RS57474B1 - Humanizovana anti-il-6 antitela, kompozicije, postupci pripreme i upotrebe - Google Patents

Description

Opis

Oblast pronalaska

[0001] Ovaj pronalazak vezuje se za antitela, uključujući specifične porcije ili varijante specifične za najmanje jedan IL-6 protein ili njegov deo i nukleinske kiseline koje kodiraju ovakva IL-6 antitela, komplementarne nukleinske kiseline, vektore, ćelije domaćina i metode formiranja i korišćenja, uključujući terapeutske formulacije, administraciju i uređaje.

Stanje tehnike

[0002] IL-6 je pleiotropski proinflamatorni citokin koji proizvodi i luči širok spektar tipova ćelija, pre svega antigen prezentujuće ćelije, T i B ćelije. IL-6 je uključen u razne aktivnosti kao što su rast i diferencijacija B ćelija, aktivacija T ćelija, hematopoeza, aktivacija osteoklasta, keratinocitni rast, rast neurona i aktivacija hepatocita. IL-6 se vezuje za transmembranski ili rastvorni IL-6R i šalje signal kroz gp130 koji je podeljen između nekoliko drugih citokina.

[0003] IL-6 ima veoma važnu ulogu kod abnormalnosti kao što je prikazano u sistemskom Lupus erythematosus, multipla mijelomu i limfoproliferativnim poremećajima. Slično, IL-6 takođe ukazuje na patogenezu autoimunih i inflamatornih bolesti kao što su reumatoidni artritis i osteoartritis. Od nedavno, indirektni dokazi ukazuju na vezu između IL-6 i hroničnih opstruktivnih bolesti pluća i otpornost na insulin kod dijabetesa tipa 2. IL-6 ima i proinflamatorne i antiinflamatorne efekte na imuni sistem što ukazuje da verovatno ovaj citokin ima centralnu ulogu u regulisanju fizioloških odgovora na bolest. Stoga, obeležavanjem IL-6 može potencijalno da obezbedi terapeutsku korist u raznim područjima koji su zahvaćeni bolešću.

[0004] Porast produkcije IL-6 posmatra se u mnogim bolestima uključujući: Alchajmerovu bolest, autoimune bolesti kao što su reumatoidni artritis, zapaljenje, infarkt miokarda, Pagetova bolest, osteoporoza, tumori (karcinom bubrežnih ćelija), kanceri prostate i bešike, neurološki kanceri i malignosti B ćelija (npr. Kastelmanova bolest, određeni limfomi, hronična limfocitna leukemija i multipla mijeloma. Istraživanja ukazuju da je IL-6 vezan za patogenezu mnogih bolesti, pre svega kancer i dalje da blokiranje IL-6 treba da se prevede u kliničke koristi.

[0005] Mišja, himerna i druga ne-humana anti-IL-6 antitela razvijena su u (npr. WO 2004/039826 i EP0783893); međutim, ona mogu da budu ograničena u svojoj moći, efektivnosti, mogu često da pokrenu neprihvatljiv imun odgovor (npr. imunogenezu) i/ili zahtevaju veliku dozu (Videti, Trikha et al., Clin. Can. Res.9, 4653-4665, Oct.2003). Na primer, antitela koja sadrže ne-humane porcije često povećavaju imunu reakciju kod ljudi. Prema tome, ponavljanje administracije antitela je nepogodno jer terapija i imuni kompleks koji posreduje čišćenje antitela iz cirkulacije može da redukuje moć/efektivnost antitela. Serumska bolest i anafilaksa su dva primera stanja koje mogu da se jave ponavljanjem administracije antitela koje imaju ne-humane porcije. U tom smislu, anti-IL-6-antitela sa manje potencijala za imunogenezu, npr. koju ljudski organizam bolje toleriše, zahteva manje doze u poređenju sa prethodno korišćenim anti-IL-6 antitelima.

SUŠTINA PRONALASKA

[0006] Pronalazak obezbeđuje izolovano IL-6 antitelo koje sadrži potpuno humane okvire čitanja i konstantne regione, koje sadrži:

(i) varijabilni region lakog lanca, koji sadrži region koji određuje komplementarnost 1 lakog lanca (CDRL1) sekvencu aminokiselina SEQ ID NO:3, CDRL2 sekvencu aminokiselina SEQ ID NO:21, CDRL3 sekvencu aminokiselina SEQ ID NO:29, i varijabilni region teškog lanca gde region koji određuje komplementarnost 1 teškog lanca (CDRH1) sekvence aminokiselina SEQ ID NO:39, CDRH2 sekvence aminokiselina SEQ ID NO:59, i CDRH3 sekvence aminokiselina SEQ ID NO:89;ili

(ii) varijabilni region lakog lanca, gde CDRL1 sadrži sekvencu aminokiselina SEQ ID NO:3, CDRL2 sadrži sekvencu aminokiselina SEQ ID NO:21, CDRL3 sadrži sekvencu aminokiselina SEQ ID NO:29, i varijabilni region teškog lanca gde CDRH1 sadrži sekvencu aminokiselina SEQID NO:41, CDRH2 sadrži sekvencu aminokiselina SEQ ID NO:75, i CDRH3 sadrži sekvencu aminokiselina SEQ ID NO:89; ili

(iii) varijabilni region lakog lanca, gde CDRL1 sadrži sekvencu aminokiselina SEQ ID NO:15, CDRL2 sadrži sekvencu aminokiselina SEQ ID NO:27, CDRL3 sadrži sekvencu aminokiselina SEQ ID NO:35, i varijabilni region teškog lanca gde CDRH1 sadrži sekvencu aminokiselina SEQ ID NO:47, CDRH2 sadrži sekvencu aminokiselina SEQ ID NO:57, i CDRH3 sadrži sekvencu aminokiselina SEQ ID NO:91; ili

(iv) varijabilni region lakog lanca, gde CDRL1 sadrži sekvencu aminikiselina SEQ ID NO:15, CDRL2 sadrži sekvencu aminokiselina SEQ ID NO:17, CDRL3 sadrži sekvencu aminokiselina SEQ ID NO:29, i varijabilni region teškog lanca gde CDRH1 sadrži sekvencu aminokiselina SEQ ID NO:45, CDRH2 sadrži sekvencu aminokiselina SEQ ID NO:59, i CDRH3 sadrži sekvencu aminokiselina SEQ ID NO:89; ili

(v) varijabilni region lakog lanca gde CDRL1 sadrži sekvencu aminokiselina SEQ ID NO:7, CDRL2 sadrži sekvencu aminokiselina SEQ ID NO:21, CDRL3 sadrži sekvencu aminokiselina SEQ ID NO:29, i varijabilni region teškog lanca gde CDRH1 sadrži sekvencu aminokiselina SEQ ID NO:41, CDRH2 sadrži sekvencu aminokiselina SEQ ID NO:75, i CDRH3 sadrži sekvencu aminokiselina SEQ ID NO:87, gde se pomenuto antitelo vezuje za IL-6 ili njegov fragment sa afinitetom od 0,1-9,9 x 10<-14>M kao što se određuje Kinexa™ postupkom.

[0007] Pronalazak takođe obezbeđuje izolovani molekul nukleinske kiseline koja kodira antitelo pronalaska.

[0008] Pronalazak takođe obezbeđuje izolovani vektor nukleinske kiseline koji sadrži izolovani molekul nukleinske kiseline pronalaska.

[0009] Pronalazak takođe obezbeđuje prokariotsku ili eukariotsku ćeliju domaćina koja sadrži izolovane molekule nukleinske kiseline pronalaska.

[0010] Pronalazak takođe obezbeđuje postupak za proizvodnju najmanje jednog antitela koje je specifično za IL-6 koji sadrži translaciju molekula nukleinske kiseline pod uslovima in vitro, in vivo ili in situ kao što je IL-6 antitelo izraženo u detektovanim ili nadoknadivim količinama.

[0011] Pronalazak takođe obezbeđuje kompoziciju koja sadrži najmanje jedno izolovano antitelo pronalaska koje je specifično za IL-6 i najmanje jedan farmaceutski prihvatljivi nosač ili rastvarač.

[0012] Pronalazak takođe obezbeđuje kompoziciju koja sadrži najmanje jedno izolovano antitelo pronalaska je specifično za IL-6 pronalaska za korišćenje u terapiji.

[0013] Pronalazak takođe obezbeđuje antitelo pronalaska za upotrebu u postupku dijagnostikovanja ili lečenja stanja vezanih za IL-6 u ćeliji, tkivu, organu ili životinji gde se stanja vezana za IL-6 biraju iz grupe koja sadrži gojaznost, bolesti vezane za imuni sistem, kardiovaskularne bolesti, infektivne bolesti ili maligne bolesti i neurološke bolesti.

[0014] Pronalazak takođe obezbeđuje predmet ili proizvodnju za humanu farmaceutsku ili dijagnostičku primenu koja sadrži spakovan materijal i kontejner koji sadrži rastvor liofilizovanih oblika IL-6 antitela pronalaska.

OPIS SLIKA

[0015]

Slika 1 pokazuje vezivanje humanog inženjerizovanog i himernog anti-IL-6 antitela za IL-6/IL-6R kompleks.

Slika 2 pokazuje vezivanje epitopa za humano inženjerizovano anti-IL-6 antitelo ovog pronalaska.

Slika 3 pokazuje da humano inženjerizovano anti-IL-6 antitelo inhibira IL-6 stimulisanu MCP-1 sekreciju iz U937 ćelija što je mereno pomoću ELISA.

Slika 4 pokazuje da humano inženjerizovano anti-IL-6 antitelo inhibira IL-6 i IL-1β stimulisanu SAA sekreciju iz HepG2 ćelija što je mereno pomoću ELISA.

Slika 5A i 5B pokazuju da humano inženjerizovano anti-IL-6 antitelo blokira IL-6-posredovanu fosforilaciju stat3 kao što je izmereno pomoću “Western Blot” analize prikazane kroz gel elektroforezu.

Slika 6 pokazuje inhibiciju humanoh inženjerizovanih i himernog anti-IL-6 antitela l indukovanog IL-6 SAA proizvoda u Balb/C mišu.

Slika 7 pokazuje inhibiciju proizvodnje anti-dsDNK autoanititela pomoću anti-IL-6 mAt u NZB/W F1 mišu.

Slika 8A pokazuje efekat IL-6 u prisustvu i odsustvu ljudski inženjerizovanog anti-IL-6 antitela na Akt fosforilaciju koja je indukovana insulinom.

Slika 8B pokazuje “western blot” analizu efekta IL-6 u prisustvu i odsustvu ljudski inženjerizovanog anti-IL-6 antitela na Akt fosforilaciju indukovanu insulinom.

Slika 9 pokazuje rezultate ELISA vezujućeg testa opisanog u Primeru 3.

Slika 10 pokazuje rezultate anti-proliferacionog testa koristeći IL-6 zavisne ćelijske linije koje su opisane u primeru 3.

Slika 11A pokazuje aktivaciju PI3 kinaze u hepatocitima pacova u odnosu na fosforilaciju IR koja je indukovana insulinom.

Slika 11B pokazuje kontrolu ispitivanja aktivacije PI3 kinaze u hepatocitima pacova.

Slika 12A pokazuje efekat IL-6 na signalizaciju u hepatocitima pacova u odnosu na fosforilaciju IR koja je indukovana insulinom.

Slika 12B pokazuje efekat IL-6 na signalizaciju u hepatocitima pacova u odnosu na fosforilaciju Akt koja je indukovana insulinom.

Slika 13A pokazuje nivo glukoze u DIO mišu posle tretmana sa anti-IL-6 antitelom.

Slika 13B pokazuje nivo insulina u DIO mišu posle tretmana sa anti-IL-6 antitelom.

Slika 13C pokazuje indeks homeostatskog modela procene (HOMA) u DIO mišu posle tretmana sa anti-IL-6 antitelom.

Slika 14A-F pokazuje nivo lipida pre i posle tretmana sa anti-IL-6 antitelom.

Slika 15 pokazuje raspored tretmana miša pomoću IL-6 mAt za test intraperitonealne tolerancije na glukozu (ipGTT)

OPIS PRONALASKA

[0016] Predmetni pronalazak obezbeđuje izolovana, rekombinantna i/ili sintetička anti-IL-6 antitela kao što su kompozicije i kodirajuće molekule nukleinskih kiselina koji sadrže najmanje jedan polinukleotid koji kodira najmanje jedno anti-IL-6 antitelo. Ovaj pronalazak dalje uključuje, ali nije ograničen na njih, postupke dobijanja i upotrebe ovakvih nukleinskih kiselina i antitela uključujući dijagnostičke i terapeutske kompozicije i aparate.

[0017] Kao što je ovde korišćeno “anti-IL-6 antitelo”, “IL-6 antitelo”, “porcija anti-IL-6 antitela” ili “fragment anti-IL-6 antitela” i/ili “varijanta anti-IL-6 antitela” i sl. uključuju bilo koji protein ili peptid koji sadrži molekul koji ima najmanje porciju molekula imunoglobulina, kao što je, ali nije ograničen na njih, najmanje jedan region koji određuje komplementarnost (CDR) teškog ili lakog lanca ili njihovog vezujućeg liganda, varijabilnu regiju teškog ili lakog lanca, konstantnu regiju teškog ili lakog lanca, okvirne sekvence, njihovu porciju ili najmanje jednu porciju IL-6 receptora ili vezujući protein koji može da se inkorporira u antitelo ovog pronalaska. Ovakvo antitelo, dalje, opciono, utiče na specifični ligand, kao što se, ali nisu ograničeni na njih, gde takva antitela modulišu, smanjuju, povećavaju, antagonizuju, agonizuju, ublažavaju, umanjuju, blokiraju, inhibiraju, poništavaju i/ili se mešaju sa najmanje jednom aktivnosti koja je povezana sa IL-6, ili sa aktivnošću IL-6 receptora ili se vezuju sa njima in vitro, in situ i/ili in vivo. Pogodno anti-IL-6 antitelo, određene porcije ili kao varijanta ovog pronalaska može da veže najmanje jedan IL-6 molekul ili određene porcije, varijante ili njihove domene. Pogodno anti-IL-6 antitelo, određene porcije ili varijante mogu opciono da utiču na najmanje jednu aktivnost ili funkciju IL-6 kao što su, ali nisu ograničeni na njih, RNK, DNK ili sinteza proteina, IL-6 otpuštanje, signalizacija IL-6 receptora, cepanje membrane IL-6, aktivnost IL-6, proizvoodnja IL-6 i/ili sinteza.

[0018] Termin “antitelo” dalje se koristi da obuhvati antitela, digestivne fragmente, specifične porcije i njihove različite varijante uključujući mimetička antitela ili čineći porcije antitela koje oponašaju strukturu i/ili funkciju antitela ili specifičnog fragmenta ili njihove porcije uključujući antitela s jednim lancem i njihove fragmente. Funkcionalni fragmenti uključuju antigen-vezujuće fragmente koji se vezuju za IL-6 sisara. Na primer, fragmenti antitela koji su sposobni za vezivanje za IL-6 ili njihove porcije, koji uključuju, ali nisu ograničeni na njih, Fab (npr. digestija papainom), Fab’ (npr. digestija pepsinom i parcijalna redukcija) i F(ab’)2(npr. digestija pepsinom), facb (digestija plazminom), pFc’ (npr., digestija pepsinom ili plazminom), Fd (npr. digestija pepsinom, parcijalna redukcija i reagregacija), Fv ili scFv (npr. pomoću tehnika molekularne biologije) fragmente, obuhvaćeni su pronalaskom (videti, npr. Colligan, Immunology, supra).

[0019] Ovakvi fragmenti mogu da se proizvedu enzimskim razlaganjem, sintetskim ili rekombinantnim tehnikama, kao što je poznato u oblasti tehnke i/ili kao što je ovde opisano. Antitela mogu takođe da se proizvode u različitim skraćenim oblicima koristeći gene antitela u koje se uvode jedan ili više stop kodona koji se uvode ushodno od prirodnog stop mesta zaustavljanja. Na primer, kombinacija gena koja kodira F(ab’)2porciju teškog lanca može da uključi DNK sekvence koje kodiraju CH1domen i/ili zglobni region teškog lanca. Različite porcije antitela mogu da se spoje hemijski pomoću konvencionalnih tehnika ili mogu da se pripreme kao susedni protein koristeći tehnike genetskog inženjeringa.

[0020] Kao što je ovde korišćeno, termin “humano inženjerizovano antitelo” je antitelo sa najmanje potpunim okvirnim sekvencama i konstantnim regionima (CL, CH domeni (npr. CH<1>, CH<2>, CH<3>) i zglobnim regionom) i regionima koji determinišu komplementarnost izvedenih iz antitela koji se vezuju za antigen. Potpuna humana okvirna sekvenca sadrži okvire koji odgovaraju humanim germinativnim (eng. “germline”) sekvencama kao i sekvencama sa somatskim mutacijama. Regioni koji determinišu komplementarnost (CDR) mogu da se dele na jedan ili više CDR-a koji se vezuje za IL-6 u kontekstu okvirne sekvence bilo kog antitela. Na primer, CDR-i ljudskog inženjerizovanog antitela mogu da se izvedu iz CDR-a koji vezuju IL-6 u kontekstu okvirne sekvence antitela miša i onda se inženjerizuju da bi se vezali za IL-6 u kontekstu potpuno ljudske okvirne sekvence. Često, humana inženjerizovana antitela su u osnovi neimunogena kod ljudi.

[0021] Slično, antitela naznačenih primata (majmuna, babuna, šimpanze itd.), glodara (miševa, pacova, zečeva, morskih prasića, hrčkova i sl.) i ostalih sisara određenih vrsta, podrodova, rodova, podporodica, i porodica označavaju specifična antitela. Dalje, himerna antitela mogu da uključe bilo koju gore navedenu kombinaciju. Ovakve promene ili varijacije opciono i poželjno zadržavaju ili redukuju imunogenost kod ljudi ili kod drugih vrsta koje su povezane u odnosu na nemodifikovana antitela. Stoga, humano inženjerizovano antitelo se razlikuje od himernog ili humanizovanog antitela.

[0022] Istaknuto je da humano inženjerizovano antitelo može da se proizvede pomoću životinjske nehumane ćelije ili prokariotske ili eukariotske ćelije koja je sposobna da izrazi funkcionalno reorganizovane humane gene ili gene humano inženjerizovanog imunoglobulina (npr. težak lanac i/ili lak lanac). Dalje, kada je ljudski inženjerizovano antitelo pojedinačan lanac antitela, može da sadrži peptidnu vezu koja nije nađena u prvobitnim humanim antitelima. Na primer, Fc može da sadrži peptidnu vezu koja sadrži dva do osam ostataka glicina ili ostataka drugih aminokiselina koji povezuju varijabilni region teškog lanca i varijabilni region lakog lanca. Smatra se da su ovakve peptidne veze humanog porekla.

[0023] Bispecifična, heterospecifična, heterokonjugovana ili slična antitela mogu takođe da se koriste kao monoklonska antitela, poželjno, ljudska, ljudska inženjerizovana ili humanizovana antitela koja imaju specifičnost vezivanja za najmanje dva različita antigena. U ovom slučaju jedna od specifičnosti vezivanja je da se vezuju za najmanje jedan IL-6 protein, a druga da se vezuju za bilo koji drugi antigen. Metode za pravljenje bispecifičnih proteina poznate su u praksi. Tradicionalno, rekombinantna proizvodnja bispecifičnih antitela bazirana je na koekspresiji dva para imunoglobulinskog teškog lanca-lakog lanca gde dva teška lanca imaju različite specifičnosti (Milstein i Cuello, Nature 305:537 (1983)). Zbog nasumičnog sortiranja imunoglobulinskih teških i lakih lanaca, ovi hibridomi (kvadromi) proizvode potencijalnu smešu od 10 različitih molekula antitela od kojih samo jedan ima bispecifičnu strukturu. Prečišćavanje tačnog molekula obično se izvodi pomoću koraka afinitetne hromatografije. Slični proizvodi su otkriveni, npr. u WO 93/08829, US Patent Nos, 6210668, 6193967, 6132992, 6106833, 6060285, 6037453, 6010902, 5989530, 5959084, 5959083, 5932448, 5833985, 5821333, 5807706, 5643759, 5601819, 5582996, 5496549, 4676980, WO 91/00360, WO 92/00373, EP 03089, Traunecker et al., EMBO J. 10:3655 (1991), Suresh et al., Methods in Enzymology 121:210 (1986).

[0024] Anti-IL-6 antitela koja su korisna u postupcima i kompozicijama predmetnog pronalaska mogu opciono da budu karakterisana pomoću velikog afiniteta vezivanja za IL-6, opciono i poželjno je da imaju nisku toksičnost. Posebno, antitelo, specifični fragment ili varijante pronalaska gde su individualne komponente, kao što je varijabilni region, konstantni region i okvirna sekvenca, individualno i/ili kolektivno, opciono i poželjno poseduje nisku imunogenost korisno je u ovom pronalasku. Antitela koja mogu da se koriste u pronalasku su opciono okarakterisana sposobnošću da leče pacijente u dužem periodu sa merljivim ublažavanjem simptoma i niskom i/ili prihvatljivom toksičnošću. Niska ili prihvatljiva imunogenost i/ili visok afinitet, kao što su i druge prihvatljive osobine mogu da doprinesu postizanju terapeutskih rezultata. “Niska imunogenost” je ovde definisana kao učestalost titracionih nivoa antitela prema anti-IL-6 antitelu kod pacijenata koji su tretirani anti-IL-6 antitelom, što pokazuje u manje od 25% slučajeva pacijenata koji su lečeni, poželjno, u manje od 10% slučajeva koji su podvrgnuti preporučenom dozom u određenom periodu lečenja.

[0025] Izolovane nukleinske kiseline ovog pronalaska mogu da se koriste za proizvodnju najmanje jednog anti-IL-6 antitela ili njegovih specifičnih varijanti koje mogu da se koriste za merenje ili efekta ćeliji, tkivu, organu ili životinji (uključujući sisare i ljude) za dijagnostikovanje, praćenje, modulisanje, lečenje, ublažavanje, pomaganje u prevenciji učestalosti simptoma ili redukovanje simptoma najmanje jednog stanja koje je u vezi sa IL-6, koje se bira od, ali bez ograničenja, najmanje jedanog imunskog poremećaja ili bolesti, kardiovaskularnog poremećaja ili bolesti, infektivnog, malignog i/ili neurološkoh poremećaja ili bolesti ili drugog specifičnog stanja koje je u vezi sa IL-6.

[0026] Ovakav metod može da sadrži administriranje efektivne količine kompozicije ili farmaceutske kompozicije koja sadrži najmanje jedno anti-IL-6 antitelo za ćeliju, tkivo, organ, životinju ili pacijenta kome je potrebna ovakva modulacija, lečenje, ublažavanje, prevencija ili redukcija simptoma, efekti ili mehanizmi. Efektivna količina može da sadrži količinu od oko 0.001 do 500 mg/kg po pojedinačnoj (npr. bolusnoj), višestrukoj ili kontinualnoj administraciji, ili za postizanje koncentracije u serumu od 0,01-5000 μg/ml koncentracije u serumu po pojedinačnoj, višestrukoj ili kontinualnoj administraciji ili za bilo koji efektivni opseg ili vrednost, što je utvrđeno upotrebom poznatih postupaka, kao što je opisano ovde ili je poznato u odgovarajućoj oblasti tehnike.

Antitela prema pronalasku – Proizvodnja i dobijanje

[0027] Najmanje jedno anti-IL-6 antitelo ovog pronalaska može opciono da se proizvede pomoću ćelijske linije, mešovite ćelijske linije, besmrtne ćelije ili klonirane populacije besmrtnih ćelija kao što je poznato u praksi. Videti, na primer, Ausubel, et al., ed., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., NY, NY (1987-2001); Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor, NY (1989); Harlow i Lane, Antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY (1989); Colligan, et al., eds., Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, Inc., NY (1994-2001); Colligan et al., Current Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, NY, NY, (1997-2001).

[0028] Humana inženjerizovana antitela koja su specifična za humane IL-6 proteine ili njihove fragmente mogu da se gaje nasuprot prikladnog imunogenog antigena kao što je izolovani IL-6 protein i/ili njihova porcija (uključujući sintetske molekule kao što su sintetski peptidi). Druga specifična ili opšta antitela sisara mogu da se gaje na sličan način. Dobijanje imunogenih antitela i proizvodnja monoklonskih antitela može da se izvede upotrebom bilo kog pogodnog postupka.

[0029] U jednom pristupu, hibridom se proizvodi fuzijom pogodne besmrtne ćelijske linije (npr. ćelijske linije mijeloma, kao što su, ali nisu ograničeni na njih, Sp2/0, Sp2/0-AG14, NSO, NS1, NS2, AE-1, L.5, L243, P3X63Ag8.653, Sp2 SA3, Sp2 MAI, Sp2 SS1, Sp2 SA5, U937, MLA 144, ACT IV, MOLT4, DA-1, JURKAT, WEHI, K-562, COS, RAJI, NIH 3T3, HL-60, MLA 144, NAMALWA, NEURO 2A i sl., ili heteromijelomi ili njihovi fuzioni proizvodi ili bilo koja ćelija ili fuzija ćelija koja je izvedena iz njih, ili bilo koja pogodna ćelijska linija poznata u praksi) (videti, www.atcc.org, www.lifetech.com i sl.); sa ćelijama koje proizvode antitela, kao što su, ali nisu ograničeni na njih, izolovana ili klonirana slezina, periferalna krv, limfa, krajnici, druge imune ili ćelije koje sadrže B ćelije, neke druge ćelije koje izražavaju konstantne, varijabilne, okvirne ili CDR sekvence lakog ili teškog lanca ili sa endogenom ili heterolognom nukleinskom kiselinom, kao rekombinantna ili endogena, virusna, bakterijska, algalna, prokariotska, vodozemska, insektna, reptilska, riblja, sisarska, glodarska, konjska, ovčija, kozija, primatska, eukariotska, genomska DNK, cDNK, rDNK, mitohondrijalna DNK ili RNK, DNK ili RNK hloroplasta, hnRNK, mRNK, tRNK, pojedinačna, dvostruka ili trostruka, hibridizovana i sl. ili kombinacija neke od njih. Videti, na primer, Ausubel, supra i Colligan, Immunology, supra, chapter 2.

[0030] Ćelije koje proizvode antitela takođe mogu da se dobiju iz periferne krvi ili poželjnije iz slezine ili limfnih čvorova ljudi ili nekih pogodnih životinja koje su imunizovane sa antigenom od interesa. Bilo koja druga pogodna ćelija domaćina može takođe da se koristi za ekspresiju heterologne ili endogene nukleinske kiseline koja kodira antitelo, njegov specifični fragment ili varijantu predmetnog pronalaska. Kombinovane ćelije (hibridoma ćelije) ili rekombinantne ćelije mogu da se izoluju koristeći stanja selektivne kulture ili druge pogodne metode koje su poznate i koje su klonirane pomoću limitirajućeg rastvora, sortiranjem ćelija ili drugim poznatim postupcima. Ćelije koje proizvode antitela sa željenim specifičnostima mogu da se izaberu pomoću pogodnog testa (npr. ELISA test).

[0031] Metode za inženjerizaciju ili humanizaciju ne-humanih ili humanih antitela mogu takođe da se koriste i dobro su poznate u praksi. Humanizovano ili inženjerizovano antitelo može da ima jedan ili više ostataka aminokiseline iz izvora koji nije humani, ali nije ograničen na njih, npr. miš, pacov, zec, ne-humani primat ili drugi sisar. Ovi ne-humani ostaci aminokiselina zamenjuju se ostacima koji se često odnose na “unete” ostatke koji su tipično uzeti kao “ulazne” promenljive, konstante ili drugi domeni poznate ljudske sekvence.

[0032] Prikazane su poznate humane Ig sekvence npr., www. ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi; www. ncbi.nih.gov/igblast; www. atcc.org/phage/hdb.html; www. mrccpe.cam.ac.uk/ALIGNMENTS.php; www. kabatdatabase.com/top.html; ftp.ncbi.nih.gov/repository/kabat; www.sciquest.com; www.abcam.com; www.antibodyresource.com/onlinecomp.html; www. public.iastate.edu/~pedro/research_tools.html; www. whfreeman.com/immunology/CH05/kuby05.htm;www.hhmi.org/grants/lectures/1996/vlab;www.pa th.cam.ac.uk/~mrc7/mikeimages.html; mcb.harvard.edu/BioLinks/Immunology.html; www.immunologylink.com; pathbox. wustl.edu/-hcenter/index.html; www. appliedbiosystems.com; www. nal.usda.gov/awic/pubs/antibody; www.m.ehime-u.ac.jp/~yasuhito/Elisa.html; www. biodesign.com; www.cancerresearchuk.org; www.biotech.ufl.edu; www.isac-net.org; baserv.uci.kun.nl/-jraats/links1.html; www.recab.uni-hd.de/immuno.bme.nwu.edu; www.mrccpe.cam.ac.uk; www. ibt.unam.mx/vir/V_mice.html; http://www.bioinf.org.uk/abs; antibody.bath.ac.uk; www.unizh.ch; www.cryst.bbk.ac.uk/-ubcg07s; www. nimr.mrc.ac.uk/CC/ccaewg/ccaewg.html; www.path.cam.ac.uk/-mrc7/humanisation/TAHHP.html; www. ibt.unam.mx/vir/structure/stat_aim.html; www. biosci.missouri.edu/smithgp/index.html; www.jerini.de; Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Dept.Health (1983).

[0033] Ovakve ulazne sekvence mogu da se koriste za redukovanje imunogenosti ili za redukovanje, povećavanje ili modifikovanje vezivanja, afiniteta, direktne reakcije, povratne reakcije, aviditeta, specifičnosti, polu-života ili bilo koje pogodne karakteristike što je poznato u praksi. Uopšteno, CDR ostaci se direktno i najviše supstancijalno uključeni u uticanje na vezivanje antigena. Prema tome, deo humanih CDR sekvenci se održava, dok ne-humane sekvence varijabilnih ili konstantnih regiona mogu da se zamene sa humanim ili drugim aminokiselinama.

[0034] Antitela, takođe, mogu opciono da se humanizuju ili inženjerizuju ili ljudska antitela mogu da se inženjerizuju sa retencionim ili visokom afinitetom za antigen i drugim povoljnim biološkim osobinama. Da bi se to postiglo, humanizovana (ili humana) ili inženjerizovana antitela mogu opciono da se pripreme pomoću procesa analize parenteralnih sekvenci i raznih konceptualno humanizovanih i inženjerizovanih proizvoda koristeći trodimenzionalne modele parentalnih, inženjerizovanih ili humanih sekvenci. Trodimenzionalni modeli imunoglobulina su često dostupni i poznati stručnjacima iz oblasti tehnike. Dostupni su kompjuterski programi koji ilustruju i pokazuju moguće trodimenzionalne konformacione strukture izabranih kandidata sekvence imunoglobulina. Provera ovih rezultata dozvoljava analizu verovatne uloge ostataka u funkcionisanju kandidata sekvence imunoglobulina, npr., analiza ostataka koji utiču na sposobnost kandidata imunoglobulina da se veže za antigen. Ovim putem, ostaci okvirne sekvence (FR) mogu da se izaberu i kombinuju iz konsenzusnih i unetih sekvenci tako da se dostignu željene karakteristike antitela kao što je povećanje afiniteta za ciljani antigen(e).

[0035] Dodatno, ljudsko inženjerizovano IL-6 antitelo predmetnog pronalaska može da sadrži humani germinativni laki lanac okvirne sekvence. U određenim izvođenjima, laki lanac germinativne sekvence izabran je iz humanih VK sekvenci uključujući, ali bez ograničenja A1, A10, A11, A14, A17, A18, A19, A2, A20, A23, A26, A27, A3, A30, A5, A7, B2, B3, L1, L10, L11, L12, L14, L15, L16, L18, L19, L2, L20, L22, L23, L24, L25, L4/18a, L5, L6, L8, L9, O1, O11, 012, 014, 018, 02, 04 i 08. U određenim izvođenjima, lak lanac germinativne okvirne sekvence bira se iz V1-11, V-13, V1-16, V-17, V1-18, V-19, V1-2, V1-20, V1-22, V1-3, V1-4, V1-5, V1-7, V1-9, V2-1, V2-11, V2-13, V2-14, V2-15, V2-17, V2-19, V2-6, V2-7, V2-8, V3-2, V3-3, V3-4, V4-1, V4-2, V4-3, V4-4, V4-6, V5-1, V5-2, V5-4 i V5-6. Videti PCT WO 2005/005604 za opis različitih germinativnih sekvenci.

[0036] U ostalim izvođenjima, ljudsko inženjerizovano IL-6 antitelo koje je predstavljeno ovde može da sadrži humani germinativni težak lanac okvirne sekvence koji se bira iz VH1-18, VH1-2, VH1-24, VH1-3, VH1-45, VH1-46, VH1-58, VH1-69, VH1-8, VH2-26, VH2-5, VH2-70, VH3-11, VH3-13, VH3-15, VH3-16, VH3-20, VH3-21, VH3-23, VH3-30, VH3-33, VH3-35, VH3-38, VH3-43, VH3-48, VH3-49, VH3-53, VH3-64, VH3-66, VH3-7, VH3-72, VH3-73, VH3-74, VH3-9, VH4-28, VH4-31, VH4-34, VH4-39, VH4-4, VH4-59, VH4-61, VH5-51, VH6-1 i VH7-81. Videti PCT WO 2005/005604 za opis različitih germinativnih sekvenci.

[0037] U posebnim izvođenjima, varijabilni region lakog lanca i/ili varijabilni region teškog lanca sadrži okvirni region ili najmanje jednu porciju okvirnog regiona (npr., sadrži 2 ili 3 subregiona kao što su FR2 i FR3). U određenim oblicima, barem su FRL1, FRL2, FRL3 ili FRL4 potpuno humani. U određenim izvođenjima, najmanje FRL1, FRL2, FRL3 ili FRL4 su germinativne sekvence (npr. humana germinativna sekvenca) ili sadrži humane sekvence za partikularnu okvirnu sekvencu (dostupnu na izvorima humane Ig sekvence opisane iznad). U drugim izvođenjima, barem su FRL1, FRL2, FRL3 ili FRL4 germinativne sekvence (npr. humana germinativna sekvenca) ili sadrži humane konsenzusne sekvence za partikularnu okvirnu sekvencu. U poželjnim izvođenjima, okvirna sekvenca je humana okvirna sekenca (npr. humana okvirna sekvenca prikazana je u tekstu ispod u tabelama 13 i 14). U nekim izvođenjima, okvirna sekvenca sadrži SEQ ID NOS: 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, ili njihovu kombinaciju.

[0038] Humanizacija ili inženjerizovanje antitela ovog pronalaska može da se izvrši koristeći ma koju poznatu metodu, kao što je, ali nije ograničeno na one koje se opisuju u Winter (Jones et al., Nature 321:522 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323 (1988); Verhoeyen et al., Science 239:1534 (1988)), Sims et al., J. Immunol.151: 2296 (1993); Chothia i Lesk, J. Mol. Biol.196:901 (1987), Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:4285 (1992); Presta et al., J. Immunol. 151:2623 (1993), US patenti Nos: 5723323, 5976862, 5824514, 5817483, 5814476, 5763192, 5723323, 5,766886, 5714352, 6204023, 6180370, 5693762, 5530101, 5585089, 5225539; 4816567, PCT/: US98/16280, US96/18978, US91/09630, US91/05939, US94/01234, GB89/01334, GB91/01134, GB92/01755; WO90/14443, WO90/14424, WO90/14430, EP 229246.

[0039] U određenim oblicima, antitelo sadrži izmenjen (npr. mutiran) Fc region. Na primer, u nekim oblicima, Fc region je izmenjen da redukuje ili pojača efektorske funkcije antitela. U nekim oblicima, Fc region je izotip izabran kao IgM, IgA, IgG, IgE ili drugi izotip.

1

[0040] Alternativno ili dodatno,može da bude korisno kombinovanje modifikacija aminokiselina sa jednim ili više drugih modifikacija aminokiselina koje menjaju vezivanje C1q i/ili komplementarno zavisnu funkciju citotoksičnosti (CDC) Fc regiona IL-6 vezujućeg molekula. Početni polipeptid koji je posebno od interesa može da bude onaj koji se vezuje za C1q i koji pokazuje komplementarno zavisnu citotoksičnost. Polipeptidi sa prethodno već postojećom C1q vezujućom aktivnošću, dalje, opciono, imaju sposobnost da posreduju CDC i mogu da se modifikuju tako da se obe ove aktivnosti povećavaju. Opisane su modifikacije aminokiselina koje menjaju C1q i/ili modifikuju njegovu funkciju komplementarno zavisne citotoksičnosti, na primer, u WO0042072.

[0041] Kao što je pokazano u tekstu iznad, jedan može da bude Fc region ljudski inženjerizovanog IL-6 antitela ovog pronalaska sa izmenjenom efektorskom funkcijom, npr. modifikovanjem C1q vezivanja i/ili FcγR vezivanja i time se menja CDC aktivnost i/ili ADCC aktivnost. „Efektorske funkcije” su odgovorne za aktiviranje ili umanjivanje biološke aktivnosti (npr. u subjektu). Primeri efektorskih funkcija uključuju, ali nisu ograničene na njih: C1q vezivanje; citotoksičnost koja zavisi od komplementa (CDC); Fc receptorsko vezivanje; citotoksičnost posredovana ćelijama koja zavisi od antitela (ADCC); fagocitoza; donja regulacija receptora ćelijske površine (npr. receptor B ćelije; BCR) itd. Ovakve efektorske funkcije mogu da zahtevaju da se Fc region kombinuje sa vezujućim domenom (npr. varijabilnim domenom antitela) i koji može da se oceni korišćenjem raznih testova (npr. Fc vezujući testovi, ADCC testovi, CDC testovi itd.).

[0042] Na primer, antitelo može da se generiše varijantnim Fc regionom ljudskog inženjerizovanog IL-6 antitela sa unapređenim C1q vezivanjem i unapređenim FcγRIII vezivanjem (npr. imajući obe aktivnosti unapređene i ADCC i CDC). Alternativno, ako je poželjno da efektorska funkcija bude redukovana ili uklonjena, varijantni Fc region može da se inženjerizuje redukovanom CDC aktivnošću i/ili redukovanom ADCC aktivnošću. U ostalim oblicima, samo jedna od ovih aktivnosti može da se poveća, a takođe i opciono da se druga aktivnost smanji (npr. da se generiše Fc varijantni region sa poboljšanom ADCC aktivnošću, ali redukovanom CDC aktivnošću i obrnuto).

[0043] Fc mutacije takođe mogu da se uvedu u inženjerizovanje da bi se izmenile njene interakcije sa neonatalnim Fc receptorom (FcRn) i poboljšaju njegove farmakokinetičke osobine. Skup humanih Fc varijanti sa poboljšanim vezivanjem za FcRn su opisani (Shields et al., (2001)). Mapiranje visoke rezolucije mesta vezivanja na ljudskom IgG1 za FcγRI, FcγRII, FcγRIII i FcRn i dizajn IgG1 varijanti sa poboljšanim vezivanjem za FcγRI J. Biol. Chem.276:6591-6604).

[0044] Još jedan tip supstitucije aminokiselina služi da izmeni šablon glikozilacije Fc regiona ljudski inženjerizovanog IL-6 antitela. Glikozilacija Fc regiona je tipično ili vezana za N ili za O. N-vezana glikozilacija odnosi se na vezivanje ostatka ugljenog hidrata za bočni lanac ostatka asparagina. Glikozilacija vezana preko O odnosi se na vezivanje jednog šećera N-acetilgalaktozamina, galaktoze ili ksiloze za hidroksiamino kiselinu, najčešće serin ili treonin, ali takođe mogu da se koriste i 5-hidroksiprolin ili 5-hidroksilizin. Prepoznatljive sekvence za vezivanje enzima ostatka ugljenog hidrata za peptidne sekvence bočnog lanca asparagina su asparagin-X-serina i asparagin-X-treonina, gde je X bilo koja aminokiselina osim prolina. Stoga, prisustvo jedne od ovih peptidnih sekvenci u polipeptidu stvara potencijalno mesto glikozilacije.

[0045] Šablon glikolizacije može da se promeni, na primer, izbacivanjem jednog ili više glikozilatnih mesta koja su prisutna u polipeptidu i/ili dodavanjem jednog ili više mesta glikozilacije koja nisu prisutna u polipeptidu. Dodavanjem mesta glikozilacije Fc regionu ljudskom inženjerizovanom IL-6 antitelu postiže se izmenom sekvence aminokiseline tako da sadrži jednu ili više, gore navedenih, tripeptidnih sekvenci (mesta glikolizacije vezana za N). Primer varijante glikozilacije ima supstituciju ostatka Asn 297 teškog lanca. Izmena takođe može da se izvrši dodavanjem ili supstitucijom jednog ili više ostataka serina ili treonina u sekvenci originalnog polipeptida (za mesta glikozilacije vezana za O). Dodatno, promena Asn 297 u Ala može da ukloni jedno od mesta glikozilacije.

[0046] U određenim izvođenjima, IL-6 antitelo ovog pronalaska izraženo je u ćelijama koje ispoljavaju beta(1,4)-N-acetilglukozaminiltransferazu III (GnT III), kao što je GnT III dodato GlcNAc IL-6 antitelu. Metode za proizvodnju antitela na ovakav način omogućene su u WO/9954342, WO/03011878, patentu 20030003097A1 i Umana et al., Nature Biotechnology, 17:176-180, Feb.1999. Humano anti-IL-6 antitelo može opciono da se generiše imunizacijom transgene životinje (npr. miš, pacov, hrčak, primat i sl.) sposobnih za proizvodnju repertoara humanih antitela, kao što je opisano ovde i/ili kao što je poznato u praksi. Ćelije koje proizvode humane anti-IL-6 antigene mogu da se izoluju iz ovih životinja i imortalizuju koristeći pogodne postupke kao što su postupci koji se ovde opisuju.

[0047] Transgeni miš koji može da proizvede repertoar humanih antitela koje se vezuju za humane antigene mogu da se proizvedu pomoću poznatih postupaka (npr., ali nisu ograničeni na njih, U.S. Pat. Nos: 5,770,428, 5,569,825, 5,545,806, 5,625,126, 5,625,825, 5,633,425, 5,661,016 i 5,789,650 issued to Lonberg et al.; Jakobovits et al. WO 98/50433, Jakobovits et al. WO 98/24893, Lonberg et al. WO 98/24884, Lonberg et al. WO 97/13852, Lonberg et al. WO 94/25585, Kucherlapate et al. WO 96/34096, Kucherlapate et al. EP 0463151 B1, Kucherlapate et al. EP 0710719 A1, Surani et al. US. Pat. No.5,545,807, Bruggemann et al. WO 90/04036, Bruggemann et al. EP 0438474 B1, Lonberg et al. EP 0814259 A2, Lonberg et al. GB 2272440 A, Lonberg et al. Nature 368:856-859 (1994), Taylor et al., Int. Immunol.6(4)579-591 (1994), Green et al, Nature Genetics 7:13-21 (1994), Mendez et al., Nature Genetics 15:146-156 (1997), Taylor et al., Nucleic Acids Research 20(23):6287-6295 (1992), Tuaillon et al., Proc Natl Acad Sci USA 90(8)3720-3724 (1993), Lonberg et al., Int Rev Immunol 13(1):65-93 (1995) i Fishwald et al., Nat Biotechnol 14(7):845-851 (1996)). Generalno, ovi miševi sadrže najmanje jedan transgen koji sadrži DNK iz najmanje jednog lokusa humanog imunoglobulina koji je funkcionalno reorganizovan ili koji može da se podvrgne funkcionalnoj reorganizaciji. Endogena mesta imunoglobulina u ovim miševima mogu da budu prekinuta ili uklonjena da bi se eliminisao kapacitet životinje kako bi se proizvodila antitela koja su kodirana pomoću endogenih gena.

[0048] Skrining antitela za specifično vezivanje sličnih proteina ili fragmenata može da se postigne koristeći peptidne biblioteke. Ovaj postupak uključuje skrining velikih kolekcija peptida za pojedninačne članove koji imaju željenu funkciju ili strukturu. Skrining antitela peptidnih biblioteka je dobro poznat u praksi. Prikazana peptidna sekvenca može da ima od 3 do 5000 ili više aminokiselina u dužini, najčešće od 5-100 aminokiselina u dužini i često od oko 8 do 25 aminokiselina. U dodatku direktnim hemijskim sintetskim metodama za generisanje peptidnih biblioteka, opisano je nekoliko rekombinantnih DNK metoda. Jedan tip uključuje prikazivanje sekvence peptida na površini bakteriofaga ili ćelije. Svaki bakteriofag ili ćelija sadrže nukleotidnu sekvencu koja kodira određenu prikazanu peptidnu sekvencu. Ovakve metode su opisane u PCT Patent Publication Nos. 91/17271, 91/18980, 91/19818 i 93/08278.

[0049] Ostali sistemi za generisanje biblioteka peptida imaju aspekte i in vitro hemijske sinteze i rekombinantne metode. Videti, PCT Patent Publication Nos. 92/05258,92/14843, i 96/19256. See also, U.S. Patent Nos. 5,658,754; i 5,643,768. Peptidne biblioteke, vektor i oprema za skrining su komercijalno dostupni od dobavljača kao što su Invitrogen (Carlsbad, CA) i Cambridge Antibody Technologies (Cambridgeshire, UK). Videti, e.g., U.S. Pat. Nos.4704692, 4939666, 4946778, 5260203, 5455030, 5518889, 5534621, 5656730, 5763733, 5767260, 5856456, dodeljen Enzon-u; 5223409, 5403484, 5571698, 5837500, dodeljen Dyax-u, 5427908, 5580717, dodeljen Affymax-u; 5885793, dodeljen Cambridge Antibody Technologies; 5750373, dodeljen Genentech-u, 5618920, 5595898, 5576195, 5698435, 5693493, 5698417, dodeljen Xoma, Colligan, supra; Ausubel, supra; ili Sambrook, supra. Antitela ovog pronalaska takođe mogu da se pripremaju koristeći najmanje jedno anti-IL-6 antitelo koje kodira nukleinsku kiselinu da bi se obezbedile transgene životinje ili sisari, kao što su koze, krave, konji, ovce, zečevi i sl., koji proizvode ovakva antitela u svom mleku. Ovakve životinje mogu da se obezbede korišćenjem poznatih metoda. Videti, npr., ali nisu ograničeni na njih, US Patent Nos.5,827,690; 5,849,992; 4,873,316; 5,849,992; 5,994,616; 5,565,362; 5,304,489, i sl. kao što je ovde pokazano.

[0050] Antitela predmetnog pronalaska mogu dodatno da se pripremaju koristeći najmanje jedno anti-IL-6 antitelo koje kodira nukleinsku kiselinu da bi se obezbedile transgene biljke i kulture biljnih ćelija (npr., ali nisu ograničeni na njih, duvan i kukuruz) koje proizvode ovakva antitela, specifične porcije ili varijante delova biljaka ili dobijena iz ćelijskih kultura. Kao primer bez ograničenja, transgeni listovi duvana koje pokazuju rekombinantne proteine, uspešni su u obezbeđivanju velikih količina rekombinantnih proteina, npr., koristeći inducibilni promoter. Videti, npr., Cramer et al., Curr. Top. Microbol. Immunol.240:95-118 (1999) reference koje su tu citirane. Takođe, za eksprimiranje sisarskih proteina na komercijalnim nivoima, koristi se transgeni kukuruz, sa biološkim aktivnostima koje su jednake onim koji se proizvode u drugim rekombinovanim sistemima ili koji su prečišćeni iz prirodnih izvora. Videti, npr., Hood et al., Adv. Exp. Med. Biol. 464:127-147 (1999) i reference koje se ovde navode. Antitela se takođe proizvode u velikim količinama izsemena transgenih biljaka uključujući fragmente antitela, kao što je pojedinačan lanac antitela (scFv) uključujući seme duvana i krtole krompira. Videti, npr., Conrad et al., Plant Mol. Biol. 38:101-109 (1998) i reference koje su ovde citirane. Stoga, antitela predmetnog pronalaska mogu takođe da se proizvode korišćenjem transgenih biljaka prema poznatim postupcima. Videti takođe, npr., Fischer et al., Biotechnol. Appl. Biochem.30:99-108(Oct., 1999), Ma et al., Trends Biotechnol.13:522-7 (1995); Ma et al., Plant Physiol.109:341-6 (1995); Whitelam et al., Biochem. Soc. Trans.22:940-944 (1994); i reference koje su ovde citirane.

[0051] Antitela koja su ovde opisana mogu da vežu humani IL-6 sa širokim opsegom afiniteta (KD). U prioritetnom obliku, najmanje jedan humani mAt ovog pronalaska može opciono da veže humani IL-6 sa visokim afinitetom. Na primer, humani ili humano inženjerizovani mAt može da veže humani IL-6 sa KDjednakim ili manjim od 10<-7>M kao što su, ali nisu ograničeni na to, 0.1-9.9 (ili bilo koji opseg ili njihova vrednost) X 10<-7>, 10<-8>, 10<-9>, 10<-10>, 10<-11>, 10<-12>, 10<-13>, 10<-14>, 10<-15>ili bilo koji opseg ili vrednost kao što je određeno pomoću površinske plazmonske rezonance ili “Kinexa” metode od strane stručnjaka u oblasti tehnike. Prema pronalasku, antitelo se vezuje za humani IL-6 ili njegov fragment sa afinitetom od 0,1-9,9 x 10<-14>M kao što se određuje Kinexa™ postupkom.

[0052] Afinitet ili aviditet vezivanja antitela za antigen može da se odredi eksperimentalno koristeći bilo koji pogodan postupak. (Videti, na primer, Berzofsky, et al., "Antibody-Antigen Interactions," In Fundamental Immunology, Paul, W. E., Ed., Raven Press: New York, NY (1984); Kuby, Janis Immunology, W. H. Freeman i Company: New York, NY (1992); i metode koje su ovde opisane).

1

Izmereni afinitet određene interakcije antitelo-antigen može da varira ako se meri pod različitim uslovima (npr. koncentracija soli, pH). Stoga, merenja afiniteta i ostalih antigen-vezujućih parametara (npr., KD, Kon, Koff) su poželjno izmereni pomoću standardizovanih rastvora antitela i antigena i standardizovanih pufera kao što je pufer koji je ovde opisan.

[0053] Kompetitivni testovi mogu da se izvedu sa antitelom ovog pronalaska da bi se odredilo koji su proteini, antitela i drugi antagonisti kompetitivni za vezivanje za IL-6 sa antitelom ovog pronalaska i/ili koji dele epitopni region. Ovi testovi, poznati u praksi, procenjuju kompeticiju između antagonista ili liganada za ograničen broj mesta vezivanja za protein. Protein i/ili antitelo je imobilisano i nerastvorno pre ili posle kompeticije i prosta veza za IL-6 se izdvaja iz nevezanog uzorka, na primer, ceđenjem (gde se protein/antitelo rastvara) ili centrifugiranjem (gde se vrši taloženje proteina/antitela posle kompetitivne reakcije). Takođe, kompetitivno vezivanje može da se odredi po tome da li je funkcija izmenjena vezivanjem ili nedostatkom vezivanja antitela za protein, npr., da li molekul antitela inhibira ili potencira enzimsku aktivnost. Mogu da se koriste ELISA i drugi funkcionalni testovi, što je dobro poznato u praksi.

[0054] Poželjna anti-IL-6 antitela ovde prikazana imaju sekvence prikazane u tabelama u tekstu ispod 1-5 i 12-14. Na primer, anti-IL-6 antitelo ovde prikazano ima jednu od CDR sekvenci lakog lanca što je pokazano u tabeli 1 (npr. CDRL1, CDRL2, CDRL3) i jednu od CDR sekcvenci teškog lanca koje su prikazane u tabeli 1 (npr. CDRH1, CDRH2 i CDRH3). Preciznije, anti-IL-6 antitelo (molekul AME-A9) ima CDRL1 iz SEQ ID NO:15, CDRL2 iz SEQ ID NO:27, CDRL3 izSEQ ID NO:35, CDRH1 iz SEQ ID NO:47, CDRH2 iz SEQ ID NO:61, CDRH3 of SEQ ID NO:91.

Molekuli nukleinske kiseline

[0055] Koristeći informacije koje su ovde dostupne, na primer, nukleotidne sekvence kodiraju najmanje 70-100% susednih aminokiselina najmanje jednog lakog lanca sa varijabilnim regionima SEQ ID NOS: 95, 99 i 103, između ostalih sekvenci koje su ovde prikazane i najmanje jedan težak lanac sa varijabilnim regionima SEQ ID NOS: 95, 99 i 103, i između ostalih sekvenci koje su ovde opisane, specificirani fragmenti, varijante, koncenzus njihovih sekvenci ili deponovani vektor koji sadrži najmanje jednu od ovih sekvenci, molekul nukleinske kiseline ovog pronalaska kodira najmanje jedno anti-IL-6 antitelo koje može da se dobije koristeći metode koje su ovde opisane ili metode koje su poznate u praksi.

[0056] Molekuli nukleinskih kiselina ovog pronalaska mogu da budu u obliku RNK, kao što je mRNK, hnRNK, tRNK ili u formi DNK, uključujući, ali nisu ograničeni na njih, cDNK i genomsku DNK dobijenu kloniranjem, sintetskim putem ili njihovom kombinacijom. Bilo koja porcija makar jednog lanca DNK ili RNK može da bude kodirajući lanac ili može da bude nekodirajući lanac.

[0057] Izolovani molekul nukleinske kiseline koji je ovde opisan uključuje molekule nukleinske kiseline koji sadrže otvoreni okvir čitanja (ORF), opciono, sa jednim ili više introna, npr., ali nisu ograničeni na njih, najmanje jednu specifičnu porciju sa najmanje jednim CDR, kao što je CDR1, CDR2 i/ili CDR3 najmanje jednog teškog lanca (npr., SEQ ID NOS: 38, 40, 42, 44 itd.) ili lakog lanca (npr., SEQ ID NOS: 2, 4, 6, 8 itd.); molekuli nukleinskih kiselina koji sadrže sekvencu kodiranja za anti-IL-6 antitelo ili varijabilni region (npr., lak lanac varijabilnih regiona SEQ ID NOS: 94, 98 i 102 između ostalih sekvenci koje su ovde prikazane i težak lanac varijabilnih regiona SEQ ID NOS: 96, 100 i 104); i molekuli nukleinske kiseline koji sadrže nukleotidnu sekvencu supstancijalno različitu od one koja je opisana iznad, ali koja zbog degeneracije (“izrođenosti”) genetskog koda i dalje kodira najmanje jedno anti-IL-6 antitelo kao što je ovde opisano i/ili je poznato u praksi. Naravno, genetski kod je dobro poznat u praksi. Stoga, bila bi rutina za stručnjaka u praksi da generiše ovako degenerisanu varijantu nukleinske kiseline koja kodira specifična anti-IL-6 antitela ovog pronalaska. Videti, npr., Ausubel, et al., supra, i ovakve varijante nukleinskih kiselina su uključene u ovaj pronalazak.

[0058] Kao što je ovde naznačeno, molekuli nukleinske kiseline ovog pronalaska koji sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira anti-IL-6 antitelo može da uključuje, ali nije ograničeno na to, one koje kodiraju sekvence aminokiseline fragmenta antitela same po sebi; sekvenca kodiranja za antitelo, fragment ili porcija, kao i dodatne sekvence, kao što je sekvenca kodiranja najmanje jednog vodećeg signala ili fuzije peptida, sa ili bez gore napomenutim sekvencama kodiranja, kao što je najmanje jedan intron, zajedno sa dodatnim nekodirajućim sekvencama, uključuju, ali nisu ograničeni na njih, nekodirajuće 5’ i 3’ sekvence, kao što su transkribovane, netranslacione sekvence koje igraju ulogu u transkripciji, mRNK procesu, uključujući vezujuće i poliadenilacione signale (na primer, vezivanje ribozoma i stabilnost mRNK); i dodatno kodiranje sekvence koja kodira za dodatne aminokiseline kao što su one koje daju dodatne funkcionalnosti. Stoga, sekvence koje kodiraju antitelo mogu da budu vezane za marker sekvence kao što je sekvenca kodiranja peptida koja olakšava prečišćavanje vezanih antitela koja sadrže fragment antitela ili porciju.

Selektivna hibridizacija polinukleotida za polinukleotide koji su ovde opisani

[0059] Ovde su takođe opisane izolovane nukleinske kiseline koje hibridizuju pod selektivnim hibridizacionim uslovima za polinukleotide. Stoga, polinukleotidi ovog primera mogu da se koriste za izolovanje, detektovanje i/ili kvantifikovanje nukleinskih kiselina koje sadrže ovakve polinukleotide. Na primer, ovi polinukleotidi mogu da se koriste da identifikuju, izoluju ili pojačaju parcijalnu ili celokupnu dužinu klonova u bibliotekama gde se čuvaju. U nekim oblicima, polinukleotidi su genomska ili cDNK sekvenca izolovana ili na drugi način komplementarna sa cDNK iz ljudske ili nukleinske kiseline sisara.

[0060] Poželjno, cDNK biblioteka sadrži najmanje 80% sekvenci pune dužine, poželjno, najmanje 85% ili 90% sekvenci pune dužine ili još poželjnije najmanje 95% sekvenci pune dužine. cDNK biblioteke mogu da se normalizuju da bi povećale reprezentaciju retkih sekvenci. Malo ili skromno rigorozni uslovi hibridizacije su tipično, ali ne isključivo, uposleni sa sekvencom koja ima redukovani identited vezan za komplementarne sekvence. Visok nivo rigoroznosti uslova može opciono da uključi sekvence većeg identiteta. Nerigorozni uslovi dozvoljavaju selektivnu hibridizaciju sekvence koja ima oko 70% identiteta sekvence i koja može da identifikuje ortologne ili paralogne sekvence.

[0061] Opciono, ovi polinukleotidi kodiraju najmanje jednu porciju antitela koji je kodiran pomoću polinukleotida opisanim ovde. Polinukleotidi opisani ovde prihvataju sekvence nukleinskih kiselina koje mogu da se koriste za selektivnu hibridizaciju za polinukleotidno kodiranje antitela ovog pronalaska. Videti, na primer, Ausubel, supra; Colligan, supra.

Konstrukcija nukleinskih kiselina

[0062] Izolovane nukleinske kiseline ovog pronalaska mogu da se dobiju koristeći (a) rekombinantne metode, (b) sintetske tehnike, (c) tehnike prečišćavanja, i/ili (d) njihove kombinacije što je dobro poznato u praksi.

1

[0063] Nukleinske kiseline mogu da sadrže sekvence u dodatku polinukleotidima ovog pronalaska. Na primer, mesto multi-kloniranja sadrži jedno ili više restrikciono mesto endonukleaze koje može da bude ubačeno u nukleinsku kiselinu da bi se pomoglo izolaciji polinukleotida. Takođe, prevodljiva sekvenca može da se ubaci kako bi pomogla izolaciji prevedenog nukleotida ovog pronalaska. Na primer, marker sekvence heksa-histidina obezbeđuje lakši način za prečišćavanje proteina ovog pronalaska. Nukleinske kiseline ovog pronalaska, izuzimajući sekvencu kodiranja, opciono je vektor, adapter ili veza za kloniranje i/ili pokazivanje polinukleotida ovog pronalaska.

[0064] Dodatne sekvence mogu da se dodaju ovakvom kloniranju i/ili izrazu sekvence kako bi se optimizovale njene funkcije kloniranja i/ili ekspresije da bi se pomoglo izolaciji polinukleotida ili napredovanju unetih polinukleotida u ćeliju. Upotreba kloniranih vektora, vektora izraza, adaptera i veza je veoma dobro poznata u praksi. (Videti, e.g., Ausubel, supra; ili Sambrook, supra).

Rekombinantni postupci za dobijanje nukleinskih kiselina

[0065] Izolovane kompozicije nukleinskih kiselina ovog pronalaska, kao što su RNK, cDNK, genomska DNK ili njihova kombinacija može da se dobije iz bioloških izvora koristeći bilo koju metodologiju kloniranja koja je poznata u praksi. U nekim oblicima, oligonukleotidne probe koje selektivno hibridizuju polinukleotide, pod strogim uslovima, koriste se za identifikaciju željene sekvence u cDNK ili genomskoj DNK biblioteci. Izolacija RNK, konstrukcija cDNK i genomskih libraries, dobro je poznata u praksi. (Videti, npr., Ausubel, supra; ili Sambrook, supra).

Skrining nukleinskih kiselina i izolacione metode

[0066] cDNK ili genomska biblioteka skrininguju se koristeći probe bazirane na sekvenci polinukleotida ovog pronalaska kao što je ovde opisano. Sonde mogu da se koriste da hibridizuju sa genomskom DNK ili cDNK sekvencama kako bi se izolovali homoligi geni u istom ili različitim organizmima. Stručnjaci cene to što se primenjuju različiti stepeni striktnosti hibridizacije u ovom testu; čak i hibridizacija medijuma za spiranje može da bude striktna. Kako uslovi hibridizacije postaju sve striktniji, mora da bude veći stepen komplementarnosti između sonde i mesta za pojavu duple formacije. Stepen striktnosti može da se kontroliše temperaturom, jonskom jačinom, pH i prisustvom parcijalno denaturišućim rastvorom kao što je formamid. Na primer, striktnost hibridizacije konvencijalno varira promenom polarnosti reaktanta rastvora kroz, na primer, kontrolisanje koncentracije formamida u opsegu od 0% do 50%. Stepen komplementarnosti (identitet sekvence) potreban je za detektovanje vezivanja koje varira u saglasnosti sa striktnošću hibridizacije medijuma i/ili medijuma za spiranje. Stepen komplementarnosti će optimalno biti 100%, ili 70-100% ili u opsegu ili vrednosti u tome.

[0067] Metode za umnožavanje RNK ili DNK su dobro poznate u praksi i mogu da se koriste prema ovom pronalasku bez suvišnih eksperimenata, baziranim na učenju koje je ovde prikazano.

[0068] Poznati postupci za umnožavanje DNK ili RNK uključuju, ali nisu ograničene na njih, lančanu reakciju polimeraze (PCR) i slične procese umnožavanja (videti, npr., U.S. Patent Nos. 4,683,195, 4,683,202, 4,800,159, 4,965,188, to Mullis, et al.; 4,795,699 i 4,921,794 to Tabor, et al; 5,142,033 to Innis; 5,122,464 to Wilson, et al.; 5,091,310 to Innis; 5,066,584 to Gyllensten, et al; 4,889,818 to Gelfi, et al; 4,994,370 to Silver, et al; 4,766,067 to Biswas; 4,656,134 to Ringold) i RNK posredovano umnožavanje koje koristi anti-sense RNK za ciljanu sekvencu kao šablon za sintezu dvostrukog DNK

1

lanca (U.S. Patent No.5,130,238 to Malek, et al, with the tradename NASBA). (Videti, npr., Ausubel, supra; or Sambrook, supra.).

[0069] Na primer, tehnologija lančane reakcije polimeraze (PCR) može da se koristi za umnožavanje sekvenci polinukleotida ovog pronalaska i povezane gene direktno iz genomske DNK ili cDNK biblioteke. PCR i druge in vitro metode umnožavanja takođe mogu da budu korisne, na primer, za kloniranje sekvenci nukleinskih kiselina koje kodiraju ekspresiju proteina kako bi se dobile nukleinske kiseline koje se koriste kao probe za detektovanje prisustva željene mRNK u uzorcima, za sekvenciranje nukleinske kiseline ili za druge primene. Primeri tehnika dovoljnih za stručnjake kroz in vitro metode umnožavanja nalaze se u Berger, supra, Sambrook, supra, i Ausubel, supra, kao i u Mullis, et al., U.S. Patent No. 4,683,202 (1987); i Innis, et al., PCR Protocols A Guide to Methods i Applications, Eds., Academic Press Inc., San Diego, CA (1990). Komercijalno dostupna oprema za genomsko PCR umnožavanje poznata je u praksi. Videti, npr., Advantage-GC Genomic PCR Kit (Clontech). Dodatno, npr., the T4 gen 32 protein (Boehringer Mannheim) može da se koristi za poboljšanje prinosa dugih PCR proizvoda.

Sintetske metode za dobijanje nukleinskih kiselina

[0070] Izolovane nukleinske kiseline ovog pronalaska takođe mogu da se pripremaju pomoću direktne hemijske sinteze prema poznatim metodama (videti, Ausubel, et al., supra). Hemijske sinteze generalno proizvode jednolančane oligonukleotide koji mogu da se konvertuju u dvolančanu DNK pomoću hibridizacije sa komplementarnom sekvencom ili polimerizacijom sa DNK polimerazom koristeći jedan lanac kao šablon. Stručnjaci u praksi prepoznaju da sinteza DNK može da bude ograničena na sekvence od oko 100 ili više baza, i da duže sekvence mogu da se dobiju ligacijom kraćih sekvenci.

Rekombinantne ekspresione kasete

[0071] Predmetni pronalazak dalje daje rekombinantne ekspresione kasete koje sadrže nukleinske kiseline. Sekvenca nukleinske kiseline ovog pronalaska, na primer, cDNK ili sekvenca genoma koja kodira antitelo, može da se koristi za konstruisanje rekombinantne ekspresione kasete koja može da se uvede u barem jednu željenu ćeliju domaćina. Rekombinantna ekspresiona kaseta tipično sadrži polinukleotid ovog pronalaska operativno vezan za transkripcionu inicijaciju regulatornih sekvenci koje usmeravaju transkripciju polinukleotida namenjenoj ćeliji domaćina. I heterologni i neheterologni (npr. endogeni) promoteri mogu da se uposle za direktnu ekspresiju nukleinskih kiselina u ovom pronalasku.

[0072] U nekim izvođenjima, izolovane nukleinske kiseline koje se koriste kao promoteri, pojačivači ili drugi elementi mogu da se uvedu u odgovarajuće pozicije (“upstream”, “downstream” ili u intron) u nehomolognoj formi polinukleotida ovog pronalaska tako da se ekspresija polinukleotida reguliše gore ili dole. Na primer, endogeni promoteri mogu da se izmene in vivo i in vitro mutacijom, delecijom i/ili supstitucijom.

Vektori i ćelije domaćina

[0073] Predmetni pronalazak takođe se odnosi na vektore koji uključuju molekule izolovanih nukleinskih kiselina, ćelije domaćina koje su genetski inženjerizovane rekombinantnim vektorima i

1

proizvodnju najmanje jednog anti-IL-6 antitela pomoću rekombinantnih tehnika, kao što je poznato u praksi. Videti, npr., Sambrook, et al., supra; Ausubel, et al., supra.

[0074] Polinukleotidi mogu opciono da se spoje sa vektorom koji sadrži selektivan marker za propagaciju u domaćinu. Generalno, vektor plazmida uvodi se u precipitat kao što je kalcijum fosfat ili kompleks sa naelektrisanim lipidima. Ako je vektor virus, može da se pakuje in vitro koristeći odgovarajuću ćelijsku liniju za pakovanje i onda se transdukuju u ćeliju domaćina.

[0075] Ubacivanje DNK bi trebalo operativno da se vezuje za odgovarajući promoter. Izražena konstrukcija dalje sadrži mesta za inicijaciju transkripcije, terminacije i u transkribovanom regionu mesto vezivanja ribozoma za translaciju. Kodirana porcija zrelih transkripta izražena pomoću konstrukcije prioritetno će da uključi inicijaciju translacije na početku i na terminaciji kodona (npr. UAA, UGA ili UAG) pravilno pozicionirana na kraju mRNK za translaciju, sa UAA i UAG poželjno za ćelije sisara ili za ekspresiju eukariotske ćelije.

[0076] Ekspresija vektora poželjno, ali opciono uključuje najmanje jedan selektivni marker. Ovakvi markeri uključuju, npr., ali nisu ograničeni na njih, metotreksat (MTX), dihidrofolat reduktazu (DHFR, US Pat.Nos. 4,399,216; 4,634,665; 4,656,134; 4,956,288; 5,149,636; 5,179,017, ampicilin, neomicin (G418), micofenolična kiselina ili glutamin sintetaza (GS, US Pat.Nos. 5,122,464; 5,770,359; 5,827,739), otpornost za eukariotske ćelijske kulture, otpornost gena tetraciklina i ampicilina zbog gajenja u E.coli i drugim bakterijama ili prokariotama. Odgovarajuće kulture medijuma i stanja za gore opisane domaćine ćelija poznate su u praksi. Pogodni vektori biće očigledni prosečnom stručnjaku. Uvođenje vektora u ćeliju domaćina može da se izvede pomoću transfekcije kalcijum fosfata, DEAE- dekstran postredovane transfekcije, katjonski posredovane transfekcije, elektroporacije, transdukcije, infekcije ili drugih poznatih metoda. Ovakve metode opisane su u praksi, kao što je Sambrook, supra, Chapters 1-4 i 16-18; Ausubel, supra, poglavlja 1, 9, 13, 15, 16.

[0077] Najmanje jedno antitelo ovog pronalaska može da se izrazi u modifikovanoj formi, kao što je fuzija proteina i ne uključuje samo sekrecione signale, već i dodatne heterologne funkcionalne regione. Na primer, region dodatnih amino kiselina, posebno ispunjene aminokiseline mogu da se dodaju N-terminusu antitela kako bi se poboljšala stabilnost i postojanost u ćeliji domaćina tokom prečišćavanja ili tokom rukovanja i skladištenja. Takođe, peptidni ostaci mogu da se dodaju antitelu kako bi se olakšalo prečišćavanje. Ovakvi regioni mogu da se uklone pre finalne pripreme antitela ili najmanje njegovi fragmenti. Ovakve metode su opisane u mnogim stiardnim laboratorijskim uputstvima, kao što su Sambrook, supra, poglavlja 17.29-17.42 i 18.1-18.74; Ausubel, supra, poglavlja 16, 17 i 18.

[0078] Ljudi u praksi upoznati su sa brojnim ekspresionim sistemima dostupnih za ekspresiju nukleinske kiseline koja kodira protein ovog pronalaska. Alternativno, nukleinske kiseline mogu da se nađu u ćeliji domaćina uključivanjem (manipulacijom) u ćeliji domaćina koja sadrži endogenu DNK koja kodira antitelo ovog pronalaska. Ovakve metode su dobro poznate u praksi npr., kao što je opisano u US patent Nos.5,580,734, 5,641,670, 5,733,746 i 5,733,761.

[0079] Ilustrativne ćelijske kulture korisne za proizvodnju antitela, specifične porcije ili njihove varijante su ćelije sisara. Sistemi ćelija sisara često su u formi monoslojeva ćelija iako suspenzije ćelija sisara i takođe mogu da se koriste bioreaktori. Broj pogodnih domaćina ćelijskih linija sposobnih za održavanje netaknutih glikozilatnih proteina takođe se razvijaju u praksi i uključuju COS-1 (e.g., ATCC

1

CRL 1650), COS-7 (npr., ATCC CRL-1651), HEK293, BHK21 (npr., ATCC CRL-10), CHO (npr., ATCC CRL 1610) i BSC-1 (npr., ATCC CRL-26) ćelijske linije, Cos-7 ćelije, CHO ćelije, hep G2 ćelije, P3X63Ag8.653, SP2/0-Ag14, 293 ćelije, HeLa ćelije i sl koje su dostupne na American Type Culture Collection, Manassas, Va (www.atcc.org). Prioritetne ćelije domaćina uključuju ćelije limfoidnog porekla kao što su mijeloma i limfoma ćelije. Posebno prioritetne ćelije domaćina su P3X63Ag8.653 ćelije (ATCC Accession Number CRL-1580) i SP2/0-Ag14 ćelije (ATCC Accession Number CRL-1851). U posebnom obliku, rekombinantna ćelija je P3X63Ab8.653 ili SP2/0-Ag14 ćelija.

[0080] Izražavanje vektora za ove ćelije može da uključi jednu ili više ekspresionih kontrolnih sekvenci kao što su, ali nisu ograničene na njih, replikacionog porekla; promoter (npr., kasni ili rani SV40 promoteri, CMV promoter (US Pat.Nos.5,168,062; 5,385,839), HSV tk promoter, a pgk (fosfoglicerat kinaza) promoter, EF-1 alfa promoter (US Pat.No. 5,266,491), najmanje jedan promoter humanog imunoglobulina; pojačivač i/ili mesta procesiranja informacije, mesta spajanja RNK, mesta (npr., SV40 velika T Ag poli A dodatna mesta), i sekvence transkripcionog terminatora. Videti, npr., Ausubel et al., supra; Sambrook, et al., supra. Ostale ćelije korisne u proizvodnji nukleinskih kiselina ili proteina ovog pronalaska poznate su i/ili dostupne, na primer, u “American Type Culture Collection Catalogue of Cell Lines i Hybridomas” (www.atcc.org) ili drugim poznatim komercijalnim izvorima.

[0081] Kada su domaćini eukariotskih ćelija uposleni, poliadenlijacija ili sekvence transkripcionog terminatora tipično su inkorporirane u vektor. Primer sekvence terminatora je sekvenca poliadenlijacije iz goveđeg hormonalnog rasta gena. Sekvenca za pravilno razdvajanja sa transkripta takođe može da bude uključena. Primer sekvence razdvajanja je VP1 intron iz SV40 (Sprague, et al., J. Virol.45:773-781 (1983)). Dodatno, sekvence gena za kontrolu replikacije u domaćinu ćelije mogu da se inkorporiraju u vektor što je poznato u praksi.

Prečišćavanje antitela

[0082] Anti-IL-6 antitelo može da se oporavi i prečisti iz rekombinantne ćelijske kulture pomoću dobro poznatih metoda koje uključuju, ali nisu ograničene na njih, prečišćavanje proteinom A, taloženje amonijum sulfatom ili etanolom, ekstrakciju kiselinom, anjonsku ili katjonsku jonoizmenjivačku hromatografiju, fosfoceluloznu hromatografiju, hidrofobnu hromatografiju, afinitetnu hromatografiju, hidroksilapatit hromatografiju i lecitin hromatografiju. Tečna hromatografija visoke performanse (HPLC) može takođe da se primeni u prečišćavanju. Videti, npr., Colligan, Current Protocols in Immunology ili Current Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, NY, NY, (1997-2001), npr., poglavlja 1, 4, 6, 8, 9, 10.

[0083] Antitela ovog prnalaska uključuju prirodno prečišćene proizvode, proizvode iz hemijski sintetisane procedure i proizvode proizvedene rekombinantnim tehnikama iz eukariotskog domaćina, uključujući, na primer, kvasac, više biljke, insekte i ćelije sisara. U zavisnosti od domaćina koji se koristi u rekombinantnoj proceduri proizvodnje, antitelo ovog pronalaska može da bude glikosilatno ili neglikosilatno, ali je prioriteno da bude glikosilatno. Ovakve metode opisane su u mnogim stiardnim laboratorijskim uputstvima, kao što je Sambrook, supra, sekcije 17.37-17.42; Ausubel, supra, poglavlja 10, 12, 13, 16, 18 i 20, Colligan, Protein Science, supra, poglavlja 12-14.

1

Anti-IL-6 antitela

[0084] Anti-IL-6 antigen opisan ovde uključuje ma koji protein ili peptid koji ima molekul koji sadrži najmanje jednu porciju molekula imunoglobulina kao što je, ali nije ograničen na to, najmanje jedna porcija vezujućeg liganda (LBP) kao što je, ali nije ograničeno na njih, CDR teškog ili lakog lanca ili njihova vezujuća porcija, varijabilni region teškog ili lakog lanca, okvirna sekvenca (npr. FR1, FR2, FR3, FR4 ili njihovi fragmenti, ili prikazani u SEQ ID NOS: 105-112, dalje opciono sadrže najmanje jednu supstituciju, insertovanje ili deleciju), konstantan region teškog ili lakog lanca (npr. koji sadrži najmanje jedan CH1, zglob1, zglob2, zglob3, zglob4, CH2 ili CH3 ili njihove fragmente, dalje opciono sadrži najmanje jednu supstituciju, insertovanje ili deleciju) ili ma koju njihovu porciju, koja može da se inkorporira u antitelo koje je ovde opisano. Antitelo opisano ovde može da uključi li da se deli iz bilo kog sisara, kao što je, ali nije ograničen na njih, ljude, miševe, zečeve, glodare, primate ili njihovu kombinaciju i sl.

[0085] Izolovana antitela ovog pronalaska sadrže sekvence aminokiselina antitela kodiraju pomoću pogodnog polinukleotida ili ma kog izolovanog ili pripremljenog antitela. Poželjno, ljudska antitela ili fragment koji se vezuje za antigen vezuje humani IL-6 i stoga parcijalno ili supstancijalno neutrališe najmanje jednu biološku aktivnost proteina. Antitelo, ili specifična porcija ili njena varijanta koja parcijalno ili poželjno supstancijalno neutrališe najmanje jednu biološku aktivnost najmanje jednog IL-6 proteina ili fragmenta i stoga inhibira aktivnosti posredovane kroz vezivanje IL-6 do IL-6 receptora ili kroz druge IL-6 zavisne ili posredovane mehanizme. Kao što je ovde korišćeno, termin “neutralisanje antitela” odnosi se na antitelo koje može da inhibira IL-6 zavisnu aktivnost na oko 20-120%, poželjno najmanje oko 10, 20, 30, 40, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% ili više, što zavisi od testa. Kapacitet anti-IL-6 antitela za inhibiranje IL-6 zavisne aktivnosti poželjno je oceniti pomoću testa najmanje jednog pogodnog IL-6 proteina ili receptora kao što je opisano ovde i/ili poznato u praksi. Ljudsko antitelo pronalaska može da bude iz bilo koje klase (IgG, IgA, IgM, IgE, IgD, itd.) ili izotip i može da sadrži kapa (κ) ili lambda (λ) lak lanac. U jednom obliku, ljudsko antitelo sadrži IgG težak lanac ili definisani fragment, na primer, najmanje jedan od izotipova IgG1, IgG2, IgG3 or IgG4 (npr., γ1, h γ2, γ3, or γ4). Antitela ovog tipa mogu da se pripreme pomoću transgenog miša ili drugog transgenog sisara koji nije čovek i koji sadrži najmanje jedan humani laki lanac (npr. IgG, IgA i IgM) transgena kao što je ovde opisano i/ili poznato u praksi. U drugom obliku, anti-humano IL-6 humano antitelo sadrži IgG1 težak lanac i lak lanac IgG1.

[0086] Najmanje jedno antitelo pronalaska vezuje najmanje jedan specifični epitop, specifičan za najmanje jedan IL-6 protein, podjedinicu, fragment, porciju ili njihovu kombinaciju. Najmanje jedan epitop može da sadrži najmanje jedan vezujući region antitela koji sadrži najmanje jednu porciju proteina gde epitop poželjno sadrži najmanje jednu ekstracelularnu, rastvornu, hidrofilnu, eksternu ili citopazmatičnu porciju proteina. Najmanje jedan specifični epitop može da sadrži ma koju kombinaciju najmanje jedne sekvence aminokiseline sa 1-3 aminokiseline za celokupnu porciju susednih aminokiselina SEQ ID NO:115, na primer, ostaci aminokiselina 151-178, specifičnije, ostaci 171-182.

[0087] Generalno, ljudsko antitelo antigen-vezujućeg fragmenta koje je ovde opisano sadržaće antigen-vezujući regiom koji sadrži najmanje jedan humani komplementarno deterministički region (CDR1, CDR2 i CDR3) ili varijantu najmanje jednog varijabilnog regiona teškog lanca. CDR sekvence mogu da se podele iz sekvence ljudske multićelije. Na primer, CDR-ovi iz sintetičke biblioteke

2

podeljene iz originalnog miša koje CDR-ovi mogu da koriste. Ovi CDR-ovi mogu da se formiraju pomoću inkorporiranja konzervativne supstitucije iz originalne sekvence miša. Kao neograničavajući primer, antitelo ili antigen-vezujuća porcija ili njihova varijanta može da sadrži najmanje jedan težak lanac CDR3 koji ima sekvence aminokiseline izabrane iz grupe koju čine SEQ ID NOS: 79, 81, 83, 85, 87, 89, i 91 i/ili lak lanac CDR3 koji ima sekvence aminokiseline izabrane iz grupe koju čine SEQ ID NOS:29, 31, 33 i 35. U određenim oblicima, antitelo ili antigen-vezujući region koji sadrži najmanje jednu porciju, najmanje jednog teškog lanca CDR (npr. CDR1, CDR2 i/ili CDR3) koji ima sekvence aminokiseline korespondujućih CDR-a 1, 2, i/ili 3 (npr., SEQ ID NOS:37, 49 i 79). U još jednom određenom obliku, antitelo ili antigen-vezujuća porcija ili njihova varijanta može da sadrži najmanje jedan lak lanac CDR-a (npr, CDR1, CDR2 i/ili CDR3) koji ima sekvence aminokiseline korespondujućih CDR-a 1, 2 i/ili 3 (npr., SEQ ID NOS:1, 17, i 29).

[0088] U poželjnom obliku, tri teška lanca CDR-a i tri laka lanca CDR-a antitela ili antigen-vezujućih fragmenata imaju sekvence aminokiseline u korespodenciji CDR najmanje jednog mAt AME-A9, AME-1b, AME-18a, AME-22a, AME-20b, AME-23a i AME-19a kao što je ovde opisano. Ovakva antitela mogu da se pripreme hemijskim spajanjem različitih porcija (npr. CDR-ovi, okvirna sekvenca) antitela koristeći konvencionalne tehnike, pomoću pripreme i ekspresije (npr. jednog ili više) molekula nukleinske kiseline koji kodira antitelo koristeći konvencionalne tehnike ili rekombinantnu DNK tehnologiju ili neku drugu pogodnu metodu.

[0089] Anti-IL-6 antitelo može da sadrži najmanje jedan varijabilni region teškog ili lakog lanca koji ima definisanu sekvencu aminokiseline. Na primer, u prioritetnom obliku, anti-IL-6 antitelo sadrži najmanje jedan varijabilni region teškog lanca, opciono imajući sekvencu aminokiseline izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NOS: 95, 99, 103, 118, 122, 126 i 130, i/ili najmanje jedan varijabilni region lakog lanca, opciono imajući sekvencu aminokiseline izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NOS:93, 97, 101, 116, 120, 124 i 128. Antitela koja vezuju ljudski IL-6 i koja sadrže definisan varijabilni region teškog ili lakog lanca mogu da se pripreme koristeći pogodne metode kao što su “phage display” (Katsube, Y., et al., Int J Mol. Med, 1(5):863-868 (1998)) ili metode koje uključuju transgene životinje, kao što je poznato u praksi i/ili kao što je opisano ovde. Na primer, transgeni miš koji sadrži funkcionalno reorganizovan humani imunoglobulin transgena teškog lanca i transgeni DNK iz mesta lakog lanca humanog imunoglobulina koji može da se podvrgne funkcionalnom reorganizovanju može da se vakciniše humanim IL-6 ili njegovim fragmentom da dobije proizvodnju antitela. Ako je poželjno, proizvodnja ćelija antigena može da se izoluje i hibridoma i ostale besmrtne ćelije koje proizvode antitela mogu da se pripreme kao što je opisano ovde i/ili kao što je poznato u praksi. Alternativno, antitelo, specifična porcija ili varijanta može da se izrazi koristeći kodiranu nukleinsku kiselinu ili njenu porciju u pogodnoj ćeliji domaćina.

Kodovi aminokiselina

[0090] Aminokiseline koje proizvode anti-IL-6 antitela ovog pronalaska često su skraćene. Određene aminokiseline mogu da budu označene samo jednim slovom koda, sa tri slova, imenom ili sa tri nukleotidna kodona kao što je dobro poznato u praksi (videti Alberts, B., et al., Molecular Biology of The Cell, Third Ed., Garli Publishing, Inc., New York, 1994). Anti-IL-6 antitelo ovog pronalaska može da uključi jednu ili više supstitucija aminokiselina, delecije ili adicije, ili od prirodnih mutacija ili ljudskom manipulacijom kao što je ovde specificirano. Aminokiseline u anti-IL-6 antitelu ovog pronalaska koje su esencijalne za funkciju mogu da se identifikuju pomoću metoda poznatim u praksi, kao što je mutageneza usmerena na mesto ili alanin-skenirajuća mutageneza (npr., Ausubel, supra, poglavlja 8, 15; Cunningham i Wells, Science 244:1081-1085 (1989)). Kasnija procedura uvodi pojedinačne mutacije alanina na svakom ostatku molekula. Rezultujući mutirani molekuli onda se testiraju na biološku aktivnost kao što je, ali nije ograničeno na nju, najmanje jedna IL-6 aktivnost neutralizacije. Mesta koja su kritična za vezivanje antitela takođe mogu da se identifikuju pomoću strukturne analize, kao što je kristalizacija, nuklearna magnetna rezonanca ili fotoafinitetno označavanje (Smith, et al., J. Mol. Biol.224:899-904 (1992) i de Vos, et al., Science 255:306-312 (1992)).

[0091] Anti-IL-6 antitela koja su ovde opisana mogu da uključe, ali nisu ograničena na njih, najmanje jednu porciju, sekvencu ili kombinaciju od 5 do svih susednih aminokiselina, najmanje jedna od SEQ ID NOS: 91, 93, 95, 97, 99 itd.

[0092] Neograničavajuće varijante koje mogu da poboljšaju ili da održe najmanje jednu od navedenih aktivnosti uključuju, ali nisu ograničene na njih, ma koji polipeptid naveden iznad, dalje sadržeći najmanje jednu mutaciju u korespodenciji sa najmanje jednom supstitucijom ostatka koja varira između pomenutih varijanti sekvenci aminokiselina.

[0093] Anti-IL-6 antitelo može dalje opciono da sadrži polipeptid sa sekvencom aminokiseline koja varira od sekvence susednih aminokiselina najmanje jedne od SEQ ID NOS:95, 99 i 103, itd (npr., jednu ili više konzervativnih supstitucija iz sekvence koja je ovde obezbeđena). Takođe, varijante sekvenci aminokiselina varijabilnog regiona lakog lanca SEQ ID NOS:93, 97 ili 101 ili sekvenca aminokiseline teškog lanca SEQ ID NOS: 79, 81, 83, 85, 87, 89, ili 91 su prikazane ovde.

[0094] Oni u praksi će da cene, da ovaj pronalazak uključuje najmanje jednu biološku aktivnost antitela. Biološka aktivnost antitela ima specifičnu aktivnost od najmanje 20%, 30% ili 40%, poželjnije, najmanje 50%, 60% ili 70%, i, najpoželjnije, najmanje 80%, 90%, ili 95%-100% ili više od nesintetičkih, endogenih ili povezanih i poznatih antitela. Metode testova i kvantifikovanja merenja enzimske aktivnosti i specifičnosti supstrata su dobro poznati u praksi.

[0095] U još jednom aspektu, pronalazak se vezuje za humana antitela i antigen-vezujuće fragmente kao što je ovde opisano i koji su modifikovani kovalentnim vezivanjem organskog ostatka. Ovakve modifikacije mogu da proizvedu antitelo ili antigen-vezujuće fragmente sa poboljšanim farmakokinetičkim osobinama (npr. povećanje polu-života in vivo seruma). Organski ostatak može da bude linearna ili razgranata hidrofilna polimerna grupa, grupa masnih kiselina ili estarska grupa masnih kiselina. U određenom obliku, hidrofilna polimerna grupa može da ima molekulsku masu od oko 800 do 120000 Daltona i može da bude polialkan glikol (npr. polietilen glikol (PEG), polipropilen glikol (PPG), polimer karbohidrata, polimer aminokiselina ili polivinil pirolidon, masne kiseline ili estarska grupa masnih kiselina može da sadržiod osam do oko 40 ugljenikovih atoma.

[0096] Modifikovana antitela i antigen-vezujući fragmenti pronalaska mogu da sadrže jedan ili više organskih ostataka koji su kovalentno vezani, direktno ili indirektno za antitelo. Svaki organski ostatak koji je vezan za antitelo ili za antigen-vezujući fragment pronalaska mogu nezavisno da budu hidrofilne polimerne grupe, grupe masnih kiselina ili estarske grupe masnih kiselina. Kao što je ovde korišćeno, termin “masna kiselina” obuhvata monokarboksilne kiseline i dikarboksilne kiseline. “Hidrofilna polimerna grupa” kao termin koji je ovde korišćen, odnosi se na organski polimer koji je više rastvoran u vodi negou oktanu. Na primer, polilizin je više rastvoran u vodi nego u oktanu. Stoga, antitelo modifikovano kovalentnim vezivanjem polilizina je obuhvaćeno pronalaskom. Hidrofilni polimeri pogodni za modifikovanje antitela pronalaska mogu da budu linearni ili razgranati i da uključuju, na primer, polialkan glikole (npr., PEG, monometoksi-polietilen glikol (mPEG), PPG i sl.), karbohidrate (npr., dekstran, celulozu, oligosaharide, polisaharide i sl.), polimere hidrofilnih aminokiselina (npr. polilizin, poliarginin, poliaspartat i sl.) polialkan okside (npr. polietilen oksid, polipropilen oksid i sl.) i polivinil pirolidon. Poželjno, hidrofilni polimer koji modifikuje antitelo pronalaska ima molekulsku masu od oko 800 do oko 150 000 Daltona kao posebni molekularni entitet. Na primer, PEG5000 i PEG20000 gde u indeksu može da se koristi prosečna molekulska masa polimera u Daltonima. Hidrofilna polimerna grupa može da se supstituiše sa jednim do oko šest alkil, masnih kiselina ili estarskim grupama masnih kiselina. Hidrofilni polimeri koji se supstituišu masnim kiselinama ili estarskom grupom masnih kiselina mogu da se pripreme uvođenjem pogodnih metoda. Na primer, polimer koji sadrži grupu amina može da bude spojen za karboksilat masne kiseline ili estar masne kiseline gde aktivirani karboksilat (npr., aktiviran sa N, N-karbonil diimidazol) na masnoj kiselini ili estru masne kiseline može da se spoji sa hidroksilnom grupom na polimeru.

[0097] Masne kiseline i estri masnih kiselina pogodnih za modifikovanje antitela pronalaska mogu da budu zasićeni ili mogu dasadrže jednu ili više jedinica nezasićenja. Masne kiseline koje su pogodne za modifikovanje antitela pronalaska uključuju, na primer, n-dodekanoat (C12, laurat), n-tetradekanoat (C14, miristat), n-oktadekanoat (C18, stearat), n-eikosanoat (C20, arahidat), n-dokosanoat (C22, behenat), n-triakontanoat (C30), n-tetrakontanoat (C40), cis-Δ9-oktadekanoat (C18, oleat), svi cis-Δ5,8,11,14-eikosatetraenoat (C20, arahidonat), oktiioična kiselina, tetradekiioikasid, oktadekiioična kiselina, dokosanedioična kiselina i sl. Pogodan estar masne kiseline uključuje mono-estar dikarboksilnih kiselina koji sadrži linearnu ili razgranatu nižu alkil grupu. Niža alkil grupa može da sadrži od jednog do 12, poželjno, od 1 do 6 ugljenikovih atoma.

[0098] Modifikovana humana antitela i antigen-vezujući fragmenti mogu da se pripreme koristeći pogodne metode kao što su one prema reakciji sa jednim ili više modifikovanih agenasa. „Modifikovani agens“ kao termin koji se ovde koristi, odnosi se na pogodnu organsku grupu (npr. hidrofilni polimer, masnu kiselinu , estar masne kiseline) koji sadrži aktivacionu grupu. „Aktivaciona grupa“ je hemijski ostatak ili funkcionalna grupa koja može, pod određenim uslovima da reaguje sa drugom hemijskom grupom i stoga formirajući kovalentnu vezu između modifikovanih agenasa i druge hemijske grupe. Na primer, reaktivne aktivacione grupe amina uključuju elektrofilne grupe, kao što je tozilat, mezilat, halo (hloro, bromo, fluoro, jodo), N-hidroksisukcinimidil estri (NHS) i sl. Aktivacione grupe koje mogu da reaguju sa tiolima, uključujući, na primer, maleimid, jodoacetil, acrilolil, piridil disulfidi, 5-tiol-2-nitrobenzoeva kiselina tiol (TNB-thiol) i sl. Aldehidna funkcionalna grupa može da bude spojena za molekule koji sadrže amin- ili hidrazid i grupa azida može da reaguje sa trovalentnom fosfornom grupom i da formira fosforamidat ili veze fosforamida. Pogodne metode za uvođenje aktivnih grupa u molekule su poznate u praksi (see for example, Hermanson, G. T., Bioconjugate Techniques, Academic Press: San Diego, CA (1996)). Aktivna grupa može da se veže direktno za organsku grupu (npr. hidrofilni polimer, masna kiselina, estar masne kiseline) ili kroz vezu ostatka, na primer, divalentna C1-C12 grupa gde jedan ili više ugljenikovih atoma može da se zameni heteroatomom, kao što je kiseonik, azot ili sumpor. Pogodna veza ostataka uključuje, na primer, tetraetilen glikol, -(CH2)3-, -NH-(CH2)6-NH-, -(CH2)2-NH- i - CH2-O-CH2-CH2-O-CH2-CH2-O-CHNH-. Modifikovani agensi koji sadrže vezujući ostatak može da se proizvede, na primer, reakcijom mono-Boc-alkildiamina (npr., mono-Boc-etilendiamin, mono-Boc-diaminoheksan) sa masnom kiselinom u prisustvu 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil) karbodiimida (EDC) da bi se formirala veza amida između slobodnog amina i karboksilata masne kiseline. Boc zaštićena grupa može da se ukloni iz proizvoda

2

tretmanom sa trifluoroacetatnom kiselinom (TFA) da bi se otkrio primarni amin koji može da se vezuje za drugi karboksilat, kao što je opisano, ili može da reaguje sa maleinskim anhidridom i rezultujući proizvod postaje cikličan da bi proizveo aktivirani maleimido derivat masne kiseline (Videti, na primer, Thompson, et al., WO 92/16221.)

[0099] Modifikovano antitelo pronalaska može da se proizvede reakcijom humanog antitela ili antigen vezujućeg fragmenta sa modifikovanim agensom. Na primer, organski ostaci mogu da se vežu za antitelo na nespecifičan način, ubacujući modifikovani amin reaktivnog amina, na primer, NHS estar PEG-a. Modifikovana humana antitela antigen-vezujućih fragmenata takođe mogu da se pripreme redukovanjem disulfidnih veza (npr., intra-lanac disulfidne veze) antitela ili antigenihvezujućih fragmenata. Redukovano antitelo ili antigeni-vezujući fragment može onda da reaguje sa modifikovanim agensom reaktivnog tiola da bi se proizvelo modifikovano antitelo pronalaska. Modifikovana humana antitela i antigen-vezujući fragmenti sadrže organski ostatak koji je vezan za specifična mesta antitela ovog pronalaska i mogu da se pripreme koristeći pogodne metode, kao što je reverzna proteoliza (Fisch et al., Bioconjugate Chem., 3:147-153 (1992); Werlen et al., Bioconjugate Chem., 5:411-417 (1994); Kumaran et al., Protein Sci. 6(10):2233-2241 (1997); Itoh et al., Bioorg. Chem., 24(1): 59-68 (1996); Capellas et al., Biotechnol. Bioeng., 56(4):456-463 (1997)), i metode opisane u Hermanson, G. T., Bioconjugate Techniques, Academic Press: San Diego, CA (1996).

Anti-Idiotipska antitela do kompozicija Anti-IL-6 antitela

[0100] U dodatku monoklonskim anti-IL-6 antitelima, anti-idiotipsko (anti-Id) antitelo koje je specifično za ovakva antitela takođe je ovde opisano. Anti-Id antitelo je antitelo koje prepoznaje jedinstvene determinante generalno povezanim sa regionom vezivanja jednog antigena za drugi antigen. Anti-Id može da se priprema imunizacijom životinja iste vrste i genetičkog tipa (npr., soj miševa) kao izvor Id antitela sa antitelom ili sa regionom koji sadrži CDR. Vakcinisana životinja prepoznaje i reaguje na idiotipske determinante antitela i proizvode anti-Id antitela. Anti-Id antitelo takođe može da se koristi kao “imunogen” za indukovanje imune reakcije u još jednu životinju koja proizvodi takozvani anti-anti-Id antitelo.

[0101] Takođe je ovde prikazana najmanje jedna kompozicija anti-IL-6 antitela koja sadrži najmanje jednu, najmanje dve, najmanje tri, najmanje četiri, najmanje pet, najmanje šest ili više anti-IL-6 antitela kao što je ovde opisano i/ili kao što je poznato u praksi i koja obezbeđuje javljanje neprirodne kompozicije, smeše ili forme. Ovakve kompozicije sadrže javljanje neprirodne kompozicije koja sadrži najmanje jednu ili dve cele dužine, C- i/ili N-terminalno uklonjenih varijanti, domena, fragmenata ili specifičnih varijanti sekvenci aminokiselina anti-IL-6 antitela izabranih iz grupe koja sadrži od 70-100% susednih aminokiselina SEQ ID NOS:1-114 i 116-138 ili specifične fragmente, domene ili njihove varijante. Poželjne kompozicije anti-IL-6 antitela uključuju najmanje jednu ili dve cele dužine, fragmente ili varijante najmanje jednog CDR ili LBP koji sadrže porcije sekvence anti-IL-6 antitela ovde opisanih, na primer, 70-100% SEQ ID NOS:15, 27, 35, 47, 61 i 91, ili specifični fragmenti, domeni ili njihove varijante. Dalje, poželjne kompozicije sadrže na primer, 40-99% najmanje jednog od 70-100% SEQ ID NOS: 93, 95, 97, 99, 101, 103, itd., ili njihove specifične fragmente, domene ili varijante. Ovakve kompozicije imaju procente prema: masi, zapremini, koncentraciji, molaritetu, molalitetu ako su tečni ili suvi rastvori, smešama, suspenzijama, emulzijama, česticama, praškovima ili koloidima kao što je poznato u praksi i opisano ovde.

Kompozicije antitela koje dalje sadrže terapeutski aktivne sastojke

[0102] Kompozicije antitela pronalaska mogu opciono dalje da sadrže efektivnu količinu najmanje jednog jedinjenja ili proteina izabranog kao anti-infektivni lek, lek kardiovaskularnog sistema (CV), lek centralno nervnog sistema (CNS), lek autonomnog nervnog sistema (ANS), lek respiratornog trakta, lek gastrointestinalnog trakta (GI), hormonalni lek, lek za balans fluida i elektrolita, hematološkog leka, antineoplastičnog, imunomodulacionog, oftamološkog, nazalnog, topikalnog, nutricionističkog i sl. Ovakvi lekovi su dobro poznati u praksi, uključujući formulacije, indikacije, doziranje i administraciju za svaki lek koji je ovde prezentovan (videti, e.g., Nursing 2001 Hibook of Drugs, 21st edition, Springhouse Corp., Springhouse, PA, 2001; Health Professional’s Drug Guide 2001, ed., Shannon, Wilson, Stang, Prentice-Hall, Inc, Upper Saddle River, NJ; Pharmcotherapy Hibook, Wells et al., ed., Appleton & Lange, Stamford, CT).

[0103] Anti-infektivni lek može da bude najmanje jedan izabran kao amebicid ili kao antiprotozoalni, antelminitik, antifungalni, antimalarični, antituberkulozni ili kao antileprozni, aminoglikozidni, penicilini, cefalosporini, tetraciklini, sulfonamidi, fluorokinoloni, antivirusi, anti-infektivni makrolidi i ostali anti-infektivni lekovi. CV lek, najmanje jedan je izabran kao inotropčki, antiaritmijski, antianginalni, antihipertenzivni, antilipemični, i drugi kardiovaskularni lekovi. CNS lekovi, najmanje jedan je izabrani kao antipiretici, nesteroidni anti-inflamatorni lekovi, narkotici kao najmanje jedan opioidni analgetik, hipnotički sedativi, antikonvulsanti, antidepresivi, lekovi protiv anksioznosti, antipsichotici, stimulanti centralnog nervnog sistema, antiparkinson lekovi, i drugi lekovi centralnog nervnog sistema. ANS lek, najmanje jedan izabran je iz grupe holinergika (parasimpatomimetika), antiholinergika, adrenergika (simpatomimetika), adrenergičnih blokatora (simpatolitika), skeletnih mišićnih relaksanta, i nemuskulatornih blokatora. Lekovi respiratornog trakta gde je najmanje jedan izabran je iz antihistaminika, bronhodilatora, ekspektoranata sa najmanje jednim antitusivnim i drugim lekovima respiratornog trakta. Lekovi GI trakta, najmanje jedan izabran je iz grupe antacida ili kao adsorbent najmanje jednog antiflatulenta, digestivnog enzima ili najmanje jednog solubilizera kamena u žuči, antidijaretika, laksativa, antiemetika, i lekova protiv čira. Najmanje jedan hormonalni lek može da bude iz grupe kortikosteroida, irogena ili najmanje jednog anaboličkog steroida, estrogena ili najmanje jednog progestina, gonadotropina, antidijabetčkih lekova ili najmanje jedan glukagon, tiroidni hormon, antagonist tiroidnog hormona, pituitarnog hormona, i sličnog leka kao paratiroid. Lekovi za balans tečnosti i elektrolita može da bude najmanje jedan lek izabran kao diuretik, elektrolit ili najmanje jedan kao zamena rastvora, lek za povećavanje kiselosti ili baznosti. Hematološki lek kože da bude izabran kao najmanje jedan hematinik, antikoagulant, razređivač krvi i trombolitični enzim. Antineoplastici mogu da budu kao najmanje jedan izabran kao alkilacioni lek, antimetabolit, antineoplastični antibiotik, antineoplastični koji menjaju balans hormonai drugi antineoplastici. Imunomodulacioni lek, najmanje jedan može da bude izabran iz grupe imunosupresanata, vakcina ili najmanje jednog toksoida, antitoksina ili najmanje jednog protivotrova, imunog seruma, i modifikovane biološke reakcije. Oftamološki, ušni i nosni lekovi, najmanje jedan može da bude izabran iz grupe oftamoloških anti-infektivnih lekova, oftamoloških anti-inflamatornih lekova, miotika, midriatika, oftamoloških vasokonstriktora i drugih oftamoloških, ušnih i nosnih lekova. Topikalni lek, najmanje jedan može da bude izabran iz grupe lokalnih anti-infektivnih, skabicida i najmanje jednog pedikulicida ili topikalnog kortikosteroida. Nutricionistički lek, najmanje jedan može da bude izabran iz grupe vitamina, minerala ili kalorija Videti, npr., sadržaj of Nursing 2001 Drug Hibook, supra.

2

[0104] Najmanje jedan amebicid ili antiprotozoalni lek može da bude izabran kao atovakvon, hlorokin hidrohlorid, hlorokin fosfat, metronidazol, metronidazol hidrohlorid i pentamidin isetionat. Najmanje jedan antelminitik može da bude izabran kao mebendazol, pirantel pamoat i tiabendazol. Najmanje jedan antigljivični lek može da bude izabran kao amfotericin B, amfotericin B holesteril sulfat kompleks, amfotericin B lipidni kompleks, amfotericin B lipozomni, flukonazol, flucitozin, mikronski griseofulvin, ultramikronski griseofulvin, itrakonazol, ketokonazol, nistatin i terbinafin hidrohlorid. Najmanje jedan antimalarični lek može da bude izabran kao hlorokin hidrohlorid, hlorokin fosfat, doksiciklin, hidroksihlorokin sulfat, meflokin hidrohlorid, primakin fosfat, pirimetamin i pirimetamin sa sulfadoksinom. Najmanje jedan antituberkulozni ili antileprotični lek može da bude izabran kao klofazimin, cikloserin, dapson, etambutol hidrohlorid, izoniazid, pirazinamid, rifabutin, rifampin, rifapentin i streptomicin sulfat. Najmanje jedan aminoglikozid može da bude izabran kao amikacin sulfat, gentamicin sulfat, neomicin sulfat, streptomicin sulfat, i tobramicin sulfat. Najmanje jedan penicilin može da bude izabran kao amoksicilin/klavulanat kalijum, amoksicilin trihidrat, ampicilin, natrijum ampicilin, ampicilin trihidrat, ampicilin natrijum/ natrijum sulbaktam, natrijum kloksacilin, natrijum dikloksacilin, natrijum mezlocilin, natrijum nafcilin, natrijum oksacilin, penicilin G benzatin, penicilin G kalijum, penicilin G prokain, penicilin G natrijum, penicilin V kalijum, piperacilin natrijum, piperacilin natrijum/tazobaktam natrijum, tikarcilin dinatrijum i tikarcilin dinatrijum/klavulanat kalijum. Najmanje jedan cefalosporin može da bude izabran kao cefaklor, cefadroksil, cefazolin natrijum, cefdinir, cefepim hidrohlorid, cefiksim, cefmetazol natrijum, cefonicid natrijum, cefoperazone natrijum, cefotaksim natrijum, cefotetan dinatrijum, cefoksitin natrijum, cefpodoksim proksetil, cefprozil, ceftazidim, ceftibuten, ceftizoksim natrijum, ceftriakson natrijum, cefuroksim aksetil, cefuroksim natrijum, cefaleksin hidrohlorid, cefaleksin monohidrat, cefradin i lorakarbef. Najmanje jedan tetraciklin može da bude izabran kao demeclociklin hidrohlorid, doksiciklin kalcijum, doksiciklin hiklat, doksiciklin hidrohlorid, doksiciklin monohidrat, minociklin hidrohlorid i tetraciklin hidrohlorid. Najmanje jedan sulfonamid može da bude izabran kao ko-trimoksazol, sulfadiazin, sulfametoksazol, sulfisoksazol, i sulfisoksazol acetil. Najmanje jedan fluorokinolon može da bude izabran kao alatrofloksacin mezilate, ciprofloksacin, enoksacin, levofloksacin, lomefloksacin hidrohlorid, nalidiksična kiselina, norfloksacin, ofloksacin, sparfloksacin i trovafloksacin mezilat. Najmanje jedan viralni lek može da bude izabran kao abakavir sulfat, aciklovir natrijum, amantadin hidrohlorid, amprenavir, cidofovir, delavirdin mezilat, didanosine, efavirenz, famciclovir, fomivirsen natrijum, foskarnet natrijum, ganciklovir, indinavir sulfat, lamivudine, lamivudine/zidovudine, nelfinavir mezilat, nevirapin, oseltamivir fosfat, ribavirin, rimantadin hidrohlorid, ritonavir, sakuinavir, sakuinavir mezilat, stavudin, valaciklovir hidrohlorid, zalcitabin, zanamivir i zidovudin. Najmanje jedan makrolin anti-infektivni lek može da bude izabran kao azitromicin, klaritromicin, diritromicin, baza eritromicina, eritromicin estolat, eritromicin etilsukcinat, eritromicin laktobionat eritromicin stearat. Najmanje jedan drugi anti-infektiv može da bude izabran kao aztreonam, bacitracin, hloramfenikol natrijum sukcinat, clindamicin hidrohlorid, klindamicin palmitat hidrohlorid, klindamicin fosfat, imipenem i kilastatin natrijum, meropenem, nitrofurantoin makrokristali, nitrofurantoin mikrocristali, kinipristin/dalfopristin, spektinomicin hidrohlorid, trimetoprim i vankomicin hidrohlorid. (Videti, npr., pp.24-214 of Nursing 2001 Drug Hibook.).

[0105] Najmanje jedan inotropik može da bude izabran kao amrinon laktat, digoksin i milrinon laktat. Najmanje jedan antiaritmik može da bude izabran kao adenozin, amiodaron hidrohlorid, atropin sulfat, bretilium tozilat, diltiazem hidrohlorid, dizopiramid, dizopiramid fosfat, esmolol hidrohlorid, flekainid acetat, ibutilid fumarat, lidokain hidrohlorid, meksiletin hidrohlorid, moricizin hidrohlorid,

2

fenitoin, fenitoin natrijum, prokainamid hidrohlorid, propafenon hidrohlorid, propranolol hidrohlorid, kinidin bisulfat, kiinidin glukonat, kinidin poligalakturonat, kinidin sulfat, sotalol, tokainid hidrohlorid i verapamil hidrohlorid. Najmanje jedan antiaginal može da bude izabran kao amlodipidine besilat, amil nitrit, bepridil hidrohlorid, diltiazem hidrohlorid, izosorbid dinitrat, izosorbid mononitrat, nadolol, nikardipin hidrohlorid, nifedipin, nitroglicerin, propranolol hidrohlorid, verapamil i verapamil hidrohlorid. Najmanje jedan antihipersenzitiv može da bude izabran kao acebutolol hidrohlorid, amlodipin besilat, atenolol, benazepril hidrohlorid, betaksolol hidrohlorid, bisoprolol fumarat, kiesartan cileksetil, kaptopril, karteolol hidrohlorid, karvedilol, klonidin, klonidin hidrohlorid, diazoksid, diltiazem hidrohlorid, doksazosin mezilat, enalaprilat, enalapril maleat, eprosartan mezilat, felodipin, fenoldopam mezilat, fosinopril natrijum, guanabenz acetat, guanadrel sulfat, guanfacin hidrohlorid, hidralazin hidrohlorid, irbesartan, isradipin, labetalol hidrohlorid, lizinopril, lozartan kalijum, metildopa, metildopat hidrohlorid, metoprolol sukcinat, metoprolol tartrat, minoksidil, moeksipril hidrohlorid, nadolol, nikardipin hidrohlorid, nifedipin, nizoldipin, nitroprusid natrijum, penbutolol sulfat, perindopril erbumin, fentolamin mezilat, pindolol, prazosin hidrohlorid, propranolol hidrohlorid, kinapril hidrohlorid, ramipril, telmisartan, terazosin hidrohlorid, timolol maleat, triolapril, valsartan, i verapamil hidrohlorid. Najmanje jedan antilipemik može da bude izabran atorvastatin kalcijum, serivastatin natrijum, holestiramin, holestipol hidrohlorid, fenofibrat (mikronizovan), fluvastatin natrijum, gemfibrozil, lovastatin, niacin, pravastatin natrijum i simvastatin. Najmanje jedan od CV lekova može da bude izabran kao abciksimab, alprostadil, arbutamin hidrohlorid, cilostazol, klopidogrel bisulfat, dipiridamol, eptifibatid, midodrin hidrohlorid, pentoksifilin, tiklopidin hidrohlorid i tirofiban hidrohlorid. (Videti, npr., pp. 215-336 of Nursing 2001 Drug Hibook.)

[0106] Najmanje jedan nenarkotički analgetik može da bude izabran kao acetaminofen, aspirin, holin magnezijum trisalicilat, diflunisal i magnezijum salicilat. Najmanje jedan nesteroidni antiimflamatorni lek može da bude izabran kao celekoksib, diklofenak kalijum, diklofenak natrijum, etodolak, fenoprofen kalcijum, flurbiprofen, ibuprofen, indometacin, indometacin natrijum trihidrat, ketoprofen, ketorolak trometamin, nabumeton, naproksen, naproksen natrijum, oksaprozin, piroksikam, rofecoksib i sulindak. Najmanje jedan opioidni ili narkotički anelgetik može da bude izabran kao alfentanil hidrohlorid, buprenorfin hidrohlorid, butorfanol tartrat, kodein fosfat, kodein sulfat, fentanil citrat, fentanil transdermalni sistem, transmukozalni fentanil, hidromorfon hidrohlorid, meperidin hidrohlorid, metadon hidrohlorid, morfin hidrohlorid, morfin sulfat, morfin tartrat, nalbufin hidrohlorid, oksikodon hidrohlorid, oksikodon pektinat, oksimorfon hidrohlorid, pentazocin hidrohlorid, pentazocin hidrohlorid i nalokson hidrohlorid, pentazocin laktat, propoksifen hidrohlorid, propoksifen napsilat, remifentanil hidrohlorid, sufentanil citrat i tramadol hidrohlorid. Najmanje jedan hipnotički sedativ može da bude izabran kao hlor hidrat, estazolam, flurazepam hidrohlorid, pentobarbital, pentobarbital natrijum, fenobarbital natrijum, sekobarbital natrijum, temazepam, triazolam, zaleplon i zolpidem tartrat. Najmanje jedan antikonvulsant može da bude izabran kao acetazolamid natrijum, karbamazepin, hlonazepam, hlorazepat dikalijum, diazepam, divalproeks natrijum, etosuksimid, fosfenitoin natrijum, gabapentin, lamotrigin, magnezijum sulfat, fenobarbital, fenobarbital natrijum, fenitoin, fenitoin natrijum, fenitoin natrijum (extended), primidon, tiagabin hidrohlorid, topiramat, valproat natrijum i valproična kiselina. Najmanje jedan antidepresiv može da bude izabran amitriptilin hidrohlorid, amitriptilin pamoat, amoksapin, bupropion hidrohlorid, citalopram hidrobromid, hlomipramin hidrohlorid, dezipramin hidrohlorid, doksepin hidrohlorid, fluoksetin hidrohlorid, imipramin hidrohlorid, imipramin pamoat, mirtazapin,

2

nefazodon hidrohlorid, nortriptilin hidrohlorid, paroksetin hidrohlorid, fenelzin sulfat, sertralin hidrohlorid, tranilcipromin sulfat, trimipramin maleat i venlafaksin hidrohlorid. Najmanje jedan lek protiv anksioznosti može da bude izabran kao alprazolam, buspiron hidrohlorid, hlordiazepoksid, hlordiazepoksid hidrohlorid, hlorazepat dikalijum, diazepam, doksepin hidrohlorid, hidroksizin embonate, hidroksizin hidrohlorid, hidroksizin pamoat, lorazepam, mefrobamat, midazolam hidrohlorid i oksazepam. Najmanje jedan antipsihotik može da bude izabran kao hlorpromazin hidrohlorid, klozapin, flufenazin dekanoat, fluefenazin enantat, flufenazin hidrohlorid, haloperidol, haloperidol dekanoat, haloperidol laktat, loksapin hidrohlorid, loksapin sukcinat, mesoridazin besilat, molindon hidrohlorid, olanzapin, perfenazin, pimozid, prohlorperazin, ketiapin fumarat, risperidon, tioridazin hidrohlorid, tiotiksen, tiotiksen hidrohlorid i trifluoperazin hidrohlorid. Najmanje jedan stimulant centralnog nervnog sistema može da bude izabran kao amfetamin sulfat, kofein, dekstroamfetamin sulfat, doksapram hidrohlorid, metamfetamin hidrohlorid, metilfenidat hidrohlorid, modafinil, pemolin i fentermin hidrohlorid. Najmanje jedan antiparkinsonski lek može da bude izabran kao amantadin hidrohlorid, benztropin mezilat, biperiden hidrohlorid, biperiden laktat, bromokriptin mezilat, karbidopa-levodopa, entakapon, levodopa, pergolid mezilat, pramipeksol dihidrohlorid, ropinirol hidrohlorid, selegilin hidrohlorid, tolkapon i triheifenidil hidrohlorid. Najmanje jedan ostali lek centralnog nervnog sistema može da bude izabran kao bupropion hidrohlorid, donepezil hidrohlorid, droperidol, fluvoksamin maleat, litijum karbonat, litijum citrat, naratriptan hidrohlorid, nikotin polakrileks, nikotin transdermalni sistem, propofol, rizatriptan benzoat, sibutramin hidrohlorid monohidrat, sumatriptan sukcinat, takrin hidrohlorid i zolmitriptan. (See, e.g., pp. 337-530 of Nursing 2001 Drug Hibook.)

[0107] Najmanje jedan holinergik (npr., parasimatomimetik) može da bude izabran betanehol hlorid, edrofonijum hlorid, neostigmin bromid, neostigmin metilsulfat, fisostigmin salicilat i piridostigmie bromid. Najmanje jedan antiholinergik može da bude izabran kao atropin sulfat, diciklomin hidrohlorid, glicopirolat, hioskiamin, hiosciamin sulfat, propantelin bromid, skopolamin, skopolamin butilbromid i skopolamin hidrobromid. Najmanje jedan irenergik (simpatomitetik) može da bude izabran kao dobutamin hidrohlorid, dopamin hidrohlorid, metaraminol bitartrat, norepinefrin bitartarat, fenilephrine hidrohlorid, pseudoefedrin hidrohlorid i pseudoefedrin sulfat. Najmanje jedan irenergik bloker može da bude izabran kao dihidroergotamin mezilat, ergotamin tartarat, metisergid maleat i propranolol hidrohlorid. Najmanje jedan relaksant skeletnih mišića može da bude izabran kao baklofen, karisoprodol, hlorzoksazon, ciklobenzaprin hidrohlorid, dantrolen natrijum, metokarbamol i tizanidin hidrohlorid. Najmanje jedan neuromuskulatorni bloker može da bude izabran kao atrakurijum besilat, cisatrakurijum besilat, doksakurijum hlorid, mivakurijum hlorid, pankuronijum bromid, pipekuronijum bromid, rapakuronijum bromid, rokuronijum bromid, sukcinilholin hlorid, tubokurarin hlorid, i vekuronijum bromid. (Videti, e.g., pp. 531-84 of Nursing 2001 Drug Hibook.)

[0108] Najmanje jedan antihistaminik može da bude izabran kao bromfeniramin maleat, cetirizin hidrohlorid, hlorfeniramin maleat, klemastin fumarat, kiproheptadin hidrohlorid, difenidramin hidrohlorid, feksofenadin hidrohlorid, loratadin, prometazin hidrohlorid, prometazin teoklat i triprolidine hidrohlorid. Najmanje jedan bronhodilator može da bude izabran kao albuterol, albuterol sulfat, aminophilin, atropin sulfat, efedrin sulfat, epinefrin, epinefrin bitartarat, epinefrin hidrohlorid, ipratropijum bromid, izoproterenol, izoproterenol hidrohlorid, izoproterenol sulfat, levalbuterol hidrohlorid, metaproterenol sulfat, okstrifilin, pirbuterol acetat, salmeterol ksinafoat, terbutalin sulfat, i teofilin. Najmanje jedan ekspektorant ili antitusiv može da bude izabran

2

benzonatat, kodein fosfat, kodein sulfat, dekstrametorfan hidrobromid, difenidramin hidrohlorid, guaifenesin i hidromorfon hidrohlorid. Najmanje jedan različit respiratorni lek može da bude izabran kao acetylcysteine, beclomethasone dipropionate, beractant, budesonide, kalfaktant, kromolin natrijum, dornas alfa, epoprostenol natrijum, flunisolid, flutikason propionat, montelukast natrijum, nedokromil natrijum, palivizumab, triamkinolon acetonid, zafirlukast, i zileuton. (Videti, e.g., pp.585-642 of Nursing 2001 Drug Hibook).

[0109] Najmanje jedan antacid, adsorbent ili antiinflatuent mogu da budu izabrani kao aluminijum karbonat, aluminijum hidroksid, kalcijum karbonat, magaldrat, magnezijum hidroksid, magnezijum oksid, simetikon i natrijum bikarbonat. Najmanje jedan digestivni enzim ili solubilizer kamena u žuči mogu da budu izabrani kao pankreatin, pankrelipaza i ursodiol. Najmanje jedan iijarejni može da bude izabran kao atapulgit, bizmut subsalicilat, kalcijum polikarbofil, difenoksilat hidrohlorid i atropine sulfat, loperamide, octreotide acetat, opium tincture, i opium tincure (kamforni). Najmanje jedan laksativ može da bude izabran kao bisokodil, kalcijum polikarbofil, kaskara sagrada, kaskara sagrada aromatični fluidekstrakt, kaskara sagrada fluidekstrakt, ulje kastora, dokusat kalcijum, dokusat natrijum, glicerin, laktuloza, magnezijum citrat, magnezijum hidroksid, magnezijum sulfat, metilceluloza, mineralno ulje, polietilen glikol ili rastvor elektrolita, silijum, sena i natrijum fosfati. Najmanje jedan antiemetika može da bude izabran kao hlorpromazin hidrohlorid, dimenhidrinat, dolasetron mezilat, dronabinol, granisetron hidrohlorid, meclizine hidrohlorid, metocloproamide hidrohlorid, ondansetron hidrohlorid, perphenazine, prohlorperazin, prohlorperazin edisilat, prohlorperazin maleat, prometazin hidrohlorid, skopolamin, tietilperazin maleat i trimetobenzamid hidrohlorid. Najmanje jedan lek protiv čireva može da bude izabran kao cimetidin, cimetidin hidrohlorid, famotidin, lansoprazol, misoprostol, nizatidin, omeprazol, rabeprozol natrijum, rantidin bizmut citrat, ranitidin hidrohlorid, i sukralfat. (Videti, npr., pp.643-95 of Nursing 2001 Drug Hibook).

[0110] Najmanje jedan kortikosteroid može da bude izabran kao betametazon, betametazon acetat ili betametazon natrijum fosfat, betametazon natrijum fosfat, kortizon acetat, deksametazon, deksametazon acetat, deksametazon natrijum fosfat, fludrokortizon acetat, hidrokortizon, hidrokortizon acetat, hidrokortizon cipionat, hidrokortizon natrijum fosfat, hidrokortizon natrijum sukcinat, metilprednizolon, metilprednizolon acetat, metilprednizolon natrijum sukcinat, prednizolon, prednizolon acetat, prednizolon natrijum fosfat, prednizolon tebutat, prednizon, triamkinolon, triamkinolon acetonid, i triamkinolon diacetat. Najmanje jedan irogen ili anabolički steroid može da bude izabran kao danazol, fluoksimesteron, metiltestosterone, nirolon dekanoat, nirolon fenpropionat, testosteron, testosteron cipionat, testosteron enantat, testosteron propionat i testosteron transdermalni sistem. Najmanje jedan estrogen ili progesteron mogu da budu izabrani kao esterifikovani estrogeni, estradiol, estradiol cipionat, estradiol/noretindron acetat transdermalni sistem, estradiol valerat, estrogeni (spojeni), estropipat, etinil estradiol, etinil estradiol i desogestrel, etinil estradiol i etinodiol diacetat, etinil estradiol i desogestrel, etinil estradiol i etinodiol diacetat, etinil estradiol i levonorgestrel, etinil estradiol i noretindron, etinil estradiol i noretindron acetat, etinil estradiol i norgestimat, etinil estradiol i norgestrel, etinil estradiol i noretindron i acetat i fero fumarat, levonorgestrel, medroksiprogesteron acetat, mestranol i noretindron, noretindron, noretindron acetat, norgestrel, i progesteron. Najmanje jedan gonadotropin može da bude izabran kao ganireliks acetat, gonadorelin acetat, histrelin acetat i menotropins. Najmanje jedan antidijabetik ili glukaon mogu da bude izabrani kao akarboza, hlorpropamid, glimepirid, glipizid, glukagon, gliburid, insulini, metformin hidrohlorid, miglitol, pioglitazon hidrohlorid, repaglinid, roziglitazon maleat i troglitazon. Najmanje jedan tiroidni hormon može da bude izabran kao levotiroksin natrijum,

2

liotironin natrijum, liotriks i tiroid. Najmanje jedan tiroidni antagonist može da bude izabran kao metimazol, kalijum jodid, kalijum jodid (zasićen rastvor), propiltiouracil, radioaktivni jodin (natrijum jodid 131I) i jak rastvor joda. Najmanje jedan pituitarni hormon može da bude izabran kao kortikotropin, kozintropin, desmofresin acetat, leuprolid acetat, repozitorni kortikotropin, somatrem, somatropin, i vazopresin. Najmanje jedan antiaritmik može da bude izabran sličan lek paratiroidnom kao kalcifediol, kalcitonin (humani), kalcitonin (losos), kalcitriol, dihidrotahisterol i etidronat dinatrijum. (Videti, npr., pp.696-796 of Nursing 2001 Drug Hibook).

[0111] Najmanje jedan diuretik može da bude izabran kao acetazolamid, natrijum acetazolamid, amilorid hidrohlorid, bumetanid, hlortalidon, etacrinat natrijum, etakrinska kiselina furosemid, hidrohlorotiazid, indapamid, manitol, metolazon, spironolakton, torsemid, triamteren i urea. Najmanje jedan elektrolit ili zamena rastvora može da bude izabrana kao kalcijum acetat, kalcijum karbonat, kalcijum hlorid, kalcijum citrat, kalcijum glubionat, kalcijum gluceptat, kalcijum glukonat, kalcijum laktat, kalcijum fosfat (dibazni), kalcijum fosfat (trobazni), dekstran (velike molekulske mase), dekstran (mala molekulska masa), hidroksietil skrob, magnezijum hlorid, magnezijum sulfat, kalijum acetat, kalijum bikarbonat, kalijum hlorid, kalijum glukonat, Ringerova injekcija, Ringerova injekcija (laktat) i natrijum hlorid. Najmanje jedno sredstvo za zakišeljavanje i za alkalizovanje može da bude izabran kao natrijum bikarbonat, natrijum laktat i trometamin. (Videti, e.g., pp. 797-833 of Nursing 2001 Drug Hibook.)

[0112] Najmanje jedan hematinik može da bude izabran kao fero fumarat, fero glukonat, fero sulfat, fero sulfat (suvi), gvožđe dekstran, gvožđe sorbitol, polisaharid-gvožđe kompleks i natrijum feritni glukonat kompleks. Najmanje jedan antikoagulant može da bude izabran kao ardeparin natrijum, dalteparin natrijum, danaparoid natrijum, enoksaparin natrijum, heparin kalcijum, heparin natrijum, i varfarin natrijum. Najmanje jedan razblaživač krvi može da bude izabran kao albumin 5%, albumin 25%, antihemofilični faktor, anti-inhibitorski kompleks koagulanata, antitrombin III (humani), faktor IX (humani), faktor IX kompleks i delovi plazme proteina. Najmanje jedan trombolitički enzim može da bude izabran kao alteplaza, anistreplaza, reteplaza (rekombinat), streptokinaza i urokinaza. (See, e.g., pp.834-66 of Nursing 2001 Drug Hibook).

[0113] Najmanje jedan alkilatni lek može da bude izabran kao busulfan, karboplatin, karmustin, hlorambucil, cisplatin, ciklofosfamid, ifosfamid, lomustine, mehloretamin hidrohlorid, melfalan, melfalan hidrohlorid, streptozocin, temozolomid i tiotep. Najmanje jedan antimetabolit može da bude izabran kao kapecitabin, kladribin, citarabin, floksuridin, fludarabin fosfat, fluorouracil, hidroksiurea, merkaptopurin, metotreksat, metotreksat natrijum i tioguanin. Najmanje jedan antineoplastični antibiotik može da bude izabran kao bleomicin sulfat, daktinomicin, daunorubicin citrat lipozomal, daunorubicin hidrohlorid, doksorubicin hidrohlorid, doksorubicin hidrohlorid lipozomal, epirubicin hidrohlorid, idarubicin hidrohlorid, mitomicin, pentostatin, plicamicin, i valrubicin. Najmanje jedan antineoplastika koji menja balans hormona može da bude izabran kao anastrozol, bikalutamid, estramustin fosfat natrijum, eksemestan, flutamid, goserelin acetat, letrozol, leuprolid acetat, megestrol acetat, nilutamid, tamoksifen citrat, testolakton, i toremifen citrat. Najmanje jedan drugi antineoplastik može da bude izabran kao asparaginaza, bacillus Calmette-Guerin (BCG) (live intravesical), dacarbazine, docetaxel, etoposide, etoposide fosfat, gemcitabin hidrohlorid, irinotekan hidrohlorid, mitotan, mitoksantron hidrohlorid, paklitaksel, pegaspargaza, porfimer natrijum, prokarbazin hidrohlorid, rituksimab, teniposid, topotekan hidrohlorid, trastuzumab, tretinoin, vinblastin sulfat, vinkristin sulfat i vinorelbin tartarat. (Videti, npr., pp. 867-963 of Nursing 2001 Drug Hibook).

[0114] Najmanje jedan imunosupresant može da bude izabran kao azatioprin, basiliksimab, ciklosporin, daklizumab, limfocit imuni globulin, muromonab-CD3, mikofenolat mofetil, mikofenolat mofetil hidrohlorid, sirolimus i takrolimus. Najmanje jedna vakcina ili toksoid može da bude izabrana kao BCG vakcina, kolera vakcina, difterija i tetanus toksoidi (adsorbovani), difterija i tetanus toksoidi i acelularni veliki kašalj vakcina adsorbovana, difterija i tetanus toksoidi i vakcina ćele ćelije velikog kašlja, Haemophilius b konjugovane vakcine, hepatitis A vakcina (neaktivirana), hepatitis B vakcina (rekombinantna), vakcina gripa 1999-2000 trovalentnog tipa A & B (prečišćena površina antigena), vakcina virusa gripa 1999-2000 trovalentnog tipa A & B (podvirion ili prečišćeni podvirion), vakcina virusa gripa 1999-2000 trovalentnog tipa A & B (ceo virion), vakcina virusa japanskog encefalitisa (neaktivirana), vakcina protiv Lajmske bolesti (rekombinantni OspA), virus vakcine protiv malih boginja, zauški i rubeole (živi), vakcine protiv malih boginja, zauški (žive atenuirane), vakcina protiv virusnih malih boginja (žive atenuirane), meningocokalna polisaharidna vakcina, vakcina protiv zauški (žive), vakcina protiv kuge, pneumocokalna vakcina (polivalentna), poliovirus vakcina (neaktivirana), poliovirus vakcina (živa, oralna, trovalentna), vakcina (adsorbed), rabies vakcina (human diploid cell), rubella and mumps virus vakcina (live), rubella protiv virusa besnila (živa, atenuirana), tetanus toksoid (adsorbovani), tetanus toksoid (fluid), tifoid vakcina (oralna), tifoid vakcina (parenteralna), tifoidna Vi polisaharidna vakcina, vakcina protiv varičela, i vakcina protiv žute groznice. Najmanje jedan antitoksin ili protivotrov može da bude izabran kao protivotrov ujeda pauka crne udovice, Crotalidae protivotrov (polivalentni), difterija antitoksin (equine) i Micrurus fulvius protivotrov. Najmanje jedan imuni serum može da bude izabran kao citomegalovirus imuni globulin (intravenozno), hepatitis B imuni globulin (humani), imuni globulin intramuskularatorno, imuni globulin intravenozno, imuni globulin protiv besnila (humani), respiratorni sincitijalni virus imuni globulin intravenozni (humani), Rh0(D) imuni globulin (humani), Rh0(D) imuni globulin intravenozno (humani), tetanus imuni globulin (humani), i varičela-zoster imuni globulin. Najmanje jedna modifikovana biološka reakcija može da bude najmanje jedna izabrana kao aldesleukin, epoetin alfa, filgrastim, glatiramer acetat za injekcije, interferon alfakon-1, interferon alfa-2a (rekombinantni), interferon alfa-2b (rekombinantni), interferon beta-1a, interferon beta-1b (rekombinantni), interferon gama-1b, levamisol hidrohlorid, oprelvekin i sargramostim. (Videti, npr., pp. 964-1040 of Nursing 2001 Drug Handbook).

[0115] Najmanje jedan oftamološki anti-infektiv može da bude izabran kao bacitracin, hloramfenikol, ciprofloksacin hidrohlorid, eritromicin, gentamicin sulfat, ofloksacin 0.3%, polimiksin B sulfat, sulfacetamid natrijum 10%, sulfacetamid natrijum 15%, sulfacetamid natrijum 30%, tobramicin i vidarabin. Najmanje jedan oftamološki anti-imflamatorni lek može da bude izabran kao deksametazon, deksametazon natrijum fosfat, diklofenak natrijum 0.1%, fluorometolon, flurbiprofen natrijum, ketorolak trometamin, prednizolon acetat (suspenzija) i prednizolon natrijum fosfat (rastvor). Najmanje jedan miotik može da bude izabran kao acetiloholin hlorid, karbahol (intraokularno), karbahol (topikalno), ehotiofate jodid, pilokarpin, pilokarpin hidrohlorid, i pilokarpin nitrat. Najmanje jedan midrijatik može da bude izabran kao atropin sulfat, ciklopentolat hidrohlorid, epinefrin hidrohlorid, epinefril borat, homatropin hidrobromid, fenilefrine hidrohlorid, skopolamin hidrobromidbi tropikamid. Najmanje jedan oftamološki vazokonstriktor može da bude izabran kao nafazolin hidrohlorid, oksimetazolin hidrohlorid, i tetrahidrozolin hidrohlorid. Najmanje jedan ostali oftamološki lek može da bude izabran kao aprahlonidin hidrohlorid, betaksolol hidrohlorid,

1

brimonidin tartarat, karteolol hidrohlorid, dipivefrin hidrohlorid, dorzolamid hidrohlorid, emedastine difumarate, fluorescein natrijum, ketotifen fumarat, latanoprost, levobunolol hidrohlorid, metipranolol hidrohlorid, natrijum hlorid (hipertonični), i timolol maleat. Najmanje jedan antiaritmik može da bude izabran kao borna kiselina, karbamid peroksid, hloramfenikol i trietanolamin polipeptid oleat-kondensat. Najmanje jedan nazalni lek može da bude izabran kao beklometazon dipropionat, budesonid, efedrin sulfat, epinefrin hidrohlorid, flunizolid, flutikason propionat, nafazolin hidrohlorid, oksimetazolin hidrohlorid, fenilefrin hidrohlorid, tetrahidrozolin hidrohlorid, triamkinolon acetonid i ksilometazolin hidrohlorid. (Videti, npr., pp. 1041-97 of Nursing 2001 Drug Hibook).

[0116] Najmanje jedan lokalni antiinfektiv može da bude izabran kao aciklovir, amfotericin B, krema azelaitnae kiseline, bacitracin, butokonazol nitrat, klindamicin fosfat, klotrimazol, ekonazol nitrat, eritromicin, gentamicin sulfat, ketokonazol, mafenid acetat, metronidazol (topikalno), mikonazol nitrat, mupirocin, naftifin hidrohlorid, neomicin sulfat, nitrofurazon, nistatin, srebro sulfadiazin, terbinafin hidrohlorid, terkonazol, tetraciklin hidrohlorid, tiokonazol, i tolnaftat. Najmanje jedan skrabicid ili pedikulid može da bude izabran kao krotamiton, lindan, permetrin i piretrin. Najmanje jedan topikalni kortekosteroid može da bude izabran kao betametazon dipropionat, betametazon valerat, klobetazol propionat, dezonid, dezoksiimetazon, deksametazon, deksametazon natrijum fosfat, diflorazon diacetat, fluocinolone acetonid, fluocinonid, flurirenolid, fluticazon propionat, halcionid, hidrokortizon, hidrokortizon acetat, hidrokortizon butirat, hidrokorison valerat, mometazon furoat i triamkinolon acetonid. (Videti, npr., pp. 1098-1136 of Nursing 2001 Drug Hibook.)

[0117] Najmanje jedan vitamin ili mineral može da bude izabran kao vitamin A, vitamin B kompleks, cijanokobalamin, folna kiselina, hidroksokobalamin, leukovorin kalcijum, niacin, niacinamid, piridoksin hidrohlorid, riboflavin, tiamin hidrohlorid, vitamin C, vitamin D, holeekalciferol, ergokalciferol, vitamin D analogni, dokserkalciferol, parikalcitol, vitamin E, vitamin K analogni, fitonadione, natrijum fluorid, natrijum fluorid (topikalni), elementi u tragovima, hrom, bakar, jod, mangan, selenijum i cink. Najmanje jedan kalorik može da bude izabran kao infuzija aminokiselina (kristal), infuzija aminokiselne u dekstrozi, infuzija aminokiseline sa elektrolitima, infuzija aminokiselina sa elektrolitima u dekstrozi, infuzija aminokiseline za hepatički polaps, infuzija aminokiseline pri velikom stresu organizma, infuzija aminokiseline za otkazivanje bubrega, dektstroza, emulzije masti i trigliceridi srednjih lanaca. (Videti, npr., pp. 1137-63 of Nursing 2001 Drug Hibook).

[0118] Kompozicije anti-IL-6 antitela ovog pronalaska mogu dalje da sadrže najmanje jednu od pogodnih i efektivnih količina kompozicija ili farmaceutskih kompozicija koje sadrže najmanje jedno anti-IL-6 antitelo koje je u vezi ili se administrira u ćeliju, tkivo, organ, životinju ili pacijenta koji ima potrebu za modulacijama, tretmanom ili terapijom, opciono dalje sadrži najmanje jedan TNF antagonist (npr., ali nije ograničen na TNF hemikalije ili proteine antagonista, TNF monoklonska ili poliklonalna antitela ili fragmente, rastvorni TNF receptor (npr, p55, p70 ili p85) ili fragment, njihovu fuziju polipeptida ili mali molekul TNF antagonista, npr., TNF vezujući protein I ili II (TBP-1 ili TBP-II) nerelimonmab, infliksimab, etanercept, CDP-571, CDP-870, afelimomab, lenercept, i sl.), antireumatični (npr., metotreksat, auranofin, aurotiogluza, azatioprin, etanercept, zlatni natrijum tiomalat, hidroksihlorokin sulfat, leflunomid, sulfasalzin), mišićni relaksant, narkotik, nesteroidni antiinflamatorni lek (NSAID), analgetik, anestetik, sedativ, lokalni anestetik, neuromuskulatorni

2

blokator, antimikrobe (npr. aminoglikozid, antigljivični, antiparazitski, antivirusni, karbapenem, cefalosporin, fluorokinolin, makrolid, penicilin, sulfonamid, tetraciklin, drugi antimirobni), antipsorijazu, kortikosteroide, anaboličke steroide, agense vezane za dijabetes, mineral, nutricioni, tiroidni agens, vitamin, kalcijum vezan za hormone, antidijarejni, antitusivni, antiemetički, anticelularni, laksaticni, antikoagulante, eritropoetin (npr. epoetin alfa), filgrastim (npr., G-CSF, Neupogen), sargramostim (GM-CSF, Leukin), imunizacija, imunoglobulin, imunosupresiv (npr., basiliksimab, ciklosporin, daklizumab), hormon rasta, lekovi izmene hormona, modulator receptora estrogena, midrijski, agens za širenje zenica, cikloplegiju i agens za alkilovanje, antimetabolit, mitotički inhibitor, radiofarmaceutski, antidepresivni, antimanični agens, antipsihotični, anksiolitički, hipnotički, simptomatički, stimulans donepezil, takrin, lekovi protiv astme, beta agonisti, sterioidi koji se udišu, leukotrieni inhibitor, metilksantin, kromolin, epinefrin ili njegov analog dornaz alfa (Pulmozim), citokin ili antagonist citokina. Neograničavajući primeri ovakvih citokina uključuju, ali nisu ograničeni na njih, ma koji od IL-1 do IL-23 (npr. IL-1, IL-2 itd.). Pogodne doze su dobro poznate u praksi. Videti, e.g., Wells et al., eds., Pharmacotherapy Hibook, 2nd Edition, Appleton i Lange, Stamford, CT (2000); PDR Pharmacopoeia, Tarascon Pocket Pharmacopoeia 2000, Deluxe Edition, Tarascon Publishing, Loma Linda, CA (2000).

[0119] Takvi lekovi protiv raka ili anti-infektivni lekovi mogu takođe da uključuju molekule toksina koji su udruženi, vezani, zajednički formulisani ili se zajednički administriraju sa najmanje jednim antitelom iz ovog pronalaska. Toksin može opciono delovati tako da selektivno ubija patološke ćelije ili tkiva. Patološka ćelija može biti ćelija raka ili druga ćelija. Takvi toksini mogu biti, ali nisu ograničeni na, prečišćene ili rekombinantne toksine ili fragmente toksina koji sadrže najmanje jedan funkcionalni citotoksični domen toksina, npr, izabran od najmanje jednog od sledećih: ricin, toksin difterije, venom toksin, ili bakterijski toksin. Termin toksin takođe obuhvata kako endotoksine i egzotoksine proizvedene na bilo koji prirodan način, mutirane ili rekombinantne bakterije ili viruse koji mogu izazvati bilo koje patološko stanje kod ljudi i drugih sisara, uključujući toksinski šok, koji može dovesti do smrti. Takvi toksini mogu uključivati, ali nisu ograničeni na, enterotoksigeni E. coli toplotno-labilni enterotoksin (LT), toplotno-stabilni enterotoksin (ST), Shigella citotoksin, Aeromonas enterotoksin, toksin sindroma toksičnog šoka -1 (TSST-1), stafilokokni enterotoksin (SEA), B (SEB), ili C (SEC), streptokokne enterotoksine i slično. Takve bakterije uključuju, ali nisu ograničene na, sojeve jedne vrste enterotoksigene E. coli (ETEC), enterohemoragične E. coli (npr, sojevi serotipa 0157: H7), Stafilokone vrste (npr, Staphilococcus aureus, Staphilococcus piogenes), Šigela vrste (npr, Shigella disenteriae, Shigella flexneri, Shigella boydii i Shigella sonnei), Salmonela vrste (npr Salmonella typhi, Salmonela cholera-suis, Salmonella enteritidis), Klostridium vrste (npr Clostridium perfringens, Clostridium dificile, Clostridium botulinurra), Carraphlobacter vrste (npr. Carnphlobacter jejuni, Camphlobacter fetacs), Helikobakter vrste, (npr. Helicobacter pilori), Aeromonas vrste (npr Aeromonas sobria, Aeromonas hidrophyla, Aeromonas caviae), Pleisomonas shigelloides, Yersina enterocolitica, Vibrios vrste (npr Vibrios cholerae, Vibrios parahemoliticus), Klebsiella vrste, Pseudomonas aeruginosa, i Streptococci. Vidi, na primer, Stein, ed., INTERNAL MEDICINE, 3rd ed., pp 1-13, Little, Brown and Co., Boston, (1990); Evans et al., eds., Bacterial Infections of Humans: Epidemiology and Control, 2d. Ed., pp 239-254, Plenum Medical Book Co., New York (1991); Mandell et al, Principles and Practice of Infectious Diseases, 3d. Ed., Churchill Livingstone, New York (1990); Berkow et al, eds., The Merck Manual, 16th edition, Merck and Co., Rahway, N.J., 1992; Wood et al, FEMS Microbiology Immunology, 76:121-134 (1991); Marrack et al, Science, 248:705-711 (1990).

[0120] Jedinjenja Anti-IL-6 antitela, kompozicije ili kombinacije iz predmetnog pronalaska mogu dalje sadržati najmanje jedno pogodno pomoćno sredstvo, kao što su, ali bez ograničavanja, diluent, vezivo, stabilizatori, puferi, soli, lipofilni rastvarači, konzervans, adjuvans ili slično. Farmaceutski prihvatljiva pomoćna sredstva su poželjna. Neograničavajući primeri, i postupci za pripremanje takvih sterilnih rastvora su dobro poznati u struci, kao što su u: Gennaro, Ed., Remington's Pharmaceutical Sciences, 18<th>edition, Mack Publishing Co. (Easton, PA) 1990, ali ne samo oni. Farmaceutski prihvatljivi nosači koji su pogodni prema načinu administracije, rastvorljivosti i/ili stabilnosti anti-IL-6 antitela, fragmenta ili varijante kompozicije, mogu biti rutinski izabrani, kao što je dobro poznato u struci ili kao što je ovde opisano.

[0121] Farmaceutski ekscipijenti i aditivi korisni u predstavljenoj kompoziciji obuhvataju, ali se ne ograničavaju na: proteine, peptide, aminokiseline, lipide i ugljene hidrate (npr šećeri, uključujući monosaharide, di-, tri-, tetra-, i oligosaharidi ; derivatizovani šećeri, kao što su alditoli, aldonske kiseline, esterifikovani šećeri i slično; i polisaharidi ili šećerni polimeri), koji mogu biti prisutni pojedinačno ili u kombinaciji, koja sadrži samo sredstvo ili sredstvo u kombinaciji 1-99.99% po masi ili zapremini. Primeri proteinskih ekscipijenata obuhvataju serum albumine, kao što je humani serum albumin (HSA), rekombinantni humani albumin (RHA), želatin, kazein, i slično. Predstavnici komponenata amino kiselina/antitelo, koji takođe mogu da funkcionišu kao pufer, uključuju alanin, glicin, arginin, betain, histidin, glutaminsku kiselinu, asparaginsku kiselinu, cistein, lizin, leucin, izoleucin, valin, metionin, fenilalanin, aspartam i slično. Jedna poželjna amino kiselina je glicin.

[0122] Karbohidratni ekscipijenti pogodni za upotrebu u ovom pronalasku uključuju, na primer, monosaharide, kao što je fruktoza, maltoza, galaktoza, glukoza, D-manoza, sorboza, i slično; disaharide, kao što je laktoza, saharoza, trehaloza, celobioza, i slično; polisaharide, na primer melitroza, melezitoza, maltodekstrin, dekstrani, skrobovi i slično; i alditole, kao što su manitol, ksilitol, maltitol, laktitol, ksilitol sorbitol (glucitol), mioinositol i slično. Poželjni ugljeno hidratni ekscipijenti za primenu u predmetnom pronalasku su manitol, trehaloza, i rafinoza.

[0123] Kompozicije Anti-IL-6 antitela mogu takođe da uključuju pufer ili sredstvo za podešavanje pH; Obično, pufer je so dobijena iz organske kiseline ili baze. Reprezentativni puferi obuhvataju soli organske kiseline, kao što su soli limunske kiseline, askorbinske kiseline, glukonske kiseline, ugljene kiseline, vinske kiseline, ćilibarne kiseline, sirćetne kiseline ili ftalne kiseline; Tris, trometamin hidrohlorid ili fosfatni puferi. Poželjni puferi za primenu u predmetnom kompozicijama su soli organskih kiselina, kao što je citrat.

[0124] Pored toga, kompozicije anti-IL-6 antitela prema pronalasku mogu da obuhvataju polimerne ekscipijente/aditive, kao što su polivinilpirolidoni, fikoli (polimerni šećer), dekstrati (npr, ciklodekstrini, kao što je 2-hidroksipropil-β-ciklodekstrin), polietilen glikole, arome, antimikrobna sredstva, zaslađivače, antioksidanse, antistatike, surfaktante (npr, polisorbati, kao što su "Tveen 20" i "TVEEN 80"), lipide (npr, fosfolipidi, masne kiseline), steroide (npr, holesterol), i helirajuće agense (npr, EDTA).

[0125] Ovi i drugi poznati farmaceutski ekscipijenti i/ili aditivi pogodni za upotrebu u anti-IL-6 antitelima, porcijama ili varijantama kompozicija prema ovom pronalasku su poznati u struci, na primer, kao što je navedeno u "Remington: The Science & Practice of Pharmacy", 19th ed., Williams & Williams, (1995), and in the "Physician’s Desk Reference", 52nd ed., Medical Economics, Montvale, NJ (1998). Poželjni nosači ili ekscipijensi su ugljeni hidrati (npr, saharidi i alditoli) i puferi (npr, citrat)

4

ili polimerni agensi. Primer molekula nosača je slian mukopolisaharid, hijaluronska kiselina, koja može biti korisna za intraartikularnu primenu.

Formulacije

[0126] Kao što je gore navedeno, pronalazak prikazuje stabilne formulacije, koje po mogućnosti sadrže fosfatni pufer sa slanim rastvorom ili rastvorom odabrane soli, kao i konzervirane rastvore i formulacije koje sadrže konzervans, kao i za konzervirane formulacije pogodne za višekratnu farmaceutsku ili veterinarsku upotrebu, koje sadrže najmanje jedno anti-IL-6 antitelo u obliku farmaceutski prihvatljive formulacije. Konzervirane formulacije sadrže najmanje jedan poznati konzervans ili opciono izabran iz grupe koju čine najmanje jedan fenol, m-krezol, p-krezol, o-krezol, hlorokrezol, benzil alkohol, fenilmerkuri nitrit, fenoksietanol, formaldehid, hlorobutanol, magnezijum hlorid (npr. heksahidrat), alkilparaben (metil, etil, propil, butil i slično), benzalkonijum hlorid, benzetonijum hlorid, natrijum dehidroacetat i timerosal, polimeri, ili njihove mešavine u vodenom diluentu. Bilo koja pogodna koncentracija ili smeša može se koristiti na način poznat u struci, kao što je oko 0.0015%, ili u bilo kom opsegu, vrednosti ili udelu. Neograničavajući primeri uključuju, bez konzervansa, oko 0.1-2% m-krezol (npr 0.2, 0.3. 0.4, 0.5, 0.9, 1.0%), oko 0.1-3% benzil alkohola (na primer, 0.5, 0.9, 1.1, 1.5, 1.9, 2.0, 2.5%), oko 0.001-0.5% timerozala (na primer, 0.005, 0.01), oko 0.001-2.0% fenola (na primer, 0.05, 0.25, 0.28, 0.5, 0.9, 1.0%), 0.0005-1.0 % alkilparabena (npr.

0.00075, 0.0009, 0.001, 0,002, 0.005, 0.0075, 0.009, 0.01, 0.02, 0.05, 0.075, 0.09, 0.1, 0.2, 0.3, 0.5, 0.75, 0.9, 1.0%) i slično.

[0127] Kao što je gore navedeno, pronalazak obezbeđuje proizvodni artikal, koji se sastoji od ambalaže i najmanje jedne bočice koja obuhvata rastvor od najmanje jednog anti-IL-6 antitela sa propisanim puferima i/ili konzervansima, opciono u vodenom diluentu, pri čemu navedeni materijal za pakovanje sadrži etiketu koja označava da se takav rastvor može čuvati tokom perioda od 1, 2, 3, 4, 5, 6, 9, 12, 18, 20, 24, 30, 36, 40, 48, 54, 60, 66, 72 časa ili duže. Pronalazak dalje obuhvata proizvodni artikal, koji sadrži materijal za pakovanje, prvu bočicu koja obuhvata liofilizovano bar jedno anti-IL-6 antitelo, i drugu bočicu koji sadrži vodeni diluent propisanog pufera ili konzervansa, pri čemu pomenuti materijal za pakovanje sadrži etiketu koja pacijentu daje uputstvo za rekonstituisanje najmanje jednog anti-IL-6 antitela u vodenom diluentu da se formira rastvor koji može da se čuva dvadeset četiri časa ili duže.

[0128] Najmanje jedno anti-IL-6 antitelo upotrebljeno u skladu sa ovim pronalaskom može biti proizvedeno rekombinantnim sredstvima, uključujući ona iz sisarskih ćelija ili transgenih preparata, ili ona koja mogu da se prečiste iz drugih bioloških izvora, kako je ovde opisano ili kako je poznato u struci.

[0129] Asortiman od najmanje jednog anti-IL-6 antitela u proizvodu iz ovog pronalaska uključuje količine koje se dobijaju rekonstitucijom, ako su u vlažnom/suvom sistemu, koncentracija od oko 1.0 µg/ml do oko 1000 mg/ml, i ako se i manje i veće koncentracije mogu koristiti a zavise od predviđenog nosača, npr, formulacija rastvora će se razlikovati za transdermalni flaster, pulmonarnu, transmukozalnu ili osmotsku metodu ili metodu mikro pumpe.

[0130] Po mogućnosti, vodeni diluent ponekad dodatno sadrži farmaceutski prihvatljiv konzervans. Poželjni konzervansi uključuju one odabrane iz grupe koja sadrži fenol, m-krezol, p-krezol, o-krezol, hlorokrezol, benzil alkohol, alkilparaben (metil, etil, propil, butil i slično), benzalkonijum hlorid, benzetonijum hlorid, natrijum dehidroacetat i timerozal, ili njihove smeše. Koncentracija konzervansa koja se koristi u formulaciji je koncentracija dovoljna da se dobije anti-mikrobno dejstvo. Te koncentracije zavise od izabranog konzervansa i lako ih može odrediti prosečan stručnjak.

[0131] Drugi ekscipijensi, npr, izotonična sredstva, puferi, antioksidansi, i pojačivači konzervansa, mogu biti opciono a i poželjno dodati u diluent. Izotonična sredstva, kao što je glicerin, se često koriste u poznatim koncentracijama. Fiziološki prihvatljiv pufer se po mogućnosti dodaje da obezbedi bolju kontrolu pH. Formulacije mogu da obuhvate širok spektar PH, kao što je od oko pH 4 do oko pH 10, poželjni opsezi su od oko pH 5 do oko pH 9, a najpoželjniji opseg od oko 6,0 do oko 8,0. Po mogućnosti, formulacije iz ovog pronalaska imaju pH između oko 6.8 i oko 7.8. Poželjni puferi uključuju fosfatne pufere, najpoželjnije, natrijum fosfat, naročito, fosfatni slani pufer (PBS).

[0132] Drugi aditivi, kao što su farmaceutski prihvatljivi solubilizatori kao što je Tween 20 (polioksietilen (20) sorbitan monolaurat), Twen 40 (polioksietilen (20) sorbitan monopalmitat), Tween 80 (polioksietilen (20) sorbitan monooleat), Pluronic F68 (polioksietilen polioksipropilen blok kopolimeri), i PEG (polietilen glikol) ili nejonski surfaktanti, kao što je polisorbat 20 ili 80 ili poloksamer 184, ili 188, Pluronic®polili, drugi blok kopolimeri, i helatori, kao što su EDTA i EGTA, mogu opciono biti dodati u formulacije ili kompozicije za smanjenje agregacije. Ovi aditivi su naročito korisni ako se za davanje formulacije koristi pumpa ili plastično pakovanje. Prisustvo farmaceutski prihvatljivog surfaktanta ublažava sklonost ka agregaciji proteina.

[0133] Formulacije iz ovog pronalaska se mogu pripremiti procesom koji obuhvata mešanje najmanje jednog anti-IL-6 antitela i konzervansa odabranog iz grupe koju čine: fenol, m-krezol, p-krezol, okrezol, hlorokrezol, benzil alkohol, alkilparaben, (metil, etil, propil, butil i slično), benzalkonijum hlorid, benzetonijum hlorid, natrijum dehidroacetat i timerozal ili njihove mešavine u vodenom diluentu. Mešanje barem jednog anti-IL-6 antitela i konzervansa u vodenom diluentu se obavlja prema konvencionalnim procedurama za rastvaranje i mešanje. Za pripremanje pogodne formulacije, npr. izmerena količina najmanje jednog anti-IL-6 antitela u puferovanom rastvoru se kombinuje sa željenim konzervansom u puferovanom rastvoru u količinama dovoljnim da se obezbede protein i konzervans u željenim koncentracijama. Stručnjak će prepoznati varijacije ovog procesa. Na primer, redosled kojim se dodaju komponente, da li se koriste dodatni aditivi, temperatura i pH vrednosti na kojima se priprema ova formulacija, su to faktori koji se mogu optimizirati za datu koncentraciju i način primene.

[0134] Formulacije koje su predmet patentnih zahteva se mogu obezbediti pacijentima u vidu bistrih rastvora ili kao dvostruki viali koji sadrže bočicu liofilizovanog najmanje jednog anti-IL-6 antitela koje se rekonstituiše sa drugom bočicom koja sadrži vodu, konzervans i/ili ekscipijente, po mogućnosti, fosfatni pufer i/ili fiziološki rastvor i rastvor odabrane soli, u vodenom razblaživaču. I pojedinačna bočica sa rastvorom i dvostruki vial koji zahteva rekonstituciju se mogu koristiti više puta i mogu biti dovoljni za jedan ili više ciklusa terapije pacijenta i na taj način može da se obezbedi pogodniji terapijski režim od onog koji je trenutno dostupan.

[0135] Proizvodi koji su predmet ovog potraživanja su korisni za ordiniranje tokom perioda u rasponu od neposredne primene do dvadeset četiri časa ili duže. Shodno tome, proizvodi koji su predmet ovog potraživanja nude značajne prednosti za pacijenta. Formulacije prema ovom pronalasku mogu opciono biti bezbedno skladištene na temperaturama od od oko 2 °C do oko 40 °C i pri tom mogu da zadrže biološku aktivnost proteina za duži vremenski period, što omogućava da etiketa na pakovanju može da ukazuje da rastvor može biti čuvan i/ili korišćen u periodu od 6, 12, 18, 24, 36, 48, 72, ili 96 sati ili duže. Ako se koristi konzervisani diluent, ova etiketa može uključivati upotrebu u periodu 1-12 meseci, pola, jednu i po, i/ili dve godine.

[0136] Rastvori najmanje jednog anti-IL-6 antitela prema predmetnom pronalasku mogu se pripremiti pomoću procesa koji obuhvata mešanje barem jednog antitela u vodenom diluentu. Mešanje se vrši prema uobičajenim procedurama za rastvaranje i mešanje. Za pripremu pogodnog diluenta, npr. kombinuje se, izmerena količina najmanje jednog antitela sa vodom ili puferom u količinama dovoljnim da se obezbede protein i opciono, konzervans ili pufer u željenim koncentracijama. Varijacije ovog procesa biće prepoznate od strane prosečnog stručnjaka. Na primer, redosled kojim se dodaju komponente, korišćenje dodatnih aditiva, temperatura i pH pri kojima se priprema ova formulacija, su faktori koji se mogu optimizovati za određenu koncentraciju i način primene.

[0137] Proizvodi koji su predmet ovog potraživanja se mogu obezbediti pacijentima u obliku bistrih rastvora ili kao dvostruki viali (bočice) koje sadrže bočicu liofilizovanog najmanje jednog anti-IL-6 antitela koje se rekonstituiše sa drugom bočicom koja sadrži vodeni diluent. I bočica sa pojedinačnim rastvorom i dvostruki vial koji zahteva rekonstituciju mogu se koristiti više puta i dovoljne su za jedan ili više ciklusa lečenja pacijenta i prema tome obezbeđuju pogodniji terapijski režim od onog koji je trenutno dostupan.

[0138] Proizvodi koji su predmet ovog potraživanja se mogu obezbediti indirektno pacijentima preko apoteka, klinika ili drugih sličnih ustanova i objekata, bistri rastvori ili dvostruki viali koji sadrže bočice sa liofilizovanim bar jednim anti-IL-6 antitelom koje se rekonstituiše pomoću druge bočice koja sadrži vodeni diluent. Količina bistrog rastvora u ovom slučaju može biti do litar, a čak i više, obezbeđujući tako veliki rezervoar iz kojeg manje količine rastvora sa bar jednim antitelom mogu biti uzete jednom ili više puta za prenošenje u manje posude i obezbeđene od strane apoteke ili klinike za njihove klijente i/ili pacijente.

[0139] Priznati uređaji koji sadrže sistem od jedne bočice uključuju injektore u obliku olovke za davanje rastvora, kao što su BD pens, BD Autojector®, Humaject®, NovoPen®, BD®Pen, AutoPen® i OptiPen®, GenotropinPen®, Genotronorm Pen®, Humatro Pen®, Reco-Pen®, Roferon Pen®, Biojector®, Iject® J-vrh igle Injector®, Intraject®, Medi-Ject®, na primer, koje je i razvio Becton Dickensen (Franklin Lakes, NJ, www.bectondickenson.com), Disetronic (Burgdorf, Switzerland, www.disetronic.com; Bioject, Portland, Oregon (www.bioject.com); National Medical Products, Weston Medical (Peterborough, UK, www.weston-medical.com), Medi-Ject Corp (Medi-Ject Corp (Minneapolis, MN, www. mediject.com) i slični pogodni uređaji. Priznati uređaji sa dvostrukim vialom uključuju “pen-injektor” sisteme za rekonstituisanje liofilizovanog leka u patroni za isporuku rekonstituisanog rastvora, kao što je HumatroPen®. Primeri drugih pogodnih uređaja uključuju prethodno napunjene špriceve, auto-injektore, injektore bez igle i IV infuzione setove bez igle.

[0140] Proizvodi na koje se odnose zahtevi uključuju materijal za pakovanje. Materijal za pakovanje obezbeđuje, pored informacija određenih od strane regulatornih agencija, uslove pod kojima se proizvod može koristiti. Materijal za pakovanje ovog pronalaska obezbeđuje uputstva za pacijenta kako da rekonstituiše najmanje jedno anti-IL-6 antitelo u vodenom rastvaraču da se formira rastvor i da koristi rastvor tokom perioda od 2-24 sata ili dužem za dve bočice, suvog/vlažnog, proizvoda. Za jednu bočicu, rastvora proizvoda, etiketa označava da se navedeni rastvor može koristiti tokom perioda od 2-24 sata ili dužem. Proizvodi na koje se odnose zahtevi su korisni za ljudsku upotrebu farmaceutskog proizvoda.

[0141] Formulacije iz ovog pronalaska se mogu pripremiti procesom koji sadrži mešanje najmanje jednog anti-IL-6 antitela i izabranog pufera, poželjno, fosfatnog pufera koji uključuje fiziološki rastvor ili izabranu so. Mešanje najmanje jednog anti-IL-6 antitela i pufera u vodenom rastvaraču se izvodi upotrebom konvencionalnih procedura rastvaranja i mešanja. Da bi se pripremila pogodna formulacija, na primer, izmerena količina od najmanje jednog antitela u vodi ili puferu je kombinovana sa željenim sredstvom za puferovanje u vodi u dovoljnim količinama da se obezbedi protein i pufer u željenim koncentracijama. Varijacije ovog procesa će prepoznati prosečan stručnjak u ovom području tehnike. Na primer, redosled kojim se dodaju komponente, da li su korišćeni dodatni aditivi, temperatura i pH pri kojem je formulacija pripremljena, predstavljaju sve faktore koji mogu biti opitmizovani za datu koncentraciju i sredstva davanja.

[0142] Stabilne ili očuvane-konzervisane formulacije iz zahteva se mogu dati pacjentima kao bistri rastvori ili kao dvostruke bočice koje sadrže bočicu liofilizovanog najmanje jednog anti-IL-6 antitela koji se rekonstituiše sa drugom bočicom koja sadrži konzervans ili pufer i ekscipijente u vodenom rastvaraču. Ili rastvor pojedinačne bočice ili dvostruke bočice koja zahteva rekonstituciju se može koristiti više puta i može biti dovoljan za jedan ili više ciklusa lečenja pacjenta i na taj način obezbeđuje prikladniji režim lečenja od trenutno dostupnog.

[0143] Druge formulacije ili metode za stabilizaciju anti-IL-6 antitela mogu rezultirati u različitom od bistog rastvora liofilizovanog praha koji sadrži antitelo. Među ne-bistrim rastvorima su formulacije koje sadrže suspenzije čestica, navedene čestice biće kompozicija koja sadrži anti-IL-6 antitelo u strukturi varijabilne dimenzije i različito poznate kao mikrosfera, mikročestica, nanočestica, nanosfera ili lipozom. Takva relativno homogena, u suštini sferična, formulacija čestica koja sadrži aktivno sredstvo može biti formirana dovođenjem u kontakt vodene faze koja sadrži aktivno sredstvo i polimer i nevodene faze nakon čega sledi evaporacija nevodene faze čime se uzrokuje koalescencija (srastanje čestica) iz vodene faze kao što je proučeno u SAD-4.589.330. Porozne mikročestice mogu biti pripremljene upotrebom prve faze koja sadrži aktivno sredstvo i polimer raspršen (dispergovan) u kontinuiranom rastvaraču i uklanjanje navedenog rastvarača iz suspenzije sušenjem-zamrzavanjem ili razblaživanjem-ekstrakcijom-precipitacijom kao što proučeno u US 4.818.542. Poželjni polimeri za takve preparate su prirodni ili sintetski kopolimeri ili polimeri izabrani iz grupe koja se sastoji od želatin agara, skroba, arabinogalaktana, albumina, kolagena, poliglikolne kiseline, polilaktinske kiseline, glikolid-L(-)laktid poli(epsilon-kaprolaktona, poli(epsilon-kaprolakton-CO-mlečne kiseline), poli(epsilon-kaprolakton-CO-glikolne kiseline), poli (ß-hidroksi-buterne kiseline), polietilen oksida, polietilena, poli (alkil-2-cijanoakrilata), poli(hidroksietil metakrilata), poliamida, poli(amino kiseline), poli(2-hidroksietil DL-aspartamida), poli(estra uree), poli(L-fenilalanin/etilen glikol/1,6-diizocijanatoheksana) i poli(metil-metakrilata). Naročito poželjni polimeri su poliestri, kao što je poliglikolna kiselina, polilaktinska kiselina, glikolid-L(-)laktid poli(epsilon-kaprolakton, poli(epsilonkaprolakton- CO-mlečna kiselina) i poli (epsilon-kaprolakton-CO-glikolna kiselina. Rastvarači korisni za rastvaranje polimera i/ili aktivni uključuju: vodu, heksafluorizopropanol, metilenhlorid, tetrahidrofuran, heksan, benzen ili heksafluoraceton seskvihidrat. Proces disperzijom aktivnog sadržavajući fazu sa drugom fazom može uključivati nasilni pritisak navedene prve faze kroz otvor u mlaznicu utičućii na stvaranje (formaciju) kapljica.

[0144] Formulacije suvog praha mogu proisteći iz procesa različitog od liofilizacije, kao što je putem sušenja raspršivanjem ili ekstrakcijom rastvarača putem evaporacije ili putem precipitacije kristalne kompozicije nakon čega slede jedan ili više koraka za uklanjanje vodenog ili nevodenog rastvarača. Priprema pripravka sušenjem- raspršivanjem antitela se izučava u US 6.019.968. Antitelo-bazirane suve praškaste kompozicije se mogu proizvesti putem sušenja raspršivanjem rastvora ili suspenzija antitela i, opciono, ekscipijenata, u rastvaraču pod uslovima da se obezbedi respirabilni suvi prah. Stabilnost antitela se može pojačati izvođenjem procedura sušenja raspršivanjem u odsustvu kiseonika, kao što je pod azotnim pokrivačem ili upotrebom azota kao gasa za sušenje. Još jedna relativno suva formulacija je disperzija većeg broja perforiranih mikrostruktura dispergovanih u medijumu suspenzije koja sadrži hidrofluoroalkan potisni gas, kao što je proučeno u WO 9916419. Postojane (stabilizovane) disperzije se mogu davati u pluća pacijenta pomoću inhalatora sa odmerenim dozama. Oprema korisna u komercijalnoj proizvodnji medikamenata osušenih raspršivanjem je proizvedena od strane Buchi Ltd. ili Niro Corp.

[0145] Najmanje jedno anti-IL-6 antitelo i u stabilnim ili konzervisanim formulacijama ili rastvorima opisanim ovde, se može davati pacijentu u skladu sa ovim pronalaskom putem različitih metoda uključujući SC ili IM injekcije; transdermalne, pulmonalne, transmukozne, putem implantata, osmotske pumpe, ketridža, mikro pumpe, ili drugim načinima cenjenim od strane iskusnog stručnjka, kao što je dobro poznato u tehnici.

Terapijske Primene

[0146] Ovde je otkriven metod za modulaciju ili lečenje najmanje jedne bolesti koja je povezana sa IL-6, u ćeliji, tkivu, organu, životinji, ili pacjentu, kao što je poznato u tehnici ili kao što je ovde opisano, upotrebom najmanje jednog IL-6 antitela ovog pronalaska, npr. davanjem ili dovođenjem u kontakt čelije, tkiva, organa, životinje ili pacjenta sa terapijski efikasnom količinom IL-6 antitela. Ovde je takođe otkriven metod za modulaciju ili lečenje najmanje jedne IL-6 povezane bolesti, u ćeliji, tkivu, organu, životinji, ili pacjentu, uključujući, ali bez ograničenja na, najmanje jednu od gojaznosti, imuno povezane bolesti, kardiovaskularne boleti, infektivne bolesti, maligne bolesti ili neurološke bolesti.

[0147] Ovde je takođe otkriven metod za modulaciju ili lečenje najmanje jedne IL-6 imuno povezane bolesti, u ćeliji, tkivu, organu, životinji, ili pacjentu, uključujući, ali bez ograničenja na, najmanje jednu od reumatoidnog artritisa, juvenilnog reumatoidnog artritisa, sistemskog početka juvenilnog reumatoidnog artritisa, psorijatičnog artritisa, ankiloznog spondilitisa, gastričnog ulkusa, seronegativnih artropatija, osteoartritisa, osteolize, aseptičkog popuštanja ortopedskih implantata, inflamatorne bolesti creva, ulceroznog kolitisa, sistemskog eritemskog lupusa, kožnog eritemskog lupusa, lupusnog nefritisa, antifosfolipidnog sindroma, iridociklitisa/uveitisa/optičkog neuritisa, idiopatske plućne fibroze, sistemskog vaskulitisa/Vegenerove granulomatoze, sarkoidoze, orhitisa/procedure preokreta vazektomije, alergijske/atopijske bolesti, astme, alergijskog rinitisa, ekcema, alergijskog kontaktnog dermatitisa, alergijskog konjunktivitisa, hipersenzitivnog pneumonitisa, transplantacija, odbacivanja transplantiranog organa, graft-versus-host bolesti, sindroma sistemskog inflamatornog odgovora, sindroma sepse, gram pozitivne sepse, gram negativne sepse, kulture negativne sepse, gljivične sepse, febrilne neutropenije-neutropenijske groznice, urosepse, meningokokemie, traume/krvarenja, opekotina, izloženosti jonizirajućem zračenju, akutnog pankreatitisa, respiratornog distres sindroma odraslih, reumatoidnog artritisa, alkoholom izazvanog hepatitisa, hroničnih inflamatornih patoloških stanja, sarkoidoze, Kronove bolesti-patologije, anemije srpastih ćelija, dijabetesa, nefroze, atopijske bolesti, hipersenzitivnih reakcija, alergijskog rinitisa, polenske groznice, višegodišnjeg rinitisa, konjunktivitisa, endometrioze, astme, urtikarije, sistemske anafilaksije, dermatitisa, perniciozne anemije, hemolitičke bolesti, trombocitopenije, odbacivanja transplantata bilo kojeg organa ili tkiva, odbacivanja translplanta bubrega, odbacivanja transplantata srca, odbacivanja transplantata jetre, odbacivanja transplantata pankreasa, odbacivanja transplantata pluća, odbacivanja transplantata koštane srži (BMT), odbacivanja transplantata kože, odbacivanja transplantata hrskavice, odbacivanja koštanog grafta, odbacivanja transplantata tankog creva, odbacivanja implanta fetalnog timusa, odbacivanja paratirodnog transplantata, odbacivanja ksenografta bilo kojeg organa ili tkiva, odbacivanja alografta, anti-receptorske reakcije hipersenzitivnosti, Grejvsove bolesti, Rejnove bolesti, dijabetesa tipa B insulinske-rezistencije, astme, mijastenije gravis, citotoksičnosti zavisne od antitela, tipa III reakcije hipersenzitivnosti, POEMS sindroma (polineuropatije, organomegalije, endokrinopatije, monoklonalne gamopatije, i sindroma promene kože), polineuropatije, organomegalije, endokrinopatije, monoklonalne gamopatije, i sindroma promene kože, antifosfolipidnog sindroma, pemfigusa, sklerodermije, mešane bolesti vezivnog tkiva, idiopatske Adisonove bolesti, dijabetes melitusa, hroničnog aktivnog hepatitisa, primarne bilijarne ciroze, vitiliga, vaskulitisa, post-MI kardiotomog sindroma, tip IV hipersenzitivnosti, kontaktnog dermatitisa, hipersenzitivnog pneumonitisa, odbacivanja genetski različitog transplantata-alografta, granuloma nastalih zbog intracelularnih organizama, osetljivosti na lek, metaboličke/idiopatske, Vilsonove bolesti, hemahromatoze, nedostatka alfa-1-antitripsina, dijabetičke retinopatije, Hašimotovog tireoiditisa, osteoporoze, hipotalamusno-hipofizno-nadbubrežne osovine, primarne bilijarne ciroze, tireoiditisa, encefalomijelitisa, kaheksije, cistične fibroze, neonatalne hronične bolesti pluća, hronične opstruktivne bolesti pluća (COPD), familijarne hematofagocitne limfohistiocitoze, dermatoloških stanja, psorijaze, alopecije, nefrotskog sindroma, nefritisa, glomerularnog nefritisa, akutne bubrežne insuficijencije, hemodijalize, uremije, toksičnosti, preeklampsije, okt3 terapije, anti-cd3 terapije, terapije citokina, hemoterapije, terapije zračenjem (npr. uključujući ali ne ograničavajući se na, asteniju, anemiju, kaheksiju, i slično), hronične intoksikacije salicilata i slično. Videdi, npr., the Merck Manual, 12th-17th Editions, Merck & Company, Rahway, NJ (1972, 1977, 1982, 1987, 1992, 1999), Pharmacotherapy Handbook, Wells et al., eds., Second Edition, Appleton and Lange, Stamford, Conn.(1998, 2000).

[0148] Ovde je takođe otkriven metod za modulaciju ili lečenje najmanje jedne kardiovaskularne bolesti, u ćeliji, tkivu, organu, životinji, ili pacjentu, uključujući, ali bez ograničenja na, najmanje jedan srčani napad, infarkt miokarda, insuficijenciju srca, moždani udar, ishemijski moždani udar, krvarenje, akutni koronarni sindrom, arteriosklerozu, aterosklerozu, restenozu, dijabetičku aterosklerotičnu bolest, hipertenziju, arterijsku hipertenziju, renovaskularnu hipertenziju, sinkopu, šok, sifilis kardiovaskularnog sistema, srčanu insuficijenciju, plućno srce, primarnu plućnu hipertenziju, srčanu aritmiju, atrijske ektopične otkucaje, atrijalno podrhtavanje aterija, atrijalnu fibrilaciju (neprekidnu ili paroksizmalnu), post perfuzioni sindrom, odgovor na kardiopulmonalno zapaljenje, haotičnu ili multifokalnu arterijsku tahikardiju, regularno usku QRS tahikardiju, specifičnu aritmiju, ventrikularnu fibrilaciju, njegovu aritmiju snopa, AV blok, blok zajedničke grane, miokardijalne ishemijske bolesti, bolesti koronarnih arterija, anginu pektoris, infarkt miokarda, kardiomiopatiju, dilatativnu kongestivnu kardiomiopatiju, restriktivnu kardiomiopatiju, bolesti zalistaka srca, endokarditis, bolest perikarda, srčane tumore, aneurizme aorte i perifernih arterija, disekciju aorte, inflamaciju aorte, okluziju abdominalne aorte i njezinih grana, periferne vaskularne bolesti, okluzivne arterijske

4

poremećaje, perifernu aterosklerotsku bolest, tromboangitis obliterans-Birgerovu bolest, funkcionalne poremećaje perifernih arterija, Rejnov fenomen i bolest, akrocijanozu, eritromegaliju, bolesti vena, vensku trombozu, varikozne vene, arteriovenske fistule, limfedem, lipedem, nestabilnu anginu, reperfuzijsku povredu, post pump sindrom -postperfuzioni sindrom, ishemijsko-reperfuziono oštećenje, i slično. Takav metod može opciono sadržati primenu efikasne količine kompozicije ili farmaceutske kompozicije koja sadrži najmanje jedno anti-IL-6 antitelo u ćeliji, tkivu, organu, životinji ili pacjentu kojima je neophodna takva modulacija, lečenje ili terapija.

[0149] Ovde je takođe otkriven metod za modulaciju ili lečenje najmanje jedne IL-6 povezane infektivne bolesti, u ćeliji, tkivu, organu, životinji, ili pacjentu, uključujući, ali bez ograničenja na, najmanje jednu od: akutne ili hronične bakterijske infekcije, akutnog ili hroničnog parazitskog ili infektivnog procesa, uključujući bakterijske, virusne ili gljivične infekcije, HIV infekciju/HIV neuropatiju, meningitis, hepatitis (npr., A, B ili C, i slično), septički artritis, peritonitis, pneumoniju, epiglotitis, e.koli 0157:h7, hemolitički uremijskim sindrom/ trombocitičku trombocitopeničnu purpuru, malariju, denga hemoragijsku groznicu, lišmenijazu, gubu, toksični šok sindrom, streptokokni miozitis, gasnu gangrenu, mikobakterium tuberkulozis, mikobakterium avium intracelulare, pneumocistis carinii pneumonije, inflamatorne bolesti karlice, orhitisa/epididimitisa, legioneloze, lajmske bolesti, gripe, Epštajn-Barov virus, virus-povezan hemafagocitnim sindromom, virusni encefalitis/aseptički meningitis, i slično.

[0150] Ovde je takođe otkriven metod za modulaciju ili lečenje najmanje jedne IL-6 povezane maligne bolesti, u ćeliji, tkivu, organu, životinji, ili pacjentu, uključujući, ali bez ograničenja na, najmanje jednu od: leukemije, akutne leukemije, akutne limfoblastne leukemije (ALL), akutne limfocitne leukemije, B-ćelije, T-ćelije ili FAB ALL, akutne mijeloidne leukemije (AML), akutne mijeloigene leukemije, hronične mijelocitne leukemije (CML), hronične limfocitne leukemije (CLL), leukemije ćelija dlaka, mijelodisplastičnog sindroma (MDS), limfoma, Hodžkinove bolesti, malignog limfoma, ne-Hodžkinovog sindroma, Burkitovog limfoma, multiplog mijeloma, Kapošijevog sarkoma, kolorektalnog karcinoma, karcinoma pankreasa, nazofaringealnog karcinoma, maligne histiocitoze, paraneoplastičnog sindroma/hiperkalcemije maligniteta, čvrstih tumora, kancera mokraćne bešike, kancera dojke, kolorektalnog kancera, endometirijalnog kancera, kancera glave, kancera vrata, naslednog karcinoma nonpolipozisa, Hodžkinovog limfoma, kancera jetre, kancera pluća, kancera nemalih ćelija pluća, kancera jajnika, kancera pankreasa, kancera prostate, karcinoma bubrežnih ćelija, kancera testisa, adenokarcinoma, sarkoma, malignog melanoma, hemangioma, metastatskih bolesti, kancera povezanog sa resorpcijom kosti, kancera povezanog sa bolom u kostima, i slično.

[0151] Ovde je takođe otkriven metod za modulaciju ili lečenje najmanje jedne IL-6 povezane neurološke bolesti, u ćeliji, tkivu, organu, životinji, ili pacjentu, uključujući, ali bez ograničenja na, najmanje jednu od: neurodegenerativnih bolesti, multiple skleroze, migrenske glavobolje, kompleksa AIDS demencije, demijelinizirajuće bolesti, kao što je multipla skleroza i akutni transverzni mijelitis; ekstrapiramidalnih i cerebelarnih poremećaja, kao što su lezije kortikospinalnog sistema; poremećaja bazalnih ganglija; hiperkinetičkih poremećaja kretanja, kao što je Hantingtonova horea i senilna horea; lekovima indukovanih poremećaja kretanja, kao što su oni indukovani lekovima koji blokiraju u CNS-u receptore dopamina; hipokinetičkih poremećaja kretanja, kao što je Parkinsonova bolest; Progresivih supra-nukleo paraliza; strukturnih lezija malog mozga; spinocerebelarne degeneracije, kao što su spinalna ataksija, Fridrajhova ataksija, cerebelarne kortikalne degeneracije, multiple sistemske degeneracije (Mencel, Dejerine-Thomas, Shi-Drager i Machado-Joseph); sistemskih poremećaja (Refsumova bolest, abetalipoproteinemija, ataksija, teleangiektazija, i mitohondrijski poremećaj više sistema); poremećaja demijelinizacije jezgara, kao što je multipla skelroza, akutni transverzalni mijelitis; i poremećaja motoričke jedinice kao što su neurogene muskularne atrofije (degeneracija ćelija prednjih rogova, kao što je amiotrofična lateralna skleroza, infantilna spinalna muskularna atrofija i juvenilna spinalna muskularna atrofija); Alchajmerove bolesti; Daunovog sindroma u srednjim godinama; Difuzne bolesti Levijevih telešaca; Senilne demencije tipa Levijevih telešaca; Vernike-Korsakovljev sindrom; hroničnog alkoholizama; Krojcfeld-Jakobove bolesti; Subakutnog sklerozirajućeg panencefalitisa, Halervorden-Spatzove bolesti; Demencije pugilistike; neurotraumatiske ozlede (npr., povrede kičmene moždine, povrede mozga, potres mozga, ponavljajući potres); bola; inflamatornog bola; autizma; depresije; moždanog udara; kognitivnih poremećaja; epilepsije; i slično. Takav metod može opciono sadržavati primenu efikasne količine kompozicije ili farmaceutske kompozicije koja sadrži najmanje jedno TNF antitelo ili specifični deo ili varijantu u ćeliji, tkivu, organu, životinji ili pacjentu kom je neophodna takva modulacija, lečenje ili terapija. Videti, npr., the Merck Manual, 16th Edition, Merck & Company, Rahway, NJ (1992).

[0152] Ovde je takođe otkriven metod za modulaciju ili lečenje najmanje jedne IL-6 povezane rane, traume ili povrede tkiva ili povezanog hroničnog stanja, u ćeliji, tkivu, organu, životinji ili pacijentu, uključujući, ali bez ograničenja na, najmanje jednu od: telesne povrede ili traume povezane sa oralnom hirurgijom, uključujući periodontalnu hirurgiju, vađenje zuba ( više zuba), endodontsko lečenje, umetanje implantata zuba, aplikaciju i upotrebu zubnih proteza; ili pri čemu je rana izabrana iz grupe koja se sastoji od aseptičkih rana, kontuzionih rana, incizionih rana, poderotina, nepenetrirajućih rana, perforirajućih rana, ubodnih rana, septičkih rana, infarkta i subkutanih rana; ili pri čemu je rana izabrana iz grupe koja se sastoji od ishemijskih ulcera, rana usled pritiska, fistule, teških ugriza, termalnih opekotina i donatorskih rana na licu mesta; ili pri čemu je rana aftozna rana, traumatska rana ili rana povezana sa herpesom.

[0153] Rane i/ili ulceri se obično nalaze vireći iz kože ili na površini sluzokože, ili kao rezultat infarkta u organu ("udara"). Rana može biti rezultat defekta mekih tkiva ili lezije ili osnivnog stanja. U sadašnjem kontekstu, termin "koža" se odnosi na spoljnu površinu tela životinje, uključujući i čoveka, i obuhvata netaknutu ili gotovo netaknutu kožu kao i povređenu površinu kože. Termin "sluzokoža" se odnosi na neoštećenu ili oštećenu sluzokožu životinje, kao i čoveka, i može biti oralna, bukalna, auralna, nazalna, plućna, očna, gastrointestinalna, vaginalna ili rektalna sluzokoža.

[0154] U ovom kontekstu termin "rana" označava telesnu povredu nanesenu remećajem normalnog integriteta strukture tkiva. Termin takođe obuhvata pojmove "blagi bol", "lezija", "nekroza," i "ulcer". Normalno, termin "sores-kao zapaljenje-blagi bol" je popularan izraz za gotovo svaku leziju kože ili sluzokože i pojam "ulcer" je lokalni defekt, ili ekskavacija, površine organa ili tkiva, koji je proizveden od strane odlubljivanja od nekrotičnog tkiva. Lezija se generlno odnosi na sve defekte tkiva. Nekroza se odnosi na mrtvo tkivo kao rezultat infekcije, povrede, inflamacije ili infarkta.

[0155] Termin "rana" korišćen u ovom kontekstu označava bilo koju ranu (videti ispod za klasifikaciju rana) i na svakom određenom stepenu u procesu isceljenja-ozdravljenja, uključujući fazu pre nego što je isceljenje inicirano-pokrenuto ili čak i pre napravljene specifične rane poput hirurškog reza (profilaktičko lečenje). Primeri rana koje mogu biti sprečene i/ili tretirane su, npr., aseptičke rane, kontuzione rane, incizalne rane, razderotine, ne-penetrirajuće rane (tj., rane u kojoj ne postoji prekid kože, ali postoji povreda osnovnih struktura), otvorene rane, penetrirauće rane, perforirajuće rane, ubodne rane, septičke rane, potkožne rane, itd. Primeri rana su rane od kreveta, rane od kancera, rane od hroma, hladne rane, dekubitusi, itd. Primeri ulkusa su, npr., peptički ulkus, duodenalni ulkus, ulkus želuca, ulkus gihta, dijabetički ulkus, hipertenzivno ishemični ulkus, ulkus mirovanja, ulkus kruris (venski ulkus), sublingvalni ulkus, submukozni ulkus, simptomatski ulkus, trofički ulkus, tropski ulkus i genitalni ulkus, npr., uzrokovan gonorejom (uključujući uretritis, endocervicitis i proktitis). Uslovi koji se odnose na rane ili blagi bol koji se mogu uspešno liečiti su opekotine, antraks, tetanus, gasna gangrena, šarlah, crveni vetar, sikoza folikla dlaka brade, folikulitis, impetigo kontagioza ili impetigo buloza itd. Tu su često određena preklapanja između upotrebe termina "rana" i "ulcer" i "rana" i "bolan" i, osim toga, pojmova koji se često koriste nasumce. Stoga, kao što je navedeno iznad, u ovom kontekstu termin "rana" obuhvata pojmove "ulcer ", "lezija-oštećenje", "bolan" i "infarkt" i izrazi se koriste nasumice, ukoliko nije drugačije naznačeno.

[0156] Vrste rana koje treba da budu tretirane uključuju takođe (i) generalno rane, kao što su, npr., hirurške, traumatske, infektivne, ishemijske, toplotne, hemijske i bulozne rane; (ii) rane specifična za usnu duplju, kao što su, npr., post-ekstrakcione rane, endodontske rane posebno u vezi sa lečenjem cista i apscesa, čireva-ulkusa i bakterijskih lezija, virusnog ili autoimunološkog porekla, mehaničke, hemijske, toplotne, infektivne i lihenoidne rane; herpesni ulceri, stomatitis afthoza, akutni nekrotizirajući ulcerozni gingivitis i sindrom pečenja usta su specifični primeri; i (iii) rane na koži, kao što su, npr., neoplazme, opekotine (npr., hemijske, toplotne), lezije (bakterijske, virusne, auto imunološke), ugrizi i hirurški rezovi. Drugi način klasifikacije rana je kao (i) mali gubitak tkiva zbog hirurških rezova, manje ogrebotine i manji ugrizi, ili kao (ii) značajni gubitak tkiva. Potonja grupa uključuje ishemijske ulcere, dekubituse, fistule, razderotine, teške ugrize, toplotne opekline i rane donatorskog mesta (u mekim i tvrdim tkivima) i infarkte.

[0157] Druge rane koje su od važnosti su rane poput ishemijskih ulcera, dekubitusi, fistule, teški ugrizi, termičke opekotine i donatorske rane na licu mesta. Ishemijske ulceracije i dekubitusi su rane koje obično samo leče veoma polako i posebno u takvim slučajevima, poboljšanje i brži proces izlečenja je, naravno, od velike važnosti za pacjenta. Dalje, troškovi uključeni za lečenje pacijenata koji pate od takvih rana su značajno smanjeni kada je lečenje poboljšano i kada se odvija brže.

[0158] Donatorske rane na licu mesta su rane koje se, npr., javljaju u vezi sa uklanjanjem čvrstog tkiva iz jednog dela tela na drugi deo tela, npr., u vezi sa transplantacijom. Rane koje rezultiraju iz takvih operacija su veoma bolne i poboljšanje zarastanja-isceljivanja je stoga najvrednije. Termin "koža" se koristi u najširem smislu obuhvaćajući epidermalni sloj kože i - u onim slučajevima kada je površina kože manje ili više ozleđena–takođe dermalni sloj kože. Osim stratum korneuma, epidermalni sloj kože je spoljašnji (epitelijalni) sloj i dublji sloj vezivnog tkiva kože se zove dermis.

[0159] Ovde je takođe otkriven metod za modulaciju ili lečenje osteoartritisa, sistemskog lupusa eritematozusa, kožnog lupus eritematozusa, lupusnog nefritisa, tip II dijabetesa melitusa, i hronične opstruktivne bolesti pluća, među ostalim bolestima navedenim iznad kao IL-6 povezanih, u ćeliji, tkivu, organu, životinji ili pacjentu, uključujući, ali bez ograničenja na, najmanje jednu od imuno povezane bolesti, kardiovaskularne bolesti, infektivne, maligne i/ili neurološke bolesti. Takav metod može opciono sadržavati primenu efikasne količine najmanje jedne kompozicije ili farmaceutske kompozicije koja sadrži najmanje jedno anti-IL-6 antitelo u ćeliji, tkivu, organu, životinji ili pacjentu kojima je neophodna takva modulacija, lečenje ili terapija.

4

[0160] Bilo koji metod otkriven ovde može opciono sadržavati primenu efikasne količine kompozicije ili farmaceutske kompozicije koja sadrži najmanje jedno anti-IL-6 antitelo u ćeliji, tkivu, organu, životinji ili pacjentu kojemu je potrebna takava modulacija, lečenje ili terapija. Takav metod može opciono dalje sadržavati istovremenu primenu ili kombinaciju terapije za lečenje takvih bolesti ili poremećaja, pri čemu primena navedenog najmanje jednog anti-IL-6 antitela, specifičan deo ili varijanta od njih, dalje sadrži primenu, pre istovremenog i/ili posle, najmanje jednog izabranog od najmanje jednog TNF antagonista (npr., ali bez ograničenja na, TNF hemijski ili proteinski antagonist, TNF monoklonalno ili poliklonalno antitelo ili fragment, rastvorljivi TNF receptor (npr., p55, p70 ili p85) ili fragmenta, fuzionog polipeptida od njih, ili malog molekula TNF antagonista, npr., TNF vezujući protein I ili II (TBP-1 ili TBP-II), nerelimonmaba, infliksimaba, etanercepta (Enbrel™), adalimulaba (Humira™), CDP-571, CDP-870, afelimomaba, lenercepta, i slično), antireumatika (npr., metotreksata, auranofina, aurotioglukoze, azatioprina, zlatnog natrijum tiomalata, hidroksihlorohin sulfata, leflunomida, sulfasalzina), mišićnog relaksanta, narkotika, ne-steroidnih anti-inflamatornih lekova (NSAID), analgetika, anestetika, sedativa, lokalnog anestetika, neuromuskularnog blokatora, antimikrobnog sredstva (npr., aminoglikozida, antifungalnog sredstva, antiparazitika, antivirusnog sredstva, karbapenema, cefalosporina, flurorhinolona, makrolida, penicilina, sulfonamida, tetraciklina, drugog antimikrobnog sredstva), antipsorijatika, kortikosteroida, anaboličkog steroida, dijabetesom povezanog sredstva, minerala, nutritivnog, tiriodnog sredstva, vitamina, hormona povezanog sa kalcijumom, antidijaretika, antitusika, antiemetika, antiulcera, laksativa, antikoagulanta, eritropoetina (npr., epoetin alfa), filgrastima (npr., G-CSF, Neupogen), sargramostima (GM-CSF, Leukin), imunizacijskog sredstva, imunoglobulina, imunosupresiva (npr., baziliksimaba, ciklosporina, daklizumaba), hormona rasta, zamene hormona lekom, modulatora receptora estrogena, midrijatika, cikloplegika, alkilirajućeg sredstva, antimetabolita, mitotičkog inhibitora, radiofarmakološkog sredstva, antidepresiva, antimaničnog sredstva, antipsihotika, anksiolitika, hipnotika, simpatomimetika, stimulanta, donepezila, takrina, leka za astmu, beta agonista, inhalacijskog steroida, inhibitora leukotriena, metilksantina, kromolina, epinefrina ili analoga, dornaza alfe (Pulmozim), citokina ili antagonista citokina. Pogodne doze su dobro poznate u tehnici. Videti, npr., Wells et al., eds., Pharmacotherapy Handbook, 2nd Edition, Appleton and Lange, Stamford, CT (2000); PDR Pharmacopoeia, Tarascon Pocket Pharmacopoeia 2000, Deluxe Edition, Tarascon Publishing, Loma Linda, CA (2000); Nursing 2001 Handbook of Drugs, 21st edition, Springhouse Corp., Springhouse, PA, 2001; Health Professional’s Drug Guide 2001, ed., Shannon, Wilson, Stang, Prentice-Hall, Inc, Upper Saddle River, NJ.

[0161] TNF antagonisti pogodni za kompozicije, kombinovanu terapiju, istovremenu primenu, i/ili uređaje ovog pronalaska (dalje sadržavajući najmanje jedno antitelo, njegov specifičan deo ili varijantu od njih, ovog pronalaska), uključuju, ali nisu ograničeni na, anti-TNF antitela (npr. najmanje jedan TNF antagonist kao što je iznad definisano), antigen-vezujuće fragmente od njih, i receptore molekula koji se sespecifično vežu na TNF; jedinjenja koja sprečavaju i/ili inhibiraju TNF sintezu, TNF otpuštanje ili njegovo delovanje na ciljne ćelije, kao što su talidomid, tenidap, inhibitori fosfodiesteraze (npr. pentoksifilin i rolipram), A2b agonisti adenozinskih receptora i A2b stimulatori adenozinskih receptora; jedinjenja koja sprečavaju i/ili inhibiraju TNF receptorsku signalizaciju, kao što su mitogenom aktivirani protein (MAP) kinaza inhibitori; jedinjenja koja blokiraju i/ili inhibiraju membransko TNF cepanje, kao što su inhibitori metaloproteinaze; jedinjenja koja blokiraju i/ili inhibiraju TNF aktivnost, kao što su inhibitori angiotenzin konvertujućeg enzima (ACE) (npr, kaptopril); i jedinjenja koja blokiraju i/ili inhibiraju TNF proizvodnju i/ ili sintezu, kao što su inhibitori MAP kinaze.

[0162] Kao što se ovde koristi, "antitelo za faktor nekroze tumora", "TNF antitelo", "TNFα antitelo", ili fragment i slično smanjuje, blokira, inhibira, poništava ili ometa sa aktivnošću TNFα in vitro, in situ i/ili poželjno in vivo. Na primer, pogodno TNF humano antitelo može vezati TNFα i uključuje anti-TNF antitela, antigen-vezujuće fragmente od njih, i specificirane mutante ili njihove domene koje se vežu specifično na TNFα. Pogodno TNF antitelo ili fragment takođe može smanjiti, blokirati, poništiti, omesti, sprečiti i/ili inhibirati TNF, RNA, DNK ili sintezu proteina, TNF otpuštanje, TNF signalizaciju receptora, membransko TNF cepanje, TNF aktivnost, TNF produkciju i/ili sintezu.

[0163] Primer TNF antitela ili antagonista je himerno antitelo cA2. Dodatni primeri monoklonalnih anti-TNF antitela koja mogu biti korišćena su opisani u tehnici (videti, npr., U.S. Patent No.5,231,024; Möller, A. et al., Cytokine 2(3):162-169 (1990); U.S. Application No.07/943,852 (filed September 11, 1992); Rathjen et al., International Publication No. WO 91/02078 (published February 21, 1991); Rubin et al., EPO Patent Publication No.0218868 (published April 22, 1987); Yone et al., EPO Patent Publication No.0288 088 (October 26, 1988); Liang, et al., Biochem. Biophys. Res. Comm.137:847-854 (1986); Meager, et al., Hybridoma 6:305-311 (1987); Fendly et al., Hybridoma 6:359-369 (1987); Bringman, et al., Hybridoma 6:489-507 (1987); and Hirai, et al., J. Immunol. Meth.96:57-62 (1987).

TNF Receptorski Molekuli

[0164] Poželjni korisni molekuli TNF receptora su oni koje vežu TNFα sa visokim afinitetom (videti, npr., Feldmann et al., International Publication No. WO 92/07076 (objavljen April 30, 1992); Schall et al., Cell 61:361-370 (1990); i Loetscher et al., Cell 61:351-359 (1990)) i opciono imaju nisku imunogenost. Naročito, 55 kDa (p55 TNF-R) i 75 kDa (p75 TNF-R) TNF receptori površinskih ćelija su korisni. Razgranati oblici ovih receptora, koji sadrže ekstracelularne domene (ECD) receptora ili funkcionalnih delova od njih (videti, npr., Corcoran et al., Eur. J. Biochem. 223:831-840 (1994)), su takođe korisni. Razgranati oblici TNF receptora, koji sadrže ECD, otkriveni su u urinu i serumu kao 30 kDa i 40 kDα TNFa inhibitori vezujućih proteina (Engelmann, H. et al., J. Biol. Chem. 265:1531-1536 (1990)). TNF receptor multimernih molekula i TNF imunoreceptor fuzionih molekula, i derivati i fragmenti ili delovi od njih, predstavljaju dodatne primere TNF receptora molekula koji su korisni u metodama i kompozicijama koje su ovde otkrivene.

[0165] Multimerni molekuli TNF receptora sadrže sve ili funkcionalni deo od ECD od dva ili više TNF receptora povezanih putem jednog ili više polipeptidnih veza ili drugih ne-peptidnih veza, kao što je polietilen glikol (PEG). Primer takvog TNF imunoreceptorskog fuzionog molekula je TNF receptor/IgG fuzioni protein. TNF imunoreceptorska fuzija molekula i metode za njihovu proizvodnju su opisani u tehnici (Lesslauer et al., Eur. J. Immunol.21:2883-2886 (1991); Ashkenazi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:10535-10539 (1991); Peppel et al., J. Exp. Med.174:1483-1489 (1991); Kolls et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:215-219 (1994); Butler et al., Cytokine 6(6):616-623 (1994); Baker et al., Eur. J. Immunol. 24:2040-2048 (1994); Beutler et al., U.S. Patent No. 5,447,851; and U.S. Application No.

08/442,133 (filed May 16, 1995)). Metode za proizvodnju imunoreceptorskih fuzijskih molekula se isto tako se mogu pronaći un Capon et al., U.S. Patent No. 5,116,964; Capon et al., U.S. Patent No.

5,225,538; i Capon et al., Nature 337:525-531 (1989).

4

[0166] Citokini uključuju bilo koji poznati citokin. Videti, npr., CopewithCytokines.com. Antagonisti citokina uključuju, ali nisu ograničeni na, bilo koje antitelo, fragment ili mimetik, bilo koji rastvorljivi receptor, fragment ili mimetik, bilo koji atagonist malog molekula, ili bilo koju kombinaciju od njih.

Terapijski tretmani

[0167] Bilo koja metoda otkrivena ovde može obuhvatiti postupak za lečenje poremećaja koji je posredovan sa IL-6, koji obuhvata primenu efikasne količine kompozicije ili farmaceutske kompozicije koja sadrži najmanje jedno anti-IL-6 antitelo u ćeliji, tkivu, organu, životinji ili pacjentu kome je neophodna takva modulacija, lečenje ili terapija. Takav metod može opciono dalje sadržavati istovremenu primenu ili kombinovanu terapiju za lečenje takvih bolesti ili poremećaja, pri čemu davanje navedenog najmanje jednog anti-IL-6 antitela, specificiranog dela ili varijante od njih, dalje sadrži primenu pre, za vreme i/ili posle, najmanje jednog izabranog od anti-infektivnog leka, leka kardiovaskularnog (CV) sistema, leka centralnog nervnog sistema (CNS), leka autonomnog nervnog sistema (ANS), leka respiratornog trakta, leka gastrointestinalnog (GI) trakta, hormonalnog leka, leka za balans tečnosti ili elektrolita, hematološkog leka, antineoplastičnog, imunomodulacionog leka, oftalmičkog, otičkog, ili nazalnog leka, topkalnog leka, nutritivnog leka ili slično, najmanje jednog TNF antagonista (npr., ali ne ograničavajući se na TNF antitelo ili fragment, rastvorljivi TNF receptor ili fragment fuzionih proteina od njih, ili mali molekul-male molekulske mase TNF antagonista), antireumatika (npr. metotreksat, auranofin, aurotioglukoza, azatioprin, etanercept, zlatni natrijum tiomalat, hidroksihlorohin sulfat, leflunomid, sulfasalazin), mišićnog relaksanta, narkotika, nesteroidnog anti-inflamatornog leka (NSAID), analgetika, anestetika, sedativa, lokalnog anestetika, neuromuskularnog blokatora, antimikrobnog sredstva (npr., aminoglikozida, antifungalnog sredstva, antiparazitika, antivirusnog, karbapenema, cefalosporina, flurorhinolona, makrolida, penicilina, sulfonamida, tetraciklina, drugog antimikrobnog sredstva), antipsorijatika, kortikosteroida, anaboličkog steroida, dijabetesom povezanog sredstva, minerala, nutritivnog sredstva, tireoidnog, vitamina, hormona povezanog sa kalcijumom, antidiaretika, antitusika, antiemetika, antiulcera, laksativa, antikoagulanta, eritropoetina (npr., epoetin alfe), filgrastima (npr., G-CSF, Neupogena), sargramostima (GM-CSF, Leukina), imunizacijskog sredstva, imunoglobulina, imunosupresiva (npr., baziliksimaba, ciklosporina, daklizumaba), hormona rasta, leka kao zamene hormona, modulatora receptora estrogena, midrijatika, cikloplegika, alkilirajućeg sredstva, antimetabolita, inhibitora mitoze, radiofarmakološkog sredstva, antidepresiva, antimaničnog sredstva, antipsihotika, anksiolitika, hipnotika, simpatomimetika, stimulanta, donepezila, takrina, leka za astmu, beta agonista, inhaliranog steroida, inhibitora leukotriena, metilksantina, kromolina, epinefrina ili analoga, dornaza alfe (Pulmozim), citokina ili antagonista citokina. Takvi lekovi su dobro poznati u tehnici, uključujući formulacije, indikacije, doziranja i primene za svaki predstavljen ovde (Videti., npr., Nursing 2001 Handbook of Drugs, 21st edition, Springhouse Corp., Springhouse, PA, 2001; Health Professional’s Drug Guide 2001, ed., Shannon, Wilson, Stang, Prentice- Hall, Inc, Upper Saddle River, NJ; Pharmcotherapy Handbook, Wells et al., ed., Appleton & Lange, Stamford, CT).

[0168] Tipično, lečenje patoloških stanja se vrši primenom efikasne količine ili doze od najmanje jedne kompozicije anti-IL-6 antitela koja dolazi u ukupnom, u proseku, rasponu od oko najmanje 0.01 do 500 miligrama na najmanje jedno anti-IL-6 antitelo po kilogramu telesne težine pacjenta po dozi, i, poželjno, od najmanje oko 0.1 do 100 miligrama antitela/kilogramu pacjenta u pojedinačnoj ili višestrukim primenama, u zavisnosti od specifične aktivnosti aktivnog sredstva sadržanog u kompoziciji. Alternativno, efikasna koncentracija u serumu može sadržavati 0.1-5000 μg/ml

4

koncentracije seruma za pojedinačnu ili višestruku primenu. Pogodne doze su poznate lekarma, i biće, naravno, zavisne od stanja pojedine bolesti, specifične aktivnosti kompozicije koja je primenjena, i određenog pacjenta koji je podvrgnut lečenju. U nekim slučajevima, da se postignu željene terapijske količine, može biti neophodno da se obezbede ponovljene primene, tj., da se pojedinačne primene posebno prate ili izmerenom dozom, gde su pojedinačne primene ponovljene dok se ne postigne željena dnevna doza ili efekat.

[0169] Poželjne doze mogu opciono uključivati oko 0.1-99 i/ili 100-500 mg/kg/primene, ili bilo koji raspon, vrednost ili frakciju od njih, ili da bi se postigla koncentracija u serumu od oko 0.1-5.000 μg/ml koncentracije seruma u jednokratnoj ili višestrukoj primeni, ili bilo koji raspon, vrednost ili njena frakcija. Poželjan raspon doza za anti-IL-6 antitelo ovog pronalaska je od oko 1 mg/kg do oko 3, oko 6 ili oko 12 mg/kg telesne težine pacijenta.

[0170] Alternativno, primenjena doza može varirati u zavisnosti od poznatih faktora, kao što su farmakodinamičke karakteristike određenog sredestva, i njegov način i put primene; starosti, zdravstvenog stanja i težine primaoca; prirode i obima simptoma, vrste istovremenog lečenja, učestalosti lečenja, i željenog efekta. Uobičajena doza aktivnog sastojka može biti od oko 0.1 do 100 miligrama po kilogramu telesne težine. Obično 0.1 do 50, i, poželjno 0.1 do 10 miligrama po kilogramu telesne težine po primeni ili u formi produženog oslobađanja je efikasno da se dobiju željeni rezultati.

[0171] Kao ne-ograničavajući primer, lečenje ljudi ili životinja može biti obezbeđeno kao jednokratna doza ili periodična doza najmanje jednog antitela ovog pronalaska oko 0.1 do 100 mg/kg, ili bilo koji raspon, vrednost ili frakcija od njih po danu, na najmanje jednom dnevno 1-40, ili, alternativno ili dodatno, najmanje jednom nedeljno 1-52, ili, alternativno ili dodatno, najmanje jednom u 1-20 godina, ili bilo koja kombinacija od njih, upotrbom jednokratne, infuzije ili ponavljenih doza.

[0172] Oblici doziranja (kompozicije) pogodni za internu primenu generalno sadrže od oko 0.001 miligrama do oko 500 miligrama aktivnog sastojka po jedinici ili spremniku. U ovim farmaceutskim kompozicijama aktivni sastojak će obično biti prisutan u količini od oko 0.5 do 99.999% po težini u odnosu na ukupnu masu-težinu kompozicije.

[0173] Za parenteralnu primenu, antitelo može biti formulisano kao rastvor, suspenzija, emulzija, čestica, prah ili liofilizovani prah zajedno, ili odvojeno obezbeđen, sa farmaceutski prihvatljivim parenteralnim nosačem. Primeri takvih nosača su voda, fiziološki rastvor, Ringerov rastvor, rastvor dekstroze, i oko 1-10% humani serumski albumin. Lipozomi i nevodeni nosači kao što su fiksaciona ulja takođe mogu biti korišćeni. Nosač ili liofilizovani prah može da sadrži aditive koji održavaju izotoničnost (npr., natrijum hlorid, manitol) i hemijsku stabilnost (npr., puferi i konzervansi). Formulacija je sterilisana poznatim ili pogodnim tehnikama.

[0174] Pogodni farmaceutski nosači su opisani u najnovijem izdanju Remington's Pharmaceutical Sciences, A. Osol, koji predstavlja referentni tekst u ovoj oblasti.

Alternativna Primena

[0175] Mnogi poznati i razvojni načini mogu biti korišćeni za primenu farmaceutski efikasnih količina od najmanje jednog anti-IL-6 antitela prema ovom pronalasku. Dok se pulmonalna primena koristi u sledećem opisu, drugi načini primene mogu biti korišćeni sa pogodnim rezultatima. IL-6 antitela ovog

4

pronalaska mogu biti isporučena na nosaču, kao rastvor, emulzija, koloid, ili suspenzija, ili kao suvi prah, primenom bilo kojeg od različitih sredstava i metoda pogodnih za primenu putem inhalacije ili drugim načinima opisanim ovde ili poznatim u tehnici.

Parenteralne Formulacije i Primena

[0176] Formulacije za parenteralnu primenu mogu sadržavati kao zajedničke ekscipijente sterilnu vodu ili fiziološki rastvor, polialkilen glikole, kao što je polietilen glikol, ulja biljnog porekla, hidrogenizovane naftalene i slično. Vodene ili uljane suspenzije za injekcije se mogu pripremiti primenom odgovarajućeg emulzifikatora ili sredstva za vlaženje i suspendujućeg sredstva, prema poznatim metodama. Sredstva za injekcije možgu biti ne-toksična, ne-oralno primenjiva sredstva za razblaživanje, kao što je vodeni rastvor ili sterilni injektibilni rastvor ili suspenzija u rastvaraču. Kao primenjivi nosač ili rastvarač, dozvoljeni su voda, Ringerov rastvor, izotonični fiziološki rastvor, itd.; kao običan rastvarač ili suspendujući rastvarač, sterilno ulje koje nije eterično može biti korišćeno. Za ove svrhe, bilo koja vrsta ulja koje nije eterično i masna kiselina mogu biti korišćeni, uključujući prirodna ili sintetska ili polusintetska masna ulja ili masne kiseline; prirodne ili sintetske ili polusintetske mono- ili di- ili- tri-gliceride. Parenteralna primena je poznata u tehnici i uključuje, ali nije ograničena na, uobičajene-konvencionalne načine ubrizgavanja pod pritiskom gasa beziglične injekcijske naprave kao što je opisano u U.S. Pat. No.5.851.198i laserskog perforirajućeg uređaja kao što je opisano u U.S. Pat. No.5.839.446.

Alternativna Isporuka

[0177] Ovde je takođe otkrivena primena najmanje jednog anti-IL-6 antitela parenteralnim, supkutanim, intramuskularnim, intravenoznim, intraartikularnim, intrabronhijalnim, intraabdominalnim, intrakapsularnim, intrahrskavičavim, intrakavitalnim, intracerebelarnim, intracerebroventikularnim, intrakoličnim, intracervikalnim, intragastičnim, intrahepatičnim, intramiokardialnim, intraostealnim, intrapelvičnim, intraperikardialnim, intraperitonealnim, intrapleuralnim, intraprostatičnim, intrapulmonalnim, intrarektalnim, intrarenalnim, intraretinalnim, intraspinalnim, intrasinovijalnim, intratorakalnim, intrauterinim, intravezikalnim, intralezionalnim, u bolusu, vaginalnim, rektalnim, bukalnim, sublingvalnim, intranazalnim, ili transdermalnim načinima. Najmanje jedna kompozicija anti-IL-6 antitela može biti pripremljena za upotrebu za parenteralnu (subkutanu, intramuskularnu ili intravenoznu) ili bilo koju drugu primenu naročito u obliku tečnih rastvora ili suspenzija; za vaginalnu ili rektalnu primenu naročito u polučvrstim oblicima kao što su, ali bez ograničenja na, kreme i supozitorije; za bukalnu, ili sublingvalnu primenu, kao što je, ali bez ograničenja na, u obliku tableta ili kapsula; ili intranazalnu kao što je, ali bez ograničenja na, u obliku praha, kapi za nos ili aerosola ili određenog sredstva; ili transdermalnu, kao što je bez ograničenja na gel, mast, losion, suspenziju ili flaster za isporuku sitema sa hemijskim pojačivačem kao što je dimetil sulfoksid koji ili modifikuje strukturu kože il povećava koncentraciju leka u transdermalnom flasteru (Junginger, et al. In "Drug Permeation Enhancement;" Hsieh, D. S., Eds., pp. 59-90 (Marcel Dekker, Inc. New York 1994), ili sa oksidacionim sredstvima koja omogućavaju aplikaciju formulacija koje sadrže proteine i peptide na kožu (WO 98/53847), ili aplikacije električnih polja da bi se stvorili prolazni transportni putevi kao što je elektroporacija, ili da bi se povećala pokretljivost naelekrisanih lekova kroz kožu kao što je jontoforeza, ili aplikacija ultrazvukom kao što je sonoforeza (U.S. Pat. Nos.4,309,989 and 4,767,402).

4

Pulmonalna/Nazalna Isporuka

[0178] Za plumonalnu primenu, poželjno, najmanje jedna kompozicija anti-IL-6 antitela je preneta u česticama efikasne veličine za dostizanje u niže disajne puteve pluća ili sinuse. Prema pronalasku, najmanje jedno anti-IL-6 antitelo se može se preneti bilo kojim od različitih inhalacionih ili nazalnih uređaja poznatih u tehnici za primenu terapijskog sredstva putem inhalacije. Ovi uređaji sposobni deponovanju aerosolizovanih formulcija u sinusnu šupljinu ili alveole pacjenta uključuju inhalatore sa izmerenom dozom, nebulizatore, generatore suvog praha, raspršivače, i slično. Drugi uređaji pogodni za usmeravanje plućne ili nazalne primene antitela su takođe poznate u tehnici. Svi takvi uređaji mogu koristiti formulacije pogodne za primenu raspršivanja antitela u obliku aerosola. Takvi aerosoli mogu sadržavati ili rastvore (i vodene i ne-vodene) ili čvrste čestice.

[0179] Inhalatori sa izmerenom dozom kao Ventolin® inhalator sa izmerenom dozom, obično koriste potisni gas i zahtevaju aktivranje tokom inspiracije ( Videti, npr., WO 94/16970, WO 98/35888). Inhalatori za suvi prah kao što je Turbuhaler™ (Astra), Rotahaler® (Glaxo), Diskus® (Glaxo), Spiros™ inhalator (Dura), uređaji plasirani na tržište od strane tzv. "Inhale Therapeutics", i Spinhaler® powder inhaler (Fisons), koriste aktivaciju-udahom mešanog praha (US 4668218 Astra, EP 237507 Astra, WO 97/25086 Glaxo, WO 94/08552 Dura, US 5458135 Inhale, WO 94/06498 Fisons). Nebulizatori kao AERx™ Aradigm, Ultravent® nebulizatir (Mallinckrodt), i Acorn II® nebulizator (Marquest Medical Products) (US 5404871 Aradigm, WO 97/22376), proizvode aerosole iz rastvora, dok inhalatori sa izmerenom dozom, inhalatori za suvi prah, itd. generišu male aerosole čestica.

[0180] Poželjno, kompozicija sadrži najmanje jedno anti-IL-6 antitelo preneto pomoću inhalatora za suvi prah ili prskalice. Postoji nekoliko poželjnih karakteristika inhalacionog uređaja za primenu najmanje jednog antitela ovog pronalaska. Na primer, isporuka putem inhalacionog uređaja ima prednost u pouzdanosti prenosa, reproduktibilnosti, i preciznosti. Inhalacioni uređaj može opciono isporučiti male suve čestice, npr., manje od oko 10 µm, poželjno oko 1-5 µm, uz dobru respiraciju.

Primena Kompozicija IL-6 Antitela u obliku Spreja

[0181] Sprej koji sadrži kompoziciju IL-6 antitela može biti proizveden potiskom suspenzije ili rastvora od najmanje jednog anti-IL-6 antitela kroz mlaznicu pod pritiskom. Veličina mlaznice i konfiguracija, primenjeni pritisak, i brzina punjenja tečnosti mogu biti izabrani tako da se postigne željeni izlazni mlaz i veličina čestice. Elektrosprej može biti proizveden, na primer, od strane električnog polja u vezi sa kapilarnim punjenjem ili potiskom kroz mlaznicu. Povoljno, čestice najmanje jedne kompozicije anti -IL-6 antitela isporučene raspršivačem imaju veličinu čestica manju od oko 10 μm, poželjno, u rasponu od oko 1 μm do oko 5 μm, i, najpoželjnije oko 2 μm do oko 3 μm.

[0182] Formulacije najmanje jedne kompozicije anti-IL-6 antitela pogodne za upotrebu sa raspršivačem tipično uključuju kompoziciju antitela u vodenom rastvoru u koncentraciji od oko 0.1 mg do oko 100 mg od najmanje jedne kompozicije anti-IL-6 antitela po ml rastvora ili mg/gm, ili bilo koji raspon, vrednost ili frakciju u njemu. Formulacija može uključivati sredstva, kao što je ekscipijent, pufer, izotonično sredstvo, konzervans, surfaktant, i poželjno cink. Formulacija može takođe uključivati ekscipijent ili sredstvo za stabilizaciju kompozicije antitela, kao što je pufer, redukujuće sredstvo, tzv. "bulk" protein, ili ugljeni hidrat. "Bulk" proteini korisni u formulisanju kompozicija antitela uključuju albumin, protamin, ili slično. Tipični ugljeni hidrati korisni u formulisanju kompozicija antitela uključuju saharozu, manitol, laktozu, trehalozu, glukozu, ili slično. Formulacija

4

kompozicije antitela može takođe uključiti surfaktant, koji može smanjiti ili sprečiti površinski indukovanu agregaciju kompozicije antitela uzrokovanu atomizacijom rastvora u formiranju aerosola. Različiti konvencionalni surfaktanti mogu biti korišćeni, kao što su polioksietilen estri masne kiseline i alkoholi, i polioksietilen sorbitol estri masnih kiselina. Količine će generalno varirati između 0.001 i 14% po težini formulacije. Naročito poželjni surfaktanti za svrhe ovog pronalaska su polioksietilen sorbitan mono-oleat, polisorbat 80, polisorbat 20, ili slično. Dodatna sredstva poznata u tehnici za formulaciju proteina, kao što su IL-6 antitela, ili specificirani delovi ili varijante, mogu takođe biti uključena u formulaciju.

Primena kompozicija IL-6 antitela putem Nebulizatora

[0183] Kompozicije antitela ovog pronalaska se mogu primeniti putem nebulizatora, kao što je džetmlazni nebulizator ili ultrazvučni nebulizator. Tipično, u mlaznom nebulizatoru, izvor komprimovanog vazduha se koristi da bi se stvorila struja vazduha velike brzine kroz otvor. Dok se gas širi iza mlaznice, stvara se regija pod niskim pritiskom, koja odvodi-skreće kompoziciju rastvora antitela kroz kapilarnu cevčicu povezanu sa rezervoarom ispunjenim tečnošću. Tečna struja iz kapilarne cevi oblikovana je u nestabilne filamente i kapljice tokom izlaska iz cevi, stvarajući aerosol. Raspon konfiguracija, protok, i vrste usmeravanja se mogu upotrebiti da bi se ostvarile željene karakteristike izvođenja iz mlaznog nebulizatora. U ultrazvučnom nebulizatoru, električna energija visoke frekvencije se koristi da bi se stvorila vibraciona, mehanička energija, uobičajeno koristeći indukcioni prenosnik. Ova energija se prenosi na kompoziciju formulacije antitela ili direktno kroz tečnost za spajanje, stvarajući aerosol koji sadrži kompoziciju antitela. Prednost je da čestice kompozicije antitela prensesne nebulizatorom imaju veličinu čestica manju od oko 10 μm, poželjno u rasponu od oko 1 μm do oko 5 μm, i najpoželjnije oko 2 μm do oko 3 μm.

[0184] Formulacije najmanje jednog anti-IL-6 antitela pogodne za upotrebu sa nebulizatorom, bilo mlaznim ili ultrazvučnim, obično uključuju koncentraciju od oko 0.1 mg do oko 100 mg najmanje jednog anti-IL-6 proteinskog antitela po ml rastvora. Formulacija može uključiti sredstva kao što je ekscipijent, pufer, izotonično sredstvo, konzervans, surfaktant, i, poželjno cink. Formulacija može takođe uključivati ekscipijent ili sredstvo za stabilizaciju kompozicije najmanje jednog anti-IL-6 antitela , kao što je pufer, redukujuće sredstvo, "bulk" protein, ili ugljeni hidrat. "Bulk" proteini korisni u formulisanju kompozicija najmanje jednog anti-IL-6 antitela uključuju albumin, protamin, ili slično. Tipični ugljeni hidrati korisni u formulisanju najmanje jednog anti-IL-6 antitela uključuju saharozu, manitol, laktozu, trehalozu, glukozu, ili slično. Formulacija najmanje jednog anti-IL-6 antitela može takođe uključiti surfaktant, koji može smanjiti ili sprečiti površinski indukovanu agregaciju najmanje jednog anti-IL-6 antitela uzrokovanu atomizacijom rastvora u formiranju aerosola. Različiti konvencionalni surfaktanti mogu biti korišćeni, kao što su polioksietilen estri masne kiseline i alkoholi, i polioksietilen sorbitol estri masnih kiselina. Količine će generalno varirati između 0.001 i 4% po težini formulacije. Naročito poželjni surfaktanti za svrhe ovog pronalaska su polioksietilen sorbitan mono-oleat, polisorbat 80, polisorbat 20, ili slično. Dodatna sredstva poznata u tehnici za formulaciju proteina, kao što je proteinsko antitelo, mogu takođe biti uključena u formulaciju.

Primena kompozicija IL-6 antitela putem Samodozirajućeg Inhalatora

[0185] U samodozirajućem inhalatoru (MDI), potisni gas, najmanje jedno anti-IL-6 antitelo, i bilo koji ekscipijenti ili drugi aditivi su sadržani u kanisteru kao smeša uključujući i tečni komprimovani gas.

Aktiviranje ventila za doziranje otpušta smešu u obliku aerosola, poželjno sadržavajući čestice u rasponu veličine manje od oko 10 μm, poželjno, oko 1 μm do oko 5 μm, i, najpoželjnije oko 2 μm do oko 3 μm. Željena veličina čestice aerosola se može ostvariti korišćenjem formulacije kompozicije antitela proizvedene različitim metodama poznatim stručnjacima sa ovog područja tehnike, uključujući mlevenje u mlazu, sušenje raspršivanjem, kondenzaciju kritične tačke, i slično. Poželjni samodozirajući inhalatori uključuju one proizvedene u "3M" ili "Glaxo" i primenjujući hidrofluorougljenikov potisni gas. Formulacije najmanje jednog anti-IL-6 antitela za upotrebu u samodozirajućem inhalatoru će generalno uključivati fino usitnjen prah koji sadrži najmanje jedno anti-IL-6 antitelo u obliku suspenzije u nevodenom medijumu, na primer u suspendirajućem potisnom gasu uz pomoć surfaktanta. Potisni gas može biti bilo koji konvencionalni materijal korišćen za ovu svrhu, kao što je hlorofluorougljenik, hidrohlorofluorougljenik, hidrofluorougljenik, ili ugljovodonik, uključujući trihlorofluorometan, dihlorodifluorometan, dihlorotetrafluoroetanol i 1,1,1,2-tetrafluoroetan, HFA-134a (hidrofluoroalkan-134a), HFA-227 (hidrofluoroalkan-227), i slično. Poželjno potisni gas je hidrofluorougljenik. Surfaktant može biti izabran da se stabilizuje najmanje jedno anti-IL-6 antitelo u obliku suspenzije u potisnom gasu, da se zaštiti aktivno sredstvo od hemijske razgradnje, i slično. Pogodni surfaktanti uključuju sorbitan trioleat, soja lecitin, oleinsku kiselinu, ili slično. U nekim slučajevima, rastvor aerosola su poželjno upotrbljeni rastvarači, kao što je etanol. Dodatna sredstva poznata u tehnici za formulaciju proteina mogu takođe biti uključena u formulaciju. Prosečan stručnjak u ovom području tehnike će prepoznati da metode otkrivene ovde mogu biti ostvarene plućnom primenom kompozicije najmanje jednog anti-IL-6 antitela putem uređaja koji nisu ovde opisani.

Oralne Formulacije i Primena

[0186] Formulacije za oralnu primenu se oslanjaju na istovremenu primenu adjuvanata (npr., rezorcinola i nejonskih surfaktanata, kao što je polioksietilen oleil etar i n-heksadecilpolietilen etar) da bi se veštački povećala permeabilnost intestinalnih zidova, kao i istovremenu primenu enzimskih inhibitora (npr., inhibitora pankreasnog tripsina, diizopropilfluorofosfata (DFF) i trazilola) da bi se inhibirala enzimska degradacija. Formulacije za prenos hidrofilnih sredstava uključujući proteine i antitela i kombinaciju od najmanje dva surfaktanta namenjena za oralnu, bukalnu, mukoznu, nazalnu, pulmonalnu, vaginalnu ili transmembransku, ili rektalnu primenu su proučene u U.S. 6.309.663. Aktivni konstitucijski sastojak jedinjenja čvrstog oblika doziranja za oralnu primenu može biti mešan sa najmanje jednim aditivom, uključujući saharozu, laktozu, celulozu, manitol, trehalozu, rafinozu, maltitol, dekstran, skrobove, agar, arginate, hitine, hitozane, pektine, gumu tragakant, gumu arabiku, želatin, kolagen, kazein, albumin, sintetske ili polusintetske polimere, i gliceride. Ovi oblici doziranja mogu takođe sadržavati drugu vrstu (vrste) aditiva, npr., inaktivno sredstvo za razblaživanje, lubrikant kao što je magnezijum stearat, paraben, konzervans, kao što je sorbinska kiselina, askorbinska kiselina, alfa-tokoferol, antioksidant kao što je cistein, dezintegrator, vezivo, sredstvo za zgušnjavanje, pufer, zaslađivač, sredstvo za poboljšanje ukusa, mirisa, itd.

[0187] Tablete i pilule mogu dalje biti obrađene u obliku enterički-obloženih preparata. Tečni preparati za oralnu primenu obuhvataju emulziju, sirup, eliksir, suspenziju i preparate rastvora dozvoljene za medicinsku primenu. Ovi preparati mogu sadržavati inaktivna sredstva za razblaživanje koji se uobičajeno koriste u navedenom polju, npr, vodi. Lipozomi su isto tako bili opisani kao sistemi za isporuku leka, za insulin i heparin (U.S. Pat. No. 4,239,754). Nedavno, mikrosfere veštačkih polimera od mešovitih amino kiselina (proteinoidi) su korišćene za isporuku farmaceutika (U.S. Pat.

1

No.4.925.673). Dalje, nosači jedinjenja opisani u U.S. Pat. No.5.879.681 i U.S. Pat. No.5.5.871.753 i korišćeni za isporuku biološki aktivnih sredstava oralnim putem su poznati u tehnici.

Mukozne Formulacije i Primena

[0188] Formulacija za oralno davanje bioaktivnog sredstva inkapsuliranog u jednom ili više biokompatibilnih polimera ili kopolimera ekscipijenata, poželjno, biorazgradivog polimera ili kopolimera, dajući mikrokapsule koje zbog odgovarajuće veličine dobijenih rezultata mikrokapsula u sredstvu postižu i bivaju izdvojene po agregatu folikula limfoidnog tkiva, inače poznatog kao "Pejerova ploča" ili "GALT" životinje bez gubitka efikasnosti zbog sredstva što prolazi kroz gastrointestinalnii trakt. Slični agregati limfnih folikula se mogu naći u bronhialnim cevčicama(BALT) i debelom crevu. Iznad opisana tkiva se odnose na generalno kao mukozno povezana limforetikularna tkiva (MALT). Za apsorpciju preko mukoznih površina, kompozicije i metode najmanje jednog anti-IL-6 antitela uključuju emulziju koja sadrži veći broj submikronskih čestica, mukoadhezivne makromolekule, bioaktivne peptide, i vodenu kontinuiranu fazu, koje pospešuju apsorpciju na mukoznim površinama ostvarujući mukoadheziju emulzijskih čestica (U.S. Pat. No. 5.514.670). Pogodne mukozne površine za aplikaciju emulzija ovog pronalaska mogu uključiti kornealni, konjunktivalni, bukalni, sublingvalni, nazalni, vaginalni, plućni, želudačni, intestinalni, i rektalni put primene. Formulacije za vaginalnu ili rektalnu primenu, npr. supozitoriji, mogu sadržavati ekscipijente, na primer, polialkilenglikole, vazelin, kakao puter i slično. Formulacije za intranazalnu primenu mogu biti čvrste i sadržavati kao ekscipijente, na primer, laktozu ili mogu biti vodeni ili uljani rastvori nazalnih kapi. Za bukalnu primenu ekscipijenti uključuju šećere, kalcijum stearat, magnezijum stearat, preželatinizovani skrob, i slično (U.S. Pat. No.5.849.695).

Transdermalne Formulacije i Primena

[0189] Za transdermalnu primenu, najmanje jedno anti-IL-6 antitelo je inkapsulirano u uređaju za prenos, kao što su lipozom ili polimerske nanočestice, mikročestice, mikrokapsule, ili mikrosfere (pod zajedničkim nazivom mikročestice ako drugačije nije navedeno). Niz prikladnih uređaja su poznati, uključujući mikročestice koje potiču od sintetskih polimera kao što su polihidroksilne kiseline, kao što je polimlečna kiselina, poliglikolna kiselina i kopolimeri od njih, poliortoestri, polianhidridi, i polifosfazeni, i prirodini polimeri kao što su kolagen, poliamino kiseline, albumin i drugi proteini, alginat i drugi polisaharidi, i kombinacije od njih (U.S. Pat. No.5.814.599).

Produžena Primena i Formulacije

[0190] Može biti poželjno preneti jedinjenja ovog pronalaska subjektu tokom produženih vremenskih perioda, na primer, za periode od jedne nedelje do jedne godine jednom primenom. Razno sporo otpuštanje, depo ili oblici implantat doziranja mogu biti korišćeni. Na primer, dozirani oblik može sadržavati farmaceutski prihvatljivu ne-toksičnu so jedinjenja koja imaju nizak stepen rastvorljivosti u telesnim tečnostima, na primer, (a) kisela adiciona so sa polibaznom kiselinom kao što je fosforna kiselina, sumporna kiselina, limunska kiselina, vinska kiselina, taninska kiselina, pamoinska kiselina, algininska kiselina, poliglutaminska kiselina, naftalen mono- ili di-sulfonske kiseline, poligalakturonska kiselina, i slično; ((b) so sa katjonom polivalentnog metala kao što je cink, kalcijum, bizmut, barijum, magnezijum, aluminijum, bakar, kobalt, nikl, kadmijum i slično, ili s organskim katjonom formiranim od npr. N,N 'dibenziletilendiamina ili etilendiamina; ili (c) kombinaciju od (a) i (b), npr. cink tanatne soli. Dodato, jedinjenja ovog pronalska, ili, poželjno, relativno nerastvorljive soli kao što su ove

2

upravo opisane, mogu biti formulisane u obliku gela, na primer, aluminijum monostearatnog gela sa npr. susamovim uljem, pogodnim za injekcije. Naročito poželjne soli su soli cinka, cink tanatne, pamoatne soli i slično. Druga vrsta depo formulacije za sporo otpuštanje za injekcije trebala bi da sadrži jedinjenje ili so dispergovanu za inkapsulaciju u sporo razgrađujućem, ne-toksičnom, neantigenom polimeru, kao što je polimer polimlečne kiseline/poliglikolne kiseline na primer kao što je opisano u U.S. Pat. No.3.773.919. Jedinjenja ili, poželjno, relativno nerastvorljive soli, kao što su one opisane iznad, mogu takođe biti formulisane u obliku silastičnih kuglica holesterolskog matriksa, naročito za primenu kod životinja. Dodatno sporo otpuštanje, depo ili implant formulacija, npr., gas ili tečni lipozomi, poznati su u literaturi (U.S. Pat. No. 5,770,222 i "Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems", J. R. Robinson ed., Marcel Dekker, Inc., N.Y., 1978).

[0191] Nakon detaljnog opisa pronalaska, isti će se moći bolje razumeti putem sledećih primera, koji su prikazani kao neka vrsta ilustracije, i nisu namenjeni kao ograničavajući.

Indikacije

Reumatoidni Artritis (RA)

[0192] Reumatoidni artritis (RA) je hronična stemska inflamatorna bolest sa autoimunim karakteristiksma. Broj karakteristika od RA može biti objašnjen delovanjem deregulisanog IL-6.

[0193] IL-6 delovanje potencijalnog značaja u RA uključuje indukciju poliklonalne hipergamaglobulinemije i proizvodnju autoantitela (reumatoidni faktor), kroz delovanje IL-6 kao faktora diferencijacije B-ćelije; promovisanje razvoja citotoksične T ćelije, u saradnji sa IL-2; proizvodnju akutne faze proteina (CRP, SAA, fibrinogen), preko stimulativne aktivnosti hepatocita; aktivaciju osteoklasta, što dovodi do periartikularne osteoporoze i razaranja kostiju; indukciju trombocitoze, kroz delovanje kao faktora diferencijacije megakariocita ; i regulacije VEGF, a time potencijalno angiogeneze, u saradnji sa IL-1β i TNFα.

[0194] IL-6 je proizveden od RA sinovijalnih fibroblasta stimulisanih putem TNFα ili IL-1, i prisutan je u visokoj koncentraciji i u sinovijalnoj tečnosti (SF) i serumu u RA. Postoje korelacije između nivoa seruma i kliničkih/laboratorijskih indeksa delovanja bolesti.

[0195] Anti-IL-6/IL-6R mAt-a su analizirani u nekoliko kliničkih studija kod pacjenata sa aktivnim RA. Dosadašnji rezultati su ukratko opisani u daljem tekstu.

Faza I/II istraživanja

[0196] U prvom od tih istraživanja, mišje anti-IL-6 mAt (BE-8) se daje dnevno tokom 10 uzastopnih dana kod 5 pacjenata sa RA i bilo je povezano sa prolaznim kliničkim i laboratorijskim poboljšanjem (9) ( Wendling, D; et al. 1993 J. Rheumatol. 20:259). Humanizovano anti-IL-6R (80kDa) mAt (MRA, Chugai) je ispitano u nekoliko faza I/ II ispitivanja kod pacjenata sa RA. U prvom od njih, MRA je primenjen intravenskom infuzijom u dozama od 1-50 mg jedanom ili dvaput nedeljno, uz terapiju održavanja od 50 mg nedeljno u trajanju do 6 meseci. To je rezultiralo brzim smanjenjem mera u akutnoj fazi, C-reaktivnog proteina (CRP) i fibrinogena, i u blagoj groznici, umoru, i kliničkim rezultatima, kao što su jutarnja ukočenost i oticanje i osetljivost tačaka zglobova. Takođe je navedeno su poboljšanja u anemiji, trombocitozi i hipergamaglobulinemiji. U narednom istraživanju, 45 pacijenata je tretirano sa jednom intravenskom infuzijom MRA u dozi od 0.1-10 mg/kg, što je rezultiralo u tendenciji poboljšanja u kliničkim rezultatima na višim nivoima doze, uz smanjenje reaktanata akutne faze.

Faza II istraživanja

[0197] U prvoj od ovih istraživanja, 15 pacjenata je lečeno sa MRA (nivoima doze 2, 4 ili 8 mg/kg dvonedeljno tokom 24 nedelje), i pokazali su ACR20 odgovora u 13/15 u 24 nedelje, sa normalizacijom CRP/ serum-Amiloid A (SSP). Iako nije bilo većih akutnih sigurnosnih problema zaštite, do dve trećine pacjenata je pokazalo izrazito povećan nivo LDL holesterola. U drugoj fazi II istraživanja, 164 pacjenata sa RA rezistentnim na DMARDs su tretirani sa placebom ili sa MRA IV infuzijom (nivoi doziranja od 4 ili 8 mg/kg, davani svake 4 nedelje tokom 3 meseca), i pokazali su ACR20 stope odgovora u 12 nedelja od 11%, 57%, i 78% za placebo, 4 i 8 mg/kg, redom. Na kraju, 359 pacjenata sa aktivnim RA je primilo MTX sam (10-25 mg /nedeljno), MRA sam (nivoi doze 2, 4 ili 8 mg/kg, primenjen jednom mesečno IV infuzijom) ili MTX plus MRA. MRA i MRA MTX je bila efikasnija od samog MTX, što se utvrđeno ACR20 odgovorom.

Sistemski Eritemski Lupus-Lupus Eritematozus (SLE)

[0198] SLE je hronična, potencijalno fatalna-smrtonosna, autoimuna bolest sa više raznovrsnih manifestacija. Etiologija je nepoznata. Jedan znak bolesti uključuje, hiperproliferaciju B-ćelije, aktivaciju i proizvodnju autoantitela protiv raznih vlastitih antigena.

[0199] IL-6 indukuje B ćelije na diferencijaciju u ćelijama u kojima se formiraju antitela. U SLE, postoji povećana proizvodnja autoantitela (ANA, anti-dsDNK) putem ovih ćelija koja formiraju antitela i depoziciju imuno kompleksa. IL-6 promoviše citotoksični razvoj T ćelije, povećava akutnu fazu reaktanata jetre, mezangijalnu proliferaciju ćelije, rast keratinocita, megakariocitnu diferencijaciju i trombozu.

[0200] Nivoi IL-6 su povišeni i kod pacjenata sa SLE i mišjih modela SLE. Pokazano je da receptor IL-6 vezujući se na B ćelije indukuje terminalnu diferencijaciju B-ćelija u ćelijama koje proizvode autoantitela. Linker-Israeli i ostali (Linker-Israeli M et al., 1991 J Immunol 147: 117-123) su pokazali smanjenje u spontanoj proizvodnji poliklonalnih antitela kada se koriste neutralizirajuća antitela protiv IL-6. Kitani i drugi (Kitani A, et al., 1992 Clin Exp Immunol 88: 75-83) podržavaju ove nalaze demonstrirajući da se in vitro proizvodnja T ćelija od IL-6 udvostručila u SLE kulturama i da B ćelije SLE imaju pet puta veću IL 6 proizvodnju od kontrolnih B ćelija. Međutim, patološka proizvodnja autoantitela u SLE nije isključivo ograničena na delovanje IL-6. Uloga receptora IL-6 je istraživana takođe. Nagafuchi i drugi su pokazli regulaciju receptora IL-6 u većini B ćelija SLE nasuprot normalnih B ćelija. Anti-IL-6-receptor antitela je inhibiran terminalnom diferencijacijom ovih B-ćelija u ćelijama koje formiraju antitela. Uloga rastvorljivog IL-6 receptora u SLE tek treba da bude utvrđena.

Tip II Dijabetes Melitus (T2DM)

[0201] Insulinska rezistencija (poremećeno delovanje insulina) i poremećaj funkcije β-ćelija (funkcionalni deficit β-ćelija pankreasa za lučenje insulina) se smatraju da su glavni uzroci razvoja T2DM. Insulinska rezistencija se manifestuje kao nemogućnost perifernih tkiva da adekvatno odgovore na insulinski izazov, što izaziva povećanje nivoa glukoze u krvi. Povećanje insulinske rezistencije i nivoa glukoze u krvi je praćeno kompenzacijskom hiper-sekrecijom insulina β-ćelija

4

pankreasa u ranim fazama bolesti. Kako T2DM napreduje, sposobnost β-ćelija da luče insulin se pogoršava.

[0202] Odgovorni mehanizmi za razvoj insulinske rezistencije su nejasni. Jedno stanje najčešće povezano sa razvojem T2DM je gojaznost i čak i skroman gubitak težine značajno poboljšava nivo glukoze kod pacjenata sa T2DM.

[0203] I gojaznost i insulinska rezistencija/hiperinsulinemija, u kombinaciji sa dislipidemijom, smanjenom tolerancijom glukoze i hipertenzija karakterišu stanje koje se naziva Metabolički Sindrom. Prirodna progresija Metaboličkog Sindroma za T2DM predisponira pojedince za razvoj mikro i makro-vaskularnih promena koje mogu dovesti do kardiovaskularnih (KV) bolesti i na kraju smrti. Gojaznost, insulinska rezistencija, i hiper-insulinemija sugerišu da postoje najverovatnije veze između T2DM i CV bolesti.

[0204] Masno tkivo je identifikovano kao jedan od glavnih organa koji reguliše metabolizam, kao i energija skladišnog depoa i endokrini organ koji luči brojne molekule uključene u regulaciju osetljivosti na insulin. Osim leptina, rezistina, adiponektina, i TNFa, adipozno tkivo luči IL-6, koje ukazuje da predstavlja vezu između gojaznosti, inflamcije, T2DM i kardiovaskularne (CV) bolesti.

[0205] Dokumentovana je pozitivna korelacija između gojaznosti i nivoa IL-6. Moguće je da povećanje adipoznog tkiva kod gojaznosti može obezbediti neprekidan porast i cirkulirajućim IL-6 koji bi mogli smanjiti osetljivost na insulin promovišući inflamaciju u insulin-odgovornim tkivima ili uzrokovati otpornost na insulin, ometajući aktivnost i ekspresiju proteina uključenih u insulin-signalnu kaskadu. I in vitro i in vivo postoje podaci koji podržavaju ili suprotstavljaju potencijalnu ulogu IL-6 u razvoju rezistencije na insulin.

[0206] Podaci in vitro upotrebom dobro-definisanih ćelija sistema uključujući jetru (HepG2) (44), masti (3T3L1) ili izdvojene ćelije ostrvca pankreasa pacova pokazuju direktan negativan efekat IL-6 na signalizirajući insulin, uzimanjem glukoze i izlučivanjem insulina, respektivno. S druge strane, podaci iz eksperimenata napravljeni na skeletnom mišiću biopsijama ukazuju da IL-6 može povećati potrošnju glukoze pri vežbanju mišića.

[0207] In vivo podaci o povezanosti između nivoa IL-6 i osetljivosti na insulin su podjednako mešani. Modeli IL-6 prekomerne ekspresije ili potpuno odstranjivanje sugerišu da potpuna inhibicija IL-6 aktivnosti ne može imati blagotvoran efekat. Na primer, u transgenom ne-debelom dijabetičnom (NOD) mišu, prekomerna ekspresija humanog IL-6 odlaže pojavu dijabetesa i produžava preživljavanje. Osim toga, podaci iz IL-6 nokaut miševa sugerišu da IL-6 može igrati ulogu u regulaciji energetskog bilansa pošto se kod ovih životinja kasnije razvija gojaznost i viši nivoi glukoze.

[0208] Kod ljudi, prirodno javljajuća mutacija u području IL-6 promotera dovodi do povećanja IL-6 sekrecione stope. Ova mutacija je povezana sa oba, povećanjem i smanjenjem osetljivosti na insulin.

[0209] U drugom skupu eksperimenata, ispitan je efekat egzogenog IL-6. Kod normalnih subjekata, IL-6 primena je dovela do povećanja nivoa glukoze bez uticaja koncentracije insulina u plazmi, dok, kod pacjenata sa karcinomom, dodatak IL-6 povećava deponovanje glukoze. Dodatno, korelacija između nivoa IL-6 i rezistencije na insulin je ispitana. Podaci iz ovih eksperimenata predlažu da su i kod muškaraca i žena, viši cirkulirajući nivoi IL-6 u korelaciji sa visokom otpornošću na insulin, iako uzročno-posledične odnose treba dalje utvrditi.

[0210] IL-6 je pokazala da ima važnu ulogu u razvoju debljine-povezane sa insulinskom rezistencijom. Međutim, u sukobu in vitro i in vivo postoje podaci da oba podržavaju ili se protive njegovoj potencijalnoj ulozi u insulinskoj rezistenciji.

Osteoartritis (OA)

[0211] OA je hronični, degenerativni zajednički poremećaj karakterisan gubitkom zglobne hrskavice i srodnih promena subhondralne kosti. Iako su različiti stepeni infamacije uočeni na artroskopiji ili sinovijalnoj biopsiji uzoraka, bolest nije primarno inflamatorna. Umesto toga, smatra se da potiče iz promena u hondrocitu i/ili metabolizmu osteoblasta. TNF, IL-1 i IL-6 su citokini najjače povezani sa ovim promenama.

[0212] IL-6 je detektovan u sinovijalnoj tečnosti kod pacijenata sa OA, mada na nivoima znatno ispod onih viđenih u inflamatornim artropatijama (Bertazzolo, N. et al.1994 Agents and Actions 41: 90-92). IL-6 je prepoznat da bude primarni stimulans za hepatičnu akutnu fazu sinteze proteina, i CRP nivoi su povezani sa prisustvom OA kolena, čak i nakon uzimanja u obzir poznatu povezanost između CRP i gojaznosti (Mohtai, M. et al.1996 J Orthopedic Research 14: 67-73).

[0213] IL-6 je izražen u hondrocitima iz OA hrskavice, ali ne normalne hrskavice (Sowers, M. et al.

2002 Osteoarthritis and Cartilage 10: 595-601). U eksperimentima ispitivanja efekata mehaničkog stresa na hondrocit ekspresijom citokina in vitro, tečnost je izazvana naponom trenja znatno regulisanim IL-6 mRNA i proteinom. To sugeriše da ekspresija IL-6 kod OA hrskavice može biti posledica mehaničkog opterećenja. IL-6 takođe može bitu proizveden kao odgovor na IL-1 delovanjem na hondrocite (Dozin, B. et al.2002 Matrix Biology 21: 449-459).

[0214] U drugim eksperimentima, IL-6, u kombinaciji sa sIL-6R, je dovelo do inhibicije sinteze proteoglikana putem humanih zglobnih hondrocita kultivisanim ex vivo, iako je efekat skroman u poređenju sa IL-1 (Guerne, P. et al.1999 Matrix Biology 18: 253-260).

Hronična Obstruktivna Bolest Pluća (COPD)

[0215] COPD je bolesno stanje karakterisano ograničenim protokom vazduha koji nije u potpunosti reverzibilno. Ograničenje protoka vazduha je obično progresivno i povezano sa abnormalnim inflamatornim odgovorom pluća na štetne čestice i gasove (Pauwels RA et al. 2001 Am.J.Respir Crit Care Med 163:1256-1276). COPD karakteriše ubrzanje u normalnom padu funkcije pluća koja se vidi sa starenjem. Sporo progresivno smanjenje protoka vazduha dovodi do invaliditeta i prerane smrti. COPD je vodeći uzrok smrti i invaliditeta, ali je tek nedavno obimno istražen iz ćelijske i molekularne perspektive (Barnes P.J. et al. 2003 Eur Respir J 22:672-688). U COPD, postoji hronična inflamacija koja dovodi do fiksnih sužavanja malih disajnih puteva i alveolarnog razaranja (emfizem). Inflamatorni odgovor je karakterisan povećanim brojem alveolarnih makrofaga, neutrofila i citotoksičnih T-limfocita i oslobađanjem višestrukih inflamatornih medijatora (hemokina, citokina, faktora rasta i lipida). Visok nivo oksidativnog stresa može pojačati inflamaciju. Tu je takođe povećana elastoliza i dokazi za uključivanje nekoliko elastolitskih enzima. Inflamacija i proteoliza u COPD je pojačana od normalnog inflamatirnog odgovora dima cigarete. Za razliku od astme, izgleda da je inflamacija otporna na kortikosteroide (Barnes P.J. et al.2003).

[0216] U životinjskim modelima, bakterijski endotoksini ili lipopolisaharidi (LPS) i izlaganje dimu cigarete indukuju neutrofiliju i povećanu proizvodnju IL-6 u bronhoalveolarnom ispiranju (BAL) tečnošću (Underwood D.C. et al.2000 AJPLCMP 279:L895-902). Prekomerna ekspresija IL-6 u mišjim plućima indukuje emfizem (Kuhn III Ch. et al. 2000 AJRCMB 22:289-295). Kod ljudi, forsiran ekspiratorni volumen u prvoj sekundi (FEV1) je u obrnutoj korelacii sa IL-6, IL-8 nivoima i polimorfonuklearnoj ćeliji brojenoj u BAL (Soler N. et al. 1999 Eur Respir J 14:1015-1022). Plazma TNFa, IL-6 i CRP nivoi su povećani kod subjekata sa blagom do teškom COPD (Yasuda N. et al. 1998 Respir Med 92:993-999).

[0217] Akutno pogoršanje COPD je definisano kao održavano pogoršanje stanja pacijenta, od stabilnog stanja i dalje od normalnih varijacija dan za dan, akutno je u početku i zahteva promenu u regularnim lekovima (Burge S. et al. 2003 Eur Respir J 21: Suppl. 41, 46s-53s). Iako su povećani simptomi i pogoršanje plućne funkcije čest uzrok prijema u bolnicu (oko 500.000 svake godine u SAD-u), istaknuti ćelijski i molekularni mehanizmi nisu široko istraženi i slabo su razumljivi (Wedzicha, J.A.

2002 Chest 121: 1365-1415). Akutne egzacerbacije-pogoršanja se mogu produžiti i imaju veliki uticaj na kvalitet života i mogu ubrzati progresiju -napredovanje COPD (Soto FJ sur 2003 Pulm Mediteran 9:.

117-124). Respiratorne infekcije su najčešći uzroci pogoršanja bolesti kod COPD. Većina tih infekcija su uzrokovana bakterijama, ali mnoge od njih su zbog virusne infekcije, naročito rinovirusa (Soto F.J. i saradnici 2003). Faktori sredine, zagađivači vazduha i temperatura takođe mogu igrati ulogu.

[0218] Tokom pogoršanja, postoji porast neutrofila i koncentracija IL-6, IL-8, TNFα i LTB4 u sputumuispljuvku pacjenata sa COPD. Neki pacjenti sa umerenom do teškom COPD su skloni čestim egzacerbacijama-pogoršanjima (tri ili više egzacerbacija godišnje). Ova grupa pacjenata ("česta pogoršanja") ima viši nivo IL-6 i niži nivo sekretornog leukocitnog inhibitora proteaze čak kada je COPD stabilna. (Bhowmik A. et al. 2000 Thorax 55: 114-120; Gompertz S. et al.2001 Thorax 56: 36-41; Gompertz S. et al.2001 EurRespirJ 17: 1112-1119).

[0219] Niz drugih mehanizama, kao što je oksidativni stres i bakterijska kolonizacija, su takođe uključeni u patofiziologiju COPD pogoršanja.

Primer 1: Kloniranje i Ekspresija IL-6 Antitela u Ćelijama Sisara

[0220] Tipični ekspresioni vektor sisara sadrži najmanje jedan promotorski element, koji posreduje na iniciranje-početak transkripcije mRNA, antitelo kodirajuće sekvence i signale potrebne za završetak transkripcije i poliadenilaciju transkripta. Dodatni elementi uključuju pojačivače, Kozak sekvence i interventirajuće sekvence sa svake strane dobijene donorskim i akceptorskim mestima za spajanje RNA. Transkripcija visokog efekta se može ostvariti ranim i kasnim promoterima od SV40, dugim terminalnim ponavljanjem (LTRS) iz retrovirusa, npr., RSV, HTLVI, HIVI i ranim promoterom od citomegalovirusa (CMV). Međutim, ćelijski elementi se isto tako mogu koristiti (npr, humani promoter aktina). Pogodni ekspresijski vektori za upotrebu u praksi ovog pronalaska uključuju, na primer, vektore kao što su pIRES1neo, pRetro-Off, pRetro-On, PLXSN, ili pLNCX (Clonetech Labs, Palo Alto, CA), pcDNA3.1(+/-), pcDNA/Zeo(+/-) ili pcDNA3.1/Hygro(+/-) (Invitrogen), PSVL i PMSG (Pharmacia, Uppsala, Sweden), pRSVcat (ATCC 37152), pSV2dhfr (ATCC 37146) i pBC12MI (ATCC 67109). Pogodni sisari i drugi domaćini ćelija uključuju Hela 293, H9 i Jurkat ćelije, mišje NIH3T3 i C127 ćelije, Cos 1, Cos 7 i CV 1, kuail QC1-3 ćelije, mišje L ćelije i ćelije jajnika kineskog hrčka (CHO). Alternativno, gen može biti izražen u stabilnoj ćelijskoj liniji koja sadrži gen integrisan u hromozomu. Istovremena transfekcija selektivnim markerom kao što je dhfr, gpt, neomicin, ili higromicin, omogućuje identifikaciju i izolaciju transfektovanih ćelija.

[0221] Transfektovani gen isto tako može biti pojačan tako da izražava velike količine kodiranih antitela. DHFR (dihidrofolat reduktaza) marker je koristan u razvoju ćelijskih linija koje nose nekoliko stotina ili čak nekoliko hiljada kopija gena od interesa. Drugi koristan selekcioni marker je enzim glutamim sintaza (GS) (Murphy, et al., Biochem. J. 227:277-279 (1991); Bebbington, et al., Bio/Technology 10:169-175 (1992)). Upotrebom ovih markera, ćelije sisara se uzgajaju u selektivnom medijumu i izabrane su ćelije sa najvećom otpornošću. Ove ćelijske linije sadrže amplificirani-pojačan gen (gene) integrisan u hromozom. Ćelije jajnika kineskog hrčka (CHO) i NSO ćelije su često korišćene u proizvodnji antitela.

[0222] Ekspresioni vektori pC1 i pC4 sadrže snažan promoter (LTR) od Virus Rous Sarkoma (Cullen, et al., Mol. Cell. Biol.5:438-447 (1985)) plus fragment CMV-pojačivaća (Boshart, et al., Cell 41:521-530 (1985)). Višestruka mesta kloniranja, npr., sa ograničenjem mesta cepanja enzima BamHl, Xbal i Asp718, pospešuju kloniranje gena od interesa. Vektori sadrže pored toga 3'intron, poliadenilaciju i prestanak signala preproinsulinskog gena pacova.

Kloniranje i Ekspresija u CHO Ćelijama.

[0223] Vektor pC4 se može koristi za ekspresiju IL-6 antitela. Plazmid pC4 je derivat plazmidnog pSV2-dhfr (ATCC Pristupni Br.37146). Plazmid sadrži DHFR gen miša pod kontrolom SV40 ranog promotera. Ćelije ovarijuma kineskog hrčka ili druge ćelije u kojima nedostaje dihidrofolatna aktivnost koje su transfektovane sa ovih plazmida mogu biti izabrane gajenjem ćelija u selektivnom medijumu (npr., alpha minus MEM, Life Technologies, Gaithersburg, MD) dopunjenim sa hemoterapeutskim sredstvom metotreksata. Amplifikacija DHFR gena u ćelijama rezistentnim-otpornm na metotreksat (MTX) dobro je dokumentovana (videti, npr., F. W. Alt, et al., J. Biol. Chem.253:1357-1370 (1978); J. L. Hamlin and C. Ma, Biochem. et Biophys. Acta 1097:107-143 (1990); i M. J. Page and M. A. Sydenham, Biotechnology 9:64-68 (1991)). Ćelije gajene u rastućim koncentracijama MTX-a razvijaju otpornost na lek prekomernom proizvodnjom ciljnog enzima, DHFR, kao rezultat amplifikacije DHFR gena. Ako je drugi gen povezan sa DHFR genom, obično je isto tako amplifikovan i prekomerno izražen. Poznato je u struci da se navedeni pristup može koristiti da bi se razvile ćelijske linije koje nose preko 1.000 kopija amplificiranog gena (više gena). Nakon toga, kada je povučen metotreksat, dobijene su ćelijske linije koje sadrže amplificirani-pojačan gen integrisan u jednom ili više hromozoma ćelije domaćina.

[0224] Visokoefikasni promoteri različiti od snažnog promotera dugog terminalnog ponavljanja (LTR) od Rouz Sarkom Virusa takođe mogu biti korišćeni za ekspresiju, npr, humani β-akcioni promoter, SV40 rani ili kasni promoteri dugih terminalnih ponavljanja iz drugih retrovirusa, npr., HIV i HTLVI. Tzv. "Clontech Tet-Off i Tet-On" genski ekspresioni sistemi i slični sistemi se mogu koristiti u ekspresiji IL-6 antitela na regulisani način u ćelijama sisara. (M. Gossen, and H. Bujard, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 5547-5551 (1992)). Za poliadenilaciju mRNA, drugi signali, npr., iz humanog hormona rasta ili globin gena se mogu koristiti dobro. Stabilne ćelijske linije koje nose gen od interesa integrisan u hromozomima isto tako mogu biti izabrane nakon istovremene transfekcije selektabilnim markerom, kao što je gtp, G418 ili higromicin. Povoljno je da se koristi više od jednog selektabilnog markera u početku, npr., G418 plus metotreksat. Plazmid pC4 je razgrađen restrikcijom enzima i zatim defosforilovan primenom teleće intestinalne fosfataze postupcima poznatim u tehnici. Vektor je zatim izolovan iz 1% agaroznog gela.

[0225] DNK sekvenca koja kodira kompletno IL-6 antitelo se koristi, na primer, kao što je prikazano u SEQ ID NOS: 98 i 96, odgovarajućim HC i LC varijabilnih regija IL-6 antitela ovog pronalaska, redom, u skladu sa poznatim koracima metode. Izolovana nukleinska kiselina koja kodira pogodnu humanu konstantnu regiju (tj. HC i LC regije) se isto koristi u ovoj konstrukciji.

[0226] Izolovane varijabilne i konstantne regije koje kodiraju DNK i defosforiliovani vektor su zatim povezane sa T4 DNK ligazom. E.coli HB101 ili XL-1 Plave ćelije su zatim transformisane i identifikovane su bakterije koje sadrže fragmen umetnut u plazmid pC4 upotrebom, na primer, analize restrikcionog enzima.

[0227] Ćelije jajnika kineskog hrčka (CHO) u kojima nedostaje aktivan DHFR gen korišćene su u transfekciji.5 mikrograma ekspresionog plazmida pC4 su transfektovani sa 0.5 mikrograma plazmida pSV2-neo upotrebom lipofektina. Plazmid pSV2neo sadrži dominantni selektabilni marker, neo gen iz Tn5 kodirajući enzim koji daje rezistenciju na grupu antibiotika uključujući G418. Ćelije su kultivisane u alfa minus MEM-u dopunjene sa 1 mikrogram/ml G418. Nakon 2 dana, ćelije su tripsinizovane i zasejane na klonirajuće ploče hibridoma (Greiner, Germany) u alfa minus MEM dopunjenom sa 10, 25 ili 50 ng/ml metotreksata plus 1 mikrogram/ml G418. Nakon približno 10-14 dana pojedinačni klonovi su tripsinizovani i zatim kultivisani-zasejani na 6-jažične petrijeve šolje ili 10 ml laboratorijske boce upotrebom različitih koncentracija metotreksata (50 nM, 100 nM, 200 nM, 400 nM, 800 nM). Klonovi gajeni na najvišim koncentracijama metotreksata su zatim prebačeni u nove 6-jažične ploče koje sadrže još veće koncentracije metotreksata (1 mM, 2 mM, 5 mM, 10 mM, 20 mM). Isti postupak je ponovljen sve dok nisu dobijeni klonovi koji rastu na koncentraciji od 100 do 200 mM. Ekspresija željenog genskog proizvoda je analizirana, na primer, putem SDS-PAGE (Elektroforeze na poliakrilamidnom gelu i Vestern blota ili putem reverzne faze HPLC analize.

Primer 2 - Konstrukcija i Skrining Anti-IL-6 Antitela

[0228] Varijante IL-6 antitela (klon AME-A9) su konstruisane i ispitivane za aktivnost. U ovom primeru i inače ovde, CDRs su kao što je definisano po tzv." Kabat" sa izuzetkom CDRH1 koji je zbir "Kabat" i "Chothia" definicija. Dužina CDRH2 je potrebna da izgradi dve odvojene tzv. "biblioteke" da pokriju celu regiju. Potrebni klonovi-od interesa su sekvencionisani i dalje karakterisani pomoću ELIZA testa i bili su određeni u testu baziranom na ćeliji i kinetičkim konstantama.

[0229] Primer ELIZA testa urađenog sa prečišćenim IgGs je prikazan na Slici 9. ELIZA test generalno koristi Costar 3366 mikrotitarske ploče obložene sa kozjim anti-humanim kapa antitelom. Razblaženja od Fab (ili IgG) su inkubirani u obložene jažice za 1 sat na 22°C. Jažice su zatim isprane sa PBS, 0.1% Tween 20 i biotinilovanim IL-6 na 200 ng/ml u trajanju od 1 sata. Posle ispiranja, konjugat alkalne fosfataze od NeutrAvidina je dodat i inkubiran tokom 1 sata na 22°C. Kolorimetrijski supstrat je dodat nakon opsežnog ispiranja i određena je veza IL-6. Jedna varijanta ovog ELIZA testa uključuje produženje koraka ispiranja u čašu od PBS, 0.01% BSA na 37°C nakon biotinilovane IL-6 inkubacije, npr., 18 sati produženog koraka ispiranja.

[0230] Nekoliko generisanih humanih modifikovanih IL-6 reaktivnih IgG monoklonalnih antitela iz ovog pronalaska imaju afinitet konstante između 1x10<9>i 9x10<12>. Visoki afiniteti ovih humanih modifiikovanih monoklonalnih antitela čine ih pogodnim za terapijsku primenu kod IL-6-zavisnih bolesti, patoloških stanja ili povezanih poremećaja.

[0231] Varijante višestrukih različitih humanih modifikovanih anti-IL-6 antitela su dobijene menjanjem jedne ili više CDR regija od antitela. Tabela 3 ispod prikazuje rezime korisnih mutacija koje su pronađene u individualnim CDR "bibliotekama" (promene amino kiseline su u odnosu na varijantu AME-A9). Pored toga, Tabela 13 ispod prikazuje aminokiselinske sekvence za lake i teške lance CDRs sa mogućim položajima supstitucije (označenim kao "X").

[0232] "Kombinatorna" biblioteka je konstriuisana na osnovu najboljih klonova (tj. varijanti) koje se nalaze u individualnim CDR bibliotekama. Tabela 4 prikazuje mutacije koje su uključene u "kombinatornu" biblioteku. Kombinatorna biblioteka je ispitana i okarakterisana kao što je opisano iznad. Mutacije pronađene u šest od boljih klonova su prikazane u Tabeli 5A ispod, dok su sekvence ID brojeva za CDRs iz ovih klonova prikazane u Tabeli 5B.

Testiranje anti-IL-6 IgGs u Ćelijski -zasnovanom Testu

[0233] Himerno anti-IL-6 i humana modifikovana anti-IL-6 (klon AME-19a) antitela su testirana za sposobnost da spreče rast od IL-6 zavisne ćelijske linije. 7TD1 ćelije su stavljene u Costar 3610 96 jažica na 200 ćelija po jažici. Antitela, razblažena u IMDM medijumu, su dodata u jažice praćena dodavanjem humanog IL-6 u konačnoj koncentraciji od 500 pg/ml i ploče su inkubirane u kulture tkiva inkubatora tokom 64-72 sata. U to vreme, 50 µl od ćelijskog lizirajućeg pufera iz ATPlite kompleta (Packard Bioscience) je dodato u sve jažice i ploče su mešane tokom 3 minuta.50 µl ATPlite supstrata je dodato i pokrivene ploče su promućkane tokom 1 minuta. Određena je hemiluminescencija na luminometru.

[0234] Rezultati od ćelijski baziranog testa su prikazani na Slici 10, pri čemu su izračunate vrednosti EC50prikazane u Tabeli 6 ispod. EC50vrednost od himernog anti-IL-6 antitela je 2.7 x 10<-11>M (4.09 ng/ml) i da od humanog modifikovanog anti-IL-6 (klon AME-19a) antitela je 2.7 x 10<-12>M (0.41 ng/ml). EC50vrednost humanog modifikovanog antitela pokazuje oko 10 puta veće poboljšanje, iako je moguće dobiti od oko 10-struko do oko 60-struko poboljšanje, uključujući vrednosti intervenisanja, u EC50vrednosti.

Primer 3 - Kinetika vezivanja Humanih Modifikovanih Anti-Humanih IL-6 antitela

[0235] ELIZA analiza potvrđuje da prečišćeno antitelo iz ovih ćelija domaćina veže IL-6 na način zavisan od koncentracije. U ovom slučaju, afinitet antitela za njegov srodan antigen (epitop) je izmeren. Konstante kvantitativnog vezivanja su dobijene pomoću BIAcore analize i KinExA<TM>3000 instrumenta. Rezultati pokazuju da je nekoliko humanih modifikovanih monoklonalnih antitela vrlo visokog afiniteta sa KD u rasponu od 1x10<-9>do 3x10<-14>.

[0236] Enzimski imunološka analiza (EIA) koja koristi anti-humana IL-6 monoklonalna antitela (AME-A9, AME-A16, AME-18a, AME-20b, AME-22a, i AME-23a) i CNTO 328 korišćena kao pozitivna kontrola za detekciju vezivanja IL-6 na rastvorljivi receptor IL-6, sIL-6R, je izvedena. Rastvorljivi humani IL-6 receptor, sIL-6R, i rekombinantni humani IL-6 dobijeni su od R&D Systems (Minneapolis, MN) (kataloški broj # 227-SR-025 i 206-IL-010, redom). Kozji anti-humani IgG "horseradish" peroksidazavezan (H L lanacem) je dobijen od Jackson Immunoresearch (West Grove, PA) (Catalog # 109-035-003). Vodonik Peroksid i OPD tablete su dobijene iz Sigma (St. Louis, MO) (Catalog #H-1009 and P-8287, redom).

Enzim vezan za imunoanalizu sgp80/IL-6/anti-IL-6 mAt formaciju kompleksa

[0237] "Costar" EIA ploče (Corning / Costar, Acton, MA), (katalog # 9018) su prevučene sa sIL-6R (10 µg/ml u PBS-u, 100 µL/jažici), preko noći na 4°C. Pločice su isprane sa 0.15 M fiziološkim rastvorom koji sadrži 0.02% (v/v) Tween 20 i jažice su blokirane sa 1% (w/v) BSA u PBS-u, 200 µL/jažici tokom jednog sata na sobnoj temperaturi. Jažice su ponovo isprane jednom u sekvencijalnom obliku, zatim inkubirane sa 200 ng/ml humanog IL-6 (100 µl/jažici) u PBS-u tokom jednog sata na sobnoj temperaturi. Antitelo je dodato u jažice u 10-strukim serijskim razblaživačima počevši sa koncentracijom od 10 µg/ml u 100 µl/jažici tokom jednog sata na sobnoj temperaturi. Nakon ispiranja, jažice su inkubirane sa kozjim anti-humanim IgG (H+L)- vezanim, (10 µg/ml u PBS-u) tokom 30 minuta na sobnoj temperaturi. Jažice su isprane i 100 µl/jažici rastvorom supstrata citrat-fosfata (0.1M Limunske Kiseline i 0.2M Natrijum Fosfata, 0.01% H2O2i 1 mg/ml OPD) tokom 15 minuta na sobnoj temperaturi. Reakcija je zaustavljena dodatkom 25 µl/jažica od 4N sumporne kiseline i OD490je očitan putem automatizovanog ELIZA čitača (Molecular Devices Spectromax Plus, Sunnyvale, CA).

[0238] Za testiranje efekta preinkubacije IL-6 sa anti-hIL 6 monoklonalnim antitelima ili CNTO 328, 200 ng/ml IL-6 (100 µl) je inkubirano sa deseterostrukim serijskim razblaživačima antitela (100 µl), počevši sa 10 µg/ml tokom jednog sata na sobnoj temperaturi. Ova prethodno-inkubirana smeša je zatim inkubirana sa sIL-6R tokom jednog sata na sobnoj temperaturi i detekcija sIL-6R/IL-6/anti humanog IL-6 je otkrivena upotrebom kozjeg anti-humanog IgG (H+L)- HRP-vezanog, (10 µg/ml u PBS) tokom 30 minuta na sobnoj temperaturi. Ostatak uslova ispitivanja bio je isti kao što je opisano u prethodnom paragrafu.

Prethodne studije su pokazale da CNTO 328 može otkriti IL-6 kada je zarobljen od strane sIL-6R koja je obložena na EIA internoj ploči tehničkog izveštaja. Osim toga, AME-A9, AME-A16, AME-18a, AME-20b, AME-22a, AME -23a može otkriti IL-6 vezan na sgp80 (sIL-6R) u dozno zavisnom načinu upotrebom EIA. Svako humano modifikovano anti-IL-6 antitelo je procenjeno u odnosu na CNTO 328. Međutim, prethodne inkubacije IL-6 i bilo koji od ovih anti-hIL 6 monoklonalnih antitela isključuju mogućnost sIL-6R da veže IL-6.

Merenje Kinetičkih Konstanti za anti-IL-6 IgGs

[0239] KinExA<TM>3000 instrument proizvođača Sapidyne, je korišćen za merenje kinetčkih vezivanja. Ukratko, humano IL-6 je kovalentno vezano na alzakton kuglice i vezivanje slobodnog IgG na kuglice je detektovano na instrumentu. Za merenje KD, individualne-pojedinačne epruvete koje sadrže konstantnu koncentraciju ili 0.5, 1 ili 5 pM IgG sa smanjenjem serijski razblaženog humanog IL-6, su inkubirane tokom 3-4 dana pri 20°C u 0.1% BSA, PBS. Ukupno 13 cevi je korišćeno za svako određivanje KD.Na primer, himerno anti-IL-6 antitelo je korišćeno pri konstantnoj koncentraciji od 5 pM i pojedinačne epruvete su inkubirane sa 0-200 pM od IL-6. Inkubacije za druge IgGs su postavljene na sličan način. Nakon inkubacije, slobodni IgG u svakom ekvilibrisanom uzorku je određen na KinExA<TM>3000 instrumentu prema uputstvima proizvođača. KDvrednosti su određene u KinExA 3000 softveru pomoću KinExA<TM>3000 instrumenta, kao što je opisano detaljnije ispod.

[0240] Za merenje Kon, pojedinačni-individualni IgGs na 200 pM su pomešani sa 100-200 pM humanog IL-6 i nevezani IgG je detektovan putem vezivanja na humani IL-6 kovalentno spojen na alzakton kuglice na KinExA<TM>3000 instrumentu. Serije merenja su preduzete tokom vremena. Dobiveni podaci su korišćeni za izračunavanje Konsa softverom KinExA<TM>3000. koffje izračunat pomoću formule KD= koff/kon. Rezime kinetičkih konstanti za anti-IL-6 IgGs je prikazan u Tabeli 7.

1

Primer 4: In vitro karakterizacija anti-IL-6 Antitela

[0241] In vitro su sprovedena ispitivanja da bi se okarakterisala sekvenca, specifičnost epitopa, afinitet, i biološka aktivnost u anti-IL-6 antitelu.

Humani Modifikovani mAt

[0242] Analiza sekvence potvrđuje da anti-IL-6 antitelo iz ovog pronalaska (otelotvoreno u različitim varijantama/klonovima) sadrži u celosti humane okvire. Tabela 5a pokazuje ukupno od 10 aminokiselinskih ostataka promenjenih i u teških i lakim lancima CDR1, 2 i 3 u anti-IL-6 antitelu iz ovog pronalaska (u različitim varijantama antitela) u poređenju sa himernim anti-IL-6 antitelom ( opisano u PCT WO 04/039826).

Specifičnost epitopa

[0243] Anti-IL-6 antitelo iz ovog pronalaska i himerno anti-IL-6 antitelo prepoznaje sličan epitop na humanom IL-6. Ova antitela se ne takmiče sa komercijalnim mišjim anti-humanim IL-6 mAt od R&D Sistema # MAB-206 sugerišući na to da oni prepoznaju epitop koji je jedinstveno različit od R&D anti-IL-6 mAt. Anti-IL-6 antitelo iz ovog pronalaska i himerno anti-IL-6 antitelo se ne takmiči sa R&D antihumanim IL-6 mAt pacova.

[0244] Humano IL-6 (200 ng/ml) je zarobljeno putem ploče-vezanog anti-IL-6 mAt (mišji anti-humani IL-6 mAt, MAB-206, koji je korišćen samo kao pločom vezni mAt za snimanje humanog IL-6) (10 µg/ml) i serijska razblaženja anti-IL-6 antitela iz ovog pronalaska i himerno anti-IL-6 antitelo, kao što je naznačeno po X-osi su zatim dodai na ploču. Vezivanje na IL-6 je mereno kao povećanje u OD490 duž Y ose. I anti-IL-6 antitelo iz ovog pronalaska i himerno anti-IL-6 antitelo pokazuju dozno-zavisno vezivanje na IL-6.

[0245] Nasuprot tome, anti-IL-6 antitelo iz ovog pronalaska i himerno anti-IL-6 antitelo kompetitivno su vezani za humano IL-6, sugerišući da dva molekula dele slično vezivanje epitopa na IL-6. Humano IL-6 (200 ng/ml) je zarobljeno putem ploče vezanog MAB-206 (10 µg/ml). Serijska razblaženja anti-IL-6 antitela ovog pronalaska kao što je naznačeno po X-osi i 50 ng/ml biotinilovanog himernog anti-IL-6 antitela su zatim dodati na ploču. Vezanje biotinilovanog himernog anti-IL-6 antitela na IL-6 je detektovano pomoću streptavidin-HRP i mereno je kao OD490očitavanja duž Y ose.

[0246] Šta više, humana modifikovana i himerna antitela pokazuju slična svojstva u pogledu vezivanja na sIL-6/sIL-6R kompleks (Slika 1). Anti-IL-6 antitelo iz ovog pronalaska se veže na sIL-6/SIL-6R kompleksa. Rastvorljivi receptor IL-6 (sIL-6R) je obložen na ploči pri 10 µg/ml koncentracije. Humani IL-6 je zatim dodat na ploču pri 200 ng/ml koncentracije. Serijska razblaženja anti-IL-6 antitela ovog pronalaska ili himerna anti-IL-6 antitela, kao što je naznačeno duž X-ose, su zatim dodati na ploču i vezivanje na IL-6/sIL-6R kompleks je detektovano upotrebom HRP-anti-humanog IgG i mereno kao OD490očitavanja duž Y ose.

[0247] Da bi se dodatno potvrdili gore navedeni rezultati, izvedeno je unakrsno ispitivanje reaktivnosti primenom IL-6 koje sadrži uslovni supernatant generisan od LPS i IFNy-stimulisanih PBMCs od različitih vrsta u 7TD1 (IL-6, zavisnoog mišjeg hibridoma ćelijske linije) bazirano na testu proliferacije ćelija. Humano modifikovano antitelo pronalaska je pokazalo aktivnost neutralizacije uslovljenih supernatanata u stimulisanju ćelijske proliferacije 7TD1 različitih vrsta primata, uključujući

2

čoveka, marmozeta, cinomolgus majmuna, šimpanzu, rezus makaki-majmuna, pavijana, svinjorepog majmuna i pamukoglavog majmuna, i pokazali su obrazac reaktivnosti sličnih unakrsnih vrsta u poređenju sa himernim antitelom (Tabela 8).

[0248] Na kraju, kada je mapiranje epitopa izvedeno primenom triptinske digestivne metode, isto vezivanje epitopa za humana modifikovana i himerna antitela na humanom IL-6 je primećeno i nalazi se u rasponu Helix D aminokiselinskih ostataka 168-184 (Slika 3). Nedavna analiza mutacije je potvrdila da su ostaci 179 i 182 neophodni za antitela pronalaska da se vežu na IL-6. Epitop (aminokiselinski ostaci 168-184) su identifikovani kao površina od IL-6 koja zadržava deuterijum u prisusvu humanog modifikovanog anti-IL-6 antitela.

Biološka aktivnost

[0249] IL-6 neutralizacija potentnog humanog modifikovanog anti-IL-6 antitela je određena putem 7TD1 ćelijski-zasnovanom biološkom testu. Humano modifikovano anti-IL-6 antitelo je pokazalo 10-puta veću moć neutralizacije u poređenju sa himernim anti-IL-6 antitelom u 7TD1 testu proliferacije ćelije. 7TD1 ćelije su stimulisane sa 500 pg/ml od hIL-6, u prisustvu serijskih razblaženja humanog modifikovanog anti-IL-6 antitela ili himernog anti-IL-6 antitela ili kontrole izotopa mAt tokom 72 sata. Proliferacija ćelija je merena kao broj impulsa u sekundi što je označeno na Y-osi. Stupci grešaka označavaju SD duple uzorke. Zatvoreni krug označava ćelije bez IL-6; otvoreni krug označava ćelije stimulisane sa 500 pg/ml od hIL-6.

[0250] Humano modifikovano anti-IL-6 antitelo takođe inhibira IL-6 indukovani monocit hemoatraktantni protein-1(MCP-1)proizveden iz U937 ćelija (Slika 3) i IL-6/IL-1β-indukovanog amiloidnog seruma A (SAA) proizvedenog iz HepG2 humanih ćelija hepatoma (Slika 4). Slika 3 pokazuje da humano modifikovano anti-IL-6 antitelo inhibira IL-6 stimulisano MCP-1 sekrecijom iz U937 ćelija. 5x10<5>ćeija/jažici je obrađeno sa 1 ng/ml od hIL-6 i serijskim razblaženjima humanog modifikovanog anti-IL-6 antitela tokom 72 sata. Ćelijska kultura supernatanata je analizirana u triplikatu-tri kopije ELIZA testom na prisustvo MCP-1.

[0251] Slika 4 prikazuje da humano modifikovano anti-IL-6 antitelo inhibira IL-6 i IL-1β stimulisanu SAA sekreciju iz HepG2 ćelija.2.25 x105 ćelija su stimulisane sa 100 ng/ml od hIL-6, 200 ng/ml od sIL-6R i 1 ng/ml od IL-1β u prisustvu serijskih razblaživača od humanog modifikovanog anti-IL-6 antitela tokom 24 sata. Ćelijske kulture supernatanata su zatim analizirane u duplikatu pomoću ELIZA testa na prisustvo SAA.

Fosforilacija Stat 3 koja zavisi od IL-6

[0252] Za procenu sposobnosti humanog modifikovanog anti-IL-6 antitela da blokira signalnu kaskadu rezultirajući od IL-6 vezivanjem za IL-6R i gp130, imunoprecipitaciono ispitivanje je izvedeno da bi se testirao efekat na IL-6 zavisne STAT3 fosforilacije u THP- 1 ćelijama, koje eksprimiraju gp130 na ćelijskoj površini.

[0253] mAt-a su sterilno-filtrirani filterski sterilisani i čuvani u PBS na 4°C. Rekombinantni humani IL-6 (206-IL-010) i sIL-6R (227-SR-025) iz R&D Sistema (Minneapolis, MN) su korišćeni. RPMI medijum (11875-085), toplotom inaktivisani fetalni goveđi serum (16000-069), L-Glutamin (25030-081), neesencijalne amino kiseline (11140-050) i natrijum piruvat (11360-070) su dobijeni od Invitrogena (Carlsbad, CA). TBS (10 mM Tris, pH 7.5, 100 mM NaCl) takođe je korišćena.

[0254] THP-1, ćelijska linija humane akutne monocitne leukemije dobijena iz istraživanja ćelijskih banaka, je ispitana da mikoplazma bude negativna i bez bakterija. Ove ćelije su kultivisane u RPMI medijumu koji sadrži 10% fetalnog goveđeg seruma, 2 mM glutamina, i 1 mM natrijum piruvata. Ćelije su subkultivisane ili sakupljene kada su kulture dosegle oko 85% konfluencije. Ćelje su rutinski podeljene 1:5 svaka tri dana.

[0255] Za fosforilaciju tirozina, ćelije su gajene do konfluencije od 80-90% u T-225 laboratorijskim bocama. Medijum je uklonjen i zamenjen sa svežim medijumom bez seruma i inkubiran preko noći. Nakon nedostatka seruma, ćelije su sakupljene iz svake laboratorijske boce, istaložene i konačna koncentracija 20x10<6>ćelija po stanju je ponovo suspendovana u 0,5 ml medijuma bez seruma.

[0256] RhIL-6 (0,1 µg/ml) su prethodno-inkubirane pri 37°C tokom 15 minuta sa sledećim reagensima: 0.5 ml samog medijuma, anti-IL-Ab (10 µg/ml); i sIL-6R (0.2 µg/ml). SIL-6R (0.2 µg/ml) i anti-IL-6 Ab (10 µg/ml) su zatim dodati ćelijama prethodno inkubiranim sa anti-IL-6 Ab i sIL-6R, redom, za inkubaciju na 37°C tokom 15 minuta. Ćelije su zatim kombinovane sa medijumom kao negativna kontrola i IL-6/ Ab/sIL-6R kompleksa i inkubirane na 37°C tokom 6 minuta. Ćelije su dva puta isprane u ledeno hladnom TBS i kuglice -pelete ćelija su obrađene kao što je opisano u Odeljku 5.4 i uskladištene na -70°C.

[0257] Za imunoprecipitaciju, ćelijske pelete su lizirane u 1 ml pufera za liziranje (50 mM Tris, pH 7.5, 300 mM NaCl, 0.5% Triton-X-100) (T-9284, Sigma, St. Louis, MO) koji sadrži kompletni koktel tableta inhibitora proteaze (1697498, Roche, Basel, Switzerland). Ćelije su mešane centrifugiranjem 30 sekundi i inkubirane na -70°C tokom 20-60 minuta. Čelijski debris-ostatak je uklonjen putem centrifugiranja na 13.000 rpm (okretaja u minuti) tokom 20 minuta. Da bi se smanjilo nespecifično pozadinsko bojenje, uzorci su prethodno obrisani inkubacijom sa 2 µg zečjeg IgG (15006, Sigma, St. Louis, MO) plus 50 µl Protein A agaroze (SC-2001, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) 1 sat na 4°C na orbitalnoj mešalici. Agarozne čestice su uklonjene centrifugiranjem pri 2500 rpm tokom 5 minuta. Bistri lizati su preneseni u epruvete za mikrocentrifugiranje i inkubirani sa anti-STAT3 (2 µg/ml) (SC-7179, Santa Cruz Biotechnology) preko noći na 4°C na orbitalnoj mešalici, nakon čega sledi dodavanje 50 µ protein A agaroze čestica-kuglica i inkubirane tokom 2 sata na 4°C na orbitalnom šejekeru. Agarozne kuglice su sakupljene centrifugiranjem na 2500 okretaja u minuti tokom 5 minuta i isprane 5 puta u ledeno hladnoj TBS, na 4°C. Agarozne perlice su zatim resuspendovane u 40 ml tzv. "Laemmli" uzorku pufera plus DTT (NP0007-465030, Invitrogen, Carlsbad, CA)i zagrevane na 95°C tokom 5 minuta.

[0258] Uzorci su ponovo rastvoreni na 3-8% NuPage Bis-Tris gelu (EA0375BOX, Invitrogen, Carlsbad, CA) sa pokrenutim puferom (NP0002-465026, Invitrogen, Carlsbad, CA) pri 100 V tokom 1 sata. Proteini su prebačeni na Nitroceluloznu membranu (LC2001, Invitrogen, Carlsbad, CA) pomoću pufera za prenos (NP0006-465029, Invitrogen, Carlsbad, CA), na 30 V tokom 1 sata. Membrane su blokirane u 10% masnoći mleka u prahu (Nestle, Glendale, Californija) u TBS-T preko noći na 4°C. Nakon nekoliko ispiranja u TBS-T na sobnoj temperaturi, membrane su inkubirane sa mišjim monoklonalnim anti-p-STAT3 Ab (SC-8059, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), koji je razređen 1: 1000 u TBS-T tokom 4 sata na 4°C na orbitalnom šejkeru. Posle nekoliko ispiranja, membrane su zatim inkubirane sa magarećim anti-mišjim IgG-HRP (1:1000) (SC-2318, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) na sobnoj temperaturi tokom 2 sata na orbitalnom mikseru. Posle nekoliko ispiranja, uzorci su detektovani upotrebom ECLplus Western Blot Analize Reagenasa i

4

analize kita (RPN2108, Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) prateći protokol proizvođača i vizualizirani putem izlaganja ECL filmu. Membrane su zatim uklonjene sa Ab potapanjem u 100 mM DTT, 2% SDS, 62.5% mM Tris-HCl, pH 6.7 pri 100°C tokom 30 minuta uz mućkanje. Membrane su zatim isprane u TBS-T i blokirane preko noći sa 10% obezmašćenim mlekom u prahu. Membrane su zatim isprane i inkubirane sa anti-STAT3 (1:1000) (SC-7179, Santa Cruz Biotechnology) u TBS-T tokom 2 sata na 4°C, isprane 5 puta nakon čega sledi 1 sat inkubacije sa kozjim anti-zečjim IgG-HRP (1:1000) (SC2030, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) i otkrivene pomoću ECLplus. Sve membrane su rutinski uklonjene i ponovno ispitane sa STAT3 da pokažu prisustvo STAT3 proteina.

[0259] Rezultati su pokazali da humano modifikovano anti-IL-6 antitelo blokira IL-6-posredovan STAT3 fosforilacijom, ključnu komponentu u IL-6 signalnom putu (Slike 5A i 5B). Humano modifikovano anti-IL-6 antitelo (AME-19A) inhibira IL-6/sIL-6R-indukovanu STAT3 fosforilaciju. Rekombinantno humano IL-6/sIL-6R indukobano fosforilacijom STAT3 je otkriveno u THP-1 ćelijama (Slika 5B). Dodatak 10 µg/ml humanog modifikovanog anti-IL-6 antitela (AME-19A) ili himernog anti-IL-6 antitela u potpunosti inhibira fosforilaciju STAT3 (Slika 5B). Slika 5A pokazuje prisustvo slične količine nefosforilovanog STAT3 proteina u svim uzorcima koji odgovaraju različitim humanim modifikovanim anti IL-6 klonovima. Kao što se ovde koristi, CNTO328 (ili 328), označava himerno, humano-mišje antitelo (takođe označen kao divlji tip (WT)), 150 označava klon AME-22a, 143 označava klon AME-23a, 140 označava klon AME-20b, 136 označava klon AME-19a, 130 označava klon AME-18a, 106 označava klon AME-A16,104 označava klon AME-A9.

In vivo efikasnost Humanog modifikovanog anti-IL-6 antitela

[0260] Efikasnost humanog modifikovanog anti-IL-6 antitela je ispitana u dva različita in vivo modela. Prvo, efekti humanog modifikovanog i himernog anti-IL-6 antitela su testirani i u odnosu na humano IL-6-indukovano Matrigel testom angiogeneze kod miševa.200 ng/ml humanog IL-6 je bilo uključeno u Matrigel čepu. Dva Matrigel čepa su ubrizgavani u svaki "goli" miš. Grupe od šest miševa je primilo i.v. injekciju od 1, 3 ili 6 mg/kg humanog modifikovanog ili himernog anti-IL-6 antitela. PBS ili kontrolni izotip je takođe davan za kontrolne grupe. Čepovi su uklonjeni 7-og dana i angiogeneza je merena sadržajem hemoglobina, dužininom krvnih sudova, brojem krvnih sudova u čepovima. Rezultati su pokazali da humano IL-6 (PBS grupa) stimuliše angiogenezu u Matrigelovom modelu čepa kao što je mereno pomoću sva tri parametra.

[0261] Humano modifikovano anti-IL-6 antitelo (AME-19A) inhibira prosečan broj kapilara u Matrigel čepovima. Osim toga, humano modifikovano anti-IL-6 antitelo (AME-19A) inhibira prosečnu dužinu kapilara u Matrigel čepovima. Takođe, humano modifikovano anti-IL-6 antitelo (AME-19A) inhibira nivoe hemoglobina u Matrigel čepovima-punjenjima.

[0262] Pored toga, i humano modifikovano (AME-19A) i himerno anti-IL-6 antitelo zvisno od doze inhibiše IL-6-posredovanu angiogenezu kod "golih" miševa. Konačno, humano modifikovano i himerno anti-IL-6 antitelo je pokazalo komparabilnu aktivnost u inhibiranju IL-6-indukovane angiogeneze po 6 mg/kg, najviše testirane doze. Iako himerno anti-IL-6 antitelo značajno inhibira humanu IL-6-indukovanu angiogenezu na 3 mg/kg, kao što je mereno dužinom krvnog suda i brojem krvnih sudova nije bilo statistički značajne razlike između humanog modifikovanog i himernog anti-IL-6 antitela na ovim dozama.

[0263] Dodatni in vivo model je razvijen da dalje procenjuje efekat humanog modifikovanog anti-IL-6 antitela na humanu IL-6-indukovanu akutnu fazu reaktanta, proizvodnju serumskog amiloidnog proteina A (SAA) kod Balb/C miševa. Miševi su primili i.p. primenom 0.01, 0.5 ili 5 mg/kg humanog modifikovanog anti-IL-6 antitela 4 sata pre i.v. primene od 5 µg/kg humanog IL-6 (Slika 6). PBS i kontrolni izotip mAt su korišćeni kao kontrole. Nivoi SAA seruma su određeni na 16 sati nakon injekcije IL-6. I humano modifikovano i himerno anti-IL-6 antitelo značajno inhibiše humanu IL-6-indukovanu proizvodnju SAA u Balb/C miševa na 0.5 i 5 mg/kg, i humano modifikovano anti-IL-6 antitelo značajno inhibiše proizvodnju SAA kod najniže testirane doze. Međutim, nema statistički značajnih razlika uočenih između humanog modifikovanog i himerinog anti-IL-6 antitela na sve tri testirane doze (Slika 6).

[0264] Slika 6 prikazuje da humano modifikovano anti-IL-6 antitelo inhibiše humanu IL-6-indukovanu proizvodnju SAA. Svaka tačka predstavlja srednju vrednost SAA za svaku životinju i linija predstavlja srednju vednost svih tačaka podataka u svakoj grupi. Par-mudrog poređenja je sproveden i tzv. "Tukey’s" 95% simultani intervali pouzdanosti su korišćeni u cilju kontrolisanja ukupne greške tipa I (** p<0.001, *p<0.05).

Primer 5 - Terapijsko obrazloženje za anti-IL-6 mAt

Reumatoidni artritis. Efekat anti-IL-6 mAt na Kolagenom Indukovani Artritis (CIA)-životinjski model

reumatoidnog artritisa

Preklinički in vivo modeli bolesti

[0265] IL-6 je ciljan na različitim in vivo modelima. I anti-mišje IL-6 antitelo pacova je korišćeno u standardnim mišjim modelima ili humanizovano anti-IL-6R (80kDa) mAt (MRA, Chugai) je korišćeno u modelima primata i u humanom/mišjem SCID modelu. U mišjem kolagen indkovanom artritisu (CIA), anti-IL-6 je efikasano u prevenciji bolesti ako se koristi rano (0 ili 3 dana nakon imunizacije sa kolagenom), ali ne pri kasnijim vremenskim tačkama. U humanom/mišjem modelu SCID transplantata, u kojem je humano sinovijalno tkivo transplantirano imunodeficijentnom mišu, MRA lečenje je dovelo do skupljanja tkiva implantata i smanjenja inflamatornih ćelija i osteoklasta. U CIA kod cinomolgus majmuna, MRA je inhibirala razvoj artritisa i poboljšane su mere akutne faze.

[0266] Efekat surogata anti-mišjeg IL-6 mAt u razvoju bolesti je procenjen u CIA modelu. Rezultati pokazuju da i.p. primena anti-mišjeg IL-6, na lmg/miš/nedelju dana pre izazivanja bolesti značajno suprimira razvoj kolagenom indukovanog artritisa što se vidi po jasnom smanjenju težine bolesti. Artritis je izazvan u 8-nedelja staroj DBA/1 LacJ miša sa 100 mg goveđeg kolagena tipa II u Freundovom kompletnom adjuvansu (FCA) intradermalno u bazu repa. Miševi su klinički svakodnevno praćeni na početku bolesti. Anti-IL-6 mAt ili izotip kontrol mAt je davan i.p.2 dana pre CIA indukcije i nedelju dana nakon toga po 1 mg/mišu. Ocena artritisa je utvrđena na osnovu oticanja, eritema i diskonfiguracije zgloba.

[0267] Histopatološki podaci su potvrdili kliničko zapažanje da nedeljno i.p. injekcija anti-mišjeg IL-6 mAt značajno poboljšava parametre kolagenom indukovanogi artritisa. Svi ispitani parametri artritisa uključujući inflamatorne odgovore (sinovitis i formiranje panusa) i erozivne promene (erozije i ukupnoj konfiguraciji zgloba) su značajno poboljšani u anti-mišjim IL-6 tretiranim miševima u poređenju sa kontrolnim mAt-tretiranim životinjama. Anti-IL-6 mAt potiskuje artritis na histopatološkom nivou. Sinovitis je ocenjen na osnovu debljine sinovijalne membrane; formiranje panusa je ocenjeno na osnovu obima panusa u odnosu na zajednički prostor; i erozija je ocenjena na osnovu obima u hrskavici i subhondralnoj kosti.

[0268] Gubitak proteina matriksa hrskavice je značajno smanjen kod miševa tretiranih sa anti-mišjim IL-6 mAt. Reprezentativne zajedničke sekcije dobijene od kontrolnog i anti-IL-6 mAt tretiranih životinja na kraju studije (dan 53) su ispitani bojenjem Toluidinskim Plavim za matriks hrskavice.

[0269] Mikro-CT analiza podržava kliničko opažanje da je efekat anti-mišje IL-6 terapije izvršen na nivou progresije bolesti u okviru pojedinog zgloba. Vizualni pregled tipičnih 3D CT slika pokazuje značajni stepen erozivnih promena koje se događaju u izotipom kontrolnoj mAt- tretiranoj grupi u poređenju sa pretežno blagim inflamatornim promenama mekih tkiva u zglobovima sa anti-mišjem IL-6 tretiranim životinjama. Eksperimenti su izvedeni sa reprezentativnim tretiranim životinjama sa kontrolnim mAt i anti-mišjim IL-6 mAt tretiranim životinjama.

Lupus. Efekat anti-IL-6 u NZBAV F1 miša

Pre-klinički in vivo modeli bolesti

[0270] Mišji modeli postoje za SLE i oni imaju bliske sličnosti sa bolešću kod ljudi. Istraživanja MRL/lpr i NZB/W F1 sojeva su pokazale hiperproliferaciju B ćelije, proizvodnju autoantitela i depoziciju imuno komleksa koji liče na bolest kod ljudi. Anti-IL-6 mAt je pokazalo efikasnost u inhibiciji proizvodnje autoantitela, smanjenju proteinurije, i poboljšavanju preživljavanje životinja u NZB/W F1 miševa.

[0271] Efekat surogata anti-mišjeg IL-6 mAt na razvoj lupusne bolesti je procenjen u NZB/W F1 miševa. Preliminarni rezultati su pokazali da i.p. davanje anti-mišjeg IL-6 mAt po 1mg/mišu/nedeljno za 22 nedelje potiskuje proizvodnju anti-dsDNK autoantitela, glavnog patogenog autoantitela na ovom modelu bolesti (Slika 7). Nivoi anti-dsDNK autoantitela u anti-IL-6 mAt tretiranih životinja su bili konstantno niži tokom ispitivanja u poređenju sa onim u fiziološkom rastvoru i kontrolom Ab tretiranih životinja.

[0272] Kao što je objašnjeno iznad, Slika 7 prikazuje inhibiciju proizvodnje anti-dsDNK autoantitela pomoću anti-IL-6 mAt u NZB/W F1 miševa. Individualna O.D. vrednost za svaki uzorak je normalizovana do pozitivnog kontrolnog seruma i predstavljena kao % pozitivne kontrole. Svaka tačka predstavlja % pozitivne kontrole svakog uzorka i linija predstavlja srednju vrednost svih tačaka podataka u svakoj grupi. Značajna razlika je označena kao * p <0.01.

[0273] Pored toga, anti-IL-6 mAt je inhibiralo B-ćelijsku proliferaciju i smanjilo oštećenje bubrega kada je ispitan podskup životinja. Dok nije bilo značajne razlike u proliferaciji T ćelije među različito tretiranim grupama na kraju ispitivanja, B-ćelijska proliferacija indukovana sa anti-IgM i anti-CD40 bila je niža u anti-IL-6 mAt tretiranih miševa u poređenju sa onim miševima tretiranim fiziološkim rastvorom tokom vremena, konkretno, posle 34 nedelje. Ovaj rezultat je u skladu sa redukovanom proizvodnjom anti-dsDNK autoantitela opisanom iznad i pokazuje da autoreaktivne B ćelije mogu biti direktne i dominantne mete za anti-IL-6 mAt tretman.

[0274] Histopatološka analiza je pokazala da životinje u istraživanju mogu biti kategorizovane u 3 različite grupe bolesti bubrega (blage, umerene i teške) (Tabela 9). Patologija bolesti bubrega u NZB/W F1 miša ukazuje na pomešanu limfoidnu hiperplaziju i imuno složeno deponovanje u glomerularnoj bazalnoj membrani.

[0275] Životinje tretirane sa anti-IL-6 mAt razvile su manje ozbiljne bolesti bubrega. Perivaskularna pomešana limfoidna hiperplazija i deponovanje proteina je bilo odsutno kod anti-IL-6 mAt tretiranih životinja dok su životinje tretirane sa fiziološkim rastvorom i kontrolne Ab razvile umerenu i tešku perivaskularnu pomešanu limfoidnu hiperplaziju i deponovanje proteina. Dalje, imuni kompleks deponovanja u glomerularnoj bazalnoj membrane je bio blag kod anti-IL-6 mAt tretiranih životinja u poređenju sa tim u druge dve tretirane grupe. Dalja disekcija mehanizma delovanja anti-IL-6 mAt na B, T i makrofag ćelijskih funkcija se izvodi kao što ove ćelije imaju kritičnu ulogu u patogenezi SLE.

Tip II Dijabetes Melitus

[0276] IL-6 je pokazalo da ima važnu ulogu u razvoju insulinske rezistencije povezane sa gojaznošću. Međutim, in vitro i in vivo podaci generisani do danas i podržavaju i protive se njegovoj mogućoj ulozi u insulinskoj rezistenciji.

In vitro eksperimenti

[0277] Eksperimenti su izvedeni da bi se bolje razumeli efekti koje IL-6 može imati na insulinsku signalizaciju i na biološke efekte i funkciju insulina, kao što je potrošnja glukoze, regulacija gena i srodni mehanizmi upotrebom in vitro modela od insulin osetljivih tkiva (3T3 L1 ćelije za masno tkivo, HepG2 ćelije za ćelije jetre, C2C12 ćelije za skeletne mišiće) i in vivo modeli insulinske rezistenije i T2DM, kao što su db/db miša.

[0278] Podaci In vitro sugerišu da IL-6 ispoljava svoje primarno delovanje na signaliziranje insulina u jetri. IL-6 lečenje HepG2 ćelija dovodi do inhibicije insulina indukovanog Akt fosforilacijom. Ovaj inhibitorni efekat IL-6 na insulinsko signaliziranje je blokiran anti-IL-6 antitelima. Promene metabolizma glukoze i efekti insulina u jetri se smatraju da predstavljaju glavne uzroke razvoja insulinske rezistencije i T2D. Efekti IL-6 na insulinsko signaliziranje u 3T3 L1 ćelijama (L1 adipocitna ćelijska linija) i C2C12 (ćelijska linija skeletnih mišića) su ispitivani za utvrđivanje mehanizmama IL-6 u T2D.

[0279] 3T3 L1. Eksprimenti su izvedeni upotrebom 3T3 L1 adipocitne ćelijske linije miša. U 90% diferenciranih 3T3 L1 ćelija, procenjen je efekat IL-6 na insulin indukovano uzimanje glukoze. U ovim eksperimentima, tretman sa 10 ng/ml od TNFα tokom 24 sata dosledno inhibira insulinom indukovano uzimanje glukoze dok 20 ng/ml IL-6 nije imao nikakvog efekta. Ovi podaci sugerišu da IL-6 delovanje na masno tkivo nije primarni mehanizam IL-6 posredovane insulinske rezistencije, već masno tkivo može biti glavni izvor IL-6 koji zatim utiče na insulinsku osetljivost u jetri i mišićima. Isti podaci su dobijeni korišćenjem diferenciranih primarnih humanih adipocita iz potkožnog-subkutanog depoa. IL-6 delovanje na uzimanje glukoze pomoću primarnih humanih adipocita iz depoa visceralnog masnog tkiva je testirano jer taj depo bi mogao biti relevantniji za gojaznost povezanu insulinskom rezistencijom.

[0280] HepG2. HepG2 ćelije su izabrane kao in vitro predstavnik tkiva jetre. HepG2 ćelije su ćelijska linija humanog hepatoma gde je efekat IL-6 na insulinsku signalizaciju ranije prikazan. U eksperimentima, 20 ng/ml IL-6 blokira insulin indukovanu Akt fosforilaciju, ključnu kinazu u insulin signalizirajućem putu, sa maksimalnim efektom koji se može uočiti nakon inkubacije od 60 minuta; ovo je u skladu sa rezultatima opisanim u naučnoj literaturi.

[0281] Akt fosforilacije na sub-konfluentnim HepG2 ćelijama u posudama od 10 cm je meren posle rh IL-6 (20 ng/ml) inkubacije tokom 30, 60, 90 i 120 minuta. Tokom poslednjih 5 minuta inkubacije, 0.5 nM, 1 nM i 5 nM insulina su dodati da indukuju Akt fosforilaciju. Ćelije su lizirane korišćenjem modifikovanog RIPA pufera za lizu i Akt fosforilacija je izmerena pomoću Ser-Fosfo-Akt ELIZA. Rezultati su dobijeni upotrebom pAkt i Akt ELIZA kompleta (BioSource).60 minuta od IL-6 lečenja, u prisustvu fiziološke koncentracije insulina (0.5-1nM). Akt fosforilacije je inhibiranan ~50% u odnosu na kontrolnu grupu. Kvantifikovane su koncentracije proteina sa Pierce BCA protein oglednim kompletom.

Efekat IL-6 Antitela

[0282] Izmerena je sposobnost humanog modifikovanog anti-IL-6 antitela da inhibira IL-6 efekte na insulin-indukovanu Akt fosforilaciju.20 µg/ml humanog modifikovanog anti-IL-6 antitela je moglo da inhibira IL-6 efekte u HepG2 ćelijama. Slike 8A i 8b prikazuju efekat IL-6 u prisustvu i odsustvui humanog modifikovanog anti-IL-6 antitela na insulin indukovanu Akt fosforilaciju.

[0283] U gornjoj slici (Slika 8A), podaci predstavljaju srednju /- SEM. (* Značajno u poređenju na (+) insulin, IL-6, P = 0.029; ** Značajno u poređenju na (+) insulin IL-6, P=0.02). Sub-konfluentne HepG2 ćelije su tretirane sa 20 ng/ml IL-6 tokom 60 minuta. Tokom poslednjih 5 minuta tretmana, 1 nM insulina je dodat i ćelije su lizirane upotrebom modifikovanog RIPA pufera. Uzorci su analizirani pomoću ELIZA koji detektuje fosforilaciju na Ser 473 Akt. Svi podaci su normalizovani prema ukupnoj Akt izmerenoj pomoću ELIZA. AME-19a tretman je bio u stanju da ponovo uspostavi normalnu Akt signalizaciju.

[0284] U donjoj slici (Slika 8B), prikazan je predstavnik vestern blota. Najbolje trake uključuju uzorke tretirane sa IL-6 (20 ng/ml, 60 min, 5 min sa 1 nM insulina), AME-19a (20 ug/ml /- IL-6, na 20 ng/ml tokom 60 minuta, 5 minuta sa 1 nM insulina) ili puferom. Blot je ispitivan sa anti-fosfo Ser/Akt antitelom (gornji panel-dijagram) (pS473, Biosource). Niže trake (isti je skinut i ponovno ispitan sa anti-Akt iz BioSource) pokazuju da je ekvivalentni protein nanesen na traku.

[0285] Metod: HEPG2 ćelije su gajane u 100 mm posudama za kulturu tkiva do konfluentnosti. Ćelije su ostavljene preko noći u DMEM-1% BSA. AME-19a (20 ug/ml) je inkubiran na ćelijama tokom ~ 30 minuta pre dodavanja IL-6. IL-6 (20 ng/ml) /- AME-19a (20 ug/ml) su bile inkubirane tokom ~ 30 minuta pre dodavanja u ćelije. Uzorci su inkubirani na ćelijama tokom 60 minuta, na 37°C; zatim 1 nM insulina (konačna koncentracija) je dodat u ćelije tokom 5 minuta, na sobnoj temperaturi. Ćelije su isprane odmah sa 3 ispiranja ledeno hladnim PBS. Ploče su zamrznute do lize. Fosfo Akt i ukupan Akt su određeni upotrebom ELIZA kompleta (BioSource i Sigma). Referenca: JJ Senn, PJ Kover, IA Nowak i RA Mooney. Interleukin 6 indukuje ćelijsku insulinsku rezistenciju u hepatocitima. Dijabetes.

51: 3391-3399, 2002.

Primarni hepatociti pacova

[0286] Primarni hepatociti predstavljaju relevantniji in vitro sistem pogodan za ispitivanje efekta IL-6 i anti-IL-6 antitela (ili drugih IL-6 antagonista) na insulin signaliziranje i efekat insulina na proizvodnju glukoze od jetre. Za određivanje aktivacije PI3 kinaze (PI3K) u hepatocitima pacova tretiranih insulinom, IL-6 i/ili IL-6 mAt, izolovane ćelije su tretirane sa insulinom u prisustvu i odsustvu od 5 ng/ml IL-6, i fosforilacija insulinskog receptora, IRS-1 (Slika 12A), i Akt (Slika 12B) je određena upotrebom ELIZA testova i Western blot analizom. Pored toga, efekti IL-6 na insulin stimulisane IRS1/p85 asocijacije su ispitane (Slike 11A i B). Eksperimenti su izvedeni kao što sledi:

Primarni hepatociti pacova (~ 2 meseca starosti) u 6 jažica kolagen obloženim pločama su uravnoteženi-ekvilibrisani preko noći u medijumu Hepatocizim. Sledećeg dana, ćelije su ostavljene tokom 6 sati u DMEM-1% BSA-Penn strep; zatim su inkubirane sa hIL- 6 (5 ng/ml); anti-IL-6 antitelom (AME-19a) (20 ng/ml) ili anti-IL-6 antitelom (AME-19a) hIL-6 tokom 90 minuta na 37°C. Ćelije su prethodno tretirane tokom 1 sata sa anti-IL-6 antitelom (AME-19a) pre dodavanja kombinacije. Kombinacija je takođe prethodno inkubirana pre dodavanja ćelijama.5 nM insulina (od BioSource) je dodato ćelijama tokom 5 minuta; ćelje su zatim aspirirane - ispražnjene i odmah lizirane sa BioSource ekstrakcionim puferom inhibitori proteaze. Lizati su centrifugirani i supernatanti su razblaženi 1:10 i testirani u ELIZA (od BioSource).

IRS1/p85 Associjacija:

[0287] Jednake količine proteina (45 µg) su inkubirane preko noći sa 2 µg anti-IRS-1 poliklonalnog antitela (iz Upstate, Item # 06-248). Uzorci su zatim imunoprecipitirani sa protenskim A kuglicama tokom 1 sata i isprani sa uzorkom pufera 3 x za SDS-PAGE (Natrijum Dodecil Sulfat-Elektroforeza na poliakrilamidnom gelu). IP uzorci su zatim prikazani na 4-12% SDS- Page (Poliakrilamid gel elektroforezi) gelu zatim preneseni na membranu za Vestern blot analizu. Membrane su ispitane sa: (1) 1: 100 razblaženog p85 mAt (iz Upstate, Item # 05-217) za IRS-1 povezanog p85, tj. aktivnog PI3K (kao što je prikazano na Slici 11A); i (2) 1: 600 razblaženog IRS-1 mAt (iz BD Biosciences, Item # 611395) za ukupan IRS-1 kao kontrola učitavanja (kao što je prikazano na Slici 11B).

[0288] Podaci pokazuju da IL-6 tretman dovodi do smanjenja insulin- indukovane fosforilacije IR, IRS-1 i Akt. Ovaj efekat IL-6 je ukinut kada su ćelije prethodno tretirane sa anti-IL-6 antitelom (klon AME-19a). Pored toga, IL-6 inhibirani insulin indukuje p85 (subjedinice od PI3K) povezan sa IRS-1. Ponovo, ovaj efekat IL-6 je inhibiran prethodnim tretmanom sa anti-IL-6 antitelom.

In vivo eksperimenti

[0289] Efekti IL-6 na insulinsku osetljivost nisu opsežno testirani na životinjama. Da bi se procenilo da li bi anti-IL-6 terapija mogla poboljšati osetljivost na insulin i T2DM, db/db miševa i C57B16 mužjaci na ishrani bogatoj mastima su tretirani sa komercijalnim anti-mišjim IL-6 antitelom (dobijenim iz R & D Sistema).

db/db miševi

[0290] Efekti anti IL-6 tretmana su testirani upotrebom db/db miševa različitog doba. Miševe između 8-10 nedelja starosti karakteriše hiperinsulinemija i insulinska rezistencija, predstavljajući tako ranije faze bolesti, dok miševe starosti od 12 do 14 nedelja odlikuje povišeni sadržaj-nivo glukoze pored hiperinsulinemije, predstavljajući tako uznapredovale faze T2DM. Obe starosne grupe miševa se koriste za testiranje sposobnosti anti IL-6 terapije za poboljšanje osetljivosti na insulin i kontrole glikemije u intraperitonalnom testu tolerancije glukoze (ipGTT).

[0291] db/db miševi imaju nefunkcionalni signalizirajući leptin zbog mutacija unutar receptora leptina. Ovi miševi razvijaju gojaznost, hiperinsulinemiju i insulinsku rezistenciju sa starošću, pri čemu su prvi simptomi otkriveni kada su miševi stari 6-8 nedelja. Dve grupe miševa različitiog doba-uzrasta - 8 i 12 nedelja starosti su tretirani sa 5 mg/kg anti IL-6 mAt i izveden je intraperitonealni test tolerancije glukoze (ipGTT) prvog i 7-og dana posle tretmana. Raspored tretmana je pokazan na Slici 15.

[0292] U 8 nedelja starih životinja, tretman sa anti IL-6 mAp nije imalo efekat na klirens glukoze tokom GTT. Anti IL-6 mAt tretman vodi do poboljšanja tolerancije glukoze (GT) u 12 nedelja starih životinja, iako efekat nije bio statistički značajan (p = 0.063). Ovo poboljšanje u GTT je viđeno 7-og dana nakon tretmana. Pored toga, uzorci seruma pre i posle završetka istraživanja su analizirani za svoje adipokin i adiponektin profile. Nivoi IL-6, TNFα i MCP-1 su bili ispod nivoa detekcije-otkrivanja. Ovaj podatak uzet zajedno sa rezultatima iz ipGTT može sugerisati da: db/db životinja nisu dobar model za proučavanje anti IL-6 efkta na otpornost na insulinsku rezistenciju; i nivoi u tkivima IL 6 su relevantniji za moguću ulogu koju IL-6 može imati u razvoju insulinske rezistencije i T2DM.

Ishranom Izazvana Gojaznost (DIO) - Žvotinjski Model za Gojaznost i Insulinsku Rezistenciju

[0293] C57/B1 mužjaci miševa su hranjeni ishranom koja sadrži 60% masti za 20-35 nedelja. Oni su razvili gojaznoat (prosečna telesna težina je bila 50.5 grama) i povećani nivo glukoze u krvi natašte (FBG> 145 mg/dl). Pored toga, oni su smanjili GT. DIO životinje su tretirane sa 10 mg/kg mišjeg anti IL-6 Ab (R&D Sistemi). Sveukupno, su primili 50 mg/kg od anti IL-6 mAt tokom perioda od 3 nedelje. ipGTT je izveden posle prve 2 doze (dan 5.), nakon 4 doze ( 12. i 16. dana) i nakon 5 doza ( 23. dana). U isto vreme, krv je dobijena za merenje adipocitokina i adiponektina.

[0294] Anti IL-6 tretman nije poboljšao toleranciju glukoze do 5 i 12 dana; međutim, kada je izveden 16. i 23. dana, poboljšanje kliresa glukoze kao i nivoi glukoze su bili zabeleženi. Ovo poboljšanje je doseglo statistički značaj na 39, 60 i 90 minuta tokom GTT.

[0295] U drugom setu eksperimenata, DIO životinje su tretirane nedeljno (2 doze tokom prve nedelje i 1 doza svake naredene nedelje u periodu od 4 nedelje) sa 10 i 20 mg/kg anti IL-6 Ab i 20 mg/kg IgG kontrole izotopa i.p. putem. HOMA-IR (posle 2, 4 i 6 nedelja lečenja-tretmana), ipGTT, ipITT i adipokin profil (6 nedjelja od lečenja) su izvedeni.

HOMA-IR Analiza na Anti-IL-6 Ab Tretiranim DIO Životinjama:

[0296] U ovim istraživanjima je došlo do smanjenja glukoze u krvi natašte i nivoa insulina u DIO životinjama tretiranih sa 10 i 20 mg/kg mišjeg anti-IL-6 Ab i kontrole izotipa. Životinje su krvarile i nivoi glukoze natašte i insulin su određeni pomoću "Trace"/DMA glukoze (vola) (termo Elektron Korp) i Ultra Senzitiv Insulin Pacova ELIZA (Crystal Chem), redom. Ove vrednosti su korišćene da se odredi HOMA-IR. HOMA-IR indeks odražava stanje osetljivosti na insulin i to dobro korelira sa nalazom iz tzv."clamp" istraživanja. HOMA-IR je izračunat formulom: (glukoze u (mM) X insulina natašte (mIU/Lit))/22.5 (Slike 13A, B i C).

[0297] Poboljšanja u HOMA-IR su uočena nakon 2, 4 i 6 nedelja terapije (Slike 13A-C prikazuju podatke nakon 6 nedelja lečenja). Na kraju ispitivanja, i ipGTT ipITT su izvedeni. U oba testa, anti-IL-6 lečenje-tretman (20 mg/ ml) značajno je poboljšao oba i "ekskurziju" glukoze i klirens kada se uporede sa izotipom tretiranih životinja.

1

[0298] Analiza adipokina i citokina u uzorcima seruma iz kontrolnih i anti-IL-6 tretiranih životinja pokazuje da neutralizacija IL-6 dovodi do smanjenja nivoa u cirkulirajućim IL-6 i TNFα uz smanjenje nivoa trenda MCP-1 i rezistina. U drugom setu podataka, nivoi adiponektina su povećani sa anti-IL-6 tretmanom.

[0299] Izvedena je histološka analiza uzoraka jetre iz lečenja i kontrolne grupe. Uzorci su obojeni sa tzv." Oil Red O " bojenjem da se odredi sadržaj lipida u parenhimu jetre. Sadržaj lipida u jetri DIO životinja se smanjio u odgovoru na tretman mišjim anti-IL-6 antitelom.

[0300] Bojanje otkriva da su 34% od delova uzorka jetre povezani sa masnoćom u netretiranih životinja i samo 8% u 20 mg/kg anti-IL-6 tretiranih životinja (Slike 14A-F). Slike 14A i D predstavljaju kontrolnu grupu; Slike 14B i E predstavljaju netretirane DIO životinje; i Slike 14C i F predstavljaju anti-IL-6 tretirane životinje. Povećani sadržaj lipida u jetri je povezan sa razvojem insulinske rezistencije i Tip 2 Dijabetes Melitusa. Prema tome, razumljivo je da IL-6 neutralizacija dovodi do poboljšanja osetljivosti na insulin i T2DM utičući na metabolizam lipida u jetri. Ovi podaci uzeti zajedno snažno sugerišu ulogu IL-6 u patologiji Tip 2 Dijabetesa i da neutralizacija IL-6 može poboljšati osetljivost na insulin.

Dodatna Ispitivanja

[0301] Efekti IL-6 u prisustvu ili odustvu humanog modifikovanog anti-IL-6 antitela na insulin stimuliraju IRS 1 fosforilaciju, povezivanje sa p85/PI3K, insulin receptor (IR) fosforilaciju, sinteze glikogena, i uključenost SOCS3 i STAT signalizaciju u HepG2ćelijama su praćeni. Dodatni eksperimenti ispituju efekat IL-6 na glukozu indukovanu lučenjem insulina iz pankreasnih ostrvaca. Objavljeni podaci do danas opisuju oba i inhibitorne kao i stimulativne efekte IL-6 na lučenje insulina iz ostrvca pankreasa. Sveže izolovana ostrvca pacova (iz "Liefscann") su tretirana sa IL-6 i humanim modifkovanim anti-IL-6 antitelom (AME-19a), u prisustvu ili odsustvu glukoze. Nivoi insulina lučeni iz ostrvca pod različitim tretmanima su mereni.

[0302] C2C12. C2C12 ćelije su korišćene za proučavanje efekta insulina na skeletne mišiće. Izvođeni su eksperimenti da se ispita -ekspresija IRS1 i Glut4, insulinom indukovana IRS 1 fosforilacija i efekti IL-6 na dejstvo adiponektina.

Prednost:

[0303] Inhibicija IL-6 aktivnosti putem IL-6 antitela iz ovog pronalaska može predstavljati značajan terapijski napredak s obzirom da će se moći poboljšati osetljivost na insulin i metabolička kontrola bez nuspojava od postojećih sredstava. Pored toga, trenutne terapije čine malu kontrolu sistemske inflamacije, kojima se predlaže da se naglašava uzrok T2DM, povezan dijabetičkim komplikacijama. Terapije poput IL-6 antitela ovog pronalaska, pored povećanja osetljivosti na insulin, će očekivati da inhibiraju sistemsku inflamaciju i spreče stvaranje dijabetičkih komplikacija.

[0304] Broj pacijenata pogođenih T2DM raste i procjenjuje se proširenje na 300 miliona pojedinaca do 2025. Anti IL-6 antitelo se može koristiti kao monoterapija ili u kombinaciji sa drugim već postojećim OAD, kao što su sulfonilureaze, bigvanidi (npr., Metformin), tiazolidindioni, meglitinid (npr., repaglinid), inhibitori alfa-glukozidaze (npr. akarboza). Osim toga, može se koristiti u kombinaciji sa insulinom i drugim terapeuticima, kao što je da se poboljša osetljivost na insulin i kontrola glikemije i izbegavanje hipoglikemijskih događaja koji su povezani sa tretmanom insulina.

2

Takođe se očekuje da pored poboljšanja osetljivosti na insulin i regulacije nivoa glukoze u T2D i Metaboličkog Sindroma pacijenata, anti IL-6 terapija može imati efekat na CV promene često uočene kod ovih pacjenata. Videti Saltiel, AR, and Kahn, CR. 2001. Nature 414:799-806; Hansen, BC., 1995. Diabetes Care 18:A2-A9; Diabetes Prevention Program research group. 2002. New Engl. J Med., 346:393-403; Hansen, BC., 2000, Ann New York Academy of Science, 892:1-24; Hsueh, WA., and Quinones, MJ., 2003, Am. J. Cardiology, 93: 10J-17J; Resnick, HE and Howard, BV., 2002, Ann. Rev. Med., 53:245-267; Korner, J. and Aronne, L., 2003, J Clin. Invest., 111(5):565-570; Skoog, T., et al., 2001. Diabetologia, 44:654:655; Fernandez-Real, JM., and Ricart W., 2003, Endocrine Reviews, 24(3):278-301; Fernandez-Real, JM., et al., 2001, J Clin Endocrinol Metab., 86:1154-1159.; 10a. Fried, S., et al., 1998. J Clin Endocrinol Metab., 83:847-850; Senn, JJ., et al., 2002, Diabetes, 51:3391-3399; Rotter, V., et al, 2003, JBC in press, Manus.#301977200; 12a. Stouthard, JM., et al., 1996, BBRC, 220:241-245; Southern, C., et al., 1990, BiochemJ., 272:243-245; Sandler, S., et al., 1990, Endocrinology, 126:1288-1294; Pedersen, BK., et al., 2001, J Physiol., 536:329-337; DiCosmo, BF, et al., 1994, Int. Immunol., 6:1829-1837; Wallenius, V., et al., 2002, Nature Medicine, 8:75-79; Vozarova, B., et al., 2003, Human Genetic, 112:409-413; Kubaszek, A., et al., 2003, Diabetes, 52:558-461; Tsigos, C., et al., 1997, J Clin Endocrinol Metab, 82:4167-4170; Stoutharad, JM., et al., 1995, Am J Physiol., 268;E813- E819; Kern, PA., et al., 2001, Am J Physiol Endocrinol Metab., 280:E745-E751; Bastard, JP., et al., 2000, J Clon Endocrinol Metab., 85:3338-3342; and Bastard, JP., et al, 2002, J. Clin. Endocrinol. Metab., 87:2084-2089.

TABELA 1 – Laki Lanac CDRa

(nastavak)

4

TABELA 2 – Težak lanac CDRa

(nastavak)

(nastavak)

TABELA 3 – Mutacije iz Individualnih CDR Datoteka

(nastavak)

TABELA 4 – Mutacije uključene u Kombinovane Datoteke

TABELA 5A

TABELA 5B- Humano inženjerisana anti IL6 antitela i korespodentni CDR'i (prim prev. SEQ ID: je identifikacioni broj sekvence)

1

TABELA 6- EC Vrednosti

50

TABELA 7- Kinetičke konstante za anti-IL6 IgG

2

TABELA 8- Reakcija ukrštanjem vrsta ljudski inženjerisanih i himeričkih antitela

TABELA 9 – Dejstvo anti-IL6 mAt tretmana na renalnu patologiju kod NZB/WF1 miša

Tabela 10 - Varijabilni region sekvenci klona

4

1

Tabela 11 – Aminokiselinsa sekvenca regiona L6 okvira humanog lakog lanca sa rasutim obeleženim CDR sekvencama

(FRL1 - SEQ ID NO:105) CDRL1 (FRL2 - SEQ ID NO:106) CDRL2

EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCXXXXXXXXXXWYQQKPGQAPRLLIYXXXXXXX

(FRL3 - SEQ ID NO:107) CDRL3 (FRL4 - SEQ ID NO:108) GIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCXXXXXXXXXFGGGTKVEIK

2

Tabela 12 – Aminokiselinska sekvenca regiona VH3-7 okvira humanog teškog lanca sa rasutim obeleženim CDR sekvencama

(FRH1 - SEQ ID NO:109) CDRH1 (FRH2 - SEQ ID NO:110) EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASXXXXXXXXXXWVRQAPGKGLEWVA CDRH2 (FRH3 - SEQ ID NO:111) XXXXXXXXXXXXXXXXXRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR CDRH3 (FRH4- SEQID NO: 112) XXXXXXXXXXWGQGTTVTVSS

Tabela 13 - CDR Sekvence

[0305] SEQ ID NO:115 – SEKVENCA AMINOKISELINA IL-6 PROTEINA

LISTA SEKVENCI

[0306]

4

1

11

12

1

14

1

1

1

1

1

11

11

11

11

11

11

11

12

12

12

12

12

12

12

1

11

12

1

14

1

1

1

1

1

14

Claims (13)

Patentni zahtevi

1. Izolovano anti IL-6 antitelo sa potpuno humanim okvirnim sekvencama i konstantnim regionima, koje sadrži:

(i) varijabilni region lakog lanca, koji obuhvata region koji određuje komplementarnost lakog lanca 1 (CDRL1) sekvence aminokiselina SEQ ID NO:3, CDRL2 sekvence aminokiselina SEQ ID NO:21, CDRL3 sekvence aminokiselina SEQ ID NO:29, i varijabilni region teškog laca, koji obuhvata region koji određuje komplementarnost teškog lanca 1 (CDRH1) sekvence aminokiselina SEQ ID NO:39, CDRH2 sekvence aminokiselina SEQ ID NO:59, i CDRH3 sekvence aminokiselina SEQ ID NO:89; ili

(ii) varijabilni region lakog lanca, gde CDRL1 obuhvata sekvencu aminokiselina SEQ ID NO:3, CDRL2 obuhvata sekvencu aminokiselina SEQ ID NO:21, CDRL3 obuhvata sekvencu aminokiselina SEQ ID NO:29, i varijabilni region teškog lanca gde CDRH1 obuhvata sekvencu aminokiselina SEQ ID NO:41, CDRH2 obuhvata sekvencu aminokiselina SEQ ID NO:75, i CDRH3 obuhvata sekvencu aminokiselina SEQ ID NO:89; ili

(iii) varijabilni region lakog lanca, gde CDRL1 obuhvata sekvencu aminokiselina SEQ ID NO:15, CDRL2 obuhvata sekvencu aminokiselina SEQ ID NO:27, CDRL3 obuhvata sekvencu aminokiselina SEQ ID NO:35, i varijabilni region teškog lanca gde CDRH1 obuhvata sekvencu aminokiselina SEQ ID NO:47, CDRH2 obuhvata sekvencu aminokiselina SEQ ID NO:57, i CDRH3 obuhvata sekvencu aminokiselina SEQ ID NO:91; ili

(iv) varijabilni region lakog lanca, gde CDRL1 obuhvata sekvencu aminokiselina SEQ ID NO:15, CDRL2 obuhvata sekvencu aminokiselina SEQ ID NO:17, CDRL3 obuhvata sekvencu aminokiselina SEQ ID NO:29, i varijabilni region teškog lanca gde CDRH1 obuhvata sekvencu aminokiselina SEQ ID NO:45, CDRH2 obuhvata sekvencu aminokiselina SEQ ID NO:59, i CDRH3 obuhvata sekvencu aminokiselina SEQ ID NO:89; ili

(v) varijabilni region lakog lanca, gde CDRL1 obuhvata sekvencu aminokiselina SEQ ID NO:7, CDRL2 obuhvata sekvencu aminokiselina SEQ ID NO:21, CDRL3 obuhvata sekvencu aminokiselina SEQ ID NO:29, i varijabilni region teškog lanca gde CDRH1 obuhvata sekvencu aminokiselina SEQ ID NO:41, CDRH2 obuhvata sekvencu aminokiselina SEQ ID NO:75, i CDRH3 obuhvata sekvencu aminokiselina SEQ ID NO:87,

gde se pomenuto antitelo vezuje za humani IL-6 ili njegov fragment sa afinitetom od 0,1-9,9 x 10<-14>M kao što se određuje Kinexa® postupkom.

2. Anti IL-6 antitelo prema zahtevu 1, gde su regioni okvirnih sekvenci humane germinativne okvirne sekvence.

3. Anti IL-6 antitelo prema bilo kojim od zahteva 1-2, gde pomenuto antitelo moduliše najmanje jednu aktivnost IL-6 polipeptida.

4. Izolovani molekul nukleinske kiseline koji kodira najmanje jedno izolovano anti IL-6 antitelo prema bilo kojim od zahteva 1-3.

5. Izolovani vektor nukleinske kiseline koji sadrži izolovani molekul nukleinske kiseline prema zahtevu 4.

6. Prokariotska ili eukariotska ćelija domaćina koja obuhvata izolovani molekul nukleinske kiseline prema zahtevu 4, opciono gde je pomenuta ćelija domaćina najmanje jedna koja se bira od COS-1, COS-7, HEK293, BHK21, CHO, BSC-1, Hep G2, 653, SP2/0, 293, HeLa, mijeloma, ili ćelija limfoma.

7. Postupak za proizvodnju najmanje jednog anti IL-6 antitela, koji obuhvata translaciju molekula nukleinske kiseline prema zahtevu 4 pod uslovima in vitro, in vivo or in situ, tako da je anti IL-6 antitelo eksprimirano u količinama koje mogu da se detektuju ili povrate, gde se antitelo proizvodi u ne-humanoj životinji ili prokariotskoj ili eukariotskoj ćeliji.

8. Kompozicija koja sadrži najmanje jedno izolovano anti IL-6 antitelo prema bilo kojim od zahteva 1-3 i najmanje jedan farmaceutski prihvatljivi nosač ili rastvarač, opciono dalje sadrži najmanje jedno jedinjenje ili polipeptid koji se bira od detektabilnog obeleživača ili reportera, antigonista TNF, anti-infektivnog leka, leka kardiovaskularnog sistema (CV), leka za centralni nervni sistem (CNS), leka za autonomni nervni sistem (ANS), leka za respiratorni trakt, leka za gastrointestinalni trakt (GI), hormonskog leka, leka za ravnotežu tečnosti ili elektrolita, hematološkog leka, antineoplastika, imunomodulatornog leka, očni, otički ili nazalni lek, topikalni lek, nutritivni lek, citokin, i antagonist citokina.

9. Kompozicija koja sadrži najmanje jedno izolovano anti IL-6 antitelo prema bilo kojim od zahteva 1-3 za upotrebu u terapiji.

10. Antitelo prema bilo kojim od zahteva 1-3 za upotrebu u postupku postavljanja dijagnoze za stanje koje je u vezi sa IL-6 u ćeliji, tkivu, organu ili životinji, gde stanje koje je u vezi sa IL-6 se bira iz grupe koja se sastoji iz gojaznosti, bolesti posredovane imunskim sistemom, kardiovaskularne bolesti, infektivne bolesti, ili maligne bolesti i neurološke bolesti.

11. Antitelo prema bilo kojim od zahteva 1-3 za upotrebu u lečenju stanja koje je povezano sa IL-6 u ćeliji, tkivu, organu ili životinji, gde stanje koje je u vezi sa IL-6 se bira iz grupe koja se sastoji iz gojaznosti, bolesti posredovane imunskim sistemom, kardiovaskularne bolesti, infektivne bolesti, ili maligne bolesti i neurološke bolesti.

12. Antitelo i njegova upotreba prema zahtevu 10 ili zahtevu 11, gde

(i) stanje koje je povezano sa IL-6 se bira iz grupe koja se sastoji iz reumatoidnog artritisa, osteoartritisa, osteolize, aseptičkog slabljenja ortopedijskih implanta, sistemskog lupusa eritematozusa, kutanog lupusa eritematozusa, lupusa nefritisa, tipa 2 dijabetes mellitusa, hronične opstruktivne bolesti pluća, i karcinoma renalnih ćelija; ili

(ii) antitelo je pogodno za davanje u efikasnoj količini od oko 0, 1-100 mg/kilogramu pomenute životinje; ili

(iii) antitelo je pogodno za davanje najmanje jednim načinom koji se bira od parenteralnog, subkutanog, intramuskularnog, intravenoznog, intraartikularnog, intrabronhijalnog, intraabdominalnog, intrakapsularnog, intrahrskavičnog, intrakavitarnog, intracelialnog, intracerebelarnog, intracerebroventrikularnog, intrakoličnog, intracervikalnog, intragastričnog, intrahepatičnog, intramiokardijalnog, intraostealnog, intrapelvičnog, intraperikardijalnog, intraperitonealnog, intrapleuralnog, intraprostatičnog, intrapulmonarnog, intrarektalnog, intrarenalnog, intraretinalnog, intraspinalnog, intrasinovijalnog, intratoraksnog, intrauterinskog, intravezikalnog, intralezionalnog, bolusnog, vaginalnog, rektalnog, bukalnog, sublingualnog, intranazalnog, i transdermalnog; ili

(iv) antitelo je pogodno za davanje, pre, tokom ili posle najmanje jedne kompozicije koja sadrži efikasnu količinu najmanje jednog jedinjenja ili polipeptida koje se bira iz detektabilnog obeleživača ili reportera, anti-infektivnog leka, kardiovaskularnog sistemskog leka (CV), leka za centralni nervni sistem (CNS), leka za autonomni nervni sistem (ANS), leka za respiratorni trakt, leka za gastrointestinalni trakt (GI), hormonski lek, lek za održavanje ravnoteže tečnosti i elektrolita, hematološki lek, antineoplastik, imunomodulatorni lek, oftamološki, otički ili nazalni lek, topikalni lek, nutritivni lek, citokin, i antagonist citokina.

13. Proizvodni artikal pogodan za humanu farmaceutsku ili dijagnostičku potrebu, koji se sastoji od ambalaže i bočice koja obuhvata rastvor ili liofilizovani oblik anti IL-6 antitela prema bilo kojim od zahteva 1-3, opciono gde pomenuti kontejner je komponenta parenteralne,

14

subkutane, intramuskularne, intravenozne, intrartikularne, intrabronhijalne, intraabdominalne, intrakapsularne, intrahrskavične, intrakavitarne, intracelialne, intracerebelarne, intracerebroventrikularne, intrakolične, intracervikalne, intragastrične, intrahepatične, intramiokardijalne, intraostealne, intrapelvične, intraperikardične, intraperitonealne, intrapleuralne, intraprostatične, intrapulmonarne, intrarektalne, intrarenalne, intraretinalne, intraspinalne, intrasinovijalne, intratoraksne, intrauterinske, intravesikalne, intralezionalne, bolusne, vaginalne, rektalne, bukalne, sublingualne, intranazalne, ili transdermalne sprave ili sistema za isporuku.