RS59252B1 - Modulatori faktora b komplementa - Google Patents

Description

Opis

Oblast pronalaska

[0001] Predmetna izvođenja se odnose na postupke, jedinjenja, i kompozicije za lečenje, prevenciju, ili ublažavanje bolesti koja je povezana sa disregulacijom alternativnog puta komplementa ordiniranjem specifičnog inhibitora faktora B komplementa (engl. Complement Factor BCFB) subjektu.

Stanje tehnike

[0002] Sistem komplementa je deo urođenog imunskog sistema domaćina koji je uključen u lizu stranih ćelija, pospešivanje fagocitoze antigena, grupisanja agenasa koji nose antigene, i privlačenje makrofaga i neutrofila. Sistem komplementa je podeljen u tri puta inicijacije - klasičan, lektinski, i alternativni putevi koji konvergiraju ka komponenti C3 da se dobije enzimski kompleks koji je poznat pod imenom C3 konvertaza, koja cepa C3 u C3a i C3b. C3b se udružuje sa C3 konvertazom pomoću CFB i za rezultat se dobija C5 konvertaza, koja cepa C5 u C5a i C5b, pri čemu se pokreće put membranskog napada koji za rezultat ima obrazovanje kompleksa koji napada membranu (engl. membrane attack complex -MAC) koji obuhvata komponente C5b, C6, C7, C8, i C9. Kompleks koji napada membranu (MAC) obrazuje transmembranske kanale i narušava fosfolipidni dvosloj ciljanih ćelija, što dovodi do ćelijske lize.

[0003] U homeostatskom stanju, alternativni put je kontinuirano aktiviran na niskom "tickover" nivou kao rezultat aktivacije alternativnog puta spontanom hidrolizom C3 i proizvodnjom C3b, pri čemu nastaje C5 konvertaza.

[0004] WO 2004/103288 prikazuje postupke za lečenje, prevenciju, ili smanjenje rizika za, pobačaje, posebno rekurentne pobačaje.

Suština pronalaska

[0005] Sistem komplementa posreduje u urođenom imunitetu i igra važnu ulogu u normalnom zapaljenskom odgovoru na povredu, ali njegova disregulacija može da uzrokuje ozbiljnu povredu. Aktivacija alternativnog puta komplementa izvan njegovog konstitutivnog "tickover" nivoa može da dovede do nekontrolisane hiperaktivnosti i ispoljava se u vidu bolesti koje se karakterišu disregulacijom komplementa.

[0006] Predmetni pronalazak obezbeđuje jedinjenje koje obuhvata modifikovani oligonukleotid koji se sastoji iz 20 vezanih nukleozida koji imaju nukleobaznu sekvencu koja obuhvata sekvencu koja je navedena u SEQ ID NO: 440, 198, 228, 237, 444,448, 450, 453, ili 455, pri čemu modifikovani oligonukleotid obuhvata:

segment razmaka koji se sastoji iz deset vezanih dezoksinukleozida;

5’ segment „krila“ koji se sastoji iz pet vezanih nukleozida; i

3’ segment „krila“ koji se sastoji iz pet vezanih nukleozida;

pri čemu je segment razmaka pozicioniran između 5’ segmenta „krila“ i 3’ segmenta „krila“, pri čemu svaki nukleozid od svakog segmenta „krila“ obuhvata 2’-O-metoksietil šećer; pri čemu svaka internukleozidna veza je fosforotioatna veza i pri čemu svaki citozin je 5-metilcitozin.

[0007] Pronalazak takođe obezbeđuje jedinjenje koje ima formulu:

, ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so.

[0008] Pronalazak takođe obezbeđuje jedinjenje koje obuhvata modifikovani oligonukleotid koji se sastoji iz 16 vezanih nukleozida koji imaju nukleobaznu sekvencu koja se sastoji iz sekvence koja je navedena u SEQ ID NO: 598, pri čemu modifikovani oligonukleotid obuhvata:

segment razmaka koji se sastoji iz deset vezanih dezoksinukleozida;

5’ segment „krila“ koji se sastoji iz pet vezanih nukleozida; i

3’ segment „krila“ koji se sastoji iz pet vezanih nukleozida;

pri čemu je segment razmaka pozicioniran između 5’ segmenta „krila“ i 3’ segmenta„krila“; pri čemu 5’ segment „krila“ obuhvata 2’-O-metoksietil šećer, 2’-O-metoksietil šećer, i cEt šećer u 5’ ka 3’ smeru; pri čemu 3’ segment „krila“ obuhvata cEt šećer, cEt šećer, i 2’-O-metoksietil šećer u 5’ ka 3’ smeru; pri čemu svaka internukleozidna veza je fosforotioatna veza; i pri čemu svaki citozin je 5-metilcitozin.

[0009] Pronalazak takođe obezbeđuje jedinjenje koje obuhvata modifikovani oligonukleotid koji se sastoji iz 16 vezanih nukleozida koji imaju nukleobaznu sekvencu koja se sastoji iz sekvence koja je navedena u SEQ ID NO: 549, pri čemu modifikovani oligonukleotid obuhvata:

segment razmaka koji se sastoji iz deset vezanih dezoksinukleozida;

5’ segment „krila“ koji se sastoji iz tri vezana nukleozida; i

3’ segment „krila“ koji se sastoji iz tri vezana nukleozida;

pri čemu je segment razmaka pozicioniran između 5’ segmenta „krila“ i 3’ segmenta „krila“; pri čemu svaki nukleozid od svakog segmenta „krila“ obuhvata cEt šećer; pri čemu svaka internukleozidna veza je fosforotioatna veza; i pri čemu svaki citozin je 5-metilcitozin.

[0010] Pronalazak takođe obezbeđuje kompoziciju koja obuhvata jedinjenje iz pronalaska i farmaceutski prihvatljivi nosač, opciono gde modifikovani oligonukleotid jedinjenja je so.

[0011] Pronalazak takođe obezbeđuje jedinjenje iz pronalaska ili kompoziciju iz pronalaska za upotrebu u lečenju, prevenciji, ili ublažavanju bolesti koja je povezana sa disregulacijom alternativnog puta komplementa.

[0012] Određena ovde prikazana izvođenja se odnose na postupke za lečenje, prevenciju, ili ublažavanje bolesti koja je povezana sa disregulacijom alternativnog puta komplementa kod subjekta koji obuhvata ordiniranje specifičnog inhibitora faktora B komplementa (CFB). Nekoliko ovde prikazanih izvođenja se odnose na postupak inhibiranja ekspresije CFB kod subjekta koji ima, ili se nalazi u riziku da dobije, bolest koja je povezana sa disregulacijom alternativnog puta komplementa pomoću ordiniranja specifičnog inhibitora CFB subjektu. U određenim izvođenjima, postupak kojim se smanjuje ili inhibira nakupljanje C3 depozita u oku subjekta koji ima, ili se nalazi u riziku da dobije, bolest koja je povezana sa disregulacijom alternativnog puta komplementa obuhvata ordiniranje CFB specifičnog inhibitora subjektu. U nekoliko izvođenja, postupak kojim se redukuje ili se inhibira nakupljanje C3 depozita u bubregu subjekta koji ima, ili se nalazi u riziku da dobije, bolest koja je povezana sa disregulacijom alternativnog puta komplementa obuhvata ordiniranje specifičnog inhibitora CFB subjektu.

Detaljni opis

[0013] Treba razumeti da oba prethodna opšta opisa i detaljni opis koji sledi su primeri i dati su u svrhu objašnjenja i ne ograničavaju pronalazak, koji je predstavljen patentnim zahtevima. Ovde, upotreba oblika u jedinini uključuje množinu osim ukoliko nije specifično drugačije naznačeno. Kao što se ovde koristi, upotreba "ili" označava "i/ili" osim ukoliko nije drugačije naznačeno. Dalje, upotreba termina "uključujući" kao i drugih oblika, kao što su "uključuje" i "uključeno", nije ograničavajuća. Takođe, termini kao što su "element" ili "komponenta" obuhvataju oba elementa i komponente koje sadrže jednu jedinicu i elemente i komponente koji sadrže više od jedne podjedinice, osim ukoliko nije specifično drugačije naznačeno.

[0014] Naslovi odeljaka koji se ovde koriste su namenjeni samo za organizacione svrhe i ne treba ih tumačiti kao ograničavajuće za predmet koji se opisuje. Osim ukoliko nije drugačije naznačeno, sledeći termini imaju sledeća značenja: "2’-O-metoksietil" (takođe 2’-MOE i 2’-O(CH2)2-OCH3) se odnosi na O-metoksi-etil modifikaciju na 2’ položaju furanoznog prstena. 2’-O-metoksietil modifikovani šećer je modifikovani šećer.

[0015] "2’-MOE nukleozid" (takođe 2’-O-metoksietil nukleozid) označava nukleozid koji obuhvata 2’-MOE modifikovani šećerni ostatak.

[0016] "2’-supstituisani nukleozid" označava nukleozid koji obuhvata supstituent na 2’-položaju furanozil prstena koji nije H ili OH. U određenim izvođenjima, 2’ supstituisani nukleozidi uključuju nukleozide sa bicikličnim modifikacijama šećera.

[0017] "3’ ciljno mesto" se odnosi na nukleotid od ciljne nukleinske kiseline koji je kompementaran sa 3’-ciljnim nukleotidom određenog antisens jedinjenja.

[0018] "5’ ciljno mesto" se odnosi na nukleotid od ciljne nukleinske kiseline koji je komplementaran sa 5’-ciljnim nukleotidom određenog antisens jedinjenja.

[0019] "5-metilcitozin" označava citozin koji je modifikovan sa metil grupom koja je vezana za položaj 5. 5-metilcitozin je modifikovana nukleobaza.

[0020] "Oko" označava unutar ±10% vrednosti. Na primer, ako je navedeno, "jedinjenja koja su uticala najmanje oko 70% inhibicije CFB", podrazumeva se da su nivoi CFB inhibirani u okviru opsega od 60% i 80%.

[0021] "Ordiniranje" ili "davanje" se odnosi na načine kojim se uvodi ovde obezbeđeno antisens jedinjenje subjektu kako bi se sprovela njegova namenjena funkcija. Primer načina ordiniranja koji može da se koristi uključuje, ali nije ograničen na parenteralno ordiniranje, kao što je subkutano, intravenozno, ili intramuskularna injekcija ili infuzija.

[0022] "Ublažavanje" se odnosi na slabljenje najmanje jednog indikatora, znaka, ili simptoma povezane bolesti, poremećaja, ili stanja. U određenim izvođenjima, ublažavanje uključuje odlaganje ili usporavanje u razvijanju jednog ili više indikatora stanja ili bolesti. Ozbiljnost indikatora može da bude određena subjektivnim ili objektivnim merenjima, koji su poznati stručnjacima iz oblasti tehnike.

[0023] "Životinja" se odnosi na čoveka ili na životinju koja nije čovek, uključujući, ali bez ograničenja, miševe, pacove, zečeve, pse, mačke, svinje, i ne-humane primate, uključujući, ali bez ograničenja, majmune i šimpanze.

[0024] "Antisens aktivnost" označava bilo koju aktivnost koja može da se detektuje ili izmeri koja se pripisuje hibridizaciji antisens jedinjenja sa njegovom ciljnom nukleinskom kiselinom. U određenim izvođenjima, antisens aktivnost predstavlja smanjenje u količini ili ekspresiji ciljne nukleinske kiseline ili proteina koji je kodiran takvom ciljnom nukleinskom kiselinom.

[0025] "Antisens jedinjenje" označava oligomerno jedinjenje koje je sposobno da hibridizuje sa ciljnom nukleinskom kiselinom preko obrazovanja vodoničnih veza. Primeri antisens jedinjenja uključuju jednolančana i dvolančana jedinjenja, kao što su, antisens oligonukleotidi, siRNK, shRNK, ssRNK, i jedinjenja koja se zasnivaju na zauzetosti.

[0026] "Antisens inhibicija" označava smanjenje nivoa ciljne nukleinske kiseline u prisustvu antisens jedinjenja koje je komplementarno sa ciljnom nukleinskom kiselinom u poređenju sa nivoima ciljne nukleinske kiseline u odsustvu antisens jedinjenja.

[0027] "Antisens mehanizmi" su svi oni mehanizmi koji uključuju hibridizaciju jedinjenja sa ciljnom nuklenskom kiselinom, pri čemu ishod ili efekat hibridizacije je ili ciljano degradiranje ili ciljano zauzimanje sa istovremenim odlaganjem prateće ćelijske mašinerije koja uključuje, na primer, transkripciju ili splajsovanje.

[0028] "Antisensni oligonukleotid" označava jednolančani oligonukleotid koji ima nukleobaznu sekvencu koja dozvoljava hibridizaciju sa odgovarajućim regionom ili segmentom ciljne nukleinske kiseline.

[0029] "Komplementarnost baza" se odnosi na kapacitet za precizno sparivanje nukleobaza anisens oligonukleotida sa odgovarajućim nukleobazama u ciljnoj nukleinskoj kiselini (tj., hibridizacija), i posredovano je sa Watson-Crick-ovim, Hoogsteen-ovim ili reverznim Hoogsteen-ovim vodoničnim vezivanjem između odgovarajućih nukleobaza.

[0030] "Biciklični šećerni ostatak" označava modifikovani ostatak šećera koji obuhvata 4 do 7-člani prsten (uključujući ali bez ograničnja furanozil) koji obuhvata most koji povezuje dva atoma od 4 do 7 članog prstena da bi se obrazovao drugi prsten, pri čemu se dobija biciklična struktura. U određenim izvođenjima, 4 do 7 člani prsten je šećerni prsten. U određenim izvođenjima 4 do 7 člani prsten je furanozil. U određenim takvim izvođenjima, most spaja 2’-ugljenik i 4’ugljenik furanozila.

[0031] "Biciklična nukleinska kiselina" ili " BNA" ili "BNA nukleozidi" označava monomere nukleinske kiseline koji imaju most koji povezuje dva ugljenikova atoma između 4’ i 2’položaja nukleozidne jedinice šećera, pri čemu se obrazuje biciklični šećer. Primeri takvog bicikličnog šećera uključuju, ali nisu ograničeni na A) α-L-Metilenoksi (4’-CH2-O-2’) LNA , (B) β-D-Metilenoksi (4’CH2-O-2’) LNA , (C) Etilenoksi (4’-(CH2)2-O-2’) LNA, (D) Aminooksi (4’-CH2-O-N(R)-2’) LNA i (E) Oksilamino (4’CH2-N(R)-O-2’) LNA, kao što je predstavljeno dole u tekstu ispod.

[0032] Kao što se ovde koristi, LNA jedinjenja uljučuju, ali nisu ograničena na, jedinjenja koja imaju najmanje jedan most između 4’ i 2’ položaju šećera pri čemu svaki od mostova nezavisno obuhvata 1 ili od 2 do 4 vezane grupe koje su nezavisno izabrane od -[C(R1)(R2)]-, -C(R1)=C(R2)-, -C(R1)=N-, -C(=NR1)-, -C(=O)-, -C(=S)-, -O-, -Si(R1)2-, n-S(=O)-i -N(R1)-; pri čemu: x je 0, 1, ili 2; n je 1, 2, 3, ili 4; svaki R1i R2je, nezavisno, H, zaštitna grupa, hidroksil, C1-C12alkil, supstituisani C1-C12alkil, C2-C12alkenil, supstituisani C2-C12alkenil, C2-C12alkinil, supstituisani C2-C12alkinil, C5-C20aril, supstituisani C5-C20aril, heterociklični radikal, supstituisani heterociklični radikal, heteroaril, supstituisani heteroaril, C5-C7aliciklični radikal, supstituisani C5-C7aliciklični radikal, halogen, OJ1, NJ1J2, SJ1, N3, COOJ1, acil (C(=O)-H), supstituisani acil, CN, sulfonil (S(=O)2-J1), ili sulfoksil (S(=O)-J1); i svaki J1i J2je, nezavisno, H, C1-C12alkil, supstituisani C1-C12alkil, C2-C12alkenil, supstituisani C2-C12alkenil, C2-C12alkinil, supstituisani C2-C12alkinil, C5-C20aril, supstituisani C5-C20aril, acil (C(=O)-H), supstituisani acil, heterociklični radikal, supstituisani heterociklični radikal, C1-C12aminoalkil, supstituisani C1-C12aminoalkil ili zaštitna grupa.

[0033] Primeri 4’-2’ grupa koje spajaju koje su obuhvaćene definicijom LNA uključuju, ali nisu ograničene na formule: -[C(R1)(R2)]n-, -[C(R1)(R2)]n-O-, -C(R1R2)-N(R1)-O- ili -C(R1R2)-O-N(R1)-. Dalje, druge grupe koje povezuju koje su obuhvaćene definicijom LNA su 4’-CH2-2’, 4’-(CH2)2-2’,4’-(CH2)3-2’, 4’-CH2-O-2’, 4’-(CH2)2-O-2’, 4’CH2-O-N(R1)-2’ i 4’-CH2-N(R1)-O-2’-mostovi, pri čemu svaki R1i R2je, nezavisno, H, zaštitna grupa ili C1-C12alkil.

[0034] Takođe uključene u definiciju LNA prema pronalasku su LNA-e u kojima je 2’-hidroksil grupa ribozil prstena šećera povezana sa 4’ ugljenikovim atomom prstena šećera, pri čemu se obrazuje metilenoksi (4’-CH2-O2’) most da bi se formirao biciklični šećerni ostatak. Most takođe može da bude metilenska (-CH2-) grupa koja povezuje 2’ atom kiseonika i 4’ atom ugljenika, za koje se koristi termin metilenoksi (4’-CH2-O-2’) LNA. Dalje; u slučaju ostatka bicikličnog šećera koji ima etilensku grupu koja premošćuje na ovom položaju, koristi se termin etillenoksi (4’-CH2CH2-O-2’) LNA. α-L-metilenoksi (4’CH2-O-2’), izomer metilenoksi LNA je takođe obuhvaćen definicijom LNA, kao što se ovde koristi.

[0035] "Struktura kape" ili "terminalni ostatak kape" označava hemijske modifikacije, koji su uključeni na bilo kom kraju antisens jedinjenja.

[0036] "cEt" ili "ograničeni etil" označava ostatak bicikličnog šećera koji obuhvata most koji povezuje 4’-ugljenik i 2’-ugljenik, pri čemu je most formule: 4’-CH(CH3)-O-2’.

[0037] "Ograničeni etil nukleozid" (takođe cEt nukleozid) označava nukleozid koji obuhvata ostatak bicikličnog šećera koji obuhvata 4’-CH(CH3)-O-2’ most.

[0038] " Faktor B komplementa (CFB)" označava bilo koju nukleinsku kiselinu ili protein CFB. "CFB nukleinska kiselina" označava bilo koju nukleinsku kiselinu koja kodira CFB. Na primer, u određenim izvođenjima, CFB nukleinska kiselina uključuje DNK sekvencu koja kodira CFB, RNK sekvencu koja se transkribuje sa DNK koja kodira CFB (uključujući DNK koja obuhvata introne i egzone), uključujući RNK sekvencu koja ne kodira proteine (tj. ne-kodirajuću), i sekvencu iRNK koja kodira CFB. "CFB iRNK" označava iRNK koja kodira CFB protein.

[0039] " Specifični inhibitor CFB " se odnosi na bilo koje sredstvo koje je sposobno da specifično inhibira CFB RNK i/ili ekspresiju CFB proteina ili aktivnosti na molekulskom nivou. Na primer, specifični inhibitori CFB uključuju nukleinske kiseline (uključujući antisens jedinjenja), peptide, antitela, male molekule, i druga sredstva koja su sposobna da inhibiraju ekspresiju CFB RNK i/ili protein CFB.

[0040] "Region koji se hemijski razlikuje" se odnosi na region antisens jedinjenja koje je na neki način hemijski razlikuje od drugog regiona istog antisens jedinjenja. Na primer, region koji ima 2’-O-metoksietil nukleotide je hemijski različit od regiona koji ima nukleotide bez 2’-O-metoksietil modifikacija.

[0041] "Himerna antisens jedinjenja" označava antisens jedinjenja koja imaju najmanje 2 hemijski različita regiona, gde svaki položaj ima mnoštvo podjedinica.

[0042] "Komplementarnost" označava kapacitet za sparivanje između nukleobaza prve nukleinske kiseline i druge nukleinske kiseline.

[0043] "Obuhvata," "sadrži" i "sastoji se" će biti jasno da implicira uključivanje navedenog koraka ili elementa ili grupe koraka ili elemenata ali ne isključivanje bilo kog drugog koraka ili elementa ili grupe koraka ili elemenata.

[0044] "Susedne nukleobaze" označava nukleobaze koje se nalaze neposredno jedna do druge.

[0045] "Dezoksiribonukleotid" označava nukleotid koji ima vodonik na 2’ položaju porcije šećera u nukleotidu. Dezoksiribonukleotidi mogu da budu modifikovani sa bilo kojim različitim supstituentima.

[0046] "Dizajn" ili "Dizajnirano za" se odnosi na postupak za dizajniranje oligomernog jedinjenja koje specifično hibridizuje sa odabranim molekulom nukleinske kiseline.

[0047] "Efikasna količina" označava količinu aktivnog farmaceutskog sredstva koje je dovoljno da se ostvari željeni fiziološki ishod kod individue kojoj je sredstvo potrebno. Efikasna količina može da se razlikuje između individua u zavisnosti od zdravlja i fizičkog stanja individue koja treba da se leči, taksonomske grupe individua koje trebaju da se leče, formulacije kompozicije, procene zdravstvenog stanja pojedinca, i drugih relevantnih faktora.

[0048] "Efikasnost" označava sposobnost da se proizvede željeni efekat.

[0049] "Ekspresija" uključuje sve funkcije pomoću kojih informacija koja je genski kodirana konvertuje u strukture koje se nalaze i deluju u ćeliji. Takve strukture uključuju, ali nisu ograničene na proizvode transkripcije i translacije.

[0050] "Potpuno komplementarno" ili "100% komplementarnost" označava da svaka nukleobaza prve nukleinske kiseline ima komplementarnu nukleobazu u drugoj nukleinskoj kiselini. U određenim izvođenjima, prva nukleinska kiselina je antisens jedinjenje i ciljna nukleinska kiselina je druga nukleinska kiselina.

[0051] "Gapmer" označava himerno antisens jedinjenje u kome je unutrašnji region koji ima veliki broj nukleozida koji podržavaju cepanje RNazom H pozicioniran između spoljašnjih regiona koji imaju jedan ili više nukleozida, pri čemu nukleozidi koji obuhvataju unutrašnji region su hemijski različiti od nukleozida ili nukleozida koji obuhvataju spoljašnje regione. Unutrašnji region može da bude naznačen sa "razmakom" (engl.gap) i spoljašnji regioni mogu da budu označeni sa "krilima" (engl.wings).

[0052] "Hibridizacija" označava spajanje molekula komplementarnih nukleinskih kiselina. U određenim izvođenjima, molekuli komplementarnih nukleinskih kiselina uključuju, ali nisu ograničeni na, antisens jedinjenja i ciljnu nukeinsku kiselinu. U određenim izvođenjima, komplementarni molekuli nukleinskih kiselina uključuju, ali nisu ograničeni na, antisens oligonukleotid i ciljnu nukleinsku kiselinu.

[0053] "Identifikovanje životinje koja ima, ili se nalazi u riziku da ima, bolest, poremećaj i/ili stanje" označava identifikovanje životinje kojoj je dijagnozirana bolest, poremećaj i/ili stanje ili identifikovanje životinje koja ima predispoziciju za razvijanje bolesti, poremećaja i/ili stanja. Takva identifikacija može da se postigne bilo kojim postupkom koji uključuje procenu medicinske istorije individue i standardne kliničke testove ili ispitivanja.

[0054] "Odmah pored" označava da ne postoje elementi koji se nalaze između neposredno susednih elemenata.

[0055] "Individua" označava čoveka ili životinju koja nije čovek izabranu za lečenje ili terapiju.

[0056] "Inhibiranje ekspresije ili aktivnosti" se odnosi na smanjenje, blokiranje ekspresije ili aktivnosti i ne ukazuje neophodno na potpuno uklanjanje ekspresije ili aktivnosti.

[0057] "Internukleozidna veza" se odnosi na hemijsku vezu između nukleozida.

[0058] "Produženi" antisens oligonukleotidi su oni koji imaju jedan ili više dodatnih nukleozida u odnosu na ovde prikazani antisens oligonukleotid.

[0059] "Vezani dezoksinukleozid" označava bazu nukleinske kiseline (A, G, C, T, U) koja je supstituisana dezoksiribozom koja je vezana fosfatnim estrom da bi se obrazovao nukleotid.

[0060] "Vezani nukleozidi" označava susedne nukleozide koji su međusobno povezani internukleozidnom vezom.

[0061] "Mismatch" ili "ne-komplementarna nukleobaza" se odnosi na slučaj kada nukleobaza prve nukleinske kiseline ne može da obrazuje par sa odgovarajućom nukleobazom druge ciljne nukleinske kiseline.

[0062] "Modifikovana internukleozidna veza" se odnosi na supstituciju ili bilo koju promenu od internukleozidne veze koja se pojavljuje u prirodi (tj. fosfodiestarske internukleozidne veze).

[0063] "Modifikovana nukleobaza" označava bilo koji nukleobazu koja nije adenin, citoizn, guanin, timidin, ili uracil. "Nemodifikovana nukleobaza" označava purinske baze adenin (A) i guanin (G), i pirimidinske baze timidin (T), citozin (C) i uracil (U).

[0064] "Modifikovani nukleozid" označava nukleozid koji ima, nezavisno, modifikovani ostatak šećera i/ili modifikovanu nukleobazu.

[0065] "Modifikovani nukleotid" označava nukleotid koji ima, nezavisno, modifikovani ostatak šećera, modifikovanu internukleozidnu vezu, ili modifikovanu nukleobazu.

[0066] "Modifikovani oligonukleotid" označava oligonukleotid koji obuhvata najmanje jednu modifikovanu internukleozidnu vezu, modifikovani šećer, i/ili modifikovanu nukleobazu.

[0067] "Modifikovani šećer" označava supstituciju i/ili bilo koju promenu od prirodnog ostatka šećera.

[0068] "Modulacija" se odnosi na menjanje ili podešavanje svojstva u ćeliji, tkivu, organu ili organizmu. Na primer, modulacija iRNK koja kodira CFB može da znači da se poveća ili da se smanji nivo iRNK za CFB i/ili CFB proteina u ćeliji, tkivu, organu ili organizumu. "Modulator" utiče na promenu u ćeliji, tkivu, organu ili organizmu. Na primer, CFB antisens jedinjenje može da bude modulator koji smanjuje količinu iRNK koja kodira za CFB i/ili CFB protein u ćeliji, tkivu, organu ili organizmu.

[0069] "Monomer" se odnosi na samu jedinicu ili na oligomer. Monomeri uključuju, ali nisu ograničeni na, nukleozide i nukleotide, bilo prirodne ili modifikovane.

[0070] "Motiv" označava obrazac nemodifikovanih i modifikovanih nukleozida u antisens jedinjenju.

[0071] "Prirodni šećerni ostatak" označava ostatak šećera koji se nalazi u DNK (2’-H) ili RNK (2’-OH).

[0072] "Internukleozidna veza koja se prirodno pojavljuje" označava 3’ do 5’ fosfodiestarsku vezu.

[0073] "Ne-komplementarna nukleobaza" se odnosi na par nukleobaza koje ne međusobno ne obrazuju vodonične veze ili na drugi način podržavaju hibridizaciju.

[0074] "Nukleinska kiselina" se odnosi na molekule koji se sastoje iz monomera nukleotida. Nukleinska kiselina uključuje, ali nije ograničena na, ribonukleinske kiseline (RNK), dezoksiribonukleinske kiseline (DNK), jednolančane nukleinske kiseline, i dvolančane nukleinske kiseline.

[0075] "Nukleobaza" označava heterociklični ostatak koji je sposoban za sparivanje sa bazom druge nukleinske kiseline.

[0076] "Komplementarnost nukleobaze" se odnosi na nukleobazu koja je sposobna za bazno sparivanje sa drugom nukleobazom. Na primer, u DNK, adenin (A) je komplementaran sa timinom (T). Na primer, u RNK, adenin (A) je komplementaran sa uracilom (U). U određenim izvođenjima, komplementarnost nukleobaza se odnosi na nukleobazu antisens jedinjenja koja je sposobna za bazno sparivanje sa nukleobazom njene ciljne nukleinske kiseline. Na primer, ukoliko nukleobaza na određenom položaju antisens jedinjenja može da formira vodonične veze sa nukleobazom na određenom položaju ciljne nukleinske kiseline, onda se smatra sa je položaj vezivanja preko obrazovanja vodoničnih veza između nukleotida i ciljne nukleinske kiseline komplementaran na tom nukleobaznom paru.

[0077] "Nukleobazna sekvenca" označava red susednih nukleobaza nezavisno od bilo kog šećera, veze, i/ili modifikacije nukleobaze.

[0078] "Nukleozid" označava nukleobazu koja je vezana sa šećerom.

[0079] "Mimetik nukleozida" uključuje one strukture koje se koriste da zamene šećer ili šećer i bazu i ne neophodno vezu na jednom ili više položaja u oligomernom jedinjenju kao što su na primer mimetici nukleozida koji imaju morfolino, cikloheksenil, cikloheksil, tetrahidropiranil, biciklo ili triciklo mimetike šećera, npr., ne-furanoznih šećernih jedinica. Mimetik nukleotida uključuje one strukture koje se koriste da zamene nukleozid i vezu na jednom ili više položaja u oligomernom jedinjenju kao što su na primer peptidne nukleinske kiseline ili morfolini (morfolini povezani sa -N(H)-C(=O)-O- ili drugom vezom koja nije fosfodiestarska). Surogat šećera se preklapa sa blago širim terminom imitiranja nukleozida ali je namenjen da naznači zamenu samo jedinice šećera (furanozni prsten). Ovde obezbeđeni tetrahidropiranil prstenovi su ilustrativni primer surogata šećera pri čemu je furanozna šećerna grupa zamenjena sa sistemom prstena tetrahidropiranila. "Mimetik" se odnosi na grupe koje su zamena za šećer, nukleobazu, i/ ili internukleozidnu vezu. Generalno, mimetik se koristi umesto šećera ili kombinacije šećer-internukleozidna veza, i nukleobaza se održava za hibridizaciju sa ciljnom metom.

[0080] "Nukleotid" označava nukleozid koji ima fosfatnu grupu koja je kovalentno vezana za grupu šećera u nukleozidu.

[0081] "Oligomerno jedinjenje" označava polimer koji se sastoji iz vezanih jedinica monomera koji je sposoban da hibridizuje najmanje sa regionom molekula nukleinske kiseline.

[0082] "Oligonukleozid" označava oligonukleotid u kome veze koje povezuju nukleozide ne sadrže atom fosfora.

[0083] "Oligonukleotid" znači polimer vezanih nukleozida u kome svaki može da bude modifikovan ili nemodifikovan, nezavisno jedan od drugog.

[0084] "Parenteralno ordiniranje" znači ordiniranje kroz injekciju ili infuziju. Parenteralno ordiniranje uključuje subkutano ordiniranje, intravenozno ordiniranje, intramuskularno ordiniranje, intraarterijalno ordiniranje, intraperitonealno ordiniranje, ili intrakranijalno ordiniranje, npr. intratekalno ili intracerebroventrikularno ordiniranje.

[0085] "Farmaceutska kompozicija" znači smešu supstanci koja je pogodna za ordiniranje individui. Na primer, farmaceutska kompozicija može da obuhvati jedno ili više aktivnih farmaceutskih sredstava i sterilni vodeni rastvor.

[0086] "Farmaceutski prihvatljive soli" znači fiziološki i farmaceutski prihvatljive soli antisens jedinjenja, tj., soli koje zadržavaju željenu biološku aktivnost roditeljskog oligonukleotida i ne prenose neželjene toksikološke efekte.

[0087] "Fosforotioatna veza" znači vezu između nukleozida gde je fosfodiestarska veza modifikovana zamenom jednog od atoma kiseonika koje ne obrazuju vezu sa atomom sumpora. Fosforotioatna veza je modifikovana veza koja povezuje nukleozide.

[0088] "Porcija" znači definisani broj susednih (tj., vezanih) nukleobaza u nukleinskoj kiselini. U određenim izvođenjima, porcija je definisani broj susednih nukleobaza u ciljnoj nukleinskoj kiselini. U određenim izvođenjima, porcija je definisani broj susednih nukleobaza antisens jedinjenja.

"Sprečiti" se odnosi na odlaganje ili sprečavanje početka, razvijanja ili napredovanja bolesti, poremećaja, ili stanja za vremenski period od minuta do neodređenog vremena. Sprečiti takođe označava smanjenje rizika od razvijanja bolesti, poremećaja, ili stanja.

[0089] "Profilaktički efikasna količina" se odnosi na količinu farmaceutskog sredstva koje obezbeđuje profilaktički ili preventivni benefit životinji.

1

[0090] "Region" je definisan kao porcija ciljne nukleinske kiseline koja ima najmanje jednu strukturu, funkciju, ili karakteristiku koja može da se identifikuje.

[0091] "Ribonukleotid" označava nukleotid koji ima hidroksi grupu na 2’ položaju porcije šećera u nukleotidu. Ribonukleotidi mogu da budu modifikovani sa bilo kojim od različitih supstituenata.

[0092] "Segmenti" su definisani kao manje ili pod-porcije regiona u ciljnoj nukleinskoj kiselini.

[0093] "Nepoželjni efekti" znače fiziološku bolest i/ili stanja koja se pripisuju tretmanu koja ne pripadaju željenim efektima. U određenim izvođenjima, nepoželjni efekti uključuju reakcije na mestu ubrizgavanja, abnormalitete u ispitivanju funkcije jetre, abnormalitete u funkciji bubrega, toksičnost jetre, toksičnost bubrega, abnormalitete u centralnom nervnom sistemu, miopatije, i malaksalost. Na primer, povećani nivoi aminotransferaze u serumu mogu da ukazuju na toksičnost jetre ili na abnormalnu funkciju jetre. Na primer, povećan bilirubin može da ukazuje na toksičnost u jetri ili na abnormalnost u funkciji jetre.

[0094] "Mesta," kao što se ovde koristi, su definisana kao jedinstveni položaju nukleobaza u ciljnoj nukleinskoj kiselini.

[0095] "Usporava napredovanje" znači smanjenje u razvijanju pomenute bolesti.

[0096] "Specifično hibridizuje" se odnosi na antisens jedinjenje koje ima dovoljan stepen komplementarnosti između antisens oligonukleotida i ciljne nukleinske kiseline da bi se indukovao željeni efekat, dok se ispoljavaju minimalni ili nema efekata na nukleinskim kiselinama koje nisu ciljna meta u uslovima u kojima je poželjno specifično vezivanje, tj., u fiziološkim uslovima u slučaju in vivo testova i terapeutskih tretmana. "Strogi uslovi hibridizacije" ili "strogi uslovi" se odnose na uslove pod kojima će oligomerno jedinjenje hibridizovati sa njegovom ciljnom sekvencom, ali sa minimalnim brojem drugih sekvenci.

[0097] "Subjekat" označava čoveka ili životinju koja nije čovek koja je izabrana za tretman ili terapiju.

[0098] "Meta" se odnosi na protein, na modulaciju koja je poželjna.

[0099] "Ciljni gen" se odnosi na gen koji kodira metu.

[0100] "Ciljanje" označava postupak dizajna i selekcije antisens jedinjenja koje će specifično hibridizovati sa ciljnom nukleinskom kiselinom i indukovaće željeni efekat.

[0101] "Ciljna nukleinska kiselina," "ciljna RNK," "ciljni transkript RNK" i "ciljna nukleinska kiselina" svi označavaju nukleinsku kiselinu koja je sposobna da bude ciljana antisens jedinjenjima.

[0102] "Ciljni region" označava porciju ciljne nukleinske kiseline na koju je usmereno jedno ili više antisens jedinjenja.

[0103] "Ciljni segment" označava sekvencu nukleotida ciljne nukleinske kiseline na koju je usmereno antisens jedinjenje. "5’ ciljno mesto" se odnosi na 5’-ciljni nukleotid ciljnog segmenta. "3’ ciljno mesto" se odnosi na 3 ’-ciljni nukleotid ciljnog segmenta.

[0104] "Terapeutski efikasna količina" označava količinu farmaceutskog sredstva koje obezbeđuje terapeutski benefit individui.

[0105] "Lečenje" se odnosi na ordiniranje farmaceutske kompozicije životinji da bi se uticalo na izmenu ili poboljšanje bolesti, poremećaja, ili stanja kod životinje. U određenim izvođenjima, životinji može da se ordinira jedna ili više farmaceutskih kompozicija.

[0106] "Nemodifikovane" nukleobaze znači purinske baze adenin (A) i guanin (G), i pirimidinske baze timin (T), citozin (C) i uracil (U).

[0107] "Nemodifikovani nukleotid" znači nukleotid koji se sastoji iz nukleobaza koje se nalaze u prirodi, šećernih ostataka, i veza koje se ostvaruju između nukleozida. U određenim izvođenjima, nemodifikovani nukleotid je RNK nukleotid (tj. β-D-ribonukleozidi) ili DNK nukleotid (tj. β-D-dezoksiribonukleozid).

Određena izvođenja

[0108] Određena izvođenja obezbeđuju postupke, jedinjenja i kompozicije za inhibiranje ekspresije faktora B komplementa (CFB).

[0109] Određena izvođenja obezbeđuju antisens jedinjenja koja su usmerena prema nukleinskoj kiselini koja kodira za CFB. U određenim izvođenjima, CFB nukleinska kiselina ima sekvencu koja je predstavljena u GENBANK pristupni br. NM_001710.5 (ovde uključena pod SEQ ID NO: 1), GENBANK pristupni br. NT_007592.15 prekinuta od nukleotida 31852000 do 31861000 (ovde uključena pod SEQ ID NO: 2), GENBANK pristupni br NW _001116486.1 prekinuta od nukletida 536000 do 545000 (ovde uključena pod SEQ ID NO: 3), GENBANK pristupni br. XM _001113553.2 (ovde uključena pod SEQ ID NO: ili-ili GENBANK pristupni br. NM_008198.2 (ovde uključena pod SEQ ID NO: 5).

[0110] U određenim izvođenjima, jedinjenje obuhvata modifikovani oligonukleotid sa nukleobaznom sekvencom koja obuhvata bilo koju od SEQ ID NOs: 198, 228, 237, 440, 444, 448, 450, 453, 455, 549, i 598.

[0111] U određenim izvođenjima, bilo koje od gore navedenih jedinjenja ili oligonukleotida obuhvata najmanje jednu modifikovanu vezu koja povezuje nukleozide, najmanje jedan modifikovani šećer, i/ili najmanje jednu modifikovanu nukleobazu.

[0112] U određenim izvođenjima, bilo koje od gore navedenih jedinjenja ili nukleotida obuhvata najmanje jedan modifikovani šećer. U određenim izvođenjima, najmanje jedan modifikovani šećer obuhvata 2’-O-metoksietil grupu. U određenim izvođenjima, najmanje jedan modifikovani šećer je biciklični šećer, kao što je 4’-CH(CH3)-O-2’ grupa, 4’-CH2-O-2’ grupa, ili 4’-(CH2)2-O-2’grupa.

[0113] U određenim izvođenjima, modifikovani oligonukleotid obuhvata najmanje jednu modifikovanu vezu koja povezuje nukleozide, kao što je fosforotioatna internukleozidna veza.

[0114] U određenim izvođenjima, bilo koje od gore navedenih jedinjenja ili oligonukleotida obuhvata najmanje jednu modifikovanu nukleobazu, kao što je 5-metilcitozin.

[0115] U određenim izvođenjima, bilo koje od gore navedenih jedinjenja ili oligonukleotida obuhvata:

segment razmaka koji se sastoji iz vezanih dezoksinukleozida;

5’ segment „krila“ koji se sastoji iz vezanih nukleozida; i

3’ segment „krila“ koji se sastoji iz vezanih nukleozida;

pri čemu je segment razmaka pozicioniran između 5’ segmenta „krila“ i 3’ segmenta „krila“ i pri čemu svaki nukleozid od svakog segmenta „krila“ obuhvata modifikovani šećer. U određenim izvođenjima, oligonukleotid se sastoji iz 10 do 30 vezanih nukleozida koji imaju nukleobaznu sekvencu koja obuhvata sekvencu koja se navodi u SEQ ID NO: 198, 228, 237, 440, 444, 448, 450, 453, 455, 549, ili 598.

[0116] U određenim izvođenjima, modifikovani oligonukleotid ima nukleobaznu sekvencu koja obuhvata sekvencu koja se navodi u SEQ ID NO: 198, 228, 237, 440, 444, 448, 450, 453, ili 455, pri čemu modifikovani oligonukleotid obuhvata segment razmaka koji se sastoji iz deset vezanih dezoksinukleozida; 5’ segment „krila“ koji se sastoji iz pet vezanih nukleozida; i 3’ segment „krila“ koji se sastoji iz pet vezanih nukleozida; pri čemu segment razmaka je pozicioniran između 5’ segmenta „krila“ i 3’ segmenta„krila“, pri čemu svaki nukleozid od svakog segmenta „krila“ obuhvata 2’-O-metoksietil šećer; pri čemu svaka internukleozidna veza je fosforotioatna veza i pri čemu svaki citozin je 5-metilcitozin.

[0117] U određenim izvođenjima, jedinjenje obuhvata ili se sastoji iz jednolančanog modifikovanog oligonukleotida koji obuhvata 20 vezanih nukleozida koji imaju nukleobaznu sekvencu koja se sastoji iz sekvence koja se navodi u SEQ ID NO: 198, 228, 237, 440, 444, 448, 450, 453, ili 455, pri čemu oligonukleotid obuhvata:

segment razmaka koji se sastoji iz deset vezanih dezoksinukleozida;

5’ segment „krila“ koji se sastoji iz pet vezanih nukleozida; i

3’ segment „krila“ koji se sastoji iz pet vezanih nukleozida;

pri čemu segment razmaka je pozicioniran između 5’ segmenta „krila“ i 3’ segmenta „krila“, pri čemu svaki nukleozid od svakog segmenta „krila“ obuhvata 2’-O-metoksietil šećer; pri čemu svaka intrnukleozidna veza je fosforotioatna veza; i pri čemu svaki citozin je 5-metilcitozin.

[0118] U određenim izvođenjima, jedinjenje obuhvata ISIS 588540. U određenim izvođenjima, jedinjenje obuhvata ISIS 588540. U određenim izvođenjima, ISIS 588540 ima sledeću hemijsku strukturu:

1

[0119] U određenim izvođenjima, jedinjenje obuhvata ili se sastoji iz jednolančanog modifikovanog oligonukleotida koji se sastoji iz 16 vezanih nukleozida koji imaju nukleobaznu sekvencu koja se sastoji iz sekvence koja se navodi u SEQ ID NO: 549, pri čemu modifikovani oligonukleotid obuhvata segment razmaka koji se sastoji iz deset vezanih dezoksinukleozida; 5’ segment „krila“ koji se sastoji iz tri vezana nukleozida; i 3’ segment „krila“ koji se sastoji iz tri vezana nukleozida; pri čemu segment razmaka je pozocioniran između 5’ segmenta „krila“ i 3’ segmenta„krila“; pri ćemu svaki nukleozid od svakog segmenta „krila“ obuhvata cEt šećer; pri čemu svaka internukleozidna veza je fosforotioatna veza; i pri čemu svaki citozin je 5-metilcitozin.

[0120] U određenim izvođenjima, jedinjenje obuhvata ili se sastoji od jednolančanog modifikovanog oligonukleotida koji se sastoji iz 16 vezanih nukleozida koji imaju nukleobaznu sekvencu koja se sastoji iz sekvence koja se navodi u SEQ ID NO: 598, pri čemu modifikovani oligonukleotid obuhvata segment razmaka koji se sastoji iz deset vezanih dezoksinukleozida; 5’ segment „krila“ koji se sastoji iz tri vezana nukleozida; i 3’ segment „krila“ koji se sastoji iz tri vezana nukleozida; pri čemu segment razmaka je pozicioniran između 5’ segmenta „krila“ i 3’ segmenta„krila“; pri čemu 5’ segment „krila“ obuhvata 2’-O-metoksietil šećer, 2’-O-metoksietil šećer, i cEt šećer u 5’ ka 3’ smeru; pri čemu 3’ segment „krila“ obuhvata cEt šećer, cEt šećer, i 2’-O-metoksietil šećer u 5’ ka 3’ smeru; pri čemu je svaka internukleozidna veza fosforotioatna veza; i pri čemu svaki citozin je 5-metilcitozin.

[0121] U bilo kom od gore navedenih izvođenja, jedinjenje ili oligonukleotid može da bude najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98%, najmanje 99%, ili 100% komplementarno sa nukleinskom kiselinom koja kodira CFB.

[0122] U bilo kom od gore navedenih izvođenja, jedinjenje ili oligonukleotid može da bude jednolančano.

[0123] U određenim izvođenjima, jedinjenja ili kompozicije kao što se ovde opisuju su efikasni zahvaljujući tome što imaju najmanje jednu od in vitro IC50manju od 250 nM, manju od 200 nM, manju od 150 nM, manju od 100 nM, manju od 90 nM, manju od 80 nM, manju od 70 nM, manju od 65 nM, manju od 60 nM, manju od 55 nM, manju od 50 nM, manju od 45 nM, manju od 40 nM, manju od 35 nM, manju od 30 nM, manju od 25 nM, ili manju od 20 nM.

[0124] U određenim izvođenjima, jedinjenja ili kompozicije kao što je ovde opisano se veoma dobro podnose kako je pokazano da imaju najmanje jedno od povećanja u vrednosti ALT ili AST koja nije veća od 4 puta, 3 puta, ili 2 puta u odnosu na životinje koje su tretirane slanim rastvorom ili povećanje u težini jetre, slezine, ili bubrega koje nije veće od 30%, 20%, 15%, 12%, 10%, 5%, ili 2%. U određenim izvođenjima, jedinjenja ili kompozicije kao što se ovde opisuju se veoma dobro podnose kao što je pokazano da nemaju povećanje ALT ili AST u odnosu na životinje koje su tretirane slanim rastovrom. U određenim izvođenjima, jedinjenja ili kompozicije kao što se ovde opisuju se veoma dobro podnose kao što je pokazano da nema povećanja u težini jetre, slezine, ili bubrega u odnosu na životinje koje su tretirane slanim rastovorom.

[0125] Određena izvođenja obezbeđuju kompoziciju koja obuhvata jedinjenje iz bilo kojih od gore pomenutih izvođenja i njihovu so i najmanje jedan od farmaceutski prihvatljivog nosača ili rastvarača. U određenim izvođenjima, kompozicija ima viskozitet koji je manji od oko 40 centipoaza (cP), manji od oko 30 centipoaza (cP), manji od oko 20 centipoaza (cP), manji od oko 15 centipoaza (cP), ili manji od oko 10 centipoaza (cP). U određenim izvođenjima, kompozicija koja ima bilo koji od gore navedneih viskoziteta obuhvata jedinjenje koje je ovde obezbeđeno u koncentraciji od oko 100 mg/mL, oko 125 mg/mL, oko 150 mg/mL, oko 175 mg/mL, oko 200 mg/mL, oko 225 mg/mL, oko 250 mg/mL, oko 275 mg/mL, ili oko 300 mg/mL. U određenim izvođenjima, kompozicija koja ima bilo koji od gore navedenih viskoziteta i/ili koncentracije jedinjenja ima temperaturu sobne temperature ili oko 20°C, oko 21°C, oko 22°C, oko 23°C, oko 24°C, oko 25°C, oko 26°C, oko 27°C, oko 28°C, oko 29°C, ili oko 30°C.

[0126] U određenim izvođenjima, postupak za lečenje, prevenciju, ili ublažavanje bolesti koja je povezana sa disregulacijom alternativnog puta komplementa kod subjekta obuhvata ordiniranje subjektu specifičnog inhibitora faktora B komplementa (CFB), pri čemu se bolest leči, sprečava, ili ublažava. U određenim izvođenjima, alternativni put komplementa je više aktiviran od normalnog. U određenim izvođenjima, specifični inhibitor CFB je antisens jedinjenje koje je usmereno prema CFB, kao što je antisens oligonukleotid koji je usmeren prema CFB. U određenim izvođenjima, CFB specifični inhibitor je jedinjenje koje obuhvata ili se sastoji od modifikovanog oligonukleotida koji se sastoji iz 10 do 30 vezanih nukleozida i koje ima nukleobaznu sekvencu koja obuhvata najmanje 8 susednih nukleobaza od bilo kojih nukleobaznih sekvenci SEQ ID NOs: 6-808. U određenim izvođenjima, CFB specifični inhibitor je jedinjenje koje obuhvata ili se sastoji od modifikovanog oligonukleotida koji obuhvata 10 do 30 vezanih nukleozida i koje ima nukleobaznu sekvencu koja obuhvata ili se sastoji od bilo koje od SEQ ID NOs: 6-808. U određenim izvođenjima, CFB specifični inhibitor je jedinjenje koje obuhvata ili se sastoji od modifikovanog oligonukleotida koji se sastoji iz 10 do 30 vezanih nukleozida koji imaju nukleobaznu sekvencu koja obuhvata ili se sastoji od bilo koje od SEQ ID NOs: 198, 228, 237, 440, 444, 448, 450, 453, 455, 549, i 598. U određenim izvođenjima, specifični inhibitor CFB je jedinjenje koje obuhvata ili se sastoji od ISIS 532770, 532800, 532809, 588540, 588544, 588548, 588550, 588553,

1

588555, 588848, ili 594430. U određenim izvođenjima, specifični inhibitor CFB je jedinjenje koje obuhvata ili se sastoji od ISIS 588540, koje ima sledeću hemijsku strukturu:

U određenim izvođenjima, bolest je makularna degeneracija, kao što je starosna makularna degeneracija (AMD), koja može da bude vlažna AMD ili suva AMD. U određenim izvođenjima, suva AMD može da bude geografska atrofija. U određenim izvođenjima, bolest je bolest bubrega kao što je lupus nefritis, sistemski lupus ertiematozus (SLE), bolest gustih depozita (DDD), C3 glomerulonefritis (C3GN), CFHR5 nefropatija, ili atipični hemolitički uremijski sindrom (aHUS), ili bilo koja njihova kombinacija.

[0127] U određenim izvođenjima, postupak za lečenje, prevenciju, ili ublažavanje makularne degeneracije, kao što je starosna makularna degeneracija (AMD) kod subjekta obuhvata ordiniranje subjektu CFB specifičnog inhibitora, čime se leči, sprečava, ili ublažava AMD, kao što je vlažni AMD i suvi AMD. U određenim izvođenjima, suvi AMD može da bude geografska atrofija. Geografska atrofija se smatra uznapredovanim oblikom suvog AMD koji uključuje degeneraciju retine. U određenim izvođenjima, subjekat ima alternativni put komplementa koji je aktiviran više od normalnog. U određenim izvođenjima, ordiniranje antisens jedinjenja smanjuje ili inhibira nakupljanje nivoa C3 u očima, kao što su nivoi C3 proteina. U određenim izvođenjima, ordiniranje antisens jedinjenja smanjuje nivo depozita C3 u očima ili inhibira nakupljanje C3 depozita u očima. U određenim izvođenjima, CFB specifični inhibitor je jedinjenje koje obuhvata ili se sastoji od ISIS 532770, 532800,532809,

1

588540,588544, 588548,588550, 588553, 588555, 588848, ili 594430. U određenim izvođenjima, jedinjenje se subjektu ordinira parenteralno.

[0128] U određenim izvođenjima, postupak za lečenje, prevenciju, ili ublažavanje bolesti bubrega koja je povezana sa disregulacijom alternativnog puta komplementa kod subjekta obuhvata ordiniranje subjektu specifičnog inhibitora faktora B komplementa (CFB), pri čemu se leči, sprečava, ili se ublažava bolest bubrega. U određenim izvođenjima, alternativni put komplementa je aktiviran više od normalnog. U određenim izvođenjima, specifični inhibitor CFB je jedinjenje koje obuhvata ili se sastoji iz ISIS 532770, 532800, 532809, 588540, 588544, 588548, 588550, 588553, 588555, 588848, ili 594430. U određenim izvođenjima, jedinjenje se ordinira subjektu parenteralno. U određenim izvođenjima, bolest bubrega je lupus nefritis, sistemski lupus eritematozus (SLE), bolest gustih depozita (DDD), C3 glomerulonefritis (C3GN), CFHR5 nefropatija, ili atipični hemolitični uremični sindrom (aHUS), ili bilo koja njihova kombinacija. U određenim izvođenjima, bolest bubrega je povezana sa C3 depozitima, kao što su C3 depositi u glomerulu. U određenim izvođenjima, bolest bubrega je povezana sa nivoima C3 u krvotoku koji su niži od normalnih, kao što su nivoi C3 u serumu ili plazmi. U određenim izvođenjima, ordiniranje jedinjenja smanjuje ili inhibira nakupljanje C3 nivoa u bubregu, kao što su nivoi C3 proteina. U određenim izvođenjima, ordiniranje jedinjenja smanjuje nivo depozita C3 u bubregu ili inhibira nakupljanje C3 depozita u bubregu, kao što su nivoi C3 u glomerulu. U određenim izvođenjima, subjekt je identifikovan da ima ili se nalazi u riziku da dobije bolest koja je povezana sa disregulacijom alternativnog puta komplementa, na primer detekcijom nivoa komplementa ili nivoa kompleksa koji napada membranu u krvi subjekta i/ili izvođenjem genskog testa za mutacije gena koji kodiraju faktore komplementa koji su povezani sa razvijanjem bolesti.

[0129] U određenim izvođenjima, postupak inhibiranja ekspresije faktora B komplementa (CFB) kod subjekta koji ima, ili se nalazi u riziku da dobije, bolest koja je povezana sa disregulacijom alternativnog puta komplementa obuhvata ordiniranje specifičnog inhibitora komplement faktora B (CFB) subjektu, pri čemu se inhibira ekspresija CFB kod subjekta. U određenim izvođenjima, ordiniranje inhibitora inhibira ekspresiju CFB u oku. U određenim izvođenjima, subjekat ima, ili se nalazi u riziku da razvije, makularnu degeneraciju koja je povezana sa starenjem (AMD), kao što je vlažna AMD i suva AMD. U određenim izvođenjima, suva AMD može da bude geografska atrofija. U određenim izvođenjima ordiniranje inhibitora inhibira ekspresiju CFB u bubregu, kao što je u glomerulu. U određenim izvođenjima, subjekat ima, ili se nalazi u riziku da razvije, lupus nefritis, sistemski lupus eritematozus (SLE), bolest gustih depozita (DDD), C3 glomerulonefritis (C3GN), CFHR5 nefropatiju, ili atipični hemolitički uremijski sindrom (aHUS), ili bilo koju njihovu kombinaciju. U određenim izvođenjima, CFB specifični inhibitor je jedinjenje koje obuhvata ili se sastoji iz ISIS 532770, 532800, 532809, 588540, 588544, 588548, 588550, 588553, 588555, 588848, ili 594430. U određenim izvođenjima, jedinjenje se subjektu ordinira parenteralno.

[0130] U određenim izvođenjima, postupak za smanjivanje ili inhibiranje nakupljanja C3 depozita u oku subujekta koji ima, ili je u riziku da razvije, bolest koja je povezana sa disregulacijom alternativnog puta komplementa obuhvata ordiniranje specifičnog inhibitora faktora komplementa B (CFB) subjektu, pri čemu se smanjuje ili inhibira nakupljanje C3 depozita u oku subjekta. U određenim izvođenjima, subjekat ima, ili je u riziku da razvije, starosnu makularnu degeneraciju (AMD), kao što je vlažna AMD i suva AMD. U određenim izvođenjima, suva AMD može da bude geografska atrofija. U određenim izvođenjima, specifični inhibitor CFB je jedinjenje koje obuhvata ili se sastoji od ISIS 532770, 532800, 532809, 588540, 588544, 588548, 588550, 588553, 588555, 588848, ili 594430. U određenim izvođenjima, jedinjenje se subjektu ordinira parenteralno.

[0131] U određenim izvođenjima, postupak za smanjivanje ili inhibiranje nakupljanja C3 depozita u bubregu subjekta koji ima, ili je u riziku da razvije, bolest koja je povezana sa disregulacijom

1

alternativnog puta komplementa obuhvata ordiniranje specifičnog inhibitora faktora B komplement (CFB) subjektu, pri čemu se smanjuje ili inhibira nakupljanje depozita C3 u bubregu subjekta. U određenim izvođenjima, subjekat ima, ili je u riziku da razvije, lupus nefritis, sistemski lupus eritematozus (SLE), bolest gustih depozita (DDD), C3 glomerulonefritis (C3GN), CFHR5 nefropatiju, ili atipični hemolitični uremični sindrom (aHUS), ili bilo koju njihovu kombinaciju. U određenim izvođenjima, specifični inhibitor CFB je jedinjenje koje obuhvata ili se sastoji od ISIS 532770, 532800, 532809, 588540, 588544, 588548, 588550, 588553, 588555, 588848, ili 594430. U određenim izvođenjima, jedinjenje se subjektu ordinira parenteralno.

[0132] Određena izvođenja se odnose na ovde opisano jedinjenje ili kompoziciju za upotrebu u terapiji. Određena izvođenja se odnose na jedinjenja koja obuhvataju ili se sastoje iz ISIS 532770, 532800, 532809, 588540, 588544, 588548, 588550, 588553, 588555, 588848, ili 594430 za upotrebu u terapiji.

[0133] Određena izvođenja se odnose na ovde opisano jedinjenje ili kompoziciju za upotrebu u lečenju bolesti koja je povezana sa disregulacijom alternativnog puta komplementa. Određena izvođenja se odnose na jedinjenje koje obuhvata ili se sastoji iz ISIS 532770, 532800, 532809, 588540, 588544, 588548, 588550, 588553, 588555, 588848, ili 594430 za upotrebu u lečenju bolesti koja je povezana sa disregulacijom alternativnog puta komplementa. U određenim izvođenjima, alternativni put komplementa se aktivira više nego što je normalno. U određenim izvođenjima, bolest je makularna degeneracija, kao što je starosna makularna degeneracija (AMD), koja može da bude vlažna AMD ili suva AMD. U određenim izvođenjima, suva AMD može da bude geografska atrofija. U određenim izvođenjima, bolest je bolest bubrega kao što je lupus nefritis, sistemski lupus eritematozus (SLE), bolest gustih depozita (DDD), C3 glomerulonefritis (C3GN), CFHR5 nefropatija, ili atipični hemolitični uremijski sindrom (aHUS), ili bilo koja njihova kombinacija.

[0134] Određena izvođenja se odnose na jedinjenje koje obuhvata ili se sastoji od ISIS 588540, koje ima sledeću hemijsku strukturu:

1

, za upotrebu u lečenju bolesti koja je povezana sa disregulacijom alternativnog puta komplementa. U određenim izvođenjima, alternativni put komplementa je aktiviran više nego što je normalno. U određenim izvođenjima, bolest je makularna degeneracija, kao što je starosna makularna degeneracija (AMD), koja može da bude vlažna AMD ili suva AMD. U određenim izvođenjima, suva AMD može da bude geografska atrofija. U određenim izvođenjima, bolest je bolest bubrega kao što je lupus nefritis, sistemski lupus eritematozus (SLE), bolest gustih depozita (DDD), C3 glomerulonefritis (C3GN), CFHR5 nefropatija, ili atipični hemolitički uremijski sindrom (aHUS), ili bilo koja njihova kombinacija.

[0135] Određena izvođenja se odnose na upotrebu ovde opisanih jedinjenja ili kompozicija za dobijanje leka za lečenje bolesti koja je povezana sa disregulacijom alternativnog puta komplementa. Određena izvođenja se odnose na upotrebu jedinjenja koje obuhvata ili se sastoji iz ISIS 532770, 532800, 532809, 588540, 588544, 588548, 588550, 588553, 588555, 588848, ili 594430 za dobijanje leka za lečenje bolesti koja je povezana sa disregulacijom alternativnog puta komplementa. U određenim izvođenjima, alternativni put komplementa je aktiviran više nego što je normalno. U određenim izvođenjima, bolest je makularna degeneracija, kao što je starosna makularna degeneracija (AMD), koja može da bude vlažna AMD ili suva AMD. U određenim izvođenjima, suva AMD može da bude geografska atrofija. U određenim izvođenjima, bolest je bolest bubrega kao što je lupus nefritis, sistemski lupus eritematozus (SLE), bolest gustih depozita (DDD), C3 glomerulonefritis (C3GN), CFHR5 nefropatija, ili atipični hemolitički uremijski sindrom (aHUS), ili bilo koja njihova kombinacija.

1

[0136] Određena izvođenja se odnose na upotrebu jedinjenja koje obuhvata ili se sastoji od ISIS 588540, koje ima sledeću hemijsku strukturu:

, za dobijanje leka za lečenje bolesti koja je povezana sa disregulacijom alternativnog puta komplementa. U određenim izvođenjima, alternativni put komplementa je aktiviran više nego što je normalno. U određenim izvođenjima, bolest je makularna degeneracija, kao što je makularna degeneracija koja je povezana sa starenjem (AMD), koja može da bude vlažna AMD ili suva AMD. U određenim izvođenjima, suva AMD može da bude geografska atrofija. U određenim izvođenjima, bolest je bolest bubrega kao što je lupus nefritis, sistemski lupus eritematozus (SLE), bolest gustih depozita bubrega (DDD), C3 glomerulonefritis (C3GN), CFHR5 nefropatija, ili atipični hemolitički uremijski sindrom (aHUS), ili bilo koja njihova kombinacija.

[0137] U bilo kom od prethodno navedenih izvođenja, CFB specifični inhibitor može da bude antisens jedinjenje koje je ciljano usmereno prema CFB. U određenim izvođenjima, antisens jedinjenje obuhvata antisens oligonukleotid, na primer antisens oligonukleotid koji se sastoji od 8 do 80 vezanih nukleozida, 12 do 30 vezanih nukleozida, ili 20 vezanih nukleozida. U određenim izvođenjima, antisens oligonukleotid je najmanje 80%, 85%, 90%, 95% ili 100% komplementaran sa bilo kojom od nukleobaznih sekvenci koje se navode u SEQ ID NOs: 1-5. U određenim izvođenjima, antisens oligonukleotid obuhvata najmanje jednu modifikovanu vezu koja povezuje nukleozide, najmanje jedan modifikovani šećer i/ili najmanje jednu modifikovanu nukleobazu. U određenim izvođenjima, modifikovana internukleozidna veza je fosforotioatna internukleozidna veza, modifikovani šećer je

2

biciklični šećer ili 2’-O-metoksietil, i modifikovana nukleobaza je 5-metilcitozin. U određenim izvođenjima, modifikovani oligonukleotid obuhvata segment razmaka koji se sastoji iz vezanih dezoksinukleozida; 5’ segment „krila“ koji se sastoji iz vezanih nukleozida; i 3’ segment „krila“ koji se sastoji iz vezanih nukleozida, pri čemu segment razmaka je pozicioniran odmah pored i između 5’ segmenta „krila“ i 3’ segmenta „krila“ i pri čemu svaki nukleozid od svakog segmenta „krila“ obuhvata modifikovani šećer. U određenim izvođenjima, antisens oligonukleotid se ordinira parenteralno. Na primer, u određenim izvođenjima antisens oligonukleotid može da se ordinira preko injekcije ili infuzije. Parenteralno ordiniranje uključuje subkutano ordiniranje, intravenozno ordiniranje, intramuskularno ordniranje, intraarterijalno ordiniranje, intraperitonealno ordiniranje, ili intrakranijalno ordiniranje, npr. intratekalno ili intracerebroventrikularno ordiniranje.

Antisens jedinjenja

[0138] Oligomerna jedinjenja uključuju, ali nisu ograničena na, oligonukleotide, oligonukleozide, analoge oligonukleotida, mimetike oligonukleotida, antisens jedinjenja, antisens oligonukleotide, i siRNK molekule. Oligomerno jedinjenje može da bude "antisens" prema ciljnoj nukleinskoj kiselini, što znači da je sposobno da se podvrgne hibridizaciji sa ciljnom nukleinskom kiselinom preko obrazovanja vodoničnih veza.

[0139] U određenim izvođenjima, antisens jedinjenje ima nukleobaznu sekvencu koja, kada je napisana u 5’ ka 3’ smeru, obuhvata reverzni komplement ciljnog segmenta u ciljnoj nukleinskoj kiselini prema kojoj je usmerena.

[0140] U određenim izvođenjima antisens oligonukleotidi mogu da budu skraćeni ili prekinuti. Na primer, jedna podjedinica može da bude uklonjena sa 5’ kraja (5’ prekid), ili alternativno sa 3’ kraja (3’ prekid). Skraćeno ili prekinuto antisens jedinjenje koje je usmereno prema CFB nukleinskoj kiselini može da ima dve podjedinice koje su ukonjene sa 5’ kraja, ili alternativno može da ima dve podjedinice koje su uklonjenje sa 3’ kraja, antisens jedinjenja. Alternativno, uklonjeni nukleozidi mogu da budu rasejani kroz antisens jedinjenje, na primer, u antisens jedinjenju koje ima jedan nukleozid koji je uklonjen sa 5’ kraja i jedan nukleozid koji je uklonjen sa 3’ kraja.

[0141] Kada se jedna dodatna subjedinica nalazi u produženom antisens jedinjenju, dodatna podjedinica može da bude locirana na 5’ ili 3’ kraju antisens jedinjenja. Kada su prisutne dve ili više dodatnih podjedinica, dodatne podjedinice mogu da budu jedna pored druge, na primer, u antisens jedinjenju koje ima dve podjedinice koje su dodate na 5’ kraju (5’ dodavanje), ili alternativno na 3’ kraju (3’ dodavanje), u antisens jedinjenju. Alternativno, dodate podjedinice mogu da budu rasejane kroz antisens jedinjenje, na primer, u antisens jedinjenju koje ima jednu subjedinicu koja je dodata na 5’ kraju i jednu subjedinicu koja je dodata na 3’ kraju.

[0142] Moguće je da se poveća ili smanji dužina antisens jedinjenja, kao što je antisens oligonukleotid, i/ili uvedu „mismatch“ baze bez eliminisanja aktivnosti. Na primer, u Woolf et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:7305-7309, 1992), serije antisens oligonukleotida 13-25 nukleobaza u dužini su ispitivane za njihovu sposobnost da indukuju isecanje ciljne RNK u modelu ubrizgavanja u oocitu. Antisens oligonukleotidi dužine 25 nukleobaza sa 8 ili 11 „mismatch“ baza blizu krajeva antisens oligonukleotida su bili sposobni da usmere specifično isecanje ciljne iRNK, iako u manjoj meri od antisens oligonukleotida koji nisu imali pogrešno sparene baze tj. „mismatches“. Slično tome, ciljno specifično isecanje je postignuto upotrebom antisens oligonukleotida od 13 nukleobaza, uključujući one sa 1 ili 3 pogrešno sparenih baza.

[0143] Gautschi et al. (J. Natl. Cancer Inst. 93:463-471, March 2001) su pokazali sposobnost oligonukleotida koje je 100% komplementaran sa iRNK koja kodira za bcl-2 i ima 3 pogrešno sparene baze prema bcl-xL iRNK da smanjuje ekspresiju oba bcl-2 i bcl-xL in vitro i in vivo. Dalje, ovaj oligonukleotid pokazuje potentnu anti-tumorsku aktivnost in vivo.

[0144] Maher i Dolnick (Nuc. Acid. Res. 16:3341-3358,1988) su ispitivali serije tandema antisens nukleotida od 14 nukleobaza, i 28 i 42 nukleobaznih antisens oligonukleotida koji se obuhvataju sekvence redom, dva ili tri tandema antisens oligonukleotida, za njihovu sposobnost da zaustave translaciju humanog DHFR u testu zečjih retikulocita. Svaki od tri 14 nukleobaznih antisens oligonukleotida zasebno je bio sposoban da inhibira translaciju, iako na manjem nivou od 28 ili 42 nukleobaznih antisens oligonukleotida.

Određeni motivi i mehanizmi antisens jedinjenja

[0145] U određenim izvođenjima, antisens jedinjenja imaju hemijski modifikovane podjedinice koje su uređene u obrascima, ili motivima, kako bi se dodelila svojstva antisens jedinjenjima kao što je pojačana inhibitorna aktivnost, povećani afinitet vezivanja za ciljnu nukleinsku kiselinu, ili otpornost na degradiranje in vivo nukleazama.

[0146] Himerna antisens jedinjenja obično sadrže najmanje jedan region koji je modifikovan tako da mu se dodeljuje otpornost na degradiranje nukleazom, povećani ćelijski unos, povećani afinitet vezivanja za ciljnu nukleinsku kiselinu, i/ili povećana inhibitorna aktivnost. Drugi region himernog antisens jedinjenja može da dodeli drugo željeno svojstvo npr., da služi kao supstrat za ćeljsku endonukelazu RNazu H, koja cepa lanac RNK u RNK:DNK dupleksu.

[0147] Antisensna aktivnost može da se dobije od bilo kog mehanizma koji uključuje hibridizaciju antisens jedinjenja (npr., oligonukleotida) sa ciljnom nukleinskom kiselinom, pri čemu hibridizacija na kraju ima za rezultat biološki efekat. U određenim izvođenjima, količina i/ili aktivnost ciljne nukleinske kiseline je modulirana. U određenim izvođenjima, količina i/ili aktivnost ciljne nukleinske kiseline je smanjena. U određenim izvođenjima, hibridizacija antisens jedinjenja sa ciljnom nukleinskom kiselinom na kraju ima za rezultat degradiranje ciljne nukleinske kiseline. U određenim izvođenjima, hibridizacija antisens jedinjenja sa ciljnom nukleinskom kiselinom ne dovodi do degradiranja ciljne nukleinske kiseline. U određenim takvim izvođenjima, prisustvo antisens jedinjenja koje je hibridizovalo sa ciljnom nukleinskom kiselinom (zauzimanje) dovodi do modulacije antisensne aktivnosti. U određenim izvođenjima, antisensna jedinjenja koja imaju određeni hemijski motov ili obrazac hemijskih modifikacija su posebno pogodna za korišćenje jednog ili više mehanizama. U određenim izvođenjima, antisens jedinjenja funkcionišu pomoću više od jednog mehanizma i/ili preko mehanizama koji nisu rasvetljeni. U skladu sa tim, ovde opisana antisensna jedinjenja nisu ograničena određenim mehanizmom.

[0148] Antisens mehanizmi uključuju, bez ograničenja, antisens posredovan sa RNazom H; mehanizme RNKi, koji koriste RISC put i uključuju, bez ograničenja, siRNK, ssRNK i mikroRNK mehanizme; i mehanizme koji su zasnovani za zauzimanju. Određena antisens jedinjenja mogu da deluju preko više od jednog takvog mehanizma i/ili preko dodatnih mehanizama.

Antisens koji je posredovan sa RNazom H

[0149] U određenim izvođenjima, antisens aktivnost nastaje najmanje delom od degradiranja ciljne RNK od RNaze H. RNaza H je ćelijska endonukleaza koja cepa RNK lanac u RNK:DNK dupleksu. U oblasti tehnike je poznato da jednolančana antisens jedinjenja koja su "slična DNK" pokreću aktivnost RNaze H u sisarskim ćelijama. Prema tome, antisens jedinjenja koja obuhvataju najmanje porciju DNK ili nukleozida koji su slični DNK mogu da aktiviraju RNazu H, što rezultuje cepanjem ciljne nukleinske kiseline. U određenim izvođenjima, antisens jedinjenja koja koriste RNazu H obuhvataju jedan ili više modifikovanih nukleozida. U određenim izvođenjima, takva antisens jedinjenja obuhvataju najmanje jedan blok od 1-8 modifikovanih nukleozida. U određenim takvim izvođenjima, modifikovani nukleozidi ne podržavaju aktivnost RNaze H. U određenim izvođenjima, takva antisens jedinjenja su gapmeri, kao što se ovde opisuje. U određenim takvim izvođenjima, „gap“ od gapmera obuhvata DNK nukleozide. U određenim takvim izvođenjima, „gap“ od gapmera obuhvata nukleozide koji su slični DNK. U određenim takvim izvođenjima, „gap“ od gapmera obuhvata DNK nukleozide i nukleozide koji su slični DNK.

[0150] Određena antisens jedinjenja sa motivom gapmera se smatraju himernim antisens jedinjenjima. U unutrašenjem regionu gapmera koji imaju mnoštvo nukleotida koji podržavaju cepanje RNazom H je pozicionirano između spoljašnjih regiona koji imaju mnoštvo nukleotida koji su hemijski različiti od nukleozida iz unutrašnjeg regiona. U slučaju antisens oligonukleotida koji ima motiv gapmera, segment razmaka generalno služi kao supstrat za isecanje endonukleazom, dok segmenti „krila“ obuhvataju modifikovane nukleotide. U određenim izvođenjima, regioni gapmera se razlikuju prema tipovima šećernih ostataka . Tipovi šečernih ostataka koji se koriste za razlikovanje regiona gapmera mogu u nekim izvođenjima da uključe β-D-ribonukleozide, β-Ddezoksiribonukleozide, 2’-modifikovane nukleozide (kao što 2’-modifikovani nukleozidi mogu između ostalih da uključe 2’-MOE i 2’-O-CH3), i nukleozide koji su modifikovani bicikličnim šećerom (takvi nukleozidi koji su modifikovani bicikličnim šećerom mogu da uključe one koji imaju ograničeni etil). U određenim izvođenjima, nukleozidi u „krilima“ mogu da uključe nekoliko modifikovanih ostataka šećera, uključujući, na primer 2’-MOE i biciklične ostatke šećera kao što je ograničeni etil ili LNA. U određenim izvođenjima, „krila“ mogu da uključe nekoliko modifikovanih i nemodifikovanih ostataka šećera. U određenim izvođenjima, „krila“ mogu da uključe različite kombinacije 2’-MOE nukleozida, biciklične ostatke šećera kao što su ograničeni etil nukleozidi ili LNA nukleozidi, i 2’-dezoksinukleozidi.

[0151] Svaki region koji se razlikuje može da sadrži jednoobrazne ostatke šećera, varijantu, ili naizmenične ostatke šećera. Motiv „krilo“razmak-„krilo“ se često opisuje kao "X-Y-Z", gde "X" predstavlja dužinu 5’-„krila“, "Y" predstavlja dužinu razmaka, i "Z" predstavlja dužinu 3’-„krila“. "X" i "Z" mogu da sadrže iste, različite, ili naizmenične ostatke šečera. U određenim izvođenjima, "X" i "Y" mogu da uključe jedan ili više 2’-dezoksinukleozida."Y" može da obuhvati 2’-dezoksinukleozide. Kao što se ovde koristi, gapmer koji se opisuje se "X-Y-Z" ima takvu konfiguraciju da je razmak pozicioniran odmah pored svakog 5’-„krila“ i 3’ „krila“. Prema tome, nema nukleotida koji se pojavljuju i nalaze između 5’-„krila“ i razmaka, ili razmaka i 3’-„krila“. Bilo koje od ovde opisanih antisens jedinjenja mogu da imaju gapmer motiv. U određenim izvođenjima, "X" i "Z" su isti; u drugim izvođenjima oni su drugačiji. U određenim izvođenjima, "Y" je između 8 i 15 nukleozida. X, Y, ili Z može da bude bilo koji od 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30 ili više nukleozida.

[0152] U određenim izvođenjima, antisens jedinjenje koje je usmereno prema nukleinskoj kiselini koja kodira za CFB ima gapmer motiv u kome se razmak sastoji iz 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, ili 16 vezanih nukleozida.

[0153] U određenim izvođenjima, antisens oligonukleotid ima motiv šećera koji se opisuje Formulom A kao što sledi:

(J)m-(B)n-(J)p-(B)r-(A)t-(D)g-(A)v-(B)w-(J)x-(B)y-(J)z

pri čemu:

svaki A je nezavisno 2’-supstituisani nukleozid;

svaki B je nezavisno biciklični nukleozid;

svaki J je nezavisno ili 2’-supstituisani nukleozid ili 2’-dezoksinukleozid;

2

svaki D je 2’-dezoksinukleozid;

m je 0-4; n je 0-2; p je 0-2; r je 0-2; t je 0-2; v je 0-2; w je 0-4; x je 0-2; y je 0-2; z je 0-4; g je 6-14;

pod uslovom da:

najmanje jedan od m, n, i r je osim 0;

najmanje jedan od w i y je osim 0;

zbir m, n, p,r, i t je od 2 do 5; i

zbir v, w, x, y, i z je od 2 do 5.

RNKi jedinjenja

[0154] U određenim izvođenjima, antisens jedinjenja su interferirajuća RNK jedinjenja (RNKi), koja uključuju dvolančana RNK jedinjenja (takođe naznačena sa kratke interferirajuće RNK ili siRNK) i jednolančana RNKi jedinjenja (ili ssRNK). Takva jedinjenja deluju bar delom kroz RISC put da degradiraju i/ili sekvestriraju ciljnu nukleinsku kiselinu (prema tome, uključuju mikroRNK/jedinjenja koja imitiraju mikroRNK). U određenim izvođenjima, antisens jedinjenja obuhvataju modifikacije koje ih čine posebno pogodnim za takve mehanizme.

i. ssRNK jedinjenja

[0155] U određenim izvođenjima, antisens jedinjenja uključujući ona koja su posebno pogodna za upotrebu kao jednolančana RNKi jedinjenja (ssRNK) obuhvataju modifikovani 5’-terminalni kraj. U određenim takvim izvođenjima, 5’-terminalni kraj obuhvata modifikovani fosfatni ostatak. U određenim izvođenjima, takav modifikovani fosfat je stabilizovan (npr., otporan je na degradiranje/isecanje u poređenju sa nemodifikovanim 5’-fosfatom). U određenim izvođenjima, takvi 5’-terminalni nukleozidi stabilizuju 5’-fosforni ostatak. Određeni modifikovani 5’-terminalni nukleozidi mogu da se nađu u oblasti tehnike, na primer u WO/2011/139702.

[0156] U određenim izvođenjima, 5’-nukleozid ssRNK jedinjenja ima formulu IIc:

pri čemu:

T1je opciono zaštićeni ostatak fosfora; T2je intenukleozidna grupa za povezivanje koja povezuje jedinjenje formule IIc sa oligomernim jedinjenjem;

A ima jednu od formula:

Q1i Q2su svaki, nezavisno, H, halogen, C1-C6alkil, supstituisani C1-C6alkil, C1-C6alkoksi, supstituisani C1-C6alkoksi, C2-C6alkenil, supstituisani C2-C6alkenil, C2-C6alkinil, supstituisani C2-C6alkinil ili N(R3)(R4); Q3je O, S, N(R5) ili C(R6)(R7);

svaki R3, R4R5, R6i R7je, nezavisno, H, C1-C6alkil, supstituisani C1-C6alkil ili C1-C6alkoksi;

M3je O, S, NR14, C(R15)(R16), C(R15)(R16)C(R17)(R18), C(R15)=C(R17), OC(R15)(R16) ili OC(R15)(Bx2);

R14je H, C1-C6alkil, supstituisani C1-C6alkil, C1-C6alkoksi, supstituisani C1-C6alkoksi, C2-C6alkenil, supstituisani C2-C6alkenil, C2-C6alkinil ili supstituisani C2-C6alkinil;

R15, R16, R17i R18su svaki, nezavisno, H, halogen, C1-C6alkil, supstituisani C1-C6alkil, C1-C6alkoksi, supstituisani C1-C6alkoksi, C2-C6alkenil, supstituisani C2-C6alkenil, C2-C6alkinil ili supstituisani C2-C6alkinil;

Bx1je heterociklični bazni ostatak;

ili ukoliko je Bx2prisutan onda Bx2je heterociklični bazni ostatak i Bx1je H, halogen, C1-C6alkil, supstituisani C1-C6alkil, C1-C6alkoksi, supstituisani C1-C6alkoksi, C2-C6alkenil, supstituisani C2-C6alkenil, C2-C6alkinil ili supstituisani C2-C6alkinil;

J4, J5, J6i J7su svaki, nezavisno, H, halogen, C1-C6alkil, supstituisani C1-C6alkil, C1-C6alkoksi, supstituisani C1-C6alkoksi, C2-C6alkenil, supstituisani C2-C6alkenil, C2-C6alkinil ili supstituisani C2-C6alkinil;

ili J4obrazuje most sa jednim od J5ili J7pri čemu pomenuti most obuhvata od 1 do 3 vezane biradikalne grupe koje su izabrane od O, S, NR19, C(R20)(R21), C(R20)=C(R21), C[=C(R20)(R21)] i C(=O) i druge dve od J5, J6i J7su svaka, nezavisno, H, halogen, C1-C6alkil, supstituisani C1-C6alkil, C1-C6alkoksi, supstituisani C1-C6alkoksi, C2-C6alkenil, supstituisani C2-C6alkenil, C2-C6alkinil ili supstituisani C2-C6alkinil; svaki R19, R20i R21je, nezavisno, H, C1-C6alkil, supstituisani C1-C6alkil, C1-C6alkoksi, supstituisani C1-C6alkoksi, C2-C6alkenil, supstituisani C2-C6alkenil, C2-C6alkinil ili supstituisani C2-C6alkinil;

G je H, OH, halogen ili O-[C(R8)(R9)]n-[(C=O)m-X1]j-Z;

svaki R8i R9je, nezavisno, H, halogen, C1-C6alkil ili supstituisani C1-C6alkil;

X1je O, S ili N(E1);

Z je H, halogen, C1-C6alkil, supstituisani C1-C6alkil, C2-C6alkenil, supstituisani C2-C6alkenil, C2-C6alkinil, supstituisani C2-C6alkinil ili N(E2)(E3);

E1, E2i E3su svaki, nezavisno, H, C1-C6alkil ili supstituisani C1-C6alkil;

n je od 1 do oko 6;

m je 0 ili 1;

j je 0 ili 1;

svaka supstituisana grupa obuhvata jednu ili više opciono zaštićenih grupa supstituenata koje su nezavisno izabrane od halogen, OJ1, N(J1)(J2), =NJ1, SJ1, N3, CN, OC(=X2)J1, OC(=X2)N(J1)(J2) i C(=X2)N(J1)(J2);

X2je O, S ili NJ3;

svaki J1, J2i J3je, nezavisno, H ili C1-C6alkil;

pri čemu kada j je 1 onda Z je osim halogena ili N(E2)(E3); i

pri čemu pomenuto oligomerno jedinjenje obuhvata od 8 do 40 pojedinica monomera i sposobno je da hibridizuje sa najmanje porcijom ciljne nukleinske kiseline.

[0157] U određenim izvođenjima, M3je O, CH=CH, OCH2ili OC(H)(Bx2). U određenim izvođenjima, M3je O.

[0158] U određenim izvođenjima, J4, J5, J6i J7su svaki H. U određenim izvođenjima, J4obrazuje most sa jednim od J5ili J7.

[0159] U određenim izvođenjima, A ima jednu od formula:

2

pri čemu:

Q1i Q2su svaki, nezavisno, H, halogen, C1-C6alkil, supstituisani C1-C6alkil, C1-C6alkoksi ili supstituisani C1-C6alkoksi. U određenim izvođenjima, Q1i Q2su svaki H. U određenim izvođenjima, Q1i Q2su svaki, nezavisno, H ili halogen. U određenim izvođenjima, Q1i Q2je H i drugi od Q1i Q2je F, CH3ili OCH3.

[0160] U određenim izvođenjima, T1ima formulu:

pri čemu:

Rai Rcsu svaki, nezavisno, zaštićeni hidroksil, zaštićeni tiol, C1-C6alkil, supstituisani C1-C6alkil, C1-C6alkoksi, supstituisani C1-C6alkoksi, zaštićeni amino ili supstituisani amino; i Rbje O ili S. U određenim izvođenjima, Rbje O i Rai Rcsu svaki, nezavisno, OCH3, OCH2CH3ili CH(CH3)2.

[0161] U određenim izvođenjima, G je halogen, OCH3, OCH2F, OCHF2, OCF3, OCH2CH3, O(CH2)2F, OCH2CHF2, OCH2CF3, OCH2-CH=CH2, O(CH2)2-OCH3, O(CH2)2-SCH3, O(CH2)2-OCF3, O(CH2)3-N(R10)(R11), O(CH2)2-ON(R10)(R11), O(CH2)2-O(CH2)2-N(R10)(R11), OCH2C(=O)-N(R10)(R11), OCH2C(=O)-N(R12)-(CH2)2-N(R10)(R11) ili O(CH2)2-N(R12)-C(=NR13)[N(R10)(R11)] pri čemu R10, R11,R12i R13su svaki, nezavisno, H ili C1-C6alkil. U određenim izvođenjima, G je halogen, OCH3, OCF3, OCH2CH3, OCH2CF3, OCH2-CH=CH2, O(CH2)2-OCH3, O(CH2)2-O(CH2)2-N(CH3)2, OCH2C(=O)-N(H)CH3, OCH2C(=O)-N(H)-(CH2)2-N(CH3)2ili OCH2-N(H)-C(=NH)NH2. U određenim izvođenjima, G je F, OCH3ili O(CH2)2-OCH3. U određenim izvođenjima, G je O(CH2)2-OCH3.

[0162] U određenim izvođenjima, 5’-terminalni nukleozid ima Formulu IIe:

[0163] U određenim izvođenjima, antisens jedinjenja, uključujući ona koja su posebno pogodna za ssRNK obuhvataju jedan ili više tipova modifikovanih šećernih ostataka i/ili ostataka šećera koji se pojavljuju u prirodi koji su aranžirani uz nukleotid ili njegov region u definisanom obrascu ili motivu modifikacije šećera. Takvi motivi mogu da uključe bilo koju od modifikacija šećera koja se ovde razmatra i/ili druge poznate modifikacije šećera.

[0164] U određenim izvođenjima, oligonukleotidi obuhvataju ili se sastoje iz regiona koji imaju uniformne modifikacije šećera. U određenim takvim izvođenjima, svaki nukleotid regiona obuhvata istu RNK-sličnu modifikaciju šećera. U određenim izvođenjima, svaki nukleozid u regionu je 2’-F nukleozid. U određenim izvođenjima, svaki nukleozid u regionu je 2’-OMe nukleozid. U određenim izvođenjima, svaki nukleozid u regionu je 2’-MOE nukleozid. U određenim izvođenjima, svaki nukleozid

2

u regionu je cEt nukleozid. U određenim izvođenjima, svaki nukleozid u regionu je LNA nukleozid. U određenim izvođenjima, uniformni region predstavlja sve ili u suštini svaki nukleotid. U određenim izvođenjima, region predstavlja celi oligonukleotid osim 1-4 terminalnih nukleozida.

[0165] U određenim izvođenjima, oligonukleotidi obuhvataju jedan ili više regiona ili naizmeničnih modifikacija šećera, gde su nukleozidi naizmenični između nukleotida koji imaju modifikaciju šećera prvog tipa i nukleotida koji imaju modifikaciju šećera drugog tipa. U određenim izvođenjima, nukleozidi oba tipa su RNK-slični nukleozidi. U određenim izvođenjima naizmenični nukleozidi su izabrani iz: 2’-OMe, 2’-F, 2’-MOE, LNA, i cEt. U određenim izvođenjima, naizmenične modifikacije su 2’-F i 2’-OMe. Takvi regioni mogu da budu kontinuirani ili mogu da budu prekinuti sa različito modifikovanim nukleozidima ili sa konjugovanim nukleozidima.

[0166] U određenim izvođenjima, naizmenični region ili svaka od naizmeničih modifikacija se sastoje iz jednog nukleozida (tj., obrazac je (AB)xAypri čemu A je nukleozid koji ima modifikaiju šećera prvog tipa i B je nukleozid koji ima modifikaciju šećera drugog tipa; x je 1-20 i y je 0 ili 1). U određenim izvođenjima, jedan ili više naizmeničnih regiona u naizmeničnom motivu uključuje više od jednog nukleozida jednog tipa. Na primer, oligonukleotidi mogu da uključe jedan ili više regiona od svakog od sledećih motiva nukleozida:

AABBAA;

ABBABB;

AABAAB;

ABBABAABB;

ABABAA;

AABABAB;

ABABAA;

ABBAABBABABAA;

BABBAABBABABAA; ili

ABABBAABBABABAA; pri čemu A je nukleozid prvog tipa i B je nukleozid drugog tipa. U određenim izvođenjima, A i B su svaki izabrani od 2’-F, 2’-OMe, BNA, i MOE.

[0167] U određenim izvođenjima, oligonukleotidi koji imaju takav naizmenični motiv takođe obuhvataju modifikovani 5’ terminalni nukleozid, kao što je onaj koji ima formulu IIc ili IIe.

[0168] U određenim izvođenjima, oligonukleotidi obuhvataju region koji ima 2-2-3 motiv. Takvi regioni obuhvataju sledeći Motiv:

-(A)2-(B)x-(A)2-(C)y-(A)3

pri čemu: A je prvi tip modifikovanog nukleozida;

B i C, su nukleozidi koji su različito modifikovani u odnosu na A, međutim, B i C mogu međusobno da imaju iste ili različite modifikacije;

x i y su od 1 do 15.

[0169] U određenim izvođenjima, A je 2’-OMe modifikovani nukleozid. U određenim izvođenjima, B i C su oba 2’-F modifikovani nukleozidi. U određenim izvođenjima, A je 2’-OMe modifikovani nukleozid i B i C su oba 2’-F modifikovani nukleozidi.

[0170] U određenim izvođenjima, oligonukleotidi imaju sledeći motiv šećera:

2

5’-(Q)-(AB)xAy-(D)z

pri čemu:

Q je nukleozid koji obuhvata stabilizovani fosfatni ostatak. U određenim izvođenjima, Q je nukleozid koji ima Formulu IIc ili IIe;

A je prvi tip modifikovanog nukleozida;

B je drugi tip modifikovanog nukleozida;

D je modifikovani nukleozid koji obuhvata modifikaciju koja je različita od nukleozida koji je pored njega. Prema tome, ukoliko y je 0, onda

D mora da bude različito modifikovan od B i ukoliko y je 1, onda D mora da bude različito modifikovan od A. U određenim izvođenjima,

D se razlikuje od oba A i B.

X je 5-15;

Y je 0 ili 1;

Z je 0-4.

[0171] U određenim izvođenjima, oligonukleoidi imaju motiv šećera:

5’-(Q)-(A)x-(D)z

pri čemu:

Q je nukleozid koji obuhvata stabilizovani fosfatni ostatak. U određenim izvođenjima, Q je nukleozid koji ima Formulu IIc ili IIe;

A je prvi tip modifikovanog nukleozida;

D je modifikovani nukleozid koji obuhvata mofikaciju koja se razlikuje od A.

X je 11-30;

Z je 0-4.

[0172] U određenim izvođenjima A, B, C, i D u gore navedenim motivima su izabrani od: 2’-OMe, 2’-F, 2’-MOE, LNA, i cEt. U određenim izvođenjima, D predstavlja terminalne nukleozide. U određenim izvođenjima, takvi terminalni nukleozidi nisu dizajnirani da hibridizuju sa ciljnom nukleinskom kiselinom (iako jedan ili više mogu slučajno da hibridizuju). U određenim izvođenjima, nukleobaza svakog D nukleozida je adenin, bez obzira na identitet nukleobaza na odgovarajuem položaju u ciljnoj nukleinskoj kiselini. U određenim izvođenjima nukleobaza svakog D nukleozida je timin.

[0173] U određenim izvođenjima, antisens jedinjenja, uključujući ona koja su posebno pogodna za upotrebu kao ssRNK obuhvataju modifikovane internukleozidne veze koje su uređene duž nukleotida ili njegovog regiona u određenom obrascu ili modifikovanom motivu internukleozidne veze. U određenim izvođenjima, oligonukleotidi obuhvataju region koji ima naizmenični motiv internukleozidne veze. U određenim izvođenjima, oligonukleotidi obuhvataju region ili jednoobrazno modifikovane internukleozidne veze. U određenim takvim izvođenjima, oligonukleotid obuhvata region koji je jednoobrazno povezan fosforotioatnim internukleozidnim vezama. U određenim izvođenjima, oligonukleotid je jednoobrazno povezan sa fosforotioatnim internukleozidnim vezama. U određenim izvođenjima, svaka internukleozidna veza oligonukleotida je izabrana od fosforodiestra i fosforotioata. U određenim izvođenjima, svaka internukleozidna veza oligonukleotida je izabrana od fofodiestra i fosforotioata i najmanje jedna internukleozidna veza je fosforotioat.

[0174] U određenim izvođenjima, oligonukleotid obuhvata najmanje 6 fosforotioatnih internukleozidnih veza. U određenim izvođenjima, oligonukleotid obuhvata najmanje 8 fosforotioatnih

2

internukleoidnih veza. U određenim izvođenjima, oligonukleotid obuhvata najmanje 10 fosforotioatnih internukleozidnih veza. U određenim izvođenjima, oligonukleotid obuhvata najmanje jedan blok od najmanje 6 uzastopnih fosforotioatnih internukleozidnih veza. U određenim izvođenjima, oligonukleotid obuhvata najmanje jedan blok od najmanje 8 uzastopnih fosforotioatnih internukleozidnih veza. U određenim izvođenjima, oligonukleotid obuhvata najmanje jedan blok od najmanje 10 uzastopnih fosforotioatnih internukleozidnih veza. U određenim izvođenjima, oligonukleotid obuhvata najmanje jedan blok od najmanje 12 susednih foforotioatnih internukleozidnih veza. U određenim takvi izvođenjima, najmanje jedan takav blok se nalazi na 3’ kraju oligonukleoida. U određenim takvim izvođenjima, najmanje jedan takav blok se nalazi unutar 3 nukleozida u 3’ kraju oligonukleotida.

[0175] Oligonukleotidi koji imaju bilo koji od ovde opisanih različitih motiva šećera, mogu da imaju bilo koji motiv veze. Na primer, oligonukleotidi, uključujući ali bez ograničenja na one koji se ovde opisuju, mogu da imaju motiv veze koji je tabele u tekstu ispod koja nije ograničavajuća:

ii. siRNK jedinjenja

[0176] U određenim izvođenjima, antisens jedinjenja su dvolančana RNKi jedinjenja (siRNK). U takvim izvođenjima, jedan ili oba lanca mogu da obuhvate bilo koji motiv modifikacije koji se ovde opisuje za ssRNK. U određenim izvođenjima, ssRNK jedinjenja mogu da budu nemodifikovana RNK. U određenim izvođenjima, siRNK jedinjenja mogu da obuhvate nemodifikovane nukleozide RNK, ali modifikovane internuklezidne veze.

[0177] Nekoliko izvođenja se odnose na dvolančane kompozicije pri čemu svaki lanac obuhvata motiv koji se definiše položajem jednog ili više modifikovanih ili nemodifikovanih nukleozida. U određenim izvođenjima, obezbeđene su kompozicije koje obuhvataju prvo i drugo oligomerno jedinjenje koji su u potpunosti ili najmanje delom hibridizovali da se obrazuje region dupleksa i dalje obuhvataju region koji je komplementaran sa i hibridizuje sa ciljnom nukleinskom kiselinom. Pogodno je da takva kompozicija obuhvati prvo oligomerno jedinjenje koje je antisens lanac koji je u potpunosti ili je delom komplementaran sa ciljnom nukleinskom kiselinom i drugo oligomerno jedinjenje koje je „sens“ lanac koji ima jedan ili više regiona koji su komplementarni i obrazuju najmanje jedan region dupleksa sa prvim oligomernim jedinjenjem.

[0178] Kompozicije iz nekoliko izvođenja moduliraju gensku ekspresiju hibridizacijom sa ciljnom nukleinskom kiselinom pri čemu dolazi do gubitka njene normalne funkcije. U određenim izvođenjima, degradiranje ciljnog CFB je olakšano aktiviranjem RISC kompleksa koji se obrazuje sa kompozicijama iz pronalaska.

[0179] Nekoliko izvođenja su usmereni prema dvolančanim kompozicijama pri čemu je jedan od lanaca koristan za, na primer, uticaj na preferencijalno vođenje suprotnog lanca na kompleks RISC (ili za isecanje). Kompozicije su korisne za ciljanje odabranih molekula nukleinske kiseline i moduliranje ekspresije jednog ili više gena. U nekim izvođenjima, kompozicije iz predmetnog pronalaska hibridizuju sa porcijom ciljne RNK pri čemu dolazi do gubitka u normalnoj funkciji RNK.

2

[0180] Određena izvođenja se odnose na dvolančane kompozicije pri čemu oba lanca obuhvataju motiv hemimer, u potpunosti modifikovani motiv, motiv koji je modifikovan u položaju ili naizmenični motiv. Svaki lanac kompozicija iz predmetnog pronalaska može da bude modifikovan da bi ispunio određenu ulogu na primer u putu siRNK. Korišćenjem različitog motiva u svakom lancu ili istog motiva sa različitim hemijskim modifikacijama u svakom lancu dozvoljava ciljanje antisens lanca za RISC kompleks pri čemu se inhibira uključivanje sens lanca. U ovom modelu, svaki lanac može nezavisno da bude modifikovan tako da je unapređen za njegovu posebnu ulogu. Antisens lanac može da bude modifikovan na 5’-kraju da se pojača njegova uloga u različitom regionu RISC dok 3’-kraj može različito da bude modifikovan da se njegova uloga pojača u različitom regionu RISC.

[0181] Dvolanačani molekuli oligonukleotida možu da budu dvolančani polinukleotidni molekul koji obuhvata samo komplementarne sens i antisens regione, pri čemu antisens region obuhvata nukleotidnu sekvencu koja je komplementarna sa nukleotidnom sekvencom u molekulu ciljne nukleinske kiseline ili njegovij porciji i sens region ima nukleotidnu sekvencu koja odgovara ciljnoj nukleinskoj sekvenci ili njegovoj porciji. Dvolančani molekuli nukleotida mogu se sastaviti iz dva odvojena oligonukleotida, pri čemu jedan lanac je sens lanac i drugi je antisens lanac, pri čemu su antisens i sens lanci komplementarni (tj. svaki lanac obuhvata nukleotidnu sekvencu koja je komplementarna sa nukleotidnom sekvencom u drugom lancu; pri čemu antisens i sens lanac obrazuju dupleks ili dvolančanu strukturu, na primer pri čemu dvolančani region je oko 15 do oko 30, npr., oko 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ili 30 baznih parova; antisens lanac obuhvata nukleotidnu sekvencu koja je komplementarna sa nukleotidnom sekvencom u ciljnom molekulu nukleinske kiseline ili njenoj porciji i sens lanac obuhvata nukleotidnu sekvencu koja odgovara ciljnoj sekvenci nukleinske kiseline ili njenoj porciji (npr., oko 15 do oko 25 ili više nukleotida od dvolančanog oligonukleotidnog molekula su komplementarni sa ciljnom nukleinskom kiselinom ili njenom porcijiom). Alternativno, dvolančani oligonukleotid je sastavljen iz jednog oligonukleotida, gde samokomplementarni sens i antisens regioni siRNK su povezani pomoću grupe(a) za vezivanje koje su zasnovane na nukleinskoj kiselini ili nisu zasnovane na nukleinskoj kiselini.

[0182] Dvolančani oligonukleotid može da polinukleotid sa dupleksom, asimerični dupleks, ukosnica ili sekundarna asimetrična struktura ukosnice, koji ima samo-komplementarne sens i antisens regione, pri čemu antisens region obuhvata nukleotidnu sekvencu koja je komplementarna sa nukleotidnom sekvencom u odvojenom molekulu ciljne nukleinske kiseline ili njenoj porciji i sens region koji ima nukleotidnu sekvencu koja odgovara sekvenci ciljne nukleinske kiseline ili njenoj porciji. Dvolančani oligonukleotid može da bude kružni jednolančani polinukleotid koji ima dve ili više strukturi petlji (eng. loop) i osnovu koja obuhvata samo-komplementarne sens i antisens regione, pri čemu antisens region obuhvata nukleotidnu sekvencu koja je komplementarna sa nukleotidnom sekvencom u ciljnom molekulu nukleinske kiseline ili njegovoj porciji i sens region ima nukleotidnu sekvencu koja odgovara ciljnoj nukleinskoj sekvenci ili njenoj porciji, i pri čemu kružni polinukleotid može da bude obrađen ili in vivo ili in vitro da se dobije aktivni siRNK molekul koji je sposoban da posreduje u RNKi.

[0183] U određenim izvođenjima, dvolačani oligonukleotid obuhvata odvojene sens i antisens sekvence ili regione, pri čemu su sens i antisens regioni kovalentno vezani sa nukleotidnim ili nenukleoidnim molekulima za povezivanje koji su poznati oblasti tehnike, ili su naizmenično kovalentno povezani pomoću jonskih interakcija, vezivanje preko vodonika, van der Valsovima interakcijama, hidrofobnim interakcijama, i/ili slaganjem interakcija. U određenim izvođenjima, dvolančani oligonukleotid obuhvata nukleotidnu sekvencu koja je komplementarna sa nukleotidnom sekvencom ciljnog gena. U drugom izvođenju, dvolančani oligonukleotid interaguje sa nukleotidnom sekvencom ciljnog gena na takav način da uzrokuje inhibiciju ekspresije ciljnog gena.

[0184] Kao što se ovde koristi, dvolančani oligonukleotidi ne treba da budu ograničeni sa onim molekulima koji samo sadrže RNK, ali dalje obuhvata hemijski modifikovane nukleotide i ne-nukleotide. U određenim izvođenjima, molekuli kratke interferirajuće nukleinske kiseline nemaju nukleotide koji sadrže 2’-hidroksi OH). U određenim izvođenjima kratke interferirajuće nukleinske kiseline opciono ne uključuju bilo koje ribonukleotide (npr., nukleoidi koji imaju 2’-OH grupu). Takvi dvolančani oligonukleotidi kojima nije potrebno prisustvo ribonukleotida u molekulu da bi se podržala RNKi koja međutim ima vezanu grupu ili grupe za povezivanje ili druge vezane ili pridružene grupe, ostatke, ili lance koji sadrže jedan ili više nukleotida sa 2’-OH grupama. Opciono, dvolančani oligonukleotidi mogu da sadrže ribonukleotide na 5, 10, 20, 30, 40, ili 50% od položaja nukleotida. Kao što se ovde koristi, termin siRNK treba sa bude ekvivalentna sa drugim terminima koji se koriste da se opišu molekuli nukleinske kiseline koja je sposobna da posreduje RNKi koja je specifična za sekvencu, na primer kratka interferirajuća RNK (siRNK), dvolančana RNK (dsRNK), mikro-RNK (miRNK), kratka RNK sa strukturom ukosnice (shRNK), kratki interferirajući oligonukleotid, kratka interferirajuća nukleinska kiselina, kratki interferirajući modifikovani oligonukleotid, hemijski modifikovana siRNK, post-transkripciono utišavanje gena RNK (ptgsRNK), i drugi. Dodatno, kao što se ovde koristi, termin RNKi treba da bude ekvivalentan sa drugim terminima koji se koriste da se opiše RNK interferencija koja je specifična za sekvencu, kao što je post transkripciono utišavanje gena, inhibicija translacije, ili epigenetika. Na primer, dvolančani oligonukleotidi mogu da se koriste za epigenetičko utišavanje gena na oba, posttranskripcionom nivou i na predtranskripcionom nivou. U primeru koji nije ograničavajući, epigenetička regulacija ekspresije gena pomoću molekula siRNK iz pronalaska može da se dobije od modifikacije strukture hromatina koja je posredovana sa siRNK ili obrascem metilacije kako bi se izmenila genska ekspresija (videti, na primer, Verdel et al., 2004, Science, 303, 672-676; Pal-Bhadra et al., 2004, Science, 303, 669-672; Allshire, 2002, Science, 297, 1818-1819; Volpe et al., 2002, Science, 297, 1833-1837; Jenuwein, 2002, Science, 297, 2215-2218; i Hall et al., 2002, Science, 297, 2232-2237).

[0185] Podrazumeva se da jedinjenja i kompozicije iz nekoliko ovde obezbeđenih izvođenja mogu da ciljaju CFB pomoću dsRNK-posredovanog utišavanja gena ili mehanizmom RNKi, uključujući, npr., "ukosnicu" ili drška-petlja dvolančane RNK efektorske molekule u kojima jedan RNK lanac sa samo komplementarnim sekvencama je sposoban da zauzme dvolančanu konformaciju, ili dupleks dsRNK efektorskih molekula koji obuhvataju dva odvojena lanca RNK. U različitim izvođenjima, dsRNK se u potpunosti sastoji iz ribonukleotida ili se sastoji iz smeše ribonukleotida i dezoksinukleotida, kao što su prikazani RNK/DNK hibridi, na primer, od WO 00/63364, koja je podneta 19 aprila 2000, ili U.S. Ser. br.

60/130,377, koja je podneta 21 aprila 1999. dsRNK ili dsRNK efektorski molekul može da bude jedan molekul sa regionom samo-komplementarnosti koji je takav da nukleotidi u jednom segmentu molekula obrazuju bazne parove sa nukleotidima u drugom segmentu molekula. U različitim izvođenjima, dsRNK koja se sastoji iz jednog molekula se u potpunosti sastoji iz ribonukleotida ili uključuje region ribonukleotida koji je komplementaran sa regionom dezoksiribonukleotida. Alternativno, dsRNK može da uključi dva različita lanca koji međusobno imaju region komplementarnosti.

[0186] U različitim izvođenjima, oba lanca se u potpunosti sastoje iz ribonukleotida, jedan lanac se u potpunosti sastoji iz ribonukleotida i drugi lanac se u potpunosti sastoji iz dezoksiribonukleotida, ili jedan ili oba lanca sadrže smešu ribonukleotida i dezoksiribonukleotida. U određenim izvođenjima, regioni komplementarnosti su najmanje 70, 80, 90, 95, 98, ili 100% komplementarni jedan sa drugim i sa sekvencom ciljne nukleinske kiseline. U određenim izvođenjima, region dsRNK koji se nalazi u dvolančanoj konformaciji uključuje najmanje 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 50, 75,100, 200, 500, 1000, 2000 ili 5000 nukleotida ili uključuje svaki od nukleotida u cDNK ili drugoj ciljnoj sekvenci nukleinske kiseline koja je zastupljena u dsRNK. U nekim izvođenjima, dsRNK ne obuhvata bilo koje jednolančane regione, kao što su jednolančani krajevi, ili dsRNK ima oblik ukosnice. U drugim

1

izvođenjima, dsRNK ima jedan ili više jednolančanih regiona ili lepljivih krajeva. U određenim izvođenjima, hibridi RNK/DNK uključuju DNK lanac ili region koji je antisensni lanac ili region (npr, koji je najmanje 70, 80, 90, 95, 98, ili 100% komplementaran sa ciljnom nukleinskom kiselinom) i RNK lanac ili region koji je sensni lanac ili region (npr, najmanje je 70, 80, 90, 95, 98, ili 100% identičan sa ciljnom nukleinskom kiselinom), i obrnuto.

[0187] U različitim izvođenjima, hibrid RNK/DNK se dobija in vitro korišćenjem enzimskih ili hemijskih postupaka sinteze kao što su oni koji se ovde opisuju ili oni koji se opisuju u WO 00/63364, koja je podneta 19 aprila 2000, ili U.S. Ser. br. 60/130,377, koja je podneta 21 aprila 1999. U drugim izvođenjima, DNK lanac koji je in vitro sintetisan je u kompleksu sa RNK lancem dobijenim in vivo ili in vitro pre, posle, ili istovremeno sa transformacijom DNK lanca u ćeliji. U još drugim izvođenjima, dsRNK je jedna kružna nukleinska kiselina koja obuhvata sens i antisensni region, ili dsRNK uključuje kružnu nukleinsku kiselinu i ili drugu kružnu nukleinsku kiselinu ili linearnu nukleinsku kiselinu (videti, na primer, WO 00/63364, koja je podneta 19 aprila 2000, ili U.S. Ser. br.60/130,377, koja je podneta 21 aprila 1999.) Primeri kružnih nukleinskih kiselina uključuju strukture oblika lasa u kojima slobodna 5’ fosforil grupa nukleotida postaje povezana sa 2’ hidroksilnom grupom drugog nukleotida na način koji podrazumeva obrazovanje petlje.

[0188] U drugim izvođenjima, dsRNK uključuje jedan ili više modifikovanih nukleotida u kojima 2’ pozicija u šećeru obuhvata halogen (kao što je grupa fluora) ili obuhvata alkoksi grupu (kao što je metoski grupa) koja povećava polu-život dsRNK in vitro ili in vivo u poređenju sa odgovarajućom dsRNK u kojoj odgovarajuća 2’ pozicija obuhvata vodonik ili hidroksilnu grupu. U još drugim izvođenjima, dsRNK uključuje jednu ili više veza između susednih nukleotida koja nije fosfodiestarska veza koja se nalazi u prirodi. Primeri takvih veza uključuju fosforoamidne, fosforotioatne, i fosforoditioatne veze. dsRNK mogu takođe da budu hemijski modifikovani molekuli nukleinske kiseline kao što je predstavljeno u U.S. Pat. br. 6,673,661. U drugim izvođenjima, dsRNK sadrži jedan ili dva lanca koji obuhvataju strukturu kape, kao što je prikazano, na primer, od strane WO 00/63364, koja je podneta 19 aprila 2000, ili U.S. Ser. br.60/130,377, koja je podneta 21 aprila 1999.

[0189] U drugim izvođenjima, dsRNK može da bude bilo koji od najmanje delom dsRNK molekula koji su prikazani u WO 00/63364, kao i bilo koji od dsRNK molekula koji se opisuju u U.S. privremenoj prijavi 60/399,998; i U.S. privremenoj prijavi 60/419,532, i PCT/US2003/033466. Bilo koja od dsRNK može da bude eksprimirana in vitro ili in vivo upotrebom postupaka koji se ovde opisuju ili standardnih postupaka, kao što su oni koji se opisuju u WO 00/63364.

Zauzetost

[0190] U određenim izvođenjima, ne očekuje se da antisens jedinjenja dovedu do isecanja ili ciljne nukleinske kiseline pomoću RNaze H ili da dovedu do isecanja ili sekvestriranja kroz RISC put. U određenim takvim izvođenjima, antisens aktivnost može da se dobije iz zauzetosti, pri čemu prisustvo hibridizovanog antisens jedinjenja narušava aktivnost ciljne nukleinske kiseline. U određenim takvim izvođenjima, antisens jedinjenje može jednoobrazno da bude modifikovano ili može da sadrži kombinaciju modifikacija i/ili modifikovanih i nemodifikovanih nukleozida.

Ciljne nukleinske kiseline, ciljni regioni i nukleotidne sekvence

[0191] Nukleotidne sekvence koje kodiraju faktor B komplementa (CFB) uključuju, bez ograničenja, sledeće: GENBANK pristupni br. NM_001710.5 (ovde prikazan sa SEQ ID NO: 1), GENBANK pristupni br. NT_007592.15 koji je prekinut od nukleotida 31852000 do 31861000 (ovde prikazan sa SEQ ID NO: 2), GENBANK pristupni br. NW_001116486.1 koji je prekinut od nukleotida 536000 to 545000 (ovde

2

prikazan sa SEQ ID NO: 3), GENBANK pristupni br. XM_001113553.2 (ovde prikazan sa SEQ ID NO: 4), ili GENBANK pristupni br. NM_008198.2 (ovde prikazan sa SEQ ID NO: 5).

Hibridizacija

[0192] U nekim izvođenjima, hibridizacija se događa između ovde prikazanog antisens jedinjenja i nukleinske kiseline koja kodira CFB. Najviše zastupljeni mehanizam hibridizacije uključuje vezivanje vodonika (npr., Watson-Crick-ovo, Hoogsteen-ovo ili reverzno Hoogsteen-ovo vezivanje vodonika) između komplementarnih nukleobaza u molekulima nukleinske kiseline.

[0193] Hibridizacija može da se dogodi pod uslovima koji se razlikuju. Strogi uslovi su zavisni od sekvence i određuju se prirodom i kompozicijom molekula nukleinske kiseline koja treba da hibridizuje.

[0194] Postupci kojima se određuje da li sekvenca može specifično da hibridizuje sa ciljnom nukleinskom kiselinom su dobro poznati u oblasti tehnike. U određenim izvođenjima, ovde obezbeđena antisens jedinjenja posebno hibridizuju sa nukleinskom kiselinom koja kodira za CFB.

Koplementarnost

[0195] Antisens jedinjenje i ciljna nukleinska kiselina su međusobno komplementarne kada dovoljan broj nukleobaza iz antisens jedinjenja može da obrazuje vodoničnu vezu sa odgovarajućim nukleobazama u ciljnoj nukleinskoj kiselini, tako da će se desiti željeni efekat (npr., antisens inhibicija ciljne nukleinske kiseline, kao što je nukleinska kiselina koja kodira za CFB).

[0196] Ne-komplementarne nukleobaze između antisens jedinjenja i nukleinske kiseline koja kodira za CFB mogu da se tolerišu pod uslovom da antisens jedinjenje ostaje sposobno da specifično hibridizuje sa ciljnom nukleinskom kiselinom. Osim toga, antisens jedinjenje može da hibridizuje preko jednog ili više segmenata nukleinske kiseline koja kodira za CFB tako da segmenti koji se nalaze između ili susedni nisu uključeni u događaj hibridizacije (npr., struktura petlje, pogrešno sparena ili struktura ukosnice).

[0197] U određenim izvođenjima, ovde obezbeđena anitsens jedinjenja, ili njihova specifična porcija, su, ili su najmanje, 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% komplementarni sa nukleinskom kiselinom koja kodira za CFB, ciljnim regionom, ciljnim segmentom, ili njegovom specifičnom porcijom. Procenat komplementarnosti antisens jedinjenja sa ciljnom nukleinskom kiselinom može da se odredi korišćenjem rutinskih postupaka.

[0198] Na primer, antisens jedinjenje u kome je 18 od 20 nukleobaza antisens jedinjenja komplementarno sa ciljnim regionom, i prema tome specifično hibridizuje, će predstavljati 90 procentnu komplementarnost. U ovom primeru, preostale nekomplementarne nukleobaze mogu da budu grupisane ili isprekidane sa komplementarnim nukleobazama i ne moraju da budu bliske jedne drugima ili sa komplementarim nukleobazama. Kao takvo, antisens jedinjenje koje ima 18 nukleobaza u dužini ima četiri nekomplementarne nukleobaze koje su ograničene sa dva regiona koji su u potpunosti komplementarni sa ciljnom nukleinskom kiselinom će imati 77.8% sveukupnu komplementarnost sa ciljnom nukleinskom kiselinom i prema tome će biti obuvaćene obimom prikazanog predmetnog prikaza. Procenat komplementarnosti antisens jedinjenja sa regionom ciljne nukleinske kiseline će rutinski biti određena upotrebom BLAST programa (alati za pretraživanje osnovnog lokalnog poravnanja) i PowerBLAST programa koji su poznati u oblasti tehnike (Altschul et al., J. Mol. Biol., 1990, 215, 403410; Zhang and Madden, Genome Res., 1997, 7, 649656). Procenat homologije, identitet sekvence ili komplementarnost, može da bude određena od strane, na primer, Gap programa (Wisconsin Sekvenca Analysis Package, Version 8 for Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, Madison Wis.), upotrebom osnovnih podešavanja, koja koriste Smith i Waterman- ov algoritam (Adv. Appl. Math., 1981, 2, 482489).

[0199] U određenim izvođenjima, ovde obezbeđena antisens jedinjenja, ili njihove specifične porcije, su u potpunosti komplementarne (tj. 100% komplementarne) sa ciljnom nukleinskom kiselinom, ili njenom specifičnom porcijom. Na primer, antisens jedinjenje može da bude u potpunosti komplementarno sa nukleinskom kiselinom koja kodira za CFB, ili ciljnim regionom, ili ciljnim segmentom ili njegovom ciljnom sekvencom. Kao što se ovde koristi, "u potpunosti komplementarna" znači da je svaka nukleobaza antisens jedinjenja sposobna za precizno sparivanje baza sa odgovarajućim nukleobazama u ciljnoj nukleinskoj kiselini. Na primer, antisens jedinjenje koje sadrži 20 nukleobaza je u potpunosti komplementarno sa ciljnom sekvencom koja je dužine 400 nukleobaza, dokle god postoji odgovarajuća porcija 20 nukleobaza ciljne nukleinske kiseline koja je u potpunosti komplementarna sa antisens jedinjenjem. U potpunosti komplementarno može takođe da se koristi u referenci za specifičnu porciju prve i /ili druge nukleinske kiseline. Na primer, porcija od 20 nukleobaza 30 nukleobaza antisens jedinjenja može da bude "u potpunosti komplementarna" sa ciljnom sekvencom koja je duga 400 nukleobaza. Porcija 20 nukleobaza od oligonukleotida 30 nukleobaza je u potpunosti komplementarna sa ciljnom sekvencom ukoliko ciljna sekvenca ima odgovarajuću porciju 20 nukleobaza pri čemu je svaka nukleobaza komplementarna sa procijom 20 nukleobaza antisens jedinjenja. Istovremeno, celo antisens jedinjenje od 30 nukleobaza može ili ne mora da bude u potpunosti komplementarno sa ciljnom sekvencom, u zavisnosti od toga da li su preostalih 10 nukleobaza antisens jedinjenja takođe komplementarni sa ciljnom sekvencom.

[0200] Položaj ne-komplementarne nukleobaze može da bude na 5’ kraju ili 3’ kraju antisens jedinjenja. Alternativno, ne-komplementarna nukleobaza ili nukleobaze mogu da budu na unutrašnjem položaju antisens jedinjenja. Kada su prisutne dve ili više ne-komplementarnih nukleobaza, mogu da budu kontinuirane (tj. povezane) ili ne-kontinuirano. U jednom izvođenju, ne-komplementarna nukleobaza je pozicionirana u segmentu „krila“ gapmera antisens oligonukleotida.

[0201] U određenim izvođenjima, antisens jedinjenja koja su, ili su do 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, ili 20 nukleobaza u dužini obuhvataju ne više od 4, ne više od 3, ne više od 2, ili ne više od 1 nekomplementarne nukleobaze(a) u odnosu na ciljnu nukleinsku kiselinu, kao što je nuklelinska kiselina koja kodira CFB, ili njenu specifičnu porciju.

[0202] U određenim izvođenjima, antisens jedinjenja koja su, ili su do 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, ili 30 nukleobaza u dužini obuhvataju ne više od 6, ne više od pet 5, ne više od 4, ne više od 3, ne više od 2, ili ne više od 1 ne-komplementarne nukleobaze(a) u odnosu na ciljnu nukleinsku kiselinu, kao što je nukleinska kiselina koja kodira za CFB, ili njena specifična porcija.

[0203] Ovde obezbeđena jedinjenja takođe uključuju ona koja su komplementarna sa porcijom ciljne nukleinske kiseline. Kao što se ovde koristi, "porcija" se odnosi na definisani broj kontinuiranih (tj. povezanih) nukleobaza unutar regiona ili segmenta ciljne nukleinske kiseline. "Porcija" može takođe da se odnosi na definisani broj kontinuiranih nukleobaza antisens jedinjenja.

Identičnost

[0204] Ovde obezbeđena antisens jedinjenja mogu takođe da u određenom procentu budu identična sa određenom nukleotidnom sekvencom, SEQ ID NO, ili jedinjenje koje je predstavljeno specifičnim Isis brojem, ili njegovom porcijom. Kao što se ovde koristi, antisens jedinjenje je identično sa sekvencom koja je ovde prikazana ukoliko ima istu sposobnost spajanja nukleobaza. Na primer, RNK koja sadrži uracil umesto timidin u prikazanoj DNK sekvenci će se smatrati identičnom sa DNK sekvecom s obzirom da i uraci i timidin obrazuju bazni par sa adeninom. Takođe se razmatraju skraćene i produžene verzije ovde opisanih antisens jedinjenja kao i jedinjenja koja imaju ne-identične nukleobaze u odnosu na ovde obezbeđena antisens jedinjenja. Ne-identične baze mogu da budu jedna pored druge ili mogu da budu

4

dispergovane kroz antisens jedinjenje. Procenat identičnosti antisens jedinjenja se izračunava prema broju baza koje imaju identično spajanje baza u odnosu na sekvencu sa kojom se porede.

[0205] U određenim izvođenjima, antisens jedinjenja, ili njihove porcije, su, ili su najmanje 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identične sa jednim ili više antisens jedinjenjima ili SEQ ID NOs, ili njihovu porciju, koji su ovde prikazani.

[0206] U određenim izvođenjima, porcija antisens jedinjenja se poredi sa porcijom jednake dužine ciljne nukleinske kiseline. U određenim izvođenjima, porcija 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, ili 25 nukleobaza se poredi sa porcijom jednake dužine ciljne nukleinske kiseline.

[0207] U određenim izvođenjima, porcija antisens oligonukleotida se poredi sa porcijom jednake dužine ciljne nukleinske kiseline. U određenim izvođenjima, porcija 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, ili 25 nukleobaza se poredi sa porcijom jednake dužine ciljne nukleinske kiseline.

Modifikacije

[0208] Nukleozid je kombinacija baze i šećera. Nukleobazna (takođe poznata kao bazna) porcija nukleozida je normalno heterociklični bazni ostatak. Nukleotidi su nukleozidi koji dalje uključuju fosfatnu grupu koja je kovalentno vezana za ostatak šećera u nukleozidu. Za one nukleozide koji uključuju pentofuranozil šećer, fosfatna grupa može da bude vezana za 2’, 3’ ili 5’ hidroksilni ostatak šećera. Oligonukleotidi se obrazuju preko kovalentih vezivanja susednih nukleotida jedan sa drugim, da se obrazuje linearni polimerni oligonukleotid. U oligonukleotidnoj strukturi, fosfatne grupe se obično nazivaju grupe koje obrazuju oligonukleozidne veze u oligonukleotidu.

[0209] Izmene u antisens jedinjenja obuhvataju supstitucije ili promene u internukleozidnim vezama, ostacima šećera, ili nukleobazama. Modifikovana antisens jedinjenja su često poželjnija u odnosu na prirodne oblike zbog željenih svojstava kao što su, na primer, pojačani ćelijski unos, pojačani afinitet za ciljnu nukleinsku kiselinu, povećana stabilnost u prisustvu nukleobaza, ili povećana inhibitorna aktivnost.

[0210] Hemijski modifikovani nukleozidi mogu takođe da se koriste da se poveća afinitet vezivanja skraćenog ili prekinutog antisens oligonukleotida za njegovu ciljnu nukleinsku kiselinu. U skladu sa tim, uporedivi rezultati mogu često da se dobiju sa skraćenim antisens jedinjenjima koji imaju takve modifikovane nukleozide.

Modifikovane internukleozidne veze

[0211] Internukleozidna veza RNK i DNK koja se nalazi u prirodi je 3’ ka 5’ fosfodiestarska veza. Antisens jedinjenja koja imaju jedan ili više modifikovanih, tj. koje se ne pojavljuju u prirodi, internukleozidne veze su često izabrane od antisens jedinjenja koja imaju internukleozidne veze koje se pojavljuju u prirodi zbog željenih svojstava kao što su, na primer, pojačani ćelijski unos, pojačani afinitet za ciljne nukleinske kiseline, i pojačana stabilnost u prisustvu nukleaza.

[0212] Oligonukleotidi koji imaju modifikovane internukleozidne veze uključuju internukleozidne veze koje zadržavaju atom fosfora kao internukleozidne veze koje ne sadrže atom fosfora. Primeri interukleozidnih veza koje obuhvataju fosfor uključuju, ali nisu ograničene na, fosfodiestre, fosfotriestre, metilfosfonate, fosforoamidate, i fosfotioate. Postupi za dobijanje veza koje sadrže fosfor i koje ne sadrže fosfor su dobro poznate u oblasti tehnike.

[0213] U određenim izvođenjima, antisens jedinjenja koja su usmerena prema nukleinskoj kiselini koja kodira za CFB obuhvataju jednu ili više internukleozidnih veza. U određenim izvođenjima, modifikovane internukleozidne veze su fosforotioatne veze. U određenim izvođenjima, svaka internukleozidna veza antisens jedinjenja je fosforotioatna internukleozidna veza.

Modifikovani ostaci šećera

[0214] Antisens jedinjenja mogu opciono da sadrže jedan ili više nukleozida pri čemu grupa šećera može da bude modifikovana. Takvi nukleozidi sa modifikovanim šećerom mogu da prenesu pojačanu stabilnost prema nukleazama, pojačani afinitet vezivanja, ili neko drugo korisno biološko svojstvo prema antisens jedinjenjima. U određenim izvođenjima, nukleozidi obuhvataju hemijski modifikovane ostatke ribofuranoznog prstena. Primeri hemijski modifikovanih ribofuranoznih prstenova uključuju bez ograničenja, dodavanje grupa supstituenata (uključujući 5’ i 2’ grupa supstituenata, premošćavanje ne-geminalnih atoma u prstenu da se obrazuju biciklične nukleinske kiseline (BNA), zamena atoma kiseonika u ribozil prstenu sa S, N(R), ili C(R1)(R2) (R, R1i R2su svaki nezavisno H, C1-C12alkil ili zaštitna grupa) i njene kombinacije. Primeri hemijski modifikovanih šećera uključuju 2’-F-5’-metil supstituisani nukleozid (videti PCT Međunarodnu prijavu WO 2008/101157 koja je objavljena 8/21/08 za druge prikazane 5’,2’-bis supstituisane nukleozide) ili zamena atoma kiseonika u ribozil prstenu sa S sa daljom supstitucijom na 2’-položaju (videti objavljenu U.S. prijavu patenta US2005-0130923, koja je objavljena 16 juna, 2005) ili alternativno 5’-supstituciju BNA (videti PCT Međunarodnu prijavu WO 2007/134181 koja je objavljena 11/22/07 pri čemu LNA je supstituisana sa na primer 5’-metil ili 5’-vinil grupom).

[0215] Primeri nukleozida koji imaju modifikovane ostatke šećera uključuju bez ograničenja nukleozide koji obuhvataju 5’vinil, 5’-metil (R ili S), 4’-S, 2’-F, 2’-OCH3, 2’-OCH2CH3, 2’-OCH2CH2F i 2’-O(CH2)2OCH3grupe supstituenata. Supstituent na 2’ položaju može tkođe da bude izabran od alil, amino, azido, tio, O-alil, O-C1-C10alkil, OCF3, OCH2F, O(CH2)2SCH3, O(CH2)2-O-N(Rm)(Rn), O-CH2-C(=O)-N(Rm)(Rn), i O-CH2-C(=O)-N(R1)-(CH2)2-N(Rm)(Rn), pri čemu svaki R1, Rmi Rnje, nezavisno, H ili supstituisani ili nesupstituisani C1-C10alkil.

[0216] Kao što se ovde koristi, "biciklični nukleozidi" se odnose na modifikovane nukleozide koji obuhvataju biciklični ostatak šećera. Primeri bicikličnih nukleozida uključuju bez ograničenja nukleozida obuhvataju most između 4’ i 2’ atoma ribozil prstena. U određenim izvođenjima, ovde obezbeđena antisens jedinjenja uključuju jedan ili više bicikličnih nukleozida koji obuhvataju most 4’ do 2’. Primeri takvih 4’ do 2’ premošćenih bicikličnih nukleozida, uključuju ali nisu ograničeni na jednu od formula: 4’-(CH2)-O-2’ (LNA); 4’-(CH2)-S-2’; 4’-(CH2)2-O-2’ (ENA); 4’-CH(CH3)-O-2’ (takođe nazačen sa ograničeni etil ili cEt) i 4’-CH(CH2OCH3)-O-2’ (i njegove analoge videti U.S. Patent 7,399,845, koji je objavljen 15 jula, 2008); 4’C(CH3)(CH3)-O-2’ (i njegove analoge videti objavljenu Međunarodnu prijavu WO/2009/006478, koja je objavljenja 8 januara, 2009); 4’-CH2-N(OCH3)-2’ (i njegove analoge videti videti objavljenu Međunarodnu prijavu WO/2008/150729, koja je objavljena 11 decembra, 2008); 4’-CH2-O-N(CH3)-2’ (videti objavljenu U.S. prijavu patenta US2004-0171570, koja je objavljena 2 septembra, 2004); 4’-CH2-N(R)-O-2’, pri čemu R je H, C1-C12alkil, ili zaštitna grupa (videti U.S. Patent 7,427,672, koja je objavljena 23 septembra, 2008); 4’-CH2-C(H)(CH3)-2’ (videti Chattopadhyaya et al., J. Org. Chem., 2009, 74, 118-134); i 4’CH2-C(=CH2)-2’ (a i njegove analoge videti objavljenu Međunarodnu prijavu WO 2008/154401, koja je objavljena 8 decembra, 2008).

[0217] Dalji izveštaji koji se odnose na biiklične nukleozide mogu takođe da se nađu u objavljenoj literaturi (videti na primer: Singh et al., Chem. Commun., 1998, 4, 455-456; Koshkin et al., Tetrahedron, 1998, 54, 3607-3630; Wahlestedt et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 2000, 97, 5633-5638; Kumar et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 1998, 8, 2219-2222; Singh et al., J. Org. Chem., 1998, 63, 10035-10039; Srivastava et al., J. Am. Chem. Soc., 2007, 129(26) 8362-8379; Elayadi et al., Curr. Opinion Invest. Drugs, 2001, 2, 558-561; Braasch et al., Chem. Biol., 2001, 8, 1-7; and Orum et al., Curr. Opinion Mol. Ther., 2001, 3, 239-243; U.S. Patent Nos.6,268,490; 6,525,191; 6,670,461; 6,770,748; 6,794,499; 7,034,133; 7,053,207; 7,399,845; 7,547,684; and 7,696,345; U.S. Patent Publication No. US2008-0039618; US2009-0012281; U.S. Patent Serial Nos. 60/989,574; 61/026,995; 61/026,998; 61/056,564; 61/086,231; 61/097,787; i 61/099,844; Objavljene PCT Međunarodne prijave WO 1994/014226; WO 2004/106356; WO 2005/021570; WO 2007/134181; WO 2008/150729; WO 2008/154401; i WO 2009/006478. Svaki od gore navedenih bicikličnih nukleozida može da se pripremi tako da ima jednu ili više stereohemijskih konfiguracija šećera uključujući na primer α-L-ribofuranozu i β-D-ribofuranozu (videti PCT međunarodnu prijavu PCT/DK98/00393, koja je objavljenja 25 marta, 1999 pod WO 99/14226).

[0218] U određenim izvođenjima, biciklični ostaci šećera BNA nukleozida uključuju, ali nisu ograničeni na, jedinjenja koja imaju najmanje jedan most između 4’ i 2’ položaja pentofuranozil ostatka šećera gde takvi mostovi nezavisno obuhvataju 1 ili od 2 do 4 vezane grupe koje su nezavisno izabrane od -[C(Ra)(Rb)]n-, -C(Ra)=C(Rb)-, -C(Ra)=N-, -C(=O)-, -C(=NRa)-, -C(=S)-, -O-, -Si(Ra)2-, -S(=O)x-, i -N(Ra)-;

pri čemu:

x je 0, 1, ili 2;

n je 1, 2, 3, ili 4;

svaki Rai Rbje, nezavisno, H, zaštitna grupa, hidroksil, C1-C12alkil, supstituisani C1-C12alkil, C2-C12alkenil, supstituisani C2-C12alkenil, C2-C12alkinil, supstituisani C2-C12alkinil, C5-C20aril, supstituisani C5-C20aril, heterociklični radikal, supstituisani heterociklični radikal, heteroaril, supstituisani heteroaril, C5-C7aliciklični radikal, supstituisani C5-C7aliciklični radikal, halogen, OJ1, NJ1J2, SJ1, N3, COOJ1, acil (C(=O)-H), supstituisani acil, CN, sulfonil (S(=O)2-J1), ili sulfoksil (S(=O)-J1); i

svaki J1i J2je, nezavisno, H, C1-C12alkil, supstituisani C1-C12alkil, C2-C12alkenil, supstituisani C2-C12alkenil, C2-C12alkinil, supstituisani C2-C12alkinil, C5-C20aril, supstituisani C5-C20aril, acil (C(=O)-H), supstituisani acil, heterociklični radikal, supstituisani heterociklični radikal, C1-C12aminoalkil, supstituisani C1-C12aminoalkil ili zaštitna grupa.

[0219] U određenim izvođenjima, most u bicikličnom ostatku šećera je -[C(R)(Rb)]-, -[C(R)(Rb)]-O-, -C(RaRb)-N(R)-O- ili -C(RaRb)-O-N(R)-. U određenim izvođenjima, most je 4’-CH2-2’, 4’-(CH2)2-2’, 4’-(CH2)3-2’, 4’CH2-O-2’, 4’-(CH2)2-O-2’, 4’-CH2-O-N(R)-2’ i 4’-CH2-N(R)-O-2’- pri čemu svaki R je, nezavisno, H, zaštitina grupa ili C1-C12alkil.

[0220] U određenim izvođenjima, biciklični nukleozidi su dalje definisani izomernom konfiguracijom. Na primer, nukleozid koji obuhvata 4’-2’metilen-oksi most, može da bude u α-L konfiguraciji ili u β-D konfiguraciji. Prethodno, α-L-metilenoksi BNA u uključeni u antisens oligonukleotide koji ispoljavaju antisens aktivnost (Frieden et al., Nucleic Acids Research, 2003, 21, 6365-6372).

[0221] U određenim izvođenjima, biciklični nukleozidi uključuju, ali nisu ograničeni na, (A) α-L-metilenoksi (4’-CH2-O2’) BNA, (B) β-D- metilenoksi (4’-CH2-O-2’) BNA, (C) etilenoksi (4’-(CH2)2-O-2’) BNA, (D) aminooksi (4’-CH2-ON(R)-2’) BNA, (E) oksiamino (4’-CH2-N(R)-O-2’) BNA, i (F) metil(metilenoksi) (4’-CH(CH3)-O-2’) BNA, (G) metilen-tio (4’-CH2-S-2’) BNA, (H) metilen-amino (4’-CH2-N(R)-2’) BNA, (I) metil karbociklični (4’-CH2-CH(CH3)-2’) BNA, (J) propilen karbociklični (4’-(CH2)3-2’) BNA i (K) vinil BNA kao što je predstavljeno u tekstu ispod:

pri čemu Bx je bazi ostatak i R je nezavisno H, zaštitna grupa, C1-C12alkil ili C1-C12alkoksi.

[0222] U određenim izvođenjima, obezbeđeni su biciklični nukleozidi koji imaju Formulu I:

pri čemu:

Bx je heterociklični bazni ostatak;

-Qa-Qb-Qc- je -CH2-N(Rc)-CH2-, -C(=O)-N(Rc)-CH2-, -CH2-O-N(Rc)-, -CH2-N(Rc)-O-ili -N(Rc)-O-CH2;

Rcje C1-C12alkil ili amino zaštitna grupa; i

T i Tbsu svaki, nezavisno H, hidroksil zaštitna grupa, konjugatna grupa, reaktivna fosforna grupa, ostatak fosfora ili kovalentno vezivanje za medijum za podršku.

[0223] U određenim izvođenjima, obezbeđeni su biciklični nukleozidi koji imaju Formulu II:

pri čemu:

Bx je heterociklični bazni ostatak;

Tai Tbsu svaki, nezavisno H, hidroksil zaština grupa, konjugovana grupa, reaktivna fosforna grupa, fosforni ostatak ili kovalentno vezivanje za medijum za podršku;

Zaje C1-C6alkil, C2-C6alkenil, C2-C6alkinil, supstituisani C1-C6alkil, supstituisani C2-C6alkenil, supstituisani C2-C6alkinil, acil, supstituisani acil, supstituisani amid, tiol ili supstituisani tio.

[0224] U jednom izvođenju, svaka od supstituisanih grupa je, nezavisno, mono ili poli supstituisana sa grupama supstituenata koje su nezavisno izabrane od halogen, okso, hidroksil, OJc, NJcJd, SJc, N3, OC(=X)Jc, i NJeC(=X)NJcJd, pri čemu svaka Jc, Jdi Jeje, nezavisno, H, C1-C6alkil, ili supsitisani C1-C6alkil i X je O ili NJc.

[0225] U određenim izvođenjima, obezbeđeni su biciklični nukleozidi koji imaju Formulu III:

pri čemu:

Bx je heterociklični bazni ostatak;

Tai Tbsu svaki, nezavisno H, hidroksil zaština grupa, konjugovana grupa, reaktivna fosforna grupa, fosforni ostatak ili kovalentno vezivanje za medijum za podršku;

Zbje C1-C6alkil, C2-C6alkenil, C2-C6alkinil, supstituisani C1-C6alkil, supstituisani C2-C6alkenil, supstituisani C2-C6alkinil ili supstituisani acil (C(=O)-).

[0226] U određenim izvođenjima, obezbeđeni su biciklični nukleozidi koji imaju Formulu IV:

pri čemu:

Bx je heterociklični bazni ostatak;

Tai Tbsu svaki, nezavisno H, hidroksil zaština grupa, konjugovana grupa, reaktivna fosforna grupa, fosforni ostatak ili kovalentno vezivanje za medijum za podršku;

Rdje C-C6alkil, supstituisani C1-C6alkil, C2-C6alkenil, supstituisani C2-C6alkenil, C2-C6alkinil ili supstituisani C2-C6alkinil;

svaki qa, qb, qci qdje, nezavisno, H, halogen, C1-C6alkil, supstituisani C1-C6alkil, C2-C6alkenil, supstituisani C2-C6alkenil, C2-C6alkinil ili supstituisani C2-C6alkinil, C1-C6alkoksil, supstituisani C1-C6alkoksil, acil, supstituisani acil, C1-C6aminoalkil ili supstituisani C1-C6aminoalkil;

[0227] U određenim izvođenjima, obezbeđeni su biciklični nukleozidi koji imaju Formulu V:

pri čemu:

Bx je heterociklični bazni ostatak;

Tai Tbsu svaki, nezavisno H, konjugovana grupa, reaktivna fosforna grupa, fosforni ostatak ili kovalentno vezivanje za medijum za podršku;

qa, qb, qei qfsu svaki, nezavisno, vodonik, halogen, C1-C12alkil, supstituisani C1-C12alkil, C2-C12alkenil, supstituisani C2-C12alkenil, C2-C12alkinil, supstituisani C2-C12alkinil, C1-C12alkoksi, supstituisani C1-C12alkoksi, OJj, SJj, SOJj, SO2Jj, NJjJk, N3, CN, C(=O)OJj, C(=O)NJjJk, C(=O)Jj, O-C(=O)NJjJk, N(H)C(=NH)NJjJk, N(H)C(=O)NJjJkili N(H)C(=S)NJjJk;

ili qei qfsu zajedno =C(qg)(qh);

qgi qhsu svaki, nezavisno, H, halogen, C1-C12alkil ili supstituisani C1-C12alkil.

[0228] Sinteza i priprema metilenoksi BNA monomera adenina, citozina, guanina, 5-metilcitozina, timina i uracila, zajedno sa njihovom oligomerizacijom, i svojstva prepoznavanja nukleinske kiseline su opisani (Koshkin et al., Tetrahedron, 1998, 54, 3607-3630). BNA-i i njihove pripreme su takođe opisani u WO 98/39352 i WO 99/14226.

[0229] Analozi metilenoksi BNA i 2’-tio-BNA, su takođe pripremljeni (Kumar et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 1998, 8, 2219-2222). Priprema zaključanih analoga nukleozida koji obuhvataju oligodezoksiribonukleotidne duplekse kao supstrate za polimeraze nukleinske kiseline su takođe opisani (Wengel et al., WO 99/14226). Dalje, sinteza 2’-amino-BNA, novog konformaciono ograničenog visoko afinitetnog oligonukleotidnog analoga je opisana u oblasti tehnike (Singh et al., J. Org. Chem., 1998, 63, 10035-10039). Dodatno, 2’-amino-i 2’-metilamino-BNA su pripremljeni i termalna stabilnost njihovih dupleksa sa komplementarnim RNK i DNK lancima je prethodno opisana.

[0230] U određenim izvođenjima, obezbeđeni su biciklični nukleozidi koji imaju Formulu VI:

pri čemu:

Bx je heterociklični bazni ostatak;

Tai Tbsu svaki, nezavisno H, hidroksilna zaštitna grupa, konjugovana grupa, reaktivna fosforna grupa, fosforni ostatak ili kovalentno vezivanje za medijum za podršku;

4

svaki qi, qj, qki qlje, nezavisno, H, halogen, C1-C12alkil, supstituisani C1-C12alkyl, C2-C12alkenyl, supstituisani C2-C12alkenil, C2-C12alkinil, supstituisani C2-C12alkinil, C1-C12alkoksil, supstituisani C1-C12alkoxil, OJj, SJj, SOJj, SO2Jj, NJjJk, N3, CN, C(=O)OJj, C(=O)NJjJk, C(=O)Jj, O-C(=O)NJjJk, N(H)C(=NH)NJjJk, N(H)C(=O)NJjJkili N(H)C(=S)NJjJk; i

qii qjili qli qkzajedno su =C(qg)(qh), pri čemu qgi qhsu svaki, nezavisno, H, halogen, C1-C12alkil ili supstituisani C1-C12alkil.

[0231] Opisani su jedan karbociklični biciklični nukleozid ima 4’-(CH2)3-2’ most i alkenil analog most 4’-CH=CH-CH22’ (Freier et al., Nucleic Acids Research, 1997, 25(22), 4429-4443 and Albaek et al., J. Org. Chem., 2006, 71, 7731-7740). Takođe je opisana sinteza i priprema karbocikličnih bicikličnih nukleozida zajedno sa njihovom oligomerizacijom i biohemijskim ispitivanjima (Srivastava et al., J. Am. Chem. Soc., 2007, 129(26), 8362-8379).

[0232] Kao što se ovde koristi, "4’-2’ biciklični nukleozid" ili "4’ do 2’ biciklični nukleozid" se odnosi na biciklični nukleozid koji obuhvata furanozni prsten koji obuhvata most koji povezuje dva atoma ugljenika furanoznog prstena koji povezuje 2’ ugljenikov atom i 4’ atom ugljenika prstena šećera.

[0233] Kao što se ovde koristi, "monociklični nukleozidi" se odnosi na nukleozide koji obuhvataju modifikovane ostatke šećera koji nisu biciklični ostaci šećera. U određenim izvođenjima, ostatak šećera, ili analog ostatka šećera, nukleozida mogu da budu modifikovani ili izmenjeni na bilo kom položaju.

[0234] Kao što se ovde koristi, "2’-modifikovani šećer" znači furanozil šećer koji je modifikovan na 2’ položaju. U određenim izvođenjima, takve modifikacije uključuju supstituente izabrane od: halogenida, uključujući, ali bez ograničenja na supstituisani i nesupstituisani alkoksi, supstituisani i nesupstituisani tioalkil, supstituisani i nesupstituisani amino alkil, supstituisani i nesupstituisani alkil, supstituisani i nesupstituisani alil, i supstituisani i nesupstituisani alkinil. U određenim izvođenjima, 2’ modifikacije su izabrane od supstituenata koji uključuju, ali nisu ograničeni sa: O[(CH2)nO]mCH3, O(CH2)nNH2, O(CH2)nCH3, O(CH2)nF, O(CH2)nONH2, OCH2C(=O)N(H)CH3, i O(CH2)nON[(CH2)nCH3]2, pri čemu n i m su od 1 do oko 10. Druge 2’-supstituent grupe mogu takođe da budu izabrane od: C1-C12alkil, supstituisanog alkil, alkenil, alkinil, alkaril, aralkil, O-alkaril ili O-aralkil, SH, SCH3, OCN, Cl, Br, CN, F, CF3, OCF3, SOCH3, SO2CH3, ONO2, NO2, N3, NH2, heterocikloalkil, heterocikloalkaril, aminoalkilamino, polialkilamino, supstituisani silil, RNK grupe za isecanje, reporterska grupa, interkalirajuće sredstvo, grupa za poboljašnje farmakokinetičkih svojstava, ili grupa za poboljšanje farmakodinamičkih svojstava antisens jedinjenja, i drugi supstituenti koji imaju slična svojstva. U određenim izvođenjima, modifikovani nukleozidi obuhvataju 2’-MOE bočni lanac (Baker et al., J. Biol. Chem., 1997, 272, 11944-12000). Takva 2’-MOE supstitucija je opisana da ima unapređen afinitet vezivanja u poređenju sa nemodifikovanim nukleozidima i sa drugim modifikovanim nukleozidima, kao što su 2’-O-metil, O-propil, i O-aminopropol. Takođe je pokazano da su oligonukleotidi koji imaju 2’-MOE supstituent antisens inhibitori genske ekspresije sa svojstvima koja su obećavajuća za in vivo uporebu (Martin, Helv. Chim. Acta, 1995, 78, 486-504; Altmann et al., Chimia, 1996, 50, 168-176; Altmann et al., Biochem. Soc. Trans., 1996, 24, 630-637; i Altmann et al., Nucleosides Nucleotides, 1997, 16, 917-926).

[0235] Kao što se ovde koristi, "modifikovani tetrahidropiran nukleozid" ili "modifikovani THP nukleozid" znači nukleozid koji ima šestočlani tetrahidropiranozni "šećer" koji je supstituisan za pentofuranozil ostatak u normalnim nukleozidima (zamena šećera). Modifikovani THP nukleozidi uključuju, ali nisu ograničeni na, šta je u oblasti tehnike naznačeno sa heksitol nukleinska kiselina (HNA), anitol nukleinska kiselina (ANA), manitol nukleinska kiselina (MNA) (videti Leumann, Bioorg. Med. Chem., 2002, 10, 841-854) ili fluoro HNA (F-HNA) koja ima tetrahidropiranozni sistem prstena kao što je ilustrovano u tekstu ispod:

[0236] U određenim izvođenjima, zamene šećera su izabrane da imaju Formulu VII:

gde nezavisno za svaki od pomenutoig najmanje jednog tetrahidropiran nukleozidnog analoga Formule VII:

Bx je heterociklični bazni ostatak;

Tai Tbsu svaki, nezavisno, grupa za internukleozidno povezivanje koja povezuje tetrahidropiranozni nukleozidni analog sa antisens jedinjenjem ili jedan od Tai Tbje grupa za internukleozidnog povezivanja koja povezuje tetrahidropiranozni nukleozidni analog sa antisens jedinjenjem i drugi od Tai Tbje H, hidroksil zaštitna grupa, vezana konjugatna grupa ili 5’ ili 3’-terminalna grupa; q1, q2, q3, q4, q5, q6i q7su svaki nezavisno, H, C1-C6alkil, supstituisani C1-C6alkil, C2-C6alkenil, supstituisani C2-C6alkenil, C2-C6alkinil ili supstituisani C2-C6alkinil; i svaki od R1i R2je izabran od vodonika, hidroksil, halogen, supstituisani ili ne supstituisani alkoksi, NJ1J2, SJ1, N3, OC(=X)J1, OC(=X)NJ1J2, NJ3C(=X)NJ1J2i CN, pri čemu X je O, S ili NJ1i svaki J1, J2i J3je, nezavisno, H ili C1-C6alkil.

[0237] U određenim izvođenjima, modifikovani THP nukleozidi Formule VII su obezbeđeni pri čemu q1, q2, q3, q4, q5, q6i q7su svaki H. U određenim izvođenjima, najmanje od q1, q2, q3, q4, q5, q6i q7je drugi i ne obuhvata H. U određenim izvođenjima, najmanje jedan od q1, q2, q3, q4, q5, q6i q7je metil. U određenim izvođenjima, THP nukleozidi Formule VII su obezbeđeni pri čemu jedan od R1i R2je fluoro. U određenim izvođenjima, R1je fluoro i R2je H; R1je metoksi i R2je H, i R1je metoksietoksi i R2je H.

[0238] U određenim izvođenjima, zamene šećera obuhvataju prstenove koji imaju više od 5 atoma i više od jednog heteroatoma. Na primer prijavljeni su nukleozidi koji obuhvataju morfolino ostatke šećera i njihova upotreba u oligomernim jedinjenjima (videti na primer: Braasch et al., Biochemistry, 2002, 41, 4503-4510; i U.S. Patents 5,698,685; 5,166,315; 5,185,444; i 5,034,506). Kao što se ovde koristi, termin "morfolino" znači zamenu ostatka šećera koji imaju:

U određenim izvođenjima, morfolini mogu da budu modifikovani, na primer dodavanjem ili menjanjem različitih grupa supstituenata od gore navedene morfolino strukture. Takve zamene šećera su ovde naznačene sa "modifikovani morfolini."

[0239] Kombinacije modifikacija su takođe obezbeđene bez ograničenja, kao što su 2’-F-5’-metil supstituisani nukleozidi (videti PCT međunarodnu prijavu WO 2008/101157 koja je objavljena 8/21/08 za druge prikazane 5’, 2’-bis supstituisane nukleozide) i zamena atoma kiseonika ribozil prstena sa S i dalja supstitucija na 2’-položaju (videti objavljenu U.S. prijav patenta US2005-0130923, koja je objavljena 16 juna, 2005) ili alternativno 5’-supstitucija biciklične nukleinske kiseline (videti PCT međunarodnu prijavu WO 2007/134181, koja je objavljena 11/22/07 pri čemu 4’-CH2-O2’ biciklični nukleozid je dalje supstituisan na 5’ položaju sa 5’-metil ili 5’-vinil grupom). Sinteza i priprema karbocikličnih bicikličnih nukleozida zajedno sa njihovom oligomerizacijom i biohemijskim ispitivanjima je takođe opisana (videti, npr., Srivastava et al., J. Am. Chem. Soc.2007, 129(26), 8362-8379).

[0240] U određenim izvođenjima, antisens jedinjenja obuhvataju jedan ili više modifikovanih cikloheksenil nukleozida, koji je nukleozid koji ima šestočlani cikloheksenil umesto pentofuranozil ostatka u nukleozidima koji se pojavljuju u prirodi. Modifikovani cikloheksenil nukleozidi uključuju, ali nisu ograničeni na one koji su opisani u stanju tehnike (pogledate na primer u uobičajenom vlasništvu, objavljenu PCT prijavu WO 2010/036696, koja je objavljena 10 aprila, 2010, Robeyns et al., J. Am. Chem. Soc., 2008, 130(6), 1979-1984; Horváth et al., Tetrahedron Letters, 2007, 48, 3621-3623; Nauwelaerts et al., J. Am. Chem. Soc., 2007, 129(30), 9340-9348; Gu et al.,, Nucleosides, Nucleotides & Nucleic Acids, 2005, 24(5-7), 993-998; Nauwelaerts et al., Nucleic Acids Research, 2005, 33(8), 2452-2463; Robeyns et al., Acta Crystallographica, Section F: Structural Biology and Crystallization Communications, 2005, F61(6), 585-586; Gu et al., Tetrahedron, 2004, 60(9), 2111-2123; Gu et al., Oligonucleotides, 2003, 13(6), 479-489; Wang et al., J. Org. Chem., 2003, 68, 4499-4505; Verbeure et al., Nucleic Acids Research, 2001, 29(24), 4941-4947; Wang et al., J. Org. Chem., 2001, 66, 8478-82; Wang et al., Nucleosides, Nucleotides & Nucleic Acids, 2001, 20(4-7), 785-788; Wang et al., J. Am. Chem., 2000, 122, 8595-8602; Objavljenu PCT prijavu, WO 06/047842; i Objavljenu PCT prijavu WO 01/049687). Određeni modifikovani cikloheksenil nukleozidi imaju Formulu X.

pri čemu nezavisno za svaki od pomenutog najmanje jednog cikloheksenil analoga nukleozida Formule X:

Bx je heterociklični bazni ostatak;

T3i T4u svaki, nezavisno, internukleozidna grupa za povezivanje koja povezuje cikloheksenil analog nukleozida sa antisens jedinjenjem ili jednim od T3i T4je internkleozidna grupa za povezivanje koja povezuje tetrahidropiranozni analog nukleozida sa antisens jedinjenjem i drugi od T3i T4je H, hidroksil zaštitna grupa, vezana konjugovana grupa, ili 5’-ili 3’-terminalna grupa; i

q1, q2, q3, q4, q5, q6, q7, q8i q9u svaki, nezavisno, H, C1-C6alkil, supstituisani C1-C6alkil, C2-C6alkenil, supstituisani C2-C6alkenil, C2-C6alkinil, supstituisani C2-C6alkinil ili druga grupa supstituenta šećera.

[0241] Kao što se ovde koristi, "2’-modifikovani" ili "2’-supstituisani" se odnosi na nukleozid koji obuhvata supstituent na 2’ položaju koji nije H ili OH. 2’-modifikovane nukleozide, uključuje, ali nije ograničeno na, biciklične nukleozide pri čemu most povezuje dva ugljenikova atoma i prsten šećera

4

koji povezuje 2’ ugljenik i drugi ugljenik prstena šećera; i nukleozide sa 2’supstituentima koji ne premošćuju, kao što su alil, amino, azido, tio, O-alil, O-C1-C10alkil, -OCF3, O-(CH2)2-O-CH3, 2’-O(CH2)2SCH3, O-(CH2)2-O-N(Rm)(Rn), ili O-CH2-C(=O)-N(Rm)(Rn), pri čemu svaki Rmi Rnje, nezavisno, H ili supstituisani ili nesupstituisani C1-C10alkil. 2’-modifikovani nukleozidi mogu dalje da obuhvate druge modifikacije, na primer na drugom položajima u šećeru i/ili na nukleobazi.

[0242] Kao što se ovde koristi, "2’-F" se odnosi na nukleozid koji obuhvata šećer koji obuhvata fluoro grupu na 2’ položaju u prstenu šećera.

[0243] Kao što se ovde koristi, "2’-OMe" ili "2’-OCH3" ili "2’-O-metil" svaki se odnosi na nukleozid koji obuhvata šećer koji obuhvata -OCH3grupu na 2’ položaju prstena šećera.

[0244] Kao što se ovde koristi, "MOE" ili "2’-MOE" ili "2’-OCH2CH2OCH3" ili "2’-O-metoksietil" svaki se odnosi na nukleozid koji obuhvata šećer koji obuhvata -OCH2CH2OCH3grupu na 2’ položaju u prstenu šećera.

[0245] Kao što se ovde koristi, "oligonukleotid" se odnosi na jedinjenje koje obuhvata brojne vezane nukleozide. U određenim izvođenjima, jedan ili više od brojnih nukleozida je modifikovan. U određenim izvođenjima, oligonukleotid obuhvata jedan ili više ribonukleozida (RNK) i/ili dezoksiribonukleozida (DNK).

[0246] Mnoga drugi biciklo i triciklo sistemi prstenova koji zamenjuju šećer u takođe poznate u oblasti tehnike koji mogu da se koriste da modifikuju nukleozide za uključivanje u antisens jedinjenjima (videti na primer revijski članak: Leumann, Bioorg. Med. Chem., 2002, 10, 841-854). Takvi sistemi prstenova mogu mogu da se podvrgnu različitim dodatnim supstitucijama da bi se pojačala aktivnost.

[0247] Postupci za dobijanje modifikovanih šećera su dobro poznati stručnjacima iz oblasti tehnike. Neki primeri U.S. patenata koji pokazuju pripremu takvih modifikovanih šećera uključuju bez ograničenja, U.S.: 4,981,957; 5,118,800; 5,319,080; 5,359,044; 5,393,878; 5,446,137; 5,466,786; 5,514,785; 5,519,134; 5,567,811; 5,576,427; 5,591,722; 5,597,909; 5,610,300; 5,627,053; 5,639,873; 5,646,265; 5,670,633; 5,700,920; 5,792,847 i 6,600,032 i međunarodnu prijavu PCT/US2005/019219, koja je podneta 2 juna, 2005 i objavljenja pod WO 2005/12137122 decembra, 2005.

[0248] U nukleotidima sa modifikovanim ostacima šećera, ostaci nukleobaza (prirodni, modifikovani ili njihove kombinacije) se održavaju za hibridizaciju sa odgovarajućom ciljnom nukleinskom kiselinom.

[0249] U određenim izvođenjima, antisens jedinjenja obuhvataju jedan ili više nukleozida koji imaju modifikovane ostatke šećera. U određenim izvođenjima, modifikovani ostatak šećera je 2’-MOE. U određenim izvođenjima, 2’-MOE modifikovani nukleozidi su uređeni u motivu gapmera. U određenim izvođenjima, modifikovani ostatak šećera je biciklični nukleozid koji ima CH(CH3)-O-2’) grupu za premošćavanje. U određenim izvođenjima, (4’-CH(CH3)-O-2’) modifikovani nukleozidi su uređeni preko krila u gapmer motivu.

Modifikovane nukleobaze

[0250] Nukleobazne (ili bazne) modifikacije ili supstitucije se strukturno razlikuju od, ali su fukcionalno zamenjive sa, nukleobazama koje se nalaze u prirodi ili sintetičkim nemodifikovanim nukleobazama. I prirodne i modifikovane nukleobaze su sposobne da učestvuju u vodoničnom vezivanju. Takve nukleobazne modifikacije mogu da pruže stabilnost prema nukleazama, afinitet vezivanja ili neka druga korisna biološka svojstva antisens jedinjenjima. Modifikovane nukleobaze uključuju sintetičke i prirodne nukleobaze kao što su, na primer, 5-metilcitozin (5-me-C). Određene nukleobazne supstitucije, uključujući 5-metilcitozin supstitucije, su posebno korisne za povećanje afiniteta vezivanja antisens jedinjenja za ciljnu nukleinsku kiselinu. Na primer, pokazano je da 5-metilcitozin supstitucije povećavaju stabilnost dupleksa nukleinske kiseline za 0.6-1.2°C (Sanghvi, Y.S., Crooke, S.T. and Lebleu, B., eds., Antisense Research and Applications, CRC Press, Boca Raton, 1993, pp.276-278).

[0251] Dodatne modifikovane nukleobaze uključuju 5-hidroksimetil citozin, ksantin, hipoksantin, 2-aminoadenin, 6-metil i druge alkil derivate adenina i guanina, 2-propil i druge alkil derivate adenina i guanina, 2-tiouracil, 2-tiotimin i 2-tiocitozin, 5-halouracil i citozin, 5-propinil (-C≡C-CH3) uracil i citozin i druge alkinil derivate pirimidinskih baza, 6-azo uracil, citozin i timin, 5-uracil (pseudouracil), 4-tiouracil, 8halo, 8-amino, 8-tiol, 8-tioalkil, 8-hidroksil i druge 8-supstituisane adenine i guanine, 5-halo posebno 5-bromo, 5-trifluorometil i druge 5-supstituisane uracile i citozine, 7-metilguanin i 7-metiladenin, 2-F-adenin, 2amino-adenin, 8-azaguanin i 8-azaadenin, 7-deazaguanin i 7-deazaadenin i 3-deazaguanin i 3deazaadenin.

[0252] Heterociklični bazni ostaci mogu takođe da uključe u kojima je purinska ili pirimidinska baza zamenjena sa drugim heterociklima, na primer 7-deaza-adeninom, 7-deazaguanozinom, 2-aminopiridinom i 2-piridonom. Nuleobaze koje su poebno korisne za povećanje afiniteta vezivanja antisens jedinjenja uključuju 5-supstituisane pirimidine, 6-azapirimidine i N-2, N-6 i O-6 supstituisane purine, uključujući 2 aminopropiladenin, 5-propiniluracil i 5-propinilcitozin.

[0253] U određenim izvođenjima, antisens jedinjenja koja su usmerena prema nukleinskoj kiselini koja kodira CFB obuhvataju jednu ili više modifikovanih nukleobaza. U određenim izvođenjima, skraćeni ili „gap“-prošireni antisens oligonukleotidi koji su usmereni prema nukleinskoj kiselini koja kodira za CFB obuhvataju jednu ili više modifikovanih nukleobaza. U određenim izvođenjima, modifikovana nukleobaza je 5-metilcitozin. U određenim izvođenjima, svaki citozin je 5-metilcitozin.

Konjugovana antisens jedinjenja

[0254] Antisens jedinjenja mogu da budu kovalentno vezana sa jednim ili više ostataka ili konjugata koji pojačavaju aktivnost, ćelijsku distribuciju ili ćelijsko preuzimanje dobijenih antisens oligonukleotida. Uobičajene konjugovane grupe uključuju ostatke holesterola i lipidne ostatke. Dodatne konjugovane grupe uključuju ugljene hidrate, fosfolipide, biotin, fenazin, folat, fenantridin, antrahinon, akridin, fluoresceine, rodamine, kumarine, i boje.

[0255] Antisens jedinjenja takođe mogu da budu modifikovana da imaju jednu ili više stabilizujćih grupa koje su generalno vezane sa jednim ili više kraja antisens jedinjenja da se pojačaju svojstva kao što su na primer, nukleazna stabilnost. Strukture koje obrazuju kapu su uključene u stabilizujuće grupe. Ove terminalne modifikacije štite antisens jedinjenje koji ima terminalnu nukleinsku kiselinu i egzonukleaznog degradiranja, i može da pomogne u isporuci i/ili lokalizaciji unutar ćelije. Struktura kape može da bude prisutna na 5’-kraju (5’-kapa), ili na 3’-kraju (3’-kapa), ili mogu da budu prisutne na oba kraja. Strukture kape su dobro poznate u oblasti tehnike i uključuju, na primer, invertovane dezoksi abazne kape. Dalje 3’ i 5’-stabilizujuće grupe koje mogu da budu korisne za postavljanje strukture kape na jednom ili oba kraja antisens jedinjenja da se omogući nukleazna stabilnost uključujući one koji su prikazane u WO 03/004602 koja je objavljena 16 januara, 2003.

[0256] U određenim izvođenjima, antisens jedinjenja, uključujući, ali bez ograničenja na one koji su posebno pogodni za upotrebu kao ssRNK, su modifikovani vezivanjem jedne ili više konjugovanih grupa. Generalno, konjugovane grupe modifikuju jedno ili više svojstva vezanog oligonukleotida, uključujući ali bez ograničenja na farmakodinamiku, farmakokinetiku, stabilnost, vezivanje, apsorpciju, ćelijsku distribuciju, ćelijko preuzimanje, punjenje i čišćenje. Konjugovane grupe koje se rutinski koriste u hemijskoj oblasti tehnike i vezane su direktno ili preko konjugovanog vezujućeg ostatka ili konjugovane vezujuće grupe sa roditeljskim jedinjenjem kao što je oligonukleotid. Konjugovane grupe

4

uključuju bez ogrančienja, interkalirajuća sredstva, reporterski molekuli, poliamini, poliamidi, polietilen glikoli, tioetri, polietri, holesteroli, tioholesteroli, ostatke holne kiseline, folat, lipide, fosfolipide, biotin, fenazin, fenantridin, antrahinon, adamantan, akridin, fluoresceine, rodamini, kumarini i boje. Određene konjugovane grupe koje su prethodno opisane, na primer: ostatak holesterola (Letsinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, 86, 6553-6556), holna kiselina (Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Let., 1994, 4, 1053-1060), tioetar, npr., heksil-S-tritiltiol (Manoharan et al., Ann. N.Y. Acad. Sci., 1992, 660, 306-309; Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Let., 1993, 3, 2765-2770), tioholesterol (Oberhauser et al., Nucl. Acids Res., 1992, 20, 533-538), alifatični lanac, npr., dodekan-diol ili ostaci undecila (Saison-Behmoaras et al., EMBO J., 1991, 10, 1111-1118; Kabanov et al., FEBS Lett., 1990, 259, 327-330; Svinarchuk et al., Biochimie, 1993, 75, 49-54), fosfolipid, npr., diheksadecil-rac-glicerol ili trietil-amonijum 1,2-di-O-heksadecil-rac-glicero-3-H-fosfonat (Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3651-3654; Shea et al., Nucl. Acids Res., 1990, 18, 3777-3783), poliamin ili polietilen glikol lanac (Manoharan et al., Nucleosides & Nucleotides, 1995, 14, 969-973), ili adamantan sirćetna kiselina (Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3651-3654), palmitil ostatak (Mishra et al., Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1264, 229-237), oktadecilamin ili heksilamino-karbonil-oksiholesterol ostatak (Crooke et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 1996, 277, 923-937).

[0257] Za dodatne konjugate uključujući one koji su korisni za ssRNK i njihovo postavljanje u antisens jedinjenjima, videti npr., US prijavu br.; 61/583,963.

In vitro ispitivanje antisens jedinjenja

[0258] Ovde su opisani postupci za tretman ćelija sa antisens oligonukleotidima, koji mogu da budu modifikovani na odgovarajući način za tretman sa drugim antisens jedinjenjima.

[0259] Ćelije mogu da budu tretirane sa antisens oligonukleotidima kada ćelije dostignu približnu 60-80% konfluentnost u kulturi.

[0260] Jedan reagens koji se uobičajeno koristi za uvođenje antisens oligonunkelotida u ćelije koje se gaje u kulturi uključuje katjonski lipidni reagens LIPOFECTIN za transfekciju (Invitrogen, Carlsbad, CA). Antisens oligonukleotidi mogu da budu pomešani sa LIPOFECTIN u OPTIMEM 1 (Invitrogen, Carlsbad, CA) da se postigne željena finalna koncentracija antisens oligonukleotida i koncentracija LIPOFECTIN može da ima opseg od 2 do 12 µg/mL po 100 nM antisens oligonukleotida.

[0261] Drugi reagens koji se koristi za uvođenje antisens oligonukleotida u ćelije koje se gaje u kulturi uključuje LIPOFECTAMINE (Invitrogen, Carlsbad, CA). Antisens oligonukleotid se pomeša sa LIPOFECTAMINE u OPTI-MEM 1 medijumu redukovanog seruma (Invitrogen, Carlsbad, CA) da bi se postigla željena koncentracija antisens oligonukleotida i LIPOFECTAMINE koncentracija koja može da ima koncentraciju od 2 do 12 µg/mL po 100 nM antisens oligonukleotida.

[0262] Drugi postupak koji se koristi za uvođenje antisens oligonukleotida u ćelijama koji se gaje u kulturi uključuje elektroporaciju odn. primenu električnog polja na ćelijskoj membrani.

[0263] Još drugi postupak koji se koristi za uvođenje antisens oligonukleotida u ćelije koje se gaje u kulturi uključuje slobodno ćelijsko preuzimanje oligonukleotida.

[0264] Ćelije su tretirane sa antisens oligonukleotidima korišćenjem rutinskih postupaka. Ćelije mogu da budu pokupljene 16-24 časova posle tretmana sa antisens oligonukleotidom, gde su RNK ili nivoi proteina ciljnih nukleinskih kiselina izmereni korišćenjem postupaka koji su poznati u oblasti tehnike i ovde opisani. Generalno, kada se tretmani sprovode u brojnim replikatima, podaci su prikazani kao srednja vrednost tretmana replikata.

4

[0265] Koncentracija antisens oligonukleotida koje se koristi se razlikuje od ćelijske linije do ćelijske linije. Postupci za određivanje optimalne koncentracije antisens oligonukleotida za određenu ćelijsku liniju su dobro poznati u oblasti tehnike. Antisens oligonukleotidi se obiičo koriste u koncentracijama koje imaju opseg od 1 nM do 300 nM kada su transfektovane sa LIPOFECTAMINE. Antisens oligonukleotidi se koriste na većim koncentracijama koje imaju opseg od 625 do 20,000 nM kada se transfekcija vrši elektroporacijom.

Izolovanje RNK

[0266] RNK analiza može da se izvede na ukupnoj ćelijskoj RNK ili poli(A)+ iRNK. Postupci za izolovanje RNK su dobro poznati u oblasti tehnike. RNK se priprema upotrebom postupaka koji su dobro poznati u oblasti tehnike, na primer, upotrebom TRIZOL Reagensa (Invitrogen, Carlsbad, CA) u skladu sa preporučenim protokolima proizvođača.

Određene indikacije

[0267] Određena ovde obezbeđena izvođenja se odnose na postupke lečenja, prevencije ili ublažavanja bolesti koja je povezana sa disregulacijom alternativnog puta komplementa kod subjekta ordiniranjem specifičnog inhibitora CFB, kao što je antisens jedinjenje koje je usmereno prema CFB.

[0268] Primeri bolesti bubrega koje su povezane sa disregulacijom alternativnog puta komplementa koje se leče, gde se vrši prevencija, i/ili mogu da se ublaže sa ovde obezeđenim postupcima uključuju C3 glomerulopatiju, atišični hemolitički uremijski sindrom (aHUS), bolest gustih depozita (DDD; takođe poznata pod imenom MPGN Type II ili C3Neph), i CFHR5 nefropatija.

[0269] Dodatne bolesti bubrega koje su povezane sa disregulacijom alternativnog puta komplementa koje se leče, gde se vrši prevencija, i/ili mogu da se ublaže sa ovde obezeđenim postupcima uključuju IgA nefropatiju; mezangiokapilarni (membrano proliferativni) glomerulonefritis (MPGN); autoimunske bolesti koje uključuju lupus nefritis i sistemski lupus eritematozus (SLE); glomerulonefritis koji je indukovan infekcijom (takođe poznat pod imenom postinfektivni glomerulonefritis); i ishemijskoreperfuzina povreda bubrega, na primer ishemijsko-reperfuziona povreda bubrega posle transplantacije.

[0270] Primeri poremećaja koji nisu bubrežni koji su povezani sa disregulacijom alternativnog puta komplementa koje se leče, gde se vrši prevencija, i/ili mogu da se ublaže sa ovde obezbeđenim postupcima uključuju bolesti oka kao što je makularna degeneracija, na primer starosna makularna degeneracija (AMD), uključujući vlažnu AMD i suvu AMD, kao što je geografska atrofija; neuromijelitis oka; bolest rožnjače, kao što je zapaljenje rožnjače; autoimunski juveitis; i dijabetska retinopatija. Prijavljeno je da je sistem komplementa uključen u bolesti oka. Jha P, et al., Mol Immunol (2007) 44(16): 3901-3908. Dodatni primeri poremećaja koji nisu bubrežni koji su povezani sa disreglacijom alternativnog puta komplementa je se leče, gde se vrši prevencija, i/ili mogu da se ublaže sa ovde obezeđenim postupcima uključuju ANCA-povezani vaskulitis, antifosfolipidni sindrom (takođe poznat pod imenom sindrom antifosfolipidnih antitela (APS)), astma, reumatoidni artitis, mijastenija gravis, i multiple skleroza.

[0271] Određena ovde obezbeđena izvođenja se odnose na postupke za lečenje, prevenciju, ili ublažavanje bolesti bubrega koja je povezana sa disregulacijom alternativnog puta komplementa kod subjekta ordiniranjem CFB specifičnog inhibitora, kao što je antisens jedinjenje koje je usmereno prema CFB. U određenim izvođenjima, bolest bubrega je lupus nefritis, sistemski lupus eritematozus (SLE), bolest gustih depozita (DDD), C3 glomerulonefitis (C3GN), CFHR5 nefropatija, ili atipični hemolitički uremijski sindrom (aHUS), ili bilo koja njihova kombinacija.

4

[0272] Određena ovde obezbeđena izvođenja se odnose na postupke za lečenje, prevenciju, ili ublažavanje makularne degeneracije, kao što je starosna makularna degeneracija (AMD), kod subjekta ordiniranjem CFB specifičnog inhibitora, kao što je antisens jedinjenje koje je usmereno prema CFB. U određenim izvođenjima, AMD je vlažna AMD ili suva AMD. U određenim izvođenjima, suva AMD može da bude geografska atrofija. Studije su pokazale udruženost disregulacije alternativnog puta komplementa i AMD. Komponente komplementa su uobičajeni sastojci očnih druza, vanćelijskog materijala koji se nakuplja u makuli AMD pacijenata. Dalje, prijavljeno je da se CFH i CFB varijante računaju za skoro 75% AMD slučajeva u severnoj Evropi i Severnoj Americi. Takođe je poznato da specifični polimorfizam CFB pruža zaštitu protiv AMD. Patel, N. et al., Eye (2008) 22(6):768-76. Dodatno, CFB homozigoti nokaut miševa imaju nižu aktivnost puta komplementa, ispoljavaju manja oštećenja u oku, i horoidnu neovaskularizaciju (CNV) posle laserske fotokoagulacije. Rohrer, B. et al., Invest Ophthalmol Vis Sci. (2009) 50(7):3056-64. Dalje, tretman CFB siRNK štiti miševe od laserski indukovanog CNV. Bora, NS et al., J Immunol. (2006) 177(3):1872-8. Studije su takođe pokazale da bubreg i oko dele razvojne puteve i strukturne karakteristike uključujući kompoziciju protomera kolagena IV bazalne membrane i vaskularnost. Savige et al., J Am Soc Nephrol. (2011) 22(8):1403-15. Postoji dokaz da je put komplementa uključen u bolestima bubrega i oka. Na primer, nasleđena deficijencija regulatornog proteina komplementa uzrokuje predispoziciju za atipični hemolitički uremijski sindrom i AMD. Richards A et al., Adv Immunol. (2007) 96:141-77. Dodatno, hronična bolest bubrega je povezana sa AMD. Nitsch, D. et al., Ophthalmic Epidemiol. (2009) 16(3):181-6; Choi, J. et al, Ophthalmic Epidemiol. (2011) 18(6):259-63. Bolest gustih depozita (DDD), bolest bubrega koja je povezana sa disreglacijom alternativnog puta komplementa, se karakteriše akutnim nefritičnim sindromom i očnim druzama. Cruz and Smith, GeneReviews (2007) Jul 20. Osim toga, miševi koji nose gensku deleciju komponente alternativnog puta komplementa imaju paralelne fenotipove bubrežnih i očnih bolesti. Prijavljeno je da CFH homozigoti nokaut miševa razvijaju DDD i prisutne abnormalitete u u mrežnjači i vizuelnu disfunkciju. Pickering et al., Nat Genet. (2002) 31(4):424-8. Mišji modeli boelsti bubrega koja je povezana sa disregulacijom alternativnog puta komplementa su takođe prihvaćeni kao modeli AMD. Pennesi ME et al., Mol Apects Med (2012) 33:487-509. CFH nokaut miševi, na primer, su prihvaćeni model za bolesti bubrega, kao što su DDD, i AMD. Osim toga, prijavljeno je da je AMD povezan sa sistemskim izvorom faktora komplementa, koji se talože lokalno u oku kako bi se postigla aktivacija alternativnog puta komplementa. Loyet et al., Invest Ophthalmol Vis Sci. (2012) 53(10):6628-37.

PRIMERI

Neograničavajući primeri

[0273] Dok određena, ovde opisana jedinjenja, kompozicije i postupci koji su opisani sa specifičnošću u skladu sa određenim izvođenjima, sledeći primeri služe samo da ilustruju ovde opisana jedinjenja i nisu namenjeni da ista ograniče.

[0274] Podrazumeva se da je sekvenca koja je predstavljena u svakoj SEQ ID NO u primerima koji se ovde nalaze nezavisna od bilo koje modifikacije prema ostaku šećera, internukleozidne veze, ili nukleobaze. Kao takva, antisensna jedinjenja koja se definišu sa SEQ ID NO mogu da obuhvate, nezavisno, jednu ili više modifikacija šećernog ostatka, internukleozidne veze, ili nukleobaze. Antisensna jedinjenja koja se opisuju Isis brojem (Isis No) ukazuju na kombinaciju nukleobazne sekvence i motiva.

Primer 1: Antisens inhibicija humanog komplement Faktora B (CFB) u HepG2 ćelijama upotrebom MOE gapmera

4

[0275] Antisensni oligonukleotidi u dizajnirani da ciljaju nukleinsku kiselinu humanog Faktora B komplement (CFB) I ispitani su za njihove efekte in vitro na iRNK za CFB iRNK. Antisensni oligonukleotidi su ispitani u serijama eksperimenata koji su imali slične uslove u kulturi. Rezultati za svaki eksperiment su predstavljeni u odvojenim tabelama koje su prikazane u tekstu ispod. HepG2 ćelije u kulturi na gustini od 20,000 ćelija po bunariću su transfektovane upotrebom elektroporacije sa 4,500 nM antisens oligonukleotidom. Posle perioda tretmana od približno 24 časova, RNK je izolovana iz ćelija i nivoi iRNK za CFB iRNK su mereni kvantitativnim PCR-om u realnom vremenu. Set probe humanog prajmera RTS3459 (prednja sekvenca AGTCTCT- GTGGCATGGTTTGG, ovde naznačena pod imenom SEQ ID NO: 810; reverzna sekvenca GGGCGAATGACTGAGATCTTG, ovde naznačena pod imenom SEQ ID NO: 811; sekvenca probe TACCGATTACCACAAGCAACCATGGCA, ovde naznačena pod imenom SEQ ID NO: 812) je korišćena za merenje nivoa iRNK. Nivoi iRNK koja kodira za CFB mRNK su prilagođeni u odnosu na sadržaj ukupne RNK, kako je mereno RIBOGREEN®. Rezultati su prikazani kao procenat inhibicije CFB, u odnosu na netretiranu kontrolnu ćeliju.

[0276] Novo dizajnirani himerni antisens oligonukleotidi u Tabelama u tekstu ispod su dizajnirani kao 5-10-5 MOE gapmeri. 5-10-5 MOE gapmeri su dužine 20 nukleozida, pri čemu centralni segment razmaka obuhvata deset 2’-dezoksinukleozida i ograničen je pomoću segmenata „krila“ (engl. wing) na 5’ smeru i 3’ smeru pri čemu svaki obuhvata pet nukleozida. Svaki nukleozid u 5’ segmentu “krila” i svaki nukleozid u 3’ segmentu “krila” ima 2’-MOE modifikaciju. Internukleozidne veze kroz svaki gapmer su fosforotioatne (P=S) veze. Svi citozinski ostaci kroz svaki gapmer su 5-metilcitozini. "Mesto početka" ukazuje na najviši 5’-nukleozid na kome je gapmer ciljan u humanoj genskoj sekvenci. "Stop mesto" ukazuje na najviši 3’-nukleozid na kome je gapmer ciljan u humanoj genskoj sekvenci. Svaki gapmer koji se navodi u Tabelama u tekstu ispod je ciljan ili prema humanoj iRNK za CFB, koja je ovde naznačena sa SEQ ID NO: 1 (GENBANK Pristupni broj. NM_001710.5) ili humanoj genomskoj sekvenci za CFB, koja je ovde naznačena sa SEQ ID NO: 2 (GENBANK Pristupni broj. NT_007592.15 prekinuto od nukleotida 31852000 do 31861000), ili oba. ’n/a’ ukazuje da antisens oligonukleotid ne cilja tu određenu gensku sekvencu sa 100% komplementarnosti.

4

Tabela 1

1

Tabela 2

2

4

Tabela 3

Tabela 4

1

2

Tabela 5

4

Primer 2: Antisens inhibicija humanog Faktora B komplementa (CFB) u HepG2 ćelijama pomoću MOE gapmera

[0277] Dizajnirani su dodatni antisens oligonukleotidi koji ciljaju nukleinsku kiselinu koja kodira za Faktor B komplementa (CFB) i ispitani su za njihove efekte na CFB iRNK in vitro. Ćelije HepG2 gajene u kulturi na gustini od 20,000 ćelija po bunariću su transfektovane antisens oligonukleotidom elektroporacijom sa 4,500 nM. Posle perioda tretmana od približno 24 časova, RNK je izolovana iz ćelija i nivoi CFB iRNK su izmereni kvantitativnim PCR-om u realnom vremenu. Humani set proba prajmera RTS3460_MGB (prednja sekvenca CGAAGCAGCTCAATGAAATCAA, ovde naznačena sa SEQ ID NO: 813; reverzna sekvenca TGCCTGGAGGGCCTTCTT, ovde nanačena sa SEQ ID NO: 814; sekvenca probe AGACCACAAGTTGAAGTC, ovde naznačena sa SEQ ID NO: 815) je korišćena za merenje nivoa iRNK. Nivoi CFB iRNK su podešeni prema ukupnom RNK sadržaju, kao što se meri sa RIBOGREEN®. Rezultati su prikazani kao procenat inhibicije CFB, u odnosu na netretirane kontrolne ćelije.

[0278] Novi dizajnirani himerni antisens oligonukleotidi u Tabelama u tekstu ispod su dizajnirani kao 5-10-5 MOE gapmeri.5-10-5 MOE gapmeri su 20 nukleozida dužine, gde centralni segment razmaka obuhvata deset 2’-dezoksinukleozida i ograničen je segmentima „krila“ u 5’ smeru i 3’ smeru koji svaki obuhvataju pet nukleozida. Svaki nukleozid u 5’ segmentu „krila“ i svaki nukleozid u 3’ segmentu „krila“ ima 2’-MOE modifikaciju. Internukleozidne veze kroz svaki gapmer su fosforotioatne veze (P=S). Svi ostaci citozina kroz svaki gapmer su 5-metilcitozini. "Start mesto" ukazuje za 5’-ciljni nukleozid prema kome je gapmer usmeren u humanoj genskoj sekvenci. "Stop mesto" ukazuje na 3’-ciljni nukleozid prema kome je gapmer usmeren u humanoj genskoj sekvenci. Svaki gapmer koji je naveden u Tabelama u tekstu ispod je usmeren ili prema CFB iRNK, ovde naznačena sa SEQ ID NO: 1 (GENBANK pristupni br. NM_001710.5) ili genomska sekvenca humanog CFB, ovde naznačena sa SEQ ID NO: 2 (GENBANK pristupni br. NT_007592015 prekinut od nukleozida 31852000 do 31861000), ili oba. ’n/a’ ukazuje da antisens oligonukleotid ne cilja tu određenu gensku sekvencu sa 100% komplementarnosti.

Tabela 6

1 Primer 3: Antisens inhibicija Faktora B komplementa (CFB) u HepG2 ćelijama upotrebom MOE gapmera

[0279] Dizajnirani su dodatni antisens oligonukleotidi koji ciljaju nukleinsku kiselinu humanog Faktora B komplementa (CFB) i ispitani su za njihove efekte na CFB iRNK in vitro. Antisens oligonukleotidi su ispitani u serijama eksperimenata koji su imali slične uslove u kulturi. Rezultati svakog eksperimenta su prikazani u odvojenim tabelama koje su prikazane u tekstu ispod. HepG2 ćelije se gaje u kulturi na gustini od 20,000 ćelija po bunariću i transfektovane su antisens oligonukleotidom upotrebom elektroporacije sa 5,000 nM. Posle perioda tretmana od približno 24 časova, RNK je izolovana iz ćelija i nivoi CFB iRNK su izmereni kvantitativnim PCR-om u realnom vremenu. Humani set proba prajmera RTS3459 je korišćen za merenje nivoa iRNK. Nivoi CFB iRNK su podešeni prema ukupnom RNK sadržaju, kao što je mereno RIBOGREEN®. Rezultati su prikazani kao procenat inhibicije CFB, u odnosu na netretirane kontrolne ćelije.

[0280] Novo dizajnirani himerni antisens oligonukleotidi u Tabelama u tekstu ispod su dizajnirani kao 5-10-5 MOE gapmeri. Gapmeri su 20 nukleozida u dužini, pri čemu centralni segment razmaka obuhvata 2’-deoksinukleozide i ograničen je sa segmentima „krila“ u 5’ pravcu i 3’ pravcu pri čemu svaki obuhvata pet nukleozida. Svaki nukleozid u 5’ segmentu „krila“ i svaki nukleozid u 3’ segmentu „krila“ ima 2’-MOE modifikaciju. Internukleozidne veze kroz svaki gapmer su fosforotioatne veze (P=S). Svi ostaci citozina kroz svaki gapmer su 5-metilcitozini. "Start mesto" ukazuje na 5’-ciljni nukleozid prema kome je gapmer usmeren u humanoj genskoj sekvenci. "Stop mesto" ukazuje na 3’-ciljni nukleozid prema kome je gapmer usmeren u humanoj genskoj sekvenci. Svaki gapmer koji je naveden u Tabelama u tekstu ispod je usmeren prema ili humanog CFB iRNK, koja je ovde naznačena sa SEQ ID NO: 1 (GENBANK pristupni br. NM_001710.5) ili humana genomska sekvenca CFB, koja je ovde naznačena sa SEQ ID NO: 2 (GENBANK pristupni br. NT_007592.15 prekinuta od nukleotida 31852000 do 31861000), ili oba. ’n/a’ ukazuje da antisens oligonukleotid nije usmeren prema toj ciljnoj genskoj sekvenci sa 100% komplementarnosti. U slučaju da poravnanje sekvence za ciljni gen u određenoj tabeli nije prikazano, podrazumeva se da nijedan od oligonukleotida koji se nalazi u tabeli ne poravnava sa 100% koplementarnosti sa tim ciljnim genom.

Tabela 7

2

4 Tabela 8

[0281] Dizajirani su antisens oligonukleotidi koji ciljaju nukleinsku kiselinu humanog Faktora B komplementa (CFB) i ispitani su za njihove efekte na CFB iRNK in vitro. Antisens oligonukleotidi su ispitani u serijama eksperimenata koji su imali slične uslove u kulturi. Rezultati svakog eksperimenta su prikazani u odvojenim tabelama koje su prikazane u tekstu ispod. Ćelije HepG2 su gajene u kulturi na 20,000 ćelija po bunariću i transfektovane su elektroporacijom sa 3,000 nM antisens oligonukleotidom. Posle perioda tretmana od približno 24 časova, RNK je izolovana iz ćelija i nivoi CFB iRNK su izmereni kvantitativnim PCR-om u realnom vremenu. Humani set probe prajmera RTS3459 je korišćen za merenje nivoa iRNK. Nivoi CFB iRNK su podešeni u skladu sa ukupnim RNK sadržajem, kao što je mereno RIBOGREEN®. Rezultati su pokazani kao procenat inhibicije CFB, u odnosu na netretirane kontrolne ćelije.

[0282] Novo dizajnirani himerni antisens oligonukleotidi u Tabelama u tekstu ispod su dizajnirani kao 4-8-5 MOE, 5-9-5 MOE, 5-10-5 MOE, 3-10-4 MOE, 3-10-7 MOE, 6-7-6- MOE, 6-8-6 MOE, ili 5-7-5 MOE gapmeri, ili kao dezoksi, MOE, i cEt oligonuleotidi.

[0283] 4-8-5 MOE gapmeri su dužine 17 nukleozida, pri čemu centralni segment razmaka obuhvata osam 2’-dezoksinukleozida i ogrančen je sa segmentima „krila“ u 5’ pravcu i 3’ pravcu koji redom obuhvata četiri i pet nukleozida. 5-9-5 MOE gapmeri su dužine 19 nukleozida, pri čemu centralni segment razmaka obuhvata devet 2’-dezokinukleozida i ogrančen je sa segmentima „krila“ u 5’ pravcu i 3’ pravcu gde svaki obuhvata pet nukleozida.5-10-5 MOE gapmeri su dužine 20 nukleozida, pri čemu centralni segment razmaka obuhvata deset 2’-dezoksinukleozida i ogrančen je sa segmentima „krila“ u 5’ pravcu i 3’ pravcu gde svaki obuhvata pet nukleozida.5-7-5 MOE gapmeri su dužine 17 nukleozida, pri čemu centralni segment razmaka obuhvata sedam 2’- dezoksinukleozida i ogrančen je sa segmentima „krila“ u 5’ pravcu i 3’ pravcu gde svaki obuhvata pet nukleozida.3-10-4 MOE gapmeri su dužine 17 nukleozida, pri čemu centralni segment razmaka obuhvata deset 2’-dezoksinukleotida i ogrančen je sa segmentima „krila“ u 5’ pravcu i 3’ pravcu koji redom obuhvata tri i četiri nukleozida.3-10-7 MOE gapmeri su dužine 20 nukleozida, pri čemu centralni segment razmaka obuhvata deset 2’-dezoksinukleozida i ograničen je sa segmentima „krila“ u 5’ pravcu i 3’ pravcu koji redom obuhvata tri i sedam nukleozida.6-7-6 MOE gapmeri su dužine 19 nukleozida, pri čemu centralni segment razmaka obuhvata sedam 2’- dezoksinukleozida i ogrančen je sa segmentima „krila“ u 5’ pravcu i 3’ pravcu koji svaki obuhvata šest nukleozida. 6-8-6 MOE gapmeri su dužine 20 nukleozida, pri čemu centralni segment razmaka obuhvata osam 2’- dezoksinukleozida i ogrančen je sa segmentima „krila“ u 5’ pravcu i 3’ pravcu koji obuhvata svaki šest nukleozida. Internukleozidne veze u svakom gapmeru su fosforotioatne veze (P=S). Svi ostaci citozina u svakom gapmeru su 5-metilcitozini.

[0284] Dezoksi, MOE i cEt oligonukleotidi su dužine 16 nukleozida pri čemu nukleozid ima ili MOE modifikaciju šećera, i cEt modifikaciju šećera, ili dezoksi modifikaciju. Kolona ’Hemija’ opisuje modifikacije šećera od svakog oligonukleotida. ’k’ ukazuje na cEt modifikaciju šećera; ’d’ ukazuje na dezoksiribozu; i ’e’ ukazuje na MOE modifikaciju.

[0285] "Start mesto" ukazuje na 5’-ciljni nukleozid prema kom je gapmer usmeren u humanoj genskoj sekvenci. "Stop mesto" ukazuje na 3’-ciljni nukleozid prema kome je gapmer usmeren u humanoj genskoj sekvenci. Svaki gapmer koji je naveden u Tabelama u tekstu ispod je usmeren ili prema humanoj CFB iRNK, koji je ovde naznačen sa SEQ ID NO: 1 (GENBANK pristupni br. NM_001710.5) ili humana CFB genomska sekvenca, koja je ovde naznačena sa SEQ ID NO: 2 (GENBANK pristupni br. NT_007592015 prekinut od nukleotida 31852000 do 31861000), ili oba. ’n/a’ ukazuje da antisens oligonukleotid nije usmeren prema toj određenoj genskoj sekvenci sa 100% kompementarnosti.

Tabela 10

4

11 ela ab T

21 ela ba T

13 a elab T

14 a elba T

Primer 5: Antisens inhibicija humanog Faktora B komplementa (CFB) u HepG2 ćelijama sa MOE gapmerima

[0286] Dizajnirani su dodatni antisens origonukleotidi koji su usmereni prema nukleinskoj kiselini koja kodira Faktor B komplementa (CFB) i testirani su za njihove efekte na CFB iRNK in vitro. Antisens oligonukleotidi su testirani u seriji eksperimenata koji su imali slične uslove u kulturi. Rezultati za takve eksperimente su prikazani u odvojenim tabelama koje su prikazane u tekstu ispod. Ćelije HepG2 se gaje u kulturi na gustini od 20,000 ćelija po bunariću su transfektovane korišćenjem elektroporacije sa 2,000 nM antisens oligonukleotidom. Posle perioda tretmana od približno 24 časova, RNK je izolovana iz ćelija i nivoi CFB iRNK su izmereni kvantitativnim PCR-om u realnom vremenu. Humani set proba prajmera RTS3459 je korišćen za merenje nivoa iRNK. Nivoi CFB iRNK su podešeni prema ukupnom sadržaju RNK, kao što je mereno sa RIBOGREEN®. Rezultati su prikazani kao procenat inhibicije CFB, u odnosu na netretirane kontrolne ćelije.

[0287] Novo dizajnirani antisens oligonukleotidi u Tabelama u tekstu ispod su naznačeni kao 4-8-5 MOE, 5-8-5 MOE, 5-9-5 MOE, 5-10-5 MOE, 6-7-6- MOE, 3-10-5 MOE, ili 6-8-6 MOE gapmeri.

[0288] 4-8-5 MOE gapmeri su dužine 17 nukleozida, pri čemu centralni segment razmaka obuhvata osam 2’-deozoksinukleozida i ograničen je sa segmentima „krila“ u 5’ pravcu i 3’ pravcu koji redom obuhvata četiri i pet nukleozida. 5-8-5 MOE gapmeri su dužine 18 nukleozida, pri čemu centralni segment razmaka obuhvata osam 2’- deozoksinukleozida i ograničen je sa segmentima „krila“ u 5’ pravcu i 3’ pravcu pri čemu svaki obuhvata pet nukleozida.5-9-5 MOE gapmeri su dužine 19 nukleozida, pri čemu centralni segment razmaka obuhvata devet 2’- deozoksinukleozida i ograničen je sa segmentima „krila“ u 5’ pravcu i 3’ pravcu pri čemu svaki obuhvata pet nukleozida. 5-10-5 MOE gapmeri u dužine 20 nukleozida, pri čemu centralni segment razmaka obuhvata deset 2’-deozoksinukleozida i ograničen je sa segmentima „krila“ u 5’ pravcu i 3’ pravcu pri čemu svaki obuhvata pet nukleozida. 3-10-5 MOE gapmeri su dužine 18 nukleozida, pri čemu centralni segment razmaka obuhvata deset 2’- deozoksinukleozida i ograničen je sa segmentima „krila“ u 5’ pravcu i 3’ pravcu koji redom sadrže tri i pet nukleozida. 6-7-6 MOE gapmeri su dužine 19 nukleozida, pri čemu centralni segment razmaka obuhvata sedam 2’-d deozoksinukleozida i ograničen je sa segmentima „krila“ u 5’ pravcu i 3’ pravcu pri čemu svaki obuhvata šest nukleozida. 6-8-6 MOE gapmeri su dužine 20 nukleozida, pri čemu centralni segment razmaka obuhvata osam 2’- deozoksinukleozida i ograničen je sa segmentima „krila“ u 5’ pravcu i 3’ pravcu pri čemu svaki obuhvata šest nukleozida. Svaki nukleozid u 5’ segmentu „krila“ i svaki nukleozid u 3’ segmentu „krila“ ima 2’-MOE modifikaciju. Internukleozidne veze u svakom gapmeru su fosforotioatne (P=S) veze. Svi ostacicitozina u vakom gapmeru su 5-metilcitozini.

[0289] "Start mesto" ukazuje na 5’-ciljni nukleozid prema kome je gapmer usmeren u humanoj genskoj sekvenci. "Stop mesto" ukazuje na 3’-ciljni nukleozid ome je gapmer usmeren u humanoj genskoj sekvenci. Svaki gapmer koji je naveden u Tabeli u tekstu ispod je usmeren ili prema humanoj CFB iRNK, koja je ovde naznačena sa SEQ ID NO: 1 (GENBANK pristupni br. NM_001710.5) ili humanoj CFB genomskoj sekvenci, koja je ovde naznačena sa SEQ ID NO: 2 (GENBANK pristupni br. NT_007592.15 prekinuto od nukleotida 31852000 do 31861000), ili oba. ’n/a’ ukazuje da antisens oligonukleotid nije usmeren prema određenoj genskoj sekvenci sa 100% komplementarnosti.

11

15la be Ta

16 a elab T

17 ela ab T

Primer 6: Antisens inhibicija humanog Faktora B komplementa (CFB) kod HepG2 ćelija

[0290] Dizajnirani su dodatni antisens oligonkleotidi koji su usmereni prema nukleinskoj kiselini humanog Faktora B komplementa (CFB) i ispitani su za njihove efekte na CFB iRNK in vitro. Ćelije HepG2 koje se gaje u kulturi u gustini od 20,000 ćelija po bunariću su transfektovane upotrebom elektroporacije sa 1,000 nM antisens oligonukleotidom. Posle perioda tertmana od približno 24 čaova, RNK je izolovana iz ćelija i nivoi CFB iRNK su izmereni kvantitativnim PCR-om u realnom vremenu. Set humane probe prajmera RTS3459 je korišen za merenje nivoa iRNK. Nivoi CFB iRNK su podešeni prema ukupnom RNK sadržaju, kako je mereno sa RIBOGREEN®. Rezultati su prikazani kao procenat inhibicije CFB, u odnosu na netretirane kontrolne ćelije.

[0291] Novo dizajnirani himerni antisens oligonukleotidi u Tabelama u tekstu ispod su dizajnirani kao dezoksi, MOE i cEt oligonukleotidi. Dezoksi, MOE i cEt oligonukleotidi su dužine 16 nukleozida pri čemu nukleozid ima ili MOE modifikaciju šećera, cEt modifikaciju šećera, ili dezoksi modifikaciju. Kolona ’Hemija’ opisuje modifikacije šećera svakog oligonukleotida. ’k’ ukazuje na cEt modifikaciju šećera; ’d’ naznačava dezoksiribozu; i ’e’ naznačava MOE modifikaciju.

[0292] "Start mesto" naznačava 5’-ciljni nukleozid u odnosu na koga je gapmer usmeren u humanoj genskoj sekvenci. "Stop mesto" ukazuje na 3’- nukleozid u odnosu na koga je gapmer usmeren u humanoj genskoj sekvenci. Svaki gapmer koji je naveden u Tabelama u tekstu ispod je usmeren ili prema humanog CFB iRNK, koja je ovde naznačena sa SEQ ID NO: 1 (GENBANK pristupni br. NM_001710.5) ili humanom genomskom sekvencom CFB, koja je ovde naznačena sa SEQ ID NO: 2 (GENBANK pristupni br. NT_007592015 prekinuta od nukleotida 31852000 do 31861000), ili oba. ’n/a’ ukazuje da antisens oligonukleotid nije usmeren prema određenoj genskoj sekvenci sa 100% komplementarnosti.

12

18la be Ta

Primer 7: Antisens inhibicija humanog Faktora B komplementa (CFB) u HepG2 ćelijama

[0293] Dizajnirani su dodatni antisens oligonukleotidi koji cilju nukleinsku kiselinu humanog faktora B komlementa (CFB) i ispitani su za njihove efekte na CFB iRNK in vitro. Antisens oligonukleotidi su ispitani u serijama eksperimenata u kojima su uslovi kulture bili slični. Rezultati svakog eksperimenta su prikazani u odvojenim tabelama u tekstu ispod. Ćelije HepG2 koje su gajene u kulturi na gustini od 20,000 ćelija po bunariću su transfektovane elektroporacijom sa 500 nM antisens oligonukleotida. Posle perioda tretmana od približno 24 časova, RNK je izolovana iz ćelija i nivoi CFB iRNK su mereni kvantitativnim PCR-om u realnom vremenu. Humani set prajmera probe RTS3459 je korišćen za merenja nivoa iRNK. Nivoi CFB iRNK su podeđšeni prema ukupnom RNK sadržaju, kako je mereno RIBOGREEN®. Rezultati su prikazani kao procenat inhibicije CFB, u odnosu na netretirane kontrolne ćelije.

[0294] Novo dizajnirani antisens oligonukleotidi u Tabelama u tekstu ispod su dizajnirani kao dezoksi, MOE i cEt oligonukleotidi, ili kao 5-8-5 MOE, 5-9-5 MOE, 5-10-5 MOE, 6-7-6- MOE, 3-10-5 MOE, ili 6-8-6 MOE gapmeri.

[0295] Dezoksi, MOE i cEt oligonukleotidi su dužine 16 nukleozida pri čemu svaki nukleozid ima MOE modifikaciju šećera, cEt modifikaciju šećera, ili dezoksi modifikaciju. Kolona ’Hemije’ opisuje modifikacije šećera u svakom oligonukleotidu. ’k’ naznačava cEt modifikaciju šećera; ’d’ naznačava dezoksiribozu; i ’e’ naznačava MOE modifikaciju.

[0296] 5-8-5 MOE gapmeri su dužine 18 nukleozida, pri čemu centralni segment razmaka obuhvata osam 2’-dezoksinukleozida i ograničen je segmentima „krila“ u 5’ pravcu i 3’ pravcu svaki obuhvata pet nukleozida. 5-9-5 MOE gapmeri su dužine 19 nukleozida, pri čemu centralni segment razmaka obuhvata devet 2’-dezoksinukleozida i ograničen je segmentima „krila“ u 5’ pravcu i 3’ pravcu pri čemu svaki obuhvata pet nukleozida. 5-10-5 MOE gapmeri su dužine 20 nukleozida, pri čemu centralni segment razmaka obuhvata deset 2’-dezoksinukleozida i ograničen je segmentima „krila“ u 5’ pravcu i 3’ pravcu pri čemu svaki obuhvata pet nukleozida. 3-10-5 MOE gapmeri su dužine 18, pri čemu centralni segment razmaka obuhvata deset 2’- dezoksinukleozida i ograničen je segmentima „krila“ u 5’ pravcu i 3’ pravcu pri čemu svaki redom obuhvata tri i pet nukleozida.6-7-6 MOE gapmeri su dužine 19 nukleozida, pri čemu centralni segment razmaka obuhvata sedam 2’-dezoksinukleozida i ograničen je segmentima „krila“ u 5’ pravcu i 3’ pravcu pri čemu svaki obuhvata šest nukleozida. 6-8-6 MOE gapmeri su dužine 20 nukleozida, centralni segment razmaka obuhvata osam 2’- dezoksinukleozida i ograničen je segmentima „krila“ u 5’ pravcu i 3’ pravcu pri čemu svaki obuhvata šest nukleozida. Svaki nukleozid u segmentu 5’ „krila“ i svaki nukleozid u segementu 3’ „krila“ ima 2’- MOE modifikaciju. Internukleozidne veze kroz svaki gapmer su fosforotioatne (P=S) veze. Svi ostaci citozina u svakom gapmeru su 5-metilcitozini.

[0297] "Start mesto" ukazuje na 5’-ciljni nukleozid prema kome je gapmer usmeren u humanoj genskoj sekvenci. "Stop mesto" ukazuje na 3’-ciljni nukleozid prema kome je gapmer usmeren u humanoj genskoj sekvenci. Svaki gapmer koji je naveden u Tabelama u tekstu ispod je usmeren ili prema humanoj CFB iRNK, ovde naznačen sa SEQ ID NO: 1 (GENBANK pristupni br. NM_001710.5) ili humana genomska sekvenca CFB, ovde naznačena sa SEQ ID NO: 2 (GENBANK pristupni br. NT_007592015 koja je prekinuta od 31852000 do 31861000), ili oba. ’n/a’ ukazuje da antisens oligonukleotid nije usmeren prema određenoj genskoj sekvenci sa 100% komplementarnosti.

1 4

22 ela ab T

23 ela ba T

Tabela 24

11

12

1

Primer 8: Dozno-zavisna antisens inhibicija humanog CFB u HepG2 ćelijama 5-10-5 MOE gapmerima

[0298] Gapmeri iz studija koje su opisane gore u tekstu ispoljavaju in vitro inhibiiju CFB iRNK u izabrani i ispitani u raličitim dozama na HepG2 ćelijama. Ćelije su zasejane na gustini od 20,000 ćelija po bunariću i transfektovane su upotrebom elektroporacije sa 0.313 µM, 0.625 µM, 1.25 µM, 2.50 µM, 5.00 µM, ili 10.00 µM koncentracijama antisens oligonukleotida, kao što je naznačeno u tabeli u tekstu ispod. Posle perioda tretmana od približno 16 sati, RNK je izolovana iz ćelija i nivoi CFB iRNK su mereni kvantitativnim PCR-om u realnom vremenu. Humani set proba prajmera RTS3459 je korićen za merenje nivoa iRNK. Nivoi CFB iRNK u podešeni prema ukupnom RNK sadržaju, kao što je mereno sa RIBOGREEN®. Rezultati su prikazani kao procenat inhibicije CFB, u odnosu na netretirane kontrolne ćelije.

[0299] Polovina maksimalne inhibitorne koncentracije (IC50) od svakog oligonukleotida je takođe prikazana. Nivoi CFB iRNK su smanjeni na način koji zavisi od doze u ćelijama tretiranim sa antisens oligonukleotidom.

1 4

Tabela 25

Primer 9: Dozno-zavisna antisens inhibicija humanog CFB u HepG2 ćelijama

[0300] Gapmeri iz studija koje se gore opisuju ispoljavaju in vitro inhibiciju CFB iRNK su izabrani i ispitani u različitim dozama u HepG2 ćelijama. Antisens oligonukleotidi su ispitani u brojnim eksperimentima sa sličnim uslovima kulture. Rezultati za svaki eksperiment su predstavljeni u odvojenim tabelama koje su prikazane u tekstu ispod. Ćelije su zasejane u gustini od 20,000 ćelija po bunariću i izvršena je transfekcija elektroporacijom upotrebom električnog polja sa 0.08 μM, 0.25 μM, 0.74 μM, 2.22 μM, 6.67 μM, i 20.00 μM koncentracija antisens oligonukleotida, kao što je naznačeno u Tabeli u tekstu ispod. Posle perioda tretmana od približno 16 sati, RNK je izolovana iz ćelija i nivoi CFB iRNK su mereni pomoću kvantitativnog PCR-a u realnom vremenu. Set humanih proba prajmera RTS3459 je korišćen za merenje nivoa iRNK. Nivoi CFB iRNK su podešeni u skladu sa sadržajem ukupne RNK, kao što je mereno sa RIBOGREEN®. Rezultati su prikazani kao procent inhibicije CFB, u odnosu na netretirane kontrolne ćelije.

[0301] Polovina maksimalne inhibitorne koncentracije (IC50) svakog nukleotida je takođe prikazana. Nivoi CFB iRNK su smanjeni na dozno zavisan način u ciljnim ćelijama koje su tretirane sa antisens oligonukleotidima.

1

Tabela 26

Tabela 27

1 Tabela 28

Tabela 29

Tabela 30

1

Primer 10: Dozno-zavisna antisens inhibicija humanog CFB u HepG2 ćelijama

[0302] Gapmeri iz studija koje su opisane gore u tekstu koji ispoljavaju in vitro inhibiciju CFB iRNK su izabrani i ispitani u različitim dozama u HepG2 ćelijama. Antisens oligonukleotidi su ispitani u brojnim eksperimentima koji imaju slične uslove kulture. Rezultati za svaki eksperiment su prikazani u odvojenim tabelama koje su prikazane u tekstu ispod. Ćelije su zasejane u gustini od 20,000 ćelija po bunariću i izvršena je transfekcije upotrebom elektroporacije sa 0.06 μM, 0.25 μM, 1.00 μM, i 4.00 μM koncentracija antisens oligonukleotida, kao što je naznačeno u Tabeli u tekstu ispod. Posle perioda tretmana od približno 16 sati, RNK je izolovana iz ćelija i CFB iRNK nivoi su mereni kvantitativnim PCR-om u realnom vremenu. Set humanih proba prajmera RTS3459je korišćen za merenje nivoa iRNK. Nivoi CFB iRNK su podešeni u skladu sa ukupnim RNK sadržajem, kao što je mereno sa RIBOGREEN®. Rezultati su predstavljeni kao procenat inhibicije CFB, u odnosu na netretirane kontrolne ćelije.

[0303] Polovina maksimalne inhibitorne koncentracije (IC50) od svakog oligonukleotida je takođe prikazana. Nivoi CFB iRNK su smanjeni na dozno-zavisan način u ćelijama koje su tretirane sa antisens oligonukleotidom.

1

Tabela 32

Tabela 33

1

Tabela 34

1 Tabela 35

Tabela 36

11

Primer 11: Dozno-zavisna antisens inhibicija humanog CFB u HepG2 ćelijama

[0304] Gapmeri iz studija koji su opisani gore u tekstu ispoljavaju in vitro inhibiciju CFB iRNK su izabrani i ispitani u različitim dozama u HepG2 ćeljama. Dodatno, dezoksi, MOE i cEt oligonukleotid, ISIS 594430, je dizajniran sa istom sekvencom (CTCCTTCCGAGTCAGC, SEQ ID NO: 549) i ciljnim regionom (ciljno start mesto 2195 SEQ ID NO: 1 i ciljno start mesto 6983 od SED ID NO: 2) kao ISIS 588870, drugi dezoksi, MOE, i cEt oligonukleotid. ISIS 594430 je 3-10-3 cEt gapmer.

[0305] Ćelije su zasejane u gustini od 20,000 ćelija po bunariću i izvršena je transfekcija upotrebom elektroporacije sa 0.01 μM, 0.04 μM, 0.12 μM, 0.37 μM, 1.11 μM, 3.33 μM, i 10.00 μM koncentracija antisens oligonukleotida, kao što je naznačeno u Tabeli u tekstu ispod. Posle perioda tretmana od približno 16 sati, RNK je izolovana iz ćelija i CFB iRNK nivoi su mereni upotrebom kvantitativnog PCR-a u realnom vremenu. Set humanih proba prajmera RTS3459 je korišćen za merenje nivoa iRNK. Nivoi CFB iRNK su podešeni u skladu sa ukupnim sadržajem RNK, kao što je mereno sa RIBOGREEN®. Rezultati su predstavljeni kao procenat inhibicije CFB, u odnosu na netretirane kontrolne ćelije.

[0306] Polovina maksimalne inhibitorne koncentracije (IC50) svakog oligonukleotida je takođe prikazana. Nivoi CFB iRNK su smanjeni na dozno-zavisnom načinu u ćelijama koje su tretirane sa antisens oligonukleotidom.

Tabela 37

1 2

Primer 12: Podnošljivost MOE gapmera koji ciljaju CFB kod CD1 miševa

[0307] CD1® miševi (Charles River, MA) su višenamenski mišji modeli, često korišćeni za ispitivanja koja se tiču bezbednosti i efikasnosti. Miševi su tretirani sa ISIS antisens oligonukleotidima koji su izabrani iz studija koje su opisane u tekstu iznad i procenjene za promene u nivoima različitih hemijskih markera u plazmi.

Studija 1 (sa 5-10-5 MOE gapmerima)

[0308] Grupama od CD1 miševa mužjaka starosti sedam nedelja je subkutano ubrizgavano jednom nedeljno za 6 nedelja sa 100 mg/kg od ISIS oligonukleotida. Grupi mužjaka CD1 miševa je jednom nedeljno tokom šest nedelja subkutano ubrizgavan PBS. Jednoj grupi miševa je jednom nedeljno tokom šest nedelja subkutano ubrizgano 100 mg/kg kontrolnog oligonukleotida ISIS 141923 (CCTTCCCTGAAGGTTCCTCC, ovde naznačen sa SEQ ID NO: 809, 5-10-5 MOE gapmer bez poznate mišje mete). Miševi su eutanizovani 48 sati posle zadnje doze, i organi i plazma su sakupljeni za dalju analizu. Hemijski markeri plazme

[0309] Da bi se ispitao efekat ISIS oligonukleotida na funkciju jetre i bubrega, nivoi transaminaza u plazmi, i BUN su mereni upotrebom automatizovanog kliničkog hemijskog analizatora (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). Rezultati su prikazani u Tabeli u tekstu ispod. ISIS oligonukleotidi koji uzrokuju promene u nivoima u bilo kojim markerima funkcije jetre ili bubrega izvan očekivanog opsega za antisens oligonukleotide su isključeni u daljim ispitivanjima.

Tabela 38

1

Težine

[0310] Telesne težine miševa su merene u danu 40 pre žrtvovanja miševa. Težine organa, jetre, bubrega, i slezine su takođe izmerene posle žrtvovanja miševa. Rezultati su prikazani u Tabeli u tekstu ispod. ISIS oligonukleotidi koji uzrokuju promene u težinama izvan očekivanog opsega za antisens oligonukleotide su isključeni iz daljih ispitivanja.

Tabela 39

Studija 2 (sa 5-10-5 MOE gapmerima)

[0311] Grupe od šest do deset nedelja starosti mužjaka CD1 miševa je jednom nedeljno tokom 6 nedelja ubrizgano 100 mg/kg ISIS oligonukleotida. Dve grupe mužjaka CD1 miševa je subkutano jednom nedeljno tokom 6 nedjelja ubrizgan PBS. Jednoj grupi miševa je jednom nedeljno tokom 6 nedjelja ubrizgano 100 mg/kg kontrolnog oligonukleotida ISIS 141923. Miševi su eutanizovani 48 sati posle poslednje doze, i organi i plazma su sakupljeni za dalju analizu.

Hemijski markeri plazme

[0312] Da bi se ispitao efekat ISIS oligonukleotida na funkciju jetre i bubrega, nivoi transaminaza u plazmi, albumina, i BUN su mereni upotrebom automatskog kliničkog hemijskog analizatora (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). Rezultati su prikazani u Tabeli u tekstu ispod. ISIS oligonukleotidi koji

1 4

uzrokuju promene u nivoima bilo kog markera funkcije jetre ili bubrega izvan očekivanog opsega za antisens oligonukleotide su isključeni iz daljih ispitivanja.

Tabela 40

Težine

[0313] Telesne težine miševa su izmerene u danu 42. Težine organa, jetre, bubrega, i slezine su takođe izmerene posle žrtvovanja miševa u danu 45. Rezultati su prikazani u Tabeli u tekstu ispod. ISIS oligonukleotidi koji su uzrokovali promene u težinama izvan očekivanog opsega za antisens oligonukleotide su isključeni u daljim ispitivanjima.

Tabela 41

1

Studija 3 (sa 5-10-5 MOE gapmerima)

[0314] Grupe od šest do osam nedjelja starosti mužjaka CD1 miševa je jednom nedeljno tokom 6 nedelja ubrizgano 100 mg/kg ISIS oligonukleotida. Dve grupe mužjaka CD1 miševa je subkutano jednom nedeljno tokom 6 nedelja ubrizgan PBS. Miševi su eutanizovani 48 sati posle poslednje doze, i organi i plazma su sakupljeni za dalju analizu.

Hemijski markeri iz plazme

[0315] Da bi se ispitao efekat ISIS oligonukleotida na funkciju jetre i bubrega, nivoi transaminaza u plazmi, albumin, i BUN su izmereni korišćenjem automatskog kliničkog hemijskog analizatora (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). Rezultati su prikazani u Tabeli u tekstu ispod. ISIS oligonukleotidi koji uzrokuju promene u nivoima bilo kog markera funkcije jetre ili bubrega izvan očekivanog opsega za antisens oligonukleotide su isključeni iz daljih ispitivanja.

Tabela 42

1

Težine

[0316] Telesne težine miševa su izmerene u danu 42. Težine organa, jetre, bubrega, i slezine su takođe izmerene posle žrtvovanja miševa u danu 45. Rezultati su prikazani u Tabeli u tekstu ispod. ISIS oligonukleotidi koji su uzrokovali promene u težinama izvan očekivanog opsega za antisens oligonukleotide su isključeni u daljim ispitivanjima.

Tabela 43

Studija 4 (sa (S) cEt gapmerima i dezoksi, MOE i cEt oligonukleotidima)

[0317] Grupama koje sadrže mužjake CD1 miševa starosti deset nedelja je subkutano ubrizgano jednom nedeljno za 6 nedelja 50 mg/kg ISIS oligonukleotida iz studija koje su opisane gore u tekstu. Dodatno, dva oligonukleotida, ISIS 594431 i ISIS 594432, su dizajnirani u obliku 3-10-3 cEt gapmera i

1

takođe se ispituju u ovoj studiji. ISIS 594431(ACCTCCTTCCGAGTCA, SEQ ID NO: 550) cilja isti region kao ISIS 588871, dezoksi, MOE i cEt gapmer (ciljno start mesto 2197 od SEQ ID NO: 1 i ciljno start mesto 6985 od SEQ ID NO: 2). ISIS 594432 (TGGTCACATTCCCTTC, SEQ ID NO: 542) cilja isti region kao ISIS 588872 dezoksi, MOE i cEt gapmer (ciljno start mesto 154 SEQ ID NO: 1 i ciljno start mesto 1875 od SEQ ID NO: 2).

[0318] Dve grupe mužjaka CD1 mipeva su subkutano ubrizgani jednom nedeljno za 6 nedjelja sa PBS. Miševi su eutanizovani 48 sati nakon poslednje doze, i organi i plazma su sakupljeni za dalju analizu.

Hemijski markeri iz plazme

[0319] Da bi se ispitao efekat SIS oligonukleotid na funkciju jetre i bubrega, nivoi transaminaza u plazmi, albumina, kreatinina, i BUN su izmereni upotrebom automatskog kliničkog hemijskog analizatora (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). Rezultati su prikazani u Tabeli u tekstu ispod. ISIS oligonukleotidi koji uzrokuju promene u nukleotidima u bilo kojim markerima funkcije jetre i bubrega izvan očekivanog opsega za antisens oligonukleotide su isključeni iz daljih studija.

Tabela 44

1

Težine

[0320] Telesne težine miševa su izmerene u danu 39. Težine organa, jetre, bubrega, i slezine su takođe izmerene posle žrtvovanja miševa u danu 42. Rezultati su prikazani u Tabeli u tekstu ispod. ISIS oligonukleotidi koji su uzrokovali promene u težinama izvan očekivanog opsega za antisens oligonukleotide su isključeni u daljim ispitivanjima.

Tabela 45

1

Studija 5 (sa MOE gapmerima, (S) cEt gapmerima i dezoksi, MOE i cEt oligonukleotidima)

[0321] Grupama koje sadrže mužjake CD1 miševa osam-do devet nedelja starosti je subkutano ubrizgano jednom nedeljno tokom 6 nedelja 50 mg/kg ISIS oligonukleotida. Dve grupe mužjaka CD1 miševa su subkutano ubrizgani jednom nedeljno tokom 6 nedjelja sa PBS. Miševi su eutanizovani 48 sati nakon poslednje doze, i organi i plazma su sakupljeni za dalju analizu.

Hemijski markeri iz plazme

[0322] Da bi se ispitao efekat ISIS oligonukleotida na funkciju jetre i bubrega, nivoi transaminaza u plazmi, albumina, kreatinina, i BUN su izmereni upotrebom automatskog kliničkog hemijskog analizatora (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). Rezultati su prikazani u Tabeli u tekstu ispod. ISIS oligonukleotidi koji uzrokuju promene u nivoima bilo kog markera funkcije jetre ili bubrega izvan očekivanog opsega za antisens oligonukleotide su isključeni u daljim studijama.

Tabela 46

1

Težine

[0323] Telesne težine miševa su izmerene u danu 40. Težine organa, jetre, bubrega, i slezine su takođe izmerene posle žrtvovanja miševa u danu 42. Rezultati su prikazani u Tabeli u tekstu ispod. ISIS oligonukleotidi koji su uzrokovali promene u težinama izvan očekivanog opsega za antisens oligonukleotide su isključeni u daljim ispitivanjima.

Tabela 47

Studija 6 (sa dezoksi. MOE i cEt oligonukleotidima)

[0324] Grupama koje sadrže mužjake CD1 miševa osam-do-devet nedelja starosti je subkutano ubrizgano jednom nedeljno tokom 6 nedelja 50 mg/kg dezoksi, MOE, i ISIS oligonukleotida. Dve grupe mužjaka CD1 miševa su subkutano ubrizgani jednom nedeljno tokom 6 nedjelja sa PBS. Miševi su eutanizovani 48 sati nakon poslednje doze, i organi i plazma su sakupljeni za dalju analizu.

1 1

Hemijski markeri iz plazme

[0325] Da bi se ispitao efekat ISIS oligonukleotida na funkciju jetre i bubrega, nivoi transaminaza u plazmi, albumina, kreatinina, bilirubina i BUN su izmereni upotrebom automatskog kliničkog hemijskog analizatora (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). Rezultati su prikazani u Tabeli u tekstu ispod. ISIS oligonukleotidi koji uzrokuju promene u nivoima bilo kog markera funkcije jetre ili bubrega izvan očekivanog opsega za antisens oligonukleotide su isključeni u daljim studijama.

Tabela 48

Težine

[0326] Telesne težine miševa su izmerene u danu 40. Težine organa, jetre, bubrega, i slezine su takođe izmerene posle žrtvovanja miševa u danu 45. Rezultati su prikazani u Tabeli u tekstu ispod. ISIS oligonukleotidi koji su uzrokovali promene u težinama izvan očekivanog opsega za antisens oligonukleotide su isključeni u daljim ispitivanjima.

1 2

Tabela 49

Studija 7 (sa MOE gapmerima i dezoksi, MOE i cEt oligonukleotidi)

[0327] Grupama koje sadrže mužjake CD1 miševa osam-do-devet nedelja starosti je subkutano ubrizgano jednom nedeljno tokom 6 nedelja 100 mg/kg ISIS oligonukleotida. Jedna grupa mužjaka CD1 miševa je subkutano ubrizgana jednom nedeljno tokom 6 nedelja sa PBS. Miševi su eutanizovani 48 sati nakon poslednje doze, i organi i plazma su sakupljeni za dalju analizu.

Hemijski markeri iz plazme

[0328] Da bi se ispitao efekat ISIS oligonukleotida na funkciju jetre i bubrega, nivoi transaminaza u plazmi, albumina, kreatinina, i BUN su izmereni upotrebom automatskog kliničkog hemijskog analizatora (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). Rezultati su prikazani u Tabeli u tekstu ispod. ISIS oligonukleotidi koji uzrokuju promene u nivoima bilo kog markera funkcije jetre ili bubrega izvan očekivanog opsega za antisens oligonukleotide su isključeni u daljim studijama.

1

Tabela 50

Težine

[0329] Telesne težine miševa su izmerene u danu 44. Težine organa, jetre, bubrega, i slezine su takođe izmerene posle žrtvovanja miševa u danu 49. Rezultati su prikazani u Tabeli u tekstu ispod. ISIS oligonukleotidi koji su uzrokovali promene u težinama izvan očekivanog opsega za antisens oligonukleotide su isključeni u daljim ispitivanjima.

Tabela 51

1 4

Studija 8 (sa MOE gapmerima, dezoksi, MOE i cEt oligonukleotidima, i cEt gapmerima)

[0330] Grupama CD1 miševa starosti osam do devet nedelja je subkutano ubrizgano jednom nedeljno tokom 6 nedelja 100 mg/kg MOE gapmera, ili 50 mg/kg dezoksi, MOE i cEt oligonukleotida ili cEt gapmera. Jedna grupa mužjaka CD1 miševa je subkutano injecirana jednom nedeljno tokom 6 nedelja sa PBS. Miševi su eutanizovani 48 sati nakon poslednje doze, i organi i plazma su sakupljeni za dalju analizu.

Hemijski markeri plazme

[0331] Da bi se procenio efekat ISIS oligonukleotida na funkciju jetre i bubrega, nivoi transaminaza u plazmi, albumina, kreatinina, i BUN su izmereni upotrebom automatskog kliničkog hemijskog analizatora (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). Rezultati su prikazani u Tabeli u tekstu ispod.

1

Tabela 52

Težine

[0332] Telesne težine miševa su izmerene u danu 36. Težine organa, jetre, bubrega, i slezine su takođe izmerene posle žrtvovanja miševa u danu 43. Rezultati za težine organa su izraženi kao odnos prema telesnim težinama i normalnizovani sa odnosom PBS kontrole.

1

Tabela 53

Analiza citokina

[0333] Krv dobijena iz svih grupa miševa je poslata u Antech Diagnostics za merenja različitih nivoa citokina, kao što su IL-6, MDC, MIP1β, IP-10, MCP1, MIP-1α, i RANTES. Rezultati su prikazani u Tabeli 54.

Tabela 54

1

Hematološki testovi

[0334] Krv dobijena iz svih grupa miševa je poslata u Antech Dijagnostike za merenja hematokrita (HCT), kao i različitih ćelija krvi, kao što su WBC, RBC, i krvne pločice, i sadržaj ukupnog hemoglobina (Hb). Rezultati su prikazani u Tabeli 55.

Tabela 55

Primer 13: Podnošljivost antisens oligonukleotida koji ciljaju humani CFB kod Sprague-Dawley pacova

[0335] Sprague-Dawley pacovi su višenamenski model koji se koristi za svrhu ispitivanja bezbednosti i efikasnosti. Pacovi su tretirani sa ISIS antisens oligonukleotidima iz studija koje su opisane u Primerima gore u tekstu i procenjene za promene u nivoima različitih hemijskih markera u plazmi.

Studija 1 (sa 5-10-5 MOE gapmerima)

[0336] Mužjaci Sprague-Dawley pacova, starosti sedam do osam nedelja, su održavani na 12-časovnom ciklusu svetla/mraka sa ishranom tipa ad libitum sa Purina normal prehranom za pacove, diet 5001. Grupe od 4 Sprague-Dawley pacova svaki su subkutano ubrizgani jednom nedeljno tokom 6 nedelja 100 mg/kg 5-10-5 MOE gapmera. Jedna kontrolna grupa koja sadrži 6 pacova je subkutano ubrigana jednom nedeljno tokom 6 nedelja sa PBS. Četrdeset osam časova nakon poslednje doze, pacovi su eutanazovani i organi i plazma su sakupljeni za dalju analizu.

Funkcija jetre

[0337] Da bi se ispitao efekat ISIS oligonukleotida na fukciju jetre, nivoi transaminaza u plazmi su mereni korišćenjem automatskog kliničkog hemijskog analizatora (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). Nivoi ALT (alanin transaminaze) i AST (aspartat transaminaze) u plazmi su izmereni i rezultati su prikazani u Tabeli u tekstu ispod izraženi u IU/L. ISIS oligonukleotidi koji uzrokuju promene u nivoima bilo kojih marker koji određuju funkciju jetre izvan očekivanog opsega za antisens oligonukleotide su isključeni u daljim studijama.

1

Tabela 56

Funkcija bubrega

[0338] Da bi se ispitao efekat ISIS oligonukleotida na funkciju bubrega, nivoi u plazmi azota uree u krvi (BUN) i kreatinina su izmereni korišećenjem automatskog kliničkog hemijskog analizatora (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). Rezultati su prikazani u Tabeli u tekstu ispod, izraženi u mg/dL. ISIS oligonukleotidi koji uzrokuju promene u nivoima bilo kog markera funkcije bubrega izvan očekivanog opsega za antisens oligonukleotide su isključeni iz daljih studija.

Tabela 57

1

Težine

[0339] Merenja telesne težine su sprovedena u danu 39. Težine jetre, srca, slezine i bubrega su izmereni na kraju studije u danu 42, i prikazani su u Tabeli u tekstu ispod. ISIS oligonukleotidi koji uzrokuju bilo koje promene u težinama organa izvan očekivanog opsega za antisens oligonukleotide su isključeni iz daljih studija.

Tabela 58

Studija 2 (sa dezoksi, MOE i cEt oligonukleotidima)

[0340] Mužjaci Sprague-Dawley pacova, starosti devet do deset nedelja, su održavani na 12-časovnom ciklusu svetla/mraka sa ishranom tipa ad libitum sa Purina normal prehranom za pacove, 5001. Grupe od 4 Sprague-Dawley pacova svaki su subkutano ubrizgani jednom nedeljno tokom 6 nedelja sa 100 mg/kg dezoksi, MOE, i cEt oligonukleotidima. Dve kontrolne grupe od 3 pacova je svaka subkutano ubrizana jednom nedeljno tokom 6 nedelja sa PBS. Četrdeset osam časova nakon poslednje doze, pacovi su eutanazovani i organi i plazma su sakupljeni za dalju analizu.

Funkcija jetre

[0341] Da bi se ispitao efekat ISIS oligonukleotida na fukciju jetre, nivoi transaminaza u plazmi su mereni u danu 42 korišćenjem automatskog kliničkog hemijskog analizatora (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). Nivoi ALT (alanin transaminaze) i AST (aspartat transaminaze) i albumina u plazmi su izmereni i rezultati su prikazani u Tabeli u tekstu ispod. ISIS oligonukleotidi koji uzrokuju promene u nivoima bilo kojih markera koji određuju funkciju jetre izvan očekivanog opsega za antisens oligonukleotide su isključeni u daljim studijama.

1

Tabela 59

Funkcija bubrega

[0342] Da bi se ispitao efekat ISIS oligonukleotida na funkciju bubrega, nivoi u plazmi azota uree u krvi (BUN) i kreatinina su izmereni korišećenjem automatskog kliničkog hemijskog analizatora (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). Rezultati su prikazani u Tabeli u tekstu ispod, izraženi u mg/dL. ISIS oligonukleotidi koji uzrokuju promene u nivoima bilo kog markera funkcije bubrega izvan očekivanog opsega za antisens oligonukleotide su isključeni iz daljih studija.

Tabela 60

1 1

Težine

[0343] Merenja telesne težine su sprovedena u danu 39. Težine jetre, srca, slezine i bubrega su izmereni na kraju studije u danu 42, i prikazani su u Tabeli u tekstu ispod. ISIS oligonukleotidi koji uzrokuju bilo koje promene u težinama organa izvan očekivanog opsega za antisens oligonukleotide su isključeni iz daljih studija.

Tabela 61

Studija 3 (sa MOE gapmerima)

[0344] Mužjaci Sprague-Dawley pacova, starosti devet do deset nedelja, su održavani na 12-časovnom ciklusu svetla/mraka sa ishranom tipa ad libitum sa Purina normal prehranom za pacove, 5001. Grupe od 4 Sprague-Dawley pacova svaki su subkutano ubrizgani jednom nedeljno tokom 6 nedelja sa 100 mg/kg dezoksi, MOE gapmerima. Jedna kontrolna grupa od 6 pacova je svaka subkutano ubrizana jednom nedeljno tokom 6 nedelja sa PBS. Četrdeset osam časova nakon poslednje doze, pacovi su eutanazovani i organi i plazma su sakupljeni za dalju analizu.

Funkcija jetre

[0345] Da bi se ispitao efekat ISIS oligonukleotida na fukciju jetre, nivoi transaminaza u plazmi su mereni u danu 43 korišćenjem automatskog kliničkog hemijskog analizatora (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). Nivoi ALT (alanin transaminaze) i AST (aspartat transaminaze) u plazmi su izmereni i rezultati su prikazani u Tabeli u tekstu ispod. ISIS oligonukleotidi koji uzrokuju promene u nivoima bilo kojih markera koji određuju funkciju jetre izvan očekivanog opsega za antisens oligonukleotide su isključeni u daljim studijama.

1 2

Tabela 62

Funkcija bubrega

[0346] Da bi se ispitao efekat ISIS oligonukleotida na funkciju bubrega, nivoi u plazmi azota uree u krvi (BUN) i kreatinina su izmereni korišećenjem automatskog kliničkog hemijskog analizatora (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). Rezultati su prikazani u Tabeli u tekstu ispod, izraženi u mg/dL. ISIS oligonukleotidi koji uzrokuju promene u nivoima bilo kog markera funkcije bubrega izvan očekivanog opsega za antisens oligonukleotide su isključeni iz daljih studija.

Tabela 63

1

Težine

[0347] Merenja telesne težine su sprovedena u danu 39. Težine jetre, srca, slezine i bubrega su izmereni na kraju studije u danu 42, i prikazani su u Tabeli u tekstu ispod. ISIS oligonukleotidi koji uzrokuju bilo koje promene u težinama organa izvan očekivanog opsega za antisens oligonukleotide su isključeni iz daljih studija.

Tabela 64

Studija 4 (sa MOE gapmerima)

[0348] Mužjaci Sprague-Dawley pacova, starosti devet do deset nedelja, su održavani na 12-časovnom ciklusu svetla/mraka sa ishranom tipa ad libitum sa Purina normal prehranom za pacove, 5001. Grupe od 4 Sprague-Dawley pacova svaki su subkutano ubrizgani jednom nedeljno tokom 6 nedelja sa 100 mg/kg dezoksi, MOE gapmerima. Jedna kontrolna grupa od 6 pacova je svaka subkutano ubrizana jednom nedeljno tokom 6 nedelja sa PBS. Četrdeset osam časova nakon poslednje doze, pacovi su eutanazovani i organi i plazma su sakupljeni za dalju analizu.

Funkcija jetre

[0349] Da bi se ispitao efekat ISIS oligonukleotida na funkciju bubrega, nivoi transaminaza su izmereni u danu 42 korišćenjem automatskog kliničkog hemijskog analizatora (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). Nivoi ALT (alanin transaminaze) i AST (aspartat transaminaze) u plazmi su izmereni i rezultati su prikazani u Tabeli ispod izraženi u IU/L. ISIS oligonukleotidi koji uzrokuju promene u nivoima bilo kog markera funkcije jetre izvan očekivanog opsega za antisens oligonukleotide su isključeni iz daljih studija.

Tabela 65

1 4

Funkcija bubrega

[0350] Da bi se ispitao efekat ISIS oligonukleotida na funkciju bubrega, nivoi u plazmi azota uree u krvi (BUN) i kreatinina su izmereni korišećenjem automatskog kliničkog hemijskog analizatora (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). Rezultati su prikazani u Tabeli u tekstu ispod, izraženi u mg/dL. ISIS oligonukleotidi koji uzrokuju promene u nivoima bilo kog markera funkcije bubrega izvan očekivanog opsega za antisens oligonukleotide su isključeni iz daljih studija.

Tabela 66

Težine

[0351] Merenja telesne težine su sprovedena u danu 39. Težine jetre, srca, slezine i bubrega su izmereni na kraju studije u danu 42, i prikazani su u Tabeli u tekstu ispod. ISIS oligonukleotidi koji uzrokuju bilo koje promene u težinama organa izvan očekivanog opsega za antisens oligonukleotide su isključeni iz daljih studija.

Tabela 67

1

Studija 5 (sa MOE gapmerima i dezoksi, MOE i cEt oligonukleotidima)

[0352] Mužjaci Sprague-Dawley pacova, starosti devet do deset nedelja, su održavani na 12-časovnom ciklusu svetla/mraka sa ishranom tipa ad libitum sa Purina normal prehranom za pacove, 5001. Grupe od 4 Sprague-Dawley pacova svaki su subkutano ubrizgani jednom nedeljno tokom 6 nedelja sa 100 mg/kg dezoksi, MOE gapmerima ili sa 50 mg/kg dezoksi, MOE i cEt oligonuklotidima. Jedna kontrolna grupa od 4 pacova je svaka subkutano ubrizgana jednom nedeljno tokom 6 nedelja sa PBS. Četrdeset osam časova nakon poslednje doze, pacovi su eutanazovani i organi i plazma su sakupljeni za dalju analizu.

Funkcija jetre

[0353] Da bi se ispitao efekat ISIS oligonukleotida na funkciju bubrega, nivoi transaminaza su izmereni u danu 42 korišćenjem automatskog kliničkog hemijskog analizatora (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). Nivoi ALT (alanin transaminaze) i AST (aspartat transaminaze) u plazmi su izmereni i rezultati su prikazani u Tabeli ispod izraženi u IU/L. ISIS oligonukleotidi koji uzrokuju promene u nivoima bilo kog markera funkcije jetre izvan očekivanog opsega za antisens oligonukleotide su isključeni iz daljih studija.

Tabela 68

Funkcija bubrega

[0354] Da bi se ispitao efekat ISIS oligonukleotida na funkciju bubrega, nivoi u plazmi azota uree u krvi (BUN) i kreatinina su izmereni korišećenjem automatskog kliničkog hemijskog analizatora (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). Rezultati su prikazani u Tabeli u tekstu ispod, izraženi u mg/dL. ISIS oligonukleotidi koji uzrokuju promene u nivoima bilo kog markera funkcije bubrega izvan očekivanog opsega za antisens oligonukleotide su isključeni iz daljih studija.

1

Tabela 69

Tabela 70

Težine

[0355] Merenja telesne težine su sprovedena u danu 39. Težine jetre, srca, slezine i bubrega su izmereni na kraju studije u danu 42, i prikazani su u Tabeli u tekstu ispod. ISIS oligonukleotidi koji uzrokuju bilo koje promene u težinama organa izvan očekivanog opsega za antisens oligonukleotide su isključeni iz daljih studija.

Tabela 71

1

Studija 6 (sa MOE gapmerima, Dezoksi, MOE i cEt oligonukleotidima, i cEt gapmerima)

[0356] Mužjaci Sprague-Dawley pacova, starosti devet do deset nedelja, su održavani na 12-časovnom ciklusu svetla/mraka sa ishranom tipa ad libitum sa Purina normal prehranom za pacove, 5001. Grupe od 4 pacova svaki su subkutano ubrizgani jednom nedeljno tokom 6 nedelja sa 100 mg/kg dezoksi, MOE gapmerima ili sa 50 mg/kg dezoksi, MOE i cEt oligonuklotid ili cEt gapmer. Jedna kontrolna grupa od 4 pacova je svaka subkutano ubrizgana jednom nedeljno tokom 6 nedelja sa PBS. Četrdeset osam časova nakon poslednje doze, pacovi su eutanazovani i organi i plazma su sakupljeni za dalju analizu.

Funkcija jetre

[0357] Da bi se ispitao efekat ISIS oligonukleotida na funkciju jetre, nivoi transaminaza su izmereni u danu 42 korišćenjem automatskog kliničkog hemijskog analizatora (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). Nivoi ALT (alanin transaminaze) i AST (aspartat transaminaze) u plazmi su izmereni i rezultati su prikazani u Tabeli ispod izraženi u IU/L.

Tabela 72

1

Funkcija bubrega

[0358] Da bi se procenio efekat ISIS oligonukleotida na funkciju bubrega, nivoi ukupnih proteina u urinu i kreatinina su mereni korišćenjem automatskog kliničkog hemijskog analizatora (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). Rezultati su prikazani u Tabeli ispod. ISIS oligonukleotidi koji uzrokuju promene u nivoima u bilo kojim markerima funkcije bubrega izvan očekivanog opsega za antisens oligonukleotide su isključeni u daljim ispitivanjima.

Tabela 73

1

Težine

[0359] Merenja telesne težine su sprovedena u danu 39. Težine jetre, srca, slezine i bubrega su izmereni na kraju studije u danu 42, i prikazani su u Tabeli u tekstu ispod. Rezulati za težine organa su izraženi kao odnos prema telesnim težinama i normalizovani su sa odnosom za PBS kontrolu.

Tabela 74

Primer 14: Efikasnost antisens oligonukleotida prema CFB iRNK u hCFB transgenim miševima

[0360] Izabrana jedinjenja su ispitana za efikasnost u humanim CFB transgenim miševima, liniji osnivača #6. Humani CFB gen se nalazi na hromozomu 6: položaj 31913721- 31919861. Fozmid (ABC14-50933200C23) koji sadrži CFB sekvencu je izabran da se dobiju transgeni miševi koji eksprimiraju humani CFB gen. Cla I (31926612) i Age I (31926815) restrikcioni enzimi su korišćeni da se dobije fragment 22,127 bp koji sadrži CFB gen za ubrigavanje u pronukleus. DNK je potvrđena analizom restrikcionog enzima upotrebom Pvu I. DNK fragment 22,127 bp je ubrizgan u C57BL/6Ntac embrione. Gajeno je 6 pozitivnih osnivača. Osnivač #6 ispoljava humanu CFB iRNK u jetri i vrši se unakrsno ukrštanje sa 3-om generacijom. Potomstvo od 3 generacije miševa je korišćeno za ispitivanje humanih CFB ASOs za smanjenje humane iRNK za CFB.

Tretman

[0361] Grupe od 3 miševa svaka su subkutano ubrizgani dva puta nedeljno za prvu nedelju sa 50 mg/kg ISIS oligonukeotida, nakon čega sledi doziranje jednom nedeljno sa 50 mg/kg ISIS oligonukleotida za dodatne tri nedelje. Jedna kontrolna grupa od 4 miševa je subkutano injecirana dva puta nedeljno tokom 2 nedelje za prvu nedelju sa PBS za prvu nedelju za dodatne tri nedelje. Četrdeset osam časova nakon poslednje doze, miševi su eutanizovani i organi i plazma su sakupljeni za dallju analizu.

RNK analiza

[0362] Na kraju perioda doziranja, RNK je ekstrahovana iz jetre i bubrega za PCR analizu nivoa CFB iRNK u realnom vremenu. Nivoi humane CFB iRNK su izmereni korišćenjem seta proba humanog prajmera RTS3459. Nivoi CFB iRNK su normalizovani prema RIBOGREEN®, i takođe prema genima čuvarkućama (eng. „housekeeping gene“), Ciklofilin. Rezultati su izračunati kao procenat inhibicije ekspresije CFB

2

iRNK u poređenju sa kontrolom. Svi antisens oligonukleotidi su uticali na inibiciju nivoa humane CFB iRNK u jetri.

Tabela 75

Primer 15: In vivo antisens inhibicija mišjeg CFB

[0363] Nekoliko antisens oligonukleotida su dizajnirani tako da su usmereni prema mišjoj CFB iRNK (GENBANK Accession No. NM_008198.2, ovde uključena pod SEQ ID NO: 5). Ciljna start mesta i sekvence svakog oligonukleotida su opisani u tabeli u tekstu ispod. Himerni antiens oligonukleotidi u tabeli u tekstu ispod su dizajnirani sa 5-10-5 MOE gapmerima. Gapmeri imaju 20 nukleozida u dužini, gde centralni segment razmaka se sastoji od 102’-Dezoksinukleozida i ograničen je sa obe strane (u pravcima 5’ i 3’) sa „krilima“ gde svako sadrži 5 nukleozida. Svaki nukleozid u 5’ segmentu „krila“ i svaki nukleozid u 3’ segmentu „krila“ ima 2’-MOE modifikaciju. Internukleozidne veze kroz svaki gapmer su fosforotioatne veze (P=S). Svi ostaci citozina kroz svaki gapmer su 5-metilcitozini.

Tabela 76

2 1

Tretman

[0364] Grupe od četiri C57BL/6 miševa svaka su ubrizgane sa 50 mg/kg ISIS 516269, ISIS 516272, ISIS 516323, ISIS 516330, ili ISIS 516341 su ordinirane nedeljno tokom 3 nedelje. Kontrolna grupa miševa je ubrizgana sa fosfatnim fiziološkim rastvorom (PBS) ordiniranim nedeljno tokom 3 nedelje.

Analiza CFB RNK

[0365] Na kraju studije, RNK je ekstrahovana iz tkiva jetre za PCR analizu CFB u realnom vremenu, upotrebom seta proba prajmera RTS3430 (prednja sekvenca GGGCAAACAGCAATTTGTGA, ovde naznačena sa SEQ ID NO: 816; reverzna sekvenca TGGCTACCCACCTTCCTTGT, ovde naznačena sa SEQ ID NO: 817; sekvenca probe CTGGATACTGTCCCAATCCCGGTATTCCX, ovde naznačena sa SEQ ID NO: 818). Nivoi iRNK su normalizovani korišćenjem RIBOGREEN ®. Kao što je prikazano u Tabeli u tekstu ispod, neki od antisens oligonukleotida postižu smanjenje CFB u odnosu na PBS kontrolu. Rezultati su prikazani kao procenat inhibicije od CFB, u odnosu na kontrolu.

Tabela 77

Analiza proteina

[0366] Nivoi CFB proteina su mereni u bubregu, jetri, plazmi, i u oku korišćenjem western blot postupka upotrebom kozjeg anti-CFB antitela (Sigma Aldrich). Rezultati su prikazani kao procenat inhibicije CFB, u odnosu na PBS kontrolu. ’n/a’ ukazuje na to da za taj uzorka merenja nisu izvršena. Kao što je prikazano u Tabeli u tekstu ispod, antisens inhibicija CFB od strane ISIS oligonukleotida dovodi do smanjenja CFB proteina u različitim tkivima. Kao što je prikazano u Tabeli u tekstu ispod, sistemsko ordiniranje ISIS oligonukleotida je efikasno u smanjivanju nivoa CFB u oku.

Tabela 78

2 2

Primer 16: Dozno zavisna antisens inhibicija mišjeg CFB

[0367] Grupama od četiri C57BL/6 miševa su svakom ubrizgani 25 mg/kg, 50 mg/kg, ili 100 mg/kg ISIS 516272, i ISIS 516323 ordiniran nedeljno tokom 6 nedelja. Druge dve grupe miševa su ubrizgane sa 100 mg/kg ISIS 516330 ili ISIS 516341 koji je ordiniran nedeljno tokom 6 nedelja. Dve kontrolne grupe miševa su ubrizgane sa fosfatnim puferom (PBS) koji je ordiniran nedeljno tokom 6 nedelja.

Analiza CFB RNK

[0368] RNK je ekstrahovana ili tkiva jetre ili bubrega za analizu CFB PCR-om u realnom vremenu, korišćenjem seta probe prajmera RTS3430. Nivoi iRNK su normalizovani korišenjem RIBOGREEN®. Kao što je prikazano u Tabeli u tekstu ispod, antisens oligonukleotidi koji su posigli dozno-zavisno smanjenje mišjeg CFB u odnosu na PBS kontrolu. Rezultati su prikazani kao procenat inhibicije CFB, u odnosu na kontrolu.

Tabela 79

Analiza proteina

[0369] Nivoi CFB proteina su mereni u plazmi korišćenjem western Blot upotrebom kozjeg anti-CFB antitela (Sigma Aldrich). Kao što je prikazano u Tabeli u tekstu ispod, antisens inhibicija CFB od strane ISIS oligonukleotida dovodi do smanjenja u CFB proteinu. Rezultati su prikazani kao procenat inhibicije CFB, u odnosu na PBS kontrolu. ’n/a’ ukazuje na to da merenja nisu sprovedena za taj uzorak.

[0370] Nivoi CFB proteina su takođe izmereni u oku sa Western Blot-om. Sve grupe koje se ispituju pokazuju inhibiciju CFB za 95%, sa nekim merenjima uzorka koji su ispod nivoa detekcije testa.

2

Tabela 80

Primer 17: Efekat antisens inhibicije CFB u NZB/W F1 mišjem modelu

[0371] NZB/W F1 je najstariji klasični model lupusa, u kome miševi razvijaju ozbiljne lupusu-slične fenotipove koji su uporedivi sa lupusom pacijenta (Theofilopoulos, A.N. and Dixon, F.J. Advances in Immunology, vol. 37, pp. 269-390, 1985). Ovi lupusu slični fenotipovi ukljčuju limfadenopatiju, splenomegaliju, povećana antinuklearna autoantitela u serumu (ANA) uključujući anti-dsDNK IgG, od kojih su većina IgG2a i IgG3, i glomerulonefritis koji je posredovan imunskim kompleksom (GN) koji ostaje očigledan u 5-6 meseci starosti, koji dovodi do prestanka rada bubrega i smrti u starosti od 10-12 meseci.

Studija 1

[0372] Studija je izvedena da se pokaže da tretman sa antisens oligonukleotidima koji ciljaju CFB će unaprediti patologiju bubrega u mišjem modelu. Ženke NZB/W F1 miševa, 17 nedelja stare, su kupljene od Jackson Laboratories. Grupe od 16 miševa su svaka primile doze od 100 µg/kg/nedeljno ISIS 516272 ili ISIS 516323 tokom 20 nedelja. Druga grupa od 16 miševa je primila doze od 100 µg/kg/nedeljno kontrolnog oligonukleotida ISIS 141923 tokom 20 nedelja. Druga grupa od 10 miševa je primila doze PBS tokom 20 nedelja i služi kao kontrolna grupa sa kojom se sve druge grupe porede. Terminalne krajnje tačke su sakupljene 48 sati nakon ubrigavanja poslednje doze.

CFB RNK Analiza

[0373] RNK je ekstrahovana iz tkiva jetre i bubrega za analizu CFB PCR-om u realnom vremenu, upotrebom seta probe prajmera RTS3430. Nivoi iRNK u normalizovani upotrebom RIBOGREEN®. Kao što je pokazano u Tabeli u tekstu ispod, neki od antisens oligonukleotida su postigli smanjenje u mišjem CFB u odnosu na PBS kontrolu. Rezultati su prikazani kao procenat inhibicije CFB, u odnosu na kontrolu.

2 4

Tabela 81

Proteinurija

[0374] Proteinurija je očekivana kod 60% životinja u ovom mišjem modelu. Kumulativna učestalost teške proteinurije je izmerena računanjem odnosa ukupnog proteina prema kreatininu upotrebom kliničkog analizatora. Rezultati su prikazani u Tabeli u tekstu ispod i pokazuju da tretman sa antisens oligonukleotidima koji ciljaju CFB postiže smanjenje proteinurije kod miševa u poređenju sa PBS kontrolom i miševima koji su tretirani sa kontrolnim oligonukleotidom.

Tabela 82

Preživljavanje

[0375] Preživljavanje miševa je praćeno brojanjem miševa na početku tretmana i nakon toga ponovo u nedelji 20. Rezultati su prikazani u tabeli u tekstu ispod i pokazuju da tretman sa antisens oligonukleotidima koji ciljaju CFB povećava preživljavanje kod miševa u poređenju sa PBS kontrolom i miševima koji su tretirani sa kontrolnim oligonukleotidima.

Tabela 83

Depozicija u glomerulima

[0376] Količina taloženja C3, kao i taloženja IgG, u glomerulima bubrega je merena imunohistohemijski sa anti-C3 antitelom. Rezultati su prikazani u tabeli u tekstu ispod i pokazuju da tretman sa antiens oligonukleotidima koji ciljaju CFB postiže smanjenje oba taloženja C3 i IgG u glomerulima bubrega u poređenju sa PBS kontrolom i miševima koji su tretirani sa kontrolnim oligonukleotidom.

2

Tabela 84

Studija 2

[0377] Ženke NZB/W F1 miševa, 16 nedelja starosti, su kupljene od Jackson Laboratories. Grupa od 10 miševa je primila doze od 100 µg/kg/nedelji od ISIS 516323 za 12 nedelja. Druga grupa od 10 mišev aje primila doze 100 µg/kg/nedelji kontrolnog oligonukleotida ISIS 141923 tokom 12 nedelja. Druga grupa od 10 miševa je primila doze PBS tokom 12 nedelja i služila je kao kontrolna grupa sa kojom se porede sve druge grupe. Terminalne krajnje tačke se sakupljaju 48 sati nakon ubrigavanja posle poslednje doze.

Analiza CFB RNK

[0378] RNK je ekstrahovana iz tkiva jetre i bubrega za PCR analizu CFB u realnom vremenu, korišćnjem sete probe prajmera RTS3430. Kao što je prikazano u tabeli ispod, tretmanom sa ISIS 516323 se postiže smanjenje CFB preko PBS kontrole. Rezultati su prikazani kao procenat inhibicije CFB, u odnosu na kontrolu.

Tabela 85

Proteinurija

[0379] Kumulativno pojavljivanje teške proteinurije je ispitano merenjem odnosa ukupnih proteina prema kreatininu u urinu, kao i merenjem ukupnih nivoa mikroalbumuna. Rezultati su prikazani u tabelama u tekstu ispod i pokazuju da tretman sa antisens oligonukleotidima koji ciljaju CFB smanjuje proteinuriju kod miševa u poređenju sa PBS kontrolom i miševima koji su tretirani sa kontrolnim oligonukleotidom.

Tabela 86

2

Tabela 87

Preživljavanje

[0380] Preživljavanje miševa je praćeno brojanjem miševa na početku tretmana i nakon toga ponovo u nedelji 12. Rezultati su prikazani u tabeli u tekstu ispod i pokazuju da tretman sa antisens oligonukleotidima koji ciljaju CFB povećavaju preživljavanje kod miševa u poređenju sa PBS kontrolom i miševima koji su tretirani sa kontrolnim oligonukleotidom.

Tabela 88

Primer 18: Efekat antisens inhibicije CFB u MRL mišjem modelu

[0381] MRL/lpr lupus nefritis mišji model razvija SLE-sličan fenotip koji se karakteriše limfadenopatijom zbog nakupljanja dvostruko negativnih (CD4- CD8-) i B220+ T-ćelija. Ovi miševi ispoljavaju pojačanu stopu smrtnosti. Pored toga, miševi imaju visoke koncentracije imunoglobulina u krvotoku, što uključuje povećane nivoe autoantitela kao što su ANA, anti-ssDNK, anti-dsDNK, anti-Sm, i reumatoidnih faktora, što za rezultat ima obrazovanje velikih količina imunskih kompleksa (Andrews, B. et al., J. Exp. Med.148: 1198-1215, 1978).

Lečenje

[0382] Studija je sprovedena da bi se ispitalo da li tretman sa antisens oligonukleotidima koji ciljaju CFB može da dovede do reverzije patologije bubrega u mišjem modelu. Ženke MRL/lpr miševa, 14 nedelja starosti, su kupljene od Jackson Laboratories. Grupa od 10 miševa je primila doze 50 µg/kg/nedelji ISIS 516323 tokom 7 nedelja. Druga grupa koja sadrži 10 miševa je primila doze od 50 µg/kg/nedelji kontrolnog oligonukleotida ISIS 141923 tokom 7 nedelja. Druga grupa koja sadrži 10 miševa je primila doze PBS tokom 7 nedelja i služi kao kontrolna grupa sa kojom su poređene sve druge grupe. Terminalne krajnje tačke su sakupljene 48 časova nakon što je ubrizgana poslednja doza.

CFB RNK Analiza

[0383] RNK je ekstrahovana iz tkiva jetre za analizu CBF PCR-om u realnom vremenu, korišćenjem seta proba prajmera RTS3430. Kao što je prikazano u tabeli u tekstu ispod, ISIS 516323 smanjuje CFB u odnosu na PBS kontrolu. Rezultati su prikazani kao procenat inhibicije CFB, u odnosu na kontrolu.

2

Tabela 89

Patologija bubrega

[0384] Patologija bubrega je procenjena upotrebom dva postupka. Histološki preseci bubrega su obojeni sa Hematoksilinom & Eozinom. PBS kontrola je pokazala prisustvo multiglomerularnih srpastih cevastih segmenata, što predstavlja sindrom glomeruloskleroze. Suprotno tome, preseci iz miševa koji su tretirani sa ISIS 516323 pokazuju odsustvo crescents tubular casts sa minimalnim fibroznim promenama bowman-ove kapsule, umerenog do ozbiljno segmentalnog proširenja mezangijalne ćelije i zadebljanja glomerularne bazalne mebrane.

[0385] Nakupljanje C3 u bubregu je takođe ispitano imunohistohemijski sa anti-C3 antitelima. Rezultat intenziteta ukupne C3 imunohistohemije je izračunato korišćenjem sistema bodovanja intenziteta, koji je obračunat hvatanjem 10 glomerula po bubregu i računanjem intenziteta pozitivnog bojenja C3. Rezultati su prikazani u tabeli u tekstu ispod i pokazuju da tretman sa ISIS 516323 smanjuje nakupljanje C3 u bubregu u poređenju sa kontrolim grupama.

Tabela 90

Nivoi C3 u plazmi

[0386] Smanjenje CFB inhibira aktivaciju alternativnog puta komplementa, pri čemu sprečava potrošnju C3 i dovodi do značajnog povećanja nivoa C3 u plazmi. Nivoi C3 u plazmi iz terminalnog krvarenja su mereni kliničkim analizatorom. Rezultati su prikazani u tabeli ispod i pokazuju da tretman sa ISIS 516323 povećava nivoe C3 (p< 0.001) u plazmi u poređenju sa kontrolnim grupama.

Tabela 91

2

Rezultati ukazuju na to da tretman sa antisens oligonukleotidima koji ciljaju CFB dovodi do reverzije patologije bubrega u mišjem modelu lupusa.

Primer 19: Efekat antisens inhibicije CFB u CFH Het mišjem modelu

[0387] CFH heterozigotni (CFH Het, CFH+/-) mišji model eksprimira mutirani protein Faktor H zajedno sa mišjim proteinom pune dužine (Pickering, M.C. et al., J. Exp. Med.2007.204: 1249-56). Histologija bubrega kod ovih miševa ostaje normalna do šest meseci starosti.

Studija 1

[0388] Grupe 8 CFH+/- miševa, starosti 6 nedelja, su svaki primili doze 75 mg/kg/nedelji ISIS 516323 ili ISIS 516341 tokom 6 nedelja. Druga grupa od 8 miševa je primila doze 75 mg/kg/nedelji kontrolnog oligonukleotida ISIS 141923 tokom 6 nedelja. Druga grupa od 8 miševa je primila doze PBS tokom 6 nedelja i služi kao kontrolna grupa sa kojom su poređene ostale grupe. Terminalne krajnje tačke su sakupljene 48 sati nakon ubrizgavanja poslednje doze.

Analiza CFB RNK

[0389] RNK je ekstrahovana iz tkiva jetre i bubrega analizu CFB PCR-om u realnom vremenu, upotrebom seta proba prajmera RTS3430. Kao što je prikazano u Tabeli u tekstu ispod, antisens oligonukleotidi smanjuju CFB u odnosu na PBS kontrolu. Rezultati su prikazani kao procenat inibicije CFB, u odnosu na kontrolu.

Tabela 92

Nivoi C3 u plazmi

[0390] Redukcija CFB inhibira aktivaciju alternativnog puta komplementa, pri čemu sprečava C3 potrošnju i dovodi do očiglednog povećanja u nivoima C3 u plazmi. Nivoi C3 u plazmi iz terminalnog sakupljanja plazme su mereni korišenjem kliničkog analizatora. Rezultati su prikazani u tabeli u tekstu ispod i pokazuju da tretman sa ISIS 516323 povećava C3 do normalnih nivoa u plazmi.

Tabela 93

2

Studija 2

[0391] Grupe 5 CFH+/- miševa svaka su primile 12.5 mg/kg/nedeljno, 25 mg/kg/nedeljno, 50 mg/kg/nedeljno, 75 mg/kg/nedeljno, ili 100 mg/kg/nedeljno od ISIS 516323 ili ISIS 516341 tokom 6 nedelja. Druga grupa od 5 miševa je primila doze od 75 µg/kg/nedeljno kontrolnog oligonukleotida ISIS 141923 tokom 6 nedelja. Druga grupa od 5 miševa koja je primila doze PBS tokom 6 nedelja i služila je kao kontrolna grupa sa kojom se druge grupe porede. Terminalne krajnje tačke su sakupljene 48 sati nakon što je ubrizgana poslednja doza.

Analiza CFB RNK

[0392] RNK je ekstrahovana iz tkiva jetre i bubrega za analizu PCR u realnom vremenu CFB, upotrebom seta probe prajmera RTS3430. Kao što je prikazano u Tabeli u tekstu ispod, antisens oligonukleotidi smanjuju CFB u skladu sa PBS kontrolom na dozno zavisan način. Rezultati su prikazani kao procenat inhibicije CFB, u odnosu na kontrolu.

Tabela 94

Nivoi C3 u plazmi

[0393] Smanjenje CFB inhibira aktivaciju alternaivnog puta komplementa, sprečava potrošnju C3 i dovodi do očiglednog povećenja nivoa C3 u plazmi. Nivoi C3 u plazmi iz terminalnog sakupljanja plazme su mereni upotrebom kliničkog analizatora. Rezultati su prikazani u tabeli u tekstu ispod i prikazuju da tretman sa ISIS oligonukleotidima koji ciljaju CFB povećava nivoe C3 u plazmi.

21

Tabela 95

Primer 20: Efekat ISIS antisens oligonukleotida koji ciljaju humani CFB kod makaki majmuna

[0394] Makaki majmuni su tretirani sa ISIS antisens oligonukleotidima koji su izabrani iz studija koje se opisuju u Primerima gore u tekstu. Ispitani su efikasnost i podnošljivost antisens oligonukleotida, kao i njihov farmakokinetički profil u jetri i bubregu.

[0395] U vreme kada je ova studija spovedena, genomska sekvenca makaki majmuna nije bila dostupna u bazi podataka National Center for Biotechnology Information (NCBI); prema tome unakrsna reaktivnost sa sekvencom gena makaki majmuna nije mogla da bude potvrđena. Umesto toga, sekvence ISIS antisens oligonukleotida koje se koriste kod makaki majmuna su poređene sa sekvencom rezus majmuna za homologiju. Humani antisens oligonukleotidi koji se ispituju u tekstu ispod su unakrsno reaktivni (sa 0 ili 1 pogrešno sparenih baza) sa rezus genomskom sekvencom (GENBANK pristupni br. NW _001116486.1 prekinuo od nukleotida 536000 do 545000, ovde naznačeno sa SEQ ID NO: 3). Start i stop mesta svakog nukleotida koji je umeren prema SEQ ID NO: 3 je prikazan u tabeli u tekstu ispod. "Start mesto" ukazuje na 5’-ciljni nukleotid prema kom je gapmer usmeren u genskoj sekvenci rezus majmuna. Pogrešna sparivanja’ ukazuje na broj nukleobaza u humanom oligonukleotidu koji su pogrešeno spareni sa rezus genomskom sekvencom.

Tabela 96

Lečenje

[0396] Pre ispitivanja, majmuni su držani u karantinu u periodu od najmanje 30 dana, tokom kojeg su životinje svakodnevno posmatrane za opšte zdravlje. Majmuni su starosti 2-4 godine i imali su težinu između 2 i 4 kg. Jedanaest grupa 4-6 slučajno dodeljenih mužjaka makaki majmuna su svaki primili subkutanu injekciju ISIS oligonukleotida ili PBS na četiri mesta na leđima u rotaciji u smeru kazaljke na satu (tj. levo, gore, desno, i na dnu), jedno mesto po dozi. Majmunima su date četiri početne doze od PBS ili 40 mg/kg ISIS 532800, ISIS 532809, ISIS 588540, ISIS 588544, ISIS 588548, ISIS 588550, ISIS 588553, ISIS 588555, ISIS 588848, ili ISIS 594430 za prvu nedelju (dani 1, 3, 5, i 7), i zatim su dozirani jednom nedeljno tokom 12 nedelja (dani 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63, 70, 77, i 84) sa PBS ili 40 mg/kg ISIS oligonukleotidom. ISIS 532770 je ispitan u odvojenoj studiji sa sličnim uslovima sa dva mužjaka i dve ženke makaki majmuna u grupi.

Smanjenje cilja u jetri

RNK analiza

[0397] U danu 86, uzorci jetre i bubrega su sakupljeni u duplikatu (približno 250 mg svaki) za analizu CFB iRNK. Uzorci su brzo zamrznuti u tečnom azotu na nekropsiji u približno 10 minuta žrtvovanja.

[0398] RNA je ekstrahovana iz jetre i bubrega za analizu PCR-a u realnom vremenu merenja ekspresije iRNK koja kodira za CFB. Rezultati su prikazani kao procenat inhibicije iRNK, u odnosu na PBS kontrolu, normalizovano sa RIBOGREEN®. Nivoi RNK u takođe normalizovani sa „house-keeping“ genom, ciklofilinom A. Nivoi RNK su izmereni sa setovima proba prajmera RTS3459, koje su gore opisane, ili RTS4445_MGB (prednja sekvenca CGAAGAAGCTCAGTGAAATCAA, ovde naznačena sa SEQ ID NO: 819; reverzna sekvenca TGCCTGGAGGGCCCTCTT, ovde naznačena sa SEQ ID NO: 820; sekvenca probe AGACCACAAGTTGAAGTC, ovde naznačena sa SEQ ID NO: 815).

[0399] Kao što je prikazano u Tabelama u tekstu ispod, tretman sa ISIS antisens oligonukleotidima dovodi do redukcije CFB iRNK u poređenju sa PBS kontrolom. Analiza nivoa CFB iRNK je otkrila da nekoliko od ISIS oligonukleotida smanjuju CFB nivoe u jetri i/ili bubregu. Ovde ’0’ ukazuje da nivoi ekspresije nisu inhibirani. ’*’ ukazuje da je oligonukleotid testiran u odvojenoj studiji sa sličnim uslovima.

Tabela 97

Tabela 98

Analiza proteina

[0400] Približno 1 mL krvi je sakupljeno iz svih dostupnih životinja u danu 85 i preneti su u epruvete koje sadrže kalijumovu so EDTA. Uzorci krvi su odmah postavljeni na vlažni led ili Kryorack, i centrifugirani (3000 oum za 10 min na 4°C) da bi se dobila plazma (približno 0.4 mL) tokom 60 minuta sakupljanja. Nivoi CFB u plazmi su izmereni u plazmi korišćenjem radijalne imunodifuzije (RID), upootrebom poliklonskog anti-Factor B antitela. Rezultati su predstavljeni u Tabeli u tekstu ispod. ISIS 532770 je ispitan u odvojenoj studiji i nivoi proteina u plazmi su izmereni u danu 91 ili 92 u toj grupi.

21

[0401] Analiza CFB u plazmi je otkrila da nekoliko ISIS oligonukleotida smanjuje nivoe proteina sa odloženim načinom. ISIS 532770, koji je ispitan u odvojenoj studiji, smanjeni nivoi CFB proteina u danu 91/92 za 50% u poređenju sa vrednostima osnovnog nivoa. Smanjenje nivoa CFB proteina u plazmi se je u dobroj korelaciji sa smanjenjem nivoa CFB iRNK u jetri u odgovarajućoj grupi životinja.

Tabela 99

Ispitivanja podnošljivosti

Merenja telesne težine

[0402] Da bi se procenio efekat ISIS oligonukleotida na sveukupno zdravlje životinja, merene su težine teća i organa i prikazane su u Tabeli u tekstu ispod. ’*’ ukazuje da je oligonukleotid ispitan u odvojenoj studiji sa sličnim uslovima i predstavlja srednju vrednost merenja mužjaka i ženki majmuna. Rezultati ukazuju na to da je efekat tretmana sa antisens oligonukleotidima na težine tela i organa je bio u okviru očekivanog opsega za antisens oligonukleotide.

Tabela 100

Tabela 101

Funkcija jetre

[0403] Da bi se procenio efekat ISIS oligonukleotida na funkciju jetre, uzorci krvi su sakupljeni iz svih testiranih grupa. Krvni uzorci su sakupljeni iz cefaličnih, safenoznih, ili femoralnih vena, 48 sati posledoziranja. Majmuni su držani gladni preko noći pre uzorkovanja krvi. Krv (1.5 mL) je sakupljena u epruvetama bez antikoagulanta za razdvajanje seruma. Epruvete su držane na sobnoj temperaturi minimum 90 minuta nakon čega su centrifugirane (približno 3,000 oum za 10 min) da bi se dobio serum. Nivoi različitih markera koji određuju funkciju jetre su izmereni upotrebom Toshiba 200FR NEO hemijskog analizatora (Toshiba Co., Japan).

[0404] Izmereni su nivoi ALT i AST u plazmi i rezultati su prikazani u Tabeli u tekstu ispod, koji su izraženi u IU/L. Bilirubin, marker funkcije jetre, je na sličan način izmeren i prikazan u Tabeli u tekstu ispod izražen u mg/dL. ’*’ ukazuje da je oligonukleotid ispitan u odvojenoj studiji sa sličnim uslovima i predstavlja srednju vrednost merenja za mužjake i ženke majmuna. Rezultati ukazuje da većina antisens oligonukleotida nije imao efekat na funkciju jetre van očekivanog opsega za antisens oligonukleotide.

21

Tabela 102

Funkcija bubrega

[0405] Da bi se ispitao efekat ISIS oligonukleotida na funkciju bubrega, uzorci krvi su skupljeni iz svih testiranih grupa. Uzorci krvi su sakupljeni iz cefaličnih, safenoznih, ili femoralnih vena, 48 sati posledoziranja. Majmuni su držani gladni preko noći pre uzorkovanja krvi. Krv je sakupljena u epruvetama bez antikoagulanta za razdvajanje seruma. Epruvete su držane na sobnoj temperaturi minimum 90 minuta i zatim su centrifugirane (približno 3,000 oum za 10 min) da bi se dobio serum. Nivoi BUN i kreatinina su izmereni upotrebom Toshiba 200FR NEO hemijskog analizatora (Toshiba Co., Japan). Rezultati su prikazani u Tabeli u tekstu ispod, izraženo u mg/dL. ’*’ ukazuje da je oligonukleotid ispitan u odvojenoj studiji sa sličnim uslovima i predstavlja srednju vrednost merenja za mužjake i ženke majmuna.

[0406] Za analizu urina, svež urin iz svih životinja je sakupljen ujutru upotrebom čistog dna kaveza na vlažnom ledu. Hrana je uklonjena preko noći dana pre sakupljanja urina ali je voda dostavljena. Uzorci urina (približno 1 mL) su analizirani za odnos proteina prema kreatininu (P/C) upotrebom Toshiba 200FR NEO automatskog hemijskog analizatora (Toshiba Co., Japan). ’n.d.’ ukazuje da nivo proteina u urinu je bio ispod nivoa detekcije analizatora.

[0407] Hemijski podaci plazme i urina ukazuju da većina ISIS oligonukleotida nije imala bilo koji efekat na funkciju bubrega izvan očekivanog opsega za antisens oligonukleotida.

21

Tabela 103

Tabela 104

21 Hematologija

[0408] Da bi se ispitao bilo koji efekat ISIS oligonukleotida kod makaki majmuna na hematološke parametre, uzorci krvi od približno 0.5 mL krvi su sakupljeni iz svake od dostupnih životinja koje se ispituju u epruvetama koje sadrže K2-EDTA. Uzorci su analizirani za broj crvenih krvnih zrnaca (RBC), broj belih krvnih ćelija (WBC), brojevi individualnih belih ćelija, kao što su monociti, neutrofili, limfociti, kao i za broj krvnih pločica, sadržaj hemoglobina i hematokrita, upotrebom ADVIA120 hematološkog analizatora (Bayer, USA). Podaci su prikazani u Tabelama u tekstu ispod. ’*’ ukazuje da je oligonukleotid ispitan u odvojenoj studiji sa sličnim uslovima i predstavlja srednju vrednsot merenja iz mužjaka i ženki majmuna.

[0409] Podaci ukazuju da oligonukleotidi nisu uzrokovali bilo koje promene u hematološkim parametrima koji su izvan očekivanih parametara za antisens oligonukleotide na ovoj dozi.

Tabela 105

21

Tabela 106

Merenje koncentracije oligonukleotida

[0410] Koncentracija oligonukleotida pune dužine je izmerena u tkivima bubrega i jetre. Postupak koji je korišćen u modifikaciji prethodno objavljenih postupaka (Leeds et al., 1996; Geary et al., 1999) koji se sastoji iz ekstrakcije fenolhloroformom (tečna-tečna) nakon čega sledi ekstrakcija na čvrstoj fazi. Koncentracije uzoraka tkiva su izračunate upotrebom kalibracionih kriva, sa nižom granicom za kvantifikaciju (LLOQ) od približno 1.14 µg/g. Rezultati su prikazani u Tabeli u tekstu ispod, izraženi sa µg/g jetre ili bubrega tkiva.

Tabela 107

21

22

22

22

22

22

22

22

2

21

22

�

��

�

2

�

�

�

��

24

��

��

24

24

24

2

21

22

2

24

2

2

2

2

2

2

21

22

2

24

2

2

2

2

2

2

21

22

2

24

2

2

2

2

2

2

21

22

2

24

2

2

2

2

2

2

21

22

2

24

2

2

2

2

2

1

2

4

1

11

12

1

14

1

1

1

1

1

2

21

22

2

24

2

2

2

2

2

1

2

4

4

41

42

4

44

4

4

4

4

4

1

2

4

1

2

4

1

2

4

1

2

4

1

2

4

4

41

42

4

44

4

4

4

4

4

41

41

41

41

41

41

41

42

42

42

42

42

42

42

4

41

42

4

44

4

4

4

4

4

44

44

44

44

44

44

44

4

41

42

4

44

4

4

4

4

4

4

41

42

4

44

4

4

4

4

4

4

Claims (12)

1. Patentni zahtevi 1. Jedinjenje koje obuhvata modifikovani oligonukleotid koji se sastoji iz 20 vezanih nukleozida koji imaju nukleobaznu sekvencu koja obuhvata sekvencu koja je navedena u SEQ ID NO: 440, 198, 228, 237, 444, 448, 450, 453, ili 455, pri čemu modifikovani oligonukleotid obuhvata: segment razmaka koji se sastoji iz deset vezanih dezoksinukleozida; 5’ segment „krila“ koji se sastoji iz pet vezanih nukleozida; i 3’ segment „krila“ koji se sastoji iz pet vezanih nukleozida; pri čemu se segment razmaka nalazi između 5’ segmenta „krila“ i 3’ segmenta „krila“, pri čemu svaki nukleozid iz svakog segmenta „krila“ obuhvata 2’-O-metoksietil šećer; pri čemu svaka internukleozidna veza je fosforotioatna veza i pri čemu svaki citozin je 5-metilcitozin.
2. 2. Jedinjenje prema zahtevu 1, pri čemu se modifikovani oligonukleotid sastoji iz 20 vezanih nukleozida koji imaju nukleobaznu sekvencu koja se sastoji iz sekvence koja je navedena u SEQ ID NO: 440, pri čemu modifikovani oligonukleotid obuhvata: segment razmaka koji se sastoji iz deset vezanih dezoksinukleozida; 5’ segment „krila“ koji se sastoji iz pet vezanih nukleozida; i 3’ segment „krila“ koji se sastoji iz pet vezanih nukleozida; pri čemu se segment razmaka nalazi između 5’ segmenta „krila“ i 3’ segmenta „krila“, pri čemu svaki nukleozid iz svakog segmenta „krila“ obuhvata 2’-O-metoksietil šećer; pri čemu svaka internukleozidna veza je fosforotioatna veza i pri čemu svaki citozin je 5-metilcitozin.
3. 3. Jedinjenje koje ima formulu:

   ili njegova farmaceutski prihvatljiva so.
4. 4. Jedinjenje koje obuhvata modifikovani oligonukleotid koji se sastoji iz 16 vezanih nukleozida koji imaju nukleobaznu sekvencu koja se sastoji iz sekvence koja je navedena u SEQ ID NO: 598, pri čemu modifikovani oligonukleotid obuhvata: segment razmaka koji se sastoji iz deset vezanih dezoksinukleozida; 5’ segment „krila“ koji se sastoji iz tri vezana nukleozida; i 3’ segment „krila“ koji se sastoji iz tri vezana nukleozida; pri čemu se segment razmaka nalazi između 5’ segmenta „krila“ i 3’ segmenta„krila“; pri čemu 5’ segment „krila“ obuhvata 2’-O-metoksietil šećer, 2’-O-metoksietil šećer, i cEt šećer u 5’ do 3’ smeru; pri čemu 3’ segment „krila“ obuhvata cEt šećer, cEt šećer, i 2’-O-metoksietil šećer u 5’ do 3’ smeru; pri čemu svaka internukleozidna veza je fosforotioatna veza; i pri čemu svaki citozin je 5-metilcitozin.
5. 5. Jedinjenje koje obuhvata modifikovani oligonukleotid koji se sastoji iz 16 vezanih nukleozida koji imaju nukleobaznu sekvencu koja obuhvata sekvencu koja je navedena u SEQ ID NO: 549, pri čemu modifikovani oligonukleotid obuhvata: segment razmaka koji se sastoji iz deset vezanih dezoksinukleozida; 5’ segment „krila“ koji se sastoji iz tri vezana nukleozida; i 3’ segment „krila“ koji se sastoji iz tri vezana nukleozida; pri čemu se segment razmaka nalazi između 5’ segmenta „krila“ i 3’ segmenta„krila“; pri čemu svaki nukleozid iz svakog segmenta „krila“ obuhvata cEt šećer; pri čemu svaka internukleozidna veza je fosforotioatna veza; i pri čemu svaki citozin je 5-metilcitozin.
6. 6. Jedinjenje prema bilo kom od zahteva 1 do 5, pri čemu se jedinjenje sastoji iz modifikovanog oligonukleotida.
7. 7. Jedinjenje prema bilo kom od zahteva 1 do 6, pri čemu modifikovani oligonukleotid dalje obuhvata konjugovanu grupu.
8. 8. Kompozicija koja obuhvata jedinjenje prema bilo kom od zahteva 1 do 7 i farmaceutski prihvatljivi nosač.
9. 9. Jedinjenje prema bilo kom od zahteva 1 do 7, ili kompozicija prema zahtevu 8, za upotrebu u lečenju, prevenciji, ili ublažavanju bolesti koja je povezana sa disregulacijom alternativnog puta komplementa.
10. 10. Jedinjenje ili kompozicija za upotrebu prema zahtevu 9, pri čemu je alternativni put komplementa aktiviran više od normalnog.
11. 11. Jedinjenje ili kompozicija za upotrebu prema zahtevu 9, pri čemu je bolest makularna degeneracija, starosna makularna degeneracija (AMD), vlažna AMD, suva AMD, ili geografska atrofija.
12. 12. Jedinjenje ili kompozicija za upotrebu prema zahtevu 9, pri čemu je bolest, bolest bubrega, lupus nefritis, sistemski lupus eritematozus (SLE), bolest gustih depozita (DDD), C3 glomerulonefritis (C3GN), CFHR5 nefropatija, ili atipični hemolitički uremijski sindrom (aHUS). Izdaje i štampa: Zavod za intelektualnu svojinu, Beograd, Kneginje Ljubice 5 4