RS61741B1 - Hitozan sa anjonskim naelektrisanjem - Google Patents

Description

Opis

[0001] Ovaj pronalazak se odnosi na karboksialkilhitozan, kompozicije koje ga obuhvataju, njegov proizvodni postupak i njegove razne primene, određenije u oblasti terapije, reumatologije, oftalmologije, estetske medicine, plastične hirurgije, interne hirurgije, dermatologije, ili kozmetike.

Stanje tehnike

[0002] Derivati hitozana su već poznati, određenije otkriveni u patentnim prijavama Kiomed Pharma objavljenim pod brojevima WO 2016/016463 i WO 2016/016464 i odgovarajućim patentima. Ove patentne prijave se bave fizičkim, hemijskim ili fizičko-hemijskim svojstvima derivata hitozana. Međutim, postoji potreba da se ove kompozicije poboljšaju, određenije u kontekstu terapijskog lečenja tako da se pacijentima koji možda moraju da koriste takve kompozicije obezbedi optimizovana terapijska korist, i određenije da se poveća odnos koristi/rizika.

[0003] Moguće je da se dobije rastvorljivi hitozan povećavanjem stepena acetilacije (DA) ponovnom acetilacijom gljivičnog hitozana. Zapravo je moguće da se dobiju formulacije koje su rastvorljive pri fiziološkoj pH ponovnom acetilacijom gljivičnog hitozana, ali je konstatovano da se javlja sledeće:

− veoma brza degradacija in vivo ili u sličnim uslovima ;

− imuna reakcija se javlja kod subjekta kod kojeg je hitozan ubrizgan ili ugrađen, na primer injekcijom ili intra-artikularnom implantacijom;

− hitozan nije pogodan za predviđene primene, i samim tim ne obezbeđuje dovoljno zadovoljavajuću terapijsku upotrebu hitozana, određenije injekcijom ili intra-artikularnom implantacijom.

[0004] Postoje razne objave koje se odnose na karboksialkilaciju hitozana, određenije karboksimetilaciju hitozana, suštinski sa ciljem rastvaranja hitozana. U teoriji, hitozan ima formulu bez N -acetil -glukozaminske jedinice, ali u praksi, hitozan je dobijen iz hitina, koji obuhvata N -acetil -glukozaminske jedinice, a hitozan ima određeni stepen acetilacije ( DA), koji predstavlja proporciju N -acetil -glukozaminske jedinice u hitozanu. DA hitozana je generalno nizak. Pored toga, posebno iznad 30%, hitozan je generalno ponovo acetilisan.

[0005] Dalje, kineska patentna prijava CN1431229A se odnosi na karboksimetilisane derivate hitozana, konkretnije na njihovu mogućnost hidriranja, mada je ograničena na ovu karakterističnu osobinu.

[0006] Karboksimetilacija hitina životinjskog porekla, određenije zglavkara, je takođe predviđena u stanju tehnike. Međutim, hitin dobijen od zglavkara je težak za supstituciju , određenije, neophodno je da se zamrzne i alkalizuje kako bi mogao da se susptituiše (videti na primer kinesku patentnu prijavu CN106474569). Postupak je težak za primenu a naročito da se industrijalizuje. Sa druge strane, takav postupak supstitucije baziran na hitinu poreklom od zglavkara je skup u smislu energije, niske reproduktivnosti, i postoji rizik od razgradnje polimera i hidrolizovanja acetilnih grupa N -acetil -glukozaminskih jedinica u značajnoj meri, pri čemu je takođe težak i da se kontroliše.

PREDMETI OVOG PRONALASKA

[0007] Predmet ovog pronalaska je da reši tehnički problem obezbeđivanja odgovarajućeg derivata hitozana koji je pogodan za upotrebu kod ljudi ili životinja, određenije u oblasti terapije, reumatologije, oftalmologije, estetske medicine, plastične hirurgije, interne hirurgije, dermatologije ili kozmetike.

[0008] Još određenije, predmet ovog pronalaska je da se reši tehnički problem obezbeđivanja odgovarajućeg derivata hitozana koji je pogodan za upotrebu kod ljudi ili životinja u terapijskoj oblasti, a određenije može da se upotrebljava kao viskozni suplement, i određenije može da se ubrizgava u ili meša sa sinovijalnom tečnošću.

[0009] Cilj ovog pronalaska je naročito da reši tehnički problem obezbeđivanja rekonstruisane sinovijalne tečnosti, odnosno kompozicije koja čuva svojstva zgloba, kao što je, na primer, obezbeđivanje mogućnosti podmazivanja površina hrskavice.

[0010] Drugi cilj ovog pronalaska je da reši tehnički problem obezbeđivanja derivata hitozana, ili kompozicije koja obuhvata isti, koji ispoljava dobra svojstva i kompatibilnost u mešavini sa sinovijalnom tečnošću, određenije sinovijalnom tečnošću humanog ili životinjskog subjekta, na primer kako bi se tretirala artikularna ili zglobna patologija ili degeneracija određene sinovijalne tečnosti.

[0011] Cilj ovog pronalaska je takođe da reši tehnički problem obezbeđivanja derivata hitozana, ili kompozicije koja obuhvata isti, koji ograničava imunu reakciju subjekta, određenije humanog ili životinjskog subjekta, koji prima takvo davanje, na primer ubrizgavanjem, derivata hitozana ili kompozicije koja obuhvata isti.

[0012] Drugi cilj ovog pronalaska je takođe da reši tehnički problem obezbeđivanja derivata hitozana, ili kompozicije koja obuhvata isti, sa karakteristikama koje se malo razlikuju u zavisnosti od pH.

[0013] Cilj ovog pronalaska je takođe da reši tehnički problem obezbeđivanja derivata hitozana, ili kompozicije koja obuhvata isti, koji ima pogodan osmolalitet i pH vrednost koja je pogodna za njegovu upotrebu u kontaktu sa tkivom humanog ili životinjskog subjekta, i koji je prihvatljiv u smislu životnog veka in situ, imunološke reakcije i/ili reakcije na strano telo i njegovih biomehaničkih svojstava, u zavisnosti od ciljane terapijske indikacije, određenije u kontekstu regenerativne medicine.

Opis ovog pronalaska

[0014] Iznenađujuće je otkriveno da derivat hitozana prema ovom pronalasku omogućava rešavanje najmanje jednog, ali poželjno svih, ovde prethodno opisanih tehničkih problema.

[0015] Iznenađujuće je otkriveno da derivat hitozana koji ispoljava elektrostatičko naelektrisanje (okarakterisano njegovim zeta potencijalom) u opsegu pH oko pH podloge u kojoj se daje, a određenije pri pH jednakoj 7,5, koja je niža od određene vrednosti, omogućava rešavanje najmanje jednog, a poželjno svih, opisanih ili predočenih tehničkih problema. Određenije, takav derivat hitozana omogućava ograničavanje imunog odgovora subjekta kojem se derivat hitozana ili kompozicija koja obuhvata isti daju, obično ubrizgavanjem ili implantacijom.

[0016] Ovaj pronalazak se, prema drugom aspektu, odnosi na derivat hitozana sa glukozaminskim jedinicama, N -acetil -glukozaminskim jedinicama i glukozaminskim jedinicama supstituisanim karboksialkilnom grupom, pri čemu pomenuti karboksialkilhitozan ima zeta potencijal, izmeren pri pH 7,5, niži od ili jednak -10 mV, i poželjno niži od ili jednak -15 mV.

[0017] Određenije, otkriveno je da derivat hitozana gljivičnog porekla omogućava rešavanje najmanje jednog, ali poželjno svih, opisanih ili predočenih tehničkih problema. Određenije, derivat hitozana glivičnog porekla obezbeđuje sredstva za ograničavanje imunog odgovora subjekta kojem se derivat hitozana ili kompozicija koja obuhvata isti daju, obično ubrizgavanjem ili implantacijom.

[0018] Ovaj pronalazak se, prema prvom aspektu, odnosi na karboksialkilhitozan gljivičnog porekla sa glukozaminskim jedinicama, N-acetilglukozaminskim jedinicama i glukozaminskim jedinicama supstituisanim karboksialkilnom grupom, pri čemu pomenuti karboksialkilhitozan poželjno ima stepen supstitucije karboksialkilnom grupom veći od 20%, izražen kao broj molova supstituenta u odnosu na broj molova ukupnih jedinica.

[0019] Takođe se naziva derivat hitozana ili supstituisani derivat hitozana.

[0020] Hitozan je na primer zaveden pod CAS brojem 9012-76-4.

[0021] Hitozan koji se koristi za ovaj pronalazak je poželjno gljivičnog porekla, i poželjno je dobijen iz micelijuma gljive tipa Ascomycetes, određenije iz Aspergillus niger, i/ili iz gljive Basidiomycetes, određenije Lentinula edodes (šitake) i/ili Agaricus bisporus (šampinjon). Poželjno, hitozan je dobijen iz Agaricus bisporus. Hitozan je poželjno veoma čist, odnosno sa izuzetno malim sadržajem nečistoća koji se dobija od njegovog gljivičnog porekla ili iz proizvodnog postupka, i od mikrobiološkog kvaliteta koji je kompatibilan sa njegovom upotrebom kao implanta ili farmaceutske kompozicije. Postupak pripreme hitozana je opisan u patentima WO 03/068824 (EP 1483299 ; US 7556946).

[0022] Generalno, hitin se stavlja u vodeni rastvor u prisustvu natrijumhidroksida, nakon čega se podloga stavlja na visoku temperaturu zbog različitog trajanja koje varira prema željenoj molekulskoj masi. Hitozan se naknadno prečišćava solubilizacijom u kiseloj podlozi i taloži se u alkalnoj podlozi, zatim se pere i suši.

[0023] Poželjno, hitozan ima stepen čistoće za farmaceutsku upotrebu.

[0024] Hitozan je poželjno prečišćen a zatim poželjno osušen. Nakon prečišćavanja, postupak ovog pronalaska može da uključuje fazu sušenja karboksialkilhitozana, zatim opciono sitnjenja kako bi se dobio prah. Karboksialkilhitozan može biti osušen na primer isparavanjem vode, pomoću postupka sušenja sprejom, ili sušenja toplotom pod vakuumom ili na atmosferskom pritisku, ili čak liofilizacijom.

[0025] Karboksialkilhitozan može biti rastvoren u vodenom rastvoru, na primer u vodi farmaceutski prihvatljivog kvaliteta pogodnog za ubrizgavanje ili implantaciju u telo, a određenije telo čoveka.

[0026] Pripremljeni hitozan može imati različite molekulske mase, a generalno u opsegu 10000 do 500 000.

[0027] Prema jednoj varijanti, prosečna molekulska masa je obuhvaćena između 20000 i 60,000.

[0028] Prema drugoj varijanti, prosečna molekulska masa je obuhvaćena između 60000 i 100000.

[0029] Prema drugoj varijanti, prosečna molekulska masa je obuhvaćena između 100000 i 120000.

[0030] Prema drugoj varijanti, prosečna molekulska masa je obuhvaćena između 120000 i 150000.

[0031] Prema drugoj varijanti, prosečna molekulska masa je obuhvaćena između 150000 i 220000.

[0032] Prema drugoj varijanti, prosečna molekulska masa je obuhvaćena između 220000 i 300000.

[0033] Prema drugoj varijanti, prosečna molekulska masa je obuhvaćena između 300000 i 500000.

[0034] Kada je hitozan umrežen, molekulska masa umreženog polimera zapravo može biti mnogo viša.

[0035] Moguće je da se hitozan hidrolizuje kako bi se smanjila molekulska masa.

[0036] Ovde je poželjno da prosečna molekulska masa predstavlja prosečnu molekulsku masu u viskoznosti (Mv), izračunatu na osnovu unutrašnje viskoznosti prema Mark-Houvinkovoj jednačini. Unutrašnja viskoznost se meri kapilarnom viskozimetrijom, sa Ubelohdovim kapilarnim viskozimetrom, prema postupku iz monografa 2.2.9 Evropske farmakopeje. Vreme protoka rastvora kroz pogodnu kapilarnu epruvetu (Lauda, na primer Ubelohd 51001 kapilarna epruveta prečnika 0,53 mm) se meri pomoću automatskog viskozimetra I-Visc (Lauda), prvo pri početnoj koncentraciji hitozana, zatim za nekoliko razblaženja, na primer prema preporukama iz monografa 2.2.9. Iz ovoga je zaključeno da je unutrašnja viskoznost smanjena za svaku od koncentracija. Smanjena viskoznost je grafički prikazana kao funkcija temperature, a vrednost pri koncentraciji 0 je ekstrapolirana kako bi se iz toga utvrdila unutrašnja viskoznost. Na primer neophodno je da se grafički prikaže smanjena viskoznost (hcrvenu mL / g) i razblaženja u funkciji koncentracije C i razblaženja (g / mL) prema formuli 5.

Formula 2. [hcrven] = (t1- t0) - (1 - C).

[0037] Da bi se izračunala prosečna viskozimetrijska masa, Mark-Houvinkova jednačina se koristi sa konstantama k i alfa koje preporučuju Rinaudo et al. (in : Int J Biol Macromol, 15, 281, 1993), prema stepenu acetilacije (DA) hitozana, u skladu sa jednom od sledeće tri formule.

Formula 3. Mv = ([h] / 0,082)<(1/0,76)>,

za DA od 2% ;

Formula 4. Mv = ([h] / 0,076)<(1/0,76)>,

za DA od 10% (na primer 11,5%) ;

Formula 5. Mv = ([h] / 0,074)<(1/0,76)>,

za DA od 20% (na primer 21%).

[0038] Za intermedijarne DA vrednosti, linearna interpolacija se izvodi da bi se izračunala prosečna viskozometrijska masa (Mv).

[0039] Poželjno, hitozan koji se upotrebljava ima prosečnu molekulsku masu između 120000 i 150000, ili čak između 150000 i 220000, ili zaista čak između 220000 i 300000, ili čak iznad 300000, a generalno do 500000.

[0040] Takođe je moguće da se izmeri konačna molekulska masa karboksialkilhitozana : moguće je na primer da se izmeri unutrašnja viskoznost pomoću kapilarnog viskoziteta, iz čega se utvrđuje njegova prosečna molekulska masa (Mw) (prethodnim određivanjem parametara K i alfa karboksialkilhitozana), ili hromatografskim postupkom, na primer gel-propusnom hromatografijom.

[0041] Prema ovom pronalasku u karboksialkilhitozanu, glukozaminske jedinice obično predstavljaju D -glukozaminske jedinice (D -glukozaminske jedinice, N -acetil- D -glukozaminske jedinice, i sa najmanje jednom od D -glukozaminskih jedinica a pri čemu su N -acetil- D -glukozaminske jedinice supstituisane).

[0042] Prema jednoj varijanti, supstituisani hitozan ima supstituciju samo D -glukozaminskih jedinica.

[0043] Prema drugoj varijanti, supstituisani hitozan ima supstituciju D -glukzamina i N -acetil- D -glukozaminskih jedinica istovremeno, u kojoj je karboksialkilna grupa kovalentno vezana, prema jednoj varijanti za aminske grupe samo hitozana, ili prema drugoj varijanti za aminske i hidroksilne grupe hitozana istovremeno.

[0044] Supstitucija je generalno samo delimična, ne supstituišu se nužno sve jedinice.

[0045] Prema jednom načinu ostvarivanja, stepen supstitucije D -glukozaminskih jedinica izražen u broju molova D -glukozaminskih jedinica u odnosu na broj molova ukupnih jedinica (D -glukozamin i N -acetil- D -glukozaminske jedinice, ili supstituisane ili nesupstituisane) supstituisanog hitozana, je u opsegu od 30% do 250%.

[0046] Prema jednom načinu ostvarivanja, stepen supstitucije karboksialkilnom grupom je veći od 50%, izraženo u broju molova supstituenta u odnosu na broj molova ukupnih jedinica.

[0047] Prema jednom načinu ostvarivanja, stepen supstitucije D -glukozaminskih jedinica izražen u broju molova D -glukozaminskih jedinica u odnosu na broj molova ukupnih jedinica (D -glukozamin i N -acetil- D -glukozaminske jedinice, ili supstituisane ili nesupstituisane) supstituisanog hitozana, je u opsegu od 50% do 200%, a poželjnije je veći od 70%.

[0048] Prema jednom načinu ostvarivanja, stepen supstitucije karboksialkilnom grupom je manji od 80%, izraženo u broju molova supstituenta u odnosu na broj molova ukupnih jedinica.

[0049] Supstitucija se obično izvodi kovalentnim vezivanjem.

[0050] Prema jednoj varijanti, karboksialkilhitozan predstavlja N, O -karboksialkilhitozan. Proporcija jedinica supstituisanih karboksialkilnom grupom na O položaju (ili O3 ili O6 glukozaminskih i/ili N -acetil -glukozaminskih jedinica) i/ili na N položaju (glukozaminskih jedinica) varira. Stepen supstitucije stoga može biti veći od 100%.

[0051] Poželjno, stepen supstitucije (DS) i stepen acetilacije (DA) karboksialkilhitozana su izmereni pomoću NMR ugljenika u čvrstom stanju, uz pomoć Bruker spektrometra (Avance III HD 400 MHz), opremljenog sa sondom PH MAS VTN 400SB BL4 NP / H. Na primer, spektar je snimljen na sobnoj temperaturi, pri čemu je vreme relaksacije u opsegu od 1 do 8 sekundi, a broj skeniranja je u opsegu od 64 do 512. Signalna područja ugljenika se određuju nakon dekonvolucije. Ugljenici koji su u razmatranju su sledeći: “acetil CH3” (ugljenik iz metila acetilne grupe N -acetil -glukozaminskih jedinica, ili supstituisane ili nesupstituisane), “C1” (ugljenik na položaju 1 glukozaminskih i N -acetil -glukozaminskih jedinica) i "C = O" (ugljenik iz karbonil karboksimetil supstituenta i karbonil ugljenika C = O acetilne grupe N -acetil -glukozaminskih jedinica, ili supstituisanih ili nesupstituisanih). Da bi se odredio DS datog karboksialkilhitozana, takođe je neophodno da se snimi NMR ugljenika 13 prekursora hitozana ovog karboksialkilhitozana. Na osnovu spektra prekursora hitozana, izračuna se “CSU odnos”, odnosno odnos između signalnog područja “acetil CH3” grupe (ugljenik iz metila acetilne grupe N -acetil -glukozaminskih jedinica) i oblasti signala "C = 0" (karbonilugljenik acetil grupe N -acetil- D -glukozaminskih jedinica). DA karboksialkilhitozana se izračunava prema formuli 1, a DS prema formuli 2, u kojoj I predstavlja signalno područje razmatranog ugljenika.

Formula 1 :

Formula 2 :

[0052] DA i DS mogu da se odrede pomoću drugih poznatih postupaka za karboksialkilhitozane, na primer pomoću NMR protona u vodenoj podlozi, pomoću spektrometra magnetne rezonance, na primer prema postupku koji su opisali Liu et al. (in : Carb Polym 137, 600, 2016), na primer uz prethodnu hidrolizu karboksialkilhitozana dodavanjem koncentrovanog rastvora deuterisane hlorovodonične kiseline pre analize.

[0053] Ukoliko je drugi NMR postupak poželjniji za pouzdano procenjivanje stepena supstitucije, trebalo bi da se koristi taj drugi alternativni postupak. Gore pomenute postupke bi stručnjak trebalo da prilagodi pripremi uzorka i signala koje je potrebno integrisati, određenije kao funkciju rezolucije, robusnosti i položaja protona signala koji se koriste za izračunavanje stepena supstitucije.

[0054] Stepen karboksialkilacije hitozana poželjno može da varira od 50 do 200%, poželjno od 70 do 170%, izraženo u broju molova karboksialkila u odnosu na broj molova ukupnih jedinica.

[0055] Prema jednoj varijanti, stepen karboksialkilacije hitozana poželjno može da varira od 70 do 130%, izraženo u broju molova karboksialkila u odnosu na broj molova ukupnih jedinica.

[0056] Stepen supstitucije hitozana je obično u korelaciji sa masenim odnosom polaznih reagenasa i hitozana na početku reakcije. Kao karboksialkilišući agensi, mogu se pomenuti kiseli hloridi (ili njihove soli, na primer natrijum-monohloroacetat), kao što su na primer oni koji nose jednu ili više karboksimetil, karboksietil, karboksipropil, karboksibutil grupa, itd.

[0057] Prema jednoj varijanti, ovaj pronalazak se odnosi na karboksialkilhitozan u kojem alkilni deo karboksialkila predstavlja C1-C5 alkilnu grupu, ravnu ili razgranatu.

[0058] Prema jednoj varijanti, ovaj pronalazak se odnosi na karboksimetilhitozan.

[0059] Prema ovoj varijanti, supstituisani hitozan je N-karboksialkilisani hitozan.

[0060] Prema ovoj varijanti, supstituisani hitozan je O-karboksialkilisani hitozan.

[0061] Prema ovoj varijanti, supstituisani hitozan je N-karboksialkilisani i O-karboksialkilisani hitozan.

[0062] Poželjno, zeta potencijal, izmeren pri pH 7,5, je manji od ili jednak -18 mV.

[0063] Poželjno, karboksialkilhitozan ima zeta potencijal, izmeren pri pH 7,5, koji je manji od ili jednak -22 mV, poželjno manji od ili jednak -24 mV.

[0064] Prema jednoj konkretnoj varijanti, supstituisani hitozan poželjno ima prosečnu molekulsku masu od 150000 do 220000 i stepen supstitucije koji je u opsegu od 50 do 200%, pri čemu je molekulska masa poželjno izražena pre supstitucije.

[0065] Prema drugoj konkretnoj varijanti, supstituisani hitozan ima prosečnu molekulsku masu od 120 000 do 150000, i stepen supstitucije koji je u opsegu od 70 do 200%, pri čemu je molekulska masa poželjno izražena pre supstitucije.

[0066] Prema jednoj konkretnoj varijanti, supstituisani hitozan poželjno ima prosečnu molekulsku masu od 220000 do 300000 i stepen supstitucije koji je u opsegu od 70 do 200%, pri čemu je molekulska masa poželjno izražena pre supstitucije.

[0067] Prema drugoj konkretnoj varijanti, supstituisani hitozan ima prosečnu molekulsku masu od 220 000 do 300000 i stepen supstitucije koji je u opsegu od 50 do 200%, pri čemu je molekulska masa poželjno izražena pre supstitucije.

[0068] Prema drugoj konkretnoj varijanti, supstituisani hitozan ima prosečnu molekulsku masu od 300 000 do 500000 i stepen supstitucije koji je u opsegu od 50 do 200%, pri čemu je molekulska masa poželjno izražena pre supstitucije.

[0069] Prema drugoj konkretnoj varijanti, supstituisani hitozan ima prosečnu molekulsku masu od 300 000 do 500000 i stepen supstitucije koji je u opsegu od 70 do 200%, pri čemu je molekulska masa poželjno izražena pre supstitucije.

[0070] Prema jednoj konkretnoj varijanti, supstituisani hitozan ima stepen supstitucije koji je u opsegu od 50 do 200%, a poželjno od 70 do 200%, i stepen acetilacije koji je u opsegu od 20 do 80%, a poželjno od 30 do 75%.

[0071] Prema jednoj konkretnoj varijanti, supstituisani hitozan ima stepen supstitucije koji je u opsegu od 50 do 200%, a poželjno od 70 do 200%, i stepen acetilacije koji je u opsegu od 20 do 50%, a poželjno od 20 do 40%.

[0072] Prema jednoj konkretnoj varijanti, supstituisani hitozan ima stepen supstitucije koji je u opsegu od 50 do 200%, a poželjno od 70 do 200%, i stepen acetilacije koji je u opsegu od 50 do 75%.

[0073] Prema drugoj konkretnoj varijanti, supstituisani hitozan ima stepen supstitucije koji je u opsegu od 90 do 200%, a poželjno od 90 do 150%, i stepen acetilacije koji je u opsegu od 20 do 80%, pri čemu je molekulska masa poželjno izražena pre supstitucije.

[0074] Prema jednoj konkretnoj varijanti, supstituisani hitozan ima stepen supstitucije koji je u opsegu od 90 do 200%, a poželjno od 90 do 150%, i stepen acetilacije koji je u opsegu od 20 do 50%, a poželjno od 20 do 40%.

[0075] Prema jednoj konkretnoj varijanti, supstituisani hitozan ima stepen supstitucije koji je u opsegu od 90 do 200%, a poželjno od 90 do 150%, i stepen acetilacije koji je u opsegu od 50 do 75%.

[0076] Prema jednoj konkretnoj varijanti, supstituisani hitozan poželjno ima prosečnu molekulsku masu od 220000 do 300000, i stepen supstitucije koji je u opsegu od 90 do 200%, a poželjno od 90 do 150%, i stepen acetilacije koji je u opsegu od 50 do 75%, pri čemu je molekulska masa poželjno izražena pre supstitucije.

[0077] Prema jednoj varijanti, karboksialkilhitozan je umrežen. Tako nekoliko hitozanskih lanaca može biti umreženo, na primer reakcijom sa agensom za umrežavanje, kao što su na primer agensi za umrežavanje koji se upotrebljavaju za umrežavanje polisaharida, kao što je na primer genipin, butilbiglicidil etar, glutaraldehid, epihlorohidrin, 1 -bromo-3, 4 -epoksibutan, 1 -bromo-4,5 -epoksipentan, l -hloro-2,3 -epitio -propan, 1 -bromo -2,3 -epitiopropan, I -bromo-3,4 -epitio -butan, 1 -bromo -4,5 -epitiopentan, 2,3 -dibromopropanol, 2,4 -dibromobutanol, 2,5 -dibromopentanol, 2,3 -dibromopropanetiol, 2,4 -dibromobutanetiol, i 2,5 -dibromopentan -tiol epihlorohidrin, 2,3 -dibromopropanol, 1 -hloro-2,3 -epitiopropan, dimetilaminopropilkarbodiimid, oksidovani dekstran, galna kiselina, epigalokatehin galat, kurkumin, taninska kiselina, ili čak jedinjenja diizocijanata kao što je heksametilendiizocijanat ili toluendiizocijanat.

[0078] Sa umreženim karboksialkilhitozanom molekulska masa može biti veoma visoka.

[0079] Supstituisanjem hitozana, bilo je moguće da se pripremi rastvor karboksialkilhitozana koji je rastvorljiv u vodenom rastvoru čija pH varira u širokom opsegu, dok je nesupstituisani hitozan rastvorljiv samo pir pH ispod 5,5 do 6,5. Time karboksialkilhitozan može da bude rastvoren pri raznim različitim pH vrednostima zahvaljujući prisustvu karboksialkilnih grupa koje modifikuju njegov profil rastvorljivosti, a određenije pri fiziološkoj pH ili pri pH fizioloških tečnosti koje su modifikovane patologijom, na primer zapaljenskom patologijom. Poznato je da pH fizioloških tečnosti kao što su sinovijalna tečnost u zglobovima, očna vodica, staklasto telo, i suze, mogu značajno da variraju od pojedinca do pojedinca, usled raznih faktora, kao što su uzrast, patologija itd. Zbog toga je poželjno da karboksialkilhitozan može da ostane rastvorljiv u širokom opsegu pH, na primer od 6,0 do 8,5, ili čak od 5,0 do 8,5, ili čak od 4,5 do 8,5.

[0080] Prema jednom načinu ostvarivanja, formulacija supstituisanog hitozana ima osmolalitet od 100 do 700 mosm / kg, poželjno od 200 do 500 mosm / kg.

[0081] Poželjno, osmolalitet formulacije supstituisanog hitozana obuhvata između 250 i 400 mosm / kg, a poželjno od 275 do 325 mosm / kg.

[0082] Prema jednoj varijanti, formulacija supstituisanog hitozana ima osmolalitet koji je kompatibilan sa zglobom.

[0083] Prema jednoj varijanti, formulacija supstituisanog hitozana ima osmolalitet koji je kompatibilan sa okularnom ili intraokularnom površinom.

[0084] Poželjno je da osmolalitet formulacije supstituisanog hitozana obuhvata između 250 i 400, a konkretnije između 250 i 380 mosm / kg.

[0085] Smatra se da pojam “rastvorljiv u vodi” označava da karboksialkilhitozan ne ispoljava bilo kakvu zamućenost vidljivu golim okom kada se stavi u vodeni rastvor. Konkretnije, moguće je da se potvrdi rastvorljivost, odnosno odsustvo bilo kakve zamućenosti, rastvora karboksialkilhitozana pri koncentraciji na primer od 1% (m / m) u vodi ili puferu, na primer fosfatnom puferu, pri optičkoj gustini manjoj od 0,5, a poželjno manjoj od 0,2, kako je izmereno UV-vidljivom spektrometrijom na talasnoj dužini od 500 nm u odnosu na referentni sud koji obuhvata samo vodeni rastvarač koji se koristi za izmereni uzorak, ali bez prisustva supstituisanog hitozana. Drugi postupak se sastoji od vizuelnog pregleda prema monografu 2.9.20 Evropske farmakopeje. Kad hitozan nije dovoljno supstituisan, kompozicija nije rastvorljiva u zadovoljavajućem pH opsegu, na primer u opsegu od pH 6,0 do pH 8,5, na sobnoj temperaturi.

[0086] Stepen acetilacije (DA) hitozana se određuje na primer kao što je opisano u patentnim prijavama WO 2017009335 i WO 2017009346 potenciometrijskom titracijom. DA može alternativno da se izmeri drugim postupcima poznatim za hitozan, kao što je NMR, NMR ugljenika 13 u čvrstom stanju, infracrvenom spektrometrijom.

[0087] Poželjno, karboksialkilhitozan ima stepen acetilacije između 5 i 80%, izražen u broju molova N -acetil -glukozaminskih jedinica u odnosu na broj molova ukupnih jedinica. Stepen acetilacije je izražen brojem N -acetil- D -glukozaminskih jedinica u odnosu na broj ukupno prisutnog N -acetil- D -glukozamina i D -glukozaminskih jedinica.

[0088] Poželjno, karboksialkilhitozan ima stepen acetilacije između 40 i 80%, izražen u broju molova N -acetil -glukozaminskih jedinica u odnosu na broj molova ukupnih jedinica.

1

[0089] Prema jednoj varijanti, stepen acetilacije je u opsegu od 40 do 50%.

[0090] Prema jednoj varijanti, stepen acetilacije je u opsegu od 50 do 60%.

[0091] Prema jednoj varijanti, stepen acetilacije je u opsegu od 60 do 75%.

[0092] Stepen acetilacije se određuje pomoću NMR ugljenika 13 ili NMR protona, prema istom postupku kao za određivanje DS. Karboksialkilhitozan poželjno ima kontrolisan stepen acetilacije. Pojam "hitozan koji ima kontrolisan stepen acetilacije" označava proizvod za koji stepen acetilacije, odnosno proporcija N -acetil -glukozaminskih jedinica, može kontrolisano da se podesi, određenije reakcijom acetilacije.

[0093] Prema jednoj varijanti, kompozicija prema ovom pronalasku može biti u obliku rastvora i ne može se pretvoriti u gel usled varijacije u temperaturi (nema sposobnost termogeliranja).

[0094] Prema jednoj varijanti, reološke karakteristike rastvora prema ovom pronalasku mogu da se menjaju sa temperaturom, ali bez sol-gel prelaza. Reološke karakteristike rastvora prema ovom pronalasku se mogu određenije posmatrati po modulu elastičnosti (G') i/ili gubitku modula (G''), ili čak kompleksnom modulu G*.

[0095] Prema jednoj varijanti, reološke karakteristike rastvora prema ovom pronalasku su suštinski konstantne nevezano za temperaturu.

[0096] Prema jednoj varijanti, kompozicija prema ovom pronalasku može biti u obliku rastvora i može imati sposobnost termogeliranja.

[0097] Prema jednoj varijanti, kompozicija prema ovom pronalasku može biti u obliku gela i ne može imati sposobnost termogeliranja.

[0098] Ovaj pronalazak omogućava, prema jednoj varijanti, pripremu kompozicije koja je sposobna za temrogeliranje u tečnom stanju na temperaturi koja je niža od temperature upotrebe, obično na temperaturi koja je niža od fiziološke temperature, na primer 37 ° C, ali koja je u obliku gela na temperaturi upotrebe, obično na fiziološkoj temperaturi, na primer 37 ° C, pri neutralnoj pH (pH 7) ili pri fiziološkoj pH, i na primer od 7 do 8,5, sa osmolalitetom koji je pogodan za predviđenu upotrebu. To je na primer fiziološki osmolalitet.

[0099] Prema jednoj varijanti, termogelirajuća kompozicija pokazuje termoreverzibilni prelaz sol-gel.

[0100] Poželjno, ovaj pronalazak omogućava dobijanje kompozicije niske koncentracije supstituisanog hitozana.

[0101] Poželjno, koncentracija karboksialkilhitozana je manja od 10%, na primer manja od ili jednaka 5 mas.%, u odnosu na ukupnu masu kompozicije (m / m).

[0102] Prema jednoj varijanti, koncentracija hitozana je manja od 4%, na primer manja od ili jednaka 3%, ili čak na primer manja od ili jednaka 2 mas.% u odnosu na ukupnu masu kompozicije (m / m).

[0103] Poželjno, kompozicija ovog pronalaska takođe može da obuhvata i neki drugi bipolimer a da to nije supstituisani hitozan. Prema jednoj poželjnoj varijanti, taj biopolimer je polisaharid, oksidiran ili neoksidiran, umrežen ili neumrežen kovalentnim vezama, na primer hijaluronskom kiselinom ili natrijumhijaluronatom.

[0104] Hijaluronska kiselina može da ima molekulsku masu do 5 miliona Da. Molekulska masa hijaluronske kiseline može biti izražena unutrašnjom viskoznošću ili po svojoj dinamičkoj viskoznosti u rastvoru. Hijaluronska kiselina može da ima gustinu koja je u opsegu od 1 do 4 m³ / kg, i na primer može biti okarakterisana malom (na primer približno 1 do 2 m³ / kg) ili velikom (na primer približno 2 do 4 m³ / kg) molekulskom masom.

[0105] Poželjno, koncentracija hijaluronske kiseline je manja od 4%, na primer manja od ili jednaka 3%, ili čak na primer manja od ili jednaka 2 mas.% u odnosu na ukupnu masu kompozicije (m / m).

[0106] Prema jednoj konkretnoj varijanti, koncentracija hijaluronske kiseline je manja od 1,9 mas.% (m / m), u odnosu na masu finalne kompozicije. Poželjno, koncentracija hijaluronske kiseline je obuhvaćena između 0,5 i 1,5 mas.% (m / m), u odnosu na masu finalne kompozicije. Prema jednoj određenoj varijanti, koncentracija hijaluronske kiseline je približno 0,9 mas.%, 1,0 mas.%, 1,1 mas.%, 1,2 mas.%, 1,3 mas.%, 1,5 mas.% (m / m), u odnosu na masu finalne kompozicije.

[0107] Odnos između hitozana i hijaluronske kiseline može na primer da varira od 5 do 95%, na primer od 10 do 90%, a čak na primer od 30 do 70% supstituisanog hitozana, i od 5 do 95%, na primer od 10 do 90%, čak na primer od 30 do 70% tim redom, hijaluronske kiseline, pri čemu su procenti izraženi u odnosu na : suvu masu supstituisanog hitozana / suvu masu hijaluronske kiseline. Prema jednoj varijanti, ovaj odnos između hitozana i hijaluronske kiselina je 1/1 (odnosno 50% hitozana i 50% hijaluronske kiseline). Prema drugoj varijanti, odnos između hitozana i hijaluronske kiseline je 1,5 / 0,5 (odnosno 75% hitozana i 25% hijaluronske kiseline).

[0108] Prema jednoj varijanti, hijaluronska kiselina može biti umrežene između različitih lanaca hijaluronske kiseline.

[0109] Ovaj pronalazak se takođe odnosi na postupak pripreme karboksialkilhitozana.

[0110] Prema jednoj varijanti, postupak pripreme karboksialkilhitozana prema ovom pronalasku uključuje pripremu hitozana gljivičnog porekla, reacetilaciju hitozana, i karboksialkilaciju ponovo acetilisanog hitozana. Samim tim, ovaj pronalazak se odnosi na ponovo acetilisani hitozan ili ponovo acetilisani karboksialkilhitozan.

[0111] Prema jednom načinu ostvarivanja, tako je moguće da se rastvori hitozan u vodenom rastvoru, poželjno blago zakiseljenom (pH 6 na primer). Sirćetni anhidrid može da se doda rastvoru hitozana jednom ili više puta. Bazni agens se zatim dodaje, kao što je, na primer, natrijumhidroksid i/ili urea. Nakon toga, dodaje se alkilišući agens kao što je, na primer, natrijum-monohloroacetat (odnosno so natrijuma hlorosirćetne kiseline) ili hlorosirćetna kiselina. Supstituisani hitozan se nakon toga prečišćava, obnavlja i suši.

[0112] Prema jednoj varijanti, postupak pripreme karboksialkilhitozana prema ovom pronalasku uključuje pripremu hitozana, karboksialkilaciju hitozana, zatim reacetilaciju karboksialkilisanog hitozana. Poželjno, takav postupak služi da se omogući precizna kontrola stepena acetilacije finalnog karboksialkilhitozana, a određenije da se dobije visok stepen acetilacije, na primer iznad 40%. Samim tim se ovaj pronalazak odnosi na ponovo acetilisani zatim karboksialkilisani hitozan ili ponovo acetilisani karboksialkilhitozan.

[0113] Prema jednoj varijanti, postupak pripreme karboksialkilhitozana prema ovom pronalasku uključuje pripremu hitina gljivičnog porekla, karboksialkilaciju hitina, i opciono racetilaciju karboksialkilisanog hitina kako bi se dobio karboksialkilhitozan prema ovom pronalasku.

[0114] Prema jednoj varijanti, postupak pripreme karboksialkilisanog hitozana prema ovom pronalasku uključuje pripremu hitina gljivičnog porekla, deacetilaciju hitina, karboksialkilaciju hitina, i opciono reacetilaciju karboksialkilisanog hitina kako bi se dobio karboksialkilhitozan prema ovom pronalasku.

[0115] Prema jednom načinu ostvarivanja, faza karboksialkilacije uključuje fazu alkalinizacije hidroksilnih grupa hitozana, kako bi se pospešio visok stepen supstitucije, i na primer i N -položaj glukozaminskih jedinica i O -položaj glukozamina i N -acetil -glukozaminskih jedinica.

[0116] Prema jednom načinu ostvarivanja, postupak ovog pronalaska uključuje fazu alkalinizacije koja obuhvata dispergovanje hitozana u rastvoru alkohola, kao što je izopropranol u prisustvu baznog agensa kao što je na primer natrijumhidroksid, i mešanja tokom vremenskog perioda od najmanje jednog sata na temperaturi od minimum -32 ° C a poželjno maksimalno 15 ° C. Ovoj suspenziji se zatim dodaje alkilišući agens, kao što je, na primer, monohlorosirćetna kiselina. Supstituisani hitozan se nakon toga prečišćava, oporavlja, a zatim suši.

[0117] Prema jednoj varijanti, postupak pripreme karboksialkilisanog hitozana prema ovom pronalasku uključuje pripremu hitozana, karboksialkilaciju hitozana i posle toga reacetilaciju karboksialkilisanog hitozana.

[0118] Prema jednom načinu ostvarivanja, faza karboksialkilacije ne uključuje fazu alkalizacije.

[0119] Faza reacetilacije karboksialkilhitozana može na primer da uključuje jedan ili više dodataka sirćetnog anhidrida u rastvor karboksialkilhitozana.

[0120] Finalne faze prečišćavanja, filtracije i sušenja kako bi se sakupio prečišćeni karboksialkilhitozan se izvode prema poznatim postupcima sa ciljem da se dobije karboksialkilhitozan prema željenom stepenu čistoće, koji generalno zavisi od predviđene primene, kao što je na primer ciklusima taloženja i solubilizacije ili dijalizom.

[0121] Prema jednoj varijanti, odnos sirćetnog anhidrida/hitozana (zapremina / masa) varira između 0,1 i 10, a poželjno od 0,1 do 2, tokom faze reacetilacije.

[0122] Prema jednoj varijanti, maseni odnos karboksialkilišućeg agensa/ hitozana varira između 1 i 50, a poželjno od 2,5 do 25, tokom faze karboksialkilacije.

1

[0123] Prema jednoj varijanti, upotrebljava se maseni odnos reagenasa koji obezbeđuju karboksilnu grupu (odnosno alilišući agens) koji se odnosi na bazni agens koji je neophodan i dovoljan da se dobije željeni stepen supstitucije. Na primer, maseni odnos alkilišućeg agensa baznog agensa je veći od 1 a manji od 10, a poželjno je u opsegu od 1,4 do 3,3.

[0124] Ovaj pronalazak se takođe odnosi na postupak pripreme kompozicije prema ovom pronalasku.

[0125] Prema jednoj varijanti, postupak obično uključuje :

- rastvaranje supstituisanog hitozana u vodenom rastvoru, poželjno u puferisanom rastvoru, poželjno sa pH koja je obuhvaćena između 6,2 i 8,5, a poželjno između 6,5 i 7,5 ;

- opciono podešavanje pH na željenu pH, generalno na fiziološku pH za predviđenu primenu, na primer dodavanjem pufera, kiseline ili baze ;

- opciono dodavanje drugih ekscipijenasa, kao što je na primer redukujući šećer, na primer sorbitol ili manitol ;

- opciono podešavanje finalnog osmolaliteta kompozicije.

[0126] Poželjno, taj postupak takođe obuhvata dodatnu fazu punjenja za punjenje sredstva za injekciju ili implantaciju, kao što je na primer špric, sa karboksialkilhitozanom ili kompozicijom koja obuhvata isti. Poželjno, sredstvo za injekciju, kao što je na primer špric, može zatim da bude podvrgnuto postupku parne sterilizacije. Ovo sredstvo, na primer špric, može zatim biti upakovano, poželjno sterilno. To takođe može biti kesica, bočica, ili boca koja služi da omogući instilaciju rastvora karboksialkilhitozana.

[0127] Poželjno je da se upotrebljava hitozan čiji je stepen čistoće dovoljan za predviđenu primenu.

[0128] Poželjno, postupak takođe uključuje dodatnu fazu punjenja sredstva za injekcijeu, implantaciju ili instilaciju, kao što je na primer špric, kompozicijom prema ovom pronalasku. Poželjno, sredstva za injekciju, kao što je na primer špric, može zatim da bude podvrgnuto postupku parne sterilizacije. Ovo sredstvo, na primer špric, zatim može sterilno da bude upakovano.

[0129] Prema jednoj varijanti, karboksialkilhitozan prema ovom pronalasku je sterilisan filtracijom i/ili parnom sterilizacijom, pre nego se njime napuni sredstvo za injekciju, implantaciju ili instilaciju, kao što je na primer špric ili bočica.

[0130] Poželjno je da se koristi hitozan dovoljne čistoće za namensku primenu.

[0131] Ovaj pronalazak se još određenije odnosi na injektabilnu kompoziciju koja obuhvata karboksialkilhitozan prema ovom pronalasku.

[0132] Ovaj pronalazak se takođe odnosi na farmaceutsku kompoziciju koja obuhvata najmanje jedan karboksialkilhitozan definisan prema ovom pronalasku.

[0133] Prema jednoj varijanti, karboksialkilhitozan ili kompozicija koja obuhvata isti se koristi kao farmaceutska kompozicija koja je injektabilna, implantabilna ili pogodna za instilaciju, ili medicinsko sredstvo koje je injektabilno, implantabilno ili pogodno za instilaciju.

[0134] Ovaj pronalazak takođe pokriva karboksialkilhitozan ili kompoziciju koja obuhvata isti, u suvom obliku, određenije u liofilizovanom obliku. Moguće je određenije da se (ponovo) disperguje, a poželjno solubilizuje liofilizovani oblik pre upotrebe.

[0135] Ovaj pronalazak se još određenije odnosi na kompoziciju prema ovom pronalasku za upotrebu u terapijske svrhe, na primer koja obuhvata injekciju pomenute kompozicije, supkutanim, intradermalnim, ili intraokularnim putem, na primer za oporavak, regeneraciju ili punjenje najmanje jednog telesnog tkiva kojem je potrebna popravka ili ispunjavanje.

[0136] Poželjno, prema jednom načinu ostvarivanja, karboksialkilhitozan prema ovom pronalasku ispoljava imunokompatibilnost formulacija gljivičnog porekla karboksimetilhitozana sa upotrebom mišjeg modela vazdušnog džepa, 24 časa nakon injekcije, i izražena je brojem belih krvnih zrnaca koja su manje od 10x10<6>ćelija / mL, a poželjno manja od 8 x 10<6>ćelija / mL.

[0137] Poželjno, prema jednom načinu ostvarivanja, karboksialkilhitozan prema ovom pronalasku ispoljava imunokompatibilnost formulacija karboksimetilhitozana gljivičnog porekla upotrebom mišjeg modela vazdušnog džepa, 24 sata nakon injekcije izražene koncentracijom Intereukina 1 beta (IL1 –beta) manjom od 10x10<-9>g / mL, a poželjno manjom od 5x10<-9>g / mL.

[0138] Poželjno, prema jednom načinu ostvarivanja, karboksialkilhitozan prema ovom pronalasku ispoljava imunokompatibilnost formulacija karboksimetilhitozana gljivičnog porekla upotrebom mišjeg modela vazdušnog džepa, 24 sata nakon injekcije izraženog koncentracijom KC/C-X-C manjom od 50x10<-9>g / mL, a poželjno manjom od 30x10<-9>g / mL.

[0139] Poželjno, prema jednom načinu ostvarivanja, karboksialkilhitozan prema ovom pronalasku ispoljava imunokompatibilnost formulacija karboksimetilhitozana gljivičnog porekla upotrebom mišjeg modela vazdušnog džepa, 24 sata nakon injekcije i izražen je koncentracijom TNF -alfa manjom od 150x10<-9>g / mL, a poželjno manjom od 125x10<-9>g / mL.

[0140] Poželjno, prema jednom načinu ostvarivanja, karboksialkilhitozan prema ovom pronalasku ispoljava imunokompatibilnost formulacija karboksimetilhitozana gljivičnog porekla upotrebom mišjeg modela vazdušnog džepa, 24 sata nakon injekcije i izražen je koncentracijom KC / CXCL1 manom od 50x10<-9>g / mL, a poželjno manjom od 30x10<-9>g / mL.

[0141] Poželjno, prema jednom načinu ostvarivanja, karboksialkilhitozan prema ovom pronalasku ispoljava imunokompatibilnost formulacija karboksimetilhitozana gljivičnog porekla upotrebom mišjeg modela vazdušnog džepa, 24 sata nakon injekcije, čime se istovremeno zadovoljavaju ograničenja prethodno izražena kao broj belih krvnih zrnaca i koncentracija od IL1-beta, KC / CXCL1 i TNF -alfa.

[0142] Merenja broja belih krvnih zrnaca i koncentracija IL1-beta, KC / CXCL1 i TNF -alfa se izvode prema protokolima naznačenim u primerima.

1

[0143] Poželjno, prema jednom načinu ostvarivanja, karboksialkilhitozan prema ovom pronalasku ima poluživot u prisustvu mešavine enzima lizozoma i hijaluronidaze na 37 ° C duži od 500 minuta, prema protokolu za merenje iz primera 6.

[0144] Poželjno, prema jednom načinu ostvarivanja, određenije kod intra-artikularne primene, karboksialkilhitozan prema ovom pronalasku ima koeficijent trenja (COF0) manji od 5, poželjno manji od ili jednak 4 (prema protokolu iz primera 9).

[0145] Ovaj pronalazak se određenije odnosi na kompoziciju prema ovom pronalasku za upotrebu u lečenju iz oblasti reumatologije, oftalmologije, estetske medicine, plastične hirurgije, interne hirurgije, na primer za sprečavanje adhezija na tkivu posle operacija, u kozmetičkoj ili dermatološkoj hirurgiji.

[0146] Prema jednoj varijanti, telesno tkivo je izabrano od tkiva koja pripadaju glasnim žicama, mišićima, ligamentima, tetivama, hrskavicama, reproduktivnim organima, kostima, zglobovima, očima, dermisu, epidermisu, jednom ili više slojeva kože, mezodermu, ili bilo kojoj od njihovih kombinacija, a još određenije koji pripada očima, dermisu i artikularnim zglobovima.

[0147] Ovaj pronalazak se takođe odnosi na kompoziciju prema ovom pronalasku za upotrebu u terapijskom lečenju sindroma suvog oka, oštećenja ili povrede rožnjače, ili zapaljenja zglobova.

[0148] Pored toga ovaj pronalazak se odnosi na primenu kompozicije prema ovom pronalasku instilacijom na očnu površinu kako bi se sprečilo ili kako bi se izborilo sa oštećenjem ili povredom rožnjače, ili sindromom suvog oka, određenije za podmazivanje ili regenerisanje očne površine.

[0149] Samim tim ovaj pronalazak se takođe odnosi na kompoziciju kapi za oči koja obuhvata karboksialkilhitozan definisan prema ovom pronalasku.

[0150] Prema jednoj varijanti, subjekat pati od zapaljenske patologije (npr. osteoartroze).

[0151] Ovaj pronalazak se još određenije odnosi na kompozicija prema ovom pronalasku za lečenje artroze, artritisa, ili popravku oštećene hrskavice, na primer injekcijom u šupljinu za sinovijalnu tečnost ili implantacijom na mestu oštećene hrskavice.

[0152] Ovaj pronalazak se još određenije odnosi na medicinsko sredstvo, na primer medicinski implant, naznačen time, što obuhvata ili se sastoji od kompozicije prema ovom pronalasku.

[0153] Prema jednoj poželjnoj varijanti, ovaj pronalazak se samim tim odnosi na medicinsko sredstvo koje obuhvata komoru koja sadrži karboksialkilhitozan u suvom obliku, određenije, u liofilizovanom obliku, i opciono jednu ili više drugih komora koje sadrže jedan ili više aktivnih proizvoda, aditiva ili ekscipijenasa.

[0154] Kompozicija prema ovom pronalasku takođe može da obuhvata jedan ili više aditiva ili ekscipijenasa koji omogućavaju moduliranje njenih svojstava.

[0155] Ovaj pronalazak se takođe odnosi na kompoziciju prema ovom pronalasku za upotrebu u postupku terapijskog lečenja, na primer koje obuhvata instilaciju ili ubrizgavanje pomenute kompozicije

1

subkutanim, intradermalnim, okularnim, intraokularnim, ili intra-artikularnim putem, na primer za popravku ili ispunjavanje najmanje jednog telesnog tkiva kojem je potrebna popravka ili ispunjavanje.

[0156] Ovaj pronalazak se takođe odnosi na kompoziciju prema ovom pronalasku za upotrebu u postupku lečenja artroze, ili popravke oštećene hrskavice, na primer injekcijom u sinovijalnu tečnost ili nakon mešanja sa krvlju i instilacijom u hrskavicu.

[0157] Ovaj pronalazak se takođe odnosi na kompoziciju prema ovom pronalasku za upotrebu u postupku lečenja ili postupku estetske nege koju obezbeđuje punjenje dermisa (“dermalno punjenje”). Ovo određenije uključuje, na primer, ubrizgavanje kompozicije prema ovom pronalasku supkutano ili intradermalno.

[0158] Ovaj pronalazak se takođe odnosi na kompoziciju prema ovom pronalasku za upotrebu u postupku lečenja površine kože pomoću višestrukih injekcija intradermalnim putem. Takve kompozicije obično mogu da se koriste u dermatologiji, kao terapije namenjene u estetske svrhe. Takav postupak na primer služi da se koža zgusne kako bi izgubila svoj naborani izgled (tretman za bore i/ili fine linije). Takav jedan tretman može da primenjuje subjekat koji svojoj koži želi da obezbedi podmlađeni izgled.

[0159] Ovaj pronalazak se takođe odnosi na kompoziciju prema ovom pronalasku za upotrebu u postupku lečenja u kojem ta kompozicija predstavlja sredstvo za viskozno dopunjavanje. U ovom slučaju, na primer na uključuje ubrizgavanje kompozicije ovog pronalaska u intra-artikularno mesto određenije kako bi se ograničilo trenje površina hrskavice zgloba.

[0160] Ovaj pronalazak se takođe odnosi na kompoziciju prema ovom pronalasku za upotrebu u funkciji ćelijskog vektora, za jedan ili više ćelijskih tipova, i/ili jedan ili više aktivnih agenasa. To mogu biti aktivni agensi sa farmaceutskog ili biološkog stanovišta. Kompozicija ovog pronalaska zapravo može biti kompatibilna sa prisustvom ćelija, poželjno živih ćelija. Među živim ćelijama od značaja, na primer mogu da se spomenu: hondorciti (artikularna hrskavica), fibrohondrociti (meniskus), fibroblasti ligamenata (ligament), fibroblasti kože (koža), tenociti (tetive), mijofibroblasti (mišići), mezenhimalne ćelije, crvena krvna zrnca (krv), i keratinociti (kože). Kompozicija ovog pronalaska takođe može biti predviđena i za terapijski vektor za predviđenu isporuku i/ili kontrolisano oslobađanje najmanje jednog terapijskog agensa.

[0161] Prema jednoj varijanti, dodavanje krvi, ili plazme, ili lizata trombocita ili plazme bogate trombocitima, ili bilo koje druge biološke tečnosti sa kompozicijom ovog pronalaska samim tim omogućava na primer da se pojačaju aspekti učinka ovog proizvoda.

[0162] Prema jednoj varijanti, kompozicija prema ovom pronalasku je formulisana u čvrstom obliku (na primer filmu ili poroznoj peni), koja se rastvori kada se implantira.

[0163] Prema jednoj varijanti, kompozicija je formulisana u obliku kompozicije raspršivača (spreja).

1

[0164] Ovaj pronalazak se takođe odnosi na kompoziciju prema ovom pronalasku za upotrebu u postupku lečenja ili postupku estetske nege jednog ili više tkiva ili organa zahvaćenih previsokom temperaturom, kao što je u slučaju opekotine.

[0165] Ovaj pronalazak se takođe odnosi na kompoziciju prema ovom pronalasku za upotrebu u postupku lečenja popravke hrskavice (na primer implantacijom na oštećenoj hrskavici kako bi se poboljšala regeneracija takve hrskavice.

[0166] Ovaj pronalazak se takođe odnosi na kompoziciju prema ovom pronalasku za upotrebu u postupku tretmana sprečavanja adhezija na tkivu nakon operacije : ovaj proizvod se nanosi na tkiva na kraju operacije, na primer, ginekološke operacije, abdominalne operacije, itd.

[0167] Ovaj pronalazak se takođe odnosi na kompoziciju predviđenu za veštačku sinovijalnu tečnost, koja obuhvata karboksialkilhitozan prema ovom pronalasku.

[0168] Kompozicija prema ovom pronalasku obezbeđuje sposobnost imitiranja zdrave sinovijalne tečnosti ili poboljšanja zdrave ili oštećene ili degenerativne sinovijalne tečnosti pokušavanjem, na primer, da se poboljša mogućnost podmazivanja kako bi se smanjilo trenje u zglobu, i/ili njegova svojstva apsorpcije šokova (koja mogu da se identifikuju modulom elastičnosti G'), pri čemu se lako ubrizgava radi punjenja šprica na primer ili se ubrizgava u telo čoveka ili životinje. Kao indikacija, modul elastičnosti G' zdrave sinovijalne tečnosti je obuhvaćen između 40 i 100Pa, a njegov modul gubitka G'' je obuhvaćen između 1 i 10Pa.

[0169] Prema jednoj varijanti, karboksialkilhitozan, ili kompozicija koja obuhvata isti, se ubrizgava u obliku rastvora. Poželjno, prema ovoj varijanti, karboksialkilhitozan, ili kompozicija koja obuhvata isti, se lako ubrizgava finom iglom, na primer iglom opsega prečnika 21, na sobnoj temperaturi. Pojam “laka” injekcija se smatra da označava silu manju od 50 njutna koju je poželjno primeniti kod takvog šprica kako bi kompozicija prema ovom pronalasku mogla da prođe kroz iglu prečnika opsega 21, poželjno manju od 20 njutna.

[0170] Ovaj pronalazak se takođe odnosi na kompoziciju za primenu u funkciji veštačkih suza, koja obuhvata karboksialkilhitozan prema ovom pronalasku.

[0171] Generalno, opsezi osmolaliteta i pH vrednosti koji se traže u biomedicinskim primenama su blizu sledećih opsega:

-Osmolalitet :

[0172]

- Izoosmolarni u plazmi : 285 do 295 mosm / kg ;

- Izoosmolarni u sinovijalnoj tečnosti : 404 ± 57 mosml / kg, prema “Clin Orthop Relat Res, 235, 289-95, 1988” i “Biochem Biophys Res Comm, 422, 455–461, 2012” ;

- od 280 do 350 mosm / kg.

1

-pH :

[0173] Generalno fiziološka pH je iznad 6,8, određenije iznad 7,0, a određenije 7,4 (kao za plazmu ili sinovijalnu tečnost).

[0174] Generalno pH plazme je 7,4. pH sinovijalne tečnosti je generalno 7,768 /- 0,044 prema "J Bone Joint Surg Br, 41-B (2), 388-400, 1959" ; ili 7,3 prema “Acta Orthop Scand 634–641, 1969,”, ili takođe prema “Clin Rheumatol 25, 886–888, 2006”.

[0175] Generalno pH sinovijalne tečnosti u slučaju osteoartritisa ili artritisa se smatra nižom od pH zdrave sinovijalne tečnosti.

[0176] Zbog toga se ovaj pronalazak odnosi na mešavinu sinovijalne tečnosti sa kompozicijom prema ovom pronalasku, na primer na osnovu odnosa zapremine između (i) karboksialkilhitozana, kompoziciju koja obuhvata isti, i (ii) sinovijalnu tečnost koja je u opsegu od 20/80 do 80/20 (vol.%), i na primer koja je 50/50 (v / v).

[0177] Poželjno, kompozicija prema ovom pronalasku je sterilna. Veoma poželjno, kompozicija prema ovom pronalasku je sterilisana podizanjem temperature, poželjno u autoklavu.

[0178] Prema jednoj varijanti, kompozicije ovog pronalaska su transparentne ili prozirne.

[0179] Smatra se da pojam “prozirna” označava da se predmet može razlikovati kada se kompozicija stavi između oka posmatrača i pomenutog predmeta. Smatra se da pojam “transparentna” označava da je moguće da se razlikuju alfanumerički karakteri kada se kompozicija stavi između oka posmatrača i primećenih karaktera. Generalno, ova procena se izvodi sa kompozicijom čija je gustina približno 1 cm. Takođe je moguće da se prati postupak iz monografa 2.9.20 Evropske farmakopeje, zbog vizuelnog pregleda. Takođe je moguće da se izmeri optička gustina kompozicije, na primer pomoću UV-vidljive spektrometrije na 500 nm i da se obezbedi da je optička gustina manja od 0,5, poželjno 0,2 u poređenju sa referentnim rastvaračem

[0180] Prema jednoj varijanti, kompozicije ovog pronalaska nisu ili su samo malo opalescentne.

[0181] Smatra se da pojam “opalescenta” može da znači da rastvor dovodi do difrakcije svetlosti vidljive golom oku, na primer vizuelnim pregledom prema postupku kao što je iz monografa 2.9.20 Evropske farmakopeje i poređenjem referentnih rastvora sa različitim nivoima opalescencije iz Evropske farmakopeje. Prema jednoj varijanti, kompozicija ovog pronalaska je bezbojna, odnosno određenije, kada je posmatrač posmatra, kompoziciji ne pripisuje nijednu konkretnu boju. Prema jednoj varijanti, opalescencija je manja od maksimalnog podnošljivog nivoa za predviđenu primenu.

[0182] Ovaj pronalazak se određenije odnosi na proizvode ili pakovanje, poželjno sterilno, koje obuhvata sredstva za instilaciju ili injekciju prethodno napunjena kompozicijom prema ovom pronalasku. U njih obično spadaju sredstva koja omogućavaju da se proizvod ukapa u obliku kapi ili prethodno napunjenim špricevima.

1

[0183] Kompozicija ovog pronalaska poželjno može biti sterilisana. Stoga se ovaj pronalazak odnosi na sterilisani karboksialkilhitozan. Karboksialkilhitozan je samim tim sterilan, određenije za primene u kojima je neophodan.

[0184] Prema jednoj varijanti, kompozicija ovog pronalaska je sterilisana pod parom, na primer podizanjem temperature do temperature više od 100 ° C, a poželjno više od 120 ° C, na primer između 121 ° C i 138 ° C , u autoklavu, tokom vremenskog perioda dovoljnog za sterilizaciju, na primer generalno od 15 do 20 minuta. Prema drugoj varijanti, kompozicija može biti sterilisana filtracijom upotrebom filtera podešenih za ovu svrhu, na primer filtera čija je poroznost manja od ili jednaka 0,2 μm.

[0185] Poželjno, prema jednom poželjnom načinu ostvarivanja, gubitak unutrašnje viskoznosti karboksialkilhitozana tokom postupka parne sterilizacije je manji od 40%.

[0186] Ovaj pronalazak takođe pokriva kompoziciju ovog pronalaska u suvom obliku, određenije u liofilizovanom obliku.

[0187] Moguće je, određenije, da se liofilizovana kompozicija pre upotrebe (ponovo) disperguje.

[0188] Ovaj pronalazak takođe pokriva postupak terapijskog lečenja koji obuhvata ubrizgavanje kompozicije prema ovom pronalasku.

[0189] Ovaj pronalazak takođe pokriva upotrebu kompozicije prema ovom pronalasku za pripremu farmaceutske kompozicije, određenije za terapijsko lečenje, na primer kako je konkretno definisano ovim pronalaskom.

[0190] Ovaj pronalazak takođe pokriva postupak estetske nege, drugim rečima neterapijski postupak, koji obuhvata ubrizgavanje kompozicije prema ovom pronalasku. Ovo podrazumeva na primer punjenje bora ili punjenje jedne ili više regija oštećenog vidljivog tkiva, na primer posle nesrećnog slučaja ili hirurške intervencije, u estetske svrhe.

[0191] Tkivo je skup ćelija koje su slične i imaju isto poreklo, grupisane zajedno kao funkcionalna jedinica, odnosno, koje doprinose istoj datoj funkciji. Među tim tkivima, mogu da se spomenu: epitelijalno tkivo, vezivno tkivo, mišićno tkivo, i nervno tkivo.

[0192] Pojam “kompozicija prema ovom pronalasku” ili ekvivalentni pojmovi se odnose na kompoziciju definisanu kao u ovom pronalasku, ili ekvivalentni pojmovi se odnose na kompoziciju definisanu kao u ovom pronalasku, uključujući prema bilo kojoj od varijanti, određene ili konkretne načine ostvarivanja, nezavisno ili prema bilo kojoj od njihovih kombinacija, uključuje prema poželjnim karakterističnim osobinama.

[0193] Drugi predmeti, karakteristične osobine i prednosti ovog pronalaska će postati očigledni stručnjaku nakon čitanja opisa sa objašnjenjem koje se poziva na primere koji su dati samo kao ilustracija i koji ni na koji način ne mogu da ograniče obim ovog pronalaska.

2

[0194] Primeri čine sastavni deo ovog pronalaska i bilo koja karakteristična osobina koja se pojavljuje kao nova u odnosu na dokument stanja tehnike na osnovu opisa koji se uzima kao celina, uključujući primere, čini sastavni deo ovog pronalaska u smislu funkcije i njegove uopštenosti.

[0195] Stoga je svaki primer uopšten u svom obimu.

[0196] Sa druge strane, u primerima, svi procenti su dati u odnosu na masu, ukoliko nije drugačije naznačeno, a temperatura je izražena u stepenima celzijusa ukoliko nije drugačije naznačeno, a pritisak predstavlja atmosferski pritisak, ukoliko nije drugačije naznačeno.

PRIMERI

[0197] Prekursori hitozana supstituisanih hitozana prema ovom pronalasku imaju prosečnu molekulsku masu u viskoznosti (određenu pomoću kapilarne viskozimetrije) i stepen acetilacije (DA, proporcija N -acetil- D -glukozaminske jedinice, određen potenciometrijskom titrracijom) koji obuhvataju opsege date u tabeli 1. Molekulska masa hitozana takođe može biti definisana dinamičkom viskoznošću rastvora koncentracije od 1% (m / m) hitozana u sirćetnoj kiselini koncentracije od 1% (v / v ), merena pomoću rotirajućeg pokretnog viskozimetra, na primer Brookfield viskometra, kako je opisano u tabeli 1.

[0198] Sledeći postupci se koriste u ovom pronalasku, ukoliko nije drugačije naznačeno:

Postupak za merenje zeta potencijala

[0199] Formulacija koja bi trebalo da se analizira je razblažena u fosfatnom puferu kako bi se dobila konačna koncentracija polimera od 0,05%, zatim se blago meša dok se ne postigne homogenizacija. Rastvor se zatim razdvaja u različite frakcije, a zatim se pH svake frakcije podešava na željenu vrednost, između pH 4 i 8, ili dodavanjem natrijumhidroksida u 0,1N ili dodavanjem hlorovodonične kiseline u 0,1N. Zeta potencijal svake frakcije se meri pomoću uređaja “Nano-Z” (Zeta-Sizer range, Malvern Instruments).

Postupak za merenje opsega rastvorljivosti polimera hitozana

[0200] Opseg rastvorljivosti je utvrđen pripremanjem rastvora polimera koji bi trebalo da se ispita u koncentraciji od 1% i pH 9, deljenjem na nekoliko frakcija pri čemu je pH svake podešena na različitu vrednost u opsegu od 9 do 1. Za svaku frakciju, polimer se proverava kako bi se utvrdilo da je rastvorljiv – odnosno da ne stvara bilo kakvu zamućenost – prema postupku vizuelnog pregleda iz monografa 2.9.20 Evropske farmakopeje. Zabeležen je pH opseg u okviru kojeg je polimer rastvorljiv ili nerastvorljiv.

Model potkožnog vazdušnog džepa kod miševa

[0201] Model potkožnog vazdušnog džepa kod miševa se koristi kako bi se ocenila reakcija na strano telo i imunokompatibilnost raznih različitih polimera dobijenih iz hitozana gljivičnog porekla. Kod ovog modela, šupljina vazdušnog džepa se proizvodi ponovljenim supkutanim injekcijama sterilnog vazduha u leđa miša. Džep koji se stvara upuhavanjem vazduha oponaša sinovijalnu šupljinu, čime se obezbeđuje lokalizovana sredina u kojoj je moguće da se ispituje stimulacija zapaljenskog odgovora u tečnosti koja se povlači iz vazdušnog džepa i koja okružuje tkiva, kao što su opisali Segwick et al. (in : J Pathol 141, 483, 1983) i Sin et al. (in : Ann Rheum Dis 45, 873, 1986). Šupljina vazdušnog džepa obezbeđuje sredstva za ubrizgavanje 1 mL proizvoda u životinju mase od približno 30 g. Prema protokolu koji su opisali Dawson et al. (in : Int J Tiss Reac 8, 171, 1991), vazdušni džep je utvrđen kod nesrodnih mužjaka CD-1 Swiss albino miševa (bez patogena, telesne mase na prijemu od 25 do 35 g) u vremenskom periodu od 0. dana do 4. dana ponovljenom injekcijom od 5 mL a zatim 3 mL sterilnog vazduha.7. dana, pojedinačna supkutana injekcija od 1 mL proizvoda se daje direktno u šupljinu vazdušnog džepa. Injekcije od 1 mL slanog rastvora i 1% rastvora morske trave služe kao negativna i pozitivna kontrola, tim redom. Životinje se uredno prate u satima nakon injekcije kako bi se detektovali mogući klinički znaci sistemske ili lokalne toksičnosti, a porast telesne mase i temperatura se javljaju u vreme injekcije i žrtvovanja. Životinje su eutanazirane nakon perioda od 24 sata od kontakta sa proizvodom (3 životinje po proizvodu).

Imunološke procene ispiranja tečnosti oporavljene od džepa uključuju citološku analizu (brojanje i raspodelu belih i crvenih krvnih zrnaca) i kavantifikaciju glavnih zapaljenskih posrednika (IL-1-beta, TNF-alfa i KC / CXCL1) pri čemu se upotrebljavaju 'ELISA' kompleti (AbCam), koje se izvode prema uputstvima. Izvedene su makroskopska analiza i histopatologija pomoću bojenja hematokislinom/ eozinom okolnih kožnih tkiva. Posebna pažnja se obraća na lokalizaciju proizvoda na okolnim tkivima kao i na njihovu apsorpciju u tečnosti.

Model za ocenu lokalne intra-artikularne podnošljivosti kod ovčijeg modela

[0202] Prema literaturi i preporukama OARSI, ovce su prepoznate kao dobro okarakterisan model za ocenu efekata intra-artikularne injekcije inovativnih terapija (Little et al. In : Osteoartritis Cartilage 18, S80, 2010 ; Edouard et al. In : Phys Ther Sport 14, 116, 2013 ; McCoy et al. In : Vet Pathol 52, 803, 2015). Ovčiji model obezbeđuje sredstva za injkeciju intra-artikularnim putem formulacije u zapremini koja simuliše kliničku upotrebu viskoznih dodataka kod ljudi (Fraser et al. In : Semin Arthritis Rheum 22, 9, 1993). Merenja lokalne podnošljivosti uključuju kliničke znake sinovijalnog zapaljenja (izliv, hromost, komfort) upotrebom validiranih polukvantitativnih kliničkih lestvica, koje opisuju Shafford et al. (in : Vet Anaesth Analg 31, 20, 2004) i Kaler et al. (in : Vet J 180, 189, 2009), kao i citološke procene sinovijalne tečnosti. U nekim slučajevima, ove analize mogu biti dopunjene anatomskom i histološkom procenom rebra u koje se ubrizgava. Zapremina od 2 mL formulacije se ubrizgava u zglob (koleno) zdrave ovce (uzrasta od 2 do 6 godina ; mase od 60 do 80 kg). Nakon injekcije, klinički znaci životinja se snimaju na dnevnom nivou tokom perioda od 15 dana, na osnovu polukvantitativne lestvice od 0 do 4 za izliv (palpitacijom kolena) i hromost. Prijavljen je broj znakova na koji se naišlo za svaki od rezultata tokom čitavog perioda praćenja. Kako bi se procenili efekti ponovljene injekcije iste date formulacije, daje se druga injekcija nakon 1 meseca u zglob istih životinja, i životinje se prate prema istom protokolu kao i za prvu injekciju. Pored toga, 15. dana se izvodi punkcija sinovijalne tečnosti, i određuju se makroskopski (boja, viskoznost), citološki (brojanje i raspodela belih i crvenih krvnih zrnaca) parametri, kao i količina ukupnih proteina u serumu prema konvencionalnim postupcima. Smatra se da se količina ukupnih proteina u serumu određuje prema konvencionalnim postupcima. Smatra se da je sinovijalna tečnost normalna ako je izgled bistar, viskozan ili blago žućkast, a citološka analiza ukazuje da je broj belih krvnih zrnaca manji od 1x10<5>ćelija / mL a koncentracija ukupnih proteina je približno 25 mg / mL.

Primer 1 – N-sukcinilhitozani (nije zaštićeno)

[0203] N-sukcinilhitozani koji imaju različitu molekulsku masu i molekulsku strukturu (stepen acetilacije (DA), i stepen supstitucije sukcinilskom grupom (DS)) su pripremljeni i okarakterisani prema opštem postupku opisanom u patentnoj prijavi WO 2016/016463 ili WO 2016/016464 (patent EP 3016663). Prva faza acetilacije dodavanjem sirćetnog anhidrida se izvodi kako bi se povećao stepen acetilacije, izuzev za polimer CSS-1 (tabela 1a).

[0204] Formulacije su bile pripremljene sa ovim N-sukcinilhitozanima (CSS) u koncentraciji od 2% pri fiziološkoj pH i osmolaritetu, i upakovane u staklene špriceve. Špricevi su sterilisani autoklavom standardnim ciklusom (15 minuta na 121 ° C). Formulacije su proverene tako da bi se utvrdilo da ne ispoljavaju bilo kakvu nerastvorljive materije ili zamućenost u širokom opsegu pH oko fiziološke pH (pH 6,5 do 7,5), vizuelnim pregledom prema postupku EP 2.9.20. Proverava se da li je nivo bakterijskih endotoksina u formulacijama manji od 20 EU / mL prema postupku monografa 2.6.14 (D) Evropske

2

farmakopeje i da je mikrobiološko opterećenje manje od 100 cfu / g prema postupku 2.6.12 Evropske farmakopeje, pre izvođenja procene njihove imunokompatibilnosti in vivo.

* molekulska masa prekursora hitozana, prema tabeli 1 ; **DA i DS mereni protonskom NMR prema postupku opisanom u patentu EP 3016663.

[0205] Imunokompatibilnost CSS formulacija je ocenjena pomoću modela supkutanog vazdušnog džepa kod miševa (tabela 1b). Primećena reakcija je upoređena sa reakcijom primećenom nakon ubrizgavanja slanog rastvora (negativna kontrola), veoma reaktivne pozitivne kontrole (1% rastvor morske trave), i komercijalno dostupnog proizvoda baziranog na Hylan GF-20, delimično umrežene hijaluronske kiseline (Synvisc®, Sanofi).

* prosečna vrednost sa 3 životinje ; ** limit detekcije: 3,10<-9>g / mL za IL1-beta i 125,10<-9>g / mL za TNF-alfa.

[0206] Generalno, čini se da ove formulacije bazirane na CSS uzrokuju imunološku reakciju na vrstu stranog tela, što je dokazano brojem belih krvnih zrnaca u filtratu ćelije koji je veći od negativne kontrole, mada nije toliko veliki kao za pozitivnu kontrolu (1% karagenan). Reakcija koju su izazvale formulacije je okarakterisana aktivacijom neutrofila, što je zabeleženo većom koncentracijom markera KC / CXCL1 od onih za negativnu kontrolu i za Synvisc® proizvod. Što se tiče markera IL1-beta i TNF-alfa, njihovi nivoi su niski.

[0207] Modifikovanje DA i/ili DS od CSS ili stvarno modifikovanje njegove molekulske mase ne dovodi do bilo kakve razlike u imunološkoj reakciji. Iako formulacije CSS ne uzrokuju bilo kakve štetne efekte lokalno na tkiva, neophodno je da postoji mogućnost da se dobije viši nivo imunokompatibilnosti u slučaju terapijskih primena koje ciljaju tkiva koja su oslabljena osnovnom patologijom, na primer kao što je sindrom suvog oka, oštećenje rožnjače ili zapaljenje povezano sa patologijama zgloba.

Primer 2 – Karboksimetilhitozani životinjskog porekla

[0208] Mogu da se dobiju dva karboksimetilhitozana životinjskog porekla, za farmaceutsku ili medicinsku upotrebu koja su implantabilna ili injektabilna (CC-1 i CC-2 u tabeli 2a).

[0209] Ispitana su dva druga karboksimetilhitozana :

− jedan CC dobijen karboksimetilacijom hitina životnjskog porekla (CC-3),

− jedan CC dobijen karboksimetilacijom hitozana životinjskog porekla, pri čemu se hitozan priprema deacetilacijom hitina životinjskog porekla (CC-4).

[0210] Karboksimetilhitozani (CC) su okarakterisani NMR ugljenika 13 kako bi se potvrdio njihov identitet i odredile vrednosti DA (stepen acetilacije) i DS (stepen supstitucije karboksimetilnom grupom), sa marginom greške procenjenom na približno ± 10% (tabela 2a). Elektrostatičko naelektrisanje polimera je okarakterisano merenjem zeta potencijala pri koncentraciji od 0,05% (m / m) u opsegu pH od pH 8 do pH 4, a prijavljena je vrednost zeta potencijala pri pH 7,5 (tabela 2a). Primećuje se da je vrednost zeta potencijala pri pH 7,5 relativno povezana sa vrednošću DS kako je određeno pomoću NMR ugljenika 13. Na primer polimer CC-3 je više supstituisan od polimera CC-4 anjonskom karboksimetil grupom (u obliku karboksilata pri pH 7,5) i ima sličan DA, i samim tim celokupno negativno naelektrisanje je veće (-28mV nasuprot -11mV pri pH 7,5).

2

[0211] Primećeno je da polimeri CC-1 i CC-2 nisu veoma rastvorljivi u fiziološkom pH opsegu (pH 6,5 do 7,5). Nije moguće da se oceni njihova imunokompatibilnost pomoću modela supkutanog vazdušnog džepa kod miševa. Polimeri CC-3 i CC-4 su rastvorljivi u širokom opsegu pH od 1 do 9.

* DA i DS vrednosti polimera karboksimetilhitozana su određene NMR ugljenika 13 u čvrstom stanju. #nije zaštićeno

[0212] CC-3 (2%) i CC-4 (1,5%) formulacije su zatim pripremljene prema istom postupku koa u primeru 1, upakovane u staklene špriceve a zatim sterilisane autoklavom prema standardnom ciklusu od 15 minuta na 121 ° C (tabela 2a). Zaključeno je da 2% formulacija polimera CC-3 ne podnosi finalnu sterilizaciju autoklavom, što je dokazano gubitkom unutrašnje viskoznosti od približno 60% čime se prevodi hidroliza polimera, kao i 98% gubitkom u svom modulu čuvanja G '. Kao alternativa finalnoj sterilizaciji autoklavom, formulacija CC-3 se zatim filtrira pre pakovanja u špric kako bi se proizvela formulacija koja može da se proceni korišćenjem modela vazdušnog džepa kod miševa.

[0213] Formulacije CC-3 (2%, filtrirane) i CC-4 (1,5%, stesteriliane autoklavom) su proverene tako da se utvrdi da su nivo endotoksina i mikrobiološko opterećenje niži od 20 EU / mL i 100 cfu / g, a zatim se njihova imunokompatibilnost procenjuje korišćenjem supkutanog modela vazdušnog džepa kod miševa (tabela 2b).

2

*prosečna vrednost kod 3 subjekta ; ** limit detekcije: 3.10<-9>g / mL za IL1-beta i 125.10<-9>g / mL za TNF-alfa.

[0214] Formulacija CC-4 uzrokuje značajnu reakciju, koju karakteriše visoka koncentracija ta dva markera KC / CXCL1 (aktivacija neutrofila) i TNF-alfa u infiltratu, istovremeno. Marker TNF-alfa nije detektovan nakon injekcije CSS formulacija opisanih u primeru 2 ili Synvisc® (Hylan GF-20). Međutim, nije poželjno da se izaziva reakcija koju karakteriše marker TNF-alfa. Budući da je poželjno da ima dobru imunokompatibilnost u slučaju terapijskih primena kod kojih se očekuje da će formulacija biti u kontaktu sa tkivima koja su oslabljena osnovnom patologijom, kao što je na prime sindrom suvog oka, oštećenja ili povrede rožnjače, ili artikularna zapaljenja, i kako bi se izbegla aktivacija neutrofila i TNF-alfa, karboksimetilhitozan životinjskog porekla CC-4 nije poželjan.

[0215] Formulacija CC-3 izaziva slabiju reakciju, koju karakteriše broj belih krvnih zrnaca i umerena koncentracija markera KC / CXCL1, slično nivoima poredbenog proizvoda Synvisc® ali višoj od negativne kontrole (fiziološki rastvor). Stoga se čini da je CC-3 formulacija manje imunoreaktivna od CSS formulacija i CC-4 formulacije. Međutim, CC-3 formulacija ima nedostatak koncentracije markera KC / CXCL1 koji može da se pokaže kao nepogodan za postupak terapijskog lečenja u kojem subjekat zahteva dobru imunokompatibilnost i veoma značajnu hidrolizu makromolekulskih lanaca pod uticajem toplote, koji tako obezbeđuje njegovu nemoguću sterilizaciju autoklavom tokom finalne faze na kraju postupka proizvodnje, odnosno nakon punjenja šprica formulacijom.

Primer 3 – Karboksimetilhitozani gljivičnog porekla

2

[0216] Da bi se dobili karboksimetilhitozani iz tabele 3a i 3b počeviši od hitina ili hitozana gljivičnog porekla, izvedene su sledeće reakcije:

− Ponovna acetilacija posle koje je usledila karboksimetilacija gljivičnog hitozana sa “ultravisokom” molekulskom masom (CC-5 iz tabele 3a) ;

− Karboksimetilacija nakon koje sledi ponovna acetilacija gljivičnog hitozana sa “ultra-visokom” molekulskom masom (CC-5 do CC-9) ;

− Karboksimetilacija gljivičnog hitozana sa “ultra-visokom” molekulskom masom (CC-11) ;

− Karboksimetilacija gljivičnog hitina (CC-10).

[0217] Primera radi, priprema CC-8 se odvija na sledeći način :

10 g “ultra-visokog” hitozana se disperguje u 220 ml izopropranola i 68 ml 40% natrijumhidroksida (m / v).45 g alkilišućeg agensa monohlorosirćetne kiseline (MCA) se rastvoreno u 45 ml izopropanola, i dodato je u suspenziju hitozana. Reakcija može da se nastavi tokom perioda od 16 sati na 25 ° C. Polimer je oporavljen taloženjem u etanolu, zatim prečišćen ciklusima solubilizacije/taloženja u etanolu. Talog se suši u pećnici sa ventilacijom. Masa od 15 g taloga je dispergovana u vodi, i tome je dodato 3,75 ml sirćetnog anhidrida. Nakon 30 minuta mešanja na sobnoj temperaturi, pH podloge je podešena do 6, i dodato je 3,75 ml kiselog anhidrida (AC). Nakon 30 minuta mešanja na sobnoj temperaturi, podloga je neutralisana i nataložena u etanolu. Talog koji je dobijen na taj način je ponovo rastvoren a zatim ponovo nataložen. Finalni talog karboksimetilhitozana (CC-8) je osušen u pećnici sa ventilacijom.

[0218] Parametri sinteze koji se primenjuju kod pripreme drugih CC su opisani u tabelama 3a i 3b.

2

*MCA : monohlorosirćetna kiselina; SCA : natrijumova so monohlorosirćetne kiseline.

[0219] Dobijeni karboksimetilhitozani (CC) gljivičnog porekla su okarakterisani NMR ugljenika 13 kako bi se potvrdila njihova struktura i odredila vrednost DA i DS (tabela 3c). Uzimajući u obzir standardnu devijaciju svojstvenu postupku spektrometrije NMR ugljenika 13 (približno ± 10%), primećeno je da je vrednost zeta potencijala pri pH 7,5 u međusobnoj korelaciji sa molekulskom strukturom, određenije sa DS.

2

* DA i DS kako su određeni putem 13C-NMR ; ** smatraju se kao mogućim za sterilizaciju ukoliko je gubitak unutrašnje viskoznosti pre/posle sterilizacije manji od 40%.#nije zaštićeno

[0220] Dobijeni CC su svi rastvorljivi u velikom opsegu pH, određenije u opsegu pH od 4,0 do 8,5, bez opalescentnosti.

[0221] Formulacije su pripremljene pri CC koncentraciji od 1,5 ili 2%, upakovane u staklene špriceve, zatim sterilisane autoklavom prema standardnom 15-minutnom ciklusu na 121 ° C. Kako bi se procenilo da li formulacije mogu da se sterilišu autoklavom, da li viskoznost polimera može da se izmeri pre i nakon autoklaviranja kapilarnom viskozimetrijom, nakon razblaženja faktorom 25 sa fosfatnim puferom. Gubitak unutrašnje viskoznosti CC je manji od 40%, što predstavlja prihvatljivu otpornost, nasuprot CC-3 formulacije u primeru 2 (koja je pretrpela gubitak od približno 60% unutrašnje viskoznosti).

[0222] Vizuelni pregled sterilisanih formulacija prikazan u tabeli 3C znači da su transparentne a ne opalescente. Zatim su proverene tako da se utvrdi da je nivo endotoksina i mikrobiološkog opterećenja manji od 20 EU / mL i 100 cfu / g, a posle toga je njihova imunokompatibilnost procenjena korišćenjem modela vazdušnog džepa kod miševa.

*prosečna vrednost kod 3 subjekta ; ** limit detekcije : 3,10<-9>g / mL za IL1-beta i 125,10<-9>g / mL za TNF-alfa.

[0223] Generalno, zabeleženo je da postoji dobra imunokompatibilnost CC formulacija gljivičnog porekla, sa atenuacijom ili čak supresijom imune reakcije u poređenju sa formulacijama N-sukcinilhitozana koje su opisane u primeru 1 i sa formulacijama karboksimetilhitozana životinjskog porekla koje su opisane u primeru 2.

[0224] Zabeleženo je da je niska koncentracija markera KC / CXCL1 izazvana formulacijama CC gljivičnog porekla, na istom nivou kao ona za negativnu kontrolu (fiziološki rastvor) i niža od one za proizvod Synvisc®. Ovo prikazuje zanemarljivu ili čak odsutnu aktivaciju neutrofila, nasuprot nivoa koji je prijavljen nakon injekcije formulacije CSS (primer 1) i CC životinjskog porekla (primer 2).

[0225] Dalje, za određene formulacije CC gljivičnog porekla (tj. CC-8 i CC-10) je zabeleženo da su četiri parametra imunološke reakcije atenuisana ili suprimirana istovremeno, odnosno ukupan broj belih krvnih zrnaca, marker IL1-beta, marker KC-CXCL1 i marker TNF-alfa. Ovo se ne dešava sa CSS formulacijama ili sa formulacijama CC životinjskog porekla.

[0226] Čini se da za CC gljivičnog porekla, formulacije koje ispoljavaju ovu istovremenu atenuaciju četiri parametra su one sa najvišim negativnim naelektrisanjem (npr. -26 mv za CC-8 i -24,5 mV za CC-10 pri pH 7,5).

[0227] Primećeno je da formulacije CC-4 životinjskog porekla opisane u primeru 2 i CC-5 gljivičnog porekla slabo supstituisane karboksilnom grupom, uzrokuju određenu aktivaciju markera TNF-alfa, a da

1

sa druge strane sama formulacija CC-4 životinjskog porekla dovodi do značajnog izlučivanja markera KC / CXCL1. Takođe je primećeno da formulacija CC-10 (gljivičnog porekla) nije dovela do aktivacije neutrofila, za razliku od formulacije CC-3 životinjskog porekla opisane u primeru 2.

Primer 4 – Procena lokalne podnošljivosti intra-artikularnog davanja formulacija karboksimetilhitozana gljivičnog porekla upotrebom ovčijeg modela

[0228] Formulacije sa 2% dva karboksimetilhitozana gljivičnog porekla (CC-8 i CC-10) opisane u primeru 3 su pripremljene kako bi se ocenio njihov potencijal za upotrebu putem intra-artikularne injekcije, pomoću ovčijeg (ovce) modela. Zapremina od 2mL od dve formulacije se daje ovcama, a lokalna reakcija izazvana njenom intra-artikularnom injekcijom se ocenjuje tokom perioda od 2 nedelje. Efekti druge injekcije CC-8 formulacije u istom zglobu, 1 mesec od datuma prve injekcije, su takođe procenjeni. Proizvod Synvisc® se daje na isti način, u zapremini od 1 mL ili 2 mL.

[0229] Klinički znaci se prate dnevno palpitacijom zgloba i praćenjem hromosti tokom perioda od 15 dana a procena se pravi prema rezultatu polukvantitativnog rezultata od 0 (bez signala) do maksimalnog rezultata od 3 zbog izliva i 5 za hromost. Prijavljen je celokupni klinički rezultat tokom perioda od 15 dana u smislu incidence prema rezultatu (tabela 4), kao i zbog karakterizacije sinovijalne tečnosti proizvedene 15. dana.

2

Primer 5 – Procena lokalne podnošljivosti formulacija karboksimetilhitozana gljivičnog porekla nakon intradermalne injekcije kod zečeva

[0230] Formulacija karboksimetilhitozana gljivičnog porekla pri fiziološkoj pH i osmolalitet se pripremaju u smislu procene njegovog potencijala za intradermalno davanje, korišćenjem modela zeca (tabela 5a). CC-15 gljivičnog porekla se priprema pomoću karboksimetilacije, nakon koje sledi ponovna acetilacija prema opštem postupku opisanom u primeru 3 za CC-8, pri čemu se moduliraju parametri sinteze tako da se uzrokuje variranje DA i DS (tabela 5a).

[0231] Formulacija se pakuje u stakleni špric od 1 ml, a zatim se steriliše autoklavom prema standardnom ciklusu (15 minuta na 121 ° C). Formulacija je otporna na sterilizaciju autoklavom, pri čemu je gubitak unutrašnje viskoznosti manji od 40%. Konačno, formulacija se proverava tako da se utvrdi da je nivo bakterijskih endotoksina manji od 40 EU / mL i da je mikrobiološko opterećenje manje od 100 cfu / mL.

[0232] Zapremina od 200 µL formulacije se daje zečevima intradermalnom injekcijom preko igle opsega prečnika 27 (igla sa veoma malim prečnikom), prema protokolu koji je u skladu sa standardom ISO10993 (deo 10) za procenu primarne iritacije izazvane intradermalnim implantom. Broj od šest zečeva, pri čemu svaki prima tri injekcije formulacije. Komercijalno dostupan proizvod dermalnog punioca na bazi umrežene hijaluronske kiseline, Juvéderm® Voluma (Allergan), se takođe ubrizgava putem igle opsega prečnika 27. Makroskopski signali kožne iritacije su prijavljeni za sve životinje i sva mesta u koje se ubrizgava 12, 24 i 48 sati u smislu određivanja rezultata primarne iritacije, ocenjivanjem mogućeg izgleda eritema, eshara, edema i stvrdnutosti na polukvantitativnoj skali, na osnovu rezultata od 0 (bez signala) do 4 (maksimalni signal). Rezultat primarne iritacije za svaki proizvod se ocenjuje na sledeći način: prosečni rezultati za eritem sa 18 mesta na kojima je injekcija data nakon 24, 48 i 72 sata. Zbir prosečnih rezultata edema se izračunava na isti način.2 zbira (eritem i edem) se dodaju, a zatim se dele sa 54 kako bi se dobio srednji rezultat primarne iritacije. Isti pristup u postupku se prati i sa proredbenim proizvodom. Rezultati iritacije su prijavljeni u tabeli 5b. Primećeno je da CC formulacija nije proizvela znake edema i par znakova eritema, sa rezultatom koji je niži od onih koje izaziva Juvéderm® Voluma u svakom slučaju. Zaključeno je da formulacija nije iritirajuća i da je manje iritirajuća od Juvéderm® Voluma.

* kako je određeno 13C-NMR ; ** smatra se mogućim za sterilizaciju ukoliko je gubitak unutrašnje viskoznosti pre/posle sterilizacije autoklavom manji od ili jednak 40% ; *** vrednost procenjena iz polinomijlane regresije krive zeta potencijala pri 7,5 u funkciji DS (± 20%).

[0233] Period praćenja je zatim produžen do 2 nedelje nakon injekcije, sa procenom kliničkih signala 5., 7., 9., 11. i 14. dana. Kako bi se izvela moguća histološka analiza, 2 životinje su žrtvovane 3. dana, 7. dana i 14. dana nakon injekcije.

Makroskopski rezultati su prijavljeni u tabeli 5c. Primećeno je da formulacija ispoljava odličnu lokalnu podnošljivost tokom perioda od 2 nedelje nakon intradermalne injekcije, sa rezultatima koji su niži od onih primećenih sa proizvodom Juvéderm® Voluma za sve ukupne makroskopske znake, i bez znakova eshara ili edema.

4

* broj mesta makroskopski procenjenih u svakom vremenskom okviru nakon injekcije. Dalje, kompozicija (CC-15) lako može da se ubrizga putem fine igle 27 Gauge, pogodne za intradermalno davanje.

Primer 6 – Podložnost enzimatskoj razgradnji in vitro

[0234] U ovom primeru, upoređena je brzina na kojoj se formulacija degradira u prisustvu mešavine dva lizozomska enzima i hijaluronidaze prisutnih u biološkim tečnostima (na primer sinovijalnoj tečnosti, suzama ili intersticijalnoj tečnosti vezivnih tkiva). Lizozomski enzim se generalno prepoznaje po svojoj mogućnosti da hidrolizuje biomaterijale bazirane na hitozanu.

[0235] Gljivični karboksimetilhitozan CC-16 se priprema na isti način kao CC-8 označen u primeru 3, moduliranjem parametara sinteze kako bi se podesili DA i DS.2% formulacije CC-16, CC-8 (primer 3) i CC-10 (primer 3) su pripremljene u fosfatnom puferu sa 3,5% sorbitola. Takođe se ocenjuje i 2% formulacija CC-3 životinjskog porekla (primer 2) i dva komercijalno dostupna viskozna suplementa bazirana na neumreženoj hijaluronskoj kiselini (HA-1 i HA-2).

[0236] Formulacija se razblažuje faktorom 25 u fosfatnom puferu. Rastvor se zatim meša tokom perioda od 12 sati i dodaje se mešavina lizozomskih enzima i hijaluronidaze razblaženom rastvoru, u dozama od 184 jedinica / mL i 2,6 jedinica / mL, tim redom. Merenje unutrašnje viskoznosti se redovno izvodi, pomoću automatskog kapilarnog viskometra I-Visc (Lauda) opremljenog sa Ubelohdovim kapilarom (model 0a). Zatim se izračunava poluživot svake formulacije, odnosno vreme potrebno za unutrašnju viskoznost polimera da bi se postigla polovina njegove početne vrednosti (tabela 6).

* kako je određeno NMR ugljenika 13 u čvrstom stanju

[0237] Iz rezultata može da se zaključi da su formulacije karboksimetilhitozana hidrolizovane mešavinom lizozoma/hijaluronidaze, i da kinetika hidrolize može biti modulirana putem molekulske strukture karboksimetilhitozana. Ovo omogućava da se vreme zadržavanja proizvoda podesi u skladu sa predviđenom terapijskom primenom. Takođe se utvrđuje da se karboksimetilhitozani gljivičnog porekla sporije razgrađuju od karboksimetilhitozana životinjskog porekla (CC-3) kao i dva komercijalno dostupna proizvoda bazirana na hijaluronskoj kiselini.

PRIMER 7 – Uticaj toplote

[0238] U ovom primeru, špricevi koji sadrže formulacije su stavljeni u pećnicu na temperaturi kontrolisanoj na 60 ° C tokom perioda od 11 dana, što omogućava procenu njihove otpornosti na zagrevanje na temperaturi koja je viša od uobičajene temperature čuvanja. U svakoj vremenskoj tački, špric se povlači i meri se unutrašnja viskoznost polimera prema postupku opisanom u primeru 6.

Prijavljen je odnos između viskoznosti u datoj vremenskoj tački i početne viskoznosti (u % početne viskoznosti).

[0239] Urađena je procena 2% formulacije CC-3 životinjskog porekla naznačene u primeru 2 (sa 3,5% sorbitola), kao i komercijalno dostupnog viskoznog dodatka ishrani baziranog na neumreženoj hijaluronskoj kiselini naznačenoj u primeru 6 (HA-2).

* kako je određeno NMR ugljenika 13 u čvrstom stanju

[0240] Zaključeno je da su formulacije karboksimetilhitozana gljivičnog porekla otporne na toplotu, i da su manje osetljive od obe formulacije životinjskog porekla (CC-3) kao i na komercijalno dostupan proizvod na bazi hijaluronske kiseline.

PRIMER 8 – Postupci za smanjenje mikrobiološkog opterećenja karboksimetilhitozana

[0241] Karboksimetilhitozan gljivičnog porekla, CC-19, se proizvodi prema postupku koji se koristi za pripremu CC-8 primera 3, počevši od “ultra-visokog ” hitozana. Njegove karakteristike su sledeće : DA 67% i DS 115% (mereno NMR ugljenika), rastvorljiv pri bilo kojoj pH, transparentan, neopalescentan.

Zeta potencijal pri pH 7,5 formulacije se procenjuje na -27 mV (iz polinomijalne regresije krive zeta potencijala u funkciji DS).2% CC-19 formulacija u fosfatnom puferu sa 3,5% sorbitola se priprema, kako je opisano u primeru 3. Njegove karakteristike su sledeće : pH 7,3 i osmolalitet 279 mOsm / kg. Da bi se ispitala njihova izvodljivost i uticaj na finalne karakteristike formulacije, dva poznata postupka se efikasno primenjuju kako bi se smanjilo mikrobiološko opterećenje vodenih formulacija, a unutrašnja viskoznost formulacije (razblažene faktorom 25), se poredi iskorišćavanjem I-Visc kapilarnog viskometra (Lauda, kapilarni 0a) i njegovog indeksa refrakcije izmerenog upotrebom HI88713 refraktometra (Hanna) pre i posle postupka (tabela 8). Ta dva postupka su sledeća:

− Autoklav : formulacija se stavi u stakleni špric, a zatim se špric autoklavira prema standardnom postupku (15 minuta na 121 ° C) ;

− Filtracija : zapremina od 300mL formulacije se filtrira upotrebom 0,2µm filtera za poroznost (Preflow capsule filtre, Pall).

[0242] Postupak filtracije pomoću filtera od 0,2µm se odvija na odgovarajući način, sa konstantnim pritiskom od 2 bara i konstantnom brzinom protoka od približno 6 litara na sat.

[0243] Zaključeno je da ta dva postupka imaju uticaj u smislu smanjenja materijala (indeks refrakcije) i razgradnje polimera (unutrašnja viskoznost). Samim tim mogu da se primenjuju industrijski kako bi se dobila medicinska sredstva i farmaceutski proizvodi bazirani na formulacijama karboksimetilhitozana.

Primer – 9 Mogućnost podmazivanja formulacije karboksimetilhitozana gljivičnog porekla, In Vitro [0244] Ovaj primer ima za cilj da ilustruje mogućnost podmazivanja formulacija ta dva karboksimetilhitozana gljivičnog porekla, CC-8 označenog u primeru 3 (2% i 1% ) i CC-19 označenog u primeru 8 (2%), u smislu njihove moguće upotrebe kao intra-artikularnog viskoznog suplementa ili oftalmološke kapi za očnu površinu. Mogućnost podmazivanja se procenjuje upotrebom in vitro modela koji omogućava ocenu smanjenja trenja između dve površine. Formulacija CC-3 (2%) životinjskog porekla označena u primeru 2 i komercijalno dostupnih proizvoda baziranih na hijaluronskoj kiselini su takođe okarakterisane:

- Intra-artikularni viskozni suplementi : Synvisc® (Sanofi) i dva viskozna suplementa bazirana na neumreženoj hijaluronskoj kiselini, HA-2 označenog u primerima 6 i 7) i HA-3.

- Kapi za oči : dva proizvoda bazirana na neumreženoj hijaluronskoj kiselini (HA-4 i HA-5)

[0245] Pored toga, uzorak sinovijalne tečnosti se uzima iz kolena pacijenta koji pati od osteoartroze, pre hirurške operacije stavljanja proteze za koleno. Tečnost se čuva na -20 ° C, zatim se čuva na 25 ° C pre analize koeficijenta trenja.

[0246] Koeficijent trenja je izmeren prema sledećem postupku. Dva diska napravljena od poliakrilatnog biomaterijala koji se koristi za proizvodnju hidrofobnih intraokulanih sočiva (kako je opisano u patentu EP 1830898, prečnika 16,15 mm, su unapred nakvašena uranjanjem u vodu na 60 ° C tokom perioda od približno 2 sata, zatim su fiksirani za gornje i donje geometrije reometra DHR-2 (TA Instruments).

Zapremina od približno 100 µL tečnosti koja bi trebalo da se ispita se stavlja na niži disk, zatim se gornja geometrija spušta između ta dva diska, i primenjuje se normalna sila od 5 njutna. Merenja koeficijenta trenja se izvode na 25 ° C tokom perioda od 150 sekundi, pri konstantnoj normalnoj sili (5 N), frekvenciji oscilacije od 1,256 rad / s i uglom deformacije od približno 0,05 radijana, prema protokolu prilagođenom iz protokola koji su opisali Waller et al. (in : J Rheumatol 39, 7, 1473, 2012). Aktivira se opcija "usklađenost sa nultom tačkom početka oscilatornog pokreta ". Pri svakom merenju, vrednost obrtnog momenta se snima, a zatim se izračunava koeficijent trenja (COF) prema formuli : COF = obrtni momenat / (1/3 x prečnik diska x normalna sila). Za svaku formulaciji, merenje se ponavlja 5 puta. Vrednost koeficijenta trenja je prijavljena ekstrapolacijom odsečka na početku svake COF krive u funkciji vremena (COF0, tabela 7).

[0247] U prisustvu formulacije 2% i 1% karboksimetilhitozana, koeficijent trenja je nizak, iste jačine ili čak manje od komercijalno dostupnih proizvoda za intra-artikulatnu i oftalmološku upotrebu, i značajno slabili od sinovijalne tečnosti kod artitisa, u uslovima merenja. Iz toga je zaključeno da formulacije karboksimetilhitozana imaju potencijal da dejstvuju kao lubrikans smanjenjem trenja između dve površine, na primer površina karlica zgloba posle intra-artikularne injekcije ili površina oka posle instilacije u obliku kapi. Formulacije gljivičnog porekla CC su efikasnije u smanjenju trenja od formulacije životinjskog porekla CC-3.

Primer 10 – Upotreba finih igala za davanje formulacije karboksimetilhitozana gljivičnog porekla intradermalnim putem

[0248] Ovaj primer želi da pokaže da formulacija od 2% karboksimetilhitozana gljivičnog porekla može lako da se ubrizgava u dermis, određenije upotrebom veoma finih igala dizajniranih za ubrizgavanje u slojeve površine dermisa. Ovo ispitivanje se sastoji od merenja sile koja je neophodna da se izbaci proizvod iz šprica opremljenog iglom, pri datoj brzini izbacivanja, pomoću kompresorskog klipa.

Empirijski se smatra da je ubrizgavanje proizvoda lako i prijatno za doktora i pacijenta kada je sila izbacivanja onakva kako je izmereno ovim ispitivanjem manja od 50 njutna, a izbacivanje se izvodi redovno i glatko. Poželjno je da može da se daje proizvod upotrebom igala prečnika manjeg od 0,3mm (30G) kako bi se bol i krvarenje sveli na minimum nakon injekcije kao i naknadni rizik od hematoma i crvenila kože.

[0249] Referentni karboksimetilhitozan CC-20 gljivičnog porekla se proizvodi prema opštem postupku za CC-8 označenog u primeru 3, počevši od “ultra-visokog” hitozana, uz sledeće modifikacije : za 10 g hitozana, koristi se 228 ml izopropanola, 57 ml 40% natrijumhidroksida, i 47 g MCA. Reakcija se izvodi na 35 ° C tokom perioda od 23 sata. Za 15 g intermedijarnog karboksimetilhitozana, koristi se 7,5 ml sirćetnog anhidrida sa svakim dodavanjem, i primenjuju se 3 dodatna ciklusa prečišćavanja pre sušenja i oporavka finalnog karboksimetilhitozana. Karakteristike CC-20 su sledeće : DA 53% i DS 85% (određeni NMR ugljenika 13), rastvorljiv u vodi pri bilo kojoj pH (prema ove prethodno opisanom postupku), čime se obrazuje neopalescentni rastvor, sa zeta potencijalom pri pH 7,5 koji je ocenjen na -24 mV (od polinomijalne regresije krive zeta potencijala u funkciji DS).

[0250] Pripremi se 2% (m / m) CC-20 formulacija kako je opisano u primeru 3. Formulacija se pakuje u stakleni špric od 1 ml (BD-Medical) na koji se postavlja igla. Pomoću MultiTest 2,5-i kompresorskog klipa (Mecmesin) opremljenog sa 100N kompresorskom ćelijom, sila potrebna za izbacivanje proizvoda se meri primenom konstantne brzine izbacivanja od 80mm / min. Maksimalna sila koju podnosi oprema je približno 70 njutna. Sledeće igle su ispitane : 30G, 32G, 33G i Invisible Needle<TM>(TSK Laboratory), pri čemu su njihove dimenzije (spoljašnji prečnik x dužina) prijavljene u tabeli 10.

[0251] Radi poređenja, komercijalno dostupni proizvodi bazirani na neumreženoj hijaluronskoj kiselini (reference HA-6, HA-7) i umreženoj hijaluronskoj kiselini (HA-8), označeni za podmlađivanje kože intradermalnim putem, su procenjeni prema istom postupku, u njihovom originalnom špricu. Rezultati su prijavljeni u tabeli 10.

Primer 11 – Formulacije niske koncentracije karboksimetilhitozana gljivičnog porekla za indikaciju u obliku kapi za oči

[0252] Ovim primerom se želi pokazati da rastvor niske koncentracije karboksimetilhitozana gljivičnog porekla može da se primeni u pripremi oftalmoloških kapi namenjenih za upotrebu smanjenja simptoma poremećaja očne površine ili za zaštitu iste. Pored fizioloških karakteristika, poželjno pH oko 7,2 i osmolaliteta od oko 200 mOsm / kg, oftalmološke kapi bi poželjno trebalo da imaju sledeća fizičkohemijska svojstva : nizak indeks refrakcije (blizu 1,33) i mogućnost da se na minimum svede trenje između očne površine i vežnjače i očnih kapaka (mogućnost podmazivanja). Konačno, njegov reološki profil je takav da taj proizvod nije previše tečan da bi mogao da se stavi u oko, već je takav da može homogeno da se širi i lepljiv je. Njegov reološki profil bi takođe trebalo da bude takav da su treptaji kapaka laki, bez nakupljanja, odnosno niske viskoznosti pri visokoj brzini obrtaja. Određenije, Orobia et al. smatraju da je viskoznost tokom pomeranja oka (isključujući treptaje očnih kapaka) poželjno veća od 10 mPa.s, na primer oko 20 mPa.s (u : Clinical Ophthalmology 12, 453, 2018). Trebalo bi imati na umu da je vrednost viskoznosti podložna variranju u skladu sa postupkom merenja, a određenije opremom, režimom merenja i parametrima, temperaturom i brzinom smicanja koji se primenjuju na proizvod koji se ispituje.

[0253] Referentni karboksimetilhitozan CC-21 gljivičnog porekla se proizvodi prema istom postupku kao CC-20 označen u primeru 10. Upoređene su molekulske strukture CC-20 i CC-21 u kiselom obliku, pomoću Fourrier infracrvene transformacione spektrometrije pomoću spektrometra Nicolet iS5 opremljenog sa ID7-ATR (Thermo Scientifics), prema postupku koji su opisali Chen et al. (Carbohydrate Polymers 53, 355, 2003). Određeno je da su njihove molekulske strukture 99% identične u oblasti talasne dužine od 1200 do 1800 cm<-1>, a kao posledica toga njihove DA i DS su slične.

Pripremljene su dve formulacije karboksimetilhitozana CC-21, koncentracija od 0,7% i 0,4% (m / m), u fosfatnom puferu sa glicerolom. pH je podešena do 7,2 ± 0,2 a osmolalitet do 200 ± 20 mOsm / kg, i zatim su formulacije filtrirane, nakon čega su njihova mogućnost podmazivanja i njihov profil viskoznosti okarakterisani prema postupcima opisanim u nastavku. Hijaluronska kiselina (HA) bazirana na oftalmološkim kapima varijabilne kompozicije, je okarakterisana prema istim postupcima (HA-5 do HA-9). Rezultati su prijavljeni u tabeli 11b.

Postupak za merenje koeficijenta trenja (pogodan za oftalmološke kapi)

4

[0254] Mogućnost podmazivanja, odnosno smanjenja trenja između dve površine koje su u kontaktu, je procenjena merenjem koeficijenta trenja između dva diska napravljena od poliakrilatnog biomaterijala koji je identičan onim označenim u primeru 9. Ta dva diska su fiksirana za gornje i donje geometrije DHR-2 reometra (TA Instruments), pri čemu se proizvod zapremine od približno 100 μL koji bi trebalo da se ispita stavlja na donji disk a zatim se gornja geometrija spušta dok ne dođe do kontakta između ta dva diska, pri primeni normalne sile od 5 njutna. Merenje koeficijenta trenja se izvodi na 25 ° C tokom perioda od 60 sekundi, pri konstantnoj normalnoj sili (5 N), frekvenciji oscilacije od 6 rad / s i uglom deformacije od približno 1,71 radijana, prema protokolu preuzetom od Waller et al. (J Rheumatol 39, 7, 1473, 2012) i parametrima koji imitiraju kinematske uslove treptaja očnih kapaka koje su opisali Kwon et al. (J Royal Society Interface 10, 2, 2013). Aktivira se opcija "usklađenost sa nultom tačkom početka oscilatornog pokreta ". Pri svakoj tački merenja, vrednost obrtnog momenta se snima, a zatim se izračunava koeficijent trenja (COF) prema formuli : COF = obrtni momenat / (1/3 x prečnik disk x normalna sila). Srednja vrednost COF se određuje između 0 i 60 s. Srednji koeficijent trenja kao i standardna devijacija 5 uzastopnih merenja su izračunati na taj način. Minimalna vrednost COF je 52 u slučaju gde dve površine nisu u kontaktu. Gornja granica COF odgovara slučaju u kojem ta dva diska više nisu u pokretu u odnosu jedan na drugi.

[0255] Imajući u vidu da COF vrednost varira od jedne serije do druge, neophodno je da se okarakterišu proizvodi koji se porede u istoj datoj seriji, upotrebom istih diskova nasumičnim redom. Lestvica relativnih rezultata se zatim koristi kako bi se klasifikovali proizvodi koji bi trebalo da se ispitaju u istoj seriji, od najefikasnijeg (rezultat 1) do najmanje efikasnog (rezultat 3), prema kriterijumima iz tabele 11a. Ograničenja “COFA” i “COFB” su identifikovana COF dvaju komercijalno dostupnih oftalmoloških kapi uzetih kao referenca za svaku seriju : kapi A (koje se sastoje od 0,15% HA i 0,25% karbomera) i kapi B (0,15% HA). Prema ovoj lestvici, poželjno je da rezultat smanjenja trenja bude 1 ili 2, a poželjno 1, za upotrebu kao kapi za podmazivanja za podmazivanje očne površine. Za proizvode sa rezultatom od 3, mogućnost podmazivanja nije zadovoljavajuća a varijacija u merenju je značajna.

Postupci merenja viskoznosti u funkciji smicanja

[0256] Simmons et al. su odredili da je brzina smicanja tokom pokreta otvorenog oka 10s<-1>a da je brzina smicanja tokom žmirkanja očnog kapka oko 10000s<-1>(in : Clinical Ophthalmology 11, 1637, 2017).

Postupak reometrijskog merenja je izabran prema opsegu brzina smicanja koje bi trebalo izučiti, i uzimajući u obzir da ti proizvodi predstavljaju tečne rastvore niske viskoznosti :

- Opseg smicanja koji odgovara pomeranju oka. Viskoznost se meri u rotacionom režimu rada pomoću testa pomeranja protoka uz pomoć DHR-2 reometra sa kontrolisanim naprezanjem (TA Instruments) koji je opremljen sa Peltier pločom i geometrijom “konusa” prečnika od 60 mm i ugla odvajanja od 2°. Proizvod se ekvilibriše tokom 1 minuta na 37 ° C, pri čemu temperaturu kontroliše Peltier. Kako bi se izbeglo isparavanje, sistem je opremljen sa zamkom za rastvarač i metalnim poklopcem. Zatim se započinje sa testom pomeranja protoka i viskoznost se meri kao funkcija brzine smicanja, od 0,001s<-1 do>100s<-1>. Prijavljena je vrednost viskoznosti na 10 s<-1>. - Opseg smicanja koji odgovara treptaju očnih kapaka. Viskoznost se meri u rotacionom režimu rada uz test pomeranja protoka pomoću DHR-2 reometra kontrolisanog naprezanja (TA Instruments) opremljenog sa “meračem viskoznosti sa dvostrukom prazninom (cilindričnog)” geometrijom i Peltier koncentričnim cilindrom, i opremljenim sa zamkom za rastvarač i metalnim poklopcem. Proizvod se ekvilibriše tokom 1 minuta do 37 ° C, a zatim se primenjuje varijabilna brzina smicanja koja varira od 0,001 s<-1 do>10000 s<-1>. Vrednost viskoznosti pri 10000s<-1>se na taj način poredi sa vrednošću pri 10s<-1>.

Claims (22)

1. [0257] Rezultati potvrđuju da dve formulacije karboksimetilhitozana CC-21 gljivičnog porekla zadovoljavaju tehničke specifikacije za oftalmološke kapi : imaju nizak indeks refrakcije, zadovoljavajući koeficijent trenja (rezultat 1, odnosno efikasan kao kod većine komercijalno dostupnih kapi za podmazivanje), viskoznost od 10 do 30 mPa.s u uslovima pomeranja oka i nisku viskoznost prilikom treptaja očnih kapaka. Bez karboksimetilhitozana, fosfatni pufer sa dodatim glicerolom ne obezbeđuje sredstva koja zadovoljavaju tehničke specifikacije za oftalmološke kapi. Na kraju, zabeleženo je da viskoznost može biti snižena smanjenjem koncentracije karboksimetilhitozana (na primer sa 0,7 na 0,4%) bez neželjenog izmenjivanja mogućnosti da se umanji trenje (rezultat 1).

   Patentni zahtevi

   1. Karboksialkilhitozan sa glukozaminskim jedinicama, N-acetil-glukozaminskim jedinicama i glukozaminskim jedincima supstituisanim karboksialkilnom grupom, pri čemu pomenuti karboksialkilhitozan ima zeta potencijal, izmeren pri pH 7,5, koji je niži od ili jednak -18 mV, pri čemu karboksialkilhitozan ima stepen acetilacije između 40% i 80%, izražen u broju molova N-acetilglukozaminskih jedinica u odnosu na broj molova ukupnih jedinica, i sa stepenom supstitucije karboksialkilnom grupom većom od 50%, izraženom kao broj molova supstituenta u odnosu na broj molova ukupnih jedinica.
2. 2. Karboksialkilhitozan prema zahtevu 1, naznačen time, što pomenuti karboksialkilhitozan ima zeta potencijal, izmeren pri pH 7,5, koji je manji od ili jednak -20 mV, poželjno manji od ili jednak -22 mV.
3. 3. Karboksialkilhitozan hitozan prema zahtevu 1 ili 2, pri čemu pomenuti karboksialkilhitozan ima stepen supstitucije karboksialkilnom grupom veći od 70%, na primer manji od 200%, izražen kao broj molova supstituenta u odnosu na broj molova ukupnih jedinica.
4. 4. Karboksialkilhitozan prema bilo kom od zahteva 1 do 3, naznačen time, što je hitozan dobijen iz micelijuma gljive tipa Ascomycetes, a određenije iz Aspergillus niger, i/ili iz gljive Basidiomycetes, a određenije Lentinula edodes (šitake) i/ili Agaricus bisporus (šampinjon). Poželjno, hitozan je dobijen iz Agaricus bisporus.
5. 5. Karboksialkilhitozan prema bilo kom od zahteva 1 do 4, naznačen time, što karboksialkilhitozan predstavlja N-karboksilisan i O-karboksilisan hitozan.

   4
6. 6. Karboksialkilhitozan prema bilo kom od zahteva 1 do 5, naznačen time, što je karboksialkilhitozan ponovo acetilisan.
7. 7. Karboksialkilhitozan prema bilo kom od zahteva 1 do 6, naznačen time, što je sterilisan.
8. 8. Kompozicija naznačena time, što obuhvata najmanje jedan karboksialkilhitozan definisan prema bilo kom od zahteva 1 do 7.
9. 9. Kompozicija prema zahtevu 8, naznačena time, što ta kompozicija takođe obuhvata bipolimer koji nije karboksialkilhitozan.
10. 10. Kompozicija prema zahtevu 9, naznačena time, što je taj biopolimer polisaharid , oksidiran ili neoksidiran, umrežen ili neumrežen kovalentnim vezama.
11. 11. Kompozicija prema zahtevu 9, naznačena time, što je taj biopolimer hijaluronska kiselina ili natrijumhijaluronat, umrežen ili neumrežen kovalentnim vezama.
12. 12. Injektabilna kompozicija naznačena time, što obuhvata najmanje jedan karboksialkilhitozan definisan prema bilo kom od zahteva 1 do 7.
13. 13. Farmaceutska kompozicija, naznačena time, što obuhvata najmanje jedan karboksialkilhitozan definisan prema bilo kom od zahteva 1 do 7.
14. 14. Kompozicija prema zahtevu 12 ili 13, naznačena time, što ta kompozicija takođe obuhvata bipolimer koji nije karboksialkilhitozan.
15. 15. Kompozicija prema zahtevu 14, naznačena time, što je taj biopolimer polisaharid , oksidiran ili neoksidiran, umrežen ili neumrežen kovalentnim vezama.
16. 16. Kompozicija prema zahtevu 14, naznačena time, što je taj biopolimer hijaluronska kiselina ili natrijumhijaluronat, umrežen ili neumrežen kovalentnim vezama.
17. 17. Kompozicija prema bilo kom od zahteva 12 do 16, naznačena time, što se ta kompozicija koristi kao farmaceutska kompozicija koja je injektabilna, implantabilna ili pogodna za instilaciju, ili medicinsko sredstvo koje je injektabilno, implantabilno ili pogodno za instilaciju.
18. 18. Kompozicija prema zahtevu 17, za upotrebu u postupku terapijskog lečenja, na primer koje obuhvata instilaciju ili ubrizgavanje pomenute kompozicije subkutanim, intradermalnim, okularnim, intraokularnim, ili intra-artikularnim putem, na primer za popravku ili ispunjavanje najmanje jednog telesnog tkiva kojem je potrebna popravka ili ispunjavanje.
19. 19. Kompozicija prema zahtevu 18, naznačena time, što je to telesno tkivo izabrano od tkiva koja pripadaju glasnim žicama, mišićima, ligamentima, tetivama, hrskavicama, reproduktivnim organima, kostima, zglobovima, očima, koži, ili bilo kojoj njihovoj kombinaciji, a naročito zglobovima.
20. 20. Kompozicija prema zahtevu 18 ili 19, za upotrebu u postupku lečenja artroze, ili za popravku oštećenja hrskavice, na primer ubrizgavanjem u sinovijalnu tečnost ili nakon mešanja sa krvlju i instilacije u hrskavicu.
21. 21. Medicinsko sredstvo, na primer medicinski implant, naznačeno time, što obuhvata ili se sastoji od kompozicije kakva je definisana u bilo kom od zahteva 8 do 20.
22. 22. Postupak pripreme kompozicije koja obuhvata karboksialkilhitozan definisan prema bilo kom od zahteva 8 do 20, pri čemu pomenuti postupak uključuje:

    - rastvaranje karboksialkilhitozana definisanog prema bilo kom od zahteva 1 do 9 u vodenom rastvoru, poželjno vodi, opciono puferisanoj, poželjno sa pH između 6,2 i 8,5, a poželjno između 6,5 i 7,5;

    - opciono podešavanje pH na željenu pH, generalno na fiziološku pH za ciljanu primenu, na primer dodavanjem pufera, baze ili kiseline;

    - opciono dodavanje drugih ekscipijenasa, kao što je na primer redukujući šećer, na primer sorbitol ili manitol;

    - opciono podešavanje osmolaliteta kompozicije.

    Izdaje i štampa: Zavod za intelektualnu svojinu, Beograd, Kneginje Ljubice 5

    4