RS60679B1 - Neurozaštitna biciklična jedinjenja i postupci za njihovu upotrebu u lečenju poremećaja iz spektra autizma i neurorazvojnih poremećaja - Google Patents

Description

Opis

Zatraženi prioritet

[0001] Ova međunarodna patenta prijava zahteva prioritet američke privremene patentne prijave br.

61/958,329 podnete 25 jula 2013 pod nazivom "Neurozaštitna biciklična jedinjenja i postupci za njihovu upotrebu u lečenju poremećaja iz spektra autizma i neurorazvojnih poremećaja," od pronalazača Lawrence Irwin Glass, Michael John Bickerdike, Michael Fredrick Snape, i Patricia Perez de Cogram.

Obalast pronalaska

[0002] Prikazani pronalazak se odnosi na nova biciklična jedinjenja koja su u strukturnoj vezi sa diketopiperazinima i postupcima za njihovu terapeutsku upotrebu. Posebno, ovaj pronalazak se odnosi na neurozaštitnu aktivnost takvih jedinjenja. Određenije, ovaj pronalazak se odnosi na upotrebu cikličnog glicil prolina ("cPG") i njegovih analoga uključujući ciklični glicil-2-glicl prolin ("ciklični G-2-AlilP" ili "cG-2-AlilP" ili "NNZ 2591") i njihove farmaceutske kompozicije u lečenju poremećaja iz spektra autizma (engl. poremećaji iz spektra autizma - ASDs) i neurorazvojnih poremećaja (engl. neurorazvojnog poremećajas - NDDs), kao što je sindrom fragilnog X (engl. Sindrom fragilnog X - FSX).

STANJE TEHNIKE

[0003] Poremećaji iz spektra autizma (ASDs) se sve više dijagnosticiraju. ASDs su skup povezanih razvojnih poremećaja, karakterisanih abnormalnostima u socijalnim interakcijama i komunikacijama, ograničenih interesovanja i repetitivnih ponašanja. Pored klasičnog autizma ili autističnog poremećaja, peto izdanje American Psychiatric Association’s (APA) Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders (DSM-5) prepoznaje Aspergerov sindrom, dezintegrativni poremećaj u detinjstvu, i pervazivni razvojni poremećaj koji nije na drugom mestu specifikovan (engl. Pervasive Developmental Disorder Not Otherwise Specified - PDD-NOS) kao ASDs.

[0004] Neurorazvojni poremećaji (NDDs) uključuju sindrom fragilnog (FXS), Angelmanov sindrom, kompleks tuberozne skleroze, Phelan McDermid-ov sindrom , Retov sindrom , CDKL5 mutacije (koje su takođe u vezi sa Retovim sindrom i poremećaje infantilnog spazma u vezi sa X) i ostale. Mnogi, ali ne svi NDDs su izazvani sa genetičkim mutacijama i, kao takvi se nekad nazivaju monogenskim poremećajima. Neki pacijenti sa NDDs pokazuju ponašanja i simptome autizma .

[0005] Kao primer NDD, sindroma fragilnog X je genetski poremećaj u vezi sa X u kome pojedinci koji od njega boluju su intelektualno hendikepirani u različitom stepenu i pokazuju sa tim u vezi različite psihijatrijske simptome. Klinički, sindrom fragilnog X je karakterisan intelektualnim hendikepom, hiperaktivnošću i problemima sa pažnjom, simptomima iz spektra autizma, emocijalnom labilnošću i epilepsijom (Hagerman, 1997a). Epilepsija u sindromu fragilnog X je najuobičajenije prisutna u detinjstvu, ali zatim postepeno popušta u odraslom dobu. Hiperaktivnost je prisutna kod približno 80 procenata bolesnih muškaraca (Hagerman, 1997b). Fizičke karakteristike kao što su istaknute uši i vilica, hiperosetljivost zglobova su često prisutne ali nisu dijagnostičke. Intelektualni hendikep je najuobičajenija karakteristika koja definiše fenotip. Generalno, muškarci su ozbiljnije ugoženi nego žene. Rani utisci su da žene ne oboljevaju su zamenjeni sa razumevanjem prisustva specifinih teškoća pri učenju i ostali neuropsihijatrijskih karakteristika kod žena. Nesposobnost učenja prisutna kod muškaraca postaje definisana sa godinama, mada ovaj longitudinalni efekat je verovatno refleksija uravanjavanja razvojnih trajektorija pre nego eksplicitno neurodegenerativni postupak.

[0006] Kompromitovana moždana funkcija koja se vidi kod sindroma fragilnog X je paralelna sa promenama u moždanim strukturama ljudi . Ispitivanja MRI skeniranja su otkrila da je sindrom fragilnog X u vezi sa većim zapreminama mozga nego one koje bi se očekivale u podudarnim kontrolama i ova promene su u korelaciji sa ekspanzijom trinukleotida u FMRP promoterskom regionu (Jakala et al., 1997). Na mikroskopskom nivou, ljudi sa sindromom fragilnog X pokazuju abnormalnosti neuronske dendritske strukture, posebno, abnormalno visoki broj nezrelih dendritskih bodlji (Irwin et al., 2000).

[0007] Trenutno dostupni tretmani za NDDs su simptomatsko fokusiranje na kontrolisanje simptoma i podrške, koja zahteva multidisciplinarni pristup. Vežbanje obrazovnih i socijalnih veština se rano primenjuje da bi se tretirali osnovni problemi zaostatak u učenju i socijane smetnje. Specijalne akademske, socijalne, stručne i pomoćne usluge su često potrebne. Davanje lekova, psihoterapija ili bihejvioralna terapija mogu biti korišćeni za kontrolisanje prateće anksioznosti, poremećaja hiperaktivnosti sa nedostatkom pažnje (Attention Deficit Hyperactivity Disorder-"ADHD"), depresije, maladaptivnog ponašanja poput agresije i poremećaja spavanja. Antiepileptički lekovi mogu biti korišćeni za kontrolisanje napada.

SUŠTINA PRONALASKA

[0008] Ranije smo pokazali u patentnoj prijavi PCT/US2004/02830 podentoj 31avgusta, 2004, da ciklični glicil prolin ("cPG") i njegovi analozi, uključujući ali bez ograničenja ciklični ciklopentil-G-2-MeP i ciklični-G-2-AlilP)"cG-2-AlilP") su neurozaštitni i neuroregenerativni . Ne postoji trenutno, efikasno lečenje ASDs ili NDDs, i nega pacijenta je ogranična na kontrolisanje simptoma, pretežno korišćenjem socijalnih i bihejvioralnih intervencija. Pronalazači su sada ustanovili da ciklični G-2-AlilP i ostala biciklična jedinjenja koja su ovde opisana mogu biti efikasna u lečenju ASDs i NDDs, i posebno za normalizaciju abnormalnog socijalnog ponašanja.

[0009] Neočekivano smo otkrili da cG-2-AlilP ima jak terapeutski efekat na anksioznost, hiperaktivnost, pamćenje, učenje i vrste tipičnog abnormalnog socijalnog ponašanja i repetativnog ponašanja kod životinja koje imaju sindrom fragilnog X ("FXS") ili drugi ASDs. Pored toga, mi smo ustanovili da promene u ERK1/2 i Akt fosforilaciju u cG-2-AlilP treranim životinjama sa inaktiviranim fmr1, obezbeđuju in vitro dijagnostičko procenjivane ASDs, i podršku hipotezama da fenotip sindroma fragilnog X je rezultat promenjene ekspresije mGIuR . Pored toga, davanje cG-2-AlilP značajno smanje broj neuronskih bodlji kod miševa sa intaktiviranim fmr1.

[0010] Zbog toga što su životinje sa inaktiviranim fmr1 korišćene za ovde opisana in vivo ispitivanja imaju istu genetsku mutaciju kao ljudska bića sa sindrom fragilnog X, davanje cikličnih glicil prolinih ("cGP") jedinjenja prema pronalasku, uključujući cG-2-AlilP, može biti korisno u lečenju simptoma poremećaja iz spektra autizma, neurorazvojnih poremećaja i sindroma fragilnog X kod ljudskih bića. Pored toga, mi smo neočekivano ustanovili da cGPs prema ovom pronalasku može efikasno lečiti neželjena socijalna ponašanja i repetitivna ponašanja kod životinja sa ASDs, na taj način vraćajući normalnije socijalne interakcije.

[0011] Prema tome, jedan aspekt prema pronalasku obezbeđuje nova ciklična jedinjenja koja imaju dole opisane strukturne formule i supstituente.

[0012] U nekim aspektivma, jedinjenja formule 1 uključuju supstituente u kojima:

X<1>je izabran iz grupe koju čine NR’, O i S;

X<2>je izabran iz grupe koju čine CH2, NR’, O i S;

R<1>, R<2>, R<3>, R<4>i R<3>su nezavisno izabrani iz grupe koju čine -H, -OR’,-SR’, -NR’R’, -NO2, -CN, -C(O)R’, -C(O)OR’, -C(O)NR’R’, -C(NR’)NR’R’, trihalometil, halogen, alkil, supstituisani alkil, heteroalkil, supstituisani heteroalkil, alkenil, supstituisani alkenil, alkinil, supstituisani alkinil, aril, supstituisani aril, heteroaril, supstituisani heteroaril, arilalkil, supstituisani arilalkil, heteroarilalkil i supstituisani heteroarilalkil; svaki R’ je nezavisno izabran iz grupe koju čine -H, alkil, heteroalkil, alkenil, alkinil, aril, arilalkil, heteroaril i heteroarilalkil; ili R<4>i R<5>uzeti zajedno su -CH2-(CH2)n-CH2-gde n je ceo broj od 0-6; ili R<2>i R<3>uzeti zajedno su -CH2-(CH2)n-CH2-gde n je ceo broj od 0-6; uz uslov da kada R<1>= metil i R<2>=R<3>=R<4>=H tada R<5>≠ benzil i; kada R<1>= H, bar jedan od R<2>i R<3>≠ H.

[0013] U drugim aspektima, ovaj pronalazak obezbeđuje jedinjenje formule 1 ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, stereoizomer ili njegov hidrat, gde R<1>= alil, R<2>=R<3>= R<4>= R<5>= H, X<1>= NH, X<2>= CH2(ciklični glicil-2-alilprolin).

[0014] U drugim ostalim aspektima, ovaj pronalazak obezbeđuje farmaceuteke kompozicije koje sadrže farmaceutski prihvatljiv ekscipijent i terapeutski efikasnu količinu cikličnog G-2AlilP.

[0015] U drugim aspektima, ovaj pronalazak obezbeđuje postupke lečenja životinja koje imaju kognitivno oštećenje, koji obuhvataju davanje životinji efikasne količine kompozicije koja sadrži ciklični G-2-AlilP. U drugim aspektima , životinja koja se leči je čovek .

KRATAK OPIS SLIKA NACRTA

[0016] Ovaj pronalazak je opisan uz pozivanje na njegova specifična izvođenja . Drugi aspekti prema pronalasku mogu biti razmatrani uz pozivanje na slike nacrta , na kojima:

SLIKA 1A je grafik koji pokazuje efekte lečenja sa cikličnim G-2-AlilP na izvođenja testa u Morisovom vodenom laviritnu (Morris Water Maze Test- MWMT) u fazi sticanja (dani 1-4) posle tretmana sa skopolaminom. SLIKA 1B je grafik koji pokazuje efekte lečenja sa cikličnim G-2-AlilP na latencu u kvadrantu platforme u testu sa probom (dana 5) MWMT. SLIKA 1C je grafik koji pokazuje vreme potrebno da se nađe platfoma 4. dana u fazi sticanja za životinje u 3 grupe: (1) tretirane nosačem, (2) tretirane skopolamin i cG-2-AlilP-i (3) tretirane skopolaminom.

SLIKA 2 je grafik koji pokazuje razliku u vremenu provedenom na ispitivanje familijarnih objekata naspram novih objekata u toku testa sa probom 25 dana posle lečenja. Tačke podataka za familijarne objekte reflektuju srednju vrednost vremena provedenog za istraživanje 3 člana familijarnih objekata. Vremenske tačke prepoznavanja novih objekta je stvarno vreme provedeno za istraživanje novog objekta.

SLIKA 3 je grafik koji prikazuje korelaciju između bojenja AMPA glutamatnog receptora CA1 regiona hipokampusa i odnosa vremena provedenog za istraživanje novog objekta prema familijarnom objektu u fazi testriraja NORT dana 24.

SLIKA 4 je grafik koji pokazuje efekte cG-2-AlilP (t) na gustinu AMPA GluRl u sloju CA1 granularnih ćelija dana 6 i 24 u nosaču za upoređivanje (nos).

SLIKA 5 je grafik koji pokazuje efekte cG-2-AlilP (t) na gustinu AMPA GluR1 u CA1 stratum oriens dana 24 posle lečenja.

SLIKA 6 je grafik koji pokazuje efekat cG-2-AlilP na stepen povećanja gustine presinaptičkog bojenja u CA3 regionu hipokapusa dana 24 posle lečenja.

SLIKA 7 je grafik koji pokazuje efekat cG-2-AlilP na stepen povećanja gustine presinaptičkog bojenja u stratum oriens CA1 regiona dana 24 posle lečenja.

SLIKA 8 je grafik koji pokazuje efekat cG-2-AlilP na povećanje gustine presinaptičkog bojenja u stratum radiatum CA1 regiona dana 24 posle tretmana.

SLIKE.9A, B, C su grafici koji pokazuju efekte cG-2-AlilP treatmana na gustinu NMDAR-1 u CA1 i CA3.

SLIKA 10 je grafik koji pokazuje efekte cG-2-AlilP na gustinu Krox24 bojenja u CA1-2 hipokapusa.

SLIKA 11 je grafik koji pokazuje efekte cG-2-AlilP na brojne nosače u 200nm<2>kvadratna koji predstavljaju postsinaptičku gustinu u podregionima CA3 i CA1 hipokamusa pacova srednje starosti (n=2 u svakoj grupi).

SLIKA 12 je grafik koji pokazuje efekte cikličnog G-2-AlilP na preživljavanje neurona kod životinja posle ekscitotoksičnog oksidativnog stresa .

SLIKA 13 je grafik koji pokazuje efekte cikličnog ciklopentilG-2-MeP na preživljavanje neurona kod životinja koje prati ekscitoksični oksidativni stres.

SLIKA 14 je grafik koji pokazuje neurozaštitne efekte G-2-AlilP kod životinja koje su podvrgnute globalnoj moždanoj ishemiji .

SLIKA 15 je grafik koji pokazuje efekte različitih doza cikličnog G-2-AlilP na neurozaštitu životinja koje su podrgnute globalnoj moždanoj ishemiji.

SLIKE. 16A-D prikazuju komoru (SLIKA 16A) korišćenju za in vitro ispitivanje neurona hipokampusa . SLIKA 16B prikazuje fotografiju neurona hipokampusa posle 17 dana u kulturi.

SLIKA 16C prikazuje GFP obeležene neurone hipokamusa sa inaktiviranim Fmr1. SLIKA 16D pokazuje fotografiju neurona hipokampusa iz miševa sa inaktiviranim Fmrl tretiranim sa cG-2-2AlilP.

SLIKA 17 prikazuje fotografiju uređaja za testiranje na otvorenom polju korišćenom da se testiraju efekti cG-2-AlilP prema ovom pronalasku.

SLIKA 18 prikazuje grafik vremena T1 provedenog u testu sa otvorenim poljem prirodnih životinja i životinja sa inaktiviranim fmr1 tretiranih sa ili nosačem ili cG-2-AlilP.

SLIKA 19 prikazuje grafik rezultata kratkoročne memorije u testu na otvorenom polju prirodnih životinja i životinja sa inaktiviranim fmr1 tretiranim sa ili nosačem ili cG-2-AlilP. SLIKA 20 prikazuje grafik rezultata dugoročne memorije u testu otvornog polja prirodnih životinja i životinja sa inaktiviranim fmr1tretiranim sa ili nosačem ili cG-2-AlilP. SLIKA 21 prikazuje grafik rezultata testa sukcesivnih prolaza na priodnim životinjama i životinjama sa inaktiviranim fmr1tretiranim sa nosačem .

SLIKA 22 prikazuje grafik rezultata testa sukcesivnih prolaza kod prirodnih životinja i životinja sa inaktiviranim fmr1 tretiranim sa cG-2-AlilP.

SLIKA 23 prikazuje fotografiju podignutog krstastog lavirinta korišćenog u ispitivanju efekata cG-2-AlilP prema ovom pronalasku na prirodnim miševima i miševima sa inaktiviranim fmr1-miševima.

SLIKA 24 prikazuje grafik rezultata u testu podignutog krstastog lavirinta sa zatvorenim krakom kod prirodnih miševa i miševa sa inaktiviranim fmr1 tretiranim sa ili nosačem ili cG-2-AlilP.

SLIKA 25 prikazuje grafik rezultata u testu podignutog krstastog lavirinta sa otvorenim krakom kod prirodnih životinja i životinja sa inaktiviranim fmr1 tretiranih sa nosačem ili cG-2-AlilP.

SLIKA 26 prikazuje grafik rezultata u testu podignutog krstaskog centra lavirinta kod prirodnih životinja i životinja sa inaktiviranim fmr1 tretiranim sa ili nosačem ili cG-2-AlilP.

SLIKA 27 prikazuje fotografiju uređaja koji je korišćen za ispitivanje efekata cG-2-AlilP na uslovljavanje strahom kod miševa prirodnog tipa i sa inaktiviranim fmr1.

SLIKA 28 pokazuje grafik rezultata u testu uslovaljavanja strahom kod prirodnih životinja i životinja sa inaktiviranim fmr1 tretiranim sa ili nosačem ili cG-2-AlilP.

SLIKE.29A-E prikazuju fotografije rezultata gnezdenja korišćenih za procenu efekata cG-2-AlilP na prirodnim miševima i miševima sa inaktiviranim fmr1. SLIKA 29A prikazuje rezultat 1, SLIKA 20B prikazuje rezultat 2, SLIKA 29C prikazuje rezultat 3, SLIKA 20D prikazuje rezultat 4, i SLIKA 29E prikazuje rezultat 5.

SLIKA 30 prikazuje grafk rezultata u testu društvenosti prirodnih životinja i životinja sa inaktiviranim fmr1 tretiranim sa ili nosačem ili cG-2-AlilP.

SLIKA 31 prikazuje grafik rezultata nivoa ekspresije pERK kod prirodnih životinja i životinja sa inaktiviranim fmr1 tretiranim sa ili nosačem ili cG-2-AlilP.

SLIKA 32 prikazuje grafik rezultata nivoa ekspresije pAKT kod prirodnih životinja i životinja sa inaktiviranim fmr1 –tretiranim sa ili nosačem ili cG-2-AlilP.

SLIKA 33A do 33F prikazuju grafike rezultata efekata PBBI i cG-2-AlilP na ekspresiju inflamatornih medijatora interleukina 1-beta ("IL1-beta") i interleukina 6 ("IL-6"). FIGs.33A -33C prikazuju rezultate za IL1-beta i FIGs.33D -33F prikazuje rezultate za IL-6.

SLIKA 34A do 34 H prikazuje grafike rezultata efekata PBBI i cG-2-AlilP na ekspresiju BAX i BCL2.

SLIKE.34A -34C prikazuju rezultate za BAX ekspresiju. SLIKE 34D -34H prikazuju rezultate za BCL2 ekspresiju.

SLIKA 35A do 35C prikazuju grafike rezultata efekta PBBI i cG-2-AlilP na ekspresiju ATF3 u tri različite vremenske tačke .

SLIKA 36A potpuno prikazuje grafike rezultata efekata PBBI i cG-2-AlilP na ekspresiju nekoliko genetskih markera u vezi sa neuroplastičnošću .

DETALJNI OPIS

Definicije

[0017] "Alkenil" odnosi se na nezasićeni razgranati, pravog lanca ili ciklični ugljovodonični radikal koji ima bar jednu ugljenik-ugljenik dvostruku vezu. Radikal može biti ili u cis ili trans konformaciji oko dvostruke veze(a). Primeri alkenil grupa ukljućuju alil, etenil, propenil, izopropenil, butenil, izobutenil, ciklopentenil i slično. U nekim izvođenjima alkenil grupe su (C2-C6) alkenil, i u ostalim izvođenjima, alil može biti naročito koristan .

[0018] "Alkil" odnosi se na zasićeni razgranati, pravog lanca ili zasićeni razgranati, ugljovodonični radikal. Primeri alkil grupa uključuju metil, etil, izopropil, ciklopropil, terc-butil, ciklopropilmetil, heksil i slično. U nekim izvođenjima alkil grupe su (C1-C6) alkil.

[0019] "Alkinil" odnosi se na nezasićeni razgranati, pravog lanca ili ciklični ugljovodonični radikal koji ima bar jednu ugljenik-ugljenik dvostruku vezu . Primeri alkinil grupa uključuju etinil, propinil, butinil, izobutinil i slično. U nekim izvođenjima alkinil grupa je (C2-C6) alkinil.

[0020] "Aril" odnosi se na nezasićeni ciklični ugljovodonični radikal sa konjugovanim sistemom π elektrona. Primeri aril grupa uključuju fenil, naftil i slično. U nekim izvođenjima aril grupa je (C5-C20) aril.

[0021] "Arilalkil" se odnosi na alkil, alkenil ili alkinil grupu ravnog lanca gde jedan od vodonikovih atoma vezanih za krajnji ugljenikov atom je zamenjen sa aril grupom. Primeri arilalkil grupa uključuju benzil, naftilmetil, benziliden i slično.

[0022] Kognitivna pogoršanja mogu se primetiti kod pacijenata koji imaju ASDs, NDDs, Alchajmerovu bolest, Parkinsonovu bolest, demenciju sa Levijevim telima i ostale poremećaje, kao i kod starijih životinja, uključujući ljude.

[0023] "Sadrži" i "sastoji se" označava da uključuje, ali bez ograničenja samo na navedene elemente .

[0024] "Faktor rasta" se odnosi na ekstracelularni aktivni polipeptid koji stimuliše ćelijski rast ili proliferaciju interakcijom sa receptorom na ćeliji.

[0025] "Heteroalkil" se odnosi na alkil deo u kojem jedan ili više ugljenikovih atoma je zamenjeno sa drugim atomom kao što je N, P, O, S itd. Primeri heteroalkil grupa uključuju pirolidin, morfolin, piperidin, piperazin, imidazolidin, pirazolidin, tetrahidrofuran, (C1-C10) supstituisane amine, (C2-C6) tioetre i slično.

[0026] "Heteroaril" se odnosi na aril deo u kome jedan ili više ugljenikovih atoma je zamenjeno sa drugim atomom kao što je N, P, O, S itd. Primeri heteroaril grupa uključuju karbazol, furan, imidazol, indazol, indol, izohinolin, purin, pirazin, pirazol, piridazin, piridin, pirol, tiazol, tiofen, triazol i slično.

[0027] "Povreda" uključuje bilo koje akutno ili hronično oštećenje životinje koje je rezultat degeneracije, disfunkcije ili smrti ćelija nervnog sistema. Takve ćelije uključuju neuronske ćeliji i ćelije koje nisu neuronske. Povrede uključuju moždani udar, nehemoragnični udar, traumatsku povrednu mozga , perinatalnu afiksiju u vezi sa fetalnim distresom koji prati abrupciju, okluzijom pupčane vrpce ili u vezi sa usporavanjem rasta u materici, perinatalnom asfikcijom u vezi sa neuspehom odgovarajućeg oživljavanja ili disanja, ozbiljnim CNS oštećenjima u vezi sa izbegnutim davljenjem (engl. near miss drowning), izbegnutom ’smrti u kolevci’, inhalacijom ugljenmonoksida, amonijaka ili drugih gasnih intoksikacija, srčanog zastoja, kome, meningitisa, hipoglikemije, statusnog epileptika, epizoda cerebralne asfiksije u vezi sa koronarnom operacijom bajpasa, hipotenzivne epizode i hipertenzivne krize i cerebralne traume . Razume se da gornji primeri su dati samo kao ilustracija i nemaju nameru da budu iscrpna lista povreda koje se leče jedinjenjima i postupcima prema pronalasku .

[0028] "Farmaceutski prihvatljiv ekscipijent" se odnosi na ekscipijent koji je koristan u pripremanju farmaceutske kompozicije koje je generalno sigurna, netoksična i poželjna i uključuje ekscipijente koji su prihvatljivi za veterinarsku upotrebu kao za humanu farmaceutsku upotrebu. Takvi ekscipijenti mogu biti čvrsti, tečni polučvrsti ili u slučaju kompozicija u obliku aerosola, gasni.

[0029] "Farmaceutski prihvatljive soli" se odnosi na so koja je farmaceutski prihvatljiva i ima željene farmakološke osobine. Takve soli uključuju soli koje mogu biti obrazovane kada kisel iprotoni su prisustni u jedinjenjima koja su u stanju da reaguju sa neorganskim ili organskim bazama. Pogodne neorganske soli uključuju one obazovane sa alkalnim metalima, npr. natrijumom i kalijumom, magnezijumom, kalcijumom i aluminijumom. Pogodne organske soli uključuju one obrazovane sa organskim bazama kao što su aminske baze npr. etanolamin, dietanolamin, trietanolamin, trometamin, N-metilglukamin, i slično. Takve soli uključuju kisele adicione soli obrazovane sa neorganskim kiselinama (npr. kiseline hlorovodonična i bromovodonična) i organskim kiselinama (npr. sirćetna kiselina, limunska kiselina, jabučna kiseline, i alkan-i aren-sulfonska kiselina kao što su metansulfonske kiseline i benzensulfonska kiselina). Kada ima dve kisele grupe prisutne, farmaceutski prihvatljiva so može biti mono-so mono-kiseline ili so di -kiseline; i slično kada ima više od dve kisele grupe prisutne, neke ili sve grupe mogu biti prisutne kao soli .

[0030] "Zaštitna grupa" ima značenje konvencionalno u vezi sa organskom sintezom, tj. grupa koja selektivno blokira jedno ili više reaktvnih mesta u višefunkcionalnom jedinjenju tako da hemijska reakcija može biti izvedena selektivno na drugom nezaštićenom reaktivnom mestu i tako da grupa može lako biti uklonjena pošto je selektivna reakcija gotova.

[0031] "Stereoizomer" je molekul koji ima strukturu cikličnog G-2-Alil prolina, ali ima hiralni centar. Izraz "ciklični G-2-Alil Prolin" uključuje sve stereoizomere.

[0032] "Supstituisani" odnosi se da kada je jedan ili više vodonikovih atoma na alkil, heteroalkil, alkenil, alkinil, aril, heteroaril ili arilalkil radikalima nezavisno zamenjeno sa drugim supstituentom. Supstituenti uključuju -R’, -OR’, -SR’, -NR’R’, -NO2, -CN, -C(O)R’, -C(O)OR’,-C(O)NR’R’, -C(NR’)NR’R’, -NR’-C(NR’)-OR’, -NR’-C(NR’)-SR’, NR’C(NR’)-NR’R’, trihalometil i halogen gde svaki R’ je nezavisno -H, alkil, heteroalkil, alkenil, alkinil, aril, arilalkil, heteroaril ili heteroarilalkil.

[0033] "Simptom" ili "simptomi" označava kognitivna oštećenja ili kognitivnu disfunkciju, jednan ili više znakova ili simptoma gubitka pamćenja, gubitka prostorne orijentacije, smanjenu sposobnost učenja, smanjenu sposobnost obrazovanje kratkoročne ili dugoročne memorije, smanjenu epizodnu memoriju, smanjenu sposobnost konsolidovanja memorije, smanjenu prostornu memoriju, smanjenu sinaptogenezu, smanjenu sinaptičku stabilnost, nedostatke u izvršnim funkcijama, nedostatke kognitivnog mapiranja i scenske memorije, nedostatke u deklarativnoj i relacijskoj memoriji, smanjeno brzo sticanje konfiguracionih ili konjuktivnih asocijacija, smanjeno kodiranje i pronalaženje specifičnih događaja vezanih za kontekst, smanjenu epizodnu memoriju i/ili memoriju sličnu epizodnoj, anksioznost, nenormalno uslovljavanje straha, abnormalna socijalna ponašanja, repetativno ponašanje, abnormalno noćno ponašanje, napade, nenormalno kretanje, abnormalnu ekspresiju fosfo-ERK1/2 i fosfo-Akt, i bradikardija.

[0034] "Terapeutski efikasna količina" označava količinu, koja kada se da životinji za lečenje bolesti, je dovoljna da se postigne lečenje bolesti ili povrede. "Terapeutski efikasna količina" označava količinu koja smanjuje neželjene simptome ili nalaze, pospešuje poželjne simptome ili nalaze, i/ili leči osnovni poremećaj i/ili je lekovita.

[0035] "Lečenje" ili "tretman" bolesti uključuje sprečavanje bolesti da se javi kod životinje koja može biti predisponirana za bolest, ali koje se još nije javila ili se nisu javiti simptomi bolesti (profilaktičko lečenje), inhibiranje bolesti (usporavanje ili zaustavljanje njenog razvijanja), pri čemu obezbeđuje smanjenje simptoma ili neželjenih dejstava bolesti (uključujući palijativno lečenje), i oslobađanje od bolesti (izazvanje regresije bolesti).

[0036] Obuhvaćeni vodonikovi atomi (kao što su vodonici na pirolnom prstenu , itd.) su izostavljeni iz formule radi jasnoće, ali se podrazumeva da su prisutni .

"ATF3" označava faktor aktivacje transkripcije 3

"BAX" označava BAX regulator apoptoze takođe poznat kao protein sličan bcl-2

"BLC2 alfa" označava B-ćelije limfoma-2

"IL1-beta" označava interleukin 1-beta.

"IL-6" označava interleukin-6.

"BDNF" označava neurotropski faktor koji potiče iz mozga.

"Cdh2" označava kadherin-2

"Cebpb" označava CCAAT/pospešivač vezivanja proteina beta

"Crem" označava vezivanje cikličnog-AMP elementa odgovora

"Egr1" označava protein odgovora 1 ranog rasta

"Gria 4" označava jonotropin AMPA 4 glutamatnog receptora

"Grm5" označava metabotropni glutamatni receptor 5

"Mapk 1" označava protein kinazu 1 aktiviranu mitogenom

"MeCP2" označava Metil cPg vezujući protein 2

"Nr4a1" označava podfamiliju 4 nuklearnoih receptora grupe A član 1, takođe poznatu kao nervni faktor rasta nervaIB

"Ntf3" označava neurotrofin 3

"Ntf4" označava neurotrofin 4

"Pcdh8" označava Protokadherin-8

"Plm1" označava Protein 1 curenja Pre-mRNK

"Ppp3ca" oznčava protein fosfataze 3, katalitičku podjedinicu, Alfa

"Tnf’ označava faktor nekroze tumomora .

Poremećaji iz spektra autizma

[0037] Poremećaji iz spektra autizma (ASDs) su skup povezanih razvojnih poremećaja, karkaterisanih abnormalnostima u socijalnoj interakciji i komunikaciji, ograničenim interesima i repetativnim ponašanjem. Dodatno prema klasičnom autizmu ili autistučnom poremećaju, peto izdanje American Psychiatric Association’s (APA) Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders (DSM-5) prepoznaje Aspergerov sindom, dezintegrativni poremećaj u detinjstvu i pervarzivni razvojni poremećaj koji nije drugačije specifikovan (PDD-NOS) kao ASDs.

[0038] Neurorazvojni poremećaji (NDDs) uključuju sindrom fragilnog X (FXS), Angelmanov sindrom, kompleks tuberozne skleroze, Phelan McDermid-ov sindrom, Retov sindrom, CDKL5 mutacije (koje su takođe u vezi sa Retovim sindrom i infantilnim poremećajem spazma u vezi sa X) i ostale. Mnogi ali ne svi NDDs su izazvani sa genetskim mutacijama i, kao takvi, se ponekada nazivaju monogenetskim poremećajima. Neki pacijenti NDDs pokazuju ponašanja i simptome autizma.

Klinički alati za procenu ASDs i NDDs

[0039] ASDs i NDDs mogu biti procenjeni korišćenjem jednog ili više kliničkih testova, na primer, Prirodna istorija Retovog sindroma/ skala kliničke ozbiljnosti, Kontrolna lista neneormalnog ponašanja izdanje zajednice (Aberrant Behavior Checklist Community Edition-ABC), Kontrolna lista nenormalnog ponašanja (stereotip), Vinelandi, Globalan utisak kliničke ozbiljnosti (Clinical Global Impression of Severity-CGI-S), Upitnik napora negovatelja (Caregiver Strain Questionnaire CSQ), Dečija Yale-Brawn OC skala (Children’s Yale-Brown OC Scale-CYBOCS-PDD), Skala ocene dečijeg autizma, Intervju repetativnog ponašanja, Nisongerova dečija skala ocene ponašanja, Popis ponašanja pervazivnog razvojnog poremećaja, Skala stereotipnih ponašanja, Skala repetativnih ponašanja, Rossago skala, Upitinik repetativnog ponašanja, i Skala stereotipnog ponašanja, ili jedan ili više fizoloških testova izabranih iz grupe koj u čine udarna frekvenca elektorencefalograma (EEG), celokupna snaga traka frekvence EEG, pokreti ruku, QTc i varjabilnost srčanog rada (HRV), i respiratorne iregularnosti u poređenju sa kontrolnim životinajma koje ne pate od pomenutog poremećaja. Pouzdanost i relevantost nekih od ovih oruđa su prikazani dole u Tabeli 1.

[0040] Kako je korišćeno u ovom odeljku, izaz "odgovarajući" označava alat koji meri klinički relevantni ishod sa dobrim do odličnom pouzdanošću i validnošću sa informacijama dostupnim o svim relevantim kategorijama . Izraz "odgovarajuće prema stanjima" označava alat koji meri "klinički relevantan ishod za koji su samo izvesne podskale relevatne," ili može biti "samo relevantan za opseg mlađih godina." Izrazi "obećavajuće" i "potencijalno priklano" označava alat koje meri "klinički relevantan ishod, ali se pojavljuje, ili ima nekonzistentu pouzdanost i validnost (npr., dobru do odličnu pouzdanost/validnost, ali podaci nisu dostupni u svim kategorijama, ali u bar 2, adekvatna u svim kategorijama."

Tabela 1

[0041] Anksioznost može biti procenjena korišćenjem jednom ili više merenja uključujući, skalu anksioznosti, depresije i raspoloženja (Anxiety, Depression and Mood Scale-ADAMS), popis sindroma dece i adolescenata (Child and Adolescent Symptom Inventory-CASI), Kontrolna lista ponašanja dece (Child Behavior Checklist-CBCL), Skalu multidimenzionalne anksioznosti za decu (Multidimensional Anxiety Scale for Children-MASC), Skalu ocene pedijatrijskog autizma (Pediatric Autism Rating Scale PARS), Revidiranu skalu dečije anksioznosti i depresije (Revised Child Anxiety and Depression Scale RCAD), Odabir poremećaja u vezi sa dečijom anksioznošću (Screen for Child Anxiety Related Disorders SCARED). Nisongeroveov formular za ocenu dečijeg ponašanja, i skalu dijagnostičkog intervjua anksioznosti (Anxiety Diagnostic Intervju Scale - ADIS). Pouzdanost i relevantost nekih od ovih alata su dole prikazani u Tabeli 2.

Tabela 2

[0042] Potencijalno odgovarajući klinički alati za procenu anksioznosti u ASDs i NDDs su dole prikazani u Tabeli 3.

Tabela 3

[0043] Socijalna komunikacija može biti procenjivana korišćenjem kliničkih alata, na primer, ABAS-II Domenski rezultati, Kontrolna lista nenormalnog ponašanja (ABC)-Letargija/Socijalno povlačenje, ADI-R, Generička skala zapažanja kod dijagnoziranja autizma (ADOSG)-novi rezultati ozbiljnosti, Mera uticaja autizma, Skala ocene autističkog spektra, Kontrolna lista procene lečenja autizma (ATEC), Igra bacanja lopte, Skala procene ponašanja (BAS), Sistem procene ponašanja za decu 2. izdanje BASC-2 (podskale relevantne za socijalne), Popis ocene ponašanja izvršnih funkcija, Kalifornijski zadaci verbalnog učenja – dečija verzija (VLT-C) i modifikovani VLT-C (MVLT-C), Interakcije negovatelja-dece, Jahromi 2009, CGI, Skala za ocenu autizma u detinjstvu (CARS), Dečiji upitnik socijalnog ponašanja, Klinička procena jezičkih osnova (CELF-3 i 4)-Pragmatični profil, Skale komunikacionog i simboličkog ponašanja (CSBS), Razumevanje afektivnog govornog zadatka, Opšta skala poverenja, Skala ocene Gilijamovog autizma (GARS), Mera zajedničke pažnje iz ESCS (JAMES), Suočimo se!, Opservaciona procena spontanog ekspresivnog jezika (OSEL), Roditeljski upitnik, Nagaraj et al.2006, Upitnik za ocenu roditelja, Chan et al, 2009, Popis ponašanja pervazivnog razvojnog poremećaja (PDD-BI) (dostupna kratka verzija: PDD-BI-Screening Version), Ocena osećanja na osnovu facijalne ekspresije ( engl.Reading the Mind in Films)-odrasli, Ocena osećanja na osnovu facijalne ekspresije - deca, Ocena osećanja u Eda zadatku -Revidiranom (RMET-R)-odrasli, Ocena osećanja u Eda zadatku -Revidiranom (RMET-R)-deca, Ocena osećanja u glasu - odrasli, Upitnik socijalne komunikacije (SCQ), Skala socijalne reaktivnosti, Sistem unapređenja socijalnih veština (SSiS), Test teorije uma, i VABS-socijalizacija i komunikacija.

[0044] Od alata korišćenih za procenu socijalnih komunikacija, sledeći se smatraju da su "odgovarajući za stanje:" Kontrolna lista nenormalnog ponašanja (ABC): Letargija/Socijalno povlačenje podskale, BASC-2: socijalne veštine, povlačenje, funkcionalne podskale, CSBS, ESCS, JAMES, SSiS, Vinelandova skale adaptivnog ponašanja i podskale socijalizacije i komunikacije. Alati koji se smatraju "potencijalno odgovarajući" uključuju ABAS-II: konceptualne i socijalne domene, rezultati ADGS ozbiljnosti, Skala ocene autističkog spektra: socijalna komunikacija, CSBQ: podskale razumevanja, i PDD-BI.

Autizam

[0045] Klasični autizam je visoko varjabilni neurorazvojni poremećaj. Tipično je dijagnoziran kod beba ili u ranom detinjstvu, sa očitim simptomima često očiglednim od starosti od 6 meseci, a koji postaju ustaljeni do 2-3 godine. Prema postavljenim kriterijumima u DSM-5 dijagnoza autizma zahteva prisutnu trijadu simptoma, uključujući (a) pogoršanja u socijalnim interakcijama, (b) pogoršanja u komunkaciji (c) ograničene i repetativne interese i ponašanja. Ostale disfunkcije, kao što su atipično jedinjenje, su takođe uobičajeni, ali nisu esencijalni za dijagnozu. Od ovih pogoršanja, pogoršanja socijalnih interakcija su naročito vazna za dijagnozu, i dva od sledećih pogoršanja moraju da budu prisutna za dijagnozu autizma:

(i) pogoršanja u upotrebi višestrukog neverbalnog ponašanja (npr. kontak očima) da bi se regulisale socijalne interakcije;

(ii) neuspeh u razvoju odnosa sa vršnjacima primeren razvojnom nivou ;

(iii) nedostatak spontanog pokušaja da se deli uživanje, interesovanje ili dostignuća;

(iv) nedostatak socijalnog ili emocionalnog reciprociteta.

[0046] Pogoršanja komunikacije kod autizma mogu da se manifestuju na jedan ili više sledećih načina: odloženi (ili potpun nedostatak) razvojnog govornog jezika; uočljivo pogoršanje sposobnosti iniciranja ili zadržavanja u konverzaciji; sterotipna i repetativna upotreba jezika; i/ili nedostatak spontane igre poverenja. Ograničeni, repetitivni, i stereotipni uzorci ponašanja su takođe neophodni za dijagnozu, kao što je preokupacija sa jednim ili više interesovanja koji su abnormalni po intenzitetu, nefleksibilno držanje rutine ili rituala , repetitivni motorni manirizam i/ili uporna usredsređenost na delove objekta.

[0047] Na kraju za dijagnozu autizma, neophodno je da pogoršanje u funkcionisanju bar jedne oblasti (tj. socijalne interakcije, jezika ili maštovite igre) treba da ima početak pri starosti manjoj od 3 godine.

Aspergerov sindrom

[0048] Aspergerov sindrom je sličan autizmu i sa njim deli izvesne karakteristike. Kao autizam, Aspergerov sindrom je takođe karakterisan pogoršanjem u socijalnim interakcijama, i ovo je praćeno sa ograničenim i repetativnim interesovanjima i ponašanjem. Prema tome, dijagnoza Aspergerovog sindroma je karakterisana sa istom trijadom pogoršanja kao što je autizam. Međutim, razlikuje se od ostalih ASDs time što nema generalnog kašnjenja u jeziku ili kognitinom razvoju i bez deficita u interesu subjekta za okolinu. Pored toga, Aspergerov sindrom je tipično manje ozbiljan po simptomatologiji nego klasičnog autizma i Aspergerovi pacijenti mogu funkcionisati samodovoljno i živeti relativno normalne živote.

Dezintegrativni poremećaj u detinjstvu

[0049] Dezintegrativni poremećaj u detinjstvu (CDD), takođe poznat kao Helerov sindrom, je stanje u kojem se dete razvija normalno do starosti od 2-4 godine (tj. kasnije nego u autizmu i Retovom sindromu), ali zatim pokazuje ozbiljan gubitak u socijalnim, komunikacionim i ostalim veštinama. Dezintegrativni poremećaj u detinjstvu je veoma sličan autizmu, i oba uključuju normalni razvoj koji je praćen značajnim gubitkom govora, društvene igre i motornih veština. Međutim, dezintegrativni poremećaj u detinjstvu tipično se javlja kasnije nego autizam, uključuje dramatičniji gubitak veština i mnogo je manje uobičajen.

[0050] Dijagnoza CDD zavsi od dramatičnog gubitka ranije stečenih veština u dve ili više sledeće oblasti: jezik, socijalne vieštine , igra, motorne veštine (kao što je dramatični pad u sposobnosti hoda, penjanja, razumevanja itd.), kontrole creva i bešike (uprkos što je ranije stečena kontrola fizioloških potreba). Gubitak razvojnih veština može biti nagao i desiti se u tokom dana ili nedelja ili može biti postepeniji.

Pervazivni razvojni poremećaj -koji nije drugačije specifikovan (PDD-NOS)

[0051] Pervazivni razvojni poremećaj -koji nije drugačije specifikovan (PDD-NOS) je ASD koji je opisan time da pacijenti pokazuju neke, ali ne sve, simptome u vezi sa ostalim dobro definisanim ASDs. Ključni kriterijum za dijagnozu ASD uključuje teškoću socijalizacije sa ostalim, repetitivna ponašanja, i povećana osetljivost na izvesne stimulanse. Ovo se sve može naći kod gore opisanih ASDs . Međutim autizam, Aspergerov sindrom, Retov sindrom i CDD svi imaju ostale karakteristike koje omogućavaju njihovu specifičnu dijagnozu. Kada specifična dijagnoza jednog od ova četiri poremećaja ne može biti napravljena, ali je ASD očigledan, dijagnozira se PDD-NOS. Takva dijagnoza može biti proizvod simptoma koji počinju u ranijem uzrastu nego što je primećeno u drugim stanjima spektra.

Retov sindrom

[0052] Retov sindrom (RTT) je neurorazvojni poremećaj koji je gotovo isključivo napada žene (1 u 10:000 živorođenih). Donedavno, RTT je klasifikovan kao poremećaj iz spektra autizma (Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders, Fourth Edition -Revised (DSM-IV-R). Približno 16,000 pacijenata je trenutno ima ovu bolest u U.S.A. (Retov sindrom Research Trust data). Za dijagnoziranje Retovog sindroma, sledeći simptomi su karakteristični: pogoršani razvoj u starosti 6-18 meseci; usporavanje brzine rasta glave polazeći između starosti od 3 meseca i 4 godine; ozbilno pogoršanje jezika; repetitivni i stereotipni pokreti rukom ; i nenormalnosti u hodu , npr. hodanje na prstima ili nestabilan hod sa uključenim nogama. Pored toga, brojni kriterijumi mogu biti podrška i pomoć u dijagnozi Retovog sindroma, ali nisu suštinski za dijagnozu. Ovo uključuje teškoće u disanju, EEG abnormalinosti, napade, krutost mišića i spastičnost, skoliozu (krivljenje kičme), škrgutanje zubima, male ruke i stopala u odnosu na visinu, retardaciju u rastu, smanjenu telesnu masnoću i mišićnu masu, abnormalne obrasce spavanja, razdražljivost i uzmemirenost, poteškoće u žvakanju i/ili gutanju, slabu cirkulaciju i konstipaciju.

[0053] Početak RTT uglavnom počinje između 6-18 meseci starosti sa usporavanjem brzine razvoja i rasta. Ovo je praćeno sa fazom regresije (tipično kod dece starosti 1-4 godine), pseudo-stacionarna faza (2-10 godina starosti) i naknadno kasnije stanje progresivnog motornog pogoršanja . RTT simtomi uključuju iznenadno usporavanje rasta i regresije u jeziku i motornim veštinama uključujući svrsishodne pokrete ruku zamenjenje sa sterotipnim pokretima, autističnim karakteristikama, napadima sličnim paničnim, poremećaje ciklusa spavanja, tremori, napadi, respiratorne disfunkcije (epizodna apnea, hiperpnea), apraksija, distonija, diskinezija, hipotonija, progresivna kifoza ili skolioza i ozbiljna kognitivna oštećenja. Većina RTT pacijenata preživljava odraslo doba sa invaliditetima i zahtevaju 24-časovni dnevnu negu.

[0054] Između 85% i 95% slučajeva RTT je zabeleženo da je izazvano sa mutacijom Mecp2 gena (Amir et al.1999. Nat Genet 23:185-188; Retov sindrom Research Trust) –gena koji kodira metil-CpG-vezujući protein 2 (MeCP2). Mecp2 mapira u X-hromozomu (lokacijan Xq28) i iz ovog razloga, mutacije u genu muškarca su ugalvnom smrtonosne. Dok je RTT genetički poremećaj, manje od 1% zabeleženih slučajeva je nasleđeno; gotovo se sve mutacije Mecp2 javljaju de novo, sa dve trećine izazvanih sa mutacijama na 8 CpG dinukleotidima (R106, R133, T158, R168, R255, R270, R294 i R306) smeštenim u trećem i četvrtom egzonu .

[0055] MeCP2 je protein koji vezuje metilovane CpG dinukleotide da se izvrši transkripciono utišavanje DNK u CNS. Ključni efekat smanjenja ili odustva MeCP2 javlja se da je oštećenje razvoja dendritnih bodlji i obrazovanja sinapsi. MeCP2 ekspresija se javlja da je privremeno u korelaciji sa sazrevanjem mozga, objašnjavajuči zašto se tipično simptomi javljaju pri starosti od oko 18 meseci.

Predstavljanje karakteristika zajedničkih za ASDs

[0056] Uzimanje zajedno ASDs, jasno je da postoje zajedničkih simptomi u prikazivanju simptoma u 5 oblika. Ove zajedničke karkateristike su pogoršanja u normalnim socijalnim sposobnostima, i repetativnim ponašanjima. Kod svih osim Aspergerovog sindroma takođe postoji konzistentno prikazivanje zakasnelog intelekturalnog razvoja koji se najuobičajenije manifestuje kao nedostatak u jezičkim veštinama. Kognitivni gubitak relativno prema normanim parametrima za starosnu dob je često veoma uočljiv u autizmu, Retovom sindromu, CDD iPDD-NOS.

Genetički modeli ASDs

[0057] Radi validnosti, životinjski modeli ASDs moraju prikazivati slične simptome sa kliničkim stanjima i imati racionalan stepen suočavanja sa validnošću u odnosu na etiologiju ovih simtoma . Poznato je da klasični autizam može biti izazvan sa mnogo različitih genetskih ošećenja i ni jedan pojedinačni genetski nedostatak se smatra da ne doprinosi više od nekoliko procenata slučajevima autizma. Zaista, skorašnja ispitivanja su otkrila brojne de novo strukturne varijacije lokacija hromozoma za koje se misli da leže u osnovi ASD, pored retkih naslednih gentičkih deficita (Marshall et al, 2008; Sebat et al, 2007). Prema tome, kopije brojnih varijacija (CNV), translokacija i inverzija genskih sekvenci na 20 ključnih mesta ili više, uključujući 1p, 5q, 7q, 15q, 16p, 17p i Xq, su mapirani kao ASD mesta.

[0058] Međutim, uprkos poligenetskoj pozadini koja leži u osnovi ASD i komplesnošću etiologije, poznato je da izvesni genetički defekti mogu proizvesti ASD. Neke od najbolje karakterisanih defekata potiču iz hromozomskih aberacija gena koji kodiraju klaster proteina postsinaptičke gustine, uključujući neuroligin-3 (NLGN3), neuroligin-4 (NLGN4), neureksin-1α (NRXN1) i shank3 (Sebat et al, 2007).

[0059] NLGN3 i NLGN4 su adhezioni molekuli postsinaptičkih ćelija prisutni u glutamatergičnim sinapsama. Oni igraju ulogu u koordinisanju presinaptičkih kontakata do postinaptičkog mesta i takođe interakciju sa postinaptičkim shank3 proteinom ’skele’. Mutacije u NLGN3 i NLGN4 su primećene u ASD populaciji i doprinose na primer 1% svih ASD slučajeva (Lintas & Persico, 2008). Jamain and kolege su prvi zabeleželi ’missense’ na NLGN3 i pomicanje okvira na NLGN4 kod dva nevezana subjekta, što je dovelo do Aspergerovog sindroma i klasičnog autizma, respektivno (Jamain et al, 2003). Dok je javljanje NLGN3 ili NLGN4 mutacija kod ASD populacije naravno nisko (zaista, nisu takve mutacije primećene u ispitivanju 96 ASD pacijenata u Kandadstoj studiji; Gauthier et al, 2005), i potvrđeno je u predkliničkim ispitivanjima da mutacije neuroligina mogu zaista dovesti do modela autističnih simptoma. Prema tome, uvođenje u miševe istog R451C ’missense’ na NLGN3 koji je zabeležen klinički dovodi do mutatnog soja miša koji pokazuje smanjene socijalne interakcije i povećava inhibotornu sinaptičku transmisiju (Tabuchi et al, 2007).

[0060] R451C mutant prema tome je miš predstavlja model za ASD zasnovan na NLGN3 mutaciji. U ovom slučaju, mutacija na R451 položaju NLGN3 dovodi do mutacije ’dobitka funkcije’ .

[0061] Suprotno, modeliranje kliničke mutacije NLGN4 u miševima je postignuto sa mutacijom ’gubitka funkcije’ NLGN4 (klasičan model inaktivacije gena). Na ovom modelu, mutantni miševi pokazuju deficit socijalne interakcije i smanjenu ultrazvučnu vokalizaciju (Jamain et al, 2008). Komunikacioni deficiti su centralni za kliničke ASDs i kod miševa sa inaktiviranim NLGN4 smanjenje u ultrazvučnoj vokalizaciji izloženih muških miševa u odnosu na odgovarjuće prirodne ženske podržavaju suočenu validnost soja kao modela za ASD.

[0062] Presinaptički proteini neureksina izazivaju postsinaptičku diferencijaciju u obližnjim dendritima kroz interakcije sa postinaptičkim odgovarajućim delovima neuroligina. Mutacije gena neureksina-1α (NRXN1) su zabeležene u brojnim ispitivanjima (Sebat et al, 2007; Marshall et al, 2008; Kim et al, 2008; Yan et al, 2008) i one su primećene u obliku kopiranog broja varijanti. Kao sa NLGN mutacijama, kada su mutacije NRXN1 gena unete u miševe (u obliku inaktiviranog gena), dobijeni su mutantni soj sa izvesnim karakteristika sličnim ASD (Etherton et al, 2009). Ovi miševi sa inaktiviranim NRXN1 pokazuju pad u frekvenci hipkapalne minijaturne ekscitatorne postsinaptičke struje (mEPSC) i smanjeni unosizlaz odnosa izazvanih struja. Ovi elektrofiziloški efekti se odnose na smanjenu ekscitatornu transmisiju u hipokapusu. Pored smanjene ekscitatorne neurotransmisije, miševi sa inaktiviranim NRXN1 prikazuju pad u inhibiciji pre-pulsa, premda na socijalno ponašanje izgleda da nema uticaja (Etherton et al, 2009).

[0063] Deljenje izvesnih karakteristika sa trans-sinaptičkim konstruktom neureksin-NLGN, ćelijski adhezioni molekul 1 (CADM1) je protein iz imunoglobulinske familije prisutan i pre-i post-sinaptički koji je takođe uključen u sintaptičku transćelijski adhezionu aktivnost (Biederer et al, 2002). Mutacije na CADM1 genu su detektovane kod ASD pacijentima i izgleda da predstavljaju dalji mogući uzrok ovih stanja (Zhiling et al, 2008).

[0064] Analiza miševa sa inaktiviranim CADM1 otkriva da ovi miševi pokazuju ponašanje u vezi sa povećanom anksioznošću, pogoršanje u socijalnim interakcijama i pogoršanje socijalne memorije i prepoznavanja (Takayanagi et al, 2010). Ove disfunkcije su ponovo konzistentne sa ASD simptomatologijom.

[0065] Sindom delecije 21q13 (takođe poznat kao Phelan-McDermid sindrom), je redak genetski poremećaj koji je izazvan mikrodelecijom na q13.3 terminalnom kraju hromozoma 22. Ova mikrodelecija je retko nepokrivena sa tipičnim genetskim odabirom i fluorescentnom in situ hibridizacionom testu je preporučeno da se potvrdi dijagnoza. Skorašnji rad ukazuje na sindrom koji je izazvan sa greškom u genu shank3 koji kodira za protein postsinaptičke gustine kritičan za normalno neurološko funkcionisanje. Interesantno, greške u ovom genu su takođe bile u vezi sa sindromom delecije ASD i 22q13 mogu uobičajeno voditi do dijagnoze ASD (Durand et al, 2007; Moessner et al, 2007; Sykes et al, 2009). S obzirom na usku povezanost sindroma delecije 22q13 i konsekventnih dijagnoza ASD, razvijen je model mutantnog miša prema ovoj mutaciji .

[0066] Miš sa inaktiviranim shank3 pokazuje nekoliko deficita koji su isti sa ASD simtomima, uključujući smanjenu ultrazvučnu vokalizaciju (tj., smanjenu socijalnu komunikaciju) kao pogoršano vreme socijalne interakcije između miševa. Pored toga, ovi miševi takođe imaju pogoršanu hipokamusnu CA1 ekscitatornu transmisiju, merenu sa odnosom ulaz-izlaz izazvanih struja i dugoročnih potenciranja (LTP). LTP se veruje da su fiziološki postupci koji leže u osnovu obrazovanja memeorije i konsolidacije. Prema tome, model pokazuje slični fenotip sa inaktiviranim NLGN4 , konzistentan sa ASD.

[0067] Kao što je zabeleženo, sindrom delecije 22q13 sam po sebi je veoma redak. Međutim, obezbeđuje važnu informaciju da uključivanje specifičnih gena može imati definitivnu ulogu u etiologiji ASDs. Pored shank3, ovaj poremećaj otkriva drugi mogući genski defekt u ASD. Od 50 ili oko toliko opisanih slučajeva sindroma delecije 22q13 , svi osim jednom imaju deleciju gena koji koja se prostire preko shank3 da bi uključila drugi gen, poznat kao gen Islet Brain-2 (EB2) (Sebat et al, 2007). IB2 protein reaguje sa mnogo drugih proteina uključujući MAP kinaze i protein amiloidnog prekursora , javlja se da utiče na prolaz proteina u neuritima i obogaćen je pri postisinaptičkim gustinama (Giza et al, 2010). Miševi kojima nedostaje protein (miševi sa inaktiviranim IB2-/-) pokazuju oštećene socijalne interakcije (smanjeno socijalno njuškanje i vreme interakcije), smanjeno istraživanje i kognitivni i motorni deficiti (Giza et al, 2010). Ovaj bihejvioralni fenotip je u vezi sa smanjenom ekscitatornom transmisijom u cereberalnim ćelijama. Sa inaktiviranjem shank3, fenotip IB2 mutacija je prema tome takođe konzistentan sa ASD.

[0068] Pored životinjskih modela nedostataka gore opisanih proteina postsinaptičke gustine, drugi monogenetski sindromi koji dele različite karakteristike sa ASDs mogu vodtiti do autizma nude još jedan put za ciljane lekove za ASD.

[0069] Nedavno, sindrom fragilnog X je dodeljen drugoj familjii poremećaja, nazvanoj neurorazvojni poremećaji (NDDs). Opis ovde ne pravi razlike zasnovane na zvaničnoj klasifikaciji poremećaja .Ukoliko u budućnosti jedan ili drugi, ASD ili NDD je reklasifikovan, ovaj opis i podaci se odnose na one novo klasifikvoane, bez obzira na njihovo ime(na).

Sindrom fragilnog X

[0070] Sindrom fragilnog X (FXS) je izazvn ekspanzijom jedne trinukleotidne genske sekvence (CGG) na X-hromozomu koja dovodi do nemogućnosti ekspresije proteina kodiranog sa finr1 genom. FMR1 ( mentalna retardacija 1 fragilnog X) je protein koji je protreban za normalan neuronski razvoj. Sindrom fragilnog X može izazvati da dete ima autizam (Hagerman et al, 2010); u 2-6% od sve dece kod koje je dijagnoziran autizam uzrok je mutacija gena FMR1. Pored toga, približno 30% dece sa FXS ima neki stepen autizma i kod još 30% je dijagnoziran PDD-NOS (Hagerman et al, 2010). Zaista, sindrom fragilnog X je najuobičajenih poznati uzrok autizma jednog gena. Miševi sa inaktiviranim FMR1 su razvijeni kao meodel FXS, i prema tome, kao drugi model mutacije fmr1 gena je bio prikazan da dovodi do razvoja abnormalnih dendritnih bodlji i skraćivanja (Comery et al, 1997), zajedno sa vezanom disregulacijom dendritnih proteina ’skele’ (uključujući shank1) i podjedinice glutamatnog receptora u postsinaptičkim gustinama (Schütt et al, 2009). Ovi efekti dendritne morfologije dovode do pogoršane LTP u kortekstu i amigdali (Zhao et al, 2005) i hipokampusu (Lauterborn et al, 2007), kao i kod pogoršanog saznanja (Kreuger et al, 2011) i povećanja socijalne anksioznosti (Spencer et al, 2005).

Retov sindrom

[0071] Suprotno ASD autizma, Aspergeru, CDD i PDD-NOS, Retov sindrom izgleda da ima gotovo monogenetsku bazu i može biti modelovan na miševima sa dobro viđenom validnošću . Retov sindrom se smatra de je izazvan , u do 96% slučajeva, sa defektom u Mecp2 genu (Zoghbi, 2005). Kao rezultat, mutantni miševi sa inaktiviranim MeCP2 obezbeđuju životinjski model sa obeležjima kliničkog Retovog sindroma, sa fenotipom koji pokazuje neka preklapanja sa modelima ASD inaktiviranja NLGN4, shank3 i IB2 . Prema tome, miševi sa inaktiviranim MeCP2 pokazuju jasna pogoršanja u LTP u hipokalmpusu zajedno sa odgovarajućim padom u socijalnim i prostornoj memoriji (Moretti et al, 2006) i pogoršanom prepoznavanju objekata (Schaevitz et al, 2010).

[0072] Prema tome, ASDs kod ljudi deli mnogo karakteristika kognitivnih ili razvojnih poremećaja kod životinja, uključujući glodare. Prema tome, ispitivanje terapija ASDs kod pacova kao što su miševi i pacovi je razumno predvidivo sa rezultatima dobijenim kod ljudskih bića.

Jedinjenja prema pronalasku

[0073] Izvesna izvođenja prema ovom pronalasku uključuju nove derivate cikličnog prolil-glutamata ("cPG") koji ima strukturu kao što je dole opisano.

[0074] U izvesnim izvođenjima, jedinjenja formule 1 uključuju supstituente gde:

X<1>je izabran iz grupe koju čine NR’, O i S;

X<2>je izabran iz grupe koju čine CH2, NR’, O i S;

R<1>, R<2>, R<3>, R<4>i R<5>su nezavisno izabrani iz grupe koju čine -H, -OR’,-SR’, -NR’R’, -NO2, -CN, -C(O)R’, -C(O)OR’, -C(O)NR’R’, -C(NR’)NR’R’, trihalometil, halogen, alkil, supstituisani alkil, heteroalkil, supstituisani heteroalkil, alkenil, supstituisani alkenil, alkinil, supstituisani alkinil, aril, supstituisani aril, heteroaril, supstituisani heteroaril, arilalkil, supstituisani arilalkil, heteroarilalkil i supstituisani heteroarilalkil; svaki R’ je nezavisno izabran iz grupe koju čine -H, alkil, heteroalkil, alkenil, alkinil, aril, arilalkil, heteroaril i heteroarilalkil;

ili R<4>i R<5>uzeti zajedno su -CH2-(CH2)n-CH2- gde n je ceo broj od 0-6;

ili R<2>i R<3>uzeti zajedno su -CH2(CH2)n-CH2-gde n je ceo broj od 0-6;

uz uslov da kada R<1>= metil i R<2>=R<3>=R<4>=H tada R<5>≠ benzil i; kada R<1>= H, bar jedan od R<2>i R<3>≠ H.

[0075] U drugim izvođenjima, jedinjenja formule 1 uključuju supstituente, gde:

R<1>=metil, R<2>=R<3>=R<4>=R<5>= H, X<1>=NH, X<2>=CH2;

R<1>=alil, R<2>=R<3>=R<4>=R<5>=H, X<1>-NH, X<2>=CH2;

R<1>=R<2>=R<3>=H, R<4>=R<5>=metil, X<1>=NH, X<2>=CH2;

R<1>=R<4>=R<5>=H, R<2>=R<3>=metil, X<1>-NH, X<2>=CH2.

[0076] U drugim izvođenjima prema pronalasku, jedinjenja formule 1 uključuju supstituente, gde; R<4>i R<5>uzeti zajedno su -CH2-(CH2)n-CH2- i:

R<1>=metil, R<2>=R<3>=H, n=0, X<1>=NH, X<2>=CH2;

R<1>-metil, R<2>=R<3>=H, n=2, X<1>=NH, X<2>=CH2;

R<1>=alil, R<2>=R<3>=H, n=0, X<1>-NH, X<2>=CH2;

R<1>=alil, R<2>=R<3>=H, n=2, X<1>=NH, X<2>=CH2.

R<1>=metil, R<2>=R<3>=H, n=3, X<1>=NH, X<2>=CH2;

R<1>=alil, R<2>=R<3>=H, n=3, X<1>=NH, X<2>=CH2.

[0077] U još nekim izvođenjima pronalaska, jedinjenja formule 1 uključuju supstituente gde R<1>=metil ili alil, R<2>=R<3>=R<4>=H i R<5>je izabran iz grupe koju čine bočni lanci aminokiselina: alanin, arginin, asparagin, asparaginska kiselina, cistein, glutaminska kiseline , glutamin, histidin, izoleucin, leucin, lizin, metionin, prolin, serin, treonin, triptofan, tirozin, valin, norvalin, norleucin, citrulin, ornitin, homocistein, homoserin, aloizoleucin, izovalin, sarkozin i slično.

[0078] U drugačijim izvođenjima pronalaska, jedinjenja formule 1 uključuju supstituente u kojima:

R’=metil, R<2>=R<3>=metil, R<4>=R<5>=H, X<1>=NH i X<2>=S;

R<1>=alil, R<2>=R<3>=metil, R<4>=R<5>=H, X<1>=NH, i X<2>=S.

[0079] Stručnjaci iz ove oblasti će znati da gornji strukturni prikaz mogu sadržati hiralne centre, broj koji će zavisti od različitih supstituenata. Hiralnost može biti ili R ili S u svakom centru. Strukturne slike mogu prikazivati samo jedan od mogućih tautomernih, konformacionih diastereomernih ili enantiomernih oblika i podrazumeva se da pronalazak obuhvata bilo koji tautomerni, konformacioni izomerni diasteroizomerni ili enantiomerni oblik, koji pokazuje biološku ili farmakološku aktivnosot koja je ovde opisana .

Farmakologija i korišćenje

[0080] Ciklični Glicil-2-Alil Prolin (cG-2-AlilP) je opisan u US prijavi korisnog modela br: 11/399,974 podnetoj aprila 7, 2006, pod nazivom "Ciklični G-2Alil Prolin u lečenju Parkinskonove bolesti ," sada U.S. Patentu br. 7,776,876, izdatom avgusta 17, 2010, US prijavi korisnog modela br: 10/570,395, podnetoj marta 2, 2006 pod naslovom "Neuroprotektivna biciklična jedinjenja i postupci za njihovu upotrebu," sada U.S. Patent br. 8,067,425, PCT međunarodnoj patentoj prijavi br: PCT/US2004/028308, pod nazivom "Neuroprotektivna biciklična jeidnjenja i postupci za njihovu upotrebu ," US privremena patentna prijava pod serijskim brojem: 60/499,956 podneta septembra 3, 2003, pod nazivom "Neuroprotektivna biciklična jedinjenja i postupci za njihovu upotrebu ," i US Patentna prijava br. 13/043,215 podneta marta 8, 2011, pod nazivom "Ciklični Glicil-2-AlilProlin poboljšava kognitivno ponašanje oštećenih životinja ."

[0081] Izvesni aspekti ovog pronalaska uključuju upotrebu cikličnog G-2-AlilP u lečenju kognitivnih oštećenja u vezi sa starenjem sa neurodegenerativnim stanjima ili u situacijama u kojima kognitivna oštećenja su nađena bez očigledne neurodegeneracije.

[0082] Skopolamin je uobičajeno korišćen na životinjskim modelima sa holinergičnom hipofunkcijom u vezi sa Alchajmerovom bolešću. Primećeni funkcionalni deficiti posle tretmana skopolaminom uključuju one nađene kod humanih pacijenata sa Alchajmerovom bolešću. Prema tome, tretman sa skopolaminom razumno predviđa kognitivna oštećenja koja su nađena kod humanih bolesti. Dodatno, tretiranje skopolaminom podražava kognitivne disfunckije kod ljudi koji nemaju neurodegenerativne poremećaje.

[0083] cG-2-AlilP davan životinjama tretiranim sa skopolaminom izazvanim kognitivnim disfunkcijama izaziva kliničko poboljšanje kod ovih životinja, slično terapeutskom poboljšanju primećenom kod ljudi koji pate od holinergične hipofunkcije. Na primer, holinergična hipofunkcija je u vezi sa Alchajmerovom bolešću. Prema tome, ispitivanje efekata cikličnog G-2-AlilP životinja tretiranih sa skopolaminom racionalno predviđaju efekte primećene kod ljudi koje pate od holinergične disfunkcije.

[0084] Druga sredstva mogu biti davana zajedno sa jedinjenjem prema ovom pronalasku . Takva druga sredstva mogu biti izabrana iz grupe koju čine na primer, faktori rasta i sa njim u vezi derivati, npr. faktor rasta sličan insulinu-I (IGF-I), faktor rasta sličan insulinu-II (IGF-II), tripeptidni GPE, transformišući faktor rasta-β1, aktivin, hormon rasta, nervni faktor rasta, proten koji vezuje hormon rasta , i/ili IGF-vezujući proteini. Dodatna jedinjenja uključuju Glicil-2-Metil Prolil Glutamat i/ili druga jedinjenja opisana u U.S. patentnoj prijavi br: 10/155,864, sada U.S. patentu br.7,041,314, izdatom maja 9, 2006.

Terapeutske primene

[0085] Kompozicije i postupci prema pronalasku koji nalaze upotrebu u lečenju životinja, kao što su humani pacijenti, koji pate od kognitivnih oštećenja i simptoma u vezi sa ASDs i NDDs. Generalnije, kompozicije i postupci prema pronalasku nalaze upotrebu u lečenju sisara, kao što su humani pacijenti, koji pate od oštećene memorije, intelekturalnog invaliditeta, pogoršane socijalne interkacije, pogoršanja u komunikaciji, ograničenim i repetativnim interesima i ponašanju i napadima.

Farmaceutske kompozicije i davanja

[0086] Ciklični G-2-AlilP može biti davan kao lek ili farmaceutski preparat. Ovo može ukljućivati kombinovanje jedinjenja prema pronalasku sa bilo kojim odgovarajućim nosačem, adjuvantom ili ekscipijentom. Odabir nosača, adjuvanta ili eskcipijenta koji je korišćen će naravno uglavnom zavisisti od načina davanja.

[0087] Generalno, jedinjenja prema pronalasku mogu biti davana u terapeutski efikasnim količinama bilo kojim od uobičajenim poznatih načina u ovoj oblasti, ili pojedinačno ili u kombinaciji sa ostalim konvencionalnim terapeutskim sredstvima za bolesti koje se leče. Terapeutski efikasna količina može varirati široku u zavisnosti od bolesti ili povrede, njene ozbiljnosti, godina i relativnog zdravlja životinje koja se leči, jačine jedinjenja i ostalih faktora. Kao anti-apoptotska, anti-inflamatorna i anti-nekrotična sredstva, terapeutski efikasne količine cikličnog G-2-AlilP mogu biti u opsegu od 0.001 do 100 milligrama po klilogramu mase životinje, sa nižim dozama kao što su 0.001 do 0.1 mg/kg koje su odgovarajuće za davnje kroz cerebrospinalnu tečnost, kao što su intracerebroventrikularno davanje, i više doze kao što su 1 do 100 mg/kg koje su odgovarajuće za davanje psotupcima kao što su oralno, sistemsko (npr. transdermalno), ili parenteralno (npr. intravensko) davanje. Osoba iz struke će biti u stanju da bez neželjenog eksperimentisanja, uzimajući u obzir znanja i veštine iz ove oblasti i opisa, da se odredi terapeutski efikasne količina jedinjenja prema ovom pronalasku za datu bolest ili provredu.

[0088] Ciklični G-2-AlilP i druga jedinjenja slična cGP mogu biti davana periferno pomoću bilo kog perifernog načina poznatog u ovoj oblasti. Oni mogu uključivati parenteralne načine na primer za injekciju u perifernoj cirkulaciji, subkutanozno, intraorbitalno, oftalmički, intraspinalno, intracisternalno, lokalno, infuzijom (korišćenje npr. uređajima za sporo oslobađanje ili mini-pumpama kao što su osmotske pumpe ili flasteri za kožu), implant, aerosol, inhalacija, skarifikacija, intraperitonealno, intrakapsularno, intramuskularno, intranazalno, oralno, bukalno, transdermalno, pulmonarno, rektalno ili vaginalno. Kompozicije mogu biti formulsane za pareteralno davanje ljudima ili drugim sisarima u terapeutski efikasnim količinama (npr. količinama koje eliminišu ili smanjuju pacijenovo patološko stanje) da se obezbedi terapija za gore opisane neurološke bolesti.

[0089] Poželjno, ukoliko je moguće, kada se daje kao anti-apoptotsko, anti-inflamatorno i antinekrotičko sredstvo, ciklični G-2-AlilP može biti davan oralno. Količina jedinjenja prema ovom pronalasku u kompoziciji može široko variratati u zavisnosti od tipa , veličine jedinične doze, vrste ekscipijenata, i drugih faktora dobro poznatih osobi iz struke. Generalno, krajnja kompozciija može sadržati od 0.0001 masenih procenata (% mas) do 10% mas jedinjenja prema ovom pronalasku, poželjno 0.001% mas do 1% mas, a ostatak je ekscipijent ili ekscipijenti.

[0090] Drugi pogodni načini davanja uključuju subkutanoznu injekciju (npr. rastvorenu u nosaču uporedivom sa fiziološkim kao što je 0.9% natrijum hlorid) ili direktno davanje u CNS. Korišćenje stereotaktičkih uređaja i preciznih mapa CNS životinja, jedinjenje može biti injektovano direktno u mesto neurološkog oštećenja. Takvi načini davanja mogu se naročito očekivati u situacijama u kojima je ugrožena perfuzija tog mesta ili kod smanjenog protok vaskularne perfuzije ili cerebralne spinalane tečnosti (CSF) u toj oblasti. Primeri uključuju davanje lateralne cerebroventrikularne injekcije ili preko hiruški umetnutog šanta u lateralne cerebroventrikule mozga pacijenta, intravenski, direktnom injekcijom u željeno mesto, ili direktno ili indirektno pomoću cirkulacije ili drugim putevima.

[0091] Pod "direktno ili indirektno pomoću cirkulacije" mislimo na davanje cG-2-AlilP u bilo koje tkivo koji ima dovoljan protok krvi da dostavi sredstvo u cirkulaciju. Neograničavajući primeri obuhvataju, kožu, nos, farinks, gastrointestinalni trakt ili druga takva tkiva. Kada su davana u takva tkiva, sredstvo je adsorbovano od strane tkiva, tako da sredstvo ulazi u intestinalnu tečnost tkiva i naknado je apsorbovano venulama, kapilarima arteriolama i limfnim kanalima. Sredstvo je zatim uneto u opštu sistemsku cirkulaciju, gde može biti dostavljeno u oštećeno mesto, uključujući mozak. Kada se sredstvo daje subkutanozno ili peritonealno, sredstvo je absorbovano susednim tkivnom, i sredstvo ulazu u cirkulaciju lokalno, i nakandno je raspoređeno u generalnu cirkulaciju, gde može biti transportovano u mozak . Kada sredstvo prilazi krvno-moždanoj barijeri, sredstvo zatim može difuzijom doći do mozga , ili do neutralnog tkiva, ili u cerebrospinalnu tečnost, gde može biti dostavljen u neutralna tkiva.

[0092] Efikasna količina jedinjenja u CNS može biti povećana davanjem oblika jedinjenja, koje obuhvata jedinjenje prema pronalasku i nosač, gde je nosač spojen sa jedinjenjem prema pronalasku vezom koja je podložna cepanju ili razlaganju u pacijentu. Bilo koja veza može biti korišćena koja će se cepati ili razložiti posle davanja .

[0093] Međutim, ne postoji namera prijavioca da isključe ostale oblike davanja.

[0094] U drugim izvođenjima pronalaska, povratak nervne funkcije kod životinja može obuhvatati davanje terapautske količine cikličnog G-2-AlilP u kombinaciji sa drugim neurozaštitnim sredstvom, izabranim između, na primer, faktora rasta i srodnih derivata (fraktor rasta sličan inskulinu-I (IGF-I), faktor rasta sličan insulinu-II (IGF-II), transformišući faktor rasta-β1, aktivin, hormon rasta, nervni faktor rasta, vezujući protein hormona rasta , IGF-vezujući proteini (naročito IGFBP-3), bazni faktor rasta fibroblasta, kiseli faktor rasta fibroblasta, proizvod hst/Kfgk gena, FGF-3, FGF-4, FGF-6, keratocitni faktor rasta, faktor rasta izazvan androgenom. Dodatni članovi FGF familije uključuju, na primer, int-2, homologni faktor faktoru rasta fibroblasta -1 (FHF-1), FHF-2, FHF-3 i FHF-4, karatinocitni faktor rasta 2, glialni aktivirajući faktor, FGF-10 i FGF-16, cilijarni neurotrofni faktor, faktor rasta koji potiče iz mozga, nerotrofin 3, nerotrofin 4, koštani morfogenski protein 2 (BMP-2), nerotrofini faktor koji potiče iz glijalnih ćelija, nerotrofini faktor koji zavisi od aktivnosti, inhibirajući faktor citokinske leukemije, onkostatin M, interleukin), α-, β-, γ-, ili konsezusni interferon, i TNF-α. Drugi oblici neuroprotektivnih terapeutskih sredstava uključuju, na primer, klometiazol; kinurinska kiselina, Semaks, takrolimus, L-treo-1-fenil-2-dekanoilamino-3-morfolino-1-propanol, andrenokortikotropinski-(4-9) analog (ORG 2766) i dizolcipin (MK-801), selegilin; glutamat antagonisti kao što su , NPS1506, GV1505260, MK-801, GV150526; AMPA antagonisti kao što su 2,3-dihidroksi-6-nitro-7-sulfamoilbenzo(f)hinoksalin (NBQX), LY303070 i LY300164; anti-inflamatora sredstva koja su usmerana protiv adresin MAdCAM-1 i/ili njegovi integrin α4 receptori (α4β1 i α4β7), kao što su anti-MAdCAM-lmAb MECA-367 (ATCC pristupni br. HB-9478).

[0095] Ciklični G-2-AlilP i ostala jedinjenja u vezi sa cGP su suštinski davana sistemom sa odloženim oslobađanjem. Pogodni primeri kompozicija sa odloženim oslobađanjem uključuju polupropusne polimerne matrice u obliku oblikovanih proizvoda, npr., filmova, ili mikrokapsula. Matrice sa odloženim oslobađanjem obuhvataju polilaktide (U.S. Pat. br. 3,773,919; EP 58,481), kopolimere L-glutaminsku kiselinu i gama -etil-L-glutamat (Sidman et al., 1983, Biopolymers: 22: 547-56), poli(2-hidroksietil metakrilat) (Langer et al., 1981, J. Biomed. Mater. Res.: 15: 267), etilen vinil acetat (Langer et al., 1981, J. Biomed. Mater. Res.: 15: 267), ili poli-D-(-)-3-hidroksibuternu kiselinu (EP 133,988). Kompozicije sa odloženim oslobađanjem takođe uključuju lipozomalno zarobljeno jedinjenje. Lipozomi koji sadrže jedinjenje su poželjno pripremljeni postupcima poznatim per se: DE 3,218,121, EP 52,322, EP 36,676, EP 88,046, EP 143,949, EP 142,641, Japanese Pat. Appln.83-118008, U.S. Pat. br.4,485,045 i 4,544,545, i EP 102,324. Obično, lipozomi su mali (od oko 200 do 800 Angstroma) unilamelarnog tipa u kome lipidni sadžaj je veći od oko 30 mol percenata holesterola, izabranih proporcija koje su prilagođene za najefikasniju terapiju.

[0096] Za pranteralno davanje, u jednom izvođenju ciklični G-2-AlilP mogu biti formulisani generalno mešanjem svakog u željenom stepenu čistoće, u jediničnom doznom injektibilnom obliku (rastvoru, suspenziji, ili emulziji), sa farmaceutski, ili parenteralno, prihvatljivim nosačem, tj., onim koji nije toksičan za primaoca u dozama i korišćenim koncentracijma i kompatibilan je sa drugim sastojcima formulacije.

[0097] Za davanje jedinjenja prema pronalasku u mukozno tkivno, može se ugraditi jedinjenje u gel formulaciju. Jednom dato preko mukoze (npr., oralna šupljina, gastrointestinalni takt, rektum), sredstvo može biti difundovati iz gela, ili gel može biti degradiran, na taj način oslobađanjem sredstva u tkivo, gde može biti adsorbovano u cirkulaciju. Primeri gel formulacija mogu uključivati one napravljene sa karboksipolisaharidima kao što su karboksimetil celuloza, karboksietil celuloza, hitin, hitosan, skrob, celuloza, proteini kao što su hijaluronska kiselina, ili ostali polimeri, kao što su polivinilpirollidin, polivinil alkoholi, kao i ostali gel materijali koji su poznati u stanju tehnike.

[0098] Generalno, formulacije su dobijene dovođenjem u kontakt cikličnog G-2-AlilP sa tečnim nosačima ili fino raspoređenim u čvrstim nosačima ili oba. Zatim ukoliko je neophodno proizvod je obrazovan u željenu formulaciju. Poželjno nosač je parenteralni nosač, poželjnije rastvor je izotoničan sa krvlju primaoca. Primeri takvih nosača uključuju vodu, rastvor soli, Ringerov rastvor, puferisani rastvor, i dekstrozni rastvor. Nevodena sredstva kao što su fiksna ulja i etil oleat su takođe ovde korisna.

[0099] Nosač pogodno sadrži manje količine kao što su supstance koje pospešuju izotoničnost i hemijsku stabilnost. Takvi materijali su netoksični za primaoce u dozama i koncentracijama korišćenim, i uključuju pufere kao što su fosfat, citrat, sukcinat, sirćetna kiselina, i ostala organska sredstva ili njihove soli; antioksidansi kao što je askorbinska kiselina; niska molekulska masa (manja od oko deset ostataka) polipeptidi, npr., poliarginin ili tripeptidi; proteini, kao što su serum albumin, želatin, ili imunoglobulini; hidrofilni polimeri kao što su polivinilpirolidon; glicin; amino kiseline kao što su glutaminska kiselina, asparaginska ksielina, histidin ili arginin; monosaharidi, disaharidi, i drugi ugljenihidrati koji uključuju celulozu ili njihove derivate, glukozu, manozu, ili dekstrine; sredstvo za helataciju kao što je EDTA; šećerne alkohole kao što su manitol ili sorbitol; suprotne jone kao što natrijum; nejonska površinski aktivna sredstva kao što su polisorbati, polokasmeri, ili polietilen glikol (PEG); i/ili neutralne soli, npr., NaCl, KCl, MgCl2, CaCl2, itd.

[0100] Ciklični G-2-AlilP i ostala cGP jedinjenja tipično formulisana u takvim sredstva na pH od ili oko 4.5 do 8. Razume se da upotreba izvesnih prethodno pomenutih ekscipijenata, nosača ili stabilizatora će dovesti do obrazovanja soli jedinjenja. Krajnji preparat može biti stabilna tečnost ili liofilizovani čvrsti oblik.

[0101] Formulacije cikličnog G-2-AlilP u farmaceutskim kompozicijama mogu takođe uključivati adjuvanse. Tipični adjuvansi koji mogu biti uključeni u tablete, kapsule i slično su nosači kao što je akacija, kukuruzni skrob ili želatin; ekscipijenti kao što je mikrokristalna celuloza; sredstvo za dezintegraciju kako što je kukuruzni skrob ili alginska kiselina ; lubrikans kao što je magnezijums tearat; sredstvo za zaslađivanje kao što je saharoza ili laktoza; sredstvo za korekciju ukusa kao što je pepermint, zimzelen ili višnja. Kada su dozni oblici tablete, kompozicije cikličnog G-2-AlilP mogu uključivati vezivna sredstva i opciono glatke obloge. Kada je dozni oblik kapsula, pored gornjih materijala, može takođe sadržati tečni nosač kao što su masna ulja. Drugi materijali različitih tipova mogu biti korišćeni u oblaganju ili kao modifikatori fizilčkog oblika dozne jedinice. Sirup ili eliksir mogu sadržati aktivno jedinjenje, zaslađivač kao što je saharoza, sredstva za održavanje kao što je propil paraben, sredstva za bojenje, i sredstvo za korekciju uskusa kao što je višnja. Sterilne kompozicije za injekciju mogu biti formulsiane prema konvencionalnoj farmaceutskoj praksi. Na primer, rastvaranje ili suspenzija aktivnog jedinjenja u sredstvu kao što je voda ili biljno ulje koje se javlja u prirodi kao što je susamovo, kikirikijevo ili ulje semena pamuka ili sintetička masna sredstva kao što su etil oleat ili slično mogu biti poželjni. puferi, sredstva za održavanje, antioksidanti, i slično mogu biti ugrađeni prema prihvaćenoh farmaceutskoj praksi .

[0102] Za injekcije, intraventrikularno davanje, i ostali invanzivni putevi davanja, ciklični G-2-AlilP moraju biti sterilni. Sterilnost se može postići bilo kojim poznatim postupkom za davanje ceđenjem kroz sterilne memebrane za filtraciju (npr., membrane od 0.2 mikrona). Terapeutske kompozicije generalno mogu biti smeštene u kontejner koji ima sterilni pristupni port, na primer, kesa za intravenski rastvor ili fiola koja ima zapušač koji je u stanju da se probuši hipodermičkom injekcionom iglom.

[0103] Farmaceutska formulacija koja sadrži ciklični G-2-AlilP obično može biti čuvana u jediničnim ili višedoznim kontejnerima, na primer, u zatopljenim ampulama ili fiolama, kao vodeni rastvor ili kao liofilizovana formulacija za rekonstituciju. Kao primer liofilizovane formulacije, fiole od 10 mL su napunjene sa 5 mL sterilno proceđenog 1% (mas/v) vodenog rastvora jedinjenja, dobijena smeša je liofilizovana. Infuzioni rastvor je pripremljen rekonstitucijom liofilizovanjem jedinjenja pomoću bakteriostatske vode za injekcije. Podrazumeva se da ostali dozni oblici i tipovi preparata mogu biti korišćeni, i svi se smatraju kao deo ovog pronalaska .

Dobijanje jedinjenja

[0104] Polazni materijali i korišćena sredstva u dobijanju cikličnog G-2-AlilP su ili dostupna kod komercijalnih snabdevača kao što su Aldrich Chemical Company (Milwaukee, Wis.), Bachem (Torrance, Calif.), Sigma (St.Louis, Mo.), ili su pripremljena dobro poznatim postupcima stručnjacima iz ove oblasti koje prate postupke opisane u takvim referencama kao što su Fieser and Fieser’s Reagents for Organic Synthesis, vols 1-17, John Wiley and Sons, New York, N.Y., 1991; Rodd’s Chemistry of Carbon Compounds, vols.1-5 and supplements, Elsevier Science Publishers, 1989; Organic Reactions, vols.1-40, John Wiley and Sons, New York, N.Y., 1991; March J; Advanced Organic Chemistry, 4th ed. John Wiley and Sons, New York, N.Y., 1992; i Larock: Comprehensive Organic Transformations, VCH Publishers, 1989. U većini slučajeva, aminokiseline i njihovi estri ili amidi, i zaštićene aminokisleine, su široko komercijalno dostupne; i dobijanje modifkovanih aminokisleina i njihovih amida ili estara je opširno opisano u hemijskoj i biohemijskoj literaturi i prema tome je dobro poznato osobama iz struke.

[0105] Polazni materijali, intermedijeri, i krajnji proizvodi ovog pronalaska mogu biti izolovani i prečišćeni korišćenjem konvencionalnih tehnika, uključujući ceđenje, destilaciju, kristalizaciju, hromatografiju, i slično. Oni mogu biti karakterisani pomoću konvencionalnih postupaka, korišćenjem fizičkih konstanti i spektralnih podataka .

[0106] Ciklični G-2-AlilP je ciklični dipeptid (biciklični 2,5-diketopiperazin), i član je klase jedinjenja poznatog kao ciklični GPx ("cGP"). Generalno, cGPs i ciklični G-2-AlilP mogu biti pripremljeni postupcima koji su već dobro poznati stručnjacima iz ove oblasti peptida i modifikovanih pepetidinih sinteza, praćenjem reakcionih šema iznetih na slikama koje prate ovaj opis, ili praćenjem drugih postupaka dobro poznatih stručnjacima iz ove oblasti sinteze peptida i analoga. Videti na primer, Bodanzsky: Principles of Peptide Synthesis, Berlin, New York: Springer-Verlag 1993.

[0107] Sinteza diketopiperazinskih jedinjenja prema pronalasku može biti sinteza u vodenoj fazi kao što je diskutovano u Primerima ili pomoću sinteze na čvrstoj fazi kao postupcima koji su dati kao primer u Merrifield et al.1963 J. Amer. Chem. Soc.: 85, 2149-2156. Sinteze na čvrstoj fazi mogu biti izvedene pomoću komercijalnih peptidinih sintetizatora, kao što je Applied Biosystems Model 430A, pomoću ustanovljenih protokola za ovaj instrument.

[0108] Specifični primeri diketopiperazinskih sinteza mogu biti nađeni u Primerima koji slede i u , na primer, Fischer, 2003, J. Peptide Science: 9: 9-35 i njegovim referenacma. Osoba iz struke neće imati poteškoće, uzimajući u obzir dostupne veštine i znanje, i prema ovog opisu, razvijanju jednog ili više pogodnih sintetskih postupaka prema ovom pronalasku .

[0109] Izbor odgovarajućih zaštitinih grupa za izabrani postupak (na čvrstoj fazi ili u tečnoj fazi ), i odgovarajući supstrati ukoliko je korišćena sinteza na čvrstoj fazi, će biti u okviru umešnosti prosečne osobe iz stuke iz ove oblasti. Odgovarajuće zaštitne grupe za sintezu peptida uključuju tbutiloksikarbonil (Boc), fluorenilmetiloksikarbonil (Fmoc), Benzil (Bzl), t-amiloksikarbonil (Aoc), tozil (Tos), benziloksikarbonil (Z ili Cbz), o-bromo-benzilooksikarbonil (BrZ) i slično. Dodatne zaštitne grupe su identifikovane u Goodman M. (ed.), "Sinteza Peptides and Peptidomimetics" in Methods of organic chemistry (Houben-Weyl) (Workbench Edition,E22a,b,c,d,e;2004;Georg Thieme Verlag, Stuttgart, New York)..

[0110] Izbor sredstva za kuplovanje za izabrani postupak će takođe biti u okviru umešnosti prosečne osobe iz stuke iz ove oblesti. Pogodna sredstva za kuplovanje obuhvataju DCC (N, N’-Dicikloheksilkarbodiimid), Bop (Benzotriazol-1-il-oksi-tris-(dimetilamino)-fosfonijum heksafluorofosfat), PyBop (Benzotriazol-1-il-oksitripirolidinofosfonijum heksafluorofosfat), BopCl (bis(2-okso-3-oksazolidinil)fosfinski hlorid), 2-Hloro-1,3-dimetilimidazolidinium heksafluorofosfat (CIP) i slično. Druga jedinjenja mogu biti korišćena u sintezi npr. za sprečavanja racemizacije, kao što su HOBt (N-Hidroksibenzotriazol) i HOAt (1-Hidroksi-7-azabenzotriazol).

Izvođenja

[0111]

Izvođenje 1. Postupak za lečenje simptoma poremećaja iz spektra autizma (ASD) ili neurorazvojnih poremećaja (NDD) kod životinja koje pate od tog poremećaja, koji se sastoji od davanja životinji, jedinjenja koje ima formulu:

ili njegove farmaceutski prihvatljive soli ili hidrata, gde

X<1>je izabran iz grupe koju čine NR’, O i S;

X<2>je izabran iz grupe koju čine CH2, NR’, O i S;

R<1>, R<2>, R<3>, R<4>i R<5>su nezavisno izabrani iz grupe koju čine -H, -OR’,-SR’, -NR’R’, -NO2, -CN, -C(O)R’, -C(O)OR’, -C(O)NR’R’, -C(NR’)NR’R’, trihalometil, halogen, alkil, supstituisani alkil, heteroalkil, supstituisani heteroalkil, alkenil, supstituisani alkenil, alkinil, supstituisani alkinil, aril, supstituisani aril, heteroaril, supstituisani heteroaril, arilalkil, supstituisani arilalkil, heteroarilalkil i supstituisani heteroarilalkil; svaki R’ je nezavisno izabran iz grupe koju čine -H, alkil, heteroalkil, alkenil, alkinil, aril, arilalkil, heteroaril i heteroarilalkil;

ili R<4>i R<5>uzeti zajedno su -CH2-(CH2)n-CH2-gde je n celi broj od 0-6;

ili R<2>i R<3>uzeti zajedno su -CH2-(CH2)n-CH2-gde je n celi broj od 0-6;

uz uslov da kada R<1>= metil i R<2>=R<3>=R<4>=H tada R<5>≠ benzil i; gde R<1>= H, bar jedan od R<2>i R<3>≠ H.

Izvođenje 2. Postupak za lečenje simptoma poremećaja iz spektra autizma (ASD) ili neurorazvojnog poremećaja (NDD) kod životinje koja pati od takvog poremećaja, koji obuhvata davanje životinji, jedinjenja koje ima formulu:

ili njegove farmaceutski prihvatljive soli ili hidrata, gde

X<1>je izabran iz grupe koju čine NR’, O i S;

X<2>je izabran iz grupe koju čine CH2, NR’, O i S;

R<1>, R<2>i R<3>su nezavisno izabrani iz grupe koju čine grupa koju čine -H, -OR’, -SR’, -NR’R’, -NO2, -CN, -C(O)R’, -C(O)OR’, -C(O)NR’R’, -C(NR’)NR’R’, trihalometil, halogen, alkil, supstituisani alkil, heteroalkil, supstituisani heteroalkil, alkenil, supstituisani alkenil, alkinil, supstituisani alkinil, aril, supstituisani aril, heteroaril, supstituisani heteroaril, arilalkil, supstituisani arilalkil, heteroarilalkil i supstituisani heteroarilalkil; svaki R’ je nezavisno izabran iz grupe koju čine -H, alkil, heteroalkil, alkenil, alkinil, aril, arilalkil, heteroaril i heteroarilalkil;

ili R<2>i R<3>uzeti zajedno su -CH2-(CH2)n-CH2-gde je n celi broj od 0-6;

uz uslov da bar jedan od R ≠ H.

Izvođenje 3. Postupak za lečenje simptoma poremećaja iz spektra autizma (ASD) ili neurorazvojnog poremećaja (NDD) kod životinje koja pati od takvog poremećaja, obuhvata davanje životinji, a jedinjenja koje ima formulu :

ili njegove farmaceutski prihvatljive soli ili hidrata, gde

X<1>je izabran iz grupe koju čine NR’, O i S;

X<2>je izabran iz grupe koju čine CH2, NR’, O i S;

R<1>, R<2>i R<3>su nezavisno izabrani iz grupe koju čine grupa koju čine -H, -OR’, -SR’, -NR’R’, -NO2, -CN, -C(O)R’, -C(O)OR’, -C(O)NR’R’, -C(NR’)NR’R’, trihalometil, halogen, alkil, supstituisani alkil, heteroalkil, supstituisani heteroalkil, alkenil, supstituisani alkenil, alkinil, supstituisani alkinil, aril, supstituisani aril, heteroaril, supstituisani heteroaril, arilalkil, supstituisani arilalkil, heteroarilalkil i supstituisani heteroarilalkil; svaki R’ je nezavisno izabran iz grupe koju čine -H, alkil, heteroalkil, alkenil, alkinil, aril, arilalkil, heteroaril i heteroarilalkil;

ili R<2>i R<3>uzeti zajedno su -CH2-(CH2)n-CH2-gde je n celi broj od 0-6.

Izvođenje 4. Postupak za lečenje simptoma poremećaja iz spektra autizma (ASD) ili neurorazvojnog poremećaja (NDD) kod životinje koja pati od takvog poremećaja, obuhvata davanje životinji, jedinjenja formule:

ili njegove farmaceutski prihvatljive soli ili hidrata, gde

X<1>, X<3>, i X<4>su nezavisno izabrani iz grupe koju čine S, O, i NH;

X<2>je izabran iz grupe koju čine S, O, CH2i NH;

R<1>, R<2>, R<3>, R<4>i R<5>su nezavisno izabrani iz grupe koju čine -H, -OR’,-SR’, -NR’R’, -NO2, -CN, -C(O)R’, -C(O)OR’, -C(O)NR’R’, -C(NR’)NR’R’, trihalometil, halogen, alkil, supstituisani alkil, heteroalkil, supstituisani heteroalkil, alkenil, supstituisani alkenil, alkinil, supstituisani alkinil, aril, supstituisani aril, heteroaril, supstituisani heteroaril, arilalkil, supstituisani arilalkil, heteroarilalkil i supstituisani heteroarilalkil; svaki R’ je nezavisno izabran iz grupe koju čine H, alkil, heteroalkil, alkenil, alkinil, aril, arilalkil, heteroaril i heteroarilalkil;

ili R<4>i R<5>uzeti zajedno su -CH2-(CH2)n-CH2-gde je n celi broj od 0-6;

ili R<2>i R<3>uzeti zajedno su -CH2-(CH2)n-CH2-gde je n celi broj od 0-6; uz uslov da bar jedan od R ≠ H i da oba X<3>i X<4>≠ O.

Izvođenje 5. Postupak za lečenje simptoma poremećaja iz spektra autizma (ASD) ili neurorazvojnog poremećaja (NDD) kod životinje koja pati od takvog poremećaja, obuhvata davanje životinji, jedinjenja formule:

ili njegove farmaceutski prihvatljive soli ili hidrata, gde

R<1>i R<2>su nezavisno izabrani iz grupe koju čine grupa koju čine -H, -OR’, -SR’, -NR’R’, -NO2, -CN, -C(O)R’, -C(O)OR’, -C(O)NR’R’, -C(NR’)NR’R’, trihalometil, halogen, alkil, supstituisani alkil, heteroalkil, supstituisani heteroalkil, alkenil, supstituisani alkenil, alkinil, supstituisani alkinil, aril, supstituisani aril, heteroaril, supstituisani heteroaril, arilalkil, supstituisani arilalkil, heteroarilalkil i supstituisani heteroarilalkil;

svaki R’ je nezavisno izabran iz grupe koju čine -H, alkil, heteroalkil, alkenil, alkinil, aril, arilalkil, heteroaril i heteroarilalkil;

ili R<1>i R<2>uzeti zajedno su -CH2-(CH2)n-CH2-gde je n celi broj od 0-6.

Izvođenje 6. Postupak za lečenje simptoma poremećaja iz spektra autizma (ASD) ili neurorazvojnog poremećaja (NDD) kod životinje koja pati od takvog poremećaja, obuhvata davanje životinji, jedinjenja formule:

ili njegove farmaceutski prihvatljive soli ili hidrata, gde

R<1>, R<2>i R<3>su nezavisno izabrani iz grupe koju čine grupa koju čine -H, -OR’, -SR’, -NR’R’, -NO2, -CN, -C(O)R’, -C(O)OR’, -C(O)NR’R’, -C(NR’)NR’R’, trihalometil, halogen, alkil, supstituisani alkil, heteroalkil, supstituisani heteroalkil, alkenil, supstituisani alkenil, alkinil, supstituisani alkinil, aril, supstituisani aril, heteroaril, supstituisani heteroaril, arilalkil, supstituisani arilalkil, heteroarilalkil i supstituisani heteroarilalkil;

svaki R’ je nezavisno izabran iz grupe koju čine -H, alkil, heteroalkil, alkenil, alkinil, aril, arilalkil, heteroaril i heteroarilalkil; i

li R<2>i R<3>uzeti zajedno su -CH2-(CH2)n-CH2-gde je n celi broj od 0-6.

Izvođenje 7. Postupak za lečenje simptoma poremećaja iz spektra autizma (ASD) ili neurorazvojnog poremećaja (NDD) kod životinje koja pati od takvog poremećaja, obuhvata davanje životinji, jedinjenja formule:

ili njegove farmaceutski prihvatljive soli ili hidrata, gde

R je izabran iz grupe koju čine alkil, supstituisani alkil, heteroalkil, supstituisani heteroalkil, alkenil, supstituisani alkenil, alkinil, supstituisani alkinil, aril, supstituisani aril, heteroaril, supstituisani heteroaril, arilalkil, supstituisani arilalkil, heteroarilalkil i supstituisani heteroarilalkil.

Izvođenje 8. Postupak prema bilo kom od izvođenja 1 do 4 ili 6 gde R<1>= metil.

Izvođenje 9. Postupak prema bilo kom od izvođenja 1 do 4 ili 6 gde R<1>= alil.

Izvođenje 10. Postupak prema bilo kom od izvođenja 1 do 4 gde R<2>= R<3>= metil i X<2>= S.

Izvođenje 11. Postupak prema izvođenju 1 gde R<1>= alil, R<2>= R<3>= R<4>= R<5>= H, X<1>= NH, X<2>= CH2.

Izvođenje 12. Postupak prema izvođenju 1 gde R<1>= metil, R<2>= R<3>= H, R<4>i R<5>uzeti zajedno su -CH2-(CH2)3-CH2-, X<1>= NH, X<2>= CH2.

Izvođenje 13. Postupak prema izvođenju 1 gde R<1>= metil, R<2>= R<3>=H, R<4>i R<5>uzeti zajedno su -CH2-(CH2)2-CH2-, X<1>= NH, X<2>= CH2.

Izvođenje 14. Postupak prema bilo kom od izvođenja 1 do 13, dalje obuhvata davanje farmaceutski prihvatljivog ekscipijenta.

Izvođenje 15. Postupak prema bilo kom od izvođenja 1 do 13, dalje obuhvata davanje farmaceutski prihvatljivog ekscipijenta i sredstva za povezivanje.

Izvođenje 16. Postupak prema bilo kom od izvođenja 1 do 13, dalje obuhvata davanje farmaceutski prihvatljivog ekscipijenta i kapsule.

Izvođenje 17. Postupak prema bilo kom od izvođenja 1 do 13, dalje obuhvata davanje bar jednog drugog anti-apoptotičkog, anti-nekrotičnog ili neuroprotektivnog sredstva.

Izvođenje 18. Postupak prema izvođenju 17 gde drugo anti-apoptotičko ili neurozaštitno sredstvo je izabrano izgrupe koju čine faktori rasta i njihovih derivata (faktor rasta sličan insulinu-I [IGF-I], faktor rasta sličan insulinu-II [IGF-II], transformišući faktor rasta-β1, aktivin, hormon rasta, nervni faktor rasta, vezujući protein hormon rasta, IGF-vezujući proteini [naročito IGFBP-3], bazni faktor rasta fibroblasta, kiseli faktor rasta fibroblasta, hst/Kfgk genski proizvd, FGF-3, FGF-4, FGF-6, keratocitni faktor rasta, faktor rasta izazvan androgenom, int2, homologni faktor faktru rasta fibroblasta -1 (FHF-1), FHF-2, FHF-3 i FHF-4, karatinocitni faktor rasta 2, glijalni aktivirajući faktor, FGF-10 i FGF-16, cilijarni neurotropni faktor,faktor rasta koji potiče iz mozga, nerotrofin 3, nerotrofin 4, koštani morfogenski protein 2 [BMP-2], nerotrofini faktor koji potiče iz glijalnih ćelija, neurotrofini faktor koji zavisi od aktivnosti, inhibirajući faktor citokinske leukemije, onkostatin M, interleukin, α-interferon, β-interferon, γ-interferon, konsezusni interferon, TNF-α, klometiazol; kinurinska kiselina, Semaks, takrolimus, L-treo-1-fenil-2-dekanoilamino-3-morfolino-1-propanol, adrenokortikotropin-(4-9) analog [ORG 2766], dizolcipin [MK-801], selegilin, antagonist glutamata , AMPA antagonist, i anti-inflamatorno sredstvo.

Izvođenje 19. Postupak prema izvođenju 18 gde pomenuti antagonist glutamata je izabran iz grupe koju čine NPS1506, GV1505260, MK-801, i GV150526.

Izvođenje 20. Postupak prema izvođenju 18, gde pomenuti AMPA antagonist je izabran iz grupe koju čine 2,3-dihidroksi-6-nitro-7-sulfamoilbenzo(f)hinoksalin (NBQX), LY303070 i LY300164.

Izvođenje 21. Postupak prema izvođenju 18, gde pomenuto anti-inflamatorno sredstvo je izabrano iz grupe koju čine anti-MAdCAM-1 antitelo i antitelo naspram integrinskog α4β1 receptora i integrinskog α4β7 receptora.

Izvođenje 22. Postupak prema izvođenju 21, gde je pomenuto anti-MAdCAM-1 antitelo MECA-367.

Izvođenje 23. Postupak prema izvođenju 1, gde je pomenuto jedinjenje ciklični G-2-AlilP.

Izvođenje 24. Postupak prema izvođenju 1, gde je pomenuto jedinjenje ciklični cikloheksil-G-2MeP.

Izvođenje 25. Postupak prema izvođenju 1, gde je pomenuto jedinjenje ciklični ciklopentil-G-2MeP.

Izvođenje 26. Postupak za lečenje simptoma poremećaja iz spektra autizma (ASD) ili neurorazvojnog poremećaja (NDD) kod životinje koja pati od takvog poremećaja, obuhvata davanje životinji, farmaceutski efikasne količine cikličnog Glicil-2-Alil Prolina (cG-2-AlilP) pomenutom sisaru.

Izvođenje 27. Postupak prema izvođenju 26, gde pomenuti cG-2-AlilP obuhvata vodeni rastvor i jedan ili više farmaceutski prihvatljivih ekscipijenta, aditiva, noača ili ajduvanasa.

Izvođenje 28. Postupak prema izvođenju 26, dalje obuhvata jedan ili više ekscipijenata, nosača, aditiva, adjuvanasa ili vezivnih sredstava u tableti ili kapsuli.

Izvođenje 29. Postupak prema bilo kom od izvođenja 1 do 28, gde je pomenuti poremečaj izabran iz grupe koju čine autistični poremećaj, Aspergerov sindrom, dezintegrativni poremećaj u detinjstvu i pervazivni razvojni poremećaj koji nije drugačije specifikovan (PDD-NOS), i patološko izbegavanje naloga (engl.Pathological Demand Avoidance-PDA).

Izvođenje 30. Postupak prema bilo kom od izvođenja 1 do 28, gde je poremećaj izabran iz grupe koju čine Sindrom fragilnog X (FXS), Angelmanov sindrom, Kompleks tuberozne skleroze, Phelan McDermidov sindrom, Retov sindrom, CDKL5 mutacije, i poremećaj infantilnog spazma u vezi sa X.

Izvođenje 31. Postupak prema bilo kom od izvođenja 1 do 30, gde je jedinjenje davano ili direktno ili indirektno preko cirkulacije.

Izvođenje 32. Postupak prema bilo kom od izvođenja 1 do 31, gde je pomenuto jedinjenje davano oralnim, intraperitonealnim, intravaskularnim, perifernom cirkulacijom, subkutanozno, intraorbitalno, oftalmički, intraspinalno, intracisternalno, lokalno, infuziono, implantom, aerosolom, inhalacijom, skarifikacijom, intraperitonealno, intrakapsularno, intramuskularno, intranazalno, bukalno, transdermalno, pulmonarno, rektalno, ili vaginalnim putem.

Izvođenje 33. Postupak prema bilo kom od izvođenja 1 do 32, gde pomenuta efikasna količina ima nižu granicu od oko 0.001 milligrama po klogramu mase (mg/kg) životinje i gornju granicu od oko 100 mg/kg.

Izvođenje 34. Postupak prema bilo kom od izvođenja 1 do 33, gde je procena efikasnosti pomoću merenja fosforilovanog ERK (pERK) ili fosforilovanog Akt (pAkt) u limfocitima životinje, gde normalizacija od ili pERK ili pAkt ukazuje na smanjenje ozbiljnosti pomenutog poremećaja.

Izvođenje 35. Postupak prema bilo kom od izvođenja 1 do 33, gde pomenuto lečenje izaziva poboljšanje simptoma ASD ili NDD kako je procenjeno korišćenjem jednog ili više kličikih testova izabranih iz grupe koju čine Prirodna istorija Retovog sindroma/ skala kliničke ozbiljnosti, Kontrolna lista neneormalnog ponašanja izdanje zajednice (Aberrant Behavior Checklist Community EditionABC), Vinelandove skale adaptivnog ponašanja, Globalan utisak kliničke ozbiljnosti (Clinical Global Impression of Severity-CGI-S), Globalan utisak kliničkog poboljšanja (Clinical Global Impression Improvement - CGI-I) Upitnik napora negovatelja (Caregiver Strain Questionnaire CSQ) ili jedan ili više fizoloških testova izabranih iz grupe koj u čine udarna frekvenca elektroencefalograma (EEG), celokupna snaga u trakama frekvence EEG, hemisferne koherence EEG frekvenciji, stereotipni pokreti ruku, QTc i varjabilnost srčanog rada (HRV), abnormalna ćelijska ekspresija fosfo -ERK1/2 i fosfo-Akt, abnormalna ekspresija rasta u vezi sa proteinom-43 (GAP-43), abnormalna ekspresija sinaptofizina (SYN), respiratorne neregularnosti i kuplovanje srčane i respiratorne iregularnosti u poređenju sa kontrolnim životinajma koje ne pate od pomenutog poremećaja.

Izvođenje 36. Postupak prema bilo kom od izvođenja 1-35, gde pomenuti simptom ASD je kognitivno oštećenje ili kognitivna disfunkcija, jedan ili više znakova ili simptoma gubitka pamćenja, gubitka prostorne orijentacije orijentacije, smanjene sposobnost učenja, smanjene sposobnost obrazovanja kratkoročne ili dugoročne memorije, smanjene epizodne memorije, smanjene sposobnost konsolidovanja memorije, smanjena prostorne memorije, smanjene sinaptogeneze, smanjene sinaptička stabilnost, nedostaci u izvršnim funkcijama, nedostaci kognitivnog mapiranja i scenske memorije, nedostaci u deklarativnoj i relacijskoj memoriji, smanjeno brzo sticanje konfiguracionih ili konjuktivnih asocijacija , smanjeno kodiranje i pronalaženje specifičnih događaja vezanih za kontekst, smanjena epizodna memorija i/ili memorija slična epizodnoj, anksioznost nenormalno uslovljavanje straha, abnormalna socijalna ponašanja, repetativno ponašanje, abnormalno noćno ponašanje, napadi, nenormalno kretanje, abnormalna ćelijska ekspresija fosfo-ERK1/2 i fosfo-Akt, i bradikardija.

Izvođenje 37.Postupak detektovanja prisustva, ozbiljnosti ili procene terapeutske efikanosti bilo kog od prethodnih izvođenja, koji obuhava merenje ekspresije fosfo-ERK1/2 ili fosfo-Akt u perifernim limfocitima subjekta sa ASD u poređenju sa ekspresijom fosfo-ERK1/2 ili fosfo-Akt u perifernim limfocitima grupe koja je podvrgnuta subjektima koji nemaju ASD, ili ekspresiji fosfo-ERK1/2 ili fosfo-Akt u perifenim limfocitima subjekta pre lečenja .

PRIMERI

[0112] Prikazani pronalazak je dalje prikazan sa sledećim primerima. Ovi primeri su ponuđeni samo kao ilustracija i nemaju nameru da ograniče obim pronalaska .

Opšti postupci sinteze jedinjenja

[0113] Fleš hromatografija je izvedena pomoću Scharlau 60 (40-60 m mesh) silikagela. Analitička tankoslojena hromatografija je izvedna na pločama predhodno obloženim sa 0.20 mm silikagela (ALUGRAM® SIL G/UV254) i jedinjenja su vizuelizovana pomoću UV fluorescence, ili zagrevanjem ploča potopleljenih u kalijum permanganat u alkalnom rastvoru.

[0114] Tačke topljenja u stepenima Celzijusa (°C) su određene na Electrothermal® uređaju za tačku topljenja i nisu korigovane .

[0115] Optičke rotacije su merene na 20° C na Perkin Elmer 341 polarimeteru korišćenjem ćeliija sa dužinom prolaza 10 cm i dati su u jedinicama od 10<-1>degcm<2>g<-1>. Uzorci su pripremljeni u navedenom rastvaraču sa označenim koncentracijama (merenim u g/100 cm<3>). IR spektri su snimani na Perkin Elmer Spectrum One FT-IR spektrometru. Uzorci su pripremljeni kao tanki filmovi na diskovima od natrijum hlorida ili kao čvrste supstance na kalijum bromidnim diskovima . Široki signal je označen kao br. Frekvence (�) apsorpcioni maksimum su dati kao talasni brojevi (cm<-1>).

[0116] NMR spektri su snimani na Bruker AVANCE DRX400 (<1>H, 400 MHz;<13>C, 100 MHz) ili na Bruker AVANCE 300 (<1>H, 300 MHz;<13>C, 75 MHz) spektrometru na temperaturama okoline . Za<1>H NMR podatke hemijski pomaci su ispisani u delovima po milion niz polje od SiMe4i zabeleženi su konsekutivno kao položaj (δH), relativni integral, multiplicitet (s = singlet, d = dublet, t = triplet, dd = dublet dubleta, m = multiplet, br = širok), konstanta kuplovanja (J/Hz) i dodeljeni. Za<13>C NMR podatke, hemijski pomaci su opisani u delovima na milion u odnosu na CDCl3i zabeleženi su konsekutivno kao položaj (δC), stepen hibridizacije koje je određen sa DEPT eksperimentima, i dodeljeni.<1>H NMR spektri su urađeni u odnosu na unutrašnji SiMe4(δ 0.00) ili CDCl3(δ 7.26).<13>C NMR spektri su bili urađeni u odnosu na unutrašnji CDCl3(δ 77.0). Kada dva seta signala se jave u NMR spektru usled različitih konformacija oko glicinprolin amidne veze, hemijski pomak za manje zastupljen cis konformer je obeležena sa zvezdicom (*).

[0117] Merenja tačne mase su zabeležena na VG-70SE masenom spektrometru.

[0118] Heksan i dihlorometan su rastvoreni pre upotrebe. Metanol je osušen pomoću opiljaka magenzijm i joda, i destilovan je pod azotom. Trietilamin je osušen preko kalcijum hidrida i destilovan pod azotom .

Primer 1: Sinteza (8aS)-Metil-heksahidropirolo[1,2-a]pirazin-1,4-diona (Ciklični G-2MeP) [0119]

[0120] Šema 1: Reagensi, uslovi i prinosi: (i) LDA, THF, -78 °C, jodometan, -78 -> -50 °C, 2 h (63%); (ii) SOCl2, CH3OH, refluks, N2, 2.5 h (98%); (iii) Et3N, BoPCl, CH2Cl2, RT, N2, 20.5 h (78%); (iv) 10% Pd/C, CH3OH, RT, 15 h (98%).

(2R,5S)-4-Metil-2-trihlorometil-1-aza-3-oksabiciklo[3.3.0]oktan-4-on 9

[0121] n-BuLi (1.31 M, 4.68 cm<3>, 6.14 mmol) je dodat u kapima u mešani rastvor diizopropilamina (0.86 cm<3>, 6.14 mmol) u suvom tetrahidrofuranu (10 cm<3>) na -78 °C u atmosferi azota. Rastvor je mešan u toku 5 min, zagrejan na 0 °C i mešan u toku 15 min. Rastvor je zatim dodat u kapima u rastvor oksazolidinona 8 (1.00 g, 4.09 mmol) u suvom tetrahidrofuranu (20 cm<3>) na -78 °C u toku 20 min (pri čemu se boja pretvorila u tamno braon), mešan je u toku još 30 min a zatim je dodat jodometan (0.76 cm<3>, 12.3 mmol) u kapima u toku 5 min. Rastvor je zagrejan na -50 °C u toku 2 h. Dodata je voda (15 cm<3>) i rastvor je zagrejan na sobnu temepraturu i ekstrahovan sa hloroform (3 x 40 cm<3>). Spojeni organski ekstrakti su osušeni (MgSO4), proceđeni i upareni do suvog in vacuo da bi se dobila tamno braon polu-čvrsta supstanca. Prečišćavanje ostatka sa fleš hroamtografijom na koloni (15% etil acetatheksan) dalo je oksazolidinona 9 (0.67 g, 63%) kao bledo žutu čvrstu supstancu : mp 55-57 °C (lit., 57-60 °C); δH(300 MHz, CDCl3) 1.53 (3H, s, CH3), 1.72-2.02 (3H, m, Proβ-H i Proγ-H2), 2.18-2.26 (1H, m, Proβ-H), 3.15-3.22 (1H, m, Proδ-H), 3.35-3.44 (1H, m, Proδ-H) i 4.99 (1H, s, NCH).

Metil L-2-metilprolinat hidrohlorid 10

a) Korišćenje acetil hlorida

[0122] Oksazolidinon 9 (0.60 g, 2.33 mmol) je rastvoren u suvom metanolu (15 cm<3>) u atmosferi azota i u kapima je dodat acetil hlorid (0.33 cm<3>, 4.66 mmol) u rastvor hlađen ledom. Rastvor je zagrejan pod refluksom u toku 4.5 h, zatim je rastvarač uklonjen pod sniženim pritiskom da bi se dobilo braon ulje koje je prečišćeno sa fleš khromatografijom (10% CH3OH-CH2Cl2) dajući hidrohlorid 10 (0.2 g, 48%) kao pahuljastu belu čvrstu supstancu: tt 107-109 °C (lit., 106-108 °C); δH(300 MHz, CDCl3) 1.81 (3H, s, CH3), 1.93-2.14 (3H, m, Proβ-HAHBi Proγ-H2), 2.33-2.39 (1H, m, Proβ-HAHB), 3.52-3.56 (2H, m, Proδ-H2) i 3.82 (3H, s, CO2CH3).

b) Korišćenje tionil hlorid

[0123] Ledom hlađen rastvor oksazolidinona 9 (53 mg, 0.21 mmol) u suvom metanolu (1 cm<3>) je tretiran u kapima sa tionil hloridom (0.045 cm<3>, 0.62 mmol). Rastvor je grejan pod refluksom 2.5 h, ohlađen i rastvarač je uklonjen pod sniženim pritiskom da se dobije braon ulje. Ulje je rastvoreno u toluenu (5 cm<3>), koncentrovano do suvog da bi se uklonio zaostali tionil hlorid i metanol zatim prečišćen fleš hromatografijom na koloni (10% CH3OH-CH2Cl2) da bi se dobio hidrohlorid 10 (16 mg, 43%) kao pahuljasta bela čvrsta supstanca.<1>H NMR signali su se slagali sa onim gore zabeleženim.

Metil-N-benziloksikarbonil-glicil-L-2-metilprolinat 12

[0124] Suvi trietilamin (0.27 cm<3>, 1.96 mmol) je dodat u kapima u rastvor hidrohlorida 10 (0.11 g, 0.61 mmol) i N-benziloksikarbonil-glicina 11 (98.5%) (0.17 g, 0.79 mmol) u suvom dihlorometanu (35 cm<3>) u atmosferi azota na sobnoj temperaturi, i reakciona smeša je mešana u toku 10 min. Bis(2-okso-3-oksazolidinil)fosfinski hlorid (BoPCl, 97%) (0.196 g, 0.77 mmol) je dodat i dobijeni bezbojni rastvor je mešan u toku 20.5 h. Rastvor je ispran uzastopno sa 10% vodenom hlorovodoničnom kiselinom (30 cm<3>) i zasićenim vodenim natrijum hidrogen karbonatom (30 cm<3>), osušen (MgSO4), proceđen i uparen do suvog in vacuo. Prečišćavanje dobijenog ostatka sa fleš hromatografijom na koloni (50-80% etil acetat-heksan; gradijentna elucija) dala je dipeptid 12 (0.18 g, 92%) kao bezbojno ulje. Amid 12 je pokazano da postoji kao smeša 98:2 trans:cis komformera sa<13>C NMR analizom (odnos je procenjen iz relativnih intenziteta rezonanci na δ 20.8 i 23.5 pripisanih Proy-C atomima manje zastupljenog i glavnog konformera, respektivno ): [α]D-33.0 (c 1.0 in MeOH); vmax(film)/cm<-1>3406, 2952, 1732, 1651, 1521, 1434, 1373, 1329, 1310, 1284, 1257, 1220, 1195, 1172, 1135, 1107, 1082, 1052, 1029, 986, 965, 907, 876, 829, 775, 738 i 699; δH(300 MHz, CDCl3) 1.49 (3H, s, CH3), 1.77-2.11 (4H, m, Proβ-H2i Proγ-H2), 3.43-3.48 (2H, m, Proδ-H2), 3.61 (3H, s, OCH3), 3.85-3.89 (2H, m, Glyα-H2), 5.04 (2H, s, PhCH2), 5.76 (1H, br s, N-H) i 7.21-7.28 (5H, s, ArH); δC(75 MHz, CDCl3) 13.8<∗>(CH3, Proα-CH3), 21.1 (CH3, Proα-CH3), 20.8<∗>(CH2, Proy-C), 23.5 (CH2, Proy-C), 38.0 (CH2, Prop-C), 40.8<∗>(CH2, Prop-C), 43.3 (CH2, Glyα-C), 45.5<∗>(CH2, Glyα-C), 46.6 (CH2, Proδ-C), 48.7<∗>(CH2, Prοδ-C), 51.9* (CH3, OCH3), 52.1 (CH3, OCH3), 60.0* (quat., Proα-C), 66.0 (quat., Proα-C), 66.3 (CH2, PhCH2), 68.6* (CH2, PhCH2), 127.5 (CH, Ph), 127.6 (CH, Ph), 127.9* (CH, Ph), 128.1 (CH, Ph), 128.3* (CH, Ph), 136.2 (quat., Ph), 155.9 (quat., NCO2), 166.0 (quat., Gly-CON), 169.4* (quat., Gly-CON) i 173.6 (quat., CO2CH3); m/z (EI+) 334.1535 (M<+>. C17H12N2O5requires 334.1529).

(8aS)-Metil-heksahidropirolo[1,2-a]pirazin-1,4-dion (Ciklični G-2MeP)

[0125] U rastvor dipeptida 12 (0.167 g, 0.51 mmol) u metanolu (8.0 cm<3>) je dodat 10% Pd na aktivnom uglju (8.1 mg, 0.076 mmol) i sud ispran sa gasovitim vodonikom. Dobijena suspenzija je mešana intenzivno u atmosferi vodonika u toku 15 h. Smeša je zatim proceđena kroz sloj celita i zatim kroz čep silikagela sa metanolom i rastvarač je uklonjen pod sniženim pritiskom da bi se dobio ciklični G-2MeP (83 mg, 98%) kao žuta čvrsta supstanca: tt 133-135 °C; [α]D-128.1 (c 0.52 in MeOH); δH(300 MHz, CDCl3) 1.36 (3H, s, CH3), 1.87-2.01 (3H, m, ProβHAHBi Proγ-H2), 2.07-2.21 (1H, m, Proβ-HAHB), 3.45-3.64 (2H, m, Proδ-H2), 3.82 (1H, dd, J 17.1 i 4.1, CHAHBNH), 3.99 (1H, d, J 17.1, CHAHBNH) i 7.66 (1H, br s, N-H); δC(75 MHz, CDCl3) 20.2 (CH2, Proy-C), 23.2 (CH3, Proα-CH3), 35.0 (CH2, Proβ-C), 44.7 (CH2, Proδ-C), 45.9 (CH2, CH2NH), 63.8 (quat., Proα-C), 163.3 (quat., NCO) i 173.3 (quat., CONH); m/z (EI+) 168.08986 (M<+>. C8H12N2O2zahteva 168.08988).

Primer 2: Sinteza (8aS)-Metil-spiro[cikloheksan-1,3(4H)-tetrahidropirolo[1,2-a]pirazin]-1,4(2H)-dion (Ciklični cikloheksil-G-2-MeP)

[0126]

[0127] Šema 2: Reagensi, uslovi i prinosi: (i) BnO2CCl, Na2CO3, H2O-dioksan (3:1), 19 h, 96%; (ii) Et3N, HOAt, CIP, 1,2-dihloroetan, refluks, N2, 19 h (23%); (iii) 10% Pd/C, CH3OH, RT, 17 h (65%).

N-benziloksikarbonil-1-aminocikloheksan-1-karboksilna kiselina (14)

[0128] U suspenziju 1-aminocikloheksankarboksilne kiseline 13 (0.72 g, 5.02 mmol) i natrijum karbonata (1.6 g, 15.1 mmol) rastvorenu u voda-dioksanu (21 cm<3>, 3:1) je dodat benzil hloroformijat (0.79 cm<3>, 5.52 mmol) dodat je u kapima i rastvor je mešan na sobnoj temperaturi u roku 19.5 h. Vodeni sloj je ispran sa dietil etrom (60 cm<3>), zakišeljen sa 2 M HCl i ekstrahovan sa etil acetatom (2 x 60 cm<3>). Organski slojevi su sakupljeni, osušeni (MgSO4), proceđeni i upareni pod sniženim pritiskom da se dobije bezbojno ulje, koje očvršćava stajanjem da bi se dobio čvrsti karbamat 14 (1.23 g, 88%) kao bele čvrsta supstanca: mp 152-154 °C (lit., 148-150°C); δH(400 MHz, CDCl3) 1.27-1.56 (3H, m, 3 x cikloheksil-H), 1.59-1.73 (3H, m, 3 x cikloheksil-H), 1.85-1.91 (2H, m, 2 x ciklopentil-H), 2.05-2.09 (2H, m, 2 x ciklopentil-H), 5.02 (1H, br s, N-H), 5.12 (2H, s, OCH2Ph) i 7.27-7.36 (5H, s, Ph); δC(100 MHz, CDCl3) 21.1 (CH2, 2 x cikloheksil-C), 25.1 (CH2, 2 x cikloheksil-C), 32.3 (CH2, cikloheksil-C), 59.0 (quat.,1-C), 67.1 (CH2, OCH2Ph), 128.1 (CH, Ph), 128.2 (CH, Ph), 128.5 (CH, Ph), 136.1 (quat., Ph), 155.7 (quat., NCO2) i 178.7 (quat., CO2H).

Metil-N-benziloksikarbonil-cikloheksil-glicil-L-2-metilprolinat (15)

[0129] Suvi trietilamin (0.21 cm<3>, 1.5 mmol) je dodat u kapima u rastvor hidrohlorida 10 (84.0 mg, 0.47 mmol), karboksilne kiseline 14 (0.17 g, 0.61 mmol) i 1-hidroksi-7-azabenzotriazola (16 mg, 0.12 mmol) u suvom 1,2-dihloroetanu (26 cm<3>) u atmosferi azota na sobnoj temperaturi, i reakciona smeša je mešana u toku 10 min. 2-Hloro-1,3-dimetilimidazolidinium heksafluorofosfat (0.13 g, 0.47 mmol) je dodat i dobijeni rastvor je zagrejan pod refluksom u toku 21 h, zatim je ispran uzastopno sa 10% vodenom hlorovodoničnom kiselinom (30 cm<3>) i zasićenim vodenim natrijum hidrogen karbonatom (30 cm<3>), osušen (MgSO4), proceđen i uparen do suvog in vacuo. Prečišćavanje dobijenog ostatka sa fleš hromatografijom na koloni (40-50% etil acetat-heksan; gradijentna elucija) dobijen je amid 15 (16 mg, 9%) kao bela čvrsta supstanca. Amid 15 je pokazano da postoji kao smeša 11:1 trans:cis konformera sa<13>C NMR analizom (odnos je procenjen iz relativnih intenziteta rezonanci na δ 41.3 i 48.2 dodeljenih Proy-C atomima manje zastupljenog i glavnog konformera, respektivno ): tt 219-222 °C; [α]D-44.9 (c 1.31 u CH2Cl2); vmax(film)/cm<-1>3239, 2927, 1736, 1707, 1617, 1530, 1450, 1403, 1371, 1281, 1241, 1208, 1194, 1165, 1150, 1132, 1089, 1071, 1028, 984,912, 796, 749, 739 i 699; δH(400 MHz, CDCl3) 1.24-2.10 (17H, m, Proα-CH3, Proβ-H2, Proγ-H2i 5 x cikloheksil-H2), 3.25-3.48 (1H, br m, Proδ-HAHB), 3.61-3.87 (4H, br m, OCH3i Proδ-HAHB), 4.92-5.19 (3H, m, N-H i OCH2Ph) i 7.35-7.37 (5H, s, Ph); δC(100 MHz, CDCl3) 21.26 (CH2, cikloheksil-C), 21.33 (CH2, cikloheksil-C), 21.7 (CH3, ProαCH3), 24.8 (CH2, cikloheksil-C), 25.0 (CH2, Proγ-C), 29.4* (CH2, cikloheksil-C), 29.7* (CH2, cikloheksil-C), 31.1 (CH2, cikloheksil-C), 31.6 (CH2, cikloheksil-C), 31.9* (CH2, cikloheksil-C), 32.2* (CH2, cikloheksil-C), 32.8* (CH2, cikloheksil-C), 37.3 (CH2, Proβ-C), 41.4* (CH2, Proδ-C), 48.2 (CH2, Proδ-C), 52.1 (CH3, OCH3), 59.1 (quat., Glyα-C), 66.7 (CH2, OCH2Ph), 67.3* (CH2, OCH2Ph), 67.4 (quat., Proα-C), 128.0* (CH, Ph), 128.1* (CH, Ph), 128.3 (CH, Ph), 128.5 (CH, Ph), 128.7 (CH, Ph), 136.6 (quat., Ph), 153.7 (quat., NCO2), 171.0 (quat., Gly-CO) i 174.8 (quat., CO2CH3); mlz (EI+) 402.2151 (M<+>. C22H30N2O5zahteva 402.2155).

(8aS)-Metil-spiro[cikloheksan-1,3(4H)-tetrahidropirolo[1,2-a]pirazin]-1,4(2H)-dion (Ciklični cikloheksil-G-2MeP)

[0130] U rastvor amida 15 (40 mg, 0.01 mmol) u metanolu (3.3 cm<3>) je dodat 10% Pd na aktivnom uglju (1.6 mg, 0.015 mmol) i sud je ispran sa gasovitim vodonikom. Dobijena suspenzija je mešana intenzivno u atmosferi vodonika u toku 61.5 h, zatim proceđena kroz sloj Celite™ sa metanolom (15 cm<3>). Filtrat je koncentrovan do suvog pod sniženim pritiskom da bi se dobila polu-čvrsta supstanca koja je prečišćena sa fleš hromatografijom na koloni C18 sa reverznom fazom (0-10% CH3CN/H2O; gradijentna elucija) da bi se dobio ciklični cikloheksil-G-2MeP (19 mg, 81%) kao bela čvrsta supstanca: tt 174-177 °C; [α]D-63.8 (c 1.13 in CH2Cl2); vmax(film)/cm<-1>3215, 2925, 2854, 1667, 1646, 1463, 1427, 1276, 1232, 1171, 1085, 1014, 900, 868, 818, 783, 726 i 715; δH, (400 MHz, CDCl3) 1.31-1.89 (12H, m, 9 x cikloheksil-H i 8a-CH3), 1.94-2.15 (4H, m, 7-H2i 8-H2), 2.26 (1H, td, J 13.7 i 4.5, 1 x cikloheksil-H), 3.44-3.51 (1H, m, 6-HAHB), 3.79-3.86 (1H, m, 6-HAHB) i 6.40 (1H, br s, N-H); δC(100 MHz, CDCl3) 19.5 (CH2, 7-C), 20.6 (CH2, cikloheksil-C), 20.8 (CH2, cikloheksil-C), 24.5 (CH2, cikloheksil-C), 25.0 (CH3, 8a-CH3), 33.7 (CH2, cikloheksil-C), 36.3 (CH2, 8-C), 36.5 (CH2, cikloheksil-C), 44.7 (CH2, 6-C), 59.5 (quat., 8a-C), 64.0 (quat., 3-C), 168.1 (quat., 4-C) i 171.6 (quat., 1-C); m/z (EI+) 236.15246 (M<+>. C13H20N2O2zahteva 236.15248).

Primer 3: Sinteza (8aS)-Alil-heksahidropirolo[1,2-a]pirazin-1,4-dion (Ciklični G-2-AlilP)

[0131]

[0132] Šema 3: Reagensi, uslovi i prinosi: (i) LDA, THF, -78 °C, alil bromid, -78 -> -30 °C, N2, 4 h (60%); (ii) acetil hlorid, CH3OH, reflux, N2, 24 h (63%); (iii) Et3N, BoPCl, CH2Cl2, RT, N2, 19.5 h (45%); (iv) TFA, CH2Cl2, 1 h, then Et3N, CH2Cl2, 23 h (37%).

(2R,5S)-4-Alil-2-trihlorometil-1-aza-3-oksabiciklo[3.3.0]oktan-4-on 17

[0133] n-BuLi (1.31 M, 9.93 cm<3>, 13.0 mmol) je dodat u kapima u rastvor koji se meša diizopropilamina (1.82 cm<3>, 13.0 mmol) u suvom tetrahidrofuranu (20 cm<3>) na -78 °C u atmosferi azota. Rastvor je mešan u toku 5 min, zagrejan na 0 °C, mešan u toku 15 min zatim je dodat u kapima u rastvor prooksazolidinona 16 (2.12 g, 8.68 mmol) u suvom tetrahidrofuranu (40 cm<3>) na -78 °C u toku 20 min i reakciona smeša je mešana u toku još 30 min, zatim je dodat alil bromid (2.25 cm<3>, 26.0 mmol) u kapima u toku 5 min. Rastvor je polako zagrejan na -30 °C u toku 4 h, zaustavljen sa H2O (30 cm<3>) i smeša je zagrejana na sobjoj temperaturi i ekstrahovana sa hloroform (3 x 80 cm<3>). Spojeni organski ekstrakti su osušeni (MgSO4), proceđeni i upareni do suvog in vacuo da bi se dobila tamno braon polučvrsta supstanca koja je prečišćena sa fleš hromatografijom na koloni (10-20% etil acetat-heksan; gradijentna elucija) da bi se dobio oxazolidinon 17 (1.48 g, 60%) kao narandžasto ulje koje je očvrslo na 0 °C, za koji su nmr podaci bili saglasni sa onim zabeleženim u literaturi : δH(400 MHz, CDCl3) 1.58-1.92 (2H, m, Proγ-H2), 1.96-2.14 (2H, m, ProβH2), 2.50-2.63 (2H, m, Proδ-H2), 3.12-3.23 (2H, m, CH2-CH=CH2), 4.97 (1H, s, NCH), 5.13-5.18 (2H, m, CH=CH2) i 5.82-5.92 (1H, m, CH=CH2); δC(100 MHz, CDCl3) 25.1 (CH2, Proγ-C), 35.1 (CH2, Proβ-C), 41.5 (CH2, Proδ-C), 58.3 (CH2) CH2CH=CH2), 71.2 (quat., Proα-C), 100.4 (quat., CCl3), 102.3 (CH, NCH), 119.8 (CH2, CH2CH=CH2), 131.9 (CH, CH2CH=CH2) i 176.1 (quat., C=O); m/z (CI+) 284.0009 [(M+H)<+>. C10H13<35>Cl3NO2zahteva 284.0012], 285.9980 [(M+H)<+>. C10H13<35>Cl2<37>ClNO2, zahteva 285.9982], 287.9951 [(M+H)<+>. C10H13<35>Cl<37>Cl2NO2zahteva 287.9953] i 289.9932 [(M+H)<+>. C10H13<37>Cl3NO, zahteva 289.9923].

Metil L-2-alilprolinat hidrohlorid 18

[0134] Rastvor oksazolidinona 17 (0.64 g, 2.24 mmol) hlađen na ledu u suvom metanolu (15 cm<3>) je tretiran u kapima sa rastvorom acetil hlorida (0.36 cm<3>, 5.0 mmol) u metanolu (5 cm<3>). Rastvor je zagrevan pod refluksom u toku 24 h, zatim je ohlađen i rastvarač je uklonjen pod sniženim pritiskom. Dobijeno braon ulje je rastvoreno u toluenu (40 cm<3>) i koncentrovano do suvog da bi se uklonio zaostali tionil hlorid i metanol, zatim je prečišćen fleš hromatografijom na koloni (5-10% CH3OH-CH2Cl2; gradijentna elucija) da bi se dobio hidrohlorid 18 (0.29 g, 63%) kao zelena čvrsta supstanca za koju su se NMR podaci slagali sa oni zabeleženim u literaturi : δH(300 MHz, CDCl3) 1.72-2.25 (3H, m, ProβHAHBi Proγ-H2), 2.32-2.52 (1H, m, Proβ-HAHB), 2.72-3.10 (2H, m, Proδ-H2), 3.31-3.78 (2H, m, CH2CH=CH2), 3.84 (3H, s, CO2CH3), 5.20-5.33 (2H, m, CH=CH2), 5.75-5.98 (1H, m, CH=CH2) i 8.06 (1H, br s, N-H); m/z (CI+) 170.1183 [(M+H)<+>. C9H16NO2zahteva 170.1181].

Metil-N-terc-butiloksikarbonil-glicil-L-2-alilprolinat 20

[0135] Suvi trietilamin (0.28 cm<3>, 2.02 mmol) je dodat u kapima u rastvor hidrohlorida 18 (0.13 g, 0.63 mmol) i N-terc-butiloksikarbonil-glicina 19 (0.14 g, 0.82 mmol) u suvom dihlorometanu (35 cm<3>) u atmosferi azota na sobnoj temperaturi, i reakciona smeša je mešana u toku 10 min. Bis(2-okso-3-oksazolidinil)fosfinski hlorid (BoPCl, 97%) (0.20 g, 0.80 mmol) je dodat i rastvor je mešan u toku 19.5 h, zatim ispran uzastopno sa 10% vodenom hlorovodoničnom kiselinom (35 cm<3>) i zasićenim vodenim natrijum hidrogen karbonatom (35 cm<3>), osušen (MgSO4), proceđen i uparen do suvog in vacuo. Prečišćavanje dobijenog ostatka sa fleš hromatografijom na koloni (40% etil acetat-heksan) dalo je dipeptid 20 (0.09 g, 45%) kao svetlo žuto ulje: [α]D+33.8 (c 0.83 u CH2Cl2); vmax(film)/cm<-1>3419, 3075, 2977, 2930, 2874, 1739, 1715, 1656, 1499, 1434, 1392, 1366, 1332, 1268, 1248, 1212, 1168, 1122, 1051, 1026, 1003, 943, 919, 867, 830, 779, 739, 699 i 679; δH(300 MHz, CDCl3) 1.42 [9H, s, C(CH3)3], 1.93-2.08 (4H, m, Proβ-H2i Proγ-H2), 2.59-2.67 (1H, m, CHAHBCH=CH2), 3.09-3.16 (1H, m, CHAHBCH=CH2), 3.35-3.44 (1H, m, ProδHAHB), 3.56-3.62 (1H, m, Proδ-HAHB), 3.70 (3H, s, OCH3), 3.89 (2H, d, J 4.2, Glyα-H2), 5.06-5.11 (2H, m, CH=CH2), 5.42 (1H, br s, Gly-NH) i 5.58-5.72 (1H, m, CH=CH2); δC(75 MHz, CDCl3) 23.7 (CH2, Proy-C), 28.3 [CH3, C(CH3)3], 35.0 (CH2, Prop-C), 37.6 (CH2, CH2CH=CH2), 43.3 (CH2, Glyα-C), 47.5 (CH2, Proδ-C), 52.5 (CH3, OCH3), 68.8 (quat., Proα-C), 79.5 [quat., C(CH3)3], 119.4 (CH2, CH=CH2), 132.9 (CH, CH=CH3), 155.7 (quat., NCO2), 166.9 (quat., Gly-CON) i 173.8 (quat., CO2CH3); m/z (EI+) 326.1845 (M<+>. C16H26N2O5zahteva 326.1842).

(8aS)-Alil-heksahidropirolo[1,2-a]pirazin-1,4-dion (Ciklični G-2AlilP)

[0136] U rastvor dipeptida 20 (0.09 g, 0.28 mmol) u dihlorometanu (9 cm<3>) na sobnoj temperaturi je dodata trifluorosirćetna kiselina (1 cm<3>, 0.013 mmol) u kapima i reakcioan smeša je mešana u toku 1 h u atmosferi azota. Rastvor je uparen pod smanjem pritiksu da bi se dobilo bezbojno ulje koje je rastvoreno u dihlorometanu (10 cm<3>), dodat je suvi trietilamin (0.096 cm<3>, 0.69 mmol) i reakciona smeša je mešana u toku 4.5 h, posle čega je dodat trietilamin (0.096 cm<3>, 0.69 mmol) . Reakcioan smeša je mešana u toku noći, koncentrovana do suvog da bi se dobilo zeleno ulje koje je prečišćeno sa fleš hromatografijom na koloni (10% CH3OH-CH2Cl2) da bi se dobio ciklični G-2AlilP (20 mg, 37%) kao beličasta bela čvrsta supstanca: tt 106-109 °C; [α]D-102.7 (c 0.95 u CH2Cl2); vmax(CH2Cl2)/cm<-1>3456, 3226, 2920, 1666, 1454, 1325, 1306, 1299, 1210, 1133, 1109, 1028, 1010, 949, 928, 882, 793, 761 i 733; δH(400 MHz, CDCl3) 1.92-2.01 (2H, m, Proγ-H2), 2.09-2.16 (2H, m, Proβ-H2) 2.39-2.56 (2H, m, CH2CH2=CH2), 3.46-3.53 (1H, m, Proδ-HAHB), 3.78-3.87 (2H, m, Proδ-HAHBi Glyα-HAHB), 4.09 (1H, d, J 17.2, Glyα-HAHB), 5.16-5.20 (2H, m, CH=CH2), 5.73-5.84 (1H, m, CH=CH2) id 7.17 (1H, br s, N-H); δC(100 MHz, CDCl3) 20.1 (CH2, Proy-C), 34.1 (CH2, Prop-C), 41.7 (CH2, CH2CH2=CH2), 44.9 (CH2, Proδ-C), 46.4 (CH2, Glyα-C), 67.2 (quat., Proα-C), 120.9 (CH2, CH=CH2), 131.0 (CH, CH=CH2), 163.4 (quat., NCO) i 171.7 (quat., CONH); m/z (EI+) 195.1132 (M<+>. C10H15N2O2zahteva 195.1134).

Primer 4: Sinteza (8aS)-Metil-spiro[ciklopentan-1,3(4H)-tetrahidropirolo[1,2-a]pirazin]-1,4(2H)-diona (Ciklični Ciklopentil-G-2-MeP)

[0137]

[0138] Šema 4: Reagensi, uslovi i prinosi: (i) Et3N, HOAt, CIP, 1,2-dihloroetan, 83 °C, N2, 19 h (23%); (ii) 10% Pd/C, CH3OH, RT, 17 h (65%).

N-Benziloksikarbonil-1-aminociklopentan-1-karboksilna kiselina 21

[0139] Rastvor benzil hloroformijata (0.290 g, 1.1 mmol) u dioksanu (2.5 cm<3>) je dodat u kapima u rastvor 1-aminociklopentankarboksilne kiseline (Fluka) (0.2 g, 1.54 mmol) i natrijum karbonata (0.490 g, 4.64 mmol) u vodi (5 cm<3>) na 0 °C. Mešanje je nastavljeno na sobnoj temperaturi u toku noći i reakciona smeša je isprana sa etrom, vodeni sloj je zakišeljen sa 2M hlorovodoničnom kiselinom, ekstrahovan sa etil acetatom, suvim (Na2SO4), proceđen i rastvarač je uklonjen da bi se dobio karbamat 21 (0.253 g, 62%) kao ulje koje je očvrslo stajanjem . Karbamat 21 je pokazano da je bio smeša 70:30 konformera sa<1>H NMR analizom (odnos je procenjen integracijom rezonanci na δ 5.31 i 7.29-7.40, koje su pripisane N-H protonima manje zastupljenog i glavnog konformera , respektivno): tt 70-80 °C (lit.<1>82-86 °C, etil acetat, petroleum etar); δH(400 MHz; CDCl3; Me4Si) 1.83 (4H, br s, 2 x ciklopentil-H2), 2.04 (2H, br s, ciklopentyil-H2), 2.20-2.40 (2H, m, ciklopentil-H2), 5.13 (2H, br s, OCH2Ph), 5.31 (0.7H, br s, N-H) i 7.29-7.40 (5.3H, m, Ph i N-H*); δC(100 MHz; CDCl3) 24.6 (CH2, ciklopentil-C), 37.5 (CH2, ciklopentil-C), 66.0 (quat., ciklopentil-C), 66.8 (CH2, OCH2Ph), 128.0 (CH, Ph), 128.1 (CH, Ph), 128.4 (CH, Ph), 136.1 (quat, Ph), 155.8 (quat., NCO2) i 179.5 (quat., CO2H).

Metil N-benziloksikarbonil ciklopentil-glicil-L-2-metilprolinat 22

[0140] Suvi trietilamin (0.19 cm<3>, 1.4 mmol) je dodat u kapima u rastvor hidrohlorida 10 (78 mg, 0.43 mmol), karboksilne kiseline 21 (0.15 g, 0.56 mmol) i1-hidroksi-7-azabenzotriazola (Acros) (15 mg, 0.11 mmol) u suvom 1,2-dihloroetani (24 cm<3>) u atmosferi azota na sobnoj temperaturi, i reakciona smeša je mešana u toku 10 min.2-Hloro-1,3-dimetilimidazolidinium heksafluorofosfat (CIP) (Aldrich) (0.12 g, 0.43 mmol) je dodat i dobijeni rastvor je zagrevan pod refluksom u toku 19 h, zatim ispran uzastopno sa 10% vodenom hlorovodoničnom kiselinom (30 cm<3>) i zasićenim vodenim natrijum hidrogen karbonatom (30 cm<3>), osušen (MgSO4), proceđen i uparen do suvog in vacuo. Prečišćavanjem dobijenog ostatka sa fleš hromatografijom na koloni (60% etil acetat-heksan) dobijen je amid 22 (39 mg, 23%) kao bele čvrsta supstanca. Amid 22 je pokazano da postoji kao smeša 3:1 trans:cis karbamatnih konformera sa<13>C NMR analizom (odnos je procenjen iz relativnih intenziteta rezonanci na δ 154.1 i 155.7 pripisanim karbamat karbonil-C atomima manje zastupljenog i glavnog konformera, respektivno): tt 200-203 °C; [α]D-54.5 (c 1.52 in CH2Cl2); vmax(film)/cm<-1>3432, 3239, 3042, 2953, 1736, 1712, 1627, 1540, 1455, 1417, 1439, 1374, 1282, 1256, 1216, 1194, 1171, 1156, 1136, 1100, 1081, 1042, 1020, 107, 953, 917, 876, 756 i 701; δH(400 MHz, CDCl3) 1.33-1.53 (3H, br m, Proα-CH3), 1.62-2.20 (11H, m, Proβ-H2, Proγ-H2i 7 x ciklopentil-H), 2.59-2.71 (1H, br m, 1 x ciklopentil-H), 3.31-3.42 (1H, br m, Proδ-HAHB), 3.58-3.79 (4H, br m, OCH3i Proδ-HAHB), 4.92-5.17 (3H, m, N-H i OCH2Ph) i 7.27-7.42 (5H, s, Ph); δC(100 MHz,CDCl3) 21.7 (CH3, Proα-CH3), 24.1* (CH2, ciklopentil-C), 24.2 (CH2, ciklopentil-C), 24.4 (CH2, Proγ-C), 24.5 (CH2, ciklopentil-C), 36.4 (CH2, ciklopentil-C), 37.1 (CH2, ciklopentil-C), 37.2* (CH2, ciklopentil-C), 37.7 (CH2, Proβ-C), 38.2* (CH2, ciklopentil-C), 48.5 (CH2, Prοδ-C), 52.1 (CH3, OCH3), 66.6 (CH2, OCH2Ph), 66.9 (quat., Proα-C), 67.2 (quat., Glyα-C), 127.8 (CH, Ph), 128.2 (CH, Ph), 128.4 (CH, Ph), 136.6 (quat., Ph), 154.1 (quat., NCO2), 155.7* (quat., NCO2), 170.5 (quat., Gly-CO) i 174.7 (quat., CO2CH3); m/z (EI+) 388.1991 (M<+>. C21H28N2O5zahteva 388.1998).

* označava rezonance pripisane manje zastupljenom konformeru.

(8aS)-Metil-1,3(4H)-tetrahidropirolo[1,2-a]pirazin]-1,4(2H)-dion (Ciklični ciklopentil-G-2MeP)

[0141] U rastvor amida 22 (54 mg, 0.14 mmol) u metanolu (4.6 cm<3>) je dodat 10% Pd na aktivnom uglju (2.2 mg, 0.021 mmol) i sud je isrpan sa gasovitim vodonikom. Dobijena suspenzija je mešana intenzivno u atmosferi vodonika u toku 17 h, zatim proceđena kroz sloj Celite™ sa metanolom (15 cm<3>). Filtrat je koncentrovan do suvog pod sniženim pritiskom da bi se dobila žuta polu-čvrsta supstanca koja je prečišćena sa fleš hromatografiji na koloni C18 sa reverznom fazom (0-10% CH3CN/H2O; gradijentna elucija) da bi se dobio ciklični ciklopentil-G-2MeP (20 mg, 65%) kao žuta čvrsta supstanca: tt 160-163 °C; [α]D-97.9 (c 1.61 in CH2Cl2); vmax(film)/cm<-1>3429, 2956, 2928, 2856, 1667, 1643, 1463, 1432, 1373, 1339, 1254, 1224, 1175, 1086, 1048, 976, 835, 774 i 730; δH(300 MHz, CDCl3) 1.47 (3H, br s, 8a-CH3), 1.56-2.19 (11H, m, 8-H2, 7-H2i 7 x ciklopentil), 2.58-2.67 (1H, br m, 1 x ciklopentil), 3.48-3.56 (1H, m, 6-HAHB), 3.72-3.82 (1H, m, 6-HAHB) i 6.56 (1H, br s, N-H); δC(75 MHz,CDCl3) 19.9 (CH2, 7-C), 24.6 (CH2, ciklopentil), 24.92 (CH3, 8a-CH3), 24.93 (CH2, ciklopentil), 36.0 (CH2, 8-C), 38.7 (CH2, ciklopentil), 41.9 (CH2, ciklopentil), 44.8 (CH2, 6-C), 64.3 (quat., 8a-C), 66.8 (quat., 3-C), 168.3 (quat., 4-C) i 172.2 (quat., 1-C); m/z (EI+) 222.1369 (M<+>. C12H18N2O2zahteva 222.1368).

In Vitro i In Vivo Testiranje

[0142] Sledeća farmakološka ispitivanja pokazuju efikasnost cikličnog G-2-AlilP u smanjivanju kognitivnih oštećenja. Oni nemaju nameru da budu ograničavajuća, i druge kompozicije i postupci ovog pronalaska mogu biti razvijeni bez neželjenog eksperimentisanja. Sve ove kompozicije i postupci se smatraju da su deo ovog pronalaska . Svi eksperimenti koji slede su izvedeni korišćenem protokola razvijenih prema smernicama odobrenim od strane University of Auckland Animal Ethics Committee ili sličnih regulatornih tela.

[0143] Efikasnost nootropskih lekova može pogodno biti testirana korišćenjem modela holinergičnih hipofunkcija. Holinergične hipofunkcije je pokazano da doprinose kognitivnim padovima koji su u vezi sa demencijom i ostaju meta terapautskih intervencija za Alchajmerovu bolest (Hunter 2004). Model holinergične hipofunckije je takođe primenjiv na ostala stanja. Na primer, pokazano je da holinergična hipofunkcija izazvana skoploaminom može selektivno oslabiti tačnost prepoznavanja facijalne ekspresije gađenja i besa čineći efekat skoplomania na prepoznavanje emocija sličan onome koji se nalazi kod pacijenata sa Huntingtonovom bolešću (Kamboy 2006). Skopolamin je uobičajeno korišćen za izazivanje holinergične hipofunckije i dobro je poznat model za humanu Alchajmerovu bolest , stanja i ostalih poremećaja kognitivnih funkcija (Liskowsky et al, Int. J. Dev. Neurosci, 24(2-3):149-156 (2006), Lindner et al., Psychopharmacology (Berl.) Sept 27 (2006), Bouger et al., Eur. Neuropsychopharmacol 15(3):331-346 (2005), Ebert et al, Eur. J. Clin. Invest., 28(11):944-949 (1998), Barker et al, Int. J. Geriatr. Psychiatry, 13(4):244-247 (1998), G. Smith, Brain Res. 471(2):103-118 (1998), Flood et al, Behav. Neural. Biol.45(2):169-184 (1986)).

Primer 5: Morisov vodeni lavirint (MWM) učenja i memorije korišćen da se procene efekti cikličnog G-2-AlilP na kognitivnu funkciju

[0144] Svrha ispitivanja je da se ispita ciklični G-2AlilP na različitim stanjima kognitivnog deficita i afektivnog stanja (anksioznosti).

Postupci

[0145] Prvi deo ispitivanja uključuje akutno testiranje cG-2-AlilP na modelu memorije Morisovog vodenog lavirinta (MWM). MWM test je jedan od najčešće korišćenih testova za procenjivanje prostorne memorije kod pacova i dobro je poznato da tačno predviđa efekte bolesti i lečenja generalno na prostornu memoriju. Prema tome, MWM test odražava efekte bolesti i lečenja na humanim subjektima.

[0146] Praćen je standardni postupak za MWM . Mi smo koristili kružni bazen (dubine 80cm x 150cm prečnika) napunjen sa neprozirnom vodom, sa temperaturom koja je održavana na 20°C. Platforma je bila sakrivena 1 cm ispod površine vode, sa smeštenom belom zastavicom (10cm x 10cm) ili 20cm iznad platforme kao vizuelni znak i na položaju ’3 sata’ u odnosu na polaznu lokaciju kao prostorni znak.

Dana 1-4 eksperimenta pacovi su podvrgnuti ispitivanjima stečene memorije sa 6 ispitivanja (60 sekundi svaki) svakog dana testiranja (faza navikavanja). Latenca da se dođe do platforme je zabeležena i dnevno smanjenje srednje vrednosti latence je korišćeno za merenje sposobnosti da se uči gde je bila sakrivena platforma.

[0147] Dana 5 normalnog eksperimenta, Wistar pacovi koji nisu stari, podeljeni su u grupe za primanje ili rastvora soli (n=28) ili skopolamina (0.5 mg/kg, i.p., n=27) da bi se izazvao memorijski deficit. Skopolamin je davan pola sata pre početka probnog testa.

[0148] 10 min posle tretiranja sa skopolaminom, dat je ciklični G-2AlilP oralno 30 mg/kg (n=31) spri čemu su životinjame koje su tretirane sa nosačem primile razblaživač oralnom gavažom korišćenjem istih protokola za testiranje (n=24).

[0149] Akutni efekti cG-2-AlilP su zatim testirani na životinjama sa oštećenom memorijom izazavanom skopolaminom i kod kontrolnih životinja u skladu sa godinama bez oštećene memorije da se odredi bilo koji direktni farmakološki efekat na obradu memorije. Eksperimentalne grupe su detaljno date dole u Tabeli 4.

Tabela 4: Životinje korišćenje za testiranje efekata cG-2-AlilP na memoriju

[0150] Dana 5, probni MWM test je izveden sa uklonjenom platformom. Bilo je 6 ispitivanja, svako sa maksimalnim trajanjem od 60s, sa bar 5 min odmora između ispitivanja). Vreme koji su pacovi proveli plivajući blizu platforme obezbeđeno je kao mera koliko se oslanjaju na vizuelne i prostorne znakove da se odredi platforma, nasuprot korišćenja neprostrone strategije. Podaci su sakupljeni i analizirani korišćenjem softvera za bilo koji lavirint (v4.2) .

[0151] Skupljeni podaci iz bihejvioralnih testova su anlizirani korišćenjem jednosmerne ANOVA za određivanje razlike između starosnih grupa. Dvosmerna ANOVA je korišćena za ispitivanja napredovanja bihjevioralnih rezultata sa vremenskim tačkama tretiranim kao zavisnim faktorima. GraphPad Prism verzija 3.02 su korišćeni za analize podataka.

Rezultati

[0152] Tretiranje sa skopolaminom značajno utiče na pogoršanje sticanja prostorne memorije kod lečenih životinja (vreme do platforme približno 208% kontrole dana 4). Ciklični G-2AlilP (30 mg/kg; dnevno) značajno preokreće kognitivno oštećenje izazvano sa skopolaminom (SLIKE.1A, 1B, 1C).

Primer 6: cG-2-AlilP poboljšava sinaptičku plastičnost i gubitak pamćenja u vezi sa godinama

Postupci

[0153] Stariji pacovi (muški Wistar pacovi, stari 18-20 meseci) su podeljeni u četiri grupe : dve grupe tretirane nosačem (grupe 1 i 3) i dve G-2-AlilP tretirane (grupe 2 i 4) (sve grupe n=6-8). Ciklični G-2-AlilP je sintetisan od strane Department of Medicinal Chemistry i rastvoren u normalnom rastvoru soli pre lečenja. Dana 1 pojedinačna doza cikličnog G-2-AlilP je davana centralno (20ng/životinji i.c.v.) životinjama u grupama 2 i 4; rastvor soli je davan grupama 1 i 3. Testovi memorije su koristi Test prepoznavanja novog objekta koji je počeo ili dana 3 (grupe 1 i 2) ili 24 (grupe 3 i 4) posle lečenja. Po završetku NORT, pacovi su ubijeni sa prekomernom dozom natrijum pentobarbitala i transkardijalno su perfuzirani sa normalnim rastvorom soli što je praćeno sa 10% formalinom. Sakupljena tkiva dana 7 u grupama 1 i 2, i dana 28 iz grupe 3 i 4. Mozgovi su čuvani u istom fiksiru u toku minimalno 2 dana pre obrađivanja korišćenjem standardnih postupaka smeštanja u parafin . Ukratko, mali blokovi (10x10x3 mm) tkiva su fiksirani do 24 h. Blokovi su zatim infiltrirani i smešteni u parafin i isečeni u trake i postavljeni na pločice. Pločice su zatim čuvane do početka imuno-bojenja. Sinaptogeneza u tkivu mozga je ispitivana korišćenjem imunohistohemijskog bojenja.

Test prepoznavanja novih objekta (Novel Object Recognition Test-NORT)

[0154] Istraživačka aktivnost je tipično ponašanje učenja koje životinje pokazjuju uključujući i ljude i pacove u novim okolnostima. Istraživačka aktivnost opada u toku vremena kada novo postane familijarno i javlja se navikavanje. U familijarnim okolinama, istraživačka aktivnost može biti ponovo aktivirana uvođenjem novih objekata. Porast u istraživačkom ponašanju, onda kada se izmeni okolina koje prati navikavanje, obezbeđuje merenje memorije za familijarnost i prepoznavanje novosti .

[0155] U ovom primeru, izveli smo dva NORTs, jedan dana 3-6 i drugi 24-27 dana. Pacovima je omogućeno da se međusobno familijarizuju sa arenom za testiranje (90 x 60 x 40cm) u prvom danu NORT. U sledeća dva dana svakog testa, četiri nova objekta su smeštena u arenu za testiranje i pacovi su imali 2 ispitivanja svakog dana (svaki je trajao 15 min u razmaku od 2 sata). Vreme provedeno u ispitivanju objekata je smanjeno onda kada su testirane životinje naučile objekte (faza treniranja). U poslednjem danu (dan 4 svakog testa), jedan familijarni objekat je zamenjen sa novim objektom pre drugog ispitivanja (test 6, faza testiranja). Srednje vreme provedeno u ispitivanju 3 familijarna objekta i vreme provedeno u ispitivanju novih objekata je korišćeno kao mera za memoriju familijarnosti i prepoznavanja novosti.

Efekti cG-2-AlilP na ekspresiju NMDA receptora, AMPA receptora, rKrox-24 i m RNK sinaptofizina u hipokampusu

[0156] Prihvaćeno je da formacije u hipokapusu kod ljudi i životinja igra presudnu ulogu u broju tipova memorije (Morris et al.2006 Europ. J. Neurosci.23, 2829). Specifična funkcionalnost ostaje sporna, ali postoji razumevanje da hipokampus igra ključnu ulogu u automatskom kodiranju i inicijalnom skladištenju prisutnih iskustava (obrazovanje epizodne memorije ), konsolidacije memorije i detekcije novosti. Prvi aspekt, kodiranje i kratkoročno skladištenje memorije zavisi od sinaptičke plastičnsoti i sinaptičke transmisije, od kojih su oboje vezani za glutaminergičnu neurotransmisiju.

[0157] Glutaminergična transmisija je olakšana sa dva tipa glutamatnih receptora: N-metil-D-aspartatnim receptorima (NMDAR) i receptorima a-amino-3-hidroksi-5-metil-4-izoksalon propionske kiseline AMPA ili ne-NMDA receptorima.

[0158] APMA receptorska podjedinica GluR1 je post-sinaptički receptor i uobičajeno je korišćena za merenje memorije. GluR1 se veruje da posreduje u kalcijumovom influksu, i ima vitalnu funkciju u sinaptičkoj plastičnosti u vezi sa učenjem . Ranije je sugerisano (Hayashi et al., 2000) da inkorporacija GluR1 u sinapsi može biti važna za dugoročno potenciranje (LTP), koje je esencijalno za memoriju učenja.

[0159] Pokazano je da je NMDA receptorska podjedinica NR1 krucijelna za obrazovanje prostorne memorije. Na inaktiviranim modelima (engl.’knock-out’) u kojima je R1 podjedinica NMDA receptora u piramidalnim ćelijama CA1 regiona selektivno inaktivirana, pokazano da je poništeno dugoročno potenciranje je (Tsien 1996).

[0160] Sinaptofizin je protein presinaptičkih vezikula. Njegova kvantitativna detekcija je ustanovljena kao molekulski marker sinaptičke gustine .

[0161] Bojenje neuronskog faktora transkripta Krox24 je korišećno kao marker neuronske plastičnosti. Proteinski proizvodi Krox24 familije (kao i neurotropni faktori koji potiču iz mozga , BDNF) su nedavno povezani sa stabilizovanjem sinaptičkih modifikacija koje se javljaju u toku hipokampalne LTP i LTD posredovane NMDA receptorom. (Dragunow.2006. Behaviour genetics.23; 293).

Imunohistohemijsko bojenje

[0162] Konvencionalne tehnike deparafinizacije i rehidratacije su korišćene da se omogući puferima na bazi vode i antitelima da prodru u režnjeve tkiva. Pronalaženje antigena je korišćeno samo pre bojenja AMPA receptora (GluR1) , tj pločice su bile smeštene u ključajući pufer citrata i omogućeno je da se ohlade.

[0163] Sledeća antitela su korišćena :

i) primarna zečija antitela na NMDA NR1 podjedinicu, pri 1:200 koncentraciji u puferu, inkubirana u toku 48 h (Chemicon -AB1516), a zatim sledi Sigma fluorescentno sekundarno antitelo (alexaFluor 594), pri razblaženju 1:200 , inkubirano u toku 24 sata na 40C.

ii) primarna antitela na AMPA GluR1 podjedinicu, pri 1:50 koncentraciji u puferu, inkubirana u toku 48h (Chemicon -AB1504), a zatim sledi 3,3’-diaminobenzidin (DAB) pri razblaženju 1:200, inkubiran u toku 24 sata na 40C.

iii) primarna antitela na mSinaptofizin (Sigma -S5768), pri 1:200 koncentraciji u puferu, a zatim sledi DAB pri razblaženju 1:200 , inkubirana u toku 24 sata na 40C).

iv) primarna antitela na rKrox-24 (Santa Cruz - kataloški broj SC-189) pri 1:200 koncentraciji u puferu, a zatim slede anti-zečijija sekundarna antitelia pri koncentraciji razblaženja 1:200 , inkubirana u toku 24 sati na 40C.

(e) Antitela su detektovana pomoću svetlosnog mikroskopa .

Rezultati

NORT

[0164] Trend poboljšanja prepoznavanja novosti u grupi tretiranoj sa cG-2-AlilP je primećen posle 27 dana (SLIKA 2), ali ne 6 dana posle tretmana (nema slike). Zaključili smo da tretman sa cG-2AliP poboljšava prepoznavanje novosti kod životinja tretiranih sa lekom 27 dana.

Bojenje AMPA glutamatnog receptora-1

[0165] Hipokampalni režnjevi iz regiona CA1 (granularni ćelijski sloj, strata oriens i radiatum) i CA3 (piramidalni ćelijski sloj) su bojeni na AMPA receptore GluR1.

[0166] U CA3 nije bilo promene u broju receptora u svakom regionu dana 7 ili 28. Međutim bio je zanačajan porast u broju AMPA receptora u CA1 (granularni ćelijski sloj) (SLIKA 4) i CA1 stratum oriens (SLIKA 5) i dana 28.

[0167] Ova histološka promena je u korelaciji sa poboljšanim izvođenjem testa prepoznavanja novog objekta. Poboljšana memorija (SLIKA 2) je bila u korelaciji sa povećanim AMPA glutamatnim receptorom-1 (SLIKA 3). Zaključili smo da cG-2-AlilP poboljšava glutaminergičnu neurotransmisiju (GluRl) na postsinaptičkom nivou.

[0168] Primetili smo da tretiranje sa cG-2-AlilP dovodi do dugoročnog porastva u bojenju GluR1 na postsinapsama i povećanoj gustini presinaptičkih vezikula. Kako je većina vezikula u hipokampusu glutamičke vezikule, zaključili smo da je poboljšanje dugoročne memorije uvezi sa povećanom glutamičkom neurotransmisijom.

Bojenje sinaptofizina

[0169] Naknadno smo analizirali efekte cG-2AliP na nivoe bojenja sinaptofizina u CA3 i CA1 regionima hipokapusa.

[0170] U svim testiranim područjima bio je ili značajan porast (CA3) ili jasan trend ka (CA1 -strata oriens i radiatum) porastu gustine sinaptofizina koji boje u toku 28 dana posle tretmana . Taj porast je marker povećane sinaptičke plastičnsoti i jasna indikacija sinaptogeneze koja najverovatnije izaziva poboljšanje u izvođenju tretirane grupe u primenjenim testovima memorije.

Bojenje NMDA Receptora-1

[0171] Dok postoji značajno poboljšanje u AMPA receptorima posle tretiranja, promene u NMDA receptorima nisu tako izražene (SLIKE.9A, 9B I 9C).

Bojenje Krox24

[0172] Mi smo analizirali gustinu bojenja Krox24 u CA1-2 regionima hipokapusa . Mi smo primetili trend ka povećanoj gustini u tretiranoj grupi u poređenju sa grupom tretrianom sa nosačem . Zaključili smo da bojenje Krox24 dovodi do pozitivne korekalcije sa poboljšanom funkcijom memorije (SLIKA 10).

Primer 7: cG-2-AlilP povećava broj presinaptičkih vezikula u hipokampusu srednjovečnih pacova

Postupci

[0173] Četiri srednjovečna Wistar muška pacova (12 meseci) su podeljena u dve grupe: jedna tretirana nosačem (n=2) i jedna cG-2-AlilP-tretirana (n=2). Pacovi su tretirani subkutanozno sa 3mg/kg/danu ili sa rastvorom soli ili cG-2-AlilP u toku 7 dana. Dana 21 eksperimenta životinje su žrtvovane i tkivo hipokampusa je sakupljeno. Polutanke sekcije tkiva su fiksirane sa OsO4i smeštene u smolu. CA1 stratum oriens i CA3 sekcije su zatim isečene na ultra tanke delove, režnjeve veličine 80nm i obojeni sa uranil acetatom i olovo citratom. Približno 50 sinapsi po životinji je analizirano, tip sinapsi je klasifikovan i merena je gustina vezikula pomoću AnalySIS®.

[0174] Elektronska transmisiona elektroskopija je korišćena da izbroji celokupni ukupni broj vezikula na pločicama. Srednja vrednost gustine je izračunata merenjem uskupne površine (korišćenjem AxioVision softvera) i koršćenjem broja vezikula. Mi smo sledili protokol iz Yoshida et al.97, Journal of Neurochemistry da se izračuna gustina vzikula na 200nm x 200nm kvadratnih postavljanjem postsinaptičke gustine (PSD).

Rezultati

[0175] SLIKA 6 je grafik koji pokazuje efekat cG-2-AlilP na trend povećanja gustine presinaptičkog bojenja u CA3 hipokampusa dana 24 posle tretmana.

[0176] SLIKA 7 je grafik koji pokazuje efekat cG-2-AlilP na trend povećanja gustine presinatičkog bojenja u stratum oriens CA1 regiona dana 24 pole tretmana.

[0177] SLIKA 8 je grafik koji pokazuje efekat cG-2-AlilP na povećanje gustine presinaptičkog bojanja u stratum radiatum CA1 regiona dana 24 posle tretmana.

[0178] Broj presinaptičkih vezikula u CA1 i C3 podregionima hipokampusa je bio povećan posle tretmana sa cG-2-AlilP (3mg/kg/danu x 7 dana, s.c.) u poređenju sa životinjama tretiranim nosačem 21 dan posle tretmana (SLIKA 11).

[0179] Zaključili smo da ova ispitivanja da tretman sa skopolaminom može smanjiti kognitivne funkcije životinja , i da ove promene mogu podražvati kognitivna oštećenja kod ljudskih bića sa jednim ili više varijeteta neuroloških stanja. Dodatno, mi smo zaključili da cG-2-AlilP može poboljšati kognitivnu funkciju kod životinja tretiranih skopolaminom i kod životinja sa normalim kognitivnim oštećenjem u vezi sa godinama. Dalje, mi smo zaključili sa cG-2-AlilP može povećati sinaptogenezu, povećati AMPA receptore, povećati neuronsku plastičnost, može stabilizovati sinaptičke modifikacije i može povećati prepoznavanje novosti .

[0180] Ova ispitivanja prema tome podržavju upotrebu cG-2-AlilP kao efikasnih farmaceutskih sredstava za lečenje različitih kognitivnih pogoršanja kod životinja uključujući ljude koji pate od Alchajmerove bolesti, Parkinsonove bolesti i ostalih hroničnih i neuronskih poremećaja, kao i kognitivnih oštećenja koja su u vezi sa godinama .

Primer 8: Efekti cikličnog G-2-AlilP i cikličnog ciklopentil-G-2MeP na cerebelarne ćelijske eksplante

[0181] Da bi se odredili uticaji cG-2-AlilP i cikličnog ciklopentil-G-2-MeP na neuronske ćelije in vitro, serije ispitivanja su izvedene korišćenjem cerebelatnih eksplanata iz odraslih pacova. In vitro sistemi su pogodni za ispitivanje neuronske proliferacije, rasta neurita, obarzovanja nervnih završetka, i efekti toksina na neuronske ćelije, efekti paralelni efekatima primećenim in vivo. Prema tome, rezultati ispitivanja pomoću in vitro cerebelarni eksplanata su prediktivni za efekte intervencija in vivo.

[0182] U prvim srijama ispitivanja, bili su određeni efekti glutamata na cerebelarne eksplante. Pri fiziološkim koncentracijama, glutamat je neurotransmier u CNS kod sisara, ulključujući ljude. Međutim, pri dovoljno visokim koncentracijama, glutamat je neurotoksičnan, i dovodi do smrti neuronskih ćelija. Što je glutamat neurotransmiter koji se javlja u prirodi u CNS sisara, uključujući ljude, i zbog toga što je glutamatna neurotoksičnost prepoznata u stanju tehnike kao odraz generalno neurotoksičnosti , i uključujući ćelijski smrt i degeneraciju, vredno je oruđe korisno za identifikovanje i karakterizaciju sredstava efikasnih u lečenju neurodegeneratcije i smrti neuronskih ćelija .

Materijali i postupci

[0183] Poklopci staklenih pločica su smešteni u veliku Petrijevu šolju i isprani u 70% alkoholu u toku 5 minuta, zatim isprani sa Millipore H2O. Poklopci staklenih pločica su osušeni na vazduhu i prevučeni sa Poli-D-Lizinom (1 mg/ml štok rastvora u PBS, 90-100µl) u toku 2 sata na 34°C.

Ekstrakcija cerebelarnog tkiva

[0184] Postnatalno dana 8 Wistar pacovi su bili korišćeni za ispitivanje. Pacovi su žrtvovani i smešteni na led u toku 1 minut, odesčena im je glava i uklonjen je cerebelum i smešten na led. Tkivo cerebeluma je smešteno u 1 ml 0.65% PBS obogaćenog glukozom (10 µl 65% štok D (+)glukoza/1ml PBS) u velikoj Petrijevoj šolji, isitnjeno na manje delve i triturisano sa insulinskim špricom od 1ml pomoću 23 G (0.4mm) igle, i zatim vrećeno nazad u glukozni rastvor u veliku Petrijevou šolju . Tkivo je prosejano (125µm velična porea) i centrifugorano (2 minuta na 60g) dva puta da se izmeni medijum u BSA-bez seruma obogaćen sa START V medijumom (Biochrom, Germany). Drugi korak centrifugiranja je urađen sa 1ml START V medijuma. Mikroeksplanti su rekonstruisani u 500µl START V medijuma i stavljeni na led.

Kultivacija cerebelarnih ćelija

[0185] Dva sata posle PDL-obloge, pločice su isprane sa Millipore H2O i osušene na vazduhu. Svaka pločica je smeštena u malu Petrijevu šolju (prečnika: 35 mm) i dodato je 40µl START V/suspenziji ćelija. Tkivo je inkubirano u toku 2 sata na 34°C (period taloženja). START V-medium (1ml) je zatim dodat u Petrijevu šolju i kultivisano na 34° C u prisustvu 5% CO2na vazduhu pri 100% vlažnosti u toku 48 sati.

Primena leka

[0186] Za ovo ispitivanje, izvesne kulture eksplanta su izložene samo nosaču (PBS). U prvom ispitivanju (Ispitivanje 1) 10µl toksina 1 (L-glutamat-100mM u Millipore vodi; krajnja koncentracija: 1mM) i 10 µl toksina 2 (3-nitropropionska kiselina -50mM-pH 7-u Millipore vodi, krajnja koncentracija: 0.5mM) je primenjeno simultano sa lekom koji se testira (10mM štok rastvora pripremljenog u PBS i razblaženog do krajnjih koncentracija između 1-100 nM). U svakom slučaju, lekovi su ostavljeni u kontaktu sa eksplantima u toku trajanja ispitivanja .

Postupci za određivanje efekata lekova

[0187] Pošto su eksplatni izloženi lekovima u toku ispitivanja, ćelije su zatim isprane u PBS i zatim fiksirane u rastućim koncentracijama paraformaldehida (500 µl 0.4% PFA je primenjeno; zatim 1.2% PFA; zatim 3% PFA i na kraju 4% PFA (svaki korak fiksacije: 2-3 minuta). Na kraju, mikroeksplanti su isprani u PBS.

[0188] Neuroni u eksplantima su zatim procenjivani morfološki (prisustvo neurita) i izbrojane su žive ćelije po mikroskopskom polju. Četiri polja koja pokazuju najveću ćelijsku gustinu su brojana po poklopcu pločica i podaci su prikazani kao srednja vrednost ± standardna greška srednje vrednosti (SEM); n= 4 svaka. Statistička značajnost je procenjena korišćenjem nesparenog Studentovog t-testa .

Rezultati

Ciklični G-2-AlilP

[0189] Rezultati ispitivanja su prikazani na SLICI 12. Glutamatni tretman (1 mM; popunjeni stupac) doveo je do gubitka od 85% celebelarnih neurona koji imaju neurite u poređenju sa kontrolama koje su tretirane samo sa nosačem (otvoreni stupac). Nasuprot tome, cG-2-AlilP je zanačajno povećao brojeve ćelija koje imaju neurite na dozno-zavisan način kada se daje simultano sa glutamatom (šrafirni stupci). Tretman sa niskim dozama cG-2-AlilP (100 pm do 10 nm) pokazao je značajni pad u neurotoksičnosti izazvanoj glumatima.

Ciklični Ciklopentil-G-2-MeP

[0190] Rezultati ispitivanja su prikazani na SLICI 13. Ciklični ciklopentil-G-2MeP značajno povećava broj ćelija koje imaju neurite kada su simultano davani glutamati (svetlo-šrafirani stupci). Tretman sa niskim dozama cikličnog ciklopentil-G-2MeP pokazao je značajan pad u neurotoksičnosti izazvanoj glutamatom.

Zaključci

[0191] Oba cG-2-AlilP i ciklični ciklopentil-G-2-MeP nezavisno smanjuju ili sprečavaju neurotoksičnost izazvanu glutamatima, ukazujući da su oba leka neurozaštitna i mogu biti korišćeni u inhbiciji neuronske degeneracije ili ćelijske smrti.

Primer 9: Efekti cG-2-AlilP na hiposkično-ishemijsku povredu I

Matrijali i postupci

[0192] Da bi se odredilo da li cG-2-AlilP može da spreči neuronsku povredu kao odgovor na moždani udar, srčanu operaciju arteriskog grafta bajpasa (CABG) ili drugi hipoksični udar, serije ispitivanja su izvedene na pacovima koji su bili izloženi hiposkično-ishemijskoj povredi (HI).

[0193] Odrasli pacovi (Wistar, 280-310g, male) su korišćeni. Modifikovani Levinov model pripremanja i eksperimentalnih postupaka je korišćen (Rice et al, 1981, Ann. Neurol. :9: 131-141; Guan et al J., 1993, Cereb. Blood Flow Metab.: 13(4): 609-16). Ovi postupci ukratko, se sastoje od HI povrede indukovane unilateralnim podvezivanjem karitinoidne arterije praćene inhalacionom asfiksijom kod životinja sa implatiranim lateralnim ventrikularnim kanilama. Vodeća kanila je sterotrakisčno smeštena na vrh dubine 1.5mm desno od srednje linije i 7.5mm ispred interauralne nulte ravni u anesteziji sa halotanom. Desna karotidna arterija dvostruko podvezana dva dana posle umetanja kanile. Posle 1 sata za oporavljanje od anestezije, svaki od pacova je smešten u inkubator, gde su vlažnost (90±5%) i temperatura (31°±0.5°C) kontrolisani u toku još jednog sata, zatim izloženi hipoksiji (6% kiseonika) u toku 10 min. Životinje su održavane u inkubatoru u toku dodatna 2 sata pre lečenja.

[0194] Dvet pari pacova je tretirano intracerebralno ventirkularno (icv) sa ili cG-2-AlilP (2 ng) ili njegovim nosačem (normalno rastvor soli) 2 sata posle hipoksijsko-ishemijskog udara. Pacovi u svakoj grupi su simultano infuzirani sa cG-2-AlilP ili njihovim nosačem pod blagom anestezijom (1.5% halotan) 2 sata posle udata. Ukupna zparemina 20µl je data infuzijom (icv) u toku 20 minuta sa mikro-infuzijom pumpe.

[0195] Histološko ispitivanje je izvedeno na pacovima 5 dana posle hipoksisko-ishemijske povrede. Pacovi su ubijeni sa prekomernom dozom natrijum pentobarbitala i bili su perfuzirani transkardijalno sa normalnim rastvorom soli a zatim sa 10% formalinom. Mozgovi su održavani u istom fiksiru u toku minimalno 2 dana pre nego što su bili obrađeni korišćenjem stanardnih postupaka za smeštanje u parafin.

[0196] Koronalne sekcije debljine 8 µm su isečene iz striatuma, cerebralnog koteksa i hipokampusa i bojene su sa tioniom i kiselim fuksionom. Histološki ishod je procenjivan na tri nivoa : (1) srednji sloj striatuma, (2) kada se prvo pojavio potpuni hipokampus i (3) nivo kada se upravo pojavio ventralni rog hipokampusa. Ozbiljnost oštećenog tkiva je bodovana u striatumu, korteksu i CA1-2, CA3, CA4 i dentatni girus hipokampusa. Oštećenje tkiva je identifikovano neuronskim gubitkom (acidofilna (crvena) citoplazma i kontrahovano jezgro), pan-nekroza i ćelijske reakcije. Oštećenje tkiva je bodovano korišćenjem sledećeg sistema bodovanja : 0: tkivo nema tkivnih oštećenja, 1: <5% tkiva je oštećeno, 2: <50% tkiva je oštećeno, 3: >50% tkiva je oštećeno i 4: >95% tkiva je oštećeno.

Rezultati i zaključci

[0197] Rezultati ovog ispitivanja su pokazani na SLICI 14. SLIKA 14 pokazuje da je hipoksično-ishemijska povreda (levi supac svakog seta) dovela do rezultata značajnog ošećenja u svakoj ispitivanoj oblasti mozga. SLIKA 14 takođe pokazuje centralno davanje relativno niske doze cG-2-AlilP (desni stupac svakog seta ; 2 ng) značajno smanjeno oštećenje u svakom regionu mozga ispitivanom u poređenju sa grupom tretiranom sa nosačem (p<0.001).

[0198] Može se videti da cG-2-AlilP može biti neuroprotektivan naspram neuronskih oštećenja izazvanih sa hipoksično-ishemijskom povrednom, čak kada se daje posle hipoksično-ishemijske povrede. Ovaj iznanađujući podatak ukazuje da cG-2-AlilP je korisno sredstvo za lečenje različitih stanja karakterisanih sa neuronskom degeneracijom ili smrti ćelija.

Primer 10: Efekti cG-2-AlilP na hipoksično-ishemijsku povredu II

Matrijali i postupci

[0199] Matrijali i postupci opisani u primeru 9 su korišćeni i broj tretiranih grupa je povećan. Pacovi su podeljeni u 5 grupa za tretiranje koje su tretirane intracerebralno ventirkularno (icv) sa jednom od 4 doze cG-2-AlilP ili sa njegovim nosačem (normalni rastvor soli) 2 sata posle hipoksi-ishemijskog udara (1: n=10, 2ng; 2: n=9, 4 ng; 3: n=9, 20 ng; 4: n=10, 100 ng; i 5: n=9, nosač).

Rezultati

[0200] SLIKA 15 pokazuje samo hipoksiju (nosač) koja izaziva rezultujuća neuronska oštećenja u svim oblastima ispitivanim mozga. Kod životinja tretiranih sa cG-2-AlilP, hiposkaija ima manje efekta, mada se sredstvo daje posle hipoksično/ishemijske povrede. Neurozaštitni efekat je primećen za sve doze cG-2-AlilP, osim za najvišu dozu (100 ng) datu u striatum. Međutim, na svim ostalim mestima i sa svim ostalim dozama, cG-2-AlilP je smanjio neuronska oštećena nastala hipoksijom/ishemijom. Pored toga, cG-2-AlilP ima povećanu efikasnost u regionima mozga kod kojih se javila progresivna povreda u vezi sa odloženom smrti ćelija, kao što je ona u vezi sa apoptozom. U regionima mozga kao što je dentatni girus i cereberalni korteks, koji su otporniji na HI povrede, napredovanje povrede je poznato da je sporije i ozbiljnije od regiona mozga koji su osetljiviji na HI povrede kao što je striatum i CA1-2, CA3 i CA4 podregionima hipokampusa. Ovaj rezultat pokazuje da cG-2-AlilP može biti korišćen u lečenju hroničnih neuroloških poremećaja.

Primer 11: Efekti cG-2-AlilP u sindromu fragilnog X I Opšti postupci

[0201] Eksperimenti su izvedeni prema United Kingdom Animals (Scientific Procedures) Act of 1986. Fmr1-KO2 miševi i prirodni (WT) miševi iz istog legla su proizvedeni na C57BL/6J osnovi i više puta ukrštani na C57BL/6J osnovi u toku više od osam generacija i poslati u Chile by the Jackson’s laboratoriju. Miševi su smešteni u grupe (4-6 po kavezu) i svim životinjama je obezbeđeno ad libitum hrana i voda osim ako nije drugačije navedeno. Miševi su održavani na ciklusu 12 h svetlo/mrak (gašenje svetla 19:00 do 7:00) u okolini sa kontrolisanom temperaturom (21 ± 1 °C).

[0202] Rezultati su izvođeni redosledom opisanim sa ne više od izvođenja jednog zadatka dnevno. Svi eksperimenti su bili slepi za istraživače koji su izvodili testove i osobu koja je injektirala miševe .

[0203] Parametarski podaci su analizirani korišćenjem dvosmerne ANOVAs (genotip i pol kao faktori između subjekta). Kada su podaci ugrozili pretpostavke normalnosti ili jednakosti varijanse, korišćene su transformacije (log10 ili kvadratni koren). Za ponovljena merenja ANOVAs, homogenosti varijanse su testirane pomoću Mauchly-ovog testa sferičnosti, i kada su bile narušene, korišćene su Huyn-Feldtove korekcije. Neparametarski podaci su analizirani pomoću Mann-Whitney U testa. p-vrednost < 0.05 se smatra statistički potpuno značajnom .

[0204] Nisu primećeni slučajevi toksičnosti. Životinje su ispitivane na različitosti u izgledu krzna, da li je prisutna piloerekcija, stanje oka (suzne oči ili porfirija, ptoza) izgled hoda, tremor, tonus repa, rekacija na rukovanje, itd.

Primer 12: Efekti cG-2-AlilP na hipokampalne neurone iz životinja sa sindromom fragilnog X

[0205] Da bi se odredilo da li cG-2-AlilP može uticati na neurone, mi smo izveli serije ispitivanja na neuronima in vitro iz prirodnih miševa ili miševa sa inaktiviranim fmr1.

Postupci

[0206] Ćelijske kupture hipokampusa su pripremljene iz prirodnih fetalnih miševa i fetalnih miševa sa inaktiviranim fmr1 (14 -16 dana gestacije). Ukratko, miševi su ubijeni sa cerkvikalnom dislokacijom pod anestezijom hloroforma, i disocirane hipokampalne ćelije su nanete u sudove sa više bunarčića od 15 mm (Falcon Primaria). Kao medijum za nanošenje korišćen MEM-Eagle-ove soli (koje su bez glutamina) obogaćene sa 10% fetusnog goveđeg seruma. Kulture su održavane na 37°C u vlažnoj atmosferi 5% CO2. Posle 3d in vitro, zeleni florescentni protein (GFP) je dodat da bi se pratila morfogeneza dendritnih bodlji u toku vremena kultivisanja (Ethell and Yamaguchi, 1999; Ethell et al., 2001, Henkemeyer et al., 2003). Dendritne bodlje se uglavnom obrazuju između 7 i 14 dana in vitro (DVI). Do 14 DIV većina dendritnih protruzija su bodlje. Srednja vrednost (±SD) gustina bodlji je merena kao broj bodlji po mikrometu i eksperimenti su izvođeni u triplikatu .

Rezultati

[0207] Rezultati ovih ispitivanja su prikazani na SLIKAMA. 16A-16D. SLIKA 16A prikazuje podelu komore za kulture za merenje neuronske morfologije. SLIKA 16B pokazuje fotomikrografiju hipokapalnih neurona tretiranih sa cG-2-AlilP ("NNZ 2591") pri koncentraciji od 0.5 nM. Mi nismo primetili statistički značajnu promenu (srednja vrednost ± SD, n = 3 nezavisni eksperimenti: 0.36 ± 0.02).

[0208] Nasuprto tome, SLIKA 16C pokazuje fotomikrografiju kultivisanih hipokampalnih neurona tretiranih sa cG-2-AlilP pri koncentraciji od 5 nM (0.25 ± 0.03). Mi smo primetili statistički značajne efekte kada se porede sa kontrolnim kulturama (0.26 ± 0.04).

[0209] SLIKA 16D pokazuje fotomikrografiju kultivisanih hipokampalnih neurona tretiranih sa cG-2-AlilP. Značajan efekat na smanjenje bodlja je primećen u kulturama koje su tretirane sa cG-2-AlilP pri koncentraciji 50 nM (0.27 ± 0.10). Mi smo nismo primeti statistički značajnu razliku u odnosu na prirodni tip životinja (0.26 ± 0.05).

[0210] Mi smo zaključili iz ovih ispitivanja da cG-2-AlilP smanjuje dendritne bodlje in vitro, i ovaj rezultat ukazuje da cG-2-AlilP može poboljšati neurološki razvoj i funkciju in vivo, i prema tome može biti koristan u lečenju sindroma fragilnog X kod miševa. S obzirom da mišji model sindroma fragilnog X ima istu genetsku mutaciju nađenu kod ljudskih bića sa sindromom fragilnog X, cG-2-AlilP može biti efikasna u lečenju ljudskih bića sa sindromom fragilnog X.

Primer 13: Efekti cG-2-AlilP na ponašanje kod životinja sa sindrom fragilnog X I: Anksioznost i memorija

[0211] Da se odredi da li cG-2-AlilP ima koristan efekat na životinje sa sindrom fragilnog X, mi smo izveli serije ispitivanja na memeoriji ili navikavanju in vivo prirodnih životinja i životinja sa inaktivniranim fmr1.

Postupci

Životinje

[0212] Miševi sa inaktiviranim fmr1- 2 (C57BL/6 osnova) su smešteni u grupe istog genotipa u prostoriju sa kontrolisanom temperaturom i vlažnošću sa ciklusom 12-h svetlo-mrak (svetla upaljena 7 am do 7 pm). Testiranje je nastavljeno u toku svetle faze . Hrana i voda su bili dostupni ad libitum. Testiranje je izvedeno na miševima sa inaktiviranim fmr1-i njihovim prirodnim životinjama iz istog legla. Eksperimenti su izvođeni u skladu sa UK Animals (Scientific Procedures) Act, 1986.

[0213] Ispitivane grupe (n=10 svaka) su kreirane prema sledećem .

1. fmr-inaktivirani (KO) tretirani sa nosačem

2. Prirodni tip (Wt) tretirani sa nosačem

3. fmr1-inaktivirani (KO) tretirani sa cG-2-AlilP ("NNZ-2591")

4. Prirodni tip (Wt) tretirani sa cG-2-AlilP.

Test na otvorenom polju za anksioznost

[0214] Test na otvorenom polju (OF) je kombinovani test koji se koristi za određivanje anksioznosti/hiperaktivnosti, i za navikavanje na novu okolinu, jedan od najelementarnih oblika učenja, u kome je smanjeno ispitivanje kao funkcija ponovljenog izlaganja istoj okolini uzeto kao indeks memorije . Ovo je normalno proučavano u dve sesije izlaganja otvorenom polju, 10-min i 24h sesija navikavanja.

[0215] SLIKA 17 prikazuje fotografiju uređaja korišćenog za ova ispitivanja. Otvoreno polje je izloženi prostor u kome se može pratiti kretanje .

[0216] Korišćeni uređaj za ovo ispitivanje je siva PVC ograđena arena 50 x 30 cm podeljena u kvadrate 10 cm . Miševi su dovedeni u eksperimentalnu prostoriju 5-20 min pre testiranja. Miš je smešten u ugaoni kvadrat okrenut u čošak i posmatran u toku 3 min. Broj kvadrata u koje je ušao (celim telom) i izvijanjem (obe prednje šape iznad zemlje, ali ne kao deo doterivanja) su izeti u obzir. Latenca prvog zadnjeg dela je takođe zabeležena . Kretanje miša oko polja je obeleženo sa video uređajem u toku 300s (vNT4.0, Viewpoint). Latenca da miš uđe u najsvetlji centralni deo polja, ukupno vreme provedeno u ovom centrlnom regionui ukupna aktivnost (u smislu dužine putanje u centrimatima), su beleženi.

[0217] Test otvorenog polja (OF) je test koji je korišćen za karakterizaciju eksplorativnog ponašanja, anksioznosti i hiperaktivnosti kod životinja naviknutih na dnevnu rutinu pod novim i familijarnim uslovima. U toku izlaganja otvorenom polju miševi će se navići na okolinu i prema tome istraživati manje, smanjiti količinu pokreta koji pokazuju u toku vremena .

[0218] U prikazanom eksperimentu, zabeleželi smo pokrete i izvijanje u toku inicijalnog izlaganja (T1), u toku drugog izlaganja posle 10 minuta (T2) i u toku trećeg izlaganja posle 24 sata (T3). Nemogućnost da se smanji kretanje ili izvijanje u 10 minuta i 24 sata ukazuje na deficit kratkotrajne i dugotrajne memorije respektivno .

Rezultati

cG-2-AlilP smanjuje anksioznost kod životinja sa sindrom fragilnog X

[0219] SLIKA 18 pokazuje grafike rezultata OF testa u kome broj ulazaka u kvadrate (vertikalna osa) je prikazan za svaku tretiranu grupu. Prirodne životinje tretirane sa nosačem (levi stupac) prešli su ukupnu razdaljinu od oko 80 kvadrata u toku peroda testiranja T1. Slično, prirodne životinje tretirane sa cG-2-AlilP ("NNZ 2591") (treći stupac sa leve strane) ušle su u oko isti broj kvadrata u toku perioda testiranja.

[0220] Nasuprot tome, životinje sa inaktiviranim fmr1 tretirane nosačem (drugi stupac sa leve strane) ušle su u više kvadrata u toku istog vremenskkog perioda (p<0.001). Jačina ovog efekta je statistički značajna i suštinska, sa ovim životinjama koje ulaze u oko 150 kvadrata u toku testiranog perioda T1. Međutim, neočekivan smo našli da cG-2-AlilP ("NNZ 2591") značajno smanjuje istraživačko ponašanje životinja sa inaktiviranim fmr1 (desni stupac), sa rezultatima koji su uporedivi sa onima koji su viđeni kod prirodnih životinja koje su tretirani sa nosačem i cG-2-AlilP (streći stupac sa leve strane).

[0221] Mi smo zaključili iz ovog rezultata da cG-2-AlilP smanjuje anksioznost kod životinja sa inaktiviranim fmr1. Zbog toga što miševi sa inaktivniranim fmr1-korišćeni u ovom ispitivanju imaju istu genetsku mutaciju kao ljudska bića sa sindromom fragilnog X, zaključili smo cG-2-AlilP može smanjiti anksioznost kod ljudskih bića sa sindrom fragilnog X.

cG-2-AlilP poboljšava kratkoročnu memoriju životinja sa sindrom fragilnog X

[0222] SLIKA 19 pokazuje rezultate OF testa u periodu T2 (10 minuta), u kome broj kvadrata u koje su ušli (vertikalna osa) je grafiki prikazano za svaku grupu testiranja. Prema rezultatima T1 (SLIKA 18), prirodne životinje tretirane sa nosačem (levi stupac) i prirodne životinje testirane sa cG-2-AlilP ("NNZ 2591")-(treći stupac sa leve strane) pokazano je normalno istraživačko ponašanje, pri čemu je svaka grupa ulazila oko 45 kvadrata u proku vremenskog perida T2. Rastojanje pređeno u periodu testiranja T2 je bilo manje od rastojanja pređenog u periodu T1, ukazujući da su životinje postale bar delimično naviknute na OF test do tog vremena.

[0223] Životinje sa inaktiviranim fmr1 (drugi stupac sa leve strane) su pokazale suštinski više istraživačkog ponašanja od bilo koje prve dve grupe životinja (p<0.001). U stvari, jačina povećanja je bila oko 2-struka, do oko 100 kvadrata.

[0224] Nasuprto tome, neočekivano je nađeno da cG-2-AlilP smanjuje eksplorativno ponašanje miševa sa inaktiviranim fmr1 (desni stupac), i u stvari, normalizuje jačinu njihovog ponašanja na ono prirodnih životinja .

[0225] Mi smo zaključili iz ovih rezultata da : (1) Sindrom fragilnog X kod miševa smanjuje kratkoriočnu memoriju ili navikavanje, i (2) cG-2-AlilP poboljšava kratkoročnu memoriju i navikavanje životinja sa inaktivniranim fmr1. Zbog toga što miševi sa inaktiviranim fmr1 korišćeni u ovom ispitivanju imaju istu genetsku mutaciju kao i ljudi sa -sindrom fragilnog X, zaključili smo da cG-2-AlilP može poboljšati kratkoročnu memoriju kod ljudskih bića sa sindrom fragilnog X.

cG-2AlilP poboljšava drugoročnu memoriju kod životinja sa sindrom fragilnog X

[0226] SLIKA 20 pokazuje grafike rezultata OF testa u vremenskom periodu T3, u kome broj kvadrata u koje su ušli (vertikalna osa) je grafički prikazan za svaku tretiranu grupu. Prema rezultatima u T1 (SLIKA 18) i T2 (SLIKA 19), prirodne životinje tretirane nosačem (levi stupac) i prirodne životinje tretirane sa cG-2-AlilP ("NNZ 2591") (treći stupac sa leve strane) pokazale su normalno istrživačko ponašanje, od kojih svaka grupa je ulazila u oko 25-30 kvadrata u toku T3. Pređeno rastojanje u periodu T3 testa je bio manje od pređenog rastojanja u toku T2, i dalje smanjenje u odnosu na ona primećena u T1, ukazujući da su životinje postale progresivno naviknutije, i imale bolju dugoročnu memoriju u OF testu u vremenskom periodu T3.

[0227] Nasuprot tome, životinje sa inaktiviranim fmr1-tretirane nosačem (drugi stupac sa leve strane) pokazale su suštinski više istraživačko ponašanje (p<0.001), od onih tretiranih nosačem ili grupa tretirnih sa cG-2-AlilP. U stvari, jačina povećanja je bilo oko 2-struka, do oko 100 kvadrata. Zanimljivo, u životinjama sa inaktiviranim fmr1, navikavanje nije povećano sa vremenom i izlaganjem OF uređaju. Broj kvadrata u koje su ušli u vremenskom periodu T3 je bio sličan onome koji je nađen u vremenskim periodima T2 ili T1.

[0228] Neočekivano su našli da kratkoročna memorija, kod životinja sa inaktiviranim fmr1, cG-2-AlilP je suštinski smanjila (drugi stupac sa leve strane), i u stvari, normalizovano istraživačko ponašanje pri T3 u poređenju sa životinjama sa inaktiviranim Fmr1-tretiranim sa nosačem, ukazuju da dugoročna memorija ili navikavanje se vratilo na normalu.

Zaključi

[0229] Iz ovih rezultata smo zaključili da: (1) miševi sa inaktiviranim fmr1 pokazuju smanjenje dugoročne memorije ili navikavanja i (2) cG-2-AlilP poboljšavaju dugoročnu memoriju ili navikavanje životinja sa inkativiranim fmr1. Zbog toga što miševi sa inaktiviranim fmr1 korišćeni u ovom ispitivanju imaju istu genetsku mutaciju kao ljudska bića sa sindrom fragilnog X, zaključili smo da cG-2-AlilP može normalizovati dugoročnu memoriju ili navikavanje kod ljudskih biča sa sindrom fragilnog X.

Primer 14: Efekti cG-2-AlilP na ponašanje kod životinja sa sindrom fragilnog X II: Hiperaktivnost

[0230] Da bi se odredilo da li cG-2-AlilP ima korisne efekte na hiperaktivnost kod životinja sa sindrom fragilnog X, izveli smo srednje ispitivanja in vivo na miševima prirodnog tipa i sa inaktiviranim fmr1.

Postupci

Životinje

[0231] Miševi sa inaktiviranim fmr1- (KO2) (C57BL/6 osnova) su smešteni u grupe istog genotipa u sobu sa kontrolisanom temperaturom i vlažnošću sa ciklusom 12-h svetlo-mrak (upaljena svetla 7 am do 7 pm). Testiranje je izvedeno u toku svetle faze. Hrana i voda su bili dostupni ad libitum. Testiranje je izvedeno na miševima sa inaktiviranim fmr1-i njihovim prirodnim životinjama iz istog legla. Eksperimenti su izvedeni prema zahtevima UK Animals (Scientific Procedures) Act, 1986. Životinje su bile podeljene u četiri grupe :

prirodni tip tretiran nosačem

inaktivirani fmr1 tretiran nosačem;

prirodni tip tretiran sa cG-2-AlilP; i

inaktivirani fmr1-tretirani sa G-2-AlilP .

Test sukcesivnih prolaza

[0232] U jednom ispitivanju, koristili smo uređaj za "test sukcesivnih prolaza" . Ovaj uređaj se sastojao od četiri sukcesivna, linearno povezana prolaza sa povećanom anksiogenošću. Svaki sledeći prolaz je obojen svetlijom bojom, imao je niže zidove i/ili bio je uži od prethodnog puta. Životinje su smeštene na zatvoreni kraj prolaza 1 (A1), okrenute licem ka krajnjem zidu. Latenca do prvog ulaska u svaki prolaz (A2, A3, i/ili A4), dužina vremena provedena u svakom prolazu i broj ulaza u svaki prolaz su beleženi u toku ukupnog vremena testa od 300 sekundi.

[0233] Za test uzastopnih prolaza, mi smo merili broj ulaza u prolaz 1 (A1), prolaz 2 (A2), prolaz 3 (A3), i prolaz 4 (A4) za svaku od 4 grupe gore opisanih životinja.

Rezultati

[0234] SLIKE.21 i 22 prikazuju rezultate za test sukcesivnih prolaza . SLIKA 21 prikazuje grafik rezultata dobijenih sa životinjama tretiranih nosačem. SLIKA 22 prikazuje grafik rezultata dobijenih sa životinjama tretiranim sa cG-2-AlilP ("NNZ 2591"). Broj ulaza je prikazan (vertikalna osa) za svaku tretiranu grupu je prikazan na svakom putu (A1-A4). Na SLICI 21, životinje tretirane sa nosačem su pokazale istraživačko ponašanje, dok su životinje sa inaktiviranim fmr1pokazivale veći broj ulaza nego prirodne životinje. Prirodne životinje tretirane nosačem ulazile su u krake A1 (WT-A1) i A2 (WT-A2) oko 3-4 puta u toku perioda testiranja i nisu ušli značajnije u krake A3 (WT-A3) ili A4 (WT-A4) .

[0235] Nasuprot tome, miševi sa inaktiviranim fmr1 tretirani sa nosačem imaju značajno kraće vreme latence da uđu u prvi otvoreni prolaz (p<0.001) i provedu zanačajno više vremena u otvorenim prolazima (p < 0.001). Ove životinje su ulazile u krake A1 (KO-A1) i A2 (KO-A2) oko 10 puta u toku perioda testiranja. Vreme za koje su životinje sa inaktiviranim fmr1-ušle u krake A1 i A2 su viša dva puta od broja puta prirodnih životinja, ukazujući zanačajno na nivo hiperaktivnosti od prirodnih životinja tretiranih nosačem. Životinje sa inaktiviranim fmr1-tretirane sa nosačem su takođe napravile više prelaza između puteva u kracima A3 (KO-A3) i A4 (KO-A4) (p<0.0001).

[0236] Zaključili smo iz ovih rezultata da su miševi sa inaktiviranim fmr1- pokazivali veći stepen anksioznosti od prirodnih životinja .

[0237] SLIKA 22 pokazuje rezultate testa sukcesivnih puteva kod životinja tretiranih sa cG-2-AlilP ("NNZ 2591"). Prirodne životinje tretirane sa cG-2-ušle su u krak A1 (WT-A1) oko 2 puta u toku testiranog perioda, i ušle su u krak A2 (WT-A2) oko 4 puta u toku testiranog perioda. Ovi rezultati su uporedivi sa rezultatima dobijenim za prirodne životinje tretirane sa nosačem prikazane na SLICI 21.

[0238] Nasuprot tome, životinje sa inaktiviranim fmr1 tretirane sa cG-2-AlilP- sa cG-2-AlilP pokazale su značajno smanjenje u ulascima u otvoreni krak (p<0.001) kao i u vremenu provedenom u centru (p<0.005), ukazujući na smanjenje u hiperaktivnosti u poređenju sa životinjama sa inaktiviranim fmr1 tretiranim sa nosačem. Jačina efekta cG-2-AlilP je bila značajna, pri čemu su životinje sa inaktiviranim fmr1 tretirane sa cG-2-AlilPušle u krak A1 (KO-A1) oko 4 puta u poređenju sa oko 8 puta za životinje sa inaktiviranim fmr1 tretirane sa nosačem prikazane na SLICI 21. Slično, životinje sa inaktiviranim fmr1 tretirane sa cG-2-AlilP-su ušle u krak A2 (KO-A2) oko 4 puta u poređenju sa oko 10 puta za životinje sa inaktiviranim fmr1 tretirane sa nosačen prikazane na SLICI 21. Žvotinje sa inaktiviranim fmr1 tretirane sa cG-2-AlilP-ušle su u krak A3 (KO-A3) oko 4 puta u poređenju sa oko 9 puta sa životinjama sa inaktiviranim fmr1 tretiranim sa nosačem prikazanim na SLICI 21. Na kraju, životinje sa inaktiviranim fmr1 tretirane sa cG-2-AlilP –ušle su u krak A4 (KO-A4) oko 3 puta u poređenju sa oko 4 puta za životinje sa inaktiviranim fmr1 tretirane sa nosačem prijazanim na SLICI 21.

Zaključci

[0239] Zaključili smo iz ovog ispitivanja da cG-2-AlilP smanjuje anksioznost kod miševa sa inaktiviranim fmr1 pod ovim uslovima. Zbog toga što miševi sa inaktiviranim fmr1 korišćeni u ispitivanju imaju istu genetsku mutaciju kao i ljudska bića sa sindrom fragilnog X, zaključili smo da cG-2-AlilP može biti efikasan u lečenju ljudskih bića sa sindrom fragilnog X.

Podignuti krstasti lavirint

[0240] U drugom ispitivanju, mi smo koristili "Podignuti krstasti lavirint." Test podignutom krstastog lavirinta je onaj koji je najšire korišćen test za merenje hiperaktivnosti slične anksioznosti kod miševa. Test je zasnovan na prirodnoj averziji miševa prema otvorenim i podignutim prostorima, kao i na njihovom prirodno spontanom istraživačkom ponašanju novih sredina. SLIKA 23 prikazuje fotografiju uređaja koji je korišćen u ispitivanju. Uređaj se sastojao od dva otvorena kraka i dva zatvorena kraka ukrštena u sredini normalna jedan na drugi i centralnog prostora. Otvoreni kraci su izloženiji i prema tome izazivaju više anksioznosti kod miševa. Miševi prema tome provode više vremena u zatvorenim kracima i posećuju ih češće. Miševima je dat pristup svim kracima i omogućeno je da se slobodno kreću između njih . Broj ulaza u otvorene krake, vreme provedeno u otvorenim kracima i vreme provedeno u centru je bilo korišćeno kao pokazatelj anksioznosti izazvane otvorenim prostorom:

Vreme provedeno u zatvorenom kraku

[0241] SLIKA 24 pokazuje rezultate ispitivanja pomoću podignutog krstastog lavirinta na osnovu dužine vremena provedenog u zatvorenom kraku (vertikalna osa) uređaja za svaku od četiri grupe testiranih životinja .

[0242] Kao što je prikazano na SLICI 24, prirodni miševi tretirani sa nosačem (levi stupac) proveli su oko 240 sekundi u zatvorenom kraku. Prirodni miševi tretirani sa cG-2-AlilP ("NNZ 2591")- (treći stupac sa leve strane) proveli su gotovo isto vreme u zatvorenom kraku .

[0243] Nasuprot tome, životinje sa inaktiviranim fmr1-tretirane sa nosačem (drugi stupac sa leve strane0 provele su značajno manje vremena u zatvorenom kraku (oko 160 sekundi; p<0.001), ukazujući na stanje hiperaktivnosti kod životinja sa inaktiviranim fmr1. cG-2-AlilP normalizuje vreme provedeno u zatvorenom kraku kod životinja sa inaktiviranim fmr1-(desni stupac ). Ova hiperaktivnost je značajno smanjena kod životinja sa intaktiviranim fmr1 tretiranim cG-2-AlilP i u poređenju sa prirodnim tipom životinja tretiranih sa cG-2-AlilP. Statistički zanačajna razlika je bila primećena između grupe sa inaktiviranim fmr1 tretirane sa nosačem i grupe sa inaktiviranim fmr1 tretirane sa cG-2-AlilP (p<0.001).

[0244] Iz ovog istraživanja zaključili smo cG-2-AlilP smanjuje hiperaktivnost miševa sa inaktiviranim fmr1-pod ovim uslovima. Zbog toga što miševi sa inaktiviranim fmr1 korišćeni u ovom istraživanju imaju istu genetsku mutaciju kao ljudska bića sa sindrom fragilnog X, zaključili smo da cG-2-AlilP može biti efikasan u lečenju ljudskih bića sa sindrom fragilnog X.

Vreme provedeno u otvorenom kraku podignutog krstastog lavirinta

[0245] SLIKA 25 prikazuje grafike rezultata ovog ispitivanja, u kome vreme provedeno u otvorenom kraku (vertikalna osa) je prikazano za svaku od 4 grupe testiranih životinja.

[0246] Životinje sa inaktiviranim fmr1-tretirane sa nosačem (drugi stupac sa leve strane) provele su značajno manje vremena u otvorenim kracima (p<0.001) u poređenju sa njihovim prirodnim životinjama iz legla tretiranim nosačem (levi stupac). Nasuprot tome, cG-2-AlilP ("NNZ 2591") normalizuje vreme provedeno u otvorenim kracima sa životinjama sa inaktiviranim fmr1. Vreme provedeno u otvorenom kraku životinja sa inaktiviranim fmr1 tretiranim sa cG-2-AlilP, miševi nisu značajno razlikovali od onih primećenih za prirodne miševe tretirane sa nosačem (levi stupac), ili prirodne životinje tretirane sa cG-2-AlilP (treći stupac sa leve strane).

[0247] Zaključili smo iz ovog ispitivanja da: (1) životinje sa inaktiviranim fmr1 pokazuju više ponašanja hiperaktivnosti nego prirodne životinje , i (2) cG-2-AlilP je normalizovao hiperaktivnost. Zbog toga što miševi sa inaktiviranim fmr1 korišćeni u ovom istraživanju imaju istu genetsku mutaciju kao ljudska bića sa sindrom fragilnog X, zaključili smo da cG-2-AlilP može biti efikasan u lečenju ljudskih bića sa sindrom fragilnog X.

Vreme u centru podignutog krstastog lavirinta

[0248] SLIKA 26 pokazuje grafike vremena provedeno u centru uređaja (vertikalna osa), za svaku od 4 grupe testiranih životinja. Vreme provedeno u centru podignutog krstastog lavirinta je prepoznato u stanju tehnike kao mera hiperaktivnosti.

[0249] Prirodni miševi tretirani nosačem (levi stupac) proveli su oko 30 sekundi u centru lavirinta . Prirodni miševi tretirani sa cG-2-AlilP ("NNZ 2591") (treći stupac sa leve strane) proveli su malo manje vremena u centru nego prirodne životinje tretirane sa nosačem. Nasuprot tome, miševi sa inaktiviranim fmr1-tretirani sa nosačem proveli su značajno više vremena u centru (drugi stupac sa leve strane; p<0.001) u poređenju sa prirodnim životinjama tretiranim sa nosačem .

[0250] Neočekivano samo pronašli da miševi sa inaktiviranim fmr1 tretirani sa cG-2-AlilP (desni stupac) proveli su značajno manje vremena nego životinje sa inaktiviranim fmr1 tretirane sa nosačem (drugi stupac sa leve strane). Primetili smo značajne razlike u vremenu provedenom u centru za životinje sa inaktiviranim fmr1 tretirane sa nosačem (drugi stupac sa leve strane), u poređenju sa prirodnim životinjama tretiranim sa nosačem (levi stupac; p<0.001), prirodne živtotinje tretirane sa cG-2-AlilP-(treći stupac sa leve strane; p<0.001), ili životinje sa inaktiviranim fmr1 tretirane sa cG-2-AlilP (desni stupac ; p<0.001). U stvari, nismo primeti statistički značajne razlike između vremena provedenog u centru bilo prirodne grupe tretirane sa nosačem (levi stupac), prirodne grupe tretirane sa cG-2-AlilP-(treći stupac sa leve strane) ili grupe sa inaktiviranim fmr1 tretirane sa cG-2-AlilP- (desni stupac ).

[0251] Zaključili smo iz ovog ispitivanja da cG-2-AlilP smanjuje hiperaktivnost miševi sa inaktiviranim fmr1 pod ovim uslovima. Zbog toga što miševi sa inaktiviranim fmr1 korišćeni u ovom istraživanju imaju istu genetsku mutaciju kao ljudska bića sa sindrom fragilnog X, zaključili smo da cG-2-AlilP može biti efikasan u lečenju ljudskih bića sa sindrom fragilnog X.

Primer 15: Efekti cG-2-AlilP na stanje straha kod životinja sa sindrom fragilnog X

[0252] Uslovljavnje straha ili lečenja ili konteksta predstavlja oblik asocijativnog učenja koje je dobro korišćen kod mnogo vrsta. Zavisne mere korišećene u kontekstualno (odloženom) uslovljavanju straha je odgovor na ’zamrzavanje’ koje se odvija posle sparivanja neuslovljenih stimulanasa (šok stopala), sa uslovljenim stimulansa (CS), određenim kontekstom i/ ili takvim redom. Ukoliko u kontekstu uslovljavaja onaj koji je podvrgnut šoku stopala je sparen sa tonom, stvoriće se učenje ne samo za ton, nego o čitavom kontekstu .

[0253] Uslovljavanje kontekstnog straha je osnovni postupak uslovljavanja. On uključuje uzimanje žviotinje i smeštanje u novu okolinu, obezbeđivanje averzivnog stimulansa, i zatim njegovo uklanjanje. Kada životinja se vrati u istu okolinu, generalno će pokazati odgovor ’zamrzavanja’ ukoliko se seti i asocira okoline sa averzivnim stimulansom . ’Zamrzavanje’ je kao odgovor na strah, koji može biti definisan kao "nedostatak prokreta osim disanja." Ovo ponašanje ’zamrzavanja’ može trajati od nekoliko sekundi do minuta u zavisnosti od jačine averzivnog stimulansa, broja prezentacija i postignutog stepena učenja od strane subjekta.

Postupci

Životinje

[0254] Koristili smo ili prirodne ili životinje sa inaktiviranim fmr1 za ovo istraživanje, kao što je gore opisano. Životinje su podeljene u sledeće grupe.

prirodni tip tretiran nosačem;

Inaktivirani fmr1 tretiran nosači;

prirodni tip tretiran sa cG-2-AlilP; i

inaktivirani fmr1 tretiran sa cG-2-AlilP.

Uređaj za procenu kontekstualnog uslovaljavanja straha

[0255] Uređaj korišćen u ovom ispitivanju je prikazan na SLICI 27. Neuslovljeni stimulans (blagi šok stopala) je primenjen, i uslovljeni stimulans je primenjen uz zvuk zajedno sa šokom na stopalima . Pod ovim uslovima, životinje su asocirale neuslovljeni stimulans i uslovljenim stimulansom i kontekstom stimulansa . Životinje su testirane u toku pet (5) minuta.

Rezultati

[0256] SLIKA 28 prikazuje grafik vremena provedenog u "zamrznutom ponašanju" za svaku od grupa testiranih životinja. Pod uslovima akutnog stresa ovog ispitivanja, prirodne životinje tretirane sa nosačem (levi stupac) provele su u proseku 30% perioda testiranja od pet minuta (tj., oko 100 sekundi). Nasuprot tome, životinje sa inaktiviranim fmr1 tretirane sa nosačem (drugi stupac sa leve strane) provele su suštinski manje vremena u ’zamrznutom’ ponašanju (oko 18 % testa od pet minuta ili oko 54 sekunde). Zaključili smo da životinje sa inaktiviranim fmr1 pokazuju manje straha nego prirodne životinje tretirane sa nosačem.

[0257] Neočekivano smo našli da cG-2-AlilP ("NNZ 2591") proizvodi u suštini i statistički značajan porast u vremenu provedenom u ’zamrznutom’ ponašanju kod životinja sa inaktiviranim fmr1 (desni stupac). U stvari, vreme provedeno u ’zamrznutom’ ponašanju primećeno za - životinje sa inaktiviranim fmr1 tretirane sa cG-2-Alil P je bilo slično vremenu provedenom prirodnih životinja tretiranih nosačem (levi stupac) i prirodnih životinja tretiranih sa cG-2-AlilP=(treći stupac sa leve strane).

Zaključci

[0258] Zaključili smo iz ovog ispitivanja da životinje sa inaktiviranim fmr1 pokazuju niži stepen uslovljavanja straha nego prirodne životinje. Ovi ukazuje da životinje sa inaktiviranim fmr1 mogu imati isti nedostatke pri preživljavanju u odnosu na prirodne životinje . Mi takođe zaključujemo da cG-2-AlilP povećava uslovljavanje straha kod miševa sa inaktiviranim fmr1 pod ovim uslovima. Ovaj efekat može ublažavati neostatke za preživljavanje primećene kod životinja sa inaktiviranim fmr1 tretiranim sa nosačem. Zbog toga što miševi sa inaktiviranim fmr1 korišćeni u ovom istraživanju imaju istu genetsku mutaciju kao ljudska bića sa sindrom fragilnog X, zaključili smo da cG-2-AlilP može biti efikasan u lečenju ljudskih bića sa sindrom fragilnog X.

Primer 16: Efekti cG-2-AlilP na zakopavanje klikera i ponašanje gneždenja kod životinja sa sindrom fragilnog X

[0259] Miševi su socijalna vrsta, koji su uključeni u lako bodovana socijalna ponašanja uključujući prilaženje, praćenje, njuškanje, međusobno čišćenje, agresivne susrete, seksualne interakcije i roditeljsko ponašanje , gneždenje i spavanje u gomili, socijalno prepoznavanje i socijalnu memoriju kod miševa, procenjenu dužinom vremena provedenog u njuškanju novog miša posle ponovljenog izlaganja, izazivanja familijarnosti i ponovnog uspostavljanja intenzivnog njuškanja kada je uvedena nova životinja kao stimulans.

Zakopavanje klikera

[0260] Miševi spontano kopaju u mnogo različitih supstrata u laboratoriji. Ovo ponašanje potiče od njihovih predaka u divljini, kada bi tragali za semenima, insektima i drugom hranom da je nađu i zakopaju u zemlju ili lišće gnezda u njihovom prirodnom okruženju . Korišćeno je uobičajeno prirodno ponašanje glodara, obezbeđen su kvantitativni podaci pod kontrolisanim laboratorijskim uslovima i dokazana je ekstremna oseljivost na prionsku bolest, sindrom fragilnog X, i lezije u mozgi. Pogoršanje u sposobnosti izvođenja "Aktivnosti dnevnog preživljavanja" (ADL) je rani znak Alchajmerove bolesti (AD), i kongnitivnog pogoršanja (Deacon, 2012).

[0261] Da bi se proučili efekti cG-2-AlilP na ponašanje zakopavanja klikera, izveli smo serije ispitivanja na prirodnim miševima i miševa sa inaktiviranim fmr1.

Postupci

Životinje

[0262] Koristili smo ili priodni tip ili životinje sa inaktiviranim fmr1 za ovo ispitivanje, kao što je gore opisano. Životinje su podeljene u sledeće grupe.

prirodni tip tretiran nosačem;

inaktivirani fmr1 tretiran nosačem;

prirodni tip tretiran sa cG-2-AlilP; i

inaktivirani fmr1- tretiran sa G-2-AlilP .

[0263] Miševi su smešteni u zatvorenu okolinu sa ležajem od piljevine . Deset (10) klikera je stavljeno u okolinu i određeivan je broj zakopanih klikera vizeulenom opservacijom (srednja vrednost interkvartilni opsege (IQR)).

Rezultati

[0264] Primetili smo da prirodni miševi tretirani nosačem i prirodni miševi tretirani sa cG-2-AlilP zakopaju 10 od 10 (100%) prisutnih klikera. Nasuprto tome, životinje sa inaktiviranim fmr1 su zakopale znatno manje klikera (prosečno 3 od 10 ili 30%; (p<0.001) nego prirodne životinje tretirane sa nosačem.

[0265] Neočekivano samo našli da životinje sa inaktiviranim fmr1 tretirane sa cG-2-AlilP ("NNZ 2591su zakopale kao srednju vrednost 8 od 10 klikera (80%). U stvari, cG-2-AlilP normalizuje broj klikera zakopanih do nivoa veoma sličnih onima nađenim za prirodne miševe tretirane nosačem, ili prirodne miševe tretirane sa cG-2-AlilP .

Zaključci

[0266] Zaključili smo iz ovog ispitivanja da miševi sa inaktiviranim fmr1 zakopavaju nekoliko klikera u odnosu na prirodne životinje , i da cG-2-AlilP smanjuje ovaj pad , i u stvari, normalizuje ponašanje. Zbog toga što miševi sa inaktiviranim fmr1 korišćeni u ovom istraživanju imaju istu genetsku mutaciju kao ljudska bića sa sindrom fragilnog X, zaključili smo da cG-2-AlilP može biti efikasan u lečenju ljudskih bića sa sindrom fragilnog X.

Ponašanje gneždenja

[0267] Muški i ženski miševi prave gnjezda i jednako obavalju ovaj test, u tu svrhu je uključena termoregulacija kao i veza sa reprodukcijom. Ovaj test je takođe korišćen kao indikator za lezije hipokapusa i disfunkcije.

Postupci

Životinje

[0268] Mi smo korisili ili prirodne ili životinje sa inaktiviranim fmr1 za ovo ispitivanje, kao što je gore opisano. Životinje su podeljene u sledeće grupe.

prirodni tip tretiran nosačem;

inaktivirani fmr1 tretirani nosačem;

prirodni tip tretiran sa cG-2-AlilP; i

inaktivnirani fmr1- tretiran sa G-2-AlilP.

Test za ponašanje gneždenja

[0269] Miševi tipično koriste izvesne materijale sa kojima prave gnezda. U ovom ispitivanju, mi smo uneli pamuk "materal za pravljenje gnezda" u kaveze na gneždenje. Miševi mogu zatim pocepati i koristiti pamuk za gnezda i koristiti ih da se naprave sledeći u ležištu kaveza za gnježdenje. Gneždenje je tipično ponašanje za miševe i predstavlja aspekt rutine, dnevnog življenja. Ovaj testi je prema tome odraz dnevih životnih zadataka izvođenih od strane žvitih bića. Promene u ponašanju gneždenja kod miševa sa inaktiviranim fmr1 su prema tome predviđanje ponašanja kod ljudskih bića sa sindrom fragilnog X. Dalje, efekti lekova na miševe sa inaktiviranim fmr1 su razumno predviđanje efekata lekova na ljudska bića sa Sindrom fragilnog X.

[0270] Miševi su smešteni pojedinačno u kaveze za gneždenje oko jednog sata pre tamne faze ciklusa svetlo-mrak, i rezultati su procenjivani sledećeg jutra. Javljanje gnezdašaca je procenjivano prema skali od 5-tačaka kao što je dole opisano i količina neiscepanog materijala je takođe merena .

1. Materijal za pravljenje gnezda je bio u velikoj meri netaknut (>90% netaknut). SLIKA 20A prikazuje fotografiju materijala za pravljenje gnezda koja ima rezultat 1.

2. Materijal za pravljenje gnezda je parcijalno pocepan (50-90% ostalo nedirnuto). SLIKA 20B prikazuje fotografiju materijala za pravljenje gnezda koja ima rezultat 2.

3. Materijal za pravljenje gnezda iscepan, ali ne postoji identifikovano mesto za gnezdo: < 50% materijala za pravljenje gnezda ostaje nedirnuto ali < 90% je između četvrtine površine poda kaveza, tj. pamuk nije bio sakupljen u gnezdo ali je bio raspoređen oko kaveza. Materijal može ponekad biti široko definisana površina gnezda, ali je kritična definicija da je 50-90% bila iscepano. SLIKA 29C prikazuje fotografiju materijala za pravljenje gnezda koji ima rezultat 3.

4. Prepoznatljivo je, ali ravno gnezdo: > 90% materijala za pravljene gnezda je iscepano, materijal je sakupljen u gnezdo u okviru četvrtine površine poda kaveza, ali gnezdo je ravno, sa zidovima višim od visine tela miša (povijeno ka njegovoj strani) manje od 50% njegov obim. SLIKA 29D prikazuje fotografiju gnezda koje ima rezultat 4, sa mišem na vrhu gnezda .

5. Gotovo savršeno gnezdo: > 90% materijala za pravljene gnezda je iscepano, gnezdo je krater, sa zidovima koji su viši od visine miša na više od 50% njegovog obima. SLIKA 29E prikazuje fotografiju materijal za pravljene gnezda koji ima rezultat 5, sa mišem na vrhu gnezda .

Rezultati i zaključci

[0271] Ustanovi smo da prirodni miševi tretirani nosačem C57BL/6 bodovani oko 4-5 na konstrukciji gnezda. Nasuprot tome, za miševe sa inaktiviranim fmr1 tretiranim nosačem, srednja vrednost rezultata je bila oko 1-2.

[0272] Mi smo neočekivano našli da tretman sa cG-2-AlilP ("NNZ 2591") povećava bodovanje gneždenja do oko 4-5 kod miševa sa inaktiviranim fmr1.

[0273] Zaključili smo da miševi sa inaktiviranim fmr1 pokazuju deficit u građenju gnezda , i da cG-2-AlilP bar delom parcijalno revidira ovaj deficit. Zbog toga što miševi sa inaktiviranim fmr1 korišćeni u ovom istraživanju imaju istu genetsku mutaciju kao ljudska bića sa sindrom fragilnog X, zaključili smo da cG-2-AlilP može biti efikasan u lečenju ljudskih bića sa sindrom fragilnog X.

Primer 17: Drušvenost: Socijalno prepoznavanje, preference za socijalnu novost

[0274] Miševi su socijane vrste koje su angažovane u lako bodovanje sociijalnih ponašanja uključujući prilaženje, praćenje, njuškanje, međusobno čišćenje, agresivne susrete, seksualne interakcije, roditeljsko ponašanje, gneždenje i spajanje u grupama. Da bi se ispitala društvenost, mi smo izveli serije ispitivanja na prirodnim miševima, i miševima sa inaktiviranom mutacijom fmr1.

Postupci

Životinje

[0275] Mi sno koristili ili prirone ili životinje sa inaktiviranim fmr1 za ovo ispitivanje, kao što je gore opisano. Životinje su podeljene u sledeće grupe.

prirodni tip tretiran nosačem ;

inaktivirani fmr1 tretiran nosači;

prirodni tip tretiran sa cG-2-AlilP; i

inaktivirani fmr1 tretiran sa cG-2-AlilP.

Postupci testiranja

[0276] Socijalno prepoznavanje i socijalna memorija kod miševa su bile procenjivane sa dužinom vremena provedenog u njuškanju novog miša posle ponavljenog izlaganja, da bi se izazvala familijarnost i ponovo ustanovili visoki intenzitet njuškanja kada je uveden novi stimulans. Mi smo merili broj napada njuškanja u svakoj grupi životinja.

Rezultati i zaključci

[0277] SLIKA 30 prikazuje grafik trajanja napada njuškanja (vertikalna osa) za različite grupe ispitivanih miševa. Našli smo da prirodnim životinjama tretiranim sa nosačem (levi stupac) pokazuju napade njuškanja od oko 23 u toku perioda testiranja. Nasuprot tome, životinje sa inaktiviranim fmr1 (drugi stupac sa leve strane) pokazuju manje njuškanja (oko 6).

[0278] Iznenađujuće smo ustanovili, da kod životinja sa inaktiviranim fmr1 tretiranim sa cG-2-AlilP ("NNZ 2591") (desni stupac ), količina njuškanja značajno je povećana na oko 21 (p<0.001). Ustvari, cG-2-AlilP povećava njuškanje kod životinje sa inaktiviranim fmr1 do oko istog nivoa kao prirodni tip tretiran nosačem (levi stupac) ili životinje tretirane sa cG-2-AlilP (treći stupac sa leve strane).

[0279] Zaključili smo da životinje sa inaktiviranim fmr1 pokazuju da defict društvenosti u poreženju sa prirodnim životinjama. Rezultati ovoga su konzistenti sa dobro poznatim deficitima primećenim kod ljudskih bića sa sindrom fragilnog X. Takođe smo zakljućčili da cG-2-AlilP povećava društvenost poremećenu kod miševa sa inaktiviranim fmr1, i normalizuje ponašanje.

[0280] Zbog toga što miševi sa inaktiviranim fmr1 korišćeni u ovom istraživanju imaju istu genetsku mutaciju kao ljudska bića sa sindrom fragilnog X, zaključili smo da cG-2-AlilP može biti efikasan u poboljšavanju socijalnih interakcija kod živih bića sa sndrom fragilnog X.

Primer 18: cG-2-AlilP normalizuje prekomernu ekspresiju pERK i pAKT kod životinja sa sindrom fragilnog X

[0281] Neuroni su pod kritičnim uticajem proteina mentalne retardacije fragilnog X, koji reguliše lokalne dendritne transakcije kroz fosfatidilinozitol 3-kinaze-Akt-sisarske mete rapamicina (mTOR) i Ras-ERK signalizirajućih kaskada i umešano u mGluR5 signalizirajuću kaskadu. Prekomerna aktivacija intracelularnih signalizirajućih molekula , ERK i Akt igra kritičnu ulogu u sinaptičkoj plastičnosti. Nivoi ekspresije ovih proteina su krakteristika ćelijske patologije sindroma fragilnog X i veruje se da doprinose direktno neurobihejvioralnom fenotipu FXS. ERK je klasični MAPK protein transdukcije signala, odgovoran za rast faktora transdukcije, proliferacije, odgovora citokina na stres i apoptozu . Akt je ključna komponenta u signalnom putu PI3K/Akt/mTOR i reguliše ćelijsko preživljavanje i metabolizam vezivanjem i regulisanjem mnogo nishodnih efektora, kao što je nuklearni faktor-κB (NfκB) i Bcl-2 familija proteina. Prekomerna aktivacija (fosforilacija) ovih proteina je uključena u poremećaje iz spektra autizma.

Postupci

Životinje

[0282] Mi smo koristili ili prirodne ili životinje sa inaktiviranim fmr1 za ovo ispitivanje, kao što je gore opisano. Životinje su podeljene u sledeće grupe (n=4 životinje po grupi) .

prirodni tip tretiran nosačem ;

inaktivirani fmr1 tretiran nosači;

prirodni tip tretiran sa cG-2-AlilP; i

inaktivirani fmr1 tretiran sa cG-2-AlilP.

Biohemijsko testiranje

[0283] Nivoi fosforlilacije ERK1/2 i Akt lizati celog mozga su procenjivani pomoću Western blots. Miševi su žrtvovani i njihovi mozgovi su uklonjeni 12 dana posle poslednje injekcije, i neposredno posle poslednjeg bihejvioralnog testa. Druga ispitivanja su merila pERK i pAkt u krvnim limfocitima. Rezultati Western analize su normalizovani u količini GAPDH proteina viđenih u svakom blotu .

Rezultati

Fosforilovani ERK

[0284] SLIKA 31 prikazuje grafike rezultata ispitivanja na mozgovima iz miševa . Prirodni miševi tretirani nosačem imaju srednju vrednost od oko 0.9 (UA jedinice) (levi stubac). Nasuprot, životinje sa inaktiviranim fmr1 (drugi stupac sa leve strane) su imale povećani nivo fosforilacije ERK do oko 1.3 (UA jedinica) (p<0.05). Tretiranje životinje sa inaktiviranim fmr1 sa c-2-AlilP ("NNZ 2591") (treći stupac sa leve strane) značajno smanjuje ERK fosforilaciju (p<0.05) u poređenju sa životinjama sa inaktiviranim fmr1 tretiranim sa nosačem. Primećen nivoi pERK posle tretiranja životinja sa inaktiviranim fmr1 sa cG-2-AlilP su bili veoma slični sa onim prirodnih životinja tretiranih sa nosačem (levi stupac) ili prirodnih životinjama tretiranim sa cG-2-AlilP (treći stupac sa leve strane).

[0285] Slični rezultati su nađeni za pERK kod limfocita izolovanih iz grupe životinja .

Fosforilovani AKT

[0286] Primetili smo slične uzorke u fosforilovanim AKT kao za ERK u mozgovima životinja. SLIKA 32 prikazuje grafike rezultata ovog ispitivanja. Prirodni miševi tretirani nosačem imaju srednju vrednost od oko 0.9 (UA jedinica) (levi stupac). Nasuprto tome, životinje sa inaktiviranim fmr1 (drugi stupac sa leve strane) imaju povećane nivoe fosforilacije AKT od oko 1.3 (UA jedinica) (p<0.05). Tretiranje životinja sa inaktiviranim fmr1 sa c-2-AlilP ("NNZ 2591") (treći stupac sa leve strane) značajno smanjuje ERK fosforilaciju na oko 0.9 (UA jedinice (p<0.05) u poređenju sa životinjama sa inaktiviranim fmr1 tretiranim sa nosačem. Nivoi pAKT primeđeni posle tretiranja životinja sa inaktiviranim fmr1 sa cG-2-AlilP su bili veoma slični onima sa prirodnim životinjama tretiranim sa nosačem (levi stubac) ili prirodnim životinjama tretiranim sa cG-2-AlilP (treći stupac sa leve strane).

[0287] Slični rezultati su nađeni za pAkt kod limfocita izolovanih iz grupe životinja .

Primer 19: Tretiranje Retovog sindroma: Efekti cG-2-AlilP na životni vek i dugitrajno potenciiranje na modelu Retovog sindroma (RTT)

[0288] Da bi se odredilo da li tretman sa cG-2-AlilP može uticati na razvijanje i napredovanje Retovog sindroma na mišijem modelu poremećaja, koristili smo hemizigotne MeCP2(1lox) muške miševe. Mišji sistem sa inaktiviranim MeCP2 (MeCP2-KO) je široko prizant u stanju tehnike da blisko podražva opseg i ozbiljnost fizioloških i neuroloških abnormalnosti karakterisitčnih za humani poremećaj, Retov sindrom.

[0289] Svi eksperimeti su izvedeni u the University of Texas Southwestern Medical Center i dozvoljeni od strane University of Texas Southwestern Medical Center Animal Care and Use Committee ili sličnim odobrenjima od ostalih organizacija. cG-2-AlilP je sintetizovan u Albany Molecular Research Inc. (Albany, NY) i snabdeven od Neuren Pharmaceuticals Limited.

Postupci

Tretmani

[0290] Tretirali smo hemizigotne MeCP2(llox) muške miševe sa 20 mg/kg/danu sa cG-2-AlilP ili rastvorom soli, (0.01%BSA, n=15 po grupi u nekoliko eksperimenata i n=20 u LTP eksperimentu). Tretmani su davani intraperitonealno u toku 4 nedelje posle rođenja. Za ekspreimente preživljavanja tretman je održavan u toku eksperimenta . Za LTP eksperiment miševi su tretirani do nedelje 9 kada su korišćeni za pripremanje slojeva.

Preživljavanje

[0291] Mutirani miševi deficijentni u MeCP2 su razvili RTT simptome na oko 4-6 nedelja starosti i umrli između 10-12 nedelja (Chen et al., 2001. Nat Genet 27: 327-331). Mi smo upoređivali preživljavanje prirodnih kontrola i životinja deficijentnih u MeCP2 u grupi sa nosačem i tretiranoj sa cG-2-AlilP. Preživljavanje je mereno nedeljno od početka tretmana (4 nedelja) i korišćeno da bi se dobio Kaplan-Meier-ova kriva preživljavanja da bi se prikazala proporcija miševa koji preživljavaju (y osa) u intervalima svake nedelje (x osa).

Dugotrajno potenciranje (elektrofiziologija)

[0292] Ranije je zabeleženo da miševi deficijentni u MeCP2 pate od funkcionalne i ultrastrukturalne sinaptičke disfunkcije, značajnog oštećenja memorije zavisne od hipokapusa i hipokampusnog dugotrajnog potenciranja (LTP) (Moretti et al. The Journal of Neuroscience.2006. 26(1):319-327).Da bi se testirali efekti tretiranja sa cG-2-AlilP na sinaptičku funkciju na RTT modelu mi smo upoređivali hipokampusni LTP u oba nosača i životinjama tretiranim sa cG-2-AlilP-starim 9 nedelja. Da bi se to uradilo, mi smo merili nagib fEPSP kao % osnovnog potencijala u neuronima u slojevima hipokampusa i miševa deficijentnih u MeCP2 tretiranih sa ili rastvorom soli ili cG-2-AlilP.

Rezultati

[0293] Rezultati pokazuju sa tretman sa cG-2-AlilP povećava preživljavanja miševa deficijentnih u MeCP2. Prirodni miševi gornja linija) su kontrolne životinje, i prema tome njihovo preživljavanje je 100% u svakoj vremenskoj tački. Miševi deficijentni u MeCP2 tretirani samo sa rastvorom soli umiru brže od prirodnih miševa, kao što je oko 11 nedelje, samo neki od miševa deficijentnih u MeCP preživljava. Nasuproto tome, međutim, mi smo našli da miševi deficijentni u MeCP2 tretirani sa cG-2AlilP preživljavaju suštinski duže od miševa tretiranih sa rastvorom soli. Kod mecp2 miševa tretiranih sa cG-2-AlilP nisu primećeni zdravstveni problemi.

[0294] Ovi rezultati pokazuju da cG-2-AlilP može suštinski povećati preživljavanje miševa deficijentnih u MeCP2. Znog toga što su miševi deficijentni u MeCP2 prediktivni za patologiju i terapeutske efikasnosti kod ljudskih bića sa Retov sindrom, zaključili smo da cG-2-AlilP može povećati životni vek humanih bića sa Retovim sindrom.

[0295] Rezultati takođe pokazuju da cG-2-AlilP tretman povećava hipokapusni dugoročni potencijal (LTP) kako je mereno sa nagibom fEPSP kod životinja deficijentih u MeCP2 u poređenju sa mutiranim miševima tretiranim sa rastvorom soli. Mi smo našli da cG-2-AlilP povećava nagib fESPS kod miševa deficijentih u MeCP2 u poređenju sa životinjama tretiranm samo sa rastvorm soli.

[0296] Ovi rezultati pokazuju da cG-2-AlilP može biti efikasan u lečenju miševa deficijentnih u MeCP2 in vivo. Zbog toga što su miševi deficijentni u MeCP2 prediktivni za patologiju i terapeutsku efikasnost ljudskih biča sa Retovim sindromom, zaključili smo da cG-2-AlilP može biti efikasan u terapiji kod ljuskih bića sa Retovim sindromom.

Primer 20: cG-2-AlilP Poboljšava dendritsku arborizaciju i povećava dužinu dendritnih bodlji

[0297] Mi smo procenili efekte tretmana sa cG-2-AlilP na dendrite. Transgeni miševi sa inaktiviranim mecp2 (n = 15 do 20) je davan cG-2-AlilP intraperitonealno pri dozi od 20 mg/kg jednom dnevno. Posle žrtvovanja gustina dendritnih bodlji, dužina bodlji i aborizacija je ispitivana posle Golgi bojenja posle devet nedelja, prema donjoj tabeli 5.

Tabela 5

Većina uzorka za celu analizu neuronske morfologije i bodlji

[0298] Dendritna dužina je procenjena kao rastojanje od soma reprezentativnih hipokampusnih CA1 neurona od 9 nedelja starih muških mecp2 golih mutantnih miševa tretiranih sa ili rastvorom soli (3 neurona analizirana iz 3 odvojena miša, n=9) ili cG-2-AlilP (20 mg/kg i.p.1/dana, iz nedelje 4; 3 neuroni su analizirani iz 3 odvojena miša, n=9).

[0299] Mi smo primetili da cG-2-AlilP poboljšava dendritnu arborizaciju i povećava dužine dendritnih bodlji . Dužina dendrita u µm (vertikalna osa) je prikazana naspram razmaka (u µm; horizontalna osa) od some ćelija. Za ćelije sa dendritima blizu somama, dendriti su kratki. Međutim, kao se razmak od stoma povećava, tretman sa rastvorom soli proizvodi dendritne dužine koje se povećavaju do maksimalnog razmaka od oko 70 µm od some i smanjenje u razmaku dalje od soma. Nasuprot tome, tretiranje sa cG-2-AlilP (popunjeni kvadrati) proizvodi duže dendrite preko opsega razmaka od soma.

Primer 21: Tretiranje Retovog sindrom kod miševa II: Parenje miševa i određivanje genotipa

[0300] Korišćena je MeCP2 roditeljska linija golih alela miševa (Chen et al., 2001). Određivanje genotipa je izvedeno kao u Chen et al. (Chen et al., 2001).

cG-2-AlilP Treatman

[0301] Za merenje preživljavanja, analiza noćne aktivnosti i analize imunoblot analize, cG-2-AlilP obezbeđen od Neuren Pharmaceuticals Limited je davan dnevno pomoću intra-peritonealnih injekcija (20 mg/kg, nosač=rastvor soli, 0.01% BSA). Tretman je počeo P15 i održavan je u toku trajanja eksperimenata. Za intracelularne fiziološke eksperimente, miševi su injektirani dnevno sa cG-2-AlilP (20 mg/kg telesna masa, nosač=rastvor soli, 0.01% BSA) u toku 2 nedelje, od P15 do P28-P32 kada su korišćeni za akutno pripremanje režnjeva. Za optičko snimanje eksperimenata, miševi su injektirani sa cG-2-AlilP (20 mg/kg telesna masa, nosač=rastvor soli, 0.01% BSA) dnevno od dana šava kaka do dana snimanja.

Fiziološko pripremanje režnjeva

[0302] Koronalne sekcije (300 µm debljine) na ili blizu senzomotornog korteksa su isečene na <4°C ACSF korišćenjem Vibratome. Režnjevi su inkubirani na 37°C u toku 20 minuta posle sečenja i na sobnoj temperaturu u toku preostalog eksperimenta. Režnjevi su premeštei u Warnerovu komoru i snimanje je izvedeno vizuelnom identifikacijom piramidalnih neurona smeštenih u sloju 5. Veštačka cerebralna spinalna tečnost (ACSF) koja sadrži 126 mM NaCl, 25 mM NaHCO3, 1 mM NaHPO4, 3 mM KCl, 2 mM MgSO4, 2 mM CaCl2, i 14 mM dekstroze, je podešena na 315-320 mOsm i 7.4 pH, i uvođen je u mehurovima 95% O2/5% CO2. Intracelularni pipetirani rastvor je sadržao 100 mM kalijum glukonata, 20 mM KCl, 10 mM HEPES, 4 mM MgATP, 0.3 mM NaGTP, i 10 mM Na-fosfokreatina.

Intracelularno snimanje celih ćelija

[0303] Borosilikatne pipete (3-5 MΩ, WPI) su povučene korišćenjem Sutter P-80 potezača (SutterInstruments). Ćelije su vizuelizovane sa Achroplan 40x sočivima potopljenim u vodu sa infracrvenom-DIC optikom (Zeiss) i detektovane sa infracrvenom kamerom (Hamamatsu) projektovanjem na video monitor . Eksperimenti su vođeni sa uobičajenim prilagođavanjem i analizom u realnom vremenu pomoću softvera napisanog u Matlab (Mathworks, Natick, Mass.) korišćenjem Multiclamp 700B amplifikatora (Axon Instruments) povezanog sa BNC-2110 konektivnim blokom i M-Serijama dvokanalne kartice (National Instruments). Zatapanje i rupture su postignute i snimanje celih ćelija je kontinulano potvrđivano na niske nivoe curenja i serijskog otpora Za svako snimanje, primenjivan je 5 mV test-puls na ’voltage clamp’ ∼10 puta da bi se merio ulaz i serijska otpornost . Zatim u ’current clamp’ ∼10 pulseva (500 ms, 40-140 pA pri inkrimentima 10 pA ), su primenjene da se kvantitativno izazovu stope pucanja i ćeliske ekscitabilnosti. Pristupna otpornost, curenje i ćelijska unutrašnja eksctabilnost su verifikovane da budu konzistentne duž. Na kraju, spontani EPSCs ispod ’voltage clamp’ na -60 mV su uzorkovani na 10 kHz i niski prolaz je filtriran na 1 kHz. Analiza je izvedena korišćenjem uobičajenog paketa softvera napisanog u Matlab, sa svim slučajevima detektovanim duž automatizovanih pragova i slepo verifikovani za svaki događaj pojedinačno od strane osobe koja izvodi eksperiment.

Golgi bojenje

[0304] Uzorci (<1 cm) od P28 miševa su fiksirani u 10% formalinu i 3% kalijum bihromatu u toku 24 sata. Tkivo je zatim premešteno u 2% srebro nitrat u toku 2 dana u mraku na sobnoj temperaturi . Sekcije iz ovih uzorka su zatim isečene na debljinu 50 µm u destilovanoj vodi. Sekcije koje odgovaraju motornom korteksu su nanete na pločice, osušene na vazduhu u toku 10 minuta, i zatim dehidrirane kroz sekvencionalno ispiranje 95% alkoholom, 100% alkoholom, i kiselnom, i zatim zatopljene sa gornjom pločicom. Slike su ponovo nabavljene pri 10x (cela ćelija) i 100x (snimanje bodlji) korišćenjem Zeiss Pascal 5 Exciter konfokalnim mikroskopom.

Optičko snimanje unutrašnjih signala

[0305] Odrasli (>P60) prirodni tip (SVEV ili BL6) i MeCP2 (+/-) mutantnih ženki (BL6) su korišečni za ovaj eksperiment. Kontrolna grupa prirodnog tipa je sastavljena od oba prirodna tipa iz istog legla MeCP2+/-ženki ili prirodnih starosno sparenih SVEV ženki. Za monokularnu deprivaciju, životinje su anestezirane sa avertinom (0.016 ml/g) i očni kapak jednog oka je zašiven u toku 4 dana. Pre snimanja, šav je uklonjen i uskraćeno oko je ponovo otvoreno. Samo životinje u kojima su deprivacioni šavovi intaktni i stanje deprivacionog oka je bilo zdravo su korišćene u sesiji snimanja. Za cG-2-AlilP signalizirajuću aktivaciju, rastvor koji sadrži cG-2-AlilP je injektiran intra-peritonealno (IP) dnevno za celokupni period deprivacije. Za sesije snimanja miševi su anesterizrani sa uretanom (1.5 g/kg; 20% puna doza je davanja IP svakih 20-30 minuta do krajnje doze , 0.02 ml kloroprotiksena 1% je takođe injektovano zajedno sa prvim davanjem ). Lobanja je izložena i ploča napravljena po meri je zalepljena da bi se minimizirali porekti glave. Lobanja je stanjena preko VI sa dremel bušilicom i prekrivena sa agaroznim rastvorom u rastvoru soli (1.5%) i staklenim prekrivačem. U toku sesije snimanja, životinja je konstantno oksigenirana, njena temperatura je održavana sa pokrivačem koji se greje i oči su periodično tretirane sa silikonskim uljem; fiziološka stanja su konstanto praćena. Anestezirani miš je smešten ispred monitora koji prikazuje periodične stimulasane prikazane na bilo koje oko, monokularno; stimulus se sastojao pokretanja vertikalne ili horizontalne bele šipke dimenzija 9°x72°, pokretanja 9 sec/ciklusu, preko jednoobrazne sive pozadine. Površina lobanje je osvetljena sa crvenim svetlom (630 nm) i promena u luminiscenciji je zabeležena sa CCD kamerom (Cascade 512B, Roper Scientific) pri brzini 15 okvira/sek u toku svakog stimulansa u toku 25 minuta. Temporalni filter visokog prolaza (135 okvira) je korišćen da se ukloni spori šum signala, posle čega je signal kompjuterski obrađe u cilju da se ekstrahuje, u svakom pikeslu, vremenski brza komponenta Furijeove transformacije (FFT) odgovara na frekvencu stimulnsa. FFT amplituda je korišćena za merenje jačine vizuelno izazvanog odgovora za svako oko. Indeks očne dominacije potiče iz odogovora svakog oka (R) pri svakom pikselu ODI=(Rcontra-Ripsi)/(Rcontra+Ripsi). Binokularna zona je definisana kao region aktiviran stimulacijom oka ipsilateralno na snimljnoj hemisferi.

Merenja brzine srca

[0306] Brzina srčanog rada u realnom vremenu je merena korišćnjem pomoću senzora repne štipaljke (Mouse OX Oximeter-Oakmont, PA). Miševi su anestezirani, ali fiziči zadržavni u opremljenim otvorenim plastičnim cevima. Pre snimanja sesije, cev je smeštena preko noći u kućišta kaveza da se omogući navikavanje životinja. Telesna temperatura je održavana na ∼82-84°F u toku perioda snimanja. Snimi smo 3 probe od 15 minuta za svakog miša, miševi su bili 8 nedelja stari i tretiran nosačem ili cG-2-AlilP iz P15.

Merenja noćne aktivnosti

[0307] Spontana motorna aktivnost je merena korišćenjem komore za praćenje sa infracrvenim snopom koji se aktivira pokretom (Opto-Varimax-MiniA; Columbus Instruments, Columbus, Ohio). Za svaki eksperimet, miš je smešten u komoru bar 3 h pre početka snimanja. Pokreti su praćeni toku normalnog ciklusa 12-h mraka (7 p.m. do 7 a.m.). Jedan tamni ciklus je sakupljen po životinji u vremenskoj tački.

Rezultati

[0308] Da bi se testiralo da li tretman sa cG-2-AlilP će uticati na razvijanje kardinalnih karakteristika RTT bolesti, 2 nedelje starim mutantnim životinja davane su dnevne intra-peritonealne injekcije u toku njihovog životnog veka. Merenja sintaptičke fiziologije, spatičkih molekulskih kompozicija i kortikalne plastičnosti su zatim dobijeni kako je dole detaljno dato, zajedno sa merenjima u vezi sa zdravljem kao što je brzina srca, nivo lokomotorne aktivnosti i životni vek .

Efekti cG-2-AlilP na sinaptičku fiziologiju MeCP2 Mutantnih miševa

[0309] Skorašnja ispitivanja su zabeležila da neuroni duž višestrukih moždanih regiona MeCP2-/y miševa pokazuju izrazito smanjenje u spontanoj aktivnosti (Chang et al., 2006; Chao et al., 2007; Dani et al., 2005; Nelson et al., 2006) fenotipa koji je spašen od prekomerne ekspresije BDNF (Chang et al., 2006). Slično, akutna primena IGF1 derivata je prikazano da podiže izabrane ekscitatorne postsinaptičke amplitude struje (EPSC) za 40% kod hipokampusnih kultura pacova (Ramsey et al., 2005; Xing et al., 2007). Da bi se testirala efikasnoast cG-2-AlilP u spašavanju MeCP2-/y fiziološkog fenotipa, sakupili smo snimanja za intracelularne cele ćelije u režnjevima akutnog mozga, merenjem ekscitatornog sinaptičkog pobuđivanja (spontane EPSC amplitude i frekvence) u sloju kortikalnih neurona. Ovde EPSCs snimljen od -/y životinja je značajno smanjio amplitudu u poređenju sa EPSCs merenjima kod prirodnih životinja . Trend je parcijalno preokrenut kod EPSCs zabeleženih kod MeCP2-/y životinja tretiranih sa cG-2-AlilP, koje su značajno više u amplitudi od EPSCs iz MeCP2-/y miševima tretiranim sa nosačem. Ove razlike su takođe vide sa uprosečavanjem duž ćelija . U ovim merenjima, pristupni otpor, curenje, i ćelijska unutrašnja ekscitabilnost su takođe potvrđeni da su konzistenti duž grupe. Kvantifikovanje EPSC intervala takođe pokazuje blagi porast u intervalu između EPSC događaja (smanjena EPSC frekvenca) između prirodnih i MeCP2-/y životinja (P=0.04, Kolmogorov-Smimov test). Mi smo našli da smanjenje u ekscitatornim sinaptičnom nadraživanju kortikalnih ćelija McCP2-/y miševa, i njegov parcijalno spašavanje posle tretmana sa cG-2-AlilP, je delom od promene EPSC amplitude kao posledice promene u jačini sinapsi koje posreduju u ekscitatornoj transmisiju u ovom regionu .

cC-2-AlilP Treatman stimuliše sazrevanje kortikalnih bodlji

[0310] Koristili smo Golgi bojenje da bi se obeležili neuroni retko i izričito i primenjeno je konfokalno snimanje visoke rezolucije da bi se merila gustina dendritnih bodlji i morfologija u obeleženim ćelijama, ograničavanjem analize na sloj 5 piramidalnih neurona u sekcijama motrnog korteksa iz kritičnih perioda miševa (P28).

[0311] Dok snimanje sa malim uvećanjem jasno označava stepen dendrita piramidalnih ćelija mi smo koristili velka uvećanja da se izbroje sinaptički kontakti i odredi morfološka klasa svakog šiljka . Mi smo klasifikovali šiljke kao velike i bulbozne ("pečurkasti", M), kratke i zdepaste ("zdepasti", S), kratke i tanke ("tanki", T) ili filopodne (F). Upoređivanje gustine bodlji po jedinici granjanja prikazuje trend smanjenja gustine šiljka u inaktiviranim neuronima što je u velikoj meri ublaženo kod inaktiviranje sa tretmanom.

[0312] Mi smo našli potetencijal za deficite u broju i statusu zrenja dendritnih kontakata u inaktiviranim da se podupru funkcionalni nedostaci u ekscitatornoj transmisiji, na način koji može biti tretiran posle davanja cG-2-AlilP.

Plastičnost okularne dominance (OD) kod odraslih MeCP2+/-Miševa je smanjeno sa cG-2-AlilP

[0313] Razvojene promene kod plastičnosti OD su kontrolisane delom aktivacijom IGF-1 puta, i davanje (1-3)IGF-1 može smanjiti plastičnost OD u prirodnom tipu mladog miša (Tropea et al., 2006). Prema tome, mi smo testirali da li tretman sa cG-2-AlilP može stabilizovati produženu plastičnost OD primećenu kod odraslih MeCP2 mutanta. Ženski MeCP2+/-miševi, stari P60 ili više, su monokularno deprivirani 4 dana i tretirani konkurento sa cG-2-AlilP. cG-2-AlilP treatman smanjuje plastičnost OD kod odraslih Mecp2+/-miševa, ukazujući da zaista cG-2-AlilP može lako izazvati stabilizaciju ili zrenje sinapse.

Bradikardija kod iMeCP2-/y Miševa je tretirana sa cG-2-AlilP

[0314] Pored prikazaivanja primera cG-2-AlilP u ublažavanju neurofizioloških simptoma, tražili smo da krakterišemo njihove efekte na opšte zdravlje organizma. Klinički i eksperimentalni dokazi pokazuju autonomne sistemske disfukcije kao što su labilni ritmovi disanja i smanjenje osnovne linije srčanog vagusnog tona kod pacijenata sa Retovim sindromom (Julu et al., 2001). Slaba kontrola mehanizma povratnih informacija koja reguliše homeostazu krvnog pritiska kroz simpatički sistem, na primer pad srčanog rada usled hiperventilacije, je uobičajen kod pacijenata sa Retovim sindromom i može izazvati životno ugrožavajuće srčane aritmije (Acampa and Guideri, 2006; Julu et al., 2001).

[0315] Patogeneza srčane disautonomije, mada se ne razume dovoljno, sugeriše da nezrele neuronske konekcije u moždanom stablu mogu biti uzrok. Da bi se ispitale abnormalnosti srčanog rada kod MeCP2-/y miševa i uticaj tretmana cG-2-AlilP, pratili smo u relanom vremenu brzinu srčanog rada kod neanesteziranih prirodnih i MeCP2-/y životinja tretiranih sa nosačem ili cG-2-AlilP. Prirodni tip miševa pokazuje pravilni raspored merenja srčanog rada koji se nalazi blizu 750 otkucaja u minuti. Nasuprot tome, MeCP2-/y miševi pokazuju nepravilniji srčani rad sa nižom prosečnom brzinom, javiljanjem koje je značajno smanjeno sa tretiranjem sa cG-2-AlilP.

cG-2-AlilP davanje poboljšava lokomotornou aktivnost i životni vek

[0316] MeCP2-/y miševi razvijaju simptome slične Retovom koji počinu u 4-6 nedelja starosti kada progresivno postaju letargični, razvija se ataksija hoda i smrt između 10 i 12 nedelja starosti (Chen et al., 2001). Osnovna linija lokomotorne aktivnosti je takođe zabeležena kod miševa posle 6 nedelja brojanjem noćnih slučajeva prelaženja preko infracrvenog snopa u okviru oblasti kaveza. Miševi sa inaktiviranim MeCP2 (KO) pokazuju zanačajno smanjene nivoe lokomotorne aktivnosti u poređenju sa prirodnim miševima (WT), ali tretman sa cG-2-AlilP (KO-T) podiže ove nivoe.

[0317] Na kraju, u poređenju sa MeCP2 KO iz istog legla, MeCP2-/y miševi tretirani sa cG-2-AlilP takođe pokazuju porast u životnom veku .

[0318] Mi smo takođe merili efekat cG-2-AlilP treatmana na veličinu neuronskim soma u hipokampusu. Mišvi su tretirani sa cG-2-AlilP kao što je gore opisano na lokomotornu aktivnost. Veličina soma kod neurona u regionu CA3 hipokampusa je značajno oštećena kod MeCP2 KO životinja u odnosu na prirodne životinje. cG-2-AlilP tretman povećava srednju veličinu soma kod KO životinja, ali ima mali ili nikakav efekat na veličinu soma kod prirodnih životinja .

Primer 22: Efekti oralnog cG-2-AlilP na preživaljavanje u Retovom sindromu kod miševa

[0319] Zbog toga što je Retov sindrom hronični, poremećaj slabljenja koji uključuje gubitak monornih veština, poželjno je lečenje Retovog sindroma korišćenjem preparata koji se lako daju. Sa ove strane , možemo iskoristiti neočekivane terapeutske prednosti i farmakokinetičke osobine cG-2-AlilP i srodnih jedinjenja (U.S. Pat. Nos.7,776,876, i 8,067,425).

[0320] Prema tome, davali smo cG-2-AlilP oralno miševima deficijentnim u MeCP2 . Ukratko, vodeni rastvor ili druge kompozicije koje sarže farmaceutski efikasnu količinu cG-2-AlilP (20 ili 80 mg/kg po životinji) je davan dnevno. Kao kontrola životinjama deficijentim u MeCP2 , davali smo samo rastvor soli, i prirodne životinje su korišćene da i se dobila osnovna linija koja je slična osmišljenoj .

[0321] Kod prirodnih životinja, definisano je da je preživljavanje 100% u svakoj vremenskoj tački. Kod životinja deficijentnim u MeCP2, s preživljavanje je suštinski opalo. Međutim, posle oralnog davanja cG-2-AlilP miševima deficijentnim u McCP2 , preživljavanje je suštinski povećano.

Primer 23: Efekti cG-2-AlilP na aktivnost napada kod Retovog sindroma kod miševa

[0322] Zbog toga što su napadi istaknuti, opasni i aspekt koji se teško leči Retovog sindroma, mi smo odredili efkete cG-2-AlilP na aktivnost napada kod životinja deficijentnih u MeCP2.

[0323] Snimanja elektoencefalografije kod prirodnih miševa i miševa deficijentnih u MeCP2 tretiranih ili sa rastvorom soli ili cG-2-AlilP su dobijeni pomoću postupaka opisanih u U.S. Pat. No.7,714,020.

[0324] Našli smo da cG-2-AlilP može biti efikasan u smanjenju i motornih napada i nekonvulzivnih napada .

Zaključci

[0325] cG-2-AlilP može biti efikasna terapija za lečenje ljudskih bića sa Retovim sindromom. Međutim, zbog toga što cG-2-AlilP ima neočekivano dužu polovinu života od jedinjanja koja se javljaju u prirodi ((1-3) IGF-1; Glicil-Prolil-Glutamat ili GPE), ustanovili smo da upotreba cG-2-AlilP ima posebne i suštinske prednosti u odnosu na ostala farmakološka sredstva, uključujući GPE.

[0326] Na primer, cG-2-AlilP je potrebno da se dostavi intravenski, subkutanozno, intraventrikularno ili parenteralno. U stvari, oralne formulacije koje sadrže mikro-emulzije, grube emulzije, preparate tečnih kristala, nanokapsule i hidrogelove mogu biti korišćeni u proizvodnji oralno davanih preparata kao što su tabelte, kapsule i gelovi koji mogu poboljšati neuronske funkcije i tretirati neurodegenerativna stanja. Jedinjenja prema ovom pronalasku mogu biti korišćena u situacijama u kojima je pacijentova motorna funkcija ispod potrebe da bude progutana tableta ili kapsula. Postoji nekoliko tipova rastvorljivih gelova za oralno davanje jedinjenja i oni mogu biti korišćeni za davanje jedinjenja ili kompozcijie prema pronalasku pacijentu . Zbog toga što cG-2-AlilP može biti lako davano oralno i oralno je efikasno u lečenju neurodegenerativnih poremećaja, uključujući Retov sindrom, zaključili smo da cG-2-AlilP može biti pogodno i korisno za dugoročnu terpaiju pacijenata sa Retovim sindromom.

[0327] Dalje, zbog toga što Retov sindrom deli ključne karakteristike sa drugim poremećajima iz spektra autizma, jedinjenja prema ovom pronalasku mogu biti korisna u obezbeđivanju terapeutske koristi kod životinja koji imaju drugi ASD, i kod ljudi sa autizmom, Aspergerovim sindromom, dezintegrativnim poremećajem u detinjstvu, i pervazivnim razvojnim poremećajem -koji nije drugačije specifikovan (PDD-NOS).

Primer 24: Lečenje ASDs

[0328] Postoji nekoliko životinjskih sistema koji su bili korišćeni za procenu terapeutske efikasnosti jedinjenja kod ASPDs.

Model miša deficijentnog u Shank3

[0329] Miševi deficijentni u Shank3 su korišćeni u ispitivanju kao modela za sindrom delecije 22q13 u vezi sa ASD.

[0330] Sindrom delecije 22q13 je povezan sa delecijom ili mutacijom gena Shank3 (Bonaglia et al, 2006). Gen Shank3 kodira glavni protein ’skele’ koji obrazuje okvir u glutamatnergičnim sinapsama (Boeckers et al, 2006). Shank3 je krucijalni deo jezgra postsinaptičke gustine (PSD) i aktivira mnogo ključnih elemenata za PSD i za sinapsu, uključujući komponente α-amino-3-hidroksil-5-metil-4-izoksazol-propionsku kiselinu (AMPA), metabotropni glutamat (mGlu), i glutamatne receptore N-metil-D-aspartanske kiseline (NMDA) , kao i citoskeletne elemente. Skorašnja ispitivanja koja ispituju brzinu 22q13 delecija/ Shank3 mutacija sugerišu da haploinsuficijencija Shank3 može izazvati monogeni oblik ASD sa frekvencom 0.5% do 1% ASD slučajeva (Durand et al, 2007; Moessner et al, 2007; Gauthier et al, 2008).

[0331] Stvaranje modela miša sa poremećenom eskpresijom pune dužine Shank3 ranije je opisano u stanju tehnike (Bozdagi et al., Molecular Autism 2010, 1:15, p4). Ukratko, Bruce4 C57BL/6 embrionske stem ćelije su korišćene za stvaranje mišje linije koja ima loxP mesta umetnuta pre egzona 4 i egzona 9. ’Floksirani’ aleli su isečeni i linija je održana sa delecojom egzona 4 do 9, tj. potpunom delecijom ankirin domena ponovaka Shank3. Prirodni (+/+), heterozigotni (+/-) i inaktivirani (-/-) miševi su dobijeni, sa Mendeljejevim frekvencama heterozigot-heterozigot ukrštanja.50% redukcija pune dužine Shank3 mRNK je portvrđena u heterozigotima (qPCR) kao i u smanjenoj ekspresiji Shank3 proteina (imunoblotovanjem sa Shank3 antitelom N69/46).

[0332] Heterozigotni miševi dobijeni ukrštanjem prirodnih miševa sa heterozigotima korišćeni suu ovom primeru kao najbolji model haploinsuficijencije Shank3, odgovorni za sindrom delecije 22q13.

Postupci

Tretiranje lekom

[0333] 1 do 3 meseca stari prirodni i heterozigotni miševi deficijentni u Shank3 su podeljeni u 4 grupe za tretiranje: prirodna tretirana placebom, grupa deficijentna u Shank3 tretirana sa placebom i dve grupe deficijentne u Shank3 tretirane sa cG-2-AlilP . Životinjama je dat palacebo (voda) ili cG-2-AlilP formulisan u vodi davan oralno, b.i.d u toku 14 dana. cG-2-AlilP je davan u dve doze: 15 ili 60 mg/kg.

Metodologija

[0334] Detaljni opis metodologije može se naći kod Bozdagi et al. (Molecular Autism 2010, 1:15).

Bihejvioralne analize

[0335] Bihejvioralne procene su napravljene u nekoliko vremenskih tačaka, i uključuju analize socijalnih interakcija i ultrazvučnih socijalnih komunikacija u liniji sa metodologijama opisanim od strane Bozdagi et al. Ukratko, muško-ženske socijalne interakcije u svoj tretiranoj grupi su procenjivane. Muški subjekti su grupno smešteni i pojedinačno testirani u čistim kavezima sa čistim prostirkama. Svaka testirana sesija je trajala 5 min. Svaki od podvrgnutih miševa je sparen sa različitim nefamilijarnim estrusnim C57BL/6J ženkama. Digitalno zatvorena televizijska kamera (Panasonic, Secaucus, NJ, USA) je smeštena horizantalno 30 cm od kaveza. Ultrasonični mikrofon (Avisoft UltraSoundGate condenser microphone capsule CM15; Avisoft Bioacoustics, Berlin, Germany) je montiran 20 cm iznad kaveza. Frekvenca uzorkovana za mikrofon je 250 kHz, i rezolucija je 16 bits. Dok korišćena oprema ne može napraviti razliku između zvukova koji emituju muški subjekti i ženski partner, prevlast zvukova u toku muško-ženskih interakcija kod miševa uglavnom emituje mužjak. Celokupna aparatura se nalazi u komori za utišavnje spoljnih zvukova (ENV-018V; Med Associates, St Albans, VT, USA) osvetljenoj sa jednim crvenom sijalicom od 25-Watt. Video muških subjekata je naknadno bodovan od strane istraživča kome je subjektov genotip nepoznat i tretirana grupa merenja njuškanja nos -nos , nos - anogenitalna regija i njuškanje drugih telesnih regiona, pomoću Noldus Observer softvera (Noldus Information Technology, Leesburg, VA, USA). Ultrazvučne vokalizacije su identifikovane ručno od strane dva visoko osposobljenja istraživača kojima nije bio poznat genotip/informacija o tretiranoj grupi i sažete statistke su izračunate korišćenjem Avisoft-ovog paketa. Unutrašnja pouzdanost je 95%. Podaci su analizirani korišćenjem nesparenog Studentovog t-testa.

[0336] Testrianje olfaktornog navikavanja/ odvikavanja je izvedeno kod muških i ženskih miševa za svaku grupu . Metodologija je ranije opisana (Silverman et al 2010, Yang et al 2009 and Silverman et al 2010). Nesocijalni i socijalni mirisi su prikazani u serijama pamučnih briseva umetnutih kaveze, svaki u toku 2 min, sledećim redosledom: voda, voda, voda (desilovana voda); badem, badem, badem (1:100 razblaženi ekstrakt badema ); banana, banana, banana (1:100 razblaženje veštačke arome banane ); socijalni 1, socijalni 1, socijalni 1 (bris sa dna kaveza za smeštanje nefamilijarnih po polu sparenih B6 miševa); i socijalni 2, socijalni 2, socijalni 2 (bris sa dna drugog kaveza za smeštanje nefamilijarnih po polu sparenih 129/SvImJ miševa). Merenja jJednosmerne ponovljenje ANOVA je izvedena u toku svake tretirane grupe za svaki set događaja navikavanja i svaki slučaj odvikavanja, praćen sa Tukey post hoc testom.

Elektrofiziologija hipokapalni režnjevi

[0337] Post-mortem, akutni hipokampalni rešnjevi (350 µm) su pripremljeni iz miševa pomoću tkivne seckalice. Režnjevi su održavani i ekspreimenti su izvođeni na 32°C. Režnjevi su perfuzirani sa Ringerovim rastvorom koji sadrži (u mM): NaCl, 125.0; KCl, 2.5; MgSO4, 1.3; NaH2PO4, 1.0; NaHCO3, 26.2; CaCl2, 2.5; glukoze, 11.0. U Ringerov rastvor je uvođen 95% O2/5% CO2, na 32°C, u toku ekstracelularnog snimanja (elektrodni rastvor: 3 M NaCl). Režnjevi su održavani u toku 1 h pre ustanovljavanja osnovne linije polja ekscitatornih postsinaštičkih potencijala (fEPSPs) zabeleženih iz stratum radiatum u oblasti CA1, izazvanoj sa stimulacijom Schaffer-vih kolateralno-komisuralnih aferentnih vlakana (100 ms pulseva svakih 30 s) sa bipolarnim volframovim elektrodama smeštenim oblastima CA3. Test intenziteta stimulansa je prilagođen da bi se dobio fEPSPs sa amplitudama koje su jedna polovina maksimalnog odgovora. EPSP inicijalni nagib (mV/ms) je određen iz prosečne vrednosti oblika talasa četiri uzastopna odgovora. Krive ulaza-izlaza (I/O) su dobijene sa grafika fEPSP nagiba naspram amplitude volej vlakna u niskom-Mg<2+>(0.1 mM) rastvoru. AMPA receptor-posredovane i NMDA receptor-podredovane I/O relacije su merene u prisustvu antagonista jonotropnih glutamatnih: 2-amino-2-fosfonopentanske kiseline APV (50mM) i 6-cijano-7-nitrohinoksalin-2,3-diona CNQX (100mM). Spareni pulsni odgovori su mereni u intervalima između stimulansa od 10 do 200 ms, i izraženi su kao odnos srednje vrednosti odgovora na drugi stimulacioni puls na prvi stimulacioni puls.

[0338] LTP je indukovan ili sa stimulansom visoke frekvence (četiri treniranja od 100 Hz, 1 s stimulacija odvojena sa 5 min), ili sa teta-nalet stimulacije (TBS) (10 naleta četiri pulsa na 100 Hz odvojenih sa 200 ms), ili sa pojedinačnom 100 Hz stimulacijom, za kontrolisanje i genetički modifikvanih miševa. Da bi se izazvala dugoročna depresija (LTD), Schaffer-ovi kolaterali su stimuisalni sa niskom frekvencom ili stimulansom sparenog pulsa niske frekvencije (900 pulseva na 1 Hz u toku 15 min) da bi se izazvao mGlu receptor-zavisan LTD. Podaci su izraženi kao srednja vrednost ± SD, i statističke analize su izvedene pomoču analiza varijansi (ANOVA) ili studentovog t-testa, sa setom značajnosti na α nivou od 0.05.

Rezultati

Bihejvioralni

[0339] Kumulativno trajanje socijalnog njuškanja kod muških testiranih subjekta je niže u grupi deficijentnoj u Shank3-tretiranoj sa placebom nego nego u priodnoj grupi tretiranoj placebom . Pored toga, manje ultrazvučnih vokalizacije je emitovano u grupi deficijentnoj u Shank3 tretiranoj sa placebom nego u prirodnim kontrolama u toku muško-ženskih socijalnih interakcija.

[0340] Tretman cG-2-AlilP u dve grupe deficijentne u Shank3-dovodi do značajnog porasta u kumulativnom trajanju ukupnog socijalnog njuškanja u poređenju sa grupom deficijentom u Shank3-tretiranom sa placebom. Pored toga, grupa tretirana sa cG-2-AlilP pokazuje povećani broj ultazvučne vokalizacije nego mutantna grupa tretirana placebom.

[0341] U ispitivanju olfaktornog navikavanja/odvikavanja, nameravano je da se potvrdi da su miševi u stanju da detektuju socijalne feromone, sve 4 grupe pokazuju normalne nivoe navikavanja (pokazivane kao smanjeno vreme provedeno u njuškanju sekvence tri ista mirisa), i očekivanom odvikavanju (pokazano povećanom vremenu provedenom u njuškanju različitih mirisa ).

Elektrofiziologija

[0342] Nagib grafičkog prikaza polja ekscitatornog postsinaptičkog potencija (fEPSP) naspram intenziteta stimulansa intenzivno pokazuje smanjenje u I/O krivi u grupi deficijentnoj u Shank3-tretiranoj placebom nasporam kontrolne grupe. U heterozigotnoj placebo tretiranoj grupi takođe je primećen pad u polju potencijala posredovanim AMPA receptorima, koji se reflektuje u 50% padu u srednoj vrednosti nagiba I/O funkcije u poređenju sa prirodnom kontrolom grupom. Nasuprot tome, kada je anliziran odnos I/O u prisustvu kompetitivnog antagonista AMPA/kianatnog receptora CNQX da se izmeri sinaptička funkcija NMDA receptora, ne postoji razlika između prirodne i heterozigotne grupe tretirane palcebom. Ovi rezultati ukazuju da postoji specifična redukcija u osnovnoj transmisiji poredovanoj MPA receptorom kod Shank3 heterozigotnih miševa.

[0343] Tretman sa cG-2-AlilP u obe heterozigotne grupe normalizuje potencijale polja posredovane AMPA receptorom i izazivaju porast u srednjem nagibu - I/O funkcije u poređenju sa grupom deficijentnom u Shank3-tretiranom placebom.

[0344] Održavanje LTP u grupi deficijentnoj u Shank3 tretiranoj sa placebom je jasno pogoršano u poređenju sa prirodnom kontrolom. TBS LTP testovi (10 naleta četiri pulseva na 100 Hz odvojeno sa 200 ms) takođe prikazuje značajan pad u potencijalu 60 min posle TBS kod grupe deficijentne u Shank3 tretirane placebom. Nasuprot izmenjenoj sinaptičkoj plastičnosti primećenoj sa LTP, dugoročna depresija (LTD) nije bila značajno promenjena u mutantnoj grupi. Tretman cG-2-AlilP povećava hipokampusni dugoročni potencijal (LTP) i njegovo održavanje kod obe grupe deficijentne u Shank3-u poređenju sa grupom deficijentnom u Shank3 tretiranom placebom.

Diskusije i zaključci

[0345] Slabe socijane kompetencije i repetativna ponašanja su uobičajene karakteristike i ključne dijagnostičke mere svih oblika ASD. Odloženi intelektualni razvoj i nerazvijene jezičke veštine su takođe uobičajena karakteristika prisutna kod svih ASD, osim Aspergerovog sindroma.

[0346] Gore opisani životinjski modeli su bili prihvaćeni u ovoj oblasti jer pokazuju slične simptome kliničkim humanim stanjima. Svi modeli mutanta koji su gore diskutovani (NLGN3, NLGN4, CADM1, NRXN1, FMR1, shank3) pokazuju pogoršane socijalne veštine ili povećanu socijalnu anksioznost. Smanjena ekscitatorna transmisija u hipokampusu je identifikovana na modelima mutantani životinja NRXN1, shank3, MeCP2 i FMR1. Do danas poligenetski ili multifaktorni modeli ASD nisu opisani. Gore opisani modeli životinja, zasnovani na genetskim deficitima koji su poznat da bi se dobio ASD u ljudskoj populaciji, obezbeđuju najbolju mogućnost za testiranje efikasnosti ASD terapija.

[0347] Prema tome efikasnost cG-2-AlilP na životinjskim modelima ASD je razumno predviđanje efikasnosti na humanim subjektima koji pate od ASD.

Primer 25: Merenje signalnih proteina fosfo-ERK1/2 i fosfo-Akt analizom fosfo-protočne citometrije FXS mišjih limfocita

[0348] Putevi signalne transdukcije povezuju spoljašnji stimulans sa ćelijskim odgovorima, koji mormalno regulišu ćelijsku proliferaciju, smrt i diferencijaciju. Mi koristimo fosfo-specifična antitela za ERK1/2 i Akt koji prepoznaju one proteine samo kada su oni fosforilovani. Jedna od jedinstvenih karakteristika protočne citometrije je sposobnost da se izvedu merenja fosforilacionih stanja što nije dobijeno standardim biohemijskim tehnikama pa ovo očigledno ima veliki potencijal za ispitivanje efkata lečenja leka .

Postupci

[0349] Limfociti su izolovani iz pet inakaktiviranih fmr1-i pet prirodnih primeraka iz istog legla kao kontrolnih miševa, u vreme ispitivanja posle injekcije cG-2-AlilP. Limfociti su ispitivani na aktivaciju dva signalna efektora , p-ERK1/2 i p-Akt korišćenjem fosforilacionog statusa kao mere aktivacije protočnom citometrijom (fosfo-protok).

Merenje je izvršeno sa:

1. Protočnom citometrijom ukupnom i fosforilovani ERK u limfocitima

2. Protočnom citomerijom ukupnom i fosforilovanim AKT u limfocitima

Rezultati

[0350] Ustanovili smo da limfociti izolovani iz miševa sa inaktiviranim fmr1 pokazuju aktivaciju ERK1/2 i Akt fosfoepitopa. Srednja vrednost nivoa fluorescentnog intenziteta (MFI) za p-AKT ip-ERK1/2 kod miševa sa inaktiviranim fmr1 tretiranim sa cG-2-AlilP smanjuje u svim vremenskim tačkama : 15, 30, 60 i 240 minuta posle jednog tretmana. Mi smo našli slična smanjenja MFI kod miševa sa inaktiviranim fmr1 posle 5 i uzastopnih dana tretmana cG-2-AlilP .

[0351] Ukratko, cG-2-AlilP proizvodi značajno smanjenje u fosofo-aktivaciji ERK1/2 i Akt kod miševa sa inaktiviranim fmr1. Ovaj rezultat ukazuje da p-ERK i p-Akt su korisni biološki markeri da bi se procenila terapeutska efikasnost u lečenju ljudskih bića sa ASD ili NDD. Zbog toga što je ekspresija pERK i pAkt u limfocitima slična ekspresiji onih fosforilovanih proteina u mozgovima miševa sa inaktiviranim fmr1, obzervacije terapeutskih efekata kod limfocita su razumno predvidljive efektima cG-2-AlilP u mozgovima bolesnih životinja, uključujući ljudska bića.

Primer 26: Lečenje ljudskih bića koja imaju sindrom fragilnog X pomoću G-2-AlilP

[0352] Da bi se odredilo da li je cG-2-AlilP efikasn u lečenju pacijenata sa sindrom fragilnog X, izveli smo dvostruko slepo, placebo kontrolisano ispitivanje .

Postupci

Pacijenti

[0353] Muški pacijenti koji imaju sindrom fragilnog X su dijagnosticirani genetskom analizom koja pokazuje potpunu mutaciju fmr1. Simptomi su procenjivani korišćenjem jednog ili više gore diskutovanih klinički evalucionih alata. Svaki pacijent je bodovan prema jednom ili više klinički evalucionih alata za jedno ili više od Repetativna ponašanja (RBB), Anksioznost, i Društvensot. Rezultat opšteg kliničkog utiska - ozbiljnost i(CGI-S) 4 ili veći, ili ukupan rezultat ABC 30 ili veći je za uključivanje.

Davanje leka

[0354] Uključeni pacijenti su podeljeni u grupe. Svi uključeni su počeli ispitivanje sa 2-nedeljnim pojedinačnim slepim davanjem placeba b.i.d. Posle toga , cG-2-AlilP je davan oralno u dozi od 35 mg/kg b.i.d. (n=20) ili 70 mg/kg b.i.d (n=20) u toku 28 dana, praćeno sa 28 dana placeba, ili ako je nasumično davan placebo, cG-2-AlilP je davan u dozi od 70 mg/kg b.i.d. polazeći od dana 42 i prestajanjem dana 70. Pre proučavanja leka za davanje , cG-2-AlilP je rekonstruisan sa razblaživačem sa ukusom jagode da bi se obezbedila tečnost za oralno davanje . Placebo (n=20) je razblaživač sa ukusom jagode i voda.

Procene

Farmakokinetike

[0355] Uzorci krvi svih subjekta u svakoj grupi su sakupljeni dana 42 i dana 70. Četiri (4) uzorka su sakupljena polazeći od dana 42 (pre-doziranja i 2-4 sata posle doze) i dana 70 (pre doziranja i 2-4 sata posle doze ). Rezervni uzorak za svaku vremensku tačku je takođe sakupljen.

Efikasnost

[0356] Efikasnost je određena korišćenjem Opšteg kliničkog utiska ozbiljnosti (CGI-S), Opšteg kliničkog utiska poboljšanja(CGI-I), Skale ocenivanja sindroma fragilnog X , Specifičnih pitanja iz domena fragilnog X klinički-popunjena (Vizuelna analogna skala), Tri glavna zapažanja davaoca nege (Vizuelna analogna skala), Kontrolna lista nenormalnog ponašanja, Vinelandove skale adaptivnog ponašanja, CASI-16, CYBOCS-PDD, dnevnika napada, kompjuterizovanog praćenja očiju, kompjuterizovanog merenja saznanja korišćenjem KiTap, i Uzornog zadatka ekspresivnog jezika.

Merenje efikasnosti ishoda

[0357] Sledeće četiri grupe su procenjivane radi merenja efikasnosti ishoda, upoređivanjem dva dozna nivoa cG-2AlilP, odvojeno i zajedno , sa placebom.

Globalne mere funkcionalnih ishoda

[0358] Sledeće mere su procenjene na baznoj liniji i u toku tretmana i promene su poređene između aktivne i placebo grupe .

[0359] Promene u Skali bodovanja sindromu fragilnog X su izračunavane za svaki subjekat između osnovne linije (pre tretmana) dan 14, i kraja tretmana (Dani 42 i 70).

[0360] Opšti ishod je meren sa Opštim kliničkim utiskom -ozbiljnosti i skalama poboljšanja (CGI-S i CGI-I) pri svakoj kliničkoj poseti, od osnovne linije nadalje (npr. dani 14, 28, 42, 56, 70, i 84.

[0361] Promene u Specifičnim pitanjima iz domena fragilnog X- klinički-popunjeni , kako je zabeleženo sa Vizuelnom analognom skalom (VAS), je izračunato za svaki subjekt između osnovne linije (pretretmana), Dana 14, i kraja tretmana (Dana 42 i 70).

[0362] Promene u tri glavna zapažanja davaoca nege (u vezi sa subjektovim sindrom fragilnog X) zabeleženi sa Vizuelnom analognom skalom (VAS) je izračunato u okviru subjekata između bazne linije (pre-tretmana), Dana 14, i kraja tretmana (Dani 42 i 70).

[0363] Promene u CASI-16, CYBOCS-PDD, Kontrolnaoj listai nenormalnog ponašanja (ABC), Uzornom zadatku ekspresivnog izražavanja i Vinelandoveoj skalei adaptivnog ponašanja (VABS) je izračunato za svaki subjekt između osnovne linije , Dana 14, i dana 42, i 70.

Merenje fizioloških ishoda

[0364] Nivoi u serumu i promene stadarnih hematololoških i hemijskih parametra (uključujući tiroidnu funkciju) su izračunati iz osnovne linije do dana 70. Fundoskopija i veličina krajnika je dokumentovana na osnovnoj liniji i dana 14, 28, 42, 56, 70 i 84. Protočna citometrija je korišćena za procenu stanja fosforilacije enzima Akt i ERK u perifernim limfocitima, na uzorcima krvi dobijenim dana 14, 28, 42, 56, i 70. ECG je procenjivan odabirom, osnovnom linijom, dana 28, 42, 56 i 70.

Merenje kognitivih/ automatizovanih ishoda

[0365] Sledeće mere su procenjivane na osnovoj liniji, u toku i posle ispitivanja davanja leka. Kompjuterizovana merenja spoznaje pomoću KiTap, je procenjivano na osnovnoj liniji, dana 14, dana 42, dana 70 i dana 84. Kompjuterski zasnovano prećenje očiju je mereno na osnovnoj liniji dana 14, 28, 42, 56 i dana 70.

Farmakokinetički-farmakodinamički odnos

[0366] Podudarna farmakokinetička merenja (PK) i merenja efikasnosti (PD) su sakupljena od svih pacijenata koji su nasumično oralno primili dva puta dnevno ili 35 mg/kg ili 70 mg/kg cG-2-AlilP . Farmakodinamički markeri uključuju globalne funkcionalne, fiziološke i kognitivne/automatizovane ishode. Prilaz je da se procene promene u merenju efikasnosti u toku ispitivanja i da se dovedu u vezu sa onima sa merenjem ili izračunavanjem farmakokinetičkih krajnjih tačaka. Pored toga PK/PD modeli su korišćeni da se ustanovi odnos između koncentracije u krvi cG-2-AlilP i efekta, kada je pogodno.

Statistički postupci

Efikasnost

[0367] ANOVA, ANCOVA i Chi-kvadrat testovi su korišćeni za upoređivanje efikasnosti merenja nivoa i promena između tretiranih grupa. Svaka dozna grupa je poređena sa konkuretnom placebo grupom i kombinovana dozna grupa je poređena sa kombinovanom placebo grupom. p-vrednost sa dva kraja <0.05 je smatrana da ukazuje na statističku značajnost.

[0368] Ukupna veličina uzorka od 60 (40:20) omogućava da se efikasne veličine >0.između aktivnih i placebo detektuju kao statistički značajne (2-kraja α=0.05) sa 80% jačine na ključni ishod merenja kao što je skala bodovanja sindrom fragilnog X. Za upoređivanje sa svakom doznom grupom (tj. upoređivanje upoređenih vremena), veličina efekata >0.7 u okviru aktivnih i placebo je detektovano kao statistički značajno (2-kraja α=0.05) sa 80% jačine.

Farmakokinetike

[0369] Maksimalna koncentracija (Cmax; signal), minimalna koncentracija (Cmin; uvala), C0-4 i parametri površine ispod krive (AUC) u ravnotežnom stanju su izračvanavani direktno iz podataka koncentracije cG-2-AlilP i ukratko dati u svakoj vremenskoj tački pomoću standardnih opisanih statistika uključujući srednju vrednsot, medijane, geometrisku srednju vrednost, standardne devijacije, opsege i 95% intervale pouzdanosti .

[0370] U cilju određivanja da li postoje veze između PK parametara i merenja efikasnost, promene u merenju efikasnost u toku ispitivanja su u korelaciji sa PK parametrima procenjenim pri različitim vremenskim tačkama. Ove veze su statistički testirane korišćenjem korelacionih koeficijenata i opštih linearnih modele.

Rezultati i zaključci

[0371] Ustanovili smo da cG-2-AlilP je dobro tolerisano od strane pacijenata . Mi smo dalje našli da cG-2-AlilP ima klinički relevantne i značajne efekate na poboljšanje kliničkih ishoda koji su mereni korišćenjem jednog ili više ovde opisanih alata . Takođe smo ustanovili da cG-2-AlilP normalizuje pERK i pAkt nivoe.

[0372] Ovo ispitivanje pokazuje da je cG-2-AlilP efikasno u tretiranju neželjenih simptoma sindroma fragilnog X kod ljudskih bića.

Primer 26: Efekti cG-2-AlilP na simpatičku plastičnost posle povrede mozga sličnoj probojnoj balističkoj povredi kod pacova I:

[0373] U ovom primeru, istraživali smo da li cG-2-AlilP ima antiinflamatornu i antiapoptotičku aktivnost posle povrede mozga sličnoj probojnoj balističkoj povredi (PBBI). Molekuli koji su struktuirani slično cG-2-AlilP je pokazano da imaju efekte na pospešivanje pamćenja ili poboljšavanja učenja pasivnog izbegavanja in vivo i pospešuje porast neurita in vitro. Ovo sugeriše da tretman sa analozima c(GP) posešuje neuroplastičnost i obrazovanje sinapse. Mi smo zbog toga ispitivali da li cG-2-AlilP reguliše gene i kodirane proteine koji vladaju sinaptičkom plastičnosti posle PBBI.

Postupci

Povreda mozga slična probojnoj balističkoj povredi (PBBI)

[0374] Unilateralni frontal PBBI model, koji podražava balističku dinamiku rane na glavi od metka ili fragmenta (Williams, 2005; Williams, 2006), je izazvan sa stereotaktičkim umetanjem sonde kroz desni frontalni korteks. Privremena šupljina je obrazovana brzom inflacijom/deflacijom (tj. <40 msec) elastičnog balona prikačenog na kraju sonde. PBBI uređaj se sastojao od generatora hidrauličnog pritiska kontrolisanog kompjuterom (Mitre Corp McLean, VA), PBBI sonda i sterotaksični okvir snabdeven sa nosačem sonde napravljenim po meri kao što je ranije opisano (Lu , 2009; Williams, 2005). Ozbiljnost povrede je određena veličinom balona pod kontrolom kompjuterizovanog hidrauličkog pritiska. Prečnik balona je kalibrisan na 0.63 cm ekspanziju predstavljenu 10% ukupnom zapreminom mozga pacova tako izražavajući 10% PBBI. Sve operacije su napravljene od anestezijom. Testirane grupe: Kontrola nosač, PBBI nosač, PBBI cG-2-AlilP (30 mg/kg oralna gavaža, 30 min posle povrede, i ponovo jednom dnevno do krajnje tačka). Svi postupci su odobreni sa the Institutional Animal Care and Use Committee of WRAIR. Životinje su smeštene u akreditovani objekat AAALAC.

Oralno davanje cG-2-AlilP

[0375] cG-2-AlilP (ili nosač) je davan životinjama pomoću oralne gavaže pri dozi od 30mg/kg.

ELISA

[0376] Ciljani proteini su kvantifikovani sa interleukinom 1 beta ("IL-1beta") (GenWay Biotech GWB-SKR107) i interleukinom-6 ("IL-6") (GenWay Biotech GWB-ZZD100) ELISAs prema uputstvima proizvođača. Nivoi su izračunati i normalizovani do ukupne koncentracije proteina kako je određeno sa BCA testom (n=9-10 po grupi).

Zapadno blotovanje

[0377] Uzorci su analizirani na 24 h i 3 i 7 dana posle povrede u toku svih grupa (kontrola nosač, PBBI nosalč, PBBI cG-2-AlilP). Tkivo je homogenizovano u RIPA puferu koji sadrži inhibitore HALT proteaze. Ukupni protein je zasnovan na BCA testu. Blotovi su blokirani sa 5% mlekom, ispitivani sa anti-ATF3, anti-BAX, ili anti-BCL2. Blotovi su ponovo ispitivani sa anti-beta-aktin antitelom za kontrolisanje opterećanja proteina. Analiza intenziteta trake je napravljena korišćenjem LAS4000 i ImageQuantTL softvera (GE Healthcare) (n=9-10 po grupi).

Neuroplastičnost mRNK čipova

[0378] cDNK je stvoren . Iz ukupnog RNK iz pojedinačnih životinja korišćenjem nasumičnih prajemera. cDNK je nanet na ploče na ciljani PCR čip dobijen od SA Biosciences i proizvod je detektovan korišćenjem SyBr zelene fluorescence. Ct nivoi su normalizovani na beta aktin. Rezultati povreda su upoređeni sa kontrolom za procenu relativnih količina (RQ) (n=6 po grupi).

Rezultati

[0379] Sama PBBI povreda vodi do akutnog ( 24 h posle PBBI) povećanja u ispitivanjima inflamatornih i apoptotičkih merenja . SLIKA 33A-33F pokazuje ove rezultate . PBBI povećava količinu IL-1beta (SLIKA 33A) i IL-6 (SLIKA 33D). cG-2-AlilP smanjuje proinflamatorne citokine IL1-beta (SLIKA 33C) i IL-6 (SLIKE.

33D i 33F). ANOVA: * p<0.05, ** p<0.01; granica greške: SEM. cG-2-AlilP povećava nivoe IL1-beta 3 dana posle PBBI, što može biti kompenzatorno za njihovu niskohodnu metu IL-6. Tretman sa cG-2-AlilP smanjuje nivoe IL1-beta 7 dana posle PBBI (SLIKA 33C). cG-2-AlilP tretman smanjuje IL-6 nivoe oba 24 h (SLIKA 33D). i 7 dana (SLIKA 33E) posle PBBI, ali ima malo efekta 3 dana (SLIKA 33B). Ovi rezultati ukazuju da cG-2-AlilP smanjuje ove inflamatorne citokine.

[0380] SLIKA 34 prikazuje da PBBI značajno i suštinski povećava ekspresiju BAX (SLIKE.34 A, 34B, i 34C) i BCL2 (SLIKE.34D, 34E, 34F, 34G, i 34H). cG-2-AlilP ne menja značajno BAX (SLIKA.34A -34C) ili BCL2 (SLIKA.34D -34H) .

[0381] SLIKA 35 pokazuje da PBBI povećana ekspresiju ATF3 u svim vremenskim tačkama (SLIKE.35A -35C). Iznenađujuće ustanovili smo da cG-2-AlilP smanjuje ATF3 24 h. posle PBBI kako je mereno globalno sa Zapadnim blotovanjem (SLIKA 35A).

[0382] SLIKA 36 pokazuje da posle PBBI, cG-2-AlilP treatman značajno povećava Gria 4 ( AMPA receptor; SLIKA 36F) 24 h. vremenska tačka. Pored toga, primetili smo trendove ukljujući smanjeni Crem (CREB inhibitor; SLIKA 36D), smanjeni NTF3 (SLIKA 36J), smanjeni NTF4 (SLIKA 36K), smanjeni Pcdh8 (gen supresor tumora; SLIKA 36L), smanjeni BDNF (SLIKA 36A), smanjeni Pim1; SLIKA 36M) i povećani Ppp3ca (SLIKA 36N).

Zaključci

[0383] Ovi trendovi u RNK ekspresiji, naročito povećani Gria 4, smanjeni Crem, i smanjena Pcdh8 ekspresija promoviše neuroplastičnost. Smanjeni NTF3 i NTF4 dozvoljavaju sinaptičko obrazovanje .

[0384] Kolektivno, ovi rezultati ukazuju da cG-2-AlilP ima anti-inflamatorne efekte posle ozbiljnog PBBI i povećane neuroplastičnosti. Zbog toga što dobijeni rezultati u ovom eksperimantalnom sistemu su realno predviđanje efekata koji se vide kod ljudskih bića , cG-2-AlilP i slična ciklična GP jedinjenja mogu efikasna u lečenju simptoma blage, umerne ili ozbiljne traumatične povrede mozga .

Primer 27: Efekti cG-2-AlilP na sinaptičku plastičnost posle povrede mozga slične probojnoj balističkoj povredi kod pacova II:

Protein u vezi sa rastom 43 i sinaptofizin

[0385] U ovom primeru, mi smo ispitali ulogu cG-2-AlilP na ekspresiju gena i proteina u vezi sa neuroplatičnošću posle povredne mozga slične probojnoj balističkoj povredi (PBBI; 10% ozbiljna povreda) kod pacova.

Postupci

[0386] Postupci za izazivanje PBBI u ovom primeru je isti kao što je gore opisano za primer 26. Odrasli Sprague-Dawley pacovi su nasumično dodeljeni u tri grupe : kontrola (samo kraniotomija), PBBI nosač (tj. H2O), i PBBI cG-2-AlilP. cG-2-AlilP (ili nosač) je davan pomoću orlane gavaže pri 30mg/kg na 30min posle povrede i nastavljeno je jednom dnevno posle u toku 7, 14 ili 28 dana. U svakoj krajnjoj tački tretmana, pacovi su perfuzirani i mozgovi su obrađeni za histološke analize (n=5-6/grupi/vremenska tačka). Za detekciju izrastanja aksona, korišćena je imunohistohemijska detekcija proteina u vezi sa rastom -43 (GAP-43). Sinaptogeneza je određena sa imunohistohemijski za sinaptofizin (SYN). Za histološku kvantifikaciju, integrisana gustina u regionu hipokampusa je određena korišćenjem NIH ImageJ softvera.

Rezultati

[0387] U grupi tretiranoj sa nosačem, PBBI značajno smanjuje GAP-43 ekspresiju kod ipsilateralnog hipokampusa 7d, 14d i 28d posle povrede, i kod kontralateralnog hipokampusa 7d i 14d posle povrede (p<0.05 nasp. kontrole). Značajno smanjenje u SYN bojenju je detektovano 14d i 28d posle povrede u ipsilateralnom hipokampusu i 14d posle povrede u kontralateralnom u PBBI+grupi sa nosačem (p<0.05 nasp. kontrole). Kontinualni tretman sa cG-2-AlilP pokazao je da ne posti efekat na smanjenje izazvano povrednom u GAP-43 ili SYN ekspresiji 7d ili 14d post-PBBI. Međutim, 28 dana posle povrede, smanjenja izazvana PBBI ulažena tretmanom cG-2-AlilP u oba GAP-43 i SYN ekspresiji do nivoa koji ne razlikuju se značajno od kontrola, indikativni su intermedijernih efekata tretmana .

Zaključci

[0388] Histološke analize ukazuju da značajno smanjenje izvazvano PBBI rasta aksona i sinaptogeneze u toku subakutne do hronične faze posle povrede. Ovi rezultati pokazuju trend cG-2-AlilP u promovisanju neuroplastičnosti. Zbog toga što korišćeni životinjski sistem je prediktivan za neuroplastičnost kod ljudskih bića, ovi rezultati ukazuju da cG-2-AlilP može biti efikasan u ublažavanju neželjenih efekata povrede mozga.

[0389] Opisi i primeri koji su ovde opisani su samo u svrhu ilustracije. Obim ovog pronalska nije ograničen opisanim izvođenjima. Druga izvođenja koja uključuju elemente pronalaska mogu biti izvođena bez neželjenog eksperimentisanja od strane prosečne osobe iz struke. Sva takva izvođenja se prema tome smatra da su deo ovog pronalaska .

Reference

[0390]

Alarcon,M., Abrahams,B.S., Stone,J.L., Duvall,J.A., Perederiy,J.V., Bomar,J.M., Sebat,J., Wigler,M., Martin,C.L., Ledbetter,D.H., Nelson,S.F., Cantor,R.M., and Geschwind,D.H. (2008). Linkage, association, and gene-expression analyses identify CNTNAP2 as an autism-susceptibility gene. Am. J. Hum. Genet.

82, 150-159.

Amir RE, Van den Veyver IB, Wan M, Tran CQ, Francke U, Zoghbi HY. Retov sindrom is caused by mutations in X-linked MECP2, encoding metil-CpG-binding protein 2. Nat Genet.199923:185-188.

Andari E, Duhamel JR, Zalla T, Herbrecht E, Leboyer M, Sirigu A. (2010) Promoting social behavior with oxytocin in high-functioning poremećaji iz spektra autizma. PNAS 107:4389-4394.

Arking,D.E., Cutler,D.J., Brune,C.W., Teslovich,T.M., West,K., Ikeda,M., Rea,A., Guy,M., Lin,S., Cook,E.H., and Chakravarti,A. (2008). A common genetic variant in the neurexin superfamily member CNTNAP2 increases familial risk of autism. Am. J. Hum. Genet.82, 160-164.

Bakkaloglu,B., O’Roak,B.J., Louvi,A., Gupta,A.R., Abelson,J.F., Morgan,T.M., Chawarska,K., Klin,A., Ercan-Sencicek,A.G., Stillman,A.A., Tanriover,G., Abrahams,B.S., Duvall,J.A., Robbins,E.M., Geschwind,D.H., Biederer,T., Gunel,M., Lifton,R.P., and State MW (2008). Molecular cytogenetic analysis and resequencing of contactin associated protein-like 2 in poremećaji iz spektra autizma.

Bakkaloglu,B., O’Roak,B.J., Louvi,A., Gupta,A.R., Abelson.J.F., Morgan,T.M., Chawarska,K., Klin,A., Ercan-Sencicek,A.G., Stillman,A.A., Tanriover,G., Abrahams,B.S., Duvall,J.A., Robbins,E.M., Geschwind,D.H., Biederer,T., Gunel,M., Lifton,R.P., and State MW (2008). Molecular cytogenetic analysis and resequencing of contactin associated protein-like 2 in poremećaji iz spektra autizma. Am. J. Hum. Genet.82, 165-173.

Baron-Cohen S, Wheelwright S, Hill J, Raste Y, Plumb I (2001) The "Reading the Mind in the Eda" test, revised version: A study with normal adults, and adults with Asperger’s syndrome or high-functioning autism. J Child Psychol Psychiatry 42:241-251.

Belichenko PV, Oldfors A, Hagberg B, Dahlström A. Retov sindrom: 3-D confocal microscopy of cortical pyramidal dendrites and afferents. Neuroreport.19945:1509-1513.

Biederer T, Sara Y, Mozhayeva M, Atasoy D, Liu X, Kavalali ET, Südhof TC. (2002) SynCAM, a synaptic adhesion molecule that drives synapse assembly. Science 297(5586): 1525-1531.

Chapleau CA, Larimore JL, Theibert A, Pozzo-Miller L. (2009) Modulation of dendritic spine development and plasticity by BDNF and vesicular trafficking: fundamental roles in neurorazvojnog poremećajas associated with mental retardation and autism. J. Neurodev. Disord.1: 185-196.

Cheng CM, Mervis RF, Niu SL, Salem N Jr, Witters LA, Tseng V, Reinhardt R, Bondy CA. Faktor rasta sličan insulinu 1 is essential for normal dendritic growth. J Neurosci Res.200373:1-9.

Comery TA, Harris JB, Willems PJ, Oostra BA, Irwin SA, Weiler IJ, Greenough WT. (1997) Abnormal dendritic spines in fragile X knockout mice: maturation and pruning deficits. Proc. Natl Acad. Sci. USA 94: 5401-5404.

Durand CM, Betancur C, Boeckers TM, Bockmann J, Chaste P, Fauchereau F, Nygren G, Rastam M, Gillberg IC, Anckarsäter H, Sponheim E, Goubran-Botros H, Delorme R, Chabane N, Mouren-Simeoni MC, de Mas P, Bieth E, Rogé B, Heron D, Burglen L, Gillberg C, Leboyer M, Bourgeron T. (2007) Mutations in the gene encoding the synaptic scaffolding protein SHANK3 are associated with poremećaji iz spektra autizma. Nat Genet.39: 25-27.

Etherton MR, Blaiss CA, Powell CM, Südhof TC. (2009) Mouse neurexin-1α deletion causes correlated electro-physiological and behavioural changes consistent with cognitive impairments. Proc. Nat. Acad. Sci.106: 17998-18003.

Garbern,J.Y., Neumann,M., Trojanowski,J.Q., Lee,V.M., Feldman,G., Norris,J.W., Friez,M.J., Schwartz,C.E., Stevenson,R., and Sima,A.A. (2010). A mutation affecting the sodium/proton exchanger, SLC9A6, causes mental retardation with tau deposition. Brain 133, 1391-1402.

Gauthier J, Bonnel A, St-Onge J, Karemera L, Laurent S, Mottron L, Fombonne E, Joober R, Rouleau GA. (2005) NLGN3/NLGN4 gene mutations are not responsible for autism in the Quebec population. Am. J. Med. Genet. B. Neuropsychiatr. Genet.132B(1): 74-75.

Gilfillan,G.D., Selmer,K.K., Roxrud,I., Smith,R., Kyllerman,M., Eiklid,K., Kroken,M., Mattingsdal,M., Egeland,T., Stenmark,H., Sjoholm,H., Server,A., Samuelsson,L., Christianson,A., Tarpey,P., Whibley,A., Stratton,M.R., Futreal,P.A., Teague,J., Edkins,S., Gecz,J., Turner,G., Raymond,F.L., Schwartz,C., Stevenson,R.E., Undlien,D.E., and Stromme,P. (2008). SLC9A6 mutations cause X-linked mental retardation, microcephaly, epilepsy, and ataxia, a phenotype mimicking Angelman syndrome. Am. J. Hum. Genet.82, 1003-1010.

Gilman SR, Iossifov I, Levy D, Ronemus M, Wigler M, Vitkup D. Rare de novo variants associated with autism implicate a large functional network of genes involved in formation and function of synapses. Neuron.2011 70:898-907.

Giza J, Urbanski MJ, Prestori F, Bandyopadhyay B, Yam A, Friedrich V, Kelley K, D’Angelo E, Goldfarb M. (2010) Behavioural and cerebellar transmission deficits in mice lacking autism-linked gene Islet Brain-2. J. Neurosci.30: 14805-14816.

Guastella AJ, Einfeld SL, Gray KM, Rinehart NJ, Tonge BJ, Lambert TJ, Hickie IB. (2010) Intranasal oxytocin improves emotion recognition for youth with poremećaji iz spektra autizma. Biol Psychiatry.

67:692-694.

Hagerman R, Hoem G, Hagerman P. (2010) Fragile X and autism: Intertwined at the molecular level leading to targeted treatments. Mol. Autism 1: 12-24.

Harris SW, Hessl D, Goodlin-Jones B, Ferranti J, Bacalman S, Barbato I, Tassone F, Hagerman PJ, Herman H, Hagerman RJ. (2008) Autism profiles of males with sindrom fragilnog X. Am J Ment Retard.113:427-438.

Hiramoto T, Kang G, Suzuki G, Satoh Y, Kucherlapati R, Watanabe Y, Hiroi N. (2011) Tbxl: identification of a 22q11.2 gene as a risk factor for autism spectrum disorder in a mouse model. Hum Mol Genet.

201120:4775-4785.

Hutsler JJ, Zhang H. Increased dendritic spine densities on cortical projection neurons in poremećaji iz spektra autizma. Brain Res.20101309:83-94.

Irwin SA, Galvez R, Greenough WT. Dendritic spine structural anomalies in fragile-X mental retardation syndrome. Cereb Cortex.200010:1038-1044.

Jamain S, Quach H, Betancur C, Råstam M, Colineaux C, Gillberg IC, Soderstrom H, Giros B, Leboyer M, Gillberg C, Bourgeron T; Paris Autism Research International Sibpair Study. (2003) Mutations of the X-linked genes encoding neuroligins NLGN3 and NLGN4 are associated with autism. Nat. Genet.34: 27-29.

Jamain S, Radyushkin K, Hammerschmidt K, Granon S, Boretius S, Varoqueaux F, Ramanantsoa N, Gallego J, Ronnenberg A, Winter D, Frahm J, Fischer J, Bourgeron T, Ehrenreich H, Brose N. (2008) Reduced social interaction and ultrasonic communication in a mouse modelof monogenic heritable autism. Proc. Nat. Acad. Sci.105:1710-1715.

Kim HG, Kishikawa S, Higgins AW, Seong IS, Donovan DJ, Shen Y, Lally E, Weiss LA, Najm J, Kutsche K, Descartes M, Holt L, Braddock S, Troxell R, Kaplan L, Volkmar F, Klin A, Tsatsanis K, Harris DJ, Noens I, Pauls DL, Daly MJ, MacDonald ME, Morton CC, Quade BJ, Gusella JF. (2008) Disruption of neurexin 1 associated with autism spectrum disorder. Am. J. Hum. Genet.82: 199-207.

Klemmer P, Meredith RM, Holmgren CD, Klychnikov OI, Stahl-Zeng J, Loos M, van der Schors RC, Wortel J, de Wit H, Spijker S, Rotaru DC, Mansvelder HD, Smit AB, Li KW. Proteomics, ultrastructure, and physiology of hippocampal synapses in a sindrom fragilnog X mouse model reveal presynaptic phenotype. J Biol Chem.2011286:25495-25504.

Krueger DD, Osterweil EK, Chen SP, Tye LD, Bear MF. (2011) Cognitive dysfunction and prefrontal synaptic abnormalities in a mouse model of sindrom fragilnog X. Proc. Natl Acad. Sci. USA 108: 2587-2592.

Lauterborn JC, Rex CS, Kramár E, Chen LY, Pandyarajan V, Lynch G, Gall CM. (2007) Brain-derived neurotrophic factor rescues synaptic plasticity in a mouse model of sindrom fragilnog X. J. Neurosci.

27: 10685-10694.

Lintas C, Persico AM. (2009) Autistic phenotypes and genetic testing: state-of-the-art for the clinical geneticist. J. Med. Genet.46: 1-8.

Makkonen I, Kokki H, Kuikka J, Turpeinen U, Riikonen R. Effects of fluoxetine treatment on striatal dopamine transporter binding and cerebrospinal fluid faktor rasta sličan insulinu-1 in children with autism. Neuropediatrics.201142:207-209.

Marchetto et al. (2010) A model for neural development and treatment of Retov sindrom using human induced pluripotent stem cells. Cell 143:527-539 (incl. supplemental information). Marshall CR, Noor A, Vincent JB, Lionel AC, Feuk L, Skaug J, Shago M, Moessner R, Pinto D, Ren Y, Thiruvahindrapduram B, Fiebig A, Schreiber S, Friedman J, Ketelaars CE, Vos YJ, Ficicioglu C, Kirkpatrick S, Nicolson R, Sloman L, Summers A, Gibbons CA, Teebi A, Chitayat D, Weksberg R, Thompson A, Vardy C, Crosbie V, Luscombe S, Baatjes R, Zwaigenbaum L, Roberts W, Fernandez B, Szatmari P, Scherer SW. (2008) Structural variation of chromosomes in autism spectrum disorder. Am J Hum Genet.82: 477-488.

Minshew NJ, Williams DL. The new neurobiology of autism: cortex, connectivity, and neuronal organization. Arch Neurol.200764:945-950.

Moessner R, Marshall CR, Sutcliffe JS, Skaug J, Pinto D, Vincent J, Zwaigenbaum L, Fenandez B, Roberts W, Szatmari P, Scherer SW. (2007) Contribution of SHANK3 mutations to autism spectrum disorder. Am. J. Hum. Genetics 81: 1289-1297.

Moretti P, Levenson JM, Battaglia F, Atkinson R, Teague R, Antalffy B, Armstrong D, Arancio O, Sweatt JD, Zoghbi HY. (2006) Learning and memory and synaptic plasticity are impaired in a mouse model of Retov sindrom. J. Neurosci.26: 319-327.

Paylor,R., Glaser,B., Mupo,A., Ataliotis,P., Spencer,C., Sobotka,A., Sparks,C., Choi,C.H., Oghalai,J., Curran,S., Murphy,K.C., Monks,S., Williams,N., O’Donovan,M.C., Owen,M.J., Scambler,P.J., and Lindsay,E. (2006). PNAS 103, 7729-7734.

Penagarikano,O., Abrahams,B.S., Herman,E.I., Winden,K.D., Gdalyahu,A., Dong,H., Sonnenblick,L.L, Gruver,R., Almajano,J., Bragin,A., Golshani,P., Trachtenberg,J.T., Peles,E., and Geschwind,D.H. (2011). Absence of CNTNAP2 Leads to Epilepsy, Neuronal Migration Abnormalities, and Core Autism-Related Deficits. Cell 147, 235-246.

Riikonen R, Makkonen I, Vanhala R, Turpeinen U, Kuikka J, Kokki H. (2006) Cerebrospinal fluid faktor rasta sličan insulinus IGF-1 and IGF-2 in infantile autism. Dev. Med. Child Neurol.48: 751-755.

Sebat J, Lakshmi B, Malhotra D, Troge J, Lese-Martin C, Walsh T, Yamrom B, Yoon S, Krasnitz A, Kendall J, Leotta A, Pai D, Zhang R, Lee YH, Hicks J, Spence SJ, Lee AT, Puura K, Lehtimäki T, Ledbetter D, Gregersen PK, Bregman J, Sutcliffe JS, Jobanputra V, Chung W, Warburton D, King MC, Skuse D, Geschwind DH, Gilliam TC, Ye K, Wigler

M. (2007) Strong association of de novo copy number variation mutations with autism. Science 316(5823): 445-449.

Schaevitz LR, Moriuchi JM, Nag N, Mellot TJ, Berger-Sweeney J. (2010) Cognitive and social functions and growth factors in a mouse model of Retov sindrom. Physiol. Behav.100: 255-263.

Schütt J, Falley K, Richter D, Kreienkamp HJ, Kindler S. (2009) Fragile X mental retardation protein regulates the levels of scaffold proteins and glutamate receptors in postsynaptic densities. J. Biol. Chem.284: 25479-25487.

Silverman JL, Turner SM, Barkan CL, Tolu SS, Saxena R, Hung AY, Sheng M, Crawley JN: Sociability and motor functions in Shank1 mutant mice. Brain Res 2010.

Silverman JL, Yang M, Lord C, Crawley JN: Behavioural phenotyping assays for mouse models of autism. Nat Rev Neurosci 2010, 11:490-502.

Spence SJ, Schneider MT. The role of epilepsy and epileptiform EEGs in poremećaji iz spektra autizma. Pediatr Res.200965:599-606.

Spencer CM, Alekseyenko O, Serysheva E, Yuva-Paylor LA, Paylor R. (2005) Altered anxiety-related and social behaviors in the Fmr1 knockout mouse model of sindrom fragilnog X. Genes Brain Behav.4: 420-430.

Strauss,K.A., Puffenberger,E.G., Huentelman,M.J., Gottlieb,S., Dobrin,S.E., Parod.J.M., Stephan,D.A., and Mor-ton,D.H. (2006). Recessive symptomatic focal epilepsy and mutant contactin-associated protein-like 2. N. Engl. J. Med.354, 1370-1377.

Stromme,P., Dobrenis,K., Sillitoe,R.V., Gulinello,M., Ali,N.F., Davidson,C., Micsenyi,M.C., Stephney,G., Ellevog,L., Klungland,A., and Walkley,S.U. (2011). X-linked Angelman-like syndrome caused by Slc9a6 knockout in mice exhibits evidence of endosomal-lysosomal dysfunction. Brain.134:3369-3383.

Sykes NH, Toma C, Wilson N, Volpi EV, Sousa I, Pagnamenta AT, Tancredi R, Battaglia A, Maestrini E, Bailey AJ, Monaco AP; International Molecular Genetic Study of Autism Consortium (IMGSAC). (2009) Copy number variation and association analysis of SHANK3 as a candidate gene for autism in the IMGSAC collection. Eur. J. Hum. Genet.17: 1347-1353.

Tabuchi K, Blundell J, Etherton MR, Hammer RE, Liu X, Powell CM, Südhof TC. (2007) A neuroligin-3 mutation implicated in autism increases inhibitory synaptic transmission in mice. Science 318(5847): 71-76.

Takayanagi Y, Fujita E, Yu Z, Yamagata T, Momoi MY, Momoi T, Onaka T. (2010) Impairment of social and emotional behaviors in Cadm1-knockout mice. Biochem. Biophys. Res. Commun.396: 703-708.

Tropea D, Giacometti E, Wilson NR, Beard C, McCurry C, Fu DD, Flannery R, Jaenisch R, Sur M. (2009) Partial reversal of Retov sindrom-like symptoms in MeCP2 mutant mice. Proc. Natl Acad. Sci. USA 106: 2029-2034.

Vernes,S.C., Newbury,D.F., Abrahams,B.S., Winchester,L., Nicod,J., Groszer,M., Alarcon,M., Oliver,P.L., Dav-ies,K.E., Geschwind,D.H., Monaco,A.P., and Fisher,S.E. (2008). A functional genetic link between distinct developmental language disorders. N. Engl. J. Med.359, 2337-2345.

Yan J, Noltner K, Feng J, Li W, Schroer R, Skinner C, Zeng W, Schwartz CE, Sommer SS. (2008) Neurexin 1 alpha structural variants associated with autism. Neurosci Lett.438: 368-370.

Yan QJ, Asafo-Adjei PK, Arnold HM, Brown RE, Bauchwitz RP. (2004) A phenotypic and molecular characterization of the fmr1-tm1Cgr fragile X mouse. Genes Brain Behav.3:337-359.

Yang M, Crawley JN: Simple behavioural assessment of mouse olfaction. Curr Protoc Neurosci 2009, Chapter 8(Unit 8):24.

Zhiling Y, Fujita E, Tanabe Y, Yamagata T, Momoi T, Momoi MY. (2008) Mutations in the gene encoding CADM1 are associated with autism spectrum disorder. Biochem. Biophys. Res. Commun.377: 926-929.

Zhao MG, Toyoda H, Ko SW, Ding HK, Wu LJ, Zhuo M. (2005) Deficits in trace fear memory and longterm potentiation in a mouse model for sindrom fragilnog X. J. Neurosci.25: 7385-7392. (Erratum in: J Neurosci.2005, 25: 8112).

Zoghbi HY. (2005) MeCP2 dysfunction in humans and mice. J Child Neurol.20: 736-740.

Claims (20)

1. Patentni zahtevi 1. Jedinjenje za upotrebu u postupku lečenja simptoma poremećaja iz spektra autizma (ASD) ili neurorazvojnog poremećaja (NDD) kod životinje koja pati od takvog poremećaja, koji obuhvata davanje farmaceutski efikasne količine pomenutog jedinjenja, a pomenuto jedinjenje je ciklični glicil-2-alil prolin (cG-2-AlilP), ciklični cikloheksil-G-2MeP, ili ciklični ciklopentil-G-2MeP, gde je pomenuti simptom jedan ili više deficita u izvršnoj funkciji, anksioznost, nenormalno uslovljavanje straha, abnormalno socijalno ponašanje i repetativno ponašanje.
2. 2. Jedinjenje za upotrebu prema zahtevu 1, gde pomenuti cG-2-AlilP, ili ciklični cikloheksil-G-2MeP, ili ciklični ciklopentil-G-2MeP sadrži ili vodeni rastvor ili jedan ili više farmaceutski prihvatljivih ekscipijenata, aditiva, nosača ili adjuvanata ili jedan ili više ekscipijenata, nosača, aditiva, adjuvanta ili vezivnih sredstava u tableti ili kapsuli.
3. 3. Jedinjenje za upotrebu prema bilo kom od zahteva 1 do 2, gde je poremećaj izabran iz grupe koju čine autistični poremećaj, Aspergerov sindrom, dezintegrativni poremećaj u detinjstvu i pervazivni razvojni poremećaj koji nije drugačije specifikovan (PDD-NOS), patološko izbegavanje naloga (PDA), sindrom fragilnog X (FXS), Angelmanov sindrom, kompleks tuberozne skleroze, Phelan McDermid-ov sindrom, Retov sindrom, CDKL5 mutacije, i poremećaj infantilnog spazma u vezi X.
4. 4. Jedinjenje za upotrebu prema bilo kom od zahteva 1 do 2, gde je jedinjenje davano ili direktno ili indirektno preko cirkulacije.
5. 5. Jedinjenje za upotrebu prema bilo kom od zahteva 1 do 2, gde pomenuta efikasna količina pomenutog jedinjenja ima donju granicu od oko 0.001 milligrama po kilogramu mase (mg/kg) sisara i gornju granicu od oko 100 mg/kg.
6. 6. Jedinjenje za upotrebu prema bilo kom od zahteva 1 do 2, gde pomenuto lečenje izaziva poboljšanje simptoma ASD ili NDD kako je procenjeno korišćenjem jednog ili više kliničkih testova izabranih iz grupe koju čine Priroda Retovog sindroma / Klinička skala ozbiljnosti, Kontrolna lista nenormalnog ponašanja izdanje zajednice (ABC), Vinelandove skale adaptivnog ponašanja, Opšti utisak kliničke ozbiljnosti (CGI-S), Opšti utisak kliničkog poboljšanja (CGI-I), Upitnik napora negovatelja (CSQ), ili jedan ili više fizioloških testova izabranih iz grupe koju čine udarna frekvenca elektroencefalograma (EEG), celokupna snaga traka frekvence na EEG, hemisferna koherenca EEG frekvenci, stereotipni pokreti ruke, QTc i varjabilnost srčanog rada (HRV), respiratorne nepravilnosti i kuplovanje srčane i respiratorne funkcije u poređenju sa kontrolnim životinjama koje ne pate od pomenutog poremećaja.
7. 7. Jedinjenje za upotrebu prema bilo kom od zahteva 1 do 2, gde pomenuto lečenje dalje smanjuje simptom izabran iz grupe koju čine gubitak prostorne orijentacije, smanjena sposobnost učenja, smanjena prostorna memorija, nedostaci kognitivnog mapiranja i scenske memorije, smanjeno brzo sticanje konfiguracijskih ili konjuktivnih asocijacija, nenormalno kretanje, i bradikardija.
8. 8. Jedinjenje za upotrebu u postupku lečenja poremećaja iz spektra autizma (ASD) ili neurorazvojnog poremećaja (NDD) kod sisara koji pati od takvog poremećaja, koji obuhvata davanje pomenutog jedinjenja sisaru, pomenuto jedinjenje ima formulu :

   ili njegove farmaceutski prihvatljive soli ili hidrata, gde X<1>je izabran iz grupe koju čine NR’, O i S; X<2>je izabran iz grupe koju čine CH2, NR’, O i S; R<1>, R<2>, R<3>, R<4>i R<3>su nezavisno izabrani iz grupe koju čine -H, -OR’, -SR’, -NR’R’, -NO2, -CN, -C(O)R’, -C(O)OR’, -C(O)NR’R’, -C(NR’)NR’R’, trihalometil, halogen, alkil, supstituisani alkil, heteroalkil, supstituisani heteroalkil, alkenil, supstituisani alkenil, alkinil, supstituisani alkinil, aril, supstituisani aril, heteroaril, supstituisani heteroaril, arilalkil, supstituisani arilalkil, heteroarilalkil i supstituisani heteroarilalkil; svaki R’ je nezavisno izabran iz grupe koju čine -H, alkil, heteroalkil, alkenil, alkinil, aril, arilalkil, heteroaril i heteroarilalkil; ili R<4>i R<3>uzeti zajedno su -CH2-(CH2)n-CH2-gde je n celi broj od 0-6; ili R<2>i R<3>uzeti zajedno su -CH2-(CH2)n-CH2-gde je n celi broj od 0-6; uz uslov da kada R<1>= metil i R<2>=R<3>=R<4>=H zatim R<5>≠ benzil i; kada R<1>= H, bar jedan od R<2>i R<3>≠ H.
9. 9. Jedinjenje za upotrebu prema zahtevu 8, gde R<1>= metil; ili R<1>= alil; ili R<2>= R<3>= metil i X<2>= S; ili gde R<1>= alil, R<2>=R<3>= R<4>= R<5>= H, X<1>= NH, X<2>= CH2; ili gde R<1>= metil, R<2>=R<3>= H, R<4>i R<5>uzeti zajedno su -CH2-(CH2)3-CH2-, X<1>= NH, X<2>= CH2; ili gde R<1>= metil, R<2>=R<3>=H, R<4>i R<5>uzeti zajedno su -CH2-(CH2)2-CH2-, X<1>= NH, X<2>= CH2.
10. 10. Jedinjenje za upotrebu prema zahtevu 8, gde pomenuti postupak dalje obuhvata davanje farmaceutski prihvatljivog ekscipijenta ili farmaceutski prihvatljivog ekscipijenta i nosača, ili farmaceutski prihvatljivog ekscipijenta i kapsule.
11. 11. Jedinjenje za upotrebu prema zahtevu 8, gde pomenuti postupak dalje obuhvata davanje bar jednog drugog sredstva izabranog iz grupe koju čine faktor rasta sličan insulinu-I [IGF-I], faktor rasta sličan insulinu-II [IGF-II], transformišući faktor rasta-β1, aktivin, hormon rasta, nervni faktor rasta, vezujući protein hormona rasta, IGFBP-3, osnovni faktor rasta fibroblasta, kiseli faktor rasta fibroblasta, proizvod hst/Kfgk gena, FGF-3, FGF-4, FGF-6, keratocitni faktor rasta, faktor rasta izazvan androgenom, int-2, homologni faktor-1 faktoru rasta fibroblasta (FHF-1), FHF-2, FHF-3 i FHF-4, keratocitni faktor rasta 2, glijalni-aktivirajući faktor, FGF-10, FGF-16, cilijarno neurotrofni faktor, faktor rasta izveden iz mozga, nerotrofin 3, nerotrofin 4, koštani morfogenski protein 2 [BMP-2], nerotrofini faktor koji potiče iz glijalnih ćelija, nerotrofini faktor koji zavisi od aktivnosti, inhibirajući faktor citokinske leukemije, onkostatin M, interleukin, α-interferon, β-interferon, γ-interferon, konsezusni interferon, TNF-α, klometiazol; kinurinska kiselina, Semaks, takrolimus, L-treo-1-fenil-2-dekanoilamino-3-morfolino-1-propanol, analog adrenokortikotropina-(4-9) [ORG 2766], dizolcipin [MK-801], selegilin, glutamatni antagonist izabran iz grupe koju čine NPS1506, GV1505260, MK-801, i GV150526, AMPA antagonist izabran iz grupe koju čine 2,3-dihidroksi-6-nitro-7-sulfamoilbenzo(f)hinoksalin (NBQX), LY303070 i LY300164, i anti-MAdCAM-1 antitelo MECA-367.
12. 12. Jedinjenje za upotrebu prema zahtevu 8, gde je pomenuto jedinjenje ciklični G-2-AlilP.
13. 13. Jedinjenje za upotrebu prema zahtevu 8, gde je pomenuto jedinjenje ciklični cikloheksil-G-2MeP.
14. 14. Jedinjenje za upotrebu prema zahtevu 8, gde je pomenuto jedinjenje ciklični ciklopentil-G-2MeP.
15. 15. Jedinjenje za upotrebu prema bilo kom od zahteva 1 do 2, gde je poremećaj izabran iz grupe koju čine autistični poremećaj, Aspergerov sindrom, dezintegrativni poremećaj u detinjstvu i pervazivni razvojni poremećaj koji nije drugačije specifikovan (PDD-NOS), i patološko izbegavanje naloga (PDA).
16. 16. Jedinjenje za upotrebu prema bilo kom od zahteva 1 do 2, gde je poremećaj izabran iz grupe koju čine sindrom fragilnog X (FXS), Angelmanov sindrom, kompleks tuberozne skleroze, Phelan McDermidov sindrom, Retov sindrom, CDKL5 mutacije, i poremećaj infantilnog spazma u vezi sa X.
17. 17. Jedinjenje za upotrebu prema zahtevu 3, gde je pomenuti poremećaj Retov sindrom.
18. 18. Jedinjenje za upotrebu prema zahtevu 3, gde je pomenuti poremećaj sindrom fragilnog X.
19. 19. Jedinjenje za upotrebu prema zahtevu 3, gde je pomenuti poremećaj Phelan-McDermid-ov sindrom.
20. 20. Jedinjenje za upotrebu prema zahtevu 3, gde je poremećaj Angelmanov sindrom.