RS58794B1 - Formulacija rnk za imunoterapiju - Google Patents

Description

Opis

OBLAST TEHNIKE PRONALASKA

[0001] Predmetni pronalazak je iz oblasti imunoterapije, naročito imunoterapije tumora. Predmetni pronalazak se odnosi na obezbeđivanje farmaceutskih formulacija za isporuku RNK sa visokom selektivnošću do antigen-prikazujućih ćelija kao što su dendritske ćelije (DC) u slezini posle sistemske primene. Naročito, formulacije koje su ovde opisane omogućavaju indukciju imunog odgovora posle sistemske primene antigen-kodirajuće RNK.

OSNOVA PRONALASKA

[0002] Nukleinske kiseline kao što su DNK, siRNK ili RNK su od interesa za različite terapeutske intervencije kod pacijenata. Relativno nov imunološki pristup u terapiji tumora je zasnovan na ekspresiji antigena tumora od strane kodirajuće RNK u antigen-prikazujućim ćelijama (APCs) u cilju indukcije T-ćelijskog odgovora na tumor (Weide, B. et al. (2008) Journal of Immunotherapy 31(2): 180-188; Weide, B. et al. (2009) Journal of Immunotherapy 32(5): 498-507; Kreiter, S. et al. (2010) Kancer Res 70(22): 9031-9040; Kuhn, A. N. et al. (2010) Gene Ther 17(8): 961-971). Ciljne ćelije za takvu intervenciju su dendritske ćelije (DC) koje se nalaze, na primer, u limfnim čvorovima (LNs) ili u slezini.

[0003] U cilju obezbeđivanja dovoljnog unosa RNK od strane DC, lokalna primena RNK na limfne čvorove je dokazana kao uspešna. Međutim, takva lokalna primena zahteva specifične veštine kod lekara. Prema tome, postoji potreba za formulacijama RNK koje se mogu primenjivati sistemski, na primer intravenski (i.v.), subkutano (s.c.), intradermalno (i.d.) ili putem inhalacije. Iz literature su poznati različiti pristupi za sistemsku primenu nukleinskih kiselina. U nevirusnom genskom transferu, katjonski lipozomi se koriste za indukciju DNK/RNK kondenzacije i za olakšanje ćelijskog unosa. Katjonski lipozomi se obično sastoje od katjonskog lipida, kao što je DOTAP, i jednog ili više pomoćnih lipida, kao što je DOPE. Takozvani ’lipopleksi’ mogu biti formirani od katjonskih (pozitivno naelektrisanih) lipozoma i anjonske (negativno naelektrisane) nukleinske kiseline. U najjednostavnijem slučaju, lipopleksi se spontano formiraju mešanjem nukleinske kiseline sa lipozomima sa određenim protokolom mešanja, međutim moguće je koristiti različite druge protokole. Elektrostatičke interakcije između pozitivno naelektrisanih lipozoma i negativno naelektrisane nukleinske kiseline su pokretačka sila za formiranje lipopleksa. Pored kompozicije lipida, odnos naelektrisanja između katjonskih i anjonskih grupa ima ključnu ulogu za efikasnu kondenzaciju i transfekciju. Generalno, višak pozitivnog naelektrisanja lipopleksa smatra se neophodnim za efikasnu transfekciju (Templeton, N. S. et al. (1997) Nature Biotechnology 15(7): 647-652; Zhdanov, R. I. et al. (2002) Bioelectrochemistry 58(1): 53-64; Templeton, N. S. (2003) Current Medicinal Chemistry 10(14): 1279-1287). Većina prirodnih membrana su negativno naelektrisane, i prema tome privlačna elektrostatička interakcija između pozitivno naelektrisanih lipopleksa i negativno naleketrisane biomembrane može imati ulogu u vezivanju ćelija i unosu lipopleksa. Tipični opsezi od /- odnosa koji se smatraju optimalnim za transfekciju su između 2 i 4. Sa manjim viškom pozitivnog naelektrisanja, efikasnost transfekcije drastično ide naniže ka virtuelnoj nuli. Nažalost, za pozitivno naelektrisane lipozome i lipoplekse objavljena je povećana toksičnost, koja može biti problem za primenu takvih preparata kao farmaceutskih proizvoda.

[0004] US 2011/0311584 se odnosi na snabdevanje RNK ćelijama za vakcinaciju ili imunostimulaciju, naročito RNK kodirajućim antigenima povezanim sa infektivnim bolestima ili kancerom. Generalno je navedeno da RNK može biti isporučena preko lipozoma koji generalno obuhvataju neutralno ili negativno naelektrisane fosfolipide.

[0005] Martinon F. et al., 1993, Eur. J. Immunol. 23, 1719-1722 opisuju iRNK obuhvaćenu u lipozome koja je sposobna da indukuje virus-specifične citotoksične T limfocite.

[0006] WO 2011/005799 se odnosi na auto-replicirajući molekul RNK obuhvaćen u pozitivno naelektrisani lipozom koji može biti isporučen u subjekta npr. za gensku terapiju ili vakcinaciju.

[0007] US 5,580,859 se odnosi na molekule DNK i RNK koji se mogu primenjivati zajedno sa pozitivno naelektrisaim lipozomom.

[0008] WO 2012/006378 se odnosi na RNK koja kodira imunogen isporučen u lipozom za svrhe imunizacije.

[0009] WO 2013/113502 A1 se odnosi na komplekse koji sadrže negativno naelektrisane nukleinske kiseline za imunostimulaciju.

[0010] WO 2010/037539 A1 se odnosi na kompozicije koje sadrže (i)RNK u kompleksu i golu iRNK za imunostimulaciju.

[0011] Dokazano je da gore opisani lipopleksi omogućavaju transfekciju u različitim organima. Detaljna raspodela ekspresije u organu zavisi od formulacije i parametara primene (sastav lipida, veličina, put primene) na složeni način. Do sada, selektivna ekspresija u datom ciljnom organu ili ćelijskog grupi, izbegavajući ekspresiju u organima koji nisu ciljni, ne bi se mogla realizovati dovoljno. Upotrebom DNK ili RNK luciferaze kao reportera, na primer, objavljena je transfekcija u plućima, jetri, slezini, bubrezima i srcu. Izbegavanje ciljnog delovanja na pluća i jetru dokazano je kao naročito teško zbog toga što, u mnogim slučajevima, predominantno je ciljno delovanje na pluća i jetru. Pluća imaju veoma veliku površinu i to je prvi organ koji i.v. injektirana jedinjenja prolaze posle primene. Jetra je tipični ciljni organ za lipozome i formulacije sa lipofilnim jedinjenjima kao što su lipidi prisutni u lipopleksima.

[0012] Za imunoterapiju na bazi RNK, ciljno delovanje na pluća ili jetru može biti štetno, zbog rizika od imunog odgovora protiv ovih organa. Prema tome, za takvu terapiju, potrebna je formulacija sa visokom selektivnošću samo za DC, kao što je u slezini. Pretpostavljeno je da određeni ligandi poboljšavaju selektivnost ciljnog delovanja. Na primer, lipozomi koji sadrže manozom funkcionalizovane lipide smatra se da poboljšavaju ciljno delovanje makrofaga. Međutim, takve komponente čine formulacije složenijim, što čini praktičan farmaceutski razvoj komplikovanijim. Pored toga, selektivnost je ograničena i određena frakcija lipozoma se još uvek preuzima od strane drugih organa. Sledeći problem su interakcije seruma i razgradnja RNK u serumu, što je favorizovano od strane pozitivno naelektrisanih lipopleksa. Takođe, za terapeutsku prihvatljivost, potrebno je ispuniti zahteve za farmaceutske proizvode kao što su hemijska i fizička stabilnost. Pored toga, potrebno je da su proizvodi za intraperitonealnu primenu sterilni i moraju da ispune određene zahteve u vezi sa karakteristikama čestica. Dodatno, proizvodi moraju biti pogodni za proizvodnju.

[0013] Ukratko, problem razvoja injektabilne formulacije RNK sa visokom selektivnošću za slezinu, koja ispunjava kriterijume za proizvode za primenu na pacijente, tek bi trebao biti rešen.

[0014] Predmetni pronalazak daje rešenje gore opisanog problema. Iznenađujuće je nađeno da negativno naelektrisani lipopleksi od RNK i lipozoma dovode do značajne ekspresije RNK u DC slezine posle sistemske primene. Određena je snažna ekspresija reporter gena u ciljnim ćelijama (slezini), dok je ekspresija u drugim organima bila niska. Pored toga, mogao bi se indukovati snažan imuni odgovor protiv model antigena. Ovo je neočekivano, zbog toga što obično, prekomerno pozitivno naelektrisanje se smatra uslovom za uspešan unos i ekspresiju. Ovde smo našli da, iako se apsolutna količina ekspresije smanjuje sa smanjenjem viška pozitivnog naelektrisanja, ekspresija je i dalje dovoljno visoka da obezbedi terapeutsku efikasnost lipopleksa posle sistemske primene.

[0015] Prema pronalasku bilo je moguće formirati lipoplekse sa dobro definisanim profilom raspodele veličine čestica kao što je mereno preko dinamičkog rasipanja svetlosti i sa niskom frakcijom čestica ispod granice vidljivosti, što je potrebno za intravensku primenu na pacijente. Ako su formirani inkubacijom lipozoma sa RNK pomoću auto-sklapanja, veličina čestica originalnih lipozoma je samo malo pogođena, i nisu nađene neželjene grupe velikih agregata. Različite veličine se mogu dobiti selekcijom veličine prekursorskih lipozoma i uslova mešanja. Ovo je bilo iznenađujuće zbog toga što je obično zabeleženo formiranje velikih agreagata prilikom inkubacije RNK sa katjonskim lipozomima. Ovo formiranje agregata je jedna glavna prepreka za razvoj formulacija lipopleksa koje su prihvatljive za intravensku ili subkutanu primenu. Čestice su bile stabilne najmanje 24 časa i nisu imale tendenciju da formiraju agregate tokom vremena. Čestice bi mogle biti zamrznute i odmrznute bez formiranja agregata, uz održavanje originalnog profila veličine čestica, i održavanje biološke aktivnosti. Čestice bi mogle biti liofilizovane i rekonstituisane sa vodom bez formiranja agregata, uz održavanje originalnog profila veličine čestica i održavanje biološke aktivnosti. Čestice mogu biti proizvedene pomoću različitih protokola koji su skalabilni i koji se mogu izvesti pod kontrolisanim uslovima. Sa takvim osobinama formulacije lipopleksa prema pronalasku ispunjavaju važne potrebe za farmaceutskim formulacijama za primenu na pacijente, prema profilu raspodele veličine čestica i stabilnosti. Pored toga, u poređenju sa pozitivno naelektrisanim lipopleksima, nanočestice RNK koje su opisane ovde očekuje se da su manje toksične i ispoljavaju manje neželjenih interakcija seruma. Naročito, formulacije su pogodne za parenteralnu primenu, uključujući intravensku i subkutanu primenu.

OPIS PRONALASKA

Rezime pronalaska

[0016] Imunoterapeutske strategije su obećavajuće opcije za lečenje npr. infektivnih bolesti i kancera. Identifikacija rastućeg broja antigena povezanih sa patogenom i tumorom (takođe označeni ovde kao tumorski antigeni) dovela je do široke kolekcije pogodnih ciljnih mesta za imunoterapiju.

[0017] Predmetni pronalazak generalno obuhvata imunoterapeutski tretman bolesti ciljnim delovanjem na obolele ćelije. Pronalazak daje selektivno iskorenjivanje ćelija koje eksprimiraju antigen na taj način minimizujući štetne efekte na normalne ćelije koje ne eksprimiraju navedene antigene. Na taj način, poželjne bolesti za terapiju su one kod kojih su eksprimirani jedan ili više antigena kao što su kanceri ili infektivne bolesti.

[0018] Predmetni pronalazak ima cilj specifično ciljno delovanje ćelija koje eksprimiraju antigen aktivnom imunizacijom indukujući i šireći T ćelije u pacijentu, koji je sposoban da specifično prepoznaje i ubije obolele ćelije. Specifično, predmetni pronalazak omogućava selektivnu ugradnju antigena predstavljenog kao RNK u antigen-prikazujuće ćelije kao što su dendritske ćelije in vivo. Antigen može biti obrađen tako da proizvodi peptidni partner za MHC molekul ili može biti predstavljen bez potrebe za daljom obradom, ako može da se vezuje za MHC molekule. Prednost se daje oblicima primene u kojima je kompletan antigen obrađen in vivo antigen-prikazujućim ćelijama, s obzirom na to da ovo takođe može da proizvede odgovore T pomoćnih ćelija koji su potrebni za efikasan imuni odgovor. Na taj način, kompozicije obezbeđene prema pronalasku kada su primenjene na pacijenta daju jedan ili više MHC prikazanih epitopa za stimulaciju, prajming i/ili širenje T ćelija usmerenih protiv ćelija koje eksprimiraju antigene od kojih su izvedeni MHC prikazani epitopi. Prema tome, kompozicije koje su ovde opisane su poželjno sposobne za indukciju ili stimulaciju ćelijskog odgovora, poželjno citotoksične T ćelijske aktivnosti, protiv bolesti okarakterisane prikazivanjem antigena sa klasom I MHC.

[0019] Naročito, predmetni pronalazak se odnosi na farmaceutsku kompoziciju koja sadrži nanočestice koje sadrže najmanje jedan katjonski lipid, najmanje jedan neutralni pomoćni lipid i RNK koja kodira najmanje jedan antigen za upotrebu u postupku za isporuku najmanje jednog antigena profesionalnim antigen-prikazujućim ćelijama u slezini subjekta, pri čemu navedeni postupak sadrži sistemsku primenu farmaceutske kompozicije na subjekta, pri čemu, antigen je antigen povezan sa bolešću ili izaziva imuni odgovor protiv antigena koji je povezan sa bolešću ili ćelija koje eksprimiraju antigen povezan sa bolešću, i pri čemu su nanočestice lipopleksi koji sadrže

(i) DOTMA i DOPE u molarnom odnosu od 8:2 do 3:7, poželjno od 7:3 do 5:5, pri čemu je odnos naelektrisanja pozitivnog naelektrisanja u DOTMA prema negativnom naelektrisanju u RNK jednak 1.6:2 do 1:2, poželjno 1.4:2 do 1.1:2; ili

(ii) DOTMA i holesterol u molarnom odnosu od 8:2 do 3:7, poželjno od 7:3 do 5:5, pri čemu je odnos naelektrisanja pozitivnog naelektrisanja u DOTMA prema negativnom naelektrisanju u RNK jednak 1.6:2 do 1:2, poželjno 1.4:2 do 1.1:2; ili

(iii) DOTAP i DOPE u molarnom odnosu od 8:2 do 3:7, poželjno od 7:3 do 5:5, pri čemu je odnos naelektrisanja pozitivnog naelektrisanja u DOTAP prema negativnom naelektrisanju u RNK jednak 1.6:2 do 1:2, poželjno 1.4:2 do 1.1:2.

[0020] Poželjno, nanočestice opisane ovde su koloidno stabilne najmanje 2 časa u smislu da se ne odigrava agregacija, taloženje ili povećanje veličine i indeksa polidisperzije za više od 30% kao što je mereno pomoću dinamičkog rasipanja svetlosti.

[0021] U jednom primeru izvođenja, zeta potencijal nanočestica je -5 ili manje, -10 ili manje, -15 ili manje, -20 ili manje ili -25 ili manje. U različitim primerima izvođenja, zeta potencijal nanočestica je -35 ili viši, -30 ili viši ili -25 ili viši. U jednom primeru izvođenja, nanočestice imaju zeta potencijal od 0 mV do -50 mV, poželjno 0 mV do -40 mV ili -10 mV do -30 mV.

[0022] Katjonski lipid može biti monokatjonski ili polikatjonski. Bilo koji katjonski amfifilni molekul, npr., molekul koji sadrži najmanje jednu hidrofilnu i lipofilnu grupu je katjonski lipid unutar značenja predmetnog pronalaska. Neutralni pomoćni lipid može biti prirodni lipid, kao što je fosfolipid ili analog prirodnog lipida, ili potpuno sintetički lipid, ili molekul sličan lipidu, bez sličnosti sa prirodnim lipidima. U jednom primeru izvođenja, katjonski lipid i/ili neutralni pomoćni lipid je lipid koji formira dvosloj.

[0023] U različitim primerima izvođenja, lipidi nisu funkcionalizovani kao što je funkcionalizovani manozom, histidinom i/ili imidazolom, nanočestice ne sadrže ciljni ligand kao što su manozom funkcionalizovani lipidi i/ili nanočestice ne sadrže jedan ili više od sledećih: pH zavisna jedinjenja, katjonske polimere kao što su polimeri koji sadrže histidin i/ili polilizin, pri čemu polimeri mogu izborno biti PEGilovani i/ili histidilovani, ili dvovalentne jone kao što su Ca<2+>.

[0024] U jednom primeru izvođenja, nanočestice imaju prosečni prečnik u opsegu od 50 nm do 1000 nm, poželjno od 50 nm do 400 nm, poželjno 100 nm do 300 nm kao što je 150 nm do 200 nm. U jednom primeru izvođenja, nanočestice imaju prečnik u opsegu od 200 do 700 nm, 200 do 600 nm, poželjno 250 do 550 nm, naročito 300 do 500 nm ili 200 do 400 nm.

[0025] U jednom primeru izvođenja, indeks polidisperzije nanočestica opisanih ovde kao što je meren pomoću dinamičkog rasipanja svetlosti je 0.5 ili manje, poželjno 0.4 ili manje ili čak poželjnije 0.3 ili manje.

[0026] U jednom primeru izvođenja ne prema pronalasku, nanočestice koje su ovde opisane mogu se dobiti pomoću jednog ili više od sledećih: (i) inkubacija lipozoma u vodenoj fazi sa RNK u vodenoj fazi, (ii) inkubacija lipida rastvorenog u organskom rastvaraču koji se meša sa vodom, kao što je etanol, sa RNK u vodenom rastvoru, (iii) tehnika reverzno-faznog isparavanja, (iv) zamrzavanje i odmrzavanje proizvoda, (v) dehidratacija i rehidratacija proizvoda, (vi) liofilizacija i rehidratacija proizvoda, ili (vii) sušenje raspršivanjem i rehidratacija proizvoda.

[0027] U jednom primeru izvođenja ne prema pronalasku, nanočestice su proizvedene pomoću postupka koji sadrži korak inkubacije RNK sa bivalentnim katjonima poželjno u koncentraciji od između 0.1 mM do 5 mM kao što je 0.1 mM do 4 mM ili 0.3 mM do 1 mM pre ugradnje u navedene nanočestice i/ili inkubacijom RNK sa monovalentnim jonima poželjno u koncentraciji od između 1 mM do 500 mM kao što je 100 mM do 200 mM ili 130 mM do 170 mM pre ugradnje u navedene nanočestice i/ili inkubacijom RNK sa puferima pre ugradnje u navedene nanočestice.

[0028] U jednom primeru izvođenja ne prema pronalasku, posle inkubacije bivalentnih katjona sa RNK uključen je korak razblaženja putem dodavanja lipozoma i/ili drugih vodenih faza za najmanje faktor veći od 1.5, poželjno za faktor veći od 2, ili za faktor veći od 5.

[0029] U jednom primeru izvođenja, bivalentni katjoni su joni kalcijuma, pri čemu je finalna koncentracija navedenih jona kalcijuma manja od 4 mM, poželjno manja od 3 mM i čak poželjnije 2.2 mM ili manje.

[0030] U jednom primeru izvođenja ne prema pronalasku, nanočestice koje su ovde opisane su proizvedene pomoću postupka koji sadrži korak ekstruzije i/ili korak filtracije i/ili korak liofilizacije nanočestica.

[0031] U jednom primeru izvođenja, posle sistemske primene nanočestica, javlja se ekspresija RNK u slezini. U jednom primeru izvođenja, posle sistemske primene nanočestica, ne javlja se ili se uglavnom ne javlja ekspresija RNK u plućima i/ili jetri. U jednom primeru izvođenja, posle sistemske primene nanočestica, ekspresija RNK u slezini je najmanje 5-struka, poželjno najmanje 8-struka, poželjno najmanje 10-struka, poželjno najmanje 20-struka, poželjno najmanje 50-struka, poželjno najmanje 100-struka, poželjno najmanje 1000-struka ili čak veća od količine ekspresije RNK u plućima. U jednom primeru izvođenja, posle sistemske primene nanočestica, javlja se ekspresija RNK u antigen-prikazujućim ćelijama, poželjno profesionalnim antigen-prikazujućim ćelijama u slezini.

[0032] Nanočestice kada su primenjene sistemski ciljno deluju ili se akumuliraju u slezini. Naročito, nanočestice kada su primenjene sistemski isporučuju RNK do profesionalnih antigen-prikazujućih ćelija kao što su dendritske ćelije i/ili makrofage u slezini. Poželjno nanočestice oslobađaju RNK na ciljni organ ili tkivo i/ili ulaze u ćelije na ciljnom organu ili tkivu, pri čemu, ciljni organ ili tkivo je slezina i ćelije na ciljnom organu ili tkivu su profesionalne antigen-prikazujuće ćelije kao što su dendritske ćelije. U jednom primeru izvođenja, nanočestice kada su primenjene sistemski ne deluju ili uglavnom ne deluju ciljno na ili se ne akumuliraju u plućima i/ili jetri. U jednom primeru izvođenja, količina nanočestica koje ciljno deluju na ili se akumuliraju u slezini je najmanje 5-struka, poželjno najmanje 8-struka, poželjno najmanje 10-struka, poželjno najmanje 20-struka, poželjno najmanje 50-struka, poželjno najmanje 100-struka, poželjno najmanje 1000-struka ili čak veća od količine koja ciljno deluje ili se akumulira u plućima.

[0033] Prema pronalasku, sistemska primena je poželjno preko parenteralne primene, poželjno preko intravenske primene, subkutane primene, intradermalne primene ili intraarterijske primene.

[0034] Farmaceutska kompozicija prema pronalasku može dalje da sadrži jedan ili više farmaceutski prihvatljivih nosača, razblaživača i/ili ekscipijenasa. Farmaceutska kompozicija prema pronalasku može dalje da sadrži najmanje jedan ađuvans.

[0035] Farmaceutska kompozicija prema pronalasku može biti formulisana za sistemsku primenu.

[0036] Farmaceutska kompozicija prema pronalasku može biti korišćena za indukciju imunog odgovora, naročito imunog odgovora protiv antigena povezanog sa bolešću ili ćelija koje eksprimiraju antigen povezan sa bolešću, kao što je imuni odgovor protiv kancera. Prema tome, farmaceutska kompozicija može biti korišćena za profilaktički i/ili terapeutski tretman bolesti koja uključuje antigen povezan sa bolešću ili ćelije koje eksprimiraju antigen povezan sa bolešću, kao što je kancer. Poželjno navedeni imuni odgovor je T ćelijski odgovor. U jednom primeru izvođenja, antigen povezan sa bolešću je tumorski antigen.

[0037] U jednom primeru izvođenja, RNK sadržana u nanočesticama opisanim ovde ne sadrži pseudouridinske ostatke i poželjno ne sadrži modifikovane nukleozide. Ostale karakteristike i prednosti ovog pronalaska će biti očigledni iz sledećeg detaljnog opisa i patentnih zahteva.

Detaljan opis pronalaska

[0038] Iako je predmetni pronalazak detaljno opisan u daljem tekstu, potrebno je razumeti da ovaj pronalazak nije ograničen na određene metodologije, protokole i reagense opisane ovde jer oni mogu da variraju. Takođe je potrebno razumeti da je terminologija korišćena ovde za svrhu opisivanja samo određenih primera izvođenja, i nije bila namera da ograniči obim predmetnog pronalaska koji će biti ograničen samo priloženih patentnim zahtevima. Osim ukoliko je definisano drugačije, svi tehnički i naučni termini korišćeni ovde imaju ista značenja kao što uobičajeno podrazumevaju stručnjaci iz date oblasti tehnike.

[0039] U sledećem, elementi predmetnog pronalaska će biti opisani.

[0040] Poželjno, termini koji su ovde korišćeni su definisani kao što su opisani u "A multilingual glossary of biotechnological terms: (IUPAC Recommendations)", H.G.W. Leuenberger, B. Nagel, and H. Kölbl, Eds., (1995) Helvetica Chimica Acta, CH-4010 Basel, Switzerland.

[0041] Izvođenje predmetnog pronalaska će koristiti, osim ukoliko nije drugačije naznačeno, konvencionalne metode biohemije, ćelijske biologije, imunologije i tehnike rekombinantne DNK koji su objašnjeni u literaturi iz date oblasti (cf., npr., Molecular Cloning: Laboratory Manual, 2nd Edition, J. Sambrook et al. eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor 1989).

[0042] U ovoj specifikaciji i patentnim zahtevima koji slede, osim ukoliko kontekst ne zahteva drugačije, reč "sadrže", i varijacije kao što su "sadrži" i "koji sadrži", biće shvaćene da ukazuju na obuhvatanje naznačenog broja člana, celog broja ili koraka ili grupe članova, celih brojeva ili koraka, ali ne isključivanje bilo kog drugog člana, celog broja ili koraka ili grupe članova, celih brojeva ili koraka, iako u nekim primerima izvođenja takav drugi član, ceo broj ili korak ili grupa članova, celih brojeva ili koraka mogu biti isključeni, tj. predmet zaštite se sastoji u uključivanju naznačenog člana, celog rboja ili koraka ili grupe članova, celih brojeva ili koraka. Termini u jednini (članovi "a" i "an" i "the" na engleskom jeziku) i slične reference korišćene u kontekstu opisivanja pronalaska (naročito u kontekstu patentnih zahteva) trebalo bi tumačiti tako da obuhvataju jedninu i množinu, osim ukoliko je drugačije naznačeno ovde ili jasno kontradiktorno kontekstu. Navođenje opsega vrednosti ovde samo služi kao skraćeni metod navođenja individualno svake posebne vrednosti koja je unutar opsega. Osim ukoliko je drugačije naznačeno ovde, svaka pojedinačna vrednost je obuhvaćena u specifikaciju kao da su pojedinačno ovde navedene.

[0043] Svi postupci koji su ovde opisani mogu biti izvedeni po bilo kom pogodnom redosledu osim ukoliko je drugačije naznačeno ovde ili inače jasno kontradiktorno kontekstu. Upotreba bilo kojih i svih primera, ili primera izraza (npr., "kao što su"), koji su ovde obezbeđeni namenjena je samo za bolju ilustraciju pronalaska i ne predstavlja ograničenje obima pronalaska za koji je inače tražena zaštita. Nikakvi izrazi u specifikaciji ne bi trebalo da se tumače kao da ukazuju na bilo koji element za koji nije tražena zaštita esencijalan za izvođenje pronalaska.

[0044] Predmetni pronalazak opisuje sredstva i kompozicije koji posle primene indukuju imuni odgovor, naročito ćelijski imuni odgovor, usmeren protiv antigena povezanog sa bolešću ili ćelija koje eksprimiraju antigen povezan sa bolešću kao što su ćelije kancera. Naročito, predmetni pronalazak predviđa upotrebu RNK koja kodira antigene proteine ili peptide (takođe označeni terminom "antigen" ovde) indukujući imuni odgovor, naročito T ćelijski odgovor, protiv antigena povezanog sa bolešću ili ćelija koje eksprimiraju antigen povezan sa bolešću. Ovi antigeni proteini ili peptidi mogu da sadrže sekvencu koja uglavnom odgovara ili je identična sekvenci antigena povezanog sa bolešću ili jednom ili više njenih fragmenata. U jednom primeru izvođenja, antigeni protein ili peptid sadrži sekvencu MHC prikazujućeg peptida poreklom od antigena povezanog sa bolešću. Imunizacija sa RNK koja kodira intaktni ili značajno intaktni antigen povezan sa bolešću ili njegove fragmente kao što su peptidi MHC klase I i klase II moguće je izazvati odgovor tipa MHC klase I i/ili klase II i na taj način, stimuliše T ćelije kao što su CD8+ citotoksični T limfociti koji su sposobni za liziranje obolelih ćelija i/ili CD4+ T ćelija. Takva imunizacija takođe može da izazove humoralni imuni odgovor (B ćelijski odgovor) koji rezultuje u proizvodnji antitela protiv antigena. Prema tome, farmaceutska kompozicija prema predmetnom pronalasku može biti korišćena u genetičkoj vakcinaciji, pri čemu je imuni odgovor stimulisan uvođenjem u subjekta pogodnog molekula RNK koji kodira antigeni protein ili peptid. Sredstva i kompozicije otkriveni ovde mogu biti korišćeni kao terapeutska ili profilaktička vakcina za lečenje ili prevenciju bolesti kao što je bolest kao što je ovde otkrivena. U jednom primeru izvođenja, antigen povezan sa bolešću je tumorski antigen. U ovom primeru izvođenja, sredstva i kompozicije opisani ovde mogu biti korisni u lečenju kancera ili metastaze kancera. Poželjno, oboleli organ ili tkivo je okarakterisan obolelim ćelijama kao što su ćelije kancera koje eksprimiraju antigen povezan za bolešću i poželjno prikazuju antigen povezan sa bolešću u kontekstu MHC molekula.

[0045] Termin "imuni odgovor" označava integrisani odgovor tela na antigen ili ćeliju koja eksprimira antigen i poželjno označava ćelijski imuni odgovor ili ćelijski kao i humoralni imuni odgovor. Imuni odgovor može biti zaštitni/preventivan/profilaktički i/ili terapeutski.

[0046] "Indukovanje imunog odgovora" može da označava da nema imunog odgovora protiv određenog antigena ili ćelije koja eksprimira antigen pre indukcije, ali takođe može da označava da postoji određeni nivo imunog odgovora protiv određenog antigena ili ćelije koja eksprimira antigen pre indukcije i posle indukcije navedeni imuni odgovor je pojačan. Na taj način, "indukovanje imunog odgovora" takođe obuhvata "pojačanje imunog odgovora". Poželjno, posle indukcije imunog odgovora kod subjekta, navedeni subjekat je zaštićen od razvoja bolesti kao što je infektivna bolest ili kancer ili stanje bolesti je poboljšano indukcijom imunog odgovora. Na primer, imuni odgovor protiv virusnog antigena može biti indukovan kod pacijenta koji ima virusnu bolest ili kod subjekta koji je u riziku od razvoja virusne bolesti. Na primer, imuni odgovor protiv tumorskog antigena može biti indukovan kod pacijenta koji ima kancer ili kod subjekta koji je u riziku od razvoja kancera. Indukcija imunog odgovora u ovom slučaju može da označava da je stanje bolesti subjekta poboljšano, da subjekat ne razvija metastaze, ili da subjekat u riziku od razvoja kancera ne razvija kancer.

[0047] "Ćelijski imuni odgovor", "ćelijski odgovor", "ćelijski odgovor protiv antigena" ili sličan termin određen je tako da obuhvata ćelijski odgovor usmeren na ćelije koje eksprimiraju antigen i okarakterisane su prikazivanjem antigena sa klasom I ili klasom II MHC. Ćelijski odgovor se odnosi na ćelije označene kao T ćelije ili T limfociti koji deluju kao "pomoćne" ili "ubice". Pomoćne T ćelije (takođe označene kao CD4+ T ćelije) imaju centralnu ulogu preko regulacije imunog odgovora i ćelije ubice (takođe označene kao citotoksične T ćelije, citolitičke T ćelije, CD8+ T ćelije ili CTLs) ubijaju obolele ćelije kao što su inficirane ćelije ili ćelije kancera, sprečavajući proizvodnju još obolelih ćelija. U poželjnim primerima izvođenja, predmetni pronalazak obuhvata stimulaciju anti-tumorskog CTL odgovora protiv ćelija kancera koje eksprimiraju jedan ili više tumorskih antigena i poželjno prikazuju takve tumorske antigene sa klasom I MHC.

[0048] Prema predmetnom pronalasku, termin "antigen" sadrži bilo koji molekul, poželjno peptid ili protein, koji sadrži najmanje jedan epitop koji će da izazove imuni odgovor i/ili protiv koga je usmeren imuni odgovor. Poželjno, antigen u kontekstu predmetnog pronalaska je molekul koji, izborno posle obrade, indukuje imuni odgovor, koji je poželjno specifičan za antigen ili ćelije koje eksprimiraju antigen. Naročito, "antigen" se odnosi na molekul koji, izborno posle obrade, je prikazan pomoću MHC molekula i reaguje specifično sa T limfocitima (T ćelijama).

[0049] Na taj način, antigen ili njegovi fragmenti bi trebalo da su prepoznatljivi od strane T ćelijskog receptora. Poželjno, antigen ili fragment ako je prepoznat od strane T ćelijskog receptora je sposoban da indukuje u prisustvu odgovarajućih ko-stimulatornih signala, klonalnu ekspanziju T ćelije koja nosi T ćelijski receptor koji specifično prepoznaje antigen ili fragment. U kontekstu primera izvođenja prema predmetnom pronalasku, antigen ili fragment je poželjno prikazan pomoću ćelije, poželjno pomoću antigen-prikazujuće ćelije i/ili obolele ćelije, u kontekstu MHC molekula, što rezultuje u imunom odgovoru protiv antigena ili ćelija koje eksprimiraju antigen.

[0050] Prema predmetnom pronalasku, predviđen je bilo koji pogodan antigen koji je kandidat za imuni odgovor, gde je imuni odgovor poželjno ćelijski imuni odgovor.

[0051] Antigen je poželjno proizvod koji odgovara ili poreklom od prirodnog antigena. Takvi prirodni antigeni mogu da obuhvataju ili mogu biti poreklom od alergena, virusa, bakterija, gljiva, parazita i drugih infektivnih agenasa i patogena ili antigen takođe može biti tumorski antigen. Prema predmetnom pronalasku, antigen može da odgovara prirodnom proizvodu, na primer, virusnom proteinu ili njegovom delu.

[0052] Termin "patogen" se odnosi na patogene mikroorganizme i sadrži viruse, bakterije, gljive, jednoćelijske organizme i parazite. Primeri patogenih virusa su virus humane imunodeficijencije (HIV), citomegalovirus (CMV), virus herpesa (HSV), virus hepatitisa (HAV), HBV, HCV, papiloma virus i humani T-limfotrofni virus (HTLV). Jednoćelijski organizmi sadrže plazmodije, tripanozome, amebe, itd.

[0053] Termin "antigen povezan sa bolešću" označava sve antigene koji su od patološkog značaja i obuhvata "tumorske antigene". Prema pronalasku poželjna je indukcija imunog odgovora na antigen povezan sa bolešću ili ćelije koje eksprimiraju antigen povezan sa bolešću i poželjno prikazuju antigen povezan sa bolešću u kontekstu MHC molekula. Poželjno, antigen povezan sa bolešću je prirodni antigen. U jednom primeru izvođenja, antigen povezan sa bolešću je eksprimiran u oboleloj ćeliji i poželjno prikazan pomoću MHC molekula ćelije.

[0054] Antigen kodiran od strane RNK sadržanom u nanočesticama opisanim ovde trebalo bi da indukuje imuni odgovor koji je usmeren protiv antigena povezanog sa bolešću na koji se ciljno deluje ili ćelije koje eksprimiraju antigen povezan sa bolešću na koje se ciljno deluje. Na taj način, antigen kodiran sa RNK sadržanom u nanočesticama opisanim ovde može da odgovara ili može da sadrži antigen povezan sa bolešću ili jedan ili više njegovih imunogenh fragmenata kao što su jedan ili više MHC vezujućih peptida antigena povezanog sa bolešću. Na taj način, antigen kodiran sa RNK sadržanom u nanočesticama opisanim ovde može biti rekombinantni antigen.

[0055] Termin "rekombinantan" u kontekstu predmetnog pronalaska označava "napravljen preko genetičkog inženjeringa". Poželjno, "rekombinantni objekat" kao što je rekombinantna nukleinska kiselina u kontekstu predmetnog pronalaska se ne javlja u prirodi.

[0056] Termin "priroda/koji se javlja u prirodi" kao što je ovde korišćen označava činjenicu da se objekat može naći u prirodi. Na primer, peptid ili nukleinska kiselina koji su prisutni u organizmu (uključujući viruse) i mogu se izolovati iz izvora u prirodi i koje čovek nije namerno modifikovao u laboratoriji je prirodan/javlja se u prirodi.

[0057] U poželjnom primeru izvođenja, antigen može biti tumorski antigen, tj., sastavni deo ćelija kancera kao što je protein ili peptid eksprimiran u ćeliji kancera koji može biti poreklom iz citoplazme, sa ćelijske površine ili ćelijskog jedra, naročito oni koji se primarno javljaju intracelularno ili kao površinski antigeni ili ćelije kancera. Na priemr, tumorski antigeni obuhvataju karcinoembrionalni antigen, α1-fetoprotein, izoferitin i fetusni sulfoglikoprotein, α2-H-feroprotein i γ-fetoprotein. Prema predmetnom pronalasku, tumorski antigen poželjno sadrži bilo koji antigen koji je eksprimiran u i izborno karakterističan u odnosu na tip i/ili nivo ekspresije za tumore ili kancere kao i za tumorske ćelije ili ćelije kancera. U kontekstu predmetnog pronalaska, termin "tumorski antigen" ili "antigen povezan sa tumorom" poželjno se odnosi na proteine koji su pod normalnim uslovima specifično eksprimirani u ograničenom broju tkiva i/ili organa ili u specifičnim razvojnim stadijumima, na primer, tumorski antigen može biti pod normalnim uslovima specifično eksprimiran u tkivu želudca, poželjno u mukozi želudca, u reproduktivnim organima, npr., u testisu, u trofoblastičnom tkivu, npr., u placenti, ili u ćelijama klicine linije, i eksprimirani su ili aberantno eksprimirani u jednom ili više tkiva tumora ili kancera. U ovom kontekstu, "ograničeni broj" poželjno označava ne više od 3, poželjnije ne više od 2 ili 1. Tumorski antigeni u kontekstu predmetnog pronalaska obuhvataju, na primer, diferencijacione antigene, poželjno diferencijacione antigene specifične za ćelijski tip, tj., proteine koji su pod normalnim uslovima specifično eksprimirani u određenom ćelijskom tipu u određenom stadijumu diferencijacije, antigene kancera/testisa, tj., proteine koji su pod normalnim uslovima specifično eksprimirani u testisu i nekada u placenti, i antigeni specifični za klicinu liniju. U kontekstu predmetnog pronalaska, tumorski antigen poželjno nije ili je samo retko eksprimiran u normalnim tkivima. Poželjno, tumorski antigen ili aberantna ekspresija tumorskog antigena identifikuje ćelije kancera. U kontekstu predmetnog pronalaska, tumorski antigen koji je eksprimiran od strane ćelije kancera u subjektu, npr., pacijentu koji pati od kancera, je poželjno auto-protein u navedenom subjektu. U poželjnom primeru izvođenja, tumorski antigen u kontekstu predmetnog pronalaska je eksprimiran pod normalnim uslovima specifično u tkivu ili organu koji nije esencijalan, tj., tkiva ili organi koji kada su oštećeni imunim sistemom ne dovode do smrti subjekta, ili u organima ili strukturama tela koje nisu ili su teško dostupne od strane imunog sistema. Poželjno, aminokiselinska sekvenca tumorskog antigena je identična između tumorskog antigena koji je eksprimiran u normalnim tkivima i tumorskog antigena koji je eksprimiran u tkivima kancera. Poželjno, tumorski antigen je prikazan od strane ćelije kancera u kojoj je eksprimiran.

[0058] Primeri za tumorske antigene koji mogu biti kiorisni u predmetnom pronalasku su p53, ART-4, BAGE, beta-katenin/m, Bcr-abL CAMEL, CAP-1, CASP-8, CDC27/m, CDK4/m, CEA, proteini ćelijske površine familije klaudina, kao što su CLAUDIN-6, CLAUDIN-18.2 i CLAUDIN-12, c-MYC, CT, Cyp-B, DAM, ELF2M, ETV6-AML1, G250, GAGE, GnT-V, Gap100, HAGE, HER-2/neu, HPV-E7, HPV-E6, HAST-2, hTERT (or hTRT), LAGE, LDLR/FUT, MAGE-A, poželjno MAGE-A1, MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A5, MAGE-A6, MAGE-A7, MAGE-A8, MAGE-A9, MAGE-A10, MAGE-A11 ili MAGE-A12, MAGE-B, MAGE-C, MART-1/Melan-A, MC1R, miozin/m, MUC1, MUM-1, -2, -3, NA88-A, NF1, NY-ESO-1, NY-BR-1, pl90 minor BCR-abL, Pm1/RARa, PRAME, proteinaza 3, PSA, PSM, RAGE, RU1 ili RU2, SAGE, SART-1 ili SART-3, SCGB3A2, SCP1, SCP2, SCP3, SSX, SURVIVIN, TEL/AML1, TPI/m, TRP-1, TRP-2, TRP-2/INT2, TPTE i WT, poželjno WT-1.

[0059] Termin "epitop" označava antigenu determinantu u molekulu kao što je antigen, tj., deo u ili fragment molekula koji imuni sistem prepoznaje, na primer, koji prepoznaje T ćelija, naročito kada je prikazan u kontekstu MHC molekula. Epitop proteina kao što je tumorski antigen poželjno sadrži kontinuirani ili diskontinuirani deo navedenog proteina i poželjno je između 5 i 100, poželjno između 5 i 50, poželjnije između 8 i 30, najpoželjnije između 10 i 25 aminokiselina u dužinu, na primer, epitop može biti poželjno 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, ili 25 aminokiselina u dužinu. Naročito je poželjno da je epitop u kontekstu predmetnog pronalaska T ćelijski epitop.

[0060] Prema pronalasku epitop može da se vezuje za MHC molekule kao što su MHC molekuli na površini ćelije i na taj način, može biti "MHC vezujući peptid". Termin "MHC vezujući peptid" označava peptid koji se vezuje za molekul MHC klase I i/ili MHC klase II. U slučaju kompleksa klase I MHC/peptida, vezujući peptidi su tipično 8-10 aminokiselina dužine iako duži ili kraći peptidi mogu biti efikasni. U slučaju kompleksa klase II MHC/peptida, vezujući peptidi su tipično 10-25 aminokiselina dužine i naročito su 13-18 aminokiselina dužine, iako duži i kraći peptidi mogu biti efikasni.

[0061] Prema pronalasku, antigen kodiran sa RNK sadržanom u nanočeticama opisanim ovde može da sadrži imunogeni fragment antigena povezanog sa bolešću kao što je peptidni fragment antigena povezanog sa bolešću (takođe označen terminom peptid antigena ovde) koji je poželjno MHC vezujući peptid.

[0062] "Imunogeni fragment antigena" prema pronalasku poželjno se odnosi na deo ili fragment antigena koji je sposoban da stimuliše imuni odgovor, poželjno ćelijski odgovor protiv antigena ili ćelija koje eksprimiraju antigen i poželjno prikazuju antigen kao što su obolele ćelije, naročito ćelije kancera. Poželjno, imunogeni fragment antigena je sposoban da stimuliše ćelijski odgovor protiv ćelije okarakterisane prikazivanjem antigena sa klasom I MHC i poželjno je sposoban da stimuliše antigen-responsivni CTL. Poželjno, deo antigena prepoznaje (tj., specifično vezuju) T ćelijki receptor, naročito ako je prikazan u kontekstu MHC molekula. Određeni poželjni imunogeni fragmenti se vezuju za molekul MHC klase I ili klase II. Kao što je ovde korišćen, navedeno je da se imunogeni fragment "vezuje za" molekul MHC klase I ili klase II ako je takvo vezivanje detektabilno upotrebom bilo koje analize poznate u stanju tehnike.

[0063] Poželjno, imunogeni fragment antigena prema pronalasku je MHC klase I i/ili klase II prikazani peptid ili može biti obrađen tako da proizvodi MHC klase I i/ili klase II prikazani peptid. Poželjno, imunogeni fragment antigena sadrži aminokiselinsku sekvencu koja značajno odgovara i poželjno je identična aminokiselinskoj sekvenci fragmenta antigena. Poželjno, navedeni fragment antigena je MHC klase I i/ili klase II prikazani peptid.

[0064] Ako se peptid prikazuje direktno, tj., bez obrade, naročito bez cepanja, on ima dužinu koja je pogodna za vezivanje za MHC molekul, naročito molekul klase I MHC, i poželjno je 7-20 aminokiselina u dužinu, poželjnije 7-12 aminokiselina u dužinu, poželjnije 8-11 aminokiselina u dužinu, naročito 9 ili 10 aminokiselina u dužinu.

[0065] Ako je peptid deo većeg entiteta koji sadrži dodatne sekvence, npr. polipeptida, i prikazuje se posle obrade, naročito posle cepanja, peptid proizveden obradom ima dužinu koja je pogodna za vezivanje za MHC molekul, naročito molekul klase I MHC, i poželjno je 7-20 aminokiselina u dužinu, poželjnije 7-12 aminokiselina u dužinu, poželjnije 8-11 aminokiselina u dužinu, naročito 9 ili 10 aminokiselina u dužinu. Poželjno, sekvenca peptida koji se prikazuje posle obrade je poreklom od aminokiselinske sekvence antigena, tj., njegova sekvenca značajno odgovara i poželjno je potpuno identična fragmentu antigena.

[0066] Na taj način, antigen kodiran sa RNK sadržanom u nanočesticama opisanim ovde može da sadrži sekvencu od 7-20 aminokiselina u dužinu, poželjnije 7-12 aminokiselina u dužinu, poželjnije 8-11 aminokiselina u dužinu, naročito 9 ili 10 aminokiselina u dužinu koja značajno odgovara i poželjno je potpuno identična fragmentu antigena povezanog sa bolešću prikazanom MHC i posle obrade čini prikazani peptid.

[0067] Peptidi koji imaju aminokiselinske sekvence koje značajno odgovaraju sekvenci peptida koja je predstavljena klasom I MHC mogu da se razlikuju na jednom ili više ostataka koji nisu esencijalni za prepoznavanje TCR peptida kao što je prikazan klasom I MHC, ili za peptid koji se vezuje za MHC. Takvi značajno odgovarajući peptidi su takođe sposobni za stimulaciju CTL koje imaju željenu specifičnost i mogu se smatrati imunološki ekvivalentnim.

[0068] Peptid kada je predstavljen od strane MHC trebalo bi da može da prepoznaje T ćelijski receptor. Poželjno, prikazani peptid ako je prepoznat od strane T ćelijskog receptora je sposoban da indukuje u prisustvu odgovarajućih ko-stimulatornih signala, klonalnu ekspanziju T ćelije koja nosi T ćelijski receptor koji specifično prepoznaje prikazani peptid. Poželjno, peptidi antigena, naročito ako su prikazani u kontekstu MHC molekula, su sposobni za stimulaciju imunog odgovora, poželjno ćelijskog odgovora protiv antigena od koga su poreklom ili ćelija koje eksprimiraju antigen i poželjno prikazuju antigen. Poželjno, peptid antigena je sposoban da stimuliše ćelijski odgovor protiv ćelije koja prikazuje antigen sa klasom I MHC i poželjno je sposoban za stimulaciju antigen-responsivne CTL. Takva ćelija poželjno je ciljna ćelija za svrhe pronalaska.

[0069] "Ciljna ćelija" će označavati ćeliju koja je ciljno mesto za imuni odgovor kao što je ćelijski imuni odgovor. Ciljne ćelije obuhvataju ćelije koje eksprimiraju antigen kao što je antigen povezan sa bolešću i poželjno prikazuju navedeni antigen (koji, naročito, označava da je antigen obrađen u ćelijama i jedan ili više fragmenata antigena su prikazani u kontekstu MHC molekula na ćelijama). Ciljne ćelije obuhvataju bilo koju neželjenu ćeliju kao što je inficirana ćelija ili ćelija kancera. U poželjnim primerima izvođenja, ciljna ćelija je ćelija koja eksprimira antigen kao što je ovde opisan i poželjno koji prikazuje navedeni antigen sa klasom I MHC.

[0070] "Obrada antigena" označava razlaganje antigena u proizvode obrade, koji su fragmenti navedenog antigena (npr., razlaganje proteina u peptide) i vezivanje jednog ili više ovih fragmenata (npr., preko vezivanja) sa MHC molekulima za prikazivanje od strane ćelija, poželjno antigen-prikazujućih ćelija specifičnim T ćelijama.

[0071] Antigen-prikazujuća ćelija (APC) je ćelija koja prikazuje, tj. ispoljava, antigen u kontekstu glavnog kompleksa histokompatibilnosti (MHC) na svojoj površini. Ovo, obuhvata situaciju gde su prikazani samo jedan ili više fragmenata antigena. T ćelije mogu da prepoznaju ovaj kompleks upotrebom svog T ćelijskog receptora (TCR). Antigen-prikazujuće ćelije obrađuju antigene i prikazuju ih T ćelijama.

[0072] Profesionalne antigen-prikazujuće ćelije su veoma efikasne u internalizaciji antigena, bilo preko fagocitoze ili preko endocitoze posredovane preko receptora, i zatim ispoljava fragment antigena, vezan za klasu II MHC molekula, na svojoj membrani. T ćelija prepoznaje i interaguje sa kompleksom antigena-klase II MHC molekula na membrani antigenprikazujuće ćelije. Dodatni ko-stimulatorni signal je zatim proizveden od strane antigenprikazujuće ćelije, dovodeći do aktivacije T ćelije. Ekspresija ko-stimulatornih molekula je karakteristika koja definiše profesionalne antigen-prikazujuće ćelije.

[0073] Glavni tipovi profesionalnih antigen-prikazujućih ćelija su dendritske ćelije, koje imaju najširi opseg prikazivanja antigena, i verovatno su najvažnije antigen-prikazujuće ćelije, makrofage, B-ćelije i određene aktivirane epitelijalne ćelije.

[0074] Dendritske ćelije (DC) su populacije leukocita koji prikazuju antigene uhvaćene u perifernim tkivima T ćelijama preko oba, MHC klase II i I antigen-prikazujućih puteva. Dobro je poznato da su dendritske ćelije potentni induktori imunih odgovora i aktivacija ovih ćelija je kritičan korak za indukciju antitumorskog imuniteta.

[0075] Dendritske ćelije su uobičajeno kategorizovane kao "nezrele" i "zrele" ćelije, koje mogu biti korišćene kao jednostavan način za pravljenje razlike između dva dobro okarakterisana fenotipa. Međutim, ovu nomenklaturu ne bi trebalo tumačiti tako da isključuje sve moguće intermedijerne stadijume diferencijacije.

[0076] Nezrele dendritske ćelije su okarakterisane kao antigen-prikazujuće ćelije sa visokim kapacitetom za unos i obradu antigena, što je u korelaciji sa visokom ekspresijom Fcγ receptora i manoznog receptora. Zreo fenotip je tipično okarakterisan nižom ekspresijom ovih markera, ali visokom ekspresijom molekula na ćelijskoj površini odgovornih za aktivaciju T ćelija kao što su klasa I i klasa II MHC, adhezioni molekuli (npr. CD54 i CD11) i kostimulatorni molekuli (npr., CD40, CD80, CD86 i 4-1 BB).

[0077] Sazrevanje dendritskih ćelija je označeno kao status aktivacije dendritske ćelije na kome takve antigen-prikazujuće dendritske ćelije dovode do prajminga T ćelije, dok prikazivanje pomoću nezrelih dendritskih ćelija rezultuje u toleranciji. Sazrevanje dendritske ćelije je uglavnom uzrokovano biomolekulima sa mikrobijalnim karakteristikama detektovanim od strane urođenih receptora (bakterijska DNK, virusna RNK, endotoksin, itd.), pro-inflamatornim citokinima (TNF, IL-1, IFNs), ligacijom CD40 na površini dendritske ćelije od strane CD40L, i supstancama oslobođenim iz ćelija koje prolaze kroz stresnu ćelijsku smrt. Dendritske ćelije mogu biti izvedene kultivisanjem ćelija koštane srži in vitro sa citokinima, kao što je faktor stimulacije kolonija granulocita-makrofaga (GM-CSF) i faktor alfa nekroze tumora.

[0078] Ne-profesionalne antigen-prikazujuće ćelije konstitutivno ne eksprimiraju proteine MHC klase II neophodne za interakciju sa naivnim T ćelijama; one su eksprimirane samo nakon stimulacije ne-profesionalnih antigen-prikazujućih ćelija od strane određenih citokina kao što je IFNγ.

[0079] Antigen prikazujuće ćelije se mogu napuniti sa MHC prikazanim peptidima transdukcijom ćelija sa nukleinskom kiselinom, kao što je RNK, koja kodira peptid ili protein koji sadrži peptid za prikazivanje, npr. nukleinsku kiselinu koja kodira antigen. Transfektovanje dendritske ćelije sa iRNK je obećavajuća tehnika za punjenje antigan za stimulisanje snažnog antitumorskog imuniteta.

[0080] Termin "imunogenost" odnosi se na relativnu efikasnost antigena da indukuje imunu reakciju.

[0081] Termini "T ćelija" i "T limfocit" se koriste ovde naizmenično i uključuju T pomoćne ćelije (CD4+ T ćelije) i citotoksične T ćelije (CTLs, CD8+ T ćelije) koje sadrže citolitičke T ćelije.

[0082] T ćelije pripadaju grupi belih krvnih ćelija poznatih kao limfociti, i igraju centrlnu ulogu u ćelijski-posredovanom imunitetu. One se mogu razlikovati od drugih limfocitnih tipova, kao što su B ćelije i ćelije prirodne ubice prisustvom specijalnog receptora na njihovoj ćelijskoj površini nazvanih T ćelijski receptori (TCR). Timus je glavni organ odgovoran za sazrevanje T ćelija. Nekoliko različitih subsetova T ćelija je otkriveno, svaki sa različitom funkcijom.

[0083] T pomoćne ćelije pomažu drugim belim krvnim ćelijama u imunološkim procesima, uključujući sazrevanje B ćelija u plazma ćelije i aktivaciju citotoksičnih T ćelija i makrofaga, između ostalih funkcija. Ove ćelije su takođe poznate kao CD4+ T ćelije jer eksprimiraju CD4 protein na njihovoj površini. Pomoćne T ćelije postaju aktivirane kada su prikazane sa peptidnim antigenima od strane molekula MHC klase II koji su eksprimirani na površini antigen prikazujuće ćelije (APCs). Po aktivaciji, one se brzo dele i izlučuju male proteine nazvane citokini koji regulišu ili pomažu u aktivnom imunom odgovoru.

[0084] Citotoksične T ćelije uništavaju obolele ćelije, npr. inficirane ćelije kao što su ćelije inficirane virusom ili ćelije kancera, i takođe su uključene u odbacivanje transplanta. Ove ćelije su takođe poznate kao CD8+ T ćelije jer na njihovoj površini eksprimiraju CD8 glikoprotein. Ove ćelije prepoznaju njihova ciljna mesta vezivanjem sa antigenom povezanim sa MHC klase I, koji je prisutan na površini skoro svake ćelije tela.

[0085] Najveći deo T ćelija ima T ćelijski receptor (TCR) koji postoji kao kompleks nekoliko proteina. Stvarni T ćelijski receptor je sastavljen od dva zasebna peptidna lanca, koji su proizvedeni od strane nezavisnih gena T ćelijskog receptora alfa i beta (TCRα i TCRβ) i nazvani su α- i β-TCR lanci. γδ T ćelije (gamma delta T ćelije) predstavljaju mali subset T ćelija koji poseduje različit T ćelijski receptor (TCR) na svojoj površini. Međutim, kod γδ T ćelija, TCR je stvoren od jednog γ-lanca i jednog δ-lanca. Ova grupa T ćelija je dosta ređa (2% od ukupnih T ćelija) nego αβ T ćelije.

[0086] Sve T ćelije su poreklom od hematopoetske matične ćelije u kostnoj srži. Hematopoetski progenitori izvedeni iz hematopoetskih matičnih ćelija nastanjuju timus i šire se ćelijskom deobom da bi stvorile veliku populaciju nezrelih timocita. Najraniji timociti ne eksprimiraju CD4 niti CD8, i stoga su klasifikovani kao dvostruko negativne (CD4-CD8-) ćelije. Kako njihovo razviće napreduje postaju dvostruko pozitivne timocite (CD4+CD8+), i konačno sazrevaju do pozitivnih (CD4+CD8- ili CD4-CD8+) timocita koje su zatim oslobođene iz timusa u periferna tkiva.

[0087] Prvi signal aktivacije T ćelije je obezbeđen vezivanjem T ćelijskog receptora sa kratkim peptidom prikazanim od strane glavnog kompleksa histokompatibilnosti (MHC) na drugoj ćeliji. Ovo obezbeđuje da je aktivirana samo T ćelija TCR specifična za taj peptid. Ćelija partner je obično profesionalna antigen prikazujuća ćelija (APC), obično dendritska ćelija u slučaju naivnih odgovora, iako B ćelije i makrofage mogu biti važne APCs. Peptidi prikazani CD8+ T ćelijama od strane molekula MHC klase I su dužine 8-10 aminokiselina; peptidi prikazani CD4+ T ćelijama od strane molekula MHC klase II su duži, jer su krajevi vezujućeg procepa molekula MHC klase II otvoreni.

[0088] Termin "klonska ekspanzija" odnosi se na proces gde se specifični entitet umnožava. U kontekstu predmetnog pronalaska, termin je poželjno korišćen u kontekstu imunološkog odgovora u kome limfociti stimulisani od strane antigena, proliferišu, i umnožavaju se specifični limfociti koji prepoznaju pomenuti antigen. Poželjno, klonska ekspanzija dovodi do diferencijacije limfocita.

[0089] Prema pronalasku, citotoksični T limfociti mogu se generisati in vivo inkorporacijom antigena ili peptida antigena u antigen-prikazujuće ćelije in vivo. Antigen ili peptid antigena je predstavljen kao RNK. Antigen se može obraditi tako da proizvede partnerski peptid za molekul MHC, dok njegov fragment može biti prikazan bez potrebe za daljom obradom. Poslednje pomenuto je naročito slučaj, ukoliko se oni mogu vezati za MHC molekule.

Rezultujuće ćelije prikazuju kompleks od interesa i prepoznate su od strane autolognih citotoksičnih T limfocita koje zatim propagiraju.

[0090] Specifična aktivacija CD4+ ili CD8+ T ćelija može se detektovati na različite načine. Postupci za detekciju aktivacije specifičnih T ćelija uključuju detekciju proliferacije T ćelija, proizvodnju citokina (npr., limfokina), ili stvaranje citolitičke aktivnosti. Za CD4+ T ćelije, poželjan postupak za detekciju aktivacije specifičnih T ćelija je detekcija proliferacije T ćelija. Za CD8+ T ćelije, poželjan postupak za detekciju aktivacije specifičnih T ćelija je detekcija stvaranja citolitičke aktivnosti.

[0091] Termin "glavni kompleks histokompatibilnosti" i skraćenica "MHC" uključuju molekule MHC klase I i MHC klase II i odnose se na kompleks gena koji se javlja kod svih kičmenjaka. MHC proteini ili molekuli su važni za signalizaciju između limfocita i antigen prikazujućih ćelija ili obolelih ćelija u imunim reakcijama, pri čemu MHC proteini ili molekuli vezuju peptide i prikazuju ih za prepoznavanje od strane receptora T ćelija. Proteini kodirani sa MHC su eksprimirani na površini ćelije, i prikazuju i sopstvene antigene (peptidne fragmente iz same ćelije) i strane antigene (npr., fragmente invazivnih mikroorganizama) T ćeliji.

[0092] MHC region je podeljen u tri podgrupe, klasa I, klasa II, i klasa III. Proteini MHC klase I proteina sadrže α-lanac i β2-mikroglobulin (koji nije deo MHC kodiran na hromozomu 15). Oni prikazuju fragmente antigena citotkisčnim T ćelijama. Na većini ćelija imunog sistema, specifično na antigen-prikazujućim ćelijama, proteini MHC klase II sadrže α- i βlance i prikazuju fragmente antigena T-pomoćnim ćelijama. MHC klase III region kodira druge imune komponente, kao što su kompoenente komplementa i neki kodiraju citokine.

[0093] Kod ljudi, geni u MHC regionu koji kodiraju antigen-prikazujuće proteine na površini ćelije označavaju se kao geni humanog leukocitnog antigena (HLA). Međutim skraćenica MHC se često koristi za označavanje proizvoda HLA gena. HLA geni uključuju devet takozvanih klasičnih MHC gena: HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DPA1, HLA-DPB1, HLA-DQA1, HLA-DQB1, HLA-DRA, i HLA-DRB1.

[0094] U jednom poželjnom primeru izvođenja svih aspekata pronalaska molekul MHC je molekul HLA.

[0095] Pod "ćelija karakterisana prikazivanjem antigena", "ćelija koja prikazuje antigen", "antigen prikazan od strane ćelije", "antigen prikazivanje" ili slični izrazima podrazumeva se ćelija, naročito obolela ćelija ili ciljna ćelija kao što je inficirana ćelija ili ćelija kancera, ili antigen prikazujuća ćelija koja prikazuje antigen koji eksprimira ili fragment izveden iz pomenutog antigena, npr. obradom antigena, u kontekstu molekula MHC, naročito molekula MHC klase I. Slično, termini "bolest karakterisana prikazivanjem antigena" označava bolest koja uključuje ćelije karakterisane prikazivanjem antigena, naročito sa klasom I MHC. Prikazivanje antigena od strane ćelija može se izvesti transfekcijom ćelije sa nukleinskom kiselinom kao što je RNK koja kodira antigen.

[0096] Termin "imunološki ekvivalent" označava da imunološki ekvivalentni molekul kao što je imunološki ekvivalentna aminokiselinska sekvenca pokazuje iste ili suštinski iste imunološke osobine i/ili izaziva iste ili suštinski iste imunološke efekte, npr., u odnosu na tip imunološkog efekta kao što je indukcija humoralnog i/ili ćelijskog imunog odgovora, snaga i/ili trajanje indukovane imune reakcije, ili specifičnost indikovane imune reakcije.

[0097] Termin "imune efektorne funkcije" u kontekstu predmetnog pronalaska uključuju bilo koje funkcije posredovane komponentama imunog sistema koje rezultuju, na primer, u ubijanju inficirane ćelije ili ćelije kancera, ili u inhibiciji rasta tumora i/ili inhibiciji razvoja tumora, uključujući inhibiciju diseminacije i metastaziranja tumora. Poželjno, imune efektorne funkcije u kontekstu predmetnog pronalaska su efektorne funkcije posredovane T ćelijama. Takve funkcije sadrže u slučaju pomoćnih T ćelija (CD4+ T ćelija) prepoznavanje antigena ili peptida antigena u kontekstu molekula MHC klase II od strane receptora T ćelija, oslobađanje citokina i/ili aktivaciju CD8+ limfocita (CTLs) i/ili B-ćelija, i u slučaju CTL prepoznavanje antigena ili peptida antigena u kontekstu molekula MHC klase I od strane receptora T ćelije, eliminaciju ćelija prikazanih u kontekstu molekula MHC klase I, tj., ćelija karkaterisanih prikazivanjem antigena sa klasom I MHC, na primer, preko apoptoze ili ćelijske lize posredovane perforinom, proizvodnje citokina kao što su IFN-γ i TNF-α, i specifično citolitičko ubijanje antigen eksprimirajuće ciljne ćelije.

[0098] Nukleinska kiselina je prema pronalasku ribonukleinska kiselina (RNK), najpoželjnije in vitro transkribovana RNK (IVT RNK) ili sintetička RNK. Nukleinske kiseline uključuju prema pronalasku iRNK. Nukleinska kiselina može prema pronalasku biti u obliku molekula koji je jednolančan ili dvolančan i linearan ili kovalentno zatvoren da formira krug. Nukleinska kiselina može biti upotrebljena za introdukciju u, tj. transfektovanje, ćelije, na primer, u obliku RNK koja se može pripremiti in vitro transkripcijom iz DNK šablona. RNK može dodatno biti modifikovana pre primene sa stabilizujućim sekvencama, kapingom, i poliadenilacijom.

[0099] Nukleinske kiseline mogu biti sadržane u vektoru. Termin "vektor" kao što je ovde korišćeno uključuju bilo koje vektore poznate stručnjaku uključujući plazmidne vektore, kozmidne vektore, fagne vektore kao što je lambda fag, virusne vektore kao što su adenovirusni ili bakulovirusni vektori, ili vektori veštačkog hromozoma kao što su bakterijski veštački hromozomi (BAC), veštački hromozomi kvasca (YAC), ili PI veštački hromozomi (PAC). Pomenuti vektori uključuju ekspresiju kao i klonirajuće vektore. Ekspresioni vektori sadrže plazmide kao i virusne vektore i generalno sadrže željenu kodirajuću sekvencu i odgovarajuće DNK sekvence neophodne za ekspresiju operativno vezane kodirajuće sekvence u određenom organizmu domaćinu (npr., bakterija, kvasac, biljka, insekt, ili sisar) ili u in vitro ekspresionim sistemima. Klonirajući vektori su generalno korišćeni za konstrukciju i umnožavanje određenih željenih DNK fragmenata i mogu im nedostajati funkcionalne sekvence potrebne za ekspresiju željenih DNK fragmenata.

[0100] U kontekstu predmetnog pronalaska, termin "RNK" se odnosi na molekul koji sadrži ostatke ribonukleotida i poželjno je u celini ili u značajnom stepenu sastavljen od ribonukleotidnih ostataka. "Ribonukleotid" se odnosi na nukleotid sa hidroksilnom grupom na 2’-položaju β-D-ribofutanozil grupe. Termin uključuje dvolančanu RNK, jednolančanu RNK, izolovanu RNK kao što je delimično prečišćena RNK, suštinski čista RNK, sintetička RNK, rekombinatno proizvedena RNK, kao i modifikovana RNK koja se razlikuje od prirodne RNK u adiciji, deleciji, supstituciji i/ili izmeni jednog ili više nukleotida. Takve izmene mogu uključivati dodavanje ne-nukleotidnog materijala, kao što je na kraj(eve) RNK ili interno, na primer na jednom ili više nukleotida RNK. Nukleotidi u molekulima RNK mogu takođe sadržati ne-standardne nukleotide, kao što su nukleotidi koji se ne javljaju u prirodi ili hemijski sintetisani nukleotidi dezoksinukleotidi. Ove izmenjene RNK se mogu označiti kao analozi ili analozi prirodnih RNK.

[0101] Prema predmetnom pronalasku, termin "RNK" uključuje i poželjno se odnosi na "iRNK" koja označava "informacionu RNK" i odnosi se na "transkript" koji se može proizvesti korišćenjem DNK kao šablona i kodira peptid ili protein. iRNK tipično sadrži 5’ netranslatirani region (5’-UTR), kodirajući region za protein ili peptid i 3’ neprevedeni region iRNK ima ograničen polu-život u ćelijama i in vitro. Poželjno, iRNK je proizvedena in vitro transkripcijom korišćenjem DNK šablona. U jednom primeru izvođenja pronalaska, RNK je dobijena in vitro transkripcijom ili hemijskom sintezom. Metodologija in vitro transkripcije je poznata stručnjaku. Na primer, postoje komercijalno dostupni različiti in vitro transkripcioni kompleti.

[0102] U kontekstu predmetnog pronalaska, termin "transkripcija" se odnosi na proces, gde je genetički kod u DNK sekvenci prepisan u RNK. Nakon toga, RNK se može prevesti u protein. Prema predmetnom pronalasku, termin "transkripcija" sadrži "in vitro transkripciju".

[0103] Termin "in vitro transkripcija" se odnosi na proces gde RNK, naročito iRNK, je in vitro sintetisana u sistemu bez ćelije, poželjno korišćenjem odgovarajućih ekstrakata ćelija. Poželjno, klonirajući vektori su primenjeni za stvaranje transkripata. Klonirajući vektori su generalno označeni kao transkripcioni vektori i prema predmetnom pronalasku su obuhvaćeni terminom "vektor". Prema predmetnom pronalasku, RNK se može dobiti in vitro transkripcijom odgovarajućeg DNK šablona. Promotor za kontrolu transkripcije može biti bilo koji promotor za bilo koju RNK polimerazu. Naročiti primeri RNK polimeraza su T7, T3, i SP6 RNK polimeraze. DNK šablon za in vitro transkripciju može se dobiti kloniranjem nukleinske kiseline, naročito cDNK, i njenom introdukcijom u odgovarajući vektor za in vitro transkripciju. cDNK se može dobiti reverznom transkripcijom RNK. Poželjno su klonirajući vektori korišćeni za proizvodnju transkripata koji su generalno označeni kao transkripcioni vektori.

[0104] Termin "ekspresija" je ovde korišćen u svom najširem smislu i sadrži proizvodnju RNK i/ili proteina ili peptida. U odnosu na RNK, termin "ekspresija" ili "translacija" odnosi se naročito na proizvodnju peptida ili proteina. Ekspresija može biti prolazna ili može biti stabilna. Prema pronalasku, termin ekspresija takođe uključuje "aberantnu ekspresiju" ili "abnormalnu ekspresiju".

[0105] "Aberantna ekspresija" ili "abnormalna ekspresija" prema pronalasku označava da je ekspresija izmenjena, poželjno povećana, u poređenju sa referentnom, npr. stanjem kod subjekta koji nema bolest povezanu sa aberantnom ili abnormalnom ekspresijom određenog proteina, npr., tumor antigena. Povećanje u ekspresiji odnosi se na povećanje za najmanje 10%, naročito najmanje 20%, najmanje 50% ili najmanje 100%, ili više. U jednom primeru izvođenja, ekspresija je pronađena samo u obolelom tkivu, dok je ekspresija u zdravom tkivu suzbijena.

[0106] Termin "specifično eksprimiran" označava da je protein suštinski eksprimiran samo u specifičnom tkivu ili organu. Na primer, tumor antigen specifično eksprimiran u mukozi želudca označava da je pomenuti protein primarno eksprimiran u mukozi želudca i nije eksprimiran u drugim tkivima ili nije eksprimiran u značajnom stepenu u drugom tkivu ili tipu organa. Stoga, protein koji je ekskluzivno eksprimiran u ćelijama mukoze želudca i u značajno manjem stepenu u bilo kom drugom tkivu, kao što je testis, je specifično eksprimiran u ćelijama mukoze želudca. U nekim primerima izvođenja, tumor antigen može takođe biti specifično eksprimiran pod normalnim uslovima u više od jednog tipa tkiva ili organa, kao što je u 2 ili 3 tipa tkiva ili organa, ali poželjno u ne više od 3 različita tkiva ili tipa organa. U ovom slučaju, tumor antigen je onda specifično eksprimiran u ovim organima. Na primer, ukoliko je tumor antigen eksprimiran u normalanim uslovima poželjno u približno istom stepenu u plućima i želudcu, pomenuti tumor antigen je specifično eksprimiran u plućima i želudcu.

[0107] Termin "translacija" prema pronalasku odnosi se na proces u ribozomima ćelije kojim lanac informacione RNK upravlja sastavljanjem aminokiselinske sekvence da bi se stvorio protein ili peptid.

[0108] Prema pronalasku, termin "RNK koja kodira" označava da RNK, ukoliko je prisutna u odgovarajućem okriuženju, poželjno unutar ćelije, kao što je antigen-prikazujuća ćelija, naročito dendritska ćelija, može biti eksprimirana da proizvede protein ili peptid koji kodira.

[0109] Prema pronalasku, stabilnost i efikasnost translacije RNK mogu se modifikovati po potrebi. Termin "modifikacija" u kontekstu RNK kao što je korišćeno u skladu sa predmetnim pronalaskom uključuje bilo koju modifikaciju RNK koja nije prirodno prisutna u pomenutoj RNK.

[0110] U jednom primeru izvođenja pronalaska, RNK korišćena prema pronalasku nema nekapovane 5’-trifosfate. Uklanjanje takvih nekapovanih 5’-trifosfata može se postići tretiranjem RNK sa fofatazom.

[0111] RNK prema pronalasku mogu biti modifikovani ribonukleotidi da bi se povećala njena stabilnost i/ili smanjila citotoksičnost. Na primer, u jednom primeru izvođenja, u RNK korišćenoj prema pronalasku 5-metilcitidin je supstituisan delimično ili potpuno, poželjno kompletno, sa citidinom. Alternativno ili dodatno, u jednom primeru izvođenja, u RNK korišćenoj prema pronalasku pseudouridin je supstituisan delimično ili potpuno, poželjno potpuno, sa uridinom.

[0112] U jednom primeru izvođenja, termin "modifikacija" odnosi se na obezbeđivanje RNK sa 5’-kap ili 5’-kap analogom. Termin "5’-kap" odnosi se na kap strukturu koja se nalazi na 5’-kraju iRNK molekula i generalno se sastoji od guanozin nukelotida povezanog sa iRNK preko neuobičajene 5’ sa 5’ trifosfat vezom. U jednom primeru izvođenja, ovaj guanidin je metilovan na 7-položaju. Termin "konvencionalni 5’-kap" odnosi se na prirodni RNK 5’-kap, poželjno na 7-metilguanozin kap (m7G). U kontekstu predmetnog pronalaska, termin "5’-kap" uključuje 5’-cap analog koji podseća na RNK kap strukturu i modifikovan je da poseduje sposobnost da stabilizuje RNK i/ili pojača translaciju RNK ukoliko je zakačen za nju, poželjno in vivo i/ili u ćeliji.

[0113] Poželjno, 5’ kraj RNK uključuje kap strukturu koja ima sledeću opštu formulu:

naznačeno time da su R1i R2nezavisno hidroksi ili metoksi i W-, X- i Y- su nezavisno kiseonik, sumpor, selen, ili BH3. U poželjnom primeru izvođenja, R1i R2su hidroksi i W-, X-i Y- su kiseonik. U sledećem poželjnom primeru izvođenja, jedan od R1i R2, poželjno R1je hidroksi i drugi je metoksi i W-, X- i Y- su kiseonik. U sledećem poželjnom primeru izvođenja, R1i R2su hidroksi i jedan od W-, X- i Y-, poželjno X- je sumpor, selen, ili BH3, poželjno sumpor, dok su drugi kiseonik. U sledećem poželjnom primeru izvođenja, jedan od R1i R2, poželjno R2je hidroksi i drugi je metoksi i jedan od W-, X- i Y-, poželjno X- je sumpor, selen, ili BH3, poželjno sumpor dok su drugi kiseonik.

[0114] U prethodnoj formuli, nukleotid na desnoj strani je povezan sa RNK lancem preko njegove 3’ grupe.

[0115] Obezbeđivanje RNK sa 5’-kap ili 5’-kap analogom može se postići sa in vitro transkripcijom DNK šablona u prisustvu pomenutog 5’-kap ili 5’-kap analoga, naznačeno time da 5’-kap je co-transkripciono uključen u stvoreni RNK lanac, ili RNK se može stvoriti, na primer, in vitro transkripcijom, i 5’-kap može biti zakačen za RNK post-transkripciono korišćenjem kaping enzima, na primer, kaping enzima vakcinija virusa.

[0116] RNK može sadržati dodatne modifikacije. Na primer, dodatna modifikacija RNK korišćena u predmetnom pronalasku može biti ekstenzija ili skraćivanje prirodnog poli(A) repa ili izmena 5’- ili 3’-neprevedenih regiona (UTR) kao što je introdukcija UTR koji nije srodan kodirajućem regionu pomenute RNK, na primer, zamena postojećeg 3’-UTR sa ili insercija jedne ili više, poželjno dve kopije 3’-UTR izvedene iz globin gena, kao što je alfa2-globin, alfal-globin, beta-globin, poželjno beta-globin, poželjnije humani beta-globin.

[0117] RNK koja ima nemaskiranu poli-A sekvencu je translatirana efikasnije od RNK koja ima maskiranu poli-A sekvencu.

[0118] Termin "poly(A) rep" ili "poli-A sekvenca" odnosi se na sekvencu adenil (A) ostatke koji se tipično nalaze na 3’-kraju RNK molekula i "nemaskirana poli-A sekvenca" označava da poli-A sekvenca na 3’ kraju RNK molekula se završava sa poli-A sekvence i nije praćena nukleotidima koji su različiti od smeštenih na 3’ kraju, tj. nishodno, od poli-A sekvence. Dodatno, dugačka poli-A sekvenca od oko 120 baznih parova rezultuje u optimalnoj stabilnosti transkripta i efikasnosti translacije RNK.

[0119] Stoga, da bi se povećala stabilnost i/ili ekspresija RNK korišćene prema predmetnom pronalasku, ona se može modifikovati tako da bude prisutna zajedno sa poli-A sekvencom, poželjno sa dužinom od 10 do 500, poželjnije 30 do 300, još poželjnije 65 do 200 i naročito 100 do 150 adenozin ostataka. U naročito poželjnom primeru izvođenja poli-A sekvenca ima dužinu od približno 120 adenozinskih ostataka. Da bi se dodatno povećala stabilnost i/ili ekspresija RNK korišćene prema pronalasku, poli-A sekvenca može biti nemaskirana.

[0120] Dodatno, inkorporacija 3’-ne prevedenog regiona (UTR) u 3’-neprevedeni region RNK molekula može rezultovati u pojačanju efikasnosti translacije. Sinergistički efekat se može postići inkorporacijom dva ili više takvih 3’-neprevedenih regiona. 3’-ne prevedeni regioni autologni ili heterologni sa RNK u koju su introdukovani. U jednom naročitom primeru izvođenja 3’-neprevedeni region je izveden iz humanog β-globin gena.

[0121] Kombinacija prethodno opisanih modifikacija, tj. inkorporacije poli-A sekvence, demaskiranja poli-A sekvence i inkorporacije jednog ili više 3’-neprevedenih regiona, ima sinergistički uticaj na stabilnost RNK i povećanje efikasnosti translacije.

[0122] Da bi se povećala ekspresija RNK korišćene prema predmetnom pronalasku, ona može biti modifikovana unutar kodirajućeg regiona, tj. sekvence koja kodira eksprimirani peptid ili protein, poželjno bez izmene sekvence eksprimiranog peptida ili proteina, da bi se povećao GC-sadržaj da bi se povećala stabilnost iRNK i da bi se izvela optimizacija kodona i, stoga, pojačala translacija u ćelijama.

[0123] Termin "stabilnost" RNK odnosi se na "polu-život" RNK. "Polu-život" odnosi se na vremenski period koji je potreban za eliminisanje polovine aktivnosti, količine, ili broja molekula. U kontekstu predmetnog pronalaska, polu-život RNK je indikativan za stabilnost pomenute RNK. Polu-život RNK može uticati na "dužinu ekspresije" RNK. Može se očekivati da će RNK koja ima dugačak polu-život biti eksprimirana produženi vremenski period.

[0124] Naravno, ukoliko prema predmetnom pronalasku je poželjno da se smanji stabilnost i/ili efikasnost translacije RNK, moguće je miodifikovati RNK tako da se utiče na funkciju elemenata kao što je prethodno opisano prethodno za povećanje stabilnosti i/ili efikasnosti translacije RNK.

[0125] Prosečan "prečnik" ili "veličina" nanočestica opisanih ovde je generalno "veličina dizajna" ili nameravana veličina nanočestica pripremljenih prema ustanovljenom procesu. Veličina može biti direktno merena dimenzija, kao što je prosečan ili maksimalni prečnik, ili se može odrediti indirektnim testom kao što je test filtracionog skrininga. Direktno merenje veličine čestica je tipično izvedeno dinamičkim rasipanjem svetlosti. Često, rezultati merenja dinamičkog rasipanja svetlosti su izraženi u terminima Zaverage(mera za prosečnu veličinu) i indeksu polidisperznosti, PI ili PDI (merea polidisperznosti). Kako se minorna varijacija u veličini javlja tokom procesa proizvodnje, varijacija do 40% navedene mere je prihvatljiva i smatra se da je unutar navedene veličine. Alternativno, veličina može biti određena testom filtracionog skrininga. Na primer, preparat čestice je manji od navedene veličine, ukoliko najmanje 97% čestica prođe filter "skrining tipa" navedene veličine.

[0126] Poželjno, RNK ukoliko je isporučena u, tj. transfektovana u, ćeliju, naročito ćeliju prisutnu in vivo, kao što je dendritska ćelija, eksprimira protein, peptid ili antigen koji kodira.

[0127] Termin "transfekcija" odnosi se na introdukciju nukleinskih kiselina, naročito RNK, u ćeliju. Za svrhe predmetnog pronalaska, termin "transfektovanje" takođe uključuje introdukciju nukleinske kiseline u ćeliju kao što je antigen-prikazujuća ćelija ili usvajanje nukelinske kiseline od strane takve ćelije, naznačeno time da ćelija može biti prisutna u subjektu, npr., pacijentu.

[0128] Prema pronlasku poželjno je da introdukcija RNK koja kodira antigen u ćelije rezultuje u ekspresiji pomenutog antigena.

[0129] Termin "peptid" prema pronalasku sadrži oligo- i polipeptide i odnosi se na supstance koje sadrže dve ili više, poželjno 3 ili više, poželjno 4 ili više, poželjno 6 ili više, poželjno 8 ili više, poželjno 9 ili više, poželjno 10 ili više, poželjno 13 ili više, poželjno 16 ili više, poželjno 21 ili više i poželjno do 8, 10, 20, 30, 40 ili 50, naročito 100 aminokiselina kovalentno spojenih peptidnim vezama. Termin "protein" se odnosi na velike peptide, poželjno na peptide sa više od 100 aminokiselinskih ostataka, ali u opštem smislu "peptidi" i "proteini" su sinonimi i ovde su naizmenično korišćeni.

[0130] Termin "ćelija" poželjno je intaktna ćelija, tj. ćelija sa intaktnom membranom koja još nije oslobodila svoje normalne intraćelijske komponente kao što su enzimi, organele, ili gentički materijal. Intaktna ćelija poželjno je vijabilna ćelija, tj. živa ćelija sposobna da izvodi svoje normalne metaboličke funkcije. Poželjno pomenuti termin se odnosi prema pronalasku na bilo koju ćeliju koja se može transfektovati sa egzogenom nukleinskom kiselinom. Termin "ćelija" uključuje prema pronalasku prokariotske ćelije (npr., E. coli) ili eukariotske ćelije (npr., dendritske ćelije, B ćelije, CHO ćelije, COS ćelije, K562 ćelije, HEK293 ćelije, HELA ćelije, ćelije kvasca, i ćelije insekta). Egzogena nukleinska kiselina može se naći unutar ćelije (i) slobodno dispergovana kao takva, (ii) inkorporisana u rekombinatni vektor, ili (iii) integrisana u genom ćelije domaćina ili mitohondrijalnu DNK. Ćelije sisara su naročito poželjne, kao što su ćelije iz ljudi, miševa, hrčaka, svinja, koza, i primata. Ćelije se mogu izvesti iz velikog broja tipova tkiva i uključuju primarne ćelije i ćelijske linije. Specifični primeri uključuju keratinocite, leukocite periferne krvi, matične ćelije kostne srži, i embrionalne matične ćelije. U dodatnim primerima izvođenja, ćelija je antigen-prikazujuća ćelija, naročito dendritska ćelija, monocit, ili makrofag.

[0131] Kao što je ovde korišćeno, termin "nanočestica" odnosi se na bilo koju česticu koja ima prečnik koji je čini pogodnom za sistemsku, naročito parenteralnu, primenu, naročito, nukleinskih kiselina, tipično prečnik manji od 1000 nanometara (nm). U nekim primerima izvođenja, nanočestica ima prečnik manji od 600 nm. u nekim primerima izvođenja, nanočestica ima prečnik manji od 400 nm.

[0132] Kao što je ovde korišćeno, termin "formulacija nanočestica" ili slični termini odnose se na bilo koju supstancu koja sadrži najmanje jednu nanočesticu. U nekim primerima izvođenja, kompozicija nanočestica je uniformni skup nanočestica. U nekim primerima izvođenja, kompozicije nanočestica su dipserzije ili emulzije. Generalno, disperzija ili emulzija je formirana kada su kombinovana najmanje dva materijala koja se ne mešaju.

[0133] Termin, "lipopleks" ili "RNK lipopleks" se odnosi na kompleks lipida i nuklenskih kiselina kao što je RNK. Lipopleksi se formiraju spontano kada su katjonski lipozomi, koji takođe uključuju neutralni "pomoćni" lipid, pomešani sa nukleinskim kiselinama.

[0134] Zeta potencijal je naučni naziv za elektrokinetički potencijal u koloidnim sistemima. Sa teorijske tačke gledišta, zeta potencijal je električni potencijal u interfejsnom dvostrukom sloju na mestu klizajuće površine nasuprot tačke u masi fuida udaljenoj od interfejsa. Drugim rečima, zeta potencijal je razlika potencijala između disperzionog medijuma i stacionarnog sloja fluida vezanog za dispergovanu česticu. Zeta potencijal je u širokoj uportebi za kvantifikaciju veličine električnog naboja na dvostrukom sloju.

[0135] Zeta potencijal se može izračunati korišćenjem teoretskih modela i eksperimentalno određenih vrednosti elektroforetičke pokretljivosti ili dinamičke elektroforetičke pokretljivosti. Elektrokinetički fenomen i elektroakustični fenomen su obično izvori podataka za izračunavanje zeta potencijala.

[0136] Elektroforeza se može koristiti za procenu zeta potencijala čestica. U praksi, zeta potencijal disperzije se može meriti primenom električnog polja u disperziji. Čestice unutar disperzije sa zeta potencijalom će migrirati prema elektrodi suprotnog naelektrisanja sa brzinom proporcionalnom veličini zeta potencijala. Ova brzina se može meriti korišćenjem tehnike laser Doppler anemometra. Pomeranje učestalosti ili pomeranje faze incidentnog laserskog zraka izazvano od strane ovih pokretnih čestica može se meriti kao pokretljivost čestica, i ova pokretljivost se može pretvoriti u zeta potencijal ubacivanjem viskoznosti disperzanta i dielektrične propustljivosti, i primenom Smoluchowski teorija.

[0137] Elektroforetska brzina je proporcionalna elektroforetskoj pokretljivosti, koja je parametar koji se može meriti. Postoji nekoliko teorija koje povezuju elektroforetsku pokretljivost sa zeta potencijalom.

[0138] Pogodni sistemi kao što je Nicomp 380 ZLS sistem može se koristit za određivanje zeta potencijala. Takvi sistemi obično mere elktroforetsku pokretljivost i stabilnost naelektrisanih čestica u tečnoj suspenziji. Ove vrednosti su prediktor odbojnih sila koje vrše čestice u suspenziji i direkno su povezane sa stabilnošću koloidnog sistema. Zeta potencijal se može meriti prema protokolu kao što je opisano u nastavku.

[0139] Električni naboj je fizička osobina koja uzrokuje da materija doživi silu kada je blizu druge materije sa električnim nabojem. Postoje dva tipa električnog naboja, nazvani pozitivni i negativni. Naelektrisane čestice čiji naboji imaju isti znak međusobno se odbijaju, i čestice sa različitim znacima se privlače.

[0140] Električni naboj makroskopskog objekta kao što je čestica je zbir električnih naboja čestica koje ga čine. Nanočestice opisane ovde mogu imati jednak broj pozitivnih i negativnih naboja, u kom slučaju se njihovi naboji potiru, dajući neto naboj od nula, čime čine nanočestice neutralnim. Neto naboj je naboj na celom objektu kao što je jedinjenje.

[0141] Jon koji ima ukupni neto naboj pozitivan je katjon dok jon koji ima ukupni neto naboj negativan je anjon.

[0142] Nanočestice opisane ovde mogu se formirati podešavanjem pozitivnog u negativni naboj, u zavisnosti od (+/-) odnosa naboja katjonskog lipida i RNK i mešanja RNK i katjonskog lipida. /- odnos naboja katjonskog lipida i RNK u nanočesticama opisan ovde može se izračunati sledećom jednačinom. (+/- odnos naboja)=[(količina katjonskog lipida (mol)) * (ukupan broj pozitivnog naboja u katjonskom lipidu)]:[(RNK količina (mol)) *(ukupan broj negativnih naboja u RNK)]. Količina RNK i količina katjonskog lipida mogu se lako odrediti od strane stručnjaka u pogledu količina za punjnje pri pripremanju nanočestica.

[0143] Ukoliko se predmetni pronalazak odnosi na naboj kao što je pozitivni naboj, negativni naboj ili neutralni naboj ili katjonsko jedinjenje, negativno jedinjenje ili neutralno jedinjenje to generalno znači da je spomenuti naboj prisutan na izabranoj pH, kao što je fiziološka pH. Na primer, termin "katjonski lipid" označava lipid koji ima neto pozitivni naboj na izabranoj pH, kao što je fiziološka pH. Termin "neutralni lipid" označava lipid koji nema neto pozitivni ili negativni naboj i može biti prisutan u obliku nenaelektrisanog ili neutralnog amfoternog jona na izabranoj pH, kao što je fiziološka pH. Pod "fiziološkom pH" ovde je označena pH od oko 7.5.

[0144] Nanočestični nosači kao što su lipidni nosači uključuju bilo koje supstance ili vehikulume sa kojima se može povezati RNK, npr. formiranjem kompleksa sa RNK ili formiranjem vezikula u kojima je zatvorena ili inkapsulirana RNK. Ovo može rezultovati u povećanoj stabilnosti RNK u poređenju sa golom RNK. Naročito, stabilnost RNK u krvi može biti povećana.

[0145] Katjonski lipidi, katjonski polimeri i druge supstance sa pozitivnim nabojem mogu formirati komplekse sa negativno naelektrisanim nukleinskim kiselinama. Ovi katjonski molekuli se mogu koristiti za formiranje kompleksa nukleinskih kiselina, čime se formiraju npr. takozvani lipopleksi ili polipleksi, respektivno, i pokazano je da ovi kompleksi isporučuju nukleinske kiseline u ćelije.

[0146] Nanočestični RNK preparati mogu se dobiti različitim protokolima i od različitih RNK kompleksujućih jedinjenja. Lipidi, polimeri, oligomeri, ili amfifili su tipično kompleksujuća sredstva. U jednom primeru izvođenja, kompleksujuće jedinjejne sadrži najmanje jedno sredstvo izabrano iz grupe koja sadrži protamin, polietilenimin, poli-L-lizin, poli-L-arginin ili histon.

[0147] Protamin je koristan kao katjonsko nosačko sredstvo. Termin "protamin" odnosi se na bilo koji od različitih jako bazih proteina relativno niske molekulske težine koji su bogati argininom i nalaze se povezani naročito sa DNK umesto somatskih histona u ćelijama sperme različitih životinja (kao što su ribe). Naročito, termin "protamin" odnosi se na protein koji se nalazi u spermi riba koji je jako bazni, rastvorljivi u vodi, ne koagulišu pri zagrevanju, i daju uglavnom arginin nakon hidrolize. U prečišćenom obliku, korišćeni su formulacijama insulina sa dugotrajnim dejstvom i za neutralizaciju antikoagulantnih efekata heparina.

[0148] Termin "protamin" kao što je ovde korišćeno je nameravano da sadrži bilo koju aminokiselinsku sekvencu protamina dobijenu ili isporučenu iz nativnih ili bioloških izvora uključujući njihove fragmente i multimerne oblike pomenute aminokiselinske sekvence ili njenog fragmenta. Dodatno, termin obuhvata (sintetisane) polipeptide koji su veštački i specifično dizajnirani za specifične svrhe i ne mogu se izolovati iz nativnih ili bioloških izvora.

[0149] Protamin može biti sulfonovani protamin ili hidrohloridni protamin. U poželjnom primeru izvođenja, izvor protamina korišćen za proizvodnju nanočestica opisanih ovde je protamin 5000 koji sadrži protamin sa više od 10 mg/ml (5000 heparin-neutralizujućih jedinica po ml) u izotoničnom rastvoru soli.

[0150] Lipozomi su mikroskopske lipidne vezikule koje često imaju jedan ili više dvosloja lipida koji formiraju vezikulu, kao što je fosfolipid, i sposobni su da inkapsuliraju lek. Različiti tipovi lipozoma mogu se upotrebiti u kontekstu predmetnog pronalaska, uključujući, bez ograničenja na, višeslojne vezikule (MLV), male jednoslojne vezikule (SUV), velike jednoslojne vezikule (LUV), sterički stabilizovane lipozome (SSL), višeslojne vezikule (MV), i velike višeslojne vezikule (LMV) kao i druge dvoslojne oblike poznate u tehnici. Veličina i slojevitost lipozoma zavisiće od načina pripreme i izbor tipa vezikule koji će se koristiti zavisiće od poželjnog načina primene. Postoji nekoliko drugih oblika supramolekulske organizacije u kojima lipidi mogu biti prisutni u vodenom medijumu, sadržavajući lamelarne faze, heksagonalne i inverzno heksagonalne faze, kubne faze, micele, reverzne micele sastavljene od monoslojeva. Ove faze se mogu takođe dobiti u kombinaciji sa DNK ili RNK, i interakcija sa RNK i DNK može značajno uticati na stanje faze. Opisane faze mogu biti prisutne u nanočestičnim RNK formulacijama opisanim ovde.

[0151] Za formiranje RNK lipopleksa od RNK i lipozoma, može se koristiti bilo koji pogodni postupak formiranja lipozoma sve dok obezbeđuje predviđene RNK lipoplekse. Lipozomi se mogu formirati koiršćenjem standardnih postupaka reverznog uparavanja (REV), postupka injekcije etanola, postupka dehidratacije-rehidratacije (DRV), obrade ultrazvukom ili drugi pogodni postupci.

[0152] Nakon formiranja lipozoma, lipozomima se može podesiti veličina da bi se dobila populacija lipozoma koji imaju suštinski homogen opseg veličina.

[0153] Lipidi koji formiraju dvosloj imaju tipično dva ugljvodonična lanca, naročito acil lance, i glavenu grupu, ili polarnu ili nepolarnu. Lipidi koji formiraju dvosloj su ili sastavljeni od prirodnih lipida ili su sintetičkog porekla, uključujući fosfolipide, kao što je fosfatidilholin, fosfatidiletanolamin, fosfatidinska kiselina, fosfatidilinozitol, i sfingomijelin, gde su dva ugljovodonična lanca tipično dužine oko 14-22 atoma ugljenika, i imaju različite stepene nezasićenosti. Drugi pogodni lipidi za upotrebu u kompoziciji opisanoj ovde uključuju glikolipide i sterole kao što je holesterol i njegovi različiti analozi koji se takođe mogu koristiti u lipozomima.

[0154] Katjonski lipidi tipično imaju lipofilnu grupu, kao što je sterol, acil ili diacil lanac, i imaju ukupni neto pozitivni naboj. Glavena grupa lipida tipično nosi pozitivni naboj. Katjonski lipid poželjno ima pozitivni naboj od 1 do 10 valenci, poželjnije pozitivni naboj od 1 do 3 valence, i poželjnije pozitivninaboj od 1 valence. Primeri katjonskih lipida uključuju, ali nisu ograničeni na 1,2-di-O-oktadecenil-3-trimetilamonijum propan (DOTMA); dimetildioktadecilamonijum (DDAB); 1,2-dioleoil-3-trimetilamonijum-propan (DOTAP); 1,2-dioleoil-3-dimetilamonijum-propan (DODAP); 1,2-diaciloksi-3-dimetilamonijum propani; 1,2-dialkiloksi-3-dimetilamonijum propani; dioktadecildimetil amonijum hlorid (DODAC), 1,2-dimiristoiloksipropil-1,3-dimetilhidroksietil amonijum (DMRIE), i 2,3-dioleoiloksi-N-[2(sperminkarboksamid)etil]-N,N-dimetil-1-propanamium trifluoroacetat (DOSPA). Poželjni su DOTMA, DOTAP, DODAC, i DOSPA. Najpoželjniji je DOTMA.

[0155] Dodatno, nanočestice opisane ovde poželjno dodatno uključuju neutralne lipide u pogledu strukturne stabilnosti i slično. Neutralni lipid može biti odgovarajuće izabran u pogledu efikasnosti isporuke RNK-lipid kompleksa. Primeri neutralnih lipida uključuju, ali nisu ograničeni na, 1,2-di-(9Z-oktadecenoil)-sn-glicero-3-fosfoetanolamin (DOPE), 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoholin (DOPC), diacilfosfatidil holin, diacilfosfatidil etanol amin, ceramid, sfingomijelin, cefalin, sterol, i cerebrozid. Poželjan je DOPE i/ili DOPC. Najpoželjniji je DOPE. U slučaju gde katjonski lipozom uključuje i katjonski lipid i neutralni lipid, molarni odnos katjonskog lipida prema neutralnom lipidu može se odgovarajuće odrediti u pogledu stabilnosti lipozoma i slično.

[0156] Prema jednom primeru izvođenja, nanočestice opisane ovde mogu sadržati fosfolipide. Fosfolipidi mogu biti glicerofosfolipidi. Primeri glicerofosfolipida uključuju, bez ograničavanja na njih, tri tipa lipida: (i) cviterjonski fosfolipidi, koji uključuju, na primer, fosfatidilholin (PC), fosfatidilholin iz žumanceta, PC izveden iz soje u prirodnom, delimično ili potpuno hidrogenizovanom obliku, dimiristoil fosfatidilholin (DMPC) sfingomijelin (SM); (ii) fosfolipidi negativnog naboja: koji uključuju, na primer, fosfatidilserin (PS), fosfatidilinozitol (PI), fosfatidinsku kiselinu (PA), fosfatidilglicerol (PG) dipalmitoil PG, dimiristoil fosfatidilglicerol (DMPG); sintetičke derivate u kojima konjugat čini cviterjonski fosfolipid negativno naelektrisan kakav je slučaj sa metoksi-polietilen, glikol-distearoil fosfatidiletanolamin (mPEG-DSPE); i (iii) katjonske fosfolipide, koji uključuju, na primer, fosfatidilholin ili sfingomijelin od kojih fosfomonoestar je bio O-metilovan da bi formirao katjonske lipide.

[0157] Vezivanje RNK sa lipidnim nosačem može se javiti, na primer, sa RNK koja popunjava intersticijalne prostore nosača, tako da nosač fizički zarobljava RNK, ili sa kovalentnim, jonskim, ili vodoničnim vezama, ili sa adsorpcijom sa nespecifičnim vezama. Bilo koji da je postupak vezivanja, RNK mora zadržati svoje terapeutske, tj. antigenkodirajuće, osobine.

[0158] "Indeks polidisperzije" je mera homogenosti ili heterogenosti distribucije veličine individualnih čestica kao što su lipozomi u smeši čestica i ukazuju na širinu distribucije čestica u smeši. PI se može odrediti, na primer, kao što je ovde opisano.

[0159] Kao što je ovde korišćeno, namera je termin da "bivalentni katjon" označava pozitivno naelektrisani element, atom ili molekul koji ima naelektrisanje od plus 2. Termin uključuje jone metala kao što su Ca<2+>, Zn<2+>, Mn<2+>, Mg<2+>, Fe<2+>, Co<2+>, Ni<2+>i/ili Cu<2+>. Bivalentni katjoni prema pronalasku takođe uključuju oblike soli jona. Specifični primeri bivalentne soli uključuju CaCl2, ZnCl2, MnSO4, MnCl2i MgCl2i druge kombinacije prethodnih primera dvovalentnih katjona u obliku soli sa, na primer, hloridom (CI), sulfatom (SO4), acetatom i/ili fosfatom. Bivalentni katjoni i oblici soli različiti od onih prethodno datih kao primer su dobro poznati u tehnici i uključeni u značenje termina kao što je ovde korišćeno.

[0160] Termin "monovalentni jon" uključuje katjon koji ima naelektrisanje od plus 1. Tipično, termin uključuje alkalne metale kao što je litijum, natrijum, kalijum, rubidijum, i cezijum.

[0161] Termin "deo" odnosi se na frakciju. U odnosu na određenu strukturu kao što je aminokiselinska sekvenca ili protein termin njegov "deo" može označavati neprekidnu ili diskontinuiranu frakciju pomenute strukture. Poželjno, deo aminokiselinske sekvence sadrži najmanje 1%, najmanje 5%, najmanje 10%, najmanje 20%, najmanje 30%, poželjno najmanje 40%, poželjno najmanje 50%, poželjnije najmanje 60%, poželjnije najmanje 70%, još poželjnije najmanje 80%, i najpoželjnije najmanje 90% aminokiselina od pomenute aminokiselinske sekvence. Poželjno, ukoliko je deo diskontinuirana frakcija pomenuta diskontinuirana frakcija je sastavljena od 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, ili više delova strukture, pri čemu je svaki deo kontinuirani element strukture. Na primer, diskontinuirana frakcija aminokiselinske sekvence može se sastojati od 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, ili više, poželjno ne više od 4 delova pomenute aminokiselinske sekvence, naznačeno time da svaki deo poželjno sadrži najmanje 5 kontinuiranih aminokiselina, najmanje 10 kontinuiranih aminokiselina, poželjno najmanje 20 kontinuiranih aminokiselina, poželjno najmanje 30 kontinuiranih aminokiselina od aminokiselinske sekvence.

[0162] Termini "deo" i "fragment" su ovde korišćeni naizmenično i odnose se na neprekidni element. Na primer, deo strukture kao što je aminokiselinska sekvenca ili protein odnosi se na kontinuirani element pomenute strukture. Deo, ili fragment strukture poželjno sadrži jednu ili više funkcionalnih osobina pomenute strukture. Na primer, deo, ili fragment epitopa, peptida ili proteina je poželjno imunološki ekvivalentan epitopu, peptidu ili proteinu iz kojeg je izveden. U kontekstu predmetnog pronalaska, "deo" strukture kao što je aminokiselinska sekvenca poželjno sadrži, poželjno se sastoji od najmanje 10%, najmanje 20%, najmanje 30%, najmanje 40%, najmanje 50%, najmanje 60%, najmanje 70%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 92%, najmanje 94%, najmanje 96%, najmanje 98%, najmanje 99% cele strukture ili aminokiselinske sekvence.

[0163] "Smanjenje" ili "inhibiranje" kao što je ovde korišćeno označava sposobnost da se izazove ukupno smanjenje, poželjno of 5% ili veće, 10% ili veće, 20% ili veće, poželjnije of 50% ili veće, i najpoželjnije od 75% ili veće, u nivou. Termin "inhibiranje" ili slični izrazi uključuje kompletno ili suštinski kompletno inhibiranje, tj. smanjenje do nule ili suštinski do nule.

[0164] Termini kao što je "povećanje" ili "pojačanje" poželjno se odnose na povećanje ili pojačanje oko najmanje 10%, poželjno najmanje 20%, poželjno najmanje 30%, poželjnije najmanje 40%, poželjnije najmanje 50%, even poželjnije najmanje 80%, i najpoželjnije najmanje 100%, najmanje 200%, najmanje 500%, najmanje 1000%, najmanje 10000% ili čak više.

[0165] Sredstva, kompozicije i postupci opisani ovde mogu se koristiti da se tretira subjekat sa bolešću, npr., bolešću koja se karakteriše prisustvom obolelih ćelija koje eksprimiraju antigen i prikazuju peptid antigena. Primeri bolesti koje se mogu tretirati i/ili sprečiti obuhvataju sve bolesti koje eksprimiraju jedan od antigena opisanih ovde. Naročito poželjne su infektivne bolesti kao što su virusne bolesti i bolesti kancera. Sredstva, kompozicije i postupci opisani ovde mogu se takođe koristiti za imunizaciju ili vakcinaciju da bi se sprečila bolest opisana ovde.

[0166] Prema pronalasku, termin "bolest" odnosi se na bilo koje patološko stanje, uključujući infektivne bolesti i bolesti kancera, naročito one oblike infektivnih bolesti i bolesti kancera opisanih ovde.

[0167] Bolest koju bi trebalo tretirati prema pronalasku je poželjno boest koja uključuje antigen. "Bolest koja uključuje antigen" ili slični izraz prema pronalasku označava da je antigen eksprimiran u ćelijama obolelog tkiva ili organa. Ekspresija u ćelijama obolelog tkiva ili organa može se povećati u poređenju sa stanjem kod zdravog tkiva ili organa. U jednom primeru izvođenja, ekspresija se nalazi samo u obolelom tkivu, dok je ekspresija u zdravom tkivu suzbijena. Prema pronalasku, bolesti koje uključuju antigen uključuju infektivne bolesti i bolesti kancera, naznačeno time da antigen povezan sa bolešću je poželjno antigen od infektivnog sredstva i tumor antigen, respektivno. Poželjno bolest koja uključuje antigen je poželjno bolest koja uključuje ćelije koje eksprimiraju antigen i prikazuju antigen u kontekstu MHC molekula, naročito sa klasom I MHC.

[0168] Termini "normalno tkivo" ili "normalni uslovi" odnose se na zdravo tkivo ili uslove kod zdravog subjekta, tj., ne-patološke uslove, naznačeno time da "zdrav" poželjno označava ne-inficiran ili ne-kancerski.

[0169] Kancer ili bolest kancera (medicinski termin: maligna neoplazma) je klasa bolesti u kojoj grupe ćelija pokazuju nekontrolisan rast (deoba iznad normalnih granica), invaziju (upad i destrukciju susednih tkiva), i nekada metastaze (širenje do drugih mesta u telu preko limfe ili krvi). Ove tri maligne osobine kancera razlikuju ih od benignih tumora, koji su sami po sebi ograničeni, i ne vrše invaziju ili metastaziraju. Većina kacera formira tumor, tj. otok ili leziju formiranu abnormalnim rastom ćelija (nazvane neoplastične ćelije ili ćelije tumora), ali neke, kao leukemija, to ne rade. Termin "kancer" prema pronalasku sadrži leukemije, seminome, melanome, teratome, limfome, neuroblastome, gliome, kancer rektuma, endometrjialni kancer, kancer bubrega, kancer nadbubrežne žlezde, kancer tiroidee, kancer krvi, kancer kože, kancer mozga, cervikalni kancer, intestinalni kancer, kancer jetre, kancer debelog creva, kancer želudca, kancer creva, kancer glave i vrata, gastrointestinalni kancer, kancer limfnog čvora, kancer jednjaka, kolorektalni kancer, kancer pankreasa, kancer uha, nosa i grla (ENT), kancer dojke, kancer prostate, kancer uterusa, kancer jajnika i kancer pluća i njihove metastaze. Njihovi primeri su karcinomi pluća, karcinomi dojke, karcinomi prostate, karcinomi debelog creva, karcinomi bubrežnih ćelija, cervikalni karcinomi, ili metastaze prethodno opisanih tipova kancera ili tumora. Termin kancer prema pronalasku takođe sadrži metastaze kancera.

[0170] Primeri kancera koji se mogu tretirati sa farmaceutskim kompozicijama opisanim ovde uključuju maligni melanom, sve tipove karcinoma (debelog creva, ćelija bubrega, mokraćne bešike, prostate, nesitnoćelijski i sitnoćelijski karcinom pluća, itd.), limfome, sarkome, blastome, gliome, itd.

[0171] Maligni melanom je ozbiljan tip kancera kože. Nastaje usled nekontrolisanog rasta pigmentnih ćelija, nazvanih melanociti.

[0172] Prema pronalasku, "karcinom" je maligni tumor izveden iz epitelne ćelije. Ova grupa predstavlja najčešće kancere, uključujući uobičajene oblike kancera dojke, prostate, pluća i debelog creva.

[0173] Limfom i leukemija su maligniteti izvedeni iz hematopetičkih (koje formiraju krv) ćelija.

[0174] Sarkom je kancer koji nastaje od transformisanih ćelija u jednom od brojnih tkiva koja se razvijaju iz embrionalnog mezoderma. Stoga, sarkomi uključuju tumore kostiju, hrskavice, masnog tkiva, mišića, vaskularnog, i hematopoetskog tkiva.

[0175] Blastični tumor ili blastom je tumor (obično maligni) koji podseća na nezrelo ili embrionalno tkivo. Mnogi od ovih tumora su najčešći kod dece.

[0176] Gliom je tip tumora koji počinje u mozgu ili kičmi. Nazvan je gliom jer nastaje od glijalnih ćelija. Najčešće mesto glioma je mozak.

[0177] Pod "metastazom" označeno je širenje ćelija kancera sa njihovog mesta porekla do drugog dela tela. Formiranje metastaza je veoma kompleksan proces i zavisi od odvajanja malignih ćelija od primarnih tumora, invaziju ekstracelularnog matriksa, penetraciju endotelne bazalne membrane da bi ušle u telesne šupljine i sudove, i zatim, nakon što su transportovane krvlju, infiltracije do ciljnih organa. Konačno, rast novog tumora, tj. sekundarnog tumora ili metastaziranog tumora, na ciljnom mestu zavisi od angiogeneze. Metastaze tumora se često dešavaju čak nakon uklanjanja primarnog tumora jer ćelije tumora ili komponente mogu ostati i razviti metastatski potencijal. U jednom primeru izvođenja, termin "metastaza" prema pronalasku odnosi se na "udaljenu metastazu" koja se odnosi na metastazu koja je udaljena od primarnog tumora i regionalnog sistema limfnih čvorova.

[0178] Primeri infektivnih bolesti koje se mogu tretirati farmaceutskim kompozicijama opisanim ovde uključuju virusne infektivne bolesti, kao što je AIDS (HIV), hepatitis A, B ili C, herpes, herpes zoster (varičela), rubeola (rubeola virus), žuta groznica, deng itd. flaviviruse, influenca viruse, hemoragijske infektivne bolesti (Marburg ili Ebola virusi), bakterijske infektivne bolesti, kao što je legionarska bolest (Legionella), čir na želudcu (Helicobacter), kolera (Vibrio), infekcije sa E. coli, Staphylococci, Salmonella ili Streptococci (tetanus); infekcije sa protozojskim patogenima kao što su malarija, bolest spavanja, lejšmanijaza; toksoplazmoza, tj. infekcije sa Plasmodium, Trypanosoma, Leishmania i Toxoplasma; ili gljivične infekcije, koje su izazvane npr. sa Cryptococcus neoformans, Histoplasma capsulatum, Coccidioides immitis, Blastomyces dermatitidis ili Candida albicans).

[0179] Pod "tretiranjem" je označena primena jedinjenja ili kompozicije kao što je opisano ovde na subjekta da bi se sprečila ili eliminisala bolest, uključujući smanjenje veličine tumora ili broja tumora kod subjekta; zaustavljanje ili usporavanje bolesti kod subjekta; inhibiranje ili usporavanje razvoja nove bolesti kod subjekta; smanjenje učlestalosti ili težine simptoma i/ili ponovne pojave kod subjekta koji trenutno ima ili je prethodno imao bolest; i/ili produžavanje, tj. povećanje životnog veka subjekta. Naročito, termin "tretman bolesti" uključuje lečenje, skraćivanje trajanja, ublažavanje, sprečavanje, usporavanje ili inhibiranje napredovanja ili pogoršanja, ili sprečavanje ili odlaganje početka bolesti ili njenih simptoma.

[0180] Termin "imunoterapija" odnosi se na tretaman koji uključuje aktivaciju specifičnog imunog odgovora i/ili imune efektorne funkcije (funkcija). Imunoterapija se može izvesti korišćenjem bilo koje od brojnih tehnika, u kojima sredstva obezbeđena ovde funkcionišu tako da uklanjaju ćelije koje eksprimiraju antigen iz pacijenta. Takvo uklanjanje se dešava kao rezultat pojačanja ili indukovanja imunog odgovora i/ili imune efektorne funkcije (funkcija) kod pacijenta specifičnih za antigen ili ćelije koje eksprimiraju antigen.

[0181] U kontekstu predmentog pronalaska, termini kao što je "zaštita", "sprečavanje", "profilaktički", "preventivni", ili "zaštitni" odnose se na prevenciju ili tretman ili oba od pojave i/ili propagiranja bolesti kod subjekta i, naročito, na minimizovanje verovatnoće da će subjekt razviti bolest ili na odlaganje razvoja bolesti. Na primer, osoba u riziku za kancer biće kandidat za terapiju prevencije kancera.

[0182] Profilaktička primena imunoterapije, na primer, profilaktička primena kompozicije prema pronalasku, poželjno štiti primaoca od razvoja bolesti. Terapeutska primena imunoterapije, na primer, terpaeutska primena kompozicije pronalaska, može dovesti do inhibiranja napredovanja/rasta bolesti. Ovo sadrži usporavanje napredovanja/rasta bolesti, naročito disrupciju napredovanja bolesti, koja poželjno dovodi do eliminacije bolesti.

[0183] Pod "biti u riziku" je podrazumevano da subjekat koji je identifikovan da ima veću od noramlne verovatnoće da razvije bolest, naročito kancer, u poređenju sa opštom populacijom. Dodatno, subjekat koji je imao, ili koij trenutno ima, bolest, naročito kancer je subjekat koji ima povećani rizik za razvoj bolesti, jer takav subjekat može nastaviti da razvija bolest. Subjekti koji trenutno imaju, ili koji su imali, kancer takođe imaju povećani rizik za metastaziranje kancera.

[0184] Sredstva i kompozicije obezbeđeni ovde mogu se koristit zasebno ili u kombinaciji sa konvencionalnim terapeutskim režimima kao što je operacija, zračenja, hemoterapija i/ili transplantacija kostne srži (autologna, singena, alogena ili nesrodna).

[0185] Tretman kancera predstavlja oblast gde su naročito poželjne kombinovane strategije jer često kombinovana aktivnost dva, tri, četiri ili čak više kancer lekova/terapija stvara sinergističke efekte koji su značajno snažniji od uticaja monoterapeutskog pristupa. Stoga, kancer tretman koji koristi imune ili mehanizme zasnovane na vakcinaciji kao što su ovde opisane farmaceutske kompozicije mogu se efikasno kombinovati sa različitim drugim lekovima i/ili postupcima koji ciljno deluju na slične ili druge specifične mehanizme. Među ovima su npr. kombinacije sa konvencionalnim tumor terapijama, strategije multi-epitopa, dodatna imunoterapija, i terapeutski pristupi koji ciljno deluju na angiogenezu ili apoptozu (za pregled videti npr. Andersen et al. 2008: Cancer treatment: combination of vaccination with other therapies. Cancer Immunology Immunotherapy, 57(11): 1735-1743.) Sekvencijalna primena različitih sredstava može inhibirati rast ćelija kancera na različitim kontrolnim tačkama, dok druga sredstva mogu npr. inhibirati neoangiogenezu, preživljavanje maligne ćelije ili metastaze, potencijalno pretvarajući kancer u hroničnu bolest. Sledeći spisak obezbeđuje neke neograničavajuće primere anti-kancer lekova i terapija koje se mogu koristiti u kombinaciji sa predmetnim pronalaskom:

1. Hemoterapija

[0186] Hemoterapija je standard za više tipova kancera. Najčešća hemoterapeutska sredstva deluju ubijanjem ćelija koje se brzo dele, što je jedna od glavnih osobina ćelija kancera. Stoga, kombinacija sa konvencionalnim hemoterapeutskim lekovima kao što su npr. alkilujuća sredstva, antimetaboliti, antraciklini, biljni alkaloidi, inhibitori topoizomeraze, i druga antitumorska sredstva koja ili utiču na deobu ćelija ili DNK sintezu mogu značajno poboljšati terapeutske efekte predmetnog pronalaska čišćenjem supresorskih ćelija, restartovanjem imunog sistema, činjenjem tumorskih ćelija podložnijim imuno posredovanom ubijanju, ili dodatnom aktivacijom ćelija imunog sistema. Sinergističko anti-kancer dejstvo hemoterapeutika i imunoterapijskih lekova zasnovanih na vakcini pokazana je u više studija (videti npr. Quoix et al. 2011: Therapeutic vaccination with TG4010 and first-line chemotherapy in advanced non-small-cell lung cancer: controlled phase 2B trial. Lancet Oncol. 12(12): 1125-33.; videti takođe Liseth et al. 2010: Combination of intensive chemotherapy and anticancer vaccines in treatment of human malignancies: hematological experience. J Biomed Biotechnol. 2010: 6920979; videti takođe Hirooka et al 2009: combination therapy of gemcitabine with immunotherapy for patients with inoperable locally advanced pancreatic cancer. Pancreas 38(3): e69-74). Dostupne su stotine hemoterapeutskih lekova koji su pogodni za kombinovane terapije. Neki (neoganičavajući) primeri hemoterapijskih lekova koji se mogu kombinovati sa predmetnim pronalaskom su karboplatin (Paraplatin), cisplatin (Platinol, Platinol-AQ), ciklofosfamid (Cytoxan, Neosar), docetaksel (Taxotere), doksorubicin (Adriamycin), erlotinib (Tarceva), etoposid (VePesid), fluorouracil (5-FU), gemcitabin (Gemzar), imatinib mezilat (Gleevec), irinotekan (Camptosar), metotreksat (Folex, Mexate, Amethopterin), paklitaksel (Taxol, Abraxane), sorafinib (Nexavar), sunitinib (Sutent), topotekan (Hycamtin), vinkristin (Oncovin, Vincasar PFS), i vinblastin (Velban).

2. Hirurška operacija

[0187] Operacija kancera – operacija za uklanjanje tumora – ostaje temelj tretmana kancera. Operacija se može kombinovati sa drugim tretmanima kancera da bi se uništile bilo koje preostale ćelije timora. Kombinovanje hirurških postupaka sa naknadnim imunoterapeutskim tretmanom je obećavajući pristup koji je pokazan nebrojeno puta.

3. Zračenje

[0188] Terapija zračenjem ostaje važna komponenta tretmana kancera sa približno 50% svih pacijenata sa kancerom koji primaju terapiju zračenjem tokom njihove bolesti. Glavni cilj terapije zračenjem je da uništi potencijal za umnožavanje (ćelijsku deobu) ćelija kancera. Tipovi zračenja korišćeni za tretiranje kancera su fotonsko zračenje (x i gama zraci) i čestično zračenje (zraci elektrona, protona i neutrona). Postoje dva načina da se isporuči zračenje do mesta kancera. Zračenje spoljašnjim zrakom je isporučeno van tela ciljanjem zraka visoke energije (zračenje fotona, protona ili čestica) do mesta tumora. Unutrašnje zračenje ili brahiterapija je isporučeno unutar tela radioaktivnim izvorima, zapečaćenim u kateterima ili postavljanjem direktno na mesto tumora. Tehnike terapije zračenjem koje su primenjive u kombinaciji sa predmetnim pronalaskom su npr. frakcionisanje (terapija zračenjem isporučena u frakcionisanom režimu, npr. dnevne frakcije od 1.5 do 3 Gy date tokom nekoliko nedelja), 3D konformaciona terapija (3DCRT; isporučuje zračenje do najveće mase tumora), terapija zračenjem sa moduliranjem intenziteta (IMRT; kompjuterki kontrolisano moduliranje intenziteta više zraka), vizuelno navođena radioterapija (IGRT; tehnika koja sadrži comprising pre-radioterapijsku vizuelizaciju koj aomogućava korekciju), i stereotaktičku telesnu terapiju zračenjem (SRBT, isporučuje veoma visoke pojedinačne doze zračenja tokom samo nekoliko frakcija tretmana). Za pregled terapije zračenjem videti Baskar et al. 2012: Cancer and radiation therapy: current advances and future directions. Int. J Med Sci. 9(3): 193-199.

4. Antitela

[0189] Antitela (poželjno monoklonska antitela) postižu njihov terapeutski efekat protiv ćelija kancera različitim mehanizmima. Mogu imati direktne efekte proizvodnjom apoptoze ili programirane smrti ćelija. Mogu blokirati komponente puteva prenosa signala kao što su npr. receptori faktora rasta, čime se efikasno zaustavlja proliferacija ćelija tumora. Kod ćelija koje eksprimiraju monoklonska antitela, ona mogu dovesti do formiranja anti-idiotipskog antitela. Indirektni efekti uključuju regrutovanje ćelija koje imaju citotoksičnost, kao što su monociti i makrofagi. Ovaj tip antitelo-posredovanog ubijanja ćelija je nazvan antitelo-zavisna ćelijski posredovana citotksičnost (ADCC). Antitela takođe vezuju komplement dovodeći do direktne ćelijske toksičnosti, poznate kao komplement zavisna citotoksičnost (CDC). Kombinovanje hirurških postupaka sa imunoteraputskim lekovima ili postupcima je uspešan pristup, kao što je npr. pokazano u Gadri et al. 2009: Synergistic effect of dendritic cells vaccination and anti-CD20 antibody treatment in therapy of murine lymphoma. J Immunother. 32(4): 333-40. Sledeći spisak obezbeđuje neke neograničavajuće primere anti-kancer antitela i potencijalna ciljna mesta antitela (u zagradama) koja se mogu koristiti u kombinaciji sa predmetnim pronalaskom: Abagovomab (CA-125), Abciksimab (CD41), Adekatumumab (EpCAM), Afutuzumab (CD20), Alacizumab pegol (VEGFR2), Altumomab pentetat (CEA), Amatuksimab (MORAb-009), Anatumomab mafenatoks (TAG-72), Apolizumab (HLA-DR), Arcitumomab (CEA), Bavituksimab (fosfatidilserin), Bectumomab (CD22), Belimumab (BAFF), Bevacizumab (VEGF-A), Bivatuzumab mertansin (CD44 v6), Blinatumomab (CD19), Brentuksimab vedotin (CD30 TNFRSF8), kantuzumab mertansin (mucin kanAg), kantuzumab ravtansin (MUC1), kapromab pendetid (ćelije karcinoma prostate), karlumab (CNTO888), katumaksomab (EpCAM, CD3), Cetuksimab (EGFR), Citatuzumab bogatoks (EpCAM), Ciksutumumab (IGF-1 receptor), klaudiksimab (Claudin), klivatuzumab tetraksetan (MUC1), Konatumumab (TRAIL-R2), Dacetuzumab (CD40), Dalotuzumab (receptor za insulinu sličan faktor rasta I), Denosumab (RANKL), Detumomab (B-limfom ćelija), Drozitumab (DR5), Ekromeksimab (GD3 gangliozid), Edrekolomab (EpCAM), Elotuzumab (SLAMF7), Enavatuzumab (PDL192), Ensituksimab (NPC-1C), Epratuzumab (CD22), Ertumaksomab (HER2/neu, CD3), Etaracizumab (integrin αvβ3), Farletuzumab (folat receptor 1), FBTA05 (CD20), Fiklatuzumab (SCH 900105), Figitumumab (IGF-1 receptor), Flanvotumab (glikoprotein 75), Fresolimumab (TGF-β), Galiksimab (CD80), Ganitumab (IGF-I), Gemtuzumab ozogamicin (CD33), Gevokizumab (IL-1β), Girentuksimab (karbonska anhidraza 9 (CA-IKS)), Glembatumumab vedotin (GPNMB), Ibritumomab tiuksetan (CD20), Icrucumab (VEGFR-1), Igovoma (CA-125), Indatuksimab ravtansin (SDC1), Intetumumab (CD51), Inotuzumab ozogamicin (CD22), Ipilimumab (CD152), Iratumumab (CD30), Labetuzumab (CEA), Leksatumumab (TRAIL-R2), Libivirumab (hepatitis B površinski antigen), Lintuzumab (CD33), Lorvotuzumab mertansin (CD56), Lukatumumab (CD40), Lumiliksimab (CD23), Mapatumumab (TRAIL-R1), Matuzumab (EGFR), Mepolizumab (IL-5), Milatuzumab (CD74), Mitumomab (GD3 gangliozid), Mogamulizumab (CCR4), Moksetumomab pasudotoks (CD22), Nakolomab tafenatoks (C242 antigen), Naptumomab estafenatoks (5T4), Namatumab (RON), Necitumumab (EGFR), Nimotuzumab (EGFR), Nivolumab (IgG4), Ofatumumab (CD20), Olaratumab (PDGF-R α), Onartuzumab (humani scatter faktor receptor kinaza), Oportuzumab monatoks (EpCAM), Oregovomab (CA-125), Okselumab (OKS-40), Panitumumab (EGFR), Patritumab (HER3), Pemtumoma (MUC1), Pertuzuma (HER2/neu), Pintumomab (adenokarcinom antigen), Pritumumab (vimentin), Racotumomab (N-glikolilneuraminska kiselina), Radretumab (fibronektin ekstra domen-B), Rafivirumab (glikoprotein virusa besnila), Ramucirumab (VEGFR2), Rilotumumab (HGF), Rituksimab (CD20), Robatumumab (IGF-1 receptor), Samalizumab (CD200), Sibrotuzumab (FAP), Siltuksimab (IL-6), Tabalumab (BAFF), Takatuzumab tetraksetan (alfa-fetoprotein), Taplitumomab paptoks (CD19), Tenatumomab (tenascin C), Teprotumumab (CD221), Ticilimumab (CTLA-4), Tigatuzumab (TRAIL-R2), TNKS-650 (IL-13), Tositumomab (CD20), Trastuzumab (HER2/neu), TRBS07 (GD2), Tremelimumab (CTLA-4), Tukotuzumab celmoleukin (EpCAM), Ublituksimab (MS4A1), Urelumab (4-1BB), Volociksimab (integrin α5β1), Votumumab (tumor antigen CTAA16.88), Zalutumumab (EGFR), Zanolimumab (CD4).

5. Citokini, hemokini, kostimulatorni molekuli, fuzioni proteini

[0190] Kombinovana upotreba antigen-kodirajućih farmaceutskih kompozicija predmetnog pronalaska sa citokinima, hemokinima, kostimulatornim molekulima i/ili njihovim fuzionim proteinima da bi se izazvala korisna imuno modulacija ili inhibitorni efekti na tumor je sledeći primer izvođenja predmetnog pronalaska. Da bi se povećala infiltracija imunih ćelija u tumor i olakšalo kretanje antigen-prikazujućih ćelija do limfnih čvorova sa tumorom, mogu se korisiti različiti hemokini sa C, CC, CXC i CX3C strukturama. Neki od hemokina koji najviše obećavaju su npr. CCR7 i njegovi ligandi CCL19 i CCL21, dodatno CCL2, CCL3, CCL5, i CCL16. Drugi primeri su CXCR4, CXCR7 i CXCL12. Dodatno, kostimulatorni ili regulatorni molekuli kao što su npr. B7 ligandi (B7.1 i B7.2) su korisni. Takođe su korisni drugi citokini kao što su npr. interleukini naročito (npr. IL-1 do IL17), interferoni (npr. IFNalfa1 do IFNalfa8, IFNalfa10, IFNalfa13, IFNalfa14, IFNalfa16, IFNalfa17, IFNalfa21, IFNbetal, IFNW, IFNE1 i IFNK), hematopoetski faktori, TGFs (npr. TGF-α, TGF-β, i drugi članovi TGF familije), konačno članovi familije receptora faktora nekroze tumora i njihovih liganada kao i drugih stimulatornih molekula, koji sadrže ali nisu ograničeni na 41BB, 41BB-L, CD137, CD137L, CTLA-4GITR, GITRL, Fas, Fas-L, TNFR1, TRAIL-R1, TRAIL-R2, p75NGF-R, DR6, LT.beta.R, RANK, EDAR1, XEDAR, Fn114, Troy/Trade, TAJ, TNFRII, HVEM, CD27, CD30, CD40, 4-1BB, OX40, GITR, GITRL, TACI, BAFF-R, BCMA, RELT, i CD95 (Fas/APO-1), glukokortikoid-indukovani TNFR-srodni protein, TNF receptor-srodni apoptoza-posredujući protein (TRAMP) i receptor smrti-6 (DR6). Naročito CD40/CD40L i OX40/OX40L su važna ciljna mesta za kombinovanu imunoterapiju zbog njihovog direktnog uticaja na preživljavanje i proliferaciju T ćelija. Za pregled videti Lechner et al. 2011: Chemokines, costimulatory molecules and fusion proteins for immunotherapy of solid tumors. Immunotherapy 3 (11), 1317-1340.

6. Bakterijski tretmani

[0191] Istraživači su koristili anaerobne bakterije kao što je Clostridium novyi, da konzumiraju unutrašnjost tumora siromašnik kiseonikom. Ove bi zatim trebalo da uginu kada dođu kontakt sa stranama tumora sa kiseonikom, što bi značilo da su bezopasne za ostatak tela. Druga strategija je da se koriste anaerobne bakterije koje su transformisane sa enzimom koji može da konvertuje netoksični prolek u lek. Sa proliferacijom bakterija u nekrotičnim i hipoksičnim oblastima tumora, enzim je eksprimiran isključivo u tumoru. Stoga, sistemski primenjeni prolek je metabolisan do toksičnog leka samo u tumoru. Ovo je takođe pokazano kao efikasno sa nepatogenim anaerobom Clostridium sporogenes.

7. Inhibitori kinaze

[0192] Sledeća velika grupa potencijalnih ciljnih mesta za komplementarnu terapiju kancera sadrži inhibitore kinaze, jer je rast i preživljavanje ćelija kancera blisko povezani sa deregulacijom aktivnosti kinaze. Da bi se obnovila normalna aktivnost kinaze i stoga smanjio rast tumora korišćen je širok opseg inhibitora. Grupe ciljnih kinaza sadrže receptor tirozin kinaze npr. BCR-ABL, B-Raf, EGFR, HER-2/ErbB2, IGF-IR, PDGFR-α, PDGFR-β, c-Kit, Flt-4, Flt3, FGFR1, FGFR3, FGFR4, CSF1R, c-Met, RON, c-Ret, ALK, citoplazmatske tirozin kinaze npr. c-SRC, c-YES, Abl, JAK-2, serin/treonin kinaze npr. ATM, Aurora & B, CDKs, mTOR, PKCi, PLKs, b-Raf, S6K, STK11/LKB1 i lipid kinaze npr. PI3K, SKI. Inhibitori kinaze malog molekula su npr. PHA-739358, Nilotinib, Dasatinib, i PD166326, NSC 743411, Lapatinib (GW-572016), Kanertinib (CI-1033), Semaksinib (SU5416), Vatalanib (PTK787/ZK222584), Sutent (SU11248), Sorafenib (BAY 43-9006) i Leflunomid (SU101). Za više informacija videti npr. Zhang et al. 2009: Targeting cancer with small molecule kinase inhibitors. Nature Reviews Kancer 9, 28-39.

8. Toll-slični receptori

[0193] Članovi familije Toll-sličnog receptora (TLRs) su važna veza između urođenog i stečenog imuniteta i efekat mnogih ađuvanata se zasniva na aktivaciji TLRs. Veliki broj ustanovljenih vakcina protiv kancera uključuje ligande za TLRs za pojačanje odgovora na vakcinu. Osim TLR2, TLR3, TLR4 naročito su istraživani TLR7 i TLR8 za terapiju kancera u pristupima pasivne imunoterapije. Blisko srodni TLR7 i TLR8 doprinose antitumorskim odgovorima uticajem na imune ćelije, tumorske ćelije, i mikrosredinu tumora i mogu biti aktivirane sa strukturama nukelozidnih analoga. Svi TLR’s su korišćeni kao samostalni imunoterapeutici ili ađuvanti za vakcinu za kancer i mogu se sinergistički kombinovati sa formulacijama koje su ovde opisane. Za više informacija videti van Duin et al. 2005: Triggering TLR signaling in vaccination. Trends in Immunology, 27(1):49-55.

9. Inhibitori angiogeneze

[0194] Dodatno terapijama koje ciljno deluju na imune modulatorne receptore koji su pogođeni mehanizmima izbegavanja posredovanim tumorom i imune supresije postoje terapije koje ciljno deluju na okruženje tumora. Inhibitori angiogeneze sprečavaju ekstenzivni rast krvnih sudova (angiogenezu) koji su neophodni tumorima da prežive. Angiogeneza promovisana od strane ćelija tumora da bi se ispunile njihove rastuće potrrebe za nutrijentima i kiseonikom na primer se mogu blokirati ciljnim dejstvom na različite molekule. Neograničavajući primeri molekula koji posreduju u angiogenezi ili inhibitori angiogeneze koji se mogu kombinovati sa predmetnim pronalaskom su rastvorljivi VEGF (VEGF izoforme VEGF121 i VEGF165, receptori VEGFR1, VEGFR2 i ko-receptori Neuropilin-1 i Neuropilin-2) 1 i NRP-1, angiopoietin 2, TSP-1 i TSP-2, angiostatin i srodni molekuli, endostatin, vazostatin, kalretikulin, faktor trombocita-4, TIMP i CDAI, Meth-1 i Meth-2, IFN-α, -β i -γ, CXCL10, IL-4, -12 i -18, protrombin (kringle domen-2), antitrombin III fragment, prolaktin, VEGI, SPARC, osteopontin, maspin, kanstatin, proliferin-srodni protein, restin i lekovi kao npr. bevacizumab, itrakonazol, karboksiamidotriazol, TNP-470, CM101, IFN-α,, faktor trombocita-4, suramin, SU5416, trombospondin, VEGFR antagonisti, angiostatski steroidi heparin, inhibitorni faktor angiogeneze izveden iz hrskavice, inhibitori matriks metaloproteinaze, 2-metoksiestradiol, tekogalan, tetratiomolibdat, talidomid, trombospondin, prolaktin α Vβ3 inhibitori, linomid, tashinimod, za pregled videti Schoenfeld i Dranoff 2011: Anti-angiogenesis immunotherapy. Hum Vaccin. (9):976-81.

10. Ciljana terapija lekovima malog molekula

[0195] Lekovi malog molekula za ciljanu terapiju su generalno inhibitori enzimskih domena na mutiranim, prekomerno eksprimiranim, ili na drugi način kritičnim proteinima unutar ćelije kancera. Istaknuti i neograničavajući primeri su inhibitori tirozin kinaze imatinib (Gleevec/Glivec) i gefitinib (Iressa). Upotreba malih molekula npr. sunitinib malata i/ili sorafenib tozilata koji ciljno deluju na neke kinaze u kombinaciji sa vakcinama za terapiju kancera je takođe opisana u prethodnoj patentnoj prijavi US2009004213.

11. Vakcine zasnovane na virusima

[0196] Dostupne su ili su u razvoju brojne vakcine za kancer zasnovane na virusima koje se mogu koristiti u kombinovanom terapeutskom pristupu zajedno sa formulacijama opisanim ovde. Jedna prednost korišćenja takvih virusnih vektora je njihova urođena sposobnost da iniciraju imune odgovore, sa inflamatornim reakcijama koje se dešavaju kao rezultat virusne infekcije stvarajući signal za opasnost neophodan za imunu aktivaciju. Idealni virusni vektor treba da bude bezbedan i ne treba da introdukuje anti-vektor imuni odgovor da bi dozvolio pojačanje antitumorskih specifičnih odgovora. Rekombinantni virusi, vakcinija virusi, herpes simpleks virusi, adenovirusi, adeno-povezani virusi, retrovirusi i avipoks virusi su korišćeni u modelima životinjskih tumora i na osnovu njihovih ohrabrujućih rezultata, inicirane su kliničke studije na ljudima. Naročito važne vakcine zasnovane na virusima su virusu-slične čestice (VLPs), male čestice koje sadrže određene proteine iz spoljašnjeg omotača virusa. Virusu-slične čestice ne sadrže bilo kakav genetički materijal od virusa i ne mogu izazvati infekciju ali mogu biti konstruisani da prikažu antigene tumora na njihovom omotaču. VLPs mogu biti izvedene iz različitih virusa kao što je npr. hepatitis B virus ili druge familije virusa uključujući Parvoviridae (npr. adeno-povezani virus), Retroviridae (npr. HIV), i Flaviviridae (npr. Hepatitis C virus). Za opšti pregled videti Sorensen i Thompsen 2007: Virus-based immunotherapy of cancer: what do we know i where are we going? APMIS 115(11):1177-93; virusu-slične čestice protiv kancera su pregledno date u Buonaguro et al. 2011: Developments in virus-like particle-based vaccines for infectious diseases and cancer. Expert Rev Vaccines 10(11):1569-83; i in Guillén et al. 2010: Virus-like particles as vaccine antigens and adjuvants: application to chronic disease, cancer immunotherapy i infectious disease preventive strategies. Procedia in Vaccinology 2 (2), 128-133.

12. Strategije multi-epitopa

[0197] Upotreba multi epitopa pokazuje obećavajuće rezultate za vakcinaciju. Brze tehnologije sekvenciranja u kombinaciji sa inteligentnim sistemima algoritama omogućavaju iskorišćavanje tumor mutanoma i mogu obezbediti multi epitope za individualizovane vakcine koje se mogu kombinovati sa predmetnim pronalaskom. Za više informacija videti 2007: Vakcinacija pacijenata sa metastaziranim kolorektalnim kancerom sa sazrelim dendritskim ćelijama napunjenim sa više peptida glavnog kompleksa histokompatibilnosti klase I. J Immunother 30: 762-772; furthermore Castle et al. 2012: Exploiting mutanome for tumor vaccination. Kancer Res 72 (5):1081-91.

13. Transfer stečenih T ćelija

[0198] Na primer, kombinacija vakcinacije sa tumor antigenom i transfer T ćelije je opisan u: Rapoport et al. 2011: Combination immunotherapy using adoptive T-cell transfer and tumor antigen vaccination on basis of hTERT and survivin after ASCT for myeloma. Blood 117(3):788-97.

14. Ciljne terapije zasnovane na peptidima

[0199] Peptidi se mogu veziati za receptore na površini ćelija ili uticati na ekstracelularni matriks koji okružuje tumor. Radionuklidi koji su vezani za ove peptide (npr. RGDs) na kraju ubijaju ćeliju kancera ukoliko nuklid propada u blizini ćelije. Naročito su oligo- ili multimeri ovih vezujućih motiva od velikog interesa, jer ovo može voditi do poboljšane specifičnosti za tumor i aviditet. Za neograničavajuće primere videti Yamada 2011: Peptide-based cancer vaccine therapy for prostate cancer, bladder cancer, and malignant glioma. Nihon Rinsho 69(9): 1657-61.

15. Druge terapije

[0200] Postoje brojne druge terapije za kancer koje se mogu kombinovati sa formulacijama predmetnog pronalaska da bi se postigli sinergistički efekti. Neograničavajući primeri su tretmani koji ciljno deluju na apoptozu, hipertermiju, hormonsku terapiju, telomeraza terapiju, teerapiju potencijacije insulina, gensku terapiju i fotodinamičku terapiju.

[0201] Termin "imunizacija" ili "vakcinacija" opisuje proces tretiranja subjekta iz terapeutskih ili profilaktičkih razloga.

[0202] Termin "subjekt" odnosi se na sisare. Na primer, sisari u kontekstu predmetnog pronalasku su ljudi, ne-humani primati, domaće životinje kao što su psi, mačke, ovce, goveda, koze, svinje, konji itd., laboratorijske životinje kao što su miševi, pacovi, zečevi, zamorci, itd. kao i životinje u zarobljeništvu kao što su životinje u zoološkim vrtovima. Termin "životinja" kao što je ovde korišćeno takođe uključuje ljude.

[0203] Termin "autologni" je korišćen za opisivanje svega što je izvedeno iz istog subjekta. Na primer, "autologni transplant" odnosi se na transplant tkiva ili organa izveden iz istog subjekta. Takve procedure predstavljaju prednost jer prevazilaze imunološku barijeru koja bi inače rezultovala u odbacivanju.

[0204] Termin "heterologni" je korišćen za opisivanje nečega što se sastoji od više različitih elemenata. Kao primer, prenošenje kostne srži jedne individue u drugu individuu čini heterologni transplant. Heterologni gen je gen izveden iz izvora koji je različit od subjekta.

[0205] Farmaceutske kompozicije pronalaska su poželjno sterilne i sadrže efikasnu količinu nanočestica opisanih ovde i izborno dodatna sredstva kao što je ovde razmatrano da bi se stvorila željena reakcija ili željeni efekat.

[0206] Farmaceutska kompozicija pronalaska se može primeniti zajedno sa dodatnim supstancama koje pojačavaju imunitet kao što su jedan ili više ađuvanata i mogu sadržati jednu ili više supstanci koje pojačavaju imunitet da bi se dodatno povećala efikasnost, poželjno da se postigne sinergistički efekat imunostimulacije. Termin "ađuvant" se odnosi na jedinjenja koja produžavaju ili pojačavaju ili ubrzavaju imuni odgovor. U tom smislu mogući su različiti mehanizmi, u zavisnosti od različitih tipova ađuvanata. Na primer, jedinjenja koja dozvoljavaju sazrevanje DC, npr. lipopolisaharidi ili CD40 ligand, formiraju prvu klasu pogodnih ađuvanata. Generalno, bilo koje sredstvo koje utiče na imuni sistem od tipa "signala opasnosti" (LPS, GP96, dsRNK itd.) ili citokina, kao što je GM-CSF, mogu se koristiti kao ađuvanti koji omogućavaju da se intenzivira i/ili da se utiče na imuni odgovor na kontrolisani način. CpG oligodezoksinukleotidi se mogu izborno koristiti u ovom kontekstu, iako treba razmotriti njihove sporedne efekti koji se javljaju pod određenim okolnostima, kao što je prethodno objašnjeno. Naročito poželjni ađuvanti su citokini, kao što su monokini, limfokini, interleukini ili hemokini, npr. IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12, INFα, INF-γ, GM-CSF, LT-α, ili faktori rasta, npr. hGH. Dodatni poznati ađuvanti su aluminijum hidroksid, Freund ađuvant ili ulje kao što je je Montanide®, najpoželjnije Montanide® ISA51. Lipopeptidi, kao što je Pam3Cys, su takođe pogodni za korišćenje kao ađuvanti u farmaceutskoj kompoziciji predmetnog pronalaska.

[0207] Farmaceutske kompozicije su obično obezbeđene u uniformnom doznom obliku i mogu se pripremiti na način poznat per se. Farmaceutske kompozicije pronalaska mogu npr. biti u obliku rastvora ili suspenzije.

[0208] Farmaceutske kompozicije pronalaska mogu sadržati soli, pufer supstance, konzervanse, nosače, razblaživače i/ili ekscipijente od kojih su svi poželjno farmaceutski prihvatljivi. Termin "farmaceutski prihvatljiv" odnosi se na netoksičnost materijala koji ne interaguje sa dejstvom aktivne komponente farmaceutske kompozicije.

[0209] Soli koje nisu farmaceutski prihvatljive mogu se koristiti za pripremanje farmaceutksi prihvatljivih soli i uključene su u pronalazak. Farmaceutski prihvatljive soli ovog tipa sadrže na neograničavajući način one pripremljene od sledećih kiselina: hlorovodonične, bromovodonične, sumporne, azotne, fosforne, maleinske, sirćetne, salicilne, limunske, mravlje, malonske, ćilibarne kiseline, i slično. Farmaceutski prihvatljive soli mogu se takođe pripremiti kao soli alkalnih metala ili soli zemnoalkalnih metala, kao što su soli natrijuma, soli kalijuma, ili soli kalcijuma.

[0210] Pogodne pufer supstance za upotrebu u farmaceutskoj kompoziciji pronalaska uključuju sirćetnu kiselinu u soli, limunsku kiselinu u soli, bornu kiselinu u soli i fosfornu kiselinu u soli.

[0211] Pogodni konzervansi za upotrebu u farmaceutskoj kompoziciji pronalaska uključuju benzalkonijum hlorid, hlorobutanol, paraben i timerosal.

[0212] Injektabilna formulacija može sadržati farmaceutski prihvatljiv ekscipijent kao što je Ringer laktat.

[0213] Termin "nosač" odnosi se na organsku ili neorgansku komponentu, prirodnu ili sintetičku, u kojoj je komponenta kombinovana da bi se olakšala, pojačala ili omogućila primena. Prema pronalasku, termin "nosač" takođe uključuje jedan ili više kompatibilnih čvrstih ili tečnih punilaca, razblaživača ili inkapsulirajućih supstanci, koje su pogodne za primenu na pacijenta.

[0214] Moguće supstance nosača za parenteralnu primenu su npr. sterilna voda, Ringer, Ringer laktat, sterilni rastvor natrijum hlorida, polialkilen glikoli, hidrogenizovani naftaleni i naročito, biokompatibilni laktid polimeri, laktid/glikolid kopolimeri ili polioksietilen/polioksipropilen kopolimeri.

[0215] Termin "ekscipijent" kada je ovde korišćen označava sve supstance koje mogu biti prisutne u farmaceutskoj kompoziciji predmetnog pronalaska i koje nisu aktivni sastojci kao što su, npr., nosači, vezujuća sredstva, lubrikanti, sredstva za zgušnjavanje, površinski aktivna sredstva, konzervansi, emulgatori, puferi, aromatizeri, ili boje.

[0216] Sredstva i kompozicije opisane ovde mogu se primeniti preko bilo kog konvencionaclnog puta, kao što je parenteralna primena uključujući injekcijom ili infuzijom. Primena je poželjno parenteralna, npr. intravenska, intraarterijalna, subkutana, intradermalna ili intramuskularna.

[0217] Termin "parenteralna primena" odnosi se na primenu na način različit od onoga preko digestivnog trakta, kao što je intravenskom ili intramuskularnom injekcijom. Sistemska primena je put primene koji je ili enteralni, tj. primena koja uključuje apsorpciju preko gastrointestinalnog trakta, ili parenteralno.

[0218] Kompozicije pogodne za parenteralnu primenu obično sadrže sterilni vodeni ili nevodeni preparat aktivnog jedinjenja, koje je poželjno izotonično sa krvlju primaoca. Primeri kompatibilnih nosača i rastvarača su Ringer rastvor i izotonični rastvor natrijum hlorida. Dodatno, obično sterilna, neisparljiva ulja su korišćena kao rastvor ili medijum za suspenziju.

[0219] Sredstva i kompozicije opisane ovde su primenjene u efikasnim količinama. "Efikasna količina" odnosi se na koločinu koja postiže željenu reakciju ili željeni efekat sama ili zajedno sa dodatnim dozama. U slučaju tretmana određene bolesti ili određenog stanja, željena reakcija poželjno se odnosi na inhibiciju toka bolesti. Ovo sadrži usporavanje napredovanja bolesti i, naročito, prekidanje ili preokretanje napredovanja bolesti. Željena reakcija u tretmanu bolesti ili stanja može takođe biti odlaganje početka ili prevencija početka pomenute bolesti ili pomenutog stanja.

[0220] Efikasna količina sredstva ili kompozicije opisane ovde zavisiće od stanja koje se tretira, težine bolesti, individualnih parametara pacijenta, uključujući starost, fiziološko stanje, veličinu i težinu, trajanja tretmana, tipa prateće terapije (ukoliko je prisutna), specifičnog puta primene i sličnih faktora. Shodno tome, primenjene doza sredstava opisanih ovde mogu zavisiti od različitih takvih parametara. U slučaju da je reakcija kod pacijenta nedovoljna sa inicijalnom dozom, veće doze (ili efektivno veće doze postignute sa različitim, lokalizovanijim putevima primene) se mogu koristiti.

[0221] Predmetni pronalazak je detaljno opisan slikama i primerima u nastavku, koji su korišćeni samo u ilustrativne svrhe i nije namera da budu ograničavajući. Zahvaljujući opisu i primerima, dodatni primeri izvođenja koji su slično tome uključeni u pronalazak su dostupni stručnjaku.

[0222] Predmet opisan u slikama i primerima koji nije pokriven patentnim zahtevima je opisan samo za srhu upoređivanja.

SLIKE

[0223]

Slika 1: Veličina F4/RNK lipopleksa na različitim odnosima DOTMA/RNK naelektrisanja (2/1, 1/1, 1/2, 1/4) u vodi (a), PBS (b) i u PBS nakon dodavanja 2.2 mM CaCl2(c) i 22 mM CaCl2(d).

Slika 2: Veličina čestica DOTMA/Chol lipozoma (F5) i lipopleksa sa različitim puferima i odnosima DOTMA/RNK naelektrisanja 1/1 i 2/1 (pozitivni višak).

Slika 3: Srednja vrednost veličine F5/RNK lipopleksa na odnosima naelektrisanja (1/1) i (1/2) nakon kompaktovanja sa RNK korišćenjem različitih količina CaCl2.

Slika 4: Pregled izabranih rezultata fizičko-hemijske karakterizacije RNK lipopleksa sa DOTMA/DOPE lipozomima. x-osa daje odnose naelektrisanja između DOTMA i RNK. gore: veličina čestica iz PCS merenja, sredina: indeks polidisperznosti, dole: zeta potencijali istih formulacija. Linije su uvedene za lakše praćenje.

Slika 5: (a) Srednja vrednost veličine F4/Luc-RNK lipopleksa na odnosu naelektrisanja (1/2) u vodi i nakon dodavanja koncentrovanog pufera u PBS (1x), natrijum hlorida (150 mM), glukoze (5 %) ili fosfatno puferovane glukoze. Za razliku od 1/1-odnosa, koji dovodi do agregacije pod svim uslovima pufera (nije prikazano ovde), veličine čestica lipopleksa na 1/2 odnosu su bile približno 220 nm. (b) Polidisperznost veličina u opsegu od 0.23 do 0.34 ukazuje na koloidnu stabilnost.

Slika 6: (a) Srednja vrednost veličine F4/RNK lipopleksa na izabranim odnosima DOTMA/RNK naelektrisanja. Veličine čestica lipopleksa sa odnosima naelektrisanja između 1:1.8 i 1:1.4 bile su približno160 nm. Sa smanjenjem negativnog viška (odnos naelektrisanja 1:1.2) veličina čestica je određivana na 183 nm. (b) Svi testirani odnosi naelektrisanja vode do lipopleksa sa malim indeksima polidisperznosti manjim od 0.2.

Slika 7: (a) Srednja vrednost veličine DOTMA/DOPE lipozoma (1:2) u vpdi bez ekstruzije (F4-sirovo), nakon ekstruzije korišćenjem polikarbonatne membrane sa dijametrom pore od 400 nm (F4-400), 200 nm (F4-200), 100 nm (F4-100) ili 50 nm (F4-50). Odgovarajući lipopleksi sa odnosom DOTMA/RNK naelektrisanja od 1/2 u vodi (2:) i u PBS puferu (3:). (b) Polidisperznost veličine lipopleksa sa ekstrudiranim lipozomima u opsegu od 0.10 do 0.28. Međutim, lipopleksi formirani sa ne-ekstrudiranim lipozomima takođe su pokazali dovoljno usku distribuciju veličina.

Slika 8: Srednja vrednost veličine (a) i indeks polidisperznosti (b) DOTMA/DOPE lipozoma (F4) određeni pre liofilizacije i nakon liofilizacije i rekonstitucije korišćenjem vode.

Slika 9: Veličina čestica lipozoma sa različitim odnosima DOTMA/DOPE. Za lipozome sa visokom DOPE (90%) frakcijom, čestice su nestabilne u PBS i agregiraju.

Slika 10: Veličina čestica lipopleksa sa lipozomima koji sadrže različite odnose DOTMA/DOPE. Sa DOTMA/DOPE odnososm od 9/1 do 4/6, lipopleksi imaju definisane veličine čestica (<300 nm) sa niskim PI vrednostima (<0.2). Sa višom DOPE frakcijom, dobijene su veće veličine čestica sa visokim PI vrednostima.

Slika 11: Aktivnosti luciferaze in vivo i ex vivo nakon injekcije na BALB/c miševe luciferaza-RNK (20µg) kompleksovane sa različitim količinama F4 lipozoma da bi se dobili F4:RNK odnosi od 4.8:1, 2.4:1, 1.2:1, 1.2:2, 1.2:4.

Slika 12: Distribucija ukupnog signala luciferaze između organa izvedenih iz eksperimenta prikazanog na Slici 11.

Slika 13: Aktivnosti luciferaze in vivo i ex vivo nakon injekcije na BALB/c miševe luciferaza-RNK (20µg) kompleksovane sa F11 ili F12 lipozomima.

Slika 14: Aktivnosti luciferaze in vivo i ex vivo nakon injekcije na BALB/c miševe luciferaza-RNK (20µg) kompleksovane sa F2 ili F5 lipozomima.

Slika 15: Kvantifikacija aktivnosti luciferaze u slezinama miševa nakon injekcije Luciferaza-RNK (20µg) razblažene u 1X PBS (A) ili nerazblažene u vodi (B i C) kompleksovane sa F4 lipozomima rastvorenim u 1X PBS (B) ili nerazblaženim u vodi (A i C) sa F4:RNK odnosom od 1.2:2. finalnih PBS koncentracija svih kompleksa su podešene na 1X PBS.

Slika 16: Kvantifikacija aktivnosti luciferaze u slezinama miševa nakon injekcije Luciferaza-RNK (20µg) prekompleksovane sa 0.125 ili 1mM CaCl2ili bez prekomplksovanja i pomešane sa F4 lipozomima sa F4:RNK odnosom od 1.2:2.

Slika 17: Kvantifikacija aktivnosti luciferaze u slezinama miševa nakon injekcije Luciferaza-RNK (20µg) ili F4 lipozoma razblaženih u 1X PBS ili 154mM NaCl i pomešanih sa F4:RNK odnosom od 1.2:2.

Slika 18: Kvantifikacija aktivnosti luciferaze u slezinama miševa nakon injekcije Luciferaza-RNK (20µg) prekomplksovanih sa 1-4 mM CaCl2i pomešanih sa F4 lipozomima sa F4:RNK odnosom od 1.2:2 korišćenjem 154mM NaCl umesto 1X PBS kao pufera za razblaživanje.

Slika 19: (A) Luciferaza-RNK (5 µg) je inkubirana u 25 ili 50% mišjeg seruma 30 min. i zatim elektroporisana u nezrele DC izvedene iz humanih monocita. Aktivnost luciferaze je procenjena 18 č kasnije preko standardnog in vitro luciferaza testa. (B) Luciferaza-RNK (20 µg) je kompleksovana preko standardnog protokola sa F4 lipozomima sa F4:RNK odnosom od 1.2:2 i zatim inkubirana u prisustvu ili odsustvu 50% mišjeg seruma 30 min. BALB/c miševima su intravenski injektirane ove formulacije i in vivo aktivnosti luciferaze su kvantifikovane iz jetri miševa.

Slika 20: Procena preuzimanja Cy5-RNK ili F4-rho sa populacijama ćelija slezine nakon injekcije u BALB/c miševe Cy5-RNK (40µg) kompleksovanih sa F4 lipozomima obeleženim sa rodaminom (F4-rho) (1.2:2; Lipozom:RNK).

Slika 21: Procena (A) statusa sazrevanja dendritskih ćelija (otkrivena ushodnom regulacijom CD86 i CD40) i (B) koncentracija IFNa i TNFa u serumu nakon injekcije u C57BL/6 miševe HA-RNK (40mg) kompleksovane sa F4 (1.2:2; Lipozom:RNK), F4 zasebno ili PBS (kao kontrola).

Slika 22: Porcena (A) frekvencija antigen specifičnih CD8+ T ćelija i (B) memorisanih odgovora nakon imunizacije C57BL/6 miševa sa SIINFEKL-RNK (20 ili 40µg) kompleksovane sa F4 lipozomima na različitim odnosima lipozom:RNK.

Slika 23: Kaplan-Meier krive preživljavanja C57BL/6 miševa koji su primili tri intravenske imunizacije SIINFEKL-RNK (40µg) kompleksovane sa F4 lipozomima sa F4:RNK odnosom od 1.2:2 ili su ostavljene netretirane i u koje je injektirano 2x10<5>B16-OVA tumorskih ćelija s.c. u bokove.

Slika 24: Rast individualnih tumora nakon s.c. inokulacije 2x10<5>B16-OVA tumorskih ćelija u bokove C57/B16 miševa koji su primili sedam intravenskih imunizacija SIINFEKL-RNK (40µg) kompleksovane sa F4 ili F12 lipozomima sa F4:RNK odnosom od 1.2:2. Sami lipozomi bez SIINFEKL-RNK su korišćeni kao kontrolni tretman.

Slika 25: Kaplan-Meier krive preživljavanja nakon s.c. inokulacije 2x10<5>B16-OVA tumorskih ćelija u bokove C57/B16 miševa koji su primili sedam intravenskih imunizacija SIINFEKL-RNK (40µg) kompleksovanih sa F4 ili F12 lipozomima sa F4:RNK odnosom od 1.2:2. Sami lipozomi bez SIINFEKL-RNK korišćeni su kao kontrolni tretman.

Slika 26: Aktivnosti luciferaze in vivo i ex vivo nakon injekcije u BALB/c miševe luciferaza-RNK (20µg) kompleksovane sa različitim količinama F5 lipozoma da bi se dobili F5:RNK odnosi od 4.8:1, 2.4:1, 1.2:1, 1.2:2, 1.2:4.

Slika 27: Distribucija ukupnog signala luciferaze između organa izvedenih iz eksperimenta prikazanog na Slici 26.

Slika 28: Preformulacija RNK i rekonstitucija RNK-lipopleks rastvora.

Slika 29: Rezultati DLS merenja RNK lipopleksa rekonstituisanih prema kliničkom protokolu formulacije. Ograničeno širenje primljenih veličina čestica lipopleksa pokazuje robusnost procedure mešanja.

Slika 30: Veličina čestica i index poludisperznosti od 1:2 lipopleksa ekstrudiranih i neekstrudiranih lipozomalnih prekursora.

Slika 31: Aktivnosti luciferaze in vivo nakon injekcije u BALB/c miševe luciferaza-RNK 20 µg kompleksovane sa malim ili velikim lipozomima u PBS da bi se postigli lipopleksi različite veličine.

Slika 32: Kvantifikacija aktivnosti luciferaze u slezinama miševa nakon injekcije luciferaza – RNK različite veličine. Veći lipopleksi, sastavljeni od većih lipozoma imaju višu aktivnost, nezavisno od lipidne kompozicije lipozoma.

Slika 33: Lipopleksi formirani korišćenjem NaCl i PBS pufera u 'normalnom' i 10x koncentrovanom obliku. U poslednje pomenutom slučaju, 10-struko povećanje zapremine je dodatno da bi se dobila ista konačna finalna koncentracija. Svi lipopleksi imaju približno istu veličinu ali su oni iz koncentrovanih rastvora nešto manji.

Slika 34: Aktvnost (luc ekspresija) lipopleksa merena na slici 33. Kao trend, lipopleksi iz nekoncentrovanih pufera imaju veću aktivnost. Tretman sa normalnim fiziološkim rastvorom daje višu aktivnost.

Slika 35: Lipopleksi formirani nakon dodavanja NaCl u RNK na različitim koncentracijama. Finalna NaCl koncentracija bila je ista u svim slučajevima, jer iz koncentrovanih rastvora su dodate niže zapremine. Kao trend, veličina lipopleksa se povećava sa smanjenjem koncentracije dodatog rastvora NaCl. Kako su veći lipo plexi aktivni od manjih, korišćenje 0.9% NaCl (150 mM) smatra se da rezultuje u najvećoj aktivnosti.

Slika 36: Veličina (Zave) i index polidisperznosti za lipoplekse sa različitim odnosima smeše (odnosi DOTMA/nukleotid), neposredno nakon rekonstitucije, i nakon 2č i 24č.

Slika 37: Rezultati DLS merenja RNK lipopleksa sa različitim odnosima naelektrisanja testiranim in vivo.

Slika 38: Kvantifikacija aktivnosti luciferaze u slezinama miševa nakon injekcije Luciferaza-RNK lipoopleksa različite veličine.

PRIMERI

[0224] Tehnike i postupci korišćeni ovde su ovde opisani ili izvedeni na način poznat per se i kao što je opisano, na primer, u Sambrook et al., Molecular Cloning: Laboratory Manual, 2nd Edition (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. Svi postupci uključujući upotrebu kompleta i sredstava su izvedeni prema uputstvima proizvođača ukoliko nije drugačije naznačeno.

Referentni Primer 1: Materijali i postupci

Priprema lipozoma

[0225] Proizvodnja lipozoma je izvedena različitim protokolima. 'Postupak filma' ili 'injekcija etanola' korišćena je za proizvodnju lipozoma. Za postupak filma, lipidi su rastvoreni u hloroformu i stavljeni u odgovarajućim količinama u bocu sa okruglim dnom. Organski rastvarač je uparen u rotacionom uparivaču i suvi film je rekonstruisan sa vodom ili pufer/ekscipijent rastvorom blagim šejkiranjem boce. Tipično, ukupna koncentracija lipida od 5 mM je izabrana. Za injekciju etanola, lipidi su rastvoreni u pogodnim molarnim odnosima u etanolu do ukupne koncentracije u opsegu od 100-400 mM. Rastvor etanola je injektovan uz mešanje u vodu ili vodeni rastvor pufera/ekscipijenta. Veličina lipozoma je podešena ekstruzijom kroz polikarbonatne membrane različite veličine pore (50-400 nm), i/ili filtrirani su kroz komercijalno dostupne sterilne filtere od 220-450 nm veličine pore, ili su korišćeni filtere za kliničku upotrebu sa drugim veličinama pore (1µm-5µm) (Sartorius, Göttingen, Germany, Millipore, Schwalbach, Germany).

[0226] Finalna koncentracija lipida u vodenoj fazi bila je između5 mM i 25 mM. Lipidna koncentracija je kontrolisana sa HPLC analizom. Veličina čestica i zeta potencijal su određeni dinamičkim rasipanjem svetlosti.

Formiranje lipopleksa

[0227] Formiranje lipopleksa je izvedeno različitim protokolima. Detaljna procedura je data uz pojedinačne eksperimente. Za nekoliko eksperimenata, izvedena je direktna inkubacija RNK rastvora sa rastvorom lipozoma u vodi ili u prisustvu pufera ili ekscipijenta je je izvedena. Lipopleksi su se takođe mogli formirati mešanjem lipidnih rastvora u etanolu sa rastvorom RNK u vodi ili vodenim pufer/ekscipijent rastvorima. Izabrani protokol priprema zavisi od željenih karakteristika čestica i biološke primene i dodatno je opisan u odgovarajućim eksperimentima.

PCS merenja

[0228] Merenja veličina čestica i Zeta potencijala izvedeni su na 380 ZLS submicron particle / zeta potential analyzer (PSS Nicomp, Santa Barbara, CA). Veličina je određena sa Photon correlation spectroscopy (PCS) sa uglom rasipanja od 90° sa vremenom ekvilibrisanja od 2 min i vremenom izvođenja od 15 min. Autokorelacija je izvedena korišćenjem intezitet ponderovane Gauss analize, koja daje informaciju o srednjim vrednostima mase populacije i indeksa polidisperznosti (PI).

Zeta potencijal

[0229] Zeta potencijal je meren u vodi korišćenjem snage električnog polja od 5 V/cm i razmaka elektroda od 0.4 cm. Elektrostatička pokretljivost je pretvorena u zeta potencijal korišćenjem Helmholtz-Smoluchowski jedačine. Sva merenja su izvedena na temperaturi od 23 °C.

Field-Flow Frakcionisanje

[0230] FFF Asimetričnog protoka (AF4) je izvedeno korišćenjem Eclipse 3+ sistema opremljenog sa detektorom sa dugačkim kanalom (275 mm dužine) i trostrukim uglom MALS rasipanja svetlosti miniDA WN TREOS (Wyatt Technologie, Dernbach, Germany) korišćenjem sledeće opreme/parametara:

Membrana: 10 kD regenerisana celuloza (Microdyn Nadir,

Wiesbaden, Germany)

Spejser: 250 µm spejser (širok 21.5 mm)

Rastvarač: 10 mM NaNO3

Protok

detektora:<1.0 mL/min>

Fokusni 1.5 mL/min

protok:

Injekcioni 0.2 mL/min

protok:

Gradijent

ukrštenog 4 mL/min (fiksno 15 min, zatim 4 mL/min do 0.1

protoka: mL/min 20 min)

Životinje

[0231] C57BL/6 i BALB/c miševi bili su iz Jackson Laboratories. Životinje odgovarajuće po starosti (8-10 nedellja stari) i polu (ženke) korišćene su u eksperimentima.

Ćelije i ćelijske linije

[0232] B16-OVA je B16-F10 melanom ćelijska linijakoja eksprimira ovalbumin gen kokoške (OVA). Nezrele DC izvedene iz humanih monocita (iDC) su odvojene od prečišćenih CD14+ monocita u prisustvu IL-4 (1000 U/ml) i GM-CSF (1000 U/ml) 5 dana.

RNK konstrukti i in vitro transkripcija

[0233] Svi plazmidi za in vitro transkripciju gole antigen kodirajuće RNK zasnovani su na pST1-2hBgUTR-A120 osnovnom lancu sa 3’ humanim β-globin UTR (hBgUTR) i poli(A) repom od 120 nukleotida i omogućavaju stvaranje farmakološki poboljšanih in vitro transkribovanih RNK. SIINFEKL sadrži aa 257-264 kokošijeg OVA. HA konstrukt je kodon optimizovana delimična sekvenca influenca HA (aa 60-285 fuzionisane sa aa 517-527; influenca soj A/PR/8/34) dizajnirana da kombinuje glavne imunodominantne MHC epitope. pSTI-Luciferaza-A120 (Luc) sadrži luciferaza gen svica (15). RNK je stvorena in vitro transkripcijom. Obeležavanje RNK sa Cy5-UTP (Cy5-RNK) je izvedeno prema uputstvima proizvođača (Amersham Biosciences, Buckinghamshire, UK) korišćenjem HA konstrukta kao šablona.

Priprema i injekcija lipopleksa

[0234] Ukoliko nije drugačije naznačeno, kao standardni protokol, RNK ili lipozomi su prethodno razblaženi u fosfatno puferovanom fiziološkom rastvoru bez IX RNkaze (PBS) (Ambion) do finalne zapremine od 100 ml pre mešanja. 10 minuta nakon mešanja razblaženih RNK i lipozoma, injektirano je 200 ml lipopleks rastvora je injektiranje po mišu intravenski. Za neke eksperimente, PBS je zamenjen sa 154mM NaCl bez RNKaze (Ambion)

Analiza protočne citometrije

[0235] Monoklonska antitela za protočnu citometriju bila su od BD Pharmingen. Hipotonicno lizirani uzorci krvi inkubirani su na 4°C sa specifičnim mABs. Ćelije slezine dobijene su digestijom sa kolagenom (1 mg/ml; Roche). Kvantifikacija SIINFEKL-specifičnih CD8+ ćelija sa H-2 Kb/SIINFEKL tetramerom (Beckman-Coulter) je prethodno opisana. Podaci protočne citometrije su dobijeni na FACS-Canto II analitičkom protočnom citometru i analizirani korišćenjem softvera FlowJo (Tree Star).

Elektroporacija

[0236] 50µl RNK rastvora je elektroporisano u iDC sa parametrima elektroporacije od 270V i 150mF korišćenjem BioRad elektroporatora.

In vivo vizuelizacija bioluminescencije (BLI)

[0237] Preuzimanje i translacija Luc-RNK su procenjeni in vivo vizuelizacijom bioluminescencije korišćenjem IVIS Lumina imaging system (Caliper Life Sciences). Ukratko, vodeni rastvor D-luciferina (150 mg/kg body weight) (BD Biosciences) je injektovan i.p. 6č nakon primene RNK lipopleksa. 5 min nakon toga, emitovani fotoni su kvantifikovani (integraciono vreme 1 min). In vivo bioluminescencija u regionima od interesa (ROI) je kvantifikovana kao prosečnan sjaj (fotoni/sec/cm<2>/sr) korišćenjem IVIS Living Image 4.0 softvera. Intenzitet transmitovane svetlosti poreklom od ćelija koje eksprimiraju luciferazu unutra životinje predstavljen je kao crno-bela slika, gde je crna boja najmanji intenzitet i bela boja je najveći intenzitet bioluminescentnog signala. Referentne crno-bele slike miševa su dobijene pod LED osvetljenjem niskog intenziteta. Slike su superponirane korišćenjem softvera Living Image 4.0.

ELISA

[0238] Mišji IFN-a (PBL) i TNFa (eBioscience) je detektovan u serumu miševa korišćenjem ELISA testa u skladu sa uputstvima proizvođača.

Eksperimenti sa tumorom

[0239] Da bi se odredio zaštitni imunitet, miševi su primili tri imunizacije. Nakon toga, 2 x 10<5>B16-OVA tumorskih ćelija su inokulirane s.c. u bokove C57BL/6 miševa. Za procenu terapeutskog imuniteta, prvo je isti broj tumorskih ćelija inokuliran. Imunizacije su zatim iniciranje nakon što su tumori dostigli prečnik od 2 do 3 mm. Veličina tumora je merena svaka tri dana. Životinje su žrtvovane kada je prečnik tumora prešao 15mm.

Primer 2: Efekat pufera/jona na veličinu čestica i PI RNK lipopleksa

[0240] Pripremljeni su lipopleksi lipozoma i RNK na različitim odnosima naelektrisanja /-između katjonskog pozitivno naelektrisanog) lipida DOTMA i negativno naelektrisane RNK.

Fizičko hemijske karakteristike lipozoma su proučavane dinamičkim rasipanjem svetlosti (PCS) i merenjem zeta potencijala.

[0241 Korišćenje pufera koji je često neophodan za farmaceutske primene i jona može voditi agregaciji lipoleksa koja ih čini nepovoljnim za parenteralnu primenu na pacijente. Da bi se procenili ovi efekti na prosečni prečnik lipoppleksa, karakteristike čestica lipoleksa DOTMA/DOPE (F4) lipozoma [DOTMA/DOPE (1:1 mol:mol)] i RNK na različitim odnosima naelektrisanja određeni su pod uslovima sa četiri pufera, odnosno, vodom, PBS puferom, PBS plus 2.2 mM CaCl2, i PBS plus 22 mM CaCl2.. Za merenje, ukratko, lipopleksi su formirani dodavanjem RNK prethodno formiranim lipozomima nakon čega su dodati puferi. Finalna koncentracija RNK je izabrana oko 100 mg/ml. Sve druge koncentracije su podešene shodno tome ili izabrane kao što je dato na slikama. Veličine čestica su prikazane na slici 1. Odnos naelektrisanja je dat na x osi svakog grafika.

(a) U vodi, dobijeni su lipopleksi definisanih veličina čestica (srednja vrednost veličine manja od 300 nm), sa niskim indeksima polidisperznosti (< 0.3). Izmerene veličine čestica su samo blago pogođene odnosom naelektrisanja. Međutim negativno naelektrisane čestice su manje i stabilnije od nenaelektrisanih čestica (srednja vrednost veličine 100 do 200 nm) i more stable (PI < 0.15) od nenaelektrisanih čestica (srednja vrednost veličine 200 do 250 nm, PI < 0.2).

(b) U PBS puferu, Isti efekat je još uočljiviji. Komparativni lipopleksi sa pozitivnim ili neutralnim odnosom naelektrisanja formiraju veće čestica (delimično stabilizovane pozitivnim naelektrisanjem). Komparativni lipopleksi sa neutralnim odnosom naelektrisanja su stvarali nestabilne agregate. Nasuprot tome negativno naelektrisani lipopleksi su i stabilni (kao što je označeno sa niskim PI < 0.2) i kompaktni sa prosečnom veličinom čestica od 250 nm i manje.

(c) Nakon dodavanja CaCl2povećanjer u veličini čestica je uočljivo. Međutim, na fiziološkim koncentracijama Ca++ (prkazano: 2.2 mM; u nekim tipovima ćelija fiziološka koncentracija može biti do 5 mM, retko do 10 mM) negativno naelektrisane čestice još uvek imaju definisane veličine ispod 500 nm sa indeksom polidisperzije koji ne prelazi 0.6. Za komparativni primer sa viškom pozitivnog naelektrisanja veličina čestica se povećala skoro do 1000 nm.

(d) Dodavanje 22 mM CaCl2uzorcima b) (PBS) indukovalo je agregaciju/flokulaciju pod svim uslovima, verovatno usled formiranja čestica kalcijum fosfata.

[0242] Ovi rezultati pokazuju da u puferovanim rastvorima kao što je tj. u PBS puferu i/ili u prisustvu CaCl2, odnosi pozitivnog ili neutralnog naelektrisanja su neodgovarajući za proizvodnju stabilnih lipozomalnih fornulacija. Stabilnost lipopleksa visoko je zavisna od odnosa naelektrisanja /- između katjonskog DOTMA lipida i naelektrisane RNK. Dodatno, i jonska snaga pufera formulacije i prisustvo dvovalentnih katjona imaju snažan uticaj na veličinu čestica. Pod biološkim uslovima (tj. pH 7.4; 2.2 mM Ca++), negativni odnos naelektrisanja izgleda da predstavlja imperativ usled nestabilnosti komparativno neutralno ili pozitivno naelektrisanih lipopleksa. Za lipoplekse sa viškom negativnog naelektrisanja uočen je najniži trend u odnosu na agregaciju

Referenca

Primer 3: Efekat pozitivnog naelektrisanja na stabilnost RNK lipopleksa

[0243] Za dodatnu procenu potencijalnog korisnog/štetnog efekta pozitivnog naelektrisanja na stabilnost lipopleksa (videti npr. Slika 1 b i c), veličine čestica lipolipopleksa DOTMA/Chol lipozoma (F5) [DOTMA/Chol (1:1 mol:mol)] i RNK sa DOTMA/RNK odnosima naelektrisanja od 1/1 i 2/1 su merene u različitim puferima (videti Sliku 2). U cilju poređenja, takođe je merena veličina čistog lipozoma.

[0244] U 150 mM natrijum hloridu kao i u PBS pufer pozitivnom 2/1 DOTMA/RNK odnosu naelektrisanja vodi do veoma povećanih/agregiranih veličina čestica sa indeksom polidisperzije većim od 0.4. Ovaj rezultat ukazuje da pozitiivna naelektrisanja nisu pogodna za stabilizaciju lipopleksa i da treba očekivati agregaciju za pozitivno naelektrisane lipoplekse takođe pod fiziološkim uslovima.

Primer 4: Uticaj prethodnog kompaktovanja RNK posredovano sa dvovalentnim jonima na velilčine čestica RNK lipopleksa

[0245] Da bi se testirao uticaj prethodnog kompaktovanja RNK korišćenjem dvovalentnih kationa pre kompleksovanja, veličine čestica lipopleksa sa odnosom naelektrisanja (1/1 komparativno) i (1/2) su određene nakon kompaktovanja sa RNK sa različitim količinama CaCl2. Nasuprot Primerima 2 i 3 ode su joni dodati RNK pre formiranja lipopleksa. Finalna koncentracija lipozoma bila je u svim slučajevima 100 mM, i RNK koncentracija je shodno tome podešena. Kako je F5/RNK 1/2 RNK koncentracija duplirana, ovde je takođe duplirana koncentracija CaCl2.

[0246] Nakon prethodnog tretmana sa nenaelektrisanim RNK/F5 (1:1 komparativni) lipopleksima sa fiziološkim koncentracijama CaCl2, (tj. 2.2 mM), prosečna veličina čestica rezultujućeg lipopleksa je povećana (tj. do 1.2 mm); videti Sliku 3. Usled iove velike veličine, takve čestice nisu idealne za farmaceutske kompozicije i/ili isporuku RNK u ćelije. Nasuprot tome, i eksperimenti sa prethodnim kompaktovanjem sa negativno naelektrisanim lipopleksima i niskim/visokim koncentracijama (niska: 0.3 mM; visoka: 4.4 mM) CaCl2proizveli su čestice male veličine od približno 200 (350) nm.

[0247] Ovi rezultati ukazuju da RNK može biti prethodno kondenzovana sa dvovalentnim jonima. Usled ovog koraka prethodne kondenzacije, lipopleksi sa definsanim i kompaktnim veličinama čestica mogu se formirati na odnosima negativnog naelektrisanja; agregacija ili značajno povećanje veličine čestica može se sprečiti.

Primer 5: Fizičko-hemijska karakterizacija RNK lipopleksa

[0248] Na slici 4, dati su rezultati fizičko-hemijske karakterizacije RNK lipopleksa sa F4 (DOTMA/DOPE) na različitim odnosima naelektrisanja /- između DOTMA i RNK. Kao što se može videti za negativno naelektrisane lipoplekse, na /- odnosima od 1/1 (komparativni) i više, veličina čestica je konstantna na oko 200 nm. Zeta potencijal se monotono smanjuje od /- 2/1 do 1//1 (oba komparativna), i ostaje konstantan većem višku negativnog naelektrisanja. Ovi rezultati sugerišu da važne karakteristike čestica, odnosno veličina čestica i zeta potencijal, su nepromenljive sa viškom RNK, počinjući od 1/1 (komparativni) odnosa. U ovom opsegu, koloidne stabilne čestice dobro definisane veličine se mogu proizvesti. Slični rezultati se takođe mogu dobiti u prisustvu jona i pufera (PBS).

Primer 6: Efekat kompozicije pufera na stabilnost/veličinu čestica negativno naelektrisanih RNK lipopleksa

[0249] Stabilnost lipopleksa u različitim puferima je dodatno detaljno istraživana. Da bi se testiralo da li višak negativnog naelektrisanja dovodi do koloidnih stabilnih lipopleksa u potencijalno relevantnom pufer sistemu, određena je veličina čestica F4/Luc-RNK lipopleksa na odnosu naelektrisanja (1/2) u vodi i nakon dodavanja koncentrovanog pufera u PBS (1x), natrijum hloridu (150 mM), glukozi (5 %) ili fosfatno puferovanoj glukozi (videti Sliku 5).

[0250] Pod svim uslovima testa, veličine čestica nisu prelazile 300 nm sa PI vrednostima jasno manjim od 0.4. Ovi rezultati sugerišu da, ukoliko su proizvedeni kao što je ovde opisano, RNK lipopleksi sa odnosom naelektrisanja od 1/2 (višak negativno naelektrisane RNK) su koloidno stabilni pod različitim puferskim uslovima.

Primer 7: Korelacija odnosa negativnog naelektrisanja i veličine čestica/stabilnosti

[0251] Koloidna stabilnost lipopleksa na odnosu između (1/1, komparativno) i (1/2) je dodatno istraživana. Vellčina čestica F4/RNK lipopleksa sa odnosom naelektrisanja između 1:1.8 i 1:1.2 (komparativni) mereni su u vodi; videti Sliku 6.

[0252] Ovi rezultati sugerišu da se u opsegu testiranih odnosa naelektrisanja veličine čestica lipopleksa nisu promenile ili su se malo promenile u višku RNK. U vezi sa testiranim (negativnim) odnosima naelektrisanja od 1:1.2 (komparativno) do 1:1.8, veličine čestica su generalno u opsegu od 100 do 200 nm sa PI vrednostima manjim od 0.2.

Primer 8: Efekat ekstruzije na srednju vrednost veličine čestica i PI vrednosti RNK lipopleksa

[0253] U ovom eksperimentu je pokazano da se mogu proizvesti lipopleksi različite veličine. Da bi se odredio efekat dodatnog koraka ekstruzije na srednju veličinu čestica i PI vrednosti lipozoma ili RNK lipopleksa, izvedeni su ekstruzioni eksperimenti (korišćenjem polikarbonatne membrane sa različitim prečnikom pore). Rezultati dimenzioniranja čestica RNK lipopleksa sa ne-ekstrudiranim F4 (DOTMA/DOPE) i sa ekstrudiranim F4 u vodi ili PBS su prikazani na Slici 7.

[0254] Eksperimenti demostriraju da, dodatno već opisanom opesgu veličina od 200-300 nm, takođe veće i manje čestice se mogu proizvesti. Ovde su, kao primer, date čestica sa veličinom u opsegu od 400-500 nm i <100 nm.

[0255] Dok ne-ekstrudirani RNK lipopleksi pokazuju prosečne veličine čestica između 400 i 500 nm, ekstruzija RNK lipopleksa generalno dovodi do značajno manjih čestica sa veličinama manjim od 200 nm. Nasuprot tome, efekat ekstruzije na polidisperznost je marginalan; i ekstrudirani i ne-ekstrudirani i lipozomi vode do diskretnih, dobro definisanih čestica (sa PI vrednostima između 0.1 i 0.3), ukoliko su kompleksovani sa RNK.

Primer 9: Efekat liofilizacije na karakteristike čestica

[0256] Lipopleksi nisu stabilni u tečnim suspenzijama za dugoročno skladištenje i agregiraju. Liofilizacija je jedna od tehnika kojom se rešava ovaj izazov. Efekat liofilizacije na karakteristike čestica je istraživan. Veličine čestica DOTMA/DOPE lipozoma (F4) su određene pre liofilizacije i nakon liofilizacije i rekonstitucije sa vodom (videti Sliku 8, gde su kompleksi sa odnosom naelektrisanja 1.8:2 i 2:2 komparativni).

[0257] Ovi rezultati sugerišu, da lipopleksi mogu biti liofilizovani bez uticaja na karakteristike čestica.

Primer 10: Efekat DOTMA/DOPE odnosa na karakteristike čestica

[0258] Proizvedeni su lipozomi i lipopleksi sa različitim DOTMA/DOPE odnosima. Lipozomi sa veoma visokom DOPE frakcijom (90 mol%, komparativni) bili su nestabilni u PBS (Slika 9). Za lipoplekse, već na DOPE frakciji od 70 mol%, veličina čestica se značajno povećala (Slika 10). Sve druge kompozicije su bile stabilne.

Primer 11: In vivo primena RNK lipopleksa

[0259] BALB/c miševima (n=3) je intravenski injektirana Luciferaza-RNK (20 µg) kompleksovana sa različitim količinama F4 lipozoma da bi se dobili F4:RNK odnosi od 4.8:1 (komparativni), 2.4:1 (komparativni), 1.2:1 (komparativni), 1.2:2, 1.2:4 (komparativni). Aktivnosti luciferaze in vivo i ex vivo su procenjene preko in vivo vizuelizacije 6 časova nakon injekcije lipopleksa i reprezentativni miševi i setovi organa su prikazani na Slici 11. Slika 12 prikazuje distribuciju ukupnog signala luciferaze između organa izvedenih iz eksperimenta prikazanog na Slici 11.

[0260] F4 (DOTMA:DOPE) ide više do pluća (mala slezina) na odnosu od F4:RNK od 4.8:1 (komparativni), do oba pluća i slezine na odnosu od F4:RNK od 2.4:1 (komparativni) i ekskluzivno do slezine u odnosima od F4:RNK od 1.2:1 (komparativni), 1.2:2, 1.2:4 (komparativni). Stoga, neutralni i anjonski lipopleksi specifično ciljno deluju na slezinu dok katjonski lipopleksi primarno ciljno deluju na pluća (wrt ekspresije proteina). Nije eksprimirana ekspresija u jetri.

[0261] BALB/c miševima (n=5) intravenski je injektovana Luciferaza-RNK (20 µg) kompleksovana sa F11 ili F12 lipozomima sa Fx:RNK odnosom od 1.2:2 [F11: DOTMA/DOPE (1:2 mol:mol); F12: DOTMA/DOPE (2:1 mol:mol)]. Aktivnosti luciferaze in vivo i ex vivo su procenjene preko in vivo vizuelizacije 6 časova nakon injekcije lipopleksa i reprezentativni miševi i setovi organa su prikazani na Slici 13. F4 derivati F11 i F12 takođe ciljno deluju na slezinu na odnosu lipozom:RNK od 1.2:2.

[0262] BALB/c miševima (n=5) intravenski je injektovana Luciferaza-RNK (20 µg) kompleksovana sa F2 ili F5 lipozomima sa Fx:RNK odnosom od 1:1 (komparativni) [F2: DOTAP/DOPE (1:1 mol:mol); F5: DOTMA/Chol (1:1 mol:mol)]. Aktivnosti luciferaze in vivo i ex vivo su procenjene preko in vivo vizuelizacije 6 časova nakon injekcije lipopleksa i reprezentativni miševi i setovi organa su prikazani na Slici 14. Na odnosu lipozom:RNK od 1:1 (komparativni), dok F2 ciljno deluje na slezinu, F5 ciljno deluje i na slezinu i na pluća.

[0263] Luciferaza-RNK (20 µg) razblažena u 1X PBS (A) ili nerazblažena u vodi (B i C) kompleksovana je sa F4 lipozomima razblaženim u 1X PBS (B) ili nerazblaženim u vodi (A i C) sa F4:RNK odnosom od 1.2:2. Finalne PBS koncentracije svih kompleksa podešene su do 1X PBS. BALB/c miševima (n=5) je zatim intravenski injektirano A, B ili C i aktivnosti luciferaze u slezinama miševa su kvantifikovane preko in vivo vizuelizacije (srednja vrednost+SD); videti Sliku 15.

[0264] Kao standardni protokol za prpremu smeše, i lipozomi i RNK su razblaženi u PBS (1X PBS finalne konc.) i zatim pomešani u jednakim zapreminama. Prethodno razblaživanje samo RNK je dobro kao standardni protokol. Svi drugi protokoli kojima nedostaje prethodno razblaživanje RNK u PBS dalo je slabije rezultate. Prisutvo jona u rastvoru RNK pre kompleksacije je poželjna za postizanje dobrih rezultata.

[0265] Luciferaza-RNK (20 µg) prekompleksovana sa 0.125 ili 1 mM CaCl2ili bez prekompleksacije je pomešana preko standardnog protokola sa F4 lipozomima sa F4:RNK odnosom od 1.2:2. BALB/c miševima (n=5) su intravenski injektirane ove formulacije i aktivnosti luciferaze in vivo su kvantifikovane iz slezina mišava (srednja vrednost SD); videti Sliku 16.

[0266] Prekondenzacija RNK sa 1mM CaCl2kada je korišćen PBS kao pufer povećava signal luciferaze 3-puta (više koncentracije CaCl2u prisustvu PBS dovode do velikih česticaagregata). Prekondenzacija RNK sa Ca<2+>pomaže da se poveća signal luciferaze.

[0267] Luciferaza-RNK (20 µg) ili F4 lipozomi razblaženi u 1X PBS ili 154mM NaCl su pomešani sa F4:RNK odnosom od 1.2:2. BALB/c miševima (n=5) su intravenski injektirane ove formulacije i aktivnost luciferaze in vivo je kvantifikovana iz slezina miševa (srednja vrednost SD); videti Sliku 17.

[0268] Korišćenjem standardnog protokola mešanja, zamena PBS sa izoosmolarnim NaCl radilo je dobro kao PBS.

[0269] Luciferaza-RNK (20 µg) prekompleksovana sa 1-4 mM CaCl2je pomešana korišćenjem standardnog protokola sa F4 lipozomima sa F4:RNK odnosom od 1.2:2 korišćenjem 154mM NaCl umesto 1X PBS kao pufera za razblaživanje. BALB/c miševima (n=5) su intravenski injektirane ove formulacije i aktivnosti luciferaze su in vivo su kvantifikovane iz slezina miševa (srednja vrednost SD); videti Sliku 18.

[0270] Kada je PBS zamenjen sa NaCl, može se koristiti 2mM CaCl2što dovodi do 4.5-puta većeg povećanja (više koncentracije CaCl2dodatno ne povećava signal).

[0271] Luciferaza-RNK (5 µg) je inkubirana u 25 ili 50% mišjeg seruma 30 min. i zatim elektroporisane u nezrele DC izvedene iz humanih monocita. Aktivnost luciferaze je procenjena 18 č kasnije preko standardnog in vitro luciferaza testa (srednja vrednost SD); videti Sliku 19A. Luciferaza-RNK (20 µg) je kompleksovana preko standardnog protokola sa F4 lipozomima sa F4:RNK odnosom od 1.2:2 i zatim inkubirane u prisustvu ili odsustvu 50% mišjeg seruma 30 min. BALB/c miševima (n=5) su intravenski injektirane ove formulacije i aktivnost luciferaze in vivo je kvantifikovana iz slezina miševa (srednja vrednost SD); videti Sliku 19B.

[0272] Gola RNK je degradirana u prisustvu seruma. Kompleksacija RNK sa F4 lipozomima štiti ih od RNkaza posredovane degradacije u serumu.

[0273] BALB/c miševima (n=3) je intravenski injektirano Cy5-RNK (40 µg) kompleksovana sa F4 lipozomima obeleženim sa rodaminom (F4-rho) (1.2:2; Lipozom:RNK). Preuzimanje Cy5-RNK ili F4-rho od strane populacija ćelija u slezini procenjeno je sa protočnom citometrijom 1 čas nakon injekcije lipopleksa; videti Sliku 20.

[0274] Kao profesionalne antigen prikazujuće ćelije (APCs), DC i makrofage slezine efikasno su internalizovale lipozom inkapsuliranu RNK i sam lipozom dok su B i T ćelije jedva interanlizovali ni lipozom inkapsuliranu RNK niti sam lipozom. Stoga, RNK lipopleksi su selektivno internalizovani od strane APCs slezine.

[0275] C57BL/6 miševima (n=3) je injektirana HA-RNK (40 µg) kompleksovana sa F4 (1.2:2; Lipozom:RNK), samo F4 ili PBS (kao kontrola); videti Sliku 21. (A) Status sazrevanja denditskih ćelija (otkriven ushodnom regulacijom CD86 i CD40) u slezini je određen protočnom citometrijom 24 časa nokon tretmana (srednja vrednost SD). (B) Koncentracije IFNa i TNFa u serumu su procenjene preko ELISA 6 i 24 časa nakon tretmana (srednja vrednost SD).

[0276] Kao što je otkriveno ushodnom regulacijom aktivacionih markera (CD86, CD40) na DC, RNK-F4 lipopleksi aktivirali su DC slezine dok sami lipozomi nisu. Interesantno, iako su RNK-F4 lipoppleksi detektovani u 5-10% DC iz slezine u prethodnom eksperimentu, sve DC su aktivirane u slezini implicirajući postojanje inflamatornog miljea u slezini nakon isporuke. Kod svih životinja injektiranih sa RNK-lipopleksima, mogli smo detektovati visoku količinu IFNa u krvi 6 č (takođe nakon 24 č iako u mnogo nižim količinama). Mogli smo takođe detektovati TNFa ali u vrlo umerenim nivoima kod svih životinja injektiranih sa RNK-lipopleksima (samo nakon 6 č). Izlučivanje citokina je specifično za RNK-lipoplekse jer ni PBS ni lipozomi zasebno nisu doveli do bilo kakve značajne sekrecije citokina (referentna vrednost). Stoga, RNK lipopleksi aktiviraju DC slezine dovodeći do sistemske inflamacije.

[0277] C57BL/6 miševi (n=5) su intravenski imunizovani sa SIINFEKL-RNK (20 ili 40 µg) kompleksovanom sa F4 lipozomima na različitim odnosima lipozom:RNK na dane 0, 3, 8 i 15; videti Sliku 22. (A) učestalost antigen specifičnih CD8+ T ćelija je određena preko bojenja SIINFEKL-MHC tetramera 5 dana nakon poslednje imunizacije (Dan 20) (srednja vrednost SD). (B) Memorijski odgovori su procenjivani preko bojenja SIINFEKL-MHC tetramera na Dan 62 nakon još jedne injekcije F4-RNK lipopleksa na Dan 57 (srednja vrednost SD).

[0278] Visoka uređenost antigen-specifičnog T ćelijskog imuniteta mogla se stvoriti nakon repetitivne imunizacije sa F4 lipopleksima (A). 6 nedelja nakon poslednje imunizacije (d57), buster injekcija lipopleksa bila je u stanju da raširi memorijske CD8 T ćelije formirane u prethodoj injekciji (B). F4 (1.2:1 komparativni) kompleksi su formirali agregate dok F4 (1.2:2) kompeleksi su bili bistri. Poželjan je F4 (1.2:2) sa 40 µg RNK. Stoga, snažni T ćelijski efektorni i memorijski odgovori se mogu generisati sa RNK-lipopleksima.

[0279] Na dane 0, 3 i 8, C57BL/6 miševi (n = 3) primili su tri intravenske imunizacije SIINFEKL-RNK (40 µg) kompleksovane sa F4 lipozomima sa F4:RNK odnosom od 1.2:2 ili su ostavljeni netretirani. Na dan 14, 2x10<5>B16-OVA tumor ćelija je inkubirano s.c. u bokove. Kaplan-Meier krive preživljavanja su prikazane na Slici 23.

[0280] Kompletna zaštita je postignuta sa primenom RNK lipopleksa u profilaktičkom B16-OVA modelu.

[0281] 2x10<5>B16-OVA tumorskih ćelija je inokulirano s.c. u bokove C57/B16 miševa (n = 10, d0). Na dan 10 (prečnik tumora 2-3mm), miševi su primili sedam intravenskih imunizacija SIINFEKL-RNK (40 µg) kompleksovane sa F4 ili F12 lipozomima sa F4:RNK odnosom od 1.2:2 (na dane 10, 13, 17, 24, 31, 38, 45). Sami lipozomi bez SIINFEKL-RNK korišćeni su kao kontrolni tretman. Rast individualnih tumora i Kaplan-Meier krive preživljavanja su prikazani na Slikama 24 i 25, respektivno.

[0282] U terapeutskom modelu, značajno odložen rast tumora za F4+RNK ili F12+RNK grupe je detektovan. Smanjenje tumora nakon tri imunizacije je uočeno za obe grupe. BALB/c miševima (n=3) je intravenski injektirana Luciferaza-RNK (20 µg) kompleksovana sa različitim količinama F5 lipozoma da bi se dobili F5:RNK odnosi od 4.8:1 (komparativni), 2.4:1 (komparativni), 1.2:1 (komparativni), 1.2:2, 1.2:4 (komparativni). Aktivnosti luciferaze in vivo i ex vivo su procenjene preko in vivo vizuelizacije 6 časova nakon injekcije lipopleksa i reprezentativni miševi i setovi organa su prikazani na Slici 26. Slika 27 prikazuje distribuciju ukupnog signala luciferaze kod organa izvedenih iz eksperimenata prikazanih na Slici 26.

[0283] F5 (DOTMA:Chol) ide do pluća na odnosu F5:RNK od 4.8:1 (komparativni), do primarno pluća ali takođe do slezine na odnosu F5:RNK (2.4:1 komparativni), do primarno slezine ali takođe do pluća na odnosu F5:RNK (1.2:1 komparativni) i isključivo do slezine na odnosima F5:RNK (1.2:2, 1.21:4 komparativni). Neutralni i anjonski lipopleksi ciljno deluju specifičnije na slezinu dok katjonski lipopleksi primarno ciljno deluju na pluća (wrt proteinska ekspresija). U jetri nije detektovana ekspresija.

Primer 12: Klinička formulacija lipopleksa

[0284] Formulacija na osnovu prethodno ustanovljenog protokola sastoji se iz dva koraka, odnosno preformulacije date RNK korišćenjem izotoničnog rastvora natrijum hlorida kao razblaživača i formulacija lipopleksa dodavanjem definisane količine lipozoma. Za preformulaciju, prvo će se 4 ml rastvora natrijum hlorida (0.9 % tež/tež u vodi) uzeti iz NaCl vijalice sa špricem i dodato u RNK. Zatim, 400 µL lipozoma (2.8 mg/mL ukupni lipid u vodi) će biti uzeto iz vijalice sa lipozomima i injektirano korišćenjem kanile (unutrašnji prečnik od 0.9 mm) u rastvor RNK i natrijum hlorid. Dobijena formulacija RNK lipopleksa (5.5 ml) može se primeniti ili, direktnom parenteralnom injekcijom željene doze kao i nakon pripreme intravenske infuzije. U tom smislu, iz RNK lipopleks formulacije, uzeće se 5.0 mL i razblažiti u kesi za infuziju koja sadrži 50 ml izotoničnog rastvora natrijum hlorida. Ovim protokolom, formulacije lipoleksa sa veličinom čestica od oko 300 do 500 nm su dobijene na robustan i ponovljiv način; videti Sliku 28.

[0285] Materijali i komponente koje se mogu koristiti su kao što sledi:

Komponente:

• RNK: 0.5 mg/ml in 10 mM HEPES i 0.1 mM EDTA

• Razblaživač: 0.9% NaCl

• Lipozomi: 2.68 mM DOTMA, 1.34 mM DOPE, veličina čestica (Zave) 300-500 nm

Špricevi:

• 5 mL špricevi: (npr. Omnifix, 5 mL, Luer Lock, B. Braun Melsungen AG (Melsungen, Germany)

• 1 mL špric: Injekt-F Tuberculin, 1 mL, Luer Lock, B. Braun Melsungen AG (Melsungen, Germany)

Igle:

• 0.9 x 44 mm, 20 G 1 1⁄2", BD Microlance 3, Becton Dickinson S.A. (Fraga, Spain)

[0286] Veličine RNK lipopleks čestica proizvedene prema prethodnoj proceduri opsega od 300 nm do 500; videti Sliku 29.

Primer 13: Efekat veličine čestica

[0287] Pokazano je, da se aktivnost lipopleksa povećava sa povećanjem veličine. Veličina lipozoma korišćena za formiranje lipopleksa utiče takođe na veličinu lipopleksa. Veći lipozomi takođe dovode do većih lipopleksa.

[0288] Karakteristike čestica RNK lipopleksa rekonstituisanih korišćenjem F4 (DOTMA/DOPE 50:50 mol/mol) i F12 (DOTMA/DOPE 66.7:33.3 mol/mol) su istraživane stvaranjem različitih veličina prekursora. U tu svrhu, izvedeno je dobijanje veličina čestica lipopleksa sa ekstrudiranim lipozomima i ne-ekstrudiranim, 0.45 µm filtriranim lipozomima.

Tabela 1: Veličine lipozoma korišćene za formiranje lipopleksa

[0289] Rezultati za lipoplekse su prikazani na Slici 30. Pokazano je da se mogu proizvesti lipopleksi različitih veličina korišćenjem prekursora različitih veličina.

[0290] Rezultati sa Slika 31 i 32 ukazuju da veći lipozomi veći formirani lipopleksi u ovom eksperimentu uočen viši signal luciferaze.

Primer 14: Pufer natrijum hlorid

[0291] Nekoliko eksperimenata je pokazalo da dodavanje PBS pufera u RNK pre dodavanja lipozoma, dovodi do povećanja aktivnosti lipopleksa. Ovde je pokazano da, umesto PBS, normalni fiziološki rastvor (0.9% npr. 150 mM NaCl) se može koristiti za kondenzaciju RNK. Takav rastvor NaCl je dostupan kao odobreni medicinski proizvod lek, koji olakšava logistiku i rukovanje lipopleks-IMP. Dodatno je pokazano, da se takođe koncentrovani rastvori NaCl i PBS mogu koristiti za kondenzaciju RNK, što rezultuje u jednakoj aktivnosti kasnije formiranih lipopleksa. Dodatno su prikazana detaljna merenja veličine, gde su rastvori NaCl različite koncentracije dodavani RNK pre formiranja lipopleksa. Generalno, veličina lipopleksa se povećava sa smanjenjem koncentracije dodatog rastvora NaCl; videti Sliku 35. Kako je povećanje veličine korelisano sa povećanjem aktivnosti (videti Primer 13), dodavanje normalnog fiziološkog rastvora, i ne koncentrovanog fiziološkog rastvora smatra se da daje veću aktivnost.

[0292] Da bi se testirao uticaj pre-formulacije RNK korišćenjem uobičajenih pufera pre sastavljanja, veličine čestice lipopleksa na odnosu naelektrisanja od 1:2 su određene nakon tretmana RNK sa različitim koncentrovanim PBS puferima ili rastvorima natrijum hlorida; videti Slike 33 i 34.

[0293] Pre protokola za pripremu smeše, gde su i lipozomi i RNK tretirani u PBS (1x PBS final konc.) i zatim pomešani u jednakim zapreminama, mogu se zameniti jednostavnijim mešanjem sa mormalnim rastvorom natrijum hlorida (0.9%), koji je komercijalno dostupan medicinski proizvod lek. Kao protokol za pravljenje smeše za lipopleks-IMP, RNK je preformulisana sa izotoničnim fiziološkim rastvorom i zatim pomešana sa lipozomima u vodi.

[0294] Rezultati sugerišu da se može dodati monovalentni jon na različitim koncentracijama da bi se dobila ista finalna jonska snaga u formulaciji lipopleksa bez značajnog uticaja na kakrakteristike lipopleksa.

Primer 15: Lipozom/ RNK odnos naelektrisanja

[0295] Odnos naelektrisanja (odnos katjonskog lipida prema nukleotidu) od 1.3 do 2 je pogodan u odnosu na fizičko-hemijske karakteristike i biološku aktivnost. Na ovom odnosu, pretpostavljeno je da je viša frakcija RNK uključena u lipoplekse sa odnosom 1:2.

[0296] Koloidna stabilnost, karakteristike čestica i aktivnosti luciferaze lipopleksa neekstrudiranih lipozoma su dodatno istraživani. Lipopleksi su sastavljeni u izotoničnom slanom rastvoru sa odnosom naelektrisanja lipozom/RNK između 1:2 i 1.9:2 (komparativni), videti Slike 36 i 37. Za lipoplekse, na odnosu naelektrisanja od 1.7:2 (komparativni) veličina čestica se značajno povećala tokom vremena. U skladu sa lipopleksima ekstrudiranih lipozoma, lipopleksi sa odnosom naelektrisanja između 1:2 i 1.6:2 su nepromenljivi do manjih promena u višku RNK i pokazuju veličinu čestica u opsegu 350 do 480 nm sa PI vrednostima manjim od 0.3.

[0297] Kao što je prikazano na Slici 38, odnosi naelektrisanja lipozom/RNK između 1.1:2 i 1.6:2 rezultuju u dobroj aktivnosti u slezini.

[0298] Svi odnosi isporučuju RNK isključivo do slezine bez značajnih promena u performansama između različitih odnosa lipid/RNK.

Claims (3)

Patentni zahtevi

1. Farmaceutska kompozicija koja sadrži nanočestice koje sadrže najmanje jedan katjonski lipid, najmanje jedan neutralni pomoćni lipid i RNK koja kodira najmanje jedan antigen za upotrebu u postupku za isporuku najmanje jednog antigena profesionalnim antigenprikazujućim ćelijama u slezini subjekta, pri čemu navedeni postupak sadrži sistemsku primenu farmaceutske kompozicije na subjekta,

pri čemu, antigen je antigen povezan sa bolešću ili izaziva imuni odgovor protiv antigena povezanog sa bolešću ili ćelija koje eksprimiraju antigen povezan sa bolešću, i

pri čemu su nanočestice lipopleksi koji sadrže

(i) DOTMA i DOPE u molarnom odnosu od 8:2 do 3:7, poželjno od 7:3 do 5:5, pri čemu je odnos naelektrisanja pozitivnog naelektrisanja u DOTMA prema negativnom naelektrisanju u RNK jednak 1.6:2 do 1:2, poželjno 1.4:2 do 1.1:2; ili

(ii) DOTMA i holesterol u molarnom odnosu od 8:2 do 3:7, poželjno od 7:3 do 5:5, pri čemu je odnos naelektrisanja pozitivnog naelektrisanja u DOTMA prema negativnom naelektrisanju u RNK jednak 1.6:2 do 1:2, poželjno 1.4:2 do 1.1:2; ili

(iii) DOTAP i DOPE u molarnom odnosu od 8:2 do 3:7, poželjno od 7:3 do 5:5, pri čemu je odnos naelektrisanja pozitivnog naelektrisanja u DOTAP prema negativnom naelektrisanju u RNK jednak 1.6:2 do 1:2, poželjno 1.4:2 do 1.1:2.

2. Farmaceutska kompozicija za upotrebu u patentnom zahtevu 1, naznačena time što nanočestice imaju prosečni prečnik u opsegu od 50 nm do 1000 nm, poželjno od 100 nm do 800 nm, poželjno 200 nm do 600 nm, kao što je 300 nm do 500 nm, kao što je određeno pomoću dimaničkog rasipanja svetlosti.

3. Farmaceutska kompozicija za upotrebu u patentnom zahtevu 1 ili 2, naznačena time što antigen-prikazujuće ćelije su dendritske ćelije i/ili makrofage.