RS57302B1 - Pirolo[2,3-b]piridin-4-il-amini i pirolo[2m3-b]pirimidin-4-il-amini kao inhibitori janus kinaze - Google Patents

Description

KONCENTROVANI, NE-PENUŠAVI RASTVOR KVATERNERNIH

AMONIJUMSKTH JEDINJENJA I METODE PRIMENE

OPIS PRONALASKA

Ova prijava predstavlja proširenje u delu prijave U.S. serijski br. 08/840,288, podnete 14.04.1997.godine, za koju se rešenje očekuje, a koja je proširenje u delu prijave U.S. serijski br. 08/631,578 podnete 12.04.1996.godine, odnosno sada važeći patent U.S. 5,855,940.

1. Područje pronalaska

Ovaj pronalazak se odnosi na rastvor, koji sadrži koncentrovanu količinu antimikrobnog kvaternernog amonijumskog jedinjenja (QAC). Koncentrat kvaternernog amonijumskog jedinjenja iz ovog pronalaska koristi komponente, opštepriznate kao sigurne za primenu, za formiranje pravog rastvora QAC, a ne emulzije. Ovaj rastvor koncentrata QAC pripravljen je kombinovanjem sa najmanje jednim sredstvom za povećanje rastvorljivosti, i primenuje se za spravljanje rastvora za dalje razblaživanje do krajnje koncentracije, a koji se koriste u prehrambenoj industriji ili u domaćinstvu pri pripremi hrane, kao i na površinama u vezi sa obradom namirnica.

Ovaj pronalazak se uopšte odnosi na rastvor, koji se sastoji od koncentrovane količine antimikrobnog QAC i bar jednog sredstva za povećanje rastvorljivosti, a koji je pogodan za primenu u okviru metoda za sprečavanje razvoja širokog spektra mikroorganizama na površini prehrambenih proizvoda i u njima, kao i na površinama koje dolaze u kontakt sa prehrambenim proizvodima u domaćinstvu i industrijskim uslovima. Određenije, ovaj pronalazak se odnosi na rastvor koji sadrži koncentrovanu količinu antimikrobnog QAC i najmanje jedno sredstvo za povećanje rastvorljivosti, pogodan za primenu u okviru metoda za sprečavanje razvoja širokog spektra mikroorganizama na površini prehrambenih proizvoda i u njima, što se postiže kontaktom (rastvora) sa prehrambenim proizvodima kao što su proizvodi od mesa, npr. živinsko, goveđe, svinjsko, jagnjeće meso, meso divljači, i ostali prehrambeni proizvodi od mesa; plodovi mora, npr. riba, rakovi i školjke; voće, povrće, mlečni proizvodi, hrana za kućne ljubimce ili proizvodi od životinjskog mesa, kože i iznutrica, u koje mogu da se uključe svinjske uši, koža i sušeno meso, kao i svi drugi prehrambeni proizvodi koji se mogu obrađivati primenom metoda obrade vodenim rastvorom ovog pronalaska, a bez štetnog uticaja na izgled, teksturu i kvalitet hrane. Još određenije, ovaj pronalazak se odnosi na rastvor, koji sadrži koncentrovanu količinu antimikrobnog QAC, podesan za primenu u okviru metoda za sprečavanje naseljavanja, uklanjanje i/ili sprečavanje razvoja mikroorganizama na prehrambenim proizvodima. Konkretnije, primena rastvora koji sadrži koncentrovanu količinu antimikrobnog QAC odnosi se na dejstvo kvaternernih amonijumskih jedinjenja na mikroorganizme koji mogu da izazovu kontaminaciju hrane. Još konkretnije, u ove mikroorganizme spadaju mikroorganizmi rodaStaphylococcits, Streptococcus, Campylobacter, Arcobacter, Listeria, Aeromonas, Bacillm, Salmonella, Escherichiakoja ne stvara toksin, patogenaEscherichiakoja stvara toksin, npr. 0157:H7. Preciznije, ovaj pronalazak se odnosi na unapređeni metod obrade nanošenjem razblaženih (rastvora) kvaternarnih amonijumskih jedinjenja na prehrambene proizvode, nezavisno od načina, ali najbolje raspršivanjem ili nebulizacijom razblaženih QAC na prehrambene proizvode, u cilju sprečavanja razvoja širokog spektra mikroorganizama na tim proizvodima, s tim što najkraće efikasno vreme primene QAC može da iznosi najmanje jednu desetinku sekunde. Ovako kratko vreme primene razblaženog QAC posebno je korisno u trgovinskim ili industrijskim uslovima.

2. Opis poznate tehnike

Prevencija bolesti koje se prenose hranom zagađenom mikroorganizmima od velikog je značaja za prehrambenu industriju, nadležne državne institucije i potrošače. U pre nekoliko godina objavljenom izveštaju Službe za sigurnost hrane i inspekcijske poslove (FSIS) Ministarstva poljoprivrede SAD (Federalni registar, 3.02.1995.), procenjeno je da se, na više od 2 miliona slučajeva bolesti izazvanih mikrobnom kontaminacijom prehrambenih proizvoda u SAD, godišnje potroši preko milijardu dolara. Kontaminacija namirnica mikroorganizmima javlja se i pre ulaska namirnica u pogon za obradu, i kao posledica ukrštene kontaminacije u industrijskom okruženju. Služba za sigurnost hrane i inspekcijske poslove je uvela nove zahteve u okviru programa mera Analize rizika i ključne tačke kontrole (HACCP), sa ciljem da se smanji učestalost javljanja i broj patogenih mikroorganizama koji se prenose hranom. Proizvođači prehrambenih proizvoda moraju da se pridržavaju ovih propisa. Iako je izbor načina za smanjivanje kontaminacije mikroorganizmima prepušten prerađivaču, Služba za sigurnost hrane i inspekcijske poslove očekuje da će mere antimikrobne obrade biti značajna komponenta planova Analize rizika i ključnih tačaka kontrole. Metode obrade, koje se zasnivaju na izloženom pronalasku, koji koristi vodene formulacije spravljene od rastvora koncentrovanih QAC, korisne su za ispunjavanje uslova Analize rizika i ključnih tačaka kontrole.

Pokušavajući da ponude proizvod bez ikakve mikrobiološke kontaminacije, prerađivači mesa i živine su se suočavali sa problemom odstranjivanja mikroorganizama, koji naseljavaju ili čvrsto prianjanju na tkiva mesa i živine namenjena ishrani. Mikroorganizmi-kontaminanti, koji ne prianjaju čvrsto za površinu namirnice, mogu lako da se odstrane spiranjem. Međutim, oni mikroorganizmi koji čvrsto prionu ne mogu da se uklone spiranjem i otporni su na pokušaje odstranjivanja hemijskim ili fizičkim sredstvima.

U cilju smanjenja mikrobiološke kontaminacije proizvoda od mesa ponuđen je veći broj hemijskih i fizičkih metoda, npr. korišćenje hlora ili hlor dioksida, ozona, vodonik peroksida, mlečne kiseline, natrijum karbonata, trinatrijum fosfata, kao i elektro-stimulacija. Pokazalo se da je efikasnost svih ovih metoda u smanjivanju mikrobiološke kontaminacije ograničena, a da mogu da utiču na fizički izgled proizvoda od mesa.

Posebnu brigu industriji za preradu živine zadavala je kontaminacija mikro-organizmomSalmonella typhimuriutn,i to zato što je ovaj mikroorganizam često prisutan i u žive živine. Prerađivači živinskog mesa su ulagali velike napore da odstrane mikroorganizme koji se nasele ili prionu za tkiva živinskog mesa, kao što je £typhimurium.U cilju eliminacije kontaminacije zaklane živine saS. typhimuriumi svođenja na najmanju moguću meru ukrštene kontaminacije među zaklanom živinom u toku obrade, ponuđen je čitav niz različitih hemijskih i fizičkih metoda. Za suzbijanje £typhimariumpri obradi živinskog mesa korišćen je trinatrijum fosfat (TSP); međutim, ispitivanja efikasnosti TSP u suzbijanju Salmonele dala su protivrečne rezultate. Pošto je TSP rastvorljiv u vodi, može se sprati sa zaklane živine, te ne može da spreči prianjanje mikroorganizama.

Patent U.S. br. 5,366,983 otkriva metod za eliminaciju ili sprečavanje kontaminacije proizvoda od mesa Salmonelom, tretiranjem proizvoda delotvornom količinom vodenog rastvora QAC. Konkretno, kvaternerna amonijumska katjonska jedinjenja površinskog dejstva (surfaktanti), npr. alkilpiridin, a posebno cetilpiridin hlorid (CPC) i cetilpiridin bromid (CPB), efikasno su eliminisalaS.typhimuriumsa živinskog mesa. Ovaj patent, međutim; ne otkriva da, osim za Salmonelu, kvaternerna amonijumska jedinjenja imaju širi spektar antimikrobnog dejstva na druge mikroorganizme koji kontaminiraju namirnice. Osim toga, izloženi patent ne upućuje na pomisao da bi ovaj metod za tretiranje mesa mogao biti efikasno primenjen i na druge namirnice. Takođe, ne navodi na pomisao daje veoma kratko vreme primene QAC dovoljno za potpuno efikasnu antibakterijsku obradu. Ne ističe ni rastvore koncentrovanih kvaternemih amonijumskih jedinjenja, koje otkriva ovaj pronalazak, koji su posebno korisni za pripremanje razblaženih rastvora kvaternernog amonijumskog jedinjenja.

Namirnice se hemijski i fizički razlikuju po sadržaju proteina, poroznosti, lipofilnosti, površinskoj pH vrednosti, propustljivosti za vodu, po svojoj površini, kao i po površinskom neto električnom naponu. Poroznost hrane može biti važna kod vezivanja bakterija, dok čvrst, nepropustljiv omotač namirnice može da redukuje bakterijsku kontaminaciju hrane. Zbog svih pomenutih hemijskih i fizičkih razlika među namirnicama, teško je predvideti da li će se antibakterijsko sredstvo, uspešno primenjeno na proizvodima od mesa, pokazati uspešnim i kod drugih namirnica, npr. voća, povrća, riba i školjki, mlečnih proizvoda, proizvoda od iznutrica.

Poznato je, na primer, da se QAC, cetilpiridin hlorid (CPC), vezuje za proteine; ako je, međutim, antimikrobna efikasnost CPC kod prehrambenih proizvoda u velikoj meri posledica njegovog vezivanja za proteine, tada se ne bi moglo očekivati da će izloženi metod za tretiranje ne-proteinskog voća i povrća biti uspešno primenjen.

Za industriju hrane sve veći problem postaju bolesti koje se prenose putem hrane, čiji uzročnik nijeSalmonella,već druge patogene i bakterije koje izazivaju kvarenje hrane.

Tabela 1 navodi listu ovih bakterija i proizvode u kojima su identifikovane:

Među mikroorganizmima iz tabele, koji kontaminiraju namirnice, poseban problem predstavljaEscherichia col i0157:H7 zbog svoje izrazite patogenosti, težine bolesti koju izaziva, kao i posledične smrtnosti.E. coli0157:H7 produkuje jake, šiga-endotoksinu slične toksine, koji izazivaju poremećaje koagulacije krvi, bubrežnu insuficijenciju (hemolitički uremični sindrom) i smrt. Čak i ako se potpuno oporave od akutne bolesti, kod 15-30% zaaraženih, kod kojih se razvio hemolitički uremični sindrom, biće evidentno hronično oboljenja bubrega. Rizike kontaminacijeE. coli0157:H7 dodamo povećava podatak o rezistenciji mikroorganizma na antibiotike. Tokom 1993.godine jeE. coli0157:H7 bila odgovorna za 8 000-16 000 slučajeva obolelih zbog zaražene hrane što je, prema procenama, koštalo između 200 i 500 miliona dolara.

Listeria monocytogenesje, takođe, patogeni mikroorganizam koji kontaminira namirnice, nalazi se u mesu, povrću i različitim mlečnim proizvodima, a može da izazove sepsu, meningitis i diseminovane apscese.L. monocytogen. esje mikroorganizam koji dobro podnosi hladnoću i može da se razvija i na niskim temperaturama. Tokom 1993.godine je, preko namirnica, 1 700 ljudi zaraženoL. monocytogenes,što je koštalo između 100 i 200 miliona dolara.

Prehrambenoj industriji veliku brigu zadaje iAeromonas hydrophilia,koji izaziva kvarenje namirnica u prehrambenoj i mesnoj industriji i skraćuje rok trajanja ovih proizvoda.

Za sada nisu poznata mikrobicidna jedinjenja koja bi efikasno sprečavala i eliminisala kontaminaciju mnogobrojnih namirnica širokim spektrom gram-pozitivnih, gram-negativnih, aerobnih, fakultativno anaerobnih i mikroaerofilnih mikroorganizama. Autori izloženog pronalaska su utvrdili da su kvaternerna amonijumska jedinjenja efikasna protiv širokog spektra različitih mikroorganizama koji izazivaju trovanja hranom kad dopru u različite namirnice. Osetljivost širokog spektra patogenih mikroorganizama nije bilo moguće predvideti.

Osetljivost mikroorganizma na dejstvo određenog antimikrobnog sredstva nije pokazatelj osetljivosti drugih mikroorganizama na delovanje istog sredstva. Iako se smatra daje spektar dejstva antiseptika ili germicida ujednačen i stalan, mora se voditi računa o relativnoj osetljivosti različitih mikroorganizama. Germicid heksahlorofen, na primer, uglavnom deluje na gram-pozitivne mikroorganizme, a katjonski antiseptici ne deluju na mikroorganizme koji stvaraju spore. Poznato je da se neki mikroorganizmi, npr.Pseudomonas cepacia,razvijaju u rastvorima benzalkonijum hlorida. Takođe je poznato da neke druge bakterije imaju sposobnost da se razvijaju u 70% etanolu (Harvev, S.C., Antimicrobial Drugs u Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., Mack Publishing Co, s. 1163-1241 1990).

Kad je u pitanju obrada prehrambenih proizvoda, postoje podaci o tome dajeListeriaotpornija na dejstvo TSP od Salmonele iliE. coli(Somers, E.B. et al., Int. J. Food MicrobioL 22:269-276, 1994). Osim toga, dokazano je (Breen et al., J. Food Sciences, 60:1991-1996, 1995) da TSP znatno slabije inhibiše razvoj Salmonele, a efikasnije uklanja ovaj mikroorganizam. Takođe, TSP je efikasno redukovao brojE. coli0157:H7 sa zaklanih pilića, a nije imao nikakvog uticaja na suzbijanje ukrštene kontaminacije ostale zaklane živine ovim mikroorganizmom.

Ovaj pronalazak pokazuje da kvaternerna amonijumska jedinjenja efikasno deluju naE. coli0157.H7 suspendovane u tečnostima, na redukovanje broja bakterija u namirnicama, kao i na inhibiciju prodora ove bakterije u prehrambene proizvode. Postoje podaci o tome dajeE. coli0157:H7 otporna na antibiotike širokog spektra dejstva, npr. tetraciklin, streptomicin, sulfisoksazol (Kim et al., J. Infect. Dis., 170:1606-1609, 1994) i oksitetraciklin (Ciosek et al., Med. Weter., 40:335, 338: 1984), dok ti lekovi veoma efikasno deluju na obične sojeveE. colikoji ne produkuju toksin.

Očigledno je da se efikasnost dejstva antimikrobnog sredstva ili biocida na određen mikroorganizam ne može predvideti na osnovu njegove efikasnosti protiv različitih mikroorganizama. Potrebno je razmotriti mnogobrojne činioce, koji mogu biti značajni za efikasno delovanje antimikrobnog sredstva na određeni mikroorganizam, npr. karakteristike mikroorganizma. Ove karakteristike, pored ostalog, obuhvataju: (1) intenzitet kojim određena vrsta mikroorganizama formira glikokaliks, (2) prisustvo ćelijskog omotača koji sadrži lipopolisaharide i fosfolipide kod gram-negativnih bakterija, (3) prisustvo lipoproteina kad je u pitanju većina crevnih bakterija iPseudomonasi (4) prisustvo porinskih proteinskih kanala, npr. kodE. coliiSalmonella(Fulton et al., Structure u Medical Microbiologv, 3rd Ed., s. 37-54, 1991).

Prehrambenoj industriji, domaćinstvima, restoranima ili organizovanom spremanju hrane, potrebni su efikasniji proizvodi i procesi za sprečavanje razvoja širokog spektra mikroorganizama, koji kontaminiraju mnogobrojne, različite prehrambene proizvode i/ili površine u koje dolaze u dodir sa namirnicama i sokovima ili tečnostima iz hrane. Ovo se posebno odnosi na mikroorganizme koji se vezuju za površine namirnica. Zbog sve većeg broja bolesti koje izazivaju patogeni mikroorganizmi iz hrane, prehrambena industrija traži efikasnije procese, pomoću kojih će odstraniti i sprečiti kontaminaciju širim spektrom mikroorganizama, posebno patogenih, npr.E. colikoja produkuje toksin, tj.E. coli0157:H7, za koje se zna da izazivaju ozbiljne bolesti kod ljudi, kao posledicu kontaminacije hrane. Ovaj pronalazak daje formulaciju koja se sastoji od rastvora koncentrovanog QAC i najmanje jednog sredstva za povećanje rastvorljivosti, kao i metode za sprečavanje razvoja mikroorganizama na površini hrane i u njoj, u tečnostima i na površinama u kontaktu sa prehrambenim proizvodima i njihovom pripremom. Ovaj metod za prevenciju značajan je za sprečavanje ukrštene kontaminacije sa zaraženih prehrambenih proizvoda, za odstranjivanje mikroorganizama sa namirnica, za onemogućavanje vezivanja mikroorganizama za prehrambene proizvode, kao i za sprečavanje razvoja mikroorganizama koji su se zadržali na prehrambenim proizvodima. Osim toga, metod primene izloženog pronalaska može se lako prilagoditi prirneni u industrijskoj proizvodnji hrane.

Pored toga, ovaj pronalazak daje formulacije koje sadrže koncentrovanu količinu QAC kombinovanog sa najmanje jednim sredstvom za povećanje rastvorljivosti ili rastvaračem. Koncentrovani rastvor QAC iz ovog pronalaska daje osnovni rastvor, od kojeg se mogu sprav-ljati razblaženi rastvori kvaternernih amonijumskih jedinjenja za tretiranje prehrambenih proizvoda i površina u vezi sa obradom i pripremom prehrambenih proizvoda, uključujući i tela životinja od kojih se pravi prehrambeni proizvod. Rastvorom dobijenim razblaživanjem koncentrovanog rastvora QAC mogu se, pre muže, tretirati vimena muznih krava u cilju što sigurnije prerade mleka i mlečnih proizvoda. Osim toga, razblaženi rastvor QAC, sa ovde opisanim komponentama ili u kombinaciji sa drugim komponentama za pranje ruku i tela, može da se koristi za pranje ruku i ljudskog tela, kao i za kupanje kućnih ljubimaca. Koncentrovani rastvori QAC mogu da se koriste i za spravljanje razblaženih radnih rastvora za primenu u prema izloženom metodu. Formulacije izloženog pronalaska sadrže komponente za povećanje rastvorljivosti, koje omogućavaju spravljanje i koncentrovanijih rastvora kvaternernih amonijumskih jedinjenja.

Patent U.S. 5,405,604 opisuje koncentrovani rastvor za ispiranje usta, metode primene i metode proizvodnje rastvora za ispiranje usta. Rastvor za ispiranje usta predstavlja koncentrat u obliku emulzija ulje-voda, koji se u suštini sastoji od oko 0,05% do oko 10,0% kvaternernog amonijumskog jedinjenja; od oko 30% do oko 85% rastvarača koji deluje kao nosač aromatičnog ulja, gde je rastvarač propilen glikol, polietilen glikol i njihove smeše; od oko 0,2% do oko 9,0% aromatičnog ulja, i vode. Sastav ovog pronalaska se od sastava rastvora za ispiranje usta razlikuje po tome što sadrži više od 10% QAC, što predstavlja pravi homogeni rastvor, a ne emulziju i što ne sadrži aromatična ulja.

Slično, patent WO 95/17159 opisuje koncentrovani rastvor za ispiranje usta za raznošenje katjonskih i u vodi nerastvorljivih ne-antimikroba. Specifične oralne formulacije su u obliku emulzija ulje-voda, koja se sastoji od oko 0,05 do oko 10,0 kvaternernog amonijumskog jedinjenja; od oko 30% do oko 85% u vodi nerastvorljivog nekatjonskog antimikrobnog agensa, gde rastvarač deluje kao nosač aromatičnog ulja i vode.

Patent U.S. 5,414,124 opisuje metod pravljenja rastvora kvaternernog amonijumskog jedinjenja koje se sastoji od oko 50 do oko 80% kvaternernog amonijumskog jedinjenja i od oko 20% do oko 50% rastvarača, i to rastvarača od oko 25% do oko 100% alkilen.glikola sa vodom.

WO 98/03066 opisuje antimikrobnu formulaciju, metode pripravljanja i metode primene. Formulacija se sastoji od podkomponente a) supstituisane ili nesupstituisane Ci-C4monokarboksilne kiseline, zastupljene sa približno 55-99,9% težinski, i podkomponente b) mikrobicidnog ili mikrobiostatičkog jedinjenja katjonskog organskog azota zastupljenog sa približno 0,1-50% težinski. Sastav ovde izloženog pronalaska se od sastava iz WO 98/03066 razlikuje po tome što sadrži sredstvo za povećanje rastvorljivosti, dok ga u WO 98/03066 nema. Ovde ovaj pronalazak se razlikuje od WO 98/03066 i po tome što ne sadrži organsku kiselinu, npr. monokarboksilnu kiselinu, a posebno po tome što ne sadrži ni supstituisanu, ni nesupstituisanu Ci-C4monokarboksilnu kiselinu, koja je osnovna komponenta formulacije WO 98/03066. U izlaganju WO 98/03066 navodi se da se efikasnost dejstva antimikrobne formulacije, koja sadrži nesupstituisanu Ci-C4monokarboksilnu kiselinu, na Salmonelu može pojačati dodavanjem jedinjenja katjonskog organskog azota. Teorijska osnova ovog pronalaska je da mikrobicidno jedinjenje katjonskog azota svoje efekte bolje ispoljava kod mikroorganizama oštećenih Ci-C4karboksilnim kiselinama. Sastav ovog pronalaska se može dopuniti još jednom organskom kiselinom, koja se meša sa jedinjenjem katjonskog organskog azota i obrazuje "ankat" ili "katan" jedinjenje, koje ne ulazi u sastav ovde izloženog pronalaska.

KRATAK PRIKAZ PRONALASKA

Koncentrovani rastvor QAC ovog pronalaska opisuje koncentrovani antimikrobni rastvor, koji se lako razblažuje do rastvora koji dolazi u kontakt sa prehrambenim proizvodima i površinama kontakta sa namirnicama, živim ili zaklanim životinjama ili njihovim delovima - kad su u pitanju prehrambeni proizvodi životinjskog porekla. Koncentrovani rastvor QAC iz ovog pronalaska sadrži kvaternerno amonijumsko jedinjenje i najmanje jedno sredstvo za povećanje rastvorljivosti. Koncentracija QAC je veća od oko 10% težinski. Koncentrovani rastvor se razblažuje da bi se dobio razblažen vodeni rastvor QAC sa razblaženim sredstvom za povećanje rastvorljivosti, koji efikasno inhibiše razvoj (mikroorganizama). Kvaternarna amonijumska jedinjenja ovde izloženog pronalaska efikasno sprečavaju razvoj širokog spektra patogenih i mikroorganizama kvarenja (hrane). Kvaternerna amonijumova jedinjenja, a posebno cetilpiridin hlorid (CPC), posebno su efikasna u sprečavanju razvoja širokog spektra mikroorganizama na širokom spektru prehrambenih proizvoda.

Ovaj pronalazak objašnjava i metod za sprečavanje razvoja mikroorganizama na prehrambenim proizvodima, koji podrazumeva kontakt prehrambenog proizvoda sa koncentracijom QAC, koja delotvorno inhibiše razvoj, a u cilju sprečavanja razvoja širokog spektra mikroorganizama na prehrambenim proizvodima, gde je vreme trajanja kontakta jedinjenja i prehrambenog proizvoda bar deo sekunde. Cilj sprečavanja razvoja mikroorganizama na prehrambenim proizvodima je dobijanje prehrambenog proizvoda potpuno oslobođenog mikroorganizama ili sa minimalnim brojem živih mikroorganizama, koji bi mogli da, kod ljudi ili ži-votinja, izazovu bolest, ili da dovedu do kvarenja prehrambenog proizvoda pre njegovog kon-zumiranja. Sprečavanje razvoja mikroorganizama na prehrambenim proizvodima obuhvata sle-deće mehanizme: (1) odstranjivanje mikroorganizama sa prehrambenih proizvoda, (2) inhibi-ciju vezivanja mikroorganizama za prehrambene proizvode, (3) uništavanje ili onesposob-ljavanje mikroorganizama na prehrambenim proizvodima, i (4) uništavanje ili onesposoblja-vanje mikroorganizama koji se ne nalaze na prehrambenih proizvodima, ali su prisutni u teč-nostima, koje su sastavna pojava u procesu obrade prehrambenih proizvoda, npr. u rashladnim sudovima, ili se nalaze na površinama koje se koriste za spravljanje hrane, tečnostima koje se zadržavaju na radnim površinama, blokovima za sečenje i slivnicima, kao i na alatkama i opremi za spravljanje hrane i higijenu hrane.

Raspon dejstva ovde izloženog pronalaska obuhvata mikroorganizme osetljive na delovanje kvaternernih amonijumskih jedinjenja, konkretnije mikroorganizme rodovaStaphylococcus, Slreplococcus, Campylobacler, Arcobacler, Lisleria, Aeromonas, Bacillus, Salmonella, Escherichiakoja ne produkuje toksin, patogenaEscherichiakoja produkuje toksin, i druge mikroorganizme iz hrane, koji mogu da izazovu mikrobnu kontaminaciju hrane za ljude ili životinje.

Pored navedenih, u mikroorganizme osetljive na kvaternema amonijumska jedinjenja spadaju i gljivice, npr.Aspergillus flavnmiPenicillium chrysogenum,i paraziti, npr.Entamoeba

histolytica.

Ovaj pronalazak ima značajnu primenu u prehrambenoj industriji, domaćinstvu i organizovanom pripremanju hrane. Kvaternema amonijumska jedinjenja su lako dostupna, a troškovi primene metoda iz ovde izloženog pronalaska su, u odnosu na troškove primene postojećih antimikrobnih procesa, relativno niski. Za razliku od postojećih procesa tretiranja koji koriste, npr. TSP, korišćenje kvaternernih amonijumskih jedinjenja ne menja izgled, boju, ukus, niti teksturu prehrambenog proizvoda. Čitav niz koncentracija kvaternernih amoni-jumskih jedinjenja efikasno sprečava razvoj širokog spektra mikroorganizama na prehram-benim proizvodima. Za ispitivanje mutagenosti kvaternernih amonijumskih jedinjenja korišćenje Ames-ov biohemijski test, kojim je utvrđeno da istaknuti predstavnik kvaternernih amonijumskih jedinjenja ovog pronalaska, CPC, ne poseduje mutagena svojstva. Osim toga, CPC je već odobren za humanu upotrebu u proizvodima za oralnu primenu, u preparatima kao što je Cepacol<®>u obliku pastila, koje se unose oralnim putem, u dnevnim dozama koje dostižu čak 20 mg.

Ovaj pronalazak je namenjen poboljšanom metodu kontakta prehrambenih proizvoda i QAC, u kojem se najkraće vreme primene QAC na prehrambenim proizvodima meri delovima sekunde, a može da iznosi u rasponu od 0,1 sek. do oko 5 sekundi, ili u rasponu od 1 sek. do 5 sekundi. Može se, takođe, koristiti i vremenski raspon od oko 1 do 2 sekunde. Veoma je važno da vreme primene kvaternernoh amonijumskog jedinjenja bude dovoljno dugačko da u značajnoj meri osujeti razvoj mikroorganizama na prehrambenim proizvodima.

Ovaj pronalazak obuhvata i poboljšanii metod za postizanje kontakta kvaternernih amonijumskih jedinjenja sa prehrambenim proizvodima, raspršivanjem ili nebulizacijom jedinjenja po površini prehrambenog proizvoda. U okviru metoda raspršivanja ili nebulizacije može da se koristi rastvor QAC razblaženog u vodi, nova koncentrovana formulacija QAC, u kojoj je QAC kombinovano sa bar jednim sredstvom za povećanje rastvorljivosti, ili koncentrovani rastvor QAC razblažen u vodi. Moguće je i direktno raspršivanje ili nebulizacija koncentrata, ako je procentualna vrednost sadržaja QAC u koncentratu odobrena za primenu u obradi prehrambenih proizvoda.

Svrha izloženog pronalaska je da obuhvati sve metode koji dovode rastvor QAC u neposredan dodir sa prehrambenim proizvodima raspršivanjem, nebulizacijom, potapanjem ili namakanjem. Ovaj pronalazak ima, pored toga, za cilj da obuhvati i posredni kontakt rastvora kvaternernog amonijumskog jedinjenja sa prehrambenim proizvodina, npr. nanošenjem koncentrovanog ili razblaženog rastvora QAC na opremu, alatke ili površine na kojima se vrši obrada ili spravljanje hrane, a sa kojima prehrambeni proizvodi dolaze u dodir tokom obrade, spravljanja, skladištenja i/ili pakovanja.

Metod ovog pronalaska može da, po izboru, pre nanošenja QAC na prehrambeni proizvod, uključi i fazu utvrđivanja, da bi se - pre tretiranja - utvrdilo prisustvo mikroorganizama na hrani. Za fazu utvrđivanja može se koristiti neki od konvencionalnih metoda za brzo utvrđivanje prisustva mikroorganizama, uključujući i PCR i imunološke testove.

Pored navedenog, metod ovog pronalaska obuhvata, po izboru, i fazu utvrđivanja prisustva kvaternernih amonijumskih jedinjenja na površini prehrambenog proizvoda posle primene kvaternernih amonijumskih jedinjenja. Ovo utvrđivanje se obavlja neposredno posle faze kontakta ili posle nekoliko faza pranja. Na primer, QAC se ekstrahuje iz tkiva namirnica u obliku pogodnom za HPLC analizu. Metod obuhvata etanolsku ekstrakciju tkiva namirnice, nakon čega sledi ekstrakcija čvrste faze pomoću jonoizmenjivačke, katjonske HPLC kolone, koja selektivno odvaja kvaternema amonijumska jedinjenja od drugih jedinjenja u matrici, koja bi inače ometala HPLC analizu. HPLC analiza za kvantifikaciju ostataka kvaternernih amonijumskih jedinjenja koristi cijano-kolonu reverzne faze i analog QAC kao interni standard.

KRATAK OPIS CRTEŽA

SI. 1 je grafikon koji pokazuje inhibiciju prianjanjaE. coli0157:H7 na tkivo goveđe potrbušine posle tretmana sa CPC.

SI. 2 je grafikon koji pokazuje redukciju broja živih mikroorganizama na koži somića posle tretiranja sa CPC u 5% vodenom rastvoru glicerina na neselektivnim podlogama.

SI. 3 je grafikon koji pokazuje redukciju broja živihS. typhimnrinmna koži somića posle tretiranja sa CPC u 5% vodenom rastvoru glicerina na selektivnim podlogama.

SI. 4 je grafikon koji pokazuje redukciju broja živihS. lyphimuriumna crnom grožđu posle tretiranja sa CPC u 5% vodenom rastvoru glicerina.

SI. 5 je grafikon koji pokazuje redukciju broja živihS. lyphimurinmna brokoliju posle tretiranja sa CPC u 5% vodenom rastvoru glicerina.

DETALJNI OPIS PRONALASKA

Ovaj pronalazak se zasniva na saznanju da su kvaternarna amonijumska jedinjenja korisna za tretiranje širokog spektra prehrambenih proizvoda u cilju redukovanja širokog spektra mikroorganizama koji kontaminiraju hranu sa tih prehrambenih proizvoda i površina koje dolaze u dodir s njima u toku obrade i pripravljanja namirnica. Ovaj pronalazak se, takođe, zasniva na otkriću da kvaternema amonijumska jedinjenja efikasno odstranjuju, uništavaju, inaktivišu i ometaju vezivanje širokog spektra patogenih bakterija na prehrambene proizvode. Među ovim mikroorganizmima su i bakterije rodovaSalmonella, Staphylococcus, Streptococcus, Campylobacter, Arcobacter, Listeria, Aeromonas, Bacil/ us, Escherichiakoja ne produkuje toksin, kao i virulentni sojeviEscherichiakoji proizvode toksine, npr.E. coli0157:H7, gljivice, npr.Aspergilhis flavtisiPenicillinm chrysogerrnm,i paraziti kao što jeEntamoeba histolylica.

Ovaj pronalazak se sastoji od efikasne količine QAC u vodenom rastvoru. Konkretno, koncentrovani rastvor ovog pronalaska obezbeđuje antimikrobni rastvor idealan za primenu u industriji, kojoj su za obradu namirnica neophodne velike količine razblaženih rastvora kvaternernih amonijumskih jedinjenja. Koncentrovani rastvor ovog pronalaska obavezno sadrži i izvestan broj komponenti, sastojke opšte prihvaćene kao sigurne za primenu, i sredstva za povećanje rastvorljivosti.

Koncentrovani rastvori QAC ovog pronalaska imaju mnoge prednosti kad je u pitanju pripravljanje razblaženih rastvora QAC. Velika količina praška QAC se rastvara u vodenom rastvaraču, kojem je dodato najmanje jedno sredstvo za povećanje rastvorljivosti. Pravljenje koncentrovanih rastvora kvaternernih amonijumskih jedinjenja samo sa vodom je teško, jer QAC ima tendenciju da se izdvoji iz rastvora. U stvari, bez pomoći sredstva za povećanje rastvorljivosti, teško se može postići koncentracija kvaternernih amonijumskih jedinjenja u rastvorenom obliku veća od 5 do 10%, a u određenim uslovima veća od 1%, što zavisi od temperature rastvora. Ovi pronalazači su, međutim, utvrdili da se koncentrovani rastvori kvaternernih amonijumskih jedinjenja mogu napraviti, ukoliko se rastvor spravlja uz dodatak bar jednog sredstva za povećanje rastvorljivosti ili rastvarača, npr. alkohola ili propilen glikola. Kvaternema amonijumska jedinjenja su dobro poznati katjonski surfaktanti, a kao takva, pri pripremanju vodenih rastvora, intenzivno penušaju. Međutim, kad se za pripravljanje razblaženih QAC rastvora koristi koncentrovani rastvor QAC, koji sadrži QAC u koncentraciji većoj od 10% ili 15%o i najmanje jedno sredstvo za povećanje rastvorljivosti, penušanje koje se obično javlja pri spravljanju vodenih rastvora QAC značajno se smanjuje. Minimalno penušanje se javlja pri izradi koncentrovanog rastvora, a pripremljeni koncentrat ne peni. Osim toga, koncentrat se razblažuje uz minimum mućkanja, što za posledicu ima i miminalno penušanje. Ako se koncentrovani QAC izlaže niskim temperaturama, takav koncentrovani rastvor QAC je otporan na taloženje. Ukoliko se zamrzava, koncentrovan rastvor QAC, koji sadrži najmanje jedno sredstvo za povećanje rastvorljivosti, po odmrzavanju ostaje rastvor. Ukoliko se, posle transporta ili skladištenja na različitim temperaturama sredine ili po zamrzavanju, stvorio precipitat QAC, temperatura rastvora se povećava sve do nestanka precipitata. Velike količine koncentrata QAC u tankovima ili buradi mogu da se, ako je potrebno, zagrevaju pomoću grejača. Pored toga, za razliku od razblaženih vodenih rastvora kvaternernih amonijumskih jedinjenja, koncentrovani rastvori QAC sa visokom koncentracijom najmanje jednog sredstva za povećanje rastvorljivosti, npr. pogodnim organskim rastvaračima koji se mešaju sa vodom, gotovo su nepokvarljivi i rok trajanja im je gotovo neograničen. Uz to, koncentrovani rastvori QAC doprinose većoj sigurnosti krajnjeg korisnika, jer eliminišu rizik udisanja QAC prašine, što predstavlja problem pri manipulaciji sa QAC u prahu, pogotovo kada sa radi sa velikum količinama praha, jer on može da izazove iritaciju pluća, oka, grla, nosa ili kože. Koncentrovani rastvori QAC smanjuju zapreminu i masu rastvora za transport i skladištenje za potrebe industrijske primene rastvora QAC. I, što je najvažnije, kad se koncentrovan rastvor QAC razblaži u vodi u cilju pripravljanja razblaženih rastvora QAC za njihovo nanošenje na prehrambene proizvode, razblaženi koncentrat pokazuje veoma dobar nivo antimikrobne efikasnosti.

Ovaj pronalazak se konkretno bavi koncentrovanim rastvorom QAC, koji sadrži kvaternerno amonijumsko jedinjenje u koncentracijama većim od 10% težinski i najmanje jedno sredstvo za povećanje rastvorljivosti. Sredstvo za povećanje rastvorljivosti je svaki organski rastvarač koji se meša s vodom i povećava rastvorljivost praškastog QAC u vodenom rastvoru, tako da QAC obrazuje rastvore sa koncentracijama većim od 10% težinski. Težinski 10%-ni rastvor se pripravlja odmeravanjem 10 g QAC i rastvaranjem odmerene količine u 90 g tečnosti, koja sadrži najmanje jedno sredstvo za povećanje rastvorljivosti i vodu, ako je potrebno dodavanje vode da se težina tečnosti dopuni do 90 g. Koncentrovani rastvor QAC ovog pronalaska sadrži QAC u rastvoru u koncentracijama većim od 10% težinski, i bolje - u koncentracijama većim od 15% težinski. Koncentrovani rastvor QAC se sastoji od QAC u obliku rastvora u koncentracijama koje idu od više od 10% težinski, većim od 15% težinski do oko 60% težinski. Iako se koncentracije QAC veće od 60% težinski mogu koristiti u koncentrovanim rastvorima QAC, gornju granicu korisne koncentracije određuje interakcija između težinskog % QAC i sredstva/sredstava za povećanje rastvorljivosti, korišćenog za spravljanje koncentrovanog rastvora. Primenom određenih sredstva za povećanje rastvorljivosti ili kombinacije tih sredstava mogu se dobiti i koncentrovane formulacije QAC sa koncentracijom većom od 60%. Pre spravljanja razblažene formulacije za tretiranje prehrambenih proizvoda, veoma je važno da se sav QAC prah rastvori i pređe u rastvor. Najbolje je da je QAC prisutan u koncentraciji većoj od 10% ili 15%o težinski do 50% težinski, a još bolje u koncentracijama većim od 10% do 15% težinski do oko 40% težinski. Koncentracija QAC u rasponu od 10 do 30% težinski, između 15% do 25% težinski, a u okviru toga i od oko 20% težinski, pokazala se korisnom u ovde opisanom koncentrovanom rastvoru.

Koncentracije QAC u ovom pronalasku opisane su kao koncentracije delova na milion (ppm) ili kao procentualno težinske, gde je 100 000 ppm jednako 10% težinski. U izloženim primerima korišćenje CPC, a za definisanje koncentracije, obe oznake - ppm i %.

Za postizanje 100% težinski dodaje se sredstvo za povećanje rastvorljivosti ili kombinacija tih sredstava, i voda da dopuni do potrebne težine rastvora. Sredstvo za povećanje rastvorljivosti, razmotreno u ovom pronalasku, predstavlja svako kompatibilno sredstvo za povećanje rastvorljivosti koje solubilizuje kvaternema amonijumska jedinjenja u koncentracijama većim od 10% težinski, ali su alkoholi najbolja sredstva za povećanje rastvorljivosti. Nadalje, poliglikoli, kao što je polietilen glikol, predstavljaju korisna sredstva za povećanje rastvorljivosti. U ovom pronalasku razmatra se primena jednog ili više tih sredstava za povećanje rastvorljivosti. Određenije, alkohol je odabran iz grupe koju čine jednohidroksilni, dvohidroksilni trohidroksilni alkohol, polietilen glikol, i njihova kombinacija. Svaki od ovih tipova alkohola može da se koristi samostalno ili u kombinaciji sa jednim ili više drugih alkohola da bi se dobila željena težinska procentualna vrednost za sredstvo za povećanje rastvorljivosti. Ako se koristi jednohidroksilni alkohol, tada je ovaj tip alkohola najverovatnije alifatični alkohol, i još verovatnije - etil alkohol. Ako je korišćen dvohidroksilni alkohol, to će verovatno biti glikol ili njegov derivat. Kad su u pitanju glikoli, propilen glikol je najverovatniji izbor i može se nabaviti od mnogobrojnih proizvođača. U svojstvu sredstva za povećanje rastvorljivosti za visoke koncentracije kvaternernih amonijumskih jedinjenja, npr. CPC, propilen glikol je bolji od ostalih alkohola. Trohidroksilni alkoholi, kao što je glicerol ili njegovi derivati, takođe ispunjavaju zahteve kao sredstva za povećanje rastvorljivosti u ovom koncentrovanom rastvoru CPC. Izbor alkohola zavisi od vrste prehrambenih proizvoda na koje će se nanositi razblaženi rastvor, i bira se tako da bude kompatibilan sa fazama obrade pre ili posle ostvarivanja kontakta QAC sa prehrambenim proizvodom. Ako je kao sredstvo za povećanje rastvorljivosti korišćen poliglikol, to će najverovatnije biti polietilen glikol i to posebno vrste manje molekulske težine, čija je srednja vrednost molekulske težine manja ili jednaka 600, koje su dobro poznate i čija su svojstva slična svojstvima propilen glikola.

Ako je u ulozi sredstva za povećanje rastvorljivosti korišćen etil alkohol, on je zastu-pljen u koncentraciji od oko 49% težinski. Ovaj pronalazak koristi etil alkohol u rasponima koncentracija od 0,5% do 49%, od 10% do 40%, od 15% do 30%, a u okviru ovog poslednjeg - od oko 20% težinski.

Koncentrovani rastvor QAC sadrži najmanje jedno sredstvo za povećanje rastvorljivosti, npr. alkohol u koncentraciji do oko 70% težinski. Verovatnije je da će alkohol biti prisutan u koncentraciji od oko 60% težinski, a raspon koncentracija može da bude ođ oko 10% do 60% težinski. Koncentracija sredstva za povećanje rastvorljivosti je promenljiva i zavisi od težinske procentualne zastupljenosti QAC, koji treba da se rastvori u datom rastvoru, kao i od konkrente planirane namene koncentrisanog rastvora QAC i njegovih razblaženja

Ako koncentrovani rastvor QAC sadrži neko od kvaternernih amonijumskih jedinjenja u koncentraciji od 40% težinski, i najmanje jedan alkohol, u koncentraciji u rasponu od 50% do 60% težinski, voda čini preostali %. Pogodan alkohol za ovaj rastvor je propilen glikol. Bolje je ako koncentrovani rastvor QAC sadrži neko QAC u koncentraciji od 40% težinski i bar jedan alkohol u koncentraciji između 55 i 60% težinski, dok voda učestvuje sa oko 5% težinski. Najbolji koncentrovani rastvor QAC sadrži QAC u koncentraciji od 40% težinski, alkohol u koncentraciji od oko 57% težinski, a voda čini oko 3% težinski. I za ovakav rastvor je propilen glikol najpogodniji alkohol.

Može se, međutim, koristiti i koncentrovani rastvor QAC, koji sadrži QAC u koncentraciji od oko 40% težinski i najmanje jedan alkohol u koncentraciji od oko 50% težinski. U ovom koncentrovanom vodenom rastvoai, sredstvo za povećanje rastvorljivosti može da bude kombinacija alkohola, npr. etil alkohola i propilen glikola. Kao sredstvo za povećanje rastvorljivosti može se koristiti i glicerol, sam ili u kombinaciji sa drugim alkoholima ili poliglikolima. U ove svrhe koristi se glicerol u koncentracijama manjim ili jednakim 20% težinski, a može da se koristi i u koncentracijama u rasponu od 0,5 do oko 10% težinski, a u okviru ovog raspona, u koncentraciji od 1% težinski. Glicerol je pogodan za metode za koje propilen glikol nije alkohol izbora za povećanje rastvorljivosti QAC. Osim toga, pogodan je koncentrovani rastvor QAC koji sadrži QAC u koncentraciji od oko 20% težinski i najmanje jedan alkohol u koncentraciji od oko 50% težinski, npr. kombinaciju etil alkohola i propilen glikola, gde svaki od alkohola učestvuje sa 25% težinski.

Kvaternerno amonijumsko jedinjenje u ovom koncentrovanom rastvoru QAC izabrano je iz grupe koju čine alkilpiridin, tetra-alkilamonijum i alkilaliciklične amonijumove soli.

Strukturna formula alkilpiridina je (1):

gde je n 9-21, a X je halid.

Strukturna formula tetra-alkilamonijuma je (II): u kojoj je n 9-21, R je izabrano iz grupe koju čine CH3i C2H5, a X je halid. Strukturna formula alkilalicikličnih soli amonijuma je (III):

gde je n 9-21, Z je 4-5, Rje izabrano iz grupe koju čine CH3i C2H5, a X je halid.

Procenom efikasnosti uklanjanja prionulih mikroorganizama iz različitih namirnica, kao i efikasnosti sprečavanja i ometanja vezivanja mikroorganizama, obuhvaćen je čitav niz različitih kvaternernih jedinjenja, koja su katjonska, površinski aktivna sredstva, tj. surfaktanti. Pošto se kao najefikasniji među proučenim kvaternernim amonijumskim jedinjenjima pokazao cetilpiridin hlorid (CPC), korišćen je u svim opisanim primerima, što nema za cilj da svede primenu QAC samo na CPC u smislu ovog pronalaska, jer i ostala kvaternema amonijumska jedinjenja ispoljavaju slična svojstva kad su u pitanju patogeni mikroorganizmi koji se prenose hranom. Maksimalnu antimikrobnu aktivnost poseduju kvarterna amonijumska jedinjenja koja imaju između 12 i 16 ugljenikovih atoma na dugačkom bočnom lancu. CPC, odabrano kvaternerno amonijumsko jedinjenje, ima 16 ugljenikovih atoma da dugačkom bočnom lancu

Ovaj pronalazak se, osim toga, bavi i razblaživanjem koncentrovanog rastvora QAC, sa najmanje jednim sredstvom za povećanje rastvorljivosti i vodom, u cilju dobijanja željenje težinske procentualne koncentracije CPC, i ostvarivanjem kontakta tog razblaženog rastvora QAC sa prehrambenim proizvodom, radi sprečavanja razvoja mikroorganizama ili ometanja njihovog vezivanja za prehrambeni proizvod. Razblaženi rastvor QAC podrazumeva koncentraciju QAC manju ili jednaku 1% težinski. Ta težinska procentualna vrednost predstavlja, prema zahtevima Ministarstva poljoprivrede SAD, važeću prihvatljivu koncentraciju predmet-nog QAC za primenu u obradi namirnica. Količina QAC koja ostaje na prehrambenom proizvodu varira, zavisno od vrste tretiranih namirnica i metoda primene. Koncentrovani rastvor QAC, opisan u ovom pronalasku, razblažen je sa vodom da bi se dobio rablaženi rastvor sa sadržajem QAC od 0,01% do 1%, ali se može povećavati ili smanjivati, u zavisnosti od tipa prehrambenog proizvoda koji će se tretirati, kao i od odabranog metoda primene. Koncentrovani rastvor QAC, pripravljen na bazi težinskih odnosa kao što je opisano, razblažuje se da bi se dobila željena radna koncentracija razblaživanjem zasnovanim na zapreminskim odnosima. Na primer, 40% koncentrovani rastvor QAC se razblažuje do 1% QAC razbla-živanjem 2,5 mililitra koncentrata QAC sa 97,5 mililitara vode. U prehrambenoj industriji se radije odlučuju za ovaj pristup razblaživanju, jer je lakši za rad. Ipak, za pripravljanje razblaženih rastvora može se koristiti i razblaživanje u težinskim odnosima, kad se 2,5 g 40% (težinski) rastvora QAC meša sa 97,5 g vode da bi se dobio 1% rastvor. Razblaživanjem QAC iz koncentrovanog rastvora, istovremeno se razblažuje i sredstvo za povećanje rastvorljivosti, koje je sastavni deo koncentrovanog rastvora. Razblažen koncentrovani rastvor QAC se koristi za nanošenje na namirnice raspršivanjem, nebulizacijom, potapanjem i svim ostalim metoda-ma kontakta razblaženog rastvora QAC sa prehrambenim proizvodom, uključujući i posredni kontakt, npr. opremom koja dolazi u dodir sa hranom, površinama na kojima se hrana obrađuje ili priprema, a koje dolaze u kontakt sa hranom u toku obrade, pripravljanja, skladištenja /čuvanja i/ili pakovanja. Što je vreme primene rastvora QAC kraće, to bolje, pogotovo za svrhe industrijske ili komercijalne obrade hrane.

Ovaj pronalazak se, dalje, zasniva na saznanju da se vreme kontakta kvaternernih amonijumskih jedinjenja sa hranom, nanošenjem raspršivanjem ili nebulizacijom, može skratiti do čak 0,1 sekunde, a da se još uvek postigne značajna inhibicija vezivanja mikroorganizama koji se prenose hranom. Ovo predstavlja značajno poboljšanje i komercijalnu prednost za industrijsku primenu ovog procesa. Postupak nanošenja raspršivanjem ili nebulizacijom omogućava da kontakt razblaženog rastvora QAC bude kratkotrajan, kraći od 20 sekundi, ili još bolje oko 10 sekundi i kraće, a najbolje 5 sekundi ili još kraće. Najpogodniji vremenski raspon za kontakt QAC sa hranom je od 0,1 do oko 5 sekundi, a u okviru tog raspona, od 0,1 do oko 2 sekunde, a najčešće od 0,5 do oko 2 sekunde. Ovo podrazumeva da ovaj pronalazak predviđa najkraće fizički moguće vreme aplikovanja razblaženog rastvora QAC, kojim se postiže inhibicija mikroorganizama na namirnicama, u tečnostima ili na površinama sa kojima prehrambeni proizvod dolazi u dodir. Ovaj pronalazak razmatra različite vremenske intervale, kraće od 20 sekundi.

Sve dok omogućava kratko vreme nanošenja, ovaj metod smatra pogodnim svaki metod ostvarivanja kontakta QAC sa prehrambenim proizvodom. Za ovaj pronalazak je podesan metod koji se oslanja na kabine, koje omogućavaju aplikovanje raspršivanjem ili nebulizaci-jom. Mašine koje se koriste u tim kabinama na industrijskoj liniji, mogu se podesiti da svedu vreme aplikovanja na minimum, uz očuvanje efikasnosti antimikrobnog dejstva na namirnicama. Sva navedena, kratka vremena aplikovanja, tj. manje od 20 sekundi i tek 0,1 sekund, značajno smanjuju broj živih mikroorganizama na tretiranim namirnicama. Osim toga, za tretman raspršivanjem ili nebulizacijom potrebna je veoma mala količina razblaženog rastvora QAC, npr. za efikasan tretman potrebno je samo oko 1 unca (ekvivalent 28,34 grama) razblaženog rastvora QAC na oko funtu prehrambenog proizvoda.

Izloženi metod kratkotrajne aplikacije QAC podesan je za industrijsku obradu živin-skog mesa, za tretiranje pilića posle rashlađivanja potapanjem u rashladno kupatilo sa hladnom vodom. Pilići se izvade iz rashladnog kupatila i tretiraju razblaženim rastvorom QAC iz ovog pronalaska do oko 20 sekundi, bolje do oko 10 sekundi, a najbolje do 5 sekundi. Još pogodnije je ako vreme tretiranja može da se spusti ispod 2 sekunde, ili čak na samo 0,1 sekund. Obrađeni pilići se, nakon tretitanja, pakuju bez pranja ili ispiranja. Po izboru, pak, u metod može da se doda, ako se to smatra neophodnim, najmanje jedna faza - pranje pilića pre pakovanja. Izborna faza pranja može sa podrazumeva pranje raspršivanjem ili nebulizacijom vode, ili potapanjem prehrambenog proizvoda u sud ili tank sa vodom.

Detaljan opis iznetih aspekata ovog pronalaska dat je u nekim primerima iz daljeg teksta i slikama od 1-5.

Svrha primera izloženih u daljem tekstu je da ilustruju ovaj pronalazak u njegovom najpogodnijem konkretnom obliku, a ne da ga ograniče. Primeri koriste živinsko meso, gove-dinu, somovinu, brokoli i grožđe u ulozi prehrambenih proizvoda tretiranih ovim metodom, koji je, inače, namenjen tretiranju i ostalih prehrambenih proizvoda, na koje primena tretmana neće negativno uticati.

PRIMERI

U primerima su korišćeni sledeći mikroorganizmi:Staphylococcus aureusATCC 29213,Campylobacter jejuniATCC 29428,Escherichia coli(koja ne produkuje toksin) ATCC 25922,Escherichia coli0157:H7 (koja produkuje toksin) ATCC 43895,Arcobacler butzleriATCC 49616,Listeria monocytogenesATCC 49594,Aeromonas hydrophilaATCC 49140,Bacillus cereusATCC 49063,Salmonella typhimurhimATCC 14028 i NCTC 12023, i komercijalne kultureAspergillus flavusiPenicillium chrysogenum.

Primer 1

Bakterieidno dejstvo kvaternernih amonijumskih jedinjenja u suspendovanim kulturama

(Ne prionulim za proizvode od mesa)

Minimalna inhibitorna koncentracija ( MIC) kvaternernih amonijumskih jedinjenja

Minimalne inhibitorne koncentracije (MIC) za kvaternerno amonijumsko jedinjenje određivane su u Mueller Hinton hranljivoj podlozi (BBL Microbiologv Svstem), primenom metoda makrorazblaženja koji je, 1987.godine, definisao Nacionalni komitet za kliničke laboratorijske standarde. Eksperimenti su sprovedeni inkubacijomStaphylococcus aureus, Escherichia coli0157:H7,Listeria monocytogenesiSalmonella typhimuriumna 37<9>C tokom 16 sati. InkubacijaAeromonas hydrophiliaiBacillus cerensje obavljena na 30°C. MIC je određena najnižim razblaženjem bez vidljivog zamućenja. Podaci iz eksperimenta su predstavljeni u Tabeli 2.

Minimalna baktericidna koncentracija ( MBC) kvaternarnih amonijumskih jedinjenja

Minimalne baktericidne koncentracije (MBC) kvatemarnog amonijumskog jedinjenja zaCampylobacter jejuniiArcobacter butzleriodređivane su na Mueller Hinton hranljivoj podlozi (BBL Microbiologv Svstem), pomoću metoda makrorazblaženja koji je, 1987.godine, definisao Nacionalni komitet za kliničke laboratorijske standarde. Eksperimenti su obavljeni 48-satnom mikroaerofilnom inkubacijom na temperaturi od 37°C. Jednaki delovi svakog od razblaženja su nasuti u petri šolje sa agarom i inkubirani u mikroaerofilnim uslovima tokom 48 sati, na temperaturi od 37°C. Minimalne baktericidne koncentracije su određene kao najniže razblaženje u kojem se mikroorganizmi nisu razvijali. Podaci iz opisanog eksperimenta sumirani su u tabeli 3:

Podaci ispitivanja MIC i MBC pokazuju da CPC efikasno deluje na široki spektar mikroorganizama.

Dejstvo kvaternernih amonijumskih jedinjenja na planktonske ćelije

Posle 16-satne inkubacijeE. coli0157:H7 u tripton soja podlozi, kultura je centrifugirana (na 15 000 rpm, 10 min, 4°C). Po odstranjivanju supernatanta, peleta je isprana sa 10 ml 0,04 M kalijum fosfatnog pufera (PPB, pH 7,0) i suspendovana u PPB do krajnje suspenzije od 1-2 x IO<9>ćelija/ml. Istovetne količine (1,0 ml) centrifugirane su (na 14 000 rpm, 3 min), uz odstranjivanje supernatanta. Svaka peleta je suspendovana u po 1 ml vodenog rastvora različitih koncentracija (100-1000 ug/ml) ispitivane formulacije (CPC) ili 1,0 ml PPB, vorteksovana (30 sec), inkubirana 1 minut na 25°C, i centrifiigirana (14 000 rpm, 3 min). Po odstranjivanju supernatanta, svaka od peleta je suspendovana u 0,5 ml PPB. Ćelije iz svakog uzorka su brojane metodama poređenja istovetnih delova od po 0,05 ml i standardnog serijskog razblaženja na tripton soja agaru, a podaci registrovani kao srednja vrednost broja koloniformnih jedinki (CFU)/ml.

Rezultati opisanog eksperimenta pokazuju da je svim korišćenim koncentracijama CPC (100, 250, 500 i 1000 ug/ml) postignuta potpuna redukcija broja živihE. coli0157:H7. Rezultati ovog eksperimenta su posebno značajni za sprečavanje ukrštene kontaminacijeE. coli0157:H7 u industrijskoj obradi mesa. Kao stoje već pomenuto, ovaj sojE. coli,koji produkuje toksine, pokazuje otpornost na mnoga antimikrobna sredstva širokog spektra dejstva. Ovi rezultati dokazuju da se tretiranjem mesa kvaternernim amonijumskim jedinjenjem sprečava da jedan kontaminirani komad mesa kontaminira druge, nezagađene komade, jer QAC uništava mikroorganizam u tečnosti, koja i jeste sredstvo prenošenja mikroorganizama, odgovorno za ukrštenu kontaminaciju.

Primer 2

Efekti kvaternernih amonijumskih jedinjenja na redukciju živih bakterija sa pilećekože

Kvadrati pileće kože (2,5 x 2,5 cm) sa bataka sterilisani su dozom od 45 KGy radijacije iz elektronskog izvora, postavljeni epidermalnom stranom nagore u svako od udubljenja petri šolje za tkivne kulture sa 6 udubljenja. Svaki komad kože je zasejan sa 5 ml 0,008M fiziološkog rastvora sa fosfatnim puferom (PBS, pH 7,2) sa 6-8 x 10<3>CFU/ml bakterija, osim kontrolne grupe, tretirane samo sa 5 ml PBS. Šolje su inkubirane (30 min, 35°C), i svaki komad kože je ispran (2X, 5 ml PBS), da bi se odstranili slabo prionuli mikroorganizmi. Svaki uzorak zasejane kože je tretiran sa 5 ml PBS sa CPC. Za svaku od koncentracija CPC upotrebljena su po 3 uzorka kože, uključujći i grupu uzoraka tretiranih samo sa 5 ml PBS (0 koncentracija). Šolje su inkubirane uz mešanje (100 rpm) tokom 30 min. na 25°C. Posle inkubacije, svaki uzorak kože je ispran (5 ml PBS), stavljen u sterilnu plastičnu vrećicu sa 80 ml fiziološkog rastvora ili 1% peptona, pa homogenizovan 2 min u laboratorijskoj mešalici (Stomacher® 400, Seward Medical, London, England). Tri istovetna dela homogenata (1 ml) zasejana su u petri šolje i inkubirana (37°C, 18-24h). Zatim su bakterijske kolonije prebrojane, korigovane na razblaženje, i upisane kao CFU po uzorku kože.

Ova ispitivanja pokazuju redukciju broja živih bakterija( Salmonella typhimurium, Staphylococcus aureus, Campylobacter jejuni, Escherichia coli(soj koji ne produkuje toksin) iEscherichia coli0157:H7, posle tretmana koncentracijama CPC od 50 do 1 000 ppm. Više koncentracije CPC - do 8 000 ppm - korišćene su za ispitivanje saEscherichia coli0157:H7; utvrđeno je da redukuju broj prionulih bakterija do manje od 0,1%. Ova ispitivanja pokazuju značajnu inhibiciju razvoja ovih 5 bakterija na pilećoj koži.

Primer 3

Efekti kvaternernih amonijumskih jedinjenja na inhibicijuprianjanjabakterija

zapileću kožu

Kvadrati pileće kože (2,5 x 2,5 cm) sa bataka sterilisani su dozom od 45 KGy radijacije iz elektronskog izvora, postavljeni epidermalnom stranom nagore u svako od udubljenja petri šolje za tkivne kulture sa 6 udubljenja. Svaki komad kože je tretiran sa 5 ml 0,008M fiziološkog rastvora sa fosfatnim puferom (PBS, pH 7,2) sa dodatkom CPC. Za svaku od koncentracija ispitivanog jedinjenja korišćena su 3 uzorka kože, uključujući i uzorke tretirane samo sa 5 ml PBS (0 koncentracija). Petri šolje su inkubirane uz mešanje (100 rpm), a vremena inkubacije su bila različita (1 min ili 10 min), na temperaturi od 25°C. Inkubirani rastvor je odstranjen aspiracijom, uzorci kože isprani (5 ml PBS), a potom 30 min inkubirani na 35°C, sa 5 ml PBS sa 6-8 x 10<3>CFU/ml bakterija. Posle inkubacije, svaki uzorak kože je ispran (5 ml PBS) da bi se odstranili slabo prionuli mikroorganizmi, stavljen u sterilnu plastičnu vrećicu sa 80 ml fiziološkog rastvora ili 1% peptona, pa homogenizovan 2 min u laboratorijskoj mešalici (Stomacher® 400, Seward Medical, London, England). Tri istovetna dela homogenata (1 ml) zasejana su i inkubirana (37°C, 18-24h). Zatim su bakterijske kolonije prebrojane, korigovane na razblaženje, i upisane kao CFU po uzorku kože.

Ova ispitivanja dokazuju inhibiciju prianjanja bakterija{ Salmonella typhimurium, Staphylococcus aureus, Campylobacter jejuni, E. coli(soj koji ne produkuje toksin) iE. coli0157.H7) za pileću kožu posle tretmana koncentracijama CPC od 50 do 1 000 ppm. Podaci ovih ispitivanja, takođe, pokazuju da se prethodnom obradom pileće kože sa CPC značajno

inhibiše prianjanje ovih mikroorganizama za pileću kožu.

Tretiranje pileće kože sa CPC u koncentraciji 500-1 000 ppm samo 1 min, obezbeđuje značajan nivo inhibicije prianjanjaS. typhimurium.Ovako kratko vreme kontakta QAC sa mes-nim proizvodima predstavlja podstrek za skraćivanje vremena kontakta u odnosu na ona koja su se ranije smatrala efikasnim. Generalno gledano, potapanje u rashladno kupatilo je moglo tra-jati do 60 minuta, ali ovde izneti podaci govore u prilog stavu da se kraćim vremenom kontakta ili potapanja mogu postići značajne redukcije broja živih mikroorganizama. Faza kontakta sa CPC može da traje, primenom ovog pronalaska, od oko 20 sekundi do 60 minuta. Ovaj pronalazak, takođe, nudi i efikasna vremena kontakta, kraća od 10 minuta, u okviru pomenutog raspona (od oko 20 sec do oko 9 minuta, od oko 20 sc do oko 5 min, i od oko 20 sec do oko 90 sec).

Primer 4

Efektikvaternernihamonijumskih jedinjenja na redukciju brojaživihbakterija na goveđojpotrbušini

Kvadrati goveđe potrbušine (2,5 x 2,5 cm), debljine 0,5 cm, sterilisani su dozom od 45 KGy radijacije iz elektronskog izvora, postavljeni u svako od udubljenja petri šolje za tkivne kulture sa 6 udubljenja. Svaki komad tkiva je zasejan sa 5 ml 0,008M fiziološkog rastvora sa fosfatnim puferom (PBS, pH 7,2) sa 6-8 x 10<3>CFU/ml bakterija, osim kontrolne grupe, tretirane samo sa 5 ml PBS. Šolje su inkubirane (30 min, 35°C), i svaki kvadrat je ispran (2X, 5 ml PBS), da bi se odstranili slabo prionuli mikroorganizmi. Svaki uzorak zasejanog tkiva je tretiran sa 5 ml PBS sa CPC. Za svaku od koncentracija CPC upotrebljena su po 3 uzorka tkiva, uključujći i grupu uzoraka tretiranih samo sa 5 ml PBS (0 koncentracija). Šolje su inkubirane uz mešanje (100 rpm) tokom 30 min. na 25°C. Posle inkubacije, svaki kvadrat je ispran (5 ml PBS), stavljen u sterilnu plastičnu vrećicu sa 80 ml fiziološkog rastvora ili 1% peptona, pa homogenizovan 2 min u laboratorijskoj mešalici (Stomacher® 400, Sevvard Medical, London, England). Tri istovetna dela homogenata (1 ml) zasejana su i inkubirana (37°C, 18-24h). Zatim su bakterijske kolonije prebrojane, korigovane na razblaženje, i upisane kao CFU po kvadratu

Rezultati ovog ispitivanja pokazuju redukciju broja živihE. coli0157:H7 na tkivu goveđe potrbušine posle tretiranja sa CPC-om u koncentracijama od 50 do 1000 ppm, uz postignutu redukciju prionulih bakterija od 62-64% koncentracijama od 500 i 1000 ppm CPC.

Primer 5

Efekti kvaternernih amonijumskih jedinjenja na inhibiciju prianjanja bakterija na tkivo goveđe potrbušine

Kvadrati goveđe potrbušine (2,5 x 2,5 cm), debljine oko 0,5 cm, sterilisani su dozom od 45 KGy radijacije iz elektronskog izvora, postavljeni u svako od udubljenja petri šolje za tkivne kulture sa 6 udubljenja. Svaki uzorak tkiva je tretiran sa 5 ml 0,008M fiziološkog rastvora sa fosfatnim puferom (PBS, pH 7,2) sa dodatkom CPC. Za svaku od koncentracija ispitivanog jedinjenja korišćena su 3 uzorka kože, uključujući i uzorke tretirane samo sa 5 ml PBS (0 koncentracija). Petri šolje su inkubirane uz mešanje (100 rpm) 10 min, na temperaturi od 25°C. Inkubirani rastvor je odstranjen aspiracijom, kvadrati tkiva isprani (5 ml PBS), a potom 30 min inkubirani na 35°C, sa 5 ml PBS sa 6-8 x 10<3>CFU/ml bakterija. Posle inkubacije, svaki uzorak tkiva je ispran (5 ml PBS) da bi se odstranili slabo prionuli mikroorganizmi, stavljen u sterilnu plastičnu vrećicu sa 80 ml fiziološkog rastvora ili 1% peptona, pa homogenizovan 2 min u laboratorijskoj mešalici (Stomacher® 400, Seward Medical, London, England). Tri istovetna dela homogenata (1 ml) zasejana su i inkubirana (37"C, 18-24h). Zatim su bakterijske kolonije prebrojane, korigovane na razblaženje, i upisane kao CFU po uzorku kože.

Ova ispitivanja dokazuju inhibiciju prianjanja Escherichia coli 0157.H7 posle tretiranja sa CPC u koncentracijama od 50 do 1 000 ppm, uz postignutu redukciju broja bakterija prionulih na goveđe meso od 76% pri koncentracijama od 1 000 ppm CPC. Na slici 1 prikazani su rezultati posebnog ispitivanja u kojem su korišćene veće koncentracije CPC i isti eksperimentalni postupak. Koncentracija od 20 000 ppm CPC potpuno je inhibisala prianjanje bakterija na goveđe meso.

Primer 6

Prskanje piletine pre hlađenja 0,1% cetilpiridin hloridom

Probna komora za raspršivanje projektovana je i napravljena za potrebe pilot pogona za obradu živinskog mesa.Test sistem za raspršivanje se sastojao od test-komore, rezervoara za vodu, pumpe za pritisak, filtera, regulatora pritiska, plastične komore za raspršivanje sa 8 mlaznica, raspoređenih na sve četiri strane, i kolektora za iskorišćenu vodu. Za raspršivanje odozgo predviđena je jedna mlaznica, kao i jedna za raspršivanje odozdo. Dimenzije komore su 90 x 90 x 90 cm. Uz pomoć potisne pumpe visokog pritiska, pritisak se mogao podešavati u rasponu od 0-140 psi (ekvivalent 0-9,8 kg-sila/kvadratni cm). Rastojanje između mlaznica i zaklanog pileta je 30-38 cm. Gornja mlaznica je korišćena za raspršivanje u unutrašnjosti zaklanog pileta. Korišćene su mlaznice za raspršivanje u obliku zarubljene kupe (1/8TK-SS1, Spraving Svstems Co.).

Rastvor za raspršivanje iz rezervoara pumpan je do regulatora pritiska, a potom raspršen preko mlaznica u komoru. U komori za raspršivanje instalisano je nekoliko aktivnih slojeva za raspršivanje od mlaznica od nerđajućeg čelika i cevi, a komora je prekrivena plastičnim folijama da bi se sprečilo isticanja hemikalije. Za vešanje tela pilića korišćena je karika.

Nerashlađeni pilići su preuzeti iz lokalnog pogona za obradu piletine. Preuzeti su na samom kraju linije za čišćenje od iznutrica, preneti u istraživačku laboratoriju i odmah korišćeni u ispitivanju. Između proizvodnog pogona i istraživačke laboratorije proteklo je manje od 30 minuta. Temperatura tela pilića bila je 32-37°C.

Na tela pilića je raspršivanjem zasejanaS. Typhimurium(1 ml) u koncentraciji od 1 x IO<6>CFU/ml, a potom inkubirana 30 minuta na sobnoj temperaturi. Potom su tela pilića ispira-na, raspršivanjem obične vode pod pritiskom od 30 psi (ekvivalent 2,1 kg-sila/kvadratni cm), na temperaturi od 22°C tokom 5 sekundi, kako bi se sprale nadovoljno prionule ćelije Salmonele. Zatim je svako od tela obešeno u komoru za raspršivanje i isprskano jednim od ispitivanih jedinjenja. Posle prskanja je svako pile 20 sekundi ispirano običnom vodom. Zatim su pilići oprani puferovanom peptonskom vodom, u plastičnoj vrećici i u automatskoj mešalici, da bi se dobili uzorci za mikrobiološku analizu. Obavljena je i vizuelna kontrola pilića, poređenjem izgleda pilića tretiranih ispitivanim jedinjenjima, npr. CPC, i izgleda ne-tretiranih ptica.

Koncentracija CPC od 1 000 ppm korišćena je pri različitim pritiscima raspršivanja i za različita vremena. Temperatura vode za raspršivanje podešena je na sobnu temperaturu od 22°C. Pritisak je podešavan na 30, 50 i 120 psi (ekvivalent 2,1 3,5 i 9,8 kg-sila/kvadratni cm), a vreme tretiranja na 30 i 90 sekundi. Svaki test je ponovljen 3 puta. Izvršeno je poređenje redukcije brojaS. typhimnriumna telima pilića na pticama prskanim ispitivanim jedinjenjem, vodom, na pticama koje nisu ničim prskane.

Po obavljenom tretiranju, svako pile je mehanički prano sa 100 ml puferovane peptonske vode (BPW) tokom 1 min, a potom je ta voda prikupljena. Uzorci su razblaženi, obogaćeni, zasejani na XLT agar ili Petrifilm (3M, Inc., St. Paul, MN, za ukupan broj aerobnih bakterija) i inkubirani 18-24 h na 37°C. Zatim su prebrojane CFU. Broj prionulih bakterija izračunat je metodom najveće verovatnoće. Izračunavanje najverovatnijeg broja Salmonela i ukupnog broja aerobnih bakterija urađeno je za svako pile, iz uzorka vode za pranje. Eksperimentalni podaci su obuhvaćeni analizom varijanse u cilju određivanja značajnosti razlika između tretiranih i kontrolnih grupa (SAS/STAT User's Guide, SAS Inst., Inc.,Cary, NC, 1993).

Rezultati ovog eksperimenta pokazuju da se raspršivanjem rastvora CPC, u koncentraciji od 1 000 ppm, pod pritiskom od 30, 50 i 120 psi (ekvivalent 2,1 3,5 i 9,8 kg-sila/kvadratni cm), tokom 30 i 90 sekundi, postiže značajna redukcija broja Salmonela na telima pilića. Ovi podaci, takođe, pokazuju da je metod raspršivanja pogodna alternativa standardnom metodu potapanja ili namakanja pilića, ako raspršivanje traje 30 do 90 sekundi, a izvodi se pod pritiskom u rasponu od 30 do 120 psi (ekvivalent 2,1 do 9,8 kg-sila/kvadratni cm)i sa 0,1% rastvorom CPC. Za postizanje najefikasnijih procesa, koji će dati začajnu redukciju broja mikroorganizama, mogu se koristiti i niže koncentracije CPC, raspršivanjem pod bilo kojim pritiskom iz datog raspona od 30 do 120psi (ekvivalent 2,1 do 9,8 kg-sila/kvadratni cm) ili više psi, i za različita vremena. Metod raspršivanja je posebno pogodan za industrijske procese, jer se njime postiže da se veliki broj zaklanih pilića automatski kratkotrajno isprska, čime se postiže značajna redukcija broja patogenih bakterija.

Primer 7

Ispitivanje delovanja kvaternernih amonijumskih jedinjenja naS. typhimuriumsa

živinskoj koži u zavisnosti od efektivne koncentracije i vremena delovanja

Ispitivanje se bavilo efektima CPC u smislu inhibicije i redukcije broja živihS. typhimuriumsa kože pilića. Ispitivani rastvor su predstavljale različite koncentracije CPC (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) u 5% (v/v) glicerinu u fosfatnom puferovanom fiziološkom rastvoru (0,008M, pH 7,2)(PBS). Rastvori su pripravljeni rastvaranjem odgovarajućih količina CPC u smeši glicerina i PBS Kvadrati kože (2,5 x 2,5 cm) sa bataka sveže smrznutih, neobrađenih pilića su sterilisani dozom od 45 KGy radijacije (elektronskim zrakom iz linearnog akceleratora, Iowa State Universitv).S. typhimuriumvodi poreklo od ATCC soja #14028 ili NTC soja #12023). Sva brojanja kolonija su obavljena na tripton soja agaru (TSA; DIFCO, Detroit, MI). Salmonella je čuvana na TSA. Inokulirani preparati su pripravljani na sledeći način. Erlenmajer sa 50 ml tripton soja hranljive podloge zasejan je saS. typhimuriumiz jedne kolonije, i inkubiran preko noći na 37°C, uz mešanje (150 rpm). Po 1 ml kulture je dvaput ispran sa 9 ml PBS (4800 rpm, 10 min). Peleta je suspendovana u PBS da bi se dobila finalna ćelijska koncentracija (spektrofotometrijski, 420 nm) od 1-2 x IO<6>CFU po mililitru.

Pileća koža je isečena sa bataka i postavljena, epidermom nagore, u svako od udubljenja petri šolje sa 6 udubljenja. Komadi kože su inokulirani sa 5 ml PBS sa 1-2 x IO<6>CFUS. typhimuriumpo ml, s izuzetkom kontrolne grupe, tretirane samo sa 5 ml PBS. Kulture sa kožom su inkubirane (30 min, 35°C), a zatim je inkubacioni rastvor odstranjen aspiracijom. Zasejani uzorci kože su tretirani sa po 5 ml ispitivanog rastvora. Za svaku od koncentracija ispitivanog rastvora korišćeni su setovi od po 3 uzorka kože, kao i set koji su činili uzorci kože tretirane samo sa 5 ml 5% (v/v) glicerina u PBS (0 koncentracija). Kulture su inkubirane 1, 3 ili 10 minuta, na temperaturi od 25°, uz mešanje (100 rpm). Posle inkubacije je svaki uzorak kože ispran uz aspiraciju (5 ml PBS), stavljen u sterilnu plastičnu vrećicu sa 50 ml 0,1% (w/v) peptona, homogenizovan 2 minuta u laboratorijskoj mešalici Stomacher® 400 (Seward Medical Co., London, Engleska). Ugao vrećice je odsečen, pod aseptičnim uslovima, i ceo sadržaj je prebačen u sterilnu epruvetu centrifuge, zatim centrifugiran 10 minuta (12 000 rpm, 20°C). Peleta je ponovo suspendovana u 5 ml 0,1% (w/v) peptonske vode. Jedan mililitar odgovarajućeg rastvora je zasejan na TSA agar u triplikatu, inkubiran 24 h, na 37°C, nakon čega su kolonije prebrojane, korigovane na razblaženje i registrovane kao broj CFU po uzorku kože. Rezultati su pokazali da je redukcija broja Samonelle zavisila od koncentracije CPC i vremena izlaganja. Dekontaminacija za gotovo 5 logiopostignuta je tretmanom rastvorima CPC, u koncentracijama od 4 000 do 8 000 ppm, u trajanju od 3 min.

Kvadrati kože, postavljeni epidermalnom stranom nagore u svako od udubljenja petri šolje sa 6 udubljenja, tretirani su sa po 5 ml ispitivanog rastvora. Setovi od po 3 uzorka kože korišćeni su za svaku od koncentracija ispitivanog rastvora, uključujući i jedan set čiji su uzorci tretirani samo sa po 5 ml 5% (v/v) glicerina u PBS (0 koncentracija). Tkivne kulture su inkubirane, uz mešanje (100 rpm), na 25°C, 1 3 ili 10 min. Inkubacioni rastvor je odstranjen aspiracijom, a uzorci kože isprani (sa 5 ml PBS) i inkubirani (30 min, 35°C) uz dodatak 5 ml PBS sa 1-2 x IO<6>CFUS. typhimuhumpo mililitru. Posle inkubacije, svaki od uzoraka kože je aspiracijom opran (5 ml PBS), smešten u sterilnu plastičnu vrećicu sa 50 ml 0,1% (w/v) peptona, pa 2 minuta homogenizovan u laboratorijskoj mešalici Stomacher® 400. Jedan mililitar odgovarajućeg rastvora je zasejan na TSA u triplikatu, inkubiran 24 h, na 37°C, nakon čega su kolonije prebrojane, korigovane na razblaženje i registrovane kao logioCFU po uzorku kože. Rezultati pokazuju da i prevencija kontaminacije Salmonelom, primenom pred-obrade sa rastvorom CPC, pokazuje zavisnost od koncentracije rastvora i vremena izlaganja. Najbolji efekti su uočeni sa 10-minutnim vremenom pred-obrade, za koje je, koncentracijom od 8 000 ppm, postignuta inhibicija prianjanja Salmonele za 4,9 logi0. Ovaj rezultat je veoma značajan, s obzirom na to da je prevencija ukrštene kontaminacije od vrhunskog značaja za prehrambenu industriju.

Vrednosti Iog10CFU po uzorku kože kretale su se u rasponu od 4,61 do 5,03. Razlike između tretiranih i kontrolnih uzoraka, analizirane pomoću ANOVA i Nevvman-Keuls analize, bile su statistički signifikantne (p< 0,01).

U drugom eksperimentu sa metodom raspršivanja, posle 90 sekundi raspršivanja rastvora CPC u koncentraciji od 5 000 ppm, postignuta redukcija broja Salmonela na koži pilića iznosila je 3,3 log10.

Primer 8

Efekti kvaternernih amonijumskih jedinjenja na redukciju živihListeria monocytogenesna koži pilića

U ovom primeru su sve faze iz Primera 2 ponovljene, korak po korak, s tom razlikom što je za zasejavanje uzoraka pileće kože upotrebljenaListeria monocytogenes,a podloga u plastičnoj vrećici, korišćenoj za mešanje na Stomacher-u 400, sadržala je 0,1% peptona. Sa koncentracijama CPC od 2 000 ppm i većim, postignuta je redukcija broja živihListeria monocytogenesza više od 4 log]0.

Primer 9

Efekti kvaternernih amonijumskih jedinjenja na inhibiciju prianjanja živih Listeria monocvtogenes na kožu pilića

U ovom primeru su ponovljene sve faze iz Primera 2, s tom razlikom što je za zasejavanje uzoraka pileće kože upotrebljenaListeria monocytogenes,a podloga u plastičnoj vrećici, korišćenoj za mešanje na Stomacher-u 400, sadržala je 0,1% peptona. Koncentracijom CPC od 50 ppm postignuta je 82%-na redukcija, koncentracija od 100 ppm postigla je 92% redukcije, dok je sa koncentracijama od 500 i 1 000 ppm ostvarena redukcija od 100%.

Primer10

Efekti kvaternernih amonijumskih jedinjenja na redukovanje broja živihSalmonella typhimuriumna somovini, crnom grožđu i brokoliju.

Ispitivani su efekti CPC na smanjenje broja živihS. typhimuriumna somovini, crnom grožđu i brokoliju. Ispitivani rastvori su sadržali različite koncentracije CPC (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) u 5% (v/v) glicerina u 0,008M, pH 7,2 fosfatnom puferovanom fiziološkom rastvoru (PBS). Rastvori su dobijeni rastvaranjem odgovarajućih količina CPC u smeši glicerina i PBS.

Korišćeni uzorci namirnica bili su sitno, neoštećeno crno grožđe, cvetići brokolija i kvadrati kože soma (2,5 x 2,5 cm), isečeni sa neobrađene, sveže odmrznute ribe. Voće i povrće je nabavljeno kod lokalnog piljara, dok je riba dopremljena u zamrznutom stanju od lokalnogsnabdevača. S. typhimurium jepoticala iz ATCC soja #14028 ili NCTC soja # 12023).

Sva brojanja kolonija su obavljena na XLD Salmonela-selektivnom agaru (DIFCO, Detroit, Ml). Osim toga, u eksperimentima sa ribom, za dobijanje ukupnog broja aerobnih kolonija korišćena je neselektivna podloga, tnpton soja agar (TSA: DIFCO, Detroit, MI).Salmonella ječuvana na TSA.

Priprema inokuluma zaS. typhimuriumobavljena je prema opisu iz Primera 7. Uzorci namirnica su smeštani u svako od udubljenja petri šolje za tkivnu kulturu sa 6 udubljenja. Uzorci su, zatim, zasejani sa 5 ml PBS sa 1-2 x IO<6>CFUS. typhimuriumpo mililitru, osim kontrolnih, tretiranih samo sa 5 ml PBS. Usledila je inkubacija (30 min, 35°C), nakon čega je inkubacioni rastvor odstranjen aspiracijom. Zasejani uzorci su tretirani sa po 5 ml ispitivanog rastvora. Za svaku od koncentracija ispitivanog rastvora korišćeni su setovi od po 3 uzorka namirnica, uključujući i jedan set u kojem su uzorci namirnica tretirani samo sa 5 ml 5% (v/v) glicerina u PBS (0 koncentracija). Šolje su inkubirane 3 minuta, uz mešanje (100 rpm) na 25°C. Nakon inkubacije, svaki od uzoraka namirnica je obrađen i prebačen u plastičnu vrećicu za dalju obradu u Stomacher® 400 laboratorijskoj mešalici, kao u Primeru 7. Ugao vrećice je odsecan u aseptičnim uslovima, sadržaj presut u sterilnu epruvetu za centrifugiranje, koja je potom 10 minuta centrifugirana (12 000 rpm, 20°C). Peleta je potom ponovo suspendovana u 5 ml 0,1% (w/v) peptonske vode. Po jedan mililitar odgovarajućeg razblaženja je, u triplikatu, zasejan na XLD agar (za eksperimente sa grožđem i brokolijem), odnosno XLD i TSA agar (za eksperimente sa somovinom). Posle 24-satne inkubacije na 37°C, prebrojane su kolonije, korigovane na razblaženje i registrovane kao CFU po uzorku kože (za ribu) odnosno CFU po gramu za ostale uzorke namirnica. Rezultati ovih eksperimenata su prikazani na slikama 2-5. S obzirom na to da riba nije sterilisana radijacijom, na slici 2 je prikazan ukupan broj aerobnih bakterija na neselektivnoj podlozi, dok slika 3 prikazuje samo broj za Salmonelu.

Primer 11

Efekat raspršivanja kvaternernih amonijumskih jedinjenja na smanjenje broja živih

bakterija na pilićima

Ovim eksperimentima je ispitivan efekat na smanjenje broja živih bakterija, koji bi se postizao raspršivanjem kvaternernih amonijumskih jedinjenja po ćelom telu zaklanih pilića, primenom komercijalnog raspršivača. Rastvori za bakterijsko zasejavanje su pripravljeni na sledeći način:E. coli(ATTC #25922) je kultivisana na BHI podlozi 20-24 h, razblažena do koncentracije 1:1 000, dodavanjem 0,5 ml kultureE. coliu 500 ml fiziološkog rastvora (PSS).Salmonella typhimurium jeuzgajana na BHT 20-24 h, pa razblažena do koncentracije 1: 5 000, dodavanjem 0,1 ml kultureS. typhimuriumu 500 ml fiziološkog rastvora (PSS). Pripremljen je rastvor CPC za tretiranje u koncentraciji od 5 000 ppm. Za svaki ogled su, iz lokalnog pogona za obradu živine, dopremani nerashlađeni pilići. Zivinska tela su vešana na lančanu liniju, i isprskana sa po 1 ml rastvora bakterijskog inokulata po grudima i leđima. Bakterijama je ostavljeno 30 minuta, na sobnoj temperaturi, da prionu. Potom su živinska tela na liniji prana 20 sekundi običnom vodom i podeljenja na grupe od po 10. U svakoj seriji je 10 pilića tretirano raspršivanjem CPC (5 000 ppm), a 10 raspršenom običnom vodom. I testovi sa S. tvphimurium podrazumevali su grupu koja nije tretirana posle zasejavanja, radi procene efekta raspršivanja.

Za obe bakterije je po jedna grupa pilića 20 sekundi tretirana Johnson<1M>raspršivačem sa 35 šolja obične vode pod pritiskom od 60 psi (ekv. 4,2 kg-sila/kvadratni cm). Posle pranja, pilići su mirovali 90 sekundi, pa su 20 sekundi prani sa 20 šolja obične vode pod pritiskom od 80 psi (ekv. 5,6 kg-sila/kvadratni cm). Opisani ciklus pranja je ponovljen 2-3 puta, sa razmakom između ciklusa od po 90 sekundi. Druga grupa je 20 sekundi tretirana sa CPC (5 000 ppm) pod pritiskom od 60 psi (ekv. 4,2 kg-sila/kvadratni cm) (Johnson™ raspršivačem), mirovala 90 sek., pa prana 20 sekundi sa 20 šolja obične vode (80 psi). Ciklus pranja je ponovljen 2-3 puta.

Posle tretiranja, pilići su stavljani u plastične vrećice, a u svaku vrećicu je nasuto po 100 ml 0,1% puferovane peptonske vode (BPW). Vrećice su mehanički protresane, a tečnost iz njih prikupljena za metod najverovatnijeg broja (MPN). Za procenu ukupnog broja aerobnih bakterija (TPC) korišćen je i Petrifilm™. Prethodno prisutna (nezasejana)C. jejunibrojana je metodom MPN, aE. colipomoću Petrifilma.

Sledeći rezultati pokazuju da tretman sa CPC efikasno redukuje brojC. jejuni, E. coliiS. typhimurium.Oceđena voda iz ciklusa ispitivanja naS. typhimuriumproveravana je i ispitivanja su pokazala daje CPC u oceđenoj vodi smanjio broj salmonela za 1 log. Stoga se i prikazani rezultati broja uništenih mikroorganizama za salmonelu mogu umanjiti za 1 log.

Primer 12

Efekti kvaternernih amonijumskih jedinjenja na gljivice koje se prenose hranom

Ovim ispitivanjem je ispitivan efekat CPC na gljivice koje se prenose hranom. Na nakošene petri šolje su, na agar sa krompirovom dekstrozom (PDA), nanošene u trakama kultureAspergillus flavusiPenicillium chrysogenum.Trideset minuta posle zasejavanja ili nakon 24 sata (uz inkubaciju na sobnoj temperaturi), preko svake petri šolje su stavljena dva okrugla filtera (prečnika 7 mm). Svim filterima je dodato po 10 ul rastvora CPC (u koncentracijama od 200 ppm, 1 000 ppm, 5 000 ppm i 25 000 ppm) ili destilovane i dejonizovane (DD) vode. Sve kulture su, okrenute nagore, inkubirane 48 sati, na sobnoj temperaturi. Nakon toga su mereni prečnici prstenova inhibicije. Rezultati (iz tabela) pokazuju da je efikasnost CPC protiv gljivica koje se prenose hranom.

CPC efikasno deluje na ispitivane gljivice koje se prenose hranom.

Primer 13

Efekat kratkotrajno primenjenih kvaternernih amonijumskih jedinjenja na cele piliće U dva ispitivanja, sprovedena u komercijalnom pogonu za obradu brojlera, za tretiranje tela brojlera posle rashlađivanja korišćen je preparat Cecure<1M>(0,2 do 0,5% CPC), razblaženje koncentrata CPC, koji sadrži CPC (40%), propilen glikol (57%) i vodu (3%), gde su sve komponente zastupljene težinski. U okviru ovih ispitivanja je komora za finalno pranje ili komora "pada zagađenja", locirana ispred klasifikacije/merenja i pakovanja, a posle hlađenja potapanjem, modifikovana za primenu preparata CPC. Modifikacije komore obuhvatile su promenu mlaznica, kako bi se omogućilo da se raspršuju tek vaoma male količine (1 do 6 unci) preparata po brojleru, kao i modifikaciju načina raspršivanja po brojlerima, da bi se obezbedilo potpuno prskanje maksimalne površine tela brojlera. Osim toga, povećana je i dužina komore, a instalisani su i izduvni uređaji komore. Koncentrovani preparat Cecure je razblaživan do primenske koncentracije neposredno pre direktnog raspršivanja na tela brojlera, ili je razbla-živan i čuvan u velikim sudovima pre primene. Vreme primene razblaženog rastvora Cecure™ na bilo je, za svaku pticu, 1,5 sekundi, a rastvor je imao sobnu temperaturu ili nešto višu, zavisno od uslova čuvanja.

Nakon što su brojleri tretirani razblaženim rastvorom Cecure™, cedili su se oko 3 minuta, a mikrobiološko uzorkovanje je obavljano posle ceđenja. Uzorkovanje je vršeno metodom pranja čitavog brojlera u 400 ml puferovane peptonske vode. Uzorci su analizirani naCampylobacter, Salmonella, E. colikoja ne produkuje toksin, i ukupan broj aerobnih mikroorganizama. Brojleri iz kontrolne grupe su, takođe, analizirani na pomenute mikroorganizme, ali su ti brojleri skinuti sa linije neposredno pre komore za finalno pranje. U oba ispitivanja je brojCampylobacter, E. coli,kao i ukupan broj aerobnih bakterija značajno redukovan za više od 99%. U oba ispitivanja je, takođe značajno, redukovana učestalost javljanja Salmonele, i svedena na ispod 10%, dok je u kontrolnoj grupi brojlera stopa javljanja Salmonele bila, u nekim slučajevima, i veća od 60%.

Izloženi opisi konkretne primene ovog pronalaska, prezentovani su kao ilustracija, i nije im svrha da ograniče primenu pronalaska na pojedinačne formulacije, korišćene u primerima, jer su - na osnovu iznetog - moguće razne modifikacije ovde izloženog pronalaska. Ovaj pronalazak se zasniva na otkriću da kvaternema amonijumska jedinjenja značajno sprečavaju i redukuju bakterijsku kontaminaciju širokim spektrom bakterija koje se prenose hranom, daleko širim nego što se ranije i znalo.

Koncentrovana formulacija kvaternernog amonijumskog jedinjenja ima mnoga preimućstva koja je preporučuju industrijskoj primeni u pogonima za obradu prehrambenih proizvoda.

Claims (48)

1. Koncentrovani rastvor kvaternernog amonijumskog jedinjenja koji sadrži: kvaternerno amonijumsko jedinjenje sa koncentracijom većom od oko 15% težinski do oko 40% težinski, i najmanje jedno sredstvo za povećanje rastvorljivosti, karakterisan t i - m e stoje najmanje jedno sredstvo za povećanje rastvorljivosti propilen glikol.

2. Koncentrovani rastvor kvaternernog amonijumskog jedinjenja prema zahtevu 1, karakterisan time što je navedeno kvaternerno amonijumsko jedinjenje alkilpiridinska so, tetralkilamonijumska so, ili alkilaliciklična amonijumska so.

3. Koncentrovani rastvor kvaternernog amonijumskog jedinjenja prema zahtevu 2, karakterisan time što je navedena alkilpiridinska so predstavljena strukturalnom formulom (1) gde je n 9-21, a X je halid. što je navedena tetra-alkilamonijumska so predstavljena strukturalnom formulom (II): u kojoj je n 9-21, R je izabrano iz grupe koju čine CH3i C2H5, a X je halid, i stoje navedena alkilaliciklična amonijumska so predstavljena strukturalnom formulom (111): gde je n 9-21, Z je 4-5, Rje izabrano iz grupe koju čine CHji C2H5, a X je halid.

4. Koncentrovani rastvor kvaternernog amonijumskog jedinjenja koji sadrži: kvaternerno amonijumsko jedinjenje u koncentraciji višoj od 10% težinski; i najmanje jedno sredstvo za povećanje rastvorljivosti, karakterisan time što je najmanje jedno navedeno sredstvo za povećanje rastvorljivosti propilen glikol, gde je navedeno kvaternerno amonijumsko jedinjenje alkilpiridinska so ili alkilaliciklična amonijumska so.

5. Koncentrovani rastvor kvaternernog amonijumskog jedinjenja prema zahtevu 4, karakterisan time što je navedena alkilpiridinska so predstavljena strukturalnom formulom (I) gde je n 9-21, a X je halid, i što je navedena alkilaliciklična amonijumska so predstavljena strukturalnom formulom (III): gde je n 9-21, Z je 4-5, R je izabrano iz grupe koju čine CH3i C2H5, a X je halid.

6. Koncentrovani rastvor kvaternernog amonijumskog jedinjenja koji sadrži: kvaternerno amonijumsko jedinjenje u koncentraciji višoj od 10% težinski, i najmanje jedno sredstvo za povećanje rastvorljivosti, karakterisan time što je najmanje jedno navedeno sredstvo za povećanje rastvorljivosti propilen glikol, gde je navedeno kvaternerno amonijumsko jedinjenje alkilpiridinska so predstavljena strukturalnom formulom (I) gde je n 9-21, a X je halid. što je tetra-alkilamonijumska so predstavljena strukturalnom formulom (II): što je alkilaliciklična amonijumska so predstavljena strukturalnom formulom (III): gde je n 9-21, Z je 4-5, Rje izabrano iz grupe koju čine CH3i C2H5, a Xje halid.

7. Koncentrovani rastvor kvaternernog amonijumskog jedinjenja prema zahtevu 6, karakterisan time što je navedeno kvaternerno amonijumsko jedinjenje više od 15% težinski.

8. Koncentrovani rastvor kvaternernog amonijumskog jedinjenja prema bilo kojem od zahteva 1-7, karakterisan time što ne sadrži ni jedno niti više.aromatičnih ulja,

9. Rastvor prema bilo kojem od zahteva 1-8, karakterisan time što navedeno sredstvo za povećanje rastvorljivosti dalje sadrži alkohol ili poliglikol..

10. Rastvor prema zahtevu 9, karakterisan time što je navedeno sredstvo za povećanje rastvorljivosti odabrano iz grupe koju čine jednohidroksilni alkohol, dvohidroksilni alkohol, trohidroksilni alkohol, polietilen glikol i kombinacija navedenog.

11. Rastvor prema zahtevu 10, karakterisan time što je navedeni jednohidroksilni alkohol alifatični alkohol, navedeni dvohidroksilni alkohol je glikol ili njegov derivat, a navedeni trohidroksilni alkohol je glicerol ili njegov derivat.

12. Rastvor prema bilo kojem od zahteva 4, 5 ili 6, karakterisan time što sadrži navedeno kvaternerno amonijumsko jedinjenje u rasponu od više od 10% težinski do oko 60% težinski.

13. Rastvor prema bilo kojem od zahteva 4, 5 ili 6, karakterisan time što sadrži navedeno kvaternerno amonijumsko jedinjenje u rasponu od više od 10% težinski do oko 50% težinski.

14. Rastvor prema bilo kojem od zahteva 4, 5 ili 6, karakterisan time što sadrži navedeno kvaternerno amonijumsko jedinjenje u rasponu od više od 10% težinski do oko 40% težinski.

15. Rastvor prema bilo kojem od zahteva 4, 5 ili 6, karakterisan time što sadrži navedeno kvaternerno amonijumsko jedinjenje u rasponu od više od 10% težinski do oko 30%) težinski.

16. Rastvor prema zahtevu 7 ili 8, karakterisan time što sadrži navedeno kvaternerno amonijumsko jedinjenje u rasponu od više od 15% težinski do oko 50% težinski.

17. Rastvor prema zahtevu 7 ili 8, karakterisan time što sadrži navedeno kvaternerno amonijumsko jedinjenje u rasponu od više od 15% težinski do oko 40% težinski.

18. Rastvor prema bilo kojem od zahteva 1-3, 7 ili 8, karakterisan time što sadrži navedeno kvaternerno amonijumsko jedinjenje u rasponu od oko 15% težinski do oko 25% težinski.

19. Rastvor prema bilo kojem od zahteva 1-18, karakterisan time što sadrži navedeno sredstvo za povećanje rastvorljivosti u koncentraciji do oko 70% težinski.

20. Rastvor prema bilo kojem od zahteva 1-19, karakterisan time što sadrži navedeno sredstvo za povećanje rastvorljivosti u rasponu koncentracije od oko 10% težinski do oko 60% težinski.

21. Rastvor prema bilo kojem od zahteva 1-8, karakterisan time što sadrži navedeno kvaternerno amonijumsko jedinjenje u koncentraciji od oko 40% težinski, a navedeno sredstvo za povećanje rastvorljivosti u rasponu koncentracije od oko 50% težinski do oko 60%) težinski.

22. Rastvor prema zahtevu 21, karakterisan time što sadrži navedeno kvaternerno amonijumsko jedinjenje u koncentraciji od oko 40%> težinski, i navedeno sredstvo za povećanje rastvorljivosti u rasponu koncentracije od oko 55% težinski do oko 60%) težinski, i što navedeni rastvor dalje sadrži vodu do oko 5%> težinski.

23. Rastvor prema zahtevu 22, karakterisan time što sadrži navedeno kvaternerno amonijumsko jedinjenje u koncentraciji od oko 40% težinski, navedeno sredstvo za povećanje rastvorljivosti u koncentraciji od oko 57% težinski, i pomenutu vodu oko 3% težinski.

24. Rastvor prema bilo kojem od zahteva 1-8, karakterisan time što sadrži navedeno kvaternerno amonijumsko jedinjenje u koncentraciji od oko 40% težinski i navedeno sredstvo za povećanje rastvorljivosti u koncentraciji od oko 50% težinski.

25. Rastvor prema bilo kojem od zahteva 1-8, karakterisan time što sadrži navedeno kvaternerno amonijumsko jedinjenje u koncentraciji od oko 20% težinski i navedeno sredstvo za povećanje rastvorljivosti u koncentraciji od oko 50% težinski.

26. Rastvor prema bilo kojem od zahteva 1-25, karakterisan time što je navedeno sredstvo za povećanje rastvorljivosti kombinacija etil alkohola i propilen glikola.

27. Rastvor prema bilo kojem od zahteva 9-26, karakterisan time što sadrži navedeno kvaternerno amonijumsko jedinjenje u koncentraciji od oko 40% težinski i što je navedeni alkohol glicerol u koncentraciji do oko 20% težinski.

28. Rastvor prema bilo kojem od zahteva 1-27, karakterisan time što je navedena kvaternema amonijumska so alkilpiridinska so.

29. Rastvor prema zahtevu 28, karakterisan time što je navedena alkilpiridinska so cetilpiridin hlorid.

30. Rastvor kvaternernog amonijumskog jedinjenja koji sadrži: kvaternerno amonijumsko jedinjenje u koncentraciji do oko 1% težinski; najmanje jedno sredstvo za povećanje rastvorljivosti, karakterisan time što je najmanje jedno navedeno sredstvo za povećanje rastvorljivosti propilen glikol; i voda, gde navedeni rastvor ne sadrži niti jedno niti više aromatičnih ulja.

31. Rastvor kvaternernog amonijumskog jedinjenja koji sadrži samo. kvaternerno amonijumsko jedinjenje u koncentraciji do oko 1%> težinski; najmanje jedno sredstvo za povećanje rastvorljivosti, karakterisan time što je najmanje jedno sredstvo za povećanje rastvorljivosti propilen glikol; i voda.

32. Rastvor prema zahtevu 30 ili 31, karakterisan time što navedeno kvaternerno amonijumsko jedinjenje ima koncentraciju od oko 0,01% do oko 1%.

33. Rastvor prema bilo kojem od zahteva 30-32 karakterisan time što navedeno sredstvo za povećanje rastvorljivosti dalje sadrži alkohol ili poliglikol.

34. Rastvor prema zahtevu 33, karakterisan time je sredstvo za povećanje rastvorljivosti odabrano iz grupe koju čine jednohidroksilni alkohol, dvohidroksilni alkohol, trohidroksilni alkohol, polietilen glikol i kombinacija navedenog.

35. Rastvor prema zahtevu 34, karakterisan time što je navedeni jednohidroksilni alkohol alifatični etanol, navedeni dvohidroksilni alkohol je glikol ili njegov derivat, a navedeni trohidroksilni alkohol je glicerol ili njegov derivat.

36. Rastvor prema bilo kojem od zahteva 30-35, karakterisan time što je navedeni rastvor u obliku koji se može raspršivati ili nebulizovati.

37. Metod za sprečavanje razvoja mikroorganizama na prehrambenim proizvodima, koji podrazumeva: kontakt navedenih prehrambenih proizvoda sa količinom rastvora kvaternernog amonijumskog jedinjenja koji efikasno inhibiše razvoj mikroorganizama, i koji sadrži kvaternerno amonijumsko jedinjenje i najmanje jedno sredstvo za povećanje rastvorljivosti, karakterisan time što je najmanje jedno sredstvo za povećanje rastvorljivosti propilen glikol.

38. Metod prema zahtevu 37, karakterisan time što vreme primene navedenog rastvora mora biti bar deo sekunde da bi se sprečio razvoj mikroorganizama na navedenom prehrambenom proizvodu.

39. Metod prema zahtevu 38, karakterisan time što je navedeno vreme primene u rasponu od oko 0,1 sekunde do oko 5 sekundi.

40. Metod prema zahtevu 39, karakterisan t i m e što je je navedeno vreme primene u rasponu od oko 1 sekunde do oko 5 sekundi.

41. Metod prema bilo kojem od zahteva 37-40, karakterisan time što se navedeni kontakt postiže raspršivanjem ili nebulizacijom.

42. Metod prema bilo kojem od zahteva 37-41, karakterisan time što je navedeni rastvor kvaternernog amonijumskog jedinjenja razblažen od koncentrovanog rastvora kvaternernog amonijumskog jedinjenja bilo kojeg od zahteva 1-29.

43. Metod prema bilo kojem od zahteva 37-41, karakterisan time što je navedeni rastvor kvaternernog amonijumskog jedinjenja rastvor kvaternernog amonijumskog jedinjenja bilo kojeg od zahteva 30-36.

44. Metod, koji podrazumeva: a) obezbedjivanje koncentrovanog rastvora koji sadrži: kvaternerno amonijumsko jedinjenje čija je koncentracija veća od oko 10% težinski; i najmanje jedno sredstvo za povećanje rastvorljivosti, karakterisan t i m e što je najmanje jedno sredstvor za povećanje rastvorljivosti propilen glikol b) razblaživanje navedenog koncentrovanog rastvora u oblik razblaženog radnog rastvora, i c) primenu navedenog razblaženog radnog rastvora na prehrambenom proizvodu.

45. Metod prema zahtevu 44, karakterisan time što korak (b) podrazumeva razblaživanje navedenog koncentrovanog rastvora vodom radi dobijanja razblaženog radnog rastvora, gde je kvaternerno amonijumsko jedinjenje prisutno u navedenog razblaženom radnom rastvoru u količini koja efikasno sprečava rast mikroorganizama na navedenom prehrambenom proizvodu.

46. Metod prema zahtevu 44, karakterisan time što korak (b) podrazumeva razblaživanje navedenog koncentrovanog rastvora vodom radi dobijanja razblaženog radnog rastvora, gde je kvaternerno amonijumsko jedinjenje prisutno u navedenom razblaženom radnom rastvoru u koncentraciji značajno unutar raspona od oko 0,1% do oko 1% težinski.

47. Metod prema zahtevu 44, karakterisan time što korak (c) podrazumeva primenu navedenog razblaženog radnog rastvora na navedenom prehrambenom proizvodu bar deo sekunde.

48. Metod prema zahtevu 44, karakterisan time što korak (c) podrazumeva primenu navedenog razblaženog radnog rastvora na navedenom prehrambenom proizvodu odredjeno vreme, karakterisan time što je vreme primene od oko 0,1 sekunde do oko 5 sekundi.