RS60685B1

RS60685B1 - Postupci za transdukciju i obradu ćelija

Info

Publication number: RS60685B1
Application number: RS20200887A
Authority: RS
Inventors: Ryan L Crisman; Chris Ramsborg; Travis Wood
Original assignee: Juno Therapeutics Inc
Priority date: 2014-11-05
Filing date: 2015-11-04
Publication date: 2020-09-30
Also published as: BR112017009220B1; JP6740234B2; KR20170092567A; KR102635942B1; ES2987570T3; MX2021001334A; PT3757206T; AU2020233623B2; CN113736828A; EP3215601B1; NZ732130A; EP4407036A3; US11802295B2; IL252126B; FI3757206T3; AU2015343121A1; PL3757206T3; CN107109438B; TWI735418B; JP2024159813A

Description

Opis pronalaska

Unakrsna referenca za srodne prijave

[0001] Ova prijava zahteva pravo prvenstva privremene US prijave br. 62/075,801, podnete 5. novembra 2014. godine, pod nazivom "Postupci za transdukciju i obradu ćelija" i privremene US prijave br.62/129,023, podnete 5. marta 2015. godine, pod nazivom "Postupci za transdukciju i obradu ćelija".

Oblast tehnike

[0002] Predmetni opis se odnosi na obradu ćelija za terapijsku upotrebu, kao što je za adoptivnu ćelijsku terapiju. Obezbeđeni postupci uglavnom obuhvataju postupke transdukcije, u kojima se ćelije i čestice virusnog vektora inkubiraju pod uslovima koji rezultuju transdukcijom ćelija sa virusnim vektorom. Inkubacija može biti izvedena u unutrašnjoj šuplјini u principu krute centrifugalne komore, kao što je cilindrična komora napravlјena od tvrde plastike. Postupci obuhvataju i druge korake obrade, uklјučujući one koji se izvode u takvoj komori, kao što su pranje, selekcija, izolacija, kultivisanje i formulisanje. Preciznije, opis se odnosi na postupak koji obezbeđuje prednosti u odnosu na postupke obrade koji su dostupni, kao što su dostupni postupci za obradu u velikom obimu. Takve prednosti obuhvataju, na primer, smanjene troškove, pojednostavlјenje procesa, povećanu efikasnost, povećanu bezbednost i povećanu ponovljivost između različitih ispitanika i stanja.

Stanje tehnike

[0003] Određeni postupci su dostupni za obradu ćelija, uključujući postupke u velikom obimu, kao i postupke za upotrebu u pripremi ćelija za adoptivnu ćelijsku terapiju. Na primer, dostupni su postupci za uvođenje virusnog vektora, npr. transdukcija, selekcija, izolacija, stimulacija, kultivisanje, pranje i formulisanje. Dostupni postupci se nisu pokazali u potpunosti zadovoljavajućim. Potrebni su poboljšani postupci, na primer, za obradu u velikom obimu, npr. transdukciju ćelija za adoptivnu ćelijsku terapiju. Na primer, potrebni su postupci za pobolјšanje efikasnosti i reproducibilnosti i za smanjenje vremena, troškova, rukovanja, složenosti i/ili drugih parametara koji su povezani sa takvom proizvodnjom. Među opisanim primerima su postupci, sistemi i kompleti koji razmatraju takve potrebe.

[0004] EP2594632A1 opisuje postupak i uređaj za modifikaciju ćelija.

[0005] EP0995802A2 opisuje postupak za isporuku nukleinskih kiselina ćelijama in vitro ili ex vivo.

[0006] Naoki Nishimura i saradnici, Human Gene Therapy, vol. 12, br. 4, str. 333-346, opisuju centrifugalnu manipulaciju u svrhu transdukcije gena za interleukin 12, posredovane adenovirusom, u humane dendritične ćelije izvedene iz monocita.

[0007] Bahnson Alfred B i saradnici, Journal of Virological methods, vol. 54, br. 2-3, str. 131-143, opisuju centrifugalno pojačavanje genskog prenosa posredovanog retrovirusima.

[0008] US5911983A opisuje gensku terapiju za Gošerovu bolest upotrebom retrovirusnih vektora.

Kratko izlaganje suštine pronalaska

[0009] Pronalazak obezbeđuje postupak transdukcije koji obuhvata inubiranje, u unutrašnjoj šuplјini centrifugalne komore, ulazne kompozicije koju čine ćelije i virusne čestice koje sadrže rekombinantan virusni vektor, pri čemu: centrifugalna komora sadrži: zadnji zid, suštinski krut bočni zid koji se proteže od navedenog zadnjeg zida i najmanje jedan otvor, pri čemu najmanje deo navedenog bočnog zida okružuje navedenu unutrašnju šuplјinu i navedeni najmanje jedan otvor je u stanju da dozvoli preuzimanje tečnosti u navedenu unutrašnju šuplјinu i isticanje tečnosti iz navedene šuplјine; i pokretni element koji je u stanju da se kreće unutar komore da bi se menjala unutrašnja zapremina unutrašnje šupljime, čime unutrašnja šupljina predstavlja prostor promenljive zapremine definisane navedenim zadnjim zidom, navedenim krutim bočnim zidom i navedenim pokretnim elementom; centrifugalna komora se može okretati oko ose rotacije i rotira se oko navedene ose rotacije najmanje tokom dela inkubacije; i postupak stvara izlaznu kompoziciju koja sadrži mnoštvo ćelija transdukovanih sa virusnim vektorom. Primeri izvođenja pronalaska su opisani u pojedinim slučajevima koji su navedeni u tekstu koji sledi. Opis koji sledi obezbeđuje postupke za obradu ćelija, kao što su za prenos virusnih vektora i i/ili selekcija ćelija zasnovana na imunoafinitetu. U pojedinim slučajevima, ćelije su za upotrebu u ćelijskoj terapiji i takve primarne ćelije se pripremaju za autologni ili alogeni prenos, npr. u adoptivnoj ćelijskoj terapiji. Postupci mogu obuhvatati dodatne korake obrade ćelija, kao što su pranje, izolacija, razdvajanje ćelija.

[0010] U pojedinim slučajevima, postupci se izvode inkubiranjem u posudi, kao što je unutrašnja šuplјina centrifugalne komore, kompozicije (koja se smatra ulaznom kompozicijom), koja sadrži ćelije i čestice sa virusnim vektorom, pri čemu virusne čestice sadrže rekombinantan virusni vektor, čime se stvara izlazna kompozicija koja sadrži mnoštvo ćelija transdukovanih sa virusnim vektorom. Centrifugalna komora se obično može rotirati oko ose rotacije. Osa rotacije je u pojedinim slučajevima vertikalna. Komoru obično čine zadnji zid, bočni zid koji se proteže od zadnjeg zida, kao što je suštinski krut bočni zid, i najmanje jedan otvor, kao što su dovod/odvod ili dovod i odvod. Najmanje deo bočnog zida generalno okružuje unutrašnju šuplјinu. Najmanje jedan otvor (npr. dovod/odvod ili dovod i odvod) je u stanju da dozvoli ulazak tečnosti u unutrašnju šuplјinu i isticanje tečnosti iz šuplјine. Najmanje jedan otvor je, u pojedinim slučajevima, koaksijalan sa komorom, a u pojedinim slučajevima se nalazi na zadnjem zidu komore. Bočni zid može biti zakrivljen, npr. cilindričan ili u principu cilindričan.

[0011] U pojedinim slučajevima, postupci obuhvataju inkubiranje, u unutrašnjoj šuplјini centrifugalne komore, ulazne kompozicije koja sadrži ćelije i virusne čestice koje sadrže rekombinantan virusni vektor, pri čemu navedena centrifugalna komora može rotirati oko ose rotacije, a čine je zadnji zid, suštinski krut bočni zid koji se proteže od navedenog zadnjeg zida i najmanje jedan otvor, pri čemu najmanje deo navedenog bočnog zida okružuje navedenu unutrašnju šuplјinu i navedeni najmanje jedan otvor je u stanju da dozvoli ulazak tečnosti u navedenu unutrašnju šuplјinu i isticanje tečnosti iz navedene šuplјine, a pri čemu se centrifugalna komora rotira oko navedene ose rotacije tokom najmanje dela inkubacije i postupkom nastaje izlazna kompozicija koja sadrži mnoštvo ćelija transdukovanih sa virusnim vektorom.

[0012] U pojedinim slučajevima, centrifugalna komora dalјe obuhvata pokretni element, poput klipa. U takvim slučajevima, unutrašnja šuplјina je obično prostor promenljive zapremine, npr. šupljina je promenljive zapremine definisane zadnjim zidom, bočnim zidom i pokretnim elementom, npr. klipom, tako da je pokretni element u stanju da se kreće unutar komore (kao što je aksijalno unutar komore) da bi se menjala unutrašnja zapremina šuplјine. U pojedinim slučajevima, tečnost se naizmenično pomera u i izlazi iz komore pomoću pumpe, šprica i/ili motora, ili radom drugog uređaja za preuzimanje i ispuštanje tečnosti ili gasa, koji tečnost, na primer, izvlači iz šuplјine i/ili gura tečnost u istu, dok zapremina same šuplјine ostaje konstantna.

[0013] U pojedinim slučajevima, postupci obuhvataju inkubiranje, u unutrašnjoj šuplјini centrifugalne komore, ulazne kompozicije koja sadrži ćelije i virusnu česticu koja sadrži rekombinantan virusni vektor, pri čemu se navedena centrifugalna komora može rotirati oko ose rotacije i čine je zadnji zid, suštinski krut bočni zid koji se proteže od navedenog zadnjeg zida i najmanje jedan otvor, pri čemu najmanje deo navedenog bočnog zida okružuje navedenu unutrašnju šuplјinu i navedeni najmanje jedan otvor je u stanju da omogući ulazak tečnosti u navedenu unutrašnju šuplјinu i isticanje tečnosti iz navedene šuplјine, pri čemu se centrifugalna komora rotira oko ose rotacije tokom najmanje dela inkubacije, ukupna zapremina navedene tečne ulazne kompozicije prisutne u navedenoj šuplјini tokom rotacije navedene centrifugalne komore nije veća od oko 5 ml po kvadratnom inču unutrašnje površine šuplјine i postupkom nastaje izlazna kompozicija koja sadrži mnoštvo ćelija koje su transdukovane sa virusnim vektorom.

[0014] Komora može sadržavati dva zadnja zida. U pojedinim takvim slučajevima, jedan zadnji zid zajedno sa drugim karakteristikama definiše unutrašnju šuplјinu, dok je drugi izvan šuplјine. U pojedinim slučajevima, šuplјina je povezana sa oba zadnja zida.

[0015] Najmanje jedan otvor može obuhvatati: dovod i odvod, od kojih je svaki u stanju da omogući odgovarajuće navedeno preuzimanje ili isticanje, ili je prisutan jedan otvor kao dovod/odvod, koji je u stanju da omogući navedeno preuzimanje i navedeno isticanje.

[0016] Inkubacija se obično vrši, barem delom, prilikom rotacije komore, kao što je pri dejstvu centrifugalne sile ili ubrzanja. Tako, postupci u pojedinim slučajevima dodatno obuhvataju ostvarivanje rotacije centrifugalne komore, poput rotacije oko njene ose rotacije, tokom najmanje dela inkubacije.

[0017] U pojedinim od bilo kojih takvih slučajeva, navedeno rotiranje podrazumeva rotaciju sa relativnom centrifugalnom silom (RCF) na unutrašnjoj površini bočnog zida šuplјine i/ili na površinskom sloju ćelija koja je veća od ili je oko 200 g, veća je od ili je oko 300 g, ili je veća od ili je oko 500 g. U pojedinim od bilo kojih takvih slučajeva, navedeno rotiranje podrazumeva rotaciju sa relativnom centrifugalnom silom na unutrašnjoj površini bočnog zida šuplјine i/ili na površinskom sloju ćelija od ili oko 1000 g, 1500 g, 2000 g, 2100 g, 2200 g, 2500 g ili 3000 g; ili je ista najmanje ili oko 1000 g, 1500 g, 2000 g, 2100 g, 2200 g, 2500 g ili 3000 g. U pojedinim od bilo kojih takvih slučajeva, navedenog rotiranje podrazumeva rotaciju sa relativnom centrifugalnom silom na unutrašnjoj površini bočnog zida šuplјine i/ili na površinskom sloju ćelija koja iznosi: između ili između oko 1000 i 3600, 1000 i 3200, 1000 i 2800, 1000 i 2000, 1000 i 1600, 1600 i 3600, 1600 i 3200, 1600 i 2800, 1600 i 2000, 2000 i 3600, 2000 i 3200, 2000 i 2800, 2800 i 3600, 2800 i 3200, 3200 i 3600, uključujući i navedene vrednosti; ili iznosi najmanje ili oko 2000 g, 2100, 2200 g, 2400 g, 2600g, 2800 g, 3000 g, 3200 g ili 3600 g; ili iznosi ili je oko 2000 g, 2100 g, 2200 g, 2400 g, 2600g, 2800 g, 3000 g, 3200 g ili 3600 g.

[0018] U pojedinim od bilo kojih takvih slučajeva, najmanje deo inkubacije tokom koga se komora rotira je vreme koje je: veće od ili je oko 5 minuta, kao što je veće od ili oko 10 minuta, veće od ili oko 15 minuta, veće od ili oko 20 minuta, veće od ili oko 30 minuta, veće od ili oko 45 minuta, veće od ili oko 60 minuta, veće od ili oko 90 minuta ili veće od ili oko 120 minuta; ili je između ili između oko 5 minuta i 60 minuta, 10 minuta i 60 minuta, 15 minuta i 60 minuta, 15 minuta i 45 minuta, 30 minuta i 60 minuta ili 45 minuta i 60 minuta, pri čemu su uključene i navedene vrednosti.

[0019] U pojedinim slučajevima, ulazna kompozicija (ili broj ćelija) u šuplјini tokom inkubacije, npr. u bilo kom trenutku ili tokom celokupne inkubacije, i/ili ona koja je obrađena postupcima, uključuje ili je sa oko ili najmanje oko 1 x 10<6>, 5 x 10<6>, 1 x 10<7>, 5 x 10<7>, 1 x 10<8>ili 5 x 10<8>ćelija.

[0020] U pojedinim od bilo kojih ovakvih slučajeva, navedena ulazna kompozicija u šupljini sadrži najmanje ili oko 1 x 10<7>navedenih ćelija, najmanje ili oko 2 x 10<7>navedenih ćelija, 3 x 10<7>navedenih ćelija, najmanje ili oko 4 x 10<7>navedenih ćelija, najmanje ili oko 5 x 10<7>navedenih ćelija, najmanje ili oko 6 x 10<7>navedenih ćelija, najmanje ili oko 7 x 10<7>navedenih ćelija, najmanje ili oko 8 x 10<7>navedenih ćelija, najmanje ili oko 9 x 10<7>navedenih ćelija, najmanje ili oko 1 x 10<8>navedenih ćelija, najmanje ili oko 2 x 10<8>navedenih ćelija, najmanje ili oko 3 x 10<8>navedenih ćelija ili najmanje ili oko 4 x 10<8>navedenih ćelija.

[0021] U pojedinim slučajevima, unutrašnja površina šuplјine je najmanje ili je oko 1 x 10<9>µm<2>ili 1 x 10<10>µm<2>i/ili je dužina bočnog zida u pravcu kojim se proteže od zadnjeg zida najmanje oko 5 cm i/ili najmanje oko 8 cm; i/ili je unutrašnja šuplјina poluprečnika od najmanje oko 2 cm na najmanje jednom poprečnom preseku.

[0022] U pojedinim slučajevima, ulazna kompozicija je sa najmanje ili oko 1 infektivne jedinice (IU) po jednoj od ćelija, najmanje ili oko 2 IU po jednoj od ćelija, najmanje ili oko 3 IU po jednoj od ćelija, najmanje ili oko 4 IU po jednoj od ćelija, najmanje ili oko 5 IU po jednoj od ćelija, najmanje ili oko 10 IU po jednoj od ćelija, najmanje ili oko 20 IU po jednoj od ćelija, najmanje ili oko 30 IU po jednoj od ćelija, najmanje ili oko 40 IU po jednoj od ćelija, najmanje ili oko 50 IU po jednoj od ćelija ili najmanje ili oko 60 IU po jednoj od ćelija. U pojedinim slučajevima, ulazna kompozicija je sa ili oko 1 infektivne jedinice (IU) po jednoj od ćelija, sa ili oko 2 IU po jednoj od ćelija, sa ili oko 3 IU po jednoj od ćelija, sa ili oko 4 IU po jednoj od ćelija, sa ili oko 5 IU po jednoj od ćelija, sa ili oko 10 IU po jednoj od ćelija, sa ili oko 20 IU po jednoj od ćelija, sa ili oko 30 IU po jednoj od ćelija, sa ili oko 40 IU po jednoj od ćelija, sa ili oko 50 IU po jednoj od ćelija ili je sa ili oko 60 IU po jednoj od ćelija.

[0023] U pojedinim slučajevima, prosečna zapremina tečnosti ili maksimalna zapremina tečnosti ulazne kompozicije, kompozicije sa česticama virusnih vektora i ćelijama i/ili bilo koje tečne kompozicije koja je prisutna u šupljini tokom inkubacije, nije veća od oko 10, 5 ili 2,5 mililitara (ml) po kvadratnom inču unutrašnje površine šuplјine tokom inkubacije. U pojedinim slučajevima, maksimalna ukupna zapremina takve tečne kompozicije prisutne u šuplјini u bilo kom trenutku tokom inkubacije nije veća od 2 puta, nije veća od 10 puta, nije veća od 100 puta, nije veća od 500 puta ili nije veća od 1000 puta u odnosu na ukupnu zapreminu ćelija. U pojedinim slučajevima, ukupna zapremina ćelija je ukupna zapremina istaloženih ćelija. U pojedinim slučajevima, ukupna zapremina ćelija je zapremina jednoćelijskog sloja, kao što je jednoćelijski sloj prisutan na unutrašnjoj površini šupljine tokom rotacije centrifugalne komore.

[0024] U pojedinim slučajevima, zapremina tečnosti ulazne kompozicije zauzima celu ili suštinski celu zapreminu unutrašnje šuplјine tokom najmanje dela inkubacije. U drugim slučajevima, tokom najmanje dela inkubacije, zapremina tečnosti ulazne kompozicije zauzima samo deo zapremine unutrašnje šuplјine, pri čemu zapremina šuplјine tokom ovakve inkubacije dodatno sadrži barem delom gas, koji je preuzet u šuplјinu, npr. preko navedenog najmanje jednog otvora ili drugog otvora, pre ili tokom inkubacije.

[0025] U pojedinim od bilo kojih takvih slučajeva, zapremina tečnosti navedene ulazne kompozicije koja je prisutna u navedenoj šuplјini tokom navedene rotacije je između ili između oko 0,5 ml po kvadratnom inču unutrašnje površine šuplјine (ml/kv.in) i 5 ml/kv.in, 0,5 ml/kv.in. i 2,5 ml/kv.in., 0,5 ml/kv.in. i 1 ml/kv.in., 1 ml/kv.in. i 5 ml/kv.in., 1 ml/kv.in. i 2,5 ml/kv.in ili 2,5 ml/kv.in i 5 ml/kv.in

[0026] U pojedinim od bilo kojih takvih slučajeva, maksimalna ukupna zapremina tečnosti navedene ulazne kompozicije prisutne u navedenoj šuplјini u bilo kom trenutku tokom navedene inkubacije nije veća od 2 puta, nije veća od 10 puta ili nije veća od 100 puta od ukupne zapremine navedenih ćelija u navedenoj šuplјini, ili prosečna zapremina ulazne kompozicije tokom inkubacije nije veća od 2, 10 ili 100 puta u odnosu na ukupnu zapreminu ćelija u šuplјini.

[0027] U pojedinim od bilo kojih takvih slučajeva, maksimalna zapremina navedene ulazne kompozicije prisutne u navedenoj šuplјini u bilo kom trenutku tokom navedene inkubacije, ili prosečna zapremina tokom inkubacije, nije veća od ili oko 2 puta, 10 puta, 25 puta, 50 puta, 100 puta, 500 puta ili 1000 puta u odnosu na zapreminu jednoćelijskog sloja navedenih ćelija na unutrašnjoj površini navedene šuplјine tokom rotacije navedene komore pri sili od ili oko 2000 g na unutrašnjoj površini bočnog zida.

[0028] U pojedinim od bilo kojih takvih slučajeva, zapremina tečnosti ulazne kompozicije nije veće od 20 ml, nije veća od 40 ml, nije veća od 50 ml, nije veća od 70 ml, nije veća od 100 ml, nije veća od 120 ml, nije veća od 150 ml ili nije veća od 200 ml.

[0029] U pojedinim od od bilo kojih takvih slučajeva, tokom najmanje dela inkubacije u komori ili tokom rotacije komore, zapremina tečnosti ulazne kompozicije zauzima samo deo zapremine unutrašnje šuplјine komore, a zapremina šuplјine tokom navedenog najmanje dela ili tokom navedene rotacije dodatno sadrži gas, pri čemu se navedeni gas preuzima u navedenu šuplјinu kroz navedeni najmanje jedan otvor, pre ili tokom navedene inkubacije.

[0030] U pojedinim slučajevima, centrifugalna komora obuhvata pokretni element, pri čemu ulazak gasa u centrifugalnu komoru utiče na kretanje pokretnog elementa da bi se povećala zapremina unutrašnje šuplјine komore, čime se smanjuje ukupna zapremina tečnosti navedene ulazne kompozicije prisutne u navedenoj šuplјini tokom rotacije navedene centrifugalne komore po kvadratnom inču unutrašnje površine šuplјine u poređenju sa slučajem odsustva gasa u komori.

[0031] U pojedinim slučajevima, broj ćelija u šuplјini tokom inkubacije iznosi ili je oko broja ćelija koji je dovolјan da se obrazuje jednoćelijski sloj na unutrašnjoj površini šuplјine tokom rotacije centrifugalne komore uz silu od oko 2000 g i/ili broj nije veći od 1,5 put ili 2 puta u odnosu na takav broj ćelija.

[0032] U pojedinim od bilo kojih takvih slučajeva, broj navedenih ćelija u navedenoj ulaznoj kompoziciji iznosi ili je oko broja navedenih ćelija koji je dovolјan da se obrazuje jednoćelijski sloj na površini navedene šuplјine tokom rotacije navedene centrifugalne komore sa silom od ili oko 2000 g na unutrašnjoj površini bočnog zida; i/ili broj navedenih ćelija u navedenoj ulaznoj kompoziciji nije veći od 1,5 puta ili 2 puta u odnosu na broj navedenih ćelija dovoljan da se obrazuje jednoćelijski sloj na površini navedene šuplјine tokom rotacije navedene centrifugalne komore sa silom od ili oko 2000 g na unutrašnjoj površini bočnog zida.

[0033] U pojedinim slučajevima, centrifugiranje je trajanja između 120 i 7200 sekundi, kao što je između 120 i 3600 sekundi, uklјučujući i navedene vrednosti ili vrednosti koje su unutar opsega, kao što su vrednosti u vidu celih minuta koje su uključene ili su unutar opsega.

[0034] U pojedinim slučajevima, postupci obuhvataju: a) obezbeđivanje unutrašnje šuplјine centrifugalne komore koja je sa unutrašnjom površinom od najmanje ili oko 1 x 10<9>µm<2>ili najmanje ili oko 1 x 10<10>µm<2>: i) ulaznu kompoziciju koja obuhvata ćelije i virusne čestice koje sadrže rekombinantan virusni vektor, pri čemu: broj ćelija u ulaznoj kompoziciji je najmanje 1 x 10<7>ćelija, dok su virusne čestice prisutne u ulaznoj kompoziciji sa najmanje od ili oko 1 infektivne jedinice (IU) po jednoj od navedenih ćelija i ulazna kompozicija podrazumeva zapreminu tečnosti koja je manja od maksimalne zapremine unutrašnje šuplјine centrifugalne komore; i ii) gas, u zapremini koja predstavlja ostatak do maksimalne zapremine unutrašnje šuplјine centrifugalne komore; i b) inkubiranje ulazne kompozicije, pri čemu se najmanje deo inkubacije izvodi u navedenoj unutrašnjoj šuplјini navedene centrifugalne komore, uz ostarivanje rotacije navedene centrifugalne komore; a pri čemu postupkom nastaje izlazna kompozicija koja sadrži mnoštvo ćelija transdukovanih sa virusnim vektorom.

[0035] U pojedinim slučajevima, broj ćelija je najmanje ili je oko 50 x 10<6>ćelije; 100 x 10<6>ćelija; ili 200 x 10<6>ćelija; i/ili virusne čestice su prisutne sa najmanje 1,6 IU/ćeliji, 1,8 IU/ćeliji, 2,0 IU/ćeliji, 2,4 IU/ćeliji, 2,8 IU/ćeliji, 3,2 IU/ćeliji ili 3,6 IU/ćeliji, 4,0 IU/ćeliji, 5,0 IU/ćeliji, 6,0 IU/ćeliji, 7,0 IU/ćeliji, 8,0 IU/ćeliji, 9,0 IU/ćeliji ili 10,0 IU/ćeliji.

[0036] U pojedinim od bilo kojih takvih slučajeva, zapremina tečnosti ulazne kompozicije je manja od ili je jednaka 200 ml, manja je od ili je jednaka 100 ml ili je manja od ili je jednaka 50 ml ili je manja od ili je jednaka 20 ml. U pojedinim od bilo kojih takvih slučajeva, zapremina gasa je do 200 ml, do 180 ml, do 140 ml ili do 100 ml.

[0037] U pojedinim od bilo kojih takvih slučajeva, navedena rotacija je sa relativnom centrifugalnom silom na unutrašnjoj površini bočnog zida šuplјine ili na površinskom sloju ćelija od najmanje ili oko 1000 g, 1500 g, 2000 g, 2400 g, 2600 g, 2800 g, 3000 g, 3200 g ili 3600 g.

[0038] U pojedinim slučajevima, postupci su za obradu u velikom obimu.

[0039] U pojedinim slučajevima, kompozicija u šuplјini (npr. ulazna kompozicija) podrazumeva zapreminu tečnosti od najmanje 50 ml, najmanje 100 ml ili najmanje 200 ml, i/ili najmanje ili oko milion ćelija po cm<2>unutrašnje površine šuplјine tokom najmanje dela navedene inkubacije.

[0040] U pojedinim slučajevima, maksimalna zapremina tečnosti ulazne kompozicije prisutne u šuplјini u bilo kom trenutku tokom navedene inkubacije nije veća od ili oko 2 puta, 10 puta, 25 puta, 50 puta, 100 puta, 500 puta ili 1000 puta u odnosu na zapreminu jednoćelijskog sloja navedenih ćelija obrazovanih na unutrašnjoj površini navedene šuplјine tokom rotacije navedene komore, npr. uz silu, npr. efektivnu silu, od ili oko 2000 g.

[0041] U pojedinim slučajevima, rotacija komore tokom najmanje dela inkubacije je sa silom većom od ili oko 200 g, većom od ili oko 300 g, ili većom od ili oko 500 g, kao što je veća od ili oko 1000 g, 1500 g, 2000 g, 2500 g, 3000 g ili 3200 g, na unutrašnjem zidu šuplјine centrifugalne komore i/ili na sloju, npr. na površini sloja, ćelija. U pojedinim slučajevima, sila je najmanje ili oko 1000 g, 1500 g, 2000 g ili 2500 g, 3000 g ili 3200 g. U pojedinim slučajevima, sila je od ili oko 2100 g, 2200 g ili 3000 g.

[0042] U pojedinim slučajevima, postupci obuhvataju inkubiranje ulazne kompozicije koja sadrži ćelije i virusne čestice koje sadrže rekombinantan virusni vektor, pri čemu se najmanje deo navedene inkubacije izvodi u uslovima rotiranja, čime nastaje izlazna kompozicija koja sadrži mnoštvo ćelija transdukovanih sa virusnim vektorom, pri čemu je navedena ulazna kompozicija zapremine veće od ili oko 20 ml, 50 ml, najmanje je 100 ml ili najmanje je 150 ml, i/ili navedena ulazna kompozicija sadrži najmanje 1 x 10<8>ćelija; a navedeni uslovi rotiranja podrazumevaju relativnu centrifugalnu silu na površinskom sloju ćelija koja je veća od oko 1500 g.

[0043] U pojedinim slučajevima postupaka, najmanje 25% ili najmanje 50% navedenih ćelija u izlaznoj kompoziciji je transdukovano sa navedenim virusnim vektorom; i/ili najmanje 25% ili najmanje 50% navedenih ćelija u izlaznoj kompoziciji eksprimira produkt heterologne nukleinske kiseline koja je sadržana u navedenom virusnom vektoru.

[0044] U pojedinim od bilo kojih takvih slučajeva, navedena inkubacija se izvodi u šuplјini centrifugalne komore i broj navedenih ćelija u navedenoj ulaznoj kompoziciji iznosi ili je oko broja navedenih ćelija koji je dovolјan da se obrazuje jednoćelijski ili dvoćelijski sloj na unutrašnjoj površini navedene šuplјine tokom navedene rotacije.

[0045] U pojedinim slučajevima, navedena centrifugalna komora sadrži zadnji zid, suštinski krut bočni zid koji se proteže od navedenog zadnjeg zida i najmanje jedan otvor, pri čemu najmanje deo navedenog bočnog zida okružuje navedenu unutrašnju šuplјinu i navedeni najmanje jedan otvor je u stanju da omogući ulazak tečnosti u navedenu unutrašnju šuplјinu i isticanje tečnosti iz navedene šuplјine,

[0046] U pojedinim slučajevima, navedena centrifugalna komora dalјe sadrži pokretni element i navedena unutrašnja šuplјina je šuplјina promenlјive zapremine definisane navedenim zadnjim zidom, navedenim suštinski krutim bočnim zidom i navedenim pokretnim elementom, pri čemu je navedeni pokretni element u stanju da se kreće unutar komore da bi se menjala unutrašnja zapremina šuplјine.

[0047] U pojedinim od bilo kojih takvih slučajeva, ulazna kompozicija u navedenoj šuplјini čini zapreminu tečnosti od najmanje 20 ml ili najmanje 50 ml i sadrži ili sadrži oko milion ćelija po cm<2>unutrašnje površine šuplјine tokom najmanje dela navedene inkubacije.

[0048] U pojedinim od ovih takvih slučajeva, dalјi deo inkubacije se vrši izvan centrifugalne komore i/ili bez rotacije, pri čemu se navedeni dalјi deo izvodi nakon najmanje dela inkubacije koji je sproveden u komori i/ili sa rotacijom.

[0049] U pojedinim od bilo kojih takvih slučajeva, najmanje deo inkubacije se izvodi u šuplјini centrifugalne komore i/ili se dalјi deo inkubacije izvodi na ili oko 37 °C ± 2 °C.

[0050] U pojedinim od bilo kojih takvih slučajeva, inkubacija dodatno obuhvata prenošenje najmanje mnoštva ćelija u kontejner tokom navedene inkubacije, a potom i izvođenje dodatnog dela inkubacije u kontejneru. U pojedinim slučajevima, prenos se izvodi unutar zatvorenog sistema, pri čemu su centrifugalna komora i kontejner sastavni deo zatvorenog sistema.

[0051] U pojedinim od bilo kojih takvih slučajeva, inkubacija se izvodi tokom vremena između od ili oko 1 sata i od ili oko 96 sati, između od ili oko 4 sata i od ili oko 72 sata, između od ili oko 8 sati i od ili oko 48 sati, između od ili oko 12 sati i od ili oko 36 sati, između od ili oko 6 sati i od ili oko 24 sata, između od ili oko 36 sati i od ili oko 96 sati, uklјučujući i navedene vrednosti; ili se dalјi deo inkubacije izvodi tokom vremena između od ili oko 1 sata i od ili oko 96 sati, između od ili oko 4 sata i od ili oko 72 sata, između od ili oko 8 sati i od ili oko 48 sati, između od ili oko 12 sati i od ili oko 36 sati, između od ili oko 6 sati i od ili oko 24 sata, između od ili oko 36 sati i od ili oko 96 sati, uklјučujući i navedene vrednosti.

[0052] U pojedinim od bilo kojih takvih slučajeva, inkubacija ili dalјi deo inkubacije se izvode tokom vremena koje nije duže od 48 sati, nije duže od 36 sati ili nije duže od 24 sata; ili se dalјi deo inkubacije izvodi tokom vremena koje nije duže od 48 sati, nije duže od 36 sati ili nije duže od 24 sata.

[0053] U pojedinim od bilo kojih takvih slučajeva, inkubacija se izvodi u prisustvu stimulišućeg agensa; i/ili se dalјi deo inkubacije izvodi u prisustvu stimulišućeg agensa.

[0054] U pojedinim od bilo kojih takvih slučajeva, inkubacija se izvodi tokom vremena koje nije duže od 24 sata; ćelije u kompoziciji nisu bile podvrgavane temperaturi većoj od 30 °C tokom više od 24 sata; i/ili inkubacija se ne vrši u prisustvu stimulišućeg agensa.

[0055] U pojedinim od bilo kojih takvih slučajeva, stimulišući agens je agens koji je u stanju da indukuje proliferaciju T-ćelija, CD4+ T-ćelija i/ili CD8+ T-ćelija.

[0056] U pojedinim od bilo kojih takvih slučajeva, stimulišući agens je citokin izabran između IL-2, IL-15 i IL-7.

[0057] U pojedinim od bilo kojih takvih slučajeva, izlazna kompozicija koja sadrži transdukovane ćelije sadrži najmanje 1 x 10<7>ćelija ili najmanje 5 x 10<7>ćelije.

[0058] U pojedinim od bilo kojih takvih slučajeva, izlazna kompozicija koja sadrži transdukovane ćelije sadrži najmanje 1 x 10<8>ćelija, 2 x 10<8>ćelija, 4 x 10<8>ćelija, 6 x 10<8>, 8 x 10<8>ćelija ili 1 x 10<9>ćelija.

[0059] U pojedinim od bilo kojih takvih slučajeva, ćelije su T-ćelije. U pojedinim slučajevima, T-ćelije su nefrakcionisane T-ćelije, izolovane CD4+ T-ćelije i/ili izolovane CD8+ T-ćelije.

[0060] U pojedinim od bilo kojih takvih slučajeva, postupak rezultuje integracijom virusnog vektora u genom domaćina jedne ili više od najmanje mnoštva ćelija i/ili u genom domaćina najmanje ili oko 20% ili najmanje ili oko 30% ili najmanje ili oko 40% ćelija u izlaznoj kompoziciji.

[0061] U pojedinim od bilo kojih takvih slučajeva, najmanje 2,5%, najmanje 5%, najmanje 6%, najmanje 8%, najmanje 10%, najmanje 20%, najmanje 25%, najmanje 30%, najmanje 40 %, najmanje 50% ili najmanje 75% navedenih ćelija u navedenoj ulaznoj kompoziciji je postupkom transdukovano sa navedenim virusnim vektorom; i/ili je najmanje 2,5%, najmanje 5%, najmanje 6%, najmanje 8%, najmanje 10%, najmanje 20%, najmanje 25%, najmanje 30%, najmanje 40%, najmanje 50% ili najmanje 75% navedenih ćelija u navedenoj izlaznoj kompoziciji transdukovano navedenim virusnim vektorom; i/ili najmanje 2,5%, najmanje 5%, najmanje 6%, najmanje 8%, najmanje 10%, najmanje 20%, najmanje 25%, najmanje 30%, najmanje 40%, najmanje 50% ili najmanje 75% navedenih ćelija u navedenoj izlaznoj kompoziciji eksprimira proizvod heterologne nukleinske kiseline koja je sadržana unutar navedenog virusnog vektora.

[0062] Posebni slučajevi obuhvataju postupke transdukcije koji se sprovode inkubiranjem ulazne kompozicije koja sadrži ćelije i čestice virusnog vektora pod uslovima rotiranja, čime se mnoštvo ćelija inokulira radi transdukcije sa virusnim vektorom, pri čemu ulazna kompozicija podrazumeva ukupnu zapreminu veću od 50 ml, kao što je zapremina od najmanje 100 ml ili najmanje 150 ml, i/ili navedena ulazna kompozicija sadrži najmanje 1 x 10<8>ćelija; a uslovi rotiranja podrazumevaju centrifugalnu silu veću od oko 1500 g. U pojedinim takvim slučajevima, inkubacija se izvodi u šuplјini centrifugalne komore i broj navedenih ćelija u navedenoj ulaznoj kompoziciji iznosi ili je oko broja navedenih ćelija koji je dovolјan da se obrazuje jednoćelijski sloj na unutrašnjoj površini šuplјine tokom rotacije. U pojedinim takvim slučajevima, najmanje 25% ili najmanje 50% navedenih ćelija je transdukovano sa virusnim vektorom.

[0063] U pojedinim slučajevima, rezultat postupaka da je najmanje 2,5%, najmanje 5%, najmanje 6%, najmanje 8%, najmanje 10%, najmanje 20%, najmanje 25%, najmanje 30%, najmanje 40%, najmanje 50% ili najmanje 75% navedenih ćelija u navedenoj ulaznoj kompoziciji transdukovano sa virusnim vektorom i/ili je rezultat proizvodnja izlazne kompozicije u kojoj je najmanje 10%, najmanje 25%, najmanje 30%, najmanje 40%, najmanje 50% ili najmanje 75% ćelija transdukovano sa vektorom i/ili eksprimira rekombinantan proizvod kodiran vektorom. U pojedinim slučajevima, efikasnost transdukcije se izražava u odnosu na određenu ulaznu količinu ili relativnu količinu virusa. Na primer, u pojedinim slučajevima, takva efikasnost se postiže postupcima za ulaznu kompoziciju koja sadrži virus u odnosu od oko 1 ili oko 2 IU po ćelijama.

[0064] U pojedinim slučajevima, među svim ćelijama u navedenoj izlaznoj kompoziciji koja je proizvedna postupcima, prosečan broj kopija rekombinantnog virusnog vektora nije veći od oko 10, nije veći od oko 5, nije veći od oko 2,5 ili nije veći od oko 1,5. U pojedinim slučajevima, među ćelijama u izlaznoj kompoziciji koje sadrže rekombinantan virusni vektor, prosečan broj kopija vektora nije veći od oko 5, nije veći od oko 2, nije veći od oko 1,5 ili nije veći od oko 1.

[0065] U pojedinim od bilo kojih takvih slučajeva, među svim ćelijama u navedenoj izlaznoj kompoziciji koje sadrže rekombinantan virusni vektor ili u koje je integrisan virusni vektor, prosečan broj kopija rekombinantnog virusnog vektora nije veći od oko 10, nije veći od oko 5, nije veći od oko 2,5 ili nije veći od oko 1,5; ili među ćelijama u izlaznoj kompoziciji, prosečan broj kopija navedenog vektora nije veći od oko 2, nije veći od oko 1,5 ili nije veći od oko 1.

[0066] U pojedinim slučajevima, centrifugalna komora je sastavni deo zatvorenog sistema, na primer, kada zatvoreni sistem obuhvata komoru i najmanje jedan sistem cevi koji je operativno povezan sa najmanje jednim otvorom preko najmanje jednog konektora, čime je omogućeno da se tečnost i gas kreću između navedene šuplјine i najmanje jednog sistema cevi u najmanje jednoj konfiguraciji sistema. Najmanje jedan sistem cevi obično podrazumeva serije sistema cevi. Najmanje jedan konektor obično podrazumeva mnoštvo konektora. Zatvoreni sistem može dalјe sadržavati najmanje jedan kontejner koji je operativno povezan sa serijama sistema cevi, tako da najmanje jedna veza dozvolјava

1

da tečnost i/ili gas prolaze između najmanje jednog kontejnera i najmanje jednog otvora kroz serije sistema cevi.

[0067] Najmanje jedan konektor može podrazumevati jedan ili više konektora izabranih iz grupe koja se sastoji od ventila, luer adaptera i ventila sa šiljcima, npr. predstavlja rotacioni ventil, kao što je zaustavni ili višenamenski priklјučak i/ili aseptičan konektor.

[0068] Najmanje jedan kontejner može podrazumevati jedno ili više od kesa, bočica i/ili špriceva, a može podrazumevati kontejnere označene kao kontejner sa razblaživačem, kontejner za otpad, kontejner za prikuplјanje proizvoda, izlazni kontejner i/ili ulazni kontejner.

[0069] U pojedinim slučajevima, najmanje jedan kontejner obuhvata najmanje jedan ulazni kontejner sa virusom i/ili ćelijama (koji može predstavljati jedan ulazni kontejner koji sadrži virus i ćelije ili dva ulazna kontejnera koji sadrže virus i ćelije, tim redom), kontejner za otpad, kontejner za proizvod i najmanje jedan kontejner sa rastvaračem ili rastvorom za pranje, pri čemu je svaki povezan sa navedenom šuplјinom preko navedenih serija sistema cevi i najmanje jednog otvora.

[0070] U pojedinim od bilo kojih takvih slučajeva, najmanje jedan kontejner dalјe obuhvata kontejner koji sadrži gas koji se uvodi pre i/ili tokom najmanje nekog trenutka tokom navedene inkubacije i/ili zatvoreni sistem dodatno sadrži mikrobni filter koji je u stanju da preuzme gas u unutrašnju šupljinu centrifugalne komore i/ili zatvoreni sistem sadrži priključak za špric u svhu ostvarivanja unosa gasa.

[0071] Postupci u pojedinim slučajevima dodatno obuhvataju, pre i/ili tokom inkubacije, ostvarivanje unosa ulazne kompozicije u navedenu šuplјinu. Unos može podrazumevati protok tečnosti iz najmanje jednog ulaznog kontejnera u šuplјinu kroz navedeni najmanje jedan otvor. Unos može takođe podrazumevati unos virusa iz jednog ulaznog kontejnera i unos ćelija iz drugog, da bi se proizvela ulazna kompozicija za inkubaciju.

[0072] U pojedinim slučajevima, postupak obuhvata, pre i/ili tokom navedene inkubacije, obezbeđivanje ili ostvarivanje unosa gasa u navedenu šuplјinu pod sterilnim uslovima, pri čemu se navedeni unos ostvaruje (a) protokom gasa iz kontejnera koji sadrži gas, (b) protokom gasa iz okruženja koje je spoljašnje u odnosu na zatvoren sistem, preko filtera za mikrobe, ili (c) protokom gasa iz šprica koji je povezan sa sistemom preko priključka za špric.

[0073] U pojedinim slučajevima, ostvarivanje unosa gasa u unutrašnju šuplјinu centrifugalne komore se izvodi istovremeno ili zajedno sa ostvarivanjem unosa ulazne kompozicije u unutrašnju šuplјinu centrifugalne komore.

[0074] U pojedinim od bilo kojih takvih slučajeva, ulazna kompozicija i gas se spajaju u jednom kontejneru pod sterilnim uslovima izvan komore pre navedenog unosa navedene ulazne kompozicije i gasa u unutrašnju šuplјinu centrifugalne komore.

[0075] U pojedinim slučajevima, ostvarivanje unosa gasa se izvodi odvojeno, bilo istovremeno ili sekvencijalno, od ostvarivanja unosa ulazne kompozicije u navedenu šuplјinu.

[0076] U pojedinim od bilo kojih takvih slučajeva, unos gasa se ostvaruje tako što se dozvolјava ili izaziva protok gasa iz sterilnog zatvorenog kontejnera koji sadrži gas, iz spolјne sredine kroz mikrobni filter ili iz šprica koji sadrži navedeni gas.

[0077] U pojedinim od bilo kojih takvih slučajeva, gas je vazduh.

[0078] U pojedinim slučajevima obezbeđenih postupaka procesa, inkubacija je deo kontinuiranog procesa, pri čemu postupak dalјe obuhvata, tokom najmanje dela inkubacije, ostvarivanje kontinuiranog unosa navedene ulazne kompozicije u šuplјinu, obično tokom rotacije komore, a tokom dela inkubacije, ostvarivanje kontinuiranog isticanje (tj. izvođenja) tečnosti iz navedene šuplјine kroz najmanje jedan otvor, obično tokom rotacije komore. Kontinuiran unos i isticanje, u pojedinim slučajevima, odvija se istovremeno.

[0079] U pojedinim slučajevima, postupak obuhvata tokom dela navedene inkubacije, ostvarivanje unosa gasa u navedenu šuplјinu tokom rotacije komore; i/ili tokom dela navedene inkubacije, ostvarivanje kontinuiranog isticanja gasa iz navedene šuplјine.

[0080] U pojedinim slučajevima, postupak obuhvata isticanje tečnosti i isticanje gasa iz navedene šuplјine, pri čemu je svako isticanje istovremeno ili sekvencijalno i ostvaruje se u različit kontejner.

[0081] U pojedinim od bilo kojih takvih slučajeva, najmanje deo kontinuiranog unosa i kontinuiranog isticanja se odvija istovremeno.

[0082] U pojedinim slučajevima, inkubacija je deo polukontinuiranog procesa, kao što je onaj u kome postupak dalјe obuhvata ostvarivanje unosa ulazne kompozicije u šuplјinu kroz najmanje jedan otvor, sprovođenje celokupnog ili dela inkubacije, kao što je centrifugiranjem, a zatim ostvarivanje isticanja tečnosti iz šuplјine i ponavlјanje procesa, kojim se u šupljinu uvodi druga ulazna kompozicija, nako čega slede centrifugiranje i potom isticanje. Proces može biti iterativan i uključivati nekoliko ciklusa unosa, obrade i isticanja.

[0083] U pojedinim od bilo kojih takvih slučajeva, inkubacija je deo polukontinuiranog procesa, pri čemu postupak dodatno obuhvata, pre navedene inkubacije, ostvarivanje unosa navedene ulazne kompozicije i, opciono gasa, u navedenu šuplјinu kroz navedeni najmanje jedan otvor; a nakon navedene inkubacije, ostvarivanje isticanja tečnosti i/ili opciono gasa iz navedene šuplјine; ostvarivanje unosa druge ulazne kompozicije koja sadrži ćelije i navedene virusne čestice koje sadrže rekombinantan virusni vektor, i opciono gasa, u navedenu unutrašnju šuplјinu; i inkubiranje navedene druge ulazne kompozicije u navedenoj unutrašnjoj šuplјini, pri čemu postupkom nastaje druga izlazna kompozicija koja sadrži mnoštvo ćelija druge ulazne kompozicije koje su transdukovane sa navedenim virusnim vektorom.

[0084] U pojedinim od bilo kojih takvih slučajeva, navedeno obezbeđivanje ili navedeni unos ulazne kompozicije u šuplјinu podrazumeva unos jedne kompozicije koja sadrži ćelije i virusne čestice koje sadrže rekombinantan virusni vektor; ili unos kompozicije koja sadrži ćelije i zasebne kompozicije koja sadrži virusne čestice koje sadrže rekombinantan virusni vektor, tako da se kompozicije mešaju i ostvaruje se unos ulazne kompozicije.

[0085] Unos može podrazumevati unos jedne kompozicije koja sadrži ćelije i virus; ili unos kompozicije koja sadrži ćelije i zasebne kompozicije koji sadrži virus, tako da se kompozicije mešaju i ostvaruje se unos ulazne kompozicije. U pojedinim slučajevima kontinuiranog ili polu-kontinuiranog procesa, obrađuje se ukupno najmanje 1 x 10<8>ćelija ili najmanje 1x10<9>ćelija ili najmanje 1x10<10>ćelija, tokom više ciklusa ili u kontinuiranom procesu.

[0086] U pojedinim slučajevima, postupak uključuje ostvarivanje rotacije centrifugalne komore pre i/ili tokom navedene inkubacije i ostvarivanje isticanja tečnosti iz šupljine u navedeni kontejner za otpad nakon inkubacije; ostvarivanje isticanja tečnosti iz najmanje jednog kontejnera sa razblaživačem u navedenu šuplјinu kroz najmanje jedan otvor i ostvarivanje mešanja sadržaja u šuplјini; kao i ostvarivanje isticanja tečnosti iz navedene šupljine u kontejner za proizvod, čime se ćelije transdukovane sva virusnim vektorom prebacuju u kesu za proizvod.

[0087] U pojedinim slučajevima, postupak dalјe uklјučuje izvođenje drugih koraka obrade ili najmanje dela jednog ili više drugih koraka obrade, unutar iste komore i/ili zatvorenog sistema. U pojedinim slučajevima, jedan ili više koraka obrade može obuhvatati procese u kojima se ćelije izoluju, kao što je razdvajanjem ili selekcijom, i dalje formulisanje kompozicije unutar iste komore i/ili zatvorenog sistema. U pojedinim slučajevima, jedan ili više dodatnih koraka obrade mogu takođe obuhvatati pranje ćelija, resuspendovanje ćelija i/ili razblaživanje ili koncentrisanje ćelija, koji mogu biti izvedeni pre ili nakon bilo kog ili nakon više koraka obrade u svrhu izolacije, poput razdvajanja ili selekcije, stimulisanja, transdukcije i/ili formulisanja ćelija. U pojedinim slučajevima, jedan ili više drugih koraka obrade mogu biti sprovendi pre, istovremeno ili nakon inkubacije ćelija sa česticama virusnog vektora u postupcima transdukcije. U pojedinim slučajevima, jedan ili više dodatnih koraka obrade, ili deo jednog ili više koraka obrade, mogu biti izvedeni u šuplјini centrifugalne komore koja je ista ili različita od šuplјine centrifugalne komore koja se koristi za inkubaciju ćelija sa česticama virusnog vektora.

[0088] Među obezbeđenim postupcima obrade, uklјučujući postupke izolacije, npr. selekcije, postupke stimulacije, postupke formulisanja i druge postupke obrade, su i oni koji se sprovoede prema bilo kom od slučajeva koji su prethodno opisani.

[0089] Na primer, u pojedinim slučajevima, postupak dalјe obuhvata (a) pranje biološkog uzorka (npr. uzorka pune krvi, uzorka koagulisane krvi, uzorka mononuklearnih ćelija periferne krvi (PBMC), uzorka nefrakcionisanih T-ćelija, uzorka limfocita, uzorka belih krvnih zrnaca, proizvoda afereze ili leukafereze) koji sadrži ćelije, u šuplјini komore, pre inkubacije u svrhu izolovanja, npr. selekcijom ćelija, i/ili pre inkubacije u svrhu inkubacije ćelija sa česticama virusnog vektora, (b) izolovanje, npr. selekcijom, ćelija iz uzorka (npr. uzorka pune krvi, uzorka koagulisane krvi, uzorka mononuklearnih ćelija periferne krvi (PBMC), uzorka nefrakcionisanih T-ćelija, uzorka limfocita, uzorka belih krvnih zrnaca, proizvoda afereze ili leukafereze) u šuplјini pre inkubacije takvih ćelija sa česticama virusnog vektora i/ili (c) stimulisanje ćelija u šuplјini pre i/ili tokom inkubacije takvih ćelija sa česticama virusnog vektora, npr. izlaganjem ćelije stimulišućim uslovima, čime se indukuju ćelije ulazne kompozicije da proliferišu. U pojedinim slučajevima, izolovanje podrazumeva selekciju zasnovanu na imunoafinitetu.

[0090] U pojedinim od bilo kojih takvih slučajeva, postupak obuhvata (a) pranje biološkog uzorka koji sadrži navedene ćelije u unutrašnjoj šuplјini centrifugalne komore pre navedene inkubacije; i/ili (b) izolovanje navedenih ćelija iz biološkog uzorka, pri čemu se najmanje deo koraka izolacije izvodi u unutrašnjoj šuplјini centrifugalne komore pre navedene inkubacije; i/ili (c) stimulisanje ćelija pre i/ili tokom navedene inkubacije, pri čemu navedeno stimulisanje obuhvata izlaganje navedenih ćelija stimulišućim uslovima, čime se ćelije indukuju da proliferišu, pri čemu se najmanje deo koraka stimulisanja ćelija izvodi u unutrašnjoj šuplјini centrifugalne komore.

[0091] U pojedinim slučajevima, postupci mogu dalјe uklјučivati izolaciju, npr. selekcijom ćelija u komori, npr. selekcijom zasnovanom na imunoafinitetu. U pojedinim slučajevima, izolacija ćelija, npr. selekcijom, izvodi se pre inkubacije ćelija sa česticama virusnog vektora u postupcima transdukcije, pri

1

čemu izolovane, kao što su selektovane, ćelije predstavljaju ćelije koje su prisutne u ulaznoj kompoziciji i/ili inkubirane su sa česticama virusnog vektora. U pojedinim slučajevima, izolacija, npr. selekcija, obuhvata inkubaciju ćelija sa selekcionim reagensom, kao što je imunoafinitetni reagens. U pojedinim slučajevima, najmanje deo izolacije, npr. selekcije, kao što je inkubacija ćelija sa selekcionim reagensom, npr. imunoafinitetnim reagensom, izvodi se u šupljini komore, što, u pojedinim slučajevima, može obuhvatati rotaciju komore, na primer, u svrhu mešanja reagensa i ćelija.

[0092] U pojedinim slučajevima, postupci mogu dalјe obuhvatati stimulisanje ćelija pre, tokom i/ili nakon inkubacije ćelija sa česticama virusnog vektora, pri čemu se najmanje celokupna ili deo stimulacije može izvesti u šuplјini centrifugalne komore. U pojedinim slučajevima, stimulišući uslovi mogu podrazumevati inkubaciju ćelija u prisustvu agensa koji je u stanju da aktivira jedan ili više unutarćelijskih signalnih domena jedne ili više komponenti TCR kompleksa, kao što je primarni agens koji se specifično vezuje za člana TCR kompleksa, npr. CD3, kao i sekundarni agens koji se specifično vezuje za T-ćelijski kostimulatorni molekul, npr. CD28, CD137 (4-1-BB), OX40 ili ICOS, uklјučujući antitela poput onih koja su prisutna na površini čvrste podloge, poput smole. U pojedinim slučajevima, najmanje deo stimulacije, kao što je inkubacija ćelija u prisustvu stimulišućih uslova, izvodi se u šuplјini komore, što, u pojedinim slučajevima, može podrazumevati rotaciju komore, na primer, radi mešanja reagensa i ćelija.

[0093] U pojedinim od bilo kojih takvih slučajeva, postupak obuhvata formulisanje ćelija, kao što su ćelije proizvedene ili generisane u skladu sa obezbeđenim postupcima, uklјučujući ćelije koje su transdukovane postupkom, u farmaceutski prihvatlјivom puferu u unutrašnjoj šuplјini centrifugalne komore, čime nastaje formulisana kompozicija. U pojedinim slučajevima, postupci dalјe obuhvataju ostvarivanje isticanja formulisane kompozicije u jedan ili više kontejnera. U pojedinim slučajevima, postupci obuhvataju ostvarivanje isticanja formulisane kompozicije što uklјučuje ostvarivanje isticanja brojnih ćelija koje su prisutne u jediničnoj dozi, u jedan ili svaki od navedenog jednog ili mnošva kontejnera.

[0094] U pojedinim od bilo kojih takvih slučajeva, svaka od navedene šuplјine centrifugalne komore je ista ili je različita u odnosu na šuplјinu centrifugalne koja se koristi u jednom ili u više drugih koraka i/ili u procesu inkubiranja i/ili rotiranja ulazne kompozicije koja sadrži ćelije i virusne čestice.

[0095] U pojedinim od bilo kojih takvih slučajeva, svaka od navedenih centrifugalnih komora je sastavni deo zatvorenog sistema, a navedeni zatvoreni sistem obuhvata navedenu komoru i najmanje jedan sistem cevi koji je operativno povezan sa najmanje jednim otvorom preko najmanje jednog konektora, čime se omogućava tečnosti ili gasu da se kreću između navedene šupljine i navedenog najmanje jednog sistema cevi u najmanje jednoj konfiguraciji navedenog sistema.

[0096] Ćelije koje su obrađene postupcima su obično primarne ćelije, kao što su ćelije dobijene iz subjekta, obično čoveka. Ćelije mogu biti izvedene iz subjekta kome će terapija biti primenjena, kao što je onaj sa oboljenjem ili stanjem na koje ciljano deluje rekombinantan molekul koga eksprimira transdukovani vektor, npr. rekombinantan antigeni receptor poput himernog antigenog receptora ili transgenog TCR. Alternativno, ćelije mogu biti iz različitog subjekta. Tako, postupci obuhvataju obradu za autologni i alogeni prenos. Ćelije mogu podrazumevati suspenzije ćelija, npr. belih krvnih zrnaca, npr. T-ćelija, kao što su izolovane CD8<+>T-ćelije ili izolovane CD4<+>T-ćelije ili njihove subpopulacije, ili NK ćelije.

[0097] U pojedinim slučajevima, tokom inkubacije, centrifugalna komora je povezana sa senzorom, na primer, senzorom koji je u stanju na prati poziciju pokretnog elementa, kao i sa regulatorom protoka, kao što je regulator koji je u stanju da prima i prenosti informacije sa i na senzor i da prouzrokuje kretanje navedenog pokretnog elementa i/ili koji je dalјe povezan sa centrifugom i tako je u stanju da prouzrokuje rotaciju komore tokom navedene inkubacije.

[0098] U pojedinim slučajevima, komora sadrži pokretni element, a tokom inkubacije je smeštena u centrifugi i povezana je sa senzorom, koji je u stanju da nadgleda poziciju pokretnog elementa, kao i sa regulatorom protoka koji je u stanju da primi i prenese informaciju sa senzora i da prouzrokuje kretanje navedenog pokretnog elementa, preuzimanje i isticanje tečnosti u i iz navedene šupljine putem navedenog jednog ili više sistema cevi, kao i rotaciju komore putem centrifuge.

[0099] U pojedinim slučajevima, komora, regulator protoka, centrifuga i/ili senzor su smešteni unutar kućišta, npr. tokom inkubacije.

[0100] U pojedinim slučajevima bilo kog od postupaka uvođenja virusa, npr. postupaka transdukcije, rekombinantan virusni vektor kodira rekombinantan receptor, koji se na taj način eksprimira od strane ćelija izlazne kompozicije. U pojedinim slučajevima, rekombinantan receptor je rekombinantan antigeni receptor, kao što je funkcionalan receptor koji se ne javlja na T-ćelijama, npr. himerni antigeni receptor (CAR) ili transgeni T-ćelijski receptor (TCR). U pojedinim slučajevima, rekombinantan receptor je himerni receptor koji sadrži vanćelijski deo koji se specifično vezuje za ligand i unutarćelijski signalni deo koji sadrži aktivacioni domen i kostimulatorni domen.

[0101] U pojedinim od bilo kojih takvih slučajeva, ćelije obuhvataju primarne T-ćelije čoveka dobijene iz humanog subjekta, pre inkubacije sa česticama virusnog vektora i/ili pre završetka transdukcije i/ili, kada postupak obuhvata formulisanje, pre formulisanja primarne humane T-ćelije nisu bile izvan subjekta izložene temperaturi većoj od 30°C duže od 1 sata, duže od 6 sati, duže od 24 sata ili duže od 48 sati, bilo pre inkubacije i/ili pre završetka transdukcije, i/ili, kada postupak uklјučuje formulisanje, pre formulisanja, primarne humane T-ćelije nisu bile inkubirane u prisustvu antitela specifičnog za CD3 i/ili antitela specifičnog za CD28 i/ili citokin, tokom duže od 1 sata, duže od 6 sati, veće od 24 sata ili duže od 48 sati.

[0102] Ovde su obezbeđeni postupci za izolovanje ćelija, npr. selekcijom, koji obuhvataju (a) inkubiranje selekcionog reagensa i primarnih ćelija u unutrašnjoj šuplјini centrifugalne komore u uslovima uz mešanje, čime se mnoštvo primarnih ćelija vezuje za navedeni selekcioni reagens i (b) razdvajanje mnoštva primarnih ćelija od ostalih, jedne ili više primarnih ćelija, na osovu vezivanja za selekcioni reagens, čime se primarne ćelije obogaćuju, na osnovu vezivanja za selekcioni reagens, a pri čemu se centrifugalna komora može rotirati oko ose rotacije i unutrašnja šupljina je sa maksimalnom zapreminom od najmanje 50 ml, najmanje 100 ml ili najmanje 200 ml. U pojedinim slučajevima, postupci za izolaciju, npr. selekcijom, odvijaju se u zatvorenom sistemu. U pojedinim slučajevima, pre koraka razdvajanja mnoštva ćelija, ćelije inkubirane sa selekcionim reagensom se izvode iz ili se prebaciju iz komore, ali se zadržavaju u zatvorenom sistemu. U pojedinim slučajevima, opciono, nakon inkubacije sa selekcionim reagensom i pre razdvajanja ćelija, postupak dalјe uklјučuje jedan ili više koraka pranja, koji se u pojedinim slučajevima, mogu izvesti u šuplјini komore u skladu sa obezbeđenim postupcima. U pojedinim slučajevima, korak razdvajanja ćelija može biti ostvaren uporebom čvrstog nosača, kao što je upotrebom imunoafinitetne kolone, uklјučujući one za magnetno razdvajanje koje se mogu nalaziti u zatvorenom sistemu.

1

[0103] Ovde su obezbeđeni postupci za stimulaciju ćelija, uklјučujući inkubiranje stimulišućeg agensa i primarnih ćelija pod uslovima u kojima se stimulišući agens vezuje za molekul eksprimiran od strane mnošva primarnih ćelija, a mnoštvo ćelija se aktivira ili stimuliše, pri čemu se najmanje deo inkubacije izvodi u unutrašnjoj šuplјini centrifugalne komore u uslovima uz mešanje, pri čemu se centrifugalna komora može rotirati oko ose rotacije i unutrašnja šuplјina je maksimalne zapremine od najmanje 50 ml, najmanje 100 ml ili najmanje 200 ml.

[0104] U pojedinim slučajevima, postupci stimulacije se sprovode kao deo procesa koji uključuje trasdukciju ćelija, pri čemu se ceo ili deo takvog procesa izvodi u centrifugalnoj komori i/ili u delu istog zatvorenog sistema. U pojedinim slučajevima, primarne ćelije koje su stimulisane agensom za stimulaciju obuhvataju ili su ćelije dobijene nakon izolacije, npr. selekcijom, ćelija iz biološkog uzorka, kao što je u skladu sa obezbeđenim postupcima. U pojedinim slučajevima, najmanje deo stimulacije se izvodi istovremeno ili tokom inkubacije ćelija sa česticama virusnog vektora, tako da primarne ćelije obuhvataju ili su ćelije prisutne u ulaznoj kompoziciji i/ili su ćelije u kojima se transdukcija već dogodila ili je inicirana. U pojedinim slučajevima, najmanje deo stimulacije se izvodi pre inkubacije ćelija sa česticama virusnog vektora, tako da su ćelije inkubirane sa česticama virusnog vektora stimulisane ćelije, što, u pojedinim slučajevima, obuhvata ćelije koje proliferišu.

[0105] U pojedinim slučajevima, najmanje deo jednog ili više drugih koraka obrade u postupku, uklјučujući izolaciju, npr. selekciju, stimulaciju, pranje i/ili formulisanje, a koji se izvode u komori koju čine zadnji zid, suštinski krut bočni zid koji se proteže od navedenog zadnjeg zida i najmanje jedan otvor, gde najmanje deo bočnog zida okružuje unutrašnju šuplјinu i najmanje jedan otvor je u stanju da omogući preuzimanje tečnosti u unutrašnju šuplјinu i isticanje tečnosti iz šuplјine.

[0106] Ovde su obezbeđene kompozicije koje sadrže transdukovane ćelije proizvedene postupcima iz bilo kog od predhodno navedenih slučajeva. U pojedinim od bilo kojih takvih slučajeva, kompozicija sadrži ćelije koje su primarne ćelije i/ili humane ćelije i/ili uklјučuju bela krvna zrnca i/ili T-ćelije i/ili NK ćelije. U pojedinim od bilo kojih takvih slučajeva, kompozicija sadrži najmanje 5 x 10<7>ćelija, 1 x 10<8>ćelija, 2 x 10<8>ćelija, 4 x 10<8>ćelija, 6 x 10<8>ćelija, 8 x 10<8>ćelija ili 1 x 10<9>ćelija. U pojedinim od bilo kojih takvih slučajeva, kompozicija sadrži terapijski efektivan broj ćelija za upotrebu u adoptivnoj T-ćelijskoj terapiji. U pojedinim od bilo kojih takvih slučajeva, ćelije su T-ćelije i nakon transdukcije, ćelije u kompoziciji se ne podrvgavaju ekspanziji ćelija u prisustvu stimulišućeg agensa i/ili se ćelije ne inkubiraju na temperaturi većoj od 30 °C duže od 24 sata ili kompozicija ne sadrži citokin ili kompozicija ne sadrži stimulišući agens koji se specifično vezuje za CD3 ili TCR kompleks.

[0107] Ovde su obezbeđene kompozicije koje sadrže najmanje 1 x 10<7>ili najmanje 5 x 10<7>T-ćelija, od kojih je najmanje mnoštvo transdukovano sa rekombinantnim virusnim vektorom, a pri čemu, nakon transdukcije, ćelije u kompoziciji nisu bile podvrgavane ekspanziji ćelija u prisustvu stimulišućeg agensa i/ili ćelije nisu bile inkubirane na temperaturi većoj od 30 °C tokom više od 24 sata i/ili najmanje 30, 40, 50, 60, 70 ili 80% T-ćelija u kompoziciji sadrži visoko eksprimiran CD69 ili TGF-beta-II na površini. U pojedinim slučajevima, kompozicija sadrži najmanje 1 x 10<8>ćelija, 2 x 10<8>ćelija, 4 x 10<8>ćelija, 6 x 10<8>, 8 x 10<8>ćelija ili 1 x 10<9>ćelija.

[0108] U pojedinim od bilo kojih takvih slučajeva, T-ćelije su nefrakcionirane T-ćelije, izolovane CD8+ T-ćelije ili izolovane CD4+ T-ćelije.

1

[0109] U pojedinim od bilo kojih takvih slučajeva, najmanje 2,5%, najmanje 5%, najmanje 6%, najmanje 8%, najmanje 10%, najmanje 20%, najmanje 25%, najmanje 30%, najmanje 40 %, najmanje 50% ili najmanje 75% navedenih ćelija u navedenoj kompoziciji je transdukovano sa virusnim vektorom.

[0110] U pojedinim od bilo kojih takvih slučajeva, virusni vektor kodira rekombinantan receptor, a transdukovane ćelije u kompoziciji eksprimiraju rekombinantan receptor. U pojedinim slučajevima, rekombinantan receptor je rekombinantan antigeni receptor. U pojedinim slučajevima, rekombinantan antigeni receptor je funkcionalan receptor koji nije karakterističan za T-ćelije. U pojedinim slučajevima, funkcionalan receptor koji nije karakterističan za T-ćelije je himerni antigeni receptor (CAR). U pojedinim slučajevima, rekombinantan receptor je himerni receptor koji sadrži vanćelijski deo koji se specifično vezuje za ligand i unutarćelijski signalni deo koji sadrži aktivacioni domen i kostimulatorni domen. U pojedinim slučajevima, rekombinantan antigeni receptor je transgeni T-ćelijski receptor (TCR).

[0111] U pojedinim od bilo kojih takvih slučajeva, među svim ćelijama u kompoziciji, prosečan broj kopija rekombinantnog virusnog vektora nije veći od oko 10, nije veći od 8, nije veći od 6, nije veći od 4 ili nije veći od oko 2, ili među ćelijama u kompoziciji koje su transdukovane sa rekombinantnim virusnim vektorom, prosečan broj kopija navedenog vektora nije veći od oko 10, nije veći od 8, nije veći od 6, nije veći od 4 ili nije veći od oko 2.

[0112] U pojedinim od bilo kojih takvih slučajeva, kompozicija sadrži farmaceutski prihvatlјiv ekscipijens.

[0113] Ovde su obezbeđeni postupci lečenja, uklјučujući primenu kompozicije iz bilo kog od prethodno navedenih slučajeva, subjektu koji boluje od oboljenja ili stanja. U pojedinim slučajevima, transdukovane T-ćelije u kompoziciji ispoljavaju povećanu ili dužu ekspanziju i/ili postojanost u subjektu od transdukovanih T-ćelija u kompoziciji u kojoj su, nakon transdukcije, ćelije u kompoziciji podvrgavane ekspanziji ćelija u prisustvu stimulišućeg agensa i/ili su ćelije bile inkubirane na temperaturi većoj od 30 °C tokom više od 24 sata.

[0114] U pojedinim od bilo kojih takvih slučajeva, rekombinantan receptor, himerni antigeni receptor ili transgeni TCR, specifično se vezuju za antigen koji je povezna sa oboljenjem ili stanjem. U pojedinim slučajevima, oboljenje ili stanje je kancer, autoimuna bolest ili poremećaj ili infektivno oboljenje.

[0115] Ovde su obezbeđene kompozicije koje sadrže najmanje 1 x 10<7>ćelija i najmanje ili oko 1 infektivne jedinice (IU) virusnih čestica koje sadrže rekombinantan virusni vektor po ćeliji. U pojedinim slučajevima, ćelije sadrže najmanje ili oko 50 x 10<6>ćelija, 100 x 10<6>ćelija ili 200 x 10<6>ćelije i/ili su navedene virusne čestice prisutne u kompoziciji u količini koja iznosi najmanje 1,6 IU/ćeliji, 1,8 IU/ćeliji, 2,0 IU/ćeliji, 2,4 IU/ćeliji, 2,8 IU/ćeliji, 3,2 IU/ćeliji, 3,6 IU/ćeliji, 4,0 IU/ćeliji, 5,0 IU/ćeliji, 6,0 IU/ćeliji, 7,0 IU/ćeliji, 8,0 IU/ćeliji, 9,0 IU/ćeliji ili 10,0 IU/ćeliji.

[0116] U bilo kom od takvih slučajeva, zapremina tečne kompozicije je manja ili jednaka 220 ml, manja je ili jednaka 200 ml, manja je ili jednaka 100 ml, manja je ili jednaka 50 ml ili je manja ili jednaka 20 ml.

[0117] U pojedinim od bilo kojih takvih slučajeva, ćelije su primarne ćelije. U pojedinim od bilo kojih takvih slučajeva, ćelije su humane ćelije. U pojedinim od bilo kojih takvih slučajeva, ćelije podrazumevaju suspenziju ćelija, ćelije uklјučuju bela krvna zrnca i/ili ćelije uklјučuju T-ćelije ili NK

1

ćelije. U pojedinim slučajevima, ćelije su T-ćelije, a T-ćelije su nefrakcionisane T-ćelije, izolovane CD8+ T-ćelije ili izolovane CD4+ T-ćelije.

[0118] U pojedinim od bilo kojih takvih slučajeva, virusni vektor kodira rekombinantan receptor. U pojedinim slučajevima, rekombinantan receptor je rekombinantan antigeni receptor. U pojedinim slučajevima, rekombinantan antigeni receptor je funkcionalan receptor koji nije karakterističan za T-ćelije. U pojedinim slučajevima, funkcionalan receptor koji nije karakterističan za T-ćelije je himerni antigeni receptor (CAR). U pojedinim slučajevima, rekombinantan receptor je himerni receptor koji sadrži vanćelijski deo koji se specifično vezuje za ligand i unutarćelijski signalni deo koji sadrži aktivacioni domen i kostimulatorni domen. U pojedinim slučajevima, rekombinantan antigeni receptor je transgeni T-ćelijski receptor (TCR).

[0119] Ovde su obezbeđene centrifugalne komore koje se mogu rotirati oko ose rotacije i koje sadrže unutrašnju šuplјinu u kojoj se nalazi kompozicija iz bilo kog od prethodno navedenih slučajeva.

[0120] Ovde su obezbeđene centrifugalne komore koje se mogu okretati oko ose rotacije i koje sadrže unutrašnju šupljinu u kojoj se nalazi (a) kompozicija koja sadrži najmanje 5 x 10<7>primarnih T-ćelija transdukovanih sa rekombinantnim virusnim vektorom i/ili (b) kompozicija koja sadrži najmanje 5 x 10<7>primarnih T-ćelija i virusnih partikula koje sadrže rekombinantan virusni vektor.

[0121] U pojedinim od bilo kojih takvih slučajeva, komora dalјe sadrži zadnji zid, suštinski krut bočni zid koji se proteže od navedenog zadnjeg zida i najmanje jedan otvor, pri čemu najmanje deo navedenog bočnog zida okružuje navedenu unutrašnju šuplјinu i navedeni najmanje jedan otvor je u stanju da omogući ulazak tečnosti u navedenu unutrašnju šuplјinu i isticanje tečnosti iz navedene šuplјine.

[0122] U pojedinim od bilo kojih takvih slučajeva, navedena kompozicija u navedenoj šuplјini sadrži najmanje 1 x 10<8>ćelija, 2 x 10<8>ćelija, 4 x 10<8>ćelija, 6 x 10<8>ćelija, 8 x 10<8>ćelija ili 1 x 10<9>ćelija.

[0123] U pojedinim od bilo kojih takvih slučajeva, T-ćelije su nefrakcionirane T-ćelije, izolovane CD8+ T-ćelije ili izolovane CD4+ T-ćelije.

[0124] U pojedinim od bilo kojih takvih slučajeva komore, najmanje 2,5%, najmanje 5%, najmanje 6%, najmanje 8%, najmanje 10%, najmanje 20%, najmanje 25%, najmanje 30%, najmanje 40%, najmanje 50% ili najmanje 75% navedenih ćelija u navedenoj kompoziciji je transdukovano sa virusnim vektorom.

[0125] U pojedinim od bilo kojih takvih slučajeva komore, virusni vektor kodira rekombinantan receptor i ćelije u kompoziciji eksprimiraju rekombinantan receptor. U pojedinim slučajevima, rekombinantan receptor je rekombinantan antigeni receptor. U pojedinim slučajevima, rekombinantan antigeni receptor je funkcionalan receptor koji nije karakterističan za T-ćelije. U pojedinim slučajevima, funkcionalan receptor koji nije karakterističan za T-ćelije je himerni antigeni receptor (CAR). U pojedinim slučajevima, rekombinantan receptor je himerni receptor koji sadrži vanćelijski deo koji se specifično vezuje za ligand i unutarćelijski signalni deo koji sadrži aktivacioni domen i kostimulatorni domen. U pojedinim slučajevima, rekombinantan antigeni receptor je transgeni T-ćelijski receptor (TCR).

1

[0126] U pojedinim od bilo kojih takvih slučajeva komore, među svim ćelijama u kompoziciji, prosečan broj kopija navedenog rekombinantnog virusnog vektora nije veći od oko 10, nije veći od 8, nije veći od 6, nije veći od 4 ili nije veći od oko 2 ili među ćelijama u kompoziciji koje su transdukovane sa rekombinantnim virusnim vektorom, prosečan broj kopija navedenog vektora nije veći od oko 10, nije veći od 8, nije veći od 6, nije veći od 4 ili nije veći od oko 2.

[0127] Ovde su obezbeđene centrifugalne komore koje se mogu okretati oko ose rotacije, uklјučujući unutrašnju šuplјinu koja sadrži kompoziciju iz bilo kog od prethodno navedenih slučajeva. U pojedinim slučajevima, komora dalјe sadrži zapreminu gasa koja ispunjava komoru do maksimalne zapremine unutrašnje šuplјine komore. U pojedinim slučajevima, gas je vazduh.

[0128] U pojedinim od bilo kojih takvih slučajeva komore, komora se može okretati oko ose rotacije i čine je zadnji zid, suštinski krut bočni zid koji se proteže od navedenog zadnjeg zida i najmanje jedan otvor, pri čemu najmanje deo navedenog bočnog zida okružuje navedenu unutrašnju šuplјinu i navedeni najmanje jedan otvor je u stanju da dozvoli ulazak tečnosti u navedenu unutrašnju šuplјinu i isticanje tečnosti iz navedene šuplјine. U pojedinim je slučajevima, bočni zid zakrivljen. U pojedinim slučajevima, bočni zid je uglavnom cilindričan.

[0129] U pojedinim od bilo kojih takvih slučajeva komore, navedeni najmanje jedan otvor podrazumeva dovod i izlaz, odnosno u stanju je da dozvoli navedeni unos i isticanje ili navedeni najmanje jedan otvor podrazumeva jedan dovod/odvod, koji je u stanju da dozvoli navedeni unos i navedeno isticanje. U pojedinim od bilo kojih takvih slučajeva komore, pomoć je što je najmanje jedan otvor koaksijalno postavljen sa komorom i nalazi se na zadnjem zidu.

[0130] U pojedinim od bilo kojih takvih slučajeva, komora dalјe sadrži pokretni element, a navedena unutrašnja šuplјina je prostor promenlјive zapremine koja je definisana navedenim zadnjim zidom, navedenim suštinski krutim bočnim zidom i navedenim pokretnim elementom, pri čemu je navedeni pokretni element u stanju da se kreće unutar komore da bi se menjala unutrašnja zapremina šuplјine. U pojedinim slučajevima, pokretni element je klip i/ili je pokretni element u stanju da se aksijalno kreće unutar komore zarad promene unutrašnje zapremine šuplјine.

[0131] U pojedinim od bilo kojih takvih slučajeva, unutrašnja površina navedene šuplјine je najmanje ili je oko 1 x 10<9>µm<2>, unutrašnja površina navedene šuplјine je najmanje ili je oko 1 x 10<10>µm<2>, dužina krutog zida u pravcu koji se proteže od zadnjeg zida je najmanje oko 5 cm, dužina navedenog krutog zida u pravcu koji se proteže od zadnjeg zida je najmanje oko 8 cm i/ili je šuplјina poluprečnika od najmanje oko 2 cm na najmanje jednom poprečnom preseku.

[0132] U pojedinim od bilo kojih takvih slučajeva komore, zapremina tečnosti navedene kompozicije prisutne u navedenoj šuplјini je između ili je između oko 0,5 ml po kvadratnom inču unutrašnje površine šuplјine (ml/kv.in) i 5 ml/sk.in, 0.5 ml/kv.in i 2,5 ml/kv.in., 0,5 ml/kv.in. i 1 ml/kv.in., 1 ml/kv.in. i 5 ml/kv.in., 1 ml/kv.in. i 2,5 ml/kv.in ili 2,5 ml/kv.in i 5 ml/kv.in U pojedinim od bilo kojih takvih slučajeva, zapremina tečnosti navedene kompozicije koja je prisutna u navedenoj šuplјini je najmanje 0,5 ml/kv., 1 ml/kv.in., 2,5 ml/kv.in. ili 5 ml/kv.in.

[0133] Ovde su obezbeđeni zatvoreni sistemi koji sadrže centrifugalnu komoru iz bilo kog od prethodno navedenih slučajeva. U pojedinim od bilo kojih takvih slučajeva zatvorenog sistema, centrifugalna komora je u stanju da se okreće sa brzinom do 8000 g, pri čemu je centrifugalna komora u stanju da

1

izdrži silu od 500, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000 ili 3200 g, bez suštinskog popuštanja, savijanja ili lomlјenja ili bez oštećenja komore na drugi način i/ili uz suštinsko zadržavanje generalno cilindričnog oblika pri dejstvu takve sile.

Kratak opis slika nacrta

[0134]

SL. 1A prikazuje efikasnost transdukcije izračunate u vidu procenta CD3<+>T-ćelija kod kojih je na površini eksprimiran receptor za himerni antigen (CAR) kodiran virusnim vektorom, nakon inkubacije u raznim uslovima, kao što je opisano u Primeru 1. SL.1B prikazuje dupliranja populacije tokom perioda od šest dana u toku studije transdukcije opisane u Primeru 1.

SL. 2 prikazuje efikasnost transdukcije izračunate u vidu procenta CD3<+>T-ćelija kod kojih je na površini eksprimiran CAR kodiran virusnim vektorom, nakon inkubacije u naznačenim uslovima, kao što je opisano u Primeru 2.

SL. 3 prikazuje efikasnost transdukcije izračunate u vidu procenta CD3<+>T-ćelija kod kojih je na površini eksprimiran CAR kodiran virusnim vektorom, nakon inkubacije u raznim uslovima, kao što je opisano u Primeru 3.

SL. 4 prikazuje srednji broj kopija vektora (VCN) virusnog vektora u naznačenim ćelijskim populacijama, nakon transdukcije u raznim uslovima, kao što je opisano u Primeru 4.

SL. 5 obezbeđuje šematski prikaz slučaja zatvorenog sistema (kompleta za obradu) za upotrebu u slučajevima obezbeđenih postupaka. Prikazan sistem za primer obuhvata generalno cilindričnu centrifugalnu komoru (1), koja se može okretati oko ose rotacije i čine je zadnji zid (13), krut bočni zid (14) i klip (2), koji definišu unutrašnju šuplјinu (7) komore. Komora dalјe sadrži otvor kao dovod/odvod (6) da bi se omogućio protok tečnosti i gasa u i iz šuplјine u najmanje pojedinim konfiguracijama sistema. Otvor (6) je operativno povezan sa serijama sistema ceva (3) i konektorima, uklјučujući zaustavne ventile (4) i razne dodatne kontejnere. Prikazane su i stezalјke (5).

SL. 6A prikazuje dupliranja polulacije tokom perioda od deset dana u okviru studije opisane u Primeru 6. SL.6B prikazuje procenat vijabilnosti ćelija tokom perioda od deset dana u okviru studije opisane u Primeru 6.

SL. 7 obezbeđuje šematski prikaz slučaja zatvorenog sistema (kompleta za obradu) za upotrebu u slučajevima obezbeđenih postupaka. Prikazan sistem za primer obuhvata generalno cilindričnu centrifugalnu komoru (1), koja se može okretati oko ose rotacije i čine je zadnji zid (13), krut bočni zid (14) i klip (2), koji definišu unutrašnju šuplјinu (7) komore. Komora dalјe sadrži otvor kao dovod/odvod (6) da bi se omogućio protok tečnosti i gasa u i iz šuplјine u najmanje pojedinim konfiguracijama sistema. Otvor (6) je operativno povezan sa serijama sistema ceva (3) i konektorima, uklјučujući zaustavne ventile (4), razne dodatne kontejnere i filter za vazduh (15) koji je opremljen poklopcem koji se može ukloniti (16). Prikazane su i stezalјke (5).

2

SL. 8A prikazuje efikasnost transdukcije izračunate u vidu procenta CD3<+>T-ćelija kod kojih je na površini eksprimiran CAR kodiran virusnim vektorom, nakon inkubacije pod naznačenim uslovima, kao što je opisano u Primeru 8A. SL.8B prikazuje efikasnost transdukcije izračunate u vidu procenta CD3<+>T-ćelija kod kojih je na površini eksprimiran CAR kodiran virusnim vektorom, nakon inkubacije pod naznačenim uslovima, kao što je opisano u Primeru 8B. SL. 8C prikazuje srednji broj kopija vektora (VCN) virusnog vektora u naznačenim ćelijskim populacijama nakon transdukcije pod raznim uslovima, kao što je opisano u Primeru 8B.

SL. 9A prikazuje efikasnost transdukcije izračunate u vidu procenta CD3<+>T-ćelija kod kojih je na površini eksprimiran CAR kodiran virusnim vektorom, nakon inkubacije pod naznačenim uslovima, kao što je opisano u Primeru 9. SL.9B prikazuje srednji broj kopija vektora (VCN) virusnog vektora u naznačenim populacijama ćelija nakon transdukcije pod raznim uslovima, kao što je opisano u Primeru 9.

SL. 10 prikazuje efikasnost transdukcije izračunate u vidu procenta CD3<+>T-ćelija kod kojih je na površini eksprimiran CAR kodiran virusnim vektorom nakon inkubacije pod naznačenim uslovima, kao što je opisano u Primeru 10.

SL.11 obezbeđuje šematski prikaz slučaja zatvorenog sistema (kompleta za obradu) za upotrebu u slučajevima obezbeđenih postupaka. Prikazan sistem za primer obuhvata generalno cilindričnu centrifugalnu komoru (1), koja se može okretati oko ose rotacije i čine je zadnji zid (13), krut bočni zid (14) i klip (2), koji definišu unutrašnju šuplјinu (7) komore. Komora dalјe sadrži otvor kao dovod/odvod (6) da bi se omogućio protok tečnosti i gasa u i iz šuplјine u najmanje pojedinim konfiguracijama sistema. Otvor (6) je operativno povezan sa serijama sistema ceva (3) i konektorima, uklјučujući zaustavne ventile (4) i priključke (18), kao i razne dodatne kontejnere, uklјučujući mnoštvo izlaznih kesa (17). Prikazane su i stezaljke (5).

Detalјan opis

[0135] Ukoliko nije drugačije definisano, predviđeno je da svi termini iz oblasti tehnike, kao i obeležavanja i drugi tehnički i naučni termini ili terminologija koji su ovde upotrebljeni, imaju isto značenje kao što se to obično podrazumeva od strane prosečno iskusnog stručnjaka iz oblasti tehnike za koga je priložen predmet opisa i predviđen. U pojedinim slučajevima, termini sa značenjima koja se uobičajeno podrazumevaju, ovde su dodatno definisani radi jasnoće i/ili u vidu spremnih referentnih pojmova, a uključivanje definicija ne bi trebalo ovde tumačiti tako da predstavlјaju suštinski različite definicije u odnosu na one koje se uglavnom podrazumevaju u oblasti tehnike.

[0136] Naslovi poglavlja koji su ovde upotrebljeni, navedeni su samo u organizacione svrhe i ne treba ih tumačiti ograničavajućim za opisanu temu.

I. Postupci obrade ćelija i pridruženi sistemi, kompleti i uređaji

[0137] Obezbeđeni su postupci za obradu ćelija, na primer, za generisanje kompozicija ćelija za upotrebu u adoptivnoj ćelijskoj terapiji. Postupci obuhvataju one za uvođenje rekombinantnih virusnih vektora u ćelije, kao što je virusna transdukcija. Virusni vektori uglavnom kodiraju rekombinantne molekule koje je potrebno eksprimirati u ćelijama, npr. radi upotrebe u ćelijskoj terapiji. Koraci obrade u ovim postupcima mogu takođe ili alternativno uključivati sve ili pojedine od njih, poput pranja ćelija, razblaživanja, selekcije, izolacije, razdvajanja, kultivisanja, stimulacije, pakovanja i/ili formulisanja. Postupci uglavnom omogućavaju obradu, npr. selekciju ili razdvajanje i/ili transdukciju, ćelija u velikom obimu (kao što su kompozicije zapremina većih od ili oko 50 ml). Jedan ili više koraka od koraka obrade ćelija, generalno se izvode u unutrašnjoj šuplјini centrifugalne komore, kao što je u suštinski krutoj komori koja je u principu cilindričnog oblika i može se okretati oko ose rotacije, što može obezbediti određene prednosti u poređenju s drugim dostupnim postupcima. U pojedinim slučajevima, svi koraci obrade se izvode u istoj centrifugalnoj komori. U pojedinim slučajevima, jedan ili više koraka obrade se izvode u različitim centrifugalnim komorama, kao što su višestruke centrifugalne komore istog tipa.

[0138] Obezbeđeni postupci nude razne prednosti u poređenju s dostupnim postupcima za obradu ćelija, uklјučujući transdukciju i selekciju, posebno prilikom obrade ćelija u velikom obimu. Određeni dostupni postupci nisu bili u potpunosti zadovoljavajući, na primer, zbog efikasnosti, tačnosti, ponovljivosti, troškova i utrošnje vremena, rizika od greške, kompleksnosti i potrebe za rukovanjem i biološkom bezbednošću postrojenja koji su bili niži od optimalnih. U pojedinim slučajevima, obezbeđeni postupci su pogodni za proizvodnju ćelija u velikom obimu i/ili kliničkog stepena čistoće i nude dodatne prednosti koje nisu obezbeđene dostupnim postupcima. Na primer, postupci za transdukciju ćelija i/ili selekciju zasnovanu na afinitetu nude prednosti u poređenju sa dostupnim postupcima koji se izvode u fleksibilnim plastičnim kesama ili plastičnim pločicama sa više ležišta.

[0139] U pojedinim slučajevima, centrifugalna komora i/ili njena unutrašnja šuplјina u kojoj se ćelije obrađuju, okružena je ili je najmanje delimično definisana krutim ili suštinski krutim materijalom. Inkubacija u šuplјini koja je sačinjena od takvih materijala, kao što je tvrda plastika, omogućava centrifugiranje pod određenim uslovima, kao što je primena sila većih od onih koje mogu biti upotrebljene sa kesama koje se upotrebljavaju u drugim postupcima obrade ćelija u velikom obimu. Na primer, u pojedinim slučajevima, komora i šuplјina podnose centrifugiranje uz silu, npr. relativnu centrifugalnu silu, od najmanje ili oko 500 g, 1000 g, 1500 g, 2000 g, 2500 g, 3000 g ili 3200 g, koja se meri na primer na unutrašnjem ili spolјnom zidu komore ili šuplјine, ili na jednoj ili više ćelija, kao što je sloj ćelija, bez suštinskog popuštanja, savijanja ili lomlјenja ili oštećenja komore ili šuplјine u kojoj su sadržane ćelije na neki drugi način, tako da komora i/ili šuplјina suštinski zadržavaju njihov oblik pri dejstvu takve sile.

[0140] Shodno navedenom, komora i/ili njena unutrašnja šuplјina obično su okružene celokupnim ili delom krutog ili polukrutog bočnog zida, kao što je onaj napravljen od tvrde plastike, čime se održava njen oblik pod primenjenom centrifugalnom silom. Bočni zid je obično zakrivljen, npr. cilindričan je ili je u principu cilindričan, a obično se proteže od jednog ili dva zadnja zida komore, pri čemu unutrašnja strana jednog ili oba može takođe definisati granice unutrašnje šuplјine. Zadnji zidovi u pojedinim slučajevima su takođe napravljeni od krutih materijala, a u pojedinim slučajevima, mogu sadržavati i fleksibilnije materijale. U pojedinim slučajevima, iako je zid napravlјen od čvrstog materijala ili pretežno čvrstog materijala, on ipak može biti obložen i/ili prevučen fleksibilnim materijalom i/ili sadržavati male delove koji su fleksibilniji, sve dok šuplјina u celini zadržava svoj opšti oblik u uslovima postupaka.

[0141] Centrifugalna komora se uglavnom može okretati oko ose rotacije, a šuplјina je obično koaksijalna sa komorom. U pojedinim slučajevima, centrifugalna komora dalјe sadrži pokretni element, poput klipa, koji je uglavnom u stanju da se pokreće (npr. kreće se aksijalno) unutar komore, da bi se menjala zapremina šuplјine. Stoga, u posebnim slučajevima, unutrašnja šuplјina je definisana bočnim zidom i zadnjim zidom komore i pokretnim elementom i ima promenlјivu zapreminu koja se može podesiti pomeranjem pokretnog elementa. Pokretan element može biti izrađen od krutih, suštinski ili generalno krutih, fleksibilnih materijala ili njihovih kombinacija.

[0142] Komora obično takođe sadrži jedan ili više otvora, kao što su jedan ili više dovoda, jedan ili više odvoda i/ili jedan ili više otvora u vidu dovoda/odvoda, koji mogu dozvoliti unos i isticanje tečnosti i/ili gasa u i iz šuplјine. U pojedinim slučajevima, otvor može biti dovod/odvod kroz koji se tečnost i/ili gas i uvodi i odvodi. U pojedinim slučajevima, jedan ili više dovoda mogu biti odvojeni ili različiti od jednog ili više odvoda. Otvor ili otvori mogu biti na jednom od zadnjih zidova. U pojedinim slučajevima, tečnost i/ili gas se preuzimaju u i/ili ističu iz šuplјine kretanjem pokretnog elementa da bi se povećala i/ili smanjila zapremine šuplјine. U drugim slučajevima, tečnost i/ili gas mogu mogu biti preuzeti u ili isticati iz šuplјine kroz sistem cevi ili druge kanala koji se nalaze ili su postavljeni u vezu sa otvorom, na primer, postavljanjem cevi ili kanala u vezu sa i pod kontrolu pumpe, šprica ili drugih mašina koje se mogu kontrolisati na automatizovan način.

[0143] U pojedinim slučajevima, komora je deo zatvorenog sistema, poput sterilnog sistema, sa raznim dodatnim komponentama kao što su sistemi cevi i konektori i poklopci, a unutar koga se odvijaju koraci obrade. Tako, u pojedinim slučajevima, obezbeđeni postupci i/ili koraci istih se izvode u potpuno zatvorenom ili polu-zatvorenom okruženju, kao što je zatvoren ili polu-zatvoren sterilan sistem, čime se olakšava proizvodnja ćelija za terapijsku primenu subjektima bez potrebe za posebnim sterilnim okruženjem, poput sterilnog kabineta ili sobe. Postupci se u pojedinim slučajevima, izvode na automatizovan ili delimično automatizovan način.

[0144] U pojedinim slučajevima, komora je povezana sa centrifugom koja je u stanju da izvrši rotaciju komore, kao što je oko svoje ose rotacije. Rotacija se može odvijati pre, tokom i/ili nakon inkubacije u jednom ili u više koraka obrade. Tako, u pojedinim slučajevima, jedan ili više od raznih koraka obrade se izvode uz rotaciju, npr. pod dejstvom određene sile. Komora je obično u stanju da rotira vertikalno ili generalno vertikalno, tako da je komora postavljena vertikalno tokom centrifugiranja, dok su bočni zid i osa vertikalni ili generalno vertikalni, a zadnji zid(ovi) je(su) horizontalni ili generalno horizontalni. Jedna komora za primer je prikazana u okviru zatvorenog sistema za primer koji je prikazan na Sl.5, Sl.

7 ili Sl.11.

[0145] Koraci obrade postupaka (npr. koraci izvedeni u celini ili delom u komori) mogu obuhvatati bilo koji ili više od brojnih koraka obrade ćelija, samostalno ili u kombinaciji. U pojedinim slučajevima, koraci obrade obuhvataju transdukciju ćelija sa česticama virusnih vektora koji sadrže retrovirusni vektor, kao što je onaj koji kodira rekombinantan proizvod koji se eksprimira u ćelijama, pri čemu se najmanje deo inkubacije sa česticama virusnog vektora izvodi u komori da bi se inicirala transdukcija. Postupci mogu dalјe i/ili alternativno obuhvatati i druge korake obrade, kao što su koraci za izolaciju, razdvajanje, selekciju, kultivisanje (npr. stimulaciju ćelija, na primer, da bi se indukovala njihova proliferacija i/ili aktivacija), kao i za pranje, resuspendovanje, razblaživanje, koncentrovanje i/ili formulisanje ćelija. U pojedinim slučajevima, postupak obuhvata korake obrade koji se izvode po redosledu u kome se: ćelije, npr. primarne ćelije, najpre izoluju, kao što je selekcijom ili razdvajanjem, iz biološkog uzorka; dobijene izolovane ili selektovane ćelije se stimulišu u prisustvu stimulišućeg reagensa; stimulisane ćelije se inkubiraju sa česticama virusnog vektora radi transdukcije; i transdukovane ćelije se formulišu u kompoziciju. U pojedinim slučajevima, stimulacija se dodatno ili alternativno vrši tokom najmanje dela

2

inkubacije sa česticama virusnog vektora. U pojedinim slučajevima, stimulacija se dodatno ili alternativno izvodi nakon inkubacije ćelija sa česticama virusnog vektora. U pojedinim slučajevima, postupci ne obuhvataju korak stimulisanja ćelija. U pojedinim slučajevima, postupak može obuhvatati jedan ili više koraka obrade izabran od pranja, resuspendovanja, razblaživanja i/ili koncentrovanja ćelija, koji se mogu odvijati pre, tokom ili istovremeno sa ili nakon jednog ili više koraka postupka poput izolacije, kao što je razdvajanjem ili selekcijom, stimulacije, transdukcije i/ili formulisanja. Svi ili deo svakog koraka obrade može biti izveden u zatvorenom sistemu, kao što je u centrifugalnoj komori. Prema aspektima postupaka, procesi ne moraju biti izvedeni u istom zatvorenom sistemu, odnosno u istoj centrifugalnoj komori, već se mogu izvoditi u različitom zatvorenom sistemu, kao što je u različitoj centrifugalnoj komori; u pojedinim slučajevima, takve različite centrifugalne komore se nalaze na odgovarajućim tačkama u postucima, a koje su povezane sa istim sistemom, kao što je kada su postavljene u kombinaciju sa istom centrifugom. U pojedinim slučajevima, svi koraci obrade se izvode u zatvorenom sistemu, u kome se ceo ili deo svakog jednog ili više koraka obrade izvodi u istoj ili različitoj centrifugalnoj komori.

[0146] U pojedinim slučajevima, postupci obezbeđuju mogućnost transdukcije ćelija sa većom efikasnošću transdukcije u poređenju s dostupnim postupcima, npr. izvođenjem celokupne ili dela transdukcije pod većim centrifugalnim silama/brzinama i/ili omogućavanjem jednostavne, automatizovane i/ili nezavisne kontrole ili podešavanja raznih parametara, kao što su zapremina ili količina reagensa, brzina i/ili temperatura. U pojedinim slučajevima, postupci povećavaju efikasnost i/ili smanjuju varijabilnost (povećavaju ponovljivost), npr. pojednostavlјivanjem i/ili smanjenjem broja korisničkih interakcija i/ili koraka rukovanja, na primer, obezbeđivanjem automatizovane ili poluautomatizovane kontrole raznih koraka.

[0147] U pojedinim slučajevima, zahvalјujući izvođenju jednog ili više, npr. svih ili delova svih koraka obrade unutar zatvorenog sistema, kao što sterilan zatvoren sistem, obezbeđeni postupci dozvoljavaju pripremu ćelija u velikom obimu za kliničku upotrebu bez izlaganja ćelija nesterilnim uslovima, odnosno bez upotrebe odvojene sterilne sobe ili kabineta. U pojedinim slučajevima, ćelije se izoluju, razvdajaju ili selektuju, transdukuju, peru i formulišu unutar zatvorenog sistema, npr. na automatizovan način. U pojedinim slučajevima, prednost postupaka je u tome što su oni pojednostavljeni, npr. zahtevaju manje koraka, manje rukovanja ili intervencije korisnika, npr. izvođenjem u jedinstvenom, zatvorenom sistemu i/ili na automatizovan način. Na primer, u pojedinim slučajevima, postupci obezbeđuju pobolјšanje u odnosu na postupke za obradu ćelija koji su za upotrebu u kliničkim primenama, a za koje može biti potrebna transdukcija u kesama u centrifugi ili ploči, mešanje čestica virusnih vektora i ćelija u odgovarajućim odnosima u kabinetu za mere biološke bezbednosti, nakon čega sledi prenos ploče ili kese u centrifugu radi transdukcije ili drugog koraka obrade, kao i dodatnih koraka koji takođe mogu zahtevati rukovanje. U pojedinim slučajevima, za obezbeđene postupke je potrebno manje rukovanja i/ili napornog rada u poređenju sa takvim dostupnim postupcima, što zahteva smanjen stepen ili količinu rukovanja i interakcije sa eksperimentatorom.

[0148] U pojedinim slučajevima, postupci omogućavaju veći stepen kontrole procesa u poređenju sa dostupnim postupcima. Na primer, postupci u pojedinim slučajevima omogućavaju nezavisnu kontrolu raznih parametara, npr. na automatizovan način. Na primer, postupci mogu dozvoliti nezavisnu kontrolu zapremine, količine i/ili koncentracije raznih komponenata i reagenasa koji se upotrebljavaju u i obrađuju u postupcima ili raznim uslovima upotrebljenim u jednom ili više procesa ili postupaka.

Oni generalno dozvolјavaju kontrolu trajanja jednog ili više od raznih koraka postupaka i/ili kontrolu odnosa ćelija prilikom određene inkubacije ili sa određenom kompozicijom, zapreminom tečnosti i/ili površinom posude koja se upotrebljava za obradu, kao što je komora ili šuplјina. Sposobnost nezavisne kontrole takvih parametara, prevashodno na automatizovan način i nezavisno jedan od drugoga, može omogućiti korisniku laku optimizaciju i sprovođenje postupaka za pojedinačne uslove.

[0149] Takođe su obezbeđeni sistemi, uređaji i aparati za upotrebu u takvim postupcima, kompleti koji iste sadrže i postupci upotrebe kompozicija i ćelija proizvedenih ovim postupcima. Na primer, obezbeđeni su postupci lečenja i terapijske upotrebe ćelija i kompozicija proizvedenih postupcima, kao što je to u adoptivnoj ćelijskoj terapiji. Obezbeđeni su takođe farmaceutske kompozicije i formulacije za upotrebu u takvim terapijama.

II. Centrifugalne komore i pridruženi sistemi i uređaji

[0150] U pojedinim slučajevima, svi ili deo jednog ili više koraka obrade, kao što je inkubacija sa virusom, da bi se inicirala ili ostvarila transdukcija i/ili inkubacija sa smolama za razdvajanje koje je zasnovano na imunoafinitetu i/ili jedan ili više drugih koraka obrade, kao što je to opisano, izvodi se u centrifugalnoj komori. Preciznije, takvi koraci i inkubacije se uglavnom izvode u unutrašnjoj šuplјini takve komore, koja može biti ista ili različita centrifugalna komora za svaki od jednog ili više procesa.

[0151] Centrifugalna komora je generalno u stanju da se rotira, npr. upotrebom centrifuge koja može biti povezana sa komorom tokom inkubacije. U pojedinim slučajevima, komora centrifuge može rotirati oko ose rotacije, kao što je vertikalna ili generalno ili suštinski vertikalna osa rotacije. U pojedinim slučajevima, komora centrifuge podrazumeva zadnji zid i bočni zid, od koga najmanje jedan deo okružuje ili zaokružuje unutrašnju šuplјinu komore. Komora centrifuge obično takođe obuhvata još jedan zadnji zid, od kog se bočni zid pruža u suprotnom smeru.

[0152] Unutrašnja šuplјina je uglavnom spolјa spojena sa unutrašnjim stranama celokupnog ili dela zadnjeg zida, celokupnog ili dela bočnog zida i celokupnog ili dela drugog zadnjeg zida komore, ili sa drugom površinom ili predmetom, kao što je pokretni element unutar komore, poput klipa. Šuplјina je prema pojedinim aspektima šuplja. Prema drugim aspektima, u delu unutrašnjeg prostora šuplјine se nalazi čvrst ili šupalj predmet, poput cevi ili kanala.

[0153] Prema pojedinim aspektima, šuplјina je promenlјive zapremine, što označava da se ukupna zapremina koja je dostupna u šuplјini i koja može biti zauzeta, npr. tečnošću ili gasom, može menjati, na primer, kretanjem pokretnog elementa, npr. klipa. U pojedinim slučajevima, takvo kretanje je moguće tokom raznih koraka postupaka, kao što je tokom inkubacije, da bi se inicirala ili ostvarila transdukcija ili selekcija, ili koraci koji slede i/ili se odvijaju pre toga. Kretanje se u pojedinim slučajevima može ostvariti na automatizovan način, kao što je putem unapred definisanog programa koji se pokreće upotrebom regulatora protoka i mašina koje su povezane sa komorom, kao što su senzori i motori koji mogu osetiti i kontrolisati poziciju pokretnog elementa i druge aspekte procesa i protoka, u svrhu komunikacije između senzora i jedne ili više komponenti.

[0154] Bočni zid komore, ili njegov deo koji okružuje unutrašnju šuplјinu komore (a samim tim i oblikuje šuplјinu), obično je zakrivljen, tako da je cilindričnog, suštinski cilindričnog ili generalno cilindričnog oblika. Pod terminom cilindričan se u principu podrazumeva onaj koji se u oblasti tehnike odnosi na određeni tip zakrivljene površine, obrazovane tačkama sa fiksnim rastojanjem u odnosu na dati

2

segment linije, koja se razmatra kao osa cilindričnog oblika. "Generalno cilindrično" se odnosi na oblik ili površinu koji je približno cilindričan po obliku ili strukturi, kao što je onaj koji deluje cilindrično prilikom posmatranja ili je blizak cilindričnom obliku, ali koji dozvoljava neki stepen varijabilnosti. Na primer, termin obuhvata oblike i površine u kojima nije svaka tačka na istom rastojanju od ose i koji dozvoljava neki stepen odstupanja od konture i/ili suženje, sve dok oblik ili površina deluju cilindrično i/ili prevashodno su cilindričnog oblika. Navedeno takođe obuhvata oblike u kojima je većina oblika cilindrična, na primer kada je većina spolјnjeg zida centrifugalne komore cilindričnog ili pretežno cilindričnog oblika, a relativno mali delovi istog zauzimaju drugu konfiguraciju, na primer, sužavaju se ili odstupaju od konture na ili približavajući se jednom ili više krajeva zida. U pojedinim slučajevima, deo bočnog zida komore koji okružuje šuplјinu je cilindričan, dok drugi delovi zida ne moraju biti cilindrični.

[0155] U pojedinim slučajevima, svi ili delovi komore i/ili šuplјine su kruti ili generalno kruti. Na primer, celokupan ili deo bočnog zida može biti krut ili suštinski krut, na primer, da bi se omogućilo komori i šuplјini da izdrže silu, npr. primenjenu tokom centrifugiranja na velikim brzinama, na primer, sa silom (relativnom centrifugalnom silom (RCF)) na unutrašnjoj površini bočnog zida šuplјine i/ili na površinskom sloju ćelija koja je veća od ili je oko 200 g, veća je od ili je oko 300 g ili veća je od ili je oko 500 g, kao što je veća od ili oko 600 g, 800 g, 1100 g, 1000 g, 1500 g, 1600 g, 2000 g, 2200 g, 2500 g, 3000 g ili 3200 g; ili je najmanje ili oko 600 g, 800 g, 1000 g, 1100 g, 1500 g, 1600 g 2000 g, 2200 g, 2500 g, 3000 g ili 3200 g, odnosno kao što je sila od ili oko 2100 g ili 2200 g. U pojedinim slučajevima, RCF na unutrašnjoj površini bočnog zida šuplјine i/ili na površinskom sloju ćelija je veća od ili iznosi ili je oko ili iznosi ili je oko 1100 g, 1200 g, 1400 g, 1600 g, 1800 g, 2000 g, 2200 g ili više. Nasuprot navedenom, dostupni postupci za obradu ćelija u velikom obimu, npr. u zapremini većoj od 50 ili 100 ml sa upotrebom fleksibilnih kesa, mogu dozvoliti centrifugiranje samo uz relativnu centrifugalnu silu koja nije veća od 200 g, 500 g ili 1000 g. Prema tome, obezbeđeni postupci mogu proizvesti veću efikasnost u poređenju s takvim postupcima.

[0156] Pod pojmom "relativna centrifugalna sila" ili RCF generalno se podrazumeva efektivna sila koja se prenosi na predmet ili supstancu (poput ćelija, uzorka ili taloga i/ili tačke u komori ili drugom kontejneru koji se rotira), u odnosu na gravitacionu sile zemlјe, u određenoj tački prostora u odnosu na osu rotacije. Vrednost može biti određena upotrebom dobro poznatih formula, uzimajući u obzir gravitacionu silu, brzinu rotacije i poluprečnik rotacije (udalјenost od ose rotacije, kao i predmet, supstancu ili česticu na kojoj se meri RCF).

[0157] Predmet, čestica ili lokacija (ili njihov prosek) u odnosu na koji se u datom slučaju izražava ili određuje RCF, može biti specifično naveden. Na primer, vrednost RCF ili približna vrednost ili opseg u pojedinom kontekstu, ovde se navodi za određeni deo ili lokaciju unutar centrifugalne komore koja se upotrebljava u takvim postupcima, kao što je na unutrašnjoj površini bočnog zida šuplјine komore u kojoj se ćelije obrađuju, kao što je na bilo kojoj od tačaka duž površine cilindričnog bočnog zida šuplјine ili na njenom prosečnom radijalnom rastojanju. Slično navedenom, vrednost RCF može biti data za radijalno rastojanje ili prosečno radijalno rastojanju unutar drugog kontejnera, kao što je kesa u kojoj se ćelije obrađuju, u odnosu na osu rotacije. U drugim slučajevima, RCF se navodi u odnosu na poziciju uzorka ili kompozicije u celini ili u odnosu na jednu ili više određenih ćelija ili njihovu prosečnu vrednost ili sloj, tokom rotacije. Na primer, vrednost može predstavljati RCF na površinskom sloju ćelija u komori ili u drugom kontejneru tokom rotacije, kao što je na ćelijskoj površini, odnosno na površini kontakta između tečnosti u kojoj se ćelije centrifugiraju i samih ćelija.

2

[0158] U principu, RCF se izračunava formulom 1,119 x 10<-5>(rpm)<2>r (ili 1,12 x 10-5 x (rpm)2 * r), gde je r = poluprečnik (tj. udalјenost određene čestice, predmeta ili supstance od ose rotacije, u cm), rpm = broj obrtaja u minutu. Na primer, u pojedinim slučajevima, RCF na unutrašnjoj površini bočnog zida unutrašnje šuplјine za obradu, u kojoj se ćelije obrađuju, može biti izračunata upotrebom ove formule, u kojoj je r udalјenost između tačke na unutrašnjoj površini bočnog zida i ose rotacije. Alternativno, RCF na ćeliji ili na površinskom sloju ćelija (poput površine kontakta između ćelijskog sloja (slojeva) i tečnosti tokom rotacije) može biti izračunata upotrebom formule u kojoj je r udalјenost između ćelije, površinskog sloja i/ili površine kontakta, ili njihove prosečne vrednosti. Na primer, u pojedinim slučajevima, vrednost poluprečnika (r) za RCF bočnog zida se može zasnivati na srednjoj vrednosti maksimalnog i najmanje mogućeg poluprečnika ili na svim mogućim poluprečnicima duž dužine bočnog zida komore. U pojedinim slučajevima, poluprečnik centrifugalne komore za primer koju prodaje kompanija Biosafe AG za upotrebu sa Sepax® sistemom (npr. A-200/F) iznosi ili je oko 2,6 cm ili iznosi ili je oko 2,7 cm. U takvoj komori za primer, poluprečnik za određivanje RCF podrazumeva onaj na površini kontakta između sloja (slojeva) ćelija i tečnosti tokom rotacije u takovoj komori, što može biti izračunato dodavanjem tačne ili približne radijalne udalјenosti između unutrašnjeg bočnog zida šuplјine i komore koja je zauzeta slojem (slojevima) ćelija tokom rotacije. Takva vrednost može biti izračunata ili približno izračunata upotrebom poznatih postupaka, na primer, na osnovu prečnika jedne od ćelija koje se obrađuje i/ili prosečnog prečnika među takvim ćelijama, na primer, tokom rotacije komore. Takva vrednost može biti zasnovana na celokupnoj veličini ćelije, ali obično će uzimati u obzir uticaj na relativnu zapreminu koja je zauzeta svakom ćelijom prilikom rotacije ili dejstva same sile, što će, generalno govoreći, smanjiti takvu zapreminu. U pojedinim primerima, približna vrednost se određuje upotrebom veličine jedra ćelije (ili njegove prosečne vrednosti).

[0159] Tako, RCF ili prosečna RCF tokom određenog centrifugiranja u određenoj komori ili uređaju može biti izračunata za određenu tačku ili površinu na osnovu broja obrtaja po munutu (rpm), kao i na osnovu udalјenosti između te tačke i ose rotacije, uporebom dobro poznatih postupaka. Broj obrtaja u minutu (rpm) može biti određen za razne uređaje i komore upotrebom poznatih postupaka, na primer, upotrebom tahometra koji je odgovarajući za određeni uređaj, sistem ili komoru. Na primer, u pojedinim slučajevima, može biti upotrebljen ručni foto ili laserski tahometar, npr. u kombinaciji sa reflektujućom trakom, u slučaju centrifuge, sistema ili uređaja sa prozorom za povezivanje okoline sa komorom ili šupljinom, npr. kao što je Sepax®, kod koga je prozor proziran ili koji na neki drugi način omogućava prolazak svetlosti od tahometra u komoru. Za neprozirne sisteme mogu biti upotrebljeni i drugi tahometri, poput tahometara koji očitavaju vibracije.

[0160] Kao što bi stručnjaci i podrazumevali, kada se upotrebljava u kontekstu raznih posuda i kontejnera, poput komora, ploča, epruveta ili kesa koje se koriste u obradi ćelija i centrifugiranju, kao i njihovih materijala, pojam krut generalno opisuje predmet, njegov deo ili materijal koji u značajnoj meri zadržava oblik i/ili zapreminu kada se smešta u okruženje poput onog na koje deluje određeni stepen sile, temperature ili neki drugi od uslova za koji bi se uobičajeno očekivalo da bude prisutan tokom upotrebe predmeta. Na primer, u oblasti tehnike se podrazumeva da kruta centrifugalna komora i epruveta predstavlja one koje su napravljene od tvrde plastike i razlikuje se od fleksibilnih posuda kao što su kese za obradu ćelija i kulture ćelija, što su kese napravljene od meke plastike i gume, npr. od fluoro etilen propilena i sličnih materijala, a čiji se oblik menja kada se pritisak primenjuje rukom ili uvlačenjem tečnosti ili gasa, što prouzrokuje širenje kese. Tako, u pojedinim slučajevima, kruti materijali obuhvataju tvrdu plastiku, metal, karbonska vlakna, kompozite, keramiku i staklo i/ili se razlikuju od fleksibilnih materijala kao što su meka guma, silikon i plastika koji se upotrebljavaju u

2

pravljenju fleksibilnih kesa, čiji se oblika i zapremina lako mogu promeniti upotrebom uobičajenog pritiska, npr. ručnim pritiskanjem ili punjenjem posude tečnošću na sobnoj temperaturi ili u uobičajenim uslovima.

[0161] Na primer, u pojedinim slučajevima, kruta centrifugalna komora i/ili njen deo (delovi) ili materijal(i), poput krutog bočnog zida ili njegovog dela koji okružuje centralnu šuplјinu, u stanju su da zadrže svoj oblik i/ili zapreminu i/ili se ne cepaju ili lome na način kojim dolazi do toga da više ne sadrže tečnost ili gas pod određenim uslovima. U pojedinim slučajevima, takvi uslovi obuhvataju pritisak rukom, poput pritiska koji može biti primenjen lјudskom rukom. U pojedinim slučajevima, takvi uslovi obuhvataju specifično određene centrifugalne sile, kao što je sila (RCF), npr. efektivna sila, na unutrašnjoj površini bočnog zida šuplјine, koja je veća od ili je oko 200 g, veća je od ili je oko 300 g ili je veće od ili je oko 500 g, kao što je veća od ili oko 1000 g, 1500 g, 2000 g, 2500 g, 3000 g ili 3200 g; ili je najmanje ili je oko 1000 g, 1500 g, 2000 g ili 2500 g, 3000 g ili 3200 g, kao što je sila od ili oko 2100 ili 2200 g. U pojedinim slučajevima, okolina podrazumeva posebne uslove, kao što su temperature od ili oko -80° C i/ili do fizioloških temperatura ili temperatura na kojima ćelije ostaju vijabilne, i/ili su više, kao što su ot temperature od 18 °C do 42 °C, kao što je od 22 °C do 39 °C, na primer, temperature od najmanje 25 °C ± 2 °C ili 37 °C ± 2 °C.

[0162] Kao što se u oblasti tehnike podrazumeva, opisivanje predmeta kao krutih ili suštinski krutih ne isklјučuje mogućnost da se ikada dogodi bilo kakva promena u obliku ili zapremini predmeta ili materijala, kao što je to prilikom dejstva prekomerne ili neočekivane sile. Na primer, pri dejstvu prekomerne sile ili ekstremnih uslova okruženja, kao što su oni koji su izvan uslova koji se uobičejano upotrebljavaju u vezi sa postupcima transdukcije koji su ovde opisani.

[0163] Komora obično sadrži najmanje jedan otvor, kao što je dovod, odvod i/ili odvod/dovod, da bi se dozvolio prolazak supstanci između šuplјine ili drugog dela komore i drugih prostora. Na primer, takvi otvori se uglavnom nalaze na najmanje jednom od zidova komore. Komora obično sadrži najmanje jedan dovod i najmanje jedan odvod, koji u pojedinim slučajevima, mogu biti isti otvor (dovod/odvod), kroz koji se tečnost i/ili gas mogu preuzimati u ili ispuštati iz šuplјine. Otvor je uglavnom povezan sa drugim okruženjem putem kanala, npr. sistema cevi ili serija sistema cevi, a u pojedinim slučajevima, i posredstvom jednog ili više konektora.

[0164] U pojedinim slučajevima, komora je uklјučena kao deo i/ili je integralni deo sistema, kao što je zatvoren ili delimično zatvoren sistem, koji dalje obuhvata dodatne komponente, kao što su sistemi cevi, konektori i kontejneri. U pojedinim slučajevima, komora je prethodno povezana sa jednom ili sa više dodatnih komponenti, direktno i/ili indirektno. Takva komora može biti obezbeđena kao deo unapred sklopljenog kompleta, npr. kompleta koji je upakovan za jednokratnu sterilnu upotrebu povezanu sa obezbeđenim postupcima. U pojedinim slučajevima, razne komponente se pakuju odvojeno, na primer, da bi se omogućilo prilagođavanje konfiguracije tako da korisnik povezuje i uređuje komponente za određeni slučaj postupka obrade.

[0165] Komponente obično obuhvataju najmanje jedan sistem cevi, a generalno set ili serije sistema cevi, kao i najmanje jedan konektor. Konektori za primer obuhvataju ventile, priklјučke, ventile sa šiljcima, navojima, pogodne za zaptivanje i stezalјke za creva. Konektori i/ili druge komponente mogu biti aseptični, na primer, da bi se omogućilo da se celokupan proces odvija u zatvorenom, sterilnom sistemu, što može eliminisati ili smanjiti potrebu za čistim sobama, sterilnim kabinetima i/ili laminarnim protočnim sistemima.

2

[0166] U pojedinim slučajevima, najmanje jedan sistem cevi podrazumeva serije sistema cevi. Cevi mogu biti napravljene od plastike, poput polikarbonata, i mogu biti raznih veličina i/ili zapremina, a uglavnom su konstruisane tako da dozvoljavaju protok željene tečnosti/gasa odgovarajućom brzinom, kao i povezanost sa komorom i/ili sa drugim komponentama. Serije sistema cevi generalno omogućavaju protok tečnosti ili gasova između komore i/ili jedne ili više komponenti sistema, poput ostalih kontejnera, što je prema pojedinim aspektima olakšano putem konektora. U pojedinim slučajevima, sistem obuhvata sistem cevi, koji povezuje svaku od raznih komponenti sa najmanje jednom drugom komponentom, pri čemu je dozvolјeno da tečnost protiče između svakog od kontejnera, poput kesa, i komore, što može biti dozvolјeno ili zaustavlјeno konfiguracijom različitih konektora, poput ventila i/ili stezalјki.

[0167] Prema pojedinim aspektima, konektori su takvi da mogu biti postavljeni u ili usmereni na alternative konfiguracije, odnosno tako da blokiraju, dozvolјavaju i/ili usmeravaju protok tečnosti i gasova kroz razne komponente, poput različitih kontejnera, kao i kroz određene sisteme cevi koji povezuju razne komponente, kao što to čine rotacioni i ulazni ventili. U drugim slučajevima, određeni konektori i/ili druge komponente su sa jedinstvenom konfiguracijom koja dozvolјava, usmerava ili blokira prolazak tečnosti ili gasa, kao što su to konektori za zaptivanja, poklopci i/ili otvoreni priključci ili kanali. Razne komponente u sistemu mogu obuhvatati ventile, priključke, zaptivke i stezalјke. Ventili mogu obuhvatati rotacione ventile, poput zaustavnih ventila, ventila sa okretanjem i ulaznih ventila. Ventili mogu biti raspoređeni u polju za razdeljivanje ili mogu biti u vidu pojedinačnih višepriključnih rotirajućih ventila. Priključci mogu podrazumevati luer adaptere ili priključke sa šiljcima. Ventili za zaptivanje mogu podrazumevati O-prstenove, zaptivače, adhezivne zaptivke i spojnice. Stezalјke mogu da podrazumevati stezalјke po principu priklještavanja.

[0168] Ostale komponente sistema obuhvataju kontejnere u kojima se mogu čuvati ili skladištiti tečnosti i/ili gasovi. Kontejneri mogu podrazumevati kese, bočice, kutije, špriceve, loptaste spremnike, rezervoare, flaše, čaše, kante, tikvice i sisteme cevi. Takve komponente mogu sadržavati kompozicije koje se upotrebljavaju i proizvode postupcima, uklјučujući nusprodukte i intermedijerne proizvode i otpad. Takve kompozicije mogu podrazumevati tečnost, uklјučujući pufere, medijume za rast, medijume za transdukciju, vodu, razblaživače, rastvore za pranje i/ili fiziološki rastvor, a mogu takođe sadržavati ćelije, virus i/ili druge agense koji su za upotrebu u koracima obrade, poput transdukcije. Kontejneri takođe mogu podrazumevati kontejnere za otpad, kao i kontejnere u kojima se skladišti jedan ili više izlaznih proizvoda, kao što je proizvod koji sadrži ćelije koje su selektovane i/ili transdukovane u jednom ili u više koraka postupaka obrade koji su ovde opisani.

[0169] U pojedinim slučajevima sistema, mnoštvo kontejnera može biti sterilno povezano u okviru jedne ili više pozicija u sistemu cevi. Kontejneri mogu biti povezani isotvremeno i/ili sekvencijalno tokom postupaka obrade ćelija u obezbeđenim slučajevima. U pojedinim slučajevima, kontejneri mogu biti odvojeni ili uklonjeni sa konektora, tako da kontejneri mogu biti uklonjeni iz sistema i/ili zamenjeni drugim kontejnerom na istoj poziciji za upotrebu u sistemu. U pojedinim slučajevima, nisu sve pozicije konektora sistema povezane sa kontejenerom, tako da sistem može sadržavati prazne konektore. U pojedinim takvim slučajevima, zatvoreni sistem se održava radom jednog ili više zaustavnih ventila, običnih ventila ili stezalјki, bilo ručno ili automatski, da bi se zatvorila komunikacija između sistema cevi i praznog konektora, npr. priključka. U pojedinim slučajevima, zatvoreni sistem se održava zaptivanjem ili isključivanjem praznog konektora, npr. priključka iz sistema.

2

[0170] U pojedinim slučajevima sistema, kao što su sistemi za primer koji su prikazani na Sl.5, Sl.7 ili Sl. 11, kontejneri mogu biti operativno povezani sa sistemima cevi, kao što je putem konektora, na pozicijama koje odgovaraju poziciji ulazne kese, poziciji kese sa razblaživačem 1, poziciji kese sa razblaživačem 2, poziciji kese za otpad i/ili poziciji kese za izlaznu komponentu. U odnosu na slike, označavanje ovih pozicija je navedeno samo kao primer i nije predviđeno da bude ograničavajuće na određeni tip kontejnera ili sadržaj kontejnera koji može biti povezan na toj poziciji. Takođe, u slučajevima obezbeđenih postupaka, ne moraju sve pozicije u sistemu, kao što su one prikazane na Slikama, biti deo postupka, biti upotrebljene u izvođenju koraka obrade u obezbeđenim postupcima. U pojedinim od takvih slučajeva, sistem cevi koji je povezan sa praznim konektorom, npr. priključkom, može biti isključen ili zatvoren radom zaustavnog ili običnog venitla. U pojedinim slučajevima, prazan konektor može biti zaptiven ili izvađen iz sistema.

[0171] U pojedinim slučajevima, sistem, poput zatvorenog sistema, je sterilan. U pojedinim slučajevima, svi konektori komponenti sistema, kao što su oni između sistema cevi i kontejenera koji su povezani putem konektora, napravljeni su pod sterilnim uslovima. U pojedinim slučajevima, konektori se prave u laminarima sa protokom. U pojedinim slučajevima, konektori se prave upotrebom uređaja za sterilno povezivanje koji proizvode sterilne veze između sistema cevi i kontejnera, kao što su sterilni zavarivači. U pojedinim slučajevima, sterilni uređaj za povezivanje ostvaruje vezu pod termičkim uslovima koji su dovoljno visoki da se održi sterilnost, kao što su temperature od najmanje 200 °C, kao što je najmanje 260 °C ili 300 °C.

[0172] U pojedinim slučajevima, sistem može biti za jednokratnu upotrebu, kao što je komplet za jednokratnu upotrebu. U pojedinim slučajevima, komplet za jednokratnu upotrebu može biti upotrebljen u mnoštvu ciklusa procesa ili postupaka, kao što je najmanje 2, 3, 4, 5 ili više puta, na primer, u procesima koji se odvijaju na kontinuiran ili polu-kontinuirani način. U pojedinim slučajevima, sistem, kao što je komplet za jednokratnu upotrebu, koristi se za obradu ćelija iz jednog pacijenta.

[0173] Primeri centrifugalnih komora obuhvataju one koje proizvodi i prodaje kompanija Biosafe SA, uklјučujući one za upotrebu sa sistemom Sepax® i Sepax® 2, sa centrifugalnim komorama A-200/F i A-200 i razne komplete za upotrebu sa takvim sistemima. Komore, sistemi i instrumenti za obradu i kabineti za primer su opisani, na primer, u US Patent No. 6,123,655, US Patent No. 6,733,433 i U.S. Patent Application, Publication No.: US 2008/0171951, kao i u objavlјenoj međunarodnoj patentnoj prijavi br. WO 00/38762. U zavisnosti od tipa određenog postupka (npr. od tipa razblaživanja, pranja, transdukcije, formulisanja), stručnjak može odabrati određen komplet koji je odgovarajući za taj proces. Kompleti za primer koji su za upotrebu u okviru ovakvih sistema obuhvataju, ali nisu ograničeni na, komplete za jednokratnu upotrebu koje proizvod kompanija BioSafe SA u vidu proizvoda pod nazivima CS-430.1, CS-490.1, CS-600.1 ili CS-900.2.

[0174] U pojedinim slučajevima, sistem sadrži serije kontejnera, npr. kesa, cevi, zaustavnih ventila, stezalјki, konektora i centrifugalnu komoru. U pojedinim slučajevima, kontejneri, kao što su kese, podrazumevaju jedan ili više kontejnera, poput kesa, koje sadrže ćelije koje je potrebno transdukovati, kao i čestiće virusnih vekora, u istom kontejneru ili odvojenim kontejnerima, kao što su ista kesa ili odvojene kese. U pojedinim slučajevima, sistem dalјe obuhvata jedan ili više kontejnera, poput kesa, koje sadrže medijum, kao što je razblaživač i/ili rastvor za pranje, koji se uvlače u komoru i/ili druge komponente da bi se komponente i/ili kompozicije tokom postupka razblažile, resuspendovale i/ili isprale. Kontejneri mogu biti povezani na jednoj ili na više pozicija u sistemu, kao što je na poziciji koja odgovara ulaznoj liniji, liniji za razblaživanje, liniji za pranje, liniji za otpad i/ili izlaznoj liniji.

[0175] Primeri sistema za upotrebu u slučajevima obezbeđenih postupaka za izvođenje jednog ili svih delova procesa su prikazani na Sl.5, Sl.7 i Sl.11. U jednom slučaju za primer, kao što je onaj prikazan na Sl.5, centrifugalna komora (1) je najmanje generalno cilindrična i rotira se oko ose rotacije. Komoru čine zadnji zid (13) i krut bočni zid (14), kao i pokretni element, koji je klip (2). Unutrašnje površine zadnjeg zida (13), krutog bočnog zida (14) i klipa (2) zajedno definišu granice unutrašnje šuplјine (7) komore. Šuplјina (7) je promenlјive zapremine i koaksijalna je sa komorom, a konstruisana je tako da sadrži tečnost i/ili gas koji se uklјučuju u komoru tokom koraka obrade. Klip (2) je aksijalno pokretlјiv unutar komore (1) da bi se menjala zapremina unutrašnje šuplјine (7). Komora dalјe sadrži otvor kao dovod/odvod (6) da bi se dozvolio protok tečnosti i gasa u i iz šuplјine u najmanje pojedinim konfiguracijama sistema. Otvor (6) je operativno povezan sa nizom sistema cevi (3) i konektora, uklјučujući zaustavne ventile (4), koji su u stanju da kontrolišu kretanje tečnosti i/ili gasa između različitih komponenti sistema. Serije sistema cevi (3) su dalje povezane sa raznovrsnim dodatnim kontejnerima, koji u prikazanoj konfiguraciji obuhvataju kese obeležene kao Kesa za unos, Kese sa razblaživačem 1 i 2, Kesa za otpad i Izlazna kesa. Stezalјke (5) mogu biti otvorene i zatvorene, da bi se dozvolilo i blokiralo kretanje tečnosti kroz naznačene delove serija sistema cevi (3), omogućavajući protok između raznih komponenti sistema. U pojedinim slučajevima, svaki kontejner je operativno povezan sa sistemom cevi preko priklјučka, kao što je luer adapter ili priključak sa šiljcima. Na primer, u odnosu na Sl.5, u svakoj tački u kojoj je prikazan kontejner, prema pojedinim aspektima, kontejner je povezan indirektno preko priključka.

[0176] Dok je Sl. 5 prikazuje vezu kontejnera na svakoj poziciji ili liniji, u alternativnim slučajevima, prema pojedinim aspektima, kontejner nije povezan na svakoj poziciji ili liniji sistema. U pojedinim slučajevima obezbeđenih sistema, na svakoj od pozicija ili linija je dostupan priključak, a kontejner je povezan na svim pozicijama ili linijama i na manje nego na svim pozicijama ili linijama. U pojedinim slučajevima, nisu sve pozicije konektora u sistemu povezane sa kontejnerom, tako da sistem može sadržavati prazne konektore na svakoj poziciji ili liniji.

[0177] U pojedinim slučajevima, sistem, poput sistema prikazanog na Sl.5, može sadržavati sterilan ili mikrobni filter. Primer takvog sistema je prikazan na Sl. 7, koja prikazuje filter (15). U pojedinim slučajevima, filter podrazumeva membranu za filtraciju sa porama veličine koja može blokirati prolazak mikrobnih organizama, kao što su bakterije ili virusi. U pojedinim slučajevima, veličina pora je između od 0,1 µm do 0,45 µm, kao što je između od 0,1 µm do 0,22 µm, kao što je oko ili 0,20 µm. U pojedinim slučajevima, membrana se sastoji od nitroceluloze (celuloznog nitrata), celuloznog acetata, regenerisane celuloze, poliamida, politetrafluoretilena (PTFE) ili polietersulfona (PES). U pojedinim slučajevima, filter sadrži poklopac (16) za zatvaranje ili zaptivanje membrane filtera i sprečavanje izlaganja okruženju izvan zatvorenog sistema. U pojedinim slučajevima, poklopac je zatvoren ili ne ventilira se. U pojedinim slučajevima, poklopac se može odvojiti. U pojedinim slučajevima, poklopac može biti namešten za filter pomoću luer adaptera. Kao što je detalјnije opisano u nastavku teksta, u pojedinim slučajevima, filter može biti upotrebljen za ostvarivanje prolaska gasa, kao što je vazduh, u i iz komore sistema. U pojedinim takvim slučajevima, prolazak vazduha se održava pod sterilnim ili uslovima oslobođenim od mikroba.

1

[0178] U jednom slučaju, Ulazna kesa sadrži ćelije za obradu obezbeđenim postucima, poput transdukcije. U jednom slučaju, Kesa za razblaživač 1 sadrži čestice virusnog vektora koje sadrže vektor koji je za transdukciju ćelija. Tako, u pojedinim slučajevima, ulazna kompozicija koja sadrži čestice virusnog vektora i ćelije, proizvodi se ostvarivanjem unosa tečnosti iz Ulazne kese i ostvarivanjem unosa tečnosti iz Kese sa razblaživačem 1. U pojedinim slučajevima, Kesa sa razblaživačem 2 sadrži rastvor za pranje. Izlazna kesa je generalno dizajnirana tako da preuzima ćelije nakon jednog ili više koraka obrade, kao što je prenos izlazne kompozicije iz šuplјine komore u Izlaznu kesu nakon inkubacije sa česticama virusnih vektora. Tako, u pojedinim slučajevima, Izlazna kesa sadrži prebačene ćelije koje su transdukovane sa i/ili u kojima se inicira transdukcija sa česticama virusnog vektora. U pojedinim slučajevima, obrada obuhvata transdukciju ćelija sa virusnim vektorom.

[0179] U pojedinim slučajevima, može biti upotrebljen višestruki razdelnik (17) za operativno povezivanje jednog ili mnoštva kontejnera sa sistemom, putem mnoštva priključaka (18) koji su spojeni sa razvodnikom sistema cevi. Višestruki razvodnik može sadržavati serije sistema cevi koje napajaju dovod/odvod komore da bi se dozvolio protok između komore i spojenog jednog kontejnera ili više kontejnera. U pojedinim takvim slučajevima, razvodnik povezuje više kontejnera, kao što je najmanje 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ili više kontejnera, na istoj poziciji ili liniji u sistemu. U pojedinim slučajevima, svi priključci višestrukog razdjelnika (17) su povezani sa kontejnerom, kao što je kesa. U pojedinim slučajevima, manje od svih priključaka višestrukog razvodnika (17) je povezano sa kontejnerom, kao što je kesa, tako da je kontejner povezan na manje od ukupnog broja pozicija priključaka, na primer, povezan je sa manje od 8, 7, 6, 5, 4, 3 ili 2 kontejnera, kao što su kese. U pojedinim slučajevima, sistem cevi je udružen sa razvodnikom koji može sadržavati stezalјku ili poklopac, koji po potrebi može biti otvoren ili zatvoren da bi se kontrolisalo kretanja kroz sistem cevi u kontejner. Višestruki razdjelnik (17) može biti povezan na bilo kojoj od pozicija ili linija dostupnih u sistemu, kao što su pozicija ili linija koja je označena kao ulazna linija, linija razblaživanja, linija za pranje, linija za otpad i/ili izlazna linija.

[0180] U pojedinim slučajevima, višestruki razdelnik (17) za primer čija je uloga u povezivanju jednog ili više kontejnera, prikazan je na Sl.11 kao razdelnik za povezivanje jednog ili više kontejnera, kao što je jedna ili mnoštvo kesa, na primer jedna ili mnošto Izlaznih kesa. Kao što je prikazano, u pojedinim slučajevima, višenamenski razdelnik (17) može biti povezan sa izlaznom pozicijom ili linijom, što uklјučuje niz razvodnih sistema cevi od kojih se svaki završava konektorom, kao što je priključak (18), za operativno povezivanje sa kontejnerom, kao što je kesa. Jedan ili više priključaka, kao što su svi priključci, ili manje od svih priključaka, može biti povezano sa kontejnerom. U jednom slučaju, kao što je onaj prikazan na Sl. 11, do 3 kontejnera mogu biti povezana sa svakim sistemom cevi razvodnika preko priključka. U drugim slučajevima, do 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ili 8 kontejnera, poput Izlaznih kesa, može biti povezano sa izlaznom linijom. U pojedinim slučajevima, jedna ili mnoštvo stezalјki (5) povezanih sa sistemom cevi, kao što je razdelni sistem cevi, može biti otvoreno ili zatvoreno da bi se dozvolilo ili kontrolisalo kretanje tečnosti u jednu ili u više od mnošva Izlaznih kesa. U pojedinim slučajevima, jedna stezalјka može istovremeno kontrolisati kretanje tečnosti u svim Izlaznim kesama. U pojedinim slučajevima, kretanje tečnosti u svaku od mnoštva kesa je zasebno regulisano stežaljkom koja je operativno povezana sa sistemom cevi koji je udružen sa jednim odgovarajućim kontejnerom, tako da se kretanje tečnosti u odgovarajući kontejner može učiniti odvojenim od kretanja tečnosti u sve ostale kontejnere. U pojedinim slučajevima, kretanje tečnosti u svaki kontejner, kao što je svaka kesa, na primer, svaka Izlazna kesa, može biti učinjeno sekvencijalnim.

2

[0181] U pojedinim slučajevima, sistem je uključen i/ili postavlјen u vezu sa drugim instrumentima, uklјučujući instrumente za rad, automatizaciju, kontrolu i/ili nadgledanje aspekata raznih koraka obrade koji se izvode u sistemu. Ovakvi instrumenti se u pojedinim slučajevima nalaze u kućištu.

[0182] U pojedinim slučajevima, instrumenti podrazumevaju kućište, koji dalje sadrži kućište koje sadrži regulator protoka, centrifugu, poklopac, motore, pumpe, senzore, displeje i komandno mesto za korisnika (korisnički interfejs). Uređaj za primer je opisan u US Patent No.6,123,655, US Patent No.

6,733,433 i US 2008/0171951.

[0183] Regulator protoka prema pojedinim aspektima nadgleda i prenosi informacije i uputstva do i od drugih instrumenata i raznih komponenti sistema. U pojedinim slučajevima, kabinet sadrži uređaj za korisnički interfejs koji sadrži ekran i uređaj za unos, kao što su tastatura, miš ili ekran osetlјiv na dodir. Korisnički interfejs prikazuje informacije iz regulatora protoka, što omogućava korisniku da zaustavi i započne proces ili korake, kao što je ostvarivanje protokola transdukcije. Interfejs može takođe podstaći korisnika da unese podešavanja za varijable koje regulator protoka upotrebljava tokom koraka procesa, kao što je protokol transdukcije. Takve varijable mogu podrazumevati zapreminu raznih rastvora koji se je potrebno dodati i/ili ukloniti iz raznih kontejnera i/ili šupljine komore, vreme/trajanje taloženja, centrifugiranja, mešanja i/ili drugih koraka procesa, kao i sile rotacije, kretanja klipa i/ili izbor programa.

[0184] Instrumenti generalno dalje obuhvataju centrifugu u koju se postavlјa centrifugalna komora da bi se ostvarila rotacija komore. U pojedinim slučajevima, komora centrifuge se aktivira jedinicom za pokretanje rotacije u aparatu za centrifugiranje, tako da se komora može okretati oko ose rotacije. U pojedinim slučajevima, poklopac na vrhu centrifugalne komore se zatvara i tako drži komoru na mestu. U pojedinim slučajevima, poklopac se sastoji od dva polukružna diska koji mogu rotirati na šarkama. Centrifuga i poklopac za primer su opisani u US Patent No. 6,123,655 ili US Patent No. 6,733,433. Centrifuga zaključava centrifugalnu komoru na mestu i rotira centrifugalnu komoru kontaktom sa stranama ili krajevima komore.

[0185] U pojedinim slučajevima, senzor ili niz senzora u centrifugi može izmeriti brzinu rotacije centrifugalne komore, poziciju pokretnog elementa ili zapreminu koja je sadržana unutar unutrašnje šuplјine. Senzori izvan centrifuge mogu detektovati boju i stopu protoka tečnosti i gasa koji protiču u i iz centrifugalne komore. Senzori takođe mogu detektovati prazan sistem cevi ili centrifugalnu komoru. Senziori obuhvataju optičke senzore, kao što su oni opisani u US Patent No.6,123,655, US Patent No.

6,733,433 i US 2008/0171951. U pojedinim slučajevima, informacije sa jednog ili više senzora mogu biti primljene od strane regulatora protoka. Na osnovu prenetih informacija, regulator protoka, u pojedinim slučajevima, može ostvariti promene jednog ili više od brzine rotacije centrifugalne komore, pozicije pokretnog elementa, zapremine sadržane u šuplјini, orijentacije jednog ili više ventila, priključaka, zaptivača ili stezalјki, kao i drugih procesa u centrifugi, komori ili sistemu.

[0186] U pojedinim slučajevima, kabinet sadrži motor ili niz motora. Motori mogu prenositi informacije sa regulatora protoka, koji može pokrenuti ili podešavati rad motora.

[0187] U pojedinim slučajevima, motor ili niz motora mogu okretati centrifugalnu komoru unutar centrifuge. Regulator protoka može započeti, zaustaviti ili podesiti brzinu rada motora koji okreće centrifugalnu komoru unutar centrifuge.

[0188] U pojedinim slučajevima, motori ili niz motora može pomerati pokretni element unutar centrifugalne komore. Pomeranje pokretnog elementa menja zapreminu unutrašnje šuplјine, prouzrokujući preuzimanje ili isticanje tečnosti ili gasa u ili iz unutrašnje šuplјine.

[0189] U pojedinim slučajevima, motori ili niz motora mogu upravljati ventilima, priključcima, zaptivačima i stezalјkama koji su ovde opisani. Regulator protoka može prouzrokovati motore da otvaraju, zatvaraju ili usmeravaju tečnost u ili iz kontejnera ili centrifugalne komore kroz serije cevi.

[0190] U pojedinim slučajevima, motor ili motori su elektromotor, pneumatski motor ili hidraulični motor. U pojedinim slučajevima, kabinet sadrži električan motor za upravlјanje pojedinim aspektima i pneumatski motor za upravlјanje drugim aspektima. U pojedinim slučajevima, kabinet sadrži električni motor za centrifugiranje i pneumatski motor za kontrolu kretanja pokretnog elementa.

III. Prenošenje virusnih nukleinskih kiselina u ćelije, npr. transdukcijom

[0191] U pojedinim slučajevima, korak(koraci) obrade postupaka obuhvataju one za prenos virusnih čestica do ćelija, kao što su virusni vektori koji kodiraju rekombinantne proizvode da bi se eksprimirali u ćelijama. Čestice virusnih vektora obično sadrže genom koji sadrži rekombinantne nukleinske kiseline, poput transgena, koji kodiraju takve proizvode. U pojedinim slučajevima, čestice virusnih vektora kodiraju rekombinantan receptor, kao što je himerni antigeni receptor (CAR), tako da se transdukcijom ćelija mogu generisati ćelije koje eksprimiraju reakombinantan receptor (npr. CAR). Za prenos nukleinske kiseline iz virusnog vektora u ćelije može biti upotrebljen bilo koji od brojnih poznatih postupaka. Prenos je obično transdukcijom. Alternativni postupci za prenošenje virusnih vektora u ćelije obuhvata transpozone i/ili elektroporaciju. Takvi koraci obrade mogu biti izvedeni u centrifugalnoj komori, u skladu sa slučajevima obezbeđenih postupaka. U pojedinim slučajevima, centrifugalna komora je sastavni deo zatvorenog sistema, tako da se takvi koraci obrade izvode u zatvorenom sistemu.

[0192] Prenos se generalno vrši transdukcijom. Postupci za prenošenje virusa, npr. transdukcija, uglavnom obuhvataju najmanje iniciranje transdukcije, inkubiranjem u centrifugalnoj komori, ulazne kompozicije koja sadrži ćelije koje će biti transdukovane i čestice virusnog vektora koje sadrže vektor, pod uslovima u kojima se ćelije trasdukuju ili se transdukcija inicira u najmenje pojedinim od ćelija u ulaznoj kompoziciji, pri čemu se postupkom proizvodi izlazna kompozicija koja sadrži transdukovane ćelije.

[0193] U pojedinim slučajevima, ćelije za transdukciju i/ili transdukovane ćelije sadrže imunske ćelije, kao što su T-ćelije, za upotrebu u adoptivnoj imunoterapiji. U pojedinim slučajevima, pre inkubacije ćelija sa česticama virusnog vektora, ćelije za transdukciju se dobijaju postupcima koji uključuju izolovanje, kao što je selekcijom, određenog podskupa ćelija koji je pisutan u biološkom uzorku. Postupci koji se odnose na izolaciju i selekciju ćelija za transdukciju i rezultujuće ćelije, opisani su u nastavku teksta. U pojedinim slučajevima, pre iniciranja procesa transdukcije, T-ćelije se aktiviraju, kao što je kultivisanjem i stimulisanjem i kao što je opisano u nastavku teksta. U pojedinim slučajevima, jedan ili više od svih ili dela koraka koji se odnose na izolovanje, npr. selekcijom, kao i aktivaciju, takođe mogu biti izvedeni u šuplјini centrifugalne komore, u skladu sa slučajevima koji su ovde obezbeđeni, kao što je opisano u nastavku teksta.

4

[0194] U pojedinim slučajevima, čestice virusnog vektora upotrebljene u aspektima postupka transdukcije su bilo koje čestice koje su pogodne za transdukciju ćelija, poput imunskih ćelija, na primer T-ćelija. U pojedinim slučajevima, čestice virusnog vektora su čestice retrovirusnog vektora, poput čestica lentivirusnog vektora ili čestica gamaretroviralnog vektora. U pojedinim takvim slučajevima, čestica virusnog vektora sadrži genom koji sadrži rekombinantnu nukleinsku kiselinu, tj. rekombinantan virusni vektor. Primeri takvih ćestica virusnog vektora su opisani u nastavku teksta.

[0195] Ulazna kompozicija (kompozicija koja sadrži čestice virusnog vektora i ćelije tokom koraka transdukcije) može dalјe sadržavati jedan ili više dodatnih agenasa, kao što su oni koji pospešuju efikasnost transdukcije, poput polikatjona koji obuhvataju protamin (npr. protamin sulfat), heksadimetrin bromid (POLYBRENE®, Abbott Laboratories Corp) i CH-296 (RETRONECTIN®, Clontech). U pojedinim slučajevima, u ulaznoj kompoziciji može biti prisutan polikatjon u finalnoj koncentraciji od 1 µg/ml do 100 µg/ml, kao što je od 5 µg/ml do 50 µg/ml. Kompozicija može takođe sadržavati medijum, uklјučujući medijum za ćelijsku kulturu koji predstavlja medijum dizajniran za kulturu ćelijskog tipa kojeg je potrebno obraditi, kao što je medijum za hematopoetske matične ćelije, npr. medijum bez seruma.

[0196] U obezbeđenim postupcima, svi ili deo koraka obrade za transdukciju ćelija se može odvijati u centrifugalnoj komori, kao što je uz centrifugiranje ili rotaciju. U pojedinim takvim slučajevima, ulazna kompozicija koji sadrži ćelije i čestice virusnog vektora se obezbeđuje ili unosi u unutrašnju šuplјinu centrifugalne komore. U pojedinim slučajevima, ulazna kompozicija se inkubira pod uslovima koji podrazumevaju rotaciju centrifugalne komore. U pojedinim slučajevima, rotacija se može ostvariti sa relativnim centrifugalnim silama koje su veće od onih koje se mogu postići upotrebom fleksibilnih plastičnih kesa ili plastičnih mikrotitarskih ploča.

[0197] Veća efikasnost transdukcije se u pojedinim slučajevima delimično postiže zahvalјujući sposobnosti postupaka da se transdukcija ostvari na većoj relativnoj centrifugalnoj sili (RCF) u poređenju sa drugim postupcima za obradu ćelija u velikom obimu. Na primer, određeni dostupni postupci za obradu ćelija u velikom obimu, npr. u zapremini većoj od 50 ili 100 ml, upotrebom fleksibilne kese, mogu dozvoliti centrifugiranje samo pri relativnoj centrifugalnoj sili koja nije veća od 200, 500 ili 1000 g. Omogućavanjem centrifugiranja sa većim ubrzanjem ili relativnom silom, npr. od ili oko ili najmanje ili oko 1000, 1500, 2000, 2100, 2200, 2500, 3000 g, 3200 g ili 3600 g, obezbeđeni postupci mogu pobolјšati ili dozvoliti istovremeno taloženje virusa i ćelija u kompoziciji tokom transdukcije, pobolјšavanje stope interacije virusa i ćelija, a čime se poboljšava transdukcija.

[0198] Postupci su uglavnom u stanju da sprovedu transdukciju u velikom obimu. Prema tome, ulazna kompozicija inkubirana tokom transdukcije i/ili izlazna kompozicija mogu sadržavati najmanje određenu zapreminu i/ili broj ćelija. U pojedinim slučajevima, zapremina tečnosti ulazne kompozicije ili zapremina tečnosti tokom najmanje jedne tačke tokom inkubacije, iznosi najmanje ili je veća od oko 10 ml, 20 ml, 30 ml, 40 ml, 50 ml, 100 ml, 150 ml, 200 ml, 250 ml, 300 ml, 350 ml, 400 ml, 450 ml ili 500 ml. U pojedinim slučajevima, ulazna kompozicija, transdukovana kompozicija i/ili ukupan broj ćelija koje su transdukovane postupcima uključuju najmanje ili oko 1 x 10<5>, 1 x 10<6>, 1 x 10<7>, 1 x 10<8>, 1 x 10<9>ili 1 x 10<10>ćelija. U pojedinim slučajevima, za najmanje deo inkubacije, posuda u kojoj se ćelije transdukuju, npr. centrifugalna komora ili njena šuplјina, sadrži najmanje ili oko 1 x 10<5>, 1 x 10<6>, 1 x 10<7>, 1 x 10<8>, 1 x 10<9>ili 1 x 10<10>ćelija. Takvi brojevi i zapremine mogu takođe biti primenjeni u drugim koracima obrade koji se izvode u sistemu, npr. u šuplјini komore, kao što su koraci razdvajanja ćelija i/ili pranja.

[0199] U pojedinim slučajevima, pri opisu raznih koraka procesa u šuplјini centrifugalne komore, uklјučujući procese za transdukciju, kao što je priprema ulazne kompozicije ili drugi proces koji je opisan u narednim odelјcima, upućivanje na bilo koju zapreminu označava ciljnu zapreminu. U pojedinim slučajevima, tačne zapremine koje su upotrebljene u raznim koracima (npr. pranju, razblaživanju ili formulisanju) mogu varirati od želјene cilјne zapremine, zbog, prema pojedinim aspektima, zapremina koje zaostaju u sistemu cevi, pri punjenju cevi, kao i zbog osetlјivosti senzora, korisničke kontrole i drugih faktora koji su povezani sa održavanjem ili nadzorom zapremine. Postupci mogu dozvoliti preciznu kontrolu zapremine, kao što je, prema pojedinim aspektima, uklјučivanjem senzora kao dela kola povezanog sa sistemom. U pojedinim slučajevima, zapremina može varirati za ne više od 10% u odnosu na želјenu cilјnu zapreminu, kao što je za ne više od 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% ili 1%. U pojedinim slučajevima, zapremina je unutar 2 ml ili 3 ml do cilјne zapremine i/ili varira za ne više od 2 ml ili 3 ml u odnosu na cilјnu zapreminu.

[0200] U pojedinim slučajevima, koraci obrade se izvode kombinovanjem ćelija i čestica virusnog vektora da bi se generisala ulazna kompozicija. Prema aspektima postupka, kompozicija ćelija i čestica virusnog vektora se priprema na način da dobijena kombinovana ulazna kompozicija ima nizak odnos ukupne zapremine tečnosti prema unutrašnjoj površini šuplјine centrifugalne komore. U pojedinim slučajevima, ukupna zapremina tečnosti je dovolјna da pokrije ili da samo premaši zapreminu ćelija koja je prisutna u vidu jednoćelijskog sloja na unutrašnjoj površini šuplјine nakon rotacije centrifugalne komore, uz istovremeno smanjenje tečnosti koja pokriva ćelije na minimum. U pojedinim slučajevima, smanjenje deblјine tečnosti može smanjiti vreme sedimentacije koje je potrebno za kontakt čestica virusnog vektora sa ćelijama, pošto čestice virusnog vektora moraju da proputuju manju udaljenosti i/ili su izložene manjem otporu viskoznog medijuma.

[0201] U pojedinim slučajevima, prednosti kao što su pobolјšana efikasnost transdukcije, delimično su posledica sposobnosti upotrebe relativno niže zapremine tečnosti po zapremini ćelija, broju ćelija ili veličini taloga tokom procesa transdukcije, kao što je tokom rotacije, posebno u poređenju sa drugim postupcima za proizvodnju u velikom obimu.

[0202] U pojedinim slučajevima, zapremina tečnosti ulazne kompozicije (koja sadrži ćelije i čestice virusnog vektora) koja se nalaze u posudi, npr. u šuplјini, tokom rotacije nije veće od oko 0,5; 1,2; 2,5; 3; 3,5; 4; 4,5; 5; 5,5; 6; 6,5 ili 7 mililitara (ml) po kvadratnom inču unutrašnje površine šuplјine tokom rotacije ili maksimalne unutrašnje površine šuplјine.

[0203] U pojedinim slučajevima, prosečna zapremina tečnosti ulazne kompozicije prisutne u posudi, npr. šuplјini, u kojoj se transdukcija inicira, kao što je prosečna vrednost zapremine tečnosti u svim procesima izvedenim u ciklusu postupka, nije veća od oko 0,5; 1; 2; 2,5; 3; 3,5, 4, 4,5, 5, 5,5, 6, 6,5 ili 7 mililitara (ml) po kvadratnom inču unutrašnje površine šuplјine tokom inkubacije ili maksimalne unutrašnje površina šuplјine. U pojedinim slučajevima, maksimalna zapremina tečnosti ulazne kompozicije (koja sadrži ćelije i čestice virusnog vektora) prisutne u posudi, npr. šuplјini, u kojoj se transdukcija inicira, kao što je maksimalna zapremina tečnosti svih procesa izvedenih u ciklusu ovog postupka, nije veća od oko 0,5; 1; 2; 2,5; 3; 3,5, 4, 4,5, 5, 5,5, 6, 6,5 ili 7 mililitara (ml) po kvadratnom inču unutrašnje površine šuplјine centrifugalne komore. U pojedinim slučajevima, zapremina tečnosti, kao što je zapremina tečnosti ulazne kompozicije prisutne u posudi, npr. šuplјini, tokom rotacije nije veća od 50%, kao što je da nije veća od 40%, nije veća od 30%, nije veća od 20% ili nije veća od 10% zapremine unutrašnje površine šuplјine tokom rotacije ili maksimalne unutrašnje površine šuplјine. U pojedinim slučajevima, ostatak zapremine može biti gas, kao što je vazduh.

[0204] U pojedinim slučajevima, ukupna zapremina tečnosti ulazne kompozicije (koji sadrži ćelije i čestice virusnog vektora) u centrifugalnoj komori tokom inkubacije, kao što je tokom rotacije, iznosi najmanje 5 ml ili najmanje 10 ml, ali nije veća od 220 ml, kao što je da nije veća od 200 ml. U pojedinim slučajevima, zapremina tečnosti ulazne kompozicije tokom inkubacije, kao što je tokom rotacije, nije veće od 100 ml, 90 ml, 80 ml, 70 ml, 60 ml, 50 ml, 40 ml, 30 ml ili 20 ml. Prema aspektima obezbeđenog postupka, ulazna kompozicija se priprema u takvoj ukupnoj zapremini da se postigne želјena koncentracija, količina i/ili odnos ćelija i čestica virusnog vektora, kao što je opisano u nastavku teksta.

[0205] U pojedinim slučajevima, postupci omogućavaju korisniku da kontroliše odnos ćelija prema površini šuplјine, npr. promenom zapremine šuplјine i/ili broja dodatih ćelija. U pojedinim slučajevima, navedeno omogućava smanjenje sloja ćelija (npr. taloga ćelija) na površini šuplјine u poređenju s drugim postupcima, posebno onima koji su dostupni za transdukciju u velikom obimu pod dejstvom centrifugalne sile, kao što su oni izvedeni u kesama za centrifugiranje. U pojedinim slučajevima, mogućnost kontrole deblјine sloja ćelija u šuplјini centrifugalne komore tokom transdukcije može dovesti do povećane efikasnosti transdukcije pod inače uporedivim uslovima i/ili do odsustva povećanog boja kopija sa povećanjem efikasnosti transdukcije virusima.

[0206] U pojedinim slučajevima, ćelije u obezbeđenim postupcima su prisutne u šuplјini u vidu ili oko jednoćelijskog sloja, ili tako da debljina sloja ne bude veća od ili oko 1,5 ili 2 puta u odnosu na jednoćelijski sloj, ili da ne bude suštinski deblji od jednoćelijskog sloja, tokom inkubacija za transdukciju pod centrifugalnom silom. Ovo smanjenje tokom centrifugiranja može olakšati i pobolјšati interakcije između virusa i ćelija i izbeći povećanje u broju virusnih kopija (VCN), što se može odvijati naročito u kontekstu visokih relativnih virusnih ili infektivnih jedinica (IU), na primer, gde se prioritetno transdukuju spolјni ili gornji slojevi ćelija.

[0207] U pojedinim slučajevima, ulazna kompozicija sadrži najmanje milion ćelija po cm<2>površine unutrašnje površine šuplјine tokom najmanje dela navedene inkubacije, kao što je tokom rotacije ulazne kompozicije u centrifugalnoj komori. U pojedinim slučajevima, ulazna kompozicija sadrži najmanje 2 miliona ćelija po cm<2>, 3 miliona ćelija po cm<2>, 4 miliona ćelija po cm<2>, 5 miliona ćelija po cm<2>, 6 miliona ćelija po cm<2>, 7 miliona ćelija po cm<2>, 8 miliona ćelija po cm<2>, 9 miliona ćelija po cm<2>, 10 miliona ćelija po cm<2>ili 20 miliona ćelija po cm<2>unutrašnje površine šuplјine tokom najmanje dela navedene inkubacije, kao što je za vreme rotacije ulazne kompozicije u centrifugalnoj komori. U pojedinim slučajevima, unutrašnja površina šuplјine tokom najmanje dela navedene inkubacije, kao što je tokom rotacije, iznosi najmanje ili je oko 1 x 10<9>µm<2>ili je najmanje ili oko 1 x 10<10>µm<2>.

[0208] U pojedinim slučajevima, ukupan broj ćelija u ulaznoj kompoziciji tokom najmanje dela navedene inkubacije, kao što je tokom rotacije ulazne kompozicije u centrifugalnoj komori, najmanje je 10 x 10<6>ćelija, 20 x 10<6>ćelija, 30 x 10<6>ćelija, 40 x 10<6>ćelija, 50 x 10<6>ćelija, 60 x 10<6>ćelija, 70 x 10<6>ćelija, 80 x 10<6>ćelija, 100 x 10<6>ćelija, 200 x 10<6>ćelija, 300 x 10<6>ćelija ili 400 x 10<6>ćelija.

[0209] U pojedinim slučajevima, koraci obrade u zatvorenoj šuplјini centrifugalnog sistema takođe mogu biti upotrebljeni za obradu ćelija, poput aktivacije ćelija, a pre transdukcije. U pojedinim slučajevima, obrada može obuhvatati razblaživanje ili koncentrovanje ćelija do želјene koncentracije ili broja. U pojedinim slučajevima, koraci obrade mogu uklјučivati smanjenje zapremine da bi se time povećala koncentracija ćelija do željene. U pojedinim slučajevima, obrada uklјučuje zamenu medijuma u medijum prihvatlјiv ili želјen za transdukciju.

[0210] U pojedinim slučajevima, ulazna kompozicija sadrži određeni odnos kopija čestica virusnog vektora ili njihovih infektivnih jedinica (IU) po ukupnom broju ćelija (IU/ćeliji) u ulaznoj kompoziciji ili po ukupnom broju ćelija koje je potrebno transdukovati. Na primer, u pojedinim slučajevima, ulazna kompozicija sadrži broj od ili oko ili najmanje ili oko 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50 ili 60 IU čestica virusnog vektora po jednoj od ćelija.

[0211] U određenim slučajevima, mogućnost upotrebe viših IU u predmetnim postupcima obezbeđuje prednosti u poređenju s drugim postupcima. Pod inače identičnim uslovima, upotreba višeg odnosa IU/ćeliji generalno dovodi do veče efikatnosti transdukcije ili se isto postiže do određenog gornjeg nivoa IU/ćeliji na kome odgovarajući porast efikasnosti može dostići plato. Ipak, uz određene dostupne postupke, povećanje IU/ćeliji i time efikasnosti transdukcije, takođe dovodi do povećanja u broju kopija vektora (VCN), što može predstavlјati rizike po bezbednost i može usloviti nezadovoljavanje regulatornih standarda.

[0212] U pojedinim slučajevima, uz obezbeđene postupke, prosečan VCN među transdukovanim ćelijama u izlaznoj kompoziciji, kao što su ćelije koje sadrže virusni vektor ili ćelije koje eksprimiraju molekul kodiran virusnim vektorom, se ne povećava sa povećanjem IU/ćeliji u ulaznoj kompoziciji. U pojedinim slučajevima, u obezbeđenim postupcima, prosečan VCN među transdukovanim ćelijama opada sa povećanjem odnosa IU/ćeliji u ulaznoj kompoziciji.

[0213] U pojedinim slučajevima, titar čestica virusnog vektora je između ili između oko 1 x 10<6>IU/ml i 1 x 10<8>IU/ml, kao što je između ili između oko 5 x 10<6>IU/ml i 5 x 10<7>IU/ml, kao što je najmanje 6 x 10<6>IU/ml, 7 x 10<6>IU/ml, 8 x 10<6>IU/ml, 9 x 10<6>IU/ml, 1 x 10<7>IU/ml, 2 x 10<7>IU/ml, 3 x 10<7>IU/ml, 4 x 10<7>IU/ml ili 5 x 10<7>IU/ml.

[0214] U pojedinim slučajevima, ulazna kompozicija sadrži koncentraciju čestica virusnog vektora tokom najmanje dela navedene inkubacije, kao što je tokom rotacije ulazne kompozicije u centrifugalnoj komori, koja je sa određenim odnosom kopija čestica virusnog vektora, ili njihovih infektivnih jedinica (IU), po ukupnom broju ćelija (IU/ćeliji) u ulaznoj kompoziciji ili po ukupnom broju ćelija koje je potrebno transudkovati po ukupnoj zapremini tečnosti ulazne kompozicije prisutne tokom najmanje dela navedene inkubacije, kao što je tokom rotacije, tj. IU/ćeliji/ml. U pojedinim slučajevima, ulazna kompozicija podrazumeva najmanje 0,01 IU, 0,05 IU, 0,1 IU, 0,5 IU ili 0,1 IU čestica virusnog vektora po jednoj od ćelija, po ml zapremine tečnosti ulazne kompozicije, tokom najmanje dela navedena inkubacija, kao što je tokom rotacije.

[0215] U pojedinim slučajevima, korak nastanka ulazne kompozicije (od ćelija i čestica virusnog vektora) može biti izveden u centrifugalnoj komori. U pojedinim slučajevima, korak stvaranja ulazne kompozicije se izvodi izvan centrifugalne komore. Prema tome, nije predviđeno da termin "ulazna kompozicija" označava da je celokupna kompozicija preuzeta u odgovarajuću posudu, npr. epruvetu, kesu ili šuplјinu odjednom, ili da bi se isključilo uvlačenje delova kompozicije iz različitih posuda ili linija. Ulazne kompozicije mogu obuhvatati one koje su obrazovane uvlačenjem dve različite kompozicije u šuplјinu komore i njihovim mešanjem, čime nastaje ulazna kompozicija.

[0216] Ulazna kompozicija može biti preuzeta u ili na drugi način preneta u posudu u kojoj se inkubacija, poput rotacije, odvija u okviru istog kontejnera ili se preuzima iz više od jednog zasebnog kontejnera. Na primer, ulazna kompozicija može biti preuzeta u komoru uvlačenjem smeše koja sadrži ćelije i druge kompozicije koja sadrži čestice virusnog vektora, što može biti izvedeno sekvencijalno ili istovremeno. Alternativno, ulazna kompozicija koji sadrži čestice virusnih vektora i ćelije se unosi u šuplјinu ili drugu posudu u kojoj će se izvršiti transdukcija.

[0217] U pojedinim slučajevima, kada se transdukcija izvodi u unutrašnjoj šuplјini centrifugalne komore, navedeno se postiže omogućavanjem da samo određeni deo šuplјine sadrži tečnu ulaznu kompoziciju. Navedeno može biti postignuto, na primer, uvlačanjeme vazduha ili gasa u deo šupljine i/ili uklјučivanjem jednog ili više čvrstih predmeta u prostor unutar šuplјine, kao što je unutrašnji prostor. U pojedinim slučajevima, navedno može svesti na minimum ili smanjiti ukupnu zapreminu tečnosti navedene ulazne kompozicije koja je prisutna u navedenoj šuplјini tokom inkubacije, kao što je tokom rotacije navedene centrifugalne komore po kvadratnom inču unutrašnje površine šuplјine u poređenju sa slučajem kada je gas u šupljini odsutan i/ili je odsutan jedan illi više od čvrstih predmeta u prostoru šuplјine. Na ovaj način, u poređenju sa drugim postupcima kod kojih je prisutna difuzija virusa kroz veliku zapreminu tečnosti u poređenju sa zapreminom ćelija, što može ograničiti efikasnost transdukcije, obezbeđeni postupci mogu imati prednosti. Prema tome, dok u pojedinim slučajevima, ulazna kompozicija zauzima celokupnu ili suštinski celokupnu zapreminu unutrašnje šuplјine tokom najmanje dela inkubacije, u pojedinim slučajevima, tokom najmanje dela inkubacije, ulazna kompozicija zauzima samo deo zapremine unutrašnje šuplјine tokom navedene inkubacije.

[0218] U pojedinim takvim slučajevima, zapremina šuplјine tokom ovog, najmanje dela inkubacije, može dalјe uklјučivati gas koji se u navedenu šuplјinu preuzima kroz jedan ili više otvora, npr. dovoda u šuplјinu, kao što je pre ili tokom navedene inkubacije. U pojedinim slučajevima postupka, vazduh se sterilise ili je sterilan. U pojedinim slučajevima, vazduh ne sadrži ili je suštinski oslobođen od mikrobnih konaminanata ili drugih potencijalno patogenih agenasa.

[0219] U pojedinim slučajevima, obezbeđivanje ili unošenje gasa, kao što je vazduh, može biti ostvareno na bilo koji način koji dozvolјava prolazak vazduha u unutrašnju šuplјinu centrifugalne komore, kao što je, prema pojedinim aspektima, bez ugrožavanja sterilnosti zatvorenog sistema. U pojedinim slučajevima, gas, kao što je vazduh, može biti dodat u kontejner pod sterilnim uslovima, a kontejner može biti sterilno povezan na poziciji u sistemu koja je pogodna za prenos u komoru. U pojedinim slučajevima, dodavanje gasa, kao što je vazduh, u kontejner, kao što je kesa, ostvaruje se u okviru uslova u laminaru, kao što je kabinet ili laminar za biološku bezbednost. U pojedinim takvim slučajevima, gas, kao što je vazduh, dodaje se u kontejner zajedno sa zapreminom tečnosti, kao što je zapremina tečnosti koja sadrži kompoziciju ćelija i/ili zapremina tečnosti koja sadrži kompoziciju čestica virusnog vektora. Otuda, u pojedinim slučajevima, obezbeđivanje ili unošenje gasa, kao što je vazduh, u unutrašnju šuplјinu komore se odvija zajedno ili istovremeno sa obezbeđivanjem ili unosom jednog ili oba od ćelija ili čestica virusnog vektora koji čine ulaznu kompoziciju.

[0220] U pojedinim slučajevima, obezbeđivanje ili unošenje gasa, kao što je vazduh, u komoru, postiže se upotrebom šprica koji može biti povezan preko bilo kog luer adaptera udruženog sa sistemom, a koji je operativno povezan sa unutrašnjom šuplјinom centrifugalne komore. U pojedinim slučajevima, vazduh se u špric prenosi pod sterilnim uslovima, kao što je to u okviru laminara. U pojedinim slučajevima, špric je sterilan špric, kao što je, prema pojedinim aspektima, špric koji sadrži pokretan klip koji nije izložen okolnom nesterilnom okruženju. U pojedinim slučajevima, špric sadrži filter na svom kraju, da bi ostvario sterilan prenos gasa, poput vazduha, u unutrašnju šuplјinu komore.

[0221] U pojedinim slučajevima, obezbeđivanje ili unošenje gasa, kao što je vazduh, u unutrašnju šuplјinu komore se postiže upotrebom filtera koji je operativno povezan sa unutrašnjom šuplјinom komore putem sterinog sistema cevi. U pojedinim takvim slučajevima, filter je sterilan ili je mikrobni filter, kao što je opisano kod sistema za primer, kao što je prema pojedinim aspektima, filter koji je prikazan kao primer na Sl.7. U pojedinim slučajevima, uređaj je povezan sa filterom, kao što je luer adapter, za prenos vazduha. U pojedinim takvim slučajevima, uređaj je špric, pumpa ili drugi uređaj za infuziju. U pojedinim slučajevima, gas je vazduh, a unošenje vazduha kroz filter se vrši direktno iz neposrednog okruženja. U pojedinim slučajevima, filter sadrži poklopac, kao što je poklopac bez ventilacije, koji se može ukloniti ili odvojiti radi kontrole protoka vazduha kroz filter, ukoliko je to poželjno.

[0222] Otuda, u pojedinim slučajevima, postupci obuhvataju obezbeđivanje ili unošenje tečne ulazne kompozicije i zapremine gasa, kao što je vazduh, u unutrašnju šuplјinu komore. Zapremina gasa, kao što je vazduh, koja se obezbeđuje ili unosi, u funkciji je zapremine kompozicije koja sadrži ćelije i kompozicije koji sadrži čestice virusnog vektora koje čine ulaznu kompoziciju. U pojedinim slučajevima, zapremina gasa je razlika između ukupne zapremine unutrašnje šuplјine i zapremine tečnosti ulazne kompozicije. U pojedinim slučajevima, ukupna zapremina gasa i tečnosti nije veća od 200 ml, tako da je zapremina gasa koja se obezbeđuje ili unosi u unutrašnju šuplјinu razlika između 200 ml i zapremine tečnosti ulazne kompozicije (sa ćelijama i česticama virusnog vektora).

[0223] Prema aspektu obezbeđenih postupaka za primer, postupak transdukcije obuhvata obezbeđivanje u unutrašnjosti šupljine zatvorenog sistema centrifugalne komore, u kojoj unutrašnja šuplјina ima površinu od najmanje ili oko 1 x 10<9>µm<2>ili najmanje ili oko 1 x 10<10>µm<2>, kompozicije koja sadrži najmanje ili oko 50 x 10<6>ćelija u zapremini koja nije veća od 100 ml. U pojedinim slučajevima, ćelijska kompozicija sadrži najmanje ili oko 100 x 10<6>ćelija ili najmanje ili oko 200 x 10<6>ćelije u zapremini koja nije veća od 50 ml, 40 ml, 30 ml, 20 ml, 10 ml ili 5 ml. U pojedinim slučajevima, pre uvođenja ćelija u unutrašnju šuplјinu, kompozicija ćelija se razblažuje ili koncentruje do zapremine koja nije veća od 100 ml, kao što ona koja nije veća od 50 ml, 40 ml, 30 ml, 20 ml, 10 ml ili 5 ml. Pored ćelijske kompozicije, postupak takođe obuhvata obezbeđivanje, prema pojedinim aspektima, kompozicije koja sadrži čestice virusnog vektora u količini koja iznosi najmanje 1 IU/ćeliji i u zapremini koja je takva da je ukupna zapremna tečnosti, uklјučujući tečnost iz kompozicije koji sadrži ćelije, manja od maksimalne zapremine unutrašnje šuplјine centrifugalne komore, kao što je zapremina koja nije veća od 200 ml, čime se stvara ulazna kompozicija. U pojedinim slučajevima, kompozicija koja sadrži čestice virusnog vektora obezbeđena je u količini koja iznosi najmanje 1,6 IU/ćeliji, 1,8 IU/ćeliji, 2,0 IU/ćeliji, 2,4 IU/ćeliji, 2,8 IU/ćeliji, 3,2 IU/ćeliji ili 3,6 IU/ćeliji. U pojedinim slučajevima, ukupna zapremina tečnosti ulazne kompozicije je manja od 100 ml, manja od 90 ml, manja od 80 ml, manja od 60 ml, manja od 40 ml, manja od 20 ml. Opciono, postupak takođe može uključivati obezbeđivanje gasa, kao što je vazduh, na primer, do ukupne zapremine unutrašnje šuplјine, tako da ukupna zauzeta zapremina u unutrašnjoj šuplјini centrifugalne komore iznosi do ili oko 200 ml.

[0224] U pojedinim slučajevima, kompozicija koja sadrži ćelije i kompozicija koja sadrži čestice virusnog vektora, i opciono, vazduh, mogu biti spojene ili se mešati pre uvođenja kompozicija u šuplјinu. U pojedinim slučajevima, kompozicija koja sadrži ćelije i kompozicija koja sadrži čestice virusnog vektora,

4

i opciono vazduh, uvode se odvojeno, pa se spajaju i mešaju u šuplјini. U pojedinim slučajevima, kompozicija koja sadrži ćelija, kompozicija koja sadrži čestice virusnog vektora i, opciono, vazduh, mogu biti obezbeđeni u unutrašnjoj šuplјini po bilo kom redosledu. U bilo kom od takvih nekih slučajeva, kompozicija koja sadrži ćelije i čestice virusnog vektora je ulazna kompozicija koja je jednom spojena ili pomešana zajedno, bilo da je spojena ili pomešana unutar ili izvan centrifugalne komore i/ili da li su ćelije i čestice virusnog vektora uvedene u centrifugalna komora zajedno ili odvojeno, kao što je istovremeno ili sekvencijalno.

[0225] U pojedinim slučajevima, unos zapremine gasa, kao što je vazduh, odvija se pre inkubacije, poput rotacije, u postupku transdukcije. U pojedinim slučajevima, uvođenje zapremine gasa, kao što je vazduh, odvija se tokom inkubacije, kao što je rotacija, u postupku transdukcije.

[0226] U pojedinim slučajevima, zapremina tečnosti ćelija ili čestica virusnog vektora koje čine ulaznu kompoziciju, i opciono zapremina vazduha, mogu biti unapred određene zapremine. Zapremina može biti zapremina koji je programirana u i/ili kontrolisana od strane regulatora povezanog sa sistemom.

[0227] U pojedinim slučajevima, unos ulazne kompozicije, i opciono gasa, kao što je vazduh, kontroliše se ručno, polu-automatski i/ili automatski sve dok se u unutrašnju šuplјinu komore ne preuzme želјena ili unapred određena zapremina. U pojedinim slučajevima, senzor koji je povezan sa sistemom može detektovati tečnost i/ili gas koji protiče u ili iz centrifugalne komore, kao što je preko njegove boje, stope protoka i/ili gustine, a može komunicirati sa pripadajućim regulatorom da bi se zaustavio ili nastavio unos prema potrebi, dok se ne postigne unos takve želјene ili unapred određene zapremine. Prema pojedinim aspektima, senzor koji je programiran ili je u stanju da detektuje samo tečnost u sistemu, ali ne i gas (npr. vazduh), može biti napravljen tako da dozvoljava prolazak gasa, kao što je vazduh, u sistem, bez zaustavlјanja unosa. U pojedinim takvim slučajevima, u liniju sa senzorom može biti postavljen neproziran deo cevi, kada je uvođenje gasa, kao što je vazduh, poželjno. U pojedinim slučajevima, uvođenje gasa, kao što je vazduh, može biti manuelno kontrolisano.

[0228] Prema aspektima obezbeđenih postupaka, unutrašnja šuplјina centrifugalne komore se podvrgava rotaciji velikom brzinom. U pojedinim slučajevima, rotacija se vrši pre, istovremeno, nakon ili povremeno uz uvođenje tečne ulazne kompozicije i opciono vazduha. U pojedinim slučajevima, rotacija se vrši nakon uvođenja tečne ulazne kompozicije i opciono vazduha. U pojedinim slučajevima, rotacija se vrši centrifugiranjem centrifugalne komore sa relativnom centrifugalnom silom na unutrašnjoj površini bočnog zida unutrašnje šuplјine i/ili na površinskom sloju ćelija od ili oko ili najmanje ili oko 800 g, 1000 g, 1100 g, 1500, 1600 g, 1800 g, 2000 g, 2200 g, 2500 g, 3000 g, 3000 g, 3500 g ili 4000 g. U pojedinim slučajevima, rotacija je centrifugiranjem sa silom većom od ili oko 1100 g, kao što je sila veća od ili oko 1200 g, veća od ili oko 1400 g, veća od ili oko 1600 g, veća od ili oko 1800 g, veća od ili oko 2000 g, veća od ili oko 2400 g, veća od ili oko 2800 g, veća od ili oko 3000 g ili veća od ili oko 3200 g.

[0229] U pojedinim slučajevima, postupak transdukcije obuhvata rotaciju ili centrifugiranje ulazne kompozicije, i opciono vazduha, u centrifugalnoj komori koje je duže od ili je oko 5 minuta, kao što je duže od ili je oko 10 minuta, duže je od ili je oko 15 minuta, duže je od ili je oko 20 minuta, duže je od ili je oko 30 minuta, duže je od ili je oko 45 minuta, duže je od ili je oko 60 minuta, duže je od ili je oko 90 minuta ili duže je od ili je oko 120 minuta. U pojedinim slučajevima, ulazna kompozicija, i opciono vazduh, rotiraju se ili centrifugiraju u centrifugalnoj komori duže od 5 minuta, ali ne duže od 60 minuta, ne duže od 45 minuta, ne duže od 30 minuta ili ne duže od 15 minuta.

[0230] U pojedinim slučajevima, postupak transdukcije uklјučuje rotaciju ili centrifugiranje ulazne kompozicije, i opciono vazduha, u centrifugalnoj komori tokom između ili između oko 10 minuta i 60 minuta, 15 minuta i 60 minuta, 15 minuta i 45 minuta, 30 minuta i 60 minuta ili 45 minuta i 60 minuta, pri čemu su uključene i navedene vrednosti, a uz silu na unutrašnjoj površini bočnog zida unutrašnje šuplјine i/ili na površinskom sloju ćelija od najmanje ili više od ili oko 1000 g, 1100 g, 1200 g, 1400 g, 1500 g, 1600 g, 1800 g, 2000 g, 2200 g, 2400 g, 2800 g, 3200 g ili 3600 g.

[0231] U pojedinim slučajevima, postupak uklјučuje ostvarivanje isticanja iz unutrašnje šuplјine centrifugalne komore za izlaznu kompoziciju, koja je rezultujuća kompozicija ćelija inkubiranih sa česticama virusnog vektora pod uslovima koji uklјučuju rotaciju ili centrifugiranje u centrifugalnoj komori prema bilo kom od prethodno navedenih slučajeva, kao što je opisano. Prema aspektima postupka, izlazna kompozicija sadrži ćelije koje su transdukovane ili u kojima je inicirana transdukcija sa virusnim vektorom. U pojedinim slučajevima, isticanje izlazne kompozicije je u izlaznu kesu koja je operativno povezana sa centrifugalnom komorom kao deo zatvorenog sistema. U pojedinim slučajevima, isticanje izlazne kompozicije je nakon rotacije ili centrifugiranja. U pojedinim slučajevima, isticanje izlazne kompozicije je istovremeno ili delimično istovremeno sa rotacijom ili centrifugiranjem, kao što je u polukontinuiranom ili kontinuiranom procesu.

[0232] U pojedinim slučajevima, gas u šuplјini komore, kao što je vazduh, izbacuje se iz komore. U pojedinim slučajevima, gas, kao što je vazduh, izbacuje se u kontejner koji je operativno povezan sa centrifugalnom komorom kao deo zatvorenog sistema. U pojedinim slučajevima, kontejner je slobodan ili prazan kontejner. U pojedinim slučajevima, vazduh u šuplјinu komore, kao što je gas, izbacuje se kroz filter koji je operativno povezan sa unutrašnjom šuplјinom komore preko sterilnog sistema cevi. U pojedinim slučajevima, vazduh se izbacuje upotrebom manualnih, poluautomatskih ili automatskih procesa. U pojedinim slučajevima, vazduh se izbacuje iz komore pre, istovremeno, povremeno ili naknadno u odnosu na isticanje izlazne kompozicije koja sadrži inkubirane ćelije i čestice virusnog vektora, kao što su ćelije u kojima je inicirana transdukcija ili ćelije koje su transdukovane virusnim vektorom, iz šuplјine komore.

[0233] U pojedinim slučajevima, transdukcija i/ili druga inkubacija se izvodi kao celokupan ili kao deo kontinuiranog ili polu-kontinuiranog procesa. U pojedinim slučajevima, kontinuiran proces obuhvata kontinuiran unos ćelija i čestica virusnog vektora, npr. ulazne kompozicije (bilo kao jedne prethodne kompozicije ili kontinuiranim unosom u istu posudu, npr. šuplјinu, i na taj način mešanjem njihovih delova) i/ili kontinuirano isticanje ili izbacivanje tečnosti, i opciono izbacivanje gasa (npr. vazduha) iz posude, tokom najmanje dela inkubacije, npr. tokom centrifugiranja. U pojedinim slučajevima, kontinuiran unos i kontinuirano isiticanje se najmanje delom izvode istovremeno. U pojedinim slučajevima, kontinuiran unos se odvija tokom dela inkubacije, npr. tokom dela centrifugiranja, a kontinuirano isticanje se odvija tokom zasebnog dela inkubacije. Dva navedena procesa mogu biti naizmenični. Tako, kontinuirano uvođenje i isticanje tokom izvođenja inkubacije, mogu omogućiti veću sveukupnu zapreminu uzorka koja će biti obrađena, npr. transdukovana.

[0234] U pojedinim slučajevima, inkubacija je deo kontinuiranog procesa, pri čemu postupak uklјučuje, najmanje tokom dela inkubacije, ostvarivanje kontinuiranog unosa navedene ulazne kompozicije u šuplјinu tokom rotacije komore i tokom dela inkubacije, ostvarivanje kontinuiranog isticanja tečnosti i, opciono, izbacivanje gasa (npr. vazduha) iz šuplјine kroz najmanje jedan otvor tokom rotacije komore.

[0235] U pojedinim slučajevima, polukontinuirana inkubacija se izvodi naizmeničnim ostvarivanjem unosa kompozicije u šupljinu, inkubacijom, isticanjem tečnosti iz šuplјine i, opciono, izbacivanjem gasa (npr. vazduha) iz šuplјine, kao što je u izlazni kontejner, a zatim unos naredne (npr. druge, treće itd.) kompozicije koja sadrži više ćelija i drugih reagenasa za obradu, npr. čestica virusnog vektora, i ponavlјanje postupka. Na primer, u pojedinim slučajevima, inkubacija je deo polu-kontinuiranog procesa, pri čemu postupak obuhvata, pre inkubacije, ostvarivanje unosa ulazne kompozicije u šuplјinu kroz navedeni najmanje jedan otvor, a zatim nakon inkubacije, ostvarivanje isticanja tečnosti iz šuplјine; ostvarivanje unosa druge ulazne kompozicije koja sadrži ćelije i čestice virusnog vektora u navedenu unutrašnju šuplјinu; i inkubiranje druge ulazne kompozicije u navedenoj unutrašnjoj šuplјini pod uslovima u kojima se navedene ćelije u navedenoj drugoj ulaznoj kompoziciji transdukuju sa navedenim vektorom. Proces se može nastaviti na iterativan način tokom brojnih dodatnih ciklusa. U tom pogledu, polu-kontinuirani ili kontinuirani postuci mogu dozvoliti proizvodnju još veće zapremine i/ili broja ćelija.

[0236] U pojedinim slučajevima, deo inkubacije u svrhu transdukcije se izvodi u centrifugalnoj komori, i sprovodi se pod uslovima koji uključuju rotaciju ili centrifugiranje.

[0237] U pojedinim slučajevima, postupak uklјučuje inkubaciju u kojoj se dalјi deo inkubacije ćelija i čestica virusnog vektora vrši bez rotacije ili centrifugiranja, što se generalno izvodi nakon najmanje dela inkubacije koji uklјučuje rotaciju ili centrifugiranje komore. U pojedinim takvim slučajevima, dalјa inkubacija se vrši pod uslovima koji dovode do integracije virusnog vektora u genom domaćina jedne ili više ćelija. Na kvalifikovanom je stručnjaku da proceni ili odredi da li je rezultat inkubacije integracija čestica virusnog vektora u genom domaćina, a samim tim i da empirijski odredi uslove za dalјu inkubaciju. U pojedinim slučajevima, integracija virusnog vektora u genom domaćina može biti određena merenjem nivoa ekspresije rekombinantnog proteina, kao što je heterologni protein koji je kodiran nukleinskom kiselinom koja se nalazi u genomu čestice virusnog vektora nakon inkubacije. Mogu biti upotrebljeni brojni dobro poznati postupci za procenu nivoa ekspresije rekombinantnih molekula, kao što je detekcija postupcima zasnovanim na afinitetu, npr. postupcima zasnovanim na imunoafinitetu, npr. u kontekstu proteina na površini ćelija, kao što je protočnom citometrijom. U pojedinim primerima, ekspresija se meri detekcijom transdukovanog markera i/ili reporterskog konstrukta. U pojedinim slučajevima, u vektor je uklјučena nukleinska kiselina koja kodira skraćeni protein sa površine ćelije, a koji se upotrebljava kao marker ekspresije i/ili njenog pojačanja.

[0238] U pojedinim slučajevima, dalјa inkubacija se izvodi u centrifugalnoj komori, ali bez rotacije. U pojedinim slučajevima, dalјa inkubacija se izvodi izvan centrifugalne komore. U pojedinim slučajevima, dalјa inkubacija se ostvaruje na temperaturama višim od sobne temperature, kao što je ona veća od ili veća od oko 25 °C, kao što je temperature koja je generalno veća od ili veća od oko 32 °C, 35 °C ili 37 °C. U pojedinim slučajevima, dalјa inkubacija se ostvaruje na temperaturi od ili oko 37 °C ± 2 °C, kao što je na temperaturi od ili oko 37 °C. U pojedinim slučajevima, dalјa inkubacija je tokom vremena između ili približno između 1 sata i 48 sati, 4 sata i 36 sati, 8 sati i 30 sati ili 12 sati i 24 sata, uključujući i navedene vrednosti.

[0239] U pojedinim slučajevima, dalјa inkubacija se odvija u zatvorenom sistemu. U pojedinim slučajevima, nakon isticanja izlazne kompozicije iz komore, kao što je u kontejner (npr. kesu), kontejner koji sadrži izlaznu kompoziciju se inkubira tokom narednog dela vremena. U pojedinim slučajevima, kontejner, kao što je kesa, inkubira se na temperaturi od ili oko 37 °C ± 2 °C tokom vremena između ili

4

približno između od 1 sata do 48 sati, 4 sata i 36 sati, 8 sati i 30 sati ili 12 i 24 sata, uključujući i navedene vrednosti.

[0240] U pojedinim slučajevima, postupci ostvaruju transdukciju određenog broja ili procenta ćelija koje se nalaze u ulaznoj i/ili izlaznoj (transdukovanojm) kompoziciji ili njenom delu. Na primer, u pojedinim slučajevima, najmanje 2,5%, najmanje 5%, najmanje 6%, najmanje 8%, najmanje 10%, najmanje 20%, najmanje 25%, najmanje 30%, najmanje 40 %, najmanje 50% ili najmanje 75% ukupnih ćelija (ili određenog tipa ciljnih ćelija, kao što su T-ćelije) u ulaznoj kompoziciji i/ili u izlaznoj (npr. transdukovanoj) kompoziciji, je transdukovano sa navedenim virusnim vektorom i/ili eksprimira rekombinantan genski proizvod koji je njime kodiran. U pojedinim slučajevima, rezultat postupaka transdukcije je izlazna kompozicija u kojoj je najmanje 2,5%, najmanje 5%, najmanje 6%, najmanje 8%, najmanje 10%, najmanje 20%, najmanje 25%, najmanje 30%, najmanje 40%, najmanje 50% ili najmanje 75% ukupnih ćelija u kompoziciji, kao što su T-ćelije, transdukovano sa virusnim vektorom i/ili eksprimira rekombinantan genski proizvod koji je njime kodiran.

[0241] U pojedinim slučajevima, postupci su u stanju da se postigne takva, barem određena efikasnost transdukcije pod određenim uslovima. Na primer, u pojedinim slučajevima, gde ulazna kompozicija uklјučuje virus i ćelije sa odnosom od ili od oko 1 infektivne jedinice (IU) po jednoj od ćelija do 10 IU po jednoj od ćelija, kao što je količina od ili oko 1 infektivne jedinice (IU) po jednoj od ćelija ili od ili oko 2 IU po jednoj od ćelija, od ili oko 5 IU po jednoj od ćelija ili od ili oko 10 IU po jednoj od ćelija, postupak je u stanju da proizvede transdukovanu kompoziciju u kojoj je najmanje 10%, najmanje 25%, najmanje 30%, najmanje 40%, najmanje 50% ili najmanje 75% ćelija u navedenoj transdukovanoj kompoziciji generisanoj postupkom, transdukovano sa rekombinantnim virusnim vektorom. Transdukcija ćelija može biti detektovana utvrđivanjem prisustva rekombinantne nukleinske kiseline, npr. transgena koji je uklјučen u vektor ili njegovog proizvoda u ćeliji. U pojedinim slučajevima, proizvod se detektuje na površini ćelija, što ukazuje da je ćelija uspešno transdukovana. U pojedinim slučajevima, detekcija transdukcije obuhvata detekciju transdukcionog markera, poput drugog transgena ili proizvoda koji je uklјučen u svrhu obeležavanja transdukovanih ćelija i/ili drugog selektivnog markera.

[0242] U pojedinim slučajevima, izlazna kompozicija koji je rezultat transdukcionih postupaka obuhvata određen prosečan broj ili srednju vrednost broja kopija transdukovanog vektora po ćeliji (broj kopija vektora (VCN)). VCN može biti izražen brojem kopija u pojedinačnoj ćeliji. Alternativno, broj može biti izražen kao prosečan borj uu odnosu na ukupnu ćelijsku populaciju ili kompoziciju, kao što je izlazna ili transdukovana kompozicija (uklјučujući bilo koje netransdukoven ćelije unutar kompozicije, koje ne bi sadržavale kopije vektora). Alternativno, VCN može biti izražen u vidu prosečnog broja kopija samo među transdukovanim ćelijama. U pojedinim slučajevima, među svim ćelijama u transdukovanoj ili izlaznoj kompoziciji koja je proizvedena postupcima, prosečan VCN nije bio veći od ili je iznosio oko 10, 5, 4, 2,5, 1,5 ili 1. U pojedinim slučajevima, među ćelijama u transdukovanoj ili izlaznoj kompoziciji koja sadrže rekombinantan virusni vektor ili eksprimiraju rekombinantan genski proizvod, prosečan VCN nije bio veći od ili je oko 4, 3, 2, 2,5, 1,5 ili 1.

[0243] Takođe su obezbeđene kompozicije koje su proizvedene bilo kojim od prethodno navedenih postupaka. U pojedinim slučajevima, kompozicije sadrže najmanje 1 x 10<7>ćelija ili 5 x 10<7>ćelija, kao što je najmanje 1 x 10<8>ćelija, 2 x 10<8>ćelija, 4 x 10<8>ćelija, 6 x 10<8>, 8 x 10<8>ćelija ili 1 x 10<9>ćelija, u kojima je najmanje mnoštvo ćelija transdukovano sa rekombinantnim virusnim vektorom. U pojedinim slučajevima, ćelije su T-ćelije.

[0244] U pojedinim slučajevima, primenom postupaka koji su ovde obezbeđeni, moguće je proizvesti izlaznu kompoziciju koja sadrži mnoštvo transdukovanih ćelija u velikom broju, kao što je, prema pojedinim aspektima, broj koji može postići terapijski efektivnu dozu T-ćelija za upotreba u adoptivnoj imunoterapiji. U pojedinim slučajevima, navedeno može biti postignuto ne samo zbog sposobnosti transdukcije ćelija u velikom obimu, već i, prema pojedinim aspektima, ponavlјanjem procesa na kontinuiran ili polu-kontinuiran način.

[0245] Nasuprot navedenom, postojeći postupci iz oblasti tehnike u kojima se transdukcija izvodi u manjem obimu, kao što je na pločama, zahteva ekspanziju ćelija nakon transdukcije da bi se postigao broj ćelija koji je potreban za dobijanje terapijski efektivne doze. Ekspanzija ćelija, kao što su T-ćelija, sa jednim ili sa više stimulišućih agenasa, može aktivirati ćelije i/ili izmeniti fenotip ćelija, što rezultuje u generisanju efektorskih ćelija sa deplecijom T-ćelijskog fenotipa. Na primer, aktiviranje ili stimulacija T-ćelija može dovesti do promene u diferencijaciji ili aktivacionom stanju T-ćelija, što može rezultovati i/ili dovesti do smanjene postojanosti in vivo, kada se subjektu primenjuju genetički izmenjene ćelije. Među promenama u stanju diferencijacije koje se mogu dogoditi, u pojedinim slučajevima, uključeni su gubitak naivnog fenotipa, gubitak memorijskih fenotipa T-ćelija i/ili stvaranje efektorskih ćelija sa deplecijom T-ćelijskog fenotipa. Deplecija T-ćelija može dovesti do progresivnog gubitka funkcija T-ćelija i/ili do deplecije ćelija (Yi i saradnici (2010) Immunology, 129:474-481). Deplecija T-ćelija i/ili nedostatak postojanosti T-ćelija je prepreka za efikasnost i terapijske rezultate adoptivne ćelijske terapije; klinička ispitivanja su ukazala na korelaciju između većeg i/ili dužeg stepena izloženosti ćelija koje eksprimiraju antigeni receptor (npr. CAR) i rezultata lečenja.

[0246] U pojedinim slučajevima, u postupcima koji su ovde obezbeđeni nije potrebno stimulisanje i/ili aktiviranje ćelija nakon transdukcije u onoj meri u kojoj je to potrebno u drugim poznatim postupcima iz oblasti tehnike. U pojedinim slučajevima, nakon transdukcije, ćelije u kompoziciji se ne podvrgavaju ekspanziji u prisustvu stimulišućeg agensa (npr. citokina, kao što je IL-2) i/ili se ne inkubiraju na temperaturi većoj od ili oko 30 °C ili većoj od ili oko 37 °C, duže od 24 sata. U pojedinim slučajevima, najmanje 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% ili 90% T-ćelija u kompoziciji i/ili transdukovanih T-ćelija u izlaznoj kompoziciji sadrži visoku ekspresiju CD69 ili TGF-beta-II na svojoj površini. U pojedinim slučajevima, najmanje 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% ili 90% T-ćelija ili transdukovanih T-ćelije u kompoziciji ne eksprimira CD62L na svojoj površini i/ili visoko eksprimira CD25, ICAM, GM-CSF, IL-8 i/ili IL-2.

[0247] U pojedinim slučajevima, genetički izmenjene ćelije, kao što su ćelije transdukovane sa virusnim vektorima koji kodiraju rekombinantne proizvode da bi se eksprimirali u ćelijama, u izlaznoj kompoziciji koja je porizvedena prethodno navedenim postupkom, ili postupkom koji obuhvata dalje korake obrade kao što je generisanje formulisane kompozicije, ispoljavaju povećanu postojanost kada se primenjuju subjektu in vivo. U pojedinim slučajevima, postojanost obezbeđenih ćelija, kao što su ćelije kod subjekta nakon primene koje eksprimiraju receptor, npr. CAR, veća je u odnosu na onu koja bi se postigla alternativnim postupcima transdukcije, poput onih koje uklјučuju primenu ćelije koje su izmenjene genetičkim inženjeringom sa postupcima koji uklјučuju transdukciju manjeg obima u kojoj se T-ćelije aktiviraju i/ili stimulišu da bi se ostvarila ekspanzija pre i/ili nakon transdukcije i da bi se postigao broj ćelija koji predstavlja terapijski efikasnu dozu. Na primer, prema pojedinim aspektima, postojanost obezbeđenih ćelija, kao što su ćelije proizvedene obezbeđenim postupcima, veća je u odnosu na onu koja bi bila postignuta primenom populacije ćelija koje eksprimiraju rekombinantan receptor (npr. CAR) koji je izmenjen genetičkim inženjeringom, a u kojima je nivo ekspresije CD69 ili

4

TGF-beta II niži za najmanje 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% ili 90%. U pojedinim slučajevima, postojanost obezbeđenih ćelija, poput ćelija koje su proizvedene obezbeđenim postupcima, veća je u odnosu na onu koja bi bila postignuta primenom populacije ćelija koje eksprimiraju rekombinantan receptor (npr. CAR) izmenjen genetičkim inženjeringom, a u kojima je ekspresija CD62L najmanje 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% ili 90% i/ili koje su sa niskom ekspresijom CD25, ICAM, GM-CSF, IL-8 i/ili IL-2 na svojoj površini.

[0248] U pojedinim slučajevima, postojanost je povećana najmanje ili približno najmanje 1,5 put, 2 puta, 3 puta, 4 puta, 5 puta, 6 puta, 7 puta, 8 puta, 9 puta, 10 puta, 20 puta, 30 puta, 50 puta, 60 puta, 70 puta, 80 puta, 90 puta, 100 puta ili više.

[0249] U pojedinim slučajevima, stepen ili obim postojanosti primenjenih ćelija može biti detektovan ili kvantifikovan nakon primene subjektu. Na primer, prema pojedinim aspektima, upotrebljava se kvantitativni PCR (qPCR) da bi se procenila količina ćelija koje eksprimiraju rekombinantan receptor (npr. ćelija koje eksprimiraju CAR) u krvi ili serumu, ili u organu ili tkivu (npr. na mestu oboljenja) subjekta. Prema pojedinim aspektima, postojanost se kvantifikuje u vidu kopija DNK ili plazmida koji kodiraju receptor, npr. CAR, po mikrogramu DNK, ili u vidu broja ćelija koje eksprimiraju receptor, npr. ćelija koje eksprimiraju CAR, po mikrolitru uzorka, npr. krvi ili seruma, ili po ukupnom broju mononuklearnih ćelija periferne krvi (PBMC) ili belih krvnih ćelija ili T-ćelija po mikrolitru uzorka. U pojedinim slučajevima, može biti izvedenea analiza protočnom citometrijom za detekciju ćelija koje eksprimiraju receptor, uglavnom uz upotrebljavu antitela koja su speifična za receptor. Analize zasnovane na ćelijama, mogu takođe biti upotrebljene za detektovanje broja ili procenta funkcionalnih ćelija, kao što su ćelije koje su u stanju da se vežu i/ili da neutrališu i/ili indukuju odgovore, npr. citotoksičane odgovore u odnosu na ćelije oboljenja ili stanja ili one koje eksprimiraju antigen koji receptor prepoznaje. U bilo kom od takvih slučajeva, obim ili nivo ekspresije drugog markera koji je povezan sa rekombinantnim receptorom (npr. u ćelijama koje eksprimiraju CAR) može biti upotrebljen za razlikovanje primenjenih ćelija u odnosu na endogene ćelije kod subjekta.

[0250] U pojedinim slučajevima, svođenjem T-ćelijske aktivacije i/ili stimulacije na minimum, obezbeđeni slučajevi mogu rezultovati u genetički izmenjenim T-ćelijama koje su potentnije za upotrebu u adoptivnim imunoterapijskim postupcima, usled, prema pojedinim aspektima, povećane postojanosti. U pojedinim slučajevima, povećana potencija i/ili povećana postojanost obezbeđenih ćelija, kao što su ćelije proizvedene bilo kojim od obezbeđenih postupaka, dozvoljava postupke primene ćelija u nižim dozama. Takvi postupci mogu smanjiti na minimum toksičnost koja može pratiti postupke adiptivne imunoterapije.

Ostali događaji u obradi ćelija

[0251] U pojedinim slučajevima, pored i/ili alternativno u odnosu na korake transdukcije, postupci obrade obezbeđenih postupaka uklјučuju i druge korake i postupke obrade, kao što su izolacija, razdvajanje, selekcija, kultivisanje (npr. stimulacija ćelija, na primer, da bi se indukovala njihova proliferacija i/ili aktivacija), pranje, resuspendovanje, razblaživanje, koncentrovanje i/ili formulisanje ćelija. U pojedinim slučajevima, najmanje deo jednog ili više drugih koraka obrade i/ili najmanje deo mnoštva koraka se izvode u celini ili delom unutar šuplјine centrifugalne komore, kao što su iste ili različite centrifugalne komore od onih koje se upotrebljavaju u postupcima transdukcije. U pojedinim

4

slučajevima, svi ili deo takvog jednog ili više drugih koraka obrade se izvode u zatvorenom sistemu koji sadrži centrifugalnu komoru, kao što je u sterilnom zatvorenom sistemu.

[0252] U pojedinim slučajevima, postupci obuhvataju jedno ili više od (a) pranja biološkog uzorka koji sadrži ćelije (npr. uzorak pune krvi, uzorak koagulata krvi, uzorak mononuklearnih ćelija periferne krvi (PBMC), uzorak nefrakcionisanih T-ćelija, uzorak limfocita, uzorak belih krvnih zrnaca, proizvod afereze ili leukafereze) u šuplјini komore, (b) izolovanje, npr. selekcijom, iz uzorka želјene podpopulacije ili populacije ćelija (npr. CD4+ ili CD8+ T-ćelija) u šuplјini komore, na primer, inkubacijom ćelija sa selekcionim ili imunoafinitetnim reagensom za razdvajanje zasnovano na imunoaffititetu; c) inkubiranje izolovanih, kao što su selektovane ćelije, sa česticama virusnog vektora, kao što je u skladu sa postupcima koji su prethodno opisani, i d) formulisanje transdukovanih ćelija, kao što je u farmaceutski prihvatlјivom puferu, krioprezervativu ili u drugom pogodnom medijumu. U pojedinim slučajevima, postupci mogu dalјe obuhvatati (e) stimulisanje ćelija u šuplјini komore, izlaganjem ćelija stimulišućim uslovima, čime se ćelije indukuju da proliferišu. U pojedinim slučajevima, korak stimulacije ćelija se izvodi pre, tokom i/ili nakon inkubacije ćelija sa česticama virusnog vektora. U pojedinim slučajevima, jedan ili više koraka pranja ili resuspendovanja, kao što je radi razblaživanja, koncentrovanja i/ili izmene pufera ćelija, može takođe biti sproveden pre ili nakon bilo kog od prethodno navedenih koraka.

[0253] Tako, u pojedinim slučajevima, postupcima se izvodi jedan, više ili svi koraci u pripremi ćelija za kliničku upotrebu, npr. u adoptivnoj ćelijskoj terapiji, bez izlaganja ćelija nesterilnim uslovima i bez potrebe za upotrebom sterilne soba ili kabineta. U pojedinim slučajevima takvog procesa, ćelije su izolovane, razdvojene ili selektovane, stimulisane, transdukovane, oprane i formulisane u potpunosti unutar zatvorenog sistema. U pojedinim slučajevima, postupci se izvode na automatizirani način. U pojedinim slučajevima, jedan ili više koraka se izvodi odvojeno od sistema centrifugalne komore.

Uzorci

[0254] U pojedinim slučajevima, koraci obrade obuhvataju izolaciju ćelija ili njihovih kompozicija iz bioloških uzoraka, poput onih koji su dobijeni iz ili izvedeni iz subjekta, kao što je onaj koji boluje od određenog oboljenja ili stanja i kod koga postoji potreba za ćelijskom terapijom ili kome će ćelijska terapija biti primenjena. Prema pojedinim aspektima, subjekat je čovek, kao što je subjekat koji je pacijent kome je potrebna određena terapijska intervencija, poput adoptivne ćelijske terapije, u čiju su svrhu ćelije izolovane, obrađene i/ili konstruisane. Prema tome, u pojedinim slučajevima, ćelije su primarne ćelija, npr. primarne humane ćelije. Uzorci podrazumevaju tkivo, tečnost i druge uzorke uzete direktno iz subjekta, kao i uzorke koji su rezultat jednog ili više koraka obrade, poput razdvajanja, centrifugiranja, genetskog inženjeringa (npr. transdukcije sa virusnim vektorom), pranja i/ili inkubacije. Biološki uzorak može biti uzorak dobijen direktno iz biološkog izvora ili uzorka koji je obrađen. Biološki uzorci uklјučuju, ali nisu ograničeni na, telesne tečnosti, kao što su krv, plazma, serum, cerebrospinalna tečnost, sinovijalna tečnost, urin i znoj, uzorci tkiva i organa, i obuhvataju i obrađene uzorke koji su iz njih dobijeni.

[0255] Prema pojedinim aspektima, uzorak je krv ili uzorak izveden iz krvi, ili je ili je dobijen iz proizvoda afereze ili leukafereze. Uzorci za primer obuhvataju punu krv, mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC), leukocite, uzorke kosne srži, timusa, biopsije tkiva, tumora, leukemije, limfoma, limfnog čvora, limfoidnog tkiva povezanog sa crevima, limfoidnog tkiva povezanog sa sluzokožom, slezine, drugih

4

limfoidnih tkiva, jetre, pluća, želuca, creva, debelog creva, bubrega, pankreasa, dojke, kosti, prostate, grlića materice, testisa, jajnika, krajnika ili drugih organa i/ili ćelijr koje su izvedene iz ovih uzoraka. Uzorci obuzvataju, u kontekstu ćelijske terapije, npr. adoptivne ćelijske terapije, uzorke iz autolognih i alogenih izvora.

[0256] U pojedinim slučajevima, izolacija ćelija ili populacije podrazumeva jedan ili više koraka pripreme i/ili razdvajanja ćelija koji nije zasnovan na afinitetu. U pojedinim primerima, ćelije se peru, centrifugiraju i/ili inkubiraju u prisustvu jednog ili više reagenasa, na primer, da bi se uklonile neželјene komponente, obogatilo prisustvo želјene komponente, lizirale ili uklonile ćelije osetlјive na određene reagense. U pojedinim primerima, ćelije se razdvajaju na osnovu jedne ili više osobina, kao što su gustina, adhezivna svojstva, veličina, osetlјivost i/ili rezistentnost na određene komponente. U pojedinim primerima, ćelije iz cirkulišuće krvi subjekta se dobijaju, na primer, aferezom ili leukaferezom. Uzorci mogu sadržavati limfocite, uklјučujući T-ćelije, monocite, granulocite, B ćelije, druge bele krvne ćelije sa jedrom, crvena krvna zrnca i/ili trombocite.

[0257] U pojedinim slučajevima, obezbeđeni postupci uklјučuju obradu, u celini ili delimično, jednog ili više uzoraka u zatvorenom sistemu, kao što je u centrifugalnoj komori. U pojedinim slučajevima, korak obrade može uklјučivati pranje uzorka, npr. uzorka iz subjekta koji sadrži krvne ćelije, npr. da bi se uklonile frakcije plazme i/ili da bi se zamenila tečnost sa puferom ili medijumom koji je odgovarajuć da naredne korake obrade i/ili za izvođenje postupaka razdvajanja zasnovanih na gustini, kao što je to u pripremi belih krvnih ćelija iz periferne krvi liziranjem crvenih krvnih zrnaca i centrifugiranjem kroz gradijent Percoll-a ili Ficoll-a. Primeri takvih koraka obrade mogu biti izvedeni upotrebom centrifugalne komore u kombinaciji sa jednim ili sa više sistema povezanih sa sistemom za obradu ćelija, poput centrifugalne komore koju proizvodi i prodaje kompanija Biosafe SA, uklјučujući i one za upotrebu sa Sepax® ili Sepax 2® sistemima za obradu ćelija.

Selekcija zasnovana na afinitetu

[0258] Koraci obrade (npr. sprovedeni u centrifugalnoj komori) mogu uklјučivati izolaciju ćelija iz mešovitih populacija i/ili kompozicija, kao što upotrebom jednog od raznih koraka selekcije, uklјučujući postupke razdvajanja zasnovane na gustini ili drugim fizičkim osobinama i selekcije zasnovane na afinitetu. U pojedinim slučajevima, postupci podrazumevaju selekciju u kojoj se celokupna ili deo selekcije izvodi u unutrašnjoj šuplјini centrifugalne komore, na primer, prilikom centrifugalne rotacije. U pojedinim slučajevima, inkubacija ćelija sa selekcionim reagensima, kao što su selekcioni reagensi zasnovani na imunoafinitetu, izvodi se u centrifugalnoj komori. Takvi postupci mogu obezbeđiti određene prednosti u poređenju s drugim dostupnim postupcima selekcije.

[0259] Na primer, selekcija zasnovana na imunoafinitetu može zavisiti od povolјne energetske interakcije između ćelija koje se razdvajaju i molekula koji se specifično vezuje za marker na ćeliji, npr. antitela ili drugog vezujućeg partnera na čvrstoj površini, npr. čestice. U određenim dostupnim postupcima za razdvajanje zasnovano na afinitetu uz upotrebu čestica poput smola, čestice i ćelije se inkubiraju u kontejneru, kao što je epruveta ili kesa, uz treskanje ili mešanje, uz konstantan odnos gustine ćelija i čestica (npr. smole) da bi se potpomogle energetski povoljnije interakcije. Takvi pristupi možda nisu idealni za upotrebu u proizvodnji u velikom obimu, na primer, zato što mogu zahtevati upotrebu velikih količina za održavanje optimalnog ili želјenog odnosa ćelija i čestica, uz zadržavanje željenog broja ćelija. Shodno navedenom, takvi pristupi mogu zahtevati obradu u režimu ili formatu

4

serija, što može zahtevati povećanje vremena, broja koraka i rukovanja, i time povećanje troškova i rizika od greške korisnika.

[0260] U pojedinim slučajevima, sprovođenjem takvih koraka selekcije ili njihovih delova (npr. inkubacije sa česticama prekrivenim antitelima, npr. magnetnih zrna) u šuplјini centrifugalne komore, korisnik može biti u stanju da kontroliše određene parametre, kao što su zapremina raznih rastvora, dodavanje rastvora tokom njegove obrade i izmena vremenskog okvira, što može da obezbediti prednosti u poređenju sa drugim dostupnim postupcima. Na primer, mogućnost da se smanji zapremina tečnosti u šuplјini tokom inkubacije može povećati koncentraciju čestica (npr. reagensa sa smolom) koje se upotrebljavaju u selekciji, a samim time i hemijskog potencijala rastvora, bez uticaja na ukupan broj ćelija u šuplјini. Navedeno zauzvrat može pobolјšati međusobne interakcije između ćelija koje se obrađuju i čestica koje se upotrebljavaju za selekciju. U pojedinim slučajevima, izvođenje koraka inkubacije u komori, npr. kada se isti odvijaju u sistemu sa protokom i kontrolom kao što je ovde opisano, dozvolјava korisniku da ostvari mešanje rastvora u želјeno vreme(vremena) tokom inkubacije, što takođe može pobolјšati interakciju.

[0261] U pojedinim slučajevima, najmanje deo koraka selekcije se izvodi u centrifugalnoj komori, što podrazumeva inkubaciju ćelija sa selekcionim reagensom. Prema pojedinim aspektima takvih procesa, zapremina ćelija se meša sa količinom želјenog selekcionog reagensa za seleciju zasnovanu na afinitetu, koja je daleko manja od zapremine koja se uobičajeno koristi pri izvođenju sličnih selekcija u epruveti ili kontejneru za seleciju istog broja ćelija i/ili zapremine ćelija prema uputstvima proizvođača. U pojedinim slučajevima, količina selekcionog reagensa ili reagenasa nisu veće od 5%, nisu veće od 10%, nisu veće od 15%, nisu veće od 20%, nisu veće od 25%, nisu veće od 50%, nisu veće od 60%, nisu veće od 70% ili nisu veće od 80% u odnosu na količinu istog selekcionog reagensa(reagenasa) koja se upotrebljava za selekciju ćelija koja se vrši u epruveti ili kontejneru i za isti broj ćelija i/ili u istoj zapremini ćelija prema uputstvima proizvođača.

[0262] Inkubacija sa selekcionim reagensom ili reagensima, npr. kada je to deo postupaka selekcije koji se mogu izvoditi u šuplјini komore, podrazumevaju upotrebu jednog ili više selekcionih reagenasa za selekciju jednog ili više različitih tipova ćelija na osnovu ekspresije ili prisustva jednog ili više specifičnih molekula u ili na ćeliji, kao što su površinski markeri, npr. površinski proteini, unutarćelijski markeri ili nukleinska kiselina. U pojedinim slučajevima, može biti upotrebljen bilo koji poznat postupak u kome se upotreblјava selekcioni reagens ili reagensi za razdvajanje zasnovano na ovakvim markerima. U pojedinim slučajevima, selekcioni reagens ili reagensi dovode do razdvajanja koje predstavlja razdvajanje zasnovano na afinitetu ili imunoafinitetu. Na primer, prema pojedinim aspektima, selekcija podrazumeva inkubaciju sa reagensom ili reagensima za razdvajanje ćelija i ćelijskih populacija na osnovu ćelijske ekspresije ili nivoa ekspresije jednog ili više markera, obično markera ćelijske površine, na primer, inkubacijom sa antitelom ili vezujućim partnerom koji se specifično vezuju za takve markere, nakon čega generalno slede koraci pranja i razdvajanja ćelija koje su sa vezanim antitelom ili vezujućim partnerom, od ćelija za koje nije vezano antitelo ili vezujući partner.

[0263] U pojedinim slučajevima, za selekciju, npr. selekciju ćelija zasnovanu na imunoafinitetu, ćelije se inkubiraju u šuplјini komore u kompoziciji koja takođe sadrži selekcioni pufer sa selekcionim reagensom, kao što je molekul koji se specifično vezuje za površinski marker na ćeliji za koga je poželjno da bude obogaćen i/ili uklonjen, ali ne i na drugim ćelijama u kompoziciji, kao što je antitelo, a koje je opciono kuplovano sa mrežom kao što je polimer ili površina, npr. smole, npr. sa magnetnim zrnima,

4

kao što su magentna zrna kuplovana sa monoklonskim antitelima specifičnim za CD4 i CD8. U pojedinim slučajevima, kao što je opisano, selekcioni reagens se dodaje ćelijama u šuplјini komore u količini koja je znatno manja (npr. nije veća od 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70% ili 80% količine) u poređenju sa količinom selekcionog reagensa koja se obično koristi ili koja bi bila neophodna za postizanje približno iste ili slične efikasnosti selekcije istog broja ćelija ili iste zapremina ćelija prilikom izvođenja selekcije u epruveti uz treskanje ili rotiranje. U pojedinim slučajevima, inkubacija se izvodi uz dodavanje selekcionog pufera ćelijama i sa selekcionim reagensom da bi se postigala cilјna zapremina za inkubaciju reagensa od, na primer, 10 ml do 200 ml, kao što je najmanje ili oko najmanje ili oko ili 10 ml, 20 ml, 30 ml, 40 ml, 50 ml, 60 ml, 70 ml, 80 ml, 90 ml, 100 ml, 150 ml ili 200 ml. U pojedinim slučajevima, selekcioni pufer i selekcioni reagens se prethodno, pre dodavanja ćelijama, mešaju. U pojedinim slučajevima, selekcioni pufer i selekcioni reagens se dodaju ćelijama odvojeno. U pojedinim slučajevima, selekciona inkubacija se izvodi uz periodično blago mešanje, što može pomoći u pospešivanju interakcija koje su energetski pogodnije, a na taj način se može dozvoliti i upotreba manje ukupne količine selekcionog reagensa za postizanje visoke efikasnosti selekcije.

[0264] U pojedinim slučajevima, ukupno trajanje inkubacije sa selekcionim reagensom je od ili od oko 5 minuta do 6 sati, kao što je od 30 minuta do 3 sata, na primer, od najmanje ili oko 30 minuta, 60 minuta, 120 minuta ili 180 minuta.

[0265] U pojedinim slučajevima, inkubacija se uglavnom izvodi u uslovima uz mešanje, kao što je u prisustvu centrifugiranja, uglavnom pri relativno niskoj sili ili brzini, kao što je brzina koja je manja od one koja se upotrebljava za taloženje ćelija, poput one od ili od oko 600 o/min do 1700 o/min (npr. od ili oko ili najmanje 600 o/min, 1000 o/min ili 1500 o/min ili 1700 o/min), tako da RCF na uzorku ili zidu komore ili drugom kontejneru iznosi od ili je od oko 80g do 100g (npr. iznosi ili je oko ili je najmanje 80 g, 85 g, 90 g, 95 g ili 100 g). U pojedinim slučajevima, centrifugirnje se izvodi upotrebom ponovlјenih intervala centrifugiranja na tako niskim brzinama nakon čega sledi period odmora, kao što je centrifugiranje i/ili prestanak centrifugiranja tokom 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ili 10 sekundi, poput centrifugiranja od približno 1 ili 2 sekunde, nakon koga sledi mirovanje od približno 5, 6, 7 ili 8 sekundi.

[0266] U pojedinim slučajevima, takav postupak se izvodi u potpuno zatvorenom sistemu čiji je komora integralni deo. U pojedinim slučajevima, ovaj postupak (a prema pojedinim aspektima on obuhvata i jedan ili više dodatnih koraka, kao što je prethodan korak pranja uzorka koji sadrži ćelije, kao što je uzorak afereze) vrši se na automatizovan način, tako da se ćelije, reagensi i druge komponente uvlače ili izbacuju iz komore u odgovarajućim vremenima i ostvaruje se centrifugiranje, da bi se završio korak pranja i vezivanja u jednom zatvorenom sistemu upotrebom automatizovanog programa.

[0267] U pojedinim slučajevima, nakon inkubacije i/ili mešanja ćelija i selekcionog reagensa i/ili reagenasa, inkubirane ćelije se podvrgavaju razdvajanju da bi se selektovale ćelije na osnovu prisustva ili odsustva određenog reagensa ili reagenasa. U pojedinim slučajevima, dalja selekcija se izvodi izvan centrifugalne komore. U pojedinim slučajevima, razdvajanje se vrši u istom zatvorenom sistemu u kome je centrifugalna komora prisutna i u kome se vrši inkubacija ćelija sa selekcionim reagensom. U pojedinim slučajevima, nakon inkubacije sa selekcionim reagensima, inkubirane ćelija, uklјučujući ćelije za koje je selekcioni reagens vezan, ispuštaju se iz centrifugalne komore, kao što je to prebacivanjem iz centrifugalne komore u sistem za razdvajanje ćelija zasnovan na imunoafinitetu. U pojedinim slučajevima, sistem za razdvajanje zasnovan na imunoafinitetu je sa ili sadrži magnetnu separacionu kolonu. U pojedinim slučajevima, pre razdvajanja, u komori može biti izveden jedan ili više koraka obrade, kao što je pranje.

[0268] Takvi koraci razdvajanja mogu biti zasnovani na pozitivnoj selekciji, u kojoj se ćelije koje su vezale reagense, npr. antitelo ili vezujućeg partnera, zadržavaju za dalјu upotrebu i/ili negativnu selekciju, u kojoj se zadržavaju ćelije koje nisu vezale reagens, npr. antitelo ili vezujućeg partnera. U pojedinim primerima obe frakcije se zadržavaju za dalјu upotrebu. Prema pojedinim aspektima, negativna selekcija može biti posebno korisna kada nije dostupno antitelo koje specifično identifikuje tip ćelije u heterogenoj populaciji, a da bi se time najbolje moguće izvršilo razdvajanje na osnovu markera koji su eksprimirani od strane ćelija i koji su drugačije kod željene populacije.

[0269] Rezultat razdvajanja ne mora biti obogaćivanje ili uklanjanje određene ćelijske populacije ili ćelija koje eksprimiraju određeni marker od 100%. Na primer, pozitivna selekcija za obogaćivanje ćelijama određenog tipa, poput onih koje eksprimiraju marker, odnosi se na povećanje broja ili procenta takvih ćelija, ali rezultat ne mora biti potpuno odsustvo ćelija koje ne eksprimiraju marker. Slično navedenom, negativna selekcija, uklanjanje ili deplecija ćelija određene vrste, poput onih koje eksprimiraju marker, odnosi se na smanjenje broja ili procenta takvih ćelija, ali rezultat ne mora biti potpuno uklanjanje svih takvih ćelija.

[0270] U pojedinim primerima, vrši se više ciklusa koraka razdvajanja, pri čemu se pozitivno ili negativno selektovana frakcija iz jednog koraka podvrgava drugom koraku razdvajanja, kao što je naredna pozitivna ili negativna selekcija. U pojedinim primerima, jedan korak razdvajanja može dovesti do deplecije ćelije koje istovremeno eksprimiraju višestruke markere, kao što je inkubiranje ćelija sa mnoštvom antitela ili vezujućih partnera, od kojih je svaki specifičan za marker koji se ciljano upotrebljava za negativnu selekciju. Slično navedenom, mnoštvo tipova ćelija može istovremeno biti pozitivno selektovano, inkubiranjem ćelija sa mnoštvom antitela ili vezujućih partnera koji se eksprimiraju na različitim tipovima ćelija. U bilo kom od takvih primera, najmanje deo dodatne selekcije ili koraka selekcije se izvodi u centrifugalnoj komori, što obuhvata inkubaciju ćelija sa selekcionim reagensom, kao što je prethodno opisano.

[0271] Na primer, prema pojedinim aspektima, specifične subpopulacije T-ćelija, poput ćelija pozitivnih ili koje eksprimiraju visoke nivoe jednog ili više pd površinskih markera, npr. CD28+, CD62L+, CCR7+, CD27+, CD127+, CD4+, CD8+, CD45RA+ i/ili CD45RO+ T-ćelije, izoluju se tehnikama pozitivne ili negativne selekcije. U pojedinim slučajevima, takve ćelije se selektuju inkubacijom sa jednim ili sa više antitela ili vezujućih partnera koji se specifično vezuju za takve markere. U pojedinim slučajevima, antitelo ili vezujući partner može biti konjugovan, kao što je bilo direktno ili indirektno, sa čvrstim nosačem ili matriksom da bi se ostvarila selekcija, poput magnetnih zrna ili paramagnetnih zrna. Na primer, CD3+, CD28+ T-ćelije mogu biti pozitivno selektovane upotrebom magnetnih zrna konjugovanih sa CD3/CD28 (npr. DYNABEADS® M-450 CD3/CD28 T Cell Expander i/ili ExpACT® smola).

[0272] U pojedinim slučajevima, koraci procesa dalјe uklјučuju negativnu i/ili pozitivnu selekciju inkubiranih i ćelija, kao što je upotrebom sistema ili aparata koji mogu izvršiti selekciju zasnovanu na afinitetu. U pojedinim slučajevima, izolacija se sprovodi obogaćivanjem određene ćelijske populacije pozitivnom selekcijom ili deplecijom određene ćelijske populacije negativnom selekcijom. U pojedinim slučajevima, pozitivna ili negativna selekcija se postižu inkubacijom ćelija sa jednim ili sa više antitela ili drugih vezujućih agenasa koji se specifično vezuju za jedan ili za više površinskih markera koji su

1

eksprimirani ili esprimirani sa relativno višim nivoom (označeno kao ) na pozitivno ili negativno selektovane ćelije, tim redom.

[0273] U pojedinim slučajevima, T-ćelije se razdvajaju od uzorka PBMC negativnom selekcijom markera koji se eksprimiraju na ćelijama različitim od T-ćelija, kao što su B-ćelije, monociti ili druge bele krvne ćelije, a kao što je CD14. Prema pojedinim aspektima, korak CD4+ ili CD8+ selekcije se upotrebljava za razdvajanje CD4+ pomoćnih i CD8+ citotoksičnih T-ćelija. Takve CD4+ i CD8+ populacije mogu dalje biti sortirane u subpopulacije, pozitivnom ili negativnom selekcijom na markere koji se eksprimiraju ili se eksprimiraju u relativno višem stepenu na jednoj ili na više naivnih, memorijskih i/ili efektorskih T-ćelijskih subpopulacija.

[0274] U pojedinim slučajevima, CD8+ ćelije su dodatno obogaćene ili depletirane sa naivnim, centralnim memorijskim, efektorskim memorijskim i/ili centralnim memorijskim matičnim ćelijama, na primer, pozitivnom ili negativnom selekcijom zasnovanom na površinskim antigenima koji su povezani sa odgovarajućom subpopulacijom. U pojedinim slučajevima, obogaćivanje centralnih memorijskih T (TCM) ćelija se sprovodi da bi se povećala efikasnost, kao što je da bi se povećali dugoročno preživljavanje, ekspanzija i/ili ugradnja nakon primene, što je prema pojedinim aspektima posebno robusno u takvim subpopulacijama. Pogledati Terakuraet i saradnici (2012) Blood. 1:72-82; Wang i sadradnici (2012) J Immunother.35(9):689-701. U pojedinim slučajevima, kombinovanje CD8+ T-ćelija i CD4+ T-ćelija obogaćenih sa TCM dodatno poboljšava efikasnost.

[0275] Na primer, memorijske T-ćelije su prisutne i u CD62L+ i CD62L- subpopulaciji CD8+ limfocita periferne krvi. PBMC mogu biti obogaćene sa ili biti sa deplecijom CD62L-CD8+ i/ili CD62L+ CD8+ frakcija, kao što je upotrebom anti-CD8 i anti-CD62L antitela.

[0276] U pojedinim slučajevima, obogaćivanje centralnim memorijskim T-ćelijama (TCM) se zasniva na pozitivnoj ili visokoj površinskoj ekspresiji CD45RO, CD62L, CCR7, CD28, CD3 i/ili CD 127; prema pojedinim aspektima, zasniva se na negativnoj selekciji ćelija koje eksprimiraju ili visoko eksprimiraju CD45RA i/ili granzim B. Prema pojedinim aspektima, izolacija CD8+ populacije obogaćene sa TCM ćelijama se izvodi deplecijom ćelija koje eksprimiraju CD4, CD 14, CD45RA i pozitivnom selekcijom ili obogaćivanjem sa ćelijama koje eksprimiraju CD62L. Prema jednom aspektu, obogaćivanje sa centralnim memorijskim T-ćelijama (TCM) vrši se polazeći od negativne frakcije ćelija selektovanih na osnovu ekspresije CD4, koja se dalje podvrgava negativnoj selekciji zasnovanoj na ekspresiji CD14 i CD45RA i pozitivnoj selekciji zasnovanoj na CD62L. Prema pojedinim aspektima, takve selekcije se vrše istovremeno, a prema drugim aspektima, izvode se sekvencijalno, bilo kojim redosledom. Prema pojedinim aspektima, isti selekcioni korak zasnovan na ekspresiji CD4 koji se upotrebljava u pripremi CD8+ ćelijske populacije ili subpopulacije, takođe se koristi za generisanje CD4+ ćelijske populacije ili subpopulacije, tako da se zadržavaju i pozitivne i negativne frakcije iz razdvajanja zasnovanog na CD4 koje se koriste u narednim koracima postupaka, opciono nakon jednog ili više koraka dodatne pozitivne ili negativne selekcije.

[0277] U posebnom primeru, uzorak PBMC ili uzorak drugih belih krvnih ćelija se podvrgava selekciji CD4+ ćelija, pri čemu se zadržavaju i negativne i pozitivne frakcije. Negativna frakcija se zatim podvrgava negativnoj selekciji zasnovanoj na ekspresiji CD14 i CD45RA ili CD19, kao i pozitivnoj selekciji zasnovanoj na markeru koji je karakterističan za centralne memorijske T-ćelije, kao što je CD62L ili CCR7, pri čemu se pozitivna i negativna selekcija izvode po bilo kom redosledu.

2

[0278] Pomoćne CD4+ T-ćelije mogu biti sortirane u naivne, centralne memorijske i efektorske ćelije, identifikovanjem ćelijskih populacija sa specifičnim antigenima na površini ćelija. CD4+ limfociti mogu biti dobijeni standardnim postupcima. U pojedinim slučajevima, naivni CD4+ T limfociti su CD45RO-, CD45RA+, CD62L+ ili CD4+ T-ćelije. U pojedinim slučajevima, centralne memorijske CD4+ ćelije su CD62L+ i CD45RO+. U pojedinim slučajevima, efektorske CD4+ ćelije su CD62L- i CD45RO-.

[0279] U jednom primeru, da bi se negativnom selekcijom obogatilo prisustvo CD4+ ćelija, upotrebljava se koktel monoklonskih antitela koji obično sadrži antitela za CD14, CD20, CD11b, CD16, HLA-DR i CD8. U pojedinim slučajevima, antitelo ili vezujući partner su vezani za čvrst nosač ili matriks, poput magnetnog zrna ili paramagnetnog zrna, da bi se omogućilo razdvajanje ćelija u svrhu pozitivne i/ili negativne selekcije. Na primer, u pojedinim slučajevima, ćelije i ćelijske populacije se razdvajaju upotrebom imunomagnetnih (ili afinitetno-magnetnih) tehnika razdvajanja (revijski pregled je dat u Methods in Molecular Medicine, vol.58: Metastasis Research Protocols, Vol.2: Cell Behavior In Vitro and In Vivo, str.17-25, urednici: S. A. Brooks i U. Schumacher© Humana Press Inc., Totowa, NJ).

[0280] Prema pojedinim aspektima, inkubirani uzorak ili kompozicija ćelija koji se razvajaju, inkubiraju se sa selekcionim reagensom koji sadrži male, magnetibilne ili magnetno reaktivne materijale, kao što su magnetno reaktivne čestice ili mikročestice, poput paramagnetnih zrnaca (npr. kao što su Dynalbeads ili MACS® zrna). Magnetno reaktivni materijal, npr. čestica, generalno je direktno ili indirektno vezana za vezujućeg partnera, npr. antitelo, koje se specifično vezuje za molekul, npr. površinski marker, koji je prisutan na ćeliji, ćelijama ili na populaciji ćelija za koje je poželjno da budu izdvojene, npr. za koje je poželјno da budu negativno ili pozitivno selektovane.

[0281] U pojedinim slučajevima, magnetna čestica ili zrnce sadrže magnetno reakktivni materijal vezan za specifičan vezivni element, poput antitela ili drugog vezujućeg partnera. Poznati su mnogi dobro poznati magnetno reaktivni materijali za upotrebu u postupcima magnetnog razdvajanja, npr. oni koji su opisani u Molday, U.S. Pat. No.4,452,773 i u Evropskoj patentnoj specifikaciji EP 452342 B. Čestice koloidne veličine, poput onih koje su opisane u U.S. Pat. No.4,795,698 čiji je autor Owen i U.S. Pat. No.

5,200,084 Liberti-a i saradnika, takođe mogu biti upotrebljene.

[0282] Inkubacija se u principu izvodi pod uslovima u kojima se antitela ili vezujući partneri ili molekuli, kao što su sekundarna antitela ili drugi reagensi koji se specifično vezuju za takva antitela ili vezujuće partnere, a koji su vezani za magnetnu česticu ili zrno, specifično vezuju za ćelijske površinske molekule ukoliko su oni prisutni na ćelijama unutar uzorka.

[0283] U određenim slučajevima, magnetno reaktivne čestice su prevučene primarnim antitelima ili drugim vezujućim partnerima, sekundarnim antitelima, lektinima, enzimima ili streptavidinom. U određenim slučajevima, magnetne čestice su vezane za ćelije preko obloge koju čine primarna antitela specifična za jedan ili više markera. U određenim slučajevima, ćelija, pre nego zrna, obeležavaju se primarnim antitelom ili vezujućim partnerom, a zatim se dodaju magnetne čestice obložene specifičnim sekundarnim antitelima ili drugim vezujućim parnterima (npr. sa streptavidinom) koji su specifični za tip ćelija. U pojedinim slučajevima, magnetne čestice obložene streptavidinom se upotrebljavaju zajedno sa biotiniziranim primarnim ili sekundarnim antitelima.

[0284] Prema pojedinim aspektima, razdvajanje se postiže postupkom u kome se uzorak postavlja u magnetno polјe, tako da one ćelije koje su magnetno reaktivne, ili za koje su vezane čestice koje mogu biti namagnetisane, bivaju privučene magnetom i tako razdvojene od neobeleženih ćelija. Zarad pozitivne selekcija, zadržavaju se ćelije koje su privučene magnetom; u cilju negativne selekcije, zadržavaju se ćelije koje nisu privučene (neobeležene ćelije). Prema pojedinim aspektima, kombinacija pozitivne i negativne selekcije se izvodi tokom istog koraka selekcije, pri čemu se pozitivne i negativne frakcije zadržavaju i dalјe obrađuju ili podvrgavaju dodatnim koracima razdvajanja.

[0285] U pojedinim slučajevima, selekcija na osnovu afiniteta se vrši putem ćelijskog sortiranja aktiviranog magnetnim poljem (MACS) (Miltenyi Biotech, Auburn, CA). Ćelijsko sortiranje aktivirano magnetnim poljem (MACS), na primer, CliniMACS sistemi su u stanju da selektuju ćelije sa vezanim magnetizovanim čestima sa velikom čistoćom. U određenim slučajevima, MACS deluje u režimu u kome se ciljne ili vrste koje nisu ciljne sekvencijalno eluiraju nakon primene spolјašnjeg magnetnog polјa. Naime, ćelije koje su vezane za magnetizovane čestice se drže u mestu, dok se nevezane vrste eluiraju. Zatim, po završetku ovog prvog koraka elucije, vrste koje su bile zaroblјene u magnetnom polјu i time sprečene da budu eluirane, oslobađaju se na neki način tako da se mogu eluirati i izdvojiti. U određenim slučajevima, ćelije koje nisu ciljne se obeležavaju i uklanjaju iz heterogene populacije ćelija.

[0286] U pojedinim slučajevima, koraci obrade obuhvataju isticanje ćelija koje su inkubirane sa jednim ili sa više selekcionih reagenasa, iz centrifugalne komore. U pojedinim slučajevima, ćelije mogu isticati nakon i/ili uporedo sa jednim ili sa više koraka pranja, što se prema pojedinim aspektima može izvesti u centrifugalnoj komori.

[0287] U pojedinim slučajevima, magnetno reaktivne čestice se ostavlјaju pričvršćene za ćelije koje će naknadno biti inkubirane, kultivisane i/ili genetički izmenjene; prema pojedinim aspektima, čestice se ostavlјaju pričvršćene za ćelije radi primene pacijentu. U pojedinim slučajevima, magnetizovane ili magnetno reaktivne čestice se uklanjaju iz ćelija. Postupci za uklanjanje magnetizovanih čestica sa ćelija su poznati i uklјučuju, na primer, upotrebu kompetitivnih neobeleženih antitela, magnetizovanih čestica ili antitela konjugovanih sa linkerima koji se mogu cepati itd. U pojedinim slučajevima, čestice koje se mogu namagnetisati su biorazgradive.

Zamrzavanje i krioprezervacija

[0288] U pojedinim slučajevima, ćelije, kao što su selektovane ćelije, resuspenduju se u rastvoru za zamrzavanje, npr. nakon koraka pranja radi uklanjanja plazme i trombocita. Prema pojedinim aspektima, može biti upotrebljen bilo koji od raznih poznatih rastvora za zamrzavanje i parametara. Jedan primer obuhvata upotrebu PBS-a koji sadrži 20% DMSO-a i 8% humanog serumskog albumina (HSA) ili nekog drugog pogodnog medijuma za zamrzavanje ćelija. Navedene ćelije se naime razblažuje sa medijumom u odnosu od 1:1, tako da finalna koncentracija DMSO i HSA bude 10%, odnosno 4%, tim redom.

[0289] U pojedinim slučajevima, ćelije, kao što su selektovane ćelije, mogu biti prenete u medijum za krioprezervaciju, upotrebom centrifugalne komore koja je u vezi sa jednim ili sa više sistema koji su udruženi sa sistemom za obradu ćelija, kao što je centrifugalna komora koju proizvodi i prodaje kompanija Biosafe SA, uklјučujući one za upotrebu sa Sepax® ili Sepax 2® sistemima za obradu ćelija. U pojedinim slučajevima, prenos u medijum za krioprezervaciju je udružen sa jednim ili sa više koraka obrade koji mogu uklјučivati pranje uzorka, npr. uzorka selektovanih ćelija, kao što je da bi se uklonio selekcioni medijum i/ili isti zamenio sa odgovarajućim puferom ili medijumom za krioprezervaciju u svrhu kasnijeg zamrzavanja.

4

[0290] U pojedinim slučajevima, ćelije su zamrznute, npr. krioprezervisane, bilo pre, za vreme ili nakon navedenih postupaka za obradu. U pojedinim slučajevima, korak zamrzavanja i naknadnog odmrzavanja uklanja granulocite i, do neke mere, monocite u ćelijskoj populaciji. Ćelije se obično zatim zamrzavaju na -80 °C stopom od 1° po minutu i čuvaju se u fazi pare rezervoara za tečni azot.

Kultivisanje i stimulacija

[0291] U pojedinim slučajevima, koraci obrade (npr. oni izvedeni u komori i/ili zatvorenom sistemu) uklјučuju kultivisanje, stimulaciju i/ili aktivaciju ćelija, kao što je inkubacija i/ili kultura ćelija. Na primer, u pojedinim slučajevima, obezbeđeni su postupci za stimulaciju izolovanih ćelija, kao što su populacije selektovanih ćelija. U pojedinim slučajevima, koraci obrade uklјučuju inkubaciju kompozicije koja sadrži ćelije, poput selektovanih ćelija, gde se najmanje deo inkubacije odvija u centrifugalnoj komori i/ili drugoj posudi, npr. pod stimulišućim uslovima. Inkubacija može biti sprovedena pre ili uporedo sa genetičkim inženjeringom, kao što je genetički inženjering koji je rezultat slučaja sa postupkom transdukcije koji je prethodno opisan. U pojedinim slučajevima, rezultat stimulacije je aktivacija i/ili proliferacija ćelija, na primer, pre transdukcije.

[0292] U pojedinim slučajevima, koraci obrade obuhvataju inkubaciju ćelija, poput selektovanih ćelija, u kojima koraci inkubacije mogu uključivati kulturu, kultivisanje, stimulaciju, aktivaciju i/ili umnožavanje ćelija. U pojedinim slučajevima, kompozicije ili ćelije se inkubiraju u prisustvu stimulišućih uslova ili stimulišućeg agensa. Takvi uslovi podrazumevaju one koji su osmišljeni tako da indukuju proliferaciju, ekspanziju, aktivaciju i/ili preživlјavanje ćelija u populaciji, da oponašaju izloženost antigenu i/ili da prajmuju ćelije za genetički inženjering, kao što je to za uvođenje rekombinantnog antigenog receptora.

[0293] U pojedinim slučajevima, uslovi za stimulaciju i/ili aktivaciju mogu uključivati jedno ili više od određenih medijuma, temperatura, sadržaja kiseonika, sadržaja uglјen-dioksida, vremena, agenasa, npr. hranlјivih materija, aminokiselina, antibiotika, jona i/ili stimulatornih faktora, kao što su citokini, hemokini, antigeni, vezujući partneri, fuzioni proteini, rekombinantni solubilni receptori i bilo koji drugi agensi koji su dizajnirani tako da aktiviraju ćelije.

[0294] U pojedinim slučajevima, stimulišući uslovi ili agensi obuhvataju jedan ili više agensa, npr. ligand, koji je u stanju da aktivira unutarćelijski signalni domen TCR kompleksa. Prema pojedinim aspektima, agens uklјučuje ili pokreće TCR/CD3 unutarćelijsku signalnu kaskadu u T-ćeliji, kao što su to agensi pogodni za isporuku primarnog signala, npr. za pokretanje aktivacije signala indukovanog sa ITAM, kao što su oni specifični za TCR komponentu i/ili agens koji pospešuje kostimulatorni signal, kao što je onaj specifičan za T-ćelijski kostimulatorni receptor, npr. anti-CD3, anti-CD28 ili anti-41-BB, na primer, koji je vezan za čvrstu podlogu poput smole, i/ili jedan ili više citokina. Među stimulišućim agensima su anti-CD3/anti-CD28 smole (npr. DYNABEADS® M-450 CD3/CD28 T Cell Expander i/ili ExpACT® smole). Opciono, postupak ekspanzije može dalјe obuhvatati korak dodavanja anti-CD3 i/ili anti CD28 antitela u medijum kulture. U pojedinim slučajevima, stimulišući agensi uklјučuju IL-2 i/ili IL-15, na primer, koncentraciju IL-2 od najmanje oko 10 jedinica/ml. U pojedinim slučajevima, inkubacija se vrši u skladu sa tehnikama kao što su one opisane u US Patent No. 6,040,1 77 autora Riddell i saradnika, kao i u publikacijama Klebanoff i saradnici (2012) J Immunother.35(9):651-660, Terakuraet i saradnici (2012) Blood.1:72-82 i/ili Wang i saradnici (2012) J Immunother.35(9):689-701.

[0295] U pojedinim slučajevima, T-ćelije se umnožavaju dodavanjem ćelija hranilica u kompoziciju, kao što su mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC) koje se ne dele (npr. tako da rezultirajuća populacija ćelija sadrži najmanje oko 5, 10, 20 ili 40 ili više PBMC ćelija hranilica za svaki T-limfocit u početnoj populaciji koja se umnožava); i inkubiranje kulture (npr. tokom vremena koje je dovoljno za umnožavanje broja T-ćelija). Prema pojedinim aspektima, ćelije hranilice koje se ne dele mogu sadržavati PBMC ćelije hranilice koje su izlagane gama-zračenju. U pojedinim slučajevima, PBMC se zrače gama zracima opsega od oko 3000 do 3600 rad da bi se sprečila ćelijska deoba. Prema pojedinim aspektima, ćelije hranilice se dodaju u medijum kulture pre dodavanja populacija T-ćelija.

[0296] U pojedinim slučajevima, stimulišući uslovi generalno podrazumevaju temperaturu pogodnu za rast humanih T limfocita, na primer, od najmanje oko 25 stepeni Celzijusa, uglavnom od najmanje oko 30 stepeni i uglavnom od ili oko 37 stepeni Celzijusa. Opciono, inkubacija može dalјe podrazumevati dodavanje limfoblastoidnih ćelija transformisanih sa EBV (LCL) koje se ne delje, kao ćelija hranilica. LCL mogu biti zračene gama zracima opsega od oko 6000 do 10000 rad. LCL ćelije hranilice su, prema pojedinim aspektima, obezbeđene u bilo kojoj pogodnoj količini, kao što je odnos LCL ćelija hranilica i početnih T limfocita od najmanje oko 10:1.

[0297] Na primer, T-ćelije specifične za antigen, poput antigen-specifičnih CD4+ i/ili CD8+ T-ćelija, dobijaju se stimulisanjem naivnih ili T limfocita specifičnih za antigen, sa antigenom. Na primer, linije ili klonovi T-ćelija specifičnih za antigen mogu biti generisani na antigene citomegalovirusa, izolovanjem T-ćelija iz inficiranih subjekata i stimulisanjem ćelija in vitro sa istim antigenom.

[0298] U pojedinim slučajevima, najmanje deo inkubacije sa jednim ili sa više stimulišućih uslova ili stimulišućih agenasa, kao što su oni koji su opisani prethodno, izvodi se u centrifugalnoj komori. U pojedinim slučajevima, najmanje deo inkubacije koji je izveden u centrifugalnoj komori uklјučuje mešanje sa reagensom ili reagensima da se indukovala stimulacija i/ili aktivacija. U pojedinim slučajevima, ćelije, poput selektovanih ćelija, mešaju se u stimulišućim uslovima ili sa stimulišućim agensom u centrifugalnoj komori. Prema pojedinim aspektima takvih procesa, zapremina ćelija koja se meša sa količinom jednog ili više stimulišućih uslova ili agenasa je daleko manja nego što se to obično koristi kada se sprovode slične stimulacije na ploči sa kulturom ćelija ili u drugom sistemu.

[0299] U pojedinim slučajevima, stimulišući agens se dodaje ćelijama u šuplјini komore, u količini koja je znatno manja (npr. nije veća od 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60 %, 70% ili 80% količine) u poređenju sa količinom stimulišućeg agensa koja se obično koristi ili bi bila neophodna da bi se postigla približno ista ili slična efikasnost selekcije istog broja ćelija ili iste zapremine ćelija prilikom izvođenja selekcije bez mešanja u centrifugalnoj komori, npr. u cevi ili kesi uz periodično tresenje ili rotiranje. U pojedinim slučajevima, inkubacija se izvodi uz dodatak pufera za inkubiranje i stimulišućeg agensa ćelijama, da bi se postigla ciljana zapremina za inkubaciju sa reagensom od, na primer, 10 ml do 200 ml, kao što je najmanje ili približno najmanje ili oko ili 10 ml, 20 ml, 30 ml, 40 ml, 50 ml, 60 ml, 70 ml, 80 ml, 90 ml, 100 ml, 150 ml ili 200 ml. U pojedinim slučajevima, pufer za inkubaciju i stimulišući agens se pre dodavanja ćelijama prethodno mešaju. U pojedinim slučajevima, pufer za inkubaciju i stimulišući agens se odvojeno dodaju u ćelije. U pojedinim slučajevima, stimulišuća inkubacija se izvodi u uslovima sa periodičnim blagim mešanjem, što može pomoći u pospešivanju energetski pogodnih interacija i time dozvoliti upotrebu manje ukupne količine stimulišućeg agensa uz postizanje stimulacije i aktivacije ćelija.

[0300] U pojedinim slučajevima, ukupno trajanje inkubacije sa stimulišućim agensom je od ili od oko 1 sata i 72 sata, 1 sata i 48 sati, 4 sata i 36 sati, 8 sati i 30 sati ili 12 sati i 24 sata, najmanje tokom ili najmanje oko 6 sati, 12 sati, 18 sati, 24 sata, 36 sati ili 72 sata. U pojedinim slučajevima, ukupno trajanje inkubacije u centrifugalnoj komori je od ili od oko 5 minuta do 6 sati, kao što je od 30 minuta do 3 sata, na primer, najmanje ili najmanje oko 30 minuta, 60 minuta, 120 minuta ili 180 minuta. U pojedinim slučajevima, dodatni deo inkubacije može biti izveden izvan centrifugalne komore.

[0301] U pojedinim slučajevima, inkubacija se uglavnom izvodi u uslovima uz mešanje, kao što je to u prisusvu centrifugiranja, uglavnom pri relativno niskoj sili ili brzini, kao što je brzina manja od one koja se koristi za taloženje ćelija, kao što je brzina od ili od oko 600 o/min do 1700 o/min (npr. od ili oko ili najmanje 600 o/min, 1000 o/min ili 1500 o/min ili 1700 o/min), tako da RCF na uzorku ili zidu komore ili drugom kontejneru iznosi od ili od oko 80 g do 100 g (npr. iznosi ili je oko ili najmanje 80 g, 85 g, 90 g, 95 g ili 100 g). U pojedinim slučajevima, centrifugiranje se izvodi upotrebom ponavljanja intervala centrifugiranja pri tako maloj brzini, nakon čega sledi period odmora, kao što je centrifugiranje i/ili odmor od 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ili 10 sekundi, odnosno centrifugiranje od približno 1 ili 2 sekunde, nakon čega sledi mirovanje od približno 5, 6, 7 ili 8 sekundi.

[0302] U pojedinim slučajevima, ćelije se inkubiraju u centrifugalnoj komori sa agensom za stimulisanje ćelija ili sa agensima koji predstavljaju agens vezivanja ćelija, kao što je agens za vezivanj antigena, poput antitela, koji je u stanju da indukuje unutarćelijsku signalizaciju i/ili ćelijsku proliferaciju. U pojedinim slučajevima, ćelije se u centrifugalnoj komori inkubiraju sa, uklјučujući da se mešaju sa, anti-CD3/anti-CD28 smolama, u skladu sa aspektima procesa u obezbeđenim postupcima.

[0303] U pojedinim slučajevima, koraci obrade uklјučuju isticanje inkubiranih ćelija iz centrifugalne komore, tako da se mešaju sa jednim ili sa više stimulišućih uslova ili stimulišućih agenasa. U pojedinim slučajevima, jedan ili više drugih dodatnih koraka obrade može biti izvedeno u komori, kao što je pranje, koje može biti izvedeno pre, nakon i/ili uporedo sa stimulišućom inkubacijom. U pojedinim slučajevima, pranje se vrši pre stimulacije, kao što je na selektovanim ili odmrznutim ćelijama, radi uklanjanja i zamene medijuma sa medijumom koji je pogodan za stimulaciju i kultivisanje ćelija.

[0304] U pojedinim slučajevima, nakon isticanja iz centrifugalne komore, ćelije koje su bile inkubirane, kao što je uz mešanje sa jednim ili više od stimulišućih uslova ili stimulišućih agenasa, dalјe se inkubiraju van komore. U pojedinim slučajevima, dalјa inkubacija se ostvaruje na temperaturama višim od sobne temperature, kao što je one veće od ili veće od oko 25 °C, kao što je uglavnom tempreatura veća od ili veća od oko 32 °C, 35 °C ili 37 °C. U pojedinim slučajevima, dalјa inkubacija se vrši na temperaturi od ili oko 37 °C ± 2 °C, kao što je na temperaturi od ili oko 37 °C. U pojedinim slučajevima, dalјa inkubacija se izvodi tokom vremena između ili između oko 12 sati do 96 sati, kao što je najmanje ili najmanje oko 12 sati, 24 sata, 36 sati, 48 sati, 72 sata ili 96 sati.

[0305] U pojedinim slučajevima, dalјa inkubacija se odvija u zatvorenom sistemu. U pojedinim slučajevima, nakon isticanja iz centrifugalne komore, ćelije koje su bile inkubirane, kao što je sa mešanjem sa jednim ili više od stimulišućih uslova ili stimulišućih agenasa, a koje su sadržane u kontejneru (npr. kesi), inkubiraju se dalje tokom dodatnog vremenskog perioda. U pojedinim slučajevima, kontejner, kao što je kesa, inkubira se na temperaturi od ili oko 37 °C ± 2 °C tokom vremena između ili između oko 1 sata do 48 sati, 4 sata i 36 sati, 8 sati i 30 sati ili 12 i 24 sata, uključujući i navedene vrednosti.

Formulisanje

[0306] U pojedinim slučajevima, koraci procesa (npr. izvedeni u centrifugalnoj komori i/ili zatvorenom sistemu) mogu uklјučivati formulisanje ćelija, kao što je formulisanje ćelija izmenjenih genetičkim inženjeringom koje su rezultat obezbeđenih koraka obrade transdukcijom i/ili jednog ili više drugih koraka obrade koji su opisani. U pojedinim slučajevima, obezbeđeni postupci povezani sa formulisanjem ćelija obuhvatajuu obradu transdukovanih ćelija, kao što je obrada ćelija koje su transdukovane i/ili umnožene upotrebom koraka obrade koji su prethodno opisani, u zatvorenom sistemu, poput onih koji se odvijaju ili su povezani sa centrifugalnom komorom.

[0307] U pojedinim slučajevima, ćelije se formulišu u farmaceutski prihvatlјivom puferu, koji može, prema pojedinim aspektima, sadržavati farmaceutski prihvatlјiv nosač ili ekscipijens. U pojedinim slučajevima, obrada obuhvata zamenu medijuma u medijum ili pufer za formulisanje koji je farmaceutski prihvatlјiv ili poželјan za primenu subjektu. U pojedinim slučajevima, koraci obrade mogu uklјučivati pranje transdukovanih i/ili umnoženih ćelija radi zamene medijuma ćelija sa farmaceutski prihvatlјivim puferom koji može sadržavati jedan ili više opcionih farmaceutski prihvatlјivih nosača ili ekscipijenasa. Primeri takvih farmaceutskih oblika, uklјučujući farmaceutski prihvatlјive nosače ili ekscipijense, mogu biti bilo koji od onih koji su opisani u nastavku teksta u vezi sa oblicima koji su prihvatljivi za primenu ćelija i kompozicija subjektu. Farmaceutska kompozicija, u pojedinim slučajevima, sadrži ćelije u količinama koje su efektivne za lečenje ili prevenciju oboljenja ili stanja, kao što je terapijski efektivna ili profilaktički efektivna količina.

[0308] U pojedinim slučajevima, pufer za formulisanje sadrži krioprezervans. U pojedinim slučajevima, ćelija je formulisana sa rastvorom za krioprezervaciju koji predstavlja rastvor sa od 1,0% do 30% DMSO-a, kao što je rastvor sa od 5% do 20% DMSO-a ili rastvor sa 5% do 10% DMSO-a. U pojedinim slučajevima, rastvor za krioprezervaciju predstavlja ili sadrži, na primer, PBS koji sadrži 20% DMSO i 8% humanog serumskog albumina (HSA) ili koji predstavlja drugi pogodan medijum za zamrzavanje ćelija. U pojedinim slučajevima, rastvor za krioprezervaciju podrazumeva ili sadrži, na primer, najmanje ili oko 7,5% DMSO-a. U pojedinim slučajevima, koraci obrade mogu uklјučivati pranje transdukovanih i/ili propagiranih ćelija da bi se medijum ćelija zamenio sa rastvorom za krioprezervaciju.

[0309] U pojedinim slučajevima, obrada može obuhvatati razblaživanje ili koncetrovanje ćelija do želјene koncentracije ili broja, kao što je jedinični dozni oblik kompozicije koji sadrži broj ćelija za primenu u datoj njegovoj dozi ili frakciji. U pojedinim slučajevima, koraci obrade mogu uklјučivati smanjenje zapremine da bi se povećala koncentracija ćelija kao što je to poželjno. U pojedinim slučajevima, koraci obrade mogu podrazumevati dodatak zapremine i time smanjenje koncentracije ćelija do poželjne.

[0310] U pojedinim slučajevima, obrada obuhvata dodavanje zapremine pufera za formulisanje transdukovanim i/ili umnoženim ćelijama. U pojedinim slučajevima, zapremina pufera za formulisanje je od ili od oko 10 ml do 1000 ml, kao što je najmanje ili približno najmanje ili oko ili 50 ml, 100 ml, 200 ml, 300 ml, 400 ml, 500 ml, 600 ml, 700 ml, 800 ml, 900 ml ili 1000 ml.

[0311] Primer takvih koraka obrade može biti izveden upotrebom centrifugalne komore u kombinaciji sa jednim ili više sistema ili kompleta koji su povezani sa sistemima za obradu ćelija, kao što su centrifugalne komore koju proizvodi i prodaje kompanija Biosafe SA, uklјučujući one za upotrebu sa Sepax® ili Sepax 2® sistemima za obradu ćelija.

[0312] U pojedinim slučajevima, postupak uklјučuje ostvarivanje isticanja iz unutrašnje šuplјine centrifugalne komore za formulisanu kompoziciju, koja je rezultujuća kompozicija ćelija formulisanih u puferu za formulisanje, kao što je farmaceutski prihvatlјiv pufer, u bilo kom od prethodno navedenih slučajeva, kao što je opisano. U pojedinim slučajevima, isticanje formulisane kompozicije je u kontejner, kao što je kesa, koja je operativno povezana, odnosno predstavlja deo zatvorenog sistema sa centrifugalnom komorom. U pojedinim slučajevima, kontejner, kao što je kesa, povezan je sa sistemom na izlaznoj liniji ili izlaznoj poziciji, kao što je prikazano u primerima sistema prikazanim na Sl.5 ili Sl.7.

[0313] U pojedinim slučajevima, zatvoreni sistem, kao što je onaj koji je udružen sa sistemom za obradu ćelija, poput centrifugalne komore, uklјučuje komplet sa više priključaka za isticanje i koji sadrži višenamenski razdelnik povezan sa svakim krajem sistema cevi putem priključka sa kojim je dalje povezan jedan ili mnoštvo kontejnera za isticanje formulisane kompozicije. Prema pojedinim aspektima, želјeni broj ili mnoštvo izlaznih kontejnera, npr. kesa, može biti sterilno povezano sa jednim ili sa više, uglavnom sa dva ili više, kao što je sa najmanje 3, 4, 5, 6, 7, 8 ili više priključaka za odvod sa više priključaka. Na primer, u pojedinim slučajevima, jedan ili više kontejnera, npr. kesa, može biti pričvršćeno sa priključcima ili sa manje od svih priključaka. Tako, u pojedinim slučajevima, sistem može ostvariti isticanje izlazne kompozicije u mnoštvo izlaznih kesa.

[0314] Prema pojedinim aspektima, ćelije se mogu odvoditi u jednu ili u više od mnoštva izlaznih kesa u količini koja je pogodna za doznu primenu, kao što je za jednokratnu doznu jednicu primene ili višestruku doznu primenu. Na primer, u pojedinim slučajevima, svaka od izlaznih kesa može sadržavati broj ćelija dovoljan za primenu u datoj dozi ili njenoj frakciji. Tako svaka kesa, prema pojedinim aspektima, može sadržavati jednu jediničnu dozu za primenu ili može sadržavati frakciju želјene doze tako da više od jedne iz mnošva izlaznih kesa, kao što je dve izlazne kese ili 3 izlazne kese, zajedno predstavlјaju dozu za primenu.

[0315] Stoga, kontejneri, npr. kese, uglavnom sadrže ćelije koje će se primeniti, npr. jednu ili više njihovih jedničnih doza. Jedinična doza može biti količina ili broj ćelija koji se primenjuje subjektu ili dvostruko veći broj (ili više) od ćelija koje je potrebno primeniti. To može biti najniža doza ili najniža moguća doza ćelija koja bi se primenila subjektu.

[0316] U pojedinim slučajevima, svaki od kontejnera, npr. kesa, pojedinačno sadrži jediničnu dozu ćelija. Tako, u pojedinim slučajevima, svaki od kontejnera sadrži isti ili približno ili suštinski isti broj ćelija. U pojedinim slučajevima, jedinična doza uklјučuje manje od oko 1 x 10<8>, manje od oko 5 x 10<7>, manje od oko 1 x 10<6>ili manje od oko 5 x 10<5>ćelija, po kg subjekta koji se tretira i/ili iz koga su ćelije izvedene. U pojedinim slučajevima, svaka jedinična doza sadrži najmanje ili približno najmanje 1 x 10<6>, 2 x 10<6>, 5 x 10<6>, 1 x 10<7>, 5 x 10<7>ili 1 x 10<8>genetički izmenjenih ćelija, ukupnih ćelija, T-ćelija ili PBMC. U pojedinim slučajevima, zapremina formulisane ćelijske kompozicije u svakoj kesi iznosi od 10 ml do 100 ml, kao što je najmanje ili oko 20 ml, 30 ml, 40 ml, 50 ml, 60 ml, 70 ml, 80 ml, 90 ml ili 100 ml.

[0317] U pojedinim slučajevima, jedna ili više od mnoštva izlaznih kesa može biti upotrebljena za testiranje, kao što je procena efikasnosti transdukcije. Na primer, efikasnost transdukcije prema pojedinim aspektima može biti procenjena merenjem nivoa ekspresije rekombinantnog proteina, poput heterolognog proteina, kodiranog nukleinskom kiselinom koja se nalazi u genomu čestice virusnog vektora, nakon transdukcije upotrebom obezbeđenih postupaka. Tako, u pojedinim slučajevima, nivo ekspresije rekombinantnih molekula može biti procenjen bilo kojim od brojnih dobro poznatih postupaka, kao što je detekcija postupcima zasnovanim na afinitetu, npr. postupcima zasnovanim na imunoafinitetu, npr. u kontekstu proteina sa površine ćelija, na primer, protočnom citometrijom. Prema pojedinim aspektima, ćelije sadržane u jednom ili u više različitih kontejnera, npr. kesa, testiraju se na nivo ekspresije rekombinantnih molekula detekcijom transdukcionog markera i/ili reporterskog konstrukta. U drugim slučajevima, ekspresija se procenjuje upotrebom nukleinske kiseline koja kodira skraćeni protein sa površine ćelije koji je uključen unutar vektora kao marker.

[0318] U pojedinim slučajevima, svi ili suštinski svi od mnoštva kontejnera u koje su ćelije istočene, sadrži isti broj ćelija i u istoj ili suštinski istoj koncentraciji. U pojedinim slučajevima, pre isticanja ćelija u jedan od više kontejnera, sistem cevi se prethodno priprema (prajmuje).

IV. Ćelije i kompozicije

[0319] Među ćelijama koje će biti upotrebljene u postupcima, kao što su koraci obrade, npr. u prenosu virusnih nukleinskih kiselina, npr. transdukciji, podrazumevaju se ćelije, ćelijske populacije i kompozicije.

[0320] Ćelije su obično sisarske ćelije, a uglavnom su humane ćelije. U pojedinim slučajevima, ćelije su dobijene iz krvi, kosne srži, limfe ili limfoidnih organa. Prema pojedinim aspektima, ćelije su ćelije imunog sistema, kao što su ćelije urođenog ili adaptivnog imuniteta, npr. mijeloidne ili limfoidne ćelije, uklјučujući limfocite, obično T-ćelije i/ili NK ćelije. Ostale ćelije za primer obuhvataju matične ćelije, poput multipotentnih i pluripotentnih matičnih ćelija, uklјučujući indukovane pluripotentne matične ćelije (iPSC). Ćelije su obično primarne ćelija, kao što su one koje su izolovane direktno iz subjekta i/ili su izolovane iz subjekta i zamrznute. U pojedinim slučajevima, ćelije obuhvataju jednu ili više od subpopulacija T-ćelija ili drugih vrsta ćelija, kao što su ukupne T-ćelijske populacije, CD4+ ćelije, CD8+ ćelije i njihove subpopulacije, kao što su one sa definisanom funkcijom, stanjem aktivacije, maturacijom, potencijalom za diferencijaciju, propagaciju, recirkulaciju, lokalizaciju i/ili sa kapacitetima postojanosti, specifičnošću za antigen, vrstom antigenog receptora, prisustvom u određenom organu ili odjelјku, profilom sekrecije markera ili citokina i/ili stepenom diferencijacije. U odnosu na subjekta koji se tretira, ćelije mogu biti alogene i/ili autologne. U pojedinim slučajevima, postupci obuhvataju izolovanje ćelija iz subjekta, njihovu pripremu, obradu, kultivisanje i/ili primenu genetičkog inženjeringa i njihovo ponovno uvođenje u istog subjekta, pre ili nakon krioprezervacije, što se prema pojedinim aspektima može postići u zatvorenom sistemu upotrebom jednog ili više od obezbeđenih koraka obrade.

[0321] Među podtipovima i subpopulacijama T-ćelija i/ili CD4+ i/ili CD8+ T-ćelija su naivne T (TN) ćelije, efektorske T-ćelije (TEFF), memorijske T-ćelije i njihovi podtipovi, kao što su matične memorijske T-ćelije (TSCM), centralne memorijske T-ćelije (TCM), efektorske memorijske T-ćelije (TEM) ili terminalno diferencirane efektorske memorijske T-ćelije, limfociti koji infiltriraju u tumor (TIL), nezrele T-ćelija, zrele T-ćelije, pomoćne T-ćelije, citotoksične T-ćelije, invarijantne T-ćelije povezane sa mukozom (MAIT), prirodno nastale i adaptivne regulatorne T-ćelije (Treg), pomoćne T-ćelije, kao što su TH1 ćelije, TH2 ćelije, TH3 ćelije, TH17 ćelije, TH9 ćelije, TH22 ćelije, folikularne pomoćne T-ćelije, alfa/beta T-ćelije i delta/gama T-ćelije.

[0322] U pojedinim slučajevima, ćelije su ćelije prirodne ubice (NK). U pojedinim slučajevima, ćelije su monociti ili granulociti, npr. mijeloidne ćelija, makrofagi, neutrofili, dendritične ćelija, mastociti, eozinofili i/ili bazofili.

V. Čestice virusnog vektora, virusni vektori i kodirani rekombinantni proizvodi

[0323] Postupci transdukcije uglavnom podrazumevaju transdukciju virusnim vektorima, poput onih koji kodiraju rekombinantne proizvode koji se eksprimiraju u ćelijama. Termin "vektor", kako se ovde upotrebljava, odnosi se na molekul nukleinske kiseline koji je u stanju da umnožava drugu nukleinsku kiselinu sa kojom je povezan. Termin takođe obuhvata vektor kao strukturu koja se smostalno može umnožavati kao i vektor koji je ugrađen u genom ćelije domaćina u koju je uveden. Određeni vektori su u stanju da usmere ekspresiju nukleinskih kiselina sa kojima su operativno povezani. Takvi vektori su ovde označeni kao "ekspresioni vektori". Vektori obuhvataju virusne vektore, poput retrovirusnih vektora, na primer lentivirusne ili gamaretrovirusne vektore, koji su sa genomom u kome se nalazi druga nukleinksa kiselina i koji su u stanju da se ugrade u genom domaćina radi svog umnožavanja.

[0324] U pojedinim slučajevima, virusni vektor se prenosi u ćeliju u okviru nošača koji predstavlja česticu virusnog vektora, a koja uklјučuje virion koji inkapsulira i/ili pakuje genom virusnog vektora. U pojedinim takvim slučajevima, genom virusnog vektora obično obuhvata sekvence pored nukleinske kiseline koja kodira rekombinantan molekul, a koje omogućavaju pakovanje genoma u virusnu česticu.

[0325] U pojedinim slučajevima, virusni vektor sadrži rekombinantnu nukleinsku kiselinu, poput nukleinske kiseline koja kodira rekombinantan i/ili heterologni molekul, kao što je rekombinantan ili heterologni protein. U pojedinim slučajevima, kao što je to prema aspektima obezbeđenih postupaka, transdukcija sa virusnim vektorima proizvodi izlaznu kompoziciju, u kojoj su ćelije transdukovane i eksprimiraju rekombinantne ili genetičkim inženjeringom proizvedene proizvode takvih nukleinskih kiselina. U pojedinim slučajevima, nukleinske kiseline su heterologne, tj. normalno nisu prisutne u ćeliji ili uzorku dobijenom iz ćelija, kao što je ona koja je dobijena iz drugog organizma ili ćelije, a koja se, na primer, obično ne nalazi u ćelijama koje se transdukuju i/ili u organizmu iz koga je takva ćelija izvedena. U pojedinim slučajevima, nukleinske kiseline nisu one koje se javljaju u prirodi, poput nukleinske kiseline koja se ne javlja u prirodi, uklјučujući one koje sadrže himerne kombinacije nukleinskih kiselina koje kodiraju različite domene iz višestrukih različitih tipova ćelija.

[0326] U pojedinim slučajevima, rekombinantne nukleinske kiseline se prenose u ćelije upotrebom rekombinantnih virusa ili čestica virusnog vektora, kao što su, npr. vektori izvedeni iz simijan virusa 40 (SV40), adenovirusa, adeno-asociranih virusa (AAV). U pojedinim slučajevima, rekombinantne nukleinske kiseline se prenose u ćelije, poput T-ćelija, upotrebom rekombinantnih lentivirusnih vektora ili retrovirusnih vektora, kao što su gama-retrovirusni vektori (pogledati npr. Koste i saradnici (2014) Gene Therapy, 3. april 2014. doi: 10.1038/gt.2014.25; Carlens i sadradnic (2000) Exp Hematol 28(10): 1137-46; AlonsoCamino i saradnici (2013) Mol Ther Nucl Acids 2, e93; Park i saradnici, Trends Biotechnol.2011, novembar 29(11): 550-557.

[0327] U pojedinim slučajevima, retrovirusni vektor sadrži dugu ponavljajuću teminalnu sekvencu (LTR), npr. retrovirusnog vektora izvedenog iz Moloni virusa mišje leukemije (MoMLV), virusa mijeloproliferativnog sarkoma (MPSV), virusa mišjih embrionalnih matičnih ćelija (MESV), virusa mišjih matičnih ćelija (MSCV), virusa formiranja fokusa slezine (SFFV) ili adeno-asociranog virusa (AAV). Većina retrovirusnih vektora potiče iz mišjih retrovirusa. U pojedinim slučajevima, retrovirusi uklјučuju one koji su izvedeni iz bilo kog ptičijeg ili sisarskog ćelijskog izvora. Retrovirusi su obično amfotropni, što označava da su u stanju da inficiraju ćelije domaćina iz nekoliko vrsta, uklјučujući lјude. U jednom slučaju, gen koji je potrebno eksprimirati se zamenjuje sa retrovirusnim gag, pol i/ili env sekvencama. Opisani su brojni ilustrativni retrovirusni sistemi (npr. u U.S. Pat. Nos.5,219,740; 6,207,453; 5,219,740;

1

Miller i Rosman (1989) BioTechniques 7:980-990; Miller, A. D. (1990) Human Gene Therapy 1:5-14; Scarpa i saradnici (1991) Virology 180:849-852; Burns i saradnici (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:8033-8037; i Boris-Lawrie i Temin (1993) Cur. Opin. Genet. Develop.3:102-109.

[0328] Virusni vektori uglavnom sadrže rekombinantne nukleinske kiseline poput transgena koji kodiraju rekombinantne proizvode za ekspresiju od strane ćelija. Rekombinantni proizvodi obuhvataju rekombinantne receptore, uklјučujući antigene receptore kao što su funkcionalni antigeni receptori različiti od TCR, npr. himerni antigeni receptori (CARs) i drugi receptori za vezivanje antigena, kao što su transgeni T-ćelijski receptori (TCR). Među receptorima su i drugi himerni receptori.

[0329] Primeri receptora za antigen, uklјučujući CAR, i postupci za genetički inženjering i uvođenje takvih receptora u ćelija, obuhvataju one opisane, na primer, u međunarodnim patentnim prijavama br. WO200014257, WO2013126726, WO2012/129514, WO2014031687, WO2013/166321, WO2013/071154, WO2013/123061, U.S. patentne prijave br. US2002131960, US2013287748, US20130149337, U.S. Patente br.: 6,451,995, 7,446,190, 8,252,592, , 8,339,645, 8,398,282, 7,446,179, 6,410,319, 7,070,995, 7,265,209, 7,354,762, 7,446,191, 8,324,353 i 8,479,118, kao i Evropsku patentnu prijavu broj EP2537416, i/ili one koje opisuju Sadelain i saradnici, Cancer Discov.2013, april; 3(4): 388-398; Davila i saradnici (2013) PLoS ONE 8(4): e61338; Turtle i saradnici, Curr. Opin. Immunol., 2012, oktobar; 24(5): 633-39; Wu i saradnici, Cancer, 2012, mart, 18(2): 160-75. Prema pojedinim aspektima, antigeni receptori obuhvataju CAR, kao što je opisano u U.S. Patent No.: 7,446,190, kao i one opisane u međunarodnoj patentnoj prijavi br.: WO/2014055668 A1. Primeri CAR obuhvataju CAR koji su prijavljeni u bilo kojoj od prethnodno navedenih publikacija, kao što su WO2014031687, US 8,339,645, US 7,446,179, US 2013/0149337, U.S. Patent No.: 7,446,190, US Patent No.: 8,389,282, Kochenderfer i saradnici, 2013, Nature Reviews Clinical Oncology, 10, 267-276 (2013); Wang i saradnici (2012) J. Immunother. 35(9): 689-701; i Brentjens i saradnici, Sci Transl Med. 20135(177). Pogledati takođe WO2014031687, US 8,339,645, US 7,446,179, US 2013/0149337, U.S. Patent No.: 7,446,190 i US Patent No.: 8,389,282. Himerni receptori, kao što su CAR, generalno obuhvataju vanćelijski domen za vezivanje antigena, kao što je deo molekula antitela, uglavnom varijabilni regiona teškog (VH) lanca i/ili varijabilni region lakog (VL) lanca antitela, npr. fragment scFv antitela.

[0330] U pojedinim slučajevima, deo antitela rekombinantnog receptora, npr. CAR, dalјe uklјučuje najmanje deo imunoglobulinskog konstantnog regiona, kao što je zglobni region, npr. zglobni region IgG4 i/ili CH1/CL i/ili Fc region. U pojedinim slučajevima, konstantni region ili deo je iz humanog IgG, kao što je IgG4 ili IgG1. Prema pojedinim aspektima, deo konstantnog regiona služi kao spejserski region između komponente za prepoznavanje antigena, npr. ScFv, i transmembranskog domena. Spejser može biti dužine koja obezbeđuje povećanu reaktivnost ćelija nakon vezivanja antigena u poređenju sa odsustvom spejsera. Spejseri za primer, npr. zglobni regioni, obuhvataju one koji su opisani u međunarodnoj patentnoj prijavi br. WO2014031687. U pojedinim primerima, spejser je dužine od ili oko 12 aminokiselina ili nije duži od 12 aminokiselina. Spejseri za primer obuhvataju one koji sadrže najmanje oko od 10 do 229 aminokiselina, oko od 10 do 200 aminokiselina, oko od 10 do 175 aminokiselina, oko od 10 do 150 aminokiselina, oko od 10 do 125 aminokiselina, oko od 10 do 100 aminokiselina, oko od 10 do 75 aminokiselina, oko od 10 do 50 aminokiselina, oko od 10 do 40 aminokiselina, oko od 10 do 30 aminokiselina, oko od 10 do 20 aminokiselina ili oko od 10 do 15 aminokiselina, uklјučujući bilo koji ceo broj između krajnjih tačaka bilo kog od navedenih opsega. U pojedinim slučajevima, spejserski region sadrži oko 12 aminokiselina ili manje, oko 119 aminokiselina

2

ili manje ili oko 229 aminokiselina ili manje. Spejseri za primer uklјučuju samo zglobni region IgG4, zglobni region IgG4 povezan sa CH2 i CH3 domenima ili zglobni region IgG4 povezan sa CH3 domenom.

[0331] Ovaj domen za prepoznavanje antigena uglavnom je povezan sa jednom ili sa više unutarćelijskih signalnih komponenti, kao što su signalne komponente koje oponašaju aktivaciju preko antigenog receptorskog kompleksa, poput TCR kompleksa, u slučaju CAR, i/ili signale preko nekog drugog površinskog ćelijskog receptora. Tako, u pojedinim slučajevima, komponenta koja vezuje antigen (npr. antitelo) povezana je sa jednim ili sa više transmembranskih i unutarćelijskih signalnih domena. U pojedinim slučajevima, transmembranski domen je fuzionisan sa vanćelijskim domenom. U jednom slučaju, upotrebljava se transmembranski domen koji je prirodno povezan sa jednim od domena u receptoru, npr. CAR. U pojedinim slučajevima, transmembranski domen je selektovan ili modifikovan aminokiselinskom supstitucijom da bi se izbeglo vezivanje takvih domena za transmembranske domene istih ili različitih površinskih membranskih proteina i da bi se interakcije sa drugim članovima receptorskog kompleksa smanjile na minimum.

[0332] Transmembranski domen, u pojedinim slučajevima, potiče bilo iz prirodnog ili iz sintetskog izvora. Kada je izvor prirodan, domen u pojedinim aspektima potiče od bilo kog proteina vezanog na membranu ili transmembranog proteina. Transmembranski regioni podrazumevaju one koji su izvedeni iz (tj. sadrže najmanje transmembranski region(e)) alfa, beta ili zeta lanca T-ćelijskog receptora, CD28, CD3 epsilon, CD45, CD4, CD5, CDS, CD9, CD 16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD 134, CD137, CD 154. Alternativno, transmembranski domen je u pojedinim slučajevima sintetski. Prema pojedinim aspektima, sintetski transmembranski domen sadrži pretežno hidrofobne ostatke, poput leucina i valina. Prema pojedinim aspektima, triplet fenilalanina, triptofana i valina će se naći na svakom kraju sintetskog transmembranskog domena. U pojedinim slučajevima, veza se ostvaruje linkerima, spejserima i/ili transmembranskim domenima.

[0333] Među unutraćelijskim signalnim domenima su oni koji oponašaju ili približno predstavljaju signal koji postoji kod prirodnih antigenih receptora, signal koji se ostvaruje putem takvog receptora u kombinaciji sa kostimulatornim receptorom i/ili signal koji se ostvaruje samo putem kostimulatornog receptora. U pojedinim slučajevima, prisutan je kratak oligo- ili polipeptidni linker, na primer, linker dužine od između dve i 10 aminokiselina, kao što je onaj koji sadrži glicin i serin, npr. glicin-serinski dublet, a koji obrazuje vezu između transmembranskog domena i citoplazmatskpg signalnog domena CAR.

[0334] Receptor, npr. CAR, generalno sadrži najmanje jednu unutarćelijsku signalnu komponentu ili komponente. U pojedinim slučajevima, receptor obuhvata unutarćelijsku komponentu TCR kompleksa, kao što je TCR CD3 lanac koji posreduje u aktivaciji i citotoksičnosti T-ćelija, npr. CD3 zeta lanac. Tako, prema pojedinim aspektima, deo koji vezuje antigen je povezan sa jednim ili sa više od ćelijskih signalnih modula. U pojedinim slučajevima, ćelijski signalni moduli uklјučuju CD3 transmembranski domen, CD3 unutarćelijske signalne domene i/ili druge CD transmembranske domene. U pojedinim slučajevima, receptor, npr. CAR, dalјe sadrži deo jednog ili više dodatnih molekula kao što su Fc receptor γ, CD8, CD4, CD25 ili CD16. Na primer, prema pojedinim aspektima, CAR ili drugi himerni receptor obuhvata himerni molekul između CD3-zeta (CD3-ζ) ili Fc receptora γ i i CD8, CD4, CD25 ili CD16.

[0335] U pojedinim slučajevima, nakon ligacije CAR ili drugog himernog receptora, citoplazmatski domen ili unutarćelijski signalni domen receptora aktivira najmanje jednu od normalnih efektorskih funkcija ili odgovora imunske ćelija, npr. u T-ćeliji konstruisanoj tako da eksprimira CAR. Na primer, u pojedinim kontekstima, CAR indukuje funkciju T-ćelija, kao što je citolitička aktivnost ili aktivnost pomoćnih T-ćelija, poput sekrecije citokina ili drugih faktora. U pojedinim slučajevima, skraćeni deo unutarćelijskog signalnog domena komponente antigenog receptora ili kostimulatorni molekul, upotrebljavaju se umesto intaktnog imunostimulatornog lanca, na primer, ukoliko on prenosi efektorski funkcionalni signal. U pojedinim slučajevima, unutarćelijski signalni domen ili domeni obuhvataju citoplazmatske sekvence T-ćelijskog receptora (TCR), a prema pojedinim aspektima, i one od koreceptora koje u prirodnom kontekstu deluju u skladu sa takvim receptorima da bi se inicirala signalna transdukcija nakon angažovanja antigenog receptora.

[0336] U kontekstu prirodnog TCR-a, puna aktivacija uglavnom zahteva ne samo signalizaciju preko TCR, već i kostimulatorni signal. Stoga, u pojedinim slučajevima, za pospešivanje pune aktivacije, komponenta za generisanje sekundarnog ili kostimulatornog signala takođe je uklјučena u CAR. U drugim slučajevima, CAR ne sadrži komponentu za generisanje kostimulatornog signala. Prema pojedinim aspektima, dodatni CAR se eksprimira u istoj ćeliji i obezbeđuje komponentu za generisanje sekundarnog ili kostimulatornog signala.

[0337] Aktivacija T-ćelija je, prema pojedinim aspektima, opisana kao posredovana sa dve klase sekvenci citoplazmatske signalizacije: onih koje iniciraju primarnu aktivaciju preko TCR i koja zavisi od antigena (primarna citoplazmatska signalna sekvenca) i onih koje deluju na način koji nije zavisan od antigena da bi se obezbedio sekundarni ili kostimulatorni signal (sekundarne citoplazmatske signalne sekvence). Prema pojedinim aspektima, CAR obuhvata jednu ili obe od takvih signalnih komponenti.

[0338] Prema pojedinim aspektima, CAR uklјučuje primarnu citoplazmatsku signalnu sekvencu koja reguliše primarnu aktivaciju TCR kompleksa. Primarne citoplazmatske signalne sekvence koje deluju na stimulativan način mogu sadržavati signalne motive koji su poznati kao aktivacioni motivi zasnovani na tirozinu imunoreceptora ili ITAM. Primeri ITAM koji sadrže primarne citoplazmatske signalne sekvence uklјučuju one izvedene iz TCR zeta, FcR gama, FcR beta, CD3 gama, CD3 delta, CD3 epsilon, CDS, CD22, CD79a, CD79b i CD66d. U pojedinim slučajevima, molekul(i) citoplazmatske signalizacije u CAR sadrže citoplazmatski signalni domen, njegov deo ili sekvencu izvedenu iz CD3 zeta.

[0339] U pojedinim slučajevima, CAR sadrži signalni domen i/ili transmembranski deo kostimulatornog receptora, kao što je CD28, 4-1BB, OX40, DAP10 i ICOS. Prema pojedinim aspektima, isti CAR sadrži i aktivirajuće i kostimulatorne komponente.

[0340] U pojedinim slučajevima, aktivirajući domen je uklјučen unutar jednog CAR, dok je kostimuliratorna komponenta obezbeđena od strane drugog CAR koji prepoznaje drugi antigen. U pojedinim slučajevima, CAR uklјučuju aktivirajuće ili stimulišuće CAR, kostimulatorne CAR, od kojih su oba eksprimirana na istoj ćeliji (pogledati WO2014/055668). Prema pojedinim aspektima, ćelije uklјučuju jedan ili više stimulišućih ili aktivirajućih CAR i/ili kostimulatorni CAR. U pojedinim slučajevima, ćelije dodatno uklјučuju inhibitorne CAR (iCARs, pogledati Fedorov i saradnici, Sci. Transl. Medicine, 5215) (decembar, 2013), kao što je CAR koji prepoznaje antigen različit od onog koji je povezan sa i/ili je specifičan za bolest ili stanje, čime se aktivirajući signal koji se isporučuje preko CAR na koga bolest ciljano deluje, smanjuje ili inhibira vezanjem inhibitornog CAR za njegov ligand, npr. da bi se smanjili efekti koji ne predstavljaju ciljano dejstvo.

4

[0341] U određenim slučajevima, unutarćelijski signalni domen sadrži CD28 transmembranski i signalni domen povezan sa CD3 (npr. CD3-zeta) unutarćelijskim domenom. U pojedinim slučajevima, unutarćelijski signalni domen sadrži himerne CD28 i CD137 (4-1BB, TNFRSF9) ko-stimulatorne domene, povezane sa CD3 zeta unutarćelijskim domenom.

[0342] U pojedinim slučajevima, CAR obuhvata jedan ili više, npr. dva ili više, kostimulatorna domena i aktivacioni domen, npr. primarni aktivacioni domen, u citoplazmatskom delu. Primeri CAR uklјučuju unutarćelijske komponente CD3-zeta, CD28 i 4-1BB.

[0343] U pojedinim slučajevima, CAR ili drugi antigeni receptor dalјe uklјučuju marker, kao što je marker površine ćelija, a koji može biti upotrebljen za potvrđivanje transdukcije ili izmene ćelija genetičkim inženjeringom tako da eksprimiraju receptor, kao što je skraćena verzija receptora sa površine ćelije, poput skraćenog EGFR (tEGFR). Prema pojedinim aspektima, marker uklјučuje celokupan ili deo (npr. skraćeni oblik) CD34, NGFR ili receptora za epidermalni faktor rasta (npr. tEGFR). U pojedinim slučajevima, nukleinska kiselina koja kodira marker je operativno povezana sa polinukleotidom koji kodira linkersku sekvencu, kao što je linkerska sekvenca koja je podložna cepanju, npr. T2A. Pogledati WO2014031687.

[0344] U pojedinim slučajevima, marker je molekul, na primer, protein sa površine ćelija, koji se u prirodi ne nalazi na T-ćelijama ili se u prirodi ne nalazi na površini T-ćelija, ili je njegov deo.

[0345] U pojedinim slučajevima, molekul nije molekul datog organizma, npr. nije sopstveni protein, tj. onaj koji se prepoznaje kao sopstveni od strane imunog sistema domaćina u koga je ćelija adoptivno prebačena.

[0346] U pojedinim slučajevima, marker ne služi za neku terapijsku funkciju i/ili ne proizvodi efekte drugačije od onih koji će biti upotrebljeni za genetički inženjering, npr. za selekciju ćelija koje su uspešno izmenjene genetičkim inženjeringom. U drugim slučajevima, marker može biti terapijski molekul ili molekul koji na drugi način ispoljava pojedini želјeni efekat, kao što je ligand za ćeliju koja se sreće in vivo, poput kostimulatornog ili molekula kontrolne tačke zarad poboljšanja i/ili ublaživanja reakcije ćelija nakon adoptivnog prenosa i susreta sa ligandom.

[0347] U pojedinim slučajevima, CAR se odnosi na CAR prve, druge i/ili treće generacije. Prema pojedinim aspektima, prva generacija CAR je ona koja isklјučivo omogućava signal indukovan sa CD3 lancem, nakon vezivanja antigena; prema pojedinim aspektima, druga generacija CAR je ona koja obezbeđuje takav signal i kostimulatorni signal, kao što je onaj koji uklјučuje unutarćelijski signalni domen iz kostimulatornog receptora kao što je CD28 ili CD137; prema pojedinim aspektima, treća generacija CAR je ona koja obuhvata višestruke kostimulatorne domene različitih kostimulatornih receptora.

[0348] U pojedinim slučajevima, himerni receptor za antigen sadrži vanćelijski deo koji sadrži antitelo ili fragment antitela. Prema pojedinim aspektima, himerni antigeni receptor uklјučuje vanćelijski deo koji sadrži antitelo ili fragment i unutarćelijski signalni domen. U pojedinim slučajevima, antitelo ili fragment uklјučuju scFv, a unutarćelijski domen sadrži ITAM. Prema pojedinim aspektima, unutarćelijski signalni domen uklјučuje signalni domen zeta lanca CD3 (CD3ζ). U pojedinim slučajevima, himerni antigeni receptor uklјučuje transmembranski domen koji povezuje vanćelijski i unutarćelijski signalni domen. Prema pojedinim aspektima, transmembranski domen sadrži transmembranski deo CD28. U pojedinim slučajevima, himerni antigeni receptor sadrži unutarćelijski domen T-ćelijskog kostimulatornog molekula. Prema pojedinim aspektima, T-ćelijski kostimulatorni molekul je CD28 ili 41BB.

[0349] Pojmovi „polipeptid“ i „protein“ se naizmenično koriste za označavanje polimera aminokiselinskih ostataka i nisu ograničeni na minimalnu dužinu. Polipeptidi, uklјučujući obezbeđene receptore i druge polipeptide, npr. linkere ili peptide, mogu obuhvatati aminokiselinske ostatke koji obuhvataju prirodne i/ili aminokiselinske ostatke koji nisu prirodni. Termini takođe uklјučuju modifikacije polipeptida nakon ekspresije, na primer, glikozilaciju, sijaliaciju, acetilaciju i fosforilaciju. Prema pojedinim aspektima, polipeptidi mogu sadržavati modifikacije u odnosu na nativnu ili prirodnu sekvencu, sve dok protein zadržava želјenu aktivnost. Ovakve modifikacije mogu biti namerne, kao što je putem mutageneze usmerene na mesto, ili mogu biti slučajne, poput mutacija domaćina koji proizvode proteine ili greške usled PCR amplifikacije.

[0350] Rekombinantni receptori, kao što su CAR, eksprimirani od strane ćelija koje su primenjene subjektu, uglavnom prepoznaju ili se specifično vezuju za molekul koji je eksprimiran, povezan sa i/ili specifičan za oboljenje ili stanje ili ćelije koje se leče. Nakon specifičnog vezanja za molekul, npr. antigen, receptor obično šalje u ćeliju imunostimulativni signal, kao što je signal posredovan sa ITAM, čime se pospešuje imuni odgovor usmeren na oboljenje ili stanje. Na primer, u pojedinim slučajevima, ćelije eksprimiraju CAR koja se specifično vezuje za antigen koga eksprimiraju ćelije ili tkiva u oboljenju ili stanju ili koji je povezan sa oboljenjem ili stanjem.

[0351] U pojedinim kontekstima, prekomerna ekspresija stimulatornog faktora (na primer, limfokina ili citokina) može biti toksična za subjekta. Tako, u pojedinim kontekstima, virusni vektor se uvodi u ćelijske genske segmente što prouzrokuje da su ćelije podložne negativnoj selekciji in vivo, kao što je nakon primene u adoptivnoj imunoterapiji. Na primer, prema pojedinim aspektima, nakon transdukcije ćelija sa takvim genskim segmentima, ćelije se eliminišu kao rezultat promene u in vivo stanju subjekta kome su iste primenjene. Fenotip koji se može negativno selektovati može biti rezultat insercije gena kojim se postiže osetlјivost na primenjeni agens, na primer, jedinjenje. Geni koji se mogu negativno selektovati obuhvataju gen za timidin kinazu herpes simpleks virus tipa I (HSV-I TK) (Wigler i saradnici, Cell II :223,1977), kojim se postiže osetlјivost na ganciklovir; gen za ćelijsku hipoksantinfosfribosiltransferazu (HPRT), gen za ćelijsku adenin-fosforibosiltransferazu (APRT), bakterijsku citozin deaminazu, (Mullen i saradnici, Proc. Natl. Acad. Sci. USA.89:33 (1992)).

[0352] Među dodatnim nukleinskim kiselinama koje mogu biti uklјučene u virusni vektor za transdukciju i ekspresiju u ćelijama su i oni koji kodiraju proizvode koji pobolјšavaju efikasnost terapije, kao što je pospešivanjem vijabilnosti i/ili funkcije transferovanih ćelija; koji obezbeđuju genetički marker za selekciju i/ili procenu ćelija, kao što je procena in vivo preživljavanja ili lokalizacije, i/ili koji pobolјšavaju bezbednost, na primer, čineći ćeliju podložnom negativnoj selekciji in vivo, kao što je opisano u Lupton S.D. i saradnici, Mol. and Cell Biol., 11:6 (1991); i Riddell i saradnici, Human Gene Therapy 3:319-338 (1992); pogledati i publikacije PCT/US91/08442 i PCT/US94/05601, autora Lupton i saradnici, koji opisuju upotrebu bifunkcionalnih selekcionih fuzionih gena dobijenih fuzijom dominantno pozitivnog selekcionog markera sa negativno selektivnim markerom. Pogledati, npr. Riddell i saradnici, US Patent No.6,040,177, u kolonama 14-17.

VI. Terapijski postupci i kompozicije

[0353] Prema pojedinim aspektima, proizvodi ovih postupaka se upotrebljavaju u postupcima lečenja, npr. terapijskim postupcima, kao što su primena ćelija i kompozicija subjektima u adoptivnoj ćelijskoj terapiji. Obezbeđeni su takođe takvi postupci i upotrebe ćelija koje se obrađene i proizvedene postupcima, kao i farmaceutske kompozicije i formulacije za upotrebu u istima. Obezbeđeni postupci uglavnom obuhvataju primenu ćelija ili kompozicija, npr. izlazne kompozicije i/ili formulisane kompozicije subjektima.

[0354] U pojedinim slučajevima, ćelije eksprimiraju rekombinantne receptore, kao što su CAR, ili drugi antigeni receptori, poput transgenih TCR, npr. onih koji su ubačeni postupcima transdukcije koji su ovde opisani. Takve ćelije se uglavnom primenjuju subjektima sa oboljenjem ili stanjem koje receptor može specifično prepoznati. U jednom slučaju, ćelije eksprimiraju rekombinantan receptor ili himerni receptor, kao što je receptor za antigen, npr. CAR ili TCR, a koji se specifično vezuju za ligand priduržen oboljenju ili stanju ili koji se eksprimira u ćeliji ili tkivu istih. Na primer, u pojedinim slučajevima, receptor je antigeni receptor, a ligand je antigen specifičan za i/ili povezan sa bolešću ili stanjem. Primena uglavnom ostvaruje pobolјšanje jednog ili više simptoma oboljenja ili stanja i/ili leči ili sprečava oboljenje ili stanje ili njegov simptom. Među bolestima, stanjima i poremećajima su tumori, uklјučujući solidne tumore, hematološki maligniteti i melanomi, uklјučujući lokalizovane i metastatske tumore, infektivne bolesti, poput infekcije sa virusom ili drugim patogenom, npr. sa HIV, HCV, HBV, CMV, kao i parazitske bolesti, autoimune i inflamatorne bolesti. U pojedinim slučajevima, bolest ili stanje je tumor, kancer, malignitet, neoplazija ili drugo proliferativno oboljenje ili poremećaj. Takve bolesti uklјučuju, ali nisu ograničene na leukemiju, limfom, npr. hroničnu limfocitnu leukemiju (CLL), ALL, ne-Hočkinov limfom, akutnu mijeloidnu leukemiju, multipli mijelom, refraktorni folikularni limfom, limfom ćelija ovojnice, indolentni B-ćelijski limfom, B-ćelijske malignitete, kancere debelog creva, pluća, jetre, dojke, prostate, jajnika, kože, melanome, kancere kostiju i mozga, kancer jajnika, epitelne kancere, karcinom bubrežnih ćelija, adenokarcinom pankreasa, Hočkinov limfom, karcinom grlića materice, kolorektalni kancer, glioblastom, neuroblastom, Juvingov sarkom, meduloblastom, osteosarkom, sinovijalni sarkom i/ili mezoteliom.

[0355] U pojedinim slučajevima, bolest ili stanje je infektivna bolest ili stanje, kao što su, ali nije ograničeno na, virusne, retrovirusne, bakterijske i protozoalne infekcije, imunodeficijencija, citomegalovirusna (CMV), infekcija Epstein-Barr virusom (EBV), adenovirusom, BK poliomavirusom. U pojedinim slučajevima, bolest ili stanje je autoimuna ili inflamatorna bolest ili stanje, poput artritisa, npr. reumatoidnog artritisa (RA), dijabetesa tipa I, sistemskog eritematoznog lupusa (SLE), inflamatorne bolesti creva, psorijaze, skleroderme, autoimmune bolesti štitne žlezde, Greveove bolesti, Kronove bolesti, multiple skleroze, astme i/ili je to bolest ili stanje koje je povezano sa transplantacijom.

[0356] U pojedinim slučajevima, antigen povezan sa bolešću ili poremećajem na koje ćelije ili kompozicije ciljano deluju, izabran je iz grupe koja se sastoji od orfanskog tirozin kinaznog receptora ROR1, tEGFR, Her2, L1-CAM, CD19, CD20, CD22, mezotelina, CEA i površinskog antigena hepatitisa B, anti-folatnog receptora, CD23, CD24, CD30, CD33, CD38, CD44, EGFR, EGP-2, EGP-4, OEPHa2, ErbB2, 3 ili 4, FBP, fetalnog acetiholinskog e receptora, GD2, GD3, HMW-MAA, IL-22R-alfa, IL-13R-alfa2, kdr, kapa lakog lanca, Lewis Y, ćelijskog adhezinog molekula L1, MAGE-A1, mezotelina, MUC1, MUC16, PSCA, NKG2D liganada, NY-ESO-1, MART-1, gp100, onkofetalnog antigena, ROR1, TAG72, VEGF-R2, karcinoembrionskog antigena (CEA), antigena specifičnog za prostatu, PSMA, Her2/neu, estrogenskog receptora, progesteronskog receptora, efrinaB2, CD123, CS-1, c-Met, GD-2 i MAGE A3, CE7, Vilmsovog tumorskog antigena 1 (VT-1), ciklina, kao što je ciklin A1 (CCNA1), i/ili biotiniziranih molekula i i/ili molekula koje eksprimiraju HIV, HCV, HBV ili drugi patogeni.

[0357] U pojedinim slučajevima, ćelije ili kompozicije se primenjuju u količini koja je efektivna za lečenje ili prevenciju oboljenja ili stanja, kao što je terapisjki efektivna ili profilatički efektivna količina. Tako, u pojedinim slučajevima, postupci primene obuhvataju primenu ćelija i kompozicija u efektivnim količinama. Terapijska ili profilaktička efikasnost se u pojedinim slučajevima prati periodičnom pocenom lečenih subjekata. Za ponovljene primene tokom nekoliko dana ili duže, u zavisnosti od stanja, lečenje se ponavlјa sve dok se ne pojavi želјena supresija simptoma bolesti. Međutim, drugi dozni režimi mogu biti korisni i mogu biti određeni.

[0358] Kako se ovde upotrebljava, "lečenje" (i njegove gramatičke varijacije, kao što su "lečiti" ili "lečenja") odnosi se na potpuno ili delimično pobolјšanje ili smanjenje oboljenja ili stanja ili poremećaja ili simptoma, štetnog dejstva ili ishoda ili fenotipa koji je sa istim povezan. Poželјni efekti lečenja obuhvataju, ali nisu ograničeni na, sprečavanje pojave ili ponovne pojave oboljenja, ublažavanje simptoma, smanjenje bilo kakvih direktnih ili indirektnih patoloških posledica oboljenja, sprečavanje metastaza, smanjenje brzine napredovanja bolesti, pobolјšanje ili ublažavanje stanja bolesti, kao i remisiju ili pobolјšanu prognozu. Ovi termini ne podrazumevaju potpuno izlečenje oboljenja ili potpuno uklanjanje bilo kog simptoma ili efekta(efekata) na sve simptome ili ishode.

[0359] Kako se ovde upotrebljava, „odlaganje razvoja bolesti“ označava odlaganje, ometanje, usporavanje, stabilizovanje, suzbijanje i/ili kašnjenje u razvoju oboljenja (kao što je kancer). Ovakvo odlaganje može biti različitog vremenskog trajanja, u zavisnosti od istorije bolesti i/ili pojedinca koji se leči. Kao što bi stručnjak i podrazumevao, dovolјno ili značajno odlaganje može, u stvari, obuhvatiti prevenciju, tako da pojedinac ne razvija oboljenje. Na primer, kancer u kasnoj fazi, kao što je razvoj metastaza, može biti odložen.

[0360] "Prevencija", kako se ovde upotrebljava, označava obezbeđivanje profilakse u vezi sa pojavom ili ponovnim javljanjem oboljenja kod subjekta koji je sa predispozicijom da oboli, ali kod koga još uvek nije postavljena dijagnoza oboljenja. U pojedinim slučajevima, obezbeđene ćelije i kompozicije se upotrebljavaju za odlaganje razvoja oboljenja ili za usporavanje napredovanja oboljenja.

[0361] Kako se ovde upotrebljava, "suprimiranje" funkcije ili aktivnosti je smanjenje funkcije ili aktivnosti u poređenju sa, na druge načine istim uslovima, osim u pogledu uslova ili parametra od interesa, ili alternativno, u poređenju sa drugim uslovima. Na primer, ćelije koje suprimiraju rast tumora, smanjuju stopu rasta tumora u poređenju sa stopom rasta tumora u odsustvu ćelija.

[0362] "Efektivna količina" agensa, npr. farmaceutske formulacije, ćelija ili kompozicije, u kontekstu primene, odnosi se na količinu koja je efektivna, u dozama/količinama i tokom potrebnog vremenskog perioda da se postigne želјeni rezultat, poput terapijskog ili profilaktičkog rezultata.

[0363] "Terapijski efektivna količina" agensa, npr. farmaceutske formulacije ili ćelija, odnosi se na količinu koja je efektivna, u dozama i tokom potrebnog vremenskog perioda, za postizanje želјenog terapijskog rezultata, kao što je lečenje oboljenja, stanja ili poremećaja i/ili farmakokinetički ili farmakodinamički efekat lečenja. Terapijski efektivna količina može varirati u zavisnosti od faktora kao što su stadijum oboljanja, starost, pol i težina subjekta, kao i od populacije ćelija koja je primenjena.

[0364] "Profilaktički efektivna količina" se odnosi na količinu koja je efektivna, u dozama i tokom potrebnog vremenskog perioda, za postizanje želјenog profilaktičkog rezultata. Obično, ali ne i nužno, pošto se profilaktička doza upotrebljava kod subjekata pre ili u ranijem stadijumu oboljenja, profilaktički efektivna količina biće manja od terapijski efektivne količine.

[0365] Postupci primene ćelija za adoptivnu ćelijsku terapiju su poznati i mogu biti upotrebljeni u vezi sa obezbeđenim postupcima i kompozicijama. Na primer, postupci adoptivne T-ćelijske terapije su opisani, npr. u US patentnoj prijavi br. 2003/0170238, autora Gruenberg i saradnici; US Patent No.

4,690,915 od Rosenberg-a; Rosenberg (2011) Nat Rev Clin Oncol.8(10):577-85). Pogledati npr. Themeli i saradnici (2013) Nat Biotechnol.31(10): 928-933; Tsukahara i saradnici (2013) Biochem Biophys Res Commun 438(1): 84-9; Davila i saradnici (2013) PLOS ONE 8(4): e61338.

[0366] U pojedinim slučajevima, ćelijska terapija, npr. adoptivna ćelijska terapija, npr. adoptivna T-ćelijska terapija, se izvodi autolognim transferom, u kome su ćelije izolovane i/ili na drugi način pripremlјene iz subjekta koji treba da primi ćelijsku terapiju ili iz uzorka dobijenog iz takvog subjekta. Tako, prema pojedinim aspektima, ćelije su dobijene iz subjekta, npr. pacijenta, kome je potrebno lečenje, a ćelije se, nakon izolacije i obrade ćelija, primenjuju istom subjektu.

[0367] U pojedinim slučajevima, ćelijska terapija, npr. adoptivna ćelijska terapija, npr. adoptivna T-ćelijska terapija, se izvodi alogenim transferom, u kome su ćelije izolovane i/ili na drugi način pripremlјene iz subjekta koji nije subjekt koji treba da primi ili koji konačno prima ćelijsku terapiju, npr. to je prvi navedeni subjekat. U takvim slučajevima, ćelije se zatim primenjuju drugom subjektu, npr. drugom subjektu iste vrste. U pojedinim slučajevima, prvi i drugi subjekat su genetički identični. U pojedinim slučajevima, prvi i drugi subjekat su genetički slični. U pojedinim slučajevima, drugi subjekat eksprimira istu HLA klasu ili supertip kao i prvi subjekat.

[0368] Ćelije mogu biti primenjene na bilo koji pogodan način, na primer, bolusnom infuzijom, injciranjem, npr. intravenskim ili subkutanim injekcijama, intraokularnom injekcijom, periokularnom injekcijom, subretinalnom injekcijom, intravitrealnom injekcijom, trans-septalnom injekcijom, subskleralnom injekcijom, intrahoroidnom injekcijom, intrakamernom injekcijom, subkonjektivnom injekcijom, subkonjuntivnom injekcijom, sub-Tenonovom injekcijom, retrobulbarnom injekcijom, peribulbarnom injekcijom ili posteriornom jukstaskleralnom isporukom. U pojedinim slučajevima, ćelije se primenjuju parenteralno, intrapulmonalno i intranazalno, a ukoliko je poželjno za lokalno lečenje, intralezijskom primenom. Parenteralne infuzije obuhvataju intramuskularnu, intravensku, intraarterijsku, intraperitonealnu ili subkutanu primenu. U pojedinim slučajevima, data doza se primenjuje u vidu jedne bolusne primene ćelija, višestrukih bolusnih primena ćelija ili kontinuiranom primenom ćelija u vidu infuzije.

[0369] Za prevenciju ili lečenje oboljenja, odgovarajuća doza može zavisiti od vrste bolesti koja se leči, vrste ćelija ili rekombinantnih receptora, ozbiljnosti i toka oboljenja, da li se ćelije primenjuju u preventivne ili terapijske svrhe, kao i od tipa prethodne terapije, kliničke istorije subjekta i odgovora na ćelije i dalje diskrecionog prava ordinirajućeg lekara. Kompozicije i ćelije se, u pojedinim slučajevima, primenjuju subjektu na pogodan način, jednom ili u vidu serija lečenja.

[0370] U pojedinim slučajevima, ćelije se primenjuju kao deo kombinovanog tretmana, kao što je istovremeno sa ili sekvencijalno sa, po bilo kom redosledu, drugim terapijskim intervencijama, poput antitela ili genetiči izmenjenih ćelija ili receptora ili agensa, kao što je citotoksičan ili terapijski agens. Ćelije se, u pojedinim slučajevima, primenjuju istovremeno sa jednim ili sa više dodatnih terapijskih agenasa ili u vezi sa drugom terapijskom intervencijom, bilo istovremeno ili sekvencijalno, i po bilo kom redosledu. U pojedinim kontekstima, ćelije se primenjuju zajedno sa drugom terapijom u dovolјno bliskom vremenskom periodu, tako da ćelijske populacije pojačavaju efekat jednog ili više dodatnih terapijskih agenasa ili obrnuto. U pojedinim slučajevima, ćelije se primenjuju pre jednog ili više dodatnih terapijskih agenasa. U pojedinim slučajevima, ćelije se primenjuju nakon jednog ili više dodatnih terapijskih agenasa. U pojedinim slučajevima, jedan ili više dodatnih agenasa podrazumevaju citokin, kao što je IL-2, na primer, da bi se pojačala postojanost.

[0371] Jednom kada se ćelije primene subjektu (npr. čoveku), biološka aktivnost ćelijske populacije se, prema pojedinim aspektima, meri bilo kojim od brojnih poznatih postupaka. Parametri za procenu obuhvataju specifično vezivanje ćelija za antigen, in vivo, npr. medicinskim snimanjem, ili ex vivo, na primer, ELISA postupkom ili protočnom citometrijom. U određenim slučajevima, sposobnost ćelija da razore cilјne ćelije može biti izmerena bilo kojim poznatim postupkom koji je poznat u oblasti tehnike, kao što su citotoksični testovi opisani u, na primer, Kochenderfer i saradnici, J. Immunotherapy, 32(7): 689-702 (2009) i Herman saradnici, J. Immunological Methods, 285(1): 25-40 (2004). U određenim slučajevima, biološka aktivnost ćelija takođe može biti izmerena ispitivanjem ekspresije i/ili sekrecije određenih citokina, kao što su CD 107a, IFNγ, IL-2 i TNF. Prema pojedinim aspektima, biološka aktivnost se meri procenom kliničkog ishoda, kao što je smanjenje opterećenja ili obima tumora. Prema pojedinim aspektima, procenjuju se i toksični ishodi, postojanost i/ili širenje ćelija, i/ili prisustvo ili odsustvo imunskog odgovora domaćina.

[0372] U određenim slučajevima, ćelije se modifikuju na bilo koji od brojnih načina, tako da se povećava njihova terapijska ili profilaktička efikasnost. Na primer, genetički konstruisan CAR ili TCR koga eksprimira populacija ćelija, može biti konjugovan direktno ili indirektno preko linkera sa ostatkom na koga se ciljano deluje. Primena konjugovanih jedinjenja, npr. CAR ili TCR, na ostatke na koje ciljano deluje, poznata je u oblasti tehnike. Pogledati, na primer, Wadwa i saradnici, J. Drug Targeting 3: 111 (1995) i U.S. Patent 5,087,616.

[0373] Obezbeđene su takođe farmaceutske kompozicije ili formulacije za upotrebu u takvim postupcima, koje su u pojedinim slučajevima, formulisane u skladu sa obezbeđenim postupcima obrade, kao što je u zatvorenom sistemu u kome se izvode drugi koraci obrade, odnosno kao što je na automatizovan ili delimično automatizovan način.

[0374] U pojedinim slučajevima, ćelije i kompozicije se primenjuju subjektu u obliku farmaceutske kompozicije ili formulacije, kao što je kompozicija koja sadrži ćelije ili ćelijske populacije i farmaceutski prihvatlјiv nosač ili ekscipijens.

[0375] Izraz "farmaceutska formulacija" se odnosi na preparat koji je u takvom obliku da je omogućeno da biološka aktivnost aktivnog sastojka koji se u njemu nalazi bude efektivna, a koji ne sadrži dodatne komponente koje su neprihvatlјivo toksične za subjekta kome se formulacija primenjuje.

[0376] U pojedinim slučajevima, farmaceutske kompozicije dodatno sadrže druge farmaceutski aktivne agense ili lekove, kao što su hemoterapijski agensi, npr. asparaginaza, busulfan, karboplatina, cisplatina, daunorubicin, doksorubicin, fluorouracil, gemcitabin, hidroksiurea, metotreksat, paklitakel, rituksimab, vinblastin, vinkristin itd. U pojedinim slučajevima, agensi se primenjuju u obliku soli, npr. farmaceutski prihvatlјive soli. Pogodne farmaceutski prihvatlјive adicione soli obuhvataju one izvedene iz mineralnih kiselina, kao što su hlorovodonična, bromovodična, fosforna, metafosforna, azotna i sumporna kiselina, kao i iz organskih kiselina, poput vinske, sirćetne, limunske, jabučne, mlečne, fumarne, benzoeve, glikolne, glukonske, ćilibarne i arilsulfonske kiseline, na primer, p-toluensulfonske kiseline.

[0377] "Farmaceutski prihvatlјiv nosač" se odnosi na sastojak u farmaceutskoj formulaciji koji je drugačijji od aktivnog sastojka i nije toksičan za subjekta. Farmaceutski prihvatlјiv nosač obuhvata, ali nije ograničen na, pufer, ekscipijens, stabilizator ili konzervans.

[0378] Prema pojedinim aspektima, izbor nosača je delimično određen konkretnom ćelijom i/ili postupkom primene. Shodno tome, postoje raznovrsne pogodne formulacije. Na primer, farmaceutska kompozicija može sadržavati konzervanse. Pogodni konzervansi mogu podrazumevati, na primer, metilparaben, propilparaben, natrijum benzoat i benzalkonijum hlorid. Prema pojedinim aspektima, koristi se mešavina dva ili više konzervansa. Konzervans ili njegove smeše su obično prisutni u količini od oko 0,0001 tež.% do oko 2 tež.% ukupne kompozicije. Nosači su opisani npr. u Remington's Pharmaceutical Sciences, 16. izdanje, ur. Osol A. (1980). Farmaceutski prihvatlјivi nosači uglavnom nisu toksični za primaoce u korišćenim dozama i koncentracijama i uklјučuju, ali nisu ograničeni na: pufere poput fosfatnog, citratnog i drugih pufera organskih kiselina; antioksidanse, uklјučujući askorbinsku kiselinu i metionin; konzervanse (kao što je oktadecildimetilbenzil amonijum hlorid; heksametonijum hlorid; benzalkonijum hlorid; benzetonijum hlorid; fenol, butil ili benzil alkohol; alkil parabene poput metil ili propil parabena; katehol; rezorcinol; cikloheksanol; 3-pentanol; i m-krezol); polipeptide niske molekulske težine (manje od oko 10 ostataka); proteine, kao što su albumin u serumu, želatin ili imunoglobulini; hidrofilne polimere, poput polivinilpirolidona; aminokiseline kao što su glicin, glutamin, asparagin, histidin, arginin ili lizin; monosaharide, disaharide i druge uglјene hidrate uklјučujući glukozu, manozu ili dekstrine; helatorne agense kao što je EDTA; šećere poput saharoze, manitola, trehaloze ili sorbitola; jone sa suprotnim naelektrisanjem koji obrazuju soli, poput natrijuma; metalne komplekse (npr. proteinske komplekse sa Zn); i/ili nejonske surfaktante kao što je polietilen glikol (PEG).

[0379] Puferski agensi su prema pojedinim aspektima uključeni u kompozicije. Pogodni puferski agensi obuhvataju, na primer, limunsku kiselinu, natrijum citrat, fosfornu kiselinu, kalijum fosfat i razne druge kiseline i soli. Prema pojedinim aspektima, upotrebljavaju se smeše dva ili više puferskih agenasa. Pufeski agens ili njegova smeša obično su prisutni u količini od oko 0,001 tež.% do oko 4 tež.% ukupne kompozicije. Postupci za pripremu farmaceutskih kompozicija koje se mogu primeniti su poznati. Primeri postupaka su detalјnije opisani u, na primer, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott Williams & Wilkins; 21. izd. (1. maj, 2005).

[0380] Formulacije mogu sadržavati vodene rastvore. Formulacija ili kompozicija može takođe sadržavati više od jednog aktivnog sastojka koji je korisan za određenu indikaciju, bolest ili stanje koje se leči sa ćelijama, poželјno onaj sa aktivnostima koje su komplementarne ćelijama, pri čemu ove aktivnosti ne utiču štetno jedna na drugu. Takvi aktivni sastojci su pogodno prisutni u kombinaciji, u količinama koje su efektivne za predviđenu svrhu. Tako, u pojedinim slučajevima, farmaceutska kompozicija dalјe obuhvata druge farmaceutski aktivne agense ili lekove, kao što su hemoterapijski

1

agensi, npr. asparaginaza, busulfan, karboplatin, cisplatin, daunorubicin, doksorubicin, fluorouracil, gemcitabin, hidroksiurea, metotreksat, paklitakel, rituksimab, vinblastin i/ili vinkristin.

[0381] U pojedinim slučajevima, farmaceutska kompozicija sadrži ćelije u količinama koje su efektivne za lečenje ili prevenciju oboljenja ili stanja, kao što je terapijski efektivna ili profilaktički efektivna količina. Terapijska ili profilaktička efikasnost se, u pojedinim slučajevima, prati periodičnom procenom lečenih subjekata. Želјena doza može biti isporučena jednom bolusnom primenom ćelija, višestrukom bolusnom primenom ćelija ili primenom ćelija u vidu kontinuirane infuzije.

[0382] Ćelije i kompozicije mogu biti primenjene upotrebom standardnih tehnika primene, formulacija i/ili uređaja. Primena ćelija može biti autologna ili heterologna. Na primer, imunoreaktivne ćelije ili progenitori mogu biti dobijeni iz jednog subjekta i primenjeni istom subjektu ili drugom, kompatibilnom subjektu. Imunoreaktivne ćelije izvedene iz periferne krvi ili njihovo potomstvo (npr. dobijeno in vivo, ex vivo ili in vitro) mogu biti primenjene lokalizovanim injeciranjem, uključujući primenu putem katetera, sistemsko injeciranje, lokalizovano injeciranje, intravensko injeciranje ili parenteralnu primenu. Kada se primenjuje terapijska kompozicija (npr. farmaceutska kompozicija koja sadrži genetički modifikovanu imunoreaktivnu ćeliju), ona će generalno biti formulisana u jedničnom doznom obliku za injeciranje (rastvoru, suspenziji, emulziji).

[0383] Formulacije obuhvataju one za oralnu, intravensku, intraperitonealnu, subkutanu, plućnu, transdermalnu, intramuskularnu, intranazalnu, bukalnu, sublingvalnu ili primenu u vidu supozitorija. U pojedinim slučajevima, ćelijska populacija se primenjuje parenteralno. Termin "parenteralno", kako se ovde upotrebljava, obuhvata intravensku, intramuskularnu, subkutanu, rektalnu, vaginalnu i intraperitonealnu primenu. U pojedinim slučajevima, ćelije se primenjuju subjektu upotrebom periferne sistemske isporuke putem intravenske, intraperitonealne ili subkutane injekcije.

[0384] Kompozicije se u pojedinim slučajevima obezbeđuju u vidu sterilnih tečnih preparata, npr. izotoničnih vodenih rastvora, suspenzija, emulzija, disperzija ili viskoznih kompozicija, koje prema pojedinim aspektima mogu biti puferisane do izabranog pH. Tečni preparati su normalno lakši za pripremu od gelova, drugih viskoznih kompozicija i čvrstih kompozicija. Dodatno, tečne kompozicije su nešto pogodnije za primenu, posebno u odnosu na injekcije. Viskozne kompozicije, sa druge strane, mogu biti formulisane sa odgovarajućim opsegom viskoznosi da bi se obezbedili duži periodi konakta sa specifičnim tkivima. Tečne ili viskozne kompozicije mogu sadržavati nosače, koji mogu biti rastvarači ili medijumi za dispergovanje i koji sadrže, na primer, vodu, fiziološki rastvor, fosfatom puferisan fiziološki rastvor, polioe (na primer, glicerol, propilen glikol, tečni polietilen glikol) i njihove odgovarajuće smeše.

[0385] Sterilni rastvori za injeciranje mogu biti pripremljeni uključivanjem ćelija u rastvarač, kao što je mešavina sa pogodnim nosačem, razblaživačem ili eksipijenskom poput sterilne vode, fiziološkog rastvora, glukoze, dekstroze i sličnog. Kompozicije mogu sadržavati pomoćne supstance kao što su agensi za vlaženje, dispergovanje ili emulgovanje (npr. metilceluloza), agensi za puferisanje pH, aditivi za pojačavanje želatinoznosti ili viskoznosti, konzervansi, agensi za ukus i/ili boju, u zavisnosti od puta primene i pripreme koja je željena. Prema pojedinim aspektima, za pripremu odgovarajućih preparata mogu biti konsultovani standardni tekstovi.

[0386] Za poboljšanje stabilnosti i sterilnosti kompozicija mogu biti dodati različiti aditivi, uključujući antimikrobne konzervanse, antioksidanse, helatorne agense i pufere. Prevencija delovanja

2

mikroorganizama može biti obezbeđena raznim antibakterijskim i antifungalnim agensima, na primer, parabenima, hlorobutanolom, fenolom i sorbinskom kiselinom. Produžena apsorpcija farmaceutskog oblika za injeciranje može biti postignuta upotrebom agenasa koji odlažu apsorpciju, na primer, aluminijum monostearata i želatina.

[0387] Formulacije koje su za upotrebu u in vivo primenama generalno su sterilne. Sterilnost može lako biti postignuta, npr. filtracijom kroz filtracione membrane za sterilizaciju.

[0388] Među koracima obrade može biti uključeno i formulisanje takvih kompozicija.

[0389] Kako se ovde upotrebljava, jednine oblika obuhvataju množinu pojmova ukoliko kontekst jasno ne ukazuje drugačije. Na primer, jednina označava „najmanje jedan“ ili „jedan ili više“. Podrazumeva se da ovde opisani aspekti i varijacije uklјučuju aspekata i varijacija koji se „sastoje od“ i/ili „suštinski se sastoje od“.

[0390] Kroz ovaj opis, razni aspekti opisanih tema opisa su predstavljeni u formatu opsega. Podrazumeva se da je opis u vidu formata opsega naveden uglavnom radi praktičnosti i sažetosti i da ga ne treba tumačiti kao ograničenje u vezi opisane teme koje nije fleksibilno. Shodno tome, opis opsega treba tumačiti tako da su njime specifično opisani svi podopsezi, kao i pojedinačne numeričke vrednosti unutar tog opsega. Na primer, kada je obezbeđen opseg vrednosti, podrazumeva se da je svaka obuhvaćena vrednost između gornje i donje granice opsega i bilo koja druga navedena ili uključena vrednost u takvom navedenom opsegu obuhvaćena unutar opisane teme. Gonje i donje granice ovih manjih opsega mogu biti nezavisno uključene u još manje opsege i takođe su obuhvaćene opisanim pojmom, koji se odnosi na bilo koji specifičnu granicu u navedenom opsegu koja je isključena. Kada navedeni opseg uključuje jednu ili obe od granica, opsezi koji isključuju bilo jednu ili obe od granica su takođe uključeni u opis pojma. Navedeno se primenjuje bez obzira na širinu opsega.

[0391] Termin "oko/približno", kako se ovde upotrebljava, odnosi se na uobičajen opseg grešaka za odgovarajuću vrednost koju stručnjak iz oblasti tehnike lako može prepoznati. Upućivanje na vrednost ili parametar sa "oko" ovde obuhvata (i opisuje) slučajeve koji su usmereni na tu vrednost ili parametar sam po sebi. Na primer, opis koji se odnosi na "oko X" uklјučuje opis "X".

[0392] Kako se ovde upotrebljava, kompozicija se odnosi na bilo koju mešavinu dva ili više proizvoda, supstanci ili jedinjenja, uklјučujući ćelije. To može biti rastvor, suspenzija, tečnost, prah, pasta, vodeni, nevodeni rastvor ili bilo koja njihova kombinacija.

[0393] Kako se ovde upotrebljava, navođenje da je ćelija ili populacija ćelija „pozitivna“ na određeni marker, odnosi se na prisustvo određenog markera koje se može detektovati na ili u ćeliji, obično na površinski marker. Kada se odnosi na površinski marker, termin se odnosi na prisustvo ekspresije na površini ćelije, a koje može biti detektovano protočnom citometrijom, na primer, bojenjem sa antitelima koja se specifično vezuju za marker i detekovanjem navedenog antitela, pri čemu se bojenje može detektovati protočnom citometrijom na nivou koji je značajno iznad bojenja koje se detektuje izvođenjem iste procedure sa podudarnom izotipskom kontrolom, a pod drugačije identičnim uslovima, i/ili je na nivou koji je značajno sličan onom koji se detektuje kod ćelija za koje je poznato da su pozitivne na marker i/ili je na nivou znatno višem u odnosu na onaj koji se detektuje kod ćelije za koju je poznato da je negativna na marker.

[0394] Kako se ovde upotrebljava, navođenje da je ćelija ili populacija ćelija „negativna“ za određeni marker, odnosi se na odsustvo značajnog prisustva određenog markera koje se može detektovati na ili u ćeliji, obično na površinski marker. Kada se odnosi na površinski marker, termin se odnosi na odsustvo ekspresije na površini ćelije, a koje može biti detektovano protočnom citometrijom, na primer, bojenjem sa antitelima koja se specifično vezuju za marker i detekovanjem navedenog antitela, pri čemu se bojenje ne može detektovati protočnom citometrijom na nivou koji je značajno iznad bojenja koje se detektuje izvođenjem iste procedure sa podudarnom izotipskom kontrolom, a pod drugačije identičnim uslovima, i/ili na nivou koji je značajno niži od onog koji se detektuje kod ćelija za koje je poznato da su pozitivne na marker, i/ili na nivou koji je značajno sličan nivou koji se detektuje kod ćelija za koje je poznato da su negativne na marker.

PRIMERI

[0395] Primeri koji slede su uključeni samo u ilustrativne svrhe i nije predviđeno da ograničavanju obim pronalaska.

Primer 1: Virusna transdukcija primarnih humanih T-ćelija u centrifugalnoj komori

[0396] Ovaj primer pokazuje transdukciju izolovanih primarnih humanih T-ćelija sa rekombinantnim virusnim vektorom koji kodira himerni antigeni receptor (CAR), pri čemu je transdukcija inicirana uz centrifugalnu silu u suštinski krutoj cilindričnoj centrifugalnoj komori, prema slučaju koji je ovde obezbeđen. T-ćelije su izolovane pozitivnom selekcijom iz humanog uzorka koji je predstavljao proizvod afereze.

[0397] Dobijene ćelije su aktivirane upotrebom anti-CD3/CD28 reagensa. Radi inicijacije transdukcije, ćelije su nakon aktivacije inkubirane sa virusnom česticom koja sadrži genom virusnog vektora koji kodira anti-CD 19 CAR, pod raznim uslovima.

[0398] U jednoj grupi uslova ("Sepax"), transdukcija je započeta inkubiranjem ćelija u šuplјini centrifugalne komore (Biosafe SA, A200), uz centrifugiranje u Sepax® 2 jedinici za obradu(Biosafe SA). Tečna kompozicija od 50 ml koji je sadržavala 50 x 10<6>izolovanih ćelija je spojena, u prenosnom pakovanju od 300 ml, sa 50 ml tečne kompozicije koja je sadržavala čestice virusnog vektora. Upotrebom Sepax® sistema za pomeranje klipa komore, kompozicija je uvučena u šuplјinu centrifugalne komore. Takođe je uvučeno 100 ml vazduha, čime je povećana zapermina šupljine na 200 ml, što je dovelo do pada u odnosu zapremine tečnosti u šupljini i unutrašnje površine šuplјine. Komora je centrifugirana povećanjem brzine na približno 4600 o/min, na Sepax® 2 jedinici, što je odgovaralo relativnoj g sili (relativna centrifugalna sila (RCF)) na unutrašnjem bočnom zidu šupljine za obradu iz komore od približno 600. Trajanje centrifugiranja na ovoj brzini je iznosilo 60 minuta.

[0399] Za analizu druge grupe uslova („VueLife“), kompozicija koja je sadržavala 25 x 10<6>ćelija i istu koncentraciju čestica virusnog vektora u zapreminskom odnosu od 1:1, inkubirana je u 50 ml, u kesi za centrifuge i u adapteru centrifuge CI-50, uz centrifugiranje sa približnom relativnom centrifugalnom silom (RCF) na ćelijama od približno 1000 g tokom 60 minuta. Kesa sa manjom zapreminom u poređenju sa komorom za centrifugu je upotrebljena da bi se dozvolilo centrifugiranje pri relativnoj centrifugalnoj sili na ćelijama od 1000 g. Kontrole su uklјučivale „netransdukovan“ uzorak (ista

4

koncentracija ćelija je inkubirana tokom istog vremena u ploči sa 24 ležišta, bez virusa i bez centrifugiranja, kao i „necentrifugiran“ kontrolni uzorak („0xg“) (ista koncentracija ćelija/virusa je inkubirana tokom istog vremena u istoj ploči bez centrifugiranja). U svaku grupu uslova je uključen i polikatjon. Nakon centrifugiranja (ili uporedive inkubacije "bez centrifugiranja"), kompozicije su inkubirane tokom 24 sata na 37 stepeni C do potpune transdukcije.

[0400] Ćelije su umnožene i efikasnost transdukcije za svaki od odgovarajućih uslova je izračunata 6. dana nakon izolacije u vidu procenta CD3<+>T-ćelija sa kodiranim CAR koji je bio eksprimiran na površini (što je detektovano protočnom citometrijom, upotrebom antitela specifičnog za CAR). Rezultati su prikazani na Sl. 1A. Kao što je prikazano, veća efikasnost transdukcije je uočena nakon inicijacije transdukcije inkubiranjem ćelija u šuplјini centrifugalne komore pod rotacijom, u poređenju sa efikasnošću u kesama za centrifugiranje (VueLife®) i kontrolama. SL.1B prikazuje umnožavanje ćelija (naznačeno brojem dupliranja populacije) tokom perioda od šest dana.

Primer 2: Transdukcija primarnih humanih T-ćelija u centrifugalnoj komori sa različitim odnosima zapremine tečnosti i površine

[0401] Efikasnost transdukcije nakon inicijacije transdukcije u komori centrifuge, procenjena je pod različitim uslovima, upotrebom istog broja ćelija i infektivnih jedinica virusa, ali i različitih odnosa zapremine tečnosti prema unutrašnjoj površini šuplјine komore. Ćelije su generalno pripremlјene i stimulisane kao što je opisano u Primeru 1. Svi uslovi inicijacije transdukcije su podrazumevali odnos IU:ćeliji od 2:1 i ukupan broj ćelija od 100 x 10<6>.

[0402] Za prvi uzorak („5,1ml/kv.in.“ što podrazumeva odnos tečnosti po kvadratnom inču unutrašnje površine šuplјine od 5,1:1 ml, upotrebljen u ovim uslovima), 100 x 10<6>ćelija, u zapremini tečnosti od 100 ml, spojen je sa 100 ml tečne kompozicije koji je sadržavala čestice virusnog vektora. Za drugi uzorak („2,5 ml/kv.in.“, što se odnosi na 2,5 ml tečnosti po kvadratnom inču površine šuplјine i što je upotrebljeno u ovim uslovima), 50 ml tečne kompozicije sa istim brojem ćelija je spojeno sa 50 ml tečnog kompozicije koji je sadržavala čestice virusnog vektora. U svakom od slučajeva, uklјučen je i polikatjon tako da je njegova finalna koncentracija tokom centrifugiranja iznosila 10 µg/ml. Odgovarajuće tečne kompozicije (i za drugi uzorak, 100 ml vazduha) uvučene su i inkubirane u šupljini komore dizajnirane za držanje tečnosti. U svakom od slučajeva, komora je centrifugirana (ubrzavanjem) u Sepax® 2 jedinici za obradu uz brzinu od 4600 o/min, što odgovara RCF na bočnom zidu unutrašnje šupljine od približno 600 g, tokom 60 minuta. Uzorci su zatim inkubirani tokom dodatnih 24 sata na 37 stepeni, radi završetka transdukcije.

[0403] Ćelije su umnožene i efikasnost transdukcije je izračunata 6. dana nakon izolacije, određivanjem procenta CD3<+>T-ćelija sa površinskom ekspresijom CAR, što je detektovano kao što je prethodno opisano. Rezultati su prikazani na Sl.2. Kao što je prikazano, kod inicijacije transdukcije u centrifugalnoj komori upotrebom istog broja ćelija i infektivnih jedinica virusa, utvrđena je veća efikasnost transdukcije kada je upotrebljen niži odnos zapremine tečnosi kompozicije u šupljini i unutrašnje površine šuplјine.

Primer 3: Transdukcija primarnih humanih T-ćelija u centrifugalnoj komori

[0404] Druga studija je uporedila efikasnost transdukcije pod raznim uslovima, uklјučujući transdukciju u skladu sa slučajevima ovde obezbeđenih postupaka, u centrifugalnoj komori, upotrebom raznih odnosa zapremine tečnosti i površine šuplјine. Humane T-ćelije su izolovane iz proizvoda afereze i stimulisane su kao što je prethodno opisano.

[0405] Nakon stimulacije, 80 x 10<6>ćelija je inkubirano pod varijabilnim uslovima, uključujući transdukciju sa virusnim vektorom koji kodira CAR. Polikatjon je bio uklјučen u sve uzorke.

[0406] Za uslove pod kojima je transdukcija inicirana u komori centrifuge, 80 x 10<6>ćelija je inkubirano sa virusom koji je sadržavao vektor, u šuplјini komore, sa odnosom od 2 IU virusa po ćeliji. Inkubacija je izvršena tokom centrifugiranja komore, upotrebom Sepax® 2 sistema za obradu tokom 60 minuta, pri čemu je RCF na bočnom zidu unutrašnje šuplјine iznosila oko 600 g. Pod jednom grupom uslova ("Sepax (0,1 IU/ćeliji/ml)", sa zapreminom tečnosti od 0,5 ml po kvadratnom inču unutrašnje površine šuplјine), radi centrifugiranja, ćelije i virus su uvučeni u šuplјinu komore u ukupnoj zapremini tečnosti od 20 ml; u šuplјinu je uvučeno i 180 ml vazduha. Pod drugim setom uslova ("Sepax (0,01 IU/ćeliji/ml"), sa zapreminom tečnosti od 5,1 ml po kvadratnom inču unutrašnje površine šuplјine), isti broj ćelija i infektivnih jedinica virusa uvučen je u zapremin tečnosti od 200 ml.

[0407] U zasebnim uslovima, „1000 g u ploči“, transdukcija ćelija u prisustvu virusa (2 IU/ćeliji) je inicirana u ploči sa 24 ležišta, centrifugiranjem sa RCF na ćelijama od približno 1000 g tokom 60 minuta. Upotrebljene su i „netransdukovana“ negativna kontrola (inkubacija u ploči sa 24 ležišta bez virusa ili centrifugiranja) i kontrola „bez centrifugiranja“ (inkubacija sa virusom u odnosu od 2 infektivne jedinice (IU) po ćeliji i bez centrifugiranja u istoj ploči sa 24 ležišta). Ćelije su inkubirane tokom 24 sata na 37 stepeni C do potpune transdukcije.

[0408] Ćelije su umnožene i efikasnost transdukcije za svaki uzorak izračunata kao procenat CD3<+>ćelije koje eksprimiraju CAR na svojoj površini, kao što je opisano u Primerima 1 i 2. Rezultati su prikazani na Sl.3. Kao što je prikazano, transdukcija je utvrđena nakon inicijacije transdukcije sa rotacijom u komori centrifuge i na ploči sa 24 ležišta, u poređenju sa kontrolnim uslovima. Za inicijaciju transdukcije u komori centrifuge, utvrđena je veća efikasnost transdukcije sa nižim odnosom zapremine tečnosti i unutrašnje površine šuplјine komore.

Primer 4: Procena broja kopija vektora (VCN) nakon transdukcije u centrifugalnoj komori

[0409] Broj kopija integrisanog virusnog vektora (VCN) je procenjen nakon transdukcije inicirane pod određenim uslovima u studiji koja je opisana u Primeru 3. VCN po ćeliji je određivan za retrovirusni vektor dobijen sa SGF, upotrebom kvantitativnog PCR-a u realnom vremenu (RT-qPCR). Prosečan VCN je određen qPCR-om specifičnim za virusni genom među svim ćelijama u kompoziciji nakon transdukcije ("VCN/ćeliji"), a odvojeno samo među transdukovanim ćelijama (ćelije koje eksprimiraju transgene) ("VCN/CAR<+>). Rezultati su predstavlјeni na Sl. 4. Na grafiku prikazanom na Sl. 4, oznaka "Sepax 20" se odnosi na zapreminu tečnosti od 20 ml koja se upotrebljena u šuplјini komore tokom inicijacije transdukcije; rezultati koji su tako obeleženi su iz iste studije i sa istim uslovima koji su označeni kao "Sepax (0,1 IU/ćeliji/ml)" u Primeru 3 (za koji je određena efikasnost transdukcije od 25%). Slično navedenom, oznaka "Sepax 200" se odnosi na zapreminu tečnosti od 200 ml koja je upotrebljena u šuplјini komore tokom inicijacije transdukcije; rezultati koji su tako obeleženi su iz iste studije i sa uslovima koji su označeni kao "Sepax (0,01 IU/ćeliji/ml)" u Primeru 3 (za koje je određena efikasnost transdukcije od 7%). Kao što je prikazano, kada je transdukcija inicirana inicijacijom transdukcije ćelija u cilindričnoj, suštinski krutoj komori centrifuge pri rotaciji, povećana efikasnost transdukcije nije bila povezana sa povećanjem broja vektorskih kopija. U ovom istraživanju, uslovi koji proizvode povećanu efikasnost transdukcije takođe su proizveli smanjenu prosečnu broja kopija vektora po ćeliji.

Primer 5: Transdukcija upotrebom Sepax® 2 sistema za obradu

[0410] U procesu za primer, T-ćelije su transdukovane sa česticama virusnog vektora na automatizovan način, u centrifugalnoj komori integrisanoj u sistem za jednokratnu upotrebu i u Sepax® 2 sistem za obradu (Biosafe SA). Komora je sastavni deo sterilnog zatvorenog sistema za jednokratnu upotrebu, koji predstavlja komplet za jednokratnu upotrebu koji prodaje kompanija Biosafe SA, za upotrebu u regenerativnoj medicini. Komplet je konfigurisan tako da sadrži serije sistema cevi koji povezuju komoru sa serijama kontejnera, uz opštu konfiguraciju prikazanu na Sl.5 i/ili Sl.7. Komora (1) sadrži zadnji zid (13) na kome se nalazi dovod/odvod (6), krut bočni zid (14) i klip (2), koji zajedno definišu unutrašnju šuplјinu (7) komore. Sistem je konfigurisan tako da uklјučuje razne kontejnere obeležene kao: Izlazna kesa, Kesa za otpad, Ulazna kesa i dve kese sa razblaživačem (Kesa za razblaživač 1 i Kesa za razblaživač 2), kao i razne konektore, uključujući zaustavne i obične venitle. Stezalјke (5) su uklјučene za blokiranje protoka između različitih delova sistema preko sistema cevi. U pojedinim slučajevima, sistem uklјučuje sterilni filter sa ispustom luer adaptera (15) i udubljenim poklopcem luer adaptera (16), kroz koji se gas, npr. vazduh, može stalno uvlačiti na sterilan način, kada se poklopac oslobodi/ukloni. Sistem je povezan sa Sepax® 2 jedinicom za obradu, uklјučujući centrifugu i kabinet za komponente kućišta.

[0411] U postupku za primer, Ulazna kesa sadrži kompoziciju koja sadrži ćelije koje je potrebno transdukovati. Kesa sa razblaživačem 1 sadrži čestice virusnog vektora, polikatjon i medijum. U pojedinim slučajevima, u kesi sa vektorskim česticama se nalazi vazduh. Na primer, u alternativnom slučaju, kontejner sa vazduhom i/ili dodatnim medijumom može biti povezan na ovoj poziciju umesto i/ili pored kompozicije sa virusima.

[0412] Korisnik navodi procesnu jedinicu preko korisničkog interfejsa da treba pokrenuti novi program i unosi razne parametre u sistem, uklјučujući početnu zapreminu (između 20-900 ml), finalnu zapreminu (između 20-220 ml), intermedijernu zapreminu (između 10-100 ml), zapreminu za razblaživanje (između 50-220 ml), silu u g (između 100-1600 ili između 200-3200 g) (RCF na bočnom zidu unutrašnje šuplјine komore za obradu) i vreme sedimentacije (između 120 i 3600 sekundi). Korisnik navodi sistem i da proces treba pokrenuti, unosi identifikacione informacije za subjekta iz koga su izvedene ćelije i navodi sistem da je unos završen, što zahteva od sistema da izvede testiranje kompleta zatvorenog sistema.

[0413] Sa svim odgovarajućim zaustavnim ventilima u zatvorenoj pozicijiu, stezalјke blokiraju kretanje tečnosti između sistema cevi i Kese sa razblaživačem 1, Kese za otpad, Ulazne kese i Izlazne kese (za prikuplјanje proizvoda koji sadrži ćelije), tim redom, nakon čega sledi otvaranja i automatizovan program se inicira komunikacijom sa sistemom od strane korisnika.

[0414] Kao odgovor, sistem prouzrokuje, na automatizovan način, kretanje tečnosti i/ili gasa između raznih komponenti zatvorenog sistema, prouzrokovanjem otvaranja i zatvaranja ventila i kretanjem klipa da bi se promenila zapremina šuplјine. Ovo prouzrokuje ponovno postavlјanje zaustavnog ventila, da bi se omogućio protok između Izlazne kese i unutrašnje šuplјine komore kroz otvor koji predstavlja dovod/odvod, i dalje spuštanje klipa unutar centrifugalne komore, čime se povećava zapremina šuplјine i uvlači zapremina (početna zapremina definisana od strane korisnika) kompozicije ćelija i čestica virusnog vektora iz Ulazne kese u šuplјinu za obradu, kroz otvor dovoda/odvoda na zadnjem zidu komore.

[0415] Sistem navodi centrifugu da centrifugira komoru tokom 120 sekundi na 500 g, navodi izduvavanje zapremine od 20 ml iz šupljine u Ulaznu kesu da bi se ona isprala i uvlači istu zapreminu nazad u šupljinu. Sistem dalje navodi centrifuge da centrifugira komoru tokom 180 sekundi na 500 g, što prouzrokuje sedimentaciju. Sistem ponovo postavlјa zaustavne ventile tako da dozvole protok tečnosti i/ili gasa između šuplјine i Kese za otpad i dalje ostvaruje izvlačenje tečnosti iz šupljine u Kesu za otpad, ostavljajući intermedijernu zapreminu definisanu od strane korisnika unutar šupljine.

[0416] Sistem prouzrokuje rotaciju zaustavnog ventila da bi se blokiralo kretanje tečnosti između sistema cevi i Kese za otpad. Sistem prouzrokuje unos tečne kompozicije koja sadrži čestice virusnog vektora i, ukoliko je primenlјivo, vazduha (zajedno, u zapremini za razblaživanje koje je definisana od strane korisnika) iz Kese sa razblaživačem 1 u šuplјinu komore. Ovi koraci zajedno ostvaruju unos ulazne kompozicije koja sadrži ćelije koje je potrebno transdukovati i čestica virusnog vektora, a u pojedinim slučajevima, i vazduha, u šuplјinu. U pojedinim slučajevima, ukupna zapremina šuplјine je 200 ml, na primer, uklјučujući zapreminu tečnosti od 200 ml ili uklјučujući zapreminu tečnosti manju od 200 ml i ostatak zapremine šuplјine ispunjen vazduhom.

[0417] Centrifugiranje komore se vrši tokom vremena sedimentacije definisanog od strane korisnika kao g-sila, što rezultuje iniciranjem transdukcije ćelija u ulaznoj kompoziciji sa česticama virusnog vektora. U alternativnom slučaju, zapremina vazduha i/ili medijuma se uvlači u šuplјinu iz druge kese na poziciji Kese sa razblaživačem 1 i 2, pre centrifugiranja. U alternativnom slučaju, vazduh se uvlači pre centrifugiranja kroz filter sa luer adapterom (15), npr. tako što korisnik otvori stezalјku (5) blokirajući kretanja tečnosti između filtera (15) i sistema cevi i šuplјine (7) i oslobađanjem poklopca sa udubljenjem (16), što omogućava vazduhu koji je ostao u komori da prođe kroz filter iz okoline. U pojedinim slučajevima, kretanje vazduha je automatizovano od strane sistema, na primer, na osnovu dodatne ulazne zapremine vazduha koja je definisana od strane korisnika i programirana u sistemu, a korisnik navodi sistem da vazduh može biti preuzet u defnisanoj zapremini vazduha. U pojedinim slučajevima, vazduh, ukoliko je prisutan, ispušta se kroz sistem cevi i filter bez poklopca (15) sličnim postupkom nakon centrifugiranja.

[0418] Kada sistem to zahteva, korisnik zatvara stezaljku koja blokira kretanje tečnosti između Kese sa razblaživačem 1 i sistema cevi i otvara stezaljku koja blokira kretanje tečnosti između Kese sa razblaživačem 2 i sistema cevi. Sistem prouzrokuje kretanje tečnosti iz Kese sa razblaživačem 2 u šuplјinu za obradu, otvaranjem odgovarajućeg zaustavnog ventila i pokretanjem klipa tako da se u šupljinu uvuče zapremina tečnosti iz Kese sa razblaživačem 2 koja je jednaka količini potrebnoj da se dobije ukupna zapremna tečnosti u komori koja je jednaka finalnoj zapremnini koju je definisao korisnik. Sistem zatim prouzrokuje mešanje tečnosti u šupljini tokom 60 sekundi, a zatim prenosi tečnost iz unutrašnje šuplјine u Izlaznu kesu, koja na taj način sadrži izlaznu kompoziciju sa ćelijama za koje su se virusne čestice vezale i/ili koje su inficirane virusnim vektorom. Ovakve ćelije se dalje uglavnom inkubiraju radi završetka transdukcije, na primer, na 37 stepeni C, na primer, tokom 24 sata.

Primer 6: Procena rasta i vijabiliteta pri različitim centrifugalnim silama

[0419] Procenjivano je i dejstvo centrifugalne sile koja je upotrebljena za iniciranje transdukcije ćelija u komori prema određenim obezbeđenim slučajevima na ćelije tokom centrifugiranja. Umnožavanje ćellija i ćelijska vijabilnost su procenjivane nakon izlaganja različitim centrifugalnim silama.

[0420] T-ćelije su izolovane i stimulisane suštinski kao što je opisano u Primeru 1. Na dan 4, razne, pri čemu je svaka pojedinačno sadržavala ćelije, uvučene su u šuplјinu centrifugalne komore Sepax® 2 jedinice za obradu (Biosafe SA), a potom su podvrgnute centrifugiranju pri raznim centrifugalnim silama. Preciznije, uzorci su centrifugirani tokom 60 minuta u komori (A-200F) koja je bila sastavni deo kompleta za jednokratnu upotrebu, upotrebom sistem za obradu Sepax® 2, na približno 4600 o/min, približno 6000 o/min i približno 7400 o/min, tim redom), čime je postignuta RCF na unutrašnjoj površini bočnog zida šuplјine od približno 600 g 1000 g i 1600 g, tim redom. Kao kontrola, uzorak ćelija je posebno uvučen u šuplјinu centrifuge, ali nije centrifugiran (uslov sa 0 g). U svakom slučaju, nakon centrifuge (ili inkubacije bez centrifugiranja), ćelije su inkubirane na 37 °C, sa 5% CO2, do 10.dana. U raznim tačkama tokom procesa, praćeni su proliferacija ćelija (dupliranja populacije u poređenju sa brojem ćelija na dan 0) i vijabilnost. Preciznije, ova merenja su vršena u danima 0, 3, 4, 5, 6, 7 i 10. Rezultati su prikazani na Sl.6

[0421] Kao što je prikazano na Sl.6A i Sl.6B, tim redom, utvrđeno je da centrifugiranje pri različitim brzinama nije imalo značajnog uticaja na umnožavanje ćelije („udvostručenja populacije“) ili na vijabilnost tokom 10 dana. Rezultati pokazuju da su T-ćelije mogle tolerisati centrifugiranje sa relativnim centrifugalnim silama od najmanje do ili oko 1600 g, izmerenim na bočnom zidu šuplјine komore, što odgovara približno istoj prosečnoj sili na ćelijama na površini kontakta ćelija i tečnosti, pod uslovima koji su upotrebljeni za inicijaciju transdukcije u slučajevima koji su ovde obezbeđeni, bez značajnih promena u umnožavanju ili vijabilnosti koji su se mogli detektovati.

Primer 7: Korak procesa transdukcije upotrebom inicijacije transdukcije u generalno cilindričnoj centrifugalnoj komori

[0422] Ovaj primer opisuje opšte parametre koraka procesa transdukcije koji su upotrebljeni u studijama opisanim u Primerima 8-10. Transdukcija ćelija sa rekombinantnim virusnim vektorom koji kodira himerni antigeni receptor (CAR) je inicirana u centrifugalnoj komori prema obezbeđenim primerima.

[0423] CD4<+>/ CD8<+>T-ćelije su izolovane pozitivnom selekcijom iz humanog uzorka koji je predstavljao proizvod afereze. Izolovane ćelije su sačuvane zamrzavanjem, pa su odmrznute na 37 °C. Odmrznute ćelije su pre započinjanja transdukcije aktivirane upotrebom CD3/CD28 smole u prisustvu IL-2 (100 IU/ml) tokom 72 sata na 37 °C. U pojedinim slučajevima, razni aspekti koraka pripreme, izolacije i/ili aktivacije afereze su takođe izvedeni u šuplјini centrifugalne komore prema obezbeđenim primerima, upotrebom sistema Sepax® 2, npr. kao što je opisano u Primeru 11.

[0424] U pripremi za transdukciju, centrifugalna komora za obradu (1) (A-200F) koja je bila sastavni deo sterilnog kompleta za jednokratnu upotrebu koga prodaje kompanije Biosafe SA za upotrebu u regenerativnoj medicini, suštinski kao što je prikazano na Sl.7, povezana je sa Sepax® 2 jedinicom za obradu, koja je na taj način mogla da obezbedi komori centrifugalnu silu i aksijalno pomeranje (omogućava se kontrola dimenzija unutrašnje šuplјine). (US Patent No.6,733,433).

[0425] Za inicijaciju transdukcije, izvedeni su sledeći koraci.

[0426] Za generisanje kompozicije koja sadrži čestice virusnog vektora za sterilno mešanje sa aktiviranim ćelijama u komori centrifuge, kompletan medijum (koji sadrži medijum za hematopoetske ćelije bez seruma, sa 5% humanog seruma i IL-2, kao i polikatjon u količini dovolјnoj da finalna koncentracija tokom inicijacije transdukcije iznosi 10 µg/ml), čestice virusnog vektora sa naznačenim brojem ili relativnim brojem infektivnih jedinica (IU) (na primer, 1,8 IU/ćeliji ili 3,6 IU/ćeliji), i, kada je to primenljivo, vazduh, aseptično su prebačeni u kesu za centrifugu, koja je na kraju bila sterilno povezana sa kompletom na poziciji Kese sa razblaživačem radi unosa, kao što je opisano u nastavku teksta.

[0427] Kesa sa kulturom koja sadrži aktivirane ćelije, sterilno je povezana sa kompletom za jednokratnu upotrebu preko sistema cevi na poziciju „Ulazne kese“, prikazanoj na Sl.5 i Sl.7. Na Sepax® 2 jedinici za obradu je pokrenut protokol automatizovanog „razblaživanja“. Tako, kretanjem klipa, želјeni broj ćelija (kao što je naznačeno u pojedinačnim opisanim studijama, na primer, 50 x 10<6>, 100 x 10<6>ili 200 x 10<6>ćelija) prebačen je iz Kese za kulturu u Kesu za proizvod na poziciji "Izlazne kese" prikazane na Sl.

5 i Sl.7, preko šuplјine komore.

[0428] Da bi se generisala ulazna kompozicija i sa ćelijama i sa virusom (i gde je to primenljivo, vazduhom) za unos u komoru i transdukciju, kesa za proizvod koja je sadržavala željeni broj aktiviranih ćelija je zatim sterilno povezana sa pozicijom za Ulaznu kesu kao što je prikazano na Sl.5 i Sl.7. Kesa za centrifugiranje koja je sadržavala virusne čestice, medijum i opciono vazduh, sterilno je vezana na poziciju Kese sa razblaživačem 1, prikazanu na slikama. Automatizovan ciklus pranja je pokrenut na Sepax® 2, čime je olakšano uvlačenje kompozicije koja je sadržavala ćelije u šuplјinu komore, centrifugiranje kompozicije na Sepax® 2 uz približnu RCF na unutrašnjem zidu šuplјine od 500 g, da bi se istaložile ćelije i uklonila odgovarajuća zapremina tečnosti koja je bila potrebna da bi se postigla željena zapremina od, npr. 10 ml. Sadržaj kese za centrifugiranje na poziciji Kese sa razblaživačem 1, koji je uključivao virusne čestice, medijume, polikatjon i, gde je to bilo primenljivo, vazduh, uvučen je zatim u šuplјinu komoru sa ćelijama. Ovaj postupak je na taj način ostvario smanjenje zapremine ćelijske kompozicije i spojio smanjenu zapreminu ćelija sa kompozicjiom koja je sadržavala viruse i, kada je to bilo primenljivo, vazduh. Dobijena zapremina od 200 ml (koja je sadržavala ćelije, virus i opciono vazduh) zatim je preneta u kesu za centrifugirenja na poziciji "Izlazna kesa" kompleta, kao što je prikazano na Sl.5 i Sl.7.

[0429] Da bi se inicirala transdukcija, kesa za centrifugiranje koja je sadržavala 200 ml virusa, ćelije i vazduha, tamo gde je to bilo moguće, uklonjena je i sterilno vezana na poziciju Ulazne kese u kompletu. Kesa sa kompletnim medijumom je sterilno spojena sa kopletom na poziciji „Kese sa razblaživačem“. Kesa sa ćelijskom kulturom sterilno je takođe povezana sa sistemom na poziciju "Izlazna kesa". Korisnik je preko komandne table naveo sistem da je potrebno pokretanje automatizovanog protokola za inicijaciju transdukcije. Preciznije, program je prouzrokovao prenos zapremine od 200 ml koja je sadržavala ćelije, virus, i gde je to naznačeno, vazduh, kroz sistem cevi u šuplјinu komore, kretanjem klipa. Program je nastavlјen centrifugiranjem sadržaja u šuplјini komore (ukupna zapremina 200 ml) uz naznačenu silu, da bi se inicirala transdukcija ćelija česticama virusnog vektora. U pojedinim slučajevima, ručni laserski tahometar je upotrebljen da bi se potvrdio broj obrtaja po minutu (rpm) na raznim postavlјenim tačkama Sepax® jedinice, upotrebom poznatih postupaka. Osim kada je specifično navedeno, centrifugirenja je izvedeno sa naznačenim brzinama tokom 1 sata (3600 s), uz dodatno vreme ubrzavanja i usporavanja. Nakon centrifugiranja i kada je zahtevano od strane sistema, korisnik je zatvarao stezaljke da bi se dozvolilo kretanje tečnosti između šuplјine i Ulazne kese, i otvarao je sterzaljke koje blokiraju kretanje tečnosti između šupljine i kese za proizvod na poziciji Izlazne kese. Nakon naloga korisnika, program je nastavljao ostvarivanje kretanja tečnosti iz komore u Izlaznu kesu.

[0430] Kada je bilo primenljivo, za izbacivanje vazduha, a kada sistem to zatraži, korisnik je otvarao stezaljke koje blokiraju kretanje tečnosti između šuplјine komore i filtera, a program je pokretao izbacivanje vazduha kroz filter.

[0431] Program razblaživanja je zatim izveden na sistemu Sepax® 2, pri čemu su stezaljke blokirale kretanje tečnosti između Kese sa razblaživačem koja je sadržavala medijum i otvorene komore, a program je pokretao pomeranje (otvaranjem zaustavnog(ih) ventila i pomeranjem klipa) odgovarajuće količine tečnosti iz te kese u komoru, kao i mešanje tokom 60 sekundi i dalje prenošenje tečnosti iz šuplјine za obradu u Izlaznu kesu, u odgovarajućoj količini koja je bila potrebna za postizanje finalne zapremine od 200 ml koju je definisao korisnik, imajući u vidu prisustvo vazduha tokom centrifugiranja, ukoliko je bio prisutan.

[0432] Kesa sa kulturom na poziciju Izlazne kese je time sadržavala izlaznu kompoziciju sa ćelijama koje su sadržavala vezane virusne čestice i/ili ćellije inokulirane virusnim genomom. Ćelije su zatim inkubirane u kesi tokom ∼24 sata na 37 stepeni C, sa 5% CO2, do završetka transdukcije. Tokom inicijacije i završetka transdukcije, čestice virusnih vektora su inokulirale ćelije i njihovi genomi su postali integrisani u ćelijske genome, na šta ukazuju različita merenja za efikasnost transdukcije i broj kopija u pojedinačnim primerima.

Primer 8: Inicijacija transdukcije u centrifugalnoj komori sa konstantnim zapreminom i brojem virusnih čestica i sa različitim koncentracijama ćelija

[0433] Kompozicije sa raznim brojevima ćelija i infektivnim jedinicama (IU) virusnih čestica, u konstantnoj zapremini tečnosti, podvrgavane su procesu transdukcije koji je opisan u Primeru 7. U svakom slučaju, pre započinjanja transdukcije, ćelije su prikupljane, prane, izolovane, sačuvane zamrzavanjem i aktivirane kao što je opisano u Primeru 11.

Primer 8A.

[0434] Inicijacija transdukcije i dalјa kultivisanje do završetka transdukcije je izvedeno kao što je opisano u Primeru 7, sa sledećim specifičnostima.

[0435] Dva odvojena tipa uslova su primenjena u dve odojene studije, a inicijacija transdukcije je izvedena u ukupnoj zapremini tečnosti od 70 ml (preostalih 130 ml zapremine šuplјine tokom centrifugiranja je činio vazduh). Odvojeni uslovi su ispitani na 200 x 10<6>ćelija i 100 x 10<6>ćelija, tim redom. Upotrebljen je isti ukupan broj jedinica čestica virusnog vektora sa vektorima koji su kodirali anti-CD 19 CAR, što je rezultovalo sa 1,8 IU/ćeliji i 3,6 IU/ćeliji za dva tipa uslova, tim redom. Tokom programa transdukcije, upotrebljavano je centrifugiranje od približno 7400 o/min, tokom 3600 sekundi, što je odgovaralo RCF od približno 1600 g na bočnom zidu šupljine za obradu.

1

[0436] Nakon inkubacije od ∼24 sata, ćelije su umnožavane u Bioreactor sistemu sa perfuzijom. Efikasnost transdukcije za odgovarajuće kompozicije je izračunata 6. dana, kao procenat CD3<+>T-ćelije sa kodiranim CAR koji je bio eksprimiran na površini, što je detektovano kao što je opisano u Primeru 1, pa su vrednosti upoređene sa netransdukovanom populacijom ćelija kao kontrolom („netransdukovano“). Rezultati su prikazani na Sl. 8A. Kao što je prikazano, sa istom ukupnom zapreminom i ukupnim brojem infektivnih jedinica tokom inkubacije i uz rotaciju, utvrđena je veća efikasnost transdukcije pod uslovima u kojima je u šuplјini tokom inkubacije upotrebljen manji broj ćelija od 100 x 10<6>.

Primer 8B.

[0437] U drugoj studiji, inicijacija transdukcije i dalјe kultivisanje do završetka transdukcije je izvedeno kao što je opisano u Primeru 7, sa sledećim specifičnostima.

[0438] Primenjena su tri odvojena tipa uslova i proces inicijacije transdukcije je sproveden u ukupnoj zapremini tečnosti od 70 ml (preostalih 130 ml zapremine šuplјine tokom centrifugiranja je činio vazduh). Odvojeni uslovi su ispitani na 200 x 10<6>ćelija, 100 x 10<6>ćelija i 50 x 10<6>ćelija, tim redom. Upotrebljen je isti ukupan broj jedinica čestica virusnog vektora sa vektorima koji su kodirali anti-CD 19 CAR, što je bio broj jedinica koji je bio potrebna da bi se dobilo 1,8 IU/ćeliji za uslove sa 200 x 10<6>ćelija. Tokom programa transdukcije, upotrebljavano je centrifugiranje na sistemu Sepax® 2 od približno 7400 o/min, tokom 3600 sekundi, što je odgovaralo RCF od približno 1600 g na bočnom zidu šupljine za obradu.

[0439] Nakon inkubacije od ∼24 sata, ćelije su umnožavane u Bioreactor sistemu sa perfuzijom. Efikasnost transdukcije za odgovarajuće kompozicije je izračunata 6. dana, kao procenat CD3<+>T-ćelije sa kodiranim CAR koji je bio eksprimiran na površini, što je detektovano kao što je opisano u Primeru 1, nakon čega su vrednosti upoređene sa netransdukovanom populacijom ćelija kao kontrolom („netransdukovano“). Rezultati su prikazani na Sl. 8B. Kao što je prikazano, sa istom ukupnom zapreminom i ukupnim brojem infektivnih jedinica tokom inkubacije i uz rotaciju, utvrđena je veća efikasnost transdukcije pod uslovima u kojima je u šuplјini tokom inkubacije upotrebljen manji broj ćelija od 100 x 10<6>.

[0440] Broj kopija vektora (VCN) takođe je procenjen u transdukovanim ćelijama 6. dana, kao što je opisano u Primeru 4, sa prosečnim VCN koji je određen među transdukovanim ćelijama (ćelije koje su sadržavale SGF+ nukleinsku kiselinu virusnog vektora u svom genomu). Takođe su ispitane netransdukovane kontrolne ćelije („PD neTD“) i pozitivne kontrolne ćelije („pozitivna kontrola sa 2 kopije“). Rezultati su predstavlјeni na Sl.8C.

Primer 9: Inicijacija transdukcije u centrifugalnoj komori sa različitim zapreminama i jedinicama čestica virusnog vektora

[0441] Kompozicije sa povećanim brojevima infektivnih jedinica (IU) virusnih čestica i zapremine tečnosti (sa konstantnim brojem (100 x 10<6>) ćelija) podvrgnute su postupku transdukcije opisanom u Primeru 7, sa sledećim specifičnostima. U svakom od slučajeva, pre započinjanja transdukcije, ćelije su prikuplјane, prane, izolovane, sačuvane zamrzavanjem i aktivirane kao što je opisano u Primeru 11.

2

[0442] U postupku opisanom u Primeru 7, kompozicija koja sadrži virusne čestice, medijum i vazduh koji je uvučen sa pozicije Kese sa razblaživačem radi kombinovanja sa ćelijama u protokolu za razblaživanje, podrazumevale su zapremine tečnosti od 60, 90 i 120 ml, tim redom, kao različite uslove (sa 10 ml kompozicije koja je sadržavala ćelije, što je rezultovalo u zapremini tečnosti od 70, 100 i 130 ml, tim redom, kao različitim pojedinačnim uslovima), dok je preostalih do 200 ml ukupne zapremine koje je uvučeno u komoru radi centrifugiranja predstavljalo vazduh. Svaka od ovih zapremina tečnosti je sadržavala 6 x 10<6>IU čestica virusnog vektora po ml zapremine tečnosti, što je rezultovalo povećanjem IU i IU/ćeliji u svakom od uslova. Brzina za centrifugiranja od 3600 sekundi je izvedena sa približno 7400 o/min, što odgovara RCF od oko 1600 g na unutrašnjem zidu šuplјine u Sepax® jedinici. Upotrebljena je takođe netransdukovana kontrola ("netransd.").

[0443] Nakon inkubacije od ∼24 sata, ćelije su umnožavane u Bioreactor sistemu sa perfuzijom. Efikasnost transdukcije za odgovarajuće kompozicije je izračunata 6. dana, kao procenat CD3<+>T-ćelije sa kodiranim CAR koji je bio eksprimiran na površini, što je detektovano kao što je opisano u Primeru 1. Rezultati su prikazani na Sl. 9A. Kao što je prikazano, za isti broj ćelija, rastuća količina virusa sa odgovarajućim povećanjem zapremine rezultovala je u povećanju efikasnosti transdukcije u ovoj studiji.

[0444] Prosečan broj kopija vektora (VCN) po transdukovanoj ćeliji (ćelijama koje eksprimiraju transgen) takođe je određen 6. dana za svaki od uslova, uporebom kvantitativnog PCR-a u relanom vremenu (RT-qPCR), kao što je opisano u Primeru 4. Rezultati su predstavlјeni na Sl.9B.

Primer 10: Uticaj vremena centrifugiranja na efikasnost transdukcije upotrebom centrifugalne komore

[0445] Po 100 x 10<6>ćelija je podvrgnuto transdukciji kao što je opisano u Primeru 7, sa različitim upotrebljenim trajanjima inkubacije uz centrifugiranje. Preciznije, ukupna zapremina tečnosti koja je bila upotrebljena za centrifugiranje u šuplјini komore za obradu je bila 70 ml (s preostalih 130 ml od 200 ml ukupne zapremine sačinjene od vazduha). Čestice virusnog vektora koje su sadržavale vektor koji kodira anti-CD 19 CAR, bile su uklјučene u ovu zapreminu sa odnosom od 3,6 IU/ćeliji. U svakom od uslova, pre inicijacije transdukcije, ćelije su prikuplјane, prane, izolovane, krioprezervisane i aktivirane kao što je opisano u Primeru 11.

[0446] Centrifugiranje u svrhu inicijacije transdukcije izvršeno je pri približno 7400 o/min, što odgovara relativnoj centrifugalnoj sili od približno 1600 g na bočnom zidu unutrašnje komore za obradu. Trajanje centrifugiranja pri ovoj brzini je izosilo 10 minuta što je predstavljalo jedan od uslova, dok je za drugi iznosilo 60.

[0447] Nakon inkubacije od ∼24 sata, ćelije su umnožavane u Bioreactor sistemu sa perfuzijom. Efikasnost transdukcije za odgovarajuće kompozicije je izračunata 6. dana, kao procenat CD3<+>T-ćelije sa kodiranim CAR eksprimiranim na površini, što je detektovano kao što je opisano u Primeru 1. Ispitana je takođe i netransdukovana kontrola ("netransdukovano"). Rezultati su prikazani na Sl.10. Kao što je prikazano, u ovoj studiji je utvrđena veća efikasnost transdukcije nakon započinjanja transdukcije 100 x 10<6>ćelija u šuplјini za obradu centrifugalne komore sa centrifugiranjem tokom 60 minuta u poređenju sa 10 minuta.

Primer 11: Priprema ćelija izmenjenih genetičkim inženjeringom

[0448] Ovaj primer opisuje postupak za primer koji je izveden da bi se iz biološkog uzorka pripremile, genetičkim inženjeringom izmenjenje T-ćelije koje su transdukovane nukleinskom kiselinom kodiranom od strane virusnog vektora, u skladu sa određenim primerima koji su ovde navedeni. Kao što je opisano u pojedinačnim primerima, pre koraka transdukcije koji su izvedeni u studijama ovde opisanih raznih primera, izvedeni su i neki od koraka ovog postupka, na primer, koraci prikuplјanja, pranja, krioprezervacije, selekcije i aktivacije, kao što je opisano u ovom primeru.

[0449] Razni koraci postupka su izvedeni u šuplјini za obradu centrifugalne komore sa krutim, uglavnom cilindričnim bočnim zidom i klipom koji je bio u stanju da se kreće unutar komore radi promene zapremine šuplјine (šuplјina za obradu komore za centrifugu Sepax® koja se nalazi u kompletu za jednokratnu upotrebu). Preciznije, koraci koji su izvođeni u komori uklјučivali su pranje ćelija, razblaživanje/izmenu pufera, korake za selekciju zasnovanu na afinitetu (npr. inkubaciju sa imunospecifičnim vezivajućim agensima), inicijaciju transdukcije, formulisanje i korake za aktiviranje/ekspanziju (npr. inkubaciju sa stimulišućim agensom(agensima)).

1. Prikuplјanje uzoraka i leukafereza

[0450] Humani uzorak leukafereze obogaćen mononuklearnim ćelijama, dobijen je iz uzorka pune krvi subjekta, upotrebom sistema za prikuplјanje za leukaferezu. Uzorak leukafereze je dobro zatvoren (zaptiven) i čuvan na 2-8 °C, ne duže od oko 48 sati.

2. Pranje uzorka za leukaferezu

[0451] Uzorak leukafereze je sterilno prenet u prenosno pakovanje. Ćelije uzorka leukafereze su oprane i ponovo resuspendovane u puferu za upotrebu u selekciji zasnovanoj na afinitetu, puferu koji je sadržavao PBS, EDTA i humani serumski albumin. Pranje je izvršeno unutar sterilnog kompleta za jednokratnu upotrebu koji prodaje kompanija Biosafe SA za upotrebu u regenerativnoj medicini, a koji je uklјučivao centrifugalnu komoru (1), u suštini isto kao što je prikazano na Sl.7. Prenosno pakovanje koje je sadržavalo ćelije i kesa sa puferom su sterilno povezani sa kompletom, koji je bio postavljen u vezu sa Sepax® 2 jedinicom za obradu. Pranje i reresuspendovanje su urađeni upotrebom standardnog protokola za pranje ćelija na jedinici, pri čemu su ćelije zadržane u šuplјini za obradu (7) centrifugalne komore na kraju protokola, radi naknadne inkubacija sa reagensima za selekciju zasnovanu na afinitetu (pogledati 3).

3. Selekcija zasnovana na afinitetu

[0452] Radi pozitivne selekcije T-ćelija zasnovane na imunoafinitetu, isti automatizovan program je nastavio sa inkubacijom opranih ćelija u selekcionom puferu sa magnetnim kuglicama kuplovanim sa monoklonskim antitelima specifičnim za CD4 i CD8. Inkubacija je izvršena na sobnoj temperaturi u istoj centrifugalnoj komori (1) u kojoj su ćelije zadržane nakon pranja (pogledati 2), što je prethodno opisano. Preciznije, kuglice su mešane u selekcionom puferu, u prenosnom pakovanju, koje je zatim sterilno povezano na mestu Kese sa razblaživačem u komplet za jednokratnu upotrebu koji je upotrebljen za fazu pranja. Na Sepax® 2 jedinici je pokrenut program koji je prouzrokovao da se smeša

4

zrnaca i pufera za selekciju uvuče u komoru sa opranim ćelijama, a sadržaj komore (ukupna zapremina tečnosti 100 ml) je mešana tokom 30 minuta, polu-kontinuiranim procesom. Mešanje je izvedeno u ponovljenim intervalima, od kojih svaki podrazumevao kratkotrajno (približno od 1 sekunde) centrifugiranje pri maloj brzini (približno 1700 o/min), nakon čega je sledio kratak period mirovanja (približno 6 sekundi).

[0453] Na kraju programa, Sepax® 2 jedinica je prouzrokovala taloženje ćelija i izbacivanje viška pufera/kuglica u kesu na poziciji Kese za otpad, pranje istaloženih ćelija i njihovo resuspendovanje u selekcionom puferu. Pranje je izvršeno na Sepax® sa RCF na unutrašnjem zidu šuplјine od oko 200 g, tokom 180 sekundi. Program je prouzrokovao da se oprane ćelije sakupe u prenosno pakovanje postavlјeno na pozicij Izlazne kese u kompletu za primer prikazan na SL. 7, čiji je sadržaj mogao biti prenet sistemom cevi do kolone za magnetno razdvajanje unutar zatvorenog sistema. Tako, pranje ćelija i inkubacija sa selekcionim reagensom zasnovanim na afinitetu su u potpunosti izvedeni unutar istog zatvorenog, sterilnog sistema, propuštanjem tečnosti i ćelija u i iz šuplјine centrifugalne komore. Sposobnost kontrole i podešavanja zapremine tečnosti, kao i mešanja ćelija pri rotaciji u komori, omogućila je upotrebu znatno manje selekcionog reagensa po ćeliji koja je obrađena, u poređenju sa inkubacijom u epruveti uz treskanje ili rotiranje.

[0454] Zatim su ćelije prosleđene iz prenosnog pakovanja, putem zatvorenog, sterilnog sistema cevi i kolone za razdvajanje, u prisustvu magnetnog polјa, upotrebom standardnih postupaka, da bi se razdvojile ćelije koje su se vezale za reagense specifične za CD4- i/ili CD8. Ćelije koje su bile magnetno obeležene su zatim prikupljene u prenosno pakovanje radi dalje obrade.

4. Krioprezervacija

[0455] Prenosno pakovanje sa obeleženim, selektovanim ćelijama, sterilno je povezano sa kompletom za jednokratnu upotrebu koji prodaje kompanija Biosafe AS za upotrebu u regenerativnoj medicini, postavljenom u Sepax® 2 sistem. Komplet je suštinski bio kao što je prikazano na Sl.7, osim što su dva priklјučka, za razliku od jednog, bila prisutna na mestu za koje je u sistemu za primer, prikazanom na Sl. 7, pričvršćena Izlazna kesa, sa Kesom za prikuplјanje koja je bila sterilno povezana sa svakim priključkom; dva priklјučka, za razliku od jednog, bila su prisutna na poziciju na kojoj je na Sl.7 povezana Izlazna kesa; i jedan priključak, za razliku od dva, je bio prisutan na poziciju Kesa za razblaživanje 1 i 2 na Sl. 7. Izveden je standardan ciklus pranja na Sepax® 2 jedinici, da bi se zapremina opranih ćelija smanjila. Kesa sa kriomedijumom je bila sterilno povezana sa kompletom i protokol razblaživanja je izveden dva puta da bi se kriomedijum preneo u ćelije kompozicije i da bi se dobijena kompozicija izbacija u dve izlazne krioprotektivne kese. Ćelije u kesama za krioprezervaciju su zamrznute i čuvane u tečnom azotu do dalјe upotrebe.

5. Odmrzavanje i aktiviranje

[0456] Krioprezervirane ćelije su odmrznute. Odmrznute ćelije su aktivirane upotrebom anti-CD3/CD28 reagensa(reagenasa), uglavnom na 37 °C, tokom vremenskog perioda koji je naznačen za pojedinačne studije. Pre inkubacije sa reagensom, ćelije su oprane i resuspendovane u kompletnom medijumu upotrebom Sepax® 2 sistema, upotrebom standardnog program za pranje ćelija i u kompletu koji je suštinski bio kao što je prikazano na Sl. 7. U istom kompletu ćelije su spojene sa anti-CD3/28 reagensom(reagensima) u šuplјini komore, mešanjem uz intervale centrifugiranja na maloj brzini i mirovanja, kao što je opisano za inkubaciju smola za selekciju, u trajanju od 30 minuta na sobnoj temperaturi. Nakon inkubacije, inkubiran materijal je prebačen preko Sepax® 2 jedinice u Izlaznu kesu za ćelijsku kulturu, koja je potom inkubirana na 37 °C tokom ostatka perioda aktivacije.

6. Transdukcija

[0457] Transdukcija je izvedena u centrifugalnoj komori koja je bila sastavni deo kompleta i koja je bila postavljena u vezu sa Sepax® jedinicom za obradu, kao što je opisano u Primeru 7, sa specifičnim detaljima koji su navedeni u određenim primerima.

7. Umnožavanje

[0458] U pojedinim slučajevima, nakon transdukcije, ćelije su dalјe inkubirane, uglavnom na 37 stepeni C, da se omogućilo umnožavanje ćelija.

8. Pranje, formulisanje

[0459] U pojedinim slučajevima, umnožene i/ili transdukovane ćelije su dalјe oprane, razblažene i/ili formulisane radi testiranja, skladištenja i/ili primene. U pojedinim primerima, umnožene i/ili transdukovane ćelije su oprane u komori koja je bila sastavni deo kompleta za jednokratnu upotrebu postavljeno u Sepax® 2 sistem, na primer kao što je opisano za krioprezervaciju. U pojedinim slučajevima, kesa koja je sadržavala oprane ćelije, sterilno je povezana sa kompletom kao što je prikazano na Sl. 7 ili je takav komplet sa mnoštvom priključaka bio na raspolaganju za povezivanje kontejnera, npr. kesa, na poziciji Izlazne kese prikazane na Sl.7.

[0460] Jedan primer takvog izlaza sa više priključaka u okviru kompleta, prikazan je na Sl. 11, koja prikazuje mnoštvo priključaka (17), od kojih je jedan ili više njih moglo biti vezano za kontejner, kao što je kesa, radi prikupljanja izlazne kompozicije. Veze mogu biti sterilni zaptivači željenog broja kontejnera, u zavisnosti, na primer, od želјenog broja jediničnih doznih oblika ćelija koji se dobija datim postupkom. Za generisanje kompleta prikazanog na Sl.11, upotrebljen je višestruki razvodnik za cevi sa mnoštvom priključaka (u primeru prikazanom na Slici 11, osam ih je) koji su sterilno povezani preko zaptivača sa izlazom linijom kompleta za jednokratnu upotrebu koji prodaje kompanija Biosafe AS, za upotrebu u regenerativnoj medicini. Želјeni broj mnoštva izlaznih kesa je bio sterilno povezan sa jednim ili sa više, uglavnom dva ili više, od ovih priključaka. U pojedinim primerima su takve kese bile pričvršćene na manje od svih priključaka. Stezalјke (5) su bile postavljene na sisteme cevi čime su sprečavale kretanje tečnosti u pojedinačne kese dok to nije bilo poželjno. Kesa koja je sadržavala željenu tečnost, kao što je medijum za formulaciju, ispitivanje i/ili krioprezervaciju, sterilno je povezana sa kompletom i pokrenut je protokol za razblaživanje na Sepax® 2 jedinici mnoštvo puta, tako što je korisnik otvarao i zatvarao odgovarajuće stezalјke koje su vodile do odgovarajućeg broja kesa, generišući tako izlaznu kompoziciju u želјenoj formulaciji, podelјenu na želјeni broj kesa. U pojedinim slučajevima, pojedinačna dozna jedinica ćelija je prikupljana u svaku od odgovarajućih kesa, u vidu formulacije za primenu subjektu, kao što je subjekt iz koga je izveden proizvod leukafereze.

Claims

Patentni zahtevi

1. Postupak transdukcije, koji obuhvata inkubiranje, u unutrašnjoj šuplјini centrifugalne komore, ulazne kompozicije koja sadrži ćelije i virusne čestice koje sadrže rekombinantan virusni vektor, pri čemu:

centrifugalnu komoru čine:

zadnji zid, suštinski krut bočni zid koji se proteže od navedenog zadnjeg zida i najmanje jedan otvor, pri čemu najmanje deo navedenog bočnog zida okružuje navedenu unutrašnju šuplјinu i navedeni najmanje jedan otvor je u stanju da dozvoli preuzimanje tečnosti u navedenu unutrašnju šuplјinu i isticanje tečnosti iz navedene šuplјine; i

pokretni element koji je u stanju da se kreće unutar komore, da bi se menjala unutrašnja zapremina unutrašnje šuplјine, čime unutrašnja šuplјina predstavlja prostor promenljive zapremine definisane navedenim zadnjim zidom, navedenim suštinski krutim bočnim zidom i navedenim pokretnim elementom;

centrifugalna komora se može okretati oko ose rotacije i rotira oko navedene ose rotacije tokom najmanje dela inkubacije; i

postupkom se proizvodi izlazna kompozicija koja sadrži mnoštvo ćelija transdukovanih sa virusnim vektorom.

2. Postupak prema patentnom zahtevu 1, gde navedeno rotiranje predstavlja rotaciju sa relativnom centrifugalnom silom na unutrašnjoj površini bočnog zida šuplјine i/ili na površinskom sloju ćelija od najmanje ili oko 600 g, 1000 g ili 1600 g.

3. Postupak prema patentnom zahtevu 1 ili 2, pri čemu:

prosečna zapremina tečnosti navedene ulazne kompozicije prisutne u navedenoj šupljini tokom navedene inkubacije nije veća od oko 5 mililitara (ml) po kvadratnom inču (po 6,4516 kvadratnih cm) unutrašnje površine šuplјine tokom navedene inkubacije;

maksimalna zapremina tečnosti navedene ulazne kompozicije prisutne u navedenoj šuplјini u bilo kom trenutku tokom navedene inkubacije nije veća od oko 5 ml po kvadratnom inču (po 6,4516 kvadratnih cm) maksimalne unutrašnje površine šuplјine;

prosečna zapremina tečnosti navedene ulazne kompozicije prisutne u navedenoj šuplјini tokom navedene inkubacije nije veća od oko 2,5 mililitara (ml) po kvadratnom inču (po 6,4516 kvadratnih cm) unutrašnje površine šuplјine tokom navedene inkubacije; ili

maksimalna zapremina tečnosti navedene ulazne kompozicije prisutne u navedenoj šuplјini u bilo kom trenutku tokom navedene inkubacije nije veća od oko 2,5 ml po kvadratnom inču (po 6,4516 kvadratnih cm) maksimalne unutrašnje površine šuplјine.

4. Postupak prema bilo kom od patentnih zahteva 1-3, pri čemu:

broj navedenih ćelija u navedenoj ulaznoj kompoziciji iznosi ili je oko broja navedenih ćelija koji je dovoljan da se obrazuje jednoćelijski sloj na površini navedene šuplјine tokom rotacije navedene centrifugalne komore sa silom od ili oko 1000 g ili od ili oko 2000 g na unutrašnjoj površini bočnog zida i/ili na površinskom sloju ćelija; i/ili

broj navedenih ćelija u navedenoj ulaznoj kompoziciji nije veći od 1,5 puta ili 2 puta u odnosu na broj navedenih ćelija koji je dovoljan da se obrazuje jednoćelijski sloj na površini navedene šuplјine tokom rotacije navedene centrifugalne komore sa silom od ili oko 1000 g ili od ili oko 2000 g na unutrašnjoj površini bočnog zida i/ili na površinskom sloju ćelija; i/ili

ulazna kompozicija u šuplјini sadrži najmanje ili oko 1 x 10<6>navedenih ćelija, 5 x 10<6>navedenih ćelija, 1 x 10<7>navedenih ćelija ili 1 x 10<8>navedenih ćelija; i/ili

ulazna kompozicija sadrži najmanje ili oko 1 infektivne jedinice (IU) virusnih čestica po jednoj od navedenih ćelija.

5. Postupak prema bilo kom od patentnih zahteva 1-4, pri čemu:

maksimalna ukupna zapremina tečnosti navedene ulazne kompozicije prisutne u navedenoj šuplјini u bilo kom trenutku tokom navedene inkubacije nije veća od 2 puta, nije veća od 10 puta ili nije veća od 100 puta u odnosu na ukupnu zapreminu navedenih ćelija u navedenoj šuplјini, ili prosečna zapremina ulazne kompozicije tokom inkubacije nije veća od 2, 10 ili 100 puta u odnosu na ukupnu zapreminu ćelija u šuplјini; ili

zapremina tečnosti ulazne kompozicije nije veća od 20 ml, nije veća od 40 ml ili nije veća od 100 ml ili nije veća od 200 ml.

6. Postupak prema bilo kom od patentnih zahteva 1-5, pri čemu, tokom najmanje dela inkubacije u komori ili tokom rotacije komore, zapremina tečnosti ulazne kompozicije zauzima samo deo zapremine unutrašnje šuplјine komore, zapremina šuplјine tokom navedenog najmanje dela ili tokom navedene rotacije dodatno sadrži gas, pri čemu se navedeni gas preuzima u navedenu šuplјinu preko navedenog najmanje jednog otvora, pre ili tokom navedene inkubacije.

7. Postupak prema patentnom zahtevu 6, pri čemu unos gasa u centrifugalnu komoru ostvaruje kretanje pokretnog elementa da bi se povećala zapremina unutrašnje šupljine komore, čime se smanjuje ukupna zapremina tečnosti navedene ulazne kompozicije koja je prisutna u navedenoj šuplјini tokom rotacije navedene centrifugalne komore po kvadratnom inču (po 6,4516 kvadratnih cm) unutrašnje površine šuplјine, u poređenju sa situacijom odsustva gasa u komori.

8. Postupak prema bilo kom od patentnih zahteva 1-7, gde:

unutrašnja šuplјina centrifugalne komore je sa unutrašnjom površinom od najmanje ili oko 1 x 10<9>µm<2>ili najmanje ili oko 1 x 10<10>µm<2>;

broj ćelija u ulaznoj kompoziciji je najmanje 1 x 10<7>ćelija, a virusne čestice su prisutne u ulaznoj kompoziciji sa oko ili najmanje 1 infektivnom jedinicom (IU) po jednoj od navedenih ćelija; ulazna kompozicija čini zapreminu tečnosti koja je manja od maksimalne zapremine unutrašnje šuplјine centrifugalne komore i

unutrašnja šuplјina sadrži gas, u zapremini koja predstvalja preostali deo do maksimalne zapremine unutrašnje šuplјine centrifugalne komore.

9. Postupak prema bilo kom od patentnih zahteva 1-8, pri čemu se dalјi deo inkubacije izvodi izvan centrifugalne komore i/ili bez rotacije, odnosno navedeni dalјi deo se izvodi nakon najmanje dela koji je sproveden u komori i/ili sa rotacijom; i opciono, pri čemu se inkubacija i/ili dalјi deo inkubacije izvode tokom vremenskog perioda koji nije duži od 24 sata, ćelije u ulaznoj kompoziciji nisu bile podvrgavane temperaturi većoj od 30 °C tokom više od 24 sata i/ili inkubacija i/ili dalјi deo inkubacije se ne vrše u prisustvu stimulišućeg agensa.

10. Postupak prema bilo kom od patentnih zahteva 1-9, gde:

izlazna kompozicija koji sadrži transdukovane ćelije, sadrži najmanje ili oko 1 x 10<7>ćelija ili najmanje ili oko 5 x 10<7>ćelija;

za ulaznu kompoziciju koja sadrži virus u odnosu od oko 1 ili oko 2 IU po ćelijama, navedeni postupak je u stanju da proizvede izlaznu kompoziciju u kojoj je najmanje 10%, najmanje 25%, najmanje 30%, najmanje 40%, najmanje 50% ili najmanje 75% ćelija u navedenoj izlaznoj kompoziciji proizvedeno postupkom koji uključuje navedeni rekombinantan virusni vektor i/ili kojim se eksprimira proizvod rekombinantne nukleinske kiseline koji je sadržana unutar navedenog vektora; ili

među svim ćelijama u navedenoj izlaznoj kompoziciji koje sadrže rekombinantan virusni vektor ili u koje je integrisan virusni vektor, prosečan broj kopija navedenog rekombinantnog virusnog vektora nije veći od oko 10, nije veći od oko 5, nije veći od oko 2,5 ili nije veći od oko 1,5; ili među ćelijama u izlaznoj kompoziciji, prosečan broj kopija navedenog vektora nije veći od oko 2, nije veći od oko 1,5 ili nije veći od oko 1.

11. Postupak prema bilo kom od patentnih zahteva 1-10, gde je centrifugalna komora sastavni deo zatvorenog sistema, pri čemu navedeni zatvoreni sistem čine:

navedena komora i najmanje jedan sistem cevi koji je operativno povezan sa najmanje jednim otvorom preko najmanje jednog konektora, čime se dozvoljava tečnosti i gasu da se kreću između navedene šuplјine i navedenog najmanje jednog sistema cevi u najmanje jednoj konfiguraciji navedenog sistema; i

opciono, gde:

navedeni najmanje jedan sistem cevi sadrži serije sistema cevi;

navedeni najmanje jedan konektor obuhvata mnoštvo konektora; i

navedeni zatvoren sistem dodatno sadrži najmanje jedan kontejner operativno povezan sa serijama sistema cevi, pri čemu veza dozvoljava da tečnost i/ili gas prolaze između navedenog najmanje jednog kontejnera i navedenog najmanje jednog otvora preko serija sistema cevi, a opciono, gde navedeni najmanje jedan kontejner uključuje najmanje jedan kontejner sa ulaznom komponentom koji sadrži navedene čestice virusnog vektora i navedene ćelije, kontejner za otpad, kontejner za proizvod i najmanje jedan kontejner sa razblaživačem, pri čemu su svi povezani sa navedenom šuplјinom preko navedenih serija sistema cevi i navedenog najmanje jednog otvora.

12. Postupak prema patentnom zahtevu 11, pri čemu navedeni postupak dodatno obuhvata:

pre i/ili tokom navedene inkubacije, ostvarivanje unosa navedene ulazne kompozicije u navedenu šuplјinu, pri čemu navedeni unos podrazumeva protok tečnosti od navedenog najmanje jednog kontejnera za ulaznu kompoziciju u navedenu šuplјinu kroz navedeni najmanje jedan otvor; i

opciono, kada najmanje jedan kontejner dodatno sadrži kontejner koji sadrži gas, pre i/ili tokom najmanje jedne tačke tokom navedene inkubacije, i/ili zatvoreni sistem dodatno sadrži mikrobni filter koji je u stanju da uvede gas u unutrašnju šuplјinu centrifugalne komore; i/ili zatvoreni sistem sadrži otvor za špric radi ostvarenja unosa gasa; pri čemu opciono, pre i/ili tokom navedene inkubacije, obezbeđivanjem ili ostvarivanjem unosa gasa u navedenu šuplјinu pod sterilnim uslovima, navedeni unos se ostvaruje (a) protokom gasa iz kontejnera koji sadrži gas, (b) protokom gasa iz okruženja izvan zatvorenog sistema, preko mikrobnog filtera, ili (c) protokom gasa iz šprica koji je povezan sa sistemom preko ulaznog otvora za špric.

13. Postupak prema bilo kom od patentnih zahteva 6-12, pri čemu je gas vazduh.

14. Postupak prema bilo kom od patentnih zahteva 1-13, gde:

(a) inkubacija je deo kontinuiranog procesa, pri čemu postupak dodatno obuhvata:

tokom najmanje dela navedene inkubacije, ostvarivanje kontinuiranog unosa navedene ulazne kompozicije, i opciono gasa, u navedenu šuplјinu tokom rotacije komore; i

tokom dela navedene inkubacije, ostvarivanje kontinuiranog isticanja tečnosti, i opciono gasa, iz navedene šuplјine kroz navedeni najmanje jedan otvor tokom rotacije komore; ili

(b) inkubacija je deo polu-kontinuiranog procesa, pri čemu postupak dodatno obuhvata:

pre navedene inkubacije, ostvarivanje unosa navedene ulazne kompozicije, i opciono gasa, u navedenu šuplјinu kroz navedeni najmanje jedan otvor;

nakon navedene inkubacije, ostvarivanje isticanja tečnosti i/ili opciono gasa iz navedene šuplјine;

ostvarivanje unosa druge ulazne kompozicije koja sadrži ćelije i navedene virusne čestice koje sadrže rekombinantan virusni vektor, i opciono gasa, u navedenu unutrašnju šuplјinu; i

inkubiranje navedene druge ulazne kompozicije u navedenoj unutrašnjoj šuplјini,

pri čemu postupak proizvodi drugu izlaznu kompoziciju koja sadrži mnoštvo ćelija druge ulazne kompozicije koje su transdukovane sa navedenim virusnim vektorom.

15. Postupak prema bilo kom od patentnih zahteva 12-14, pri čemu postupak dodatno obuhvata: vršenje rotacije navedene centrifugalne komore pre i/ili tokom navedene inkubacije;

ostvarivanje isticanja tečnosti iz navedene šuplјine u kontejner za otpad nakon navedene inkubacije;

ostvarivanje isticanja tečnosti iz najmanje jednog kontejnera sa razblaživačem u navedenu šuplјinu preko navedenog najmanje jednog otvora i ostvarivanje mešanja sadržaja navedene šuplјine; i

ostvarivanje isticanja tečnosti iz navedene šuplјine u kontejner za proizvod, čime se ćelije transdukovane virusnim vektorom prenose u navedeni kontejner za proizvod.

16. Postupak prema bilo kom od patentnih zahteva 1-15, koji dodatno obuhvata:

(a) ispiranje biološkog uzorka koji sadrži navedene ćelije u unutrašnjoj šuplјini centrifugalne komore pre navedene inkubacije; i/ili

(b) izolovanje navedenih ćelija iz biološkog uzorka, pri čemu se najmanje deo koraka izolacije izvodi u unutrašnjoj šuplјini centrifugalne komore pre navedene inkubacije; i/ili

(c) stimulisanje ćelija pre i/ili tokom navedene inkubacije, pri čemu navedeno stimulisanje obuhvata izlaganje navedenih ćelija uslovima stimulacije, čime se indukuju ćelije ulazne kompozicije da proliferišu, pri čemu se najmanje deo koraka stimulisanja ćelija izvodi u unutrašnjoj šuplјini centrifugalne komore i/ili

(d) formulisanje ćelija koje su transdukovane postupkom u farmaceutski prihvatlјivom puferu u unutrašnjoj šuplјini centrifugalne komore i time proizvodnju formulisane kompozicije, a opciono i ostvarivanje isticanja formulisane kompozicije u jedan ili mnoštvo kontejnera.

17. Postupak prema bilo kom od patentnih zahteva 1-16, gde:

navedene ćelije u navedenoj ulaznoj kompoziciji čine suspenziju ćelija;

navedene ćelije u navedenoj ulaznoj kompoziciji sadrže bela krvna zrnca; i/ili

navedene ćelije u navedenoj ulaznoj kompoziciji sadrže T-ćelije ili NK ćelije.

18. Postupak prema bilo kom od patentnih zahteva 1-17, gde se centrifugalna komora nalazi u centrifugi i povezana je sa senzorom, navedeni senzor je u stanju da prati položaj navedenog pokretnog elementa, dok je regulator protoka u stanju da prima i prenosi informacije sa navedenog senzora i da prouzrokuje pokretanje navedenog pokretnog elementa, preuzimanje i isticanje tečnosti i/ili gasa u i iz navedene šuplјine preko navedenog jednog ili više sistema cevi, kao i rotaciju navedene komore putem navedene centrifuge.

1

19. Postupak prema bilo kom od patentnih zahteva 1-18, pri čemu navedeni rekombinantan virusni vektor kodira rekombinantan receptor koji se time eksprimira od strane ćelija izlazne kompozicije.

2