RS60314B1 - Ciljani kompleksi koji emituju alfa-čestice i obuhvataju torijumski radionuklid i ligand koji sadrži hidroksipiridon - Google Patents

Description

Opis

OBLAST PRONALASKA

[0001] Predmetni pronalazak se odnosi na komplekse torijuma-227 koji ciljaju tkivo sa određenim oktadentatnim ligandima kako je definisano u zahtevima. Pronalazak se takođe odnosi na tretman bolesti, naročito neoplastičnih bolesti, koje uključuju primenu takvih kompleksa.

POZADINA PRONALASKA

[0002] Specifično ubijanje ćelija može biti od suštinskog značaja za uspešan tretman raznih bolesti kod sisara. Tipični primeri su u lečenju malignih bolesti kao što su sarkomi i karcinomi. Međutim, selektivno otklanjanje određenih vrsta ćelija takođe može igrati ključnu ulogu u lečenju drugih bolesti, posebno hiperplastičnih i neoplastičnih bolesti.

[0003] Najčešći postupci selektivnog lečenja trenutno su operacija, hemoterapija i spoljno zračenje. Terapija ciljanim radionuklidima je, međutim, obećavajuća i oblast koja se razvija sa potencijalom da omogući visoko citotoksično zračenje neželjenim tipovima ćelija.

Najčešći oblici radiofarmaceutskih sredstava koji su trenutno odobreni za upotrebu kod ljudi koriste radionuklide koji emituju beta i/ili radionuklide koji emituju gama. Međutim, postoji interesovanje za upotrebu u lečenju radionuklida koji emituju alfa zbog njihovog potencijala za specifično ubijanje ćelija.

[0004] Opseg zračenja tipičnih alfa emitera u fiziološkom okruženju je uglavnom manji od 100 mikrometara, što je ekvivalentno samo nekoliko ćelijskih prečnika. Zbog toga su ovi izvori pogodni za lečenje tumora, uključujući i mikrometastaze, jer ako su dobro usmereni onda će malo energije koja se zrači izaći van ciljanih ćelija. Prema tome, oštećenje okolnog zdravog tkiva može se minimizovati (pogledati Feinendegen i dr., Radiat Res 148:195-201 (1997)). Za razliku od toga, beta čestica ima opseg od 1 mm ili više u vodi (pogledati Wilbur, Antibody Immunocon Radiopharm 4: 85-96 (1991)).

[0005] Energija radijacije alfa-čestica je velika u poređenju sa onom koju nose beta čestice, gama zraci i rendgenski zraci, koji su obično 5-8 MeV ili 5 do 10 puta veći od beta čestica i 20 ili više puta više energije gama zraka. Dakle, ovo koncentrisanje velike količine energije na vrlo kratkom rastojanju daje α-zračenju izuzetno visok linearni prenos energije (LET), visoku relativnu biološku efikasnost (RBE) i nizak odnos poboljšanja kiseonika (OER) u poređenju sa gama i beta zračenjem (pogledati Hall, „Radiobiology for the radiologist“, Fifth edition, Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia PA, USA, 2000). Ovo objašnjava izuzetnu citotoksičnost radionuklida koji emituju alfa, i takođe nameće stroge zahteve za biološkim ciljem takvih izotopa i na nivou kontrole i proučavanja distribucije radionuklida koji emituju alfa koja je neophodna kako bi se izbegli neprihvatljivi neželjeni efekti.

[0006] Tabela 1 u nastavku prikazuje karakteristike fizičkog raspada alfa emitera za koje je do sada široko predloženo u literaturi da mogu imati terapeutsku efikasnost.

Tabela 1

[0007] Do sada, kada je reč o primeni u radioimunoterapiji, glavna pažnja je bila usmerena<211>At,<213>Bi i<225>Ac, i ova tri nuklida su istražena u kliničkim imunoterapijskim istraživanjima.

[0008] Nekoliko radionuklida koji su predloženi su kratkog veka, tj. imaju pola života manje od 12 sati. Takav kratak period polu-života otežava proizvodnju i distribuciju radiofarmaceutika zasnovanih na ovim radionuklidima na komercijalni način. Primena nuklida kratkog veka takođe povećava udo doze zračenja koja će se emitovati u telu pre nego što se dostigne ciljana mesta.

[0009] Povratna energija iz alfa emisije će u mnogim slučajevima prouzrokovati oslobađanje ćerki nuklida sa roditeljevog položaja raspadanja. Ova povratna energija je dovoljna da razbije mnoga jezgra ćerki iz hemijskog okruženja koje je možda držalo roditelja, npr. gde je roditelj bio kompleksiran od strane liganda, kao što je agens za heliranje. Ovo će se dogoditi čak i kada je ćerka hemijski kompatibilna, tj. kompleksirana od istog liganda. Podjednako, kad je ćerka nuklid gas, posebno plemeniti gas kao što je radon, ili je hemijski nekompatibilan sa ligandom, ovaj efekat oslobađanja će biti još veći. Kada ćerka nuklidi imaju polu-život od više od nekoliko sekundi, oni mogu difundirati u krvni sistem, neobuzdani od strane kompleksanta koji je držao roditelja. Ove slobodne radioaktivne ćerke mogu izazvati neželjenu sistemsku toksičnost.

[0010] Upotreba Torijuma-227 (T1/2= 18,7 dana) pod uslovima u kojima se kontroliše<223>Ra izotop ćerka predložena je pre nekoliko godina (pogledati WO 01/60417 i WO 02/05859). Ovo je bilo u situacijama kada se koristi sistem nosača koji dozvoljava zadržavanje ćerka nuklida zatvorenim okruženjem. U jednom slučaju, radionuklid se nalazi u lipozomu, i značajna veličina lipozoma (u poređenju sa povratnim rastojanjem) pomaže u zadržavanju ćerke nuklide unutar lipozoma. U drugom slučaju koriste se kompleksi radionuklida koji traže kosti, koji se inkorporiraju u matricu kostiju i stoga ograničavaju oslobađanje ćerka nuklida. Ovo su potencijalno veoma povoljni postupci, ali primena lipozoma nije poželjna u nekim okolnostima i postoji mnogo bolesti mekog tkiva u kojima radionuklidi ne mogu biti okruženi mineralizovanom matricom kako bi se zadržali izotope ćerke.

[0011] Nedavno je utvrđeno da se toksičnost jezgra<223>Ra ćerki oslobođenih nakon raspada<227>Th može tolerisati u telu sisara u mnogo većoj meri nego što bi se moglo predvideti iz prethodnih ispitivanja na uporedivim jezgrima. U odsustvu specifičnih načina za zadržavanje radijumskih ćerki torijuma-227 o kojima se govori gore, javno dostupne informacije o toksičnosti radijuma jasno su pokazale da nije bilo moguće koristiti torijum-227 kao terapeutski agens, s obzirom da bi doze potrebne za postizanje terapeutskog efekta raspada torijuma-227 rezultovale visoko toksičnom i eventualno smrtonosnom dozom zračenja od raspada radijumskih ćerki, tj. ne postoji terapeutski prozor.

[0012] WO 04/091668 opisuje neočekivano otkriće da postoji prozor terapijskog lečenja u kom se terapeutski efikasna količini ciljanog torijum-227 radionuklida može primeniti pacijentu (tipično sisaru) bez stvaranja količine radijuma-223 dovoljne da izazove neprihvatljivu mijelotoksičnost. In se stoga može koristiti za lečenje i profilaksu svih vrsta bolesti i na koštanim mestima i na mestima mekih tkiva.

[0013] S obzirom na gore navedene događaje, sada je moguće primeniti jezgra torijuma-227 koji emituje alfa u endoradionuklidnoj terapiji bez smrtonosne mijelotoksičnosti koja je rezultat generisanog<223>Ra. Bez obzira na to, terapeutski prozor ostaje relativno uski i u svim slučajevima je poželjno da se pacijentima ne primenjuju radioizotopi koji emituju alfa više od apsolutno neophodnog. Korisna primena ovog novog terapeutskog prozora bi stoga bila značajno poboljšana ako bi jezgra torijuma-227 koji emituje alfa mogla biti kompleksirana i usmerena sa visokim stepenom pouzdanosti. WO-A-2006/003123 otkriva radionuklide za medicinsku upotrebu. Primeri 11 i 12 otkrivaju redom radioimunološke konjugate za<227>Thbenzil-DTPA-antitela i<227>Th-HEHA-antitela.

[0014] Zbog toga što se radionuklidi neprekidno raspadaju, vreme u kom se rukuje materijalom između izolacije i primene pacijentu je od velike važnosti. Takođe bi bilo od velike vrednosti ako bi jezgra torijuma koji emituje alfa mogla biti kompleksirana, ciljana i/ili primenjena u obliku koji bi bio brz i zgodan za pripremu, kom je poželjno potrebno malo koraka, kratak period inkubacije i/ili temperatura ne utiče nepovratno na svojstva ciljanog entiteta.

[0015] Predmetni pronalazači su sada neočekivano utvrdili da upotreba 4+ torijum-227 jona kompleksirana sa oktadentatnim ligandom hidroksipiridinonskog (HOPO) tipa povezanim sa ciljanim delom daje izuzetan stepen kontrole nad torijum-227 jonom. Pored toga, takvi kompleksi mogu se relativno brzo i/ili lako pripremiti koristeći postupke opisane ovde.

SAŽETAK PRONALASKA

[0016] Pronalazak je definisan patentnim zahtevima. Bilo koji predmet pronalaska koji spada izvan obima zahteva dat je samo u informativne svrhe. Sve reference na postupke lečenja iz opisa odnose se na jedinjenja, farmaceutske kompozicije i lekove iz ovog pronalaska za upotrebu u postupku za lečenje ljudskog ili životinjskog tela terapijom. Gledano iz jednog aspekta, predmetni pronalazak stoga pruža kompleks za ciljanje tkiva koji obuhvata deo koji cilja tkivo vezan na, oktadentatni ligand koji sadrži hidroksipiridinon- kako je definisano u zahtevu 1, i 4+ jon radionuklida 227-torijuma koji emituje alfa. Posebno poželjan aspekt je takav kompleks za ciljanje tkiva koji sadrži polipeptidni deo koji cilja tkivo koji se kovalentno vezuje za oktadentatni ligand koji sadrži najmanje jedan 3,2-hidroksipiridinon deo kako je definisano u zahtevima, gde je navedeni ligand kompleksiran na 4+ jon<227>Th.

[0017] Gledano iz još jednog aspekta, pronalazak pruža upotrebu pomenutog kompleksa za ciljanje tkiva u proizvodnji medikamenta za tretman hiperplastičnog ili neoplastičnog oboljenja uključujući i bilo koju takvu bolest opisanu ovde.

[0018] Gledano iz daljeg aspekta, pronalazak pruža farmaceutski sastav koji sadrži pomenutog kompleks za ciljanje tkiva, zajedno sa najmanje jednim farmaceutskim nosačem ili ekscipijentom.

[0019] Kako bi se razlikovali od kompleksa torijuma najčešćeg prirodnog izotopa torijuma, tj. torijuma-232 (polu-život 10<10>godina i efektivno neradioaktivan), trebalo bi shvatiti da kompleksi torijuma i njihovi sastavi koje su ovde objavljeni uključuju radioizotop torijuma koji emituje alfa (tj. bar jedan izotop torijuma sa polu-životom manjim od 10<3>godine, npr. torijum-227) u većoj meri od relativnog izobilja u prirodi, npr. najmanje 20% više.

[0020] Gledano iz još jednog daljeg aspekta, otkrivanje takođe osigurava komplet za upotrebu u postupku prema pronalasku, pri čemu navedeni komplet sadrži deo za ciljanje tkiva, konjugovan ili koji se može konjugovati sa oktadentatnim ligandom koji sadrži hidroksipiridinon. Svi delovi za vezivanje i ligandi, poželjno su oni opisani ovde. Takav komplet će po izboru i poželjno obuhvatati radionuklid torijuma koji emituje alfa, kao što je<227>Th.

DETALJNI OPIS PRONALASKA

[0021] U kontekstu ovog pronalaska, „ciljanje tkiva“ se koristi ovde kako bi se ukazalo da supstanca u pitanju (naročito kada je u obliku konjugata kompleksa torijuma) služi za lokalizaciju (a posebno za lokalizaciju bilo kog konjugovanog kompleksa torijuma) poželjno na najmanje jedno mesto tkiva na kom je poželjno njeno prisustvo (npr. za isporuku radioaktivnog raspada). ciljajući deo se, na primer, može vezati za markere ćelijske površine (npr. receptore, transportne proteine, molekule adhezije ćelija itd.) prisutne na ćelijama pogođenim bolestima ili na ćelijama u blizini ćelija pogođenih bolestima. Ovakvi markeri za površinu ćelija uključuju proteine koji se više eksprimiraju na obolelim ćelijskim površinama nego na zdravim ćelijskim površinama ili onima koji se više eksprimiraju na ćelijskim površinama tokom perioda rasta ili replikacije nego u toku neaktivnih faza. Komponente prisutne u blizini ciljanih ćelija ili tkiva ili povezanih sa njima mogu se takođe koristiti na cilju za terapiju u skladu sa bilo kojim aspektom pronalaska. Na primer, komponente koje su prisutne u matrici ili koje se nalaze u matrici oko ciljanih ćelija ili tkiva mogu se koristiti za ciljanje ako prisustvo, oblik ili koncentracija omogućavaju razlikovanje regije od zdravog tkiva. Primeri toga su matrični antigeni kao što je tenascin, koji je povezan sa tumorima mozga, ali se izražava u matrici između ćelija. Ovakvi matrični antigeni mogu biti ciljani od strane pojedinačnog ili kompozitnog dela za ciljanje kao što je ovde razmatrano.

[0022] Deo koji cilja tkivo može takođe da sadrži dve ili više komponenti koje kolektivno imaju efekat usmeravanja kompleksa torijuma na željeno tkivo. Ovo može biti, na primer, kada se prva komponenta primenjuje i koja se vezuje za određeno tkivo, tumor ili ćelijski tip (agens za vezivanje tkiva), i druga i/ili dodatna komponenta (vezivnih agens) se primenjuje istovremeno ili poželjno kasnije, koja se vezuje in vivo na agens za vezivanje tkiva. Vezivni agens bi bio konjugovan direktno ili indirektno na kompleksirani torijum koji emituje alfa i na taj način kolektivno, agensi za vezivanje tkiva i vezivni agensi formiraju deo koji cilja tkivo. Pogodni specifični vezivni parovi odgovarajući za pružanje agenasa za vezivanje tkiva i vezivnih agenasa sa uzajamnim afinitetom su dobro poznati u struci (npr. biotin sa avidinom ili streptavidinom).

[0023] Različiti aspekti pronalaska koji su ovde opisani odnose se na lečenje bolesti, posebno za selektivno usmeravanje obolelog tkiva, kao i vezano za komplekse, konjugate, lekove, formulaciju, komplete i slično korisne u takvim postupcima. U svim aspektima, obolelo tkivo može boraviti na jednom mestu u telu (na primer u slučaju lokalizovanog čvrstog tumora) ili može boraviti na više mesta (na primer kada je nekoliko zglobova pogođenih artritisom ili u slučaju distribuirane ili metastazirane kancerogene bolesti).

[0024] Bolesno tkivo koje treba ciljati može biti na mestu mekog tkiva, na mestu kalcifikovanog tkiva ili na mnoštvu mesta koja sva mogu biti u mekom tkivu, sva u kalcifikovanom tkivu ili mogu uključivati najmanje jedno mesto mekog tkiva i/ili najmanje jedno kalcifikovano tkivo. U jednom aspektu, ciljano je najmanje jedno mesto mekog tkiva. Mesto ciljanja i mesto porekla bolesti mogu biti ista, ali alternativno mogu biti različita. Kada je uključeno više od jednog mesta, ovo može uključivati mesto porekla ili može biti mnoštvo sekundarnih mesta.

[0025] Izraz „meko tkivo“ se ovde koristi da označi tkiva koja nemaju

„tvrdu“ mineralizovanu matricu. Konkretno, meka tkiva koja se ovde koriste mogu biti bilo koja tkiva koja nisu skeletna tkiva. U skladu s tim, „bolest mekog tkiva“, kako se ovde koristi, označava bolest koja se javlja u „mekim tkivima“ kad se ovde koristi. Pronalazak je naročito pogodan za lečenje kancera i „bolest mekog tkiva“ tako obuhvata karcinome, sarkome, mijelome, leukemije, limfome i rakove mešovitog tipa koje se javljaju u bilo kojim „mekim“ (tj. nemineralizovanim) tkivima, kao i druge ne-kancerogene bolesti takvog tkiva. Kancerogeno „oboljenje mekog tkiva“ uključuje čvrste tumore koji se javljaju u mekim tkivima, kao i metastatske i mikrometastatske tumori. Zaista, bolest mekog tkiva može sadržati primarni čvrsti tumor mekog tkiva i najmanje jedan metastatski tumor mekog tkiva kod istog pacijenta. Alternativno, „bolest mekog tkiva“ može se sastojati samo od čvrstog tumora ili samo metastaza sa primarnim tumorom koji predstavlja skeletnu bolest.

[0026] Ključni nedavni zaključak je da neki izotopi alfa-radioaktivnog torijuma (npr.<227>Th) mogu da se primene u količini koja je terapeutski efikasna i ne stvara netolerantnu mijelotoksičnost. Kad se ovde koristi, izraz „prihvatljivo ne-mijelotoksični“ se koristi kako bi se ukazalo na to da je, najvažnije, količina radijuma-223 nastala propadanjem primenjenog torijum-227 radioizotopa generalno nedovoljna da bude direktno smrtonosna po pacijenta. Međutim, kvalifikovanom stručnjaku će biti jasno da će količina oštećenja srži (i verovatnoća smrtonosne reakcije) koja će biti prihvatljiv sporedni efekat takvog tretmana znatno varirati u zavisnosti od vrste bolesti koja se leči, ciljeva režima lečenja i prognoze pacijenta. Iako su poželjni pacijenti za ovaj pronalazak ljudi, drugi sisari, posebno psi, će imati koristi od upotrebe pronalaska, a nivo prihvatljivog oštećenja srži takođe može zavisiti od vrste pacijenta. Prihvatljiv nivo oštećenja srži će generalno biti veći pri lečenju malignih bolesti nego kod nemalignih bolesti. Jedna dobro poznata mera nivoa mijelotoksičnosti je broj neutrofilnih ćelija i, u ovom pronalasku, prihvatljiva ne-mijelotoksična količina<223>Ra je tipično kontrolisana količina tako da je fragment neutrofila u najnižoj tački (nadir) ne manja od 10% broja pre tretmana. Poželjno, prihvatljivo ne-mijelotoksično količina<223>Ra će biti takva da je fragment neutrofilnih ćelija najmanje 20% pri nadiru i još poželjnije najmanje 30%. Najpoželjniji je nadir fragmenta ćelija neutrofila od najmanje 40%.

[0027] Pored toga, radioaktivni torijum (npr.<227>Th) može se koristiti u režimima velikih doza gde bi mijelotoksičnost generisanog radijuma (npr.<223>Ra) uobičajeno bila nepodnošljiva kada je uključena podrška matičnih ćelija ili uporedivi metod oporavka. U takvim slučajevima, broj neutrofilnih ćelija može se smanjiti na ispod 10% pri nadiru i izuzetno će se smanjiti na 5% ili ako je potrebno ispod 5%, ako se preduzmu se odgovarajuće mere predostrožnosti i pruži se podrška za matične ćelije. Takve tehnike su dobro poznate u struci.

[0028] Izotop torijuma prema ovom pronalasku je torijum-227, i torijum-227 je izotop za sve reference na torijum ovde gde to omogućava kontekst. Torijum-227 je relativno jednostavan za proizvodnju i može se pripremiti indirektno od neutronskog zračenja<226>Ra, koji će sadržati matični nuklid<227>Th, tj.<227>Ac (T1/2 = 22 godine). Aktinijum-227 se lako može odvojiti od<226>Ra cilja t i koristi se kao generator za<227>Th. Ovaj proces se može uvećati na industrijsku razmeru, ako je potrebno, i samim tim se može izbeći problem snabdevanja koji postoji sa većinom drugih alfa emitera koji se smatraju kandidatima za molekularno ciljanu radioterapiju.

[0029] Torijum-227 se raspada preko radijuma-223. U ovom slučaju primarna ćerka ima polu-život 11,4 dana. Od čistog<227>Th izvora, samo umerene količine radijuma proizvedene su tokom prvih nekoliko dana. Međutim, potencijalna toksičnost<223>Ra je veća od one kod<227>Th jer se emitovanje<223>Ra alfa čestice prati unutar nekoliko minuta sa još tri alfa čestice iz kratkotrajnih ćerki (pogledati Tabelu 2 u nastavku koja određuje seriju raspada za torijum-227).

Tabela 2

[0030] Delimično zbog toga što proizvodi potencijalno štetne proizvode raspadanja, torijum-227 (T1/2 = 18,7 dana) nije široko razmatran za terapiju alfa česticama.

[0031] Torijum-227 se može primenjivati u količinama dovoljnim da obezbedi poželjne terapeutske efekte bez stvaranja toliko radijuma-223 koliko izaziva nepodnošljivu supresiju koštane srži. Poželjno je održavati ćerke izotope u ciljanoj regiji, tako da se dalje terapeutski efekti mogu izvesti iz njihovog raspada. Međutim, nije neophodno održavati kontrolu nad proizvodima raspadanja torijuma kako bi imali koristan terapeutski efekat bez indukovanja neprihvatljive mijelotoksičnosti.

[0032] Pod pretpostavkom da će efekat ubijanja ćelija tumora biti uglavnom od torijuma-227, a ne od ćerki, verovatna terapeutska doza ovog izotopa može se ustanoviti u poređenju sa drugim alfa emiterima. Na primer, za astatin-211, terapeutske doze kod životinja su tipično 2-10 MBq po kg. Korigujući polu-život i energiju, odgovarajuća doza za torijum-227 bi bila najmanje 36-200 kBq po kg telesne težine. Ovo bi postavilo niže ograničenje na iznos<227>Th koji se može korisno primeniti u očekivanju terapijskog efekta. Ovo izračunavanje pretpostavlja uporedivo zadržavanje astatina i torijuma. Očigledno je da, međutim, polu-život torijuma od 18,7 dana, najverovatnije rezultuje većim uklanjanjem ovog izotopa pre njegovog raspadanja. Prema tome, obračunata doza se obično smatra minimalnom efektivnom količinom. Terapeutska doza izražena putem u potpunosti zadržanog<227>Th (tj.<227>Th, koji se ne uklanja iz tela) obično će biti najmanje 18 ili 25 kBq/kg, poželjno najmanje 36 kBq/kg i još poželjnije najmanje 75 kBq/kg, na primer 100 kBq/kg ili više. Očekuje se da će veće količine torijuma imati veći terapeutski efekat, ali se ne mogu davati ukoliko dođe do neprihvatljivih neželjenih efekata. Isto tako, ako se torijum primenjuje u obliku koji ima kratki biološki polu-život (tj. polu-život pre eliminacije iz tela koje još uvek nosi torijum), onda će biti potrebna terapeutska dejstva veća količina radioizotopa, jer će većina torijuma biti eliminisana pre nego što se raspadne. Međutim, postojaće odgovarajuće smanjenje količine radijuma-223. Gornje količine torijuma-227 koje treba davati kada je izotop potpuno zadržan lako se mogu povezati sa ekvivalentnim dozama sa kraćim biološkim polu-životom. Takvi proračuni su dobro poznati u struci i dati u WO 04/091668 (npr. u tekstu i u Primerima 1 i 2).

[0033] Ako radioaktivno obeleženo jedinjenje oslobađa ćerke nuklide, važno je znati sudbinu, ako je primenjivo, bilo kog radioaktivnog nuklida ćerke. Sa<227>Th, glavni ćerka proizvod je<223>Ra, koji je pod kliničkom ocenom zbog svojstva za traženje kostiju. Radijum-223 vrlo brzo uklanja krv i koncentriše se u skelet ili se izlučuje preko crevnih i renalnih

1

linija (pogledati Larsen, J Nucl Med 43(5, Supplement): 160P (2002)). Radijum-223 oslobođen in vivo od<227>Th stoga ne može uticati na zdravo meko tkivo. U studiji Müller in Int. J. Radiat. Biol.20:233-243 (1971) o distribuciji<227>Th kao rastvorene citratne soli, otkriveno je da se<223>Ra generisan od strane<227>Th u mekim tkivima lako distribuira do kostiju ili se izlučuje. Poznata toksičnost radijuma koji emituje alfa, naročito u koštanu srž, jeste problem sa dozama torijuma.

[0034] Utvrđeno je po prvi put u WO 04/091668 da, zapravo, doza od najmanje 200 kBq/kg<223>Ra može da se primenjuje i toleriše kod ljudi. Ovi podaci su predstavljeni u toj publikaciji. Prema tome, sada se može videti da, sasvim neočekivano, postoji terapeutski prozor u kom se terapeutski efikasna količina<227>Th (kao što je više od 36 kBq/kg) može primenjivati pacijentu sisaru bez očekivanja da će takav pacijent trpiti neprihvatljiv rizik od ozbiljne ili čak smrtonosne mijelotoksičnosti. Ipak, izuzetno je važno da se učini najbolja upotreba ovog terapeutskog prozora i zbog toga je od suštinskog značaja da se radioaktivni torijum brzo i efikasno kompleksira i da se drži sa veoma visokim afinitetom tako da se najveća moguća proporcija doze dostavlja ciljanom mestu.

[0035] Količina<223>Ra generisana od<227>Th farmaceutski će zavisiti od biološkog polu-života radioaktivno obeleženog jedinjenja. Idealna situacija bi bila da se koristi kompleks sa brzim upijanjem tumora, uključujući internalizaciju u tumorsku ćeliju, jako zadržavanje tumora i kratki biološki polu-život u normalnim tkivima. Kompleksi sa manjim od idealnog biološkog polu-života mogu ipak biti korisni sve dok se doza<223>Ra održava u okviru tolerantnog nivoa. Količina radijuma-223 generisanog in vivo će biti faktor količine primenjenog torijuma i biološkog vremena zadržavanja kompleksa torijuma. Količina radijuma-223 generisana u bilo kom konkretnom slučaju može se lako izračunati od strane stručnjaka u oblasti. Maksimalna primenjena količina<227>Th će biti određena količinom radijuma generisanog in vivo i mora biti manja od količine koja će dovesti do neprihvatljivog nivoa neželjenih efekata, naročito mijelotoksičnosti. Ova količina će uglavnom biti manja od 300kBq/kg, posebno manja od 200 kBq/kg i poželjnije manja od 170 kBq/kg (npr. manje od 130 kBq/kg). Minimalna efikasna doza će se utvrditi pomoću citotoksičnost torijuma, osetljivosti obolelog tkiva na generisano alfa zračenje i stepen do kog se torijum efikasno kombinuje, drži i isporučuje od strane ciljanog kompleks (koji je kombinacija liganda i ciljanog dela u ovom slučaju).

[0036] Prema pronalasku kompleks torijuma se poželjno primenjuje uz dozu torijuma-227 od 18 do 400 kBq/kg telesne težine, poželjno 36 do 200 kBq/kg, (npr.50 do 200 kBq/kg), poželjnije 75 do 170 kBq/kg, posebno 100 na 130 kBq/kg. Odgovarajući na to, pojedinačna doza može se sastojati oko bilo kog od ovih opsega pomnoženih odgovarajućom telesnom težinom, kao što je 30 do 150 kg, poželjno 40 do 100 kg (npr. opseg od 540 kBq do 4000 kBq po dozi itd). Doziranje torijuma, agens za kompleksiranje i put za primenu će takođe poželjno biti takvi da je doza radijuma-223 generisana in vivo manja od 300 kBq/kg, poželjnije manja od 200 kBq/kg, još poželjnije manja od 150 kBq/kg, posebno manja od 100 kBq/kg. Ponovo, ovo će obezbediti izloženost<223>Ra indikovanu množenjem ovih opsega sa bilo kojom navedenom telesnom težinom. Prethodno navedeni nivoi doze su poželjno potpuno zadržana doza<227>Th, ali može biti primenjena doza uzimajući u obzir da se nešto<227>Th očisti iz tela pre nego što se raspadne.

[0037] Kada je biološki polu-život<227>Th kompleks je kratak u poređenju sa fizičkim poluživotom (npr. manje od 7 dana, naročito manje od 3 dana), može biti potrebna veća primenjena doza kako bi se obezbedila ekvivalentna zadržana doza. Tako, na primer, potpuno zadržana doza od 150 kBq/kg je ekvivalentna kompleksu sa polu-životom od 5 dana koji se primenjuje u dozama od 711 kBq/kg. Ekvivalentna primenjena doza za bilo koje odgovarajuće zadržane doze može se izračunati iz brzine biološkog čišćenja kompleksa korišćenjem postupaka koji su dobro poznati u struci.

[0038] S obzirom da raspadanje jednog<227>Th jezgra daje jedan<223>Ra atom, zadržavanje i terapijska aktivnost<227>Th će biti direktno vezani za<223>Ra dozu datoj pacijentu. Količina<223>Ra koji se generiše u bilo kojoj posebnoj situaciji može se izračunati korišćenjem poznatih postupaka.

[0039] Očigledno je poželjno minimizovati izlaganje pacijenta<223>Ra ćerka izotopu, osim ako se njegova svojstva ne primenjuju korisno. Konkretno, količina radijuma-223 generisanog in vivo obično će biti veća od 40 kBq/kg, npr. veća od 60 kBq/Kg. U nekim slučajevima biće potrebno za<223>Ra generisan in vivo da bude veći od 80 kBq/kg, npr. veći od 100 ili 115 kBq/kg. Konjugati obeleženi sa tomijumom-227 u odgovarajućim nosač rastvorima mogu se primenjivati intravenozno, intracavitarno (npr. intraperitonealno), potkožno, oralno ili topično, kao pojedinačna primena ili u režimu frakcionisane primene. Poželjno, kompleksi konjugovani u ciljajući deo biće primenjeni kao rastvori putem parenteralnog (npr. transkutanog) puta, posebno intravenozno ili intrakavitarnim putem. Poželjno je da se sastavi iz ovog pronalaska formulišu u sterilnom rastvoru za parenteralnu primenu.

[0040] Torijum-227 u korišćenju i proizvodima iz ovog pronalaska može se koristiti samostalno ili u kombinaciji sa drugim modalitetima lečenja, uključujući hirurgiju, terapiju spoljašnjeg snopa zračenja, hemoterapiju, druge radionuklide ili podešavanje temperature tkiva itd. Ovo formira dalje, poželjno otelotvorenje upotreba pronalaska i formulacije/lekovi mogu, prema tome, da obuhvate najmanje jedan dodatni terapeutski aktivni agens, kao što je drugi radioaktivni agens ili hemoterapeutski agens. U jednoj posebno poželjnoj realizaciji subjekt se takođe podvrgava lečenju matičnim ćelijama i/ili drugim podsticajnim terapijama kako bi se smanjili efekti mijelotoksičnosti izazvani radijumom-223.

[0041] Prema ovom pronalasku<227>Th je kompleksiran ciljanjem kompleksirajućih agenasa, kao što je definisano u patentnim zahtevima. Tipično, ciljajući deo će imati molekulsku težinu od 100 g/mol do nekoliko miliona g/mol (posebno 100 g/mol do 1 milion g/mol) i poželjno će imati afinitet za receptor koji je vezan za bolest bilo direktno i/ili će sadržati odgovarajući prethodno dat veznik (npr. biotin ili avidin) vezan za molekul koji je bio ciljan za bolest pre nego što je primenjen<227>Th. Pogodna ciljana grupa uključuju poli- i oligopeptide, proteine, fragmente DNK i RNK, aptamere itd., poželjno protein, npr. avidin, strepatavidin, poliklonsko ili monoklonsko antitelo (uključujući antitela tipa IgG i IgM) ili mešavinu proteina ili fragmenata ili konstrukta proteina. Posebno su poželjna antitela, konstrukcije antitela, fragmenti antitela (npr. FAB fragmenti ili bilo koji fragment koji sadrži najmanje jednu regiju za vezivanje antigena), konstrukti fragmenata (npr. jednolančana antitela) ili njihove mešavine.

[0042] Takođe pogodni za upotrebu u predmetnom pronalasku su terapeutski konjugati kompleksiranog<227>Th sa peptidom, aminokiselinom, steroidnim ili nestaroidnim hormonom, folatom, estromom, testosteronom, biotinom ili drugim specifičnim vezivnim jedinjenjima sa molekulskom težinom koja je tipično ispod 10000 g/mol.

[0043] Generalno, oktadentatni ligand je konjugovan direktno ili indirektno (npr. kroz veznik deo) u ciljajući deo. Opšti konstruktori ovog tipa; tj. aktivan (npr. terapeutski ili dijagnostički aktivan) metal - kompleksirajući delo - opciono veznik deo, poznati su u oblasti ciljanih radiofarmaceutika i ciljanih agenasa za slikanje. Međutim, na raspolaganju je malo ili nimalo istraživanja koje procenjuje pogodnost različitih liganda za specifičnu upotrebu sa jonima

1

torijuma 4+. U vezi sa tim, može se pomenuti na primer „Handbook of Targeted Delivery of Imaging agenss“, Ed. Torchilin, CRC Press, 1995.

[0044] Prethodno poznati helatatori za torijum uključuju poliaminopoliakiselina helatore koji sadrže linearnu, cikličnu ili razgranatu poliazalkansku kičmu sa kiselim (npr. karboksialkil) grupama vezanim na azote kičme. Primeri takvih helatatora uključuju DOTA derivate kao što su p-izotiocianatobenzil-1,4,7,10-tetraazaciklododekan-1,4,7,10-tetrasirćetna kiselina (p-SCN-Bz-DOTA) i DTPA derivati kao što je p-izotiocianatobenzil -dietilentriaminpentasirćetna kiselina (p-SCN-Bz-DTPA), pri čemu su prvi ciklični helatatori, a drugi linearni helatori.

[0045] Derivati 1,4,7,10-tetraazaciklododekan-1,4,7,10-tetrasirćetne kiseline prethodno su predstavljeni primerima, ali standardni postupci se ne mogu lako upotrebiti za heliranje torijuma sa DOTA derivatima. Zagrevanje DOTA derivata sa metalom efektivno daje helat, ali često sa niskim prinosima. Postoji tendencija da bar jedan deo liganda bude nepovratno denaturisan tokom postupka. Pored toga, zbog relativno visoke osetljivosti na ireverzibilnu denaturaciju, neophodno je izbegavati vezivanje ciljane grupe sve dok se ne završe svi koraci zagrevanja. Ovo dodaje dodatni hemijski korak (sa svim potrebnim izolovanjem i razdvajanjem), koji se mora izvesti tokom životnog veka izotopa torijuma koji emituje alfa. Očigledno je poželjno da se na ovaj način ne rukuje materijalima koji emituju alfa ili da se u većoj meri generiše odgovarajući otpad nego što je to potrebno. Štaviše, sve vreme utrošeno na pripremu konjugata gubi procenat torijuma koji će se raspasti tokom ovog pripremnog perioda.

[0046] Poželjno je da se kompleksi torijuma koji emituju alfa i oktadentatni ligand u svim aspektima predmetnog pronalaska formiraju ili mogu da se formiraju bez zagrevanja iznad 60°C (npr. bez zagrevanja iznad 50°C), poželjno bez zagrevanja iznad 38°C, a najpoželjnije bez zagrevanja iznad 25°C.

[0047] Dodatno je poželjno da se konjugat ciljajućeg dela i oktadentatnog liganda pripremi pre dodavanja izotopa torijuma koji emituje alfa (npr.<227>Th<4+>ion). Prema tome, proizvodi pronalaska se poželjno formiraju ili se mogu formirati kompleksacijom izotopa torijuma koji emituje alfa (npr.<227>Th<4+>jon) sa konjugatom oktadentatnog liganda i tkiva.

[0048] Helatori su ne-fosfonatni molekuli i u jednom otelotvorenju predmetnog pronalaska<227>Th neće biti vezan ni za bilo koju fosfonatnu ili drugu grupu koja cilja kosti niti se primenjuje sa takvim materijalima.

[0049] Tipovi ciljajućih jedinjenja koji mogu biti povezani sa torijumom (npr. Torijum-227) pomoću oktadentatnog helentora (koji sadrži deo za spajanje kao što je ovde opisano). ciljajući deo može biti izabran od poznatih ciljajućih grupa, koje uključuju monoklonska ili poliklonska antitela, faktore rasta, peptide, hormone i analoge hormona, derivate folata i folata, botina, avidina i streptavidina ili njihove analoge. Ostali mogući nosači mogu biti RNA, DNK ili njegovi fragmenti, oligonukleotidi, ugljeni hidrati, lipidi ili jedinjenja napravljena kombinovanjem takvih grupa sa ili bez proteina itd.

[0050] Deo za ciljanje tkiva može, u jednom otelotvorenju, da isključi tragače kostiju, lipozome i antitela konjugovana folatom ili fragmente antitela. Alternativno, takvi delovi mogu biti uključeni.

[0051] Torijum-227 obeleženi molekuli pronalaska mogu se koristiti za lečenje kancerogenih ili ne-kancerogenih bolesti usmeravanjem receptora vezanih za bolesti. Tipično, takva medicinska upotreba<227>Th biće radioimunoterapija zasnovana na povezivanju<227>Th uz pomoć helatora za antitela, fragmenta antitela ili konstrukcije antitela ili fragmenata antitela za lečenje kancerogenih ili ne-kancerogenih bolesti. Upotreba<227>Th u postupcima i farmaceutskim proizvodima prema predmetnom pronalasku posebno je pogodan za lečenje bilo kog oblika karcinoma uključujući karcinome, sarkome, limfome i leukemije, naročito rak pluća, dojke, prostate, bešike, bubrega, želuca, pankreasa, jednjaka, mozga, jajnika, uterusa, oralni kancer, kolorektalni kancer, melanom, višestruki mijelom i ne-Hodžkinov limfom.

[0052] Količina<223>Ra se može smanjiti ako molekul koji nosi<227>Th ima kratak polu-život biološkog zadržavanja in vivo jer se radionuklid uglavnom eliminiše pre nego što se veliki broja<227>Th raspadne do<223>Ra. Količinu<227>Th bi, međutim, trebalo povećati kako bi se prema ovom pronalasku ostalo terapeutski efikasno. Ako je agens za kompleksiranje izabran tako da isporučuje<227>Th u unutrašnjost ciljanih ćelija to će dodatno povećati specifičnu citotoksičnost i smanjiti sistemski toksični efekat radioaktivnih ćerki zbog barem delimičnog zadržavanja izotopa ćerki na mestu tumora. Obe ove karakteristike proširuju<227>Th terapijski prozor i na taj način formiraju poželjne varijante pronalaska.

1

[0053] U daljnjoj realizaciji pronalaska pacijenti sa bolešću mekog tkiva i skeletnom bolešću mogu se tretirati i sa<227>Th i sa<223>Ra generisanim in vivo od strane primljenog torijuma. U ovom posebno povoljnom aspektu, dodatna terapijska komponenta za tretman je izvedena iz prihvatljivo ne-mijelotoksične količine<223>Ra ciljanjem skeletne bolesti. U ovom terapijskom postupku,<227>Th se obično koristi za lečenje primarnog i/ili metastatskog kancera mekog tkiva odgovarajućim ciljanjem na njega i<223>Ra koji je nastao od<227>Th raspadanja se koristi za lečenje povezanih skeletnih bolesti kod istog pacijenta. Ova skeletna bolest može biti metastaze do skeleta koja proizilazi iz primarnog raka mekog tkiva ili može biti primarna bolest gde se tretman mekog tkiva sprovodi kao odgovor na metastatski karcinoma.

Povremeno bolesti mekog tkiva i skeletne bolesti mogu biti nepovezane (npr. dodatni tretman skeletne bolesti kod pacijenta sa reumatološkim oboljenjem mekog tkiva).

[0054] Objavljena je upotreba oktadentatnog liganda, posebno oktadentatnog liganda koji sadrži hidroksipiridinon. Takvi ligandi će obično sadržati najmanje jednu helatnu grupu sledeće supstituisane piridinske strukture (I):

[0055] Gde je R1opciono N-supstituentna grupa i na taj način može biti odsutna ili može biti izabrana od hidrokarbil, OH, O-hidrokarbil, SH i S-hidrokarbi grupa, gde je bilo koji ili svaki hidrokarbilni ostatak nezavisno izabran od kratkih hidrokarbilnih grupa, kao što je C1 do C8 hidrokarbil, uključujući C1 do C8 alkil, alkenil ili alkinil grupe, ili može biti OH ili O-hidrokarbil. R1može takođe sadržati veznik deo, kao što je naznačeno u nastavku i/ili može sadržati deo za spajanje, kao što je naznačeno u nastavku.

[0056] U Formuli I, grupe R2do R6mogu sve biti nezavisno odabrane od H, OH, =O, kratkog hidrokarbila (kao što je ovde opisano), veznik dela (kao što je ovde opisano) i/ili dela za spajanje (kao što je ovde opisano). Generalno, najmanje jedna od grupa R1do R6će biti OH. Generalno, najmanje jedna od grupa R2do R6će biti =O. Generalno, najmanje jedna od grupa

1

R1do R6će biti veznik deo (kao što je ovde opisano). Poželjno, tačno jedna od grupa R2do R6će biti =O. Poželjno tačno jedna od grupa R1do R6će biti OH. Poželjno tačno jedna od grupa R1do R6će biti veznik deo (kao što je ovde opisano). Preostale grupe R1do R6mogu biti bilo koja od onih grupa koje su ovde navedene, ali su poželjno H. Kada veznik deo ili bilo koji dodatni veznik, šablon ili helatne grupe vezane za veznik deo ne sadrže deo za spajanje, onda je jedna od grupa R1do R6poželjno deo za spajanje (kao što je ovde opisano).

[0057] U poželjnom aspektu objave, jedna od grupa R1do R6će biti OH i jedna od R2do R6će biti =O, i OH i =O grupe će biti na susednim atomima prstena. Stoga, u poželjnoj realizaciji, OH i =O mogu biti na atomima 1,2; 2,3; 3,2; 3,4; ili 4,3 respektivno (numerisanje od azota kao što se očekuje). Oktadentatni ligandi koji imaju barem jedan helatni deo gde su OH i =O grupe prisutne na pozicijama 3 i 2 su visoko poželjni. Oktadentatni ligandi mogu imati 2, 3 ili 4 takve grupe za heliranje, gde su 2 ili 4 takve grupe veoma poželjne.

[0058] Pogodne helatne grupe mogu se formirati postupcima poznatim u struci, uključujući postupke opisane u US 5,624,901 (npr. primeri 1 i 2) i WO2008/063721.

[0059] Kad se ovde koristi, izraz „veznik deo“ (RLu formuli II) se koristi za označavanje hemijskog entiteta koji služi za udruživanje najmanje dve grupe za heliranje u oktadentatnim ligandima, koje čine ključnu komponentu u različitim aspektima pronalaska. Tipično, svaka grupa za heliranje (na primer, ona sa formulom I iznad i/ili formulom II u nastavku) će biti bi-dentatna, pa će četiri helatne grupe, od kojih će najmanje jedna biti formule I, obično biti prisutne u ligandu. Takve helatne grupe su povezane jedne sa drugima pomoću svojih veznik delova. Prema tome, veznik deo (npr. Grupa RLu nastavku) može se deliti između više od jedne helatne grupe formule I i/ili II. Veznik delovi mogu takođe poslužiti kao tačka vezivanja između složenog dela oktadentatnog liganda i ciljanog dela. U takvom slučaju, najmanje jedan veznik deo će se pridružiti delu za spajanje (RC). Pogodni veznik delovi uključuju kratke hidrokarbilne grupe, kao što su C1 do C12 hidrokarbil, uključujući C1 do C12 alkil, alkenil ili alkinil grupu, uključujući metil, etil, propil, butil, pentil i/ili heksil grupe svih topologija.

[0060] Vezni delovi takođe mogu biti ili obuhvataju bilo koje druge odgovarajuće robusne hemijske veze, uključujući estarske, eterske, aminske i/ili amidne grupe. Ukupan broj atoma koji spajaju dva dela za heliranje (brojanje po najkraćem putu ako postoji više od jednog

1

puta) uglavnom će biti ograničen, tako da se ograničavaju delove za heliranje u odgovarajućem rasporedu za formiranje kompleksa. Prema tome, veznik delovi će tipično biti izabrani tako da ne daju više od 15 atoma između delova za heliranje, poželjno 1 do 12 atoma, i poželjnije 1 do 10 atoma između delova za heliranje. Kada veznik deo direktno povezuje dve dela za heliranje, veznik će obično biti 1 do 12 atoma dugačak, poželjno 2 do 10 (kao što su etil, propil, n-butil itd.). Tamo gde se veznik deo pridružuje centralnom šablonu (pogledati u nastavku), onda svaki veznik može biti kraći sa dva odvojena veznika koji se spajaju delom za heliranje. U ovom slučaju može biti poželjna dužina veznika od 1 do 8 atoma, poželjno 1 do 6 atoma (metil, etil i propil su pogodni, kao i grupe kao što su estar, eter ili amidna veza na jednom kraju ili oboje).

[0061] Pored veznik dela, koji prvenstveno služi za povezivanje različitih helatnih grupa oktadentatnog liganda jednih sa drugima i/ili sa centralnim šablonom, oktadentat poželjno dalje sadrži „deo za spajanje“ (RC). Funkcija dela za spajanje je da poveže oktadentatni ligand sa ciljajućim delom. Ovo se može postići bilo kovalentnim ili nekovalentnim vezivanjem (npr. pomoću specifičnog vezujućeg para kao što je biotin/avidin (streptavidin). Poželjno će delovi za spajanje biti kovalentno povezani sa helatnim grupama, bilo direktnim kovalentnim vezivanjem na jednu od helatnih grupa ili više tipično vezivanjem na veznik deo ili šablon. Ukoliko se koriste dva ili više dela za spajanje, svaki se može povezati na bilo kom dostupnom mestu kao što je bilo koji šablon, veznik ili grupa za heliranje.

[0062] U jednom aspektu objave, deo za spajanje može imati strukturu:

gde R7je premošćavajući deo, koji je izabran od supstituisanog ili nesupstituisanog alkila, supstituisanog ili nesupstituisanog heteroalkila, supstituisanog ili nesupstituisanog heterocikloalkila, supstituisanog ili nesupstituisanog arila i supstituisanog ili nesupstituisanog heteroarila; i X je ciljajući deo ili reaktivna funkcionalna grupa. Poželjni premošćavajući delovi obuhvataju sve one grupe koje su ovde navedene kao pogodni veznik delovi. Poželjni ciljajući delovi uključuju sve one koje su ovde opisani, a poželjne reaktivne X grupe obuhvataju svaku grupu sposobnu da formira kovalentnu vezu sa ciljajućim delom, uključujući, na primer, COOH, OH, SH, NHR i COH grupe, gde R od NHR može biti H ili bilo koja od kratkih hidrokarbilnih grupa opisanih ovde. Visoko poželjne grupe za vezivanje na ciljajući deo uključuju epsilon-amine ostataka lizina i tiolne grupe ostataka cisteina.

1

Neograničavajući primeri pogodnih reaktivnih X grupa uključuju N-hidroksisukcimidilestre, imidoestare, acilhalide, N-maleimide, alfa-halo acetil i izotiocianate, gde su poslednja tri pogodni za reakciju sa tiol grupom.

[0063] Deo za spajanje je poželjno vezan tako da rezultujući spojeni oktadentatni ligand može biti podvrgnut formiranju stabilnih kompleksa metalnih jona. Veznik deo će, prema tome, poželjno biti vezan za veznik, šablon ili helatni deo na mestu koje značajno ne ometa kompleksiranje. Ovakvo mesto će poželjno biti na vezniku ili šablonu, poželjnije na položaju koji je udaljen od površine koja se vezuje za cilj.

[0064] Prema objavi, poželjne helatne grupe uključuju one formule II u nastavku:

[0065] U formuli II iznad, ostatak =O predstavlja keto grupu vezanu za bilo koji ugljenik piridinskog prstena, -OH predstavlja hidroksi deo vezan za bilo koji atom piridinskog prstena i -RLpredstavlja veznik deo koji povezuje hidroksipiridinonski deo sa drugim kompleksrajućim delovima kako bi se formirao ukupni oktadentatni ligand. Bilo koji veznik deo opisan ovde je pogodan kao RLuključujući i kratke hidrokarbilne grupe, kao što su C1 do C8 hidrokarbil, uključujući C1 do C8 alkil, alkenil ili alkinil grupu, uključujući metil, etil, propil, butil, pentil i/ili heksil grupe svih topologija. RLmože da se pridruži prstenu formule II na bilo kom atomu piridinskog prstena, kao što je atom ugljenika ili azota. RLgrupe mogu potom direktno da se vezuju za drugu helatnu grupu, drugu veznik grupu i/ili centralni atom ili grupu, kao što je prsten ili drugi šablon (kao što je ovde opisano). Veznici, helatne grupe i opcioni šablonski delovi su izabrane tako da formiraju odgovarajući oktadentatni ligand.

[0066] U jednom poželjnom aspektu objave, -OH i =O delovi formule II se nalaze na susednim atomima piridinskog prstena, tako da su 1,2-; 2,3-, 3,2-; 4,3-; i 3,4-hidroksipiridinonski derivati svi vrlo pogodni.

1

[0067] Gde se OH grupa ili veznik deo RLnalaze na azotu piridinskog prstena, grupa RNće generalno biti odsutna. Međutim, tamo gde je prisutan, RN može biti bilo koja odgovarajuća grupa, uključujući supstituisane ili nesupstituisane hidrokarbilne grupe, naročito kratke hidrokarbilne grupe navedene ovde.

[0068] U jednom poželjnom aspektu objave, najmanje jedan 3,2-hidroksipiridinonski deo je prisutan u strukturi oktadentatnog liganda. Ovo se očigledno može supstituisati bilo kojim od različitih supstituenat delova koji su ovde navedeni.

[0069] Budući da svaka od delova formule II ima dva potencijalno kompleksirajuća kiseonika, jedan aspekt objave pruža oktadentatni ligand koji sadrži najmanje 2, poželjno najmanje 3 i najpoželjnije 4 nezavisno izabrana dela formule I. Svaki deo formule II može imati nezavisan obrazac supstitucije, ali u jednom poželjnom aspektu, najmanje jedan deo je 3,2-hidroksipiridinonski deo. Ligand može uključivati 2, 3 ili 43,2-hidroksipiridinonske grupe (odgovarajuće supstituisano, kao što je opisano ovde).

[0070] Svaki deo formule I ili II u oktadentatnom ligandu može biti spojen sa ostatkom liganda bilo kojom odgovarajućom veznik grupom kao što je ovde razmatrano i u bilo kojoj prikladnoj topologiji. Na primer, četiri grupe formule I mogu se pridružiti sa svojim veznik grupama za kičmu tako da se formira linearni ligand, ili se mogu premostiti veznik grupama kako bi se formirala struktura tipa „oligomer“, koja može biti linearna ili ciklična.

Alternativno, delovi liganda formule I i/ili II mogu biti spojeni topografijom „ukrštanja“ ili „zvezda“ u centralni atom ili grupu, svaka pomoću veznika (npr. „RL“ deo). Veznik delovi (RL) se mogu pridružiti isključivo putem ugljenik-ugljenik veza, ili se mogu povezati jedan sa drugim, sa drugim helatnim grupama, za kičmu, šablon, deo za spajanje ili drugim veznik pomoću bilo koje odgovarajuće robusne funkcionalnosti uključujući amin, amid, estar, etar, tio-etar ili disulfidna veza.

[0071] „Zvezdani“ raspored je naznačen u formuli III u nastavku:

2

[0072] Gde su sve grupe i položaji navedeni kao iznad i „T“ je dodatno centralni atom ili šablonska grupa, kao što je atom ugljenika, hidrokarbilni lanac (kao što je bilo koji od onih opisanih iznad), alifatski ili aromatični prsten (uključujući heterociklične prstene) ili spojeni prstenasti sistem. Najosnovniji šablon bi bio jedan ugljenik, koji bi se zatim povezao za svaki od delova za heliranje pomoću njihovih vezujućih grupa. Duži lanci, kao što su etil ili propil, jednako su održivi sa dve helatne grupe koje se nalaze na svakom kraju šablona. Očigledno, svako pogodno robusno povezivanje može se koristiti pri spajanju u šablon i veznikove delove, uključujući ugljenik-ugljenik veze, estar, etar, amin, amid, tio-eter ili disulfid.

[0073] U strukturi formule III grupe RNi RLmogu biti iste grupe takve da se helatni delovi vezuju za šablon T preko atoma azota piridinskog prstena. Ovo pruža strukture tipa IIIb ispod:

[0074] Očigledno je da u strukturama formule II III, IIIb, IV i Ivb, oni položaji piridinskog prstena koji nisu drugačije supstituisani (npr. putem veznik dela ili dela za spajanje) mogu nositi supstituente opisane za R1do R5u Formuli I, po potrebi. Konkretno, mali alkilni supstituenti, kao što su metil, etil ili propil grupe mogu biti prisutni na bilo kom položaju.

[0075] Oktadentatni ligand će uopšteno dodatno sadržati bar jedan deo za spajanje kao što je gore opisano. Ovo može biti bilo koja pogodna struktura koja uključuje bilo šta od onoga navedenog ovde, i završiće se sa ciljajućim delom, specifičnim veznikom ili funkcionalnom grupom sposobnom da se poveže sa takvim ciljajućim delom ili specifičnim veznikom.

[0076] Deo za spajanje može da se prikaže na bilo kojoj pogodnoj tački veznika, šablona ili helatnog dela, kao što je u tačkama a), b) i/ili c) kako je navedeno u formuli III. Priključak dela za spajanje može biti sa bilo kojom odgovarajućom robusnom vezom kao što su ugljenikugljenik veza, estar, etar, amin, amid, tio-eter ili disulfidne veze. Slično tome, grupe sposobne da formiraju bilo kakve takve veze sa ciljajućim delom pogodne su za funkcionalni kraj dela za spajanje i taj deo će se završiti sa takvim grupama kada su vezane za ciljajući deo.

[0077] Alternativna struktura tipa „kičme“ navedena je u daljem tekstu u Formuli IV

[0078] Kad su sve grupe i položaji kako je navedeno u patentnim zahtevima i „RB“ je dodatno kičmeni deo koji će obično imati sličnu strukturu i funkciju bilo kog od veznika koji su ovde navedeni, i stoga se svaka definicija veznik dela može uzeti da se primeni na kičmeni deo gde to omogućava kontekst. Odgovarajući kičmeni delovi će formirati skele na koje će se zakačiti helatni delovi pomoću svojih veznik grupa. Obično su potrebne tri ili četiri kičme. Tipično to će biti tri za linearnu kičmu ili četiri ako je kičma ciklična. Posebno poželjni kičmeni delovi uključuju kratke ugljovodonične lance (kao što su ovde opisani) koji po izboru imaju heteroatom ili funkcionalni deo na jednom ili oba kraja. Aminske i amidne grupe su naročito pogodne u tom pogledu.

[0079] Deo za spajanje se može prikačiti na bilo koju pogodnu tačku veznika, kičme ili helatne grupe, kao što su tačkama a), b) i/ili c') kao što je naznačeno u formuli IV. Priključak dela za spajanje može biti sa bilo kojom odgovarajućom robusnom vezom kao što su ugljenik-ugljenik veza, estar, etar, amin, amid, tio-eter ili disulfidne veze. Slično tome, grupe sposobne da formiraju bilo kakve takve veze sa ciljajućim delom pogodne su za funkcionalni kraj dela za spajanje i taj deo će se završiti sa takvim grupama kada se veže za ciljajući deo.

[0080] Kao i kod Formule III, u strukturi formule IV grupe RNi RLmogu biti ista grupa tako da se helatni delovi zakačinju za kičmu RBpreko atoma azota piridinskog prstena. Ovo pruža strukture tipa IVb u nastavku:

2

[0081] Primer oktadentatnog liganda „kičma“ tipa koji ima dva 1,2 i dva 3,2-HOPO dela za heliranje vezana za kičmu amidnim veznik grupama biće formula V na sledeći način:

[0082] Primeri „šablonski“ oktadentatni ligandi, od kojih svaki ima četiri 3,2-HOPO helatne grupe, povezane etil amidnim grupama za etil i propil diamin, biće formule VI i VII na sledeći način:

[0083] Treba napomenuti da su u gore navedenim formulama slobodni azoti od 3,2-HOPO delova supstituisani sa metil grupama i male hidrokarbilne grupe kao što su metil ili etil su poželjne na ovom položaju (R1u Formuli I ili RNu formuli II).

[0084] Primerni „šablonski“ oktadentatni ligand (referenca) koji ima četiri 3,2-HOPO dela za heliranje vezana azotom u HOPO prstenu na amin ciklan bi bile formule VIII na sledeći način:

[0085] Kao što je prethodno naznačeno, oktadentatni ligand će uobičajeno uključivati veznik deo koji se može pridružiti ostatku liganda u bilo kojoj tački. Primerno jedinjenje sa funkcionalizovanim delom koji završava veznik deo, u skladu sa ovim otelotvorenjem, je struktura IX (prema pronalasku) u nastavku:

Dalje se upućuje na referencu Gordon AEV i dr., Rational design of sequestering agents for plutonium and other actinides. Chem. Rev.2003, 103, 4207-4282, PCT prijava patenta WO 2008/063721 A2 i T.N. Lambert i dr., Tetrahedron Letters 43 (2002) 7379-7383.

[0087] Pronalazak se dalje ilustruje priloženim Slikama, gde:

Slika 1 - prikazuje hromatogram reakcione smeše<232>Th<4+>(HNO3) i 1 mg/mL ALG-DD-NCS u DMSO (teoretski odnos 2:3) nakon 15 minuta na sobnoj temperaturi. Postoje značajne količine kompleksa<232>Th-ALG-DD-NCS (tR= 5,74 minuta; m/z

2

1328,5), i nema tragova slobodnog ALG-DD-NCS liganda (tR= 5,36).

Slika 2 - prikazuje maseni spektar<232>Th-ALG-DD-NCS kompleksa (m/z 1328,3949). Slika 3 - prikazuje hromatogram reakcione smeše Fe<3+>(HNO3) i 1 mg/mL ALG-DD-NCS u DMSO (teoretski odnos 2:3) nakon 15 minuta na sobnoj temperaturi. Postoje značajne količine kompleksa Fe-ALG-DD-NCS (tR= 5,81 minuta; m/z 1153,5), i nema tragova slobodnog ALG-DD-NCS liganda (tR= 5,36 minuta).

Slika 4 - prikazuje maseni spektar Fe-ALG-DD-NCS kompleksa (m/z 1153,3002). Slika 5 - prikazuje hromatogram reakcione smeše In<3+>(HCl) i 1 mg/mL ALG-DD-NCS u DMSO (teoretski odnos 2:3) nakon 15 minuta na sobnoj temperaturi. Postoje značajne količine kompleksa In-ALG-DD-NCS (tR= 5,95 minuta; m/z 1212,5), i nema tragova slobodnog ALG-DD-NCS liganda (tR= 5,36 minuta).

Slika 6: - prikazuje maseni spektar In-ALG-DD-NCS kompleksa (m/z 1212,2666). Slika 7 - prikazuje hromatogram reakcione smeše<232>Th<4+>(HNO3) i 1 mg/mL ALG1005-38 u acetatnom puferu, pH 5,5, nakon 10 minuta na sobnoj temperaturi (teoretski odnos 1:3). Postoje značajne količine kompleksa<232>Th-ALG1005-38 (tR= 3,56; m/z 1184,5) i ostaci slobodnog ALG1005-38 liganda (tR= 3,20).

Slika 8 - prikazuje maseni spektar<232>Th-ALG1005-38 kompleksa (m/z 1184,4662). Slika 9 - prikazuje hromatogram reakcione smeše Fe<3+>(HNO3) i 1 mg/mL ALG1005-38 u acetatnom puferu, pH 5,5, nakon 10 minuta na sobnoj temperaturi (teoretski odnos 1:3). Postoje značajne količine kompleksa Fe-ALG1005-38 (tR= 3,70; m/z 1009,5) i ostaci slobodnog ALG1005-38 liganda (tR= 3,22).

Slika 10 - prikazuje maseni spektar Fe-ALG1005-38 kompleksa (m/z 1009,3727). Slika 11 - prikazuje hromatogram reakcione smeše In<3+>(HCl) i 1 mg/mL ALG1005-38 u acetatnom puferu, pH 5,5, nakon 10 minuta na sobnoj temperaturi (teoretski odnos 1:3). Postoje značajne količine kompleksa In-ALG1005-38 (tR= 3,72; m/z 1068,5) i samo tragovi slobodnog ALG1005-38 liganda (tR= 3,21).

Slika 12 - prikazuje maseni spektar In-ALG1005-38 kompleksa (m/z 1068,3485). Slika 13 - prikazuje hromatogram reakcione smeše Ga<3+>(HCl) i 1 mg/mL ALG1005-38 u acetatnom puferu, pH 5,5, nakon 10 minuta na sobnoj temperaturi (teoretski odnos 1:3). Značajne količine kompleksa Ga-ALG1005-38 (tR= 3,65; m/z 1022,5) i ostaci slobodnog ALG1005-38 liganda (tR= 3,21).

Slika 14 - prikazuje maseni spektar Ga-ALG1005-38 kompleksa (m/z 1022,3571). Slika 15 - prikazuje hromatogram reakcione smeše<232>Th<4+>(HCl) i 1 mg/mL Bb-1-HOPO-1-DEBN (teoretski odnos 2:3) nakon 15 minuta na sobnoj temperaturi. Postoje

2

značajne količine kompleksa<232>Th-Bb-1-HOPO-1-DEBN (tr= 3,52). Gornji trag: Maseni hromatogram od m/z 1222,5. Donji trag: UV na 330 nm.

Slika 16 - prikazuje maseni spektar<232>Th-Bb-1-HOPO-1-DEBN kompleksa (m/z 1222,5).

Slika 17 - prikazuje izračunatu količinu<227>Th-ALG-DD-NCS-trastuzumaba i slobodan<227>Th vezan za SK-OV-3 ćelijske pelete na dan 0-7, prikazano kao raspadom korigovana<227>Th-aktivnost (cpm).

Slika 18 – prikazuje normalizovane vrednosti luminesencije za SK-OV-3 ćelije tretirane sa (1) Redovnim medijumom (kontrola); (2) 20 µg/mL trastuzumabom; (3) 20 kBq/mL<227>Th-ALG-DD-NCS-trastuzumabom (10166 Bq/µg); i (4) 20 kBq/mL slobodnim<227>Th.

Slika 19 - prikazuje klonogeni test 1000 SK-OV-3 pojedinačnih ćelija tretiranih sa (1) Redovnim medijumom (kontrola); (2) trastuzumabom; (3) slobodnim<227>Th; i (4)<227>Th-ALG-DD-NCS-trastuzumabom (10166 Bq/µg). (Sredina ± SD; n = 3) Slika 20 - prikazuje klonogeni test 3000 SK-OV-3 pojedinačnih ćelije tretiranih sa (1) Redovnim medijumom (kontrola); (2) trastuzumabom; (3) free<227>Th; i (4)<227>Th-ALG-DD-NCS-trastuzumabom (10166 Bq/µg). (Sredina ± SD; n = 3)

Slika 21 – prikazuje raspodelu po organima<227>Th-ALG-DD-NCS-trastuzumaba (2700 Bq/µg) kod Balb/c golih miševa sa SK-OV-3 ksenograftima, nakon biodistributiona tokom 24 sata i 4 dana. (Sredina ± SD; n = 5)

[0088] Pronalazak će sada biti ilustrovan sledećim primerima. Sva jedinjenja data u primerima formiraju poželjne aspekte otkrića (uključujući poželjne međuproizvode i prekursore) i mogu se koristiti pojedinačno ili u bilo kojoj kombinaciji u bilo kom aspektu gde to omogućuje kontekst. Tako, na primer, svako i sva jedinjenja 2 do 4 iz Primera 2, jedinjenje 10 iz Primera 3 i jedinjenje 7 iz Primera 4 formiraju poželjne aspekte njihovih različitih tipova. Samo jedinjenja 3, 4 i 6-10, kao i struktura IX, su strukture zatražene u predmetnom zahtevu 1.

Primer 1 -Izolacija čistog torijuma-227

[0089] Torijum-227 se izoluje od aktinijuma-227. Aktinijum-227 je proizveden kroz termalno neutronsko zračenje Radijuma-226 praćeno raspadanjem Radijuma-227 (t1/2=42,2 m) do Aktinijuma-227. Torijum-227 je selektivno zadržan od smeše raspadanja Aktinijuma-227 u 8 M HNO3rastvoru hromatografijom razmene anjona. Korišćena je kolona unutrašnjeg

2

prečnika 2 mm, dužine 30 mm, koja sadrži 70 mg AG®1-X8 smole (200-400 mreža, nitratni oblik). Nakon Aktinijuma-227, Radijum-223 i ćerke su eluirani od kolone, Torijum-227 je ekstrakovan od kolon sa 12 M HCl. Eluat koji sadrži

[0089] Torijum-227 je isparen do suvoće i ostatak je resuspendovan u 0,01 M HCl.

Primer 2- Sinteza ALG-DD-NCS

[0090]

2

[0091] 3-benziloksi-1-metil-4-(2-tioksothiazolidin-1-il)karbonil-2(1H)-piridinon (sintetisan prema Raymond, K.; Xu, J.,.US 5,624,901) (2,22 mmol, 0,8 g), trietilamin (0,31 mL, 2,22 mmol) i DMAP (5 mg) su dodati rastvoru [5-Amino-6-((2-amino-etil)-{2-[bis-(2-amino-etil)-amino]-etil}-amino)-heksil]-karbaminska kiselina tert-butil estera (BocLys-H(2,2)amin) (sintetisan prema Raymond, K.; Corneillie, T. M.; Xu. J. WO 2008/063721 A2) (0,204 g, 0,505 mmol) u dihlorometanu (80 mL). Ova smeša je mešana na sobnoj temperaturi preko noći i zatim isparena do suvoće. Ostatak je rastvoren u dihlorometanu i postavljen na fleš silika gel kolonu i eluiran sa gradijentom od 2-8% metanola u dihlorometan. Odgovarajući fragmenti su prikupljeni i ispareni do suvoće kako bi se dobio ALG-001 (1) (-0,4 g) kao bledo bež gusto ulje.

[0092] ALG-001 (1) (280 mg, 0,205 mmol) je rastvoren u glacijalnoj sirćetnoj kiselini (20 mL), 20% Pd(OH)2i ugljeni katalizator (60 mg) su dodati, i smeša je hidrogenizovana pod

2

40-45 psi na sobnoj temperaturi preko noći. Filtracija praćena rotacionim isparavanjem dala je ALG-DEBN (2) (-260 mg, sa tragovima sirćetne kiseline) kao vino crveno gusto ulje.

[0093] ALG-DEBN (2) (70 mg) je rastvoren u 2:1 MeOH/dihlorometanu (15 mL) na temperaturi okruženja. Zatim je 0,5 g očišćene Amberlist-15 smole dodato, i smeša je blago mešana preko noći. Smola je zatim razdvojena filtriranjem i oprana sa heksanom (10 mL), tetrahidrofuranom (10 mL), i metanolom (10 mL), redom. Ova aminom vezana smola je premeštena do 4 M amonijak metanolskog rastvora (20 mL) i blago je mešana tokom 50 minuta. Tetrahidrofuran (10mL) je dodat, kako bi se rastvorio sam proizvod kom je uklonjena zaštita. Smola je zatim uklonjena filtriranjem, i rastvor je isparen, dajući kao prinos ALG-DEBN-DEBOC (3) (37 mg).

[0094] Suspenzija 40 mg ALG-DEBN-DEBOC (3) u 6:1 izopropanol-vodi (v/v, 7 mL) je reagovana sa rastvorom o1,4-fenilendiizotiocijanata (4,1 ekvivalent) u hloroformu (2,5 mL). Reaktanti su mešani na sobnoj temperaturi za 30 minuta, kada je uzorak povučen za MS analizau. Vrhovi koji odgovaraju očekivanoj masi (1100) su posmatrani. Oko 95 mg svetlo braon čvrste supstance je izolovano nakon uklanjanja isparljive materije pod vakuumom. Svetlo braon čvrsta supstanca je suspendovana u acetonitrilu, i smeša je zagrejana pod refluksom tokom 15 minuta. Smeša je ohlađena do sobne temperature, praćeno izolacijom filtriranjem 26 mg ALG-DD-NCS (4) kao braon čvrsta supstanca.

Primer 3: Sinteza asimetričnog 3,2-HOPO koji sadrži helator.

[0095]

[0096] Natrijum hidrid (60,1 g kao 60% disperzija u mineralnom ulju, 1,5 mol, 5 ekvivalent) je sipan u bocu i tetrahidrofuran (1 L) je dodati Dimetil malonat (172 mL, 1,5 mol, 5 ekvivalent) je dodat kapanjem tokom 1,5 sata; temperatura reakcione smeše je držana ispod 10 °C. Reakciona smeša je zatim rastvorena sa tetrahidrofuranom (400 mL). Rastvor 4-nitrobenzil bromida (65,0 g, 0,3 mol, 1 ekvivalent) u tetrahidrofuranu (170 mL) je polako dodat tokom 30 minuta iznad pripremljenoj smeši pod žustrim mešanjem. Nakon 30 minuta mešanja na 0°C, reakciona smeša je sipana u rasol (1 L zasićen NaCl rastvor) i ostavljena da se meša preko noći na temperaturi okruženja, dajući kao prinos beli talog. Smeša je zatim rastvorena sa metil terc-butil eterom, i talog je filtriran i rastvoren u vrućem etanolu.

1

Etanolska smeša je filtrirana, i filtrat je koncentrisan do male zapremine, od čega je 24,8 g (31%) dimetil (4-nitrobenzil)propandioata (1) taloženo kao bela, kristalna čvrsta supstanca. LC čistoća: >90% (254 nm)

MS (APCI pos) m/z 285,1 [M+NH4]+

[0097] Jedinjenje 1 (24,8 g, 92,7 mmol) je rastvoreno u tetrahidrofuranu (230 mL) i dodato boran-dimetil sulfid kompleksu (28,5 mL, 301 mmol, 3,3 ekvivalent). Reakciona smeša je refluksovana tokom 24 sata, i i zatim je puštena da stoji na temperaturi okruženja preko noći. Metanol (250 mL) je dodat na 0°C, sipan u rasol (600 mL) i ekstrakovan sa etil acetatom. Kombinovani organski ekstrakti su osušeni preko Na2SO4i koncentrisani u vakuumu. Ostatak je ko-isparen sa metanolom. Sirov proizvod je pročišćen fleš hromatografijom, dajući 14,5 g (74%) 2-(4-nitrobenzil)propan-1,3-diol (2) kao žuto ulje.

LC čistoća: >92% (254 nm)

[0098] Jedinjenje 2 (10,0 g, 47,3 mmol) je rastvoreno u dihlorometanu (100 mL) i dodato trietilaminu (14,5 mL, 104 mmol, 2 ekvivalent). Reakciona smeša je ohlađena u ledenoj kadi i metansulfonil hlorid (8,0 mL, 104 mmol, 2 ekvivalent) je dodat iz delova. Konačna smeša je puštena da dostigne temperaturu okruženja preko noći. Dodatni trietilamin (1,5 mL) i metansulfonil hlorid (0,8 mL) su zatim dodati, i mešanje je nastavljeno tokom 30 minuta. Reakciona smeša je zatim rastvorena sa dihlorometanom, i formirani talog je filtriran.

Dihlorometan filtrat je opran sa zasićenim vodenim NaHCO3rastvorom, 0,5 M vodenim HCl i rasolom, osušen preko Na2SO4i koncentrisan u vakuumu, dajući 14,5 g (83%) 2-(4-nitrobenzil)propan-1,3-diil dimetansulfonat (3) kao narandžasto ulje, koje je korišćeno u sledećem koraku bez daljeg pročišćavanja.

LC čistoća: >87% (254 nm)

MS (APCI pos) m/z 385,3 [M+NH4]+

[0099] Jedinjenje 3 (14,5 g, 39,5 mmol) je rastvoreno u metil etil ketonu (100 mL), natrijum jodid (16,0 g, 107 mmol, 2,7 ekvivalent) je dodat, i smeša je zagrejana na 95 °C tokom 1 sata. Rezultujući beli talog je filtriran i opran sa metil etil ketonom, i filtrat je koncentrisan u vakuumu. Sirov proizvod je zdrobljen od metil terc-butil etera i pročišćen fleš hromatografijom, dajući 10,6 g (63%) 1-[3-jodo-2-(jodometil)propil]-4-nitrobenzen (4) kao žutu čvrstu supstancu.

LC čistoća: >90% (254 nm)

2

MS (APCI pos) m/z 431,1 [M+H]<+>

[0100] Dietilen triamin (10,8 mL, 100 mmol) i trietilamin (42 mL, 300 mmol, 3 ekvivalent) su rastvoreni u tetrahidrofuranu (500 mL) i ohlađeni u ledenoj kadi. Rastvor Boc-ON (49,5 g, 200 mmol, 2 ekvivalent) u tetrahidrofuranu (190 mL) je zatim dodat kapanjem tokom 2,5 sata. Reakciona smeša je mešana na 0°C tokom dodatnog 1 sata, pre nego što je puštena da dostigne temperaturu okruženja preko noći. Reakciona smeša je zatim koncentrisana u vakuumu. Ostatak je rastvoren u dihlorometanu i opran sa 1 M vodenim NaOH. Organska faza je osušena preko Na2SO4i koncentrisana u vakuumu. Sirovi materijal je pročišćen fleš hromatografijom, dajući 20,0 g (66%) di-terc-butil (iminodietan-2,1-diil)biskarbamat (5) kao žuto viskozno ulje.

MS (APCI pos) m/z 304,3 [M+H]<+>

[0101] Jedinjenje 5 (26,0 g, 86 mmol, 4 ekvivalent) je rastvoreno u suvom toluenu (40 mL) i dodato N-etil morfolinu (5,4 mL, 42 mmol, 2 ekvivalent). Jedinjenje 4 (9,2 g, 21 mmol) je rastvoreno u suvom toluenu (35 mL) i dodato je reakcionoj smeši. Smeša je inkubirana u reaktoru pod pritiskom na 105 °C tokom 5 dana. Reakciona smeša je zatim ohlađena do temperature okruženja, rastvorena sa etil acetatom i oprana sa zasićenim vodenim NaHCO3rastvorom. Kombinovani organski ekstrakti su oprani sa vodom i rasolom, osušeni preko Na2SO4i koncentrisani u vakuumu. Sirov proizvod je pročišćen fleš hromatografijom, dajući kao prinos 11,4 g (70%) jedinjenja 6 kao žutu čvrstu penu.

LC čistoća: >96% (210 nm)

MS (APCI pos) m/z 782,8, [M+H]<+>; 682,7 [M+H-Boc]<+>; 582,6 [M+H-2Boc]<+>; 382,1 [M+H-4Boc]<+>

[0102] Jedinjenje 6 (2,0 g, 2,6 mmol) je rastvorenu u dioksanu (16 mL), i 9 M rastvora HCl u dioksanu (22 mL) je dodati. Reakciona smeša je mešana na temperaturi okruženja preko noći, i zatim koncentrisana do suvoće u vakuumu, dajući 1,9 g HCl soli jedinjenja 7 kao bež čvrstu supstancu.

MS (APCI pos) m/z 382,5 [M+H]<+>

[0103] Jedinjenje 7 (1,9 g, 2,6 mmol) je dodato u DMPU (1,3-dimetil-3,4,5,6-tetrahidro-2(1H)-pirimidinon) (9,5 mL) i 3-(benziloksi)-1-metil-4[(2-tiokso-1,3-tiazolidin-3-il)karbonil]piridin-2-(1H)-on (3,7 g, 10,3 mmol, 4 ekvivalent). Rastvor DBU (2,3 mL, 15,5 mmol, 6 ekvivalent) u DMPU (4,7 mL) je zatim dodat polako tokom 40 minuta. Mešanje je nastavljeno preko noći na temperaturi okruženja. Reakciona smeša je zatim rastvorena sa dihlorometanom i oprana sa zasićenim vodenim NaHCO3rastvorom. Kombinovani organski ekstrakti su oprani sa vodom i polu-zasićenim rasolom, zatim osušeni preko Na2SO4i koncentrisani u vakuumu. Sirov proizvod je pročišćen fleš hromatografijom kako bi se dobilo 4,0 g jedinjenja 8 kao žuto ulje koje je korišćeno u sledećem koraku bez daljeg pročišćavanja. MS (APCI pos) m/z1347,7 [M+H]<+>

[0104] Jedinjenje 8 (4,0 g, 2,6 mmol) je rastvoreno u sirćetnoj kiselini (200 mL) i Pd(OH)2(20% udeo težine na C, 50% vlažan) (800 mg, 10% udeo težine) je dodat. Reakciona smeša je mešana u Parr reaktoru pod pritiskom na 30 bar pritisku vodonika na temperaturi okruženja preko noći. Reakciona smeša je zatim filtrirana kroz ploču od Celite®, i filtrat je koncentrisan u vakuumu. Sirov proizvod je pročišćen fleš hromatografijom, dajući jedinjenje 9 kao bež penastu čvrstu supstancu.

[0105] Jedinjenje 9 (996 mg) je rastvoreno u sirćetnoj kiselini (5,5 mL), praćeno dodavanjem 6 M vodenog HCl (2,5 mL) i 5% Pd/C (99 mg, 10% udeo težine). Reakciona smeša je mešana u reaktoru pod pritiskom na 8 bar pritisku vodonika preko noći, i zatim filtrirana kroz ploču od Celite®. Filtrat je koncentrisan u vakuumu i ko-isparen sa toluenom i metanolom. Ostatak je rastvoren u metanolu i taložen dodavanjem dietil etera. Formirani bež talog je filtriran i osušen u vakuumu preko noći, dajući kao prinos 700 mg HCl soli jedinjenja 10, ALG1005-38.

MS (APCI pos) m/z 956,7 [M+H]<+>

Primer 4: Sinteza alternativnog simetričnog 3,2-HOPO koji sadrži helator.

[0106]

4

[0107] Boc anhidrid (24,4 g, 119 mmol) je dodat iz delova rastvoru imidazola (8,0 g, 117 mmol) u 50mL dihlorometana na sobnoj temperaturi. Reakciona smeša je mešana tokom jednog sata. Reakciona smeša je oprana dvaput sa 50 mL vode, osušena preko Na2SO4, filtrirana i redukovana u vakuumu. Ostatak je rastvoren u 25mL toluena i tris(2-aminoetil)amin (8,19 g, 56 mmol) je dodat. Reakciona smeša je mešana tokom 2 sata na 60 °C i redukovana u vakuumu. Ostatak je rastvoren u 125mL dihlorometana i opran sa vodom (4 puta sa 50mL), osušen preko Na2SO4, filtriran i redukovan u vakuumu. Suva fleš hromatografija (0 - 15% metanol u dihlorometanu sa 1% trietilamina) je dala di-terc-butil (((2-aminoetil)azanediil)bis(etan-2,1-diil))dikarbamat (1) (13,51g, 39,0mmol, 70%) kao gusto bezbojno ulje.

[0108] Spektroskopski podaci su u skladu sa podacima objavljenim od strane Frullano i dr.

(Chem. Eur. J.2004, 10, 5205-17).

[0109] N-Cbz-β-alanin ( 8,04 g, 36 mmol), 4-(dimetilamino)piridin (4,40g, 36 mmol) i EDC·HCl (6,90g, 36 mmol) su rastvoreni u 25mL tetrahidrofurana i mešani tokom 10 minuta pre nego što je dodato Jedinjenje 1 (10,4 g, 30 mmol) rastvoreno u 75mL tetrahidrofurana. Reakciona smeša je mešana tokom 4 sata i redukovana u vakuumu. Pročišćavanje suvom fleš hromatografijom (0 - 40% tetrahidrofuran u dihlorometanu) je dalo di-terc-butil (((2-(3-(Cbzamino)propanamido)etil)azanediil)bis(etan-2,1-diil)dikarbamat (2) (15,11 g, 27,4mmol, 91 %) kao veoma viskozno blago žuto ulje.

[0110] Di-terc-butil (((2-(3-(Cbz-amino)propanamido)etil)azanediil)bis(etan-2,1-diil)dikarbamat (10,30 g, 18,7 mmol) je rastvoren u 100mL metanola i acetil hlorid (25mL, 0,35 mol) je dodat kapanjem. Reakciona smeša je mešana tokom jednog sata na temperaturi okruženja. Reakciona smeša je redukovana do otprilike 1/3 zapremine u vakuumu pre nego što je 100mL etera dodato, dovodeći do taloženja bezbojne čvrste supstance. Čvrsta supstanca je filtrirana, oprana sa eterom i osušena u vakuumu, dajući benzil (3-((2-(bis(2-aminoetil)amino)etil)amino)-3-okspropil)karbamat tri-hidrohlorid (3) (8,70 g, 18,7 mmol, ∼100%) kao bezbojnu čvrstu supstancu.

[0111] Trietilamin (6,75mL, 48,4 mmol) je dodat suspenziji Jedinjenja 3 (10,56 g, 11,4 mmol) u 320mL tetrahidrofurana i 320mL N,N-dimetilformamida na sobnoj temperaturi. N-boc-2-aminoacetaldehid (16,0g, 100,5 mmol) i natrijum triacetoksiborohidrid (32,00 g, 151 mmol) su dodati. Reakciona smeša je mešana tokom 20 sata.200mL rasola i 500mL hloroforma je dodato, faze su razdvojene, i vodena faza je ekstrakovana sa 3 x 100mL hloroforma. Kombinovane organske faze su oprane sa 100mL rasola, osušene preko Na2SO4, filtrirane i redukovane u vakuumu. Fleš hromatografija (0 - 10% metanol u dihlorometanu) je dala tetra-terc-butil (((((2-3-Cbz-aminopropanamido)etil)azanediil)bis(etan-2,1-diil))bis(azanetriil)tetrakis(etan-2,1-diil)tetrakarbamat (4) (3,40 g, 3,7 mmol, 32 %) kao žutu čvrstu supstancu.

[0112] Jedinjenje 4 (3,40 g, 3,7 mmol) je rastvoreno u 60mL metanola i acetil hlorid (12mL, 0,17 mol) je dodat kapanjem. Reakcija je mešana na temperaturi okruženja tokom jednog sata. Reakciona smeša je redukovana do otprilike 10mL u vakuumu i 50mL acetonitrila je dodato, dovodeći do taloženja. Čvrsta supstanca je filtrirana, oprana sa acetonitrilom i osušena u vakuumu, dajući benzil (3-((2-(bis(2-aminoetil)amino)etil)amino)etil)amino)-3-oksopropil)karbamat hepta-hidrohlorid (5) (2,88 g, 3,7 mmol, ∼100%) kao bezbojnu čvrstu supstancu.

[0113] Trietilamin (2,52 mL, 18,1 mmol) i 4-(dimetilamino)piridin (12 mg, cat.) je dodat suspenziji Jedinjenja 5 (0,81g, 1,04 mmol) i 3-(benziloksi)-1-metil-4-(2-tioksotiazolidin-3-karbonil)piridin-2(1H)-ona (1,50g, 4,16 mmol) u 180mL dihlorometana. Reakciona smeša je mešana preko noći i redukovana u vakuumu. Fleš hromatografija (0 - 10% metanol u dihlorometanu) je dala benzil (1-(3-(benziloksi)-1-metil-2-okso-1,2-dihidropiridin-4-il)-5-(2-(3-(benziloksi)-1-metil-2-okso-1,2-dihidropiridin-4-karboksamido)etil)-8-(2-(bis(2-(3-(benziloksi)-1-metil-2-okso-1,2-dihidropiridin-4-karboksamido)etil)amino)etil)-1,12-diokso-2,5,8,11-tetraazatetradecan-14-il)karbamat (6) (673 mg, 0,45 mmol, 43 %) kao svetlo braon čvrstu supstancu.

[0114] Jedinjenje 6 je rastvoreno i debenzilovano u suštini kako je opisano u Primeru 2, kako bi se dobio Bb-1-HOPO-1-DEBN (7).

Primer 5 – Eksperimenti heliranja sa ALG-DD-NCS

[0115] Reakcioni rastvor je pripremljen rastvaranjem čvrstog ALG-DD-NCS (4 u Primeru 2) u DMSO (Biotech rastvarač 99,8 %) do 1 mg/mL.

[0116] Reakcije heliranja sa različitim metalima su sprovedene mešanjem 1 mg/mL reakcionog rastvora sa izabranim metalnim rastvorima, koristeći odnos liganda i metala od 3:2. Metalni joni za testiranje dobijeni su od sledećeg:<232>Th-rastvor 2 % HNO3(Perkin Elmer Pure Plus), Fe<3+>-rastvor u 2 % HNO3(Perkin Elmer Pure Plus), i InCl3(nevodeni prašak 99,999+ %, Aldrich) su rastvoreni u 0,01 M HCl. Reagensi su pušteni da reaguju tokom 15 minuta na sobnoj temperaturi, pre nego što je injektirano 5 µL reakcione smeše na LC-MS za analizu.

[0117] Rezultati pokazuju da su metal-ALG-DD-NCS kompleksi formirani kvantitativno za metale<232>Th<4+>, Fe<3+>i In<3+>. LC-MS hromatogrami i spektri od<232>Th-ALG-DD-NCS, Fe-ALG-DD-NCS i In-ALG-DD-NCS kompleksa su prikazani na Slikama 1-6.

[0118] LC-MS uslovi su kako sledi: razdvajanje je izvršeno na 1,7 µm, 2,1 x 50 mm Acquity UPLC BEH C18 kolonai, na 50 °C, koristeći 0,05 % mravlju kiselinu u H2O kao mobilnu fazu A i 0,05 % mravlju kiselinu u acetonitrilu kao mobilnu fazu B. Sastav gradijenta i protok su prikazani u Tabeli 3.

Tabela 3.

[0119] Analiza masene spektroskopije je obavljena na Xevo-ToF-1instrumentu, koristeći opseg dobijanja mase od ∼ 450-1950 Da, molarnost ES+, 3,0 kV kapilarno, skeniranje tokom 1,000 sekundi sa kon naponom od 20 V.

Primer 6 - Eksperimenti heliranja sa ALG1005-38

[0120] Običan rastvor je pripremljen rastvaranjem ALG1005-38 (10 u Primeru 3) u MeOH (LC-MS stepen) do 10 mg/mL.10 mg/mL običnog rastvora je rastvoreno sa MeOH i 0,5 M NaOAc-puferom (pH 5,5) u razmerama 1:8:1, kako bi se dobilo 1 mg/mL ALG1005-38 reakcionog rastvora. Reakcije heliranja sa različitim metalima su sprovedene mešanjem 1 mg/mL reakcionog rastvora sa izabranim metalima, kako je navedeno u Primeru 5 i dodatni GaCl3(nevodene perle 99,99 %, Aldrich) je rastvoren u 0,01 M HCl, dajući odnos liganda i metala od 3:1 do 1:2. Reagensi su pušteni da reaguju tokom 10 minuta na sobnoj temperaturi. Konačno, reakcione smeše su rastvorene 10-puta sa mravljom kiselinom (0,1 %) pre nego što je injektirano 5 µL na LC-MS za analizu. LC-MS razdvajanje i analiza su obavljeni kako je opisano u Primeru 5, osim što je kon napon 35 V.

[0121] Rezultati pokazuju da su metal-ALG1005-38 kompleksi formirani u značajnoj količini za metals poput<232>Th<4+>, Fe<3+>, In<3+>i Ga<3+>. LC-MS hromatogrami i spektri od<232>Th-ALG1005-38, Fe-ALG1005-38, In-ALG1005-38 i Ga-ALG1005-38 kompleksa su prikazani na Slikama 7-14.

Primer 6 - Eksperiment heliranja sa Bb-1-HOPO-1-DEBN

[0122] Običan rastvor je pripremljen rastvaranjem Bb-1-HOPO-1-DEBN (napravljen u Primeru 4) u DMSO (Biotech rastvarač 99,8%) do 1 mg/mL. Eksperiment heliranja je sproveden mešanjem 1 mg/mL rastvora sa<232>Th 0,01 M HCl (Perkin Elmer) kako je navedeno u Primeru 5. LC-MS razdvajanje i analiza su obavljeni kako je opisano u Primeru 6. Rezultati pokazuju da se očekivani<232>Th-Bb-1-HOPO-1-DEBN kompleks brzo formirao, Slike 15 i 16.

Primer 8 -Konjugacija ALG-DD-NCS do trastuzumaba, obeležavajući konjugat sa

4

torijumom-227, uz potvrdu zadržavanja vezivanja cilja.

Konjugacija

[0123] Farmaceutski nivo monoklonskog antitela trastuzumaba (Herceptin®, Roche) je korišćen. Antitelo je razmenjeno u puferu u 0,9 % NaCl do koncentracije od 6,3 mg/mL. Običan rastvor ALG-DD-NCS je pripremljen u DMSO, i sadrži 1 mg/mL (ne računajući nečistoće). DMSO rastvor je dodat rastvoru antitela koji odgovara molarnom odnosu helatora i antitela od 6,5:1, ili manje.0,07 M boraks rastvor je dodat reakcionom rastvoru kako bi se dobio pH 9 što je praćeno inkubacijom na 37 °C preko noći. Rezultujući konjugat je pročišćen i razmenjen u puferu na Amicon Ultra-4 (30k MWCO) centrifugalnoj filter jedinici. Alikvoti od 1 mg u 100 µL 0,9 % NaCl su zamrznuti i čuvani na -18 °C do upotrebe.

Obeležavanje

[0124] 100 µL 0,5 M NaOAc-pufer (pH 5,5) je dodat jednoj bočici sa 1 mg ALG-DD-NCS-trastuzumab konjugata kako bi se dobio pH odgovarajuć za obeležavanje. Ovaj rastvor je pomešan sa 4,2-16,4 MBq<227>Th u 0,01 M HCl, i pH je proveren sa pH papirom. Ependorf poklopac za bocu je upakovan u aluminijumsku foliju i boca je smeštena u termomikser na sobnoj temperaturi tokom 15 minuta sa blagim mešanjem.

[0125] Boca je dalje inkubirana na sobnoj temperaturi tokom 5 minuta nakon dodavanja 10 µL zasićenog DTPA u MF-H2O, namenjen da zarobi preostali slobodan torijum-227. Rezultat je pročišćen na NAP-5 koloni koristeći PBS da eluira obeležen ALG-DD-NCS-trastuzumab konjugat, ostavljajući većinu slobodnih radionuklida (torijum-227 i nuklidi ćerke) i DTPA-torijum helat na koloni.

[0126] Kolona i eluirani fragmenti su mereni na HPGe-detektor GEM(15) kako bi se odredio prinos reakcije i specifična aktivnost proizvoda. Fragment proizvoda je sterilno filtriran i čuvan na 4 °C preko noći.

[0127] Drugo NAP-5 kolona pročišćavanje fragmenta proizvoda je obavljeno pre korišćenja.

Određivanje imunoreaktivnog fragmenta

[0128] SK-OV-3 ćelije (ATCC) su uzgajane pod standardnim uslovima. Fiksirane SK-OV-3 ćelije su pripremljene i ispitane protočnom citometrijom pre korišćenja kako bi se potvrdilo prisustvo HER2 na površini (podaci nisu prikazani). Uobičajeni medijum je pripremljen sa McCoy's 5A medijumom (GIBCO) dodatom u 10 % FBS (PAA) i 1 % Pen/Strep (BioChrom). Inkubacija ćelija je obavljena u CO2-inkubatoru na 37 °C i 5 % CO2, koristeći T25 (25 cm<2>) i T75 (75 cm<2>) boce sa ćelijama.

[0129] Svaki eksperiment je obavljen u duplikatu. Fiksirane SK-OV-3 ćelije su suspendovane u PBS i prebačene u Ependorf boce (10 miliona ćelija/boca). Ne-konjugovan trastuzumab (Herceptin®, 10 µL običnog rastvora) je dodat do dve referentne boce, i reakcija blokiranja je sprovedena na 37 °C tokom 30 minuta. Jednake količine<227>Th-ALG-DD-NCS-trastuzumaba (ca 500 cpm) su dodate u svaku bocu, praćeno inkubacijom na 37 °C tokom 2,5 sata. Uzorci su rastvoreni sa PBS, praćeno centrifugom i transferom polovine supernatanta do nove Ependorf boce. Sve boce su merene tokom 5 minuta na Wizard gama brojaču i količina torijuma-227 je određena primenom<227>Th-protokola.

[0130] Vezivanje u % je izračunato kao: 100* [(P+1⁄2S) - (1⁄2S)]/[(P+1⁄2S) (1⁄2S)], gde su P i S aktivnosti izmerene u ćelijskom peletu i supernatantu, respektivno. Izračunavanje je obavljeno na ne-blokiranim uzorcima kako bi se dobilo ukupno vezivanje (%) i blokiranim uzorcima kako bi se dobilo nespecifično vezivanje (%), i IRF je izračunat kao: IRF (%) = ukupno vezivanje (%) - nespecifično vezivanje (%).

[0131] Podaci ove kontrole kvaliteta, sumarizovani u Tabeli 4, pokazuju da<227>Th-ALG-DD-NCS-trastuzumab vezuje ciljane ćelije.

Tabela 4: Rezultati za kontrolu kvaliteta obavljenu na<227>Th-ALG-DD-NCS-trastuzumab serijama A i B, potom korišćenim u Primerima 9 i 10 respektivno.

Primer 9 - In vitro ispitivanja stabilnosti i efikasnosti ALG-DD-NCS-trastuzumaba obeleženog sa torijumom-227

Procena vezivanja tokom vremena

[0132] Stabilnost vezivanja SK-OV-3 ćelija je procenjena za 2<27>Th-ALG-DD-NCS-trastuzumab konstrukt merenjem količine<227>Th-aktivnosti povezane sa SK-OV-3 ćelijskim peletima tokom 7 dana. Rezultati su poređeni sa podacima dobijenim nakon inkubacije sa slobodnim<227>Th.

[0133] SK-OV-3 ćelije uzgajane kako je opisano u Primeru 8 su inicijelno tretirane sa 700 kBq<227>Th-ALG-DD-NCS-trastuzumabom ili 700 kBq slobodnim<227>Th, rezultujući u respektivno 77 kBq (11 %) i 7 kBq (1 %)<227>Th-aktivnosti na ćelijskom peletu nakon 1 sata inkubacije (HPGe-detektor GEM(50)).<227>Th-aktivnost na SK-OV-3 ćelijama je merena dnevno koristeći Wizard gama brojač (<227>Th-protokol). Merena radioaktivnosti je korigovana za raspad. Rezultati predstavljeni na Slici 17 pokazuju da je samo 20 % aktivnosti preostale sa peletom nakon 1 sata je izgubljeno u narednih 7 dana. Nasuprot tome, ćelije tretirane sa slobodnim<227>Th vezuju samo mali fragment dodatne aktivnosti, i gube veći deo nje (ca 95 %) tokom naredna 24 sata. Stoga, nepa specifičnog vezivanja slobodnog<227>Th za SK-OV-3 ćelije, dok je<227>Th-ALG-DD-NCS-trastuzumab efikasno zadržan.

Procena citotokstičnosti

[0134] Efekat na rast tumorskih ćelija je ispitivan u dva komplementarna testa. U prvom eksperimentu, metabolička aktivnost ćelija je merena koristeći luminescentni reagens koji se vezuje za ATP molekule. Stoga, smanjen luminescentni signal ukazuje na gubitak metaboličke aktivnosti. U drugom eksperimentu, posmatran je broj formiranih kolonija.

[0135] Luminescencija je merena svakodnevno tokom 9 dana, a rezultati izloženosti<227>Th-ALG-DD-NCS-trastuzumabu upoređeni su sa luminescencijom SK-OV-3 ćelija izloženih trastuzumabu i slobodnom<227>Th, respektivno. SK-OV-3 ćelije uzgajane u redovnom medijumu korišćene su kao kontrola.

[0136] Na dan 0, 35 ml 500000 SK-OV-3 ćelija/mL u redovnom medijumu prebačeno je u 4 T75 boce sa ćelijama. Ove boce sa ćelijama su korišćene za pripremu sledećih uzoraka: (1) Redovni medijum, (2) 20 mg/mL trastuzumab, (3) 20 kBq/mL<227>Th-ALG-DD-NCS-trastuzumab (10166 Bq/mg), (4) 20 kBq/mL slobodan<227>Th. Bočice su inkubirane u CO2inkubatoru u trajanju od 1 sata. Supernatanti su odbačeni, i ćelije su tripsinizovane sa 0,25%

4

rastvora Tripsin-EDTA, isprane redovnim medijumom i centrifugirane. Ćelijski peleti su suspendovani u svežem redovnom medijumu i merene na Wizard gama brojaču (<227>Thprotokol). Svaki inkubacijski rastvor je bio distribuiran u 7 novih T25 boca sa ćelijama i inkubiran u CO2inkubatoru.

[0137] Na dane 1 i 2 supernatanti iz jedne bode svakog od četiri uzorka rastvora su odbačeni. Ćelijski peleti su pripremljene kao na dan 0 i radioaktivnost je merena na Wizard gama brojaču (<227>Th-protokol) i na HPGe-detektoru GEM(50). Svi uzorci su razblaženi 4 puta u redovnom medijumu, i 5 x 100 µL svake ćelijske suspenzije preneto je u 5 komorica View ploče-96. Do pet komorica je dodato 100 µL redovnog medijuma (bez ćelija) za merenje pozadinske luminescencije. Konačno, 100 µL ćelijskog Titer-Glo reagensa je dodato u svaku bazu, i rastvori su mešani na orbitalnom mikseru kako bi indukovali lizu. Signalom luminescencije je omogućeno stabilizovanje na sobnoj temperaturi tokom 10 minuta, i zatim je luminescencija merena tri puta na Envision višestrukom čitaču ploča, koristeći LUM-single program.

[0138] Na dan 3 su pripremljene ćelije i merenja na Wizard gama brojaču i Envision višestrukom čitaču ploča, kao što je opisano za dane 1-2. Zatim je svaka ćelijska suspenzija razređena usled gustog rasta ćelija; 3⁄4 ćelijska suspenzija je prebačena u novu T75 bocu sa ćelijama, dodat je redovan medijum i inkubirano je u CO2inkubatoru preko noći.

[0139] Na svakih 4-9 dana četiri T75 boce sa ćelijama su tripsinizovane sa 0,25% Tripsin-EDTA rastvora, isprane redovnim medijumom i centrifugirane. Ćelijski peleti su razblaženi 4 puta u redovnom medijumu, 100 µL porcije su uzete i izvršena su merenja kao što je gore navedeno. Zatim je % suspenzija ćelija koji je razređen u redovnom medijumu prebačen u nove T75 boce sa ćelijama i inkubiran u CO2inkubatoru preko noći.

[0140] Slika 18 pokazuje merenja luminescencije na SK-OV-3 ćelijama tretiranim sa<227>Th-ALG-DD-NCS-trastuzumabom (10166 Bq/mg), trastuzumabom i slobodnim<227>Th, normalizovanim do vrednosti luminescencije dobijenih za SK-OV- 3 ćelije uzgajane u redovnom medijumu (kontrola). Signali luminescencije za SK-OV-3 ćelije tretirane sa<227>Th-ALG-DD-NCS-trastuzumabom postepeno su se smanjivali od dana 1 do 9, dok su drugi tretmani pokazivali gotovo konstantne signale i rast luminescencije tokom ovog perioda. Metabolička aktivnost SK-OV-3 ćelija tretiranih sa<227>Th-ALG-DD-NCS-trastuzumabom se smanjila tokom vremena, a na devetom danu gotovo su sve ćelije bile su mrtve. Ovaj rezultat ukazuje na značajan i trajni citotoksični efekat<227>Th-ALG-DD-NCS-trastuzumaba.

[0141] Klonogeni test je izvršen da proceni rast ćelija nakon izlaganja pojedinačnih ćelija potencijalno citotoksičnim uslovima. SK-OV-3 ćelije su inkubirane u različitim koncentracijama<227>Th-ALG-DD-NCS-trastuzumaba, trastuzumaba ili<227>TH u trajanju od 1 sata, nakon čega sledi inkubacija tokom 12 dana da izazove rast kolonija.

Priprema ćelija je obavljena kao što je gore navedeno, i u svakom uzorku 12000 ćelija u 5 mL redovnog medijuma je prebačen u T25 bocu. Ispitivan je efekat 3 količine svakog reagensa za<227>Th-ALG-DD-NCS-trastuzumab i<227>Th, 5, 10 i 20 kBq/mL, i za trastuzumab 5, 10 i 20 mg/mL, (konačne koncentracije). Pripremljena je jedna kontrolna boca. Svih 10 T25 boca sa ćelijama su inkubirane u CO2inkubatoru tokom 1 sata. Supernatanti su odbačeni, i ćelije su isprane redovnim medijumom, tripsinizovane sa 0,25% Tripsin-EDTA rastvora, isprane redovnim medjumom i centrifugirane. Ćelijski peleti su suspendovani u redovnom medijumu, i svaka od deset ćelijskih suspenzija podeljena je na 6 novih T25 boca sa ćelijama; 3 boce sa 1000 ćelija i 3 boce sa 3000 ćelija. Dobijenih 60 T25 boca sa ćelijama su inkubirane u CO2inkubatoru dok kolonije nisu dostigle vidljivu veličinu (oko 50 ćelija/kolonija). Posle inkubacije tokom 12 dana, medijum je uklonjen. Ćelije su isprane sa PBS, fiksirane etanolom, obojene sa 0,25% Tripan Blue u PBS, isprane vodom iz česme i konačno sušene na 45°C preko noći. Kolonije su prebroane ručno, a prosečan broj kolonija u svakom inkubacijskom rastvoru grafički je iscrtan.

[0142] Rezultati prikazani na Slikama 19 i 20 pokazuju da je 1 sat inkubacije sa<227>Th-ALG-DD-NCS-trastuzumabom efikasno ubio SK-OV-3 ćelije. Inkubacija sa slobodnim<227>Th može imati neki efekat ubijanja ćelija, koji nije očigledan u prvom testu citotoksičnosti gde se koristi veći broj ćelija. Inkubacija sa trastuzumabom nije imala negativnog utjecaja na rast ćelija.

Primer 10 - In vivo ciljanje tumora od strane torijuma-227 obeleženog sa ALG-DD-NCS-trastuzumabom

[0143] 100 µL (15 kBq) sterilno filtriranog<227>Th-ALG-DD-NCS-trastuzumaba (2700 Bq/µg) je injektirano u lateralnu repnu venu deset Balb/c golih miševa koji nose SK-OV-3 ksenograft. Pet miševa je žrtvovano nakon 24 sata i preostalih pet nakon 4 dana, i organi od interesa su izvađeni i izmereni. Svi uzorci i 3 standardna rastvora koji sadrže 10 % ID/g su

4

mereni tokom 5 minuta na Wizard gama brojaču (<227>Th-protokol). Rezultati su izraženi kao % injektirane doze po gramu tkiva (% ID/g).

[0144] Rezultati prikazani na Slici 21 idu u prilog tome da se<227>Th-ALG-DD-NCS-trastuzumab specifično vezuje za tumor. Vrednosti uzimanja su umerene, ali su se nešto povećale između 24 sata i 4 dana od uzimanja (od 8,7 % ID/g do 11,3 % ID/g), dok je koncentracija u krvi smanjena do oko 1% ID/g.

[0145] Uzimanje u lobanji i butnoj kosti je takođe nešto povećano između 24 sata i 4 dana, ali te vrednosti su generalno niske (2,8-3,2 %, 24 sata), što ukazuje da veoma malo slobodnog<227>Th cirkuliše u sistemu, i stoga ukazuje na visok stepen stabilnosti<227>Th-ALG-DD-NCS-trastuzumab kompleksa. Dalje ukazivanje na ovaj zaključak pruža visoka verovatnoća da je fragment aktivnosti meren u lobanji i butnoj kosti izazvan uzimanjem ćerka nuklida<223>Ra. Neki od ovih<223>Ra mogu biti detektovani unutar prozora specifikovanog tokom 2<27>Thmerenja na Wizard gama brojaču, stoga izračunate % ID/g-vrednosti za lobanju i butnu kost mogu biti prekomerno procenjena količina<227>Th-ALG-DD-NCS-trastuzumaba akumulirana u tim tkivima.

Primer 11 – Priprema helatnog dela

[0146] Priprema 3-benziloksi-1-metil-4-(2-tioksotiazolidin-1-il)karbonil-2(1H)-piridinona (Struktura A).

Korak 1) - 1-Metil-3-hidroksi-2(1H)-piridinon:

[0147] 3-hidroksi-2(1H)-piridinon (34,44 g, 0,31 mol) i jodometan (75 g, 0,53 mol) su smešteni u 80 mL zatvoren Teflon kontejner, i zagrejani do 150 °C tokom otprilike 48-60 sati u Parr bombi. Ohlađena bomba je otvorena i višak jodometana je proceđen. Rezultujuće gusto tamno ulje je pomešano sa natrijum sulfitom (64 g, 0,5 mol) i rastvoreno u 300 mL vode kako bi se formirao bledo braon rastvor. Rastvor je neutralizovan do pH 7-8 i filtriran kako bi se uklonile nerastvorljive nečistoće. Filtrat je zatim ekstrakovan sa metilen hloridom (4 x100 mL). Kombinovani ekstrakti su zatim osušeni, primenjeni na fleš silika gel čep (6 cm x 8 cm) i eluirani sa 4% metanolom u metilen hloridu. Rastvarač je uklonjen kako bi se dobio jedinjenje iz naslova (24,3 g, 62,6%) kao bezbojni kristali.

Korak 2_-4-karboksi-1-metil-3-hidroksi-2(1H)-piridinon

4

[0148] 1-Metil-3-hidroksi-2(1H)-piridinon (1) (6,25 g, 50 mmol) je pomešan sa nevodenim kalijum karbonatom (36 g, 0,26 mol) i osušen u vakuumu. Smeša je zatim zagrejana do 175 -185° C tokom 3 dana u Parr bombi pod suvim karbon dioksid gasom (850 psi). Ohlađena bomba je otvorena i rezultujuća bledo žuta čvrsta supstanca je rastvorena u ledenoj vodi i acidifikovana sa 6N HCl kako bi se dobio bež kristalni proizvod.

Korak 3-3-Benziloksi-4-karboksi-1-metil-2(1H)-piridinon

[0149] 4-karboksi-1-metil-3-hidroksi-2(1H)-piridinon (6,8 g, 0,04 mol) je pomešan sa benzil hloridom (12,1 g, 0,088 mol) i nevodenim kalijum karbonatom (13,8 g, 0,1 mol) u nevodenom dimetil-formamidu (DMF) (120 mL). Smeša je zagrejana u tami pod azotom do 75 -80° C tokom 16 sati. Rezultujući smeša je zatim filtrirana i rastvarač je isparen kako bi se dobilo tamno ulje. Ulje je pročišćeno primenom na silika gel čep (6 cm.x 8 cm) i eluirao sa 4% metanolom u metilen hloridu rezultujući u 3-benziloksi-4-benziloksikarbonil-1-metil-2(1H)-piridinonu kao bledo žuto gusto ulje. Ovo je uzeto u metanolu (50 mL) i 6M NaOH rastvoru (10 mL), i smeša je mešana na sobnoj temperaturi tokom 4 sata, praćeno isparavanjem do suvoće. Ostatak je rastvoren u vodi (100 mL), i acidifikovan sa 6M HCl rastvorom do pH 2 kako bi se dobilo jedinjenje iz naslova (9,3 g 88,7%), kao beli kristalni proizvod.

Korak 4-3-benziloksi-1-metil-4-(2-tioksotiazolidin-1-il)karbonil-2(1H)-piridinon [0150] Rastvoru 3-benziloksi-4-karboksi-1-metil-2(1H)-piridinona (1,05 g, 4 mmol), 2-mercaptotiazolina (0,50 g, 4,2 mmol) i katalitičke količine 4-dimetilaminopiridina (DMAP) u suvom dihlorometanu (50 mL), dodat je N,N'-dicikloheksilkarbodiimid (DCC) (0,86 g, 4,2 mmol). Nakon mešanje tokom 4 sata, dicikloheksilurea (DCU) čvrsta supstanca je uklonjena filtriranjem. Žuti filtrat je zatim rotaciono isparen kako bi se dobila žuta čvrsta supstanca. Kristalizacija izopropanol-metilen hlorida daje jedinjenje iz naslova (Struktura A, 1,16 g, 80,4%) kao svetlo žute kristalne ploče.

Primer 12-Priprema 3,2-HOPO prekursora za formulu VIII

4

[0151] Priprema ciklične soli (Struktura 5) je obavljena prema narednoj šemi:

[0152] Cezijum fluoridom (10 mol%) pomognuta Michael reakcija 2,3-dihidroksipiridina (2,3-DHP) 1 sa etil akrilatom u refluksujućem acetonitrilu dala je odgovarajući ester 2 u dobrom prinosu. Naredna O-benzilacija 2 koristeći standardne uslove K2CO3/acetonitril/refluks) praćena redukcijom ester dela (BH3-THF,rt) dala je alkohol 3 u 90% prinosu nakon hromatografije. Tretman alkohola 3 sa metansulfonskim anhidridom u dihlorometanu u prisustvu trietilamina dovela je direktno do formiranja željene ciklične soli 5 (∼ 85-90%) zajedno sa nešto međuproizvoda mesilata 4 (∼ 10-15%), kao je određeno<1>H NMR spektril analizom. Kompletna konverzija do ciklične soli 5 može se postići mešanjem smeše sirovog proizvoda do mezilacije u hloroformu na sobnoj temperaturi. Nakon trituracije sa vrućim etil acetatom, so 5 je izolovana kao bledo bela čvrsta supstanca sa 92% prinosom visoke čistoće.

Primer 13 - Priprema jedinjenja formule VIII

[0153] So 5 (0,2 g) je dodata do 1,2 ekvivalenata od ciklena (1,4,7,10-tetraazaciklododekan) u prisustvu trietilamina u acetonitrilu (3 ml) i zagrejana na 60 °C tokom 2 dana pod azotom. Reakcija je zatim rastvorena sa dihlorometanom (50 ml) i oprana sa zasićenim NaHCO3(50 ml). Vodeni sloj je ekstrakovan još jednom sa dihlorometanom (25 ml). Kombinovani organski ekstrakti su osušeni sa natrijum sulfatom, rastvarač je uklonjen u vakuumu i višak N-metilbenzilamina je uklonjen putem vakuumske destilacije kako bi se dobio VIII.

Primer 14 - Priprema jedinjenja formule IX

[0154] Rastvoru 3-benziloksi-1-metil-4-(2-tioksotiazolidin-1-il)karbonil-2(1H)-piridinona u metilen hloridu biće dodat odgovarajući funkconalizovan N,N,N',N'-tetrakis(2-aminoetil)etilendiamin (Struktura B, gde je Z zaštitna grupa). Nakon mešanja tokom četiri sata, smeša je filtrirana i uzeta do suvoće..

4

[0155] Odgovarajući benzil-zaštićen prekursor proizvod će biti izolovan od reakcione smeše na fleš silika koloni sa propanolom u metilen hloridu. Konačni proizvod sa strukturom IX biće dostupan nakon kiselog uklanjanja zaštite hidroksil grupa.

Primer 15

[0156] Struktura VIII će biti konjugovana do ciljajućeg molekula koristeći standardne postupke stručnjaka u oblasti. Na primer, N-hidroksisukcinimid (NHS) ester će biti pripremljen i konjugovan do proteina i peptida koristeći standardne uslove i rezultujući konjugovan protein će biti izolovan koristeći gel filtraciju.

Primer 16

Torijum-227 obeležavanje konjugovanog proteina

[0157] 10 mg/mL rastvor konjugovanog proteina (koji ima oktadentatni ligand vezan pomoću dela za spajanje) biće napravljen u odgovarajućem pufer rastvoru, npr.0,5 M NaOAc-pufer (pH 5,5), i obeležen sa pročišćenim torijumom-227 na 25 °C tokom 1 sata, praćeno korakom pročišćavanja na koloni gel filtracije.

4

Claims (7)

1. Patentni zahtevi 1. Kompleks koji cilja tkivo, koji sadrži: - deo za ciljanje tkiva vezan za strukturu odabranu sa liste koja sadrži:

   �

   i 2

   - 4+ jon radionuklida 227-torijuma koji emituje alfa.
2. 2. Kompleks prema patentnom zahtevu 1, naznačen time što je deo za ciljanje tkiva odabran od antitela, konstrukata antitela, fragmenata antitela, konstrukata fragmenata ili njihove mešavine, peptida, aminokiseline, steroidnog ili ne-steroidnog hormona, folata, estrogena, testosterona ili biotina.
3. 3. Upotreba kompleksa za ciljanje tkiva kao što je definisano u patentnom zahtevu 1 ili 2 u proizvodnji medikamenta za lečenje hiperplastične ili neoplastične bolesti.
4. 4. Upotreba prema patentnom zahtevu 3, gde je pomenuto oboljenje karcinom, sarkom, mijelom, leukemija, limfom ili rak mešanog tipa.
5. 5. Farmaceutski sastav koji sadrži kompleks za ciljanje tkiva kao što je definisano u patentnom zahtevu 1 ili 2, zajedno sa najmanje jednim farmaceutskim nosačem ili ekscipijentom.
6. 6. Kompleks koji cilja tkivo kako je definisano u bilo kom patentnom zahtevu 1 do 2 za upotrebu u lečenju hiperplastične ili neoplastične bolesti.
7. 7. Kompleks za ciljanje tkiva za upotrebu prema patentnom zahtevu 6, gde je navedena bolest karcinom, sarkom, mijelom, leukemija, limfom ili rak mešanog tipa. 4