[go: up one dir, main page]

RS60131B1 - Humanizovana ili himerna anti-cd3 antitela - Google Patents

Humanizovana ili himerna anti-cd3 antitela

Info

Publication number
RS60131B1
RS60131B1 RS20200307A RSP20200307A RS60131B1 RS 60131 B1 RS60131 B1 RS 60131B1 RS 20200307 A RS20200307 A RS 20200307A RS P20200307 A RSP20200307 A RS P20200307A RS 60131 B1 RS60131 B1 RS 60131B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
antibody
heavy chain
igg1
human
amino acid
Prior art date
Application number
RS20200307A
Other languages
English (en)
Inventor
Den Brink Edward Van
Joost J Neijssen
Aran Frank Labrijn
Joyce Meesters
Janine Schuurman
Paul Parren
Original Assignee
Genmab As
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from PCT/EP2013/064330 external-priority patent/WO2014006217A1/en
Application filed by Genmab As filed Critical Genmab As
Publication of RS60131B1 publication Critical patent/RS60131B1/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2809—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against the T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
    • C07K16/10—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from RNA viruses
    • C07K16/1036—Retroviridae, e.g. leukemia viruses
    • C07K16/1045—Lentiviridae, e.g. HIV, FIV, SIV
    • C07K16/1063—Lentiviridae, e.g. HIV, FIV, SIV env, e.g. gp41, gp110/120, gp160, V3, PND, CD4 binding site
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2863—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for growth factors, growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2887—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against CD20
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2896—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against molecules with a "CD"-designation, not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/32—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against translation products of oncogenes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/42—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins
    • C07K16/4208—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins against an idiotypic determinant on Ig
    • C07K16/4241—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins against an idiotypic determinant on Ig against anti-human or anti-animal Ig
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6854—Immunoglobulins
    • G01N33/686—Anti-idiotype
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6872—Intracellular protein regulatory factors and their receptors, e.g. including ion channels
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/40—Immunoglobulins specific features characterized by post-translational modification
    • C07K2317/41—Glycosylation, sialylation, or fucosylation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/51—Complete heavy chain or Fd fragment, i.e. VH + CH1
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/515—Complete light chain, i.e. VL + CL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/524—CH2 domain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/526—CH3 domain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/53—Hinge
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/567—Framework region [FR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/71—Decreased effector function due to an Fc-modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/732—Antibody-dependent cellular cytotoxicity [ADCC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/734—Complement-dependent cytotoxicity [CDC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/74—Inducing cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/75—Agonist effect on antigen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/70503—Immunoglobulin superfamily, e.g. VCAMs, PECAM, LFA-3
    • G01N2333/7051—T-cell receptor (TcR)-CD3 complex

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • AIDS & HIV (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Description

Opis
Oblast tehnike
[0001] Predmetni pronalazak se odnosi na humanizovano antitelo koje se vezuje za humani CD3, kompozicije koje sadrže navedeno humanizovano antitelo i na navedena humanizovana antitela za upotrebu u lečenju oboljenja.
Stanje tehnike
[0002] Klaster diferencijacije 3 (CD3) je poznat već duži niz godina i stoga je bio predmet interesovanja u mnogim aspektima. Specifična antitela dobijena za CD3 ili T-ćelijski receptorski kompleks, čiji je CD3 deo, su poznata. Opisana je in vitro karakterizacija pet humanizovanih OKT3 efektorskih funkcionalnih varijanti antitela [1].
[0003] Rezultat tretmana sa anti-CD3 monoklonskim antitelom hOKT3gama1 (Ala-Ala) su pobolјšani C-peptidni odgovori i klinički parametric, tokom namanje dve godine nakon početka dijabetesa tipa 1, u odsustvu kontinuirane primene imunosupresivnih lekova [2].
[0004] Obećavajući pristup za pobolјšanje cilјane terapije antitelima je specifična isporuka citotoksičnih ćelija do kancerskih ćelija koje eksprimiraju antigen. Ovaj koncept upotrebe T-ćelija za efikasno ubijanje tumorskih ćelija je opisan [3]. Ipak, inicijalna klinička ispitivanja su bila prevashodno razočaravajuća, uglavnom zbog slabe efikasnosti, ozbilјnih neželјenih efekata (citokinska oluja) i imunogenosti bispecifičnih antitela [4]. Napredak u dizajnu i primeni bispecifičnih antitela je delimično prevazišao početnu barijeru tipa citokinske oluje i pobolјšao kliničku efikasnost, bez toksičnosti koja bi bila ograničena dozom [5].
[0005] Na primer, određena bispecifična antitela koja jednim krakom cilјano deluju na antigen na tumorskoj ćeliji, a drugim krakom, na primer, na CD3 na T-ćelijama, obezbeđuju vezivanje Fc receptora posredstvom Fc regiona. Nakon vezivanja, obrazuje se kompleks T-ćelija, tumorskih ćelija i efektorskih ćelija koje vezuju Fc region antitela, što dovodi do ubijanja tumorskih ćelija [4]. Katumaksomab se sastoji od heterodimera mišjegG2a i IgG2b pacova i pokazao se uspešnim u lečenju pojave ascita povezanih sa kancerom, nakon intraperitonealne primene [6]. Međutim, hibrid miša i pacova je imunogen [7] i ne može biti primenjen u cilju dugoročnog intravenskog lečenja kod lјudi. Česti neželјeni događaji povezani sa lečenjem, koji se pripisuju katumaksomabu, obuhvataju simptome povezane sa oslobađanjem citokina (tj. pireksiju, mučninu, povraćanje, jeze, tahikardiju i hipotenziju) [8]-[9], koji su posledica efektorskih funkcija Fc regiona katumaksomaba. Drugo antitelo je ertumaksomab (HER2xCD3), koji indukuje citotoksičnost u ćelijskim linijama sa niskom ekspresijom HER2. Ertumaksomab je bio u fazi II kliničkog razvoja za metastatski kancer dojke [10]-[11].
[0006] Opisana su anti-CD3 antitela koja unakrsno reaguju sa CD3 cinomolgus majmuna i/ili rezus majmuna [12]-[13], međutim, potrebna su dodatna pobolјšanja za takva antitela sa unakrsnom reaktivnošću.
[0007] Opisana su i bispecifična antitela koja ispoljavaju specifičnost za antigene između vrsta, radi procene njihove in vivo bezbednosti i/ili aktivnosti i/ili farmakokinetičkog profila kod vrsta različitih od čoveka i kod ljudi [85].
Kratko izlaganje suštine pronalaska
[0008] Predmet pronalaska je da se obezbede humanizovana anti-CD3 antitela. Tako, prema jednom aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje humanizovano antitelo koje se vezuje za humani CD3, pri čemu navedeno antitelo sadrži vezujući region koje sadrži varijabilni region teškog lanca (VH) iz SEQ ID NO:6 i varijabilni region lakog lanca (VL) iz SEQ ID NO:10
[0009] Prema drugom aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje bispecifično antitelo koje sadrži prvi vezujući region antitela prema pronalasku i drugi vezujući region koji vezuje različit ciljni molekul od navedenog prvog regiona vezivanja antigena.
[0010] Prema sledećem aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje konstrukt nukleinske kiseline koja kodira varijabilni region teškog lanca (VH) iz SEQ ID NO:6 i varijabilni region lakog lanca (VL) iz SEQ ID NO:10.
[0011] Prema sledećem aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje ekspresioni vektor koji sadrži (i) sekvencu nukleinske kiseline koja kodira sekvencu teškog lanca humanizovanog antitela prema pronalasku i (ii) sekvencu nukleinske kiseline koja kodira sekvencu lakog lanca humanizovanog antitela prema pronalasku.
[0012] Prema sledećem aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje ćeliju domaćina koja sadrži prehtodno navedeni ekspresioni vektor ili ekspresioni vektor koji sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira sekvencu teškog lanca humanizovanog antitela pronalaska i ekspresioni vektor koji sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira sekvencu lakog lanca humanizovanog antitela pronalaska.
[0013] Prema sledećem aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje kompoziciju koja sadrži antitelo ili bispecifično antitelo prema pronalasku.
[0014] Prema sledećem aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja sadrži antitelo ili bispecifično antitelo prema pronalasku i farmaceutski prihvatlјiv nosač
[0015] Prema sledećem aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje antitelo ili bispecifično antitelo, kompoziciju ili farmaceutsku kompoziciju prema pronalasku, za upotrebu u vidu medikamenta.
[0016] Prema sledećem aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje antitelo ili bispecifično antitelo, kompoziciju ili farmaceutsku kompoziciju prema pronalasku, za upotrebu u lečenju oboljenja.
[0017] Prema sledećem aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje postupak za proizvodnju antitela ili bispecifičnog antitela prema pronalasku, koji obuhvata korake a) kultivisanja ćelije domaćina prema pronalasku i b) prečišćavanje antitela iz medijuma za kulturu.
[0018] Prema sledećem aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje postupak za detekciju prisustva CD3 antigena ili ćelije koja eksprimira CD3 u uzorku, postupak koji obuhvata korake a) kontakta uzorka sa antitelom ili bispecifičnim antitelom prema pronalasku, pod uslovima koji omogućavaju obrazovanje kompleksa između antitela ili bispecifičnog antitela i CD3 i b) analizu da li je kompleks obrazovan.
[0019] Prema sledećem aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje komplet za detekciju prisustva CD3 antigena ili ćelije koja eksprimira CD3 u uzorku, komplet koji sadrži i) antitelo ili bispecifično antitelo prema pronalasku i ii) uputstva za upotrebu kompleta.
Kratak opis slika nacrta
[0020]
Slika 1: Prikazuje krive vezivanja (Slika 1A) monospecifičnih varijanti IgG1-huCD3 antitela i (Slika 1B) bispecifičnih bsIgG1 huCD3xHER2 varijanti antitela za humanu T-ćelijsku Jurkat liniju. Prikazani podaci su srednje vrednosti intenziteta fluorescencije (MFI) jednog reprezentativnog eksperimenta, kao što je opisano u Primeru 2. Tabele prikazuju koncentracije antitela (µg/mL) koje dovode do polovine maksimalne vrednosti vezivanja (EC50).
Slika 2: Prikazuje krive vezivanja (Slika 2A) monospecifičnih varijanti IgG1-huCD3 antitela i (Slika 2B) bispecifičnih bsIgG1 huCD3xHER2 varijanti antitela za T-ćelijsku liniju HSC-F cinomolgus majmuna. Prikazani podaci su srednje vrednosti intenziteta fluorescencije (MFI) iz jednog reprezentativnog eksperimenta, kao što je opisano u Primeru 2.
Slika 3: Aktivacija T-ćelija sa varijantama IgG1-huCD3 antitela. Ekspresija CD69 na T-ćelijama poreklom iz čoveka (Slika 3A) i cinomolgus majmuna (Slika 3B) u PBMC kulturi, određena je FACS analizom, kao što je opisano u Primeru 3. Ovi eksperimenti su urađeni dva puta i prikazani su reprezentativni rezultati jednog eksperimenta.
Slika 4: Proliferacija T-ćelija indukovana varijantama IgG1-huCD3 antitela. Humane (Slika 4A) ili PBMC cinomolgus majmuna (Slika 4B) su inkubirane sa varijantama IgG1-huCD3 antitela tokom 3 dana, nakon čega je proliferacija izmerena ELISA postupkom za ćelijsku proliferaciju, kao što je opisano u Primeru 4. Prikazani su reprezentativni rezultati iz dva nezavisna eksperimenta.
Slika 5: Indukcija citotoksičnosti posredovane T-ćelijama kod čoveka (Slika 5A) i cinomolgus majmuna (Slika 5B) sa varijantama huCD3 antitela koje sadrže neaktivirajuće LFLEDA mutacije, određena kao što je objašnjeno u Primeru 5. Prikazani su reprezentativni rezultati dva nezavisna eksperimenta koji su rađeni u duplikatima.
Slika 6: Prikazuje krive vezivanja neaktivirajućih, monospecifičnih varijanti IgG1-huCD3 antitela (Slika 6A) i neaktivirajućih, bispecifičnih varijanti bsIgG1-huCD3xHER2 antitela (Slika 6B) za humanu T-ćelijsku Jurkat liniju. Prikazani podaci su srednje vrednosti intenziteta fluorescencije (MFI) iz jednog reprezentativnog eksperimenta, kao što je opisano u Primeru 2. Tabele prikazuju koncentracije antitela (µg/mL) koje dovode do vezivanja u vrednosti od polovine maksimalnog vezivanja (EC50).
Slika 7: Prikazuje krive vezivanja neaktivirajućih, monospecifičnih varijanti IgG1-huCD3 antitela (Slika 7A) i neaktivirajućih, bispecifičnih varijanti bsIgG1-huCD3xHER2 antitela (Slika 7B) za T-ćelijsku liniju cinomolgus majmuna, HSC-F. Prikazani podaci su srednje vrednosti intenziteta fluorescencije (MFI) iz jednog reprezentativnog eksperimenta, kao što je opisano u Primeru 2. Tabele prikazuju koncentracije antitela (µg/mL) koje dovode do vezivanja u vrednosti od polovine maksimalnog vezivanja (EC50).
Figura 8: Aktivacija T-ćelija neaktivirajućim monospecifičnim IgG1-huCD3 (Slika 8A i B) ili neaktivirajućim bispecifičnim varijantama bsIgG1-huCD3xHER2 antitela (Slika 8C i D). Ekspresija CD69 na T-ćelijama poreklom iz čoveka (Slika 8A i C) i cinomolgus majmuna (Slika 8B i D) u PBMC kulturi je izmerena FACS analizom, kao što je opisano u Primeru 3. Ovi eksperimenti su urađeni dva puta i prikazani su reprezentativni rezultati iz jednog eksperimenta.
Slika 9: Proliferacija T-ćelija indukovana neaktivirajućim monospecifičnim IgG1-huCD3 (Slika 9A i B) ili neaktivirajućim bispecifičnim varijantama bsIgG1-huCD3xHER2 antitela (Slika 9C i D).
Proliferacija T-ćelija je merena u PBMC lјudi (Slika 9A i C) ili cinomolgus majmuna (Slika 9B i D) koje su bile inkubirane sa različitim varijantama antitela tokom 3 dana, nakon čega je proliferacija izmerena ELISA postupkom za ćelijsku proliferaciju, kao što je opisano u Primeru 4. Prikazani su reprezentativni rezultati dva nezavisna eksperimenta.
Slika 10: Indukcija citotoksičnosti posredovane T-ćelijama kod čoveka (Slika 10A) i cinomolgus majmuna (Slika 10B) sa varijantama huCD3 antitela koje sadrže neaktivirajuće LFLEDA mutacije, određena kao što je objašnjeno u Primeru 5. Prikazani su reprezentativni rezultati dva nezavisna eksperimenta koji su izvedeni u duplikatima.
Slika 11: Aktivacija T-ćelija rezus majmuna sa varijantama IgG1-huCD3 antitela. Ekspresija CD69 na T-ćelijama poreklom iz rezus majmuna u kulturi PBMC je izmerena FACS analizom, kao što je opisano u Primeru 6.
Slika 12: Aktivacija T-ćelija sa neaktivirajućim varijantama huCLB-T3/4 antitela. Varijante IgG1-huCLB-T3/4 su titrirane na PBMC. Ekspresija CD69 na T-ćelijama u PBMC kulturi je izmerena FACS analizom, kao što je opisano u Primeru 7. Prikazani su reprezentativni primeri iz 3 eksperimenta.
Slika 13: Proliferacija T-ćelija sa neaktivirajućim varijantama huCLB-T3/4 antitela. PBMC su inkubirane sa antitelima tokom 3 dana, nakon čega je proliferacija izmerena ELISA postupkom za ćelijsku proliferaciju, kao što je opisano u Primeru 8. Prikazani su reprezentativni rezultati iz dva nezavisna eksperimenta.
Slika 14: In vitro citotoksičnost posredovana T-ćelijama, indukovana neaktivirajućim varijantama anti-CD3 antitela. Indukcija citotoksičnosti posredovane T-ćelijama sa varijantama antitela (N297Q, LFLE, LFLENQ, LFLEDA, DANQ, LFLEDANQPS [Slika 14A-G]), određivana je kao što je objašnjeno u Primeru 9. Prikazane su prosečne vrednosti iz dva eksperimenta koji su urađeni u duplikatima.
Slika 15: In vitro citotoksičnost posredovana T-ćelijama, indukovana sa neaktivirajućim varijantama huCLB-T3/4. Indukcija citotoksičnosti posredovane T-ćelijama sa varijantama antitela (LFLEDA LAL [Slika 15A-C] je određivana kao što je opisano u Primeru 9. Prikazane su prosečne vrednosti iz jednog eksperimenta izvedenog u duplikatu.
Slika 16: Procena vezivanja C1q za neaktivirajuće varijante huCLB-T3/4 antitela. Vezivanje C1q za monospecifičan IgG1 huCLB-T3/4 (Slika 16A-C) i bsIgG1-huCLB-T3/4xHER2 (Slika B-D), kao i njihove neaktivirajuće varijante antitela, određivana je ELISA postupkom, kao što je opisano u Primeru 10. Rezultati na graficima su reprezentativni za n=2 eksperimenta.
Slika 17: Farmakokinetička (PK) analiza neaktivirajućih varijanti huCLB-T3/4 antitela je upoređivana sa istom za IgG1-huCLB-T3/4 antitelo divlјeg tipa, kao što je opisano u Primeru 11. Koncentracija humanog IgG1 u plazmi je uneta u grafik u odnosu na vreme (Slika 17A). Stopa klirensa iz plazme je izračunata kao što je opisano u Primeru 11 (Slika 17B). Horizontalna isprekidana linija predstavlјa prosečnu stopu klirensa humanih IgG1 antitela kod SCID miševa (10 mL/dan/kg).
Slika 18: Učestalost pozitivnih T-ćelijskih odgovora kod zdravih, HLA-tipizovanih davalaca. SI indeksi od ≥1,9 i u testu proliferacije i sekrecije IL-2 je smatran pozitivnim odgovorima. Humanizovano A33 je upotrebljavano kao kliničko kontrolno antitelo koga karakteriše visok nivo imunogenosti u klinici i koje rutinski indukuje T-ćelijske odgovore od 20-30% u EpiScreen analizi. KLH odgovori su uklјučeni da bi se proverio kvalitet PBMC (nakon odmrzavanja).
Slika 19: Poravnavanje sekvenci varijabilnih regiona teških lanaca (VH) i lakih lanaca (VL) humanizovanih anti-CD3 antitela prema predmetnom pronalasku.
Detalјan opis pronalaska
[0021] Prema jednom aspektu, predmetni opis se odnosi na humanizovano ili himerno antitelo koje se vezuje za humani CD3, pri čemu navedeno antitelo sadrži vezujući region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 varijabilnog regiona teškog lanca sa sekvencama navedenim u SEQ ID NO:1, 2 i 3, tim redom, i CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence varijabilnog regiona lakog lanca (VL) sa sekvencama navedenim u u SEQ ID NO:4, sekvenci GTN i sekvenci navedenoj u SEQ ID NO:5, tim redom.
[0022] Predviđeno je da se termin "antitelo", kako se ovde upotrebljava, odnosi na imunoglobulinski molekul, fragment imunoglobulinskog molekula ili na derivat bilo koga od njih, koji je sa sposobnoću da se specifično vezuje za antigen pod uobičajenim fiziološkim uslovima, sa polu-životom u vidu značajnih vremenskih perioda, kao što je najmanje oko 30 minuta, najmanje oko 45 minuta, najmanje oko jednog sata, najmanje oko dva sata, najmanje oko četiri sata, najmanje oko 8 sati, najmanje oko 12 sati, oko 24 sata ili više, oko 48 sati ili više, oko 3, 4, 5, 6, 7 ili više dana itd. ili u vidu bilo kog drugog relevantnog, funkcionalno definisanog perioda (kao što je vreme dovolјno da se indukuje, pospeši, pojača i/ili moduliše fiziološki odgovor udružen sa vezivanjem antitela za antigen i/ili vreme dovolјno da antitelo ispolji efektorsku aktivnost). Region za vezivanje (ili vezujući domen, kako se ovde upotrebljava, oba su istog značenja) koji intreaguje sa antigenom, sadrži varijabilne regione i teških i lakih lanaca imunoglobulinskog molekula. Konstantni regioni antitela (engl. Abs) mogu posredovati vezivanje imunoglobulina za tkiva ili faktore domaćina, uklјučujući razne ćelije imunog sistema (poput efektorskih ćelija ili T-ćelija) i komponente sistema komplemenata kao što je C1q, prva komponenta u klasičnom putu aktivacije sistema komplementata. Kao što je prethodno naznačeno, termin antitelo, kako se ovde upotrebljava, osim ukoliko je drugačije navedeno ili jasno suprotstavlјeno kontekstu, obuhvata fragmente antitela koja zadržavaju sposobnost da specifično interaguju, kao što je da se vezuju sa antigenom. Pokazano je da funkcija antitela da vezuje antigen može biti ostvarena fragmentima antitela pune dužine. Primeri vezujućih fragmenata koji su obuhvaćeni pojmom "antitelo" uklјučuju (i) Fab' ili Fab fragment, monovalentan fragment koji se sastoji od VL, VH, CLi CH1 domena ili monovalentno antitelo kao što je ono opisano u WO2007059782 (Genmab A/S); (ii) F(ab')2fragmente, bivalentne fragmente koji sadrže dva Fab fragmenta povezana disulfidnim mostom u zglobnom regionu; (iii) Fd fragment koji se suštinski sastoji od VHi CH1 domena; i (iv) Fv fragment koji se suštinski sastoji od VLi VHdomena jednog kraka antitela. Štaviše, iako su dva domena Fv fragmenta, VLi VH, kodirana odvojenim genima, oni mogu biti spojeni upotrebom postupaka rekombinantne tehnologije i sintetskog linkera, koji im omogućava da budu pripremljeni kao jedinstven proteinski lanac u kome se VLi VHregioni uparuju tako da se obrazuju monovalentan molekuli (poznati su kao jednolančana antitela ili jednolančani Fv (scFv), pogledati na primer Bird i saradnici, Science 242, 423-426 (1988) i Huston i saradnici, PNAS USA 85, 5879-5883 (1988)). Takva jednolančana antitela su obuhvaćena terminom antitela, osim ukoliko nije drugačije navedeno ili jasno naznačeno kontekstom. Iako su takvi fragmenti generalno obuhvaćeni značenjem pojma antitelo, oni zajedno, kao i svaki nezavisno predstavljaju jedinstvene karakteristike predmetnog pronalaska ispoljavajući različite biološke osobine i korisnost. Ovakvi i drugi korisni fragmenti antitela se ovde dalje razmatraju u kontekstu predmetnog pronalaska. Takođe se podrazumeva da termin antitelo, ukoliko nije drugačije specifično navedeno, obuhvata i poliklonska antitela, monoklonska antitela (mAb), himerna antitela i humanizovana antitela, kao i fragmente antitela koji zadržavaju sposobnost specifičnog vezivanja za antigen (fragmente koji vezuju antigen), a koji su obezbeđeni bilo kojom poznatom tehnikom poput enzimskog cepanja, sinteze peptida i rekombinantnih tehnika. Ovako generisano antitelo može biti bilo kog izotipa.
[0023] Predviđeno je da se termini "imunoglobulinski teški lanac", "teški lanac imunoglobulina ili "teški lanac", kako se ovde upotrebljavaju, odnose na jedan od lanaca imunoglobulina. Teški lanac se obično sastoji od varijabilnog regiona teškog lanca (ovde skraćenog kao VH) i konstantnog regiona teškog lanca (ovde skraćenog kao CH) koji definiše izotip imunoglobulina. Konstantni region teškog lanca se obično sastoji od tri domena, CH1, CH2 i CH3. Konstantni region teškog lanca može dalje sadržavati zglobni region. Predviđeno je i da se termin "imunoglobulin", kako se ovde upotrebljava, odnosi na klasu strukturno srodnih glikoproteina koji se sastoje od dva para polipeptidnih lanaca, jednog para lakih (L) lanaca niske molekulske težine i jednog para teških (H) lanaca, pri čemu su sva četiri potencijalno međusobno povezana disulfidnim vezama. Struktura imunoglobulina je dobro okarakterisana (pogledati, na primer, [14]). Unutar strukture imunoglobulina, dva teška lanca su međusobno povezana disulfidnim vezama u takozvanom "zglobnom regionu". Isto kao i teški lanci, svaki laki lanac se obično sastoji iz nekoliko regiona; varijabilnog regiona lakog lanca (ovde skraćenog kao VL) i konstantnog regiona lakog lanca (ovde skraćenog kao CL). Konstantni region lakog lanca se obično sastoji od jednog domena, CL. Dalјe, VH i VL regioni mogu dodatno biti podeljeni na regione hipervarijabilnosti (ili hipervarijabilne regione koji mogu biti hipervarijabilni u sekvenci i/ili obrazovati strukturno definisane petlјe), koji se označavaju i kao regioni koji određuju komplementarnost (CDR), a koji se smenjuju sa regionima koji su više evolutivno očuvani i označeni kao uokvirujući regioni (FR). Svaki VH i VL se obično sastoji od tri CDR sekvence i četiri FR sekvence, raspoređene od amino-kraja ka karboksilnom-kraju po sledećem redosledu: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. CDR sekvence mogu biti određene upotrebom postupaka koji su obezbeđeni od strane IMGT [16]-[17]).
[0024] Termin "izotip", kako se ovde upotrebljava, odnosi se na imunoglobulinsku klasu (na primer IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgD, IgA, IgE ili IgM) ili bilo koji njen alotip, kao što je IgG1m(za) i IgG1m(f) [SEQ ID NO:15]) koji je kodiran genima konstantnih regiona teškog lanca. Tako, u jednom primeru izvođenja, antitelo sadrži teški lanac imunoglobulina IgG1 klase ili bilo koji njegov alotip. Svaki izotip teškog lanca se može dalje kombinovati sa kapa (κ) ili lambda (λ) lakim lancem.
[0025] Termin "himerno antitelo", kako se ovde upotrebljava, odnosi se na antitelo u kome je varijabilni region izveden iz vrste različite od čoveka (npr. izveden je iz glodara), a konstantni region je izveden iz različite vrste, kao što je čovek. Himerna antitela mogu biti generisana genetičkim inženjeringom antitela. "Genetički inženjering antitela" je termin koji se upotrebljava generički, za različite vrste modifikacija antitela, i koji je za stručnjaka dobro poznat proces. Preciznije, himerno antitelo može biti generisano upotrebom standardnih DNK tehnika kao što je opisano u [18]. Tako, himerno antitelo može biti genetički ili enzimski kontruisano rekombinantno antitelo. Stručnjaku će biti poznato kako da pripremi himerno antitelo, a shodno tome, generisanje himernog antitela može biti izvedeno i drugim postupcima od onih koji su ovde opisani. Himerna monoklonska antitela za terapijsku primenu su razvijena da bi se smanjila imunogenost antitela. Ona obično mogu sadržavati varijabilne regione poreklom iz životinja različitih od čoveka (npr. iz miša), koji su specifični za antigen od interesa, kao i humane konstantne domene teških i lakih lanaca. Termini "varijabilni region" ili "varijabilni domeni", kako se upotrebljavaju u kontekstu himernih antitela, odnose se na region koji sadrži CDR i uokvirujuće regione i teških i lakih lanaca imunoglobulina.
[0026] Termin "humanizovano antitelo", kako se ovde upotrebljava, odnosi se na genetički konstruisano antitelo koje nije humano i koje sadrži konstantne domene humanog antitela i varijabilne domene antitela koje nije humano, a modifikovano je tako da ga karakteriše visok nivo homologije sekvenci sa humanim varijabilnim domenama. Navedeno može biti postignuto ugradnjom šest regiona za određivanje komplementarnosti antitela koje nije humano (CDR sekvenci), a koji zajedno obrazuju mesto vezivanja antigena, u homologni humani akceptorski uokvirujući region (FR) (pogledati [19]-[20]). Da bi se u potpunosti rekonstituisao afinitet vezivanja i specifičnost matičnog antitela, može biti neophodna supstitucija ostataka uokvirujućeg regiona iz matičnog antitela (tj. antitela koje nije humano) u humani uokvirujući region (povratne mutacije). Obrazovanje modela strukturne homologije može biti od pomoći u identifikaciji aminokiselinskih ostataka u uokvirujućem region koji su od važnosti za osobine vezivanja antitela. Prema tome, humanizovano antitelo može sadržavati CDR sekvence koje nisu humane, primarno humani uokvirujući region koji opciono sadrži jednu ili više aminokiselinskih povratnih mutacija u aminokiselinskoj sekvenci koja nije humana, kao i u potpunosti humane konstantne regione. Opciono, mogu biti primenjene dodatne aminokiselinske modifikacije, koje nisu nužno povratne mutacije, da bi se dobilo humanizovano antitelo sa poželјnim karakteristikama poput afiniteta i odgovarajućih biohemijskih osobina.
[0027] Humanizovano antitelo prema bilo kom aspektu ili primeru izvođenja predmetnog pronalaska može biti označeno kao "humanizovano anti-CD3 antitelo", "humanizovano antitelo pronalaska", "anti-CD3 antitelo" ili "anti-CD3 antitelo pronalaska", pri čemu svi temini imaju isto značenje i svrhu, ukoliko navedeno nije na drugi način u suprotnosti sa kontekstom.
[0028] Aminokiselinska sekvenca antitela koje je porekla različitog od humanog, jasno je različita od iste za antitelo humanog porekla, pri čemu je antitelo koje nije humanog porekla stoga potencijalno imunogeno kada se primenjuje humanim pacijentima. Ipak, uprkos poreklu antitela koje nije humano, njegovi CDR segmenti su odgovorni za sposobnost antitela da se vezuje za svoj cilјni antigen, dok je cilj humanizacije da se održi specifičnost i afinitet vezivanja antitela. Humanizacija terapijskih antitela koja nisu humana se stoga vrši da bi se njegova imunogenost kod čoveka svela na minimum, pri čemu takva humanizovana antitela istovremeno zadržavaju specifičnost i afinitet vezivanja antitela koje nije humanog porekla.
[0029] Termin "vezujući region", kako se ovde upotrebljava, odnosi se na region antitela koji je sposoban da se vezuje za bilo koji molekul, poput polipeptida, npr. prisutnog na ćeliji, bakteriji ili virionu.
[0030] Termin "vezivanje", kako se ovde upotrebljava, odnosi se na vezivanje antitela za unapred određeni antigen ili cilјni molekul za koji je vezivanje obično sa afinitetom koji odgovara KDod oko 10<-6>M ili manje, npr.10<-7>M ili manje, kao što je oko 10<-8>M ili manje, kao što je oko 10<-9>M ili manje, oko 10<-10>M ili manje ili oko 10<-11>M ili čak manje, kada je ista određena, na primer, tehnologijom površinske plazmonske rezonancije (SPR) i upotrebom BIAcore 3000 instrumenta, antigena kao liganda i antitela kao analita, a dalje se odnosi i na vezivanje za unapred određeni antigen sa afinitetom koji odgovara KDkoja je najmanje deset puta niža, kao što je najmanje 100 puta niža, na primer najmanje 1000 puta niža, kao što je najmanje 10.000 puta niža, na primer, najmanje 100.000 puta niža od njegovog afiniteta za vezivanje za nespecifičan antigen (npr. BSA, kazein) koji je drugačiji u odnosu na unapred određen antigen ili blisko srodan antigen. Stepen sa kojim je afinitet niži, zavisi od KDantitela, tako da kada je KDantitela veoma niska (to jest, antitelo je visoko specifično), stepen sa kojim je afinitet za antigen niži od afiniteta za nespecifičan antigen može biti najmanje 10000 puta. Termin "KD" (M), kako se ovde upotrebljava, odnosi se na ravnotežnu konstantu disocijacije određene interakcije antitela i antigena.
[0031] Termin "humani CD3”, kako se ovde upotrebljava, odnosi se na humani protein klastera diferencijacije tipa 3 koji je deo T-ćelijskog koreceptorskog proteinskog kompleksa i sastoji se od četiri jasno različita lanca. CD3 se nalazi i u drugim vrstama, pa se termin "CD3" stoga ovde može upotrebljavati tako da nije ograničen na humani CD3, osim ukoliko nije u suprotnosti sa kontekstom. Kod sisara, kompleks sadrži CD3γ (gama) lanac (humani CD3γ lanac, u Swissprot bazi podataka označen kao P09693 ili CD3γ cinomolgus majmuna, Swissprot Q95LI7), CD3δ (delta) lanac (humani CD3δ, Swissprot P04234 ili CD3δ cinomolgus majmuna, Swissprot Q95LI8), dva CD3ε (epsilon) lanca (humani CD3ε Swissprot P07766; ili CD3ε cinomolgus majmuna, Swissprot Q95LI5), CD3ε lanac rezus majmuna (Swissprot G7NCB9) i CD3ζ (zeta) lanac (humani CD3ζ Swissprot P20963, CD3ζ cinomolgus majmuna, Swissprot Q09TK0). Ovi lanci se udružuju sa molekulom poznatim kao T-ćelijski receptor (TCR) i stvaraju signal aktivacije u T limfocitima. Molekuli TCR i CD3 zajedno čine TCR kompleks.
[0032] Stručnjaku je poznato da aminokiselinske sekvence označene u Swissprot bazi podataka u vidu bojeva, obuhvataju signalne peptide koji se uklanjaju nakon translacije proteina. Tako, proteini, kao što je CD3, koji su prisutni na površinama ćelija, ne uklјučuju signalni peptid. Preciznije, aminokiselinske sekvence navedene u Tabeli 1 ne sadrže takav signalni peptid. Ovakvi proteini, navedeni u vidu liste u Tabeli 1, mogu biti označeni stoga kao "zreli proteini". Dakle, SEQ ID NO:14 prikazuje aminokiselinsku sekvencu zrelog humanog CD3δ (delta), SEQ ID NO:13 prikazuje aminokiselinsku sekvencu zrelog humanog CD3ε (epsilon), SEQ ID NO:21 prikazuje aminokiselinsku sekvencu zrelog CD3ε cinomolgus majmuna, dok SEQ ID NO:23 prikazuje aminokiselinsku sekvencu zrelog CD3ε rezus majmuna. Shodno navedenom, termin "zreli”, kako se ovde upotrebljava, odnosi se na protein koji ne sadrži bilo kakvu signalnu ili vodeću sekvencu.
[0033] Dobro je poznato da se homologija, dužina i pozicije mesta cepanja signalnog petpida značajno razlikuju između različitih proteina. Signalni peptidi mogu biti određeni različitim postupcima, npr. SEQ ID NO:13 predmetnog pronalaska je određena upotrebom aplikacije SignalP (dostupne na http://www.cbs.dtu.dk/services/SignaIP/).
[0034] U određenom slučaju, humanizovano ili himerno antitelo predmetnog opisa vezuje epsilon lanac CD3, kao što je epsilon lanac humanog CD3 (SEQ ID NO:13). U još jednom određenom primeru, humanizovano ili himerno antitelo vezuje epitop unutar aminokiselina 1-27 sa N-terminalnog dela humanog CD3ε (epsilon) (SEQ ID NO:13). Antitelo pronalaska unakrsno reaguje sa antitelima drugih vrsta primata različitih od čoveka, kao što su cinomolgus majmuna (CD3 epsilon cinomolgus majmuna, SEQ ID NO:21) i/ili rezus majmuna (CD3 epsilon rezus majmuna, SEQ ID NO:23).
[0035] Termin "unakrsno reaguje”, kako se ovde upotrebljava, odnosi se na sposobnost antitela, kao što je humanizovano antitelo prema pronalasku, da vezuje svoj cilјni molekul u različitoj vrsti. Preciznije, humanizovano anti-CD3 antitelo koje je prikazano u ovde opisanim primerima, je sa sposobnošću da vezuje i humani (Primer 2) i CD3 cinomolgus majmuna (Primer 2) i rezus majmuna.
[0036] Antitelo prema predmetnom opisu, koje sadrži CDR sekvence kao što je ovde definisano i dodatno sadrži uokvirujuće regione, može se razlikovati u sekvenci izvan CDR sekvenci, ali ipak zadržavati punu sposobnost vezivanja u poređenju sa originalnim antitelom. Stoga se predmetni opis takođe odnosi na antitela koja sadrže aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona koja je u određenom stepenu identična sa bilo kojom sekvencom koja je ovde opisana.
[0037] Termin "identičnost sekvenci”, kako se upotrebljava u kontekstu predmetnog pronalaska, odnosi se na procenat identičnosti između dve sekvence i funkcija je broja identičnih pozicija koje su zajedničke za obe sekvence (tj. % homologije = br. identičnih pozicija / ukupan br. pozicija x 100), uzimajući u obzir broj praznina (engl. gaps) i dužinu svake praznine, koji moraju biti uvedeni radi optimalnog poravnanja dve sekvence. Procenat identiteta između dve nukleotidne sekvence može npr. biti određen upotrebom algoritma koji su razvili E. Meyers i W. Miller [21]. Dodatno, procenat identiteta između dve aminokiselinske sekvence može biti određen upotrebom algoritma razvijeno od strane Needleman-a i Wunsch-a [22]. Poželjno je da se vrše višestruka poravnavanja, upotrebom Clustal W algoritma [23] (kao što se koristi, npr. u kompjuterskom programu Vector NTI Advance®, verzija 11.5; Invitrogen Inc.).
[0038] U pronalasku, vezujući region sadrži VH sekvencu navedenu u SEQ ID NO:6 i VL sekvencu navedenu u SEQ ID NO:10.
[0039] Humanizovana antitela mogu biti generisana poređenjem aminokiselinskih sekvenci varijabilnih regiona teških i lakih lanaca sa bazom podataka za vrijabilne regione humanih germinativnih sekvenci, da bi se identifikovala humana sekvenca teškog i lakog lanca sa odgovarajućim stepenom homologije za upotrebu u humanim varijabilnim uokvirujućm regionima. Serije humanizovanih varijabilnih regiona teških i lakih lanaca mogu biti dizajnirane uvođenjem, npr. mišjih, CDR sekvenci u uokvirujuće regione (identifikovane kao što je prethodno opisano) i, ukoliko je potrebno, povratnom mutacijom (mutacijom jednog ili više humanih aminokiselinskih ostataka u uokvirujućim regionima nazad u aminokiselinu koja je različita od humane na specifičnoj poziciji/pozicijama, odnosno do specifičnog identifikovanog ostataka mišje sekvence koji može biti kritičan za obnavlјanje efikasnosti vezivanja antitela. Potom mogu biti selektovane varijantne sekvence sa najnižom učestalošću potencijalnih T-ćelijskih epitopa, što se određuje primenom in silico tehnologija; iTope™ i TCED™ ([24], [25] i [26]).
[0040] Humanizovana antitela se dalje takođe mogu „deimunizovati“. Deimunizacija može biti poželjna, pošto unutar proteinske sekvence, npr. humanizovanog antitela, prisustvo humanih T-ćelijskih epitopa može povećati profil rizika imunogenosti, pošto iste karakteriše potencijal da aktiviraju pomoćne T-ćelije. Takva aktivacija pomoćnih T-ćelija se može izbeći deimunizacijom. Deimunizacija se može izvesti uvođenjem mutacije u aminokiselinsku sekvencu humanizovanog antitela da bi se uklonili T-ćelijski epitopi, bez značajnog smanjenja afiniteta vezivanja antitela.
[0041] Stoga, prema jednom aspektu opisa, humanizovano antitelo može biti proizvedeno postupkom koji obuhvata korake (i) poređenja celokupne sekvence varijabilnog regiona teškog lanca i/ili cepokupne sekvence varijabilnog regiona lakog lanca koja nije humana, sa bazom podataka humanih germinativnih sekvenci, (ii) odabir humane germinativne sekvence sa najvećom homologijom sekvenci koja nije humana, da bi se dobila humanizovana sekvenca, (iii) optimizaciju humanizovane sekvence povratnom mutacijom/mutacijama, ukoliko je to potrebno, i (iv) ekspresiju sekvence u pogodnom ekspresionom sistemu.
[0042] Tako, antitelo pune dužine može biti proizvedeno postupkom koji obuhvata korake (i) poređenja celokupne sekvence varijabilnog regiona teškog lanca i/ili cepokupne sekvence varijabilnog regiona lakog lanca koja nije humana, sa bazom podataka humanih germinativnih sekvenci, (ii) odabir humane germinativne sekvence sa najvećom homologijom sekvenci koja nije humana, (iii) uvođenje CDR sekvenci koje nisu humane u odabrane humane geminativne linije da bi se dobile humanizovane sekvence, (iv) optimizaciju humanizovanih sekvenci povratnom mutacijom/mutacijama, ukoliko je to potrebno, (v) identifikaciju sekvenci konstantnih regiona teških i lakih lanaca i (vi) ekspresiju kompletnih sekvenci teških lanaca i kompletnih sekvenci lakih lanaca u pogodnim ekspresionim sistemima. Antitelo pune dužine može, stoga, biti proizvedeno kao što je opisano u Primeru 1. Iskusna osoba može proizvesti antitelo pune dužine kada polazi bilo od CDR sekvenci ili potpunih sekvenci varijabilnog regiona. Dakle, stručnjak će znati kako da proizvede antitelo pune dužine.
[0043] Termin "kompletne sekvence teškog lanca”, kako se ovde upotrebljava, odnosi se na sekvencu koja se sastoji od sekvenci varijabilnog regiona teškog lanca i konstantnih regiona teškog lanca.
[0044] Termin "kompletne sekvence lakog lanca”, kako se ovde upotrebljava, odnosi se na sekvencu koja se sastoji od sekvenci varijabilnog regiona lakog lanca i konstantnih regiona lakog lanca.
[0045] Povratne mutacije mogu biti uvedene standardnom DNK mutagenezom. Takve standardne tehnike mutageneze DNK su opisane u [18]. Alternativno, mogu biti upotrebljeni komercijalno dostupni kompleti poput kompleta za mutagenezu usmerenu na mesto Quickchange™ (Stratagene) ili želјene povratne mutacije mogu biti uvedene de novo sintezom DNK.
[0046] U jednom primeru izvođenja, antitelo je antitelo pune dužine. Termin "antitelo pune dužine", kako se ovde upotrebljava, odnosi se na antitelo (npr. matično ili varijantno antitelo) koje sadrži sve konstantne i varijabilne domene teških i lakih lanaca koji odgovaraju onima koji se normalno nalaze u antitelu divlјeg tipa datog izotipa.
[0047] U jednom primeru izvođenja, antitelo sadrži Fc region koji sadrži prvi i drugi imunoglobulinski teški lanac.
[0048] Termin "Fc region", kako se ovde upotrebljava, odnosi se na region koji sadrži, u pravcu od N-ka C-kraju, najmanje zglobnu region, CH2 region i CH3 region. Fc region može dalјe sadržavati CH1 region na N-terminalnom kraju zglobnog regiona.
[0049] Termin "zglobni region”, kako se ovde upotrebljava odnosi se na zglobni region teškog lanca imunoglobulina. Tako, na primer, zglobni region humanog IgG1 antitela odgovara aminokiselinama 216-230 prema Eu numeraciji navedenoj u publikaciji Kabat-a.
[0050] Ukoliko nije drugačije navedeno ili je u suprotnosti sa kontekstom, aminokiseline sekvenci konstantnih regiona su ovde numerisane prema Eu-indeksu numeracije (opisanom u [27]) i mogu biti označene sa „prema Eu numeraciji navedenoj u publikaciji Kabat-a“, "Eu numeracija prema Kabat-u" ili "prema EU sistemu numeracije".
[0051] Termin "CH1 region" ili "CH1 domen”, kako se ovde upotrebljava, odnosi se na CH1 region imunoglobulinskog teškog lanca. Tako, na primer, CH1 region humanog IgG1 antitela odgovara aminokiselinama 118-215 prema EU sistemu numeracije. Međutim, CH1 region takođe može biti bilo koji od drugih potipova, kao što je ovde opisano.
[0052] Termin "CH2 region" ili "CH2 domen”, kako se ovde upotrebljava, odnosi se na CH2 region imunoglobulinskog teškog lanca. Tako, na primer, CH2 region humanog IgG1 antitela odgovara aminokiselinama 231-340 prema EU sistemu numeracije. Međutim, CH2 region takođe može biti bilo koji od drugih potipova, kao što je ovde opisano.
[0053] Termin "CH3 region" ili "CH3 domen”, kako se ovde upotrebljava, odnosi se na CH3 region imunoglobulinskog teškog lanca. Tako, na primer, CH3 region humanog IgG1 antitela odgovara aminokiselinama 341-447 prema EU sistemu numeracije. Međutim, CH3 region takođe može biti bilo koji od drugih potipova, kao što je ovde opisano.
[0054] U jednom primeru izvođenja, izotip imunoglobulinskog teškog lanca je izabran iz grupe koja se sastoji od IgG1, IgG2, IgG3 i IgG4. Imunoglobulinski teški lanac može biti bilo kog alotipa unutar svake od imunoglobulinskih klasa, poput IgG1m(f) (SEQ ID NO:15). Tako, u jednom posebnom primeru izvođenja, izotip imunoglobulinskih teških lanaca je IgG1 ili bilo koji njegov alotip, kao što je IgG1m(f) (SEQ ID NO:15).
[0055] Prilikom ciljanog dejstva na CD3 antigen koji je deo T-ćelijskog receptora (TCR), poželјni su specifični T-ćelijski mehanizmi ubijanja ćelija. Ostale efektorske funkcije, npr. aktivacija komplemenata, ne moraju biti poželjni i stoga je poželjno i smanjenje efektorskih funkcija. Vezivanje C1q je prvi korak u kaskadi sistema komplemenata i time služi kao pokazatelj kapaciteta antitela za citotoksičnost zavisnu od komplemenata (CDC). Ukoliko se vezivanje C1q za anitelo može izbeći, aktivacija kaskade komplemenata takođe može biti izbegnuta.
[0056] Shodno navedenom, u jednom primeru izvođenja, antitelo sadrži Fc region koji je modifikovan tako da se vezivanje C1q za navedeno antitelo smanjuje u poređenju sa antitelom divlјeg tipa za najmanje 70%, najmanje 80%, najmanje 90%, na najmanje 95%, najmanje 97%, najmanje 99% ili 100%, pri čemu se vezivanje C1q određuje ELISA postupkom.
[0057] Termin "modifikovan", kako se ovde upotrebljava, odnosi se na aminokiselinsku sekvencu Fc regiona koja nije identična aminokiselinskoj sekvenci Fc regiona divlјeg tipa. odnosno aminokiselinski ostaci na specifičnim pozicijama Fc regiona su supstituisani, deletirani ili insertovani da bi se izmenilo, na primer, mesto vezivanja za C1q, mesto vezivanja za druge efektorske molekule ili vezivanje za Fc receptore (FcR). Takve modifikacije aminokiselinske sekvence mogu biti uvedene supstitucijom jedne ili više aminokiselina sa konzervativnom aminokiselinom ili mogu biti uvedene supstitucijom jedne ili više aminokiselina sa alternativnom aminokiselinom koja je fizički i/ili funkcionalno slična aminokiseline prisutnoj u Fc divljeg tipa. Supstitucije mogu takođe biti uvedene supstitucijom sa nekonzervatinom aminokiselinom.
[0058] U kontekstu predmetnog pronalaska, aminokiselina može biti definisana kao konzervativna ili nekonzervativna aminokiselina i shodno tome može biti i klasifikovana. Aminokiselinski ostaci mogu takođe biti podeljeni u klase definisane alternativnim fizičkim i funkcionalnim osobinama. Tako klase aminokiselina mogu odražavati podele poput onih koje su navedene u jednoj ili u obe od tabela koje slede:
Aminokiselinski ostaci konzervativne klase
Alternativne fizičke i funkcionalne klasifikacije aminokiselinskih ostataka
[0059] U kontekstu predmetnog pronalaska, supstitucija u antitelu je naznačena sa:
Originalna aminokiselina - pozicija - supstituisana aminokiselina;
Shodno dobro prepoznatoj nomenklaturi aminokiselina, upotrebljava se kod od tri slova ili kod u vidu jednog slova, uključujući kodove Xaa gde X ukazuje na bilo koji aminokiselinski ostatak. Tako, obeležje "L234F" ili "Leu234Phe" označava da antitelo sadrži supstituciju leucina sa fenilalaninom na aminokiselinskoj poziciji 234.
[0060] Supstitucija aminokiseline na datoj poziciji sa bilo kojom drugom aminokiselinom je naznačena sa:
Originalna aminokiselina - pozicija; ili npr. "L234".
[0061] Za modifikacije u kojima originalna(e) aminokiselina(e) i/ili supstituisana(e) aminokiselina(e) mogu sadržavati više od jedne, ali ne i sve aminokiseline, više od jedne aminokiseline može biti razdvojeno sa "," ili "/".
Na primer, supstitucija leucina sa fenilalaninom, argininom, lizinom ili triptofanom na pozicijama 234 je:
"Leu234Phe,Arg,Lys,Trp" ili "Leu234Phe/Arg/Lys/Trp" ili "L234F,R,K,W" ili "L234F/R/K/W" ili "L234 u F, R, K ili W"
[0062] Ovakvo označavanje može biti u kontekstu pronalaska upotrebljavano naizmenično, ali je sa istim značenjem i svrhom.
[0063] Štaviše, termin "supstitucija" obuhvata supstituciju u bilo koju od drugih devetnaest prirodnih aminokiselina ili u druge aminokiseline, kao što su aminokiseline koje nisu prirodne. Na primer, supstitucija aminokiseline L na poziciji 234 uklјučuje svaku od sledećih supstitucija: 234A, 234C, 234D, 234E, 234F, 234G, 234H, 2341, 234K, 234M, 234N, 234Q, 234R, 234S, 234T, 234V, 234W, 234P i 234Y. Navedeno je, između ostalog, ekvivalentno oznaci 234X, gde X označava bilo koju aminokiselinu drugačiju od originalne aminokiseline. Ovakve supstitucije se takođe mogu označavati sa L234A, L234C itd. ili L234A,C itd. ili L234A/C/itd. Isto se analogno odnosi na svaku poziciju koja je ovde navedena, da bi time bile specifično obuhvaćene i bilo koje od ovakvih supstitucija.
[0064] Antitelo prema pronalasku može takođe sadržavati deleciju aminokiselinskog ostatka. Takva delecija može biti označena sa "del" i obuhvata, npr. slučaj napisan kao L234del. Prema tome, u takvim primerima izvođenja, leucin na poziciji 234 je deletiran iz aminokiselinske sekvence.
[0065] Termini "aminokiselina" i "aminokiselinski ostatak" ovde mogu biti upotrebljavani naizmenično.
[0066] Termin "C1q vezivanje", kako se ovde upotrebljava, odnosi se na vezivanje C1q za antitelo, kada je navedeno antitelo vezano na njegov antigen. Termin "vezan za njegov antigen", kako se ovde upotrebljava, odnosi se na vezivanje antitela za njegov antigen in vivo i in vitro.
[0067] Termin "smanjuje/redukuje”, kako se ovde upotrebljava kada se odnosi na vezivanje C1q, odnosi se na sposobnost antitela pronalaska da smanji, svede na minimum ili čak u potpunosti inhibira vezivanje C1q za antitelo u poređenju sa vezivanjem C1q za antitelo divljeg tipa.
[0068] Termin "antitelo divlјeg tipa", kako se ovde upotrebljava u odnosu na upotrebu u uporednim testovima, odnosi se na antitelo koje je identično antitelu koje se ispituje, osim što nije inertno. U ovom kontekstu, termin "inertan" se odnosi na modifikovan Fc region koji je sa smanjenim vezivanjem ili koji ne vezuje C1q, a što se određuj kao u Primeru 10, tj. kada je vezivanje za C1q određeno ELISA postupkom; i koga karakteriše smanjenje ili odsustvo T-ćelijske proliferacije posredovane sa Fc koja se određuje kao u Primera 4, tj. kada je T-ćelijska proliferacija izmerena u funkcionalnom testu zasnovanom na perifernim mononuklearnim ćelijama krvi (PBMC); i/ili koga karakteriše smanjenje ili odsustvo CD69 ekspresije posredovane sa Fc, određene kao u Primeru 3, tj. kada je CD69 ekspresija posredovana sa Fc određena u funkcionalnom testu zasnovanom na PBMC. Tako, antitelo divlјeg tipa sadrži u imunoglobulinskim teškim lancima aminokiseline koje se javljaju u prirodi, tj. antitelo ne sadrži bilo kakve modifikacije aminokiselina koje mogu izmeniti ili smanjiti sposobnost antitela interaguje sa npr. C1q, Fc receptorima ili sličnim. Prema tome, takvo antitelo divlјeg tipa će ostati aktivirajuće antitelo koje je sposobno da se vezuje za npr. C1q. Antitelo divlјeg tipa i modifikovano antitelo mogu sadržavati druge aminokiselinske modifikacije osim onih koje utiču na sposobnost antitela da indukuje efektorske funkcije, da bi antitelo postalo bispecifično antitelo ili slično.
[0069] Termin "ELISA", kako se ovde upotrebljava, odnosi se na imunosorbentnu analizu povezanu za enzimom koja predstavlja analiizu u kojoj se upotrebljavaju antitela i promena boje radi identifikacije određene supstance. Prvo specifično antitelo je vezano za površinu ploče. Time se ispituje protein iz uzorka koji se dodaje, odnosno ispituje se vezivanje za navedeno prvo specifično antitelo. Potom se ispituje vezivanje drugog antitela za antitelo iz uzorka. Drugo antitelo je povezano sa enzimom, a u konačnom koraku, dodaje se supstanca koja sadrži supstrat enzima. Reakcija koja sledi proizvodi signal koji se može detektovati, najčešće promenu boje u supstratu. Koncept ELISA postupka je dobro poznat u oblasti tehnike, tako da se razni načini izvođenja ELISA postupka razmatraju kao deo postupka za evaluaciju antitela prema pronalasku. Stoga, ovo tumačenje ne treba shvatiti ograničavajućim, pošto mogu biti izvedeni razni vidovi ELISA postupka, kao što je opisano u Primeru 4.
[0070] Preciznije, sposobnost antitela prema predmetnom pronalasku da vezuje C1q može biti određena ELISA postupkom koji obuhvata korake (i) oblaganje mikrotitar ploče sa 96 mesta sa navedenim antitelom, (ii) dodavanje 3% seruma, (iii) dodavanje humanog anti-C1q antitela, (iv) razvijanje ploče i (v) merenje OD405nm. Tako, u jednom primeru izvođenja, antitelo sadrži Fc region koji je modifikovan tako da se vezivanje navedenog antitela za C1q smanjuje u poređenju sa antitelom divljeg tipa za najmanje 70%, najmanje 80%, najmanje 90%, na najmanje 95%, najmanje 97% ili 100%, pri čemu se C1q vezivanje određuje ELISA postupkom koji obuhvata korake (i) oblaganja mikrotitar ploče sa 96 mesta sa navedenim antitelom, (ii) dodavanje 3% seruma, (iii) dodavanje anti-humanog C1q, (iv) razvijanje ploče i (v) merenje OD405nm. Tako, u posebnom primeru izvođenja, vezivanje C1q se procenjuje kao što je opisano u Primeru 10.
[0071] Termini "Fc receptor" ili "FcR", kako se ovde upotrebljavaju, odnose se na protein koji se nalazi na površini određenih ćelija. FcR se vezuju za Fc region antitela. Postoji nekoliko različitih vrsta FcR koji su klasifikovani na osnovu vrste antitela koje prepoznaju. Na prime, Fcγ (gama) receptori se vezuju za antitela IgG klase.
[0072] Termini "Fcγ receptor", "Fc gama receptor" ili "FcγR", kako se ovde upotrebljavaju, odnose se na grupu Fc receptora koji pripadaju imunoglobulinskoj superfamiliji i predstavljaju najvažnije Fc receptore za indukciju fagocitoze opsonizovanih (obloženih) mikroba. Ova familija obuhvata nekoliko članova, FcγRI (CD64), FcγRIIa (CD32a), FcγRIIb (CD32b), FcγRIIIa (CD16a), FcγRIIIb (CD16b), koji se razlikuju po svojim afinitetima za antitela usled svoje različite molekulske strukture.
[0073] Efektorske funkcije posredovane sa Fc čine deo biološke aktivnosti molekula humanog imunoglobulina G (IgG). Primeri takvih efektorskih funkcija uklјučuju npr. citotoksičnost posredovanu ćelijama i zavisnu od antitela (ADCC) i citotoksičnost zavisna od komplementa (CDC) koji se pokreću vezivanjem raznih efektorskih molekula za Fc region. U kontekstu predmetnog pronalaska, "vezivanje Fc", "vezivanje Fc receptora", "vezivanje FcR" i "vezivanje Fc regiona antitela za FcR" se odnose na vezivanje Fc regiona za Fc receptor (FcR) ili efektorski molekul. Izrazi "FcyR vezivanje" i "FcyRI vezivanje" se odnose na vezivanje za ili sa Fc regionom za Fc gama receptora i Fc gama receptora I, redom. Kad se anti-CD3 antitelo vezuje za T-ćelije, Fc region divlјeg tipa anti-CD3 antitela se vezuje za FcR koji su prisutni na drugim ćelijama, npr. monocitima, što dovodi do nespecifične aktivacije T-ćelija posredovane sa Fc. Takva nespecifična aktivacija T-ćelija posredovana sa Fc može biti nepoželјna. T-ćelije takođe mogu biti aktivirane ciljanom ili ciljno specifičnom aktivacijom T-ćelija. Takva cilјana aktivacija T-ćelija može biti veoma poželјna za lečenje niza indikacija, poput kancera. Termin "cilјana aktivacija T-ćelija”, kako se ovde upotrebljava, odnosi se na usmeravanje T-ćelija ka specifičnim ćelijama, poput tumorskih ćelija, upotrebom bispecifičnog antitela koja sadrži prvi vezujući region koji se vezuje za specifičan ciljni molekul, kao što je ciljno mesto tumora na tumorskoj ćeliji, i drugi vezujući region koji vezuje specifično ciljno mesto na T-ćelijama, poput CD3. Tako, ciljano dejstvo T-ćelija na specifične ćelije, npr. tumorske ćelije, može biti olakšano upotrebom bispecifičnog antitela, pri čemu jedan od vezujućih regiona vezuje CD3 prisutan na T-ćeliji, dok drugi vezujući region vezuje specifičan antigen na koga se ciljano deluje, npr. na tumorskoj ćeliji. Iako nespecifična aktivacija T-ćelija posredovana sa Fc može i dalјe biti moguća, a pošto je i takvu neželјenu nespecifičnu aktivaciju T-ćelija posredovanu sa Fc putem umrežavanja posredovanog sa Fc potrebno izbegavati, ista može biti onemogućena stvaranjem Fc regiona koji je inertan u pogledu takve aktivnosti. Time se sprečava interakcija između navedenog inertnog Fc regiona sa prisutnim Fc receptorima. Dokazano je da je humanizovano antitelo predmetnog pronalaska inertno kada se ispituje u nekoliko različitih testova, pogledati npr. Primere od 3 do 5. Dokazano je i da je drugo ispitivano anti-CD3 antitelo, huCLB-T3/4, koje sadrži aminokiselinske modifikacije u Fc regionu, takođe inertno prilikom ispitivanja u različitim testovima, tj. pogledati Primere od 7 do 10. Humanizovano anti-CD3 antitelo prema predmetnom pronalasku, koje sadrži aminokiselinske supstitucije L234F, L235E i D265A, kao što je opisano u Primerima, pokazalo je nizak nivo CD69 ekspresije na T-ćelijama (Primer 3), ukidanje T-ćelijske proliferacije posredovane sa Fc (Primer 4), kao i odsustvo nespecifičnog ciljanog ubijana kada je u obliku bispecifičnog antitela (Primer 5). Stoga, humanizovano antitelo predmetnog pronalaska u nekoliko testova pokazuje superiorne rezultate u poređenju sa antitelom divlјeg tipa.
[0074] Antitelo prema predmetnom pronalasku može sadržavati modifikacije u Fc regionu. Kada antitelo sadrži takve modifikacije, ono može postati inertno ili neaktivirajuće antitelo. Termini "inertnost", "inertan" ili "neaktivirajući”, kako se ovde upotrebljavaju, odnose se na Fc region koji najmanje nije u stanju da vezuje bilo koji Fcγ receptor, da indukuje umrežavanje FcR posredovano sa Fc ili da indukuje umrežavanje ciljnih antigena posredovano sa FcR, putem dva Fc regiona pojedinačnih antitela, ili nije u stanju da vezuje C1q. Inertnost Fc regiona humanizovanog ili himernog anti-CD3 antitela je ispitivana na pogodan način, upotrebom antitela u monospecifičnom formatu, mada inertan Fc region koji je tako identifikovan može biti upotrebljen u bispecifičnim ili drugim humanizovanim ili himernim multispecifičnim CD3 antitelima.
[0075] U cilju pripreme terapijskih antitela, može biti konstruisano nekoliko varijanti antitela da bi Fc region postao neaktivan u pogledu interakcije sa Fc gama receptorima i C1q. Ovde su opisani primeri takvih varijanti.
[0076] Tako, u jednom primeru izvođenja, antitelo sadrži Fc region koji je modifikovan tako da navedeno antitelo posreduje u smanjenoj T-ćelijskoj proliferaciji posredovanoj sa Fc u poređenju sa antitelom divljeg tipa, za najmanje 50%, najmanje 60%, najmanje 70 %, najmanje 80%, najmanje 90%, najmanje 99% ili 100%, pri čemu se navedena proliferacija T-ćelija meri u funkcionalnom testu zasnovanom na mononuklearnim ćelijama periferne krvi (PBMC).
[0077] Termin “smanjuje/redukuje”, kako se ovde upotrebljava, odnosi se na smanjenje aktivnosti ili ekspresije u poređenju sa kontrolnim proteinom poput antitela. Preciznije, "smanjuje", kada se odnosi na proliferaciju T-ćelija, odnosi se na sposobnost antitela prema pronalasku da smanji, svede na minimun ili čak u potpunosti inhibira proliferaciju T-ćelija u poređenju sa proliferacijom T-ćelija koja je povezana sa antitelom divlјeg tipa. Sposobnost antitela da smanji proliferaciju T-ćelija može biti procenjena funkcionalnim testom zasnovanim na PBMC, kao što je opisano u Primeru 4 i u Primeru 8. U jednom primeru izvođenja, test se izvodi sa humanim PBMC. U drugom primeru izvođenja, test se izvodi sa PBMC iz cinomolgus majmuna. U još jednom izvođenju, test se izvodi sa PBMC rezus majmuna. Pošto su antitela prema predmetnom pronalasku unakrsno reaktivna, testovi zasnovani na PBMC koji su ovde opisani, mogu biti urađeni sa bilo kojom vrstom PBMC da bi se pokazalo smanjenje proliferacije T-ćelija sve dok su vrste upotrebljenih PBMC unutar spektra unakrsne reaktivnosti antitela, npr. humane su, iz cinomolgus majmuna ili rezus majmuna.
[0078] Izraz "funkcionalni test zasnovan na mononuklearnim ćelijama periferne krvi (PBMC)", kako se ovde upotrebljava, odnosi se na test koji se koristi za procenu funkcionalne karakteristike antitela predmetnog pronalaska, kao što je sposobnost navedenog antitela da utiče na proliferaciju T-ćelija ili ekspresiju CD69, pri čemu su jedine ćelije koje su prisutne zapravo mononuklearne ćelije periferne krvi. Tako, u jednom primeru izvođenja, proliferacija T-ćelija se meri postupkom koji obuhvata korake inkubacije PBMC sa antitelom opsega od 1-1000 ng/mL, na 37°C i u vlažnom inkubatoru sa 5% (vol/vol) CO2, tokom tri dana, dalje dodavanje hemijskog jedinjenje kao što je BrdU, koji se ugrađuje u DNK ćelija koje proliferišu, a zatim inkubaciju tokom pet sati, taloženje ćelija, sušenje ćelija, opciono čuvanje ćelija na 4°C, oblaganje ELISA ploče ćelijama, inkubiranje sa anti-BrdU-peroksidazom na sobnoj temperaturi tokom 90 minuta, razvijanje boje tokom oko 30 min sa 1 mg/ml 2,2'-azino-bis (3-etilbenzotiazolin-6-sulfonskom kiselinom), dodavanje 100 µL 2% oksalne kiseline radi zaustavlјanja reakcije i merenje apsorbancije na 405 nm u pogodnom čitaču mikroploča.
[0079] Termin "proliferacija", kako se ovde upotrebljava, odnosi se na rast ćelija u kontekstu ćelijske deobe.
[0080] Termin "BrdU”, kako se ovde upotrebljava, odnosi se na 5-bromo-2'-dezoksiuridin, koji je homolog timidinu. Kada se BrdU dodaje ćelijskoj kulturi tokom ograničenog vremenskog perioda (npr.
4 sata), on će se ugraditi u DNK proliferišućih ćelija. Nakon fiksiranja ćelija, detekcija ugrađenog BrdU može može biti urađena u ELISA testu, upotrebom anti-BrdU-peroksidaze. Ugradnja BrdU je, dakle, mera proliferacije.
[0081] U jednom primeru izvođenja, antitelo sadrži Fc region koji je modifikovan tako da navedeno antitelo smanjuje ekspresiju CD69 posredovanu sa Fc, za najmanje 50%, najmanje 60%, najmanje 70%, najmanje 80%, najmanje 90%, najmanje 99% ili 100% u poređenju sa antitelom divlјeg tipa, pri čemu je navedena ekspresija CD69 posredovana sa Fc izmerena u funkcionalnom testu zasnovanom na PBMC.
[0082] Termin “smanjuje/redukuje”, kako se ovde upotrebljava, odnosi se na smanjenje aktivnosti ili ekspresije u poređenju sa kontrolnim proteinom, kao što je antitelo. Preciznije, termin “smanjuje”, kada se odnosi na nivo ekspresije markera aktivacije T-ćelije CD69, odnosi se na smanjenje nivoa ekspresije CD69 u poređenju sa nivoom ekspresije CD69 kada je za T-ćeliju vezano antitelo divljeg tipa, pod uslovom da oba vezujuće regiona antitela vezuju CD3. Sposobnost antitela da smanji ekspresiju CD69 može biti procenjena funkcionalnim testom zasnovanim na PBMC, kao što je opisano u Primeru 3 i u Primeru 7. Tako, u jednom primeru izvođenja, ekspresija CD69 se meri postupkom koja obuhvata korake inkubiranja PBMC sa antitelom u opsegu od 1-1000 ng/mL, na 37°C i u vlažnom inkubatoru sa 5% (vol/vol) CO2, tokom 16-24 sata, ispiranje ćelija, bojenje ćelija na 4°C sa mišjim anti-humanim CD28-PE i mišjim anti-humanim CD69-APC antitelom, kao i određivanje ekspresije CD69 u ćelijama pozitivnim na CD28 upotrebom protočne citometrije.
[0083] Termin "CD69", kako se ovde upotrebljava, odnosi se na klaster diferencijacije 69 koji je humani transmembranski lektinski protein tipa C koji je kodiran CD69 genom. Aktivacija T limfocita i prirodnih ćelija ubica (NK), kako in vivo, tako i in vitro, indukuje ekspresiju CD69. CD69 funkcioniše kao receptor za prenos signala uključenih u događaje ćelijske aktivacije, uklјučujući proliferaciju, funkcioniše kao receptor za prenos signala u limfocitima, uklјučujući prirodne ćelije ubice i trombocite, a uključen je i u indukciju specifičnih gena.
[0084] Termin "funkcionalna analiza zasnovana na mononuklearnim ćelijama periferne krvi (PMBC)", kako se ovde upotrebljava, odnosi se na test koji se koristi za procenu funkcionalne karakteristike antitela predmetnog pronalaska, kao što je sposobnost navedenog antitela da utiče na proliferaciju T-ćelija ili ekspresiju CD69, pri čemu su jedine prisutne ćelije zapravo mononuklearne ćelije periferne krvi. Funkcionalna analiza zasnovana na PBMC koja je kao što je opisano u Primerima 3, 4, 5 i 7, obuhvata korake (i) inkubiranja PBMC sa antitelom na 37°C, u vlažnom inkubatoru sa 5% (vol/vol) CO2, tokom oko 16-24 sata, (ii) ispiranje ćelija, (iii) bojenje ćelija na 4°C sa mišjim anti-humanim CD28-PE i mišjim anti-humanim CD69-APC antitelom i (iv) određivanje ekspresije CD69 na ćelijama pozitivnim na CD28 upotrebom protočne citometrije, čime se procenjuje ekspresija CD69. Tako, u jednom primeru izvođenja, ekspresija CD69 može biti određena kao što je opisano u Primerima 3, 4, 5 ili 7.
[0085] Shodno navedenom, mogu biti modifikovane aminokiseline u Fc regionu koje su sa dominantnom ulogom u interakcijama sa C1q i Fc gama receptorima. Primeri aminokiselinskih pozicija koje mogu biti modifikovane uklјučuju pozicije L234, L235 i P331. Nјihove kombinacije, kao što su L234F/L235E/P331S, mogu prouzrokovati izraženo smanjenje u vezivanju za humani CD64, CD32A, CD16 i C1q.
[0086] Tako, u jednom primeru izvođenja, aminokiselina na najmanje jednoj poziciji koja odgovara L234, L235 i P331, može biti A, A i S, tim redom ([1], [28]). Takođe, razultat aminokiselinskih supstitucija L234F i L235E mogu biti Fc regioni koji ne mogu interagovati sa Fc gama receptorima i C1q ([29]-[30]). Stoga, u jednom primeru izvođenja, aminokiseline na pozicijama koje odgovaraju L234 i L235, mogu biti F i E, tim redom. Aminokiselinska supstitucija D265A može smanjiti vezivanje za sve Fc gama receptore i sprečiti ADCC ([31]). Tako, u jednom primeru izvođenja, aminokiselina na poziciji koja odgovara D265 može biti A. Vezivanje za C1q može biti poništeno mutiranjem pozicija D270, K322, P329 i P331. Mutiranjem ovih pozicija bilo na D270A ili K322A ili P329A ili P331A može nastati antitelo koga karakteriše deficijencija CDC aktivnosti ([32]). Tako, u jednom primeru izvođenja, aminokiseline na najmanje jednoj poziciji koja odgovara D270, K322, P329 i P331, mogu biti A, A, A i A, tim redom.
[0087] Alternativan pristup da se interakcija Fc regiona sa Fc gama receptorima i C1q svede na minimum je uklanjanje mesta glikozilacije antitela. Mutiranjem pozicije N297, u npr. Q, A i E, uklanja mesto glikozilacije koje je presudno za interakcije IgG-a i Fc gama receptora. Tako, u jednom primeru izvođenja, aminokiselina na poziciji koja odgovara N297 može biti G, Q, A ili E ([33]). Drugi alternativan pristup da se interakcija Fc regiona sa Fc gama receptorima svede na minimum, može biti postignut sledećim mutacijama; P238A, A327Q, P329A ili E233P/L234V/L235A/G236del ([31]).
[0088] Alternativno, potklase humanih IgG2 i IgG4 se smatraju prirodno kompromitovanim u njihovim interakcijama sa C1q i Fc gama receptorima, mada su prijavlјene interakcije sa Fcγ receptorima (Fc gama receptorima) ([34]-[35]). Mutacije koje poništavaju ovakve rezidualne interakcije mogu biti uvedene u oba izotipa, a rezultat je smanjenje neželјenih sporednih efekata koji su udruženi za vezivanjem FcR. Za IgG2, iste uključuju L234A i G237A, a za IgG4, L235E. Tako, u jednom primeru izvođenja, aminokiselina na poziciji koja odgovara L234 i G237 u teškom lancu humanog IgG2, može biti A, odnosno A, tim redom. U jednom primeru izvođenja, aminokiselina na poziciji koja odgovara L235 u teškom lancu humanog IgG4, može biti E.
[0089] Ostali pristupi za svođenje interakcije IgG2 antitela sa Fc gama receptorima i C1q na minimum, obuhvataju one opisane u [36] i [37].
[0090] Zglobni region antitela takođe može biti od važnosti u pogledu interakcija sa Fc gama receptorima i komplementom ([38]-[39]). Shodno tome, mutacije u ili delecije zglobnog regiona mogu uticati na efektorske funkcije antitela.
[0091] Termin "umrežavanje", kako se ovde upotrebljava, odnosi se na indirektno premošćivanje Fab kraka antitela (monovalentnih ili bivalentnih) koji su vezani za ciljni antigen sa ćelijama koje nose FcR, posredstvom vezivanja za Fc region antitela. Prema tome, antitelo koje vezuje svoj cilјni antigen na ćelijama koje nose ciljni antigen može biti umreženo sa drugom ćelijom koja eksprimira FcR.
[0092] Termin "nespecifično ubijanje", kako se ovde upotrebljava, odnosi se na ubijanje ćelija citotoksičnom funkcijom T-ćelija ili drugih efektorskih ćelija, putem aktivacije navedenih ćelija koja je nezavisna od tumorskog ciljnog antigena. Tako, pod nespecifičnim ubijanjem se podrazumeva da ćelije koje nose tumorske ciljne molekule mogu biti ubijene npr. sa citotoksičnim T-ćelijama, a ne antitelom koje vezuje tumorski cilјni molekul, npr. indukcijom CDC.
[0093] Predmenti pronalazači su pokazali (pogledati Primere od 3 do 5, od 7 do 10) da se neaktivirajući Fc region može dobiti modifikovanjem jedne ili više od najmanje pet specifičnih aminokiselinskih pozicija u Fc regionu.
[0094] Tako, u jednom primeru izvođenja, antitelo sadrži prvi i drugi imunoglobulinski teški lanac, pri čemu u najmanje jednom od navedenih prvih i drugih imunoglobulinskih teških lanaca, jedna ili više aminokiselina na pozicijama koje odgovaraju pozicijama L234, L235, D265, N297 i P331 u teškom lancu humanog IgG1 nisu L, L, D, N i P, tim redom.
[0095] U jednom primeru izvođenja, u oba od prvih i drugih teških lanaca, jedna ili više aminokiselina na poziciji koja odgovara pozicijama L234, L235, D265, N297 i P331 u teškom lancu humanog IgG1 nisu L, L, D, N i P, tim redom.
[0096] U drugom primeru izvođenja, u najmanje jednom od prvih i drugih teških lanaca, jedna ili više aminokiselina na pozicijama koje odgovaraju pozicijama L234, L235 i D265 u teškom lancu humanog IgG1 nisu L, L i D, tim redom, a aminokiseline na pozicijama koje odgovaraju N297 i P331 u teškom lancu humanog IgG1 su N i P, tim redom.
[0097] Termin "aminokiselina koja odgovara pozicijama", kako se ovde upotrebljava, odnosi se na broj aminokiselinske pozicije u teškom lancu humanog IgG1. Ukoliko nije drugačije navedeno ili je u suprotnosti sa kontekstom, aminokiseline sekvenci konstatnih regiona su ovde numerisane prema Euindeksu numeracije (opisanom u [27]). Prema tome, aminokiselina ili segment u jednoj sekvenci koji "odgovara" aminokiselini ili segmentu u drugoj sekvenci su oni koji mogu biti pravnati sa drugom aminokiselinom ili segmentom, upotrebom standardnog programa za poravnavanje sekvenci kao što je ALIGN, ClustalW ili sličan, obično uz podešavanja koja su zadata, pri čemu je najmanje 50%, najmanje 80%, najmanje 90% ili najmanje 95% identično humanom teškom lancu IgG1. Smatra se dobro poznatim u oblasti tehnike kako poravnati sekvence ili segmente u sekvenci i time odrediti odgovarajuću poziciju u sekvenci za aminokiselinsku poziciju prema predmetnog pronalasku.
[0098] U kontekstu predmetnog pronalaska, aminokiselina može biti definisana kao što je prethodno opisano.
[0099] Termin "aminokiselina nije" ili slična formulacija, kada se odnosi na aminokiseline u teškom lancu, treba shvatiti tako da navedeno podrazumeva da je aminokiselina bilo koja druga aminokiselina osim navedene specifične aminokiseline. Na primer, kada aminokiselina na poziciji koja odgovara L234 u teškom lancu humanog IgG1 nije L, navedeno označava da aminokiselina može biti bilo koja od ostalih priprodnih ili aminokiselina koje se ne javlјaju u prirodi u odnosu na L.
[0100] U jednom primeru izvođenja, u najmanje jednom od navedenih prvih i drugih teških lanaca, aminokiselina na poziciji koja odgovara poziciji D265 u teškom lancu humanog IgG1 nije D.
[0101] U jednom primeru izvođenja, u najmanje jednom od prvih i drugih teških lanaca, aminokiselina na poziciji koja odgovara D265 u teškom lancu humanog IgG1 nije D, a aminokiseline na pozicijama koje odgovaraju pozicijama N297 i P331 u teškom lancu humanog IgG1 su N i P, tim redom.
[0102] U jednom primeru izvođenja, u najmanje jednom od navedenih prvih i drugih teških lanaca, aminokiseline na pozicijama koje odgovaraju poziciji D265 u teškom lancu humanog IgG1 su hidrofobne ili polarne aminokiseline.
[0103] Termin "hidrofoban”, kako se ovde upotrebljava u vezi sa aminokiselinskim ostatkom, odnosi se na aminokiselinski ostatak izabran iz grupe koja se sastoji od; A, C, F, G, H, I, L, M, R, T, V, W i Y. Tako, u jednom primeru izvođenja, u najmanje jednom od navedenih prvih i drugih teških lanaca, aminokiselina na poziciji koja odgovara poziciji D265 u teškom lancu humanog IgG1 je izabrana iz grupe aminokiselina koja se sastoji od; A, C, F, G, H, I, L, M, R, T, V, W i Y.
[0104] Termin "polaran”, kako se ovde upotrebljava u vezi sa aminokiselinskim ostacima, odnosi se na bilo koji aminokiselinski ostatak izabran iz grupe koja se sastoji od; C, D, E, H, K, N, Q, R, S i T. Tako, u jednom primeru izvođenja, u najmanje jednom od navedenih prvih i drugih teških lanaca, aminokiselina na poziciji koja odgovara pozicijI D265 u humanom teškon lancu je izabrana iz grupe koja se sastoji od; C, E, H, K, N, Q, R, S i T.
[0105] U drugom primeru izvođenja, u najmanje jednom od navedenih prvih i drugih teških lanaca, aminokiselina na poziciji koja odgovara poziciji D265 u teškom lancu humanog IgG1 je alifatična nenaelektrisana, aromatična ili kisela aminokiselina.
[0106] Termin "alifatičan nenaelektrisan”, kako se ovde upotrebljava u vezi sa aminokiselinskim ostacima, odnosi se na bilo koji aminokiselinski ostatak izabran iz grupe koja se sastoji od: A, G, I, L i V. Tako, u jednom primeru izvođenja, u najmanje jednom od navedenih prvih i drugih teških lanaca, aminokiselina na poziciji koja odgovara poziciji D265 u teškom lancu humanog IgG1 je izabrana iz grupe koju čine; A, G, I, L i V.
[0107] Termin "aromatičan”, kako se ovde upotrebljava u vezi sa aminokiselinskim ostacima, odnosi se na bilo koji aminokiselinski ostatak izabran iz grupe koja se sastoji od: F, T i W. Tako, u jednom primeru izvođenja, u najmanje jednom od navedenih prvih i drugih teških lanaca, aminokiselina na poziciji koja odgovara poziciji D265 u teškom lancu humanog IgG1 je izabrana iz grupe koja se sastoji od; F, T i W.
[0108] Termin "kiseli", kako se ovde upotrebljava u vezi sa aminokiselinskim ostacima, odnosi se na bilo koji aminokiselinski ostatak izabran iz grupe koja se sastoji od: D i E. Tako, u jednom primeru izvođenja, u najmanje jednom od navedenih prvih i drugih teških lanaca, aminokiselina na poziciji koja odgovara poziciji D265 u teškom lancu humanog IgG1 je izabrana iz grupe koju čine; D i E.
[0109] U posebnom primeru izvođenja, u najmanje jednom od navedenih prvih i drugih teških lanaca, aminokiselina na poziciji koja odgovara poziciji D265 u teškom lancu humanog IgG1 je izabrana iz grupe koja se sastoji od; A, E, F, G, I, L, T, V i W.
[0110] U jednom primeru izvođenja, u oba od navedenih prvih i drugih teških lanaca, aminokiselina na poziciji koja odgovara poziciji D265 u teškom lancu humanog IgG1 nije D.
[0111] U jednom primeru izvođenja, u oba od navedenih prvih i drugih teških lanaca, aminokiselina na poziciji koja odgovara D265 u teškom lancu humanog IgG1 nije D, a aminokiseline na pozicijama koje odgovaraju pozicijama N297 i P331 u teškom humanom IgG1 lanac, su N i P, tim redom.
[0112] U jednom primeru izvođenja, u oba od navedenih prvih i drugih teških lanaca, aminokiselina na poziciji koja odgovara poziciji D265 u teškom lancu humanog IgG1 je hidrofobna ili polarna aminokiselina.
[0113] Termin "hidrofoban”, kako se ovde upotrebljava u vezi sa aminokiselinskim ostatkom, odnosi se na aminokiselinski ostatak izabran iz grupe koja se sastoji od; A, C, F, G, H, I, L, M, R, T, V, W i Y. Tako, u jednom primeru izvođenja, u oba od navedenih prvih i drugih teških lanaca, aminokiselina na poziciji koja odgovara poziciji D265 u teškom lancu humanog IgG1 je izabrana iz grupe aminokiselina koja se sastoji od; A, C, F, G, H, I, L, M, R, T, V, W i Y.
[0114] Termin "polaran”, kako se ovde upotrebljava u vezi sa aminokiselinskim ostacima, odnosi se na bilo koji aminokiselinski ostatak izabran iz grupe koja se sastoji od; C, D, E, H, K, N, Q, R, S i T. Tako, u jednom primeru izvođenja, u oba od navedenih prvih i drugih teških lanaca, aminokiselina na poziciji koja odgovara poziciji D265 u humanom teškom lancu je izabrana iz grupe koju čine; C, E, H, K, N, Q, R, S i T. U jednom primeru izvođenja, u oba od navedenih prvih i drugih teških lanaca, aminokiselina na poziciji koja odgovara poziciji D265 u teškom lancu humanog IgG1 je izabrana iz grupe aminokiselina koja se sastoji od; A, C, F, G, H, I, L, M, R, T, V, W i Y.
[0115] U jednom primeru izvođenja, u oba od navedenih prvih i drugih teških lanaca, aminokiseline na pozicijama koje odgovaraju poziciji D265 u teškom lancu čoveka su izabrane iz grupe koja se sastoji od; C, E, H, K, N, Q, R, S i T.
[0116] U drugom primeru izvođenja, u oba od navedenih prvih i drugih teških lanaca, aminokiselina na poziciji koja odgovara poziciji D265 u teškom lancu humanog IgG1 je alifatična nenaelektrisana, aromatična ili kisela aminokiselina.
[0117] Termin "alifatičan nenaelektrisan”, kako se ovde upotrebljava u vezi sa aminokiselinskim ostacima, odnosi se na bilo koji aminokiselinski ostatak izabran iz grupe koja se sastoji od: A, G, I, L i V. Tako, u jednom primeru izvođenja, u oba od navedenih prvih i drugih teških lanaca, aminokiselina na poziciji koja odgovara poziciji D265 u teškom lancu humanog IgG1 je izabrana iz grupe koja se sastoji od; A, G, I, L i V.
[0118] Termin "aromatičan”, kako se ovde upotrebljava u vezi sa aminokiselinskim ostacima, odnosi se na bilo koji aminokiselinski ostatak izabran iz grupe koja se sastoji od: F, T i W. Tako, u jednom primeru izvođenja, u oba od navedenih prvih i drugih teških lanaca, aminokiselina na poziciji koja odgovara poziciji D265 u teškom lancu humanog IgG1 je izabrana iz grupe koju čine; F, T i W.
[0119] Termin "kiseli", kako se ovde upotrebljava u vezi sa aminokiselinskim ostacima, odnosi se na bilo koji aminokiselinski ostatak izabran iz grupe koja se sastoji od: D i E. Tako, u jednom primeru izvođenja, u oba od navedenih prvih i drugih teških lanaca, aminokiselina na poziciji koji odgovara poziciji D265 u teškom lancu humanog IgG1 je izabrana iz grupe koju čine; D i E.
[0120] U posebnom primeru izvođenja, u oba od navedenih prvih i drugih teških lanaca, aminokiselina na poziciji koja odgovara poziciji D265 u teškom lancu humanog IgG1 je izabrana iz grupe koja se sastoji od; A, E, F, G, I, L, T, V i W.
[0121] U sledećem primeru izvođenja, u najmanje jednom od navedenih prvih i drugih teških lanaca, aminokiselina na poziciji koja odgovara poziciji N297 u teškom lancu humanog IgG1 nije N.
[0122] U jednom primeru izvođenja, u najmanje jednom od prvih i drugih teških lanaca, aminokiselina na poziciji koja odgovara N297 u teškom lancu humanog IgG1 nije N, a aminokiselina na poziciji koja odgovara poziciji P331 u teškom lancu humanog IgG1 je P.
[0123] U jednom primeru izvođenja, u oba od navedenih prvih i drugih teških lanaca, aminokiselina na poziciji koja odgovara poziciji N297 u teškom lancu humanog IgG1 nije N.
[0124] U jednom primeru izvođenja, u oba od navedenih prvih i drugih teških lanaca, aminokiselina na poziciji koja odgovara N297 u teškom lancu humanog IgG1 nije N, a aminokiselina na poziciji koja odgovara poziciji P331 u teškom lancu humanog IgG1 je P.
[0125] U dodatnom primeru izvođenja, u najmanje jednom od navedenih prvih i drugih teških lanaca, aminokiseline na pozicijama koje odgovaraju pozicijama L234 i L235 u teškom lancu humanog IgG1 nisu L i L, tim redom.
[0126] U jednom primeru izvođenja, u najmanje jednom od prvih i drugih teških lanaca, aminokiseline na pozicijama koje odgovaraju L234 i L235 u teškom lancu humanog IgG1 nisu L i L, tim redom, a aminokiseline na pozicijama koje odgovaraju pozicijama N297 i P331 u teškom lancu humanog IgG1 su N i P, tim redom.
[0127] U jednom primeru izvođenja, u najmanje jednom od navedenih prvih i drugih teških lanaca, aminokiseline koje odgovaraju pozicijama L234 i L235 u teškom lancu humanog IgG1 su izabrane iz grupe koja se sastoji od; A, C, D, E, F, G, H, I, K, M, N, P, Q, R, S, T, Y, V.
[0128] U jednom primeru izvođenja, u najmanje jednom od navedenih prvih i drugih teških lanaca, aminokiseline na pozicijama koje odgovaraju pozicijama L234 i L235 u teškom lancu humanog IgG1 su hidrofobne ili polarne aminokiseline.
[0129] Termin "hidrofoban”, kako se ovde upotrebljava u vezi sa aminokiselinskim ostatkom, odnosi se na aminokiselinski ostatak izabran iz grupe koja se sastoji od; A, C, F, G, H, I, L, M, R, T, V, W i Y. Tako, u jednom primeru izvođenja, u najmanje jednom od navedenih prvih i drugih teških lanaca, svaka od aminokiselina na pozicijama koje odgovaraju pozicijama L234 i L235 u teškom lancu humanog IgG1 je izabrana iz grupe koju čine; A, C, F, G, H, I, M, R, T, V, W i Y.
[0130] Termin "polaran”, kako se ovde upotrebljava u vezi sa aminokiselinskim ostacima, odnosi se na bilo koji aminokiselinski ostatak izabran iz grupe koja se sastoji od; C, D, E, H, K, N, Q, R, S i T. Tako, u jednom primeru izvođenja, u najmanje jednom od navedenih prvih i drugih teških lanaca, svaka od aminokiselina na pozicijama koje odgovaraju pozicijama L234 i L235 u teškom lancu humanog IgG1 je izabrana iz grupe aminokiselina koja se sastoji od; C, D, E, H, K, N, Q, R, S i T.
[0131] U posebnom primeru izvođenja, u najmanje jednom od navedenih prvih i drugih teških lanaca, aminokiseline na pozicijama koje odgovaraju pozicijama L234 i L235 u teškom lancu humanog IgG1 su izabrane iz grupe koja se sastoji od; A, C, D, E, F, G, H, I, K, M, N, Q, R, S, T, V, W i Y.
[0132] U jednom primeru izvođenja, u oba od navedenih prvih i drugih teških lanaca, aminokiseline na pozicijama koje odgovaraju pozicijama L234 i L235 u teškom lancu humanog IgG1 nisu L i L, tim redom.
[0133] U jednom primeru izvođenja, u oba od navedenih prvih i drugih teških lanaca, aminokiseline na pozicijama koje odgovaraju L234 i L235 u teškom lancu humanog IgG1 nisu L i L, tim redom, a aminokiseline na pozicijama koje odgovaraju pozicijama N297 i P331 u teškom lancu humanog IgG1 su N i P, tim redom.
[0134] U jednom primeru izvođenja, u oba od navedenih prvih i drugih teških lanaca, aminokiseline na pozicijama koje odgovaraju L234 i L235 u teškom lancu humanog IgG1 su hidrofobne ili polarne aminokiseline.
[0135] U jednom primeru izvođenja, u oba od navedenih prvih i drugih teških lanaca, aminokiseline na pozicijama koje odgovaraju pozicijama L234 i L235 u teškom lancu humanog IgG1 su izabrane iz grupe koja se sastoji od; A, C, F, G, H, I, M, R, T, V, W i Y.
[0136] U jednom primeru izvođenja, u oba od navedenih prvih i drugih teških lanaca, svaka od aminokiselina na pozicijama koje odgovaraju pozicijama L234 i L235 u teškom lancu humanog IgG1 je izabrana iz grupe aminokiselina koja se sastoji od; C, D, E, H, K, N, Q, R, S i T.
[0137] U posebnom primeru izvođenja, u oba od navedenih prvih i drugih teških lanaca, svaka od aminokiselina na pozicijama koje odgovaraju pozicijama L234 i L235 u teškom lancu humanog IgG1 je izabrana iz grupe koja se sastoji od; A, C, D, E, F, G, H, I, K, M, N, Q, R, S, T, V, W i Y.
[0138] U drugom primeru izvođenja, u najmanje jednom od navedenih prvih i drugih teških lanaca, aminokiseline na pozicijama koje odgovaraju pozicijama L234 i L235 u teškom lancu humanog IgG1 su alifatične nenaelektrisane, aromatične ili kisele aminokiseline.
[0139] Termin "alifatičan, nenaelektrisan", kako se ovde upotrebljava u vezi sa aminokiselinskim ostacima, odnosi se na bilo koji aminokiselinski ostatak izabran iz grupe koja se sastoji od: A, G, I, L i V. Tako, u jednom primeru izvođenja, u najmanje jednom od navedenih prvih i drugih teških lanaca, aminokiseline na pozicijama koje odgovaraju pozicijama L234 i L235 u teškom lancu humanog IgG1 su izabrane iz grupe koja se sastoji od; A, G, I i V.
[0140] Termin "aromatičan”, kako se ovde upotrebljava u vezi sa aminokiselinskim ostacima, odnosi se na bilo koji aminokiselinski ostatak izabran iz grupe koja se sastoji od: F, T i W. Tako, u jednom primeru izvođenja, u najmanje jednom od navedenih prvih i drugih teških lanaca, aminokiseline na pozicijama koje odgovaraju pozicijama L234 i L235 u teškom lancu humanog IgG1 su izabrane iz grupe koja se sastoji od; F, T i W.
[0141] Termin "kiseli", kako se ovde upotrebljava u vezi sa aminokiselinskim ostacima, odnosi se na bilo koji aminokiselinski ostatak izabran iz grupe koja se sastoji od: D i E. Tako, u jednom primeru izvođenja, u najmanje jednom od navedenih prvih i drugih teških lanaca, aminokiseline na pozicijama koje odgovaraju pozicijama L234 i L235 u teškom lancu humanog IgG1 su izabrane iz grupe koja se sastoji od; D i E.
[0142] U posebnom primeru izvođenja, u najmanje jednom od navedenih prvih i drugih teških lanaca, svaka od aminokiselina na pozicijama koje odgovaraju L234 i L235 je izabrana iz grupe koja se sastoji od; A, D, E, F, G, I, T, V i W.
[0143] U jednom primeru izvođenja, u najmanje jednom od navedenih prvih i drugih teških lanaca, aminokiseline na pozicijama koje odgovaraju pozicijama L234 i L235 u teškom lancu humanog IgG1 su F i E; ili A i A, tim redom.
[0144] U jednom primeru izvođenja, u najmanje jednom od prvih i drugih teških lanaca, aminokiseline na pozicijama koje odgovaraju L234 i L235 u teškom lancu humanog IgG1 su F i E; ili A i A, tim redom, a aminokiseline na pozicijama koje odgovaraju pozicijama N297 i P331 u teškom lancu humanog IgG1 su N i P, tim redom.
[0145] U jednom primeru izvođenja, u oba od navedenih prvih i drugih teških lanaca, aminokiseline na pozicijama koje odgovaraju pozicijama L234 i L235 u teškom lancu humanog IgG1 su F i E; ili A i A, tim redom.
[0146] U jednom primeru izvođenja, u oba od navedenih prvih i drugih teških lanaca, aminokiseline na pozicijama koje odgovaraju L234 i L235 u teškom lancu humanog IgG1 su F i E; ili A i A, tim redom, a aminokiseline na pozicijama koje odgovaraju pozicijama N297 i P331 u teškom lancu humanog IgG1 su N i P, tim redom.
[0147] U posebnom primeru izvođenja, u najmanje jednom od navedenih prvih i drugih teških lanaca, aminokiseline na pozicijama koje odgovaraju pozicijama L234 i L235 u teškom lancu humanog IgG1 su F i E, tim redom.
[0148] U jednom primeru izvođenja, u oba od navedenih prvih i drugih teških lanaca, aminokiseline na pozicijama koje odgovaraju pozicijama L234 i L235 u teškom lancu humanog IgG1 su F i E, tim redom.
[0149] U jednom primeru izvođenja, u najmanje jednom od navedenih prvih i drugih teških lanaca, najmanje aminokiseline na pozicijama koje odgovaraju pozicijama L234 i L235 u teškom lancu humanog IgG1 su A i A, tim redom.
[0150] U jednom primeru izvođenja, u oba od navedenih prvih i drugih teških lanaca, najmanje aminokiseline na pozicijama koje odgovaraju pozicijama L234 i L235 u teškom lancu humanog IgG1 su A i A, tim redom.
[0151] U jednom primeru izvođenja, u najmanje jednom od navedenih prvih i drugih teških lanaca, aminokiseline na pozicijama koje odgovaraju pozicijama L234, L235 i D265 u teškom lancu humanog IgG1 nisu L, L i D, tim redom.
[0152] U jednom primeru izvođenja, u najmanje jednom od prvih i drugih teških lanaca, aminokiseline na pozicijama koje odgovaraju L234, L235 i D265 u teškom lancu humanog IgG1 nisu L, L i D, a aminokiseline na pozicijama koje odgovaraju pozicijama N297 i P331 u teškom lancu humanog IgG1 su N i P, tim redom.
[0153] U jednom primeru izvođenja, u najmanje jednom od navedenih prvih i drugih teških lanaca, aminokiseline koje odgovaraju pozicijama L234 i L235 u teškom lancu humanog IgG1 su izabrane iz grupe koja se sastoji od; A, C, D, E, F, G, H, I, K, M, N, P, Q, R, S, T, Y, V i W, a aminokiselina koja odgovara poziciji D265 je izabrana iz grupe koja se sastoji od; A, C, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, Y, V i W.
[0154] U jednom primeru izvođenja, u najmanje jednom od navedenih prvih i drugih teških lanaca, aminokiseline na pozicijama koje odgovaraju pozicijama L234, L235 i D265 u teškom lancu humanog IgG1 su hidrofobne ili polarne aminokiseline.
[0155] Termin "hidrofoban”, kako se ovde upotrebljava u vezi sa aminokiselinskim ostatkom, odnosi se na aminokiselinski ostatak izabran iz grupe koja se sastoji od; A, C, F, G, H, I, L, M, R, T, V, W i Y. Tako, u jednom primeru izvođenja, u najmanje jednom od navedenih prvih i drugih teških lanaca, aminokiselina na poziciji koja odgovara poziciji D265 u teškom lancu humanog IgG1 je izabrana iz grupe aminokiselina koja se sastoji od; A, C, F, G, H, I, L, M, R, T, V, W i Y, a aminokiseline na pozicijama koje odgovaraju pozicijama L234 i L235 u teškom lancu humanog IgG1 su izabrane iz grupe koja se sastoji od; A, C, F, G, H, I, M, R, T, V, W i Y.
[0156] Termin "polaran”, kako se ovde upotrebljava u vezi sa aminokiselinskim ostacima, odnosi se na bilo koji aminokiselinski ostatak izabran iz grupe koja se sastoji od; C, D, E, H, K, N, Q, R, S i T. Tako, u jednom primeru izvođenja, u najmanje jednom od navedenih prvih i drugih teških lanaca, svaka od aminokiselina na pozicijama koje odgovaraju pozicijama L234 i L235 u teškom lancu humanog IgG1 je izabrana iz grupe aminokiselina koja se sastoji od; C, D, E, H, K, N, Q, R, S i T, a aminokiselina na poziciji koja odgovara poziciji D265 u humanom teškom lancu je izabrana iz grupe koja se sastoji od; C, E, H, K, N, Q, R, S i T.
[0157] U posebnom primeru izvođenja, u najmanje jednom od navedenih prvih i drugih teških lanaca, aminokiseline na pozicijama koje odgovaraju pozicijama L234 i L235 u teškom lancu humanog IgG1 su izabrane iz grupe koja se sastoji od; A, C, D, E, F, G, H, I, K, M, N, Q, R, S, T, V, W i Y, a aminokiselina na poziciji koja odgovara poziciji D265 u teškom lancu humanog IgG1 je izabrana iz grupe koju čine; A, C, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W i Y.
[0158] U jednom primeru izvođenja, u oba od navedenih prvih i drugih teških lanaca, aminokiseline na pozicijama koje odgovaraju L234, L235 i D265 u teškom lancu humanog IgG1 su hidrofobne ili polarne aminokiseline.
[0159] U jednom primeru izvođenja, u oba od navedenih prvih i drugih teških lanaca, aminokiselina na poziciji koja odgovara poziciji D265 u teškom lancu humanog IgG1 je izabrana iz grupe aminokiselina koja se sastoji od; A, C, F, G, H, I, L, M, R, T, V, W i Y, a aminokiseline na pozicijama koje odgovaraju pozicijama L234 i L235 u teškom lancu humanog IgG1 su izabrane iz grupe koja se sastoji od; A, C, F, G, H, I, M, R, T, V, W i Y.
[0160] U jednom primeru izvođenja, u oba od navedenih prvih i drugih teških lanaca, svaka od aminokiselina na pozicijama koje odgovaraju pozicijama L234 i L235 u teškom lancu humanog IgG1 je izabrana iz grupe aminokiselina koja se sastoji od; C, D, E, H, K, N, Q, R, S i T, dok je aminokiselina na poziciji koja odgovara poziciji D265 u humanom teškom lancu izabrana iz grupe koja se sastoji od; C, E, H, K, N, Q, R, S i T.
[0161] U posebnom primeru izvođenja, u oba od navedenih prvih i drugih teških lanaca, aminokiseline na pozicijama koje odgovaraju pozicijama L234 i L235 u teškom lancu humanog IgG1 su izabrane iz grupe koja se sastoji od; A, C, D, E, F, G, H, I, K, M, N, Q, R, S, T, V, W i Y, dok je aminokiselina na poziciji koja odgovara poziciji D265 u teškom lancu humanog IgG1 izabrana iz grupe koju čine; A, C, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W i Y.
[0162] U drugom primeru izvođenja, u najmanje jednom od navedenih prvih i drugih teških lanaca, aminokiseline na pozicijama koje odgovaraju pozicijama L234, L235 i D265 u teškom lancu humanog IgG1 su alifatične nenaelektrisane, aromatične ili kisele aminokiseline.
[0163] Termin "alifatičan, nenaelektrisan”, kako se ovde upotrebljava u vezi sa aminokiselinskim ostacima, odnosi se na bilo koji aminokiselinski ostatak izabran iz grupe koja se sastoji od: A, G, I, L i V. Tako, u jednom primeru izvođenja, u najmanje jednom od navedenih prvih i drugih teških lanaca, aminokiselina na poziciji koja odgovara poziciji D265 u teškom lancu humanog IgG1 je izabrana iz grupe koju čine; A, G, I, L i V, a aminokiseline na pozicijama koje odgovaraju pozicijama L234 i L235 u teškom lancu humanog IgG1 su izabrane iz grupe koja se sastoji od; A, G, I i V.
[0164] Termin "aromatičan”, kako se ovde upotrebljava u vezi sa aminokiselinskim ostacima, odnosi se na bilo koji aminokiselinski ostatak izabran iz grupe koja se sastoji od: F, T i W. Tako, u jednom primeru izvođenja, u najmanje jednom od navedenih prvih i drugih teških lanaca, aminokiseline na pozicijama koje odgovaraju pozicijama L234, L235 i D265 u teškom lancu humanog IgG1 su izabrane iz grupe koja se sastoji od; F, T i W.
[0165] Termin "kiseli", kako se ovde upotrebljava u vezi sa aminokiselinskim ostacima, odnosi se na bilo koji aminokiselinski ostatak izabran iz grupe koja se sastoji od: D i E. Tako, u jednom primeru izvođenja, u najmanje jednom od navedenih prvih i drugih teških lanaca, aminokiseline na pozicijama koje odgovaraju pozicijama L234, L235 i D265 u teškom lancu humanog IgG1 su izabrane iz grupe koja se sastoji od; D i E.
[0166] U posebnom primeru izvođenja, u najmanje jednom od navedenih prvih i drugih teških lanaca aminokiselina na poziciji koja odgovara poziciji D265 u teškom lancu humanog IgG1 je izabrana iz grupe koja se sastoji od; A, E, F, G, I, L, T, V i W, a aminokiseline na pozicijama koji odgovaraju L234 i L235 su izabrane iz grupe koja se sastoji od; A, D, E, F, G, I, T, V i W.
[0167] U jednom primeru izvođenja, u oba od navedenih prvih i drugih teških lanaca, aminokiseline na pozicijama koje odgovaraju pozicijama L234, L235 i D265 u teškom lancu humanog IgG1 nisu L, L i D, tim redom.
[0168] U jednom primeru izvođenja, u oba od navedenih prvih i drugih teških lanaca, aminokiseline na pozicijama koje odgovaraju L234, L235 i D265 u teškom lancu humanog IgG1 nisu L, L i D, tim redom, a aminokiseline na pozicijama koje odgovaraju pozicijama N297 i P331 u teškom lancu humanog IgG1 su N i P, tim redom.
[0169] U jednom primeru izvođenja, u oba od navedenih prvih i drugih teških lanaca, aminokiseline na pozicijama koje odgovaraju L234, L235 i D265 u teškom lancu humanog IgG1 su alifatične nenaelektrisane, aromatične ili kisele aminokiseline.
[0170] U jednom primeru izvođenja, u oba od navedenih prvih i drugih teških lanaca, aminokiselina na poziciji koja odgovara poziciji D265 u teškom lancu humanog IgG1 je izabrana iz grupe koja se sastoji od; A, G, I, L i V, a aminokiseline na pozicijama koje odgovaraju pozicijama L234 i L235 u teškom lancu humanog IgG1 su izabrane iz grupe koja se sastoji od; A, G, I i V.
[0171] U jednom primeru izvođenja, u oba od navedenih prvih i drugih teških lanaca, aminokiseline na pozicijama koje odgovaraju pozicijama L234, L235 i D265 u teškom lancu humanog IgG1 su izabrane iz grupe koja se sastoji od; D i E.
[0172] U posebnom primeru izvođenja, u oba od navedenih prvih i drugih teških lanaca, aminokiselina na poziciji koja odgovara poziciji D265 u teškom lancu humanog IgG1 izabrana iz grupe koja se sastoji od; A, E, F, G, I, L, T, V i W, a aminokiseline na pozicijama koji odgovaraju L234 i L235 su izabrane iz grupe koja se sastoji od; A, D, E, F, G, I, T, V i W.
[0173] U jednom primeru izvođenja, u najmanje jednom od navedenih prvih i drugih teških lanaca, aminokiseline na pozicijama koje odgovaraju pozicijama L234, L235 i D265 u teškom lancu humanog IgG1 su F, E i A; ili A, A i A, tim redom.
[0174] U jednom primeru izvođenja, u najmanje jednom od prvih i drugih teških lanaca, aminokiseline na pozicijama koje odgovaraju L234, L235 i D265 u teškom lancu humanog IgG1 su F, E i A; ili A, A i A, tim redom, a aminokiseline na pozicijama koje odgovaraju pozicijama N297 i P331 u teškom lancu humanog IgG1 su N i P, tim redom.
[0175] U jednom primeru izvođenja, u oba od navedenih prvih i drugih teških lanaca, aminokiseline na pozicijama koje odgovaraju pozicijama L234, L235 i D265 u teškom lancu humanog IgG1 su F, E i A; ili A, A i A, tim redom.
[0176] U jednom primeru izvođenja, u oba od navedenih prvih i drugih teških lanaca, aminokiseline na pozicijama koje odgovaraju L234, L235 i D265 u teškom lancu humanog IgG1 su F, E i A; ili A, A i A, tim redom, a aminokiseline na pozicijama koje odgovaraju pozicijama N297 i P331 u teškom lancu humanog IgG1 su N i P, tim redom.
[0177] U posebnom primeru izvođenja, u najmanje jednom od navedenih prvih i drugih teških lanaca, aminokiseline na pozicijama koje odgovaraju pozicijama L234, L235 i D265 u teškom lancu humanog IgG1 su F, E i A, tim redom.
[0178] U jednom primeru izvođenja, u oba od navedenih prvih i drugih teških lanaca, aminokiseline na pozicijama koje odgovaraju pozicijama L234, L235 i D265 u teškom lancu humanog IgG1 su F, E i A, tim redom.
[0179] U jednom primeru izvođenja, u najmanje jednom od navedenih prvih i drugih teških lanaca, aminokiseline na pozicijama koje odgovaraju pozicijama L234, L235 i D265 u teškom lancu humanog IgG1 su A, A i A, tim redom.
[0180] U jednom primeru izvođenja, u oba od navedenih prvih i drugih teških lanaca, aminokiseline na pozicijama koje odgovaraju pozicijama L234, L235 i D265 u teškom lancu humanog IgG1 su A, A i A, tim redom.
[0181] U sledećem primeru izvođenja, u najmanje jednom od navedenih prvih i drugih teških lanaca, aminokiseline na pozicijama koje odgovaraju pozicijama L234, L235, D265, N297 i P331 u teškom lancu humanog IgG1 su F, E, A, Q i S, tim redom.
[0182] U jednom primeru izvođenja, u oba od navedenih prvih i drugih teških lanaca, aminokiseline na pozicijama koje odgovaraju pozicijama L234, L235, D265, N297 i P331 u teškom lancu humanog IgG1 su F, E, A, Q i S, tim redom.
[0183] U posebnom primeru izvođenja, antitelo prema pronalasku sadrži VH sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO:8, VL sekvencu navedenu u SEQ ID NO:10, a u najmanje jednom od teških lanaca, aminokiseline na pozicijama koja odgovaraju pozicijama L234, L235 i D265 u teškom lancu humanog IgG1 su F, E i A, tim redom.
[0184] U drugom primeru izvođenja, antitelo prema pronalasku sadrži VH sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO:8, VL sekvencu navedenu u SEQ ID NO:12, a u najmanje jednom od teških lanaca, aminokiseline na pozicijama koje odgovaraju pozicijama L234, L235 i D265 u teškom lancu humanog IgG1 su F, E i A, tim redom.
[0185] U sledećem primeru izvođenja, antitelo prema pronalasku sadrži VH sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO:6, VL sekvencu navedenu u SEQ ID NO:10, a u najmanje jednom od teških lanaca, aminokiseline na pozicijama koje odgovaraju pozicijama L234, L235 i D265 u teškom lancu humanog IgG1 su F, E i A, tim redom.
[0186] U sledećem primeru izvođenja, antitelo prema pronalasku sadrži VH sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO:6, VL sekvencu navedenu u SEQ ID NO:12, a u najmanje jednom od teških lanaca, aminokiseline na pozicijama koje odgovaraju pozicijama L234, L235 i D265 u teškom lancu humanog IgG1 su F, E i A, tim redom.
[0187] U sledećem primeru izvođenja, antitelo prema pronalasku sadrži VH sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO:9, VL sekvencu navedenu u SEQ ID NO:10, a u najmanje jednom od teških lanaca, aminokiseline na pozicijama koje odgovaraju pozicijama L234, L235 i D265 u teškom lancu humanog IgG1 su F, E i A, tim redom.
[0188] U sledećem primeru izvođenja, antitelo prema pronalasku sadrži VH sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO:9, VL sekvencu navedenu u SEQ ID NO:12, a u najmanje jednom od teških lanaca, aminokiseline na pozicijama koje odgovaraju pozicijama L234, L235 i D265 u teškom lancu humanog IgG1 su F, E i A, tim redom.
[0189] Prema jednom aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na multispecifično antitelo koje sadrži najmanje prvi vezujući region antitela prema pronalasku i jedan ili više vezujućih regiona koji vezuju jedan ili više različitih ciljnih molekula u odnosu na prvi vezujući region. Takvo multispecifično antitelo može biti bispecifično antitelo.
[0190] Tako, prema jednom aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na bispecifično antitelo koje sadrži prvi vezujući region antitela prema pronalasku i drugi vezujući region koje vezuje različit ciljni molekul od prvog vezujućeg regiona.
[0191] Termin "multispecifično antitelo" se odnosi za antitelo koje karakterišu specifičnosti za najmanje dva različita, kao što su najmanje tri, obično nepreklapajuća epitopa. Takvi epitopi mogu biti na istim ili na različitim ciljnim molekulima. Ukoliko su epitopi na različitim ciljnim molekulima, takvi ciljni molekuli mogu biti na istoj ćeliji ili na različitim ćelijama ili ćelijskim tipovima.
[0192] Termin "bispecifično antitelo" se odnosi na antitelo koje karakterišu specifičnosti za najmanje dva različita, obično nepreklapajuća epitopa. Takvi epitopi mogu biti na istim ili različitim ciljnim molekulima. Ukoliko su epitopi na različitim ciljnim molekulima, takvi ciljni molekuli mogu biti na istoj ćeliji ili na različitim ćelijama ili ćelijskim tipovima.
[0193] U jednom primeru izvođenja, bispecifično antitelo sadrži prvi i drugi teški lanac.
[0194] Primeri izvođenja koji se odnose na modifikaciju Fc regiona i primeri izvođenja koji se odnose na specifične aminokiselinske supstitucije, razmatraju se kao deo bilo kog bispecifičnog antitela prema pronalasku. Tako, u jednom primeru izvođenja, najmanje jedan od prvih i drugih teških lanaca sadrži jednu ili više aminokiselina modifikovanih kao što je definisano u bilo kom primeru izvođenja koji je ovde opisan, kao što su oni opisani u vezi sa obezbeđivanjem inertnog Fc regiona. U jednom primeru izvođenja, oba navedena prva i druga teška lanca sadrže jednu ili više aminokiselina modifikovanih kao što je definisano u bilo kom ovde opisanom primeru izvođenja, poput onih opisanih u vezi sa obezbeđivanjem inertnog Fc regiona. Shodno navedenom, bispecifično antitelo sadrži Fc region modifikovan prema bilo kom aspektu ili primeru izvođenja koji je ovde opisan; ili najmanje jedan od navedenih prvih ili drugih teških lanaca sadrži jednu ili više aminokiselina modifikovanih kao što je definisano u bilo kom aspektu ili primeru izvođenja koji je ovde opisan.
[0195] U jednom primeru izvođenja, bispecifično antitelo sadrži prvi vezujući region koje sadrži VH sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO:6 i VL sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO:10; pri čemu je Fc region modifikovan tako da se vezivanje C1q za navedeno antitelo smanjuje u poređenju sa vezivanjem za antitelo divlјeg tipa za najmanje 70%, najmanje 80%, najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 97% ili 100%, pri čemu se C1q vezivanje određuje ELISA postupkom.
[0196] U jednom primeru izvođenja, bispecifično antitelo sadrži prvi vezujući region koje sadrži VH sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO:6 i VL sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO:10; pri čemu je Fc region modifikovan tako da navedeno antitelo posreduje u smanjenju T-ćelijske proliferacije posredovane sa Fc u poređenju sa smanjenjem sa antitelom divlјeg tipa za najmanje 50%, najmanje 60%, najmanje 70%, najmanje 80%, na najmanje 90%, najmanje 99% ili 100%, pri čemu se navedena T-ćelijska proliferacija meri u funkcionalnom testu zasnovanom na mononuklearnim ćelijama periferne krvi (PBMC).
[0197] U jednom primeru izvođenja, bispecifično antitelo sadrži prvi vezujući region koje sadrži VH sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO:6 i VL sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO:10; pri čemu je Fc region modifikovan tako da navedeno antitelo smanjuje ekspresiju CD69 posredovanu sa Fc za najmanje 50%, najmanje 60%, najmanje 70%, najmanje 80%, najmanje 90%, najmanje 99% ili 100 % u poređenju sa antitelom divlјeg tipa, pri čemu se navedena ekspresija CD69 posredovana sa Fc određuje u funkcionalnom testu zasnovanom na PBMC.
[0198] U sledećem primeru izvođenja, bispecifično antitelo sadrži prvi vezujući region koje sadrži VH sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO:6 i VL sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO:10; pri čemu, u najmanje jednom od prvih i drugih teških lanaca, aminokiseline na pozicijama koje odgovaraju pozicijama L234, L235 i D265 u teškom lancu humanog IgG1 su F, E i A, tim redom.
[0199] Primeri molekula bispecifičnih antitela koji mogu biti upotrebljeni u predmetnom pronalasku obuhvataju (i) jedno antitelo sa dva kraka koji sadrži različite regione koji vezuju antigen, (ii) jednolančano antitelo koje je sa specifičnošću za dva različita epitopa, npr. čine ga dva scFv povezana u tandem dodatnim peptidnim linkerom; (iii) antitelo sa dvostruko varijabilnim domenom (DVD-Ig™), gde svaki laki lanac i teški lanac sadrži dva varijabilna domena koji su povezani u tandem preko kratkog peptidnog linkera [40]; (iv) hemijski povezan bispecifičan (Fab’)2 fragment; (v) Tandab®, koji predstavlja fuziju dva jednolančana dimerna antitela što rezultuje u tetravalentnom bispecifičnom antitelu koje sadrži dva mesta vezivanja za svaki cilјni antigen; (vi) fleksibilno antitelo, koje je kombinacija scFv i dimernog antitela što rezultuje multivalentnim molekulom; (vii) takozvani molekul "usidri i zaključaj" (Dock-and-Lock®), zasnovan na "dimerizacionom i usidravajućem domenu" u Protein kinazi A, koji, kada se primenjuje Fab segmentima, može proizvesti trovalentan bispecifičan vezujući protein koji se sastoji od dva identična Fab fragmenta povezana sa različitim Fab fragmentom; (viii) molekul označen kao “Škorpija” (engl. Scorpion), koji sadrži, npr. dva scFv koji su fuzionisani na oba kraja kraka humanog Fab; i (ix) dimerno antitelo.
[0200] U jednom primeru izvođenja, bispecifično antitelo predmetnog pronalaska je dimerno antitelo, umreženo antitelo ili bispecifično antitelo dobijeno kontrolisanom izmenom Fab kraka, npr. DuoBody® (kao što je opisano u [41]), a kao što su antitela opisana u predmetnom pronalasku.
[0201] Primeri različitih klasa bispecifičnih antitela obuhvataju, ali nisu ograničeni na, (i) molekule slične IgG sa komplementarnim CH3 domenima u cilju prinudne heterodimerizacije; (ii) rekombinantne dvostruko ciljajuće molekule slične IgG, gde svaka od dve strane molekula sadrži Fab fragment ili deo Fab fragmenta iz najmanje dva različita antitela; (iii) IgG fuzione molekule, gde su IgG antitela pune dužine fuzionisana sa dodatnim Fab fragmentom ili delovima Fab fragmenta; (iv) Fc fuzione molekule, gde su jednolančani Fv molekuli ili stabilizovana dimerna antitela fuzionisani sa konstantnim domenima teških lanaca, Fc-regionima ili njihovim delovima; (v) Fab fuzione molekule, gde su različiti Fab-fragmenti fuzionisani zajedno i fuzionisani sa konstantnim domenima teških lanaca, Fc-regionima ili njihovim delovima; i (vi) antitela zasnovana na SCFv- i dimernim antitelima i antitelima teškog lanca (npr. domenskim antitelima, nano antitelima - Nanobodies®), gde su različiti jednolančani Fv molekuli ili različita dimerna antitela ili različita antitela teškog lanca (npr. domenska antitela, Nanobodies®) fusionisana jedna sa drugima ili sa drugim proteinom ili molekulom nosača koji je fuzionisan sa konstantnim domenima teških lanaca, Fc-regionima ili njihovim delovima.
[0202] Primeri molekula sličnih IgG koji su sa molekulima komplementarnim CH3 domenima obuhvataju, ali nisu ograničeni na, Triomab® (Trion Pharma/Fresenius Biotech, [42]), Knobs-into-Holes (Genentech, [43]), CrossMabs (Roche, [44]) i elektrostatičke podudarne (Amgen, [45]-[46]; Chugai, [47]; Oncomed, [48]), LUZ-Y (Genentech), DIG-antitelo i PIG-antitelo (Pharmabcine), antitelo konstruisanih domena dobijeno izmenom lanaca (SEEDbody od engl. Strand Exchange Engineered Domain body) (EMD Serono, [49]), Biclonics (Merus), FcΔAdp (Regeneron, [50]), bispecifičan IgG1 i IgG2 (Pfizer/Rinat, [51]), Azymetric mrežu (Zymeworks/Merck, [52]), mAb-Fv (Xencor, [43]), bivalentna bispecifična antitela (Roche) i DuoBody® molekule (Genmab A/S, [41]).
[0203] Primeri rekombinantnih dualno ciljajućih molekula sličnih IgG obuhvataju, ali nisu ograničeni na, dvostruko cilјajući (DT)-Ig (GSK/Domantis), antitelo “dva-u-jedan” (Genentech), umrežene Mabs (Karmanos Cancer Centar), mAb2 (F-Star, [54]), Zybodies™ (Zyngenia), pristupe sa uobičajenim lakim lancima (Crucell/Merus, [55]), κλ antitela (NovImmune) i CovX-antitelo® (CovX/Pfizer).
[0204] Primeri IgG fuzionih molekula obuhvataju, ali nisu ograničeni na, dvostruko varijabilni domen (DVD)-Ig™ (Abbott, [56]), antitela sa dvostrukom domenom i dvostrukim vrhom (Unilever; Sanofi Aventis, [57]), bispecifične molekule slične IgG (ImClone)/Eli Lilly), Ts2Ab (MedImmune/AZ) i BsAb (Zymogenetics), HERCULES (Biogen Idec, [58]), scFv fuziju (Novartis), scFv fuziju (Changzhou Adam Biotech Inc, [59]) i TvAb (Roche, [59], [60]).
[0205] Primeri Fc fuzionih molekula uklјučuju, ali nisu ograničeni na, ScFv/Fc fuzione molekule (Academic Insitution), SCORPION (Emergent BioSolutions/Trubion, Zymogenetics/BMS), molekule dobijene tehnologijom dualnog afiniteta i preusmeravanja specifičnosti (Fc-DART™) (MacroGenics, [62], [63]) i dualni (ScFv)2-Fab (National Research Center for Antibody Medicine - Kina).
[0206] Primeri Fab fuzionih bispecifičnih antitela obuhvataju, ali nisu ograničeni na, F(ab)2 (Medarex/AMGEN), dualno delujuća antitela ili Bis-Fab (Genentech), Dock-and-Lock® (DNL) (ImmunoMedics), bivalentna bispecifična antitela (Biotecnol) i Fab-Fv (UCB-Celltech).
[0207] Primeri antitela zasnovanih na ScFv-, dimernim antitelima i domenskim antitelima obuhvataju, ali nisu ograničeni na, bispecifičan angažer T ćelija (BiTE®) (Micromet, Tandem Diabody (Tandab™) (Affimed), antitela dobijena tehnologijom za dualni afinitet i preusmeravanje specifičnosti (DART) (MacroGenics), jednolančano dimerno antitelo (Academic), antitela nalik TCR (AIT, ReceptorLogics), fuzioni molekul ScFv i humanog serumskog albumina (Merrimack) i COMBODY (Epigen Biotech), dvostruko ciljajuća nanoantitela® (Ablynx), antitela sa samo dualno ciljajućim domenima teških lanaca.
[0208] Dalјe se razmatra da bilo koje monospecifično antitelo koje ispunjava ovde opisane uslove ispitivanja može činiti osnovu bispecifičnog antitela, tj. bispecifičnog antitela gde jedan od vezujućih regiona koji vezuje CD3 može poticati iz bilo kog monospecifičnog anti-CD3 antitela koje se ispituje u funkcionalnim testovima i ispunjava zahteve koji su ovde navedeni. Takvo bispecifično antitelo može biti obezbeđeno postupcima opisanim u [41]. Stoga, u posebnom primeru izvođenja, svaki od navedenih prvih i drugih teških lanaca sadrži najmanje zglobni region, CH2 i CH3 region, pri čemu je u navedenom prvom teškom lancu supstituisana najmanje jedna od aminokiselina na pozicijama koje odgovaraju poziciji izabranoj iz grupe koja se sastoji od T366, L368, K370, D399, F405, Y407 i K409 u teškom lancu humanog IgG1, dok je u navedenom drugom teškom lancu supstituisana najmanje jedna od aminokiselina na pozicijama koje odgovaraju poziciji izabranoj iz grupe koja se sastoji od T366, L368, K370, D399, F405, Y407 i K409 u teškom lancu humanog IgG1, i pri čemu navedeni prvi i navedeni drugi teški lanci nisu supstituisani na istim pozicijaima. U ovom kontekstu, termin "supstituisan" se odnosi na to da je aminokiselina na specifičnoj aminokiselinskoj poziciji supstituisana sa drugom prirodnom ili aminokiselinom koja se ne nalazi u prirodi. Tako, "supstituisana" aminokiselina na poziciji koja odgovara poziciji u teškom lancu humanog IgG1 označava da je aminokiselina na određenoj poziciji različita od prirodne aminokiseline u teškom lancu IgG1.
[0209] U jednom primeru izvođenja, u navedenom prvom teškom lancu, aminokiselina na poziciji koja odgovara K409 u teškom lancu humanog IgG1 nije K, L ili M i, opciono, aminokiselina na poziciji koja odgovara F405 u teškom lancu humanog IgG1 je F, dok je u navedenom drugom teškom lancu supstituisana najmanje jedna od aminokiselina na poziciji koja odgovaraju poziciji izabranoj iz grupe koja se sastoji od; T366, L368, K370, D399, F405 i Y407 u teškom lancu humanog IgG1.
[0210] U jednom primeru izvođenja, u navedenom prvom teškom lancu, aminokiselina na poziciji koja odgovara K409 u teškom lancu humanog IgG1 nije K, L ili M, dok u drugom teškom lancu aminokiselina na poziciji koja odgovara F405 u teškom lancu humanog IgG1 nije F i, opciono, aminokiselina na poziciji koja odgovara K409 u teškom lancu humanog IgG1 je K.
[0211] U jednom primeru izvođenja, u navedenom prvom teškom lancu, aminokiselina na poziciji koja odgovara F405 u teškom lancu humanog IgG1 nije F, R i G, dok su u drugom teškom lancu supstituisane aminokiseline na pozicijama koje odgovaraju pozicijama izabranim iz grupe koju čine; T366, L368, K370, D399, Y407 i K409 u teškom lancu humanog IgG1.
[0212] U jednom primeru izvođenja, aminokiselina na poziciji koja odgovara K409 u teškom lancu humanog IgG1 nije K, L ili M u navedenom prvom teškom lancu, a aminokiselina na poziciji koja odgovara F405 u teškom lancu humanog IgG1 nije F.
[0213] U sledećem primeru izvođenja, aminokiselina na poziciji koja odgovara F405 u teškom lancu humanog IgG1 je L u navedenom prvom teškom lancu, a aminokiselina na poziciji koja odgovara K409 u teškom lancu humanog IgG1 je R u navedenom drugom teškom lancu ili obrnuto.
[0214] Tako, u jednom primeru izvođenja, aminokiselina na poziciji koja odgovara K409 u teškom lancu humanog IgG1 je R u prvom teškom lancu, a aminokiselina na poziciji koja odgovara F405 u teškom lancu humanog IgG1 je L u drugom teškom lancu.
[0215] U daljem primeru izvođenja, humanizovano anti-CD3 antitelo pronalaska sadrži u najmanje jednom od prvih i drugih teških lanaca jednu ili više inaktivirajućih supstitucija kao što je opisano u bilo kom od prethodnih primera izvođenja, poput L234F, L235E i D265A; pri čemu aminokiselina na poziciji koja odgovara F405 nije F. U jednom primeru izvođenja, humanizovano anti-CD3 antitelo pronalaska sadrži u najmanje jednom od prvih i drugih teških lanaca jednu ili više inaktivirajućih supstitucija kao što je opisano u bilo kom od prethodnih primera izvođenja, poput L234F, L235E i D265A; i dodatnu supstituciju na poziciji K409, kao što je K409R. Preciznije, u jednom primeru izvođenja, humanizovano anti-CD3 antitelo pronalaska sadrži u prvom i drugom teškom lancu jednu ili više inaktivirajućih supstitucija kao što je opisano u bilo kom od prethodnih primera izvođenja, poput L234F, L235E i D265A; i supstituciju na poziciji F405, kao što je F405L. U jednom primeru izvođenja, humanizovano anti-CD3 antitelo pronalaska sadrži u prvom i drugom teškom lancu jednu ili više inaktivirajućih supstitucija kao što je opisano u bilo kom od prethodnih primera izvođenja, poput L234F, L235E i D265A; i dodatnu supstituciju na poziciji K409, kao što je K409R. Ovakva antitela su korisna za generisanje bispecifičnog antitela.
[0216] Shodno navedenom, u dalјem primeru izvođenja, u najmanje jednom od prvih i drugih teških lanaca, aminokiseline na pozicijama koje odgovaraju pozicijama L234, L235 i D265 u teškom lancu humanog IgG1 su F, E i A, tim redom, aminokiselina na poziciji koja odgovara F405 u teškom lancu humanog IgG1 je L u prvom teškom lancu, a aminokiselina na poziciji koja odgovara K409 u teškom lancu humanog IgG1 je R u drugom teškom lancu.
[0217] U jednom primeru izvođenja, u najmanje jednom od prvih i drugih teških lanaca, aminokiseline na pozicijama koje odgovaraju L234, L235, D265, N297 i P331 u teškom lancu humanog IgG1 su F, E, A, N i P, tim redom, aminokiselina na poziciji koja odgovara F405 u teškom lancu humanog IgG1 je L u prvom teškom lancu, a aminokiselina na poziciji koja odgovara K409 u teškom lancu humanog IgG1 je R u drugom teškom lancu.
[0218] U alternativnom primeru izvođenja, u najmanje jednom od prvih i drugih teških lanaca, aminokiseline na pozicijama koje odgovaraju pozicijama L234, L235 i D265 u teškom lancu humanog IgG1 su F, E i A, tim redom, aminokiselina na poziciji koja odgovara K409 u teškom lancu humanog IgG1 je R u prvom teškom lancu, a aminokiselina na poziciji koja odgovara F405 u teškom lancu humanog IgG1 je L u drugom teškom lancu.
[0219] U jednom primeru izvođenja, u najmanje jednom od prvih i drugih teških lanaca, aminokiseline na pozicijama koje odgovaraju L234, L235, D265, N297 i P331 u teškom lancu humanog IgG1 su F, E, A, N i P, tim redom, aminokiselina na poziciji koja odgovara K409 u teškom lancu humanog IgG1 je R u prvom teškom lancu, a aminokiselina na poziciji koja odgovara F405 u teškom lancu humanog IgG1 je L u drugom teškom lancu.
[0220] U drugom primeru izvođenja, u oba od prvih i drugih teških lanaca, aminokiseline na pozicijama koje odgovaraju pozicijama L234, L235 i D265 u teškom lancu humanog IgG1 su F, E i A, tim redom, aminokiselina na poziciji koja odgovara do F405 u teškom lancu humanog IgG1 je L u prvom teškom lancu, a aminokiselina na poziciji koja odgovara K409 u teškom lancu humanog IgG1 je R u drugom teškom lancu.
[0221] U jednom primeru izvođenja, u oba od prvih i drugih teških lanaca, aminokiseline na pozicijama koje odgovaraju L234, L235, D265, N297 i P331 u teškom lancu humanog IgG1 su F, E, A, N i P, tim redom, aminokiselina na poziciji koja odgovara F405 u teškom lancu humanog IgG1 je L u prvom teškom lancu, a aminokiselina na poziciji koja odgovara K409 u teškom lancu humanog IgG1 je R u drugom teškom lancu.
[0222] U alternativnom primeru izvođenja, u oba od prvih i drugih teških lanaca, aminokiseline na pozicijama koje odgovaraju pozicijama L234, L235 i D265 u teškom lancu humanog IgG1 su F, E i A, tim redom, aminokiselina na poziciji koja odgovara K409 u teškom lancu humanog IgG1 je R u prvom teškom lancu, a aminokiselina na poziciji koja odgovara F405 u teškom lancu humanog IgG1 je L u drugom teškom lancu.
[0223] U jednom primeru izvođenja, u oba od prvih i drugih teških lanaca, aminokiseline na pozicijama koje odgovaraju L234, L235, D265, N297 i P331 u teškom lancu humanog IgG1 su F, E, A, N i P, tim redom, aminokiselina na poziciji koja odgovara K409 u teškom lancu humanog IgG1 je R u prvom teškom lancu, a aminokiselina na poziciji koja odgovara F405 u teškom lancu humanog IgG1 je L u drugom teškom lancu.
[0224] Kao što je ovde opisano, regrutovanje T-ćelija do specifičnih ciljnih ćelija, kao što su kancerske ili tumorske ćelije, obezbeđuje način ubijanja cilјnih ćelija. Predmetni pronalazači su pokazali da je bispecifično CD3xHER2 antitelo koje sadrži specifične aminokiselinske supstitucije L234F, L235E i D265A u oba teška lanca sposobno da indukuje ubijanje AU565 ćelija kao što je opisano u Primeru 5. Ubijanje posredovano T-ćelijama može biti postignuto bispecifičnim antitelom koje cilјano deluje na CD3 sa prvim vezujućim regionom i sa drugim mestom cilјnog delovanja u vidu drugog vezujućeg regiona. Tako, u jednom primeru izvođenja, prvi vezujući region je u skladu sa bilo kojim primerom izvođenja koji je ovde opisan za humanizovano anti-CD3 antitelo, a drugi vezujući region vezuje različit ciljni molekul u odnosu na prvi vezujući region. Podrazumeva se da kada je antitelo bispecifično antitelo, najmanje jedna polovina antitela, tj. jedan par teških i lakih lanaca antitela, predstavlja humanizovano antitelo pronalaska. Prema tome, jedna polovina bispecifičnog antitela je humanizovano antitelo koje vezuje CD3 prema predmetnom pronalasku, dok druga polovina može biti humanizovana, himerna, u potpunosti različita od humane ili u potpunosti humana i takva da vezuje drugi ciljni molekul. Tako, u jednom primeru izvođenja, antitelo sadrži prvi i drugi teški lanac, prvi i drugi laki lanac, pri čemu su navedeni prvi teški i navedeni prvi laki lanci humanizovani i povezani preko disulfidnih mostova tako da obrazuju prvi vezujući region; dok su navedeni drugi teški i laki lanci u potpunosti humani i povezani su preko disulfidnih mostova tako da obrazuju drugi vezujući region, pri čemu je prvi vezujući region prema bilo kom aspektu ili primeru izvođenja koji je ovde opisan, a navedeni drugi vezujući region vezuje različit ciljni molekul. U jednom primeru izvođenja, antitelo sadrži prvi i drugi teški lanac, prvi i drugi laki lanac, pri čemu su navedeni prvi teški i navedeni prvi laki lanci humanizovani i povezani preko disulfidnih mostova tako da obrazuju prvi vezujući region; dok su navedeni drugi teški i laki lanci humanizovani ili himerni i povezani preko disulfidnih mostova tako da obrazuju drugi vezujući region, pri čemu je navedeni prvi vezujući region u skladu sa pronalaskaom, dok navedeni drugi vezujući region vezuje drugačiji epitop CD3 od navedenog prvog vezujućeg regiona.
[0225] U sledećem primeru izvođenja, bispecifično antitelo sadrži prvi vezujući region koje sadrži VH sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO:6 i VL sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO:10; drugi vezujući region koje sadrži VH sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO:19 i VL sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO:20; pri čemu su, u najmanje jednom od prvih i drugih teških lanaca, aminokiseline na pozicijama koje odgovaraju pozicijama L234, L235 i D265 u teškom lancu humanog IgG1, F, E i A, tim redom; i pri čemu, u prvom teškom lancu, aminokiselina na poziciji koja odgovara poziciji F405 u teškom lancu humanog IgG1, je L, dok u drugom teškom lancu, aminokiselina na poziciji koja odgovara poziciji K409 u teškom lancu humanog IgG1, je R.
[0226] U sledećem primeru izvođenja, bispecifično antitelo sadrži prvi vezujući region koje sadrži VH sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO:6 i VL sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO:10; drugi vezujući region koje sadrži VH sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO:29 i VL sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO:30; pri čemu su, u najmanje jednom od prvih i drugih teških lanaca, aminokiseline na pozicijama koje odgovaraju pozicijama L234, L235 i D265 u teškom lancu humanog IgG1, F, E i A, tim redom; i pri čemu, u prvom teškom lancu, aminokiselina na poziciji koja odgovara poziciji F405 u teškom lancu humanog IgG1 je L, i u drugom teškom lancu, aminokiselina na poziciji koja odgovara poziciji K409 u teškom lancu humanog IgG1, je R.
[0227] U sledećem primeru izvođenja, bispecifično antitelo sadrži prvi vezujući region koje sadrži VH sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO:6 i VL sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO:10; drugi vezujući region koje sadrži VH sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO:19 i VL sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO:20; pri čemu, u oba od navedenih prvih i drugih teških lanaca, aminokiseline na pozicijama koje odgovaraju pozicijama L234, L235 i D265 u teškom lancu humanog IgG1 su F, E i A, tim redom; i pri čemu, u prvom teškom lancu, aminokiselina na poziciji koja odgovara poziciji F405 u teškom lancu humanog IgG1 je L, dok u drugom teškom lancu, aminokiselina na poziciji koja odgovara poziciji K409 u teškom lancu humanog IgG1, je R.
[0228] U sledećem primeru izvođenja, bispecifično antitelo sadrži prvi vezujući region koje sadrži VH sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO:6 i VL sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO:10; drugi vezujući region koje sadrži VH sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO:29 i VL sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO:30; pri čemu su u oba od navedenih prvih i drugih teških lanaca, aminokiseline na pozicijama koje odgovaraju pozicijama L234, L235 i D265 u teškom lancu humanog IgG1, F, E i A, tim redom; i pri čemu, u prvom teškom lancu, aminokiselina na poziciji koja odgovara poziciji F405 u teškom lancu humanog IgG1, je L, dok u drugom teškom lancu, aminokiselina na poziciji koja odgovara poziciji K409 u teškom lancu humanog IgG1, je R.
[0229] Termin "disulfidni mostovi”, kako se ovde upotrebljava, odnosi se na kovalentnu vezu između dva cisteinska ostatka, tj. navedena interakcija se takođe može označiti kao Cys-Cys interakcija.
[0230] Termin "ciljni molekul”, kako se ovde upotrebljava, odnosi se na molekul za koji se vezuje region za vezivanje antitela prema pronalasku. Kada se koristi u kontekstu vezivanja antitela, termin uklјučuje bilo koji antigen na koga dobijeno antitelo umereno deluje.
[0231] U jednom posebnom primeru izvođenja, prvi teški i prvi laki lanci su humanizovani i povezani su preko disulfidnih mostova tako da obrazuju prvi vezujući region; a drugi teški i laki lanci su potpuno humani i povezani su preko disulfidnih mostova tako da obrazuju drugi vezujući region, pri čemu je prvi vezujući region u skladu sa bilo kojim ovde opisanim primerom izvođenja, a drugi vezujući region vezuje različit ciljni molekul; i pri čemu u najmanje jednom od prvih i drugih teških lanaca, aminokiseline na pozicijama koje odgovaraju pozicijama L234, L235 i D265 u teškom lancu humanog IgG1 su F, E i A, tim redom.
[0232] U jednom posebnom primeru izvođenja, prvi teški i prvi laki lanci su humanizovani i povezani su preko disulfidnih mostova tako da obrazuju prvi vezujući region; a drugi teški i laki lanci su potpuno humani i povezani su preko disulfidnih mostova tako da obrazuju drugi vezujući region, pri čemu je prvi vezujući region u skladu sa bilo kojim ovde opisanim primerom izvođenja, a drugi vezujući region vezuje drugačiji epitop CD3 od prvog vezujućeg regiona; i pri čemu, u najmanje jednom od prvih i drugih teških lanaca, aminokiseline na pozicijama koje odgovaraju pozicijama L234, L235 i D265 u teškom lancu humanog IgG1 su F, E i A, tim redom.
[0233] U jednom posebnom primeru izvođenja, prvi teški i prvi laki lanci su humanizovani i povezani su preko disulfidnih mostova tako da obrazuju prvi vezujući region; a drugi teški i laki lanci su potpuno humani i povezani preko disulfidnih mostova tako da obrazuju drugi vezujući region, pri čemu je prvi vezujući region u skladu sa bilo kojim ovde opisanim primerom izvođenja, a drugi vezujući region vezuje različit ciljni molekul; i pri čemu su, u oba od navedenih prvih i drugih teških lanaca, aminokiseline na pozicijama koje odgovaraju pozicijama L234, L235 i D265 u teškom lancu humanog IgG1 F, E i A, tim redom.
[0234] U jednom posebnom primeru izvođenja, prvi teški i prvi laki lanci su humanizovani i povezani preko disulfidnih mostova tako da obrazuju prvi vezujući region; a drugi teški i laki lanci su potpuno humani i povezani su preko disulfidnih mostova tako da obrazuju drugi vezujući region, pri čemu je prvi vezujući region u skladu sa bilo kojim ovde opisanim primerom izvođenja, a drugi vezujući region vezuje drugačiji epitop CD3 od prvog vezujućeg regiona; i pri čemu su, u oba od navedenih prvih i drugih teških lanaca, aminokiseline na pozicijama koje odgovaraju pozicijama L234, L235 i D265 u teškom lancu humanog, F, E i A, tim redom.
Konstrukti nukleinskih kiselina, ekspresioni vektori i ćelije domaćini
[0235] Prema jednom aspektu, predmetni opis se odnosi na kontrukt nukleinske kiseline koji kodira jednu ili više sekvenci navedenih u Tabeli 1. Tako, predmetni opis se odnosi na konstrukt nukleinska kiselina koji kodira bilo koju od sekvenci navedenih u SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 i 26.
[0236] Pronalazak obezbeđuje konstrukt nukleinske kiseline koja kodira sekvence humanizovanog anti-CD3 antitela prema predmetnom pronalasku, ekspresione vektore koji sadrže konstrukt nukleinske kiseline prema predmetnom pronalasku, ćelije domaćine koje sadrže takve ekspresione vektore i postupke proizvodnje takvog antitela kultivisanjem navedenih ćelija domaćina pod odgovarajućim uslovima, čime se proizvodi antitelo i, opciono, dalje izdvaja. Humanizovana anti-CD3 antitela mogu takođe biti označena kao "huCD3".
[0237] U jednom primeru izvođenja, pronalazak obezbeđuje ekspresioni vektor koji sadrži (i) sekvencu nukleinske kiseline koja kodira sekvencu teškog lanca humanizovanog antitela prema pronalasku i (ii) sekvencu nukleinske kiseline koja kodira sekvencu lakog lanca humanizovanog antitela prema pronalasku
[0238] Prema jednom aspektu opisa, ekspresioni vektor sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira jednu ili više CDR sekvenci teških i lakih lanca izabranih iz grupe koja se sastoji od: SEQ ID NO.:1, 2, 3, 4 i 5; i sekvence GTN.
[0239] U pronalasku, ekspresioni vektor sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira VH aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 6 i sekvencu nukleinske kiseline koja kodira VL aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:10. Ekspresioni vektor može sadržavati sekvencu nukleinske kiseline koja kodira konstantni region lakog lanca humanog antitela, teški lanac humanog antitela ili oba. Takođe je obezbeđen ekspresioni vektor koji sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira aminokiselinsku sekvencu u skladu sa SEQ ID NO: 15, 16, 23, 24, 25 i 26.
[0240] Sekvence nukleinskih kiselina različite od prethodno navedenih sekvenci nukleinskih kiselina, ali koje zbog varijanse genetičkog koda kodiraju istu aminokiselinsku sekvencu kao antitelo predmetnog pronalaska, takođe su obezbeđene. Npr. sekvenca nukleinske kiseline može varirati, ali rezultat mogu biti identične aminokiselinske sekvence kao što je bilo koja aminokiselinska sekvenca koja je ovde opisana. Stručnjaku je dobro poznato kako da identifikuje takve dodatne sekvence nukleinskih kiselina na osnovu genetičkog koda.
[0241] U dalјem primeru izvođenja, ekspresioni vektor dalјe sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira konstantni region lakog lanca, teškog lanca ili oba od lakih i teških lanaca antitela, npr. humanog antitela.
[0242] Takvi ekspresioni vektori poput prethodno opisanih mogu biti upotrebljeni za rekombinantnu proizvodnju antitela predmetnog pronalaska.
[0243] Ekspresioni vektor, u kontekstu predmetnog pronalaska, može biti bilo koji pogodan vektor, uklјučujući hromozomske, nehromozomske i sintetske vektore nukleinskih kiselina (sekvence nukleinskih kiselina koje sadrže odgovarajući set elemenata za kontrolu ekspresije). Primeri takvih vektora obuhvataju derivate SV40, bakterijske plazmide, fagnu DNK, bakulovirusne, plazmide kvasca, vektore izvedene iz kombinacije plazmida i fagne DNK, kao i vektore na bazi virusnih nukleinskih kiselina (RNK ili DNK). U jednom primeru izvođenja, nukleinska kiselina koja kodira humanizovano anti-CD3 antitelo se nalazi u okviru “golog” DNK ili RNK vektora, uklјučujući, na primer, linearni ekspresioni element (kao što je opisano na primer u [64]), u okvriui kompaktnog vektora nukleinske kiseline (kao što je opisano na primer u [65] i/ili [66]), plazmidnog vektora kao što je pBR322, pUC 19/18 ili pUC 118/119, vektora nukleinske kiseline minimalne veličine (engl. midge - kao što je opisano na primer u [67]), ili precipitiranog vektorskog konstrukta nukleinske kiseline, poput konstrukta precipitiranog sa CaP04 (kao što je opisano na primer u [68], [69], [70] i [71]). Takvi vektori nukleinskih kiselina i njihova upotreba su dobro poznati u oblasti tehnike (pogledati na primer [72] i [73]).
[0244] U jednom primeru izvođenja, vektor je pogodan za ekspresiju humanizovanog anti-CD3 antitela u bakterijskoj ćeliji. Primeri takvih vektora obuhvataju ekspresione vektore kao što su BlueScript (Stratagene), pIN vektori ([74], pET vektori (Novagen, Madison WI) i slični.
[0245] Ekspresioni vektor takođe može biti ili je, alternativno, vektor pogodan za ekspresiju u sistemu kvasca. Bilo koji vektor pogodan za ekspresiju u sistemu kvasca može biti upotrebljen. Pogodni vektori uklјučuju, na primer, vektore koji sadrže konstitutivne ili inducibilne promotore kao što su alfa faktor, alkoholna oksidaza i PGH (revijski pregled u: [75] i [76]).
[0246] Konstrukt i/ili vektor nukleinske kiseline može takođe sadržavati sekvencu nukleinske kiseline koja kodira sekvencu sekrecije/lokalizacije, koja može omogućiti ciljano dopremanje polipeptida, kao što je nascentni polipeptidni lanac, do periplazmatskog prostora ili u medijum ćelijske kulture. Takve sekvence su poznate u oblasti tehnike i obuhvataju liderske ili signalne peptide sekrecije, sekvence za ciljanu isporuku u organele (npr. sekvence lokalizacije u jedro, signale zadržavanja u ER, sekvence tranzita kroz mitohondrije, sekvence tranzita kroz hloroplaste), sekvence lokalizacije/usidravanja u membrani (npr. sekvence zaustavljanja transfera, GPi sekvence za usidravanje) i slične, a koje su dobro poznate u oblasti tehnike.
[0247] U ekspresionom vektoru pronalaska, nukleinske kiseline koje kodiraju humanizovano anti-anti-CD3 antitelo mogu sadržavati ili biti udružene sa bilo kojim pogodnim promotorom, pojačivačem i drugim elementima koji olakšavaju ekspresiju. Primeri takvih elemenata obuhvataju snažne promotore ekspresije (npr. humani CMV IE promotor/pojačivač, kao i RSV, SV40, SL3-3, MMTV i HIV LTR promotore), efektivne sekvence poli (A) terminacije, sekvencu početka replikacije za proizvod plazmida u E. coli, gen rezistencije na antibiotike kao selektivni marker i/ili pogodno mesto za kloniranje (npr. polilinker). Nukleinske kiseline konstrukta i/ili vektora takođe mogu sadržavati inducibilni promotor nasuprot konstitutivnom promotoru, kao što je CMV IE (iskusan stručnjak će prepoznati da navedni termini zapravo predstavljaju opise stepena genske ekspresije pod određenim uslovima).
[0248] U jednom primeru izvođenja, ekspresioni vektor koji kodira humanizovano anti-CD3 antitelo može biti pozicioniran u i/ili isporučen u ćeliju domaćina ili životinju domaćina putem virusnog vektora.
[0249] Takvi ekspresioni vektori mogu biti uporebljeni za rekombinantnu proizvodnju humanizovanih anti-CD3 antitela.
[0250] Prema jednom aspektu, pronalazak obezbeđuje ćeliju domaćina koja sadrži ekspresioni vektor prema pronalasku.
[0251] Prema jednom aspektu, humanizovana anti-CD3 antitela iz bilo kog aspekta ili primera izvođenja koji je ovde opisan, obezbeđena su upotrebom rekombinantne eukariotske, rekombinantne prokariotske ili rekombinantne mikrobne ćelije domaćina koja proizvodi antitelo. Prema tome, pronalazak obezbeđuje rekombinantnu eukariotsku, rekombinantnu prokariotsku ili rekombinantnu mikrobnu ćeliju domaćina, koja proizvodi humanizovano anti-CD3 antitelo ili imunoglobulin pronalaska. Primeri ćelija domaćina uklјučuju ćelije kvasca, bakterijske i sisarske ćelije, kao što su CHO ili HEK-293 ćelije. Na primer, u jednom primeru izvođenja, ćelija domaćin sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja je stabilno integrisana u ćelijski genom, a koja sadrži sekvencu koja kodira za ekspresiju humanizovanog anti-CD3 antitela pronalaska. U sledećem primeru izvođenja, ćelija domaćin sadrži neintegrisanu sekvencu nukleinskih kiselina, poput plazmida, kozmida, fagemida ili linearnog ekspresionog elementa, a koja sadrži sekvencu koja kodira za ekspresiju humanizovanog anti-CD3 antitela pronalaska.
[0252] Predviđeno je da se termin "rekombinantna ćelija domaćina" (ili jednostavno "ćelija domaćin"), kako se ovde upotrebljava, odnosi na ćeliju u koju je uveden ekspresioni vektor ili konstrukt ili sekvenca nukleinske kiseline. Podrazumeva se da je predviđeno da se ovakvi termini ne odnose samo na određenu predmetnu ćeliju, već i na potomstvo takve ćelije. Pošto se u sledećim generacijama mogu dogoditi određene modifikacije usled bilo mutacija ili uticaja okoline, takvo potomstvo ne može, u stvari, biti identično matičnoj ćeliji, ali je još uvek uklјučeno u opseg termina "ćelija domaćin", kako se on ovde upotrebljava. Rekombinantne ćelije domaćina obuhvataju, na primer, eukariotske ćelije domaćine kao što su CHO ćelije, HEK-293 ćelije, PER.C6, NS0 ćelije i limfocitne ćelije, kao i prokariotske ćelije kao što su E. coli, ali i druge eukariotske domaćine poput bilјnih ćelija i ćelija gljiva.
[0253] Prema daljem aspektu, pronalazak se odnosi na postupak za proizvodnju humanizovanog anti-CD3 antitela pronalaska, pri čemu navedeni postupak obuhvata korake
a) kultivisanje ćelije domaćina pronalaska kao što je ovde prethodno opisano; i
b) izdvajanje i/ili prečišćavanje antitela pronalaska iz medijuma kulture ćeliija.
[0254] Prema sledećem aspektu, nukleotidna sekvenca koja kodira sekvencu humanizovanog anti-CD3 antitela dodatno kodira drugu funcionalnu strukturu, kao što je terapijski polipeptid. Primeri terapijskih polipeptida su ovdje opisani na drugom mestu. U jednom primeru izvođenja, pronalazak se odnosi na postupak za proizvodnju fuzionog proteina humanizovanog anti-CD3 antitela, pri čemu navedeni postupak obuhvata korake
a) kultivisanje ćelije domaćina koja sadrži ekspresioni vektor, a koji sadrži takvu nukleotidnu sekvencu, i
b) izdvajanje i/ili prečišćavanje antitela fuzionog proteina humanizovanog anti-CD3 antitela iz medijuma kulture ćeliija.
Kompozicije
[0255] Prema jednom aspektu, pronalazak obezbeđuje kompoziciju koja sadrži antitelo ili bispecifično antitelo u skladu sa pronalaskom.
[0256] Prema jednom aspektu, pronalazak obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja sadrži antitelo ili bispecifično antitelo u skladu sa pronalaskom i farmaceutski prihvaljiv nosač.
[0257] Farmaceutske kompozicije mogu biti formulisane sa farmaceutski prihvatlјivim nosačima ili razblaživačima, kao i sa bilo kojim drugim poznatim adjuvansima i ekscipijensima, praćenjem konvencionalnih tehnika kao što su one opisane u [77].
[0258] Potregno je da farmaceutski prihvatlјivi nosači ili razblaživači, kao i bilo koji drugi poznati adjuvansi i eksipijensi, budu pogodni za humanizovano antitelo predmetnog pronalaska i izabrani način primene. Pogodnost za nosače i druge komponente farmaceutskih kompozicija se određuje na osnovu nedostatka značajnog negativnog uticaja na želјena biološke osobine izabranog jedinjenja ili farmaceutske kompozicije predmetnog pronalaska (npr. manji je od značajnog uticaja (10% ili manje relativne inhibicije, 5% ili manje relativne inhibicije itd.)) na vezivanje antigena.
[0259] Farmaceutska kompozicija predmetnog pronalaska može takođe obuhvatati razblaživače, ispunjivače, soli, pufere, deterdžente (npr. nejonski deterdžent, kao što je Tween-20 ili Tween-80), stabilizatore (npr. šećere ili aminokiseline oslobođene proteina), konzervanse, tkivne fiksative, solubilizatore i/ili druge materijale koji su pogodni za uklјučivanje u farmaceutsku kompoziciju.
[0260] Stvarni dozni nivoi aktivnih sastojaka u farmaceutskim kompozicijama predmetnog pronalaska mogu varirati tako da se dobije količina aktivnog sastojka koja je efektivna u postizanju želјenog terapijskog odgovora za određenog pacijenta, kompoziciju i način primene, a bez prisustva toksičnosti za pacijenta. Odabrani nivo doze će zavisiti od različitih farmakokinetičkih faktora, uklјučujući aktivnost određenih kompozicija predmetnog pronalaska koje se koriste, ili njihovih amida, načina primene, vremena primene, stope izlučivanja određenog jedinjenja koje se koristi, trajanja lečenja, drugih lekova, jedinjenja i/ili materijala koji se koriste u kombinaciji sa određenim upotrebljenim kompozicijama, kao i od starosti, pola, težine, stanja, opšteg zdravstvenog stanja i prethodne medicinske istorije pacijenta koji se leči i sličnih faktora koji su dobro poznati u medicinskoj praksi.
[0261] Farmaceutska kompozicija može biti primenjena bilo kojim pogodnim putem i načinom primene. Pogodni putevi primene humanizovanog ili himernog antitela predmetnog pronalaska in vivo i in vitro su dobro poznati u oblasti tehnike i mogu biti izbrani od strane prosečno iskusnih stručnjaka iz oblasti tehnike.
[0262] U jednom primeru izvođenja, farmaceutska kompozicija predmetnog pronalaska se primenjuje parenteralno.
[0263] Izrazi "parenteralna primena" i "primenjeno parenteralno", kako se ovde upotrebljavaju, označavaju načine primene drugačije od enteralne i topikalne primene, obično putem injekcije, pri čemu uključuje i epidermalno, intravensko, intramuskularno, intra-arterijsko, intratekalno, intrakapsularno, intraorbitalno, intrakardijalno, intradermalno, intraperitonealno, intratendinozno, transtrahealno, subkutano, subkutikularno, intra-artikularno, subkapsularno, subarahnoidno, intraspinalno, intrakranijalno, intratorakalno, epiduralno i intrasternalno injeciranje i infuziju.
[0264] U jednom primeru izvođenja, navedena farmaceutska kompozicija se primenjuje intravenskim ili subkutanim injeciranjem ili infuzijom.
[0265] Farmaceutski prihvatlјivi nosači obuhvataju bilo koji i sve pogodne rastvarače, disperzione medijume, obloge, antibakterijske i antifungalne agense, izotonične agense, antioksidanse, kao i agense za odlaganje apsorpcije i slične, koji su fiziološki kompatibilni sa humanizovanim antitelom predmetnog pronalaska.
[0266] Primeri pogodnih vodenih i nevodenih nosača koji se mogu koristiti u farmaceutskim kompozicijama predmetnog pronalaska obuhvataju vodu, fiziološki rastvor, fiziološki rastvor puferisan fosfatom, etanol, dekstrozu, poliole (kao što su glicerol, propilen glikol, polietilen glikol i slični), kao i njihove odgovarajuće smeše, bilјna ulјa, kao što su maslinovo ulјe, kukuruzno ulјe, ulјe kikirikija, ulje pamuka i susama, koloidni rastvori karboksimetil celuloze, tragakant guma i organski estri koji se mogu injecirati, poput etil oleata, i/ili razne pufere. Ostali nosači su dobro poznati u farmaceutskoj praksi.
[0267] Farmaceutski prihvatlјivi nosači obuhvataju sterilne vodene rastvore ili disperzije i sterilne praškove za pravovremenu pripremu sterilnih rastvora ili disperzija koji se mogu injecirati. Upotreba takvih medijuma i agenasa za farmaceutski aktivne supstance je poznata u oblasti tehnike. Osim u slučaju kada je bilo koji konvencionalni medijum ili agens nekompatibilan sa aktivnim jedinjenjem, razmatra se njegova upotreba u farmaceutskim kompozicijama predmetnog pronalaska. Kada se poziva na “aktivno jedinjenje”, smatra se da se navedeno takođe odnosi na humanizovano antitelo prema predmetnom pronalasku.
[0268] Pravilna fluidnost se može održavati, na primer, upotrebom materijala za oblaganje poput lecitina, kao i održavanjem potrebne veličine čestica u slučaju disperzija i upotrebom sufaktanata.
[0269] Farmaceutske kompozicije predmetnog pronalaska mogu takođe sadržavati farmaceutski prihvatlјive antioksidanse, na primer (1) antioksidanse rastvorljive u vodi, kao što su askorbinska kiselina, cistein hidrohlorid, natrijum bisulfat, natrijum metabisulfit, natrijum sulfit i slični; (2) antioksidanse rastvorljive u ulјu, kao što su askorbil palmitat, butilisan hidroksianizol (BHA), butilisan hidroksitoluen (BHT), lecitin, propil galat, alfa-tokoferol i slični; i (3) agense za helaciju metala, kao što su limunska kiselina, etilendiamin tetra sirćetna kiselina (EDTA), sorbitol, vinska kiselina, fosforna kiselina i slični.
[0270] Farmaceutske kompozicije predmetnog pronalaska mogu takođe sadržavati izotonične agense u kompozicijama, kao što su šećeri, polialkoholi poput manitola, sorbitola, glicerola, ili natrijum hlorid.
[0271] Farmaceutske kompozicije predmetnog pronalaska mogu takođe sadržavati jedan ili više adjuvanasa pogodnih za izabrani put primene, kao što su konzervansi, ovlaživači, emulgatori, sredstava za dispergovanje, konzervansi ili puferi, a koji mogu poboljšati rok trajanja ili efektivnost farmaceutske kompozicije. Humanizovana antitela predmetnog pronalaska mogu biti pripremljena sa nosačima koji će zaštititi jedinjenje od brzog otpuštanja, kao što su formulacije sa kontrolisanim oslobađanjem, uklјučujući implantate, transdermalne flastere i mikro-inkapsulirane sisteme za isporuku. Takvi nosači mogu uklјučivati želatin, gliceril monostearat, gliceril distearat, biorazgradive, biokompatibilne polimere, kao što su etilen vinil acetat, polianhidridi, poliglikolna kiselina, kolagen, poli-ortoesteri i polilaktična kiselina samostalno ili sa voskom, ili druge materijale koji su dobro poznati u oblasti tehnike. Postupci za pripremu takvih formulacija su opšte poznati stručnjacima iz oblasti (pogledati npr. [78]).
[0272] U jednom primeru izvođenja, humanizovano antitelo predmetnog pronalaska može biti formulisano tako da se obezbedi pravilna distribucija in vivo. Farmaceutski prihvatlјivi nosači za parenteralnu primenu obuhvataju sterilne vodene rastvore ili disperzije i sterilne praškove za pravovremenu pripremu sterilnih rastvora ili disperzija za injeciranje. Upotreba takvih medijuma i agenasa za farmaceutski aktivne supstance je poznata u oblasti tehnike. Osim u slučaju kada je bilo koji konvencionalni medijum ili agens nekompatibilan sa aktivnim jedinjenjem, razmatra se njegova upotreba u farmaceutskim kompozicijama predmetnog pronalaska. Ostala aktivna ili terapijska jedinjenja mogu takođe biti ugrađena u kompozicije.
[0273] Farmaceutske kompozicije za injeciranje obično moraju biti sterilne i stabilne u uslovima proizvodnje i skladištenja. Kompozicija može biti formulisana kao rastvor, mikroemulzija, lipozom ili druga uređena struktura koja je pogodna za visoku koncentraciju leka. Nosač može biti vodeni ili nevodeni rastvarač ili disperzioni medijum koji sadrži, na primer, vodu, etanol, poliole (poput glicerola, propilen glikola, polietilen glikola i sličnih), i odgovarajuće smeše istih, bilјna ulјa poput maslinovog ulja, kao i organske estre za injeciranje poput etil oleata. Pravilna fluidnost se može održati, na primer, upotrebom obloge kao što je lecitin, održavanjem potrebne veličine čestica u slučaju disperzije i upotrebom surfaktanata. U mnogim slučajevima, poželјno je da se u kompoziciju uklјuče izotonični agensi, na primer, šećeri, polialkoholi poput glicerola, manitola, sorbitola ili natrijum hlorid. Produžena apsorpcija kompozicije za injeciranje se može postići uklјučivanjem u kompoziciju agensa koja odlaže apsorpciju, na primer, monostearatnih soli i želatina. Sterilni rastvori za injeciranje mogu biti pripremljeni ugradnjom aktivnog jedinjenja u potrebnoj količini u odgovarajućem rastvaraču, sa jednim ili sa kombinacijom sastojaka, npr. onih koji su kao što je nabrojano prethodno, ukoliko je potrebno, nakon čega sledi sterilizacija mikrofiltracijom. U principu, disperzije se pripremaju ugradnjom aktivnog jedinjenja u sterilni nosač koji sadrži osnovni disperzioni medijum i potom dodavanjem drugih potrebnih sastojaka, npr. onih koji su prethodno nabojani. U slučaju sterilnih praškova za pripremu sterilnih rastvora za injeciranje, primeri postupaka za pripremu su sušenje vakuumom i sušenje zamrzavanjem (liofilizacija) kojima se dobija prah aktivnog sastojka zajedno sa bilo kojim dodatnim želјenim sastojkom iz njihovog prethodno sterilno filtriranog rastvora.
[0274] Sterilni rastvori za injeciranje mogu biti pripremljeni ugradnjom aktivnog jedinjenja u potrebnoj količini, u odgovarajući rastvarač, zajedno sa jednim ili sa kombinacijom prethodno nabrojanih sastojaka, po potrebi, nakon čega sledi sterilizacija mikrofiltracijom. Generalno, disperzije se pripremaju ugradnjom aktivnog jedinjenja u sterilni nosač koji sadrži osnovni disperzioni medijum i potom dodavanjem potrebnih drugih sastojaka od onih koji su prethnodno nabrojani. U slučaju sterilnih praškova za pripremu sterilnih rastvora za injeciranje, primeri postupaka za pripremu su sušenje vakuumom i sušenje zamrzavanjem (liofilizacija) kojima se dobija prašak aktivnog sastojka zajedno sa bilo kojim dodatnim želјeni sastojkom iz njihovog prethodno sterilno filtriranog rastvora.
Terapijske primene
[0275] Prema drugom aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje humanizovano antitelo ili farmaceutsku kompoziciju pronalaska, za upotrebu u vidu medikamenta.
[0276] Prema sledećem aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje humanizovano antitelo ili farmaceutsku kompoziciju pronalaska, za upotrebu u lečenju oboljenja.
[0277] Humanizovano antitelo ili farmaceutska kompozicija pronalaska mogu biti upotrebljeni u lečenju bilo kog kancera gde je poželjan efektorski mehanizam citotoksičnih T-ćelija. Na primer, humanizovano ili himerno antitelo može biti primenjeno ćelijama u kulturi, npr. in vitro ili ex vivo, ili humanim subjektima, npr. in vivo, radi lečenja ili prevencije poremećaja kao što su kancer, inflamatorni ili autoimuni poremećaji. Kao što se ovde upotrebljava, termin "subjekat" je obično čovek koji reaguje na humanizovano ili himerno antitelo ili na farmaceutsku kompoziciju. Subjekti mogu, na primer, obuhvatati humane pacijente sa poremećajima koji mogu biti korigovani ili poboljšani modulacijom cilјne funkcije ili dovođenjem do ubijanja ćelije, direktno ili indirektno.
[0278] Prema sledećem aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje humanizovano antitelo ili farmaceutsku kompoziciju pronalaska za upotrebu u postupcima lečenja ili prevencije poremećaja, poput kancera, pri čemu će regrutovanje T-ćelija doprineti lečenju ili prevenciji, i pri čemu postupak obuhvata primenu terapijski efektivne količine humanizovanog antitela ili farmaceutske kompozicije subjektu kome je to potrebno. Postupak obično uključuje primenu humanizovanog antitela subjektu u količini koja je efektivna za lečenje ili prevenciju poremećaja.
[0279] Prema jednom posebnom aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na humanizovano antitelo ili farmaceutsku kompoziciju pronalaska za upotrebu u postupku lečenja kancera koji obuhvata primenu humanizovanog antitela ili farmaceutske kompozicije subjektu kome je to potrebno.
[0280] Prema sledećem aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na upotrebu ili postupak koji su definisani u bilo kom aspektu ili primeru izvođenja koji je ovde opisan, pri čemu je humanizovano antitelo bispecifično antitelo koje se specifično vezuje i za CD3 i za ciljni molekul koji je specifičan za kancer, ili pak za ciljni molekul koji je prekomerno eksprimiran u kanceru ili udružen sa kancerom, kao što je HER2, CD19, EpCAM, EGFR, CD66e (ili CEA, CEACAM5), CD33, EphA2 ili MCSP (ili HMV-MAA) pri čemu je oboljenje kancer, kao što je kancer dojke, kancer prostate, nesitnoćelijski kancer pluća, kancer mokraćne bešike, kancer jajnika, kancer želuca, kolorektalni kancer, kancer jednjaka i kancer svamoznih ćelija glave i vrata, kancer grlića materice, kancer pankreasa, kancer testisa, maligni melanom, kancer mekog tkiva (npr. sinovijalni sarkom), indolentni ili agresivni oblik B-ćelijskog limfoma, hronična limfatična leukemija ili akutna limfatična leukemija.
[0281] Efikasne doze i režimi primene doza za humanizovano antitelo zavise od oboljenja ili stanja koje se leči i mogu biti određeni od strane stručne osobe
[0282] Lekar sa prosečnim iskustvom u oblasti tehnike, može lako odrediti i propisati efektivnu količinu potrebne farmaceutske kompozicije. Na primer, lekar može započeti sa dozama humanizovanog antitela upotrebljenog u farmaceutskoj kompoziciji koje su nivoa nižih od onih koji su potrebni da bi se postigao želјeni terapijski efekat i potom postepeno povećavati dozu sve dok se ne postigne želјeni efekat. U principu, pogodna doza kompozicije predmetnog pronalaska će biti ona količina humanizovanog antitela koja je najmanja doza efektivna u proizvođenju terapijskog efekta prema određenom režimu doziranja. Ovakva efektivna doza će uglavnom zavisiti od faktora koji su prethodno opisani.
[0283] Na primer, „efektivna količina“ za terapijsku upotrebu može biti izmerena sposobnošću iste da stabilizuje napredovanje bolesti. Sposobnost jedinjenja da inhibira kancer može, na primer, biti procenjena u sistemu životinjskog modela koji je pogodan za predviđanje efikasnosti u humanim tumorima. Alternativno, ova karakteristika kompozicije može biti procenjena ispitivanjem sposobnosti humanizovanog antitela da inhibira ćelijski rast ili da indukuje citotoksičnost, in vitro testovima koji su poznati iskusnom praktičaru. Terapijski efektivna količina terapijskog jedinjenja, tj. terapijskog humanizovanog antitela ili farmaceutske kompozicije prema pronalasku, može smanjiti veličinu tumora ili na drugi način pobolјšaju simptome kod subjekta. Osoba sa prosečnim iskustvom u oblasti tehnike takođe će biti u stanju da odredi takvu količini na osnovu faktora kao što su veličina subjekta, težina simptoma subjekta i određena kompozicija ili način primene koji su odabrani.
[0284] Primer neograničavajućeg opsega za terapijski efektivnu količinu humanizovanog antitela pronalaska je oko 0,001-30 mg/kg, kao što je oko 0,001-20 mg/kg, kao što je oko 0,001-10 mg/kg, kao što je oko 0,001-5 mg/kg, na primer oko 0,001-2 mg/kg, kao što je oko 0,001-1 mg/kg, na primer, oko 0,001, oko 0,01, oko 0,1, oko 1, oko 5, oko 8, oko 10, oko 12, oko 15, oko 18 mg/kg.
[0285] Primena može npr. biti intravenska, intramuskularna, intraperitonealna ili subkutana i, na primer, proksimalna u odnosu na mesto cilјanog delovanja.
[0286] Dozni režimi u prethodno navedenim postupcima lečenja i upotrebama se podešavaju tako da se obezbedi optimalan želјeni odgovor (npr. terapijski odgovor). Na primer, može biti primenjen jedan bolus, može biti primenjeno nekoliko podeljenih doza tokom vremena ili se doza proporcionalno može smanjivati ili povećavati shodno potrebama terapijske situacije.
[0287] U jednom primeru izvođenja, efikasnost lečenja se prati tokom terapije, npr. u unapred definisanim vremenskim tačkama.
[0288] Ukoliko je to poželjno, efektivna dnevna doza farmaceutske kompozicije može biti primenjena u vidu dve, tri, četiri, pet, šest ili više pod-doza koje se primenjuju posebno, u odgovarajućim intervalima tokom dana, opciono u jediničnim doznim oblicima. U drugom primeru izvođenja, humanizovano antitelo ili farmaceutska kompozicija se primenjuje sporom kontinuiranom infuzijom tokom dužeg perioda, kao što je više od 24 sata, da bi se neželјeni sporedni efekti sveli na minimum.
[0289] Iako je moguće da se humanizovano antitelo predmetnog pronalaska primenjuje samostalno, poželјno je da se humanizovano antitelo primenjuje kao farmaceutska kompozicija, kao što je prethodno opisano.
[0290] Efeketivna doza humanizovanog antitela predmetnog pronalaska može takođe biti primenjena upotrebom nedelјnog, dvonedelјnog ili tronedelјnog perioda za primenu doze. Period primene doze može biti ograničen na, npr. 8 nedelјa, 12 nedelјa ili do momenta utvrđivanja kliničke progresije. Alternativno, efektivna doza humanizovanog antitela pronalaska može biti primenjena svake druge, treće ili četvrte nedelјe.
[0291] U jednom primeru izvođenja, humanizovano antitelo može biti primenjeno infuzijom u nedelјnoj dozi izračunatoj u mg/m<2>. Takve doze se mogu, na primer, zasnivati na dozama u mg/kg koje su prethodno navedene, u skladu sa sledećim: doza (mg/kg) x 70: 1,8. Takva primena se može ponoviti, npr.1 do 8 puta, kao što je od 3 do 5 puta. Primena može biti izvođena kontinuiranom infuzijom tokom perioda od 2 do 24 sata, kao što je tokom od 2 do 12 sati. U jednom primeru izvođenja, humanizovano antitelo može biti primenjeno sporom kontinuiranom infuzijom tokom dužeg perioda, kao što je tokom više od 24 sata, da bi se smanjili toksični sporedni efekti.
[0292] U jednom primeru izvođenja, humanizovano antitelo može biti primenjeno u nedelјnoj dozi izračunatoj kao fiksna doza, do 8 puta, kao što je od 4 do 6 puta, prilikom primene tipa jednom nedelјno. Takav režim može biti ponovljen jednom ili više puta ukoliko je to potrebno, na primer, nakon 6 meseci ili 12 meseci. Navedene fiksne doze se mogu, na primer, zasnivati na dozama u mg/kg koje su prethodno navedene, uz prilagođavanje procene u odnosu na telesnu težinu od 70 kg. Dozni režim može biti određen ilil prilagođen merenjem količine humanizovanog antitela predmetnog pronalaska u krvi nakon primene, na primer, uzimanjem biološkog uzorka i upotrebom anti-idiotipskih antitela koja se cilјano vezuju za vezujući region humanizovanih antitela predmetnog pronalaska.
[0293] U jednom primeru izvođenja, humanizovano antitelo može biti primenjeno u vidu terapije održavanja, kao što je npr. jednom nedelјno u periodu od 6 meseci ili više.
[0294] Humanizovano antitelo može takođe biti primenjeno profilaktički da bi se smanjio rizik od razvoja kancera, odložio početak pojave događaja u progresiji kancera i/ili smanjio rizik od ponovne pojave kancera kada je on u remisiji.
[0295] Parenteralne kompozicije mogu biti formuliane u jediničnim doznim oblicima za laku primenu i ujednačenost doze. Jedinični dozni oblik, kako se ovde upotrebljava, odnosi se na fizički diskretne jedinice koje su pogodne kao jedinične doze za subjekte koji se leče; svaka jedinica sadrži unapred određenu količinu aktivnog jedinjenja izračunatu tako da se proizvede želјeni terapijski i da je koristi potreban farmaceutski nosač. Specifikacija jediničnog doznog oblika predmentog pronalaska je uslovljena i direktno zavisna od (a) jedinstvenih karakteristika aktivnog jedinjenja i određenog terapijskog efekta koga je potrebno postići i (b) ograničenja svojstvenih oblasti tehnike sinteze kompozicija, a tako da navedeno jedinjenje bude za lečenje osetljivosti kod pojedinaca.
[0296] Humanizovano antitelo može takođe biti primenjeno profilaktički da bi se smanjio rizik od razvoja kancera, odložio početak pojave događaja u progresiji kancera i/ili smanjio rizik od ponovne pojave kada je kancer u remisiji. Navedeno može biti posebno korisno kod pacijenata kod kojih je teško locirati tumor za koga je, na osnovu drugih bioloških faktora, poznato da je prisutan.
Dijagnostičke primene
[0297] Humanizovano antitelo pronalaska može takođe biti upotrebljeno u dijagnostičke svrhe, upotrebom kompozicije koja sadrži humanizovano antitelo. Takvi postupci i kompozicije mogu biti upotrebljeni u čisto dijagnostičke svrhe, kao što su detekcija ili identifikovanje oboljenja, kao i za praćenje progresije terapijskog lečenja, praćenje progresije oboljenja, procene statusa nakon lečenja, praćenja ponovne pojave oboljenja, procene rizika za razvoj oboljenja i sličnog.
[0298] Prema jednom aspektu, predmetni opis se odnosi na postupak postavljanja dijagnoze oboljenja koga karakteriše uključivanje ili nagomilavanja ćelija koje eksprimiraju CD3, postupka koji obuhvata primenu subjektu humanizovanog ili himernog antitela prema pronalasku, kompozicije prema opisu ili farmaceutske kompozicije prema opisu, opciono pri čemu je navedeno humanizovano ili himerno antitelo obeleženo agensom koji se može detektovati.
[0299] Prema jednom aspektu, humanizovano antitelo predmetnog pronalaska se koristi ex vivo, kao što je u postavljanju dijagnoze oboljenja u kome ćelije eksprimiraju određeni ciljni molekul od interesa, a za koji se humanizovano antitelo vezuje i koji je pokazatelj oboljenja ili je uključen u patogenezu, detekcijom nivoa ciljnog molekula ili nivoa ćelija koje eksprimiraju ciljni molekul od interesa na svojoj površini u uzorku koji je uzet od pacijenta. Navedeno može biti postignuto, na primer, kontaktom uzorka koji se ispituje, opciono zajedno sa kontrolnim uzorkom, sa humanizovanim antitelom prema pronalasku, pod uslovima koji omogućavaju vezivanje antitela za ciljni molekul. Potom može biti detektovano obrazovanje kompleksa (npr. upotrebom ELISA postupka). Kada se istovremeno sa ispitivanim uzorkom upotrebljava kontrolni uzorak, nivo humanizovanog antitela ili kompleksa antitela i ciljnog molekula se analizaira u oba uzorka, a statistički značajno viši nivo humanizovanog antitela ili kompleksa antitela sa ciljnim molekulom u uzorku koji se ispituje ukazuje na viši nivo ciljnog molekula u ispitivanom uzorku u poređenju sa kontrolnim uzorkom.
[0300] Primeri konvencionalnih imunotestova u kojima se mogu upotrebiti humanizovana antitela predmetnog pronalaska obuhvataju, bez ograničavanja samo na, ELISA, RIA, FACS analize, testove plazmonske rezonance, hromatografska ispitivanja, imunohistohemijsku analizu tkiva, imunoblot postupak i/ili imunoprecipitaciju.
[0301] Shodno navedenom, prema jednom aspektu, predmetni opis se odnosi na postupak postavljanja dijagnoze oboljenja koga karakteriše uključenosti ili nagomilavanje ćelija koje eksprimiraju CD3, postupak koji obuhvata primenu antitela, bispecifičnog antitela, kompozicije ili farmaceutske kompozicije subjektu, opciono, gde je antitelo obeleženo sa obeleživačem koji se može detektovati.
[0302] U jednom primeru izvođenja, pronalazak se odnosi na postupak za detekciju prisustva ciljnog molekula ili ćelije koja eksprimira cilјni molekul, u uzorku, koji obuhvata:
- kontakt uzorka sa humanizovanim antitelom pronalaska pod uslovima koji omogućavaju vezivanje humanizovanog antitela za ciljni molekul u uzorku; i
- analizu da li je obrazovan kompleks. Uzorak je obično biološki uzorak.
[0303] U jednom primeru izvođenja, uzorak je uzorak tkiva za koga je poznato ili se sumnja da sadrži specifičan ciljni molekul i/ili ćelije koje eksprimiraju ciljni molekul. Na primer, in situ detekcija cilјne ekspresije se može postići uzimanjem histološkog uzorka iz pacijenta i kontaktom humanizovanog antitela predmetnog pronalaska sa takvim uzorkom. Kontakt sa humanizovanim antitelom može biti obezbeđen nanošenjem ili prekrivanjem uzorka sa humanizovanim antitelom, nakon čega se detekcija vrši na odgovarajuće načine. Moguće je utvrditi ne samo prisustvo ciljnog molekula ili ćelija koje eksprimiraju ciljni molekul, već i distribuciju ciljnog molekula ili ćelija koje eksprimiraju ciljni molekul u tkivu koje se ispituje (npr. u kontekstu procene širenja kancerskih ćelija). Upotrebom predmetnog pronalaska, prosečno iskusni stručnjaci će lako uočiti da bilo koji od širokog spektra histoloških postupaka (kao što su postupci bojenja) mogu biti modifikovani da bi se postigla takva in situ detekcija.
[0304] U prethodno navedenim analizama, humanizovano antitelo može biti obeleženo supstancom koja se može detektovati, a da bi se omogućila detekcija vezanog antitela. Alternativno, vezano (primarno) specifično humanizovano antitelo može biti detektovano antitelom koje je obeleženo supstancom koja se može detektovati, a koja se vezuje za specifično primarno humanizovano antitelo. Štaviše, u prethodno navedenim analizama, može biti upotrebljena dijagnostička kompozicija koja sadrži antitelo ili bispecifično antitelo prema pronalasku.
[0305] Nivo ciljnog molekula u uzorku takođe može biti procenjen kompetitivnom imunoanalizom, upotrebom standarda ciljnih molekula koji su obeleženi supstancom koja se može detektovati, kao i upotrebom neobeleženog humanizovanog antitela koje je specifično za ciljni molekul. U ovom tipu ispitivanja, mogu se spojiti biološki uzorak, obeleženi standard(i) ciljnog molekula i humanizovana antitela specifična za ciljni molekul i tako odrediti količina obeleženog standarda ciljnog molekula koji je vezan za neobeleženo humanizovano antitelo specifično za ciljni molekul. Količina ciljnog molekula u biološkom uzorku je obrnuto proporcionalna količini obeleženog standarda ciljnog molekula koji je vezan za humanizovano antitelo specifično za ciljni molekul.
[0306] Pogodni obeleživači za humanizovana antitela specifična za ciljni molekul, sekundarna antitela i/ili standard ciljnog molekula koji se upotrebljava u in vitro dijagnostičkim tehnikama obuhvataju, bez ograničavanja samo na, razne enzime, prostetične grupe, fluorescentne materijale, luminescentne materijale i radioaktivne materijale. Primeri pogodnih enzima obuhvataju peroksidazu rena, alkalnu fosfatazu, β-galaktozidazu i acetilholinesterazu; primeri pogodnih kompleksa prostetičnih grupa uklјučuju streptavidin/biotin i avidin/biotin; primeri pogodnih fluorescentnih materijala uklјučuju umbeliferon, fluorescein, fluorescein izotiocijanat, rodamin, dihlorotriazinilamin fluorescein, danzil hlorid i fikoeritrin; primer luminiscentnog materijala uklјučuje luminol; a primeri pogodnog radioaktivnog materijala obuhvataju<125>J,<131>J,<35>S i<3>H.
[0307] Prema jednom aspektu, humanizovano antitelo pronalaska specifično za ciljni molekul se upotrebljava za in vivo tehnike snimanje tkiva koja eksprimiraju ciljni molekul, kao što su tumori. Za in vivo postupke, posebno su pogodni fragmenti antitela kao što su npr. (Fab’)2, Fab i Fab’, zbog njihove brze kinetike raspodele.
[0308] In vivo snimanje se može izvesti bilo kojom pogodnom tehnikom. Na primer, humanizovano ili himerno antitelo specifično za cilјni molekul (npr. antitelo ili fragment) obeleženo sa<99>Tc,<131>I,<111>In ili drugim izotopom koji emituju gama zrake, može biti upotrebljeno za snimanje nagomilavanja ili raspodele antitela specifičnog za ciljni molekul u tkivima koja eksprimiraju ciljni molekul poput tumora, upotrebom gama scintilacionih kamera (npr. uređaja Elscint Apex 409ECT), obično upotrebom niskoenergetskog kolimatora visoke rezolucije ili niskoenergetskog kolimatora za široku upotrebu. Alternativno, za snimanje humanizovanog ili himernog antitela specifičnog za ciljni molekul, ili distribucije fragmenata antitela, u tumorima, upotrebom pozitronske emisione tomografije (PET), može biti upotrebljeno obeležavanje sa<89>Zr,<76>Br,<18>F ili drugim radionuklidom koji emituje pozitrone. Snimci dobijeni upotrebom takvih tehnika mogu biti upotrebljeni za procenu biodistrbucije ciljnog molekula kod pacijenta, sisara ili u tkivu, na primer u kontekstu upotrebe cilјnog molekula kao biomarkera prisustva kancerskih/tumorskih ćelija. Varijacije u ovoj tehnici mogu uključivati upotrebu snimanja magnetne rezonance (MRI) da bi se poboljšalo snimanje u odnosu na tehnike sa gama kamerama. Konvencionalni imunoscintigrafski postupci i principi su opisani u, npr. [79], [80] i [81]. Štaviše, takvi snimci mogu takođe, ili anternativno, poslužiti kao osnova za hirurške tehnike uklanjanja tumora. Navedene in vivo tehnike snimanja nadalje mogu omogućiti identifikaciju i lokalizaciju tumora u situaciji kada je pacijent identifikovan kao onaj koji je sa tumorom (zbog prisustva drugih biomarkera, metastaza itd.), ali se tumor ne može identifikovati tradicionalnim analitičkim tehnikama.
[0309] In vivo snimanja i drugi dijagnostički postupci su posebno korisni u detekciji mikrometastaza kod humanog pacijenta (npr. pacijenta kome prethodno nije dijagnostikovan kancer ili kod pacijenat u periodu oporavka od ili remisije kancera).
[0310] Prema jednom apsektu, predmetni opis obezbeđuje in vivo postupak snimanja u kome je humanizovano ili himerno antitelo predmetnog opisa specifično za ciljni molekul konjugovano sa agensom koji pospešuje detekciju radio-opalescentnosti, potom primenu konjugovanog humanizovanog ili himernog antitela domaćinu, kao što je injeciranjem u krvotok, i dalje analizu prisustva i lokacija obeleženog humanizovanog ili himernog antitela u domaćinu. Putem ove tehnike i putem bilo koje druge tehnike koja je ovde obezbeđena, predmetni pronalazak obezbeđuje postupak za skrining prisustva ćelija povezanih sa oboljenjem kod humanog pacijenta ili u uzorku uzetom iz humanog pacijenta i/ili za procenu raspodele humanizovanog ili himernog antitela specifičnog za ciljni molekul pre ADC terapije specifične za ciljni molekul.
[0311] Za dijagnostičko snimanje, radioizotopi mogu biti direktno ili indirektno vezani za humanizovano ili himerno antitelo specifično za ciljni molekul, upotrebom funkcionalne grupe koja je tipa posrednika. Korisne posredničke funkcionalne grupe obuhvataju helatore, poput etilen diamino tetra sirćetne kiseline i dietilen triamino penta sirćetne kiseline (pogledati na primer [82]). Pored radioizotopa i radio-opalescentnih agenasa, dijagnostički postupci mogu biti izvedeni upotrebom antitela specifičnih za ciljni molekul koja su konjugovana sa bojama (kao što je biotin-streptavidinski kompleks), kontrastnim sredstvima, fluorescentnim jedinjenjima ili molekulima i agensima za pojačavanje signala (npr. paramagnetnim jonima) prilikom snimanje magnetne rezonance (MRI) (pogledati npr. [83], koji opisuje MRI tehnike i pripremu antitela konjugovanih sa agensima za pojačavanje MRI signala). Takva sredstva za dijagnostiku/detekciju mogu biti izabrana između agenasa za upotrebu u MRI, kao i fluorescentnih jedinjenja. Da bi se humanizovano ili himerno antitelo specifično za ciljni molekul opteretilo radioaktivnim metalima ili paramagnetnim jonima, može biti potrebno da ono reaguje sa reagensom koji sadrži duge lance za koje se mogu vezati višestruke helatorne grupe čija je funkcija u vezivanju jona. Takvi lanci mogu biti polimeri poput polilizina, polisaharida ili nekih drugih derivatizovanih ili lanaca koji se mogu derivatizovati, sa bočnim grupama za koje mogu biti vezane helatorne grupe kao što su, npr. porfirini, poliamini, krunski etri, bisthiosemikarbazoni, polioksimi i slične vezujuće grupe, a za koje je poznato da su korisne za ove svrhe. Helati mogu biti kuplovani sa humanizovanim ili himernim antitelima specifičnim za ciljni molekul upotrebom standarnih hemijskih proizvoda.
[0312] Tako, predmetni opis obezbeđuje dijagnostičko humanizovano ili himerno antitelo specifično za cilјni molekul, pri čemu je humanizovano ili himerno antitelo specifično za cilјni molekul konjugovano sa kontrastnim agensom (kao što je agens za snimanje magnetne rezonance, kompjuterizovanu tomografiju ili kontrastni agens koji pojačava signal kod ultrazvučnih snimanja) ili radionuklid koji može biti, na primer, izotop koji emituje gama-, beta-, alfa-, Ogerove elektrone ili pozitrone.
[0313] Prema jednom aspektu, predmetni opis se odnosi na dijagnostičku kompoziciju koja sadrži antitelo ili bispecifično antitelo prema pronalasku.
[0314] Prema dodatnom aspektu, pronalazak se odnosi na komplet za detekciju prisustva cilјnog antigena ili ćelije koja eksprimira cilјni molekul, u uzorku, koji sadrži:
- humanizovano antitelo predmetnog pronalaska specifično za ciljni molekul; i
- uputstva za upotrebu kompleta.
[0315] Preciznije, predmetni pronalazak obezbeđuje komplet za detekciju prisustva CD3 antigena ili ćelije koja eksprimira CD3 u uzorku, čija primena obuhvata korake;
a) kontakt uzorka sa antitelom ili bispecifičnim antitelom prema pronalasku, pod uslovima koji omogućavaju obrazovanje kompleksa između antitela ili bispecifičnog antitela i CD3; i
b) analizu da li je kompleks obrazovan.
[0316] U jednom primeru izvođenja, predmetni pronalazak obezbeđuje komplet za dijagnozu kancera koji sadrži spremnik sa humanizovanim antitelom pronalaska specifičnim za ciljni molekul i jedan ili više reagenasa za detekciju vezivanja humanizovanog antitela specifičnog za cilјni molekul. Reagensi mogu obuhvatati, na primer, fluorescentne oznake, enzimske oznake ili druge oznake koje se mogu detektovati. Reagensi mogu takođe uključivati sekundarna ili tercijarna antitela ili reagense za enzimske reakcije, pri čemu enzimske reakcije proizvode proizvod koji se može vizuelizovati. U jednom primeru izvođenja, predmetni pronalazak obezbeđuje dijagnostički komplet koji sadrži jedno ili više humanizovanih antitela pronalaska koja su specifična za ciljni molekul u obeleženom ili neobeleženom obliku, u odgovarajućim spremnicima, reagense za inkubacije indirektinih analiza i supstrate ili derivatizirajuće agense za detekciju u ovakvim analizama, u zavisnosti od prirode obeleživača. Takođe mogu biti uklјučeni kontrolni reagens(i) i uputstva za upotrebu.
[0317] Dijagnostički kompleti takođe mogu biti isporučeni za upotrebu sa humanizovanim antitelom specifičnim za ciljni molekul, kao što je obeleženo antitelo specifično za ciljni molekul, radi detekcije prisustva ciljnog molekula u uzorku tkiva ili domaćinu. U takvim dijagnostičkim kompletima, kao i u kompletima za terapijske upotrebe koji su ovde opisani na drugom mestu, humanizovano antitelo specifično za cilјni molekul obično može biti obezbeđeno u liofilizovanom obliku, u spremniku, bilo samostalno ili u kombinaciji sa dodatnim antitelima specifičnim za ciljnu ćeliju ili peptid. Uobičajeno je da farmaceutski prihvatlјiv nosač (npr. inertni razblaživač) i/ili njegove komponente, kao što su Tris, fosfatni ili karbonatni pufer, stabilizatori, konzervansi, biocidi, inertni proteini, npr. serumski albumin, ili slično, takođe budu uključeni (obično u odvojenom spremniku za mešanje), kao i dodatni reagensi (takođe obično u posebnim spremnicima). U određenim kompletima, takođe su uključena, u odvojenom spremniku, sekundarna antitela sposobna da se vezuju za humanizovano antitelo specifično za ciljni molekul. Drugo antitelo je obično konjugovano sa obeleživačem i formulisano je na način sličan humanizovanom antitelu predmetnog pronalaska specifičnom za ciljni molekul. Upotrebom postupaka koji su opisani prethodno i u drugim delovima teksta, humanizovana antitela specifična za ciljni molekul mogu biti upotrebljenja za definisanje podgrupe kancerskih/tumorskih ćelija i za karakterizaciju takvih ćelija i srodnih tumorskih tkiva.
Sekvence
[0318]
Tabela 1
Primeri
Primer 1 - Generisanje humanizovanih anti-CD3 antitela i neaktivirajućih varijanti antitela
Humanizacija anti-CD3 antitela
[0319] Humanizacija mišjeg anti-CD3 antitela (US 8,236,308, ovde opisanog kao IgG1-CD3) je izvedena od strane kompanije Antitope (Cambridž, Velika Britanija), upotrebom njihove pobolјšane verzije tehnologije za germinativnu humanizaciju (CDR-graft-ovanje) (EP 0 629 240). Upotrebom ove tehnologije su dizajnirana 4 različita VH lanca (SEQ ID NO:6, 7, 8 i 9) i 3 različita VL lanca (SEQ ID NO:10, 11 i 12). Kombinovanjem ova 4 VH sa 3 VL lanca je stvoreno 12 različitih antitela. Humanizovane varijante su ovde opisane kao huCD3. Tako, humanizovane varijante koje sadrže VH i VL prema pronalasku su opisane kao, npr. IgG1-huCD3-H1L1, što označava da je navedena specifična varijanta IgG1 izotipa humanizovani CD3 i da sadrži aminokiselinsku sekvencu VH označenu kao "H1" koja je definisana u skladu sa SEQ ID NO:6, dok je aminokiselinska sekvenca VL označena sa "L1 " i definisana prema SEQ ID NO:10. Stoga, H1 se odnosi na varijabilni region teškog lanca VH1, L1 se odnosi na varijabilni region lakog lanca VL1 i tako dalјe.
[0320] Preciznije, generisane su varijante IgG1-huCD3-H1L1 (humanizovani CD3 koji sadrži VH1 sekvencu navedenu u SEQ ID NO:6 i VL1 sekvencu navedenu u SEQ ID NO:10), IgG1-huCD3-H1L2 (humanizovani CD3 koji sadrži VH1 sekvenca navedenu u SEQ ID NO:6 i VL2 sekvencu navedenu u SEQ ID NO:11), IgG1-huCD3-H1L3 (humanizovani CD3 koji sadrži VH1 sekvencu navedenu u SEQ ID NO:6 i VL3 sekvencu navedenu u SEQ ID NO:12), IgG1-huCD3-H3L3 (humanizovani CD3 koji sadrži VH3 sekvencu navedenu u SEQ ID NO:8 i VL3 sekvencu navedenu u SEQ ID NO:12), IgG1-huCD3-H4L1 (humanizovani CD3 koji sadrži VH4 sekvencu navedenu u SEQ ID NO:9 i VL1 sekvencu navedenu u SEQ ID NO:10), IgG1-huCD3-H3L1 (humanizovani CD3 koji sadrži VH3 sekvencu navedenu u SEQ ID NO:8 i VL1 sekvencu navedenu u SEQ ID NO:10), IgG1-huCD3-H3L3 (humanizovani CD3 koji sadrži VH3 sekvencu navedenu u SEQ ID NO:8 i VL3 sekvencu navedenu u SEQ ID NO:12) i IgG1-huCD3-H4L3 (humanizovani CD3 koji sadrži VH4 sekvencu navedenu u SEQ ID NO:9 i VL3 sekvencu navedenu u SEQ ID NO:12), a koje su dalje ispitane u primerima koji su ovde opisani.
[0321] U pojedinim primerima, antitelo koje sadrži sekvence varijabilnih regiona teških i lakih lanaca huCLB-T3/4 (SEQ ID NO:17 i 18, tim redom) upotrebljeno je kao kontrolno antitelo (Labrijn i saradnici, PNAS 2013, 110: 5145-50) i za verifikaciju različitih neaktivirajućih kombinacija mutacija u Fc regionu (pogledati Primere 8 do 10). HuCBL-T3/4 je humanizovana verzija mišjeg anti-CD3 antitela CLB-T3/4 (Parren i saradnici, Res Immunol.1991, 142(9):749-63). Obe sekvence (SEQ ID NO:17 i 18) su klonirane u relevantne pcDNK3.3 ekspresione vektore (Invitrogen) i eksprimirane su kotransfekcijom u HEK293F ćelijama. Rezultujuće kontrolno antitelo je opisano kao IgG1-huCLB-T3/4.
[0322] U pojedinim primerima, antitelo koje sadrži sekvence varijabilnih regiona teških i lakih lanaca CD20 antitela 7D8 (SEQ ID NO:29 koja odgovara VH sekvenci i SEQ ID NO:30 koja odgovara VL sekvenci) upotrebljeno je kao pozitivna kontrola. Kada je upotrebljavano u kontekstu pozitivne kontrole, označeno je kao "IgG1-CD20".
[0323] Navedena IgG1-CD3 (tj. himerna, matična anti-CD3 antitela), IgG1-huCD3 i IgG1-huCLB-T3/4 antitela su upotrebljavana u monospecifičnom i bispecifičnom formatu, pri čemu su bispecifična antitela proizvedena kao što je opisano u tekstu koji sledi.
HER2 antitelo
[0324] U pojedinim primerima, upotrebljavano je anti-HER2 antitelo. VH i VL sekvence za ovo anti-HER2 antitelo (antitelo 169, SEQ ID NO:19 i 20, tim redom) su prethodno opisane (WO2012/143524 [Genmab]; Labrijn i saradnici, PNAS 2013, 110: 5145-50). Antitelo je korišćeno u monospecifičnom i bispecifičnom formatu i označeno je kao "IgG1-HER2".
b12 antitelo
[0325] U pojedinim primerima, antitelo b12, antitelo specifično za gp120 (Barbas, CF. J Mol Biol. 5. april 1993.; 230(3):812-23.) je upotrebljavano kao negativna kontrola i označeno je kao "IgG1-b12".
Ekspresija
[0326] Antitela su eksprimirana kao IgG1,κ ili IgG1,λ sa ili bez neaktivirajućih mutacija koje su opisane u tekstu koji sledi i sa mutacijom u CH3 domenu koja omogućava generisanje bispecifičnih antitela postupkom koji je opisan u nastavku: IgG1-HER2-K409R, IgG1-b12-K409R, IgG1-CD3-F405L. Smeše plazmidnih DNK koje kodiraju i teški i laki lanac antitela, tranzijentno su transfektovane u Freestyle HEK293F ćelije (Invitrogen, US) upotrebom 293fectin-a (Invitrogen, US), suštinski kao što je opisano od strane proizvođača.
Prečišćavanje antitela
[0327] Supernatant kulture je profiltriran kroz 0,2 µm “dead-end” filtere, pa je nanet na MabSelect SuRe kolone od 5 mL (GE Health Care) koje su dalje eluirane sa 0,1 M NaOH-natrijum citratom, pH 3. Eluat je odmah neutralizovan sa 2M Tris-HCl, pH 9, pa podvrgnut dijalizi preko noći sa 12,6 mM NaH2PO4, 140 mM NaCl, pH 7,4 (B.Braun). Alternativno, nakon prečišćavanja, eluat je nanošen na HiPrep kolonu za desalinizaciju i antitelo je izmenom prebačeno u pufer sa 12,6 mM NaH2PO4, 140 mM NaCl, pH 7,4 (B.Braun). Nakon dijalize ili izmene pufera, uzorci su sterilno profiltrirani upotrebom“dead-end” filtera od 0,2 µm. Čistoća je određena SDS-PAGE postupkom, a koncentracija je izmerena apsorbancom na 280 nm. Prečišćena antitela su čuvana na 4°C.
Generisanje bispecifičnih antitela
[0328] Bispecifična antitela su generisana in vitro, upotrebom tehnologije sa DuoBody® platformom, tj. izmenom Fab-kraka indukovanom sa 2-MEA, kao što je opisano u WO 2011/147986 i u publikaciji Labrijn i saradnici (Labrijn i saradnici, PNAS 2013, 110:5145-50; Gramer i saradnici, MAbs 2013, 5:962-973). Da bi se omogućila proizvodnja bispecifičnih antitela ovim postupkom, generisani su IgG1 molekuli koji nose jednu mutaciju u CH3 domenu: u jednom matičnom IgG1 antitelu, mutaciju F405L (tj. IgG1-anti-CD3 antitelo), a u drugom matičnom IgG1 antitelu, mutaciju K409R (tj. HER2 ili b12 antitela). Da bi se generisala bispecifična antitela, ova dva matična antitela, svako antitelo u finalnoj koncentraciji od 0,5 mg/mL, su inkubirana sa 25 ili 75 mM 2-merkaptoetilamin-HCI-a (2-MEA) u ukupnoj zapremini od 500 µL TE, na 31°C i tokom 5 sati. Reakcija redukcije je zaustavlјena uklanjanjem redukujućeg agensa 2-MEA, upotrebom PD-10 kolona (GE-healthcare, kat.br. 17-0851-01), ekvilibrisanih sa 25 mL PBS-a. Pre desalinizacije, uzorcima je dodato 2 ml PBS-a (B.Braun, kat.br.
3623140) da bi se zapremina podesila do 2,5 ml. Elucija je urađena u 3,5 mL PBS-a. Uzorci su prikuplјani u Amicon Ultra jedinicama za centrifugiranje (30 kD MWCO, Millipore, kat.br. UFC803096) i koncentrovani centrifugiranjem od 8 min na 3000xg. Zapremine su podešene do 500 µL (kada je to bilo potrebno) sa PBS-om i uzorci su profiltrirani radi sterilizacije, upotrebom filtera od 0,2 µm (Millex-GV, kat.br. SLGV004SL). Bispecifični proizvodi su čuvani na 2-8°C.
[0329] Na alternativan način za generisanje istog bispecifičnog antitelo, a upravo da bi se proizvela bispecifična antitela, pomešano je po 100 µg dva matična antitela i smeša je inkubirana sa 75 mM 2-merkaptoetilamin-HCI-om (2-MEA) u ukupnoj zapremini od 400 µL PBS-a (B. Braun, kat.br.3623140), na 31°C i tokom 5 sati. Reakcija redukcije je zaustavlјena uklanjanjem redukcionog sredstva 2-MEA, upotrebom Amicon Ultra jedinica za centrifugiranje od 0,5 ml (10 kD MWCO, Millipore, kat.br. UFC501096) i ispiranjem, 4x sa po 400 ul PBS-a, a dalje centrifugiranjem tokom 10 min na 13000x g. Uzorci su prikuplјani u nove epruvetu invertovanjem filtera i centrifugiranjem od 2 min na 1000 g. Zapremine su potom podešene do 200 µL (ukoliko je to bilo potrebno) sa PBS-om. Radi određivanja finalne koncentracije, izmerena je apsorbancija bispecifičnih proizvoda na 280 nm (A280). Urađena je i katjon-izmenjivačka HPLC hromatografija (HPLC-CEX) (kao što je opisano u WO 2013/060867) da bi se odredila količina bispecifičnog proizvoda. Uzorci su čuvani na 2-8°C.
[0330] Generisana bispecifična antitela su u dalјem tekstu opisana kao "K409R IgG1 okosnica" i "F405L IgG1 okosnica".
Neaktivirajuće mutacije
[0331] Generisano je i nekoliko varijanti antitela sa jednom ili sa više aminokiselinskih supstitucija u Fc regionu. Neaktivirajući Fc region sprečava da antitelo interaguje sa Fc receptorima koji su prisutni na ćelijama krvi, kao što su monociti, ili sa C1q u cilju aktivacije klasičnog puta sistema komplemenata. Smanjenje Fc aktivnosti je ispitivano za varijante antitela koje sadrže različite kombinacije aminokiselinskih supstitucija u Fc regionu. Uvedeno je maksimalno pet aminokiselinskih supstitucija, koje obuhvataju mutacije N297Q, L234A, L235A, L234F, L235E, D265A i P331S. Supstitucije na jednoj ili više od ovih pet aminokiselinskih pozicija su uvođene u K409R i/ili F405L IgG1 okosnicu. Generisane su tako sledeće varijante Fc regiona huCLB-T3/4 antitela: N297Q (odnosi se na supstituciju N297Q, varijanta označena kao IgG1-huCLB-T3/4-N297Q), LFLE (odnosi se na supstitucije L234F/L235E, varijanta označena kao IgG1-huCLB-T3/4-LFLE), LALA (odnosi se na supstitucije L234A/L235A, varijanta označena kao IgG1-huCLB-T3/4-LALA), LFLENQ (odnosi se na supstitucije L234F/L235E/N297Q, varijanta označena kao IgG1-huCLB-T3/4 -LFLENQ), LFLEDA (odnosi se na supstitucije L234F/L235E/D265A, varijanta označena kao IgG1-huCLB-T3/4-LFLEDA), DA (odnosi se na supstituciju D265A, varijanta označena kao IgG1-huCLB-T3/4-DA), DAPS (odnosi se na supstitucije D265A/P331S, varijanta označena kao IgG1-huCLB-T3/4-DAPS), DANQ (odnosi se na supstitucije D265A/N297Q, varijanta označena kao IgG1-huCLB-T3/4-DANQ), LFLEPS (odnosi se na supstitucije L234F/L235E/P331S, varijanta označena kao IgG1-huCLB-T3/4-LFLEPS) i LFLEDANQPS (odnosi se na supstitucije L234F/L235E/D265A/N297Q/P331S, varijanta označena kao IgG1-huCLB-T3/4-LFLEDANQPS).
[0332] Preciznije, u varijantama IgG1-huCD3 antitela, kombinacija tri aminokiselinske supstitucije koja obuhvata mutacije L234F, L235E i D265A i koja je označena kao LFLEDA, uvedena je u K409R i F405L IgG1 okosnicu da bi generisala antitela sa neaktivirajućim Fc regionom. Dobijena neaktivirajuća varijanta antitela se označava sufiksom "-LFLEDA".
Primer 2 - Vezivanje humanizovanih anti-CD3 antitela i njihove neaktivirajuće varijante za humane i T-ćelijske linije koje eksprimiraju CD3 cinomolgus majmuna
[0333] Vezivanje prečišćenih varijanti humanizovanih CD3 (huCD3) antitela i bispecifičnih (bs)IgG1-huCD3 x HER2 molekula, sa ili bez LFLEDA mutacija u Fc regionu (pogledati Primer 1), za humanu T-ćelijsku Jurkat liniju (klon E6-1, ATCC® TIB-152™, LGC Standards GmbH, Wesel, Nemačka) ili T-ćelijsku liniju HSC-F cinomolgus majmuna (kat.br. JCRB1164; Health Science Research Resources Bank, Osaka, Japan), analizirana je FACS analizom. Pored neaktivirajućih mutacija, LFLEDA, varijante antitela su sadržavale F405L ili K409R mutacije kao što je opisano u Primeru 1.
[0334] Ćelije (1x10<5>ćelije/bunariću) su inkubirane u polistirenskim pločama sa 96 bunarića okruglog dna (Greiner bio-one 650101) sa serijskim razblaženjima preparata antitela (opsega od 5 do 10000 ng/mL, u vidu trostrukih razblaženja) u 100 µL PBS/0,1% BSA /0,02% azida, na 4°C tokom 30 min.
[0335] Nakon dva ispiranja u PBS/0,1% BSA/0,02% azidu, ćelije su inkubirane u 100 µL sa sekundarnim antitelom, na 4°C i tokom 30 minuta. Kao sekundarno antitelo, u svim eksperimentima je upotrebljavan R-fikoeritrin (PE) konjugovan sa kozjim anti-humanim IgG F(ab')2 (109-116-098, Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc., West Grove, PA), koji je bio u razblaženju od 1/100, u PBS/0,1% BSA/0,02% azidu. Ćelije su zatim isprane dva puta sa PBS/0,1% BSA/0,02% azidom, resuspendovane u 150 µL PBS/0,1% BSA/0,02% azida i analizirane na FACS uređaju tipa Canto ll (BD Biosciences). Krive vezivanja su analizirane nelinearnom regresijom (sigmoidna kriva odgovora na doze, sa varijabilnim nagibom) upotrebom GraphPad Prism V5.04 kompjuterskog programa (GraphPad Software, San Diego, Kalifornija, SAD).
[0336] Slika 1A pokazuje da je vezivanje za Jurkat ćelije navedenih IgG1λ-huCD3 varijanti IgG1-huCD3-H1L1 (SEQ ID NO:6 i 10, tim redom), IgG1-huCD3-H1L2 (SEQ ID NO:6 i 11, tim redom), IgG1-huCD3-H1L3 (SEQ ID NO:6 i 12, tim redom), IgG1-huCD3-H3L3 (SEQ ID NO:8 i 12, tim redom) i IgG1-huCD3-H4L1 (SEQ ID NO:9 i 10, tim redom) preko Fc regiona divljeg tipa uočava kod svih varijanti i da je sposobnost vezivanja IgG1-CD3-LFLEDA (matičnog CD3 antitela opisanog u Primeru 1, sa neaktivirajućim LFLEDA mutacijama) i IgG1-huCD3-H3L1-LFLEDA, sa neaktivirajućim LFLEDA mutacijama, bilo slično kao za huCD3 varijatu sa Fc regionom divljeg tipa. Vezivanje IgG1-huCLB-T3/4 za Jurkat ćelije, uklјučenog u vidu pozitivne kontrole, je bilo snažnog inteziteta u poređenju sa onim za IgG1-huCD3 varijante. Nije primećeno vezivanje negativnog kontrolnog antitela IgG1-b12.
[0337] Slika 6A pokazuje da je vezivanje za Jurkat ćelije pri primeni IgG1-CD3-LFLEDA (matičnog anti-CD3 antitela opisanog u Primeru 1, sa neaktivirajućim LFLEDA mutacijama), IgG1-huCD3-H3L1-LFLEDA, IgG1-huCD3-H3L3-LFLEDA, IgG1-3huCD3-H1L1-LFLEDA, IgG1-huCD3-H1L3-LFLEDA, IgG1-huCD3-H4L1-LFLEDA i IgG1-huCD3-H4L3-LFLEDA sa neaktivirajućim LFLEDA mutacijama, bilo slično sposobnosti vezivanja za huCD3 varijante sa Fc regionom divljeg tipa. Vezivanje IgG1-huCLB-T3/4 za Jurkat ćelije, uklјučenog u vidu pozitivne kontrole, je bilo jače u poređenju sa IgG1-huCD3 varijantama u niskim koncentracijama antitela, ali je bilo i slično kao pri većim koncentracijama antitela. Sveukupno, humanizovane CD3 varijante su zadržale sposobnost vezivanja za CD3 koja karakteriše IgG1-anti-CD3 antitelo. Nije utvrđeno vezivanje kod negativnog kontrolnog antitela IgG1-b12.
[0338] Slike 1B pokazuje da se varijante bispecifičnog antitela bsIgG1 CD3 x HER2, bsIgG1 CD3 x b12-LFLEDA i bsIgG1 huCD3-H3L1 x HER2-LFLEDA takođe vezuju za Jurkat ćelije. Maksimalne vrednosti vezivanja za ova bispecifična antitela su veće od maksimalnih vrednosti vezivanja monospecifičnih antitela. EC50 koncentracije bispecifičnih antitela su bile 6 do 10 puta veće. Ponovo nije primećeno vezivanje u slučaju negativnog kontrolnog antitela IgG1-b12.
[0339] Slika 6B pokazuje da se varijante bispecifičnog neaktivirajućeg Fc antitela huCD3-H3L1 x HER2-LFLEDA, bsIgG1-huCD3-H3L3 x HER2-LFLEDA, bsIgG1-huCD3-H1L1 x HER2-LFLEDA, bsIgG1-huCD3-H1L3 x HER2-LFLEDA, bsIgG1-huCD3-H4L1 x HER2-LFLEDA i bsIgG1-huCD3-H4L3 x HER2-LFLEDA takođe vezuju za Jurkat ćelije. Maksimalne vrednosti vezivanja za ova bispecifična antitela su veće od maksimalnih vrednosti vezivanja monospecifičnih antitela. EC50 koncentracije bispecifičnih antitela su bile 4 do 10 puta veće. Monovalentno vezivanje omogućava da se više antitela akumulira na ćelijskoj površini, odnosno, veće vrednosti vezivanja za bispecifična antitela. Opet, nije utvrđeno vezivanje negativnog kontrolnog antitela IgG1-b12.
[0340] Slike 2A pokazuje da je vezivanje IgG1-huCD3 varijanti IgG1-huCD3-H1L1, IgG1-huCD3-H1L2, IgG1-huCD3-H1L3, IgG1-huCD3-H3L3 i IgG1-huCD3-H4L1 sa Fc regionom divljeg tipa i IgG1-CD3-LFLEDA, IgG1-huCD3-H3L1-LFLEDA za T-ćelijsku liniju HSC-F cinomolgus majmuna bilo slično. Nije utvrđeno vezivanje negativnog kontrolnog antitela huCLB-T3/4, koje ne reaguje unakrsno sa CD3 cinomolgus majmuna, kao ni negativnog kontrolnog antitela IgG1-b12.
[0341] Slika 7A pokazuje da je vezivanje IgG1-huCD3 varijanti IgG1-CD3-LFLEDA, IgG1-huCD3-H3L1-LFLEDA, IgG1-huCD3-H3L3-LFLEDA, IgG1-huCD3-H1L1-LFLEDA, IgG1-huCD3-H1L3-LFLEDA, IgG1-huCD3-H4L1-LFLEDA i IgG1-huCD3-H4L3-LFLEDA za T-ćelijsku liniju HSC-F cinomolgus majmuna bilo slično. Nije utvrđeno vezivanje negativnog kontrolnog antitela IgG1-b12.
[0342] Slike 2B pokazuju da se bispecifične varijante antitela bsIgG1 CD3 x HER2 i bsIgG1 huCD3-H3L1-LFLEDA takođe vezuju za HSC-F ćelije. Maksimalne vrednosti vezivanja za ova bispecifična antitela su veće od maksimalnih vrednosti vezivanja monospecifičnih anti-CD3 varijanti. EC50 koncentracije bispecifičnih antitela su bile 10 do 12 puta veće od koncentracija za monospecifična anti-CD3 antitela. Ponovo nije primećeno vezivanje za negativno kontrolno antitelo IgG1-b12.
[0343] Slika 7B pokazuje da se varijante bispecifičnih neaktivirajućih Fc antitela bsIgG1 huCD3-H3L1 x HER2-LFLEDA, bsIgG1-huCD3-H3L3 x HER2-LFLEDA, bsIgG1-huCD3-H1L1 x HER2-LFLEDA, bsIgG1-huCD3-H1L3 x HER2-LFLEDA, bsIgG1-huCD3-H4L1 x HER2-LFLEDA i bsIgG1-huCD3-H4L3 x HER2-LFLEDA takođe vezuju za HSC-F ćelije. Maksimalne vrednosti vezivanja za ova bispecifična antitela su veće od maksimalnih vrednosti vezivanja za monospecifične anti-CD3 varijante. EC50 koncentracije bispecifičnih antitela su bile 3 do 6 puta veće od koncentracija za monospecifična anti-CD3 antitela. Ponovo nije primećeno vezivanje za negativno kontrolno antitelo IgG1-b12.
Primer 3 - Aktivacija T-ćelija humanizovanim varijantama anti-CD3 antitela
[0344] Ekspresija CD69 je rani marker aktivacije T-ćelija. Anti-CD3 antitela mogu posredovati u unakrsnom povezivanju T-ćelija i imunih ćelija putem vezivanja CD3 koga eksprimiraju T-ćelije i Fc receptora koje eksprimiraju imunske ćelije, posredstvom Fc regiona antitela, kao što je Fc region IgG1. Ovo može dovesti do aktivacije T-ćelija i indukcije CD69. Varijante antitela koje sadrže neaktivirajući Fc region (LFLEDA mutacije) ne vezuju Fc receptore. Stoga, predviđano je da neaktivirajuća anti-CD3 antitela ne indukuju T-ćelijsku aktivaciju i ekspresiju CD69, pošto se neaktivirajući Fc region ne vezuje za Fc receptor koga eksprimiraju imune ćelije i da time ne može umrežiti T-ćelije i imunske ćelije.
[0345] Ekspresija CD69 na T-ćelijama je procenjena FACS analizom da bi se utvrdila rana aktivacija T-ćelija nakon inkubacije sa humanizovanim varijantama CD3 (huCD3) sa i bez LFLEDA mutacija u Fc regionu. Pored neaktivirajućih mutacija, LFLEDA varijante sadrže mutacije F405L ili K409R, kao što je opisano u Primeru 1.
[0346] PBMC su izolovane iz pune krvi ili interfaze prilikom izdvajanja plazme na gradijenatu gustine upotrebom Leucosep epruveta (kat.br. 227290; Greiner Bio-one, Alphen a/d Rijn, Holandija), nakon čega su isprane PBS-om i resuspendovane u medijumu za kulturu.
[0347] Serije doznih odgovora za varijatne huCD3 antitela, negativnu kontrolu (IgG1-b12) i pozitivne kontrole (IgE-huCD3 i matični IgG1-CD3) su pripremlјene u medijumu za kulturu (u rasponu od 0,1 do 1,000 ng/mL, kao razblaženja od 10 puta), pa su dodate u bunariće mikrotitar ploče sa 96 mesta okruglog dna koji su sadržavali humane ili PBMC cinomolgus majmuna. Nakon inkubacije od 16 do 24 sata, ćelije su istaložene centrifugiranjem, a supernatant (koji sadrži citokine) je prikuplјen i čuvan na -20°C. Ćelije su zatim isprane sa PBS/0,1% BSA/0,02% azidom i bojene tokom 30 minuta na 4°C sa mišjim anti-humanim CD28-PE (854.222.010; Sanquin, Amsterdam, Holandija; marker T-ćelija) i mišjim anti-humanim CD69-APC antitelo (340560; BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ), koje su unakrsno reaktivne sa CD28 i CD69 cinomolgus majmuna, tim redom. Nevezana antitela su uklonjena ispiranjem, dva puta sa PBS/0,1% BSA/0,02% azidom. Ćelije su resuspendovane u 150 µL/bunariću, pa je ekspresija CD69 na CD28 pozitivnim ćelijama izmerena na FACS Canto II uređaju (BD Biosciences).
[0348] Slika 3 pokazuje da IgG1-CD3 (kao što je opisano u Primeru 1) i humanizovane varijante IgG1-huCD3 sa IgG1 Fc regionom divljeg tipa indukuju slične nivoe ekspresije CD69 na T-ćelijama poreklom iz ljudi (Slika 3A) i cinomolgus majmuna (Slika 3B). Neaktivirajuće (LFLEDA) varijante IgG1-CD3-LFLEDA i IgG1-huCD3-H3L1 su indukovale niske nivoe ekspresije CD69 u humanim T-ćelijama. Ekspresija CD69 nije bila indukovana neaktivirajućim IgG1-huCD3 varijantama u T-ćelijama cinomolgus majmuna. Kontrolno antitelo IgG1-b12 takođe nije indukovalo ekspresiju CD69 u T-ćelijama čoveka ili cinomolgus majmuna.
[0349] Figura 8 pokazuje da su neaktivirajuće (LFLEDA) varijante IgG1-huCD3-H3L1-LFLEDA, IgG1-huCD3-H3L3-LFLEDA, IgG1-3huCD3-H1L1-LFLEDA, IgG1-huCD3-H1L3-LFLEDA, IgG1-huCD3-H4L1-LFLEDA i IgG1-huCD3-H4L3- LFLEDA indukovale niske nivoe ekspresije CD69 u humanim T-ćelijama.
Slike 8A i 8B pokazuju indukciju CD69 ekspresije na T-ćelijama cinomolgus majmuna. Minorna aktivacija koja je utvrđena za neaktivirajuće varijante može biti posledica umrežavanja CD3 molekula putem bivalentnog vezivanja anti-CD3 antitela. Ovakvo objašnjenje je podržano zapažanjem da je aktivacija smanjena pri najvećoj koncentraciji i kada je vezivanje antitela monovalentno. Kontrolno antitelo IgG1-b12 takođe nije indukovalo ekspresiju CD69 u T-ćelijama čoveka ili cinomolgus majmuna.
[0350] Slike 8C i 8D pokazuju da neaktivirajuće varijante bispecifičnih antitela bsIgG1-huCD3-H3L1 x HER2-LFLEDA, bsIgG1-huCD3-H3L3 x HER2-LFLEDA, bsIgG1-huCD3-H1L1 x HER2-LFLEDA, bsIgG1-huCD3-H1L3 x HER2- LFLEDA, bsIgG1-huCD3-H4L1 x HER2-LFLEDA i bsIgG1-huCD3-H4L3 x HER2LFLEDA ne indukuju ekspresiju CD69 u T-ćelijama kod lјudi (Slika 8C) ili cinomolgus majmuna (Slika 8D). Ipak, pri višim koncentracijama antitela je primećena indukcija ekspresije CD69.
Primer 4 - Proliferacija T-ćelija indukovana humanizovanim varijantama anti-CD3 antitela.
[0351] Dejstvo varijanti humanizovanog anti-CD3 (huCD3) antitela (opisanih u Primeru 1) na proliferaciju T-ćelija čoveka i cinomolgus majmuna je procenjivanja upotrebom ELISA kompleta za ćelijsku proliferaciju kompanije Roche Astrlied Science (Cell Proliferation ELISA, BrdU komplet, kat.br.
11647229001; Roche Astrlied Science, Mannheim, Nemačka), što je izvedeno prema uputstvima proizvođača.
[0352] Humani ili PBMC cinomolgus majmuna su izolovani iz pune krvi ili interfaze prilikom izolacije plazme i inkubirani su u mikrotitar pločama sa 96 mesta u serijama razblaženja (u rasponu od 0,1 do 1,000 ng/mL, kao razblaženja od 10 puta) varijanti IgG1 huCD3 antitela. IgE-CD3 i IgG1-huCLB-T3/4 su bili uklјučeni kao pozitivne kontrole, dok je IgG1-b12 bilo uključeno kao negativna kontrola. Nakon 3 dana inkubacije sa antitelima, BrdU (Roche Astrlied Science, Mannheim, Nemačka) je dodat u medijum i ploče su inkubirane tokom 5 sati. Ćelije su zatim istaložene centrifugiranjem, a supernatant je prikupljen i čuvan na -20°C. Ploče su osušene i čuvane na 4°C sve dok nije izvedena ELISA analiza.
[0353] Ugradanja BrdU u DNK je određivana ELISA postupkom, prema uputstvima proizvođača (Roche Astrlied Science). Ćelije su fiksirane za ploče, pri čemu su ploče inkubirane tokom 90 minuta na ST sa anti-BrdU antitelom konjugovanim sa peroksidazom. Ploče su zatim isprane PBST-om i vezivanje je detektovano upotrebom ABTS pufera (umesto TMB rastvora koji je isporučen u kompletu). Razvoj boje je zaustavlјen nakon 30 minuta, dodavanjem 2% oksalne kiseline u bunariće. OD405 nm je izmeren na ELISA čitaču EL808.
[0354] Slika 4 pokazuje da inkubacija PBMC sa matičnim IgG1-CD3 i humanizovanim varijantama IgG1-huCD3 koje sadrže IgG1 Fc region divljeg tipa, indukuje snažnu proliferaciju T-ćelija lјudi (Slika 4A) i cinomolgus majmuna (Slika 4B), čak i pri veoma niskim koncentracijama antitela. Inkubacija sa neaktivirajućim LFLEDA varijantama IgG1-huCD3 antitela nije indukovala proliferaciju humanih T-ćelija (Slike 4A i 9A) ili T-ćelija cinomolgus majmuna (Slike 4B i 9B). Stoga, iako neaktivirajuće varijante IgG1-huCD3 antitela indukuju niske nivoe ekspresije CD69 u humanim T-ćelijama (kao što je prikazano u Primeru 3), proliferacija humanih T-ćelija nije indukovana ovim neaktivirajućim IgG1-huCD3 varijantama.
[0355] Slike 9C i 9D pokazuju da neaktivirajuće varijante bispecifičnih antitela bsIgG1-huCD3-H3L1 x HER2-LFLEDA, bsIgG1-huCD3-H3L3 x HER2-LFLEDA, bsIgG1-huCD3-H1L1 x HER2-LFLEDA, bsIgG1-huCD3-H1L3 x HER2- LFLEDA, bsIgG1-huCD3-H4L1 x HER2-LFLEDA i bsIgG1-huCD3-H4L3 x HER2-LFLEDA ne indukuju proliferaciju T-ćelija izolovanih iz lјudi (Slika 9C) ili cinomolgus majmuna (Slika 9D).
Primer 5 - In vitro citotoksičnost posredovana T-ćelijama, indukovana humanizovanim varijantama anti-CD3 antitela
[0356] Citotoksičnost T-ćelija specifična za tumor može biti posredovana bispecifičnim antitelima koja se vezuju jednim krakom za CD3, a drugim krakom za ciljni molekul specifičan za tumor, kao što je HER2. Istovremeno vezivanje bispecifičnih antitela i za T-ćelije i za tumorske ćelije, dovešće do aktivacije T-ćelija i citotoksičnosti specifične za tumorske ćelije. U ovom Primeru, citotoksičnost tumorskih ćelija pozitivnih na HER2 koja je posredovana T-ćelijama, ispitivana je upotrebom bispecifičnih anti-CD3 antitela (humanizovanih varijanti) i HER2.
[0357] Stoga, AU565 ćelije (humanog karcinoma dojke) su gajene u RPMI 1640 u koji je bilo dodato 10% (vol/vol) toplotom inaktiviranog CCS, 1,5 g/L natrijum bikarbonata (Lonza), 1 mM natrijumpiruvata, 4,5 g/L glukoze (Sigma), 50 IU/mL penicilina i 50 µg/mL streptomicina. Ćelijska linija je održavana na 37°C u vlažnom inkubatoru sa 5% (vol/vol) CO2. AU565 ćelije su kultivisane skoro do konfluentnosti, nakon čega su ćelije tripsinizovane, resuspendovane u medijumu za kulturu i propuštene kroz ćelijska sita da bi se dobila suspenzija pojedinačnih ćelija. U svaki bunarić ploče sa 96 mesta je zatim zasejano po 5x10<4>ćelija, nakon čega su ćelije inkubirane na 37°C, sa 5% CO2, tokom najmanje 3 sata, da bi im se omogućila adhezija za podlogu ploče.
[0358] Humane ili PBMC cinomolgus majmuna su izolovane iz pune krvi ili interfaze pri izolaciji plazme. Izolovane PBMC su isprane sa PBS-om, resuspendovane u medijumu za kulturu, pa su dodate tumorskim ćelijama AU565 u mikrotitar pločama sa 96 bunarića u odnosu 1:1. Procenat T-ćelija koji je bio prisutan u PBMC je izmeren FACS analizom, upotrebom mišjeg anti-humanog CD3-PerCP antitela (BD, kat.br.345766)(radi bojenja T-ćelija), koje se umražavaju sa CD3 cinomolgus majmuna. Sadržaj T-ćelija u populaciji upotrebljenih PBMC je obično iznosio od 50 do 60%.
[0359] Serije razblaženja (finalne koncentracije opsega od 0,001 do 10,000 ng/mL) varijatni bispecifičnih antitela bsIgG1 CD3 x HER2-LFLEDA, bsIgG1 CD3 x b12-LFLEDA, bsIgG1 huCD3-H3L1 x HER2-LFLEDA, bsIgG1-huCD3- H3L3 x HER2-LFLEDA, bsIgG1-huCD3-H1L1 x HER2-LFLEDA, bsIgG1-huCD3-H1L3 x HER2-LFLEDA, bsIgG1- huCD3-H4L1 x HER2-LFLEDA i bsIgG1-huCD3-H4L3 x HER2-LFLEDA su pripremljene u medijumu za kulturu i potom dodate u mikrotitar ploče. IgG1-HER2-LFLEDA i IgG1-b12 su bili uklјučeni kao kontrole. Pored neaktivirajućih mutacija, varijante LFLEDA antitela su sadržavale mutacije F405L ili K409R za pripremu u bispecifičnom formatu (pogledati Primer 1). Ploče su inkubirane tokom 3 dana na 37°C, 5% CO2. Inkubacija ćelija sa 1 µM staurosporinim (kat.br. S6942-200, Sigma) je korišćena kao referentna vredonst za ubijanje tumorskih ćelija od 100%. Ploče su isprane dva puta sa PBS-om, pa je u svaki bunarić dodato 150 µL medijuma za kulturu koji je sadržavao 10% Alamar plave boje. Ploče su inkubirane 4 sata na 37°C, 5% CO2. Izmerena je potom apsorbanca na 590 nm (Envision, Perkin Elmer, Waltham, MA).
[0360] Varijante bispecifičnog CD3xHER2-LFLEDA antitela (bsIgG1-huCLB-T3/4xHER2-LFLEDA i bsIgG1-CD3xHER2-LFLEDA) su indukovale ubijanje AU565 ćelija u niskim koncentracijama, upotrebom humanih efektorskih ćelija (Slika 5A) ili efektorskih ćelija cinomolgus majmuna (Slika 5B). Kontrolno bispecifično anti-anti-CD3 antitelo huCLB-T3/4xHER2-LFLEDA, koga ne karakteriše unakrsna aktivnost sa CD3 cinomolgus majmuna, indukovalo je samo ubijanje AU565 ćelija kada su upotrebljene humane PBMC (Slika 5A). Prema tome, nije utvrđeno ubijanje cilјnih ćelija kada su u testu uporebljene efektorske ćelije cinomolgus majmuna (Slika 5B). Inkubacija sa monospecifičnim IGG1-b12 ili IgG1-HER2-LFLEDA ili bsIgG1-CD3xb12-LFLEDA antitelima nije indukovala nespecifično ubijanje cilјnih ćelija.
[0361] Varijante bispecifičnih antitela bsIgG1 huCD3-H3L1 x HER2-LFLEDA, bsIgG1-huCD3-H3L3 x HER2-LFLEDA, bsIgG1-huCD3-H1L1 x HER2-LFLEDA, bsIgG1-huCD3-H1L3 x HER2-LFLEDA, bsIgG1-huCD3-H4L1 x HER2-LFLEDA i bsIgG1-huCD3-H4L3 x HER2-LFLEDA su indukovale ubijanje AU565 ćelija u niskim koncentracijama upotrebom humanih efektorskih ćelija (Slika 10A) ili efektorskih ćelija cinomolgus majmuna (Slika 10B). Inkubacija sa monospecifičnim antitelima IgG1-b12 ili IgG1-HER2-LFLEDA nije indukovala nespecifično ubijanje cilјanih ćelija (Slika 10A i B). Prema tome, humanizovane CD3 varijante koje su sadržavale neaktivirajuću Fc region ne indukuju nespecifično ubijanje cilјnih ćelija, što ukazuje da se varijante koje sadrže neaktivirajući Fc region mogu koristiti za obezbeđivanje cilјane aktivacije T-ćelija i na taj način za izbegavanje aktivacija T-ćelije koja nije ciljana.
Primer 6 - Aktivacija T-ćelija rezus majmuna humanizovanim varijantama anti-CD3 antitela
[0362] Ekspresija CD69 na T-ćelijama rezus majmuna je određivana da bi se utvrdila rana aktivacija T-ćelija nakon inkubacije sa humanizovanim varijantama anti-CD3 (huCD3) antitela sa IgG1 Fc regionom divlјeg tipa. Izolacija PBMC rezus majmuna i procena ekspresije CD69 protočnom citometrijom, izvođena je kao što je opisano u Primeru 3.
[0363] Slika 11 pokazuje da varijante humanizovanog anti-CD3 antitela IgG1-huCD3-H1L1, IgG1-huCD3-H1L2, IgG1-huCD3-H1L3, IgG1-huCD3-H3L3 i IgG1-huCD3-H4L1 indukuju ekspresiju CD69 na T-ćelijama poreklom iz rezus majmuna do nivoa sličnih kao za IgG1-CD3 (kao što je opisano u Primeru 1). Negativno kontrolno antitelo IgG1-b12 nije indukovalo ekspresiju CD69 u T-ćelijama rezus majmuna. Stoga, varijante huCD3 prema predmetnom pronalasku mogu biti upotrebljene u eksperimentima koji uklјučuju CD3 rezus majmuna. Varijante huCD3 unakrsno reaguju sa CD3 rezus majmuna.
Primer 7 - Aktivacija T-ćelija neaktivirajućim varijantama huCLB-T3 /4
[0364] Ekspresija CD69 na T-ćelijama je procenjena FACS analizom da bi se utvrdila rana aktivacija T-ćelija nakon inkubacije sa IgG1-huCLB-T3/4 varijantima koje sadrže mutacije u Fc regionu (pogledati Primer 1).
[0365] PBMC su izolovane iz pune krvi ili interfaze pri izolaciji plazme, razdvajanjem na gradijentu gustine upotrebom Leucosep epruveta (kat.br.227290; Greiner Bio-one, Alphen a/d Rijn, Holandija), nakon čega su isprane PBS-om i resuspendovane u medijumu za kulturu.
[0366] Serije doznih odgovora za IgG1-huCLB-T3/4 varijante, negativnu kontrolu (IgG1-huCLB-T3/4-Fab) i pozitivnu kontrolu (IgE-huCLB-T3/4), su pripremlјene u medijumu za kulturu (u rasponu od 1 do 1000 ng/mL, u vidu trostrukih razblaženja), nakon čega su dodate u bunariće okruglog dna ploče sa 96 mesta koji su sadržavali PBMC. Nakon inkubacije od 16 do 24 sata, ćelije su istaložene centrifugiranjem, a supernatant (koji je sadržavao citokine) je prikuplјen i čuvan na - 20°C. Ćelije su zatim isprane sa PBS/0,1% BSA/0,02% azidom i bojene tokom 30 minuta na 4°C sa mišjim antihumanim CD28-PE (854.222.010; Sanquin, Amsterdam, Holandija; marker T-ćelija) i mišjim antihumanin CD-APC antitelom (340560; BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ). Nevezana antitela su uklonjena ispiranjem, dva puta sa PBS/0,1% BSA/0,02% azidom. Ćelije su resuspendovane u 150 µL/bunariću, pa je ekspresija CD69 na ćelijama pozitivnim za CD28 izmerena na uređaju FACS Canto II (BD Biosciences).
[0367] Slika 12A pokazuje da je ekspresija CD69 bila visoka na ćelijama koje su bile inkubirane sa IgE-huCLB-T3/4, IgG1-huCLB-T3/4, IgG1-huCLB-T3/4-DA i IgG1-huCLB-T3/4-DAPS. Inkubacija sa IgG1-huCLB-T3/4-N297Q je indukovala nešto niže nivoe ekspresije CD69 u poređenju sa IgG1-huCLB-T3/4 divljeg tipa, dok je inkubacija sa IgG1-huCLB-T3/4-LFLE i IgG1-huCLB-T3/4-LFLEPS u manjoj meri indukovala CD69. Inkubacija PBMC sa IgG1-CD3 Fab, IgG1-huCLB-T3/4-LFLEDA, IgG1-huCLB-T3/4LFLENQ, IgG1-huCLB-T3/4-DANQ i IgG1-huCLB-T3/4-LFLEDANQPS antitelima nije indukovala bilo kakvu ekspresiju CD69 na T-ćelijama.
[0368] Slika 12B pokazuje da je ekspresija CD69 bila visoka na ćelijama koje su inkubirane sa IgE-huCLB-T3/4 i IgG1-huCLB-T3/4. Inkubacija sa IgG1-huCLB-T3/4-LALA je indukovala nešto niže nivoe ekspresije CD69 u poređenju sa IgG1-huCLB-T3/4 divljeg tipa, dok inkubacija sa IgG1-huCLB-T3/4-LFLEDA i IgG1-b12 (negativnom kontrolom) nije indukovala bilo kakvu ekspresiju CD69 na T-ćelijama.
Primer 8 - Proliferacija T-ćelija neaktivirajućim varijantama huCLB-T3/4
[0369] Uticaj huCLB-T3/4 varijanti (opisanih u Primeru 1) na proliferaciju T-ćelija je procenjen upotrebom ELISA kompleta za ćelijsku proliferaciju kompanije Roche Astrlied Science (Cell Proliferation ELISA, BrdU komplet, kat.br. 11647229001; Roche Astrlied Science, Mannheim, Nemačka), što je izvedeno prema uputstvima proizvođača.
[0370] PBMC, izolovane iz pune krvi ili interfaze pri pripremi plazme, inkubirane su u pločama za kulturu sa 96 bunarića sa serijama razblaženja (opsega od 0,1 do 1000 ng/mL) IgG1-CD3 varijanti. IgE-CD3 i IgG1-CD3 su uklјučeni kao pozitivne kontrole, a IgG1-b12 (sa mutacijom K409R za stvaranje bispecifičnih antitela) kao negativna kontrola. Nakon 3 dana inkubacije sa antitelima, u medijum je dodat BrdU (Roche Astrlied Science, Mannheim, Nemačka) i ploče su inkubirane tokom 5 sati. Ćelije su zatim istaložene centrifugiranjem, nakon čega je supernatant prikupljen i čuvan na -20°C. Ploče se osušene i čuvane na 4°C sve do izvođenja ELISA postupka.
[0371] Ugradnja BrdU u DNK je određivana ELISA postupkom, prema uputstvima proizvođača (Cell Proliferation ELISA, BrdU komplet, kat.br.11647229001; Roche Astrlied Science). Ćelije su fiksirane za ploče, nakon čega su ploče inkubirane tokom 90 minuta na sobnoj temperaturi (ST) sa anti-BrdU antitelom konjugovanim sa peroksidazom. Ploče su dalje isprane PBST-om i vezivanje je detektovano upotrebom ABTS pufera (umesto TMB rastvora koji je isporučen u kompletu). Razvoj boje je zaustavlјen nakon 30 minuta, dodavanjem 2% oksalne kiseline u bunariće. OD405 nm je izmeren na ELISA čitaču EL808.
[0372] Slika 13A pokazuje da inkubacija PBMC sa IgG1-huCLB-T3/4, IgG1-huCLB-T3/4-DA i IgG1-huCLB-T3/4-DAPS indukuje snažnu proliferaciju T-ćelija, čak i pri veoma niskim koncentracijama antitela. Inkubacija sa IgG1-huCLB-T3/4-N297Q je indukovala proliferaciju koja je bila zavisna od doze i uporediva sa pozitivnom kontrolom IgE-huCLB-T3/4. Inkubacija PBMC sa IgG1-huCLB-T3/4-Fab, IgG1-b12-N297Q, IgG1-huCLB-T3/4-LFLE, IgG1-huCLB-T3/4- LFLEDA, IgG1-huCLB-T3/4-LFLENQ, IgG1-huCLB-T3/4-LFLEPS, IgG1-huCLB-T3/4-DANQ i IgG1-huCLB-T3/4- LFLEDANQPS antitelima nije indukovala proliferaciju T-ćelija.
[0373] Slika 13B pokazuje da inkubacija PBMC sa IgG1-huCLB-T3/4 indukuje snažnu proliferaciju T-ćelija, čak i pri veoma niskim koncentracijama antitela. Inkubacija sa IgE-huCLB-T3/4 (pozitivnom kontrolom) i IgG1-huCLB-T3/4-LALA je indukovala proliferaciju koja je bila zavisna od doze. Inkubacija PBMC sa IgG1-huCLB-T3/4-LFLEDA nije indukovala proliferaciju T-ćelija.
[0374] Na osnovu rezultata iz Primera 7 i 8, podgrupa mutanata za koje se smatralo da se najmanje aktiviraju, podvrgnuta je dalјoj analizi.
Primer 9 - In vitro citotoksičnost posredovana T-ćelijama indukovana neaktivirajućim varijantama huCLB-T3/4 antitela
[0375] AU565 ćelije (humanog karcinoma dojke) su gajene u RPMI 1640 u koji je bilo dodato 10% (vol/vol) toplotom inaktiviranog CCS, 1,5 g/L natrijum bikarbonata (Lonza), 1 mM natrijum-piruvata, 4,5 g/L glukoze (Sigma), 50 IU/mL penicilina i 50 µg/mL streptomicina. Ćelijska linija je održavana na 37°C u vlažnom inkubatoru sa 5% (vol/vol) CO2. AU565 ćelije su kultivisane skoro do konfluentnosti, nakon čega su ćelije tripsinizovane, resuspendovane u medijumu za kulturu i propuštene kroz ćelijska sita da bi se dobila suspenzija pojedinačnih ćelija. U svaki bunarić ploče sa 96 mesta je zatim zasejano po 5x10<4>ćelija, nakon čega su ćelije inkubirane na 37°C, sa 5% CO2, tokom najmanje 3 sata, da bi im se omogućila adhezija za podlogu ploče.
[0376] Mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC) su izolovane iz krvi zdravih dobrovolјaca upotrebom Leucosep epruveta od 30 ml, prema protokolu proizvođača (Greiner Bio-one). Izolovane PBMC su isprane sa PBS-om, resuspendovane u medijumu za kulturu, pa dodate u tumorske ćelije AU565 u pločama sa 96 bunarića u odnosu 1:1. Procenat T-ćelija prisutnih u PBMC je izmeren FACS analizom, upotrebom mišjeg anti-humanog CD3-PerCP (BD, kat.br. 345766) antitela (za bojenje T-ćelija). Sadržaj T-ćelija u populaciji upotrebljenih PBMC je obično iznosio od 50 do 60%.
[0377] Serije razblaženja (finalne koncentracije u rasponu od 0,004 do 1000 ng/mL) IgG1-b12, IgG1-huCLB-T3/4, IgG1-HER2 i bispecifičnih huCLB-T3/4xb12 i huCLB-T3/4xHER2 antitela eksprimiranih u vidu različitih Fc varijatni, divljeg tipa, N297Q, LFLE, LALA, LFLENQ, LFLEDA, DANQ i LFLEDENQPS, pripremlјene su u medijumu za kulturu i dodavane u ploče. Ploče su inkubirane tokom 3 dana na 37°C i sa 5% CO2. Inkubacija ćelija sa 1 µM staurosporinom (br. S6942-200, Sigma) je upotrevljavana kao referentna vrednost za ubijanje tumorskih ćelija od 100%. Nakon inkubacije, supernatanti su uklonjeni i čuvani na -20°C. Ploče su isprane dva puta sa PBS-om, pa je u svaki bunarić dodato po 150 µL medijuma za kulturu koji je sadržavao 10% Alamar plave boje. Ploče su dalje inkubirane 4 sata na 37°C i sa 5% CO2. Izmereno je apsorpcija na 590 nm (Envision, Perkin Elmer, Waltham, MA).
[0378] Urađena su dva eksperimenta, upotrebom PBMC iz različitih donora. U prvom eksperimentu su ispitane Fc-varijante N297Q, LFLE, LFLENQ, LFLEDA, DANQ i LFLEDANQPS (Slika 14A-G). U drugom eksperimentu su ispitane Fc-varijante LFLEDA i LALA (Slika 15A-C). Antitela sa Fc domenom divljeg tipa su uključene u oba eksperimenta u vidu referentnih kontrola. Inkubacija sa monospecifičnim IgG1-huCLB-T3/4 ili bispecifičnim huCLB-T3/4xb12 antitelima divlјeg tipa indukovala je nespecifično ubijanje cilјnih ćelija (Slike 14A-G i 15A-C). Monospecifične IgG1-huCLB-T3/4 i bsIgG1-huCLB-T3/4xb12 varijante N297Q (Slika 14A-G) i LALA (Slika 15A-C) još uvek su indukovale nešto od nespecifičnog ubijanja cilјnih ćelija, mada u manjoj meri od antitela divlјeg tipa koje je bilo ispitano u isom eksperimentu. Nespecifično ubijanje cilјnih ćelija nije biloo indukovano nijednim drugim ispitivanim IgG1-huCLB-T3/4 ili bsIgG1-huCLB-T3/4xb12 antitelima sa neaktivirajućim mutacijama (Slike 14A-G i 15A-C).
[0379] Sva bispecifična huCLB-T3/4xHER2 antitela su idnukovala ubijanje AU565 ćelija koje je bilo zavisno od doze, sa najmanje uporedivom efikasnošću u poređenju sa bispecifičnim huCLB-T3/4xHER2 antitelom divljeg tipa, a koje je bez neaktivirajućih mutacija (Slike 14A-G i 15A-C). Maksimalno ubijanje se dogodilo u prisustvu veoma niskih koncentracija.
[0380] Varijantama divljeg tipa ili neaktivirajućim varijantama monospecifičnih antitela b12 ili HER2 nije bila indukovana ni citotoksičnost (Slike 14A-G i 15A-C), što je bilo i očekivano.
Primer 10 - Procena vezivanja C1q na neaktivirajućih varijante antitela huCLB-T3 /4
[0381] Interakcija C1q sa antitelom vezanim za cilјanu ćeliju je prvi korak u klasičnom putu aktivacije komplemenata. Pošto IgG1 divlјeg tipa sadrži meto interakcije za C1q, interakcija C1q sa ovim neaktivirajućim IgG1 varijantama je utrđivana ELISA postupkom.
[0382] Serijama razblaženja (opsega 7-30,000 ng/mL, u vidu razblaženja od 4 puta) za IgG1-huCLB-T3/4, bsIgG1-huCLB-T3/4xHER2 i IgG1-CD20 (pozitivnu kontrolu), kao i neaktivirajućih varijanti antitela koje su prethodno opisane u Primeru 1, obložena je Microlon ELISA ploča sa 96 bunarića (Greiner, Nemačka), tokom noći, na 4°C. Ploče su zatim isprane i blokirane sa PBS-om u koji je bilo dodato 0,025% Tween 20 i 0,1% želatina. Sa ispiranjima između inkubacija, ploče su se kontinuirano bile inkubirane sa 3% objedinjenog humanog seruma (Sanquin, kat.br. M0008), tokom 1 h na 37°C, uz upotrebu 100 µL/bunariću zečjeg anti-humanog C1q (DAKO, kat.br. A0136, 1/4.000) tokom 1 h na ST, kao i sa 100 µL/bunariću anti-zečjeg IgG-HRP iz svinje (DAKO, P0399, 1:10 000) kao antitela za detekciju, tokom 1 sata na ST. Detekcija je izvođena dodavanjem 1 mg/mL 2,2'-azino-bis (3-etilbenzotiazolin-6-sulfonske kiseline) (ABTS; Roche, Mannheim, Nemačka) tokom oko 30 min. Reakcija je zaustavlјana dodavanjem 100 µL 2% oksalne kiseline. Apsorbancija je merena na 405 nm u čitaču mikroploča (Biotek, Winooski, VT). Logaritamski transformisani podaci su analizirani na osnovu sigmoidnih kriva doznog odgovora sa varijabilnim nagibom upotrebom GraphPad Prism kompjuterskog programa.
[0383] Slika 16A pokazuje da antitela sa IgG1 Fc regionima divljeg tipa, IgG1-CD20 i IgG1-huCLB-T3/4, karakteriše vezivanje C1q. Vezivanje C1q nije detektovano za sve ispitivane varijante antitela sa neaktivirajućim mutacijama (N297Q, LFLE, LFLENQ, LFLEDA, DA, DAPS, DANQ, LFLEPS, LFLEDANQPS, LALA).
[0384] Slika 16B pokazuje da antitelo sa IgG1 Fc regionom divljeg tipa, bsIgG1-huCLB-T3/4xHER2 karakteriše vezivanje C1q. Vezivanje C1q nije detektovano za sve ispitivane varijante antitela sa neaktivirajućim mutacijama (N297Q, LFLE, LFLENQ, LFLEDA, DA, DAPS, DANQ, LFLEPS, LFLEDANQPS, LALA).
[0385] Slika 16C i Slika 16D pokazuju da antitela sa IgG1 Fc regionima divljeg tipa, IgG1-CD20, IgG1-huCLB-T3/4 i bsIgG1-huCLB-T3/4xHER2 karakteriše vezivanje C1q. Vezivanje C1q nije detektovano za sve ispitivane varijante antitela sa neaktivirajućim mutacijama (LFLEDA i LALA).
Primer 11 - Farmakokinetička (PK) analiza neaktivirajućih varijanti antitela
[0386] Miševi ove studije su gajeni u ograđenoj jedinici Centralne laboratorije odgajališta za životinje (Utrecht, Holandija) i držani su u kavezima sa filterom i vodom i hranom obezbeđenima ad libitum. Sve eksperimente je odobrila etička komisija za životinje sa Univerziteta Utrecht. C.B-17 SCID miševima (C.B-17/Icr-Prkdc<Scid>/IcrIcoCrl, Charles-River), starim 7-10 nedelјa, intravenski je injecirano po 100 µg antitela divlјeg tipa (IgG1-huCLB-T3/4, IgG1-HER2 ili bsIgG-huCLB-T3/4xHER2) ili njihovih neaktivirajućih varijanti (LALA, LFLEDA, LFLENQ, DANQ ili LFLEDANQPS), upotrebom 3 miša po grupi. Uzorci krvi od 50 µL su prikuplјeni iz safasne vene i to 10 minuta, 4 sata, 1 dan, 2 dana, 7 dana, 14 dana i 21 dan nakon primene antitela. Krv je prikuplјana u bočice koje su sadržavale heparin i centrifugirana je 5 minuta na 10,000 x g. Plazma je čuvana na -20°C do određivanja koncentracije antitela.
[0387] Koncentracije humanog IgG su određivane upotrebnom “sendvič” ELISA postupka za ukupan hIgG. Za ovu analizu je upotrebljeno mišje anti-humano IgG-kapa mAt klona MH16 (kat.br. M1268, CLB Sanquin, Holandija) kao antitelo za “hvatanje”, kojim je bila obložena Microlon ELISA ploča sa 96 bunarića (Greiner, Nemačka) u koncentraciji od 2 µg/mL. Nakon blokiranja ploča sa PBS-om u koji je bilo dodato 0,2% goveđeg serumskog albumina, dodavani su uzorci, serijski razblaženi sa ELISA puferom (PBS sa 0,05% Tween 20 i 0,2% goveđeg serumskog albumina), nakon čega je ploča inkubirana na šejkeru tokom 1 h na sobnoj temperaturi (ST). Ploče su zatim inkubirane sa kozjim anti-humanim IgG imunoglobulinom (kat.br. 109-035-098, Jackson, West Grace, PA) i razvijene sa 2,2'-azino-bis (3-etilbenztiazolin-6-sulfonskom kiselinom) (ABTS; Roche, Mannheim, Nemačka). Reakcija je zaustavlјena nakon 30 min, dodavanjem u bunariće 2% oksalne kiseline. Apsorbancija je izmerena u čitaču za mikrotitar ploče (Biotek, Winooski, VT) na 405 nm.
[0388] Stope klirensa plazme (ml/dan/kg) su izračunate na osnovu površine ispod krive (AUC), prema sledećoj jednačini:
Doza (µg/kg)
Klirens iz plazme
AUC (µg/ml/dan)
[0389] Analiza podataka je urađena upotrebom Graphpad prism kompjuterskog programa.
[0390] Slika 17A pokazuje da su koncentracije humanog IgG u plazmi bile niže za varijante antitela N297Q, DANQ, LFLENQ i LFLEDANQPS u poređenju sa antitelom divlјeg tipa, što sugeriše brži klirens. Koncentracije humanog IgG u plazmi za varijante antitela LFLEDA i LALA su bile slične koncentracijama antitela divlјeg tipa.
[0391] Slika 17B pokazuje da su stope klirensa iz plazme kod varijanti antitela N297Q, DANQ i LFLENQ bile 2 do 3 puta veće od onih za antitela divlјeg tipa. Stopa klirensa varijante antitela LFLEDANQPS je bila 3-5 puta veća od one za antitelo divlјeg tipa. Stope klirensa iz plazme za varijante antitela LFLEDA i LALA su bile slične onima za antitelo divlјeg tipa.
Primer 12 – Ispitivanje in vitro imunogenosti IgG1-LFLEDA okosnice
[0392] Da bi se utvrdio potencijal za kliničku imunogenost IgG1-LFLEDA-K409R okosnice, na IgG1-HER2-LFLEDA je primenjena EpiScreen™ platforma kompanije Antitope. Ukratko, PBMC su izolovani iz kohorte od 50 HLA-tipizovanih zdravih davalaca koji predstavlјaju populaciju Evrope i Severne Amerike. Nakon uklanjanja CD8+ T-ćelija, PBMC preparati su pojedinačno zamrznuti i čuvani. Odmrznute PBMC su potok gajene u kulturi i inkubirane sa IgG1-HER2-LFLEDA-K409R ili jednim od kontrolnih uzoraka (IgG1-HER2 ili IgG1-HER2-LFLE-K409R) tokom 5 do 8 dana. Sposobnost uzoraka da indukuju odgovor CD4+ T-ćelija je ispitana merenjem ćelijske proliferacije (ugradnjom [3<H>]-timidina) i proizvodnje IL-2 (test ELISpot). Donatori koje su karakterisali odgovori sa indeksom stimulacije (SI; signal/početni signal) ≥1,9 u oba ispitivanja, smatrani su pozitivnima.
[0393] EpiScreen™ analiza je pokazala da su za IgG1-HER2-LFLEDA 4 donora (8%) bila sa pozitivnim odgovorom CD4+ T-ćelija, što je bilo uporedivo sa 4 (8%) i 3 (6%) pozitivnih odgovora na IgG1-HER2 i IgG1- HER2-LFLE, tim redom (Slika 18). Stoga, IgG1-HER2-LFLEDA-K409R (kao i IgG1-HER2 i IgG1-HER2LFLE-K409R) su ispoljili nizak potencijal imunogenosti sa učestalošću odgovora ispod 10%. Pozitivna kontrola humanizovanog A33 (npr. [84]) je korišćena kao kliničko referentno kontrolno antitelo koga karakterišu visoki nivoi imunogenosti u klinici i koje rutinski indukuje 20-30% T-ćelijskih odgovora u EpiScreen analizi.
Spisak referenci
[0394]
[1] Xu i saradnici, 2000, Cell Immunol.200(1):16-26
[2] Herold i saradnici, 2005, Diabetes, 54(6):1763-9
[3] Staerz i saradnici, 1985, Nature 314:628-631
[4] Muller i Kontermann, 2010, BioDrugs 24: 89-98
[5] Lum i Thakur, 2011, BioDrugs 25: 365-379
[6] Linke i saradnici, 2010, MAbs 2: 129-136
[7] Ruf i saradnici, 2010, Br J Clin Pharmacol 69: 617-625
[8] Bokemeyer i saradnici, 2009, J Clin Oncol (Meeting Abstracts), 3036
[9] Heiss i saradnici, 2010, Int J Cancer 127: 2209-2221
[10] Jones i saradnici, 2009, Lancet Oncol 10:1179-1187
[11] Kiewe i saradnici, 2006, Clin Cancer Res 12:3085-3091
[12] WO 2012/162067
[13] WO 2008/119567
[14] Fundamental Immunology pogl.7, Paul W., ur., 2. izd. Raven Press, N.Y. (1989)
[15] Lefranc MP i saradnici, 2003, Dev Comp Immunol. Jan;27(1):55-77
[16] Brochet X. i saradnici, 2008, Nucl.Acids Res.36, W503-508
[17] Giudicelli V., Brochet X, Lefranc M.-P., 2011, Cold Spring Harb Protoc. Jun 1;2011(6)
[18] Sambrook i saradnici, 1989, Molecular Cloning: A laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, pogl.15
[19] WO92/22653
[20] EP 0629240
[21] E. Meyers i W. Miller, 1988, Comput. Astrl. Biosci 4, 11-17
[22] Needleman i Wunsch, 1970, J. Mol. Biol.48, 444-453
[23] Clustal W algorithm, Thompson, 1994
[24] T cell Epitope Database, npr. http://www.iedb.org/
[25] Perry i saradnici, 2008 Drugs R D 9 (6):385-396
[26] Bryson i saradnici, 2010, Biodrugs 24 (1):1-8
[27] Kabat E.A. i saradnici, 1991, Sequences of proteins of immunological interest.5. izdanje - US Department of Health and Human Services, NIH publication No.91-3242, str.662,680,689
[28] Oganesyan i saradnici, 2008, Acta Cryst. (D64):700-4
[29] Canfield i saradnici, 1991, J. Exp.Med. (173): 1483-91
[30] Duncan i saradnici, 1988, Nature (332):738-40
[31] Shields i saradnici, 2001, J. Biol. Chem. (276):6591-604
[32] Idusogie EE i saradnici, 2000, J Immunol.164: 4178-84
[33] Leabman i saradnici, 2013, MAbs; 5(6):896-903
[34] Parren i saradnici, 1992, J. Clin Invest.90: 1537-1546
[35] Bruhns i saradnici, 2009, Blood 113: 3716-3725
[36] WO 2011/066501
[37] Lightle S. i saradnici, 2010, Protein Science (19):753-62
[38] Brekke i saradnici, 2006, J Immunol 177:1129-1138
[39] Dall’Acqua WF i saradnici, 2006, J Immunol 177:1129-1138
[40] Wu i saradnici, 2010, Generation and Characterization of a Dual Variable Domain Immunoglobulin (DVD-Ig™) Molecule, u: Antibody Engineering, Springer Berlin Heidelberg [41] WO 2011/131746
[42] WO 2002/020039
[43] WO 98/050431
[44] WO 2011/117329
[45] EP 1870459
[46] WO 2009/089004
[47] US 201000155133
[48] WO 2010/129304
[49] WO 2007/110205
[50] WO 2010/015792
[51] WO 2011/143545
[52] WO 2012/058768
[53] WO 2011/028952
[54] WO 2008/003116
[55] US 7,262,028
[56] US 7,612,181
[57] WO 2010/0226923
[58] US 7,951,918
[59] CN 102250246
[60] WO 2012/025525
[61] WO 2012/025530
[62] WO 2008/157379
[63] WO 2010/080538
[64] Sykes i Johnston, 1997, Nat Biotech 17, 355-59
[65] US 6,077,835
[66] WO 2000/70087
[67] Schakowski i saradnici, 2001, Mol Ther 3, 793-800
[68] WO 2000/46147
[69] Benvenisty i Reshef, 1986, PNAS USA 83, 9551-55
[70] Wigler i saradnici, 1978, Cell 14, 725
[71] Coraro i Pearson, 1981, Somatic Cell Genetics 7, 603
[72] US 5,589,466
[73] US 5,973,972
[74] Van Heeke & Schuster, 1989, J Biol Chem 264, 5503-5509
[75] F. Ausubel i saradnici, 1987, izd. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley InterScience New York
[76] Grant i saradnici, 1987, Methods in Enzymol 153, 516-544
[77] Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19. izdanje, Gennaro, izd., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1995
[78] Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, izd., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978
[79] Srivastava (ur.), Radiolabeled Monoclonal Antibodies For Imaging And Therapy, Plenum Press 1988
[80] Chase, "Medical Astrlications of Radioisotopes," u Remington’s Pharmaceutical Sciences, 18. izdanje, Gennaro i saradnici, (ur.), str.624-652, Mack Publishing Co., 1990
[81] Brown, "Clinical Use of Monoclonal Antibodies," u Biotechnology And Pharmacy 227-49, Pezzuto i saradnici, (ur.), Chapman & Hall 1993
[82] US 5,057,313
[83] US 6,331,175
[84] Ritter G, i saradnici; 2001, Cancer Res., 61:6851-9
[85] WO 2007/042261

Claims (1)

  1. Patentni zahtevi
    1. Humanizovano antitelo koje se vezuje za humani CD3, pri čemu navedeno antitelo sadrži vezujući region koji sadrži varijabilni region teškog lanca (VH) iz SEQ ID NO: 6 i varijabilni region lakog lanca (VL) iz SEQ ID NO: 10.
    2. Antitelo prema patentnom zahtevu 1, pri čemu je antitelo antitelo pune dužine.
    3. Antitelo prema patentnom zahtevu 1 ili 2, gde Fc region sadrži teške lance izotipa izabranog iz grupe koja se sastoji od IgG1, IgG2, IgG3 i IgG4.
    4. Antitelo prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, pri čemu navedeno antitelo sadrži Fc region koji sadrži prvi i drugi imunoglobulinski teški lanac, pri čemu u navedenom prvom i drugom teškom lancu, aminokiseline na pozicijama koje odgovaraju pozicijama L234, L235 i D265 u teškom lancu humanog IgG1 su F, E i A, tim redom, a aminokiseline na pozicijama koje odgovaraju N297 i P331 u teškom lancu humanog IgG1 su N i P, tim redom, pri čemu su pozicije aminokiselina numerisane prema EU sistemu numeracije.
    5. Antitelo prema patentnom zahtevu 4, koje sadrži konstantne regione teškog lanca iz SEQ ID NO:
    16.
    6. Antitelo prema patentnom zahtevu 4, koje sadrži konstantne regione teškog lanca iz SEQ ID NO:
    25.
    7. Antitelo prema patentnom zahtevu 4, koje sadrži konstantne regione teškog lanca iz SEQ ID NO:
    26.
    8. Bispecifično antitelo koje sadrži prvi vezujući region antitela prema bilo kom od patentnih zahteva od 1 do 3 i drugi vezujući region koje vezuje različit ciljni molekul od navedenog prvog vezujućeg regiona.
    9. Bispecifično antitelo prema patentnom zahtevu 8, pri čemu navedeno antitelo sadrži prvi i drugi teški lanac.
    10. Bispecifično antitelo prema patentnom zahtevu 9, pri čemu navedeno bispecifično antitelo sadrži Fc region modifikovan prema bilo kom od patentnih zahteva od 4 do 7.
    11. Bispecifično antitelo prema bilo kom od patentnih zahteva od 8 do 10, pri čemu svaki od navedenih prvih i drugih teških lanaca sadrži najmanje zglobni region, CH2 i CH3 region, pri čemu je u navedenom prvom teškom lancu najmanje jedna od aminokiselina na pozicijama koje odgovaraju pozicijama izabranim iz grupe koja se sastoji od T366, L368, K370, D399, F405, Y407 i K409 u teškom lancu humanog IgG1 supstituisana, a u navedenom drugom teškom lancu najmanje jedna od amino kiselina na pozicijama koje odgovaraju poziciji izabranoj iz grupe koja se sastoji od T366, L368, K370, D399, F405, Y407 i K409 u teškom lancu humanog IgG1 je supstituisana, i pri čemu navedeni prvi i navedeni drugi teški lanci nisu supstituisani na istim pozicijama.
    12. Bispecifično antitelo prema patentnom zahtevu 11, pri čemu aminokiselina na poziciji koji odgovara F405 u teškom lancu humanog IgG1 je L u navedenom prvom teškom lancu, a aminokiselina na poziciji koji odgovara K409 u teškom lancu humanog IgG1 je R u navedenom drugom teškom lancu ili obrnuto.
    13. Bispecifično antitelo prema bilo kom od patentnih zahteva od 9 do 12, pri čemu je prvi vezujući region prema patentnom zahtevu 1, a navedeni drugi vezujući region vezuje različit ciljni molekul od od navedenog prvog vezujućeg regiona.
    14. Konstrukt nukleinske kiseline koji kodira varijabilni region teškog lanca (VH) iz SEQ ID NO: 6 i varijabilni region lakog lanca (VL) iz SEQ ID NO: 10.
    15. Ekspresioni vektor koji sadrži
    (i) sekvencu nukleinske kiseline koja kodira sekvencu teškog lanca humanizovanog antitela prema bilo kom od patentnih zahteva od 1 do 13; i
    (ii) sekvencu nukleinske kiseline koja kodira sekvencu lakog lanca humanizovanog antitela prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 13.
    16. Ćelija domaćin koja sadrži ekspresioni vektor prema patentnom zahtevu 15 ili ekspresioni vektor koji sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira sekvencu teškog lanca humanizovanog antitela prema bilo kom od patentnih zahteva od 1 do 13 i ekspresioni vektor koji sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira sekvencu lakog lanca humanizovanog antitela prema bilo kom od patentnih zahteva od 1 do 13.
    17. Ćelija domaćin prema patentnom zahtevu 16, pri čemu je navedena ćelija domaćin rekombinantna eukariotska, rekombinantna prokariotska ili rekombinantna mikrobna ćelija domaćin.
    18. Kompozicija koja sadrži antitelo prema bilo kom od patentnih zahteva od 1 do 7 ili bispecifično antitelo prema bilo kom od patentnih zahteva od 8 do 13.
    19. Farmaceutska kompozicija koja sadrži antitelo prema bilo kom od patentnih zahteva od 1 do 7 ili bispecifično antitelo prema bilo kom od patentnih zahteva od 8 do 13 i farmaceutski prihvatlјiv nosač.
    20. Antitelo prema bilo kom od patentnih zahteva od 1 do 7, navedeno bispecifično antitelo prema bilo kom od patentnih zahteva od 8 do 13, navedena kompozicija prema patentnom zahtevu 18 ili navedena farmaceutska kompozicija prema patentnom zahtevu 19, za upotrebu u vidu medikamenta.
    21. Antitelo prema bilo kom od patentnih zahteva od 1 do 7, navedeno bispecifično antitelo prema bilo kom od patentnih zahteva od 8 do 13, navedena kompozicija prema patentnom zahtevu 18 ili navedena farmaceutska kompozicija prema patentnom zahtevu 19, za upotrebu u lečenju bolesti.
    22. Antitelo, bispecifično antitelo, kompozicija ili farmaceutska kompozicija za upotrebu prema patentnom zahtevu 21, pri čemu je bolest kancer, infektivna bolest ili autoimuno oboljenje.
    23. Postupak za proizvodnju antitela prema bilo kom od patentnih zahteva od 1 do 7 ili bispecifičnog antitela prema bilo kom od patentnih zahteva od 8 do 13, pri čemu postupak obuhvata korake
    a) kultivisanje ćelije domaćina prema patentnom zahtevu 16 ili 17; i
    b) prečišćavanje navedenog antitela iz medijuma kulture.
    24. Postupak za detekciju prisustva CD3 antigena ili ćelije koja eksprimira CD3 u uzorku, koji obuhvata korake;
    a) kontakt uzorka sa antitelom prema bilo kom od patentnih zahteva od 1 do 7 ili bispecifičnim antitelom prema bilo kom od patentnih zahteva od 8 do 13, pod uslovima koji omogućavaju obrazovanje kompleksa između navedenog antitela ili bispecifičnog antitela i CD3; i
    b) analizu da li je kompleks obrazovan.
    25. Komplet za detekciju prisustva CD3 antigena ili ćelije koja eksprimira CD3 u uzorku, koji sadrži
    (i) antitelo prema bilo kom od patentnih zahteva od 1 do 7 ili bispecifično antitelo prema bilo kom od patentnih zahteva od 8 do 13; i
    (ii) uputstva za upotrebu navedenog kompleta.
RS20200307A 2013-07-05 2014-07-04 Humanizovana ili himerna anti-cd3 antitela RS60131B1 (sr)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PCT/EP2013/064330 WO2014006217A1 (en) 2012-07-06 2013-07-05 Dimeric protein with triple mutations
DKPA201400009 2014-01-09
PCT/EP2014/050340 WO2014108483A1 (en) 2013-01-10 2014-01-09 Inert format
EP14737200.7A EP3016681B1 (en) 2013-07-05 2014-07-04 Humanized or chimeric cd3 antibodies
PCT/EP2014/064326 WO2015001085A1 (en) 2013-07-05 2014-07-04 Humanized or chimeric cd3 antibodies

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS60131B1 true RS60131B1 (sr) 2020-05-29

Family

ID=52143134

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20200307A RS60131B1 (sr) 2013-07-05 2014-07-04 Humanizovana ili himerna anti-cd3 antitela
RS20250910A RS67220B1 (sr) 2014-01-09 2015-01-08 Humanizovana ili himerna cd3 antitela

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20250910A RS67220B1 (sr) 2014-01-09 2015-01-08 Humanizovana ili himerna cd3 antitela

Country Status (30)

Country Link
US (5) US10465006B2 (sr)
EP (4) EP3016681B1 (sr)
JP (7) JP6546162B2 (sr)
KR (4) KR102531517B1 (sr)
CN (5) CN105722529B (sr)
AU (4) AU2014286116A1 (sr)
BR (1) BR122023002590B1 (sr)
CA (1) CA2915575A1 (sr)
CY (1) CY1122840T1 (sr)
DK (2) DK3016681T5 (sr)
EA (1) EA201690167A1 (sr)
ES (2) ES2776706T3 (sr)
FI (2) FI4249515T3 (sr)
HK (1) HK1231369A1 (sr)
HR (2) HRP20200382T1 (sr)
HU (2) HUE048722T2 (sr)
IL (4) IL311371B2 (sr)
LT (2) LT3016681T (sr)
ME (1) ME03675B (sr)
MX (2) MX373245B (sr)
NZ (1) NZ715896A (sr)
PL (1) PL3016681T3 (sr)
PT (2) PT3016681T (sr)
RS (2) RS60131B1 (sr)
SG (2) SG11201510739TA (sr)
SI (2) SI3016681T1 (sr)
SM (2) SMT202000287T1 (sr)
UA (1) UA119646C2 (sr)
WO (2) WO2015001085A1 (sr)
ZA (1) ZA201800385B (sr)

Families Citing this family (99)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
LT2647707T (lt) 2010-11-30 2018-11-12 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Citotoksiškumą indukuojantis terapinis agentas
CN104736174B (zh) 2012-07-06 2019-06-14 根马布私人有限公司 具有三重突变的二聚体蛋白质
JOP20200236A1 (ar) 2012-09-21 2017-06-16 Regeneron Pharma الأجسام المضادة لمضاد cd3 وجزيئات ربط الأنتيجين ثنائية التحديد التي تربط cd3 وcd20 واستخداماتها
TWI635098B (zh) 2013-02-01 2018-09-11 再生元醫藥公司 含嵌合恆定區之抗體
ME03675B (me) 2013-07-05 2020-10-20 Genmab As Humanizovana ili himerna anтi-cd3 antiтela
CA2918795A1 (en) 2013-07-25 2015-01-29 Cytomx Therapeutics, Inc. Multispecific antibodies, multispecific activatable antibodies and methods of using the same
TWI701042B (zh) 2014-03-19 2020-08-11 美商再生元醫藥公司 用於腫瘤治療之方法及抗體組成物
MX380176B (es) * 2014-04-07 2025-03-12 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Molecula ligada a antigeno inmunoactivada.
US11505605B2 (en) 2014-05-13 2022-11-22 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha T cell-redirected antigen-binding molecule for cells having immunosuppression function
WO2016014974A2 (en) 2014-07-25 2016-01-28 Cytomx Therapeutics, Inc. Anti-cd3 antibodies, activatable anti-cd3 antibodies, multispecific anti-cd3 antibodies, multispecific activatable anti-cd3 antibodies, and methods of using the same
SI3221359T1 (sl) 2014-11-17 2020-08-31 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Metode zravljenja tumorja z uporabo bispecifičnega protitelesa CD3XCD20
CN107074955B (zh) 2014-11-20 2021-06-22 豪夫迈·罗氏有限公司 针对FolR1和CD3的T细胞活化性双特异性抗原结合分子
RS60615B1 (sr) 2014-11-20 2020-08-31 Hoffmann La Roche Zajednički laki lanci i postupci upotrebe
CN114478792A (zh) 2015-01-08 2022-05-13 根马布股份公司 针对cd3和cd20的双特异性抗体
EP3277725B1 (en) 2015-03-30 2020-11-25 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Heavy chain constant regions with reduced binding to fc gamma receptors
IL256562B2 (en) * 2015-07-15 2024-07-01 Genmab As Human CD3 antibodies or chimeras
WO2017077382A1 (en) 2015-11-06 2017-05-11 Orionis Biosciences Nv Bi-functional chimeric proteins and uses thereof
JP6931329B2 (ja) 2015-11-18 2021-09-01 中外製薬株式会社 免疫抑制機能を有する細胞に対するｔ細胞リダイレクト抗原結合分子を用いた併用療法
EP3378488A4 (en) 2015-11-18 2019-10-30 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha METHOD FOR IMPROVING THE HUMORAL IMMUNE REACTION
CN105296421B (zh) * 2015-11-24 2019-01-29 高岱清 一种双特异性抗体活化的t细胞及制备方法与应用
IL257696B2 (en) 2015-12-09 2024-11-01 Hoffmann La Roche Type ii anti-cd20 antibody for reducing formation of anti-drug antibodies
CN116769054A (zh) 2016-02-05 2023-09-19 奥里尼斯生物科学私人有限公司 双特异性信号传导剂及其用途
BR112018016281A2 (pt) * 2016-03-22 2019-01-02 F. Hoffmann-La Roche Ag molécula biespecífica ativadora de célula t ativável por protease, polipeptídeo idiotipo-específico, composição farmacêutica, usos da molécula biespecífica e método de tratamento de uma doença em um indivíduo
FI3433280T3 (fi) * 2016-03-22 2023-06-06 Hoffmann La Roche Proteaasin aktivoimia t-solubispesifisiä molekyylejä
AU2018276419A1 (en) 2016-06-02 2019-10-17 F. Hoffmann-La Roche Ag Type II anti-CD20 antibody and anti-CD20/CD3 bispecific antibody for treatment of cancer
EP3252078A1 (en) 2016-06-02 2017-12-06 F. Hoffmann-La Roche AG Type ii anti-cd20 antibody and anti-cd20/cd3 bispecific antibody for treatment of cancer
BR112018076260A2 (pt) 2016-06-20 2019-03-26 Kymab Limited anticorpo ou fragmento do mesmo que se liga especificamente a hpd-l1, anticorpo biespecífico ou proteína de fusão, uso de um anticorpo ou fragmento, método, composição farmacêutica, método de modulação, método de inibição, método de tratamento, ácido nucleico, vetor, hospedeiro e imunocitocina
UA128304C2 (uk) * 2016-07-14 2024-06-05 Ґенмаб А/С Мультиспецифічне антитіло до cd40 і cd137
EP3551047A1 (en) 2016-12-07 2019-10-16 Progenity, Inc. Gastrointestinal tract detection methods, devices and systems
WO2018144999A1 (en) 2017-02-06 2018-08-09 Orionis Biosciences, Inc. Targeted engineered interferon and uses thereof
CN116836285A (zh) * 2017-03-09 2023-10-03 健玛保 针对pd-l1的抗体
US20210138213A1 (en) 2017-03-30 2021-05-13 Progenity, Inc. Treatment of a disease of the gastrointestinal tract with an immune modulatory agent released using an ingestible device
CN110913895B (zh) * 2017-05-08 2024-04-02 阿迪马布有限责任公司 抗cd3结合结构域和包含它们的抗体以及它们的产生及使用方法
EP3409322A1 (en) 2017-06-01 2018-12-05 F. Hoffmann-La Roche AG Treatment method
US10882907B2 (en) 2017-06-21 2021-01-05 Gilead Sciences, Inc. Multispecific antibodies that target HIV GP120 and CD3
EP3668898B1 (en) 2017-08-14 2023-07-05 MorphoSys AG Humanized antibodies for cd3
US20190100587A1 (en) * 2017-10-02 2019-04-04 Covagen Ag IgG1 Fc MUTANTS WITH ABLATED EFFECTOR FUNCTIONS
IL321773A (en) 2017-10-14 2025-08-01 Cytomx Therapeutics Inc Activatable antibodies and methods for preparing them
KR101973060B1 (ko) * 2017-10-20 2019-04-26 주식회사 녹십자 항-cd3 항체 및 이를 포함하는 암 치료용 약학적 조성물
CN107860925B (zh) * 2017-11-03 2019-07-12 合肥瀚科迈博生物技术有限公司 用于检测血清中HuA21抗体的ELISA检测试剂盒
CN109971725B (zh) * 2017-12-28 2024-02-02 上海细胞治疗研究院 抗体修饰的嵌合抗原受体修饰t细胞及其用途
AU2019222666B2 (en) * 2018-02-15 2025-12-04 Macrogenics, Inc. Variant CD3-binding domains and their use in combination therapies for the treatment of disease
EP3765493A2 (en) * 2018-03-12 2021-01-20 Genmab A/S Antibodies
JP7377590B2 (ja) * 2018-03-14 2023-11-10 ノビミューン エスアー 抗ｃｄ３イプシロン抗体およびそれを使用する方法
DK3797121T3 (da) * 2018-05-23 2024-07-08 Pfizer Antistoffer, der er specifikke for CD3, og anvendelser deraf
RS66901B1 (sr) * 2018-05-24 2025-07-31 Janssen Biotech Inc Anti-cd3 antitela i njihova upotreba
WO2019246317A1 (en) 2018-06-20 2019-12-26 Progenity, Inc. Treatment of a disease or condition in a tissue originating from the endoderm
US20230041197A1 (en) 2018-06-20 2023-02-09 Progenity, Inc. Treatment of a disease of the gastrointestinal tract with an immunomodulator
RS66543B1 (sr) 2018-08-31 2025-03-31 Regeneron Pharma Strategija doziranja koja ublažava sindrom oslobađanja citokina za cd3/cd20 bispecifična antitela
WO2020076970A1 (en) 2018-10-11 2020-04-16 Inhibrx, Inc. B7h3 single domain antibodies and therapeutic compositions thereof
TW202506736A (zh) 2018-10-11 2025-02-16 美商因荷布瑞克斯生物科學公司 5t4單域抗體及其治療性組合物
US11208485B2 (en) 2018-10-11 2021-12-28 Inhibrx, Inc. PD-1 single domain antibodies and therapeutic compositions thereof
CA3115089A1 (en) 2018-10-11 2020-04-16 Inhibrx, Inc. Dll3 single domain antibodies and therapeutic compositions thereof
CN116726362A (zh) 2018-11-19 2023-09-12 比奥拉治疗股份有限公司 用生物治疗剂治疗疾病的方法和装置
JP7621948B2 (ja) * 2018-12-04 2025-01-27 ノバルティス アーゲー Ｃｄ３に対する結合分子及びその使用
BR112021023048A2 (pt) 2019-05-21 2022-04-19 Novartis Ag Moléculas de ligação a cd19 e usos das mesmas
WO2021048423A1 (en) 2019-09-12 2021-03-18 Genmab A/S Bispecific antibodies binding to 5t4 and cd3 for use in treatment of cancer
TWI841790B (zh) * 2019-09-30 2024-05-11 大陸商和鉑醫藥（上海）有限責任公司 靶向cd3的抗體、雙特異性抗體及其用途
CN115666704B (zh) 2019-12-13 2025-09-26 比特比德科有限责任公司 用于将治疗剂递送至胃肠道的可摄取装置
IL293994A (en) 2019-12-23 2022-08-01 Denali Therapeutics Inc Progranulin variants, compositions comprising same and uses thereof
US20230057263A1 (en) * 2020-01-06 2023-02-23 Cytomx Therapeutics, Inc. Single-and multi-chain polypeptides that bind specifically to cd3 epsilon
CN115380047A (zh) 2020-01-29 2022-11-22 印希比股份有限公司 Cd28单结构域抗体及其多价和多特异性构建体
US20230075244A1 (en) * 2020-02-20 2023-03-09 The Feinstein Institutes For Medical Research Agonist antibodies against endoglin and uses thereof
AU2021236906A1 (en) 2020-03-18 2022-08-18 Genmab A/S Antibodies binding to B7H4
CN113563473A (zh) * 2020-04-29 2021-10-29 三生国健药业（上海）股份有限公司 四价双特异性抗体、其制备方法和用途
US20230227570A1 (en) 2020-05-08 2023-07-20 Genmab A/S Bispecific antibodies against cd3 and cd20
KR20230017841A (ko) 2020-05-27 2023-02-06 얀센 바이오테크 인코포레이티드 Cd3 항원 결합 도메인을 포함하는 단백질 및 이의 용도
CA3187085A1 (en) 2020-08-25 2022-03-03 Manuel Baca Multi-specific antigen binding molecules targeting hiv and methods of use
EP4208200A2 (en) 2020-09-02 2023-07-12 Genmab A/S Antibody therapy
CA3190376A1 (en) 2020-09-10 2022-03-17 Brian Elliott Bispecific antibody against cd3 and cd20 in combination therapy for treating follicular lymphoma
JP2023541860A (ja) 2020-09-10 2023-10-04 ジェンマブ エー／エス びまん性大細胞型ｂ細胞リンパ腫を治療するための併用療法におけるｃｄ３及びｃｄ２０に対する二重特異性抗体
BR112023004319A2 (pt) 2020-09-10 2023-04-04 Genmab As Método para tratar linfoma difuso de grandes células b
CN116406293A (zh) 2020-09-10 2023-07-07 健玛保 用于治疗滤泡性淋巴瘤的联合疗法中的针对cd3和cd20的双特异性抗体
CA3190349A1 (en) 2020-09-10 2022-03-17 Brian Elliott Bispecific antibodies against cd3 and cd20 for treating chronic lymphocytic leukemia
BR112023004296A2 (pt) 2020-09-10 2023-04-04 Genmab As Método para tratar linfoma de célula b grande difusa em um indivíduo humano
CN116438198A (zh) 2020-10-02 2023-07-14 健玛保 能够结合ror2的抗体以及结合ror2和cd3的双特异性抗体
KR102671734B1 (ko) * 2021-04-13 2024-06-04 건국대학교 글로컬산학협력단 개과 동물의 CD3ε 특이적 항체 또는 그의 항원 결합 단편
TW202244059A (zh) 2021-04-30 2022-11-16 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司 用抗ｃｄ２０／抗ｃｄ３雙特異性抗體進行治療之給藥
MX2023012408A (es) 2021-04-30 2023-10-31 Hoffmann La Roche Dosis para tratamiento conjunto con anticuerpo biespecifico anti-cd20/anti-cd3 y conjugado anticuerpo farmaco anti-cd79b.
JP2024519212A (ja) 2021-05-07 2024-05-09 ジェンマブ エー／エス Ｂ７ｈ４およびｃｄ３に結合する二重特異性抗体を含む薬学的組成物
CN115558023A (zh) * 2021-07-02 2023-01-03 安源医药科技（上海）有限公司 抗cd3抗体及其用途
JP7503215B2 (ja) 2021-10-08 2024-06-19 ジェンマブ エー／エス Ｃｄ３０及びｃｄ３に結合する抗体
US20230303693A1 (en) 2022-01-28 2023-09-28 Genmab A/S Bispecific antibody against cd3 and cd20 in combination therapy for treating diffuse large b-cell lymphoma
KR20240135663A (ko) 2022-01-28 2024-09-11 젠맵 에이/에스 미만성 대 b-세포 림프종을 치료하기 위한 조합 요법에서의 cd3 및 cd20에 대한 이중특이적 항체
KR20240164782A (ko) 2022-03-23 2024-11-20 에프. 호프만-라 로슈 아게 항-cd20/항-cd3 이중특이적 항체와 화학요법의 병용 치료
KR20250004776A (ko) 2022-04-13 2025-01-08 에프. 호프만-라 로슈 아게 항-cd20/항-cd3 이중특이성 항체의 약학 조성물 및 사용 방법
WO2023198839A2 (en) 2022-04-13 2023-10-19 Genmab A/S Bispecific antibodies against cd3 and cd20
AU2023266445A1 (en) * 2022-05-09 2024-11-28 Hangzhou Viromab Biotech Co., Ltd. Therapeutic agent comprising multispecific antibody and use thereof in tumor therapy
WO2024088987A1 (en) 2022-10-26 2024-05-02 F. Hoffmann-La Roche Ag Combination therapy for the treatment of cancer
EP4612179A1 (en) 2022-11-02 2025-09-10 Genmab A/S Bispecific antibodies against cd3 and cd20 for treating richter's syndrome
WO2024102948A1 (en) 2022-11-11 2024-05-16 Celgene Corporation Fc receptor-homolog 5 (fcrh5) specific binding molecules and bispecific t-cell engaging antibodies including same and related methods
TW202506178A (zh) 2023-04-05 2025-02-16 丹麥商珍美寶股份有限公司 包含與ｃｄ３０和ｃｄ３結合之抗體之醫藥組成物
WO2024213754A1 (en) 2023-04-13 2024-10-17 Genmab A/S Methods of treating lymphoma with bispecific antibodies against cd3 and cd20
WO2025057225A1 (en) * 2023-09-14 2025-03-20 Invitrogen Bioservices India Private Limited Engineered antibodies and uses thereof
WO2025061993A1 (en) 2023-09-21 2025-03-27 Domain Therapeutics Anti-ccr8 monoclonal antibodies and their therapeutic use
WO2025061994A1 (en) 2023-09-21 2025-03-27 Domain Therapeutics Anti-ccr8 monoclonal antibodies and their therapeutic use
WO2025116732A1 (en) * 2023-12-01 2025-06-05 Rijksuniversiteit Groningen Methods and kits for detecting proliferating cells
WO2025199352A2 (en) 2024-03-20 2025-09-25 Juno Therapeutics, Inc. Antibodies specific for solute carrier family 34 member 2 (slc34a2)
WO2025240670A2 (en) 2024-05-15 2025-11-20 Abalytics Oncology, Inc. Anti-pd-1 antibodies and related binding molecules and methods and uses thereof

Family Cites Families (71)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4699880A (en) 1984-09-25 1987-10-13 Immunomedics, Inc. Method of producing monoclonal anti-idiotype antibody
US5776093A (en) 1985-07-05 1998-07-07 Immunomedics, Inc. Method for imaging and treating organs and tissues
US5057313A (en) 1986-02-25 1991-10-15 The Center For Molecular Medicine And Immunology Diagnostic and therapeutic antibody conjugates
US5703055A (en) 1989-03-21 1997-12-30 Wisconsin Alumni Research Foundation Generation of antibodies through lipid mediated DNA delivery
EP0590058B1 (en) 1991-06-14 2003-11-26 Genentech, Inc. HUMANIZED Heregulin ANTIBODy
GB9203459D0 (en) 1992-02-19 1992-04-08 Scotgen Ltd Antibodies with germ-line variable regions
US6077835A (en) 1994-03-23 2000-06-20 Case Western Reserve University Delivery of compacted nucleic acid to cells
KR970029803A (ko) 1995-11-03 1997-06-26 김광호 반도체 메모리장치의 프리차지 회로
EP0979281B1 (en) 1997-05-02 2005-07-20 Genentech, Inc. A method for making multispecific antibodies having heteromultimeric and common components
MXPA01007895A (es) 1999-02-03 2003-07-21 Biosante Pharmaceuticals Inc Particulas terapeuticas de fosfato de calcio, metodos de manufactura y usos.
US6281005B1 (en) 1999-05-14 2001-08-28 Copernicus Therapeutics, Inc. Automated nucleic acid compaction device
DE10043437A1 (de) 2000-09-04 2002-03-28 Horst Lindhofer Verwendung von trifunktionellen bispezifischen und trispezifischen Antikörpern zur Behandlung von malignem Aszites
SI1523496T1 (sl) 2002-07-18 2011-11-30 Merus B V Rekombinantno proizvajanje zmesi protiteles
WO2004035607A2 (en) * 2002-10-17 2004-04-29 Genmab A/S Human monoclonal antibodies against cd20
BR122019012028B1 (pt) 2004-04-13 2023-09-26 F. Hoffmann-La Roche Ag Anticorpos anti-p-selectina, molécula de ácido nucléico, vetor, e composição
EP1740946B1 (en) 2004-04-20 2013-11-06 Genmab A/S Human monoclonal antibodies against cd20
US7741568B2 (en) 2005-01-13 2010-06-22 The Wiremold Company Downward facing receptacle assembly for cable raceway
CN101115771B (zh) * 2005-02-03 2013-06-05 安迪拓普有限公司 人类抗体和蛋白质
CN101155832B (zh) 2005-02-08 2013-02-06 一般财团法人化学及血清疗法研究所 抗体的改良方法
JP5620626B2 (ja) 2005-03-31 2014-11-05 中外製薬株式会社 会合制御によるポリペプチド製造方法
TWI323734B (en) 2005-08-19 2010-04-21 Abbott Lab Dual variable domain immunoglobulin and uses thereof
US7612181B2 (en) 2005-08-19 2009-11-03 Abbott Laboratories Dual variable domain immunoglobulin and uses thereof
ES2856451T3 (es) * 2005-10-11 2021-09-27 Amgen Res Munich Gmbh Composiciones que comprenden anticuerpos específicos para diferentes especies, y usos de las mismas
US10155816B2 (en) 2005-11-28 2018-12-18 Genmab A/S Recombinant monovalent antibodies and methods for production thereof
US7951918B2 (en) 2006-03-17 2011-05-31 Biogen Idec Ma Inc. Stabilized polypeptide compositions
WO2007110205A2 (en) 2006-03-24 2007-10-04 Merck Patent Gmbh Engineered heterodimeric protein domains
AT503902B1 (de) 2006-07-05 2008-06-15 F Star Biotech Forsch & Entw Verfahren zur manipulation von immunglobulinen
AU2008234019B2 (en) * 2007-04-03 2014-05-29 Amgen Research (Munich) Gmbh Cross-species-specific bispecific binders
PT2155783E (pt) 2007-04-03 2013-11-07 Amgen Res Munich Gmbh Domínio de ligação específico inter-espécies
MX2009013816A (es) 2007-06-21 2010-02-24 Macrogenics Inc Diacuerpos covalentes y usos de los mismos.
PT2235064E (pt) 2008-01-07 2016-03-01 Amgen Inc Método de preparação de moléculas heterodiméricas de fc de anticorpos utilizando efeitos de indução eletrostática
WO2010015792A1 (en) 2008-08-06 2010-02-11 Argenta Discovery Limited Nitrogen containing heterocyclic compounds useful as bifunctional modulators of m3 receptors and beta-2 receptors
DE102008039957A1 (de) 2008-08-27 2010-03-04 Continental Automotive Gmbh Verfahren zur Ermittlung eines Unfallschwerekriteriums mittels eines Beschleunigungssignals und eines Körperschallsignals
JP5397668B2 (ja) 2008-09-02 2014-01-22 ソニー株式会社 記憶素子および記憶装置
FR2935974B1 (fr) 2008-09-15 2010-10-08 Centre Nat Rech Scient Derives de metalloporphyrines, nanoparticules les comprenant
AU2009299794B2 (en) * 2008-10-01 2015-08-13 Amgen Research (Munich) Gmbh Cross-species-specific single domain bispecific single chain antibody
JP2012505654A (ja) * 2008-10-14 2012-03-08 ヤンセン バイオテツク，インコーポレーテツド 抗体をヒト化及び親和性成熟する方法
CN102369021B (zh) 2008-12-19 2016-09-07 宏观基因有限公司 共价双抗体及其用途
CN102459346B (zh) 2009-04-27 2016-10-26 昂考梅德药品有限公司 制造异源多聚体分子的方法
US9493578B2 (en) 2009-09-02 2016-11-15 Xencor, Inc. Compositions and methods for simultaneous bivalent and monovalent co-engagement of antigens
SI2506871T1 (sl) 2009-11-30 2016-12-30 Janssen Biotech, Inc. Mutanti Fc protitelesa z odstranjenimi efektorskimi funkcijami
US8786135B2 (en) 2010-03-25 2014-07-22 Mitsubishi Electric Research Laboratories, Inc. Wireless energy transfer with anisotropic metamaterials
TWI426920B (zh) 2010-03-26 2014-02-21 Hoffmann La Roche 雙專一性、雙價抗－ｖｅｇｆ／抗－ａｎｇ－２抗體
TWI653333B (zh) * 2010-04-01 2019-03-11 安進研究（慕尼黑）有限責任公司 跨物種專一性之ＰＳＭＡｘＣＤ３雙專一性單鏈抗體
CN110066339A (zh) 2010-04-20 2019-07-30 根马布股份公司 含异二聚体抗体fc的蛋白及其制备方法
EP2569337A1 (en) 2010-05-14 2013-03-20 Rinat Neuroscience Corp. Heterodimeric proteins and methods for producing and purifying them
CA3051311A1 (en) 2010-05-27 2011-12-01 Genmab A/S Monoclonal antibodies against her2
JP5934203B2 (ja) * 2010-07-14 2016-06-15 メルク・シャープ・エンド・ドーム・コーポレイション 抗ａｄｄｌモノクローナル抗体およびこの使用
TW201208703A (en) * 2010-08-17 2012-03-01 Roche Glycart Ag Combination therapy of an afucosylated CD20 antibody with an anti-VEGF antibody
RU2013110876A (ru) 2010-08-24 2014-09-27 Рош Гликарт Аг Активируемые биспецифические антитела
CA2807278A1 (en) 2010-08-24 2012-03-01 F. Hoffmann - La Roche Ag Bispecific antibodies comprising a disulfide stabilized - fv fragment
RU2604490C2 (ru) 2010-11-05 2016-12-10 Займворкс Инк. ДИЗАЙН УСТОЙЧИВОГО ГЕТЕРОДИМЕРНОГО АНТИТЕЛА С МУТАЦИЯМИ В Fc ДОМЕНЕ
LT2647707T (lt) * 2010-11-30 2018-11-12 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Citotoksiškumą indukuojantis terapinis agentas
BR112013021473A2 (pt) 2011-02-23 2020-08-04 F. Hoffmann-La Roche Ag anticorpos contra il33r humano e seus usos
JP2014514314A (ja) * 2011-04-20 2014-06-19 ゲンマブ エー／エス Ｈｅｒ２およびｃｄ３に対する二重特異性抗体
ME03440B (me) 2011-05-21 2020-01-20 Macrogenics Inc Cd3-vezujući molekuli sposobni za vezivanje za humani i nehumani cd3
CN102250246A (zh) 2011-06-10 2011-11-23 常州亚当生物技术有限公司 抗VEGF/PDGFRβ双特异性抗体及其应用
SG11201401422VA (en) 2011-10-27 2014-09-26 Genmab As Production of heterodimeric proteins
UA115439C2 (uk) * 2012-01-27 2017-11-10 Протена Біосаєнсиз Лімітед Гуманізоване антитіло, яке розпізнає альфа-синуклеїн
CN104736174B (zh) 2012-07-06 2019-06-14 根马布私人有限公司 具有三重突变的二聚体蛋白质
ME03675B (me) 2013-07-05 2020-10-20 Genmab As Humanizovana ili himerna anтi-cd3 antiтela
MX2016000272A (es) * 2013-07-12 2016-08-03 Zymeworks Inc Construcciones de unión a los antígenos cd19 y cd3 biespecificos.
KR102357961B1 (ko) * 2013-12-17 2022-02-08 제넨테크, 인크. 항-cd3 항체 및 이의 사용 방법
CN114478792A (zh) * 2015-01-08 2022-05-13 根马布股份公司 针对cd3和cd20的双特异性抗体
IL256562B2 (en) 2015-07-15 2024-07-01 Genmab As Human CD3 antibodies or chimeras
CH713600A2 (de) 2017-03-21 2018-09-28 Digi Sens Ag Vorrichtung und Verfahren zum Messen einer Last.
EP3668898B1 (en) * 2017-08-14 2023-07-05 MorphoSys AG Humanized antibodies for cd3
CN116406293A (zh) * 2020-09-10 2023-07-07 健玛保 用于治疗滤泡性淋巴瘤的联合疗法中的针对cd3和cd20的双特异性抗体
BR112023004296A2 (pt) * 2020-09-10 2023-04-04 Genmab As Método para tratar linfoma de célula b grande difusa em um indivíduo humano
CA3190349A1 (en) * 2020-09-10 2022-03-17 Brian Elliott Bispecific antibodies against cd3 and cd20 for treating chronic lymphocytic leukemia
JP2023541860A (ja) * 2020-09-10 2023-10-04 ジェンマブ エー／エス びまん性大細胞型ｂ細胞リンパ腫を治療するための併用療法におけるｃｄ３及びｃｄ２０に対する二重特異性抗体

Also Published As

Publication number Publication date
HRP20200382T1 (hr) 2020-06-12
EP3016681B1 (en) 2019-12-18
ES2776706T3 (es) 2020-07-31
EP4249515B1 (en) 2025-06-18
AU2025256200A1 (en) 2025-11-13
JP2020048564A (ja) 2020-04-02
IL276530B (en) 2022-03-01
EP3693385A1 (en) 2020-08-12
JP2020005635A (ja) 2020-01-16
AU2022203851A1 (en) 2022-06-23
CN105722529A (zh) 2016-06-29
JP2022101539A (ja) 2022-07-06
MX373245B (es) 2020-05-11
JP2016529882A (ja) 2016-09-29
ES3038421T3 (en) 2025-10-13
US10465006B2 (en) 2019-11-05
SMT202000287T1 (it) 2020-07-08
MX2015017487A (es) 2016-03-21
EP4631978A2 (en) 2025-10-15
CN106255507A (zh) 2016-12-21
PT3016681T (pt) 2020-03-26
SMT202500322T1 (it) 2025-11-10
CA2915575A1 (en) 2015-01-08
JP7389833B2 (ja) 2023-11-30
IL311371B1 (en) 2024-05-01
IL311371A (en) 2024-04-01
UA119646C2 (uk) 2019-07-25
HUE072527T2 (hu) 2025-11-28
JP7208129B2 (ja) 2023-01-18
BR122023002590B1 (pt) 2023-12-05
KR20160027177A (ko) 2016-03-09
LT4249515T (lt) 2025-08-25
CN105722529B (zh) 2021-06-08
SI3016681T1 (sl) 2020-04-30
US20200123255A1 (en) 2020-04-23
US10407501B2 (en) 2019-09-10
RS67220B1 (sr) 2025-10-31
EA201690167A1 (ru) 2016-06-30
IL243127B (en) 2020-08-31
IL290613B2 (en) 2024-11-01
JP2017505121A (ja) 2017-02-16
AU2014286116A1 (en) 2016-02-04
HUE048722T2 (hu) 2020-08-28
AU2020202792A1 (en) 2020-05-21
EP4249515A2 (en) 2023-09-27
EP3016681A1 (en) 2016-05-11
EP3091998A1 (en) 2016-11-16
WO2015001085A1 (en) 2015-01-08
PT4249515T (pt) 2025-09-08
FIC20250036I1 (fi) 2025-12-09
JP2022163009A (ja) 2022-10-25
KR102813816B1 (ko) 2025-05-29
HK1231369A1 (zh) 2017-12-22
SG11201510739TA (en) 2016-01-28
SG10201800982QA (en) 2018-03-28
AU2020202792B9 (en) 2022-07-07
PL3016681T3 (pl) 2020-06-15
KR102531517B1 (ko) 2023-05-12
MX2020004503A (es) 2020-08-13
EP4249515A3 (en) 2023-11-15
IL276530A (en) 2020-09-30
BR112015032986A2 (pt) 2017-08-22
FI4249515T3 (fi) 2025-09-02
DK3016681T5 (da) 2020-05-04
JP6546162B2 (ja) 2019-07-17
SI4249515T1 (sl) 2025-11-28
CY1122840T1 (el) 2021-05-05
US20230374131A1 (en) 2023-11-23
EP3091998B1 (en) 2025-08-20
JP7104000B2 (ja) 2022-07-20
DK4249515T3 (en) 2025-09-15
CN113248615B (zh) 2025-07-04
AU2020202792B2 (en) 2022-06-23
ME03675B (me) 2020-10-20
NZ715896A (en) 2022-02-25
IL290613A (en) 2022-04-01
IL311371B2 (en) 2024-09-01
JP6619342B2 (ja) 2019-12-11
US20160168247A1 (en) 2016-06-16
IL290613B1 (en) 2024-07-01
US20160333095A1 (en) 2016-11-17
JP2024026114A (ja) 2024-02-28
CN118063621A (zh) 2024-05-24
KR20220025210A (ko) 2022-03-03
LT3016681T (lt) 2020-03-25
CN120365424A (zh) 2025-07-25
US20200199229A1 (en) 2020-06-25
DK3016681T3 (da) 2020-03-09
CN113248615A (zh) 2021-08-13
ZA201800385B (en) 2019-09-25
JP7757247B2 (ja) 2025-10-21
US11613575B2 (en) 2023-03-28
AU2022203851B2 (en) 2025-07-24
CN106255507B (zh) 2025-05-02
KR20230073341A (ko) 2023-05-25
KR20250078622A (ko) 2025-06-02
HRP20251127T1 (hr) 2025-11-21
KR102363220B1 (ko) 2022-02-15
WO2015104346A1 (en) 2015-07-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU2020202792B2 (en) Humanized or chimeric CD3 antibodies
HK40092168A (en) Humanized or chimeric cd3 antibodies
HK40092168B (en) Humanized or chimeric cd3 antibodies
HK40035360A (en) Humanized or chimeric cd3 antibodies
HK1224574B (en) Humanized or chimeric cd3 antibodies
HK1224574A1 (en) Humanized or chimeric cd3 antibodies