RS60032B1 - Detekcija ciljne nukleinske kiseline i varijanti - Google Patents

Description

Opis

Oblast pronalaska

[0001] Predmetni pronalazak se odnosi na oblast postupaka kojima se vrši detekcija nukleinskih kiselina. Postupci iz pronalaska su visoko senzitivni i specifični i prema tome su korisni na primer, za detekciju retkih mutacija, ili za detekciju nisko zastupljenih varijanti u sekvencama nukleinskih kiselina.

Stanje tehnike pronalaska

[0002] Detekcija nukleinskih kiselina koje su prisutne u niskim količinama i/ili su nisko zastupljene je poželjna za mnoge primene. Detekcija genskih mutacija je na primer važna za veliki broj bolesti, kao što je cistična fibroza, anemija srpastih ćelija, i kanceri. Sve više se prepoznaje da su neophodni izuzetno osetljivi i specifični postupci za detekciju mutacije, naročito za uzorke sa malim unosom kao što su cirkulišuća tumorska DNK (ctDNK) i analiza pojedinačnih ćelija. Današnji konvencionalni postupci su izloženi brojnim pitanjima, uključujući visok zahtev za količinu unosa uzorka DNK, visoke troškove po uzorku, složene i naporne radne procese, nedovoljnu osetljivost i/ili specifičnost, i nemogućnost detekcije nisko zastupljenih mutiranih DNK sekvenci unutar visoke pozadinske sekvence normalnog divljeg tipa (takozvana frakcija mutiranog alela; MAF). Skoro svi postupci za detekciju mutacije se oslanjaju na umnožavanje DNK korišćenjem polimerazne reakcije lanaca (eng. PCR) da se kopiraju, eksponencijalno, ciljni regioni DNK od interesa korišćenjem enzima DNK polimeraze.

[0003] Kada je svrha da se napravi razlika između normalne sekvence divljeg tipa i varijante (mutirane) sekvence koja može da se razlikuje onoliko malo koliko je samo jedna baza nukleotida, tačnost enzima DNK polimeraze može da postane značajno ograničenje diskriminatornoj moći (koje utiču na većinu mera performansi detekcije mutacije). Svaki enzim polimeraza ima određenu stopu ugrađivanja pogrešnih baza za svaku moguću netačnu promenu baza, tipično u opsegu od 0.5 do 300 grešaka na milion umnoženih baznih parova (tj., 5 X 10<-7>do 3 X 10<-4>). Za mnoge primene, ove greške polimeraznog baznog ugrađivanja baznog ugrađivanja jedne baze su podnošljive. Na primer, ukoliko su dostupne velike količine DNK i MAF je umeren do visok, npr. >10-20%, obićan PCR može da bude dovoljan. Međutim, u prijavama koje obuhvataju detekciju nisko-zastupljenih varijanti, postoji potreba za ultra osetljivim postupcima za detekciju tako da prava pozitivna mutacija može da se razlikuje od lažno pozitivne izazvane greškom polimeraze. Trenutni testovi za detekciju mutacije koji se koriste imaju ograničenja detekcije 10-20% MAF (Sanger sekvenciranje), 5-10% MAF (pirosekvenciranje), 1-5% MAF (sekvenciranje sledeće generacije), i 0.1% MAF (digitalni PCR, COLD-PCR, ultra-dubinsko sekvenciranje sledeće generacije).

[0004] Digitalni PCR je postupak koji deli PCR reakciju u mnoge manje individualne reakcije tako da svaka particija reakcije sadrži nula do samo nekoliko molekula ciljne sekvence. Podela ovih molekula je slučajna i prati Poasonovu distribuciju. Deljenje transformiše situaciju od ekstremno niske relativne zastupljenosti retke varijante sekvence među velikom zastupljenošću sekvence divljeg tipa, u situaciju gde većina particija ima samo sekvencu divljeg tipa i neke particije imaju veoma visoku relativnu zastupljenost retke varijante sekvence u poređenju sa sekvencom divljeg tipa. Rezultat je povećanje u osetljivosti za detekciju retke varijante sekvence putem razblaživanja sekvence divljeg tipa unutar svake particije. Međutim, greška polimeraze je i dalje značajan problem čak i za digitalni PCR koji može da prikaze lažno pozitivne rezultate, prema tome može negativno da utiče na diskriminatorne performanse i granice za detekciju.

[0005] Različiti postupci bazirani na PCR-u za obogaćenje i detekciju manjih alela i mutacija su opisani npr. od Milbury et al., Clin Chem.2009 Apr; 55(4): 632-640, međutim, nijedan od ovih postupaka nije ektremno senzitivan i jednostavan za izvođenje.

[0006] US 2012164652 opisuje postupke za analizu uzoraka visokog titra koji ne mogu da budu podeljeni u dovoljnom broju particija koje sadrže nula molekula nukleinske kiseline po particiji da bi se omogućila Poasonova analiza (digitalna PCR analiza).

Suština pronalaska

[0007] Prema tome, postoji nezadovoljena potreba za ekstremno senzitivnim postupcima za detekciju nukleinskih kiselina koje su prisutne u malim količinama sa veoma niskom učestalošću lažnih pozitivnih rezultata.

[0008] Pronalazači su pronašli da u postupcima koji koriste standardni PCR, učestalosti grešaka DNK polimeraze stvara barijeru performansi da se ograniči detekcija, zbog toga što je DNK eksponencijalno umnožena do brojeva u milijardama kopija, greške su slučajno uvedene u mnoge kopije DNK uključujući lažno dobijanje varijanti sekvenci od interesa, i ovde greške se kopiraju i umnožavaju.

[0009] Maksimum senzitivnosti koji se može postići u standardnom digitalnom PCR testu je takođe ograničen sa tačnošću enzima polimeraze korišćenog u reakciji. Kada je sekvenca divljeg tipa netačno kopirana od strane polimeraze, onda može da nastane kopija koja nosi lažnu mutiranu sekvencu, i takva reakcija može da se čita kao pozitivna za mutiranu ciljnu sekvencu. U zavisnosti od toga koliko je mnogo PCR ciklusa izvedeno i na kom ciklusu je uvedena lažna mutirana sekvenca, signal može da bude neprimetan od onog koji je pravi pozitivan i prema tome će se čitati kao lažno-pozitivan. Ukoliko se ovaj događaj greške polimeraze dogodi tokom kasnog PCR ciklusa, pravi pozitivni signali su već stekli "početnu prednost" u odnosu na potencijalne lažno pozitivne signale i tada može da postoji mogućnost da se napravi razlika između pravih-pozitivnih rezultata i lažno-pozitivnih.

[0010] Postupci iz pronalaska pouzdano daju konzistentnu prednost signala pravih pozitivnih reakcija u odnosu na bilo koja lažno-pozitivne reakcije.

[0011] Prema tome, pronalazak obezbeđuje postupak koji je u stanju da se suprotstavi posledicama polimeraznih grešaka da bi se povećala performansa ispitivanja za bar jedan stepen veličine. Postupci iz pronalaska postižu izuzetno visoku osetljivost i specifičnost, imaju jednostavan proces rada i relativno su jeftini.

[0012] Predmetni pronalazak obezbeđuje izuzetno osetljive postupke za detekciju nukleinskih kiselina prisutnih u niskoj količini sa veoma niskom učestalosti lažno pozitivnih rezultata. Postupci iz pronalaska se generalno sastoje iz faze asimetrične postepene polimerazne reakcije (AIPR) korišćenjem visoke temperature vezivanja, zatim sledi konvencionalnija simetrična PCR faza koriščenjem niske temperature vezivanja, obe su izvedene unutar podeljenih reakcija kao što je digitalni PCR u kapljicama.

[0013] Postupci za umnožavanje nukleinskih kiselina upotrebom PCR zasnovanih testova korišćenjem prajmera sa različitim temperaturama topljenja (Tm) su poznati u oblasti tehnike. WO2006/094360 na primer opisuje jednu zatvorenu tubu PCR, pri čemu su izvedena dva uzastopna simetrična PCR-a. U prvoj rundi nukleinska kiselina na lokusu od interesa je specifično umnožena upotrebom obeleženih prajmera specifičnih za lokus koji su pogodni za izvođenje iscrpne PCR. U drugoj rundi, proizvod umnožavanja prve runde je zatim umnožen upotrebom obeleženih prajmera sa nižom Tm od obeleženih prajmera koji su specifični za lokus.

[0014] Zbog visoke senzitivnosti i specifičnosti, postupci iz pronalaska su korisni za detekciju sekvenci nukleinskih kiselina prisutnih u niskoj količini. Posebno, postupci su korisni za detekciju retkih jednobaznih varijanti među izuzetno u velikim količinama prisutnim alelom divljeg tipa, i korisni su čak kada je niska količina unetog ukupnog uzorka, kao što može da bude slučaj sa cirkulišućom tumorskom DNK (ctDNK) u plazmi krvi pacijenta.

[0015] Postupci iz pronalaska se generalno sastoje iz asimetrične postepene polimerazne reakcije (AIPR) faze koju prati više konvencionalna simetrična PCR faza. U AIPR fazi generalno je kopiran samo jedan lanac ciljne sekvence nukleinske kiseline, koji omogućava nastanak brojnih matrica za konvencionalni simetrični PCR. Prema tome, gde je konvencionalni PCR u principu eksponencijalno umnožavanje, onda je AIPR u principu linearno umnožavanje. Za umnožavanje bilo koje date sekvence od interesa, dizajnirana su bar dva prajmera koja ograničavaju sekvencu od interesa tako da jedan prajmer (ovde poznat pod imenom "prajmer-H") ima veoma visoku temperaturu topljenja (Tm) i drugi prajmer na suprotnom lancu i orijentaciji, ima mnogo nižu Tm ("prajmer-L"). Dve faze (AIPR i PCR) razlikuju se u termocikličnim uslovima i prajmerima koji su funkcionalno aktivni tokom svake faze.

[0016] U AIPR fazi, ciljna jednolančana sekvenca se kopira od strane polimeraze koja je prajmovana upotrebom oligonukleotida prajmera-H komplementarnog sa jednim krajem ciljne sekvence od interesa i samo jedna kopija (npr. sekvenca koja je komplementarna sa matricom) je sintetisana po termalnom ciklusu. Ovo se generalno postiže termalnim ciklusom do 1) temperature DNK u jednolančanim molekulima; 2) temperature koja omogućava vezivanje prajmera-H da bi se prajmovalo mono-direkciono kopiranje ciljne sekvence od interesa sa DNK polimerazom, ali temperatura ne omogućava vezivanje prajmera-L; 3) do temperature koja omogućava sintezu komplementarnih lanaca (eng. extension) sintetisanog lanca sa DNK polimerazom ali na kojoj prajmer-L još uvek ne može da se veže; 4) ponavljanje koraka 1 do 3 u ciklusima koji se ponavljaju ukoliko je potrebno, sa jednom dodatnom komplementarnom kopijom koja je sintetisana po ciklusu koja je prajmovana i izvršena je sinteza komplementarnog lanca počev od prajmera-H. Sintetisana kopija je Watson-Crick komplementarna sa jednolančanom sekvencom za koju je vezan prajmer-H i prema tome svaka sintetisana kopija ne postaje matrica za dalje umnožavanje tokom bilo kog termalnog ciklusa u AIPR fazi. Nekoliko do veoma mnogo rundi AIPR kopiranja samo u jednom pravcu su izvedene u ciklusima kao što je gore navedeno u termalnim uslovima u kojima samo mono-direkcionalni prajmer-H može da se veže i da se nastavi sinteza komplememtarnog lanca da bi se sintetisao lanac nukleinske kiseline. Prema tome, iz svake originalene jednolančane matrice i za svaki termalni ciklus, dobijena je jednolančana komplementarna sekvenca tako da, na primer, posle X-broja trajanja asimetričnih ciklusa, biće X novih komplementarnih DNK molekula na kraju faze za svaki Y-broj jednolančanih polaznim molekula matrtica u particiji (ukupan broj novih komplementarnih DNK molekuila u reakcionoj particiji će prema tome biti X*Y). Na primer, posle 64 ciklusa sa samo 1 jednolančanom matricom u reakcionoj particiji, prema tome će biti 1 jednolančana matrica plus 1*64=64 komplementarnih kopija u particiji. Sa veoma visokom verovatnoćom, velika količina ovih novih molekula će biti tačna komplementarna kopija originalnog molekula matrice, kako je stopa greške polimeraze niska (0.5 do 300 grešaka na milion umnoženih baznih parova) i samo npr. 64 kopija od nekoliko desetina do nekoliko hiljada baznih parova dužine su svaki sintetisani. Čak i u slučaju da se greška polimeraze pojavi tokom jednog od ovih ciklusa AIPR u rekacionoj particiji koja sadrži samo 1 ciljnu sekvencu molekula divljeg tipa i 0 mutiranih ciljnih sekvenci sa kojima se počinje, od 64 nova DNK molekula, samo 1 bi bio mutiran između 63 ne-mutirana. Ova greškom uvedena mutirana ciljna sekvenca će potencijalno biti problematična ukoliko se pojavi na tačnom položaju u sekvenci od najvećeg interesa, ali neće biti problematična ukoliko se pojavi na drugom položaju. Sa druge strane, u pravoj pozitivnoj reakciji particije koja počinje sa 1 pravom mutiranom ciljnom sekvecom molekula i 0 ciljnih divljih tipova, u tom slučaju će biti 64 nova mutanta koji sadrže molekule DNK, i izuzetno retko, 63 nova mutanta koji sadrže molekule i 1 molekul lažno divljeg tipa. Prema tome, u digitalnoj PCR reakciji, particije prave pozitivne reakcije će imati 62 do 64 dodatna mutirana ciljna molekula u odnosu na particiju koja se retko pojavljuje koja sada sadrži lažno-pozitivnu mutiranu sekvencu zbog greške polimeraze. Nakon ove AIPR faze, počinje konvencionalna simetrična PCR faza i particije lažnopozitivne reakcije imaju ekvivalent od približno log2(X) ciklusa "vrući početak" (eng. hot start) u terminima kopija molekula u odnosu na particije lažno-pozitivne reakcije. Drugim rečima, u gore navedenom primeru sa X=64 asimetrična ciklusa, particije prave pozitivne reakcije će imati približno log2(64)=6 ciklusa vrućeg-početka.

[0017] U digitalnom PCR sistemu korišćenjem ugašenih fluorescentnih proba, koje su komplementarne sa ciljnom sekvencom od interesa, koje se vezuju za svoju ciljnu sekvencu i čija je fluorofora isečena sa egonukleaznom aktivnosti polimeraze i prema tome nije više ugašena, oslobođene fluorofore se nakupljaju u particiji i povećavaju njen fluorescentni signal. Konvencionalni PCR se nastavlja sve dok ne postane vidljiv pravi pozitivni signal i lažni pozitivni signal još uvek zaostaje brojnim ciklusima. Napravljena je granica za razdvajanje dva signala. Drugi postupci za detekciju proizvoda konvencionalnog PCR takođe mogu da se koriste.

[0018] Slika 1 obezbeđuje pregled postupka u skladu sa jednim izvođenjem iz pronalaska.

[0019] Jedan način za postizanje jedno-smernog kopiranja samo jednog matričnog lanca toko asimetrične faze dok se izbegava kopiranje u suprotnom smeu (suprotni lanac) je da se uključi samo jedan prajmer tokom AIPR faze i dodavanje drugog prajmera na kraju simetrične PCR faze. Većina digitalnih PCR postupaka koji su zasnovani na particijama, međutim, trenutno ne dozvoljavaju dodavanje reagenasa jednom kada se dogodi deljenje, na primer teško je da se dodaju reaktanti u reakcione kapljice u digitalnom PCR u kapljicama (ddPCR).

[0020] Jedan prikaz obezbeđuje postupak za dizajn testa koji proizvodi prajmere koji omogućavaju AIPR sa oba prajmera prisutna u reakciji korišćenjem parova prajmera sa značajno različitim temperaturama topljenja. Prajmer sa visokom-Tm (prajmer-H) je dizajniran za jedan lanac na kraju ciljne sekvence od interesa i prajmer sa niskom-Tm (prajmer-L) je dizajniran za drugi lanac na drugom kraju ciljne sekvence od interesa. Postupci takođe uključuju sredstva za detekciju specifičnih alela. Pomenuta sredstva mogu na primer da budu alel-specifične probe pozionirane preko varijante baze. AIPR faza je pokrenuta na veoma visokoj temperaturi dok prajmer-H sa visokom Tm je sposoban da se efikasno veže i prajmer L sa niskom-Tm nije. Konvencionalna simetrična PCR faza je pokrenuta na niskoj temperaturi gde su prajmer-L sa niskom Tm i prajmer-H sa visokom-Tm sposobni da se efikasno vežu za specifičnu matricu. Ukoliko sistem koristi alel specifične probe, onda su one poželjno dizajnirane tako da se one vezuju na ili blizu niže temperature vezivanja. Tm prajmera, i prema tome aktivnost tokom dve faze, može da bude manipulisana dužinom prajmera, uvođenjem dizajniranih pogrešno sparenih sekvenci u prajmer, i/ili modifikacijama prajmera (npr. upotrebom varijati nukeotida, kao što su zaključane baze nukleinskih kiselina [LNA], ili druge oligonukleotidne modifikacije kao što je dodavanje grupe za vezivanje u malom žljebu [MGB]). Kritično je da aktivnost prajmera-L bude suprimirana tokom asimetrične AIPR faze zbog toga što kad god se dogodi vezivanje prajmera sa niskom-Tm i dogodi se sinteza komplementarnog lanca, dešava se simetrično kopiranje oba lanaca, što povećava supstrat za potencijal grešaka polimeraze koje će nakon toga biti propagirane tokom svakog sledećeg ciklusa. Zbog toga, poželjni dizajn testa u terminima izbegavanja lažnih pozitiva je onaj u kome je razlika između temperature vezivanja asimetrične faze i niska-Tm prajmer temperatura topljenja je visoka.

[0021] Pronalazak je definisan patentnim zahtevima i obezbeđuje postupak za detekciju prisustva ciljne sekvence nukleinske kiseline ili detekciju prisustva varijante sekvence u ciljnoj sekvenci nukleinske kiseline u uzorku koji obuhvata korake

a) obezbeđivanja uzorka koji obuhvata matrice nukleinskih kiselina

b) obezbeđivanja niza prajmera koji obuhvata bar par prajmera koji su specifično sposobni za umnožavanje ciljne sekvence nukleinske kiseline, pri čemu niz prajmera bar obuhvata prajmer-H i prajmer-L, pri čemu je temperatura topljenja prajmera-H bar 16°C viša od temperature topljenja prajmera-L, i pri čemu prajmer-L sadrži sekvencu koja je komplementarna sa fragmentom proizvoda elongacije prajmera-H,

c) obezbeđivanja polimeraze nukleinske kiseline koja ima polimeraznu aktivnost na temperaturi elongacije,

d) dobijanja podeljenih PCR reakcija svaka obuhvata deo uzorka, niz prajmera, polimerazu nukleinske kiseline, PCR reagense i po potrebi reagense za detekciju

e) izvođenje asimetrične postepene polimerazne reakcije (AIPR) koja obuhvata korake:

i. inkubacije podeljenih PCR reakcija na temperaturi denaturacije, pri čemu se DNK denaturiše do jednolančanih molekula

ii. inkubacije podeljenih PCR reakcija na visokoj temperaturi vezivanja čime se omogućava vezivanje prajmera-H, ali ne prajmera-L,

iii. opciono inkubacije podeljenih PCR reakcija na temperaturi elongacije,

iv. opciono ponavljanja koraka i do iii,

v. čime se umnožava samo jedan lanac ciljne sekvence nukleinske kiseline

f) izvođenja reakcije polimerizacije lanaca (PCR) koja obuhvata korake:

1) inkubacije podeljenih PCR reakcija na temperaturi denaturacije, pri čemu se DNK denaturiše do jednolančanih molekula

2) inkubacije PCR na niskoj temperaturi vezivanja čime se omogućava vezivanje i prajmera-H i prajmera-L,

3) inkubacije PCR na temperaturi elongacije čime se omogućava sinteza komplementarnih lanaca svih hibridizovanih prajmera

4) opciono ponavljanja koraka II do IV,

5) čime se umnožavaju oba lanca ciljne sekvence nukleinske kiseline da se dobije PCR proizvod g) detekcija da li PCR proizvod sadrži ciljnu sekvencu nukleinske kiseline ili varijantu sekvence u ciljnoj sekvenci nukleinke kiseline.

[0022] Pronalazak takođe obuhvata komplet iz delova koji sadrži:

a) niz prajmera koji obuhvata bar par prajmera specifično sposobnih za umnožavanje ciljne sevence nukleinske kiseline, pri čemu niz prajmera bar obuhvata prajmer-H i prajmer-L, pri čemu temperatura topljenja prajmera-H je bar 16°C viša od temperature topljenja prajmera-L, i pri čemu prajmer-L obuhvata sekvencu komplementarnu sa proizvodom elongacije prajmera-H, b) probu za detekciju koja je sposobna da hibridizuje sa ciljnom sekvencom nukleinske kiseline, pomenuta proba je povezana sa bar jednom fluoroforom i bar jednim prigušivačem

c) polimerazu nukleinske kiseline ;

d) PCR reagense;

e) reagense za dobijanje kapljica koje sadrže podeljene PCR reakcije.

Opis nacrta

[0023]

Slika 1 daje pregled IBSAFE postupka. Slika 1A prikazuje situaciju u kojoj je prisutna mutirana matrica. Tokom AIPR faze dobijaju se komplementarne kopije mutirane sekvence. Temperatura se održava dovoljno visokom tako da prajmer-L i probe ne hibridizuju. U simetričnoj fazi mutirana DNK je eksponencijalno umnožena. Slika 1B pokazuje situaciju u kojoj je prisutna matrica divljeg tipa, ali se pojavljuju greške polimeraze. Tokom AIPR faze dobijaju se nekoliko kopija sekvence divljeg tipa, ali samo jedna kopija mutirane sekvence sa greškom. Temperatura se održava dovoljno visokom tako da prajmer-L i probe ne hibridizuju međusobno. U simetričnoj fazi i DNK divljeg tipa i mutirana DNK sa greškom su eksponencijalno umnožene, međutim s obzirom na to da postoji mnogo više kopija DNK divljeg tipa na početku eksponencijalne faze, DNK divljeg tipa značajno prevazilazi broj mutirane DNK.

Slika 2 pokazuje dva specifična primera dizajna testa za dve ciljne sekvence od interesa, obe unutar onkogena PIK3CA: H1047R varijanta locirana na kodonu 3140 sa izmenom nukleotida A do G (na vrhu), i E542K varijanta locirana na kodonu 1624 sa izmenom nukleotida od G do A (na dnu).

Slika 3 pokazuje digitalne PCR u kapljicama grafike. Slika pokazuje da dobijeni signal mutirane DNK iz PrimePCR™ Mutacionog testa (leva strana) i IBSAFE testova (desna strana) za PIK3CA H1047R varijantu (gornja polovina) i PIK3CA E542K varijantu (donja polovina). Kapljice (X-osa) su naznačene sa tačkicama sa njihovim intenzitetom fluorescencije (Y-osa). Primećuje se nedostatak lažno negativnih kapljica u bunarićima sa negativnom kontrolom pri čemu korišćenje IBSAFE postupka (istaknuto u okvirima u gornjim desnim uglovima svakog dijagrama) u poređenju sa PrimePCR™ Mutacionim testom.

Slika 4 prikazuje dizajn eksperimentalnog testa – Dizajn testa koji cilja PIK3CA c.3140A>G (H1047R) sa alternativnim verzijama Prajmera-H (beta 1 i beta 2). Prajmer-H beta 1 je kraći i prema tome ima nižu temperaturu topljenja od Prajmera-H beta 2. Probe korišćene u ovom testu su prilagođene TaqMan® MGB Probe (Applied Biosystems) koje sadrže 5’ reportersku boju (FAM ili HEX), 3’ nefluorescenti prigušivač, i 3’ grupu za vezivanje manjeg žljeba vezanu za molekul prigušivač.

Slika 5 pokazuje grafike mutiranog (specifičnog) signala koji pokazuje AIPR efekat na lažnopozitivnom signalu – Dizajn eksperimentalnog testa koji je prikazan na Slici 4 je korišćen uključujući beta 1 ili beta 2 Prajmer-H zajedno sa Prajmerom-L i probama specifčnih za mutaciju i probama za divlji tip (videti sliku 4) su pokrenuti sa DNK matricom pozitivnom na mutacije (nije prikazano; svi testovi detektuju mutaciju) i matrica divljeg tipa bez AIPR (A), sa AIPR na nižoj (67°C) temperaturi (B), i sa AIPR na višoj (74°) temperaturi (C). Paneli D, E i F pokazuju mutirani (Specifični) Signal i ne pokazuju lažno negativne signale upotrebom različitih AIPR temperatura za hibridizaciju i simetrične temperature za hibridizaciju; (D) IBSAFE test za PIK3CA E542K mutaciju. U ovom primeru AIPR je pokrenut sa 75°C temperaturom vezivanja za hibridizaciju i simetrična faza sa 46°C temperaturom za hibridizaciju; (E) IBSAFE test za mutaciju E545K u PIK3CA. U ovom primeru AIPR je pokrenuta sa 75°C temperaturom za hibridizaciju i simetrična faza upotrebom 46°C temperature za vezivanje; (F) IBSAFE test za NRAS Q61R mutaciju sa AIPR upotrebom 73°C temperature za vezivanje i simetrična faza upotrebom 48°C temperature za vezivanje.

Slika 6 pokazuje primer poređenja granice detekcije – izmerena učestalost mutiranog alela za PrimePCR™ Mutation Assay (leva strana) i IBSAFE testove (desna strana) za PIK3CA H1047R varijantu (panel na vrhu i panel na dnu) i PIK3CA E542K varijanta (srednji panel) su prikazani. Gornji i srednji paneli pokazuju rezultate iz testova koji sadrže matricu DNK koja obuhvata 0, 0.01, 0.1 i 1% mutiranu DNK (ostatak je divljeg tipa), pri čemu niži panel pokazuje rezultate iz testova koji sadrže matricu DNK koja sadrži 0, 0.001, 0.01, 0.1, 1 i 10% mutiranu DNK. Lažno pozitivni signali za PrimePCR™ Mutation Assay ukazuju da rezultati na 0.01% MAF ne mogu biti pouzdani (poklapaju se sa negativnom kontrolom), i prema tome, niža granica za detekciju je 0.1%. Suprotno tome, za IBSAFE testove, 0.01% MAF je pouzdano, čak i na 0.001% rezultati su pouzdani. Najniža granica za detekciju treba još u potpunosti da bude testirana ali je verovatno, u zavisnosti od testa, da bude značajno manja od 0.001%.

Slika 7 pokazuje dizajn testa (A) i rezultate (B) postupka prema pronalasku upotrebom prajmera-L modifikovanog sa pogrešnim sparivanjem koji cilja mutaciju KRAS G13D.

Detaljni opis pronalaska

Definicije

[0024] Umnožavanje: Umnožavanje nukleinske kiseline je stvaranje kopija pomenute nukleinske kiseline. Termin "par prajmera sposobnih za umnožavanje ciljne nukleinske kiseline" kao što se ovde koristi se odnosi na to da je pomenuti par prajmera dodat u PCR zajedno sa ciljnom nukleinskom kiselinom, nukleotidima i polimerazom nukleinske kiseline, nakon čega će pomenuti PCR imati za rezultat proizvodnju ciljne nukleinske kiseline.

[0025] Približno: Termin približno kao što se ovde koristi se odnosi na /- 10%, poželjno /-5%, za primer do /- 1%.

[0026] Temperatura denaturacije: Temperatura denaturacije je temperatura koja mogućava dentaturaciju svih DNK molekula u uzorku i/ili u PCR reakcijama i/ili AIPR da se izvrši denaturacija do jednolančanih molekula. Temperatura denaturacije je poželjno dovoljno niska da se osigura da polimeraza nukleinske kiseline nije trajno denaturisana. Obično, temperatura denaturacije je temperatura u opsegu od 90 do 99°C, kao što je u opsegu od 92 do 97°C, na primer u opsegu od 94 do 95°C.

[0027] Temperatura elongacije: Temperatura elongacije je temperatura koja omogućava enzimsku aktivnost polimeraze nukleinske kiseline. Obično polimeraza nukleinske kiseline ima aktivnost u temperaturnom opsegu, i prema tome temperatura elongacije može da bude bilo koja temperatura unutar tog opsega. Većina polimeraza nukleinske kiseline imaju temperaturni optimum, ali zadržavaju aktivnost na drugim temperaturama koje nisu temperaturni optimum. U takvim slučajevima, temperatura elongacije može da bude bilo koja temperatura na kojoj polimeraza nukleinske kiseline ima aktivnost čak ukoliko temperatura nije optimum temperature. Termin "polimeraza nukleinske kiseline koja ima aktivnost polimeraze na temperaturi elongacije" kao što se ovde koristi se odnosi na to da je polimeraza nukleinske kiseline sposobna da katalizuje sintezu novog lanca nukleinske kiseline komplementarnog sa lancem matricom na temperaturi elongacije. U nekim izvođenjima pronalaska temperatura elongacije je blizu temperature topljenja prajmera-H. Prema tome, može da bude izabrana polimeraza nukleinske kiseline, koja ima polimeraznu aktivnost na temperaturi blizu temperature topljenja prajmera-H i/ili prajmer-H može da bude dizajniran da ima temperaturu topljenja blizu temperature elongacije. Termin "blizu temperature" kako se koristi u ovoj vezi može na primer da bude unutar /- 5°C, kao što je /- 2°C, na primer /- 1°C pomenute temperature. Obično, temperatura elongacije je u opsegu od 65 do 80°C, na primer u opsegu od 68 do 75°C.

[0028] Temperatura topljenja: Temperatura topljenja prajmera je temperatura na kojoj 50% prajmera obrazuje stabilni dvostruki heliks sa njegovom komplementarnom sekvencom i drugih 50% je razdvojeno do jendolančanih molekula. Temperatura topljenja takođe može da bude naznačena sa Tm.

Tm kao što se ovde koristi je izračunata upotrebom najbližeg susednog postupka zasnovanog na postupku opisanom u Breslauer et al., Proc. Natl. Acad. Sci.83, 3746-50 (1986) upotrebom parametra koncentracije soli od 50 mM i koncentracije prajmera od 900 nM. Na primer, postupak je implementiran od strane softvera "Multiple Primer Analyzer" iz Life Technologies/Thermo Fisher Scientific Inc.

[0029] Termin "par prajmera sposobnih za umnožavanje ciljne nukleinske kiseline" kao što se ovde koristi se odnosi na to da ukoliko se pomenuti par prajmera dodaje u PCR zajedno sa ciljnom nukleinskom kiselinom, nukleotidima, polimerazom nukleinske kiseline, i drugim PCR reagensima, onda će pomenuti PCR za rezultat imati prozivodnju ciljne sekvence nukleinske kiseline. Jedan od prajmera od para prajmera će biti prednji prajmer, dok će drugi biti reverzni prajmer. Ukoliko prajmer-H je prednji prajmer, onda poželjno prajmer-L je reverzni prajmer i obrnuto.

[0030] PCR reagensi: PCR reagensi su reagensi koji se dodaju u PCR pored polimeraze nukleinske kiseline, uzorka i niza prajmera. PCR reagensi najmanje obuhvataju nukleotida. Dodatno, PCR reagensi mogu da obuhvate druga jedinjenja kao što su so(li) i pufer(i).

[0031] Prajmer-H i prajmer-L: Prajmer-H je prajmer koji ima visoku temperaturu topljenja, pri čemu prajmer-L je prajmer koji ima nisku temperaturu topljenja.

[0032] Niz prajmera: Niz prajmera sadrži dva ili više različita prajmera. Niz prajmera sadrži bar par prajmera specifično sposobnih za umnožavanje ciljne nukleinske kiseline. Osim toga, niz prajmera prema pronalasku sadrži bar prajmer-H i prajmer-L. Prema tome, u izvođenjima iz pronalaska, u kojima niz prajmera sadrži samo dva različita prajmera, onda niz prajmera sadrži prajmer-H i prajmer-L, pri čemu prajmer-H i prajmer-L su sposobni za umnožavanje ciljne sekvence nukleinske kiseline.

[0033] Ciljna nukleinska kiseline: Bilo koja sekvenca nukleinske kiseline čije je prisustvo poželjno detektovati. Ciljna nukleinska kiselina može na primer da bude sekvenca nukleinske kiseline koja je povezana sa kliničkim stanjem.

Postupak za detekciju varijante sekvence ili ciljne nuklenske sekvence

[0034] Predmetni pronalazak obezbeđuje postupke za detekciju prisustva varijante sekvence u ciljnoj nukleinskoj sekvenci u uzorku.

[0035] Takvi postupci mogu da budu korisni za detekciju da li je varijanta sekvence prisutna u uzorku, koji može da obuhvati smešu ciljnih nukleinskih kiselina pri čemu samo porcija ciljnih nukleinskih kiselina može da sadrži varijantu sekvence. Posebno, postupci su korisni za detekciju prisustva varijante sekvence u uzorku koji sadrži ciljne nukleinske kiseline od koji samo manja frakcija može potencijalno da sadrži varijantu sekvence.

[0036] Pomenuta varijanta sekvence može da bude bilo koja varijanta sekvence koju je poželjno detektovati. Na primer, varijanta sekvence može da bude povezana sa kliničkim stanjem kao što je ovde opisano detaljnije u tekstu ispod u odeljku "Postupak za predviđanje prisustva kliničkog stanja". Posebno, varijanta sekvence mogu da budu bilo koje varijante sekvenci opisane u tekstu ispod u odeljku "Varijanta sekvence i ciljna sekvenca nukleinske kiseline".

[0037] Uzorak može da bude bilo koji uzorak u kome je poželjno da se detektuje, da li je prisutna pomenuta varijanta sekvence. Na primer ukoliko je varijanta sekvence indikator kliničkog stanja, uzorak može da bude uzorak od individue koja je u riziku od dobijanja pomenutog kliničkog stanja.

[0038] Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje postupke za detekciju prisustva ciljne sekvence nukleinske kiseline u uzorku.

[0039] Takvi postupci mogu da budu korisni za detekciju da li se ciljna sekvenca nukleinske kiseline nalazi u uzorku. Pomenuti uzorak može da sadrži smešu matrica nukleinskih kiselina koje potencijalno sadrže ciljnu sekvencu nukleinske kiseline. Posebno, postupci su korisni za detekciju prisustva ciljne sekvence nukleinske kiseline u uzorku, koji potencijalno može da sadrži samo veoma niski nivo pomenute ciljne sekvence nukleinske kiseline.

[0040] Pomenuta ciljna sekvenca nukleinske kiseline može da bude bilo koja ciljna sekvenca nukleinske kiseline, koju je poželjno detektovati. Na primer, prisustvo ciljne sekvence nukleinske kiseline može da bude povezano sa kliničkim stanjem kao što je ovde detaljnije opisano u tekstu ispod u odeljku "Postupak za predviđenje prisustva kliničkog stanja". Posebno, ciljna sekvenca nukleinske kiseline može da bude bilo koja od ciljnih sekvenci nukleinskih kiselina koje su opisane u tekstu ispod u odeljku "Varijanta sekvence i ciljna sekvenca nukleinske kiseline".

[0041] Uzorak može da bude bilo koji uzorak u kome je poželjno detektovati, da li je prisutna pomenuta ciljna sekvenca nukleinske kiseline. Na primer ukoliko je ciljna sekvenca nukleinske kiseline indikativna za kliničko stanje, uzorak može da bude uzorak iz individue koja je u riziku od dobijanja pomenutog kliničkog stanja.

[0042] Postupci za detekciju prisustva ciljne sekvence nukleinske kiseline ili prisustva varijante nukleinske kiseline u uzorku generalno obuhvata sledeće korake:

a) obezbeđivanja uzorka koji obuhvata matrice nukleinskih kiselina;

b) obezbeđivanja niza prajmera koji na primer mogu da budu bilo koji od niza prajmera koji su opisani ovde u tekstu ispod u odeljku "Niz prajmera",

c) obezbeđivanja polimeraze nukeinske kiseline koja ima polimeraznu aktivnost na temperaturi elongacije, koja na primer može da bude bilo koja od ovde opisanih polimeraza nukleinskih kiselina u tekstu ispod u odeljku "PCR reagensi";

d) dobijanja podeljenih PCR reakcija na primer kao što je ovde opisano u tekstu ispod u odeljku "Podeljene PCR reakcije"

e) Izvođenje asimetrične postepene polimerazne reakcije (AIPR) na primer kao što je ovde opisano u tekstu ispod u odeljku "Asimetrična postepena polimerazna reakcija"

f) izvođenja reakcije polimerizacije lanaca (PCR), poželjno eksponencijalne PCR reakcije kao što je ovde opisano u tekstu ispod u odeljku "Eksponencijalni PCR"

g) detekcije da li PCR proizvod sadrži ciljnu sekvencu nukleinske kiseline ili varijantu sekvence u ciljnoj sekvenci nukleinske kiseline, pri čemu pomenuta detekcija može na primer da se izvede kao što je ovde opisano u tekstu ispod u odeljku "Detekcija".

[0043] Svaka podeljena PCR reakcija treba da sadrži bar deo uzorka, niz prajmera, i dovoljno PCR reagenasa da se omogući PCR reakcija. Postupci i reagensi korisni za izvođenje PCR reakcije su dobro poznati stručnjaku iz oblasti tehnike. Na primer svaka podeljena PCR reakcija može da sadrži bilo koju od polimeraza nukleinske kiseline i PCR reagense, kao što je ovde u tekstu ispod opisano u odeljku "PCR reagensi".

[0044] U zavisnosti od načina detekcije da li PCR proizvod sadrži varijantu sekvence, svaka podeljena PCR reakcija može takođe sa sadrži reagense za detekciju, kao što je bilo koji od reagensa za detekciju koji je opisan u tekstu ispod u odeljku "Detekcija".

[0045] Postupci iz pronalaska su na primer korisni za primene koje zahtevaju razlikovanje visokih performansi između bilo koje dve sekvence od broja nukleotida. Na primer postupci iz pronalaska su korisni za primene koje zahtevaju razlikovanje visokih performansi između dve sekvence koje se razlikuju u samo nekoliko baza nukleotida i gde svojstvena brzina grešaka ugrađivanja baza polimeraze

1

može da dovede do lažno pozitivnih ciljnih sekvenci od interesa. Postupci mogu da se koriste sa razlikovanjem zasnovanim na probi jednonukleotidnih varijanata na primer kao što je ovde opisano dole u tekstu u odelju "Detekcija" ili sa razlikovanjem zasnovanim na prajmeru. Postupak može da se primeni na bilo koji tip nemodifikovane ili modifikovane dezoksiribonukleinske ili ribonukelinske kiseline (DNK/RNK) sekvence od interesa u bilo kom organizmu i bilo koje dužine od nekoliko desetina nukleotida u dužini do mnogo stotina do hiljada nukleotida u dužini. Postupak može da se koristi sa nemodifikovanim ili modifikovanim prajmerima, sa ili bez modifikovanih ili nemodifikovanih proba. Postupak može da se izvede u multipleksu sa mnogim istovremenim ispitivanjima brojnih ciljnih sekvenci od interesa.

[0046] Generalno, postupci iz pronalaska imaju jako nisku granicu detekcije. Ovo omogućava detekciju ciljne sekvence nukleinske kiseline koja je potencijalno prisutna u jako niskim nivoima, i/ili detekciju prisustva varijanti sekvenci koje se potencijalno nalaze na jako niskim nivoima u smešama koje sadrže druge ciljne sekvence nukleinskih kiselina. Generalno, velika razlika između temperature topljenja prajmera-H i prajmera-L može da omogući jako nisku granicu detekcije. Korisne temperature topljenja prajmera-H i prajmera-L su ovde opisane u tekstu ispod. Takođe velika razlika između primenjene visoke temperature vezivanja i niske temperature vezivanja može da omogući jako nisku granicu detekcije. Korisne visoke i niske temperature vezivanja su ovde opisane u tekstu ispod.

[0047] Granica za detekciju može da se odredi različitim načinima. Na primer granica za detekciju može da se odredi definisanjem minimalne frakcije mutiranih alela (MAF) koja pouzdano može da se razlikuje od negativen kontrole koja sadrži samo matricu divljeg tipa. Frakcija mutiranog alela je frakcija detektovanih mutiranih alela u poređenju sa ukupnim brojem detektovanih alela (divlji tip plus mutirani). U teoriji, MAF treba da bude nula kada je ulazna matrica samo divlji tip, međutim zbog lažnih pozitiva frakcija može da bude veća od nule. Lažni pozitivi dovode do slabije granice detekcije za postupak zbog toga što jako niski MAF u pravim pozitivnim ne može da se razlikuje od jako niskog MAF koji se detektuje u pravom negativnom. Poželjno, postupci iz pronalaska imaju granicu detekcije MAF koja je niža od 0.01%, na primer može da bude niža od 0.001%. MAF može na primer da bude određen kao što je ovde opisano u tekstu ispod u Primeru 1.

Komplet iz delova

[0048] Predmetni prikaz takođe obuhvata komplet iz delova koji obuhvata:

a) niz prajmera, koji na primer može da bude bilo koji od niza prajmera koji su ovde opisani u tekstu ispod u odeljku "Niz prajmera",

b) probu za detekciju koja je sposobna da hibridizuje sa ciljnom sekvencom nukleinske kiseline, pri čemu je pomenuta proba spojena sa bar jednom fluoroforom i bar jednim prigušivačem, pri čemu pomenuta proba za detekciju na primer može da bude bilo koja od proba za detekciju koje su ovde opisane u tekstu ispod u odelju "Detekcija",

c) polimerazu nukleinske kiseline, koja na primer može da bude bilo koja od polimeraza nukleinskih kiselna opisanih u tekstu ispod u odeljku "PCR reagensi";

d) PCR reagense, koji na primer mogu da budu bilo koji od reagenasa koji su opisani ovde u tekstu ispod u odeljku "PCR reagensi";

e) reagense za dobijanje kapljica koje sadrže podeljene PCR reakcije, koji na primer može da bude bilo koji od reagenasa koji je ovde opisan u odeljku "Podeljene PCR reakcije".

[0049] Komplet iz delova je posebno koristan za izvođenje postupaka iz pronalaska.

Varijanta sekvence i ciljna sekvenca nukleinske kiseline

[0050] Kao što je opisano gore u tekstu postupci iz pronalaska su korisni za detekciju prisustva varijante sekvence u ciljnoj sekvenci nukleinske kiseline.

[0051] Često, pomenuta varijanta sekvence može da bude mutirana sekvenca. Prema tome, ciljna sekvenca nukleinske kiseline može da bude sekvenca nukleinske kiseline, koja može da se nalazi ili kao sekvenca divljeg tipa ili kao mutirana sekvenca.

[0052] Takođe je moguće da je varijanta sekvence polimorfizam, i prema tome ciljna sekvenca nukleinske kiseline može da bude prisutna u obliku različitih polimorfa. Da bi se pojednostavila diskusija ciljna sekvenca nukleinske kiseline koja se najčešće pojavljuje ovde je takođe naznačena sa "sekvenca divljeg tipa" iako strogo rečeno takođe varijanta sekvence u nekim slučajevima može da se smatra sekvencom divljeg tipa.

[0053] Prema tome, postupci iz pronalaska mogu da budu postupci za detekciju prisustva varijante sekvence u ciljnim sekvencama nukleinskih kiselina, pri ćemu pomenuta ciljna sekvenca nukleinske kiseline potencijalno može da bude prisutna kao sekvenca divljeg tipa ili može da sadrži varijantu sekvence.

[0054] Varijanta sekvence može da se razlikuje od sekvence divljeg tipa supstitucijom(a), delecijom(jama) i/ili insercijom(jama). Poželjno je da oba, sekvenca divljeg tipa i varijanta sekvence budu umnožene u PCR reakciji pomoću para prajmera koji su specifično sposobni za umnožavanje ciljne sekvence nukleinske kiseline. Prema tome, poželjno je da se sekvenca divljeg tipa i varijanta sekvence ne razlikuju previše jedna od druge u dužini. Varijanta sekvence može na primer da se razlikuje od sekvence divljeg tipa insercijom u opsegu od 1 do 1000 nukleotida, kao što je u opsegu od 1 do 100 nukleotida, na primer u opsegu od 1 do 50 nukleotida, kao što je u opsegu od 1 do 10 nukleotida, na primer u opsegu od 1 do 5, nukleotida, kao što je insercija 1 nukleotida. Slično tome, varijanta sekvence može na primer da se razlikuje od sekvence divljeg tipa delecijom u opsegu od 1 do 1000 nukleotida, kao što je u opsegu od 1 do 100 nukleotida na primer u opsegu od 1 do 50 nukleotida, kao što je u opsegu od 1 do 10 nukleotida, na primer u opsegu od 1 do 5, nukleotida, kao što je delecija 1 nukleotida. Varijanta sekvence može takođe da se razlikuje od sekvence divljeg tipa preko suspstitucije, na primer supstitucijom u opsegu 1 do 1000 nukleotida, kao što je u opsegu od 1 do 100 nukleotida, na primer u opsegu od 1 do 50 nukleotida, kao što je u opsegu od 1 do 10 nukleotida, na primer u opsegu od 1 do 5, nukleotida, kao što je supstitucija 1 nukleotida.

[0055] Prema tome, u jednom izvođenju iz pronalaska, varijanta sekvence može da se razlikuje od sekvence divljeg tipa samo za jedan nukleotid, npr. delecijom, insercijom ili supstitucijom 1 nukleotida. Prema tome, varijanta sekvence može da bude varijacija jednog nukleotida ili mutacija jednog nukleotida. Varijanta sekvence može takođe da bude polimorfizam, kao što je polimorfizam u jednom nukleotidu.

[0056] Kao što je opisano gore u tekstu, može biti poželjno da i sekvenca divljeg tipa i varijanta mogu da budu umnoženi u PCR reakciji upotrebom para prajmera koji su specifično sposobni da umnože ciljnu sekvencu nukleinske kiseline. Pomenuti par prajmera se sastoji iz prednjeg prajmera i reerznog prajmera. Poželjno je da prednji prajmer obuhvata ili se čak sastoji iz sekvence koja je identična sa delom ciljne sekvence, koja se nalazi i u ciljnoj sekvenci divljeg tipa i u ciljnoj sekvenci koja sadrži varijantu sekvence. Međutim, takođe je moguće da prednji prajmer obuhvata ili se čak sastoji iz sekvence koja je identična sa delom ciljne sekvence osim nekoliko pogređno sprenih baza, npr. izuzev do oko 10 pogrešno sparenih, kao što je do oko 5 pogrešno sparenih, na primer do 2 pogrešno sparene, Slično tome, poželjno je da reverzni prajmer obuhvata ili se čak sastoji iz sekvence koja je komplementarna sa delom ciljne sekvence, koja se nalazi i u ciljnoj sekvenci divljeg tipa i u ciljnoj sekvenci koja obuhvata varijantu sekvence. Međutim, takođe je moguće da reverzni prajmer sadrži ili se čak sastoji od sekvence koja je komplementarna sa delom ciljne sekvence osim nekoliko pogrešno sparenih baza, npr. izuzev do 10 pogrešno sparenih, kao što je do 5 pogrešno sparenih, na primer do 2 pogrešno sparene. Prajmeri mogu da sadrže pogrešno sparene baze iz različitih razloga na primer da bi se prajmer prilagodio do pogodne Tm. Na taj način postupci iz pronalaska će imati za rezultat umnožavanje i ciljne sekvence divljeg tipa i ciljne sekvence koja obuhvata varijantu sekvence. Prema tome, PCR proizvod može da sadrži i ciljnu sekvencu nukleinske kiseline koja obuhvata varijantu sekvence i ciljnu sekvencu nukleinske kiseline koja nema varijantu sekvence.

[0057] Prisustvo varijante sekvence može nakon toga da bude određeno bilo kojim postupkom koji je dostupan stručnjaku iz oblasti tehnike, na primer kao što je ovde u tekstu ispod opisano u odeljku "Detekcija".

[0058] Kao što je ovde gore u tekstu opisano postupci iz pronalaska mogu da se koriste za uočavanje razlike između dve veoma slične sekvence, i prema tome za detekciju prisustva varijante sekvence koja je slična sa sekvencom divljeg tipa.

[0059] Postoje mnogi različiti razlozi, zbog čega je poželjno detektovati varijantu date sekvence. Na primer varijanta sekvence može da bude povezana sa kliničkim stanjem ili rizikom od dobijanja kliničkog stanja. Varijanta sekvence može takođe da obezbedi otisak ili bar da doprinese otisku individue, na taj način se pomaže u identifikaciji pojedinca. Ovo može da ima primene u forenzici.

[0060] Međutim, postupci iz pronalaska mogu takođe da se koriste za jednostavno detektovanje prisustva date ciljne sekvence nukleinske kiseline. Pomenuta ciljna sekvenca nukleinske kiseline može da bude bilo koja sekvenca nukleinske kiseline, koja je poželjna za detekciju. Na primer, može da bude poželjno detektovati prisustvo nukleinskih kiselina iz stranog patogena. Generalno je poželjno da je ciljna sekvenca nukleinske kiseline pogodna kao matrica za polimeraze nukleinskih kiselina.

Niz (skup) prajmera

[0061] Ovde opisani postupci uključuju upotrebu niza prajmera. Niz prajmera obuhvata bar par prajmera koji su specifično sposobni za umnožavanje ciljne sekvence nukleinske kiseline, i niz prajmera obuhvata bar prajmer-H i prajmer-L.

[0062] Pronalaskom je obuhvaćeno da prajmer-H i prajmer-L čine par prajmera specifično sposobnih za umnožavanje ciljne sekvence nukleinske kiseline. Prema tome, u nekim izvođenjima pronalaska niz prajmera može da se sastoji iz prajmera-H i prajmera-L.

[0063] U određenim izvođenjima iz prikaza podeljene PCR reakcije mogu da sadrže samo sledeće nukleinske kiseline: nukleinske kiseline koje se nalaze u uzorku, prajmer-H, prajmer-L, slobodne nukleotide, i po potrebi jednu ili više proba za detekciju.

[0064] Međutim, takođe je moguće da je par prajmera specifično sposobnih za umnožavanje ciljne sekvence nukleinske kiseline različit u odnosu na prajmer-H i prajmer-L. Ovim prikazom je takođe obuhvaćeno da prajmer-L zajedno sa prajmerom, koji nije prajmer-H obuhvata par prajmera specifično sposobnih za umnožavanje ciljne sekvence nukleinske sekvence.

[0065] Par prajmera specifično sposobnih za umnožavanje ciljne sekvence nukleinske kiseline sastoji se iz dva prajmera, koji mogu da budu označeni kao prednji prajmer i reverzni prajmer. Prednji prajmer je poželjno sposoban za vezivanje sa komplementarnim lancem ciljne sekvence nukleinske kiseline na 5’-kraju ili blizu 5’-kraja ciljne sekvence nukleinske kiseline. Poželjno prednji prajmer obuhvata

1

sekvencu identičnu sa 5’-krajem ciljne sekvence nukleinske kiseline. Prednji prajmer čak može da se sastoji iz sekvence koja je identična sa 5’-krajem ciljne sekvence nukleinske kiseline. U slučaju da prednji prajmer obuhvata sekvencu koja nije identična sa ciljnom sekvencom nukleinske kiseline, poželjno je da se 3’kraj prajmera sastoji iz sekvence koja je identična sa ciljnom sekvencom nukleinske kiseline. Reverzni prajmer je poželjno sposoban za vezivanje sa ciljnom sekvencom nukleinske kiseline na 3’-kraju ili blizu 3’-kraja ciljne sekvence nukleinske kiseline. Poželjno reverzni prajmer obuhvata sekvencu komplementarnu sa 3’-krajem ciljne sekvence nukleinske kiseline. Reverzni prejmer čak može da se sastoji iz sekvence komplementarne sa 3’-krajem ciljne sekvence nukleinske kiseline. U slučaju da reverzni prajmer obuhvata sekvencu koja nije komplementarna sa ciljnom sekvencom nukleinske kiseline, poželjno je da se 5’-kraj prajmera sastoji iz sekvence komplementarne sa ciljnom sekvencom nukleinske kiseline.

[0066] Takođe je razmotreno da prednji prajmer može da bude prajmer -H, i reverzni prajmer može da bude prajmer-L.

[0067] Takođe je razmotreno da prednji prajmer može da bude prajmer-H, i reverzni prajmer može da bude prajmer, koji nije ni prajmer-H niti prajmer-L.

[0068] Takođe je razmotreno da prednji prajmer može da bude prajmer-L, i reverzni prajmer može da bude prajmer-H.

[0069] Takođe je razmotreno da prednji prajmer može da bude prajmer-L, i reverzni prajmer može da bude prajmer, koji nije ni prajmer-H niti prajmer-L.

[0070] U nekim prikazima u kojima prednji prajmer je prajmer-H, može biti poželjno da PCR reakcije sadrže samo reverzne prajmere koji imaju temperaturu topljenja, koja je bar 10°C niža, poželjno bar 15°C niža, kao što je bar 20°C niža, na primer bar 25°C niža, kao što je bar 30°C, kao što je u opsegu od 15 do 50°C, na primer u opsegu od 15 do 40°C niža od temperature topljenja prajmera-H. U izvođenjima iz pronalaska, u kojima niz prajmera obuhvata nekoliko parova prajmera koji se sastoje iz prajmera-H i reverznog prajmera, onda svaki reverzni prajmer poželjno ima prethodno pomenutu temperaturu topljenja u odnosu na prajmer-H para prajmera.

[0071] U nekim prikazima u kojima reverzni prajmer je prajmer-H, može biti poželjno da PCR reakcije sadrže samo prednje prajmere koji imaju temperaturu topljenja, koja je bar 10°C niža, poželjno bar 15°C niža, kao što je bar 20°C niža, na primer bar 25°C niža, kao što je bar 30°C, na primer u opsegu od 15 do 50°C niža, na primer u opsegu od 15 do 40°C niža od temperature topljenja prajmera-H. U izvođenjima iz pronalaska, u kojima niz prajmera obuhvata nekoliko parova prajmera koji se sastoje iz prajmera-H i prednjeg prajmera, zatim svaki prednji prajmer poželjno ima prethodno pomenutu temperaturu topljenja u odnosu na prajmer-H para prajmera.

[0072] Prajmeri mogu da budu bilo koji oligonukleotid ili nukleinska kiselina koja je sposobna da deluje kao tačka inicijacija sinteze DNK pod odgovarajućim uslovima. Takvi uslovi mogu da uključe one koje obuhvataju AIPR ili PCR koji su opisano ovde u tekstu ispod u odeljku "Asimetrična postepena polmerazna lančana reakcija" ili "Eksponencijalni PCR".

[0073] U nekim slučajevima, prajmer može biti obeležen za detekciju. U nekim slučajevima, prajmer nije obeležen za detekciju.

[0074] Dužina prajmera može da zavisi od sekvence ciljne sekvence nukleinske kiseline. Kao što je ovde na drugom mestu objašnjeno, prajmer-H ima temperaturu topljenja koja je značajno viša od temperature topljenja prajmera-L. Ukoliko niz prajmera sadrži više prajmera-H i prajmera-L, onda je poželjno da su preostali prajmeri dizajnirani da imaju temperaturu topljenja sličnu sa temperaturom topljenja prajmera-L ili nižom od temperature topljenja prajmera-L. Međutim, pronalaskom je obuhvaćeno da niz prajmera može da obuhvati više od jednog prajmera-H. U takvim slučajevima, poželjno je da bilo koji prajmer koji zajedno sa bilo kojim od prajmera-H su sposobni za umnožavanje ciljne nukleinske kiseline imaju temperaturu topljenja koja je slična sa temperaturom topljenja prajmera-L ili niža od temperature topljenja prajmera-L.

[0075] Prema tome, niz prajmera obuhvata prajmer-H i prajmer-L, pri čemu prajmer-H ima temperaturu topljenja koja je bar 16°C viša od temperature topljenja svih drugih prajmera u nizu prajmera. Na primer, prajmer-H može da ima temperaturu topljenja koja je bar 18°C, na primer bar 20°C viša od temperature topljenja svih drugih prajmera u nizu prajmera. Prajmer-H može da ima čak višu temperaturu topljenja, na primer temperaturu topljenja koja je bar 25°C viša, kao što je bar 30°C viša od temperature topljenja svih drugih prajmera u nizu prajmera. Ukoliko podeljene PCR reakcije takođe obuhvataju jednu ili više proba, takve probe mogu takođe da imaju temperaturu topljenja, koja je bar 16°C, kao što je bar 18°C, na primer bar 20°C niža od temperature topljenja prajmera-H. Međutim, probe takođe mogu da imaju više temperature topljenja.

[0076] U jednom izvođenju prajmer-H je jedini prajmer u nizu prajmera koji ima temperaturu topljenja bar 16°C višu od temperature topljenja prajmera-L. U pomenutom izvođenju svi drugi prajmeri imaju temperaturu topljenja, koja je najviše 10°C viša od temperature topljenja prajmera-L. Na primer, svi prajmeri osim prajmera-H mogu da imaju temperaturu topljenja unutar opsega od /- 10°C temperature topljenja prajmera-L, kao što je unutar opsega /- 8°C temperature opsega prajmera-L, na primer unutar opsega od /-6°C temperature topljenja prajmera-L, kao što je unutar opsega od /-4°C temperature topljenja prajmera-L. Ukoliko podeljene PCR reakcije takođe sadrže jednu ili više proba pomenute probe mogu takođe da imaju temperaturu topljenja unutar opsega od /- 10°C temperature topljenja prajmera-L, kao što je unutar opsega od /- 8°C temperature topljenja prajmera-L, na primer unutar opsega od /-6°C temperature topljenja prajmera-L, kao što je unutar opsega od /- 4°C temperature topljenja prajmera-L. Međutim, unutar pronalaska je takođe obuhvaćeno da probe imaju višu temperaturu topljenja, na primer temperature topljenja do 20°C višu od temperature topljenja prajmera-L.

[0077] U jednom izvođenju pronalaska poželjno je da niz prajmera ne obuhvata bilo koje prajmere:

a) koji imaju temperaturu topljenja koja je u opsegu od /- 15°C, poželjno u opsegu od /- 20°C, kao što je u opsegu od /- 25°C, na primer u opsegu od /- 10°C temperature topljenja prajmera-H, kao što je u opsegu od /- 8°C temperature topljenja prajmera-H, na primer u opsegu od /-6°C temperature topljenja prajmera-H, kao što je u opsegu od /- 4°C temperature topljenja prajmera-H; i

b) koji zajedno sa prajmerom-H mogu da čine par prajmera specifično sposobnih za umnožavanje ciljne sekvence nukleinske kiseline.

[0078] U jednom izvođenju pronalaska poželjno je da svi prajmeri unutar niza prajmera, koji zajedno sa prajmerom-H mogu da čine par prajmera specifično sposobnih za umnožavanje ciljne sekvence nukleinske kiseline, imaju temperaturu topljenja koja je bar 10°C, poželjno bar 15°C, kao što je bar 20°C, na primer bar 25°C, kao što je bar 30°C, na primer u opsegu od 15 do 50°C, kao što je u opsegu od 15 do 40°C niža od temperature topljenja prajmera-H.

[0079] Prema tome, niz prajmera obuhvata prajmer-H i prajmer-L, pri čemu prajmer-H ima temperaturu topljenja koja je bar 16°C viša od temperature topljenja svih drugih prajmera u nizu prajmera. Na primer, prajmer-H može da ima temperaturu topljenja koja je bar 18°C, na primer bar 20°C viša od temperature topljenja svih drugih prajmera u nizu prajmera. Ukoliko podeljene PCR reakcije takođe obuhvataju jednu ili više proba, takve probe mogu takođe da imaju temperaturu

1

topljenja, koja je bar 16°C, kao što je bar 18°C, na primer bar 20°C niža, na primer u opsegu od 20 do 45°C niža od temperature topljenja prajmera-H. Međutim, pronalaskom je takođe obuhvaćeno da probe mogu da imaju višu temperaturu topljenja, čak temperaturu topljenja koja je slična sa temperaturom topljenja prajmera-H.

[0080] Stručnjak iz oblasti tehnike će biti u mogućnosti da dizajnira prajmere koji imaju odgovarajuću temperaturu topljenja. Generalno, temperatura topljenja prajmera može da zavisi od dužine prajmera, sekvence prajmera i takođe od prisustva nukleotidnih analoga. Postoje neka ograničenja u sekvenci prajmere, zbog toga što treba da bude sposobna da se veže za ciljnu sekvencu nukleinske kiseline i/ili komplementrarnu sekvencu. Prema tome, unutar ograničenja na sekvencu, stručnjak iz oblasti tehnike može dizajnirati prajmer sa željenom temperaturom topljenja pomoću podešavanja dužine prajmera. Temperatura topljenja (Tm) može da se odredi kao što je ovde u gore u tekstu opisano u odeljku "Definicije".

[0081] Temperatura topljenja takođe može da zavisi od prisustva nukleotidnih analoga, i prema tome prajemeri koji imaju odgovarajuću temperaturu topljenja mogu da budu dizajnirani pomoću dizajna prajmera koji obuhvataju jedan ili više nukleotidnih analoga. Temperatura topljenja takođe može da zavisi od pogrešno sparenih nukleotida sa ciljnom nukleinskom kiselinom, i prema tome prajmeri koji imaju odgovarajuću temperaturu topljenja mogu da budu dizajnirani da sadrže jedan ili više pogrešno sparenih nukleotida.

[0082] Prajmeri mogu da sadrže dodatne karakteristike koje omogućavaju detekciju ili imobilizaciju prajmera ali ne menjaju osnovno svojstvo prajmera (npr., deluju kao tačka za inicijaciju sinteze DNK). Na primer, prajmeri mogu da sadrže dodatnu sekvencu nukleinske kiseline na 5’-kraju koja ne hibridizuje sa ciljnom sekvencom nukleinske kiseline ili sekvencu komplementarnu sa ciljnom sekvencom nukleinske kiseline, ali koja olakšava kloniranje ili detekciju umnoženog proizvoda. Na primer, dodatna sekvenca može da sadrži isecanje restrikcionim enzimom i/ili mesto prepoznavanja. Region prajmera koji je dovoljno komplementaran sa matricom za hibridizaciju može ovde da bude naznačen kao region za hibridizaciju. Prajmeri mogu takođe da budu povezani sa obeleživačima, na primer fluorescentnim, funkcionizovanim, ili vezujućim obeleživačima. Pomenuti obeleživači mogu da budu vezani za njihove krajeve, šećere, ili nukleobaze. Prajmeri mogu takođe da sadrže pogrešno sparen(i) 3’-kraj u dizajnima u kojima prajmer razlikuje između divljeg tipa i varijante ciljnih sekvenci nukleinskih kiselina, da bi se umanjila ili ugasila elongacija nepoželjne sekvence matrice.

[0083] Prajmer može da bude jednolančana DNK pre vezivanja za matricu nukleinske kiseline. U nekim slučajevima, prajmer u početku obuhvata dvolančanu sekvencu, npr. prajmer može da obrazuje petlju u obliku ukosnice. Prema tome, generalno prajmer je polinukleotid ili oligonukleotid, i prajmeri su često DNK. Međutim, prajmeri prema pronalasku mogu da obuhvate jedan ili više nukleotidnih analoga kao i da sadrže ribonukleinsku kiselinu (RNK).

[0084] Nukleotidni analozi su dobro poznati u oblasti tehnike, i ovde prikazani prajmeri i probe mogu da uključe bilo koji korisni nukleotidni analog. Nukleotidni analozi mogu na primer, da budu nukleotidni analozi koji imaju modifikovanu grupu šećera, nukeotidni analozi zaključanih nukleinskih kiselina (LNA), nukleotidni analozi peptidnih nukleinskih kiselina (PNA), nukleotidni analozi glikolnih nukleinskih kiselina (GNA), nukleotidni analozi treozne nukleinske kiseline (TNA), biciklični i triciklični nukleozidni analozi, fosfonomonoestarske nukleinske kiseline koje uključuju fosfornu grupu u osnovnom lancu, ili policiklična heterociklična jedinjenja, koja mogu da se koriste umesto jedne ili više heterocikličnih baznih ostataka koji se nalaze u prirodi. U drugom izvođenju, prajmer ili proba koja je korišćena u ovde opisanim postupcima i kompozicijama može da obuhvati jedan ili više univerzalnih nukleozida. Neograničavajući primeri univerzalnih nukleozida su 5-nitroindol i inozin.

1

[0085] Prajmeri mogu da budu dizajnirani prema poznatim parametrima kojima se izbegavaju sekundarnih struktura i samo-hibridizacije.

[0086] Prajmeri su komercijalno dostupni iz brojnih dobavljača i mogu da se dobiju pomoću različitih postupaka uključujući ali bez ograničenja kloniranje ogovarajućih sekvenci i direktnu hemijsku sintezu upotrebom postupaka dobro poznatih u oblasti tehnike (Narang et al., Methods Enzymol.68:90 (1979); Brown et al., Methods Enzymol.68:109 (1979)).

Prajmer-H i Prajmer-L

[0087] Postupci i kitovi iz pronalaska uključuju niz prajmera koji obuhvataju prajmer-H i prajmer-L, gde je temperatura topljenja prajmera-H bar 16°C viša od temperature topljenja prajmera-L, i gde prajmer-L sadrži sekvencu komplementarnu sa proizvodom elongacije prajmera-H. Niz prajmera može da obuhvati druge prajmere, na primer kao što je ovde gore u tekstu opisano u odeljku "Niz prajmera", međutim niz prajmera može takođe da sadrži prajmer-H i prajmer-L, pri čemu prajmer-H i prajmer-L su specifično sposobni za umnožavanje ciljne sekvence nukleinske kiseline.

[0088] Prajmer-H je poželjno dizajniran kao prajmer za umnožavanje ciljne sekvence ili sekvence koja je komplementarna sa ciljnom sekvencom. Prema tome, prajmer-H je poželjno sposoban za vezivanje ili sa ciljnom sekvencom nukleinske kiseline ili sa sekvencom koja je komplementarna sa ciljnom sekvencom nukleinske kiseline. Na primer, prajmer-H može da bude sposoban za vezivanje sa komplementarnim lancem ciljne sekvence nukleinske kiseline na 5’-kraju ili blizu 5’-kraja ciljne sekvence nukleinske kiseline, ili prajmer-H može da bude sposoban za vezivanje sa sekvencom ciljne nukleinske kiseline na 3’-kraju ili blizu 3’-kraja ciljne sekvence nukleinske kiseline. Prema tome, prajmer-H može da sadrži sekvencu identičnu sa 5’-krajem ciljne sekvence nukleinske kiseline. Prajmer-H može čak i da se sastoji iz sekvence identične sa 5’- krajem ciljne sekvence nukleinske kiseline. Primer-H takođe može da sadrži sekvencu koja je identična sa ciljnom sekvencom nukleinske kiseline. Prema tome, prajmer-H može da sadrži sekvencu komplementarnu sa 3’-krajem ciljne nukleinske sekvence. Prajmer-H može čak da se sastoji iz sekvence koja je komplementarna sa 3’-krajem ciljne sekvence nukleinske kiseline.

[0089] Slično tome, prajmer-L je poželjno dizajniran kao prajmer za umnožavanje ciljne sekvence ili sekvence koja je komplementarna sa ciljnom sekvencom. Ukoliko je prajmer-H dizajniran za umnožavanje ciljne sekvence, prajmer-L je poželjno dizajniran za umnožavanje sekvence koja je komplementarna sa ciljnom sekvencom i obrnuto. Prema tome, prajmer-L je sposoban za vezivanje sa ili ciljnom sekvencom nukleinske kiseline ili sekvencom koja je komplementarna sa ciljnom sekvencom nukleinske kiseline. Ukoliko je prajmer-H sposoban za vezivanje sa ciljnom sekvencom nukleinske kiseline, onda je prajmer-L poželjno sposoban za vezivanje sa sekvencom koja je komplementarna sa ciljnom sekvencom nukleinske kiseline i obrnuto. Na primer, prajmer-L može da bude sposoban za vezivanje sa komplementarnim lancem ciljne sekvence nukleinske kiseline na 5’-kraju ili blizu 5’-kraja ciljne sekvence nukleinske kiseline, ili prajmer-L može da bude sposoban za vezivanje sa ciljnom sekvencom nukleinske kiseline na 3’-kraju ili blizu 3’-kraja ciljne sekvence nukleinske kiseline. Prema tome, prajmer-L može da sadrži sekvencu identičnu sa 5’-krajem ciljne sekvence nukleinske kiseline. Prajmer-L može čak da se sastoji iz sekvence koja je identična sa 5’-krajem ciljne sekvence nukleinske kiseline. Prajmer-L može takođe da sadrži sekvencu identičnu sa ciljnom sekvencom nukleinske kiseline. Prema tome, prajmer-L može da sadrži sekvencu komplementarnu sa 3’-krajem ciljne sekvence nukleinske kiseline. Prajmer-L može čak da se sastoji iz sekvence koja je komplementarna sa 3’-krajem ciljne sekvence nukleinske kiseline.

[0090] U jednom izvođenju iz pronalaska prajmer-H sadrži ili se sastoji iz nukleotidne sekvence, koja je identična sa sekvencom na 5’-kraju ciljne sekvence nukleinske kiseline i prajmer-L sadrži ili se sastoji iz

1

sekvence koja je identična sa komplementarnom sekvencom na 3’-kraju ciljne sekvence nukleinske kiseline.

[0091] U drugom izvođenju iz pronalaska prajmer-L sadrži ili se sastoji iz nukleotidne sekvence, koja je identična sa sekvencom na 5’-kraju ciljne sekvence nukleinske kiseline i prajmer-H sadrži ili se sastoji iz sekvence koja je identična sa komplementarnom sekvencom na 3’-kraju ciljne sekvence nukleinske kiseline.

[0092] U još drugom izvođenju iz pronalaska prajmer-L se sastoji iz dva dela, jedan deo koji je komplementaran sa ili je identičan sa fragmentom ciljne sekvence nukleinske kiseline i drugi deo koji nije komplementaran ili identičan sa ciljnom sekvencom nukleinske kiselone. Takvi prajmeri takođe mogu ovde da budu naznačeni sa "prajmer-L modifikovan pogrešnim sparivanjem". Pomenuti deo koji je komplementaran ili je identičan sa fragmentom ciljne sekvence nukleinske kiseline može da ima veoma nisku temperaturu topljenja, i mogu da budu naznačeni sa "deo prajmera-L koji nije pogrešno sparen". Deo prajmera-L koji nije pogrešno sparen može obično da se sastoji u opsegu od 7 do 15, nukleotida, na primer u opsegu od 7 do 12 nukleotida. Pomenuti deo koji nije komplementaran ili identičan sa ciljnom sekvencom nukleinske kiseline može da sadrži slučajnu sekvencu i može da bude naznačen sa "delom prajmera-L koji je pogrešno sparen". Pogrešno spareni deo prajmera-L može obićno da se sastoji iz 2 do 8 nukleotida, kao što je u opsegu od 2 do 6 nukleotida, ali može da bude 1 nukleotid ili >8 nukleotida. Ovo može posebno da bude slučaj u izvođenjima iz pronalaska koji obuhvataju korak PCR -a niske temperature kao što je ovde opisano gore u tekstu u odeljku "PCR niske temperature". 3’-kraj pomenutog prajmera-L može na primer da bude baza koja se razlikuje između prave ciljne sekvence nukleinske kiseline blisko homologne sekvence koja nije ciljna. Pogrešno spareni deo, nakon ugrađivanja u novosintetisane nukleinske kiseline i posle sinteze 2og komplementarnog lanca, može da postane odgovarajući region hibridizacije.

[0093] Prajmer-H i prajmer-L su dizajnirani da imaju temperature topljenja kao što je ovde naznačeno. Stručnjak iz oblasti tehnike će biti sposoban da dizajnira prajmer-H i prajmer-L da imaju željenu temperaturu topljenja pomoću prilagođavanja sekvenci prajmera, dužine prajmera i opciono ugrađivanjem nukleotidnih analoga kao što je ovde opisano gore u tekstu u odeljku "Niz prajmera".

[0094] Prajmer-H je dizajniran tako da prajmer-H ima temperaturu vezivanja koja je značajno viša od temperature vezivanja prajmera-L, bar 16°C viša. Prema tome, temperatura topljenja prajmera-H može da bude bar 16°C viša, na primer bar 18°C viša, kao što je bar 20°C viša od temperature topljenja prajmera-L. U nekim izvođenjima poželjno je da je temperatura topljenja prajmera-H bar 30° viša, kao što je u opsegu od 30 do 50.

[0095] Generalno je poželjno da temperatura topljenja prajmera-H je visoka koliko je moguće, ali ne viša od najviše funkcionalne temperature elongacije bar jedne polimeraze nukleinske kiseline. Pomenuta temperatura elongacije ne treba da bude optimalna temperatura za pomenutu polimerazu nukleinske kiseline, ali je poželjno da bar jedna polimeraza nukleinske kiseline bude aktivna na temperaturi topljenja prajmera-H. Prema tome, temperatura topljenja prajmera-H može da dostigne ili čak da pređe preko 80°C.

[0096] Prajmer-H može takođe da sadrži jedan ili više nukleotidnih analoga, na primer bilo koji od ovde opisanih nukleotidnih analoga u odeljku "Niz prajmera". Ugrađivanje nekih nukelotidnih analoga može da poveća temperaturu topljenja, i prema tome, Prajmer-H može posebno da obuhvati nukleotidne analoge, pri čemu ugrađivanje pomenutih nukleotidnih analoga povećava temperaturu topljenja prajmera. Prema tome, Prajmer-H može da obuhvati jedan ili više od LNAs, PNAs, GNAs i/ili TNAs. Na primer, Prajmer-H može da obuhvati u opsegu od 1 do 20, kao što je u opsegu od 1 do 15, na primer u opsegu od 5 do 10 nukleotidnih analoga, na primer LNA.

1

[0097] S obzirom da je takođe poželjno da temperatura topljenja prajmera-L bude dovoljno visoka da se osigura specifično vezivanje prajmera-L sa ciljnom sekvencom nukleinske kiseline/komplementarnom sekvencom ciljne sekvence nukleinske kiseline, i temperatura topljenja prajmera-H treba da bude značajno veća od tempereture topljenja prajmera-H, onda često, temperatura topljenja prajmera-H je bar 60°C. Temperatura topljenja prajmera-H može takođe često da bude 70°C. Temperatura topljenja prajmera-H može na primer da bude u opsegu 60 do 90°C, na primer u opsegu od 60 do 85°C, kao što je u opsegu od 70 do 85°C, na primer u opsegu od 70 do 80°C.

[0098] Temperatura topljenja prajmera-L je poželjno dovoljno visoka da omogući specifično vezivanje prajmera-L sa ciljnom sekvencom nukleinske kiseline/komplementarnom sekvencom ciljne sekvence nukleinske kiseline, ali je takođe značajno niža od temperature topljenja prajmera-H. Često, temperatura topljenja prajmera-L je u opsegu od 30 do 55°C, kao što je u opsegu od 35 do 55°C, poželjno u opsegu od 40 do 50°C.

PCR reagensi

[0099] Postupci iz pronalaska uključuju korake za izvođenje PCR. Stručnjak iz oblasti tehnike je dobro razume kako se izvodi PCR i koji reagensi mogu da budu korisni za izvođenje PCR. Takvi reagensi su ovde naznačeni sa PCR reagensima. Komplet u delovima iz pronalaska takođe sadrži PCR reagense.

[0100] Za većinu svrha PCR reagensi sadrže nukleotide. Prema tome, PCR reagensi mogu da sadrže dezoksinukleozid trifosfate (dNTPs), posebno svaki od četiri dezoksinukleozid trifosfata koji se pojavljuju u prirodi (dNTPs).

[0101] PCR reagensi često sadrže dezoksiribonukleozid trifosfatne molekule, uključujući sve od dATP, dCTP, dGTP, dTTP. U nekim slučajevima dodaje se dUTP.

[0102] PCR reagensi mogu takođe da obuhvate jedinjenja koja su korisna u pomaganju aktivnosti polimeraze nukleinske kiseline. Prema tome, PCR reagens može da sadrži divalentni katjon, npr., magnezijumove jone. Pomenuti magnezijumovi joni mogu da budu dodati u obliku npr. magnezijum hlorida ili magnezijum acetata (MgCl2) ili je korišćen magnezijum sulfat.

[0103] PCR reagensi mogu takođe da obuhvate jedno ili više od sledećih:

- ne-specifična sredstva za blokiranje kao što je BSA ili želatin iz goveđe kože, betalaktoglobulin, kazein, osušeno meko, ili druga poznata sredstva za blokiranje,

- nukleinske kiseline koje blokiraju/ ne-specifičnu pozadinu (npr., DNK sperme lososa),

- biokonzervansi (npr. natrijum azid),

- PCR pojačivači (npr. Betain, Trehaloza, itd.),

- inhibitori (npr. inhibitori RNA-ze).

[0104] PCR reagens takođe može da sadrži druga dodatna sredstva, npr., dimetil sulfoksid (DMSO), glicerol, betain (mono) hidrat (N,N,N-trimetilglicin=[karoksi-metil]trimetilamonijum), trehalozu, 7-Deaza-2’-dezoksiguanozin trifosfat (dC7GTP ili 7-deaza-2’-dGTP), formamid (metanamid), tettrmetilamonijum hlorid (TMAC), druge derivate tetraalkilamonijuma (npr., tetraetiamonijum hlorid (TEA-CI) i tetrapropilamonijum hlorid (TPrACI), ne-jonski deterdžent (npr., Triton X-100, Tween 20, Nonidet P-40 (NP-40)), ili PREXCEL-Q.

[0105] PCR reagensi mogu da sadrže sredstvo za puferovanje.

[0106] U nekim slučajevima, ne-jonski Etilen Oksid/Propilen Oksid blok kopolimer je dodat u vodenu fazu u koncentraciji od oko 0.1%, 0.2%, 0.3%, 0.4%, 0.5%, 0.6%, 0.7%, 0.8%, 0.9%, ili 1.0%. Uobičajena

1

biopovršinska sredstva uključuju ne-jonska površinska sredstva kao što su Pluronic F-68, Tetronics, Zonyl FSN. Pluronic F-68 može da se nalazi u koncentraciji od 0.5% mas/v.

[0107] U nekim slučajevima magnezijum sulfat može da bude zamenjen sa magnezijum hloridom, na sličnim koncentracijama. Širok opseg uobičajenih, komercijalnih PCR pufera od različitih proizvođača mogu da budu zamenjeni sa puferisanim rastvorom.

[0108] Postupci iz pronalaska takođe uključuju upotrebu polimeraze nukleinske kiseline i komplet u delovima iz pronalaska takođe može da sadrži polimerazu nukleinske kiseline. Pomenuta polimeraza nukleinske kiseline može da bude bilo koja polimeraza nukleinske kiseline, kao što je DNK polimeraza. Polimeraza nukleinske kiseline treba da ima aktivnost na temperaturi elongacije.

[0109] U nekim izvođenjima polimeraza nukleinske kiseline je DNK polimeraza sa 5’ do 3’ egzonukleaznom aktivnošću. Ovo može posebno da bude slučaj u izvođenjima iz pronalaska, pri ćemu postupci ili kitovi uključuju upotrebu probe za detekciju, kao što je Taqman proba za detekciju.

[0110] Bilo koja DNK polimeraza, npr., DNK polimeraza sa 5’ do 3’ egzonukleaznom aktivnosti koja katalizuje proširenje prajmera može da se koristi. Na primer, može da se koristi termostabilna DNK polimeraza.

[0111] U jednom izvođenju polimeraza nukleinske kiseline je Taq polimeraza.

Podela PCR reakcija

[0112] Postupci iz pronalaska obuhvataju korak dobijanja podeljenih PCR reakcija. Podeljena PCR reakcija može zatim da bude izložena koraku AIPR koji prati jedan ili više PCR-a kao što je ovde opisano. Dobijanje podeljenih PCR reakcija uključuje deljenje uzorka u višestruke manje frakcije, pri čemu svaka obuhvata niz prajmera, polimerazu nukleinske kiseline, PCR reagense i po potrebi reagense za detekciju.

[0113] Podeljene PCR reakcije mogu da se dobiju brojnim različitim postupcima. Generalno, uključuje deljenje PCR reakcija u fizički i prostorno odvojene kompartmente. Pomenuti kompartmenti mogu da se dobiju brojnim načinima, na primer PCR reakcije mogu da budu podeljene u različite kontejnere. Podeljene PCR reakcije mogu takođe da se dobiju deljenjem PCR reakcije u bunariće na mikrotitarskim pločama. Podeljene PCR reakcije mogu takođe da se dobiju deljenjem PCR reakcije u mikrobunariće, mikrofluidne komore, kapilare, dispergovanu fazu emuzije, komoru (npr., komora u nizu minijaturnih komora), kapljica, ili površina za vezivanje nukleinskih kiselina. Podeljenje PCR reakcije mogu takođe da se dobiju deljenjem PCR reakcije na diskretnim tačkama na čvrstoj podlozi.

[0114] Poželjno je da su PCR reakcije podeljene na način tako da svaka podeljena PCR reakcija sadrži samo mali broj matrica nukleinskih kiselina koje sadrže ciljnu sekvencu nukleinske kiseline. S obzirom da je uzorak slučajno normalno raspoređen u podeljenim PCR reakcijama moguće je da neke reakcije sadrže više matrica nukleinskih kiselina koje sadrže ciljnu sekvencu nukleinske kiseline od drugih. U stvari, neke od podeljenih PCR reakcija mogu da ne sadrže matrice nukleinskih kiselina koje sadrže ciljnu sekvencu nukleinske kisleine, pri čemu druge mogu da sadrže nekoliko kopija. Ukoliko su kopije matrice nukleinske kiseline raspoređene nasumično između particija, neke particije ne treba da sadrže kopije, druge samo jednu kopiju, i, ukoliko je broj particija dovoljno veliki, druge još treba da sadrže dve kopije, tri kopije, i čak veći broj kopija. Verovatnoća nalaženja tačno 0, 1, 2, 3, ili više kopija u particiji, na osnovu date prosečne koncentracije matrice nukleinske kiseline u particijama, je opisana sa Poasnovom raspodelom. Neki uzorci neke sadržati matrice nukleinskih kiselina koje sadrže ciljnu sekvencu, i u takvim izvođenjima takođe nijedna od podeljenih particija PCR neće sadržati matricu nukleinske kiseline koja sadrži ciljnu sekvencu.

2

[0115] U jednom izvođenju podeljenje PCR reakcije svaka sadrži najviše 10, kao što je najviše 5 matrica nukleinskih kiselina koje obuhvataju ciljnu sekvencu nukleinske kiseline.

[0116] Jedan veoma koristan postupak za dobijanje podeljenih PCR reakcija je pomoću dobijanja zatvorenih kapljica reakcije, pri čemu svaka kapljica sadrži podeljenu PCR reakciju. Prema tome, podeljene PCR reakcije mogu svaka da se nađu u kapljicama koje su dobijene upotrebom generatora kapljica.

[0117] Veličina takvih kapljica može da se razlikuje, ali podeljene PCR reakcije mogu na primer svaka da se nalaze u kapljici zapremine u opsegu od 1 do 10,000 pikolitara, na primer približno 1000 pikolitara.

[0118] Ovde korišćene kapljice mogu da uključe kompozicije emulzije (ili smeše dve ili više tečnosti koje se ne mešaju) na primer kao što je opisano u U.S. Pat. No. 7,622,280 ili kao što je opisano u Primerima ovde u tekstu ispod. Kapljice mogu da se dobiju pomoću sprava koje su opisane u WO/2010/036352. Termin emulzija, kao što se ovde koristi, može da označi smešu nemešljivih tečnosti (kao što su ulje i voda). Uljana faza i/ili emulzije vode u ulju omogućavaju kompartmentalizaciju reakcionih smeša unutar vodenih kapljica. Emulzije mogu da sadrže vodene kapljica unutar kontinuirane uljane faze. Ovde obezbeđene emulzije mogu da budu emulzije ulja u vodi, pri čemu su kapljice uljane kapljice unutar kontinutirane vodene faze. Ovde korišćene kapljice su normalno dizajnirane da spreče mešanje između kompartmenata, pri čemu svaki kompartment štiti svoj sadržaj od isparavanja i slepljivanja sa sadržajima iz drugih kompartmenata.

[0119] Mogu da se dobiju kapljice koje imaju prosečan prečnik od oko, manje od oko, ili više od oko, ili bar oko 0.001, 0.01, 0.05, 0.1, 1, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 100, 120, 130, 140, 150, 160, 180, 200, 300, 400, ili 500 mikrona. Kapljice mogu da imaju prosečan prečnik od oko 0.001 do oko 500, oko 0.01 do oko 500, oko 0.1 do oko 500, oko 0.1 do oko 100, oko 0.01 do oko 100, ili oko 1 do oko 100 mikrona. Mikrofluidni postupci za proizvodnju kapljica emulzije upotrebom fokusiranja sa mikrokanalskim unakrsnim tokom ili fizičkom agitacijom su poznati da proizvode ili monodisperzne ili polidisperzne emulzije. Kapljice mogu da budu monodisperzne kapljice. Kapljice mogu da se dobiju tako da se veličina kapljica ne razlikuje za više od plus ili minus 5% prosečne veličine kapljica. U nekim slučajevima, kapljice su dobijene tako da se veličina kapljica ne razlikuje za više od plus ili minus 2% prosečne veličine kapljica. Generator kapljica može da stvori populaciju kapljica iz jednog uzorka, pri čemu se nijedna od kapljica ne razlikuje u veličini za više od plus ili minus oko 0.1%, 0.5%, 1%, 1.5%, 2%, 2.5%, 3%, 3.5%, 4%, 4.5%, 5%, 5.5%, 6%, 6.5%, 7%, 7.5%, 8%, 8.5%, 9%, 9.5%, ili 10% srednje veličine ukupne populacije kapljica.

[0120] Veća mehanička stabilnost može da bude korisna za mikrofluidne manipulacije i fluidnom obradom sa većim smicanjem (npr., u mikrofluidnim kapilarima ili kroz 90 stepeni okreta, kao što su talasi, u fluidnim stazama). Pre- i posle-termalno tretirane kapljice ili kapsule mogu da budu mehanički stabilne za standarne manipulacije pipetom i centrifugiranjem.

[0121] Kapljice mogu da budu polidisperzne ili monodisperzne, dobijene agitacijom, izlaganjem ultrazvučnim talasima ili mikrofluidno preko veze sa T-kanalom ili drugim sredstvima koja su poznata u oblasti tehnike.

[0122] Kapljice mogu da se obrazuju protokom uljane faze preko vodenog uzorka. Vodena faza može da sadrži puferisani rastvor i reagense za izvođenje PCR reakcije, uključujući nukleotide, prajmere, probe za detekciju fluorescencije, matrice nukleinskih kiselina, enzim DNK polimerazu, i opciono, enzim reverznu transkriptazu.

[0123] Vodena faza generalno sadrži uzorak, PCR reagense, polimerazu nukleinske kiseline, niz prajmera i po potrebi reagense za detekciju.

[0124] Uljana faza može da sadrži fluorisano bazno ulje koje dodatno može da bude stabilisano sa kombinacijom sa fluorisanim površinski aktivnim sredstvom kao što je perfluorisani polietar. U nekim slučajevima, bazno ulje može da bude jedno ili više od HFE 7500, FC-40, FC-43, FC-70, ili druga poznata fluorisana ulja. U nekim slučajevima, anjonsko površinski aktivno sredstvo je Amonijum Krytox (Krytox-AM), amonijumova so Krytox FSH, ili morfolino derivat Krytox-FSH.

[0125] Uljana faza dalje može da sadrži dodatno sredstvo za podešavanje svojstva ulja, kao što je pritisak pare ili viskozitet ili površinska tenzija. Primeri koji ne ograničavaju uključuju perfluoro-oktanol i 1H, 1H,2H,2H-Perfluorodekanol.

[0126] Emulzija može da bude formulisana da proizvede visoko monodisperzne kapljice koji imaju sličan tečnosti međuprostorni film koji može da se konvertuje zagrevanjem u mikrokapsulama koje imaju sličan čvstom međuprostorni film; takve mikrokapsule mogu da se ponašaju kao bioreaktori koji su sposobni da zadrže njihove sadržaje kroz reakcioni proces kao što je umnožavanje sa AIPR ili PCR. Konverzija u oblik mikrokapsule može da se dogodi nakon zagrevanja. Na primer, takva konverzija može da se dogodi na temperaturi koja je veća od oko 50, 60, 70, 80, 90, ili 95 stepeni Celzijusa. U nekim slučajevima ovo zagrevanje se događa korišćenjem uređaja (eng. thermocycler). Tokom procesa zagrevanja, prekrivanje tečnim ili mineralnim uljem može da se koristi za sprečavanje isparavanja. Biokompatibilne kapsule mogu da budu rezistentne na koalescenciju i/ili flokulaciju preko širokog opsega termalnog i mehaničkog obrađivanja.

[0127] U nekim slučajevima, kapljica se dobija korišćenjem komercijalno dostupnog generatora kapljica, kao što je Bio-Rad QX100™ Droplet Generator. AIPR i PCR mogu da se izvedu korišćenjem komercijalno dostupnog aparata, i kapljice mogu da se analiziraju upotrebom komercijalno dostupnog čitača kapljica kao što je generator, kao što je Bio-Rad QX100™ Droplet Reader.

Asimerična pojedinačna polimerazna reakcija

[0128] Postupci iz pronalaska obuhvataju korak asimetrične pojedinačne (postepene) polimerazne reakcije (AIPR). Važno je da se AIPR izvede pre bilo kog koraka eksponencijalnog PCR. Prema tome, genralno, korak e) je izveden pre koraka f). AIPR obuhvata korake:

i. inkubacije podeljenih PCR reakcija na temperaturi denaturacije, pri čemu se vrši denaturacija DNK do jednolančanih molekula

ii. inkubacije podeljenih PCR reakcija na visokoj temperaturi vezivanja pri čemu se omogućava vezivanje prajmera-H, ali ne prajmera-L,

iii. opciono inkubacije podeljenih PCR reakcija na temperaturi elongacije,

iv. opciono ponavljanja koraka i do iii.

[0129] Generalno, AIPR je asimetrična reakcija koja dovodi do umnožavanja samo jednog lanca ciljne nukleinske kiseline. Prema tome, poželjno PCR reakcija ne sadrži bilo koji drugi prajmer, koji je zajedno sa prajmerom-H sposoban za umnožavanje ciljne sekvence nukleinske kiseline, pri čemu pomenuti drugi prajmer ima temperaturu topljenja koja je slična sa ili je veća od temperature topljenja prajmera-H. U izvođenjima iz pronalaska, gde niz prajmera obuhvata brojne prajmere-H it poželjno je da PCR reakcija ne sadrži bilo koje druge prajmere, koji zajedno sa bilo kojim prajmeom-H su sposobne da umnože bilo koje od ciljnih sekvenci nukleinskih kiselina, pri čemu pomenuti drugi prajmeri imaju temperaturu topljenja koja je slična sa ili je veća od temperature topljenja prajmera-H. Poželjne temperature topljenja prajmera su opisane u odeljku "Set prajmera" i "Prjamer-L i Prajmer-H". Prema tome, na visokoj temperaturi vezivanja samo prajmer-H će hibridizovati što će dovesti do polimerizacije samo sa prajmera-H. Prema tome, brojne runde AIPR vode do umnožavanja samo jednog lanca ciljne sekvence nukleinske kiseline, i AIPR je prema tome, u suštini linearno umnožavanje.

[0130] Često, polimeraza nukleinske kiseline ima aktivnost elongacije na visokoj temperaturi vezivanja prajmera. U takvim izvođenjima visoka temperatura vezivanja može takođe da se smatra temperaturom elongacije čak iako visoka temperatura vezivanja nije temperaturni optimum za polimerazu nukleinske kiseline. Prema tome, AIPR može da obuhvati dva koraka, koji se ponavljaju, tj. korak denaturacije inkubacijom na temperaturi na kojoj se izvodi denaturacija, i kombinovani korak vezivanja i elongacije prajmera-H inkubacijom na visokoj temperaturi vezivanja. U pomenutim izvođenjima, prajmer-H je poželjno dizajniran da ima temperaturu topljenja, na temperaturi na kojoj polimeraza nukleinske kiseline ima dovoljno aktivnosti da katalizuje elongaciju prajmera-H.

[0131] Prema tome, AIPR iz koraka e) može da obuhvata korake:

i. inkubacije podeljenih PCR reakcija na temperaturi denaturacije, pri čemu se vrši denaturacija DNK do jednolančanih molekula

ii. inkubacije podeljenih PCR reakcija na visokoj temperaturi vezivanja pri čemu se omogućava vezivanje prajmera-H, ali ne prajmera-L, pri čemu je visoka temperatura vezivanja takođe temperatura elongacije, pri čemu se omogućava proširenje vezanog prajmera-H;

iii. ponavljanje koraka i do ii,

[0132] U drugim izvođenjima iz pronalaska, temperatura topljenja prajmera-H je različita u odnosu na temperaturu elongacije. U takvim izvođenjima, AIPR iz koraka e) može da obuhvata korake:

i. inkubacije podeljenih PCR reakcija na temperaturi denaturacije, pri čemu se vrši denaturacija DNK do jednolančanih molekula

ii. inkubacije podeljenih PCR reakcija na visokoj temperaturi vezivanja pri čemu se omogućava vezivanje prajmera-H, ali ne prajmera-L,

iii. inkubacije podeljenih PCR reakcija na temperaturi elongacije, pri čemu se omogućava elongacija vezanog prajmera-H,

iv. ponavljanje koraka i do iii.

[0133] Korak i. inkubiranja podeljenih PCR reakcija na temperaturi denaturacije, se izvodi dovoljno dugo da se DNK denaturiše do to jednolančanih molekula. Moguće je da je korak i. izveden tokom dužeg perioda tokom prvog ciklusa AIPR nego u kasnijim ciklusima. Stručnjak iz oblasti tehnike će biti sposoban da odabere odgovarajuća vremena za inkubaciju na temperaturi denaturacije. U prvom ciklusu denaturacija na temeperaturi na kojoj se izvodi denaturacija može na primer da bude u opsegu od 0.5 do 10 min (na primer za DNK polimeraze sa vrućim početkom), gde u ciklusima koji slede inkubacija na temperaturi denaturacije na primer može da bude u opsegu od 0.1 do 2 min.

[0134] Slično, stručnjak iz oblasti tehnike će biti sposoban da izbere odgovarajuća vremena za inkubaciju na visokoj temperaturi vezivanja/temperaturi elongacije. U poslednjem ciklusu inkubacija na temperaturi elongacije može da bude duža nego u drugim ciklusima, na primer u opsegu od 0.5 do 10 min, dok u drugim ciklusima inkubacija na temperaturi elongacije na primer može da bude u opsegu od 0.1 do 2 min. Kao što je gore istaknuto, onda visoka temperatura vezivanja može da bude ista kao temperatura elongacije. U izvođenjima u kojima je visoka temperatura vezivanja različita od temperature elongacije, onda inkubacija na temperaturi vezivanja može na primer da bude u opsegu od 0.1 do 2 min.

[0135] Koraci i do ii mogu da budu ponovljeni odgovarajući broj puta. Generalno, koraci i do ii su ponovljeni dovoljan broj puta da se osigura veoma nisko do odsustvo pojave lažno pozitivnih signala.

2

Na primer, koraci i. do ii. mogu da budu ponovljeni u opsegu od 8 do 256 puta, poželjno u opsegu od 16 do 128 puta, na primer u opsegu od 32 do 128 puta, na primer približno 64 puta, kao što je 64 puta.

[0136] U izvođenjima iz pronalaska, u kojima su visoka temepratura vezivanja prajmera i temperatura sinteze komplementarnih lanaca različite onda koraci i. do iii. mogu mogu da budu ponovljeni u opsegu od 8 do 256 puta, poželjno u opsegu od 16 do 128 puta, na primer u opsegu od 32 do 128 puta, na primer približno 64 puta, kao što je 64 puta.

[0137] Poželjno je da se tokom AIPR, izvodi samo postepeno kopiranje. Drugim rečima poželjno je da samo jedan lanac ciljne nukleinske kiseline služi kao matrica za kopiranje tokom AIPR. Ukoliko se prajmer-H vezao za sekvencu koja je komplementarna sa ciljnom sekvencom nukleinske kiseline, onda je poželjno da samo lanac koji sadrži ciljnu sekvencu nukleinske kiseline bude sintetisan tokom AIPR. S obzirom na to da je AIPR monodirekcionalan, pomenuti lanci mogu da imaju različite dužine, ali oni poželjno obuhvataju bar sekvencu ciljne nukleinske kiseline. U ovom izvođenju, sekvenca koja je komplementarna sa ciljnom sekvencom nukleinske kiseline, poželjno nije sintetisana tokom faze AIPR. Slično tome, ukoliko se prajmer-H vezao za ciljnu sekvencu nukleinske kiseline, onda je poželjno da samo jedan lanac koji obuhvata sekvencu koja je komplementarna sa ciljnom sekvencom nukleinske kiseline bude sintetisan tokom AIPR. S obzirom da je AIPR monodirekcionalan, pomenuti lanci mogu da imaju različite dužine, ali oni poželjno sadrže bar sekvencu komplementarnu sa ciljnom sekvencom nukleinske kiseline. U ovom izvođenju ciljna sekvenca nukleinske kiseline poželjno nije umnožena tokom AIPR.

[0138] Prema tome, u jednom izvođenju iz pronalaska korak e) dovodi do elongacije prajmera-H, ali se ne može detektovati elongacija prajmera-L. Na primer, korak e) može da dovede do elongacije prajmera-H, ali bez elongacije prajmera-L.

[0139] U jednom izvođenju korak e) dovodi do elongacije prajmera-H, ali se ne može detektovati elongacija bilo kog drugog prajmera. Na primer, korak e) može za rezultat da ima elongaciju prajmera-H, ali bez elongacije bilo kog drugog prajmera.

[0140] Visoka temperatura vezivanja je izabrana da se omogući hibridizacija prajmera-H, ali ne prajmera-L. Prema tome, poželjno je da je visoka temperatura vezivanja podešena da bude značajno veća od temperature topljenja prajmera-L. Prema tome, visoka temperatura vezivanja u koraku e) može da bude bar 10°C veća, poželjno bar 15°C veća, na primer bar 20°C, kao što je bar 25°C veća od temperature topljenja prajmera-L.

[0141] Visoka temperatura vezivanja može na primer da bude podešena da bude približna temperaturi topljenja prajmera-H. Treba međutim da bude nešto niža.

PCR niske temperature

[0142] U nekim izvođenjima iz prikaza postupci obuhvataju korak PCR-a niske temperature, koji se izvodi nakon završetka AIPR i pre eksponencijalnog PCR-a.

[0143] U takvim izvođenjima prajmer-L je obično prajmer-L modifikovan sa pogrešnim spajanjem kao što je ovde opisano.

[0144] Ovo posebno može da bude koristan u nezgodnim ciljevima (na primer, cilj sa veoma homolognom sekvencom na drugom mestu u genomu, kao što je pseudogen), ovaj prajmer-L modifikovan pogrešnim spajanjem može da omogući upotrebu kraćeg prajmera-L koji je specifičniji za pravi cilj.

[0145] PCR sa niskom temperaturom obično uključuje korake:

1) inkubacije podeljenih PCR reakcija na temperaturi denaturacije, čime se DNK denaturiše do jednolančanih molekula

2) inkubacije PCR na veoma niskoj temperaturi za vezivanje čime se omogućava vezivanje oba prajmera-H i dela prajmera-L koji nije pogrešno sparen,

3) inkubacije PCR na temperaturi elongacije čime se omogućava sinteza komplementarnih lanaca svih vezanih prajmera

4) opciono ponavljanja koraka 1) do 3), pri čemu se dobija PCR proizvod.

[0146] Ovaj korak će omogućiti umnožavanje proizvoda koji ugrađuje pogrešno spareni deo prajmera-L. Jednom kada je dovoljno pomenutog proizvoda dostupno, onda normalni eksponencijalni PCR može da se izvede korišćenjem niske temperature vezivanja, koja na primer može da bude približna temperaturi topljenja prajmera-L.

[0147] Generalno, veoma niska temperatura topljenja je niska od niže temperature vezivanja. Obično, veoma niska temperatura vezivanja je bar 5°C, poželjno bar 10°C, poželjnije bar 15°C, kao što je bar 20°C niža u odnosu na nisku temperaturu vezivanja. Na primer, veoma niska temperatura vezivanja je u opsegu od 5 do 30°C niža od niske temperature vezivanja, na primer veoma niska temperatura vezivanja može da bude u opsegu od 20 do 25°C niža od niske temperature vezivanja. Prema tome, veoma niska temperatura vezivanja može da bude bar 20°C niža, na primer bar 25°C, kao što je bar 30°C, na primer bar 35°C niža od temperature topljenja prajmera-H.

[0148] Obično, koraci 1) do 3) mogu da budu ponovljeni više od jednom, na primer u opsegu od 1 do 40. Na primer, koraci 1) do 3) mogu da budu ponovljeni u opegu od 2 do 10 puta, na primer 4 do 6 puta. Često je poželjno da ukupni broj ciklusa PCR izvedenih tokom niske temperature PCR i eksponencijalnog PCR su u opsegu od 20 do 40, kao što je u opsegu od 20 do 30. Prema tome, u zavisnosti od toga koliko mnogo puta su ponovljeni koraci I do III eksponencijalnog PCR, koraci 1) do 3) niske temperature PCR mogu da budu ponovljeni da se dostigne ukupan broj ciklusa u opsegu od 20 do 40, kao što je u opsegu od 20 do 30.

Eksponencijalni PCR

[0149] Postupci iz pronalaska obuhvataju korak izvođenja reakcije polimerizacije lanaca (PCR). Da bi se ovaj korak razlikovao od AIPR, ovaj korak takođe može da bude naznačen sa "eksponencijalni PCR". IU postupcima iz pronalaska, reakcija polimerizacije lanaca se izvodi nakon AIPR. Eksponencijalni PCR može generalno da obuhvati korake:

I. inkubacije podeljenih PCR reakcija na temperaturi denaturacije, pri čemu se DNK denaturiše do jednolančanih molekula

II. inkubacije PCR na niskoj temperaturi vezivanja koji omogućava vezivanja oba prajmera-H i prajmera-L,

III. inkubacije PCR na temperaturi elongacije pri čemu se omogućava ekstenzija svih vezanih prajmera

IV. opciono ponavljanja koraka I do III, pri čemu se dobija PCR proizvod.

[0150] Inkubacija na niskoj temperaturi vezivanja poželjno omogućava vezivanje oba prajmera para prajmera specifično sposbnih za umnožavanje ciljne sekvence nukleinske kiseline. Prema tome, eksponencijalni PCR će za rezultat imati oba lanca ciljne sekvence nukleinske kiseline. U teoriji pomenuto umnožavanje će biti eksponencijalno, i prema tome može da bude naznačeno sa "eksponencijalni PCR", čak iako je u praksi moguće da nije u potpunosti eksponencijalno.

[0151] Eksponencijalni PCR može da se izvede na bilo koji način, na primer na bilo koji pogodni način za izvođenje PCR koji je poznat stručnjaku iz oblasti tehnike.

2

[0152] Korak I. inkubacije podeljenih PCR reakcija na temperaturi denaturacije, se izvodi dovoljno dugo da se DNK denaturiše do jednolančanih molekula. Moguće je da se korak I. izvodi duže vreme tokom prvog ciklusa PCR nego u odnosu na kasnije cikluse. Stručnjak iz oblasti tehnike će biti sposoban da odabere odgovarajuća vremena inkubaciju na temperaturi denaturacije. U prvom ciklusu inkubacija na temperaturi denaturacije može na primer da bude u opsegu od 0.5 do 10 min, pri čemu u sledećim ciklusima inkubacija na temperaturi denaturacije na primer može da bude u opsegu od 0.1 do 2 min.

[0153] Slično, stručnjak iz oblasti tehnike će biti sposoban da izabere odgovarajuća vremena za inkubaciju na niskoj temperaturi vezivanja. Na primer inkubacija na niskoj temperaturi vezivanja bi mogla da bude na primer u opsegu od 0.1 do 2 min.

[0154] Slično tome, stručnjak iz oblasti tehnike će bit sposoban da izabere odgovarajuća vremena za inkubaciju na temperaturi elongacije. U poslednjem ciklusu, inkubacija na temperaturi elongacije može da bude duža nego u drugim ciklusima, na primer u opsegu od 0.5 do 10 min, pri čemu u drugim ciklusima inkubacija na temperaturi elongacije može na prime da bude u opsegu od 0.1 do 2 min.

[0155] Koraci I do III mogu da budu ponovljeni za odgovarajući broj puta. Generalno, poželjno je da koraci I do III nisu ponovljeni previše veliki broj puta da bi se smanjio rizik od lažno pozitivnih signala. Na primer korak f) može da obuhvati ponavljajuće korake I. do III. Za u opsegu od 15 do 60 puta, poželjo za u opsegu od 20 do 40 puta, na primer za u opsegu od 20 do 30 puta, na primer u opsegu od 25 do 30 puta.

[0156] U izvođenjima iz pronalaska, gde niz prajmera obuhvata dodatne prajmere pored prajmera-H i prajmera-L, zatim pomenuti dodatni prajmeri u nekim izvođenjima mogu takođe da sse vežu sa njihovom matricom na niskoj temperaturi vezivanja.

[0157] Prema tome, u jednom izvođenju pronalaska korak f) za rezultat ima elongaciju prajmera-H i prajmera-L. U drugom izvođenju iz pronalaska, korak f) za rezultat ima elongaciju svih prajmera iz niza prajmera.

[0158] Niska temperatura vezivanja je izabrana tako da prajmer-L može da se veže za ciljnu sekvencu nukleinske kiseline. Prema tome, niska temperatura vezivanja može na primer da bude podešena da bude približno temperaturi topljenja prajmera-L. Takođe, može da bude nešto niža.

[0159] Primeri PCR postupaka koji mogu da se koriste za eksponencijalni PCR uključuju, ali nisu ograničeni na, kvantitativni PCR, kvantitativni fluorescentni PCR (QF-PCR), višestruki fluorescentni PCR (MF-PCR), PCR u realnom vremenu (RT-PCR), jednoćelijski PCR, PCR polimorfizama dužine restrikcionih fragmenata (PCR-RFLP), PCR-RFLP/RT-PCR-RFLP, ’hot start’ PCR , ’nested’ PCR, in situ ’polony’ PCR, in situ ’rolling circle’ (RCA), digitalni PCR (dPCR), digitalni PCR u kapljicama (ddPCR), ’bridge’ PCR, pikotiterski PCR, i emulzioni PCR.

Detekcija

[0160] Postupci iz pronalaska obuhvataju korak detekcije, da li PCR proizvod sadrži varijantu sekvence i/ili ciljnu sekvencu nukleinske kiseline. Pomenuta detekcija može da se postigne na bilo koji način koji je poznat stručnjaku iz oblasti tehnike. Na primer u oblasti tehnike su poznati brojni načini za detekciju, koji mogu da se koriste sa postupcima iz pronalaska.

[0161] U jednom izvođenju iz pronalaska, pomenuta detekcija uključuje da podeljene PCR reakcije sadrže reagens za detekciju. Pomenuti reagens za detekciju može da bude bilo koji reagens koji može da se detektuje, na primer može da bude jedinjenje koje sadrži obeleživač koji može da se detektuje,

2

pri čemu pomenuti obeleživač koji može da se detektuje na primer može da bude boja, radioaktivna aktivnost, fluorofora, teški metal ili bilo koji drugi obeleživač koji može da se detektuje.

[0162] Često reagens za detekciju sadrži fluorescentno jedinjenje.

[0163] U jednom izvođenju iz pronalaska reagens za detekciju sadrži ili se sastoji iz proba za detekciju. Probe za detekciju poželjno sadrže ili se sastoje iz nukleotidnih oligomera ili polimera, koji mogu opciono da sadrže nukleotidne analoge, kao što su bilo koji od ovde gore opisanih nukleotidnih analoga u odeljku "Niz prajmera". Često, proba za detekciju može da bude DNK oligomer. Obično, proba za detekciju je povezana sa obeleživačem koji se može detektovati, na primer preko kovalentne veze. Obeleživač koji se može detektovati može da bude bilo koji od prethono pomenutih obeleživača koji se mogu detektovati, ali često je to fluorofora. Poželjno da proba ne bude specifično sposobna za umnožavanje ciljne nukleinske kiseline zajedno sa Prajmerom-H. Na primer, ukoliko Prajmer-H sadrži sekvencu koja je identična sa fargmentom ciljne sekvence, onda proba(e) mogu da sadrže sekvencu koja je identična sa drugim fragmentom ciljne sekvence. Ukoliko Prajmer-H sadrži sekvencu koja je komplementarna sa fragmentom ciljne sekvence, onda proba(e) mogu da sadrže sekvencu koja je komplementarna sa drugim fragmentom ciljne sekvence.

[0164] Proba za detekciju je generalno sposobna da se specifično veže za ciljnu sekvencu nukleinske kiseline. Na primer proba za detekciju može da bude sposoba da se specifično veže sa ciljnom sekvencom nukleinske kiseline koja sadrži varijantu sekvence. Prema tome, proba za detekciju može da bude sposobna da hibridizuje sa ciljnom sekvencom nukleinske kiseline ili sa sekvencom koja je komplementarna sa ciljnom sekvencom nukleinske kiseline. Prema tome, proba za detekciju može da sadrži sekvencu koja je identična sa fragmentom ciljne sekvence nukleinske kiseline ili sekvencom koja je komplementarna sa ciljnom sekvencom nukleinske kiseline. Generalno je poželjno da proba za detekciju obuhvata sekvencu koja je različita od sekvence bilo kog prajmera od niza prajmera.

[0165] Detekciona proba(e) su dizajnirane sa imaju odgovarajuću temperaturu topljenja. U jednom izvođenju temperatura topljenja bar jedne probe za detekciju je značajno niža od temperature topljenja prajmera-H. Na primer, temperatura topljenja svih proba za detekciju je značajno niža od temperature topljenja prajmera-H. Prema tome, th temperatura topljenja bar jedne probe za detekciju može da bude bar 12°C niža, poželjno bar 14°C niža, još poželjnije bar 16°C niža, još više poželjno 18°C niža, kao što je bar 20°C niža, na primer u opsegu od 15 do 25°C, kao što je u opsegu od 30 do 40°C, ili čak do 45°C niža od temperature topljenja prajmera-H. Na primer, temperatura topljenja svih proba za detekciju može da bude bar 12°C niža, poželjno bar 14°C niža, još poželjnije bar 16°C niža, još više poželjno 18°C niža, kao što je 20°C niža, na primer u opsegu 15 do 45°C niža od temperature topljenja prajmera-H. Međutim, probe sa višom temperaturom topljenja mogu takođe da se primene .

[0166] Temperatura topljenja detekcione proba(e) je poželjno dovoljno visoka da osigura specifično vezivanje proba za detekciju, ali je značajno niža od temperature topljenja prajmera-H. Često, temperatura topljenja proba za detekciju može da bude slična sa temperaturom topljenja prajmera-L. Na primer temperatura topljenja bar jedne probe za detekciju može da bude ista kao temperatura topljenja prajmera-L /- 10°C, kao što je ista kao temperatura topljenja prajmera-L /- 5°C, na primer približno ista kao temperatura topljenja prajmera-L. U drugim izvođenjima temperatura toljenja probe može da bude veća od temperature topljenja Prajmera-L, na primer 15 do 20°C veća od temperature topljenja Prajmera-L. Prema tome, proba za detekciju može na primer da ima temperaturu topljenja u opsegu od 35 do 60°C, kao što je u opsegu od 35 do 55°C, poželjno u opsegu od 40 do 50°C.

[0167] Često, poželjno je da proba za detekciju obezbedi različiti signal za detekciju u zavisnosti od prisustva ciljne sekvence nukleinske kiseline. Ovo može da se postigne brojnim različitim načinima.

2

[0168] U jednom izvođenju proba za detekciju je povezana sa bar jednom fluoroforom i bar jednim prigušivačem, koji je sposoban da ugasi signal fluorofore, pri čemu pomenuta proba za detekciju nije vezana za svoju ciljnu sekvencu. Prema tome, fluorescencija pomenute fluorofor neće moći da se detektuje. Međutim, ukoliko se proba za detekciju veže za ciljnu sekvencu nukleinske kiseline/sekvencu koja je komplementarna sa ciljnom sekvencom nukleinske kiseline, onda ovo dovodi do toga da prigušivač postane dovoljno daleko udaljen od fluorofore da bi se ukinulo gašenje čime se omogućava da se detektuje fluorescencija fluorofore. Uklanjanje prigušivača od fluorofore može da se postigne različitim načinima. Na primer, PCR može da koristi polimerazu nukleinske kiseline koja ima 5’ ka 3’ egzonukleaznu aktivnost. Nakon elongacije bilo koja vezana proba će biti degradirana sa pomenutom 5’ ka 3’ egzonukleaznom aktivnošu čime se fluorofora odvaja od prigušivača. Takođe je moguće da proba za detekciju promeni 3D konformaciju nakon vezivanja što dovodi do toga da se prigušivač ukloni iz fluorofore.

[0169] U jednom izvođenju iz pronalaska podeljene PCR reakcije mogu da sadrže reagens za detekciju, koji je varijanta probe za detekciju. Varijanta probe za detekciju je proba za detekciju kao što je opisano gore u tekstu, koja je sposobna da hibridizuje sa ciljnom sekvencom nukleinske kiseline koja sadrži varijantu sekvence sa značajno većim afinitetom u odnosu na ciljnu sekvencu nukleinske kiseline koja ne sadrži varijantu sekvence.

[0170] U jednom izvođenju iz pronalaska podeljene PCR reakcije svaka sadrži reagens za detekciju koji je proba za detekciju divljeg tipa. Proba za detekciju divljeg tipa je proba za detekciju kao što je opisano gore u tekstu koja je sposobna da hibridizuje sa ciljnom sekvencom nukleinske kiseline koja ne sadrži varijantu sekvence. Može biti poželjno da je proba za detekciju divljeg tipa sposobna da hibridizuje sa ciljnom sekvencom nukleinske kiseline koja ne sadrži varijantu sekvence sa značajno većim afinitetom u odnosu na ciljnu sekvencu nukleinske kiseline koja sadrži varijantu sekvence. U izvođenjima koji su povezani sa detekcijom prisustva ciljne sekvence nukleinske kiseline, onda podeljene PCR reakcije može svaka da sadrži reagens za detekciju koji je proba za detekciju divljeg tipa. U takvom izvođenju, može biti dovoljno da podeljene PCR reakcije sadrže samo jednu probu za detekciju. Na primer, PCR reakcije mogu da sadrže probu za detekciju divljeg tipa kao jedinu probu za detekciju ili PCR reakcije mogu da sadrže varijantu probe za detekciju kao jedinu probu za detekciju.

[0171] U jednom izvođenju iz pronalaska, svaka podeljena PCR reakcija sadrži obe, varijantu probe za detekciju i probu za detekciju divljeg tipa. Ovo posebno može da bude slučaj u izvođenjima koji su povezani sa detekcijom varijante sekvence u ciljnoj sekvenci nukleinske kiseline.

[0172] Varijanta probe za detekciju može da bude povezana sa bar jednom fluoroforom i bar jednim prigušivačem, pri čemu je prigušivač sposoban da ugasi fluorescenciju fluorofore. Poželjno, prigušivač i fluorofora su vezani sa varijantom probe za detekciju na način, tako da je prigušivač sposoban da ugasi fluorescenciju fluorofore, kada se proba nalazi u svom slobodnom stanju. Prema tome, često su fluorofora i prigušivač pozicionirani blisko jedno drugom, tako da je prigušivač sposoban da ugasi fluorescenciju fluorofore. Često, fluorofora i prigušivač su povezani sa različitim nukleotidima u varijanti probe za detekciju.

[0173] Proba za detekciju divljeg tipa može da bude povezana sa bar jednom fluoroforom i bar jednim prigušivačem, pri čemu je prigušivač sposoban da ugasi fluorescenciju fluorofore. Poželjno, prigušivač i fluorofora su vezani sa divljim tipom probe za detekciju na način, , tako da je prigušivač sposoban da ugasi fluorescenciju fluorofore, kada se proba nalazi u svom slobodnom stanju. Prema tome, često su fluorofora i prigušivač pozicionirani blisko jedno drugom, tako da je prigušivač sposoban da ugasi fluorescenciju fluorofore. Često, fluorofora i prigušivač su povezani sa različitim nukleotidima u divljem tipu probe za detekciju.

2

[0174] U izvođenjima iz pronalaska koja koriste i varijantu probe za detekciju i divlji tip probe za detekciju, onda varijanta probe za detekciju može da bude povezana sa različitom fluoroforom u odnosu na divlji tip probe za detekciju. Posebno, varijanta probe za detekciju može da bude povezana sa bar jednom fluoroforom, koja fluorescira, koja se razlikuje od fluorescencije svih drugih fluorofora povezanih sa divljim tipom probe za detekciju. Slično, varijanta divljeg tipa probe za detekciju može da bude povezana sa bar jednom fluoroforom, koja fluorescira, koja se razlikuje od fluorescencije svih drugih fluorofora povezanih sa varijantom probe za detekciju.

[0175] Korak g) postupaka iz pronalaska može da uključi detekciju fluorescencije sa varijante probe za detekciju. Prema tome, korak g) može da obuhvati detekciju fluorescenciju fluorofore koja je povezana sa varijantom probe za detekciju. Ovo može na primer da bude slučaj u izvođenjima iz pronalaska, u kojima:

• varijanta probe je povezana sa bar jednom fluoroforom, bar jednim prigušivačem, koji je sposoban da ugasi fluoreseniciju fluorofore;

• polimeraza nukleinske kiseline je DNK polimeraza koja ima 5’ do 3’ egzonukleazu aktivnost; i/ili • postupak je postupak za detekciju prisustva varijanti sekvence u ciljnoj sekvenci nukleinske kiseline.

[0176] Slično, korak g) postupaka iz pronalaska može da uključi detekciju fluorescencije sa divljeg tipa probe za detekciju. Prema tome, korak g) može da obuhvati detekciju fluorescenciju fluorofore koja je povezana sa divljim tipom probe za detekciju. Ovo može na primer da bude slučaj u izvođenjima iz pronalaska, u kojima:

• divlji tip probe je povezana sa bar jednom fluoroforom, bar jednim prigušivačem, koji je sposoban da ugasi fluoreseniciju fluorofore;

• polimeraza nukleinske kiseline je DNK polimeraza koja ima 5’ do 3’ egzonukleazu aktivnost; i/ili • postupak je postupak za detekciju prisustva ciljne sekvence nukleinske kiseline.

[0177] U izvođenjima iz pronalaska, u kojima je PCR podeljen u PCR reakcije koje su sadržane u kapljicama, onda pomenuta fluorescencija može na primer da se detektuje korišćenjem detektora koji ima mogućnost rukovanja sa kapljicama uzorka, sa individualnim kapljicama koje ulaze u detektor, prolaze kroz detekciju, i nakon toga napuštaju detektor. Na primer, uređaj protočnog citometra može da bude prilagožen za upotrebu u detekciji fluorescencije iz uzoraka u kapljicama. U nekim slučajevima, mikrofluidna sprava koja je opremljena sa pumama da bi se kontrolisalo kretanje kapljica je korišćena za detekciju fluorescencije iz kapljica u jednom dosijeu. U nekim slučajevima, kapljice su nanete na dvo-dimenzionalnu površinu i kretanje detektora se vrši u odnosu na površinu, gde se vrši detekcija fluorescencije na svakom položaju koji sadrži jednu kapljicu.

[0178] Nakon dobijanja podataka za detekciju fluorescencije, kompjuter može da se koristi za skladišenje i obrađivanje podataka. Logika kompjutera može da se koristi za izvođenje takvih funkcija kao što je oduzimanje pozadinskog signala fluorescencije, dodele ciljnih i/ili referentnih sekvenci, i kvantifikacija podataka. Kompjuter može da bude od koristi za prikazivanje, skladištenje, preuzimanje, ili računanje dijagnostičkih rezultata iz molekularnog profilisanja; prikazivanje, skladištenje, preuzimanje, ili računanje neobrađenih podataka iz genomske ili ekspresione analize nukelinskih kiselina; ili prikazivanje, skladištenje, preuzimanje ili računanje bilo kog uzrorka ili informacije pacijenta korisne u ovde opisanim postupcima.

[0179] Signal(i) za detekciju mogu da se kreiraju na osnovu detektovane emitovane svetlosti od probe za detekciju divljeg tipa, i opciono iz varijante probe za detekciju parcijama. Varijanta proba za detekciju može da prijavi da li bar jedna od dve ili više određenih reakcija umnožavanja prestavljenih

2

signalom se dogodila u particiji i prema tome da li je bar jedna kopija varijante sekvence prisutna u particiji. Nivo ili amplituda signala koja odgovara probama može da se analizira da se odredi da li se bar jedna od određenih reakcija se dogodila ili nije i da li je bar jedna kopija jedne od pomenutih meta prisutna. Nivo ili amplituda signala može da se razlikuje između particija prema prisustvu ciljne sekvence nukleinske kiseline je prisutna ili odsutna u svakoj particiji. Na primer, particija koja je pozitivna za određenu metu može da proizvede nivo signala ili amplitudu koja je iznad date granice i/ili unutar datog opsega. Particije mogu da se analiziraju i signali mogu da se dobiju u bilo kom pogodnom vremenu(ima). Primeri vremena uključuju na kraju testa (krajnja tačka testa), kada su reakcije došl do kraja i podaci se više ne menjaju, ili u neko ranije vreme, sve dok su podaci dovoljno i pouzdano razdvojeni. Generalno može biti poželjno da se detekcija izvede nakon izvođenja broja eksponencijalnih PCR ciklusa koji su neophodni da pravi pozitivni signali imaju dovoljno visoku amplitudu.

[0180] U jednom aspektu, ovde je obezbeđen postupak za detekciju prisustva ciljne sekvence upotrebom jedne probe za detekciju.

[0181] U nekim slučajevima, AIPR i eksponencijalni PCR su izvedeni u postavci dPCR, kao što je ddPCR. Dve različite populacije kapljica mogu da se detektuju i broje da se odredi koncentracija ciljne sekvence nukleinske kiseline koja obuhvata varijantu sekvence (videti pregled u Sl. 1A) u odnosu na kada ne obuhvata varijantu sekvence (videti Sl.1B).

[0182] Fluorofora kao što se ovde koristi može da označi jedinjenje sa fluorescentnom emisijom, npr. sa maksimumom fluorescentne emisije između oko 350 i oko 900 nm. Može da se koristi veliki izbor fluorofora, uključujući ali bez ogrančenja na: 5-FAM (takođe poznata pod imenom 5-karboksifluorescein; takođe pod imenom Spiro(izobenzofuran-1(3H), 9’-(9H)ksanten)-5-karboksilna kiselina,3’,6’-dihidroski-3-okso-6-karboksifluorescein); 5-Heksahloro-Fluorescein; ([4,7,2’,4’,5’,7’-heksahloro-(3’,6’-dipivaloil-fluoresceinil)-6-karboksili-c kiselina]); 6-Heksahloro-Fluorescein; ([4,7,2’,4’,5’,7’-heksahloro-(3’,6’-dipivaloilfluoresceinil)-5-karboksilna kiselina]); 5-Tetrahloro-Fluorescein; ([4,7,2’,7’-tetra-hloro-(3’,6’-dipivaloilfluoresceinil)-5-karboksilna kiselina]); 6-Tetrahloro-Fluorescein; ([4,7,2’,7’-tetrahloro-(3’,6’-dipivaloilfluoresceinil)-6-karboksilna kiselina]); 5-TAMRA (5-karboksitetrametilrodamin); Ksantilijum, 9-(2,4-dikarboksifenil)-3,6-bis(dimetil-amino); 6-TAMRA (6-karboksitetrametilrodamin); 9-(2,5-dikarboksifenil)-3,6-bis(dimetilamino); EDANS (5-((2-aminoetil)amino) naftalen-1-sulfonska kiselina); 1,5-IAEDANS (5-((((2-jodoacetil)amino)etil)amino)naftalen-1-sulfonska kiselina); Cy5 (Indodikarbocijanin-5); Cy3 (Indodikarbocijanin-3); i BODIPY FL (2,6-dibromo-4,4-difluoro-5,7-dimetil-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacen-3-propanska kiselina); Quasar™-670 boja (Biosearch Technologies); Cal Fluor™ Oranž boja (BiosearchTechnologies); Rox boje; Max boje (Integrated DNA Technologies), kao i njihovi odgovarajući derivati.

[0183] Prigušivač, kao što se ovde koristi, može da označi molekul ili deo jedinjenja koji je sposoban da smanju fluorescenciju fluorofore kada je vezana za ili je u blizini probe za detekciju. Gađenje može da se dogodi pomoću bilo kog od nekoliko mehanizama uključujuću fluorescentno rezonantni transfer energije, foto-indukovani transfer elektrona, paramagnetsko pojačanje intesistemskog prelaza, Dexter-ovo spajanje izmenom, i spajanje ekscitonom kao što je obrazovanje tamnih kompleksa. Izbor ugašivača može da zavisi od korišćene fluorofore. Brojni komercijalno dostupnih prigušivači su poznati u oblasti tehnike, i uključuju ali nisu ograničeni na DABCYL, Black Hole™ Prigušivače (BHQ-1, BHQ-2, i BHQ-3), Iowa Black™ FQ i Iowa Black™ RQ. Oni su takozvani tamni prigušivači. Oni nemaju prirodnu fluorescenciju, koja može da eliminiše pozadinu koja se uočava sa drugim prigušivačima kao što je TAMRA, koji je u suštini fluorescentan.

[0184] U literaturi je na raspolaganju mnogo praktičnih uputstava za odabir odgovarajućih parova reportera-prigušivača za određene probe, kao što je predstavljeno primerima sledećim referencama: Clegg, Meth. Enzymol., 211: 353-388 (1992); Wo et al., Anal. Biochem., 218: 1-13 (1994); Pesce et al., editors, Fluorescence Spectroscopy (Marcel Dekker, New York, 1971); White et al., Fluorescence Analysis: A Practical Approach (Marcel Dekker, New York, 1970); i slično. Literatura takođe uključuje reference koje obezbeđuju iscrpne liste fluorescentnih i hromogenih molekula i njiovih relevantnih optičkih svojstava za izbora parova reporter-prigušivač, npr., Berlman, Handbook of Fluorescence Spectra of Aromatic Molecules, 2nd Edition (Academic Press, New York, 1971); Griffiths, Colour and Constitution of Organic Molecules (Academic Press, New York, 1976); Bishop, editor, Indicators (Pergamon Press, Oxford, 1972); Haugland, Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals (Molecular Probes, Eugene, 1992) Pringsheim, Fluorescence and Phosphorescence (Interscience Publishers, New York, 1949); i slično. Dalje, postoje iscrpne smernice u literaturi za derivatizaciju molekula reportera i prigušivača za kovalentno vezivanje preko zajedničkih reaktivnih grupa koje mogu da se dodaju u oligonukleotid, kao što je predstavljeno primerima u sledećim referencama: Haugland (cited above); Ullman et al., U.S. Pat. No.3,996,345; Khanna et al., U.S. Pat. No.4,351,760.

[0185] Oba, detektabilni obeleživač (npr. fluorofora) i prigušivač mogu da budu vezani sa probom upotrebom postupaka koji su poznati u oblasti tehnike. U nekim slučajevima, jedan od para reportera/prigušivača je povezan sa 5’ porcijom probe i 5’ sa ciljnim lokusom ukoliko je sekvenca probe komplementarna sa ciljnim lokusom, i drugi od para reportera/prigušivača je povezan sa 3’ porcijom probe.

[0186] Detektabilni obeleživači i prigušivači mogu da se dodaju tokom sinteze oligonukleotida preko standardne fosforamiditne hemije. Takođe mogu da se dodaju posle-sinteze preko uvođenja grupe za povezivanje sa odgovarajućom funkcionalnom grupom tokom oligo sinteze. Nakon sinteze, detektabilna (npr., fluorofora) može da bude spojena sa oligonukleotidnom funkcionalnom grupom. Za duže sekvence, da bi se dozvolilo efikasno gašenje, sekvenca neporedno do 3’ fluorofore i 5’ priguišivača, mogu da se naprave komplementarnim jedna sa drugom da se omogući obrazovanje drške oblika ukosnice (npr., molekularni svetionik). Prema tome, tokom faze vezivanja u AIPR i/ili eksponencijalnog PCR, takva proba će hibridizovati sa umnoženom ciljnom sekvencom, samim tim će fizički udaljiti detektabilni obeleživač (npr., fluoroforu) od prigušivača i time će omogućiti da se detektuje veća fluorescencija. Međutim, u odsustvu umnožene ciljne sekvence, proba obrazuje ukosnicu koja uzrokuje detektabilnu (npr., fluoroforu) i prigušivač da budu bliski jedno drugom, pri čemu se ograničava fluorescencija reakcije. U ovim reakcijama, polimeraza sa 5’-3’ egzonukleaznom aktivnošću nije potrebna da bi se proba isekla. Odgovarajuće mesto vezivanja reportera signala (npr., fluorofore) i prigušivača i distanca između reportera signala (npr., fluorofore) i prigišivača je poznata u oblasti tehnike.

[0187] U nekim slučajevima, proba za detekciju je proba TaqMan®.

[0188] TaqMan® proba (Heid et. al, 1996) može da koristi fluorogenu 5’ egzonukleoaznu aktivnost Taq polimeraze da se izmeri količina ciljnih sekvenci u uzorcima cDNK. TaqMan® probe mogu da sadrže fluorofore obično blizu 5’ baze, i prigušivač može da bude blizu 3’ baze. Prigušivač može da bude boja kao što je TAMRA ili može da bude ne-fluorescentni molekul kao što je 4-(4-dimetilaminofenilazo)benzojeva kiselina (DABCYL). Videti Tyagi et al., Nature Biotechnology 16:49-53 (1998). Kada se ozrači, pobuđena fluorescentna boja prenosi energiju na blisku boju prigušivača pre nego što fluorescira (ovo je poznato pod imenom FRET=Forster ili transfer fluorescentne rezonante energije). Prema tome, neposredna blizina fluorofore i prigušivača može da spreči emisiju bilo koje fluorescencije dok je proba intaktna. TaqMan® probe mogu da budu dizajnirane da se vežu za unutrašnji region proizvoda PCR. Kada polimeraza replicira matricu za koju je TaqMan® proba vezana,

1

njena 5’ egzonukleazna aktivnost može da iseče probu. Ovo isecanje može da okonča aktivnost prigušivača (bez FRET) i reporterska boja počinje da emituje fluorescenciju koja može da se pojača u svakom ciklusu proporcionalno sa brzinom isecanja probe. Nakupljanje PCR proizvoda može da se detektuje praćenjem povećanja fluorescenije fluorofore. Zbog toga što isecanje može da se pojavi ukoliko proba za detekciju hibridizuje sa ciljnom sekvencom nukleinske kiseline, detektovana fluorescencija može da ima poreklo iz specifičnog umnožavanja. U nekim slučajevima, postupak hibridizacije i isecanje ne interferira sa eksponencijalnom PCR. U nekim slučajevima, fluorogena proba nema G na 5’-kraju. A i G pored reporterske boje mogu da ugase fluorescenciju reportera čak i posle isecanja.

[0189] U nekim slučajevima, proba za detekciju je molekulski svetionik. Molekulski svetionici (MBs) mogu da budu oligonukleotidi dizajnirani za detekciju i kvantifikaciju ciljnih nukleinskih kiselina (npr., ciljne DNKs). 5’ i 3’ krajevi MB mogu kolektivno da obuhvate par ostataka koji može da potvrdi detektabilna svojstva MB. Jedan od krajeva može da bude povezan sa fluoroforom i drugi može da bude povezan sa molekulom prigušivačem koji je sposoban za gašenje emisije fluorescencije fluorofore. Na primer, par fluorofore/prigušivača može da koristi fluoroforu kao što je EDANS ili fluorescein, npr., na 5’-kraju i prigušivač kao što je Dabcyl, npr., na 3’-kraju.

[0190] Kada se MB nalazi slobodno u rastvoru, tj., nije hibridizovao sa drugom nukleinskom kiselinom, petlja iz MB može da se stabilizuje komplementarnim banim sparivanjem. Ovo samo-komplementarno sparivanje može da dovede do obrazovanja strukture "petlje ukosnice" za MB u kojoj fluorofora i grupe za gašenje su u blizini jedna sa drugom. U ovoj potvrdi, fluorescentni ostatak može da bude ugašen sa fluoroforom.

[0191] Petlja molekularnog svetionika može da bude komplementarna sa ili identična da delom ciljne sekvence nukleinske kiseline, tako da je hibridizacija petlje sa njenom komplementarnom sekvencom i ciljnoj sekvenci forsira disocijaciju petlje, čime se fluorofora međuobno udaljava od prigušivača. Ovo udaljavanje može dovesti do prekida gašenja fluorofore, pri čemu se uzrokuje povećanje fluorescencije MB.

[0192] Dalji detelji u vezi sa standardnim postupcima za dobijanje i upotrebu MBs su dobro uspostavljeni u literaturi npr., u Leone et al. (1995) "Molecular beacon probes combined with amplification by NASBA enable homogenous real-time detection of RNA." Nucleic Acids Res.26:2150-2155; Tyagi and Kramer (1996) "Molecular beacons: probes that fluoresce upon hybridization" Nature Biotechnology 14:303-308; Blok and Kramer (1997), and U.S. Pat. No.6,548,254.

[0193] Proba za detekciju takođe može da bude Scorpions™ proba. Scorpions™ proba može da obezbedi FRET-zasnovani mehanizam detekcije ukosnice koji je sličan sa molekularnim svetionikom (eng. Molecular Beacon), osim toga što proba takođe ima vezani segment koji služi kao prajmer za umnožavanje (videti npr., Whitcombe et al. Nat. Biotechnol.1999, August 17(8): 804-7; U.S. Pat. No.

6,326,145). U nekim slučajevima, proba može da bude Sunrise™ proa. Sunrise™ proba može sadrži prajmer koji je vezan za probu ukosnice koji je proširen tokom umnožavanja. Ovaj aranžman može da razdvoji unutrašnji obeleživač prigušivač of 5’ terminalne fluorofore (Nazarenko et al., Nucl. Acids Res.

1997, 25: 2516-2521).

[0194] 3’ terminalni oligonukleotid oligonukleotidne probe može da bude blokiran ili da se učini nemogućim za proširenje sa polimerazom nukleinske kiseline. Takvo blokiranje pogodno može da bude izvedeno sa vezivanjem reportera ili molekula prigušivača sa 3’ terminalnim ugljenikom oligonukleotidne probe pomoću grupe za povezivanje.

2

[0195] U nekim slučajevima, referentna proba može da bude uključena u podeljenim PCR reakcijama. Referentna proba može da bude nespecifična referentna proba ili specifična referentna proba. Referentna proba može da hibridizuje sa referentnim lokusom.

[0196] U jednom izvođenju, postupci iz pronalaska uključuju jedan par prajmera koji se sastoji iz prajmera-H i prajmera-L kombinovanih sa jednom probom za detekciju, kao što je proba za detekciju varijante ili proba za detekciju divljeg tipa. U drugim izvođenjima iz pronalaska postupci uključuju upotrebu jednog para prajmera koji se sastoji iz prajmera-H i prajmera-L kombinovanih sa dve probe za detekciju, koje su varijanta probe za detekciju i divlji tip probe za detekciju.

[0197] U jednom izvođenju detekcija je izvedena pomoću reagensa za detekciju, koje je boja. Boja može na primer da se vezuje za veliki žleb, ili može da se veže za mali žleb, interkalator, ili sredstvo za spoljno vezivanje, između ostalih. Primeri boja koje mogu da budu korisne uključuju luminiscentne cijanine, fenantridine, akridine, indole, imidazole, i slično, kao što su DAPI, Hoechst® 33258 boja, akridin oranž, itd. Primeri interkalirajućih boja koje mogu da budu pogodne uključuju etidijum bromid, propidijum jodid, EvaGreen® boju, SYBR® Green boju, SYBR® Gold boju, i 7-aminoaktinomicin D (7-AAD), između ostalih.

[0198] Kao što se ovde koristi "proba sposobna da detektuje specifičnu mutaciju" je obično proba koja sadrži uzastopnu sekvencu ciljne sekvence koja obuhvata pomenutu mutaciju ili njenu komplementarnu sekvencu.

Postupci za predviđanje prisustva kliničkog stanja

[0199] Postupci iz pronalaska mogu da imaju mnoštvo različitih primena. U suštini, postupci su korisni u bilo kojoj primeni, gde je poželjno detektovati prisustvo ciljne sekvence nukleinske kiseline, i/ili da se napravi razlika između ciljnih sekvenci nukleinskih kiselina koje obuhvataju ili ne obuvataju varijantu sekvence.

[0200] Na primer postupci mogu da budu korisni za primenu u forenzici, gde analiza nukleinskih kiselina često izvodi na veoma ograničenom materijalu. Postupci mogu na primer da se koriste u dobijanju otisaka genetičkog materijala da bi se odredilo prisustvo određenih polimorfizama.

[0201] Jedna veoma korisna primena postupaka iz pronalaska je za predviđanje prisustva kliničkog stanja kod individue.

[0202] Mnoga klinička stanja su povezana sa prisustvom određenih ciljnih sekvenci nukleinskih kiselina. Neka klinička stanja su karakterisana prisustvom varijante sekvence u ciljnoj nukleinskoj sekvenci. Druga klinička stanja su povezana sa markerima, npr. prisustvom varijante sekvence mogu da budu indikatori kliničkih stanja.

[0203] Prema tome, ovde su takođe opisani postupci za predviđanje prisustva kliničkog stanja kod individue, pri čemu je pomenuto kliničko stanje povezano sa prisustvom varijante sekvence u ciljnoj sekveci nukleinske kiseline, pomenuti postupak obuhvata korake

a) obezbeđivanja uzorka iz pomenute individue koji obuhvata matrice nukleinskih kiselina b) izvođenja postupaka za detekciju varijante sekvence u ovde opisanoj ciljnoj sekvenci nukleinske kiseline

pri čemu prisustvo pomenute varijante sekvence u pomenutoj ciljnoj nukleinskoj kiselini je indikativno za prisustvo pomenutog kliničkog stanja.

[0204] Mnoga klinička stanja su povezana sa prisustvom jedne ili više varijanti sekvence(a). Prema tome, kliničko stanje može da bude bilo koje kliničko stanje koje je povezano sa prisustvom varijante sekvence u ciljnoj sekvenci nukleinske kiseline.

[0205] Varijanta sekvence može da bude biomarker, koji je u korelaciji sa npr. prisustvom kliničkog stanja, rizika napredovanja kliničkog stanja, a osetljivošću kliničkog stanja na dati tretman, ili sa rizikom od smrti. Prema tome, varijata sekvenca može da bude u korelaciji sa predviđanjem u odnosu na kliničko stanje.

[0206] U jednom izvođenju, kliničko stanje je kancer. Pomenuti kancer je bilo koji kancer, npr. kancer je izabran iz grupe koja obuhvata karcinom grudi, kolorektalni, pankreasa, stomaka, GIST, hepatoćelijski, pluća, sitnoćelijski pluća, jajnika, uterusa, cerviksa, bešike, bubrega, prostate, testisa, tiroidni karcionom, maligni melanom, osteosarkom, hondrosarkom, miosarkom, glioblastom ili drugi tumori mozga, glave/vrata pored gastrointestinalnih i tumora germinativnih ćelija, i hematoloških maligniteta.

[0207] Varijanta sekvence može da bude povezana sa pomenutim kancerom. Na primer prisustvo varijante sekvence može da bude indikator prisustva pomenutog kancera. Međutim, često će biti potrebno dodatno ispitivanje da se odredi da li pomenuta individua pati od pomenutog kancera.

[0208] Tabela u tekstu ispod obezbeđuje ne-ograničavajuće primere mutacija koje su povezane sa kancerom, čije prisustvo može da se detektuje korišćenjem postupaka iz pronalaska. Međutim, stručnjak iz oblasti tehnike je svestan brojnih drugih mutacija koje su povezane sa kancerom koje mogu da se detektuju korišćenjem postupaka iz pronalaska.

[0209] Gore navedene mutacije su naznačene na proteinskom nivou. Prvo slovo označava aminokiselinu divljeg tipa, broj je položaj aminokiseline, i poslednje slovo je zamena aminokiseline koja se nalazi u mutantu. Prema tome, primerom H1047R je označeno da histidin na broju aminokiseline 1047 je zamenjen sa argininom. Ovde su korišćeni IUPAC kodovi jednog slova ili kodovi tri slova za aminokiseline.

[0210] Pronalazak može prema tome da se odnosi na postupke i komplete-iz delova koji obuhvataju (upotrebu) para prajmera, pri čemu

• prajmer-H obuhvata uzastopnu sekvencu u opsegu od 50 do 100 nukleotida SEQ ID NO:69, 70, 71 ili 72 i prajmer-L obuhvata uzastopnu sekvencu u opsegu od 10 do 20 nukleotida sekvence komplementarne sa SEQ ID NO:69, 70, 71 ili 72; ILI

• prajmer-H obuhvata uzastopnu sekvencu u opsegu od 50 do 100 nukleotida sekvence komplementarne sa SEQ ID NO:69, 70, 71 ili 72 i prajmer-L obuhvata uzastopnu sekvencu u opsegu od u opsegu od 10 do 20 nukleotida SEQ ID NO:69, 70, 71 ili 72;

4

i pri čemu prajmer-H i prajmer-L su zajedno sposobni da umnože ciljnu sekvencu koja obuhvata bar jedan od nukleotida koji kodira bilo koju od ovde pomenutih mutacija.

[0211] Jedan prikaz obezbeđuje postupke za predviđanje prisustva kliničkog stanja kod individe, pri čemu pomenuto kliničko stanje je povezano sa prisutnošću ciljne sekvence nukleinske kiseline, pomenuti postupak obuhvata korake

a) obezbeđivanja uzorka iz date individue koji sadrži matricu nukleinskih kiselina

b) izvođenja postupaka za detakciju varijante sekvence u ovde opisanoj ciljnoj sekvenci nukleinske kiseline

pri čemu prisustvo pomenute ciljne nukleinske kiseline je indikativno za prisustvo pomeutog kliničkog stanja.

[0212] Kliničko stanje je infekcija sa infektivnim patogenom u kom slučaju ciljna nukleinska kiselina na primer može da bude sekvenca nukleinske kiseline iz genoma pomenutog patogena.

[0213] Uzorak može da bude bilo koji uzorak iz pomenute individue. Posebno, uzorak treba da bude uzorak koji sadrži matrice nukleinskih kiselina. U nekim prikazima, u kojima je kliničko stanje kancer poželjno je da uzorak sadrži DNK iz ćelija kancera. Prema tome, uzorak može da sadrži ćelije kancera koje sadrže DNK i/ili uzorak može da sadrži slobodnu DNK koja je poreklom iz ćelija kancera.

[0214] Uzorak može na primer da bude izabran iz grupe koja se sastoji iz uzoraka krvi, biopsija, uzoraka fecesa, uzoraka pljuvačke, uzoraka urina, uzoraka vaginalne tečnosti, uzoraka ascitne tečnosti, uzoraka cerebrospinalne tečnosti, i uzroka tkivnog ekskudata. Uzorak može takođe da bude frakcija bilo kog od gore pomenutog. Na primer uzorak može da bude uzorak krvi ili njegova frakcija, kao što je uzorak plazme ili uzorak seruma.

[0215] Matrice nukleinskih kiselina mogu da budu bilo koje nukleinske kiseline koje se nalaze u uzorku, npr. genomska DNK ili RNK. Matrica nukleinskih kiselina može takođe da bude cDNK koja je dobijena na osnovu RNK prisutne u uzorku.

[0216] U jednom izvođenju matrice nukelinskih kiselina su izabrane iz grupe koja obuhvata DNK oslobođenu od ćelije, nukleozomalnu DNK, i cirkulišuću tumosku DNK (ctDNK), koja može da se nađe u krvotoku i u drugim telesnim tečnostima

[0217] Uzorak prema predmetnom pronalasku može da bude ekstrahovan iz individue i korišćen za postupke iz pronalaska.

[0218] Individua može da bude bilo koja životnja, kao što je sisar, uključujući humana bića. U poželjnom izvođenju, individua je humano biće.

Primeri

[0219] Pronalazak je dalje ilustrovan sledećim primerima, koje međutim ne treba tumačiti kao ograničenje pronalaska.

Primeri

[0220] Pronalazak je dalje ilustrovan sledećim Primerima, koje međutim ne treba tumačiti kao ograničenje pronalaska.

Primer 1

IBSAFE (Inkrementalni Pre, Simetrični Nakon, Pojačana tečnost) Postupci

[0221] IBSAFE postupak je inovativni postupak da se pouzdano umanji posledica bilo kojih potencijalnih grešaka DNK polimeraze tako da prave pozitivne reakcije imaju stalnu prednosti signala u odnosu na lažno pozitivne reakcije.

[0222] Predmetni primer opisuje IBSAFE postupak unutar digitalne postavke PCR-a u kapljicama upotrebom para prajmera specifičnih za ciljnu sekvencu i specifičnih proba koje prave rezliku između varijante (npr. mutanta) i sekvenci divljeg tipa (aleli). Principi postupka mogu, međutim da se primene na mnoge različite sisteme bazirane na polimerazi.

[0223] Primer opisuje postupke za detekciju mutacije jednog nukleotida u uzorku koji može da sadrži divlji tip i mutiranu DNK.

[0224] Za pilot testove, prajmeri sa visokom-Tm (prajmer-H) su dizajnirani sa dužinom od ∼60bp i testirani su da deluju relativno efikasno na temperaturama vezivanja ∼72°C ili višim. Probe su dizajnirane da se preklapaju sa varijantom baze sa dužinom od -13-16 bp, sa ravnotežom između pozicioniranja varijante baze centralno dok se pokušava da se maksimizira Tm. Prajmeri sa niskom-Tm (prajmer-L) su dizajnirani tako da budu što kraći sa najnižom mogućom Tm (obično < 48°C) dok se još uvek postiže adekvatna specifičnost sekvence i prema tome dovoljan kvalitet fluoroscentnog signala bez obzira na fluoroforu. Za fluorescentno obeležene ugašene probe, obično je FAM korišćen za mutirani alel i HEX za divlji tip; ali mogu da se koriste bilo koje fluorofore. Dužine i Tm proba mogu da budu slične sa onim za prajmer-L ili nekoliko stepeni više. Broj korišćenih AIPR može da se razlikuje, ai obično može da bude 64, i broj simetričnih PCR ciklusa može da se razlikuje, ali obično može da bude 27. S obzirom da postojim mnogo termalnih ciklusa i polimeraza gubi aktivnost na osnovu količine ukupnog vremena na visokim temperaturama, u ovom primeru svaki korak denaturacije je izabran da traje 10 sekundi (videti Tabela 1 za uobičajeni program termalnog ciklusa).

[0225] Primer korisnog dizajna testa je prikazan na Slici 2. Slika 2 prikazuje prajmer-H i Prajmer-L, kao i mutiranu probu za detekciju (MUT Proba) i probu za detekciju divljeg tipa (WT Proba) za detekciju dve mutacije u onkogenu PIK3CA, odnosno H1047R i E542K.

[0226] Uobičajeni rezultati IBSAFE u poređenju sa prethodnim testovima iz oblasti tehnike su prikazani na Slici 3. Određenije, Slika 3 pokazuje rezultat IBSAFE testa koji je izveden kao digitalni PCR u kapljicama upotrebom uslova termalnih ciklusa navedenih u Tabeli 1, i prajmeri i probe koje su prikazane na Slici 2, u poređenju sa komercijalnim testovima iz Bio-Rad Laboratories (PrimePCR™ Mutation Assay PIK3CA p.H1047R, Human, katalog # 100-31246, i PrimePCR™ Mutation Assay PIK3CA WT za p.H1047R, Čovek, katalog # 100-31249) se izvode prema standardnom protokolu proizvođača (ovde naznačen sa "Komercijalni test").

[0227] Za oba komercijalne i IBSAFE testove, digitalni PCR u kapljicama je izveden korišćenjem instrumenata Bio-Rad Laboratories uključujući QX100 Droplet Generator (katalog # 186-3002) i QX100 Droplet Reader (katalog # 186-3001) i QuantaSoft softver (katalog # 186-3003). Za komercijalne testove iz Bio-Rad Laboratories, poštovan je protokol proizvođača. IBSAFE testovi su izvedeni prema našim ovde navedenim postupcima.

[0228] Slika 6 pokazuje izmerenu učestalost mutiranog alela u odnosu na očekivanu učestalost mutiranog alela. Eksprerimenti su izvedeni u suštini kao što je ovde opisano gore u tekstu u vezi sa Slikom 3 osim toga što su postupci izvedeni korišćenjem matrice koja obuhvata smešu divljeg tipa i mutirane DNK u različitim odnosima kao što je naznačeno na slici. S obzirom da nisu detektovane lažno pozitivne mutirane sekvence u negativnim kontrolama korišćenjem IBSAFE postupka, negativna kontrola za komercijalni test je pokazala istu količinu mutiranog (lažno-pozitivnog) kao uzorak sa očekivanom učestalošću mutiranog alela od 0.01%. Prema tome, kada je koristeći IBSAFE postupka dobijena očekivana učestalost mutiranog alela na svim ispitanim koncentracijama mutirane matrice, dok rezultati komercijalnog testa u istoj učestalosti izmerenih mutiranih alela za uzorke koji ne obuvataju mutiranu DNK, 0.001% i 0.01% mutiranu DNK. Prema tome, IBSAFE postupak detektuje očekivanih % mutiranih alela čak u uzorku koji obuhvata sam 0.001% mutirane DNK (videti sliku 6 niži panel).

Tabela 1. Tipični IBSAFE uslovi Termalnog ciklusa

[0229] Slika 4 pokazuje dva različita prajmera-H, Prajmer-L, kao i mutiranu detekcionu probu (MUT Probe) i divlji tip detekcione probe (WT Proba) za detekciju mutacije u onkogenu PIK3CA, odnosno H1047R.

[0230] Rezultat korišenja prajmera i proba koji je prikazan na slici 4 u različitim postupcima reakcije je prikazan na slici 5. Određenije, u podeljenim reakcijama uključujući beta 1 ili beta 2 Prajmer-H zajedno sa Prajmerom-L i specifičnim za mutaciju i divljeg tipa specifični probama kao što je prikazano na slici 4 su pokrenuti sa DNK matricom koja je pozitivna na mutaciju (nije prikazano; svi testovi su detektovali mutaciju) i matrica divljeg tipa bez AIPR (A), sa AIPR na nižoj (67°C) temperaturi (B), i sa AIPR na višoj (74°) temperaturi (C). Značajno smanjenje lažno pozitivnih signala je postignuto u C.

[0231] Digitalni PCR u kapljicama i IBSAFE su izvedeni kao što je ovde opisano gore u tekstu upotrebom termociklikličnih kružnih uslova kao što je naznačeno na slici 5.

[0232] Slične IBSAFE reakcije su izvede korišćenjem opsega različitih prajmera. Slika 5D pokazuje mutirani specifični signal i ne pokazuje lažno pozitivne signale u testu kojim se detektuje PIK3CA E542K mutacija. Korišćeni su sledeći prajmeri i probe:

[0233] Slika 5E pokazuje mutirani specifični signal i ne pokazuje lažno pozitivne signale u testu za detekciju PIK3CA E545K mutacije. Korišćeni su sledeći prajmeri i probe:

[0234] Prajmer-H koji je korišćen za Slike 5D i 5E obuhvata nekoliko LNA baza, što ima za rezultat visoku temperaturu topljenja pri čemu se obezbeđuje visoka Tm razlika između prajmera-H i prajmera-L, tako da je AIPR faza čisto asimetrična (jednog smera) kopira jedan lanac matrice. Kao što je prikazano, nisu detektovani lažni pozitivi.

[0235] Slika 5F pokazuje mutirani specifični signal i ne pokazuje lažno pozitivne signale u testu za detekciju NRAS Q61R mutacije. Korišćeni su sledeći prajmeri i probe:

[0236] Teorijski proračuni predviđaju 100% efikasnost za brojne mutirane kopije alela po ciklusu IBSAFE AIPR i simetričnom PCR u odnosu na standardni PCR su prikazani u Tabeli 2. Kao što se može videti, na tipičnoj tački za detekciju signala korišćenjem IBSAFE postupka posle ciklusa 27, najgori slučaj scenarija ugradnje lažno pozitivne varijante u ciklusu 1 vodi do nastanka lažnih nukleinskih kiselina u velikoj količini od približno 2% u poređenju sa pravom pozitivnom reakcijom.Suprotno tome, u standardnom PCR testu, lažno pozitivne nukleinske kiseline mogu da budu prisutne na približno 25% od količine pravih pozitiva u suštini bilo kom ciklusu (obično se detekcija izvodi na 40 ciklusa), doprinoseći značajnom lažno pozitivnom signalu.

Tabela 2. Teorijska računanja za kopije mutiranih alela

[0237] Stručnjak iz oblasti tehnike će biti sposoban da dizajnira korisne prajmere i probe za detekciju drugih mutacija prema ovde opisanom IBSAFE postupku. Tabela 3 daje pregled primera koji ne ogrančavaju korisnost prajmera-H, prajmera-L i detekcionih proba za detekciju brojnih različitih mutacija.

[0238] Sva od mutacija koje su predstavljene na Tabeli 3 mogu da se detektuju izvođenjem IBSAFE kao što je ovde opisano, pri čemu reakcija IBSAFE sadrži prajmer-H, prajmer-L Probu-WT i Probu-MUT naznačenu za određenu mutaciju u Tabeli 3. IBSAFE postupak može da se izvede u suštini kao štoje opisano u ovom primeru npr. korišćenjem uslova termalnog kruženja promene temperautre naznačenih u Tabeli 1. Visoke i niske temperature vezivanja hibridizacijom mogu da se postave prema Tm naznačenoj u tabeli 3.

4

3 a elab T

k) avta(nas

ak)tav(nas

Primer 2

[0239] IBSAFE postupci se izvode u suštini kako je opisano u Primeru 1 osim toga što se koristi i dodatni korak niske temperature PCR. U ovom primeru IBSAFE postupka korišćena je pogrešno sparena sekvenca za Prajmer-L. Ovo dalje ima za rezultat prekid u razlici efektivne temperature topljenja između Prajmera-H i Prajmera-L tokom AIPR faze

[0240] Dizajn testa koji je korišćen u ovom primeru je prikazan na slici 7A i uključuje prajmer-H, probu za detekciju divljeg tipa (WT proba) i varijantu probe za detekciju (MUT proba). Osim toga, test uključuje upotrebu Prajmera-L koji obuhvata 4 pogrešno sparena nukleotida. Postupak korišćen u ovom primeru obuhvata korak AIPR, korak niske temperature PCR koga prati eksponencijalni PCR. Tačni program termociklusa PCR aparata (eng. thermocycler programme) koji je korišćen prikazan je na slici 7B.

[0241] Ovaj primer je IBSAFE test za KRAS G13D mutaciju. Sekvenca sa 4-baze koje su pogrešno sparene je uključena na 5’ kraju Prajmera-L i sekvenca prajmera koja je komplementarna sa ciljnom sekvencom je kratka. Prema tome, Prajmer-L ima veoma nisku temperaturu topljenja i neće se spajati na visokoj temperaturi spajanja tokom AIPR faze (73°C u ovom primeru). U simetričnoj fazi, korišćena temperatura spajanja je veoma niska (30°C u ovom primeru). Posle nekoliko ciklusa (u ovom primeru, 5 ciklusa), sekvenca komplementarna sa punom dužinom Prajmera-L je ugrađena u sintetizovani proizvod i simetrični PCR može da se nastavi na višoj temperaturi spajanja (53°C u ovom primeru), u kome sada Prajmer-L pune dužine ima savšeno poklapanje.

[0242] Rezultat koji je prikazan na slici 7B pokazuje mutirani specifični signal i ne pokazuje lažne pozitive.

4

4

4

4

4

1

2

4

�

2

4

Claims (20)

Patentni zahtevi

1. Postupak za detekciju prisustva ciljne sekvence nukleinske kiseline ili detekcije prisustva varijante sekvence u ciljnoj sekvenci nukleinske kiseline u uzorku koji obuhvata korake

a) obezbeđivanja uzorka koji obuhvata matrice nukleinskih kiselina

b) obezbeđivanja niza prajmera koji obuhvata bar par prajmera koji su specifično sposobni za umnožavanje ciljne sekvence nukleinske kiseline, pri čemu niz prajmera bar obuhvata prajmer-H i prajmer-L, pri čemu je temperatura topljenja prajmera-H bar 16°C viša, kao što je bar 20°C viša od temperature topljenja prajmera-L, i pri čemu prajmer-L sadrži sekvencu komplementarnu sa fragmentom proizvoda elongacije prajmera-H,

c) obezbeđivanja polimeraze nukleinske kiseline koja ima aktivnost polimerizacije na temperaturi elongacije,

d) dobijanje podeljenih PCR reakcija svaka obuhvata deo uzorka, niz prajmera, polimerazu nukleinske kiseline, PCR reagense i opciono reagense za detekciju

e) izvođenje asimetrične postepene reakcije polimerizacije (AIPR) koja obuhvata korake:

i. inkubacije podeljenih PCR reakcija na temperaturi denaturacije, pri čemu se DNK denaturiše do jednolančanih molekula

ii. inkubacije podeljenih PCR reakcija na visokoj temperaturi vezivanja čime se omogućava vezivanje prajmera-H, ali ne prajmera-L,

iii. opciono inkubacije podeljenih PCR reakcija na temperaturi elongacije,

iv. opciono ponavljanja koraka i do iii,

v. pri čemu se umnožava samo jedan lanac ciljne sekvence nukleinske kiseline

f) izvođenja reakcije polimerizacije lanaca (PCR) koja obuhvata korake:

1) inkubacije podeljenih PCR reakcija na temperaturi denaturacije, pri čemu se DNK denaturiše do jednolančanih molekula

2) inkubacije PCR na niskoj temperaturi vezivanja pri čemu se omogućava vezivanje oba prajmera-H i prajmera-L,

3) inkubacije PCR na temperaturi elongacije pri čemu se omogućava sinteza komplementarnih lanaca svih vezanih prajmera

4) opciono ponavljanja koraka II do IV,

5) pri čemu se umnožavaju oba lanca ciljne sekvence nukleinske kiseline da se dobije PCR proizvod g) detekcija da li PCR proizvod obuhvata ciljnu sekvencu nukleinske kiseline ili varijantu sekvence u ciljnoj sekvenci nukleinske kiseline.

2. Postupak prema zahtevu 1, pri čemu varijanta sekvence je mutacija jednog nukleotida.

3. Postupak prema bilo kom od prethodnih zahteva, pri čemu AIPR iz koraka e) obuhvata korake: i. inkubacije podeljenih PCR reakcija na temperaturi denaturacije, pri čemu se DNK denaturiše do jednolančanih molekula

ii. inkubacije podeljenih PCR reakcija na visokoj temperaturi vezivanja pri čemu se omogućava vezivanje prajmera-H, ali ne prajmera-L, pri čemu je visoka temperatura vezivanja takođe temperatura elongacije, pri čemu se omogućava sinteza komplementarnog lanca vezanog prajmera-H;

iii. ponavljanja koraka i do ii

iv. pri čemu se umnožava samo jedan lanac ciljne sekvence nukleinske kiseline.

4. Postupak prema bilo kom od prethodnih zahteva, pri čemu prajmer-H je jedini prajmer u nizu prajmera koji ima temperaturu topljenja bar 16°C višu u odnosu na temperaturu topljenja prajmera-L.

5. Postupak prema bilo kom od prethodnih zahteva, pri čemu niz prajmera obuhvata više od jednog para prajmera koji su sposobni za umnožavanje različitih ciljnih sekvenci nukleinskih kiselina.

6. Postupak prema bilo kom od prethodnih zahteva, pri čemu prajmer-H ima temperaturu topljenja bar 16°C višu u odnosu na temperaturu topljenja bilo kog drugog prajmera u nizu prajmera, koji je zajedno sa Prajmerom-H sposoban za umnožavanje ciljne sekvence nukleinske kiseline.

7. Postupak prema bilo kom od prethodnih zahteva, pri čemu niz prajmera ne obuhvata bilo koje prajmere:

a) koji imaju temperaturu topljenja koja je u opsegu od /- 15°C, poželjno u opsegu od /- 20°C, kao što je u opsegu od /- 25°C od temperature topljenja prajmera-H; i

b) koji zajedno sa prajmerom-H mogu da obrazuju par prajmera koji su specifično sposobni za umnožavanje ciljne sekvence nukleinske kiseline.

8. Postupak prema bilo kom od prethodnih zahteva pri čemu visoka temperatura vezivanja u koraku e) je bar 10°C viša, poželjno bar 15°C viša, na primer bar 20°C viša od temperature topljenja prajmera-L.

9. Postupak prema bilo kom od prethodnih zahteva, pri čemu korak e) za rezultat ima elongaciju prajmera-H, ali se ne može detektovati elongacija bilo kog drugog prajmera.

10. Postupak prema bilo kom od prethodnih zahteva, pri čemu prajmer-L je prajmer-L modifikovan pogrešnim spajanjem i postupak obuhvata korak niske temperature PCR između koraka e) i f), pri čemu niska temperatura PCR obuhvata korake:

1) inkubacije podeljenih PCR reakcija na temperaturi denaturacije, pri čemu se DNK denaturiše do jednolančanih molekula

2) inkubacije PCR na veoma niskoj temperaturi vezivanja pri čemu se omogućava spajanje oba prajmera-H i dela prajmera-L koji nije pogrešno spojen,

3) inkubacije PCR na temperaturi elongacije pri čemu se omogućava sinteza komplementarnih lanaca spojenih prajmera

4) opciono ponavljanja koraka 1) do 3), pri čemu se dobija PCR proizvod.

11. Postupak prema zahtevu 10, pri čemu veoma niska temperatura vezivanja je bar 5°C niža u odnosu na nisku temperaturu vezivanja.

12. Postupak prema bilo kom od zahteva 10 do 11, pri čemu je prajmer-L oligonukleotid koji obuhvata: a) 5’ sekvencu od 1 do 10 nukleotida; i

b) uzastopnu sekvencu u opsegu od 7 do 15 nukleotida, koja je identična sa ili je komplementarna sa fragmentom ciljne sekvence nukleinske kiseline.

13. Postupak prema bilo kom od prethodnih zahteva, pri čemu svaka od podeljenih PCR reakcija sadrži reagens za detekciju, koji je varijanta probe za detekciju, pomenuta varijanta probe za detekciju je sposobna za hibridizaciju sa ciljnom sekvencom nukleinske kiseline koja sadrži varijantu sekvence sa značajno većim afinitetom od ciljne sekvence nukleinske kiseline koja ne sadrži varijantu sekvence i/ili podeljenih PCR reakcija u kojima svaka sadrži reagens za detekciju koji je proba za detekciju divljeg tipa, pri čemu pomenuta proba za detekciju divljeg tipa je sposobna za hibridizaciju sa ciljnom sekvencom nukleinske kiseline koja ne sadrži varijantu sekvence.

14. Postupak za predviđanje prisustva kliničkog stanja kod individue, pri čemu je pomenuto kliničko stanje povezano sa prisustvom varijante sekvence u ciljnoj sekvenci nuklelinske kiseline ili pomenuto kliničko stanje je povezano sa prisustvom ciljne sekvence nukleinske kiseline, pomenuti postupak obuhvata korake

a) obezbeđivanja uzorka iz pomenute individue koji obuhvata matrice nukleinskih kiselina b) izvođenja postupka prema bilo kom od zahteva 1 do 13

pri čemu prisustvo pomenute varijante sekvence u pomenutoj ciljnoj nukleinskoj kiselini ili prisustvo pomenute ciljne sekvence nukleinske kiseline je indikativno za prisustvo pomenutog kliničkog stanja.

15. Postupak prema zahtevu 14, pri čemu je kliničko stanje kancer.

16. Komplet iz delova koji obuhvata:

a) niz prajmera koji obuhvataju bar par prajmera koji su specifično sposobni da umnože ciljnu sekvencu nukleinske kiseline, pri čemu niz prajmera bar obuhvata prajmer-H i prajmer-L, pri čemu je temperatura topljenja prajmera-H bar 16°C viša od temperature topljenja prajmera-L, i pri čemu prajmer-L sadrži sekvencu komplementarnu sa proizvodom elongacije prajmera-H,

b) probu za detekciju koja je sposobna da hibridizuje sa ciljnom sekvencom nukleinske kiseline, pomenuta proba je povezana sa bar jednom fluoroforom i bar jednim prigušivačem

c) polimerazu nukleinske kiseline;

d) PCR reagense;

e) reagense za dobijanje kapljica koje sadrže podeljene PCR reakcije.

17. Komplet iz delova prema zahtevu 16, pri čemu

a) prajmer-H obuhvata uzastopnu sekvencu u opsegu od 50 do 100 nukleotida SEQ ID NO:69 i prajmer-L obuhvata uzastopnu sekvencu u opsegu od 10 do 20 nukleotida sekvence komplementarne sa SEQ ID NO:69; ILI

b) prajmer-H obuhvata uzastopnu sekvencu u opsegu od 50 do 100 nukleotida sekvence komplementarne sa SEQ ID NO:69, i prajmer-L obuhvata uzastopnu sekvencu u opsegu od 10 do 20 nukleotida SEQ ID NO:69;

i gde su prajmer-H i prajmer-L zajedno sposobni da umnože ciljnu sekvencu koja obuhvata bar jedan od nukleotida 3140, 1624 ili 1633 od SEQ ID NO:69.

18. Komplet iz delova prema zahtevu 16, pri čemu

a) prajmer-H obuhvata uzastopnu sekvencu u opsegu od 50 do 100 nukleotida SEQ ID NO:70 i prajmer-L obuhvata uzastopnu sekvencu u opsegu od 10 do 20 nukleotida sekvence komplementarne sa SEQ ID NO:70; ILI

b) prajmer-H obuhvata uzastopnu sekvencu u opsegu od 50 do 100 nukleotida sekvence komplementarne sa SEQ ID NO:70, i prajmer-L obuhvata uzastopnu sekvencu u opsegu od 10 do 20 nukleotida SEQ ID NO:70;

i gde su prajmer-H i prajmer-L zajedno sposobni da umnože ciljnu sekvencu koja obuhvata 1799 od SEQ ID NO:70.

19. Komplet iz delova prema zahtevu 16, pri čemu

a) prajmer-H obuhvata uzastopnu sekvencu u opsegu od 50 do 100 nukleotida SEQ ID NO:71 i prajmer-L obuhvata uzastopnu sekvencu u opsegu od 10 do 20 nukleotida sekvence komplementarne sa SEQ ID NO:71; ILI

b) prajmer-H obuhvata uzastopnu sekvencu u opsegu od 50 do 100 nukleotida sekvence komplementarne sa SEQ ID NO:71, i prajmer-L obuhvata uzastopnu sekvencu u opsegu od 10 do 20 nukleotida SEQ ID NO:71;

i gde su prajmer-H i prajmer-L zajedno sposobni da umnože ciljnu sekvencu koja obuhvata bar jedan od nukleotida 2573 ili 2369 od SEQ ID NO:71.

20. Komplet iz delova prema zahtevu 16, pri čemu

a) prajmer-H obuhvata uzastopnu sekvencu u opsegu od 50 do 100 nukleotida SEQ ID NO:72 i prajmer-L obuhvata uzastopnu sekvencu u opsegu od 10 do 20 nukleotida sekvence komplementarne sa SEQ ID NO:72; ILI

b) prajmer-H obuhvata uzastopnu sekvencu u opsegu od 50 do 100 nukleotida sekvence komplementarne sa SEQ ID NO:72, i prajmer-L obuhvata uzastopnu sekvencu u opsegu od 10 do 20 nukleotida SEQ ID NO:72;

i gde prajmer-H i prajmer-L zajedno su sposobni da umnože ciljnu sekvencu koja obuhvata bar nukleotid 34, 35 ili 38 od SEQ ID NO:72.

1