RS59880B1

RS59880B1 - Formulacije za anti-pdl1 antitelo

Info

Publication number: RS59880B1
Application number: RS20200089A
Authority: RS
Inventors: Ying Yang; Sreedhara Alavattam
Original assignee: Hoffmann La Roche
Priority date: 2013-09-27
Filing date: 2014-09-26
Publication date: 2020-03-31
Also published as: TW201936209A; CL2016000680A1; EP3049441A1; NZ719036A; MX2016003939A; US10875922B2; HRP20200102T1; CN105793288B; IL270165B; WO2015048520A1; EP4285928A2; CA2925310C; AU2022235627A1; US20250145717A1; PH12016500566A1; AU2014324703A1; JP2016533335A; AU2020203267A1; TWI660738B; PL3049441T3

Description

OPIS

OBLAST PRONALASKA

Ovaj pronalazak se odnosi na stabilne vodene farmaceutske formulacije koje sadrže anti-PDL1 antitela.

OSNOVA PRONALASKA

Davanje dva različita signala T-ćelijama je široko prihvaćen model za aktiviranje limfocita mirujućih T limfocita od strane ćelija koje predstavljaju antigen (APC). Lafferty i sar., Aust. J. Exp. Biol. Med. ScL 53: 27-42 (1975). Ovaj model dalje predviđa diskriminaciju svojstvene od nesvojstvene i imunološke tolerancije. Bretscher i sar., Science 169: 1042-1049 (1970); Bretscher, P.A., P.N.A.S. USA 96: 185-190 (1999); Jenkins i sar., J. Exp. Med. 165: 302-319 (1987). Primarni signal, ili signal specifičan za antigen, se prenosi putem receptora T-ćelije (TCR) nakon prepoznavanja stranog antigen peptida predstavljenog u kontekstu glavnog kompleksa histokompatibilnosti (MHC). Drugi ili kostimulativni signal se dostavlja T-ćelijama pomoću kostimulativnih molekula izraženim na ćelijama koje predstavljaju antigen (APC) i indukuju T-ćelije za pospešivanje klonalnog širenja, sekrecije citokina i efektorske funkcije. Lenschow i sar., Ann Rev. Immunol. 14: 233 (1996). U odsustvu kostimulacije, T-ćelije mogu postati otporne na stimulaciju antigenom, ne postavljaju efikasan imunski odgovor i dalje mogu dovesti do iscrpljenosti ili tolerancije prema stranim antigenima.

U modelu sa dva signala, T-ćelije primaju i pozitivne i negativne sekundarne kostimulativne signale. Regulacija takvih pozitivnih i negativnih signala je kritična za dobijanje maksimalnih zaštitnih imunskih odgovora domaćina, uz održavanje imune tolerancije i sprečavanje autoimunosti. Negativni sekundarni signali se čine potrebnim za indukciju tolerancije T-ćelije, dok pozitivni signali podstiču aktiviranje T-ćelija. Dok jednostavan model sa dva signala još uvek daje valjano objašnjenje za nezrele limfocite, imunski odgovor domaćina je dinamički proces, a i kostimulativni signali se mogu obezbediti T-ćelijama koje su izložene antigenu. Mehanizam kostimulacije je od terapeutskog značaja jer se pokazalo da manipulacija kostimulacionim signalima omogućava povećanje ili ukidanje imunskog odgovora zasnovanog na ćeliji. Nedavno je otkriveno da se T-ćelijska disfunkcija ili anergija istovremeno javlja sa indukovanim i produženim ispoljavanjem inhibicionog receptora, programirane ćelijske smrti polipeptida 1 (PD-1). Kao rezultat toga, terapeutsko ciljanje PD-1 i drugih molekula čiji signal preko interakcija sa PD-1, kao što su programirana ćelijska smrt ligand 1 (PD-L1) i programirana ćelijska smrt ligand 2 (PD-L2), predstavlja područje od velikog značaja.

PD-L1 je prekomerno izražen kod mnogih karcinoma i često je povezan sa lošom prognozom (Okazaki T i sar., Intern. Immun. 200719(7):813) (Thompson RH i sar., Cancer Res 2006, 66(7):3381). Zanimljivo je da većina T-limfocita infiltriranih u tumorskom tkivu uglavnom ispoljava PD-1, za razliku od T-limfocita u normalnim tkivima i T-limfocitima u perifernoj krvi, što ukazuje da povišena regulacija PD-1 na tumorski reaktivnim T-ćelijama može doprineti oslabljenim antitumorskim imunskim odgovorima (Blood 2009, 114(8): 1537). To može biti posledica iskorišćavanja signalizacije PD-L1 posredovane ispoljavanjem PD-L1 tumorskih ćelija koje međusobno deluju sa T-ćelijama koje ispoljavaju PD-1, što dovodi do slabljenja aktivacije T ćelije i izbegavanja imunskog nadzora (Sharpe i sar., Nat Rev 2002) (Keir ME i sar., 2008 Annu. Rev. Immunol. 26:677). Stoga, inhibicija interakcije PD-L1/PD-1 može poboljšati ubijanje tumora posredovano CD8 T ćelijom.

Terapeutsko ciljanje PD-1 i drugih molekula čiji signal preko interakcija sa PD-1, kao što su programirana ćelijska smrt ligand 1 (PD-L1) i programirana ćelijska smrt ligand 2 (PD-L2), predstavlja područje od velikog značaja. Inhibicija signala PD-L1 je predložena kao sredstvo za jačanje imunosti T-ćelije za lečenje kancera (npr. imunost tumora) i infekcije, uključujući akutnu i hroničnu (npr. trajno prisutnu) infekciju. Međutim, kako na tom putu optimalna terapija usmerena na cilj još nije komercijalizovana, postoji značajna nezadovoljena medicinska potreba. WO2013/019906 otkriva anti-PD-L1 antitela. WO2013/093809 otkriva sastav koji sadrži do 20 mg/ml antitela, natrijum acetata i polisorbata 80 pri pH vrednosti od oko 5 do 6.

SAŽETAK PRONALASKA

Ovde su date stabilne vodene farmaceutske formulacije koje sadrže antitelo. Formulacija sadrži anti-PDL1 monoklonsko antitelo u koncentraciji od 40 mg/ml do 125 mg/ml, histidin acetat ili natrijum acetat u koncentraciji od 15 mM do 25 mM, saharozu u koncentraciji od 60 mM do 240 mM, polisorbat u koncentraciji od 0,005% (w/v) do 0,06% (w/v), i pH 5,0 do 6,3; naznačenu time da monoklonsko antitelo sadrži varijabilni region jednog lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:7 i varijabilni region jednog teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO.:32; i naznačenu time da je pomenuto monoklonsko antitelo humanizovano IgG1 antitelo.

U nekim realizacijama, monoklonsko antitelo u formulaciji iznosi 40 mg/ml do 80 mg/ml. U nekim realizacijama, monoklonsko antitelo u formulaciji iznosi 54 mg/ml do 66 mg/ml. U nekim realizacijama, monoklonsko antitelo u formulaciji iznosi 60 mg/ml. U nekim realizacijama, monoklonsko antitelo u formulaciji iznosi 60 mg/ml do 125 mg/ml. U nekim realizacijama, monoklonsko antitelo u formulaciji iznosi 125 mg/ml.

U nekim realizacijama, navedeni histidin acetat ili natrijum acetat u formulaciji ima koncentraciju od 17 mM do 22 mM. U nekim realizacijama, navedeni histidin acetat ili natrijum acetat u formulaciji ima koncentraciju od 20 mM.

U nekim realizacijama, navedena saharoza u formulaciji iznosi 60 mM do 180 mM. U nekim realizacijama, navedena saharoza u formulaciji iznosi 120 mM. U nekim realizacijama, navedena saharoza u formulaciji iznosi 240 mM.

U nekim realizacijama, formulacija ima pH vrednost od 5,5 do 6,1. U nekim realizacijama, formulacija ima pH vrednost 5,5 ili 5,8.

U nekim realizacijama, navedeni polisorbat u formulaciji je polisorbat 20. U nekim realizacijama, navedeni polisorbat (npr. polisorbat 20) u formulaciji iznosi od 0,02% do 0,04%.

U nekim realizacijama, navedeno monoklonsko antitelo u formulaciji iznosi 60 mg/ml, saharoza u formulaciji iznosi 120 mM, a pH vrednost je 5,8. U nekim realizacijama, navedeno monoklonsko antitelo u formulaciji iznosi 125 mg/ml, saharoza u formulaciji iznosi 240 mM, a pH vrednost je 5,5.

U nekim realizacijama, formulacija sadrži ovde opisano anti-PDL1 antitelo u količini od 60 mg/ml, histidin acetat u koncentraciji od 20 mM, saharozu u koncentraciji od 120 mM, i polisorbat koji je polisorbat 20 u koncentraciji od 0,04% (w/v), a formulacija ima pH vrednost 5,8.

U nekim realizacijama, formulacija sadrži navedeno monoklonsko antitelo u količini od 125 mg/ml, histidin acetat u koncentraciji od 20 mM, saharozu u koncentraciji od 240 mM, i polisorbat koji je polisorbat 20 u koncentraciji od 0,02%, a formulacija ima pH vrednost 5,5.

U nekim realizacijama, navedeno monoklonsko antitelo u formulaciji nije podložno prethodnoj liofilizaciji.

U nekim realizacijama predmetnog pronalaska, navedeno monoklonsko antitelo u formulaciji sadrži

(a) varijabilni region jednog lakog lanca koji sadrži:

(b) varijabilni region jednog teškog lanca koji sadrži:

(1) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO.:4); (2) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO.:5);

(3) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO.:6). U nekim realizacijama, navedeno monoklonsko antitelo u formulaciji sadrži varijabilni region jednog lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO.:7, i varijabilni region jednog teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO.:32. U nekim realizacijama, navedeno monoklonsko antitelo u formulaciji sadrži jedan laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO.:9, i jedan teški koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO.: 10.

U nekim realizacijama, formulacija koja sadrži antitelo se čuva u staklenoj bočici ili posudi od metalne legure. U nekim realizacijama, metalna legura je nerđajući čelik 316L ili hastelloy. U nekim realizacijama, formulacija je stabilna na temperaturi od 2-8°C tokom najmanje 6 meseci, najmanje 12 meseci, najmanje 18 meseci ili najmanje 24 meseca. U nekim realizacijama, antitelo u formulaciji zadržava, nakon skladištenja, najmanje oko 75%, najmanje oko 80%, najmanje oko 85%, najmanje oko 90% biološke aktivnosti pre skladištenja. U nekim realizacijama, biološka aktivnost se meri vezivanjem antitela na PD-L1.

U nekim realizacijama, ovde opisana formulacija je sterilna. U nekim realizacijama, ovde opisana formulacija je pogodna za primenu na subjektu. U nekim realizacijama, ovde opisana formulacija je za intravensku (IV) primenu.

U drugom aspektu, ovde je obezbeđen proizvod ili komplet koji sadrži posudu u kojoj se drži neka od iznad i ovde opisanih stabilnih vodenih farmaceutskih formulacija. U nekim realizacijama, posuda je staklena bočica ili posuda od metalne legure. U nekim realizacijama, metalna legura je nerđajući čelik 316L ili hastelloy.

U drugom aspektu, ovde je otkriven postupak lečenja bolesti ili poremećaja kod subjekta koji obuhvata davanje subjektu efektivne količine ovde opisane formulacije, pri čemu je bolest ili poremećaj izabran iz grupe koja se sastoji od infekcije, karcinoma i inflamatorne bolesti.

KRATAK OPIS SLIKA SL. 1 predstavlja niz grafikona koji prikazuju statističku analizu podataka o stabilnosti formulacija za α-PDL1 na 40°C pomoću ICIEF-a koristeći JMP softver. A) Prosečni gubitak stope glavnog vrha iz frakcionog faktorskog dizajna eksperimenata (DOE).

B) Analiza glavnog vrha iz frakcionog faktorskog DOE-a. Glavni vrh sadrži nabojne vrste α-PDL1 iste pH vrednosti kao i pi (izoelektrična tačka) molekula.

SL. 2 predstavlja niz grafikona koji prikazuju statističku analizu podataka o stabilnosti formulacija za α-PDL1 na 25°C pomoću ICIEF-a koristeći JMP softver. A) Prosečni gubitak stope glavnog vrha iz frakcionog faktorskog dizajna eksperimenata (DOE).

SL. 3 predstavlja niz grafikona koji prikazuju statističku analizu podataka o stabilnosti formulacija za α-PDL1 na 40°C pomoću SE-HPLC-a koristeći JMP softver. A) Prosečni gubitak stope glavnog vrha iz frakcionog faktorskog dizajna eksperimenata (DOE).

B) Analiza glavnog vrha iz frakcionog faktorskog DOE-a. Glavni vrh sadrži α-PDL1 monomer.

SL. 4 predstavlja niz grafikona koji prikazuju statističku analizu podataka o stabilnosti formulacija za α-PDL1 na 25°C pomoću SE-HPLC-a koristeći JMP softver. A) Prosečni gubitak stope glavnog vrha iz frakcionog faktorskog dizajna eksperimenata (DOE).

SL. 5 predstavlja grafikon koji prikazuje nedostatak značajne razgradnje PS20 u različitim formulacija za α-PDL1 uskladištenih na različitim temperaturama i vremenu. Grafikon procenta (%) PS20 koji ostaje u formulaciji detektovan pomoću evaporativnog detektora rasipanja svetlosti (ELSD) u formulacijama od F1 do F10. a je nulto vreme (T0); b je 40°C, 1M; c je 25°C, 2M; d je 5°C, 2M; e je 5°C, 6M; f je 5°C, 6M, staklena bočica od 20 cc (GV), visoko punjenje; i g je 5°C, 6M, staklena bočica od 20cc (GV), nisko punjenje.

SL. 6 predstavlja niz grafikona koji prikazuju stabilnost formulacija za α-PDL1 čuvanim na - 20°C ili 5°C do 6 meseci u staklenoj bočici (GV). A) Grafikon procenta (%) monomera u formulacijama nakon pet ciklusa zamrzavanja i odmrzavanja tokom skladištenja na -20°C određeno vreme. B) Grafikon procenta (%) monomera u formulacijama čuvanim na 5°C određeno vreme. C) Grafikon procenta (%) glavnog vrha dobijenog iz formulacija nakon pet ciklusa zamrzavanja i odmrzavanja tokom skladištenja na -20°C određeno vreme. D) Grafikon procenta (%) glavnog vrha dobijenog iz formulacija čuvanim na 5°C određeno vreme.

SL. 7 predstavlja niz grafikona koji prikazuju stabilnost formulacije za α-PDL1 nakon tri ciklusa zamrzavanja i odmrzavanja i skladištenja u maloj limenki od nerđajućeg čelika ili hastelloy. A) Grafikon procenta (%) monomera u formulaciji nakon skladištenja na naznačenoj temperaturi tokom 3 meseca. B) Grafikon procenta (%) glavnog vrha u formulaciji nakon skladištenja na naznačenoj temperaturi tokom 3 meseca.

SL. 8 predstavlja niz grafikona koji prikazuju stabilnost skladištenja formulacije za α-PDL1 u bočici od 20 cc. A) Grafikon procenta (%) monomera u formulaciji nakon skladištenja na naznačenoj temperaturi tokom 3 meseca. B) Grafikon procenta (%) glavnog vrha u formulaciji nakon skladištenja na naznačenoj temperaturi tokom 3 meseca.

SL. 9 predstavlja niz grafikona koji prikazuju stabilnost formulacija za α-PDL1 koje sadrže različite koncentracije PS20 kada se mešaju u staklenim bočicama. A) Grafikon procenta (%) monomera u formulacijama nakon mešanja tokom naznačenog vremena na sobnoj temperaturi. B) Grafikon zamućenja izmeren apsorbancijom na 350 nm nakon mešanja tokom naznačenog vremena na sobnoj temperaturi.

SL. 10 predstavlja grafikon koji prikazuje stabilnost formulacija za α-PDL1 čuvanih u staklenim bočicama tokom određenog vremena na navedenim temperaturama, a zatim podvrgnutih mešanju. Procentna promena monomera u formulacijama je izmerena po SEC-u.

SL. 11 predstavlja niz grafikona koji prikazuju uporedivost stope gubitka α-PDL1 nedeljno sa povećanjem pH vrednosti. A) Grafikon procenta (%) gubitka monomera nedeljno u formulaciji nakon skladištenja na 40°C. B) Grafikon procenta (%) gubitka glavnog vrha nedeljno u formulaciji nakon skladištenja na 40°C.

DETALJAN OPIS

I. Definicije.

Pre detaljnog opisivanja pronalaska treba razumeti da ovaj pronalazak nije ograničen na posebne kompozicije ili biološke sisteme, koji mogu, naravno, varirati. Takođe, treba razumeti da ovde korišćena terminologija služi samo u svrhu opisivanja određenih realizacija i nema za cilj da bude ograničavajuća. Kako se koristi u ovoj specifikaciji i u priloženim patentnim zahtevima, oblici u jednini uključuju i množinu, osim ako kontekst izričito ne nalaže drugačije. Tako, na primer, upotreba reči „molekul“ opcionalno uključuje kombinaciju dva ili više takva molekula i slično.

Termin „oko“ koji se ovde koristi odnosi se na uobičajeni opseg grešaka za odgovarajuću vrednost lako poznatu stručnjaku u ovom tehničkom području. Upotreba reči „oko” za vrednosti ili parametre u ovom dokumentu obuhvata (i opisuje) realizacije koje se odnose na tu vrednost ili parametar.

Podrazumeva se da aspekti i realizacije pronalaska koji su ovde opisani, obuhvataju „sadrže“, „sastoje se” i „sastoje se u suštini od” aspekata i realizacija.

Termin „farmaceutska formulacija” odnosi se na preparat koji je u takvom obliku da omogućava efikasnu biološku aktivnost aktivnog sastojka i koji ne sadrži dodatne komponente koje su neprihvatljivo toksične za ispitanika na kome će formulacija biti primenjena. Takve formulacije su sterilne. „Farmaceutski prihvatljivi“ pomoćni sastojci (sredstva, aditivi) su oni koji se mogu razumno davati predmetnom sisaru kako bi se dobila efikasna doza upotrebljenog aktivnog sastojka.

„Sterilna“ formulacija je aseptična ili oslobođena, odnosno suštinski oslobođena prisustva svih živih mikroorganizama i njihovih spora.

„Zamrznuta“ formulacija je ona koja se nalazi na temperaturi ispod 0°C. Generalno, zamrznuta formulacija nije liofilizovana, niti je podvrgnuta ranijoj ili naknadnoj liofilizaciji. U određenim realizacijama, zamrznuta formulacija sadrži zamrznutu supstancu leka za skladištenje (u rezervoaru od nerđajućeg čelika) ili zamrznuti lek (u konačnoj konfiguraciji bočice).

„Stabilna“ formulacija je ona u kojoj protein u njoj zadržava fizičku stabilnost i/ili hemijsku stabilnost i/ili biološku aktivnost nakon skladištenja. Poželjno je da formulacija suštinski zadrži svoju fizičku i hemijsku stabilnost, kao i svoju biološku aktivnost nakon skladištenja. Period skladištenja se obično bira na osnovu predviđenog roka trajanja formulacije. U ovoj oblasti su dostupne razne analitičke tehnike za merenje stabilnosti proteina, a prikazane su, na primer, u Peptide and Protein Drug Delivery, 247-301, Vincent Lee Ed., Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., Pubs. (1991) i Jones, A. Adv. Drug Delivery Rev. 10: 29-90 (1993). Stabilnost može biti merena na odabranoj temperaturi tokom odabranog vremenskog perioda. Stabilnost se može kvalitativno i/ili kvantitativno proceniti na različite načine, uključujući procenu stvaranja agregata (na primer, pomoću hromatografije na bazi isključenja po veličini, merenjem zamućenosti i/ili vizuelnim pregledom); procenom heterogenosti naboja korišćenjem hromatografije pomoću katjonskih izmenjivača, kapilarnog izoelektričnog fokusiranja (icIEF) ili elektroforeze kapilarne zone; analizom aminoterminalne ili karboksi-terminalne sekvence; masenom spektrometrijskom analizom; SDS-PAGE analizom radi poređenja redukovanih i netaknutih antitela; analizom peptidne mape (na primer triptičke ili LYS-C); procenom biološke aktivnosti ili funkcije vezivanja antigena antitela; itd. Nestabilnost može uključivati bilo koju ili više: agregacija, deamidacija (npr. deamidacija Asn), oksidacija (npr. Met oksidacija), izomerizacija (npr. izomerizacija Asp), isečka/hidrolize/fragmentacije (npr. fragmentacija regiona zgloba), formiranje sukcinimida, neuparen cistein(e), proširenje N-terminala, obrada C-terminala, razlike glikozilacije, itd.

Protein „zadržava svoju fizičku stabilnost“ u farmaceutskoj formulaciji ako ne pokazuje nikakve znakove ili pokazuje vrlo malu agregaciju, taloženje i/ili denaturaciju nakon vizuelnog pregleda boje i/ili bistrine, ili mereno UV zračenjem ili hromatografijom na bazi isključenja po veličini.

Protein „zadržava svoju hemijsku stabilnost“ u farmaceutskoj formulaciji, ako je hemijska stabilnost u određenom trenutku takva da razmatrani protein i dalje zadržava svoju biološku aktivnost, kao što je u nastavku definisano. Hemijska stabilnost može da se proceni otkrivanjem i kvantifikacijom hemijski izmenjenih oblika proteina. Hemijska promena može da uključi izmenu veličine (npr. odsecanje) koja se može proceniti, na primer, hromatografijom na bazi isključenja po veličini, SDS-PAGE i/ili jonizacijom matricom potpomognute laserske resorpcije/vremenske masene spektrometrije (MALDI/TOF MS). Ostale vrste hemijskih promena uključuju promene naboja (npr. koje nastaju kao rezultat deamidacije) koje se mogu proceniti, na primer, hromatografijom pomoću jonskih izmenjivača ili icIEF-om.

Antitelo "zadržava svoju biološku aktivnost" u farmaceutskoj formulaciji, ako biološka aktivnost antitela u određenom trenutku iznosi najmanje oko 60% (u okviru grešaka testa) biološke aktivnosti koja je bila prikazana u vreme kada je farmaceutska formulacija bila pripremljena, kao što je utvrđeno u testu (npr. test vezivanja antigena). Ostali testovi „biološke aktivnosti“ za antitela su detaljnije izloženi u nastavku dokumenta.

U smislu ovog dokumenta, „biološka aktivnost“ monoklonskog antitela se odnosi na sposobnost vezivanja antitela sa antigenom, a za rezultat ima merljivi biološki odgovor koji se može izmeriti in vitro ili in vivo.

„Deamidovano" monoklonsko antitelo je ono u kome je jedan ili više njegovih ostataka asparagina zamenjen, npr. u asparaginsku kiselinu ili izo-asparaginsku kiselinu.

Ovde je „oksidisano“ monoklonsko antitelo ono u kome je jedan ili više ostataka triptofana i/ili jedan ili više njegovih metionina oksidisano.

Ovde je „glikovano“ monoklonsko antitelo ono u kojem je jedan ili više ostataka lizina glikovano.

Antitelo koje je „podložno deamidizaciji“ je ono koje sadrži jedan ili više ostataka, za koje je utvrđeno da su skloni deamidizaciji.

Antitelo koje je „podložno oksidaciji“ je ono koje sadrži jedan ili više ostataka, za koje je utvrđeno da su skloni oksidaciji.

Antitelo koje je „podložno agregaciji“ je ono za koje je utvrđeno da agregira s drugim molekulom(ima) antitela, posebno nakon zamrzavanja i/ili mešanja.

Antitelo koje je „podložno fragmentaciji“ je ono za koje je utvrđeno da se cepa na dva ili više fragmenata, na primer, u regionu zgloba.

„Smanjivanjem deamidacije, oksidacije, agregacije ili fragmentacije“ se nastoji sprečiti ili smanjiti iznos deamidacije, oksidacije, agregacije ili fragmentacije u odnosu na monoklonsko antitelo formulisano u drugoj formulaciji.

Antitelo koje je formulisano je poželjno suštinski čisto i poželjno suštinski homogeno (tj. bez kontaminirajućih proteina). „Suštinski čisto“ antitelo označava sastav koji sadrži najmanje oko 90% masenog udela antitela, na osnovu ukupne mase proteina, poželjno najmanje oko 95% masenog udela. „Suštinski homogeno“ antitelo označava sastav koji sadrži najmanje oko 99% masenog udela antitela, na osnovu ukupne mase proteina u sastavu.

Pod „izotoničnim“ se podrazumeva da formulacija od interesa u osnovi ima isti osmotski pritisak kao i ljudska krv. Izotonične formulacije obično imaju osmotski pritisak od oko 250 do 350 mOsm. Izotoničnost se može meriti, na primer, osmometrom tipa pritiska pare ili zamrzavanja.

U smislu ovog dokumenta, „pufer“ se odnosi na puferisani rastvor koji odoleva promenama pH vrednosti delovanjem njegovih kiselinsko-baznih komponenti konjugata. Pufer ovog predmetnog pronalaska poželjno ima pH vrednost u opsegu od oko 4,5 do oko 7,0, poželjno od oko 5,6 do oko 7,0, na primer od 5,6 do 6,9, 5,7 do 6,8, 5,8 do 6,7, 5,9 do 6,6, 5,9 do 6,5, 6,0, od 6,0 do 6.4, ili 6,1 do 6,3. U jednoj realizaciji pufer ima pH vrednost 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6,0, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, ili 7,0. Na primer, natrijum fosfat je primer pufera koji će kontrolisati pH vrednost u ovom opsegu.

U smislu ovog dokumenta, „surfaktant“ se odnosi na površinski aktivni agens, poželjno nejonski površinski aktivni agens. Primeri surfaktanata ovde uključuju polisorbat (na primer, polisorbat 20 i polisorbat 80); poloksamer (npr. poloksamer 188); triton; natrijum dodecil sulfat (SDS); natrijum lauril sulfat; natrijum oktil glikozid; lauril-, miristil-, linoleilili stearil-sulfobetain; lauril-, miristil-, linoleil- ili stearil-sarkozin; linoleil-, miristil- ili cetilbetain; lauroamidopropil-, kokamidopropil-, linoleamidopropil-, miristamidopropil-, palidoidopropil- ili izostearamidopropil-betain (npr. lauroamidopropil); miristamidopropil-, palmidopropil- ili izostearamidopropil-dimetilamin; natrijum metil kokoil- ili dinatrijum metil oleil-taurat; i serije MONAQUAT™ (Mona Industries, Inc., Paterson, NJ); polietil glikol, polipropil glikol i kopolimeri etilen i propilen glikola (npr. Pluronics, PF68, itd.); itd. U jednoj realizaciji, surfaktant je ovde polisorbat 20.

U farmakološkom smislu, u kontekstu ovog pronalaska, „terapeutski efikasna količina“ antitela se odnosi na količinu koja je efikasna u prevenciji ili lečenju poremećaja za tretmane čije je antitelo efikasno. „Poremećaj“ je svako stanje koje bi imalo koristi od lečenja antitelom. To uključuje hronične i akutne poremećaje i bolesti, uključujući ona patološka stanja koja predstavljaju predispoziciju sisara za odgovarajući poremećaj.

„Konzervans“ je jedinjenje koje se po izboru može uključiti u formulaciju kako bi se

1

suštinski smanjilo delovanje bakterija u njemu, na taj način olakšala, na primer, proizvodnja višenamenske formulacije. Primeri mogućih konzervansa uključuju oktadecilldimetilbenzil amonijum hlorid, heksametonijum hlorid, benzalkonijum hlorid (mešavina alkilbenzildimetilamonijum hlorida u kojoj su alkilne grupe dugolančana jedinjenja) i benzetonijum hlorid. Ostale vrste konzervansa uključuju aromatske alkohole poput fenol, butil i benzil alkohola, alkil parabene poput metil ili propil parabena, katehola, resorcinola, cikloheksanola, 3-pentanola i m-krezola. U jednoj realizaciji, konzervans ovde je benzil alkohol.

U smislu ovog dokumenta, termin „lečenje“ se odnosi na kliničku intervenciju namenjenu promeni prirodnog toka pojedinca ili ćelije koja se leči tokom kliničke patologije. Poželjni efekti lečenja uključuju smanjenje brzine napredovanja bolesti, poboljšanje ili ublažavanje bolesnog stanja i remisiju ili poboljšanu prognozu. Na primer, pojedinac se uspješno „leči“ ako se jedan ili više simptoma povezanih sa karcinom ublaži ili eliminiše, uključujući, ali ne ograničavajući se na smanjenje proliferacije (ili uništavanje) ćelija karcinoma, smanjenje simptoma kao rezultat bolesti, povećanje kvaliteta života obolelih, smanjenje doze drugih lekova potrebnih za lečenje bolesti, odlaganje napredovanja bolesti i/ili produženje života pojedinaca.

U smislu ovog dokumenta, „odlaganje napredovanja bolesti” podrazumeva odgađanje, ometanje, usporavanje, nazadovanje, stabilizaciju i/ili prolongiranje razvoja bolesti (kao što je kancer). Ovo odlaganje može biti različitog trajanja, u zavisnosti od istorije bolesti i/ili pojedinca koji se leči. Kao što je očigledno stručnjaku u ovoj oblasti, dovoljno ili značajno odlaganje može, u suštini, obuhvatiti prevenciju, u tom smislu što se kod pojedinca ne razvija bolest. Na primer, kasna faza kancera, kao što je razvoj metastaza, može biti odložena.

„Efikasna količina“ je najmanje minimalna količina potrebna da izazove merljivo poboljšanje ili prevenciju konkretnog poremećaja. Efikasna količina iz ovog dokumenta može varirati u skladu sa faktorima kao što su stanje bolesti, starost, pol i težina pacijenta, kao i sposobnosti antitela da izazove željeni odgovor kod pojedinca. Efikasna količina je takođe ona pri kojoj su bilo koji toksični ili štetni uticaji lečenja manje važni u odnosu na terapeutski korisna dejstva. Za profilaktičku upotrebu, korisni ili željeni rezultati uključuju rezultate kao što su: eliminisanje ili smanjenje rizika, smanjenje ozbiljnosti ili odlaganje početka bolesti, uključujući biohemijske, histološke i/ili bihejvioralne simptome bolesti, njene komplikacije i posredne patološke fenotipove koji se javljaju tokom razvoja bolesti. Za terapeutsku upotrebu, korisni ili željeni rezultati uključuju kliničke rezultate, kao što su: smanjenje jednog ili više simptoma koji su rezultat bolesti, povećanje kvaliteta života onih koji pate od bolesti, smanjenje doze drugih lekova potrebnih za lečenje bolesti, pojačavanje dejstva drugih lekova, kao putem ciljanja, odlaganje napredovanja bolesti i/ili produžetak preživljavanja. U slučaju kancera ili tumora, efikasna količina leka može redukovati broj ćelija kancera; smanjiti veličinu tumora; inhibirati (tj. do izvesne mere usporiti ili, poželjno, zaustaviti) infiltraciju ćelija kancera u periferne organe; inhibirati (tj. do izvesne mere usporiti ili, poželjno, zaustaviti) metastaze tumora; do izvesne mere inhibirati rast tumora; i/ili do izvesne mere ublažiti jedan ili više simptoma povezanih sa poremećajem. Efikasna količina se može dati u jednoj ili više primena. Za potrebe ovog pronalaska, efikasna količina leka, jedinjenja ili farmaceutske kompozicije predstavlja količinu dovoljnu za ostvarivanje profilaktičkog ili terapeutskog lečenja, bilo posredno ili neposredno. Kao što se podrazumeva u kliničkom kontekstu, efikasna količina leka, jedinjenja ili farmaceutske kompozicije može se ili ne može postići u kombinaciji sa drugim lekom, jedinjenjem ili farmaceutskom kompozicijom. Prema tome, „efikasna količina” se može razmotriti u kontekstu davanja jednog ili više terapeutskih agenasa, a može se razmotriti i davanje jednog agensa u efikasnoj količini ako, u kombinaciji sa jednim agensom ili više drugih agenasa, može da se postigne, ili je postignut željeni rezultat.

U smislu ovog dokumenta, „u kombinaciji sa“ se odnosi na primenu jednog načina lečenja pored drugog načina lečenja. Kao takav, „u kombinaciji sa“ se odnosi na primenu jednog načina lečenja pre, tokom ili nakon primene drugog načina lečenja kod pojedinca.

„Poremećaj“ je svako stanje koje bi imalo koristi od lečenja, uključujući, ali ne ograničavajući se na hronične i akutne poremećaje ili bolesti, uključujući i ona patološka stanja koja predstavljaju predispoziciju sisara za odgovarajući poremećaj.

Izrazi „proliferativni poremećaj ćelije” i „proliferativni poremećaj” se odnose na poremećaje koji su u vezi sa određenim stepenom abnormalne proliferacije ćelija. U jednoj realizaciji, proliferativni poremećaj ćelija je kancer. U jednoj realizaciji, poremećaj proliferacije ćelije je tumor.

Izraz „tumor”, koji se ovde koristi, se odnosi na rast i proliferaciju svih neoplastičnih ćelija, bilo malignih ili benignih, i svih prekancerogenih i kancerogenih ćelija i tkiva. Izrazi „kancer”, „kancerogeni”, „proliferativni poremećaj ćelija”, „proliferativni poremećaj” i „tumor” međusobno se ne isključuju prilikom pominjanja u ovom dokumentu.

Termini „kancer“ i „kancerogeni“ odnose se na fiziološko stanje sisara koje se tipično karakteriše neregulisanim rastom ćelija, ili ga opisuju. Primeri za kancer uključuju, ali nisu ograničeni na, karcinom, limfom, blastom, sarkom, i leukemiju ili limfoidne malignitete. Konkretniji primeri takvih karcinoma uključuju, ali se ne ograničavaju na karcinom skvamoznih ćelija (npr. skvamozne epitelne ćelije), karcinom pluća uključujući mikrocelularni karcinom pluća, nemikrocelularni karcinom pluća, adenokarcinom pluća i skvamozni karcinom pluća), karcinom peritoneuma, hepatocelularni karcinom, gastrični karcinom ili karcinom želuca uključujući gastrointestinalni karcinom i gastrointestinalni stromalni karcinom, karcinom pankreasa, glioblastom, karcinom cerviksa, karcinom jajnika, karcinom jetre, karcinom bešike, karcinom urinarnog trakta, hepatom, karcinom dojke, karcinom kolona, karcinom rektuma, kolorektalni karcinom, karcinom endometrijuma ili materice, karcinom pljuvačnih žlezda, karcinom bubrega ili renalni karcinom, karcinom prostate, karcinom vulve, tiroidni karcinom, karcinom jetre, analni karcinom, karcinom penisa, melanom, površinski šireći melanom, lentigo maligni melanom, akralni lentiginozni melanomi, nodularni melanomi, multipli mijelom i limfom B-ćelija (uključujući niskostepeni/folikularni ne-Hodžkinsov limfom (NHL); mali limfocitni (SL) NHL; srednjestepeni/folikularni NHL; difuzni NHL srednje klase; imunoblastični NHL visokog stepena; visokostepeni limfoblastični NHL; visokostepeni neprikačeni NHL male klase ; glomazna bolest NHL; limfom ćelija plašta; Limfom povezan sa AIDS; i Valdenstromova Makroglobulinemija); hronična limfocitna leukemija (CLL); akutna limfoblastična leukemija (ALL); leukemija vlasastih ćelija; hronična mijeloblastična leukemija; i posttransplantacioni limfoproliferativni poremećaj (PTLD), kao i abnormalna vaskularna proliferacija u vezi sa fakomatozama, edemom (kao oni u vezi sa tumorom mozga), Meigsovim sindromom, mozgom, kao i karcinomom glave i vrata i pridruženim metastazama. U određenim realizacijama, kanceri koji su podložni lečenju antitelima prema pronalasku uključuju rak dojke, kolorektalni karcinom, rektalni karcinom, nemikrocelularni karcinom pluća, glioblastom, ne-Hodžkinsov limfom (NHL), karcinom bubrežne ćelije, karcinom prostate, karcinom jetre, karcinom gušterače, sarkom mekog tkiva, kaposijev sarkom, karcinoidni karcinom, karcinom glave i vrata, karcinom jajnika, mezoteliom i multipli mijelom. U nekim realizacijama, karcinom je odabran između: mikrocelularnog karcinoma pluća, gliblastoma, neuroblastoma, melanoma, karcinoma dojke, gastričnog karcinoma, karcinoma debelog creva (CRC) i hepatocelularnog karcinoma. Međutim, u nekim realizacijama, karcinom je odabran između: nemikrocelularnog karcinoma pluća, karcinoma debelog crijeva, glioblastoma i karcinoma dojke, uključujući metastatske oblike tih karcinoma.

„Hemoterapeutski agens“” je hemijsko jedinjenje koje je od koristi u lečenju kancera. Primeri hemoterapeutskih agenasa uključuju alkilujuće agense, kao što je tiotepa i ciklosfosfamid (CYTOXAN<®>); alkil-sulfonate, kao što je busulfan, improsulfan i piposulfan; aziridine, kao što je benzodopa, karbokvon, meturedopa i uredopa; etilenimine i

1

metilamelamine, uključujući altretamin, trietilenmelamin, trietilenfosforamid, trietilentiofosforamid i trimetilomelamin; acetogenine (naročito bulatacin i bulatacinon); delta-9-tetrahidrokanabinol (dronabinol, MARINOL<®>); beta-lapahon; lapahol; kolhicine; betulinsku kiselinu; kamptotecin (uključujući sintetičke analoge topotekan (HYCAMTIN<®>), CPT-11 (irinotekan, CAMPTOSAR<®>), acetilkamptotecin, skopolektin i 9-aminokamptotecin); briostatin; kalistatin; CC-1065 (uključujući njegove sintetičke analoge adozelesin, karzelesin i bizelesin); podofilotoksin; podofilinsku kiselinu; tenipozid; kriptoficine (naročito kriptoficin 1 i kriptoficin 8); dolastatin; duokarmicin (uključujući sintetičke analoge, KW-2189 i CB1-TM1); eleuterobin; pankratistatin; sarkodiktin; spongistatin; azotne iperite, kao što je hlorambucil, hlornafazin, holofosfamid, estramustin, ifosfamid, mehloretamin, mehloretamin oksid hidrohlorid, melfalan, novembicin, fenesterin, prednimustin, trofosfamid, uracil iperit; nitrozouree, kao što je karmustin, hlorozotocin, fotemustin, lomustin, nimustin i ranimnustin; antibiotike, kao što su endiinski antibiotici (npr., kaliheamicin, naročito kaliheamicin gama1I i kaliheamicin omegal (pogledati, npr., Nicolaou i sar., Angew. Chem Intl. Ed. Engl., 33: 183-186 (1994)); CDP323, oralni inhibitor alfa-4 integrina; dinemicin, uključujući dinemicin A; esperamicin; kao i neokarzinostatin hromofor i srodne hromoproteinske enediin antiobiotske hromofore), aklacinomicine, aktinomicin, autramicin, azaserin, bleomicine, kaktinomicin, karabicin, karminomicin, karzinofilin, hromomicini, daktinomicin, daunorubicin, detorubicin, 6-diazo-5-okso-L-norleucin, doksorubicin (uključujući ADRIAMYCIN®, morfolino-doksorubicin, cijanomorfolino-doksorubicin, 2-pirolino-doksorubicin, doksorubicin HCl liposomsku injekciju (DOXIL®), liposomalni doksorubicin TLC D-99 (MYOCET®), pegilovani liposomalni doksorubicin (CAELYX®) i deoksidoksorubicin), epirubicin, ezorubicin, idarubicin, marcelomicin, mitomicine, kao što je mitomicin C, mikofenolnu kiselinu, nogalamicin, olivomicine, peplomicin, porfiromicin, puromicin, kvelamicin, rodorubicin, streptonigrin, streptozocin, tubercidin, ubenimeks, zinostatin, zorubicin; anti-metabolite, kao što su metotreksat, gemcitabin (GEMZAR®), tegafur (UFTORAL®), kapecitabin (XELODA®), epotilon i 5-fluorouracil (5-FU); kombretastatin, analoge folne kiseline, kao što su denopterin, metotreksat, pteropterin, trimetreksat; purinske analoge, kao što su fludarabin, 6-merkaptopurin, tiamiprin, tiogvanin; pirimidinske analoge, kao što su ancitabin, azacitidin, 6-azauridin, karmofur, citarabin, dideoksiuridin, doksifluridin, enocitabin, floksuridin; androgeni poput kalusterona, dromostanolona propionata, epitiostanola, mepitiostana, testolaktona; anti-adrenalne lekove, kao što su aminoglutetimid, mitotan, trilostan; sredstva za obnavljanje folne kiseline, kao što je frolinska kiselina; aceglaton; aldofosfamid glikozid; aminolevulinsku kiselinu; eniluracil; amsakrin; bestrabucil; bisantren; edatraksat; defofamin; demekolcin; diazikvon; elformitin; eliptinijum acetat; epotilon, etoglucid; galijum nitrat; hidroksiureu; lentinan; lonidainin; majtansinoide, kao što su majtansin i ansamitocini; mitogvazon; mitoksantron; mopidanmol; nitraerin; pentostatin; fenamet; pirarubicin; lozoksantron; 2-etilhidrazid; prokarbazin; PSK® polisaharidni kompleks (JHS Natural Products, Eugene, Oreg.); razoksan; rizoksin; sizofuran; spirogermanijum; tenuazonsku kiselinu; triazikvon; 2,2’,2"-trihlorotrietilamin; trihotecene (posebno T-2 toksin, verakurin A, roridin A i angvidin); uretan; vindesin (ELDISINE®, FILDESIN®); dakarbazin; manomustin; mitobronitol; mitolaktol; pipobroman; gacitozin; arabinozid ("Ara-C"); tiotepu; taksoid, npr., paklitaksel (TAXOL®, Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.), albuminskim-inženjeringom proizvedenu nanočestičnu formulaciju paklitaksela (ABRAXANE™) i docetaksela (TAXOTERE®, Rhome-Poulene Rorer, Antony, France); ; hloranbucil; 6-tiogvanin; merkaptopurin; metotreksat; platinska sredstva, kao što su cisplatin, oksaliplatin (npr. ELOXATIN®) i karboplatin; vinke, koji sprečavaju polimerizaciju tubulina pri formiranju mikrotubula, uključujući vinblastin (VELBAN®), vinkristin (ONCOVIN®), vindesin (ELDISINE®, FILDESIN®), i vinorelbin (NAVELBINE®); etoposid (VP-16); ifosfamid; mitoksantron; leukovorin; novantron; edatreksat; daunomicin; aminopterin: ibandronat; inhibitor topoizomeraze RFS 2000; difluorometilornitin (DMFO); retinoide, kao što su retinoinska kiselina, uključujući beksaroten (TARGRETIN®); bisfosfonate, kao što su klodronat (na primer, BONEFOS® ili OSTAC®), etidronat (DIDROCAL®), NE-58095, zoledronska kiselina/zoledronat (ZOMETA®), alendronat (FOSAMAX®), pamidronat (AREDIA®), tiludronat (SKELID®) ili risedronat (ACTONEL®); troksacitabin (analog 1,3-dioksolan nukleozid citozina); antisens oligonukleotide, posebno one koji inhibiraju ekspresiju gena na putu signalizacije, koji je uključen u proliferaciju aberantnih ćelija, kao što su, na primer, PKC-alfa, Raf, H-Ras i receptor epidermalnog faktora rasta (EGF-R); (npr. erlotinib (Tarceva™)); i VEGF-A koji smanjuje ćelijsku proliferaciju; vakcine, kao što su THERATOPE® vakcina i vakcine za gensku terapiju, na primer, ALLOVECTIN® vakcina, LEUVECTIN® vakcina i VAXID® vakcina; inhibitor topoizomeraze 1 (npr., LURTOTECAN®); rmRH (npr., ABARELIX®); BAY439006 (sorafenib; Bayer); SU-11248 (sunitinib, SUTENT®, Pfizer); perifosin, COX-2 inhibitor (npr., celekoksib ili etorikoksib), inhibitor proteosoma (npr., PS341); bortezomib (VELCADE®); CCI-779; tipifarnib (R11577); orafenib, ABT510; Bcl-2 inhibitor, kao što je oblimersen natrijum (GENASENSE®); piksantron; inhibitori EGFR-a, inhibitori tirozin kinaze; inhibitori serin-treonin kinaze, kao što je rapamicin (sirolimus, RAPAMUNE®);

1

inhibitori farnesiltransferaze kao što je lonafarnib (SCH 6636, SARASAR™); i farmaceutski prihvatljive soli, kiseline ili derivate bilo kog od prethodnih jedinjenja; kao i kombinacije dva ili više prethodnih jedinjenja, kao što su CHOP, što je skraćenica za kombinovanu terapiju ciklofosfamida, doksorubicina, vinkristina i prednizolona; i FOLFOX, što je skraćenica za režim lečenja sa oksaliplatinom (ELOXATIN™), u kombinaciji sa 5-FU i leukovorinom, i farmaceutski prihvatljivim solima, kiselinama ili derivatima bilo kog od gore navedenog; kao i kombinacije dva ili više od gore navedenih.

Hemoterapeutski agensi, prema definiciji iz ovog dokumenta, obuhvataju „antihormonske agense” ili „endokrine terapeutike” koji deluju tako što regulišu, smanjuju, blokiraju ili inhibiraju efekte hormona koji mogu pospešiti rast kancera. Oni mogu biti sami hormoni, uključujući, ali ne ograničavajući se na: antiestrogene i selektivne modulatore receptora estrogena (SERM-ovi), uključujući, na primer, tamoksifen (uključujući NOLVADEX® tamoksifen), raloksifen, droloksifen, 4-hidroksitamoksifen, trioksifen, keoksifen, LY117018, onapriston i FARESTON.cndot.toremifene; aromatazne inhibitore koji inhibiraju enzim aromatazu, koji reguliše proizvodnju estrogena u nadbubrežnoj žlezdi, kao što su, na primer, 4(5)-imidazoli, aminoglutetimid, MEGASE® megestrol acetat, AROMASIN® eksamestan, formestan, fadrozol, RIVISOR® vorozol, FEMARA® letrozol i ARIMIDEX® anastrozol; i anti-androgene poput flutamida, nilutamida, bikalutamida, leuprolida i goserelina; kao i troksacitabine (analog citozina 1,3-dioksolan nukleozid); antisens oligonukleotidi, posebno oni koji inhibiraju ekspresiju gena na putu signalizacije, koji je uključen u proliferaciju aberatnih ćelija, kao što su, na primer, PKC-alfa, Raf i H-Ras; ribozimi kao što su inhibitor ekspresije VEGF (npr. ANGIOZYME® ribozim) i inhibitor ekspresije HER2; vakcine poput vakcina za gensku terapiju, na primer, ALLOVECTIN® vakcina, LEUVECTIN® cjepivo i VAXID® vakcina; PROLEUKIN® rIL-2; LURTOTECAN® inhibitor topoizomeraze 1; ABARELIX® rmRH; vinorelbin i esperamicini (pogledajte U.S. pat. br. 4,675,187), i farmaceutski prihvatljive soli, kiseline ili derivati bilo kog od gore navedenog; kao i kombinacije dva ili više od gore navedenih.

„Sredstvo inhibicije rasta“ kada je ovde korišćeno, odnosi se na jedinjenje ili smešu koje inhibira rast ćelija, bilo in vitro ili in vivo. U jednoj realizaciji, sredstvo inhibicije rasta je antitelo koje inhibira rast koje sprečava ili smanjuje proliferaciju ćelije koja eksprimira antigen za koji se antitelo veže. U drugoj realizaciji, sredstvo inhibicije rasta može biti ono koje značajno smanjuje procenat ćelija u S fazi. Primeri sredstava inhibicije rasta obuhvataju sredstva koja blokiraju progresiju ćelijskog ciklusa (na mestu koje nije S faza), kao što su sredstva koja indukuju G1 zastoj i zastoj M-faze. Klasični blokatori M-faze uključuju vinke

1

(vinkristin i vinblastin), taksane i inhibitore topoizomeraze II, kao što su: doksorubicin, epirubicin, daunorubicin, etopozid i bleomicin. Ona sredstva koja zaustavljaju G1, isto tako, prelivaju se u zastoj S-faze, na primer, DNA alkilirajuća sredstva, kao što su: tamoksifen, prednizon, dakarbazin, mehloretamin, cisplatin, metotreksat, 5-fluorouracil i ara-C. Dalje informacije, mogu se naći u: Mendelsohn and Israel, eds., The Molecular Basis of Cancer, poglavlje 1, naslovljeno: „Cell cycle regulation, oncogenes, and antineoplastic drugs“ autora Murakami i sar. (W.B. Saunders, Philadelphia, 1995), npr., str. 13. Taksani (paklitaksel i docetaksel) su lekovi protiv kancera koji su dobijeni iz drveta tise. Docetaksel (TAXOTERE®, Rhone-Poulenc Rorer), dobijen iz evropske tise, je polusintetički analog paklitaksela (TAXOL®, Bristol-Myers Squibb). Paklitaksel i docetaksel podstiču obrazovanje mikrotubula iz dimera tubulina i stabilizuju mikrotubule sprečavanjem depolimerizacije, što rezultira inhibicijom mitoze u ćelijama.

Pod „zračnom terapijom“ se podrazumeva upotreba usmerenih gama zraka ili beta zraka kako bi se izazvalo dovoljno oštećenje na ćeliji koje će da ograniči njenu sposobnost da normalno funkcioniše ili da se potpuno uništi ćelija. Podrazumeva se da će postojati mnogo poznatih načina u struci za određivanje doze i trajanja lečenja. Tipične terapije se daju kao jednokratna primena, a tipične doze su u opsegu od 10 do 200 jedinica (greja) dnevno.

„Subjekt“ ili „pojedinac“ za potrebe lečenja se odnosi na sve životinje klasifikovane kao sisari, uključujući ljude, domaće i seoske životinje i u zoološkom vrtu, sportske ili kućne ljubimce, poput pasa, konja, mačaka, krava, itd. Poželjno je da sisar bude čovek.

Termin „antitelo" je ovde upotrebljen u najširem smislu, i specifično pokriva monoklonska antitela (uključujući monoklonska antitela pune dužine), poliklonska antitela, multispecifična antitela (npr. bispecifična antitela) i fragmente antitela, dokle god pokazuju željenu biološku aktivnost.

„Izolovano“ antitelo je ono koje je identifikovano i odvojeno i/ili se obnavlja iz komponente njegove prirodne sredine. Komponente zagađivača njegove prirodne sredine su materijali koji bi ometali istraživanje, dijagnostiku ili terapeutske upotrebe za antitelo i mogu uključivati enzime, hormone i druge proteinske ili neproteinske rastvorljive supstance. U nekim realizacijama, antitelo se prečišćava (1) do više od 95% masenog udela antitela, kao što je određeno, na primer, metodom Lovri, a u nekim realizacijama do više od 99% masenog udela; (2) do stepena koji je dovoljan da se dobije najmanje 15 ostataka N-terminala ili interne aminokiselinske sekvence korišćenjem, na primer, uređaja za sekvenciranje sa rotacionom posudom ili (3) do homogenosti pomoću SDS-PAGE u uslovima smanjenja ili nesmanjenja korišćenjem, na primer, Coomassie blue ili bojenja srebrom. Izolovano antitelo

1

obuhvata antitelo in situ u rekombinantnim ćelijama jer barem jedna komponenta prirodnog okruženja antitela neće biti prisutna. Međutim, izolovano antitelo će se obično pripremiti najmanje jednim korakom prečišćavanja.

„Nativna antitela” su obično heterotetramerni glikoproteini od oko 150.000 daltona, sastavljeni od dva identična laka (L) lanca i dva identična teška (H) lanca. Svaki laki lanac je povezan sa teškim lancem pomoću jedne kovalentne disulfidne veze, dok broj disulfidnih veza varira između teških lanaca različitih imunoglobulinskih izotipova. Svaki teški i laki lanac takođe ima pravilno razmaknute intralančane disulfidne mostove. Svaki teški lanac ima na jednom kraju varijabilni domen (VH), praćen nizom konstantnih domena. Svaki laki lanac ima varijabilni domen na jednom kraju (VL) i konstantni domen na drugom kraju; konstantni domen lakog lanca je poravnat sa prvim konstantnim domenom teškog lanca, a varijabilni domen lakog lanca je poravnat sa varijabilnim domenom teškog lanca. Veruje se da određeni aminokiselinski ostaci formiraju interfejs između varijabilnih domena lakog i teškog lanca.

Izraz „konstantni domen“ se odnosi na deo molekula imunoglobulina koji ima sačuvaniju aminokiselinsku sekvencu u odnosu na drugi deo imunoglobulina, varijabilni domen, koji sadrži mesto vezivanja antigena. Konstantni domen sadrži CH1, CH2 i CH3 domene (zajednički CH) teškog lanca i CHL (ili CL) domen lakog lanca.

„Varijabilni region“ ili „varijabilni domen“ antitela se odnosi na aminoterminalne domene teškog ili lakog lanca antitela. Varijabilni domen teškog lanca može se nazvati „VH.“. Varijabilni domen lakog lanca može se nazvati „VL. “ Ti domeni su uglavnom najpromjenjiviji delovi antitela i sadrže antigen-vezujuća mesta.

Termin „varijabla” se odnosi na činjenicu da se određeni delovi varijabilnih domena znatno razlikuju u sekvenci između antitela i koriste se za vezivanje i specifičnost svakog pojedinačnog antitela za njegov specifični antigen. Međutim, varijabilnost nije ravnomerno raspoređena po varijabilnim domenima antitela. Koncentrisana je u tri segmenta koji se nazivaju hipervarijabilni regioni (HVR-i) u varijabilnim domenima lakog i teškog lanca. Više konzervirani delovi varijabilnih domena nazivaju se okvirni regioni (FR). Svaki varijabilni domen nativnih teških i lakih lanaca obuhvata četiri FR regiona, koji u velikoj meri zauzimaju konfiguraciju beta-ravni, povezanu sa tri HVR regiona, koji formiraju petlje koje povezuju, a u nekim slučajevima i formiraju, deo konfiguracije beta-ravni. HVR regioni u svakom lancu se drže zajedno u neposrednoj blizini FR regiona, a sa HVR regionima iz drugog lanca doprinose stvaranju antigen-vezujućih mesta (videti Kabat i sar., Sequences of Proteins of Immunological Interest, peto izdanje, National Institute of Health, Bethesda, Md. (1991)). Konstantni domeni nisu direktno uključeni u vezivanje antitela antigenu, ali

1

pokazuju različite efektorske funkcije, kao što je učešće antitela u ćelijskoj citotoksičnosti zavisnoj od antitela.

„Laki lanci” antitela (imunoglobulini) iz bilo koje vrste sisara mogu se svrstati u jedan od dva jasno odvojena tipa, koji se nazivaju kapa („κ“) i lambda („λ“), na osnovu aminokiselinskih sekvenci njihovih konstantnih domena.

Termin IgG „izotip“ ili „potklasa“ kako se ovde koristi, označava bilo koju potklasu imunoglobulina definisanu hemijskim i antigenim karakteristikama njihovih konstantnih regiona.

U zavisnosti od aminokiselinske sekvence konstantnih domena njihovih teških lanaca, antitela (imunoglobulini) se mogu svrstati u različite klase. Postoji pet glavnih klasa imunoglobulina: IgA, IgD, IgE, IgG i IgM, a neke od njih mogu dalje da se dele na potklase (izotipove), npr. IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, i IgA2. Konstantni domeni teškog lanca koji odgovaraju različitim klasama imunoglobulina zovu se α, γ, ε, γ, odnosno μ. Strukture podjedinica i trodimenzionalne konfiguracije različitih klasa imunoglobulina su dobro poznate i uopšteno opisane u, na primer, Abbas i sar., Cellular i Mol. Immunology, 4. izd. (W.B. Saunders, Co., 2000). Antitelo može biti deo većeg fuzionog molekula, formiranog kovalentnom ili nekovalentnom vezom antitela sa jednim ili više drugih proteina ili peptida.

Termini „antitelo pune dužine“, „netaknuto antitelo“ i „celo antitelo“ se u ovom dokumentu naizmenično koriste za označavanje antitela u njegovom uglavnom netaknutom obliku, a ne za fragmente antitela kako je definisano u nastavku. Termini se posebno odnose na antitelo sa teškim lancima koje sadrži Fc region.

„Golo antitelo“ u ove svrhe je antitelo koje nije konjugovano sa citotoksičnim ostatkom ili radiolabelom.

„Fragmenti antitela” obuhvataju deo netaknutog antitela, poželjno sadrže njegov antigen-vezujući region. U nekim realizacijama, fragment antitela koji je ovde opisan je antigen-vezujući fragment. Primeri fragmenata antitela uključuju Fab, Fab', F(ab')2, i Fv fragmente; dijatela; linearna antitela; jednolančane molekule antitela; i multispecifična antitela nastala od fragmenata antitela.

Digestija antitela papainom dala je dva identična antigen-vezujuća fragmenta, pod nazivom „Fab” fragmenti, svaki sa jednim mestom vezivanja antigena, a ostatak je „Fc” fragment, oznaka koja odražava sposobnost lake kristalizacije. Tretman pepsinom daje F(ab')2fragment koji ima dva mesta za kombinovanje antigena i još uvek je sposoban za umrežavanje antigena.

„Fv“ je minimalni fragment antitela koji sadrži kompletno antigen-vezujuće mesto. U

1

jednoj realizaciji, dvolančana Fv vrsta se sastoji od dimera varijabilnog domena jednog teškog i jednog lakog lanca u čvrstoj, nekovalentnoj vezi. U vrstama sa jednim lancem Fv (scFv), varijabilni domen jedan teškog i jednog lakog lanca može biti kovalentno povezan sa fleksibilnim peptidnim linkerom tako da se laki i teški lanci mogu povezati u „dimernoj“ strukturi analognoj onoj kod dvolančane Fv vrste. U ovoj konfiguraciji, tri HVR regiona svakog varijablnog domena vrše interakciju i definišu antigen-vezujuće mesto na površini VH-VL dimera. Zajedno, šest HVR regiona daje antigen-vezujuću specifičnost antitelu. Međutim, čak i jedan varijabilni domen (ili polovina Fv koja sadrži samo tri HVR regiona specifična za antigen) ima sposobnost prepoznavanja i vezivanja antigena, ali sa nižim afinitetom od celog mesta vezivanja.

Fab fragment sadrži varijabilne domene teškog i lakog lanca i takođe sadrži konstantni domen lakog lanca i prvi konstantni domen (CH1) teškog lanca. Fab’ fragmenti se razlikuju od Fab fragmenata dodavanjem nekoliko ostataka na karboksi terminusu CH1 domena teškog lanca uključujući jedan ili više cisteina iz regiona zgloba antitela. Fab’-SH je ovde oznaka za Fab’ u kojoj ostatak cisteina konstantnih domena nosi slobodnu tiol grupu. F(ab’)2fragmenti antitela su prvobitno proizvedeni kao parovi Fab’ fragmenata koji imaju između sebe šarke cisteina. Takođe su poznati i drugi hemijski sklopovi fragmenata antitela.

Fragmenti „jednolančanog Fv” ili „scFv” antitela obuhvataju VH i VL domene antitela, naznačene time što su ovi domeni prisutni u jednom polipeptidnom lancu. Generalno, scFv polipeptid dalje sadrži polipeptidni linker između VH i VL domena koji omogućava da scFv formira željenu strukturu za vezivanje antigena. Za pregled scFv, pogledajte, npr., Pluckthünti u The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, tom 113, Rosenburg and Moore eds., (Springer-Verlag, New York, 1994), str.269-315.

Termin „dijatela“ se odnosi na fragmente antitela sa dva antigen-vezujuća mesta, čiji fragmenti sadrže varijabilni domen teškog lanca (VH) koji je povezan sa varijabilnom domenom lakog lanca (VL) u istom polipeptidnom lancu (VH-VL). Koristeći linker koji je prekratak da bi se omogućilo uparivanje između dva domena na istom lancu, domeni su prisiljeni da se uparuju sa komplementarnim domenima drugog lanca i stvaraju dva antigenvezujuća mesta. Dijatela mogu biti dvovalentna ili bispecifična. Dijatela su detaljnije opisana u, na primer, EP 404,097; WO 1993/01161; Hudson i sar., Nat. Med. 9:129-134 (2003); i Hollinger i sar., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993). Trijatela i tetratela su takođe opisana u radu Hudson et al., Nat. Med.9:129-134 (2003).

Termin „monoklonsko antitelo“, kako se ovde koristi, odnosi se na antitelo dobijeno od populacije u suštinski homogenim antitelima, npr. pojedinačna antitela koja sadrže

2

populaciju su identična osim za moguće mutacije, npr. prirodne mutacije koje mogu biti prisutne u manjim količinama. Tako reč „monoklonsko“ ukazuje na karakter antitela, koje nije smeša diskretnih antitela. U određenim realizacijama, takvo monoklonsko antitelo tipično uključuje antitelo koje sadrži polipeptidnu sekvencu koja vezuje cilj, naznačeno time što je ciljna sekvenca vezivanja polipeptida dobijena procesom koji uključuje selekciju jedne ciljne vezne sekvence iz mnoštva sekvenci polipeptida. Na primer, proces selekcije može biti selekcija jedinstvenog klona iz mnoštva klonova, kao što je skup klonova hibridoma, klonova faga ili klonova rekombinantnih DNK. Treba razumeti da izabrana ciljna sekvenca vezivanja može biti dodatno izmenjena, na primer, za poboljšanje afiniteta za cilj, za humanizaciju ciljne sekvence vezivanja, za poboljšanje njegove proizvodnje u ćelijskoj kulturi, za smanjivanje njegove imunogenosti in vivo, za stvaranje multispecifičnog antitela, itd., i da antitelo koje sadrži promenjenu ciljnu sekvencu vezivanja takođe bude monoklonsko antitelo ovog pronalaska. Nasuprot preparatima poliklonskih antitela, koji tipično uključuju različita antitela, usmerena prema različitim determinantama (epitopima), svako monoklonsko antitelo iz preparata monoklonskog antitela je usmereno na pojedinačnu determinantu na antigenu. Pored njihove specifičnosti, prednost preparata monoklonskih antitela je ta što po pravilu nisu kontaminirani drugim imunoglobulinima.

Reč „monoklonsko“ ukazuje na karakter antitela koje je dobijeno iz suštinski homogene populacije antitela, i ne treba da se tumači tako da se zahteva proizvodnja antitela nekim određenim postupkom. Na primer, monoklonska antitela koja se koriste shodno pronalasku se mogu proizvesti različitim tehnikama, uključujući, na primer, metod hibridoma (npr. Kohler i Milstein, Nature, 256:495-97 (1975); Hongo i sar., Hybridoma, 14 (3): 253-260 (1995), Harlow i sar., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2. izd. 1988); Hammerling i sar., u: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681 (Elsevier, N.Y., 1981)), metode rekombinantne DNK (pogledajte, npr. U.S. pat. br. 4,816,567), tehnologije prikaza faga (pogledajte, npr. Clackson i sar., Nature, 352: 624-628 (1991); Marks i sar., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1992); Sidhu i sar., J. Mol. Biol. 338(2): 299-310 (2004); Lee i sar., J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093 (2004); Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34): 12467-12472 (2004); Lee i sar., J. Immunol. Metode 284(1-2): 119-132 (2004) i tehnologije za proizvodnju humanih ili nalik humanim antitela kod životinja koje imaju delove ili sve humane imunoglobulinske lokuse ili gene koji kodiraju sekvence humanog imunoglobulina (pogledajte, npr. WO 1998/24893; WO 1996/34096; WO 1996/33735; WO 1991/10741; Jakobovits i sar., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 2551 (1993); Jakobovits i sar., Nature 362: 255-258 (1993); Bruggemann i sar., Year in Immunol. 7:33 (1993); U.S. pat. br. 5,545,807; 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; i 5,661,016; Marks i sar., Bio/Technology 10: 779-783 (1992); Lonberg i sar., Nature 368: 856-859 (1994); Morrison, Nature 368: 812-813 (1994); Fishwild i sar., Nature Biotechnol. 14: 845-851 (1996); Neuberger, Nature Biotechnol. 14: 826 (1996); i Lonberg i Huszar, intern, Intern. Rev. Immunol.13: 65-93 (1995).

Monoklonska antitela ovde specifično uključuju „himerna” antitela kod kojih je deo teškog i/ili lakog lanca identičan ili homologan sa odgovarajućim sekvencama antitela dobijenih od određenih vrsta, ili koji pripadaju naročitoj klasi ili potklasi antitela, dok je ostatak lan(a)ca identičan ili homologan sa odgovarajućim sekvencama antitela dobijenih od drugih vrsta, ili koje pripadaju drugoj klasi ili potklasi antitela, kao i fragmente takvih antitela, sve dok oni ispoljavaju željenu biološku aktivnost (pogledajte, npr., U.S. pat. br.

4,816,567; i Morrison i sar., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1984)). Himerna antitela uključuju PRIMATTZED<®>antitela naznačena time da je antigen-vezujući region antitela izveden iz antitela koja se proizvode, npr. imunizacijom makaki majmuna sa antigenom od interesa.

„Humanizovani” oblici antitela koji nisu ljudskog porekla (npr., mišjih) su himerna antitela koja sadrže minimalnu sekvencu dobijenu iz imunoglobulina koji nije ljudskog porekla. U jednoj realizaciji, humanizovano antitelo je humani imunoglobulin (antitelo primaoca) kod kojih su ostaci iz HVR regiona primaoca zamenjeni ostacima HVR regiona vrste koja nije ljudskog porekla (antitelo donora), kao što je miš, pacov, zec ili nehumani primat koji ima željenu specifičnost, afinitet i/ili kapacitet. U nekim slučajevima, ostaci FR regiona humanog imunoglobulina su zamenjeni odgovarajućim ostacima koji nisu ljudskog porekla. Nadalje, humanizovana antitela mogu da uključe ostatke koji nisu nađeni u antitelu primaoca ili u antitelu donora. Te modifikacije se mogu učiniti kako bi se dodatno preradilo dejstvo antitela. Uopšteno, humanizovano antitelo će da sadrži u suštini sve ili barem jedan, a obično dva, varijabilna domena, u kojima sve ili suštinski sve hipervarijabilne petlje odgovaraju onima iz imunoglobulina koji nije ljudskog porekla, a svi ili suštinski svi FR regioni su oni iz sekvence humanog imunoglobulina. Humanizovano antitelo će opciono takođe da sadrži najmanje deo konstantnog regiona imunoglobulina (Fc), tipično humanog imunoglobulina. Za više detalja pogledajte, npr., Jones i sar., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann i sar., Nature 332:323-329 (1988); i Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992). Takođe, pogledajte, npr., Vaswani i Hamilton, Ann. Allergy, Asthma & Immunol.

1:105-115 (1998); Harris, Biochem. Soc. Transactions 23:1035-1038 (1995); Hurle i Gross, Curr. Op. Biotech.5:428-433 (1994); i U.S. pat. br.6,982,321 i 7,087,409.

„Humano antitelo“ je ono telo koji poseduje sekvencu aminokiselina koja odgovara onoj u antitelu proizvedenom od strane čoveka i/ili je napravljeno pomoću bilo koje od tehnika za stvaranje humanih antitela kako je u ovom dokumentu objavljeno. Ova definicija humanog antitela specifično isključuje humanizovano antitelo koje sadrži antigen-vezujuće ostatke koji nisu ljudskog porekla. Humana antitela se mogu proizvoditi korišćenjem različitih tehnika poznatih u struci, uključujući biblioteke prikaza faga. Hoogenboom i Winter, J. Mol. Biol., 227:381 (1991); Marks i sar., J. Mol. Biol., 222:581 (1991). Takođe dostupni za pripremu humanih monoklonskih antitela su metode opisane u radu Cole i sar., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, str. 77 (1985); Boerner i sar., J. Immunol., 147(1):86-95 (1991). Takođe pogledajte van Dijk i van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol., 5: 368-74 (2001). Humana antitela se mogu pripremiti davanjem antigena transgenskoj životinji koja je modifikovana tako da proizvodi takva antitela u odgovoru na antigenski izazov, ali čiji su endogeni lokusi onemogućeni, npr., imunizovani ksenomiks (pogledajte, npr., U.S. pat. br. 6,075,181 i 6,150,584 vezano za tehnologiju XENOMOUSE™). Takođe pogledajte, na primer, Li i sar., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:3557-3562 (2006) vezano za humana antitela koja su generisana tehnologijom humanog B-ćelijskog hibridoma.

„Antitelo zavisno od vrste“, je ono antitelo koje ima jači afinitet vezivanja za antigen iz prve vrste sisara od onog za homolog tog antigena od druge vrste sisara. Obično, antitelo zavisno od vrste se „specifično vezuje“ za humani antigen (npr., ima vrednost afiniteta vezivanja (Kd) ne više od oko 1x10<-7>M, poželjno ne više od oko 1x10<-8>M i poželjno ne više od oko 1x10<-9>M), ali ima afinitet vezivanja za homolog antigena iz druge ne-humane vrste sisara koji je najmanje oko 50 puta, 500 puta ili bar oko 1000 puta slabiji od afiniteta vezivanja za humani antigen. Antitelo zavisno od vrste može biti bilo koje od različitih vrsta antitela kako je prethodno definisano, ali poželjno je humanizovano ili humano antitelo.

Termin „hipervarijabilni region“, „HVR“ ili „HV“, kada se ovde koristi, se odnosi na regione varijabilnog domena antitela koji su hipervarijabilni u nizu i/ili formiraju strukturno definisane petlje. Generalno, antitela sadrže šest HVR regiona, tri u VH (H1, H2, H3) i tri u VL (L1, L2, L3). U nativnim antitelima H3 i L3 pokazuju najviše raznolikosti od šest HVR regiona, a veruje se da posebno H3 ima jedinstvenu ulogu u dodeli fine specifičnosti antitelima. Pogledajte, npr., Xu i sar., Immunity 13:37-45 (2000); Johnson i Wu, u Methods in Molecular Biology 248:1-25 (Lo, izd., Human Press, Totowa, NJ, 2003). Zapravo, antitela koja se prirodno pojavljuju kod vrsta iz porodice Camelida, koja se sastoje samo od teškog lanca su funkcionalna i stabilna u odsustvu lakog lanca. Pogledajte, npr., Hamers-Casterman i

2

sar., Nature 363:446-448 (1993); Sheriff i sar., Nature Struct. Biol.3:733-736 (1996).

U upotrebi je određeni broj razgraničenja HVR regiona i ovde su obuhvaćeni. Kabat regioni za određivanje komplementarnosti (CDR) su bazirani na varijabilnosti sekvence i najčešće se koriste (Kabat i sar., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5. izd. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)). Umesto toga, Chothia se odnosi na lokaciju strukturnih petlji (Chothia i Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)). HVR regioni AbM predstavljaju kompromis između Kabat HVR regiona i Chothia strukturnih petlji, a koristi ih softver za modeliranje AbM antitela kompanije Oxford Molecular. HVR regioni „kontakta“ su bazirani na analizi raspoloživih kompleksnih kristalnih struktura. Ostaci iz svakog od ovih HVR regiona su navedeni u nastavku.

Petlja Kabat AbM Chothia Kontakt

L1 L24-L34 L24-L34 L26-L32 L30-L36

L2 L50-L56 L50-L56 L50-L52 L46-L55

L3 L89-L97 L89-L97 L91-L96 L89-L96

H1 H31-H35B H26-H35B H26-H32 H30-H35B (Kabat numeracija)

H1 H31-H35 H26-H35 H26-H32 H30-H35 (Chothia numeracija)

H2 H50-H65 H50-H58 H53-H55 H47-H58

H3 H95-H102 H95-H102 H96-H101 H93-H101

HVR regioni mogu sadržati „proširene HVR regione" na sledeći način: 24-36 ili 24-34 (L1), 46-56 ili 50-56 (L2) i 89-97 ili 89-96 (L3) u VL lancu i 26-35 (H1), 50-65 ili 49-65 (H2) i 93-102, 94-102 ili 95-102 (H3) u VH lancu. Ostaci varijabilnog domena su numerisani prema Kabatu i sar., u tekstu, za svaku od ovih definicija.

Ostaci „okvirnih” ili „FR” regiona su oni ostaci varijabilnog domena koji nisu ostaci HVR regiona, kao što su ovde definisani.

Termin „numerisanje ostataka varijabilnog domena kao u Kabatu“ ili „numerisanje pozicije aminokiselina kao u Kabatu“, i njegove varijacije, odnose se na sistem numeracije koji se koristi za varijabilne domene teškog lanca ili varijabilne domene lakog lanca kompilacije antitela u Kabatu i sar., u tekstu. Koristeći ovaj sistem numeracije, stvarna linearna aminokiselinska sekvenca može sadržati manje ili dodatne aminokiseline koje odgovaraju skraćivanju ili unošenju u FR ili HVR region varijabilnog domena. Na primer, varijabilni domen teškog lanca može da uključuje jedan pojedinačni aminokiselinski unos (ostatak 52a prema Kabatu) nakon ostatka 52 od H2 i ubačenih ostataka (npr. ostaci 82a, 82b i 82c, itd. prema Kabatu) nakon ostatka FR teškog lanca 82. Numeracija ostataka prema Kabatu može se odrediti za dato antitelo poravnanjem u oblastima homologije sekvence antitela sa „standardnom“ numerisanom sekvencom prema Kabatu.

Sistem numerisanja prema Kabatu se generalno koristi kada se govori o ostatku u varijabilnom domenu (otprilike ostaci od 1-107 lakog lanca i ostaci od 1-113 teškog lanca) (npr. Kabat i sar., Sequences of Immunological Interest. 5. izd. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)). „EU sistem numerisanja“ ili „EU indeks“ se generalno koristi kada se ukazuje na ostatak u konstantnom regionu teškog lanca imunoglobulina (npr. EU indeks koji su objavili Kabat i sar., u tekstu). „EU indeks kao u Kabatu“ se odnosi na numerisanje ostatka humanog IgG1 EU antitela.

Izraz „linearna antitela“ se odnosi na antitela opisana u radu Zapata i sar. (1995. Protein Eng, 8(10):1057-1062). Ukratko, ova antitela sadrže par tandemskih Fd segmenata (VH-CH1-VH-CH1) koji zajedno sa komplementarnim polipeptidima lakog lanca formiraju par regiona koji vezuju antigen. Linearna antitela mogu biti bispecifična ili monospecifična.

Kao što se ovde koristi, termin „specifično veže za“ ili je „specifičan za“ se odnosi na merljive i obnovljive interakcije poput vezivanja između cilja i antitela, što je odlučujuće za prisustvo cilja u prisustvu heterogene populacije molekula, uključujući i biološke molekule. Na primer, antitelo koje se specifično veže za cilj (što može biti epitop) je antitelo koje se veže za ovaj cilj sa većim afinitetom, okretnošću, spremnije i/ili dugotrajnije nego što se veže za druge ciljeve. U jednom primeru izvođenja, obim vezivanja antitela za nepovezani cilj manji je oko 10% od vezivanja antitela za cilj kao što je izmereno, npr., radioimunotestom (RIA). U određenim realizacijama, antitelo koje se specifično veže za cilj ima konstantu disocijacije (Kd) ≤ 1µM, ≤ 100 nM, ≤ 10 nM, ≤ 1 nM ili ≤ 0,1 nM. U određenim realizacijama, antitelo se specifično veže za epitop na proteinu koji je konzerviran među proteinima različitih vrsta. U drugoj realizaciji, specifično vezivanje može da uključi, ali ne zahteva isključivo vezivanje.

II. Formulacije i priprema antitela

Predmetni pronalazak se ovde odnosi na stabilne vodene formulacije koje sadrže anti-PDL1 antitelo. U nekim realizacijama, anti-PDL1 antitelo opisano u ovoj formulaciji iznosi od 40 mg/ml do 125 mg/ml. U nekim realizacijama, pufer je histidin acetat ili natrijum acetat. U nekim realizacijama, pufer u formulaciji je u koncentraciji od 15 mM do 25 mM. U nekim realizacijama, saharoza u formulaciji iznosi od 60 mM do 240 mM. U nekim realizacijama,

2

surfaktant u formulaciji je polisorbat (npr. polisorbat 20). U nekim realizacijama, polisorbat u formulaciji je u koncentraciji od 0,005% (w/v) do 0,06% (w/v). U nekim realizacijama, formulacija ima pH vrednost od 5,0 do 6,3. U nekim realizacijama, stabilna vodena farmaceutska formulacija iz ovog dokumenta je formulacija koja sadrži navedeno anti-PDL1 monoklonsko antitelo u koncentraciji od 40 mg/ml do 125 mg/ml, histidin acetat ili natrijum acetat u koncentraciji od 15 mM do 25 mM, saharozu u koncentraciji od 60 mM do 240 mM, polisorbat u koncentraciji od 0,005% (w/v) do 0,06% (w/v), i pH vrednost od 5,0 do 6,3. U nekim realizacijama, formulacija sadrži navedeno anti-PDL1 monoklonsko antitelo u iznosu od 125 mg/ml, saharozu u koncentraciji od 240 mM, i pH vrednost 5,5. U nekim realizacijama, formulacija sadrži navedeno anti-PDL1 monoklonsko antitelo u iznosu od 60 mg/ml, saharozu u koncentraciji od 120 mM, i pH vrednost 5,8.

U nekim realizacijama, antitelo u formulaciji je stabilno na temperaturi od -20°C najmanje oko 6 meseci, najmanje oko 12 meseci, najmanje oko 18 meseci, najmanje dve godine, najmanje tri godine ili najmanje četiri godine. U nekim realizacijama, antitelo u formulaciji je stabilno na temperaturi od 2-8°C najmanje oko 6 meseci, najmanje oko 12 meseci, najmanje oko 18 meseci, najmanje dve godine ili najmanje tri godine. U nekim realizacijama, nakon skladištenja, antitelo zadržava najmanje oko 60%, najmanje oko 65%, najmanje oko 70%, najmanje oko 75%, najmanje oko 80%, najmanje oko 85%, najmanje oko 90% ili najmanje oko 95% svoje biološke aktivnosti (npr. vezivanje za cilj ili terapeutska moć) izložene pre skladištenja, tj. u vreme pripreme farmaceutske formulacije.

U određenim realizacijama, formulacija je stabilna na oko 40°C najmanje oko 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 14, 21, 28 ili više dana. U određenim realizacijama, formulacija je stabilna na oko 40°C najmanje oko 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ili više nedelja. U određenim realizacijama, formulacija je stabilna na oko 25°C najmanje 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 ili više meseci. U određenim realizacijama, formulacija je stabilna na oko 5°C najmanje 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 ili više meseci. U određenim realizacijama, formulacija je stabilna na oko -20°C najmanje 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48 ili više meseci. U određenim realizacijama, formulacija je stabilna na 5°C ili -20°C najmanje 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48 ili više meseci. Pored toga, formulacija je poželjno stabilna nakon zamrzavanja (na, npr., -20°C, -40°C ili -70°C) i odmrzavanja formulacije, na primer, nakon 1, 2, 3, 4 ili 5 ciklusa zamrzavanja i

2

odmrzavanja.

A. Antitela (kao što su anti-PDL1 antitela)

U nekim realizacijama, antitelo u formulaciji je anti-PDL1 antitelo. PD-L1 (programirana ćelijska smrt 1 ligand 1), poznat i kao PDL1, B7-H1, B7-4, CD274 i B7-H, je transmembranski protein, a njegova interakcija sa PD-1 inhibira aktiviranje T-ćelija i proizvodnju citokina. U nekim realizacijama, anti-PDL1 antitelo opisano u ovom dokumentu se veže za humani PD-L1. Primeri anti-PDL1 antitela koja se mogu formulisati korišćenjem formulacija koje su opisane u ovom dokumentu i opisane u PCT patentnoj prijavi WO 2010/077634 A1 i US 8,217,149.

U nekim realizacijama, anti-PDL1 antitelo je sposobno da inhibira vezivanje između PD-L1 i PD-1 i/ili između PD-L1 i B7-1. U nekim realizacijama, anti-PDL1 antitelo je monoklonsko antitelo. U nekim realizacijama, anti-PDL1 antitelo je humanizovano antitelo.

U još jednoj daljnjoj realizaciji, obezbeđeno je izolovano anti-PDL1 antitelo koje sadrži sekvencu teškog lanca i lakog lanca, naznačeno time što:

(a) sekvenca teškog lanca ima:

NO.:10), ili

(b) sekvence lakog lanca imaju:

U nekim realizacijama, izolovano anti-PDL1 antitelo je oksidisano monoklonsko antitelo. U nekim realizacijama, oksidisano monoklonsko antitelo u formulaciji sadrži jedan laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO.:9, i jedan teški koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO.:10. U nekim realizacijama, oksidisano monoklonsko antitelo u formulaciji sadrži jedan teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID

2

NO.:10, naznačeno time što jedan ili više od W33, W50 ili W101 oksidira. U nekim realizacijama, oksidisano monoklonsko antitelo u formulaciji sadrži jedan teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO.:10, naznačeno time što jedan ili više od M253 i M429 oksidira. U nekim realizacijama, oksidisano monoklonsko antitelo zadržava najmanje oko 60%, najmanje oko 65%, najmanje oko 70%, najmanje oko 75%, najmanje oko 80%, najmanje oko 85%, najmanje oko 90% ili najmanje oko 95% svoje biološke aktivnosti (npr. vezivanje za cilj ili terapeutska moć) izložene pre skladištenja, tj. u vreme pripreme farmaceutske formulacije.

U nekim realizacijama, izolovano anti-PDL1 antitelo je glikovano monoklonsko antitelo. U nekim realizacijama, glikovano monoklonsko antitelo u formulaciji sadrži jedan laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO.:9, i jedan teški koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO.:10. U nekim realizacijama, glikovano monoklonsko antitelo u formulaciji sadrži jedan teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO.:10, naznačeno time što je jedan ili više lizina glikovano. U nekim realizacijama, glikovano monoklonsko antitelo u formulaciji sadrži jedan teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO.:10, naznačeno time što je K65 glikovan.

U nekim realizacijama, izolovano anti-PDL1 antitelo je neglikozilirano.

U bilo kojoj realizaciji iz ovog dokumenta, izolovano anti-PDL1 antitelo se može vezati za humani PD-L1, na primer, humani PD-L1 kao što je prikazano u UniProtKB/Swiss-Prot Accession br.Q9NZQ7.1, ili njegovoj varijanti.

U još jednoj daljnjoj realizaciji, opisana je izolovana nukleinska kiselina koja kodira bilo koje antitelo opisano u ovom dokumentu. U nekim realizacijama predmetnog pronalaska, nukleinska kiselina dalje sadrži vektor pogodan za ekspresiju nukleinske kiseline koja kodira bilo koje od prethodno opisanih anti-PDL1 antitela. U još specifičnijem aspektu predmetnog pronalaska, vektor se nalazi u ćeliji domaćina pogodnoj za ekspresiju nukleinske kiseline. U još specifičnijem aspektu predmetnog pronalaska, ćelija domaćina je eukariotska ćelija ili prokariotska ćelija. U još specifičnijem aspektu predmetnog pronalaska, eukariotska ćelija je ćelija sisara, poput jajnika kineskog hrčka (CHO).

Antitelo se može proizvesti postupcima poznatim u struci, na primer, procesom koji uključuje kultivaciju ćelije domaćina koja sadrži nukleinsku kiselinu, koja kodira bilo koje od prethodno opisanih anti-PDL1 antitela ili antigen-vezujući fragment u obliku pogodnom za ekspresiju, pod pogodnim uslovima za proizvodnju takvog antitela ili fragmenta i obnavljanje antitela ili fragmenta.

B. Priprema antitela

2

Antitelo u formulaciji je pripremljeno upotrebom dostupnih tehnika u struci za stvaranje antitela, čiji su primeri metoda detaljnije opisani u sledećim odeljcima.

Antitelo je usmereno protiv antigena od interesa (tj. PD-L1, kao što je humani PD-L1). Poželjno, antigen je biološki važan polipeptid i primena antitela na sisaru koji pati od poremećaja može dovesti do terapeutske koristi kod tog sisara.

(i) Priprema antigena

Rastvorljivi antigeni ili njihovi fragmenti, opciono konjugovani sa drugim molekulima, mogu da se koriste kao imunogeni za stvaranje antitela. Za transmembranske molekule, kao što su receptori, njihovi fragmenti (npr. vanćelijski domen receptora) mogu da se koriste kao imunogen. Alternativno, ćelije koje eksprimiraju transmembranske molekule mogu da se koriste kao imunogen. Takve ćelije mogu biti izvedene iz prirodnog izvora (npr. ćelijske linije karcinoma) ili mogu biti ćelije koje su transformisane rekombinantnim tehnikama za ekspresiju transmembranskog molekula. Ostali antigeni i njihovi oblici korisni za pripremu antitela biće očigledni osobama u struci.

(ii) Određene metode zasnovane na antitelima

Poliklonska antitela se poželjno uzgajaju u životinjama, putem višestrukih supkutanih (sc) ili intraperitonealnih (ip) injekcija relevantnog antigena i adjuvansa. Može biti korisno da se relevantni antigen konjuguje sa proteinom koji je imunogen u vrstama koje se imunizuju, npr. hemocijaninom iz puža prilepka, serumskim albuminom, goveđim tiroglobulinom ili inhibitorom sojinog tripsina pomoću bifunkcionalnog ili derivatizujućeg agensa, na primer, maleimidobenzoil sulfosukcinimid ester (konjugacija preko cisteinskih ostataka), N-hidroksisukcinimid (preko lizinskih ostataka), glutaraldehid, sukcinski anhidrid, SOCl2, ili R<1>N=C=NR, pri čemu su R i R<1>različite alkilne grupe.

Životinje se imunizuju protiv antigena, imunogenih konjugata ili derivata kombinovanjem, npr. 100 µg ili 5 µg proteina ili konjugata (za zečeve, odnosno miševe) sa 3 zapremine Frojndovog kompletnog adjuvanta i injektiranjem rastvora intradermalno na više mesta. Mesec dana kasnije, životinjama se daje još 1/5 do 1/10 originalne količine peptida ili konjugata u Frojndovom kompletnom adjuvansu, supkutanom injekcijom na više mesta. Nakon sedam do 14 dana, životinjama se pusti krv, a serum se ispituje na titar antitela. Životinjama se dodaju nove doze dok titar ne dostigne vodoravnu liniju. Poželjno, životinji se daju nove doze konjugata istog antigena, koji je konjugovan sa različitim proteinom i/ili putem različitog reagensa za umrežavanje. Konjugati se takođe mogu napraviti u rekombinantnoj ćelijskoj kulturi kao fuzije proteina. Takođe, agregacioni agensi, kao što je stipsa, pogodno se koriste za povećanje imunog odgovora.

2

Monoklonska antitela predmetnog pronalaska mogu da se proizvedu primenom metode hibridoma koju su prvo opisali Kohler i sar., Nature, 256:495 (1975), i dalje opisali, npr., u Hongo i sar., Hybridoma, 14 (3): 253- 260 (1995), Harlow i sar., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2. izd.1988); Hammerling i sar., u: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681 (Elsevier, N.Y., 1981), i Ni, Xiandai Mianyixue, 26(4):265-268 (2006) koja se odnosi na hibridome čoveka i čoveka. Dodatne metode uključuju one koje su opisane, na primer, u U.S. pat. br. 7,189,826 koji se odnosi na proizvodnju monoklonskih humanih prirodnih IgM antitela iz ćelijskih linija hibridoma. Tehnologiju humanih hibridoma (Trioma tehnologija) su takođe opisali Vollmers i Brandlein, Histology and Histopathology, 20(3):927-937 (2005) i Vollmers i Brandlein, Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology, 27(3):185-91 (2005).

Za razne druge tehnike hibridoma, pogledajte, npr., US 2006/258841; US 2006/183887 (potpuno humana antitela), US 2006/059575; US 2005/287149; US 2005/100546; US 2005/026229; i U.S. pat. br. 7.078.492 i 7.153.507. Primer protokola za proizvodnju monoklonskih antitela metodom hibridoma opisan je na sledeći način. U jednoj realizaciji, miš ili druga životinja domaćin, kao što je hrčak, imunizovana je kako bi se izazvali limfociti koji proizvode, ili su sposobni da proizvode antitela koja će se specifično vezati za protein koji se koristi za imunizaciju. Antitela se povećavaju u životinjama višestrukim supkutanim (sc) ili intraperitonealnim (ip) injekcijama polipeptida predmetnog pronalaska ili njegovog fragmenta, i adjuvansa, kao što je monofosforil lipid A (MPL)/trehaloza dikrinomikolat (TDM) (Ribi Immunochem. Research, Inc., Hamilton, Mont.). Polipeptid predmetnog pronalaska (npr. antigen) ili njegov fragment može da se pripremi koristeći metode dobro poznate u struci, kao što su rekombinantne metode, od kojih su neke kasnije opisane u ovom dokumentu. Serum imunizovanih životinja se testira na antiantigen antitela, a po potrebi se primenjuju i pojačane imunizacije. Izoluju se limfociti iz životinja koje proizvode anti-antigen antitela. Alternativno, limfociti mogu biti imunizovani in vitro.

Limfociti se zatim spajaju sa ćelijama mijeloma pomoću prikladnog agensa za fuziju, kao što je polietilen glikol, dajući ćelije hibridoma. Pogledajte, npr., Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, str. 59-103 (Academic Press, 1986). Ćelije mijeloma mogu efikasno da se fuzionišu, da podrže stabilnu proizvodnju velike koncentracije antitela od strane odabranih ćelija koje proizvode antitela, i osetljive su na medijum, kao što je HAT medijum. Primeri ćelija mijeloma uključuju, ali nisu ograničeni na linije mišjeg mijeloma, kao one dobijene od mišjih tumora MOPC-21 i MPC-11, koje se mogu nabaviti od Distribucionog centra za ćelije Salkovog instituta (Salk Institute Cell Distribution Center), San Diego, California SAD, i SP-2 ili X63-Ag8-653 ćelije koje se mogu nabaviti od American Type Culture Collection, Rockville, Md. SAD. Ćelijske linije humanog mijeloma i mišje-humanog heteromijeloma takođe su opisane za proizvodnju humanih monoklonskih antitela (Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984); Brodeur i sar., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, str.51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)).

Tako pripremljene ćelije hibridoma se stoga zasejavaju i uzgajaju u pogodnom mediju za uzgajanje, npr. medijum koji sadrži jednu ili više supstanci koje inhibiraju rast ili preživljavanje nefuzionisanih, matičnih ćelija mijeloma. Na primer, ako matične ćelije mijeloma nemaju enzim hipoksantin guanin fosforibozil transferazu (HGPRT ili HPRT), medij za uzgajanje hibridoma tipično će sadržati hipoksantin, aminopterin i timidin (HAT medij), jer te supstance sprečavaju rast HGPRT-deficijentnih ćelija. Poželjno je da se koriste metode ćelijske kulture hibridoma bez seruma da bi se smanjila upotreba seruma koji potiče od životinja, kao što je fetalni goveđi serum, kao što je opisano, na primer, u Even i sar., Trends in Biotechnology, 24(3), 105-108 (2006).

Oligopeptidi, kao alati za poboljšanje produktivnosti ćelijskih kultura hibridoma, su opisani u radu Franek, Trends in Monoclonal Antibody Research, 111-122 (2005). Naime, standardni mediji za ćelijske kulture su obogaćeni određenim aminokiselinama (alanin, serin, asparagin, prolin) ili frakcijama proteinskih hidrolizata, a apoptoza se može značajno suzbiti sintetičkim oligopeptidima, sastavljenim od tri do šest aminokiselinskih ostataka. Peptidi su prisutni u milimolarnim ili višim koncentracijama.

Medijum za ćelijsku kulturu u kome se ćelije hibridoma uzgajaju, može se ispitati za proizvodnju monoklonskih antitela koja se vežu za antitelo iz predmetnog pronalaska. Specifičnost vezivanja monoklonskih antitela koje proizvode ćelije hibridoma određuje se imunoprecipitacijom ili in vitro testom vezivanja, kao što je radioimunotest (RIA) ili test sa imunoadsorbentom vezanim za enzim (ELISA). Afinitet vezivanja monoklonskog antitela može da se odredi, na primer, Scatchard-ovom analizom. Pogledajte, npr., Munson i sar., Anal. Biochem., 107:220 (1980).

Nakon što se identifikuju ćelije hibridoma koje proizvode antitela željene specifičnosti, afiniteta, i/ili aktivnosti, klonovi mogu biti potklonirani postupcima ograničavanja razblaženja i uzgajeni standardnim metodama. Pogledajte, npr., Goding, u tekstu. Pogodni mediji za ćelijske kulture za ovu namenu uključuju, na primer, medijum D-MEM ili RPMI-1640. Pored toga, ćelije hibridoma se mogu uzgajati in vivo kao ascites tumori u životinji. Monoklonska antitela koja izlučuju potklonovi su pogodno odvojena od

1

medijuma za ćelijske kulture, ascites tečnosti ili seruma klasičnim postupcima prečišćavanja imunoglobulina, kao što je, na primer, protein A sefaroza, hidroksilapatitna hromatografija, gel elektroforeza, dijaliza ili afinitetna hromatografija. Jedan postupak za izolaciju proteina iz ćelija hibridoma je opisan u US 2005/176122 i US Pat. br. 6,919,436. Metoda uključuje u postupku vezivanja upotrebu minimalnih soli, kao što su liotropne soli, i poželjno upotrebu malih količina organskih rastvarača u procesu elucije.

(iii) Određene metode pretraživanja biblioteke

Antitela iz predmetnog pronalaska mogu da se izoluju pretraživanjem kombinatornih biblioteka u potrazi za antitelima sa željenom aktivnošću ili aktivnostima. Na primer, veliki broj postupaka je poznat u struci za stvaranje biblioteka prikaza faga i pretraživanje takvih biblioteka za antitela koja imaju željene karakteristike vezivanja. Takvi postupci su uopšteno opisani u Hoogenboom i sar. u Methods in Molecular Biology 178: 1-37 (O'Brien i sar., izd., Human Press, Totowa, NJ, 2001). Na primer, jedna metoda stvaranja antitela od interesa je korišćenjem biblioteke antitela faga, kao što je opisano u radu Lee i sar., J. Mol. Biol. (2004), 340(5):1073-93.

U principu, sintetički klonovi antitela se biraju pretraživanjem biblioteka faga u kojima se nalazi fag koji prikazuje različite fragmente varijabilnog regiona antitela (Fv) spojen sa proteinskim omotačem faga. Takve biblioteke faga su obuhvaćene afinitetnom hromatografijom prema željenom antigenu. Klonovi koji eksprimiraju Fv fragmente sposobne da se vežu na željeni antigen, adsorbiraju se na antigen i na taj način bivaju odvojeni od klonova koji se ne vežu u biblioteci. Klonovi koji se vezuju se zatim eluiraju iz antigena, a mogu se i dodatno obogatiti dodatnim ciklusima adsorpcije/elucije antigena. Bilo koje od antitela predmetnog pronalaska može da se dobije dizajniranjem pogodnog postupka pretraživanja antigena za izbor klona faga od interesa, nakon čega sledi izgradnja klona antitela pune dužine koristeći Fv sekvence iz klona faga od interesa i odgovarajuće sekvence konstantnog regiona (Fc) opisane u radu Kabat i sar., Sequences of Proteins of Immunological Interest, peto izdanje, NIH Publication 91-3242, Bethesda Md. (1991), vols.

1-3.

U određenim realizacijama, antigen-vezujući domen antitela se formira iz dva varijabilna (V) regiona od oko 110 aminokiselina, od kojih svaki iz lakog (VL) i teškog (VH) lanca, a oba predstavljaju tri hipervarijabilne petlje (HVR regioni) ili regioni koji određuju komplementarnost (CDR regioni). Varijabilni domeni se mogu funkcionalno prikazati na fagu, bilo kao jednolančani Fv (scFv) fragmenti, u kojima su VH i VL kovalentno povezani kratkim, fleksibilnim peptidom ili kao Fab fragmenti u kojima je svaki spojen sa konstantnim

2

domenom i komuniciraju nekovalentno, kao što je opisano u radu Winter i sar., Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455 (1994). U smislu ovog dokumenta, scFv koji kodira kloneve faga i Fab koji kodira klonove faga, zajedno se nazivaju „Fv klonovi faga“ ili „Fv klonovi.“ Repertoari VH i VL gena mogu biti odvojeno klonirani putem lančane reakcije polimeraze (PCR) i nasumično rekombinovani u biblioteke faga, u kojima zatim mogu da se pretražuju antigen-vezujući klonovi, kao što je opisano u radu Winter i sar., Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455 (1994). Biblioteke iz imunizovanih izvora daju antitela velikog afiniteta prema imunogenu, ne zahtevajući konstruisanje hibridoma. Alternativno, naivni repertoar može biti kloniran da bi se dobio jedan izvor humanih antitela za širok spektar nesvojstvenih, kao i svojstvenih antigena bez ikakve imunizacije, kao što opisuju Griffiths i sar., EMBO J, 12: 725-734 (1993). Najzad, naivne biblioteke mogu takođe da se naprave sintetički, kloniranjem nepreuređenih V-genskih segmenata iz matičnih ćelija, i upotrebom PCR prajmera koji sadrže nasumične sekvence za kodiranje veoma varijabilnih CDR3 regiona, i za postizanje premeštanja in vitro, kao što opisuju Hoogenboom i Winter, J. Mol. Biol., 227: 381-388 (1992).

U određenim realizacijama, filamentozni fag se koristi za prikaz fragmenata antitela fuzijom manjeg proteinskog omotača pIII. Fragmenti antitela mogu da se prikažu kao jednolančani Fv fragmenti, u kojima su VH i VL domeni povezani na istom polipeptidnom lancu fleksibilnim polipeptidnim odstojnikom, npr. kao što su opisali Marks i sar., J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991), ili kao Fab fragmenti u kojima se jedan lanac spaja na pIII, a drugi se izlučuje u periplazmu bakterijske ćelije domaćina gde se sastavlja Fab struktura proteinskog omotača, koja se prikazuje na površini faga zamenjujući neke proteinske omotače divljeg tipa, npr. kao što je opisano u radu Hoogenboom i sar., Nucl. Acids Res., 19: 4133-4137 (1991).

Uopšteno, nukleinske kiseline koje kodiraju fragmente gena antitela dobijaju se iz imunih ćelija prikupljenih od ljudi ili životinja. Ako se želi biblioteka naklonjena anti-antigen klonovima, subjekt se imunizira antigenom da bi se stvorio odgovor na antitela, a ćelije slezine i/ili cirkulirajuće B ćelije ostalih limfocita periferne krvi (PBL) se obnavljaju za izgradnju biblioteke. U jednoj realizaciji, biblioteka fragmenta gena humanog antitela naklonjena anti-antigen klonovima se dobija generisanjem odgovora antitela protiv antigena kod transgenih miševa koji nose funkcionalni niz gena humanih imunoglobulina (a nedostaje funkcionalni sistem proizvodnje endogenog antitela), tako da imunizacijom antigenom nastaju B ćelije koje proizvode humana antitela protiv antigena. U nastavku je opisano generisanje humanog antitela koje se proizvodi kod transgenih miševa.

Dodatno obogaćivanje reaktivnih anti-antigen ćelijskih populacija se može postići primenom odgovarajuće procedure skrininga, da bi se izolovale B ćelije koje eksprimiraju antitelo vezano za membranu određenog antigena, npr. odvajanjem ćelija pomoću afinitetne hromatografije antigena ili adsorpcijom ćelija na antigen označen fluorhromom, nakon čega sledi sortiranje ćelija aktiviranih protokom (FACS).

Alternativno, upotreba ćelija slezine i/ili B ćelija ili drugih PBL-a od neimunizovanog donora pruža bolju predstavu mogućeg repertoara antitela, a takođe dozvoljava i izgradnju biblioteke antitela koristeći bilo koju životinjsku vrstu (humanu ili onu koja nije ljudskog porekla) kod koje antigen nije antigenski. Za biblioteke koje uključuju izgradnju gena antitela in vitro, matične ćelije se prikupljaju od subjekta da bi se obezbedile nukleinske kiseline koje kodiraju neuređene genske segmente antitela. Imunske ćelije od interesa mogu da se dobiju od različitih životinjskih vrsta, kao što su ljudi, miš, štakor, dvozupci, luprin, pas, mačka, svinja, govedo, kopitar i ptičja vrsta, itd.

Nukleinska kiselina koja kodira varijabilne genske segmente antitela (uključujući VH i VL segmente) se obnavlja iz ćelija od interesa i amplifikuje. U slučaju preraspoređenih biblioteka VH i VL gena, željena DNK može da se dobije izolacijom genomske DNK ili mRNK iz limfocita, nakon čega sledi lančana reakcija polimeraze (PCR) sa prajmerima koji odgovaraju 5 'i 3' krajevima preuređenih VH i VL gena, kao što je opisano u radu Orlandi i sar., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 86: 3833-3837 (1989), stvarajući tako različite repertoare V gena za ekspresiju. V geni se mogu amplificirati iz cDNK i genomske DNK, sa povratnim prajmerima na 5' kraju egzona koji kodiraju zreli V-domen i prednje prajmere bazirane na J-segmentu, kao što je opisano u radu Orlandi i sar. (1989) i u Ward i sar., Nature, 341: 544-546 (1989). Međutim, za amplifikaciju iz cDNK, zadnji prajmeri se takođe mogu bazirati u vodećem egzonu, kao što je opisano u radu Jones i sar., Biotechnol., 9: 88-89 (1991), i prednji prajmeri unutar konstantnog regiona, kao što je opisano u radu Sastry i sar., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 86: 5728-5732 (1989). Da bi se povećala komplementarnost, degeneracija se može inkorporirati u prajmere, kao što je opisano u radu Orlandi i sar. (1989) ili Sastry i sar. (1989). U određenim realizacijama, raznovrsnost biblioteke se povećava korišćenjem PCR prajmera usmerenih na svaku familiju V-gena kako bi se amplificirali svi raspoloživi VH i VL aranžmani prisutni u uzorku imunske ćelije nukleinske kiseline, npr. kao što je opisano u metodi Marks i sar. J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991) ili kao što je opisano u metodi Orum i sar., Nucleic Acids Res., 21: 4491-4498 (1993). Za kloniranje amplificirane DNK u ekspresione vektore, retka mesta restrikcije mogu da se uvedu u PCR prajmer kao oznaka na jednom kraju, kao što je opisano u radu Orlandi i sar. (1989), ili daljnjim PCR

4

amplifikacijama sa označenim prajmerom, kao što je opisano u radu Clackson i sar., Nature, 352: 624-628 (1991).

Repertoari sintetički preuređenih V gena mogu se in vitro izvesti iz V genskih segmenata. Većina humanih VH-genskih segmenata je klonirana i sekvencirana (objavljeno u radu Tomlinson i sar., J. Mol. Biol., 227: 776-798 (1992)) i mapirana (objavljeno u radu Matsuda i sar., Nature Genet., 3: 88-94 (1993); ti klonirani segmenti (uključujući sve glavne konformacije H1 i H2 petlje) mogu da se koriste za stvaranje različitih repertoara VH gena sa PCR prajmerima koji kodiraju H3 petlje različite sekvence i dužine, kao što je opisano u radu Hoogenboom i Winter, J. Mol. Biol., 227: 381-388 (1992). VH repertoari se takođe mogu izraditi sa svim raznovrsnostima sekvence fokusirane u dugu H3 petlju jedne dužine, kao što je opisano u radu Barbas i sar., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 4457-4461 (1992). Humani Vκ i Vλ segmenti su klonirani i sekvencirani (objavljeno u radu Williams i Winter, Eur. J. Immunol., 23: 1456-1461 (1993)) i mogu se koristiti za izradu sintetičkih repertoara lakog lanca. Sintetički repertoari V gena, zasnovani na opsegu VH i VL preklopa, i dužine L3 i H3, kodiraće antitela značajne strukturne raznovrnosti. Nakon amplifikacije V-gena koji kodira DNK, V-genski segmenti germinativne linije mogu da se preurede in vitro prema metodama Hoogenboom i Winter, J. Mol. Biol., 221: 381-388 (1992).

Repertoari fragmenata antitela mogu se izraditi kombinovanjem repertoara VH i VL gena na više načina. Svaki repertoar se može kreirati u različitim vektorima, a vektori su rekombinovani in vitro, npr. kao što je opisano u radu Hogrefe i sar., Gene, 128: 119-126 (1993), ili in vivo kombinatornom infekcijom, npr., sistem loxP opisan u radu Waterhouse i sar., Nucl. Acids Res., 21: 2265-2266 (1993). In vivo pristup rekombinaciji koristi dvolančanu prirodu Fab fragmenata da bi prevladalo ograničenje veličine biblioteke nametnuto efikasnošću transformacije E. coli. Naivni VH i VL repertoari se odvojeno kloniraju, jedan u fagemid, a drugi u vektor faga. Dve biblioteke se zatim kombinuju fagom infekcije bakterijama koje sadrže fagemid tako da svaka ćelija sadrži različitu kombinaciju, a veličina biblioteke se ograničava samo brojem prisutnih ćelija (oko 10<12>klonova). Oba vektora sadrže in vivo signale rekombinacije tako da se VH i VL geni rekombinuju na jedan replikon i zajednički pakuju u virione faga. Ove ogromne biblioteke daju veliki broj različitih antitela dobrog afiniteta (Kd<-1>od oko 10<-8>M).

Alternativno, repertoari se mogu sekvencijalno klonirati u isti vektor, npr. kao što je opisano u radu Barbas i sar., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 7978-7982 (1991), ili sastavljeni zajedno pomoću PCR-a, a zatim klonirani, npr. kao što je opisano u radu Clackson i sar., Nature, 352: 624-628 (1991). PCR sklop se takođe može koristiti za spajanje VH i VL DNK sa kodirajućom DNK fleksibilnog peptidnog odstojnika za formiranje repertoara jednolančanog Fv (scFv). U još jednoj drugoj tehnici, „PCR sklop u ćeliji“ se koristi za kombinovanje VH i VL gena unutar limfocita pomoću PCR-a, a zatim za kloniranje repertoara povezanih gena, kao što je opisano u radu Embleton i sar, Nucl. Acids Res., 20: 3831-3837 (1992).

Antitela proizvedena od naivnih biblioteka (prirodnih ili sintetičkih) mogu biti umerenog afiniteta (Kd<-1>od oko 10<6>do 10<7>M<-1>), ali sazrevanje afiniteta se takođe može oponašati in vitro konstrukcijom i ponovnom selekcijom iz sekundarnih biblioteka, kao što je opisano u radu Winter i sar. (1994), u tekstu. Na primer, mutacija se može nasumično uvesti in vitro primenom polimeraze sklone greškama (objavljeno u radu Leung i sar., Technique 1: 11-15 (1989)) u metodi Hawkins-a i sar., J. Mol. Biol., 226: 889-896 (1992) ili metodom Gram-a i sar., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 89: 3576-3580 (1992). Pored toga, sazrevanje afiniteta može da se sprovede nasumičnim mutiranjem jednog ili više CDR-a, npr. upotrebom PCR-a sa prajmerima koji nose nasumične sekvence koje obuhvataju CDR od interesa, u izabranim pojedinačnim Fv klonovima i pretraživanjem klonova većeg afiniteta. WO 9607754 (objavljeno 14. marta 1996.) opisuje metodu za indukciju mutageneze u region koji određuje komplementarnost imunoglobulinskog lakog lanca radi kreiranja biblioteke gena lakog lanca. Drugi efikasan pristup je rekombinacija VH ili VL domena izabranih prikazom faga pomoću repertoara varijanti V domena koji se javljaju prirodno od neimuniziranih donora i traženje većeg afiniteta u nekoliko krugova preusmeravanja lanca, kao što je opisano u radu Marks i sar., Biotechnol., 10: 779-783 (1992). Ova tehnika omogućava proizvodnju antitela i fragmenata antitela sa afinitetima od oko 10<-9>M ili manje.

Pretraživanje biblioteka se može izvršiti različitim tehnikama poznatim u struci. Na primer, antigen se može koristiti za oblaganje mesta na adsorpcionim pločama, izraženih na ćelijama domaćina pričvršćenim na adsorpcione ploče ili koristiti u sortiranju ćelija, ili konjugovati na biotin za hvatanje zrnaca obloženih streptavidinom, ili koristiti u bilo kojoj drugoj metodi za razgledanje biblioteka prikaza faga.

Uzorci biblioteke faga dolaze u dodir sa imobilizovanim antigenom pod uslovima koji su pogodni za vezivanje barem dela čestica faga sa adsorbentom. Normalno, uslovi, uključujući pH vrednost, jonsku snagu, temperaturu i slično, biraju se tako da oponašaju fiziološke uslove. Fagi vezani za čvrstu fazu su isprani, a zatim eluirani kiselinom, npr. kao što je opisano u radu Barbas i sar., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 88: 7978-7982 (1991), ili bazom, npr. kao što je opisano u radu Marks i sar., J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991), ili konkurencijom antigena, npr. u postupku sličnom metodi kompeticije antigena u radu Clackson i sar., Nature, 352: 624-628 (1991). Fagi se mogu obogatiti od 20-1,000 puta u jednom krugu selekcije. Osim toga, obogaćeni fagi se mogu uzgajati u bakterijskoj kulturi i podvrgnuti daljnjim krugovima selekcije.

Efikasnost selekcije zavisi od mnogih faktora, uključujući kinetiku disocijacije tokom pranja i od toga da li se više fragmenata antitela na jednom fagu može istovremeno angažovati sa antigenom. Antitela sa brzom kinetikom disocijacije (i slabim afinitetima vezivanja) mogu se zadržati kratkim ispiranjima, prikazom viševalentnog faga i velikom gustinom prekrivanja antigena u čvrstoj fazi. Velika gustina ne samo da stabilizuje fag kroz multivalentne interakcije, već i favorizuje ponovno vezivanje faga koji se disocirao. Selekcija antitela sa sporom kinetikom disocijacije (i dobrim afinitetima vezivanja) može da se promoviše primenom dužeg pranja i prikazom monovalentnog faga, kao što je opisano u radu Bass i sar., Proteins, 8: 309-314 (1990) i u WO 92/09690, a mala gustina prekrivanja antigena kao što je opisano u radu Marks i sar., Biotechnol., 10: 779-783 (1992).

Moguće je birati između antitela faga različitih afiniteta, čak i sa afinitetima koji se malo razlikuju, za antigen. Međutim, slučajna mutacija izabranog antitela (npr. izvedena u nekim tehnikama sazrevanja afiniteta) će verovatno dovesti do mnogih mutanata koji se najviše vežu za antigen, a nekoliko sa većim afinitetom. Uz ograničavanje antigena, retki fagi visokog afiniteta mogu konkurisati. Da bi se zadržali svi mutanti sa višim afinitetom, fagi se mogu inkubirati sa viškom biotiniliranog antigena, ali sa biotiniliranim antigenom u koncentraciji niže molarnosti od ciljane molarnosti afiniteta konstantne za antigen. Fagi sa visokim afinitetom vezivanja se tada mogu uhvatiti paramagnetnim zrncima obloženih streptavidinom. Takvo „ravnomerno hvatanje“ omogućava da se antitela izaberu prema njihovim afinitetima vezivanja, sa osetljivošću koja omogućava izolaciju klonova mutanta sa samo dvostruko većim afinitetom od velikog viška faga sa nižim afinitetom. Uslovi korišćeni u pranju faga vezanim za čvrstu fazu, takođe se mogu manipulisati tako da se diskriminišu na osnovu kinetike disocijacije.

Anti-antigen klonovi mogu biti izabrani na osnovu aktivnosti. U određenim realizacijama, pronalazak obezbeđuje anti-antigen antitela koja se vežu za žive ćelije koje prirodno eksprimiraju antigen ili se vežu za slobodno plutajući antigen ili antigen pričvršćen na druge ćelijske strukture. Fv klonovi koji odgovaraju takvim anti-antigen antitelima mogu biti izabrani (1) izolovanjem anti-antigen klonova iz biblioteke faga kao što je već opisano, i opcionom amplifikacijom izolovane populacije klonova faga uzgajanjem populacije u pogodnom bakterijskom domaćinu; (2) biranjem antigena i drugog proteina protiv kojih je poželjna aktivnost blokiranja i neblokiranja; (3) adsorbovanjem anti-antigen klonova faga na imobilizovanom antigenu; (4) upotrebom viška drugog proteina za eluiranje neželjenih klonova koji prepoznaju antigen-vezujuće determinante koje se preklapaju ili dele sa determinantama vezivanja drugog proteina; i (5) eluiranjem klonova koji ostaju adsorbovani nakon koraka (4). Po izboru, klonovi sa željenim svojstvima blokiranja/neblokiranja mogu se dodatno obogatiti ponavljanjem postupaka selekcije, ovde opisanih, jednom ili više puta.

Kodirajuća DNK monoklonskih antitela izvedenih iz hibridoma ili klonova Fv prikaza faga predmetnog pronalaska, lako se izoluju i sekvenciraju korišćenjem konvencionalnih postupaka (npr. korišćenjem oligonukleotidnih prajmera dizajniranih da posebno amplificiraju regione kodiranja teškog i lakog lanca od interesa iz hibridoma ili šablona DNK faga). Kada se izoluje, DNK se može ubaciti u ekspresione vektore, koji se zatim transficiraju u ćelije domaćina, kao što su ćelije E. coli, majmunske COS ćelije, ćelije jajnika kineskog hrčka (CHO), ili ćelije mijeloma koje inače ne proizvode protein imunoglobulina, da bi se dobila sinteza željenih monoklonskih antitela u rekombinantnim ćelijama domaćina. Pregledajte članke o rekombinantnoj ekspresiji u bakterijama za DNK koja kodira antitelo, uključuju Skerra i sar., Curr. Opinion in Immunol., 5: 256 (1993) i Pluckthun, Immunol. Revs, 130: 151 (1992).

Kodirajuća DNK klonova Fv predmetnog pronalaska može da se kombinuje sa poznatim DNK sekvencama koje kodiraju konstantne regione teškog i/ili lakog lanca (npr. odgovarajuće DNK sekvence se mogu dobiti od Kabata i sar., u tekstu) da bi se formirali klonovi koji kodiraju punu ili parcijalnu dužinu teških i/ili lakih lanaca. Podrazumeva se da se za tu svrhu mogu koristiti konstantni regioni bilo kojeg izotipa, uključujući konstantne regione IgG, IgM, IgA, IgD i IgE i da se takvi konstantni regioni mogu dobiti od bilo koje ljudske ili životinjske vrste. Fv klon je izveden iz varijabilnog domena DNK jedne životinjske vrste (kao što je ljudska), a zatim je spojen u konstantni region DNK druge životinjske vrste da bi se formirala kodirajuća sekvenca(e) za „hibridni“ teški lanac i/ili laki lanac pune dužine, uključuje se u definiciju „himernih“ i „hibridnih“ antitela kao što se koristi u ovom dolumentu. U određenim realizacijama, Fv klon izveden iz ljudske varijabilne DNK se spaja sa konstantnim regionom ljudske DNK da bi se formirala kodirajuća sekvenca(e) za humane teške i/ili lake lance pune ili parcijalne dužine.

Kodirajuće DNK anti-antigen antitelo izvedeno iz hibridoma predmetnog pronalaska takođe se može modifikovati, na primer, zamenom kodirajuće sekvence za humane konstantne domene teškog i lakog lanca umesto homolognih mišjih sekvenci izvedenih iz klona hibridoma (npr. kao u metodi Morrison i sar., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 6851-6855 (1984)). Kodirajuća DNK antitela ili fragmenta koji je izveden iz hibridomskog ili Fv klona može se dalje modifikovati kovalentnim spajanjem na kodirajuću sekvencu imunoglobulina, celu ili deo kodirajuće sekvence za neimunoglobulinski polipeptid. Na taj način se pripremaju „himerna“ ili „hibridna“ antitela koja imaju specifičnost vezivanja Fv klona ili antitela koja su izvedena iz klona hibridoma predmetnog pronalaska.

(iv) Humanizovana i humana antitela

Različite metode za humanizaciju antitela koja nisu ljudskog porekla su poznate u struci. Na primer, humanizovano antitelo ima jedan ili više ostataka aminokiseline uvedenih iz izvora koji nije ljudskog porekla. Ovi ne-humani aminokiselinski ostaci se često nazivaju „uvoznim” ostacima, koji se tipično uzimaju iz „uvoznog” varijabilnog domena. Humanizacija može da se na kraju obavi metodom Wintera i saradnika (Jones i sar., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann i sar., Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen i sar., Science, 239:1534-1536 (1988)), zamenom sekvenci CDR regiona glodara ili CDR regiona za odgovarajuće sekvence humanog antitela. Prema tome, takva „humanizovana” antitela su himerna antitela (U.S. pat. br. 4,816,567), naznačena time što se u značajno manjoj meri netaknuti humani varijabilni domen zamenjuje odgovarajućom sekvencom vrsta koje nisu ljudskog porekla. Obično su humanizovana antitela humana antitela kod kojih su neki CDR ostaci i verovatno neki FR ostaci zamenjeni ostacima sa analognih mesta antitela glodara.

Izbor humanih varijabilnih domena, i lakih i teških, koji će se koristiti za dobijanje humanizovanih antitela, veoma je važan za smanjivanje antigenosti. U skladu sa takozvanom metodom „najboljeg poklapanja“, sekvenca varijabilnog domena antitela glodara upoređuje se sa celom bibliotekom poznatih sekvenci humanih varijabilnih domena. Humana sekvenca koja je najbliža sekvenci glodara zatim se prihvata kao humani okvir (FR) za humanizovano antitelo (Sims i sar., J. Immunol., 151:2296 (1993); Chothia i sar., J. Mol. Biol., 196:901 (1987)). Druga metoda koristi određeni okvir dobijen iz sekvence konsenzusa svih humanih antitela određene podgrupe lakih ili teških lanaca. Isti okvir se može koristiti za nekoliko različitih humanizovanih antitela (Carter i sar., Proc. Natl. Acad Sci. USA, 89:4285 (1992); Presta i sar., J. Immunol., 151:2623 (1993)).

Nadalje, važno je da antitela budu humanizovana uz zadržavanje velikog afiniteta prema antigenu, i drugih povoljnih bioloških osobina. Da bi se to postiglo, prema jednoj realizaciji metode, humanizovana antitela se pripremaju postupkom analize matičnih sekvenci i različitih konceptualnih humanizovanih proizvoda pomoću trodimenzionalnih modela matičnih i humanizovanih sekvenci. Trodimenzionalni imunoglobulinski modeli obično su dostupni, i poznati su stručnjacima u ovoj oblasti. Dostupni su računarski programi koji ilustruju i prikazuju verovatne trodimenzionalne konformacijske strukture odabranih kandidatskih imunoglobulinskih sekvenci. Pregled ovih prikaza omogućava analizu verovatne uloge ostataka u funkcionisanju kandidata za imunoglobulinsku sekvencu, tj. analizu ostataka koji utiču na sposobnost kandidata imunoglobulina da veže svoj antigen. Na ovaj način, FR ostaci se mogu izabrati i kombinovati iz recipijenta i sekvenci uvoza tako da se postigne željena karakteristika antitela, kao što je povećani afinitet za ciljni antigen(e). Uopšteno, ostaci hipervarijabilnog regiona direktno i najneposrednije utiču na vezivanje antigena.

Humana antitela predmetnog pronalaska mogu se izraditi kombinovanjem sekvence(i) varijabilnog domena Fv klona izabranih iz biblioteka prikaza faga ljudskog porekla sa poznatom sekvencom(ama) humanog konstantnog domena kao što je iznad opisano. Alternativno, humana monoklonska antitela predmetnog pronalaska mogu da se proizvedu metodom hibridoma. Opisane su ćelijske linije humanog mijeloma i mišjeg-humanog heteromijeloma za proizvodnju humanih monoklonskih antitela, na primer, Kozbor J. Immunol., 133: 3001 (1984); Brodeur i sar., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, str. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987); i Boerner i sar., J. Immunol., 147: 86 (1991).

Moguće je proizvesti transgene životinje (npr. miševe) koje mogu, po imunizaciji, da proizvode pun repertoar humanih antitela u odsustvu endogene imunoglobulinske produkcije. Na primer, opisano je da homozigotno izbacivanje gena spojnog regiona teškog lanca antitela (JH) kod himernih miševa i miševa sa germinalnim mutacijama dovodi do potpune inhibicije endogene proizvodnje antitela. Transfer čipa humanog gena imunoglobulina germinalne linije u takve miševe sa germinalnim mutacijama dovešće do proizvodnje humanih antitela izazvane antigenom. Pogledajte, npr., Jakobovits i sar, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551 (1993); Jakobovits i sar., Nature, 362:255-258 (1993); Bruggermann i sar., Year in Immuno., 7:33 (1993); i Duchosal i sar. Nature 355:258 (1992).

Takođe, mešanje gena može da se koristi i za dobijanje humanih antitela iz onih koja nisu ljudskog porekla, npr. antitela glodara, pri čemu humano antitelo ima slične afinitete i specifičnosti kao početno antitelo koje nije ljudskog porekla. Prema ovoj metodi, koja se takođe naziva „utiskivanje epitopa“, varijabilni region teškog ili lakog lanca fragmenta antitela koji nije ljudskog porekla, koji je dobijen tehnikama prikaza faga kao što je ovde opisano, zamenjen je repertoarom gena humanih V domena, stvarajući populaciju scFv ili Fab himera humanog lanca/lanca koji nije ljudskog porekla. Selekcija antigenom rezultuje izolacijom himernog scFv ili Fab humanog lanca/lanca koji nije ljudskog porekla, naznačeno time što humani lanac obnavlja mesto vezivanja antigena, uništenog nakon uklanjanja

4

odgovarajućeg lanca koji nije ljudskog porekla, u primarnom klonu prikaza faga, tj. epitop upravlja (utiskuje) izbor partnera u humanom lancu. Kad se postupak ponovi u cilju zamene preostalog lanca koji nije ljudskog porekla, dobija se humano antitelo (pogledajte PCT WO 93/06213 objavljen 1. aprila 1993.). Za razliku od tradicionalne humanizacije antitela koja nisu ljudskog porekla pomoću CDR presađivanja, ova tehnika daje potpuno humana antitela koja nemaju FR ili CDR ostatke koja nisu ljudskog porekla.

(v) Fragmenti antitela

Fragmenti antitela mogu da se proizvedu tradicionalnim načinima, kao što je enzimska digestija, ili rekombinantnim tehnikama. U određenim okolnostima postoje prednosti upotrebe fragmenata antitela, a ne celih antitela. Manja veličina fragmenata omogućava brzo uklanjanje i može dovesti do poboljšanog pristupa čvrstim tumorima. Pregled fragmenata pojedinih antitela potražite u Hudson i sar. (2003) Nat. Med.9:129-134.

Razvijene su različite tehnike za proizvodnju fragmenata antitela. Tradicionalno, ovi fragmenti su izvedeni proteolitičkom digestijom netaknutih antitela (pogledajte, npr. Morimoto i sar., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992); i Brennan i sar., Science, 229:81 (1985)). Međutim, ovi fragmenti se sada mogu proizvesti direktno pomoću rekombinantnih ćelija domaćina. Svi fragmenti Fab, Fv i ScFv antitela se mogu eksprimirati i izlučiti iz E. coli, omogućavajući tako laku proizvodnju velikih količina ovih fragmenata. Fragmenti antitela mogu biti izolovani iz biblioteka faga antitela koja su iznad razmotrena. Alternativno, Fab'-SH fragmenti se mogu direktno dobiti iz E. coli i hemijski vezati da bi se formirali F(ab')2fragmenti (Carter i sar., Bio/Technology 10:163-167 (1992)). Prema drugom pristupu, F(ab')2fragmenti mogu da se izoluju direktno iz rekombinantne kulture ćelija domaćina. Fab i F(ab')2fragment sa povećanim in-vivo poluživotom koji sadrže ostatke epitopa koji vezuju receptor spašavanja, opisani su u U.S. pat. br. 5,869,046. Druge tehnike za proizvodnju fragmenata antitela će biti očigledne stručnjaku. U određenim realizacijama, antitelo je jednolančani Fv fragment (scFv). Pogledajte WO 93/16185; US pat. br. 5,571,894; i 5,587,458. Fv i scFv su jedine vrste sa netaknutim kombinovanim mestima koja su lišena konstantnih regiona; na taj način, oni mogu biti pogodni za smanjeno nespecifično vezivanje tokom in vivo upotrebe. scFv fuzioni proteini mogu biti izrađeni tako da daju fuziju efektorskog proteina na amino ili na karboksi terminusu scFv. Pogledajte Antibody Engineering, izd. Borrebaeck, u tekstu. Fragment antitela može takođe biti npr. „linearno antitelo”, kao što je opisano, na primer, u U.S. pat. br.

5,641,870. Takva linearna antitela mogu biti monospecifična ili bispecifična.

(vi) Multispecifična antitela

Multispecifična antitela imaju specifičnosti vezivanja za najmanje dva različita epitopa, naznačeno time što su epitopi obično iz različitih antigena. Dok takvi molekuli normalno vežu samo dva različita epitopa (tj. bispecifična antitela, BsAbs), antitela sa dodatnim specifičnostima, kao što su trispecifična antitela, se obuhvataju ovom ekspresijom kada se koriste u ovom dokumentu. Bispecifična antitela se mogu pripremiti kao antitela pune dužine ili kao fragmenti antitela (npr. F(ab’)2bispecifična antitela).

Metode za dobijanje bispecifičnih antitela su poznate u struci. Tradicionalna proizvodnja bispecifičnih antitela pune dužine se zasniva na koekspresiji dva para teškog lanca-lakog lanca imunoglobulina, naznačeno time što dva lanca imaju različite specifičnosti (Millstein i sar., Nature, 305:537-539 (1983)). Zbog nasumičnog rasporeda teških i lakih lanaca imunoglobulina, ti hibridomi (kvadromi) proizvode potencijalnu smešu od 10 različitih molekula antitela, od kojih samo jedan ima pravilnu bispecifičnu strukturu. Prečišćavanje ispravnog molekula, što se obično radi afinitetnom hromatografijom, prilično je teško, i prinosi proizvoda su mali. Slični postupci su objavljeni u WO 93/08829 i u radu Traunecker i sar., EMBO J., 10:3655-3659 (1991).

Prema različitom pristupu, varijabilni domeni antitela sa željenim specifičnostima vezivanja (mesta sa kombinacijom antitelo-antigen) spajaju se sa sekvencama konstantnog domena imunoglobulina. Fuzija je poželjno sa konstantnim domenom teškog lanca imunoglobulina, i sadrži bar jedan deo regiona šarke, CH2 i CH3 regione. Tipično je da postoji prvi konstantni region teškog lanca (CH1) koji sadrži mesto potrebno za vezivanje lakog lanca prisutno u bar jednoj fuziji. DNK koje kodiraju fuzije teškog lanca imunoglobulina, i, po želji, lakog lanca imunoglobulina, ubacuju se u odvojene ekspresione vektore i kotransficiraju se u pogodni organizam domaćina. To obezbeđuje veliku fleksibilnost u podešavanju uzajamnih proporcija tri polipeptidna fragmenta u realizacijama kada nejednaki udeli tri polipeptidna lanca upotrebljena za konstrukciju obezbeđuju optimalne prinose. Međutim, moguće je ubaciti kodirajuće sekvence za dva ili sva tri polipeptidna lanca u jedan ekspresioni vektor, kada ekspresija najmanje dva polipeptidna lanca u istim udelima dovodi do većeg prinosa, ili kada prinosi nisu naročito značajni.

U jednoj realizaciji ovog pristupa, bispecifična antitela se sastoje od teškog lanca hibridnog imunoglobulina sa prvom specifičnošću vezivanja na jednom kraku, i para teški lanac-laki lanac hibridnog imunoglobulina (što obezbeđuje drugu specifičnost vezivanja) na drugom kraku. Nađeno je da ova asimetrična struktura olakšava separaciju željenog bispecifičnog jedinjenja od neželjenih kombinacija lanca imunoglobulina, jer prisustvo lakog lanca imunoglobulina kod samo jedne polovine bispecifičnih molekula obezbeđuje lake načine separacije. Ovaj pristup je objavljen u WO 94/04690. Za više detalja za dobijanje bispecifičnih antitela pogledajte, na primer, Suresh i sar., Methods in Enzymology, 121:210 (1986).

Prema drugom pristupu koji opisuje WO96/27011, interfejs između para molekula antitela može se konstruisati radi dobijanja maksimalnog procenta heterodimera koji su izolovani iz rekombinantne ćelijske kulture. Jedan interfejs sadrži najmanje deo CH3 domena konstantnog domena antitela. U ovoj metodi, jedan ili više malih bočnih lanaca aminokiselina sa interfejsa prvog molekula antitela zamenjeni su dužim bočnim lancima (npr. tirozin ili triptofan). Kompenzujuće „šupljine” iste ili slične veličine kao dugački bočni lanac(i) stvaraju se na interfejsu drugog molekula antitela, zamenom dugačkih bočnih lanaca aminokiselina kraćima (npr. alanin ili treonin). To obezbeđuje mehanizam za povećanje prinosa heterodimera u odnosu na druge neželjene krajnje proizvode, kao što su homodimeri.

Bispecifična antitela uključuju unakrsno vezana ili „heterokonjugatna” antitela. Na primer, jedno od antitela u heterokonjugatu može biti kuplovano sa avidinom, a drugo sa biotinom. Za takva antitela je, na primer, predloženo da se koriste za ciljanje ćelija imunskog sistema na neželjene ćelije (U.S. pat. br. 4,676,980), i za lečenje HIV infekcija (WO 91/00360, WO 92/200373 i EP 03089). Heterokonjugatna antitela se mogu napraviti korišćenjem bilo kog pogodnog postupka unakrsnog povezivanja. Pogodni agensi za umrežavanje su dobro poznati u struci, i objavljeni su u U.S. pat. br. 4,676,980, uz druge tehnike umrežavanja.

Tehnike za stvaranje bispecifičnih antitela od fragmenata antitela takođe su opisane u literaturi. Na primer, bispecifična antitela se mogu pripremiti primenom hemijskog vezivanja. Brennan i sar., Science, 229: 81 (1985) opisuju postupak naznačen time što se netaknuta antitela proteolitički cepaju, dajući F(ab')2fragmente. Ovi fragmenti su redukovani u prisustvu ditiol kompleksirajućeg agensa natrijum arsenita da bi se stabilizovali vicinalni ditioli i sprečilo stvaranje intermolekularnih disulfida. Nastali Fab’ fragmenti se zatim prevode u derivate tionitrobenzoata (TNB). Jedan od Fab'-TNB derivata se zatim ponovo konvertuje u Fab'-tiol redukcijom sa merkaptoetilaminom i meša se sa ekvimolarnom količinom drugog Fab'-TNB derivata da bi se formiralo bispecifično antitelo. Proizvedena bispecifična antitela mogu se koristiti kao agensi za selektivnu imobilizaciju enzima.

Nedavni napredak je olakšao direktnu izolaciju Fab'-SH fragmenata iz E. coli, koji se mogu hemijski kuplovati formirajući bispecifična antitela. Shalaby i sar., J. Exp. Med., 175: 217-225 (1992) opisuje proizvodnju potpuno humanizovanog bispecifičnog molekula F(ab’)2antitela. Svaki Fab’ fragment je odvojeno izlučen iz E. coli i podvrgnut usmerenom

4

hemijskom kuplovanju in vitro, da se dobije bispecifično antitelo.

Takođe su opisane različite tehnike za pripremu i izolovanje bispecifičnih fragmenata antitela direktno iz rekombinantne ćelijske kulture. Na primer, bispecifična antitela su proizvedena primenom leucinskih zatvarača. Kostelny i sar., J. Immunol., 148(5): 1547-1553 (1992). Peptidi leucinskog zatvarača iz Fos i Jun proteina vezani su za Fab' delove dva različita antitela putem fuzije gena. Homodimeri antitela su redukovani u regionu zgloba, dajući monomere, i ponovo oksidisani, formirajući heterodimere antitela. Ovaj metod se takođe može koristiti za proizvodnju homodimera antitela. Tehnologija „dijatelo” koju su opisali Hollinger i sar., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993) je obezbedila alternativni mehanizam za dobijanje fragmenata bispecifičnih antitela. Fragmenti obuhvataju varijabilni domen teškog lanca (VH) vezan za varijabilni domen lakog lanca (VL) preko linkera koji je prekratak da omogući sparivanje dva domena na istom lancu. Prema tome, VHi VLdomeni jednog fragmenta su prisiljeni da se spare sa komplementarnim VLi VHdomenima drugog fragmenta, tako formirajući dva antigen-vezujuća mesta. Druga strategija za dobijanje fragmenata bispecifičnih antitela upotrebom jednolančanih Fv (sFv) dimera takođe je objavljena. Pogledajte Gruber i sar, J. Immunol, 152:5368 (1994).

Razmatrana su antitela sa više od dve valence. Na primer, mogu se pripremiti trispecifična antitela. Tuft i sar. J. Immunol.147: 60 (1991).

(vii) Antitela sa jednim domenom

U nekim realizacijama predmetnog pronalaska, antitelo iz predmetnog pronalaska je antitelo sa jednom domenom. Antitelo sa jednim domenom je jedan polipeptidni lanac koji sadrži kompletan varijabilni domen teškog lanca antitela ili njegov deo, ili kompletan varijabilni domen lakog lanca antitela ili njegov deo. U određenim realizacijama predmetnog pronalaska, antitelo sa jednim domenom je humano antitelo sa jednim domenom (Domantis, Inc., Waltham, Mass.; pogledajte, npr., U.S. pat. br. 6,248,516 B1). U jednoj realizaciji, antitelo sa jednim domenom se sastoji od kompletnog varijabilnog domena teškog lanca antitela ili od njegovog dela.

(viii) Varijante antitela

U nekim realizacijama predmetnog pronalaska, razmatrana je modifikacija(e) aminokiselinskih sekvenci antitela opisanih u ovom dokumentu. Na primer, može biti poželjno da se poboljša afinitet vezivanja i/ili druga biološka svojstva antitela. Varijante aminokiselinskih sekvenci antitela se mogu dobiti uvođenjem odgovarajućih promena u sekvencu nukleotida koja kodira antitelo ili putem sinteze peptida. Takve modifikacije uključuju, na primer, uklanjanja, i/ili umetanja, i/ili supstitucije ostataka u aminokiselinskim sekvencama antitela. Svaka kombinacija izbacivanja, ubacivanja i supstitucije može biti napravljena da se dođe do konačnog konstrukta, pod uslovom da konačni konstrukt poseduje željene karakteristike. Izmene aminokiselina se mogu uvesti u aminokiselinsku sekvencu predmetnog antitiela u trenutku kada je ta sekvenca napravljena.

(ix) Derivati antitela

Antitela iz predmetnog pronalaska mogu se dalje modifikovati tako da sadrže dodatne neproteinske funkcionalne ostatke koji su poznati u struci i odmah dostupni. U određenim realizacijama predmetnog pronalaska, funkcionalni ostaci pogodni za derivatizaciju antitela su polimeri rastvorljivi u vodi. Neograničavajući primeri hidrosolubilnih polimera uključuju, ali nisu ograničeni na polietilen glikol (PEG), kopolimere etilen glikol/propilen glikol, karboksimetilcelulozu, dekstran, polivinil alkohol, polivinil pirolidon, poli-1,3-dioksolan, poli-1,3,6-trioksan, kopolimer etilen/anhidrid maleinske kiseline, poliaminokiseline (homopolimere ili nasumične kopolimere), i dekstran ili poli(n-vinil pirolidon)polietilen glikol, propropilen glikol homopolimere, prolipropilen oksid/etilen oksid kopolimere, polioksietilovane poliole (npr. glicerol), polivinil alkohol, i njihove smeše. Polietilen glikol propionaldehid može imati prednosti u proizvodnji zbog svoje stabilnosti u vodi. Polimer može imati bilo koju molekulsku masu, a može biti razgranat ili sa ravnim nizom. Broj polimera vezanih za antitelo može da varira i, ako je više od jednog polimera vezano, to mogu biti isti ili različiti molekuli. U suštini, broj i/ili vrsta polimera korišćenih za derivatizaciju može se odrediti na osnovu razmatranja, uključujući, bez ograničenja, naročite osobine ili funkcije antitela koje treba poboljšati i da li će derivat antitela biti korišćen u terapiji pod definisanim uslovima, itd.

(x) Vektori, ćelije domaćina i rekombinantne metode

Antitela se takođe mogu proizvesti rekombinantnim metodama. Za rekombinantnu proizvodnju anti-antigen antitela, izolovana je nukleinska kiselina koja kodira antitelo i ubačena u replikacioni vektor za dalje kloniranje (amplifikacija DNK) ili za ekspresiju. Kodirajuća DNK antitela može biti lako izolovana i sekvencirana korišćenjem klasičnih postupaka (npr., korišćenjem oligonukleotidnih sondi koje mogu specifično da se vežu za gene koji kodiraju teške i lake lance antitela). Na raspolaganju su mnogi vektori. Komponente vektora generalno uključuju, bez ograničenja, jedno ili više od sledećih: signalnu sekvencu, mesto početka replikacije, jedan ili više marker gena, element za pojačavanje, promoter i sekvencu prekida transkripcije.

(a) Komponenta signalne sekvence

Antitelo predmetnog pronalaska se može proizvesti rekombinantno ne samo direktno,

4

već i kao fuzioni polipeptid sa heterolognim polipeptidom, što je poželjna signalna sekvenca ili kao drugi polipeptid koji ima određeno mesto cepanja na N-terminusu zrelog proteina ili polipeptida. Poželjno je da Izabrana heterologna signalna sekvenca bude ona koju je ćelija domaćina prepoznala i obradila (npr. razdvojena signalnom peptidazom). Za prokariotske ćelije domaćina koje ne prepoznaju i ne obrađuju nativnu signalnu sekvencu antitela, signalna sekvenca je zamenjena prokariotskom signalnom sekvencom izabranom, na primer, iz grupe alkalne fosfataze, penicilinaze, lpp ili termostabilnih lidera II enterotoksina. Za sekreciju kvasca, nativna signalna sekvenca može biti zamenjena npr., liderom invertaze kvasca, liderom faktora (uključujući lidere α-faktora Saccharomyces i Kluyveromyces) ili liderom kiselinske fosfataze, liderom glukomilaze C. albicans ili signalom opisanim u WO 90/13646. U ćelijskoj ekspresiji sisara dostupne su signalne sekvence sisara kao i virusni sekretorni lideri, na primer, gD signal za herpes simpleks.

(b) Mesto početka replikacije

Vektori ekspresije i kloniranja sadrže sekvencu nukleinskih kiselina koja omogućava vektoru da se replikuje u jednoj ili više izabranih ćelija domaćina. Uopšteno, u vektorima kloniranja ova sekvenca je ona koja omogućava da se vektor replikuje nezavisno od hromozomalne DNK domaćina, i uključuje mesto početka replikacije ili sekvence autonomne replikacije. Takve sekvence su dobro poznate za različite bakterije, kvasce i viruse. Mesto početka replikacije iz plazmida pBR322 je pogodno za većinu gram-negativnih bakterija, mesto početka plazmida 2µ je pogodno za kvasac, a mesta početka različitih virusa (SV40, polioma, adenovirus, VSV ili BPV) su korisna za kloniranje vektora u ćelijama sisara. Uopšteno, mesto početka komponente replikacije nije potrebno za ekspresione vektore sisara (mesto početka SV40 se obično može koristiti samo zato što sadrži rani promoter.

(c) Komponenta selekcionog gena

Vektori ekspresije i kloniranja mogu sadržati selekcioni gen, koji se takođe naziva selekcioni marker. Tipični selekcioni geni kodiraju proteine koji (a) pružaju otpornost na antibiotike ili druge toksine, npr., ampicilin, neomicin, metotreksat ili tetraciklin, (b) dopunjuju auksotrofne nedostatke ili (c) dovode kritične nutrijente koji nisu dostupni iz složenih medija, npr., gen koji kodira D-alanin racemazu za Bacili.

Jedan primer šeme selekcije koristi lek za zaustavljanje rasta ćelije domaćina. One ćelije koje se uspešno transformišu heterolognim genom stvaraju proteine koji daju otpornost na lekove i tako preživljavaju režim selekcije. Primeri takve dominantne selekcije koriste lekove neomicin, mikofenolnu kiselinu i higromicin.

Drugi primer pogodnih selektivnih markera za ćelije sisara su oni koji omogućavaju

4

identifikaciju ćelija kompetentnih da preuzmu nukleinsku kiselinu koja kodira antitelo, kao što su DHFR, glutamin sintetaza (GS), timidin kinaza, metalotionein-I i -II, po mogućstvu metalotionein gena primata, adenozin deaminaza, ornitin dekarboksilaza, itd.

Na primer, ćelije transformisane DHFR genom se identifikuju kultivacijom transformanata u medijumu za ćelijske kulture koji sadrži metotreksat (Mtx), konkurentni antagonist DHFR-a. U tim uslovima, DHFR gen se amplifikuje zajedno sa bilo kojom drugom kotransformisanom nukleinskom kiselinom. Može se koristiti ćelijska linija jajnika kineskog hrčka (CHO) sa nedostatkom endogene DHFR aktivnosti (npr. ATCC CRL-9096).

Alternativno, ćelije transformisane GS genom se identifikuju kultivacijom transformanata u medijumu za ćelijske kulture koji sadrži L-metionin sulfoksimin (Msx), inhibitor GS-a. U tim uslovima, GS gen se amplifikuje zajedno sa bilo kojom drugom kotransformisanom nukleinskom kiselinom. GS sistem selekcije/amplifikacije može da se koristi u kombinaciji sa DHFR sistemom selekcije/amplifikacije koji je prethodno opisan.

Alternativno, ćelije domaćina (posebno domaćina divljeg tipa koji sadrže endogeni DHFR) transformišu se ili kotransformišu DNK sekvencama koje kodiraju antitelo od interesa, divlji tip DHFR gena, a drugi selektivni marker kao što je aminoglikozidna 3'-fosfotransferaza (APH) može se izabrati na osnovu rasta ćelija u medijumu koji sadrži selekcioni agens za selektivni marker, kao što je aminoglikozidni antibiotik, npr., kanamicin, neomicin ili G418. Pogledajte U.S. pat. br.4,965,199.

Pogodan selekcioni gen za upotrebu u kvascu je gen trp1 prisutan u kvasnom plazmidu YRp7 (Stinchcomb i sar., Nature, 282:39 (1979)). Gen trp1 daje selekcioni marker za mutirani soj kvasca kojem nedostaje sposobnost rasta u triptofanu, na primer, ATCC br.

44076 ili PEP4-1. Jones, Genetics, 85:12 (1977). Tada prisutnost trp1 lezije u genomu ćelije kvasca domaćina obezbeđuje efikasno okruženje za otkrivanje transformacije na osnovu rasta u odsustvu triptofana. Slično tome, sojevi kvasca sa manjkom Leu2 (ATCC 20,622 ili 38,626) se dopunjuju poznatim plazmidima koji nose Leu2 gen.

Pored toga, vektori izvedeni iz 1,6 µm kružnog plazmida pKD1 mogu se koristiti za transformaciju kvasaca iz roda Kluyveromyces. Alternativno, za K. lactis je prijavljen sistem ekspresije za veliku proizvodnju rekombinantnog telećeg himozina. Van den Berg, Bio/Technology, 8:135 (1990). Takođe, objavljeni su i stabilni ekspresioni vektori od više kopija za sekreciju zrelog rekombinantnog humanog serumskog albumina kod industrijskih sojeva Kluyveromyces. Fleer i sar., Bio/Technology, 9:968-975 (1991).

(d) Komponenta promotera

Vektori ekspresije i kloniranja uglavnom sadrže promoter koji prepoznaje organizam

4

domaćina i funkcionalno je povezan sa nukleinskom kiselinom koja kodira antitelo. Promoteri pogodni za upotrebu sa prokariotskim domaćinima uključuju pho A promoter, sistem promotera β-laktamaze i laktoze, promoter alkalne fosfataze, sistem promotera triptofan (trp) i promotere hibrida kao što je tac-promoter. Međutim, pogodni su i drugi poznati bakterijski promoteri. Promoteri za upotrebu u bakterijskim sistemima će takođe sadržati Shine-Dalgarno (SD) sekvencu koja je funkcionalno povezana sa kodirajućom DNK antitela.

Sekvence promotera su poznate po eukariotama. Gotovo svi eukariotski geni imaju region bogat AT-om koji se nalazi otprilike 25 do 30 baza ispred mesta na kome je pokrenuta transkripcija. Druga sekvenca koja je pronađena 70 do 80 baza iza početka transkripcije mnogih gena region u kojem N može biti bilo koji nukleotid. Na 3' kraju većine eukariotskih gena je sekvenca koja može biti signal za dodavanje poli A završeka na 3' kraj kodirajuće sekvence. Sve ove sekvence su pogodno umetnute u eukariotske ekspresione vektore.

Primeri pogodnih sekvenci promotera za upotrebu sa domaćinom kvasca uključuju promotere za 3-fosfoglicerat kinazu ili druge glikolitičke enzime, kao što su enolaza, gliceraldehid-3-fosfat dehidrogenaza, heksokinaza, piruvat dekarboksilaza, fosfofruktokinaza, glukoza-6-fosfat izomeraza, 3-fosfoglicerat mutaza, piruvat kinaza, triosefosfat izomeraza, fosfoglukozna izomeraza i glukokinaza.

Ostali promoteri kvasca, promoteri koji se mogu indukovati i koji imaju dodatnu prednost transkripcije pod kontrolom uslova rasta, predstavljaju regione promotera za alkohol dehidrogenazu 2, izocitohrom C, kiselinsku fosfatazu, razgradive enzime povezane sa metabolizmom azota, metalotionein, gliceraldehid-3-fosfat dehidrogenazu i enzime odgovorne za iskorišćenost maltoze i galaktoze. Pogodni vektori i promoteri za upotrebu u ekspresiji kvasca su dalje opisani u EP 73,657. Pojačivači kvasca se takođe povoljno koriste sa promoterima kvasca.

Transkripcija antitela iz vektora u ćelijama domaćina sisara se može kontrolisati, na primer, promoterima dobijenim iz genoma virusa, kao što su polioma virus, ptičji pox virus, adenovirus (poput Adenovirusa 2), goveđi papiloma virus, ptičji sarkomni virus, citomegalovirus, retrovirus, virus hepatitisa B, Simijan virus 40 (SV40), ili iz heterolognih promotera sisara, npr. promotera aktina ili imunoglobulinskog promotera, iz promotera toplotnog udara, pod uslovom da su takvi promoteri kompatibilni sa ćelijskim sistemima domaćina.

Rani i kasni promoteri virusa SV40 se jednostavno dobijaju kao restrikcioni fragment

4

SV40 koji takođe sadrži virusno mesto početka replikacije SV40. Neposredni rani promoter humanog citomegalovirusa se jednostavno dobija kao restrikcioni fragment HindIII E. Sistem za ekspresiju DNK kod domaćina sisara koji koristi goveđi papiloma virus kao vektor, naveden je u U.S. pat. br. 4,419,446. Modifikacija ovog sistema je opisana u U.S. pat. br.

4,601,978. Takođe, pogledajte Reyes i sar., Nature 297:598-601 (1982) o ekspresiji cDNK humanog β-interferona u ćelijama miševa pod kontrolom promotera timidin kinaze iz virusa herpes simpleks. Alternativno, dugo, krajnje ponavljanje Rous sarkomnog virusa može se koristiti kao promoter.

(e) Komponenta elementa za pojačavanje

Transkripcija kodirajuće DNK antitela predmetnog pronalaska kod viših eukariota se često povećava umetanjem pojačivačke sekvence u vektor. Danas su poznate mnoge pojačivačke sekvence iz gena sisara (globin, elastaza, albumin, α-fetoprotein i insulin). Međutim, obično će neko koristiti pojačivač iz virusa eukariotske ćelije. Primeri uključuju pojačivač SV40 na kasnoj strani mesta početka replikacije (bp 100-270), pojačivač ranog promotera citomegalovirusa, pojačivač poliome na kasnoj strani mesta početka replikacije i pojačivače adenovirusa. Takođe, pogledajte Yaniv, Nature 297: 17-18 (1982) o elementima za pojačavanje za aktivaciju eukariotskih promotera. Pojačivač se može spojiti u vektor na položaju 5' ili 3' prema kodirajućoj sekvenci antitela, ali poželjno je da se nalazi na mestu 5' od promotera.

(f) Komponenta prekida transkripcije

Ekspresioni vektori koji se koriste u eukariotskim ćelijama domaćina (kvasac, gljive, insekti, biljke, životinje, ljudi ili nukleirane ćelije iz drugih višećelijskih organizama) će takođe sadržati sekvence neophodne za prekid transkripcije i za stabilizaciju mRNK. Takve sekvence su obično dostupne iz 5' i ponekad 3' neprotumačenih regiona eukariotskih ili virusnih DNK ili cDNK. Ovi regioni sadrže nukleotidne segmente koji su transkribovani kao poliadenilirani fragmenti u neprotumačenom delu kodirajuće mRNK antitela. Jedna korisna komponenta prekida transkripcije je region poliadenilacije goveđeg hormona rasta. Pogledajte WO94/11026 i tamo navedeni ekspresioni vektor.

(g) Selekcija i transformacija ćelija domaćina

Pogodne ćelije domaćina za kloniranje ili ekspresiju DNK u ovde navedenim vektorima su prokariotske, kvasne ili više eukariotske ćelije ranije opisane. Pogodni prokarioti za tu svrhu uključuju eubakterije, kao što su gram-negativni ili gram-pozitivni organizmi, na primer, Enterobacteriaceae kao što je Escherichia, npr., E. coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, npr. Salmonella typhimurium, Serratia, npr.,

4

Serratia marcescans, i Shigella, kao i Bacili kao što je B. subtilis i B. licheniformis (npr., B. licheniformis 41P navedeno u DD 266,710 objavljeno 12. aprila 1989), Pseudomonas kao što je P. aeruginosa, i Streptomyces. Jedan poželjni domaćin za kloniranje E. coli je E. coli 294 (ATCC 31,446), mada su pogodni i drugi sojevi, kao što su E. coli B, E. coli X1776 (ATCC 31,537) i E. coli W3110 (ATCC 27,325). Ovi primeri su više ilustrativni nego ograničavajući.

Antitelo pune dužine, fuzioni proteini antitela i fragmenti antitela se mogu proizvesti u bakterijama, posebno kada glikozilacija i efektorska funkcija Fc nisu potrebni, poput one kada se terapeutsko antitelo konjuguje sa citotoksičnim agensom (npr. toksinom) koji sam po sebi pokazuje efikasnost u uništavanju tumorskih ćelija. Antitela pune dužine imaju veći poluživot u cirkulaciji. Proizvodnja u E. coli je brža i isplativija. Za ekspresiju fragmenata antitela i polipeptida u bakterijama, pogledajte, npr., U.S. pat. br. 5,648,237 (Carter i sar.), U.S. pat. br. 5,789,199 (Joly i sar.), U.S. pat. br. 5,840,523 (Simmons i sar.), koji opisuju region inicijacije translacije (TIR) i signalne sekvence za optimizaciju ekspresije i sekrecije. Pogledajte takođe Charlton, Methods in Molecular Biology, tom 248 (B. K. C. Lo, izd., Humana Press, Totowa, N.J., 2003), str. 245-254, u kom se opisuje ekspresija fragmenata antitela u E. coli. Nakon ekspresije, antitelo se može izolovati iz ćelije E. coli u rastvorljivoj frakciji i može se prečistiti kroz, npr., kolonu proteina A ili G, u zavisnosti od izotipa. Konačno prečišćavanje se može sprovesti slično procesu prečišćavanja antitela eksprimiranih, npr. u CHO ćelijama.

Pored prokariota, eukariotski mikroorganizmi kao što su filamentozne gljivice ili kvasci su pogodni domaćini za kloniranje ili ekspresiju za vektore koji kodiraju antitelo. Saccharomyces cerevisiae, odnosno obični pekarski kvasac, se najčešće koristi među nižim eukariotskim mikroorganizmima domaćina. Međutim, brojni drugi rodovi, vrste i sojevi su ovde dostupni i korisni, kao što je Schizosaccharomyces pombe; Kluyveromyces domaćini, kao npr. K. lactis, K. fragilis (ATCC 12,424), K. bulgaricus (ATCC 16,045), K. wickeramii (ATCC 24,178), K. waltii (ATCC 56,500), K. drosophilarum (ATCC 36,906), K. thermotolerans i K. marxianus; yarrowia (EP 402,226); Pichia pastoris (EP 183.070); Candida; Trichoderma reesia (EP 244.234); Neurospora crassa; Schwanniomyces poput Schwanniomyces occidentalis; i vlaknaste gljive kao npr. Neurospora, Penicillium, Tolypocladium i Aspergillus domaćini, kao što su A. nidulans i A. niger. Za pregled razmatranja o korišćenju kvasca i vlaknastih gljivica za proizvodnju terapeutskih proteina, pogledajte npr., Gerngross, Nat. Biotech.22: 1409-1414 (2004).

Moguće je izabrati određene sojeve gljivica i kvasaca kod kojih su putevi glikozilacije „humanizovani“, što rezultuje proizvodnjom antitela sa delimičnim ili potpuno humanim obrascem glikozilacije. Pogledajte, npr., rad Li i sar., Nat. Biotech. 24:210-215 (2006) (opisuje humanizaciju puta glikozilacije u Pichia pastoris); i Gerngross i sar., u tekstu.

Pogodne ćelije domaćini za ekspresiju glikozilovanog antitela, isto tako, izvedene su od višećelijskih organizama (beskičmenjaka i kičmenjaka). Primeri ćelija beskičmenjaka uključuju ćelije biljaka i insekata. Identifikovani su brojni bakuloviralni sojevi i varijante i odgovarajuće dozvoljene ćelije domaćina insekata iz domaćina kao što su Spodoptera frugiperda (gusenica), Aedes aegypti (komarac), Aedes albopictus (komarac), Drosophila melanogaster (voćna mušica) i Bombyx mori. Raznovrsni sojevi virusa za transfekciju su javno dostupni, npr., L-1 varijanta Autographa californica NPV i Bm-5 soj Bombyx mori NPV, a takvi virusi se mogu koristiti kao ovde naveden virus shodno pronalasku, posebno za transfekciju ćelija Spodoptera frugiperda.

Biljne ćelijske kulture pamuka, kukuruza, krompira, soje, petunije, paradajza, vodene leće (Leninaceae), lucerke (M. truncatula) i duvana mogu se koristiti kao domaćini. Pogledajte, npr., U.S. pat. br. 5,959,177, 6,040,498, 6,420,548, 7,125,978 i 6,417,429 (opisuju PLANTIBODIES™ tehnologiju za proizvodnju antitela u transgenim biljkama).

Ćelije kičmenjaka se mogu koristiti kao domaćini, a razmnožavanje ćelija kičmenjaka u kulturi (kultura tkiva) je postao rutinski postupak. Primeri korisnih ćelijskih linija domaćina sisara su CV1 linija majmunskog bubrega transformisana sa SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); linija bubrega ljudskog embriona (293 ili 293 ćelije subklonirane za rast u kulturi suspenzije, Graham i sar., J. Gen Virol. 36:59 (1977)); ćelije bubrega bebe hrčka (BHK, ATCC CCL 10); ćelije sertolija miša (TM4, Mather, Biol. Reprod.23:243-251 (1980)); ćelije bubrega majmuna (CV1 ATCC CCL 70); ćelije bubrega afričkog zelenog majmuna (VERO-76, ATCC CRL-1587); ćelije humanog karcinoma grlića maternice (HELA, ATCC CCL 2); ćelije bubrega pasa (MDCK, ATCC CCL 34); ćelije jetre bufalo pacova (BRL 3A, ATCC CRL 1442); ljudske ćelije pluća (W138, ATCC CCL 75); ljudske ćelije jetre (Hep G2, HB 8065); tumor dojke miša (MMT 060562, ATCC CCL51); TRI ćelije (Mather i sar., Annals N.Y. Acad. Sci.383:44-68 (1982)); MRC 5 ćelije; FS4 ćelije; i linija ljudskog hepatoma (Hep G2). Ostale korisne ćelijske linije domaćina sisara uključuju ćelije jajnika kineskog hrčka (CHO), uključujući DHFR<->CHO ćelije (Urlaub i sar., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)); i ćelijske linije mijeloma, kao što su NS0 i Sp2/0. Radi pregleda izvesnih ćelijskih linija domaćina sisara, pogodnih za proizvodnju antitela, pogledajte, npr., Yazaki i Wu, Methods in Molecular Biology, tom 248 (B. K. C. Lo, izd., Humana Press, Totowa, N.J., 2003), str.255-268.

Ćelije domaćina se transformišu pomoću ranije opisanih vektora ekspresije ili

1

kloniranja za proizvodnju antitela i uzgajaju u uobičajenim nutrijentnim medijima modifikovanim prema odgovarajućim promoterima indukcije, selekciji transformanata ili amplifikaciji gena koji kodiraju željene sekvence.

(h) Kultivacija ćelija domaćina

Ćelije domaćina koje se koriste za proizvodnju antitela predmetnog pronalaska mogu se uzgajati u različitim medijima. Komercijalno dostupni mediji, kao što su Hamov F10 (Sigma), minimalni esencijalni medijum ((MEM), (Sigma), RPMI-1640 (Sigma) i Dulbeccov modifikovan Eagleov medijum ((DMEM), Sigma) pogodni su za kultivaciju ćelija domaćina. Pored toga, bilo koji od medija opisan u radu Ham i sar., Meth. Enz. 58:44 (1979), Barnes i sar., Anal. Biochem. 102:255 (1980), U.S. pat. br. 4,767,704; 4,657,866; 4,927,762; 4,560,655; ili 5,122,469; WO 90/03430; WO 87/00195; ili U.S. pat. Re. 30,985 se može koristiti kao mediji kulture za ćelije domaćina. Bilo koji od ovih medija se može po potrebi dopuniti hormonima i/ili drugim faktorima rasta (kao što su insulin, transferin ili epidermalni faktor rasta), solima (poput natrijum-hlorida, kalcijuma, magnezijuma i fosfata), puferima (kao što je HEPES), nukleotidima (poput adenozina i timidina), antibioticima (poput leka GENTAMYCIN™), elementima u tragovima (definisani kao neorganska jedinjenja koja su obično prisutna u krajnjim koncentracijama u mikromolarnom opsegu) i glukozom ili ekvivalentnim izvorom energije. Takođe, bilo koji drugi dodaci se mogu uključiti u odgovarajućim koncentracijama koje bi bile poznate stručnjacima u ovoj oblasti. Uslovi kulture, poput temperature, pH vrednosti i slično, su oni koji su prethodno korišćeni sa ćelijom domaćina izabranom za ekspresiju, i biće jasni osobi iz struke.

(xi) Prečišćavanje antitela

Kada se koriste rekombinantne tehnike, antitelo se može proizvesti intracelularno, u periplazmičkom prostoru ili direktno izlučiti u medij. Ako se antitelo proizvodi intracelularno, kao prvi korak, ostaci čestica, bilo ćelije domaćina ili lizirani fragmenti, uklanjaju se, na primer, centrifugiranjem ili ultrafiltracijom. Carter i sar., Bio/ Technology 10:163-167 (1992) opisuju proceduru za izolaciju antitela koja se luče u periplazmički prostor E. coli. Ukratko, ćelijska pasta se odmrzava u prisustvu natrijum-acetata (pH 3,5), EDTA i fenilmetilsulfonilfluorida (PMSF) tokom oko 30 min. Ostaci ćelija se mogu ukloniti centrifugiranjem. Tamo gde se antitelo izlučuje u medijum, supernatanti iz takvih sistema ekspresije se uglavnom prvo koncentrišu korišćenjem komercijalno dostupnog filtera koncentracije proteina, na primer, „Amicon” ili „Millipore Pellicon” ultrafiltracijske jedinice. Inhibitor proteaze, kao što je PMSF, može biti uključen u bilo koji od prethodnih koraka da bi se inhibirala proteoliza i mogu biti uključeni antibiotici kako bi se sprečio rast adventnih

2

kontaminata.

Sastav antitela pripremljen iz ćelija može se prečistiti korišćenjem, na primer, hidroksilapatitske hromatografije, hromatografije hidrofobne interakcije, gel elektroforeze, dijalize i afinitetne hromatografije, pri čemu je afinitetna hromatografija jedan od tipično poželjnih koraka prečišćavanja. Prikladnost proteina A kao afiniteta prema ligandu zavisi od vrsta i izotipa bilo kojeg imunoglobulinskog Fc domena koji je prisutan u antitelu. Protein A se može koristiti za prečišćavanje antitela koja se baziraju na humanim γ1, γ2 ili γ4 teškim lancima (Lindmark i sar., J. Immunol. Meth.62:1-13 (1983)). Protein G se preporučuje za sve mišje izotipove i za humani γ3 (Guss i sar., EMBO J.5:15671575 (1986)). Matrica na koju je vezan afinitet prema ligandu je najčešće agaroza, međutim, dostupne su i druge matrice. Mehanički stabilne matrice, kao što je staklo kontrolisane poroznosti ili poli(stirenedivinil)benzen, omogućavaju brže protoke i kraća vremena obrade nego što se to može postići sa agarozom. Ako antitelo sadrži CH3 domen, smola Bakerbond ABX™ (J.T. Baker, Phillipsburg, N.J.) je korisna za prečišćavanje. Takođe su dostupne i druge tehnike prečišćavanja proteina, kao što su frakcionisanje na koloni za jonsku izmenu, taloženje etanolom, HPLC reverzne faze, hromatografija na silicijum dioksidu, hromatografija na heparinskoj hromatografiji SEPHAROSE™ na anjonskoj ili katjonskoj izmeni smole (poput kolone poliaspartinske kiseline), hromatofokusiranje,SDS-PAGE i taloženje amonijum sulfata, u zavisnosti od antitela koje treba izolovati.

Generalno, u struci su dobro utvrđene različite metodologije pripreme antitela za upotrebu u istraživanjima, testiranju i kliničkim ispitivanjima, u skladu sa iznad opisanim metodologijama i/ili ako stručnjak u ovoj oblasti smatra da je to odgovarajuće za određeno antitelo od interesa.

C. Selekcija biološki aktivnih antitela

Antitela proizvedena kao što je iznad opisano, mogu biti podvrgnuta jednom ili više testovima „biološke aktivnosti“ radi selekcije antitela sa korisnim svojstvima iz terapijske perspektive ili selekcije formulacija i uslova koji zadržavaju biološku aktivnost antitela. Antitelo se može testirati na njegovu sposobnost vezivanja antigena za koji je uzgojeno. Na primer, za anti-PDL1 antitelo, svojstva vezivanja antitela za antigen se mogu proceniti u testu koji otkriva sposobnost vezivanja za PDL1. U nekim realizacijama, vezivanje antitela se može odrediti, na primer, saturacionim vezivanjem; ELISA testom; i/ili testovima kompeticije (npr. RIA). Takođe, antitelo može biti podvrgnuto drugim analizama biološke aktivnosti, npr. da bi se procenila njegova efikasnost kao terapeutika. Takvi testovi su poznati u struci i zavise od ciljnog antigena i predviđene upotrebe za antitelo. Na primer, biološki efekti blokade PD-L1 antitelom se mogu proceniti u CD8+T ćelijama, modelu mišjeg virusa limfocitnog horiomeningitisa (LCMV) i/ili modelu singenetskog tumora, npr. kao što je opisano u US patentu 8,217,149.

Za proveru antitela koja se vežu na određeni epitop na antigenu od interesa (npr. ona koja blokiraju vezivanje anti-PDL1 antitela iz primera za PD-L1), može se izvesti rutinski test unakrsnog blokiranja, kao što je onaj opisan u radu Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow i David Lane (1988). Alternativno, može se izvesti mapiranje epitopa, npr. kao što je opisano u radu Champe i sar., J. Biol. Chem. 270: 1388-1394 (1995), da bi se utvrdilo da li antitelo veže epitop od interesa.

D. Priprema formulacija

Nakon pripreme antitela od interesa (npr. tehnike za proizvodnju antitela koja se mogu formulisati kao što je navedeno u predmetnom pronalasku, biće razrađene u nastavku i poznate su u struci), priprema se farmaceutska formulacija koja ga sadrži. U nekim realizacijama, antitelo koje se formuliše nije podvrgnuto prethodnoj liofilizaciji i formulacija od interesa u predmetnom pronalasku je vodena formulacija. Terapeutski efikasna količina antitela prisutnog u formulaciji se određuje, na primer, uzimanjem u obzir željenih količina doze i načina davanja. Od oko 25 mg/ml do oko 150 mg/ml, ili od oko 30 mg/ml do oko 140 mg/ml, ili od oko 35 mg/ml do oko 130 mg/ml, ili od oko 40 mg/ml do oko 120 mg/ml, ili od oko 50 mg/ml do oko 130 mg/ml, ili odo oko 50 mg/ml do oko 125 mg/ml, ili od oko 50 mg/ml do oko 120 mg/ml, ili od oko 50 mg/ml do oko 110 mg/ml, ili od oko 50 mg/ml do oko 100 mg/ml, ili od oko 50 mg/ml do oko 90 mg/ml, ili od oko 50 mg/ml do oko 80 mg/ml, oili od oko 54 mg/ml do oko 66 mg/ml je primer koncentracije antitela u formulaciji predmetnog pronalaska.

Vodena formulacija se priprema sa antitelom u puferisanom pH rastvoru. Pufer predmetnog pronalaska ima pH vrednost u opsegu od oko 5,0 do oko 7,0. U nekim realizacijama predmetnog pronalaska, pH je u opsegu od oko 5,0 do oko 6,5, pH je u opsegu od oko 5,0 do oko 6,4, u opsegu od oko 5,0 do oko 6,3, pH je u opsegu od oko 5,0 do oko 6,2, pH je u opsegu od oko 5,0 do oko 6,1, pH je u opsegu od oko 5,5 do oko 6,1, pH je u opsegu od oko 5,0 do oko 6,0, pH je u opsegu od oko 5,0 do oko 5,9, pH je u opsegu od oko 5,0 do oko 5,8, pH je u opsegu od oko 5,1 do oko 6,0, pH je u opsegu od oko 5,2 do oko 6,0, pH je u opsegu od oko 5,3 do oko 6,0, pH je u opsegu od oko 5,4 do oko 6,0, pH je u opsegu od oko 5,5 do oko 6,0, pH je u opsegu od oko 5,6 do oko 6,0, pH je u opsegu od oko 5,7 do oko 6,0 ili je pH u opsegu od oko 5,8 do oko 6,0. U određenim realizacijama predmetnog pronalaska, formulacija ima pH vrednost 6,0 ili oko 6,0. U određenim realizacijama

4

predmetnog pronalaska, formulacija ima pH vrednost 5,9 ili oko 5,9. U određenim realizacijama predmetnog pronalaska, formulacija ima pH vrednost 5,8 ili oko 5,8. U određenim realizacijama predmetnog pronalaska, formulacija ima pH vrednost 5,7 ili oko 5,7. U određenim realizacijama predmetnog pronalaska, formulacija ima pH vrednost 5,6 ili oko 5,6. U određenim realizacijama predmetnog pronalaska, formulacija ima pH vrednost 5,5 ili oko 5,5. U određenim realizacijama predmetnog pronalaska, formulacija ima pH vrednost 5,4 ili oko 5,4. U određenim realizacijama predmetnog pronalaska, formulacija ima pH vrednost 5,3 ili oko 5,3. U određenim realizacijama predmetnog pronalaska, formulacija ima pH vrednost 5,2 ili oko 5,2. Primeri pufera koji će kontrolisati pH vrednost u okviru ovog raspona uključuju histidin (poput L-histidina) ili natrijum acetat. U određenim realizacijama, pufer sadrži histidin acetat ili natrijum acetat u koncentraciji od 15 mM do 25 mM. U određenim realizacijama predmetnog pronalaska, pufer sadrži histidin acetat ili natrijum acetat u koncentraciji od oko 15 mM do oko 25 mM, oko 16 mM do oko 25 mM, oko 17 mM do oko 25 mM, oko 18 mM do oko 25 mM, oko 19 mM do oko 25 mM, oko 20 mM do oko 25 mM, oko 21 mM do oko 25 mM, oko 22 mM do oko 25 mM, oko 15 mM, oko 16 mM, oko 17 mM, oko 18 mM, oko 19 mM, oko 20 mM, oko 21 mM, oko 22 mM, oko 23 mM, oko 24 mM ili oko 25 mM. U jednoj realizaciji predmetnog pronalaska, pufer je histidin acetat ili natrijum acetat u količini od oko 20 mM, pH vrednosti 5,0. U jednoj realizaciji predmetnog pronalaska, pufer je histidin acetat ili natrijum acetat u količini od oko 20 mM, pH vrednosti 5,1. U jednoj realizaciji predmetnog pronalaska, pufer je histidin acetat ili natrijum acetat u količini od oko 20 mM, pH vrednosti 5,2. U jednoj realizaciji predmetnog pronalaska, pufer je histidin acetat ili natrijum acetat u količini od oko 20 mM, pH vrednosti 5,3. U jednoj realizaciji predmetnog pronalaska, pufer je histidin acetat ili natrijum acetat u količini od oko 20 mM, pH vrednosti 5,4. U jednoj realizaciji predmetnog pronalaska, pufer je histidin acetat ili natrijum acetat u količini od oko 20 mM, pH vrednosti 5,5. U jednoj realizaciji predmetnog pronalaska, pufer je histidin acetat ili natrijum acetat u količini od oko 20 mM, pH vrednosti 5,6. U jednoj realizaciji predmetnog pronalaska, pufer je histidin acetat ili natrijum acetat u količini od oko 20 mM, pH vrednosti 5,7. U jednoj realizaciji predmetnog pronalaska, pufer je histidin acetat ili natrijum acetat u količini od oko 20 mM, pH vrednosti 5,8. U jednoj realizaciji predmetnog pronalaska, pufer je histidin acetat ili natrijum acetat u količini od oko 20 mM, pH vrednosti 5,9. U jednoj realizaciji predmetnog pronalaska, pufer je histidin acetat ili natrijum acetat u količini od oko 20 mM, pH vrednosti 6,0. U jednoj realizaciji predmetnog pronalaska, pufer je histidin acetat ili natrijum acetat u količini od oko 20 mM, pH vrednosti 6,1. U jednoj realizaciji predmetnog pronalaska, pufer je histidin acetat ili natrijum acetat u količini od oko 20 mM, pH vrednosti 6,2. U jednoj realizaciji predmetnog pronalaska, pufer je histidin acetat ili natrijum acetat u količini od oko 20 mM, pH vrednosti 6,3. U jednoj realizaciji predmetnog pronalaska, pufer je histidin acetat ili natrijum acetat u količini od oko 25 mM, pH vrednosti 5,2. U jednoj realizaciji predmetnog pronalaska, pufer je histidin acetat ili natrijum acetat u količini od oko 25 mM, pH vrednosti 5,3. U jednoj realizaciji predmetnog pronalaska, pufer je histidin acetat ili natrijum acetat u količini od oko 25 mM, pH vrednosti 5,4. U jednoj realizaciji predmetnog pronalaska, pufer je histidin acetat ili natrijum acetat u količini od oko 25 mM, pH vrednosti 5,5. U jednoj realizaciji predmetnog pronalaska, pufer je histidin acetat ili natrijum acetat u količini od oko 25 mM, pH vrednosti 5,6. U jednoj realizaciji predmetnog pronalaska, pufer je histidin acetat ili natrijum acetat u količini od oko 25 mM, pH vrednosti 5,7. U jednoj realizaciji predmetnog pronalaska, pufer je histidin acetat ili natrijum acetat u količini od oko 25 mM, pH vrednosti 5,8. U jednoj realizaciji predmetnog pronalaska, pufer je histidin acetat ili natrijum acetat u količini od oko 25 mM, pH vrednosti 5,9. U jednoj realizaciji predmetnog pronalaska, pufer je histidin acetat ili natrijum acetat u količini od oko 25 mM, pH vrednosti 6,0. U jednoj realizaciji predmetnog pronalaska, pufer je histidin acetat ili natrijum acetat u količini od oko 25 mM, pH vrednosti 6,1. U jednoj realizaciji predmetnog pronalaska, pufer je histidin acetat ili natrijum acetat u količini od oko 25 mM, pH vrednosti 6,2. U jednoj realizaciji predmetnog pronalaska, pufer je histidin acetat ili natrijum acetat u količini od oko 25 mM, pH vrednosti 6,3.

Formulacija dalje sadrži saharozu u količini od 60 mM do 240 mM. U nekim realizacijama predmetnog pronalaska, saharoza u formulaciji iznosi od oko 60 mM do oko 230 mM, od oko 60 mM do oko 220 mM, od oko 60 mM do oko 210 mM, od oko 60 mM do oko 200 mM, od oko 60 mM do oko 190 mM, od oko 60 mM do oko 180 mM, od oko 60 mM do oko 170 mM, od oko 60 mM do oko 160 mM, od oko 60 mM do oko 150 mM, od oko 60 mM do oko 140 mM, od oko 80 mM do oko 240 mM, oko 90 mM do oko 240 mM, oko 100 mM do oko 240 mM, oko 110 mM do oko 240 mM, oko 120 mM do oko 240 mM, oko 130 mM do oko 240 mM, oko 140 mM do oko 240 mM, oko 150 mM do oko 240 mM, od oko 160 mM do oko 240 mM, oko 170 mM do oko 240 mM, od oko 180 mM do oko 240 mM, od 190 mM do oko 240 mM, od oko 200 mM do oko 240 mM, oko 80 mM do oko 160 mM, oko 100 mM do oko 140 mM ili oko 110 mM do oko 130 mM. U nekim realizacijama, saharoza u formulaciji iznosi oko 60 mM, oko 70 mM, oko 80 mM, oko 90 mM, oko 100 mM, oko 110 mM, oko 120 mM, oko 130 mM, oko 140 mM, oko 150 mM, oko 160 mM, oko 170 mM, oko 180 mM, oko 190 mM, oko 200 mM, oko 210 mM, oko 220 mM, oko 230 mM ili oko 240 mM.

U nekim realizacijama, koncentracija antitela u formulaciji iznosi 40 mg/ml do 125 mg/ml. U nekim realizacijama predmetnog pronalaska, koncentracija antitela u formulaciji iznosi od oko 40 mg/ml do oko 120 mg/ml, oko 40 mg/ml do oko 110 mg/ml, oko 40 mg/ml do oko 100 mg/ml, oko 40 mg/ml do oko 90 mg/ml, oko 40 mg/ml do oko 80 mg/ml, oko 40 mg/ml do oko 70 mg/ml, oko 50 mg/ml do oko 120 mg/ml, oko 60 mg/ml do oko 120 mg/ml, oko 70 mg/ml do oko 120 mg/ml, oko 80 mg/ml do oko 120 mg/ml, oko 90 mg/ml do oko 120 mg/ml, ili oko 100 mg/ml do oko 120 mg/ml. U nekim realizacijama predmetnog pronalaska, koncentracija antitela u formulaciji iznosi oko 60 mg/ml. U nekim realizacijama predmetnog pronalaska, koncentracija antitela u formulaciji iznosi oko 65 mg/ml. U nekim realizacijama predmetnog pronalaska, koncentracija antitela u formulaciji iznosi oko 70 mg/ml. U nekim realizacijama predmetnog pronalaska, koncentracija antitela u formulaciji iznosi oko 75 mg/ml. U nekim realizacijama predmetnog pronalaska, koncentracija antitela u formulaciji iznosi oko 80 mg/ml. U nekim realizacijama predmetnog pronalaska, koncentracija antitela u formulaciji iznosi oko 85 mg/ml. U nekim realizacijama predmetnog pronalaska, koncentracija antitela u formulaciji iznosi oko 90 mg/ml. U nekim realizacijama predmetnog pronalaska, koncentracija antitela u formulaciji iznosi oko 95 mg/ml. U nekim realizacijama predmetnog pronalaska, koncentracija antitela u formulaciji iznosi oko 100 mg/ml. U nekim realizacijama predmetnog pronalaska, koncentracija antitela u formulaciji iznosi oko 110 mg/ml. U nekim realizacijama predmetnog pronalaska, koncentracija antitela u formulaciji iznosi oko 125 mg/ml.

U nekim realizacijama, surfaktant se dodaje formulaciji antitela. Primeri surfaktanata uključuju nejonske surfaktante, kao što su polisorbati (npr. polisorbati 20, 80, itd.) Ili poloksameri (npr. poloksamer 188, itd.). Količina dodatog surfaktanta je takva da smanjuje agregaciju formulisanog antitela i/ili minimizuje stvaranje čestica u formulaciji i/ili smanjuje adsorpciju. Na primer, surfaktant može biti prisutan u formulaciji u količini od oko 0,001% do oko 0,5% (w/v). U nekim realizacijama predmetnog pronalaska, surfaktant (npr. polisorbat 20) iznosi od oko 0,005% do oko 0,2%, od oko 0,005% do oko 0,1%, od oko 0,005% do oko 0,09%, od oko 0,005% do oko 0,08 %, od oko 0,005% do oko 0,07%, od oko 0,005% do oko 0,06%, od oko 0,005% do oko 0,05%, od oko 0,005% do oko 0,04%, od oko 0,008% do oko 0,06%, od oko 0,01% % do oko 0,06%, od oko 0,02% do oko 0,06%, od oko 0,01% do oko 0,05% ili od oko 0,02% do oko 0,04%. U nekim realizacijama predmetnog pronalaska, surfaktant (npr. polisorbat 20) je prisutan u formulaciji u količini od 0,005% ili oko 0,005%. U nekim realizacijama predmetnog pronalaska, surfaktant (npr. polisorbat 20) je prisutan u formulaciji u količini od 0,006% ili oko 0,006%. U nekim realizacijama predmetnog pronalaska, surfaktant (npr. polisorbat 20) je prisutan u formulaciji u količini od 0,007% ili oko 0,007%. U nekim realizacijama predmetnog pronalaska, surfaktant (npr. polisorbat 20) je prisutan u formulaciji u količini od 0,008% ili oko 0,008%. U nekim realizacijama predmetnog pronalaska, surfaktant (npr. polisorbat 20) je prisutan u formulaciji u količini od 0,009% ili oko 0,009%. U nekim realizacijama predmetnog pronalaska, surfaktant (npr. polisorbat 20) je prisutan u formulaciji u količini od 0,01% ili oko 0,01%. U nekim realizacijama predmetnog pronalaska, surfaktant (npr. polisorbat 20) je prisutan u formulaciji u količini od 0,02% ili oko 0,02%. U nekim realizacijama predmetnog pronalaska, surfaktant (npr. polisorbat 20) je prisutan u formulaciji u količini od 0,03% ili oko 0,03%. U nekim realizacijama predmetnog pronalaska, surfaktant (npr. polisorbat 20) je prisutan u formulaciji u količini od 0,04% ili oko 0,04%. U nekim realizacijama predmetnog pronalaska, surfaktant (npr. polisorbat 20) je prisutan u formulaciji u količini od 0,05% ili oko 0,05%. U nekim realizacijama predmetnog pronalaska, surfaktant (npr. polisorbat 20) je prisutan u formulaciji u količini od 0,06% ili oko 0,06%. U nekim realizacijama predmetnog pronalaska, surfaktant (npr. polisorbat 20) je prisutan u formulaciji u količini od 0,07% ili oko 0,07%. U nekim realizacijama predmetnog pronalaska, surfaktant (npr. polisorbat 20) je prisutan u formulaciji u količini od 0,08% ili oko 0,08%. U nekim realizacijama predmetnog pronalaska, surfaktant (npr. polisorbat 20) je prisutan u formulaciji u količini od 0,1% ili oko 0,1%. U nekim realizacijama predmetnog pronalaska, surfaktant (npr. polisorbat 20) je prisutan u formulaciji u količini od 0,2% ili oko 0,2%. U nekim realizacijama predmetnog pronalaska, surfaktant (npr. polisorbat 20) je prisutan u formulaciji u količini od 0,3% ili oko 0,3%. U nekim realizacijama predmetnog pronalaska, surfaktant (npr. polisorbat 20) je prisutan u formulaciji u količini od 0,4% ili oko 0,4%. U nekim realizacijama predmetnog pronalaska, surfaktant (npr. polisorbat 20) je prisutan u formulaciji u količini od 0,5% ili oko 0,5%.

U jednoj realizaciji, formulacija sadrži prethodno identifikovana sredstva (npr. antitelo, pufer, saharozu i/ili surfaktant) i u suštini je bez jednog ili više konzervanasa, kao što su benzil alkohol, fenol, m-krezol, hlorobutanol i benzetonijum Cl. U drugoj realizaciji, konzervans može biti uključen u formulaciju, posebno kada je formulacija sa više doza. Koncentracija konzervansa može biti u opsegu od oko 0,1% do oko 2%, poželjno od oko 0,5% do oko 1%. Jedan ili više drugih farmaceutski prihvatljivih nosača, pomoćnih sastojaka ili stabilizatora, kao što su oni opisani u Remington's Pharmaceutical Sciences 16. izdanju, Osol, A. Ed. (1980) mogu biti uključeni u formulaciju pod uslovom da ne utiču negativno na željene karakteristike formulacije. Prihvatljivi nosači, pomoćni sastojci ili stabilizatori nisu toksični za primaoce u korišćenim dozama i koncentracijama i uključuju; dodatna puferska sredstva; korastvarače; antioksidante koji uključuju askorbinsku kiselinu i metionin; helatna sredstva kao što su EDTA; metalne komplekse (npr. Zn-proteinski kompleksi); biorazgradive polimere, poput poliestera; i/ili protivjoni koji formiraju so. Primeri farmaceutski prihvatljivih nosača, iz ovog dokumenta, dalje uključuju sredstva za intersticijalnu disperziju lekova, kao što su rastvorni neutralno aktivni glikoproteini hijaluronidaze (sHASEGP), na primer, humani rastvorljivi PH-20 glikoproteini hijaluronidaze, kao što je rHuPH20 (HYLENEX<®>, Baxter International, Inc.). Pojedini primeri za sHASEGP i postupci primene, uključujući rHuPH20, opisani su u US Patent Publication br. 2005/0260186 i 2006/0104968. U jednom aspektu, sHASEGP se kombinuje sa jednom ili više dodatnih glikozaminoglikanaza, kao što je hondroitinaza.

Formulacija ovde može takođe da sadrži više od jednog proteina, koliko je neophodno za određenu indikaciju koja se leči, poželjno one sa komplementarnim aktivnostima koje ne utiču negativno na drugi protein. Na primer, kada je antitelo anti-PDL1, može se kombinovati sa drugim agensom (npr., hemoterapeutski agens i antineoplastični agens).

U nekim realizacijama, fizička stabilnost, hemijska stabilnost ili biološka aktivnost antitela u formulaciji se procenjuje ili meri. Za procenu stabilnosti i biološke aktivnosti antitela u formulaciji može se koristiti bilo koji postupak poznat u struci i opisan u primerima iz ovog dokumenta. Na primer, stabilnost antitela u formulaciji se može meriti, bez ograničenja, hromatografijom na bazi isključenja po veličini (SEC ili SE-HPLC), slikovnim kapilarnim izoelektričnim fokusiranjem (ICIEF), mapiranjem peptida, testom laserskog brojanja čestica (HIAC) i tehnikama kapilarne elektroforeze (CE) kao što su CE-natrijum dodecil sulfat (CE-SDS) i CE-glikonska analiza U nekim realizacijama, antitelo u formulaciji je stabilno na temperaturi od -20°C najmanje oko 6 meseci, najmanje oko 8 meseci, najmanje oko 10 meseci, najmanje oko 12 meseci, najmanje oko 14 meseci, najmanje oko 16 meseci, najmanje oko 18 meseci, najmanje oko 20 meseci, najmanje oko 21 mesec, najmanje oko 22 meseca, najmanje oko 23 meseca, najmanje oko 24 meseca, najmanje oko 3 godine ili najmanje oko 4 godine. U nekim realizacijama, antitelo u formulaciji je stabilno na temperaturi od 2°C do 8°C (npr., 5°C) najmanje oko 6 meseci, najmanje oko 8 meseci, najmanje oko 10 meseci, najmanje oko 12 meseci, najmanje oko 14 meseci, najmanje oko 16 meseci, najmanje oko 18 meseci, najmanje oko 20 meseci, najmanje oko 21 mesec, najmanje oko 22 meseca, najmanje oko 23 meseca ili najmanje oko 24 meseca. U nekim realizacijama, stabilnost antitela (tj. monomera antitela) se meri hromatografijom na bazi isključenja po veličini u formulaciji nakon skladištenja. U nekim realizacijama, stabilnost antitela (tj., monomera antitela) se meri slikovnim kapilarnim izoelektričnim fokusiranjem u formulaciji nakon skladištenja. U nekim realizacijama, procenat monomera antitela u formulaciji u odnosu na ukupni protein (npr., uključujući antitelo i agregate) je veći od oko 60%, oko 65%, oko 70%, oko 75%, oko 80%, oko 85%, oko 86%, oko 87%, oko 88%, oko 89%, oko 90%, oko 91%, oko 92%, oko 93%, oko 94% ili oko 95% nakon skladištenja na temperaturi od -20°C najmanje oko 6 meseci, najmanje oko 12 meseci, najmanje oko 18 meseci ili najmanje oko 24 meseca. U nekim realizacijama, procenat monomera antitela u formulaciji u odnosu na (npr., uključujući antitelo i agregate) je veći od oko 60%, oko 65%, oko 70%, oko 75%, oko 80%, oko 85%, oko 86%, oko 87%, oko 88%, oko 89%, oko 90%, oko 91%, oko 92%, oko 93%, oko 94% ili oko 95% nakon skladištenja na temperaturi od 2°C do 8°C (npr., 5°C) najmanje oko 6 meseci, najmanje oko 12 meseci, najmanje oko 18 meseci ili najmanje oko 24 meseca. U nekim realizacijama, procenat monomera antitela u formulaciji u odnosu na (npr., uključujući antitelo i agregate) je veći od oko 60%, oko 65%, oko 70%, oko 75%, oko 80%, oko 85%, oko 86%, oko 87%, oko 88%, oko 89%, oko 90%, oko 91%, oko 92%, oko 93%, oko 94% ili oko 95% nakon mešanja na sobnoj temperaturi (npr. oko 15°C do 25°C) najmanje oko 2 sata, najmanje oko 4 sata, najmanje oko 6 sati, najmanje oko 8 sati, najmanje oko 10 sati, najmanje oko 12 sati, najmanje oko 14 sati, najmanje oko 16 sati, najmanje oko 18 sati, najmanje oko 20 sati ili najmanje oko 24 sata. U nekim realizacijama, procenat ukupnih agregata (npr. vrsta velike molekulske mase i vrsta male molekulske mase) u formulaciji je manji od bilo koje od oko 0,1%, oko 0,2%, oko 0,3%, oko 0,4%, oko 0,5%, oko 0,6%, oko 0,7%, oko 0,8%, oko 0,9%, oko 1%, oko 2%, oko 3%, oko 4%, oko 5%, oko 6%, oko 7%, oko 8%, oko 9 %, ili oko 10% nakon skladištenja na temperaturi od -20°C najmanje oko 6 meseci, najmanje oko 12 meseci, najmanje oko 18 meseci ili najmanje oko 24 meseca. U nekim realizacijama, procenat ukupnih agregata (npr. vrsta velike molekulske mase i vrsta male molekulske mase) u formulaciji je manji od bilo koje od oko 0,1%, oko 0,2%, oko 0,3%, oko 0,4%, oko 0,5%, oko 0,6%, oko 0,7%, oko 0,8%, oko 0,9%, oko 1%, oko 2%, oko 3%, oko 4%, oko 5%, oko 6%, oko 7%, oko 8%, oko 9 %, ili oko 10% nakon skladištenja na temperaturi od 2°C do 8°C (npr. 5°C) najmanje oko 6 meseci, najmanje oko 12 meseci, najmanje oko 18 meseci ili najmanje oko 24 meseca. U nekim realizacijama, procenat ukupnih agregata (npr. vrsta velike molekulske mase i vrsta male molekulske mase) u formulaciji je manji od bilo koje od oko 0,1%, oko 0,2%, oko 0,3%, oko 0,4%, oko 0,5%, oko 0,6%, oko 0,7%, oko 0,8%, oko 0,9%, oko 1%, oko 2%, oko 3%, oko 4%, oko 5%, oko 6%, oko 7%, oko 8%, oko 9 %, ili oko 10% nakon mešanja na sobnoj temperaturi (npr. oko 15°C do 25°C) najmanje oko 2 sata, najmanje oko 4 sata, najmanje oko 6 sati, najmanje oko 8 sati, najmanje oko 10 sati, najmanje oko 12 sati, najmanje oko 14 sati, najmanje oko 16 sati, najmanje oko 18 sati, najmanje oko 20 sati ili najmanje oko 24 sata. U bilo kojoj realizaciji iz ovog dokumenta, stabilna formulacija se može čuvati u staklenoj bočici, posudi od metalne legure ili intravenskoj (IV) vrećici. U nekim realizacijama, metalna legura je nerđajući čelik 316L ili hastelloy.

Formulacije za primenu in vivo moraju biti sterilne. To se lako postiže filtracijom kroz sterilne membrane za filtriranje, pre ili nakon pripreme formulacije.

III. Metode lečenja i primena formulacija antitela

Formulacija se daje sisaru kojem je potrebno lečenje antitelom, poželjno čoveku, shodno poznatim postupcima, kao što je intravenska primena (npr. kao bolus ili kontinualna infuzija tokom vremenskog perioda), intramuskularnim, intraperitonealnim, intracerebrospinalnim, supkutanim, intraartikularnim, intrasinovijalnim, intratekalnim, oralnim, topikalnim ili inhalacionim putem. U jednoj realizaciji, formulacija se daje sisaru intravenskom primenom. U takve svrhe, formulacija se može injektirati, na primer, pomoću špriceva ili preko IV linije. U jednoj realizaciji, formulacija se daje sisaru supkutanom primenom.

Odgovarajuća doza („terapeutski efikasna količina“) antitela će zavisiti, na primer, od stanja koje se tretira, težine i toka stanja, da li se antitelo daje u preventivne ili terapijske svrhe, prethodne terapije, kliničke istorije pacijenta i odgovora na antitelo, vrste korišćenog antitela i diskrecije nadležnog lekara. Antitelo se na odgovarajući način daje pacijentu odjednom ili tokom niza tretmana i može se davati pacijentu u bilo kom trenutku od dijagnoze pa nadalje. Antitelo se može primeniti kao jedini lek ili u kombinaciji sa drugim lekovima ili terapijama korisnim u lečenju predmetnog stanja.

Kao opšta pretpostavka, terapeutski efikasna količina antitela primenjena na čoveku biće u opsegu od oko 0,01 mg/kg do oko 50 mg/kg telesne težine pacijenta, bilo da je u pitanju jedna ili više primena. U nekim realizacijama, korišćeno antitelo je, na primer, primenjivano u dnevnim dozama od oko 0,01 mg/kg do oko 45 mg/kg, oko 0,01 do oko 40 mg/kg, oko 0,01 do oko 35 mg/kg, oko 0,01 do oko 30 mg/kg,oko 0,01 do oko 25 mg/kg, oko 0,01 do oko 20 mg/kg, oko 0,01 do oko 15 mg/kg, oko 0,01 do oko 10 mg/kg, oko 0,01 do oko 5 mg/kg, ili oko 0,01 do oko 1 mg/kg. U nekim realizacijama, antitelo se daje u dozi od 15 mg/kg. Međutim, mogu biti korisni i drugi dozni režimi. U jednoj realizaciji, anti-PDL1 antitelo prema opisu iz ovog dokumenta, daje se ljudima u dozi od oko 100 mg, oko 200 mg, oko 300 mg, oko 400 mg oko 500 mg, oko 600 mg, oko 700 mg, oko 800 mg, oko 900 mg, oko 1000 mg, oko 1100 mg, oko 1200 mg, oko 1300 mg ili oko 1400 mg 1. dana 21-dnevnog

1

ciklusa. Doza se može primeniti kao pojedinačna doza ili kao višestruke doze (npr., 2 ili 3 doze), kao što su infuzije. Doza antitela primenjena u kombinovanom tretmanu se može smanjiti u poređenju sa jednim tretmanom. Napredak ove terapije jednostavno se prati klasičnim tehnikama.

Formulacije koje sadrže anti-PDL1 antitelo prema opisu iz ovog dokumenta, mogu se koristiti u različitim in vitro i in vivo dijagnostičkim i terapijskim primenama. Na primer, formulacija koja sadrži antitelo se može dati subjektu ili pojedincu za lečenje bolesti ili poremećaja (npr. bolest ili poremećaj posredovan interakcijom PD-1 i PD-L1).

U nekim realizacijama, bolest ili poremećaj je kancer. U nekim realizacijama, kancer je lokalno uznapredovao ili metastazirao. U nekim realizacijama, kancer je izabran iz grupe koja se sastoji od čvrstog tumora, hematološkog karcinoma, karcinoma bešike, karcinoma mozga, karcinoma dojke, karcinoma debelog creva, kolorektalnog karcinoma, karcinoma želuca, glioma, karcinoma glave, leukemije, karcinoma jetre, karcinoma pluća (npr. nemikrocelularni karcinom pluća), limfoma, mijeloma, karcinoma vrata, karcinoma jajnika, melanoma, karcinoma gušterače, renalnog karcinoma, karcinoma žlezda, karcinoma želuca, karcinoma epitela timusa, karcinoma štitne žlezde i karcinoma skvamoznih ćelija glave i vrata. U nekim realizacijama, lečeni subjekt ili pojedinac ima PD-L1 pozitivne ćelije karcinoma (npr., otkrivene IHC-om).

U nekim realizacijama, bolest ili poremećaj je infekcija. U nekim realizacijama, infekcija je trajno prisutna infekcija. U nekim realizacijama, infekcija je virusna infekcija, bakterijska infekcija, gljivična infekcija, infekcija izazvana crevnim glistama ili protozojska infekcija. U nekim realizacijama virusna infekcija je izabrana iz grupe koja se sastoji od citomegalovirusa Epstein-Barr virusa, hepatitisa B, virusa hepatitisa C, virusa herpesa, virusa ospica, gripa, virusa humane imunodeficijencije, humanog T limftropnog virusa, limfocitnog virusa horiomeningitisa, respiratornog sincicijskog virusa i/ili rinovirusa. U nekim realizacijama bakterijska infekcija je izabrana iz grupe koja se sastoji od Helicobacter spp., Mycobacterium spp., Porphyromonas spp., Chlamydia spp., Salmonella spp., Listeria spp., Streptococcus spp., Haemophilus spp., Neisseria spp., Klebsiella spp., Borrelia spp., Bacterioides spp. I Treponema spp. U nekim realizacijama, protozojska infekcija je izabrana iz grupe koju čine Leishmania spp., Plasmodium falciparum, Schistosoma spp., Toxoplasma spp., Trypanosoma spp. I Taenia spp. U nekim realizacijama, gljivična infekcija je izabrana iz grupe koja se sastoji od blastomikoze, kokcidiodmikoze, histoplamsoze, kandidijaze, kriptokokoze, aspergiloze, mukomikoze i pneumocistoze.

U nekim realizacijama, bolest ili poremećaj je inflamatorna bolest. U nekim

2

realizacijama, inflamatorna bolest je izabrana iz grupe koja se sastoji od akutnog diseminiranog encefalomijelitisa, Adisonove bolesti, Alchajmerove bolesti, sindroma ankilozirajućeg spondilitisa, sindroma antifosfolipidnih antitela, ateroskleroze, autoimune hemolitičke anemije, autoimunog hepatitisa, artritisa, Behcetove bolesti, Bergerove bolesti, buloznog pemfigoida, celijakije, Šagasove bolesti, holangitisa, Kronove bolesti, dermatomiozitisa, dijabetesa mellitus tip 1, glomerulonefritisa, Gudpasterovog sindroma, graft-versus-host reakcije, Gravesove bolesti, Guillain-Barré sindroma, Hašimotove bolesti, osipa, sindroma hiper IgE, idiopatske trombocitopenične purpure, eritematoznog lupusa, lupus nefritisa, multipla skleroze, miastenije gravis, odbacivanja transplantovanog organa, Parkinsonove bolesti, pemfigusa, perniciozne anemije, polimiozitia, primarne bilijarne ciroze, psorijaze, Rajnaudovog sindroma, reumatodnog artritisa, skleroderme, Sjögrenovog sindroma, privremenog arteritisa, tiroiditisa, ulceroznog kolitisa, uveitisa, vaskulitisa i Wegenerove granulomatoze.

U nekim realizacijama, formulacija koja sadrži antitelo se može davati zajedno sa drugim terapeutskim agensom subjektu ili pojedincu za lečenje bolesti ili poremećaja. Na primer, za lečenje kancera, ovde opisana formulacija za anti-PDL1 antitelo se može primeniti u kombinaciji sa drugom terapijom za lečenje kancera (npr., hemoterapijom ili drugačijom terapijom antitela).

IV. Proizvodi ili kompleti

U drugoj realizaciji predmetnog pronalaska, obezbeđuje se proizvod ili komplet koji sadrži posudu u kojoj se drži vodena farmaceutska formulacija predmetnog pronalaska i opciono su obezbeđena uputstva za njegovu upotrebu. Odgovarajuće posude uključuju, na primer, boce, bočice, kese i špriceve. Posuda može biti izrađena od različitih materijala, kao što su staklo, plastika (poput polivinilhlorida ili poliolefina) ili legura metala (kao što su nerđajući čelik ili hastelloy). Primer posude je posuda od metalne legure od 300 cc (npr. za skladištenje na temperaturi od -20°C). Drugi primer posude može biti staklena bočica od 10-50 cc (npr. za skladištenje na temperaturi od 2-8°C). Na primer, posuda može biti staklena bočica od 10 cc, 15 cc, 20 cc ili 50 cc. U posudi se nalazi formulacija, a na posudi ili uz posudu može biti etiketa sa uputstvima za upotrebu. Proizvod može dalje da obuhvati druge materijale poželjne sa komercijalnog i aspekta upotrebe, uključujući druge pufere, razblaživače, filtere, igle, špriceve i letak sa uputstvima za upotrebu. U nekim realizacijama, proizvodni artikl dalje uključuje jedan ili više drugih agenasa (npr., hemoterapeutski agens i antineoplastični agens). Prikladne posude za jedan ili više agenasa uključuju, na primer, boce, bočice, vrećice i špriceve.

PRIMERI

Pronalazak će se u potpunosti bolje shvatiti kroz primere koji slede. Oni, međutim, ne treba da se tumače kao ograničenje obima pronalaska.

Primer 1: Razvoj formulacije anti-PDL1 antitela

Anti-PDL1 antitelo (α-PDL1) je neglikozilirano IgG1 antitelo izvedeno od CHO namenjeno obnavljanju funkcije T ćelija inhibicijom PDL1/PD1 interakcija. Izazovi na početku razvoja su uključivali moguću Trp oksidaciju i glikaciju u CDR regionima ili u njihovoj blizini i izvesnu oksidaciju metioninom. Ispitivanja prethodne čvrstine su pokazala da je bila optimalna veća pH vrednost od ranije ciljane vrednosti (pH 5,5). Ciljano doziranje je bila fiksna doza, ali je takođe razmatrana doza na osnovu težine. Sprovedena su analitička ispitivanja za analizu stabilnosti različitih formulacija i izabrana je formulacija (60 mg/ml α-PDL1, 20 mM His AcO pH 5,8, 120 mM saharoze, 0,04% PS20). Početna ispitivanja formulacije podržavaju stabilnost do tri godine u supstanci leka (DS) i proizvodu leka (DS).

Metode i materijali

Proizvodnja α-PDL1 formulacija

Materijal za α-PDL1 koji je bio podvrgnut postupku ultrafiltracije/diafiltracije bio je predmet ispitivanja u razvoju formulacije. Materijal je dijalizovan u različite pufere za formulaciju pomoću kaseta za dijalizu od 10000 daltona. Nakon dijalize, koncentracije proteina su prilagođene za dostizanje ciljnih koncentracija i ubrizgan je radni rastvor 10% PS20 kako bi se postigle ciljne koncentracije za PS20. Formulisani materijal je punjen aseptično u 2-cc staklene bočice Forma Vitrum sa zapreminom punjenja od 1 ml i zatvorene Daikyo 777-1 čepom od 13 mm. Uzorci su skladišeni uspravno na 5°C, 25°C ili 40°C.

Boja, izgled i bistrina (CAC)

Boja uzorka, izgled i bistrina su određeni vizuelnim pregledom pod belim fluorescentnim svetlom sa crnom i belom pozadinom na sobnoj temperaturi, kao što je opisano u metodama Evropske farmakopeje (EP) (Savet Evrope. European Pharmacopoeia, 2008, 7. izd., EP 2.2.2 i EP 2.2.1). Staklena bočica od 3 cc je napunjena sa 1 mL svakog testiranog uzorka. Za poređenje je korišćena negativna kontrola (prečišćena voda) sa odgovarajućom zapreminom uzorka.

Merenja koncentracije proteina

Koncentracija proteina je određena merenjem UV apsorpcije na Agilent 8453 spektrofotometru (Santa Clara, CA.) zapreminskim razblaživanjem uzorka do približno 0,5 mg/ml sa 0,9% fiziološkim rastvorom. Uzorci su blankirani sa 0,9% fiziološkog rastvora a apsorbancija je izmerena na Amaxod oko 280 nm i takođe na 320 nm. Razlika između Amaxi

4

A320je izračunata radi dobijanja ispravljenog Amaxkoji se koristi za određivanje konačne koncentracije proteina sa apsorptivnošću od 1,5ml cm<-1>mg<-1>.

Merenja zamućenosti

Prosečna optička gustina na 350 nm uzoraka je izmerena u kvarcnoj kiveti sa dužinom puta od 1 cm na Agilent 8453 spektrofotometru. Prečišćena voda je korišćena kao slepa proba.

Metod opskuracije svetlosti za sub-vidljive čestice (HIAC test)

Brojanje čestica uzoraka je obavljeno opskuracijom svetlosti, izmereno pomoću HIAC-Royco modela 9703 (HACH, Loveland, CO.). Prosečni ukupni broj čestica po mililitru ≥ 2 µm, ≥ 5 µm, ≥ 10 µm i ≥ 25 µm je tabelarno prikazan za svaki uzorak pomoću PharmSpec v2.0. Sprovedena su četiri očitavanja, koja su zauzela ukupno 1,6 ml svakog uzorka, pri čemu je prvo očitavanje odbačeno, a preostala 3 očitavanja daju prosečnu vrednost.

Hromatografija na bazi isključenja veličine (SEC ili SE-HPLC)

Distribucija različitih veličina je određena hromatografijom na bazi isključenja veličine (SEC) primenom TosoHaas Bioscience kolone G3000 SWXL (South San Francisco, CA) na 30°C na Agilent 1200 HPLC (Santa Clara, CA., USA). Svi uzorci su injektirani nerazređeni na 50 µg na koloni i eluirani tokom 60 minuta sa UV apsorpcijom pri 280 nm. Za testiranje uzoraka su korišćene dve različite SEC metode. U metodi 1 je korišćen 0,20 M kalijum fosfata, 0,25 M kalijum hlorida, pH 6,2, dok je u metodi 2 korišćen 0,20 M kalijum fosfat, 0,25 M kalijum hlorida, pH 6,2 sa 10% (v/v) izopropanola kao pokretne faze. Rezultati su prikazani kao relativni procenat površine vrha od ukupne površine ispod krive.

Slikovno kapilarno izoelektrično fokusiranje (ICIEF)

Distribucija varijanti naboja je procenjena iCIEF-om primenom iCE280 analizatora (ProteinSimple) sa kapilarnim patronom obloženim fluorougljenikom (100 µm x 5 cm). Rastvor amfolita se sastojao od smeše koju čini 0,35% metil celuloze (MC), 0,75% Pharmalyte 3-10 nosača amfolita, 4,2% Pharmalyte 8-10.5 nosača amfolita i 0,2% pI markera 7,40 i 0,15% pI markera 9,77 u prečišćenoj vodi. Anolit je bio 80 mM fosforne kiseline, a katolit je bio 100 mM natrijum hidroksida, oba u 0,10% metilceluloze. Uzorci su razblaženi u prečišćenoj vodi i CpB je dodavan u svaki razblaženi uzorak u odnosu enzima prema supstratu 1:100, nakon čega je usledila inkubacija na 37°C tokom 20 minuta. Uzorci tretirani sa CpB su pomešani sa rastvorom amfolita i zatim fokusirani uvođenjem potencijala od 1500 V za jedan minut, nakon čega sledi potencijal od 3000 V za 10 minuta. Slika fokusiranih varijanti α-PDL1 naboja dobijena je prolaskom ultraljubičastog zračenja od 280 nm kroz kapilaru i u sočivo digitalnog fotoaparata s uređajem za punjenje. Ova slika je zatim analizirana kako bi se odredila distribucija različitih varijanti naboja.

Mapiranje peptida

Za praćenje oksidacije triptofana (W) i metionina (M) korišćena je tehnika mapiranja peptida. Da bi se stvorile mape peptida α-PDL1, protein je razgrađen tripsinom nakon izlaganja proteina ditiotritolu (DTT) i jodosirćetnoj kiselini (IAA), u procesu koji smanjuje disulfidne veze i menja rezultirajuće slobodne tiole kako bi se stvorili karboksimetilni derivati. Rezultujući peptidi su razdvojeni pomoću reverzno–fazne tečne hromatografije visokih performansi (RP-HPLC) i praćeni na 214 nm. Mase triptoptičkih peptida su određene LC-MS analizom odvojene rastvorene smeše korišćenjem masenog spektrometra ThermoFisher Scientific LTQ-Orbitrap.

Rezultati

Izbor puferskog sistema

Tokom razvoja formulacije, procenjena su dva puferska sistema. Jedan je bio 20 mM histidin acetat sa 240 mM saharoze pri pH 5,5, a drugi 200mM arginin sukcinat pri pH 5,5. Ispitivanje ubrzane stabilnosti je otkrilo da α-PDL1 ima bolju stabilnost u histidin acetatnom puferu u odnosu na arginin sukcinatni pufer (Tabela 1). Zbog toga je izabran histidin acetat za dalji razvoj formulacija.

Tabela 1. Stope razgradnje nultog reda α-PDL1 za glavni vrh putem ICIEF-a i SE-HPLC-a u histidin acetatnom i arginin sukcinatnom puferu na 30°C

Beleška: Sve formulacije su skladištene do 1 meseca na 30°C. Analiza je izvršena pomoću ICIEF-a i SE-HPLC-a; * 150 mg/ml α-PDL1 u 20 mM L-histidin acetata, 240 mM saharoze i 0,02% (m/v) polisorbata 20 pri pH 5,5; * 150 mg/ml α-PDL1 u 200 mM arginin sukcinata, 0,02% (w/v) polisorbata 20 pri pH 5,5.

Izbor stabilizatora

Saharoza (120 mM) je izabrana kao stabilizator tečne formulacije za α-PDL1 na osnovu njene sposobnosti da štiti protein od agregacije izazvane zamrzavanjem/odmrzavanjem, kao i da deluje kao krioprotektant tokom dugotrajnog skladištenja zamrznute supstance leka (DS) i kasnije skladištenja proizvoda leka (DP) na temperaturi od 2°C-8°C.

Tokom razvoja formulacije, α-PDL1 u 50 mg/ml u 20 mM L-histidin acetata, pH 5,5, 0,02% (w/v) polisorbata 20 i različite koncentracije saharoze u opsegu od 0 mM do 120 mM je podvrgnuto pet ciklusima zamrzavanja/odmrzavanja. Kvalitet proizvoda izmeren SE-HPLC-om je pokazao da je 60 mM saharoze dovoljno za sprečavanje povećanja α-PDL1 HMWS izazvanog zamrzavanjem/odmrzavanjem (Tabela 2). Takođe, pokazano je da je sa 120 mM saharoze zadržana stabilnost supstance leka kada je skladištena u zamrznutom stanju na -20°C najmanje 6 meseci (Tabela 3). Stoga, na osnovu rezultata ispitivanja zamrzavanja/odmrzavanja, kao i dugotrajne stabilnosti supstance leka skladištene na -20°C, izabrana je saharoza u koncentraciji od 120 mM kao krioprotektant tečne formulacije za α-PDL1.

Tabela 2. Efekat koncentracije saharoze na stabilnost vrsta velike molekulske mase α-PDL1 SE-HPLC-om tokom zamrzavanja i odmrzavanja

Beleška: Sve formulacije sadrže 50 mg/ml α-PDL1, 20 mM L-histidin acetata, 0,02% (w/v) polisorbata 20, pH 5,5. Analiza je izvršena pomoću SE-HPLC-a; F/T = zamrzavanje/odmrzavanje; HMWS = vrsta velike molekulske mase; SY = blago žuto; CL = bistro; PFVP = praktično bez vidljivih čestica.

Ispitivanja čvrstine pre formulacije: Izbor koncentracije proteina, pH vrednosti i koncentracije polisorbata 20

Frakcioni faktorski dizajn eksperimenata (DOE) je dizajniran za dalja ispitivanja uticaja parametara formulacije za α-PDL1 na stabilnost proteina. Ukupno je testirano dvanaest različitih formulacija za α-PDL1 (deset eksperimenata i dve centralne tačke). Tri faktora koja su varirala u ispitivanju su bili opseg pH vrednosti od 5,0 do 6,0 sa intervalima od 0,5 jedinica, opseg koncentracije proteina od 40 - 120 mg/ml, i opseg koncentracije polisorbata 20 od 0,005% - 0,06% (w/v) (Tabela 4). Sve formulacije su puferirane sa 20 mM histidin acetata sa 120 mM saharoze, osim poslednje dve formulacije kao što je naznačeno u Tabeli 4. Procenjivana je formulacija sa 25mM histidin acetata jer se smatralo da je to scenario najgoreg slučaja u pogledu rizika od oksidacije. Procenjivan je 20 mM natrijum acetatski pufer kao rezervni puferski sistem i upoređivan sa histidin acetatskim puferom. Formulacije su skladištene na 25°C tokom 2 meseca i 40°C tokom 1 meseca. Podaci o stabilnosti iz gore navedenih ispitivanja su statistički analizirani na interakcije između parametara formulacije pomoću softvera JMP (JMP, verzija 9, SAS Institute Inc., Cary, NC).

Tabela 4. α-PDL1 supstanca leka i formulacije leka procenjene u DOE ispitivanju

Beleška:<a>Centralne tačke;<b>Scenario najgoreg slučaja: niska koncentracija proteina, visoka koncentracija PS20, visoka koncentracija histidina;<c>Testiran je 20 mM natrijum acetatski pufer (Na-Ace).

U poređenju sa pH 5,0 i 5,5, formulacija pri pH 6,0 ima nešto sporiju stopu gubitka glavnog vrha, što je određeno ICIEF-om na 40°C i 25°C (SL.1A-B i SL.2A-B, respektivno). ICIEF-om nije primećen značajan uticaj koncentracije na gubitak glavnog vrha. Analiza formulacije F1 je pokazala da porast kisele varijante doprinosi prvenstveno gubitku glavnog vrha u ICIEF-u, dok doprinos gubitku vrha od varijante baznog naboja nije bio značajan. Pod istim uslovima skladištenja, formulacija pri pH 6,0 je takođe imala sporiju stopu gubitka vrha monomera, izmerena SE-HPLC-om na 40°C i 25°C (SL. 3A-B i SL. 4A-B, respektivno). Analiza formulacije F1 je pokazala da i HMWS i LMWS formacija doprinose gubitku monomera u SEC-u pri povišenim temperaturama (tj. 40°C i 25°C). SEC i ICIEF profilii ocene pH vrednosti su otkrili da je pH vrednost od 5,5-6,0 optimalni pH opseg za α-PDF1. Da bi bio u okviru optimalne stabilnosti proteina iznad pH 5,5 i da bi se omogućio jedinični opseg pH ± 0,3 u formulisanoj supstanci leka i proizvodu leka, izabrana je ciljna pH vrednost od 5,8.

Gore navedena ispitivanja formulacije su takođe otkrila da je 120 mg/ml u formulacijama za α-PDL1 pri pH vrednosti u opsegu od 5,0 do 6,0 imale nešto višu, ali neznačajnu stopu gubitka vrha monomera zbog veće stope formiranja HMWS-a u odnosu na 40 mg/ml u formulacijama pri istoj pH vrednosti, kao što je određeno SE-HPFC-om (SL.3A-B i SL. 4A-B). Na osnovu ovih podataka i da bi se podržala formulacija sa poboljšanom stabilnošću proizvoda i olakšalo doziranje pacijenta, izabran je α-PDL1 u koncentraciji od 60 mg/ml.

Nije primećen uticaj na stabilnost proteina kod koncentracija polisorbata 20 (PS20) u opsegu od 0,005% -0,06% (w/v), kao što je naznačeno u gore navedenoj statističkoj analizi (SL. 1-4).

Poznato je da nečistoća hidrogen peroksida sadržana u sirovini polisorbata 20 može dovesti do oksidacije triptofana (W) i metionina (M). L-histidin takođe može da poveća gore navedeni rizik od oksidacije. Analizirani su uzorci izabranih formulacija sa scenarijem najgoreg slučaja, koji sadrže veće koncentracije polisorbata 20 i L-histidina, mapiranjem peptida. Rezultati analize su pokazali da čak i kombinacija veće koncentracije histidina (25mM histidin acetatski pufer) i veće količine PS20 (0,06% PS20) nije pokazala značajan rizik od oksidacije (Tabela 5), i histidinski pufer je pogodan za upotrebu za formulisanje α -PDL1.

Tabela 5. Procenat oksidacije Trp i M<253>u izabranim formulacijama pomoću peptidne mape

Beleška: Sve formulacije su skladištene do 1 meseca na 40°C. Analiza je izvršena pomoću peptidne mape.

W = triptofan; M = metionin

Da bi se procenila moguća razgradnja PS20 u formulaciji nakon skladištenja, formulacije od F1 do F10 (Tabela 4) su skladištene na 40°C 1 mesec, na 25°C 2 meseca, na 5°C 2 meseca ili na 5°C tokom 6 meseci. Nije zabeležena razgradnja PS20 u procenjenim formulacijama na bilo kojoj povišenoj temperaturi skladištenja (tj., 40°C i 25°C) i na 5°C. Promena zapremine punjenja izabranih formulacija (tj., F1, F2, F3 i F6) na 7 ml (visoko punjenje) ili 4 ml (nisko punjenje), a zatim skladištenje na 5°C tokom 6 meseci takođe nije imalo značajnog uticaja na stopu razgradnje PS20 (SL.5).

Kao mera stabilnosti je HIAC testom ispitivano stvaranje sub-vidljivih čestica (SbVP) u različitim formulacijama kada su skladištene na 5°C tokom 6 meseci (Tabela 6). Nije primećena merljiva promena SbVP-a u ispitivanoj formulaciji.

Tabela 6. HIAC podaci o stvaranju SbVP-a nakon 6 meseci skladištenja na 5°C

1

Beleška: Dve bočice od 1 ml punjenja kombinovane su zajedno da bi se obavio HIAC test malog volumena.

Stabilnost formulacija je dodatno ispitivana testom zamrzavanja/odmrzavanja. Formulacije F1 do F10 (tabela 4) prošle su ili kroz pet ciklusa zamrzavanja/odmrzavanja tokom skladištenja na -20°C ili su skladištene na povišenoj temperaturi skladištenja od 5°C u trajanju od 0 do 6 meseci, a zatim su analizirane pomoću SEC i ICIEF za procenat α-PDL1 monomera (slike 6A i B) i procenat glavnog vrha u formulaciji (slike 6C i D). Nije primećena značajna promena procenta monomera i procenta glavnog vrha nakon ciklusa zamrzavanja i odmrzavanja i skladištenja u navedenim vremenskim intervalima.

2

Stabilnost supstance leka u formulaciji F2 (tablica 4) procenjena je sprovođenjem pet ciklusa zamrzavanja i odmrzavanja tokom skladištenja u maloj limenki od nerđajućeg čelika na -20°C u intervalu do 6 meseci, nakon čega je izvršeno merenje stabilnosti pomoću CAC, SEC i ICIEF (tabela 7). Nisu primećene promene nakon 6 meseci čuvanja na -20°C.

Tabela 7. Stabilnost supstance leka u maloj limenki od nerđajućeg čelika skladištenih na -20°C

Beleška: F / T = smrzavanje / otapanje; SY = blago žuto; CL = bistro.

Stabilnost supstance leka u formulaciji koja sadrži 100 mg/mL α-PDL1, 20 mM histidin acetata, 120 mM saharoze, 0,04% PS20, pH 5,6 procenjena je sprovođenjem tri ciklusa zamrzavanja/odmrzavanja, nakon čega je čuvana u maloj limenki od nerđajućeg čelika ili hastelloy na -20°C, 5°C ili 25°C tokom 3 meseca, a zatim je izvršeno merenje stabilnosti pomoću SEC (SLIKA 7A i B). Nije uočena razlika između skladištenja u malim limenkama od nerđajućeg čelika i hastelloy pri pH 5,6. Supstanca leka bila je stabilna do 3 meseca na -20°C nakon tri ciklusa zamrzavanja/odmrzavanja. Uprkos malim razlikama kod malih limenki od nerđajućeg čelika i hastelloy-a, oba su prikladna za korišćenje kao skladišta supstance leka.

Stabilnost leka u formulaciji koja sadrži 50 mg/mL α-PDL1, 20 mM histidin acetata, 120 mM saharoze, 0,04% PS20, pH 5,6, procenjena je tokom čuvanja u bočici od 20cc sa 16 ml punjenja na -5°C, 25°C ili 40°C u trajanju do 3 meseca, nakon čega je vršeno merenje stabilnosti sa SEC i ICIEF (slike 8A i B). Nije primećena promena pri 5°C nakon tri meseca skladištenja. Stopa razgradnje pri pH 5,6 mesečno na 40°C iznosila je 0,66% i 22%, što je dobijeno analizom SEC i ICIEF.

Procena pufera u formulaciji F12 pokazala je da pufer od natrijum acetata daje sličnu stabilnost proteina kao pufer od histidin acetata, na osnovu stope razgradnje glavnog vrha izmerene pomoću SE-HPLC i ICIEF (tabela 8). Dve testirane formulacije bile su 50 mg/ml α-PDL1 u 20 mM L-histidin acetata, 120 mM saharoze i 0,04% (w/v) polisorbata 20 pri pH 5,5 i 0 mg/ml α-PDL1 u 20 mM natrijum acetata, 120 mM saharoze i 0,04% (w/v) polisorbata 20 pri pH 5,5.

Tabela 8. Stope razgradnje nultog reda α-PDL1 za glavni vrh ICIEF i SE-HPLC u puferima od histidin acetata i natrijum acetata na 40°C

Beleška: Sve formulacije su čuvane do 1 meseca na 40°C.

Sveukupno, DoE dizajnirane studije stabilnosti otkrile su da na 40°C ICIEF nije imao značajan uticaj na koncentraciju pri gubitku glavnog vrha, dok je niži pH imao nešto bržu stopu gubitka glavnog vrha (slika 1A-B). SE-HPLC nije primetio značajnije interakcije na 40°C, međutim formulacije veće koncentracije pokazuju brži gubitak monomera (sl. 3A-B). Otkriveno je i da niži pH ima bržu stopu gubitka monomera. Slični rezultati primećeni su na 25°C (slika 2A-B i slika 4A-B). Statistička analiza nije pokazala praktično značajne interakcije (povezanosti) između bilo kog testiranog parametra formulacije.

Studije mešanja i toplotnog stresa

Ispitivana je stabilnost leka u prisustvu povećanih koncentracija PS20 tokom mešanja u staklenim bočicama. Formulacija koja sadrži 57 mg/mL u 20 mM histidin acetata, 120 mM saharoze, pH 5,5, procenjena je u staklenim bočicama od 2 cc sa punjenjem od 1 mL sa različitim koncentracijama PS20 u opsegu od 0,005% do 0,06%. Staklene bočice su mešane sa 70 o/min tokom 3 dana na sobnoj temperaturi pre merenja stabilnosti pomoću SEC-a (slika 9A) i zamućenosti (slika 9B). Formulacija sa nivoima PS20 između 0,005-0,06% nije imala promene stabilnosti tokom mešanja. Međutim, formulacije kojima nedostaje PS20 pokazale su porast gubitka monomera usled povećanja HMWS-a. U ovom eksperimentu, 0,005% PS20 bilo je dovoljno za zaštitu proteina od stresa mešanja u staklenim bočicama.

Ispitana je stabilnost formulacija lekova (tabela 4) kada se čuvaju na različitim temperaturama i vremenima, a zatim pod stresom mešanja u staklenim bočicama. Formulacije F1 - F10 su procenjene u staklenoj bočici od 2 cc sa punjenjem od 1 mL. Staklene bočice su mešane sa 70 o/min tokom 1 dana na sobnoj temperaturi pre merenja stabilnosti pomoću SEC (slika 10). U ovom eksperimentu, mešanje ne utiče na stabilnost leka ako se čuva duže vreme na 40°C, 25°C ili 5°C.

Da bi se podržao transport IV kese, što se često dešava u bolničkim uslovima,

4

sprovedeno je IV ispitivanje IV kese na mešanje sa α-PDL1 formulisanim u 20 mM histidin acetata, 240 mM saharoze, pH 5,5 sa 0,005% - 0,02% (w/v) polisorbata 20. Najčešće dostupne polivinil-hlorid (PVC) ili poliolefinske (PO) IV kese od 250 mF, koje sadrže izotonični rastvor natrijum-hlorida (0,9% NaCl), procenjene su ubrizgavanjem 400-600 mg rastvora α-PDL1 i mešanjem pomoću orbitalnog šejkera pri 100 o/ min na 5°C u trajanju do 6 sati. Rezultati ispitivanja podržali su doziranje na osnovu težine i pokazali da je potrebno najmanje 0,015% (w/v) polisorbata 20 u rastvoru proteina kako bi se sprečilo stvaranje vidljivih čestica (povezanih sa taloženjem proteina) tokom transporta (tabela 9). Pored toga, za ublažavanje rizika od razgradnje polisorbata 20 tokom roka trajanja, koncentracija polisorbata 20 povećana je sa 0,02% (w/v) na 0,04% (w/v).

Tabela 9. Ispitivanje IV kese na mešanje sa različitom količinom PS20 u leku α-PDL1

Beleška: Sve formulacije α-PDL1 od 50 mg/mL u 20 mM L-histidin acetata, 240 mM saharoze pri pH 5,5. Analiza je izvršena pomoću SE-HPLC. NT = nije testirano; CAC = boja, izgled i bistrina; CO = bezbojno; CL = bistro; PFVP = praktično bez vidljivih čestica.

Procena stabilnosti formulacija α-PDL1

Dodatni pH test je sproveden na materijalima proizvedenim iz Master Cell banke i banke radnih ćelija u opsegu pH vrednosti od 5,2 do 6,3, u formulaciji koja sadrži 20 mM histidin acetata, 120 mM saharoze i 0,04% PS20 (tabela 10). Analiza pomoću SE-HPLC i ICIEF pokazala je da je pH 5,7-6,3 hemijski i fizički bio prilično stabilan i da je dozvoljeni opseg pH 5,5-6,3 u formulaciji odgovarajući (slike 11A i B). Viši pH su smanjili monomer i stope razgradnje najvišeg vrha, pri čemu se brzine izednačavaju između približno pH 5,7 i 6,3.

Tabela 10. pH test formulacija

Ispitan je učinak ekscipijenata formulacije na oksidaciju triptofana (W) i metionina (M) u formulacijama sa α-PDL1. Mapiranje peptida pokazalo je da nema značajnog povećanja oksidacije. Formulacije koje sadrže 20 mM histidin acetata, 120 mM saharoze, 0,04% PS20 sa pH vrednošću rastvora od 5,8 nisu pokazale očigledno povećanje oksidacije triptofana i metionina kada je formulacija bila čuvana mesec dana na povišenoj temperaturi bilo za lek ili supstancu leka (tabela 11).

Tabela 11. Procenat oksidacije Trp, M<253>i M<429>u formulacijama izabranim pomoću peptidne mape

Beleška: Sve formulacije α-PDL1 sadržale su 20 mM L-histidin acetata, 120 mM saharoze, 0,04% PS20, pH 5,8.

Na osnovu rezultata ovih ispitivanja formulacije i statističke analize, za klinička ispitivanja odabrana je tečna formulacija koja se sastoji od 60 mg/ml α-PDL1 u 20 mM histidin acetata, 120 mM saharoze, 0,04% polisorbata 20 sa ciljanim od pH 5,8.

Doziranje za klinička ispitivanja će se izvesti kao konstantna doza od 1200 mg α-PDL1 po pacijentu. Konfiguracija bočice sa nominalnim punjenjem od 20 mT (1200 mg α-PDL1) u staklenoj bočici od 20 cc odabrana je kako bi zadovoljila ciljni profil proizvoda.

Ispitivanja zamrzavanja/odmrzavanja sprovedena su sa nameravanom formulacijom koja je sadržala 60 mg/mL α-PDL1 u 20 mM L-histidin acetata, 120 mM saharoze i 0,02% (w/v) polisorbata 20 pri pH 5,8. Rezultati ispitivanja nakon pet ciklusa zamrzavanja/odmrzavanja potvrdili su da je 120 mM saharoze zaštitilo α-PDL1 od agregacije usled zamrzavanja/odmrzavanja (tabela 12). Slično, dugoročna stabilnost nameravane tekuće formulacije ukazuje da je stabilna više od 6 meseci pri 2-8°C (tabela 13). U toku je kontinuirano praćenje tokom 36 meseci za ovu formulaciju. Ciljana formulacija i testirani opsezi ispitivanja za supstancu leka α-PDL1 i lek prikazani su u tabeli 14.

Tabela 14. Ciljana formulacija i testirani rasponi ispitivanja za supstancu leka α-PDL1 i lek

Budući da će se lek α-PDL1 (60 mg / mL) primenjivati infuzijom nakon razređivanja u izotoničnom rastvoru natrijum-hlorida (0,9% NaCl), kompatibilnost i stabilnost aktivnog sastojka testirana je u sledećim simuliranim uslovima pripreme i primene: 1) razblaživanje leka α-PDL1 u kesama za infuziju koje sadrže 0,9% NaCl u rasponu 2,4 - 9,6 mg / ml (nazivna koncentracija nakon razređivanja) da bi se obuhvatio raspon doza u kliničkoj studiji; 2) Kratkotrajno izlaganje kesama za infuziju koje sadrže izotonični rastvor natrijum-hlorida (materijal na kontaktnoj površini kese se sastoji od PVC-a ili poliolefina); 3) Upotreba IV infuzionih linija sa (površinama koje dodiruju proizvod od PVC-a ili poliolefina); i 4) upotreba 0,2 µm linijskih filtera (filter membrana od PES-a).

Uzorci su testirani nakon 24 sata čuvanja na temperaturi od 2°C-8°C ili nakon 24 sata na temperaturi od 30°C uz izlaganje difuznoj svetlosti. Uzorci su testirani primenom odgovarajućih metoda indikacije stabilnosti, uključujući: čistoću pomoću SE-HPLC i ICIEF, koncentraciju proteina (UV), testom laserskog brojanja čestica, bistrinu / opalescenciju i pH (Tabela 15).

1

�

Proizvod testiran u simuliranim ispitivanjima primene, kao što je gore opisano, bio je fizički i hemijski stabilan u testiranim uslovima. Nakon uspešne kvalifikacije dodaju se kese za infuziju, setovi za infuziju, filteri i/ili pomoćna sredstva za IV infuziju sastavljena od različitih materijala koji dolaze u dodir sa proizvodom.

Pored statičke stabilnosti, ispitivanje IV kese na mešanje se sprovodi sa α-PDL1 formulisanim u 20 mM histidin acetata, 120 mM saharoze, pH 5,8, sa 0,02% PS20, što je potencijalno najniži nivo PS20 koji se može primetiti u lekovima tokom veka trajanja. Mešanje se izvodi na 2-8°C sa orbitalnim šejkerom pri brzini od 100 o/min. Podaci sugerišu da je sa 0,02% PS20 u leku, α-PDL1 stabilan nakon mešanja na 5°C nakon razređivanja u IV kesama (tabela 16).

Sekvence antitela koje su korišćene u primerima

Varijabilni region lakog lanca α-PDL1

7)

Varijabilni region teškog lanca α-PDL1

α-PDL1 puni teški lanac

1

2

4

1

11

12

1

14

1

Claims

PATENTNI ZAHTEVI

1. Stabilna vodena farmaceutska formulacija, formulacija koja sadrži monoklonsko antitelo anti-PDL1 u koncentraciji od 40 mg/ml do 125 mg / ml, histidin acetata ili natrijum acetata u koncentraciji od 15 mM do 25 mM, saharozu u koncentraciji od 60 mM do 240 mM, polisorbat u koncentraciji od 0,005% (w/v) do 0,06% (w/v) i pH 5,0 do 6,3; pri čemu navedeno monoklonsko antitelo sadrži varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO.: 7 i varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO.: 32; i pri čemu je navedeno monoklonsko antitelo humanizovano IgG1 antitelo.

2. Formulacija prema zahtevu 1, pri čemu navedeno monoklonsko antitelo u formulaciji iznosi 40 mg/ml do 80 mg/ml, 54 mg/ml do 66 mg/ml, 60 mg/ l do 125 mg/ml, 60 mg/ml ili 125 mg/ml.

3. Formulacija prema bilo kom od zahteva 1-2, pri čemu je navedeni histidin acetat ili natrijum acetat u koncentraciji od 17 mM do 22 mM ili 20 mM.

4. Formulacija prema bilo kom od zahteva 1-3, pri čemu je navedena saharoza u formulaciji 60 mM do 180 mM ili 120 mM.

5. Formulacija prema bilo kom od zahteva 1-4, pri čemu formulacija ima pH od 5,5 do 6,1, pH od 5,5 ili pH 5,8.

6. Formulacija prema bilo kom od zahteva 1-5, pri čemu je navedeni polisorbat u formulaciji polisorbat 20.

7. Formulacija prema bilo kom od zahteva 1-6, pri čemu navedeni polisorbat u formulaciji iznosi 0,02% do 0,04%.

8. Formulacija prema bilo kom od zahteva 1-7, pri čemu navedeno monoklonsko antitelo u formulaciji iznosi 60 mg/ml, saharoza u formulaciji je 120 mM, a pH iznosi 5,8; da navedeno monoklonsko antitelo u formulaciji iznosi 125 mg/ml, saharoza u formulaciji iznosi 240 mM, a pH iznosi 5,5;

da je navedeno monoklonsko antitelo u količini od 60 mg/mL, navedeni histidin acetat u koncentraciji od 20 mM, navedena saharoza u koncentraciji 120 mM, a navedeni polisorbat je polisorbat 20 u koncentraciji od 0,04% (w/v), i da navedena formulacija ima pH od 5,8; ili da je navedeno monoklonsko antitelo u količini od 125 mg / ml, navedeni histidin acetat u koncentraciji od 20 mM, navedena saharoza u koncentraciji od 240 mM, a navedeni polisorbat je polisorbat 20 u koncentraciji od 0,02%, i da navedena formulacija ima pH od 5,5.

9. Formulacija prema bilo kom od zahteva 1-8, pri čemu navedeno monoklonsko antitelo nije podložno prethodnoj liofilizaciji.

10. Formulacija prema bilo kom od zahteva 1-9, pri čemu navedeno monoklonsko antitelo sadrži: laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO.: 9 i težak koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO.: 10.

11. Formulacija prema bilo kom od zahteva 1-10, pri čemu, navedeno monoklonsko antitelo je čuvano u staklenoj bočici ili posudi od legure metala, opciono gde je legura metala nerđajući čelik 316L ili hastelloy.

12. Formulacija prema bilo kom od zahteva 1-11, pri čemu je formulacija stabilna na 2-8°C tokom najmanje 6 meseci, najmanje 12 meseci, najmanje 18 meseci ili najmanje 24 meseca.

13. Formulacija prema zahtevu 12, pri čemu antitelo u formulaciji zadržava najmanje 80% svoje biološke aktivnosti nakon skladištenja.

14. Formulacija prema zahtevu 13, pri čemu se biološka aktivnost meri vezivanjem antitela na PD-L1.

15. Formulacija prema bilo kom od zahteva 1-14, koja je sterilna.

16. Formulacija prema bilo kom od zahteva 1-15, koja je pogodna za primenu na subjektu, opciono za intravensku (IV) primenu.

17. Proizvod koji sadrži posudu sa stabilnom vodenom farmaceutskom formulacijom prema bilo kom od zahteva 1-16.

18. Proizvod prema zahtevu 17, pri čemu je posuda staklena bočica ili posuda od legure metala, opciono gde je legura metala nerđajući čelik 316L ili hastelloy.

19. Kompozicija za upotrebu u postupku lečenja bolesti ili poremećaja kod subjekta, koja sadrži efikasnu količinu formulacije prema bilo kom od zahteva 1-16, pri čemu su bolest ili poremećaj izabrani iz grupe koju čine infekcije, kanceri i upalne bolesti.

20. Formulacija prema bilo kom od zahteva 1-16, pri čemu monoklonsko antitelo sadrži supstituciju N297A ili D265A / N297A u konstantnom regionu, dok je numeracija ostatka u EU indeksu kao po Kabatu.

1