RS58985B1 - Katjonski polimeri na bazi glikogena - Google Patents

Description

Opis

OBLAST PRONALASKA

[0001] Ovaj pronalazak se odnosi na katjonske polimere na bazi glikogena, na komplekse koji sadrže pomenute polimere i najmanje jedno anjonsko jedinjenje, i na upotrebu pomenutih kompleksa za oslobađanje anjonskih jedinjenja.

[0002] Posebno, katjonski polimeri na bazi glikogena su korisni kao ne-virusni vektori u transficiranju nukleinskih kiselina.

STANJE TEHNIKE

[0003] Da bi se umanjili sporedni efekti aktivnih supstanci i do maksimuma dovela njihova terapeutska efikasnost, razvijeni su sistemi sa kontrolisanim oslobađanjem, u kojima takav farmaceutski oblik kontroliše fazu osobađanja aktivne supstance, a takođe i sistemi koji su u stanju da oslobađaju i usmeravaju aktivnu supstancu na neki specifičan farmakološki cilj kao metu.

[0004] Posebno, sistemi za oslobađanje i usmeravanje moraju da stupaju u interakciju sa aktivnom supstancom na takav način da nastali kompleks bude stabilan za vreme skladištena i ordiniranja, ali da oslobađa aktivnu supstancu na pravi farmakološki cilj.

[0005] Tipično, interakcije do kojih dolazi između sistema za oslobađanje i aktivne supstance nisu kovalentne, već na primer, elektrostatičke, jonske ili van der Waalsove interakcije, preko vodoničnih veza, i slično.

[0006] Problem razvoja sistema za oslobađanje, se odnosi delom na aktivne supstance male molarne mase, a delom na polimere i molekule velike molarne mase, kao što su na primer nukleinske kiseline.

[0007] Posebno poželjan proces je ugrađivanje sekvencija nukleinske kiseline i/ili genetskih konstrukta u ciljane ćelije, u svrhu kompenzovanja odsustva nekog gena, pojačane ekspresije nekog gena, stišavanja ekspresije nekog gena ili unošenje novih funkcija u pomenutu ćeliju, i indikovan je u oblasti genske terapije, pod nazivom "transfekcija".

[0008] Izgleda da ovaj proces obećava u tretiranju genetskih bolesti i u razvijanju strategija za tretiranje i prevenciju hroničnih bolesti.

[0009] Međutim, kada se ordiniraju in vivo u nativnom obliku, nukleinske kiseline, kao i druge polianjonske supstance, brzo se degradiraju sa katjonskim enzimima (nor nukleazama i proteazama), a malo ih absorbuju ćelije.

[0010] Vektori gena, koji su do sada ispitivani i razvijeni, uključuju virusne sisteme (retroviruse, adenoviruse, itd.) i ne-virusne sisteme (lipozomi, polimeri, peptidi, itd.).

[0011] Poznato je da virusni vektori imaju bolju efikasnost transficiranja, nego nevirusni sistemi. Međutim, upotreba virusnih vektora in vivo je ograničena mnogim nedostacima, kao što su, na primer rizik, replikacije, mogućnost izazivanja imunih reakcija, činjenica da su samo podeljene ćelije pogodne kao cilj, zatim mali kapacitet naelektrisanja gena velikog formata, ili nasumično insertovanje velikih gena, ili nasumično insertovanje fragmenata DNK.

[0012] U stanju tehnike je poznato da upotreba genskih terapija, bazirana na nevirusnim vektorima, sadrži brojne nedostatke, među kojima su relativna bezbednost i niski troškovi dobijanja.

[0013] Vektori ne-virusnih gena, na primer katjonski polimeri, lipozomi i sintetski vektori, široko su izučeni kao alternativa za upotrebu virusnih vektora.

[0014] N,N-dietilaminoetil-dekstran (DEAE-dekstran) je jedan od prvih hemijskih derivata nekog prirodnog polimera koji je korišćen za kontrolisano oslobađanje aktivnog sastojka (na primer, za kontrolisano oslobađanje u sluzokožu, kao što je opisano, na primer, u WO 90/09780) , a zatim kao agens za transficiranje, (kao što je opisano, na primer, u EP 1738769).

[0015] DEAE-dekstran je jedan polikatjonski polimer, koji se dobija reagovanjem N,N-dietilaminoetil hlorida i dekstrana, a predstavlja linearni polimer, u kome su molekuli glukoze vezani α-1,6 vezama, sa malo grananja, gde su monomeri glukoze vezani α-1,4 vezama (brojevi su prikazani u formuli u nastavku).

[0016] DEAE-Dekstran, prikazan sledećom strukturnom formulom, ima dva supstituenta koji sadrže ostatke azota, u kojima ovi atomi azota imaju različite fizičkohemijske karakteristike:

[0017] Prvi supstituent se sastoji od funkcije tercijarnog amina (označen kao N’), sa vrednošću pKa od oko 9.5, koji se na fiziološkom pH nalazi u jonizovanom obliku. Drugi supstituent, poznat kao "tandem", sadrži kvaternernu amonijumovu grupu (N<+>), koja ima permanentno pozitivno naelektrisanje i utiče na kiselost druge funkcije tercijarnog amina (označene kao N"), koja ima vrednost pKa od oko 5.7, a na fiziološkom pH je u nejonizovanom obliku (F. Gubensek, JouRNKl of Macromolecular Science: Part A -Chemistry - 2 (5) 1968, 1045 -1054).

[0018] Međutim, poznato je da pozitivno naelektrisanje DEAE-dekstrana stupa u interakciju in vivo sa anjonskim biološkim strukturama, koje se razlikuju od nukleinskih kiselina, što dovodi do toksičnih pojava.

[0019] Obično, mehanizam formiranja kompleksa između katjonskih polimera i nukleinske kiseline i naknadno oslobađanje, može se prikazati kao što sledi.

[0020] Genetski materijal se kompleksira preko slabih interakcija, na primer elektrostatičkih interakcija. Stvaranje ovakvog kompleksa štiti nukleinsku kiselinu od degradacije nukleazom i omogućava nukleinskoj kiselini da se oslobodi u ćeliji, zato što pozitivno naelektrisanje, prisutno na površini kompleksa, stupa u interakciju sa ćelijskom membranom, stimulišući endocitozu kompleksa, preko stvaranja endozoma.

[0021] Unutrašnjost ovih endozoma ima pH od oko 4.5-5, što je znatno kiselije od pH medijuma citoplazme, koje je oko 7.3. Ova razlika u vrednostima pH se održava pomoću protonske pumpe, zavisne od ATP, prisutne na endozomalnoj membrani, što gura H<+>jone iz citozola u endozom. Kiselo pH promoviše aktivnost lizozomalnih nukleaza, koje su enzimi odgovorni za degradaciju nukleinskih kiselina hidrolizom fosfodiestarskih veza između pojedinačnih nukleotida.

[0022] Polimeri sa puferskim kapacitetom i aktivnost ovih lizozomalnih nukleaza, istovremeno menjaju osmolarnost endozoma.

[0023] U stvari, iako polimeri odvajaju H<+>jone, za citozol su neophodni drugi H<+>joni, istovremeno kao i Cl-, za održavanje električne neutralnosti endozoma. Međutim, potreba za H<+>i Cl<->jonima dovodi do povećanja koncentracije jona unutar endozoma, a kao rezultat, raste osmolarnost endozoma, relativno prema citozolu. Porast osmolarnosti traži vodu iz citozola. Posledica toga je da endozom bubri sve dok se ne rasprsne, oslobađajući kompleks polimer-nukleinska kiselina u citoplazmi.

[0024] Ovaj mehanizam, poznat kao "mehanizam protonskog sunđera", opisao je, između ostalog, J-P. Behr, u dokumentu "The proton sponge: a trick to enter cells the viruses did not exploit" (Chimia, 1997, 51, 34-36), u vezi sa polimerima polietilenimina (PEI), a šire su opisali, H. Eliyahu et al. u dokumentu "Polimers for DNK delivery" (Molecules, 2005, 10, 34-64).

[0025] Polietilenimini (PEI) su linearni ili račvasti katjonski polimeri, koje karakteriše visoko efikasno in vitro oslobađanje oligonukleotida i plazmida u ćelijama, kao što je opisano, na primer, u O. Boussif et al. in "A versatile vector for gene and oligonukleotid transfer into cells in culture and in vivo: Polietilenimine" (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1995, Vol.92, 7297-7301) i u međunarodnoj patentnoj prijavi WO 02/100435. Polimeri PEI se opisuju kao polimeri sa visokom gustinom naelektrisanja, koja štiti nukleinsku kiselinu od degradacije nukleazama. Smatra se da visok puferski kapacitet PEI štiti nukleinsku kiselinu od degradacije u endozomima, tokom faze apsorpcije u ćeliji, izazivanjem osmotskog bubrenja endozoma (mehanizam "protonskog sunđera"), koji omogućava oslobađanje kompleksa vektor-nukleinska kiselina u citoplazmi.

[0026] Sledeći polimer, koji je široko izučen kao agens za transficiranje, je poli(L-lizin) (PLL), koji je opisan u, na primer, dokumentu International patent application WO 03/063827, koga karakterišu primarne aminske gupe koje su jonizovane na fiziološkom pH, i koje stupaju u interakciju sa fosfatnim grupama nukleinske kiseline, koje su negativno naelektrisane. Međutim, toksičnost i efikasnost transficiranja PLL su direktno proporcionalne njihovoj molekulskoj težini: kako raste molarna masa polimera, opaža se rast efikasnosti transficiranja, s jedne strane, ali i porast citotoksičnosti, s druge strane. Pored toga, glavni lanac PLL jedva da se degradira pod fiziološkim uslovima, a njegova akumulacija može dovesti do posledica pri dugotrajnoj upotrebi.

[0027] Kao i za većinu katjonskih polimera, kompleksi PLL sa nukleinskim kiselinama imaju takođe fizičko-hemijske nedostatke. Na primer, procesi dobijanja pružaju mali kapacitet za kontrolu veličine, pa to može dovesti do prisustva velikih čestica sa ograničenim difuzionim kapacitetom i/ili do mogućeg taloženja u fazi formulisanja i ordiniranja. Pored toga, izgleda da kiselo-bazne karakteristike PLL onemogućavaju dobijanje visoke efikasnost transficiranja, verovatno zbog ograničenog kapaciteta za oslobađanje nukleinske kiseline u medijum citoplazme.

[0028] Drugi katjonski polimeri, prirodni i sintetski, su opisani u prethodnom stanju tehnike, kao agensi za transficiranje nukleinskih kiselina.

[0029] Na primer, u International patent application WO 03/078576, opisan je hitozan kao agens za transficiranje nukleinske kiseline.

[0030] Hitozan je prirodni linearni polimer, sačinjen od D-glukozamina i N-acetil-D-glukozamin jedinki, ravnomerno raspoređenih u polimeru, povezanih preko β-1,4 veza, a sadrži amino grupu, sa pKa od oko 6.5.

[0031] Kao agensi za transficiranje nukleinskih kiselina, takođe su široko ispitani dendrimeri, koji se sastoje od pozitivnih jonizujućih grupa, na primer od strukture poli(amidoamina) (PAMAM), makromolekula linearne strukture; metakrilnih polimera (kao što je N,N-dimetilaminoetil metakrilat, DMAEMA), poli(etilenimin)-a (PEI), i derivata ovih polimera, sa grupama za solubilizaciju, funkcionalnim ili usmerujućim grupama, kao što su na primer polimerne strukture koje sadrže poli(etilenglikol) (PEG).

[0032] Linearni poli(amidoamini) (PAMAM) opisani su, na primer, u dokumentu International patent application WO 97/25067, kao polimeri rastvorni u vodi, koji dozvoljavaju stvaranje rastvornih i/ili disperzibilnih kompleksa. Poželjno je da se vrednost pKa ovih katjonskih grupa treba održavati između 7 i 8, pošto je poznato da niže pKa smanjuju kapacitet za šaržiranje nukleinskih kiselina. Takođe, oslobađanje kompleksa formiranih od dendrimera na bazi PAMAM i nukleinske kiseline, pomoću endozoma, obuhvata efekat "proton-sunđera". Specifično, C.L. Waite et al. in "Acetilation of PAMAM dendrimers for cellular delivery of siRNK" (BMC Biotechnology, 2009, 9:38) opisuju da delimično acetilovanje primarnog amina snižava i puferski kapacitet dendrimera na bazi PAMAM, i oslobađanje siRNK.

[0033] Katjonski polimeri razvijeni su takođe za aplikaciju agenasa za transficiranje, koji se razlikuju od nukleinskih kiselina.

[0034] Na primer, u odeljku 2.2 članka koji su objavili Pal S et al. (Colloids and Surfaces A: Physicochem. Eng. Aspects 289, 2006, pages 193-199) opisano je kako se katjonizuje glikogen, ugrađivanjem katjonskog monomera N-(3-hloro-2-hidroksipropil)-trimetil amonijum-hlorida u srž polisaharida glikogena. Nađeno je da je pomenuti katjonski polimer efikasan kao agens za flokulaciju u suspenzijama gvozdene rude.

[0035] Poznato je da idealan agens za transficiranje treba da obezbedi visok kapacitet transficiranja, i da nije potrebno da se manipuliše sa fiziološkim ciljanim mestom; zatim, treba da u efikasnoj dozi nije toksičan i treba da je biodegradibilan, tako da se izbegnu dugotrajni sporedni efekti.

[0036] Pored toga, agens za transficiranje treba da je neki polimer, treba da formira čestice manje od mikrometra (tj. manje od 10<-6>m), a poželjno je da su to nanočestice, zato što je poznato da njihova veličina može da ograniči difuzioni kapacitet kompleksa u vanćelijskom medijumu i efikasnost endicitoze/fagocitoze u ćelijama.

[0037] Konačno, ova polimerna struktura treba da sadrži aminske grupe i/ili atome azota, koji karakterišu različite pKa. Ustvari, aminske grupe, sa vrednostima pKa većim od fiziološke vrednosti pH, olakšavaju kompleksiranje nukleinske kiseline na fiziološkom pH; aminske grupe, sa vrednostima pKa oko endozomalne vrednosti pH, aktivraju mehanizam "protonskog sunđera", i obezbeđuju oslobađanje kompleksa polimer-nukleinska kiselina u citoplazmi; i konačno, kvaternerne aminijumove grupe obezbeđuju kompleksiranje i oslobađanje iz endozoma, nezavisno od vrednosti pH.

IZLAGANJE SUŠTINE PRONALASKA

[0038] Podnosilac ove prijave je ukazao na problem razvijanja novih polimera, koji se mogu upotrebiti i za oslobađanje aktivne supstance male molekulske težine, kao i nevirusnih vektora za nukleinske kiseline, sa kojima bi se mogli prevazići nedostaci materijala poznatih u prethodnom stanju tehnike.

[0039] Sa iznenađenjem podnosilac ove prijave je pronašao da se glikogen može modifikovati, tako da se dobijaju novi katjonski derivati.

[0040] Pogodnost pomenutih novih katjonskih derivata glikogena karakteriše niska citotoksičnost.

[0041] Podnosilac ove prijave smatra da je to uglavnom iz dva razloga. Prvo, glikogen je jedan biokompatibilni polimer, koji je proizvod metabolizma i skladištenja šećera u svim životinjskim telima, u kojima se kontinualno proizvodi i degradira. Pored toga, podnosilac ove prijave smatra da brojne grane u glikogenu daju strukturu jedne stabilne sferne konformacije, koja je u stanju da selektivno smanjuje pristup katjonskim naelektrisanjima: rastvorni molekuli mogu da difunduju unutar strukture polimera i kompleksiraju se preko katjonskih mesta, a suprotno tome, interakcija sa više kompleksnih struktura ne bi mogla biti dozvoljena iz sternih razloga. Ova sferna konformacija bi omogućila smanjenje toksičnosti katjonskih naelektrisanja, koje tipično oštećuje membrane ćelija.

[0042] Ovaj pronalazač je otkrio da novi katjonski derivati glikogena zadržavaju karakteristike biokompatibilnosti ovog prirodnog polimera, iz koga su izvedeni.

[0043] Takođe, ovaj pronalazač je otkrio da su ovi novi katjonski derivati glikogena u stanju da formiraju komplekse sa anjonskim jedinjenjima, koja imaju veličinu i molarne mase unutar šireg opsega.

[0044] Pogodnost ovih pomenutih kompleksa su nanometarske dimenzije i što ne pokazuju bilo kakvo ukrupnjavanje kada su u rastvoru, čak i pri visokim koncentracijama.

[0045] Ovaj pronalazač je takođe otkrio da ovi novi katjonski derivati glikogena mogu da oslobađaju anjonska jedinjenja u specifičnim fiziološkim ciljevima (na primer, organima, tkivima i ćelijama).

[0046] Ovaj pronalazač je takođe otkrio da su ovi novi katjonski derivati glikogena, u skladu sa ovim pronalaskom, u stanju da penetriraju u ćelije.

[0047] Kao posledica toga, pomenuti novi katjonski derivati glikogena mogu da se upotrebljavaju za oslobađanje anjonskih jedinjenja u ćelijama.

[0048] Konačno, ovaj pronalazač je otkrio da ovi novi katjonski derivati glikogena, u skladu sa ovim pronalaskom, mogu da se upotrebe kao stabilizatori, pri konzerviranju proteina i enzima, i kao ko-adjuvanti u proizvodnji vakcina.

[0049] Pogodnost novih katjonskih derivata glkogena je da sadrže substituente koji nose aminske grupe, koje karakterišu vrednosti pKa različite od svih drugih, tako da olakšavaju i kompleksiranje anjonskih jedinjenja i oslobađanje kompleksa polimeranjonsko jedinjenje iz endozoma u citoplazmi.

[0050] Pogodnost novih katjonskih derivata glikogena, u skladu sa ovim pronalaskom, je da imaju nisku viskozost, pa se u skladu sa tim, mogu formulisati u farmaceutske kompozicije za upotrebu u obliku injekcija.

[0051] U prvom aspektu, ovaj pronalazak se odnosi na nove katjonske polimere na bazi modifikovanog glikogena, a posebno se ovaj pronalazak odnosi na katjonske polimere na bazi glikogena, koji sadrže najmanje jedan deo koji se ponavlja, a koji se bira iz grupe koju čine:

(a)

gde su

grupe R, koje mogu biti identične ili različite, atom vodonika; neka karboksimetil grupa, opciono u obliku soli, sa nekom farmaceutski prihvatljivom organskom ili neorganskom bazom; ili neka grupa koja sadrži azot, koja se bira između: NH2-(C1-C6)alkil, [N,N-di(C1-C6)alkilamino]-(C1-C6)alkil, NH2-{[(C1-C6)alkil]-di(C1-C6)alkilamonio}-(C1-C6)alkil, {[N,N-di(C1-C6)alkilamino]-(C1-C6)alkil-di(C1-C6)alkilamonio}-(C1-C6)alkil, NH2-[(C1-C6)alkilamino]-(C1-C6)alkil, {[N,N-di(C1-C6)alkilamino]-(C1-C6)alkilamino}-(C1-C6)alkil, [tri(C1-C6)alkilamonio]-(C1-C6)alkil, azociklill-(C1-C6)alkil, u kojima su lanci (C1-C6)alkil, koji mogu biti identični ili različiti, opciono supstuisani sa jednom ili više hidroksilnih grupa; a n je ceo broj, veći ili jednak 1; i

(b)

gde su

R1 se bira između atoma vodonika; neke karboksimetil grupe, opciono u obliku soli sa nekom farmaceutski prihvatljivom organskom ili neorganskom bazom; ili neka grupa koja sadrži azot, a bira se između: NH2-(C1-C6)alkil, [N,N-di(C1-C6) alkilamino]-(C1-C6)alkil, NH2-[(C1-C6)alkil-di(C1-C6)alkilamonio]-(C1-C6)alkil, {[N,N-di(C1-C6)alkilamino]-(C1-C6)alkil-di(C1-C6)alkilamonio}-(C1-C6)alkil, NH2-[(C1-C6)alkilamino]-(C1-C6)alkil, {[N,N-di(C1-C6)alkilamino]-(C1-C6)alkilamino}-(C1-C6)alkil, [tri(C1-C6)alkilamonio]-(C1-C6)alkil, u kojima su lanci (C1-C6)alkil, koji mogu biti identični ili različiti, opciono supstituisani sa jednom ili više hidroksilnih grupa;

X1 i X2, koji mogu biti identični ili različiti, su grupa -OH ili neka grupa NHR2 koja sadrži azot, u kojoj se R2 bira između: atom vodonika, (C1-C6)alkil, i H-[NH-(C1-C6)alkil]p-, gde je p ceo broj, veći ili jednak 1, a grupe (C1-C6)alkil mogu biti identične ili različite; a

m je ceo broj veći ili jednak 1;

pod uslovom da najmanje jedna, između R, R1, X1 i X2, predstavlja neka grupa koja sadrži azot, kao što je definisano, za svaku od R, R1, X1 i X2, respektivno, i

pod uslovom da se pomenuti katjonski polimer na bazi glikogena razlikuje od proizvoda dobijenog reakcijom glikogena sa N-(3-hloro-2-hidroksipropil)-trimetil amonijum-hloridom.

[0052] Gore pomenuti izraz "pod uslovom da najmanje jedna između R, R1, X1 i X2 predstavlja neka grupa koja sadrži azot, kao što je definisano, za svaku od R, R1, X1 i X2, respektivno” znači da, u slučaju kada je R neka grupa koja sadrži azot, ova grupa je kao što je definisana za R, u slučaju kada je R1 neka grupa koja sadrži azot, ova grupa je kao što je definisana za R1, u slučaju kada je X1 neka grupa koja sadrži azot, ova grupa je kao što je definisana za X1, i u slučaju kada je X2 neka grupa koja sadrži azot, ova grupa je kao što je definisana za X2.

[0053] U drugom aspektu, ovaj pronalazak se odnosi na neki kompleks između katjonskog polimera na bazi glikogena i nekog anjonskog jedinjenja koje se bira između aktivnog sastojka i neke nukleinske kiseline.

[0054] Uskladu sa ovom realizacijom, pomenuto anjonsko jedinjenje je neki aktivni sastojak ili neka nukleinska kiselina.

[0055] U trećem aspektu, ovaj pronalazak se odnosi neku farmaceutsku kompoziciju koja sadrži neki kompleks između katjonskog polimera na bazi glikogena i nekog anjonskog jedinjenja, koje se bira između aktivnog sastojka i neke nukleinske kiseline, i najmanje jednog farmaceutski prihvatljivog ekscipijenta.

[0056] U četvrtom aspektu, ovaj pronalazak se odnosi na upotrebu nekog kompleksa između katjonskog polimera na bazi glikogena i nekog anjonskog jedinjenja, koje se bira između aktivnog sastojka i neke nukleinske kiseline, za oslobađanje ili transficiranje pomenutog anjonskog jedinjenja u nekom specifičnom farmakološkom cilju, kao što su, na primer, neki organ, neko meko tkivo ili neka ćelija.

[0057] U skladu sa ovom realizacijom, pomenuto anjonsko jedinjenje je neki aktivni sastojak ili neka nukleinska kiselina.

KRATAK OPIS SLIKA NACRTA

[0058] Slike 1 do 8 predstavljaju osam gelova agaroze, dobijenih nakon gelelektroforeze, kao što je opisano u Primeru 5. Na svim Slikama 1 do 8, zasejani su siRNK(*) i DNK(*) markeri da bi se dobile odgovarajuće trake, a korišćeni su za komparativne potrebe i proveru funkcionisanja postupka elektroforeze.

Slika 1 predstavlja gel agaroze na kome su zasejani kompleksi dobijeni između polimera 3, u skladu sa ovim pronalaskom i siRNK, pri raznim koncentracijama (od 0.5 do 8 mas%). Polimer 3, bez nukleinske kiseline (0%), je korišćen za poređenje, da se proveri da katjonski polimer, u skladu a ovim pronalaskom, ne interferira sa detektovanjem mrlje, u odnosu na siRNK.

Slika 2 predstavlja gel agaroze na kome su zasejani:

- kompleksi dobijeni između polimera 3, u skladu sa ovim pronalaskom, i siRNK, sa koncetracijama od 10 do 20 mas%;

- polimer 3, bez nukleinske kiseline (0%), za poređenje i proveru, da katjonski polimer u skladu sa ovim pronalaskom ne interferira sa detekcijom mrlja, relativno prema siRNK; i

- polimer 50 (nemodfikovani glikogen Polglumyt™), kao poređenje, da se proveri da glikogen, koji nije modifikovan u skladu sa ovim pronalaskom, nije u stanju da kompleksira nukleinsku kiselinu.

Slika 3 predstavlja gel agaroze na koji su zasejani kompleksi, dobijeni između polimera 3, u skladu sa ovim pronalaskom, i siRNK, pri različitim koncentracijama (od 30 do 800 mas%).

Slika 4 predstavlja gel agaroze na koji su zasejani kompleksi dobijeni između polimera 1, 2 i 6, u skladu sa ovim pronalaskom, i siRNK, sa koncentracijama 5 i 20 mas%, relativno prema masi svakog polimera.

Slika 5 predstavlja gel agaroze na koji su zasejani kompleksi dobijeni između polimera 10, 14 i 15 i siRNK, sa koncentracijama 5 i 20 mas%, relativno prema ukupnoj masi svakog polimera.

Slika 6 predstavlja gel agaroze na koji su zasejani kompleksi dobijeni između polimera 8, 12 i 16 i siRNK, sa koncentracijama 5 i 20 mas%, relativno prema masi svakog polimera.

Slika 7 predstavlja gel agaroze na koji su zasejani kompleksi dobijeni između polimera 21, 24 i 25, u skladu sa ovim pronalaskom i siRNK, sa koncentracijama 5 i 20 mas%, relativno prema masi svakog polimera.

Slika 8 predstavlja gel agaroze na koji su zasejani kompleksi dobijeni između polimera 20, 23 i 28, u skladu sa ovim pronalaskom, i siRNK, sa koncentracijama 5 i 20 mas%, relativno prema masi svakog polimera.

Slika 9 prikazuje krivu titracije za polimere 2, 3 i 4, u skladu sa ovim pronalaskom, koja je dobijen kao što je opisano u Primeru 8.

Slika 10 prikazuje krivu titracije za polimere 4 (u skladu sa ovim pronalaskom) i 18 (komparativni), koja je dobijena kao što je opisano u Primeru 8.

DETALJNI OPIS PRONALASKA

[0059] U ovom opisu i patentnim zahtevima koji slede, izraz "katjonski polimer" označava neki polimer sa ukupnim pozitivnim naelektrisanjem na fiziološkoj vrednosti pH.

[0060] U ovom opisu i u patentnim zahtevima koji slede, termin "glikogen" obično označava neki homopolimer glukoze, koga karakteriše visok stepen razgranatosti, u kome su monomeri glukoze vezani sa α-(1,4) vezama u linearnim lancima, dok su grane obično graftovane uz pomoć α-(1,6) veza, ali bez ograničavanja, na svakih 7-11 monomera glukoze, kao što pokazuje formula koja sledi:

[0061] Za potrebe ovog opisa i patentnih zahteva koji slede, izraz "na bazi glikogena" se koristi da se pokaže da taj polimer sadrži strukturu glikogena, opisanu gore, koja je delimično modifikovana, tako da se dobije katjonski polimer, u skladu sa ovim pronalaskom.

[0062] Za potrebe ovog opisa i patentnih zahteva koji slede, izraz "jedinka koja se ponavlja", identifikuje neki monomer koji je bar jedanput prisutan u katjonskom polimeru, u skladu sa ovim pronalaskom.

[0063] Za potrebe ovog opisa i patentnih zahteva koji slede, izraz "(C1-C6)alkil" označava neku linearnu ili račvastu alkil grupu, koja sadrži od 1 do 6 atoma ugljenika, na primer metil, etil, propil, izopropil, n-butil, izobutil, sek-butil, terc-butil, n-pentil, sekpentil, 3-pentil, izopentil, neopentil, n-heksil, sek-heksil ili neoheksil.

[0064] Za potrebe ovog opisa i patentnih zahteva koji slede, termin "azociklil" označava neki 3- do 7-člani aromatični ili alifatični heterociklični prsten, koji sadrži najmanje jedan atom azota, kao što su, na primer aziridin, pirol, pirolin, pirolidin, piridin ili piperidin. Opciono, gore pomenuti heterociklični prsten može sadržati i najmanje jedan drugi heteroatom, koji se bira između N, O i S, kao što su, na primer tiazol, oksazin ili tiazin.

[0065] Za potrebe ovog opisa i patentnih zahteva koji slede, termin "kompleks" označava neki proizvod, dobijen interakcijom ovog katjonskog polimera na bazi glikogena, u skladu sa ovim pronalaskom, i najmanje jednog anjonskog jedinjenja, preko neke ne-kovalentne interakcije (na primer, elektrostatičke, jonske ili Van der Waals-ove interakcije, vodonične veze i slično).

[0066] Za potrebe ovog opisa i patentnih zahteva koji slede, izraz "aktivni sastojak" sadrži prirodne, polu-sintetske ili sintetske molekule, koji su, posle ordiniranja, sposobni da stupe u dejstvo sa nekom biološkom funkcijom ćelije ili živog organizma, i po mogućstvu da modifikuju te biološke funkcije. Aktivni sastojci koji su korisni, u skladu sa ovim pronalaskom, su molekuli sa ukupnim negativnim naelektrisanjem, što bi se reklo, anjonski molekuli, koji se mogu upotrebiti za, terapiju, profilaksu iili dijagnozu nekog patološkog stanja. Pomenuti anjonski molekuli mogu biti organski ili neorganski. Na primer, to mogu biti organski anjonski molekuli, koji mogu imati malu molarnu masu (na primer, aminokiseline, sulfamidi ili vitamini) ili veliku molarnu masu (na primer, vakcine, ili glukozaminoglikani, kao što je heparin).

[0067] Za potrebe ovog opisa i patentnih zahteva koji slede, termin "nukleinska kiselina" odnosi se na makromolekule nukleotida, prirodnog ili sintetskog porekla, koji su dvostruko uvijeni ili jednostruko uvijeni, a koji imaju ukupno negativno naelektrisanje. Posebno, ovaj termin označava oligonukleotide, RNK (siRNK, dsRNK, ssRNK, shRNK, miRNK, rRNK, hnRNK, mRNK, tRNK, snRNK, pre-mRNK, katalitičku RNK, antisensnu RNK), DNK (cDNK, mtDNK, ssDNK, dsDNK, antisensnu DNK, plazmidnu DNK).

[0068] Za potrebe ovog opisa i patentnih zahteva koji slede, izraz "oslobađanje aktivnog sastojka" i "oslobođeni aktivni sastojak" označavaju transportovanje ovog aktivnog sastojka kompleksiranog sa katjonskim polimerom, u skladu sa ovim pronalaskom, na neki specifični fiziološki cilj, na primer, u neko tkivo ili neki organ.

[0069] Za potrebe ovog opisa i patentnih zahteva koji slede, termini "transficiran" i "transficiranje" označavaju uvođenje neke skvencije neke nukleinske kiseline u neku ćeliju, posebno u citoplzmu i/ili jedro.

[0070] Posebno, ovaj pronalazak se odnosi na neki katjonski polimer na bazi glikogena, koji sadrži najmanje jednu jedinku koja se ponavlja, a koja se bira iz grupe koju čine:

(a)

gde su

grupe R, koje mogu biti identične ili različite, predstavljaju atom vodonika; neka karboksimetil grupa, opciono u obliku soli sa nekom farmaceutski prihvatljivom organskom ili neorganskom bazom; ili neka grupa koja sadrži azot, a koja se bira između NH2-(C1-C6)alkil, [N,N-di(C1-C6)alkilamino]-(C1-C6)alkil, NH2-[(C1-C6)alkil-di(C1-C6)alkilamonio]-(C1-C6)alkil, {[N,N-di(C1-C6)alkil-amino]-(C1C6)alkil-di(C1-C6)alkilamonio}-(C1-C6)alkil, NH2-[(C1-C6)alkilamino]-(C1-C6)alkil, {[N,N-di(C1-C6)alkilamino]-(C1-C6)alkilamino}-(C1-C6)alkil, [tri(C1-C6)alkilamonio]-(C1-C6)alkil, azociklil-(C1-C6)alkil, u kojima su lanci (C1-C6)alkil, koji mogu biti identični ili različiti, opciono supstituisani sa jednom ili više hidroksilnih grupa; a

n je ceo broj veći ili jednak 1; i

(b)

gde su

R1 se bira između atoma vodonika; neke karboksimetil grupe, opciono u obliku soli sa nekom farmaceutski prihvatljivom organskom ili neorganskom bazom; ili neke grupe koja sadrži azot, koja se bira između NH2-(C1-C6)alkil, [N,N-di(C1-C6)alkilamino]-(C1-C6)alkil, NH2-[(C1-C6)alkil-di(C1-C6)alkilamonio]-(C1-C6)alkil, {[N,N-di(C1-C6)alkilamino]-(C1-C6)alkil-di(C1-C6)alkilamonio}-(C1-C6)alkil, NH2-[(C1-C6)alkilamino]-(C1-C6)alkil, {[N,N-di(C1-C6)alkilamino]-(C1-C6)alkilamino}-(C1-C6)alkil, [tri(C1-C6)alkilamonio]-(C1-C6)alkil, u kojima su lanci (C1-C6)alkil, koji mogu biti identični ili različiti, opciono substituisani sa jednom ili više hidroksilnih grupa;

X1 i X2, koji mogu biti identični ili različiti, predstavlja neka grupa -OH ili neka -NHR2 grupa koja sadrži azot, u kojoj se R2 bira između: atoma vodonika, (C1-C6)alkil, i H-[NH-(C1-C6)alkil]p-, gde je p ceo broj, veći ili jednak 1, a grupe (C1-C6)alkil mogu biti identične ili različite; i

m je ceo broj veći ili, u svakom od R, R1, X1 i X2, jednak 1; predstavlja neka grupa koja sadrži azot, kao što je definisano, respektivno i

pod uslovom da se pomenuti katjonski polimer na bazi glikogena razlikuje od proizvoda doobijenog reakcijom glikogena sa N-(3-hloro-2-hidroksipropil)-trimetil amonijum-hloridom, kao što je opisano, posebno, u odeljku 2.2, članka Pal S et al. (Colloids and Surfaces A: Physicochem. Eng. Aspects 289, 2006, pages 193-199).

[0071] Poželjno je da ove grupe R, koje mogu biti identične ili različite, predstavlja atom vodonika; neka karboksimetil grupa, opciono u obliku soli sa nekom farmaceutski prihvatljivom organskom ili neorganskom bazom; ili neka grupa koja sadrži azot, koja se bira između: [N,N-di(C1-C3)alkilamino]-(C1-C3)alkil, {[N,N-di(C1-C3)alkilamino]-(C1-C3)alkil-di(C1-C3)alkilamonio}-(C1-C3)-alkil, {[N,N-di(C1-C3)alkilamino]-(C1-C3)alkilamino}-(C1-C3)alkil, ili [tri(C1-C3)alkilamonio]-(C1-C3)alkil, azociklil-(C1-C3)alkil, u kojoj su lanci (C1-C3)alkil, koji mogu biti identični ili različiti, opciono supstituisani sa nekom hidroksilnom grupom.

[0072] Poželjno je da heterociklični prsten, koji sadrži najmanje jedan atom azota, predstavljen terminom "azociklil", predstavlja neki 5- ili 6-člani aromatični ili alifatični heterociklični prsten, kao što su, na primer pirol, pirolin, pirolidin, piridin ili piperidin. Pogodno je da pomenuti 5- ili 6-člani heterociklični prsten sadrži još najmanje jedan drugi heteroatom, koji se bira između N, O i S, a predstavlja ga, na primer, diazol, oksazin i tiazin. Poželjno je da je pomenuti heterociklični prsten alifatičan. Još je poželjnije da pomenuti heterociklični prsten predstavlja morfolin ili piperidin.

[0073] Poželjnije je da grupe R, koje mogu biti identične ili različite, predstavlja atom vodonika; neka karboksimetil grupa, opciono u obliku soli sa nekom farmaceutski prihvatljivom organskom ili neorganskom bazom; ili neka grupa koja sadrži azot, a koja se bira između: N,N-dimetilaminoetil, N,N-dimetilaminopropil, N,N-dietilaminoetil, [(N,N-dimetilaminoetil)dimetilamonio]etil, [(N,N-dimetilaminopropil)dimetilamonio]propil, [(N,N-dietilamino-etil)dietilamonio]-etil, [trimetilamonio]-2-hidroksipropil, piperidil-N-etil ili morfolinil-N-etil.

[0074] Poželjno je da R1 predsgtavlja atom vodonika; neka karboksimetil grupa, opciono u obliku soli sa nekom farmaceutski prihvatljivom organskom ili neorganskom bazom; ili neka grupa koja sadrži azot, koja se bira između: [N,N-di(C1-C3)alkilamino]-(C1-C3)alkil], {[N,N-di(C1-C3)alkilamino]-(C1-C3)alkil-di(C1-C3)alkilamonio}-(C1-C3)alkil, {[N,N-di(C1-C3)alkilamino]-(C1-C3)alkilamino}-(C1-C3)alkil ili [tri(C1-C3)alkilamonio]-(C1-C<3>)alkil, u kojima su lanci (C1-C3)alkil, koji mogu biti identični ili različiti, opciono supstituisani sa nekom hidroksilnom grupom.

[0075] Poželjnije je da R1 predstavlja atom vodonika ili neka karboksimetil grupa.

[0076] Poželjno je da X1 i X2, koji mogu biti identični ili različiti, predstavlja neka grupa -NHR2, gde je R2 atom vodonika ili H-[NH-(C1-C4)alkil]p-, gde je p ceo broj veći ili jednak 1, a grupe (C1-C4)alkil mogu biti identične ili različite.

[0077] Poželjno je da pomenutu grupu H-[NH-(C1-C4)alkil]p- predstavlja neki polietilenimin, sa molekulskom težinom od 50 to 3,000 daltona, poželjnije sa molekulskom težinom od 1,000 do 2,300 daltona, zatim spermin (H2N(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NH2), ili spermidin (H2N(CH2)4NH(CH2)4NH2).

[0078] Primeri farmaceutski prihvatljivih organskih baza su trometamin, lizin, arginin, glicin, alanin, metilamin, dimetilamin, trimetilamin, etilamin, dietilamin, trietilamin, propilamin, dipropilamin, tripropilamin, etilenediamin, monoetanolamin, dietanolamin, trietanolamin, guanidin, morfolin, piperidin, pirolidin, piperazin, 1-butilpiperidin, 1-etil-2-metilpiperidin, N-metilpiperazin, 1,4-di-metilpiperazin, N-benzilfenetilamin, N-metilglukozamin i tri(hidroksimetil)aminometan.

[0079] Primeri farmaceutski prihvatljivih neorganskih baza su hidroksidi i karbonati alkalnih metala ili zemnoalkalnih metala, kao što su, na primer natrijum-hidroksid, kalijum-hidroksid, kalcijum-hidroksid, natrijum-karbonat, kalijum-karbonat i kalcijumkarbonat.

[0080] Pogodno je da su pomenute jedinke, (a) i (b), koje se ponavljaju, nasumično raspoređene u lancima glikogena.

[0081] Primeri jedinki koje se ponavljaju, (a) i (b), kako su prikazane, respektivno, u Tabelama A i B, u nastavku.

Tabela A – primeri jedinke koja se ponavlja (a)

Tabela A (nastavak)

Tabela A (nastavak)

Tabela A (nastavak)

Tabela A (nastavak)

Tabela B – primeri jedinke koja se ponavlja (b)

Tabela B (nastavak)

[0082] U skladu sa jednom poželjnom realizacijom, pomenute jedinke (a) i (b), koje se ponavljaju, imaju najmanje jednu grupu koja sadrži azot, koja može da se jonizuje na fiziološkom pH, a koja olakšava kompleksiranje pomenutog anjonskog jedinjenja, i najmanje jednu grupu koja sadrži azot, koja može da se jonizuje na nekom pH ispod fiziološkog pH, što olakšava oslobađanje kompleksa iz endozoma.

[0083] Poželjno je da se pomenute grupe, koje sadrže azot, mogu jonizovati na fiziološkom pH, i da su prisutne u procentima od 1 do 30 %, relativno prema ukupnom broju hidroksilnih grupa u glikogenu, koji se koristi za dobijanje ovih katjonskih polimera, u skladu sa ovim pronalaskom.

[0084] Poželjno je da su pomenute grupe, koje sadrže azot, a mogu se jonizovati na nekom pH ispod fiiološkog pH, prisutne u procentima od 0.1 do 10%, relativno prema ukupnom broju hidroksilnih grupa glikogenu, koji se koristi za dobijanje polimera u skladu sa ovim pronalaskom.

[0085] Za potrebe ovog pronalaska, pomenute grupe koje sadrže azot, i koje se mogu jonizovati na fiziološkom pH, su NH2-(C1-C6)alkil, [N,N-di(C1-C6)alkilamino]-(C1-C6)alkil, NH2-[(C1-C6)alkilamino]-(C1-C6)alkil, {[N,N-di(C1-C6)alkilamino]-(C1-C6)alkilamino}-(C1-C6)alkil i azociklil-(C1-C6)alkil.

[0086] Pogodne, pomenute grupe koje sadrže azot, a koje se jonizuju na nekom pH ispod fiziološkog pH, su NH2-{[(C1-C3)alkil]-di(C1-C6)alkilamonio}-(C1-C6)alkil i {[N,N-di(C1-C6)alkilamino]-(C1-C3)alkil-di(C1-C6)alkilamonio}-(C1-C6)alkil.

[0087] Pogodno je da novi katjonski derivati glikogena, u skladu sa ovim pronalaskom, imaju nisku viskoznost, pa se stoga mogu formulisati u farmaceutske kompozicije za upotrebu kao injekcije. Posebno, novi katjonski derivati glikogena, u skladu sa ovim pronalaskom imaju viskoznost manju od 10 mPa·s, a poželjno manju od 5 mPa·s, mereno za koncentraciju 1% u PBS, pri određivanju sa rotacionim reometrom.

[0088] Glikogen, koji se koristi za dobijanje katjonskih polimera u skladu sa ovim pronalaskom, može se dobiti u skladu sa jednim od poznatih postupaka u stanju tehnike.

[0089] Poželjno je da se glikogen dobija kao što je opisano u dokumentu International patent application WO 94/03502.

[0090] Poželjno je da se pomenuti glikogen dobija iz sojeva Mytilus edulis i Mytilus galloprovincialis.

[0091] Drugi izvori glikogena, koji se mogu upotrebiti za potrebe ovog pronalaska, su školjke, kao što su ostriges i Crepidula fornicata, kao i organi kičmenjaka bogati sa glikogenom, kao što su jetra i mišići.

[0092] Poželjno je da je pomenuti glikogen u suštini bez jedinjenja koja sadrže azot i redukcione šećere. Kako se koristi u ovom opisu i u patentnim zahtevima koji slede, izraz "u suštini bez jedinjenja koja sadrže azot i redukcione šećere", označava da je sadržaj azota manji od 60 ppm, meren pomoću Kieldahl-ove metode, a sadržaj redukcionih šećera manji od 0.25%, meren pomoću metode koju su dali F.D. Snell i Snell ("Colorimetric Methods of Analysis", New York, 1954, vol. III, p.204).

[0093] Poželjno je da se glikogen, koji se koristi u skladu sa ovim pronalaskom, karakteriše i saržajem ugljenika, između oko 44 i oko 45%, molekulskom težinom, od oko (2.5±0.1)×10<6>daltona i optičkom rotacijom (α)D20 od 197±2.0 (c = 1, u vodi).

[0094] Poželjnije je da glikogen, koji se koristi u skladu sa ovim pronalaskom, predstavlja glikogen Polglumyt™, koji proizvodi firma Aziende Chimiche Riunite Angelini Francesco A.C.R.A.F. S.p.A.

[0095] Osoba verzirana u stanju tehnike, će shvatiti da se ovaj pronalazak ne odnosi na nove klase jedinjenja i na terapeutsku efikasnost kao takvu. Umesto toga, ovaj pronalazak se odnosi na upotrebu katjonskih polimera na bazi glikogena, kao što je ranije opisano, u formiranju nekog kompleksa sa najmanje jednim anjonskim jedinjenjem.

[0096] U drugom aspektu, ovaj pronalazak se odnosi na neki kompleks između katjonskog polimera na bazi glikogena i nekog anjonskog jedinjenja, koji se bira između aktivnog sastojka i neke nukleinske kiseline, u kome pomenuti katjonski polimer na bazi glikogena sadrži najmanje jednu jedinku koja se ponavlja, koja se bira uz grupe koju čine (a) i (b), kao što je opisano ranije.

[0097] Poželjno je da pomenuto anjonsko jedinjenje bude organsko ili neorgansko, s tim da bude ili male molekulske težine ili velike molekulske težine.

[0098] Poželjnije je da pomenuto anjonsko jedinjenje predstavlja neki aktivni sastojak koji pripada, na primer, jednoj od sledećih klasa: anti-infektivni agensi, kao što su, na primer, antibiotici i antivirali; analgetiici; anorektici; antelmintici; antiastmatici; antikonvulzanti; antidepresivi; antidijabetici; antidijareali; antihistaminici; antiinflamatorici; anti-hemikranijski agensi; agensi protiv mučnine; antineoplastici; antiparkinsonini; agensi protiv svraba; antipsihotici; antipiretici; antispazmolitici; antiholinergijski agensi; simpatomimetici; derivati ksantina; lekovi za kardiovaskularni sistem, na primer kalijum, blokatori kalcijumovog kanala, beta blokatori, alfa blokatori i antiaritmici; antihipertenziitivi; diuretici i antidiuretici; centralni i periferni vazodilatatori; stimulanti centralnog nervnog sistema; vazokonstriktori; antitusivni agensi; dekongestanti; hormoni; hipnotici; imunosupresanti; mišićni relaksanti; parasimpatolitici; psihostimulanti; sedativi; trankvilajzeri.

[0099] U skladu sa jednom poželjnom realizacijom, pomenuto anjonsko jedinjenje predstavlja neka nukleinska kiselina.

[0100] Poželjno je da se pomenuta nukleinska kiselina bira između: oligonukleotida, RNK (siRNK, dsRNK, ssRNK, shRNK, miRNK, rRNK, hnRNK, mRNK, tRNK, snRNK, pre-mRNK, katalitička RNK, antisensna RNK) i DNK (cDNK, mtDNK, ssDNK, dsDNK, antisensna DNK, plazmidska DNK).

[0101] Podnosilac ove prijave je opazio da je ovaj pomenuti kompleks u stanju da formira nanomerne čestice, srednjeg prečnika (Z) između 1 i 200 nm, poželjno između 20 i 100 nm, a poželjnije između 30 i 50 nm.

[0102] U skladu sa jednom poželjnom realizacijom, pomenuti kompleks sadrži neku količinu pomenutog anjonskog jedinjenja, koja je između 5 i 60 mas%, relativno prema masi pomenutog katjonskog polimera na bazi glikogena.

[0103] Poželjno je da pomenuti kompleks sadrži neku količinu pomenutog anjonskog jedinjenja, koja je između 10 i 50 mas%, relativno prema masi pomenutog katjonskog polimera na bazi glikogena.

[0104] Poželjnije je da ovaj pomenuti kompleks sadrži neku količinu pomenutog anjonskog jedinjenja, koja je između 10 i 30 mas%, relativno prema masi pomenutog katjonskog polimera na bazi glikogena.

[0105] Pogodno je da se ovaj kompleks, između nekog katjonskog polimera na bazi glikogena i nekog anjonskog jedinjenja, pripremi kao neka farmaceutska kompozicija.

[0106] U trećem aspektu, ovaj pronalazak se odnosi neku farmaceutsku kompoziciju koja sadrži neki kompleks između katjonskog polimera na bazi glikogena i nekog anjonskog jedinjenja, koje se bira između aktivnog sastojka i neke nukleinske kiseline, i najmanje jednog farmaceutski prihtavljivog ekscipijenta, u kojoj pomenuti katjonski polimer na bazi glikogena sadrži najmanje jednu jedinku koja se ponavlja, a koja se bira uz grupe koju čine (a) i (b), opisane ranije.

[0107] U jednoj poželjnoj realizaciji, pomenuto anjonsko jedinjenje predstavlja neka nukleinska kiselina.

[0108] Termin "ekscipijent" označava neki agens, poznat u stanju tehnike, koji je pogodan za pripremanje neke farmaceutske forme.

[0109] Primeri ekscipijenata, koji su pogodni, u skladu sa ovim pronalaskom, su: prezervativi, stabilizatori, surfaktanti, soli za regulisanje osmotskog pritiska, emulgatori, zaslađivači, aromatizeri, boje i slično.

[0110] Pomenuta farmaceutska kompozicija može se pripremati u obliku jedinične doze, u skladu sa postupcima koji su poznati u stanju tehnike.

[0111] Poželjno je da se pomenuta farmaceutska kompozicija upotrebljava u obliku injekcija, kao što je, na primer, u nekom vodenom rastvoru, suspenziji ili emulziji, ili može biti u obliku praha, koji treba da se rekonstituiše u preparat, u vodenom rastvoru, suspenziji ili emulziji, za intravenozne, intramuskularne, subkutane, transdermalne ili intraperitonealne aplikacije.

[0112] Alternativno, pomenuta farmaceutska kompozicija može biti, na primer, u obliku neke tablete, neke kapsule, obložene tablete, granula, rastvora i sirupa, za oralno ordiniranje; medicinskih flastera, rastvora, pasta, krema ili pomada, za transdermalno ordiniranje; supozitorija, za rektalno ordiniranje; nekog sterilnog rastvora, za ordiniranje u obliku aerosola; za trenutno, ili odloženo oslobađanje.

[0113] U četvrtom aspektu, ovaj pronalazak se odnosi na upotrebu nekog kompleksa između katjonskog polimera na bazi glikogena i nekog anjonskog jedinjenja, koje se bira između aktivnog sastojka i neke nukleinske kiseline, za oslobađanje ili transficiranje pomenutog anjonskog jedinjenja nekom specifičnom farmakološkom ciljanom mestu, na primer u neki organ, neko tkivo ili neku ćeliju, pri čemu pomenuti katjonski polimer na bazi glikogena sadrži najmanje jednu jedinku koja se ponavlja, a koja se bira iz grupe, koju čine (a) i (b), opisane ranije.

[0114] U skladu sa ovom realizacijom, pomenuto anjonsko jedinjenje je neki aktivni sastojak ili neka nukleinska kiselina. Pogodno je da pomenuto farmakološko ciljano mesto predstavlja neka ćelija.

[0115] U jednoj poželjnoj realizaciji, katjonski polimer na bazi glikogena, u skladu sa ovim pronalaskom može biti konjugovan, direktno ili preko nekog distancera, sa nekom grupom za usmeravanje, koja je u stanju da se na visoko specifičan način veže za ciljano mesto, prisustvuje na površini ćelije, i da olakša absorpciju ovog kompleksa u nekoj specifičnoj ćeliji (na primer, u ćelijama tumora, ćelijama jetre, hematopoetičkim ćelijama, i slično).

[0116] Ova grupa za usmeravanje se može upotrebiti za usmeravanje katjonskog polimera u neki deo ćelije (na primer, jedro, mitohondrije, i slično).

[0117] Ove grupe za usmeravanje se mogu birati, na primer, između folne kiseline, monosaharida, oligosaharida, peptida, proteina i oligomera hijaluronske kiseline.

[0118] Primeri koji slede treba da ilustruju ovaj pronalaazak, ali bez ograničavanja na bilo koji način.

PRIMERI

Primer 1

Dobijanje katjonskog polimera na bazi glikogena, koji sadrži jedinku (a)

(i) Sinteza katjonskog polimera na bazi glikogena, sa grupama koje sadrže azot

[0119] Rastvori se 10 g glikogena Polglumyt™ (61.73 mmol glukoze) u 124 mL 1M NaOH (za sintezu proizvoda 1-7, 9-11 i 13-15), ili u 2M NaOH (za sintezu proizvoda 8, 12 i 16), u dvogrlom balonu okruglog dna, koji je opremljen magnetskom mešalicom i refluksnim kondenzatorom. Posle završenog rastvaranja, ova smeša se zagreva na 70°C i meša 2 h.

[0120] Zavisno od proizvoda koji se želi dobiti, doda se jedan od sledećih reagensa (I) do (VI), u količini (iskazanoj u mmol reagensa), kao što je dato u Tabeli 1:

(I) 2-hloro-N,N-dietiletilamin hidrohlorid;

(II) 3-hloro-N,N-dimetilpropilamin hidrohlorid;

(III) 2-hloro-N,N-dimetiletilamin hidrohlorid;

(IV) rastvor 3-hloro-2-hidroksipropiltrimetilamonijum-hlorida, 60 mas%, u H2O; (V) 1-(2-hloroetil)piperidin; i

(VI) 4-(2-hloroetil)morfolin.

[0121] Ova smeša se preko noći meša na 70°C.

[0122] Sledećeg dana, prestane se sa zagrevanjem, a smeša se ostavi da se ohladi na sobnu temperaturu. Ovaj sirovi proizvod reakcije se zatim polagano prespe u 400 mL acetona. Po završetku ovog dodavanja, suspenzija se meša oko 30 min. Po prestanku mešanja, smeša se ostavi da se taloži, sve dok se talog i supernatant ne razdvoje.

[0123] Supernatant se odbaci, a dobijeni talog se dva puta opere sa acetonom (200 mL). Ovako dobijeni talog se profiltrira, rastvori u 200 mL destilovane vode, dovede na neutralno pH sa 1M rastvorom HCI, pa se konačno podvrgne dijalizi prema destilovanoj vodi, u cevima od regenerisane celuloze (prestanak na 15,000) sve dok provodnost ne bude konstantna (jednaka oko 2-3 µS). Ovako dobijeni rastvor se filtrira kroz filter od oko 0.45 µm, koncentriše pod vakuumom i konačno suši smrzavanjem.

[0124] Prinosi ove sinteze su sakupljeni u Tabeli 1, u nastavku.

Tabela 1

[0125] Ovim opisanim postupkom dobijeni su katjonski polimeri 1-16 i 40-41, koji imaju strukture ilustrovane u Tabeli 2, u nastavku.

[0126] U predstavljenim strukturama, skraćenica "Glu" označava da se lanac polimera može nastaviti sa jedinkama nemodifikovane glukoze, koje se ponavljaju, ili sa jedinkama koje se ponavljaju u skladu sa ovim pronalaskom. Pored toga, da bi se olakšalo predstavljanje, grane nisu predstavljene, a supstituenti su prikazani samo u položaju 6, i na različitim jedinkama koje se ponavljaju.

[0127] Osoba vezirana u stanju tehnike shvataju da ista jedinka, koja se ponavlja, može sadržati od jedan do tri substituenta, koji mogu biti identični ili različiti, a ovi supstituenti mogu biti nezavisno prikazani u položajima 2, 3 i/ili 6.

Tabela 2

Tabela 2 (nastavak)

(ii) Sinteza katjonskih polimera na bazi glikogena, koji sadrže grupe koje sadrže azot i karboksimetilovane grupe.

[0128] Glikogen Polglumyt™, koji sadrži najmanje jednu karboksimetil grupu (Glikogen-CM) sintetizovan je kao što je opisano u nastavku.

[0129] Pođe se od 9.57 g (59.07 mmol glukoze) anhidrovanog glikogena Polglumyt™, prethodno osušenog do konstantne mase, pod vakuumom, na 60°C, u sušnici, pa se pod strujom azota prebaci u dvogrli balon okruglog dna, koji je opremljen magnetskom mešalicom, i zatim se rastvori u 200 mL anhidrovanog dimetilsulfoksida. Posle završenog rastvaranja, doda se natrijum-hidrid, u količini koja je naznačena u Tabeli 3, pa se ova smeša 1 h meša na sobnoj temperaturi. Zatim se doda natrijumhloroacetat u količini koja je naznačena u Tabeli 3, pa se ova smeša meša preko noći na sobnoj temperaturi.

[0130] Sledećeg dana ova smeša se polagano prespe u aceton (800 mL), a dobijena suspenzija se meša oko 30 min. Dobijeni talog se profiltrira, i dva puta opere acetonom (400 mL), ponovo profiltrira, pa rastvori u destilovanoj vodi (200 mL). Dobijeni rastvor se podvrgne dijalizi u odnosu na destilovanu vodu, u cevima od regenerisane celuloze (prekid na 15,000), sve dok provodnost ne bude konstantna (jednaka oko 2-3 µS). Ovako dobijeni rastvor se profiltrira kroz filter od 0.45 µm, pa koncentriše pod vakuumom i konačno osuši smrzavanjem.

[0131] Stepen derivatizacije (DD, od engleski degree of derivatization), podrazumeva broj derivatizovanih molekula glukoze, derivatizovanih sa nekom karboksimetil grupom, na 100 monomera glukoze, a određuje se pomoću IR spektroskopije, generisanjem kalibracione krive sa smešama koje sadrže poznati titar glikogena Polglumyt™ i natrijum-acetata.

Tabela 3

[0132] Ovako dobijeni glikogen-CM se koristi u sintezama koje slede, da bi se dobili katjonski polimeri koji sadrže azotove grupe.

[0133] Posebno su sintetizovani Glikogen-CMs, koji sadrži dietilaminoetil (DEAE-glikogen-CM) i 2-hidroksipropiltrimetilamonijum (2-OH-PTMA-glikogen-CM) grupe.

DEAE-glikogen-CM

[0134] Rastvori se 1 g proizvoda 103 u 10.8 mL 1M NaOH, u dvogrlom balonu okruglog dna, koji je opremljen magnetskom mešalicom i refluksnim kondenzatorom, pa se 2 h zagreva na 70°C.

[0135] Doda se 0.929 g 2-hloro-N,N-dietiletilamin hidrohlorida (5.4 mmol), pa se ova smeša preko noći meša na 70°C.

[0136] Sledećeg dana, prestane se sa zagrevanjem, a smeša se ostavi da se ohladi na sobnu temperaturu. Zatim se ovaj sirovi proizvod polako prespe u 100 mL acetona. Pri kraju ovog dodavanja dobijena suspenzija se meša 30 min.

[0137] Nastali talog se profiltrira, dvaput opere sa acetonom (100 mL), rastvori u 50 mL destilovane vode, dovede na pH 6.5-7 sa 1M hlorovodoničnom kiselinom, i konačno podvrgne dijalizi u cevima od regenerisane celuloze (prekid na 15,000) u odnosu na destilovanu vodu, dok provodnost ne postane konstantna (jednaka oko 2-3 µS). Dobijeni rastvor se profiltrira kroz filter od 0,45 µm, koncentriše pod vakuumom i konačno osuši smrzavanjem.

2-OH-PTMA-glikogen-CM

[0138] Rastvori se 2.5 g proizvoda 103 u 27 mL 1M NaOH, u dvogrlom balonu okruglog dna, koji je opremljen magnetskom mešalicom i refluksnim kondenzatorom, pa se 2 h zagreva na 70°C.

[0139] Zatim se doda rastvor 3-hloro-2-hidroksipropiltrimetilamonijum-hlorida (60 mas% u vodi, = 8.1 mmol), pa se ova smeša preko noći meša na 70°C.

[0140] Sledećeg dana prestane se sa zagevanjem, pa se smeša ostavi da se ohladi na sobnu temperaturu. Zatim se ovaj sirovi proizvod polagano prespe u 80 mL acetona.

[0141] Dobijeni talog se profiltrira, dvaput opere sa acetonom (80 mL), rastvori u 50 mL destilovane vode, pa podvrgne dijalizi u cevima od regenerisane celuloze (prestanak na 15,000), u odnosu na destilovanu vodu, dok provodnost ne postane konstantna (jednaka oko 2-3 µS). Dobijeni rastvor se profiltrira kroz filter od 0,45 µm, koncentriše pod vakuumom i konačno osuši smrzavanjem.

[0142] Katjonski polimeri 17 i 19, dobijeni opisanim postupcima, prikazani su u Tabeli 4 u nastavku.

[0143] Zbog lakše vizualizacije grane nisu prikazane, a supstituenti su na različitim jedinkama koje se ponavljaju prikazani samo u položaju 6. U prikazanim strukturama, skraćenica "Glu" označava da taj lanac polimera može da se nastavi sa jedinkom koja se ponavlja, nemodifikovanom glukozom ili sa jedinkom koja se ponavlja, u skladu sa ovim pronalaskom.

[0144] Osoba vezirana u stanju tehnike lako će shvatiti da ista jedinka, koja se ponavlja, može još sadržati od jedan do tri supstituenta, koji mogu biti identični ili različiti, i da ovi supstituenti mogu biti nezavisno prisutni u položajima 2, 3 i/ili 6, jedinke koja se ponavlja.

Tabela 4

Primer 2

Dobijanje katjonskog polimera na bazi glikogena, koji sadrži jedinku (b)

[0145] Oksidiše se glikogen Polglumyt™ sa kalijum-perjodatom, u skladu sa sledećim postupkom.

[0146] Rastvori se 20 g glikogena Polglumyt™ (123.46 mmol glukoze) u 400 mL destilovane vode, u balonu od tamnog stakla. Doda se kalijum-perjodat, u količini koja je data u Tabeli 5 (iskazana u mmol reagensa), pa se ova smeša 30 min meša na sobnoj temperaturi.

[0147] Ova reakcija se zaustavlja dodavanjem viška etilenglikola (26 mL), uz 2 h kontinualnog mešanja na sobnoj temperaturi.

[0148] Smeša se podvrgne dijalizi u cevima od regenerisane celuloze (prestanak na 15,000) odnosu na destilovanu vodu, sve dok provodnost ne bude konstantna (jednaka oko 2-3 µS). Ova smeša se zatim profiltrira kroz filter od 0,45 µm, pa osuiši smrzavanjem.

[0149] Zatim se određuje stepen oksidacije (% oksidisanih monomera glukoze, titracijom hlorovodonične kiseline (sa 0.1M NaOH), oslobođene u reakciji između hidroksilamin hidrohlorida i slobodnih aldehidnih grupa, prisutnih na raznim ugljenim hidratima. Ova reakcija je data niže:

glikogen-(CH=O)z z·H2N-OH*HCl = glikogen-(CH=N-OH)z z·H2O z·HCl

[0150] Procenat oksidisanih monomera određuje se pomoću sledeće formule:

DD = [(V×N×0,5) / (W / 162)]×100

gde su:

V = ml NaOH,

N = normalna koncentracija NaOH;

W = masa anhidrovanog uzorka, u mg;

162 = molarna masa glukoze, jedinke koja se ponavlja.

Tabela 5

[0151] Ovako oksidisani glkogen Polglumyt™ reaguje sa jednim od reagenasa (VII) do (X) u nastavku, u količinama (koje su iskazane u mmol reagensa), datim u Tabeli 6:

(VII) spermin (Fluka, reference No.85590);

(VIII) tetraetilenpentamin (Fluka, reference No.15652843);

(IX) rastvor polietilenimina MW 1300, sa 50 mas% u vodi (Aldrich, reference No. 482595);

(X) rastvor polietilenimina MW 2000, sa 50 mas% u vodi (Aldrich, 408700).

[0152] Ovi derivati su sintettizovani u skladu sa sledećim opštim postupkom.

[0153] Rastvori se 2 g oksidisanog glikogena Polglumyt™ u 200 mL boratnog pufera, pH 8.5, u trogrlom balonu, okruglog dna, koji je opremljen mehaničkom mešalicom (IKA Labortechnik model). Amin se rastvori u 40 mL boratnog pufera, pa se polako dodaje u reakcioni balon, a ova smeša se mehanički meša na sobnoj temperaturi.

[0154] Posle 4 h doda se natrijum-borohidrid (473 mg; 12.5 mmol), a smeša se mehanički meša preko noći na sobnoj temperaturi.

[0155] Sledećeg dana ovaj sirovi reakcioni proizvod se polako prespe u 400 mL acetona, pa se nastala suspenzija meša 30 min. Dobijeni talog se profiltrira, dvaput opere sa acetonom (400 mL), profiltrira, pa rastvori u destilovanoj vodi (100 mL). Ovaj rastvor se neutrališe sa 1M HCl, pa podvrgne dijalizi u cevima od regenerisane celuloze (prekid na 15,000) u odnosu na destilovanu vodu, dok provodnost ne postane konstantna (jednaka oko 2-3 µS). Dobijeni rastvor se profiltrira kroz filter od 0,45 µm i konačno osuši smrzavanjem.

Tabela 6

[0156] Katjonski polimeri 20-30, dobijeni su opisanim postupcima, a prikazani su u Tabeli 7 u nastavku. U prikazanim strukturama, skraćenica "Glu" označava da taj lanac polimera može da se nastavi sa jedinkom koja se ponavlja, nemodifikovanom glukozom, ili sa jedinkom koja se ponavlja, u skladu sa ovim pronalaskom. Zbog lakše vizualizacije grane nisu prikazane, a supstituenti su pokazani na različitim jedinkama koje se ponavljaju.

Tabela 7

Tabela 7 (nastavak)

Primer 3

Određivanje stepena derivatizacije (DD) katjonskih polimera, koji sadrže jedinku koja se ponavlja tipa (a)

[0157] Stepen derivatizacije, relativno prema broju grupa koje sadrže azot, prisutnih u polimerima koji sadrže jedinku koja se ponavlja tipa (a), izračunava se transformacijom amino grupa u odgovarajući hidrohlorid, pa određivanjem količine halogenih jona prisutnih ili u aminskim grupama ili u kvaternernim amonijum grupama.

[0158] Ista procedura je primenjena i za DEAE-dekstran hidrohlorid (komercijalni proizvod DEAE-Dekstran Hidrohlorid, Sigma, reference No. D9885), koji je upotrebljen kao komparativni proizvod.

[0159] Količina halogenih jona je određivana za masu suvog polimera, koja je dobijena odbijanjem sadržaja vode, određenog Karl Fischer-ovom metodom.

[0160] Rastvori se 1 g derivata amina u 10 mL destilovane vode. Posle završenog rastvaranja, doda se 10 mL 1M hlorovodonične kiseline, pa se ova smeša 30 min meša. Po završetku mešanja, smeša se prespe u aceton (100 mL). Dobijeni talog se profiltrira, dvaput opere sa acetonom (100 mL), i suši pod vakuumom, u sušnici, na 60°C.

[0161] Količina halogenih jona se iskazuje kao maseni procenat, tj. kao masa halogenih jona na 100 g katjonskog polimera.

[0162] Za potrebe ovog određivanja, smatra se da je svaki atom azota nezavisno supstituisan.

[0163] Stepen derivatizacije se izračunava u skladu sa jednačinom u nastavku.

DD = {[(H.I. × 100 × MW) / (100 - %H2O)] / 35,45 } / 3

gde su

DD = stepen derivatizacije

H.I. = grami halogenih jona u 100 g hidratisanog uzorka

MW = molarna masa monomera substitusanog sa jednom alkilamin hidrohloridnom grupom

35.45 = molarna masa hlora

[0164] Dobijeni rezultati su prikazani u Tabeli 8, u nastavku, pri čemu jedinjenja 13-16 nisu u skladu sa ovim pronalaskom.

Tabela 8

[0165] Izučen je uticaj stepena derivatizacije i funkctionalne grupe, u zavisnosti od dva operabilna parametra: (i) tendencije prema agregaciji, koja se mora svesti naminimum; i (ii) kapaciteta naelektrisanja, koji mora biti maksimalan.

Primer 4

Merenje dinamičkog rasipanja svetlosti (DLS)

[0166] Iskorišćeno je ispitivanje dinamičkog rasipanja svetlosti za ispitivanje tendencije ka agregaciji ovih katjonskih polimera.

[0167] Ispitivanje dinamičkog rasipanja svetlosti je obavljeno, kao što se navodi unastavku, na katjonskim polimerima na bazi glikogena Polglumyt™, dobijenog kao što je opisano u Primeru 1, i na respektivnim kompleksima, sa nekom siRNK (Invitrogen kao dobavljač, reference No. 1299001), koji su dobijani sa raznim odnosima siRNK/polimer, iskazanim u masenim procentima.

[0168] Za ispitivanja rasipanja svetlosti, pripremljeni su sledeći rastvori:

- rastvor 1: polazni rastvor siRNK, od 0.1 mg/mL, u PBS, bez Rnaze;

- rastvor 2: polazni rastvor raznih katjonskih polimera, sa koncentracijom 0.2 mg/mL, u PBS, bez Rnaze, filtriran kroz sterilne filtere od 0.22 µm;

- rastvor 3: rastvor PBS, bez Rnaze, filtriran kroz sterilne filtere od 0.22 µm.

[0169] Skraćenica PBS (slani fosfatni pufer, od engleski: Phosphate-Buffered Salin) predstavlja standardni slani fosfatni pufer, sa pH 7.4, koji se sastoji od vodenog rastvora soli, natrijum-hlorida 8 g/L, natrijum-fosfata 1.78 g/L, kalijum-hlorida 0.2 g/L i kalijum-fosfata 0.27 g/L.

[0170] Uzorci, koji su analizirani, dobijeni su mešanjem rastvora 1, 2 i 3, u skladu sa odnosima, datim u Tabeli 9. Ovi uzorci su zatim tretirani, tako što su dva puta mešani tokom 30 s, pa ostavljeni da stoje 30 min. Posle toga, uzorci su analizirani sa instrumentom DLS Zetasizer Nano Malvern, pazeći od toga da se rastvor tretira mešanjem 5 min pre analize.

[0171] Merenja su obavljena korišćenjem helium-neonskog lasera (λ = 632.8 nm), na 25°C i pod uglom rasipanja od 173°. Rezultati su procesuirani korišćenjem softvera Zetasizer.

Tabela 9

[0172] Ovo ispitivanje je omogućilo određivanje sledećih parametara:

1. srednjeg prečnika (Z) katjonskih derivata glikogena Polglumyt™, bez siRNK (ovi rezultati su sabrani u Tabeli 10);

2. aspekt udela nanočestica (rezultati su sabrani u Tabeli 10); i

3. maksimalni udeo masenog procenta siRNK, relativno prema masi polimera, za koji nije opažen fenomen agregacije (rezultati su sabrani u Tabeli 10, gde jedinjenja 13-16 nisu u skladu sa ovim pronalaskom).

Tabela 10

[0173] Kao što se može videti iz Tabele 10, svi ovi derivati imaju srednji prečnik (Z) manji od 100 nm.

[0174] Pogodno je, ali suprotno od DEAE-dekstrana, da katjonski derivati u skladu sa ovim pronalaskom formiraju nanočestice sa srednjim prečnikom (Z) manjim od 70 nm.

(2) Aspekt odnosa

[0175] Aspekt odnosa predstavlja širinu na polovini visine pika distribucije veličine čestica, normalizovanih sa srednjim pečnikom, pa prema tome, opisuje oblik veličine pika distribucije.

[0176] Kao što se može videti, svi katjonski polimeri, u skladu sa ovim pronalaskom, imaju veličinu distribucije sa aspektom odnosa između 0.8 i 1.1, suprotno od DEAE-dekstrana, koji pokazuje veličinu disribucije sa aspektom odnosa jednakim 4.5.

[0177] Ovo ukazuje da, koršćenjem istog sintetskog postupka, katjonski polimer na bazi glikogena, u skladu sa ovim pronalaskom, omogućava da se dobiju nanočestice kontrolisanih veličina, unutar opsega veličine koji je blizak srednjoj vrednosti.

(3) Maksimalni maseni procentni odnos siRNK/polimer, za koji nije opažena agregacija

[0178] Ovi rezultati pokazuju da katjonski polimeri, koji sadrže sve supstituente u skladu sa ovim pronalaskom, formiraju komplekse bez agregata, sve do 50 mas% siRNK, što je funkcija stepena derivatizacije.

[0179] Polimer 18 (DEAE-dekstran) formira komplekse bez agregata samo do koncentracije od 20 mas% siRNK.

Primer 5

Određivanje kapaciteta naelektrisanja

0180] Kapacitet naelektrisanja je određen pomoću gel elektroforeze, za niz derivata koji sadrže jedinku koja se ponavlja, tipa (a) i (b).

[0181] Ovi kompleksi se dobijaju u skladu sa sledećim postupkom.

[0182] Kompleksi između siRNK i raznih derivata polimera, dobijeni su korišćenjem raznih odnosa siRNK/polimer (u mas%)%).

[0183] Rastvori polimera različitih koncentracija, opisani u Tabelama 11 i 12, mešani su u PBS bez Rnaze, filtrirani kroz filter od 0.2 µm, sa rastvorom siRNK (Invitrogen, reference No. 1299001), koncentracijom 0.340 mg/mL, u vodi bez Rnaze. Zatim se ove smeše tretiraju sa 30 s mešanja, pa ostave da stoje 5 min, na sobnoj temperaturi, zatim ponovo tretiraju sa 30 s mešanja, pa posle ostavljanja da stoje oko 30 min, podvrgavaju se gel elektroforezi.

[0184] Ovi gelovi se stvaraju šaržiranjem 10 mL rastvora svakog kompleksa na 4% gel agaroze, koji sadrži 1:200 000 odnos Green Gel Plus™ i boje za nukleinsku kiselinu 20000X, koja se priprema kao smeša MOPS-EDTA-natrijum-acetatni pufer.

[0185] Gelovi agaroze se razvijaju 1 h, na konstantnom naponu od 80 V. Tragovi se dobijaju uz pomoć sistema ImageQuant LAS 4000 (GE Healthcare).

[0186] Dobijeni gelovi su prikazani na Slikama 1 do 8.

[0187] Kompleksi između polimera 3 (DEAE-glikogen) i siRNK, su dobijeni korišćenjem rastvora polimera i siRNK, u količinama koje su date u Tabeli 11, u nastavku. Polimer 3 je šaržiran sa 0.5 do 800 mas% siRNK.

[0188] Gelovi na koje su zasejavani kompleksi između polimera 3 i siRNK, su zatim razvijani elektroforezom i prikazani na Slikama navedenim u Tabeli 11.

Tabela 11

Kao komparativni glikogen korišćen je Polglumyt<TM>(50*)

[0189] Na Slici 1, može se videti da u kolonama polimera 3, kompleksiranog sa siRNK, pri procentima od 0.5 do 8 mas%, nije bila prisutna bela traka, koja odgovara samom siRNK. Odsustvo ove trake pokazuje da je polimer 3 u stanju da potpuno kompleksira siRNK, od 0.5 do 8 mas%, relativno prema masi polimera.

[0190] Na Slici 2, odsustvo trake, koja odgovara siRNK u kolonama polimera 3, kompleksiranog sa siRNK, pokazuje da je polimer 3 u stanju da se potpuno kompleksira sa siRNK, u procentima od 10 do 20 mas%, relativno prema masi polimera. Prisustvo trake, koja odgovara siRNK, u kolonama polimera 50 (nemodifikovani glikogen Polglumyt™) pokazuje da je nemodifikovani glikogen Polglumyt™ u stanju da kompleksira siRNK čak i na procentu jednakom 10 mas%, relativno prema masi polimera.

[0191] Na Slici 3, odsustvo trake koja odgovara siRNK, u kolonama polimera 3, kompleksiranog sa 30% siRNK, pokazuje da je polimer 3 u stanju da kompleksira 30 mas% siRNK, relativno prema ukupnoj masi polimera. Suprotno tome, prisustvo trake, koja odgovara siRNK, u procentima 50 do 800 mas%, pokazuje da polimer 3 nije u stanju da kompleksira 50 mas% siRNK, relativno prema ukupnoj masi polimera.

[0192] Ova ispitivanja su na ovaj način pokazala da je maksimalni kapacitet naelektrisanja polimera 3 jednak 30 mas% siRNK. Suprotno tome, nemodifikovani glikogen Polglumyt™ (polimer 50) nije u stanju da se kompleksira sa siRNK.

[0193] Pored toga, kompleksi polimer-siRNK, su dobijeni korišćenjem sledećih polimera:

- No. 1, 2, 6, 8, 10, 12, 14, 16, koji sadrže jedinku koja se ponavlja (a);

- No. 20, 21, 23, 24, 25, 28, koji sadrže jedinku koja se ponavlja (b);

[0194] Korišćena su dva procenta naelektrisanja siRNK: 5% i 20%, relativno prema masi polimera. Korišćeni rastvori su navedeni u Tabeli 12 u nastavku, gde jedinjenja 14 i 16 nisu u skladu sa ovim pronalaskom.

Tabela 12

[0195] Na Slici 4, prisustvo trake koja odgovara siRNK u kolonama kompleksiranog polimera 1, respektivno, sa 5 % i 20 mas% siRNK, pokazuje da polimer 1 (DEAE-Polgumyt, sa niskim stepenom derivatizacije) nije u stanju da kompleksira siRNK. Polimer 2 je u stanju da kompleksira siRNK, u procentu od 5 mas%, relativno prema ukupnoj masi polimera, a polimer 6 takođe je u stanju da kompleksira siRNK sa procentom 20 mas%, relativno prema ukupnoj masi polimera.

[0196] Na Slici 5, prisustvo trake koja odgovara siRNK u kolonama polimera 10 i 14, kompleksiranog sa 20 mas% siRNK, pokazuje da su ovi polimeri u stanju da se kompleksiraju sa 5 mas% siRNK. Suprotno tome, polimer 15 je u stanju da kompleksira 20 mas% siRNK.

[0197] Na Slici 6, odsustvo trake koja odgovara siRNK, pokazuje da su polimeri 8, 12 i 16 u stanju da kompleksiraju 20 mas% siRNK.

[0198] Na Slici 7, prisustvo trake koja odgovara siRNK, u kolonama polimera 24 i 25, pokazuje da ovi polimeri nisu bili u stanju da se kompleksiraju 5% siRNK. Suprotno tome, polimer 21 je takođe kompleksirao 20% siRNK.

[0199] Na Slici 8, prisustvo trake koja odgovara siRNK, u kolonama polimera 23 i 20, kompleksiranih sa 20% siRNK, pokazuje da ovi polimeri kompleksiraju 5% siRNK. Suprotno tome, polimer 28 kompleksira 20% siRNK.

[0200] Generalno, ova ispitivanja su omogućila da se pokaže da su samo polimeri 1 (DEAE-glikogen, sa najnižim stepenom derivatizacije), 24 i 25 u stanju da kompleksiraju manje od 5 mas% siRNK.

[0201] Svi drugi derivati bili su u stanju da kompleksiraju 20% siRNK, ko i komparativni polimer 18 (DEAEdekstran). Suprotno tome, polimer 50 (nemodifikovani glikogen Polglumyt™) nije u stanju da formira komplekse sa siRNK.

Primer 6

Ispitivanja citotoksičnosti sa katjonskim derivatima glikogena Polglumyt™

[0202] Ispitivanja citotoksičnosti su obavljena na (DEAE)-glikogen (polimeri 1-4), (DMAP)-glikogen (polimeri 5-8), (DMAE)-glikogen (polimeri 9-12), (2-OH-PTMA)-glikogen (polimeri 13-16, nisu iz ovog pronalaska), na nemodifikovanom glikogenu Polglumyt™ (polimer 50), na DEAE-dekstran hidrohloridu (oslobađanje nukleinske kiseline, razgranati polietilenimin (PEI) (Aldrich, reference No.40872-7) (polimer 60).

(a) Ispitivanja katjonskih polimera u skladu sa ovim pronalaskom

• Dobijanje katjonskih polimera

[0203] Katjonski polimeri se rastvore u vodi, pa se odgovarajuće razblaže u medijumu za kultivisanje ćelija, tako da se dobijukoncentracije od 10 do 10<-5>mg/mL, koje se koriste za vrednovanja citotoksičnosti, posle 24, 48 i 72 h, sa dva soja ćelija: MonoMac-6 i HT29.

• MonoMac-6 soj ćelija

[0204] Soj ćelija humanih monocita/makrofaga, MonoMac-6, predusretljivo je donirao Prof. Mantovani (Humanitas, Italy).

[0205] Ove ćelije se drže u inkubatoru na 37°C, sa 5% CO2, u medijumu RPMI 1640, sa dodatkom 10% seruma telećeg fetusa (FCS), 2% L-glutamina, 1% penicilin/streptomicin rastvor, 1% of non-essential aminokiseline, 1% 100 mM natrijum-piruvata i 1% oksalosirćetne kiseline.

[0206] Ove ćelije, koje rastu u suspenziji, održavaju se u kulturi pasažama, koje se obavljaju nedeljno, preko razblaživanja 1:4 kulture ćelije u svežem kompletnom medijumu.

• HT-29 soj ćelija

[0207] Ćelije humanog adenokarcinoma debelog creva HT-29, dobijene iz American Type Culture Collection (ATCC Maryland, USA), održavaju se u medijumu Dulbecco’s Modified Eagles medium (DMEM sa visokim sadržajem glkoze, pH 7.4) sa dodatkom 10% seruma telećeg fetusa (FCS), 2% L-glutamina, 1% rastvora penicilin/streptomicin, 1% ne-esencijalne aminokiseline, 1% 100 mM natrijumpiruvata i 2% 1M rastvora HEPES.

[0208] Ove ćelije, koje rastu adheriranjem, održavaju se u kulturi, obavljanjem pasaža na nedeljnoj bazi, zasejavanjem 300000 ćelija po balonu, pre tretmana sa sa smešom tripsin/EDTA, da se ćelije odvoje iz monosloja.

• Test citotoksičnosti

[0209] Ćelije Mono Mac-6 i HT-29 se zaseju na ploče sa 96-bazenčića (10 000 ćelija/bazenčić), 24 h pre eksperimenta, pa se tokom 24, 48 i 72 h inkubiraju sa katjonskim derivatima raznih koncentracija.

[0210] Pri kraju tretmana sa testiranim jedinjenjima, određuje se vitalnost ćelija kao funkcija stvaranja adenozin trifosfata (ATP), korišćenjem kompleta ATPlite (Perkin-Elmer).

[0211] Ovaj ATPlite test se bazira na stvaranju luminiscencije u reakciji koja sledi. Reakcija ATP, prisutnim u ćelijama, sa luciferazom i dodatkom d-luciferina u bazenčiće, pre očitavanja. Intenzitet nastale luminiscencije direktno je proporcionalan (koncentraciji ATP prisutnog u uzorku, a meri se pomoću luminometra (VICTOR3 Wallac).

[0212] Pre obavljanja merenja luminometrom, u svaki bazenčić se doda 50 µL rastvora od lize (Triton X-1000.5% u 0.2M NaOH) u 100 mL medijuma kulture. Posle 5 min inkubacije na sobnoj temperaturi i uz mešanje sa 700 o/min, u svaki bazenčić se doda 50 µL kompleta ATPlite, pa se posle 5 min mešanja, ova ploča inkubira još 10 min u mraku, pre obavljanja merenja luminiscencije.

[0213] Za svaki derivat, eksperimenti su obavljani u duplikatu.

[0214] Procenat vitalnosti ćelija određivan je razmatranjem srednjih vrednosti luminiscencije za tretirane ćelije, i za netretirane kontrolne ćelije.

[0215] Procenat vitalnosti ćelija (% CV) za svaki derivat, iskazan je kao srednja vrednost procenta, relativno prema kontrolnom uzorku, u skladu sa sledećom jednačinom:

Vitalnost (%) = [(srednji intenzitet luminiscencije tretiranih ćelija) /

(srednji intezitet luminiscencije netretiranih ćelija)] × 100

[0216] Neko jedinjenje se smatra citotoksičnim kada je ovaj procenat vitalnosti manji od 50%.

Tabela 13 - koncentracija katjonskih polimera 0.01 mg/mL

[0217] Rezultati u Tabeli 13 omogućili su da se pokaže da katjonski polimeri u skladu sa ovim pronalaskom nisu citotoksični u koncentraciji od 0.01 mg/mL.

Tabela 14 - koncentracija katjonskih polimera 0.1 mg/mL

[0218] Rezultati u Tabeli 14 su omogućili da se pokaže da katjonski polimeri u skladu sa ovim pronalaskom nisu toksični na koncentraciji 0.1 mg/mL, za razliku od DEAE-dekstran i PEI.

Tabela 15 - koncentracija katjonskih polimera 1.0 mg/mL

[0219] Rezultai u Tabeli 15 su omogućili da se pokaže da katjonskii polimeri u skladu sa ovim pronalaskom, sa izuzetkom polimera 7, nisu citotoksični na koncentraciji od 1 mg/mL, za razliku od DEAE-dekstran i PEI. Derivat 7, pokazalo se da je citotoksičan samo na ćelijsku kuilturu u suspenziji.

Tabela 16 – koncentracija katjonskih polimera 10,0 mg/mL

Tabela 16 - nastavak

[0220] Rezultati u Tabeli 16 omogućili su da se pokaže da katjonski polimeri u skladu sa ovim pronalaskom nisu citotoksični na koncentraciji od 10 mg/mL, za razliku od DEAE-dekstran i PEI.

(b) Ispitivanja fluorescentnih derivata katjonskih polimera u skladu sa ovim pronalaskom

[0221] Ispitivanja citotoksičnosti obavljena su takođe korišćenjem fluorescentnih derivata katjonskih polimera u skladu sa ovim pronalaskom, u svrhu određivanja najveće citotoksične koncentracije pri kojoj ćelije obavljaju absorpciju

[0222] Fluorescentni derivati katjonskih polimera u skladu sa ovim pronalaskom su sintetizovani kao što sledi.

[0223] Rastvori se 500 mg jednog od katjonskih polimera u skladu sa ovim pronalaskom, u odsustvu svetlosti, u 10 mL destilovane vode, u dvogrlom balonu okruglog dna, koji je opremljen magnetskom mešalicom. Dodaju se 2 mL 1M NaOH , pa se ova smeša 1,5 h meša na sobnoj temperaturi. Zatim se rastvori, 36 mg fluorescein izotiocijanata (FITC) u oko 0.3 mL DMSO, pa doda. Ova smeša se preko noći meša na sobnoj temperaturi.

[0224] Sledećeg dana se u reakcioni balon ubaci 20 mL acetona, pa se posle oko 30 min mešanja, ostavi polimer da se staloži. Supernatant se odbaci, a talog se dva puta opere sa oko ut 20 mL acetona.

[0225] Ovaj talog se zatim rastvori u oko 10 mL destilovane vode, pa se dobijeni rastvor podvrgne dijalizi u cevima od regenerisane celuloze (prestanak na 15,000) u odnosu na destilovanu vodu, u odsustvu svetlosti. Po završetku dijalize, ovaj rastvor se profiltrira kroz filter od 0,45 µm, pa osušu smrzavanjem.

[0226] Ova ispitivanja su obavljena na adherentnim HT29 ćelijama, dobijenim kao što je ranije opisano.

[0227] Rezultati su sakupljeni u Tabeli 17 u nastavku, gde su fluorscentni derivati katjonskih polimera u skladu sa ovim pronalaskom označeni na isti način kao u tabeli 2, sa dodatkom "f".

Tabela 17

[0228] Iz ovih rezultata se zapaže da je najveća koncentracija, pri kojoj svi fluoresentni derivati katjonskih polimera, u skladu sa ovim pronalaskom, tokom perioda od 24 h nisu citotoksični, jednaka 1 mg/mL.

Primer 7

Ispitivanja ćelijske absorpcije

[0229] Ispitivanja ćelijske absorpcije su obavljena u 2, 6 i 24 h, korišćenjem fluorescentnih derivata katjonskih polimera iz ovog pronalaska (1f-12f), polimeria 13-16 koji nisu iz ovog pronalaska (13f-16f), i DEAE-dekstran hidrohlorida, sa koncentracijom 1 mg/mL, tj. najveća koncentracijakoja je analizirana u ispitivanju citotoksičnsoti, pri tome se pokazalo da fluorescentni derivativi 1f-16f nisu citotoksični tokom perioda od 24 h.

[0230] Ispitivanja su obavljena krišćenjem HT29 adherentnih ćelija, tretiranih u skladu a sledećom procedurom.

[0231] Dan pe eksperimenta ććelije HT-29, se zaseju, sa gustinom od 20,000 ćelija/bazenčić, pa se tokm 2, 6 i 24 h inkubiraju sa respektivnim florescentnim derivatima, koncentracije 1 mg/mL. Na kraju svakog inkubacionog perioda, iz bazenčića se ukloni medijum, a ćelije se tri puta operu sa standardnim slanim fisfatnim puferom (PBS), pH 7.4.

[0232] Zatim se ćelije tretiraju sa 200 µL rastvora od lize (Triton X-1000.5% u 0.2M NaOH), a fluorescencija se meri fluorimetrijom (λex 485 nm; λem 535 nm).

[0233] Za svako jedinjenje i svako vreme, izračunata je srednja fluorescencija za dve replike, a njihove vrednosti su date u Tabeli 18.

Tabela 18

[0234] Eferktivni iznos ćelijske absorpcije za fluorescentne derivate izračunavan je preko konstruisanja kalibracione krive za svaki fluorescentni derivat, u rastvaraču za lizu ćelija (Triton X-100 na 0.5% u 0.2M NaOH).

[0235] Iz kalibracionih krivih i opaženih intenziteta fluorescencije izračunavana je ćelijska absorpcija, kao što je opisano u Tabeli 19.

Tabela 19

[0236] Dobijeni rezultati pokazuju stepen ćelijske absorpcije katjonskih polimera u skladu sa ovim pronalaskom, relativno prema DEAE-dekstranu.

[0237] Pored toga, zapaženo je da stepen derivatizacije ima uticaj na ćelijsku absorpciju, koji je direktno proporcionalan.

Primer 8

Evaluacija kapaciteta pufera

[0238] Evaluiran je kapacitet pufera da se proveri da li bi katjonski polimeri u skladu sa ovim pronalaskom mogli imati karakteristike koje bi mogle takođe indukovati efekat "proton-sunđera", koji se smatra neophodnim za omogućavanje oslobađanja kompleksa polimer-nukleinska kiselina od endozoma, posle ćelijske absorpcije.

[0239] Katjonski polimeri u skladu sa ovim pronalaskom (DEAE-glikogen) i DEAE-dekstran su titrisani sa NaOH, posle transformacije u hidrohlorid (kao što je opisano u Primeru 2), a ova titracija je praćena preko promene pH.

[0240] Rastvori se 100 mg polimer hidrohlorida u 100 mL destilovane vode, pa se ovaj rastvor meša preko noći na sobnoj temperaturi. Sledećg dana, ovaj rastvor se titriše sa 0.01 M NaOH. Dodavanje titranta je praćeno sa dozimetrom, a titracija je praćena sa pH-metrom.

[0241] Ova ispitivanja titracije, koja su obavljana na katjonskim derivatima u skladu sa ovim pronalaskom, su omogućila da se u nastavku identiifikuje distribucija pKa oko fiziološkog pH, unutar opsega između oko 4.5-8, zahvaljujući kojima katjonski polimeri iz ovog pronalaska imaju visok kapacitet pufera.

[0242] Vrednosti pKa u okolini fiziološkog pH, korisni su za davanje katjonskim polimerima iz ovog pronalaska pozitivnog naelektrisanja, neophodnog za kompleksiranje nukleinske kiseline.

[0243] Vrednosti pKa, u nastavku, na fiziološkom pH, su korisne za obezbeđivanje oslobađanja ovih kompleksa sa endozoma u citoplazmu (preko efekta "protonskog sunđera").

[0244] Slika 9 prikazuje titracione krive za katjonske polimere 2, 3 i 4 (DEAE-glikogen, u skladu sa ovim pronalaskom), za komparativne svrhe. Treba zapaziti da unutar iste klase derivata puferski kapacitet raste isto kao o što raste i stepen derivatizacije.

[0245] Pored toga, opaženo je da polimer 4 (DEAE-glikogen) i proizvod 18 (DEAE-dekstran) imaju sličan stepen derivatizacije i uporedan kapacitet pufera, kao što je pokazano na Slici 10.

Primer 9

Reološka merenja

[0246] Reološka ispitivanja su obavljena na katjonskim derivativima 1-12 u skladu sa ovim pronalaskom (DEAE-, DMAP-, DMAE-glikogen), na 13-16, koji nisu iz ovog pronalaska (2-OH-PTMA-glikogen) i na DEAE-dekstran hidrohloridu, sa koncentracijom 1%, u PBS.

[0247] Ova merenja su obavljena korišćenjem rotacionog reometra Bohlin Gemini 150 i softvera Bohlin R640.5.32, opremljenog sa geometrijom konične ploče 2°/55 mm, gde termostatski režim na 25°C održava instrument Peltier Bohlin, koji radi u režimu "kontrolisanog stresa", sa opsegom stresa na smicanje od 1-5 Pa.

[0248] Svi analizirani uzorci su pokazli vrlo nisku vrednost viskoznosti, u opsegu reda veličina mPa·s. Ova karakteristika je omogućila takođe upotrebu katjonskih derivata u skladu sa ovim pronalaskom, pomoću injekcija.

[0249] Za primer, u Tabeli 20 date su vrednosti viskoznosti raznih derivata, sa jedinstvenom vrednosti stresa (2.5 Pa).

Tabela 20

Primer 10

Ispitivanja citotoksičnosti na katjonskim derivatima glikogena kompleksiranog sa anjonskim molekulima

[0250] Ćelije HT-29 se zaseju dan pre eksperimenta, sa gustinom od 10,000 ćelija/bazenčić, u zapremini od 100 µL medijuma DMEM, koji sadrži 10% seruma.

[0251] Na dan početka eksperimenta, iz bazenčića se ukloni medijum, pa se doda 150 µL medijuma DMEM, koji sadrži 2.5 % seruma. Formira se 50 µL kompleksa od nekog katjonskog polimera u skladu sa ovim pronalaskom, pa se doda fluorescentna siRNK. Kompleksi, formirani od nekog katjonskog polimera u skladu sa ovim pronalaskom i fluorescentne siRNK, su dobijeni u skladu sa sledećom procedurom.

[0252] Pripremljena su četiri rastvora, svaki sadrži 6.283 mg katjonskpg polimera 3, 7, 11 i 15, u 40 mL PBS, bez Rnaze. U 142.86 µL svakog od ovih rastvora doda se 6.6 µL rastvora siRNK, u PBS bez Rnaze (koncentracija 20 µM) a, posle nekoliko minuta svaka se razredi sa 350.54 µL PBS bez Rnaze. Konačna koncentracija siRNK u ovom rastvoru je 264 nM, što je ekvivalentno 10 mas% siRNK, relativno prema masi polimera.

[0253] Ovako dobijeni rastvor se meša oko 30 s, inkubira 10 min na sobnoj temperaturi, ponovo meša 30 s, pa se ostavi da stoji 5 min. Pred obavljanje eksperimenta ovaj rastvor se ponovo meša 30 s.

[0254] Rastvori (50 µL) katjonskih polimera 3, 7, 11 i 15, u 40 mL PBS, bez Rnaze, u koje nije dodat siRNK, koriste se kao prvo poređenje.

[0255] Kompleks između siRNK i transficiranog reagensa Lipofectamin® 2000, dobijen u skladu sa procedurom opisanom u uputstvu proizvođača, Lifetechnologies™ za transficiranje siRNK, sadrži istu količinu siRNK koja je korišćena u kompleksima sa polimerima, koristi se kao drugo poređenje.

[0256] Reagens za transficiranje Lipofectamin® 2000, u koji nije dodata siRNK, koristi se kao treće poređenje.

[0257] Kompleksi i svi materijali za poređenje, koji su pripremljeni kao što je opisano gore, dovode se u kontakt sa ćelijama.

[0258] Ove ćelije se inkubiraju 4 h i 24 h, na 37°C, posle čega se supernatant ukloni, pa se doda 100 µL medijuma, koji sadrži 2.5% seruma.

[0259] Na kraju tretmana sa testiranim jedinjenjima, određuje se vitalnost ćelija kao funkcija proizvodnje adenozin triifosfata t (ATP), upotrebom kompleta ATPlite (Perkin-Elmer), kao što je opisano, u Primeru 6 gore.

[0260] Rezultati, određeni kao što je opisano u Primeru 6, iskazani su u Tabeli 21, u nastavku, kao procenat živih ćelija.

Tabela 21

[0261] Dobijeni rezulati su pokazali da kompleksi, dobijeni između katjonskih polimera u skladu sa ovim pronalaskom i siRNK, nisu citotoksični.

[0262] Kao posledica toga, katjonski polimeri 3, 7, 11 i 15 su upotrebljeni u sledećem ispitivanju ćelijske absorpciije.

Primer 11

Ispitivanje ćelijske absorpcije sa katjonskim derivatima glikogena kompleksiranog sa fluorescentnim anjonskim molekulima

[0263] Ova ispitivanja su obavljena na način koji je sličan opisanom u Primeru 7 gore, korišćenjem adherentnih ćelija HT29.

[0264] Ćelije HT-29 se zaseju dan per eksperimenta, sa gustinom od 20,000 ćelija/bazenčić, u zapremini od 100 µL medijuma DMEM, koji sadrži 10% seruma.

[0265] Na dan eksperimenta ukloni se medijum iz bazenčića, pa se doda, 150 µL medijuma DMEM, koji sadrži 2.5 % seruma. Zatim se doda 50 µL kompleksa, formiranog iz katjonskog polimera u skladu sa ovim pronalaskom i fluorescentne siRNK.

[0266] Kompleksi, formirani iz nekog katjonskog polimera u skladu sa ovim pronalaskom i fluorescentne siRNK, dobijeni su u skladu sa sledećom procedurom.

[0267] Pripreme se četiri rastvora, svaki sadrži 6.2832 mg katjonskog polimera 3, 7, 11 i 15, u 40 mL PBS bez Rnaze. U 142.86 µL svakog od ovih rastvora doda se 6.6 µL rastvora siRNK, u PBS bez Rnaze (koncentracije 20 µM), a posle nekoliko minuta, svaki se razblaži sa 350.54 µL PBS bez RNaze. Ova siRNK se obeleži sa fluoroscentnim jedinjenjem Alexa-488. Konačna koncentracija siRNK je 264 nM, što je ekvivalentno 10 mas% siRNK, relativno prema masi polimera.

[0268] Ovako dobijeni rastvori se mešaju oko 30 s, inkubiraju na sobnoj temperaturi 10 min, mešaju još 30 s, pa se ostave da stoje još 5 min. Pre obavljanja eksperimenta ovi rastvori se ponovo mešaju još 30 s.

[0269] Kompleks između siRNK i trensficiranog reagensa Lipofectamin® 2000, dobijenog u skladu sa procedurom opisanom u uputstvu proizvođača Lifetechnologies™, za transficiranje siRNK, koji sadrži istu količinu siRNK koja je upotrebljena u kompleksima sa polimerima, koji su korišćeni kao prvo poređenje.

[0270] Izmerena fluorescencija samog siRNK, iskorošćena je kao naredno poređenje.

[0271] Kompleksi i svi komparativni materijali, dobijeni kao što je opisano gore, dovode se u kontakt sa ćelijama.

[0272] Ćelije se inkubiraju 4 h na 37°C, pa se posle odbacivanja supernatanta, ćelije dva puta operu sa 200 µL PBS.

[0273] Zatim se ove ćelije 5 min tretiraju sa 200 µL rastvora lize (Triton X-1000.5% u 0.2M NaOH), na sobnoj temperaturi, uz mešanje.

[0274] Fluorescencija koju emituje siRNK, obeležena sa Alexa-488, meri se pomoću fluorimetra (λex.485 nm; λem.535 nm), posle stvaranja kompleksa između polimera i siRNK, održavanjem kontakta sa ćelijama tokom 4 h.

[0275] Za svaki polimer, eksperiment je obavljen u triplikatu, a intenzitet srednje fluorescencije je zatim izračunat. Od ove vredosti se oduzme srednja vrednost intenziteta fluorescencije, izračunata za sam medijum kulture, koji je bio jednak 1366, dajući tako konačni intenzitet fluorescencije.

[0276] Ista procedura se sledi za prvo poređenje (Lipofectamin® 2000 siRNK), za koju je vrednost srednjeg intenziteta fluorescencije, samo za medijum kulture, bila jednaka 1328.

[0277] Rezultati su sabrani u Tabeli 22.

Tabela 22

[0278] Dobijeni rezultati su pokazali da su katjonski polimeri u skladu sa ovim pronalaskom u stanju da indukuju absorpciju siRNK u ćelijsku membranu. Pored toga, katjonski polimeri u skladu sa ovim pronalaskom, čine mogućim da se angažuje veća količina siRNK, nego kompleksa, koji jekorišćen za poređenje, a koji je sadržao Lipofectamin® 2000.

Claims (15)

1. PATENTNI ZAHTEVI 1. Katjonski polimer na bazi glikogena, što sadrži najmanje jednu jedinku koja se ponavlja, a koja se bira uz grupe koju čine: (a)

   - u kojoj grupe R, koje mogu biti identične ili različite, predstavljaju atom vodonika, neka karboksimetil grupa, opciono u obliku soli sa nekom farmaceutski prihvatljivom organskom ili neorganskom bazom, ili neka grupa koja sadrži azot, koja se bira između NH2-(C1-C6)alkil, [N,N-di(C1-C6)alkilamino]-(C1-C6)alkil, NH2-{[(C1-C6)alkil-di(C1-C6)alkilamonio]}-(C1-C6)alkil, {[N,N-di(C1-C6)alkilamino]-(C1-C6)alkil-di(C1-C6)alkilamonio}-(C1-C6)alkil, NH2-[(C1-C6)alkilamino]-(C1-C6)alkil, {[N,N-di(C1-C6)alkilamino]-(C1-C6)alkilamino}-(C1-C6)alkil, [tri(C1-C6)alkilamonio]-(C1-C6)alkil, azociklil-(C1-C6)alkil, u kojima su lanci (C1-C6)alkil, koji mogu biti identični ili različiti, opciono supstituisani sa jednom ili više hidroksilnih grupa, a n je ceo broj veći ili jednak 1; i (b)

   u kojoj R1 se bira između atoma vodonika, neke karboksimetil grupe, opciono u obliku soli sa nekom farmaceutski prihvatljivom organskom ili neorganskom bazom, ili neke grupe koja sadrži azot, a koja se bira između: NH2-(C1-C6)alkil, [N,N-di(C1-C6)-alkilamino]-(C1-C6)alkil, NH2-[(C1-C6)alkil-di(C1-C6)alkilamonio]-(C1-C6)-alkil, {[N,N-di(C1-C6)alkilamino]-(C1-C6)alkil-di(C1-C6)alkilamonio}-(C1-C6)alkil, NH2-[(C1-C6)alkilamino]-(C1-C6)alkil, {[N,N-di(C1-C6)alkilamino]-(C1-C6)alkilamino}-(C1-C6)alkil, [tri(C1-C6)alkilamonio]-(C1-C6)-alkil, u kojima su lanci (C1-C6)alkil, koji mogu biti identični ili različiti, opciono supstituisani sa jednom ili više hidroksilnih grupa; X1 i X2, koji mogu biti identični ili različiti, predstavlja neka grupa -OH ili neka grupa koja sadrži azot -NHR2, u kojoj se R2 bira između: atoma vodonika, (C1-C6)alkil, H-[NH-(C1-C6)alkil]p-, gde je p ceo broj veći ili jednak 1, a grupe (C1-C4)alkil mogu biti identične ili različite; a m je ceo broj veći ili jednak 1; pod uslovom da najmanje jednu grupu, između R, R1, X1 i X2, predstavlja neka grupa koja sadrži azot, kao što je definisana, za svaku od R, R1, X1 i X2, respektivno, i pod uslovom da se pomenuti katjonski polimer na bazi glikogena razlikuje od proizvoda dobijenog reakcijom glikogena sa N-(3-hloro-2-hidroksipropil)-trimetil amonijum-hloridom.
2. 2. Katjonski polimer na bazi glikogena prema Zahtevu 1, što pomenute grupe R, koje mogu biti identične ili različite, predstavljaju atom vodonika, neka karboksimetil grupa, opciono u obliku soli sa nekom farmaceutski prihvatljivom organskom ili neorganskom bazom, ili neka grupa koja sadrži azot, a koja se bira između: [N,N-di(C1-C3)alkilamino]-(C1-C3)alkil, {[N,N-di(C1-C3)alkilamino]-(C1-C3)alkil-di(C1-C3)alkilamonio}-(C1-C3)alkil, {[N,N-di(C1-C3)alkilamino]-(C1-C3)alkilamino}-(C1-C3)alkil, [tri(C1-C3)alkilamonio]-(C1-C3)alkil, azociklil-(C1-C3)alkil, u kojima su lanci (C1-C3)alkil, koji mogu biti identični ili različiti, opciono supstituisani sa nekom hidroksilnom grupom.
3. 3. Katjonski polimer na bazi glikogena, prema Zahtevu 2, što pomenute grupe R, koje mogu biti identične ili različite, predstavljaju atom vodonika, neka karboksimetil grupa, opciono u obliku soli sa nekom farmaceutski prihvatljivom organskom ili neorganskom bazom, ili neka grupa koja sadrži azot, a koja se bira između: N,N-dimetilamino-etil, N,N-dimetilaminopropil, N,N-dietilamino-etil, [(N,N-dimetilaminoetil)dimetilamonio]etil, [(N,N-dimetilamino-propil)-dimetilamonio]propil, [(N,N-dietilaminoetil)dietil-amonio]-etil, [trimetilamonio]-2-hidroksipropil, piperidil-N-etil ili morfolinil-N-etil.
4. 4. Katjonski polimer na bazi glikogena, prema bilo kom od prethodnih Zahteva, što R1 predstavlja atom vodonika, neka karboksimetil grupa, opciono u obliku soli sa nekom farmaceutski prihvatljivom organskom ili neorganskom bazom, ili neka grupa koja sadrži azot, a koja se bira između: [N,N-di(C1-C3)alkilamino]-(C1-C3)alkil], {[N,N-di(C1-C3)alkilamino]-(C1-C3)alkil-di(C1-C3)alkilamonio}-(C1-C3)alkil, {[N,N-di(C1-C3)alkil-amino]-(C1-C3)alkilamino}-(C1-C3)alkil ili [tri(C1-C3)alkilamonio]-(C1-C3)alkil, u kojima su lanci (C1-C3)alkil, koji mogu biti identični ili različiti, opciono supstituisani sa nekom hidroksilnom grupom.
5. 5. Katjonski polimer na bazi glikogena, prema Zahtevu 4, što R1 predstavlja atom vodonika ili neka karboksimetil grupa.
6. 6. Katjonski polimer na bazi glikogena, prema bilo kom od prethodnih Zahteva, što X1 i X2, koji mogu biti identični ili različiti, predstavlja neka grupa koja sadrži azot -NHR2, u kojoj R2 predstavlja atom vodonika ili H-[NH-(C1-C4)alkil]p-, gde je p ceo broj, veći ili jednak 1, a grupe (C1-C4)alkil mogu biti identične ili različite.
7. 7. Katjonski polimer na bazi glikogena prema Zahtevu 6, što pomenutu grupu H-[NH-(C1-C4)alkil]p- predstavlja neki polietilenimin, sa molekulskom težinom od 50 do 3,000 daltona, spermin (H2N(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NH2), ili spermidin (H2N(CH2)4NH(CH2)4NH2).
8. 8. Katjonski polimer na bazi glikogena prema bilo kom od prethodnih Zahteva, što pomenuta jedinka koja se ponavlja, (a) i (b), sadrži: - najmanje jednu grupu koja sadrži azot, koja može da se jonizuje na fiziološkom pH, a koja se bira uz grupe koju čine: NH2-(C1-C6)alkil, [N,N-di(C1-C6)alkilamino]-(C1-C6)alkil, NH2-(C1-C6)alkilamino}-(C1-C6)alkil, {[N,N-di(C1-C6)alkilamino]-(C1-C6)alkilamino}-(C1-C6)alkil i azociklil-(C1-C6)alkil; i - najmanje jednu grupu koja sadrži azot, koja može da se jonizuje na nekom pH, ispod fiziološkog pH, a koja se bira uz grupe koju čine: NH2-{[(C1-C3)alkil]-di(C1-C6)alkilamonio}-(C1-C6)alkil i {[N,N-di(C1-C3)alkilamino]-(C1-C6)alkil-di(C1-C6)alkilamonio}-(C1-C6)alkil.
9. 9. Kompleks između nekog katjonskog polimera na bazi glikogena, prema bilo kom od Zahteva 1 do 8, i nekog anjonskog jedinjenja, što se pomenuto anjonsko jedinjenje bira iz grupe koju čine neki aktivni sastojak i neka nukleinska kiselina.
10. 10. Kompleks prema Zahtevu 9, što pomenuti kompleks sadrži količinu između 5 mas% i 60 mas% pomenutog anjonskog jedinjenja, relativno prema masi pomenutog katjonskog polimera na bazi glikogena.
11. 11. Kompleks prema Zahtevu 10, što pomenuti kompleks sadrži količinu između 10 mas% i 50 mas% pomenutog anjonskog jedinjenja, relativno prema masi pomenutog katjonskog polimera na bazi glikogena.
12. 12. Farmaceutska kompozicija, što sadrži (A), neki kompleks između (1), nekog katjonskog polimera na bazi glikogena, koji sadrži najmanje jednu jedinku koja se ponavlja, a koja se bira uz grupe koju čine: (a)

    u kojoj grupe R, koje mogu biti identične ili različite, predstavlja atom vodonika, neka karboksimetil grupa, opciono u obliku soli sa nekom farmaceutski prihvatljivom organskom ili neorganskom bazom, ili neka grupa koja sadrži azot, a koja se bira između NH2-(C1-C6)alkil, [N,N-di(C1-C6)alkilamino]-(C1-C6)alkil, NH2-{[(C1-C6)alkil-di(C1-C6)alkilamonio]}-(C1-C6)alkil, {[N,N-di(C1-C6)alkilamino]-(C1-C6)alkil-di(C1-C6)alkil-amonio}-(C1-C6)alkil, NH2-[(C1-C6)alkilamino]-(C1-C6)alkil, {[N,N-di-(C1-C6)alkilamino]-(C1-C6)alkilamino}-(C1-C6)alkil, [tri(C1C6)alkil-amonio]-(C1-C6)alkil, azociklil-(C1-C6)alkil, u kojoj su lanci (C1-C6)alkil, koji mogu biti identični ili različiti, opciono supstituisani sa jednom ili više hidroksilnih grupa, a n je ceo broj veći ili jednak 1; i (b)

    u kojoj R1 se bira između atoma vodonika, neke karboksimetil grupe, opciono u obliku soli sa nekom farmaceutski prihvatljivom organskom ili neorganskom bazom, ili neke grupe koja sadrži azot, a koja se bira između: NH2-(C1-C6)alkil, [N,N-di(C1-C6)alkilamino]-(C1-C6)alkil, NH2-[(C1-C6)alkil-di(C1-C6)alkilamonio]-(C1-C6)alkil, {[N,N-di(C1-C6)alkilamino]-(C1-C6)alkil-di(C1-C6)alkilamonio}-(C1-C6)alkil, NH2-[(C1-C6)alkilamino]-(C1-C6)alkil, {[N,N-di(C1-C6)alkilamino]-(C1-C6)alkilaminol-(C1-C6)alkil, [tri(C1-C6)alkilamonio]-(C1-C6)-alkil, u i kojima su lanci (C1-C6)alkil, koji mogu biti identični ili različiti, opciono substituisani sa jednom ili više hidroksilnih grupa; X1 i X2, koji mogu biti identični ili različiti, predstavlja neka grupa -OH ili neka grupa -NHR2, koja sadrži azot, u kojoj se R2 bira između: atoma vodonika, (C1-C6)alkil, H-[NH-(C1-C6)alkil]p-, gde je p ceo broj veći ili jednak 1, i grupe (C1-C4)alkil, koje mogu biti identične ili različite; a m je ceo broj veći ili jednak 1; pod uslovom da je najmanje jednu od R, R1, X1 i X2, čini neka grupa koja sadrži azot, kao što je definisano za svaku od R, R1, X1 i X2, respektivno, i (2) neko anjonsko jedinjenje, pri čemu se pomenuto anjonsko jedinjenje bira iz grupe koju čine neki aktivni sastojak i neka nukleinska kiselina; i neki (B), najmanje jedan farmaceutski prihvatljiv ekscipijent.
13. 13. Farmaceutska kompozicija prema Zahtevu 12, što je pomenuto anjonsko jedinjenje neka nukleinska kiselina.
14. 14. Farmaceutska kompozicija prema bilo kojim prethodnim zahtevima 12 i 13, za upotrebu u obliku injekcija.
15. 15. Kompleks između (1), nekog katjonskog polimera na bazi glikogena, koji sadrži najmanje jednu jedinku koja se ponavlja, a koja se bira iz grupe koju čine: (a)

    u kojoj grupe R, koje mogu biti identične ili različite, predstavlja atom vodonika, neka karboksimetil grupa, opciono u obliku soli sa nekom farmaceutski prihvatljivom organskom ili neorganskom bazom, ili neka grupa koja sadrži azot, a koja se bira između NH2-(C1-C6)alkil, [N,N-di(C1-C6)alkilamino]-(C1-C6)alkil, NH2-{[(C1-C6)alkil-di(C1-C6)alkilamonio]}-(C1-C6)alkil, {[N,N-di(C1-C6)alkilamino]-(C1-C6)alkil-di(C1-C6)alkil-amonio}-(C1-C6)alkil, NH2-[(C1-C6)alkilamino]-(C1-C6)alkil, {[N,N-di-(C1-C6)alkilamino]-(C1-C6)alkilamino}-(C1-C6)alkil, [tri(C1-C6)alkil-amonio]-(C1-C6)alkil, azociklil-(C1-C6)alkil, u kojima su lanci (C1-C6)alkil, koji mogu biti identični ili različiti, opciono substituisani sa jednom ili više hidroksilnih grupa, a n je ceo broj veći ili jednak 1; i (b)

    u kojoj se R1 bira između atoma vodonika, neke karboksimetil grupe, opciono u obliku soli sa nekom farmaceutski prihvatljivom organskom ili neorganskom bazom, ili neke grupe koja sadrži azot, a koja se bira između: NH2-(C1-C6)alkil, [N,N-di(C1-C6)alkilamino]-(C1-C6)alkil, NH2-[(C1-C6)alkil-di(C1-C6)alkilamonio]-(C1-C6)alkil, {[N,N-di(C1-C6)alkilamino]-(C1-C6)alkil-di(C1-C6)alkilamonio}-(C1-C6)alkil, NH2-[(C1-C6)alkilamino]-(C1-C6)alkil, {[N,N-di(C1-C6)alkilamino]-(C1-C6)alkilaminol-(C1-C6)alkil, [tri(C1-C6)alkilamonio]-(C1-C6)-alkil, u kojima su lanci (C1-C6)alkil, koji mogu biti identični ili različiti, opciono substituisani sa jednom ili više hidroksilnih grupa; X1 i X2, koji mogu biti identični ili različiti, predstavlja neka grupa -OH ili neka grupa koja sadrži azot -NHR2, u kojoj se R2 bira između: atoma vodonika, (C1-C6)alkil, H-[NH-(C1-C6)alkil]p-, gde je p ceo broj, veći ili jednak 1, grupe (C1-C4)alkil, koje mogu biti identične ili različite; a m je ceo broj veći ili jednak 1; pod uslovom da najmanje jedna od grupa R, R1, X1 i X2 bude neka grupa koja sadrži azot, kao što je definisano za svaku od R, R1, X1 i X2, respektivno, i (2), nekog anjonskog jedinjenja, pri čemu se pomenuto anjonsko jedinjenje bira iz grupe koju čine neki aktivni sastojak i neka nukleinska kiselina, za upotrebu oslobađanja ili transficiranja agensa pomenutog anjonskog jedinjenja.