[go: up one dir, main page]

RS60437B1 - Rekombinantne probiotske bakterije - Google Patents

Rekombinantne probiotske bakterije

Info

Publication number
RS60437B1
RS60437B1 RS20200690A RSP20200690A RS60437B1 RS 60437 B1 RS60437 B1 RS 60437B1 RS 20200690 A RS20200690 A RS 20200690A RS P20200690 A RSP20200690 A RS P20200690A RS 60437 B1 RS60437 B1 RS 60437B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
interleukin
growth factor
factor
lactobacillus
probiotic bacteria
Prior art date
Application number
RS20200690A
Other languages
English (en)
Inventor
Thomas Wirth
JUHA YRJäNHEIKKI
Haritha Samaranayake
Dirk Weber
Igor Mierau
Peter Allard Bron
Herwig Bachmann
Original Assignee
Aurealis Oy
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Aurealis Oy filed Critical Aurealis Oy
Publication of RS60437B1 publication Critical patent/RS60437B1/sr

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
    • A61K35/74—Bacteria
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
    • A61K35/74—Bacteria
    • A61K35/741—Probiotics
    • A61K35/744—Lactic acid bacteria, e.g. enterococci, pediococci, lactococci, streptococci or leuconostocs
    • A61K35/747—Lactobacilli, e.g. L. acidophilus or L. brevis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/18—Growth factors; Growth regulators
    • A61K38/1825—Fibroblast growth factor [FGF]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/193—Colony stimulating factors [CSF]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/20—Interleukins [IL]
    • A61K38/2026—IL-4
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • C07K14/50—Fibroblast growth factor [FGF]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • C07K14/50—Fibroblast growth factor [FGF]
    • C07K14/503—Fibroblast growth factor [FGF] basic FGF [bFGF]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/53—Colony-stimulating factor [CSF]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/54—Interleukins [IL]
    • C07K14/5406—IL-4
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • C12N15/746—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for lactic acid bacteria (Streptococcus; Lactococcus; Lactobacillus; Pediococcus; Enterococcus; Leuconostoc; Propionibacterium; Bifidobacterium; Sporolactobacillus)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K2035/11—Medicinal preparations comprising living procariotic cells
    • A61K2035/115—Probiotics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/52—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells
    • A61K2039/522—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells avirulent or attenuated
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/50—Fusion polypeptide containing protease site

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Coloring Foods And Improving Nutritive Qualities (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Description

Opis
[0001] Pronalazak je usmeren na rekombinantne probiotske bakterije, naročito na upotrebu u tretmanu inflamatorne disfunkcije kože, kao i postupka za tretiranje inflamatorne disfunkcije kože.
[0002] Predmetna prijava se poziva na prioritet međunarodne prijave PCT/EP2015/052345.
[0003] Makrofagi su tip belih krvnih ćelija koje se mogu naći u suštinski svim tkivima. Makrofagi imaju kritičnu ulogu u nespecifičnoj odbrani i takođe pomažu iniciranje mehanizama specifične odbrane regrutacijom drugih imunih ćelija kao što su limfociti.
[0004] Makrofagi postoje kao otporni tkivno specifični makrofagi ili su izvedeni iz cirkulišućih krvnih monocita koji se diferenciraju u makrofage.
[0005] Makrofagi prikazuju različita aktivaciona stanja. Dva suprotna aktivaciona stanja su poznata kao klasično aktivirani makrofagi, koji su takođe označeni kao M1-polarizovani makrofagi, i alternativno aktivirani makrofagi, koji su takođe označeni kao M2-polarizovani makrofagi.
[0006] M1-polarizovani makrofagi sadrže imune efektorne ćelije sa aktivnim inflamatornim fenotipom. M1-polarizovani makrofagi se karakterišu ekspresijom visokih nivoa proinflamatornih citokina, visokom proizvodnjom reaktivnih azotovih i kiseonikovih intermedijera, promocijom Th1 odgovora, i snažnom mikrobicidnom i tumoricidnom aktivnošću.
[0007] M2-polarizovani makrofagi su anti-inflamatorni fenotip. Smatra se da su M2-polarizovani makrofagi uključeni u izolaciju parazita i promociju remodelovanja tkiva i progresije tumora i imaju imunoregulatorne funkcije. M2-makrofagi se takođe karakterišu efikasnom fagocitnom aktivnošću, visokom ekspresijom skevendžer molekula.
[0008] Plastičnost i fleksibilnost su osobine mononuklearnih fagocita u njihovim aktiviranim stanjima. Na primer, fenotip M1-polarizovanih ili M2-polarizovanih makrofaga može se preobratiti in vitro i in vivo.
[0009] Makrofagi se mogu promeniti nekoliko puta, u zavisnosti od stimulusa u mikro sredini, sekrecionog obrasca citokina i hemokina. Na primer, humani primarni M1-polarizovani makrofagi mogu se repolarizovati sekrecionim faktorima iz njihovih odgovarajućih oblika, u M2-polarizovane makrofage, i obrnuto in vitro i in vivo.
[0010] Dodatno tome što predstavljaju prvu liniju odbrane protiv patogena, mononuklearni fagociti doprinose remodelovanju i popravku tkiva pod homeostatskim i oštećujućim stanjima.
[0011] Dodatno, makrofagi esencijalno doprinose kontroli inflamacije sa M1-polarizovanim makrofagima impliciranim u iniciranje i održavanje inflamacije i M2-polarizovanim makrofagima povezanim sa kontrolom hronične inflamacije.
[0012] Na primer, makrofagi podležu dinamičkim promenama tokom različitih faza zarastanja rane. M1-polarizovani makrofagi posreduju u oštećenju tkiva i iniciraju inflamatorne odgovore. Dodatno, tokom ranih stadijuma odgovora za popravljanje rane, makrofagi koji infiltriraju u kožu pokazuju M2-polarizovani fenotip i pomažu formiranje izrazito vaskularizovanog, ćelijskog granularnog tkiva.
[0013] Inflamacija se može okarakterisati kao akutna inflamacija, u uslovima kao što je sepsa, trauma, i zarastanje rana, ili kao hronična inflamacija, na primer kod bolesti kao što je reumatoidni artritis, ulcerativni kolitis, Crohn-ova bolest, itd. Mnoge druge bolesti, kao što su kancer, dijabetes, arterioskleroza, Alzheimer-ova bolest i gojaznost su takođe povezane sa deregulisanom inflamacijom.
[0014] Akutni inflamatorni odgovor uključuje kaskadu događaja, posredovanih sa velikim nizom ćelija i molekula koji lociraju invazivne patogene ili oštećeno tkivo, upozoravaju i regrutuju druge ćelije i molekule, eliminišu ugrožavajuće agense i konačno vraćaju telo u ravnotežu.
[0015] Kod sepse i traume, ovaj odgovor je praćen makroskopskim manifestacijama kao što je groznica i povećan puls. U drugim tkivima, inflamacija se manifestuje kao crvenilo, otok i bol.
[0016] Napredovanje inflamacije koje vodi oštećenju/disfunkciji može rezultovati u stalnoj, deregulisanoj inflamaciji koja promoviše disfunkciju organa i smrt. Dobro regulisani inflamatorni odgovor je neophodan za ispravno zarastanje tkiva.
[0017] Obnavljanje integriteta kože i homeostaza koja prati povrede zahteva kompleksno i dinamično uzajamno dejstvo epitelnih i mezenhimskih ćelija zajedno sa tkivno rezistentnim i regrutovanim hematopoetskim ćelijama da bi se postigle sekvencijalne faze odgovora za obnavljanje: inflamaciju, formiranje tkiva, i sazrevanje. Rani stadijumi obnavljajućeg odgovora dominirani su od strane inflamatorne faze, koja se karakteriše lokalnom aktivacijom urođenog imunog sistema što rezultuje u trenutnom influksu neutrofila nakon čega sledi posledična invazija krvnih monocita, koji se diferenciraju u makrofage.
[0018] Srednji stadijum obnavljajućeg odgovora uključuje fazu formiranja tkiva, koja se karakteriše razvojem granularnog tkiva koje popunjava dermalni prostor rane. Formiranje granularnog tkiva obuhvata invaziju endotelnih ćelija što rezultuje u angiogenezi, influksu fibroblasta i akumulaciji dodatnih makrofaga.
[0019] Deponovanje privremenog ekstracelularnog matriksa rane olakšava ćelijsku adheziju, migraciju i proliferaciju. Dodatno, na ivici rane, kompleksne epidermalno-mezenhimalne interakcije stimulišu proliferaciju keratinocita i migraciju za obnavljanje epitelne barijere.
[0020] Formiranje granularnog tkiva nastavlja se dok se prostor rane ponovo ne napuni i obnovi epidermis koji je pokriva. Nakon završetka epidermalne barijere, obnavljajući odgovor ulazi u kasni stadijum, koji se karakteriše sazrevanjem tkiva. Tokom faze sazrevanja tkiva, granularno tkivo se transformiše u tkivo ožiljka.
[0021] Tokom obnavljanja kože, urođeni imuni odgovor rezidentnih ćelija kao i regrutovanih inflamatornih ćelija bori se sa invazivnim mikrobima, doprinosi debridmanu, ali mogu takođe pomagati procesu obnavljanja oslobađanjem spektra faktora rasta.
[0022] Međutim, usled oslobađanja proinflamatornih i citotoksičnih medijatora, nekontrolisana aktivnost makrofaga može takođe biti štetna po obnovu tkiva.
[0023] Neuravnotežena inflamacija karakterisana povećanim brojem makrofaga je obeležje oslabljenog obnavljajućeg odgovora kod humanih bolesti što vodi formiranju hroničnih rana koje ne zarastaju. Dodatni faktori koji doprinose nezarastanju hroničnih rana su, na primer, dijabetes, venske ili arterijske bolesti, infekcija, i metaboličke deficijencije u starijem dobu.
[0024] Postoje različiti postupci za tretiranje hroničnih rana, uključujući upotrebu antibiotika za tretiranje infekcija, debridman, zatvaranje potpomognuto vakuumom, i oksigenacija.
[0025] Dodatni postupci, na primer, uključuju primenu faktora rasta.
[0026] Na primer, bekaplermin je rekombinantni humani faktor rasta BB izveden iz trombocita. Bekaplermin se prodaje pod trgovačkim nazivom Regranex i indikovan je za tretman dijabetičkih neuropatskih čireva donjih ekstremiteta koji se pružaju u potkožno tkivo ili dublje i imaju adekvatno snabdevanje krvlju.
[0027] Bekaplermin je dodatno indikovan kao dodatak, i e kao zamena za, sprovođenje nege čireva na stopalu uključujući inicijalni oštri debridman, oslobađanje pritiska i kontrolu infekcije.
[0028] Međutim, povećana stopa mortaliteta u odnosu na malignost uočena je kod pacijenata tretiranih sa tri ili više tuba Regranex gela u post-marketing retrospektivnoj kohortnoj studiji.
[0029] Sledeći korišćeni faktor rasta je rekombinantni humani epidermalni faktor rasta koji se prodaje pod trgovačkim nazivom REGEN-D gel i koji je korišćen za tretiranje hroničnih čireva dijabetičkog stopala.
[0030] Dodatno, trafermin je rekombinantni oblik humanog faktora rasta fibroblasta 2, koji se prodaje pod trgovačkim nazivom "Fiblast Spray". Trafermin se koristi za tretman pritiskajućih čireva i drugih kožnih čireva uključujući čireve nastale usled opekotina i crne čireve.
[0031] Nakon dnevne primene trafermin ili placeba tokom perioda od šest nedelja na pacijente koji boluju od hroničnog dijabetičkog neuropatskog čira stopala veličina čira je procenjena preko nedeljnih kliničkih pregleda i kompjuterizovanih fotografija. Nedeljno smanjenje veličine i površine čira bilo je identično u obe grupe, kao što je bila i stopa lineranog napredovanja od ulaska do šeste nedelje tretmana. Dodatno, procenat izlečene površine na kraju studije nije se značajno razlikovao. Prema Richards et al. (1995) topikalna primena trafermina nije imala prednost u odnosu na placebo za izlečenje hroničnog neuropatskog dijabetskog čira stopala.
[0032] Komercijalno su takođe dostupne dve dermalne zamene koje sadrže humane embrionalne ćelije, koje izlučuju različite faktore rasta nakon primene na obolelu površinu rane.
[0033] Dermalna zamena Dermagraft se sastoji od fibroblasta, ekstracelularnog matriksa i bioapsorbilne baze. Dermagraf se proizvodi od humanih ćelija fibroblasta izvedenih iz doniranog tkiva prepucijuma novorođenčeta.
[0034] Tokom procesa proizvodnje, humani fibroblasti su zasejani na bioapsorbilnu poligalaktinsku osnovu.
[0035] Komercijalno dostupna dermalna zamena Apligraf sadrži dva tipa ćelija izvedena iz neonatalnog prepucijuma. Živi humani keratinociti i fibroblasti su utisnuti u kolageni matriks rane tipa 1.
[0036] Nedostaci prethodno pomenutih dermalnih zamena je uporedivo visoka cena koja je rezultat procesa proizvodnje. Na primer, krv majke se testira u odnosu na infekciju sa humanim virusima, kao što je virus stečene imunodeficijencije tipa 1 i 2, hepatitis B virus, hepatitis C virus, sifilis, humani T-limfotropni tip 1 i 2 kao i Epstein Barr virus.
[0037] Sledeći komercijalno dostupni proizvod se prodaje pod trgovačkim nazivom Procuren. Procuren je formula za zarastanje rana izvedena iz trombocita za tretiranje nezarastajućih rana.
Procuren je autologni proizvod izveden iz trombocita koji se priprema iz uzorka krvi pacijenta.
[0038] Međutim, postoji nedovoljno dokaza u odnosu na efikasnost autolognih proizvoda izvedenih iz trombocita, uključujući autologi faktor rasta izveden iz trombocita, za tretman hroničnih nezarastajućih rana ili tretman drugih stanja kao što su akutne hirurške rane.
[0039] Dodatno, količina faktora rasta obezbeđenih sa prethodno pomenutim dermalnim zamenama kao i autolognim proizvodima izvedenim iz trombocita značajno varira u zavisnosti od kvaliteta početnog materijala.
[0040] WO 2011/150127 A2 opisuje sistem za isporuku molekula eukariotskoj ćeliji. WO 2011/159880 A1 opisuje rekombinantni Lactobacillus sa smanjenom lipoteihoinskom kiselinom za smanjenje inflamatornih odgovora. WO 2008/155120 A2 opisuje postupke i kompozicije za tretiranje mukozitisa. WO 2009/114702A2 opisuje rekombinantne proizvodnje autentičnih humanih proteina korišćenjem ekspresionih sistema humane ćelije. Steidler L. i Rottiers P., Ann. N.Y. Acad. Sci. 1072: 176-178 (2006) je usmeren na terapeutsku isporuku leka sa genetički modifikovanim Lactococcus lactis.
[0041] Cilj predmetnog pronalaska je da omogući alternativni tretman hronične inflamatorne disfunkcije kože, što omogućava laku primenu korisnih faktora na hroničnu inflamatornu kožnu disfunkciju.
[0042] Dodatno, kontrolisana količina korisnih faktora koji pomažu izlečenje treba da bude obezbeđena za tretiranje hronične inflamatorne disfunkcije kože.
[0043] Cilj predmetnog pronalaska je rešen obezbeđivanjem rekombinantnih probiotskih bakterija prema patentnom zahtevu 1 što sadži (a) sekvencu (sekvence) nukleinske kiseline koje kodiraju prvi heterologni faktor, (a) sekvencu (sekvence) nukleinske kiseline koje kodiraju drugi heterologni faktor, i poželjno (a) sekvencu (sekvence) nukleinske kiseline koje kodiraju treći heterologni faktor, uz uslov da pomenuti prvi faktor, pomenuti drugi faktor, i pomenuti treći faktor su međusobno funkcionalno različiti, naznačeno time da pomenuti prvi faktor je faktor rasta, naznačeno time da pomenuti drugi faktor je izabran iz grupe koja se sastoji od M2-polarizujućih faktora, i naznačeno time poželjno pomenuti treći faktopr je izabran iz grupe koja se sastoji od M2-polarizujućeg faktora i faktora rasta, naznačeno time da M2-polarizujući faktor je izabran iz grupe koja se sastoji od interleukina 4 (IL-4), interleukina 10 (IL-10), interleukina 13 (IL-13), faktora stimulisanja kolonije-1 (CSF1), interleukina 34 (IL34), i njihovih smeša, i naznačeno time da pomenuti faktor rasta je izabran iz grupe koja se sastoji od faktora rasta fibroblasta (FGF), vaskularnih endotelnih faktora rasta (VEGF), epidermalnih faktora rasta (EGF), heparin-vezujućeg EGF-sličnog faktora rasta (HB-EGF), transformišućeg faktora rasta -α (TGF-a), insulin-sličnih faktora rasta (IGF), faktora rasta izvedenih iz trombocita (PDGF), transformišućeg faktora rasta beta (TGF-β), i njihovih smeša.
[0044] Poželjno, pomenute rekombinantne probiotske bakterije prema patentnom zahtevu 1 sadrže najmanje jednu sekvencu nukleinske kiseline koja kodira prvi heterologni faktor, najmanje jednu sekvencu nukleinske kiseline koja kodira drugi heterologni faktor, i najmanje jednu sekvencu nukleinske kiseline koja kodira treći heterologni faktor, uz uslov da pomenuti prvi faktor, pomenuti drugi faktor, i pomenuti treći faktor su funkcionalno međusobno različiti, naznačeno time da pomenuti prvi faktor je faktor rasta, gde pomenuti drugi faktor je izabran iz grupe koja se sastoji od M2- polarizujućih faktora i gde pomenuti treći faktor je izabran iz grupe koja se sastoji od M2-polarizujućih faktora i faktora rasta.
[0045] Poželjni primeri izvođenja rekombinantne probiotske bakterije su opisani u zavisnim patentnim zahtevima 2 do 17.
[0046] Cilj predmetnog pronalaska je dodatno rešen obezbeđivanjem rekombinantnih probiotskih bakterija prema patentnom zahtevu 18 za upotrebu u tretmanu hronične rane, gde pomenute rekombinantne probiotske bakterije su rekombinantne probiotske bakterije prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 16, gde pomenuti prvi, drugi, i treći heterologni faktor je kombinacija fibroblast faktora rasta 2, faktora-1 stimulisanja kolonije i interleukina 4.
[0047] Poželjni primeri izvođenja rekombinantnih probiotskih bakterija za upotrebu prema patentnom zahtevu 18 opisani su u zavisnom patentnom zahtevu 19.
[0048] Pronalazači su iznenađujuće našli da rekombinantne probiotske bakterije koje sadrže prethodno pomenute sekvence nukleinske kiseline mogu biti korišćene u tretmanu hronične rane.
[0049] Poželjni primeri izvođenja predmetnog pronalaska su opisani u zavisnim patentnim zahtevima.
[0050] Prema pronalasku termin "funkcionalno različit faktor" ili "međusobno funkcionalno različiti" označava da se respektivni faktori poželjno vezuju za različite receptore i/ili aktiviraju različite sekundarne glasnike u ciljnoj ćeliji. Sekundarni glasnici su intracelularni signalni molekuli oslobođeni od strane ćelije za okidanje fizioloških promena.
[0051] Prema pronalasku termin "funkcionalni analog" faktora označava sredstvo koje se vezuje za identični receptor(e) kao respektivni faktor i poželjno aktivira identične sekundarne glasnike u ciljnoj ćeliji.
[0052] Na primer, funkcionalni analog nisina vezuje se za NisK, koji deluje kao receptor za zreli nisin molekul ili njegov funkcionalni analog, i, poželjno, dovodi do posledične fosforilacije NisR. Fosforilisani NisR indukuje transkripciju sa respektivnog nisin promotora.
[0053] Poželjno, "funkcionalni analog" pomenutog prvog, drugog, i trećeg heterolognog faktora ima identičnost sekvence aminokiselinske sekvence od najmanje 80%, dodatno poželjno najmanje 90%, dodatno poželjno najmanje 93%, dodatno poželjno najmanje 95%, dodatno poželjno najmanje 97%.
[0054] Prema pronalasku termin "heterologni faktor" označava faktor, poželjno protein, koji se ne nalazi u prirodi ili je eksprimiran od strane pomenute korišćene probiotske bakterije.
[0055] "Funkcionalni analog" može se takođe označiti kao biosličan.
[0056] Kada se pominje "heterologni faktor(i)" generalno ili kada se odnose na specifični "heterologni faktor(e)" kao što su, npr. FGF-2, IL-4, CSF-1, itd., namera je da ovaj termin uključuje takođe njegov funkcionalni analog(e).
[0057] Rekombinantne probiotske bakterije koje sadrže prethodno pomenute sekvence nukleinske kiseline sposobne su da konstantno i/ili nakon indukcije proizvode jedinstvenu kombinaciju respektivnog prvog, drugog, i, poželjno trećeg, heterolognog faktora preko transkripcije i translacije respektivnih sekvenci nukleinske kiseline.
[0058] Ova jedinstvena kombinacija faktora sadrži najmanje jedan faktor rasta, i najmanje jedan M2-polarizujući faktor.
[0059] Poželjno, ova jedinstvena kombinacija faktora sadrži faktor rasta, prvi M2-polarizujući faktor, i drugi M2-polarizujući faktor različit od pomenutog prvog M2-polarizujućeg faktora. Alternativno, ova jedinstvena kombinacija faktora sadrži prvi faktor rasta, M2-polarizujući faktor, i drugi faktor rasta različit od pomenutog prvog faktora rasta.
[0060] Rekombinantne probiotske bakterije poželjno isporučuju obolelom tkivu mnoštvo od najmanje dva, poželjno najmanje tri, heterologna faktora kao što je navedeno u patentnom zahtevu 1, čime se modulira lokalni imuni sistem i omogućava zarastanje.
[0061] Poželjno, rekombinantne probiotske bakterije oslobađaju respektivni prvi heterologni faktor i drugi heterologni faktor, i poželjno treći heterologni faktor, nakon primene na pomenutu hroničnu ranu.
[0062] Dodatno, rekombinantne probiotske bakterije korišćene prema predmetnom pronalasku poželjno obezbeđuju konstantno oslobađanje respektivnog prvog heterolognog faktora i drugog heterolognog faktora, i poželjno trećeg heterolognog faktora, nakon primerne na mesto hronične rane.
[0063] Na taj način, dostupan je veoma poboljšani, bezbedniji, i ekonomičniji izborni tretman za subjekte koji pate od pomenute hronične rane.
[0064] Poželjno, respektivni prvi, drugi, i treći heterologni faktor, nakon oslobađanja iz bakterija, ispoljavaju biološku aktivnu funkciju koja pomaže zarastanju pomenute hronične rane.
[0065] Prvi heterologni faktor je faktor rasta izabran iz grupe navedene u patentnom zahtevu 1.
[0066] Poželjno, pomenuti faktor rasta je izabran iz grupe koja se sastoji od fibroblastnih faktora rasta (FGF), vaskularnih endotelnih faktora rasta (VEGF), epidermalnih faktora rasta (EGF), insulin-sličnih faktora rasta (IGF), faktora rasta izvedenih iz trombocita (PDGF), transformišućeg faktora rasta beta (TGF-beta), i njihovih smeša.
[0067] Naravno, funkcionalni analozi prethodno pomenutih ili pomenutih u nastavku faktora ili njihovih biosličnih supstanci takođe se mogu koristiti unutar obima pronalaska kao što je tražena zaštita. Fibroblastni faktori rasta su familija faktora rasta, koja je uključena u angiogenezu, zarastanje rana, i različite puteve endokrine signalizacije.
[0068] Kod ljudi, 22 člana FGF familije je identifikovano, FGF-1 do FGF-14 i FGF-16 do FGF-23, koji se mogu koristiti u predmetnom pronalasku.
[0069] FGF-1 do FGF-10 vezuju receptore fibroblast faktora rasta (FGFRs).
[0070] Fibroblast faktor rasta 1 je takođe poznat kao kiseli fibroblast faktor rasta. Fibroblast faktor rasta 2 je takođe poznat kao bazni fibroblast faktor rasta. Dodatno, fibroblast faktor rasta 7 je takođe poznat kao keratinocit faktor rasta (KGF) i fibroblast faktor rasta 10 je takođe poznat kao keratinocit faktor rasta 2 (KGF-2).
[0071] U poželjnom primeru izvođenja, fibroblast faktori rasta su izabrani iz grupe koja se sastoji od FGF-1, FGF- 2, FGF-3, FGF-4, FGF-5, FGF-6, FGF-7, FGF-8, FGF-9, FGF-10, i njihovih smeša, dodatno poželjno FGF-1, FGF- 2, FGF-7, FGF-10, i njihovih smeša, dodatno poželjno, FGF-2, FGF-7, njihovih funkcionalnih analoga, njihovih biosličnih supstanci, i njihovih smeša, dodatno poželjno FGF-2.
[0072] Na primer, FGF-1 i FGF-2 mogu stimulisati angiogenezu i mitogeni su za nekoliko ćelijskih tipova prisutnih na mestu inflamatorne disfunkcije kože, uključujući fibroblaste i keratinocite. Dodatno, FGF-7 može stimulisati re-epitelizaciju rane na parakrini način.
[0073] Fibroblast faktor rasta 2 (FGF-2), poželjno humani fibroblast faktor rasta 2 (hFGF-2), je impliciran u raznovrsnim biološkim procesima, uključujući zarastanje rana i rast tumora.
[0074] iRNK za ovaj gen sadrži više poliadenilacionih mesta i alternativno je translatirana sa ne-AUG i AUG inicijacionih kodona, rezultujući u pet različitih izoformi sa različitim osobinama. Ne-AUG izoforme se nalaze u jedru i odgovorne su za intrakrini efekat dok AUG-inicirana forma je uglavnom citosolna i odgovorna je za parakrine i autokrine efekte FGF-2.
[0075] Sekvenca nukleinske kiseline iRNK humanog fibroblast faktora rasta 2 (hFGF-2) je dostupna pod NCBI pristupnim brojem NM_002006.4. Respektivna aminokiselinska sekvenca AUG-izomera je dostupna pod NCBI pristupnim brojem NP_001997.5 kao i UniProt pristupnim brojem P09038 – verzija 182 i takođe je prikazana na Slici 22a.
[0076] Preproprotein uključuje propeptid, koji obuhvata aminokiseline 1 do 142 preproproteina, i zrelog humanog fibroblast faktora rasta 2 peptida, koji obuhvata aminokiseline 143 do 288 preproproteina.
[0077] U poželjnom primeru izvođenja, fibroblast faktor rasta 2 sadrži jednu ili najmanje jednu od aminokiselinskih sekvenci od SEQ IDs 26 do 30, dodatno poželjno aminokiselinsku sekvencu od SEQ ID 28. Aminokiselinska sekvenca od SEQ ID 28 je prikazana na Slici 22b.
[0078] Insulin-slični faktori rasta (IGFs) su proteini sa velikom sličnošću sekvence sa insulinom. Insulin-slični faktori rasta sadrže dva proteina IGF-1 i IGF-2, koji se mogu koristiti u predmetnom pronalasku.
[0079] Familija epidermalnih faktora rasta (EGFs) su proteini sa veoma sličnim strukturnim i funkcionalnim karakteristikama i sadrži proteine epidermalnog faktora rasta (EGF), heparinvezujućeg EGF-sličnog faktora rasta (HB-EGF), transformišućeg faktora rasta-a (TGF-a), amfiregulin (AR), epiregulin (EPR), epigen (EPGN), betacelulin (BTC), neuregulin- 1 (NRG1), neuregulin-2 (NRG2), neuregulin-3 (NRG3), i neuregulin-4 (NRG4), poželjno epidermalni faktor rasta (EGF), heparin-vezujući EGF-slični faktor rasta (HB-EGF), transformišući faktor rasta-a (TGF-a), amfiregulin (AR), epiregulin (EPR), epigen (EPGN), i betacelulin (BTC), dodatno poželjno epidermalni faktor rasta (EGF), heparin-vezujući EGF-slični faktor rasta (HB-EGF), i transformišući faktor rasta-a (TGF-a), koji se mogu koristiti u predmetnom pronalasku.
[0080] Epidermalni faktor rasta (EGF), poželjno humani epidermalni faktor rasta (hEGF), stimuliše rast različitih epidermalnih i epitelnih tkiva in vivo i in vitro i nekih fibroblasta u kulturi ćelija. Dodatno, hEGF ima dubok efekat na diferencijaciju specifičnih ćelija in vivo i potentni je mitogeni faktor za različite kultivisane ćelije i ektodermalnog i mezoderrmalnog porekla.
[0081] Humani epidermalni faktor rasta postoji u najmanje tri izoforme proizvedene alternativnim splajsingom.
[0082] Aminokiselinska sekvenca humanog epidermalnog faktora rasta izoforma 1 preproprotein je dostupna pod NCBI pristupnim brojem NP_001954.1. Respektivna sekvenca nukleinske kiseline iRNK je dostupna pod NCBI pristupnim brojem NM_001963.2.
[0083] Preproprotein izoforme 1 uključuje signalni peptid, koji obuhvata aminokiseline od 1 do 22 preproproteina, propeptid koji obuhvata aminokiseline 23 do 1207 preproproteina i zreli humani epidermalni faktor rasta peptid, koji obuhvata aminokiseline 971 do 1023 preproproteina.
[0084] Aminokiselinska sekvenca humanog epidermalnog faktora rasta izoforma 2 preproprotein je dostupna pod NCBI pristupnim brojem NP_001171601.1. Respektivna sekvenca nukleinske kiseline iRNK je dostupna pod NCBI pristupnim brojem NM_001178130.1. Aminokiselinska sekvenca humanog epidermalnog faktora rasta izoforma 3 preproprotein je dostupna pod NCBI pristupnim brojem NP_001171602.1. Respektivna sekvenca nukleinske kiseline iRNK je dostupna pod NCBI pristupnim brojem NM_001178131.1. Aminokiselinske sekvence humanog epidermalnog faktora rasta izoforme 1 do 3 su takođe dostupne pod UniProt pristupnim brojem P01133 – verzija 180 i takođe su prikazane na Slicima 25a do 25c. Aminokiselinska sekvenca zrelog humanog epidermalnog faktora rasta je prikazana na Slici 25d.
[0085] Heparin-vezujući EGF-slični faktor rasta (HB-EGF), poželjno humani heparin-vezujući EGF-slični faktor rasta (hHB-EGF), je važan faktor rasta u epitelizaciji neophodan za zarastanje kožnih rana. hHB-EGF ima mitogene i migratorne efekte na keratinocite i fibroblaste. hHB-EGF dodatno promoviše dermalno obnavljanje i angiogenezu koji su neophodni za zarastanje rana. hHB-EGF je glavna komponenta fluida rana. hHB-EGF se oslobađa od strane makrofaga, monocita, i keratinocita. Dodatno, površina hHB-EGF ćelija koja se vezuje za heparin sulfat proteoglikane pojačava promotivne sposobnosti mitogena povećavajući stopu zarastanja kožnih rana, smanjujući vremena zarastanja humanih graftova kože, i promoviše ubrzano zarastanje čireva, opekotina, i epidermalnih debelih pukotinastih rana.
[0086] Aminokiselinska sekvenca humanog heparin-vezujućeg EGF-sličnog faktora rasta preproproteina je dostupna pod NCBI pristupnim brojem NP_001936.1. Respektivna sekvenca nukleinske kiseline iRNK je dostupna pod NCBI pristupnim brojem NM_001945.2.
[0087] Prekursor humanog heparin-vezujućeg EGF-sličnog faktora rasta uključuje signalni peptid, koji obuhvata aminokiseline 1 do 19 prekursora, proheparin-vezujući EGF-slični faktor rasta koji obuhvata aminokiseline 20 do 208 prekursora i zrelog humanog epidermalnog faktora rasta peptid, koji obuhvata aminokiseline 63 do 148 prekursora.
[0088] Aminokiselinska sekvenca humanog heparin-vezujućeg EGF-sličnog faktora rasta je takođe dostupna pod UniProt pristupnim brojem Q99075 – verzija 151 i takođe je prikazana na Slicima 26a. Aminokiselinska sekvenca zrelog humanog heparin-vezujućeg EGF-sličnog faktora rasta je prikazan na Slici 26b.
[0089] Transformišući faktor rasta-a (TGF-a), poželjno humani transformišući faktor rasta-α (hTGF-α), može se proizvesti u makrofagama, ćelijama mozga, i keratinocitima. hTGF-α indukuje razvoj epitela. hTGF-α i hEGF se vezuju za isti receptor, receptor epidermalnog faktora rasta (EGFR; ErbB-1; HER1 kod ljudi). Kada se TGF-α veže za EGFR može inicirati proliferacione događaje kod više ćelija uključujući zarastanje rana.
[0090] Humani transformišući faktor rasta-α postoji u najmanje pet izoformi proizvedenih alternativnim splajsingom.
[0091] Aminokiselinska sekvenca humanog transformišućeg faktora rasta alfa izoforma 1 preproprotein je dostupna pod NCBI pristupnim brojem NP_003227.1. Respektivna sekvenca nukleinske kiseline iRNK je dostupna pod NCBI pristupnim brojem NM_003236.2.
[0092] Prekursor humanog transformišućeg faktora rasta alfa izoforma 1 uključuje signalni peptid, koji obuhvata aminokiseline 1 do 23 prekursora, protransformišući faktor rasta alfa izoforma 1 koji obuhvata aminokiseline 24 do 160 prekursora i zreli transformišući faktor rasta alfa peptid, koji obuhvata aminokiseline 40 do 89 prekursora.
[0093] Aminokiselinska sekvenca humanog transformišućeg faktora rasta alfa izoforma 2 preproprotein je dostupna pod NCBI pristupnim brojem NP_001093161.1. Respektivna sekvenca nukleinske kiseline iRNK je dostupna pod NCBI pristupnim brojem NM_001099691.1.
[0094] Aminokiselinska sekvenca humanog transformišućeg faktora rasta alfa izoforma 3 preproprotein je dostupna pod NCBI pristupnim brojem NP_001295087.1. Respektivna sekvenca nukleinske kiseline iRNK je dostupna pod NCBI pristupnim brojem NM_001308158.1.
[0095] Aminokiselinska sekvenca humanog transformišućeg faktora rasta alfa izoforma 4 preproprotein je dostupna pod NCBI pristupnim brojem NP_001295088.1. Respektivna sekvenca nukleinske kiseline iRNK je dostupna pod NCBI pristupnim brojem NM_001308159.1.
[0096] Aminokiselinska sekvenca humanog transformišućeg faktora rasta alfa izoforma 5 preproprotein je dostupna pod NCBI pristupnim brojem AAF05090.1. Respektivna sekvenca nukleinske kiseline iRNK je dostupna pod NCBI pristupnim brojem AF149097.1.
[0097] Aminokiselinske sekvence humanog transformišućeg faktora rasta alfa izoformi 1 do 5 su takođe dostupne pod UniProt pristupnim brojem P01135 - verzija 168 i prikazane su na Slicima 27a do 27e. Aminokiselinska sekvenca zrelog humanog transformišućeg faktora rasta alfa je prikazana na Slici 27f. Amfiregulin (AREG), poželjno humani amfiregulin (hAREG), je sledeći ligand EGF receptora. Humani amfiregulin je autokrini faktor rasta kao i mitogen za široki opseg ciljnih ćelija uključujući astrocite, Švanove ćelije i fibroblaste. Humani amfiregulin promoviše rast epitelnih ćelija.
[0098] Aminokiselinska sekvenca humanog amfiregulin preproproteina je dostupna pod NCBI pristupnim brojem NP_001648.1. Respektivna sekvenca nukleinske kiseline iRNK je dostupna pod NCBI pristupnim brojem NM_001657.3.
[0099] Prekursor humanog amfiregulin preproproteina uključuje signalni peptid, koji obuhvata aminokiseline 1 do 19 preproproteina, propeptid koji obuhvata aminokiseline 20 do 100 preproproteina i zreli transformišući faktor rasta alfa peptid, koji obuhvata aminokiseline 101 do 187 preproproteina.
[0100] Aminokiselinska sekvenca humanog amfiregulin preproproteina je tako]e dostupna pod UniProt pristupnim brojem P15514 - verzija 147 i takođe je prikazana na Slici 28a. Aminokiselinska sekvenca zrelog humanog amfiregulina je prikazana na Slici 28b.
[0101] Epiregulin (EPR), poželjno humani epiregulin (hEPR), je ligand EGF receptora koji može stimulisati proliferaciju i/ili angiogenezu ćelija.
[0102] Aminokiselinska sekvenca humanog epiregulin preproproteina je dostupna pod NCBI pristupnim brojem NP_001423.1. Respektivna sekvenca nukleinske kiseline iRNK je dostupna pod NCBI pristupnim brojem NM_001432.1.
[0103] Preproprotein humanog epiregulina uključuje signalni peptid, koji obuhvata aminokiseline 1 do 29 preproproteina, proepiregulin koji obuhvata aminokiseline 30 do 169 preproproteina i zreli epiregulin, koji obuhvata aminokiseline 60 do 108 preproproteina.
[0104] Aminokiselinska sekvenca humanog epiregulin preproproteina je takođe dostupna pod UniProt pristupnim brojem O14944 - verzija 146 i takođe je prikazana na Slici 29a.
Aminokiselinska sekvenca zrelog humanog epiregulina je prikazana na Slici 29b.
[0105] Epigen (EPGN), poželjno humani epigen (hEPGN), promoviše rast epitelnih ćelija. Humani epigen postoji u najmanje sedam izoformi proizvedenih alternativnim splajsingom.
[0106] Aminokiselinska sekvenca humanog epigena izoforma 1 prekursora je dostupna pod NCBI pristupnim brojem NP_001257918.1. Respektivna sekvenca nukleinske kiseline iRNK je dostupna pod NCBI pristupnim brojem NM_001270989.1.
[0107] Humani epigen izoforma 1 prekursor uključuje signalni peptid, koji obuhvata aminokiseline 1 do 22 prekursora i zrelog epiregulina, koji obuhvata aminokiseline 23 do 154 prekursora.
[0108] Aminokiselinska sekvenca humanog epigena izoforme 1 do 7 prekursora je takođe dostupna pod UniProt pristupnim brojem Q6UW88 - verzija 101 i takođe je prikazana na Slikama 30a do 30g. Aminokiselinska sekvenca zrelog humanog epigena je prikazana na Slici 30h.
[0109] Betacelulin (BTC), poželjno humani betacelulin (hBTC), je faktor rasta koji se takođe vezuje za receptor epidermalnog faktora rasta i koji se sintetiše od strane širokog opsega adultnih tkiva i u mnogim ćelijama u kulturi, uključujući ćelije glatkog mišića i epitelne ćelije. Aminokiselinska sekvenca humanog probetacelulin prekursora je dostupna pod NCBI pristupnim brojem NP_001720.1. Respektivna sekvenca nukleinske kiseline iRNK je dostupna pod NCBI pristupnim brojem NM_001729.1.
[0110] Prekursor humanog probetacelulina uključuje signalni peptid, koji obuhvata aminokiseline 1 do 31 prekursora, probetacelulin, koji obuhvata aminokiseline 32 do 178 prekursora, i zrelog betacelulina, koji obuhvata aminokiseline 32 do 111 prekursora.
[0111] Aminokiselinska sekvenca humanog probetacelulin prekursora je takođe dostupna pod UniProt pristupnim brojem P35070 - verzija 139 i takođe je prikazana na Slici 31a. Aminokiselinska sekvenca zrelog human betacelulin je prikazana na Slici 31b.
[0112] Insulin-slični faktor rasta 1 (IGF-1) se takođe naziva somatomedin C. Sekvenca nukleinske kiseline iRNK humanog IGF-1 je dostupna pod NCBI pristupnim brojem NM_000618.2. Respektiva aminokiselinska sekvenca je dostupna pod NCBI pristupnim brojem NP_000609.1 kao i UniProt pristupnim brojem P05019 - verzija 178.
[0113] Preproprotein uključuje signalni peptid, koji obuhvata aminokiseline 1 do 21 preproproteina, i humani insulin-slični faktor rasta 1 peptid, koji obuhvata aminokiseline 49 do 118 preproproteina.
[0114] Sekvenca nukleinske kiseline iRNK humanog insulin-sličnog faktora rasta 2 (hIGF-2) je dostupna pod NCBI pristupnim brojem NM_000612.4. Respektivna aminokiselinska sekvenca humanog insulin-sličnog faktor rasta 2 preproproteina je dostupna pod NCBI pristupnim brojem NP_000603.1 kao i UniProt pristupnim brojem P01344 - verzija 192.
[0115] Preproprotein uključuje signalni peptid, koji obuhvata aminokiseline 1 do 24 preproteina, i zrelog lanca insulin-sličnog faktora rasta 2, koji obuhvata aminokiseline 25 do 91 preproteina.
[0116] Familija vaskularnog endotelnog faktora rasta (VEGF) je grupa faktora rasta koja uključuje VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D i placentalni faktor rasta (PGF), koji se može koristiti u predmetnom pronalasku.
[0117] U poželjnom primeru izvođenja, vaskularni endotelni faktor rasta je vaskularni endotelni faktor rasta A (VEGF-A).
[0118] VEGF-A može indukovati angiogenezu, vaskulogenezu i rast endotelnih ćelija.
[0119] Sekvenca nukleinske kiseline iRNK humanog vaskularnog endotelnog faktor rasta A (hVEGF-A) je dostupna pod NCBI pristupnim brojem NM_001025366.1. Respektivna aminokiselinska sekvenca humanog vaskularnog endotelnog faktora rasta A je dostupna pod NCBI pristupnim brojem NP_001020537.2 kao i UniProt pristupnim brojem P15692 - verzija 197.
[0120] Prekursor protein humanog vaskularnog endotelnog faktora rasta A uključuje signalni peptid, koji obuhvata aminokiseline 1 do 26 prekursor proteina, kao i zreli humani vaskularni endotelni faktor rasta A, koji obuhvata aminokiseline 27 do 232 prekursor proteina.
[0121] Faktor rasta izveden iz trombocita (PDGF) reguliše rast i deobu ćelija. Humani faktor rasta izveden iz trombocita (hPDGF) ima četi subjedinice, PDGF-A, PDGF-B, PDGF-C i PDGF-D, koje formiraju ili homo- ili heterodimere respektivnih subjedinica, koje se mogu koristiti u predmetnom pronalasku.
[0122] Poželjno, faktor rasta izveden iz trombocita je PDGF-AA, PDGF-BB, PDGF-AB, PDGF-CC, PDGF-DD, ili njihova smeša.
[0123] Dodatno poželjno, faktor rasta izveden iz trombocita je dimerni protein sastavljen od dve PDGF-A subjedinice, dimerni glikoprotein sastavljen od dve PDGF-B subjedinice, dimerni glikoprotein sastavljen od PDGF-A subjedinice i PDGF-B jedinice, ili njihova smeša.
[0124] Sekvenca nukleinske kiseline iRNK subjedinice A humanog faktora rasta izvedenog iz trombocita (hPDGF-A) je dostupna pod NCBI pristupnim brojem NM_002607.4. Respektivna aminokiselinska sekvenca je dostupna pod NCBI pristupnim brojem NP_002598.4 kao i UniProt pristupnim brojem P04085 - verzija 159.
[0125] Respektivni preproprotein humane PDGF-A subjedinice kodira signalni peptid, koji obuhvata aminokiseline 1 do 20 preproteina, i subjedinicu A zrelog humanog faktora rasta izvedenog iz trombocita koji obuhvata aminokiseline 87 do 211 preproteina.
[0126] Sekvenca nukleinske kiseline iRNK subjedinice B humanog faktora rasta izvedenog iz trombocita (hPDGF) je dostupna pod NCBI pristupnim brojem NM_002608.1. Respektivna aminokiselinska sekvenca subjedinice humanog faktora rasta izvedenog iz trombocita preproproteina je dostupna pod NCBI pristupnim brojem NP_002599.1 kao i UniProt pristupnim brojem P01127 - verzija 181.
[0127] Preproprotein humane PDGF-B subjedinice kodira signalni peptid, koji obuhvata aminokiseline 1 do 20 preproteina, i zreli oblik subjedinice B humanog faktora rasta izvedenog iz trombocita, koji obuhvata aminokiseline 82 do 190 preproteina.
[0128] Faktor rasta hepatocita (HGF) je faktor rasta koji se izlučuje od strane mezenhimskih ćelija i deluje primarno na epitelne ćelije i endotelne ćelije ali takođe i na hematopoetske progenitorske ćelije i može se koristiti u predmetnom pronalasku.
[0129] HGF je izlučen kao pojedinačni preproprotein i isečen je sa serin proteinazom u 69-kGa alfa lanac i 34-kDa beta lanac. Aminokiselinska sekvenca preproproteina kao i respektivni alfa i beta lanac su prikazani na Slikama 23a do 23 c.
[0130] Sekvenca nukleinske kiseline iRNK humanog faktora rasta hepatocita (hHGF) je dostupna pod NCBI pristupnim brojem NM_000601.3. Respektivna aminokiselinska sekvenca humanog faktora rasta hepatocita preproproteina je dostupna pod NCBI pristupnim brojem NP_000592.3 kao i UniProt pristupnim brojem P14210 - verzija 186.
[0131] Preproprotein uključuje signalni peptid, koji obuhvata aminokiseline 1 do 31 preproteina, alfa lanac humanog faktora rasta hepatocita, koji obuhvata aminokiseline 32 do 494 preproteina, i beta lanac humanog faktora rasta hepatocita, koji obuhvata aminokiseline 495 do 728 preproteina.
[0132] Transformišući faktor rasta β (TGF-β), poželjno humani transformišući faktor rasta β (hTGF-β), je citokin koji se izlučuje od strane mnogih tipova ćelija, uključujući makrofage.
[0133] TGF-β postoji u najmanje tri izoforme, TGF-β1, TFG-β2 i TGF-β3, koje se mogu koristiti u predmetnom pronalasku. Aminokiselinske sekvence respektivnog prekursor proteina i zrelih proteina su prikazane na Slikama 21a do 21g.
[0134] Humani transformišući faktor rasta β 1 je izlučeni protein koji se seče u peptid povezan sa latencijom (LAP) i zreli TGF-β1 peptid. Zreli peptid može biti ili oblika TGF-β1 homodimera ili heterodimera sa drugim članovima familije TGF-β.
[0135] Sekvenca nukleinske kiseline iRNK humanog transformišućeg faktora rasta β1 prekursora može se dobiti sa NCBI pristupnim brojem NM_000660.4. Respektivna aminokiselinska sekvenca je dostupna pod NCBI pristupnim brojem NP_000651.3 ili UniProt pristupnim brojem P01137 - verzija 199.
[0136] Aminokiselinska sekvenca humanog TGF-β1 prekursora uključuje signalni peptid, koji obuhvata aminokiseline 1 do 29 prekursor proteina, peptid povezan sa latencijom, koji obuhvata aminokiseline 30 do 278 prekursor proteina, i zreli transformišući faktor rasta β1, koji obuhvata aminokiseline 279 do 390 prekursor proteina.
[0137] Transformišući faktor rasta β2 (TGF-β2), poželjno humani transformišući faktor rasta β2 (hTGF-β2), je multifunkcionalni citokin koji reguliše proliferaciju, diferencijaciju, adheziju, i migraciju mnogih ćelijskih tipova.
[0138] Identifikovane su alternativno splajsovane varijante transkripta gena humanog transformišućeg faktora rasta β2, koje kodiraju dve različite izoforme.
[0139] Sekvenca nukleinske kiseline iRNK humanog transformišućeg faktor rasta beta 2 izoforma 1 prekursora je dostupna pod NCBI pristupnim brojem NM_001135599.3. Respektivna aminokiselinska sekvenca je dostupna pod NCBI pristupnim brojem NP_001129071.1.
[0140] Humani transformišući faktor rasta beta 2 izoforma 1 prekursor uključuje signalni peptid koji obuhvata aminokiseline 1 do 20 prekursor proteina, peptid povezan sa latencijom, koji obuhvata aminokiseline 21 do 302 prekursor proteina, i zreli transformišući faktor rasta beta 2, koji obuhvata aminokiseline 303 do 414 prekursor proteina.
[0141] Sekvenca nukleinske kiseline iRNK humanog transformišućeg faktor rasta β2 izoforma 2 prekursor je dostupna pod NCBI pristupnim brojem NM_003238.3. Respektivna aminokiselinska sekvenca je dostupna pod NCBI pristupnim brojem NP_003229.1. Prekursor protein uključuje signalni peptid, koji obuhvata aminokiseline 1 do 20 prekursor proteina, peptid povezan sa latencijom, koji obuhvata aminokiseline 21 do 302 prekursor proteina, i zreli TGF-β2 peptid, koji obuhvata aminokiseline 303 do 414 prekursor proteina.
[0142] Aminokiselinska sekvenca transformišućeg faktora rasta β2 je dodatno dostupna pod UniProt pristupnim brojem P61812 - verzija 128.
[0143] Transformišući faktor rasta β3 (TGF-β3), poželjno human transformišući faktor rasta β3 (hTGF-β3), je izlučeni citokin koji je uključen u embriogenezu i diferencijaciju ćelija.
[0144] Sekvenca nukleinske kiseline iRNK humanog transformišućeg faktora rasta β3 prekursor proteina je dostupna pod NCBI pristupnim brojem NM_003239.3. Odgovarajuća aminokiselinska sekvenca je dostupna pod NCBI pristupnim brojem NP_003230.1 kao i UniProt pristupnim brojem P10600 - verzija 170.
[0145] Prekursor protein uključuje signalni peptid, koji uključuje aminokiseline 1 do 23 prekursor proteina, peptid povezan sa latencijom, koji uključuje aminokiseline 24 do 30 prekursor proteina, i zreli transformišući faktor rasta β3 peptid, koji obuhvata aminokiseline 301 do 412 prekursor proteina.
[0146] Poželjno, transformišući faktor rasta β sadrži jednu ili najmanje jednu od aminokiselinskih sekvenci od SEQ IDs 19 do 25
[0147] Aktivini su disulfidno-povezani dimerni proteini originalno prečišćeni iz gonadnih fluida kao proteini koji su stimulisali oslobađanje folikulostimulirajućg hormona hipofize (FSH). Aktivin proteini imaju širok opseg bioloških aktivnosti, uključujući indukciju mezoderma, diferencijaciju nervnih ćelija, remodelovanje kosti, hematopoezu i uloge u reproduktivnoj fiziologiji.
[0148] Aktivini su homodimeri ili heterodimeri različitih izoformi beta subjedinice, dok su inhibini heterodimeri jedinstvene alfa subjedinice i jedne različite beta subjedinice.
[0149] Poznate su četiri beta subjedinice, beta A, beta B, beta C, i beta E.
[0150] Drugi heterologni faktor je izabran iz grupe koja se sastoji od M2-polarizujućih faktora.
[0151] Poželjno, M2-polarizujući faktori deluju na nepolarizovane makrofage, M1-polarizovane makrofage kao i na nediferencirane monocite, i druge progenitorske ćelije makrofaga.
[0152] Dodatno poželjno, pomenuti M2-polarizujući faktori indukuju M2-polarizaciju nepolarizovanih makrofaga, M1-polarizovanih makrofaga kao i nediferenciranih monocita, i drugih progenitorskih ćelija makrofaga.
[0153] Stručnjaku je poznato da makrofagi mogu podleći specifičnoj diferencijaciji u zavisnosti od lokalnog tkivnog okruženja. Slično polarizaciji tipa 1 T-pomoćnih ćelija 1 (TH1) i tipa 2 T-pomoćnih (TH2), dva različita stanja polarizacija makrofaga su definisana: klasično aktivirani (M1-polarizovani) fenotip makrofaga i alternativno aktivirani (M2- polarizovani) fenotip makrofaga.
[0154] M2-polarizovani fenotip makrofaga može biti dodatno podeljen u subsetove: M2apolarizovani, M2b-polarizovani i M2c-polarizovani fenotip na osnovu profila genske ekspresije.
[0155] M1-polarizovani i M2-polarizovani makrofagi imaju različite profile hemokina i receptora hemokina.
[0156] M1-polarizovani makrofagi poželjno izlučuju hemokin TH1 hemokine koji privlače ćelije (C-X-C motiv) ligand 9 (CXCL9) i C-X-C motiv hemokina 10 (CXCL10). M2-polarizovani makrofagi poželjno izlučuju hemokin, hemokin (C-C motiv) ligand 17 (CCL17), C-C motiv hemokin 22 (CCL22), i hemokin (C-C motiv) ligand 24 (CCL24).
[0157] M2-polarizujući efekat heterolognog faktora može, na primer, biti određen kontaktom nepolarizovanih makrofaga, M1-polarizovanih makrofaga, ili progenitorskih ćelija makrofaga, poželjno monocita, sa najmanje jednim M2- polarizujućim faktorom, i, nakon toga, određivanjem ekspresije i/ili sekrecije M2-polarizacionih markera.
[0158] Na primer, mišja nepolarizovana ćelijska linija makrofaga, mišja M1-polarizovana ćelijska linija makrofaga, ili mišja progenitorska ćelijska linija makrofaga, poželjno mišja ćelijska linija monocita, može biti dovedena u kontakt sa najmanje jednim M2- polarizujućim faktorom stvarajući mišju ćelijsku liniju M2-polarizovanih makrofaga. M2-polarizacija mišjih ćelijskih linija makrofaga može, na primer, biti detektovana određivanjem ekspresije sledećih faktora: arginaza 1 (Arg1), interleukin 10 (IL-10), manoza receptor C tip 1 (Mrc1) i Ym1, koji se takođe naziva T-limfocit-izvedeni eozinofil hemotaktički faktor (ECF-L) ili hitinaza-sličan protein 3 (Chil3). M1 polarizacija mišjih ćelijskih linija makrofaga može, na primer, biti detektovana određivanjem ekspresije i/ili oslobađanja sledećih faktora: tumor nekroza faktor alfa (TNFalfa, TNFα), interleukin 6 (IL-6), hemokin (C-C motiv) ligand 2 (CCL2), i hemokin (C-C motiv) ligand 4 (CCL4).
[0159] Poželjno humani M2-polarizovani makrofagi su izvedeni iz humanih monocita, koji su inkubirani sa najmanje jednim M2-polarizujućim faktorom. M2-polarizacija makrofaga izvedenih iz humanih monocita može, na primer, biti detektovana određivanjem ekspresije i/ili oslobađanja sledećih faktora: interleukin 1 receptor antagonist (IL1RA),, prostaglandin E2 (PGE2), interleukin 10 (IL-10), i transformišući faktor rasta beta (TGF-β).
[0160] Nedavno je pokazano da, in vitro, makrofage su sposobne da se reverzno polarizuju od M2 do M1, i obratno, kao odgovor na promene u citokinskom okruženju (Davis et al.(2013)). Dodatno, promena polarizacije je rapidna i dešava se na nivou ekspresije gena, proteina, metabolita, i mikrobicidne aktivnosti.
[0161] Dodatno, makrofage su jedna od glavnih populacija infiltrirajućih leukocita povezanih sa solidnim tumorima. Tumor povezani makrofagi (TAMs) igraju važnu ulogu u imunitetu na tumor i pokazuju slične funkcije kao M2-polarizacija, takođe označena M2d TAM polarizacija.
[0162] Respektivni faktori neophodni za stimulaciju i/ili aktivaciju respektivne polarizacije (M1, M2a, M2b, M2c, i M2d TAM) poznati su stručnjaku i, na primer, opisani su u Hao et al. (2012) ili Duluc et al. (2007).
[0163] Poželjno, respektivni drugi heterologni faktori i, izborno, treći heterologni faktor indukuju M2- polarizaciju nakon ekspresije u pomenutim rekombinantnim probiotskim bakterijama i oslobađaju se iz bakterija u mesto hronične kožne inflamatorne disfunkcije.
[0164] Anti-inflamatorni M2-polarizovani makrofagi zatim poželjno promovišu angiogenezu, deponovanje vezivnog tkiva, i obnovu rane, što dovodi do poboljšanja, poželjno izlečenja, pomenute hronične kožne inflamatorne disfunkcije koju treba tretirati.
[0165] Poželjno, pomenuti M2 polarizujući faktor indukuje M2c polarizaciju.
[0166] Pomenuti M2-polarizujući faktor je izabran iz grupe koja se sastoji od interleukin 4 (IL-4), interleukin 10 (IL-10), interleukin 13 (IL-13), faktor-1 stimulisanja kolonije (CSF1), interleukin 34 (IL34), njihovih funkcionalnih analoga, njihovih biosličnih supstanci, i njihovih smeša, poželjno interleukin 4 (IL-4), interleukin 10 (IL-10), interleukin 13 (IL-13), faktor-1 stimulisanja kolonije (CSF1), interleukin 34 (IL34), i njihovih smeša, dodatno poželjno faktor-1 stimulisanja kolonije (CSF1), interleukin 34
[0167] (IL34) interleukin 4 (IL-4), interleukin 13 (IL-13), njihovih funkcionalnih analoga, njihovih biosličnih supstanci, i njihovih smeša, dodatno poželjno faktor-1 stimulisanja kolonije (CSF1), interleukin 34 (IL34) interleukin 4 (IL-4), interleukin 13 (IL- 13), i njihovih smeša.
[0168] Interleukin 4 (IL-4), poželjno humani interleukin 4 (hIL-4), je plejotropni citokin. Interleukin 4 je ligand interleukin 4 receptor. Interleukin 4 receptor se takođe vezuje sa interleukinom 13 (IL-13), koji može doprineti mnogim preklapajućim funkcijama interleukina 4 i interleukina 13.
[0169] Takođe je pokazano da interleukin 4 (IL-4) ima osobine indukcije proliferacije. Dodatno, interleukin 4 (IL-4) indukuje proizvodnju kolagena.
[0170] Sekvenca nukleinske kiseline iRNK humanog interleukin 4 izoforma 1 prekursora je dostupna pod NCPI-pristupnim brojem NM_000589.3. Respektivna aminokiselinska sekvenca je dostupna pod NCBI pristupnim brojem NP_000580.1 i prikazana je na Slici 18a.
[0171] Sekvenca nukleinske kiseline iRNK humanog interleukin 4 izoforma 2 prekursora je dostupna pod NCBI pristupnim brojem NM_172348.2. Respektivna aminokiselinska sekvenca je dostupna pod NCBI pristupnim brojem NP_758858.1 i prikazana je na Slici 18b.
[0172] Aminokiselinska sekvenca humanog interleukina 4 je takođe dostupna pod UniProt pristupnim brojem P05112 - verzija 178.
[0173] Aminokiselinska sekvenca sadrži signalni peptid koji obuhvata aminokiseline 1 do 24 interleukin 4 izoforma 1 i izoforma 2 prekursora.
[0174] Poželjno, humani interleukin 4 sadrži jednu ili najmanje jednu od aminokiselinskih sekvenci od SEQ IDs 10 do 14.
[0175] Interleukin 13 (IL-13), poželjno humani interleukin 13 (hIL-13), je imuno-regulatorni citokin proizveden primarno od strane aktiviranih TH2 ćelija.
[0176] Sekvenca nukleinske kiseline iRNK humanog interleukin 13 prekursora je dostupna pod NCBI pristupnim brojem NM_002188.2. Respektivna aminokiselinska sekvenca je dostupna pod NCBI pristupnim brojem NP_002179.2 kao i UniProt pristupnim brojem P35225 - verzija 157 i prikazana je na Slici 20a.
[0177] Interleukin 13 prekursor sadrži signalni peptid koji obuhvata aminokiseline 1 do 24 interleukin 13 prekursor proteina deponovanog pod UniProt pristupnim brojem P35225 - verzija 157.
[0178] Poželjno, interleukin 13 sadrži jednu ili najmanje jednu od aminokiselinskih sekvenci od SEQ IDs 17 i 18.
[0179] Interleukin 10 (IL-10), poželjno humani interleukin 10 (hIL-10), je citokin proizveden primarno od strane monocita i u manjem stepenu od strane limfocita. Interleukin 10 ima plejotropne efekte u imunoregulaciji i inflamaciji. Na primer interleukin 10 nishodno reguliše ekspresiju TH1 citokina.
[0180] Sekvenca nukleinske kiseline iRNK humanog interleukin 10 prekursora može se naći pod NCBI pristupnim brojem NM_000572.2. Respektivna aminokiselinska sekvenca može se naći pod NCBI pristupnim brojem NP_000563.1 kao i UniProt pristupnim brojem P22301 - verzija 156 i prikazana je na Slici 19a.
[0181] Aminokiselinska sekvenca humanog interleukin 10 prekursora uključuje signalni peptid koji obuhvata aminokiseline 1 do 18 humanog interleukin 10 prekursor proteina.
[0182] Poželjno, interleukin 10 sadrži jednu ili najmanje jednu od aminokiselinskih sekvenci od SEQ IDs 15 do 16.
[0183] Faktor-1 stimulisanja kolonije (CSF-1), koji je takođe poznat kao faktor stimulisanja kolonije makrofaga (M-CSF), je citokin koji kontroliše proizvodnju, diferencijaciju, i funkciju makrofaga.
[0184] Usled alternativnog splajsinga, humani CSF-1 postoji u različitim izoformama, koje se mogu koristiti u predmetnom pronalasku.
[0185] Sekvenca nukleinske kiseline iRNK humanog CSF-1 izoforma 1, koji is takođe nazvan kao faktor-1 stimulisanja kolonije makrofaga izoforma A prekursor, je dostupna pod NCBI pristupnim brojem NM_000757.5. Odgovarajuća aminokiselinska sekvenca je dostupna pod NCBI pristupnim brojem NP_000748.3 i prikazana je na Slici 16a.
[0186] Sekvenca nukleinske kiseline iRNK humanog CSF-1 izoforma 2 prekursora, koji is takođe označen kao humani faktor-1 stimulisanja kolonije makrofaga izoforma B prekursor, je dostupna pod NCBI pristupnim brojem NM_172210.2. Odgovarajuća aminokiselinska sekvenca je dostupna pod NCBI pristupnim brojem NP_757349.1 i prikazana je na Slici 16b.
[0187] Sekvenca nukleinske kiseline iRNK humanog CSF-1 izoforma 3 prekursora, koji is takođe označen kao faktor-1 stimulisanja kolonije makrofaga izoforma C prekursor, je dostupna pod NCBI pristupnim brojem NM_172211.3. Odgovarajuća aminokiselinska sekvenca je dostupna pod NCBI pristupnim brojem NP_757350.1 i prikazana je na Slici 16c.
[0188] Respektivne aminokiselinske sekvence su takođe dostupne pod UniProt pristupnim brojem P09603 - verzija 158. Izoforma 1 je izabrana kao kanonijska UniProt sekvenca.
[0189] Respektivne sekvence proteina humanog CSF-1 prekursora izoformi 1 do 3 uključuju N-terminalni signalni peptid, koji obuhvata aminokiseline broj 1 do aminokiseline broj 32 respektivnih aminokiselinskih sekvenci.
[0190] Aktiv ni oblik humanog CSF-1 može se naći ekstracelularno kao disulfidno-vezani homodimer. Aktivni oblik je proizveden proteolitičkim cepanjem membranski-vezanog prekursora što rezultuje u gubitku N-terminalnog signalnog peptida.
[0191] Poželjno, faktor-1 stimulisanja kolonije sadrži jednu ili najmanje jednu od aminokiselinskih sekvenci od SEQ IDs 1 do 6.
[0192] Interleukin 34 (IL-34) je citokin koji takođe promoviše diferencijaciju i vijabilnost monocita i makrofaga.
[0193] Usled alternativnog splajsinga, humani interleukin 34 postoji u dve izoforme, koji se može koristiti u predmetnom pronalasku.
[0194] Sekvenca nukleinske kiseline iRNK humanog interleukin 34 izoforme 1 prekursora je dostupna pod NCBI pristupnim brojem NM_001172772.1. Odgovarajuća aminokiselinska sekvenca je dostupna pod NCBI pristupnim brojem NP_001166243.1 i prikazana je na Slici 17a.
[0195] Sekvenca nukleinske kiseline iRNK humanog interleukina 34 izoforme 2 prekursora je dostupna pod NCBI pristupnim brojem NM_001172771.1. Odgovarajuća aminokiselinska sekvenca je dostupna pod NCBI pristupnim brojem NP_001166242.1 i prikazana je na Slici 17b.
[0196] Respektivna aminokiselinska sekvenca je takođe dostupna pod UniProt pristupnim brojem Q6ZMJ4 - verzija 80.
[0197] Prekursor humanog interleukina 34 uključuje signalni peptid, koji obuhvata aminokiseline 1 do 20 respektivnih aminokiselinskih sekvenci prekursor proteina.
[0198] Poželjno, interleukin 34 sadrži jednu ili najmanje od aminokiselinskih sekvenci od SEQ IDs 7 do 9.
[0199] U poželjnom primeru izvođenja, pomenuti M2-polarizujući faktor promoviše diferencijaciju i vijabilnost monocita i makrofaga preko vezivanja sa receptorom faktora-1 stimulisanja kolonije.
[0200] Receptor faktora-1 stimulisanja kolonije (CSF1R), koji je takođe poznat kao receptor faktora stimulacije kolonije makrofaga, je tirozin protein-kinaza koja deluje kao receptor na ćelijskoj površini i igra esencijalnu ulogu pri regulaciji preživljavanja, proliferacije i diferencijacije makrofaga i monocita.
[0201] CSF1R promoviše, na primer, oslobađanje pro-inflamatornih hemokina kao odgovor na vezivanje CSF1R liganda i time igra značajnu ulogu u stečenom imunitetu i u inflamatornom procesu.
[0202] Poželjno pomenuti M2-polarizujući faktor je najmanje ligand jednog receptora faktora-1 stimulisanja kolonije (CSF1R) ligand.
[0203] CSF1R ligandi su poznati stručnjaku i uključuju interleukin 34 (IL-34) i faktor 1 stimulisanja kolonije (CSF-1). Poželjno, pomenuti ligand receptora faktora 1 stimulisanja kolonije je izabran iz grupe koja se sastoji od faktora 1 stimulisanja kolonije (CSF-1), interleukina 34 (IL-34), njihovih funkcionalnih analoga, i njihovih biosličnih supstanci.
[0204] Dodatno poželjno, pomenuti ligand receptora faktora 1 stimulisanja kolonije je humani ligand receptora faktora 1 stimulisanja kolonije, dodatno poželjno izabran iz grupe koja se sastoji od faktora 1 stimulisanja kolonije (hCSF-1), humanog interleukina 34 (hIL-34), njihovih funkcionalnih analoga, i njihovih biosličnih supstanci.
[0205] U dodatnom poželjnom primeru izvođenja, pomenuti ligand receptora faktora 1 stimulisanja kolonije je protein koji ima jednu ili najmanje jednu od aminokiselinskih sekvenci od SEQ IDs No.1 do 9.
[0206] U poželjnom primeru izvođenja, pomenuti prvi, drugi, i/ili treći heterologni faktor je eksprimiran sa sekretornom signalnom sekvencom, poželjno N-terminalnim signalnim peptidom ili propeptidom. Nakon ekspresije respektivni faktor, sekretorna signalna sekvenca, poželjno N-terminalni signalni peptid ili propeptid, može se ukloniti post-translacionom modifikacijom. Alternativno, pomenuti prvi, drugi, i/ili treći heterologni faktor može biti eksprimiran u zrelom obliku, poželjno bez sekretorne signalne sekvence, poželjno N-terminalni signalni peptid ili propeptid.
[0207] U poželjnom primeru izvođenja, pomenute rekombinantne probiotske bakterije prema patentnom zahtevu 1 sadrže najmanje jednu sekvencu nukleinske kiseline koja kodira prvi heterologni faktor, najmanje jednu sekvencu nukleinske kiseline koja kodira drugi heterologni faktor, i najmanje jednu sekvencu nukleinske kiseline koja kodira treći heterologni faktor, uz uslov da pomenuti prvi faktor, pomenuti drugi faktor, i pomenuti treći faktor su međusobno funkcionalno različiti, pri čemu pomenuti prvi faktor je faktor rasta, pri čemu pomenuti drugi faktor je izabran iz grupe koja se sastoji od M2- polarizujućih faktora i pri čemu pomenuti treći faktor je izabran iz grupe koja se sastoji od M2-polarizujućih faktora i faktora rasta.
[0208] U poželjnom primeru izvođenja, pomenuti drugi heterologni faktor i pomenuti treći heterologni faktor su izabrani iz grupe koja se sastoji od M2-polarizujućih faktora, pri čemu pomenuti drugi faktor i pomenuti treći faktor su funkcionalno različiti M2-polarizujući faktori.
[0209] Odnosno, pomenuti drugi heterologni faktor je prvi M2-polarizujući faktor i pomenuti treći heterologni faktor je drugi M2-polarizujući faktor funkcionalno različit od pomenutog prvog M2-polarizujućeg faktora.
[0210] Poželjno, pomenuti prvi M2-polarizujući faktor je M2-polarizujući faktor izabran iz grupe koja se sastoji od faktora 1 stimulisanja kolonije (CSF-1), interleukina 34 (IL-34), interleukina 4 (IL-4), i interleukina 13 (IL-13), i pomenuti drugi M2- polarizujući faktor je M2-polarizujući faktor izabran iz grupe koja se sastoji od faktora 1 stimulisanja kolonije (CSF-1), interleukina 34 (IL-34), interleukina 4 (IL-4), interleukina 10 (IL-10), i interleukina 13 (IL-13), uz uslov da pomenuti drugi M2-polarizujući faktor je funkcionalno različit od pomenutog prvog M2-polarizujućeg faktora.
[0211] Dodatno poželjno, pomenuti prvi M2-polarizujući faktora je ligand receptora faktor 1 stimulisanja kolonije (CSF1R) i pomenuti drugi M2-polarizujući faktor je M2-polarizujući faktor izabran iz grupe koja se sastoji od interleukina 4 (IL-4), interleukina 10 (IL-10), interleukina 13 (IL-13), njihovih funkcionalnih analoga, njihovih biosličnih supstanci i njihovih smeša.
[0212] Dodatno poželjne kombinacije M2-polarizujućih faktora su:
• faktor-1 stimulisanja kolonije i interleukin 4,
• faktor-1 stimulisanja kolonije i interleukin 13,
• faktor-1 stimulisanja kolonije i interleukin 10,
• interleukin 34 i interleukin 4,
• interleukin 34 i interleukin 13,
• interleukin 34 i interleukin 10,
• interleukin 4 i interleukin 10, ili
• interleukin 13 i interleukin 10.
[0213] Prethodno pomenute dodatne poželjne kombinacije M2-polarizujućih faktora su kombinovane sa najmanje jednim od prethodno pomenutih faktora rasta, poželjno sa faktorom rasta izabranim iz grupe koja se sastoji od faktora rasta 1 fibroblasta, faktora rasta 2 fibroblasta, faktora rasta 7 fibroblasta, faktora rasta 10 fibroblast, faktora rasta hepatocita, transformišućeg faktora rasta beta (TGF-beta), epidermalnog faktora rasta (EGF), heparin-vezujućeg EGF-sličnog faktora rasta (HBEGF), transformišućeg faktora rasta-a (TGF-a), i faktora rasta izvedenog iz trombocita BB.
[0214] Poželjno, pomenuti prvi, drugi, i treći heterologni faktor je kombinacija
• fibroblast faktor rasta 2,
faktor 1 stimulisanja kolonije i interleukina 4,
• fibroblast faktor rasta 2, interleukin 34 i interleukin 4,
• fibroblast faktor rasta 2, faktor 1 stimulisanja kolonije i interleukin 13,
• fibroblast faktor rasta 2, interleukin 34 i interleukin 13,
• fibroblast faktor rasta 2, faktor 1 stimulisanja kolonije i interleukin 10,
• fibroblast faktor rasta 2, interleukin 34 i interleukin 10,
• fibroblast faktor rasta 7, faktor 1 stimulisanja kolonije i interleukin 4,
• fibroblast faktor rasta 7, interleukin 34 i interleukin 4,
• fibroblast faktor rasta 7, faktor 1 stimulisanja kolonije i interleukin 13,
• fibroblast faktor rasta 7, interleukin 34 i interleukin 13,
• fibroblast faktor rasta 7, faktor 1 stimulisanja kolonije i interleukin 10,
• fibroblast faktor rasta 7, interleukin 34 i interleukin 10,
• transformišući faktor rasta beta, faktor 1 stimulisanja kolonije i interleukin 4,
• transformišući faktor rasta beta, interleukin 34 i interleukin 4,
• transformišući faktor rasta beta, faktor 1 stimulisanja kolonije i interleukin 13,
• transformišući faktor rasta beta, interleukin 34 i interleukin 13
• transformišući faktor rasta beta, faktor 1 stimulisanja kolonije i interleukin 10,
• transformišući faktor rasta beta, interleukin 34 i interleukin 10,
• transformišući faktor rasta alfa, faktor 1 stimulisanja kolonije i interleukin 4,
• transformišući faktor rasta alfa, interleukin 34 i interleukin 4,
• transformišući faktor rasta alfa, faktor 1 stimulisanja kolonije i interleukin 13,
• transformišući faktor rasta alfa, interleukin 34 i interleukin 13
• transformišući faktor rasta alfa, faktor 1 stimulisanja kolonije i interleukin 10,
• transformišući faktor rasta alfa, interleukin 34 i interleukin 10
• faktor rasta BB izveden iz trombocita, faktor 1 stimulisanja kolonije i interleukin 4,
• faktor rasta BB izveden iz trombocita, interleukin 34 i interleukin 4,
• faktor rasta BB izveden iz trombocita, faktor 1 stimulisanja kolonije i interleukin 13,
• faktor rasta BB izveden iz trombocita, interleukin 34 i interleukin 13
• faktor rasta BB izveden iz trombocita, faktor 1 stimulisanja kolonije i interleukin 10, ili
• faktor rasta BB izveden iz trombocita, interleukin 34 i interleukin 10.
[0215] Dodatno poželjno, pomenuti prvi, drugi, i treći heterologni faktor je kombinacija fibroblast faktora rasta 2, faktora 1 stimulisanja kolonije i interleukina 4, njihovih funkcionalnih analoga, i njihovih biosličnih supstanci.
[0216] Poželjno, oslobađanjem dva ili više M2-polarizujućih faktora iz probiotske bakterije prema predmetnom pronalasku M2-polarizacija nepolarizovanih makrofaga, M1-polarizovani makrofagi kao i nediferencirani monociti, i druge progenitorske ćelije makrofaga su dodatno stvorene.
[0217] U alternativnom primeru izvođenja, pomenuti prvi faktor je prvi faktor rasta izabran iz grupe koja se sastoji od prethodno pomenutih faktora rasta, i pomenuti treći faktor je drugi faktor rasta izbran iz grupe koja se sastoji od prethodno pomenutih faktora rasta i koji je funkcionalno različit od pomenutog prvog faktora rasta. Poželjno, pomenuti drugi faktor rasta je transformišući faktor rasta beta (TGF-beta).
[0218] Dodatno poželjne kombinacije faktora rasta su:
• fibroblast faktor rasta 1 i transformišući faktor rasta beta,
• fibroblast faktor rasta 2 i transformišući faktor rasta beta,
• fibroblast faktor rasta 7 i transformišući faktor rasta beta,
• fibroblast faktor rasta 10 i transformišući faktor rasta beta,
• faktor rasta BB izveden iz trombocita i transformišući faktor rasta beta,
• transformišući faktor rasta alfa i transformišući faktor rasta beta,
• epidermalni faktor rasta i transformišući faktor rasta beta,
• heparin-vezujući EGF-slični faktor rasta i transformišući faktor rasta beta,
• faktor rasta hepatocita i transformišući faktor rasta beta, ili
• vaskularni endotelni faktor rasta A i transformišući faktor rasta beta.
[0219] Prethodno pomenute dodatno poželjne kombinacije faktora rasta su poželjno kombinovane sa M2- polarizujućim faktorom izabranim iz grupe koja se sastoji od faktora 1 stimulisanja kolonije (CSF-1), interleukina 34 (IL-34), interleukina 4 (IL-4), interleukina 10 (IL-10), interleukina 13 (IL-13), i njihovih smeša, poželjno faktora 1 stimulisanja kolonije (CSF-1), interleukina 34 (IL-34), interleukina 4 (IL-4), interleukina 13 (IL-13), i njihovih smeša.
[0220] Rekombinantne probiotske bakterije prema pronalasku su namenjene tretmanu hronične kožne inflamatorne disfunkcije.
[0221] Poželjno, hronična kožna inflamatorna disfunkcija, je hronična kožna inflamatorna bolest ili hronična inflamatorna bolest vezivnog tkiva. Pomenuta inflamatorna bolest kože je poželjno rana, čir, ili njihove kombinacije, dodatno poželjno čir.
[0222] Pomenuta hronična inflamatorna kožna bolest može takođe uključivati inflamatornu, poželjno hroničnu inflamatornu, traumu kože, koje mogu napredovati u hronično inflamatorno stanje.
[0223] Promrzlina je medicinsko stanje kod koga je izazvano lokalizovano oštećenje kože i drugih tkiva usled smrzavanja i može uključivati oštećenje tkiva. Pomenuta promrzlina može takođe biti ozeblina (pernioza), koje su površinski čirevi kože koji su rezultat izlaganja hladnoći i vlazi. Oštećenje kapilara u koži izaziva crvenilo, svrab, inflamaciju, i nekada plikove. Dodatno poželjno, pomenute promrzline su ozebline.
[0224] Pomenuti čir može biti dekubitusni čir ili ulcus cruris. Pomenuti čir takođe može biti venski čir, arterijski čir, dijabetički čir, ili čir nastao usled pritiska.
[0225] Pomenuti čir može takođe biti preulceracioni stadijum prethodno spomenutih čireva bez ikakvog vidljivog znaka otvorene kožne rane. Bez medicinske intervencije, preulceracioni stadijum može napredovati do ulceracije.
[0226] Pomenuta rana je hronična rana.
[0227] Hronične rane su poznate stručnjaku i uključuju, na primer, hronične venske čireve, hronične arterijske čireve, hronične dijabetičke čireve, i hronične čireve nastale usled pritiska. Hronične rane mogu takođe biti izazvane trovanjem zračenjem ili ishemijom. Poželjno pomenuta hronična rana je najmanje jedna od hroničnog venskog čira, hroničnog arterijskog čira, hroničnog čira nastalog usled pritiska i njegovog preulceracionog stadijuma, poželjno hroničnog venskog čira, hroničnog arterijalnog čira i hroničnog čira nastalog usled pritiska.
[0228] Hronični venski čirevi obično se mogu pojaviti na nogama i čine oko 70% do 90% hroničnih rana, koje uglavnom pogađaju starije pacijente.
[0229] Sledeći glavni uzrok hroničnih rana je dijabetes. Pacijenti koji pate od dijabetesa imaju 15% veći rizik u odnosu na amputaciju od opšte populacije usled hroničnih čireva. Dijabetes izaziva neuropatiju, koja inhibira nocicepciju i percepciju bola. Stoga, pacijenti mogu da ne primete male rane na nogama i stopalima i stoga ne mogu sprečiti infekciju ili ponovljenu povredu.
[0230] Dodatni problem je da dijabetes izaziva imuno kompromitovanje i oštećenje malih krvnih sudova što rezultuje u smanjenoj oksigenaciji tkiva. Sprečavanje adekvatne oksigenacije tkiva značajno povećava prevalencu za hronične rane.
[0231] Čirevi nastali usled pritiska, koji su takođe poznati kao dekubitusni čirevi ili rana koja nastaje od dugotrajnog ležanja, mogu se desiti sa ili bez dijabetičkog stanja. Čirevi nastali usled pritiska su lokalizovane povrede kože i/ili tkiva ispod nje koji se mogu javiti preko koštane izbočine kao rezultat pritiska, ili pritiska u kombinaciji sa smicanjem ili trenjem.
[0232] Dijabetes je glavni endokrini metabolički poremećaj u ekspanziji koji se približio statusu svetske pandemije. Ulceracija donjih ekstremiteta, na primer dijabetički čir na stopalu, je jedna od ozbiljnih dugotrajnih komplikacija povezanih sa dijabetesom koja se može produžiti i pojačati neuspešnom regeneracijom tkiva u osnovi.
[0233] Postoji oko 13 miliona pacijenata sa hroničnom ranom u SAD, EU, i Japanu, od kojih približno 2.8 miliona pati od ulceracije donjeg ekstremiteta kao što je dijabetički čir na stopalu.
[0234] Ulceracija donjeg ekstremiteta, na primer dijabetički čirevi stopala, su teški za lečenje bez postojeće definitivne konvencionalne, neinvazivne terapije. Ulceracija donjeg ekstremiteta zahteva puno medicinske pažnje i ekstremno je onesposobljavajuća za pacijente što je povezano sa značajnim gubitkom kvaliteta života.
[0235] Približno, 24 % od pacijenata koji boluju od ulceracije donjeg ekstremiteta zahtevaće amputaciju što vodi dugotrajnoj onesposobljenosti.
[0236] Godišnji zdravstveni troškovi za pacijente koji pate od ulceracije donjeg ekstremiteta je u opsegu od $ 100 milijarde USD. Dodatno, petogodišnja stopa mortaliteta pacijenata koji boluju od ulceracije donjeg ekstremiteta je oko 45 %, što je veće od one kod mnogih kancera.
[0237] Trenutno, standardni terapijski menadžment hroničnih rana uključujući dijabetske rane kao što je ulceracija donjeg ekstremiteta fokusirana je primarno na kontrolisanje infekcije i promovisanje revaskularizacije. Uprkos ovim strategijama, stopa amputacije ostaje neprihvatljivo visoka kod pacijenata koji boluju od ulceracije donjeg ekstremiteta.
[0238] Dodatno, kada je bolest u osnovi ili uzrok ulceracije, kao što je dijabetes melitus ili hronična venska insuficijencija, je poboljšan i/ili tretiran, na primer kontrolisanjem nivoa šećera u krvi ili primenom lekova za krvni pritisak, respektivno, postojeći čirevi mogu još uvek zahtevati veoma dugo vreme za izlečenje.
[0239] Stoga, da bi se prevazišao nedostatak definitivnih, neinvazivnih tretmana hroničnih rana uključujući dijabetičke rane kao što je ulceracija donjih ekstremiteta urgentno su potrebne nove strategije za reaktivaciju i promovisanje zarastanje rane kod pacijenata koji pate od hroničnih rana.
[0240] Poželjno, u slučaju hronične rane, jedinstvena kombinacija faktora, poželjno oslobođenih iz pomenutih probiotskih bakterija, omogućava reprogramiranje pomenute hronične rane u akutnu ranu, koja nakon toga podleže zatvaranju rane.
[0241] U poželjnom primeru izvođenja, rekombinantne probiotske bakterije se primenjuju topikalno i/ili potkožnom injekcijom, dodatno poželjno topikalno.
[0242] Rekombinantne probiotske bakterije poželjno se primenjuju topikalno, na hroničnu kožnu inflamatornu disfunkciju koja se tretira.
[0243] Rekombinantne probiotske bakterije se mogu primeniti topikalno na hroničnu kožnu inflamatornu disfunkciju i/ili potkožnom injekcijom u blizini kožne disfunkcije, poželjno na ivice ili šupljinu hronične kožne inflamatorne disfunkcije.
[0244] Nakon primene rekombinantnih probiotskih bakterija prema predmetnom pronalasku, bakterije eksprimiraju pomenuti prvi i drugi heterologni faktor, poželjno pomenuti prvi, drugi i treći heterologni faktor.
[0245] Dodatno, topikalnom primenom ili potkožnom injekcijom rekombinantnih probiotskih bakterija prema predmetnom pronalasku na i/ili u mesto preulceracije, napredovanje preulceracije u otvorenu ranu se može izbeći.
[0246] Rekombinantne probiotske bakterije su poželjno dobijene transformacijom probiotskih bakterija sa najmanje jednom sekvencom nukleinske kiseline koja kodira pomenuti prvi heterologni faktor i najmanje jednom sekvencom nukleinske kiseline koja kodira pomenuti drugi heterologni faktor and, poželjno sa jednom sekvencom nukleinske kiseline koja kodira pomenuti treći heterologni faktor.
[0247] Pogodne probiotske bakterije za dobijanje rekombinantnih probiotskih bakterija prema predmetnom pronalasku su nepatogene bakterije. Poželjno, nepatogene bakterije su neinvazivne bakterije. U dodatno poželjnom primeru izvođenja, rekombinantne probiotske bakterije su grampozitivne bakterije, poželjno gram-pozitivne nesporulišuće bakterije. Dodatno poželjno, pomenute probiotske bakterije su nekolonizujuće bakterije kojima nedostaje sposobnost da se razmnožavaju u humanom gastrointestinalnom traktu.
[0248] U dodatno poželjnom primeru izvođenja, rekombinantne probiotske bakterije sadrže gram-pozitivni bakterijski soj.
[0249] Prema poželjnom primeru izvođenja predmetnog pronalaska, rekombinantne probiotske bakterije mogu biti iz istog bakterijskog soja ili mešavine različitih bakterijskih sojeva.
[0250] U sledećem primeru izvođenja, probiotske bakterije su klasifikovane kao "generalno prepoznate kao bezbedne" (GRAS) od strane United States Food and Drug Administration (FDA).
[0251] U sledećem primeru izvođenja, probiotske bakterije imaju "kvalifikovanu pretpostavku bezbednosti " (QPS-status) kao što je definisano od strane European Food Safety Authority (EFSA). Introdukcija pristupa kvalifikovane pretpostavke bezbednosti (QPS) fili provene izabranih mikroorganizama je opisana u EFSA Journal, Vol.587, 2007, pages 1-16.
[0252] U dodatno poželjnom primeru izvođenja, probiotske bakterije su nepatogene bakterije koje pripadaju tipu firmicutes ili actinobacteria. Poželjno, probiotske bakterije su nepatogene bakterije iz najmanje jednog roda izabranog iz grupe koja se sastoji od bifidobacterium, corynebacterium, enterococcus, lactobacillus, lactococcus, leuconostoc, pediococcus, propionibacterium, i streptococcus.
[0253] U sledećem poželjnom primeru izvođenja, probiotske bakterije su mlečnokiselinske bakterije (LAB). Mlečnokiselinske bakterije su klada gram-pozitivnih, tolerantnih na kiselinu, generalno nesporulišućih, nerespiratornih bakterija koje imaju zajedničke metaboličke i fiziološke karakteristike. Ove bakterije proizvode mlečnu kiselinu kao glavni metabolički krajnji proizvod formiranja ugljenih hidrata.
[0254] Mlečnokiselinske bakterije su dugo poznate i korišćene, na primer, u fermentaciji hrane. Dodatno, proteinski bakteriocini su proizvedeni od strane nekoliko sojeva mlečnokiselinskih bakterija.
[0255] Dodatno, mlečnokiselinske bakterije generalno su prepoznate kao bakterije sa bezbednim statusom (GRAS) usled njihove sveprisutne pojave u hrani i njihovog doprinosa zdravoj mikroflori humanih mukoznih površina.
[0256] U dodatno poželjnom primeru izvođenja, probiotske bakterije isključuju patogene i/ili oportunističke bakterije.
[0257] U sledećem primeru izvođenja, probiotske bakterije su iz roda Bifidobacterium sp., uključujući, ali se ne ograničavajući na, Bifidobacterium actinocoloniiforme, Bifidobacterium adolescentis, Bifidobacterium aesculapii, Bifidobacterium angulatum, Bifidobacterium Bifidobacterium animalis, na primer Bifidobacterium animalis subsp. animalis ili Bifidobacterium animalis subsp. lactis, Bifidobacterium asteroides, Bifidobacterium biavatii, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium bohemicum, Bifidobacterium bombi, Bifidobacterium boum, Bifidobacterium breve, Bifidobacterium callitrichos, Bifidobacterium catenulatum, Bifidobacterium choerinum, Bifidobacterium coryneforme, Bifidobacterium crudilactis, Bifidobacterium cuniculi, Bifidobacterium denticolens, Bifidobacterium dentium, Bifidobacterium faecale, Bifidobacterium gallicum, Bifidobacterium gallinarum, Bifidobacterium globosum, Bifidobacterium indicum, Bifidobacterium infantis, Bifidobacterium inopinatum, Bifidobacterium kashiwanohense, Bifidobacterium lactis, Bifidobacterium longum, na primer Bifidobacterium longum subsp. infantis, Bifidobacterium longum subsp. longum, ili Bifidobacterium longum subsp. suis, Bifidobacterium magnum, Bifidobacterium merycicum, Bifidobacterium minimum, Bifidobacterium mongoliense, Bifidobacterium moukalabense, Bifidobacterium pseudocatenulatum, Bifidobacterium pseudolongum, na primer Bifidobacterium pseudolongum subsp. globosum ili Bifidobacterium pseudolongum subsp. pseudolongum, Bifidobacterium psychraerophilum, Bifidobacterium pullorum, Bifidobacterium reuteri, Bifidobacterium ruminantium, Bifidobacterium saeculare, Bifidobacterium saguini, Bifidobacterium scardovii, Bifidobacterium stellenboschense, Bifidobacterium subtile, Bifidobacterium stercoris, Bifidobacterium suis, Bifidobacterium thermacidophilum, na primer Bifidobacterium thermacidophilum subsp. porcinum ili Bifidobacterium thermacidophilum subsp. thermacidophilum, Bifidobacterium thermophilum, ili Bifidobacterium tsurumiense.
[0258] Poželjno, probiotske bakterije nisu Bifidobacterium dentium.
[0259] Poželjno, probiotske bakterije su bakterije koje imaju status "kvalifikovane pretpostavke bezbednosti" (QPS) u rodu Bifidobacterium sp., uključujući, ali se ne ograničavajući na, Bifidobacterium adolescentis, Bifidobacterium animalis, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium breve, ili Bifidobacterium bifidum.
[0260] U jednom primeru izvođenja, probiotske bakterije su iz roda Corynebacterium sp., uključujući, ali se ne ograničavajući na, Corynebacterium accolens, Corynebacterium afermentans, na primer Corynebacterium afermentans subsp. afermentans ili Corynebacterium afermentans subsp. lipophilum, Corynebacterium ammoniagenes, Corynebacterium amycolatum, Corynebacterium appendices, Corynebacterium aquatimens, Corynebacterium aquilae, Corynebacterium argentoratense, Corynebacterium atypicum, Corynebacterium aurimucosum, Corynebacterium auris, Corynebacterium auriscanis, Corynebacterium betae, Corynebacterium beticola, Corynebacterium bovis, Corynebacterium callunae, Corynebacterium camporealensis, Corynebacterium canis, Corynebacterium capitovis, Corynebacterium casei, Corynebacterium caspium, Corynebacterium ciconiae, Corynebacterium confusum, Corynebacterium coyleae, Corynebacterium cystitidis, Corynebacterium deserti, Corynebacterium diphtheriae, Corynebacterium doosanense, Corynebacterium durum, Corynebacterium efficiens, Corynebacterium epidermidicanis, Corynebacterium equi, Corynebacterium falsenii, Corynebacterium fascians, Corynebacterium felinum, Corynebacterium flaccumfaciens, na primer Corynebacterium flaccumfaciens subsp. betae, Corynebacterium flaccumfaciens subsp. flaccumfaciens, Corynebacterium flaccumfaciens subsp. oortii, ili Corynebacterium flaccumfaciens subsp. poinsettiae, Corynebacterium flavescens, Corynebacterium frankenforstense, Corynebacterium freiburgense, Corynebacterium freneyi, Corynebacterium glaucum, Corynebacterium glucuronolyticum, Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium halotolerans, Corynebacterium hansenii, Corynebacterium hoagie, Corynebacterium humireducens, Corynebacterium ilicis, Corynebacterium imitans, Corynebacterium insidiosum, Corynebacterium iranicum, Corynebacterium jeikeium, Corynebacterium kroppenstedtii, Corynebacterium kutscheri, Corynebacterium lactis, Corynebacterium lilium, Corynebacterium lipophiloflavum, Corynebacterium liquefaciens, Corynebacterium lubricantis, Corynebacterium macginleyi, Corynebacterium marinum, Corynebacterium maris, Corynebacterium massiliense, Corynebacterium mastitidis, Corynebacterium matruchotii, Corynebacterium michiganense, na primer Corynebacterium michiganense subsp. insidiosum, Corynebacterium michiganense subsp. michiganense, Corynebacterium michiganense subsp. nebraskense, Corynebacterium michiganense subsp. sepedonicum, ili Corynebacterium michiganense subsp. tessellarius, Corynebacterium minutissimum, Corynebacterium mooreparkense, Corynebacterium mucifaciens, Corynebacterium mustelae, Corynebacterium mycetoides, Corynebacterium nebraskense, Corynebacterium nigricans, Corynebacterium nuruki, Corynebacterium oortii, Corynebacterium paurometabolum, Corynebacterium phocae, Corynebacterium pilbarense, Corynebacterium pilosum, Corynebacterium poinsettiae, Corynebacterium propinquum, Corynebacterium pseudodiphtheriticum, Corynebacterium pseudotuberculosis, Corynebacterium pyogenes, Corynebacterium pyruviciproducens, Corynebacterium rathayi, Corynebacterium renale, Corynebacterium resistens, Corynebacterium riegelii, Corynebacterium seminale, Corynebacterium sepedonicum, Corynebacterium simulans, Corynebacterium singulare, Corynebacterium sphenisci, Corynebacterium spheniscorum, Corynebacterium sputi, Corynebacterium stationis, Corynebacterium striatum, Corynebacterium suicordis, Corynebacterium sundsvallense, Corynebacterium terpenotabidum, Corynebacterium testudinoris, Corynebacterium thomssenii, Corynebacterium timonense, Corynebacterium tritici, Corynebacterium tuberculostearicum, Corynebacterium tuscaniense, Corynebacterium ulcerans, Corynebacterium ulceribovis, Corynebacterium urealyticum, Corynebacterium ureicelerivorans, Corynebacterium uterequi, Corynebacterium variabile, Corynebacterium vitaeruminis, ili Corynebacterium xerosis.
[0261] Poželjno, probiotske bakterije nisu Corynebacterium diphtheriae, Corynebacterium amicolatum, Corynebacterium striatum, Corynebacterium jeikeium, Corynebacterium urealyticum, Corynebacterium xerosis, Corynebacterium pseudotuberculosis, Corynebacterium tenuis, Corynebacterium striatum, ili Corynebacterium minutissimum.
[0262] Poželjno, probiotske bakterije su bakterije klasifikovane kao "generalno smatrane kao bezbedne" (GRAS) u rodu Corynebacterium, uključujući, ali se ne ograničavajući na Corynebacterium ammoniagenes, Corynebacterium casei, Corynebacterium flavescens, ili Corynebacterium variabile.
[0263] U sledećem primeru izvođenja, bakterije su iz roda Enterococcus sp., uključujući, ali se ne ograničavajući na, Enterococcus alcedinis, Enterococcus aquimarinus, Enterococcus asini, Enterococcus avium, Enterococcus caccae, Enterococcus camelliae, Enterococcus canintestini, Enterococcus canis, Enterococcus casseliflavus, Enterococcus cecorum, Enterococcus columbae, Enterococcus devriesei, Enterococcus diestrammenae, Enterococcus dispar, Enterococcus durans, Enterococcus eurekensis, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Enterococcus flavescens, Enterococcus gallinarum, Enterococcus gilvus, Enterococcus haemoperoxidus, Enterococcus hermanniensis, Enterococcus hirae, Enterococcus italicus, Enterococcus lactis, Enterococcus lemanii, Enterococcus malodoratus, Enterococcus moraviensis, Enterococcus mundtii, Enterococcus olivae, Enterococcus pallens, Enterococcus phoeniculicola, Enterococcus plantarum, Enterococcus porcinus, Enterococcus pseudoavium, Enterococcus quebecensis, Enterococcus raffinosus, Enterococcus ratti, Enterococcus rivorum, Enterococcus rotai, Enterococcus saccharolyticus, na primer Enterococcus saccharolyticus subsp. saccharolyticus ili Enterococcus saccharolyticus subsp. taiwanensis, Enterococcus saccharominimus, Enterococcus seriolicida, Enterococcus silesiacus, Enterococcus solitarius, Enterococcus sulfureus, Enterococcus termitis, Enterococcus thailandicus, Enterococcus ureilyticus, Enterococcus viikkiensis, Enterococcus villorum, ili Enterococcus xiangfangensis.
[0264] Poželjno, probiotske bakterije su bakterije klasifikovane kao "generalno smatrane bezbednim" (GRAS) u rodu Enterococcus genus, uključujući, ali se ne ograničavajući na Enterococcus durans, Enterococcus faecalis, ili Enterococcus faecium.
[0265] U sledećem primeru izvođenja, probiotske bakterije su iz roda Lactobacillus sp., uključujući, ali se ne ograničavajući na, Lactobacillus acetotolerans, Lactobacillus acidifarinae, Lactobacillus acidipiscis, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus agilis, Lactobacillus algidus, Lactobacillus alimentarius, Lactobacillus amylolyticus, Lactobacillus amylophilus, Lactobacillus amylotrophicus, Lactobacillus amylovorus, Lactobacillus animalis, Lactobacillus antri, Lactobacillus apinorum, Lactobacillus apis, Lactobacillus apodemi, Lactobacillus aquaticus, Lactobacillus arizonensis, Lactobacillus aviaries, na primer Lactobacillus aviarius subsp. araffinosus ili Lactobacillus aviarius subsp. aviarius, Lactobacillus backii, Lactobacillus bavaricus, Lactobacillus bifermentans, Lactobacillus bobalius, Lactobacillus bombi, Lactobacillus brantae, Lactobacillus brevis, Lactobacillus buchneri, Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus cacaonum, Lactobacillus camelliae, Lactobacillus capillatus, Lactobacillus carnis, Lactobacillus casei, na primer Lactobacillus casei subsp. alactosus, Lactobacillus casei subsp. casei, Lactobacillus casei subsp. pseudoplantarum, Lactobacillus casei subsp. rhamnosus, ili Lactobacillus casei subsp. tolerans, Lactobacillus catenaformis, Lactobacillus cellobiosus, Lactobacillus ceti, Lactobacillus coleohominis, Lactobacillus collinoides, Lactobacillus composti, Lactobacillus concavus, Lactobacillus confusus, Lactobacillus coryniformis, na primer Lactobacillus coryniformis subsp. coryniformis ili Lactobacillus coryniformis subsp. torquens, Lactobacillus crispatus, Lactobacillus crustorum, Lactobacillus curieae, Lactobacillus curvatus, na primer Lactobacillus curvatus subsp. curvatus ili Lactobacillus curvatus subsp. melibiosus, Lactobacillus cypricasei, Lactobacillus delbrueckii, na primer Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus, Lactobacillus delbrueckii subsp. delbrueckii, Lactobacillus delbrueckii subsp. indicus, Lactobacillus delbrueckii subsp. jakobsenii, Lactobacillus delbrueckii subsp. lactis, ili Lactobacillus delbrueckii subsp. sunkii, Lactobacillus dextrinicus, Lactobacillus diolivorans, Lactobacillus divergens, Lactobacillus durianis, Lactobacillus equi, Lactobacillus equicursoris, Lactobacillus equigenerosi, Lactobacillus fabifermentans, Lactobacillus faecis, Lactobacillus farciminis, Lactobacillus farraginis, Lactobacillus ferintoshensis, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus floricola, Lactobacillus florum, Lactobacillus fornicalis, Lactobacillus fructivorans, Lactobacillus fructosus, Lactobacillus frumenti, Lactobacillus fuchuensis, Lactobacillus furfuricola, Lactobacillus futsaii, Lactobacillus gallinarum, Lactobacillus gasseri, Lactobacillus gastricus, Lactobacillus ghanensis, Lactobacillus gigeriorum, Lactobacillus graminis, Lactobacillus halotolerans, Lactobacillus hammesii, Lactobacillus hamsteri, Lactobacillus harbinensis, Lactobacillus hayakitensis, Lactobacillus heilongjiangensis, Lactobacillus helsingborgensis, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus heterohiochii, Lactobacillus hilgardii, Lactobacillus hokkaidonensis, Lactobacillus hominis, Lactobacillus homohiochii, Lactobacillus hordei, Lactobacillus iners, Lactobacillus ingluviei, Lactobacillus intestinalis, Lactobacillus iwatensis, Lactobacillus jensenii, Lactobacillus johnsonii, Lactobacillus kalixensis, Lactobacillus kandleri, Lactobacillus kefiranofaciens, na primer Lactobacillus kefiranofaciens subsp. kefiranofaciens ili Lactobacillus kefiranofaciens subsp. kefirgranum, Lactobacillus kefiri, Lactobacillus kefirgranum, Lactobacillus kimbladii, Lactobacillus kimchicus, Lactobacillus kimchiensis, Lactobacillus kimchii, Lactobacillus kisonensis, Lactobacillus kitasatonis, Lactobacillus koreensis, Lactobacillus kullabergensis, Lactobacillus kunkeei, Lactobacillus lactis, Lactobacillus leichmannii, Lactobacillus lindneri, Lactobacillus malefermentans, Lactobacillus mali, Lactobacillus maltaromicus, Lactobacillus manihotivorans, Lactobacillus mellifer, Lactobacillus mellis, Lactobacillus melliventris, Lactobacillus mindensis, Lactobacillus minor, Lactobacillus minutus, Lactobacillus mucosae, Lactobacillus murinus, Lactobacillus nagelii, Lactobacillus namurensis, Lactobacillus nantensis, Lactobacillus nasuensis, Lactobacillus nenjiangensis, Lactobacillus nodensis, Lactobacillus odoratitofui, Lactobacillus oeni, Lactobacillus oligofermentans, Lactobacillus oris, Lactobacillus oryzae, Lactobacillus otakiensis, Lactobacillus ozensis, Lactobacillus panis, Lactobacillus pantheris, Lactobacillus parabrevis, Lactobacillus parabuchneri, Lactobacillus paracasei, na primer Lactobacillus paracasei subsp. paracasei ili Lactobacillus paracasei subsp. tolerans, Lactobacillus paracollinoides, Lactobacillus parafarraginis, Lactobacillus parakefiri, Lactobacillus paralimentarius, Lactobacillus paraplantarum, Lactobacillus pasteurii, Lactobacillus paucivorans, Lactobacillus pentosus, Lactobacillus perolens, Lactobacillus piscicola, Lactobacillus plantarum, na primer Lactobacillus plantarum subsp. argentoratensis ili Lactobacillus plantarum subsp. plantarum, Lactobacillus pobuzihii, Lactobacillus pontis, Lactobacillus porcinae, Lactobacillus psittaci, Lactobacillus rapi, Lactobacillus rennini, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus rimae, Lactobacillus rodentium, Lactobacillus rogosae, Lactobacillus rossiae, Lactobacillus ruminis, Lactobacillus saerimneri, Lactobacillus sakei, na primer Lactobacillus sakei subsp. carnosus ili Lactobacillus sakei subsp. sakei, Lactobacillus salivarius, na primer Lactobacillus salivarius subsp. salicinius ili Lactobacillus salivarius subsp. salivarius, Lactobacillus sanfranciscensis, Lactobacillus saniviri, Lactobacillus satsumensis, Lactobacillus secaliphilus, Lactobacillus selangorensis, Lactobacillus senioris, Lactobacillus senmaizukei, Lactobacillus sharpeae, Lactobacillus shenzhenensis, Lactobacillus sicerae, Lactobacillus silagei, Lactobacillus siliginis, Lactobacillus similes, Lactobacillus sobrius, Lactobacillus songhuajiangensis, Lactobacillus spicheri, Lactobacillus sucicola, Lactobacillus suebicus, Lactobacillus sunkii, Lactobacillus suntoryeus, Lactobacillus taiwanensis, Lactobacillus thailandensis, Lactobacillus thermotolerans, Lactobacillus trichodes, Lactobacillus tucceti, Lactobacillus uli, Lactobacillus ultunensis, Lactobacillus uvarum, Lactobacillus vaccinostercus, Lactobacillus vaginalis, Lactobacillus versmoldensis, Lactobacillus vini, Lactobacillus viridescens, Lactobacillus vitulinus, Lactobacillus xiangfangensis, Lactobacillus xylosus, Lactobacillus yamanashiensis, na primer Lactobacillus yamanashiensis subsp. mali ili Lactobacillus yamanashiensis subsp. yamanashiensis, Lactobacillus yonginensis, Lactobacillus zeae, ili Lactobacillus zymae.
[0266] Poželjno, probiotske bakterije su bakterije klasifikovane kao "generalno smatrane bezbednim" (GRAS) u rodu Lactobacillus sp., uključujući, ali se ne ograničavajući na, Lactobacillus acidophilus soj NP 28, Lactobacillus acidophilus soj NP51 , Lactobacillus subsp. lactis soj NP7, Lactobacillus reuteri soj NCIMB 30242, Lactobacillus casei soj Shirota, Lactobacillus reuteri soj DSM 17938, Lactobacillus reuteri soj NCIMB 30242, Lactobacillus acidophilus soj NCFM, Lactobacillus rhamnosus soj HN001 , Lactobacillus rhamnosus soj HN001, Lactobacillus reuteri soj DSM 17938, Lactobacillus casei subsp. rhamnosus soj GG, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus lactis, Lactobacillus acetotolerans, Lactobacillus acidifarinae, Lactobacillus acidipiscis, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus alimentarius, Lactobacillus amylolyticus, Lactobacillus amylovorus, Lactobacillus brevis, Lactobacillus buchneri, Lactobacillus cacaonum, Lactobacillus casei subsp. casei, Lactobacillus collinoides, Lactobacillus composti, Lactobacillus coryniformis subsp. coryniformis, Lactobacillus crispatus, Lactobacillus crustorum, Lactobacillus curvatus subps. curvatus, Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus, Lactobacillus delbrueckii subsp. delbrueckii, Lactobacillus delbrueckii subsp. lactis, Lactobacillus dextrinicus, Lactobacillus diolivorans, Lactobacillus fabifermentans, Lactobacillus farciminis, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus fructivorans, Lactobacillus frumenti, Lactobacillus gasseri, Lactobacillus ghanensis, Lactobacillus hammesii, Lactobacillus harbinensis, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus hilgardii, Lactobacillus homohiochii, Lactobacillus hordei, Lactobacillus jensenii, Lactobacillus johnsonii, Lactobacillus kefiri, Lactobacillus kefiranofadens subsp. kefiranofaciens, Lactobacillus kefiranofadens subsp. kefirgranum, Lactobacillus kimchii, Lactobacillus kisonensis, Lactobacillus mail, Lactobacillus manihotivorans, Lactobacillus mindensis, Lactobacillus mucosae, Lactobacillus nagelii, Lactobacillus namurensis, Lactobacillus nantensis, Lactobacillus nodensis, Lactobacillus oeni, Lactobacillus otakiensis, Lactobacillus panis, Lactobacillus parabrevis, Lactobacillus parabuchneri, Lactobacillus paracasei subsp. paracasei, Lactobacillus parakefiri, Lactobacillus paralimentarius, Lactobacillus paraplantarum, Lactobacillus pentosus, Lactobacillus perolens, Lactobacillus plantarum subsp. plantarum, Lactobacillus pobuzihii, Lactobacillus pontis, Lactobacillus rapi, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus rossiae, Lactobacillus sakei subsp carnosus, Lactobacillus sakei subsp. sakei, Lactobacillus sali varius subsp. salivarius, Lactobacillus sanfranciscensis, Lactobacillus satsumensis, Lactobacillus secaliphilus, Lactobacillus senmaizukei, Lactobacillus siliginis, Lactobacillus spicheri, Lactobacillus suebicus, Lactobacillus sunkii, Lactobacillus tucceti, Lactobacillus vaccinostercus, Lactobacillus versmoldensis, ili Lactobacillus yamanashiensis.
[0267] Poželjno, probiotske bakterije su bakterije koje imaju status "kvalifikovane preptopstavke bezbednosti" (QPS) u rodu Lactobacillus sp., uključujući, ali se ne ograničavajući na, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus amylolyticus, Lactobacillus amylovorus, Lactobacillus alimentarius, Lactobacillus aviaries, Lactobacillus brevis, Lactobacillus buchneri, Lactobacillus casei, Lactobacillus crispatus, Lactobacillus curvatus, Lactobacillus delbrueckii, Lactobacillus farciminis, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus gallinarum, Lactobacillus gasseri, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus hilgardii, Lactobacillus johnsonii, Lactobacillus kefiranofaciens, Lactobacillus kefiri, Lactobacillus mucosae, Lactobacillus panis, Lactobacillus paracasei, Lactobacillus paraplantarum, Lactobacillus pentosus, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus pontis, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus sakei, Lactobacillus salivarius, Lactobacillus sanfranciscensis, ili Lactobacillus zeae.
[0268] U sledećem primeru izvođenja, the probiotske bakterije su iz roda Lactococcus sp., uključujući, ali se ne ograničavajući na Lactococcus chungangensis, Lactococcus formosensis, Lactococcus fujiensis, Lactococcus garvieae, Lactococcus lactis, na primer Lactococcus lactis subsp. cremoris, Lactococcus lactis subsp. hordniae, Lactococcus lactis subsp. lactis, ili Lactococcus lactis subsp. tructae, Lactococcus piscium, Lactococcus plantarum, Lactococcus raffinolactis, ili Lactococcus taiwanensis.
[0269] Poželjno, probiotske bakterije su bakterije klasifikovane kao "generalno smatrane bezbednim" (GRAS) u rodu Lactococcus, uključujući, ali se ne ograničavajući na, Lactococcus lactis subsp. cremoris, Lactococcus lactis subsp. lactis, i Lactococcus raffinolactis.
[0270] Poželjno, probiotske bakterije su Lactococcus lactis, poželjno Lactococcus lactis subsp. lactis, Lactococcus lactis subsp. lactis biovariant diacetylactis, ili Lactococcus lactis subsp. cremoris, dodatno poželjno Lactococcus lactis subsp. cremoris.
[0271] U sledećem primeru izvođenja, probiotske bakterije su iz roda Leuconostoc sp., uključujući, ali se ne ograničavajući na, Leuconostoc amelibiosum, Leuconostoc argentinum, Leuconostoc carnosum, Leuconostoc citreum, Leuconostoc cremoris, Leuconostoc dextranicum, Leuconostoc durionis, Leuconostoc fallax, Leuconostoc ficulneum, Leuconostoc fructosum, Leuconostoc gasicomitatum, Leuconostoc gelidum, na primer Leuconostoc gelidum subsp. aenigmaticum, Leuconostoc gelidum subsp. gasicomitatum, ili Leuconostoc gelidum subsp. gelidum, Leuconostoc holzapfelii, Leuconostoc inhae, Leuconostoc kimchii, Leuconostoc lactis, Leuconostoc mesenteroides, na primer Leuconostoc mesenteroides subsp. cremoris, Leuconostoc mesenteroides subsp. dextranicums, Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides, ili Leuconostoc mesenteroides subsp. suionicum, Leuconostoc miyukkimchii, Leuconostoc oeni, Leuconostoc paramesenteroides, Leuconostoc pseudoficulneum, ili Leuconostoc pseudomesenteroides.
[0272] Poželjno, bakterije su bakterije klasifikovane kao "generalno smatrane bezbednim" (GRAS) u rodu Leuconostoc sp., uključujući, ali se ne ograničavajući na, Leuconostoc carnosum, Leuconostoc citreum, Leuconostoc fallax, Leuconostoc holzapfelii, Leuconostoc inhae, Leuconostoc kimchii, Leuconostoc lactis, Leuconostoc mesenteroides subsp. cremoris, Leuconostoc mesenteroides subsp. dextranicums, Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides, Leuconostoc palmae, ili Leuconostoc pseudomesenteroides.
[0273] Poželjno, probiotske bakterije su bakterije imaju status "kvalifikovane preptopstavke bezbednosti" (QPS) u rodu Leuconostoc sp., uključujući, ali se ne ograničavajući na, Leuconostoc citreum, Leuconostoc lactis, Leuconostoc mesenteroides subsp. cremoris, Leuconostoc mesenteroides subsp. dextranicum, ili Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides.
[0274] U sledećem primeru izvođenja, bakterije su iz roda Pediococcus sp., uključujući, ali se ne ograničavajući na, Pediococcus acidilactici, Pediococcus argentinicus, Pediococcus cellicola, Pediococcus claussenii, Pediococcus damnosus, Pediococcus dextrinicus. Pediococcus ethanolidurans, Pediococcus halophilus, Pediococcus inopinatus, Pediococcus lolii, Pediococcus parvulus, Pediococcus pentosaceus, Pediococcus siamensis, Pediococcus stilesii, ili Pediococcus urinaeequi
[0275] Poželjno, probiotske bakterije su bakterije koje imaju status "kvalifikovane preptopstavke bezbednosti" (QPS) u rodu Pediococcus sp., uključujući, ali se ne ograničavajući na, Pediococcus acidilactici, Pediococcus dextrinicus, ili Pediococcus pentosaceus.
[0276] U sledećem primeru izvođenja, probiotske bakterije su iz roda Propionibacterium sp., uključujući, ali se ne ograničavajući na, Propionibacterium acidifaciens, Propionibacterium acidipropionici, Propionibacterium acnes, Propionibacterium australiense, Propionibacterium avidum, Propionibacterium cyclohexanicum, Propionibacterium damnosum, Propionibacterium freudenreichii, na primer Propionibacterium freudenreichii subsp. freudenreichii ili Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii, Propionibacterium granulosum, Propionibacterium innocuum, Propionibacterium jensenii, Propionibacterium lymphophilum, Propionibacterium microaerophilum, Propionibacterium olivae, Propionibacterium propionicum, ili Propionibacterium thoenii.
[0277] Prema primeru izvođenja, probiotske bakterije nisu Propionibacterium acnes.
[0278] Dodatno poželjno, probiotske bakterije su bakterije klasifikovane kao "generalno smatrane bezbednim" (GRAS) u rodu Propionibacterium sp., uključujući, ali se ne ograničavajući na Propionibacterium acidipropionici, Propionibacterium freudenreichii subsp. Freudenreichii, Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii, Propionibacterium jensenii, ili Propionibacterium thoenii.
[0279] Dodatno poželjno, probiotske bakterije su Propionibacterium freudenreichii, dodatno poželjno Propionibacterium freudenreichii subsp. freudenreichii ili Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii.
[0280] U sledećem primeru izvođenja, probiotske bakterije su iz roda Streptococcus sp., uključujući, ali se ne ograničavajući na, Streptococcus acidominimus, Streptococcus adjacens, Streptococcus agalactiae, Streptococcus alactolyticus, Streptococcus anginosus, Streptococcus australis, Streptococcus bovis, Streptococcus caballi, Streptococcus canis, Streptococcus caprinus, Streptococcus castoreus, Streptococcus cecorum, Streptococcus constellatus, na primer Streptococcus constellatus subsp. constellatus, Streptococcus constellatus subsp. pharynges, ili Streptococcus constellatus subsp. viborgensis, Streptococcus cremoris, Streptococcus criceti, Streptococcus cristatus, Streptococcus cuniculi, Streptococcus danieliae, Streptococcus defectivus, Streptococcus dentapri, Streptococcus dentirousetti, Streptococcus dentasini, Streptococcus dentisani, Streptococcus devriesei, Streptococcus didelphis, Streptococcus difficilis, Streptococcus downei, Streptococcus durans, Streptococcus dysgalactiae, na primer Streptococcus dysgalactiae subsp. dysgalactiae ili Streptococcus dysgalactiae subsp. equisimilis, Streptococcus entericus, Streptococcus equi, na primer Streptococcus equi subsp. equi, Streptococcus equi subsp. ruminatorum, ili Streptococcus equi subsp. zooepidemicus, Streptococcus equinus, Streptococcus faecalis, Streptococcus faecium, Streptococcus ferus, Streptococcus gallinaceus, Streptococcus gallinarum, Streptococcus gallolyticus, na primer Streptococcus gallolyticus subsp. gallolyticus, Streptococcus gallolyticus subsp. macedonicus, ili Streptococcus gallolyticus subsp. pasteurianus, Streptococcus garvieae, Streptococcus gordonii, Streptococcus halichoeri, Streptococcus hansenii, Streptococcus henryi, Streptococcus hongkongensis, Streptococcus hyointestinalis, Streptococcus hyovaginalis, Streptococcus ictaluri, Streptococcus infantarius, na primer Streptococcus infantarius subsp. coli ili Streptococcus infantarius subsp. infantarius, Streptococcus infantis, Streptococcus iniae, Streptococcus intermedius, Streptococcus intestinalis, Streptococcus lactarius, Streptococcus lactis, na primer Streptococcus lactis subsp. cremoris, Streptococcus lactis subsp. diacetilactis, ili Streptococcus lactis subsp. lactis, Streptococcus loxodontisalivarius, Streptococcus lutetiensis, Streptococcus macacae, Streptococcus macedonicus, Streptococcus marimammalium, Streptococcus massiliensis, Streptococcus merionis, Streptococcus minor, Streptococcus mitis, Streptococcus morbillorum, Streptococcus moroccensis, Streptococcus mutans, Streptococcus oligofermentans, Streptococcus oralis, Streptococcus orisasini, Streptococcus orisuis, Streptococcus ovis, Streptococcus parasanguinis, Streptococcus parauberis, Streptococcus parvulus, Streptococcus pasteurianus, Streptococcus peroris, Streptococcus phocae, na primer Streptococcus phocae subsp. phocae ili Streptococcus phocae subsp. salmonis, Streptococcus plantarum, Streptococcus pleomorphus, Streptococcus pluranimalium, Streptococcus plurextorum, Streptococcus pneumonia, Streptococcus porci, Streptococcus porcinus, Streptococcus porcorum, Streptococcus pseudopneumoniae, Streptococcus pseudoporcinus, Streptococcus pyogenes, Streptococcus raffinolactis, Streptococcus ratti, Streptococcus rifensis, Streptococcus rubneri, Streptococcus rupicaprae, Streptococcus saccharolyticus, Streptococcus salivarius, na primer Streptococcus salivarius subsp. salivarius ili Streptococcus salivarius subsp. thermophilus, Streptococcus saliviloxodontae, Streptococcus sanguinis, Streptococcus shiloi, Streptococcus sinensis, Streptococcus sobrinus, Streptococcus suis, Streptococcus thermophilus, Streptococcus thoraltensis, Streptococcus tigurinus, Streptococcus troglodytae, Streptococcus uberis, Streptococcus urinalis, Streptococcus ursoris, Streptococcus vestibularis, ili Streptococcus waius.
[0281] Poželjno, probiotske bakterije su bakterije klasifikovane kao "generalno smatrane bezbednim" (GRAS) u rodu Streptococcus sp., uključujući, ali se ne ograničavajući na, Streptococcus thermophilus soj Th4, Streptococcus gallolyticus subsp. macedonicus, Streptococcus salivarius subsp. salivarius, ili Streptococrus salivarius subsp. thermophilus.
[0282] Poželjno, probiotske bakterije su bakterije koje imaju status "kvalifikovane preptopstavke bezbednosti" (QPS) u rodu Streptococcus sp., uključujući, ali se ne ograničavajući na, Streptococcus thermophilus.
[0283] U poželjnom primeru izvođenja, pomenute probiotske bakterije ne proizvode endotoksine ili druge potencijalno toksične supstance. Na taj način, pomenute probiotske bakterije su bezbedne za upotrebu i nisu štetne za subjekta nakon primene.
[0284] Poželjno, pomenute probiotske bakterije ne proizvode spore. Bakterijske spore nisu deo polnog ciklusa ali su rezistentne strukture korišćene za preživljavanje pod nepovoljnim uslovima. Kako pomenute probiotske bakterije poželjno ne proizvode spore, pomenute rekombinantne probiotske bakterije ne mogu preživeti, na primer, bez nutrijenata ili ukoliko nedostaje auksotrofni faktor.
[0285] Poželjno, pomenute probiotske bakterije ne proizvode inkluziona tela. Inkluziona tela često sadrže prekomerno eksprimirane proteine i agregacija pomenutih prekomerno eksprimiranih proteina u inkluzionim telima može biti nepovratna.
[0286] Kako pomenute probiotske bakterije poželjno ne proizvode inkluziona tela, količina pomenutog prvog, drugog, i trećeg heterolognog faktora nakon transkripcije i translacije respektivnih sekvenci nukleinske kiseline nije smanjena intracelularnom akumulacijom u inkluzionim telima.
[0287] Dodatno poželjno, pomenute probiotske bakterije takođe ne proizvode ekstracelularne proteinaze. Ekstracelularne proteinaze mogu se izlučivati iz bakterija da unište ekstracelularne strukture, kao što su proteini, da stvaraju nutrijente, kao što je ugljenik, azot, ili sumpor. Ekstracelularne proteinaze mogu takođe delovati kao egzotoksin i biti primer faktora virulencije u bakterijskoj patogenezi.
[0288] Usled nedostatka ekstracelularnih proteinaza bezbednost pomenutih probiotskih bakterija nakon primene na subjekta je poželjno povećana. Dodatno, pomenute probiotske bakterije poželjno ne degradiraju respektivni prvi, drugi, i treći heterologni faktor nakon oslobađanja iz pomenute rekombinantne probiotske bakterije.
[0289] Poželjno, pomenute probiotske bakterije nemaju plazmide koji se javljaju u prirodi. Usled odsustva svih plazmida koji se javljaju u prirodi, pomenute probiotske bakterije poželjno ne poseduju rezistenciju na antibiotike.
[0290] Dodatno poželjno, pomenute probiotske bakterije nemaju faktore domaćina neophodne za konjugativnu transpoziciju.
[0291] Plazmidi koji se javljaju u prirodi mogu se široko klasifikovati u konjugativne i nekonjugativne plazmide. Konjugativni plazmidi sadrže set transfer ili tra gena koji promovišu seksualnu konjugaciju između različitih ćelija. U kompleksnom procesu konjugacije, plazmid može biti prenet iz jedne u drugu bakteriju preko polnih pila koje kodiraju neki od tra gena. Nekonjugovani plazmidi nisu sposobni da iniciraju konjugaciju, stoga mogu biti preneti samo uz asistenciju faktora domaćina neophodnih za konjugativnu transpoziciju, kao što su konjugativni plazmidi.
[0292] Usled odsustva faktora domaćina neophodnih za konjugativnu transpoziciju, transfer gena pomenute nukleinske kiseline (kiselina) koje kodiraju respektivni prvi, drugi, i treći heterologni faktor iz pomenutih probiotskih bakterija u druge mikroorganizme je malo verovatan, poželjno transfer gena je suprimiran.
[0293] U dodatno poželjnom primeru izvođenja, pomenute rekombinantne probiotske bakterije su mlečnokiselinske bakterije, poželjno lactobacillus ili vreste lactococcus. U dodatno poželjnom primeru izvođenja, pomenuta vrsta lactococcus je lactococcus lactis subsp. cremoris.
[0294] Mlečnokiselinske bakterije dodatno oslobađaju mlečnu kiselinu kao glavni metabolički krajnji proizvod fermentacije ugljenih hidrata. Takođe je poznato da mlečna kiselina takođe stimuliše rast i proliferaciju endotela. Dodatno, mlečna kiselina ima antibakterijski efekat koji smanjuje verovatnoću bakterijske infekcije na mestu disfunkcije kože.
[0295] Tehnike za transformaciju prethodno pomenutih probiotskih bakterija poznate su stručnjaku, i, na primer, opisane su u Green i Sambrook (2012): "Molecular cloning: a laboratory manual", fourth edition, Cold Spring Harbour Laboratory Press (Cold Spring Harbor, NY, USA).
[0296] Nakon transformacije rekombinantne probiotske bakterije sadrže najmanje jednu sekvencu nukleinske kiseline koja kodira pomenuti prvi heterologni faktor i najmanje jednu sekvencu nukleinske kiseline koja kodira pomenuti drugi heterologni faktor, i poželjno najmanje jednu sekvencu nukleinske kiseline koja kodira pomenuti treći heterologni faktor.
[0297] U primeru izvođenja, najmanje jedna sekvenca nukleinske kiseline koja kodira prvi heterologni faktor i najmanje jedna sekvenca nukleinske kiseline koja kodira pomenuti drugi heterologni faktor, poželjno i najmanje jedna sekvenca nukleinske kiseline koja kodira pomenuti treći heterologni faktor, nalaze se u različitim sub-populacijama rekombinantne probiotske bakterije.
[0298] Na primer, svaka respektivna sekvenca nukleinske kiseline se nalazi u zasebnim subpopulacijama probiotskih bakterija, koje su kombinovane da bi se dobile rekombinantne probiotske bakterije prema predmetnom pronalasku.
[0299] Respektivne pojedinačne sub-populacije koje sadrže respektivne sekvence nukleinskih kiselina mogu, na primer, biti iz iste vrste ili iz različitih vrsta prethodno pomenutih probiotskih bakterija.
[0300] Na primer, različite vrste rekombinantnih probiotskih bakterija koje eksprimiraju različite heterologne faktore mogu se koristiti za usvajanje ekspresije i, poželjno oslobađanje, respektivnih heterolognih faktora iz probiotskih bakterija.
[0301] U poželjnom primeru izvođenja predmetnog pronalaska, respektivne sekvence nukleinske kiseline su prisutne u rekombinantnim probiotskim bakterijama u različitom broju kopija. Na primer, rekombinantne probiotske bakterije sadrže najmanje jednu kopiju respektivnih sekvenci nukleinske kiseline koje kodiraju pomenuti prvi, pomenuti drugi, i/ili poželjno pomenuti treći faktor.
[0302] Brojevi kopija respektivne sekvence nukleinske kiseline mogu se povećati da bi se poboljšala ekspresija respektivnog heterolognog faktora.
[0303] Poželjno, odnos kopija sekvenci respektivne nukleinske kiseline koja kodira pomenuti prvi, pomenuti drugi, i/ili pomenuti treći faktor je 1 : 1 : 1.
[0304] Efikasnost translacije može se poboljšati obezbeđivanjem kopija sekvence nukleinske kiseline koju treba prepisati od strane rekombinantnih probiotskih bakterija.
[0305] U dodatnom primeru izvođenja predmetnog pronalaska, sub-populacija rekombinantnih probiotskih bakterija sadrži najmanje jednu sekvencu nukleinske kiseline koja kodira dva od tri heterologna faktora gde je poželjno treći heterologni faktor kodiran sa sekvencom nukleinske kiseline locirane u drugoj sub-populaciji rekombinantnih probiotskih bakterija.
[0306] U poželjnom primeru izvođenja, sekvence nukleinske kiseline koje kodiraju sva tri heterologna faktora su locirane u jednoj populaciji rekombinantnih probiotskih bakterija.
[0307] U dodatno poželjnom primeru izvođenja, respektivne sekvence nukleinske kiseline su locirane na najmanje jednom od hromozoma i plazmidu pomenute rekombinantnih probiotskih bakterija.
[0308] Lociranje nukleinske kiseline na hromozomu rekombinantnih probiotskih bakterija ili na plazmidu pomenutih rekombinantnih probiotskih bakterija određuje između ostalog količinu proteina translatiranog od strane bakterija, jer ekspresioni nivoi na plazmidu su viši u poređen ju sa ekspresionim nivoima na hromozomu.
[0309] U dodatno poželjnom primeru izvođenja predmetnog pronalaska, najmanje jedna sekvenca nukleinske kiseline koja kodira respektivni heterologni faktor je obezbeđena na hromozomu bakterija i najmanje jedna sekvenca nukleinske kiseline koja kodira drugi heterologni faktor je obezbeđena na plazmidu pomenutih rekombinantnih probiotskih bakterija.
[0310] Respektivna sekvenca nukleinske kiseline koja kodira treći faktor može onda biti ili obezbeđena na hromozomu ili na plazmidu rekombinantnih probiotskih bakterija.
[0311] U alternativnom primeru izvođenja predmetnog pronalaska, respektivne sekvence nukleinske kiseline su ili obezbeđene na pojedinačnim delovima hromozoma rekombinantnih probiotskih bakterija ili na različitim plazmidima pomenutih rekombinantnih probiotskih bakterija.
[0312] U naročito poželjnom primeru izvođenja pronalaska, sve sekvence nukleinske kiseline koje kodiraju pomenute heterologne faktore su obezbeđene na jednom plazmidu, na primer, svaka je kontrolisana i funkcionalno kuplovana sa različitim promotorom.
[0313] U sledećem naročito poželjnom primeru izvođenja pronalaska, respektivne sekvence nukleinske kiseline koje kodiraju respektivne heterologne faktore locirane su u jednom operon koji je operativno povezan sa i kontrolisan sa jednim promotorom.
[0314] Operon je funkcionalan jedinica DNK koja sadrži klaster gena pod kontrolom jednog promotora. Geni su transkribovani zajedno u iRNK lance i ili su translatirani zajedno u citoplazmi, ili podležu trans-splajsingu da bi stvorili monocistronske iRNK koje su zasebno translatirane.
[0315] Poželjno, respektivne sekvence nukleinske kiseline koje kodiraju respektivne heterologne faktore locirane u pomenutom jednom operonu obezbeđene su sa sekvencama nukleinske kiseline koje kodiraju vezujuće mesto ribozoma za inicijaciju translacije.
[0316] Poželjno, sekvence nukleinske kiseline koje kodiraju vezujuće mesto ribozoma locirane su ushodno od start kodona, koji je prema 5’ regionu istog lanca koji se prepisuje. Sekvenca je poželjno komplementarna sa 3’ krajem 16S ribozomalne RNK.
[0317] Poželjno, respektivne sekvence nukleinske kiseline koje kodiraju respektivne heterologne faktore locirane u pomenutom jednom operonu su obezbeđene sa sekvencom nukleinske kiseline koja kodira sekretornu signalnu sekvencu na 5’-kraju otvorenog okvira čitanja (ORF) heterolognog faktora stvarajući fuzioni protein koji sadrži sekretornu signalnu sekvencu i the heterologni faktor.
[0318] U dodatno poželjnom primeru izvođenja, sekvence nukleinske kiseline su kontrolisane sa i funkcionalno kuplovane sa konstitutivnim promotorom ili inducibilnim promotorom, poželjno sa inducibilnim promotorom.
[0319] Na primer, sekvence nukleinske kiseline koje kodiraju respektivne heterologne faktore mogu se kontrolisati sa i funkcionalno kuplovati sa individualnim promotorima, koji mogu biti ili konstitutivni promotor ili inducibilni promotor, dodatno poželjno inducibilni promotorom.
[0320] Konstitutivni promotor je aktivan u ćeliji u svim slučajevima, dok inducibilni promotor postaje aktivan kao odgovor na specifični induktor.
[0321] Promotor je sekvenca nukleinske kiseline koja inicira transkripciju određenog gena. Promotori su locirani blizu strane gena gde počinje transkripcija, na istom lancu i ushodno od DNK, što je prema 5’ regionu istog lanca koji se prepisuje.
[0322] Poželjno, korišćeni respektivni promotor je autologni promotor iz probiotskih bakterija, koje eksprimiraju respektivnu sekvencu nukleinske kiseline.
[0323] Alternativno, respektivni promotor je heterologni promotor, poželjno prokariotski promotor, dodatno poželjno promotor iz bakterija.
[0324] U dodatno poželjnom primeru izvođenja, ekspresija najmanje jedne sekvence nukleinske kiseline je kontrolisana sa inducibilnim promotorom, pomenuta najmanje jedna sekvenca nukleinske kiseline je sposobna da se eksprimira u prisustvu najmanje jednog induktora.
[0325] Poželjno, pomenuti inducibilni promotor, koji je inducibilan sa induktorom, je promotor za najmanje jedan mikrobni gen koji kodira lantibiotski peptid.
[0326] Lantibiotski peptidi su poznati stručnjaku. Lantibiotici su klasa peptida koja sadrži karakteristike policiklične tioetarske aminokiseline lantionina kao i nezasićene aminokiseline dehidroalanina i 2- aminoizobuterne kiseline.
[0327] Lantionin, na primer, je monosulfid analog cisteina i sastavljan je od dva alaninska ostatka koji su unakrsno vezani na njihovim beta-ugljenikovih atomima sa tioetarskom vezom.
[0328] Lantibiotici se proizvode od strane velikog broja gram-pozitivnih bakterija.
[0329] U poželjnom primeru izvođenja, pomenuti inducibilni promotor je nisin promotor iz lactococcus lactis, bisin promotor iz bifidobacterium longum, optilin promotor iz bacillus subtilis, salvarizin promotor iz streptococcus salivarius, epidermin promotor iz staphylococcus epidermidis, galidermin promotor iz staphylococcus gallinarum, mutacin promotor iz streptococcus mutans, streptin promotor iz streptococcus pyogenes, streptokokcinum promotor iz streptococcus pyogenes, lakticin promotor iz lactococcus lactis, epidermin promotor iz staphylococcis epidermidis, epilanzin promotor iz staphylococcus epidermidis, pep5 promotor iz staphylococcus epidermidis, laktocin-s promotor iz lactobacillus sakei, salvaricin promotor iz streptococcus salivarius, ili streptococcus pyogenes, plantarizin promotor iz lactobacillus plantarum, termofilin promotor iz streptococcus, bovicin promotor iz streptococcus ili njihove kombinacije.
[0330] Dodatno poželjno, pomenuti inducibilni promotor je PnisA, PnisZ, PnisQ, PnisF, PnisU ili njihove kombinacije iz lactococcus lactis.
[0331] U poželjnom primeru izvođenja, induktor je najmanje jedan lantibiotik peptid ili njegov funkcionalni analog, poželjno izabran iz grupe koja se sastoji od nisin A, nisin Z, nisin Q, nisin F, nisin U, njihovih funkcionalnih analoga i njihovih smeša.
[0332] Sistem genske ekspresije kontrolisan nisinom je, na primer, komercijalno dostupan od MoBiTec GmbH (Göttingen, Germany) pod trgovačkim nazivom NICE®, koji je razvijen u NIZO Food Research (Ede, Netherlands).
[0333] Nisin, koji je dobro poznat stručnjaku, lantibiotik peptid od 34 aminokiseline sa širokim spektrom domaćina. Na primer, nisin iz Lactococcus lactis je komercijalno dostupan od Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Munich, Germany).
[0334] Nisin je u širokoj upotrebi kao konzervans u hrani. Inicijalno, nisin se sintetiše u ribozomima kao prekursor. Nakon naknadnih enzimskih modifikacija, modifikovani molekul je translociran duž citoplazmatske membrane i obrađen u zreli oblik.
[0335] Nisin indukuje sopstvenu proizvodnju. Ekspresija sekvence nukleinske kiseline od interesa može se indukovati dodavanjem sub-inhibitorne količine nisina, koja je poželjno od 0.01 do 50 ng/ml medijuma kulture, dodatno poželjno od 0.1 do 5 ng/ml medijuma kulture, kada je gen od interesa naknadno baziran iza inducibilnih promotora nisin sistema.
[0336] Dodatno, NICE sistem je prenet u druge gram-pozitivne bakterije, na primer, leuconostoc lactis, lactobacillus brevis, lactobacillus helveticus, lactobacillus plantarum, streptococcus pyogenes, streptococcus agalactiae, streptococcus pneumoniae, streptococcus zooepidemicus, enterococcus faecalis ili lactobacillus subtilis.
[0337] Inducibilni nisin promotor, koji je poželjno izabran od PnisA, PnisZ, PnisQ, PnisF, PnisU, i njihovih kombinacija, može se integrisati u hromozom korišćene probiotske bakterije korišćen zajedno sa najmanje jednom sekvencom nukleinske kiseline koja kodira pomenuti prvi heterologni faktor, pomenuti drugi heterologni faktor, i/ili poželjno pomenuti treći heterologni faktor.
[0338] Poželjno, pomenuti inducibilni promotor je PnisA.
[0339] Alternativno, respektivni promotori zajedno sa najmanje jednom sekvencom nukleinske kiseline su obezbeđeni na plazmidu koji je zatim prenet u probiotske bakterije.
[0340] Respektivna sekvenca nukleinske kiseline je ekspresibilna u prisustvu nisina.
[0341] Pogodni plazmidi su komercijalno dostupni, na primer, od MoBiTec GmbH, (Göttingen, Germany) kao što su pNZ8008, pNZ8148, pNZ8149, i pNZ8150.
[0342] U dodatno poželjnom primeru izvođenja, takođe su obezbeđeni geni NisR i NisK ili na hromozomu ili plazmidu korišćene probiotske bakterije. Respektivni protein NisR i NisK pripadaju familiji bakterijskih dvokomponentnih sistema prenosa signala. NisK je histidinprotein kinaza koja se nalazi u citoplazmatskoj membrani gde poželjno deluje kao receptor za zreli molekul nisin. Nakon vezivanja nisina sa NisK, on autofosforiliše i prenosi fosfatnu grupu na NisR, koji je regulator odgovora koji postaje aktiviran nakon fosforilacije sa NisK.
[0343] Aktivirani NisR indukuje transkripciju sa PnisA promotora, PnisF promotora, PnisZ promotora, PnisQ promotora, i/ili PnisU promotora.
[0344] Respektivni regulatori ekspresije nisin gena NisR i NisK mogu, na primer, biti obezbeđeni na hromozomu probiotske bakterije i/ili na plazmidu.
[0345] Pogodni plazmidi su komercijalno dostupni i uključuju, na primer, plazmid pNZ9530 (MoBiTec GmbH, Göttingen, Germany). Plazmid pNZ9530 nosi NisR i NisK gene i poželjno je korišćen za kloniranje u sojevima lactococcus i u sojevima drugih rodova mlečnokiselinskih bakterija koji nemaju regulatorne gene integrisane u hromozom. Na primer, za nisin indukovanu ekspresiju u enterococcus faecalis, plazmid pMSP3535 je opisan od strane Brian et al. (2000) i koji je, na primer, dostupan od AddGene, ne-profitnog repozitorijuma plazmida (Plazmid No.
46886).
[0346] Sekvenca nukleinske kiseline plazmida pMSP3535 je dostupna pod NCBI pristupnim brojem AY303239.1.
[0347] U dodatno poželjnom primeru izvođenja, korišćene su probiotske bakterije, koje sadrže regulatorne gene za nisin kontrolisanu ekspresiju gena NisR i NisK.
[0348] Pogodni sojevi su komercijalno dostupni, na primer, od MoBiTec GmbH (Göttingen, Germany). Pogodni sojevi su, na primer, lactococcus lactis soj NZ9000, lactococcus lactis soj NZ9100, lactococcus lactis soj NZ3900.
[0349] Pogodan soj je takođe lactococcus lactis soj NZ3000, koji je komercijalno dostupan, na primer, od MoBiTec GmbH. Lactococcus lactis soj NZ3000 je soj bez NisR i NisK. Lactococcus lactis soj NZ3000 se može koristiti, kada je ekspresija pomenute sekvence(i) je/su kontrolisana sa konstitutivnim promotorom.
[0350] U dodatno poželjnom primeru izvođenja probiotske bakterije su lactococcus lactis soj NZ3900, koji je soj hranljivog gradusa. Lactococcus lactis soj NZ3900 uključuje selekcioni sistem plazmida koji nije zasnovan na rezistenciji na antibiotik već na sposobnosti da raste na laktozi.
[0351] Lactococcus lactis soj NZ3900 ne proizvodi endotoksine ili druge potencijalno toksične supstance. Dodatno, lactococcus lactis soj NZ3900 ne proizvodi inkluziona tela niti spore. Dodatno, lactococcus lactis soj NZ3900 ne proizvodi ekstracelularne proteinaze.
[0352] U dodatno poželjnom primeru izvođenja, sekvence nukleinske kiseline koje kodiraju respektivne heterologne faktore su modifikovane da bi se povećala ekspresija, sekrecija i/ili stabilnost kodiranog heterolognog faktora.
[0353] Pogodne modifikacije su poznate stručnjaku i uključuju, na primer, prilagođavanje korišćenja kodona najmanje jedne sekvence nukleinske kiseline sa korišćenim probiotskim bakterijama.
[0354] Na primer, najmanje jedna sekvenca nukleinske kiseline se može dizajnirati da bi se prilagodio obrazac korišćenja kodona korišćenih probiotskih bakterija. Dodatno, kao dodatak generalnoj optimizaciji kodona, mogu se koristiti specifične tabele kodona, kao što je tabela kodona za visoko eksprimirane gene ribozomskih proteina respektivnih probiotskih bakterija, da bi se dodatno povećala translacija kodiranih faktora.
[0355] Pogodne modifikacije takođe uključuju, na primer, inkorporaciju sekvence nukleinske kiseline koja kodira sekretornu signalnu sekvencu na 5’-kraju otvorenog okvira čitanja (ORF) heterolognog faktora stvarajući fuzioni protein koji sadrži sekretornu signalnu sekvencu i heterologni faktor. Sekretorna signalna sekvenca je poželjno uređena na N-terminalnoj strani respektivnog heterolognog faktora.
[0356] Sekretorna signalna sekvenca poželjno usmerava novosintetisani protein ka plazma membrani. Na kraju sekretorne signalne sekvence, poželjno signalnog peptida ili propeptida, poželjan je lanac aminokiselina koji prepoznaje i iseca signalna peptidaza da bi se stvorila slobodna sekretorna signalna sekvenca, poželjno signalni peptid ili propeptid, i zreli heterologni faktor, koji se izlučuje ekstracelularno.
[0357] Kod bakterija, postoje dva glavna puta za sekreciju proteina preko citoplazmatske membrane. Generalni put sekrecije, označen kao Sec-put, katalizuje transmembransku translokaciju proteina u njihovoj neraspakovanoj konformaciji, nakon čega se savijaju u njihovu nativnu strukturu na trans strani membrane.
[0358] Dvostruki-arginin translokacioni put, označen Tat-put, katalizuje translokaciju sekretornih proteina u njihovom savijenom stanju.
[0359] Pogodne sekretorne signalne sekvence uključuju, na primer, signalni peptid.
[0360] Poželjno, sekretorna signalna sekvenca je sekvenca nativnog signalnog peptida ili propeptida respektivnog heterolognog faktora koji je kodiran od strane sekvence nukleinske kiseline, koji poželjno je prekursor i/ili preproprotein respektivnog faktora.
[0361] U dodatno poželjnom primeru izvođenja, pomenuta sekretorna signalna sekvenca je homologa sekretorna sekvenca iz pomenutih rekombinantnih probiotskih bakterija, poželjno pomenuta sekretorna signalna sekvenca je ubikvitin specifična peptidaza 45 (Usp 45) signalna sekvenca iz Lactococcus sp.. Usp 45 sekrecioni signal ima veoma visoku efikasnost sekrecije. Drugi sekretorni signali su poznati stručnjaku i uključuju, na primer, SP310, SPEXP4 i AL9 iz Lactococcus sp..
[0362] Na primer, nativni signalni peptid heterolognog faktora može se zameniti sa homologom sekretornom signalnom sekvencom iz probiotskih bakterija korišćenih za ekspresiju pomenutog heterolognog faktora.
[0363] Sekretorna signalna sekvenca poželjno poboljšava efikasnost sekrecije respektivnog heterolognog faktora. Na primer, u lactococcus lactis, većina proteina je izlučena preko Sec-puta. Proteini su sintetisani kao prekursori koji sadrže zreli deo proteina sa N-terminalnim signalnim peptidom. Signalni peptid navodi protein do citoplazmatične membrane. Nakon isecanja signalnog peptida, zreli protein se oslobađa ekstracelularno.
[0364] Dodatno poželjno, sekretorni signal sadrži aminokiselinsku sekvencu od SEQ ID No.34.
[0365] U dodatno poželjnom primeru izvođenja, respektivni heterologni faktor je eksprimiran kao propeptid sa ili bez faktora koji poboljšava sekreciju. Propeptid može biti isečen sa proteazama da bi oslobodio zreli heterologni faktor.
[0366] U dodatno poželjnom primeru izvođenja, rekombinantne probiotske bakterije sadrže najmanje jedan inaktivirani gen koji kodira esencijalni protein neophodan za vijabilnost pomenutih probiotskih bakterija.
[0367] U poželjnom primeru izvođenja, esencijalni protein neophodan za vijabilnost pomenutih probiotskih bakterija je protein, dodatno poželjno enzim, neophodan za sintezu organskog jedinjenja neophodnog za vijabilnost pomenutih probiotskih bakterija.
[0368] Nakon inaktivacije pomenutog esencijalnog proteina, poželjno enzima, respektivno organsko jedinjenje je auksotrofni faktor neophodan za vijabilnost rekombinantnih probiotskih bakterija i koji se mora dodati da bi se održala vijabilnost rekombinantnih probiotskih bakterija.
[0369] Poželjno, pomenuti auksotrofni faktor je vitamin, aminokiselina, nukleinska kiselina, i/ili masna kiselina.
[0370] Na primer, aminokiseline i nukleotidi su biološki važna organska jedinjenja, koji su prekursori proteina i nukleinskih kiselina, respektivno.
[0371] U dodatno poželjnom primeru izvođenja, najmanje jedan gen neophodan za vijabilnost probiotskih bakterija je izabran iz grupe koja se sastoji od alanin racemaze (alaR), timidilat sintaze (thyA), asparagin sintaze (asnH), CTP sintaze (pyrG), triptofan sintaze (trbBA), i njihovih kombinacija.
[0372] Na primer, alanin racemaza je enzim koji katalizuje konverziju L-alanina u D-alanin. D-alanin proizveden sa alanin racemazom je korišćen za sintezu peptidoglikana. Peptidoglikan se nalazi u ćelijskim zidovima bakterija.
[0373] Stručnjaku je poznato da inaktivacija gena za alanin racemazu (alaR) kod bakterija rezultuje u potrebi bakterija da koriste spoljni izvor D-alanina da bi se održao integritet ćelijskog zida.
[0374] Stručnjaku je poznato da, na primer, lactococcus lactis i lactobacillus plantarum sadrže jedan alaR gen. Inaktivacija efekata gena utiče na inkorporaciju D-alanina u ćelijski zid.
[0375] Lactococcus lactis bakterije, na primer, sa inaktiviranim genom za alanin racemazom (alaR) su zavisne od eksternog izvora D-alanina da bi bile sposobne da sintetišu peptidoglikan i inkorporišu D-alanin u lipoteihoinskoj kiselini (LTA). Ove bakterije liziraju rapidno kada se ukloni D-alanin, na primer, na srednjoj fazi eksponencijalnog rasta.
[0376] Sojevi deficijentni u alanin racemazi mlečnokiselinskih bakterija mogu se, na primer, stvoriti postupcima poznatim u tehnici.
[0377] Timidilat sintaza je enzim koji katalizuje konverziju dezoksiuridin monofosfata (dUMP) u dezoksitimidilat monofosfat (dTMP). dTPM je jedan od tri nukleotida koji formiraju timin (dTMP, dTDP, i dTTP). Timidin je nukleinska kiselina u DNK.
[0378] Stručnjaku je poznato da timidilat sintaza igra ključnu ulogu u ranom stadijumu biosinteze DNK. Na primer, oštećenje ili delecija DNK dešava se svakodnevno kao rezultat endogenih i sredinskih faktora.
[0379] Dodatno, za proliferaciju probiotskih bakterija neophodna je sinteza DNK.
[0380] Inaktivacija timidilat sintaze (thyA) gena kod bakterija rezultuje u potrebi da bakterije koriste spoljni izvor timidina da bi zadržale integritet DNK.
[0381] Asparagin sintaza je enzim koji generiše aminokiselinu asparagin iz aspartata. Inaktivacija gena asparagin sintetaze (asnH) rezultuje u nemogućnosti sinteze respektivne aminokiseline, koja postaje auksotrofni faktor.
[0382] CTP-sintaza je enzim uključen u sintezu pirimidina. CTP sintaza vrši interkonverziju uridin-5’-trifosfata (UTP) i citidin trifosfata (CTP). Inaktivacija gena CTP-sintaze (pyrG) čini bakterije nesposobnim da sintetiše nukleotide citozina i iz de novo sinteze kao i puta uridin ćelijskog zida.
[0383] CTP postaje auksotrofni faktor, koji se mora dodavati za sintezu RNK i DNK.
[0384] Triptofan sintaza je enzim koji katalizuje dva finalna koraka u biosintezi aminokiseline triptofan.
[0385] Inaktivacija gena triptofan sintaze (trpBA) čini bakterije nesposobnima da sintetišu respektivnu aminokiselinu, koja postaje auksotrofni faktor.
[0386] Postupci za inaktivaciju pomenutog gena neophodnog za vijabilnost probiotskih bakterija poznati su stručnjaku i uključuju deleciju gena, mutaciju gena, epigenetsku modifikaciju pomenutog gena, RNK interferencijom (RNAi) posredovano utišavanje pomenutog gena, translacionu inhibiciju pomenutog gena, ili njihovih kombinacija.
[0387] U dodatno poželjnom primeru izvođenja, respektivni auksotrofni faktor je obezbeđen zajedno sa pomenutim probiotskim bakterijama.
[0388] U dodatno poželjnom primeru izvođenja pronalaska, pomenuti inaktivirani gen neophodan za vijabilnost probiotskih bakterija korišćen je za sredinsku izolaciju.
[0389] Nakon primene rekombinantnih probiotskih bakterija koje sadrže najmanje jedan inaktivirani gen neophodan za vijabilnost pomenutih probiotskih bakterija, respektivni auksotrofni faktor mora biti obezbeđen iz spoljne sredine, na primer, primenom medijuma ili medijuma za rast.
[0390] U slučaju da su rekombinantne probiotske bakterije oslobođene u okruženje, auksotrofni faktor nedostaje i, poželjno, rekombinantne probiotske bakterije umiru.
[0391] Dodatno, primena eksterno dodatnog auksotrofnog faktora omogućava kontrolu biosinteze i oslobađanje respektivnih heterolognih faktora.
[0392] Poželjno, najmanje jedan od pomenutog prvog faktora, pomenutog drugog faktora i pomenutog trećeg faktora može se osloboditi iz pomenutih rekombinantnih probiotskih bakterija. Dodatno poželjno, najmanje jedan od pomenutog prvog faktora, pomenutog drugog faktora i pomenutog trećeg faktora je izlučen iz pomenutih rekombinantnih probiotskih bakterija.
[0393] Na primer, u gram-pozitivnim bakterijama, kao što su mlečnokiselinske bakterije, proteini koje treba izlučiti iz bakterija su poželjno sintetisani kao prekursor koji sadrži N-terminalni signalni peptid i zreli deo proteina. Prekursori su prepoznati od strane sekretorne mašinerije bakterije i translocirani su duž citoplazmatske membrane. Signalni peptid je zatim isečen i degradiran i zreli protein je izlučen iz bakterija, na primer, u supernatant kulture ili u oblast inflamatorne kožne disfunkcije.
[0394] Na primer, lactococcus lactis je sposoban da izlučuje proteine u opsegu od male molekulske mase, na primer manje od 10 kDa, do velike molekulske mase, na primer molekulska težina iznad 160 kDa, preko Sec-zavisnog puta.
[0395] Alternativno, najmanje jedan od pomenutog prvog faktora, pomenutog drugog faktora, i pomenutog trećeg faktora je oslobođen iz pomenutih rekombinantnih probiotskih bakterija preko propustljive citoplazmatske membrane.
[0396] Na primer, kada se kao induktor za sintezu proteina koristi nisin u pomenutim rekombinantnim probiotskim bakterijama, nisin takođe formira pore unutar citoplazmatske membrane kroz koju najmanje jedan od pomenutog prvog faktora, pomenutog drugog faktora, i pomenutog trećeg faktora je oslobođen iz probiotskih bakterija.
[0397] Alternativno, citoplazmatska membrana pomenutih rekombinantnih probiotskih bakterija postaje propustljiva usled oštećene sinteze komponenti ćelijskog zida.
[0398] Na primer, pomenute rekombinantne probiotske bakterije sadrže inaktivirani gen alanin racemaze (alaR). U odsustvu D-alanina, pomenute rekombinantne probiotske bakterije ne mogu održati integritet citoplazmatske membrane i, posledično, najmanje jedan od pomenutog prvog faktora, pomenutog drugog faktora, i pomenutog trećeg faktora je oslobođen iz pomenutih rekombinantnih probiotskih bakterija.
[0399] Tokom procesa zarastanja pomenute inflamatorne kožne disfunkcije, oslobođeni prvi heterologni faktor, drugi heterologni faktor i/ili treći heterologni faktor mogu podleći degradaciji, na primer isecanjem proteazom, što može dovesti do gubitka biološke aktivnosti pomenutih heterolognih faktora.
[0400] Degradacija ili deplecija pomenutih heterolognih faktora može se kompenzovati produženim oslobađanjem pomenutih heterolognih faktora iz pomenutih rekombinantnih probiotskih bakterija. Poželjno, pomenute rekombinantne probiotske bakterije eksprimiraju najmanje jedan od pomenutog prvog heterolognog faktora, pomenutog drugog heterolognog faktora i pomenutog trećeg heterolognog faktora na konstantan način. Poželjno, pomenute rekombinantne probiotske bakterije oslobađaju pomenute heterologne faktore konstantno.
[0401] U poželjnom primeru izvođenja, pomenute probiotske bakterije su obezbeđene u farmaceutskoj kompoziciji za upotrebu u tretmanu pomenute inflamatorne kožne disfunkcije.
[0402] Poželjno, pomenuta farmaceutska kompozicija sadrži najmanje jedan farmaceutski prihvatljiv nosač ili ekscipijent koji, dodatno poželjno, je pogodan za nameravani put primene.
[0403] Poželjno, pomenuti farmaceutski prihvatljiv nosač ili farmaceutski prihvatljiv ekscipijent sadrži najmanje jedan polimerni nosač, poželjno izabran iz grupe koja se sastoji od polisaharida, poliestara, polimetakrilamida, i njihovih smeša. Na primer, pomenuti farmaceutski prihvatljiv nosač je hidrogel, koji, na primer, obezbeđuje dodatno optimalnu vlažnost sredine za promovisanje zarastanja rane. Dodatno, farmaceutski prihvatljiv nosač pomaže u adheziji pomenutih rekombinantnih probiotskih bakterija za mesto pomenute inflamatorne kožne disfunkcije nakon primene.
[0404] Poželjno, pomenuta farmaceutska kompozicija dodatno sadrži najmanje jedan nutrijent za pomenute rekombinantne probiotske bakterije, poželjno izabran iz grupe koja se sastoji od ugljenih hidrata, vitamina, minerala, aminokiselina, elemenata u tragovima i njihovih smeša.
[0405] Dodatno poželjno, pomenuta farmaceutska kompozicija dodatno sadrži najmanje jednu komponentu za stabilizovanje najmanje jedan od pomenutog prvog faktora, pomenutog drugog faktora, i pomenutog trećeg faktora.
[0406] Pomenuto stabilizujuće jedinjenje je poželjno izabrano iz grupe koja se sastoji od antimikrobnih sredstava, krioprotektanata, inhibitora proteaze, redukujućih sredstava, metal helatora, i njihovih smeša.
[0407] U dodatno poželjnom primeru izvođenja, pomenute rekombinantne probiotske bakterije su u rastvoru, zamrznute ili osušene, poželjno liofilizovane ili osušene sprejem.
[0408] Poželjno, pomenute rekombinantne probiotske bakterije se primenjuju u rastvoru, na primer, u obliku pomenute farmaceutske kompozicije.
[0409] U alternativnom primeru izvođenja, pomenute rekombinantne probiotske bakterije su zamrznute ili osušene, poželjno liofilizovane ili osušene sprejem. Rekombinantne probiotske bakterije mogu biti rekonstituisane pre upotrebe.
[0410] Nakon primene, rekombinantne probiotske bakterije mogu se dovesti u kontakt sa pomenutim najmanje jednim induktorom, poželjno da bi indukovale ekspresiju najmanje jedan od pomenutog prvog faktora, pomenutog drugog faktora, i pomenutog trećeg faktora.
[0411] Dodatno poželjno, nakon indukcije ekspresije, najmanje jedan od pomenutog prvog faktora, pomenutog drugog faktora, i pomenutog trećeg faktora je oslobođen iz pomenutih bakterija.
Literatura
Brian et al. (2000): "Improved vector for nisin-controlled expression in gram-positive bacteria", plasmid 44 (2), 2000, pages 183 to 190.
Davis et al. (2013): Macrophage M1/M2 polarization dynamically adapts do changes in cytokine microenvironments in cryptococcus neoformans infection, mbio. 4(3), 2013, e00264-13. doi:10.1128/mBio.00264-13.
de Ruyter et al. (1996): Functional analysis of promoters in the nisin gene cluster of Lactococcus lactis. J. Bacteriol.178 (12), 1996, pages 3434 do 3439.
Duluc et al. (2007): Tumor-associated leukemia inhibitory factor and IL-6 skew monocyte differentiation into tumorassociated macrophage-like cells, Blood 110(13), 2007, pages 4319 to 4330.
Hao et al. (2012): Macrophages in tumor microenvironments and the progression of Tumors: Clin. Dev. Immunol. 2012, pages 1 to 11
van Asseldonk et al. (1993): Functional analysis of the Lactococcus lactis usp45 secretion signal in the secretion of a homologous proteinase and a heterologous alpha-amylase. Mol. Gen. Genet.
240 (3), 1993, pages 428-434.
van Asseldonk et al. (1990): Cloning of usp45, a gene encoding a secreted protein from Lactococcus lactis subsp. lactis MG1363. Gene 95 (1), 1990, pages 155 to 160.
Richard et al. (1995): Effect of topical basic fibroblast growth factor on the healing of chronic diabetic neuropathic ulcer of the foot. A pilot, randomized, double-blind, placebo-controlled study; Diabetes Care 18 (1), 1995, page 64 to 69.
Sekvence
[0413]
SEQ ID Nos. 1 do 3 odgovaraju prekursoru humanog CSF-1 izoformi 1 do 3, respektivno, uključujući signalni peptid.
SEQ ID No.4 odgovara zrelom humanom CSF-1.
SEQ ID No. 5 odgovara sintetičkom konstruktu CSF-1 korišćenom u Primeru 1, uključujući Usp45 sekrecioni signal iz Lactococcus lactis, koji obuhvata aminokiseline 1 do 27 proteina, i zrelog human CSF-1, koji obuhvata aminokiseline 28 do 185 proteina.
SEQ ID No. 6 odgovara sintetičkom konstruktu CSF-1 stvorenom nakon sekrecije iz Lactococcus lactis koji eksprimira pCSF1.
SEQ ID Nos. 7 i 8 odgovaraju prekursoru humanog IL-34 izoformi 1 i 2, respektivno, uključujući signalni peptid. SEQ ID No. 9 odgovara zrelom humanom IL-34. SEQ ID Nos. 10 i 11 odgovara prekursoru humanog IL-4 izoformi 1 i 2, respektivno, uključujući signalni peptid.
SEQ ID No.12 odgovara zrelom humanom IL-4.
SEQ ID No. 13 odgovara sintetičkom konstruktu humanog IL-4 korišćenog u Primeru 1, uključujući Usp45 sekrecioni signal iz Lactococcus lactis, koji obuhvata aminokiseline 1 do 27 proteina, i zreli humani IL4, koji obuhvata aminokiseline 28 do 185 proteina.
SEQ ID No.14 odgovara sintetičkom konstruktu IL-4 stvorenom nakon sekrecije iz Lactococcus lactis koji eksprimira pIL4.
SEQ ID No.15 odgovara humanom IL-10 prekursoru uključujući signalni peptid.
SEQ ID No.16 odgovara zrelom humanom IL-10.
SEQ ID No.17 odgovara humanom IL-13 prekursoru uključujući signalni peptid.
SEQ ID No.18 odgovara zrelom humanom IL-13.
SEQ ID No.19 odgovara humanom TGF-β1 prekursoru uključujući signalni peptid.
SEQ ID No.20 odgovara zrelom humanom TGF-β1.
SEQ ID Nos. 21 i 22 odgovara prekursoru humanog TGF-β2 izoformi 1 i 2, respektivno, uključujući signalni peptid.
SEQ ID No.23 odgovara zrelom humanom TGF-β2.
SEQ ID No.24 odgovara humanom TGF-β3 preproproteinu uključujući signalni peptid.
SEQ ID No.25 odgovara zrelom humanom TGF-β3.
SEQ ID No.26 odgovara humanom FGF-2 preproproteinu, uključujući propeptid.
SEQ ID No.27 odgovara zrelom humanom FGF-2 nakon sekrecije (hFGF2-155).
SEQ ID No.28 odgovara delimičnoj sekvenci zrelog humanog FGF-2.
SEQ ID No. 29 odgovara sintetičkom konstruktu humanog FGF-2 korišćenog u Primeru 1, uključujući Usp45 sekrecioni signal iz Lactococcus lactis, koji obuhvata aminokiseline 1 do 27 proteina, i zreli humani FGF-2, koji odgovara aminokiselinama 136 do 288 od SEQ ID No.26.
SEQ ID No. 30 odgovara varijanti hFGF2-153 humanog FGF-2 korišćenog u Primeru 1 nakon sekrecije iz Lactococcus lactis koji eksprimira pFGF.
SEQ ID No.31 odgovara humanom HGF.
SEQ ID No.32 odgovara humanom HGF alfa lancu.
SEQ ID No.33 odgovara humanom HGF beta lancu.
SEQ ID No.34 odgovara Usp45 sekrecionom signal iz Lactococcus lactis.
SEQ ID No.35 odgovara sekvenci nukleinske kiseline plazmida pNZ8149.
SEQ ID Nos.36 do 43 odgovaraju prajmerima korišćenim u Primerima.
SEQ ID No.44 odgovara sekvenci nukleinske kiseline nisin A promotora Lactococcus lactis.
SEQ ID No. 45 odgovara sekvenci nukleinske kiseline sintetičkog konstrukta ssUsp45-FGF2-153 koji sadrži nisinA promotor, Usp45 signalnu sekvencu i hFGF2-153 gen.
SEQ ID No.46 odgovara sekvenci nukleinske kiseline plazmida pFGF2.
SEQ ID No.47 odgovara sekvenci nukleinske kiseline sintetičkog konstrukta ssUsp45-hIL4 koji sadrži nisinA promotor, Usp45 signalnu sekvencu i hIL4 gen.
SEQ ID No.48 odgovara sekvenci nukleinske kiseline plazmida pIL4.
SEQ ID No. 49 odgovara sekvenci nukleinske kiseline sintetičkog konstrukta ssUsp45-hCSF1 koji sadrži nisinA promotor, Usp45 signalnu sekvencu i hCSF1 gen.
SEQ ID No.50 odgovara sekvenci nukleinske kiseline plazmida pCSF1.
SEQ ID No.51 do SEQ ID No.53 odgovaraju sekvencama nukleinskih kiselina koje obezbeđuju respektivna vezujuća mesta ribozoma uključujući start kodon (ATG) respektivnog otvorenog okvira čitanja korišćenog u Primerima.
SEQ ID No. 54 odgovara sekvenci nukleinske kiseline 3’ kraja 16S ribozomalne RNK (rRNK) Lactococcus lactis.
SEQ ID No. 55 odgovara sekvenci nukleinske kiseline sintetičkog konstrukta CSF-RBS1-FGF-RBS2-IL4 prikazanoj na Slici 24b. SEQ ID No. 56 odgovara sekvenci nukleinske kiseline sintetičkog konstrukta FGFRBS1- IL4-RBS2-CSF prikazanog na Slici 24c. SEQ ID No. 57 odgovara sekvenci nukleinske kiseline sintetičkog konstrukta IL4-RBS1-CSF-RBS2-FGF prikazanog na Slici 24d.
SEQ ID No. 58 odgovara aminokiselinskoj sekvenci preproproteina epidermalnog faktora rasta izoforme 1 iz Homo sapiens. SEQ ID No.59 odgovara aminokiselinskoj sekvenci preproproteina epidermalnog faktora rasta izoforme 2 iz Homo sapiens. SEQ ID No. 60 odgovara aminokiselinskoj sekvenci preproteina epidermalnog faktora rasta izoforme 3 iz Homo sapiens. SEQ ID No. 61 odgovara aminokiselinskoj sekvenci zrelog epidermalnog faktora rasta iz Homo sapiens. SEQ ID No. 62 odgovara aminokiselinskoj sekvenci prekursora heparin-vezujućeg EGF-sličnog faktora rasta iz Homo sapiens. SEQ ID No.63 odgovara aminokiselinskoj sekvenci zrelog heparin-vezujućeg EGF-sličnog faktora rasta iz Homo sapiens.
SEQ ID No. 64 odgovara aminokiselinskoj sekvenci preproteina transformišućeg faktora rasta alfa izoforma 1 iz Homo sapiens. SEQ ID No. 65 odgovara aminokiselinskoj sekvenci preproteina transformišućeg faktora rasta alfa izoforma 2 iz Homo sapiens. SEQ ID No. 66 odgovara aminokiselinskoj sekvenci preproteina transformišućeg faktora rasta alfa izoforma 3 iz Homo sapiens. SEQ ID No.67 odgovara aminokiselinskoj sekvenci preproteina transformišućeg faktora rasta alfa izoforma 4 iz Homo sapiens. SEQ ID No. 68 odgovara aminokiselinskoj sekvenci preproteina transformišućeg faktora rasta alfa izoforma 5 iz Homo sapiens. SEQ ID No.
69 odgovara aminokiselinskoj sekvenci zrelog transformišućeg faktora rasta alfa iz Homo sapiens.
SEQ ID No. 70 odgovara aminokiselinskoj sekvenci amfiregulin preproproteina iz Homo sapiens. SEQ ID No. 71 odgovara aminokiselinskoj sekvenci zrelog amfiregulina iz Homo sapiens.
SEQ ID No.72 odgovara aminokiselinskoj sekvenci epiregulin preproproteina iz Homo sapiens. SEQ ID No.73 odgovara aminokiselinskoj sekvenci zrelog epiregulina iz Homo sapiens.
SEQ ID No. 74 odgovara aminokiselinskoj sekvenci epigen prekursora izoforma 1 iz Homo sapiens. SEQ ID No. 75 odgovara aminokiselinskoj sekvenci epigen prekursora izoforma 2 iz Homo sapiens. SEQ ID No. 76 odgovara aminokiselinskoj sekvenci epigen prekursora izoforma 3 iz Homo sapiens. SEQ ID No. 77 odgovara aminokiselinskoj sekvenci epigen prekursora izoforma 4 iz Homo sapiens. SEQ ID No. 78 odgovara aminokiselinskoj sekvenci epigen prekursora izoforma 5 iz Homo sapiens. SEQ ID No. 79 odgovara aminokiselinskoj sekvenci epigen prekursora izoforma 6 iz Homo sapiens. SEQ ID No. 80 odgovara aminokiselinskoj sekvenci epigen prekursora izoforma 7 iz Homo sapiens. SEQ ID No. 81 odgovara aminokiselinskoj sekvenci zrelog epigena iz Homo sapiens.
SEQ ID No. 82 odgovara aminokiselinskoj sekvenci betacelulin prekursora iz Homo sapiens. SEQ ID No.83 odgovara aminokiselinskoj sekvenci zrelog betacelulina iz Homo sapiens.
[0414] Sledeće Slike i Primeri dati su samo u ilustrativne svrhe. Pronalazak ne treba smatrati ograničenim sledećim primerima:
Slike:
[0415]
Slika 1 prikazuje SDS-PAGE humanog FGF2 referentnog proteina.
Slika 2 prikazuje mapu plazmida ekspresionog vektora pNZ8149. "lacF" je selekcioni marker za rast soja NZ3900 domaćina na laktozi; "Pnis" je nisin A promotor nisin operona Lactococcus lactis; "T" je terminator; "repC" i "repA" su replikacioni geni. Sekvence nukleinske kiseline su takođe prikazane u SEQ ID No.35.
Slika 3 prikazuje sekvence nukleinske kiseline nisinA promotora L. lactis, koji je takođe prikazan u SEQ ID No.44.
Slike 4a, 4b, i 4c prikazuju očitavanja SignalP 4.1 dobijenog sa aminokiselinskom sekvencom prikazanom u SEQ ID No.29, SEQ ID No.13, i SEQ ID No.5, respektivno.
Slike 5a, 5b, i 5c prikazuju sintetisane inserte korišćene u Primeru 1 kao i odgovarajuću aminokiselinsku sekvencu. "FGF2-153" označava humani FGF-2 kodirajući insert. "hIL4" označava humani IL4 kodirajući insert. "hCSF1" označava humani CSF1 kodirajući insert. "PnisA" označava nisinA promotor Lactococcus lactis nisin operona. "ssUsp45" označava signalnu sekvencu usp45 gena Lactococcus lactis. Asterisk označava stop kodon. Respektivne sekvence nukleinskih kiselina su takođe prikazane u SEQ ID No.45, SEQ ID No. 47, i SEQ ID No. 49.
Slike 6a, 6b, i 6c prikazuju rezultate PCR analize kolonije potencijalnih kolonija Lactococcus lactis NZ3900 sa pFGF2, pIL4, i pCSF1, respektivno.
Slikama 7a, 7b, i 7c prikazuju mape plazmida kao i sekvence nukleinske kiseline plazmida pFGF2, pIL4, i pCSF1, respektivno, za ekspresiju i sekreciju hFGF2, hIL4, i hCSF1, respektivno, u Lactococcus lactis. "Pnis" je nisin A promotor nisin operona Lactococcus lactis; "T" je terminator; "repC" i "repA" su replikacioni geni. Sekvence nukleinskih kiselina plazmida pFGF2, pIL4, i pCSF1, su prikazani u SEQ ID No. 46, SEQ ID No. 48, i SEQ ID No. 50, respektivno.
Slika 8 prikazuje Western blot analizu fermentacionih uzoraka Lactococcus koji eksprimiraju NZ3900(pFGF2) pod različitim indukcionim uslovima. "0.5/5" označava indukciju na OD 600 = 0.5 sa 5 ng/mL nisina; "3/5" označava indukciju na OD 600 = 3 sa 5 ng/mL nisina, "T" označava vremensku tačku, u kojoj je uzorak uzet iz fermentacije.
Slika 9 prikazuje SDS-PAGE analizu uzoraka supernatanta (Sup) iz kontrolisanih fermentacija nakon Coomassie (Coom) bojenja i Western blot (WB) analizu fermentacionih uzoraka Lactococcus koji eksprimiraju NZ3900(pIL4). 0.5/5" označava indukciju na OD 600 = 0.5 sa 5 ng/mL nisina; "3/5" označava indukciju na OD 600 = 3 sa 5 ng/mL nisina, "T" označava vremensku tačku, u kojoj je uzorak uzet iz fermentacije.
Slika 10 prikazuje SDS-PAGE analizu uzoraka supernatanta (Sup) iz kontrolisanih fermentacija nakon Coomassie (Coom) bojenja fermentacionih uzoraka Lactococcus koji eksprimira NZ3900(pCSF1). 0.5/5" označava indukciju na OD 600 = 0.5 sa 5 ng/mL nisina; "3/5" označava indukciju na OD 600 = 3 sa 5 ng/mL nisina, "T" označava vremensku tačku, u kojoj je uzorak uzet iz fermentacije.
Slika 11 prikazuje Western blot (WB) analizu fermentacionih uzoraka Lactococcus koji eksprimira NZ3900(pCSF1). 0.5/5" označava indukciju na OD 600 = 0.5 sa 5 ng/mL nisina; "3/5" označava indukciju na OD 600 = 3 sa 5 ng/mL nisina, "T" označava vremensku tačku, u kojoj je uzorak uzet iz fermentacije.
Slika 12 prikazuje rast acidifikujućih kultura za eksperiment indukcije pod uslovima koji oponašaju okolnosti kod zarastanja rane.
Slika 13 prikazuje SDS-PAGE i Western blot analizu hFGF2 proizvodnje u supernatantu nakon indukcije na pH 5 ili na OD 600 = 3.
Slika 14a prikazuje rezultat analize migracije humanih fibroblasta opisane u Primeru 4a nakon 72 č izlaganja sa rekombinantnim probiotskim bakterijama koje eksprimiraju hFGF2 ili komercijalno dostupnim proizvodom Fiblast.
Slika 14b prikazuje rezultat analize migracije humanih fibroblasta opisane u Primeru 4a nakon 72 č izlaganja sa rekombinantnim probiotskim bakterijama koje eksprimiraju hIL4 ili rekombinantni humani IL4.
Slika 14c prikazuje rezultat indukcije ERK 1+2 fosforilacije u NHDF ćelijama sa AUP-10 medijumom kulture koji sadrži 0.4-80 ng/ml FGF2 i sa rhFGF2.
Slika 14d prikazuje rezultat indukcije ERK 1+2 fosforilacije u M-NFS-60 ćelijama sa AUP-14 medijumom kulture koji sadrži 0.2-40 ng/ml CSF1 i sa rhCSF1.
Slika 14e prikazuje inhibiciju LPS-indukovane proizvodnje TNFalfa iRNK u humanim THP-1 ćelijama opisanim u Primeru 4c.
Slika 14f prikazuje indukciju RNK ekspresije M2 gena za receptor 1 manoze makrofaga (Mrc1) i Kruppel-slični faktor 4 (KLF4) u THP1-izvedenim makrofagima kao što je opisano u Primeru 4d.
Slika 14g prikazuje STAT-6 transkripcionu aktivnost AUP-12 i rhlL-4 in humane glijalne hibridne ćelijske linije MO3.13 kao što je opisano u Primeru 4e.
Slika 14h prikazuje STAT-6 transkripcionu aktivnost AUP-12 i rhlL-4 in ćelija humanog embrionalnog bubrega 293T kao što je opisano u Primeru 4e.
Slika 15a prikazuje rezultate eksperimenata sa zarastanjem rane opisanim u Primeru 5.
Slika 15b prikazuje poređenje statusa zarastanja rane kod kontrole, pozitivne kontrole i AUP-16 tretiranog tkiva nakon naznačenih vremenskih tačaka opisanih u Primeru 5.
Slika 15c prikazuje poređenje preostale oblasti rane nakon dana 8 i dana 12 pozitivne kontrole (grupa tretmana 17) i AUP-16 tretiranog tkiva (grupa tretmana 18) opisano u Primeru 5.
Slika 16a prikazuje aminokiselinsku sekvencu prekursora izoforme a faktora 1 stimulisanja kolonije makrofaga iz Homo sapiens. Slika 16b prikazuje aminokiselinsku sekvencu prekursora izoforme b faktora 1 stimulisanja kolonije makrofaga iz Homo sapiens. Slika 16c prikazuje aminokiselinsku sekvencu prekursora izoforme c faktora 1 stimulisanja kolonije makrofaga iz Homo sapiens. Slika 16d prikazuje aminokiselinsku sekvencu zrelog humanog faktora 1 stimulisanja kolonije makrofaga.
Slika 17a prikazuje aminokiselinsku sekvencu prekursora izoforme 1 interleukina-34 iz Homo sapiens. Slika 17b prikazuje aminokiselinsku sekvencu prekursora izoforme 2 interleukina-34 iz Homo sapiens. Slika 17c prikazuje aminokiselinsku sekvencu interleukina-34 iz Homo sapiens.
Slika 18a prikazuje aminokiselinsku sekvencu prekursora izoforme 1 interleukina-4 iz Homo sapiens. Slika 18b aminokiselinsku sekvencu prekursora izoforme 2 interleukina-4 iz Homo sapiens. Slika 18c aminokiselinsku sekvencu interleukina-4 iz Homo sapiens.
Slika 19a aminokiselinsku sekvencu prekursora izoforme 1 interleukina-10 iz Homo sapiens. Slika 19b prikazuje aminokiselinsku sekvencu interleukina-10 iz Homo sapiens.
Slika 20a prikazuje aminokiselinsku sekvencu prekursora interleukina-13 iz Homo sapiens. Slika 20b prikazuje aminokiselinsku sekvencu interleukina-13 iz Homo sapiens.
Slika 21a prikazuje aminokiselinsku sekvencu prekursora transformišućeg faktora rasta beta-1 iz Homo sapiens. Slika 21b prikazuje aminokiselinsku sekvencu transformišućeg faktora rasta beta-1 iz Homo sapiens. Slika 21c prikazuje aminokiselinsku sekvencu prekursora transformišućeg faktora rasta beta-2 izoforme 1 iz Homo sapiens. Slika 21d prikazuje aminokiselinsku sekvencu prekursora transformišućeg faktora rasta beta-2 izoforme 2 iz Homo sapiens. Slika 21e prikazuje aminokiselinsku sekvencu prekursora transformišućeg faktora rasta beta-2 iz Homo sapiens. Slika 21f prikazuje aminokiselinsku sekvencu preproteina transformišućeg faktora rasta beta-2 izoforme-3 iz Homo sapiens. Slika 21g prikazuje aminokiselinsku sekvencu transformišućeg faktora rasta beta-3 iz Homo sapiens.
Slika 22a prikazuje aminokiselinsku sekvencu prekursora faktor rasta 2 fibroblasta iz Homo sapiens. Slika 22b prikazuje aminokiselinsku sekvencu fragmenta prekursora faktor rasta 2 fibroblasta iz Homo sapiens.
Slika 23a: Aminokiselinska sekvenca faktora rasta hepatocita iz Homo sapiens. Slika 23b: Aminokiselinska sekvenca alfa lanca faktora rasta hepatocita iz Homo sapiens. Slika 23c: Aminokiselinska sekvenca beta lanca faktora rasta hepatocita iz Homo sapiens.
Slika 24a prikazuje pregled tri vezujuća mesta ribozoma korišćena u Primeru 2d. Respektivne sekvence sintetisanih DNK sekvenci CSF-RBS1-FGF-RBS2-IL4, FGF-RBS1-IL4-RBS2-CSF, i IL4-RBS-CSFRBS2-FGF korišćen u Primeru 2d su prikazane na Slikama 24b do 24d, respektivno, kao i u SEQ ID No.55, SEQ ID No.56, i SEQ ID No.57, respektivno. Slike 24e do 24g prikazuju respektivne SDS-PAGE gelove kao i Western blotove dobijene sa pojedinačnim operon konstruktima korišćenim u Primeru 2d).
Slika 25a prikazuje aminokiselinsku sekvencu preproproteina epidermalnog faktora rasta izoforme 1 iz Homo sapiens. Slika 25b prikazuje aminokiselinsku sekvencu preproproteina epidermalnog faktora rasta izoforme 2 iz Homo sapiens. Slika 25c prikazuje aminokiselinsku sekvencu preproproteina epidermalnog faktora rasta izoforme 3 iz Homo sapiens. Slika 25d prikazuje aminokiselinsku sekvencu zrelog epidermalnog faktora rasta iz Homo sapiens.
Slika 26a prikazuje aminokiselinsku sekvencu prekursora heparin-vezujućeg EGF-sličnog faktora rasta iz Homo sapiens. Slika 26b prikazuje aminokiselinsku sekvencu zrelog heparinvezujućeg EGF-sličnog faktor rasta iz Homo sapiens.
Slika 27a prikazuje aminokiselinsku sekvencu preproteina transformišućeg faktora rasta alfa izoforma 1 iz Homo sapiens. Slika 27b aminokiselinsku sekvencu preproteina transformišućeg faktora rasta alfa izoforma 2 iz Homo sapiens. Slika 27c aminokiselinsku sekvencu preproteina transformišućeg faktora rasta alfa izoforma 3 iz Homo sapiens. Slika 27d aminokiselinsku sekvencu preproteina transformišućeg faktora rasta alfa izoforma 4 iz Homo sapiens. Slika 27e aminokiselinsku sekvencu preproteina transformišućeg faktora rasta alfa izoforma 5 iz Homo sapiens. Slika 27f prikazuje aminokiselinsku sekvencu zrelog transformišućeg faktora rasta alfa iz Homo sapiens.
Slika 28a prikazuje aminokiselinsku sekvencu preproteina amfiregulina iz Homo sapiens. Slika 28b prikazuje aminokiselinsku sekvencu zrelog amfiregulina iz Homo sapiens.
Slika 29a prikazuje aminokiselinsku sekvencu preproteina epiregulina iz Homo sapiens. Slika 29b prikazuje aminokiselinsku sekvencu zrelog epiregulina iz Homo sapiens.
Slika 30a prikazuje aminokiselinsku sekvencu prekursora humanog epigena izoforma 1 iz Homo sapiens. Slika 30b prikazuje aminokiselinsku sekvencu prekursora humanog epigena izoforma 2 iz Homo sapiens. Slika 30c prikazuje aminokiselinsku sekvencu prekursora humanog epigena izoforma 3 iz Homo sapiens. Slika 30d prikazuje aminokiselinsku sekvencu prekursora humanog epigena izoforma 4 iz Homo sapiens. Slika 30e prikazuje aminokiselinsku sekvencu prekursora humanog epigena izoforma 5 iz Homo sapiens. Slika 30f prikazuje aminokiselinsku sekvencu prekursora humanog epigena izoforma 6 iz Homo sapiens. Slika 30g prikazuje aminokiselinsku sekvencu prekursora humanog epigena izoforma 7 iz Homo sapiens. Slika 30h prikazuje aminokiselinsku sekvencu zrelog epigena iz Homo sapiens.
Slika 31a prikazuje aminokiselinsku sekvencu prekursora betacelulina iz Homo sapiens. Slika 31b prikazuje aminokiselinsku sekvencu zrelog betacelulina iz Homo sapiens.
Slika 32a prikazuje aminokiselinsku sekvencu zrelog fibroblast faktora rasta 2 iz Homo sapiens. Slika 32b prikazuje aminokiselinsku sekvencu faktor rasta 2 fibroblasta varijanta hFGF2-153 korišćena u Primerima.
Slika 33 prikazuje aminokiselinsku sekvencu (hIL-4) varijante humanog interleukina 4 korišćene u Primerima.
Slika 34 prikazuje aminokiselinsku sekvencu (hCSF-1) varijante humanog faktora 1 stimulisanja kolonije korišćenog u Primerima.
Slika 35 prikazuje aminokiselinsku sekvencu sekrecionog signala Lactococcus proteina Usp45 korišćenog u Primerima.
Primeri:
1. Opšte eksperimentalne procedure:
[0416] Ukoliko nije naznačeno drugačije, Primeri su izvedeni praćenjem protokola proizvođača analitičkih sistema. Ukoliko nije naznačeno drugačije, naznačene hemikalije su komercijalno dobijene od Sigma-Aldrich Chemie Gmbh (Munich, DE), Merck KGaA (Darmstadt, DE), Thermo Fisher Scientific Inc.(Waltham, MA, USA) ili Becton, Dickinson i Company (Franklin Lakes, NJ, USA).
1.1 Medijum za rast
[0417] Za različite svrhe ćelije su rasle u različitim medijumima. Za opšte procedure kloniranja korišćen je M17 medijum (Oxoid Deutschland GmbH, Wesel, DE) koji sadrži 0.5% glukozu ili laktozu.
[0418] Da bi se pratila selekcija gradusa hrane korišćen je Elliker medijum, koji laktokokne kolonije boje žuto kada rastu na laktozi. Žuto bojenje je pH efekat koji menja boju indikatorne boje bromokrezol ljubičaste u blizini rastuće kolonije i same kolonije.
[0419] Recept za Elliker medijum je kao što sledi:
Sterilizacija: 15 min na 121 °C
[0420] Nakon sterilizacije i hlađenja 1% dodata je laktoza iz 20% zagrejanog- ili filtersterilisanog stoka i 0.004% bromokrezol ljubičaste (0.4% stok rastvor, filter sterilizovano).
[0421] Za fermentacije i druge eksperimente funkcionalnog rasta korišćen je IM1 medijum, koji nema sastojke izvedene iz životinja. Laktoza, jedini preostali sastojak životinjskog porekla, može se dobiti u farmaceutskom kvalitetu.
[0422] Recept za IM1 medijum je kao što sledi:
Sterilizacija: 110 °C 15 min
[0423] Tokom fermentacije nije dodavan pufer jer je pH automatski regulisana korišćenjem 2.5 M NaOH. Za acidifikovanje kultivacija u epruvetama medijumu je dodat 2% Na-betaglicerofosfat.
[0424] Ovaj pufer neutralizuje proizvedeni laktat i omogućava kulturi da dostigne gustinu ćelija od OD600 = 4 - 5.
[0425] Stokovi finalnih konstrukata NZ3900(pFGF2), NZ3900(pIL4), i NZ3900(pCSF1) su pripremljeni nakon rasta u IM1 medijumu sa laktozom i Na-beta-glicerofosfatom dodavanjem glicerola do finalne koncentracije od 20%. Stokovi su uskladišteni na -80°C.
1.2 Indukcija proizvodnje proteina korišćenjem NICE sistema
[0426] NICE sistem je indukovan korišćenjem koncentracija nisina između 0.1 - 10 ng/ml nisina. Nisin iz Lactococcus lactis je dobijen od Sigma (broj proizvoda N5764).
1.3 Tehnike molekularnog kloniranja
[0427] Za molekularno kloniranje korišćene su standardne tehnike kao što su, na primer, opisane u Green and Sambrook (2012): "Molecular cloning: a laboratory manual", fourth edition, Cold Spring Harbour Laboratory Press (Cold Spring Harbor, NY, USA).
[0428] Sekvenciranje nukleotida, sinteza gena i sinteza prajmera je predata na rad u BaseClear (Leiden, NL).
1.4 Fermentacija
[0429] Fermentacije su izvedene u 0.5-L Multifors 6-fermentor nizu (Infors Benelux, Velp, NL). Inokulacija je izvedena sa 1% pre-kulturom u IM-1 medijumu; brzina mešalice bila je 200 rpm i temperatura inkubacije bila je 30 °C. Tokom izvođenja pH je kontrolisana korišćenjem 2.5 M NaOH. pH, temperatura i dodavanje NaOH su stalno praćeni.
[0430] Indukcija sa nisinom je izvedena u različitim vremenskim tačkama ciklusa rasta sa različitim količinama nisina kao što je naznačeno u odeljku rezultata. Uzorci su uzeti takođe kao što je naznačeno u odeljku rezultata.
1.5 Cinac fermentacije
[0431] Za praćenje acidifikacije kultura korišćena je Cinac pH monitoring jedinica (AMS France, Frepillion, FR) za kontinuirano merenje pH promena. Da bi se osigurala homogena pH kulture su mešane sa magnetnom mešalicom na 200 rpm.
1.6 Tretman uzoraka
[0432] Za SDS-PAGE i Western bloting, uzorci su obrađeni da bi proizveli tri frakcije: (i) supernatant frakciju, (ii) ukupni ćelijski ekstrakt (koji sadrži ekstrakt bez ćelija, fragmente ćelijskog zida i drugi čestični materijal) i (iii) ekstrakt bez ćelija.
[0433] Supernatant frakcija je pripremljena mešanjem 1 mL fermentacionog supernatanta sa 150 µL TCA i inkubiranjem na 4 °C najmanje 1 č. Talog je sakupljen centrifugiranjem na 20,000 x g. Pelet je ili korišćen direktno ili uskladišten na - 20°C; nakon dodatnog koraka centrifugiranja da bi se uklonili tragovi TCA resuspendovan je u 15 µL L 5 mM Tris-HCI pH 7.5.
[0434] Nakon toga, dodato je 5 µL 4x pufera za uzorak (koji sadrži 75mM DTT) i suspenzija je zagrevana 20 min na 70 °C. U svim slučajevima, zapremine od 20 µL su primenjene na gel.
[0435] Ukupni ćelijski ekstrakti su pripremljeni kao što sledi: pelet od 10 mL uzorka kulture iz serije ili 1 ml fermentacione kulture je rastvoren u 1 mL 5 mM Tris-HCI pH7.5 i prenet u epruvetu sa kuglicama sa 500 mg cirkonijum kuglica i zamrznut na - 20 °C do dodatne obrade. Nakon odmrzavanja, ova suspenzija je šejkirana sa FastPrep (MP Biomedicals LLP, Santa Ana, CA, USA) bead-beater 4 x 30 drugjet speed 4 sa intermitentnim hlađenjem 1 min na ledu. Nakon smirivanja kuglica od 1 min 15 mL supernatanta je pomešano sa 5 µL pufera za punjenje i tretirano kao što je prethodno pomenuto.
[0436] Ekstrakt bez ćelija je pripremljen centrifugiranjem ukupnog ćelijskog ekstrakta 1 min na 20,000 x g. Dodatna priprema za SDS-PAGE je izvedena kao što je prethodno opisano.
1.7 Elektroforeza na natrijum dodecil sulfat poliakrilamidnom gelu elektroforeza (SDS-PAGE)
[0437] SDS-PAGE je izvedena sa komercijalno dostupnim NuPage system (Life Technologies GmbH, Darmstadt, DE) prateći protokol proizvođača.
[0438] Humani FGF2 referentni protein je dobijen od Sigma Aldrich.50 µg je rastvoreno u 25 µl 5 mM Tris pH 7.5 da bi se dobila finalna koncentracija od 2 µg/ µl. U test seriji 5 i 10 µg je primenjeno na SDS-PAGE gel nakon mešanja sa 4 x koncentrovanim puferom za punjenje što je rezultovalo u 1 x koncentraciji pufera za punjenje.
[0439] Kao što je prikazano na Slici 1, gel pokazuje monomere, malu količinu dimera i veoma malu količinu trimera hFGF2. Staze 1 i 4 = SeeBlue marker; staza = 2 5 µg FGF2 i staza 3 = 10 µg hFGF2. Ovaj gel je pušten bez dodavanja DTT puferu za punjenje i puferu za gel.
[0440] Humani IL4 referentni protein je dobijen od R&D systems (Minneapolis, MN, USA). Humani IL4 je rastvoren u PBS (5.8 mM Na2HPO4, 4.2 mM NaH2PO4, 145 mM NaCl) da bi se dobila finalna koncentracija od 100 µg/mL. Kao referenca primenjeno je 1 µg po stazi za Coomassie bojenje i 0.1 µg bojenje srebrom i Western blotove.
[0441] Humani CSF1 referentni protein je dobijen od Abcam PLC (Cambridge, GB). Humani CSF1 je rastvoren u sterilnoj vodi da bi se dobila finalna koncentracija od 100 µg/mL. Kao referenca 1 µg je primenjeno po stazi za Coomassie bojenje i 0.1 µg za bojenje srebrom i Western blotove.
1.8 Western blotovi
[0442] Bloting proteina je takođe izveden korišćenjem NuPage system (XCell Blot Module) prema protokolu LifeTechnologies. Bloting membrane bile su prethodno isečene nitrocelulozne membrane od Thermo Fisher Scientific Inc.. Transfer pufer bio je NuPage Transfer buffer (20x) od Life Technologies. Transfer proteina je izveden na 35 V 1 č.
[0443] Za detekciju humanog FGF2 prečišćeno mišje anti-humano FGF2 monoklonsko antitelo (BD Transduction laboratories, Heidelberg, DE) korišćeno je u razblaženju od 1:250. Drugo antitelo bilo je anti-mišje IgG antitelo vezano sa peroksidazom rena (HRP) sa razblaženjem od 1:10,000 dobijeno do Bioké B.V. (Leiden, NL).
[0444] Za detekciju humanog IL4 korišćeno je monoklonsko mišje anti-humano IL4 IgG1 od R&D systems (clone #3007) u razblaženju od 1:500. Drugo antitelo bilo je HRP-vezano antimišje IgG antitelo sa razblaženjem od 1:10,000 dobijeno od Bioké B.V. (Leiden, NL).
[0445] Za detekciju humanog CSF1 korišćeno je poliklonsko zečije antitelo na humani MCSF od Abcam PLC (clone ab9693) u razblaženju od 1:2,000. Drugo antitelo bilo je HRP-vezano antizečje IgG antitelo u razblaženju od 1:2,000 dobijeno od Bioké B.V. (Leiden, NL).
[0446] Western blotovi su razvijeni sa SuperSignal West Pico Chemiluminescent supstratom dobijenim od Thermo Fisher Scientific Inc..
1.9 Sekvenciranje N-terminalnih aminokiselina
[0447] Za sekvenciranje N-terminalnih aminokiselina hFGF2, hIL4, i hCSF1 iz supernatanta kontrolisanih fermentacionih kultura trake iz dve staze Coomassie obojenog SDS-PAGE su isečene i poslate u Eurosequence (Groningen, NL).
Primer 1: Stvaranje ekspresionih plazmida
1.1 Sekvenciranje plazmida pNZ8149
[0448] Plazmid pNZ8149 je korišćen kao vektor za ekspresiju humanog fibroblast faktora rasta 2 (hFGF2), humanog interleukina 4 (hIL4), i humanog faktora 1 stimulisanja kolonije 1 (hCSF1) kod L. lactis. Plazmid pNZ8149 je selektovan iz ćelija domaćina preko mehanizma sa gradusom hrane na osnovu rasta na laktozi.
[0449] U svrhu reference plazmidna DNK je izolovana i sekvencirana (za prajmere videti Tabelu 1). Nisu pronađene razlike u odnosu na trenutno dostupnu sekvencu. Sekvenca pNZ8149 je obezbeđena u SEQ ID No.35.
1.1.1 Humani fibroblast faktor rasta 2 (hFGF-2)
[0450] Zreli oblik hFGF-2 sadrži 155 aminokiselina i u nastavku je označen kao hFGF2-155. Ima molekulsku masu od 17,3 kDa i pI od 9,85. Molekul sadrži 4 cisteinska ostatka.
[0451] Varijanti hFGF-2 koja se koristi za kloniranje i ekspresiju u L. lactis nedostaju prve dve aminokiseline metionin i alanin i na taj način sadrži 153 aminokiseline. Stoga je ova varijanta u daljem tekstu označena kao hFGF2-153. hFGF2-153 ima molekulsku masu od 17,1 kDa i pI od 9,85. Ova varijanta takođe sadrži četiri cisteinska ostatka.
[0452] Odgovarajuća aminokiselinska sekvenca humanog FGF2-155 prikazana je u nastavku, na Slici 32a i u SEQ ID br.27:
[0453] Podvučene aminokiseline označavaju prve dve aminokiseline metionin i alanin koje nedostaju u varijanti hFGF2-153.
Aminokiselinska sekvenca varijante hFGF2-153 prikazana je na slici 32b i u SEQ ID br.30.
[0454] Sekvenca FGF2-155 je sekvenca zrelog humanog FGF2 nakon sekrecije. In vivo, ova sekvenca se dalje obrađuje. Međutim, različiti postojeći rekombinantni proizvodi koristili su ovu sekvencu od 155 aminokiselina sa ili bez N-terminalnog ostatka metionina.
1.1.2 Humani interleukin 4 (hIL-4)
[0455] Zreli protein hIL-4 sadrži 129 aminokiselina, što odgovara aminokiselinama 25 do 153 aminokiselinske sekvence dostupne pod NCBI pristupnim brojem NP_000580.1. Zreli protein ima molekulsku masu od 14,96 kDa, a pI 9,36. Molekul sadrži 6 cisteinskih ostataka.
[0456] Aminokiselinska sekvenca zrelog humanog IL-4 je prikazana u nastavku, na Slici 18c, i u SEQ ID No.12:
[0457] Varijanta hIL-4 koja se koristi za kloniranje i ekspresiju u L. lactis sadrži dodatni alaninski ostatak na N-kraju zrelog proteina i stoga sadrži 130 aminokiselina.
Ima molekulsku masu od 15,03 kDa i pI od 9,36. Ova varijanta takođe sadrži 6 cisteinskih ostataka.
[0458] Odgovarajuća aminokiselinska sekvenca humane hIL-4 varijante koja je korišćena za kloniranje i ekspresiju je prikazana u nastavku, na Slici 33 i u SEQ ID No.14:
[0459] Dodatni ostatak alanina na N-terminusu je podvučen u gornjoj aminokiselinskoj sekvenci.
1.1.3 Faktor 1 stimulacije humane kolonije (hCSF1)
[0460] Aminokiselinska sekvenca korišćena za ekspresiju je izvedena iz aminokiselinske sekvence od 554 aminokiselina prekursora humanog CSF1 dostupne pod NCBI pristupnim brojem NP_000748.3. Sekvenca koristi start kodone na aminokiselini 33 (E), koja je prva aminokiselina zrelog hCSF1, i završetke na aminokiselini 181 (Q).
[0461] Pored toga, dodato je još 9 aminokiselina na C-terminus koje u nativnom proteinu zauzimaju položaje 480 - 488 (GHERQSEGS).
Da bi se poboljšalo uklanjanje signalnog peptida signalnom peptidazom dodat je alaninski ostatak na N-kraju. Dobijena sekvenca aminokiselina je prikazana u nastavku, na slici 34, i u SEQ ID br.6:
[0462] Dodatni ostatak alanina na N-kraju je podvučen u gornjoj sekvenci aminokiselina. Dodatnih 9 aminokiselina dodatih na C-kraju su prikazane podebljano. Protein kodiran ovom sekvencom sadrži 159 aminokiselina, ima molekulsku masu od 18,5 kDa i pI 4,72. Protein sadrži 7 cisteinskih ostataka.
1.2 Konstrukcija plazmida za ekspresiju hFGF2, hIL4 i hCSF1 u Lactococcus lactis
[0463] Za L. lactis, cilj je bio da se eksprimiraju i izluče hFGF2, hIL4 i hCSF1, na primer, u supernatant medijuma za rast. Za to su korišćeni signali za transkripciju, translaciju i sekreciju proteina. Signali za transkripciju i translaciju bili su prisutni u NICE sistemu ekspresije L. lactis i potiču od nisinA promotora L. lactis. NisinA promotor L. lactis je prikazan na slici 3 i SEK ID br. 44 i opisan je, na primer, u de Ruiter et al. ( 1996).
[0464] Slika 3 dalje prikazuje -10 element i -35 element promotora kao i mesto vezivanja ribozoma (RBS). ATG start kodon odgovarajućeg ciljnog proteina direktno sledi dva cisteinska ostatka na 3'-kraju sekvence.
[0465] Sekrecioni signal je izveden iz proteina Lactococcus Usp45, koji je opisan, na primer, u Van Asseldonk et al. (1993) i van Asseldonk et al. (1990).
[0466] Sekrecioni signalni Lactococcus protein Usp45 je prikazan u nastavku, na Slici 35, i u SEQ ID No.34:
MKKKIISAIL MSTVILSAAA PLSGVYA
[0467] U ćeliji postoji mehanizam koji obezbeđuje da se nakon izlučivanja proteina ova signalna sekvenca odvoji od ciljnog proteina.
Ovu reakciju katalizuje signalna peptidaza koja ima specifičnu preferencu za određene aminokiseline u položajima oko mesta cepanja.
[0468] Da bi se optimizovalo mesto cepanja korišćen je veb program SignalP 4.1 (http://vvv.cbs.dtu.dk/services/SignaIP/).
[0469] Za aminokiselinsku sekvencu hFGF2 ovaj program je pokazao da optimalno cepanje nastaje kada se uklone prve dve aminokiseline hFGF2-155, a hFGF2-155 protein započne sa Ala ostatkom i ukupnom dužinom od 153 aminokiseline (Varijanta hFGF2- 153).
[0470] Odgovarajuća aminokiselinska sekvenca proteina prekursora hFGF2-153 koja se koristi za analizu sa programom SignalP 4.1 prikazana je ispod i u SEQ ID br.29:
[0471] Podvučene aminokiseline označavaju sekrecioni signal Lactococcus proteina Usp45.
[0472] Za aminokiselinsku sekvencu hIL4 ovaj program je pokazao da se optimalno cepanje događa kada se ostatak alanina doda u N-kraj zrelog proteina IL4, što rezultuje proteinom od 130 aminokiselina.
[0473] Odgovarajuća sekvenca aminokiselina proteina prekursora hIL4 korišćena za analizu sa programom SignalP 4.1 prikazana je dole i u SEQ ID br.13:
[0474] Podvučene aminokiseline označavaju sekrecioni signal Lactococcus proteina Usp45.
[0475] Za aminokiselinsku sekvencu hCSF1, ovaj program je pokazao da optimalno cepanje nastaje kada se ostatak alanina doda u N-kraj zrelog hCSF1 proteina što rezultuje u proteinu od 159 aminokiselina.
[0476] Odgovarajuća aminokiselinska sekvenca proteina prekursora hCSF1 korišćena za analizu sa programom SignalP 4.1 prikazana je u nastavku i u SEQ ID br.5:
[0477] Podvučene aminokiseline označavaju sekrecioni signal Lactococcus proteina Usp45.
[0478] Slika 4a prikazuje očitavanja iz SignalP 4.1 dobijena sa aminokiselinskom sekvencom prikazanom u SEQ ID No. 29, u kojoj je sekretorni signal Usp45 proteina fuzionisan sa N-terminusom hFGF2-153. Očitavanje prikazuje jasno mesto isecanja između aminokiselina 27 i 28 hFGF2-153 prekursora i skorove za ovo mesto isecanja.
[0479] Slika 4b prikazuje očitavanja iz SignalP 4.1 dobijena sa aminokiselinskom sekvencom prikazanom u SEQ ID No. 13 u kojoj je sekretorni signal Usp45 proteina fuzionisan sa N-terminusom hIL4. Očitavanje prikazuje jasno mesto isecanja između aminokiselina 27 i 28 hIL4 prekursora i skorove za ovo mesto isecanja.
[0480] Slika 4c prikazuje očitavanja iz SignalP 4.1 dobijena sa aminokiselinskom sekvencom prikazanom u SEQ ID No. 5, u kojoj je sekretorni signal Usp45 proteina fuzionisan sa N-terminusom hCSF1. Očitavanje prikazuje jasno mesto isecanja između aminokiselina 27 i 28 hCSF1 prekursora i skorove za ovo mesto isecanja.
[0481] Upotrebe kodona za respektivne gene, koji kodiraju hFGF2-153, hIL4, i hCSF1 prilagođene su generalnoj upotrebi kodona L. lactis. Ovo je rutinska procedura dobavljača za sintezu gena.
[0482] Dodatno, ista Usp45 signalna sekvenca je korišćena za sva tri proteina. Stoga, ekspresija sva tri proteina i post-translaciona obrada signalnog peptida u istoj bakterijskoj ćeliji je poboljšana.
[0483] Za hFGF2 sintetisan je fragment koji sadrži nisinA promotor, Usp45 signalnu sekvencu i hFGF2-153 gen.
Nukleinska sekvenca veštačkog konstrukta ssUsp45-FGF2-153 prikazana je u SEQ ID No. 45 i na Slici 5a.
Upotreba kodona optimizovana je za opštu upotrebu kodona L. lactis.
[0484] Slika 5a prikazuje sintetisani insert kao i odgovarajuću aminokiselinsku sekvencu dobijenu nakon transkripcije i translacije. FGF2-153 označava humani FGF-2 kodirajući insert. PnisA označava nisinA promotor Lactococcus lactis nisin operona. ssUsp45 označava signalnu sekvencu usp45 gena Lactococcus lactis. Asterisk označava stop kodon. Dodatno, u sekvenci nukleinske kiseline, restrikciona mesta prepoznavanja endonukleaza BamHI (položaji 1 do 6) i Xbal (položaj 751 do 756) su označeni podvlačenjem.
[0485] Za hIL4 sintetisan je fragment koji je sadržao nisinA promotor, Usp45 signalnu sekvencu i hIL4 gen. Nukleinska sekvenca veštačkog konstrukta ssUsp45-hIL4 prikazana je na SEQ ID No. 47 i Slici 5b. Upotreba kodona optimizovana je za opštu upotrebu kodona L. lactis.
[0486] Slika 5b prikazuje sintetisani insert kao i odgovarajuću aminokiselinsku sekvencu dobijenu nakon transkripcije i translacije. hIL4 označava humani IL4 kodirajući insert. PnisA označava nisinA promotor Lactococcus lactis nisin operona. ssUsp45 označava signalnu sekvencu usp45 gena Lactococcus lactis. Asterisk označava stop kodon. Dodatno, u sekvenci nukleinske kiseline, restrikciona mesta prepoznavanja endonukleaza BamHI (položaji 1 do 6) i Xbal (položaj 682 do 687) su označeni podvlačenjem.
[0487] Za hCSF1 sintetisan je fragment koji je sadržao nisinA promotor, Usp45 signalnu sekvencu i hCSF1 gen. Nukleinska sekvenca veštačkog konstrukta ssUsp45- hCSF2 prikazana je na SEQ ID No. 49 i Slici 5c. Upotreba kodona optimizovana je za opštu upotrebu kodona L. lactis.
[0488] Slika 5c prikazuje sintetisani insert kao i odgovarajuću aminokiselinsku sekvencu dobijenu nakon transkripcije i translacije. hCSF1 označava humani CSF1 kodirajući insert. PnisA označava nisinA promotor Lactococcus lactis nisin operona. ssUsp45 označava signalnu sekvencu usp45 gena Lactococcus lactis. Asterisk označava stop kodon. Dodatno, u sekvenci nukleinske kiseline, restrikciona mesta prepoznavanja endonukleaza BamHI (položaji 1 do 6) i Xbal (položaj 769 do 774) su označeni podvlačenjem.
[0489] Završni proizvodi genske sinteze su dobijeni od BaseClear svaki kao fragment kloniran u E. coli vektoru pUC57.
[0490] Fragmenti su klonirani u plazmid pNZ8149 digestijom pUC57 plazmida sa respektivnim proizvodima genske sinteze sa restrikcionim enzimima BamHI i Xbal. BamHI i Xbal fragmenti koji sadrže respektivne proizvode genske sinteze su izolovani i vezani u Psul i Xbal isečeni plazmid pNZ8149 da bi rezultovalo u respektivnim plazmidima pFGF2, pIL4, i pCSF1. Respektivne restrikcione endonukleaze su dobijene od Thermo Fisher Scientific Inc..
[0491] Respektivni ligacioni miks je transformisan u soj L. lactis NZ3900. Verifikacija plazmida je izvedena sa PCR analizom kolonije. Respektivne sekvence nukleinskih kiselina prajmera koji su korišćeni su prikazane u Tabeli 1 u nastavku. Rezultati su prikazani na Slikama 6a do 6c.
[0492] Slika 6a prikazuje rezultat PCR analize kolonije potencijalnih kolonija L. lactis soja NZ3900 sa pFGF2. Staza 1: lambda DNK digestovana sa Hindlll; staza 2: pNZ8149 (prazan vektor) amplifikovan sa prajmerima nis2 i seqlacF (očekivana veličina fragmenta 391 bp); staze 3 i 4 izolovane kolonije amplifikovane sa prajmerima nis2 i seqlacF (očekivana veličina fragmenta 907 bp).
[0493] Slika 6b prikazuje rezultat PCR analize kolonije potencijalnih kolonija L. lactis soja NZ3900 sa pIL4. Staza 1: lambda DNK digestovana sa Hindlll; staza 2: pNZ8149 (prazan vektor) amplifikovan sa prajmerima nis2 i seqlacF (očekivana veličina fragmenta 391 bp); staze 11 i 12 izolovane kolonije amplifikovane sa prajmerima nis2 i seqlacF (očekivana veličina fragmenta 838 bp).
[0494] Slika 6c prikazuje rezultat PCR analize kolonije potencijalnih kolonija L. lactis soja NZ3900 sa pCSF1. Staza 1: lambda DNK digestovana sa Hindlll; staza 2: pNZ8149 (prazan vektor) amplifikovan sa prajmerima nis2 i seqlacF (očekivana veličina fragmenta 391 bp); staza 3: izolovana kolonija amplifikovana sa prajmerima nis2 i seqlacF (očekivana veličina fragmenta 925 bp).
[0495] Slika 7a prikazuje mapu plazmida i sekvenci nukleinske kiseline plazmida pFGF2 za ekspresiju i sekreciju hFGF2 u Lactococcus lactis. lacF označava selekcioni marker za rast domaćina soja NZ3900 na laktozi; PnisA označava nisin A promotor nisin operona Lactococcus lactis; ssUSP45 označava signalnu sekvencu usp45 gena L. lactis. T označava terminator; repC i repA označava replikacione gene. Sekvenca nukleinske kiseline plazmida pFGF2 je takođe prikazana u SEQ ID No.46.
[0496] Slika 7b prikazuje mapu plazmida i sekvenci nukleinske kiseline plazmida pIL4 za ekspresiju i sekreciju hIL4 u Lactococcus lactis. lacF označava selekcioni marker za rast domaćina soja NZ3900 na laktozi; PnisA označava nisin A promotor nisin operona Lactococcus lactis; ssUSP45 označava signalnu sekvencu usp45 gena L. lactis. T označava terminator; repC i repA označava replikacione gene. Sekvenca nukleinske kiseline plazmida pIL4 je takođe prikazana u SEQ ID No.48.
[0497] Slika 7c prikazuje mapu plazmida i sekvenci nukleinske kiseline plazmida pCSF1 za ekspresiju i sekreciju hCSF1 u Lactococcus lactis. lacF označava selekcioni marker za rast domaćina soja NZ3900 na laktozi; PnisA označava nisin A promotor nisin operona Lactococcus lactis; ssUSP45 označava signalnu sekvencu usp45 gena L. lactis. T označava terminator; repC i repA označava replikacione gene. Sekvenca nukleinske kiseline plazmida pFGF2 je takođe prikazana u SEQ ID No.50.
Primer 2: Testiranje proizvodnje rekombinantnih faktora u Lactococcus lactis.
[0498] Da bi se testiralo da li su respektivni rekombinantni faktori hFGF2, hIL4, ili hCSF1 proizvedeni i izlučeni iz Lactococcus lactis, pet kolonija inicijalne transformacije je izabrano za dodatnu analizu. Ove kolonije su prvo prečišćene postavljanjem na ploču i izolacijom pojedinačne kolonije. Pet kolonija je individualno inokulirano u M17 laktozni medijum i uzgajano do OD 600 ≈ 0.5 i indukovano sa 1 ng/ml nisina.
[0499] Kulture su terminirane i sakupljene 2 č nakon dodavanja nisina. Sve kulture su pokazale isto ponašanje nakon dodavanja nisina i određenu količinu usporavanja rasta (podaci nisu prikazani).
a) Proizvodnja hFGF2 u L. lactis NZ3900(pFGF2) pod kontrolisanim uslovima fermentacije
[0500] Da bi se ustanovio prinos NZ3900(pFGF2) kulture, izvedene su kontrolisane fermentacije.
[0501] Sledećih pet fermentacija je izvedeno:
1. NZ3900(pFGF2) neindukovana
2. NZ3900(pFGF2) indukovana na OD 600 = 0.5 sa 5 ng/mL nisina
3. NZ3900(pFGF2) indukovana na OD 600 = 3 sa 5 ng/mL nisina
4. NZ3900(pNZ8149) indukovan na OD 600 = 0.5 sa 5 ng/mL nisina
5. NZ3900(pNZ8149) indukovana na OD 600 = 3 sa 5 ng/mL nisina
Uzorci su uzeti u t = 0 (pre indukcije), t = 2 č, t = 4 č i t = 6 č nakon indukcije sa naznačenom količinom nisina.
[0502] Kulture 4 i 5 su izvedene da bi se ustanovilo da li 5 ng/mL nisina ima efekat na rast kulture usled aktivacije nisin promotora, koji u ovom slučaju nije praćen sa ciljanim genom. Nije uočen efekat na rast (Podaci nisu prikazani).
[0503] Western blotovi su izvedeni sa uzorcima iz oba indukciona uslova. Detekcija hFGF2 je izvedena sa antitelima opisanim prethodno pod stavkom 1.8.
[0504] Slika 8 prikazuje u Western blot u stazama 3 i 4 bazalnu ekspresiju FGF2 bez indukcije sa nisinom.
[0505] Dodatno, Slika 8 prikazuje da nakon indukcije kulture na OD 600 = 0.5 hFGF2 proizvodnja je snažno indukovana i povećava se do 6 časova nakon trenutka indukcije.
[0506] hFGF2 trake iz SDS-PAGE gela (indukcija na OD 600 = 0.5 sa 5 ng/mL nisina, vremenske tračke t = 4 i t = 6) su izolovani i isporučeni u Eurosequence B.V. (Groningen, NL) za sekvenciranje N-terminalnih aminokiselina.
[0507] Nakon čišćenja uzoraka N-terminalna aminokiselinska test sekvenca je određena. Određena sekvenca je:
Ala-Gly-Ser-Ile-Thr-Thr.
[0508] Ova sekvenca se tačno podudara sa očekivanom sekvencom nakon što je isečena signalna sekvenca. Očekivana sekvenca je:
AGSITTLPAL.
Ovo znači da je hFGF2 eksprimiran, izlučen i korektno obrađen u L. lactis.
[0509] Supernatant kulture NZ3900(pFGF2) indukovan na OD 600 = 0.5 sa 5 ng/mL nisinom je korišćen u sledećim Primerima. Kultura je obeležena sa AUP-10.
b) Proizvodnja hIL4 u L. lactis NZ3900(pIL4) pod kontrolisanim uslovima fermentacije
[0510] Da bi se ustanovio prinos NZ3900(pIL4) kulture, izvedene su kontrolisane fermentacije sa sledećim fermentacijama:
1. NZ3900(pIL4) neindukovano
2. NZ3900(pIL4) indukovano na OD 600 = 0.5 sa 5 ng/mL nisina
3. NZ3900(pIL4) indukovano na OD 600 = 3 sa 5 ng/mL nisina
[0511] uzorci su uzeti u t = 0 (pre indukcije), t = 2 č, t = 4 č i t = 6 č nakon indukcije sa naznačenom količinom nisina.
[0512] Proizvodnja hIL4 je analizirana sa SDS-PAGE frakcije supernatanta i ekstraktom slobodnih ćelija u kombinaciji sa Western blotingom. Detekcija hIL4 je izvedena sa antitelima opisanim pod stavkom 1.8.
[0513] Tokom SDS-PAGE puferu uzorka i tekućem puferu dodat je DTT da bi se olakšala disocijacija disulfidnih mostova. Ovi isti SDS-PAGE gelovi su takođe korišćeni za izvođenje Western blota za specifičnu detekciju hIL4.
[0514] Efekat dodavanja DTT je da hIL4 formira pojedinačnu proteinsku traku u Coomassie obojenom gelu i u Western blotu (videti Sliku 9).
[0515] Dodatno, priprema hIL4 referentnog proteina je korišćena bez proteina nosača. Traka referentnog proteina je iste visine kao i protein proizveden od strane L. lactis NZ3900(pIL4) ćelija.
[0516] Western blot pokazuje dodatne detalje ekspresije hIL4 u L. lactis NZ3900(pIL4).
[0517] Indukcija se dešava kada je kultura indukovana na OD 600 = 0.5 sa 5 ng/mL nisina ali ne kada je indukovana na OD 600 = 3 sa 5 ng/mL nisina. Proizvodnja hIL4 se nastavlja do najmanje 6 č. U ovom periodu IL4 koncentracija u supernatantu se povećava.
[0518] hIL4 trake iz SDS-PAGE gela (indukcija OD 600 = 0.5 sa 5 ng/mL nisina, vremenske tačke t = 4 i t = 6) su izolovane i isporučene u Eurosequence B.V. za sekvenciranje N-terminalnih aminokiselina.
[0519] Nakon čišćenja uzorka N-terminalna aminokiselinska test sekvenca je određena. Određena sekvenca je:
Ala-His-Lys-Cys.
[0520] Ova sekvenca se tačno podudara sa očekivanom sekvencom nakon što je signalna sekvenca isečena. Očekivana sekvenca je:
AHKCDITLQE.
[0521] Ovo znači da je hIL4 eksprimiran, izlučen i korektno obrađen u L. lactis. Supernatant kulture NZ3900(pIL4) indukovan na OD 600 = 0.5 sa 5 ng/mL nisinom je korišćen u sledećim Primerima. Kultura je označena kao AUP-12.
c) Proizvodnja hCSF1 u L. lactis NZ3900(pCSF1) pod kontrolisanim uslovima fermentacije
[0522] Da bi se ustanovio prinos NZ3900(pCSF1) kulture izvedene su kontrolisane fermentacije. Sledeće tri fermentacije su izvedene.
1. NZ3900(pCSF1) neindukovana
2. NZ3900(pCSF1) indukovana na OD 600 = 0.5 sa 5 ng/mL nisina
3. NZ3900(pCSF1) indukovana na OD 600 = 3 sa 5 ng/mL nisina
[0523] NZ3900(pCSF1) kultura je označena sa AUP-14.
[0524] uzorci su uzeti u t = 0 (pre indukcije), t = 2 č, t = 4 č i t = 6 č nakon indukcije sa naznačenom količinom nisina.
[0525] Proizvodnja hCSF1 je analizirana sa SDS-PAGE frakcije supernatanta i ekstrakta slobodnih ćelija u kombinaciji sa Western blotingom. Detekcija hCSF1 je izvedena sa antitelima opisanim pod stavkom 1.8.
[0526] Tokom SDS-PAGE puferu uzorka i tekućem puferu dodat je DTT da bi se olakšala disocijacija disulfidnih mostova. Ovi isti SDS-PAGE gelovi su takođe korišćeni za izvođenje Western blota za specifičnu detekciju hCSF1.
[0527] U Western blotu (videti Sliku 11) staza sa referentnim proteinom još pokazuje malu količinu dimera. Dodatno, Coomassie obojeni gel (videti Sliku 10) takođe pokazuje trake iste veličine kao referentni protein.
[0528] U neindukovanim kulturama teško da se može detektovati bilo kakva bazalna proizvodnja. U kulturama indukovanim na OD 600 = 0.5 sa 5 ng/mL nisina CSF1 proizvodnja se povećava tokom vremena do najmanje 6 č. Mogla se uočiti samo mala količina proizvoda.
[0529] hCSF1 trake sa SDS-PAGE gela (indukcija na OD 600 = 0.5 sa 5 ng/mL nisina, vremenske tačke t = 4 i t = 6) su izolovane i podvrgnute sekvenciranju N-terminalne aminokiseline.
[0530] Nakon čišćenja uzoraka N-terminalna aminokiselinska test sekvenca je određena. Određena sekvenca je:
Ala-Glu-Glu-Val-Ser.
[0531] Ova sekvenca se tačno podudara sa očekivanom sekvencom nakon što je signalna sekvenca isečena. Očekivana sekvenca je:
AEEVSEYCSH.
[0532] Ovo znači da je hCSF1 eksprimiran, izlučen i korektno obrađen u L. lactis.
[0533] Supernatant kulture NZ3900(pCSF1) indukovan na OD 600 = 0.5 sa 5 ng/mL nisina je korišćen u sledećim Primerima. Kultura je označena kao AUP-14.
d) Proizvodnja hFGF2, hlL4 i hCSF1 u L. lactis NZ3900 iz pojedinačnog operona pod kontrolisanim uslovima fermentacije
[0534] 3 konstrukta su napravljena sa 3 od 6 permutacija tri gena (FGF2, IL4, CSF1):
a) hFGF2, hIL4, hCSF1,
b) hCSF1, hFGF2, hIL4,
c) hIL4, hCSF1, hFGF2.
[0535] Za dizajn operona svakom genu je obezbeđeno sopstveno mesto vezanja ribozoma za iniciranje translacije i sopstveni signalni peptid za lučenje proteina.
U odnosu na signalni peptid ranije je odlučeno da se za sva tri gena koristi ista signalna sekvenca (ssUsp45). Da bi se izbegle velike identične nukleotidne regije na plazmidu u neposrednoj blizini (mogućnost intra-plazmidne rekombinacije / delecije) isti signalni peptid je kodiran od strane različitih kodona na osnovu degeneracije kodona i upotrebe kodona L. lactis.
[0536] Za svaki od prvih gena ova 3 konstrukta korišćeno je mesto vezivanja ribozoma gena Nisin A (nisA). Za ostala dva gena svakog od 3 konstrukta izabrana su mesta vezivanja ribozoma ATP sintaze subjedinice gama (atpG) gena i gena galaktozid O-acetiltransferaze (lacA) na osnovu dobrog podudaranja sa 3'-krajem 16S rRNK L. lactis, kao što je opisano u Bolotin et al. ( 2001) ("The complete genome sequence of the lactic acid bacterium lactococcus lactis ssp. lactis IL1403", Genome Res. Volume 11, pages 731 to 753). Nukleotidna sekvenca gena L. lactis IL1403 dostupna je od NCBI sa pristupnim br. AE005176.1.
[0537] Pregled sva tri mesta vezanja ribozoma dat je na slici 24a. Dalje, sekvence nukleinske kiseline koje pružaju odgovarajuća mesta vezivanja ribozoma, uključujući početni kodon (ATG) odgovarajućeg otvorenog okvira za čitanje, takođe su prikazane u SEQ ID No. 51 do SEQ ID No. 53.
[0538] 3 'kraj 16S rRNA L. lactis (5' GGAUCACCUCCUUUCU 3 ') je prikazan u SEQ ID No.
54. Na slici 24a 16S rRNA je prikazana kao 16S rDNK, u kojoj je uracil (U) zamenjen timidinom (T).
[0539] Slika 24a takođe prikazuje konsenzus sekvencu od šest baza Shine-Dalgarno sekvence (5’ AGGAGG 3’). Shine-Dalgarno sekvenca je mesto vezivanja ribozoma kod prokariotske informacione RNK, generalno locirano oko 8 baza ushodno od start kodona. RNK sekvenca pomaže u regrutovanju ribozoma do iRNK da bi se inicirala sinteza proteina sa poravnanjem ribozoma sa start kodonom.
[0540] Dizajnirana su tri operona na takav način da sintetisane sekvence mogu biti klonirane u jednom koraku u plazmid pNZ8149 korišćenjem Psul i Ncol mesta vektora (BamHI i Psul su kompatibilni). Dodatno, Mlul mesta su introdukovana ispred mesta vezivanja ribozoma ispred gena dva i tri. Stoga stvaranje preostala tri operona je omogućeno delecijom srednjeg gena i kloniranjem trećeg gena sa PCR korišćenjem Ncol i Xbal mesta plazmida.
[0541] Respektivne sekvence sintetisanih nukleinskih kiselina su prikazane na Slikama 24b do 24d i u SEQ ID No.55 do SEQ ID No.57. Upotreba kodona tri gena je prilagođena za L. lactis.
[0542] Svaka ekspresija sa 3 konstrukta je kontrolisana sa jednim nisinA promotorom nakon čega slede prethodno naznačene sekvence nukleinske kiseline koje kodiraju hFGF2-153 prekursor protein, hIL4 prekursor protein, i hCSF1 prekursor protein dobijen u Primeru 1.
[0543] Završni proizvodi genske sinteze su dobijeni iz BaseClear svaki kao fragment kloniran u E. coli vektor pUC57.
[0544] Fragmenti su klonirani u plazmid pNZ8149 digestijom pUC57 plazmida koji sadrže respektivne proizvode genske sinteze sa restrikcionim enzimima BamHI i Ncol. BamHI / Ncol fragmenti koji sadrže respektivne proizvode genske sinteze su izolovani i vezani u Psul i Ncol isečeni plazmid pNZ8149 što je rezultovalo u respektivnim plazmidima
• pC-F-I (koji sadrži BamHI / Ncol fragment od CSF-RBS1-FGF-RBS2-IL4 proizvoda genske sinteze),
• pF-I-C (koji sadrži BamHI / Ncol fragment od FGF-RBS1-IL4-RBS2-CSF proizvoda genske sinteze), i
• pl-C-F (koji sadrži BamHI / Ncol fragment od IL4-RBS-CSF-RBS2-FGF proizvoda genske sinteze).
[0545] Respektivne restrikcione endonukleaze koje su korišćene su dobijene od Thermo Fisher Scientific Inc..
[0546] Respektivni konstrukti su transformisani L. lactis NZ3900.
[0547] Svaka od 5 kolonija od tri konstrukta je uzgajana u pH regulisanim fermentacijama i indukovana na OD600 = 0.5 sa 5 ng/ml nisina i sakupljena nakon 4 časa.
[0548] 1 ml supernatanta je istaložen sa TCA i primenjen na jedan bunarčić SDS-PAGE gela. Jedan gel je obojen sa Coomassie blue i drugi sa Western blotovima za tri ciljana proteina.
[0549] Respektivni SDS-PAGE gelovi kao i Western blotovi su obrađeni kao što je prethodno dato i prikazani su na Slikama 24e do 24g.
[0550] Kao što se može videti sa Slike 24e konstrukt a) pF-I-C (FGF2, hIL4, hCSF1) rezultovao je u ekspresiji i sekreciji puno FGF2, malo IL4 kao i malo CSF1.
[0551] Kao što se može videti sa Slike 24f konstrukt b) pC-F-I (hCSF1, hFGF2, hIL4) rezultovao je u ekspresiji i sekreciji puno CSF1 i FGF2 kao i srednje IL4.
[0552] Kao što se može videti sa Slike 24g konstrukt c) pl-C-F (hIL4, hCSF1, hFGF2) rezultovao je u ekspresiji i sekreciji puno IL4 i nešto manje CSF1 i FGF2. Coomassie obojeni gel pokazao je najbolju proizvodnju i indukciju sva tri proteina.
[0553] Tri ciljna proteina mogu se klonirati u i eksprimirati sa operonske strukture što rezultuje u oslobađanju respektivnih proteina hIL4, hCSF1, i hFGF2 u supernatant.
Primer 3: Indukcija FGF2 proizvodnje pod uslovima koja podsećaju na okolnosti kod zarastanja rane
[0554] Fiziološki uslovi u rani su različiti od onih u epruveti ili fermentoru.
[0555] Stoga je postavljen eksperiment da bi se testirala indukcija NICE sistema i stoga proizvodnja hFGF2 pod uslovima u kojima soj NZ3900 ne raste ili raste samo minimalno. Ovi uslovi su prisutni kada pH kulture dostigne 5.0 i kada kultura prelazi u stacionarnu fazu.
[0556] Eksperiment je izveden u 200 mL bocama sa mešanjem i praćenjem pH. Kao medijum za rast korišćen je IM1 medijum sa 2% težine po zapremine Na-beta-glicerofosfata i 0.5% težine po zapremini laktoze. Sledeće fermentacije su izvedene:
1. NZ3900(pFGF2) – bez indukcije
2. NZ3900(pFGF2) – indukcija kada kultura dostigne pH = 5 sa 1 ng/mL nisina
3. NZ3900(pFGF2) - indukcija kada kultura dostigne pH = 5 sa 0.1 ng/mL nisina
4. NZ3900(pFGF2) - indukcija kada kultura dostigne OD 600 = 3 sa 1 ng/mL nisina
5. NZ3900(pFGF2) - indukcija kada kultura dostigne OD 600 = 3 sa 0.1 ng/mL nisina.
[0557] Kulture su sakupljene 3 č nakon indukcije. Kontrolna kultura je sakupljena u isto vreme kao kulture koje su indukovane na pH 5.0. Rezultati su prikazani na Slici 11.
[0558] Slika 12 prikazuje da su rast i razvoj pH identični u svih pet kultura i da indukcija sa nisinom nema efekat ni na rast ni na razvoj pH.
[0559] Formiranje hFGF2 je mereno u 1 ml supernatanta kulture korišćenjem SDS-PAGE i Western blotinga. Slika 13 pokazuje da pod uslovima gde ćelije ne rastu ili su u fazi usporavanja rasta, nisin ne indukuje ekspresiju gena. U odnosu na bazalnu proizvodnju FGF2 (bez indukcije) postoji malo ili ne postoji povećanje u količini FGF2 u supernatantu kulture.
[0560] Western blot analiza pokazuje da je hFGF2 detektabilan u supernatantu kulture svih pet kultura. Dodatno, dva proizvoda razlaganja hFGF2 su detektabilna.
[0561] Ovo znači da je sav FGF2 sa signalnom sekvencom koji je proizveden u ćeliji obrađen i izlučen.
[0562] Gen za humani FGF2 je kloniran u NICE ekspresioni vektor gradusa hrane za Lactococcus lactis.
[0563] Ekspresija FGF2 gena se može indukovati dodavanjem nisina. hFGF2 je izlučen u supernatant sa oko 100 - 200 ng/mL. Određivanje N-terminalne aminokiselinske sekvence izlučenog FGF2 je pokazalo da je protein korektno obrađen.
[0564] Indukcija proizvodnje FGF2 dovodi do ograničenog usporavanja rasta, ali ne zaustavlja rast.
[0565] U kontrolisanoj fermentaciji FGF2 proizvodnja je indukovana u širokom opsegu krive rasta (između OD 600 = 0.5 - 3). Najveća proizvodnja FGF2 je uočena nakon indukcije na OD 600 = 0.5 sa 5 ng/ml nisina.
[0566] Plazmid pFGF2 je stabilan najmanje 100 generacija u soju NZ3900 takođe pod neselektivnim uslovima, kao što je rast na glukozi.
Primer 4a: Analiza migracije humanog fibroblasta
[0567] Biološka aktivnost FGF2 oslobođenog iz Lactococcus lactis NZ3900(pFGF2) i IL4 oslobođenog iz Lactococcus lactis NZ3900(pIL4) na zarastanje rane je procenjena merenjem migracije normalnih humanih dermalnih fibroblasta (NHDF) u veštačku migracionu zonu. Efekat test jedinjenja je procenjen korišćenjem analize slike oporavljanja rane.
[0568] Svaki od Lactococcus lactis NZ3900(pFGF2) iz Primera 2a i Lactococcus lactis NZ3900(pIL4) iz Primera 2b su indukovani na OD 600 = 0.5 sa 5 ng/mL nisina. Nakon 6 č fermentacije, respektivni supernatanti kulture su izolovani, osušeni zamrzavanjem i uskladišteni na -20°C kao što je prethodno opisano.
[0569] Za dodatno testiranje pripremljeni su stok rastvori iz zamrzavanjem osušenih supernatanata u koncentraciji od 1 mg/ml rekonstitucijom praška sa tris HCl (5 mM, pH 7.6). AUP-10 stok rastvor je dobijen iz supernatanta kulture Lactococcus lactis NZ3900(pFGF2) iz Primera 2a. AUP-12 stok rastvor je dobijen iz supernatanta kulture Lactococcus lactis NZ3900(pIL4) iz Primera 2b.
[0570] Stok rastvori su razblaženi sa analitičkim medijumom n°1 do finalne koncentracije od 0.5 ng/ml, 1 ng/ml, 2.5 ng/ml, i 5 ng/ml, respektivno, za AUP-10 (FGF2) i do finalne koncentracije od 0.1 ng/ml, 1 ng/ml, 5 ng/ml, i 10 ng/ml, respektivno, za AUP-12 (IL4).
[0571] Naznačene koncentracije za stok rastvore kao i razblaženja odnose se na ukupnu količinu proteina, koji je prisutan u respektivnom rastvoru i koji uglavnom odgovara količini FGF2 i IL4 u supernatantima kulture Lactococcus lactis NZ3900(pFGF2) iz Primera 2a i Lactococcus lactis NZ3900(pIL4) iz Primera 2b, respektivno.
[0572] Dodatno, rekombinantni humani bFGF (Fiblast,), koji je kupljen od Kaken Pharmaceutical Co., Inc (Tokyo, Japan), razblažen je sa analitičkim medijumom n°1 do finalne koncentracije od 0.5 ng/ml, 1 ng/ml, 2.5 ng/ml, i 5 ng/ml, respektivno.
[0573] Rekombinantni humani IL4, koji je kupljen od R&D systems (Minneapolis, MN, USA), je razblažen sa tris HCl (5 mM, pH 7.6) do finalne koncentracije od 0.1 ng/ml, 1 ng/ml, 5 ng/ml, i 10 ng/ml, respektivno. Normalni humani dermalni fibroblasti (NHDF) su dobijeni od Lonza Group AG (Basel, CH).
[0574] Fibroblasti su zasejani u mikroploče sa 96 bunarčića namenjenih za analizu migracije i inkubirani 24 časa.
• Uslovi kulture: 37°C, 5% CO2.
• Medijum kulture: Dulbecco’s modifikovani Eagle’s medijum (DMEM) sa dodatkom L-glutamina 2 mM, penicilina 50 U/ml, streptomicina 50 µg/ml, i fetalnog goveđeg seruma (FCS) 10% po zapremini.
[0575] U ovim pločama, bunarčići su obloženi sa rastvorom kolagena i stoper za zasejavanje ćelija je postavljen u centar bunarčića da bi se ograničilo zasejavanje ćelija na spoljne prstenaste regione bunarčića, čime se stvara veštačka rana (zona migracije). Ove ćelije su zatim obeležene korišćenjem kalcein-AM dobijenog od Thermo Fisher Scientific.
[0576] Kalcein-AM je premanentna ćelijska boja koja se može koristiti da bi se odredila vijabilnost ćelija kod većine eukariotskih ćelija. U živim ćelijama ne-fluorescentni kalcein AM se konvertuje u zeleni-fluorescentni kalcein nakon hidrolize acetoksimetil estra sa intracelularnim esterazama.
[0577] Nakon 30 minuta inkubacije, stoperi su uklonjeni i medijum kulture je zamenjen sa analitičkim medijumom n°1 koji sadrži test jedinjenja (FGF2, Fiblast, IL4 ili rekombinantni hIL4) ili samo analitički medijum n°1 (kontrola) ili referencu (FCS na 10%). Ćelije su zatim inkubirane 72 časa. Svi eksperimentalni uslovi su izvedeni u n=5.
• Analitički medijum n°1: DMEM sa dodatkom L-glutamina 2 mM, penicilina 50 U/ml, i streptomicina 50 µg/ml.
[0578] Migracija ćelija u zonu migracije je posmatrana nakon 0, 24, 48 i 72 časova inkubacije, korišćenjem NIKON Diaphot 300 mikroskopa (objektiv x 4) i slike su slikane korišćenjem NIKON DX-1200 kamere.
[0579] Površina veštačke rane je merena u svakoj vremenskoj tački i poređena sa premigracionom površinom merenom u T0 da bi se vizuelizovalo i kvantifikovalo oporavljanje rane. Efekti test jedinjenja na migraciju ćelija su poređeni sa netretiranom kontrolom.
[0580] Respektivne primenjene koncentracije bile su 0.5 ng/ml, 1.0 ng/ml, 2.5 ng/ml, i 5.0 ng/ml za hFGF2 i 0.1 ng/ml, 1 ng/ml, 5 ng/ml, i 10 ng/ml za hIL4. Nakon 72 č izlaganja migracija fibroblasta su poređene sa fibroblastima inkubiranim sa medijumom za rast (kontrola).
[0581] %-oporavka površine veštačke rane je prikazan na Slikama 14a i 14b.
[0582] Slika 14a prikazuje značajno povećanje migrirajućih fibroblasta nakon inkubacije sa hFGF2 koji eksprimiraju rekombinantne probiotske bakterije. Pod eksperimentalnim uslovima analize, rekombinantni humani bFGF (Fiblast,) kupljen od Kaken Pharmaceutical Co., Inc (Tokyo, Japan), nije modulisao NHDF migraciju i proliferaciju.
[0583] hFGF2 eksprimiran u rekombinantnim probiotskim bakterijama AUP-10 dobijen u Primeru 2a poseduje biološku aktivnost.
[0584] Slika 14b pokazuje da medijum kulture AUP-12 koji sadrži 0.1-10 ng/ml hIL4 indukuje proliferaciju NHDF sličnu rhIL4.
[0585] hIL4 eksprimiran u rekombinantnim probiotskim bakterijama AUP-12 dobijen u Primeru 2b poseduje biološku aktivnost.
Primer 4b: ERK1- i ERK2-fosforilacija u normalnim humanim dermalnim fibroblastima i u mišjim limfoblastima.
[0586] Biološka aktivnost FGF2 oslobođenog iz Lactococcus lactis NZ3900(pFGF2) je dodatno procenjivana merenjem fosforilacije ekstracelularne signalom-regulisane kinaze 1 (ERK1) i ekstracelularne signalom-regulisane kinaze 2 (ERK2) u normalnim humanim dermalnim fibroblastima (NHDF).
[0587] Biološka aktivnost CSF1 oslobođenog iz Lactococcus lactis NZ3900(pCSF1) je procenjivana merenjem fosforilacije ekstracelularne signalom-regulisane kinaze 1 (ERK1) i ekstracelularne signalom-regulisane kinaze 2 (ERK2) u mišjim limfoblastičnim M-NFS-60 ćelijama.
[0588] Stok rastvor AUP-10 je pripremljen kao što je opisano u prethodnom tekstu u Primeru 4a.
[0589] Dodatno, Lactococcus lactis NZ3900(pCSF1) iz Primera 2c (AUP-14) je indukovan na OD 600 = 0.5 sa 5 ng/mL nisina. Posle 6 h fermentisanja, supernatant kulture je izolovan, osušen zamrzavanjem i čuvan na -20°C. Za dodatno testiranje pripremljen je stok rastvor od supernatanta osušenog zamrzavanjem u koncentraciji od 1 mg/ml ukupnog proteina rekonstitucijom praha sa tris HCl (5 mM, pH 7.6) čime se dobija stok rastvor AUP-14.
[0590] Stok rastvori su dodatno razblaženi odgovarajućim medijumom bez seruma do finalne koncentracije od 0.4 ng/ml, 4 ng/ml, 40 ng/ml, i 80 ng/ml, respektivno, za AUP-10 (FGF2) i do finalne koncentracije od 0.2 ng/ml, 2 ng/ml, 20 ng/ml, i 40 ng/ml, respektivno, za AUP-14 (CSF1).
[0591] Rekombinantni humani bFGF iz Kaken Pharmaceutical Co. je razblažen sa medijumom bez seruma (medijum za analizu br.1) do finalne koncentracije od 0.5 ng/ml, 5 ng/ml, 50 ng/ml, i 100 ng/ml, respektivno.
[0592] Rekombinantni humani CSF1, koji je kupljen iz Abcam PLC (Cambridge, GB), je razblažen medijumom bez seruma (medijum za analizu br. 2) do finalne koncentracije od 0.2 ng/ml, 2 ng/ml, 20 ng/ml, i 40 ng/ml, respektivno.
[0593] Normalni humani dermalni fibroblasti (NHDF) su zasejani u 96-komorne mikroploče i inkubirani u trajanju od 24 časa pod uslovima opisanim u prethodnom tekstu pod Primerom 4a.
[0594] Mišje M-NFS-60 ćelije (ATCC® CRL-1838™) su dobijene iz LGC Standards GmbH (Wesel, Germany). Ćelije su zasejane u 96-komornim pločama i inkubirane u trajanju od 24 časa pod sledećim uslovima:
• Uslovi kulture: 37°C.
• Medijum za kulturu: RPMI-1640 medijum (Life Technologies Corporation, Carlsbad, CA, USA) dopunjen sa 0.05 mM 2-merkaptoetanolom, 62 ng/ml humanog rekombinantnog faktora stimulacije kolonija makrofaga (M-CSF), penicilinom 50 U/ml, streptomicinom 50 µg/ml, i fetusnim telećim serumom do finalne koncentracije od 10% prema zapremini.
• Medijum za analizu br. 2: RPMI-1640 medijum, dopunjen sa 0.05 mM 2-merkaptoetanolom, penicilinom 50 U/ml i streptomicinom 50 µg/ml,
[0595] Eksponencijalno rastuće NHDF su inkubirane u medijumu bez seruma (medijum za analizu br. 1) u trajanju od 24 časa, prebačene u ependorf epruvete (0.5 x 10<5>ćelija/epruveti) i inkubirane u trajanju od 15 min na 37°C u medijumu bez seruma (medijum za analizu br.1) koji sadrži 0.5 ng/ml, 5 ng/ml, 50 ng/ml, i 100 ng/ml rhFGF2 ili razblaženjima stok rastvora AUP-10 u finalnim koncentracijama kao što su naznačene u prethodnom tekstu. Ćelije su zatim isprane sa PBS i resuspendovane u puferu za lizu.
[0596] Eksponencijalno rastuće mišje M-NFS-60 ćelije su inkubirane u medijumu bez seruma (medijum za analizu br. 2) u trajanju od 24 časa, prebačene u ependorf epruvete (2 x 10<6>ćelija/epruveti) i inkubirane sa Ki-20227 u koncentraciji od 1µM u trajanju od 1 časa. c-fms inhibitor Ki-20227, koji je dobijen iz Abcam PLC, je indukovan kao kontrola za specifičnost CSF-1 receptora (CSF-1R).
[0597] Posle 1 h prethodne inkubacije sa Ki-20227, ćelije su inkubirane 15 min na 37°C u medijumu za analizu br.2 koji sadrži 0.2, 2, 20, i 40 ng/ml rhCSF1 ili razblaženja stoka rastvora AUP-14 u finalnim koncentracijama kao što su naznačene u prethodnom tekstu. Ćelije su zatim isprane sa PBS i resuspendovane u puferu za lizu.
[0598] Recept za pufer za lizu je kao što sledi: 0.5 % prema zapremini Surfact-Amps NP-40 (Pierce Biotechnology, Rockford, IL, USA), 20 mM Hepes (pH 8.0), 0.35 M NaCl, 0.1 mM EGTA, 0.5 mM EDTA, 1 mM MgCl2, 20 % prema zapremini Glicerola, 1 mM DTT, 1 µg/ml leupeptina, 0.5 µg/ml pepstatina, 0.5 µg/ml apronitina i 1 mM fenilmetilsulfonil fluorid.
[0599] Sve ćelije su inkubirane 15 min na ledu i ćelijski proteini su dobijeni centrifugiranjem. Koncentracija proteina je određivana pomoću Bradford analize (Bio-Rad), i 50 µg proteina je ključalo u Laemmli puferu i podvrgnuto elektroforezi u 10% natrijum dodecil sulfatpoliakrilamidnom gelu. Odvojeni proteini su prebačeni u nitrocelulozne membrane (24V) na 30 min. Blotovi su blokirani u Tris-puferisanom fiziološkom rastvoru koji sadrži 0.1% Tween 20 i 5% nemasno mleko u prahu, i ekspresija fosforilisanog ERK 1+2 i ukupnog ERK 1+2 su određivane upotrebom sledećih specifičnih antitela.
[0600] Za detekciju ERK1 i ERK2, zečje anti-humano ERK1 i ERK2 poliklonsko antitelo (ceo antiserum, dobijen iz Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Munich, Germany, proizvod br. M5670) je korišćeno u razblaženju od 1:10000. Drugo antitelo je bilo antitelo anti-zečji IgG vezan za renovu peroksidazu (HRP) u razblaženju od 1:10,000 dobijeno iz Bioké B.V. (Leiden, NL).
[0601] Za detekciju fosforilisane ERK1 i ERK2, korišćeno je prečišćeno mišje anti-humano p-ERK (E-4) monoklonsko antitelo (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Heidelberg, Germany, proizvod br. sc-7383) u razblaženju od 1:1000. p-ERK (E-4) je epitop mišjeg monoklonskog antitela koji odgovara sekvenci koja sadrži ERK sa fosforilisanim Tyr 204 humanog porekla. Monoklonsko antitelo detektuje ERK 1 fosforilisan na Tyr 204 i odgovarajuće fosforilisan ERK 2 mišjeg, pacovskog i humanog porekla.
[0602] Drugo antitelo je bilo antitelo anti-mišji Ig G vezan za renovu peroksidazu (HRP) u razblaženju od 1:10,000 dobijeno iz Bioké B.V. (Leiden, NL).
[0603] Indukcija fosforilacije ERK1+2 je kvantitativno određivana upotrebom Image J softvera (National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA).
[0604] Kao što se može videti sa Slike 14c, medijum kulture AUP-10 koji sadrži 0.4-80 ng/ml FGF2 indukuje fosforilaciju ERK 1+2 u NHDF slično rhFGF2.
[0605] Kao što se može videti sa Slike 14d, medijum za kulturu AUP-14 koji sadrži 0.2-40 ng/ml CSF1 indukuje fosforilaciju ERK 1+2 u mišjim M-NFS-60 ćelijama slično rhCSF1.
Primer 4c: Inhibicija lipopolisaharidom (LPS) indukovane M1-aktivacije humanih mononuklearnih ćelija periferne krvi (PBMCs)
[0606] Humane THP-1 ćelije (ATCC® TIB-202™) su dobijene iz LGC Standards GmbH. Ćelije su zasejane u 96-komorne mikroploče i inkubirane 24 časa pod sledećim uslovima:
• Uslovi kulture: 37°C, 5% CO2.
• Medijum za kulturu: RPMI-1640 medijum (Life Technologies Corporation, Carlsbad, CA, USA) dopunjen sa 0.05 mM 2-merkaptoetanolom, penicilinom 50 U/ml, streptomicinom 50 µg/ml i fetusnim telećim serumom do finalne koncentracije od 10% prema zapremini.
• Medijum za analizu br. 2: RPMI-1640 medijum, dopunjen sa 0.05 mM 2-merkaptoetanolom, penicilinom 50 U/ml i streptomicinom 50 µg/ml,
[0607] THP1 je humana ćelijska linija monocita poreklom od pacijenta sa akutnom monocitnom leukemijom. THP-1 ćelije su diferencirane u ćelije makrofage i polarizovane prema ustanovljenim protokolima. Lipopolisaharid (LPS) poreklom od Escheria coli (serotip 026:B6 – dobijen iz Sigma-Aldrich) i interferon gama (IFN-γ) dobijen iz U-Cytech (Utrecht, The Netherlands) je korišćen za polarizaciju.
[0608] Ukratko, 1 milion THP1 ćelija je postavljen u 6-komorne ploče u 3-mL DMEM medijuma plus 100 ng/mL forbol-12-miristat-13-acetata (PMA), koji je dobijen iz Sigma-Aldrich, za 24 časa da bi se indukovala diferencijacija u nepolarizovane makrofage (makrofage poreklom od nepolarizovanih THP-1).
[0609] Posle diferencijacije, makrofage poreklom od nepolarizovanih THP-1 su tretirane u DMEM medijumu 48 časova sa LPS (1 µg/ml) i IFN-γ (100U/ml) da bi se indukovao M1 fenotip rezultujući u generisanju makrofaga poreklom od M1 polarizovanih THP-1.
[0610] Za inhibiciju M1 polarizacije, nepolarizovane THP-1 makrofage su prvo inkubirane sa razblaženjima stok rastvora AUP-12 dobijenog u Primeru 4a ili sa razblaženjima stok rastvora rekombinantnog humanog IL4 (rhIL4) u trajanju od 18 časova i zatim stimulisane kao što je opisano u prethodnom tekstu sa LPS i IFN-γ dodatnih 48 časova.
[0611] Stok rastvor AUP-12, koji ima ukupnu koncentraciju proteina od 1 mg/ml, razblažen je do koncentracija od 0.1%, 1%, 10% i 20% prema zapremini sa DMEM medijumom. Stok rastvor rhIL4 je razblažen do koncentracija od 0.1 ng/ml, 1 ng/ml, 10 ng/ml i 20 ng/ml prema zapremini sa DMEM medijumom.
[0612] Ćelije su sakupljene i ukupna RNK je ekstrahovana upotrebom High Pure RNA Isolation kompleta (Roche Diagnostics). Ukupna RNK (1 µg) je retrotranskribovana upotrebom iScriptTM kompleta za sintezu cDNK (Bio-Rad; Hercules, CA, USA) i generisana cDNK je analizirana pomoću PCR-a u realnom vremenu, upotrebom iQTM SYBR Green Supermix (Bio-Rad; Hercules, CA, USA). PCR u realnom vremenu je izveden upotrebom CFX96 Real-time PCR Detection System (Bio-Rad; Hercules, CA, USA). HPRT gen je korišćen za standardizaciju ekspresije iRNK u svakom uzorku i ekspresija gena je kvantitativno određena upotrebom 2-ΔΔCt postupka. Marker za M1 polarizaciju je bio proizvodnja iRNK faktora alfa nekroze tumora (TNF-α).
[0613] Slika 14e prikazuje inhibiciju LPS-indukovane proizvodnje iRNK TNFalfa u humanim THP-1 ćelijama.
[0614] Kao što se može videti sa Slike 14e, medijum za kulturu AUP-12 inhibira LPS-indukovanu proizvodnju iRNK TNFalfa u humanim THP-1 ćelijama slično rhIL4. Efikasna doza rhIL4 je između 1-20 ng/ml.
[0615] * na Slici 14e označava p-vrednost P<0.05 u poređenju samo sa LPS. Na grafikonu je prikazana standardna devijacija.
Primer 4d: Indukcija M2-polarizacije u makrofagama poreklom od Thp1
[0616] U cilju indukcije M2 polarizacije, makrofage poreklom od nepolarizovanih THP-1 dobijene u Primeru 4c inkubirane su sa razblaženjima stok rastvora AUP-12 dobijenim u Primeru 4a ili sa razblaženjima stok rastvora rekombinantnog humanog IL4 (rhIL4) koji imaju finalnu koncentraciju od 20 ng/ml u trajanju od 18 časova.
[0617] Stok rastvor AUP-12, koji ima ukupnu koncentraciju proteina od 1 mg/ml, razblažen je do koncentracija od 0.1 % i 1 % prema zapremini sa DMEM medijumom.
[0618] Ćelije su analizirane kao što je opisano u prethodnom tekstu. Posle polarizacije ćelije su sakupljene i ekstrahovana je ukupna RNK. Ukupna RNK je retrotranskribovana i generisana cDNK je analizirana pomoću PCR-a u realnom vremenu. PCR u realnom vremenu je izveden upotrebom CFX96 Real-time PCR Detection System. HPRT gen je korišćen za standardizaciju ekspresije iRNK u svakom uzorku i ekspresija gena je kvantitativno određena upotrebom 2-ΔΔCt postupka. Markeri za M2 polarizaciju bili su manozni receptor 1 makrofaga (Mrc1) i Kruppelsličan faktor 4 (KLF4).
[0619] Slika 14f prikazuje indukciju ekspresije RNK M2 gena za manozni receptor 1 makrofaga (Mrc1) i Kruppel-sličan faktor 4 (KLF4) u makrofagama poreklom od THP1.
[0620] Kao što se može videti sa Slike 14f, medijum za kulturu AUP-12 indukuje ekspresiju RNK M2 gena za manozni receptor 1 makrofaga (Mrc1) i Kruppel-sličan faktor 4 (KLF4) u makrofagama poreklom od THP1 slično rhIL4. Efikasna doza rhIL4 je između 2-20 ng/ml.
[0621] * na Slici 14f označava p-vrednost P<0.05 u poređenju sa M0 (M0 = PMA indukovani THP1) i Mn = neindukovani THP1. ** na Slici 14f označava p-vrednost P<0.05 u poređenju sa Mn = neindukovanim THP1. Na grafikonu je prikazana standardna devijacija.
Primer 4e: STAT-6 transkripciona aktivnost AUP-12 u različitim ćelijskim linijama.
[0622] Da bi se odredila biološka aktivnost rekombinantnog IL-4 i AUP-12 na STAT6 transkripcionu aktivnost, korišćene su MO3.13 (humane) i HEK293T (humane) ćelije prolazno ko-transficirane sa STAT-6 i STAT6-Luc plazmidima (Addgene Inc, Cambridge, MA, USA).
[0623] Humane embrionalne ćelije bubrega 293T HEK293T (ATCC® CRL-3216™) dobijene su iz LGC Standards GmbH. Ćelije su zasejane u 96-komorne mikroploče i inkubirane 24 časa pod sledećim uslovima:
• Uslovi kulture: 37°C, 5% CO2.
• Medijum za kulturu: DMEM medijum, penicilin 50 U/ml, streptomicin 50 mg/ml i fetusni teleći serum do finalne koncentracije od 10% prema zapremini.
[0624] Humana glijalna (oligodendrocitna) hibridna ćelijska linija MO3.13 je dobijena iz tebubio GmbH (Offenbach, Germany). Ćelije su zasejane u 96-komorne mikroploče i inkubirane 24 časa pod sledećim uslovima:
• Uslovi kulture: 37°C.
• Medijum za kulturu: DMEM medijum, penicilin 50 U/ml, streptomicin 50 mg/ml i fetusni teleći serum do finalne koncentracije od 10% prema zapremini.
[0625] Transfekcije sa STAT-6 i STAT6-Luc plazmidima su izvedene upotrebom RotiFect™ reagensa (Carl Roth GmbH Co. KG, Karlsruhe, Germany) prema preporukama proizvođača. Ćelije su tretirane sa 0.1 ng/ml, 1 ng/ml,10 ng/ml, 20 ng/ml i 100 ng/ml rekombinantnog humanog IL4 (rhIL-4) i razblaženjima AUP-12 stok rastvora u trajanju od 6 časova. Stok rastvor AUP-12 je razblažen do koncentracija od 0.1%, 1%, 10% i 20% prema zapremini sa DMEM medijumom.
[0626] Zatim su ćelije lizirane u 25 mM Tris-fosfatu pH 7.8, 8 mM MgCl2, 1 mM DTT, 1% Triton X-100 i 7% glicerolu.
[0627] Aktivnost luciferaze je merena upotrebom Autolumat LB 953 (EG&G Berthold, USA) praćenjem uputstava za komplet za analizu luciferaze (Promega, Madison, WI, USA). Rezultati specifične transaktivacije su izraženi kao višestruka indukcija u odnosu na netretirane ćelije.
[0628] Slika 14g prikazuje STAT-6 transkripcionu aktivnost AUP-12 i rhlL-4 u humanoj glijalnoj hibridnom ćelijskoj liniji (MO3.13).
[0629] Slika 14h prikazuje STAT-6 transkripcionu aktivnost AUP-12 i rhlL-4 u humanim embrionalnim ćelijama bubrega 293.
[0630] Kao što se može videti sa Slika 14g i 14h AUP-12 medijum za kulturu indukuje STAT-6 transkripcionu aktivnost u humanoj glijalnoj hibridnoj ćelijskoj liniji (MO3.13) kao i 4 u humanim embrionalnim ćelijama bubrega 293 slično rhIL4. Efikasna doza rhIL4 je između 0,1 i 20 ng/ml.
Primer 5: Eksperimenti zatvaranja rane
[0631] Posledica primene probiotske bakterije koja eksprimira humani FGF-2, CSF-1 i IL-4 pojedinačno ili u kombinaciji na full-thickness ekcizione rane na db/db dijabetičkim miševima je ispitivana u kombinovanoj farmakokinetičkoj (PK) / farmakodinamskoj (PD) – studiji efikasnosti. Tu, bakterija koja eksprimira FGF2 (AUP-10), IL4 (AUP-12) i CSF1 (AUP-14) je procenjivana pojedinačno ili kombinovana kao trodelna kombinacija (tj. AUP-10 AUP-12 AUP14) i upoređivana u odnosu na efikasnost sa pozitivnom kontrolom (tj. kombinacija rekombinantnog proteina TGF-alfa PDGF-BB). Dodatno, bakterija koja eksprimira FGF2, IL4 i CSF1 u jednoj bakterijskoj ćeliji (AUP-16) je procenjivana i upoređivana sa tretmanom vehikulumom (tj. fiziološki rastvor filmski omotač ili IM1 medijum filmski omotač) i pozitivna kontrola (TGF-alfa PDGF-BB).
[0632] Pacijenti sa dijabetesom su podložni oslabljenom zarastanju rana, pri čemu je naročito preovlađujuća ulceracija stopala. Ovo odlaganje u zarastanju rana takođe se odnosi i na dijabetičke životinje, uključujući spontano dijabetičkog (db/db) miša - koji je komercijalno dobijen iz The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA).
[0633] 99 dijabetičkih miševa (naziv soja BKS.Cg-Dock<7m>+/+ Lepr<db>/J - Stock Code 00642), svi mužjaci i starosti približno 10 nedelja, su korišćeni u prvoj studiji i kasnijoj drugoj studiji.
[0634] Rekombinantne probiotske bakterije koje eksprimiraju humani FGF-2, CSF-1 ili IL-4 pojedinačno ili kao trodelna kombinacija kao i rekombinantne probiotske bakterije koje eksprimiraju FGF2, IL4 i CSF1 u jednog bakterijskoj ćeliji su primenjene na rane na dan ranjavanja (dan 0) i njihovo preživljavanje je ispitivano 6 časova posle primene. U cilju olakšavanja određivanja proizvodnje FGF-2, CSF-1 i/ili IL-4 od strane bakterija primenjenih na rane, uzorci tečnosti rane su uzeti iz rana posle 6 časova, i 1, 2 & 7 dana. Sistemska krv i ključni organi su sakupljeni posle 6 & 24 časa i 7 dana da bi se olakšala PK/PD analiza. Rane koje su primale samo IM1 medijum su korišćene kao kontrole za PK/PD komponentu ove studije.
[0635] U cilju ispitivanja uticaja ovih rekombinantnih probiotskih bakterija na proces zarastanja rana, bakterije koje eksprimiraju humani FGF-2, CSF-1 i IL-4, kao i bakterije koje eksprimiraju humani FGF-2, CSF-1 ili IL-4 pojedinačno, su primenjene na rane na dan ranjavanja (dan 0) i svaki dan nakon toga do dana 6 posle ranjavanja. Zarastanje rana koje primaju ove rekombinantne probiotske bakterije upoređivano je sa onim kod sličnih rana izloženih samo svežem IM1 medijumu.
[0636] Dodatno, rekombinantni faktor rasta-BB poreklom iz humanih trombocita (rh-PDGF-BB) u kombinaciji sa rekombinantnim humanim transformišućim faktorom rasta-alfa (rh-TGF-α) korišćen je kao "pozitivna kontrola" u ovoj studiji. Pozitivna kontrola je pripremljena u vehikulumu 0.25% hidroksipropil metilcelulozi (HPMC), koja je pripremljena rastvaranjem 0.5g hidroksipropil metilceluloze, dobijene iz Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA) u 100 ml destilovane vode i dodavanjem natrijum hidroksida da bi se pH doveo do 7.0.
[0637] Kombinacija PDGF-BB i TGF je zasnovana na studiji izvedenoj od strane Brown RL et al. (Brown RL, Breeden MP, Greenhalgh DG.: "PDGF i TGF-alfa act synergistically do improve wound healing in the genetically diabetic mouse. J. Surg. Res. 56(6), 1994, pages 562 do 570). Brown et al. opisuju da su poboljšanja u zatvaranju rane zabeležena sa kombinacijom PDGF-BB i TGF-alfa u poređenju sa tretmanom individualnim faktorima rasta.
[0638] Zarastanje rana je ispitivano kako na makroskopskom tako i na histološkom nivou. Zarastanje rana je ispitivano na makroskopskom nivou prema (i) započinjanju odgovora neodermalne popravke i (ii) zatvaranju rane.
[0639] Zatvaranje rane i njene komponente, kontrakcija rane i re-epitelizacija rane, određivani su sa digitalnih fotografija uzetih posle ranjavanja na dane 0, 4 & 7 posle ranjavanja. Histološke procene formiranja granulacionog tkiva (dubina) i širine rane (kranio-kaudalna kontrakcija) su izvedene na rutinski (H&E) obojenim isečcima. Ove histološke procene su izvedene na tkivima sakupljenim na dan 7 posle ranjavanja.
[0640] Razvoj štetnih efekata je praćen i potpuno dokumentovan.
Stvaranje eksperimentalnih rana pune-debljine i primena tretmana
[0641] Posle eksperimentalnog ranjavanja, životinje su smeštene u individualne kaveze (veličina kaveza 500 cm<2>sa ležajem od piljevine, menjanim tri puta nedeljno), u sredini održavanoj na temperaturi sredine od 23°C sa 12-časovnim ciklusima svetlosti/mraka. Njima je obezbeđena hrana (CRM-P, šifra proizvoda 801722, SDS diets, UK) i voda ad libitum. Da bi se životinje prilagodile na svoje okruženje, pre eksperimentisanja, one su smeštene tokom perioda od 5 - 7 dana bez remećenja, osim za obnovu njihovog ležaja i za punjenje njihovih rezervi hrane i vode. Posle svih anestetičkih događaja, životinje su postavljene u toplu sredinu i praćene su sve dok se nisu potpuno oporavile od procedure. Sve životinje su primile odgovarajuću analgeziju (buprenorfin) posle operacije i primile su dodatne analgetike prema potrebi.
[0642] Sve procedure na životinjama su izvedene u UK Home Office licenciranoj ustanovi prema UK Home Office Licences (PCD: 50/2505; PPL: 40/3614; PIL: IBCEFDF55; PIL: 134817249). Zdravlje životinja je praćeno na dnevnoj bazi tokom studije.
[0643] Životinje su randomizovane u jednu od 18 režima tretmana prema Tabelama 2a i 2b.
[0644] Na dan 0, životinje su anestezirane (izofluoran & vazduh) i dorzalna strana je obrijana i očišćena gazom potopljenom u fiziološki rastvor. Koža će zatim biti obrisana sa 70% EtOH i obrisana suvom sterilnom gazom. Jedna standardizovana rana pune-debljine (10.0mm x 10.0mm) stvorena je u koži levog boka dorzalno svake eksperimentalne životinje.
[0645] Rane na životinjama u svim grupama su zatim obložene obodnom trakom od providnog filma Bioclusive (Systagenix Wound Management, Gatwick, UK); nakon čega su primile jedan od tretmana opisanih u daljem tekstu (videti Tabelu 2a i 2b) koji je primenjen injekcijom kroz Bioclusive film upotrebom igle veličine 27.
[0646] Za svaki tretman respektivne neindukovane rekombinantne probiotske bakterije su obezbeđene u 10 ml IM1 medijuma koji ima sledeću gustinu ćelija (jedinice koje formiraju kolonije (CFU) po ml medijuma):
[0647] Šema tretmana "kombinacija" predstavlja trodelnu kombinaciju koja je rezultat smeše neindukovanog NZ3900(pFGF2) dobijenog u Primeru 2a, neindukovanog NZ3900(pCSF1) dobijenog u Primeru 2c, i neindukovanog NZ3900(pIL4) dobijenog u Primeru 2b. Smeša ima ukupnu ćelijsku gustinu od 3 x 10<8>CFU/ml.
[0648] Pre primene tretmana, respektivne neindukovane rekombinantne probiotske bakterije obezbeđene u 10 ml IM1 medijuma inkubirane su na 30°C bez mućkanja i optička gustina je određivana spektrofotometrijski na talasnoj dužini od 600 nm (OD600).
[0649] Na OD600 0.5 nisina je dodato u krajnjoj koncentraciji od 5 ng/ml. Posle dodatne inkubacije u trajanju od 30 min. na 30°C indukovana kultura je prebačena do 10°C. Kasnije, respektivna indukovana kultura je primenjena injekcijom kroz Bioclusive film upotrebom igle veličine 27.
[0650] Tretmani su primenjivani prema šemi opisanoj u Tabeli 2a i 2b. Životinje grupe tretmana 1 do 9 primile su jednu primenu od 50 µl na dan 0. Životinje grupa tretmana 10 do 18 primile su sedam uzastopnih primena podeljenih kao pojedinačne primene od 50 µl na dan i to na dane 0, 1, 2, 3, 4, 5, i 6.
[0651] Šest časova posle prve primene tretmana, tečnost rane je sakupljena iz svih životinja u grupama 1 do 4. Tečnost rane sakupljena iz kombinovane grupe (grp 1) je obrađena na takav način da se omogući brojanje CFU rekombinantnih probiotskih bakterija. Tečnost uzeta iz rana u preostalim grupama je održavana na vlažnom ledu pre prebacivanja na -80°C za dugotrajnije čuvanje. Posle sakupljanja tečnosti rane, sve životinje u ovim grupama su žrtvovane (pomoću postupka odobrenog od strane UK Home Office). Pre žrtvovanja, uzimana je sistemska krv preko punkture srca u EDTA tretirane epruvete. Jedna polovina uzorka krvi je centrifugirana da bi se dobila plazma; preostala polovina je održavana na 4°C preko noći pre slanja u Langford Veterinary Services Ldt. (Bristol, UK), gde je izvršena analiza cele krvi i diferencijalna analiza krvi. Post-mortem uzorci jetre, bubrega, slezine, srca, plućnog tkiva i isušenih limfnih čvorova su sakupljeni iz svih životinja (plazma i tkiva se postavljaju u kriovijalice koje su brzo zamrznute u tečnom azotu – nakon čega su čuvane na -80°C).
[0652] 24 časa posle prve primene tretmana, tečnost rane je sakupljena iz svih životinja u grupama 5 do 9 i čuvana je kao što je opisano u prethodnom tekstu. Krv je sakupljana i čuvana i životinje su zatim žrtvovane. Tečnost rane, cela krv, plazma i uzorci tkiva su sakupljeni i čuvani kao što je opisano u prethodnom tekstu.
[0653] Jedan dan posle prive primene i u dnevnim intervalima nakon toga do dana 6, tretmani su ponovo primenjivani na sve rane u grupama 10 do 15.
[0654] 2 dana posle prve primene tretmana (1 dan posle druge primene), tečnost rane je sakupljena iz svih životinja u grupama 10 do 15 i čuvana je kao što je opisano u prethodnom tekstu.
[0655] 7 dana posle prve primene tretmana (jedan dan posle finalne primene tretmana na dan 6), tečnost rane je sakupljena iz svih životinja u grupama 10 do 15 i čuvana kao što je opisano u prethodnom tekstu. Krv je sakupljana i čuvana i životinje su zatim žrtvovane. Posle žrtvovanja, tkivo rane i marginalno tkivo su sakupljeni i obrađeni za histološko ispitivanje (videti deo 3.7). Tečnost rane, cela krv, plazma i uzorci tkiva su sakupljeni i čuvani kao što je opisano u prethodnom tekstu.
[0656] Na dane 4 i 7 posle ranjavanja, životinje u grupama 10 do 15 su ponovo anestezirani i njihove rane su procenjivane i digitalno fotografisane zajedno sa kalibracionom/pločom identiteta. Na dan 4 ovo je izvedeno sa postavljenim Bioclusive filmom. Na dan 7, omotači i svi slobodni ostaci su uklonjeni i rane su zatim čišćene upotrebom sterilne gaze natopljene fiziološkim rastvorom i suvo obrisane sterilnom gazom. Rane su procenjivane i digitalno fotografisane zajedno sa kalibracionom/pločom identiteta.
Tabela 2a: Eksperimentalne grupe studije 1
Tabela 2b: Eksperimentalne grupe studije 2
Analiza slike zatvaranja rane
[0657] Image Pro softver za analizu slika (verzija 4.1.0.0, Media Cybernetics, USA) je korišćen za merenje zatvaranja rane sa slika rana u grupama 10 do 15 i 16 do 18 tokom vremena. Za svaku ranu u svakoj vremenskoj tački (dani 4 & 7 za grupe 10 do 15 i dane 4, 7, 8, i 12 za grupe 16 do 18), merena je površina otvorene rane i izražena je u % površine rane u odnosu na dan 0.
Preživljavanje rekombinantnih probiotskih bakterija posle 6 časova nakon primene.
[0658] Šest časova posle uvođenja kombinacije bakterije koje eksprimiraju FGF2, IL4 i CSF1 u ranu, tečnost rane je ekstrahovana i izvedeno je brojanje jedinica koje formiraju bakterijsku koloniju (CFU). Rezultati brojanja CFU iz 5 rana dati su u Tabeli 3.
[0659] Rezultat potvrđuje da su bakterije vijabilne u rani i još uvek sposobne da proliferišu, posle boravka u rani od 6 časova, ističući činjenicu da se gore navedene rekombinantne probiotske bakterije mogu koristiti za isporuku terapeutskih proteinskih kombinacija na rane.
Tabela 3: Rezultati brojanja CFU
Odgovor zarastanja rane u različitim grupama tretmana
[0660] Odgovor zarastanja rane u različitim grupama tretmana na post-ranjavanje je procenjivan vizuelnim pregledom 4 i 7 dana posle početnog tretmana.
[0661] Vizuelni pregled golim okom kao i kvantitativna analiza pomoću Image Pro softvera za analizu slika grupa 10 do 15 otkriva da se zarastanje rane javlja čak tako rano kao četiri dana posle početnog tretmana. Pored toga, na dan sedam miševi tretirani trodelnom kombinacijom rekombinantnih probiotskih bakterija koje eksprimiraju FGF2, IL4, i CSF1 (grupe tretmana 1, 5 i 10) pokazuju bolji odgovor zarastanja (pokazujući nagomilavanje roze/crvenog granulacionog tkiva kao epitelizaciju rane) u poređenju sa individualnim grupama tretmana probiotskim bakterijama koje eksprimiraju FGF2 (AUP-10), probiotskim bakterijama koje eksprimiraju IL4 (AUP-12) i probiotskim bakterijama koje eksprimiraju CSF1 (AUP-14), kao i u poređenju sa pozitivnom kontrolom (tj. TGF-alfa i PDGF-BB). Rezultati su prikazani na Slici 15a.
[0662] Slika 15a ilustruje odgovor zarastanja rane u različitim grupama tretmana.
[0663] Individualne grupe tretmana pokazuju sličan odgovor zarastanja, koji je bolji nego kod grupe tretirane IM1 medijumom (grupa tretirana vehikulumom). Rezultati su pokazali sinergistički efekat kombinovanja FGF2, IL4 i CSF1 u zarastanju rane.
[0664] Miševi tretirani sa FGF2 (AUP-10) dodatno su pokazali formiranje granulacionog tkiva, kao i vaskularizaciju, ali ne epitelizaciju. Takođe se može videti da postoji curenje iz krvnih sudova kada su probiotske bakterije koje eksprimiraju FGF2 korišćene pojedinačno. Probiotske bakterije koje eksprimiraju IL4 (AUP-12) i probiotske bakterije koje eksprimiraju CSF1 (AUP-14) pokazale su uglavnom epitelijelizaciju rane, ali ne granulaciju, dok rane tretirane trodelnom kombinacijom rekombinantnih probiotskih bakterija (AUP-10 AUP-12 AUP-14) pokazuju formiranje granulacionog tkiva kao i epitelizaciju rane. Ne može se videti curenje krvnih sudova.
[0665] Važno je znati da je kod dijabetičkih čireva stopala (kod ljudi) epitelijelizacija zavisna od formiranja granulacionog tkiva. Bez formiranja granulacionog tkiva, epitelijalizacija se ne može javiti i rana se ne zatvara.
[0666] U grupama 16 do 18 AUP-16 (rekombinantne bakterije koje eksprimiraju FGF2, IL4 i CSF1 u jednoj bakterijskoj ćeliji) je upoređivan sa tretmanom vehikulumom (fiziološki rastvor+ zavoj) i pozitivna kontrola (tj. TGF-alfa PDGF-BB). Tokom dana 4, 8 i 12 AUP-16 je pokazala superiornost u zarastanju rane u poređenju sa pozitivnom kontrolnom grupom (TGFalfa PDGF-BB). Rezultati su prikazani na Slici 15b.
[0667] Poređenje statusa zarastanja rane kontrolne (grupa 16 tretirana fiziološkim rastvorom), pozitivne kontrolne (grupa tretmana 17) i tkiva tretiranog sa AUP-16 (grupa tretmana 18) posle post-ranjavanja i posle 4, 8 i 12 dana je prikazano na Slici 15b.
[0668] Dan 0 predstavlja originalnu ranu neposredno posle ranjavanja. Ista rana je takođe prikazana na dane 4, 8 i 12. Odgovarajuće fotografije su približno istih razmera da bi se vizuelizovalo zarastanje rane. Crni stub na svakoj fotografiji predstavlja 1 cm.
[0669] Poređenje preostale površine rane posle dana 8 i dana 12 pozitivne kontrolne (grupe tretmana 17) i tkiva tretiranog sa AUP-16 (grupa tretmana 18) prikazano je na Slici 15c.
[0670] Preostala površina rane je merena pomoću Image Pro softvera za analizu slika na slikama rana i izražena prema % površine rane u odnosu na dan 0.
[0671] Na dan 12 zabeleženo je skoro potpuno zatvaranja rane u ranama tretiranim kombinacijom (AUP-16). Ovo je reflektovano preostalom površinom rane od 1,37 % u odnosu na površinu rane na dan 0 neposredno posle ranjavanja.
[0672] Dodatno, sa Slika 15a i 15b se može videti da je u ranama tretiranim trodelnom kombinacijom kao i AUP-16 zabeleženo značajno bolje zatvaranje rane u poređenju sa ranama tretiranim rekombinantnim faktorom rasta-BB poreklom od humanih trombocita u kombinaciji sa rekombinantnim humanim transformišućim faktorom rasta-alfa (pozitivna kontrola), naročito na dan 12.
[0673] Svi režimi bakterijskog tretmana ispitivani u ovom eksperimentu, AUP-10, AUP-12 i AUP-14 – primenjeni pojedinačno ili kao deo trodelne kombinacije kao i AUP-16, nađeno je da stimulišu popravku rane u dijabetičkom db/db mišu, koji je široko prihvaćen i jedan od najbolje potvrđeni životinjski model osloženog zarastanja rane kod ljudi.
[0674] Ekcizione rane kod db/db miševa pokazuju statistički značajno odlaganje u zatvaranju rane, smanjeno formiranje granulacionog tkiva, smanjen vaskularitet dna rane i izrazito smanjena proliferacija, kao što je na primer opisano u Michaels et al. (2007) ("db/db mice exhibit severe wound-healing impairments compared sa other murine diabetic strains in a silicone-splinted excisional wound model", Wound Rep. Reg. 15, pages 665 do 670).
[0675] Eksperimentalni rezultati jasno pokazuju da primena rekombinantnih probiotskih bakterija prema predmetnom pronalasku daje značajno poboljšanje u lečenju rana kod ljudi, naročito hroničnih rana.
[0676] Primena rekombinantnih probiotskih bakterija prema predmetnom pronalasku indukuje formiranje granulacionog tkiva, povećanu vaskularnost dna rane i proliferaciju, na taj način dovodeći do poboljšanog i ubrzanog zatvaranja rane čak u modelu koji ispoljava teška pogoršanja zarastanja rane.
[0677] Ovi rezultati, na taj način, pokazuju da hronične inflamatorne kožne disfunkcije kao što su čir, rana ili njihove kombinacije, dodatno poželjno čir, imaju korist od primene rekombinantnih probiotskih bakterija prema predmetnom pronalasku.
[0678] Na primer, hronične rane kao što su hronični venski čirevi, hronični arterijski čirevi, hronični dijabetički čirevi i hronični dekubitusi, mogu biti tretirani primenom rekombinantnih probiotskih bakterija prema predmetnom pronalasku, s obzirom na to da su pogoršanja zarastanja rane zabeležena u odgovarajućim hroničnim ranama prevaziđena posle primene rekombinantnih probiotskih bakterija prema predmetnom pronalasku.
LISTING SEKVENCI

Claims (20)

Patentni zahtevi
1. Rekombinantne probiotske bakterije, koje sadrže
(a) sekvencu (sekvence) nukleinske kiseline koje kodiraju prvi heterologni faktor, (a) sekvencu (sekvence) nukleinske kiseline koje kodiraju drugi heterologni faktor, i poželjno (a) sekvencu (sekvence) nukleinske kiseline koje kodiraju treći heterologni faktor,
uz uslov da pomenuti prvi faktor, pomenuti drugi faktor, i pomenuti treći faktor su međusobno funkcionalno različiti, pri čemu pomenuti prvi faktor je faktor rasta, pri čemu pomenuti drugi faktor je izabran iz grupe koja se sastoji od M2- polarizujućih faktora, i naznačeno time poželjno pomenuti treći faktor je izabran iz grupe koja se sastoji od M2-polarizujućih faktora i faktora rasta,
pri čemu pomenuti M2-polarizujući faktor je izabran iz grupe koja se sastoji od interleukina 4 (IL-4), interleukina 10 (IL-10), interleukina 13 (IL-13), faktora stimulisanja kolonije-1 (CSF1), interleukina 34 (IL34), i njihovih smeša, i
pri čemu pomenuti faktor rasta je izabran iz grupe koja se sastoji od faktora rasta fibroblasta (FGF), vaskularnih endotelnih faktora rasta (VEGF), epidermalnih faktora rasta (EGF), heparinvezujućeg EGF-sličnog faktora rasta (HB-EGF), transformišućeg faktora rasta -α (TGF-a), insulin-sličnih faktora rasta (IGF), faktora rasta izvedenih iz trombocita (PDGF), transformišućeg faktora rasta beta (TGF-β), i njihovih smeša
2. Rekombinantne probiotske bakterije prema patentnom zahtevu 1, naznačene time što je (su) pomenuta (pomenute) aminokiselinske sekvence locirane na najmanje jednom od hromozoma i plazmida pomenute rekombinantne probiotske bakterije.
3. Rekombinantne probiotske bakterije prema bilo kom od patentnih zahteva 1 ili 2, naznačene time što je ekspresija pomenute/pomenutih sekvence (sekvenci) nukleinske kiseline kontrolisana pomoću konstitutivnog promotora ili inducibilnog promotora.
4. Rekombinantne probiotske bakterije prema patentnom zahtevu 3, naznačene time što je ekspresija pomenute (pomenutih) sekvence (sekvenci) nukleinskih kiselina kontrolisana pomoću inducibilnog promotora, pri čemu pomenuta(e) sekvenca (sekvence) nukleinske kiseline je (su) ekspresibilna(e) u prisustvu najmanje jednog induktora.
5. Rekombinantne probiotske bakterije prema bilo kom od patentnih zahteva 3 ili 4, naznačene time što pomenuti inducibilni promotor, koji je inducibilan induktorom, je promotor za mikrobijalni gen koji kodira lantibiotski peptid ili njegov funkcionalni analog, pri čemu poželjno pomenuti inducibilni promotor je PnisA, PnisZ, PnisQ, PnisF, PnisU, ili njihove kombinacije od Lactococcus lactis.
6. Rekombinantne probiotske bakterije prema bilo kom od patentnih zahteva 4 ili 5, naznačene time što induktor je najmanje jedan lantibiotski peptid ili njegov funkcionalni analog, poželjno izabran iz grupe koja se sastoji od nisina A, nisina Z, nisina Q, nisina F, nisina U, njihovih funkcionalnih analoga i njihovih smeša.
7. Rekombinantne probiotske bakterije prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 6, naznačene time što pomenute probiotske bakterije dodatno sadrže najmanje jedan inaktivirani gen koji kodira esencijalni protein neophodan za vijabilnost pomenute probiotske bakterije.
8. Rekombinantne probiotske bakterije prema patentnom zahtevu 7, naznačene time što pomenuti najmanje jedan inaktivirani gen neophodan za vijabilnost pomenutih probiotskih bakterija je izabran iz grupe koja se sastoji od alanin racemaze (alaR), timidilat sintaze (thyA), asparagin sintaze (asnH), CTP sintaze (pyrG), triptofan sintaze (trpBA) i njihovih kombinacija.
9. Rekombinantne probiotske bakterije prema bilo kom od patentnih zahteva 7 ili 8, naznačene time što pomenuti gen je inaktiviran delecijom pomenutog gena, mutacijom pomenutog gena, epigenetičkom modifikacijom pomenutog gena, utišavanjem pomenutog gena koje je posredovano preko RNK interferencije (RNKi), translacionom inhibicijom pomenutog gena ili njihovim kombinacijama.
10. Rekombinantne probiotske bakterije prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 9, naznačene time što najmanje jedan od pomenutog prvog faktora, pomenutog drugog faktora i pomenutog trećeg faktora se može osloboditi iz pomenute rekombinantne probiotske bakterije.
11. Rekombinantne probiotske bakterije prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 10, naznačene time što pomenuti faktori rasta fibroblasta (FGF) su izabrani iz grupe koja se sastoji od faktora 1 rasta fibroblasta, faktora 2 rasta fibroblasta, faktora 7 rasta fibroblasta (faktor rasta keratinocita), faktora 10 rasta fibroblasta (faktor 2 rasta keratinocita) i njihovih smeša.
12. Rekombinantne probiotske bakterije prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 11, naznačene time što pomenuti prvi, drugi, i treći heterologni faktor je kombinacija sledećih
• faktor 2 rasta fibroblasta, faktor-1 stimulacije kolonija i interleukin 4,
• faktor 2 rasta fibroblasta, interleukin 34 i interleukin 4,
• faktor 2 rasta fibroblasta, faktor-1 stimulacije kolonija i interleukin 13,
• faktor 2 rasta fibroblasta, interleukin 34 i interleukin 13,
• faktor 2 rasta fibroblasta, faktor-1 stimulacije kolonija i interleukin 10,
• faktor 2 rasta fibroblasta, interleukin 34 i interleukin 10,
• faktor 7 rasta fibroblasta, faktor-1 stimulacije kolonija i interleukin 4,
• faktor 7 rasta fibroblasta, interleukin 34 i interleukin 4,
• faktor 7 rasta fibroblasta, faktor-1 stimulacije kolonija i interleukin 13,
• faktor 7 rasta fibroblasta, interleukin 34 i interleukin 13,
• faktor 7 rasta fibroblasta, faktor-1 stimulacije kolonija i interleukin 10,
• faktor 7 rasta fibroblasta, interleukin 34 i interleukin 10,
• transformišući faktor rasta beta, faktor-1 stimulacije kolonija i interleukin 4,
• transformišući faktor rasta beta, interleukin 34 i interleukin 4,
• transformišući faktor rasta beta, faktor-1 stimulacije kolonija i interleukin 13,
• transformišući faktor rasta beta, interleukin 34 i interleukin 13
• transformišući faktor rasta beta, faktor-1 stimulacije kolonija i interleukin 10,
• transformišući faktor rasta beta, interleukin 34 i interleukin 10,
• transformišući faktor rasta alfa, faktor-1 stimulacije kolonija i interleukin 4,
• transformišući faktor rasta alfa, interleukin 34 i interleukin 4,
• transformišući faktor rasta alfa, faktor-1 stimulacije kolonija i interleukin 13,
• transformišući faktor rasta alfa, interleukin 34 i interleukin 13
• transformišući faktor rasta alfa, faktor-1 stimulacije kolonija i interleukin 10,
• transformišući faktor rasta alfa, interleukin 34 i interleukin 10
• faktor BB rasta poreklom iz trombocita, faktor-1 stimulacije kolonija i interleukin 4,
• faktor BB rasta poreklom iz trombocita, interleukin 34 i interleukin 4,
• faktor BB rasta poreklom iz trombocita, faktor-1 stimulacije kolonija i interleukin 13,
• faktor BB rasta poreklom iz trombocita, interleukin 34 i interleukin 13
• faktor BB rasta poreklom iz trombocita, faktor-1 stimulacije kolonija i interleukin 10, ili • faktor BB rasta poreklom iz trombocita, interleukin 34 i interleukin 10.
13. Rekombinantne probiotske bakterije prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 12, naznačene time što pomenuti prvi, drugi i treći heterologni faktor je kombinacija faktora 2 rasta fibroblasta, faktora-1 stimulacije kolonija i interleukina 4, njihovih funkcionalnih analoga i njihovih biosličnih supstanci.
14. Rekombinantne probiotske bakterije prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 13, naznačene time što pomenuti rekombinantne probiotske bakterije su bakterije mlečne kiseline, poželjno vrste Lactobacillus ili Lactococcus.
15. Rekombinantne probiotske bakterije prema patentnom zahtevu 14, naznačene time što pomenuta vrsta Lactococcus je Lactococcus lactis, poželjno Lactococcus lactis podvrsta cremoris.
16. Rekombinantne probiotske bakterije prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 15, naznačene time što pomenute rekombinantne probiotske bakterije su u rastvoru, zamrznute ili osušene, poželjno liofilizovane ili osušene zamrzavanjem.
17. Rekombinantne probiotske bakterije prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 16, naznačene time što pomenute rekombinantne probiotske bakterije će se primenjivati topikalno i/ili preko potkožne injekcije.
18. Rekombinantne probiotske bakterije za upotrebu u lečenju hronične rane, naznačene time što pomenute rekombinantne probiotske bakterije su rekombinantne probiotske bakterije prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 16, pri čemu pomenuti prvi, drugi i treći heterologni faktor je kombinacija faktora 2 rasta fibroblasta, faktora-1 stimulacije kolonija i interleukina 4.
19. Rekombinantne probiotske bakterije za upotrebu prema patentnom zahtevu 18, naznačene time što pomenuta hronična rana je najmanje jedna od hroničnog venskog čira, hroničnog arterijskog čira, hroničnog dijabetičkog čira, hroničnog dekubitusa i njegovog hroničnog preulceroznog stadijuma.
20. Farmaceutska kompozicija za upotrebu u lečenju hronične rane, koja sadrži rekombinantne probiotske bakterije prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 16, pri čemu pomenuti prvi, drugi, i treći heterologni faktor je kombinacija faktora 2 rasta fibroblasta, faktora-1 stimulacije kolonija i interleukina 4.
RS20200690A 2015-02-04 2015-11-02 Rekombinantne probiotske bakterije RS60437B1 (sr)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PCT/EP2015/052345 WO2016124239A1 (en) 2015-02-04 2015-02-04 Recombinant probiotic bacteria for use in the treatment of a skin dysfunction
PCT/EP2015/075484 WO2016124266A1 (en) 2015-02-04 2015-11-02 Recombinant probiotic bacteria
EP15821025.2A EP3253402B1 (en) 2015-02-04 2015-11-02 Recombinant probiotic bacteria

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS60437B1 true RS60437B1 (sr) 2020-07-31

Family

ID=53039847

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20200690A RS60437B1 (sr) 2015-02-04 2015-11-02 Rekombinantne probiotske bakterije

Country Status (27)

Country Link
US (1) US10738315B2 (sr)
EP (1) EP3253402B1 (sr)
JP (1) JP6726419B2 (sr)
KR (1) KR102172228B1 (sr)
CN (1) CN107438666B (sr)
AU (1) AU2015381262B2 (sr)
CA (1) CA2975636C (sr)
CY (2) CY20182200002T2 (sr)
DE (1) DE15821025T8 (sr)
DK (1) DK3253402T3 (sr)
ES (1) ES2673007T3 (sr)
HR (1) HRP20200973T1 (sr)
HU (1) HUE050790T2 (sr)
IL (1) IL253782B (sr)
LT (1) LT3253402T (sr)
MX (1) MX384240B (sr)
NZ (1) NZ734579A (sr)
PL (1) PL3253402T3 (sr)
PT (1) PT3253402T (sr)
RS (1) RS60437B1 (sr)
RU (1) RU2723324C2 (sr)
SG (1) SG11201706398VA (sr)
SI (1) SI3253402T1 (sr)
SM (1) SMT202000344T1 (sr)
TR (1) TR201808169T3 (sr)
WO (2) WO2016124239A1 (sr)
ZA (1) ZA201705812B (sr)

Families Citing this family (24)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2864373T3 (es) 2014-12-23 2021-10-13 Ilya Pharma Ab Métodos para la cicatrización
WO2018051223A1 (en) 2016-09-13 2018-03-22 Intrexon Actobiotics N.V. Mucoadhesive microorganism
US12121573B2 (en) 2019-07-14 2024-10-22 Tianxin Wang Methods and agents including STING agonist to treat tumor
WO2019113023A1 (en) * 2017-12-04 2019-06-13 The BioCollective, LLC Probiotics and methods of use
WO2019162935A1 (en) 2018-02-24 2019-08-29 Clearskin Ltd Compositions, devices, systems, kits and methods for the treatment of a skin condition
US20230240348A1 (en) * 2018-06-19 2023-08-03 Coenbio Co., Ltd. Composition for improving liver function comprising leuconostoc sp. strain
WO2019245225A1 (ko) * 2018-06-19 2019-12-26 (주)코엔바이오 류코노스톡속 균주를 포함하는 장 기능 개선용 조성물
KR102173168B1 (ko) * 2018-06-19 2020-11-03 주식회사 엠디헬스케어 류코노스톡속 균주를 포함하는 장 기능 개선용 조성물
KR102283127B1 (ko) * 2018-06-19 2021-07-29 주식회사 엠디헬스케어 류코노스톡속 균주를 포함하는 간 기능 개선용 조성물
US20220177533A1 (en) * 2018-08-08 2022-06-09 Sree Chitra Tirunal Institute For Medical Sciences And Technology Recombinant TGF a for wound healing purposes, and the process thereof
CN109078171A (zh) * 2018-09-10 2018-12-25 因之彩生物科技（武汉）有限公司 一种外用组合物及其应用以及外用治疗剂
IL285990B2 (en) * 2019-03-04 2025-09-01 Celloryx AG Chloride-induced prenuclear expression system
IT201900003115A1 (it) * 2019-03-04 2020-09-04 Univ Degli Studi Roma La Sapienza Lattococco ingegnerizzato
BR112021023682A2 (pt) * 2019-06-24 2022-04-12 Mendes Srl Composição com ação antibacteriana e de reepitelização incluindo probióticos
CN112175890A (zh) * 2019-07-02 2021-01-05 深伦生物科技（深圳）有限公司 一种以食用菌分泌乙醇脱氢酶的基因工程菌
KR102343938B1 (ko) * 2020-09-02 2021-12-28 주식회사 비피도 재조합 비피도박테리움 비피덤 bgn4를 포함하는 염증 개선용 조성물
CN112359049B (zh) * 2020-12-10 2022-01-28 昆明理工大学 一种岷江百合几丁质酶基因LrCHI2及其应用
KR102253283B1 (ko) * 2020-12-21 2021-05-18 주식회사 비피도 비피도박테리움 비피덤을 이용한 인간 egf 단백질의 생산방법 및 이를 함유하는 조성물
JP2024508541A (ja) * 2021-03-05 2024-02-27 ザ リージェンツ オブ ザ ユニヴァーシティ オブ カリフォルニア 皮膚プロバイオティクス
KR102809763B1 (ko) * 2021-12-06 2025-05-20 주식회사 바이오에프디엔씨 세포 투과형 성장인자를 포함하는 세포 배양 또는 증식을 위한 조성물
CN114395514B (zh) * 2022-02-28 2023-09-01 鲁东大学 一株嗜酸乳杆菌、菌剂及其应用
KR102838081B1 (ko) * 2022-04-12 2025-07-24 고려대학교 산학협력단 마이크로바이옴을 이용하여 당뇨족부궤양 예후를 예측하는 방법
CN114957437B (zh) * 2022-06-06 2023-03-21 陕西理工大学 一种leap-2重组蛋白和一种重组乳酸乳球菌及其应用
CN115181710B (zh) * 2022-09-13 2022-11-25 北京量化健康科技有限公司 一株唾液乳杆菌b12wu及其应用

Family Cites Families (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
BRPI0511261A (pt) 2004-05-18 2007-11-27 Vib Vzw linhagem isolada de lactobacillus sp., uso de uma linhagem isolada de lactobacillus sp., e composição farmacêutica
US8682619B2 (en) * 2005-12-14 2014-03-25 The Invention Science Fund I, Llc Device including altered microorganisms, and methods and systems of use
CA2675115C (en) 2007-01-12 2014-12-09 Actogenix N.V. Lactococcus promoters and uses thereof
CA2689658A1 (en) * 2007-06-20 2008-12-24 Actogenix Nv Methods and compositions for treating mucositis
AU2009223115B2 (en) * 2008-03-14 2015-09-24 Humanzyme, Inc. Recombinant production of authentic human proteins using human cell expression systems
EP2356242A2 (en) 2008-09-30 2011-08-17 Novozymes Inc. Methods for using positively and negatively selectable genes in a filamentous fungal cell
DK2362866T3 (en) 2008-11-11 2015-10-12 Signum Biosciences Inc Isoprenylforbindelser and their methods
US20100247461A1 (en) 2009-01-20 2010-09-30 Signum Biosciences, Inc. Anti-inflammatory complexes
FR2948868B1 (fr) * 2009-08-07 2011-10-07 Anthogyr Sa Piece a main a moyens de connexion electrique
AU2011206532B8 (en) 2010-01-14 2015-08-06 Inserm (Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale) Recombinant probiotic bacteria for the prevention and treatment of inflammatory bowel disease (IBD) and irritable bowel syndrome (IBS)
US20130078275A1 (en) * 2010-05-25 2013-03-28 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Novel systems, vectors, and methods for delivery of biomolecules to eukaryotic cells
CN103189504B (zh) * 2010-06-18 2017-05-24 北卡罗莱纳州立大学 减少炎性反应的具有减少的脂磷壁酸的重组乳杆菌
CN101892189B (zh) 2010-07-05 2012-07-04 浙江大学 一种口服免疫阻断猪生长抑素作用的转化子及其应用
JP2012019768A (ja) 2010-07-16 2012-02-02 Osaka Univ Ｊｍｊｄ３遺伝子改変非ヒト哺乳動物、Ｊｍｊｄ３遺伝子改変骨髄キメラ非ヒト哺乳動物、及びその利用
TWI566701B (zh) 2012-02-01 2017-01-21 日本農藥股份有限公司 芳烷氧基嘧啶衍生物及包含該衍生物作為有效成分的農園藝用殺蟲劑及其使用方法
GB201206599D0 (en) * 2012-04-13 2012-05-30 Univ Manchester Probiotic bacteria
TWI613833B (zh) 2012-11-09 2018-02-01 Sony Corp 光電變換元件、固體攝像裝置及電子機器
CA2890034A1 (en) * 2012-11-16 2014-05-22 Allergan, Inc. Skin wound healing and scar reduction with prostaglandin ep4 agonist combinations
CA2950945A1 (en) * 2014-06-17 2015-12-23 Xycrobe Therapeutics, Inc. Genetically modified bacteria and methods for genetic modification of bacteria

Also Published As

Publication number Publication date
EP3253402B1 (en) 2020-04-29
TR201808169T3 (tr) 2018-07-23
DE15821025T8 (de) 2018-09-13
HUE15821025T1 (hu) 2018-12-28
WO2016124266A1 (en) 2016-08-11
KR20170118772A (ko) 2017-10-25
DK3253402T1 (da) 2018-06-18
CA2975636A1 (en) 2016-08-11
PL3253402T3 (pl) 2021-02-08
CA2975636C (en) 2022-12-06
LT3253402T (lt) 2020-06-10
KR102172228B1 (ko) 2020-11-02
MX2017010150A (es) 2018-06-15
EP3253402A1 (en) 2017-12-13
SI3253402T1 (sl) 2020-08-31
US20180135062A1 (en) 2018-05-17
RU2017127991A (ru) 2019-03-04
DK3253402T3 (da) 2020-06-02
CN107438666B (zh) 2021-08-17
AU2015381262B2 (en) 2019-03-28
MX384240B (es) 2025-03-14
CY20182200002T2 (el) 2018-09-05
CY1123065T1 (el) 2021-10-29
ZA201705812B (en) 2019-12-18
HUE050790T2 (hu) 2021-01-28
ES2673007T1 (es) 2018-06-19
JP2018509932A (ja) 2018-04-12
ES2673007T3 (es) 2021-01-22
NZ734579A (en) 2019-10-25
JP6726419B2 (ja) 2020-07-22
CN107438666A (zh) 2017-12-05
IL253782B (en) 2022-04-01
PT3253402T (pt) 2020-07-07
DE15821025T1 (de) 2018-07-26
HRP20200973T1 (hr) 2020-10-02
US10738315B2 (en) 2020-08-11
RU2723324C2 (ru) 2020-06-09
RU2017127991A3 (sr) 2019-03-04
BR112017016772A2 (pt) 2018-04-17
SMT202000344T1 (it) 2020-07-08
SG11201706398VA (en) 2017-09-28
AU2015381262A1 (en) 2017-08-17
WO2016124239A1 (en) 2016-08-11
IL253782A0 (en) 2017-09-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU2015381262B2 (en) Recombinant probiotic bacteria
EP3735979B1 (en) Methods for wound healing
CA3131796C (en) Chloride-inducible prokaryotic expression system
HK1240848A1 (en) Recombinant probiotic bacteria
HK1240848B (en) Recombinant probiotic bacteria
BR112017016772B1 (pt) Bactérias probióticas recombinantes
RU2812766C2 (ru) Хлорид-индуцируемая прокариотическая система экспрессии
HK40065816A (en) Chloride-inducible prokaryotic expression system
HK40065816B (en) Chloride-inducible prokaryotic expression system
HK1242736B (en) Methods for wound healing