RS60592B1

RS60592B1 - Nova imunoterapija za lečenje nekoliko tumora krvi, posebno hronične limfocitne leukemije (hll)

Info

Publication number: RS60592B1
Application number: RS20200910A
Authority: RS
Inventors: Juliane Stickel; Daniel Kowalewski; Hans-Georg Rammensee; Stefan Stevanovic
Original assignee: Immatics Biotechnologies Gmbh
Priority date: 2014-06-20
Filing date: 2015-06-17
Publication date: 2020-08-31
Also published as: DK3157549T3; ES2802155T3; EP3157549A2; SI3157549T1; TW202024125A; EP3708185A3; PL3157549T3; JP6560261B2; JP2017525336A; WO2015193359A3; GB201411037D0; EP3708185A2; CA2950827A1; LT3157549T; HUE050070T2; TW201930347A; TWI670282B; WO2015193359A2; TW201613956A; PT3157549T

Description

Predmetni pronalazak odnosi se na peptide, nukleinske kiseline i ćelije za upotrebu u imunoterapijskim metodama. Predmetni pronalazak se konkretno odnosi na imunoterapiju raka. Pored toga, predmetni pronalazak odnosi se na peptidne epitope tumor-asocirane citotoksične T ćelije (CTL), samostalno ili u kombinaciji sa drugim tumor-asociranim peptidima koji predstavljaju aktivne farmaceutske sastojke smeše za vakcinu koji stimulišu antitumorske imunske odgovore. Predmetni pronalazak odnosi se na nekoliko peptidnih sekvenci dobijenih iz HLA molekula klase I humanih tumorskih ćelija koje mogu da se koriste u smešama za vakcinu za izazivanje antitumorskih imunskih odgovora.

Osnovne informacije o pronalasku

B-ćelijska hronična limfocitna leukemija (B-HLL), poznata i kao hronična limfocitna leukemija (HLL), najčešći je tip leukemije.

Leukemije su maligni tumori belih krvnih ćelija (leukocita). HLL zahvata B ćelijske limfocite. B ćelije nastaju u kostnoj srži, razvijaju se u limfnim čvorovima i obično se bore protiv infekcije putem proizvodnje antitela. Kod HLL, B ćelije nekontrolisano rastu i akumuliraju se u kostnoj srži i krvi, gde potiskuju zdrave ćelije krvi. HLL je stadijum sitnoćelijskog limfocitnog limfoma (SLL), vrste B-ćelijskog limfoma, koji se javlja prvenstveno u limfnim čvorovima. Smatra se da su HLL i SLL ista osnovna bolest, uz različito manifestovanje.

HLL je bolest odraslih osoba, ali, u retkim slučajevima, može se javiti kod tinejdžera i ponekad kod dece (nasledno). Većina (>75%) ljudi sa novodijagnostikovanom HLL je starija od 50 godina, i većinom su muškarci, uz medijanu starosti od 70 godina u trenutku postavljanja dijagnoze. Iako ređe, HLL ponekad pogađa osobe starosti između 30 i 39 godina. Incidencija HLL ubrzano raste sa rastom godina.

U Sjedinjenim Američkim Državama, tokom 2012. godine očekuje se da se dijagnostikuje oko 16.060 novih slučajeva, a očekuje se da će 4580 pacijenata umreti od HLL.

HLL je veoma retka u azijskim zemljama, kao što su Japan i Kina, i čini samo 10 procenta svih leukemija u tim područjima.

Imajući u vidu gore navedeno, ostaje potreba za novom efikasnom i bezbednom terapijskom opcijom za maligne tumore, konkretno hroničnu limfocitnu leukemiju (HLL) i druge maligne tumore krvi različitih fenotipova, a koja poboljšava blagostanje pacijenata bez korišćenja prekomernih hemioterapijskih agenasa ili drugih agenasa koji mogu imati teška neželjena dejstva.

Predmetni pronalazak koristi peptide koji stimulišu imunski sistem pacijenta i deluju kao antitumorski agensi na neinvazivan način.

Kratak pregled pronalaska

U prvom aspektu predmetnog pronalaska, predmetni pronalazak odnosi se na peptid dužine između 10 i 30 aminokiselina, koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja se sastoji od ID BR. SEKV: 167, ili njenu farmaceutski prihvatljivu so

U sledećim tabelama prikazani su peptidi u skladu sa predmetnim pronalaskom, njihovi odgovarajući ID BR. SEKV: i prospektivni izvorni (osnovni) proteini za ove peptide. Svi peptidi u tabeli 1a i 1b vezuju se za HLA A HLA B ili HLA C alele, peptidi u tabeli 2 se vezuju za HLA-DR alele (MHC klasa II). Peptidi u tabeli 3 su dalje korisni u dijagnostikovanju i/ili lečenju HLL, akutne mijeloidne leukemije (AML) i drugih hematoloških maligniteta, koji podrazumevaju prekomernu ekspresiju ili prekomernu prezentaciju dotičnog osnovnog polipeptida.

Tabela 1a: Poželjnih 49 tumor-asociranih antigena dobijenih iz ligandoma HLA klase I (LiTAA) za koje je utvrđeno da su predstavljeni u ≥20% ligandoma pacijenata sa HLL (n=30) i 225 koji predstavljaju HLA ligande (LiTAP) označeni odgovarajućom restrikcijom HLA. ID BR. SEKV: 167 je u skladu sa pronalaskom.

B j

1

2

738, 534, 535, 914, 739, 477, 164, 364, 531, 536, 186, 179, 159, 365, 895, 44 i 180, i njihova upotreba u lečenju AML i/ili HML kao što je ovde opisano.

Predmetni pronalazak se dalje odnosi na peptide u skladu sa predmetnim pronalaskom za upotrebu u lečenju HLL/AML. Kako je prikazano u sledećoj tabeli 3, mnogi od predstavljenih peptida se takođe mogu koristiti kod drugih malignih i proliferativnih indikacija.

Tabela 3: Predstavljeni peptidi i njihove specifične primene u drugim proliferativnim oboljenjima, opciono u drugim organima. ID BR. SEKV: 167 je u skladu sa pronalaskom.

2

1

2

4

1

2

4

1

2

4

Tako, prikazana je upotreba predstavljenih peptida za, poželjno kombinovano, lečenje proliferativne bolesti izabrane iz grupe koju čine adrenokortikalni adenom; neosifikujući fibrom; malignitet mozga i proliferativne bolesti izabrane od onkocitoma bubrega, Vilmovog tumora bubrega, malignog melanoma limfnog čvora i lejomiosarkoma omentuma; glioblastoma i proliferativne bolesti izabrane od oligodendroglioma, angiomiolipoma bubrega, adenoma jetre, hepatocelularnog karcinoma jetre, sitnoćelijskog karcinoma pluća, pleomorfnog adenoma parotidne žlezde, malignog mezotelioma plućne maramice, švanoma, gastrointestinalnog stromalnog tumora (GIST) tankog creva i papilarnog karcinoma štitaste žlezde; karcinoma dojke; hondrosarkoma; karcinoma kolona ili rektuma i proliferativne bolesti izabrane od gigantocelularnog tumora kosti, kosti, neosifikujućeg fibroma, mucinoznog karcinoma dojke, adenokarcinoma kolona, adenoma kolona, adenokarcinoma endometrijuma endometrioidnog tipa, adenokarcinoma jednjaka, angiomiolipoma bubrega, karcinoma bubrežnih ćelija, liposarkoma, hepatocelularnog karcinoma jetre, tumora granuloznih ćelija jajnika, mikrocističnog adenoma pankreasa, malignog mezotelioma plućne maramice, benigne nodularne hiperplazije prostate, non-Hodžkinovog limfoma slezine, mucinoznog adenokarcinoma želuca, timoma timusa, maligne nodularne hiperplazije štitaste žlezde, mokraćne bešike, karcinoma ćelija prelaznog epitela i skvamocelularnog karcinoma vulve; adenoma kolona; adenokarcinoma jednjaka; malignog karcinoidnog tumora creva; intramuskularnog lipoma; svetloćelijskog karcinoma bubrežnih ćelija i proliferativne bolesti izabrane od nadbubrežne žlezde, adrenokortikalnog karcinoma, adenokarcinoma endometrijuma endometrioidnog tipa, adenokarcinoma endometrijuma endometrioidnog tipa, angiomiolipoma lejomiosarkoma bubrega, lipoma, hepatocelularnog karcinoma jetre, Hodžkinove bolesti limfnog čvora, non-Hodžkinovog limfoma, adenokarcinoma pankreasa, pleomorfnog adenoma parotidne žlezde, adenokarcinoma prostate, adenokarcinoma rektuma, hronične mijeloidne leukemije slezine, non-Hodžkinovog limfoma slezine i folikularnog adenoma štitaste žlezde; onkocitoma bubrega; bolesti policističnih bubrega; karcinoma bubrežnih ćelija; lipoma; hepatocelularnog karcinoma jetre i proliferativne bolesti izabrane od adrenokortikalnog adenoma nadbubrežne žlezde, karcinoma dojke, fokalne nodularne hiperplazije jetre, adenokarcinoma rektuma, malignog tumora štitaste žlezde, nodularne hiperplazije, malignog tumora štitaste žlezde, papilarnog karcinoma, non-Hodžkinovog limfoma kolona, hiperplazije endometrijuma, adenoma jetre, karcinoma bubrega, onkocitoma bubrega, lipoma, liposarkoma, fokalne nodularne hiperplazije jetre, hepatičkog adenoma jetre, malignog mezotelioma plućne maramice, neuroblastoma, adenokarcinoma pankreasa, mikrocističnog adenoma pankreasa, pleomorfnog adenoma parotidne žlezde, malignog mezotelioma plućne maramice, sinovijalnog sarkoma, nodularne hiperplazije štitaste žlezde i skvamocelularnog karcinoma grlića materice; pluća, nesitnoćelijskog karcinoma pluća i proliferativne bolesti izabrane od karcinoma dojke, hondrosarkoma, onkocitoma bubrega, hepatocelularnog karcinoma jetre, adenokarcinoma pluća, Hodžkinove bolesti limfnog čvora, non-Hodžkinovog limfoma limfnog čvora, papilarnog karcinoma štitaste žlezde u limfnom čvoru, adenokarcinoma omentuma, mešovitog Milerovog tumora jajnika, adenokarcinoma pankreasa, mešovitog tumora germinativnih ćelija testisa, benignog timoma timusa i štitaste žlezde, nodularne hiperplazije; Hodžkinove bolesti limfnog čvora; papilarnog karcinoma štitaste žlezde u limfnom čvoru; metastatskog papilarnog karcinoma limfnog čvora štitaste žlezde; lejomioma miometrijuma; non-Hodžkinovog limfoma; non-Hodžkinovog limfoma, perifernog T-ćelijskog ili sitnoćelijskog limfocitnog tipa; adenokarcinoma pankreasa i proliferativne bolesti izabrane od gigantocelularnog tumora kosti, adenokarcinoma kolona, fibromatoze, intramuskularnog lipoma, angiomiolipoma bubrega, karcinoma bubrežnih ćelija, hepatičnog adenoma jetre, adenokarcinoma pluća, lejomioma miometrijuma, non-Hodžkinovog limfoma sitnoćelijskog limfocitnog tipa, adenokarcinoma pankreasa, benigne nodularne hiperplazije prostate, adenokarcinoma rektuma, hronične mijeloidne leukemije slezine i timusa, timoma, malignog; adenokarcinoma rektuma; hronične mijeloidne leukemije slezine; ekstramedularne hematopoeze slezine; želuca, adenokarcinoma i proliferativne bolesti izabrane od, adrenokortikalnog adenoma nadbubrežne žlezde, gigantocelularnog tumora kosti, neosifikujućeg fibroma kosti, karcinoma dojke, adenokarcinoma kolona, non-Hodžkinovog limfoma kolona, endometrioidnog adenokarcinoma endometrijuma, angiomiolipoma bubrega, karcinoma bubrega, onkocitoma bubrega, jetre, fokalne nodularne hiperplazije, hepatocelularnog karcinoma jetre, Hodžkinove bolesti limfnog čvora, papilarnog karcinoma štitaste žlezde u limfnom čvoru, medularnog karcinoma tireoidnog porekla, metastatskog adenokarcinoma želuca, neurofibroma, tekoma-fibroma jajnika, adenokarcinoma pankreasa, mikrocističnog adenoma pankreasa, adenoma paraštitaste žlezde, adenokarcinoma rektuma, skvamocelularnog karcinoma kože, hronične mijeloidne leukemije slezine, gastrointestinalnog stromalnog tumora (GIST) želuca, nodularne hiperplazije štitaste žlezde, papilarnog karcinoma štitaste žlezde, skvamocelularnog karcinoma grlića materice i hronične limfocitne leukemije belih krvnih ćelija; gastrointestinalnog stromalnog tumora (GIST) želuca; metastatskog malignog tumora želuca i proliferativne bolesti izabrane od adrenokortikalnog karcinoma nadbubrežne žlezde, papilarnog karcinoma štitaste žlezde, kože, skvamocelularnog karcinoma, karcinoma dojke, adenokarcinoma kolona, mešovitog Milerovog tumora endometrijuma, karcinoma bubrega, lejomiosarkoma, neuroendokrinog karcinoma pluća (nesitnoćelijski tip), non-Hodžkinovog limfoma limfnog čvora, non-Hodžkinovog limfoma, mešovitog Milerovog tumora jajnika, adenokarcinoma pankreasa, adenokarcinoma rektuma, bazocelularnog karcinoma kože, gastrointestinalnog stromalnog tumora (GIST) želuca i adenokarcinoma grlića materice; seminoma tetisa; benignog timoma timusa; folikularnog adenoma štitaste žlezde; i nodularne hiperplazije štitaste žlezde.

Prikazana je upotreba predstavljenih peptida za poželjnu imunoterapiju, poželjno kombinovanu, oboljenja prema sledećoj tabeli 4.

Tabela 4: Poželjni peptidi i oboljenja koja se leče. ID BR. SEKV: 167 je u skladu sa pronalaskom.

1

2

4

1

2

4

1

2

4

Predmetni pronalazak se pored toga odnosi na peptide u skladu sa predmetnim pronalaskom koji imaju sposobnost da se vežu za molekul klase I humanog glavnog kompleksa gena tkivne podudarnosti (MHC).

Predmetni pronalazak se dalje odnosi na peptide u skladu sa predmetnim pronalaskom, naznačeno time što navedeni peptid sadrži nepeptidne veze.

Predmetni pronalazak se dalje odnosi na fuzioni protein koji sadrži (a) aminokiselinsku sekvencu koja se sastoji od ID BR. SEKV: 167 i (b) N-terminalnih aminokiselina 1-80 HLA-DR antigen-asociranog nepromenljivog lanca (Ii).

Predmetni pronalazak se dalje odnosi na nukleinsku kiselinu koja kodira peptide u skladu sa predmetnim pronalaskom.

Predmetni pronalazak se dalje odnosi na nukleinsku kiselinu u skladu sa predmetnim pronalaskom koja je DNK, cDNK, PNK, RNK ili njihova kombinacija.

Predmetni pronalazak se dalje odnosi na vektor ekspresije koji eksprimira i/ili prezentuje nukleinsku kiselinu u skladu sa predmetnim pronalaskom.

Predmetni pronalazak se dalje odnosi Antitelo koje se specifično vezuje za humani glavni kompleks gena tkivne podudarnosti (MHC) klase I koji je u kompleksu sa peptidom u skladu sa ID BR. SEKV: 167, i na postupke za njihovu proizvodnju.

Predmetni pronalazak se dalje odnosi na T-ćelijski receptor koji se specifično vezuje za humani glavni kompleks gena tkivne podudarnosti (MHC) klase I koji je u kompleksu sa peptidom u skladu sa ID BR. SEKV: 167, i na postupke za njihovu proizvodnju.

Predmetni pronalazak se dalje odnosi na ćeliju domaćina koja sadrži nukleinsku kiselinu u skladu sa predmetnim pronalaskom ili vektor ekspresije kako je ranije opisan.

Predmetni pronalazak se dalje odnosi na ćeliju domaćina u skladu sa predmetnim pronalaskom koja je antigen-prezentujuća ćelija.

Predmetni pronalazak se dalje odnosi na ćeliju domaćina u skladu sa predmetnim pronalaskom, naznačeno time što je antigen-prezentujuća ćelija dendritična ćelija.

Predmetni pronalazak se dalje odnosi na metod proizvodnje peptida u skladu sa predmetnim pronalaskom, pri čemu se metod sastoji od kultivisanja ćelije domaćina u skladu sa predmetnim pronalaskom i izolovanja peptida iz ćelije domaćina ili njenog medijuma za kultivaciju.

Predmetni pronalazak se dalje odnosi na in vitro metod za proizvodnju aktiviranih citotoksičnih T limfocita (CTL), pri čemu se metod sastoji od dovođenja u kontakt in vitro CTL sa humanim MHC molekulima klase I sa ubačenim antigenom eksprimiranim na površini prikladne antigen-prezentujuće ćelije u toku vremenskog perioda koji je dovoljan da se navedeni CTL aktiviraju na antigen-specifičan način, pri čemu je navedeni antigen peptid u skladu sa predmetnim pronalaskom.

Predmetni pronalazak se dalje odnosi na metod u skladu sa predmetnim pronalaskom, naznačeno time što se antigen postavlja na MHC molekule klase I eksprimirane na površini prikladne antigen-prezentujuće ćelije tako što se dovoljna količina antigena dovodi u kontakt sa antigen-prezentujućom ćelijom.

Predmetni pronalazak se dalje odnosi na metod u skladu sa predmetnim pronalaskom, naznačeno time što antigen-prezentujuća ćelija sadrži vektor ekspresije koji eksprimira navedeni peptid koji sadrži ID BR. SEKV: 167.

Predmetni pronalazak se dalje odnosi na aktivirane citotoksične T limfocite (CTL), proizvedene pomoću metoda u skladu sa predmetnim pronalaskom, koji selektivno prepoznaju ćeliju koja aberantno eksprimira polipeptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu u skladu sa predmetnim pronalaskom.

Predmetni pronalazak dalje predstavlja metod ubijanja ciljnih ćelija kod pacijenta čije ciljne ćelije aberantno eksprimiraju polipeptid koji sadrži bilo koju aminokiselinsku sekvencu u skladu sa predmetnim pronalaskom, pri čemu metod obuhvata davanje pacijentu efikasnog broja citotoksičnih T limfocita (CTL) u skladu sa predmetnim pronalaskom.

Predmetni pronalazak dalje predstavlja upotrebu bilo kog opisanog peptida, nukleinske kiseline u skladu sa predmetnim pronalaskom, vektora ekspresije u skladu sa predmetnim pronalaskom, ćelije u skladu sa predmetnim pronalaskom, ili aktiviranog citotoksičnog T limfocita u skladu sa predmetnim pronalaskom u vidu leka ili u proizvodnji leka.

Predmetni pronalazak se dalje odnosi na upotrebu u skladu sa predmetnim pronalaskom, naznačeno time što je navedeni lek vakcina.

Predmetni pronalazak se dalje odnosi na upotrebu u skladu sa predmetnim pronalaskom, naznačeno time što je lek aktivan protiv malignog tumora.

Predmetni pronalazak se dalje odnosi na upotrebu u skladu sa predmetnim pronalaskom, naznačeno time što su navedene ćelije malignog tumora ćelije hematoloških maligniteta, poput ćelija HLL ili AML.

Predmetni pronalazak dalje predstavlja određene proteine markere i biomarkere zasnovane na peptidima u skladu sa predmetnim pronalaskom koji se mogu koristiti kod određivanja dijagnoze i/ili prognoze hematoloških maligniteta, posebno za ćelije hronične limfocitne leukemije (HLL).

Pored toga, predmetni pronalazak prikazuje upotrebu ovih novih ciljeva za lečenje raka.

Nadalje, predmetni pronalazak prikazuje postupak za proizvodnju personalizovane antitumorske vakcine za pojedinačnog pacijenta korišćenjem baze podataka („skladišta“)

1

prethodno pretraženih tumor-asociranih peptida.

Stimulacija imunskog odgovora zavisi od prisustva antigena koje imunski sistem domaćina prepoznaje kao strane. Otkriće postojanja tumor-asociranih antigena otvorilo je mogućnost primene imunskog sistema domaćina za intervenciju u rastu tumora. Trenutno se istražuju različiti mehanizmi za iskorišćavanje kako humoralnog tako i ćelijskog dela imunskog sistema za imunoterapiju raka.

Specifični elementi ćelijskog imunskog odgovora su u stanju da specifično prepoznaju i unište ćelije tumora. Izolacija citotoksičnih T ćelija (CTL) iz ćelijskih populacija koje infiltriraju tumor ili iz periferne krvi navodi na to da takve ćelije imaju značajnu ulogu u prirodnim imunskim odbranama protiv raka. U ovom odgovoru naročito važnu ulogu imaju CD8-pozitivne T ćelije, koje prepoznaju molekule klase I glavnog kompleksa gena tkivne podudarnosti (MHC) koji nose peptide od obično 8 do 10 aminokiselinskih ostataka dobijene iz proteina ili defektnih proizvoda ribozoma (DRIP-ovi) koji se nalaze u citosolu. MHC molekuli ljudi se takođe nazivaju humani leukocitni antigeni (HLA).

Postoje dve klase MHC molekula: MHC molekuli klase I koji se nalaze na većini ćelija koje sadrže jedro. MHC molekuli su sastavljeni od alfa teškog lanca i beta-2 mikroglobulina (MHC klasa I receptori) odnosno alfa i beta lanca (MHC klasa II receptori). Njihova trodimenzionalna konformacija rezultuje stvaranjem udubljenja za vezivanje, koje se koristi za nekovalentnu interakciju sa peptidima. MHC klase I prezentuju peptide koji nastaju kao posledica proteolitičkog cepanja predominantno endogenih proteina, DRIP-ova i većih peptida. MHC molekuli klase II predominantno se nalaze na profesionalnim antigenprezentujućim ćelijama (APĆ), i primarno prezentuju peptide egzogenih ili transmembranskih proteina koje APĆ preuzimaju u toku procesa endocitoze, i nakon toga obrađuju. Komplekse peptida i MHC molekula klase I prepoznaju CD8-pozitivni citotoksični T limfociti koji nose odgovarajući TCR (T-ćelijski receptor), dok komplekse peptida i MHC molekula klase II prepoznaju CD4-pozitivne pomoćničke T ćelije koje nose odgovarajući TCR. Dobro je poznato da su TCR, peptid i MHC pritom prisutni u stehiometrijskom odnosu od 1:1:1.

1 1

CD4-pozitivne pomoćničke T ćelije imaju važnu ulogu u indukovanju i održavanju efikasnih odgovora od strane CD8-pozitivnih citotoksičnih T ćelija. Identifikacija CD4-pozitivnih T-ćelijskih epitopa dobijenih iz tumor-asociranih antigena (TAA) je od velikog značaja za razvoj farmaceutskih proizvoda za izazivanje antitumorskih imunskih odgovora (Gnjatic S, et al. Survey of naturally occurring CD4+ T cell responses against NY- ESO-1 in cancer patients: correlation with antibody responses. Proc Natl Acad Sci U S A. 2003 Jul 22;100(15):8862-7). Na mestu tumora T-pomoćničke ćelije podržavaju citokinski milje koji je povoljan za CTL Mortara L, et al. CIITA-induced MHC class II expression in mammary adenocarcinoma leads to a Th1 polarization of the tumor microenvironment, tumor rejection, and specific antitumor memory. Clin Cancer Res. 2006 Jun 1;12(11 Pt 1):3435-43) i privlače efektorske ćelije, npr. CTL, NK ćelije, makrofage, granulocite (Hwang ML, et al. Cognate memory CD4+ T cells generated with dendritic cell priming influence the expansion, trafficking, and differentiation of secondary CD8+ T cells and enhance tumor control. J Immunol. 2007 Nov 1;179(9):5829-38).

U odsustvu zapaljenja, ekspresija MHC molekula klase II je uglavnom ograničena na ćelije imunskog sistema, naročito profesionalne antigen-prezentujuće ćelije (APĆ), npr. monocite, ćelije izvedene iz monocita, makrofage, dendritične ćelije. Kod pacijenata koji boluju od raka, neočekivano je otkriveno da ćelije tumora eksprimiraju MHC molekule klase II (Dengjel J, et al. Unexpected abundance of HLA class II presented peptides in primary renal cell carcinomas. Clin Cancer Res.2006 Jul 15;12(14 Pt 1):4163-70).

Na životinjskim modelima na sisarima, npr. miševi, dokazano je da su čak i u odsustvu CTL efektorskih ćelija (tj. CD8-pozitivnih T limfocita), CD4-pozitivne T ćelije dovoljne za inhibiranje manifestacija tumora putem inhibicije angiogeneze pomoću sekrecije interferonagama (IFNγ).

Dodatno, pokazano je da CD4-pozitivne T ćelije koje prepoznaju peptide iz tumor-asociranih antigena prezentovanih od strane HLA molekula klase II mogu da se suprotstave progresiji tumora pomoću indukcije odgovora antitelima (At).

1 2

Za razliku od tumor-asociranih peptida koji se vezuju za HLA molekule klase I, do danas je opisan samo mali broj liganda klase II tumor-asociranih antigena (TAA).

Budući da je konstitutivna ekspresija HLA molekula klase II obično ograničena na ćelije imunskog sistema, mogućnost izolovanja peptida klase II direktno iz primarnih tumora nije se smatrala mogućom. Međutim, Dengjel i saradnici uspešno su identifikovali određeni broj epitopa MHC klase II direktno iz tumora (WO 2007/028574, EP 1 760 088 B1; (Dengjel et al., 2006).

Antigeni koje prepoznaju tumor-specifični citotoksični T limfociti, to jest, njihovi epitopi, mogu biti molekuli dobijeni iz svih klasa proteina, kao što su enzimi, receptori, faktori transkripcije, itd. koji se eksprimiraju i, u poređenju sa neizmenjenim ćelijama istog porekla, ushodno regulišu u ćelijama datog tumora.

Budući da obe vrste odgovora, CD8 i CD4-zavisan, zajednički i sinergistički doprinose antitumorskom efektu, identifikacija i karakterizacija tumor-asociranih antigena prepoznatih pomoću ili CD8+ CTL (ligand: MHC molekul klase I peptidni epitop) ili pomoću CD4-pozitivnih T pomoćničkih ćelija (ligand: MHC molekul klase II peptidni epitop) je važna u razvoju tumorskih vakcina.

Dužinske varijante su uopšteno N- i/ili C-terminalno produženi (između 1 i 5, poželjno 1 do 10 aminokiselina) ili N- i/ili C-terminalno skraćeni (između 1 i 5 aminokiselina) peptidi, koji i dalje mogu da se vežu za MHC, i izazovu ćelijski imunski odgovor kako je opisano u ovom dokumentu.

Da bi peptid pokrenuo (izazvao) ćelijski imunski odgovor, on mora da se veže za MHC molekul. Ovaj proces zavisi od alela MHC molekula i specifičnih polimorfizama aminokiselinske sekvence peptida. Peptidi koji vezuju MHC klasa I su obično dužine 8-12 aminokiselinskih ostataka i obično sadrže dva konzervirana ostatka („sidra“) u svojoj sekvenci koji interaguju sa odgovarajućim udubljenjem za vezivanje MHC molekula. Na ovaj način, svaki MHC alel ima „vezujući motiv“ koji određuje koji peptidi mogu specifično da se

1

vežu za udubljenje za vezivanje.

U MHC klasa I-zavisnoj imunskoj reakciji, peptidi ne samo da moraju da budu sposobni da se vežu za određene MHC molekule klase I koje eksprimiraju tumorske ćelije, već njih takođe moraju da prepoznaju T ćelije koje nose specifične T-ćelijske receptore (TCR).

Trenutno važeća klasifikacija tumor-asociranih antigena sadrži sledeće velike grupe:

a) Karcinom-testis antigeni: Prvi TAA koji su ikad identifikovani koje mogu da prepoznaju T ćelije pripadaju ovoj klasi, koja je originalno nazvana karcinom-testis (CT) antigeni zbog ekspresije njenih članova u histološki različitim humanim tumorima i, među normalnim tkivima, samo u spermatocitima/spermatogonijama testisa i, povremeno, u placenti. Budući da ćelije testisa ne eksprimiraju HLA molekule klase I i II, ove antigene ne mogu da prepoznaju T ćelije u normalnim tkivima te se stoga mogu smatrati imunološki tumorspecifičnim. Dobro poznati primeri za CT antigene su pripadnici MAGE familije ili NY-ESO-1.

b) Antigeni diferencijacije: Ove TAA dele tumori i normalno tkivo iz kojeg je tumor nastao; većina njih nalazi se u melanomima i normalnim melanocitima. Mnogi od ovih proteina povezanih sa melanocitnom linijom uključeni su u biosintezu melanina te stoga nisu tumorspecifični, ali bez obzira na to naširoko se koriste za imunoterapiju raka. Primeri uključuju, ali nisu i ograničeni na, tirozinazu i Melan-A/MART-1 za melanom ili PSA za karcinom prostate.

c) Prekomerno eksprimirani TAA: Geni koji kodiraju naširoko eksprimirane TAA detektovani su u histološki različitim tipovima tumora kao i u mnogim normalnim tkivima, generalno sa nižim nivoima ekspresije. Moguće je da su mnogi od epitopa koje normalna tkiva obrađuju i potencijalno prezentuju ispod nivoa praga za prepoznavanje od strane T ćelija, dok njihova prekomerna ekspresija u ćelijama tumora može da pokrene antitumorski

1 4

odgovor probijanjem prethodno uspostavljene tolerancije. Istaknuti primeri za ovu klasu TAA su Her-2/neu, survivin, telomeraza ili WT1.

d) Tumor-specifični antigeni: Ovi jedinstveni TAA nastaju iz mutacija normalnih gena (kao što je β-katenin, CDK4, itd). Neke od ovih molekularnih promena su u vezi sa neoplastičnom transformacijom i/ili progresijom. Tumor-specifični antigeni su generalno u stanju da indukuju jake imunske odgovore a da pritom ne nose rizik od autoimunskih reakcija protiv normalnih tkiva. S druge strane, ovi TAA su u većini slučajeva relevantni samo za određeni tumor na kojem su identifikovani i obično ih ne deli mnogo individualnih tumora.

e) TAA koji nastaju iz abnormalnih posttranslacionih modifikacija: Takvi TAA mogu nastati iz proteina koji su niti specifični niti prekomerno eksprimirani u tumorima, ali bez obzira na to postaju tumor-asocirani pomoću posttranslacionih procesa koji su primarno aktivni u tumorima. Primeri za ovu klasu nastaju iz izmenjenih obrazaca glikozilacije koji dovode do novih epitopa u tumorima kao za MUC1 ili događaja poput spajanja proteina u toku degradacije, koji mogu i ne moraju biti tumor-specifični.

f) Onkovirusni proteini: Ovi TAA su virusni proteini koji mogu imati kritičnu ulogu u procesu onkogeneze i, zbog toga što su stranog (a ne humanog) porekla, oni mogu pokrenuti T-ćelijski odgovor. Primeri takvih proteina su proteini humanog papiloma virusa tip 16, E6 i E7, koji se eksprimiraju u karcinomu grlića materice.

Da bi proteini mogli da budu prepoznati od strane citotoksičnih T limfocita kao tumorspecifični ili tumor-asocirani antigeni, i da bi mogli da se koriste u terapiji, moraju da budu ispunjeni određeni preduslovi. Antigen bi trebalo da bude uglavnom eksprimiran od strane ćelija tumora a ne uopšte ili samo u uporedivo malim količinama od strane normalnih zdravih tkiva ili u drugom poželjnom otelotvorenju peptid bi trebalo da bude prekomerno prezentovan od strane ćelija tumora u poređenju sa normalnim zdravim tkivima. Nadalje je poželjno da dati antigen ne bude samo prisutan u određenoj vrsti tumora, već takođe i u visokim koncentracijama (tj. broj kopija datog peptida po ćeliji). Tumor-specifični i tumor-asocirani antigeni se često dobijaju od proteina koji su direktno uključeni u transformaciju normalne ćelije u tumorsku ćeliju zbog funkcije npr. u kontroli ćelijskog ciklusa ili supresiji apoptoze. Pored toga, nishodni ciljevi proteina koji su direktno odgovorni za transformaciju mogu biti ushodno regulisani i tako mogu indirektno biti tumor-asocirani. Takvi indirektni tumor-

1

asocirani antigeni mogu takođe biti ciljevi vakcinalnog pristupa (Singh-Jasuja et al., 2004). U oba slučaja, esencijalno je da epitopi budu prisutni u aminokiselinskoj sekvenci antigena, budući da takav peptid („imunogeni peptid“) koji je dobijen iz tumor-asociranog antigena treba da dovede do in vitro ili in vivo T-ćelijskog odgovora.

U osnovi, svaki peptid koji je u stanju da veže MHC molekul može funkcionisati kao T-ćelijski epitop. Preduslov za indukciju in vitro ili in vivo T-ćelijskog odgovora je prisustvo T ćelije sa odgovarajućim TCR i odsustvo imunološke tolerancije za ovaj konkretni epitop.

Zato su TAA početna tačka za razvoj tumorske vakcine. Metodi za identifikaciju i karakterizaciju TAA zasnovani su na upotrebi CTL koji mogu biti izolovani iz pacijenata ili zdravih ispitanika, ili se oni zasnivaju na stvaranju diferencijalnih profila transkripcije ili diferencijalnih obrazaca ekspresije peptida između tumora i normalnih tkiva.

Ipak, identifikacija gena koji su prekomerno eksprimirani u tumorskim tkivima ili humanim tumorskim ćelijskim linijama, ili selektivno eksprimirani u takvim tkivima ili ćelijskim linijama, ne obezbeđuje precizne informacije o upotrebi antigena koji se transkribuju iz ovih gena u imunskoj terapiji. Ovo je iz razloga što je samo pojedinačna potpopulacija epitopa ovih antigena prikladna za takvu primenu budući da mora da bude prisutna T ćelija sa odgovarajućim TCR i da imunološka tolerancija za ovaj naročit epitop bude odsutna ili minimalna. U veoma poželjnom otelotvorenju pronalaska je zato važno da se odaberu samo oni prekomerno ili selektivno prezentovani peptidi protiv kojih se može naći funkcionalna i/ili proliferišuća T ćelija. Takva funkcionalna T ćelija je definisana kao T ćelija koja nakon stimulacije sa specifičnim antigenom može klonalno da se proširi i koja je sposobna da izvrši efektorske funkcije („efektorska T ćelija“).

U slučaju TCR i antitela u skladu sa pronalaskom, imunogenost osnovnih peptida je sekundarna. Za TCR i antitela u skladu sa pronalaskom prezentacija je određujući faktor.

T-pomoćničke ćelije imaju važnu ulogu u orkestriranju efektorske funkcije CTL u antitumorskoj imunosti. T-pomoćnički ćelijski epitopi koji izazivaju T-pomoćnički ćelijski

1

odgovor TH1tipa podržavaju efektorske funkcije CD8-pozitivnih T ćelija ubica, koje obuhvataju citotoksične funkcije usmerene protiv tumorskih ćelija koje prikazuju komplekse tumor-asocirani peptid/MHC na površini ćelije. Na ovaj način tumor-asocirani peptidni epitopi T-pomoćničke ćelije, samostalno ili u kombinaciji sa drugim tumor-asociranim peptidima, mogu da služe kao aktivni farmaceutski sastojci smeša za vakcinu koje stimulišu antitumorske imunske odgovore.

Pronalazači su identifikovali novu kategoriju tumor-asociranih antigena izvedenih od ligandoma (LiTAA) koji su često i ekskluzivno detektovani kod pacijenata sa HLL. Specifično imunsko prepoznavanje odgovarajućih HLA liganada (LiTAP) uočeno je isključivo kod pacijenata sa HLL, i iznenađujuće pokazuje direktnu korelaciju sa učestalošću HLA-restrikovane reprezentacije. Nadalje, retrospektivna analiza preživljavanja 33 pacijenta sa HLL ukazala je na potencijalnu povezanost LiTAP-specifičnih imunskih odgovora sa poboljšanim ukupnim preživljavanjem kod pacijenata sa HLL.

Primene protiv drugih malignih tumora predstavljene su u sledećem opisu proteina peptida u skladu sa pronalaskom.

Detaljan opis pronalaska

Na način kako su korišćeni u ovom tekstu, i sem ako nije naznačeno drugačije, svi termini su definisani kako je navedeno u nastavku.

Termin „peptid“ je korišćen u ovom tekstu da označi seriju aminokiselinskih ostataka, povezanih jedan sa drugim tipično pomoću peptidnih veza između alfa-amino i karbonilnih grupa susednih aminokiselina. Peptidi su poželjno dužine 9 aminokiselina, ali mogu biti i kraći, dužine 8 aminokiselina, ili duži, dužine 10, 11, 12, 13 ili 14, a u slučaju peptida MHC klase II oni mogu biti dužine 15, 16, 17, 18, 19 ili 20 aminokiselina.

Pored toga, termin „peptid“ će obuhvatati soli serija aminokiselinskih ostataka, povezanih jedan sa drugim tipično pomoću peptidnih veza između alfa-amino i karbonilnih grupa susednih aminokiselina. Poželjno, soli su farmaceutski prihvatljive soli peptida, kao što su, na

1

primer, hloridne ili acetatne (trifluoroacetat) soli.

Termin „peptid“ će obuhvatati „oligopeptid“. Termin „oligopeptid“ je korišćen u ovom tekstu da označi seriju aminokiselinskih ostataka, povezanih jedan sa drugim tipično pomoću peptidnih veza između alfa-amino i karbonilnih grupa susednih aminokiselina. Dužina oligopeptida nije presudna za pronalazak, sve dok je u njemu zadržan ispravni epitop ili epitopi. Oligopeptidi su tipično dužine manje od oko 30 aminokiselinskih ostataka, a duži od oko 15 aminokiselina.

Termin „peptidi predmetnog pronalaska“ će obuhvatati peptide koji se sastoje od ili sadrže peptid kako je definisan ranije u skladu sa ID BR. SEKV: 167.

Termin „polipeptid“ označava seriju aminokiselinskih ostataka, povezanih jedan sa drugim tipično pomoću peptidnih veza između alfa-amino i karbonilnih grupa susednih aminokiselina. Dužina polipeptida nije presudna za pronalazak, sve dok su u njemu zadržani ispravni epitopi. Suprotno terminima peptid ili oligopeptid, termin polipeptid je namenjen da označi molekule koji sadrže više od oko 30 aminokiselinskih ostataka.

Peptid, oligopeptid, protein ili polinukleotidni kod za takav molekul je „imunogen“ (pa je zato „imunogen“ u okviru predmetnog pronalaska), ako je sposoban da indukuje imunski odgovor. U slučaju predmetnog pronalaska, imunogenost je specifičnije definisana kao sposobnost indukovanja T-ćelijskog odgovora. Tako bi „imunogen“ bio molekul koji je u stanju da indukuje imunski odgovor, a u slučaju predmetnog pronalaska, molekul koji je u stanju da indukuje T-ćelijski odgovor. U drugom aspektu, imunogen može biti peptid, kompleks peptida sa MHC, oligopeptid i/ili protein koji se koristi za pokretanje specifičnih antitela ili TCR protiv njega.

T-ćelijski „epitop“ klase I zahteva kratak peptid koji je vezan za MHC receptor klase I, obrazujući trojni kompleks (alfa lanac MHC klase I, beta-2-mikroglobulin i peptid), koji može da prepozna T ćelija koja nosi podudarni T-ćelijski receptor koji se vezuje za kompleks MHC/peptid sa odgovarajućim afinitetom. Peptidi koji se vezuju za MHC molekule klase I su

1

tipično dužine 8-14 aminokiselina, a najčešće su dugački 9 aminokiselina.

Kod ljudi postoje tri različita genska lokusa koji kodiraju MHC molekule klase I (MHC molekuli ljudi se takođe nazivaju humani leukocitni antigeni (HLA)): HLA-A, HLA-B i HLA-C. HLA-A*01, HLA-A*02 i HLA-B*07 su primeri različitih alela MHC klase I koji mogu biti eksprimirani od ovih lokusa.

Tabela 7: Učestalosti ekspresije F HLA*A02 i najučestaliji serotipovi HLA-DR. Učestalosti su izvedene iz učestalosti haplotipova Gf unutar američke populacije adaptirane iz rada Mori i sar. (Mori M, et al. HLA gene and haplotype frequencies in the North American population: the National Marrow Donor Program Donor Registry. Transplantation. 1997 Oct 15;64(7):1017-27) primenom Hardi-Vajnbergove formule F=1-(1-Gf)2. Kombinacije A*02 sa određenim HLA-DR alelima mogu biti obogaćene ili manje učestale nego što je očekivano u odnosu na njihove pojedinačne učestalosti usled neravnoteže povezivanja. Za detalje pogledajte rad Chanock i sar. (S.J. Chanock, et al (2004) HLA-A, -B, -Cw, -DQA1 and DRB1 in an African American population from Bethesda, USA Human Immunology, 65: 1223-1235).

1

Stoga, za terapijske i dijagnostičke svrhe, veoma je poželjan peptid koji se vezuje sa odgovarajućim afinitetom za nekoliko različitih receptora HLA klase II. Peptid koji se vezuje za nekoliko različitih HLA molekula klase II naziva se slobodan vezivač.

Na način kako je korišćeno u ovom dokumentu, upućivanje na DNK sekvencu obuhvata i jednolančanu i dvolančanu DNK. Tako, specifična sekvenca, sem ako kontekst ne ukazuje drugačije, odnosi se na jednolančanu DNK takve sekvence, dupleks takve sekvence sa njenim komplementarnim delom (dvolančana DNK) i komplementarni deo takve sekvence. Termin „kodirajući region“ odnosi se na onaj deo gena koji ili prirodno ili normalno kodira proizvod ekspresije datog gena u njegovoj prirodnoj genomskoj sredini, tj. region koji in vivo kodira proizvod prirodne ekspresije tog gena.

Kodirajući region može biti iz nemutiranog („normalnog“), mutiranog ili izmenjenog gena, ili čak iz DNK sekvence, ili gena, koji su u potpunosti sintetizovani u laboratoriji pomoću metoda koji su dobro poznati stručnjacima iz oblasti sinteze DNK.

Termin „nukleotidna sekvenca“ odnosi se na heteropolimer dezoksiribonukleotida.

Nukleotidna sekvenca koja kodira određeni peptid, oligopeptid ili polipeptid može biti prirodno postojeća ili mogu biti sintetički napravljene. Uopšteno, DNK segmenti koji kodiraju peptide, polipeptide i proteine ovog pronalaska sastavljaju se iz cDNK fragmenata i kratkih oligonukleotidnih povezivača, ili iz serije oligonukleotida, kako bi se obezbedio sintetički gen koji je u stanju da bude eksprimiran u rekombinantnoj transkripcionoj jedinici koja sadrži regulatorne elemente dobijene iz mikrobnog ili virusnog operona.

Na način kako je korišćen u ovom dokumentu termin „nukleotidni kod za peptid“ (ili koji kodira) odnosi se na nukleotidnu sekvencu koja kodira peptid uključujući veštačke (napravljene od strane ljudi) start i stop kodone kompatibilne za biološki sistem koji će eksprimirati sekvencu.

Termin „proizvod ekspresije“ označava polipeptid ili protein koji je prirodni proizvod

11

translacije gena i bilo koje sekvence nukleinskih kiselina koja kodira ekvivalente koji nastaju iz degeneracije genetskog koda i tako kodiraju istu aminokiselinu(e).

Termin „fragment“, kada se odnosi na kodirajuću sekvencu, označava deo DNK koji sadrži manje od kompletnog kodirajućeg regiona, čiji proizvod ekspresije esencijalno zadržava istu biološku funkciju ili aktivnost kao i proizvod ekspresije kompletnog kodirajućeg regiona.

Termin „DNK segment“ odnosi se na DNK polimer, u obliku zasebnog fragmenta ili kao komponenta većeg DNK konstrukta, koji je dobijen iz DNK koja je izolovana najmanje jednom u suštinski čistom obliku, tj. ne sadrži kontaminirajuće endogene materijale i u količini ili koncentraciji koja omogućava identifikaciju, manipulaciju i ponovno dobijanje segmenta i njegovih komponentnih nukleotidnih sekvenci pomoću standardnih biohemijskih metoda, na primer upotrebom vektora za kloniranje. Takvi segmenti se obezbeđuju u obliku otvorenog okvira čitanja koji nije prekinut unutrašnjim netranslatornim sekvencama, ili intronima, koji su tipično prisutni u eukariotskim genima. Sekvence netranslatorne DNK mogu biti prisutne nishodno od otvorenog okvira čitanja, gde iste ne ometaju manipulaciju ili ekspresiju kodirajućih regiona.

Termin „prajmer“ označava kratku sekvencu nukleinskih kiselina koja može biti uparena sa jednim lancem DNK i obezbeđuje slobodan 3'-OH kraj na kojem DNK polimeraza započinje sintezu dezoksiribonukleotidnog lanca.

Termin „promoter“ označava region DNK koji je uključen u vezivanje RNK polimeraze kako bi se inicirala transkripcija.

Termin „izolovan“ označava da je materijal uklonjen iz njegove originalne sredine (npr. prirodne sredine, ako se javlja u prirodi). Na primer, prirodno postojeći polinukleotid ili polipeptid prisutan u živoj životinji nije izolovan, ali isti polinukleotid ili polipeptid, izdvojen iz nekog ili svih koegzistirajućih materijala u prirodnom sistemu, jeste izolovan. Takvi polinukleotidi mogu biti deo vektora i/ili takvi polinukleotidi ili polipeptidi mogu biti deo smeše, a da i dalje budu izolovani tako što takav vektor ili smeša nije deo njegove prirodne sredine.

Polinukleotidi, i rekombinantni ili imunogeni polipeptidi, predstavljeni u skladu sa predmetnim pronalaskom mogu takođe biti u „prečišćenom“ obliku. Termin „prečišćen“ ne zahteva apsolutnu čistoću; on je pre namenjen kao relativna definicija, i može obuhvatati preparate koji su visoko prečišćeni ili preparate koji su samo delimično prečišćeni, shodno razumevanju tih termina od strane stručnjaka u relevantnoj oblasti. Na primer, pojedinačni klonovi izolovani iz biblioteke cDNK su dogovorno prečišćeni do elektroforetske homogenosti. Prečišćavanje početnog materijala ili prirodnog materijala do najmanje jednog reda veličine, poželjno dva ili tri reda, i još poželjnije četiri ili pet redova veličine se izričito razmatra. Pored toga, polipeptid patentnog zahteva koji ima čistoću od poželjno 99,999%, ili najmanje 99,99% ili 99,9%; i čak poželjno 99% po težini ili veću izričito se razmatra.

Nukleinske kiseline i proizvodi ekspresije polipeptida predstavljeni u skladu sa predmetnim pronalaskom, kao i vektori ekspresije koji sadrže takve nukleinske kiseline i/ili takve polipeptide, mogu biti u „obogaćenom obliku“. Na način kako je korišćen u ovom dokumentu, termin „obogaćen“ znači da je koncentracija materijala najmanje oko 2, 5, 10, 100 ili 1000 puta veća od njegove prirodne koncentracije (na primer), pri čemu prednost ima 0,01% po težini, poželjno najmanje oko 0,1% po težini. Obogaćeni preparati od oko 0,5%, 1%, 5%, 10% i 20% po težini takođe se razmatraju. Sekvence, konstrukti, vektori, klonovi i drugi materijali koji sačinjavaju predmetni pronalazak mogu pogodno biti u obogaćenom ili izolovanom obliku.

Termin „aktivni fragment“ označava fragment koji izaziva imunski odgovor (tj. ima imunogenu aktivnost) kada se primeni, samostalno ili opciono sa prikladnim adjuvansom, na životinji, kao što je sisar, na primer, zec ili miš, i takođe uključujući ljude, pri čemu takav imunski odgovor po obliku stimuliše T-ćelijski odgovor unutar životinje primaoca, kao što je čovek. Alternativno, „aktivni fragment“ može takođe da se koristi za indukciju T-ćelijskog odgovora in vitro.

Na način kako su korišćeni ovde, termini „deo“, „segment“ i „fragment“, kada se koriste u vezi sa polipeptidima, odnose se na kontinuiranu sekvencu ostataka, kao što su aminokiselinski ostaci, čija sekvenca obrazuje podskup veće sekvence. Na primer, ako je polipeptid bio podvrgnut tretmanu sa bilo kojom od uobičajenih endopeptidaza, kao što su tripsin ili himotripsin, oligopeptidi nastali kao posledica takvog tretmana bi predstavljali delove, segmente ili fragmente početnog polipeptida. Kada se koriste u vezi sa polinukleotidima, ovi termini se odnose na proizvode koji se dobijaju tretiranjem navedenih polinukleotida sa bilo kojom od endonukleaza.

U skladu sa predmetnim pronalaskom, termin „procenat identičnosti“ ili „procentualno identičan“, kada se odnosi na sekvencu, znači da je sekvenca upoređena sa traženom ili opisanom sekvencom nakon poravnanja sekvence koja se upoređuje („upoređena sekvenca“) sa opisanom ili traženom sekvencom („referentna sekvenca“). Procenat identičnosti se zatim utvrđuje prema sledećoj formuli:

Procenat identičnosti = 100 [1 -(C/R)]

gde je C broj razlika između referentne sekvence i upoređene sekvence u okviru dužine poravnanja između referentne sekvence i upoređene sekvence, naznačeno time što

(i) svaka baza ili aminokiselina u referentnoj sekvenci koja nema odgovarajuću poravnatu bazu ili aminokiselinu u upoređenoj sekvenci, i

(ii) svaka praznina u referentnoj sekvenci, i

(iii) svaka poravnata baza ili aminokiselina u referentnoj sekvenci koja se razlikuje od poravnate baze ili aminokiseline u upoređenoj sekvenci, predstavlja razliku, i

(iiii) poravnanje mora da počne na poziciji 1 poravnatih sekvenci;

a R je broj baza ili aminokiselina u referentnoj sekvenci u okviru dužine poravnanja sa upoređenom sekvencom, pri čemu se svaka praznina u referentnoj sekvenci takođe broji kao baza ili aminokiselina.

Ako između upoređene sekvence i referentne sekvence postoji poravnanje za koje je procenat identičnosti izračunat pomoću gore navedene formule skoro jednak ili veći od određenog minimalnog procenta identičnosti, onda upoređena sekvenca ima određeni minimalni procenat

11

identičnosti sa referentom sekvencom iako mogu postojati poravnanja u kojima je ovde naveden i ranije izračunat procenat identičnosti manji od određenog procenta identičnosti.

Peptidi pronalaska mogu biti produženi za najviše četiri aminokiseline, to jest mogu da se dodaju 1, 2, 3 ili 4 aminokiseline na bilo koji kraj u bilo kojoj kombinaciji između 4:0 i 0:4.

Kombinacije elongacija u skladu sa pronalaskom mogu se videti iz tabele 8:

Aminokiseline za elongaciju mogu biti peptidi originalne sekvence proteina ili bilo koja druga aminokiselina. Elongacija može da se koristi za poboljšavanje stabilnosti ili rastvorljivosti peptida.

Termin „T-ćelijski odgovor“ označava specifičnu proliferaciju i aktivaciju efektorskih funkcija indukovanih peptidom in vitro ili in vivo. Za MHC klasa I restrikovane CTL, efektorske funkcije mogu biti liza ciljnih ćelija pulsiranih peptidom, pulsiranih prekursorom peptida ili ciljnih ćelija koje prirodno prezentuju peptid, sekrecija citokina, poželjno interferon-gama, TNF-alfa ili IL-2, indukovana peptidom, sekrecija efektorskih molekula, poželjno granzima ili perforina, indukovana peptidom, ili degranulacija.

Poželjno, kada se CTL specifični za peptid u skladu sa predmetnim pronalaskom testiraju na supstituisane peptide, koncentracija peptida pri kojoj supstituisani peptidi dostižu polovinu maksimalnog povećanja lize u odnosu na pozadinu nije veća od oko 1 mmol/l, poželjno nije veća od oko 1 µmol/l, poželjnije nije veća od oko 1 nmol/l, a još poželjnije nije veća od oko 100 pmol/l, i najpoželjnije nije veća od oko 10 pmol/l. Takođe je poželjno da supstituisani peptid bude prepoznat od strane CTL dobijenih od više od jedne osobe, najmanje dve, a još poželjnije tri osobe.

Stimulacija imunskog odgovora zavisi od prisustva antigena koje imunski sistem domaćina prepoznaje kao strane. Otkriće postojanja tumor-asociranih antigena sada je otvorilo mogućnost primene imunskog sistema domaćina za intervenciju u rastu tumora. Trenutno se istražuju različiti mehanizmi za iskorišćavanje kako humoralnog tako i ćelijskog dela imunskog sistema za imunoterapiju raka.

Specifični elementi ćelijskog imunskog odgovora su u stanju da specifično prepoznaju i unište ćelije tumora. Izolacija citotoksičnih T ćelija (CTL) iz ćelijskih populacija koje infiltriraju tumor ili iz periferne krvi navodi na to da takve ćelije imaju značajnu ulogu u prirodnim imunskim odbranama protiv raka. U ovom odgovoru naročito važnu ulogu imaju CD8-pozitivne T ćelije, koje prepoznaju molekule klase I glavnog kompleksa gena tkivne podudarnosti (MHC) koji nose peptide od obično 8 do 12 ostataka dobijene iz proteina ili defektnih proizvoda ribozoma (DRIP-ovi) koji se nalaze u citosolu. MHC molekuli ljudi se takođe nazivaju humani leukocitni antigeni (HLA).

MHC molekuli klase I se mogu naći na većini ćelija koje sadrže jedro koje prezentuju peptide koji nastaju kao posledica proteolitičkog cepanja uglavnom endogenih proteina, proteina citosola ili jedra, DRIP-ova i većih peptida. Međutim na MHC molekulima klase I se često nalaze i peptidi dobijeni iz endozoma ili egzogenih izvora. Ovaj neklasičan način prezentacije klase I se u literaturi naziva unakrsna prezentacija.

Budući da obe vrste odgovora, CD8 i CD4-zavisan, zajednički i sinergistički doprinose antitumorskom efektu, identifikacija i karakterizacija tumor-asociranih antigena prepoznatih pomoću ili CD8-pozitivnih CTL (MHC molekul klase I) ili pomoću CD4-pozitivnih CTL (MHC molekul klase II) važna je u razvoju tumorskih vakcina. Zato je cilj predmetnog

11

pronalaska, da obezbedi smeše peptida koje sadrže peptide koji se vezuju za MHC komplekse bilo koje od ove dve klase.

Imajući u vidu ozbiljna neželjena dejstva i trošak u vezi sa lečenjem raka preko su potrebni bolji metodi prognoze i dijagnostikovanja. Zato, postoji potreba da se identifikuju drugi faktori koji predstavljaju biomarkere za rak uopšte i konkretno za HLL. Pored toga, postoji potreba da se identifikuju faktori koji mogu da se koriste u lečenju raka uopšte i konkretno HLL.

Predmetni pronalazak obezbeđuje peptide koji su korisni u lečenju raka / tumora, poželjno HLL koji prekomerno ili isključivo prezentuju peptide pronalaska. Za ove peptide je pokazano masenom spektrometrijom da ih prirodno prezentuju HLA molekuli na primarnim humanim uzorcima HLL.

Za izvorni gen/protein (takođe nazvan „protein kompletne dužine“ ili „osnovni protein“) od kojeg se dobijaju peptidi pokazano je da je visoko prekomerno eksprimiran u bolesnim (npr. kanceroznim) tkivima u poređenju sa zdravim. „Normalna tkiva“ u pogledu ovog pronalaska posebno će označavati uzorak krvi od zdravog donora i potpopulacije krvnih ćelija, posebno belih krvnih ćelija, (vidite primer 2 i sliku 2) koja pokazuju visok stepen tumorske asocijacije izvornih gena. Štaviše, sami peptidi su snažno prekomerno prezentovani na tumorskom tkivu – „tumorsko tkivo“ u pogledu ovog pronalaska će označavati uzorak od pacijenta koji boluje od HLL i potpopulacije krvnih ćelija, posebno belih krvnih ćelija, ali ne na normalnim tkivima (vidite primer 3 i sliku 3).

HLA-vezani peptidi mogu da budu prepoznati od strane imunskog sistema, specifično T limfocita/T ćelija. T ćelije mogu da unište ćelije koje prezentuju prepoznati kompleks HLA/peptid, npr. ćelije koje prezentuju peptide predmetnog pronalaska koji su dobijeni od njihovih osnovnih proteina.

Za prikazane peptide je dokazano da su sposobni da stimulišu T-ćelijske odgovore i/ili da su prekomerno prezentovani i da samim tim mogu da se koriste za proizvodnju antitela i/ili TCR,

11

konkretno sTCR, u skladu sa predmetnim pronalaskom (vidite primer 4 i sliku 4). Pored toga, peptidi, kada su u kompleksu sa odgovarajućim MHC, mogu takođe da se koriste za proizvodnju antitela i/ili TCR, konkretno sTCR, u skladu sa predmetnim pronalaskom. Odgovarajući metodi dobro su poznati osobi stručnoj u ovoj oblasti i mogu se naći i u odgovarajućoj literaturi. Tako su peptidi predmetnog pronalaska korisni za generisanje imunskog odgovora kod pacijenta pomoću kojeg mogu da se unište tumorske ćelije. Imunski odgovor kod pacijenta može da se indukuje direktnim davanjem opisanih peptida ili prikladnih prekursorskih supstanci (npr. produženi peptidi, proteini, ili nukleinske kiseline koje kodiraju ove peptide) pacijentu, idealno u kombinaciji sa agensom koji pojačava imunogenost (tj. adjuvansom). Može se očekivati da imunski odgovor koji potiče od takve terapeutske vakcinacije bude visoko specifičan protiv tumorskih ćelija zato što ciljni peptidi predmetnog pronalaska nisu prezentovani na normalnim tkivima u uporedivom broju kopija, čime se sprečava rizik od neželjenih autoimunskih reakcija protiv normalnih ćelija kod pacijenta.

„Farmaceutska smeša“ je smeša koja je pogodna za davanje ljudskom biću u medicinskim okolnostima. Poželjno, navedena farmaceutska smeša je sterilna i proizvedena u skladu sa smernicama Dobre proizvođačke prakse (DPP).

Farmaceutske smeše sadrže peptide ili u slobodnom obliku ili u obliku farmaceutski prihvatljive soli (pogledajte ranije u tekstu). Na način kako je korišćen u ovom tekstu, termin „farmaceutski prihvatljiva so“ odnosi se na derivat opisanih peptida, naznačeno time što je peptid modifikovan pravljenjem kiselih ili baznih soli agensa. Na primer, kisele soli se dobijaju od slobodne baze (tipično naznačeno time što neutralni oblik leka ima neutralnu -NH2grupu), što uključuje reakciju sa pogodnom kiselinom. Pogodne kiseline za dobijanje kiselih soli uključuju i organske kiseline, npr. sirćetna kiselina, propionska kiselina, glikolna kiselina, piruvična kiselina, oksalna kiselina, jabučna kiselina, malonska kiselina, ćilibarna kiselina, maleinska kiselina, fumarna kiselina, vinska kiselina, limunska kiselina, benzojeva kiselina, cimetna kiselina, bademova kiselina, metansulfonska kiselina, etansulfonska kiselina, p-toluensulfonska kiselina, salicilna kiselina, i slično, kao i neorganske kiseline, npr. hlorovodonična kiselina, bromovodonična kiselina, sumporna kiselina, azotna kiselina,

11

fosforna kiselina i slične. Obratno, preparati baznih soli iz kiselih delova koji mogu biti prisutni na peptidu dobijaju se upotrebom farmaceutski prihvatljive baze kao što je natrijum hidroksid, kalijum hidroksid, amonijum hidroksid, kalcijum hidroksid, trimetilamin ili slične.

U jednom posebno poželjnom otelotvorenju, farmaceutske smeše sadrže peptide u vidu soli sirćetne kiseline (acetati), trifluoro acetata ili hlorovodonične kiseline (hloridi).

Peptidi predmetnog pronalaska mogu da se koriste za stvaranje i razvoj specifičnih antitela protiv kompleksa MHC/peptid. Ona se mogu koristiti za terapiju, tako što će ciljno dovoditi toksine ili radioaktivne supstance u obolelo tkivo. Druga primena ovih antitela može biti ciljno dovođenje radionuklida u obolelo tkivo u svrhe imidžinga kao što je PET. Ova primena može pomoći da se detektuju male metastaze ili utvrdi veličina i precizna lokacija obolelih tkiva.

Zato, dalji aspekt pronalaska je obezbeđivanje metoda za proizvodnju rekombinantnog antitela koje se specifično vezuje za humani glavni kompleks gena tkivne podudarnosti (MHC) klase I koji je u kompleksu sa HLA-restrikovanim antigenom, pri čemu se metod sastoji od: imunizacije genetičkim inžinjeringom napravljenog nehumanog sisara koji sadrži ćelije koje eksprimiraju navedeni humani glavni kompleks gena tkivne podudarnosti (MHC) klase I sa solubilnim oblikom MHC molekula klase I koji je u kompleksu sa navedenim HLA-restrikovanim antigenom; izolacije molekula iRNK iz ćelija navedenog sisara koji nije čovek koje proizvode antitela; proizvodnje biblioteke prikaza faga koja prikazuje molekule proteina kodiranih navedenim molekulima iRNK; i izolacije najmanje jednog faga iz navedene biblioteke prikaza faga, pri čemu taj navedeni najmanje jedan fag prikazuje navedeno antitelo koje se specifično vezuje za navedeni humani glavni kompleks gena tkivne podudarnosti (MHC) klase I koji je u kompleksu sa navedenim HLA-restrikovanim antigenom.

Dalji je aspekt pronalaska da se obezbedi antitelo koje se specifično vezuje za humani glavni kompleks gena tkivne podudarnosti (MHC) klase I koji je u kompleksu sa HLA-restrikovanim antigenom, naznačeno time što je antitelo poželjno poliklonalno antitelo, monoklonalno antitelo, bispecifično antitelo i/ili himerno antitelo.

11

Još jedan aspekt predmetnog pronalaska odnosi se na metod proizvodnje navedenog antitela koje se specifično vezuje za humani glavni kompleks gena tkivne podudarnosti (MHC) klase I koji je u kompleksu sa HLA-restrikovanim antigenom, pri čemu se metod sastoji od: imunizacije genetičkim inžinjeringom napravljenog nehumanog sisara koji sadrži ćelije koje eksprimiraju navedeni humani glavni kompleks gena tkivne podudarnosti (MHC) klase I sa solubilnim oblikom MHC molekula klase I koji je u kompleksu sa navedenim HLA-restrikovanim antigenom; izolacije molekula iRNK iz ćelija navedenog sisara koji nije čovek koje proizvode antitela; proizvodnje biblioteke prikaza faga koja prikazuje molekule proteina kodiranih navedenim molekulima iRNK; i izolacije najmanje jednog faga iz navedene biblioteke prikaza faga, pri čemu taj navedeni najmanje jedan fag prikazuje navedeno antitelo koje je u stanju da se specifično veže za navedeni humani glavni kompleks gena tkivne podudarnosti (MHC) klase I koji je u kompleksu sa navedenim HLA-restrikovanim antigenom. Odgovarajući metodi za proizvodnju takvih antitela i jednolančanih glavnih kompleksa gena tkivne podudarnosti klase I, kao i ostali alati za proizvodnju ovih antitela izneti su u patentima WO 03/068201, WO 2004/084798, WO 01/72768, WO 03/070752, kao i radovima Cohen CJ, et al. Recombinant antibodies with MHC-restricted, peptide-specific, T-cell receptor-like specificity: new tools to study antigen presentation and TCR-peptide-MHC interactions. J Mol Recognit.2003 Sep-Oct;16(5):324-32.; Denkberg G, et al. Selective targeting of melanoma and APCs using a recombinant antibody with TCR-like specificity directed toward a melanoma differentiation antigen. J Immunol. 2003 Sep 1;171 (5):2197-207; i Cohen CJ, et al. Direct phenotypic analysis of human MHC class I antigen presentation: visualization, quantitation, and in situ detection of human viral epitopes using peptide-specific, MHC-restricted human recombinant antibodies. J Immunol. 2003 Apr 15; 170(8):4349-61.

Poželjno, antitelo se vezuje za kompleks sa afinitetom vezivanja manjim od 20 nanomol/l, poželjno ispod 10 nanomol/l, što se u kontekstu predmetnog pronalaska smatra „specifičnim“.

Dalji je aspekt pronalaska da se obezbedi metod za proizvodnju rastvorljivog T-ćelijskog receptora koji prepoznaje specifični kompleks peptid-MHC. Takvi rastvorljivi T-ćelijski receptori mogu da se naprave od specifičnih T-ćelijskih klonova, a njihov afinitet može da se

11

poveća pomoću mutageneze koja cilja komplementarne determinišuće regione. U svrhe odabira T-ćelijskog receptora, može se koristiti prikaz faga (US 2010/0113300, Liddy N, et al. Monoclonal TCR-redirected tumor cell killing. Nat Med 2012 Jun;18(6):980-987). U svrhu stabilizacije T-ćelijskih receptora u toku prikaza faga i u slučaju praktične primene u vidu leka, alfa i beta lanac mogu da se povežu, npr. neprirodnim disulfidnim vezama, bilo kovalnetnim vezama (jednolančani T-ćelijski receptor) ili pomoću domena dimerizacije (vidite rad Boulter JM, et al. Stable, soluble T-cell receptor molecules for crystallization and therapeutics. Protein Eng 2003 Sep;16(9):707-711.; Card KF, et al. A soluble single-chain T-cell receptor IL-2 fusion protein retains MHC-restricted peptide specificity and IL-2 bioactivity. Cancer Immunol Immunother 2004 Apr;53(4):345-357; i Willcox BE, et al. Production of soluble alphabeta T-cell receptor heterodimers suitable for biophysical analysis of ligand binding. Protein Sci 1999 Nov; 8 (11 ):2418-2423). T-ćelijski receptor može biti povezan sa toksinima, lekovima, citokinima (vidite patent US 2013/0115191), domenima koji regrutuju efektorske ćelije kao što je anti-CD3 domen, itd. kako bi se izvršile određene funkcije na ciljnim ćelijama. Pored toga, on može biti eksprimiran u T ćelijama koje se koriste za adoptivni transfer.

Dalje informacije se mogu naći u patentima WO 2004/033685A1 i WO 2004/074322A1. Kombinacija sTCR opisana je u WO 2012/056407A1. Dalji metodi za proizvodnju izneti su u WO 2013/057586A1.

Pored toga, ona mogu da se koriste za verifikaciju dijagnoze malignog tumora patologa postavljene na osnovu uzorka biopsije.

Da bi se izabrali prekomerno prezentovani peptidi, izračunava se profil prezentacije koji pokazuje srednju prezentaciju uzorka kao i varijaciju replikata. Profil postavlja jedno uz drugo uzorke tumora od interesovanja sa polaznim vrednostima uzoraka normalnog tkiva. Svaki od ovih profila može zatim biti konsolidovan u rezultat prekomerne prezentacije pomoću izračunavanja p-vrednosti modela linearnih mešovitih efekata (J. Pinheiro, et al. The nlme Package: Linear and Nonlinear Mixed Effects Models. 2007) uz prilagođavanje za višestruko testiranje pomoću stope lažnog otkrivanja (Y. Benjamini and Y. Hochberg.

12

Controlling the False Discovery Rate: A Practical and Powerful Approach to Multiple Testing. Journal of the Royal Statistical Society. Series B (Methodological), Vol.57 (No.1):289- 300, 1995).

Radi identifikacije i relativne kvantifikacije HLA liganada pomoću masene spektrometrije, HLA molekuli iz uzoraka tkiva zamrznutih brzim zamrzavanjem su prečišćeni a HLA-asocirani peptidi su izolovani. Izolovani peptidi su razdvojeni a sekvence su identifikovane pomoću onlajn eksperimenata nano-elektrosprej-jonizacije (nanoESI) tečne hromatografijemasene spektrometrije (LC-MS). Tako dobijene peptidne sekvence su potvrđene poređenjem obrasca fragmentacije prirodnih TUMAP zabeleženog iz uzoraka HLL sa obrascima fragmentacije odgovarajućih sintetičkih referentnih peptida identičnih sekvenci. Budući da su peptidi direktno identifikovani kao ligandi HLA molekula primarnih tumora, ovi rezultati daju direktan dokaz za prirodnu obradu i prezentaciju identifikovanih peptida na tkivu primarnog karcinoma dobijenog od pacijenata sa HLL.

Linija korišćena u otkriću XPRESIDENT® v2.1 (vidite na primer US 2013-0096016 koji je ovde u celosti uključen u reference) omogućava identifikaciju i selekciju relevantnih prekomerno prezentovanih peptida kandidata za vakcinu na osnovu direktne relativne kvantifikacije nivoa HLA-restrikovanog peptida na malignim tkivima u poređenju sa nekoliko različitih nemalignih tkiva i organa. Ovo je postignuto razvojem diferencijalne kvantifikacije bez obeležavanja primenom podataka dobijenih pomoću LC-MS koji su obrađeni vlasničkom linijom za analizu podataka, kombinovanjem algoritama za identifikaciju sekvence, grupisanje spektra, brojanje jona, poravnanje vremena zadržavanja, slabljenje naelektrisanog stanja i normalizaciju.

Ustanovljeni su nivoi prezentacije uključujući procene greške za svaki peptid i uzorak. Identifikovani su peptidi koji su isključivo prezentovani na tumorskom tkivu i peptidi koji su prekomerno prezentovani u tumorskim u poređenju sa nemalignim tkivima i organima.

Kompleksi HLA-peptid iz uzoraka HLL tkiva su prečišćeni a HLA-asocirani peptidi su izolovani i analizirani pomoću LC-MS (vidite primere). Svi TUMAP koji su sadržani u predmetnoj aplikaciji ovim pristupom su identifikovani na uzorcima primarne HLL čime je potvrđena njihova prezentacija na primarnoj HLL.

Svi TUMAP koji su sadržani u navedenoj aplikaciji ovim pristupom su identifikovani na uzorcima primarne HLL čime je potvrđena njihova prezentacija na primarnoj HLL.

TUMAP identifikovani na multiplim HLL tumorskim i normalnim tkivima kvantifikovani su pomoću brojanja jona LC-MS podataka bez obeležavanja. Metod pretpostavlja da oblasti LC-MS signala peptida koreliraju sa njegovom obilnošću u uzorku. Svi kvantitativni signali peptida u raznim LC-MS eksperimentima su normalizovani na osnovu centralne tendencije, uprosečene po uzorku i sjedinjeni u stubičasti dijagram, koji se naziva profil prezentacije. Profil prezentacije objedinjuje različite metode analize kao što su pretraživanje baze podataka proteina, grupisanje spektra, slabljenje naelektrisanog stanja (gubitak naelektrisanja) i poravnanje vremena zadržavanja i normalizaciju.

Predmetni pronalazak se stoga odnosi na peptid dužine između 10 i 30 aminokiselina, koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja se sastoji od ID BR. SEKV: 167, ili njenu farmaceutski prihvatljivu so.

Predmetni pronalazak se dalje odnosi na peptide u skladu sa pronalaskom koji imaju sposobnost da se vežu za molekul klase I humanog glavnog kompleksa gena tkivne podudarnosti (MHC).

Predmetni pronalazak se dalje odnosi na peptide u skladu sa pronalaskom naznačene time što peptid sadrži aminokiselinsku sekvencu prema ID BR. SEKV: 167.

Predmetni pronalazak se dalje odnosi na peptide u skladu sa pronalaskom, naznačene time što peptid sadrži nepeptidne veze.

Predmetni pronalazak se dalje odnosi na peptide u skladu sa pronalaskom naznačene time što je peptid fuzioni protein koji sadrži (a) aminokiselinsku sekvencu koja se sastoji od ID BR. SEKV: 167 i (b) N-terminalne aminokiseline 1-80 HLA-DR antigen-asociranog nepromenljivog lanca (li).

Predmetni pronalazak se dalje odnosi na nukleinsku kiselinu koja kodira peptide u skladu sa pronalaskom.

Predmetni pronalazak se dalje odnosi na nukleinsku kiselinu u skladu sa pronalaskom koja je DNK, cDNK, PNK, RNK ili njihova kombinacija.

Predmetni pronalazak se dalje odnosi na vektor ekspresije koji eksprimira nukleinsku kiselinu u skladu sa pronalaskom.

Predmetni pronalazak se dalje odnosi na ćeliju domaćina koja sadrži nukleinsku kiselinu u skladu sa pronalaskom ili vektor ekspresije u skladu sa pronalaskom.

Predmetni pronalazak se dalje odnosi na ćeliju domaćina u skladu sa pronalaskom koja je antigen-prezentujuća ćelija.

Predmetni pronalazak se dalje odnosi na ćeliju domaćina u skladu sa pronalaskom, naznačeno time što je antigen-prezentujuća ćelija dendritična ćelija.

Predmetni pronalazak se dalje odnosi na metod proizvodnje peptida u skladu sa pronalaskom, pri čemu se metod sastoji od kultivisanja opisane ćelije domaćina i izolovanja peptida iz ćelije domaćina ili njenog medijuma za kultivaciju.

Predmetni pronalazak se dalje odnosi na in vitro metod za proizvodnju aktiviranih citotoksičnih T limfocita (CTL), pri čemu se metod sastoji od dovođenja u kontakt in vitro CTL sa humanim MHC molekulima klase I sa ubačenim antigenom eksprimiranim na površini prikladne antigen-prezentujuće ćelije u toku vremenskog perioda koji je dovoljan da se navedeni CTL aktiviraju na antigen-specifičan način, naznačeno time što je navedeni antigen bilo koji peptid u skladu sa pronalaskom.

Predmetni pronalazak se dalje odnosi na metod kako je opisan, naznačeno time što se

12

navedeni antigen postavlja na MHC molekule klase I eksprimirane na površini prikladne antigen-prezentujuće ćelije tako što se dovoljna količina antigena dovodi u kontakt sa antigenprezentujućom ćelijom.

Predmetni pronalazak se dalje odnosi na metod u skladu sa pronalaskom, naznačeno time što antigen-prezentujuća ćelija sadrži vektor ekspresije koji eksprimira navedeni peptid koji sadrži ID BR. SEKV: 167.

Predmetni pronalazak se dalje odnosi na aktivirane citotoksične T limfocite (CTL), proizvedene pomoću metoda u skladu sa pronalaskom, koji selektivno prepoznaju ćeliju koja aberantno eksprimira polipeptid koji sadrži opisanu aminokiselinsku sekvencu.

Predmetni pronalazak dalje predstavlja metod ubijanja ciljnih ćelija kod pacijenta čije ciljne ćelije aberantno eksprimiraju polipeptid koji sadrži bilo koju aminokiselinsku sekvencu u skladu sa pronalaskom, pri čemu metod obuhvata davanje pacijentu efikasnog broja citotoksičnih T limfocita (CTL) u skladu sa pronalaskom.

Predmetni pronalazak se dalje odnosi na svaki peptid u skladu sa pronalaskom, nukleinsku kiselinu u skladu sa pronalaskom, vektor ekspresije u skladu sa pronalaskom, ćeliju u skladu sa pronalaskom, ili aktivirani citotoksični T limfocit u skladu sa pronalaskom za primenu u vidu antitumorskog leka.

Predmetni pronalazak se dalje odnosi na upotrebu u skladu sa pronalaskom, naznačeno time što je lek vakcina.

Predmetni pronalazak se dalje odnosi na upotrebu u skladu sa pronalaskom, naznačeno time što su navedene ćelije malignog tumora ćelije HLL ili ćelije drugih nesolidnih tumora.

Termin „antitelo“ ili „antitela“ je u ovom dokumentu korišćen u širokom smislu i uključuje kako poliklonalna tako i monoklonalna antitela. Pored intaktnih ili „kompletnih“ molekula imunoglobulina, terminom „antitela“ su takođe obuhvaćeni i fragmenti ili polimeri tih molekula imunoglobulina i humanizovane verzije molekula imunoglobulina, ukoliko oni ispoljavaju bilo koje od željenih svojstava (npr. specifično vezivanje markerskog polipeptida HLL, isporučivanje toksina ćelijama HLL (leukemije) koje eksprimiraju markerski gen u povećanom stepenu, i/ili inhibicija aktivnosti markerskog polipeptida HLL) u skladu sa pronalaskom.

Kad god je to moguće, antitela pronalaska mogu da se nabave iz komercijalnih izvora. Antitela pronalaska mogu takođe biti napravljena pomoću dobro poznatih metoda. Osobi stručnoj u predmetnoj oblasti će biti poznato da za stvaranje antitela pronalaska mogu da se koriste ili markerski polipeptidi za HLL kompletne dužine ili njihovi fragmenti. Polipeptid koji će se koristiti za stvaranje antitela pronalaska može biti parcijalno ili kompletno prečišćen iz prirodnog izvora, ili može biti proizveden pomoću tehnika rekombinantne DNK.

Na primer, cDNK koja kodira peptid u skladu sa predmetnim pronalaskom, kao što je peptid u skladu sa ID BR. SEKV: 167, polipeptid, ili njegova varijanta ili fragment, može biti eksprimirana u prokariotskim ćelijama (npr. bakterije) ili eukariotskim ćelijama (npr. kvasnice, insekti ili ćelije sisara), nakon čega rekombinantni protein može da se prečisti i koristi za stvaranje preparata monoklonalnog ili poliklonalnog antitela koje se specifično vezuje za markerski polipeptid za HLL koji se koristi za stvaranje antitela u skladu sa pronalaskom.

Osoba stručna u predmetnoj oblasti će shvatiti da stvaranje dva ili više različitih skupova monoklonalnih ili poliklonalnih antitela maksimizira verovatnoću dobijanja antitela sa specifičnošću i afinitetom neophodnim za njegovu namenu (npr. ELISA, imunohistohemija, in vivo imidžing, terapija imunotoksinima). Antitela se testiraju za njihovu željenu aktivnost pomoću poznatih metoda, u skladu sa svrhom za koju će se antitela koristiti (npr. ELISA, imunohistohemija, imunoterapija, itd; za dalje smernice o stvaranju i testiranju antitela pogledajte, npr. Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1988, novo 2. izdanje 2013). Na primer, antitela mogu biti testirana ELISA ili vestern blot testom. Nakon njihove inicijalne in vitro karakterizacije, antitela namenjena za terapeutsku ili in vivo dijagnostičku upotrebu testiraju se u skladu sa poznatim metodama kliničkog testiranja.

12

Termin „monoklonalno antitelo“ na način na koji je korišćen u ovom dokumentu odnosi se na antitelo dobijeno iz značajno homogene populacije antitela, to jest, pojedinačna antitela koja sačinjavaju populaciju su identična izuzev za moguće prirodno javljajuće mutacije koje mogu biti prisutne u manjim količinama. Monoklonalna antitela opisana u ovom dokumentu specifično obuhvataju „himerna“ antitela u kojima je deo teškog i/ili lakog lanca identičan sa ili homologan sa korespondentnim sekvencama u antitelima dobijenim iz određenih vrsta ili koja pripadaju određenoj klasi ili potklasi antitela, dok je preostali deo lanca (lanaca) identičan sa ili homologan sa korespondentnim sekvencama u antitelima dobijenim iz drugih vrsta ili koja pripadaju drugoj klasi ili potklasi antitela, kao i fragmente takvih antitela, sve dok oni ispoljavaju željenu antagonističku aktivnost (patent registrovan u SAD pod brojem 4,816,567).

Monoklonalna antitela pronalaska mogu da se pripreme pomoću metoda hibridoma. U metodu hibridoma, miš ili druga odgovarajuća životinja domaćin se obično imunizuje sa sredstvom za imunizaciju kako bi se izazvali limfociti koji proizvode ili su u stanju da proizvode antitela koja će specifično da se vezuju za sredstvo za imunizaciju. Alternativno, imunizacija limfocita može da se izvrši in vitro.

Monoklonalna antitela mogu takođe da se naprave pomoću metoda rekombinantne DNK, kao što su one koje su opisane u patentu registrovanom u SAD pod brojem 4,816,567. DNK koja kodira monoklonalna antitela pronalaska može lako da se izoluje i sekvencionira pomoću konvencionalnih procedura (npr. primenom oligonukleotidnih proba koje su sposobne da se specifično vežu za gene koji kodiraju teške i lake lance mišjih antitela).

Za pripremanje monovalentnih antitela takođe su pogodne i in vitro metode. Digestija antitela u cilju proizvodnje njihovih fragmenata, konkretno, Fab fragmenata, može da se izvrši pomoću rutinskih tehnika poznatih u predmetnoj oblasti. Na primer, digestija može da se izvrši pomoću papaina. Primeri papainske digestije opisani su u dokumentu WO 94/29348 i patentu registrovanom u SAD pod brojem 4,342,566. Papainska digestija antitela tipično proizvodi dva identična fragmenta koja vezuju antigen, koji se nazivaju Fab fragmenti, i svaki sadrži jedno mesto za vezivanje antigena i rezidualni Fc fragment. Tretiranje pepsinom

12

proizvodi F(ab')2 fragment i pFc' fragment.

Fragmenti antitela, bilo da su povezani sa drugim sekvencama ili ne, mogu takođe uključivati insercije, delecije, supstitucije, ili druge izabrane modifikacije konkretnih regiona ili specifičnih aminokiselinskih ostataka, pod uslovom da aktivnost fragmenta nije značajno izmenjena ili narušena u poređenju sa nemodifikovanim antitelom ili fragmentom antitela. Ove modifikacije mogu obezbediti neka dodatna svojstva, kao što je uklanjanje/dodavanje aminokiselina sposobnih za disuflidno vezivanje, povećanje njegove biološke dugovečnosti, menjanje njegovih sekretornih karakteristika itd. U svakom slučaju, fragment antitela mora da poseduje bioaktivno svojstvo, kao što je aktivnost vezivanja, regulacija vezivanja na domenu za vezivanje, itd. Funkcionalni ili aktivni regioni antitela mogu biti identifikovani pomoću mutageneze specifičnog regiona proteina, nakon čega sledi ekspresija i testiranje eksprimiranog polipeptida. Takvi metodi su očigledni osobi stručnoj u predmetnoj oblasti i mogu uključivati mutagenezu specifičnu za mesto nukleinske kiseline koja kodira fragment antitela.

Antitela pronalaska mogu dalje da sadrže humanizovana antitela ili humana antitela. Humanizovani oblici nehumanih (npr. mišjih) antitela su himerni imunoglobulini, imunoglobulinski lanci ili njihovi fragmenti (poput Fv, Fab, Fab' ili druge podsekvence antitela koje vezuju antigen) koji sadrže najmanju sekvencu dobijenu iz nehumanog imunoglobulina. Humanizovana antitela uključuju humane imunoglobuline (recipijentno antitelo) u kojim su ostaci iz komplementarnog determinišućeg regiona (CDR) recipijenta zamenjeni ostacima iz CDR nehumanih vrsta (donorsko antitelo) kao što je miš, pacov ili zec koji imaju željenu specifičnost, afinitet i kapacitet. U nekim slučajevima, ostaci okvira Fv (FR) humanog imunoglobulina se zamenjuju odgovarajućim nehumanim ostacima. Humanizovana antitela mogu takođe da sadrže ostatke koji se ne nalaze niti u recipijentnom antitelu niti u uvezenim sekvencama CDR ili okvira. Uopšteno, humanizovano antitelo će u značajnoj meri da sadrži sve od najmanje jednog, i tipično dva, varijabilna domena, u kojem svi ili značajno svi CDR regioni odgovaraju regionima nehumanog imunoglobulina i svi ili značajno svi FR regioni su regioni konsenzus sekvence humanog imunoglobulina. Humanizovano antitelo će takođe optimalno sadržati najmanje deo konstantnog regiona

12

imunoglobulina (Fc), tipično iz humanog imunoglobulina.

Metodi humanizacije nehumanih antitela dobro su poznati u predmetnoj oblasti. Uopšteno, humanizovano antitelo ima jedan ili više aminokiselinskih ostataka uvedenih u njega iz izvora koji nije ljudski. Ovi nehumani aminokiselinski ostaci se često nazivaju „uvozni“ ostaci, koji se tipično uzimaju iz „uvoznog“ varijabilnog domena. Humanizacija se u suštini može izvršiti supstitucijom glodarskih CDR ili CDR sekvenci za korespondentne sekvence humanog antitela. U skladu sa tim, takva „humanizovana“ antitela su himerna antitela (patent registrovan u SAD pod brojem 4,816,567), naznačeno time što je značajno manje od intaktnog humanog varijabilnog domena supstituisano odgovarajućim sekvencama iz nehumanih vrsta. U praksi, humanizovana antitela su tipično humana antitela u kojima su neki CDR ostaci, a moguće i neki FR ostaci, supstituisani ostacima sa analognih mesta u antitelima glodara.

U ovu svrhu mogu da se upotrebe transgenske životinje (npr. miševi) koji su sposobni da nakon imunizacije proizvedu kompletan repertoar humanih antitela u odsustvu endogene proizvodnje imunoglobulina. Na primer, opisano je da homozigotna delecija gena koji kodira region spajanja teškog lanca antitela kod miševa sa himernom i gametskom mutacijom rezultira kompletnom inhibicijom endogene proizvodnje antitela. Transfer humanog gametskog niza gena za imunoglobuline u takve miševe sa gametskom mutacijom rezultovaće proizvodnjom humanih antitela nakon izazivanja od strane antigena. Humana antitela mogu takođe da se proizvedu u bibliotekama prikaza faga.

Antitela pronalaska se poželjno daju ispitaniku u farmaceutski prihvatljivom nosaču. Tipično, koristi se odgovarajuća količina farmaceutski prihvatljive soli za pravljenje formulacije kako bi se napravila izotona formulacija. Primeri farmaceutski prihvatljivog nosača uključuju fiziološki rastvor, Ringerov rastvor i rastvor dekstroze. pH rastvora je poželjno od oko 5 do oko 8, još poželjnije od oko 7 do oko 7,5. Dalji nosači obuhvataju preparate sa održivim oslobađanjem, kao što su polupropustljive matrice solidnih hidrofobnih polimera koji sadrže antitelo, pri čemu su matrice u obliku oblikovanih proizvoda, npr. filmovi, lipozomi ili mikročestice. Osobama stručnim u predmetnoj oblasti će biti očigledno da određeni nosači

12

mogu biti poželjniji u zavisnosti od, na primer, načina primene i koncentracije antitela koje se primenjuje.

Antitela se mogu dati ispitaniku, pacijentu ili ćeliji pomoću injekcije (npr. intravenska, intraperitonealna, potkožna, intramuskularna) ili pomoću drugih metoda kao što je infuzija, koje osiguravaju isporučivanje u cirkulaciju u efikasnom obliku. Antitela mogu takođe da se primene intratumorskim ili peritumorskim putevima, kako bi ispoljila lokalne kao i sistemske terapijske efekte. Preferira se lokalna ili intravenska injekcija.

Efikasne doze i režimi primene antitela mogu da se utvrde empirijski a takva određivanja spadaju u okvir veštine predmetne oblasti. Osobe stručne u predmetnoj oblasti će razumeti da će doza antitela, koja mora da se primeni, zavisiti od, na primer, ispitanika koji će dobiti antitelo, načina primene, konkretne vrste korišćenog antitela i drugih lekova koji se primenjuju. Tipična dnevna doza antitela koje se koristi samostalno može se kretati od oko 1 µg/kg do 100 mg/kg telesne težine ili više dnevno, u zavisnosti od gorepomenutih faktora. Nakon primene antitela za lečenje HLL, efikasnost terapijskog antitela može da se proceni na različite načine koji su dobro poznati osobi stručnoj u predmetnoj oblasti.

Antitela se takođe mogu koristiti za in vivo dijagnostičke eseje. Uopšteno, antitelo se obeležava radionuklidom (kao što je<111>In,<99>Tc,<14>C,<131>I,<3>H,<32>P ili<35>S) tako da se tumor može lokalizovati upotrebom imunoscintigrafije.

Antitela za dijagnostičku primenu mogu biti obeležena probama koje su prikladne za detekciju različitim imidžing metodama. Metode za detekciju proba uključuju, ali nisu i ograničene na, fluorescenciju, svetlosnu, konfokalnu i elektronsku mikroskopiju; imidžing magnetnom rezonancom i spektroskopiju; fluoroskopiju, kompjuterizovanu tomografiju i pozitronsku emisionu tomografiju. Prikladne probe uključuju, ali nisu i ograničene na, fluorescein, rodamin, eozin i druge fluorofore, radioizotope, zlato, gadolinijum i druge lantanide, paramagnetsko gvožđe, fluorin-18 i druge radionuklide koji emituju pozitrone. Pored toga, probe mogu biti bi- ili multi-funkcionalne i mogu se detektovati pomoću više od jednog od navedenih metoda. Ova antitela mogu biti direktno ili indirektno obeležena navedenim probama. Vezivanje proba za antitela uključuje kovalentno vezivanje probe,

12

inkorporaciju probe u antitelo, i kovalentno vezivanje helirajućeg jedinjenja za vezivanje probe, među ostalima koji su dobro poznati u predmetnoj oblasti. Za imunohistohemiju, uzorak obolelog tkiva može biti svež ili zamrznut ili može biti ukalupljen u parafin i fiksiran konzervansom kao što je formalin. Fiksirani ili ukalupljeni isečci koji sadrže uzorak dovode se u kontakt sa obeleženim primarnim antitelom i sekundarnim antitelom, naznačeno time što se antitelo koristi za detekciju ekspresije proteina in situ.

Predmetni pronalazak tako obezbeđuje peptid dužine između 10 i 30 aminokiselina, koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja se sastoji od ID BR. SEKV: 167, ili njenu farmaceutski prihvatljivu so.

Peptidi pronalaska imaju sposobnost da se vezuju za molekul humanog glavnog kompleksa gena tkivne podudarnosti (MHC) klase I.

U predmetnom pronalasku, termin „homologno“ odnosi se na stepen identiteta (vidite Procenat identičnosti ranije) između sekvenci dveju aminokiselinskih sekvenci, tj. peptidnih ili polipeptidnih sekvenci. Gore pomenuta „homologija“ utvrđena je upoređivanjem dve sekvence koje su poravnate pod optimalnim uslovima preko sekvenci koje se upoređuju. Takva homologija sekvence može da se izračuna kreiranjem poravnanja pomoću, na primer, ClustalW algoritma. Opšte dostupni softver za analizu sekvence, specifičnije, Vector NTI, GENETYX ili druge alatke za analizu dostupne su u javnim bazama podataka.

Osoba stručna u predmetnoj oblasti će moći da proceni da li će T ćelije koje su indukovane varijantom specifičnog peptida biti sposobne da unakrsno reaguju sa samim peptidom (Fong L, et al. Altered peptide ligand vaccination with Flt3 ligand expanded dendritic cells for tumor immunotherapy. Proc Natl Acad Sci USA. 2001 Jul 17;98(15):8809-14; Zaremba S, et al. Identification of an enhancer agonist cytotoxic T lymphocyte peptide from human carcinoembryonic antigen. Cancer Res. 1997 Oct 15;57(20):4570-7; Colombetti S, et al. Impact of orthologous melan-A peptide immunizations on the anti-self melan-A/HLA-A2 T cell cross-reactivity. J Immunol. 2006 Jun 1 ;176(11 ):6560-7; Appay V, et al. Decreased specific CD8+ T cell cross-reactivity of antigen recognition following vaccination with

1

Melan-A peptide. Eur J Immunol. 2006 Jul;36(7):1805-14).

CTL mogu naknadno da unakrsno reaguju sa ćelijama i ubijaju ćelije koje eksprimiraju polipeptid koji sadrži prirodnu aminokiselinsku sekvencu srodnog peptida kako je definisan u aspektima pronalaska. Kako se može izvesti iz naučne literature (Godkin A, et al. Use of eluted peptide sequence data to identify the binding characteristics of peptides to the insulindependent diabetes susceptibility allele HLA- DQ8 (DQ 3.2). Int Immunol. 1997 Jun;9(6):905-11) i baza podataka (Rammensee H. et al. SYFPEITHI: database for MHC ligands and peptide motifs. Immunogenetics. 1999 Nov;50(3-4):213-9), određene pozicije peptida koji vezuju HLA su tipično sidreni ostaci koji obrazuju jezgrenu sekvencu koja se uklapa u vezujući motiv HLA receptora, koji je definisan polarnim, elektrofizičkim, hidrofobnim i prostornim svojstvima polipeptidnih lanaca koji čine udubljenje za vezivanje.

Takođe, mogu biti prikladni i duži peptidi. Takođe je moguće da se obradom peptida iz dužih peptida ili proteina koji sadrže sam epitop, stvore epitopi MHC klase I, mada su oni obično dužine između 8 i 11 aminokiselina. Poželjno je da ostaci koji su bočni na aktuelni epitop budu ostaci koji ne ometaju u značajnoj meri proteolitičko cepanje koje je neophodno da bi se aktuelni epitop eksponirao tokom obrade.

U skladu sa tim, predmetni pronalazak takođe obezbeđuje peptide epitopa MHC klase I naznačene time što peptid ima ukupnu dužinu od između 10 i 30 aminokiselina.

Naravno, peptid u skladu sa predmetnim pronalaskom će imati sposobnost da se veže za molekul humanog glavnog kompleksa gena tkivne podudarnosti (MHC) klase I. Vezivanje peptida za MHC kompleks može da se testira pomoću metoda poznatih u predmetnoj oblasti.

U naročito preferiranom otelotvorenju pronalaska peptid se sastoji od aminokiselinske sekvence u skladu sa ID BR. SEKV: 167.

U jednom otelotvorenju predmetnog pronalaska, peptid je fuzioni protein koji sadrži, na primer, 80 N-terminalnih aminokiselina HLA-DR antigen-asociranog nepromenljivog lanca (p33, u nastavku koji je dobijen od američkog Nacionalnog centra za biotehnološke

1 1

informacije (NCBI), GenBank pristupni broj X00497. U drugim fuzijama, peptidi predmetnog pronalaska mogu biti fuzirani na antitelo kako je opisano u ovom dokumentu, ili na njegov funkcionalni deo, naročito u sekvencu antitela, tako da budu specifično ciljani od strane navedenog antitela, ili, na primer, na ili u antitelo koje je specifično za dendritične ćelije.

U reverznoj peptidnoj vezi, aminokiselinski ostaci nisu povezani peptidnim (-CO-NH-) vezama već je peptidna veza obrnuta. Takvi retro-inverzni peptidomimetici mogu biti napravljeni pomoću metoda poznatih u predmetnoj oblasti, na primer poput onih opisanih u radu Meziere et al (1997) J. Immunol. 159, 3230-3237. Ovaj pristup obuhvata pravljenje pseudopeptida koji sadrže izmene koje uključuju kostur, a ne orijentaciju bočnih lanaca. Meziere i saradnici (1997) pokazuju da su ovi pseudopeptidi korisni za vezivanje MHC i T-pomoćničke ćelijske odgovore. Retro-inverzni peptidi, koji sadrže NH-CO veze umesto CO-NH peptidnih veza, mnogo su otporniji na proteolizu.

Nepeptidna veza je, na primer, -CH2-NH, -CH2S-, -CH2CH2-, -CH=CH-, -COCH2-, -CH(OH)CH2- i -CH2SO-. Patent registrovan u Sjedinjenim Američkim Državama pod brojem 4,897,445 obezbeđuje metod za sintezu nepeptidnih veza (-CH2-NH) u čvrstoj fazi u polipeptidnim lancima koji uključuje polipeptide sintetisane pomoću standardnih postupaka i nepeptidnu vezu sintetisanu reakcijom aminoaldehida i aminokiseline u prisustvu NaCNBH3.

Peptidi koji sadrže sekvence opisane ranije mogu biti sintetisani tako da na svojim amino i/ili karboksi krajevima sadrže dodatne hemijske grupe, kako bi se pojačala stabilnost, bioraspoloživost i/ili afinitet peptida. Na primer, na amino krajevima peptida mogu da se dodaju hidrofobne grupe kao što su karbobenzoksil, dansil ili t-butiloksikarbonil grupa. Isto tako, na amino krajeve peptida mogu biti postavljene acetilna grupa ili 9-fluorenilmetoksikarbonilna grupa. Pored toga, na karboksi krajeve peptida mogu da se dodaju hidrofobna grupa, t-butiloksikarbonil, ili amido grupa.

Peptid, naznačen time što peptid sadrži nepeptidne veze, poželjno je otelotvorenje pronalaska. Uopšteno, peptidi (najmanje oni koji sadrže peptidne veze između aminokiselinskih ostataka) mogu da se sintetišu pomoću Fmoc-poliamid režima sinteze peptida u solidnoj fazi kako je

1 2

izloženo u radu Lukas et al. (Solid-phase peptide synthesis under continuous-flow conditions. Proc Natl Acad Sci USA. May 1981; 78(5): 2791–2795) i referencama u istom. Privremenu zaštitu N-amino grupe obezbeđuje 9-fluorenilmetiloksikarbonil (Fmoc) grupa. Ponovljeno cepanje ove zaštitne grupe koja je veoma labilna u bazama vrši se pomoću 20% piperidina u N,N-dimetilformamidu. Funkcionalne grupe bočnog lanca mogu da se zaštite u obliku njihovih butil etara (u slučaju serina, treonina i tirozina), butil estara (u slučaju glutaminske kiseline i asparaginske kiseline), butiloksikarbonil derivata (u slučaju lizina i histidina), tritil derivata (u slučaju cisteina) i 4-metoksi-2,3,6-trimetilbenzensulfonil derivata (u slučaju arginina). Kada su glutamin ili asparagin C-terminalni ostaci, za zaštitu amido funkcionalnih grupa bočnog lanca koristi se 4,4'-dimetoksibenzhidril grupa. Potpora solidne faze zasniva se na polidimetil-akrilamid polimeru koji se sastoji od tri monomera dimetilakrilamida (monomer kostura), bisakriloiletilen diamina (unakrsni povezivač) i akriloilsarkozin metil estra (agens za funkcionalizaciju). Odvojivi vezani agens peptid-smola koji se koristi je derivat 4-hidroksimetil-fenoksisirćetne kiseline koji je nestabilan u kiselinama. Svi derivati aminokiselina se dodaju u obliku njihovih prethodno formiranih simetričnih anhidridnih derivata, sa izuzetkom asparagina i glutamina, koji se dodaju pomoću procedure reverznog kuplovanja posredstvom N, N-dicikloheksil-karbodiimida/1 hidroksibenzotriazola. Sve reakcije spajanja i deprotekcije se prate pomoću ninhidrin, trinitrobenzen sulfonska kiselina ili izotin test procedura. Nakon završetka sinteze, peptidi se odvajaju od potpore od smole sa istovremenim uklanjanjem zaštitnih grupa bočnog lanca tretiranjem sa 95% trifluorosirćetnom kiselinom koja sadrži 50% smešu čistača. Čistači koji se uobičajeno koriste obuhvataju etanditiol, fenol, anizol i vodu, pri čemu tačan izbor zavisi od konstituentnih aminokiselina peptida koji se sintetizuje. Takođe je moguća kombinacija metodologija za solidnu fazu i fazu rastvora za sintezu peptida (pogledajte, na primer, rad Bruckdorfer et al., 2004 i reference koje su tamo citirane).

Trifluorsirćetna kiselina se uklanja evaporacijom in vacuo,, uz naknadnu trituraciju dietil etrom, što obezbeđuje sirovi peptid. Svi prisutni čistači se uklanjaju jednostavnim postupkom ekstrakcije koji po liofilizaciji vodene faze obezbeđuje sirovi peptid bez čistača. Reagensi za sintezu peptida su generalno dostupni kod npr. kompanije Calbiochem-Novabiochem (UK) Ltd, Nottingham NG72QJ, UK.

1

Prečišćavanje može da se vrši pomoću bilo koje tehnike, ili kombinacije tehnika kao što su rekristalizacija, ekskluziona hromatografija, jonoizmenjivačka hromatografija, hidrofobna hromatografija i (obično) reverzno-fazna tečna hromatografija visokih performansi upotrebom npr. acetonitril/voda gradijenta separacije.

Analiza peptida može da se sprovede upotrebom hromatografije na tankom sloju, elektroforeze, konkretno kapilarne elektroforeze, ekstrakcije iz čvrste faze (CSPE), reverznofazne tečne hromatografije visokih performansi, analizom aminokiselina nakon kisele hidrolize i pomoću maseno spektrometrijske analize korišćenjem bombardovanja brzim atomima (FAB), kao i MALDI i ESI-Q-TOF maseno spektrometrijske analize.

Dalji aspekt pronalaska obezbeđuje nukleinsku kiselinu (na primer polinukleotid) koja kodira peptid pronalaska. Polinukleotid može biti, na primer, DNK, cDNK, PNK, RNK ili njihove kombinacije, bilo jedno- i/ili dvolančana, ili nativni ili stabilizovani oblici polinukleotida, kao što su, na primer, polinukleotidi sa fosforotioatnim kosturom i oni mogu i ne moraju sadržati introne sve dok kodiraju peptid. Naravno, polinukleotid može da kodira isključivo peptide koji sadrže prirodno postojeće aminokiselinske ostatke spojene prirodnim peptidnim vezama. Još jedan aspekt pronalaska obezbeđuje vektor ekspresije koji je sposoban da eksprimira polipeptid u skladu sa pronalaskom.

Razvijeni su raznovrsni metodi za povezivanje polinukleotida, naročito DNK, sa vektorima, na primer, preko komplementarno kohezivnih terminusa. Na primer, komplementarni homopolimerni traktovi mogu da se dodaju na DNK segment koji se umeće u vektorsku DNK. Vektor i DNK segment se zatim spajaju vodoničnom vezom između komplementarnih homopolimernih repova kako bi se obrazovali molekuli rekombinantne DNK.

Sintetički povezivači koji sadrže jedno ili više restrikcionih mesta obezbeđuju alternativni metod za spajanje DNK segmenta sa vektorima. Sintetički povezivači koji sadrže raznovrsna restrikciona endonukleazna mesta komercijalno su dostupni iz velikog broja izvora, uključujući International Biotechnologies Inc., New Haven, CN, SAD.

1 4

Poželjan metod modifikovanja DNK koja kodira polipeptid pronalaska koristi lančanu reakciju polimeraze koja je izneta od strane Saiki RK, et al. (Diagnosis of sickle cell anemia and beta-thalassemia with enzymatically amplified DNA and nonradioactive allele-specific oligonucleotide probes. N Engl J Med. 1988 Sep 1;319(9):537-41). Ovaj metod može da se koristi za uvođenje DNK u pogodan vektor, na primer, ugradnjom u prikladna restrikciona mesta, ili se može koristiti za modifikaciju DNK na druge korisne načine koji su poznati u predmetnoj oblasti. Ako se koriste virusni vektori, poželjni su poks- ili adenovirus vektori.

DNK (ili u slučaju retrovirusnih vektora, RNK) može zatim da se eksprimira u prikladnom domaćinu kako bi proizvodio polipeptid koji sadrži peptid pronalaska. Tako, DNK koja kodira peptid ili varijantu pronalaska može da se koristi u skladu sa poznatim tehnikama, odgovarajuće modifikovanih u smislu ovde sadržanih učenja, radi konstruisanja vektora ekspresije, koji se zatim koristi da se odgovarajuća ćelija domaćin transformiše za ekspresiju i proizvodnju polipeptida pronalaska. Takve tehnike uključuju one izložene u patentima registrovanim u SAD pod br. 4,440,859, 4,530,901, 4,582,800, 4,677,063, 4,678,751, 4,704,362, 4,710,463, 4,757,006, 4,766,075 i 4,810,648.

DNK (ili u slučaju retrovirusnih vektora, RNK) koja kodira polipeptid koji sačinjava jedinjenje pronalaska može da se spoji sa širokim spektrom drugih DNK sekvenci za uvođenje u odgovarajućeg domaćina. Pridružena DNK će zavisiti od prirode domaćina, načina uvođenja DNK u domaćina, i od toga da li se želi epizomalno održavanje ili integracija.

Uopšteno, DNK se umeće u vektor ekspresije, kao što je plazmid, u pravilnoj orijentaciji i pravom okviru čitanja za ekspresiju. Ako je neophodno, DNK može da se poveže sa odgovarajućim regulatornim kontrolnim nukleotidnim sekvencama za transkripciju i translaciju koje prepoznaje željeni domaćin, iako su takve kontrole generalno dostupne u vektoru ekspresije. Vektor se zatim standardnim tehnikama uvodi u domaćina. Uopšteno, vektor neće transformisati sve domaćine. Zato će biti neophodno da se izaberu transformisane ćelije domaćini. Jedna tehnika selekcije obuhvata inkorporiranje DNK sekvence u vektor ekspresije, sa svim neophodnim kontrolnim elementima, koja kodira osobinu po izboru u

1

transformisanoj ćeliji, kao što je otpornost na antibiotike.

Alternativno, gen za takvu osobinu po izboru može biti na drugom vektoru, koji se koristi za kotransformaciju željene ćelije domaćina.

Ćelije domaćini koje su transformisane pomoću rekombinantne DNK pronalaska se zatim kultiviraju dovoljno dugo i u odgovarajućim uslovima koji su poznati osobama stručnim u predmetnoj oblasti, uzimajući u obzir učenja izneta u ovom dokumentu, kako bi se omogućila ekspresija polipeptida, koji nakon toga može da se prikupi.

Poznati su mnogi sistemi za ekspresiju, uključujući bakterije (na primer E. coli i Bacillus subtilis), kvasnice (na primer Saccharomyces cerevisiae), filamentozne gljivice (na primer Aspergillus spec.), biljne ćelije, životinjske ćelije i ćelije insekata. Poželjno, sistem mogu biti ćelije sisara kao što su CHO ćelije dostupne iz ATCC kolekcije biologije ćelija.

Tipični plazmidni vektor ćelije sisara za konstitutivnu ekspresiju sadrži CMV ili SV40 promoter sa prikladnim poli A repom i markerom rezistencije, kao što je neomicin. Jedan primer je pSVL koji je dostupan kod kompanije Pharmacia, Piscataway, NJ, SAD. Primer inducibilnog sisarskog vektora ekspresije je pMSG, koji je takođe dostupan kod kompanije Pharmacia. Korisni kvasnički plazmidni vektori su pRS403-406 i pRS413-416 koji su generalno dostupni kod kompanije Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA 92037, SAD. Plazmidi pRS403, pRS404, pRS405 i pRS406 su integrišući plazmidi kvasnice (YIps) i inkorporiraju selektivne markere kvasnica HIS3, TRP1, LEU2 i URA3. Plazmidi pRS413-416 su centromerni plazmidi kvasnice (Ycps). Vektori zasnovani na CMV promoteru (na primer, kompanije Sigma-Aldrich) obezbeđuju prolaznu ili stabilnu ekspresiju, citoplazmatsku ekspresiju ili sekreciju, i N-terminalno ili C-terminalno označavanje u različitim kombinacijama FLAG, 3xFLAG, c-myc ili MAT. Ovi fuzioni proteini omogućavaju detekciju, prečišćavanje i analizu rekombinantnog proteina. Dvostruko označene fuzije obezbeđuju fleksibilnost prilikom detekcije.

Snažni regulatorni region, humani citomegalovirus (CMV) promoter dovodi nivoe ekspresije

1

konstitutivnog proteina čak i do 1 mg/l u COS ćelijama. Za manje potentne ćelijske linije, nivoi proteina su tipično -0,1 mg/l. Prisustvo izvora SV40 replikacije će rezultovati visokim nivoima DNK replikacije u COS ćelijama koje dozvoljavaju replikaciju SV40. CMV vektori, na primer, mogu sadržati izvor pMB1 (derivat pBR322) za replikaciju u bakterijskim ćelijama, gen za b-laktamazu za izbor rezistencije na ampicilin u bakterijama, hGH poliA i izvor f1. Vektori koji sadrže preprotripsin (PPT) vodeću sekvencu mogu usmeriti sekreciju FLAG fuzionih proteina u medijum za kultivaciju za prečišćavanje pomoću ANTI-FLAG antitela, smola i pločica. Drugi vektori i sistemi za ekspresiju su dobro poznati u predmetnoj oblasti za upotrebu sa raznim ćelijama domaćinima.

U drugom otelotvorenju dva ili više peptida pronalaska su kodirani i samim tim eksprimirani po sukcesivnom redosledu (slično konstruktima „brojanica“). Pritom, peptidi mogu biti povezani ili spojeni zajedno pomoću regija povezujućih aminokiselina, kao što je na primer LLLLLL, ili mogu biti povezani bez bilo kakvih dodatnih peptida između njih.

Predmetni pronalazak se takođe odnosi na ćeliju domaćina koja je transformisana sa konstruktom vektora polinukleotida predmetnog pronalaska. Ćelija domaćin može biti prokariotska ili eukariotska. Bakterijske ćelije mogu biti preferirane prokariotske ćelije domaćini u nekim okolnostima i tipično su soj E. coli kao što su, na primer, sojevi E. coli DH5 dostupan kod kompanije Bethesda Research Laboratories Inc., Bethesda, MD, SAD, i RR1 dostupan kod organizacije American Type Culture Collection (ATCC) iz mesta Rockville, MD, SAD (Br. ATCC 31343). Preferirane eukariotske ćelije domaćini obuhvataju kvasnice, ćelije insekata i sisara, poželjno ćelije kičmenjaka kao što su ćelije miševa, pacova, majmuna ili humane fibroblastne ćelijske linije i ćelijske linije kolona. Ćelije domaćini kvasnica uključuju YPH499, YPH500 i YPH501, koje su generalno dostupne kod kompanije Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA 92037, SAD. Preferirane ćelije domaćini sisara uključuju ovarijalne ćelije kineskog hrčka (CHO) dostupne kod organizacije ATCC kao CCL61, NIH embrionske ćelije švajcarskog miša NIH/3T3 dostupne kod organizacije ATCC kao CRL 1658, COS-1 ćelije dobijene iz bubrega majmuna dostupne kod organizacije ATCC kao CRL 1650 i 293 ćelije koje su humane embrionske ćelije bubrega. Preferirane ćelije insekata su Sf9 ćelije koje mogu da se transfektuju sa bakulovirusnim vektorima ekspresije.

1

Kratak pregled izbora pogodnih ćelija domaćina za ekspresiju može se naći u, na primer, udžbeniku autora Paulina Balbás i Argelia Lorence „Methods in Molecular Biology Recombinant Gene Expression, Reviews and Protocols“, deo jedan, drugo izdanje, ISBN 978-158829-262-9, i drugoj literaturi poznatoj stručnoj osobi.

Transformacija odgovarajućih ćelija domaćina sa DNK konstruktom predmetnog pronalaska postiže se dobro poznatim metodama koje tipično zavise od vrste korišćenog vektora. U pogledu transformacije prokariotskih ćelija domaćina, pogledajte, na primer, Cohen et al (1972) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69, 2110, i Sambrook et al (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY. Transformacija ćelija kvasnica opisana je u radu Sherman et al (1986) Methods In Yeast Genetics, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY. Metod koji je izložio Beggs (1978) Nature 275,104-109 takođe je koristan. U pogledu ćelija kičmenjaka, reagensi koji su korisni za transfekciju takvih ćelija, na primer kalcijum fosfat i DEAE-dekstran ili formulacije lipozoma, dostupni su kod kompanije Stratagene Cloning Systems ili Life Technologies Inc., Gaithersburg, MD 20877, SAD. Elektroporacija je takođe korisna za transformaciju i/ili transfekciju ćelija i dobro je poznata u predmetnoj oblasti za transformaciju ćelija kvasnica, bakterijskih ćelija, ćelija insekata i ćelija kičmenjaka.

Uspešno transformirane ćelije, tj. ćelije koje sadrže DNK konstrukt predmetnog pronalaska, mogu da se identifikuju pomoću dobro poznatih tehnika kao što je PCR. Alternativno, prisustvo proteina u supernatantu može da se detektuje pomoću antitela.

Podrazumeva se da su određene ćelije domaćini pronalaska korisne za pripremanje peptida pronalaska, na primer, bakterijske, ćelije kvasnica i insekata. Međutim, u određenim terapeutskim metodama mogu biti korisne druge ćelije domaćini. Na primer, antigenprezentujuće ćelije, kao što su dendritične ćelije, mogu korisno da se upotrebe za ekspresiju peptida pronalaska tako da oni mogu da se ubace u odgovarajuće MHC molekule. Tako, prikazani pronalazak obezbeđuje ćeliju domaćina koja se sastoji od nukleinske kiseline ili vektora ekspresije u skladu sa pronalaskom.

1

U jednom poželjnom otelotvorenju ćelija domaćin je antigen-prezentujuća ćelija, konkretno dendritična ćelija ili antigen-prezentujuća ćelija. APĆ u koje je postavljen rekombinantni fuzioni protein koje sadrže prostatičnu kiselu fosfatazu (PAP) odobrene su od strane Američke uprave za hranu i lekove (FDA) 29. aprila 2010. godine za lečenje asimptomatskog ili minimalno simptomatskog metastatskog karcinoma prostate refraktornog na hormone – HRPC (Sipuleucel-T) (Small EJ, et al. Placebo-controlled phase III trial of immunologic therapy with sipuleucel-T (APC8015) in patients with metastatic, asymptomatic hormone refractory prostate cancer. J Clin Oncol.2006 Jul 1 ;24(19):3089-94. Rini et al. Combination immunotherapy with prostatic acid phosphatase pulsed antigen-presenting cells (provenge) plus bevacizumab in patients with serologic progression of prostate cancer after definitive local therapy. Cancer.2006 Jul 1 ;107(1):67-74).

Dalji aspekt pronalaska obezbeđuje metod za proizvodnju peptida, pri čemu metod obuhvata kultivisanje ćelije domaćina i izolaciju peptida iz ćelije domaćina ili njegovog medijuma za kultivaciju.

U drugom otelotvorenju, peptid, nukleinska kiselina ili vektor ekspresije pronalaska koriste se u medicini. Na primer, peptid može biti pripremljen za intravensku (i.v.) injekciju, potkožnu (s.c.) injekciju, intradermalnu (i.d.) injekciju, intraperitonealnu (i.p.) injekciju, intramuskularnu (i.m.) injekciju. Poželjni načini primene injekcije peptida obuhvataju s.c., i.d., i.p., i.m. i i.v. Poželjni načini primene injekcije DNK obuhvataju i.d., i.m., s.c., i.p. i i.v. Mogu se dati doze od npr. između 50 µg i 1,5 mg, poželjno 125 µg do 500 µg, peptida ili DNK i one će zavisiti od datog peptida ili DNK. Doze u ovom opsegu su uspešno korišćene u ranijim ispitivanjima (Walter et al Nature Medicine 18, 1254–1261 (2012)).

Drugi aspekt predmetnog pronalaska uključuje in vitro metod za proizvodnju aktiviranih T ćelija, pri čemu se metod sastoji od dovođenja u kontakt in vitro T ćelija sa humanim MHC molekulima sa ubačenim antigenom eksprimiranim na površini prikladne antigenprezentujuće ćelije u toku vremenskog perioda koji je dovoljan da se T ćelija aktivira na antigen-specifičan način, naznačeno time što je antigen peptid u skladu sa pronalaskom. Poželjno, sa antigen-prezentujućom ćelijom se koristi dovoljna količina antigena.

1

Poželjno, ćelija sisara ne poseduje ili ima smanjen nivo ili funkciju TAP peptidnog transportera. Pogodne ćelije kojima nedostaje TAP peptidni transporter obuhvataju T2, RMA-S i ćelije vinske mušice. TAP je transporter koji je u vezi sa obradom antigena.

Ćelijska linija T2 koja je deficijentna za ubacivanje humanih peptida dostupna je kod organizacije American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, SAD pod kataloškim brojem CRL 1992; ćelijska linija vinske mušice Schneider 2 dostupna je kod organizacije ATCC pod kataloškim brojem CRL 19863; mišja RMA-S ćelijska linija opisana je u radu Karre et al 1985 (Ljunggren, H.-G., and K. Karre. 1985. J. Exp. Med.162:1745).

Poželjno, ćelija domaćin pre transfekcije značajno ne eksprimira MHC molekule klase I. Takođe je poželjno da stimulatorna ćelija eksprimira molekul koji je važan za obezbeđivanje kostimulatornog signala za T ćelije kao što su bilo koji od B7.1, B7.2, ICAM-1 i LFA 3. Sekvence nukleinskih kiselina brojnih MHC molekula klase I i kostimulatornih molekula javno su dostupne iz GenBank i EMBL baza podataka.

U slučaju epitopa MHC klase I koji se koristi kao antigen, T ćelije su CD8-pozitivni CTL.

Ako se antigen-prezentujuća ćelija transficira da eksprimira takav epitop, ćelija se poželjno sastoji od vektora ekspresije koji eksprimira peptid koji sadrži ID BR. SEKV: 167.

Brojne druge metode mogu da se koriste za generisanje CTL in vitro. Na primer, za generisanje CTL mogu da se koriste autologni tumor-infiltrišući limfociti. Plebanski i saradnici (1995) (Induction of peptide-specific primary cytotoxic T lymphocyte responses from human peripheral blood.Eur J Immunol. 1995 Jun;25(6):1783-7) upotrebljavaju autologne limfocite iz periferne krvi (PLB) za pripremanje CTL. Pored toga, moguća je proizvodnja autolognih CTL pulsiranjem dendritičnih ćelija sa peptidom ili polipeptidom, ili putem infekcije sa rekombinantnim virusom. Takođe, za proizvodnju autolognih CTL mogu da se koriste B ćelije. Pored toga, makrofagi pulsirani sa peptidom ili polipeptidom, ili inficirani sa rekombinantnim virusom, mogu da se koriste za pripremu autolognih CTL. S.

14

Walter i sar. 2003 (Cutting edge: predetermined avidity of human CD8 T cells expanded on calibrated MHC/anti- CD28-coated microspheres.J Immunol. 2003 Nov 15;171(10):4974-8) opisuju in vitro prajming T ćelija upotrebom veštačkih antigen-prezentujućih ćelija (aAPĆ), što je takođe prikladan način za generisanje T ćelija protiv peptida izbora. U predmetnom pronalasku, aAPĆ su generisane spajanjem preformiranih kompleksa MHC:peptid za površinu polistirenskih čestica (mikroperle) pomoću biohemije biotin:streptavidin. Ovaj sistem dozvoljava egzaktnu kontrolu gustine MHC na aAPĆ, što omogućava da se selektivno izazovu visoko- ili nisko-aviditetni antigen-specifični T-ćelijski odgovori sa visokom efikasnošću iz uzoraka krvi. Pored ovih kompleksa MHC:peptid, aAPĆ bi trebalo da nose druge proteine sa kostimulatornom aktivnošću poput anti-CD28 antitela spojenih za njihovu površinu. Osim toga takvi sistemi zasnovani na aAPĆ često iziskuju dodavanje odgovarajućih solubilnih faktora, npr. citokina, kao što je interleukin-12.

Alogene ćelije mogu takođe da se koriste u pripremanju T ćelija a metod je detaljno opisan u patentu WO 97/26328. Na primer, pored ćelija vinske mušice i T2 ćelija, mogu da se koriste druge ćelije za prezentovanje antigena kao što su CHO ćelije, ćelije insekata inficirane bakulovirusom, bakterije, kvasnice, ciljne ćelije inficirane vakcinijom. Pored toga, mogu se koristiti biljni virusi (vidite, na primer, rad Porta et al. (1994) Development of cowpea mosaic virus as a high-yielding system for the presentation of foreign peptides. Virology.1994 Aug 1 ;202(2):949-55) koji opisuje razvoj mozaičkog virusa kravljeg graška kao sistem sa visokim prinosom za prezentaciju stranih peptida.

Aktivirane T ćelije koje su usmerene protiv peptida pronalaska korisne su u terapiji. Tako, dalji aspekt pronalaska obezbeđuje aktivirane T ćelije koje se mogu dobiti prethodno navedenim metodima pronalaska.

Aktivirane T ćelije, koje su proizvedene pomoću gore navedenog metoda, selektivno će prepoznati ćeliju koja aberantno eksprimira polipeptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu sa ID BR. SEKV: 167.

Poželjno, T ćelija prepoznaje ćeliju pomoću interakcije kroz njen TCR sa kompleksom HLA/peptid (na primer, vezivanje). T ćelije su korisne u metodu ubijanja ciljnih ćelija kod pacijenta čije ciljne ćelije aberantno eksprimiraju polipeptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu pronalaska, naznačeno time što se pacijentu daje efikasan broj aktiviranih T ćelija. T ćelije koje se daju pacijentu mogu biti dobijene od pacijenta i aktivirane na način opisan ranije (tj. one su autologne T ćelije). Alternativno, T ćelije nisu od dotičnog pacijenta već od druge osobe. Naravno da je poželjno da osoba bude zdrava osoba. Pod „zdravom osobom“ pronalazači podrazumevaju da osoba bude uopšteno dobrog zdravlja, poželjno da ima kompetentan imunski sistem i, još poželjnije, da ne boluje ni od jedne bolesti za koju se mogu izvršiti testovi i koja se može detektovati.

In vivo, ciljne ćelije za CD8-pozitivne T ćelije u skladu sa predmetnim pronalaskom mogu biti ćelije tumora (koje ponekad eksprimiraju MHC klase II) i/ili ćelije strome koje okružuju tumor (tumorske ćelije) (koje ponekad takođe eksprimiraju MHC klase II; (Dengjel et al., 2006)).

T ćelije predmetnog pronalaska mogu da se koriste kao aktivni sastojci terapeutske smeše. Na taj način, pronalazak takođe obezbeđuje metod ubijanja ciljnih ćelija kod pacijenta čije ciljne ćelije aberantno eksprimiraju polipeptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu pronalaska, pri čemu metod obuhvata davanje efikasnog broja T ćelija pacijentu kako je definisano ranije.

Pod pojmom „aberantno eksprimiran“ pronalazači takođe podrazumevaju da je polipeptid prekomerno eksprimiran u poređenju sa normalnim nivoima ekspresije, ili da je gen neaktivan u tkivu iz kojeg je tumor nastao ali da je eksprimiran u tumoru. Pod pojmom „prekomerno eksprimiran“ pronalazači podrazumevaju da je polipeptid prisutan u nivou koji je najmanje 1,2 puta veći od nivoa prisutnog u normalnom tkivu; poželjno je najmanje 2 puta veći, a još poželjnije najmanje 5 puta ili 10 puta veći od nivoa prisutnog u normalnom tkivu.

T ćelije mogu da se dobiju pomoću metoda poznatih u predmetnoj oblasti, npr. ranije opisanih.

Protokoli za ovaj takozvani adoptivni transfer T ćelija dobro su poznati u predmetnoj oblasti.

Pregledi se mogu naći u: Gattinoni L, et al. Adoptive immunotherapy for cancer: building on success. Nat Rev Immunol. 2006 May;6(5):383-93. Review, i Morgan RA, et al. Cancer regression in patients after transfer of genetically engineered lymphocytes. Science. 2006 Oct 6;314(5796):126-9).

Svaki molekul pronalaska, tj. peptid, nukleinska kiselina, antitelo, vektor ekspresije, ćelija, aktivirani CTL, T-ćelijski receptor ili nukleinska kiselina koja ga kodira koristan je za lečenje poremećaja, koji karakterišu ćelije koje izbegavaju imunski odgovor.

Zato svaki molekul predmetnog pronalaska može da se koristi kao lek ili u proizvodnji leka. Molekul može da se koristi samostalno ili u kombinaciji sa drugim molekulom(ima) pronalaska ili poznatim molekulom(ima).

Poželjno, lek predmetnog pronalaska je vakcina. Ona se može dati direktno pacijentu, primeniti u zahvaćeni organ ili sistemski i.d., i.m., s.c., i.p. i i.v., ili primeniti ex vivo u ćelije dobijene od pacijenta ili humane ćelijske linije koje se nakon toga daju pacijentu, ili koristiti in vitro za odabir subpopulacije imunskih ćelija dobijenih od pacijenta, koje se zatim ponovo daju pacijentu. Ako se nukleinska kiselina primenjuje u ćelije in vitro, može biti od koristi da ćelije budu transficirane tako da koeksprimiraju imunostimulišuće citokine, kao što je interleukin-2. Peptid može biti značajno prečišćen, ili kombinovan sa imunostimulišućim adjuvansom (pogledajte u nastavku), ili da se koristi u kombinaciji sa imunostimulatornim citokinima, ili da se primenjuje sa pogodnim dostavnim sistemom, kao na primer lipozomima. Peptid može takođe da bude konjugovan sa prikladnim nosačem kao što je hemocijanin iz puža Megathura crenulata (keyhole limpet haemocyanin – KLH) ili manan (pogledajte WO 95/18145 i Longenecker, 1993). Peptid takođe može biti obeležen, može biti fuzioni protein, ili može biti hibridni molekul. Od peptida čija je sekvenca data u predmetnom pronalasku se očekuje da stimulišu CD4 ili CD8 T ćelije. Ipak, stimulacija CD8 CTL je efikasnija u prisustvu pomoći koju pružaju CD4 T-pomoćničke ćelije. Tako, za epitope MHC klase I koji stimulišu CD8 CTL, fuzioni partner ili delovi hibridnog molekula prikladno obezbeđuju epitope koji stimulišu CD4-pozitivne T ćelije. CD4- i CD8-stimulišući epitopi su dobro poznati u predmetnoj oblasti, i uključuju one identifikovane u predmetnom pronalasku.

14

U jednom aspektu, vakcina sadrži najmanje jedan peptid koji ima aminokiselinsku sekvencu iznetu u ID BR. SEKV 167 i najmanje jedan dodatni peptid, poželjno dva do 50, poželjnije dva do 25, još poželjnije dva do 20 i najpoželjnije dva, tri, četiri, pet, šest, sedam, osam, devet, deset, jedanaest, dvanaest, trinaest, četrnaest, petnaest, šesnaest, sedamnaest ili osamnaest peptida. Peptid(i) može biti dobijen od jednog ili više specifičnih TAA i može se vezivati za MHC molekule klase I.

U drugom aspektu, vakcina sadrži najmanje jedan peptid koji ima aminokiselinsku sekvencu navedenu u ID BR. SEKV: 167 i najmanje jedan dodatni peptid, poželjno dva do 50, poželjnije dva do 25, još poželjnije dva do 20 i najpoželjnije dva, tri, četiri, pet, šest, sedam, osam, devet, deset, jedanaest, dvanaest, trinaest, četrnaest, petnaest, šesnaest, sedamnaest ili osamnaest peptida. Peptid(i) može biti dobijen od jednog ili više specifičnih TAA i može se vezivati za MHC molekule klase I.

Polinukleotid može biti značajno prečišćen ili sadržan u pogodnom vektoru ili sistemu za dostavljanje. Nukleinska kiselina može biti DNK, cDNK, PNK, RNK ili njihova kombinacija. Metodi za dizajniranje i uvođenje takve nukleinske kiseline su dobro poznati u predmetnoj oblasti. Pregled je obezbeđen od strane npr. (Pascolo et al., Human peripheral blood mononuclear cells transfected with messenger RNA stimulate antigen-specific cytotoxic T-lymphocytes in vitro.Cell Mol Life Sci. 2005 Aug;62(15):1755-62). Polinukleotidne vakcine se lako pripremaju, ali način delovanja ovih vektora u indukovanju imunskog odgovora nije u potpunosti jasan. Prikladni vektori i sistemi za dostavljanje uključuju virusnu DNK i/ili RNK, kao što su sistemi zasnovani na adenovirusu, virusu vakcinije, retrovirusima, herpes virusu, adeno-asociranom virusu ili hibridima koji sadrže elemente više od jednog virusa. Nevirusni sistemi za dostavljanje uključuju katjonske lipide i katjonske polimere i dobro su poznati u oblasti dostavljanja DNK. Fizičko dostavljanje, kao što je preko „genskog pištolja“, može takođe da se koristi. Peptid ili peptidi koje kodira nukleinska kiselina mogu biti fuzioni protein, na primer sa epitopom koji stimuliše T ćelije za dati suprotni CDR kako je navedeno ranije.

Lek pronalaska može takođe da sadrži jedan ili više adjuvanasa. Adjuvansi su supstance koje nespecifično pojačavaju ili potenciraju imunski odgovor (npr. imunske odgovore posredovane CTL i pomoćničkim T (TH) ćelijama na antigen, i na taj način se smatraju korisnim u leku predmetnog pronalaska. Pogodni adjuvansi uključuju, ali nisu i ograničeni na, 1018 ISS, soli aluminijuma, AMPLIVAX®, AS15, BCG, CP-870,893, CpG7909, CyaA, dSLIM, flagelin ili TLR5 ligande dobijene od flagelina, FLT3 ligand, GM-CSF, IC30, IC31, imikvimod (ALDARA®), rezikvimod, ImuFact IMP321, interleukine poput IL-2, IL-13, IL-21, interferon-alfa ili -beta, ili njihove pegilovane derivate, IS Patch, ISS, ISCOMATRIX, ISCOMs, JuvImmune®, LipoVac, MALP2, MF59, monofosforil lipid A, Montanide IMS 1312, Montanide ISA 206, Montanide ISA 50V, Montanide ISA-51, emulzije voda u ulju i ulje u vodi, OK-432, OM-174, OM-197-MP-EC, ONTAK, OspA, PepTel® vektorski sistem, poli(laktid ko-glikolid) [PLG]-zasnovane i mikročestice dekstrana, talaktoferin, SRL172, virozome i druge virusu slične partikule, YF-17D, VEGF klopku, R848, beta-glukan, Pam3Cys, QS21 stimulon kompanije Aquila, koji je dobijen od saponina, mikobakterijske ekstrakte i sintetičke mimetike bakterijskog ćelijskog zida i druge zaštićene adjuvanse kao što su Ribi-jev Detox, Quil, ili Superfos. Preferirani su adjuvansi kao što je Freund-ov ili GM-CSF. Nekoliko imunoloških adjuvanasa (npr. MF59) specifičnih za dendritične ćelije i njihova priprema su opisani ranije (Allison and Krummel, 1995 The Yin and Yang of T cell costimulation.Science. 1995 Nov 10;270(5238):932-3. Review). Takođe, mogu se koristiti citokini. Nekoliko citokina je direktno dovedeno u vezu sa uticajem na migraciju dendritičnih ćelija u limfna tkiva (npr. TNF-), ubrzavanjem sazrevanja dendritičnih ćelija u efikasne antigen-prezentujuće ćelije za T limfocite (npr. GM-CSF, IL-1 i IL-4) (patent registrovan u SAD pod brojem 5,849,589) i delovanjem kao imunoadjuvansi (npr. IL-12, IL-15, IL- 23, IL-7, IFN-alfa. IFN-beta) (Gabrilovich, 1996 Production of vascular endothelial growth factor by human tumors inhibits the functional maturation of dendritic cells Nat Med. 1996 Oct;2(10):1096-103).

Takođe, objavljeno je da CpG imunostimulatorni oligonukleotidi poboljšavaju efekte adjuvanasa u sastavu vakcine. Bez ograničavanja postojećom teorijom, CpG oligonukleotidi deluju aktiviranjem urođenog (neadaptivnog) imunskog sistema preko Toll-like receptora (TLR), uglavnom TLR9. Aktivacija TLR9 pokrenuta CpG-om pojačava antigen-specifične humoralne i ćelijske odgovore na širok spektar antigena, uključujući peptidne ili proteinske

14

antigene, žive ili mrtve viruse, vakcine dendritičnim ćelijama, autologne ćelijske vakcine i polisaharidne konjugate kako u profilaktičkim tako i terapijskim vakcinama. Što je važnije, on poboljšava sazrevanje i diferencijaciju dendritičnih ćelija, što dovodi do pojačane aktivacije TH1ćelija i snažnog stvaranja citotoksičnih T limfocita (CTL), čak i u odsustvu pomoći CD4 T ćelija. Predominacija TH1indukovana stimulacijom TLR9 se održava čak i u prisustvu adjuvanasa u vakcini, kao što je aluminijum ili nekompletni Frojndov adjuvans (IFA), koji normalno promovišu predominaciju TH2. CpG oligonukleotidi pokazuju još veću adjuvansnu aktivnost kada se formulišu ili istovremeno primenjuju sa drugim adjuvansima ili u formulacijama kao što su mikročestice, nanočestice, lipidne emulzije ili slične formulacije, koje su naročito neophodne za indukovanje snažnog odgovora kada je antigen relativno slab. Oni takođe ubrzavaju imunski odgovor i omogućavaju da se doze antigena smanje za približno dva reda veličine, sa uporedivim odgovorima antitelima na punu dozu vakcine bez CpG u pojedinim eksperimentima (Krieg, 2006). Patent registrovan u SAD pod br.6,406,705 B1 opisuje kombinovanu upotrebu CpG oligonukleotida, adjuvanasa u obliku nenukleinskih kiselina i antigena za indukovanje antigen-specifičnog imunskog odgovora. Antagonist CpG TLR9 je dSLIM (double Stem Loop Immunomodulator) kompanije Mologen (Berlin, Nemačka) koji je preferirana komponenta farmaceutske smeše predmetnog pronalaska. Takođe, mogu se koristiti i drugi molekuli koji vezuju TLR kao što su RNK koja vezuje TLR 7, TLR 8 i/ili TLR 9.

Drugi primeri korisnih adjuvanasa uključuju, ali nisu i ograničeni na, hemijski modifikovane CpG-jeve (npr. CpR, Idera), analoge dsRNK kao što su Poly(I:C) i njegovi derivati (npr. AmpliGen®, Hiltonol®, poli-(ICLC), poli(IC-R), poli(I:C12U), ne-CpG bakterijska DNK ili RNK kao i imunoaktivne male molekule i antitela poput ciklofosfamida, sunitiniba, Bevacizumab®-a, celebreksa, NCX-4016, sildenafila, tadalafila, vardenafila, sorafeniba, temozolomida, temsirolimusa, XL-999, CP-547632, pazopaniba, VEGF klopke, ZD2171, AZD2171, anti-CTLA4, druga antitela koja ciljaju ključne strukture imunskog sistema (npr. anti-CD40, anti-TGFbeta, anti-TNFalfa receptor) i SC58175, koji mogu delovati terapijski i/ili kao adjuvans. Količine i koncentracije adjuvanasa i aditiva korisnih u kontekstu predmetnog pronalaska, stručnjak iz ove oblasti može lako da utvrdi bez izvođenja suvišnih eksperimenata.

14

Poželjni adjuvansi su imikvimod, rezikvimod, GM-CSF, ciklofosfamid, sunitinib, bevacizumab, interferon-alfa, CpG oligonukleotidi i derivati, poli(I:C) i derivati, RNK, sildenafil i formulacije čestica sa PLG ili virozomima.

U poželjnom otelotvorenju, farmaceutskoj smeši u skladu sa pronalaskom adjuvans je izabran iz grupe koja se sastoji od faktora stimulacije kolonija, kao što je faktor stimulacije granulocitno-makrofagne kolonije (GM-CSF, sargramostim), ciklofosfamida, imikvimoda, rezikvimoda i interferona alfa.

U poželjnom otelotvorenju, farmaceutskoj smeši u skladu sa pronalaskom adjuvans je izabran iz grupe koja se sastoji od faktora stimulacije kolonija, kao što je faktor stimulacije granulocitno-makrofagne kolonije (GM-CSF, sargramostim), ciklofosfamida, immikvimoda i rezikvimoda.

U poželjnom otelotvorenju farmaceutske smeše u skladu sa pronalaskom, adjuvans je ciklofosfamid, imikvimod ili rezikvimod.

Još poželjniji adjuvansi su Montanide IMS 1312, Montanide ISA 206, Montanide ISA 50V, Montanide ISA-51, poli-ICLC (Hiltonol®) i anti-CD40 mAT ili njihove kombinacije.

Ova smeša se koristi za parenteralnu primenu, kao što je supkutana, intradermalna, intramuskularna ili oralnu primenu. Za navedeno, peptidi i opciono drugi molekuli se rastvaraju ili suspenduju u farmaceutski prihvatljivom, poželjno, vodenom nosaču. Pored toga, smeša može sadržati pomoćne materije, poput pufera, vezujućih agenasa, raspršivača, rastvarača, aroma, lubrikanata itd. Peptidi takođe mogu biti primenjeni zajedno sa imunostimulišućim supstancama kao što su citokini. Opsežna lista pomoćnih materija koje se mogu koristiti u navedenom sastavu može, na primer, biti preuzeta od A. Kibbe, Handbook of Pharmaceutical Excipients, 3rd Ed., 2000, American Pharmaceutical Association and pharmaceutical press. Smeša se može koristiti za prevenciju, profilaksu i/ili terapiju adenomatoznih ili malignih oboljenja. Primerne formulacije se mogu naći u, na primer, patentu EP2112253.

14

Bez obzira na to, u zavisnosti od broja i fizičko-hemijskih karakteristika peptida pronalaska, potrebno je dalje istraživanje kako bi se obezbedile formulacije za specifične kombinacije peptida, posebno kombinacije sa više od 20 peptida koje su stabilne duže od 12 do 18 meseci.

Predmetni pronalazak obezbeđuje lek koji je koristan u lečenju raka, posebno AML, hronične limfocitne leukemije (HLL) i drugih hematoloških maligniteta.

Predmetni pronalazak dalje predstavlja komplet koji se sastoji od:

(a) posude koja sadrži farmaceutsku smešu kako je opisana iznad, u obliku rastvora ili u liofiliziranom obliku;

(b) opciono druge posude koja sadrži razblaživač ili rastvor za rekonstituciju za liofiliziranu formulaciju; i

(c) opciono, uputstva za (i) upotrebu rastvora ili (ii) rekonstituciju i/ili upotrebu liofilizirane formulacije.

Komplet dalje može da se sastoji od jednog ili više od navedenih (iii) pufer, (iv) rastvarač, (v) filter, (vi) igla ili (v) brizgalica. Posuda je preferirano boca, bočica, brizgalica ili epruveta; i ona može biti višekratna posuda. Farmaceutska smeša je preferirano liofilizirana.

Predstavljeni kompleti se poželjno sastoje od liofilizirane formulacije predmetnog pronalaska u pogodnoj posudi i uputstava za njenu rekonstituciju i/ili upotrebu. Pogodne posude uključuju, na primer, boce, bočice (npr. bočice sa dve šupljine), brizgalice (kao što su brizgalice sa dve šupljine) i epruvete. Posuda može biti izrađena od različitih materijala kao što su staklo ili plastika. Poželjno, komplet i/ili posuda sadrži/e uputstva o ili u vezi sa posudom koja navode uputstva za rekonstituciju i/ili upotrebu. Na primer, na nalepnici može biti navedeno da liofilizirana formulacija treba da se rekonstituiše do koncentracija peptida kako je opisano ranije. Na nalepnici može dalje da bude naznačeno da je formulacija korisna ili namenjena za potkožnu primenu.

Posuda u kojoj se nalazi formulacija može da bude višekratna bočica, što omogućava ponavljane primene (npr. 2-6 primena) rekonstituisane formulacije. Komplet može dalje da

14

sadrži i drugu posudu u kojoj se nalazi pogodni rastvarač (npr. rastvor natrijum bikarbonata).

Nakon mešanja rastvarača i liofilizirane formulacije, konačna koncentracija peptida u rekonstituisanoj formulaciji je poželjno najmanje 0,15 mg/ml/peptida (=75 µg) a poželjno ne više od 3 mg/ml/peptida (=1500 µg). Komplet može dalje da uključuje druge materijale poželjne sa komercijalne ili korisničke tačke gledišta, uključujući druge pufere, rastvarače, filtere, igle, brizgalice i uputstva za upotrebu uz pakovanje.

Predstavljeni kompleti mogu da imaju jednu posudu koja sadrži formulaciju farmaceutskih smeša u skladu sa predmetnim pronalaskom sa ili bez drugih komponenti (npr. druga jedinjenja ili farmaceutske smeše ovih drugih jedinjenja) ili mogu da imaju zasebnu posudu za svaku komponentu.

Poželjno, predstavljeni kompleti obuhvataju formulaciju pronalaska upakovanu za upotrebu u kombinaciji sa istovremenom primenom drugog jedinjenja (kao što su adjuvansi (npr. GM-CSF), hemioterapijski agens, prirodni proizvod, hormon ili antagonist, antiangiogeni agens ili inhibitor, agens koji indukuje apoptozu ili helirajući agens) ili njegove farmaceutske smeše. Komponente kompleta mogu biti u vidu prethodno napravljenog kompleksa ili svaka komponenta može biti u odvojenoj zasebnoj posudi pre primene kod pacijenta. Komponente kompleta mogu biti obezbeđene u jednom ili više tečnih rastvora, poželjno, vodenom rastvoru, poželjnije sterilnom vodenom rastvoru. Komponente kompleta mogu takođe biti obezbeđene kao čvrste materije, koje se mogu pretvoriti u tečnosti dodavanjem pogodnih rastvarača, koji su preferirano obezbeđeni u drugoj zasebnoj posudi.

Posuda terapeutskog kompleta može biti bočica, epruveta, pljosnata boca, boca, brizgalica ili neka druga posuda za čuvanje čvrstih supstanci ili tečnosti. Obično, kada postoji više od jedne komponente, komplet će sadržati drugu bočicu ili drugu posudu, koja omogućava zasebno doziranje. Komplet takođe može sadržati drugu posudu za farmaceutski prihvatljivu tečnost. Poželjno, terapeutski komplet će sadržati pribor (npr. jednu ili više igala, brizgalice, kapaljke, pipete itd) koji omogućava primenu agenasa pronalaska koji su komponente prikazanog kompleta.

14

Prikazana formulacija je jedna koja je pogodna za primenu peptida na bilo koji prihvatljiv način primene kao što je oralni (enteralni), nazalni, očni, supkutani, intradermalni, intramuskularni, intravenski ili transdermalni. Poželjno, primena je s.c., a najpoželjnije i.d. Primena može biti i pomoću infuzione pumpe.

Budući da su peptidi pronalaska izolovani iz HLL, lek pronalaska se poželjno koristi za lečenje HLL.

Predmetni pronalazak dalje otkriva metod za proizvodnju personalizovanog farmaceutskog sredstva za pojedinačnog pacijenta, koji obuhvata proizvodnju farmaceutske smeše koja sadrži najmanje jedan peptid izabran iz skladišta prethodno skriniranih TUMAP, naznačenu time što je najmanje jedan peptid upotrebljen u farmaceutskoj smeši izabran zbog prikladnosti za pojedinačnog pacijenta. Poželjno, farmaceutska smeša je vakcina. Metod takođe može biti prilagođen za proizvodnju T-ćelijskih klonova za nishodne primene kao što je izolacija TCR.

„Personalizovano farmaceutsko sredstvo“ će označavati specifično prilagođene terapije za jednog pojedinačnog pacijenta koje će se koristiti samo za terapiju kod tog pojedinačnog pacijenta, uključujući aktivno personalizovane antitumorske vakcine i adoptivne ćelijske terapije korišćenjem autolognog tkiva pacijenta.

Kako se ovde koristi, termin „skladište“ će se odnositi na grupu peptida koji su prethodno skrinirani za imunogenost i prekomernu prezentaciju kod konkretnog tipa tumora. Termin „skladište“ ne treba da implicira da su konkretni peptidi koji su obuhvaćeni vakcinom unapred proizvedeni i skladišteni u fizičkom postrojenju, mada se razmatra ta mogućnost. Izričito je razmatrano da peptidi mogu biti proizvedeni de novo za svaku proizvedenu individualizovanu vakcinu, ili mogu biti unapred proizvedeni i uskladišteni.

Skladište (npr. u obliku baze podataka) sastavljeno je od tumor-asociranih peptida koji su visoko prekomerno eksprimirani u tumorskom tkivu više analiziranih HLA-A, HLA-B i HLA-C pozitivnih pacijenata sa HLL (vidite prethodne tabele). Ono sadrži peptide MHC klase I i MHC klase II. Pored tumor-asociranih peptida sakupljenih iz više GBM tkiva,

1

skladište može da sadrži HLA-A*02 i HLA-A*24 peptidni marker. Ovi peptidi omogućavaju kvantitativno poređenje veličine T-ćelijskog imuniteta indukovanog putem TUMAP, te stoga omogućavaju donošenje značajnih zaključaka o sposobnosti vakcine da izazove antitumorske odgovore. Drugo, deluje kao važan peptid pozitivne kontrole dobijen od „nesvojstvenog“ antigena u slučaju da bilo koji vakcinom indukovani T-ćelijski odgovori na TUMAP dobijen od „svojstvenih“ antigena nisu uočeni kod pacijenta. I treće, može da omogući da se donesu zaključci u pogledu statusa imunokompetencije populacije pacijenata.

TUMAP HLA klase I i II za skladište identifikuju se korišćenjem integrisanog pristupa funkcionalne genomike koji kombinuje analizu ekspresije gena, masenu spektrometriju i T-ćelijsku imunologiju. Ovaj pristup obezbeđuje da samo TUMAP koji su istinski prisutni na velikom procentu tumora, ali koji uopšte nisu eksprimirani na normalnom tkivu ili su minimalno eksprimirani, budu izabrani za dalju analizu. Za selekciju peptida, uzorci HLL pacijenata i krv zdravih donora su analizirani korak po korak:

1. HLA ligandi iz malignog materijala su identifikovani masenom spektrometrijom 2. Analiza ekspresije genomske informacione ribonukleinske kiseline (iRNK) pomoću mikročipova korišćena je za identifikaciju gena koji su prekomerno eksprimirani u malignom tkivu (HLL) u poređenju sa dijapazonom normalnih organa i tkiva

3. Identifikovani ligandi za HLA upoređeni su sa podacima o ekspresiji gena. Peptidi koje kodiraju selektivno eksprimirani ili prekomerno eksprimirani geni koji su detektovani u 2. koraku smatrani su pogodnim TUMAP kandidatima za multipeptidnu vakcinu.

4. Sprovedena je pretraga literature kako bi se pronašli dodatni dokazi koji podržavaju značaj identifikovanih peptida kao TUMAP

5. Značaj prekomerne ekspresije na nivou iRNK je potvrđen ponovnom detekcijom izabranih TUMAP iz koraka 3 na tumorskom tkivu i nedostatak (ili mala učestalost) detekcije na zdravim tkivima

6. Da bi se procenilo da li je indukovanje in vivo T-ćelijskih odgovora izabranim peptidima izvodljivo, obavljeni su in vitro testovi imunogenosti korišćenjem humanih T-ćelija zdravih donora, kao i pacijenata sa HLL.

U jednom aspektu, peptidi su prethodno ispitani na imunogenost pre uključivanja u skladište.

1 1

Na primer, ali bez ograničenja, imunogenost peptida uključenih u skladište se određuje pomoću metoda koji obuhvata in vitro prajmovanje T-ćelija putem ponovljene stimulacije CD8+ T ćelija zdravih donora veštačkim antigen-prezentujućim ćelijama sa ubačenim kompleksima peptid/MHC i anti-CD28 antitelom.

Ovaj metod je poželjan kod retkih maligniteta i pacijenata sa retkim profilom ekspresije. Nasuprot multipeptidnim koktelima sa fiksnim sastavom koji se trenutno razvijaju, skladište dozvoljava znatno veće usklađivanje stvarne ekspresije antigena na tumoru sa vakcinom. Odabrani pojedinačni peptidi ili kombinacija nekoliko peptida „iz zaliha“ koristiće se za svakog pacijenta u višeciljnom pristupu. U teoriji, pristup zasnovan na odabiru npr. 5 različitih antigenih peptida iz biblioteke od 50 bi već dao oko 17 miliona mogućih kompozicija lekovitog proizvoda (LP).

U jednom aspektu, peptidi se biraju za uključivanje u vakcinu na osnovu njihove prikladnosti za pojedinačnog pacijenta na osnovu metoda kako je opisan i kako sledi.

HLA fenotip, transkriptomski i peptidomski podaci će biti prikupljeni iz tumorskog materijala pacijenta i uzoraka krvi kako bi se identifikovali najprikladniji peptidi za svakog pacijenta koji sadrže uskladištene TUMAP i one jedinstvene za pacijenta (tj. mutirane). Biće izabrani oni peptidi koji su selektivno ili prekomerno eksprimirani u tumoru pacijenta i, gde je to moguće, koji su pokazali snažnu in vitro imunogenost ako su testirani sa individualnim PBMC pacijenta.

Poželjno, peptidi uključeni u vakcinu identifikovani su pomoću metoda koji se sastoji od: (a) identifikacije tumor-asociranih peptida (TUMAP) koje prezentuje uzorak tumora od pojedinačnog pacijenta; (b) upoređivanja peptida identifikovanih u tački (a) sa skladištem (bazom podataka) peptida kako je opisano ranije; i (c) biranja najmanje jednog peptida iz skladišta (baze podataka) koji korelira sa tumor-asociranim peptidom identifikovanim kod pacijenta. Na primer, TUMAP koje prezentuje uzorak tumora identifikuju se pomoću: (a1) upoređivanja podataka o ekspresiji iz uzorka tumora sa podacima o ekspresiji iz uzorka normalnog tkiva koje odgovara vrsti tkiva uzorka tumora kako bi se identifikovali proteini

1 2

koji su prekomerno eksprimirani ili aberantno eksprimirani u uzorku tumora; i (a2) koreliranja podataka o ekspresiji sa sekvencama MHC liganada vezanih za MHC klasa I i/ili klasa II molekule u uzorku tumora kako bi se identifikovali MHC ligandi dobijeni iz proteina koje tumor prekomerno eksprimira ili aberantno eksprimira. Poželjno, sekvence MHC liganada se identifikuju eluiranjem vezanih peptida sa MHC molekula izolovanih iz uzorka tumora, i sekvenciranjem eluiranih liganada. Poželjno, uzorak tumora i normalno tkivo se dobijaju od istog pacijenta.

Dodatno, ili kao alternativa biranju peptida pomoću modela skladišta (baze podataka), TUMAP mogu da se identifikuju kod pacijenta de novo a zatim da se uključe u vakcinu. Kao jedan primer, kandidati za TUMAP mogu da se identifikuju kod pacijenta pomoću (a1) upoređivanja podataka o ekspresiji iz uzorka tumora sa podacima o ekspresiji iz uzorka normalnog tkiva koje odgovara vrsti tkiva uzorka tumora, kako bi se identifikovali proteini koji su prekomerno eksprimirani ili aberantno eksprimirani u uzorku tumora; i (a2) koreliranja podataka o ekspresiji sa sekvencama MHC liganada vezanih za MHC molekule klase I i/ili klase II u uzorku tumora kako bi se identifikovali MHC ligandi dobijeni iz proteina koje tumor prekomerno eksprimira ili aberantno eksprimira. Kao drugi primer, mogu biti identifikovani proteini koji sadrže mutacije koje su jedinstvene za uzorak tumora u odnosu na normalno istovetno tkivo od pojedinačnog pacijenta, te mogu biti identifikovani TUMAP koji specifično ciljaju mutaciju. Na primer, genom tumora i istovetnog normalnog tkiva može da se sekvencira pomoću sekvenciranja celog genoma: Za otkrivanje nesinonimnih mutacija u regionima gena koji kodiraju protein, iz tumorskih tkiva se ekstrahuju genomska DNK i RNK, a normalna nemutirana genomska DNK germinativne linije se ekstrahuje iz mononuklearnih ćelija periferne krvi (PBMC). Primenjeni NGS pristup ograničen je na resekvenciranje regiona koji kodiraju protein (resekvenciranje egzoma). U ovu svrhu, egzonska DNK iz uzoraka ljudskog porekla se sakuplja pomoću kompleta za obogaćivanje cilja koje dostavlja dobavljač, nakon čega sledi sekvenciranje pomoću npr. HiSeq2000 (Illumina). Dodatno, tumorska iRNK se sekvencira radi direktne kvantifikacije genske ekspresije i potvrde da su mutirani geni eksprimirani u tumorima pacijenta. Nastali milioni očitanih sekvenci se obrađuju kroz algoritme softvera. Izlazna lista sadrži ekspresiju mutacija i gena. Tumor-specifične somatske mutacije se utvrđuju upoređivanjem sa germinativnim

1

varijacijama dobijenim iz PBMC i daje im se prioritet. De novo identifikovani peptidi zatim mogu da se testiraju u pogledu imunogenosti kako je opisano ranije za skladište, a kandidati za TUMAP koji poseduju prikladnu imunogenost se biraju za uključivanje u vakcinu.

U jednom primernom otelotvorenju, peptidi koji su uključeni u vakcinu se identifikuju pomoću: (a) identifikacije tumor-asociranih peptida (TUMAP) koje prezentuje uzorak tumora pojedinačnog pacijenta pomoću ranije opisanih metoda; (b) upoređivanja peptida identifikovanih pod tačkom a) sa skladištem peptida koji su prethodno ispitani za imunogenost i prekomernu prezentaciju u tumorima u poređenju sa odgovarajućim normalnim tkivom; (c) biranja najmanje jednog peptida iz skladišta koji korelira sa tumorasociranim peptidom identifikovanim kod pacijenta; i (d) opciono, biranja najmanje jednog peptida identifikovanog de novo pod tačkom (a) i potvrđivanja njegove imunogenosti.

U jednom primernom otelotvorenju, peptidi koji su uključeni u vakcinu se identifikuju pomoću: (a) identifikacije tumor-asociranih peptida (TUMAP) koje prezentuje uzorak tumora pojedinačnog pacijenta; i (b) biranja najmanje jednog peptida identifikovanog de novo pod tačkom (a) i potvrđivanja njegove imunogenosti.

Kada se peptidi izaberu, proizvodi se vakcina.

Vakcina je poželjno tečna formulacija koja se sastoji od pojedinačnih peptida rastvorenih u 33% DMSO.

Svaki peptid koji će biti uključen u proizvod se rastvara u DMSO. Koncentracija rastvora pojedinačnih peptida treba da se izabere u zavisnosti od broja peptida koji će biti uključeni u proizvod. Rastvori pojedinačan peptid-DMSO se mešaju u jednakim delovima kako bi se dobio rastvor koji sadrži sve peptide koji treba da budu uključeni u proizvod sa koncentracijom od ~2,5 mg/ml po peptidu. Pomešani rastvor se zatim razblažuje u odnosu 1:3 sa vodom za injekcije kako bi se dobila koncentracija od 0,826 mg/ml po peptidu u 33% DMSO. Razblaženi rastvor se filtrira kroz sterilni filter veličine 0,22 µm. Dobijen je konačan ukupni rastvor.

1 4

Konačni ukupni rastvor se puni u bočice i čuva na -20 °C do upotrebe. Jedna bočica sadrži 700 µl rastvora koji sadrži 0,578 mg svakog peptida. Od toga će 500 µl (oko 400 µg po peptidu) biti primenjeno za intradermalnu injekciju.

Predmetni pronalazak će sada biti opisan u sledećim primerima koji opisuju njegova poželjna otelotvorenja, ali to neće biti ograničeno na ovde navedeno.

Slika 1 prikazuje HLA površinsku ekspresiju primarnih uzoraka HLL, ekspresiju (a) HLA klase I i (b) HLA klase II CD5+CD19+ HLL ćelija u poređenju sa autolognim CD5-CD19<+>B ćelijama u 7 primarnih uzoraka HLL. Podaci su predstavljeni kao srednja vrednost ± s.d. trostrukih eksperimenata, srednja vrednost ekspresije (c) HLA klase I i (d) HLA klase II CD5+CD19+ HLL ćelija u poređenju sa autolognim CD5-CD19<+>B ćelijama (n=7). * P<0,01 Skraćenice: UPN, uniformni broj pacijenta

Slika 2 prikazuje identifikovanje nove kategorije tumor-asociranih antigena putem profilisanja HLA ligandoma, (a) preklapanje izvornih proteina HLA klasa I liganda primarnih uzoraka HLL (n=30) i HV PBMC (n=30). (b) Komparativno profilisanje izvornih proteina HLA klasa I liganada na osnovu učestalosti HLA-restrikovane reprezentacije u HLL i HV PBMC ligandomima. Učestalost [%] pacijenata sa HLL/HV pozitivnih na HLA-restrikovanu prezentaciju dotičnog izvornog proteina (x osa) navedene su na y osi. Pravougaonik sa leve strane ističe podskup izvornih proteina koji prikazuju isključivo reprezentaciju HLL kod >20% pacijenata (LiTAA: tumor-asocirani antigeni izvedeni od ligandoma), (c) reprezentacija objavljenih HLL-asociranih antigena kod ligandoma HLA klase I. Stupci pokazuju relativnu reprezentaciju [%] dotičnih antigena od strane HLA klase I liganada u HLL i HV PBMC. Isprekidane linije dele antigene u tri grupe prema njihovom stepenu povezanosti sa HLL. (d) Izvorni protein se preklapa sa uzorcima HLL različitih stadijuma bolesti (Binet A (n=9), Binet B (n=7), Binet C (n=14)). (e) Analiza toplotne karte učestalosti reprezentacije [%] LiTAA u različitim stadijumima bolesti (Binet A-C, kao pod (d)) (f) Analiza toplotne karte reprezentacije LiTAA [%] na primarnim uzorcima CLL sa del17p (n=5) i bez del17p (n=25). Skraćenice: HLL, hronična limfocitna leukemija; HV, zdravi dobrovoljac

1

Slika 3 prikazuje da su LiTAA specifično prepoznati od strane imunskog odgovora pacijenta sa HLL, (a) LiTAA HLA klase I i odgovarajući LiTAP (3 HLA-A*03, 5 HLA- A*02, 5 HLA-B*07) funkcionalno procenjeni u testovima IFNγ ELISPOT. Apsolutni brojevi i učestalosti imunskog prepoznavanja specifičnog za peptid u PBMC pacijenata sa HLL su rezimirani u desnoj koloni, (b) Primer A*03 LiTAP procenjenih u ELISPOT uz korišćenje HV PBMC kao kontrole. Smeša EBV epitopa koja sadrži 4 često prepoznata peptida (...) korišćena je kao pozitivna kontrola, HIV GAG18-26A*03 peptid je bio negativna kontrola, (c) Primer ELISPOT testa korišćenjem HLA-A*03 LiTAP (n=3) na PBMC tri različita pacijenta sa HLL. Rezultati su prikazani za imunoreaktivne LiTAP. Smeša EBV epitopa je bila pozitivna kontrola, HIV GAG18-26A*03 peptid negativna kontrola, (d) Primer HLA-A*03 LiBAP dobijenih od benignog tkiva (n=3) testiranih na PBMC pacijenata sa HLL kao interna kontrola za strategiju izbora cilja. Smeša EBV epitopa je bila pozitivna kontrola, HIV GAG18-

26A*03 peptid negativna kontrola, (e) Dijagram rasejanja učestalosti podešenih prema alelima prezentacije LITAP na ligandomima HLL (određeno pomoću MS) i odgovarajuće učestalosti podešene prema alelima imunskog prepoznavanja od strane pacijenta sa HLL kod IFNγ ELISPOT. Pojedinačni podaci su prikazani za 14/15 LiTAP koji pokazuju imunsko prepoznavanje. Skraćenice: LiTAP, tumor-asocirani peptid izveden od ligandoma; HV, zdravi dobrovoljac; neg. negativni; poz. pozitivni; UPN, uniformni broj pacijenta; LiBAP, peptid asociran sa benignim tkivom izveden od ligandoma; MS, masena spektrometrija.

Slika 4 prikazuje identifikovanje dodatnih/sinergističkih HLA klasa II LiTAA i LiTAP (a) Preklapanje izvornih proteina HLA klase II liganada iz primarnih uzoraka HLL (n=20) i HV PBMC (n=13). (b) Komparativno profilisanje izvornih proteina HLA klase II liganada na osnovu učestalosti HLA restrikovane reprezentacije u ligandomima PBMC HLL i HV. Učestalost [%] pacijenata sa HLL/HV pozitivnih na HLA-restrikovanu prezentaciju dotičnog izvornog proteina (x osa) navedene su na y osi. Pravougaonik sa leve strane ističe podskup izvornih proteina koji pokazuju ekskluzivnu HLL reprezentaciju kod >20% pacijenata (LiTAA: tumor-asocirani antigeni dobijeni iz ligandoma). (c) HLA klasa II LiTAA i odgovarajući LiTAP (n=6) funkcionalno procenjeni u testovima IFNγ ELISPOT. Apsolutni brojevi i učestalosti imunskog prepoznavanja specifičnog za peptid u PBMC pacijenata sa HLL rezimirani su u desnoj koloni. (d) Primer HLA klase II LiTAP procenjenih na testu

1

ELISPOT uz korišćenje PBMC HV kao kontrole. PHA je korišćena kao pozitivna kontrola. FLNA1669-1683HLA-DR peptid je bio negativna kontrola. (e) Primer testa ELISPOT korišćenjem HLA klase II LiTAP (n=6) na PBMC 3 različita pacijenta sa HLL. Rezultati su prikazani za imunoreaktivne LiTAP. PHA je korišćena kao pozitivna kontrola, FLNA1669-1683HLA-DR peptid je bio negativna kontrola. (f) Analiza preklapanja ekskluzivnih HLL izvornih proteina HLA klase I i HLA klase II liganada za zajedničke/sinergijske ciljeve vakcina. (g) Analiza toplotne karte 132 zajednička LiTAA HLA klase I/II (identifikovani pod (d)). Dva izvorna proteina prikazuju reprezentaciju kod ≥20% za oba, naznačeni su HLA ligandomi klase I i II pacijenta sa HLL.

Slika 5 prikazuje longitudinalnu analizu HLA ligandoma klase I pacijenata sa HLL koji su na hemio-/imunoterapiji. Vulkanski dijagram relativne zastupljenosti liganada kod HLA ligandoma klase I pacijenata nakon tretmana u poređenju sa njihovom relativnom zastupljenošću pre terapije (odnos posle terapije/pre terapije). Isprekidane linije označavaju pragove značajnih promena zastupljenosti (>2-struki odnos, p<0,05), sa značajno ushodno regulisanim ligandima gore desno i značajno nishodno regulisanim ligandima gore levo. Učestalosti značajno regulisanih liganada naznačene su u odgovarajućim kvadrantima. LITAP koji pokazuju značajnu regulaciju tokom terapije označeni su crvenom bojom i njihove sekvence su naznačene, (a) Analiza ligandoma pacijenta sa HLL pre terapije i 48 h/24 h posle terapije rituksimabom/bendamustinom (375 mg/m2 / 90 mg/m2). 1/28 (3,6%) detektabilnih LiTAP pokazali su značajne promene zastupljenosti. (b) Analiza ligandoma pacijenta sa HLL pre terapije i nakon prvih 7 dana lečenja alemtuzumabom (3 doze alemtuzumaba, 10 mg, 20 mg i 30 mg 1, 3. i 5. dana; analiza ligandoma 7. dana). 3/24 (12,5%) detektabilnih LiTAP pokazali su značajne promene zastupljenosti. (c) Analiza ligandoma pacijenta sa HLL pre terapije i 24 h nakon lečenja sa 300 mg ofatumumaba. 2/10 (20,0%) detektabilnih LiTAP pokazali su značajne promene zastupljenosti.

Slika 6 prikazuje retrospektivnu analizu preživljavanja pacijenata sa HLL u odnosu na njihovo imunsko prepoznavanje LiTAP. (a) Kaplan Majerova kriva ukupnog preživljavanja 44 pacijenta sa HLL. (b) Ukupno preživljavanje ispitanika ocenjenih na imunske odgovore specifične za LiTAP grupisano je na sledeći način: crno, pacijenti sa HLL koji pokazuju

1

imunski odgovor na >1 LiTAP (n=10). Crveno, pacijenti sa HLL koji pokazuju imunsku reakciju na 0-1 LiTAP (n=34).

Slika 7 prikazuje analizu zasićenja identifikacije izvornih proteina liganda HLA klase I kod pacijenata sa HLL. Broj identifikacija jedinstvenih izvornih proteina liganda HLA u funkciji ukupnih identifikacija izvornih proteina liganda HLA kod 30 pacijenata sa HLL. Eksponencijalna regresija je omogućila robusni proračun (R<2>=0,9912) maksimalnog broja različitih identifikacija izvornih proteina koji se može dostići (isprekidana linija). Tačkasta linija prikazuje pokrivenost izvornog proteoma postignutu u našoj kohorti pacijenata sa HLL.

Slika 8 prikazuje da su LiTAP HLA-A*02 i B*07 specifično prepoznati od strane imunskih odgovora pacijenata sa HLL, (a) Primer HLA-A*02 (n=3) i (d) HLA-B*07 (n=3) LiBAP dobijenih od benignog tkiva ispitanih na PBMC pacijenata sa HLL kao internoj kontroli za izbor ciljne strategije. Smeša EBV epitopa bila je pozitivna kontrola, HIV XXxx-xxA*02 odnosno HIV XXxx-xxHLA-B*07 je bio negativna kontrola. (B) Primer za HLA-A*02 (n=6) i (e) HLA-B*07 (n=5) LiTAP ocenjene na ELISPOT testu koristeći PBMC HV kao kontrolu. Pozitivne i negativne kontrole su kao što je opisano pod (a). (C) Primer za ELISPOT testove koristeći HLA-A*02 (n=6) i (f) HLA-B*07 (n=5) LiTAP na PBMC 3 različita pacijenta sa HLL sa odgovarajućim HLA. Rezultati su prikazani za imunoreaktivne LiTAP. Pozitivne i negativne kontrole su kao što je opisano pod (a). Skraćenice: LiBAP, peptid asociran sa benignim tkivom izveden od ligandoma; LiTAP, tumor-asocirani peptid izveden od ligandoma; HV, zdravi dobrovoljac; neg. negativni; poz. pozitivni; UPN, uniformni broj pacijenta.

Slika 9 prikazuje intracelularno bojenje citokina i tetramera HLA-A*03 LiTAP specifičnih T ćelija pacijenta sa HLL, (a) Intracelularno bojenje za IFNγ i TNFα P 3

A*03(DMXL11271-1279SSSGLHPPK (ID BR. SEKV: 77) stimulisanih PBMC pacijenta sa HLL. PMA/jonomicin je služio kao pozitivna kontrola, HIV GAG18-26A*03 peptid kao negativna kontrola. (b) Bojenje tetramera pacijenta sa HLL CD8<+>T ćelija sa P 3

A*03(DMXL11271-1279SSSGLHPPK (ID BR. SEKV: 77)) tetramerima. Kao kontrola, prikazano je bojenje tetramera neprepoznatih P 1

A*03(ABCA61270-1278ILDEKPVII (ID BR. SEKV: 63) kod istog pacijenta.

1

Slika 10 prikazuje kvantifikaciju površinske ekspresije HLA na primarnim ćelijama pacijenata sa HLL na hemio-/imunoterapiji. Površinska ekspresija HLA na CD5<+>CD19<+>ćelijama HLL kvantifikovana je protočnom citometrijom, pre i posle terapije. Podaci su izraženi kao srednja vrednost ± s.d. trostrukih eksperimenata. (a) Površinska ekspresija HLA klase I i (b) HLA klase II na primarnim ćelijama HLL 4 pacijenta pre terapije i 24 h nakon tretmana rituksimabom. (c) Površinska ekspresija HLA klase I i (d) HLA klase II na primarnim ćelijama HL pacijenta pre terapije, 72 h (10 mg) i 7d (60 mg) nakon tretmana alemtuzumabom. *P<0,01 Skraćenice: UPN, uniformni broj pacijenta; h, sat; d, dan.

Slika 11 prikazuje prekomernu prezentaciju peptida ILDEKPVII u normalnim tkivima u poređenju sa uzorcima HLL. Prikazani su samo uzorci u kojima je peptid detektovan. Test panel je obuhvatao 12 uzoraka HLL i sledeće normalne uzorke: 1 x adipozno tkivo, 3 x nadbubrežna žlezda, 6 x arterija, 5 x kostna srž, 7 x mozak, 3 x dojka, 5 x nerv, 13 x kolon, 7 x jednjak, 2 x žučna kesa, 5 x srce, 12 x bubreg, 20 x jetra, 44 x pluća, 3 x limfni čvor, 4 x mononuklearne ćelije periferne krvi, 2 x jajnik, 6 x pankreas, 1 x trbušna maramica, 3 x hipofiza, 2 x placenta, 3 x plućna maramica, 3 x prostata, 6 x rektum, 7 x pljuvačna žlezda, 4 x skeletni mišić, 5 x koža, 3 x tanko crevo, 4 x slezina, 5 x želudac, 4 x testis, 3 x timus, 3 x štitasta žlezda, 3 x dušnik, 2 x mokraćovod, 5 x mokraćna bešika, 2 x materica, 2 x vena.

PRIMERI

PRIMER 1:

Identifikacija i kvantifikacija tumor-asociranih peptida prezentovanih na površini ćelije Uzorci tkiva

Uzorci tumora pacijenata dobijeni su od Univerziteta u Tubingenu, Tübingen, Nemačka. Od svih pacijenata pribavljeni su pisani informisani pristanci. Kod analize ligandoma, PBMC pacijenta sa HLL (učestalost HLL ćelija >80%), kao i PBMC zdravih dobrovoljaca (HV) izolovane su centrifugiranjem na osnovu gradijenta gustine. Informisani pristanak je pribavljen u skladu sa Helsinškim protokolom. Ova studija je sprovedena u skladu sa smernicama lokalnog etičkog odbora. Određivanje tipa HLA je izvršilo Odeljenje za hematologiju i onkologiju, Tibingen. Uzorci su skladišteni na -80 °C do dalje upotrebe.

1

Kvantifikacija površinske ekspresije HLA

Za poređenje sa zdravim autolognim B limfocitima, kvantifikacija površinske ekspresije HLA je izvršena na uzorcima pacijenata koji imaju najmanje 0,5% CD5-CD19<+>normalnih B ćelija. Površinska ekspresija HLA analizirana je pomoću QIFIKIT® kompleta za kvantitativnu protočnu citometriju (Dako) prema uputstvu proizvođača. Ukratko, triplikati svakog uzorka su obojeni pan-HLA klasa I specifičnim monoklonalnim antitelom (mAt) W6/32, HLA-DR-specifičnim mAt L243 (oba proizvedena interno) odnosno kontrolom IgG izotipa (BioLegend). Bojenje površinskog markera je obavljeno direktno obeleženim CD3 (BD), CD5 (BD) i CD19 (BD) antitelima. 7-AAD (BioLegend) je dodat kao marker vijabilnosti neposredno pre analize protočnom citometrijom na FACSCanto analizatoru (BD).

Izolacija HLA peptida iz uzoraka tkiva

HLA molekuli klase I i II izolovani su primenom standardnog imunoafinitetnog prečišćavanja kako je ranije opisano. Ukratko, brzo zamrznuti peleti ćelija su lizirani u 10 mmol/l CHAPS/PBS (AppliChem, St. Louis, MO, SAD/Gibco, Carlsbad, CA, SAD) koji je sadržao 1x proteazni inhibitor (Complete, Roche, Basel, Švajcarska). HLA molekuli prečišćeni su u jednom koraku pomoću pan-HLA klasa I specifičnog mAt W6/32 odnosno pan-HLA klasa II specifičnog mAt Tü39, kovalentno vezanog za CNBr-aktiviranu sefarozu (GE Healthcare, Chalfont St Giles, UK). Kompleksi HLA:peptid su eluirani ponovljenim dodavanjem 0,2% trifluorosirćetne kiseline (TFA, Merck, Whitehouse Station, NJ, SAD). Elucione frakcije E1-E8 su pulirane a slobodni HLA ligandi su izolovani pomoću ultrafiltracije primenom centrifugalnih filterskih jedinica (Amicon, Millipore, Billerica, MA, SAD). HLA ligandi su ekstrahovani i desalinizovani iz filtrata primenom ZipTip C18 vrhova za pipete (Millipore). Ekstrahovani peptidi su eluirani u 35 µl 80% acetonitrila (ACN, Merck)/0,2% TFA, centrifugirani do suva i ponovo suspendovani u 25 µl 1% ACN/0,05% TFA. Uzorci su uskladišteni na -20 °C do analize pomoću LC-MS/MS.

Analiza HLA liganda pomoću LC-MS/MS

Uzorci peptida razdvojeni su pomoću reverzno-fazne tečne hromatografije (nanoUHPLC, UltiMate 3000 RSLCnano, ThermoFisher, Waltham, MA, SAD) te naknadno analizirani u onlajn spregnutom LTQ Orbitrap XL hibridnom masenom spektrometru (ThermoFisher).

1

Uzorci su analizirani u 5 tehničkih replikata. Zapremine uzoraka od 5 µl (udeo uzorka od 20%) ubrizgavane su na 75 µm x 2 cm kolonu za hvatanje (Acclaim PepMap RSLC, ThermoFisher) pri 4 µl/min tokom 5,75 min. Separacija peptida naknadno je izvršena na 50 °C sa brzinom protoka od 175 nl/min na 50 µm x 50 cm koloni za separaciju (Acclaim PepMap RSLC, ThermoFisher) primenom gradijenta u rasponu od 2,4 do -32,0% ACN u toku 140 min. Eluirani peptidi su jonizovani pomoću nanosprej jonizacije i analizirani u masenom spektrometru koji koristi prvih 5 CID (disocijacija indukovana kolizijom) metod koji generiše spektre fragmenata za 5 najobilnijih prekursorskih jona u istražnim skenovima. Rezolucija je bila podešena na 60.000. Za HLA klasa I ligande, opseg za masu ograničen je na 400-650 m/z pri čemu su stanja naelektrisanja 2 i 3 bila dozvoljena za fragmentaciju. Za HLA klasu II analiziran je maseni opseg od 300-1.500 m/z sa stanjima naelektrisanja ≥2 dozvoljenim za fragmentaciju.

Pretraga baze podataka i spektralna anotacija

Za obradu podataka, softver Proteome Discoverer (v1.3, ThermoFisher) korišćen je za integrisanje rezultata pretrage Mascot pretraživača (Mascot 2.2.04, Matrix Science) sa humanim proteomom sačinjenim u Swiss-Prot bazi podataka (www.uniprot.org, datum izdavanja: 27. septembar 2013; sadrži 20.279 pregledanih sekvenci proteina). Pretraga je kombinovala podatke tehničkih replikata i nije bila ograničena enzimskom specifičnošću. Tolerancija za masu prekursora postavljena je na 5 ppm, tolerancija mase fragmenta na 0,5 Da. Oksidisani metionin je dopušten kao dinamična modifikacija. Pogrešne stope otkrića (FDR) određene su algoritmom perkolatora na bazi obrade u odnosu na lažnu bazu podataka koja se sastoji od izmešane ciljne baze podataka. FDR je postavljena na ciljnu vrednost od q≤0,05 (5% FDR). Slaganja peptidnog spektra (PSM) sa q≤0,05 su filtrirana prema dodatnim, ortogonalnim parametrima, da bi se obezbedio kvalitet i valjanost spektra. Mascot rezultati su filtrirani do ≥20. Za HLA klasu I, dužine peptida su ograničene na dužinu od 8-12 aminokiselina (ak). Za HLA klasu II, peptidi su ograničeni na dužinu od 12-25 ak. Grupisanje proteina je onemogućeno, što je dovelo do višestrukih anotacija peptida (npr. očuvane sekvence mapirane u više proteina). Radi kontrole kvaliteta, primenjene su granice prinosa od ≥300 jedinstvenih liganada HLA klase I i ≥100 jedinstvenih liganada HLA klase II po uzorku. HLA anotacija je izvršena korišćenjem SYFPEITHI (www.syfpeithi.de) ili proširene interne

1 1

baze podataka.

Longitudinalna analiza ligandoma pacijenta sa HLL tokom terapije

Za kvantifikaciju bez obeležavanja (LFQ) relativne zastupljenosti HLA liganda tokom terapije, količine injektovanog peptida uparenih uzoraka su normalizovane i izvršena je LC-MS/MS analiza u 5 tehničkih replikata za svaki uzorak.

Ukratko, relativne količine supstance uparenih uzoraka su izračunate iz srednjeg intenziteta prekursorskog jona određenog u ciklusima masene spektrometrije za nalaženje doze, i po potrebi su podešene razblaživanjem. Relativna kvantifikacija HLA liganda je obavljena izračunavanjem površine ispod krive odgovarajućih jonskih hromatograma sa ekstrakcijom prekursora (XIC) koristeći Proteome Discoverer 1.3. Izračunati su udeli srednje vrednosti površine pojedinačnih peptida u 5 LFQ-MS ciklusa za svaki uzorak, i urađeni su dvostrani ttestovi pomoću interne Matlab skripte (v8.2, Mathworks).

Sinteza peptida

Automatizovani sintetizator peptida EPS221 (Abimed) korišćen je za sintezu peptida korišćenjem strategije sa 9-fluorenilmetil-oksikarbonilom/terc-butilom (Fmoc/tBu) kako je opisano. Sintetički peptidi su korišćeni za potvrđivanje LC-MS/MS identifikacije, kao i za funkcionalne eksperimente.

Amplifikacija peptid-specifičnih T ćelija

PBMC pacijenata sa HLL i zdravih dobrovoljaca su uzgajane u medijumu RPMI1640 (Gibco) u koji su dodati 10% objedinjen ljudski serum (PHS, proizveden interno), 100 mmol/l βmerkaptoetanol (Roth, Karlsruhe, Nemačka) i 1% penicilin/streptomicin (GE). Za stimulaciju CD8<+>T ćelija, PBMC su odmrznute i pulsirane sa 1 µg/ml po peptidu. PBMC pulsirane peptidom (5-6 x 10<6>ćelija/ml) uzgajane su na 37 °C i 5% CO2 tokom 12 dana. U medijum za kultivaciju je 0. dana i dana dodato 1,5 ng/ml IL-4 (R&D Systems, Minneapolis, MN, SAD) i 5 ng/ml IL-7 (Promokine, Heidelberg, Nemačka). Trećeg, 5, 7. i 9. dana u medijum za kultivaciju dodato je 2 ng/ml IL-2 (R&D Systems). Peptidom-stimulisane PBMC su funkcionalno okarakterisane pomoću ELISPOT eseja 12. dana odnosno pomoću bojenja

1 2

unutarćelijskih citokina 13. dana. Za stimulaciju CD4<+>T ćelija, uzgajanje je izvršeno kao što je opisano za CD8<+>T ćelije sa 2 modifikacije: pulsiranje je izvršeno sa 10 µg/ml HLA peptida klase II i nisu dodati IL-4 i IL-7.

IFN-γ ELISPOT esej

IFN-γ ELISPOT testovi su sprovedeni kako je prethodno opisano (33). Ukratko, nitrocelulozne pločice sa 96 mesta (Millipore) obložene su sa 1 mg/ml IFN-γ mAb (Mabtech, Cincinnati, OH, SAD) i inkubirane preko noći na 4 °C. Ploče su blokirane sa 10% PHS tokom 2 h na 37 °C. 5 x 105 ćelija/mestu prethodno stimulisanih PBMC je pulsirano sa 1 µg/ml (HLA klasa I) ili 2,5 µg/ml (HLA klasa II) peptida i inkubirano 24-26 h. Očitavanja su izvršena prema uputstvu proizvođača. Tačke su brojane pomoću ImmunoSpot S5 analizatora (CTL, Shaker Heights, OH, SAD). Odgovori T ćelija smatrali su se pozitivnim kada je izbrojano >15 tačaka/mestu a srednji broj tačaka po mestu je bio najmanje 3 puta veći od srednjeg broja tačaka u mestima sa negativnom kontrolom (u skladu sa smernicama programa za imunovođenje u malignim tumorima (CIP)).

Bojenje unutraćelijskog IFN-γ i TNF-α

Učestalost i funkcionalnost peptid-specifičnih CD8<+>T ćelija analizirani su pomoću bojenja unutraćelijskih IFN-γ i TNF-α. PBMC su pulsirane sa 1 µg/ml pojedinačnog peptida i inkubirane u prisustvu 10 µg/ml brefeldina A (Sigma, St. Louis, MO, SAD) i 10 µg/ml GolgiStop (BD) tokom 6-8 h. Ćelije su obeležene primenom Cytofix/Cytoperm (BD), CD8-PECy7 (Beckman Coulter, Fullerton, CA, SAD), CD4- APC (BD Bioscience), TNF-α-PE (Beckman Coulter) i IFN-γ-FITC (BD). Uzorci su analizirani na FACS Canto II.

Učestalost CD8<+>T ćelija specifičnih za peptid određena je bojenjem pomoću anti-CD8 i HLA:peptid-tetramer-PE

Rezultati

Primarne HLL ćelije pokazuju da nema gubitka niti nishodne regulacije ekspresije HLA u poređenju sa autolognim normalnim B ćelijama

Gubitak ili nishodna regulacija HLA kod maligniteta može predstavljati glavno ograničenje imunoterapije na bazi T ćelija. Stoga, kao prvi korak, pronalazači su odredili nivoe ekspresije

1

HLA na CD19+CD5+ HLL ćelijama u poređenju sa autolognim CD19<+>CD5<->B limfocitima. Površinski nivoi HLA su kvantifikovani protočnom citometrijom u panelu 7 pacijenata sa HLL. Nivoi površinske ekspresije HLA pokazali su heterogenost individualnog pacijenta sa ukupnim brojem HLA klasa I molekula u rasponu od ~42.500-288.500 molekula/ćeliji na HLL ćelijama i -32.000-256.500 molekula/ćeliji na normalnim B ćelijama. Analiza površinske ekspresije HLA individualnog pacijenta u triplikatu otkrila je malu, ali značajnu razliku u nivoima ekspresije (P<0,01) za 4/7 pacijenata (sl. 1a). Ekspresija HLA-DR se kretala od ~29.000-100.500 na ćelijama HLL i ~19.500-79.500 na B ćelijama. Manje razlike u nivoima HLA-DR (P<0,01) uočene su kod 5/7 pacijenata. Statistička analiza srednje vrednosti površinske ekspresije HLA na ćelijama HLL u poređenju sa normalnim B ćelijama nije pokazala značajne razlike kod ekspresije HLA klase I i HLA klase II (sl. 1c,d). Ovi podaci zajedno pokazuju visoke nivoe ekspresije HLA klase I i HLA klase II na ćelijama HLL bez dokaza o gubitku HLA ili nishodnoj regulaciji u poređenju sa normalnim B ćelijama.

LC-MS/MS identifikuje širok spektar prirodno prezentovanih liganda HLA klase I i II Mapiranjem ligandoma HLA klase I 30 pacijenata sa HLL, pronalazači su mogli da prepoznaju ukupno 18.844 različitih peptida koji predstavljaju 7.377 izvornih proteina, dostižući >95% od maksimalno dostižne pokrivenosti (slika 7). Broj različitih peptida identifikovanih po pacijentu kretao se od 345-2.497 (srednja vrednost 1.131). Ukupno su u ovoj studiji identifikovani peptidi restrikovani od strane više od 30 različitih HLA-A i -B allela (koji pokrivaju >99% bele populacije_ENREF_27). U HV kohorti sa 30 donora PBMC, identifikovana su ukupno 17.322 jedinstvena peptida koji predstavljaju 7.180 različitih izvornih proteina (>90% pokrivenosti). Distribucija HLA alela u HV kohorti pokrila je 100% HLA-A i >80% HLA-B alela kohorte pacijenata sa HLL.

Analiza ligandoma HLA klase II obavljena je kod 20 pacijenata sa HLL. Identifikovano je ukupno 5.059 jedinstvenih peptida koji predstavljaju 1.486 izvornih proteina. HV kohorta HLA klase II od 13 donora PBMC dala je 2.046 različitih peptida koji predstavljaju 756 izvornih proteina.

1 4

Komparativno profilisanje ligandoma HLA klase I otkriva mnoštvo HLL-asociranih antigena

Da bi identifikovali nove HLL-asocirane antigene, pronalazači su uporedili izvorne proteome HLA liganda HLL i HV kohorti. Analiza preklapanja izvornih proteina HLA otkrila je da je 2.148 proteina (29,1% mapiranog izvornog proteoma HLL) ekskluzivno reprezentovano u HLA ligandomima pacijenata sa HLL (slika 2a). Sa ciljem da se osmisli široko primenljiva komercijalna peptidna vakcina, pronalazači su zatim odredili prioritete selekcije potencijalnih ciljeva prema sledećim kriterijumima:

HLL ekskluzivnost je definisana kao najvažniji kriterijum, za kojim slede rangiranje antigena prema učestalosti reprezentacije HLL ligandoma (sl. 2b). Naša platforma je istakla 49 izvornih proteina (0,7% izvornog proteoma HLL) predstavljenih putem 225 različitih HLA liganda koji prikazuju ekskluzivnu reprezentaciju u HLL kod ≥20% pacijenata sa HLL. Primenom iste strategije rangiranja antigena na ekskluzivne antigene PBMC HV, identifikovana je grupa od 71 antigena dobijenih od ligandoma povezanih sa benignim tkivom (LiBAA) i 298 odgovarajućih liganada (LiBAP) za primenu kao interna kontrola u imunološkim testovima.

Pored široko reprezentovanih CLL-LiTAA prikladnih za dizajn komercijalnih vakcina, naša platforma je identifikovala drugi panel od 2.099 ekskluzivnih HLL antigena sa učestalošću reprezentacije <20%. Ovi ciljevi predstavljaju skladišta za individualizovanije terapeutske pristupe.

Detekcija prirodno prezentovanih liganada HLA klase I dobijenih iz ustanovljenih HLL-asociranih antigena putem LC-MS/MS

Pored identifikacije novih HLL-asociranih antigena, drugi pristup je bio usredsređen na rangiranje nekoliko utvrđenih HLL antigena u okviru predmetne baze podataka prirodno prezentovanih HLA liganda. Pronalazači su mogli da identifikuju 28 različitih HLA liganda koji predstavljaju 8 opisanih HLL-asociranih antigena. Kao napomena, samo fibromodulin (FMOD324-333, RINEFSISSF, HLA-A*23 (ID BR. SEKV: 526) je pokazao ekskluzivnu reprezentaciju HLL, rangiran kao br.437 od HLL antigena u predmetnoj bazi podataka, usled male učestalosti reprezentacije u kohorti pacijenata sa HLL. Preostalih sedam antigena je

1

pokazalo reprezentaciju na HLL i PBMC HV , pa tako ne ispunjavaju najvažniji kriterijum za HLL ekskluzivnost. Međutim, kod CD19, CD20, RHAMM i PRAME, detektovana je prekomerna prezentacija povezana sa HLL različitog stepena (sl.2c).

Komparativno profilisanje ligandoma identifikuje LiTAA zajednički za različite faze bolesti i slojeve rizika

Da bi se ocenila primenljivost novih ciljeva u različitim fazama bolesti, pronalazači su izvršili profilisanje ligandoma specifično za podskup poređenjem pacijenata u fazama bolesti po Binetu A (n=9), B (n=7) i C (n=14). Analizom preklapanja 2.148 ekskluzivnih HLL izvornih proteina određeno je da je njih 550 (25,6%) zajedničko za najmanje dve faze, sa osnovnom grupom od 137 proteina (6,1%) predstavljenih kod pacijenata u sve tri faze bolesti (sl. 2d). Kao napomena, 45/49 (91,8%) LiTAA pripada osnovnoj grupi zajedničkih izvornih proteina predstavljenih u sve tri podgrupe. Analiza toplotne karte učestalosti reprezentacije svih 49 LiTAA u fazama bolesti po Binetu A, B i C prikazana je na sl.2e.

Drugi akcenat je stavljen na određivanje reprezentacije LiTAA kod podgrupe pacijenata sa visokim rizikom koji imaju deleciju 17p13 (del17p, n=5) u poređenju sa pacijentima bez genetske aberacije (bez del17p, n=25). Pronalazači su našli 77,7% identifikovanih LiTAA predstavljenih u obe podgrupe (sl. 2f). Ovi podaci zajedno podržavaju osmišljenu strategiju analize koja uključuje kohortu ligandoma HLA za izbor široko primenljivih ciljeva.

Funkcionalna karakterizacija HLA klasa I LiTAP otkriva HLL-asociranu imunoreaktivnost

Da bi se izvršila procena imunogenosti i specifičnosti naših LiTAP HLA klase I, istraživači su zatim sproveli 12-dnevne IFN-γ ELISPOT testove podsećanja. Panel od 15 LiTAP (6 A*02, 4 A*03 i 5 B*07 LiTAP) primenjen je za stimulaciju PBMC sa odgovarajućim HLA dobijenih od pacijenata sa HLL i zdravih dobrovoljaca (sl. 3a). Pronalazači su primetili sekreciju IFNγ kod 14/15 (93,3%) od ispitanih LiTAP kod pacijenata sa HLL (3/4 A*03 (sl. 3c), 6/6 A*02 i 5/5 B*07 LiTAP (sl. 8 c,f)), ali ne kod uzoraka zdravih ljudi (0/10, sl. 3b, sl. 8 b,e). Ti rezultati su potvrđeni na primerima za P 3

A*03(DMXL11271-1279 SSSGLHPPK) bojenjem tetramera CD8+ T ćelija i intracelularnim bojenjem citokina za IFNγ i TNFα (sl. 9 a,b).

1

ELISPOT testovi u kojima se koriste LiBAP dobijeni od benignog tkiva sa odgovarajućim HLA obavljeni su da se proveri specifičnost HLL primećenog imunskog prepoznavanja usmerenog na LiTAP kod pacijenata sa HLL. Pronalazači su ispitali panel od 9 LiBAP (3 A*02, 3 A*03, 3*B*07) i nisu primetili značajnu sekreciju IFNγ ni kod jednog od ispitanih pacijenata sa HLL (0/7 A*03 (sl.3d), 0/10 A*02+ i 0/5 B*07 (sl.8 a,d)).

Za 14/15 LiTAP koji pokazuju imunsko prepoznavanje kod 1 ili više pacijenata, pronalazači su izračunali učestalosti HLA restrikovane prezentacije podešene prema alelima (detektovano pomoću LC-MS/MS) i učestalosti imunoreaktivnosti (detektovano pomoću ELISPOT) kod pacijenata sa HLL. Uočljivo je da je primećena linearna korelacija ova dva parametra (Pirsonov r=0,77, R<2>=0,59, sl. 3 e). Ovi rezultati ukazuju na dve glavne tačke: Prvo, ekskluzivna reprezentacija u tumoru je preduslov za imunsko prepoznavanje. Drugo, može se direktno doneti zaključak o učestalosti imunskog prepoznavanja na osnovu učestalosti HLA restrikovane prezentacije za imunoreaktivne LiTAP. Ovi podaci zajedno pokazuju efikasnost našeg pristupa identifikovanju imunološki bitnih ciljeva za peptidne vakcine specifične za HLL.

Analiza ligandoma HLA klase II identifikuje dodatne CD4+ T ćelijske epitope za dizajniranje sinergističke vakcine

Zbog značajne indirektne i direktne uloge koje CD4<+>T ćelije imaju u antitumorskom imunskom odgovoru, optimalni dizajn vakcine zahteva uključivanje dodatnih epitopa HLA klase II. Pronalazači su obavili analizu preklapanja za ligandome HLL i PBMC HV i identifikovali su 937 proteina (63,0% od identifikovanih izvornih proteina HLL) ekskluzivno predstavljenih u ligandomima pacijenata sa HLL (sl.4 a). Primenom iste strategije rangiranja antigena koja je opisana za HLA klase I, pronalazači su identifikovali 73 LiTAA HLA klase II koje predstavlja 460 odgovarajućih LiTAP (sl. 4 b). Funkcionalna karakterizacija panela 7 LiTAP HLA klase II (sl. 4c) na testovima IFNγ ELISPOT otkrila je značajnu sekreciju IFNγ za 6/7 (85,7%) LiTAP kod pacijenata sa HLL (sl. 4e), ali ne kod kontrolnih uzoraka zdravih ljudi (0/10, sl.4d). Pronalazači su nadalje obavili kombinovanu analizu ligandoma HLA klase I i II da bi identifikovali zajedničke, sinergističke ciljeve. Analizom preklapanja ekskluzivnih HLL izvornih proteina određena su 132 proteina koji su predstavljeni i kod ligandoma HLA

1

klase I i kod klase II (sl. 4f). Analizom toplotne karte identifikovana su 2 proteina koji prikazuju učestalosti reprezentacije ≥20% kod oba ligandoma (B4GALT1 (26,7% klasa I/30,0% klasa II), HLA-DMA (20,0% klasa I/20% klasa II), sl. 4g). Uočljivo je da je jedan LiTAP klase I (HLA-DMA206-214, HEIDRYTAI, B*18) potpuno ugrađen u odgovarajući LiTAP klase II (VTHEIDRYTAIAY (ID BR. SEKV. 924)). Pronalazači su zajedno identifikovali panel LiTAP klase II koji se mogu potvrditi kao epitopi T ćelija, kao i spektar potencijalno sinergističkih liganada HLA klase II koji pokrivaju LiTAA klase I.

Longitudinalna analiza ligandoma pacijenata sa HLL pod različitim terapeutskim režimima

Opseg imunoterapije na bazi peptida obuhvata terapiju održavanja i iskorenjivanje MRD. Usled toga, vakcinacija peptidom kod HLL bi se odigrala posle standardne hemio-/imunoterapije. Zato su pronalazači analizirali ekspresiju HLA i izvršili profilisanje ligandoma u različitim vremenskim tačkama kod pacijenata sa HLL na različitim terapijskim režimima.

Pronalazači su kvantifikovali površinsku ekspresiju HLA klase I i II kod 4 pacijenta koji se leče rituksimabom (Rt0h, Rt24h) i 1 pacijenta koji prima alemtuzumab (At0h, At72h, At7d, sl. 10 a-d). Površinska ekspresija HLA je pokazala heterogenost pojedinačnog pacijenta bez značajnih promena srednje vrednosti ekspresije HLA klase I (Rt0h=50.500, Rt24h=48.000; At0h=42.500, At7d=61.500) i HLA klase II (Rt0h=36.500, Rt24h=27.500; At0h=47.000, At7d=55.500) tokom bilo kog režima terapije.

Longitudinalno profilisanje ligandoma HLA klase I je izvršeno na pojedinačnim pacijentima koji primaju rituksimab-bendamustin, alemtuzumab ili ofatumumab (sl. 5a-c). Primećena je različita prezentacija (≥2-struka promena, p≤0,05) za 11,1% liganada HLA klase I kod lečenja rituksimabom-bendamustinom, 21,6% liganada kod lečenja ofatumumabom i 33,6% liganada kod lečenja alemtuzumabom. Ukupno je otkriveno da su LiTAP koji predstavljaju 8/49 (16,3%) LiTAA diferencijalno prezentovani tokom terapije. Ovi podaci zajedno pokazuju stabilnu ekspresiju površinskog HLA i robusnu prezentaciju LiTAP tokom različitih terapija.

1

Imunski odgovori na LiTAP mogu biti povezani sa poboljšanim ukupnim preživljavanjem pacijenata sa HLL

Kao poslednji korak, pronalazači su izvršili retrospektivnu analizu preživljavanja 33 pacijenta sa HLL (sl. 6a) putem ELISPOT testova, upoređujući slučajeve sa 0-1 LiTAP-specifičnih (n=23) prema >1 LiTAP-specifičnih (n=10) T-ćelijskih odgovora (sl.6 b). U kohorti sa malim odgovorom umrlo je 6/23 (26,1%) pacijenata, u kohorti sa velikim odgovorom 0/11. Izgleda da je ukupno preživljavanje produženo u kohorti koja je pokazala >1 imunske reakcije.

PRIMER 2

Sinteza peptida

Svi peptidi su sintetisani pomoću standardne i dobro ustanovljene sinteze peptida u čvrstoj fazi primenom strategije Fmoc. Nakon prečišćavanja pomoću preparativne RP-HPLC, sproveden je postupak jonske izmene da bi se inkorporirali fiziološki kompatibilni kontrajoni (na primer, trifluoro-acetat, acetat, amonijum ili hlorid).

Identitet i prečišćenost svakog pojedinačnog peptida utvrđeni su masenom spektrometrijom i analitičkom RP-HPLC. Nakon jonoizmenjivačke procedure peptidi su dobijeni kao beli do prljavo-beli liofilizati u čistoćama 90% do 99,7%.

Svi TUMAP se poželjno primenjuju u obliku trifluoro-acetatnih soli ili acetatnih soli, mogući su i drugi oblici soli. Za merenja u primeru 4 korišćene su trifluoro-acetatne soli peptida.

PRIMER 3

Test vezivanja MHC

Peptidi kandidati za terapije zasnovane na T ćelijama kako su predstavljeni su dalje testirani u pogledu njihovog kapaciteta vezivanja MHC (afinitet). Pojedinačni kompleksi peptid-MHC su proizvedeni pomoću izmene peptid-ligand, gde je peptid osetljiv na cepanje odvojen i zamenjen peptidom od interesa prema analizi. Samo peptidi kandidati koji mogu efikasno da vežu i stabilizuju peptid-receptivne MHC molekule sprečavaju disocijaciju MHC kompleksa. Da bi se utvrdio prinos reakcije zamene, sprovedena je ELISA zasnovana na detekciji lakog lanca (β2m) stabilizovanih MHC kompleksa. Esej je sproveden kako je uopšteno opisano u

1

radu Rodenko et al. (Rodenko et al., Nat Protoc.1 (2006): 1120- 1132).

MAXISorp pločice sa 96 mesta (NUNC) obložene su preko noći sa 2 ug/ml streptavidina u PBS-u na sobnoj temperaturi, isprane 4 puta i blokirane tokom 1 h na 37 °C u 2% BSA koji sadrži pufer za blokiranje. Ponovo presavijeni HLA-A*0201/MLA-001 monomeri služili su kao standardi, pokrivajući opseg od 15-500 ng/ml. Monomeri peptid-MHC iz UV-izmenjivačke reakcije razblaženi su 100 puta u puferu za blokiranje. Uzorci su inkubirani tokom 1 h na 37 °C, isprani četiri puta, inkubirani sa 2 µg/ml HRP konjugovanog anti-β2m tokom 1 h na 37 °C, isprani ponovo i detektovani sa rastvorom TMB koji je zaustavljen sa NH2SO4. Apsorpcija je izmerena na 450 nm. Peptidi kandidati koji pokazuju visok prinos izmene (poželjno veći od 50%, najpoželjnije veći od 75%) se generalno preferiraju za generisanje i proizvodnju antitela ili njihovih fragmenata, i/ili T-ćelijskih receptora ili njihovih fragmenata, jer oni pokazuju dovoljan aviditet prema MHC molekulima i sprečavaju disocijaciju MHC kompleksa.

Rezultati vezivanja MHC klasa I za testirane peptide bili su; <20% = ; 20%–49% = +; 50%–75%= ++; >= 75% = +++

PRIMER 4

In vitro imunogenost za MHC klasa I-prezentovane peptide

Da bi se dobile informacije u pogledu imunogenosti predstavljenih TUMAP, istraživači su sproveli ispitivanja pomoću eseja za in vitro prajming T ćelija zasnovanog na ponovljenim stimulacijama CD8+ T ćelija sa veštačkim antigen-prezentujućim ćelijama (aAPĆ) napunjenim kompleksima peptid/MHC i anti-CD28 antitelom. Na ovaj način istraživači su mogli da pokažu imunogenost za HLA-A*0201-restrikovane TUMAP koji su do sada predstavljeni, dokazujući da su ovi peptidi T-ćelijski epitopi protiv kojih kod ljudi postoje CD8+ prekursorske T ćelije.

1

In vitro priprema CD8+ T ćelija

Da bi izvršili in vitro stimulacije pomoću veštačkih antigen-prezentujućih ćelija napunjenih kompleksom peptid-MHC (pMHC) i anti-CD28 antitelom, istraživači su prvo izolovali CD8+ T ćelije iz svežih proizvoda leukafereze HLA-A*02 putem pozitivne selekcije primenom CD8 mikroperli (Miltenyi Biotec, Bergisch-Gladbach, Nemačka) zdravih donora dobijenih iz Univerzitetskih klinika u Manhajmu, Nemačka, nakon pribavljanja informisanog pristanka.

PBMC i izolovani CD8+ limfociti su inkubirani do primene u T-ćelijskom medijumu (TCM) koji je sadržao RPMI-Glutamax (Invitrogen, Karlsruhe, Nemačka) u koji je dodat 10% humani toplotom inaktiviran AB serum (PAN-Biotech, Aidenbach, Nemačka), 100 U/ml penicilina / 100 µg/ml streptomicina (Cambrex, Cologne, Nemačka), 1 mmol/l natrijum piruvata (CC Pro, Oberdorla, Nemačka), 20 µg/ml gentamicina (Cambrex). U ovom koraku, u TCM je takođe dodato 2,5 ng/ml IL-7 (PromoCell, Heidelberg, Nemačka) i 10 U/ml IL-2 (Novartis Pharma, Nurnberg, Nemačka).

Stvaranje perli obloženih sa pMHC/anti-CD28, stimulacije T ćelija i očitavanje su izvršeni u visoko definisanom in vitro sistemu primenom četiri različita pMHC molekula po uslovu stimulacije i 8 različitih pMHC molekula po uslovu očitavanja.

Prečišćeno kostimulatorno mišje IgG2a antihumano CD28 At 9.3 (Jung et al., Proc Natl Acad Sci USA 84 (1987): 4611-4615) je hemijski biotinilovano pomoću sulfo-N-hidroksisukcinimidobiotina, kako je preporučeno od strane proizvođača (Perbio, Bonn, Nemačka). Korišćene perle bile su polistirenske čestice obložene streptavidinom prečnika 5,6 µm (Bangs Laboratories, Illinois, SAD).

pMHC korišćeni za stimulacije pozitivne i negativne kontrole bili su A*0201/M LA-001 (peptid ELAGIGILTV (ID BR. SEKV.1017) iz modifikovanog Melan-A/MART-1) odnosno A*0201/DDX5-001 (YLLPAIVHI iz DDX5, ID BR. SEKV.1018).

800.000 perli / 200 µl je bilo obloženo u pločicama sa 96 mesta u prisustvu 4 x 12,5 ng različitih biotin-pMHC, isprano i naknadno je dodato 600 ng biotin anti-CD28 u zapremini od

1 1

200 µl. Stimulacije su bile pokrenute u pločicama sa 96 mesta istovremenim inkubiranjem 1x106 CD8+ T ćelija sa 2x10<5>ispranih obloženih perli u 200 µl TCM u koji je dodato 5 ng/ml IL-12 (PromoCell) u toku 3 dana na 37 °C. Polovina medijuma je zatim zamenjena sa svežim TCM u koji je dodato 80 U/ml IL-2 i inkubacija je nastavljena u toku 4 dana na 37 °C. Ovaj ciklus stimulacije je izvršen ukupno tri puta. Za očitavanje pMHC multimera pomoću 8 različitih molekula pMHC po uslovu, korišćen je pristup dvodimenzionalnog kombinatornog kodiranja kako je ranije opisano (Andersen et al., Nat.Protoc. 7 (2012): 891-902) sa manjim modifikacijama koje obuhvataju spajanje sa 5 različitih fluorohroma. Na kraju, analize multimera su izvršene bojenjem ćelija sa bojom Live/dead near IR dye (Invitrogen, Karlsruhe, Nemačka), klonom CD8-FITC antitela SK1 (BD, Heidelberg, Nemačka) i fluorescentnim pMHC multimerima. Za analizu je korišćen BD LSRII SORP citometar opremljen odgovarajućim laserima i filterima. Peptid-specifične ćelije izračunate su kao procenat ukupnih CD8+ ćelija. Evaluacija analize multimera izvršena je primenom FlowJo softvera (Tree Star, Oregon, SAD). In vitro prajming specifičnih multimer+ CD8+ limfocita detektovan je upoređivanjem sa stimulacijama negativne kontrole. Imunogenost datog antigena detektovana je ako je pronađeno da najmanje jedno procenjivo in vitro stimulisano mesto jednog zdravog donora sadrži specifičnu CD8+ T-ćelijsku liniju nakon in vitro stimulacije (tj. ovo mesto je sadržalo najmanje 1% specifičnih multimer+ među CD8+ T ćelijama a procenat specifičnih multimer+ ćelija je bio najmanje 10x veći od srednje vrednosti stimulacija negativne kontrole).

In vitro imunogenost za HLL peptide

Za testirane HLA klasa I peptide, in vitro imunogenost je mogla da se pokaže stvaranjem peptid-specifičnih T-ćelijskih linija. Kao primer rezultata, peptid KFAEEFYSF (ID BR. SEKV. 20) doveo je do in vitro T-ćelijskih odgovora kod 2 od 5 testiranih donora.

PRIMER 5

Identifikacija i kvantifikacija tumor-asociranih peptida prezentovanih na površini ćelije Uzorci tkiva:

Pored uzoraka koji se koriste za identifikaciju peptida, nezavisan set uzoraka koji sadrži i normalno i tumorsko (HLL) tkivo je korišćen za analizu / potvrđivanje HLA-A*02-asociranih

1 2

kao što je prikazano. Pre operacije ili autopsije, od svih pacijenata je pribavljen pisani informisani pristanak. Tkiva su zamrznuta brzim zamrzavanjem neposredno nakon ekscizije i uskladištena na -70 °C ili manje do izolacije TUMAP.

Izolacija HLA peptida iz uzoraka tkiva

Skupovi HLA peptida iz brzo zamrznutih uzoraka tkiva su dobijeni imunskom precipitacijom iz čvrstih tkiva prema malo modifikovanom protokolu (Falk et al., Nature 351 (1991): 290-296; Seeger et al., Immunogenetics 49 (1999): 571-576) upotrebom HLA-A*02-specifičnog antitela BB7.2, HLA-A, -B, -C-specifičnog antitela W6/32, CNBr-aktivirane sefaroze, tretiranjem kiselinom i ultrafiltracijom.

Analize masenom spektrometrijom

Dobijeni pulovi HLA peptida su odvojeni prema njihovoj hidrofobnosti pomoću reverznofazne hromatografije (nanoAcquity UPLC sistem, Waters) a eluirani peptidi su analizirani u LTQ-velos i fuzionim hibridnim masenim spektrometrima (ThermoElectron) opremljenim ESI izvorom. Pulovi peptida su direktno postavljeni na analitičku mikrokapilarnu kolonu od fuzirane silike (75 µm i.d. x 250 mm) upakovanu sa 1,7 µm C18 reverzno-faznim materijalom (Waters) uz primenu brzine protoka od 400 nl u minutu. Nakon toga, peptidi su izdvojeni primenom dvostepenog 180-minutnog binarnog gradijenta od 10% do 33% B pri brzini protoka od 300 nl u minutu. Gradijent su činili rastvarač A (0,1% mravlja kiselina u vodi) i rastvarač B (0,1% mravlja kiselina u acetonitrilu). Staklena kapilara obložena zlatom (PicoTip, New Objective) je korišćena za uvođenje u nanoESI izvor. LTQ-Orbitrap maseni spektrometri su radili u režimu zavisnom od podataka primenom strategije TOP5 (5 najvećih). Ukratko, iniciran je ciklus skeniranja sa kompletnim skeniranjem visoke masene preciznosti u orbitrap (R = 30 000), što je bilo praćeno MS/MS skeniranjima takođe u orbitrap (R = 7500) na 5 najzastupljenijih prekursorskih jona sa dinamičkim isključivanjem prethodno odabranih jona. Tandem maseni spektri su interpretirani pomoću SEQUEST i dodatnom ručnom kontrolom. Identifikovana peptidna sekvenca je potvrđena poređenjem generisanog obrasca fragmentacije prirodnog peptida sa obrascem fragmentacije sintetičkog referentnog peptida identične sekvence.

1

Relativna LC-MS kvantifikacija bez obeležavanja izvršena je pomoću brojanja jona tj. ekstrakcijom i analizom LC-MS karakteristika (Mueller et al., Proteomics. 7 (2007): 3470-3480). Metod pretpostavlja da oblast LC-MS signala peptida korelira sa njegovom obilnošću u uzorku. Ekstrahovane karakteristike su dalje obrađene pomoću dekonvolucije naelektrisanog stanja i poravnanja vremena zadržavanja (Mueller et al., J Proteome.Res 7 (2008): 51-61; Sturm et al., BMC.Bioinformatics. 9 (2008): 163). Na kraju, sve LC-MS karakteristike su referencirane sa rezultatima identifikacije sekvence kako bi se kvantitativni podaci od različitih uzoraka i tkiva kombinovali u profile prezentacije peptida. Kvantitativni podaci su normalizovani na dvostepeni način u skladu sa centralnom tendencijom kako bi se uračunala varijacija u okviru tehničkih i bioloških replikata. Tako svaki identifikovani peptid može biti povezan sa kvantitativnim podacima što omogućava relativnu kvantifikaciju između uzoraka i tkiva. Pored toga, svi kvantitativni podaci dobijeni za peptidne kandidate su ručno pregledani kako bi se osigurala doslednost podataka i potvrdila tačnost automatizovane analize. Za svaki peptid je izračunat profil prezentacije koji pokazuje srednju prezentaciju uzorka kao i varijacije replikata. Profili postavljaju jedno uz drugo uzorke HLL sa polaznim vrednostima uzoraka normalnog tkiva. Profil prezentacije primernog prekomerno prezentovanog peptida prikazan je na slici 11.

Navedene reference

Ding, M. X. et al., Asian Pac.J Cancer Prev.13 (2012): 5653-5657

Gallardo-Perez, J. C. et al., Biochim.Biophys.Acta 1843 (2014): 1043-1053

Jardim, B. V. et al., Oncol Rep.30 (2013): 1119-1128

Jevnikar, Z. et al., J Biol.Chem 288 (2013): 2201-2209

Liu, Y. Y. et al., Mol.Cancer 9 (2010): 145

Mayr, C. et al., Blood 105 (2005): 1566-1573

Men, T. et al., Tumour.Biol. 35 (2014): 269-275

Nagai, K. et al., Cancer Med.3 (2014): 1085-1099

Pallasch, C. P. et al., Blood 112 (2008): 4213-4219

Poeta, M. L. et al., Genes Chromosomes.Cancer 51 (2012): 1133-1143

Teh, M. T. et al., PLoS.One. 7 (2012): e34329

1 4

Yi, S. et al., Leuk.Lymphoma 52 (2011): 72-78

Yoon, D. Y. et al., Biochem.Biophys.Res.Commun. 288 (2001): 882-886 Yu, Z. et al., Zhonghua Yi.Xue.Za Zhi.91 (2011): 1371 -1374 Zhang, K. et al., Chin Med.J (Engl.) 126 (2013): 4660-4664

Zhou, H. et al., lUBMB.Life 64 (2012): 889-900

1

11

12

1

14

1

11

12

1

14

1

2

21

22

2

24

2

21

22

2

21

22

2

24

2

24

2

21

22

2

24

2

21

22

2

24

2

21

22

2

24

2

21

22

2

24

2

21

22

2

24

2

1

2

4

1

11

12

1

14

1

2

21

22

2

24

2

1

2

4

41

42

4

44

4

1

2

4

1

2

4

Claims

Patentni zahtevi

1. Peptid dužine između 10 i 30 aminokiselina, koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja se sastoji od ID BR. SEKV: 167, ili njenu farmaceutski prihvatljivu so.

2. Peptid prema zahtevu 1, naznačen time što navedeni peptid ima sposobnost vezivanja za molekul humanog glavnog kompleksa gena tkivne podudarnosti (MHC) klase I.

3. Peptid prema zahtevu 1 ili 2, sadrži sekvencu ID BR. SEKV: 167.

4. Peptid prema bilo kom od zahteva 1 do 3, naznačen time što navedeni peptid sadrži nepeptidne veze.

5. Fuzioni protein koji sadrži

(a) aminokiselinsku sekvencu koja se sastoji od ID BR. SEKV: 167 i

(b) N-terminalnih aminokiselina 1-80 HLA-DR antigen-asociranog nepromenljivog lanca (Ii).

6. Antitelo koje se specifično vezuje za humani glavni kompleks gena tkivne podudarnosti (MHC) klase I koji je u kompleksu sa peptidom prema bilo kom od zahteva 1 do 3.

7. T-ćelijski receptor koji se vezuje za humani glavni kompleks gena tkivne podudarnosti (MHC) klase I koji je u kompleksu sa peptidom prema bilo kom od zahteva 1 do 3.

8. Nukleinska kiselina koja kodira (a) peptid prema bilo kom od zahteva 1 do 3, (b) T-ćelijski receptor prema zahtevu 7, (c) fuzioni protein prema zahtevu 5 ili (d) antitelo prema zahtevu 6.

9. Vektor ekspresije koji sadrži nukleinsku kiselinu prema zahtevu 8.

10. Ćelija domaćin koja sadrži nukleinsku kiselinu prema zahtevu 8 ili vektor ekspresije prema zahtevu 9.

11. Metod za proizvodnju peptida prema bilo kom od zahteva 1 do 3; T-ćelijskog receptora prema zahtevu 7; fuzionog proteina prema zahtevu 5, ili antitela prema zahtevu 6, pri čemu se navedeni metod sastoji od uzgajanja ćelije domaćina prema zahtevu 10, i izolovanja navedenog peptida, navedenog T-ćelijskog receptora, navedenog fuzionog proteina ili navedenog antitela iz navedene ćelije domaćina i/ili njenog medijuma za kultivaciju.

12. In vitro metod za proizvodnju aktiviranih citotoksičnih T limfocita (CTL), pri čemu se metod sastoji od dovođenja u kontakt in vitro CTL sa humanim MHC molekulima klase I sa ubačenim antigenom eksprimiranim na površini prikladne antigenprezentujuće ćelije u toku vremenskog perioda koji je dovoljan da se navedeni CTL aktiviraju na antigen-specifičan način, naznačeno time što je navedeni antigen navedeni peptid prema zahtevu 1 ili 2.

13. Aktivirani citotoksični T limfocit (CTL), proizveden metodom prema zahtevu 12.

14. Farmaceutska smeša, koja sadrži najmanje jedan aktivni sastojak izabran iz grupe koja se sastoji od peptida prema bilo kom od zahteva 1 do 3, T-ćelijskog receptora prema zahtevu 7, fuzionog proteina prema zahtevu 5, ili antitela prema zahtevu 6, nukleinske kiseline prema zahtevu 8, vektora ekspresije prema zahtevu 9, ćelije domaćina prema zahtevu 10 i aktiviranog citotoksičnog T limfocita prema zahtevu 13, i farmaceutski prihvatljivog nosača.

15. Farmaceutska smeša prema zahtevu 14 za upotrebu kao lek koji je aktivan protiv malignog tumora, kao što je, na primer, hronična limfocitna leukemija (HLL), akutna mijeloidna leukemija (AML), adenokarcinom i karcinom jajnika.