[go: up one dir, main page]

RS59724B1 - Terapija deoksinukleotidom za bolesti prouzorkovane neuravnoteženim zalihama nukleotida uključujući sindrome osiromašenja mitohondrijalne dnk - Google Patents

Terapija deoksinukleotidom za bolesti prouzorkovane neuravnoteženim zalihama nukleotida uključujući sindrome osiromašenja mitohondrijalne dnk

Info

Publication number
RS59724B1
RS59724B1 RS20191295A RSP20191295A RS59724B1 RS 59724 B1 RS59724 B1 RS 59724B1 RS 20191295 A RS20191295 A RS 20191295A RS P20191295 A RSP20191295 A RS P20191295A RS 59724 B1 RS59724 B1 RS 59724B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
substance
day
use according
therapeutically effective
effective amount
Prior art date
Application number
RS20191295A
Other languages
English (en)
Inventor
Michio Hirano
Caterina Garone
Ramon Marti
Original Assignee
Univ Columbia
Fundacio Hospital Univ Vall Dhebron Institut De Recerca
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Univ Columbia, Fundacio Hospital Univ Vall Dhebron Institut De Recerca filed Critical Univ Columbia
Publication of RS59724B1 publication Critical patent/RS59724B1/sr

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A61K31/505—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim
    • A61K31/513—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim having oxo groups directly attached to the heterocyclic ring, e.g. cytosine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7042—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings
    • A61K31/7052—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides
    • A61K31/706—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides containing six-membered rings with nitrogen as a ring hetero atom
    • A61K31/7064—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides containing six-membered rings with nitrogen as a ring hetero atom containing condensed or non-condensed pyrimidines
    • A61K31/7068—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides containing six-membered rings with nitrogen as a ring hetero atom containing condensed or non-condensed pyrimidines having oxo groups directly attached to the pyrimidine ring, e.g. cytidine, cytidylic acid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7042—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings
    • A61K31/7052—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides
    • A61K31/706—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides containing six-membered rings with nitrogen as a ring hetero atom
    • A61K31/7064—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides containing six-membered rings with nitrogen as a ring hetero atom containing condensed or non-condensed pyrimidines
    • A61K31/7068—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides containing six-membered rings with nitrogen as a ring hetero atom containing condensed or non-condensed pyrimidines having oxo groups directly attached to the pyrimidine ring, e.g. cytidine, cytidylic acid
    • A61K31/7072—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides containing six-membered rings with nitrogen as a ring hetero atom containing condensed or non-condensed pyrimidines having oxo groups directly attached to the pyrimidine ring, e.g. cytidine, cytidylic acid having two oxo groups directly attached to the pyrimidine ring, e.g. uridine, uridylic acid, thymidine, zidovudine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7042—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings
    • A61K31/7052—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides
    • A61K31/706—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides containing six-membered rings with nitrogen as a ring hetero atom
    • A61K31/7064—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides containing six-membered rings with nitrogen as a ring hetero atom containing condensed or non-condensed pyrimidines
    • A61K31/7076—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides containing six-membered rings with nitrogen as a ring hetero atom containing condensed or non-condensed pyrimidines containing purines, e.g. adenosine, adenylic acid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7042—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings
    • A61K31/7052—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides
    • A61K31/706—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides containing six-membered rings with nitrogen as a ring hetero atom
    • A61K31/7064—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides containing six-membered rings with nitrogen as a ring hetero atom containing condensed or non-condensed pyrimidines
    • A61K31/7076—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides containing six-membered rings with nitrogen as a ring hetero atom containing condensed or non-condensed pyrimidines containing purines, e.g. adenosine, adenylic acid
    • A61K31/708—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides containing six-membered rings with nitrogen as a ring hetero atom containing condensed or non-condensed pyrimidines containing purines, e.g. adenosine, adenylic acid having oxo groups directly attached to the purine ring system, e.g. guanosine, guanylic acid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0053—Mouth and digestive tract, i.e. intraoral and peroral administration
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/04—Anorexiants; Antiobesity agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6827—Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2300/00—Mixtures or combinations of active ingredients, wherein at least one active ingredient is fully defined in groups A61K31/00 - A61K41/00

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Physiology (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Child & Adolescent Psychology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)

Description

Opis
OBLAST PRONALASKA
[0001] Ovaj se pronalazak generalno odnosi na farmakološku terapiju za humane genetske bolesti, specifično bolesti koje karakterišu nebalansirane zalih nukleotida, npr., sindromi osiromašenja mitohondrijalne DNK, i preciznije, deficijencija timidin kinaze 2 (TK2). Farmakološka terapija obuhvata isporuku dva deoksinukleotida. Za lečenje TK2 deficijencije, farmakološka terapija obuhvata isporuku bilo deoksitimidina (dT) i deoksicitidina (dC). Ova isporuka deoksinukleotida pacijentu je primenljiva i na druge poremećaje neuravnoteženih zaliha nukleotida, posebno one koji se nalaze u sindromu osiromašene mitohondrijalne DNK.
STANJE TEHNIKE
[0002] Hirano, Michio, Columbia University (N.Y.), Project #3, 2014, "Pharmacological and gene therapy of TK2 deficiency in mice and human (Farmakološka i genska terapija TK2 nedostatka kod miševa i ljudi)" tvrdi da terapija molekularnog zaobilaska sa oralno isporučenim dCMP i dTMP poboljšava abnormalni fenotip i produžava životni vek Tk2-/- miševa za 2-3 puta, ali ne leči bolest.
[0003] Garone et al, Neurology 80(7), 2013, "Deoxypyrimidine monophosphates treatment for thymidine kinase 2 deficiency (S05.005) (Terapija deoksipirimidin monofosfatima za timidin kinaze 2 deficijenciju (S05.005)" navodi da izostanak TK2 aktivnosti kod miševa prouzrokuje neravnotežu zaliha nukleotida sa smanjenjem deoksipirimidin trifosfata (dTTP i dCTP) u mozgu i jetri, što vodi smanjenju mtDNK broja kopija.
[0004] Mitohondrijalne bolesti su klinički heterogene bolesti usled nedostataka mitohondrijalnog respiratornog lanca (RC) i oksidativne fosforilacije, biohemijske putanje koje pretvaraju energiju u elektrone u adenozin tifosfat (ATP). Respiratorni lanac se sastoji od četiri višetrukih podjediničnih enzima (kompleksa I-IV) koji prenose elektrone da bi generisali gradijent protona preko unutrašnje membrane mitohondrija i protok protona kroz kompleks V pogoni ATP sintezu (Di-Mauro and Schon 2003; DiMauro and Hirano 2005). Koenzim Q10(CoQ10) je osnovni molekul koji lansira elektrone iz kompleksa I i II u kompleks III.
Respiratorni lanac je jedinstven kod ćelija eukariota, npr., sisara, zahvaljujući tome što ih kontrolišu dva genoma, mitohondrijalna DNK (mtDNK) i nuklearna DNK (nDNK). Kao posledica toga, mutacije u bilo kom genomu mogu da prouzrokuju mitohondrijalne bolesti. Većina mitohondrijalnih bolesti utiče na više organa u organizmu i obično je fatalna u detinjstvu ili ranom životnom dobu odrasle osobe. Ne postoje dokazane delotvorne terapije za mitohondrijalne bolesti, samo pomoćne terapije, kao što je isporuka CoQ10i njegovih analoga da bi se povećala respiratorna lančana aktivnost i da bi se detoksikovale reaktivne vrste kiseonika (ROS) koje su toksični nusproizvodi disfunkcionalnih respiratornih lančanih enzima. enzima disfunkcionalnog respiratornog lanca.
[0005] Sindrom osiromašenja mitohondrijalne DNK (MDS), koji je podrgupa mitohondrijalne bolesti, je čest uzrok ozbiljne encefalomiopatije u detinjstvu karakterisanu molekularno smanjenjem broja kopija mitohondrijalne DNK (mtDNK) u tkivima i nedovoljnom sintezom mitohondrijalnih RC kompleksa (Hirano, et al. 2001). Mutacije u nekoliko nuklearnih gena su identifikovane kao uzroci infantilne MDS, uključujući: TK2, DGUOK, POLG, POLG2, SCLA25A4, MPV17, RRM2B, SUCLA2, SUCLG1 TYMP, OPA1, i C10orf2 (PEO1). (Bourdon, et al. 2007; Copeland 2008; Elpeleg, et al.
2005; Mandel, et al.2001; Naviaux and Nguyen 2004; Ostergaard, et al.2007; Saada, et al.2003; Sarzi, et al. 2007; Spinazzola, et al.2006). Pored toga, mutacije kod ovih nuklearnih gena mogu takođe da prouzrokuju višestruke delecije mtDNK sa ili bez mtDNK osiromašenja (Béhin, et al.2012; Garone, et al.2012; Longley, et al.2006; Nishino, et al.1999; Paradas, et al.2012; Ronchi, et al.
2012; Spelbrink, et al. 2001; Tyynismaa, et al.2009; Tyynismaa, et al. 2012; Van Goethem, et al.
2001).
[0006] Jedan od ovih gena je TK2, koji kodira timidin kinazu (TK2), mitohondrijalni enzim neophodan za fosforilaciju pirimidin nukleotida (timidin i deoksicitidin) da bi se proizveo deoksitimidin monofosfat (dTMP) i deoksicitidin monofosfat (dCMP) (Saada, etal.2001). Mutacije u TK2 oštećuju putanje mitohondrijalnog nukleotida/ spašavanja nukleotida neophodne za sintezu deoksinukleotid trifosfata (dNTP), sastavnih delova za replikaciju i obnavljanje mDNK.
[0007] TK2 nedostatak je prvo bio opisan u radu iz 2001 koji su pripremili Saada i kolege (Saada, et al. 2001), kod četiri obolela deteta koja potiču iz četiri različite familije, koji su imali ozbiljnu, razornu miopatiju. Posle jednoličnog ranog razvoja, u starosnim dobima od 6-36 meseci pacijenti su razvili hiperCKemiju, ozbiljnu hipotoniju mišića sa naknadnim gubitkom spontane aktivnosti. Bolest je napredovala veoma brzo i dva pacijenta su stavljena na aparat za mehaničko disanje u uzrastu od 3 godine, dok su dva druga pacijenta bila već mrtva u vreme pripreme izveštaja.
[0008] Posle prvog opisa, šest dodatnih pacijenata je prikazano u literaturi i kod najmanje još dvadeset šest pacijenata je dijagnostikovana ali nije prijavljena (Alston, et al.2013; Bartesaghi, et al. 2010: Béhin, et al. 2012; Blakely, et al. 2008: Carrozzo, et al. 2003; Chanprasert, et al. 2013; Collins, et al.2009; Galbiati, et al.2006; Gotz, et al.2008; Leshinsky-Silver, et al.2008; Lesko, et al. 2010; Mancuso, et al. 2002; Mancuso, et al. 2003; Marti, et al. 2010; Oskoui, et al. 2006; Paradas, et al. 2012; Roos, et al. 2014; Tulinius, et al. 2005; Tyynismaa, et al. 2012; Vilà, et al.
2003; Wang, et al.2005), što je kao rezultat dalo devedest pacijenata, 53 muškarca i 37 žena.
[0009] Dvadeset šest skorije dijagnostikovanih pacijenata je identifikovano putem sledeće generacije DNK sekvenciranja. Ovaj veliki broj novoidentifikovanih slučajeva nagoveštava da je TK2 deficijencija poremećaj koji se dijagnostikuje ređe nego što se na njega nailazi.
[0010] TK2 deficijencija manifestuje širok klinički i molekularno genetički spektar koji se kod većine pacijenata manifestovao u ranom detinjstvu sa razornim kliničkim tokom, pri čemu drugi imaju sporo progresivnu slabost tokom decenija.
[0011] Lečenje TK2 deficijencije, kao kod većine MDS i mitohondrijalnih poremećaja, je ograničeno na pomoćne terapije. Kako je isporuka deoksi timidin monofosfata (dTMP) i deoksicitidin monofosfata (dCMP) poboljšala stanja i kod TK2 laboratorijskih mutiranih miševa i kod humanih pacijenata sa TK2 nedostatkom (US prijava serijski br.15/082,207), postoji potreba za terapijskom intervencijom za TK2 nedostatkom.
[0012] Dodatno, postoji potreba za lečenjem drugih oblika MDS i drugih bolesti koje karakterišu neuravnotežene zalihe nukleotida. Na primer, nekoliko mendelovihporemećaja sa mtDNK osiromašenjem ili više osiromašenja, ili obe karakterišu neuravnotežene zalihe deoksinukleotid trifosfata što vodi do poremećaja mtDNK replikacije. Jedan takav poremećaj, DGUOK mutacije oštećuje intramitohondrijalni enzim deoksi guanozin kinaze, koja normalno fosforiliše deoksipurin nukleotide deoksiguanozin i deoksicitidin da bi se proizveo deoksiguanozin monofosfat (dGMP) i deoksicitidin monofosfat (dCMP). Drugi nuklearni geni koji poremete mitohondrijalne dNTP zalihe obuhvataju TYMP, RRA12B, SUCLA2, SUCLG1 i MPV17. Terapije koje obnavljaju dNTP uravnoteženost zaliha bi isto tako bile korisne za lečenje ovih poremećaja.
KRATAK OPIS PRONALASKA
[0013] Ovaj pronalazak obezbeđuje terapijski delotvornu količinu supstance koja obuhvata mešavinu deoksicitidina (dC) i deoksitimidina (dT) za upotrebu u postupku za lečenje deficijencije timidin kinaze 2 (TK2) kod humanog pacijenta kom je potrebno.
[0014] Bolesti ili poremećaji koje karakterišu neuravnotežene zalihe nukleotida obuhvataju one koje karakterišu mutacije u sledećim genima: TK2; DGUOK; TYMP; RRM2B; SUCLA2; SUCLG1; i MPV17.
[0015] Takav poremećaj može da bude sindrom osiromašenja mitohondrijalne DNK (MDS). Sindrom osiromašenja mitohondrijalne DNK (MDS) može da obuhvati poremećaje miopatnog oblika koje karakterišu mutacije u TK2, encefalomiopatni oblik koji karakterišu mutacije u SUCLA2, oblik neurogastrointestinalne encefalopatije koji karaktrišu mutacije u TYMP, i hepatopatni oblik koji karakterišu mutacije u DGUOK, POLG, i MPV17.
[0016] U preporučenom izvođenju ovog pronalaska, deficijenciju timidin kinaze 2 karakterišu mutacije na genu TK2.
[0017] Svi sindromi deplecije mitohondrijalne DNK mogu biti lečeni postupkom iz ovog opisa, koji obuhvata isporuku deoksinukleotida. Primeri MDS koje je moguće lečiti postupkom iz ovog opisa obuhvataju ali se ne ograničavaju na, nedostatke u: DGUOK genu, koji kodiraju deoksiguanozin kinazu, dGK; RRM2B gen, kodiranje p53R2, uz pomoć p53 indukovana mala podjedinica reduktaze ribonukleotida, RNR; i TYMP gen, koja kodira timidin fosforilazu, TP.
[0018] U jednom delu opisa, deoksinukleotid je bilo deoksitimidin (dT) ili deoksicitidin (dC) ili njegove mešavine. Deoksiadenozin (dA) i deoksiguanozin (dG), sam ili zajedno, moguće je takođe koristiti. Jedan deoksinukleotid (t.j., dT, dC, dA, ili dG) i mešavine dva ili više od bilo kog od četiri deoksinukleotida moguće je koristiti u opisanom postupku.
[0019] Preporučene doze deoksinukleotida su između oko 100 i oko 1.000 mg/kg/dan, još poželjnije između oko 300 i oko 800 mg/kg/dan, i najpoželjnije između oko 250 i oko 600 mg/kg/dan. Ako opisana supstanca obuhvata jedan deoksinukleotid, onda su doze od jednog deoksinukleotida. Ako, kao što je u pronalasku, supstanca obuhvata više od jednog deoksinukleotida, doze mogu biti od svakog deoksinukleotida ili od ukupnih deoksinukleotida u toj supstanci.
[0020] Isporuka deoksinukleotida može da bude jednom dnevno, dvaput dnevno, triput dnevno, četiri puta dnevno, pet puta dnevno, sve do šest puta dnevno, poželjno u redovnim intervalima.
[0021] Preporučeni postupci isporuke pacijentu su oralni, intratekalni, intavenozni, i enteralni.
[0022] Isporuka deoksinukleotida treba da počne čim poremećaj karakterišu neuravnotežene zalihe nukleotida, npr., MDS, za čije postojanje postoji sumnja i nastave se tokom života pacijenta. Test za dijagnozu takvih poremećaja obuhvata TK2 deficijenciju su poznati u ovoj oblasti.
KRATAK OPIS SLIKA NACRTA
[0023] U svrhe boljeg opisa ovog pronalaska, prikazana su na crtežima izvesna izvođenja ovog pronalaska. Međutim, taj pronalazak nije ograničen na precizne rasporede i instrumentalnosti izvođenja prikazanih na slikama.
Slika 1 prikazuje krivulju rasta divljeg tipa (Tk2<+/+>i Tk2<+/->), i Tk2<-/->miševi lečeni sa 260 mg/kg/dan ili 520 mg/kg/dan deoksicitidina (dC) i deoksitimidina (dT) od 4. dana posle rođenja. Svaki simbol predstavlja srednju težinu u svakoj vremenskoj tački. N od svake grupe je prikazan na slici.
Slika 2 prikazuje krivulju opstanka divljeg tipa (Tk2<+/+>), i Tk2<-/->miševa sa sledećim terapijama: Tk2<-/-mleko>naspram Tk2<-/-200 mg/kg/dan dCMP+dTMP>, p=0,0013; Tk2<-/-mleko>naspram Tk2<-/-260 mg/kg/dan dC+dT>, p=0,0006; Tk2<-/-mleko>naspram Tk2<-/-520 mg/kg/dan dC+dT>, p<0,0001; Tk2<-/- 260 mg/kg/dan dC-dT>naspram Tk2<-/-520mg/kg/dan dCdT>, p=0,0009, 4. dana posle rođenja. N od svake grupe je prikazan na slici, pvrednosti su utvrđene putem Mantel-Koksovih (Mantel-Cox) testova.
Slika 3 su grafIkoni relativnih proporcija dNTP u izolovanim mitohondrijama iz tkiva mozga i jetra divljeg tipa (Tk2<+/+>), i Tk2<-/->, nelečeni ili lečeni sa 200 mg/kg/dan dCMP i dAMP, ili 260 mg/kg/dan ili 520 mg/kg/dan deoksicitidina (dC) i deoksitimidin (dT) u uzrastu od 13 dana posle rođenja (gornji paneli) i 29 dana posle rođenja (donji paneli).
Slika 4 su grafikoni koji pokazuju odnos od mtDNK/nDNK u mozgu, jetri, crevima, i mišiću kod divljgeg tipa Tk2 miševa (Tk2<+/+>) (levi stubac) u poređenju sa Tk2<-/->miševima, nelečeni ili lečeni sa 260 mg/kg/dan ili 520 mg/kg/dan deoksicitidin (dC) i deoksitimidin (dT), 13. i 29. dana posle rođenja. Podaci su predstavljeni kao srednje ± standardno odstupanje (SD) procenta mtDNK primeraka u odnosu na Tk2<+>.
p-vrednosti su procenjene pmoću Man-Vitnijevih (Mann-Whitney) testova. (*p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001, ****p<0,0001).
Slika 5 su grafikoni prikazuju rezultate HPLC merenja dT i uracila u plazmi netretiranih miševa divljeg tipa (Tk2<+/+>), miševa divljeg tipa (Tk2<+/+>) tretiranih sa 260 mg/kg/dan deoksicitidina (dC) i deoksitimidina (dT), Tk2<-/->miševa lečenih sa 260 mg/kg/dan deoksicitidina (dC) i deoksitimidina (dT), i Tk2<-/->miševa lečenih sa 200 mg/kg/dan dCMP i dTMP, 30 minuta posle lečenja. Podaci su izraženi kao srednje ± SD.
Slika 6 su grafikoni nivoa aktivnosti enzima respiratornog lanca kod Tk2<-/->miševa lečenih sa 400 mg/kg/dan od dCMP i dTMP i THU i to 13 dana postnatalno, 260 mg/kg/dan deoksicitidina (dC) i deoksitimidina (dT) na 13. i 29. dana postnatalno, ili 520 mg/kg/dan deoksicitidina (dC) i deoksitimidina (dT) 29. dana postnatalno. Podaci su prikazani kao procenat RCE aktivnosti u Tk2<-/->mišjim tkivima normalizovanim prema nivoima proteina i u odnosu na Tk2<+>za svako lečenje, p-vrednosti utvrđeno putem Man-Vitnijevih testova (Mann-Whitney). *p<0,05.
Slika 7A je imunoblotu proteina respiratornog lanca kod miševa divljeg tipa lečenih sa 260 mg/kg/dan ili 520 mg/kg/dan deoksicitidina (dC) i deoksitimidina (dT), i Tk2<-/->miševa lečenih sa 260 mg/kg/dan ili 520 mg/kg/dan od deoksicitidin (dC) i deoksitimidin (dT) 29. dana posle rođenja. Slika 7B su grafikoni koji pokazuju RCE nivoe normalizovani prema kompleksu II, prikazane kao procenat RCE nivoa kod TK2<+/+>miševa, p-vrednosti su procenjene Man-Vitnijevim testovima.
[0024] Skraćenice: CS= citrat sintaza; CI= NADH-dehidrogenaza; CII= sukcinat dehidrogenaza; CIII= citohrom c reduktaza; CIV= citohrom c oksidaza (COX); CI+III= NADH-citohrom c reduktaza; CII+ III= sukcinat dehidrogenaza-citohrom c reduktaza.
DETALJAN OPIS PRONALASKA
[0025] Ovaj se pronalazak zasniva na neočekivanom otkriću da je sindrome osiromašenja mitohondrijalne DNK, uključujući TK2 nedostatak, moguće lečiti deoksinukleotidima. Kao što ovde dati rezultati prikazuju, isporuka deoksinukleotida je u velikoj meri poboljšala stanje i na modelu miša sa TK2 deficijencijom i kod humanih pacijenata sa TK2 deficijencijom.
Definicije
[0026] Pojmovi korišćeni u ovom spisu generalno imaju svoja uobičajena značenja u ovoj oblasti, u kontekstu ovog pronalaska i specifičan kontekst gde se svaki pojam koristi. Izvesni pojmovi se razmatraju dole u tekstu, ili negde drugde u ovom spisu, da bi se obezbedila smernica za stručnjaka u praksi koji opisuje postupke iz ovog pronalaska i kako da ih koriste. Pored toga, biće jasno da isti pojam može da se pomene na više od jednog načina. Samim tim, alternativni jezik i sinonimi mogu biti korišćeni za bilo koji jedan ili više pojmova koji se ovde razmatraju, niti treba bilo kakav specijalni značaj pripisati zavisno od toga da li se neki pojam ovde objašnjava ili razmatra. Ovde su dati sinonimi za izvesne pojmove. Navod jednog ili više sinonima ne isključuje upotrebu drugih sinonima. Upotreba primera bilo gde u ovom spisu, uključujući primere za bilo koje od ovde razmatranih pojmova, je samo u svrhu ilustracije, a ni na koji način u svrhu ograničenja obima i značenja ovog pronalaska ili bilo kog ovde datog pojma. Isto tako, ovaj pronalazak nije ograničen na njegova preporučena izvođenja.
[0027] Pojam "subjekat" kako se koristi u ovoj prijavi znači sisare. Sisari obuhvataju pseće vrste, mačje vrste, glodare, goveda, konje, svinje, ovce, i primate. Dakle, ovaj pronalazak je moguće koristiti u veterinarskoj medicini, npr., za lečenje kućnih ljubimaca, životinja na farmi, laboratorijskih životinja u zoološkim parkovima, i životinja u divljini. Ovaj pronalazak je posebno poželjan za medicinske primene na ljudima
[0028] Pojam "pacijent" kako se ovde koristi u primeni znači humanog subjekta. Kod nekih izvođenja ovog pronalaska, "pacijent" je poznat ili se smatra da ima bolest ili poremećaj koji karakteriše neuravnoteženost zaliha nukleotida, mitohondrijalna bolest, sindrom osiromašenja mitohondrijalne DNK, ili TK2 deficijencija.
[0029] Fraza "terapijski delotvorna količina" se koristi ovde da znači količinu dovoljnu da prouzrokuje poboljšanje klinički značajnog stanja kod subjekta, ili odglaganja ili svede na minimum ili ublaži jedan ili više simptoma povezanih sa bolešću ili poremećajem, ili daje kao rezultat željenu korisnu promenu fiziologije kod subjekta.
[0030] Pojmovi "lečiti", "lečenje", i slični se odnose na sredstva za usporavanje, olakšanje, poboljšanje ili ublaženje barem jednog od simptoma bolesti ili poremećaja, ili da se, posle početka, vrati unazad bolest ili poremećaj.
[0031] Pojmovi "spreči", "sprečavanje", i slični se odnose na delovanje pre otvorene pojave bolesti ili poremećaja, na sprečavanje bolesti ili poremećaja od daljeg razvoja ili svođenje na minium bolesti ili poremećaja, ili usporavanje njenog toka razvoja.
[0032] Pojam "kod kog postoji potreba’ bi bio poznat subjekat ili subjekat za kog se sumnja da ima ili da kod njega postoji rizik da dobije bolest ili poremećaj koju karakterišu neuravnotežene zalihe nukleotida, mitohondrijalna bolest, sindrom osiromašenja mitohondrijalne DNK, ili TK2 deficijencija.
[0033] Pojam "agens" kako se ovde koristi znači supstancu koja proizvodi ili može da proizvede dejstvo i obuhvatila bi, ali se ne bi ograničila na, hemikalije, farmaceutske proizvode, biološke lekove, male organske molekule, antitela, nukleinske kiseline, peptide, i proteine.
[0034] Pojam "deoksinukleotid" kako se ovde koristi znači deoksitimidin ili dT, deoksicitidin ili dC, deoksiadenozin ili dA, i deoksiguanozin ili dG. Naziv pune dužine i uobičajena skraćenica za svaki će biti korišćeni ravnopravno. Takvi deoksinukleotidi takođe obuhvataju fiziološki funkcionalne derivate deoksinukletodia.
[0035] Kako se ovde koristi, pojam "fiziološki funkcionalan derivat" se odnosi na jedinjenje (npr., prekursor lek) koji se transformiše in vivo da bi dao deoksinukleotid. Transformacija može da nastane različtiim mehanizmima (npr., metaboličkim ili hemijskim procesima), kao što je, na primer, hidrolizom u krvi. Prolekovi su takvi derivati, i diskusija o upotrebi prolekova je data u radu T. Higuchi and W. Stella, "Pro-drugs as Novel Delivery Systems (Prolekovi kao novi sistemi isporuke," Vol.14 A.C.S. Symposium Series, i u radu Bioreversible Carriers in Drug Design (Bioreverzibilni nosači u projektovanju leka), ed. Edward B. Roche, American Pharmaceutical Association and Pergamon Press, 1987.
[0036] Kako je ovde korišćeno "neželjeno dejstvo" je neželjena reakcija prouzrokovana isporukom leka pacijentu. U većini slučajeva, isporuka deoksinukleotida nije prouzrokovala neželjena dejstva. Najočekivanije neželjeno dejstvo bi bila manja gastrointestinalna netolerancija.
[0037] Pojam "oko" ili "približno" znači unutar pihvatljivog opsega greške za specifičnu vrednost kako odedi prosečan stručnjak u ovoj oblasti, što će zavisiti delimično od na čina na koji se vrednosti meri ili određuje, npr., ograničenja sistema merenja, t.j., stepena preciznosti neophodnog za specifičnu namenu, kao što je farmaceutska formulacija. Na primer, "oko" može da znači standardno odstupanje unutar 1 ili više od 1, po praktičoj upotrebi u toj oblasti. Alternativno, "oko" može značiti opseg od najviše 20%, poželjno do 10%, još poželjnije do 5%, i još poželjnije i do 1% date vrednosti. Alternativno, posebno u vezi sa biološkim sistemima ili postupcima, pojam može da znači unutar reda veličine, poželjno 5-struko, i još poželjnije 2-struko, od neke vrednosti. Kada su specifične vrednosti opisane u prijavi i patentnim zahtevima, osim ako nije drugačije navedeno, pojam "oko" treba razumeti u značenju unutar prihvatljivog opsega greške za tu specifičnu vrednost.
Isporuka deoksinukleotida za lečenje sindroma osiromašenja mitohondrijalne DNK
[0038] Sindrom osiromašenja mitohondrijalne DNK (mtDNK) (MDS) obuhvata nekoliko ozbiljnih autosomalnih bolesti koje karakteriše smanjenje broja kopija mtDNK u zahvaćenim tkivima. Većina MDS uzročnih nuklearnih gena kodira proteine koji pripadaju mašineriji mtDNK replikacije ili su uključeni u metabolizam deoksiribonukleotidnog trifosfata (dNTP).
[0039] Jedan oblik MDS je deficijencija timidin kinaze ili TK2. TK2 je kodiran nuklearnim genom, TK2, je protein mitohondrijalne matrice koji fosforiliše timidin i deoksicitidin nukleotide da generišu deoksitimidn monofosfat (dTMP) i deoksicitidin monofosfat (dCMP), koji se zauzvrat, pretvaraju u deoksinukleotid trifosfate (dNTPs) neophodne za sintezu mitohondrijalne DNK. Kao što se razmatra u delu o oblasti tehnike, autosomalne recesivne mutacije TK2 prouzrokuju razornu slabost neuromišića sa ozbiljnim osiromašenjem mitohondrijalne DNK (mtDNK) kod odojčadi i dece, kao i progresivnu spoljnu oftalmoplegiju sa višestrukim delecijama mtDNK kod odraslih. Veliki broj pacijenata ne može da hoda i zahteva neki oblik mehaničkog disanja i cevi za hranu. Centralni nervni sistem je promenljivo uključen u ove poremećaje, sa simptomima koji obuhvataju epileptične napade, encefalopatiju, kognitivno oštećenje i gubitak sluha. Manje od 7% pacijenata živi duže od 42 godine.
[0040] Na osnovu kliničkih otkrića i otkrića molekularne genetike od pacijenata kojima je postavljena dijagnoza, prepoznate su tri prezentacije bolesti: i) pojava miopatije kod odojčadi ( ≤1. godine starosti) sa pojavom slabosti u prvoj godini života sa ozbiljnim osirmašenjem mtDNK i ranim mortalitetom; ii) pojava miopatije u detinjstvu (uzrast >1-11 godina) sa ozbiljnim osiromašenjem mtDNK; i iii) kasna pojava miopatije (uzrast ≥12 godina) sa blagom slabošću pri pojavi i sporim napredovanjem prema gubitku ambulacije (ustajanja), respiratorne insuficijencije, ili oba, često sa progresivnom spoljnom oftalmoparezom kod odrslih ili u zreloj dobi u vezi sa višestrukim delecijama mtDNK, smanjenim brojem mtDNK kopije, ili oba. Videti generalno Garone, et al., (2016) za pripremanje.
[0041] Pokušaji da se proučava patogeneza i terapije za testiranje za TK2 deficijenciju korišćenjem kultivisanih fibroblasta od pacijenata koji su neuspešni, jer replikovanje ćelija nije uspelo da manifestuje osiromašenje mtDNK. Nasuprot tome, homozigotni Tk2 H126N laboratorijski mutirani (Tk2<-/->) model miša, manifestuje fenotip koji je izrazito sličan humanoj encefalomiopatiji kod odojčadi koju prouzrokuju mutacije TK2, koje karakteriše pojava u uzrastu od 10 dana sa povećanom ambulacijom, nestabilnim hodom, grubim tremorom, zaostajanjem rasta, i osiromašenjem mitohondrijalne DNK (mtDNK) koja brzo napreduje do rane smrti u uzrastu od 14 do 16 dana, što je vremenski period analogan sa pojavom bolesti kod humanih odojčadi (Akman, et al.2008; Dorado, et al.2011).
[0042] Studije koje su ovde prikazane sa Tk2 laboratorijskim miševima su pokazale isporuku za oralnu dC/dT produženu pojavu kliničkih simptoma TK2 deficijencije i dvostruko-do trostruko produženja životnog veka kod miševa (Primer 2).
[0043] Dodatni eksperimenti su pokazali dejstva specifična za tkiva. Merenja nivoa zaliha dNTP u ekstraktima mitohondrija su pokazala da je dCTP bio spašen u mozgu i da je dTTP bio spašen u jetri (Primer 3). Merenje osiromašenja mtDNK je pokazalo da su i dCMP+dTMP i dC+dT terapije spasile broj kopija mtDNK u jetri, mišiću i tkivu (Primer 4). Prethodno je spekulisano da formiranje krvno moždane barijere može da ugrozi biodostupnost lečenja u mozgu. Bez obzira na to, HPLC merenja su pokazala da su pronađeni katalitički proizvodi ovih jedinjenja u višim koncentracijama posle lečenja i nukleotidnih monofosfata i deoksinukleotida, što ukazuje da oni mogu da pređu krvnomoždanu barijeru. Merenja osiromašenja mtDNK su takođe pokazala potpuno spašavanje broja kopija mtDNK u crevima.
[0044] Dakle, eksperimenti izneti ovde koji koriste model miša za Tk2 deficijenciju pokazuju isporuku pacijentu deoksinukleotida kao delotvornu i bezbednu za lečenje bolesti. Pored toga, kao što je pokazano na Primeru 5, isporuka dT i dC je u velikoj meri poboljšala simptome TK2 deficijencije kod pacijenata.
[0045] Dakle, ovaj opis obuhvata isporuku barem jednog pacijentu potrbnog deoksinukleotida. U jednom izvođenju, ovaj opis obuhvata isporuku barem jednog deoksipirimidina. U još jednom izvođenju ovog opisa, deoksipirimidin je izabran iz dC, dT i njihovih mešavina. U jednom izvođenju, ovaj opis obuhvata isporuku pacijentu barem jednog deoksipurina. U još jednom izvođenju, deoksipurin je izabran iz dA, dG, i njihovih mešavina.
[0046] Pacijenti koji bi imali koristi od isporuke deoksinukleotida bi bili oni kojima je dijagnostikovana TK2 deficijencija. Kod ovih pacijenata bi bili isporučeni, barem jedan deoksipirimidin, dC ili dT, ili njihove mešavine.
[0047] Paralelni nedostatak deoksiguanozin kinaze (dGK), usled autosomalnih recesivnih mutacija u DGUOK sa deficijencijama u dGMP i dAMP, prouzrokuje osiromašenje mtDNK koje karakteristiše manifestovanje pojave hepatocerebralne bolesti još u ranom detinjstvu (Mandel, et al. 2001). Ovi pacijenti bi imali korist od isporuke barem jednog deoksipurina, dG ili dA, ili njihovih mešavina.
[0048] Drugi oblici MDS kao i drugi poremećaji koji se odnose na neuravnotežene zalihe nukleotida mogu biti lečeni isporukuom specifičnih deoksinukleotida, t.j., dA, dG, dC, ili dT, ili njihovih mešavina. Ovi poremećaji bi obuhvatili deficijencije, ali bez ograničenja, kao što su RRM2B (kodira p53R2, p53 induktivna mala podjedinica ribonukleotidne reduktaze, RNR) i mutacije u TYMP (kodira timidin fosforilazu, TP) što prouzrokuje mitohondrijalnu neurogastrointestinalnu encefalomiopatiju (MNGIE). Dodatni nuklearni geni koji ometaju zalihe mitohondrijalne dNTP ali nisu ograničeni na SUCLA2, SUCLG1 i MPV17. Poremećaje koji se odnose na ove gene moguće je lečiti i isporukom jednog ili više deoksinukleotida.
[0049] Pored toga, kako mehanizmi drugih oblika MDS i drugi poremećaji postanu razjašnjeni, najbolje deoksinukleotide za lečenje može da odredi stručnjak.
[0050] Pacijenti koji ispoljavaju fenotip koji je razmatran gore u tekstu za TK2 deficijenciju uključujući najuobičajeniju prezentaciju progresivne mišićne bolesti koju karakteriše generalizovana hipotonija, proksimalna slabost mišića, gubitak prethodno stečenih motornih veština, smanjeno uzimanje hrane, i teškoće sa disanjem, mogu biti testirani da bi se definitivno dijagnostikovala ta bolest.
[0051] Ako se na osnovu kliničkih pokazatelja izrazito sumnja na postojanje sindroma osiromašenja mtDNK, treba izvesti molekularno genetičko testiranje korišćenjem panela gena poznatih da uzrokuju sindrom osiromašenja mtDNK (Chanprasert, et al.2012). Gen TK2 je jedini gen kod kog je poznato da mutacije prouzrokuju TK2-povezan sindrom osiromašenja mitohondrijalne DNK. Ovo testiranje može da obuhvati analizu sekvence celog kodirajućeg regiona i regiona sekvence međućelijskog spoja eksona/introna od TK2 za varijante sekvence i deleciju/duplikaciju. Ako se heterozigotne i homozigotne štetne mutacije utvrde u analizi sekvence, dijagnoza TK2 deficijencije je potvrđena, i samim tim, subjekat će imati koristi od deoksinukleotidne terapije. Ako analiza sekvence ne utvrdi dva jedinjenja heterozigotnih ili homozigotnih štetnih mutacija, treba ramotriti analiza delecije/duplikacije da bi se potvrdila dijagnoza TK2 deficijencije.
[0052] Dalji testovi za određenje i/ili potvrdu dijagnoze TK2 deficijencije mogu obuhvatiti testiranje koncentracije kreatin kinaze (CK) u serumu, elektromiografiju, histopatologiju na mišiću skeleta, sadržaj mitohondrijalne DNK (mtDNK) (broj kopije), i aktivnost transportnog lanca (ETC) elektrona u mišiću skeleta. Ukoliko se u ovim testovima utvrdi jedno ili više od navedenog, TK2 deficijencija je utvrđena i/ili potvrđena. Povišena CK koncentracija kada se uporedi sa zdravim kontrolama može da ukaže na TK2 deficijenciju. Moguće je izvesti biopsiju mišića skeleta, i zatim je analizu sadržaja mtDNK u mišiću skeleta moguće izvesti. Ako biopsija mišića skeleta pokaže izraženo odstupanje u
1
veličini vlakna, promenljive sarkoplazmne vakuole, promenljiva povećana vezivna tkiva, i iskrzana crvena vlakna kao i povećana aktivnost sukcinata dehidrogenaze (SDH) i slabo prisustvo ili odsustvo aktivnosti citohroma c oksidaze (COX), i broj mtDNK kopije je ozbiljno smanjen (obIčno manji od 20% starosnih i tkivno poklapajućih zdravih kontrola), dijagnozu TK2 deficijencije je moguće utvrditi i/ili potvrditi (Chanprasert, et al.2012).
[0053] Dodatno, TK2 deficijencija se nasleđuje na autozomno recesivan način. Dakle, srodnik obolelog pacijenta može biti testiran odmah posle rođenja da bi se, ukoliko postoji, dijagnostikovala bolest.
[0054] Kod svih ovih primera, posle dijagnoze TK2 deficijencije terapija deoksinukleotida treba da počne što je moguće pre.
Farmaceutske supstance, načini isporuke, i doziranje
[0055] Ovaj pronalazak obuhvata deoksinukleotide, još preciznije dva deoksinukleotida, za upotrebu u postupku za lečenje TK2 deficijencije, pomenuti postupak još obuhvata isporuku pomenutih deoksinukleotida.
[0056] Najpoželjniji postupci isporuke su oralni, intratekalni i parentalni uključujući intravenozne. Deoksinukleotidi moraju da budu pogodni oblik za izabrani način isporuke.
[0057] Deoksinukleotidi se lako rastvaraju u tečnosti (kao što je voda, formula ili mleko) pri čemu se oblik slobodne kiseline ne rastvara lako u tečnosti.
[0058] Takve farmaceutske supstance koje obuhvataju jedan ili više deoksinukleotida za isporuku mogu obuhvatiti terapijski delotvornu količinu deoksinukleotida i farmaceutski prihvatljiv nosač. Fraza "farmaceutski prihvatljivo" se odnosi na molekularne entitete i supstance koji su fiziološki tolerantni i ne proizvode obično alergijsku ili sličnu nepovoljnu reakciju, kao što je nervoza želuca, vrtoglavice i slično, kada se isporuče čoveku, i odobre od strane regulatorne agencije Savezne, ili državne vlade ili su navedei u Farmakopeji SAD (U.S. Pharmacopeia) ili drugoj opšte priznatoj farmakopeji za upotrebu na životinjama, ili preciznije na ljudima. "Nosač" se odnosi na razblaživač, adjuvans, ekscipijens, ili pomoćno farmaceutsko sredstvo sa kojim se lek isporučuje pacijentu. Takvi farmaceutski nosači mogu biti sterilne tečnosti, kao što je voda i uja, uključujući petrolej, životinjskog, biljnog ili sintetičkog porekla, kao što je kikiriki ulje, sojino ulje, mineralno ulje, susamovo ulje, i slična. Fiziološki rastvor je poželjni nosač kada se farmaceutska supstanca isporučuje intravenozno. Fiziološki rastvori i vodena dekstroza i rastvori glicerola mogu takođe da budu korišćeni kao tečni nosači, posebno za rastvore koji se ubrizgavaju. Pogodni farmaceutski ekscipijensi obuhvataju skrob, glukozu, laktozu, saharozu, želatin, slad, pirinač, brašno, kredu, silika gel, natrijum stearat, glicerol monostearat, talk, natrijum hlorid, osušeno obrano mleko, glicerol, propilen, glikol, vodu, etanol i slično. Supstanca, po želji, može takođe da sadrži manje količine agensa za ovlaživanje ili emulzifikovanje, ili pH puferske agense.
[0059] Oralna isporuka je poželjni postupak isporuke. Deoksinukleotidi mogu biti dodati bilo kom obliku tečnosti koji bi pacijent potrošio uključujući ali bez ograničenja na, mleko i kravlje i majčino mleko, formulu za odojčad, i vodu.
[0060] Dodatno, farmaceutske supstance prilagođene za oralnu isporuku mogu biti kapsule, tablete, prahovi, granule, rastvori, sirupi, suspenzije (u nevodenim ili vodenim tečnostima), ili emulzije. Tablete ili tvrde želatinaste kapsule mogu obuhvatiti laktozu, skrob ili njihove derivate, magnezijum stearat, natrijum saharin, celulozu, magnezijum karbonat, stearinsku kiselinu ili njihove soli. Meke želatinaste kapsule mogu da obuhvate biljna ulja, voskove, masnoće, polučvrste supstance, ili tečne poliole. Rastvori i sirupi mogu da obuhvate vodu, poliole, i šećere. Aktivni sastojak predviđen za oralnu isporuku pacijentu može da bude obložen sa ili pomešan sa materijalom koji oblaže razgradnju i/ili apsorpciju aktivnog sastojka u gastrointestinalnom traktu. Dakle, zadržano otpuštanje je moguće postići tokom brojnih sati i ako je potrebno, aktivni sastojak moguće je zaštititi od razgradnje unutar želuca. Farmaceutske supstance za oralnu isporuku moguće je formulisati da bi se olakšalo otpuštanje aktivnog sastojka u specifičnoj gastrointestinaloj lokaciji usled specifične pH vrednosti ili enzimskih uslova.
[0061] Da bi se prevazišao bilo kakav problem u poglledu deoksinukleotida koji prelaze krvno/moždanu barijeru, intratekalna isporuka je dalji poželjni oblik isporuke (Galbiati, et al. 2006; Gotz, et al. 2008). Intratekalna isporuka obuhvata ubrizgavanje leka u kanal kičme, preciznije u subarahnoidni prostor tako da dospeva u cerebrospinalnu tečnost. Ovaj se postupak često koristi za anesteziju kičme, hemoterapiju, i lečenje bola lekovima. Intratekalnu isporuku je moguće izvesti putem lumbarne punkture (bolusnom injekcijom) ili sistemom za ubacivanje katetera (bolus ili infuzija). Kateter se najčešće ubacuje između lamine lumbalnog pršljena i vrh se navojno ubacuje u tekalni prostor do željenog nivoa (generalno L3-L4). Intratekalne formulacije najčešće koriste vodu, i fiziološki rastvor kao ekscipijente ali EDTA i lipidi se takođe koriste.
[0062] Dalji preporučeni oblik isporuke je parenteralni uključujući intravenoznu isporuku leka pacijentu. Farmaceutske supstance prilagođene za parenteralnu isporuku kao lek pacijentu, uključujući intravenoznu isporuku, uključuju vodene i nevodene sterilne injektibilne rastvore ili suspenzije, koje mogu da sadrže antioksidanse, puferska sredstva, bakteriostate, i rastvorljive supstance koje daju supstance pretežno izotonične sa krvlju subjekta. Druge komponente koje mogu biti prisutne u takvim supstancama obuhvataju vodu, alkohole, poliole, glicerin, i biljna ulja. Supstance prilagođene za parenteralnu isporuku mogu biti predstavljene u jediničnoj dozi ili u višedoznim posudama, kao što su zaptivene ampule i bočice, i mogu biti skladištene u sušenjem zamrznutom (liofilisanom) stanju koje zahteva samo dodavanje sterilnog nosača, neposredno pre upotrebe. Improvizovane rastvore i suspenzije za ubrizgavanje je moguće dobiti iz sterilnih prahova, granula, i tableta. Pogodna pomoćna farmaceutska sredstva mogu biti korišćena da bi se dobili parenteralni dozni oblici iz ovog pronalaska koji su dobro poznati stručnjacima u ovoj oblasti. Primeri obuhvataju: vodu za ubrizgavanje USP; pomoćna sredstava vodenih rastvora kao što je injekcija natrijum hlorida, Ringerova injekcija, dekstrozna injekcija, injekcija dekstroze i natrijum hlorida, i laktatna ringerova injekcija; pomoćna farmaceutska sredstva mešljiva u vodi kao što je etil alkohol, polietilen glikol, i polipropilen glikol; i nevodena pomoćna farmaceutska sredstva kao što je kukuruzno ulje, ulje semena pamuka, kikirikijevo ulje, susamovo ulje, etil oleat, izopropil miristrat, i benzil benzoat.
[0063] Dodatno, kako neki pacijenti mogu da primaju enteralnu nutritivnu prehranu do trenutka kada počne terapija deoksi nukleotidom, dNs je moguće isporučiti kroz cev za gastronomsku prehranu ili druga medicinska sredstva za enteralno hranjenje.
[0064] Dodatni postupci isporuke obuhvataju mioznu, kao što je nazalna, podlingvalna, vaginalna, bukalna, ili rektalna; ili transdermalna isporuka subjektu.
[0065] Farmaceutske supstance prilagođene za nazalnu i pulmonarnu isporuku mogu obuhvatiti čvrste nosače kao što su prahovi, koje je moguće isporučiti brzom inhalacijom kroz nos. Supstance za nazalnu isporuku mogu obuhvatiti tečne nosače, kao što su sprejevi ili kapi. Alternativno, inhalacija direktno kroz pluća može da se izvede dubokom inhalacijom ili instalacijom kroz usnik. Ove supstance mogu obuhvatiti vodene ili uljne rastvore aktivnog sastojka. Supstance za inhalaciju moguće je isporučiti u posebno prilagođenim uređajima uključujući, ali ne i ograničeno na, aerosole pod pritiskom, nebulizatore ili insuflatore, koje je moguće konstruisati tako da obezbede unapred određene doze aktivnog sastojka.
[0066] Farmaceutske supstance prilagođene za rektalnu isporuku mogu da budu obezbeđene kao supozitorije ili eneme. Farmaceutske supstance prilagođene za vaginalnu isporuku mogu da budu obezbeđene kao pesarije, tamponi, kreme, gelovi, paste, pene ili formulacije u spreju.
[0067] Farmaceutske supstance prilagođene za transdermalnu isporuku mogu da budu obezbeđene kao diskretni flasteri predviđeni da ostanu u neposrednom kontaktu sa epidermom primaoca u produženom periodu vremena.
[0068] Terapija deoksinukleotidom obuhvata isporuku jednog ili više deoksinukleotida izabranh iz grupe koja obuhvata deoksi timidin (dT), deoksi citidin (dC), deoksiadenozin (dA) i deoksiguanozin (dG).
[0069] Stručnjak može da utvrdi koji su deoksinukleotidi korisni na osnovu deficijencije. Takođe je deo stručnosti u konkretnoj oblasti na koju se odnosi osobe koja treba da odredi da li mešavine deoksinukleotida treba isporučiti i u kom odnosu. Ako deoksinukleotide treba isporučiti, oni mogu biti u odnosu od 50/50 svakog deoksinukleotida, npr., dC i dT, ili u odnosima od oko 5/95, 10/90, 15/85, 20/80, 25/75, 30/70, 35/65, 40/60, 45/55, 55/45, 60/40, 65/35, 70/30, 75/25, 80/20, 85/15, 90/10, i 95/5.
[0070] Primera radi, dT i dC se isporučuju u mešavini sa jednakim količinama za TK2 deficijenciju.
[0071] Odabir terapijski delotvorne doze će utvrditi stučnjak u ovoj oblasti imajući u vidu nekoliko činilaca, koji će biti poznati prosečnom stručnjaku u ovoj oblasti. Takvi činioci obuhvataju specifičan oblik deoksinukleotida, i njegove farmakokinetičke parametre kao što je biodostupnost, metabolizam, i poluživot, koji treba da budu utvrđeni tokom uobičajenih procedura razvoja obično korišćenih za dobijanje regulatornog odobrenja za farmaceutsko jedinjenje. Dalji činoci u razmatranju doze obuhvataju stanje ili bolest koje treba lečiti ili za koju treba postići poboljšanje kod
1
normalnog pojedinca, telesne mase pacijenta, rute isporuke, da li je isporuka akutna ili hronična, istovremene lekove, i druge činoce za koje je dobro poznato da utiču na efikasnost isporučenih farmaceutskih sredstava. Dakle, precizna doza treba da bude određena prema sudu stručnjaka u ovoj oblasti, i okolnostima svakog pacijenta, i prema standardnim kliničkim tehnikama.
[0072] Preporučeni opseg doze od oko 100 mg/kg/dan do oko 1,000 mg/kg/dan. Dalji preporučeni opsezi doze od oko 200 mg/kg/dan do oko 800 mg/kg dan. Dalji preporučeni opsezi doze od oko 250 mg/kg/dan do oko 400 mg/kg/dan. Ove količine doze su pojedinačni deoksinukleotidi ili supstanca sa mešavinom od više od jednog deoksinukleotida, npr., dT i dC. Na primer, doza može da obuhvati 400 mg/kg/dan od samo dT. U još jednom primeru, doza može da obuhvati mešavinu od 200 mg/kg/dan od dT i 200 mg/kg/dan od dC. U još jednom primeru, doza može da obuhvati 400 mg/kg/dan mešavine od dT i dC.
[0073] Isporuka deoksinukleotida može da bude jednom dnevno, dvaput dnevno, triput dnevno i četiri puta dnevno, pet puta dnevno, i do šest puta dnevno, poželjno u redovnim intervalima. Na primer, kada se deoksinukleotidi isporuče četiri puta dnevno, doze bi bile u 8:00 AM, 12:00 PM, 4:00 PM, i 8:00 PM.
[0074] Doze je moguće smanjiti ako se isporučuu intravenozno ili intratekalno. Preporučeni opsezi doze za takvu isporuku pacijentu su od oko 50 mg/kg/dan do oko 500 mg/kg/dan.
[0075] Kao što je prikazano na Primeru 5, doze je moguće podesiti da bi se optimizovala dejstva kod subjekta. Na primer; deoksinukleotide je moguće isporučiti u dozi od 100 mg/kg/dan za početak, i zatim povećati vremenom na 200 mg/kg/dan, do 400 mg/kg/dan, do 800 mg/kg/dan, i do 1000 mg/kg/dan, zavisno od odgovora i tolerancije pacijentovog organizma.
[0076] Subjekta je moguće nadgledati za poboljšanje stanja pre povećanja doze. Subjektov odgovor na terapijsku isporuku deoksinuleeotida moguće je nadgledati posmatranjem jačine subjektovih mišića i kontrole, i mobilnosti kao i promena visine i težine. Ako se jedan ili više ovih parametara poveća posle isporuke, lečenje se može nastaviti. Ako jedan ili više ovih parametara ostane isti ili se smanji, dozu deoksinukleotida je moguće povećati.
[0077] Kao što je prikazano u Primerima, deoksinukleotidi se dobro podnose. Sva primećena neželjena dejstva su bila manja i bila su uglavnom diarea, nadutost stomaka i druge gastrointestinalne manifestacije. Kod subjekta je takođe moguće pratiti bilo kakva neželjena dejstva, kao što je gastrointestinalna netolerancija, npr., dijarea. Ako se primeti jedan ili više neželjenih dejstava posle isporuke leka pacijentu, onda je moguće smanjiti dozu. Ako takva neželjena dejstva nisu primećena, onda je moguće povećati dozu. Takođe, jedna doza je smanjena usled postojanja neželjenog dejstva, i neželjeno dejstvo više nije primećeno, dozu je moguće povećati.
[0078] Deoksinukleotidi takođe mogu da budu isporučeni istovremeno sa drugim agensima. Takvi agensi bi obuhvatili terapijska sredstva za lečenje simptoma specifičnog oblika MDS. Specifično, za TK2 deficijenciju, dT i dC je moguće isporučiti istovremeno sa inhibitorom sveprisutnog enzima katabolitčkih nukleotida, uključujući ali ne i ograničeno na inhibitore enzima kao što je tetrahidrouridin (inhibitor citidin deaminaze) i mmucilin H (inhibitor purinske fosforilaze nukleotida) i tipiracil (inhIbitor fosforilaze timidina). Takvi inhibitori su poznati i koriste se za lečenje nekih tiopova kancera.
PRIMERI
[0079] Ovaj pronalazak je moguće bolje razumeti sa pozivom na sledeće neograničavajuće primere, koji su predstavljeni redom da bi potpunije prikazali poželjna izvođenja ovog pronalaska. Ni na koji način ih ne treba tumačiti da ograničavaju širi obim pronalaska.
Primer 1- Materijali i postupci
Mišji model TK2 deficijencije
[0080] Homozigotni Tk2 H126N laboratorijski mutirani (Tk2<-/->) miš koji manifestuje fenotip veoma sličan humanoj infantilnoj encefalomiopatiji je već opisan (Akman, et al.2008). Između 10, i 13 dana od rođenja, Tk2<-/->miševi su brzo razvili fatalnu encefalopatiju koju karakteriše smanjena ambulacija, nestabilan hod, grubi temor, zaostajanje rasta i brzi napredak do rane smrti u uzrastu od 14 do 16 dana. Molekularne i biohemijske analize mišjeg modela su pokazale da je patogeneza bolesti usled gubitka reaktivnosti enzima i osigurava neravnoteže dNTP zaliha sa smanjenim dTTP nivoima u mozgu a kada je reč o jetri smanjenim nivoima i dTTP i dCTP, što, zauzvrat, proizvodi mtDNK osiromašenje i tegobe sa enzimima respiratornog lanca koji sadrže mtDNK-om kodirane podjedinice, najizraženije u mozgu i stubu kičme.
[0081] Svi eksperimenti su izvedeni prema protokolu koji je odobrio Komitet za institucionu negu i upotrebu životinja Medicinskog centra Univerziteta Kolumbija (Institutional Animal Care and Use Committee of the Columbia University Medical Center), i bilI su u skladu sa Nacionalnim institutima zdravstvenih smernica za negu i upotrebu laboratorijskih životinja (National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals). Miševi su smešteni i gajeni u skladu sa uslovima koje propisuje međunarodni standardad, ciklus sa 12-sati svetla, 12-sati tame, i žrtvovani su 4, 13, i 29. dana starosti.
[0082] Organi (mozak, kičmeni stub, jetra, srce, bubreg, četvoroglavi mišić stražnjice, pluća, i gastrointestinalni trakt) su uklonjeni i bilo da su smrznuti u tečnoj fazi izopentana, prethodno ohlađeni blizu svoje tačke smrzavanja (-160°C) suvim ledom ili fiksirani u 10% neutralnom puferskom formalinu i umetnuti u parafin korišćenjem standardnih postupaka. U parafin uklopljeno tkvio je zatim bojeno hematoksilinom i eoksinom (H&E) za morfološku studiju ili prerađeno za studije imunobojenja sa GFAP, COX I, ili složenom podjedinicom kako je detaljno opisano u dopunskim postupcima. I heterozigotni i homozigotni miševi divljeg tipa su posmatrani kao kontrolna grupa (Tk2<+>) jer nikakva klinička i biohemijska razlika nije prethodno opisana (Akman, et al.2008; Dorado, et al.2011).
1
Isporuka lečenja i eksperimentalni plan
[0083] Deoksicitidin (dC) i deoksitimidin (dT) su isporučeni u 50 µl Esbilac mlečne formule za male kućne ljubimce (Pet-Ag) dnevnom oralnom gavažom na Tk2 H126N laboratorijske miševe (Tk2<-/->) i starosno odgovarajući kontrolni divlji tip (Tk2<+>) korišćenjem 2 doze, 260 mg/kg/dan i 520 mg/kg/dan, od 4. dana posle rođenja do 29 dana. U uzrastu od 21 dana, miševi su odvojeni od majke i lečenje je nastavljeno isporukom dC i dT u vodi za piće korišćenjem jednakih molarnih doza i to 1,6 mM i 3,2 mM. Negativna kontrolna grupa nelečenih Tk2 mutiranih i kontrolnih miševa divljeg tipa su izmereni i detaljno posmatrani za poređenje.
Procena fenotipa
[0084] Telesna težina je procenjena dnevno, jer je prethodno primećeno da je nemogućnost povećanja težine prvi znak bolesti (Akman, et al.2008).
[0085] Da bi se definisao stepen bezbednosti i efikasnosti dT/dC, vremena opstanka, starosti u vreme pojave bolesti, tipa i ozbiljnosti simptoma, pojave neželjenih dejstava, i proprcije završetka lečenja usled neželjenih dejstava kod lečenih i nelečenih Tk2 miševa su upoređene. Opšte ponašanje, vreme opstanka, i telesne težine miševa su procenjeni dnevno počevši od 4 dana posle rođenja.
dNTP zaliha na osnovu ogleda polimeraznog proširenja
[0086] Tkiva su bila homogenizovana na ledu u 10 zapremina (w/v) hladnog MTSE pufera (210 mM manitola, 70 mM saharoze, 10 mM Tris-HCl pH 7,5, 0,2 mM EGTA, 0,5% BSA) i centrifugirani na 1000 g tokom 5 minuta na 4°C, posle čega su usledila tri centrifugiranja sa 13.000 g tokom 2 minuta na 4°C. Supernatant je taložen sa 60% metanolom, čuvan 2 sata na -80°C, ključao je 3 minuta, skladišten na -80°C (od 1 sata do tokom noći) i centrifugiran sa 20.800 g tokom 10 minuta na 4°C. Supernatanti su isparavani do suvoće i pelet je vraćen u suspenziju u 65 µl vode i skladišten na -80°C sve dok nije analiziran. Da bi se svela na minimum interferencija ribonukleotida, ukupne zalihe dNTP su utvrđene kako su opisali (Ferraro, et al.2010; Martí, et al.2012a). Ukratko, reakcije zapremine od 20 µl su proizvedene mešanjem 5 µl uzorka ili standardnog dNTP sa 15 µl reakcionog pufera [0,025 U/ml ThermoSequenase DNK polimerazom (GE Healthcare, Piscataway, NJ, USA) ili Taq polimerazom (Life Technologies, NY, USA), 0,75 µM 3H-dTTP ili 3H-dATP (Moravek Biochemicals), 0,25 µM specifični oligonukleotid, 40 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM MgC12, 5mM DTT]. Posle 60 minuta na 48°C, 18 ml reakcije je primećeno na Whatman DE81 filterima, osušen je vazduh i oprani tri puta tokom 10 minuta sa 5% Na2HPO4, jednom u destilovanoj vodi i jednom u apsolutnom etanolu. Zadržana radioaktivnost je utvrđena scintilacionim brojenjem.
1
Merenja nukleotida HPLC
[0087] Procenjeni su nivoi deoksi timidin (dT), deoksiuridin (dU), uracil (U) i timin (T) gradijentnim pročišćavanjem HPLC postupkom kako je prethodno opisano (Lopez, et al. 2009; Martí, et al.
2012b), sa manjim modifikacijama. Ukratko, deproteinizovani uzorci su ubrizgani u Alliance HPLC sistem (Waters Corporation) sa Alltima C18NUC reverzno-faznom kolonom (Alltech) pri konstantnoj brzini protoka od 1,5 ml/min (izuzev gde je naznačeno) korišćenjem četiri puferska sredstva: eluent A (20 mM kalijum fosfat, pH 5,6), eluent B (voda) i eluent C (metanol). Uzorci su eluirani tokom 60 minuta sa gradijentom kao u nastavku: 0-5 min, 100% eluent A; 5-25 min, 100-71% eluent A, 29% eluent B; 25-26 min, 0-100% eluent C; 26-30 min, 100% eluent C; 30-31 min, 0-100% eluent B; 31-35 min, 100% eluent B (1,5 - 2 ml/min); 35 - 45 min, 100% eluent B (2 ml/min); 45 - 46 min, 100% eluent B (2-1,5 ml/min); 46-47 min, 0-100% eluent C; 47-50 min, 100% eluent C; 50-51 min, 0-100% eluent A; i 51-60 min, 100% eluent A.
[0088] Apsorpcija eluata je praćena na 267 nm i vršne vrednosti za dThd i dUrd su kvantifikovane upoređivanjem njihovih vršnih područja sa krivuljom kalibracije dobijenom sa standardnim vodenim rastvorima. Za definitivnu identifikaciju vršnih vrednosti deoksitimidina, deoksiuridina, uracila, i timina za svaki uzorak, drugi alikvot je tretiran sa viškom prečišćenog E. coli TP (Sigma) da bi specifično eliminisao dT i dU. Granica detekcije ovog postupka je 0,05 mmol/l za sve nukleotide. Rezultati su izraženi kao nmol/mg od proteina.
RT-qPCR: kvantifikacija mitohondrijalne DNK
[0089] Izvedena je PCR analiza u stvarnom vremenu sa početnicama i sondama za mišjii COX I gen (mtDNK) i mišji gliceraldehid-3-fosfat dehidrogenaze (GAPDH, nDNK) (Applied Biosystems, Invitrogen, Foster City, CA, USA) kako je opisano korišćenjem ddCt postupka u sistemu PCR Step One Plus u realnom vremenju (Step One PlusReal Time PCR System) (Applied Biosystems) (Dorado, et al.2011). MtDNK vrednosti su normalizovane prema nDNK vrednostima i izražene kao procenat u odnosu na divlji tip (100%).
Mitohondrijalni nivoi proteina respiratornog lanca
[0090] Trideset mikroorganizama cerebruma celog mozga ili ekstrakata cerebeluma su elektroforezirani u SDS- 12% PAGE gela, prenetog na Immun-Blot™ PVDF membrane (Biorad, Hercules, CA, USA) i ispitivani sa koktelom antitela glodara MitoProfile® Total OXPHOS Rodent WB Antibody Cocktail (MitoSciences, Eugene, OR, USA). Interakcija protein-antitelo je detektovana sa peroksidazom konjugovanim mišjim antimišjim IgG antitelom (Sigma- Aldrich, St Louis, MO, USA), korišćenjem Amersham™ ECL Plus sistema za detekciju western blotting tehnikom (GE Healthcare
1
Life Sciences, UK). Kvantifikacija proteina je izvedena korišćenjem softvera NIH ImageJ 1.37V. Prosečna siva vrednost je izračunata unutar izabranih područja kao zbir sivih vrednosti svih piksela u selekciji podeljen brojem piksela.
Aktivnosti enzima mitohondrijalnog respiratornog lanca analizom spektrofotometra
[0091] Analiza enzima mitohondrijalnog respiratornog lanca (RC) je izvedena u tkivu cerebruma kao što je prethodno opisano (Di-Mauro, et al.1987).
Statističke metode
[0092] Podaci su izrađeni kao srednja ± SD od barem 3 eksperimenta po grupi. Test Gean-Breslou-Vilkokson (Gehan-Breslow-Wilcoxon) je korišćen da uporedi odnos opstanka svake grupe miševa. Smatralo se da je p vrednost < 0,05 statistički značajna.
Primer 2- Isprouka dC/dT miševima Tk2<-/->je odložila kliničku pojavu TK2 deficijencije i povećanog opstanka
[0093] Doza od 260 i 520 mg/kg/dan svakog od deoksinukleotida (dC/dT) su bile isporučene Tk2<-/->miševima. Ove doze deoksinukleotida su bile molarni ekvivalent 400 i 800 mg/kg/dan od dCMP+dTMP prema opisanom redosledu.
[0094] Miševi lečeni sa oralnim dC+dT (260 ili 520 mg/kg/dan od 4. dana od rođenja) su izgledali normalno sve do 21. dana posle rođenja (Slika 1). Posle 21. dana, mutirani miševi lečeni dozom od 260 mg/kg/dan (Tk2<-/- 260>mg/kg/dan<dC/dT>) su prestali da dobijaju na težini i razvili su blagi tremor glave i slabost koja je odvela do smrti 31+4,3 dana od rođenja (Slika 2).
[0095] Mutirani miševi su lečeni sa 520 mg/kg/dan dC+dT (Tk2<-/- 520 mg/Kg/dan dC/dT>) su nastavili da povećavaju težinu tokom još jedne nedelje, ali su naknadno manifestovali pogoršanje slično Tk2<-/-260 mg/Kg/dan dC/dT>, i umrli su 43+10. dana od rođenja. Ovi rezultati su bili uporedivi sa onima koje su pokazali Tk2<-/->miševi lečeni sa 200 ili 400 mg/kg/dan oralnom dCMP/dTMP terapijom. Tk2<+ 260>mg/kg/dan<dC/dT>i Tk2<+ 520>mg/kg/dan<dC/dT>su praćeni sve do 60. dana posle rođenja. Nisu primećena neželjena dejstva.
[0096] Kao što je prikazano, životni vek lečenih Tk2<-/->je bio značajno povećan. Nelečeni Tk2<-/->miševi su pokazali srednji životni vek od 13 dana, pri čemu su lečeni miševi opstali između 31 i 40 dana sa dozom od 260 i 520 mg/kg/dan, prema opisanom redosledu (Slika 2). Interesantno, jedan od miševa je preživeo do 56. dana posle rođenja, što je bio najduži životni vek za model Tk2 laboratorijskog miša do dana podnošenja prijave.
Primer 3- oral dC/dT obrađuje molekularne anomalije u mozgu i jetri
1
[0097] Merenja dNTP u mitohondrijalnom ekstraktu su pokazala da i Tk2<-/- 260 mg/Kg/dan dC/dT>i Tk2<-/-520 mg/KG/dan dC/dT>nisu u potpunosti ispravili nuravnoteženosti zaliha mitohondrijalne dNTP 13. dana posle rođenja i manifestovali su promenljiva dejstva u tkivima sa završenim spašavanjem dCTP nedostataka u mozgu, pri čemu je dTTP bio ispravljen u jetri. Nasuprot tome, nedostaci dTTP u mozgu i dCTP u jetri su ostali ozbiljni uprkos terapiji suplementacije deonukleotida (Slika 3).
[0098] Kod Tk2<-/-260 mg/Kg/dan dC/dT>i Tk2<-/- 520 mg/Kg/dan dC/dT>miševa 13. dana posle rođenja, lečenje je sprečilo osiromašenje mtDNK u srcu, jetri, bubregu, crevima i mišiću (Slika 4). Nasuprto tome, broj mtDNK kopije je bio samo delimično obrađen u mozgu 13. dana posle rođenja na način koji je zavisio od doze sa mtD NK/nDNK odnosima u odnosu na kontrolni mozak koji su dostizali 39% sa 260 mg/kg/dan od dC+dT, i 52% sa 520 mg/kg/dan. Merenja dT baza i uracila u mozgu pomoću HPLC su pokazala više nivoe kod životinja lečenih sa dC+dT ili sa dCMP+dTMP (Slika 5), što je dalje ukazalo da i deoksinukleotidi i deoksinukleotid monofosfati prelaze krvno-moždanu barijeru. 29. dana posle rođenja, osiromašenje mtDNK je bilo delimično spašeno pomoću 260 i 520 mg/kg/dan od dC+dT terapijom u srcu (40 i 35%), jetri (46 i 5%), bubregu (38 i 42%) i mišiću (24 i 5%), ali je neočekivano bilo potpuno spašeno u crevima (82 i 84%) (Slika 4).
Primer 4- oralna isporuka dC/dT obrađuje biohemijske anomalije u mozgu
[0099] Aktivnosti enzima respiratornog lanca (RCE) i nivoi proteina su bili potpuno spašeni u mozgu TK2<-/- 260 mg/Kg/dan dC/dT>13. dana posle rođenja (Slika 6). RCE aktivnosti su bile takođe oporavljene 29. dana posle rođenja i samo je blago smanjenje aktivnosti kompleksa I moglo biti primećeno kod TK2<-/- 520 mg/Kg/dan dC/dT>(Slika 6). Nivoi RCE proteina u mozgu su delimično oporavljeni 29 dana posle rođenja sa višim nivoima u TK2<-/- 520 mg/Kg/dan dC/dT>nego kod TK2<-/-260 mg/Kg/dan dC/dT>(Slika 7). Ove razlike u nivoima proteina su bile dosledne sa razlikama u osiromašenju mtDNK u mozgovima lečenih mutiranih miševa 29. dana posle rođenja, i verovatno je zahvaljujući tome i bio produženi opstanak primećen zajedno sa višom dozom.
Primer 5- isporuka dC/dT kod pacijenata koji imaju TK2 deficijenciju je bila efikasna
[0100] Simptomi, doze, i ishodi pacijenata sa TK2 deficijencijom koji su primili deoksinukleotidnu terapiju pod nadzorom i konrolom pronalazača su kratko prikazani dole u tekstu.
Pacijent 1
[0101] Ovaj pacijent je rođen u Sjedinjenim Američkim Državama u februaru 2011. Njegovi simptomi su se pokazali sa 12. meseci starosti kao hipotonična i nestabilna glava. On nikada nije prohodao. Takođe je imao slabost respiratornih mišića i stavljen je na aparat za mehaničko disanje sa 19 meseci starosti, od kod i dalje zavisi 24 sata/dnevno. On je takođe bio na cevi za hranjenje od 19. meseca starosti.
1
[0102] Prethodno je bio na 100 mg/kg/dan i zatim 200 mg/kg/dan od dCMP i dTMP. Na ovoj terapiji, on je mogao da uhvati male predmete i njegova težina je povećana sa 10,4 kg do 19,5 kg.
[0103] U oktobru 2015, počeo je da dobija 260 mg/kg/dan od dC i dT koja je povećana na 340 mg/kg/dan za dC i dT. Posle dva meseca, pomerao je ruke i glavu bolje, mogao je da stoji 5 minuta uz pomoć druge osobe, počinjao je da kašlje, i njegov srčani puls je bio slabiji (sve do 140-170 bpm (otkucaja u minuti) tokom dana, do 100-120 bpm (otkucaja u minuti) tokom dana).
[0104] 23. marta 2016, doza je povećana na 400 mg/kg/dan od dC i dT. Posle 6 nedelja na ovoj terapiji, pokazao je dalja poboljšanja: mogao je da sedi u stolici oko 5 sati/dan; stajao u "Stander" tokom 1,5 sat; koliko da zahvati i drži male punjene životinje; pritisne tastere na računaru; odveže svoje pelene i usmeravao je penis da pokvasi osobu koja mu menja pelenu; i držao je kolena savijena na nekoliko sekundi.
[0105] Jedino neželjeno dejstvo viđeno tokom lečenja je bila dijarea.
Pacijent 2
[0106] Ovaj pacijent je rođen u Španiji u 1987. On je počeo da pokazuje simptome u 3. godine starosti uključujući proksimalnu slabost mišića. Izgubio je sposobnost da šeta u uzrastu od 13 i 24 sata je bio na veštačkom disanju tokom dana. On je prethodno uzimao dAMP i dCMP na 200 mg/kg/dan i pokazao je povećanje težine i smanjenje sa 24 na 22 sata na aparatu za disanje.
[0107] On je bio na deoksinukleotidnoj terapiji od juna 2015 na 400 mg/kg/dan dC i dT, i pokazao je poboljšanje jačine mišića, njegova telesna težina i disanje na aparatu su se stabilizovali, i uživao je u boljem kvalitetu života.
[0108] Jedina neželjena dejstva viđena tokom lečenja su bila dijarea i gubitak kose.
Pacijent 3
[0109] Ovaj pacijent je rođen u Španiji u 1985. Njegovi simptomi su počeli sa 6 godina sa slabošću mišića lica, proksimalnog i aksijalnog mišića. Počeo je sa 200 mg/kg/dan dT i dC u junu 2015, i do danas, njegovo stanje se poboljšalo sa poboljšanjima na 6-minutnom testu šetnje, vremenu da ustane i ide, i da se popne i siđe 4 stepenika.
[0110] Jedino neželjeno dejstvo viđeno tokom lečenja je bila dijarea.
Pacijent 4
[0111] Ovaj pacijent je rođen u Španiji u februaru 2009. Njegovi simptomi su se manifestovali u šest meseci sa neuspehom da napreduje. On je počeo sa 230 mg/kg/ dan od dC i dT u julu 2015. Do januara 2016, pokazao je poboljšanje stanja i jeo je bolje.
[0112] Nisu primećena neželjena dejstva.
2
Pacijent 5
[0113] Ovaj pacijent je rođen u španiji u 1957, i počeo je da oseća simptome sa 50 godina starosti ortopnea, i slabost dijafragme. On noću koristi BiPAP. Počeo je sa 200 mg/kg/dan od dC i dT u novembru 2015.
[0114] Nisu primećena neželjena dejstva.
Pacijent 6
[0115] Ovaj pacijent je rođen u Španiji u oktobru 2011, i počinje da pokazuje simptome u 15. mesecu starosti, uključujući hipotoniju i slabost. Izgubio je ambulaciju u 22 meseca, i ima slabost respiratornog mišića. Počeo je da koristi uređaj za mehaničko disanje u 16 meseci i sada je na BiPAP uređaju dvanaest sati dnevno. Prethodno je bio na dC- MP i dAMP na 100 mg/kg/dan što je povećano do 400 mg/kg/dan. Njegova jačina je pokazana na Egenovoj skali klasifikacije pobošljanje (28/30 do 13/30) i njegova težina je povećana od 9,8 kg do 12,3 kg.
[0116] Počeo je deoksinukleotidnu terapiju u aprilu 2015 na 400 mg/kg/dan od dC i dT. U oktobru 2015, njegova promena na Egenovoj skali klasifikacije je išla od 13/30 do 11/30 i telesna težina je povećana do 16,5 kg sa 12,3 kg.
[0117] Nisu primećena neželjena dejstva.
Pacijent 7
[0118] Ovaj pacijent je rođen u Španiji u novembru 2012. Počeo je da pokazuje simptome sa 17 meseci uključujući slabost i hipotoniju. Izgubio je ambulaciju sa 22 meseca i počeo je mehaničko disanje sa 29 meseci. Prethodno je bio na dCMP i dAMP na 100 mg/kg/dan što je povećano do 400 mg/kg/dan. Njegova jačina je pokazana na Egenovoj skali klasifikacije pobošljanje (30/30 do 24/30) i njegova težina je povećana od 11 kg do 15,7 kg.
[0119] Počeo je deoksinukleotidnu terapiju u aprilu 2015 sa dozom od 400 mg/kg/dan dT i dC. U novembru 2015, njegova promena na Egenovoj skali klasifikacije je išla od 24/30 do 19/30 i telesna težina je povećana do 17 kg sa 15,7 kg.
[0120] Nisu primećena neželjena dejstva.
Pacijent 8
[0121] Ovaj pacijent je rođen u čileu u septembru 1989 i počeo je da pokazuje simptome sa 11 meseci sa čestim padovima i progresivnim oštećenjem hoda. Izgubila je sposobnost da hoda sama oko 4. godine života. Primala je nukleotidnu terapiju ranije i pokazala je poboljšanje u svojoj mobilnosti, uključujući šetnju bez pomoći, duže stajanje, penjanje uz stepenice, pohađala čas gimnastike, i posvetila se ličnim potrebama.
[0122] Prešla je na deoksinukleotidnu terapiju u februaru 2016 u dozi od 260 mg/kg/dan od dC i dT, i zatim je povećana na dozu od 400 mg/kg/dan od dC i dT u maju 2016 i nastavila da pokazuje poboljšanje.
[0123] Nisu primećena neželjena dejstva.
Pacijent 9
[0124] Ovaj pacijent je rođen u Gvatemali u septembru 1989. Počeo je sa 130 mg/kg/dan od dC i dT u avgustu 2015 i povećano na 260 mg/kg/dan u februaru 2016. Pokazao je poboljšanu energiju.
[0125] Nisu primećena neželjena dejstva.
REFERENCE
[0126]
Akman, et al. (2008) Thymidine kinase 2 (H126N) knock in mice show the essential role of balanced deoxy ucleotide pools for mitochondrial DNA maintenance. Hum. Mol. Genet.17:2433-2440
Alston, et al. (2013) Late-onset respiratory failure due to TK2 mutations causing multiple mtDNA deletions. Neurology 81 :2051-3
Bartesaghi, et al. (2010) Loss of thymidine kinase 2 alters neuronal bioenergetics and leads to neurodegeneration. Hum. Mol. Genet.19: 1669-77
Béhin, et al. (2012) Adult cases of mitochondrial DNA depletion due to TK2 defect An expanding spectrum. Neurology 78:644-648
Blakely, et al. (2008) Novel mutations in the TK2 gene associated with fatal mitochondrial DNA depletion myopathy. Neuromuscular Disorders 18:557-560
Bourdon, et al. (2007) Mutation of RRM2B, encoding p53 -controlled ribonucleotide reductase (p53R2), causes severe mitochondrial DNA depletion. Nature Genetics 39:776-780
Carrozzo, et al. (2003) Mutation analysis in 16 patients with mtDNA depletion. Hum. Mutat.
21 :453-454
Chanprasert, et al. (2013) Molecular and clinical characterization of the myopathic form of mitochondrial DNA depletion syndrome caused by mutations in the thymidine kinase (TK2) gene. Mol. Genet. Metab.110:153-61
Chanprasert, et al. (2012) TK2-Related Mitochondrial DNA Depletion Syndrome, Myopathic Form. GeneReviews® Internet, December 6, 2012
Collins, et al. (2009) Progressive myotiber loss with extensive fibro-fatty replacement in a child with mitochondrial DNA depletion syndrome and novel thymidine kinase 2 gene mutations. Neuromuscular Disorders 19:784-787
Copeland (2008) Inherited mitochondrial diseases of DNA replication. Ann. Rev. Med.59: 131 -146
DiMauro, et al. (1987) Cytochrome c oxidase deficiency in Leigh syndrome. Ann. Neurol.22:498-506
DiMauro, Schon. (2003) Mitochondrial respiratorychain diseases. New England Journal of Medicine 348 :2656-2668
DiMauro, Hirano. (2005) Mitochondrial encephalomyopathies: an update. Neuromuscul. Disord.
15:276-286
Dorado, et al. (2011) Onset and organ specificity of Tk2 deficiency depends on Tkl downregulation and transcriptional compensation. Hum. Mol. Genet.20:155-64
Elpeleg, et al. (2005) Deficiency of the ADP-forming succinyl-CoA synthase activity is associated with encephalomyopathy and mitochondrial DNA depletion.
Am. J. Hum. Genet.76: 1081-1086
Ferraro, et al. (2010) Quantitation of cellular deoxynueleoside triphosphates. Nucleic Acids Research 38:e85
Galbiati, et al. (2006) New mutations in TK2 gene associated with mitochondrial DNA depletion. Pediatr. Neurol.34: 177-185
Garone, et al. (2012). MP VI 7 Mutations Causing Adult-Onset Multisysteimc Disorder With Multiple Mitochondrial DNA Deletions. Arch Neurol 69: 1648- 1651
2
Garone, et al. (2014). Deoxypyrimidine monophosphate bypass therapy for thymidine kinase 2 deficiency. EMBO Mol Med 6: 1016-1027
Garone, et al. (2016) in preparation, "Phenotypic Spectrum and Retrospective Natural History of Thymidine Kinase 2 Deficiency"
Gotz, et al. (2008) Thymidine kinase 2 defects can cause multi-tissue mtDNA depletion syndrome. Brain 131 :2841-2850
Hirano, et al. (2001) Defects of intergenomic communication: autosomal disorders that cause multiple deletions and depletion of mitochondrial DNA. Semin. Cell. Develop. Biol.12:417-427
Hirano, et al. (2004) MtDNA maintenance and stability genes: MNGIE and mtDNA depletion syndromes. U: Kohler, Bauer, editors. Mitochondrial Function and Biogenetics. Berlin: Springer-Verlag. p.177-200
Leshinsky-Silver, et al. (2008) A defect in the thymidine kinase 2 gene causing isolated mitochondrial myopathy without mtDNA depletion. Eur.J. Paediatr. Neurol.12:309-13
Lesko, et al. (2010) Two novelmutations in thymidine kinase-2 cause early onset fatal encephalomyopathy and severe mtDNA depletion. Neurornuscul. Disord.20: 198-203
Longley, et al. (2006). Mutant POLG2 disrupts DNA polymerase gamma suhunits and causes progressive external ophthalmoplegia. Am J Hum Genet. 78: 1026-1034
Lopez, et al. (2009) Unbalanced deoxynucleotide pools cause mitochondrial DNA instability in thymidine phosphorylase deficient mice. Human Molecular Genetics 18:714-22
Mancuso, et al. (2003) Mitochondrial myopathy of childhood associated with mitochondrial DNA depletion and a homozygous mutation (T77M) in the TK2 gene. Arch. Neurol.60: 1007-9
Mancuso, et al. (2002) Mitochondrial DNA depletion: mutations in thymidine kinase gene with myopathy and SMA. Neurology.59:1197-202
Mandel, et al. (2001) The deoxyguanosine kinase gene is mutated in individuals with depleted hepatocerebral mitochondrial DNA. Nature Genet.29:337-341
Martí, et al. (2010) Hearing loss in a patient with the myopathic form of mitochondrial DNA depletion syndrome and a novel mutation in the TK2 gene. Pediatr. Res.68:151-4
Martí, et al. (2012a) Measurement of mitochondrial dNTP pools. Methods M ο/. Biol.837: 135-148
Martí, et al. (2012b) Assessment of thymidine phosphorylase function: measurement of plasma thymidine (and deoxyuridine) and thymidine phosphorylase activity. Methods Mol. Biol.837: 121-133
Naviaux, Nguyen. (2004) POLG mutations associated with Alpers’ syndrome and mitochondrial DNA depletion. Ann. Neurol.55:706-712
Nishino, et al. (1999). Thymidine phosphorylase gene mutations in MNGIE, a human mitochondrial disorder. Science 283:689-692.
Oskoui, et al. (2006) Clinical spectrum of mitochondrial DNA depletion due to mutations in the thymidine kinase 2 gene. Arch. Neurol.63: 1122-1126.
Ostergaard, et al. (2007) Deficiency of the alpha subunit of succinate-coenzyme A ligase causes fatal infantile lactic acidosis with mitochondrial DNA depletion. Am. J. Hum. Genet. 81: 383-387
Paradas, et al. (2012) TK2 mutation presenting as indolent myopathy. Neurology 29:504-506 Ronchi, et al. (2012). Next-generation sequencing reveals DGUOK mutations in adult patients with mitochondrial DNA multiple deletions. Brain 135:3404-3415.
Roos, et al. (2014) Mitochondrial DNA depletion in single fibers in a patient with novel TK2 mutations. Neuromuscul. Disord.24:713-20
Saada, et al. (2001) Mutant mitochondrial thymidine kinase in mitochondrial DNA depletion myopathy. Nature Genet.29:342-344
Saada, et al. (2003) Mitochondrial deoxyribonucleoside triphosphate pools in thymidine kinase 2 deficiency. Biochem. Biophys. Res. Commun. 310:963-966
Sarzi, et al. (2007) Twinkle helicase (PEOl) gene mutation causes mitochondrial DNA depletion. Ann. Neurol.62: 579-587
Spelbrink, et al. (2001). Human mitochondrial DNA deletions associated with mutations in the gene encoding Twinkle, a phage T7 gene 4-like protein localized in mitochondria. Nature Genet.
28:223-231
Spinazzola, et al. (2006) MPV17 encodes an inner mitochondrial membrane protein and is mutated in infantile hepatic mitochondrial DNA depletion. Nature Genet.38:570-575 Tulinius, et al. (2005) Novel mutations in the thymidine kinase 2 gene (TK2) associated with fatal mitochondrial myopathy and mitochondrial DNA depletion. Neuromuscul. Disord.15:412-415
2
Tyynismaa, et al. (2012) Thymidine kinase 2 mutations in autosomal recessive progressive external ophthalmoplegia with multiple mitochondrial DNA deletions. Hum. Mol. Genet. 21:66-75
Tyynismaa, et al. (2009). A heterozygous truncating mutation in RRM2B causes autosomaldominant progressive external ophthalmoplegia with multiple mtDNA deletions. Am. J. Hum. Genet.85: 290-295
Van Goethem, et al. (2001) Mutation of POLG is associated with progressive external ophthalmoplegia characterized by mtDNA deletions. Nature Genet.28:211-212.
Vila, et al. (2003) Reversion of mtDNA depletion in a patient with TK2 deficiency. Neurology 60:1203-1205
Wang, et al. (2005) Molecular insight into mitochondrial DNA depletion syndrome in two patients with novel mutations in the deoxyguanosine kinase and thymidine kinase 2 genes. Mol. Genet. Metab.84:75-82.
2

Claims (22)

Patentni zahtevi
1. Terapijski delotvorna količina supstance koja obuhvata mešavinu deoksicitidina (dC) i deoksitimidina (dT) za upotrebu u postupku za lečenje deficijencije timidin kinaze 2 (TK2) kod humanog pacijenta kom je potrebno.
2. Supstanca za upotrebu prema patentnom zahtevu 1, pri čemu je terapijski delotvorna količina između
a) između 100 mg/kg/dan i 1000 mg/kg/dan svakog deoksinukleotida u toj supstanci; ili:
b) između 200 mg/kg/dan i 800 mg/kg/dan svakog deoksinukleotida u toj supstanci; ili:
c) između 250 mg/kg/dan i 400 mg/kg/dan svakog deoksinukleotida u toj supstanci
3. Supstanca za upotrebu prema patentnom zahtevu 1, pri čemu je terapijski delotvorna količina između 100 mg/kg/dan 400 mg/kg/dan svakog deoksinukleotida u toj supstanci.
4. Supstanca za upotrebu prema patentnom zahtevu 1, pri čemu je terapijski delotvorna količina između 250 mg/kg/dan 400 mg/kg/dan svakog deoksinukleotida u toj supstanci.
5. Supstanca za upotrebu prema patentnom zahtevu 1, pri čemu je terapijski delotvorna količina između
a) između 100 mg/kg/dan i 1000 mg/kg/dan ukupnih deoksinukleotida u toj supstanci; ili: b) između 200 mg/kg/dan i 800 mg/kg/dan ukupnih deoksinukleotida u toj supstanci; ili:
c) između 250 mg/kg/dan i 400 mg/kg/dan ukupnih deoksinukleotida u toj supstanci; ili:
6. Supstanca za upotrebu prema bilo kom prethodnom patentnom zahtevu, pri čemu je odnos deoksicitidina (dC) i deoksitimidina (dT) 50/50, 5/95, 10/90, 15/85, 20/80, 25/75, 30/70, 35/65, 40/60, 45/55, 55/45, 60/40, 65/35, 70/30, 75/25, 80/20, 85/15, 90/10, ili 95/5.
7. Supstanca za upotrebu prema patentnom zahtevu 6, pri čemu je pomenuti odnos deoksicitidina (dC) i deoksitimidina (dT) 50/50.
8. Supstanca za upotrebu prema bilo kom prethodnom patentnom zahtevu, pri čemu se supstanca isporučuje jedanput dnevno, dvaput dnevno, triput dnevno, četiri puta dnevno, pet puta dnevno ili šest puta dnevno.
2
9. Supstanca za upotrebu prema bilo kom prethodnom patentnom zahtevu, pri čemu se ta supstanca isporučuje oralno, intratekalno, enteralno, ili intravenozno.
10. Supstanca za upotrebu prema patentnom zahtevu 9, pri čemu se ta supstanca isporučuje oralno; i pri čemu pomenuta supstanca još obuhvata kravlje mleko, ljudsko majčino mleko, formulu za odojčad ili vodu.
11. Supstanca za upotrebu prema bilo kom prethodnom patentnom zahtevu, još obuhvata isporuku subjektu inhibitora timidin fosforilaze.
12. Supstanca za upotrebu prema patentnom zahtevu 11, pri čemu je inhibitor timidina fosforilaze tipiracil.
13. Supstanca za upotrebu prema bilo kom prethodnom patentnom zahtevu, još obuhvata isporuku subjektu inhibitora citidina deaminaze.
14. Supstanca za upotrebu prema patentnom zahtevu 13, pri čemu je inhibitor citidina deaminaze tetrahidrouridin [THU].
15. Supstanca za upotrebu prema patentnom zahtevu 1, pri čemu je terapijski delotvorna količina supstance isporučene subjektu povećana tokom vremena, opciono pri čemu je prva terapijski delotvorna količina supstance isporučena subjektu oko 100 mg/kg/dan supstance, i pri čemu je terapijski delotvorna količina supstance povećana tokom vremena na 200 mg/kg/dan, do 400 mg/kg/dan, do 800 mg/kg/dan, sve do 1000 mg/kg/dan.
16. Supstanca za upotrebu prema bilo kom prethodnom patentnom zahtevu, pri čemu ta supstanca obuhvata farmaceutski prihvatljiv nosač.
17. Supstanca za upotrebu prema patentnom zahtevu 1, pri čemu postupak lečenja još obuhvata praćenje subjekta posle isporuke te supstance, što obuhvata:
a. praćenje jačine i kontrole mišića;
b. praćenje razlika u visini i težini;
c. praćenje mobilnosti; i
d. određivanje stanja poboljšanja subjekta ako za bilo koje od posmatranja (a) - (c) ima povećanja posle isporuke supstance, i određivanje da nema poboljšanja ako za bilo koje od posmatranja (a) - (c) su na istom ili smanjena posle isporuke ove supstance.
18. Supstanca za upotrebu prema patentnom zahtevu 17, pri čemu ako je utvrđeno da nema poboljšanja u koraku (d), terapijski delotvorna količina supstance je povećana.
19. Supstanca za upotrebu prema patentnom zahtevu 1, pri čemu taj postupak lečenja još obuhvata praćenje subjekta za neželjeno dejstvo posle isporuke supstance, pri čemu ako se posmatra neželjeno dejstvo, smanjuje se terapijski delotvorna količina te supstance.
20. Supstanca za upotrebu prema patentnom zahtevu 19, još obuhvata nadgledanje subjekta za posmatrano neželjeno dejstvo posle terapijski delotvorne količine supstance je smanjeno, pri čemu se to neželjeno dejstvo više ne zapaža, terapijski delotvorna količina supstance je povećana.
21. Supstanca za upotrebu prema patentnom zahtevu 19, pri čemu je neželjeno dejstvo gastrointestinalna netolerancija.
22. Supstanca za upotrebu prema patentnom zahtevu 19, pri čemu je neželjeno dejstvo izabrano iz grupe koja obuhvata dijareu i nadutost stomaka.
2
RS20191295A 2015-06-17 2016-06-17 Terapija deoksinukleotidom za bolesti prouzorkovane neuravnoteženim zalihama nukleotida uključujući sindrome osiromašenja mitohondrijalne dnk RS59724B1 (sr)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201562180914P 2015-06-17 2015-06-17
EP16812537.5A EP3310362B1 (en) 2015-06-17 2016-06-17 Deoxynucleoside therapy for diseases caused by unbalanced nucleotide pools including mitochondrial dna depletion syndromes
PCT/US2016/038110 WO2016205671A1 (en) 2015-06-17 2016-06-17 Deoxynucleoside therapy for diseases caused by unbalanced nucleotide pools including mitochondrial dna depletion syndromes

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS59724B1 true RS59724B1 (sr) 2020-01-31

Family

ID=57546446

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20200779A RS60572B1 (sr) 2015-06-17 2016-06-17 Terapija deoksinukleotidom za bolesti prouzrokovane neuravnoteženim zalihama nukleotida uključujući sindrome osiromašenja mitohondrijalne dnk
RS20191295A RS59724B1 (sr) 2015-06-17 2016-06-17 Terapija deoksinukleotidom za bolesti prouzorkovane neuravnoteženim zalihama nukleotida uključujući sindrome osiromašenja mitohondrijalne dnk

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20200779A RS60572B1 (sr) 2015-06-17 2016-06-17 Terapija deoksinukleotidom za bolesti prouzrokovane neuravnoteženim zalihama nukleotida uključujući sindrome osiromašenja mitohondrijalne dnk

Country Status (24)

Country Link
US (5) US10471087B2 (sr)
EP (3) EP3569236A1 (sr)
JP (3) JP6599484B2 (sr)
KR (3) KR20250048602A (sr)
CN (2) CN107847512A (sr)
AU (3) AU2016280293B2 (sr)
BR (2) BR122020021913B1 (sr)
CA (1) CA2989653A1 (sr)
CY (2) CY1122605T1 (sr)
DK (2) DK3505174T3 (sr)
ES (2) ES2808148T3 (sr)
HK (1) HK1252133A1 (sr)
HR (2) HRP20191794T1 (sr)
HU (2) HUE046399T2 (sr)
IL (3) IL275256B2 (sr)
LT (2) LT3310362T (sr)
MX (2) MX2017016425A (sr)
PL (2) PL3310362T3 (sr)
PT (2) PT3505174T (sr)
RS (2) RS60572B1 (sr)
RU (1) RU2721492C2 (sr)
SI (2) SI3505174T1 (sr)
SM (2) SMT201900571T1 (sr)
WO (1) WO2016205671A1 (sr)

Families Citing this family (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9549909B2 (en) 2013-05-03 2017-01-24 The Katholieke Universiteit Leuven Method for the treatment of dravet syndrome
US10292996B2 (en) 2015-03-26 2019-05-21 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Deoxyribonucleoside monophospate bypass therapy for mitochondrial DNA depletion syndrome
KR20250048602A (ko) * 2015-06-17 2025-04-09 더 트러스티스 오브 컬럼비아 유니버시티 인 더 시티 오브 뉴욕 미토콘드리아 dna 고갈 증후군을 포함하는 불균형 뉴클레오타이드 풀에 의해 야기된 질환에 대한 데옥시뉴클레오타이드 요법
HRP20250898T1 (hr) 2015-12-22 2025-09-26 Zogenix International Limited Pripravci fenfluramina i postupci njihove pripreme
WO2017112701A1 (en) 2015-12-22 2017-06-29 Zogenix International Limited Metabolism resistant fenfluramine analogs and methods of using the same
JP2019526544A (ja) 2016-08-24 2019-09-19 ゾゲニクス インターナショナル リミテッド ５−ｈｔ２ｂアゴニストの形成を阻害するための製剤およびその使用方法
US11649442B2 (en) 2017-09-08 2023-05-16 The Regents Of The University Of California RNA-guided endonuclease fusion polypeptides and methods of use thereof
US10682317B2 (en) 2017-09-26 2020-06-16 Zogenix International Limited Ketogenic diet compatible fenfluramine formulation
EP3773603A4 (en) 2018-04-12 2022-03-30 Modis Therapeutics Inc. DEOXYNUCLEOSIDE PRODRUGS FOR THE TREATMENT OF DISEASES CAUSED BY UNBALANCED NUCLEOTIDE GROUPS
US12419970B2 (en) 2018-04-18 2025-09-23 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Gene therapy for diseases caused by unbalanced nucleotide pools including mitochondrial DNA depletion syndromes
WO2019216919A1 (en) 2018-05-11 2019-11-14 Zogenix International Limited Compositions and methods for treating seizure-induced sudden death
SG11202104378SA (en) 2018-11-19 2021-05-28 Zogenix International Ltd Methods of treating rett syndrome using fenfluramine
CA3150755A1 (en) * 2019-08-19 2021-02-25 Modis Therapeutics, Inc. Polymorphic forms of deoxycytidine, compositions comprising the same and uses
IL322998A (en) * 2019-09-05 2025-10-01 Mitorainbow Therapeutics Inc Treatment of mitochondrial DNA depletion disorders
MX2022011562A (es) 2020-03-19 2022-12-13 Intellia Therapeutics Inc Métodos y composiciones para edición dirigida de genoma.
US11612574B2 (en) 2020-07-17 2023-03-28 Zogenix International Limited Method of treating patients infected with severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2)
US20220096514A1 (en) * 2020-09-29 2022-03-31 Zogenix International Limited Methods of treating thymidine kinase 2 deficiency by administering deoxycytidine and deoxythymidine
US20240041910A1 (en) * 2020-12-28 2024-02-08 Yamasa Corporation Muscular atrophy inhibitor and method for inhibiting muscular atrophy
EP4313068A4 (en) * 2021-03-26 2024-12-25 UCB Biosciences, Inc. Aqueous solutions containing purines and pyrimidines and uses thereof
CN117500510A (zh) * 2021-06-18 2024-02-02 周格尼克斯公司 用于治疗由失衡的核苷酸池引起的线粒体疾病的脱氧核苷的前药
KR20250034995A (ko) * 2022-07-12 2025-03-11 유씨비 바이오사이언시스, 인크. 뉴클레오시드 의약품의 생체이용률을 증가시키는 방법
WO2024206595A2 (en) * 2023-03-30 2024-10-03 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Pharmacological therapy for mitochondrial dna depletion deletions syndrome involving mutations in the guk1 gene

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101120947B (zh) * 1998-08-10 2010-11-24 艾丹尼克斯(开曼)有限公司 用于治疗乙型肝炎的β-L-2′-脱氧-核苷
US7638501B1 (en) * 1999-02-23 2009-12-29 The Regents Of The University Of California Method of treatment of mitochondrial disorders
DE60105424T2 (de) * 2000-05-26 2005-09-22 Idenix (Cayman) Ltd. Methoden zur behandlung von delta hepatitis virus infektionen mit beta-l-2' deoxy-nucleosiden
WO2012125848A2 (en) * 2011-03-16 2012-09-20 Baylor College Of Medicine A method for comprehensive sequence analysis using deep sequencing technology
US10292996B2 (en) 2015-03-26 2019-05-21 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Deoxyribonucleoside monophospate bypass therapy for mitochondrial DNA depletion syndrome
AU2016273340B2 (en) * 2015-06-05 2021-09-09 Centro De Investigación Biomédica En Red Treatment of mitochondrial diseases
KR20250048602A (ko) * 2015-06-17 2025-04-09 더 트러스티스 오브 컬럼비아 유니버시티 인 더 시티 오브 뉴욕 미토콘드리아 dna 고갈 증후군을 포함하는 불균형 뉴클레오타이드 풀에 의해 야기된 질환에 대한 데옥시뉴클레오타이드 요법

Also Published As

Publication number Publication date
IL256331B (en) 2020-08-31
EP3310362A1 (en) 2018-04-25
US12251392B2 (en) 2025-03-18
MX389016B (es) 2025-03-20
AU2016280293B2 (en) 2020-07-02
DK3310362T3 (da) 2019-10-07
MX2020000269A (es) 2022-01-03
LT3310362T (lt) 2019-11-11
JP6675037B2 (ja) 2020-04-01
US10471087B2 (en) 2019-11-12
DK3505174T3 (da) 2020-07-13
IL275256B1 (en) 2023-05-01
RU2018101305A3 (sr) 2019-10-31
SMT201900571T1 (it) 2019-11-13
US20200038424A1 (en) 2020-02-06
ES2808148T3 (es) 2021-02-25
IL275255A (en) 2020-07-30
HUE046399T2 (hu) 2020-03-30
WO2016205671A1 (en) 2016-12-22
AU2020204042B2 (en) 2021-07-15
PL3310362T3 (pl) 2020-04-30
CY1122605T1 (el) 2021-03-12
PL3505174T3 (pl) 2020-08-24
JP2020019792A (ja) 2020-02-06
EP3310362B1 (en) 2019-08-28
JP6599484B2 (ja) 2019-10-30
SI3505174T1 (sl) 2021-02-26
JP2020019791A (ja) 2020-02-06
CN116726035A (zh) 2023-09-12
JP2018521993A (ja) 2018-08-09
US20230277577A1 (en) 2023-09-07
EP3505174B1 (en) 2020-04-29
LT3505174T (lt) 2020-09-10
CY1123107T1 (el) 2021-10-29
US11110111B2 (en) 2021-09-07
BR112017027079B1 (pt) 2021-04-27
US20250360154A1 (en) 2025-11-27
RS60572B1 (sr) 2020-08-31
HRP20200949T1 (hr) 2020-10-02
IL275255B (en) 2021-04-29
JP7036782B2 (ja) 2022-03-15
MX2017016425A (es) 2018-12-11
CA2989653A1 (en) 2016-12-22
US11666592B2 (en) 2023-06-06
PT3310362T (pt) 2019-10-29
ES2748556T3 (es) 2020-03-17
KR20220018623A (ko) 2022-02-15
AU2016280293A1 (en) 2018-02-08
IL275256A (en) 2020-07-30
AU2020204042A1 (en) 2020-07-09
BR122020021913B1 (pt) 2021-07-06
CN107847512A (zh) 2018-03-27
IL256331A (en) 2018-02-28
IL275256B2 (en) 2023-09-01
HUE050678T2 (hu) 2020-12-28
AU2021250841A1 (en) 2021-11-04
EP3505174A1 (en) 2019-07-03
KR20180039624A (ko) 2018-04-18
WO2016205671A9 (en) 2018-01-04
RU2020112901A (ru) 2020-06-05
KR20250048602A (ko) 2025-04-09
SMT202000399T1 (it) 2020-09-10
RU2018101305A (ru) 2019-07-17
HK1252133A1 (zh) 2019-05-17
EP3310362A4 (en) 2018-12-19
RU2721492C2 (ru) 2020-05-19
HRP20191794T1 (hr) 2020-02-07
EP3569236A1 (en) 2019-11-20
US20180133241A1 (en) 2018-05-17
AU2021250841B2 (en) 2023-02-09
SI3310362T1 (sl) 2020-02-28
PT3505174T (pt) 2020-07-06
US20210244754A1 (en) 2021-08-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US12251392B2 (en) Deoxynucleoside therapy for diseases caused by unbalanced nucleotide pools including mitochondrial DNA depletion syndromes
US11633418B2 (en) Deoxyribonucleoside monophospate bypass therapy for mitochondrial DNA depletion syndrome
RU2827432C2 (ru) Дезоксинуклеозидная терапия заболеваний, вызванных несбалансированными пулами нуклеотидов, в том числе синдромов истощения митохондриальной днк
HK40020049A (en) Deoxynucleoside therapy for diseases caused by unbalanced nucleotide pools including mitochondrial dna depletion syndromes