaturi i signal se detektuje na VersaDoc sistemu za snimanje.

[0462] U nekoliko sistema ćelijskih kultura, pokazano je da katjonski lipidi poboljšavaju bioraspoloživost oligonukleotida ćelijama u kulturi (Bennet, et al., 1992, Mol. Pharmacology, 41, 1023-1033). U jednom primeru izvođenja, dsRNA molekuli iz pronalaska su kompleksirani sa katjonskim lipidima za eksperimente sa ćelijskim kulturama. Smeše dsRNA i katjonskih lipida se pripremaju u OptimMEM (InVitrogen) bez seruma neposredno pre dodavanja ćelijama. OptiMEM se zagreje na sobnu temperaturu (oko 20-25 °C) i dodaje se katjonski lipid do krajnje željene koncentracije. dsRNA molekuli se dodaju u OptiMEM do željene koncentracije i rastvor

4

se dodaje razblaženoj dsRNA i inkubira tokom 15 minuta na sobnoj temperaturi. U eksperimentima doznog odgovora, RNK kompleks se serijski razblažuje u OptiMEM pre dodavanja katjonskog lipida.

Životinjski modeli

[0463] Efikasnost anti-HAO 1 dsRNA agenasa može se proceniti na životinjskom modelu. Životinjski modeli PHI kao što su poznati u struci mogu se upotrebljavati za procenu efikasnosti, potentnosti, toksičnosti itd. anti-HAO1 dsRNA. Primeri životinjskih modela korisnih za procenu anti-HAO1 dsRNA uključuju mišje modele izazova sa glikolatom i genetički projektovane mišje modele PHI bolesti. Takvi životinjski modeli mogu se takođe upotrebljavati kao izvor ćelija ili tkiva za testove kompozicija iz pronalaska. Takvi modeli se mogu dopunski upotrebljavati ili prilagoditi za upotrebu u pretkliničkoj proceni efikasnosti dsRNA kompozicija iz pronalaska u modulaciji ekspresije HAO1 gena prema terapijskoj upotrebi.

[0464] Takvi modeli i/ili miševi divljeg tipa mogu se upotrebljavati u proceni efikasnosti dsRNA molekula iz pronalaska za inhibiranje nivoa HAO1 ekspresije, razvoja fenotipova, bolesti ili poremećaja povezanih sa HAO1, itd. Ovi modeli, miševi divljeg tipa i/ili drugi modeli mogu se slično upotrebljavati za procenu bezbednosti/toksičnosti i efikasnosti dsRNA molekula iz pronalaska u pretkliničkoj postavci.

[0465] Specifični primeri sistema životinjskih modela korisnih za procenu HAO1-ciljno delujuće dsRNA iz pronalaska uključuju miševe divljeg tipa i genetički projektovani mišji model sa nedostatkom alanin-glioksilat aminotransferaze (videti Salido et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103(48): 18249-54). U primeru in vivo eksperimenta, dsRNA iz pronalaska se injektiraju u repnu venu takvih mišjih modela pri dozama u opsegu od 0,01 do 0,1 do 1 mg/kg ili, alternativno, ponovljene doze se primenjuju pri IC50nivoima jedne doze, i uzorci organa (npr. jetra, ali takođe može uključivati prostatu, bubreg, pluća, pankreas, kolon, kožu, slezinu, kostnu srž, limfne čvorove, masno tkivo mlečnih žlezda, itd.) se sakupljaju 24 sata posle primene krajnje doze. Takvi organi se zatim procenjuju na nivoe HAO1 miša i/ili čoveka, u zavisnosti od upotrebljenog modela, i/ili na uticaj na fenotipove povezane sa PHI. Trajanje delovanja se takođe može ispitati na, npr.1, 4, 7, 14, 21 ili više dana posle krajnje primene dsRNA.

[0466] Praksa predmetnog pronalaska koristi, ukoliko nije drugačije naznačeno, konvencionalne tehnike hemije, molekularne biologije, mikrobiologije, rekombinantne DNK, genetike, imunologije, ćelijske biologije, ćelijske kulture i transgene biologije, koje su unutar veština struke. Pogledati npr. Maniatis et al., 1982, Molecular Cloning (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.); Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, 2nd Ed. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.); Sambrook i Russell, 2001, Molecular Cloning, 3rd Ed. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.); Ausubel et al., 1992, Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons, uključujući periodična ažuriranja); Glover, 1985, DNA Cloning (IRL Press, Oxford); Anand, 1992; Guthrie i Fink, 1991; Harlow i Lane, 1988, Antibodies, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.); Jakoby i Pastan, 1979; Nucleic Acid Hybridization (B. D. Hames & S. J. Higgins eds. 1984); Transcription And Translation (B. D. Hames & S. J. Higgins eds. 1984); Culture Of Animal Cells (R. I. Freshney, Alan R. Liss, Inc., 1987); Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press, 1986); B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); rasprava, Methods In Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.); Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells (J. H. Miller i M. P. Calos eds., 1987, Cold Spring Harbor Laboratory); Methods In Enzymology, Vols.154 i 155 (Wu et al. eds.), Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Mayer i Walker, eds., Academic Press, London, 1987); Handbook Of Experimental Immunology, Volumes I-IV (D. M. Weir i C. C. Blackwell, eds., 1986); Riott, Essential Immunology, 6th Edition, Blackwell Scientific Publications, Oxford, 1988; Hogan et al., Manipulating the Mouse Embryo, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1986); Westerfield, M., The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio), (4th Ed., Univ. of Oregon Press, Eugene, 2000).

[0467] Ukoliko nije drugačije definisano, svi ovde upotrebljeni tehnički i naučni termini imaju isto značenje kao što ih uobičajeno razume onaj koji je prosečno stručan u oblasti kojoj ovaj pronalazak pripada. Iako se postupci i materijali slični ili ekvivalentni ovde opisanim mogu upotrebljavati u praksi ili testiranju predmetnog pronalaska, pogodni postupci i materijali su opisani ispod. U slučaju sukoba, predmetna specifikacija, uključujući definicije, će imati prevlast. Pored toga, materijali, postupci, i primeri su samo ilustrativni i nisu namenjeni da budu ograničavajući.

PRIMERI

[0468] Predmetni pronalazak je opisan pozivanjem na sledeće Primere, koji su ponuđeni putem ilustracija i nisu namenjeni ograničavanju pronalaska na bilo koji način. Korišćene su standardne tehnike dobro poznate u struci ili tehnike specifično opisane u nastavku.

Primer 1: Priprema dvolančanih RNK oligonukleotida

Sinteza i prečišćavanje oligonukleotida

[0469] DsiRNA molekuli su dizajnirani da interaguju sa različitim mestima u RNK poruci, na primer, target sekvencama unutar ovde opisanih RNK sekvenci. U predmetno predstavljenim agensima kao primer, izabrano je 384 humane target HAO1 sekvence za procenu (predviđeno je da je odabir od 384 humanih target HAO1 mesta konzerviran sa odgovarajućim mestima u mišjoj HAO1 transkript sekvenci). Sekvence jednog lanca DsiRNA molekula bile su komplementarne sa gore opisanim sekvencama target HAO 1 mesta. DsiRNA molekuli su hemijski sintetisani upotrebom ovde opisanih postupaka. Generalno, DsiRNA konstrukti su sintetisani upotrebom postupaka sinteze oligonukleotida u čvrstoj fazi kao što je opisano za 19-23mer siRNA (videti na primer Usman et al, S.A.D. patenti br.5.804.683; 5.831.071; 5.998.203; 6.117.657; 6.353.098; 6.362.323; 6.437.117; 6.469.158; Scaringe et al., S.A.D. patenti br.

6.111.086; 6.008.400; 6.111.086).

[0470] Pojedinačni RNA lanci su sintetisani i HPLC prečišćeni u skladu sa standardnim postupcima (Integrated DNA Technologies, Coralville, Iowa). Na primer, RNK oligonukleotidi su sintetisani upotrebom hemije fosforamidita u čvrstoj fazi, deprotektovani i desalinizovani na NAP-5 kolonama (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, N.J.) upotrebom standardnih tehnika (Damha i Olgivie, 1993, Methods Mol Biol 20: 81-114; Wincott et al., 1995, Nucleic Acids Res 23: 2677-84). Oligomeri su prečišćeni upotrebom jono-izmenjivačke tečne hromatografije visokih performansi (IE-HPLC) na Amersham Source 15Q koloni (1,0 cm x 25 cm; Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, N.J.) upotrebom linearnog gradijenta u koraku od 15 min. Gradijent je varirao od 90:10 pufera A:B do 52:48 pufera A:B, gde je pufer A bio 100 mM Tris pH 8,5 i pufer B je bio 100 mM Tris pH 8,5, 1 M NaCl. Uzorci su praćeni na 260 nm i sakupljeni su pikovi koji odgovaraju oligonukleotidnim vrstama pune dužine, pulirani, desalinizovani na NAP-5 kolonama, i liofilizovani.

[0471] Čistoća svakog oligomera određena je kapilarnom elektroforezom (CE) na Beckman PACE 5000 (Beckman Coulter, Inc., Fullerton, Calif.). CE kapilari su imali unutrašnji prečnik od 100 μm i sadržali su ssDNA 100R gel (Beckman-Coulter). Tipično, oko 0,6 nmola oligonukleotida je injektirano u kapilar, pokrenuto u električnom polju od 444 V/cm i detektovano pomoću UV apsorbance na 260 nm. Denaturišući pufer za kretanje Tris-Borat-7 M-urea kupljen je od Beckman-Coulter. Dobijeni su oligoribonukleotidi koji su bili najmanje 90% čisti kao što je proceneno pomoću CE za upotrebu u eksperimentima opisanim ispod. Identičnost jedinjenja je verifikovana pomoću MALDI-TOF (matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight) masene spektroskopije na Voyager DE.TM. radnoj stanici za biospektometriju (Applied Biosystems, Foster City, Calif.) prateći preporučeni protokol proizvođača. Dobijene su relativne molekulske mase svih oligomera, često unutar 0,2% od očekivane molekulske mase.

Priprema dupleksa

[0472] Jednolančani RNK (ssRNA) oligomeri su resuspendovani, npr. pri koncentraciji od 100 μM u dupleks puferu koji se sastoji od 100 mM kalijum acetata, 30 mM HEPES, pH 7,5. Komplementarni sens i antisens lanci su pomešani u jednakim molskim količinama da bi se dobio krajnji rastvor od, npr. 50 μM dupleksa. Uzorci su zagrevani na 100 °C tokom 5’ u RNK puferu (IDT) i omogućeno im je da se ohlade na sobnu temperaturu pre upotrebe. Dvolančani RNK (dsRNA) oligomeri su skladišteni na -20 °C. Jednolančani RNK oligomeri su skladišteni liofilizovani ili u vodi bez nukleaze na -80 °C.

Nomenklatura

[0473] Zarad doslednosti, u trenutnoj specifikaciji se koristi sledeća nomenklatura. Nazivi koji su dati dupleksima označavaju dužinu oligomera i prisustvo ili odsustvo visećih krajeva. "25/27" je asimetrični dupleks koji ima sens lanac od 25 baza i antisens lanac od 27 baza sa 3’-visećim krajem od 2 baze. "27/25" je asimetrični dupleks koji ima sens lanac od 27 baza i antisens lanac od 25 baza.

Ćelijska kultura i RNK transfekcija

[0474] HeLa ćelije su dobijene i održavane u DMEM (HyClone) suplementovanom sa 10% fetalnog goveđeg seruma (HyClone) na 37 °C pod 5% CO2. Za RNK transfekcije, ćelije su transfektovane sa DsiRNA pri krajnjoj koncentraciji od 1 nM ili 0,1 nM upotrebom Lipofectamine™ RNAiMAX (Invitrogen) i prateći uputstva proizvođača. Ukratko, za 0,1 nM transfekcije, npr. u Primeru 3 ispod, alikvot štok rastvora svake DsiRNA je pomešan sa Opti-MEM I (Invitrogen) i Lipofectamine™ RNAiMAX kako bi dostigao zapreminu od 150 μl (sa 0,3 nM DsiRNA). Rezultujuća smeša od 150 μl je inkubirana tokom 20 min na RT kako bi se omogućilo formiranje DsiRNA:Lipofectamine™ RNAiMAX kompleksa. U međuvremenu, target ćelije su tripsinizovane i resuspendovane u medijumu. Na kraju 20 minuta kompleksiranja, dodato je 50 μl smeše DsiRNA:RNAiMAX po bunariću u triplikatu bunarića ploče sa 96 bunarića. Na kraju, u svaki bunarić je dodato 100 μl ćelijske suspenzije (krajnja zapremina 150 μl) i ploče su stavljene u inkubator tokom 24 sata.

Procena inhibicije glikolat oksidaze

[0475] Nokdaun HAO1target gena u humanim HeLa ćelijama određen je pomoću reporter testa (HeLa ćelije su transformisane sa Psi-Check-HsHAO1 plazmidom i zatim su detektovani nivoi Renilla luciferaze upotrebom luminometra), dok je nokdaun HAO1 target gena u mišjim Hepa1-6 ćelijama određen pomoću qRT-PCR, sa vrednostima normalizovanim na HPRT i RPL23 gene za održavanje, i na transfekcije sa kontrolnim DsiRNA i/ili kontrole lažne transfekcije.

Izolacija i analiza RNK

[0476] Medijum je aspiriran, i ukupna RNK je ekstrahovana upotrebom SV96 kompleta (Promega). Ukupna RNK je reverzno transkribovana upotrebom SuperscriptII, Oligo dT, i nasumičnih heksamera prateći uputstva proizvođača. Tipično, rezultujuća cDNA je analizirana pomoću qPCR upotrebom prajmera i proba specifičnih i za HAO1 gen i za mišje gene HPRT-1 i RPL23. ABI 7700 je upotrebljen za reakcije amplifikacije. Svaki uzorak je testiran u triplikatu. Relativni nivoi RNK glikolat oksidaze normalizovani su na nivoe RNK HPRT1 i RPL23 i upoređeni sa nivoima RNK dobijenim u kontrolnim uzorcima transfekcije.

Primer 2: DsiRNA inhibicija glikolat oksidaze

[0477] DsiRNA molekuli koji ciljno deluju na glikolat oksidazu su dizajnirani i sintetisani kao što je opisano iznad i testirani u humanim HeLa ćelijama (alternativno, HepG2 ili druge humane ćelije bi mogle da se upotrebljavaju) za inhibitornu efikasnost. Za transfekciju, vezane DsiRNA su pomešane sa reagensom za transfekciju (Lipofectamine™ RNAiMAX, Invitrogen) i inkubirane tokom 20 minuta na sobnoj temperaturi. HeLa (humane) ili Hepa1-6 (mišje) ćelije (alternativno, mišje AML12 ili druge mišje ćelije bi mogle da se upotrebljavaju) su tripsinizovane, resuspendovane u medijumu, i dodate u bunariće (100 μL po bunariću) kako bi se dobila krajnja koncentracija DsiRNA od 1 nM u zapremini od 150 μl. Svaka DsiRNA smeša transfekcije je dodata u 3 bunarića za DsiRNA tretmane u triplikatu. Ćelije su inkubirane na 37 °C tokom 24 sata u kontinuiranom prisustvu DsiRNA smeše transfekcije. Posle 24 sata, humane ćelije su podvrgnute testiranju luminometrom za detektovanje nivoa Renilla luciferaze ili je RNK pripremljena iz svakog bunarića tretiranih mišjih ćelija. Za takve mišje ćelije, supernatanti sa smešama transfekcije su prvo uklonjeni i odbačeni, zatim su ćelije lizirane i RNK je pripremljena iz svakog bunarića. Nivoi luciferaze target reportera (čovek) ili nivoi HAO1 RNK (miš) su posle tretmana procenjeni pomoću luminometra (čovek) ili qRT-PCR (miš) za HAO1target gen, sa vrednostima normalizovanim na vrednosti dobijene za kontrole. Podaci iz triplikata su svedeni na prosek i % greške je određen za svaki tretman. Normalizovani podaci su tabelirani i prikazani na grafikonu, i određeno je redukovanje target iRNK pomoću aktivnih DsiRNA u poređenju sa kontrolama (videti Tabelu 11 ispod i Slike 2A do 2F).

Tabela 11: Inhibitorna efikasnost DsiRNA glikolat oksidaze testirana pri 1 nM u humanim HeLa i mišjim HEPA1-6 ćelijama

1

2

4

1

2

4

Primer 3: DsiRNA inhibicija glikolat oksidaze - sekundarni pregled

[0478] 96 asimetričnih DsiRNA (96 koje ciljno deluju na Hs HAO1, od kojih 26 takođe ciljaju Mm HAO1) iz gore navedenog eksperimenta je zatim ispitano u sekundarnom testu ("Faza 2"), sa rezultatima takvih testova predstavljenim u obliku histograma na Slikama 3A do 3F. Specifično, 96 asimetričnih DsiRNA odabranih od onih testiranih iznad procenjeno je za inhibiciju humane HAO1 pri 1 nM ili 0,1 nM (u duplikat testovima) u okruženju humanih HeLa ćelija (Slike 3A i 3B). Ovih 96 asimetričnih DsiRNA takođe je procenjeno za inhibiciju mišje

1

HAO1 pri 1 nM ili 0,1 nM (u duplikatu) u okruženju mišjih Hepa1-6 ćelija (Slike 3C do 3F). Kao što je pokazano na Slikama 3A i 3B, većina asimetričnih DsiRNA reproducibilno je pokazivala značajne inhibitorne efikasnosti humane HAO1 pri sub-nanomolskim koncentracijama kada su testirane u okruženju HeLa ćelija.

[0479] Bez vezivanja za teoriju, uočeno je da kada se upotrebljava RT-qPCR postupak za merenje količine iRNK koja preostaje posle nokdauna iRNK posredovanog sa DsiRNA, pozicija qPCR testa unutar iRNK može uticati na detekciju nokdauna. qPCR test koji je bliži tački isecanja iRNK usmerene sa DsiRNA uobičajeno daje pouzdanije merenje nivoa iRNK. Na primer, ukoliko je qPCR test lociran dalje od tačke isecanja, spora degradacija iRNK fragmenta koji rezultuje isecanjem usmerenim sa DsiRNA može dati artefaktno visok qPCR signal ("lažno negativno" za nokdaun). Znak za to je visok nokdaun detektovan upotrebom qPCR testa lociranog u blizini DsiRNA mesta, i artefaktno ʼniskiʼ nokdaun detektovan sa qPCR testom lociranim dalje od DsiRNA mesta. U ovoj situaciji, qPCR test u blizini DsiRNA mesta se upotrebljava za kvantifikaciju.

[0480] Kao što je pokazano na Slikama 3C do 3F, određeni broj asimetričnih DsiRNA takođe je identifikovano da poseduju značajne inhibitorne efikasnosti mišje HAO1 pri sub-nanomolskim koncentracijama kada su testirane u okruženju mišjih Hepa1-6 ćelija.

Primer 4: Procena in vivo efikasnosti glikolat oksidaza-ciljno delujućih DsiRNA

[0481] Ispitana je sposobnost određenih aktivnih HAO1-ciljno delujućih DsiRNA da redukuju nivoe HAO1 unutar jetre miša. DsiRNA korišćene u studiji su bile: HAO 1-1105, HAO1-1171, HAO1-1221, HAO1-1272, HAO1-1273, HAO1-1316, HAO1-1378 i HAO1-1379, od kojih je svaka sintetisana sa obrascem modifikacije putnik (sens) lanca "SM107" i obrascem modifikacije vodič (antisens) lanca "M48" (obrasci opisani iznad). Kako bi se izvela studija, generisan je model primarne hiperoksalurije oralnom gavažom 0,25 ml 0,5 M glikolata kako bi se prouzrokovalo nakupljanje oksalata u urinu kod ženki C57BL/6 miševa. Životinje su nasumično odabrane i raspoređene u grupe na osnovu telesne težine. Intravensko doziranje životinja sa lipidnim nanočesticama (LNP; ovde je korišćena LNP formulacija nazvana EnCore-2345) koje sadrže 1 mg/kg ili 0,1 mg/kg DsiRNA, inicirano je na dan 0. Doziranje je nastavljeno dvaput nedeljno za ukupno tri doze kod miševa pre izazova sa glikolatom. Uzorci urina na četiri sata i 24 h su sakupljeni posle izazova sa glikolatom za procenu nivoa oksalata/kreatinina (videti Sliku 4 za dijagram eksperimentalnog toka). Životinje su zatim žrtvovane 24 h posle izazova sa glikolatom. Jetra je disekovana i izmerena, i nivoi HAO1 su procenjeni upotrebom RT-qPCR, ViewRNA, western blota za glikolat oksidazu i/ili imunohistohemije glikolat oksidaze

2

(ViewRNA, western blot za glikolat oksidazu i podaci o imunohistohemiji glikolat oksidaze nisu pokazani). Uzorci seruma su takođe podvrgnuti ELISA za detektovanje glikolat oksidaze (podaci nisu pokazani). Značajno, svih osam DsiRNA pokazalo je robustni nokdaun HAO1 kada su primenjene pri 1 mg/kg (Slika 5). Najmanje dve (HAO1-1171 i HAO1-1378) od osam DsiRNA testiranih in vivo takođe su pokazale robustan nokdaun HAO1 kod svih tretiranih životinja kada su primenjene pri 0,1 mg/kg. Kao što je pokazano na Slici 5, primena HAO1-1171-M107/M48 DsiRNA pri 0,1 mg/kg uzrokovala je prosečni nokdaun od 70% u tkivu jetre tretiranih miševa, dok je primena pri 1 mg/kg proizvela prosečni nokdaun od 97% u tkivu jetre tretiranih miševa. Slično, primena HAO1-1378-M107/M48 DsiRNA pri 0,1 mg/kg uzrokovala je prosečni nokdaun od 53% u tkivu jetre tretiranih miševa, dok je primena pri 1 mg/kg proizvela prosečni nokdaun od 97% u tkivu jetre tretiranih miševa. HAO-1171-indukovani nokdaun i pri 0,1 mg/kg i 1 mg/kg dodatno je potvrđen pomoću ViewRNA in situ testova hibridizacije.

[0482] Robustni nivoi HAO1 iRNK nokdauna uočeni su u tkivu jetre miševa koji su tretirani sa 1 mg/kg količinama HAO1-ciljno delujućih DsiRNA HAO1-1171 i HAO1-1378 (Slika 6 i podaci nisu pokazani), i čak 0,1 mg/kg količine ovih HAO1-ciljno delujućih DsiRNA proizvele su robustni HAO1 nokdaun. Kao što je pokazano na Slici 6, pojedinačna doza HAO1-1171 DsiRNA tretmana postigla je trajni HAO1 iRNK target nokdaun tokom najmanje 120 sati posle primene u jetri tretiranih životinja. Dok je u jetri postignut robustni HAO1 nokdaun, inicijalni eksperimenti sa izazivom sa glikolatom dali su neubedljive fenotipske rezultate (podaci nisu pokazani).

[0483] U dopunskim eksperimentima in vivo, nivoi i HAO1 i oksalata procenjeni su i kod kontrolnih i DsiRNA-tretiranih genetički projektovanih mišjih modela PH1.

Primer 5: Procena modifikovanih oblika glikolat oksidaza-ciljno delujućih DsiRNA in vitro

[0484] Odabir od 24 DsiRNA iz gore navedenog Primera 3 je pripremljen sa 2'-O-metil obrascima modifikacije vodič lanca ("M17", "M35", "M48" i "M8", kao što je pokazano iznad), sparenih sa "M107" modifikacijama putnik lanca. Za svaku od ovih DsiRNA sekvenci, DsiRNA koje poseduju svaki od četiri obrasca modifikacije vodič lanca M17, M35, M48 i M8 zajedno sa "M107" obrascem modifikacije putnik lanca testirane su za inhibiciju HAO1 u humanim HeLa ćelijama pri koncentracijama od 1,0 nM i 0,1 nM (u duplikatu) u okruženju HeLa ćelija. Slika 7A pokazuje specifične obrasce modifikacije za takve duplekse (sa osenčenim ostacima koji ukazuju na one koji poseduju 2'-O-metil modifikacije), dok Slike 7B i 7C pokazuju podatke o nokdaun efikasnosti humane HAO1 za svaki od četiri modifikovana dupleksa povezana sa 24 ispitane dupleks sekvence (HAO1-65, 75, 77, 80, 83, 96, 1198, 1480, 1490, 1491, 1499, 1501, 1171, 1279, 1504, 1549, 1552, 1696, 1315, 1316, 1375, 1378, 1379 i 1393). Kao što je demonstrirano na Slikama 7B i 7C, mnogi testirani dupleksi su demonstrirali da poseduju robustnu nokdaun efikasnost HAO1 pri koncentracijama od čak 0,1 nM u čitavom opsegu veoma modifikovanih oblika koji su testirani.

[0485] Takođe je ispitano osam dupleks sekvenci (HAO1-m1167, m1276, m1312, m1313, m1372, m1375, m1376 i m1390, koje odgovaraju humanim dupleksima HAO1-1171, 1279, 1315, 1316, 1375, 1378, 1379 i 1393, respektivno) za nokdaun efikasnost u mišjim Hepa1-6 ćelijama u istom opsegu od četiri obrasca modifikacije dupleksa. Kao što je pokazano na Slikama 7D i 7E, većina ovih dupleksa pokazala je robustnu nokdaun efikasnost HAO1 u mišjim ćelijama u opsegu obrazaca modifikacije dupleksa, pri koncentracijama od samo 0,03 nM.

Primer 6: Procena dopunski modifikovanih oblika glikolat oksidaza-ciljno delujućih DsiRNA in vitro

[0486] Isti skup od 24 HAO1-ciljno delujućih dupleks sekvenci kao što je izneto u gore navedenom Primeru 5 je pripremljen da poseduje opseg od četiri 2'-O-metil obrazaca modifikacije putnik lanca ("M107", "M14", "M24" i "M250") zajedno sa fiksnim obrascem modifikacije vodič lanca "M48". Ove DsiRNA su testirane za inhibiciju HAO1 pri koncentracijama od 1,0 nM i 0,1 nM (u duplikatu) u okruženju HeLa ćelija. Slika 8A pokazuje specifične obrasce modifikacije za takve duplekse (sa osenčenim ostacima koji ukazuju na one koji poseduju 2ʼ-O-metil modifikacije), dok Slike 8B i 8C pokazuju podatke o nokdaun efikasnosti humane HAO1 za svaki od četiri modifikovana dupleksa povezana sa 24 ispitane dupleks sekvence (HAO1-65, 75, 77, 80, 83, 96, 1198, 1480, 1490, 1491, 1499, 1501, 1171, 1279, 1504, 1549, 1552, 1696, 1315, 1316, 1375, 1378, 1379 i 1393). Kao što je demonstrirano na Slikama 8B i 8C, mnogi od dopunski testiranih dupleksa su demonstrirali da poseduju robustnu nokdaun efikasnost HAO1 pri koncentracijama od čak 0,1 nM u čitavom opsegu veoma modifikovanih putnik lanaca (sa fiksnim obrascem modifikacije putnik lanca) koji su testirani.

[0487] Takođe je ispitano osam dupleks sekvenci (HAO1-m1167, m1276, m1312, m1313, m1372, m1375, m1376 i m1390, koje odgovaraju humanim dupleksima HAO1-1171, 1279, 1315, 1316, 1375, 1378, 1379 i 1393, respektivno) za nokdaun efikasnost u mišjim Hepa1-6 ćelijama u istom opsegu od četiri obrasca modifikacije dupleksa (sa promenljivim obrascima modifikacije putnik lanca i fiksnim obrascem modifikacije vodič lanca, za razliku od dupleksa iz gore navedenog Primera 5). Kao što je pokazano na Slikama 8D i 8E, većina ovih dupleksa pokazala je robustnu nokdaun efikasnost HAO1 u mišjim ćelijama u čitavom opsegu obrazaca modifikacije dupleksa, pri koncentracijama od samo 0,03 nM.

4

Primer 7: Dodatna procena modifikovanih oblika glikolat oksidaza-ciljno delujućih DsiRNA in vitro

[0488] Dodatni obrasci modifikacije i putnik (sens) i vodič (antisens) lanaca od gore navedene 24 HAO1-ciljno delujuće dupleks sekvence (HAO1-65, 75, 77, 80, 83, 96, 1171, 1198, 1279, 1315, 1316, 1375, 1378, 1379, 1393, 1480, 1490, 1491, 1499, 1501, 1504, 1549, 1552 i 1696) bili su pripremljeni da poseduju 2'-O-metil obrasce modifikacije kao što je pokazano na Slikama 9A do 9D. Ove veoma modifikovane DsiRNA testirane su za inhibiciju HAO1 pri koncentracijama od 1,0 nM i 0,1 nM (u duplikatu) u okruženju bilo HeLa ćelija (upotrebom sistema reporter luciferaze, Psi-Check-HsHAO1 plazmida; Slike 9E do 9H) ili humanih HEK293 ćelija stabilno transfektovanih sa HAO1 (HEK293-pcDNA_HAO1 ćelije; Slike 9I do 9L). Kao što je demonstrirano na Slikama 9D do 9L, mnogi od dopunski testiranih dupleksa su identifikovani da poseduju robustnu nokdaun efikasnost HAO1 pri koncentracijama od čak 0,1 nM u čitavom opsegu opsežno modifikovanih oblika koji su testirani. Zaista, za sve target sekvence, jedan ili više dupleksa koji poseduju opsežne 2’-O-metil modifikacije na oba lanca su identifikovani kao robustni inhibitor HAO1 ekspresije. Pored toga, ovi rezultati su potvrdili podudarnost između sistema luciferaze koji se koristi u mnogim od gore navedenih primera (Psi-Check-HsHAO1 plazmid) i HEK293-pcDNA_HAO1 ćelijskog sistema stabilne tranfekcije.

Primer 8: Dopunski opsežno modifikovani oblici glikolat oksidaza-ciljno delujućih DsiRNA bili su aktivni in vitro

[0489] Četiri od gore navedene 24 HAO1-ciljno delujuće dupleks sekvence, HAO1-1171, HAO1-1315, HAO1-1378 i HAO1-1501, pripremljene su da poseduju velike varijacije u 2'-O-metil obrascima modifikacije, kao što je pokazano na Slikama 10A do 10K. Ove veoma modifikovane DsiRNA su testirane za inhibiciju HAO1 pri koncentracijama od 1,0 nM i 0,1 nM (u duplikatu) u okruženju stabilno transfektovanih HEK293 ćelija (HEK293-pcDNA_HAO1 ćelije; Slike 10L do 10O). Kao što je demonstrirano na Slikama 10L do 10O, modifikovani oblici HAO1-1171, HAO1-1315, i HAO1-1501 dupleksa su identifikovani da poseduju robustnu nokdaun efikasnost HAO1 pri koncentracijama od čak 0,1 nM u čitavom opsegu opsežno modifikovanih oblika koji su testirani. U međuvremenu, za HAO1-1378 dupleks sekvencu, neki od veoma modifikovanih oblika pokazali su redukovane inhibitorne aktivnosti pri 0,1 nM u poređenju sa drugim veoma modifikovanim oblicima (iako su identifikovani brojni robustno aktivni veoma 2'-O-metil modifikovani oblici HAO1-1378 dupleksa).

[0490] Modifikacija HAO1-1171, HAO1-1315, HAO1-1378 i HAO1-1501 dupleksa je proširena tako da uključuje fosforotioat veze na krajnjim internukleotidnim vezama i 5ʼ i 3ʼ kraja i vodič i putnik lanca različito 2ʼ-O-metil modifikovanih dupleksa, kao što je pokazano na Slikama 11A do 11D. Pet oblika svakog od četiri dupleksa sintetisano je u maloj razmeri i testirano u stabilnoj ćelijskoj liniji (HAO1-6-9), pri dozama od 100 pM, 10 pM i 1 pM, sa kontrolama. Kao što je pokazano na Slici 11E, uočen je značajan nokdaun za sve duplekse testirane pri 100 pM, pa čak i pri 10 pM za većinu dupleksa. Od 20 ispitivanih oblika, devet je odabrano za procenu IC50 kriva doze, pri koncentracijama u opsegu od 10 nM do 10 fM, smanjujući se u desetostrukim koracima, sa rezultatima pokazanim na Slici 11F.

[0491] Modifikovani oblici HAO1-1171 i HAO-1376 su dodatno modifikovani sa 2'-fluoro i invertovanim baznim i dopunski i/ili alternativno pozicioniranim fosforotioat (PS) modifikacijama, položenim na "roditeljski" obrazac modifikacije, kao što je pokazano na Slikama 12A do 12D. Kao što je pokazano na Slikama 12E i 12F, identifikovani su veoma aktivni dodatno modifikovani ("izvedeni obrazac modifikacije") oblici svakog "roditeljskog" obrasca modifikacije koji predstavlja dupleks, sa značajnim efikasnostima uočenim pri koncentracijama od čak 10 pM.

Primer 9: Glikolat oksidaza-ciljno delujuće DsiRNA bile su veoma aktivne in vivo

[0492] Osam HAO1-ciljno delujućih dupleks sekvenci, HAO1-1105, HAO1-1171, HAO1-1221, HAO1-1272, HAO1-1273, HAO1-1316, HAO1-1378 i HAO1-1379, koje poseduju M107/M48 2'-O-metil obrazac modifikacije, formulisane su za in vivo isporuku u formulaciji lipidnih nanočestica (LNP) (EnCore 2345). Pojedinačna intravenska doza pri 0,1 ili 1,0 mg/kg primenjena je miševima (n = 5 po grupi), i jetre tretiranih životinja sakupljene su 24 sata posle primene. Stepen nokdauna HAO1 iRNK u tretiranoj jetri miša je procenjen pomoću qPCR. Kao što je pokazano na Slici 13A, svih osam HAO1-ciljno delujućih DsiRNA testiranih za in vivo nokdaun efikasnost bilo je aktivno pri dozama od 1,0 mg/kg. Značajno, HAO1-1171-M107/M48 i HAO1-1378-M107/M48 dupleksi su pokazali robustan nokdaun HAO1 u jetrama tretiranih miševa čak i pri dozi od 0,1 mg/kg (pokazujući respektivne nivoe nokdauna od približno 70% i približno 53%).

[0493] Kako bi se potvrdili gore navedeni qPCR rezultati, i takođe kako bi se verifikovao nokdaun proteina glikolat oksidaze, na uzorcima jetre tretiranih miševa izvedeni su ViewRNA testovi i imunohistohemija. Kao što je pokazano na Slici 13B, miševi tretirani sa HAO1-1171 pokazali su značajan nokdaun HAO1 i pomoću ViewRNA (gornji paneli) i pomoću imunohistohemije.

[0494] HAO1-ciljno delujuće DsiRNA su zatim ispitivane za in vivo terapijsku efikasnost kod PH1 genetički projektovanog modela miševa. Kod modela miševa AGXT<-/->PH1, miševima je inicijalno intravenski primenjena HAO1-ciljno delujuća DsiRNA, pri 0,3 mg/kg. Na dane 32 i 39, primenjene su sukcesivne dopunske intravenske injekcije HAO1-ciljno delujuće DsiRNA pri 0,3 mg/kg, i ispitan je efekat ovog doznog režima za efekat i na odnos oksalat/kreatinin i na odnos glikolat/kreatinin. Kao što je pokazano na Slici 13C, svaka primena HAO1-ciljno delujuće DsiRNA rezultovala je izrazitim padom odnosa oksalat/kreatinin tretiranih miševa, dok je odnos glikolat/kreatinin istih miševa povišen nakon svake primene DsiRNA. Stoga, formulisana HAO1-ciljno delujuća DsiRNA bila je efikasna u redukovanju povišenih nivoa oksalata koji uzrokuju primarnu hiperoksaluriju tipa 1.

[0495] Pošto je utvrđen efekat HAO1-ciljno delujućih DsiRNA na odnos oksalat/kreatinin i odnos glikolat/kreatinin tretiranih miševa, ispitivano je zatim da li HAO1-ciljno delujuće DsiRNA mogu takođe redukovati nivoe glikolat oksidaze u urinu kod tretiranih miševa PH1 modela. Kao što je pokazano na Slici 13D, kada su formulisane DsiRNA injektirane na dane 1, 4, 6, 10 i 14 u ukupno 5 doza, u miševe AGXT<-/->PH1 modela, uočena su značajna redukovanja nivoa proteina glikolat oksidaze u jetri sakupljenoj na dan 16.

[0496] U skladu sa gore uočenim efektima primene HAO1-ciljno delujuće DsiRNA, uočeno je da tretman miševa AGXT<-/->PH1 modela sa HAO1-ciljno delujućom DsiRNA sprečava oštećenje bubrega kod takvih miševa kada su tretirani etilen glikolom. Kao što je pokazano na Slici 13E, miševi kojima je primenjena HAO1-ciljno delujuća DsiRNA u tri vremenske tačke tokom primene etilen glikola bili su efikasno zaštićeni od povišenih odnosa oksalat/kreatinin, što je uočeno kod kontrolnih miševa kojima je primenjivan samo PBS tokom primene etilen glikola. Čak i jedna doza HAO1-ciljno delujuće DsiRNA na krajnjoj vremenskoj tački primene uspela je dramatično da snizi odnos oksalat/kreatinin na ili blizu nivoa divljeg tipa. Stoga, oštećenje bubrega se može efikasno sprečiti ili agresivno lečiti sa HAO1-ciljno delujućom DsiRNA iz pronalaska.

[0497] Histologija je potvrdila zaštitni efekat HAO1-ciljno delujućih DsiRNA kod AGXT<-/->PH1 mišjeg modela. Slika 13F pokazuje oštećenje bubrega izazvano hranjenjem miševa AGXT<-/->PH1 modela sa ishranom sa 0,7% etilen glikola. Kao što je pokazano na Slikama 13G i 13H, tretman sa HAO1-ciljno delujućom DsiRNA efikasno je održavao bubrege tretirane životinje tokom primene etilen glikola, dok je injekcija HAO1 kao samo krajnja doza režima takođe uzrokovala dramatično redukovanje oštećenja bubrega (u poređenju sa miševima koji nisu primili HAO1 DsiRNA tretman tokom primene etilen glikola). Takvi efekti su uočeni i na uveličanim presecima (Slika 13G) i na nivou celog bubrega (Slika 13H).

[0498] Takođe su ispitani kinetika i trajanje in vivo inhibicije HAO1 iRNK i proteina (glikolat oksidaze). Kao što je pokazano na Slici 13I, kada je injektirana LNP-formulisana HAO1-ciljno delujuća DsiRNA na dan 0 u C57BL/6 miševe pri dozi od bilo 0,3 mg/kg ili 1,0 mg/kg, odmah je uočeno dramatično redukovanje nivoa HAO1 iRNK (Slika 13I, gornji panel). Konzistentno sa proteinom glikolat oksidazom koji ima kratak poluživot (brzu stopu obrta) in vivo, dramatična inhibicija HAO1 iRNK uočena nakon primene HAO1-ciljno delujuće DsiRNA proizvela je dramatična redukovanja nivoa proteina glikolat oksidaze tokom vremenskog okvira od 1-do-5 dana posle primene (Slika 13I, donji panel, i Slika 13J). Zaista, procenjeno je da je polu život HAO1 proteina in vivo kraći od 31 sata (na osnovu podataka iz dve grupe životinja, procenjenih na Slici 13J). Efekat HAO1-ciljno delujuće DsiRNA i na nivoe HAO1 iRNK i proteina glikolat oksidaze in vivo takođe je bio veoma trajan - čak i dvadeset devet dana posle pojedinačne primene, nivoi iRNK su značajno redukovani i nije detektovan protein glikolat oksidaza pomoću western analize. Stoga, HAO1 DsiRNA je postigla brz i izuzetno trajan in vivo efekat utišavanja i na HAO1 iRNK i na proizvodnju proteina.

[0499] Takođe je uočeno da je efekat utišavanja, primećen nakon primene formulisane HAO1-ciljno delujuće DsiRNA, kumulativan pri niskim nivoima doze. Kao što je pokazano na Slici 13K, dokumentovano je da je inhibicija HAO1 iRNK veoma odzivna na HAO1-ciljno delujuću DsiRNA in vivo. Dok je odzivnost tretiranih miševa na HAO1-ciljno delujuću DsiRNA na nivou proteina HAO1 očekivano prigušena u poređenju sa onom uočenom na iRNK nivou, odzivnost na nivou proteina je i dalje uočena pri niskim nivoima doze, što dodatno potvrđuje robustni in vivo uticaj primene LNP-formulisanih HAO1-ciljno delujućih DsiRNA miševima.

[0500] Takođe je procenjena in vivo efikasnost LNP-formulisanih HAO1-ciljno delujućih DsiRNA kod ne-humanih primata (NHP). Kao što je pokazano na Slici 13L, uočen je dramatičan nokdaun i HAO1 iRNK i proteina u jetri kod ne-humanih primata kojima je primenjena LNP-formulisana HAO1-ciljno delujuća DsiRNA (HAO1-1171) pri 0,3 mg/kg. Konzistentno sa gore opisanim eksperimentima na miševima, uočeno je da je inhibitorna efikasnost LNP-formulisanih HAO1-ciljno delujućih DsiRNA brza, robustna i produženog trajanja kod tretiranih ne-humanih primata. Zaista, na 29 dana posle primene, značajna inhibitorna efikasnost je zadržana i na nivou iRNK i proteina kod ne-humanih primata.

[0501] Stoga, HAO1 DsiRNA je postigla brz i izuzetno trajan in vivo efekat utišavanja i na HAO1 iRNK i na proizvodnju proteina i kod miševa i ne-humanih primata.

Primer 10: Indikacije

[0502] Današnje znanje u istraživanju HAO1 ukazuje na potrebu za postupcima za testiranje aktivnosti HAO1 i za jedinjenjima koja mogu regulisati HAO1 ekspresiju za istraživačku, dijagnostičku, i terapijsku upotrebu. Kao što je ovde opisano, molekuli nukleinske kiseline iz predmetnog pronalaska mogu se upotrebljavati u testovima za dijagnozu bolesnog stanja povezanog sa nivoima HAO1. Pored toga, molekuli nukleinske kiseline mogu se upotrebljavati za lečenje bolesnog stanja povezanog sa HAO1 funkcionalnošću, neusklađenom regulacijom, nivoima, itd.

[0503] Posebni poremećaji i bolesna stanja koji mogu biti povezani sa modulacijom HAO1 ekspresije uključuju, ali nisu ograničeni na primarnu hiperoksaluriju 1 (PHI), uključujući fenotipove takve bolesti u organima kao što su bubrezi, oči, koža, jetra, itd.

[0504] Drugi terapijski agensi se mogu kombinovati sa ili upotrebljavati zajedno sa molekulima nukleinske kiseline (npr. DsiRNA molekuli) iz trenutnog pronalaska. Oni iskusni u struci prepoznaće da se druga jedinjenja i terapije koje se upotrebljavaju za lečenje ovde opisanih bolesti i stanja mogu kombinovati sa molekulima nukleinske kiseline iz trenutnog pronalaska (npr. siNA molekuli, npr. oni koji su usmereni na druge enzime koji poseduju aktivnost 2-hidroksikiselinske oksidaze) i prema tome su unutar obima trenutnog pronalaska. Na primer, za kombinovanu terapiju, nukleinske kiseline iz pronalaska mogu se pripremiti na jedan od najmanje dva načina. Prvo, agensi se fizički kombinuju u preparat nukleinske kiseline i drugog agensa, kao što je smeša nukleinske kiseline iz pronalaska inkapsulirane u lipozomima i drugog agensa u rastvoru za intravensku primenu, pri čemu su oba agensa prisutna u terapijski efikasnoj koncentraciji (npr. drugi agens u rastvoru za isporuku 1000-1250 mg/m2/dan i nukleinska kiselina iz pronalaska povezana sa lipozomima u istom rastvoru za isporuku 0,1-100 mg/kg/dan). Alternativno, agensi se primenjuju odvojeno ali istovremeno ili sukcesivno u svojim respektivnim efikasnim dozama (npr. 1000-1250 mg/m2/d drugi agens i 0,1 do 100 mg/kg/dan nukleinska kiselina iz pronalaska).

Primer 11: Stabilnost u serumu za DsiRNA

[0505] Stabilnost u serumu DsiRNA agenasa se procenjuje putem inkubacije DsiRNA agenasa u 50% fetalnom goveđem serumu tokom različitih vremenskih perioda (do 24 h) na 37 °C. Serum se ekstrahuje i nukleinske kiseline se odvajaju na 20% ne-denaturišućoj PAGE i mogu se vizualizovati sa Gelstar bojom. Relativni nivoi zaštite od nukleazne degradacije procenjuju se za DsiRNA (opciono sa i bez modifikacija).

Primer 12: Dijagnostičke upotrebe

[0506] DsiRNA molekuli iz pronalaska mogu se upotrebljavati u različitim dijagnostičkim primenama, kao što je identifikacija molekulskih targeta (npr. RNK) u različitim primenama, na primer, u kliničkim, industrijskim, ekološkim, poljoprivrednim i/ili istraživačkim postavkama. Takva dijagnostička upotreba DsiRNA molekula uključuje korišćenje rekonstituisanih RNAi sistema, na primer, upotrebom ćelijskih lizata ili delimično prečišćenih ćelijskih lizata. DsiRNA molekuli iz ovog pronalaska mogu se upotrebljavati kao dijagnostički alat za ispitivanje genetičkog drifta i mutacija unutar obolelih ćelija. Bliska veza između DsiRNA aktivnosti i strukture target HAO1 RNK omogućava detekciju mutacija u regionu HAO1 molekula, što menja bazno sparivanje i trodimenzionalnu strukturu target HAO1 RNK. Upotrebom više DsiRNA molekula opisanih u ovom pronalasku mogu se mapirati nukleotidne promene, koje su važne za strukturu i funkciju RNK in vitro, kao i u ćelijama i tkivima. Isecanje target HAO1 RNK sa DsiRNA molekulima može se upotrebljavati za inhibiranje ekspresije gena i definisanje uloge specifičnih genskih proizvoda u progresiji bolesti ili poremećaja povezanih sa HAO1. Na ovaj način, drugi genetički targeti mogu se definisati kao važni posrednici bolesti. Ovi eksperimenti će dovesti do boljeg lečenja progresije bolesti pružajući mogućnost kombinovanih terapija (npr. više DsiRNA molekula ciljanih na različite gene, DsiRNA molekuli zajedno sa poznatim inhibitorima malog molekula, ili naizmeničan tretman sa kombinacijama DsiRNA molekula i/ili drugih hemijskih ili bioloških molekula). Druge in vitro upotrebe DsiRNA molekula iz ovog pronalaska dobro su poznate u struci, i uključuju detektovanje prisustva RNK povezanih sa bolešću ili srodnim stanjem. Takva RNK se detektuje određivanjem prisustva proizvoda isecanja posle tretmana sa DsiRNA upotrebom standardnih metodologija, na primer, fluorescentno rezonantnog energetskog transfera (FRET).

[0507] U specifičnom primeru, za testiranje se upotrebljavaju DsiRNA molekuli koji isecaju samo divlji tip ili mutantne ili polimorfne oblike target HAO1 RNK. Prvi DsiRNA molekuli (tj., oni koji isecaju samo oblike divljeg tipa target HAO1 RNK) upotrebljavaju se za identifikaciju HAO1 RNK divljeg tipa prisutne u uzorku i drugi DsiRNA molekuli (tj., oni koji isecaju samo mutantne ili polimorfne oblike target RNK) upotrebljavaju se za identifikaciju mutantne ili polimorfne HAO1 RNK u uzorku. Kao kontrole reakcije, sintetički supstrati i divljeg tipa i mutantnih ili polimorfnih HAO1 RNK se isecaju od strane oba DsiRNA molekula kako bi se demonstrirala relativna efikasnost DsiRNA u reakcijama i odsustvo isecanja "neciljanih" vrsta HAO1 RNK. Proizvodi isecanja iz sintetičkih supstrata takođe služe za generisanje markera veličine za analizu divljeg tipa i mutantnih HAO1 RNK u populaciji uzorka. Stoga, za svaku analizu potrebna su dva DsiRNA molekula, dva supstrata i jedan nepoznati uzorak, koji se kombinuje u šest reakcija. Prisustvo proizvoda isecanja određuje se upotrebom testa zaštite

1

RNaze, tako da se fragmenti pune dužine i isecanja svake HAO 1 RNK mogu analizirati u jednoj traci poliakrilamidnog gela. Nije apsolutno potrebno kvantifikovati rezultate kako bi se stekao uvid u ekspresiju mutantnih ili polimorfnih HAO 1 RNK i pretpostavljeni rizik od fenotipskih promena povezanih sa HAO 1 u target ćelijama. Ekspresija HAO 1 iRNK čiji je proteinski proizvod umešan u razvoj fenotipa (tj., povezan/udružen sa bolešću) je adekvatna za utvrđivanje rizika. Ukoliko se za oba transkripta upotrebljavaju probe uporedive specifične aktivnosti, onda je kvalitativno poređenje nivoa HAO 1 RNK adekvatno i smanjuje troškove početne dijagnoze. Viši odnosi mutantnih ili polimorfnih oblika prema divljem tipu koreliraju sa višim rizikom bilo da se nivoi HAO 1 RNK porede kvalitativno ili kvantitativno.

[0508] Svi patenti i publikacije pomenuti u specifikaciji su indikativni za nivoe veština onih iskusnih u struci na koju se pronalazak odnosi.

[0509] Onaj iskusan u struci lako bi uvideo da je predmetni pronalazak dobro prilagođen za izvođenje ciljeva i postizanje pomenutih ishoda i prednosti, kao i onih koji su njima svojstveni. Postupci i kompozicije koji su ovde opisani kao trenutno reprezentativni poželjni primeri izvođenja su kao primer i nisu namenjeni kao ograničenje obima pronalaska. Promene u njima i druge upotrebe će nastati kod onih koji su iskusni u struci, koje su definisane obimom patentnih zahteva.

[0510] Predmetni pronalazak podučava onog iskusnog u struci da testira različite kombinacije i/ili supstitucije ovde opisanih hemijskih modifikacija prema generisanju konstrukata nukleinske kiseline sa poboljšanom aktivnošću za posredovanje u RNAi aktivnosti. Takva poboljšana aktivnost može sadržati poboljšanu stabilnost, poboljšanu bioraspoloživost, i/ili poboljšanu aktivaciju ćelijskih odgovora koji posreduju u RNAi. Prema tome, ovde opisani specifični primeri izvođenja nisu ograničavajući i onaj iskusan u struci može lako uvideti da se specifične kombinacije ovde opisanih modifikacija mogu testirati bez nepotrebnog eksperimentisanja u cilju identifikovanja DsiRNA molekula sa poboljšanom RNAi aktivnošću.

[0511] Pronalazak koji je ovde ilustrativno opisan pogodno se može primeniti u odsustvu bilo kog elementa ili elemenata, jednog ili više ograničenja koja ovde nisu specifično objavljena. Stoga, na primer, u svakom slučaju ovde bilo koji od termina "sadrži", "suštinski se sastoji od" i "sastoji se od" može biti zamenjen sa bilo kojim od druga dva termina. Termini i izrazi koji su korišćeni upotrebljavaju se kao termini za opis i ne za ograničenje, i ne postoji namera da se upotrebom takvih termina i izraza isključe bilo koji ekvivalenti svojstava pokazanih i opisanih ili njihovih delova, ali je prepoznato da su različite modifikacije moguće unutar obima pronalaska koji se zahteva. Stoga, treba razumeti da iako je predmetni pronalazak specifično objavljen pomoću poželjnih primera izvođenja, oni iskusni u struci mogu pribeći opcionalnim svojstvima, modifikaciji i varijaciji ovde objavljenih koncepata, i da se takve modifikacije i varijacije

11

smatraju da su unutar obima ovog pronalaska kao što je definisano pomoću opisa i priloženih patentnih zahteva.

[0512] Pored toga, tamo gde su svojstva ili aspekti pronalaska opisani u terminima Markuš (Markush) grupa ili drugih grupa alternativa, oni iskusni u struci će prepoznati da je time pronalazak takođe opisan u smislu bilo kog pojedinačnog člana ili podgrupe članova Markuš grupe ili druge grupe.

[0513] Upotrebu neodređenih i određenih članova i sličnih referenci u kontekstu opisivanja pronalaska (naročito u kontekstu sledećih patetnih zahteva) treba tumačiti tako da pokrivaju i jedninu i množinu, osim ukoliko ovde nije drugačije naznačeno ili jasno protivrečno kontekstu. Termini "koji sadrže", "koji imaju", "uključujući", i "sadrže" treba da se tumače kao otvoreni termini (tj., što znači "uključujući, ali ne ograničavajući se na") ukoliko nije drugačije naznačeno. Navođenje opsega vrednosti ovde je samo namenjeno da služi kao stenografski postupak pojedinačnog pozivanja na svaku odvojenu vrednost koja spada unutar opsega, osim ukoliko ovde nije drugačije naznačeno, i svaka odvojena vrednost je inkorporisana u specifikaciju kao da je ovde pojedinačno navedena. Svi ovde opisani postupci mogu se izvoditi u bilo kom odgovarajućem redosledu, ukoliko ovde nije drugačije naznačeno ili na drugi način jasno protivrečno kontekstu. Upotreba bilo kog i svih primera, ili jezika koji služi kao primer (npr. "kao što je") koji je ovde obezbeđen, namenjena je samo da bolje osvetli pronalazak i ne predstavlja ograničenje obima pronalaska, osim ukoliko se drugačije zahteva. Nijedan jezik u specifikaciji ne treba tumačiti kao da ukazuje na bilo koji element koji nije zahtevan kao da je suštinski za praksu pronalaska.

[0514] Primeri izvođenja ovog pronalaska su ovde opisani, uključujući najbolji način poznat pronalazačima za izvođenje pronalaska. Varijacije ovih primera izvođenja mogu postati očigledne onima koji su prosečno iskusni u struci nakon čitanja prethodnog opisa.

12

Claims

Patentni zahtevi

1. Dvolančana nukleinska kiselina (dsNA) koja sadrži prvi i drugi lanac nukleinske kiseline koji formiraju strukturu dupleksa u kome navedeni prvi lanac je dužine 15-35 nukleotida i navedeni drugi lanac je dužine 19-35 nukleotida i gde je navedena dsNA komplementarna sa target HAO1 iRNK sekvencom kao što je navedena u SEQ. ID. NO: 1823 duž najmanje 19 uzastopnih nukleotida navedenog drugog lanca i redukuje ekspresiju HAO1 target iRNK kada je uvedena u sisarsku ćeliju koja eksprimira navedenu iRNK in vivo.

2. dsNA prema patentnom zahtevu 1, naznačena time što navedeni drugi lanac je 100% komplementaran sa HAO1 iRNK sekvencom kao što je navedena u SEQ. ID. No: 1823 duž 21 uzastopnih nukleotida.

3. dsNA prema patentnom zahtevu 1 ili patentnom zahtevu 2, naznačena time što navedeni drugi lanac je dužine 21, 22, 23, 24, 25, 26 ili 27 nukleotida.

4. dsNA prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, naznačena time što navedeni drugi lanac lanac sadrži 1-5 jednolančanih nukleotida na svom 3’ terminusu, poželjno 2 jednolančana nukleotida na svom 3’ terminusu.

5. dsNA prema patentnom zahtevu 4, naznačena time što navedeni prvi lanac je RNK lanac dužine 21 nukleotida i navedeni drugi lanac je RNK lanac (i) dužine 23 nukleotida (ii) 100% komplementaran sa HAO1 iRNK sekvencom kao što je navedena u SEQ. ID. NO: 1823 duž 21 uzastopnih nukleotida i (iii) ima 3’ viseći kraj dužine 2 nukleotida.

6. dsNA prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 5 koja obuhvata fosforotioatne internukleotidne veze.

7. dsNA prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 6, naznačena time što navedeni prvi lanac i/ili navedeni drugi lanac sadrži jedan ili više modifikovanih nukleotida.

8. dsNA prema patentnom zahtevu 7, naznačena time što svaki nukleotid navedenog prvog lanca i/ili svaki nukleotid navedenog drugog lanca je modifikovani nukleotid.

9. dsNA prema patentnom zahtevu 7 ili patentnom zahtevu 8, naznačena time što svaki modifikovani nukleotid je nezavisno 2’-O-metil ili 2’-fluoro modifikovani nukleotid.

10. dsNA prema bilo kom od patentnih zahteva 7 do 9 koji je konjugovan za GalNac grupu.

11. dsNA prema patentnom zahtevu 10, naznačena time što je GalNac grupa konjugovana za 3’ terminalni nukleotid navedenog prvog lanca.

12. dsNA prema patentnom zahtevu 10 koja je dsNA prema patentnom zahtevu 5 koja dalje ima GalNac grupu konjugovanu za 3’terminalni nukleotid navedenog prvog lanca.

13. Farmaceutska kompozicija koja sadrži dsNA prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 12 i farmaceutski prihvatljivi nosač.

14. dsNA prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 12 za upotrebu u terapiji kod subjekta pri čemu se dsNA primenjuje u količini dovoljnoj da redukuje ekspresiju HAO1 iRNK kod subjekta.

15. dsNA za upotrebu u terapiji prema patentnom zahtevu 14, naznačena time što navedena upotreba je primena za lečenje primarne hiperoksalurije (PH1).

16. dsNA prema patentnom zahtevu 12 za upotrebu u lečenju PH1.

17. dsNA za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 14 do 16, naznačena time što se navedena dsNA primenjuje subkutano.

14