RS60371B1 - Sastavi i postupci za ekspanziju i kultivisanje epitelnih matičnih ćelija - Google Patents

Description

Opis

UPUĆIVANJE NA POVEZANE PATENTNE PRIJAVE

[0001] Predmetna patentna prijava zahteva prema čl.35 U.S.C. § 119(e) beneficije privremene patentne prijave SAD br.61/783,245, podneto 14. marta 2013. godine.

PODRŠKA VLADE

[0002] Ovaj rad je podržao Nacionalni institut za stomatološka i kraniofacijalna istraživanja br. DE013023. Vlada može imati određena prava na pronalazak.

POZADINA PRONALASKA

[0003] Jedan sloj epitelnih ćelija koji se aktivno samoobnavlja i organizovan je u kripte i resice koje oblažu crevo. Nedavno je pokazano da obnavljanje crevnog epitela pokreću Lgr5+ crevne matične ćelije (ISC) koje se nalaze u osnovi ovih kripti (Barker i dr., 2007). Matične ćelije Lgr5+ mogu se izolovati i uzgajati in vitro kako bi se formirali organoidi koji sadrže kripto-resne strukture koje rekapituliraju izvorni crevni epitel (Sato i dr., 2009). Iako se ove matične ćelije mogu proširiti za više prolaza u obliku organoida, postojeći uslovi kulture omogućavaju malo ili nikakvu kontrolu nad samoobnavljanjem i diferencijacijom. Tipične kulture sastoje se od heterogene ćelijske populacije, uključujući matične ćelije i diferencirane ćelije (Sato i dr., 2009). Konkretno, samo obnavljanje i proliferacija matičnih ćelija Lgr5+, in vitro i in vivo, zavise od direktnog ćelijskog kontakta između Lgr5+ matičnih ćelija i drugog tipa kripti poznatog pod nazivom Panetove ćelije (Snippert i dr., 2010), što značajno komplikuje i ograničava mogućnost kontrole sudbine Lgr5+ matičnih ćelija u kulturi.

Nemogućnost efikasnog proširivanja Lgr5+ matičnih ćelija značajno ograničava prevođenje ove biologije na terapije, gde su homogene kulture matičnih ćelija i efikasni procesi povećavanja neophodni pre transplantacije. Štaviše, ostaje potreba za razvijanjem poboljšanih, klinički orijentisanih sistema za transplantaciju epitelnog tkiva ex vivo u oštećene organe primaoca.

REZIME PRONALASKA

[0004] Pronalazak obezbeđuje kombinaciju Wnt agonista i inhibitora histon deacetilaze (HDAC) za upotrebu kako je definisano u patentnom zahtevu 1. U jednom aspektu, obelodanjivanje pruža rešenja za ćelijsku kulturu.

[0005] U jednom primeru, obelodanjivanje obezbeđuje rastvor ćelijske kulture koji sadrži inhibitor koštanog morfogenog proteina, inhibitor glikogen sintaze kinaze-3 beta, sredstvo koje se vezuje za receptor 5 vezanog G-proteinom bogatim leucinom, i inhibitor histon deacetilaze. U jednom otelotvorenju, inhibitor glikogen sintaze kinaze-3 beta može biti CHIR99021, sredstvo koje se vezuje za receptor 5 vezanog leucinom, koji sadrži G-protein, može biti R-spondin 1, a inhibitor HDAC može biti Valproinska kiselina.

[0006] U drugom primeru, obelodanjivanje obezbeđuje rastvor ćelijske kulture koji sadrži inhibitor koštanog morfogenog proteina, najmanje oko 3 uM CHIR99021 i inhibitor histon deacetilaze.

[0007] U još jednom primeru, obelodanjivanje obezbeđuje rastvor ćelijske kulture koji sadrži inhibitor koštanog morfogenog proteina, sredstva koje se vezuje za protein bogat leucinom, vezan na G-protein 5, receptor 5, Wnt agonist i inhibitor HDAC6.

[0008] U još jednom otelotvorenju, obelodanjivanje obezbeđuje rastvor ćelijske kulture koji sadrži inhibitor koštanog morfogenog proteina, R-spondin 1, litijum hlorid i inhibitor histon deacetilaze.

[0009] U otelotvorenjima, inhibitor histon deacetilaze je Pan-HDAC inhibitor. Pan-HDAC inhibitor može biti izabran iz grupe koja se sastoji iz Valproinske kiseline, trihostatina A, suberoilanilalid hidroksamske kiseline i suberohidroksaminske kiseline (SBHA).

[0010] U još jednom primeru, obelodanjivanje daje inhibitor histon deacetilaze koji je inhibitor HDAC6. Inhibitor HDAC6 može biti izabran iz grupe koju čine Tubacin, Tubastatin A i Jedinjenje 7.

[0011] U još jednom primeru, obelodanjivanje obezbeđuje inhibitor koštanog morfogenog proteina koji može biti izabran iz grupe koja se sastoji iz Noggin, Chordin, Follistatin, DAN, proteina koji sadrže DAN domen cistein-čvora, Sclerostin, zakrivljenu gastrulaciju, gen-1 povezan sa osetljivošću materice, faktor rasta vezivnog tkiva, inhibin, BMP-3 i Dorsomorfin.

[0012] U još jednom primeru, obelodanjivanje obezbeđuje inhibitor glikogen sintaze kinaze-3 beta koji može biti izabran iz grupe koja se sastoji iz CHIR99021, LiCl, BIO-acetoksim, CHIR98014, SB 216763, SB 415286, 3F8, Kenpaullone, 1-Azakenpaullone, TC-G 24, TCS 2002, AR-A 014418, TCS 21311, TWS 119, BIO-acetoksim, 1 OZ-Himenialdizin, GSK-3 Inhibitor II, GSK-3 Inhibitor I, GSK-3 Inhibitor XXVII, GSK-3 Inhibitor XXVI, FRATtid peptid, Cdkl/5 Inhibitor i Bikinin.

[0013] U još jednom primeru, obelodanjivanje obezbeđuje sredstvo koje se vezuje za receptor 5 vezan na leucinom koji sadrži G-protein 5 koji može biti izabran iz grupe koja sadrži R-spondin 1, R-spondin 2, R-spondin 3 i R-spondin 4.

[0014] U još jednom primeru, obelodanjivanje pruža Wnt agonist koji se može izabrati iz grupe koja se sastoji iz: Wnt-1/Int-1, Wnt-2/Irp (protein povezan sa Int), Wnt-2b/13, Wnt-3/Int-4, Wnt-3a, Wnt-4, Wnt-5a, Wnt-5b, Wnt-6, Wnt-7a, Wnt-7b, Wnt-8a/8d, Wnt-8b, Wnt-9a/14, Wnt- 9b/14b/15, Wnt-10a, Wnt-10b/12, Wnt-11, Wnt-16, R-spondin 1, R-spondin 2, R-spondin 3, R- spondin 4, Norrin, CHIR99021, LiCl, BIO ((2'Z,3'E)-6-Bromoindirubin-3'-oksim), CHIR98014, SB 216763, SB 415286, 3F8, Kenpaullone, 1-Azakenpaullone, TC-G 24, TCS 2002, AR-A 014418, 2- amino-4-[3,4-(metilendioksi)benzil-amino]-6-(3-metoksifenil)pirimidin, IQ 1, DCA, QS 11, WAY-316606, (hetero)arilpirimidini, 1 OZ-Hymenialdisine, TCS 21311, TWS 119, GSK-3 Inhibitor IX, GSK-3 Inhibitor IV, GSK-3 Inhibitor II, GSK-3 Inhibitor I, GSK-3 Inhibitor XXVII, GSK- 3beta Inhibitor XXVI, FRATtid, Cdkl/5 Inhibitor, Bikinin, i 1-Azakenpaullone.

[0015] U još jednom primeru, obelodanjivanje obezbeđuje rastvor ćelijske kulture koji sadrži Noggin, R-spondin 1, CHIR99021 i Atohl inhibitor. Inhibitor Atohl može biti inhibicijska nukleinska kiselina.

[0016] U još jednom primeru, obelodanjivanje obezbeđuje rastvor ćelijske kulture koji dalje sadrži faktor rasta epidermalnog rasta i/ili Notch agonist. Notch agonist može biti izabran iz grupe koja se sastoji od Notchl antitela (N1 Ab), Delta 1, Delta-nalik 3, Delta- nalik 4, Jagged 1, Jagged 2, DSL peptida i Delta D.

[0017] U još jednom primeru, obelodanjivanje pruža između oko 5 do oko 500 ng/ml EGF-a, oko 5 do oko 500 ng/ml Noggin, oko 50 do oko 1000 ng/ml R-spondina, oko 0.1 do oko 10 uM CHIR99021 i oko 0.1 do oko 5 mM valproinske kiseline.

[0018] U još jednom aspektu, obelodanjivanje obezbeđuje sisteme ćelijske kulture koji sadrže rešenja ćelijske kulture predmetnog obelodanjivanja.

[0019] U jednom primeru, obelodanjivanje pruža sistem ćelijske kulture koji sadrži:

i) epitelnu matičnu ćeliju ili epitelnu ćeliju prethodnika ili populaciju epitelnih matičnih ćelija ili epitelnih ćelija prethodnika;

ii) R-spondin 1;

iii) CHIR99021 ;

iv) inhibitor histon deacetilaze; i

v) opciono inhibitor koštanog morfogenog proteina.

[0020] U drugom primeru, pronalazak obezbeđuje sistem ćelijske kulture koji sadrži:

i) epitelnu matičnu ćeliju ili epitelnu ćeliju prethodnika ili populaciju epitelnih matičnih ćelija ili epitelnih ćelija prethodnika;

ii) R-spondin 1;

iii) CHIR99021 ;

iv) Atohl inhibitor; i

v) opciono inhibitor koštanog morfogenog proteina.

[0021] U još jednom primeru, obelodanjivanje obezbeđuje sistem ćelijske kulture koji sadrži:

i) epitelnu matičnu ćeliju ili epitelnu ćeliju prethodnika ili populaciju epitelnih matičnih ćelija ili epitelnih ćelija prethodnika;

ii) R-spondin 1;

iii) litijum hlorid;

iv) inhibitor histon deacetilaze; i

v) opciono inhibitor koštanog morfogenog proteina.

[0022] U još jednom primeru, obelodanjivanje obezbeđuje sistem ćelijske kulture koji sadrži:

i) epitelnu matičnu ćeliju ili epitelnu ćeliju prethodnika ili populaciju epitelnih matičnih ćelija ili epitelnih ćelija prethodnika;

ii) R-spondin 1;

iii) Wnt Agonist;

iv) HDAC6 inhibitor; i

v) opciono inhibitor koštanog morfogenog proteina.

[0023] U još jednom primeru, ćelijski kulturi predmetnog obelodanjivanja sadrže epitelne matične ćelije i populacije matičnih ćelija epitela koje mogu sadržati LGR5 pozitivne matične ćelije.

[0024] U još jednom primeru, populacija epitelnih matičnih ćelija ili epitelnih ćelija potomka u sistemu ćelijskih kultura pronalazak sadrži najmanje 30%, 85%, 90%, 95% ili 99% ćelija u sistemu.

[0025] U još jednom primeru, obelodanjivanje obezbeđuje sistem ćelijske kulture koji sadrži:

i) tumorski organoid;

ii) sredstvo koje se vezuje za receptor 5 koji je bogat Leucinom pridružen ponavljajućem G-proteinu;

iii) Wnt Agonist;

iv) inhibitor histon deacetilaze ili inhibitor Atohl; i

v) opciono inhibitor koštanog morfogenog proteina.

[0026] U još jednom primeru, obelodanjivanje obezbeđuje sistem ćelijske kulture koji sadrži bazu submukoze, prekrivajući sloj koji sadrži kolagen i ćelijski sloj koji sadrži bilo koji član grupe koji se sastoji od matičnih ćelija epitela, izolovano tkivo koje sadrži epitelne matične ćelije i/ili epitelne organoidi. Prevlaka koja sadrži kolagen može da se nalazi iznad ili u okruženju epitelnih matičnih ćelija, izolovanog tkiva koje sadrži epitelne matične ćelije ili epitelnih organoida. Prevlaka koja sadrži kolagen može takođe biti između SIS baze i epitelnih matičnih ćelija, izolovanog tkiva koje sadrži epitelne matične ćelije ili epitelnih organoida. Baza submukoze može da sadrži SIS i može dalje da sadrži faktor rasta epidermalnog rasta, morfogeni protein kosti, sredstvo koje se vezuje za receptor 5 vezanog leucinom koji sadrži G-protein 5, Wnt Agonist, Y-27632 i histonsku deacetilazu inhibitor. Ovaj sistem ćelijske kulture može nadalje da sadrži rastvorne ćelijske kulture pronalaska, uključujući rastvor koji sadrži inhibitor koštanog morfogenog proteina, sredstvo koje se vezuje za receptor 5 vezanog leucinom koji sadrži G-protein, Wnt Agonist, Y-2763 i inhibitor histon deacetilaze.

[0027] U još jednom primeru, obelodanjivanje obezbeđuje sistem ćelijske kulture koji sadrži bazu submukoze i matične ćelije epitela, izolovano tkivo koje sadrži epitelne matične ćelije ili epitelne organoide, pri čemu baza submukoze sadrži epidermalni faktor rasta, koštani morfogeni protein, R-spondin 1, CHIR99021, Y-27632 i inhibitor histon deacetilaze. Ovaj sistem ćelijske kulture može nadalje da sadrži rastvor koji sadrži faktor rasta epidermalnog rasta, inhibitor koštanog morfogenog proteina, R-spondin 1, CHIR99021, Y-27632 i inhibitor histon deacetilaze.

[0028] U još jednom aspektu, obelodanjivanje pruža postupke formiranja epitelnih organoida iz izolovanih matičnih ćelija epitela.

[0029] U jednom aspektu, obelodanjivanje obezbeđuje postupak formiranja epitelnih organoida iz izolovanih matičnih ćelija visoke epitela, pri čemu navedeni postupak sadrži korake:

i) inkubiranje izolovanih matičnih ćelija epitela u prisustvu Noggin, R-spondin 1, CHIR99021 i inhibitora histon deacetilaze; i

ii) formiranje epitelnih organoida iz navedenih izolovanih matičnih ćelija epitela, pri čemu najmanje oko 25%, 40%, 50%, 75%, 90%, izolovanih epitelnih matičnih ćelija formiraju epitelne organoide.

[0030] U drugom aspektu, obelodanjivanje obezbeđuje postupak formiranja epitelnih organoida iz jedne izolovane matične ćelije visoke efikasnosti, pri čemu navedeni postupak sadrži korake:

i) inkubiranje pomenute izolovane matične ćelije epitela u prisustvu Noggin, R-spondin 1, CHIR99021 i inhibitora histon deacetilaze; i

ii) formiranje epitelnih organoida iz navedene izolovane matične ćelije epitela, pri čemu najmanje oko 6% pojedinačnih izolovanih epitelnih ćelija formiraju epitelne organoide.

[0031] U još jednom aspektu, obelodanjivanje pruža postupak za određivanje efikasnosti hemoterapeutskog sredstva u odnosu na tumor organoid, pri čemu navedeni postupak sadrži korake:

i) inkubiranje tumora organoida u prisustvu inhibitora koštanog morfogenog proteina, R-spondina 1, Wnt agonista, inhibitora histon deacetilaze i hemoterapeutskog sredstva; i ii) merenje parametra izabranog iz grupe koja se sastoji od inhibicije ćelijske vitalnosti, inhibicije ćelijske proliferacije, inhibicije ekspresije gena povezanih sa tumorima, aktiviranja apoptoze i inhibicije ćelijskog preživljavanja,

pri čemu detekcija povećanja parametra ukazuje na efikasnost hemoterapeutskog sredstva u odnosu na tumor organoid.

[0032] U još jednom aspektu, obelodanjivanje obezbeđuje postupak formiranja Panetovih ćelija u sistemu ćelijske kulture koji sadrži inkubiranje epitelne matične ćelije u prisustvu najmanje jednog Wnt agonista i najmanje jednog Notch inhibitora, svaki u količini dovoljnoj za proizvodnju Panetovih ćelija.

[0033] U jednom aspektu, epitelna matična ćelija može se dalje inkubirati u prisustvu najmanje jednog inhibitora koštanog morfogenog proteina.

[0034] U drugom primeru, Notch inhibitor je DAPT.

[0035] U još jednom primeru matična ćelija epitela je pozitivna LGR5 matična ćelija.

[0036] U još jednom aspektu, obelodanjivanje obezbeđuje postupak formiranja enterocita u sistemu ćelijske kulture koji sadrži inkubiranje epitelne matične ćelije u prisustvu najmanje jednog inhibitora Wnt i bar jednog inhibitora histon deacetilaze, svaki u količini dovoljnoj da se proizvede enterocita u sistemu ćelijske kulture. Matične ćelije epitela mogu se dalje inkubirati u prisustvu faktora rasta epiderme i/ili inhibitora koštanog morfogenog proteina.

[0037] U jednom aspektu, Wnt inhibitor može biti izabran iz grupe koju čine IWP- 2, XAV-939, ICG-001, LGK-974, IWR-1 -endo, KY02111, Wnt-C59, DKK-1, FH-535, Box5, Peptid Pen-N3, Anti-SFRP antitelo i Anti-LRP6 antitelo.

[0038] U još jednom aspektu, obelodanjivanje obezbeđuje postupak formiranja peharaste ćelije u sistemu ćelijske kulture koji sadrži inkubiranje epitelne matične ćelije u prisustvu najmanje jednog inhibitora Wnt i bar jednog Notch inhibitora, svaki u količini dovoljnoj da se proizvede peharasta ćelija u sistemu ćelijske kulture. Matična ćelija epitela može se dalje inkubirati u prisustvu faktora rasta epiderme.

[0039] U jednom primeru, Notch inhibitor može biti izabran iz grupe koju čine DAPT, RO4929097, LY450139, LY900009, LY3039478, LY411575, YO-01027, BMS-708163, BMS-906024, Jedinjenje E, BMS-299897, SAHM1, Abeta42-Selective i SB 225002.

[0040] U još jednom aspektu, obelodanjivanje obezbeđuje postupak formiranja enteroendokrine ćelije u sistemu kulture koji sadrži inkubiranje epitelne matične ćelije u prisustvu najmanje jednog Notch inhibitora i sredstva koja inhibira bar jednu od receptora tirozin kinaze, a Kitoza aktivirana mitogenom (MAP) kinaza ili kinaza regulisana vanćelijskom signalom (ERK), svaka u količini dovoljnoj za proizvodnju enteroendokrine ćelije u sistemu ćelijske kulture. Matična ćelija epitela može se dalje inkubirati u prisustvu faktora rasta epiderme, sredstva koje se vezuje za receptor 5 vezanog leucinom, koji sadrži G-protein, i/ili inhibitor koštanog morfogenog proteina. MAP kinaza može biti Mitogenaktivirana protein kinaza (MEK).

[0041] U jednom primeru, sredstvo koje inhibira MAP kinazu može biti izabrano iz grupe koja se sastoji iz AS-703026, PD0325901, PD98059, Selumetinib, SL-327, U0126, TAK-733 i Trametinib.

[0042] U drugom primeru, sredstvo koje inhibira RTK može biti izabrano iz grupe koja se sastoji iz Gefitinib, AG 99, Erlotinib, Afatinib, Lapatinib, WZ4002 i AG-18.

[0043] U još jednom otelotvorenju, sredstvo koje inhibira ERK može biti AS-703026 ili PD0325901.

[0044] U još jednom aspektu, obelodanjivanje obezbeđuje postupak formiranja ćelija crevnog epitela kod ispitanika kome je to potrebno, koji obuhvata primenu na ispitaniku Wnt agonista i inhibitora histon deacetilaze u količini dovoljnoj da formira ćelije crevnih epitela kod ispitanika. Wnt agonist može biti CHIR99021, a inhibitor histon deacetilaze može biti Valproinska kiselina. CHIR99021 se može davati u količini od oko 0.1 mg/kg/dan do oko 100 mg/kg/dan, a Valproinska kiselina može biti davana u količini od oko 1 mg/kg/dan do oko 1000 mg/kg/dan.

[0045] U još jednom aspektu, obelodanjivanje obezbeđuje postupak formiranja ćelija crevnog epitela kod subjekta kome je to potrebno, koji obuhvata primenu kod ispitanika Wnt agonista i Notch agonista u količini dovoljnoj da formira ćelije crevnih epitela kod ispitanika.

[0046] U još jednom aspektu, obelodanjivanje obezbeđuje postupak lečenja crevnog poremećaja, postupak koji uključuje davanje subjektu Wnt agonista i inhibitora histon deacetilaze ili Wnt agonista i Notch agonista. U nekim otelotvorenjima, crevni poremećaj je izabran iz grupe koja se sastoji iz: enterokolitisa; virusne infekcije, poput nespecifičnog enteritisa ili specifičnog virusnog enteritisa; divertikulitisa; bakterijskog enterokolitisa, kao što je salmoneloza, šigeloza, Campylobacter enterokolitis ili yersinia enterokolitis; protozojske infekcije poput amebijeze; helmitinska infekcija; pseudo-membranski kolitis i plućne komplikacije kod cistične fibroze i hronične opstruktivne plućne bolesti; upala slepog creva; atrofični gastritis; Barrettov jednjak; pneumonitis; upala grlića materice; hronični intersticijski nefritis; kolitis; kolonski divertikulitis; konjunktivitis; kontaktni dermatitis; Kurlingovi čirevi; Kušingovi čirevi; cistitis; gangrena; gingivitis; mastitis; ezofagitis; pankreatitis; panikulitis; flegmonousni gastritis; glomerulonefritis; i autoimune bolesti koje uključuju, ali nisu ograničene na, upalne bolesti creva, ulcerozni kolitis, Kronova bolest, Adisonova bolest i glomerulonefritis (npr., polumesečni glomerulonefritis, proliferativni glomerulonefritis).

[0047] Ostale karakteristike i prednosti pronalaska biće vidljive iz sledećeg detaljnog opisa i slika i iz patentnih zahteva.

KRATAK OPIS SLIKA

[0048] Sledeći detaljan opis, dat pomoću primera, ali nije namenjen ograničavanju pronalaska na opisana specifična otelotvorenja, može se razumeti u kombinaciji sa pratećim slikama, ovde uključenim referencama.

Slika 1 prikazuje raspršenu ekspresiju Lgr5-GFP in vivo. Tanko crevo je sakupljeno iz Lgr5-GFP miševa i direktno je snimljeno pod fluorescentnom mikroskopijom. Dok su sva područja tankog creva bila prekrivena kriptama, približno polovina tih kripti sadržala je GFP+ ćelije. Skala: 100 µιη.

Sl. 2A-2H pokazuju kombinaciju CHIR i VPA koji promovišu širenje i samoobnavljanje Lgr5+ matičnih ćelija. Sl.2A prikazuje GFP i svetle polja kripti tankog creva koje su kultivisane tokom 6 dana u prisustvu ENR (EGF, Noggin i R-spondinl), ENR+VPA (ENR-V), ENR+CHIR (ENR-C) i ENR+VPA+CHIR (ENR-CV). Apoptotičke ćelije su vidljive u lumenu sa autofluorescencijom (crvene strelice), a bele strelice ukazuju na specifičan Lgr5-GFP na dnu kripte. Skala:100 µιη. Sl.2B prikazuje kvantifikaciju ćelijske proliferacije i GFP ekspresiju kripta kultivisanih u više uslova. Kripte su kultivisane u pločama sa 24 udubljenja tokom 6 dana i disocirane u pojedinačne ćelije koristeći Accutase. Broj živih ćelija u svakom udubljenju se računa kao pokazatelj proliferacije ćelija. Ekspresija Lgr5-GFP je merena analizom protočne citometrije. Trake grešaka ukazuju na S.D. trostrukih udubljenja.

Eksperimenti su izvedeni 3 puta i pokazali su slične rezultate. Sl.2C i 2D prikazuju analizu protočne citometrije GFP ekspresije pojedinih Lgr5-GFP ćelija posle 7 dana kulture u više uslova kako je naznačeno. Trake grešaka ukazuju na S.D. trostrukih udubljenja. Slika 2E prikazuje slike GFP-a i svetlih polja pojedinih Lgr5-GFP ćelija posle 9 dana kulture. Skala: 100 µm. Slika 2F prikazuje reprezentativne slike 4.000 FACS izolovanih pojedinih Lgr5-GFP ćelija, kultivisanih u više uslova tokom 7 dana, a Sl.2G prikazuje kvantifikaciju broja kolonija. Trake grešaka ukazuju na S.D. trostrukih udubljenja. Slika 2H prikazuje širenje metafaze ćelije koja se kultiviše u stanju CV tokom 80 dana sa normalnim kariotipom (2n=40). (Ako nije drugačije naznačeno, na svim panelima: ***P<0.001; **P<0.01; *P<0.05; NS P>0.05.)

Sl. 3A-3G prikazuju rast ćelije i ekspresiju GFP-a kao funkciju uslova kulture. Sl. Slike 3A i 3B prikazuju brojeve kolonija i žive brojeve pojedinačnih ćelija iz trostrukih udubljenja nabrojanih u svakoj vremenskoj tački. Trake grešaka ukazuju na S.D. Na Slici 3A, serija su, s leva na desno, Dan 0, Dan 2, Dan 4, Dan 6, Dan 8 i Dan 10. Sl.3C prikazuje FACS sortiranje sveže izolovanih pojedinih Lgr5-GFP+ ćelija. Sakupljena je populacija GFP<high>pojedinačnih ćelija. Prikazana je reprezentativna FACS analiza i strategija vezanja za definisanje populacije ćelija GFP+. Sveže izolovane pojedinačne ćelije iz kripti pokazale su dve diskriminisane populacije GFP<high>i GFP<low>, dok kultivisane ćelije nisu pokazale diskriminisane populacije GFP<high>i GFP<low>, tako da su sve GFP+ ćelije bile zatvorene na analizu. Imajte na umu da su uzgajane ENR-CV ćelije pokazale jedinstvenu GFP+ populaciju koja je bila GFP vrlo pozitivna. Populacija GFP predstavlja Lgr5-ćelije, kao i Lgr5+/GFP-ćelije (tj. matične ćelije prigušene GFP-om), koje su prisutne u svim nesortiranim kulturama

1

kripti, ali ne i u sortiranim jedinstvenim Lgr5-GFP ćelijskim kulturama (videti Sliku 2C). Ukupno je analizirano 10.000 živih ćelija za svaki uzorak. Sl.3D prikazuje zahteve faktora rasta za samo-obnavljanje Lgr5+ matičnih ćelija u stanju CV kulture. Kripte su kultivisane tokom 6 dana u prisustvu CHIR i VPA, uz EGF, Noggin, R-spondin 1 i njihove kombinacije, kako je naznačeno. E: EGF (50 ng/ml); N: Noggin (100 ng/ml); R: R-spondin 1 (500 ng/ml); C: CHIR (3 µM); V: VPA (1 mM). Sl.3E prikazuje kripte kultivisane tokom 6 dana u više uslova kako je naznačeno. Prikazane su slike GFP i svetlih polja. Skala: 200 µm. Slika 3F prikazuje morfologiju i Lgr5-GFP ekspresiju kripta debelog creva uzgajanih u uslovima ENR, ENR-C i ENR-CV. Slika 3G prikazuje izolovani broj organoida formiranih na dan 5 u prisustvu EGF, Noggin i R-spondina 1 ili R-spondina 2 u više koncentracija. Sve skale: 200 µm.

Sl. 4A-4B prikazuju testiranje višestrukih uslova kulture za EPHB2+ matične ćelije humanih kolonija. Kripte kultivisane tokom 6 dana u više uslova kako je naznačeno. Prikazane su slike GFP i svetlih polja na Sl.4A, W: Wnt3a (100 ng/ml); Ni: Nikotinamid (10 mM); P: PGE2 (0.02 µM); A: A-83-01 (0.5 µM); S: SB202190 (10 µM); V: Valproinska kiselina ili VPA (1 mM). EGF, Noggin, R-spondin 1, Wnt3a i VPA, ili ENR-W-V, uslov služi kao kontrola koja pokazuje pojačanu ekspresiju GFP-a. Skala: 200 µm. Sl.4B prikazuje kvantifikaciju ćelijske proliferacije i GFP ekspresiju kripta kultivisanih pod više uslova. Kripte su kultivisane tokom 6 dana u pločicama sa 24 udubljenja i razdeljene su u pojedinačne ćelije. Broj živih ćelija u svakom udubljenju je izbrojen i procenat GFP+ ćelija je analiziran protočnom citometrijom. Trake grešaka ukazuju na S.D. trostrukih udubljenja.

Sl. 5A-5D prikazuje kulturu pojedinih Lgr5-GFP matičnih ćelija. Sl.5A prikazuje pojedinačne izolovane Lgr5-GFP+ ćelije, kultivisane 9 dana u CV stanju. Skala: 200 µm. Sl.

5B prikazuje 1500 FACS sortiranih pojedinačnih Lgr5+ ćelija, uzgajanih u Matrigelu, pod uslovima kao što je naznačeno. Prikazane su reprezentativne slike iz 7. dana kulture. Sl.5C pokazuje kvantifikaciju broja kolonija. Trake grešaka ukazuju na S.D. ili trostruka udubljenja. Slika 5D prikazuje sortirane pojedinačne Lgr5+ matične ćelije posejane u pločice sa 48 udubljenja. Broj održivih ćelija kvantifikovan je 12 sati nakon nanošenje prevlake. Broj kolona se broji 7. dana i efikasnost formiranja kolonija je kvantifikovana. V: VPA; C: CHIR; W: Wnt3a na 100 ng/ml. Trake grešaka ukazuju na S.D.3 trostruka udubljenja. Eksperimenti su izvedeni 3 x i pokazali su slične rezultate.

Sl. Slike 6A-6D prikazuju održavanje Lgr5+ matične ćelije samoobnavljanjem kombinacijom CHIR i VPA. Prikazane su konfokalne slike lizozima (Sl.6A), Ki67 (Sl.6B) i EdU (Sl.6C) obojenja organoida kultivisanih pod ENR uslovom (Gornji paneli) i kolonija uzgajanih u ENR-CV stanju (Donji paneli). Da bi se EdU bojilo, ćelije su kultivisane timidinskim analogom EdU (crvene) tokom 1 sata. Na Sl.6B i 6C, samo kripto domene sadrže Ki67 pozitivne ćelije ili sadrže EdU u ENR stanju (Gornji paneli), dok su Ki67 ili EdU prisutni u celim agregatima u stanju CV (Donji paneli). Sl.6D prikazuje kvantitativnu PCR analizu relativne mRNK ekspresije markera za zrele ćelije epitela creva, uzgajane tokom 6 dana pod uslovima kao što je naznačeno (Intestinalna alkalna fosfataza [Alpi] za enterocite, Mucin 2 [Muc2] za peharaste ćelije, hromogranin A [ChgA] za enteroendokrine ćelije, lizozim [Lyz] za Panetove ćelije i Lgr5 za ćelije crevnih matičnih ćelija). ENR-CV (D40) označava ćelije koje su kultivisane u CV stanju tokom 40 dana. Skala: 50 µm. Na Sl.6D, serija su s leva na desno, Alpi, Muc2, ChgA, Lyz i Lgr5.

Sl. Slike 7A-7D prikazuju diferencijaciju crevnih matičnih ćelija kultiviranih pod CV uslovima. Sl. 7A prikazuje obojenje markera diferencijacije (Alp za enterocite, Muc2 za peharaste ćelije (bele strelice) i mucina koje luče staklene ćelije, ChgA za enteroendokrine ćelije i Lyz za Panetove ćelije) ćelija prebačenih iz stanja CV u stanje ENR i uzgajanih za 4 dana. DAPI je korišćen za bojenje jezgara, a GFP ukazuje na prisustvo matičnih ćelija. Slika 7B prikazuje RT-PCR analizu u stvarnom vremenu relativne ekspresije mRNK zrelih crevnih epitelnih markera iz ćelija kultiviranih u višestrukim uslovima. Ćelije su prvobitno uzgajane iz pojedinih ćelija u CV stanju tokom 6 dana. Stanične kolonije su zatim sakupljene, isprane i ponovo stavljene u nekoliko udubljenja sa pločama sa 24 udubljenja i kultivisane su 4 dana u Matrigelu pod više uslova kako je naznačeno. ENR je dodat u svim uslovima i ćelije koje su uzgajane samo ENR korišćene su kao kontrole. I: IWP-2 (2µM), D: DAPT (10µM), C: CHIR (3µM), V: VPA (1mM). Trake grešaka ukazuju na S.D. Sl.7C prikazuje Alp bojenje ćelija kultivisanih u višestrukim uslovima. Postoji jasna morfološka promena ćelija u ID i CD uslovima, koja podseća na peharaste ćelije i Panetove ćelije. Skala: 50 µm. Slika 7D prikazuje imunocitohemijsko obojenje markera diferencijacije. Ćelije kultivisane u uslovima CD i ID korišćene su za obojenje Mucin 2 (Muc2), hromogranin A (ChgA) i lizozim (Lyz). Prikazane su trodimenzionalne rekonstruisane konfokalne slike. Skala: 50 µm.

Sl. Slike 8A-8F prikazuju kontrolisanu diferencijaciju Lgr5+ matičnih ćelija in vitro. Slika 8A prikazuje bojenje organoida uzgajanih u ENR stanju. Na levoj tabli je prikazano Alpsko obojenje enterocita. Pre bojenja, organoid je isečen pod mikroskopom za seciranje oštrim sečivom i uklonjen je luminalni sadržaj. Srednja ploča prikazuje Muc2 bojenje peharastih ćelija (strelice) kao i mucin koji luče peharaste ćelije, a desni panel prikazuje ChgA bojenje enteroendokrinih ćelija. GFP+ ćelije označavaju Lgr5+ matične ćelije. Sl.8B daje šemu protokola diferencijacije. Pojedinačne Lgr5+ matične ćelije kultivisane su u CV stanju tokom 4-6 dana, da bi se formirale kolonije. Zatim su sakupljene ćelije kolonije, isprane, ugrađene u sveži Matrigel i uzgajane u višestrukim uslovima. Slika 8C prikazuje morfologiju ćelijskih kolonija koje su prebačene iz stanja CV u stanje ENR i kultivisane 4 dana (gornji paneli). Kolonije koje se neprekidno uzgajaju u stanju CV prikazane su kao kontrola (donji paneli). Slika 8D prikazuje morfologiju diferenciranih ćelija sa slikama sa malim i velikim uvećanjem za svako stanje. Imajte na umu jasnu promenu u morfologiji većine ćelija u uslovima CD i ID, što odražava formiranje Panetovih ćelija i bobica. Slika 8E prikazuje alpsko obojenje kolonija uzgajanih u IV stanju. Prikazani su apikalni (levi panel) i homogeni (desni panel) bojenje Alpa. Sl.8F prikazuje Muc2 bojenje kolonija uzgajanih u ID i CD uslovima. Sve skale: 50 µm.

Sl. 9A-9F prikazuje mehanizam delovanja za CHIR i VPA. Sl.9A prikazuje morfologiju i Lgr5-GFP ekspresiju kripti kultivisanih u više uslova tokom 6 dana. C: CHIR (3 µM); Li: LiCl (5 mM); W: Wnt3a (100 nM). Sl.9B prikazuje broj ćelija i procenat GFP+ ćelija za 6-dnevne kripto kulture. Podaci predstavljaju tri nezavisna eksperimenta. Slika 9C prikazuje 6-dnevne kulture kripti u stanju ENR-C (kontrola) ili zajedno sa HDAC inhibitorima. Sl.9D prikazuje kvantifikaciju procenta GFP, ukupnog broja živih ćelija i relativnog intenziteta GFP ćelija na Sl.9C. Slika 9E prikazuje efekte VPA i TSA na ćelijsku proliferaciju i ekspresiju GFP u više koncentracija. Slika 9F prikazuje efekte nikotinamida (Ni) u kombinaciji sa Wnt3a (W, 100 ng/ml) ili CHIR (C, 3 µM). Prikazani su ćelijski broj i procenat GFP+ ćelija kripti kultivisanih tokom 6 dana u više uslova. (Ako nije drugačije naznačeno, na svim panelima: Trake grešaka ukazuju na S.D. ili trostruka udubljenja. ***P<0.001; **P<0.01; *P<0.05; NS P>0.05.)

Slika 10 prikazuje morfologiju i GFP ekspresiju pojedinih Lgr5-GFP ćelija kultivisanih u višestrukim uslovima. Skala: 100 µm.

Sl. 11A-11D prikazuje mehanizam VPA. Sl.11A prikazuje VPA spašavajući GFP ekspresiju nakon inhibicije Notch. Kripte su kultivisane u ENR-C stanju sa ili bez DAPT (D, 5 µM) i varirajućom koncentracijom VPA (V, 0.25-4 mM) tokom 3 dana. Skala: 200 µm. Sl.11B i 11C prikazuju kripte kultivisane u uslovima ENR (Sl.11B) ili ENR+CHIR (Sl.11C) tokom 4 dana, posle čega je dodavano VPA u različitim koncentracijama tokom 24 sata. Ekspresija Notchl, Hes1 i Atoh1 analizirana je RT-PCR u realnom vremenu. Slika 11D prikazuje analizu Notchl, Hes1 i Atohl ekspresije pomoću RT-PCR-a u realnom vremenu u kriptama nakon 6 dana kulture. Na Sl.11B-11C, serija su, s leva na desno, 0, 0.5, 1, 2 i 3. Na Slici 11D, serija, s leva na desno, su ENR, ENR-V, ENR-C i ENR-CV.

Sl. Slika 12A-12B prikazuje model samo-obnavljanja i diferencijacije crevnih ćelija (Sl.12A)

1

u fiziološkim uslovima i (Sl.12B) in vitro kulture.

Sl. Slike 13A-13B prikazuju kombinaciju CHIR i VPA koji promovišu proliferaciju i GFP ekspresiju Lgr5+ matičnih/potomskih ćelija dobijenih iz mišjeg unutrašnjeg uha. Sl.13A prikazuje svetlosne i GFP slike izolovanog epitela kohlea senzora koji je dobijen od miša Lgr5-GFP u post-natalnom danu 2. Sl.13B prikazuje izolovani senzorni kohlea epitel disociran u pojedinačne ćelije i uzgajan u više uslova tokom 11 dana. E: EGF; N: Noggin; R: R-spondin 1; C: CHIR99021, V: VPA. Skala: 100 µm.

Sl. Slike 14A-14F prikazuju kombinaciju CHIR i VPA koji promovišu proliferaciju i GFP ekspresiju Lgr5+ matičnih/potomskih ćelija iz mišjeg unutrašnjeg uha. Sl.14A prikazuje GFP ekspresiju epitelnih ćelija unutrašnjeg uha. Sl.14B prikazuje kvantifikaciju GFP ekspresije i broja ćelije. Sl.14C prikazuje svetlosne i GFP slike. Sl.14D prikazuje broj ćelija 8-dnevnih kultura matičnih ćelija unutrašnjeg uha u višestrukim uslovima kako je naznačeno. Sl.14E prikazuje GFP procenat 8-dnevnih kultura matičnih ćelija unutrašnjeg uha u višestrukim uslovima kako je naznačeno. Slika 14F prikazuje morfologiju i GFP ekspresiju matičnih ćelija unutrašnjeg uha Lgr5-GFP kultivisanih u više uslova. Sve skale: 200 µm.

Slika 15 prikazuje klijanje tankih crevnih kripti miša na zdravo tkivo debelog creva in vitro. Na levoj tabli su prikazane izolovane kripti tankog creva postavljene na debelo crevo sa delimično nagnječenim epitelom. Bele strelice označavaju zasejane kripte. Desni panel prikazuje zasijane kripte pričvršćene na debelo crevo i šire se po njegovoj površini nakon 24 sata. Crne strelice označavaju isto mesto kao i bele strelice na levoj tabli.

Sl.16 prikazuje ukopavanje kripta 48 sati nakon setve. Prikazane su fluorescentne slike (gornja ploča) i svetla polja (donja ploča) tkiva debelog creva miša zasejane kriptama. Kripte su obojene sa DiD pre setve. Bele linije označavaju područja koja uključuju ugrađene ćelije. Sl. 17 prikazuje ugradnju kripti nakon 6 dana in vitro kulture. Prikazane su slike GFP-a (levi panel), RFP (srednja ploča) i svetla polja (desni panel) kanala tkiva debelog creva miša zasejanih kriptama. GFP signal ukazuje na prisustvo Lgr5 ćelija.

Sl. 18 prikazuje konfokalnu sliku izrezanog prolapsiranog ulceroznog kolitisnog tkiva iz TRUC miša sa ugrađenim kriptama. Kripte su obojene sa DiD pre setve. Prolapsano tkivo je prikazano zelenom autofluorescencijom.

Sl. 19A-19N prikazuju šemu setve (levo) i post-inkubacijski organoidni rast (desno) u sistemima kulture koji se procenjuju. Sl.19A i 19B prikazuju tipični submukozni semenski postupak (ovde se naziva „goli flaster“), koja podržava rast u višeslojnom sloju i organoidnu disonanciju. Sl. 19C i 19D prikazuju GIS-infuzirane SIS (GF uključuju EGF, Noggin, R-spondin 1, I-27632, Valproinska kiselina, CHIR) da podrže 3-dimenzionalni organoidni rast.

Sl. 19E i 19F prikazuju gel-flaster sačinjen od GF-a infuziranog SIS sa kolagenom. Slika 19E, uložak, prikazuje svaki organoid pojedinačno u mekanom gelu kao i SIS osnovni sloj. Sl. 19G i 19H prikazuju tipičnu suspenziju kolagena sa GF (EGF, Noggin, R-spondin 1, I-27632, Valproinska kiselina, CHIR) koji su direktno dodavani u podlogu za kultivisanje. Sl.

19I i 19J prikazuju tipičnu suspenziju kolagena sa GF (EGF, Noggin, R-spondin 1, I-27632, Valproinska kiselina, CHIR) ugrađenim u gel. Sl. 19K i 19L prikazuju tipičnu suspenziju kolagena bez dodatnih GF-a koji su dodani u kulturne medije. Sl.19M i 19N prikazuju tipičnu Matrigelovu suspenziju bez dodatnih GF-a koji su dodati podlozi (eksperimentalna kontrola).

Sl. 20A prikazuje šemu postupka setve sa Lgr5+ organoidima; krugovi sa uzorkom predstavljaju infuzijske faktore rasta (EGF, Noggin, R-spondin 1, I-27632, valproinska kiselina i CHIR). Sl.20B prikazuje početnu fazu prijanjanja sa strelicama koje prikazuju podršku difuzije faktora sa ugrađenim rastom. Sl.20C prikazuje ceo sistem kulture sa prekrivenim kolagenom, merenjem debljine.

Slika 21A daje poređenje rasta organoida u sistemima 7 kultura. Serije su, od leve do desne strane, Matrigel, Gel-flaster sa GF-om, Goli flaster sa GF-ima, Kolagen I, Kolagen I sa Media GF-ovima, Kolagen I sa ugrađenim GF-om i Bare flastera bez GF-ova. Sl.21B i Sl.

21C prikazuju reprezentativni organoid u 48 sati iz sistema gel-flaster sa GFs, pri čemu GFP+ fluorescencija ukazuje na Lgr5+ matične ćelije prisutne u baznim kriptama (vidi se neka centralna autofluorescencija). *=p <0.05 u 24 sata (kolagen I (CI) u odnosu na sve), 48 sati (goli flaster sa GF-om (BPGF) naspram svih; CI vs. Matrigel (M); CI sa GF (CIGF) u odnosu na M, CI, kolagen I sa ugrađenim GF (CIEGF), golim flasterom (BP), sistemom gel-flaster sa GFs (PSGF)), 72 sata (CI protiv svih; BP, CIEGF, i CIGF vs. M, PS, BPGF, CI) i 96 sati(CI vs. svi, BP, CIEGF, i CIGF vs. svi). Skala (Sl.21B i 21C) = 200um.

Sl. 22 prikazuje uspešan rast i kripto ekspanziju zasijanog organoida u Gel-flasteru sa GF sistemom. Prikazan je reprezentativan niz slika koje prikazuju ex-vivo ekspanziju zasijanog organoida na SIS flaster sistemu sa GF. Kripte koje su van fokusa efekat su rasta u 3 dimenzijama posmatranim u mikroskopiji sa jednom pločicom.

Sl. 23A daje šemu koja prikazuje stvaranje želudačnog defekta 4 mm. Postavljanje 6 mm flastera iznad oštećenja prikazano je na Sl.23B. Kao što je prikazano na Sl.23C, nije bilo vidljivih oštećenja na spoljnom stomačnom zidu, kao što je naznačeno na reprezentativnom uzorku stomaka u toku 1 nedelje posle opcije. Bruto defekti (strelice), posmatrani sa unutrašnjeg stomačnog zida, prikazuju se prema vrsti postavljenog flastera: Sl.23D prikazuje SIS flaster bez GF-a, Sl.23E prikazuje SIS zakrpu plus GF, a Sl.23F prikazuje samo PGSU

1

pozadinu, bez SIS. SIS flaster sa GF-om pokazao je potpuno zatvaranje i epitelizaciju efekta želudačne stijenke, dok su defekti ostali delimično otvoreni samo u SIS-u i potpuno otvoreni u PGSU-u bez SIS.

Sl. 24 prikazuje RT-PCR analizu u realnom vremenu ekspresije marker gena izolovanih crevnih kripta čoveka kultivisanih u više uslova. EGF, Noggin i R-spondin1 su dodati svim uslovima. C: CHIR, Ni: Nikotinamid, W: Wnt3a, A: A83-01, S: SB202190, P: PGE2, V: VPA, Tu: Tubastatin A, Kripta označava sveže izolovane kripte tankog creva kod ljudi. Trake grešaka označavaju S.D., n=3.

Sl. 25A-25B prikazuju optimalno stanje kulture za humane crevne matične ćelije. Slika 25A prikazuje proliferaciju ćelija epitela creva čoveka kultivisanih u višestrukim uslovima. Sveže izolovane kriptografije tankog creva u čoveku uzgajane su u višestrukim uslovima kako je naznačeno. EGF, Noggin, R-spondin1 su bili prisutni u svim uslovima. Broj ćelija kvantifikovan je 9. dana posle setve. C: CHIR, V: VPA, korišćeno na 0.5-1.5 mM, Ni:

Nikotinamid. Sl.25B prikazuje LGR5 ekspresiju ćelija kultivisanih u višestrukim uslovima kao na Sl.15A. VPA je korišćen na 1 mM.

Sl. 26 prikazuje kulturu matičnih ćelija creva kod ljudi. Ćelije su kultivisane u medijima kulture matičnih ćelija creva (koji sadrže EGF, Noggin, R-Spondin1, CHIR99021, VPA i nikotinamid). Prikazane su ćelije prolaza 2 na dan 5 nakon prelaska. Skala: 400 µm.

Slika 27 prikazuje povećanu veličinu kripte nakon davanja CHIR i VPA tokom 7 dana in vivo u sistemu životinja.

DETALJNI OPIS PRONALASKA

Definicije

[0049] Kao što je ovde korišćeno, "antitelo" je bilo koji imunoglobulinski polipeptid, ili njegov fragment, koji ima sposobnost imunogenog vezivanja.

[0050] Kao što je ovde korišćeno, "agonist" je sredstvo koje izaziva povećanje ekspresije ili aktivnosti ciljnog gena, odnosno proteina, respektivno. Agonist se može vezati i aktivirati svoj kognitivni receptor na neki način, što direktno ili indirektno dovodi do ovog fiziološkog efekta na ciljni gen ili protein.

[0051] Kao što je ovde korišćen, "inhibitor" je sredstvo koje uzrokuje smanjenje ekspresije ili aktivnosti ciljnog gena, odnosno proteina, respektivno. "Antagonist" može biti inhibitor, ali je određenije sredstvo koje se vezuje za receptor, a koje zauzvrat smanjuje ili eliminiše

1

vezivanje od strane drugih molekula.

[0052] Kao što je ovde korišćeno, "inhibicijska nukleinska kiselina" je dvolančana RNK, siRNK, shRNK, ili antisens RNK, ili njen deo, ili njihov mimetik, koji kada se primenjuje u ćeliji sisara dovodi do smanjenja ekspresije ciljni gen. Tipično, inhibitor nukleinske kiseline sadrži bar deo ciljne molekule nukleinske kiseline, ili njen ortolog, ili sadrži bar deo komplementarnog lanca ciljne molekule nukleinske kiseline. Tipično je ekspresija ciljnog gena smanjena za 10%, 25%, 50%, 75%, ili čak 90-100%.

[0053] Pod "anti-sens" se podrazumeva nukleinska kiselina, bez obzira na dužinu, koja je komplementarna niti kodiranja ili mRNK sekvence nukleinske kiseline. Kao što je ovde navedeno, "komplementarna sekvenca nukleinskih kiselina" je sekvenca nukleinskih kiselina koja se može hibridizirati sa drugom sekvencom nukleinskih kiselina koja se sastoji od komplementarnih parova nukleotidnih baza. Pod "hibridizacijom" podrazumeva se par da formira dvolančane molekule između komplementarnih nukleotidnih baza (npr., adenin (A) formira bazni par sa timinom (T), kao što to čini i gvanin (G) sa citozinom (C) u DNK) pogodni uslovi strogosti. (Videti, npr., Wahl, G. M. i S. L. Berger (1987) Methods Enzymol.

152:399; Kimmel, A. R. (1987) Methods Enzymol.152:507). U jednom aspektu, antisense RNK se uvodi u pojedinačnu ćeliju, tkivo ili organoid. Anti-sense nukleinska kiselina može da sadrži modifikovani glavni lanac, na primer, fosforotioat, fosforoditioat ili druge modifikovane okosnice poznate u struci, ili može sadržati neprirodne internukleotidne veze.

[0054] Pod "siRNK" se podrazumeva dvolančana RNK. Optimalno, siRNK je dužine 18, 19, 20, 21, 22, 23 ili 24 nukleotida i na njenom 3' kraju ima 2 bazna ispusta. Ove dsRNK mogu da se uvedu u pojedinačnu ćeliju ili sistem kulture. Takve siRNK se koriste za smanjivanje nivoa mRNK ili aktivnosti promotora.

[0055] Kako se ovde koristi, "fragment" je deo polipeptida ili molekula nukleinske kiseline. Ovaj deo sadrži, preferirano, najmanje 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, ili 90% celokupne dužine referentnog molekula nukleinske kiseline ili polipeptida. Fragment može da sadrži 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, ili 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, ili 1000 nukleotida ili aminokiselina

[0056] Kao što je ovde korišćen, termin "matična ćelija" odnosi se na multipotentnu ćeliju koja ima sposobnost samoobnavljanja i diferencijacije u više ćelijskih rodova.

[0057] Kao što je ovde korišćen, termin "epitelne matične ćelije" odnosi se na multipotentnu ćeliju koja ima potencijal da se posveti više ćelijskih linija, uključujući ćelijske linije koje rezultiraju epitelnim ćelijama.

[0058] Kao što je ovde korišćen, termin "ćelijska potomstva" odnosi se na ćeliju ograničenu

1

na lozu koja je izvedena iz matične ćelije.

[0059] Kao što je ovde korišćen, termin "epitelna ćelija prethodnika" odnosi se na multipotentnu ćeliju koja ima potencijal da postane ograničena na ćelijske linije što rezultira epitelnim ćelijama.

[0060] Kao što je ovde korišćen, termin "samo-obnavljanje" odnosi se na postupak kojim se matična ćelija deli na generisanje jedne (asimetrične deobe) ili dve (simetrična podela) ćerke ćelije sa razvojnim potencijalom koji se ne može razlikovati od matične ćelije. Samoobnavljanje uključuje i širenje i održavanje nediferenciranog stanja.

[0061] Kao što je ovde korišćen, termin "kalem" ili "kalemiti" odnosi se na proces inkorporacije matičnih ili potomskih ćelija u tkivo koje je in vivo od interesa kroz kontakt sa postojećim ćelijama tkiva.

[0062] Kako se ovde koristi, termin "izolovan" odnosi se na materijal koji je u različitom stepenu slobodan od komponenti koje ga obično prate kao što je nađeno u njegovom matičnom stanju. „Izolat“ označava stepen odvojenosti od izvornog izvora ili okruženja.

[0063] Kako se ovde koristi, "populacija" ćelija je bilo koji broj ćelija veći od 1, ali je poželjno najmanje 1X10<3>ćelija, barem 1X10<4>ćelija, barem 1X10<5>ćelija, barem 1X10<6>ćelija, barem 1X10<7>ćelija, barem 1X10<8>ćelija, barem 1X10<9>ćelija, ili barem 1X10<10>ćelija.

[0064] Kako se ovde koristi, termin "organoidni" ili "epitelni organoid" odnosi se na ćelijski klaster ili agregat koji podseća na organ ili deo organa i koji poseduje tipove ćelija relevantnih za taj određeni organ.

[0065] Kako se ovde koristi, „ispitanik“ je kičmenjak, uključujući bilo koga od pripadnika klase sisara.

[0066] Kako se ovde koristi, „sisar“ se odnosi na bilo kojeg sisara, uključujući, ali ne ograničavajući se na ljude, miša, pacova, ovcu, majmuna, kozu, zeca, hrčaka, konja, krave ili svinje.

[0067] "Sisar koji nije čovek", kako se ovde koristi, odnosi se na bilo kojeg sisara koji nije čovek.

[0068] Kao što je ovde korišćeno, "povećanje" se odnosi na povećanje za najmanje 5%, na primer, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 99, 100% ili više, na primer, u poređenju sa referentnim nivoom.

[0069] Ovde se, kako se ovde koristi, "povećanja" takođe povećavaju, na primer, najmanje jedanput, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 500, 1000-struko ili više, na primer, u poređenju sa nivoom a u poređenju sa nivoom referentnog standarda.

1

[0070] Kao što se ovde koristi, „smanjenje“ se odnosi, na primer, na smanjenje za najmanje 5%, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 99 ili 100%, na primer, u poređenju sa referentnim nivoom.

[0071] Kako se ovde koristi, „smanjuje“ takođe znači, smanjuje se, na primer, najmanje jedanput, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 500, 1000-struko ili više, na primer, u poređenju sa referentnim nivoom.

[0072] Kao što je ovde korišćen, termin "referenca" označava standardno ili kontrolno stanje (npr., netretirano sa test sredstvom ili kombinacijom test sredstava).

[0073] Kako se ovde koristi, termin "eliminiše" znači da se smanji do nivoa koji nije prepoznatljiv.

[0074] Kako se ovde koristi, termin „sinergija“ ili „sinergistički efekat“ je efekat koji je veći od zbira svakog efekta koji se uzima odvojeno; veći od aditivnog efekta.

[0075] Kao što je ovde korišćeno, termini "lečiti", "lečenje", "tretiranje" i slično odnose se na smanjenje ili ublažavanje poremećaja i/ili simptoma povezanih s tim. Biće poznato da, iako nije sprečeno, lečenje poremećaja ili stanja ne zahteva potpuno uklanjanje poremećaja, stanja ili simptoma koji su s tim povezani.

[0076] U ovom obelodanjivanju, "sadrži", "sadržati", "koji sadrži" i "ima" i slično može imati značenje koje im je dodeljeno u američkom patentnom zakonu i može značiti "uključuje", "uključujući" i slično; „sastoji se suštinski iz ili „suštinski sadrži“ slično ima značenje pripisano u patentnom pravu SAD i termin je otvoren, omogućujući prisustvo više od onoga što je navedeno sve dok osnovne ili nove karakteristike navedenog nisu izmenjene prisustvom više od jednog navedenog, ali izdvaja otelotvorenja prethodnog stanje tehnike.

[0077] Druge definicije se pojavljuju u kontekstu u ovom obelodanjivanju. Osim ako nije drugačije definisano, svi tehnički i naučni termini koji se ovde koriste imaju isto značenje kao što se uobičajeno shvataju oni koji su uobičajeno upoznati sa stanjem tehnike kojem pripada pronalazak. U slučaju sukoba, ova specifikacija, uključujući definicije, će imati kontrolu. Postupci i sastavi

I. Rastvori i sistemi ćelijske kulture

[0078] Otkriveni su rastvori i sistemi za ćelijsku kulturu za promociju homogenih kultura matičnih ćelija epitela, efikasno formiranje epitela i organoida epitela za upotrebu u transplantaciji.

[0079] Rastvori ćelijske kulture koji sadrže inhibitor koštanog morfogenog proteina, inhibitor

1

glikogen sintaze kinaze-3 beta (GSK3 β), sredstvo koje se vezuje na recept za leucin obogaćen ponovljeni protein G-protein 5 (LGR5) i histon inhibitor deacetilaze može se koristiti za formiranje epitelnih ćelija iz izolovanih matičnih ćelija epitela. U specifičnim otelotvorenjima, najmanje oko 25%, oko 40%, oko 50%, oko 75%, oko 90% do oko 100% izolovanih matičnih ćelija epitela formiraju kolonije epitelnih ćelija u prisustvu ove kulture ćelijskog rastvora. Pored toga, najmanje oko 6% pojedinačnih izolovanih matičnih ćelija epitela formira kolonije epitelnih ćelija u prisustvu rastvora ove ćelijske kulture. Kombinacije 1, 6-[[2-[[4-(2,4-Dihlorofenil)-5-(5-metil-1H-imidazol-2-il)-2-pirimidinil]amino]etil]amino]-3-piridinkarbonitril "CHIR99021" (Ring i dr., 2003), inhibitor glikogen sintaze kinaze-3 beta i valproinske kiseline, inhibitor histon deacetilaze, imaju sinergističke efekte na efikasnost formiranja kolonije.

[0080] Koštani morfogeni proteini (BMP) su članovi TGF-beta super-porodice i sadrže metaloproteaze umešane u embrionalno uzorkovanje različitih vrsta kao i post-embrionalnu ćelijsku signalizaciju. Inhibitori BMP uključuju, na primer, sredstva koja se vezuju za BMP molekul da formiraju kompleks u kome se aktivnost BMP smanjuje ili eliminiše, na primer sprečavanjem ili inhibicijom vezanja BMP molekula na BMP receptor. Alternativno, inhibitor je sredstvo koje deluje kao antagonist ili reverzni agonist. Ova vrsta inhibitora vezuje se za BMP receptor i sprečava vezivanje BMP za receptor. Primer poslednjeg sredstva je antitelo koje veže BMP receptor i sprečava vezivanje BMP za receptor vezan za antitelo. Inhibitori BMPs su poznati u stanju tehnike (Rider i dr., 2010) i mogu uključiti, ali nisu ograničeni na, Noggin, Chordin, Follistatin (Schneyer i dr., 1994), DAN, proteine koji sadrže DAn domen cisteinskog čvora (uključujući Cerberus i Gremlin), Sclerostin, uvrnuta gastrulacija, gen-1 povezan sa osetljivošću materice, faktor rasta vezivnog tkiva (Abreu i dr., 2002), Inhibin (Wiater i Vale, 2003), BMP-3 (Gamer i dr., 2005), Dorsomorfin (Yu i dr., 2008) i derivati, uključujući DMH1 (Hao i dr., 2010) i LDN-193189 (Cuny i dr., 2008).

[0081] Glikogen sintaza kinaza-3 (GSK3) je prolin-usmerena serin-treonin-kinaza koja je u početku identifikovana kao fosforilirajuća i inaktivirajuća glikogenska sintaza koja ima dve poznate izoforme, alfa (GSK3A) i beta (GSK-3β). Wnt agonisti koji sadrže GSK-3β inhibitore su dobro poznati u stanju tehnike i uključuju, ali nisu ograničeni na, 1, 6-[[2-[[4-(2,4-Dihlorofenil)-5-(5-metil-1H-imidazol-2-il)-2-pirimidinil]amino]etil]amino]-3-piridinkarbonitril "CHIR99021" (Ring i dr., 2003), LiCl (Klein i dr., 1996), BIO-acetoksim ((2'Z,3'E)-6-Bromoindirubin-3'-oksim) (Meijer i dr., 2003), N6-[2-[[4-(2,4-Dihlorofenil)-5-(1H-imidazol-2-il)-2-pirimidinil]amino]etil]-3-nitro-2,6-piridindiamin "CHIR98014" (Ring i dr., 2003), 3-(2,4-Dihlorofenil)-4-(1-metil-1H-indo1-3-il)-1H-pirol-2,5-dion "SB 216763"

2

takođe poznat kao GSK-3 Inhibitor IV (Coghlan i dr., 2000), 3-[(3-Hloro-4-hidroksifenil)amino]-4-(2-nitrofenil)-1H-pirol-2,5-dion "SB 415286" (Coghlan i dr., 2000), 5-etil-7,8-dimetoksi-1H-pirolo[3,4-c]-izohinolin-1,3-(2H)-dion "3F8" (Zhong i dr., 2009), 9-Bromo-7,12-dihidro-indolo[3,2-d][1]benzazepin-6(5H)-on "Kenpaullone" (Schultz i dr.,1999; Zaharevitz i dr., 1999), 9-Bromo-7,12-dihidro-pirido[3',2':2,3]azepino[4,5-b]indol-6(5H)-on "1-Azakenpaullone" (Schultz i dr., 1999; Zaharevitz i dr., 1999), N-(3-Hloro-4-metilfenil)-5-(4-ni¬trofenil)-1,3,4-oksadiazol-2-amin "TC-G 24" (Khanfar i dr., 2010), 2-Metil-5-[3-[4-(metilsulfinil)fenil]-5-benzofuranil]-1,3,4-oksadiazol "TCS 2002" (Saitoh i dr., 2009), N-[(4-Metoksifenil)metil]-N'-(5-nitro-2-tiazolil)urea "AR-A 014418" (Bhat i dr., 2003), 3-[5-[4-(2-Hidroksi-2-metil-1-oksopropil)-1-piperazinil]-2-(trifluorometil)fenil]-4-(1H-indol-3-yl)-1H-pirol-2,5-dion "TCS 21311" (Thoma i dr., 2011), 3-[[6-(3-aminofenil)-7H-pirolo[2,3-d]pirimidin-4-il]oksi]-fenol "TWS 119" (Ding i dr., 2003), ((2'Z,3'E)-6-Bromoindirubin-3'-acetoksim) "BIO-acetoksim" takođe poznat kao GSK-3 Inhibitor IX (Meijer i dr., 2003), 4-(2-Amino-4-okso-2-imidazolin-5-iliden)-2-bromo-4,5,6,7-tetrahidropirolo[2,3-c]azepin-8-one "10Z-Hymenialdisine" (Breton i dr., 1997), 2-[(3-jodofenil)metilsulfanil]-5-piridin-4-il-1,3,4-oksadiazol, takođe poznat kao GSK-3β Inhibitor II (Wada, 2009), 4-Benzil-2-metil-1,2,4-tiadiazolidin-3,5-dion, takođe poznat kao GSK-3β Inhibitor I (Wada, 2009), 3-Amino-6-(4-((4-metilpiperazin-1-il)sulfonil)fenil)-N-(piridin-3-il)pirazin-2-karboksamid, HCl, takođe poznat kao GSK-3β Inhibitor XXVII (patentna objava SAD br.2006/0173014), 4,5-bis(1-Metil-1H-indol-3-il)-1,2-dihidropirazol-3-on, takođe poznat kao GSK-3β Inhibitor XXVI (Chen i dr, 2011), FRATtid peptid SQPETRTGDDDPHRLLQQLVLSGNLIKEAVRRLHSRRLQ (SEQ ID NO: 1) (Bax i dr., 2001), 3-Amino-1H-pirazolo[3,4-b]hinoksalin"Cdk1/5 Inhibitor" (Andreani i dr., 1996, 2000; Katoh i dr., 2011) i 4-((5-Bromo-2-piridinil)amino)-4-oksobutanoična kiselina "Bikinin" (De Rybel i dr., 2009). Poželjno, inhibitor GSK-3β je CHIR99021.

[0082] Leucin bogat ponavljajući G-protein vezan receptor 5 (LGR5 receptor) poznat je po ograničenoj ekspresiji kripti i obeležavanju matičnih ćelija u više tkiva odraslih i karcinoma. Sredstva koja se vezuju za LGR5 receptor uključuju, ali nisu ograničena na R-spondine (Kim i dr., 2006; Nam i dr., 2006), kao što su R-spondin 1, R-spondin 2, R-spondin 3 i R-spondin 4. Poželjno, sredstvo koje se vezuje za LGR5 receptor je R-spondin 1.

[0083] U alternativnim otelotvorenjima, litijum hlorid (LiCl) može biti supstituisan za CHIR99021 ili najmanje oko 3 uM CHIR99021 može biti supstituisan sa R-spondin 1.

[0084] Histoni su nuklearni proteini koji vezuju DNK i formiraju nukleozome. Oni su direktno uključeni kako sa pakovanjem DNK u hromozome, tako i sa regulacijom transkripcije. Histonska acetilacija/deacetilacija glavni je faktor u regulaciji hromatinske strukturne dinamike tokom transkripcije. Inhibitori histon deacetilaze, koji smanjuju ili eliminišu histonsku deacetilaciju, dobro su poznati u stanju tehnike i mogu da uključuju, ali nisu ograničeni na, Pan-HDAC inhibitore, kao što su valproinska kiselina, trihostatin A, suberoilanilalid hidroksaminska kiselina i suberohidroksaminska kiselina (SBHA), i HDAC6 inhibitore, kao što su Tubacin, Tubastatin A i Jedinjenje 7.

[0085] U alternativnim otelotvorenjima, inhibitor Atohl može povećati ili biti supstituisan za inhibitor Histon deacetilaze. Inhibitori Atohl uključuju, na primer, inhibitorne nukleinske kiseline koje izazivaju smanjenje ili eliminaciju u ekspresiji Atohl. Inhibitorne nukleinske kiseline koje ciljaju Atohl su poznate u struci (Shi i dr., 2010).

[0086] Rastvori ćelijskih kultura mogu opciono da uključuju faktor rasta epidermalnog rasta i/ili Notch agonist. Epidermalni faktor rasta je ćelijski signalni molekul uključen u različite ćelijske funkcije, uključujući ćelijsku proliferaciju, diferencijaciju, pokretljivost i opstanak i u razvoju tkiva. Notch proteini su jednoprolazni transmembranski receptori koji regulišu odluke sudbine ćelija tokom razvoja. Notch agonist uključuje, na primer, sredstvo koje povećava Notch aktivnost u ćeliji. Zarezi agonisti su dobro poznati u struci i mogu da uključuju, ali nisu ograničeni na, antitelo Notch1 (N1 Ab), Delta 1, Delta-3, Delta-4, Jagged 1, Jagged 2, DSL peptid i Delta D.

[0087] U specifičnim otelotvorenjima, rastvor ćelijske kulture sadrži između oko 5 do oko 500 ng/ml EGF-a, oko 5 do oko 500 ng/ml Noggin, oko 50 do oko 1000 ng/ml R-spondina, oko 0.1 do oko 10 µM CHIR99021 i oko 0.1 do oko 5 mM valproinske kiseline.

[0088] U drugim otelotvorenjima, poželjna je kombinacija Wnt agonista i HDAC6 inhibitora u rastvoru ćelijske kulture. Shodno tome, rastvor za ćelijsku kulturu može da sadrži inhibitor koštanog morfogenog proteina, R-spondin 1, Wnt agonist i HDAC6 inhibitor.

[0089] Wnt proteini su vanćelijski signalni molekuli koji učestvuju u kontroli embrionalnog razvoja. Wnt agonisti su dobro poznati u stanju tehnike i uključuju, ali nisu ograničeni na njih, Wnt-1/Int-1(Nusse i dr., 1982), Wnt-2/Irp (Protein povezan sa Int-I) (Wainwright i dr., 1988), Wnt-2b/13 (Katoh i dr., 1996), Wnt-3/Int-4 (Katoh i dr., 2001), Wnt-3a (Saitoh i dr., 2001), Wnt-4 (Smolich i dr., 1993), Wnt-5a (Burrus i dr., 1995), Wnt-5b (Burrus i dr., 1995), Wnt-6 (Burrus i dr., 1995), Wnt-7a (Smolich i dr., 1993), Wnt-7b (Burrus i dr., 1995), Wnt-8a/8d (Saitoh i dr., 2001), Wnt-8b (Lako i dr., 1998), Wnt-9a/14 (Bergstein i dr., 1997), Wnt-9b/14b/15 (Bergstein i dr., 1997), Wnt-1Oa (Wang i dr., 1996), Wnt-10b/12 (Wang i dr., 1996), Wnt-11 (Lako i dr., 1998), Wnt-16 (Bergstein i dr., 1997; Fear i dr., 2000), R-spondin 1, R-spondin 2, R-spondin 3, R-spondin 4, Norrin (Planutis i dr., 2007), CHIR99021, LiCl, BIO ((2'Z,3'E)-6-Bromoindirubin-3'-oksim), CHIR98014, SB 216763, SB 415286, 3F8, Kenpaullone, 1-Azakenpaullone, TC-G 24, TCS 2002, AR-A 014418, 2-amino-4-[3,4-(metilendioksi)benzil-amino]-6-(3-metoksifenil)pirimidin (Liu i dr., 2005), 2-[2-(4-Acetilfenil)diazenil]-2-(3,4-dihidro-3,3-dimetil-1(2H)-izohinolinzliden)acetamid "IQ 1" (Miyabayashi i dr., 2007), (3a,5 ,12a,20R)-3,12-dihidroksiholan-24-oična kiselina "DCA" (Pai i dr., 2004), (25)-2-[2-(Indan-5-iloksi)-9-(1,1'-bifenil-4-il)metil)-9H-purin-6-ilamino]-3-fenil-p-ropan-1-ol "QS 11" (Zhang i dr., 2007), piperidinil difenilsulfonil sulfonamid 1 "WAY-316606" (Bodine i dr., 2009), (hetero)arilpirimidini (Gilbert i dr., 2010), IOZ-Himenialdizin , TCS 21311, TWS 119, GSK-3 Inhibitor II, GSK-3 Inhibitor I, GSK-3 Inhibitor XXVII, FRATtid, Cdkl/5 Inhibitor i Bikinin.

[0090] Sistemi ćelijske kulture sadrže rastvor ćelijske kulture predmetnog obelodanjivanja i epitelnu organoidnu, epitelnu matičnu ćeliju ili epitelnu ćeliju prethodnika, ili populaciju epitelnih matičnih ćelija ili epitelnih progenitorskih ćelija. Epitelni organoidi su poznati u struci (Yao i dr., 2010; Lukacs i dr., 2010). Matične epitelne ćelije uključuju, ali nisu ograničene na, matične ćelije creva, želuca, pluća, pankreasa i debelog creva. Epitelne matične ćelije takođe uključuju matične ćelije pozitivne na LGR5, izvedene iz izvora koji uključuju, ali ne ograničavaju se na creva, unutrašnje uho, mozak, bubrege, jetru, mrežnjaču, želudac, pankreas, dojku, folikulu dlake, jajnike, adrenalnu moždinu, kožu, timus, kvržice na jeziku, mlečne žlezde, karcinome i tumore. Epitelne matične ćelije takođe uključuju miroljubive prekursore LGR5 pozitivnih matičnih ćelija koji eksprimiraju LGR5 (Buczacki i dr., 2013). Populacija matičnih epitelnih ćelija ili epitelnih ćelija u sistemu ćelijske kulture može da sadrži, na primer, najmanje 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% ili 100% ćelija u sistemu. Poželjno je da se populacija epitelnih matičnih ćelija ili epitelnih progenitorskih ćelija održava tokom ponovljenih prolazaka.

[0091] U specifičnim primerima, humane epitelne matične ćelije mogu se uzgajati u prisustvu dodatnih komponenti uključujući nikotinamid ili Sirtl-specifični HDAC inhibitor kao što je EX527.

[0092] U specifičnim primerima, epitelne matične ćelije izvedene iz unutrašnjeg uha mogu se uzgajati u prisustvu Wnt agonista, inhibitora histon deacetilaze, faktora rasta epidermalnog faktora, osnovnog faktora rasta fibroblasta i opciono, koštanog morfogenog proteina.

[0093] Sistemi ćelijske kulture mogu da sadrže dodatne komponente, uključujući, ali ne ograničavajući se na, submukoznu bazu i oblogu koja sadrži kolagen da bi formirao trodimenzionalne tkivne konstrukcije pogodne za transplantaciju. Prekrivanje kolagena može biti prekriveno i/ili okruženo odabranim epitelnim tkivom ili ćelijskim tipom, kao i da se

2

postavi između izabranog epitelnog tkiva ili ćelijskog tipa i baze submukoze. Odabrano epitelno tkivo ili tipovi ćelija uključuju, ali nisu ograničeni na, epitelne matične ćelije, izolovano tkivo koje sadrži epitelne matične ćelije ili epitelne organoide.

[0094] Submukoza tankog creva (SIS) je uobičajena, biokompatibilna i klinički korišćena skela (de la Fuente i dr., 2003; Ueno i dr., 2007; Schultz i dr., 2002; Kehoe i dr., 2012).

Submukozne skele se podvrgavaju brzoj neovaskularizaciji, granulaciji, biodegradaciji i generalno su dobro očuvane u pogledu sastava proteina među vrstama. Poboljšani sistem kulture zasnovan na submukozama za trodimenzionalne tkivne konstrukcije pripremljen je sejanjem submukoze prethodno odabranim tipom epitelnih ćelija i olakšavanjem rasta prekrivanjem na bazi kolagena. Različita kompozicija SIS pomoću ovog prekrivanja olakšava ćelijsku adheziju i rast na SIS, što rezultira trodimenzionalnom ekspanzijom ćelija vezanih za submukozu u velike epitelne organoide. Životinjske skele matriksa tkiva (npr. želudac, bešika, alimentarna, respiratorna, genitalna submukoza i bazalna membrana jetre) iz toplokrvnih kičmenjaka su zamenljive sa SIS i tako su u okviru predmetnog obelodanjivanja.

[0095] Konstrukti tkiva mogu biti kultivisani u prisustvu rastvora ćelijske kulture poznate u struci ili rastvora ćelijske kulture pronalaska opisanog iznad. Na primer, tkivne konstrukcije mogu biti kultivisane u prisustvu rastvora ćelijske kulture koji sadrži inhibitor koštanog morfogenog proteina, R-spondin 1, CHIR99021 i inhibitor histon deacetilaze. Pored toga, baza submukoze može sadržati slične kombinacije malih molekula i/ili faktora rasta, uključujući, ali ne ograničavajući se na, faktor rasta epidermalnog rasta, morfogeni protein kosti, R-spondin 1, CHIR99021, Y-27632 i inhibitor histon deacetilaze.

[0096] U alternativnim primerima, obezbeđeni su sistemi epitela ćelija bez kolagena, gde baza submukoze sadrži kombinacije malih molekula i/ili faktora rasta, kao što su faktor rasta epiderme, koštani morfogeni protein, R-spondin 1, CHIR99021, Y-27632 i inhibitor histon deacetilaze. Konstrukti tkiva mogu biti kultivisani u prisustvu rastvora ćelijske kulture poznate u struci ili rastvora ćelijske kulture pronalaska opisanog iznad.

II. Postupci pomoću kojih se koriste rešenja i sistemi ćelijske kulture

[0097] Rastvori ćelijskih kultura i sistemi predmetnog obelodanjivanja mogu se koristiti za formiranje epitelnih organoida iz izolovanih matičnih ćelija epitela sa visokom efikasnošću. U specifičnom otelotvorenju, inkubacija izolovanih matičnih ćelija epitela u prisustvu Noggin, R-spondin 1, CHIR99021 i inhibitora histon deacetilaze (npr. valproinska kiselina) formira kolonije epitelnih ćelija sa efikasnošću od najmanje oko 25%, 35%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ili 100%. U još jednom specifičnom otelotvorenju, pojedinačne izolovane matične ćelije epitela inkubirane u prisustvu Noggin, R-spondin 1, CHIR99021 i inhibitor histon deacetilaze formiraju kolonije epitelnih ćelija sa efikasnošću od najmanje 6% do oko 100%.

[0098] Epitelne matične ćelije održavane unutar rastvora ćelijske kulture i sistema predmetnog pronalaska mogu se zatim usmeravati u posebne puteve diferencijacije, uključujući one koji rezultiraju formiranjem Panetovih ćelija, enterocita, peharastih ćelija i enteroendokrinih ćelija.

[0099] Panetove ćelije su pokazale da su važan sastojak matične ćelije Lgr5+ unutar crevnih kripta koji pružaju bitne signale za održavanje matičnih ćelija (Sato i dr., 2011b; Yilmaz i dr., 2012). Prvo inkubiranje epitelnih matičnih ćelija u prisustvu rastvora ćelijske kulture koji sadrži inhibitor BMP, R-spondin 1, CHIR99021 i inhibitor histon deacetilaze (npr., valproinska kiselina), a zatim dalje inkubiranje epitelnih matičnih ćelija u prisustvu najmanje jedan Vnt agonist i bar jedan inhibitor Notch (npr., DAPT) proizvode Panetove ćelije. Slično, naknadna daljnja inkubacija epitelne matične ćelije u prisustvu najmanje jednog inhibitora Wnt i bar jednog inhibitora histon deacetilaze stvara enterocite; i naredna dalja inkubacija epitelne matične ćelije u prisustvu najmanje jednog Wnt inhibitora i bar jednog Notch inhibitora proizvodi peharaste ćelije. Wnt inhibitor može biti ali nije ograničen na, N-(6-Metil-2-benzotiazolil)-2-[(3,4,6,7-tetrahidro-4-okso-3-feniltieno[3,2-d]pirimidin-2-il)tio]-acetamid ("IWP-2") (Chen, Dodge i dr.2009). Notch inhibitor može biti ali nije ograničen na N-[N-(3,5-Difluorofenacetil)-L-alanil]-S-fenilglicin t-butil ester ("DAPT" ili "LY-374973") (Dovey, John i dr.2001), N1-[(7S)-6,7-dihidro-6-okso-5H-dibenz[b,d]azepin-7-il]-2,2-dimetil-N3-(2,2,3,3,3-pentafluoropropil)-("RO4929097", Propandiamid) (He, Luistro i dr. 2011), (S)-2-hidroksi-3-metil-N-((S)-1-((S)-3-metil-2-okso-2,3,4,5-tetrahidro-1H-benzo[d]azepin-1-ilamino)-1-oksopropan-2-il)butanamid ("LY450139") (Lanz, Hosley i dr.

2004), N-[(1S)-2-[[(7S)-6,7-dihidro-5-metil-6-okso-5H-dibenz[b,d]azepin-7-il]amino]-1-metil-2-oksoetil]-2-hidroksi-3-metil-, (2S)- ("LY900009", Butanamid) (Selleckchem: Br. kataloga S7168), N-[(1S)-2-[[(7S)-6,7-dihidro-5-(2-hidroksietil)-6-okso-5H-pirido[3,2-a][3]benzazepin-7-il]amino]-1-metil-2-oksoetil]-4,4,4-trifluoro-("LY3039478", Butanamid) Selleckchem: Br. kataloga S7169, N-[(1S)-2-[[(7S)-6,7-dihidro-5-metil-6-okso-5H-dibenz[b,d]azepin-7-il]amino]-1-metil-2-oksoetil]-3,5-difluoro-α-hidroksi-, (αS)-("LY411575", Benzeneacetamid) (Wehner, Cizelsky i dr.2014), 7-(S)-[N'(3,5-difluorofenilacetil)-L-alaninil]amino-5-metil-5,7-dihidro-6H-dibenz[b,d]azepin-6-on ("YO-01027" (DBZ)) (Milano, McKay i dr.2004), (2R)-2-(N-(2-fluoro-4-(1,2,4-oksadiazol-3-il)benzil)-4-hlorofenilsulfonamido)-5,5,5-trifluoropentanamid ("BMS-708163") (Saito, Fu i

2

dr. 2014), (2R,3S)-N-[(3S)-1-Metil-2-okso-5-fenil-2,3-dihidro-1H-1,4-benzodiazepin-3-il]-2,3-bis(3,3,3-trifluoropropil)sukcinamid ("BMS-906024") (Huang, Greer i dr.2009), (S,S)-2-[2-(3,5-Difluorofenil)-acetilamino]-N-(1-metil-2-okso-5-fenil-2,3-dihidro-1H-benzo[e][1,4]diazepin-3-il)-propionamid ("Jedinjenje E") (Milano, McKay i dr.2004), 2-[(1R)-1-[[(4-Hlorofenil)sulfonil](2,5-difluorofenil)amino]etil-5-fluorobenzenbutanoična kiselina ("BMS-299897") (Anderson, Holtz i dr.2005), SAHM1 Calbiochem Kataloški Broj: 491002, (Abeta42-Selective) Calbiochem Kataloški Broj: 565792, i N-(2-Bromofenil)-N'-(2-hidroksi-4-nitrofenil)urea ("SB 225002") (Bakshi, Jin i dr.2009).

[0100] Sledeća dodatna inkubacija epitelne matične ćelije u prisustvu najmanje jednog inhibitora Notch i sredstva koje inhibira bar jednu od receptora tirozin-kinaze (RTK), kinazu koja se aktivira mitogenom (MAP), takođe se navodi kao MAPK/ERK, ili vanćelijska kinaza regulisana signalom (ERK), koja se takođe naziva MAPK/ERK, proizvodi enteroendokrine ćelije. MAP kinaza može biti, ali nije ograničena na, Mitogen-aktivirana protein kinaza i sredstvo koje inhibira MAP kinazu, može biti, ali nije ograničeno na, N-[(2S)-2,3-dihidroksipropil]-3-[(2-fluoro-4-jodofenil)amino]-4-piridinkarboksamid ("AS-703026") (Kim, Kong i dr.2010), N-[(2R)-2,3-Dihidroksipropoksi]-3,4-difluoro-2-[(2-fluoro-4-jodofenil)amino]-benzamid ("PD0325901") (Thompson i Lyons 2005), 5-(2-Fenilpirazolo[1,5-a]piridin-3-il)-1H-pirazolo[3,4-c]piridazin-3-ilamin ("FR 180204") (Ohori, Kinoshita i dr.2005), 2-(2-amino-3-metoksifenil)-4H-hromen-4-on ("PD98059") (Alessi, Cuenda i dr.1995), 6-(4-bromo-2-hlorofenilamino)-7-fluoro-N-(2-hidroksietoksi)-3-metil-3H-benzo[d]imidazol-5-karboksamid ("Selumetinib") (Huynh, Soo i dr.2007), (Z)-3-amino-3-(4-aminofeniltio)-2-(2-(trifluorometil)fenil)akrilonitril ("SL-327") (Chen, Operana i dr. 2005), (2Z,3Z)-2,3-bis(amino(2-aminofeniltio)metilen)hromensukcinonitril,etanol ("U0126") (Favata, Horiuchi i dr.1998), (R)-3-(2,3-dihidroksipropil)-6-fluoro-5-(2-fluoro-4-jodofenilamino)-8-metilpiyrido[2,3-d]pirimidin-4,7(3H,8H)-dion ("TAK-733") (Dong, Dougan i dr.2011) i N-(3-(3-ciklopropil-5-(2-fluoro-4-jodofenilamino)-6,8-dimetil-2,4,7-triokso-3,4,6,7-tetrahidropirido[4,3-d]pirimidin-1(2H)-il)fenil)acetamid ("Trametinib") (Gilmartin, Bleam i dr.2011). Sredstvo koje inhibira RTK može biti, ali nije ograničeno na, N-(3-hloro-4-fluorofenil)-7-metoksi-6-[3-(4-morfolinil)propoksi]-4-hinazolinamin ("Gefitinib") (Ciardiello 2000), (E)-2-Cijano-3-(3,4-dihidroksifenil)-2-propenamid ("AG 99") (Gazit, Yaish i dr.1989),4-[[(2S)-2-(3-Hlorofenil)-2-hidroksietil]amino]-3-[7-metil-5-(4-morfolinil)-1H-benzimidazol-2-il]-2(1H)-piridinon ("BMS 536924") (Huang, Greer i dr. 2009), 5-(2-Fenil-pirazolo[1,5-a]piridin-3-il)-1H-pirazolo[3,4-c]piridazin-3-ol ("FR 180209") (Anastassiadis, Duong-Ly i dr.2013), N-(3-etinilfenil)-6,7-bis(2-metoksietoksi)hinazolin-4-

2

amin hidrohlorid ("Erlotinib") (Kuiper, Heideman i dr.2014), (S,E)-N-(4-(3-hloro-4-fluorofenilamino)-7-(tetrahidrofuran-3-iloksi)hinazolin-6-il)-4-(dimetilamino)but-2-enamid ("Afatinib") (Minkovsky i Berezov 2008), N-(4-(3-fluorobenziloksi)-3-hlorofenil)-6-(5-((2-(metilsulfonil)etilamino)metil)furan-2-il)hinazolin-4-amin,di4-metilbenzensulfonat ("Lapatinib") (Xia, Mullin i dr.2002), N-(3-(5-hloro-2-(2-metoksi-4-(4-metilpiperazin-1-il)fenilamino)pirimidin-4-iloksi)fenil)akrilamid ("WZ4002") (Sakuma, Yamazaki i dr.2012) i 2-[(3,4-dihidroksifenil)metilen]- ("AG-18", Propandinitril) (Gazit, Yaish i dr.1989).

[0101] Rastvorski rastvori i sistemi obelodanjivanja mogu se dodatno koristiti za formiranje trodimenzionalnih tkivnih konstrukcija koje sadrže transplantabilni epitel u regenerativne svrhe. Takve tkivne konstrukcije mogu se transplantirati u domaćine prema postupcima poznatim u stanju tehnike (Lloyd i dr.2006; Gupta i dr.2006; Yui i dr.2012). Tkiva koja su podložna lečenju uključuju sva oštećena tkiva, uključujući ona koja su mogla biti oštećena bolešću, povredom, traumom, autoimunom reakcijom ili virusnom ili bakterijskom infekcijom. Minimalno invazivne tehnike transplantacije mogu se koristiti, uključujući tehnologiju vođenu slikom. Konstrukcije tkiva mogu se ubrizgati ili implantirati direktno u oštećeno tkivo, gde se mogu umnožiti i na kraju razlikovati u potreban ćelijski tip, u skladu sa njihovim položajem u telu. Tkivne konstrukcije mogu biti direktno implantirane ili ubrizgane putem debelog crevnog klistira. Mikronizacija se može primeniti pre oralne isporuke za gornje crevne primene. Shodno tome, oštećena tkiva posebno pogodna za popravak uključuju tkiva debelog creva, tankog creva, pankreasa, jednjaka i želudačnog sistema. Stručnjak će biti svestan koja će biti odgovarajuća doza tkivnih konstrukcija za određeno stanje koje treba lečiti.

[0102] Rastvori ćelijske kulture i sistemi predmetnog obelodanjivanja mogu se dodatno koristiti za predviđanje efikasnosti hemoterapeutskog sredstva ili kombinacija hemoterapijskih sredstava, in vivo. Ovakvi postupci su posebno relevantni za upotrebu u kliničkim okruženjima jer se mnogi pacijenti leče pomoću više lekova.

[0103] Organoidi tumora mogu da se formiraju u skladu sa postupcima poznatim u tehnici kultivacijom izolovanih agregata tumorskih ćelija ili pojedinačnih ćelija u rastvorskim rastvorima predmetnog pronalaska (Sato i dr., 201 la). Takve kulture mogu se koristiti kao klinički modeli za različite vrste raka, uključujući, ali bez ograničenja na, rak prostate, karcinom dojke, rak želuca, karcinom gušterače, rak pluća, rak mozga, rak debelog creva, rak creva i rak mokraćne bešike.

[0104] Organoidi tumora mogu se inkubirati u prisustvu rastvora ćelijske kulture pronalaska (npr., koji sadrži inhibitor BMP, R-spondin 1, Wnt agonist, inhibitor histon deacetilaze) i

2

hemoterapeutska sredstva. Zatim se odgovarajući parametar meri i procenjuje. Relevantni parametri uključuju inhibiciju ćelijske vitalnosti, inhibiciju ćelijske proliferacije, inhibiciju ekspresije gena povezanih sa tumorima, aktiviranje apoptoze i inhibiciju ćelijskog preživljavanja. Otkrivanje povećanja parametra u poređenju sa referencom (npr., kontrola) ukazuje na efikasnost hemoterapeutskog sredstva u odnosu na tumor organoid, što prediktivno daje efikasnost hemoterapeutskog(ih) sredstva in vivo.

[0105] Generalno, hemoterapijska sredstva se inkubiraju sa sistemom ćelijske kulture koji sadrži tumorske organoide u doznom rasponu za koji se procenjuje da je terapeutski i u trajanju dovoljnom da se proizvede fiziološki efekat. Vreme inkubacije može biti u rasponu od oko 1 sat do 24 sata, ili se po potrebi može produžiti za nekoliko dana ili čak sedmica. Uslovi inkubacije obično uključuju korišćenje rastvora kulture predmetnog pronalaska i održavanje temperature od oko 37°C.

[0106] Hemoterapijsko sredstvo je svaka supstanca koja se procenjuje na njegovu sposobnost da leči, ublažava, leči ili sprečava rak kod ispitanika i uključuje, ali nije ograničeno na, hemijsko jedinjenje, biološko sredstvo, protein, peptid, nukleinsku kiselinu, lipid, polisaharid, dodatak i antitelo.

[0107] Inhibicija ekspresije gena povezanih sa tumorima može se odrediti postupcima poznatim u stanju tehnike. Na primer, inhibicija ekspresije gena povezanih sa tumorima u odnosu na kontrolu može se otkriti analizom mikro čipa, RT-PCR, in situ hibridizacijom, fluorescencijom in situ hibridizacijom ili severnom analizom. Inhibicija ekspresije proteina povezanih u vezi sa kontrolom može se otkriti kvantitativnim zapadnim blotom, imunohistohemijom, imunofluorescencijom, enzimski vezanim imunosorbentom, analizom sekvenci amino kiselina, fluorescentnim sortiranjem ćelija ili analizama koncentracije proteina. Na primer, test analize gena za karcinom želuca može da se koristi za identifikovanje promena u ekspresiji gena za angiotenzin, apolipoprotein E, apolipoprotein AI, ceruloplazmin, protrombin, fibronektin, protein D-vezujući protein, gelsolin, inhibitor interfekcije alfa-tripsina teškog lanca H3, kininogen-1, serumska paraoksonaza/arilsterazaza 1, alfa-1-antihimotripsin i transtiretin.

[0108] Aktivacija apoptoze može se odrediti postupcima poznatim u stanju tehnike. Na primer, povećanje ćelijske smrti u odnosu na kontrolu može se otkriti otpuštanjem laktat dehidrogenaze, aktivnošću kaspaze, obojenjem na aneksin V, obojenjem fosfatidilserinom ili TUNEL testom. Neki testovi otkrivaju relativno kasne događaje u procesu ćelijske smrti, kao što je oslobađanje laktat dehidrogenaze. Aktivacija kaspaze uobičajena je karakteristika hronične toksičnosti i ćelijske smrti. Aktivnost kaspaze može se relativno brzo meriti posle

2

toksične uvrede (30 minuta do 4 sata) fluorescentnom spektroskopijom, na taj način se podvrgavajući tehnikama skrininga velike propusnosti. Ostali markeri i testovi koji se obično koriste za nadgledanje apoptoze ili nekroze ćelija mogu uključivati, ali nisu ograničeni na, prisustvo fosfatidilserina na spoljnjem listiću plazma membrane zahvaćenih ćelija, obojenje aneksinom V i krajnje ispitivanje obeležavanja krajnjim deoksinukleotidiltransferazom (TUNEL).

[0109] Inhibicija ćelijske vitalnosti može se odrediti postupcima poznatim u struci, uključujući, ali ne ograničavajući se na, diferencijalno brojanje održivih i mrtvih ćelija korišćenjem vitalnih boja, kao što su tripansko plavo, 4,6-diaminofenilindol (DAPI) i propidijum jodid.

[0110] Inhibicija proliferacije ćelija može se odrediti postupcima poznatim u struci, uključujući, ali ne ograničavajući se na kvantifikaciju DNK bromodeoksiuridin, merenje tritiranog timidina (3H-timidina), obojenje propidijumom jodidom, intracelularnu metaboličku analizu pomoću tetrazolijumove soli ili redukcijom AlamarBlue i kvantitacija intracelularne koncentracije ATP-a. Dalji postupci uključuju direktno merenje sadržaja ukupne nukleinske kiseline u lizovanim ćelijama pomoću spektrofotometrijske analize; fluorescentno obeležavanje anti-cdc6-peptidnim antitelom, anti-humanim antitelom za vezivanje mRNK za antitelo (anti-HuR antitelo), antitelom protiv D ciklina i inhibitorima inhibitora kinaze zavisnim od ciklina; Ki-67 otkrivanje antigena; merenje sadržaja proteina kvantitativnim zapadnim blotom, imunohistohemijom, imunofluorescencijom, enzimski vezanim imunosorbentom, analizom aminokiselinskih sekvenci, fluorescentnom sortiranjem ćelija ili analizama koncentracije proteina. Kompletno dostupni komercijalni kompleti koji koriste gornje metode uključuju ChromaTide™ nukleotidno obeležavanje, sukcinimidil ester karboksifluoresceinskog diacetata, ABSOLUTE-S™ SBIP test proliferacije ćelija, komplet za ispitivanje ćelijske etikete Vybrant Dill, komplet za ispitivanje ćelijske proliferacije CyQUANT, komplet za ispitivanje proliferacije ćelije, Vybrant™ MTT i komplet za ispitivanje nukleinske kiseline FluoReporter™ Blue Fluorometric.

[0111] Supresija preživljavanja ćelija može se odrediti postupcima poznatim u struci, uključujući klonogenske testove.

III. Metode podsticanja ekspanzije ćelija epitela ili rasta epitelnih tkiva in vivo

[0112] Epitelne matične ćelije, uključujući matične ćelije creva, želuca, pluća, pankreasa i debelog creva i naročito, matične ćelije pozitivne na LGR5 prisutne u crevima, unutrašnjem uhu, mozgu, bubrezima, jetri, mrežnici, stomaku, pankreasu, dojci, folikulu dlake, jajnik,

2

nadbubrežna medula, koža, timus, ukusni pupoljci i mlečne žlezde mogu se proširiti in vivo primenom Wnt agonista i inhibitora histon deacetilaze ili Wnt agonista i Notch agonista subjektu. Ove kombinacije promovišu ekspanziju ćelija epitela, što rezultira rastom epitelnih tkiva in vivo.

[0113] U specifičnim otelotvorenjima, ćelije crevnog epitela mogu da se formiraju in vivo posle primene Wnt agonista, na primer, CHIR99021 i inhibitora histon deacetilaze, npr., Valproinske kiseline, ili Wnt agonista, na primer, CHIR99021 i Notch agonista subjektu.

[0114] U nekim otelotvorenjima, ove kombinacije, npr. CHIR99021 i Valproinska kiselina, mogu lečiti crevne poremećaje kod ispitanika, uključujući, ali ne ograničavajući se, na enterokolitis; virusne infekcije, poput nespecifičnog enteritisa ili specifičnog virusnog enteritisa; divertikulitisa; bakterijskog enterokolitisa, kao što je salmoneloza, šigeloza, Campylobacter enterokolitis ili yersinia enterokolitis; protozojske infekcije poput amebijeze; helmitinska infekcija; pseudomembranski kolitis i plućne komplikacije kod cistične fibroze i hronične opstruktivne plućne bolesti; upala slepog creva; atrofični gastritis; Barrettov jednjak; pneumonitis; upala grlića materice; hronični intersticijski nefritis; kolitis; kolonski divertikulitis; konjunktivitis; kontaktni dermatitis; Kurlingovi čirevi; Kušingovi čirevi; cistitis; gangrena; gingivitis; mastitis; ezofagitis; pankreatitis; panikulitis; flegmonousni gastritis; glomerulonefritis; i autoimune bolesti koje uključuju, ali nisu ograničene na, upalne bolesti creva, ulcerozni kolitis, Kronova bolest, Adisonova bolest i glomerulonefritis (npr., polumesečni glomerulonefritis, proliferativni glomerulonefritis).

[0115] Dozirana primena zavisiće od starosti, pola, zdravlja i težine primaoca, vrste istodobnog lečenja, ako postoji, učestalosti lečenja i prirode željenog efekta. Rasponi doza za primenu sastava predmetnog pronalaska su dovoljno veliki da daju željeni efekat. Doze ne treba da budu toliko velike da izazivaju neželjene efekte, kao što su neželjene unakrsne reakcije, anafilaktičke reakcije i slično. Generalno, doziranje će varirati u zavisnosti od stanja i obima bolesti kod pacijenta. Kontraindikacije, ako postoje, imunološka tolerancija i druge promenljive takođe će uticati na pravilnu dozu. Na primer, uzimajući u obzir faktore kao što su starost, težina, pol, vrsta, opšte zdravstveno/zdravstveno stanje pacijenta, stanje koje se tretira, vreme tretmana, LD50 aktivnog sastojka uključen u odgovarajući model životinja (npr., glodari, miševi) i drugi poznati faktori; i takve doze mogu biti redosleda mikrograma do miligrama, kao što je reda od 0.5 do 500 mg/kg, ili druge pogodne količine, ili se mogu izračunati iz ovde prikazanih primera, npr., uzimajući u obzir prosečnu masu tipične testne životinje (kao što su miševi) i doze koje su primenjene na njih (npr., 100 mikrograma), i tako iskusan stručnjak može odrediti doze bez nepotrebnog eksperimentiranja. Konkretno, kod ljudi, CHIR99021 se daje u količini od oko 0.1 mg/kg/dan do oko 100 mg/kg/dan, a količina Valproinske kiseline se daje u količini od oko l mg/kg/dan do oko 1000 mg/kg/dan. U specifičnim otelotvorenjima, količina Valproinske kiseline je 15-40 mg/kg/dan.

[0116] Farmaceutski sastavi CHIR99021 i Valproinska kiselina mogu se istovremeno ili sekvencijalno davati bilo kojim načinom koji postižu namenu. Na primer, davanje može biti lokalnim, parenteralnim, potkožnim, intravenskim, intramuskularnim, intraperitonealnim, transdermalnim, rektalnim ili bukalnim putevima. Alternativno, ili istovremeno, davanje može biti oralnim putem. Iz prethodnog opisa će biti očigledno da se mogu ovde da se izvrše varijacije i modifikacije u predmetnom pronalasku kako bi se on usvojio u različitim uslovima i uslovima. Ovde su opisani postupci i materijali za upotrebu u predmetnom pronalasku; mogu se koristiti i drugi pogodni postupci i materijali poznati u stanju tehnike. Materijali, postupci i primeri su samo ilustrativni i nisu namenjeni ograničavanju.

[0117] Pronalazak je dalje opisan u sledećim primerima.

PRIMERI

Primer 1: Samoobnavljanje matičnih ćelija Lgr5+ održava se korišćenjem kombinacije malih molekula

[0118] Samoobnavljanje i diferencijacija ISC-a kontroliše koordinirana regulacija nekoliko signalnih staza (Crosnier, Stamataki, & Lewis, 2006; Scoville, Sato, He, & Li, 2008; van der Flier & Clevers, 2009). U ovom istraživanju su identifikovani mali molekuli koji ciljaju relevantne signalne puteve za održavanje statusa samoobnavljanja Lgr5<+>matičnih ćelija i za kontrolu njihove diferencijacije nezavisno od nazora koji pružaju druge vrste ćelija.

[0119] Kripte i pojedinačne Lgr5-GFP ćelije su izolovane kako je ranije opisano (Sato i dr., 2009). Ukratko, prikupljena je proksimalna polovina tankog creva, otvorena je uzdužno i isprana hladnim PBS-om da bi se uklonio luminalni sadržaj. Zatim je tkivo isečeno makazama 2-4 mm i dalje isprano 5-10 puta hladnim PBS-om pipetiranjem gore-dole pomoću 10 ml pipete. Fragmenti tkiva su inkubirani sa 2 mM EDTA u PBS tokom 30 minuta na ledu. Nakon uklanjanja EDTA, fragmenti tkiva su isprani PBS-om da bi se oslobodile kripte. Frakcije supernatanta, obogaćene u kriptama, su sakupljene, propuštene kroz celija od 70 µm i centrifugirane na 300 g tokom 5 minuta. Ćelijski pelet je ponovo suspendiran sa podlogom ćelijske kulture bez faktora rasta i centrifugiran na 150 g da bi se uklonile pojedinačne ćelije. Kripta je zatim kultivisana ili korišćena za izolaciju pojedinačnih ćelija. Da bi se dobile pojedinačne ćelije, kripte su inkubirane 45 minuta u podlozi za kultivisanje na

1

37°C i triturirane staklenom pipetom. Disocijaisane ćelije su propuštene kroz 20 µm sloj, negativno obojene propidijum jodidom i jednostruke održive ćelije visoke GFP sortirane su protočnom citometrijom (FACS Aria, BD), kao što je prethodno opisano (Sato i dr., 2009). Kriptografije tankog creva izolovane iz Lgr5-EGFP-ires-CreERT2 miševa ugrađene su u Matrigel i uzgajane pod uobičajenim uslovima kulture u prisustvu EGF, Noggin i R-spondina 1 (koji se zajedno nazivaju ENR) što dovodi do organoida sa kriptama i vilusima domena i GFP<+>ćelija na vrhovima kripti, u skladu sa prethodnim izveštajima (Sato i dr., 2009).

Izolovane kripte ili pojedinačne ćelije uzgajane su kao što je prethodno opisano (Sato i dr., 2009) uz minimalne modifikacije. Ukratko, kripte ili pojedinačne ćelije bile su zarobljene u Matrigelu i stavljene u središte ploče sa 24 udubljenja. Posle polimerizacije Matrigela (faktor rasta smanjen; BD Biosciences), dodato je 500 µl podloge za kultivisanje (Advanced DMEM/F12 (Life Technologies)) koji sadrži faktore rasta, uključujući EGF (50 ng/ml, Life Technologies), Noggin (100 ng/ml, Peprotech) i R-spondin 1 (500 ng/ml, R&D) i mali molekuli, uključujući CHIR99021 (3 µM, stegen) i valproinsku kiselinu (1 mM, Sigma-Aldrich). Za poređenje različitih uslova kulture, mali molekuli ili faktori rasta su dodavani u sveže izolovane kripte odmah nakon nanošenja u Matrigel radi testiranja sposobnosti da se minimizira potencijalna diferencijacija ISC unutar kripti i na taj način održi kultura kripta. Podloga ćelijske kulture menjana je svakog drugog dana. Za kulturu sa jednom ćelijom ćelije su ugrađene u Matrigel koji sadrži Jagged-1 peptid (1 uM; AnaSpec) i Y-27632 (10 µM; Tocris) je dodat u prva 2 dana. Ćelije su pasirane ili kao ćelijske kolonije kao što je prethodno opisano (Sato i dr., 2009) ili kao pojedinačne ćelije. Za prolazak pojedinačne ćelije uklonjen je medijum ćelijske kulture i dodata je Accutase (Life Technologies). Posle inkubacije na 37°C tokom 10-20 minuta, ćelijske kolonije su disocirane u pojedinačne ćelije pipetiranjem. Ćelije su zatim isprane, ugrađene u sveži Matrigel i posute u ploče sa 24 udubljenja. Ćelije uzgajane u CV stanju pasirane su svakih 6 dana u razdelnom odnosu 1:20. Otprilike polovina uzgojenih kripta sadržavala je GFP+ ćelije, što je u skladu sa in vivo GFP ekspresijom Lgr5-GFP miševa (Sl.1).

[0120] Faktori rasta koji se koriste u stanju ENR-a pružaju suštinske, ali ne i adekvatne napore za održavanje samo-obnove Lgr5<+>matičnih ćelija. Da bi se identifikovali faktori ključni za održavanje statusa samoobnove crevnih matičnih ćelija, izabrani mali molekuli koji moduliraju signalne puteve ISC-a, kao što su Wnt, Notch i BMP, testirani su u ENR uslovima, koristeći Lgr5-GFP reporter. CHIR99021 (ovde se naziva CHIR ili C), GSK3β inhibitor koji aktivira Wnt signalni put, podstiče proliferaciju ćelija kripti, što je naznačeno kvantifikovanjem prosečne veličine organoida i broja ćelija u kulturi (Sl.2A, 2B i 3A, 3B).

2

CHIR je povećao procenat i relativni intenzitet GFP-a GFP<+>ćelija u kulturi, što ukazuje na povećanu samoobnovu matičnih ćelija (Sl.2A i 2B). Značajno je da je u organoidima još uvek postojao veliki broj negativnih ćelija na GFP (Sl.2A), što je verovatno bilo posledica nedovoljnog održavanja samoobnavljanja matičnih ćelija ili posledica promovisanja proliferacije zrelijih GFP negativnih ćelija u kriptama. Valproinska kiselina (VPA ili V), inhibitor histon deacetilaze, takođe je značajno povećala GFP ekspresiju GFP<+>organoida, uz minimalno prisustvo GFP negativnih ćelija (Sl.2A). Zanimljivo je da su se, kada su CHIR i VPA kombinovani (CV), proliferacija ćelija, kao i procenat i relativni intenzitet GFP ćelija koje eksprimiraju u kulturi značajno povećali (Sl.2A i 2B), sa skoro čistim GFP+ ćelijama u GFP organoidima (Sl.2A), što ukazuje na minimalnu diferencijaciju ili proliferaciju diferenciranih ćelija i povećanu samoobnovu matičnih ćelija u ovom stanju kulture.

[0121] GFP<+>ćelije u stanju CV pokazale su jedinstvenu populaciju visokog GFP koja odgovara onoj sveže izolovanih pojedinih ćelija (Sl.3C), što predstavlja populaciju matičnih ćelija Lgr5<+>kao što je ranije objavljeno (Sato i dr., 2009). Primetno, u stanju CV, R-spondin 1 i Noggin su još uvek bili potrebni za održavanje samo-obnavljanja Lgr5<+>matičnih ćelija, dok je EGF promovisao proliferaciju kripti, mogao je da se ukloni iz kulture bez uticaja na održavanje Lgr5<+>ćelija ( Sl.3D). Povećanje koncentracije CHIR dalje eliminiše potrebu za R-spondinom 1 za podsticanje GFP ekspresije (Sl.3E), u skladu sa ulogom R-spondina 1 u povećanju Wnt/β-katenin signalizacije. Pored toga, VPA ili CHIR+VPA takođe promovišu GFP ekspresiju Lgr5+ matičnih ćelija iz debelog creva (Sl.3F). Pored toga, R-spondin 2 je pokazao bolju efikasnost u nižim koncentracijama u promociji stvaranja organoida u stanju ENR u poređenju sa R-spondinom 1 (Sl.3G). Takođe smo testirali uslove kulture za koje je prethodno pokazano da održavaju ljudske matične ćelije EPHB2<+>ili kripte debelog creva u uglavnom nediferenciranom stanju (Jung i dr., 2011; Sato i dr., 2011a), ali nisu uspeli da postignu slične efekte na matične ćelije tankog creva Lgr5-GFP (Sl.4A i 4B), sugerišući da ovi faktori mogu delovati kroz različite mehanizme na EPHB2<+>matične ćelije debelog creva naspram Lgr5<+>matičnih ćelija.

[0122] Da bi se potvrdila proliferacija i Lgr5<+>efekti samoobnavljanja CHIR i VPA u odsustvu zrelih ćelijskih vrsta i GFP negativnih matičnih ćelija (imajući u vidu da kripte pokazuju mozaični GFP obrazac ekspresije), pojedinačne ćelije sa visokim GFP-om izolovane su FACS sortiranjem (Sl.3C) i uzgajan u Matrigelu u prisustvu ENR i CHIR ili VPA, ili u prisustvu oba jedinjenja (stanje CV). Inhibitor Rho kinaze Y-27632, koji inhibira anoikis pojedinih matičnih ćelija (Watanabe i dr., 2007), dodat je prva dva dana kao što je prethodno opisano (Sato i dr., 2009). Posle 7 dana kulture spontano su formirane kolonije koje sadrže matične ćelije GFP<+>. Slično kripto-kulturama, CHIR je značajno povećao proliferaciju ćelija, dok je samo umereno povećao ekspresiju GFP-a, dok je VPA promovisao GFP ekspresiju sa minimalnim pro-proliferativnim efektom. Za stanje CV, ćelija proliferacija se značajno povećala i veće od 97% ćelija u kulturi bile su GFP<+>ćelije (Sl.2C-2E i 5A). Potrebno je primetiti da su u poređenju sa kulturama kripti, kada su čiste pojedinačne Lgr5<+>matične ćelije uzgajane u CHIR, organoidi koji su formirali sadržavali veliki broj negativnih ćelija na GFP, što ukazuje da su matične ćelije diferencirane u ovom stanju i tako su potrebni drugi faktori za održavanje status samoobnavljanja Lgr5<+>matičnih ćelija.

[0123] Kada su izolovane pojedinačne Lgr5-GFP<+>ćelije kultivisane u standardnom ENR stanju, nekoliko ćelija je preraslo u organoide, što je u skladu sa prethodnim izveštajima (Sato i dr., 2009) i verovatno zbog pod-optimalnih uslova kulture. Kada je CHIR dodan kulturi (ENR-C), efikasnost formiranja kolonije značajno je povećana za 20-50 puta (Sl.2F, 2G i 5B, 5C), pružajući sličan odgovor na dodavanje Wnt3A kada se doda u 100 ng/ml (Sl.2F i Sato i dr., 2011b). U oštroj suprotnosti s tim, VPA samo slabo povećava efikasnost formiranja kolonije u odsustvu CHIR (ENR-V, Sl.2F, 2G i 5B, 5C). Iznenađujuće, kada su izolovane pojedinačne Lgr5-GFP+ matične ćelije uzgajane u prisustvu CHIR i VPA, došlo je do sinergističkog efekta i ∼25%-40% ukupne ćelijske populacije je preraslo u kolonije (Sl.2F). Veruje se da predstavlja najefikasniju formaciju kolonija koja je zabeležena za Lgr5<+>matične ćelije.

Tabela 1: Brojevi kolonija za formiranje kolonije na Sl.2G

Tabela 2: Brojevi kolonija za efikasnost formiranja kolonije na Sl.5C

[0124] S obzirom da je deo ćelija sortiran putem FACS bio pod pro-apoptotičkim statusom i obično je umro u roku od 12 sati (Sato i dr., 2011b), žive ćelije su ručno odbrojane 12 sati posle setve. Više od 90% živih ćelija preraslo je u organoide kada su i CHIR i VPA bili prisutni u kulturi (Sl.5D).

Tabela 3: Efikasnost kolonije na Sl.5D

4

[0125] Pored toga, ćelije uzgajane u CV stanju mogu se pasirati kao pojedinačne ćelije za više od 10 pasaža sa sličnom efikasnošću formiranja kolonije sa onom sveže izolovanih Lgr5-GFP ćelija, bez gubitka proliferativne sposobnosti, i pokazale su normalan kariotip (2n = 40) (Sl. 2H). Ovi rezultati sugerišu da CHIR i VPA daju signale koji nisu prisutni u standardnom ENR stanju za održavanje samo-obnove Lgr5<+>matičnih ćelija.

[0126] Kao što je ranije objavljeno, ćelije u stanju ENR prerasle su u organoide sa kriptovilusnom strukturom koja sadrži sve tipove ćelija epitela creva, što je potvrđeno bojenjem enterocita pozitivnih na alkalnu fosfatazu (Alp), staklenih ćelija pozitivnih Mucin 2 (Muc2), Hromogranin A (ChgA) pozitivne enteroendokrine ćelije, pozitivne Panetove ćelije i Lgr5-GFP matične ćelije Lizozime (Lyz). Lgr5<+>matične ćelije leže samo na vrhovima kripte (Sl.

6A i 7A). Bojenje Ki67 i EdU otkrilo je da proliferirajuće ćelije postoje samo u domenima kripte (Sl.6B i 6C). U CV stanju, međutim, matične ćelije GFP<+>bile su prisutne u celoj koloniji uz minimalno prisustvo Panetovih ćelija (Sl.6A) i bez prisustva drugih tipova ćelija. U poređenju sa ENR kulturom, Ki67 ili EdU pozitivne proliferirajuće ćelije u CV stanju postojale su širom ćelijske kolonije (Sl.6B i 6C). Ovo je potvrđeno kvantitativnim PCR-om u realnom vremenu, pri čemu ćelije u CV stanju izražavaju minimalne nivoe Alpi (enterociti), Muc2 (peharaste ćelije), ChgA (enteroendokrine ćelije), umerenih nivoa lizozima (Panetove ćelije) i visokih nivoa Lgr5 (ISC) u poređenju sa ćelijama u ENR stanju (Sl.6D). Taj se obrazac ekspresije održavao tokom više odlomka, a nivo ekspresije Lgr5 je održavan (Sl. 6D).

[0127] Sam CHIR smanjuje diferencijaciju enterocita, ali istovremeno povećava diferencijaciju Panetovih ćelija (Sl.6D), što je u skladu sa prethodnim izveštajem (Farin i dr., 2012). Iako je samo VPA smanjio sekretornu diferencijaciju (Sl.6D) i pomogao da se održi veći deo GFP matičnih ćelija, nije dovoljno da se suzbije diferencijacija matičnih ćelija. Zaista, kada su izolovane pojedinačne matične ćelije uzgajane u prisustvu VPA, ali bez CHIR ili drugih agensa koji promovišu Wnt signalizaciju, njihov opstanak bio je mnogo niži nego kada je Wnt bio prisutan. Kada stazu Wnt blokira IWP-2, samo VPA ne može održavati samoobnavljanje matičnih ćelija (IV stanje na Sl.7B, 7C). Kombinacija CHIR i VPA suzbila je enterocitnu i sekretornu diferencijaciju i održavala program samoobnove Lgr5<+>matičnih ćelija (Sl.6D). Ovi rezultati sugeriraju da CHIR ili VPA sami nisu dovoljni za održavanje samo-obnavljanja Lgr5<+>matičnih ćelija, ali pokazuju sinergetske efekte u kombinaciji sa CHIR ili drugim Wnt aktivatorima.

[0128] Ukratko, dva mala molekula, CHIR i VPA, mogu podržati samo obnavljanje matičnih ćelija Lgr5<+>bez direktnog kontakta sa Panetovim ćelijama ili u njihovom odsustvu.

Konkretno, ovi mali molekuli mogu značajno poboljšati stvaranje kolonija iz pojedinih matičnih ćelija, što ukazuje da pružaju esencijalne niše signale koje obično obezbeđuju Panetove ćelije.

Primer 2: Lgr5<+>matične ćelije ostaju multipotentne sledeći kulture u CHIR i VPA

[0129] Matične ćelije creva imaju sposobnost samoobnavljanja i diferencijacije u sve tipove ćelija u crevnom epitelu, uključujući četiri glavna ćelijska tipa: enterociti, peharaste ćelije, enteroendokrine ćelije i Panetove ćelije. Da bi se testirala sposobnost diferencijacije Lgr5<+>matičnih ćelija koje se uzgajaju u CV stanju, ćelijske kolonije su prebačene u stanje ENR što omogućava Lgr5<+>matičnim ćelijama da se spontano diferenciraju u zrele ćelijske tipove creva. Kao što se očekivalo, nakon povlačenja CHIR i VPA, morfologija organoida se promenila u tipičnu morfologiju organoida uzgajanih u ENR stanju, sa kripto-vilusnom strukturom i Lgr5<+>matičnim ćelijama na vrhovima kripti (Sl.7A i 8A). Ekspresija mRNK diferencijacijskih markera Alpi, Muc2 i ChgA je povišena i ćelije su izrazile sličan nivo lizozima (upoređujući ENR i CV na Sl.7B). Imunocitohemijsko bojenje ovih markera potvrdilo je postojanje diferenciranih tipova ćelija u kulturi (Sl.7A).

Primer 3: Kontroliše se diferencijacija matičnih ćelija creva

[0130] Dalje, sa sposobnošću da se prošire Lgr5<+>matične ćelije visoke čistoće in vitro, pokušalo se usmeravanje diferencijacije Lgr5<+>matičnih ćelija prema zrelim tipovima ćelija. Kako su Wnt i Notch dva glavna signalizaciona putanja koja kontroliraju diferencijaciju ISC, Wnt-inhibitor IWP-2 (takođe I) i Notch inhibitor DAPT (takođe D) korišćeni su da induciraju diferencijaciju kultiviranih Lgr5<+>matičnih ćelija. Pošto se ćelije u stanju ENR spontano diferenciraju u organoide koji sadrže sve vrste epitelnih ćelija, ENR je uključen u kulture diferencijacije. Nakon kultivacije pojedinih matičnih ćelija u CV stanju tokom 6 dana, ćelijske kolonije su sakupljene i prebačene u nekoliko udubljenja i uzgajane u prisustvu pojedinačnih ili višestrukih inhibitora (Sl.8B). Kao što je prikazano na Sl.7B, zamenom CV sa IWP-2 ili DAPT smanjena je ekspresija ISC markera Lgr5 i indukovana ekspresija markeri za diferencijaciju Alpi, Muc2, ChgA i lizozim. Izrazito, prisustvo VPA (npr. Poređenje između R i V, I i IV, C i CV, ili D i DV) izazvalo je niži nivo ekspresije Muc2, ChgA i lizozima, ali ne i Alpi, što ukazuje na VPA posebno potisnutu sekretornu ćelijsku lozu diferencijacija. Alternativno, inhibicija Wnt sa IVP-2 preferencijalno indukovanom Alpi ekspresijom, sa skromno povišenom ekspresijom Muc2 i ChgA i potpuno ukida ekspresiju lizozima i Lgr5. Ovo ukazuje da je Wnt signalizacija potrebna za održavanje strogosti i za suzbijanje diferencijacije, ali je takođe potrebna i za diferencijaciju Panetovih ćelija. Notch inhibitor DAPT je uveliko povisio markere sekretornih tipova ćelija, uključujući Muc2, ChgA i lizozim, što je u skladu sa prethodnim izveštajima da Notch inhibicija indukuje diferencijaciju sekretornih ćelija (Milano i dr., 2004; VanDussen i dr., 2012; Wong i dr., 2004). Pored toga, kombinacija IWP-2 i VPA specifično je inducirala diferencijaciju enterocita, verovatno kombinacijom efekata oba inhibitora, u kojima je IWP-2 inducirao diferencijaciju matičnih ćelija Lgr5<+>, dok je VPA potisnula diferencijaciju Lgr5<+>matičnih ćelija prema sekretornim tipovima ćelija. Slično tome, kombinacija DAPT i CHIR uglavnom je inducirala diferencijaciju Panetovih ćelija, a kombinacija IWP-2 i DAPT primarno je inducirala diferencijaciju peharastih ćelija. Ovi uslovi su takođe izazvali jasne morfološke promene koje su ličile na morfologiju svakog diferenciranog tipa ćelije (Sl.7C i 8D). Bojenje enterocita, pehara i Panetovih ćelijskih markera potvrdilo je gornja zapažanja (Sl.

7C, 7D i 8E, 8F).7C, 7D i 8E, 8F). Prisustvo IWP-2 ili CHIR nije značajno uticalo na ekspresiju ChgA, što ukazuje da u poređenju sa peharastim ćelijama i Panetovim ćelijama, diferencijacija enteroendokrinih ćelija ne zahteva strogo inhibiciju ili aktivaciju Wnt.

Primer 4: Ispituje se mehanizam koji posreduje u odgovoru CHIR i VPA

[0131] CHIR je visoko-specifični inhibitor GSK3 koji aktivira signalni put Wnt/β-katenina (Bain i dr., 2007) i korišćen je za održavanje stanja samoobnove embrionalnih matičnih ćelija (Ying i dr., 2008). Da bi se potvrdilo da je efekat CHIR bio kroz aktiviranje Wnt putanje, testirani su efekti drugih aktivatora Wnt puta, uključujući litijum i Wnt3a. Zamena CHIR sa LiCl ili Wnt3a povećala je proliferaciju kripta, što je naznačeno povećanom veličinom kolonije i brojem ćelija u poređenju sa stanjem ENR (Sl.9A i 9B). Kolonije u ovim uslovima pokazale su strukture slične cisti (Sl.9A) kao što je prethodno prikazano (Sato i dr., 2011b). Slično, testirani su i efekti drugih inhibitora HDAC, uključujući pan-HDAC inhibitore i tipične inhibitore. pan-HDAC inhibitor TSA kao i HDAC6 specifični inhibitor Tubastatin A i Jedinjenje 7 pokazali su sličan efekat promovisanja GFP ekspresije sa VPA (Sl.9C i 9D). Dok su drugi pan-HDAC inhibitori, uključujući SBHA i butirat, kao i klasa I (CI-994, MS275, Sl.9C i 9D), klasa IIa (MC1568, Sl.9C i 9D) i klasa III (nikotinamid, Sl.9F ) HDAC inhibitori nisu pokazali ili su imali samo umerene efekte za podsticanje GFP ekspresije (Sl.9C-9F). TSA i VPA su pokazali izrazit efekat inhibicije proliferacije pri većoj koncentraciji, ali su zadržali ekspresiju GFP-a u obe koncentracije (Sl.9E). Treba napomenuti da je nikotinamid, inhibitor HDAC porodice Sirtuin (klasa III) koji se koristio u kultivaciji humanih kripta debelog creva (Jung i dr., 2011; Sato i dr., 2011a), nisu promovisali GFP ekspresiju ili ćelijsku proliferaciju u kombinaciji sa CHIR ili Wnt3a (Sl. 9F), što ukazuje da deluje kroz različite mehanizme od VPA. Štaviše, kada su kultivirane pojedinačne Lgr5<+>matične ćelije koristeći CHIR sa TSA ili Tubastatin A, ili VPA sa Wnt3a, BIO ili LiCl, ćelije su pokazale sličnu efikasnost formiranja kolonije, morfologiju kolonije i GFP ekspresiju sa onim u stanju CV (Sl.10).

[0132] Prethodni izveštaji su pokazali da je potrebna aktivacija Notch putanje da se inhibira diferencijacija sekretornih ćelija i održi samoobnavljanje matičnih ćelija, što je u skladu sa efektima lečenja VPA. Procenjeno je da li VPA cilja elemente putanje Notch radi ostvarivanja njegovih efekata. Prvo je testirano sprečavanje inhibicije Notch dodavanjem VPA. Tretman inhibitorom g-sekretaze DAPT doveo je do oštećene ćelije proliferacije i ekspresije GFP, što je VPA spasio na način zavisan od doze (Sl.11A). Ovo sugeriše da VPA deluje nizvodno od formiranja NICD i da može zaobići zahtev Notch aktivacije posredovane ligandnim receptorima.

[0133] Prethodno je pokazano da VPA aktivira put Notch u ćelijama raka (Greenblatt i dr., 2007; Stockhausen i dr., 2005). Da bi se ispitao uticaj VPA na aktivaciju Notch putanje, ćelije uzgajane u uslovima ENR ili ENRC tretirane su VPA i analizirane na ekspresiju gena Notch puta. Utvrđeno je, međutim, da dodavanje VPA u ENR ili ENR-C tokom 24 sata umereno smanjuje ekspresiju Notch1 ili Hes1, koji je nizvodni ciljni gen Notch (Sl.11B i 11C). Pored toga, primećeno je značajno smanjenje negativnog cilja Notch Atohl (Math1) u ćelijama tretiranim VPA i CHIR tokom 24 sata ili 6 dana (Sl.11B-11D). Pokazalo se da je atol ključan za diferencijaciju ISC prema sekretornom ćelijskom rodu (van Es i dr., 2010; Yang i dr., 2001). Matične ćelije creva ostaju funkcionalne i in vivo i in vitro nakon ablacije Panetovih ćelije izazvane nedostatkom Atohla (Durand i dr., 2012; Kim i dr., 2012).

Inhibicija atola posle tretmana CHIR ili CHIR+VPA pomogla bi u održavanju programa samoobnove crevnih matičnih ćelija.

[0134] Shodno tome, kontrola samoobnavljanja Lgr5<+>matičnih ćelija creva i njihova diferencijacija prema diferenciranim tipovima ćelija u crevnom epitelu in vitro je sada postignuta korišćenjem kombinacije faktora rasta i inhibitora malih molekula, koji usko oponaša in vivo crevno biologija epitela (Sl. 12A i 12B). Pod fiziološkim uslovima (Sl.12A), samoobnavljanje i diferencijacija ISC kontroliše se saradnjom Wnt i Notch puteva.

Aktiviranje oba puta (naznačeno Wnt On i Notch On) održava ISC u nediferenciranom statusu koji se samo obnavlja. Deaktivacija Notch putanje (Notch Off) dovodi do specifikacije sekretornih tipova ćelija, a daljnja deaktivacija Wnt staze (Wnt Off) dovodi do diferencijacije peharastih ćelija. Kontinuirana aktivacija Wnt putanje u odsustvu Notch dovodi do diferencijacije Panetovih ćelija. Ne postoji snažna zavisnost Wnt putanje za diferencijaciju enteroendokrinih ćelija. Alternativno, kontinuirana Notch aktivacija i Wnt deaktivacija dovode do diferencijacije ćelija enterocita. Kad se Lgr5+ matične ćelije uzgajaju in vitro (Sl.12B), CHIR99021 aktivira Wnt put i inhibira diferencijaciju enterocita dok VPA sama ili zajedno sa CHIR suzbija specifikaciju sekretornih ćelija. Kombinacija CHIR i VPA održava ISC u nediferenciranom, samoobnavljajućem statusu. Inhibicija puta Notch sa DAPT dovodi do specifikacije sekretornih tipova ćelija i dalje dodavanje CHIR dovodi do diferencijacije Panetovih ćelija, dok dodavanje inhibitora Wnt-ovog puta IWP-2 dovodi do diferencijacije peharastih ćelija. Alternativno, kombinacija IWP-2 i VPA, koja indukuje diferencijaciju i suzbija specifikaciju sekretornih ćelija, dovodi do diferencijacije enterocita.

Primer 5: Proliferacija Lgr5-pozitivnih matičnih ćelija dobijenih iz unutrašnjeg uha povećava se u prisustvu CHIR i VPA

[0135] Senzorne dlake ćelija Kortijevog organa sisara u unutrašnjem uhu se ne regenerišu nakon oštećenja. Li i dr., 2003, otkrili su da senzorni epitel odraslih kod utrikulusa sadrži ćelije koje pokazuju karakteristične matične ćelije. Ove matične ćelije unutrašnjeg uha mogu se uzgajati in vitro kao sferne suspenzije u prisustvu EGF, bFGF i IGF-1 (Li i dr., 2003). Kasnije je otkriveno da post-mitotičke podržavajuće ćelije zadržavaju sposobnost deljenja i trans-diferencijacije u nove ćelije dlake u kulturi (Patricida i dr., 2006, Nature), sugerišući da ove podržavajuće ćelije mogu biti matične ćelije unutrašnjeg uha. Prečišćene kohlearne noseće ćelije mogu se uzgajati in vitro u prisustvu EGF, bFGF na embrionalnim periodičnim mezenhimnim dovodnim ćelijama. (Patricia i dr., 2006). Shi i dr. otkrili su da podskup potpornih ćelija kod novorođenčadi i odrasle mišiji kohleje izražava Lgr5, marker za matične ćelije odraslih (Shi i dr., 2012). Važno je da Lgr5-pozitivne ćelije mogu biti izolovane i kultivisane u jednoćelijskoj suspenziji, u prisustvu EGF, bFGF i IGF-1, i pokazati pojačan kapacitet samoobnove u poređenju sa Lgr5-negativnim ćelijama. Prethodne kulture matičnih ćelija unutrašnjeg uha koristile su postupak suspenzione kulture u kojoj bi samo oko 0,068% ukupnih ćelija (Li i dr., 2003) ili 2% sortiranih Lgr5-pozitivnih ćelija moglo da formira sfere (Shi i dr., 2012), verovatno zbog neadekvatnog okruženja za rast ćelija. Kao što je ovde opisano, sada je razvijen visoko efikasan in vitro sistem kulture za matične ćelije unutrašnjeg uha.

[0136] Izolovana mišja kohlea iz P1 do P2 Lgr5-GFP miševa sadržavala je Lgr5-pozitivne ćelije kao što je prikazano na Sl.13A. Prvo je uspostavljeno isto stanje kulture (EGF, Noggin, R-spondin1 ili "ENR") kao što je korišćeno u Lgr5+ kulturama matičnih ćelija tankog creva. Kao što je prikazano na Sl.13B, kombinacija EGF-a, Noggin i R-spondina 1 povećala je efikasnost formiranja kolonije iz pojedinih matičnih ćelija kohlearnih epitela u poređenju sa EGF. Kao što se očekivalo, kombinacija CHIR i VPA, ali ne i CHIR sama, uvelike je povećala efikasnost formiranja kolonije, proliferaciju ćelija i GFP ekspresiju ćelija. Iznenađujuće, uklanjanje Noggin iz ENR-CV kombinacije (uslov „ER-CV“) rezultiralo je malo većom efikasnošću formiranja kolonije i većim nivoom ekspresije GFP, što pokazuju svetlosne i GFP slike na Sl.13B. Ovi rezultati pokazuju da aktiviranje Wnt puta pomoću R-spondina1 ili CHIR promoviše proliferaciju matičnih ćelija unutrašnjeg uha, a kombinacija CHIR i VPA u velikoj meri promoviše proliferaciju i samo-obnavljanje matičnih ćelija unutrašnjeg uha.

[0137] Mitogeni faktori rasta koji uključuju EGF, bFGF i IGF-1 prethodno su korišćeni u sistemu kulture suspenzije i pokazali su da promovišu formiranje sfere izolovanih matičnih ćelija unutrašnjeg uha (Li i dr., 2003; Shi i dr., 2011). Zatim su efekti CHIR i VPA testirani u prisustvu ovih faktora rasta kako je opisano u Tabeli 1.

Tabela 4: Rastvori ćelijske kulture

4

[0138] Izolovani Kortijev organ iz Lgr5-GFP miševa je disociran u pojedinačne ćelije koristeći aktazu i uzgajan u više kombinacija rastvorljivih faktora i malih molekula u Matrigelu tokom 8 dana. Dobijene kulture su dalje disocirane u pojedinačne ćelije i analizirane pomoću FACS. U skladu sa prethodnim rezultatima, dodavanje CHIR i VPA, ali ne samo CHIR ili VPA, značajno je povećalo proliferaciju ćelija (9-20 puta) i GFP ekspresiju kako je prikazano procentom GFP+ ćelija (60 puta) i relativnim GFP intenzitetom GFP+ ćelije (2 puta) (Sl.14A i 14B). Pored toga, kombinacija EGF, bFGF-a i IGF-1 (označenih kao EFI) poboljšala je proliferaciju ćelija i ekspresiju GFP-a u poređenju sa uslovima ENR (Sl.

14A-14C).

[0139] Da bi se dalje ispitivalo uticaj pojedinačnih faktora rasta u kombinaciji sa CHIR i VPA, testirani su faktori rasta koji uključuju Mitogene faktore rasta (EGF, bFGF i IGF-1) kao i Wnt agonist R-spondin 1 u kombinaciji sa CHIR i VPA. Dodavanje EGF stanju CV značajno je povećalo proliferaciju ćelija što je naznačeno povećanim brojem ćelija u kulturi. Dodavanje bFGF, ali ne IGF-1 ili R-spondina 1, u EGF+CV dodatno povećava proliferaciju ćelija i ekspresiju GFP (Sl.14D). Iako je dodavanje IGF-1 ili R-spondina 1 kombinaciji EGF+bFGF neznatno povećalo ekspresiju GFP-a (Sl.14E), otkrili smo da oni nisu neophodni za održavanje proliferacije i GFP ekspresije uzgojenih ćelija (Sl.14F).

Primer 6: Pozitivne ćelije crevnih matičnih ćelija formiraju transplantabilne kripte

[0140] Da bi se ispitao potencijal presađivanja matičnih ćelija creva, in vitro je testirano ugrađivanje kripta tankog creva na zdravom tkivu debelog creva. Tkivo debelog creva je sakupljeno od miševa divljeg tipa i otvoreno je uzdužno. Fragment od 1 cm je uklonjen i ispran PBS-om. Epitelni sloj je uklonjen struganjem hirurškim sečivom, a tkivo je postavljeno u ploču sa 24 udubljenja. Kriptografije tankog creva izolovane od Lgr5-GFP miševa obojene su DiD membranskim bojama i stavljene na tkivo debelog creva u roku od 5-10 ul kristalizovanog medijuma koji sadrži napredni DMEM/F12 (Invitrogen), 2 mM GlutaMax (Invitrogen), 10 mM Hepes (Invitrogen), 100 U/ml penicilina/100 ug/ml Streptomicin (Invitrogen), 1x N2 dodatak (Invitrogen), 1x B27 dodatak (Invitrogen), 50 ng/ml EGF (Peprotech), 500 ng/ml R-spondina 1 (R&D sistemi), 10 µM Y-27632 (inhibitor Rho kinaze, Sigma-Aldrich; i 100 ng/ml Noggin (Peprotech). Tkivo je dalje inkubirano na 37°C tokom 30-60 minuta u vlažnom okruženju da se dozvoli prianjanje kripti. Podloge za kultivisanje kripta su zatim dodavani u udubljenja, a kripte su dalje kultivisane tokom 7 dana. Posejane kripte pričvršćene na debelo crevo i šire se za 24 sata (Sl.15). Fluorescentna slika je pokazala kripte upisane na debelo crevo za 48 sati (Sl.16) i održavale su Lgr5-GFP ekspresiju najmanje jednu nedelju (Sl.17).

[0141] Da bi se dodatno ispitala sposobnost ugradnje kripti tankog creva, korišćen je TRUC model miša koji pokazuje spontani ulcerozni kolitis i oponaša ljudsko stanje. Prolapsano tkivo se izvadi iz TRUC miša i ispere sa PBS-om i postavi u ploču sa 24 udubljenja. Kripte tankog creva obojene su DiD-om i postavljene na prolapsno tkivo. Tkivo je zatim inkubirano na 37°C tokom 30-60 min u vlažnom okruženju da se dozvoli prianjanje kripti. Podloge za kultivisanje kripti su dodavane u udubljenja. Prolapsno tkivo i kripte dalje su kultivisani in vitro tokom 2 dana. Kao što se očekivalo, kripte su ugravirane na razvučeno tkivo (Sl.17). Primer 7: Sistemi kultura flastera za male crevne organoide oponašaju trodimenzionalno fiziološko okruženje

[0142] Sada je razvijen in vitro sistem kulture koji može da podrži rast velikih, organizovanih trodimenzionalnih ćelijskih struktura (npr. organoida) na submukoznoj skeli. Kao što je opisano u daljem tekstu, poboljšani sistem kulture tankog creva ("SIS") za trodimenzionalne tkivne konstrukcije pripremljen je sejanjem submukoze prethodno odabranim ćelijskim tipom i olakšavanjem rasta pomoću jedinstvenog prekrivanja na bazi kolagena. Taj prekrivajući sloj, u početku predpolimerizacija viskozne tečnosti, koristi se za oblaganje semenki, ćelija u ranom stadijumu ili organoida (subkultura iz ćelija), kao i za oblaganje SIS baze da bi ćelije obuhvatile ostatak kolagena (Sl.19E i 19F). Posle polimerizacije, tečnost se učvršćuje kako bi održala svoj položaj u kontaktu sa ćelijskim membranama, kao i SIS-om i pospešuje organoidnu ekspanziju. Sada je otkriveno da menjanje sastava SIS-a pomoću ovog prekrivača olakšava adheziju i rast ćelija. Ovo će olakšati in vitro, za razliku od in vivo, sazrevanje tkiva. Ovo je jedinstveno poboljšanje u odnosu na druge sintetičke sisteme zasnovane na submukoznom sistemu, pri čemu se pre transplantacije postiže trodimenzionalno širenje prilepljenih ćelija na velike organoide tipa endogenog tipa.

[0143] Pored toga, otkriven je i postupak za podržavanje trodimenzionalnog organoidnog rasta submukoze brzinom koja je uporediva sa Matrigelom bez upotrebe slojeva gela. Ovaj sistem se sastoji od SIS kralježnjaka i unapred odabranih ćelija, zasijanih na SIS zakrpu. Prethodno odabrana bioaktivna sredstva se infuziju u flasteru pre setve ćelije da bi se podržao ovaj sistem kulture bez gela (Sl.19C i 19D).

[0144] Da bi se razvio sistem kulture flastera, istraživane su različite kombinacije SIS baze i prekrivanja kolagena sa infuziranim faktorima rasta (Sl.19E i 19F). Ovo je omogućilo stvaranje interfejs fiziološkog tkiva sa prelazom iz krute (SIS) u meke (kolagene) matrice. Utvrđeno je da semenske ćelije i organoidi presvučeni ostatkom kolagena obezbeđuju trodimenzionalno okruženje slično onome koje daje Matrigel. Kao takav, ovaj sistem je pogodna zamena za Matrigel u kultivaciji trodimenzionalnih organoidnih konstrukcija.

Većina semenskih ćelija ili organoida su oboje vezani za SIS na donjoj polovini ćelijskih membrana, ali su takođe omotani polimerizovanim kolagenom na nesvrstanim delovima membrane (Sl. 19E, inset). Stoga je svaka ćelijska membrana funkcionalno zatvorena u obliku matriksa, bilo da je to SIS ili kolagen. U nekim uzorcima korišćena su različita bioaktivna sredstva koja podržavaju ćelijsko i organoidno sejanje, rast i diferencijaciju osim

4

samog SIS-a (Sl.19F). Dok podnosioci prijava opisuju infuziju biomolekula specifičnih za kulturu matičnih ćelija creva, izjavljeno je da biomolekule mogu biti prilagođene da pomognu u rastu ostalih semenskih ćelija iz različitih tkiva, uključujući pankreas, dojku, jetru i želudačno tkivo. Shodno tome, biomolekule specifične za tkiva mogu se odabrati između sledećeg: antivirusno sredstvo, antimikrobno sredstvo, antibiotičko sredstvo, aminokiselina, peptid, protein, glikoprotein, lipoprotein, antitelo, steroidno jedinjenje, antibiotik, antimikotik, citokin, vitamin, ugljeni hidrat, lipid, vanćelijski matriks, vanćelijska komponenta matriksa, hemoterapijsko sredstvo, citotoksično sredstvo, faktor rasta, sredstvo protiv odbacivanja, analgetski, antiinflamatorno sredstvo, virusni vektor, kofaktor sinteze proteina, hormon, endokrino tkivo, sintesajzer, enzim, polimer-ćelijski skelet sa parenhimskim ćelijama, angiogeni lek, mali molekul, nanočestice, rešetka kolagena, antigensko sredstvo, citoskeletno sredstvo, nukleinska kiselina, ćelijski atraktant.

[0145] Za početak, izolovane su kripte u skladu s prethodnim postupcima (Sato i dr., 2009, Yui i dr., 2012). Tanko crevo miševa je izolovano, podrezano uzdužno i isprano ledeno hladnim PBS-om da bi se očistio luminalni sadržaj. Fragmenti su isečeni na komade od 2 mm, prebačeni u epruvetu od sokole od 50 ml i lagano isprani u 50 ml ledeno hladnog PBS-a korišćenjem 10 ml pipete. Supernatant je uklonjen i postupak je nastavljen dok se supernatant ne očisti. Fragmenti su inkubirani tokom 45 minuta na 4°C u PBS koji sadrži 2 mM EDTA da bi se oslobodile kripte. Supernatant je uklonjen i fragmenti se pipetiraju gore-dole sa 50 ml PBS. Jednom kada je potvrđeno da supernatant sadrži kripto-frakciju, suspenzija je filtrirana kroz ćelije od 70 µm i centrifugirana na 300 g tokom 5 minuta. Kripte su ponovo suspendovane u 10 ml ledeno hladnog medijuma bazalne kulture (koji sadrži napredni DMEM/F12 (Invitrogen) 2 mM GlutaMaxx (Invitrogen), 10 mM Hepes (Invitrogen) i 100 U/ml penicilina/100 ug/ml Streptomicin (Invitrogen)) i prenesen u epruvetu od sokola od 15 ml. PBS ispiranje je ponovljeno i kripte su centrifugirane na 200 g tokom 2 minuta da bi se uklonile pojedine ćelije. Kripti su prebrojani i premešteni u ploču sa 48 udubljenja ili sa Matrigel ili Kolagen I (koji se sastoji od 100 ul 10x PBS, 4.9 ml NaOH, 684µl H20 i 211 ul kolagena tipa I (rep pacova visoke koncentracije 9.49 mg/ml; BD Biosciences) u koncentraciji od 1000 kripti po udubljenju, od kojih svako udubljenje sadrži 200 µl matriksa. Posle polimerizacije izabranog gel proizvoda, dodato je 500 µl 1x standardnog medijuma za kripto kulturu (bez seruma) koji sadrži napredni DMEM/F12 (Invitrogen), 2 mM GlutaMax (Invitrogen), 10 mM Hepes (Invitrogen), 100 U/ml Penicilin/100 ug/ml Streptomicin (Invitrogen), dodatak 1x N2 (Invitrogen), dodatak 1k B27 (Invitrogen), 50 ng/ml EGF (Peprotech), 500 ng/ml R-spondina 1 (R&D Systems), 10 µM I -27632 (inhibitor Rho kinaze, Sigma-Aldrich; i 100 ng/ml Noggin (Peprotech). Ćelije su uzgajane 4-5 dana pre setve na flaster, menjajući podlogu svaki drugi dan. Y-27632 je uključen u podlogu za kultivisanje prvih 48 sati.

[0146] Nakon 4-5 dana provedenih u kulturi, Lgr5+ organoidi su pasirani korišćenjem prethodno opisanog modifikovanog protokola (Sato i dr., 2009). Podloga za kultivisanje je uklonjena iz Matrigela, koji je zatim ručno razbijen pipetom p1000, a zatim je prenesen u 15 ml Falcon epruvetu obloženu BSA. Kolageni gelovi su inkubirani 5 minuta u DMEM koji sadrži kolagenazu tipa XI na 37°C, a zatim su preneseni u 15 ml Falcon epruvetu obloženu BSA. Dodati su bazalne podloge i organoidi su nežno razbijeni čestim pregledom invertiranom mikroskopijom dok većina organoida nije mono-kripta. Organoidi su isprani u 10 ml bazalne podloge i centrifugirani na 200 g tokom 2 minuta. Pelet je resuspendovan u podlozi za kultivisanje za kripto kulturu u koncentraciji od 500 mono-kripto organoida na 500 µl.

[0147] Zakrpe su generisane i pripremljene za setvu unutar udubljenja standardne ploče od 48 udubljenja (jedan flaster po udubljenju, luminalna strana nagore). SIS je isečen na željenu dužinu da se pokrije dno svakog udubljenja (∼1cm za ploču od 48 udubljenja). Izolacija SIS-a je ranije opisana (Badilak i dr., 1989). Koristeći se tupim pincetama, svaki SIS segment prebačen je na dno bušotine i pažljivo se širio do punog prečnika, luminalne strane okrenute nagore. Orijentacija je potvrđena analizom pod invertiranom mikroskopom da bi se na površini prikazao acelularni ostatak kripta. Ovisno o potrebnoj usklađenosti i čvrstoći, više slojeva SIS-a mogu se slojevito i međusobno lepiti. U ovom slučaju, svaki segment može da se širi jedan iznad drugog za željeni broj segmenata i flaster je nežno stisnut pincetama i ostavljen da se osuši na 5% CO2, 37°C tokom 5 minuta. Pre setve, svaki segment flastera je dehidriran pasivnim uparavanjem tokom 24 sata i infuziran koncentrovanom podlogom za kultivisanje kripti i, izborno, malim molekulima kao što je opisano u daljem tekstu.

Konkretno, svaki segment flastera je postavljen i rasprostranjen, luminalno nagore, u jažicu ploče od 48 udubljenja i 100 µl koncentrovanih faktora (EGF, Noggin, R-spondin 1, Y-27632, Valproinska kiselina i CHIR) je deponovana na 24 sata inkubacije na 5% CO2, 37°C.

[0148] Pojedinačni 500 µl jednokriptirani organoidni uzorci su deponovani u udubljenje koje sadrži bazu flastera i inkubiraju se 24 sata na 5% CO2i 37°C (Sl.20A). Zasejani flasteri održavane su u mediju za kulturu 24 sata da bi se omogućilo čvrsto prijanjanje i da bi se dobila nutritivna podrška od ugrađenih faktora rasta u flasteru (Sl.20B).

[0149] U nekim uzorcima, tanak ostatak gena od kolagena (nazvan kao gel-flaster) nanesen je na vrh flastera/organoidnog kompleksa da bi se obezbedilo minimalno, ali funkcionalno

4

trodimenzionalno okruženje za svaki organoid. Fizički i hemijski znakovi dobijeni sa ćelijske površine povećavaju trodimenzionalnu proliferaciju ćelija kako bi se replicirala fiziološka morfologija (Seidi, A., i dr., 2011). Matrica kolagena I (20-40 µl) nanesena je na zasejane ploče, vodeći računa da se površinski napon iskoristi za sprečavanje širenja gela preko flastera (Sl.20C), a ploča sa udubljenjima se inkubira na 5% CO2, 37°C tokom 30 minuta. Podloga za kultivisanje kripte (500 µl) je odložena u svako udubljenje i menjan svaki drugi dan.

[0150] U nekim uzorcima flaster je inkubiran faktorima rasta pre sejanja da bi se ispitivalo da li će olakšati prijanjanje organoida u prva 24 sata. U skladu s tim, GF-infuzirani flasteri (uključujući EGF, Noggin, R-spondin 1, Y-27632, Valproic Acid i CHIR) nasuprot neinfuziranim flasterima (SIS u PBS) su posejani. U ovom testu, neinfuzovane zakrpe koristile su bazalni medij umesto podloga za kultivisanje kako bi i organoidi lišili faktora rasta podloge.

[0151] Rast crevnih organoida procenjen je kvantifikovanjem broja kripti po organoidu u 7 zasebnih sistema: Matrigel (kontrola), sistem gel-flastera sa infuziranim faktorima rasta (koji se ovde nazivaju GF, uključujući EGF, Noggin, R-spondin 1, I-27632, valproinska kiselina i CHIR), goli flaster sa infuziranim GF, ali bez prekrivanje kolagena, samo Kolagen I gel, Kolagen I gel sa GF-om dodan direktno u medijume kulture (uključujući EGF, Noggin, R-spondin 1, Y-27632, valproinska kiselina i CHIR), Kolagen I gel sa GF-om ugrađenim u gel sama (uključujući EGF, Noggin, R-spondin 1, Y-27632, valproinska kiselinu i CHIR), i goli flaster bez prekrivanja kolagena ili infuzije GF. Osim grupe kolagena I sa GF i malim molekulima dodanim direktno u medijum, svi medijumi kulture bili su standardni između svakog sistema, menjali su se svaki drugi dan i uključivali EGF, Noggin, R-spondin 1, Y-27632 (prvih 48 sati samo). Standardna podloga za kultivisanje kripte opisana je iznad.

[0152] Eksperiment je sproveden tokom 96 sati, a dnevno kvantifikovanje organskog rasta je dokumentovano vizuelnim pregledom broja kripti po organoidu. Sistem gel-flastera sa GF bio je u stanju da podrži rast organoida na nivoima koji su uporedivi sa Matrigelovim kontrolama (Sl. 19). Goli flaster, bez GF, nije bio u stanju da podrži merljivi rast organoida. Posle detaljnijeg pregleda, izgledalo je da goli SIS flaster raste Lgr5+ ćelije u listovima, za razliku od trodimenzionalnih organoida. Međutim, goli flaster sa infuziranim GF (EGF, Noggin, R-spondin 1, Y-27632, valproinska kiselina i CHIR) podržavao je rast organoida uporedo sa sistemom gel-flastera i Matrigelom. Ovo ukazuje da je uz dovoljnu podršku GF sistem kulture bez gela sposoban da održi kratkotrajni, trodimenzionalni organoidni rast naspram Matrigela. Dok sam kolagen I olakšava umereni organoidni rast, SIS infuziran s GF

4

predstavlja održivu zamenu za 3-dimenzionalni efekat promocije rasta kolagena. Pored toga, kada su isti GF (EGF, Noggin, R-spondin 1, I-27632, valproinska kiselina i CHIR) dodati direktno u podlogu za kultivisanje gel kulture Kolagena I, stope organoidnog rasta su ostale niske. Pored toga, kada je pripremljen gel Kolagena I sa iznad pomenutim GF ugrađenim direktno u gel pre setve, stope organoidnog rasta su ostale niske. GFP signal je održavan tokom celokupnog sistema gela-flastera (reprezentativan primer na Sl.21B i 21C). Zapažanje da goli flaster (SIS bez kolagena prekrivanja ili GF) nije uspeo da podrži strukturirani organoidni rast potvrđuje važnost dovoljnih fizičkih i hemijskih znakova za promociju trodimenzionalnih struktura.

[0153] SIS ili sam kolagen korišćen je u literaturi kao osnovna skela za sejanje ćelija, što rezultira formiranjem ćelijskih monoplasta (Baumert i dr.2007; Campodonico i dr.2004; Feil, G., i dr.2006; Zhang, Y., i dr.2000). Suprotno tome, rastuće ćelije na interfejsu ove dve matrice favorizuju trodimenzionalni rast organoida u odnosu na rast jednoslojnog sloja. Ovo bliže oponaša fiziološku okolinu, omogućavajući ubrzani i strukturirani rast. Ono što je važno, ovi rezultati opisuju sistem kulture flastera za organoide tankog creva koji su odlična alternativa Matrigelu. Transplantacija zasnovana na Matrigelu na životinjskim modelima naišla je na značajne prepreke u kretanju ka ljudskom modelu, što je najkritičnije uključujući pitanja biokompatibilnosti. Uzgoj trodimenzionalne strukture zasnovane na ćelijama često zahteva ugradnju gela sa gustim matriksom. Sistem kulture flastera prevazilazi ovaj zahtev pružajući uporedive rezultate. Zamena Matrigela kombinacijom endogenog vanćelijskog matriksa i specifičnih bioaktivnih faktora rasta izbegava probleme biokompatibilnosti uz održavanje trodimenzionalnog organoidnog, ex vivo rasta. Vremenska slika trodimenzionalne ex vivo organoidne ekspanzije iz početnog semena prikazana je na Sl.22.

[0154] Da li je inkubacija flastera u faktorima rasta pre setve olakšala prianjanje organoida u prva 24 sata. Efikasnost setve upoređena je u flasterima infuziranim faktorima rasta (uključujući EGF, Noggin, R-spondin 1, I-27632, valproinska kiselina i CHIR) u odnosu na neobrađene flastere (čuvani u PBS). Ispitivanje je sprovedeno merenjem procenta organoida zadržanih nakon ispiranja podloge u 4 i 12 sati, kada se ćelije uzgajaju isključivo u podlozi bez faktora rasta (samo bazne podloge). Kada je SIS izostavljen i organoidi zasejani direktno u plastične udubljenja obložena kolagenom i bez kolagena, disocijacija svih organoida nastala je u roku od 24 sata. Međutim, SIS zakrpe su održavale većinu organoida tokom 24 sata, i po strukturi i po GFP ekspresiji. Poboljšanje prianjanja primećeno je kada su ćelije posejane po flasterima infuziranim faktorima rasta (uključujući EGF, Noggin, R-spondin 1, Y-27632, valproinska kiselina i CHIR). Zbog toga, infuzija faktora rasta takođe može biti korisna za

4

obezbeđivanje adekvatne ishrane i faktora tokom kulture i posle transplantacije, dok premošćuje jaz do ćelijskog udubljivanja.

Primer 8: Implantirani flaster izlaže svojstva za pospešivanje rasta in vivo

[0155] Acelularne varijacije sistema flastera bez gela testirane su da se procene svojstva zaceljenja sluznice in vivo. Hirurški model pacova oštećenja sluzokože je dizajniran u cilju testiranja svojstava implantacijskog flastera koji podstiče rast in vivo. Implantacijski flaster je sastavljen pažljivim širenjem dela SIS, luminalnom stranom prema gore, preko 6 mm, kružnim poli (glicerol sebakatom) uretanskim podlogama (PGSU). Flaster je inkubiran na 5% CO2, 37°C tokom 30 minuta kako bi se omogućilo vezivanje PGSU i SIS. Defekt od 4 mm stvoren je u stomačnom zidu pomoću punkcione biopsije, kao što je prikazano na Sl.23. Acelularni flasteri (prečnika 6 mm) postavljeni su preko spoljnog stomačnog zida, pažljivo pokrivajući defekt odabranim materijalom. Flaster je učvršćen odgovarajućim postupkom flastera Graham (Sø, i dr., 1996) upotrebom šavova i vezivnog tkiva u blizini. Primenjene su tri varijante acelularnih flastera, uključujući a) SSU flaster sa PGSU (bez GF), b) SIS-flaster sa PGSU sa GF (EGF, Noggin, R-spondin 1, Y-27632, valproinska kiselina i CHIR) i c) samo PGSU (bez SIS). Ni u jednom pacovu nije primećen peritonitis. Jednu nedelju posle implantacije zbog mehanički izazvanih oštećenja želudačnog zida sakupljeno je želudačno tkivo koje sadrži defekt i flaster sa implantatima kako bi se izvršio histološki pregled tkiva.

[0156] Pretpostavljeno je da će implantacijske varijacije flastera pokazati različite stepene zarastanja sluznice. Opšte ispitivanje je pokazalo značajnu korist u SIS flasteru sa GF, jer je defekt epitelizovan i zatvoren. Delimično zatvaranje bez epitelizacije zabeleženo je kod SIS flastera bez GF, a nije bilo zatvoreno ili epitelizovano samo u PGSU (kontrolnim) flasterima. Histološki pregled je pokazao blagu upalu i u SIS flasteru sa i bez GF, ali bez curenja sadržaja želuca. Histološki pregled flastera sa samo PGSU pokazao je umerenu upalu, kao i prisustvo ogromnih ćelija koje verovatno reaguju na curenje sadržaja iz stomaka. Shodno tome, ovde opisani sistemi kulture flastera mogu se presaditi iz posude za kulturu direktno pacijentu, sa povećanim translacijskim potencijalom, jer je flaster krut i manje je verovatno da će se zaglaviti u malim prostorima (npr., crevni lumen, vaskularni prostori) s obzirom na njegov profil male visine.

Primer 9: Kultivisanje malih crevnih humanih kripti/matičnih ćelija

[0157] Ljudske kripte tankog creva izolovane su iz reseciranog normalnog uzorka tankog creva i uzgajane su kao što je opisano u Primeru 1. Isti rastvori ćelijske kulture koja se koriste

4

u kulturi matičnih ćelija/kripta tankog creva miša, koja sadrže kombinaciju CHIR99021 i VPA ili Tubastatin A dodata stanju ENR (EGF, Noggin, R-Spondin 1), upoređena su sa objavljenim rastvorom ćelijske kulture za ljudske crevne matične ćelije/kripte (Jung i dr., 2011; Sato i dr., 2011). RT-PCR je korišćen za procenu održavanja matičnih ćelija epitela u kulturi, tačnije određivanjem statusa samoobnavljanja ili diferencijacije. LGR5 je korišćen kao marker matičnih ćelija, a ALPI, MUC2, CHGA i LYZ korišćeni su kao markeri diferencijacije. Rast ćelija procenjen je brojem ćelija u kulturama i posmatranjem morfologije i veličine kolonija.

[0158] Slično kulturi matičnih ćelija crevnih ćelija miša, kombinacija CHIR+VPA ili CHIR+Tubastatin A uvelike je potaknula ekspresiju markera matičnih ćelija LGR5, sugerišući da su kultivisane ćelije obogaćene matičnim ćelijama (Sl.24). Izrazito, uslovi kulture koji sadrže CHIR i VPA ili CHIR i Tubastatin A nadmašili su objavljene uslove u promociji LGR5 ekspresije (Sl.24). Pored toga, testirane su pojedinačne komponente koje pokazuju poboljšanje kulture, uključujući A83-01 (ALK4,5,7, inhibitor Tgf-β), SB202190 (p38 inhibitor) i nikotinamid (derivat vitamina B). Utvrđeno je da 10 mM nikotinamida povećava proliferaciju kripti tankog creva čoveka kada se doda u stanje CHIR+VPA, na šta ukazuje i povećani broj ćelija u kulturi (Sl.25A), bez velikog uticaja na ekspresiju LGR5 (sl.

25B). Dok je kombinacija A83-01 i SB202190 (AS) povećala proliferaciju ćelija (Sl.25A), oni su u velikoj meri smanjili ekspresiju LGR5 (Sl.25B). Pored toga, niža koncentracija VPA (0.5 mM, u poređenju sa onom koja se koristi u mišjim kulturama (1-2 mM)) povećala je ćelijsku proliferaciju humanih kripti tankog creva (Sl.25A). Kolektivno, utvrđeno je da je stanje kulture koje sadrži EGF, Noggin, R-spondin1, CHIR, VPA (0.5 mM) i nikotinamid ili EX527 bio optimalno stanje kulture za humane crevne matične ćelije. U ovom stanju, izolovane kripte tankog creva prerastaju u kolonije uporedive sa matičnim ćelijama tankog creva miša (Sl.26).

Primer 10:

[0159] Za testiranje in vivo efekta CHIR i VPA na ćelije crevnog epitela, CHIR99021 (30 mg/kg u 100 µl DMSO) i VPA (200 mg/Kg u 100 ul vode) primenjeni su ženkama Lgr5-GFP od 4-6 nedelja miševi kroz gavažu. Kontrolni miševi su dobili smešu 100 µl DMSO i 100 µl vode. Lekovi su davani svakih 48 sati tokom 7 dana (na dan 0, 2. dan, 4. i 6. dan). 7. dana, miševi su žrtvovani i prikupljeno je crevno tkivo. Tanko crevo je dalje isprano sa PBS, fiksirano 4% PFA tokom 12 sati, stavljeno u parafin i obojeno korišćenjem standardnog protokola bojanja Hematoksilinom i eozinom (H&E). Slike su dobijene korišćenjem

4

inverznog mikroskopa (EVOS, Advanced Microscopy Group). In vivo davanje CHIR i VPA povećalo je veličinu kripti nakon 3 davanja tokom 7 dana (Sl.27).

REFERENCE

[0160]

Abreu, J.G., Ketpura, N.I., Reversade, B., and De Robertis, E.M. (2002). Connective-tissue growth factor (CTGF) modulates cell signalling by BMP and TGF-beta. Nat Cell Biol 4, 599-604.

Alessi, D. R., A. Cuenda, P. Cohen, D. T. Dudley and A. R. Saltiel (1995). PD 098059 is a specific inhibitor of the activation of mitogen-activated protein kinase kinase in vitro and in vivo. J Biol Chem 270(46): 27489-27494.

Anastassiadis, T., K. C. Duong-Ly, S. W. Deacon, A. Lafontant, H. Ma, K. Devarajan, R. L. Dunbrack, Jr., J. Wu and J. R. Peterson (2013). A highly selective dual insulin receptor (IR)/insulin-like growth factor 1 receptor (IGF-1R) inhibitor derived from an extracellular signal-regulated kinase (ERK) inhibitor. J Biol Chem 288(39): 28068-28077.

Anderson, J. J., G. Holtz, P. P. Baskin, M. Turner, B. Rowe, B. Wang, M. Z. Kounnas, B. T. Lamb, D. Barten, K. Felsenstein, I. McDonald, K. Srinivasan, B. Munoz and S. L. Wagner (2005). Reductions in beta-amyloid concentrations in vivo by the gamma-secretase inhibitors BMS-289948 and BMS-299897. Biochem Pharmacol 69(4): 689-698.

Andreani, A., Cavalli, A., Granaiola, M., Leoni, A., Locatelli, A., Morigi, R., Meijer, L. (2000). Imidazo[2,1-b]thiazolylmethylene- and indolylmethylene-2-indolinones: a new class of cyclin-dependent kinase inhibitors. Design, synthesis, and CDK1/cyclin B inhibition. Anticancer drug design, 15(6), 447-452.

Andreani, A., Locatelli, A., Rambaldi, M., Leoni, A., Bossa, R., Fraccari, A., and Galatulas, I. (1996). Potential antitumor agents. 25 [1]. Synthesis and cytotoxic activity of 3-(2-chloro-3-indolylmethylene)1,3-dihydroindol-2-ones. Anticancer research, 16(6B), 3585-3588.

Bain, J., Plater, L., Elliott, M., Shpiro, N., Hastie, C.J., McLauchlan, H., Klevernic, I., Arthur, J.S., Alessi, D.R., and Cohen, P. (2007). The selectivity of protein kinase inhibitors: a further update. The Biochemical journal 408, 297-315.

Badylak, S.F., et al. (1989). Small intestinal submucosa as a large diameter vascular graft in the dog. The Journal of Surgical Research 47(1): p.74-80.

Bakshi, P., C. Jin, P. Broutin, B. Berhane, J. Reed and M. Mullan (2009). Structural optimization of a CXCR2-directed antagonist that indirectly inhibits gamma-secretase and reduces Abeta. Bioorg Med Chem 17(23): 8102-8112.

Barker, N., van Es, J.H., Kuipers, J., Kujala, P., van den Born, M., Cozijnsen, M., Haegebarth, A., Korving, J., Begthel, H., Peters, P.J., et al. (2007). Identification of stem cells in small intestine and colon by marker gene Lgr5. Nature 449, 1003-1007.

Bax, B., Carter, P. S., Lewis, C., Guy, A. R., Bridges, A., Tanner, R., and Reith, A. D.

(2001). The Structure of Phosphorylated GSK-3β Complexed with a Peptide, FRATtide, that Inhibits β-Catenin Phosphorylation. Structure, 9(12), 1143-1152. doi:10.1016/S0969-2126(01)00679-7.

Bhat, R., Xue, Y., Berg, S., Hellberg, S., Ormo, M., Nilsson, Y., Radesater, A.C., Jerning, E., Markgren, P.O., Borgegard, T., et al. (2003). Structural insights and biological effects of glycogen synthase kinase 3-specific inhibitor AR-A014418. J Biol Chem 278, 45937-45945. Baumert, H., et al. (2007). Development of a seeded scaffold in the great omentum: feasibility of an in vivo. Eur Urol 52(3): p.884-90.

Baumert, H., et al. (2007). Terminal urothelium differentiation of engineered neoureter after in vivo. Eur Urol 52(5): p.1492-8.

Bergstein, I., Eisenberg, L. M., Bhalerao, J., Jenkins, N. A., Copeland, N. G., Osborne, M. P. and Brown, A. M. (1997). Isolation of two novel WNT genes, WNT14 and WNT15, one of which (WNT15) is closely linked to WNT3 on human chromosome 17q21. Genomics, 46(3), 450-458. doi:10.1006/geno.1997.5041

Breton, J. J., & Chabot-Fletcher, M. C. (1997). The natural product hymenialdisine inhibits interleukin-8 production in U937 cells by inhibition of nuclear factor-kappaB. The Journal of pharmacology and experimental therapeutics, 282(1), 459-466.

Burrus, L. W., & McMahon, A. P. (1995). Biochemical analysis of murine Wnt proteins reveals both shared and distinct properties. Experimental cell research, 220(2), 363-373. doi:10.1006/excr.1995.1327

Bodine, P.V., Stauffer, B., Ponce-de-Leon, H., Bhat, R.A., Mangine, A., Seestaller-Wehr, L.M., Moran, R.A., Billiard, J., Fukayama, S., Komm, B.S., et al. (2009). A small molecule inhibitor of the Wnt antagonist secreted frizzled-related protein-1 stimulates bone formation. Bone 44, 1063-1068.

Buczacki SJ, Zecchini HI, Nicholson AM, Russell R, Vermeulen L, Kemp R, and Winton DJ. (2013) Intestinal label-retaining cells are secretory precursors expressing Lgr5. Nature.2013 Feb 27. doi: 10.1038/nature11965. [Epub ahead of print].

Campodonico, F., et al. (2004). Bladder cell culture on small intestinal submucosa as bioscaffold: experimental. Eur Urol 46(4): p.531-7.

Chen, B., M. E. Dodge, W. Tang, J. Lu, Z. Ma, C. W. Fan, S. Wei, W. Hao, J. Kilgore, N. S.

1

Williams, M. G. Roth, J. F. Amatruda, C. Chen and L. Lum (2009). Small molecule-mediated disruption of Wnt-dependent signaling in tissue regeneration and cancer. Nat Chem Biol 5(2): 100-107.

Chen, S., T. Operana, J. Bonzo, N. Nguyen and R. H. Tukey (2005). ERK kinase inhibition stabilizes the aryl hydrocarbon receptor: implications for transcriptional activation and protein degradation. J Biol Chem 280(6): 4350-4359.

Chen W, Gaisina IN, Gunosewoyo H, Malekiani SA, Hanania T, Kozikowski AP (2011) Structure-guided design of a highly selective glycogen synthase kinase-3beta inhibitor: a superior neuroprotective pyrazolone showing antimania effects. ChemMedChem 6: 1587-1592.

Ciardiello, F. (2000). Epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitors as anticancer agents. Drugs 60 Suppl 1: 25-32; discussion 41-22.

Coghlan, M.P., Culbert, A.A., Cross, D.A., Corcoran, S.L., Yates, J.W., Pearce, N.J., Rausch, O.L., Murphy, G.J., Carter, P.S., Roxbee Cox, L., et al. (2000). Selective small molecule inhibitors of glycogen synthase kinase-3 modulate glycogen metabolism and gene transcription. Chemistry & biology 7, 793-803.

Crosnier, C., Stamataki, D., and Lewis, J. (2006). Organizing cell renewal in the intestine: stem cells, signals and combinatorial control. Nature Reviews Genetics 7, 349-359.

Cuny, G.D., Yu, P.B., Laha, J.K., Xing, X., Liu, J.F., Lai, C.S., Deng, D.Y., Sachidanandan, C., Bloch, K.D., and Peterson, R.T. (2008). Structure-activity relationship study of bone morphogenetic protein (BMP) signaling inhibitors. Bioorganic & medicinal chemistry letters 18, 4388-4392.

de la Fuente, S.G., et al., (2003) Evaluation of porcine-derived small intestine submucosa as a biodegradable graft for gastrointestinal healing. Journal of gastrointestinal surgery: official journal of the Society for Surgery of the Alimentary Tract.7(1): p.96-101.

De Rybel, B., Audenaert, D., Vert, G., Rozhon, W., Mayerhofer, J., Peelman, F., and Beeckman, T. (2009). Chemical inhibition of a subset of Arabidopsis thaliana GSK3-like kinases activates brassinosteroid signaling. Chemistry & biology, 16(6), 594-604. doi:10.1016/j.chembiol.2009.04.008

Ding, S., Wu, T.Y., Brinker, A., Peters, E.C., Hur, W., Gray, N.S., and Schultz, P.G. (2003). Synthetic small molecules that control stem cell fate. Proc Natl Acad Sci U S A 100, 7632-7637.

Dong, Q., D. R. Dougan, X. Gong, P. Halkowycz, B. Jin, T. Kanouni, S. M. O'Connell, N. Scorah, L. Shi, M. B. Wallace and F. Zhou (2011). Discovery of TAK-733, a potent and

2

selective MEK allosteric site inhibitor for the treatment of cancer. Bioorg Med Chem Lett 21(5): 1315-1319.

Dovey, H. F., V. John, J. P. Anderson, L. Z. Chen, P. de Saint Andrieu, L. Y. Fang, S. B. Freedman, B. Folmer, E. Goldbach, E. J. Holsztynska, K. L. Hu, K. L. Johnson-Wood, S. L. Kennedy, D. Kholodenko, J. E. Knops, L. H. Latimer, M. Lee, Z. Liao, I. M. Lieberburg, R. N. Motter, L. C. Mutter, J. Nietz, K. P. Quinn, K. L. Sacchi, P. A. Seubert, G. M. Shopp, E. D. Thorsett, J. S. Tung, J. Wu, S. Yang, C. T. Yin, D. B. Schenk, P. C. May, L. D. Altstiel, M. H. Bender, L. N. Boggs, T. C. Britton, J. C. Clemens, D. L. Czilli, D. K. Dieckman-McGinty, J. J. Droste, K. S. Fuson, B. D. Gitter, P. A. Hyslop, E. M. Johnstone, W. Y. Li, S. P. Little, T. E. Mabry, F. D. Miller and J. E. Audia (2001). Functional gamma-secretase inhibitors reduce beta-amyloid peptide levels in brain. J Neurochem 76(1): 173-181.

Durand, A., Donahue, B., Peignon, G., Letourneur, F., Cagnard, N., Slomianny, C., Perret, C., Shroyer, N.F., and Romagnolo, B. (2012). Functional intestinal stem cells after Paneth cell ablation induced by the loss of transcription factor Math1 (Atoh1). Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America.

Favata, M. F., K. Y. Horiuchi, E. J. Manos, A. J. Daulerio, D. A. Stradley, W. S. Feeser, D. E. Van Dyk, W. J. Pitts, R. A. Earl, F. Hobbs, R. A. Copeland, R. L. Magolda, P. A. Scherle and J. M. Trzaskos (1998). Identification of a novel inhibitor of mitogen-activated protein kinase kinase. J Biol Chem 273(29): 18623-18632.

Fear, M. W., Kelsell, D. P., Spurr, N. K., & Barnes, M. R. (2000). Wnt-16a, a novel Wnt-16 isoform, which shows differential expression in adult human tissues. Biochemical and biophysical research communications, 278(3), 814-820. doi:10.1006/bbrc.2000.3852.

Feil, G., et al. (2006). Investigations of urothelial cells seeded on commercially available small. Eur Urol 50(6): p.1330-7.

Farin, H.F., Van Es, J.H., and Clevers, H. (2012). Redundant sources of Wnt regulate intestinal stem cells and promote formation of Paneth cells. Gastroenterology 143, 1518-1529 e1517.

Gamer, L.W., Nove, J., Levin, M., and Rosen, V. (2005). BMP-3 is a novel inhibitor of both activin and BMP-4 signaling in Xenopus embryos. Dev Biol 285, 156-168.

Gazit, A., P. Yaish, C. Gilon and A. Levitzki (1989). Tyrphostins I: synthesis and biological activity of protein tyrosine kinase inhibitors. J Med Chem 32(10): 2344-2352.

Gilbert, A.M., Bursavich, M.G., Alon, N., Bhat, B.M., Bex, F.J., Cain, M., Coleburn, V., Gironda, V., Green, P., Hauze, D.B., et al. (2010). Hit to lead studies on (hetero)arylpyrimidines-agonists of the canonical Wnt-beta-catenin cellular messaging system. Bioorganic & medicinal chemistry letters 20, 366-370.

Gilmartin, A. G., M. R. Bleam, A. Groy, K. G. Moss, E. A. Minthorn, S. G. Kulkarni, C. M. Rominger, S. Erskine, K. E. Fisher, J. Yang, F. Zappacosta, R. Annan, D. Sutton and S. G. Laquerre (2011). GSK1120212 (JTP-74057) is an inhibitor of MEK activity and activation with favorable pharmacokinetic properties for sustained in vivo pathway inhibition. Clin Cancer Res 17(5): 989-1000.

Greenblatt, D.Y., Vaccaro, A.M., Jaskula-Sztul, R., Ning, L., Haymart, M., Kunnimalaiyaan, M., and Chen, H. (2007). Valproic acid activates notch-1 signaling and regulates the neuroendocrine phenotype in carcinoid cancer cells. The oncologist 12, 942-951.

Gupta, A., et al. (2006). Tissue engineering of small intestine--current status.

Biomacromolecules, 2006. 7(10): p.2701-2709.

Handeli, S. and J. A. Simon (2008). A small-molecule inhibitor of Tcf/beta-catenin signaling down-regulates PPARgamma and PPARdelta activities. Mol Cancer Ther 7(3): 521-529. Hao, J., Ho, J.N., Lewis, J.A., Karim, K.A., Daniels, R.N., Gentry, P.R., Hopkins, C.R., Lindsley, C.W., and Hong, C.C. (2010). In vivo structure-activity relationship study of dorsomorphin analogues identifies selective VEGF and BMP inhibitors. ACS chemical biology 5, 245-253.

He, W., L. Luistro, D. Carvajal, M. Smith, T. Nevins, X. Yin, J. Cai, B. Higgins, K.

Kolinsky, C. Rizzo, K. Packman, D. Heimbrook and J. F. Boylan (2011). High tumor levels of IL6 and IL8 abrogate preclinical efficacy of the gamma-secretase inhibitor, RO4929097. Mol Oncol 5(3): 292-301.

Huang, F., A. Greer, W. Hurlburt, X. Han, R. Hafezi, G. M. Wittenberg, K. Reeves, J. Chen, D. Robinson, A. Li, F. Y. Lee, M. M. Gottardis, E. Clark, L. Helman, R. M. Attar, A. Dongre and J. M. Carboni (2009). The mechanisms of differential sensitivity to an insulin-like growth factor-1 receptor inhibitor (BMS-536924) and rationale for combining with EGFR/HER2 inhibitors. Cancer Res 69(1): 161-170.

Huynh, H., K. C. Soo, P. K. Chow and E. Tran (2007). Targeted inhibition of the extracellular signal-regulated kinase kinase pathway with AZD6244 (ARRY-142886) in the treatment of hepatocellular carcinoma. Mol Cancer Ther 6(1): 138-146.

Jung, P., Sato, T., Merlos-Suarez, A., Barriga, F.M., Iglesias, M., Rossell, D., Auer, H., Gallardo, M., Blasco, M.A., Sancho, E., et al. (2011). Isolation and in vitro expansion of human colonic stem cells. Nat Med 17, 1225-1227.

Kazanjian, A., Noah, T., Brown, D., Burkart, J., and Shroyer, N.F. (2010). Atonal homolog 1 is required for growth and differentiation effects of notch/gamma-secretase inhibitors on

4

normal and cancerous intestinal epithelial cells. Gastroenterology 139, 918-928, 928 e911-916.

Katoh, M, Hirai, M., Sugimura, T., & Terada, M. (1996). Cloning, expression and chromosomal localization of Wnt-13, a novel member of the Wnt gene family. Oncogene, 13(4), 873-876.

Katoh, Masaru. (2001). Molecular cloning and characterization of human WNT3.

International Journal of Oncology, 19(5), 977.

Katoh, Masaru. (2011). Network of WNT and other regulatory signaling cascades in pluripotent stem cells and cancer stem cells. Current pharmaceutical biotechnology, 12(2), 160-170.

Khanfar, M.A., Hill, R.A., Kaddoumi, A., and El Sayed, K.A. (2010). Discovery of novel GSK-3beta inhibitors with potent in vitro and in vivo activities and excellent brain permeability using combined ligand- and structure-based virtual screening. Journal of medicinal chemistry 53, 8534-8545.

Kim, K.A., Zhao, J., Andarmani, S., Kakitani, M., Oshima, T., Binnerts, M.E., Abo, A., Tomizuka, K., and Funk, W.D. (2006). R-Spondin proteins: a novel link to beta-catenin activation. Cell Cycle 5, 23-26.

Kim, K., S. Y. Kong, M. Fulciniti, X. Li, W. Song, S. Nahar, P. Burger, M. J. Rumizen, K. Podar, D. Chauhan, T. Hideshima, N. C. Munshi, P. Richardson, A. Clark, J. Ogden, A. Goutopoulos, L. Rastelli, K. C. Anderson and Y. T. Tai (2010). Blockade of the MEK/ERK signalling cascade by AS703026, a novel selective MEK1/2 inhibitor, induces pleiotropic anti-myeloma activity in vitro and in vivo. Br J Haematol 149(4): 537-549.

Kim, T.H., Escudero, S., and Shivdasani, R.A. (2012). Intact function of Lgr5 receptorexpressing intestinal stem cells in the absence of Paneth cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 109, 3932-3937.

Kim, T.H., and Shivdasani, R.A. (2011). Genetic evidence that intestinal Notch functions vary regionally and operate through a common mechanism of Math1 repression. J Biol Chem 286, 11427-11433.

Kehoe, S., X.F. Zhang, and D. Boyd (2012) FDA approved guidance conduits and wraps for peripheral nerve injury: A review of materials and efficacy. Injury.43(5): p.553-572.

Klein, P. S., & Melton, D. A. (1996). A molecular mechanism for the effect of lithium on development. Proceedings of the National Academy of Sciences, 93(16), 8455-8459.

Koizumi, Y., N. Kawashima, M. Yamamoto, K. Takimoto, M. Zhou, N. Suzuki, M. Saito, H. Harada and H. Suda (2013). Wnt11 expression in rat dental pulp and promotional effects of Wnt signaling on odontoblast differentiation. Congenit Anom (Kyoto) 53(3): 101-108.

Kuiper, J. L., D. A. Heideman, E. Thunnissen, A. W. van Wijk, P. E. Postmus and E. F. Smit (2014). High-dose, weekly erlotinib is not an effective treatment in EGFR-mutated non-small cell lung cancer-patients with acquired extracranial progressive disease on standard dose erlotinib. Eur J Cancer.

Lako, M., Lindsay, S., Bullen, P., Wilson, D. I., Robson, S. C., & Strachan, T. (1998). A novel mammalian wnt gene, WNT8B, shows brain-restricted expression in early development, with sharply delimited expression boundaries in the developing forebrain. Human molecular genetics, 7(5), 813-822.

Lako, M., Strachan, T., Bullen, P., Wilson, D. I., Robson, S. C., & Lindsay, S. (1998).

Isolation, characterisation and embryonic expression of WNT11, a gene which maps to 11q13.5 and has possible roles in the development of skeleton, kidney and lung. Gene, 219(1-2), 101-110.

Lanz, T. A., J. D. Hosley, W. J. Adams and K. M. Merchant (2004). Studies of Abeta pharmacodynamics in the brain, cerebrospinal fluid, and plasma in young (plaque-free) Tg2576 mice using the gamma-secretase inhibitor N2-[(2S)-2-(3,5-difluorophenyl)-2-hydroxyethanoyl]-N1-[(7S)-5-methyl-6-oxo-6,7-di hydro-5H-dibenzo[b,d]azepin-7-yl]-L-alaninamide (LY-411575). J Pharmacol Exp Ther 309(1): 49-55.

Lazarova, D. L., C. Chiaro, T. Wong, E. Drago, A. Rainey, S. O'Malley and M. Bordonaro (2013). CBP Activity Mediates Effects of the Histone Deacetylase Inhibitor Butyrate on WNT Activity and Apoptosis in Colon Cancer Cells. J Cancer 4(6): 481-490.

Li H, Liu H, Heller S. (2003). Pluripotent stem cells from the adult mouse inner ear. Nat Med. Oct;9(10):1293-9.

Lien, W. H., L. Polak, M. Lin, K. Lay, D. Zheng and E. Fuchs (2014). In vivo transcriptional governance of hair follicle stem cells by canonical Wnt regulators. Nat Cell Biol 16(2): 179-190.

Liu, J., S. Pan, M. H. Hsieh, N. Ng, F. Sun, T. Wang, S. Kasibhatla, A. G. Schuller, A. G. Li, D. Cheng, J. Li, C. Tompkins, A. Pferdekamper, A. Steffy, J. Cheng, C. Kowal, V. Phung, G. Guo, Y. Wang, M. P. Graham, S. Flynn, J. C. Brenner, C. Li, M. C. Villarroel, P. G. Schultz, X. Wu, P. McNamara, W. R. Sellers, L. Petruzzelli, A. L. Boral, H. M. Seidel, M. E.

McLaughlin, J. Che, T. E. Carey, G. Vanasse and J. L. Harris (2013). Targeting Wnt-driven cancer through the inhibition of Porcupine by LGK974. Proc Natl Acad Sci U S A 110(50): 20224-20229.

Liu, J., Wu, X., Mitchell, B., Kintner, C., Ding, S., and Schultz, P.G. (2005). A smallmolecule agonist of the Wnt signaling pathway. Angew Chem Int Ed Engl 44, 1987-1990. Lloyd, D.A.J., et al. (2006). A pilot study investigating a novel subcutaneously implanted precellularised scaffold for tissue engineering of intestinal mucosa. European cells & materials, 11: p.27-33; discussion 34.

Lukacs RU, Goldstein AS, Lawson DA, Cheng D, Witte ON. (2010) Isolation, cultivation and characterization of adult murine prostate stem cells. Nat Protoc.5(4):702-13.

Mariadason, J.M. (2008). HDACs and HDAC inhibitors in colon cancer. Epigenetics : official journal of the DNA Methylation Society 3, 28-37.

Meijer, L., Skaltsounis, A.L., Magiatis, P., Polychronopoulos, P., Knockaert, M., Leost, M., Ryan, X.P., Vonica, C.A., Brivanlou, A., Dajani, R., et al. (2003). GSK-3-selective inhibitors derived from Tyrian purple indirubins. Chemistry & biology 10, 1255-1266.

Milano, J., McKay, J., Dagenais, C., Foster-Brown, L., Pognan, F., Gadient, R., Jacobs, R.T., Zacco, A., Greenberg, B., and Ciaccio, P.J. (2004). Modulation of notch processing by gamma-secretase inhibitors causes intestinal goblet cell metaplasia and induction of genes known to specify gut secretory lineage differentiation. Toxicological sciences : an official journal of the Society of Toxicology 82, 341-358.

Minami, I., K. Yamada, T. G. Otsuji, T. Yamamoto, Y. Shen, S. Otsuka, S. Kadota, N.

Morone, M. Barve, Y. Asai, T. Tenkova-Heuser, J. E. Heuser, M. Uesugi, K. Aiba and N. Nakatsuji (2012). A small molecule that promotes cardiac differentiation of human pluripotent stem cells under defined, cytokine- and xeno-free conditions. Cell Rep 2(5):

1448-1460.

Minkovsky, N. and A. Berezov (2008). BIBW-2992, a dual receptor tyrosine kinase inhibitor for the treatment of solid tumors. Curr Opin Investig Drugs 9(12): 1336-1346.

Montgomery, R.K., Carlone, D.L., Richmond, C.A., Farilla, L., Kranendonk, M.E., Henderson, D.E., Baffour-Awuah, N.Y., Ambruzs, D.M., Fogli, L.K., Algra, S., et al. (2011). Mouse telomerase reverse transcriptase (mTert) expression marks slowly cycling intestinal stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 108, 179-184.

Miyabayashi, T., Teo, J.L., Yamamoto, M., McMillan, M., Nguyen, C., and Kahn, M. (2007). Wnt/beta-catenin/CBP signaling maintains long-term murine embryonic stem cell pluripotency. Proc Natl Acad Sci USA 104, 5668-5673.

Nam, J.S., Turcotte, T.J., Smith, P.F., Choi, S., and Yoon, J.K. (2006). Mouse cristin/R-spondin family proteins are novel ligands for the Frizzled 8 and LRP6 receptors and activate beta-catenin-dependent gene expression. J Biol Chem 281, 13247-13257.

Nusse, R., & Varmus, H. E. (1982). Many tumors induced by the mouse mammary tumor virus contain a provirus integrated in the same region of the host genome. Cell, 31(1), 99-109.

Ohori, M., T. Kinoshita, M. Okubo, K. Sato, A. Yamazaki, H. Arakawa, S. Nishimura, N. Inamura, H. Nakajima, M. Neya, H. Miyake and T. Fujii (2005). Identification of a selective ERK inhibitor and structural determination of the inhibitor-ERK2 complex. Biochem Biophys Res Commun 336(1): 357-363.

Ootani, A., Li, X., Sangiorgi, E., Ho, Q.T., Ueno, H., Toda, S., Sugihara, H., Fujimoto, K., Weissman, I.L., Capecchi, M.R., et al. (2009). Sustained in vitro intestinal epithelial culture within a Wnt-dependent stem cell niche. Nat Med 15, 701-706.

Pai, R., Tarnawski, A.S., and Tran, T. (2004). Deoxycholic acid activates beta-catenin signaling pathway and increases colon cell cancer growth and invasiveness. Molecular biology of the cell 15, 2156-2163.

Pellegrinet, L., Rodilla, V., Liu, Z., Chen, S., Koch, U., Espinosa, L., Kaestner, K.H., Kopan, R., Lewis, J., and Radtke, F. (2011). Dll1- and dll4-mediated notch signaling are required for homeostasis of intestinal stem cells. Gastroenterology 140, 1230-1240 e1231-1237.

Planutis, K., Planutiene, M., Moyer, M.P., Nguyen, A.V., Perez, C.A., and Holcombe, R.F. (2007). Regulation of norrin receptor frizzled-4 by Wnt2 in colon-derived cells. BMC cell biology 8, 12.

Powell, D.W., Pinchuk, I.V., Saada, J.I., Chen, X., and Mifflin, R.C. (2011). Mesenchymal cells of the intestinal lamina propria. Annual review of physiology 73, 213-237.

Proffitt, K. D., B. Madan, Z. Ke, V. Pendharkar, L. Ding, M. A. Lee, R. N. Hannoush and D. M. Virshup (2013). Pharmacological inhibition of the Wnt acyltransferase PORCN prevents growth of WNT-driven mammary cancer. Cancer Res 73(2): 502-507.

Riccio, O., van Gijn, M.E., Bezdek, A.C., Pellegrinet, L., van Es, J.H., Zimber-Strobl, U., Strobl, L.J., Honjo, T., Clevers, H., and Radtke, F. (2008). Loss of intestinal crypt progenitor cells owing to inactivation of both Notch1 and Notch2 is accompanied by derepression of CDK inhibitors p27Kip1 and p57Kip2. EMBO Rep 9, 377-383.

Rider, C.C., and Mulloy, B. (2010). Bone morphogenetic protein and growth differentiation factor cytokine families and their protein antagonists. Biochem J 429, 1-12.

Ring, D.B., Johnson, K.W., Henriksen, E.J., Nuss, J.M., Goff, D., Kinnick, T.R., Ma, S.T., Reeder, J.W., Samuels, I., Slabiak, T., et al. (2003). Selective glycogen synthase kinase 3 inhibitors potentiate insulin activation of glucose transport and utilization in vitro and in vivo. Diabetes 52, 588-595.

Saito, N., J. Fu, S. Zheng, J. Yao, S. Wang, D. D. Liu, Y. Yuan, E. P. Sulman, F. F. Lang, H. Colman, R. G. Verhaak, W. K. Yung and D. Koul (2014). A high Notch pathway activation predicts response to gamma secretase inhibitors in proneural subtype of glioma tumorinitiating cells. Stem Cells 32(1): 301-312.

Sangiorgi, E., and Capecchi, M.R. (2008). Bmi1 is expressed in vivo in intestinal stem cells. Nature genetics 40, 915-920.

Sakuma, Y., Y. Yamazaki, Y. Nakamura, M. Yoshihara, S. Matsukuma, H. Nakayama, T. Yokose, Y. Kameda, S. Koizume and Y. Miyagi (2012). WZ4002, a third-generation EGFR inhibitor, can overcome anoikis resistance in EGFR-mutant lung adenocarcinomas more efficiently than Src inhibitors. Lab Invest 92(3): 371-383.

Sato, T., Stange, D.E., Ferrante, M., Vries, R.G., Van Es, J.H., Van den Brink, S., Van Houdt, W.J., Pronk, A., Van Gorp, J., Siersema, P.D., et al. (2011a). Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology 141, 1762-1772.

Sato, T., van Es, J.H., Snippert, H.J., Stange, D.E., Vries, R.G., van den Born, M., Barker, N., Shroyer, N.F., van de Wetering, M., and Clevers, H. (2011b). Paneth cells constitute the niche for Lgr5 stem cells in intestinal crypts. Nature 469, 415-418.

Sato, T., Vries, R.G., Snippert, H.J., van de Wetering, M., Barker, N., Stange, D.E., van Es, J.H., Abo, A., Kujala, P., Peters, P.J., et al. (2009). Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature 459, 262-265.

Saitoh, M., Kunitomo, J., Kimura, E., Iwashita, H., Uno, Y., Onishi, T., Uchiyama, N., Kawamoto, T., Tanaka, T., Mol, C.D., et al. (2009).2-{3-[4-(Alkylsulfinyl)phenyl]-1-benzofuran-5-yl}-5-methyl-1,3,4-oxadiazole derivatives as novel inhibitors of glycogen synthase kinase-3beta with good brain permeability. Journal of medicinal chemistry 52, 6270-6286.

Saitoh, T., Hirai, M., & Katoh, M. (2001). Molecular cloning and characterization of WNT3A and WNT14 clustered in human chromosome 1q42 region. Biochemical and biophysical research communications, 284(5), 1168-1175. doi:10.1006/bbrc.2001.5105 Saitoh, T., & Katoh, M. (2001). Molecular cloning and characterization of human WNT8A. International journal of oncology, 19(1), 123-127.

Schneyer, A.L., Rzucidlo, D.A., Sluss, P.M., and Crowley, W.F., Jr. (1994). Characterization of unique binding kinetics of follistatin and activin or inhibin in serum. Endocrinology 135, 667-674.

Schultz, C., Link, A., Leost, M., Zaharevitz, D.W., Gussio, R., Sausville, E.A., Meijer, L., and Kunick, C. (1999). Paullones, a series of cyclin-dependent kinase inhibitors: synthesis, evaluation of CDK1/cyclin B inhibition, and in vitro antitumor activity. Journal of medicinal chemistry 42, 2909-2919.

Scoville, D.H., Sato, T., He, X.C., and Li, L. (2008). Current view: intestinal stem cells and signaling. Gastroenterology 134, 849-864.

Seidi, A., et al., (2011). Gradient biomaterials for soft-to-hard interface tissue engineering. Acta Biomaterialia, 7(4): p.1441-1451.

Shi, F., Kempfle, J.S., and Edge, A.S. (2012). Wnt-responsive Lgr5-expressing stem cells are hair cell progenitors in the cochlea. J Neurosci.32, 9639-9648.

Shi F, Cheng YF, Wang XL, Edge AS. (2010) Beta-catenin up-regulates Atohl expression in neural progenitor cells by interaction with an Atohl 3' enhancer. J Biol Chem.285(1):392-400.

Snippert, H. J., L. G. Van Der Flier, T. Sato, J. H. Van Es, M. Van Den Born, C. Kroon-Veenboer, N. Barker, A. M. Klein, J. Van Rheenen and B. D. Simons (2010). Intestinal crypt homeostasis results from neutral competition between symmetrically dividing Lgr5 stem cells. Cell 143(1): 134-144.

Snippert, H.J., Van Der Flier, L.G., Sato, T., Van Es, J.H., Van Den Born, M., Kroon-Veenboer, C., Barker, N., Klein, A.M., Van Rheenen, J., and Simons, B.D. (2010). Intestinal crypt homeostasis results from neutral competition between symmetrically dividing Lgr5 stem cells. Cell 143, 134-144.

Stockhausen, M.T., Sjolund, J., Manetopoulos, C., and Axelson, H. (2005). Effects of the histone deacetylase inhibitor valproic acid on Notch signalling in human neuroblastoma cells. Br J Cancer 92, 751-759.

Sø, J. B. Y., Kum, C. K., Fernandes, M. L., & Goh, P. (1996). Comparison between laparoscopic and conventional omental patch repair for perforated duodenal ulcer. Surgical Endoscopy, 10, 1060-1063.

Schultz, D.J., et al., (2002) Porcine small intestine submucosa as a treatment for enterocutaneous fistulas. Journal of the American College of Surgeons. 194(4): p.541-543. Smolich, B. D., McMahon, J. A., McMahon, A. P., & Papkoff, J. (1993). Wnt family proteins are secreted and associated with the cell surface. Molecular Biology of the Cell, 4(12), 1267-1275.

Takeda, N., Jain, R., LeBoeuf, M.R., Wang, Q., Lu, M.M., and Epstein, J.A. (2011).

Interconversion between intestinal stem cell populations in distinct niches. Science 334, 1420-1424.

Thoma, G., Nuninger, F., Falchetto, R., Hermes, E., Tavares, G.A., Vangrevelinghe, E., and Zerwes, H.G. (2011). Identification of a potent Janus kinase 3 inhibitor with high selectivity within the Janus kinase family. Journal of medicinal chemistry 54, 284-288.

Thompson, N. and J. Lyons (2005). Recent progress in targeting the Raf/MEK/ERK pathway with inhibitors in cancer drug discovery. Curr Opin Pharmacol 5(4): 350-356.

Wiater, E., and Vale, W. (2003). Inhibin is an antagonist of bone morphogenetic protein signaling. J Biol Chem 278, 7934-7941.

Ueno, T., et al., (2007) Functional evaluation of the grafted wall with porcine-derived small intestinal submucosa (SIS) to a stomach defect in rats. Surgery.142(3): p.376-383.

van der Flier, L.G., and Clevers, H. (2009). Stem cells, self-renewal, and differentiation in the intestinal epithelium. Annual review of physiology 71, 241-260.

van Es, J.H., de Geest, N., van de Born, M., Clevers, H., and Hassan, B.A. (2010). Intestinal stem cells lacking the Math1 tumour suppressor are refractory to Notch inhibitors. Nat Commun 1, 1-5.

van Es, J.H., van Gijn, M.E., Riccio, O., van den Born, M., Vooijs, M., Begthel, H., Cozijnsen, M., Robine, S., Winton, D.J., Radtke, F., et al. (2005). Notch/gamma-secretase inhibition turns proliferative cells in intestinal crypts and adenomas into goblet cells. Nature 435, 959-963.

VanDussen, K.L., Carulli, A.J., Keeley, T.M., Patel, S.R., Puthoff, B.J., Magness, S.T., Tran, I.T., Maillard, I., Siebel, C., Kolterud, A., et al. (2012). Notch signaling modulates proliferation and differentiation of intestinal crypt base columnar stem cells. Development 139, 488-497.

Wada, A. (2009). GSK-3 inhibitors and insulin receptor signaling in health, disease, and therapeutics. Frontiers in bioscience: a journal and virtual library, 14, 1558-1570.

Wainwright, B. J., Scambler, P. J., Stanier, P., Watson, E. K., Bell, G., Wicking, C., ...

Pedersen, P. S. (1988). Isolation of a human gene with protein sequence similarity to human and murine int-1 and the Drosophila segment polarity mutant wingless. The EMBO Journal, 7(6), 1743-1748.

Wang, J., & Shackleford, G. M. (1996). Murine Wnt10a and Wnt10b: cloning and expression in developing limbs, face and skin of embryos and in adults. Oncogene, 13(7), 1537-1544. Watanabe, K., Ueno, M., Kamiya, D., Nishiyama, A., Matsumura, M., Wataya, T., Takahashi, J.B., Nishikawa, S., Muguruma, K., and Sasai, Y. (2007). A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nature biotechnology 25, 681-686.

1

Wehner, D., W. Cizelsky, M. D. Vasudevaro, G. Ozhan, C. Haase, B. Kagermeier-Schenk, A. Roder, R. I. Dorsky, E. Moro, F. Argenton, M. Kuhl and G. Weidinger (2014). Wnt/beta-Catenin Signaling Defines Organizing Centers that Orchestrate Growth and Differentiation of the Regenerating Zebrafish Caudal Fin. Cell Rep 6(3): 467-481.

White, P.M., Doetzlhofer, A., Lee, Y.S., Groves, A.K., Seigil, N. (2006). Mammalian cochlear supporting cells can divide and trans-differentiate into hair cells. Nature 441, 984-987.

Wiater, E., and Vale, W. (2003). Inhibin is an antagonist of bone morphogenetic protein signaling. J Biol Chem 278, 7934-7941.

Wong, G.T., Manfra, D., Poulet, F.M., Zhang, Q., Josien, H., Bara, T., Engstrom, L., Pinzon-Ortiz, M., Fine, J.S., Lee, H.J., et al. (2004). Chronic treatment with the gamma-secretase inhibitor LY-411,575 inhibits beta-amyloid peptide production and alters lymphopoiesis and intestinal cell differentiation. J Biol Chem 279, 12876-12882.

Xia, W., R. J. Mullin, B. R. Keith, L. H. Liu, H. Ma, D. W. Rusnak, G. Owens, K. J. Alligood and N. L. Spector (2002). Anti-tumor activity of GW572016: a dual tyrosine kinase inhibitor blocks EGF activation of EGFR/erbB2 and downstream Erk1/2 and AKT pathways.

Oncogene 21(41): 6255-6263.

Yang, Q., Bermingham, N.A., Finegold, M.J., and Zoghbi, H.Y. (2001). Requirement of Math1 for secretory cell lineage commitment in the mouse intestine. Science 294, 2155-2158. Yilmaz, O.H., Katajisto, P., Lamming, D.W., Gultekin, Y., Bauer-Rowe, K.E., Sengupta, S., Birsoy, K., Dursun, A., Yilmaz, V.O., Selig, M., et al. (2012). mTORC1 in the Paneth cell niche couples intestinal stem-cell function to calorie intake. Nature.486, 490-495.

Ying, Q.L., Wray, J., Nichols, J., Batlle-Morera, L., Doble, B., Woodgett, J., Cohen, P., and Smith, A. (2008). The ground state of embryonic stem cell self-renewal. Nature 453, 519-523.

Yui, S., et al., (2012). Functional engraftment of colon epithelium expanded in vitro from a single adult Lgr5+ stem cell. Nature Medicine 18(4): p.618-623.

Yao M, Taylor RA, Richards MG, Sved P, Wong J, Eisinger D, Xie C, Salomon R, Risbridger GP, Dong Q. (2010) Prostate-regenerating capacity of cultured human adult prostate epithelial cells. Cells Tissues Organs.191(3):203-12.

Yu, P.B., Hong, C.C., Sachidanandan, C., Babitt, J.L., Deng, D.Y., Hoyng, S.A., Lin, H.Y., Bloch, K.D., and Peterson, R.T. (2008). Dorsomorphin inhibits BMP signals required for embryogenesis and iron metabolism. Nature chemical biology 4, 33-41.

Zhang, Q., Major, M.B., Takanashi, S., Camp, N.D., Nishiya, N., Peters, E.C., Ginsberg,

2

M.H., Jian, X., Randazzo, P.A., Schultz, P.G., et al. (2007). Small-molecule synergist of the Wnt/beta-catenin signaling pathway. Proc Natl Acad Sci U S A 104, 7444-7448.

Zhang, Y., et al. (2000). Coculture of bladder urothelial and smooth muscle cells on small intestinal. J Urol 164(3 Pt 2): p.928-34; discussion 934-5.

Zhong, H., Zou, H., Semenov, M.V., Moshinsky, D., He, X., Huang, H., Li, S., Quan, J., Yang, Z., and Lin, S. (2009). Characterization and development of novel small-molecules inhibiting GSK3 and activating Wnt signaling. Molecular bioSystems 5, 1356-1360.

Zaharevitz, D.W., Gussio, R., Leost, M., Senderowicz, A.M., Lahusen, T., Kunick, C, Meijer, L., and Sausville, E.A. (1999). Discovery and initial characterization of the paullones, a novel class of small-molecule inhibitors of cyclin-dependent kinases. Cancer Res 59, 2566-2569.

DRUGA OTELOTVORENJA

[0161] Treba razumeti da, iako je pronalazak opisan zajedno sa njegovim detaljnim opisom, prethodni opis ima za cilj da ilustruje, a ne ograničava obim pronalaska, koji je definisan obimom dodatih patentnih zahteva.

Claims (10)

Patentni zahtevi

1. Kombinacija Wnt agonista i inhibitora histonske deacetilaze (HDAC) za upotrebu u postupku povećanja pozitivnih epitelnih ćelija LGR5 unutar epitelnog tkiva kod ispitanika koji ima oštećene senzorne ćelije dlake Kortijevog organa u unutrašnjem uhu, pri čemu navedena kombinacija sadrži količina Wnt agonista i HDAC inhibitora dovoljna za povećanje LGR5 pozitivnih epitelnih matičnih ćelija unutar epitelnog tkiva, pri čemu su epitelne matične ćelije prisutne u unutrašnjem uhu ispitanika.

2. Kombinacija za upotrebu prema patentnom zahtevu 1, gde upotreba kombinacije povećava proliferaciju matičnih ćelija unutrašnjeg uha kod ispitanika.

3. Kombinacija za upotrebu prema bilo kojem od patentnih zahteva 1 ili 2, gde je ispitanik čovek.

4. Kombinacija za upotrebu u skladu sa bilo kojim od patentnih zahteva 1-3, gde je Wnt agonist inhibitor glikogen sintaze kinaze-3 beta (GSK-3β).

5. Kombinacija za upotrebu prema patentnom zahtevu 4, gde je inhibitor GSK-3β CHIR99021.

6. Kombinacija za upotrebu u skladu sa bilo kojim od patentnih zahteva 1-5, gde je HDAC inhibitor Pan-HDAC inhibitor.

7. Kombinacija za upotrebu prema patentnom zahtevu 6, gde je Pan-HDAC inhibitor izabran iz grupe koja se sastoji iz valproinske kiseline (VPA), Trihostatina A, suberoilanilid hidroksamične kiseline i suberohidroksamične kiseline (SBHA).

8. Kombinacija za upotrebu u skladu sa bilo kojim od patentnih zahteva 1-7, gde je Wnt agonist CHIR99021 i inhibitor histon deacetilaze je valproinska kiselina (VPA).

9. Kombinacija za upotrebu u skladu sa patentnim zahtevom 8, gde je kombinacija za istovremeno davanje ispitaniku CHIR99021 i VPA.

10. Kombinacija za upotrebu u skladu sa patentnim zahtevom 8, gde je kombinacija za uzastopno davanje ispitaniku CHIR99021 i VPA.

4