RS60180B1

RS60180B1 - Kombinovana upotreba peptida i peptidomimetika i tretman subpopulacija pacijenata obolelih od kancera

Info

Publication number: RS60180B1
Application number: RS20191687A
Authority: RS
Inventors: Takumi Kawabe; Naoki Mine; Naoya Saito; Keiichi Sakakibara; Takuji Sato
Original assignee: Canbas Co Ltd
Priority date: 2013-06-24
Filing date: 2014-06-24
Publication date: 2020-06-30
Also published as: EP3013351A4; AU2014300713A1; CY1122523T1; IL243266B; PT3013351T; CN105324121A; EP3013351A1; RU2732440C2; CA2916136A1; MX2015017609A; CL2015003704A1; JP6401255B2; PL3013351T3; HK1219905A1; ES2765300T3; ZA201600089B; SG11201510490VA; HUE046873T2; PH12015502855B1; EP3013351B1

Description

Opis

Oblast tehnike

[0001] Ovaj pronalazak je definisan patentnim zahtevima. Ovaj pronalazak se odnosi na jedinjenja, uključujući peptide i peptidomimetike koji imaju anti-proliferativnu aktivnost, sami i u kombinaciji sa tretmanima koji direktno ili indirektno oštećuju nukleinsku kiselinu (npr. DNK). Jedinjenja su prema tome korisna za inhibiranje proliferacije ćelija i, kao takva, za lečenje poremećaja proliferacije ćelija uključujući kancer.

UVOD

[0002] Ćelijski ciklus sadrži S fazu (DNA replikacija), M fazu (mitoza), i dve među-faze (G1 i G2 faze) između S i M faza. Kontrolne tačke u ćelijskom ciklusu obezbeđuju pravilnost napredovanja, kao što je praćenje stanja integriteta DNK, DNK replikacije, veličine ćelija, i uslova okruženja (Maller, J.L. Curr. Opin. Cell Biol., 3:26 (1991)). Ovo je posebno važno za više-ćelijske organizme za održavanje integriteta genoma, i postoji više kontrolnih tačaka koji prate stanje genoma. Među njima su G1 i G2 kontrolne tačke koje egzistiraju pre DNK replikacije i mitoze, respektivno. Od presudnog je značaja da se repariraju oštećenja DNK pre ulaska u S fazu, pošto kada se već oštećena DNK replicira, to često dovodi do mutacija (Hartwell, L. Cell, 71:543 (1992)). Napredovanje kroz G1 i G2 kontrolne tačke bez reparacije velikog oštećenja DNK indukuje apoptozu i/ili katastrofu.

[0003] Većina ćelija raka nosi anomalije u proteinima povezanim sa G1 kontrolnom tačkom poput p53, Rb, MDM-2, p16<NK4>i p19<ARF>(Levine, A.J. Cell, 88:323 (1997)). Alternativno, mutacije mogu prouzrokovati prekomernu ekspresiju i/ili prekomerno aktiviranje produkata onkogena, npr, Ras, MDM-2 i ciklina D, što smanjuje restriktivnost G1 kontrolne tačke. Pored ovih mutacija, prekomerna signalizacija faktora rasta mo že biti uzrokovana prekomernom ekspresijom faktora rasta i može smanjiti restriktivnost G1 kontrolne tačke. Zajedno sa mutacijama koje donose gubitak i dobitak funkcija, kontinuirana aktivacija receptora faktora rasta ili molekula koji signal prenose nizvodno mogu dovesti do transformacije ć elije prevladavanjem (zaobilaženjem) kontrolne tačke G1. Deaktivirana G1 kontrolna tačka doprinosi već im stopama mutacija i mnogim mutacijama primeć enim u ć elijama raka. Kao rezultat, ve ć ina ć elija raka za visi od G2 kontrolne tačke za preživljavanje uprkos prekomernog ošteć enja DNK (O’Connor i Fan, Prog. Cell Cycle Res., 2:165 (1996)).

[0004] Smatra se da je mehanizam koji promoviše G2 zaustavljanje ć elijskog ciklusa nakon ošteć enja DNA očuvan među vrstama od kvasca do čoveka. U prisustvu oštećene DNK, Cdc2/Ciklin B kinaza se održava neaktivnom zbog inhibitorne fosforilacije treonin-14 i tirozin-15 rezidua Cdc2 kinaze ili se smanjuje nivo proteina Ciklina B. Na početku mitoze, dvojna fosfataza Cdc25 uklanja ove inhibitorne fosfate i tako aktivira Cdc2/Ciklin B kinazu. Aktivacija Cdc2/Ciklina B je ekvivalentna početku M faze.

[0005] U fisionom kvascu, protein kinaza Chkl je neophodna za zaustavljanje ćelijskog ciklusa kao odgovor na oštećenje DNK. Chkl kinaza deluje nizvodno od nekoliko rad genskih produkata i nakon o štećenja DNK se modifikuje fosforilacijom. Poznato je da kinaze Rad53 pupoljka kvasca i Cds1 fisionog kvasca provode signale od nereplicirane DNK. Čini se da postoji neka redundancija između Chkl i Cds1 pošto je eliminacija oba i Chkl i Cds1 kulminirala deaktiviranjem G2 zadržavanja izazvanog oštećenom DNK. Zanimljivo, i Chkl i Cds1 fosforilišu Cdc25 i promovišu vezivanje Rad24 za Cdc25 koji sekvestrira Cdc25 za citosol i sprečava aktivaciju Cdc2/Ciklina B. Prema tome Cdc25 je izgleda zajednički cilj ovih kinaza što implicira da je ovaj molekul nezaobilazan faktor za kontrolnu tačku G2.

[0006] Kod ljudi, i hChk1, humani homolog fisionog kvasca Chkl, i Chk2/HuCds1, humani homolog pupoljka kvasca Rad53 i fisionog kvasca Cds1, fosforilišu Cdc25C na serinu-216 kao ključnom regulatornom mestu kao odgovor na oštećenje DNK. Ova fosforilacija stvara mesta vezivanja za male kisele proteine 14-3-3s, humane homologe za Rad24 i Rad25 fisionog kvasca. Regulatorna uloga ove fosforilacije je jasno pokazana činjenicom da je supstitucija serina-216 alaninom na Cdc25C prekinula zadržavanje ćelijskog ciklusa G2 u ćelijama čoveka. Međutim, mehanizam G2 kontrolne tačke nije u potpunosti objašnjen.

[0007] Mikrookruženje tumora takođe ima ulogu u prevenciji ili promovisanju rasta ćelija kancera, invazije, metastaze i antitumorskog imuniteta, što utiče na prognozu pacijenta. Za makrofage, za koje se očekivalo da deluju protiv ć elija raka, se pokazalo da igraju i inhibitornu i promotivnu ulogu u razvoju tumora. Makrofagi sa klasičnim antitumorskim fenotipom, koji se nazivaju M1, su pro-inflamatorni, a oni sa pro-tumorskim i antiinflamatornim tipovima se nazivaju M2 sa najmanje tri glavna podtipa unutar ove kategorije (Martinez i Gordon, F1000Prime Reports 6:13 (2014)).

[0008] Neutrofilne ekstracelularne zamke (engl. neutrophil extracellular traps (NETs)) predstavljaju još jedan element mikrookruženja tumora zajedno sa leukocitima. Iako je formiranje zamki korisno za borbu neutrofila protiv invazivnih mikroorganizama, one mogu doprineti dubokoj trombozi vena (DVT) (Martinnod i Wanger, Blood (2013)) i metastazi ćelija tumora (Cools-Lartigue, J., et al J. Clin. Invest. (2013)) kod pacijenata sa karcinomom. Prema tome, zamke mogu nepovoljno uticati na pre življavanje pacijenta. DVT je uobičajena i potencijalno letalna kod pacijenata sa karcinomom, a leukocitoza (koja dovodi do velikog porasta WBC) predstavlja glavni faktor rizika (Pabinger, I., et al. Blood 122:12 (2013); Blix, K., et al. PLOS One 4:8 (2013); Wang, T.F., et al. Thromb. Res. 133(1):25 (2014)).

REZIME

[0009] Ovaj pronalazak je definisan patentnim zahtevima. Prema tome, predmetni pronalazak se odnosi na peptidno jedinjenje koje ima anti-proliferativnu ćelijskom aktivnost i sadrže (d-Bpa) (d-Ser) (d-Trp) (d-Ser) (d-Phe-2,3,4,5,6-F) (d-Cha) (SEK ID NO:1), pri čemu peptidno jedinjenje dalje sadrži vezan ili konjugovani peptid za penetraciju u ćeliju, ili farmaceutski prihvatljivu so peptidnog jedinjenja za upotrebu u profilaksi ili lečenju poremećaja proliferacije ćelija kod sisara, pri čemu sisar ima manje od 11.000 belih krvnih zrnaca po mikrolitru (wbc/µl) krvi.

[0010] Ovde su takođe opisani postupci i upotreba peptidnih jedinjenja koja imaju jednu ili vi še aktivnosti za inhibiranje proliferacije ćelija, stimulisanje apoptoze ili katastrofe, ukidanje G2 kontrolne tačke ćelijskog ciklusa; ili lečenje neželjene ćelijske proliferacije ili preživljavanja, poput one koju karakteriše ćelijski proliferativni poremećaj. Na primer, ovde su takođe opisani postupci i upotrebe za inhibiciju ćelijske proliferacije; ukidanje G2 kontrolne tačke ćelijskog ciklusa; povećanje senzitivnosti ćelije na agense ili tretmane koji oštećuju nukleinsku kiselinu; povećanje oštećenja nukleinske kiseline u ćeliji.

[0011] Takođe je opisano da metod ili upotreba za povećanje oštećenja nukleinske kiseline hiperproliferišuće ćelije ili za profilaksu ili lečenje poremećaja ćelijske proliferacije kod sisara (na primer, čoveka) koji ima broj leukocita unutar normalnog opsega može da uključi administraciju peptidnog jedinjenja, pri čemu peptidno jedinjenje sadrži neku od sledećih sekvenci: A) peptid koji sadrži rezidue označene sa P1-P6, sa strukturom, P1, P2, P3, P4, P5, P6 ili P6, P5, P4, P3, P2, P1; gde P1 je Cha, Nal(2), (Phe-2,3,4,5,6-F), (Phe-3,4,5F), (Phe-4CF3), amino kiselina koja zauzima prostor sličan bočnom lancu, ili bilo koja aminokiselina sa jednom ili dve aromatične, piperidin, pirazin, pirimidin, piperazin, morfolin ili pirimidin grupe, ili jednom indol, pentalen, inden, naftalin, benzofuran, benzotiofen, hinolin, indolin, hroman, hinoksalin, hinazolin grupom u bo čnom lancu; u kome je P2 Cha, Nal(2), (Phe-2,3,4,5,6-F), (Phe-3,4,5F), (Phe-4CF3), Bpa, Phe4NO2, amino kiselina koja zauzima prostor sličan bočnom lancu, ili bilo koja aminokiselina sa jednom ili dve aromatične, piperidin, pirazin, pirimidin, piperazin, morfolin ili pirimidin grupe, ili jedna indol, pentalen, inden, naftalen, benzofuran, benzotiofen, hinolin, indolin, hroman, hinoksalin, ili hinazolin grupe bo čnog lanca; gde su P3, P4, P5 bilo koja amino kiselina, ili gde jedan ili više P3, P4, P5 je jednostavan ugljenični lanac tako da je udaljenost između P2 i P6 otprilike ista kao udaljenost kada je svaki od P3, P4, P5 aminokiselina; gde P6 je Bpa, Phe4NO2, bilo koja amino kiselina i Tir, bilo koja amino kiselina i Phe, bilo koja amino kiselina, ili ništa; B) ili peptid iz A), pri čemu amino kiselina koja ima jednostavan ugljenični lanac je 11-aminoundekanska kiselina, 10-aminodekanska kiselina, 9-aminononanonska kiselina, 8-aminokaprilna kiselina, 7-aminoheptanska kiselina, 6-aminokaproinska kiselina ili slična struktura sa jednim ili više nezasićenih ugljenika, i/ili gde je svaka aminokiselina Ser, i/ili gde je P4 Trp, i/ili gde je aminokiselina koja zauzima prostor sličan bočnom lancu Tyr ili Phe; ili peptid koji sadrži rezidue označene sa P1-P12, sa bilo kojom od slede ć ih struktura:

P1, P2, P3, P4, P5, P6; P6, P5 P4 P3 P2 P1; P1, P2, P3, P4, P5, P6, P7, P8, P9, P10, P11, P12; P1, P2, P3, P4, P5, P6, P12, P11, P10, P9, P8, P7; P6, P5, P4, P3, P2, P1, P7, P8, P9, P10, P11, P12; P6, P5, P4, P3, P2, P1, P12, P11, P10, P9, P8, P7; P7, P8, P9, P10, P11, P12, P1, P2, P3, P4, P5, P6; P7, P8, P9, P10, P11, P12, P6, P5, P4, P3, P2, P1; P12, P11, P10, P9, P8, P7, P1, P2, P3, P4, P5, P6; P12, P11, P10, P9, P8, P7, P6, P5, P4, P3, P2, P1; P12, P11, P6, P9, P8, P7, P2, P1; P12, P11, P10, P6, P9, P4, P7, P2, P1; P1, P2, P7, P8, P9, P6, P11, P12; ili P1, P2, P7, P4, P9, P6, P10, P11, P12; gde P1 je Cha, Nal (2), (Phe-2,3,4,5,6-F), (Phe-3,4,5F), (Phe-4CF3), Bpa, Phe4NO2, amino kiselina koja zauzima prostor sličan bočnom lancu (npr. d- ili 1-Tyr, d- ili 1-Phe) ili bilo koja amino kiselina sa jednom ili dve aromatične, piperidin, pirazin, pirimidin, piperazin, morfolin ili pirimidin grupe, ili jednom indol, pentalen, inden, naftalin, benzofuran, benzotiofen, hinolin, indolin, hroman, hinoksalin, ili hinazolin grupom u bočnom lancu; gde P2 je Cha, Nal(2), (Phe-2,3,4,5,6-F), (Phe-3,4,5F), (Phe-4CF3), ili amino kiselina koja zauzima prostor sličan bočnom lancu ili bilo koja amino kiselina sa jednom ili dve aromatične, piperidin, pirazin, pirimidin, piperazin, morfolin ili pirimidin grupe, ili jednom indol, pentalen, inden, naftalin, benzofuran, benzotiofen, hinolin, indolin, hroma n, hinoksalin, hinazolin grupom u bočnom lancu; gde P3, P4, P5 su bilo koja amino kiselina, ili gde jedan ili vi še P3, P4, P5 je jednostavan ugljenični lanac tako da je udaljenost između P2 i P6 otprilike ista kao udaljenost kada je svaki od P3, P4, P5 aminokiselina; gde P6 je Bpa, Phe4NO2, bilo koja amino kiselina i Tir, bilo koja aminokiselina i Phe; i gde najmanje tri od P7, P8, P9, P10, P11, P12 su bazne amino kiseline sa reziduom koja je bilo koja amino kiselina ili ništa; ili peptid C), gde amino kiselina sa prostim ugljenikovim lancem je 11-aminoundekanska kiselina, 10-aminodekanska kiselina, 9-aminono-nanonska kiselina, 8-aminokaprilna kiselina, 7-aminoheptanska kiselina, 6-aminokaproinska kiselina, ili slična struktura sa jednim ili više nezasićenih ugljenika, i/ili gde bilo koja amino kiselina je Ser, i/ili gde P4 je Trp, i/ili gde amino kiselina koja zauzima prostor sličan bočnom lancu je Tyr ili Phe; ili peptid koji sadrži rezidue označene sa P1-P12, sa bilo kojom od sledećih struktura: P1, P2, P3, P4, P5, P6, P7, P8, P9, P10, P11, P12; P12, P11, P10, P9, P8, P7, P6, P5, P4, P3, P2, P1; P12, P11, P10, P6, P9, P4, P7, P2, P1; ili P1, P2, P7, P4, P9, P6, P10, P11, P12; gde P1 Ischa, Nal (2), (Phe-2,3,4,5,6-F), (Phe-3,4,5F) (Phe-4CF3), Bpa, Phe4NO2, amino kiselina koja zauzima prostor sličan bočnom lancu, ili bilo koja aminokiselina sa jednom ili dve aromatične, piperidin, pirazin, pirimidin, piperazin, morfolin ili pirimidin grupe, ili jednom indol, pentalen, inden, naftalin, benzofuran, benzotiofen, hinolin, indolin, hroman, hinoksalin, ili hinazolin grupe u bočnom lancu; gde P2 je Cha, Nal(2), (Phe-2,3,4,5,6-F), (Phe-3,4,5F), (Phe-4CF3), amino kiselina koja zauzima prostor sličan bočnom lancu ili bilo koja amino kiselina sa jednom ili dve aromatične, piperidin, pirazin, pirimidin, piperazin, morfolin ili pirimidin grupe, ili jednom indol, pentalen, inden, naftalin, benzofuran, benzotiofen, hinolin, indolin, hroman, hinoksalin, hinazolin grupom u bočnom lancu; gde P3, P4, P5 su bilo koja amino kiselina, ili gde jedan ili vi še od P3, P4, P5 je jednostavan ugljenični lanac takav da je udaljenost između P2 i P6 otprilike ista kao udaljenost kada je svaki od P3, P4, P5 aminokiselina; gde P6 je Bpa, Phe4NO2, bilo koja amino kiselina i Tir, bilo koja amino kiselina i Phe, bilo koja amino kiselina, ili ništa; i gde bar tri od P7, P8, P9, P10, P11, P12 su bazne amino kiseline a rezidua je bilo koja amino kiselina ili ništa; ili peptid E), gde amino kiselina koja ima jednostavan ugljenični lanac je aminoundekanska kiselina ili 8-aminokaproinska kiselina i/ili, gde je bilo koja amino kiselina je Ser, i/ili gde amino kiselina koja zauzima prostor sličan bočnom lancu je Tyr ili Phe; ili peptid koji sadrži ostatke označene sa P1-P12, sa bilo kojom od sledećih struktura: P1, P2, P3, P4, P5, P6 ili P6, P5, P4, P3, P2, P1, gde P1 je Cha, Nal(2), (Phe-2,3,4,5,6-F), (Phe-3,4,5F), (Phe-4CF3), Bpa, Phe4NO2, Tyr ili Phe; gde P2 je Cha, Nal(2), (Phe-2,3,4,5,6-F), (Phe-3,4,5F), (Phe-4CF3), Bpa, Phe4NO2, Tyr, ili Phe; gde P3 je Ser, Arg, Cys , Pro ili Asn; gde P4 je Trp; gde P5 je Ser, Arg ili Asn; ili gde P3, P4, P5 je aminoundekanska kiselina ili jednostruka 8- aminokaproinska kiselina; i gde P6 je Bpa, Phe4NO2, (Ser-Tir), ili (Ser-Phe); ili

peptid koji sadrži rezidue označene sa P1-P12, sa bilo kojom od sledećih struktura: P1, P2, P3, P4, P5,

P6, P7, P8, P9, P10, P11, P12; P1, P2, P3, P4, P5, P6, P12, P11, P10, P9, P8, P7; P6, P5, P4, P3, P2, P1,

P7, P8, P9, P10, P11, P12; P6, P5, P4, P3, P2, P1, P12, P11, P10, P9, P8, P7; P7, P8, P9, P10, P11, P12,

P1, P2, P3, P4, P5, P6; P7, P8, P9, P10, P11, P12, P6, P5, P4, P3, P2, P1; P12, P11, P10, P9, P8, P7, P1,

P2, P3, P4, P5, P6; P12, P11, P10, P9, P8, P7, P6, P5, P4, P3, P2, P1; P12, P11, P6, P9, P8, P7, P2, P1; P12, P11, P10, P6, P9, P4, P7, P2, P1; P1, P2, P7, P8, P9, P6, P11, P12; ili P1, P2, P7, P4, P9, P6, P10, P11, P12 gde P1 je Cha, Nal(2), (Phe-2,3,4,5,6-F), (Phe-3,4,5F), (Phe-4CF3), Bpa, Phe4NO2, Tyr, Phe ili; gde P2 je Cha, Nal (2), (Phe-2,3,4,5,6-F), (Phe-3,4,5F), (Phe-4CF3), Bpa, Phe4NO2, Tyr, Phe ili; gde P3 je Ser, Arg, Cys , Pro ili Asn; gde P4 je Trp; gde P5 je Ser, Arg ili Asn; ili gde P3, P4, P5 je jednostruka aminoundekanska kiselina ili jednostruka 8-aminokaproinska kiselina; gde P6 je Bpa, Phe4NO2, (d-Ser-d-Tyr), ili (d-Ser-d-Phe); i gde bar tri od P7, P8, P9, P10, P11, P12 su Arg ili Lys sa reziduom koja je bilo koja amino kiselina ili ništa; ili

peptid koji sadrži rezidue označene P1-P12, sa nekom od sledećih struktura: P1, P2, P3, P4, P5, P6, P7,

P8, P9, P10, P11, P12; P12, P11, P10, P9, P8, P7, P6, P5, P4, P3, P2, P1; P12, P11, P10, P6, P9, P4, P7,

P2, P1; ili P1, P2, P7, P4, P9, P6, P10, P11, P12; gde P1 je Cha ili Nal(2); gde P2 je (Phe-2,3,4,5,6-F), (Phe-3,4,5F), (Phe-4CF3); gde P3 je Ser; gde P4 je Trp; gde P5 je Ser ili Asn; gde P6 je Bpa, Phe4NO2, (Ser, Tyr), ili (Ser-Phe); i gde bar tri od P7, P8, P9, P10, P11, P12 su Arg a ostatak je bilo koja amino kiselina ili ništa; ili peptid koji sadrži rezidue označene sa P1-P12, sa bilo kojom od sledećih struktura: P1, P2, P3, P4, P5, P6 ili P6, P5, P4, P3, P2, P1; gde P1 je Cha ili Nal(2); gde P2 je (Phe-2,3,4,5,6-F), (Phe-3,4,5F) ili (Phe-4CF3); gde P3 je Ser; gde P4 je Trp; gde P5 je Ser; i gde P6 je Bpa, ili (Ser-Tyr); ili peptid koji sadrži rezidue označene sa P1-P12, sa bilo kojom od sledećih struktura: P1, P2, P3, P4, P5,

P6; P6, P5, P4, P3, P2, P1; P1, P2, P3, P4, P5, P6, P7, P8, P9, P10, P11, P12; P1, P2, P3, P4, P5, P6, P12,

P11, P10, P9, P8, P7; P6, P5, P4, P3, P2, P1, P7, P8, P9, P10, P11, P12; P6, P5, P4, P3, P2, P1, P12, P11,

P10, P9, P8, P7; P7, P8, P9, P10, P11, P12, P1, P2, P3, P4, P5, P6; P7, P8, P9, P10, P11, P12, P6, P5, P4,

P3, P2, P1; P12, P11, P10, P9, P8, P7, P1, P2, P3, P4, P5, P6; P12, P11, P10, P9, P8, P7, P6, P5, P4, P3,

P2, P1; P12, P11, P6, P9, P8, P7, P2, P1; P12, P11, P10, P6, P9, P4, P7, P2, P1; P1, P2, P7, P8, P9, P6,

P11, P12; ili P1, P2, P7, P4, P9, P6, P10, P11, P12; gde P1 je Cha, ili Nal(2); gde P2 je (Phe-2,3,4,5,6-F), (Phe-3,4,5F) ili (Phe-4CF3); gde P3 je bilo koja amino kiselina; gde P4 je d- ili 1-Trp; gde P5 je bilo koja amino kiselina; gde P6 je Bpa ili (Ser-Tyr); gde P7 je Arg; gde P8 je Arg; gde P9 je Arg; gde P10 je Gln ili Arg; gde P11 je Arg; i gde P12 je d- ili 1-Arg, ili

peptid iz K), gde bilo koja amino kiselina je Ser ili Pro; ili

P6, P7, P8, P9, P10, P11, P12; P12, P11, P10, P9, P8, P7, P6, P5, P4, P3, P2, P1; P12, P11, P10, P6, P9,

P4, P7, P2, P1; ili P1, P2, P7, P4, P9, P6, P10, P11, P12; gde P1 Cha ili Nal(2); gde P2 je (Phe-2,3,4,5,6-F); gde P3 je Ser; gde P4 je Trp; gde P5 je Ser; gde P6 je Bpa ili (Ser-Tyr); gde P7 je Arg; gde P8 je Arg; gde P9 je Arg; gde P10 je Gln ili Arg; gde P11 je Arg; i gde P12 je Arg; ili

njihov prolek ili njegova, za sisara, farmaceutski prihvatljiva so, povećavajući tako oštećenje nukleinske kiseline hiperproliferišuće ćelije ili profilaksu ili lečenje poremećaja proliferacije ćelija.

[0012] Postupak ili upotreba mogu da koriste peptidno jedinjenje koje sadr ži bilo koju od sledećih sekvenci: (d-Bpa) (d-Ser) (d-Trp) (d-Ser) (d-Phe-2,3,4,5,6-F) (d-Cha) (d-Arg) (d-Arg) (d-Arg) (d-Gln) (d-Arg) (d-Arg);

(d-Arg) (d-Arg) (d-Bpa) (d-Arg) (d-Arg) (d-Arg) (d-Phe-2,3,4,5,6-F) (d-Cha);

(d-Cha) (d-Phe-2,3,4,5,6-F) (d-Arg) (d-Arg) (d-Arg) (d-Bpa) (d- arg) (d-Arg);

[0013] Postupak ili upotreba takođe mogu da koriste peptidno jedinjenje, koje uključuje ili se sastoji od bilo koje od sledećih sekvenci: (d-Bpa) (d-Ser) (d-Trp) (d-Ser) (d-Phe-2,3,4,5,6-F) (d-Cha) (SEK ID NO: 1);

ili

[0014] Postupak ili upotreba može biti primenjena na sisara sa brojem leukocita manjim od oko 11.000 belih krvnih zrnaca po mikrolitru (wbc/µl) krvi; sisara sa brojem belih krvnih zrnaca između oko 4.000 do oko 11.000 belih krvnih zrnaca po mikrolitru (wbc/µl) krvi; sisara sa brojem leukocita manjim od oko 10.000 belih krvnih zrnaca po mikrolitru (wbc/µl) krvi; sisara sa brojem leukocita manjim od oko 9.000 belih krvnih zrnaca po mikrolitru (wbc/µl) krvi; sisara sa brojem belih krvnih zrnaca između oko 4.000 do oko 9.000 belih krvnih ćelija zrnaca po mikrolitru (wbc/µl) krvi; sisara sa brojem leukocita manjim od oko 8.000 belih krvnih zrnaca po mikrolitru (wbc/µl) krvi; sisara sa brojem belih krvnih zrnaca manjim od oko 7.000 belih krvnih zrnaca po mikrolitru (wbc/µl) krvi; ili sisara sa brojem belih krvnih zrnaca manjim od normalne gornje granice svake kliničke laboratorije za bela krvna zrnca po mikrolitru (wbc/µl) krvi.

[0015] Postupci i upotreba uključuju peptidno jedinjenje u farmaceutskoj formulaciji. Opisani postupci i upotreba obuhvataju administraciju bilo kojim putem. Peptidno jedinjenje mo že biti administrirano lokalno, regionalno ili sistemski.

[0016] Postupci i upotreba uključuju farmaceutski prihvatljivu so peptidnog jedinjenja. U određenim aspektima, farmaceutski prihvatljiva so je bilo koja ili kombinacija: acetata, sulfonata, sulfata, pirosulfata, bisulfata, sulfita, bisulfita, fosfata, monohidrogen-fosfata, dihidrogenfosfata, metafosfata, pirofosfata, hlorida, bromida, jodida, propionata, dekanoata, kaprilata, akrilata, formijata, izobutirata, kaproata, heptanoata, propiolata, oksalata, malonata, sukcinata, suberata, sebakata, fumarata, maleata, butin-1,4-dioata, heksin-1,6-dioata, benzoata, hlorobenzoata, metil benzoata, dinitrobenzoata, hidroksibenzoata, metoksibenzoata, ftalata, ksilensulfonata, fenilacetata, fenilpropionata, fenilbutirata, citrata, laktata, γhidroksibutirata, glikolata, tartrata, metan-sulfonata, propansulfonata, naftalen-1-sulfonata, naftalen-2-sulfonata, i mandelata.

[0017] Postupci i upotrebe uključuju peptidno jedinjenje koje uključuje ili se sastoji od aminokiselinskih rezidua dužine od 6 do 10, 10 do 15, 15 do 20, 20 do 25, 25 do 30, 30 do 40, 40 do 50, 50 do 75, 75 do 100, 100 do 150, 150 do 200 ili 200 do 300.

[0018] Postupci i upotreba uključuju peptidno jedinjenje koje uključuje ili ssadrži molekul za penetraciju u ćeliju koji je vezan ili konjugovan za njega. U određenim neograničavajućim aspektima, molekul za penetraciju u ćeliju se vezuje sa peptidnim jedinjenjem kovalentnom vezom ili peptidnim ili ne-peptidnim linkerom. U daljim neograničavajućim aspektima, peptid za penetraciju u ćeliju sadrži naizmenični obrazac polarnih/naelektrisanih aminokiselina i ne-polarnih, hidrofobnih aminokiselina. U slede ćim posebnim neograničavajućim rešenjima, peptid za penetraciju u ćeliju sadrži strukturu polikatjonskog ili amfipatičkog alfa-heliksa. U daljim posebnim neograničavajućim aspektima, peptid za penetraciju u ćeliju sadrži poliargininsku (Arg) sekvencu (npr. peptid sadrži ili se sastoji od (d-Arg) (d-Arg) (d-Arg) (d-Gln) (d-Arg) (d-Arg)).

[0019] U sledećim posebnim aspektima, peptidno jedinjenje i/ili peptid za penetraciju u ćeliju koji uključuje ili sadrži L- ili D-izomere amino kiselina, ili smešu L- i D-izomera amino kiselina.

[0020] U dodatnim posebnim rešenjima, postupak ili upotreba zatim obuhvata administraciju agensa za oštećenje nukleinske kiseline, tretman koji oštećuje nukleinsku kiselinu, anti-proliferativni agens, ili antiproliferativni tretman. Neograničavajući agens za oštećenje nukleinske kiseline, tretman za oštećenje nukleinske kiseline, anti-proliferativni agens ili anti-proliferativni tretman uklju čuje ili se sadrži hiruršku resekciju, radioterapiju, jonizujuću ili hemijsku radioterapiju, hemoterapiju, imunoterapiju, lokalnu ili regionalnu termalnu (hipertermija) terapiju, vakcinaciju, alkiluju ći agens, anti-metabolit, biljne ekstrakte, alkaloide biljaka, nitrozouree, hormone ili nukleozide ili nukleotidne analoge.

[0021] U narednim posebnim aspektima, postupak ili upotreba dalje uključuju ili se sastoje od peptidno jedinjenja koje se administrira pre, sa ili nakon administracije agensa za o štećenje nukleinske kiseline, tretmana za oštećenje nukleinske kiseline, anti-proliferativnog agensa, ili anti-proliferativnog tretmana. U određenim aspektima, peptidno jedinjenje se administrira manje od 48 sati pre ili posle administracije agensa za oštećenje nukleinske kiseline, tretmana za oštećenje nukleinske kiseline, anti-proliferativnog agensa, ili anti-proliferativnog tretmana; peptidno jedinjenje se administrira manje od 24 sata pre ili posle administracije agensa za oštećenje nukleinske kiseline, tretmana za oštećenje nukleinske kiseline, antiproliferativnog agensa, ili anti-proliferativnog tretmana; peptidno jedinjenje se administrira manje od 12 sati pre ili posle administracije agensa za oštećenje nukleinske kiseline, tretmana za oštećenje nukleinske kiseline, anti-proliferativnog agensa, ili anti-proliferativnog tretmana; peptidno jedinjenje se administrira manje od 6 sati pre ili posle administracije agensa za oštećenje nukleinske kiseline, tretmana za oštećenje nukleinske kiseline, anti-proliferativnog agensa, ili anti-proliferativnog tretmana; peptidno jedinjenje se primenjuje manje od 4 sata pre ili posle administracije agensa za o štećenje nukleinske kiseline, tretmana za oštećenje nukleinske kiseline, anti-proliferativnog agensa, ili anti-proliferativnog tretmana; peptidno jedinjenje se administrira manje od 2 sata pre ili posle administracije agensa za o štećenje nukleinske kiseline, tretmana za oštećenje nukleinske kiseline, anti-proliferativnog agensa, ili anti-proliferativnog tretmana; peptidno jedinjenje se administrira manje od 1 sat pre ili posle administracije agensa za o štećenje nukleinske kiseline, tretmana za oštećenje nukleinske kiseline, anti-proliferativnog agensa, ili antiproliferativnog tretmana.

[0022] Neograničavajući primeri agensa za oštećenje nukleinske kiseline ili anti-proliferativnog agensa uključuju lek. Neograničavajući primeri agensa za oštećenje nukleinske kiseline ili anti-proliferativnog agensa uključuju platinu koja sadrži lek, kao što je cis platin, karboplatin, nedaplatin, mitaplatin, satraplatin, pikoplatin, triplatin, miriplatin ili oksaliplatin.

[0023] Preciznije, postupci i upotreba uključuju ili se sastoje od administriranja platine koja sadrži lek, cisplatin, karboplatin, oksaliplatin, pemetreksed, gemcitabin, 5-fiuorouracil (5-FU), rebekamicin, adriamicin (ADR), bleomicin (Bleo), pepleomicin, cisplatin, cisplatinum ili cis-diamindihloroplatin (II) (CDDP), oksaliplatin ili kamptotecin (CPT), ciklofosfamid, azatioprin, ciklosporin A, prednizolon, melfalan, hlorambucil, mehloretamin, busulfan, metotreksat, 6-merkaptopurin, tioguanin, 5-fluorouracil, citozin arabinozid, AZT, 5azacitidin (5-AZC) ili sa 5-azacitidinom srodno jedinjenje, aktinomicin D, mitramicin, mitomicin C, karmustin, lomustin, semustin, streptozotocin, hidroksiurea, cisplatin, mitotan, prokarbazin, dakarbazin, taksan, vinblastin, vinkristin, doksorubicin, dibromomannitol, zračenje ili radioaktivni izotop. Posebni neograničavajući primeri zračenja uključuju UV zračenje, IC zračenje, X zračenje, ili alfa-, beta- ili gamazračenje. Posebni ne-ograničavajući primeri radioizotopa obuhvataju I<131>, I<125>, Sr<89>, Sm<153>, I<90>ili Lu<177>.

[0024] Postupci i upotreba kako je ovde opisano važe za ćelijske proliferativne ili hiperproliferativne poremećaje ili neželjenu ćelijsku proliferaciju. Proliferativni poremećaj može da uključuje tumor ili rak. Proliferativni poremećaj može da uključuje metastatski tumor ili kancer.

[0025] Posebni neograničavajući primeri tumora ili kancera uključuju plućni tumor ili kancer, kao što su karcinom malih ćelija ili ne-malih ćelija, ili adenokarcinom, karcinom skvamoznih ćelija, ili karcinom velikih ćelija. Dalji posebni neograničavajući primeri tumora ili kancera uključuju karcinom, sarkom, limfom, leukemiju, adenom, adenokarcinom, melanom, gliom, glioblastom, meningiom, neuroblastom, retinoblastom, astrocitom, oligodendrocitom, mezoteliom, retikuloendotelijalne, limfne ili hematopoeti čke neoplazije, tumora, raka ili maligniteta. Dodatni posebni neograničavajući primeri tumora ili kancera su neoplazija, tumor ili kancer pluća, tiroide, glave ili vrata, nazofarinksa, grla, nosa ili sinusa, mozga, kičme, grudi, nadbubrežne žlezde, hipofize, tiroide, limfe, gastrointestinalni (usta, jednjaka, stomaka, duodenuma, ileuma, jejunuma (tankog creva), debelog creva, rektuma), genito-urinarnog trakta (materica, jajnici, grli ć, endometrijum, bešika, testisi, penis, prostata), bubrega, pankreasa, jetre, ko štane srži, limfe, krvi, mišića, ili kože. Dodatni posebni neograničavajući primeri nekog tumora ili kancera uključuju kancer dojke, kancer prostate, kancer pankreasa, kancer želuca, pleuralni mezoteliom, rak debelog creva, kancer rektuma, rak debelog creva, rak tankog creva, rak jednjaka, kancer duodenuma, lingvalni kancer, kancer farinksa, kancer pljuvačne žlezde, cerebralni tumor, švanom, kancer jetre, kancer bubrega, kancer žučnih kanala, kancer endometrijuma, kancer grlića materice, kancer tela materice, kancer jajnika, kancer be šike, kancer uretre, rak kože, angiom, maligni limfom, maligni melanom, karcinom štitaste žlezde, paratireoidni karcinom, nazalni kancer, paranazalni kancer, kancer auditivnih organa, karcinom dna usne šupljine, kancer larinksa, parotidni kancer, submandibularni kancer, koštani tumor, angiofibrom, retinalni sarkom, penilni kancer, tumor testisa, pedijatrijski tvrdi tumor, Kapošijev sarkom, tumor maksilarnog sinusa, fibrozni histiocitom, leiomiosarkom, rabdomiosarkom, limfom, multipli mijelom ili leukemiju.

[0026] Posebni neograničavajući primeri sarkoma uključuju limfosarkom, liposarkom, osteosarkom, hondrosarkom, lejomiosarkom, rabdomiosarkom ili fibrosarkom. Posebni neograničavajući primeri hematopoeznog tumora, kancera ili maligniteta obuhvataju mijelom, limfom ili leukemiju.

[0027] Postupci i upotreba kako su ovde opisani obuhvataju administraciju koli čine peptidnog jedinjenja koja je efikasna za lečenje tumora ili kancera. U određenim aspektima, postupak ili upotreba inhibira ili smanjuje recidiv, rast, napredovanje, pogoršanje ili metastazu tumora ili kancera; rezultira delimičnim ili potpunim uništenjem neoplastične, tumorske, kancerske ili maligne ć elijske mase, zapremine, veličine ili broja ć elija, stimulišuć i, indukuju ć i ili pove ć avaju ć i nekrozu lizu ili apoptozu neoplastičnih, tumorskih, kancerskih ili malignih ć elija, smanjujući volumen, ćelijsku masu neoplazije, tumora, kancera ili maligniteta, inhibiranjem ili sprečavanjem napredovanja ili poveć anja neoplazije, tumora, kancera ili obima maligniteta, mase, veli čine ili broja ć elija, ili produžavanje životnog veka; dovodeći do smanjenja ili smanjenja ozbiljnosti, trajanja ili učestalosti nepovoljnih simptoma ili komplikacija u vezi sa ili uzrokovanih neoplazijom, tumorom, kancerom ili malignitetom; metoda dovodi do smanjenja ili ublažavanja bolova, nelagodnosti, mučnine, slabosti ili letargije ili rezultuje u povećanju energije, apetita, poboljšanju mobilnosti ili psihološkoj dobrobiti.

[0028] Osim toga, obezbeđeni su kompleti uključujući peptidna jedinjenja opciono u kombinaciji sa tretmanom za oštećenje nukleinske kiseline (npr. agensi za oštećenje nukleinske kiseline), ili antiproliferativni agensi. Komplet može da sadrži peptidno jedinjenje i uputstva za upotrebu u primeni metode kako je ovde opisano (npr. primenu na sisara sa brojem belih krvnih zrnaca u granicama normale, npr. sisara sa brojem leukocita manjim od oko 11.000 belih krvnih zrnaca po mikrolitru (wbc/µl) krvi; sisara sa brojem belih krvnih zrnaca između oko 4.000 do oko 11.000 belih krvnih zrnaca po mikrolitru (wbc/µl) krvi; sisara sa brojem leukocita manjim od oko 10.000 belih krvnih zrnaca po mikrolitru (wbc/ µl) krvi; sisara sa brojem leukocita manjim od oko 9.000 belih krvnih zrnaca po mikrolitru (wbc/µl) krvi; sisara sa brojem belih krvnih zrnaca između oko 4.000 do oko 9.000 belih krvnih ćelija zrnaca po mikrolitru (wbc/µl) krvi; sisara sa brojem leukocita manjim od oko 8.000 belih krvnih zrnaca po mikrolitru (wbc/µl) krvi; sisara sa brojem belih krvnih zrnaca manjim od oko 7.000 belih krvnih zrnaca po mikrolitru (wbc/µl) krvi; ili sisara sa brojem belih krvnih zrnaca manjim od normalne gornje granice svake kliničke laboratorije za bela krvna zrnca po mikrolitru (wbc/µl) krvi.

OPIS CRTEŽA

[0029]

Slika 1 prikazuje krivu doza odgovor svakog jedinjenja, kada se koristi protiv bleomicinom tretiranih Jurkat ćelija. X- osa označava dozu, a Y-osa označava % G2/M ćelija posle tretmana.

Slika 2 prikazuje krivu doza odgovor svakog jedinjenja, kada se koristi protiv kolhicinom tretiranih Jurkat ćelija. X-osa označava dozu a Y-osa označava % G2/M ćelija posle tretmana.

Slike 3A i 3B Iz humanog kancera pankreasa izvedena ćelijska linija MIAPaCa2 tretirana sa (A) bleomicinom (Bleo) ili (B) adriamicinom (ARS) sa različitim dozama jedinjenja. Sakupljene ćelije su bojene za njihovu DNK i analizirane protočnom citometrijom. Onaj % populacije pod-Gl ćelija su označene kao mrtve ćelije.

Slike 4A do 4C su šematski dijagram odnosa struktura aktivnost, abrogatora G2 kontrolne tačke, (1-Gli) (1-Arg) (1-Lys) (1-Lys) (1-Arg) (1-Arg) (1-Gln) (1-Arg) (1-Arg) (1-Cha) (1-Phe-2,3,4,5,6-F) (1-Arg) (1-Ser) (1-Pro) (1-Ser) (1-Tir)(1-Tir) (SEK ID NO:78): (A) za ukidanje aktivnosti G2 kontrolne tačke aminokiselinskih supstitucija za 1-Cha u bleomicinom tretiranim Jurkat ćelijama odgovornim se smatraju po redosledu [1-Cha=1-Nal(2)]>[1-Ala(3-BZT)=1-Nal(1)=1-Trp=1-DpH]>[1-Ala(tBu) =Cys (tBu)= Leu]; (B) za aktivnosti ukidanja kontrolne tačke M faze i/ili nespecifičnu toksičnost aminokiselinskih supstitucija za 1-Cha u kolhicinom tretiranim Jurkat ćelijama po sledećem redosledu [Ala(3-BZT)=1-Nal(1)=1-DpH]>[1-Cha=1-Nal(2)]; (C) za aktivnosti ukidanja G2 kontrolne tačke aminokiselinskih supstitucija za 1-Phe-2,3,4,5,6-F odgovornim se smatraju po sledećem redosledu, 1-(Phe-2,3,4,5,6-F)=1-(Phe-3,4,5-F)=1-(Phe-4CF3)]>[1-(Phe-3br, 4Cl,5Br) =1-(Phe-4Cl)=1-Tir].

Slika 5 prikazuje aktivnosti ukidanja G2 različitih sekvenci bogatih argininom. Navedeni peptidi su dodati Jurkat ćelijama sa ili bez bleomicina. % G2/M ćelija je prikazan na Y osi. X-osa predstavlja kako sledi: 1, bleomicin sam; 2, 0.2 µg/ml; 3, 0.39 µg/mL; 4, 0.78 µg/ml; 5, 1.56 µg/ml; 6, 3.125 µg/ml; 7, 6.25 µg/mL; 8, 12.5 µg/ml; 9.25 µg/ml; i 10.50 µg/ml. Peptidne sekvence su sledeće: rrrqrrkkr, (d-Bpa)(d-Ser)(d-Trp) (d-Ser)(d-Phe-2,3,4,5,6-F)(d-Cha)(d-Arg)(d-Arg) (d-Arg)(d-Gln) (d-Arg) (d-Arg)(d-Lys)(d-Lys)(d-Arg) (SEQ ID NO:79); CBP501, (d-Bpa) (d-Ser)(d-Trp)(d-Ser) (d-Phe-2,3,4,5,6-F)(d-Cha) (d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Gln) (d-Arg) (d-Arg)(SEQ ID NO:80); no TAT, (d-Bpa) (d-Ser)(d-Trp)(d-Ser)(d-Phe-2,3,4,5,6-F) (d-Cha) (SEQ ID NO:81); rqrr, (d-Bpa)(d-Ser)(d-Trp)(d-Ser) (d-Phe-2,3,4,5,6-F)(d-Cha) (d-Arg)(d-Gln)(d-Arg) (d-Arg)(SEQ ID NO:82); rrqrr, (d-Bpa)(d-Ser) (d-Trp) (d-Ser) (d-Phe-2,3,4,5,6-F)(d-Cha)(d-Arg)(d-Arg)(d-Gln) (d-Arg)(d-Arg) (SEQ ID NO:83); rrrq, (d-Bpa) (d-Ser)(d-Trp)(d-Ser) (d-Phe-2,3,4,5,6-F)(d-Cha) (d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Gln) (SEQ ID NO:84); and rrrqr, (d-Bpa)(d-Ser)(d-Trp)(d-Ser) (d-Phe-2,3,4,5,6-F)(d-Cha)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Gln) (d-Arg)(SEQ ID NO:85).

Slika 6 prikazuje aktivnosti ukidanja G2 od različitih peptida bez (d-Bpa). Navedeni peptidi su dodati Jurkat ćelijama sa ili bez bleomicina. % G2/M ćelija je prikazan na Y osi. X-osa predstavlja kao što sledi: 1, bleomicin sam; 2, 0.2 mg/ml; 3, 0.39 mg/ml; 4, 0.78 mg/ml; 5, 1. 56 µg/ml; 6, 3.125 µg/ml; 7, 6.25 µg/ml; 8, 12.5 µg/ml; 9, 25 µg/ml; i 10, 50 µg/ml. Peptidne sekvence su: CBP0, (d-Arg) (d-Arg) (d-Arg) (d-Gln) (d-Arg) (d-Arg) (SEK ID NO: 86); CBP451, (d-Tir) (d-Ser) (d-Pro) (1-Trp) (1-Ser) (d-Phe-2,3,4,5,6-F) (d-Cha) (d-Arg) (d-Arg) (d-Arg) (d-Gln) (d-Arg) (d- Arg) (SEK ID NO: 87); CBP452, (d-Tir) (d-Ser) (1-Pro) (1-Trp) (1-Ser) (d-Phe-2,3,4,5,6-F) (d-Cha) ( d-Arg) (d-Arg) (d- Arg) (d-Gln) (d-Arg) (d-Arg) (SEK ID NO: 88); i CBP501, (d-Bpa) (d-Ser) (d-Trp) (d-Ser) (d-Phe-2,3,4,5,6-F) (d-Cha) (d-Arg) (d-Arg) (d-Arg) (d-Gln) (d-Arg) (d-Arg) (SEK ID NO: 80).

Slika 7 prikazuje aktivnosti ukidanja G2 raznih peptidnih sekvenci bogatih argininom i bogatih lizinom. Navedeni peptidi su dodati Jurkat ćelijama kao gore i izračunat je % G2/M ćelija (Y-osa). Peptidne sekvence su: CBP603, (d-Bpa) (d-Ser) (d-Trp) (d-Ser) (d-Phe4NO2) (d-Cha) (d-Arg) (d-Arg) (d-Arg) (d-Gln) (d-Arg) (d-Arg) (SEK ID NO: 89); CBP607, (d-Bpa) (d-Ser) (d-Trp) (d-Ser) (d-Phe-2,3,4,5,6-F) (d-Cha) (d-Arg) (d-Arg) (d-Arg) (d-Arg) (d-Arg) (SEK ID NO: 90); CBP608, (d-Bpa) (d-Ser) (d-Trp) (d-Ser) (d-Phe-2,3,4,5,6-F) (d-Cha) (d-Arg) (d-Arg) (d-Arg) (d-Arg) (d-Arg) (d-Arg) (SEK ID NO:91); i CBP609, (d-Bpa) (d-Ser) (d-Trp) (d-Ser) (d-Phe-2,3,4,5,6-F) (d-Cha) (d-Lys) (d-Lys) (d-Lys) (d-Lys) (d-Lys) (d-Lys) (SEK ID BR: 92).

Slika 8 prikazuje da lokacija argininom bogatog dela sekvence može varirati. Navedeni peptidi su dodati Jurkat ćelijama kao gore i izračunat je % G2/M ćelija (Y-osa). Peptidne sekvence su: CBP501, (d-Bpa) (d-Ser) (d-Trp) (d-Ser) (d-Phe-2,3,4,5,6-F) (d-Cha) (d-Arg) (d-Arg) (d-Arg) (d-Gln) (d-Arg) (d-Arg) (SEK ID NO: 80); CBP510, (d-Arg) (d-Arg) (d-Gln) (d-Arg) (d-Arg) (d-Arg) (d-Cha) (d-Phe-2,3,4,5,6 F) (d-Ser) (d-Trp) (d-Ser) (d- Bpa) (SEK ID NO: 93); CBP511, (d-Arg) (d-Arg) (d-Gln) (d-Arg) (d-Arg) (d-Arg) (d-Bpa) (d-Ser) (d-Trp) (d-Ser) (d-Phe-2,3,4,5,6-F) (d-Cha) (SEK ID NO: 94); i CBP512, (d-Arg) (d-Arg) (d-Arg) (d-Arg) (d-Arg) (d-Arg) (d-Cha) (d-Phe-2,3,4,5,6-F) (d-Ser) (d-Trp) (d-Ser) (d-Bpa) (SEK ID BR: 95).

Slika 9 prikazuje strukturu nekoliko ispitivanih supstituisanih peptidnih sekvenci. Aktivnost ukidanja G2 se povećava sa svetlo osenčenim supstitucijama (*), aktivnost ukidanja kontrolne tačke M faze i/ili nespecifična toksičnost se povećava sa tamno osenčenim supstitucijama (*) i ostala je otprilike ista za prostale supstitucije.

Slika 10 prikazuje inhibiciju rasta tumora (humani karcinom pankreasa) u scid mi ševima nakon tretmana sa CBP501 i cisplatinom. Dan 0 označava početak tretmana. Srednje vrednosti veličine tumora sa standardnom devijacijom za svaku tretiranu grupu su označene na Y osi a broj dana posle početka tretmana je prikazan na X osi.

Slika 11 prikazuje aktivnost ukidanja G2 za peptide koji imaju region sekvence koji inhibira kinaze i region sekvence na bazi HIV-TAT sekvence transdukcije, kao gore. % G2/M ćelija je prikazan na Y osi. X-osa predstavlja sledeće: 1, bleomicin sam; 2, 0.2mg/ml; 3, 0.39 mg/ml; 4, 0.78 mg/ml; 5, 1.56 mg/ml; 6, 3.125 mg/ml; 7, 6.25 mg/ml; 8, 12.5 mg/ml; 9, 25 mg/ml; i 10, 50 mg/ml. Peptidne sekvence su: CBP501, (d-Bpa) (d- Ser) (d-Trp) (d-Ser) (d-Phe-2,3,4,5,6-F) (d-Cha) (d-Arg) (d-Arg) (d-Arg) (d-Gln) (d-Arg) (d-Arg) (SEK ID NO: 80); CBP700, (d-Arg) (d-Arg) (d-Bpa) (d-Arg) (d-Arg) (d-Arg) (d-Phe-2,3,4,5, 6-F) (d-Cha) (SEK ID NO: 96); CBP701, (d- Arg) (d-Arg) (d-Arg) (d-Bpa) (d-Arg) (d-Trp) (d-Arg) (d-Phe-2,3,4,5, 6-F) (d-Cha) (SEK ID NO: 97); CBP702, (d-Arg) (d-Arg) (d-Arg) (d-Arg) (d-Bpa) (d-Arg) (d-Trp) (d-Arg) (d-Phe-2,3 , 4,5,6-F) (d-Cha) (SEK ID NO: 98); CBP703, (d- Arg) (d-Arg) (d-Arg) (d-Bpa) (d-Arg) (d-Arg) (d-Arg) (d-Phe-2,3,4,5, 6-F) (d-Cha) (SEK ID BR: 99).

Slika 12 prikazuje poređenje između aktivnosti ukidanja G2 i aktivnosti ukidanja M i/ili ne specifičnu toksičnost peptida sa Bleomicinom za analizu ukidanja G2 i kolhicina za aktivnost ukidanja M i/ili nespecifičnu toksičnost. Navedeni peptidi su dodati Jurkat ćelijama sa bleomicinom ili kolhicinom. % G2/M ćelija je prikazan na Y osi. X-osa predstavlja sledeće: 1., bleomicin ili kolhicin sam; 2, 0.2mg/ml; 3, 0.39 mg/ml; 4, 0.78 mg/ml; 5, 1.56 mg/ml; 6, 3.125 mg/ml; 7, 6. 25 mg/ml; 8, 12.5 mg/ml; 9, 25 mg/ml; i 10, 50 mg/ml. Redosled peptida je sledeći: CBP501, (d-Bpa)(d-Ser)(d-Trp) (d-Ser)(d-Phe-2,3,4,5,6-F) (d-Cha)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Gln)(d-Arg) (d-Arg).

Slika 13 prikazuje molekulsku strukturu CBP501, (d-Bpa) (d-Ser) (d-Trp) (d-Ser) (d-Phe-2;3,4,5,6-F) (d-Cha) (d-Arg) (d-Arg) (d-Arg) (d-Gln) (d-Arg) (d-Arg).

Slika 14 prikazuje Kaplan-Meyer analizu ukupnog preživljavanja svih lečenih pacijenata u odnosu na polazne WBC: Kaplan-Meyer krive preživljavanja, prosečno OS i Odnos Rizika u odnosu na polazne WBC kod svih tretiranih pacijenata. Odnos rizika se poboljšava kako granični nivo opada i ima maksimum na WBC 8000/µl kao graničnom nivou.

Slika 15 prikazuje Kaplan-Meyer analizu ukupnog preživljavanja pacijenata uključenih u ICON u odnosu na WBC: Kaplan-Meyer krive preživljavanja, prosečan OS i odnos rizika u odnosu na polazne WBC pacijenata uključenih u ICON. Odnos rizika se poboljšava kako granični nivo opada i ima pik na WBC 8000/µl kao graničnom nivou, a razlika između grupa Arm A i Arm B je bila statistički značajna na piku.

Slika 16 prikazuje Kaplan-Meyer krive preživljavanja, prosečno OS, brojeve pacijenata, odnos rizika i p vrednosti Log-rank (Mantel-Cox) testa u odnosu na WBC, >8000 ili <8000, na skriningu u svim tretiranim populacijama prikazanim pomoću grupa.

Slika 17 prikazuje povećano formiranje zamki od neutrofila aktiviranih tretmanom sa CBP501.

Slika 18 prikazuje povećane trombin/anti-trombin komplekse pomoću CBP501 in vivo.

Slika 19 prikazuje sa CBP501 inhibiranu fagocitozu i M1 i M2 makrofaga in vitro.

Slika 20 prikazuje suzbijanje oslobađanja TNF iz mišje ćelijske linije makrofaga (RAW264.7).

DETALJAN OPIS

[0030] Pronalazak obezbeđuje jedinjenja, uključujući peptide i peptidomimetike koji inhibiraju ćelijsku proliferaciju. Ovde opisana jedinjenja su stoga korisna za lečenje poremećaja ćelijske proliferacije ili fizioloških stanja koja karakteriše neželjena proliferacija ili proliferacija nepoželjnih ćelija, kao što su benigne i maligne tumorske ćelije. Čini se da sposobnost ovde opisanih peptida i peptidomimetika da inhibiraju ćelijsku proliferaciju može biti zbog ili bar delimično zbog ukidanja G2 kontrolne tačke ćelijskog ciklusa. Pošto ćelije mogu biti indukovane da uđu u kontrolnu tačku G2 ćelijskog ciklusa u odgovoru na oštećenje nukleinske kiseline kako bi ćelija popravila oštećenje pre nego što dođe do replikacije DNK i deobe ćelije, inhibiranjem G2 kontrolne tačke, ovde opisani peptidi i peptidomimetici senzitizuju ćelije za agense koji oštećuju nukleinske kiseline i protokole tretmana. Ćelije koje akumuliraju dovoljno oštećenja nukleinske kiseline neće moći da kompletiraju reparaciju oštećene nukleinske kiseline zato što je deaktivirana G2 kontrolna tačka. Takve ćelije će ispoljavati smanjenu proliferaciju (npr. zbog mutacije gena kriti čnog za preživljavanje koji nije repariran) i eventualno pretrpeti apoptozu.

[0031] Ćelije koje imaju normalnu G1 su manje podložne da akumuliraju oštećene nukleinske kiseline pošto reparacija nukleinske kiseline takođe može da se odvija tokom G1. Prema tome, normalne ćelije su manje podložne uticajima ovde opisanih jedinjenja. Međutim, ć elije koje imaju ošteć enu ili deaktiviranu G1 kontrolnu tačku ćelijskog ciklusa imaju već u verovatno ć u da akumuliraju ošte ć enu nukleinsku kiselinu, pošto je kontrolna tačka G1 ošteć ena ili deaktivirana, čineći manje verovatnim da ć elije mogu potpuno da repariraju ošteć enu nukleinsku kiselinu. Prema tome, tretiranje ć elija sa o šte ć enom ili deaktiviranom G1 sa ovde opisanim peptidom ili peptidomimetikom koji naru šava deaktivira G2 kontrolnu tačku čini još manje verovatnim da ć e te ć elije mo ć i da kompletiraju reparaciju o šte ć ene nukleinske kiseline. Ćelije sa ošte ć enom ili deaktiviranom G1 su stoga posebno osetljive na peptide i peptidomimetike koji su ovde opisani. Prema tome, ovde opisana jedinjenja koja uključuju peptide i peptidomimetike se mogu koristiti za inhibiranje ili sprečavanje proliferacije ć elija generalno, a posebno inhibiraju proliferaciju ć elija koje imaju o šte ć enu ili deaktiviranu G1 kontrolnu tačku.

[0032] Ćelije koje imaju ošteć enu ili deaktiviranu G1 kontrolnu tačku ćelijskog ciklusa uključuju ali nisu ograničeni na ćelije koje se brzo razmnožavaju. Ćelijski proliferativni poremećaj i fiziološka stanja koja karakterišu brzo rastuće ćelije, nepoželjan rast ćelija ili ćelija koje preživljavaju umesto da budu podvrgnute apoptozi često imaju ošte ć enu ili deaktiviranu G1 kontrolnu tačku ćelijskog ciklusa. Prema tome, kako se čini sposobnost ovde opisanih peptida i peptidomimetika da inhibiraju proliferaciju ili stimuli šu apoptozu je, bar delimično, posledica poremećaja G2 kontrolne tačke ćelijskog ciklusa, ćelije koje se vrlo brzo ili nepoželjno razmnožavaju zbog ošte ć ene ili deaktivirane G1 kontrolne tačke su posebno atraktivni ciljevi.

[0033] CBP501 je peptid TAT-S216A koji inhibira G2 kontrolnu tačku ćelijskog ciklusa (Suganuma, M., et al. Cancer Res 59:5887 (1999)). Metoda skrininga ćelijskog ciklusa na bazi fenotipa je korišćen za optimizaciju TAT-S216A za smanjenje akumulacije kancerskih ćelija u G2 fazi ćelijskog ciklusa u odgovoru na agense koji oštećuju DNK bez uticaja na fenotip ćelijskog ciklusa normalnih ćelija (Sha, S., et al. Mol. Cancer Ther 6:147 (2007)). Pronađeno je da CBP501 povećava koncentracije platine i formiranje platina-DNK adukta u CBP501-senzitivnim tumorskim ćelijama i može da radi, alternativno, ili kao dodatak inhibicije/deaktivacije G2 kontrolne tačke putem inhibicije Kalmodulinom (Mine, N., et al. Mol. Cancer Ther. 10:1929 (2011)).

[0034] Jedinjenja uključujući peptide i peptidomimetike koji su ovde opisani mogu da suzbiju proliferaciju ćelija samostalno bez dodatnih tretmana koji oštećuju nukleinsku kiselinu ili imaju anti-proliferativnu aktivnost pošto će deaktiviranje G2 kontrolne tačke verovatno dovesti do akumulacije oštećenja nukleinske kiseline dok se ćelije dele. Prema tome, abnormalna ili nepoželjna proliferacija ili preživljavanje ćelija se može tretirati sa ovde opisanim jedinjenjem samostalno ili u kombinaciji sa tretmanom koji o štećuje nukleinsku kiselinu (npr. hemijski agens ili protokol tretmana), za inhibiranje ili spre čavanje proliferacije ćelija ili za stimulaciju ćelijske apoptoze/katastrofe.

[0035] Za razliku od konvencionalnih anti-proliferativnih agensa, koji ciljaju ćelije sa brzom proliferacijom bez obzira da li su ćelije normalne ili abnormalne (npr. ćelija raka), ovde opisana jedinjenja targetiraju prvenstveno ćelije sa ošte ć enom ili deaktiviranom G1 kontrolnom tačkom ćelijskog ciklusa. Na primer, CBP501, za razliku od cisplatina, ne utiče na rast HUVEC ćelija (vidi, npr. Tabelu 3). CBP501 takođe ne utiče na zadržavanje M faze ćelijskog ciklusa i/ili nespecifičnu toksičnost izazvanu kolhicinom (vidi, npr, Sliku 12). Prema tome, manje je verovatno da će ovde opisana jedinjenja proizvesti višak neželjenih sporednih efekata povezanih sa konvencionalnim agensima protiv ćelijske proliferacije, kao što je supresija koštane srži, mučnina, gubitak apetita, dijareja i gubitak kose. Pored toga, po što većina ćelija raka ima ošteć enu ili deaktiviranu G1 kontrolnu tačku ćelijskog ciklusa, ćelije raka će ispoljavati povećanu osetljivost na ovde opisana jedinjenja koja ukidaju G2 kontrolnu tačku ćelijskog ciklusa. Da su normalne ćelije manje osetljive takođe znači da ovde opisana jedinjenja uključujući peptide i peptidomimetike koji mogu da se koriste u većim količinama.

[0036] U skladu sa ovim otkrićem, obezbedjena su jedinjenja, uključujući peptide i peptidomimetike koji imaju anti-proliferativnu aktivnost i/ili anuliraju G2 kontrolnu ta čku ćelijskog ciklusa. Peptidi ili peptidomimetici obuhvataju sekvence koje inhibiraju ćelijsku proliferaciju ili koji stimulišu apoptozu ćelije. Peptidi ili peptidomimetici uključuju sekvence, koje poništavaju ukidaju G2 kontrolnu tačku ćelijskog ciklusa. Susedne peptidne ili peptidomimetičke sekvence mogu uključivati sledeću strukturu: P1, P2, P3, P4, P5, P6 (SEK ID NO:1) ili P6, P5, P4, P3, P2, P1 (SEK ID NO: 2); gde P1 je d- ili 1-Cha, d- ili 1-Nal(2), d- ili 1-(Phe-2,3,4,5,6-F), d- ili 1-(Phe-3,4,5F), d- ili 1-(Phe-4CF3), amino kiselina koja zauzima prostor sličan bočnom lancu (npr d- ili 1-Tir, d- ili 1 Phe), ili bilo koja amino kiselina sa jednom ili dve aromati čne, piperidin, pirazin, pirimidin, piperazin, morfolin ili pirimidin grupe, ili jednom indol, pentalen, inden, naftalen, benzofuran, benzotiofena, hinolin, indolin, hroman, hinoksalin, hinazolin grupom u bo čnom lancu; P2 je d- ili 1-Cha, d- ili 1-Nal(2), d- ili 1-(Phe-2,3,4,5,6-F), d- ili 1- (Phe-3,4,5F), d- ili 1-(Phe-4CF3), d- ili 1-Bpa, d- ili 1-Phe4NO2, amino kiselina koja zauzima prostor sličan bočnom lancu (npr. d- ili 1-Tir, d- ili 1-Phe) ili bilo koja amino kiselina sa jednom ili dve aromatične, piperidin, pirazin, pirimidin, piperazin, morfolin ili pirimidin grupe, ili jednom indol, pentalen, inden, naftalin, benzofuran, benzotiofen, hinolin, indolin, hroman, hinoksalin, ili hinazolin grupom u bočnom lancu; P3, P4, P5 su bilo koja amino kiselina ili jedan ili više od P3, P4, P5 je jednostavan ugljenični lanac takav da je udaljenost između P2 i P6 otprilike ista kao udaljenost kada je svaki od P3, P4, P5 aminokiselina (d- ili 1-Trp je primer na P4, P6 je d- ili 1-Bpa, d- ili 1-Phe4NO2, bilo koja amino kiselina i d- ili 1-Tyr (npr. d-Ser-d-Tyr), bilo koja amino kiselina i d- ili 1-Phe (npr. d-Ser-d-Phe), bilo koja amino kiselina, ili ništa. U različitim aspektima, amino kiselina koja ima jednostavan ugljenični lanac je d- ili 1-11-aminoundekanska kiselina, d- ili 1-10-aminodekanska kiselina, d- ili 1-9-aminonanonska kiselina, d- ili 1-8-aminokaprilna kiselina, d- ili 1-7-aminoheptanska kiselina, d- ili 1-6-amino-kaproinska kiselina, ili sli čna struktura sa jednom ili više nezasićenih ugljeničnih veza.

[0037] Susedni peptid ili peptidomimetička sekvenca takođe može da sadrži i sledeću strukturu: P1, P2, P3, P4, P5, P6 (SEK ID NO: 3); P6, P5, P4, P3, P2, P1 (SEK ID NO: 4); P1, P2, P3, P4, P5, P6, P7, P8, P9, P10, P11, P12 (SEK ID NO: 5); P1, P2, P3, P4, P5, P6, P12, P11, P10, P9, P8, P7 (SEK ID NO: 6); P6, P5, P4, P3, P2, P1, P7, P8, P9, P10, P11, P12 (SEK ID NO: 7); P6, P5, P4, P3, P2, P1, P12, P11, P10, P9, P8, P7 (SEK ID NO: 8); P7, P8, P9, P10, P11, P12, P1, P2, P3, P4, P5, P6 (SEK ID NO: 9); P7, P8, P9, P10, P11, P12, P6, P5, P4, P3, P2, P1 (SEK ID NO: 10); P12, P11, P10, P9, P8, P7, P1, P2, P3, P4, P5, P6 (SEK ID NO: 11); P12, P11, P10, P9, P8, P7, P6, P5, P4, P3, P2, P1 (SEK ID NO: 12); P12, P11, P6, P9, P8, P7, P2, P1 (SEK ID NO: 13); P12, P11, P10, P6, P9, P4, P7, P2, P1 (SEK ID NO: 14); P1, P2, P7, P8, P9, P6, P11, P12 (SEK ID NO: 15); ili P1, P2, P7, P4, P9, P6, P10, P11, P12 (SEK ID NO: 16); gde P1 je d- ili 1-Cha, d- ili 1-Nal (2), d- ili 1-(Phe-2,3,4,5,6-F), d- ili 1- (Phe-3 , 4,5F), d- ili 1- (Phe-4CF3), d- ili 1-Bpa, d- ili 1-Phe4NO2, amino kiselina koja zauzima prostor sličan bočnom lancu (npr. d- ili 1 Tyr-, d- ili 1-Phe) ili bilo koja amino kiselina sa jednom ili dve aromati čne, piperidin, pirazin, pirimidin, piperazin, morfolin ili pirimidin grupe, ili jednom indol, pentalen, inden, naftalen, benzofuran, benzotiofen, hinolin, indolin, hroman, hinoksalin, ili hinazolin grupom u bo čnom lancu; P2 je dili 1-Cha, d- ili 1-Nal(2), d- ili 1-(Phe-2,3,4,5,6-F), d- ili 1-(Phe-3,4,5F), d- ili 1-(Phe-4CF3), ili amino kiselina koja zauzima prostor sličan bočnom lancu (npr. d- ili 1-Tir, d- ili 1-Phe) ili bilo koja amino kiselina sa jednom ili dve aromatične, piperidin, pirazin, pirimidin, piperazin, morfolin ili pirimidin grupe, ili jednom indol, pentalen, inden, naftalen grupom, benzofuran, benzotiofen, hinolin, indolin, hroman, hinoksalin, hinazolin grupom u bočnom lancu; P3, P4, P5 su bilo koja amino kiselina ili jedan ili više od P3, P4, P5 je jednostavan ugljenični lanac takav da je udaljenost između P2 i P6 otprilike ista kao udaljenost kada je svaki od P3, P4, P5 aminokiselina (d- ili 1-Trp je na primer na P4); P6 je d- ili 1-Bpa, d- ili 1-Phe4NO2, bilo koja amino kiselina i dili 1-Tir (npr. d-Ser-d-Tir), bilo koja amino kiselina i d- ili 1-Phe (npr. d-Ser-d-Phe) i najmanje tri od P7, P8, P9, P10, P11, P12 su bazne amino kiseline sa ostatkom koji je bilo koja amino kiselina ili nije prisutan. U različitim aspektima, amino kiselina koja ima jednostavan ugljenični lanac je d- ili 1-11-aminoundekanska kiselina, d- ili 1-10-aminodekanska kiselina, d- ili 1-9-aminonanonska kiselina, d- ili 1-8-aminokaprilna kiselina, d- ili 1-7-aminoheptanska kiselina, d- ili 1- 6-aminokaproinska kiselina ili slična struktura sa jednim ili više nezasićenih ugljenika.

[0038] Susedni peptid ili peptidomimetička sekvenca može dalje uključivati sledeću strukturu: P1, P2, P3, P4, P5, P6, P7, P8, P9, P10, P11, P12 (SEK ID NO: 17); P12, P11, P10, P9, P8, P7, P6, P5, P4, P3, P2, P1 (SEK ID NO: 18); P12, P11, P10, P6, P9, P4, P7, P2, P1 (SEK ID NO: 19); ili P1, P2, P7, P4, P9, P6, P10, P11, P12 (SEK ID NO:20); gde P1 je d- ili 1-Cha, d- ili 1-Nal(2), d- ili 1-(Phe-2,3,4,5,6-F), d- ili 1-(Phe-3,4,5F), d- ili 1-(Phe-4CF3), d- ili 1-Bpa, d- ili 1-Phe4NO2, amino kiselina koja zauzima prostor sličan bočnom lancu (npr. d- ili 1-Tyr, d- ili 1-Phe) ili bilo koja amino kiselina sa jednom ili dve aromatične, piperidin, pirazin, pirimidin, piperazin, morfolin ili pirimidin grupe, ili jednom indol, pentalen, inden, naftalin, benzofuran, benzotiofen, hinolin, indolin, hroman, hinoksalin, ili hinazolin grupom u bočnom lancu; P2 je d- ili 1-Cha, d- ili 1-Nal(2), d- ili 1-(Phe-2,3,4,5,6-F), d- ili 1-(Phe-3,4,5F), d- ili 1-(Phe-4CF3), amino kiselina koja zauzima prostor sličan bočnom lancu (npr. d- ili 1-Tir, d- ili 1-Phe) ili bilo koja amino kiselina sa jednom ili dve aromati čne, piperidin, pirazin, pirimidin, piperazin, morfolin ili pirimidin grupe, ili jednom indol, pentalen, inden, naftalin, benzofuran, benzotiofen, hinolin, indolin, hroman, hinoksalin, hinazolin grupom u bo čnom lancu; P3, P4, P5 su bilo koja amino kiselina ili jedan ili više od P3, P4, P5 je jednostavan ugljenični lanac takav da je udaljenost između P2 i P6 otprilike ista kao udaljenost kada je svaki od P3, P4, P5 aminokiselina (d- ili 1-Trp je na primer na P4); P6 je d- ili 1-Bpa, d- ili 1-Phe4NO2, bilo koja amino kiselina i d- ili 1-Tir (npr d-Ser-d-Tir), bilo koja amino kiselina i d- ili 1-Phe (npr. d-Ser-d-Phe), bilo koja amino kiselina, ili ni šta; i najmanje tri od P7, P8, P9, P10, P11, P12 su bazne amino kiseline sa ostatkom koji je bilo koja amino kiselina ili je odsutan. U razli čitim aspektima, amino kiselina koja ima jednostavan ugljenični lanac je d- ili 1-aminoundekanska kiselina ili d- ili 1-8-aminokaprilna kiselina.

[0039] Susedni peptid ili peptidomimetička sekvenca zatim može uključivati i sledeću strukturu: P1, P2, P3, P4, P5, P6 (SEK ID NO: 21) ili P6, P5, P4, P3, P2, P1 (SEK ID NO: 22); gde P1 je d- ili 1-Cha, d- ili 1-Nal(2), d- ili 1-(Phe-2,3,4,5,6-F), d- ili 1-(Phe-3,4,5F), d- ili 1-(Phe-4CF3), d- ili 1-Bpa, d- ili 1-Phe4NO2, d- ili 1-Tir ili d- ili 1- Phe; P2 je d- ili 1-Cha, d- ili 1-Nal(2), d- ili 1-(Phe-2,3,4,5,6-F), d- ili 1-(Phe-3,4,5F), d- ili 1-(Phe-4CF3), dili 1-Bpa, d- ili 1-Phe4NO2, d- ili 1-Tir ili d- ili 1-Phe; P3 je d- ili 1-serin, d- ili 1-arginin, d- ili 1-cistein, d- ili 1-prolin ili d- ili 1-asparagin; P4 je d- ili 1-triptofan; i P5 je d- ili 1-serin, d- ili 1-arginin ili d- ili 1-asparagin; ili P3, P4, P5 je jednostruka d- ili 1-aminoundekanska kiselina ili jednostruka d- ili 1-8- aminokaprilna kiselina; P6 je d- ili 1-Bpa, d- ili 1-Phe4NO2, (d-Ser-d-Tir), ili (d-Ser-d-Phe).

[0040] Susedni peptid ili peptidomimetička sekvenca može dodatno uključivati sledeću strukturu: P1, P2, P3, P4, P5, P6, P7, P8, P9, P10, P11, P12 (SEK ID NO: 23); P1, P2, P3, P4, P5, P6, P12, P11, P10, P9, P8, P7 (SEK ID NO: 24); P6, P5, P4, P3, P2, P1, P7, P8, P9, P10, P11, P12 (SEK ID NO: 25); P6, P5, P4, P3, P2, P1, P12, P11, P10, P9, P8, P7 (SEK ID NO: 26); P7, P8, P9, P10, P11, P12, P1, P2, P3, P4, P5, P6 (SEK ID NO: 27); P7, P8, P9, P10, P11, P12, P6, P5, P4, P3, P2, P1 (SEK ID NO: 28); P12, P11, P10, P9, P8, P7, P1, P2, P3, P4, P5, P6 (SEK ID NO: 29); P12, P11, P10, P9, P8, P7, P6, P5, P4, P3, P2, P1 (SEK ID NO: 30); P12, P11, P6, P9, P8, P7, P2, P1 (SEK ID NO: 31); P12, P11, P10, P6, P9, P4, P7, P2, P1 (SEK ID NO: 32); P1, P2, P7, P8, P9, P6, P11, P12 (SEK ID NO: 33); ili P1, P2, P7, P4, P9, P6, P10, P11, P12 (SEK ID NO: 34); gde P1 je d- ili 1-Cha, Nal(2), d- ili 1-(Phe-2,3,4,5,6-F), d- ili 1-(Phe- 3,4,5F) , d- ili 1-(Phe-4CF3), d- ili 1-Bpa, d- ili 1-Phe4NO2, d- ili 1-Tir ili d- ili 1-Phe; P2 je d- ili 1-Cha, d- ili 1-Nal (2), d- ili 1- (Phe-2,3,4,5,6-F), d- ili 1- (Phe-3, 4,5F), d- ili 1- (Phe-4CF3), d- ili 1-Bpa, d- ili 1-Phe4NO2, d- ili 1-Tir ili d- ili 1-Phe; P3 je d- ili 1-serin, d- ili 1-arginin, d- ili 1-cistein, d- ili 1-prolin ili d- ili 1-asparagin; P4 je d- ili 1-triptofan; P5 je d- ili 1-serin, d- ili 1-arginin ili d- ili 1-asparagin; ili P3, P4, P5 je d- ili 1-aminoundekanska kiselina ili jednostruka d- ili 1-8- aminokaprilna kiselina; P6 je d- ili 1-Bpa, d- ili 1-Phe4NO2, (d-Ser-d-Tir), ili (d-Ser-d-Phe); i najmanje tri od P7, P8, P9, P10, P11, P12 su d- ili 1-Arg ili d- ili 1-Lys, a ostatak je bilo koja amino kiselina ili ništa.

[0041] Pored toga, susedni peptid ili peptidomimetička sekvenca može uključivati sledeću strukturu: P1, P2, P3, P4, P5, P6, P7, P8, P9, P10, P11, P12 (SEK ID NO:35); P12, P11, P10, P9, P8, P7, P6, P5, P4, P3, P2, P1 (SEK ID NO: 36); P12, P11, P10, P6, P9, P4, P7, P2, P1 (SEK ID NO:37); ili P1, P2, P7, P4, P9, P6, P10, P11, P12 (SEK ID NO: 38); gde P1 je d- ili 1-Cha, ili d- ili 1-Nal (2); P2 je d- ili 1- (Phe-2,3,4,5,6-F), d- ili 1-(Phe-3,4,5F), d- ili 1-(Phe-4CF3); i najmanje tri od P7, P8, P9, P10, P11, P12 su d- ili 1-Arg sa ostatkom koji je bilo koja amino kiselina ili ništa; P3 je d- ili 1-serin; P4 je d- ili 1-triptofan; P5 je d- ili 1-serin ili d- ili 1-asparagin; P6 je d- ili 1-Bpa, d- ili 1-Phe4NO2, (d- ili 1-Ser-d- ili 1-Tir), ili (d- ili 1-Ser-d- ili 1-Phe ).

[0042] Ipak pored toga, susedni peptid ili peptidomimetička sekvenca može uključivati sledeću strukturu: P1, P2, P3, P4, P5, P6 (SEK ID NO: 39) ili P6, P5, P4, P3, P2, P1 (SEK ID NO: 40); gde P1 je d- ili 1-Cha, ili d- ili 1-Nal (2); P2 je (d- ili 1-Phe-2,3,4,5,6-F), (d- ili 1-Phe-3,4,5F) ili (d- ili 1-Phe-4CF3); P3 je d- ili 1-Ser; P4 je d- ili 1-Trp; P5 je d- ili 1-Ser; P6 je d- ili 1-Bpa, ili (d- ili 1-Ser-d- ili 1-Tyr).

[0043] Dalje, susedni peptid ili peptidomimetička sekvenca može uključivati sledeću strukturu: P1, P2, P3, P4, P5, P6 (SEK ID NO: 41); P6, P5, P4, P3, P2, P1 (SEK ID NO: 42); P1, P2, P3, P4, P5, P6, P7, P8, P9, P10, P11, P12 (SEK ID NO: 43); P1, P2, P3, P4, P5, P6, P12, P11, P10, P9, P8, P7 (SEK ID NO: 44); P6, P5, P4, P3, P2, P1, P7, P8, P9, P10, P11, P12 (SEK ID NO: 45); P6, P5, P4, P3, P2, P1, P12, P11, P10, P9, P8, P7 (SEK ID NO: 46); P7, P8, P9, P10, P11, P12, P1, P2, P3, P4, P5, P6 (SEK ID NO: 47); P7, P8, P9, P10, P11, P12, P6, P5, P4, P3, P2, P1 (SEK ID NO: 48); P12, P11, P10, P9, P8, P7, P1, P2, P3, P4, P5, P6 (SEK ID NO: 49); P12, P11, P10, P9, P8, P7, P6, P5, P4, P3, P2, P1 (SEK ID NO: 50); P12, P11, P6, P9, P8, P7, P2, P1 (SEK ID NO: 51); P12, P11, P10, P6, P9, P4, P7, P2, P1 (SEK ID NO: 52); P1, P2, P7, P8, p9, P6, P11, P12 (SEK ID NO: 53); ili P1, P2, P7, P4, P9, P6, P10, P11, P12 (SEK ID NO: 54); gde P1 je d- ili 1-Cha, ili d- ili 1-Nal (2); P2 je (d- ili 1-Phe-2,3,4,5,6-F), (d- ili 1-Phe-3,4,5F) ili (d- ili 1- Phe-4CF3); P3 je bilo koja amino kiselina (npr d- ili 1-Ser ili d- ili 1-Pro); P4 je d- ili 1-Trp; P5 je bilo koja amino kiselina (npr d- ili 1-Ser); P7 je d- ili 1-Arg; P8 je d- ili 1-Arg; P9 je d- ili 1-Arg; P10 je d- ili 1-Gln ili d- ili 1-Arg; P11 je d- ili 1-Arg; P12 je d- ili 1-Arg; P6 je d- ili 1-Bpa ili (d- ili 1-Ser-d- ili 1-Tyr ).

[0044] Susedni peptid ili peptidomimetička sekvenca može da sadrži i sledeću strukturu: P1, P2, P3, P4, P5, P6, P7, P8, P9, P10, P11, P12 (SEK ID NO: 55); P12, P11, P10, P9, P8, P7, P6, P5, P4, P3, P2, P1 (SEK ID NO: 56); P12, P11, P10, P6, P9, P4, P7, P2, P1 (SEK ID NO: 57); ili P1, P2, P7, P4, P9, P6, P10, P11, P12 (SEK ID NO: 58); gde P1 je d- ili 1-Cha ili d- ili 1-Nal (2); P2 je (d- ili 1-Phe-2,3,4,5,6-F); P3 je d- ili 1-Ser; P4 je d- ili 1-Trp; P5 je d- ili 1-Ser; P7 je d- ili 1-Arg; P8 je d- ili 1-Arg; P9 je d- ili 1-Arg; P10 je d- ili 1-Gln ili d- ili 1-Arg; P11 je d- ili 1-Arg; P12 je d- ili 1-Arg; P6 je d- ili 1-Bpa ili (d- ili 1-Ser-d- ili 1-Tyr ).

[0045] Susedni peptid ili peptidomimetička sekvenca mogu dalje uključivati sledeću strukturu: (d-Bpa) (d-Ser) (d- Trp) (d-Ser) (d-Phe-2,3,4,5,6 -F) (d-Cha) (d-Arg) (d-Arg) (d-Arg) (d-Gln) (d-Arg) (d-Arg) (SEK ID NO: 99); (d-Arg) (d-Arg) (d-Arg) (d-Gln) (d-Arg) (d-Arg) (d-Bpa) (d-Ser) (d-Trp) (d-Ser) (d-Phe-2,3,4,5,6-F) (d-Cha) (SEK ID NO: 100); (d-Bpa) (d- Ser) (d-Trp) (d-Ser) (d-Phe-2,3,4,5,6-F) (d-Cha) (d-Arg) (d- arg) (d-Gln) (d-Arg) (d-Arg) (d-Arg) (SEK ID NO: 59); (d-Arg) (d-Arg) (d-Gln) (d-Arg) (d-Arg) (d-Arg) (d-Bpa) (d-Ser) (d -Trp) (d-Ser) (d-Phe-2,3,4,5,6-F) (d-Cha) (SEK ID NO: 60); (d-Cha) (d-Phe-2,3,4,5,6-F) (d-Ser) (d-Trp) (d-Ser) (d-Bpa) (d-Arg) (darg) (d-Arg) (d-Gln) (d-Arg) (d-Arg) (SEK ID NO: 61); (d- Arg) (d-Arg) (d-Arg) (d-Gln) (d-Arg) (d-Arg) (d-Cha) (d-Phe-2,3,4,5,6 F) (d-Ser) (d-Trp) (d-Ser) (d-Bpa) (SEK ID NO: 62); (d-Cha) (d-Phe-2,3,4,5,6-F) (d-Ser) (d-Trp) (d-Ser) (d-Bpa) (d-Arg) (d- arg) (d-Gln) (d-Arg) (d-Arg) (d-Arg) (SEK ID NO: 63); (d-Arg) (d-Arg) (d-Gln) (d-Arg) (d-Arg) (d-Arg) (d-Cha) (d-Phe-2,3,4,5,6 F) (d-Ser) (d-Trp) (d-Ser) (d-Bpa) (SEK ID NO: 64); (d-Arg) (d-Arg) (d-Arg) (d-Arg) (d-Arg) (d-Arg) (d-Cha) (d-Phe-2,3,4,5,6 F) (d-Ser) (d-Trp) (d-Ser) (d-Bpa) (SEK ID NO: 65); (d-Cha) (d-Phe-2,3,4,5, 6-F) (d-Ser) (d-Trp) (d-Ser) (d-Bpa) (d-Arg) (d-Arg) (d-Arg) (d-Arg) (d-Arg) (d- Arg) (SEK ID NO: 66); (d-Arg) (d-Arg) (d-Arg) (d-Arg) (d-Arg) (d-Arg) (d-Bpa) (d-Ser) (d-Trp) (d-Ser) , (d-Phe-2,3,4,5,6 F) (d-Cha) (SEK ID NO: 67); (d-Bpa) (d-Ser) (d-Trp) (d-Ser) (d-Phe-2,3,4,5,6-F) (d-Cha) (d-Arg) (d- arg) (d-Arg) (d-Arg) (d-Arg) (d-Arg) (SEK ID NO: 68); (d-Arg) (d-Arg) (d-Bpa) (d-Arg) (d-Arg) (d-Arg) (d-Phe-2,3,4,5,6-F) (d-Cha) (SEK ID NO: 69); (d-Cha) (d-Phe-2,3,4,5,6-F) (d-Arg) (d-Arg) (d-Arg) (d-Bpa) (d-Arg) (d-arg) (SEK ID NO: 70); (d-Arg) (d-Arg) (d-Arg) (d- Bpa) (d-Arg) (d-Trp) (d-Arg) (d-Phe-2,3,4,5,6 F) (d-Cha) (SEK ID NO: 71); (d-Cha) (d-Phe-2,3,4,5,6-F) (d-Arg) (d-Trp) (d-Arg) (d-Bpa) (d-Arg) (d-arg) (d-Arg) (SEK ID NO: 72); (d-Arg) (d-Arg) (d-Arg) (d-Arg) (d-Bpa) (d-Arg) (d-Trp) (d-Arg) (d- Phe-2,3,4,5,6-F) (d-Cha) (SEK ID NO: 73); (d-Cha) (d-Phe-2,3,4,5,6-F) (d-Arg) (d-Trp) (d-Arg) (d-Bpa) (d-Arg) (d-Arg) (d-Arg) (d-Arg) (SEK ID NO: 74 ); (d-Arg) (d-Arg) (d-Arg) (d-Bpa) (d-Arg) (d-Arg) (d-Arg) (d-Phe-2,3,4,5,6F) (d-Cha) (SEK ID NO: 75); ili (d-Cha) (d-Phe-2,3,4,5,6-F) (d-Arg) (d-Arg) (d-Arg) (d-Bpa) (d-Arg) (d Arg) (d-Arg) (SEK ID NO: 76).

[0046] Pored toga, susedni peptid ili peptidomimetička sekvenca može uključivati sledeću strukturu:

[0047] Ovde opisani peptidi i peptidomimetici opciono sadrže poli-lys i/ili arg sekvence kako bi pomogle prolaz kroz ćelijsku membranu. Pošto su druge aminokiselinske sekvence (npr. HIV tat, ligandi za ćelijske površinske receptore/proteine, itd) sposobne da prolaze kroz membranu i drugi molekuli se mogu koristiti za olakšavanje ulaska u ćeliju peptida i peptidomimetika koji poništavaju G2 (npr. lipozomi, micele i drugi molekuli lipida, virusni i drugi vektori, elektroporacija, itd.), uključivanje poli-lys i/ili poli-arg sekvenci je opciono. Dakle, pored toga, peptidi i peptidomimetici ne moraju imati poli-lys i/ili arg sekvence koje poma žu ulazak u ćeliju. Na primer, u dva specifična aspekta, minimalna sekvenca bez poli-lys/Arg sekvence koja pomaže prolazak kroz ćelijsku membranu mogu uključivati P6, P5, P4, P3, P2, P1 npr. d-Bpa, d-Ser, d-Trp , d-Ser, d-Phe-2,3,4,5,6F, d-Cha (SEK ID NO: 101); i d-Tyr , d-Ser, d-Pro, d-Trp, d-Ser, d-Phe-2,3,4,5,6F, d-Cha (SEK ID NO: 102). U dva dodatna posebna rešenja, minimalna sekvenca bez poli-lys/arg sekvence koja pomaže prolaz kroz ćelijsku membranu uključuje, na primer, d-Bpa, d-Cys , d-Trp, d- Ser, d-Phe-2,3 , 4,5,6F, d-Cha, d-Cys (SEK ID NO: 103); i d-Tyr , d-Cys , d-Pro, d-Trp, d-Ser, d-Phe-2,3,4,5,6F, d-Cha, d-Cys (SEK ID NO: 104); Ove Cys rezidue su po izboru ciklizovane.

[0048] Kao što je diskutovano, ovde opisana jedinjenja samostalno ima ju anti-proliferativnu aktivnost ili aktivnost ukidanja G2. Anti-proliferativna aktivnost se može povećati kombinovanjem ovde opisanih jedinjenja sa tretmanima koji direktno ili indirektno o štećuju nukleinsku kiselinu. Anti-proliferativna aktivnost se takođe može povećati kombinovanjem jedinjenja koja su ovde opisana sa tretmanima koji inhibiraju proliferaciju ćelija bez obzira da li ti tretmani oštećuju nukleinsku kiselinu. Ovo otkriće stoga dalje obezbeđuje kompozicije koje uključuju ovde opisano jedinjenje (npr. peptid ili peptidomimeti čku sekvencu) i agens koji oštećuje nukleinsku kiselinu, i kompozicije koje uključuju ovde opisano jedinjenje (npr, peptid ili peptidomimetičku sekvencu) i anti-proliferativni agens.

[0049] Kako se ovde koristi, termini "ukidaju G2 kontrolne tačke ćelijskog ciklusa", "deaktiviraju G2 kontrolnu tačku ćelijskog ciklusa", "narušavaju G2 kontrolnu tačku ćelijskog ciklusa" i njihove gramatičke varijacije, podrazumevaju inhibiranje ć elije da zadrži ć elijski ciklus u kontrolnoj tački G2. Ć elija u kojoj je ukinuta G2 kontrolna tačka ć elijskog ciklusa pokazuje skraćenje vremena u kome je ć elija u kontrolnoj tački G2, koje se može kretati od izostanka G2 kontrolne tačke do toga da G2 kontrolna tačka ima kraće trajanje u minutima, satima, danima, nedeljama ili duže pod odgovarajuć im uslovima. Prema tome, ć elija koja je u kontaktu sa ovde opisanim jedinjenjem ima krać e vreme kontrolne tačke G2 nego što bi ć elija normalno imala u odsustvu jedinjenja. Na primer, skraćenje dužine trajanja kontrolne tačke G2 bi značilo dać elija koja je u G2 određeno vreme, npr. 4 sata, kada je u kontaktu sa ovde opisanim jedinjenjem, u G2 ima manje od 4 sata, npr. 3.5, 3, 2.5, 2, 1 ili manje sati.

[0050] Kako se ovde koristi, termin "apoptoza" se odnosi na programiranu ćelijsku smrt, i sa njom povezane promene u ćelijskoj fiziologiji, npr. fragmentacija nukleinskih kiselina, aktivacija kaspaze itd. što je poznato u struci. Termin "katastrofa" označava ćelijsku smrt kao posledicu greške u procesu mitoze. U katastrofi, postoji nekoliko karakteristika koje su prisutne, koje su karakteristike apoptoze npr. aktivacija kaspaze, kondenzacija hromozoma, itd.

[0051] Kako se ovde koriste, termini "peptid", "polipeptid" i "protein" se koriste naizmeni čno i odnose se na dve ili više aminokiselina kovalentno vezanih preko amidne veze ili ne-amidnog ekvivalenta. Ovde opisani peptidi mogu biti bilo koje dužine. Na primer, peptidi mogu imati od oko 5 do 100 ili više rezidua, kao što je, 5 do 12, 12 do 15, 15 do 18, 18 do 25, 25 do 50, 50 do 75, 75 do 100, ili više u dužini. Peptidi koji su ovde opisani uključuju 1- i d-izomere, i kombinacije 1- i d-izomera. Peptidi mogu uključivati promene obično povezane sa post-translacionom obradom proteina, na primer, ciklizaciju (npr. disulfidne ili amidne veze), fosforilaciju, glikozilaciju, karboksilaciju, ubikvitinaciju miristilaciju ili lipidaciju.

[0052] Ovde otkriveni peptidi dalje obuhvataju jedinjenja koja imaju aminokiselinske strukturne i funkcionalne analoge, na primer, peptidomimetici imaju sinteti čke ili ne-prirodne amino kiseline ili aminokiselinske analoge, sve dok mimetik ima jednu ili više funkcija ili aktivnosti. Jedinjenja koja su ovde opisana stoga uključuju "mimetičke" i "peptidomimetičke" oblike.

[0053] Kako se ovde koristi, termini "mimetik" i "peptidomimetik" se odnosi na sinteti čko hemijsko jedinjenje koje ima suštinski iste strukturne i/ili funkcionalne karakteristike peptida koji su ovde opisani. Mimetik mo že u potpunosti biti sastavljen od sintetičkih, ne-prirodnih amino kiselinskih analoga, ili može biti himerni molekul koji uključuje jednu ili više prirodnih peptidnih amino kiselina i jedan ili vi še ne-prirodnih amino kiselinskih analoga. Mimetik takođe može uključivati bilo koji broj prirodnih amino kiselinskih konzervativnih supstitucija sve dok takve supstitucije ne uništavaju aktivnost mimetika. Kao i kod ovde opisanih polipeptida koji su konzervativne varijante, rutinsko testiranje se može koristiti za utvrđivanje da li mimetik ima neophodnu aktivnost, npr. da ima detektabilnu aktivnost ukidanja G2 kontrolne tačke ćelijskog ciklusa. Kada se administira subjektu ili kontaktira sa ćelijom, mimetik koji primetno deaktivira G2 kontrolnu tačku ćelijskog ciklusa će stoga imati aktivnost ukidanja G2 kontrolne tačke.

[0054] Kompozicije peptidnih mimetika mogu da sadrže bilo koju kombinaciju ne-prirodnih strukturnih komponenti koje su obično iz tri strukturne grupe: a) grupe za vezivanje rezidua osim prirodnih amidnih veza ("peptidna veza") za vezivanje; b) ne-prirodne rezidue umesto prirodnih aminokiselinskih rezidua; ili c) rezidue koje indukuju mimikriju sekundarne strukture, tj. indukuju ili stabilizuju sekundarnu strukturu, na primer, beta okret, gama okret, beta ravan, alfa heliks konformacija, i slično. Na primer, polipeptid se može okarakterisati kao mimetik kada su jedna ili više rezidua povezane hemijskim sredstvima osim amidne veze. Pojedinačne peptidomimetičke rezidue mogu biti povezane amidnim vezama, ne-prirodnim i ne-amidnim hemijskim vezama drugim hemijskim vezama ili sredstvima za povezivanje, uključujući, na primer, glutaraldehid, N-hidroksisukcinimidne estre, bifunkcionalne maleimide, N,N'-dicikloheksilkarbo diimid (DCC) ili N, N'-diizopropilkarbodiimid (DIC). Vezujuće grupe koje su alternativa amidnim vezama uključuju, na primer, ketometilen (npr -C(=O)-CH2- za -C(=O)-NH-), aminometilen (CH-NH2), etilen, olefin (CH=CH), etar (CH2-O), tioetar (CH2-S), tetrazol (CN4-), tiazol, retroamid, tioamid, ili estar (vidi npr. Spatola (1983) in Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides and Proteins, Vol. 7, pp 267-357, "Peptide and Backbone Modifications," Marcel Decker, NY).

[0055] Kao što je diskutovano, peptid može biti karakterisan kao mimetik po tome što sadrži jednu ili više neprirodnih rezidua umesto prirodne aminokiselinske rezidue. Ne-prirodne rezidue su poznate u tehnici. Posebni ne-ograničavajući primeri ne-prirodnih rezidua korisnih kao mimetici prirodnih amino kiselinskih rezidua su mimetici aromatičnih aminokiselina koji uključuju, na primer, D- ili L- nafilalanin; D- ili L-fenilglicin; D- ili L-2 tieneilalanin; D- ili L-1, -2, 3-, ili 4-pirenilalanin; D- ili L-3 tienilalanin; D- ili L- (2-piridinil)alanin; D- ili L-(3-piridinil)alanin; D- ili L- (2-pirazinil)alanin; D- ili L-(4-izopropil)fenilglicin; D-(trifluorometil)fenilglicin; d-(trifluorometil)-fenil-alanin; D-p-fluoro-fenilalanin; D- ili L-p-bifenilfenilalanin; K- ili L-p-metoksibifenilfenilalanin; d- ili L-2-indol(alkil) alanini; i D- ili L-alkilaininil, pri čemu alkil može biti supstituisani ili nesupstituisani metil, etil, propil, heksil, butil, pentil, izopropil, izo-butil, sek-izotil, izo-pentil, ili ne-kisela amino kiselina. Aromatični prstenovi ne-prirodne amino kiseline koji se mogu koristiti umesto prirodnih aromatičnih prstenova uključuju, na primer, tiazolil, tiofenil, pirazolil, benzimidazolil, naftil, furanil, pirolil i piridil aromatične prstenove.

[0056] Mimetici kiselih aminokiselina mogu biti generisani supstitucijom sa ne-karboksilatnim aminokiselinama uz održavanje negativnog naboja; (fosfono)alanin; i sulfatirani treonin. Karboksilne bo čne grupe (npr aspartil ili glutamil) takođe mogu biti selektivno modifikovane reakcijom sa karbodiimidima (R'-NCN-R') uključujući, na primer, 1-cikloheksil-3(2-morfolinil-(4-etil)karbodiimid ili 1-etil-3(4-azonia-4,4-dimetolpentil)karbodiimid. Aspartil ili glutamil grupe takođe mogu biti konvertovane u asparaginil i glutaminil grupe reakcijom sa amonijum jonima.

[0057] Mimetici baznih aminokiselina mogu biti generisani supstitucijom na primer, pored lizina i arginina, sa amino kiselinama ornitin, citrulin, ili (guanidino)sirćetne kiseline, ili (guanidino)alkil-sirćetne kiseline, gde alkil može biti supstituisana ili nesupstituisana metil, etil, propil, heksil, butil, pentil, izopropil, izo-butil, secizotil, izo-pentil, ili ne-kisela amino kiselina. Nitril derivat (npr. sadr ži CN-radikal umesto COOH) može biti zamenjen asparaginom i glutaminom. Asparaginil i glutaminil rezidue mogu biti deaminovane u odgovaraju će aspartil i glutamil rezidue.

[0058] Arginin mimetici se mogu generisati reakcijom arginila sa jednim ili vi še reagenasa uključujući, na primer, fenilglioksal, 2,3-butandion, 1,2-cikloheksandion ili ninhidrin, opciono u alkalnim uslovima. Mimetici tirozin rezidua se mogu generisati reakcijom tirozila sa aromatičnim diazonijum jedinjenjima ili tetranitrometanom. N-acetilimidizol i tetranitrometan se mogu koristiti za formiranje O-acetil tirozil vrsta i 3-nitro derivata, respektivno.

[0059] Mimetici lizina mogu biti generisani (i amino terminalne rezidue se mogu menjati) reagovanjem lizinila sa anhidridima ćilibarne ili drugih karboksilnih kiselina. Lizinski i drugi mimetici koji sadrže alfa-amino-rezidue takođe mogu biti generisani reakcijom sa imidoestrima, kao što su metil pikolinimidat, piridoksalfosfat, piridoksal, hloroborohidrid, trinitrobenzensulfonska kiselina, O-metilizourea, 2,4,pentandion i transamidazomkatalizovane reakcije sa glioksilatom.

[0060] Metioninski mimetici mogu biti generisani reakcijom sa metionin sulfoksidom. Prolinski mimetici uključuju, na primer, pipekolinsku kiselinu, tiazolidin karboksilnu kiselinu, 3- ili 4-hidroksi prolin, dehidroprolin, 3- ili 4-metilprolin i 3,3,-dimetilprolin. Histidinski mimetici mogu biti generisani reakcijom histidila sa dietilprokarbonatom ili para bromofenacil bromidom. Ostali mimetici uklju čuju, na primer, one generisane hidroksilacijom prolina i lizina; fosforilacijom hidroksilnih grupa seril ili treonil rezidua; metilacijom alfa-amino grupa lizina, arginina i histidina; acetilacijom N-terminalnog amina; metilacijom glavnih lanca amidnih rezidua ili supstitucijom N-metil amino kiselina; ili amidacijom C-terminalnih karboksilnih grupa.

[0061] Jedna ili više rezidua takođe može biti zamenjena amino kiselinom (ili peptidomimetičkom reziduom) suprotne hiralnosti. Prema tome, bilo koja amino kiselina koja se prirodno javlja u L-konfiguraciji (koja se takođe može nazvati R ili S, u zavisnosti od strukture hemijskog entiteta) može biti zamenjena sa istom amino kiselinom ili mimetikom, ali suprotne hiralnosti, koja se naziva D- amino kiselina, ali koja mo že dodatno biti označena kao R- ili S- oblik.

[0062] Ovde opisani peptidi i peptidomimetici zatim sadrže modifikovane oblike sekvenci koje su ovde navedene, pod uslovom da modifikovani oblik zadržava najmanje deo, funkcija nemodifikovanog ili referentnog peptida ili peptido-mimetika. Na primer, modifikovani peptid ili peptidomimetik će zadržati barem deo aktivnosti proliferativne inhibicije ili ukidanje G2, ali može imati povećanu ili smanjenu aktivnost inhibiranja proliferacije ili G2 ukidanja u odnosu na referentni peptid ili peptidomimetik.

[0063] Modifikovani peptidi i peptidomimetici mogu imati jednu ili vi še amino kiselinskih rezidua supstituisanih sa drugom reziduom, dodatih sekvenci ili izbrisanih iz sekvence. Modifikovani peptid ili peptidomimetik mogu imati jednu ili više aminokiselinskih supstitucija, adicija ili delecija (npr, 1-3, 3-5, 5-10 ili više). U jednom aspektu, supstitucija je sa aminokiselinom ili mimetikom čiji bočni lanac zauzima prostor sličan referentnoj aminokiselini ili mimetiku (amino kiselina ili mimetik koji se supstitui še). U još jednom aspektu, supstitucija sa ne-humanom amino kiselinom koja je strukturno slična humanoj rezidui. U posebnom aspektu, supstitucija je konzervativna amino kiselinska supstitucija.

[0064] Kako se ovde koristi, termin "sličan prostor" označava hemijsku grupu koja zauzima trodimenzionalni prostor sličan po veličini sa referentnom grupom. Tipično, grupa koja zauzima sličan prostor će biti slična po veličini sa referentnom grupom. Aminokiselina ili mimetik koji „zauzima prostor sličan bočnom lancu“ ima bočni lanac koji zauzima trodimenzionalni prostor slične veličine kao referentna aminokiselina ili mimetik. Specifični primeri za d-(Phe-2,3,4,5,6-F), 1-(Phe-2,3,4,5,6-F), d-(Phe-3,4,5F), 1-(Phe-3,4,5F), d-(Phe-4CF3) ili 1-(Phe-4CF3), su (1 ili d-Phe-2R1,3R2, 4R3,5R4,6R5) gde R1, R2, R3, R4, R5 mogu da budu hlorid, bromid, fluorid, jodid, vodonik, oksid vodonika ili ništa. Za male molekule, na primer, fluorid veličine oko 1 Angstrem, sličan prostor može biti odsustvo neke grupe.

[0065] Izraz "konzervativna supstitucija" označava zamenu jedne aminokiseline biološkom, hemijskom ili strukturno sličnom reziduom. Biološki slična znači da je supstitucija kompatibilna sa biološkom aktivnošć u, npr., anti-proliferativna ć elijska ili aktivnost ukidanja G2. Strukturno sli čna znači da aminokiseline imaju bočne lance slične dužine, kao što su alanin, glicin i serin, ili imaju sličnu veličinu. Hemijska sličnost znači da rezidue imaju isto naelektrisanje ili su obe hidrofilne ili hidrofobne. Konkretni primeri uklju čuju zamenu jedne hidrofobne rezidue, kao što su izoleucin, valin, leucin ili metionin drugim ili zamenu jedne polarne rezidue drugom, kao što je supstitucija arginina lizinom, glutaminske sa asparaginskom kiselinom, ili glutamina sa asparaginom, serina sa treoninom i slično.

[0066] Peptidi i peptidomimetici koji su ovde opisani, prema tome, uklju čuju peptide i peptidomimetike koji imaju sekvencu koja nije identična sa sekvencom peptidnih i peptidomimetičkih sekvenci navedenih u Tabeli 1. Peptid ili peptidomimetik može imati sekvencu koja ima 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ili više identiteta sa sekvencom datom u Tabeli 1. U jednom aspektu, taj identitet je u definisanoj oblasti sekvence, npr, amino ili karboksi terminalnih 3-5 rezidua.

[0067] Jedinjenja koja su ovde opisana, uključuju peptide i peptidomimetike koji se mogu proizvesti i izolovati korišćenjem bilo kog postupka koji je poznat u struci. Peptidi mogu biti sintetisani, potpuno ili delimično, korišćenjem hemijskih postupaka koji su poznati u struci (videti, npr. Caruthers (1980) Nucleic Acids Res. Symp. Ser. 215-223; Horn (1980) Nucleic Acids Res. Symp. Ser. 225-232; i Banga, A.K., Therapeutic Peptides and Proteins, Formulation, Processing and Delivery Systems (1995) Technomic Publishing Co., Lancaster, PA). Sinteza peptida se može izvesti korišćenjem različitih tehnika čvrste faze (vidi, npr. Roberge (1995) Science 269:202; Merrifield (1997) Methods Enzymol. 289:3-13), a automatizovana sinteza se može postići, na primer, upotrebom ABI 431A Peptide Sinthesizer (Perkin Elmer) u skladu sa uputstvima proizvođača.

[0068] Individualne sintetičke rezidue i polipeptidi koji sadrže inkorporirane mimetike mogu biti sintetisane korišćenjem različitih postupaka i metodologijama koje su poznate u struci (vidi, npr. Organic Syntheses Collective Volumes, Gilman, et al. (Eds) John Wiley&Sons, Inc., NY). Peptidi i peptidni mimetici mogu biti sintetisani korišćenjem kombinovanih metodologija. Tehnike za generisanje peptidnih i peptidomimeti čkih biblioteka su dobro poznate, i uključuju, na primer, multipin, tea bag, i tehnike split-couple-mix (vidi, npr. al-Obeidi (1998) Mol. Biotechnol. 9:205-223; Hruby (1997) Curr. Opin. Chem. Biol. 1:114-119; Ostergaard (1997) Mol. Divers. 3:17-27; i Ostresh (1996) Methods Enzymol. 267:220-234). Modifikovani peptidi se mogu dalje proizvesti i metodama hemijske modifikacije (videti, na primer, Belousov (1997) Nucleic Acids Res. 25:3440-3444; Frenkel (1995) Free Radic. Biol. Med. 19:373-380; i Blommers (1994) Biochemistry 33:7886-7896).

[0069] Peptidi takođe mogu biti sintetizovani i eksprimirani kao fuzioni proteini sa jednim ili vi še dodatnih domena povezanih sa njima za proizvodnju više imunogenog peptida, da se lakše izoluje rekombinantno sintetisani peptid, ili da se identifikuju i izoluju antitela ili B ćelije koje eksprimiraju antitela. Domeni koji omogućavaju detekciju i prečišćavanje uključuju, na primer, metal helirajuće peptide kao što su polihistidinski traktovi i histidin-triptofan moduli koji omogućavaju prečišćavanje na imobilisanim metalima; domene proteina A koji omogućavaju prečišćavanje na imobilisanom imunoglobulinu; i domen korišćen u FLAGS extension/afinitetnom sistemu prečišćavanja (Immunex Corp, Seattle WA). Uključivanje linkerske sekvence koja se može cepati kao što su faktor Xa ili enterokinaza (Invitrogen, San Diego CA) između domena za prečišćavanje i peptida se može koristiti za olakšavanje prečišćavanja peptida. Na primer, ekspresioni vektor može da uključuje sekvencu nukleinskih kiselina koja kodira peptid povezan sa šest histidinskih rezidua praćenih tioredoksinom i mestom cepanja enterokinaze (vidi npr. Williams (1995) Biochemistry 34:1787-1797; Dobeli (1998) Protein Expr. Purif. 12:404-14). Histidinske rezidue olakšavaju detekciju i prečišćavanje fuzionog proteina dok mesto cepanja enterokinaze obezbeđuje sredstva za prečišćavanje peptida iz ostatka fuzionog proteina. Tehnologija koja se odnosi na vektore koji kodiraju fuzione proteine i primena fuzionih proteina su poznate u struci (vidi npr. Kroll (1993) DNA Cell. Biol., 12: 441-53.).

[0070] Ovde su takođe opisane nukleinske kiseline koje kodiraju peptide koji su ovde opisani. Nukleinske kiseline mogu kodirati ovde opisane peptidne sekvence koje imaju du žinu od oko 8 do 12, 12 do 15, 15 do 18, 15 do 20, 18 do 25, 20 do 25, 25 do 35, 25 do 50 ili 50 do 100 amino kiselina ili više u dužini.

[0071] Izrazi "nukleinska kiselina" i "polinukleotid" su ovde korišćeni naizmenično da označe sve oblike nukleinske kiseline, uključujući dezoksiribonukleinsku kiselinu (DNK) i ribonukleinsku kiselinu (RNK). Nukleinske kiseline mogu biti dvostruke, sa jednim lancem ili trostruke, linearne ili cirkularne. Nukleinske kiseline uključuju genomsku DNK, cDNK, i antisens. RNK nukleinska kiselina može biti splajsovana i ne splajsovana iRNK, rRNK, tRNK ili antisens (npr RNKi). Nukleinske kiseline koje su ovde opisane uklju čuju prirodne, sintetičke, kao i nukleotidne analoge i derivate. Tako izmjenjeni ili modifikovani polinukleotidi obuhvataju analoge koji obezbeđuju otpornost na nukleazu, na primer. Dužine nukleinskih kiselina mogu biti manje od prikazanih peptidnih sekvenci. Na primer, podsekvenca bilo koje od peptidnih sekvenci mo že da kodira peptid koji ima anti-proliferativnu ili aktivnost ukidanja G2.

[0072] Nukleinske kiseline se mogu proizvesti korišćenjem bilo koje od velikog broja poznatih standardnih metoda kloniranja i hemijske sinteze i namerno se mogu menjati mutagenezom usmerenom na mesto ili drugim rekombinantnim tehnikama poznatim stručnjacima u tehnici. Čistoća polinukleotida se može utvrditi sekvenciranjem, gel elektroforezom i slično.

[0073] Nukleinske kiseline koje su ovde opisane mogu biti umetnute u konstrukt nukleinske kiseline u kojem je ekspresija nukleinske kiseline pod uticajem ili je reguliše "ekspresioni kontrolni element" kombinacija koja se naziva i "ekspresionom kasetom." Termin "ekspresioni kontrolni element" označava jedan ili više elemenata sekvence koji reguliše ili utiče na ekspresiju sekvence nukleinske kiseline sa kojom je operativno povezan. Ekspresioni kontrolni element operativno povezan sa sekvencom nukleinske kiseline kontroli še transkripciju i, po potrebi, translaciju sekvence nukleinske kiseline.

[0074] Termin "operativno vezan" označava funkcionalnu jukstapoziciju u kojoj su tako opisane komponente u odnosu koji im dozvoljava da funkcionišu na njima svojstven način. Tipično ekspresioni kontrolni elementi su jukstaponirani na 5' ili na 3' krajevima gena, ali takođe mogu biti intronični. Promoteri su generalno pozicionirani na 5' kodirajuće sekvence. "Promoter" označava minimalni element sekvence koja je dovoljan da usmeri transkripciju.

[0075] Elementi za kontrolu ekspresije uključuju promotere, pojačivače, transkripcione terminatore, prigušivače gena, start kodon (npr. ATG) ispred gena koji kodiraju protein. Elementi za kontrolu ekspresije aktiviraju konstitutivnu transkripciju, inducibilnu transkripciju (t.j. zahtevaju spoljni signal za aktivaciju), ili derepresira transkripciju (t.j. signal prekida transkripciju; uklanja signal koji aktivira transkripciju). Ekspresione kasete takođe mogu da sadrže kontrolne elemente koji su dovoljni da omoguć e kontrolu ekspresije gena za specifičneć elijske tipove ili tkiva (tj. kontrolne elemente specifične za tkivo).

[0076] Ovde opisane nukleinske kiseline mogu biti umetnute u plazmid za propagaciju u ć eliju doma ć ina i za naknadnu genetsku manipulaciju. Plazmid je nukleinska kiselina koja se može stabilno razmnožavati u ć eliji domać inu; plazmidi po izboru sadrže elemente za kontrolu ekspresije da bi pokrenuli ekspresiju nukleinske kiseline koja kodira peptid u ć eliji doma ć inu. Izraz "vektor" se ovde koristi sinonimno sa plazmidom i mo že takođe da uključi element za kontrolu ekspresije u ć eliji doma ć inu. Plazmidi i vektori obično sadrže najmanje početak replikacije za razmnožavanje u ć eliji i promoter. Prema tome, plazmidi i vektori su korisni za genetsku manipulaciju peptida koji kodira nukleinske kiseline, za produkciju peptida i za ekspresiju peptida, na primer, u ć elijama doma ć inima ili u celim organizmima.

[0077] Prema tome, peptidi mogu biti eksprimirani u bakterijskim sistemima kori šćenjem konstitutivnnih promotera, kao što je T7 ili inducibilnih promotera kao što je pL bakteriofag λ, plac, ptrp, ptac (ptrp-lac hibridni promoter); u sistemima kvasaca koji koriste konstitutivne promotere kao što su ADH ili LEU2 ili inducibilnog promotera kao što je GAL (vidi npr. Ausubel et al., In: Current Protocols in Molecular Biology, Vol 2, Ch 13, ed., Greene Publish. Assoc. & Wiley Interscience, 1988; Grant et al. Methods in Enzymology, 153:516 (1987), eds. Wu & Grossman; Bitter Methods in Enzymology, 152:673 (1987), eds. Berger & Kimmel, Acad. Press, N.Y.; i Strathern et al., The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces (1982) eds. Cold Spring Harbor Press, Vols. I i II; R. Rothstein In: DNA Cloning, A Practical Approach, Vol.11, Ch. 3, ed. D.M. Glover, IRL Press, Wash., D.C., 1986); u sistemima ćelija insekata upotrebom konstitutivnih ili inducibilnih promotera kao što je ekdizon; i u sistemima ćelija sisara korišćenjem konstitutivnih promotera kao što su SV40, RSV ili inducibilnih promotera izvedenih iz genoma ćelija sisara kao što su metalotionein IIA promoter, heat shock promoter, ili izvedenih iz virusa sisara, kao što je adenovirus kasni promoter ili inducibilni virus mišjeg tumora dojke sa dugim terminalnim ponovcima. Peptidni ekspresioni sistemi dalje uklju čuju vektore namenjene za in vivo upotrebu uključujući adenovirusne vektore (US Patent br. 5,700,470 i 5,731,172), adenoasocirane vektore (US Patent No. 5,604,090), herpes simpleks virusne vektore (US Patent Br. 5,501,979) i retrovirusne vektore (US Patent br. 5.624.820, 5.693.508 i 5.674.703 i WIPO publikacija WO92/05266 i WO92/14829). Goveđi papiloma virus (BPV) se takođe koristi u genskoj terapiji (US Patent br 5,719,054). Takvi vektori za gensku terapiju obuhvataju vektore na bazi CMV (US Patent Br. 5,561,063).

[0078] Ovaj pronalazak zbog toga obezbeđuje nukleinske kiseline koje kodiraju ovde opisane peptide umetnute u ćelije domaćina. Ćelija domaćin može biti prokariotska ćelija. Takođe, ćelija domaćin može biti eukariotska ćelija. U različitim aspektima, eukariotska ćelija je kvasac ili ćelija sisara (npr. čovek, primat, itd.).

[0079] Kako se ovde koristi, "ćelija domaćin" je ćelija u koju se uvodi nukleinska kiselina koja može da se razmnožava, transkribuje, ili eksprimiran kodirani peptid. Pojam takođe obuhvata bilo koje potomstvo predmetne ćelije domaćina.

[0080] Ćelije domaćini uključuju, ali nisu ograničeni na mikroorganizme kao što su bakterije ili kvasci; i ćelije biljaka, insekata i sisara. Obezbeđene su na primer: bakterije transformisane rekombinantnom nukleinskom kiselinom bakteriofaga, ekspresioni vektori nukleinskih kiselina plazmida ili nukleinskih kiselina kozmida; kvasac transformisan sa rekombinantnim ekspresionim vektorima kvasca; sistemi ćelija biljaka inficirani sa rekombinantnim virusnim ekspresionim vektorima (npr. virus mozaika karfiola, CaMV; virus mozaika duvana, TMV) ili transformisani sa rekombinantnim ekspresionim plazmidnim vektorima (npr. Ti plazmid); sistemi ćelija insekata inficirani rekombinantnim virusnim ekspresionim vektorima (npr. bakulovirus); ili sistemi životinjskih ćelija inficirani sa rekombinantnim ekspresionim vektorima virusa (npr, retrovirusi, adenovirus, vakcinija virus), ili transformisani sistemi životinjskih ćelija konstruisani za stabilnu ekspresiju,.

[0081] Ekspresioni vektor takođe može sadržati nukleinsku kiselinu koja kodira selektivni marker koji obezbeđuje rezistenciju na selektivni pritisak ili marker koji se može identifikovati (npr. β-galaktosidaza), omogućavajući da ćelije koje imaju vektor budu identifikovane, gajene i pro širene. Alternativno, selektabilni marker može biti na drugom vektoru koji se ko-transfektuje u ćeliju domaćina sa prvim vektorom koji sadrži ovde opisani polinukleotid. Veliki broj sistema selekcije se može koristiti, uključujući, ali ne ograničavajući se na gen herpes simpleks virus timidin kinaze (Wigler et al., Cell 11:223 (1977)), hipoksantin-guanin fosforiboziltransferaza gen (Szybalska et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48:2026 (1962)), i adenin fosforiboziltransferaza (Lovi et al., Cell 22:817 (1980)) geni se mogu primeniti u tk-, hgprt-oraprt-ćelijama respektivno. Antimetabolitska rezistencija se može koristiti kao baza za selekciju dhfr, koja daje rezistenciju na metotreksat (O'Hare et al., USA 78 Proc. Natl. Acad. Sci. 1527 (1981)); gpt gen koji daje rezistenciju na mikofenolnu kiselinu (Mulligan et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2072 (1981)); neomicin gen, koji daje rezistenciju na aminoglikozid G-418 (Colberre-Garapin et al., J. Mol. Biol. 150:1(1981)); i higromicin gen koji donosi rezistenciju na higromicin (Santerre et al., Gene 30:147 (1984)). Dodatni selektabilni geni obuhvataju trpB, koji omogućava ćelijama da koriste indol umesto triptofana; hisD, koji omogućava ćelijama da koriste histinol umesto histidina (Hartman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:8047 (1988)); i ODC (ornitin dekarboksilaza), koji daje rezistenciju na ornitin inhibitor dekarboksilaze, 2-(difluorometil)-DL-ornitin, DFMO (McConlogue (1987) In: Current Communications in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory).

[0082] Kako se ovde koriste, termini "tretman koji oštećuje nukleinsku kiselinu" i "agensi koji oštećuju nukleinsku kiselinu" označava bilo koji način lečenja koji direktno ili indirektno oštećuje nukleinsku kiselinu (npr. DNK, cDNK, genomsku DNK, iRNK, tRNK ili rRNK). Specifični primeri takvih agensa uključuju agense za alkilovanje, nitrozouree, anti-metabolite, biljne alkaloide, biljne ekstrakte i radioizotope. Specifi čni primeri agenasa uključuju lekove koji oštećuju nukleinsku kiselinu, na primer, 5-fluorouracil (5-FU), kapecitabin, S-1 (Tegafur, 5-hloro-2,4-dihidroksipiridin i oksonsku kiselinu), 5-etiniluracil, arabinozil citozin (ara-C), 5-azacitidin (5-AC), 2', 2'-difluoro-2'-deoksicitidin (dFdC), antimetabolite purina (mercaptopurin, azatiopurin, tioguanin), gemcitabin hidrohlorid (Gemzar), pentostatin, alopurinol, 2-fluoro-arabinosil-adenin (2F-ara-A), hidroksiureu, sumporni senf (bishloroetihilsulfid), mehloretamin, melfalan, hlorambucil, ciklofosfamid, ifosfamid, tiotepa, AZK, mitomicin C, dianhidrogalaktitol, dibromoducitol, alkil sulfonat (busulfan), nitrozouree (BCNU, CCNU, 4-metil CCNU ili ACNU), prokarbazin, dekarbazin, rebekamicin, antraciklin poput doksorubicin (adriamicin, ADR), daunorubibcin (Cerubicin), idarubicin (Idamicin) i epirubicin (Ellence), antraciklin analoge kao što je mitoksantron, aktinimicin D, inhibitore ne interkaliraju će topoizomeraze kao što su epipodofilotoksini (etopozid = VP16, tenipozid = VM-26), podofilotoksin, bleomicin (Bleo), pepleomicin, jedinjenja koja formiraju adukte sa nukleinskom kiselinom uključujući derivate platine (npr. cisplatin (CDDP), trans analogni cisplatin, karbo platin, iproplatin, tetraplatin i oksaliplatin), kamptotecin, topotekan, irinotekan (CPT-11), i SN-38. Specifični primeri tretmana koji oštećuju nukleinske kiseline uključuju zračenja (npr. ultravioletno (UV), infracrveno (IR), ili alfa-, beta- ili gama- zračenje) i ekološki šok (npr. hipertermija).

[0083] Kako se ovde koriste, termini "anti-proliferativni tretman" i "anti-proliferativni agens" ozna čava bilo koji režim tretmana koji direktno ili indirektno inhibira proliferaciju ćelija, virusa, bakterija ili drugih jednoćelijskih ili višećelijskih organizama bez obzira na to da li tretman ili agens oštećuje nukleinsku kiselinu. Posebni primeri anti-proliferativnih agensa su anti-tumorski i anti-virusni lekovi, koji inhibiraju proliferaciju ćelija ili proliferaciju ili replikaciju virusa. Specifični primeri uključuju, inter alia, ciklofosfamid, azatioprin, ciklosporin A, prednizolon, melfalan, hlorambucil, mehloretamin, busulfan, metotreksat, 6-merkaptopurin, tioguanin, citozin arabinozid, taksol, vinblastin, vinkristin, doksorubicin, aktinomicin D, mitramicin, karmustin, lomustin, semustin, streptozotocin, hidroksidureu, cisplatin, mitotan, prokarbazin, dakarbazin i dibromomannitol, anti proliferativne agense koji izazivaju gre ške replikacije nukleinske kiseline ili inhibiraju replikaciju nukleinske kiseline poput nukleozidnih i nukleotidnih analoga (npr. AZT ili 5-AZC).

[0084] Ovde opisani peptidi i peptidomimetici mogu da povećaju anti-proliferativnu aktivnost agensa za stabilizaciju ili destabilizaciju mikrotubula kao što su vinka alkaloidi (vinblastin=VLB, vinkristin= VCR, vinorelbin=VRLB, vinflunin=VFL), i taksani (paklitaksel i docetaksel=takotare). Prema tome, takva sredstva mogu biti dalje uključena u kompozicije koje su ovde opisane i korišćene u postupcima koji su ovde opisani.

[0085] Ćelije koje se mogu tretirati sa jedinjenjima koja su ovde opisana obuhvataju bilo koju ćeliju čiju proliferaciju je poželjno usporiti ili sprečiti in vitro, ex vivo ili in vivo. Posebne ciljne ć elije pokazuju kra ć e trajanje G1 kontrolne tačke nego kod normalnog ć elijskog ciklusa ili imaju ošte ć enu G1 kontrolnu tačku ć elijskog ciklusa tako da ć elije napuštaju kontrolnu tačku G1 pre nego što prođe dovoljno vremena da se završi reparacija nukleinske kiseline. Ćelije kandidati stoga uključuju ćelije koje se brzo razmnožavaju bilo da su ćelije normalne ili abnormalne. Specifični primeri su benigne ili tumorske, metastatske ili ne-metastatske ćelije. Dodatne ćelije kandidati mogu biti identifikovane na osnovu merenja njihove stope proliferacije ili dužine vremena tokom kojeg ćelije ostaju u fazi G1. Ćelije kandidati mogu takođe biti identifikovane kontaktiranjem test ćelije sa ovde opisanim jedinjenjem samim, ili u kombinaciji sa tretmanom koji o štećuje nukleinsku kiselinu, i utvrđivanjem da li kontaktirane ćelije pokazuju smanjenu proliferaciju ili povećanu ćelijsku smrt ili apoptozu/ katastrofu.

[0086] Ovde opisana jedinjenja su prema tome korisna za inhibiciju ćelijske proliferacije in vitro, ex vivo i in vivo. Kao takvi, subjekti koji imaju ili su pod rizikom od poremećaja ili fiziološkog stanja koje karakteriše abnormalna ili neželjena ili proliferacija nepoželjnih ćelija ili preživljavanje ćelija, ili abnormalna ili deficijentna ćelijska diferencijacija, mogu biti tretirani sa ovde opisanim jedinjenjem samim ili u kombinaciji sa tretmanom koji direktno ili indirektno uzrokuje oštećenje nukleinske kiseline ili anti-proliferativnim tretmanom.

[0087] Tako, u skladu sa ovim otkrićem, obezbeđene su metode za inhibiranje proliferacije ćelija, metode za povećanje senzitivnosti ćelije na agense ili tretmane koji oštećuju nukleinsku kiselinu i metode za povećanje oštećenja nukleinske kiseline u ćeliji in vitro, ex vivo i in vivo. Postupak može uključivati dovođenje u kontakt ćelije (npr. kultivisana ćelija ili ćelija prisutna u subjektu) sa količinom ovde opisanog peptida ili peptidomimetika koja je dovoljna da inhibira proliferaciju ćelije. Takođe, postupak može uključivati dovođenje u kontakt ćelije sa količinom ovde opisanog peptida ili peptidomimetika koja je dovoljna da pove ća senzitivnost ćelije na agens ili tretman koji oštećuje nukleinsku kiselinu. Osim toga, postupak može uključivati kontaktiranje ćelije sa količinom ovde opisanog peptida ili peptidomimetika koja je dovoljna da pove ća oštećenje nukleinske kiseline u ćeliji. U različitim aspektima, postupak dalje obuhvata kontaktiranje ćelije sa agensom koji oštećuje nukleinsku kiselinu ili izlaganje ćelije tretmanu za oštećenje nukleinske kiseline.

[0088] Dalje su dati postupci za tretiranje poremećaja ćelijske proliferacije ili diferencijacije kod subjekta, uključujući stanja koja karakteriše neželjena ili proliferacija nepoželjnih ćelija ili preživljavanje ćelija, stanja koje karakteriše aberantna ili deficijentna apoptoza, stanja koje karakteri še aberantno ili deficijentno preživljavanje ćelija, kao i stanja koje karakterišu aberantna ili deficijentna diferencijacija ćelija. Postupak može da obuhvati primenu na subjektu koji ima ili je u riziku od poremećaja proliferacije ćelija, količine ovde opisanih peptida ili peptidomimetika koja je delotvorna za lečenje tog poremećaja proliferacije ćelija. U jednom aspektu, količina je dovoljna da se poboljša stanje subjekata. U određenim aspektima, poboljšanje obuhvata, bar deo ciljnih ć elija (npr. ćelija sa abnormalnom proliferacijom), smanjenu proliferaciju ćelija, smanjene brojeve ćelija, inhibiranje porasta broja ćelija, povećanje apoptoze, ili smanjeno preživljavanje. U još jednom aspektu, subjektu se administrira ovde opisano jedinjenje, pre istovremeno sa, ili posle davanja tretmana koji inhibira proliferaciju ćelija. U određenim dodatnim aspektima, bar deo ćelija ćelijskog proliferativnog poremećaja se nalazi u krvi, dojci, plućima, tiroidi, glavi ili vratu, mozgu, limfi, gastrointestinalnom traktu, genitalno-urinarnom traktu, bubregu, pankreasu, jetri, kostima, mi šićima, ili koži.

[0089] Metod može da obuhvati administriranje subjektu količine jedinjenja za lečenje čvrstog tumora. Isto tako, metod može uključivati davanje subjektu količine jedinjenja za lečenje tečnog tumora. U različitim aspektima, subjektu koji ima tumor se administrira ovde opisano jedinjenje pre, istovremeno sa ili nakon druge anti-tumorske terapije.

[0090] Kako se ovde koriste, termini "proliferativni poremećaj" i "proliferativno stanje" znače bilo koje patološko ili ne-patološko fiziološko stanje karakterisano aberantnom ili neželjenom proliferacijom (npr, ćelija, virusa, bakterija, gljivica, itd). Izrazi " poremećajćelijske proliferacije" i " stanje ćelijsko proliferacije ćelija" označavaju bilo koje patološko ili ne-patološko fiziološko stanje koje karakteriše aberantna ili neželjena ćelijska proliferacija, uključujući i stanja koja karakteriše neželjena proliferacija ili proliferacija nepoželjenih ćelija ili preživljavanje ćelija (npr. zbog deficijentne apoptoze), stanja koje karakteri še aberantna ili neželjena apoptoza, kao i stanja koje karakteriše neželjeno preživljavanje ili preživljavanje nepoželjnih ćelija. Termin "poremeć aj diferencijacije" označava svako patološko ili ne-patološko fiziološko stanje koje karakteriše aberantna ili deficijentna diferencijacija.

[0091] Poremećaji proliferacije ili diferencijacije koji se mogu lečiti uključuju oboljenja i ne-patološka fiziološka stanja, benigna i neoplastična, koja karakteriše abnormalan ili neželjeni broj ćelija, ćelijski rast ili preživljavanje ćelija. Takvi poremećaji ili stanja mogu stoga predstavljati stanje bolesti i obuhvataju sve vrste kancerogenih izraslina ili onkogenih procesa, metastatskih tkiva ili maligno transformisanih ćelija, tkiva ili organa, ili mogu biti ne-patološka, t.j. odstupanje od normalnog, ali koje nije obično povezano sa bolešću. Specifičan primer ne-patološkog stanja koje može da se tretira u skladu sa ovim otkrićem je ponovni rast tkiva kod zarastanja rane koji rezultira u ožiljku.

[0092] Ćelije koje sadrže poremećaj proliferacije ili diferencijacije mogu biti agregirane u ćelijsku masu ili mogu biti dispergovane. Termin "čvrsti tumor" se odnosi na neoplaziju ili metastazu koja obično agregira zajedno i formira masu. Posebni primeri uključuju visceralne tumore kao što su želudačni ili kancer debelog creva, hepatomi, venalni karcinomi, kanceri pluća i mozga. "Tečni tumor" se odnosi na neoplazije hematopoetskog sistema, kao što su limfomi, mijelomi i leukemije ili neoplazije koje su po prirodi difuzne, jer obično ne formiraju čvrstu masu. Posebni primeri leukemije obuhvataju akutnu i hroničnu limfoblastnu, mijeloblastnu i multipli mijelom.

[0093] Takvi poremećaji obuhvataju neoplazme ili kancere koji mogu uticati na gotovo svaki tip ćelija ili tkiva, npr. karcinom, sarkom, metastatske poremećaje ili hematopoetičke neoplastične poremećaje. Metastatski tumor može da nastane od mnoštva primarnih tipova tumora, uključujući, ali ne ograničavajući se na dojke, pluća, štitnu žlezdu, glavu i vrat, mozak, limfoide, gastrointestinalni trakt (usta, jednjak, želudac, tanko crevo, debelo crevo, rektum), genitalno-urinarni trakt (materica, jajnik, cerviks, be šika, testis, penis, prostata), bubreg, pankreas, jetru, kosti, mišiće, kožu itd.

[0094] Karcinomi se odnose na malignitete epitelnih ili endokrinih tkiva, i uklju čuju karcinome respiratornog sistema, karcinome gastrointestinalnih sistema, karcinome genitalno-urinarnog sistema, karcinome testisa, karcinome dojke, karcinome prostate, karcinome endokrinog sistema i melanome. Primeri karcinoma obuhvataju one koji se formiraju iz cerviksa, pluća, prostate, dojke, glave i vrata, debelog creva, jetre i jajnika. Pojam takođe obuhvata karcinosarkome, npr, u koje spadaju maligni tumori sastavljeni od karcinomskih i sarkomskih tkiva. Adenokarcinom uključuje karcinom žlezdanog tkiva, ili u kojem tumor formira strukturu u vidu žlezde.

[0095] Sarkomi se odnose na maligne tumore mezenhimskog ć elijskog porekla. Primeri sarkoma uključuju na primer limfosarkom, liposarkom, osteosarkom i fibrosarkom.

[0096] Kako se ovde koristi, termin "hematopoetički proliferativni poremećaj" označava bolest koja uključuje hiperplastične/neoplastične ćelije hematopoeznog porekla, npr, koje proizilaze iz mijeloidne, limfoidne ili eritroidne vrste, ili njihove prekursorske ćelije. Tipično, bolesti nastaju kao posledica nedovoljno diferencirane akutne leukemije, npr. eritroblastična leukemija i akutna megakarioblastična leukemija. Dodatni primeri mijeloidnih poremećaja obuhvataju, ali nisu ograničeni na, akutnu promijeloidnu leukemiju (USPN), akutnu mijeloičnu leukemiju (AML) i hroničnu mijelogenu leukemiju (CML); limfni maligniteti uključuju, ali nisu ograničeni na, akutnu limfoblastičnu leukemiju (ALL), koja obuhvata ALL B-limfocita i ALL T-limfocita, hroničnu limfocitnu leukemiju (CLL), prolimfocitnu leukemiju (PLL), leukemiju vlasastih ćelija (HLL) i Waldenstrom makroglobulinemiju (VM). Dodatni maligni limfomi obuhvataju, ali nisu ograni čeni na, ne-Hočkinov limfom i njegove varijante, periferne limfome T ćelija, adultni limfom/leukemiju T ćelija, kožni limfom T-ćelija (CTCL), leukemiju velikih granularnih limfocita (LGF), Hočkinovu bolest i Reed-Šternbergovu bolest.

[0097] Tretmani za upotrebu u kombinaciji sa jedinjenjima koja su ovde opisana obuhvataju bilo koji antiproliferativni tretman koji ošteć uje nukleinsku kiselinu ili anti-tumorski tretman kako je ovde opisano ili poznato u struci. Na primer, anti-ć elijski proliferativni ili antitumorski tretman mo že da obuhvata lečenje zračenjem ili hiruršku resekciju, opciono u kombinaciji sa lečenjem lekovima. Tretman može da obuhvati administraciju hemijske supstance, kao što je radioaktivni izotop, lek, kao što je hemoterapeutski agens ili genetsku terapiju, kao što je antionkogen (npr. Rb, DCC, p53, itd), dominantni negativni onkogen ili antisens za onkogen. Ova jedinjenja se mogu administrirati pre, istovremeno sa ili nakon drugih protokola le čenja. Na primer, subjektu kandidatu za anti-proliferativnu terapiju (npr. terapija zra čenjem, hemoterapija, genska terapija, hirurška resekcija, itd.) se može administrirati ovde opisano jedinjenje pre započinjanja antiproliferativne terapije. Prema tome, obezbeđene su profilaktičke metode lečenja.

[0098] Izraz "subjekat" se odnosi na životinje, tipično životinje sisare, kao što su primati (ljudi, majmuni, giboni, šimpanze, orangutani, makakiji), domaće životinje (psi i mačke), stoku (konji, goveda, koze, ovce, svinje) i eksperimentalne životinje (miš, pacov, zec, zamorac). Subjekti uključuju životinjske modele bolesti (npr. mišji model tumora).

[0099] Subjekti odgovarajući za lečenje uključuju one koji trenutno prolaze ili su kandidati za lečenje poremećaja proliferacije ili diferencijacije ili (npr. anti-tumorska terapija). Dodatni subjekti kandidati uključuju, na primer, pacijente sa rizikom od razvoja poremećaja proliferacije ćelija. Postupci koji su ovde opisani se prema tome primenjuju na lečenje subjekta koji je pod rizikom od razvijanja poremećaja proliferacije ćelija, ali koji još nije pokazao otvorene simptome tog poremećaja. Subjekti pod rizikom se mogu identifikovati kao oni koji imaju genetsku predispoziciju ili porodi čnu istoriju za razvijanje proliferativnog poremećaja. Na primer, pacijenti koji imaju aktiviran onkogen ili imaju mutaciju ili deleciju gena supresora tumora su subjekti kandidati. Subjekti sa rizikom mogu da se identifikuju primenom rutinskih genetskih skrininga na prisustvo genetske lezije, ili ispitivanjem porodične istorije subjekata kako bi se utvrdilo da li im preti opasnost od poremeć aja. Poseban primer subjekta pod rizikom bi bio onaj sa porodičnom istorijom ili drugom genetskom karakteristikom koja ukazuje na predispoziciju za rak u kojem neoplastične ili rezistentne neoplastične ćelije eksprimiraju CD40. Poseban specifičan primer genetske bolesti je retinoblastom, koji je izazvan defektom u Rb tumor supresorskom genu.

[0100] Količine koje su administrirane su obično u "efikasnoj količini" ili "dovoljnoj količini" To je količina koja je dovoljna da proizvede željeni efekat. Efikasne količine prema tome uključuju jedno ili više od: inhibiciju ćelijske proliferacije, inhibiciju broja ćelija, inhibiciju povećane proliferacije, inhibiciju povećanog broja ćelija, povećanje apoptoze ili smanjenje preživljavanja, najmanje dela ćelija koje sadrže proliferišuće ćelije (npr. bar neke od ciljnih ćelija). Tako, na primer, kada je poželjno da se inhibira proliferacija ćelija, efikasna količina će biti količina koja detektabilno smanjuje proliferaciju ćelija ili brojeve proliferišućih ćelija ili povećava ćelijsku apoptozu ili smanjenjuje preživljavanje ćelija. Količina stoga može biti dovoljna da smanji broj ciljnih ćelija, stabilizuje broj ciljnih ćelija ili inhibira porast broja ciljnih ćelija. Na primer, kada poremećaj sadrži čvrsti tumor, smanjivanje veličine tumora, stabilizacija veličine tumora ili sprečavanje daljeg rasta tumora, najmanje dela tumora (npr. inhibiranje rasta 5-10% ćelija, odnosno 10-20% ili više ćelija koje čine masu tumora) je zadovoljavajuć a klinička krajnja tačka. Kada poremećaj sadrži tečni tumor, smanjenje broja ćelija tumora, stabilizovanje broja ćelija tumora odnosno inhibiranje daljeg povećanja broja tumorskih ćelija, bar jedne subpopulacije ćelija tumora (npr. inhibiranje rasta 5-10% ćelija ili 10-20% ili više ćelija) je zadovoljavajuć a klinička krajnja tačka.

[0101] Pored toga, količine koje se smatraju delotvornim mogu da spreče ili inhibiraju progresiju stanja ili poremećaja. Na primer, neki tumori sa progresijom postaju sve agresivniji, uključujući prelazak u oblike metastaze. Prema tome, količine koje se takođe smatraju efikasnim bi dovele do smanjenja ili sprečavanja da tumori postanu sve agresivniji ili metastazirajući. Prema tome, inhibiranje ili sprečavanje pogoršanja poremeć aja ili stanja, tj. stabilizovanje stanja je dodatna zadovoljavaju ć a klini čka krajnja tačka.

[0102] Ispitivanje biološkog uzorka koji sadrži tečni tumor (npr. krv ili uzorak tkiva), može da utvrdi da li su smanjeni masa tumora ili broj ćelija, ili je došlo do inhibicije proliferacije ćelija tumora. Za čvrsti tumor, invazivne i ne-invazivne metode snimanja mogu da utvrde smanjenje veli čine tumora ili inhibiranje povećanja veličine tumora. Smanjenje broja receptora receptor pozitivnog tumora se može koristiti za procenu smanjenja ili inhibicije proliferacije ćelija tumora. Količine hormona nekog tumora koji produkuje hormone, npr. dojke, testisi ili jajnici, se može koristiti za procenu smanjenja ili inhibicije proliferacije tumora.

[0103] Efikasne količine mogu objektivno ili subjektivno redukovati ili smanjiti ozbiljnost ili u čestalost simptoma povezanih sa poremećajem ili stanjem. Na primer, količina ovde opisanog jedinjenja koja smanjuje bol, mučninu ili druge nelagodnost ili povećava apetit ili subjektivno blagostanje je zadovoljavajuća klinička krajnja tačka.

[0104] Efikasne količine uključuju i smanjenje količine (npr. doze) ili učestalosti tretmana sa drugim protokolom, što se smatra zadovoljavajućom kliničkom krajnjom tačkom. Na primer, pacijent oboleo od kancera tretiran jedinjenjem koje je ovde opisano mo že zahtevati blaži tretman koji oštećuje nukleinsku kiselinu u cilju inhibiranja proliferacije ćelija kancera. U ovom primeru, efikasna količina će uključivati iznos koji smanjuje frekvenciju doziranja ili količinu agensa za oštećenje nukleinske kiseline koja se subjektu administrira u odnosu na frekvenciju doziranja ili količinu koja se administrira bez lečenja sa jedinjenjem koje je ovde opisano.

[0105] Ovde opisani postupci koji dovode do poboljšanja stanja subjekta ili terapeutskog benefita mogu biti relativno kratki po trajanju, npr. poboljšanje može trajati nekoliko sati, dana ili nedelja, ili se može produžiti na duži vremenski period, npr. mesece ili godine. Efikasna količina ne mora biti potpuna ablacija bilo kog ili svih simptoma stanja ili poremećaja. Tako se zadovoljavajuća klinička krajnja tačka za efikasnu količinu postiže kada postoji subjektivno ili objektivno poboljšanje stanja subjekta utvrđeno pomoću bilo kog od gore navedenih kriterijuma ili drugih kriterijuma poznatih u struci koji su pogodni za utvr đivanje statusa poremećaja ili stanja, u kratkom ili dugom vremenskom periodu. Količina efikasna da obezbedi jedan ili više korisnih efekata, kao što je ovde opisano ili je poznato u struci, se označava kao "poboljšanje" stanja subjekta ili "terapeutski benefit" za subjekta.

[0106] Efikasna količina ovde opisanih jedinjenja može biti određena na osnovu studija na životinjama ili opciono u kliničkim studijama na ljudima. Prosečan stručnjak će ceniti različite faktore koji mogu da utiču na doziranje i vreme potrebno za lečenje određenog subjekta, uključujući, na primer, opšte zdravstveno stanje, starost, ili pol subjekta, ozbiljnost ili fazu poremećaja ili stanja, prethodne tretmane, podložnost neželjenim sporednim efektima, željeni klinički ishod i prisustvo drugih poremećaja ili stanja. Takvi faktori mogu uticati na doziranje i tajming potreban da se obezbedi količina dovoljna za terapeutski benefit. Režim doziranja uzima u obzir i farmakokinetiku, tj. brzinu apsorpcije, bioraspoloživost, metabolizam i klirens farmaceutske kompozicije (vidi, npr. Egleton (1997) "Bioavailability and transport of peptides and peptide drugs into the brain" Peptides 18:1431-1439;

i Langer (1990) Science 249:1527-1533). Pored toga, doza ili protokoli lečenja mogu biti prilagođeni za konkretnog subjekta ili modifikovani na osnovu farmakogenomskih podataka.

[0107] Prema tome, ovde opisana jedinjenja se mogu administrirati sama ili kao farmaceutska kompozicija, sistemski, regionalno (npr. usmereno ka organu ili tkivu, npr. injekcijom u portalnu venu za le čenje ćelijskog proliferativnog poremećaja jetre), ili lokalno (npr. direktno u tumorsku masu), u skladu sa bilo kojim protokolom ili putem koji postiže željeni efekat. Jedinjenja i farmaceutske kompozicije se mogu administrirati kao pojedinačna ili višestruka doza svaki dan (npr. u malim dozama), ili sa prekidima (npr. svaki drugi dan, jednom nedeljno, itd. u većim dozama). Jedinjenja i farmaceutske kompozicije mogu biti administrirana putem inhalacije (npr. intra-trahealno), oralno, intra-venozno, intraarterijalno, intravaskularno, intratekalno, intraperitonealno, intramuskularno, subkutano, intrakavitalno, transdermalno (npr. topikalno), transmukozalno (npr. bukalno, preko bešike, vaginalno, preko uterusa, rektalno, ili nazalno), višestrukim administracijama, sa produženim oslobađanjem (npr. postepenom perfuzijom tokom vremena) ili pojedinačnim bolusom. Implantirani uređaji, uključujući mikro-uređaje, za primenu lekova su dobro poznati i takođe primenljivi za isporuku subjektu, ovde opisanih jedinjenja.

[0108] Jedinjenja administrirana intravenozno (IV) bi bila sa oko 0.01 mg/h do oko 1.0 mg/h tokom nekoliko sati (obično 1, 3 ili 6 sati), što se može ponavljati tokom jedne ili više nedelja sa prekidima ciklusa. Znatno veće doze (npr. u opsegu do oko 10 mg/ml) se mogu koristi, naročito kada se lek primenjuje na izdvojenom mestu a ne u krvotok, kao što je u telesnu šupljinu ili u lumen nekog organa, npr. cerebrospinalna tečnost (CSF). Otkriće stoga dalje obezbeđuje i farmaceutske kompozicije. Takve farmaceutske kompozicije su korisne za administraciju subjektu in vivo ili ex vivo, i za lečenje subjekta npr. sa ovde opisanim jedinjenjima,.

[0109] Kako je ovde korišćeno termin "farmaceutski prihvatljiv" i "fiziološki prihvatljiv" obuhvata rastvarače (vodene ili ne-vodene), rastvore, emulzije, disperzione medijume, prevlake, izotoni čne i agense za ubrzavanje ili odlaganje apsorpcije, koji su kompatibilni sa farmaceutskom administracijom. "Farmaceutska kompozicija" ili "farmaceutsko sredstvo" se, dakle, odnosi na kompoziciju pogodnu za farmaceutsku primenu kod subjekta. Farmaceutske kompozicije i formulacije uključuju količine ovde opisanog jedinjenja, na primer, efikasnu količinu peptida ili peptidomimetika, nukleinsku kiselinu koja ih kodira, vektor, ili ćeliju koji su ovde opisani i farmaceutski ili fiziološki prihvatljiv nosač.

[0110] Farmaceutske kompozicije mogu biti formulisane tako da budu kompatibilne sa određenim putem administriranja, sistemski ili lokalno. Prema tome, farmaceutske kompozicije uklju čuju nosače, diluente ili ekscipijente pogodne za primenu različitim putevima.

[0111] Formulacije ili enteralna (oralna) administracija mogu biti sadržane u tableti (obložena ili neobložena), kapsuli (tvrda ili meka), mikrosferi, emulziji, prahu, granulama, kristalu, suspenziji, sirupu ili eliksiru. Konvencionalni netoksični čvrsti nosači koji uključuju, na primer, manitol farmaceutskog stepena, laktozu, skrob, magnezijum stearat, natrijum saharin, talk, celulozu, glukozu, saharozu, magnezijum karbonat se mogu koristiti za pripremu čvrstih formulacija. Dodatna aktivna jedinjenja (npr. konzervansi, antibakterijski, antivirusni i antifungalni agensi) takođe mogu biti ugrađeni u formulacije. Tečna formulacija se može koristiti za enteralnu administraciju. Nosač može biti izabran od različitih ulja, uključujući petrolej, životinjska, biljna ili sintetička, na primer, kikiriki ulje, sojino ulje, mineralno ulje, susamovo ulje. Pogodni farmaceutsk i ekscipijenti obuhvataju npr. skrob, celulozu, talk, glukozu, laktozu, saharozu, želatin, slad, pirinač, brašno, kredu, silika gel, magnezijum stearat, natrijum stearat, glicerol monostearat, natrijum hlorid, obrano mleko, glicerol, propilen glikol, vodu, etanol.

[0112] Farmaceutske kompozicije za enteralnu, parenteralnu ili transmukozalnu isporuku uključuju, na primer, vodu, fiziološki rastvor, slani fosfatni pufer, Henkov rastvor, Ringerov rastvor, dekstroza/ fiziološki rastvor i rastvor glukoze. Formulacije mogu da sadrže pomoćne supstance za približavanje fiziološkim uslovima, kao što su sredstva za puferovanje, podešavanje toničnosti, sredstva za vlaženje, deterdženti i sl. Aditivi takođe mogu uključivati dodatne aktivne sastojke kao što su baktericidi ili stabilizatori. Na primer, rastvor može sadržati natrijum acetat, natrijum laktat, natrijum hlorid, kalijum hlorid, kalcijum hlorid, sorbitan monolaurat ili trietanolamin oleat. Dodatne parenteralne formulacije i postupci su opisani u Bai (1997) J. Neuroimmunol. 80:65-75; Warren (1997) J. Neurol. Sci. 152:31-38; i Tonegawa (1997) J. Exp. Med.

186:507-515. Parenteralni preparat može biti zatvoren u ampule, špriceve za jednokratnu upotrebu ili fiole za više doza, napravljene od stakla ili plastike.

[0113] Farmaceutske smeše za intradermalnu ili subkutanu administraciju mogu da sadrže sterilni diluent, kao što je voda, slani rastvor, fiksna ulja, polietilen glikol, glicerin, propilen glikol ili drugi sinteti čki rastvarači; baktericide kao što su benzil alkohol ili metil paraben; antioksidanse kao što je askorbinska kiselina, glutation ili natrijum bisulfit; helirajuća sredstva kao što je etilen-diamintetrasirćetna kiselina; pufere kao što su acetati, citrati ili fosfati i sredstva za podešavanje toničnosti kao što su natrijum hlorid ili dekstroza.

[0114] Farmaceutske kompozicije za injekcije uključuju vodene rastvore (za vodo-rastvorne) ili disperzije i sterilne praškove za ekstemporanu pripremu sterilnih rastvora ili disperzija za injektiranje. Za intravenoznu administraciju, pogodni nosači su fiziološki slani rastvor, bakteriostatska voda, Cremophor EL<TM>(BASF, Parsippany, NJ) ili fosfatni slani pufer (PBS). Nosač može biti rastvarač ili disperzioni medijum koji sadrži, na primer, vodu, etanol, poliol (na primer, glicerol, propilen glikol i tečni polietilenglikol i slično), i njihove pogodne mešavine. Fluidnost se može održavati, na primer, upotrebom prevlaka kao što je lecitin, održavanjem potrebne veličine čestica u slučaju disperzije i upotrebom surfaktanata. Antibakterijska i antifungalna sredstva uključuju, na primer, parabene, hlorobutanol, fenol, askorbinsku kiselinu i timerozal. Izotonični agensi, na primer, šećeri, polialkoholi kao što su manitol, sorbitol, natrijum hlorid mogu biti uključeni u kompoziciju. Dobijeni rastvori mogu biti pakovani za upotrebu kao takvi, ili liofilizovani, takav liofilizovani preparat kasnije može biti kombinovan sa sterilnim rastvorom pre primene.

[0115] Farmaceutski prihvatljivi nosači mogu da sadrže jedinjenje koje stabilizuje, povećava ili odlaže apsorpciju i klirens. Takva jedinjenja obuhvataju, na primer, ugljene hidrate, kao što su glukoza, saharoza ili dekstrani; proteine male molekulske težine; kompozicije koje smanjuju klirens ili hidrolizu peptida; ili ekscipijente ili druge stabilizatore i/ili pufere. Agensi koji odlažu apsorpciju uključuju, na primer, aluminijum monostearat i želatin. Deterdženti se takođe mogu koristiti za stabilizaciju ili za povećanje ili smanjenje apsorpcije farmaceutske kompozicije, uključujući lipozome kao nosače. Za zaštitu od digestije jedinjenje može biti u kompleksu sa kompozicijom da ga učini otpornim na kiselinsku i enzimsku hidrolizu, ili ovo jedinjenje može graditi kompleks u odgovarajuće otpornom nosaču kao što je lipozom. Sredstva za zaštitu jedinjenja od digestije su poznata u struci (vidi, npr Fix (1996) Pharm Res. 13:1760-1764; Samanen (1996) J. Pharm. Pharmacol. 48:119-135, i US Patent 5,391,377), koji opisuju lipidne kompozicije za oralnu isporuku terapeutskih agensa).

[0116] Za transmukozalno ili transdermalno administriranje u formulaciji se koriste penetranti koji odgovaraju barijeri kroz koju treba da prođe. Takvi penetranti su generalno poznati u struci, i obuhvataju, npr. za transmukozalnu administraciju, deterdžente, žučne soli i derivate fusidične kiseline. Transmukozna administracija može biti preko nazalnih sprejeva ili supozitorija (vidi npr. Sayani (1996) "Systemic delivery of peptides and proteins across absorptive mucosae" Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 13:85-184). Za transdermalnu administraciju, aktivno jedinjenje može biti formulisano u mastima, melemima, gelovima, ili kremama što je opšte poznato u tehnici. Transdermalni sistemi isporuke se takođe mogu postići pomoću transdermalnih flastera.

[0117] Za isporuku inhalacijom, farmaceutska formulacija može biti primenjena u obliku aerosola ili magle. Za administraciju aerosola, formulacija može biti isporučena u fino podeljenom obliku zajedno sa surfaktantom i propelantom. Uređaj za isporuku formulacije respiratornom tkivu može biti onaj u kojem formulacija isparava. Drugi sistemi za isporuku poznati u struci obuhvataju aerosole sa suvim prahom, sisteme za isporuku tečnosti, inhalatore, nebulizere i propelantske sisteme (vidi npr. Patton (1998) Biotechniques 16:141-143, Dura Pharmaceuticals, San Diego, CA; Aradigm, Hayward, CA, Aerogen, Santa Klara, CA; i Inhale Therapeutics Systems, San Carlos, CA).

[0118] Mogu se koristiti biorazgradivi biokompatabilni polimeri, kao što su etilen vinil acetat, polianhidridi, poliglikolna kiselina, kolagen, poliortoestri i polilaktična kiselina. Postupci za pripremu takvih formulacija su poznati prosečnom stručnjaku. Materijali takođe mogu biti komercijalno nabavljeni od Alza Corporation i Nova Pharmaceuticals, Inc. Lipozomske suspenzije (uključujući lipozome usmerene na ćelije ili tkiva pomoću antitela ili proteinskih omotača virusa) se takođe mogu koristiti kao farmaceutski prihvatljivi nosači. Oni se mogu dobiti prema postupcima poznatim u struci, na primer, kako je opisano u US patentima br. 4,235,871; 4,501,728; 4,522,811; 4,837,028; 6,110,490; 6,096,716; 5,283,185; 5,279,833; Akimaru (1995) Cytokines Mol. Ther. 1:197-210; Alving (1995) Immunol. Rev. 145:5-31; i Szoka (1980) Ann. Rev. Biophys. Bioeng. 9:467). Biorazgradive mikrosfere ili kapsule ili druge biorazgradive polimerne konfiguracije sposobne za odlo ženu isporuku malih molekula uključujući peptide su poznate u struci (vidi, npr. Putney (1998) Nat. Biotechnol.

16:153-157). Ovde opisana jedinjenja mogu biti inkorporirana u micele (vidi, npr Suntres (1994) J. Pharm Pharmacol 46:23-28; Woodle (1992) Pharm. Res. 9:260-265). Peptidi mogu biti vezani za površinu lipidnog monosloja ili dvosloja. Na primer, peptidi mogu biti vezani za lipozome koji sadr že hidrazid-PEG (distearoilfosfatidil) etanolamin (vidi npr. Zalipsky (1995) Bioconjug. Chem 6:705-708). Alternativno se mo že koristiti bilo koji oblik lipidne membrane, kao što je planarna lipidna membrana ili ćelijska membrana intaktne ćelije, npr. crvenog krvnog zrnca,. Lipozomalne i formulacije koji sadrže lipide mogu biti isporučene na bilo koji način, uključujući, na primer, intravensku, transdermalnu (vidi npr. Vutla (1996) J. Pharm Sci 85:5-8), transmukozalnu ili oralnu administraciju.

[0119] Farmaceutski prihvatljiva formulacija može da obuhvati oko 1% do 99.9% aktivnog sastojka (npr. peptida ili peptidomimetika). Farmaceutske kompozicije mogu biti sterilisane, dobro poznatim tehnikama konvencionalne sterilizacije ili mogu biti sterilno filtrirane.

[0120] Dodatne farmaceutske formulacije i sistemi isporuke su poznati u struci i primenljivi u ovde opisanim postupcima i kompozicijama (vidi, npr. Remington Pharmaceutical Sciences (1990) 18. izdanje, Mack Publishing Co., Easton, PA; The Merck Index (1996) 12. izdanje, Merck Publishing Group, Whitehouse, NJ; Pharmaceutical Principles of Solid Dosage Forms, Technonic Publishing Co., Inc., Lancaster, Pa., (1993); i Poznansky et al., Drug Delivery Systems, R. L. Juliano, ed., Oxford, N.Y. (1980), pp. 253-315)

[0121] Farmaceutske formulacije mogu biti pakovane u jedinične dozne oblike, radi lakše administracije i ujednačenog doziranja. "Jedinični dozni oblik" kako se ovde koristi se odnosi na fizički odvojene jedinične doze za administriranje subjektu koji se tretira; svaka jedinica sadr ži unapred odredenu količinu jedinjenja koja proizvodi željeni efekat u kombinaciji sa farmaceutskim nosačem ili ekscipijentom.

[0122] Slede skraćenice koje su ovde korišćene:

Cha: cikloheksil-alanin

Phe-2,3,4,5,6-F: Fluoridi su na poziciji 2,3,4,5,6, na fenilnom ostatku fenilalanina

F: fluorid

Bpa: Benzoil-fenilalanin

Nal (2): 2-naftil-alanil

Ala (3-BZT): (3-Benzotienil)-Alanin

Nal (1): 1-Naftil-alanil

DpH: Difenil-Alanin Ala (tBu): t-butil-alanil

Cys (tBu): t-butil-cistein

Phe-3,4,5-F: Fluoridi su na poziciji 3,4,5 na Fenilu Fenilalanina

Phe-4CF3: CF3 je na poziciji 4 na Fenilnom ostatku Fenilalanina

Phe-3BR, 4cl, 5Br: Bromid je na poziciji 3, hlorid na poziciji 4, a bromid je na poziciji 5 Fenila Fenilalanina

Phe-4CI: hlorid je na poziciji 4 fenila fenilalanina

P1, P2, P3, P4, P5, P6, itd, i (PI, P2, P3, P4, P5, P6, itd); i P7, P8, P9, P10, P11, P12, itd., i (P7, P8, P9, P10, P11, P12, itd.): susedna sekvenca P1, P2, P3, P4, P5, P6, itd.; i P7, P8, P9, P10, P11, P12, respektivno.

[0123] Ukoliko nije drugačije definisano, svi tehnički i naučni termini koji su ovde korišćeni imaju isto značenje koje obično podrazumeva prosečan stručnjak u oblasti kojoj ovaj pronalazak pripada.

[0124] Kako se ovde koristi, oblici jednine "neki", i "taj" i "je" obuhvataju i množinu osim ako kontekst jasno ne ukazuje na drugačije. Tako, na primer, pozivanje na "jedinjenje" obuhvata vi še jedinjenja i pozivanje na "jedinjenje" uključuje više jedinjenja, a pozivanje na "rezidua" ili "aminokiselina" uključuje pozivanje na jednu ili više rezidua i aminokiselina.

[0125] Sledeć i primeri su namenjeni da ilustruju ali da ne ograničavaju obim pronalaska opisan u patentnim zahtevima.

PRIMERI

Primer 1

[0126] Ovaj primer opisuje materijale i nekoliko metoda. Ovaj primer takođe opisuje sekvence analiziranih peptida/peptidomimetika.

[0127] Hemikalije i reagensi Bleomicin je kupljen od kompanije Wako Pure Chemical Co. (Osaka, Japan) i on je rastvoren u destilovanoj H20 do 10 mg/ml. Propidijum jodid (PI) i adriamicin su nabavljeni od Sigma (St. Louis, MO).

[0128] Ć elijska kultura Jurkat ćelijska linija humane leukemije T-ćelija, uzgajana je u RPMI 1640 (Sigma) sa dodatkom 10% fetalnog telećeg seruma (IBL: Immuno-Biological Laboratories, Gunma, Japan) na 37 °C/5% CO2. Ćelijska linija humanog karcinoma pankreasa, MIAPaCa2je uzgajana u DMEM sa 10% fetalnog teleć eg seruma na 37 °C/5% CO2.

[0129] Analiza ćelijskog ciklusa Statusi ćelijskog ciklusa ćelija tretiranih sa bleomicinom ili adriamcinom su analizirani pomoću protočne citometrije kako je opisao Kawabe (1997) Nature 385: 454-458. Ukratko, dva miliona ćelija je resuspendovano i inkubirano u 200 µl Krishan rastvora (0.1% Natrijum citrat, 50 µg/ml PI, 20 µg/ml RNase A i 0.5% NP-40) tokom 1 h na 4 °C i analizirano pomoću protočne citometrije, FACScan<TM>(Beckton Dickinson, Mountain View, CA) sa programom CEL- LQuest<TM>(Beckton Dickinson).

PRIMER 2

[0130] Ovaj primer opisuje podatke koji ukazuju na aktivnost različitih peptida za ukidanje G2, i uticaj različitih permutacija sekvence na aktivnost uključujući efekat smanjenja dužine sekvence.

[0131] Analiza ukidanja G2 kontrolne tačke pomoću protočne citometrije je izvedena korišćenjem Jurkat ćelijske linije humane leukemije. Ukratko, kultivisane ćelije su tretirane sa različitim dozama peptida/peptidomimetika i 40µg/ml bleomicina tokom 24 časa. DNK ćelija je bojena sa propidijum jodidom i analizirana pomoću protočne citometrije. Ovi rezultati su sumirani u Tabeli 2.

[0132] Krive doza odgovor svakog peptida/peptidomimetika kada je kori šćen protiv bleomicinom tretiranih Jurkat ćelija su prikazane na Slikama 1, 5, 6, 7, 8, 11 i 12; Y-osa označava % G2/M Jurkat ćelija 24h nakon tretmana.

[0133] Analiza protočnom citometrijom ukidanja kontrolne tačke M faze pomoću jedinjenja je izvedena korišćenjem Jurkat ćelijske linije humane leukemije T ćelija tretiranih kolhicinom (5µg/ml ili 0.5µg/ml) i različitim dozama peptida/peptidomimetika tokom 24 časa (Slika 12). DNK ćelija je bojena i analizirana protočnom citometrijom kako je gore opisano. Ovi rezultati su takođe sumirani u Tabeli 2.

[0134] Krive doza odgovor za svaki peptid/peptidomimetik kada je korišćen protiv kolchicinom tretiranih Jurkat ćelija su prikazane na Slikama 2 i 14; Y-osa označava % G2/M Jurkat ćelija 24h nakon tretmana.

Tabela 2. Doze edin en a ko a induku u ukidan e G2 kontrolne tačke ili nus o avu

[0135] "Pojavljivanje nuspojave kada se koristi sam" ukazuje na dozu peptida/peptidomimetika koja je izazvala poremeć aj ciklusa Jurkat ć elija, tj. pojavu značajnih količina SubGl ć elija (mrtvih ć elija) ili ć elija u kojima sadržaj DNK svake varira više nego inače. Na primer, G1 ć elije obično pokazuju oštar pik u FACS analizi, ali nakon tretmana pik postaje širi i niži kada je ć elijski ciklus narušen što ukazuje na nepravilnu progresiju ć elijskog ciklusa ili početak ć elijske smrti. "Doza ukidanja G2" ukazuje na dozu peptida/peptidomimetika od 40 µg/ml bleomicina koja je pokazala detektabilnu aktivnost ukidanja G2 kontrolne tačke nakon tretmana od 24 sata. "Pojavljivanje nuspojave kada je kori šćen sa kolhicinom" ukazuje na dozu peptida/peptidomimetika od 5mg/ml kolhicina koja je izazvala naru šavanje ciklusa Jurkat ć elija nakon tretmana od 24 sata.

[0136] Ispitivana je aktivnost ukidanja G2 kontrolne tačke sa CBP501 kada je kombinovan sa cis-platinom u različitim ć elijskim linijama. Ukratko, cis-platin (3 µg/ml) i CBP501 (0.4, 2 i 10 µM) su istovremeno dodavani ć elijskoj kulturi koja je inkubirana 3 sata na 37 stepeni sa 5% CO2. Medijum je aspiriran, dodat je svež medijum bez ovih jedinjenja i ć elije su inkubirane dodatnih 45 sati. Ć elije uklju čujući plutaju ć e ć elije su sakupljene korišć enjem rastvora tripsin-EDTA, inkubirane sa Krishan rastvorom i analizirane za sadr žaj DNK protočnom citometrijom kao što je prethodno opisano. Ovi rezultati su sumirani u Tabeli 3. Osenčeno, osim HUVEC, označava ć elijske linije koje imaju značajan gubitak G2 populacije i pove ć anu subG1 populaciju, što ukazuje na ukidanje G2 kontrolne tačke i senzibilizaciju za cisplatin pomoć u CBP501. Zapažanje da HUVEC ć elije, koje su ć elije sa normalnom kontrolnom tačkom G1, nisu bile senzibilisane, bar do 50 µM CBP501, ukazuje da je CBP501 specifičan za kontrolnu tačku G2, a ne nespecifičan.

[0137] Ispitivana je aktivnost ukidanja G2 kontrolne tačke različitih jedinjenja u različitim dozama na ćelijskoj liniji izvedenoj od humanog kancera pankreasa MIAPaCa2 tretiranoj bleomicinom (Bleo) ili adriamicinom (ARS). Ukratko, ćelije su inkubirane sa jedinjenjima i bleomicinom (10µg/ml) ili adriamicinom (1µg/ml) tokom 3 časa. Medijum je promenjen i inkubirane su dodatnih 21 čas. Sakupljene ćelije su za DNK bojene propijum jodidom i analizirane protočnom citometrijom kao što je prethodno opisano. % ćelijske populacije sub-G1 je prikazan kao mrtve ćelije na Slici 3. Rezultati pokazuju da je CBP501 senzibilisao MIAPaCa2 ćelije kako na bleomicin i adriamicin na dozno zavisan način.

[0138] Slike 4A i 4C su kratak rezime aktivnosti ukidanja G2 kontrolne tačke izvedene sa parovima peptida u kojima je jedan aminokiselinski ostatak drugačiji od drugih. Aktivnost ukidanja G2 kontrolne tačke ovih peptida je analizirana korišćenjem bleomicinom tretiranih Jurkat ćelija kao što je opisano gore. Slika 4B je rezime aktivnosti ukidanja M kontrolne tačke i/ili analize nespecifične toksičnosti izvedene sa parovima peptida u kojima se jedna aminokiselinska rezidua razlikuje od druge. Aktivnost ukidanja M kontrolne ta čke i/ili nespecifična toksičnost ovih peptida je analizirana korišćenjem Jurkat ćelija tretiranih kolchicinom kao što je gore opisano.

[0139] Ispitivana je aktivnost ukidanja G2 kontrolne tačke različitih sekvenci bogatih argininom pri različitim dozama na ćelije tretirane bleomicinom. Ukratko, peptidi su dodati u medijum kulture Jurkat ćelija sa bleomicinom (40µg/ml) u dozama od 0.2µg/ml, 0.39 µg/ml, 0.78 µg/ml, 1.56 µg/ml, 3.125 µg/ml, 6.25 µg/ml, 12.5 µg/ml, 25 µg/ml i 50 µg/ml. Ćelije su zatim sakupljene posle 24 sata, bojene Krishan rastvorom, i analizirane pomoću protočne citometrije kao što je prethodno opisano. Na Slici 5 je grafički prikazan %G2/M ćelija (Y-osa) u odnosu na doze peptida (X-osa). Podaci pokazuju da je sekvenca bogata baznim reziduama "(d-Arg) (d-Arg) (d-Arg) (d-Gln) (d-Arg) (d-Arg) (SEK ID NO: 137)" najbolja sekvenca u poređenju sa sekvencama koje imaju manji ili veći broj rezidua.

[0140] Ispitivana je aktivnost ukidanja G2 kontrolne tačke peptida bez (D-Bpa) pri različitim dozama na ćelijama tretiranim bleomicinom. Ukratko, peptidi su dodati u medijum kulture Jurkat ćelija sa bleomicinom (40mg/ml) u dozama od 0.2 µg/ml, 0.39 µg/ml, 0.78 µg/ml, 1.56 µg/ml, 3.125 µg/ml, 6.25 µg/ml, 12.5 µg/ml, 25 µg/ml i 50 µg/ml. Ćelije su zatim sakupljene i analizirane protočnom citometrijom kao što je prethodno opisano. Na Slici 6 je grafički prikazan % G2/M ćelija (Y-osa) u odnosu na doze peptida (X-osa). Ovaj rezultat pokazuje da sekvenca (Tir) (Ser) (Pro) (Trp) (Ser) (Phe-2,3,4,5,6F)(Cha) (SEK ID NO:138) ima aktivnost ukidanja G2 kontrolne tačke uporedivu sa sekvencom (Bpa) (Ser) (Trp) (Ser) (Phe-2,3,4,5,6F) (Cha) (SEK ID NO: 139).

[0141] Ispitivana je aktivnost ukidanja G2 kontrolne tačke sekvenci bogatih argininom i lizinom pri različitim dozama na ćelijama tretiranim bleomicinom. Ukratko, peptidi su dodati u medijum za kulturu Jurkat ćelija sa bleomicinom (40 µg/ml) u naznačenoj dozi (X-osa). Ćelije su zatim sakupljene i analizirane protočnom citometrijom kao što je ranije opisano. Na Slici 7 je grafički prikazan % G2/M ćelija (Y-osa) u odnosu na doze peptida (X-osa). Rezultati pokazuju da izgleda da Arg sekvence obezbeđuju bolju aktivnost nego Lys sekvence za sekvencu bogatu baznim amino kiselinama i da Gln nije bitan za funkciju sekvence.

[0142] Ispitivana je aktivnost ukidanja G2 kontrolne tačke sekvenci u kojima je menjana lokacija regiona bogatog argininom. Ukratko, peptidi su dodavani u medijum kulture Jurkat ćelija sa bleomicinom (40 µg/ml) u naznačenoj dozi (X-osa) tokom 24 sata. Ćelije su zatim sakupljene i analizirane protočnom citometrijom kao što je prethodno opisano. Na Slici 8 je grafički prikazan % G2/M ćelija (Y-osa) u odnosu na doze peptida (X-osa).

[0143] Podaci pokazuju da se aktivnost peptida za ukidanje G2 ne menja značajno sa promenom lokacije regiona bogatog argininom. Pored toga, CBP501 je rastvorljiv u vodi, dok CBP511 nije. Ova razlika mo že biti prednost za određene sisteme za isporučivanje leka, pošto nekim sistemima više odgovaraju jedinjenja nerastvorna u vodi.

[0144] Slika 9 ilustruje rezime analize izvedene sa raznim peptidnim parovima u kojima je samo jedna aminokiselinska rezidua bila različita između parova. Aktivnost ovih peptida za ukidanje G2 je analizirana korišćenjem bleomicinom tretiranih Jurkat ćelija kao što je opisano.

[0145] Veličina, naelektrisanje i hidrofobnost svake amino kiseline određuju koliko efikasno se sekvenca uklapa u ciljni molekul. Bočni lanac peptida ili peptidomimetika bi se kretao slobodno, pa bi čak i sa jednim ili dva nepovoljna bočna lanca peptida ili peptidomimetika mogao da stane u džep ili žljeb ciljnog molekula. Rezime ukazuje da postoje poželjne veličine za svaki bočni lanac što sugeriše veličinu vezujućeg regiona (džepa ili žleba) ciljanog proteina za svaki bočni lanac. Na primer, bočni lanci sa strukturom prstena, kao što su benzen, indol i cikloheksan, određuju jačinu ukidanja G2 ili ukidanja M i/ili ne-specifičnu toksičnost; videti Slike 9 i 4, gde strukture prstena većeg od 5-to članih utiču na aktivnost ukidanja G2 (umerena veličina na P1 i P2 povećava aktivnost ukidanja G2, dok, prevelika структура (PI, P5 i P6) povećava ukidanje M i/ili nespecifičnu toksičnost.

[0146] Bočni lanci bez prstenske strukture izgledaju neutralno. Dakle, da bi se postigla bolja aktivnost, potrebna je odgovarajuć e dimenzioniisana struktura prstena na P1, P2, P4 i P6, i ili nije potrebna nikakva struktura prstena na P3 i P5 ili je potrebna prstenasta struktura sa manje od 6 članova. Odgovarajuć i prsten za P1, P2 i P6 je od jedno- do šesto-članog prstena kondenzovanjem dva prstena sa 5 ili 6 članova. Za P4 prsten odgovarajuć a veličina je kondenzovanje dva prstena, od kojih je svaki sa 5 ili 6 članova. Prema tome, za P1 se čini da su najprikladniji Cha ili Nal(2); za P2, Phe-2,3,4,5,6F, Phe-3,4,5F ili Phe-CF3 se čine najboljim. Ove veličine bočnih lanaca ukazuju na to da u ciljnom molekulu postoje dva džepa ili jedan već i džep u kome ovaj region deluje. Za P3 i P5 je prihvatljiv mali bočni lanac, kao što je Ser ili Pro, a prihvatljiv je i već i bočni lanac, kao što je Arg, što ukazuje da u ovom regionu ciljnog molekula nema džepa, tako da bočni lanci mogu ležati samo naspram cilja. Međutim, moguć e je da struktura prstena omogu ć i peptidu ili peptidomimetiku da interaguje sa drugim molekulom (tj. osim ciljnog molekula) što opet može poveć ati nuspojave. Za P6, Bpa ili Ser-Tyr izgledaju bolje nego sam Tyr ili manji bočni lanac, ukazujući na dublji žleb koji leži horizontalno u cilju. Takođe može postojati plitak i širi džep za P4 u cilju na bazi veličina rezidua za P4.

[0147] Sledeći peptidi su analizirani korišćenjem Jurkat-a i bleomicina kao što je opisano. Sekvence peptida su: CBP501, (d-Bpa) (d-Ser) (d-Trp) (d-Ser) (d-Phe-2,3,4,5,6-F) (d-Cha ) (d-Arg) (d-Arg) (d-Arg) (d-Gln) (d-Arg) (d- Arg) (SEK ID NO: 80); CBP700, (d-Arg) (d-Arg) (d-Bpa) (d-Arg) (d-Arg) (d-Arg) (d-Phe-2,3,4,5,6-F) ( d-Cha) (SEK ID NO: 96); CBP701, (d-Arg) (d-Arg) (d-Arg) (d-Bpa) (d-Arg) (d-Trp) (d-Arg) (d-Phe-2,3,4,5, 6-F) (d-Cha) (SEK ID NO: 97); CBP702, (d-Arg) (d-Arg) (d-Arg) (d-Arg) (d-Bpa) (d-Arg) (d-Trp) (d-Arg) (d-Phe-2,3 , 4, 5,6-F) (d-Cha) (SEK ID NO: 98); i CBP703, (d-Arg) (d-Arg) (d-Arg) (d-Bpa) (d-Arg) (d-Arg) (d-Arg) (d-Phe-2,3,4,5,6-F) (d-Cha) (SEK ID NO: 99). Rezultati pokazuju da CBP700, 701, 702, 703, iako kraći od ostalih ilustrovanih peptida, zadržavaju aktivnost ukidanja G2 kontrolne tačke uporedivom sa drugim peptidima koji imaju znatnu aktivnost ukidanja G2 kontrolne tačke (Slika 11).

[0148] Izvedeno je poređenje između aktivnosti ukidanja G2 kontrolne tačke i nespecifične toksičnosti (ukidanje kontrole tačke M) sa CB501. Ukratko, Jurkat ćelije su tretirane sa 40 µg/ml bleomicina ili 0.5µg/ml kolhicina za aktivnost ukidanja G2 kontrolne tačke i nespecifičnu toksičnost, respektivno. Količina DNK u svakoj od tretiranih ćelija je analizirana pomoću protočne citometrije, kao što je prethodno opisano. Podaci pokazuju da je G2 kontrolna tačka bila ukinuta na dozno zavisan način za CBP501 dok je nespecifična toksičnost bila odsutna do 50µM peptida, što je utvrđeno po nepromenjenom procentu ćelija zadržanih u fazi M (Slika 12).

Primer 3

[0149] Ovaj primer opisuje aktivnost inhibicije kinaze pomoću peptida/peptidomimetika i analizu stabilnosti različitih peptida u serumu.

[0150] Pošto su za mehanizam kontrolne tačke G2 važne dve kinaze Chkl i Chk2, izvedena je analiza inhibicije kinaze za oba enzima. In vitro analiza inhibicije kinaze je izvedena kori šćenjem "PepTag<(R)>Non-Radioactive Protein Kinase Assays", Promega, u skladu sa protokolom kompanije, osim što je umesto PKC korišćena prečišćena CHK2 kinaza. Prečišćeni PKC je kupljen od Upstate Biotechnology, Inc. Ovi rezultati su prikazani u Tabeli 4A.

Tabela 4A Analiza inhibicije Kinaza sa jedinjenjima

[0151] In vitro analiza inhibicije kinaza je izvedena pomoću CycLex, Co. Ltd., Nagano, Japan. Ukratko, iz bakulovirusa izveden rekombinantni humani Chkl histidin tag pune du žine ili E.Coli izvedeni rekombinantni humani Chk2 pune dužine fuzionisan sa GST su korišćeni kao kinaze. E.Coli izvedeni rekombinantni GST-Cdc25c (amino kiseline 167-267) je korišćen kao supstrat. Reakcioni uslovi su bili 20mM Hepes-KOH (pH 7.5), 1 mM DTT, 80 µg/ml BSA, 10 mM MgCl2i 50mM ATP na 30 stepeni tokom 60 minuta. Fosforilacija serina 216 na GST-Cdc25C je detektovana pomoću imunskog testa anti-Cdc25c-fosforilisanog S216 antitela povezanog sa enzimom. Ovi rezultati su prikazani u Tabeli 4B.

Tabela 4B Analiza inhibici e Kinaza sa e tidima.

[0152] Podaci pokazuju da se inhibicija obe kinaze Chkl i Chk2 javlja pri dozi višoj od doze ukidanja G2 (IC50za ukidanje G2 pomoću CBP500, 501, 505, 506, 603 su sve manje od 1 µM). Ovi rezultati sugerišu da ovi peptidi imaju mehanizam delovanja pored inhibiranja Chk1/2 molekula. Alternativno, peptidi se eventualno akumuliraju u ćelijama tako da je njihova koncentracija veća u ćelijama nego u okolnom medijumu.

[0153] Analiza seruma je izvedena da bi se odredila stabilnost peptida u mi šjem i humanom serumu. Ukratko, peptidi (10mm ili 2.5mm) su inkubirani sa sveže pripremljenim humanim serumom na 37 stepeni tokom 1 h. CBP501 (10 mM) je inkubiran sa sveže pripremljenim serumom miša tokom 1 sata na 37 stepeni. Jurkat ćelije su tretirane serumom sa ili bez peptida i bleomicina (40 µg/ml) i inkubirane tokom 24 sata. Populacija ćelija G2 faze je određena protočnom citometrijom kao što je prethodno opisano. Zaostala aktivnost ukidanja G2 kontrolne tačke peptidima tretiranim serumom je određena poređenjem % G2 ć elija tretiranih serumom i standardne krive dobijene sa medijumom tretiranim peptidima, bleomicinom i Jurkat ć elijama (Tabela 5a). Zaostala količina CBP501 je određena sa HPLC posle deproteinacije tretmanom sa etanolom (Tabela 5b). Podaci pokazuju da su peptidi sa amino kiselinama d-tipa kao što su CBP501 i CBP603 stabilniji u serumu od peptida sa 1-tip amino kiselinama kao što je CBP413.

Tabela 5A Analiza tretmana humanim serumom

Tabela 5B Analiza tretmana miš im serumom

Primer 4

[0154] Ovaj primer opisuje anti-proliferativnu aktivnost CBP501 na gajenim ćelijama. Ovaj primer takođe opisuje podatke koji demonstriraju in vivo aktivnost peptida/peptidomimetika.

[0155] Da bi se pokazala anti-proliferativna aktivnost jedinjenja, kultivisane MIAPaCa2 ćelije humanog karcinoma pankreasa su tretirane sa CBP501 (10 µmM), cisplatinom (1, 3 ili 9 µg/ml) i oksaliplatinom (1, 3 ili 9 µg/ml) samim, ili u kombinaciji. Ukratko, ćelije su zasejane sa 300 ćelija/bunarčiću na ploče sa 6 bunarčića, inkubirane preko noći, i tretirane jedinjenjima tokom tri sata. Medijum je promenjen i kultivisane su jo š 10 dana. Ćelije su potom fiksirane sa 70% metanolom, bojene sa 0.1% kristalvioletom i vizuelizovane. Rezultati analize formacije kolonija pokazuju da je CBP501 pojačao citotoksičnu aktivnost kako cisplatina tako i oksaliplatina prema MIAPaCa2 ćelijama.

[0156] Slične studije su izvedene korišćenjem normalnih humanih umbilikalnih endotelnih ćelija (HUVEC). Pošto normalne ćelije ne formiraju kolonije, postavljeno je 3000 ćelija/bunarčiću umesto 300 ćelija/bunarčiću. Rezultati pokazuju da peptid sam po sebi ne ometa rast normalnih ćelija niti je peptid pojačao citotoksičnu aktivnost cisplatina i oksaliplatina prema ćeliji. Prema tome izgleda da peptidi ne pokazuju značajnu aktivnost ukidanja G2 kod normalnih ćelija podvrgnutih tretmanu koji oštećuje nukleinsku kiselinu, za razliku od ć elija sa naglo m proliferiracijom, poput ć elija raka, koje su osetljive na tretmane koji ošteć uju nukleinsku kiselinu. Rezultati ukazuju na specifičnost peptida u senzibilizaciji proliferiraju ć ih ć elija, ali ne i normalnih ć elija protiv tretmana koji ošte ć uje nukleinsku kiselinu.

Tabela 6 Analiza inhibici e rasta MIAPaCa2 korišćen em alamar blue.

[0157] AlamarBlue analiza je izvedena da se analizira aktivnost inhibiranja rasta CBP501 sa i bez cisplatina. Ukratko, MIAPaCa2 ćelije su izložene 1, 3, 10, 30, 100µM cisplatina ili 0.22, 0.67, 2, 6, i 18µM CBP501 sa ili bez 10 µM cisplatina tokom tri sata na pločama sa 96 bunarčića sa 2500 ćelija/bunarčiću u duplikatu. Medijum je promenjen i inkubiran dodatnih 24, 48 ili 72 sata. Posle inkubacije, 20µl alamarBlue 90% reagensa je dodato u svaki bunarčić tokom još 6 časova za detekciju vijabilnosti ćelija pomoću intenziteta fluorescencije. Intenzitet fluorescencije je meren korišćenjem Spectrafluor Plus čitača ploča sa ekscitacijom na 530nm i emisijom na 590nm. Izračunata je vrednost IC50(Tabela 6).

[0158] Ova studija pokazuje da CBP501 sam inhibira ćelijski rast bolje nego cisplatin u molarnoj dozi. CBP501 suzbija rast ćelija pri mnogo nižim dozama u kombinaciji sa 10mM cisplatina, što je približno doza cisplatina koja se koristi za lečenje raka. Štaviše, suzbijanje aktivnosti rasta sa CBP501 je bilo duže nago sa cisplatinom; IC50na 72 satu je bilo mnogo bolje kada je korišćen CBP501 nego kada je korišćen cisplatin.

[0159] In vivo poluživot CBP501 je određen kvantifikacijom CBP501 u mišjem serumu 1, 3 i 6h nakon intraperitonealne injekcije CBP501 (40mg/kg). Količina zaostalog intaknog CBP501 je određena sa HPLC posle deproteinacije mišjeg seruma izvučenog iz injektiranog miša tretmanom sa etanolom (Tabela 7).

Tabela 7 in vivo olu život CBP501

[0160] Da bi se odredila tolerancija na peptide, grupe od deset mi ševa su intravenozno injektirane jedanput sa CBP501 (5, 8 ili 10mg/kg) ili intra-peritonealno injektirane jedanput sa CBP501 (50, 80 ili 100 mg / kg). Injektirani miševi su posmatrani nedelju dana za njihovo preživljavanje (Tabela 8).

Tabela 8 Maksimalna tolerisana doza kod miševa sa ednom in ekcijom

[0161] Da bi se in vivo ispitala efikasnost jedinjenja, MIAPaCa2 ćelije humanog karcinoma pankreasa su subkutano implantirane scid miševima. Tretman je započet kada je veličina primarnog tumora postala 0.1cm3 (DanO) ili više, npr. 7 ili 8 mm u prečniku. CDDP (3 mg/kg) i CBP 501 (10 ili 40 mg/ kg) su intra-peritonealno administrirani sami ili u kombinaciji. Veličine tumora su merene pomoću kalibara tri puta nedeljno, a volumeni su izračunati prema formuli: težina (mg) = [širina (mm) 2xdužina (mm)]/2. Srednje veličine tumora za svaku tretiranu grupu su grafički prikazane (n = 4) u odnosu na dane nakon početka tretmana (Slika 10).

[0162] Rezultati pokazuju da samostalan tretman sa CBP501 suzbija rast humanih ćelija raka pankreasa in vivo. Rezultati dalje pokazuju da je CBP501 povećao anti-tumorsku aktivnost cisplatina.

Primer 5

[0163] Ovaj primer obuhvata opis raka pluća i studija koje koriste CBP501.

[0164] Karcinom pluća je vodeći uzrok smrti od raka odraslih u zapadnim zemljama. U SAD je u 2009. dijagnostikovano 219,440 novih slučajeva i 159,390 smrtnih slučajeva usled ove bolesti, što čini oko 29% svih smrtnih slučajeva od raka (vidi, npr. American Cancer Societ y, Cancer Facts & Figures 2009). Osamdeset sedam procenata (87%) svih novih slučajeva raka pluća su kanceri ne malih ćelija pluća (NSCLC) histologije, od kojih su tri glavne vrste: adenokarcinom, karcinom skvamoznih ć elija (epidermoid) i karcinom velikih ć elija (American Cancer Society, Cancer Facts & Figures 2009). Uprkos poboljšanjima u hirurškim tehnikama i kombinovanim terapijama, prognoza za pacijente sa dijagnozom NSCLC i dalje ostaje slaba. Stopa petogodišnjeg preživljavanja je 47% za slučajeve otkrivene u ranoj fazi, kada je bolest još uvek lokalizovana, ali većina NSCLC pacijenata (68%) (vidi, npr. AJCC Cancer Staging Manual. In: Fleming ID, izdava č Philadelphia: Lippincott-Raven; 2002) je dijagnostikovana sa uznapredovalim oboljenjem (stadijum III) ili metastazom (stadijum IV) koja zahteva hemoterapiju. Stopa petogodi šnjeg preživljavanja za pacijente sa stadijumom III bolesti je 8.4% i 1.6% za stadijum IV, uz većinu pacijenata sa uznapredovalim NSCLC, koji su podlegli bolesti u roku od 2 godine (vidi npr. American Cancer Society, Cancer Facts & figures 2009; AJCC Cancer Staging Manual. In: Fleming ID, izdavač Philadelphia: Lippincott-Raven; 2002.). Uvođenje novih lekova koji mogu da proizvedu značajan napredak u preživljavanju pacijenata i kvalitetu života je nezadovoljena potreba.

[0165] Pacijenti sa NSCLC uznapredovalim stadijumom (IIIb ili IV) koji imaju dobar status performansi mogu imati koristi od hemoterapije (videti npr. Souquet, PJ., et al., Lancet 342:19-21, 1993; Marino, P., et al., Chest 106:861-865, 1994; Marino, P., et al., Cancer 76:593-601, 1995; Helsing, M., et al., Eur J Cancer 34:1036-1044, 1998; Cullen, MH., et al.,J Clin Oncol 17:3188-3194, 1999; Pfister, DG., et al., J Clin Oncol 22:330-353, 2004). Pokazalo se da hemoterapijski dubleti poboljšavaju preživljavanje u poređenju sa pojedinačnim agensima ili režimom bez hemoterapije (videti, na primer, Bunn, PA. et al., J Clin Oncol 20: 23S-33S, 2002). Trenutno preporučeni režimi hemoterapije prve linije u uznapredovalom NSCLC uključuju jedinjenja platine (cisplatin [CDDP] ili karboplatin) u kombinaciji sa gemcitabinom, vinorelbinom ili taksanima (paklitaksel ili docetaksel), irinotekanom, etopozidom, vinblastinom i/ili pemetreksedom kao referentnim režimima (Pfister, DG., et al., J Clin Oncol 22:330-353, 2004).

[0166] Randomizovane studije su pokazale da različite kombinacije platina-dubleta sve imaju sličnu efikasnost, iako se režimi neznatno razlikuju u pogledu toksičnosti, udobnosti i troškova. Rezultati su pokazali da su ukupne stope odgovora (ORR) između 17% i 32%, srednja vremena preživljavanja od 7 do 10 meseci, a 1-godišnja stopa preživljavanja od 30 do 45% (vidi, npr. Scagliotti, G., et al., Semin Oncol 32:S5-S8, 2005; Schiller, JH., et al., N Engl J Med 346:92-98, 2002; Scagliotti, G., et al., J Clin Oncol 20:4285-4291, 2002; Kelly, K., et al., J Clin Oncol 19:3210-3218, 2001; Fossella, F., et al., J Clin Oncol 21:3016-3024, 2003).

[0167] U većini slučajeva triplet hemoterapije do sada nisu dovele do porasta pre življavanja, već do povećane toksičnosti. Nedavna studija karboplatin paklitaksel bevacizumab je, međutim, pokazala određeni benefit u pogledu preživljavanja (vidi npr. Sandler, A., et al, N Engl J Med 355:2542-2550, 2006), sugerišući da dodavanje ciljanog agensa sa nepreklapajućom toksičnosti može poboljšati dublet hemoterapiju. Aktivni pokušaji optimizacije koristi od hemoterapije se sprovode upotrebom molekularnih markera koji predvi đaju antitumorsko delovanje Geni koji predviđaju hemoterapijsku efikasnost kod NSCLC počinju da se pojavljuju (vidi, npr. Bepler, G., et al., ASCO Educational Book: 350-352, 2008; Sommers, K., et al., Proc Am Soc Clin Oncol 262008). Među njima su vredni markeri kao što su ERCC1, BRCA1/2, RRM1 i TS (Tabela 9).

Tabela 9. Molekularni markeri koji predviđaju hemoterapijsku efikasnost u NSCLC

Primer 6

[0168] Ovaj primer obuhvata opis podataka koji ukazuju da izvesne podgrupe populacije humanih pacijenata povoljno reaguju na kombinacije peptida i hemoterpijskih agensa (koji o štećuju nukleinske kiseline). Neočekivano, podaci pokazuju da je podgrupa populacije pacijenata u klini čkoj studiji o kanceru neskvamoznih, ne-malih ćelija (NSCLC), koja je pre lečenja sa CBP501 imala manje od 10.000 belih krvnih zrnaca (WBC) po kubnom milimetru krvi, imala korist od administracije CBP501.

[0169] CBP501 je sintetički dodekapeptid koji se sastoji u potpunosti od D-amino kiselina (Slika 13). To je evoluirana verzija TAT-S216A, koja je optimizovana za svoju aktivnost da smanji akumulaciju G2 (4N) ćelija kao odgovor na tretman agensima koji oštećuju DNK, u testu na bazi sadržaja DNK određenog protočnom citometrijom.

[0170] Sprovedene su dve studije faze I sa rasponom doze i farmakokinetičke studije za ispitivanje CBP501 na ukupno 78 pacijenata: monoterapijska studija CBP501, administriran kao 60 minutna i.v. infuzija na dane 1., 8. i 15. ponavljana svake 4 nedelje, i studija kombinovane terapije cisplatinom sa administracijom jednom svake 3 nedelje (vidi, npr. Shapiro, GI, et al., Clin Cancer Res. May 15;17(10):3431-42, 2011).

[0171] Faza I studije sa jednim agensom (CBP04-01): Ovo je prva studija faze I eskalacije doze sa jednim agensom kod čoveka, koja ispituje režim sa tri injekcije (dani 1-8-15) svakih 28 dana, u populaciji pacijenata sa uznapredovalim čvrstim tumorima. Ukupno 68 ciklusa je administrirano, prosečan broj ciklusa po pacijentu je 2 (raspon 1-8). Dva pacijenta su postigla 7 ciklusa tretmana sa stabilnom bolešću, jedan sa dijagnozom raka pankreasa a drugi sa rakom jajnika. Većina pacijenata (87%) je prekinula studiju zbog progresije bolesti. Nijedan pacijent nije prekinuo zbog toksičnosti (vidi, npr. Shapiro, GI., et al., Clin Cancer Res. May 15;17(10):3431-42, 2011).

[0172] Faza I studije CBP501 u kombinaciji sa cisplatinom (CBP06-01): Osnovni cilj ove faze I studije je bio da utvrdi MTD i RD za CBP501 i cisplatin kada se administriraju u kombinaciji jednom na svakih 21 dan. CBP501 je administriran prvi, kao jednosatna infuzija, a zatim cisplatin dva sata posle po četka tretmana. Pacijentima je davan profilaktički tretman za alergijske reakcije prema istom režimu razvijenom za fazu I studije sa jednim agensom (loratadin, deksametazon, ranitidin i difenhidramin).

[0173] Ukupno 48 pacijenata je tretirano u tri US centra i ukupno je administrirano 182 ciklusa, prose čan broj ciklusa po pacijentu je bio 4 (raspon 1-13). CBP501 je istražen u opsegu doza od 3.6 mg/m<2>do 36.4 mg/m<2>. Najveća ispitana doza je bila 36.4 mg/m<2>CBP501 i 75 mg/m<2>cisplatina. Na ovom nivou doze, dva od šest pacijenata je imalo alergijske reakcije koje su od istraživača procenjene kao granične doze (stepen 3). MTD je smatran nivom doze odmah ispod, koji je bio za CBP501 24.3 mg/m2 i za cisplatin 75 mg/m2. Saveti o aktivnostima su dokumentovani kod nekoliko pacijenata (videti, npr. Shapiro, G.I. et al., Clin Cancer Res. May 15;17(10):3431-42, 2011).

[0174] Cisplatin (cis-diamminodihloroplatinum), neorganskom platinom koordinisani kompleks, reaguje prvenstveno na poziciji N7 guaninskih i adeninskih rezidua DNK da bi formirao razli čite monofunkcionalne i bifunkcionalne adukte. Ovi adukti doprinose citotoksičnosti leka, ometanjem različitih ćelijskih procesa koji zahtevaju separaciju oba DNK lanca poput replikacije i transkripcije.

[0175] Cisplatin je ocenjen klinički protiv različitih tumora zbog njegove čvrste antineoplastične aktivnosti protiv kancera testisa i jajnika. Od njegovog potvrđivanja, cisplatin je kritični hemoterapeutski agens i široko se koristi, pojedinačno ili u kombinaciji sa drugim antineoplastičnim agensima. Takođe je poznato da cisplatin daje značajan palijativan efekat kod pacijenata koji imaju druge tipove tumora, npr. karcinom pluć a, karcinom mokrać ne bešike i karcinom glave i vrata, a uključen je u ve ć inu režima hemoterapije koji se koriste kod ovih bolesti.

[0176] Pemetreksed dinatrijum je strukturno novi antifolat koji poseduje jedinstveno 6-5 kondenzovano pirolo [2,3-d]pirimidinsko jezgro, i koji inhibira funkciju enzima zavisnih od folata koji su uklju čeni u sintezu supstrata neophodnih za rast i deobu ć elija kao što je timidilat sintaza, dihidrofolat reduktaza i glicinamid ribonukleotid formiltransferaza (vidi, npr. Taylor, EC., et al., J Med Chem 35:4450-4454, 1992; Schultz, RM., et al., Anticancer Res 19:437-443, 1999).

[0177] Pemetreksed je pokazao aktivnost u kliničkim ispitivanjima za veliki broj različitih tipova tumora, uključujući tumore pluća, dojke, debelog creva, pleure, pankreasa, želuca, bešike, glave i vrata, i cerviksa. Pemetreksed u kombinaciji sa cisplatinom je odobren od strane FDA 4. Februara 2004. za lečenje pacijenata sa MPM čija je bolest ili neselektivna ili koji inače nisu kandidati za kurativnu hirurgiju.

[0178] U studijama faze II kod pacijenata sa NSCLC koji nisu primali hemoterapiju, pemetreksed u kombinaciji sa cisplatinom ili karboplatinom daje efikasne rezultate uporedive sa drugim platinskim dubletima (vidi, npr Scagliotti, G., et al., Clin Cancer Res 11:690-696, 2005 ; Zinner R., et al., Cancer 104:2449-2456, 2005 ; Manegold, C., et al., Ann Oncol 11:435-440, 2000; Shepherd, FA., et al., Cancer 92:595-600, 2001). Osim toga, pemetreksed ima odličan sigurnosni profil i pogodan raspored administracije.

[0179] Nedavna randomizovana studija faze III je poredila, u studiji ne inferiornosti, ukupno pre življavanje (OS) između 1725 pacijenata koji nisu primali hemoterapiju sa fazama III ili IV NSCLC lečenih cisplatinom plus gemcitabinom ili cisplatinom plus pemetreksedom svake 3 nedelje u trajanju do šest ciklusa (vidi npr. Scagliotti, G., et al., J Clin Oncol 26:3543-3551, 2008; Pimentel, F., et al., Proc Am Soc Clin Oncol 26 (Part I of II):448s, 2008, (Suppl. 15S)(abstr) #448s). OS za cisplatin plus pemetreksed nije inferiorniji od cisplatina sa gemcitabinom (prosečno preživljavanje, 10.3 meseci za oba tretmana). OS je bio statistički superiorniji u odnosu na cisplatin plus pemetreksed u odnosu na cisplatin/gemcitabin kod pacijenata sa adenokarcinomom (n=847; 12.6 meseci, 10.9 meseci, respektivno) i histologijom karcinoma velikih ć elija (n=153; 10.4 meseca i 6.7 meseci, respektivno). Za cisplatin plus pemetreksed, stope neutropenije stepena 3 ili 4, anemije i trombocitopenije; febrilna neutropenija; i alopecija su bile zna čajno niže nego za cisplatin/gemcitabin tretmansku grupu, dok je mučnina stepena 3 ili 4 bila češć a.

PACIJENTI I METODE:

[0180] Dizajn kliničke studije: Otvorena, multicentrična faze II randomizovana, sa dve grupe, komparativna studija. Protokol je ocenio punu dozu cisplatina i pemetrekseda sa ili bez CBP501. Pacijenti su nasumi čno raspoređeni u odnosu 1: 1 prema pemetreksedu, cisplatinu i CBP501 grupa (Arm A) ili pemetreksedu i cisplatinu grupa (Arm B). Randomizacija je stratifikovana u skladu sa početnim stadijumom bolesti (IIIb vs IV), prisustvom metastaza na mozgu i bez obzira da li su pacijenti bili kvalifikovani za terapiju bevacizumabom ili ne.

[0181] Istraživač/lokacija testa: Oko 40 centara u SAD, Rusiji, Kanadi, Brazilu, Argentini i Peruu.

Ciljevi Studije:

[0182] Primarni: Da se uporedi efikasnost, preživljavanje bez progresije, cisplatina i pemetrekseda sa ili bez CBP501 kod pacijenata sa lokalno uznapredovalim (stadijum IIIB sa malignom pleuralnim izlivom ili perikardijalnim izlivom) ili metastatskim (stadijum IV) ne-skvamoznim NSCLC.

[0183] Sekundarni: Da se karakteriše sigurnosni profil studijskih režima i parametri efikasnosti osim preživljavanja bez progresije, kao što je ukupno preživljavanje.

Studijska Populacija:

Kriterijumi Inkluzije:

[0184]

1. Potpisana informisana saglasnost dobijena pre pokretanja bilo kojih postupaka specifi čnih za studiju 2. Histološki ili citološki potvrđena dijagnoza neskvamozni nesitnoćelijski karcinom pluća (NSCLC), koji nije podložan radikalnoj resekciji, stadijum IIIB sa pleuralnim ili perikardijalnim izlivom ili IV stadijum, koji prethodno nije primio hemoterapiju ili drugi sistemski tretman

3. Bar jedna jednodimenzionalno merljiva lezija prema Kriterijumima za Ocenjivanje Odgovora kod Čvrstih Tumora (RECIST)

4. Muški ili ženski pacijenti stari najmanje 18 godina

5. Status performansi ECOG (PS): 0-1

6. Očekivano trajanje života > 3 meseca

7. Dozvoljena je prethodna lokalna radioterapija ako je zavr šena ≥ 3 nedelje pre prve doze ispitivanog leka

8. Dozvoljena je istovremena palijativna radioterapija na postojeć u leziju kosti radi kontrole bolova 9. Prethodna operacija je dozvoljena ako je izvedena najmanje 4 nedelje pre prve doze ispitivanog leka i pacijent treba da je potpuno oporavljen

10. Adekvatna funkcija organa, uključujuć i slede ć e:

• Koštana srž: broj belih krvnih zrnaca (WBC) ≥ 4 x 10<9>/L, apsolutni broj neutrofila (ANC) ≥ 1.5 x 10<9>/L, broj trombocita ≥ 100 x 10<9>/L, hemoglobin ≥ 9 g/dL Jetra: Bilirubin ≤ 1.5 x gornja granica normalnog (ULN), aspartat transaminaze (AST/SGOT) i alanin transaminaze (ALT/ SGPT) ≤ 2.5 x ULN (ili ≤ 5 x ULN ako su prisutne metastaze u jetri), INR ≤ 1.5 x ULN, albumin ≤ 3.0 g/dL

• Renalni: Serumski kreatinin ≤ 1.5 mg/dL ili klirens kreatinina ≥ 45 mL/min (računato prema Cockroft i Gault formuli)

11. Pacijentkinje u rodnoj dobi moraju da imaju negativan test trudnoć e i da koriste najmanje jedan oblik kontracepcije kako je ispitivač odobrio 4 nedelje pre studije i 4 meseca nakon poslednje doze ispitivanog leka. Za potrebe ove studije, potencijal za rođenje deteta je definisan kao: „Sve pacijentkinje osim ako nisu posle menopauze najmanje jednu godinu ili su hirurški sterilne“

12. Muški pacijenti moraju da koriste neki oblik barijerske kontracepcije koji je ispitiva č odobrio tokom ispitivanja i 4 meseca nakon poslednje doze ispitivanog leka

13. Sposobnost saradnje sa tretmanom i prać enje

Kriterijumi isključivanja:

[0185]

1. Terapija zračenjem za više od 30% koštane srži pre ulaska u studiju

2. Prisustvo neuroendokrinih karakteristika u uzorku tumora

3. Prethodno lečenje hemoterapijom, novim biološkim terapijama (mali molekuli, antitela), imunoterapijom

4. Odsustvo merljivih lezija

5. Trajna ili aktivna infekcija, simptomatski li kongestivni srčani zastoj, nestabilna angina pektoris, simptomatska ili loše kontrolirana srčana aritmija, nekontrolisani trombotski ili hemoragični poremeć aj ili bilo koji drugi ozbiljan nekontrolisan medicinski poremeć aj po mišljenju istražitelja

6. Bilo koja prethodna istorija drugog zloć udnog stanja u roku od 5 godina od ulaska u studiju (osim izlečenog karcinoma bazalnih ć elija kože ili lečeni in-situ karcinom grli ć a materice)

7. Prisustvo bilo kojeg značajnog poremeć aja centralnog nervnog sistema (CNS) ili psihijatrijskih poremeć aja koji bi ometali pacijentovu saglasnost

8. Dokaz o perifernoj neuropatiji > 1 stepen prema NCI-CTCAE verziji 3

9. Lečenje bilo kojim drugim ispitivačkim agensom ili učešć e u drugoj kliničkoj studiji u roku od 28 dana pre ulaska u studju

10. Trudnice ili dojilje ili bilo koje pacijentkinje sa rodnim potencijalom koje ne koriste adekvatnu kontracepciju

11. Poznata HIV, HBV, HCV infekcija

12. Prisustvo simptomatskih metastaza na mozgu. Pacijenti sa metastazama na mozgu moraju:

• Imati stabilan neurološki status nakon lokalne terapije (operacija ili zračenje) najmanje 2 nedelje nakon završetka definitivne terapije i prekid upotrebe kortikosteroida 1 nedelju pre ulaska u studiju.

• Biti bez neurološke disfunkcije koja bi ometala procenu neuroloških i drugih AE-a

13. Nemoguć nost ili nespremnost za uzimanja folne kiseline, vitamina B12 ili kortikosteroida

14. Nemoguć nost prekida aspirina ili drugih nesteroidnih protivupalnih sredstava, osim doze aspirina ≤ 1.3 grama dnevno, tokom perioda od 5 dana (8-dnevni period za dugo delujuć a sredstva, kao što je piroksikam)

15. Značajan gubitak težine (≥ 10% telesne težine tokom prethodnih 6 nedelja)

16. Prisustvo klinički značajnih (fizičkim pregledom) nakupina tečnosti treć eg prostora, npr. ascites ili pleuralni izlivi koji se ne mogu kontrolisati drenažom ili drugim postupcima pre ulaska u studiju

Broj pacijenata:

[0186] Tretirano je ukupno 195 pacijenata od kojih je 97 pacijenata tretirano sa CBP501, cisplatinom i pemetreksedom Grupa A (Arm A) i 98 bolesnika je lečeno sa pemetrekedom i cisplatinom Grupa B (Arm B).

Ispitivani lek:

[0187] Formulacija: CBP501 za injektiranje je obezbeđen u pojedinačnim fiolama doze (20 mg) koje sadrže sterilni liofilizovani prah koji sadrži CBP501 peptid acetatnu so (peptidne bazne jedinice). Za administraciju, sadržaji fiola su rekonstituisani u injekciji 5% Dekstroze, USP, i dodati u 100 mL i.v. kesicu sa Injekcijom 5% Dekstroze, USP.

[0188] Pemetreksed: Korišćena je komercijalna formulacija pemetrekseda sa rekonstitucijom u 20 mL 0.9% rastvora natrijum hlorida za injekciju, zatim je razblažena do 100 mL.

[0189] Cisplatin: Korišćena je komercijalna formulacija cisplatina i bila je razblažena u 250 mL fiziološkog rastvora za administraciju.

Dozni režim i način administracije:

[0190] CBP501, pemetreksed i cisplatin je administriran istog dana (Dan 1), svake 3 nedelje za maksimalnih šest ciklusa. Smatralo se da je ciklus 3 nedelje (21 dan).

Grupa A (Arm A)

[0191]

1. CBP50125 mg/m<2>je administriran kao i.v. infuzija 1 sat.

2. Pemetreksed 500 mg/m<2>je administriran kao i.v. infuzija 10 minuta, odmah nakon infuzije CBP501.

3. Cisplatin 75 mg/m<2>je administriran kao 1-satna i.v. infuzija odmah nakon pemetreked infuzije.

Grupa B (Arm B)

[0192]

1. Pemetreksed 500 mg/m<2>je administriran kao i.v. infuzija tokom 10 minuta.

2. Cisplatin 75 mg/m<2>je administriran kao 1-satna i.v. infuzija odmah nakon pemetreksed infuzije.

[0193] Svaka kombinacija je administrirana preko centralnog ili perifernog venskog pristupa.

Profilaktički tretman:

Svi uključeni pacijenti su primili:

[0194]

1. Vitaminski Saplement: svi pacijenti su instruisani da svakodnevno uzimaju oralni preparat folne kiseline niske doze ili multivitamine sa folnom kiselinom. Najmanje 5 dnevnih doza folne kiseline mora biti uzeto u periodu od 7 dana koji prethodi prvoj dozi pemetrekseda i doziranje treba nastaviti celim tokom terapije i 21 dan od poslednje doze pemetrekseda. Predložena doza folne kiseline je u opsegu 350-1000 µg. Pacijenti takođe moraju da prime jednu (1) intramuskularnu injekciju vitamina B12 u nedelji koja prethodi prvoj dozi PE-metrekseda i svaka 3 ciklusa nakon toga. Naknadne injekcije vitamina B12 mogu biti date isti dan kao pemetreksed. Doza vitamina B12 je bila 1000 µg.

2. Deksametazon 4 mg oralno, dva puta dnevno, dan ranije, na dan primene tretmana i slede ći dan.

3. Profilaktički antiemetički tretman: sastoji se od 5HT3 antagonista+steroida prema standardnim protokolima centara za tretman. Pacijenti su po potrebi dobijali dodatne oralne antiemetike.

[0195] • Sledeći protokol hidratacije je predložen kod pacijenata bez kardiovaskularnog oštećenja. Slični protokoli koji se rutinski administriraju u istraživačkim centrima mogu da budu primenjeni:

1. Pacijenti su primili ukupno 1.5-2.0 litara hidratacije (5% dekstroza ili 1⁄2 normalni fiziološki rastvor) sa 20 mEq KCI/litru i 1 g MgSO4/litru, sa 500 mL/sat.

2. Nakon što je pacijent primio 1 sat infuzije za hidrataciju, 12.5 g manitola je administrirano (IV push).

3. Cisplatin infuzija (pomešan u normalnom slanom rastvoru pri 1 mg/mL) je zatim ubrizgavana tokom 1 h, uz kontinuiranu infuziju za hidrataciju.

4. Dodatni manitol je administriran (12.5-50.0 g primenjenih sa IV push), ako je potrebno da se urinarni izlaz održi na 250 mL/čas tokom trajanja hidratacije.

[0196] • Za pacijente koji su tretirani sa CBP501 (Arm A), preporučeno je da dobiju sledeći profilaktički režim za smanjenje incidence i težine simptoma usled oslobađanja histamina:

1. Difenhidramin (DPH) 50 mg IV i Ranitidin 50 mg IV (ili drugi histaminski H2 antagonist) pre svake CBP501 infuzije.

2. Loratadin (10 mg) PO dan ranije (dan-1), na dan CBP501 administracije (dan 0) i dan posle (dan 1).

Trajanje perioda ispitivanja po pacijentu:

[0197] Pacijenti su dobijati najviše šest ciklusa tretmana studije osim ako je nešto od sledećeg ranije primećeno:

• progresija bolesti

• neprihvatljiva toksičnost

• povlačenje saglasnosti

• ozbiljno kršenje protokola

• odlaganje lečenja > 2 nedelje (osim u slučaju potencijalne ili uočene koristi za pacijenta)

[0198] Nakon prekida tretmana, pacijenti će biti praćeni svakih 8 nedelja do progresije bolesti ili pokretanja dalje sistemske terapije protiv kancera, a zatim svakih 6 meseci do smrti.

Informisana Saglasnost

[0199] Istraživač je detaljno objasnio pacijentu svrhu i metode ispitivanja, kao i bilo koje o čekivane efekte i neželjene reakcije, pre izvođenja bilo kakvih, za studiju, specifičnih skrining procedura. Pacijentu je obezbeđena informativna lista i dobio je dovoljno vremena i mogućnosti da se raspita o detaljima studije i odluči da li hoće da učestvuje ili ne. Pacijent i osoba koji su razgovarali o informisanoj saglasnosti su potpisali i datirali obrazac o saglasnosti.

[0200] Istraživač je objasnio da je pacijent bio potpuno slobodan da odbije da uđe u studiju ili da se povuče iz nje u bilo koje vreme i iz bilo kog razloga. Slično tome, istraživač i/ili sponzor su bili slobodni da povuku pacijenta u bilo kom trenutku zbog bezbednosnih ili administrativnih razloga. Bilo koji drugi uslovi neophodni za zaštitu ljudskih prava pacijenta su objašnjeni, u skladu sa trenutnom CFR (21, delovi 312D, 50 i 56) i ICH (ICH E61997) GCP smernice i Helsinška Deklaracija, 1964. (kako je razjašnjeno u Tokiju 2004. godine).

Dodela Brojeva Pacijentima

[0201] Randomizacijom pacijenata i raspoređivanjem u grupu za tretman je centralno upravljano.

Statistička analiza:

[0202] Za procenu odnosa rizika (HR) za PFS između 2 tretmanske grupe (arm) je korišćen Cox-ov model sa proporcionalnim rizikom. Model je uključivao grupu za tretman kao faktor, kao i faktore randomizacije i stratifikacije. Sledeće kovarijable su istražene: starost, pol, rasa (Kavkazoidna/ne-kavkazoidna), prethodna operacija/procedura (da/ne), prethodna radioterapija (da/ne), interpretacija rendgenskog snimka (normalan/abnormalan), interpretacija EKG-a (normalan/abnormalan), snimak kosti (normalan/abnormalan), i vreme od postavljanja dijagnoze. Bilo koje kontinualne varijable kao što su starost i vreme od dijagnoze do studijskog tretmana bi mogle biti pretvorene u kategoričke promenljive određivanjem 2 ili nekoliko klasa vrednosti ako bi se dobilo bolje fitovanje modela. Istražne varijable su unete korišćenjem algoritma postepene regresije korišćenjem sledećih kriterijuma: varijabla mora biti značajna na nivou 0.25 da bi bila uneta u model i značajna na nivou 0.15 da bi ostala u modelu. Za finalni model, tačke procene odnosa rizika su date sa 95% intervalom poverenja (CI).

[0203] Analize podgrupa su sprovedene za pacijente koji su na skriningu imali WBC<10000/µL. Dodatna analiza podgrupa je izvedena sa softverom GraphPad Prism 5 sa sirovim podacima o svim analiziranim pacijentima.

Rezultati efikasnosti:

[0204] Analiza u Cox-modelu sa proporcionalnim rizikom bez istraživanja drugih kovarijabli za preživljavanje bez progresije bolesti (PFS) je pokazala da Grupa A (grupa sa CBP501) ima veći rizik od Grupe B (HR = 1.20 [0.88, 1.65]), ali razlika nije bila statistički značajna (P = 0.25). Isti model koji je razmatrao druge kovarijable je takođe ukazivao da Grupa A ima veći rizik od Grupe B (HR = 1.21 [0.85, 1.73]), ali razlika nije bila statistički značajna (P = 0.30).

[0205] Za pacijente koji su imali WBC<10000/ml na skriningu, analiza u Cox-ovom modelu sa proporcionalnim rizikom bez istraživanja drugih kovarijabli je pokazala da Grupa A ima već i rizik od Grupe B (HR = 1.04 [0.73, 1.49]), ali razlika nije bila statistički značajna (P=0.81). Isti model koji je istraživao druge kovarijable takođe je pokazao da Grupa A ima već i rizik od Grupe B (HR = 1.06 [0.71, 1.59]), ali razlika nije bila statistički značajna (P = 0.78).

[0206] Konstatovano je da je odnos rizika za PFS poboljšava za Grupu A kada je analiza ograničena na pacijente koji su imali WBC<10000/ µL na skrining u obe analize (Tabele A, B).

Tabela A Cox Analiza kovarijabli na PFS bez istraživanja drugih kovarijabli Cox analiza kovarijabli za PFS sa nezavisnim radiološkim pregledom bez istraživanja drugih kovarijabli Odnos rizika P-vrednost

Svi tretirani 1.20 0.25

WBC <10000 1.04 0.81

Tabela B Cox Analiza kovarijabli na PFS sa istraživanjem drugih kovarijabli Razmotrila druge kovarijabli

Odnos rizika P-vrednost

Svi tretirani 1.21 0.30

WBC <10000 1.06 0.78

Analiza u Cox-modelu za ukupno preživljavanje (OS) na svim Tretiranim Populacijama

[0207] Grupa A ima manji rizik od Grupe B sa i bez istraživanja drugih kovarijabli (HR = 0.96 i 0.77). Razlika nije bila statistički značajna (P = 0.82 i 0.25).

Analiza u Cox-modelu sa proporcionalnim rizikom OS pacijenata sa WBC<10000/µL na Skriningu [0208] Za OS kod pacijenata koji su imali WBC<10000/µL na skriningu u tretiranoj populaciji, Grupa A je imala manji rizik od Grupe B sa i bez istraživanja drugih kovarijabli (HR = 0.80 i 0.69); razlika nije bila statistički značajna (P = 0.32 i 0.16).

[0209] Konstatovano je da se odnos rizika na OS poboljšava za Grupu A kada je analiza ograničena na pacijente sa WBC<10000/µL na skriningu u svim analizama (Tabele C, D).

Tabela C Cox Analiza kovarijabli za OS bez istraživanja drugih kovarijabli Cox Analiza kovarijabli na ukupno preživljavanje bez istraživanja drugih kovarijabli

Odnos rizika P-vrednost

Svi tretirani 0.96 0.82

WBC<10000 0.80 0.32

Tabela D Cox Analiza kovarijabli za OS bez istraživanja drugih kovarijabli Cox Analiza kovarijabli na ukupno preživljavanje bez istraživanja drugih kovarijabli

Odnos rizika P-vrednost

Svi tretirani 0.77 0.25

WBC<10000 0.69 0.16

[0210] Slika 14 prikazuje Kaplan-Meyer krive preživljavanja, prosečno OS i odnos rizika u odnosu na WBC na skriningu (bazne vrednosti) kod svih tretiranih pacijenata. Koeficijent opasnosti se pobolj šava kako nivo odsecanja opada i dostiže maksimum na WBC 8000/µL kao nivou granične vrednosti.

[0211] Pozivajući se na Sliku 17, neutrofili su prečišćeni sa EasiSep kitom za obogaćivanje neutrofila (Stemcell Technol.) iz ljudske periferne krvi nakon uklanjanja crvenih krvnih ćelija sa Hetasep (Stemcell Technol.). Prečišćeni neutrofili (1x10<6>ćelija/bunarčiću, su kultivisani na pločama sa 24 bunarčića sa ili bez 1 µM CBP501 tokom 15 minuta (reakcija je prekinuta dodavanjem EDTA) i jo š četiri sata sa 1 nM PMA, 3 ili 10 µM A23187, ili 100 ili 1000ng/ml LPS. Bunarčići su isprani dva puta i inkubirani sa DNase tokom 15 min i supernatanti su sakupljeni, inkubirani sa elastaza supstratom tokom 2 sata i zatim analizirani za otkrivanje aktivnosti elastaze.

[0212] Pozivajući se na Sliku 18, C57BL/6 miševa, starosti 8 nedelja su intravenozno injektirani sa ili bez LPS 2.5, 5 ili 10 ug/ml 30 minuta pre injekcije difenhidramina. CBP501 (7.5 mg/kg) je ubrizgan 30 minuta posle injekcije diphenhidramina. Trombin/antitrombin kompleks je kvantifikovan sa ELISA u plazmi koja je izdvojena iz krvi izvađene 3 sata posle CBP501 ili lažne mock injekcije. Podaci su dobijeni za svako stanje od četiri životinje.

[0213] Pozivajući se na Sliku 19, makrofagi su dobijeni stimulacijom ljudskih mononuklearnih ćelija periferne krvi sa 0.32uM PMA i uklanjanjem svih ćelija iz suspenzije 48 sati od PMA stimulacije. Ćelije su zatim inkubirane sa 50 ng/ml IFN-gamma, 10 ng/ml LPS da se dobije M1 fenotip, i 20ng/ml IL-4 da se dobiju M2 makrofagi. Oba tretmana su bila sa ili bez CBP501. Fagocitarna aktivnost je praćena pomoću fluorescentnih perlica i protočne citometrije.

[0214] Pozivajući se na Sliku 20, ćelijska linija makrofaga RAW264.7 je inkubirana sa ili bez 0.1 ili 1 µM CBP501 tokom 3-6 sati, a zatim je inkubirana sa ili bez 10 ili 1000ng/ml LPS tokom 4 sata. Oslobođeni TNF su mereni ELISA testom.

[0215] CBP501 je pokazao potencijal kao efikasan anti-tumorski agens u pretkliničkoj (Sha, S., et al. Mol. Cancer Ther. 6:147 (2007)) i kliničkim studijama Faze I (Shapiro, G.I., et al. Clin. Cancer Res. (2011)). CBP501 može da deluje preko dva mehanizma delovanja, npr. preko ukidanja kontrolne tačke G2 ćelijskog ciklusa (Sha, S., et al. Mol. Cancer Ther. 6:147 (2007)) i koncentracije platine u ćelijama tumora ili preko inhibicije Kalmodulina (Mine, N., et al. Mol. Cancer Ther. 10:1929 (2011)).

[0216] Kao što je ovde prikazano, neočekivano je otkriveno analizom podgrupa u populaciji pacijenata Faze II kliničke studije sa karcinomom ne-skvamoznih, ne-malih ćelija pluća da postoji statistički značajna razlika (p<0.0001) u preživljavanju između grupa pacijenata sa visokim brojem belih krvnih zrnaca (WBC) u skriningu i onih sa normalnim ili malim brojem WBC.

[0217] Zatim kako ovde pokazuju rezultati, CBP501, pored direktnog dejstva na ćelije tumora, takođe može da deluje na mikro-okruženje tumora, kao što su makrofagi, inhibiranjem Kalmodulina i povećanjem neutrofilnih ekstracelularnih zamki (NET) kada su pacijenti pod upalom smanjenjem klirensa/fagocitoze zamki pomoću makrofaga. Ovo može povećati šansu za dobijanje duboke venske tromboze (DVT) i metastaze, i tako potencijalno negativno uticati na preživljavanje pacijenata. Nasuprot tome, inhibicija M2 tipa makrofaga kod pacijenata može sprečiti pozitivno delovanje makrofaga na rast tumora, angiogenezu, metastazu i imunolo šku evaziju tumora, sve ovo promoviše tumorske metastaze koje mogu da skrate preživljavanje pacijenata.

[0218] U skladu sa ovom obzervacijom, dokazano je pojačana formacija neutrofilnih zamki aktiviranih tretmanom sa CBP501 in vitro i poveć ana formacija trombin/Anti-trombin kompleksa kod mi ševa stimulisanih sa LPS. Takođe je dokazana inhibicija izlučivanja citokina i fagocitoza oba tipa M1 i M2 makrofaga pomoć u CBP501.

[0219] Iako su kliničke studije pokazale da CBP501 deluje poboljšavajuć i citotoksičnost cisplatina protiv ćelija tumora, rezultati ovde pokazuju neočekivani nalaz analize podgrupe koja je urađena u studiji faze II na pacijentima sa ne-skvamoznim NSCLC i ukazuju na to da su grupe pacijenata sa visokim brojem belih krvnih zrnaca (WBC) pri skriningu kliničke studije preživljavali krać e, a ostale grupe pacijenata sa normalnom ili niskim WBC su živele duže u odgovoru na režim sa CBP501, a razlika je bila statistički vrlo značajna, a p vrednost izračunata na Kaplan-Mejerovim krivim ukupnog preživljavanja po Log-rank (Mantel-Cox) testu je bila manja od 0.0001.

[0220] Neočekivano je otkriveno da pacijenti sa normalnim ili niskim WBC pre tretmana imaju koristi od CBP501 tretmana, dok bi na pacijente sa visokim WBC isti tretman mogao imati negativne posledice. Inhibitorna aktivnost CBP501 na Kalmodulin ukazuje da uticaj na različite ćelije u mikro-okruženju, kao što su makrofagi, leukociti i limfociti, može da inhibira ili modulira njihovu aktivnost što bi moglo dovesti do dvosmernih rezultata pošto, na primer, samo inhibiranjem makrofaga, ako se inhibira M1 tip makrofaga, to može imati negativan uticaj na preživljavanje pacijenata, a ako se inhibira M2 tip makrofaga to bi produ žilo preživljavanje pacijenata.

[0221] Prijavljeno je da inhibitori kalmodulina inhibiraju vi še funkcija makrofaga (Horwitz, S.B., et al. J. Cell Biol. 91:798 (1981); Takenawa, T., et al. Biochem J. 15:208 (1982); Westra, J., et al. BMC Musculoskelet. Disord. 30:11 (2010)), leukocytes (Naccache, P.H., et al. Biochem. Biophys. Res. Commun. 97(1):62 (1980); Takeshige, K., et al. Biochem. Biophys. Res. Commun. 99(2):484 (1981); Jones, H.P., et al. Biochem Biophys. Acta. 714(1):152 (1982); Jones, H.P., et al. Methods Enzymol. 015:389 (1984); Verploegen, S., et al. Eur. J. Biochem. 269(18) 4625 (2002)) i limfocita (Salisbury, J.L., et al. Nature 12:294 (1981); Boubali, S., et al. Mol. Immunol. 52(2):51 (2012)). Pacijenti sa visokim brojem WBC ć e imati tendenciju da imaju M1 makrofage, jer su pro-inflamatorni tip, a pacijenti sa normalnim ili niskim WBC sa tumorom imaju tendenciju da imaju M2 makrofage (Hao, N., et al., Clin. Dev. Immunol. (2012)). Takođe se zna da su pacijenti sa visokim WBC podložniji dubokoj trombozi vena (DVT) (Pabinger, I., et al. Blood 122:12 (2013); Blix, K., et al. PLOS One 4:8 (2013); Wang, T.F., et al. Thromb. Res. 133(1):25 (2014)), što je uzrok smrti značajnog broja pacijenata obolelih od karcinoma. Ovi pacijenti imaju tendenciju da imaju vi še zamki (NET-s), a zamke promovišu metastazu tumora (CoolsLartigue, J., et al. J. Clin. Invest. (2013)) što je jedan od razloga za kratku prognozu za mnoge pacijente obolele od karcinoma, uključujuć i i one s karcinomom plu ć a.

[0222] U ovom primeru nije utvrđena statistički značajan benefit preživljavanja nakon dodavanja CBP501 standardnom režimu, pemetrekseda i cisplatina, kada je analiziran u celoj tretiranoj populaciji. Me đutim, analizom podgrupa neočekivano je utvrđeno da je dodavanje CBP501 koristilo grupi ljudi koji su pokazivali normalan ili mali broj belih krvnih zrnaca (WBC) tokom skrininga za kliničku studiju. Normalna vrednost WBC zavisi od lokacije i zemlje. Normalne gornje granice WBC bi mogle biti od 8000/µl do 11000/µl.

[0223] Bilo je iznenađujuć e da su pacijenti sa normalnim rasponom WBC imali koristi od CBP501, a da su oni sa visokim WBC tokom skrininga imali lošije rezultate od pacijenata lečenih cisplatinom i pemetreksedom, mada obe razlike nisu statistički značajne u poređenju sa kontrolnom grupom, cisplatinom i pemetrekedom lečenom populacijom.

[0224] Iako tačan razlog za ovo potencijalno dvosmerno delovanje CBP501 nije evidentan, inhibitorno delovanje CBP501 na Kalmodulin ukazuje da inhibicija Kalmodulina u različitim ć elijama u mikrookruženju, kao što su makrofagi, leukociti i limfociti, inhibira ili modulira njihovu aktivnost što podstiče dvosmerno delovanje, pošto, na primer, ako inhibira makrofage tipa M1, negativno bi uticao na opstanak pacijenta inhibirajuć i antitumorsku aktivnost makrofaga i/ili inhibiraju ć i klirens zamki, po što zamke promovišu trombogenezu i metastazu, a ako inhibira pro-tumorne M2 makrofage produ žio bi preživljavanje pacijenta. Pored toga, poznato je da cisplatin preusmerava makrofage iz tipa M1 u M2 (Dijkgraaf, E.M., et al. Cancer Res. 15:73(8):2480 (2013)), a poznato je da hemoterapija sama po sebi promoviše metastazu tumora (Haas, M.J. SciBX 1-3 (2011)) tako da prisustvo CBP501 dok je hemoterapija uključena možda ima značajan uticaj na metastazu tumora. Poznato je da inhibitori kalmodulina mogu inhibirati vi še funkcija makrofaga (Horwitz, S.B., et al. J. Cell Biol. 91:798 (1981); Takenawa, T., et al. Biochem J. 15:208 (1982); Westra, J., et al. BMC Musculoskelet. Disord. 30:11 (2010)), leukocita (Naccache, P.H., et al. Biochem. Biophys. Res. Commun.

97(1):62 (1980); Takeshige, K., et al. Biochem. Biophys. Res. Commun. 99(2):484 (1981); Jones, H.P., et al. Biochem Biophys. Acta. 714(1):152 (1982); Jones, H.P., et al. Methods Enzymol. 015:389 (1984); Verploegen, S., et al. Eur. J. Biochem. 269(18) 4625 (2002)) i limfocita (Salisbury, J.L., et al. Nature 12:294 (1981); Boubali, S., et al. Mol. Immunol. 52(2):51 (2012)). Pacijenti sa visokim WBC će imati tendenciju da imaju više M1 makrofaga pošto su oni pro-inflamatorni a pacijenti sa normalnim ili niskim WBC i sa tumorom će imati tendenciju da imaju M2 makrofage (Hao N., et al. Clin. Dev. Immunol. (2012)). Takođe, pacijenti sa visokim WBC će imati tendenciju da imaju više zamki. Ako je fagocitoza zamki sprečena pomoću CBP501, pacijenti će biti u povećanom riziku od dobijanja DVT i metastaze koje bi obe skratile vreme preživljavanja.

[0225] Alternativno, buduć i da je kalmodulin uključen u normalne funkcije belih krvnih zrnaca (Horwitz, S.B., et al. J. Cell Biol. 91:798 (1981); Takenawa, T., et al. Biochem J. 15:208 (1982); Westra, J., et al. BMC Musculoskelet. Disord. 30:11 (2010); Naccache, P.H., et al. Biochem. Biophys. Res. Commun. 97(1):62 (1980); Takeshige, K., et al. Biochem. Biophys. Res. Commun. 99(2):484 (1981); Jones, H.P., et al. Biochem Biophys. Acta. 714(1):152 (1982); Jones, H.P., et al. Methods Enzymol. 015:389 (1984); Verploegen, S., et al. Eur. J. Biochem. 269(18) 4625 (2002); Salisbury, J.L., et al. Nature 12:294 (1981); Boubali, S., et al. Mol. Immunol.

52(2):51 (2012); Hao, N., et al. Clin. Dev. Immunol. (2012)), CBP501 može ometati i isključiti njegov koristan uticaj na ukupno preživljavanje potencijalnim ošteć ivanjem funkcije WBC kada je preko potrebna, npr. u situaciji kada pacijenti imaju akutnu infekciju koja poveć ava broj belih krvnih zrnaca.

[0226] Inhibicija kalmodulina takođe može uticati na imunitet protiv raka delujuć i na limfocite, po što je predloženo da Kalmodulin može indukovati anergiju T ć elija (Boubali, S., et al., Mol. Immunol. 52(2):51 (2012)).

[0227] Pokazalo se da je predtretman ili početni broj WBC faktor prognoze za pacijente sa NSCLC lečene terapijom na bazi platine (Teramukai, S., et al. Eur. J. Cancer (45(11:1950 (2009); Kim, J.W., et al. Cancer Res. Trest. 45:4):325 (2013)). CBP501 može pojačati ovaj efekat modulacijom aktivnosti cisplatina. Buduć i da svaki pacijent dobija laboratorijsku analizu broja WBC kao univerzalno odobrenu standardnu proceduru pre tretmana, pacijenti mogu biti odabrani na osnovu broja WBC.

[0228] Inhibicija kalmodulina pomoć u CBP501 takođe može direktno inhibirati migraciju tumora i metastaze, nezavisno od koncentracije platine, jer je pokazano da kalmodulin ima va žnu ulogu u migraciji (Wang, H., et al. Nat. Commun. 4:1354 (2013)).

Claims

Patentni zahtevi

1. Peptidno jedinjenje koje ima antitelijsku proliferativnu aktivnost koje sadr ži (d-Bpa) (d-Ser) (d-Trp) (d-Ser) (d-Phe-2,3,4,5,6-F) ( d-Cha) (SEK ID NO:1), pri čemu peptidno jedinjenje dalje sadrži peptid za prodiranje u ć eliju koji je vezan ili konjugovan na njega, ili farmaceutski prihvatljivu so peptidnog jedinjenja, za upotrebu u profilaksi ili lečenju ć elijskog proliferativnog poreme ć aja kod sisara, naznačen time što sisar ima broj belih krvnih zrnaca manji od 11.000 belih krvnih zrnaca po mikrolitru (wbc/µl) krvi.

2. Peptidno jedinjenje za upotrebu prema patentnom zahtevu 1, pri čemu sisar ima broj belih krvnih zrnaca manji od 10.000 belih krvnih zrnaca po mikrolitru (wbc/µl) krvi.

3. Peptidno jedinjenje za upotrebu prema patentnom zahtevu 1, pri čemu sisar ima broj belih krvnih zrnaca između 4.000 i 11.000 belih krvnih zrnaca po mikrolitru (wbc/ml) krvi.

4. Peptidno jedinjenje za upotrebu prema patentnom zahtevu 1, pri čemu peptidno jedinjenje ima dužinu od 6 do 10, 10 do 15, 15 do 20, 20 do 25, 25 do 30, 30 do 40, 40 do 50, 50 do 75, 75 do 100, 100 do 150, 150 do 200 ili 200 do 300 aminokiselinskih rezidua.

5. Peptidno jedinjenje za upotrebu prema patentnom zahtevu 1, pri čemu je peptid za penetraciju u ć eliju povezan sa peptidnim jedinjenjem pomoću kovalentne veze, ili peptidnog ili nepeptidnog linkera.

6. Peptidno jedinjenje za upotrebu prema patentnom zahtevu 5, pri čemu peptid za penetraciju u ć eliju sadrži (i) naizmenični raspored polarnih/naelektrisanih aminokiselina i nepolarnih, hidrofobnih aminokiselina; (ii) polikatjonsku ili amfipatičku strukturu alfa-heliksa; (iii) L- ili D-izomerne aminokiseline; (iv) sme šu L- i D-izomernih aminokiselina; ili (v) poli-Argininsku (Arg) sekvencu.

7. Peptidno jedinjenje za upotrebu prema patentnom zahtevu 5, pri čemu peptid za penetraciju u ć eliju sadrži ili se sastoji od (d-Arg) (d-Arg) (d-Arg) (d-Gln) (d-Arg) (d-Arg).

8. Peptidno jedinjenje za upotrebu prema patentnom zahtevu 1, pri čemu peptidno jedinjenje sadrži: (d-Bpa) (d-Ser) (d-Trp) (d-Ser) (d-Phe-2,3,4,5,6-F) (d-Cha) (d-Arg) (d-Arg) (d-Arg) (d-Gln) (d-Arg) (d-Arg) (SEK ID NO:80).

9. Peptidno jedinjenje za upotrebu prema bilo kojem od patentnih zahteva od 1 do 8, pri čemu je njegova farmaceutski prihvatljiva so odabrana između acetata, sulfonata, sulfata, pirosulfata, bisulfata, sulfita, bisulfita, fosfata, monohidrogenfosfata, dihidrogen-fosfata, metafosfata, pirofosfata, hlorida, bromida, jodida, propionata, dekanoata, kaprilata, akrilata, formata, izobutirata, kaproata, heptanoata, propiolata, oksalata, malonata, sukcinata, suberata, sebakata, fumarata, maleata, butin-1,4-dioata, heksin-1,6-dioata, benzoata, hloro-benzoata, metil-benzoata, dinitrobenzoata, hidroksibenzoata, metoksibenzoata, ftalata, ksilen-sulfonata, fenilacetata, fenilpropionata, fenilbutirata, citrata, laktata, b-hidroksibutirata, glikolata, tartarata, metan-sulfonata, propansulfonata, naftalen-1-sulfonata, naftalen-2-sulfonata i mandelata.

10. Peptidno jedinjenje za upotrebu prema bilo kojem od patentnih zahteva od 1 do 9, koje dalje obuhvata upotrebu sredstva za ošteć enje nukleinske kiseline izabranog između hemoterapijskog sredstva ili radioizotopa.

11. Peptidno jedinjenje za upotrebu prema patentnom zahtevu 10, pri čemu je hemoterapeutsko sredstvo izabrano od sledećeg: cisplatin (cisplatin, cis-diamindihloroplatinum(II), CDDP), karboplatin, nedaplatin, mitaplatin, satraplatin, pikoplatin, triplatin, miriplatin, oksaliplatin, pemetreksed, gemcitabin, 5-fluorouracil (5-FU), rebekamicin, adriamicin (ADR), bleomicin (Bleo), pepleomicin, kamptotecin (CPT), ciklofosfamid, azatioprin, ciklosporin A, prednizolon, melfalan, hlorambucil, mehloretamin, busulfan, metotreksat, 6-merkaptopurin, tioguanin, citozin arabinozid, AZT, 5-azacitidin (5-AZC), jedinjenje srodno 5-azacitidinu, aktinomicin D, mitramicin, mitominicin C, karmustin, lomustin, semustin, streptozotocin, hidroksiurea, mitotan, prokarbazin, dakarbazin, taksan, vinblastin, vinkristin, doksorubicin, dibromomannitol, zra čenje ili radioizotop.

12. Peptidno jedinjenje za upotrebu prema patentnom zahtevu 11, pri čemu je zračenje odabrano od UV zračenja, IR zračenja, rendgenskog zračenja, alfa-zračenja, beta-zračenja i gama-zračenja ili je radioizotop izabran od I<131>, I<125>, Sr<89>, Sm<153>, I<90>i Lu<177>.

13. Peptidno jedinjenje za upotrebu prema bilo kojem od patentnih zahteva od 1 do 12, pri čemu poremeć aj proliferacije ć elija obuhvata tumor ili rak.

14. Peptidno jedinjenje za upotrebu prema patentnom zahtevu 13, pri čemu je tumor ili karcinom odabran između karcinoma, sarkoma, limfoma, leukemije, adenoma, adenokarcinoma, melanoma, glioma, glioblastoma, meningioma, neuroblastoma, retinoblastoma, astrocitoma, oligodendrocitoma, mezotelioma, retikuloendotelne, limfatične neoplazije i hematopoetske neoplazije.

15. Peptidno jedinjenje za upotrebu prema patentnom zahtevu 13, pri čemu tumor ili karcinom obuhvata tumor pluć a ili karcinom plu ć a.

16. Peptidno jedinjenje za upotrebu prema patentnom zahtevu 15, pri čemu tumor ili rak pluć a obuhvata nesvakvamozni karcinom pluć a ne-malih ć elija.

17. Peptidno jedinjenje za upotrebu prema bilo kojem od patentnih zahteva od 1 do 16, pri čemu je sisar čovek.

18. Peptidno jedinjenje za upotrebu prema bilo kojem od patentnih zahteva od 1 do 17, pri čemu peptidno jedinjenje uključuje farmaceutsku formulaciju.