[go: up one dir, main page]

RS56140B1 - Genski proizvodi koji su diferencijalno izraženi u tumorima i njihova primena - Google Patents

Genski proizvodi koji su diferencijalno izraženi u tumorima i njihova primena

Info

Publication number
RS56140B1
RS56140B1 RS20170619A RSP20170619A RS56140B1 RS 56140 B1 RS56140 B1 RS 56140B1 RS 20170619 A RS20170619 A RS 20170619A RS P20170619 A RSP20170619 A RS P20170619A RS 56140 B1 RS56140 B1 RS 56140B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
tumor
cells
antibody
nucleic acid
specific
Prior art date
Application number
RS20170619A
Other languages
English (en)
Inventor
Özlem Türeci
Ugur Sahin
Michael Koslowski
Stefan Fritz
Harald-Gerhard Geppert
Original Assignee
Ganymed Pharmaceuticals Gmbh
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ganymed Pharmaceuticals Gmbh filed Critical Ganymed Pharmaceuticals Gmbh
Publication of RS56140B1 publication Critical patent/RS56140B1/sr

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K6/00—Preparations for dentistry
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/303—Liver or Pancreas
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3046—Stomach, Intestines
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3076—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells against structure-related tumour-associated moieties
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/44—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material not provided for elsewhere, e.g. haptens, metals, DNA, RNA, amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/88—Lyases (4.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y406/00—Phosphorus-oxygen lyases (4.6)
    • C12Y406/01—Phosphorus-oxygen lyases (4.6.1)
    • C12Y406/01002—Guanylate cyclase (4.6.1.2)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
    • G01N33/57496—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites involving intracellular compounds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/75—Agonist effect on antigen

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Oral & Maxillofacial Surgery (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)

Description

Opis pronalaska
[0001] Uprkos interdisciplinarnim pristupima i širokoj primeni klasičnih terapeutskih procedura, kanceri se još uvek nalaze među vodećim uzrocima smrti. Noviji terapeutski koncepti ciljaju na uključivanje pacijentovog imunog sistema u sveukupni terapeutski koncept putem korišćenja rekombinantnih tumorskih vakcina i drugih specifičnih mera, kao što je terapija antitelima. Preduslov za uspeh takve strategije je prepoznavanje antigena koji su specifični za tumor ili su povezani sa tumorom, odn. epitopa od strane pacijentovog imunog sistema čije efektorske funkcije treba da se pojačaju intervencijom. Tumorske ćelije se biološki suštinski razlikuju od odgovarajućih nemalignih ćelija od kojih potiču. Ove razlike potiču od genskih promena nastalih tokom razvoja tumora i rezultuju, između ostalog, i formiranjem kvalitativno ili kvantitativno promenjenih molekulskih struktura u ćelijama kancera.
Strukture ove vrste povezane sa tumorima koje prepoznaje specifični imuni sistem domaćina koji ima tumor se nazivaju antigenima povezanim sa tumorom. Specifično prepoznavanje antigena povezanih sa tumorom obuhvata celularne i humoralne mehanizme, koji su dve funkcionalno međusobno povezane jedinice: CD4<+>i CD8<+>T limfociti prepoznaju procesuirane antigene prezentovane na MHC (glavni kompleks histokompatibilnosti, engl. major histocompatibility complex) molekulima klasa II, odn. I, respektivno, dok B limfociti stvaraju molekule cirkulišućih antitela koji se vezuju direktno za neprocesuirane antigene. Potencijalni kliničko-terapeutski značaj antigena povezanih sa tumorom potiče od činjenice da prepoznavanje antigena na neoplastičnim ćelijama od strane imunog sistema dovodi do inicijacije citotoksičnih efektorskih mehanizama i, u prisustvu T pomoćnih ćelija, može izazvati eliminaciju ćelija kancera (Pardoll, Nat. Med.4:525-31, 1998). Shodno tome, centralni cilj tumorske imunologije je da se molekulski definišu ove strukture. Molekulska priroda ovih antigena je bila zagonetna tokom dužeg perioda. Tek posle razvoja odgovarajućih tehnika kloniranja postalo je moguće da se sistemski pretražuju kDNK ekspresione biblioteke (engl. cDNA) tumora u potrazi za antigenima povezanim sa tumorom analiziranjem ciljnih struktura citotoksičnih T limfocita (CTL) (van der Bruggen et al., Science 254:1643-7, 1991) ili korišćenjem cirkulišućih autoantitela (Sahin et al., Curr. Opin. Immunol.9:709-16, 1997) kao proba. Za te svrhe su od svežeg tumorskog tkiva bile pripremljene kDNK ekspresione biblioteke, pa su zatim rekombinantno izražene kao proteini u podesnim sistemima. Imunoefektori izolovani od pacijenata, odnosno CTL klonovi sa procesima lize specifičnim za tumor, ili cirkulišuća autoantitela su korišćeni za kloniranje odgovarajućih antigena.
[0002] Zahvaljujući ovim pristupima tokom prethodnih godina je bilo definisano mnoštvo antigena u različitim neoplazijama. Međutim, probe koje su korišćene za identifikaciju antigena u klasičnim metodima su imunoefektori (cirkulišuća autoantitela ili CTL klonovi) pacijenata koji obično imaju već uznapredovali kancer. Brojni podaci ukazuju da tumori mogu dovesti, na primer, do tolerizacije i anergizacije T ćelija i da se u toku bolesti iz imunoefektorskog repertoara naročito gube one specifičnosti koje bi mogle izazvati efektivno imuno prepoznavanje. Aktuelne studije na pacijentima još uvek nisu dale bilo kakav čvrst dokaz o stvarnom dejstvu prethodno otkrivenih i korišćenih antigena povezanih sa tumorom. Shodno tome, ne može biti isključeno da su proteini koji pobuđuju spontane imune reakcije pogrešne ciljne strukture.
[0003] Cilj predmetnog pronalaska je da se realizuju ciljne strukture za dijagnostiku i terapiju kancera.
[0004] Prema pronalasku, ovaj cilj je ostvaren predmetom patentnih zahteva.
[0005] Prema pronalasku, tražena je strategija za identifikaciju i realizaciju antigena izraženih zajedno sa tumorom i nukleinskih kiselina koje ih kodiraju. Ova strategija je bazirana na činjenici da se određeni geni koji su izraženi na način koji je specifičan za organ, npr. isključivo u tkivu kolona, pluća ili bubrega reaktiviraju takođe u tumorskim ćelijama odgovarajućih organa, a pored toga i u tumorskim ćelijama drugih tkiva na ektopični i zabranjeni način. Kao prvo, analiza podataka dovodi do što je moguće kompletnije liste svih poznatih gena specifičnih za organe, koji se onda evaluiraju u pogledu njihove aberantne aktivacije u različitim tumorima analizama ekspresije pomoću specifičnog RT-PCR. Analiza podataka je poznati metod identifikacije gena povezanih sa tumorom. Međutim, u uobičajenim strategijama se transkripcije biblioteka normalnog tkiva obično oduzimaju od biblioteka tumorskog tkiva, uz pretpostavku da su preostali geni specifični za tumor (Schmitt et al., Nucleic Acids Res.27:4251-60, 1999; Vasmatzis et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.95:300-4, 1998; Scheurle et al., Cancer Res. 60:4037-43, 2000).
[0006] Međutim, koncept prema pronalasku, koji se pokazao mnogo uspešnijim, je baziran na korišćenju analize podataka (engl. data mining) za elektronsku ekstrakciju svih gena specifičnih za organe, a onda za evaluaciju pomenutih gena u pogledu ekspresije u tumorima.
[0007] Shodno tome, prema jednom aspektu otkrivanje se odnosi na strategiju za identifikaciju gena specifičnih za tkivo koji su diferencijalno izraženi u tumorima. Pomenuta strategija kombinuje analizu podataka iz javno dostupnih biblioteka sekvenci ("in silico") sa sledstvenim evaluacionim laboratorijskoeksperimentalnim (engl. "wet bench") studijama.
[0008] Prema pronalasku, kombinovana strategija bazirana na dva različita bioinformatička skripta omogućila je da se identifikuju novi tumorski geni. Ovi su ranije bili klasifikovani kao čisto specifični za organe. Otkriće da se ovi geni aberantno aktiviraju u tumorskim ćelijama omogućava da im bude u suštini pripisan novi kvalitet sa funkcionalnim implikacijama. Prema pronalasku, ovi geni povezani sa tumorom i genski proizvodi koji su kodirani njima su bili identifikovani i realizovani nezavisno od imunogenog dejstva.
[0009] Antigeni povezani sa tumorom koji su identifikovani imaju aminokiselinsku sekvencu kodiranu nukleinskom kiselinom koja je izabrana iz grupe koja se sastoji od (a) nukleinske kiseline koja sadrži sekvencu nukleinske kiseline izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NOs: 1-8, 41-44, 51-59, 84, 117, 119 i 138, njihovog dela ili derivata, (b) nukleinske kiseline koja se hibridizuje sa nukleinskom kiselinom pod (a) pod specifičnim uslovima, (c) nukleinske kiseline koja je degenerat u odnosu na nukleinsku kiselinu pod (a) ili (b), i (d) nukleinske kiseline koja je komplementarna sa nukleinskom kiselinom pod (a), (b) ili (c). U poželjnom primeru izvođenja, antigen povezan sa tumorom koji je identifikovan ima aminokiselinsku sekvencu koja je kodirana nukleinskom kiselinom koja je izabrana iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NOs: 1-8, 41-44, 51-59, 84, 117, 119 i 138. U sledećem poželjnom primeru izvođenja, antigen povezan sa tumorom koji je identifikovan sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je izabrana iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NOs: 9-19, 45-48, 60-66, 85, 90-97, 100-102, 105, 106, 111-116, 118, 120, 123, 124, 135-137, 139, i 142-150, njenog dela ili derivata.
[0010] Predmetno otkrivanje se generalno odnosi na primenu antigena povezanih sa tumorom koji su identifikovani prema pronalasku ili njihovih delova ili derivata, nukleinskih kiselina koje ih kodiraju ili nukleinskih kiselina usmerenih protiv pomenutih kodirajućih nukleinskih kiselina ili antitela usmerenih protiv antigena povezanih sa tumorom koja su identifikovana ili njihovih delova ili derivata za terapiju i dijagnozu. Ova primena može se odnositi na pojedinačnu, ali takođe i na kombinacije više ovih antigena, funkcionalnih fragmenata, nukleinskih kiselina, antitela, itd., u jednom primeru izvođenja takođe u kombinaciji sa drugim genima povezanim sa tumorom i antigenima za dijagnozu, terapiju i kontrolu napredovanja.
[0011] Prvenstvene bolesti za terapiju i/ili dijagnozu su one kod kojih se jedan ili više antigena povezanih sa tumorom koji su identifikovani prema pronalasku selektivno izražavaju ili abnormalno izražavaju.
[0012] Otkrivanje se takođe odnosi na nukleinske kiseline i genske proizvode koji su izraženi zajedno sa tumorskom ćelijom.
[0013] Dalje, predmetno tehničko otkrivanje se odnosi na genske proizvode, tj. nukleinske kiseline i proteine ili peptide, koji se proizvode promenom splajsovanja (splajsne varijante) poznatih gena ili izmenjenom translacijom uz korišćenje alternativnih otvorenih okvira za čitanje. Prema ovom aspektu pronalazak se odnosi na nukleinske kiseline koje sadrže sekvencu nukleinske kiseline koja je izabrana iz grupe koja se sastoji od sekvenci prema SEQ ID NOs: 3-5 iz liste sekvenci. Pored toga, prema ovom aspektu, predmetno otkrivanje se odnosi na proteine ili peptide koji sadrže aminokiselinsku sekvencu koja je izabrana iz grupe koja se sastoji od sekvenci prema SEQ ID NOs: 10 i 12-14 iz liste sekvenci. Opisane splajsne varijante se primenjuju kao ciljevi za dijagnozu i terapiju tumorskih bolesti.
[0014] Predmetno otkrivanje se naročito odnosi na aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID NO: 10 iz liste sekvenci koja je kodirana sa alternativnim otvorenim okvirom za čitanje koja je identifikovana prema pronalasku i razlikuje se od prethodno opisane proteinske sekvence (SEQ ID NO: 9) po 85 dodatnih aminokiselina na N terminusu proteina.
[0015] Veoma različiti mehanizmi mogu izazvati proizvodnju splajsnih varijanti, kao na primer:
- korišćenje varijabilnih mesta inicijacije transkripcije
- korišćenje dodatnih egzona
- kompletno ili nekompletno uplitanje samo jednog ili više egzona,
- splajsne regulatorne sekvence izmenjene mutacijom (delecijom ili generisanjem novih donorskih/akceptorskih sekvenci)
- nekompletna eliminacija intronskih sekvenci.
[0016] Izmenjeno splajsovanje gena rezultuje izmenjenom transkriptovanom sekvencom (splajsna varijanta). Translacija splajsne varijante u regionu njene izmenjene sekvence rezultuje izmenjenim proteinom koji može biti distinktivno različit od strukture i funkcije originalnog proteina. Splajsne varijante povezane sa tumorom mogu proizvesti transkript povezane sa tumorom i proteine/antigene povezane sa tumorom. Oni se mogu koristiti kao molekulski markeri i za detekciju tumorskih ćelija i za terapeutsko ciljanje tumora. Detekcija tumorskih ćelija, na primer, u krvi, serumu, koštanoj srži, ispljuvku, bronhijalnoj lavaži, telesnim izlučevinama i biopsijama tkiva, može se izvesti prema pronalasku, na primer, posle ekstrakcije nukleinskih kiselina putem PCR amplifikacije sa oligonukleotidima sa specifičnom splajsnom varijantom. Posebno su parovi prajmera podesni kao oligonukleotidi, od kojih se najmanje jedan vezuje za region splajsne varijante koji je povezan sa tumorom pod specifičnim uslovima. Prema pronalasku, oligonukleotidi koji su opisani za ove svrhe u primerima su podesni, a naročito oligonukleotidi koji imaju ili sadrže sekvencu izabranu između SEQ ID NOs: 34-36, 39, 40, i 107-110 iz liste sekvenci. Prema pronalasku, svi sistemi za detekciju zavisni od sekvenci su podesni za detekciju. To su, pored PCR, na primer, sistemi sa genskim čipom/”microarray” sistemi, Northern blot, RNKza zaštitni testovi (RDA) i drugi. Svi sistemi za detekciju imaju zajedničko to što je detekcija bazirana na specifičnoj hibridizaciji sa najmanje jednom za splajsnu varijantu specifičnom sekvencom nukleinske kiseline. Međutim, tumorske ćelije se takođe mogu detektovati pomoću antitela koja prepoznaju specifični epitop kodiran splajsnom varijantom. Pomenuta antitela se mogu dobiti primenom imunizacije peptidima koji su specifični za pomenutu splajsnu varijantu. Prema ovom aspektu, predmetno otkrivanje se odnosi naročito na peptide koji imaju ili sadrže sekvencu izabranu između SEQ ID NOs: 17-19, 111-115, 120, i 137 iz liste sekvenci i na specifična antitela koja su usmerena na njih. Tumorske ćelije takođe mogu biti detektovane primenom antitela koja prepoznaju glikozilacione varijante koje su modifikovane na način specifičan za tumor. Podesni za generisanje takvih antitela su regioni peptida koji se razlikuju između tumorskih ćelija i zdravih ćelija što se tiče glikozilacija. Prema ovom aspektu, otkrivanje se odnosi na peptide koji imaju ili sadrže sekvencu koja je izabrana između SEQ ID NOs: 17-19, 111-115, 120, 137 i 142-145 iz liste sekvenci i na specifična antitela koja su usmerena na njih. Asparagin se transformiše u asparaginsku kiselinu endogenom deglikozilacijom N kuplovanih šećernih ostataka. Prema pronalasku, ovde opisani proteini se mogu modifikovati što se tiče njihovih sekvenci na način specifičan za tumor i, shodno tome, imati različita biohemijska svojstva i svojstva vezivanja antitela. Prema ovom aspektu, predmetno otkrivanje se naročito odnosi na peptide koji imaju ili sadrže sekvencu izabranu između SEQ ID NOs: 146-150 iz liste sekvenci i na specifična antitela koja su usmerena na njih. Za imunizaciju su posebno podesne aminokiseline čiji epitopi su distinktivno različiti od varijante, odnosno varijanti genskog proizvoda, koji se prvenstveno proizvode u zdravim ćelijama. Detekcija tumorskih ćelija sa antitelima se ovde može izvršiti na uzorku izolovanom od pacijenta ili snimanjem sa intravenski datim antitelima. Pored dijagnostičke primenljivosti, splajsne varijante koje imaju nove ili izmenjene epitope su atraktivni ciljevi za imunoterapiju. Epitopi se mogu primeniti za ciljna terapeutski aktivna monoklonska antitela ili T limfocite. U pasivnoj imunoterapiji, antitela ili T limfociti koji prepoznaju epitope sa specifičnim splajsnim varijantama se ovde adoptivno prenose. Kao i u slučaju drugih antigena, antitela se takođe mogu generisati korišćenjem standardnih tehnologija (imunizacija životinja, strategije ispiranja za izolaciju rekombinantnih antitela) sa korišćenjem polipeptida koji sadrže ove epitope. Alternativno tome, moguće je primeniti za imunizaciju nukleinske kiseline koje kodiraju oligo- ili polipeptide koji sadrže pomenute epitope. Poznate su različite tehnike za in vitro ili in vivo generisanje T limfocita sa specifičnim epitopima i oni su detaljno opisani (na primer, Kessler J H, et al.2001, Sahin et al., 1997) i isto tako su bazirani na korišćenju oligo- ili polipeptida koji sadrže epitope sa specifičnim splajsnim varijantama ili nukleinske kiseline koje kodiraju pomenute oligo- ili polipeptide. Oligo- ili polipeptidi koji sadrže epitope sa specifičnim splajsnim varijantama ili nukleinske kiseline koje kodiraju pomenute polipeptide se takođe mogu primeniti kao farmaceutski aktivne supstance u aktivnoj imunoterapiji (vakcinacija, terapija vakcinama).
[0017] Predmetni pronalazak takođe opisuje proteine koji se po prirodi i stepenu njihovih sekundarnih modifikacija razlikuju u normalnom i tumorskom tkivu (na primer, Durand & Seta, 2000; Clin. Chem.46: 795-805; Hakomori, 1996; Cancer Res.56: 5309-18).
[0018] Analiza modifikacija proteina se može izvršiti u Vestern blotovima. Naročito glikozilacije koje po pravilu imaju veličinu od nekoliko kDa rezultuju sa većom celokupnom masom ciljnog proteina koja se može izdvojiti u SDS-PAGE. Za detekciju specifičnih O- i N-glikozidnih veza proteinski lizati se inkubiraju sa O- ili N-glikozilazama (prema instrukcijama odgovarajućih proizvođača, na primer, PNgaza, endoglikozidaza F, endoglikozidaza H, Roche Diagnostics) pre denaturacije uz korišćenje SDS. Posle toga se izvodi Vestern blot. Ako je veličina ciljnog proteina smanjena onda se na ovaj način može detektovati specifična glikozilacija, posle inkubacije sa glikozidazom i na taj način se takođe može analizirati tumorska specifičnost modifikacije. Regioni proteina koji su različito glikozilovani u tumorskim ćelijama i zdravim ćelijama su od posebnog interesa. Međutim, takve razlike u glikozilaciji su do sada bile opisane samo za nekoliko proteina na površini ćelija (na primer, MucI).
[0019] Prema pronalasku, bilo je moguće detektovati diferencijalnu glikozilaciju claudina-18 u tumorima. Gastrointestinalni karcinomi, karcinomi pankreasa, tumori jednjaka, tumori prostate, kao i tumori pluća imaju oblik claudina-18 koji je glikozilovan na nižem nivou. Glikozilacija u zdravim tkivima maskira proteinske epitope claudina-18, koji nisu pokriveni na tumorskim ćelijama zbog nedostatka glikozilacije. Odgovarajuće tome, prema pronalasku je moguće izabrati ligande i antitela koja se vezuju za ove domene. Takvi ligandi i antitela prema pronalasku se ne vezuju za claudin-18 na zdravim ćelijama, pošto su tu epitopi pokriveni usled glikozilacije.
[0020] Kao što je bilo opisano gore za proteinske epitope koji su dobijeni od splajsnih varijanti povezanih sa tumorom, moguće je upotrebiti diferencijalnu glikozilaciju za razlikovanje normalnih ćelija od tumorskih ćelija za dijagnostičke, kao i terapeutske svrhe.
[0021] Prema jednom aspektu, otkrivanje se odnosi na farmaceutsku kompoziciju koja sadrži agens koji prepoznaje antigen povezan sa tumorom koji je identifikovan prema pronalasku i koji je prvenstveno selektivan za ćelije koje imaju ekspresiju ili abnormalnu ekspresiju antigena povezanog sa tumorom koji je identifikovan prema pronalasku. U posebnim primerima izvođenja, pomenuti agens može izazvati indukciju ćelijske smrti, smanjenje rasta ćelija, oštećenje ćelijske membrane ili izlučivanje citokina, a prvenstveno ima aktivnost inhibiranja tumora. U jednom primeru izvođenja, agens je antisens nukleinska kiselina koja se selektivno hibridizuje sa nukleinskom kiselinom koja kodira antigen povezan sa tumorom. U sledećem primeru izvođenja, agens je antitelo koje se selektivno vezuje za antigen povezan sa tumorom, naročito komplementom aktivirano ili toksinom konjugovano antitelo koje se vezuje selektivno za antigen povezan sa tumorom. U sledećem primeru izvođenja, agens sadrži više agenasa, od kojih svaki selektivno prepoznaje različite antigene povezane sa tumorom, od kojih je najmanje jedan antigen povezan sa tumorom koji je identifikovan prema pronalasku. Prepoznavanje ne mora da bude direktno praćeno sa inhibicijom aktivnosti ili ekspresijom antigena. Prema ovom aspektu tehničkog otkrivanje, antigen koji je selektivno ograničen na tumore prvenstveno služi kao marker za pokretanje efektorskih mehanizama na ovoj specifičnoj lokaciji. U poželjnom primeru izvođenja, agens je citotoksični T limfocit koji prepoznaje antigen na HLA molekulu i lizira ćelije koje su obeležene na ovaj način. U sledećem primeru izvođenja, agens je antitelo koje se selektivno vezuje za antigen povezan sa tumorom, a ovo pokreće prirodne ili veštačke efektorske mehanizme na pomenutoj ćeliji. U sledećem primeru izvođenja, agens je T pomoćni limfocit koji pojačava efektorske funkcije drugih ćelija koje specifično prepoznaju pomenuti antigen.
[0022] Prema jednom aspektu, predmetno otkrivanje se odnosi na farmaceutsku kompoziciju koja sadrži agens koji inhibira ekspresiju ili aktivnost antigena povezanog sa tumorom koji je identifikovan prema pronalasku. U poželjnom primeru izvođenja, agens je antisens nukleinska kiselina koja se hibridizuje selektivno sa nukleinskom kiselinom koja kodira antigen povezan sa tumorom. U sledećem primeru izvođenja, agens je antitelo koje se vezuje selektivno za antigen povezan sa tumorom. U sledećem primeru izvođenja, agens sadrži više agenasa, od kojih svaki selektivno inhibira ekspresiju ili aktivnost različitih antigena povezanih sa tumorom, od kojih je najmanje jedan antigen povezan sa tumorom koji je identifikovan prema pronalasku.
[0023] Otkrivanje se dalje odnosi na farmaceutsku kompoziciju koja sadrži agens koji, kada se daje, selektivno povećava količinu kompleksa između HLA molekula i peptidnog epitopa antigena povezanog sa tumorom koji je identifikovan prema pronalasku. U jednom primeru izvođenja, agens sadrži jednu ili više komponenata koje su izabrane iz grupe koja se sastoji od (i) antigena povezanog sa tumorom ili njegovog dela, (ii) nukleinske kiseline koja kodira pomenuti antigen povezan sa tumorom ili njegov deo, (iii) ćelije domaćina koja izražava pomenuti antigen povezan sa tumorom ili njegov deo, i (iv) izolovanih kompleksa između peptidnih epitopa pomenutog antigena povezanog sa tumorom i MHC molekula. U jednom primeru izvođenja, agens sadrži više agenasa, od kojih svaki selektivno povećava količinu kompleksa između MHC molekula i peptidnih epitopa različitih antigena povezanih sa tumorom, pri čemu najmanje jedan antigen povezan sa tumorom predstavlja antigen povezan sa tumorom koji je identifikovan prema pronalasku.
[0024] Otkrivanje se dalje odnosi na farmaceutsku kompoziciju koja sadrži jednu ili više komponenata izabranih iz grupe koja se sastoji od: (i) antigena povezanog sa tumorom koji je identifikovan prema pronalasku ili njegovog dela, (ii) nukleinske kiseline koja kodira antigen povezan sa tumorom koji je identifikovan prema pronalasku ili njegov deo, (iii) antitela koje se vezuje za antigen povezan sa tumorom koji je identifikovan prema pronalasku ili njegov deo, (iv) antisens nukleinske kiseline koja se specifično hibridizuje sa nukleinskom kiselinom koja kodira antigen povezan sa tumorom koji je identifikovan prema pronalasku, (v) ćelije domaćina koja izražava antigen povezan sa tumorom koji je identifikovan prema pronalasku ili njegov deo, i (vi) izolovanih kompleksa između antigena povezanog sa tumorom koji je identifikovan prema pronalasku ili njegovog dela i HLA molekula.
[0025] Nukleinska kiselina koja kodira antigen povezan sa tumorom koji je identifikovan prema pronalasku ili njegov deo može biti prisutna u farmaceutskoj kompoziciji u ekspresionom vektoru i funkcionalno je vezana za promotor.
[0026] Ćelija domaćin koja je prisutna u farmaceutskoj kompoziciji može izlučivati antigen povezan sa tumorom ili njegov deo, izražavati ga na površini ili može dodatno izražavati HLA molekul koji se vezuje za pomenuti antigen povezan sa tumorom ili njegov pomenuti deo. U jednom primeru izvođenja, ćelija domaćin može izražavati HLA molekul endogeno. U sledećem primeru izvođenja, ćelija domaćin može izražavati HLA molekul i/ili antigen povezan sa tumorom ili njegov deo na rekombinantan način. Ćelija domaćin je prvenstveno neproliferativna. U poželjnom primeru izvođenja, ćelija domaćin je ćelija koja prezentuje antigen, a naročito dendritska ćelija, monocit ili makrofag.
[0027] Antitelo koje je prisutno u farmaceutskoj kompoziciji prema pronalasku može biti monoklonsko antitelo. U sledećim primerima izvođenja, antitelo je himerično ili humanizovano antitelo, fragment prirodnog antitela ili sintetičkog antitela, pri čemu svi od njih mogu biti proizvedeni kombinatornim tehnikama. Antitelo može biti kuplovano sa terapeutski ili dijagnostički korisnim agensom.
[0028] Antisens nukleinska kiselina koja je prisutna u farmaceutskoj kompoziciji može sadržati sekvencu od 6-50, a naročito od 10-30, 15-30 i 20-30, susednih nukleotida nukleinske kiseline koja kodira antigen povezan sa tumorom koji je identifikovan prema pronalasku.
[0029] U sledećim primerima izvođenja, antigen povezan sa tumorom ili njegov deo, realizovani farmaceutskom kompozicijom prema pronalasku bilo direktno ili putem ekspresije nukleinske kiseline, se mogu vezivati za MHC molekule na površini ćelija, pri čemu pomenuto vezivanje prvenstveno izaziva citolitičku reakciju i/ili indukuje oslobađanje citokina.
[0030] Farmaceutska kompozicija može sadržati farmaceutski kompatibilni nosač i/ili adjuvans.
Adjuvans može biti izabran između saponina, GM-CSF, CpG nukleotida, RNK, citokina ili hemokina. Farmaceutska kompozicija se prvenstveno primenjuje za lečenje bolesti karakterisane selektivnom ekspresijom ili abnormalnom ekspresijom antigena povezanog sa tumorom. U poželjnom primeru izvođenja, bolest je kancer.
[0031] Otkrivanje se dalje odnosi na metode lečenja, dijagnostike i/ili praćenja bolesti putem ekspresije ili abnormalne ekspresije jednog ili više antigena povezanih sa tumorom. U jednom primeru izvođenja, lečenje sadrži davanje farmaceutske kompozicije prema pronalasku.
[0032] Bolest je prvenstveno kancer, pri čemu izraz "kancer" obuhvata, ali nije ograničen na leukemije, seminome, melanome, teratome, gliome, kancer bubrega, nadbubrežne žlezde, štitne žlezde, intestinalni, jetre, kolona, želuca, gastrointestinalni, limfnih čvorova, jednjaka, kolorektalni, pankreasa, uha, nosa i grla (ORL), dojke, prostate, materice, jajnika i pluća, kao i na njihove metastaze.
[0033] Prema jednom aspektu, otkrivanje se odnosi na metod dijagnoze bolesti karakterisane ekspresijom ili abnormalnom ekspresijom antigena povezanog sa tumorom koji je identifikovan prema pronalasku. Metod sadrži detekciju (i) nukleinske kiseline koja kodira antigen povezan sa tumorom ili njegov deo i/ili (ii) detekciju antigena povezanog sa tumorom ili njegovog dela, i/ili (iii) detekciju antitela za antigen povezan sa tumorom ili njegovog dela i/ili (iv) detekciju citotoksičnih ili T pomoćnih limfocita koji su specifični za antigen povezan sa tumorom ili njegov deo u biološkom uzorku izolovanom od pacijenta. U posebnim primerima izvođenja, detekcija sadrži (i) dovođenje u kontakt biološkog uzorka sa agensom koji se specifično vezuje za pomenutu nukleinsku kiselinu koja kodira antigen povezan sa tumorom ili njegov deo, sa pomenutim antigenom povezanim sa tumorom ili njegovim pomenutim delom, sa pomenutim antitelom ili njegovim pomenutim delom ili sa citotoksičnim ili T pomoćnim limfocitima specifičnim za antigen povezan sa tumorom ili njegove delove, i (ii) detektovanje formiranja kompleksa između agensa i nukleinske kiseline ili njenog dela, pomenutog antigena povezanog sa tumorom ili njegovog dela, antitelom ili njegovim delom, ili citotoksičnim ili T pomoćnim limfocitima. U jednom primeru izvođenja, bolest je karakterisana ekspresijom ili abnormalnom ekspresijom više različitih antigena povezanih sa tumorom i detekcija sadrži detekciju više nukleinskih kiselina koje kodiraju pomenuta više različitih antigena povezanih sa tumorom ili njihovih delova, detekciju više različitih antigena povezanih sa tumorom ili njihovih delova, detekciju više antitela koja se vezuju za pomenutih više različitih antigena povezanih sa tumorom ili za njihove delove ili detekciju više citotoksičnih ili T pomoćnih limfocita specifičnih za pomenutih više različitih antigena povezanih sa tumorom. U sledećem primeru izvođenja, biološki uzorak izolovan od pacijenta se upoređuje sa uporedivim normalnim biološkim uzorkom.
[0034] Prema sledećem aspektu, otkrivanje se odnosi na metod za određivanje regresije, toka ili pojave bolesti karakterisane ekspresijom ili abnormalnom ekspresijom antigena povezanog sa tumorom koji je identifikovan prema pronalasku, pri čemu taj metod sadrži praćenje uzorka od pacijenta koji ima pomenutu bolest ili se sumnja da će je dobiti ili je dobija, u pogledu jednog ili više parametara izabranih iz grupe koja se sastoji od (i) količine nukleinske kiseline koja kodira antigen povezan sa tumorom ili njegov deo, (ii) količine antigena povezanog sa tumorom ili njegovog dela, (iii) količine antitela koja se vezuju za antigen povezan sa tumorom ili njegov deo, i (iv) količine citolitičkih T ćelija ili T pomoćnih ćelija koje su specifične za kompleks između antigena povezanog sa tumorom ili njegovog dela i MHC molekula. Metod prvenstveno sadrži određivanje parametra, odnosno parametara u prvom uzorku u prvom vremenskom trenutku i sledećeg uzorka u drugom vremenskom trenutku i u kome se tok bolesti određuje upoređivanjem dva uzorka. U posebnim primerima izvođenja, bolest je karakterisana ekspresijom ili abnormalnom ekspresijom više različitih antigena povezanih sa tumorom i praćenje obuhvata praćenje (i) količine više nukleinskih kiselina koje kodiraju pomenuta više različitih antigena povezanih sa tumorom ili njihove delove, i/ili (ii) količine pomenutih više različitih antigena povezanih sa tumorom ili njihovih delova, i/ili (iii) količine više antitela koja se vezuju za pomenuta više različitih antigena povezanih sa tumorom ili njihovih delova, i/ili (iv) količine više citolitičkih T ćelija ili T pomoćnih ćelija koje su specifične za komplekse između pomenuta više različitih antigena povezanih sa tumorom ili njihovih delova i MHC molekula.
[0035] Detekcija nukleinske kiseline ili njenog dela ili praćenje količine nukleinske kiseline ili njenog dela može se izvršiti korišćenjem polinukleotidne probe koja se specifično hibridizuje sa pomenutom nukleinskom kiselinom ili njenim pomenutim delom ili se može izvesti selektivnom amplifikacijom pomenute nukleinske kiseline ili njenog pomenutog dela. U jednom primeru izvođenja, polinukleotidna proba sadrži sekvencu od 6-50, a naročito od 10-30, 15-30 i 20-30, susednih nukleotida pomenute nukleinske kiseline.
[0036] U posebnim primerima izvođenja, antigen povezan sa tumorom koji treba da bude detektovan ili njegovim delom je prisutan intracelularno ili na površini ćelije. Prema pronalasku, detekcija antigena povezanog sa tumorom ili njegovog dela ili praćenje količine antigena povezanog sa tumorom ili njegovog dela može se izvršiti korišćenjem antitela koje se specifično vezuje za pomenuti antigen povezan sa tumorom ili za njegov pomenuti deo.
[0037] U sledećim primerima izvođenja, antigen povezan sa tumorom koji treba da se detektuje ili njegov deo je prisutan u kompleksu sa MHC molekulom, a naročito HLA molekulom.
[0038] Prema pronalasku, detekcija antitela ili praćenje količine antitela se može izvesti uz korišćenje proteina ili peptida koji se specifično vezuje za pomenuto antitelo.
[0039] Prema pronalasku, detekcija citolitičkih T ćelija ili T pomoćnih ćelija ili praćenje količine citolitičkih T ćelija ili T pomoćnih ćelija koje su specifične za komplekse između antigena ili njegovog dela i MHC molekula se može izvesti korišćenjem ćelije koja prezentuje kompleks između pomenutog antigena ili njegovog pomenutog dela i MHC molekula.
[0040] Polinukleotidne probe, antitelo, protein ili peptid ili ćelija, koji se upotrebljavaju za detekciju ili praćenje, se prvenstveno obeležavaju na detektabilan način. U posebnim primerima izvođenja, detektabilni marker je radioaktivni marker ili enzimski marker. T limfociti se mogu dodatno detektovati detekcijom njihove proliferacije, njihove proizvodnje citokina, i njihove citotoksične aktivnosti aktivirane specifičnom stimulacijom sa kompleksom MHC i antigena povezanog sa tumorom ili njegovih delova. T limfociti se takođe mogu detektovati pomoću rekombinantnog MHC molekula ili pomoću kompleksa više MHC molekula koji su snabdeveni sa posebnim imunogenim fragmentom jednog ili više antigena povezanih sa tumorom i koji mogu identifikovati specifične T limfocite dolaskom u kontakt sa specifičnim T ćelijskim receptorom.
[0041] Prema sledećem aspektu, otkrivanje se odnosi na metod lečenja, dijagnostike ili praćenja bolesti karakterisane ekspresijom ili abnormalnom ekspresijom antigena povezanog sa tumorom koji je identifikovan prema pronalasku, pri čemu taj metod sadrži davanje antitela koje se vezuje za pomenuti antigen povezan sa tumorom ili za njegov deo i koje je kuplovano sa terapeutskim ili dijagnostičkim agensom ili supstancom. Antitelo može biti monoklonsko antitelo. U sledećim primerima izvođenja, antitelo je himerično ili humanizovano antitelo ili fragment prirodnog antitela.
[0042] U izvesnim primerima izvođenja, metodi dijagnostike ili praćenja bolesti karakterisane ekspresijom ili abnormalnom ekspresijom antigena povezanog sa tumorom koji je identifikovan prema pronalasku se mogu izvoditi na biološkom uzorku koji sadrži ili se sumnja da sadrži diseminirajuće tumorske ćelije ili metastatičke tumorske ćelije. Diseminirajuće tumorske ćelije se mogu detektovati, na primer, u krvi, serumu, koštanoj srži, ispljuvku, bronhijalnom aspiratu, i/ili bronhijalnoj lavaži.
[0043] Otkrivanje se takođe odnosi na metod lečenja pacijenta koji ima bolest karakterisanu ekspresijom ili abnormalnom ekspresijom antigena povezanog sa tumorom koji je identifikovan prema pronalasku, pri čemu taj metod sadrži (i) pribavljanje uzorka koji sadrži imunoreaktivne ćelije dobijenog od pomenutog pacijenta, (ii) dovođenje u kontakt pomenutog uzorka sa ćelijom domaćinom koja izražava pomenuti antigen povezan sa tumorom ili njegov deo, pod uslovima koji stimulišu stvaranje citolitičkih T ćelija protiv pomenutog antigena povezanog sa tumorom ili njegovog dela, i (iii) uvođenje citolitičkih T ćelija u pacijenta u količini koja je podesna za liziranje ćelija koje izražavaju antigen povezan sa tumorom ili njegov deo. Otkrivanje se isto tako odnosi na kloniranje T ćelijskog receptora citolitičkih T ćelija protiv antigena povezanog sa tumorom. Pomenuti receptor se može preneti na druge T ćelije, pri čemu na ovaj način one dobijaju željenu specifičnost i, kao pod (iii), mogu biti uvedene u pacijenta.
[0044] U jednom primeru izvođenja, ćelija domaćin endogeno izražava HLA molekul. U sledećem primeru izvođenja, ćelija domaćin rekombinantno izražava HLA molekul i/ili antigen povezan sa tumorom ili njegov deo. Ćelija domaćin prvenstveno nije proliferativna. U poželjnom primeru izvođenja, ćelija domaćin je ćelija koja prezentuje antigen, a naročito dendritska ćelija, monocit ili makrofag.
[0045] Prema sledećem aspektu, predmetno otkrivanje se odnosi na metod lečenja pacijenta koji ima bolest karakterisanu ekspresijom ili abnormalnom ekspresijom antigena povezanog sa tumorom koji je identifikovan prema pronalasku, pri čemu taj metod sadrži (i) identifikaciju nukleinske kiseline koja kodira antigen koji je povezan sa tumorom koji se identifikuje prema pronalasku, a koju izražavaju ćelije povezane sa oboljenjem, (ii) transfekciju ćelije domaćina sa tom nukleinskom kiselinom ili njenim delom, (iii) kultivaciju transfektovane ćelije domaćina radi ekspresije nukleinske kiseline (ovo nije obavezno u slučaju ostvarivanja visokog stepena transfekcije), i (iv) uvođenje ćelija domaćina ili njihovog ekstrakta u pacijenta u količini koja je podesna da poveća imunu reakciju protiv ćelija pacijenta povezanih sa oboljenjem. Metod može dalje sadržati identifikaciju MHC molekula koji prezentuje antigen povezan sa tumorom ili njegov deo, pri čemu ćelija domaćin izražava identifikovani MHC molekul, i prezentaciju pomenutog antigena povezanog sa tumorom ili njegovog dela. Imuna reakcija može obuhvatati reakciju B ćelija ili reakciju T ćelija. Dalje, reakcija T ćelija može sadržati proizvodnju citolitičkih T ćelija i/ili T pomoćnih ćelija koje su specifične za ćelije domaćine koje prezentuju antigen povezan sa tumorom ili njegov deo ili su specifične za ćelije pacijenta koje izražavaju pomenuti antigen povezan sa tumorom ili njegov deo.
[0046] Otkrivanje se takođe odnosi na metod lečenja bolesti karakterisane ekspresijom ili abnormalnom ekspresijom antigena povezanog sa tumorom koji je identifikovan prema pronalasku, pri čemu taj metod sadrži (i) identifikaciju ćelija kod pacijenta koje izražavaju abnormalne količine antigena povezanog sa tumorom, (ii) izolaciju uzorka pomenutih ćelija, (iii) kultivisanje pomenutih ćelija, i (iv) uvođenje pomenutih ćelija u pacijenta u količini koja je podesna za aktiviranje imune reakcije na te ćelije.
[0047] Ćelije domaćini koje se koriste prema pronalasku prvenstveno nisu proliferativne ili se čine neproliferativnim. Bolest koja je karakterisana ekspresijom ili abnormalnom ekspresijom antigena povezanog sa tumorom je naročito kancer.
[0048] Predmetno otkrivanje se dalje odnosi na nukleinsku kiselinu izabranu iz grupe koja se sastoji od (a) nukleinske kiseline koja sadrži sekvencu nukleinske kiseline izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NOs: 3-5, njenog dela ili derivata, (b) nukleinske kiseline koja se hibridizuje sa nukleinskom kiselinom pod (a) pod specifičnim uslovima, (c) nukleinske kiseline koja se degeneriše u odnosu na nukleinsku kiselinu pod (a) ili (b), i (d) nukleinske kiseline koja je komplementarna sa nukleinskom kiselinom pod (a), (b) ili (c). Otkrivanje se dalje odnosi na nukleinsku kiselinu, koja kodira protein ili polipeptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NOs: 10, 12-14, 146-150, njenog dela ili derivata.
[0049] Prema sledećem aspektu, otkrivanje se odnosi na promoterske sekvence nukleinskih kiselina prema pronalasku. Ove sekvence mogu biti funkcionalno vezane za drugi gen, a prvenstveno u vektoru ekspresije, i na taj način obezbeđuju selektivnu ekspresiju pomenutog gena u odgovarajućim ćelijama.
[0050] Prema sledećem aspektu, pronalazak se odnosi na molekul rekombinantne nukleinske kiseline, a naročito DNK ili RNK molekul, koji sadrži ovde opisanu nukleinsku kiselinu.
[0051] Predmetno otkrivanje se takođe odnosi na ćelije domaćine koje sadrže nukleinsku kiselinu ili molekul rekombinantne nukleinske kiseline koji sadrži nukleinsku kiselinu prema pronalasku.
[0052] Ćelija domaćin može sadržati nukleinsku kiselinu koja kodira HLA molekul. U jednom primeru izvođenja, ćelija domaćin endogeno izražava HLA molekul. U sledećem primeru izvođenja, ćelija domaćin rekombinantno izražava HLA molekul i/ili nukleinsku kiselinu prema pronalasku ili njegov deo. Prvenstveno, ćelija domaćin nije proliferativna. U poželjnom primeru izvođenja, ćelija domaćin je ćelija koja prezentuje antigen, a naročito dendritska ćelija, monocit ili makrofag.
[0053] U sledećem primeru izvođenja, predmetno otkrivanje se odnosi na oligonukleotide koji se hibridizuju sa nukleinskom kiselinom koja je identifikovana prema pronalasku i koji se mogu primeniti kao genetske probe ili kao "antisens" molekuli. Molekuli nukleinskih kiselina u obliku oligonukleotidnih prajmera ili kompetentnih proba, koji se hibridizuju sa nukleinskom kiselinom koja je identifikovana prema pronalasku ili njenim delovima, mogu se upotrebiti za pronalaženje nukleinskih kiselina koje su homologe sa nukleinskom kiselinom koja je identifikovana prema pronalasku, npr. PCR amplifikacijom, Southern i Northern hibridizacijom. Hibridizacija se može izvršiti pod malo specifičnim uslovima, još poželjnije pod srednje specifičnim uslovima i najpoželjnije pod visoko specifičnim uslovima. Izraz "specifični uslovi" prema pronalasku se odnosi na uslove koji omogućavaju specifičnu hibridizaciju između polinukleotida.
[0054] Prema sledećem aspektu, otkrivanje se odnosi na protein, polipeptid ili peptid koji je kodiran nukleinskom kiselinom izabranom iz grupe koja se sastoji od (a) nukleinske kiseline koja sadrži sekvencu nukleinske kiseline izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NOs: 3-5, njenog dela ili derivata, (b) nukleinske kiseline koja se hibridizuje sa nukleinskom kiselinom pod (a) pod specifičnim uslovima, (c) nukleinske kiseline koja se degeneriše u odnosu na nukleinsku kiselinu pod (a) ili (b), i (d) nukleinske kiseline koja je komplementarna sa nukleinskom kiselinom pod (a), (b) ili (c). U poželjnom primeru izvođenja, otkrivanje se odnosi na protein ili polipeptid ili peptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NOs: 10, 12-14, i 146-150, njihovog dela ili derivata.
[0055] Prema sledećem aspektu, otkrivanje se odnosi na imunogeni fragment antigena povezanog sa tumorom koji je identifikovan prema pronalasku. Pomenuti fragment se prvenstveno vezuje za humani HLA receptor ili za humano antitelo. Fragment prema pronalasku prvenstveno sadrži sekvencu od najmanje 6, naročito najmanje 8, najmanje 10, najmanje 12, najmanje 15, najmanje 20, najmanje 30 ili najmanje 50, aminokiselina.
[0056] Prema ovom aspektu otkrivanje se naročito odnosi na peptid koji ima ili sadrži sekvencu koja je izabrana iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NOs: 17-19, 90-97, 100-102, 105, 106, 111-116, 120, 123, 124, 135-137, 139, i 142-150, njen deo ili derivat.
[0057] Prema sledećem aspektu, otkrivanje se odnosi na agens koji se vezuje za antigen povezan sa tumorom koji je identifikovan prema pronalasku ili za njegov deo. U poželjnom primeru izvođenja, agens je antitelo. U sledećim primerima izvođenja, antitelo je himerično, ili humanizovano antitelo, antitelo proizvedeno kombinatornim tehnikama, ili fragment antitela. Dalje, otkrivanje se odnosi na antitelo koje se selektivno vezuje za kompleks (i) antigena povezanog sa tumorom koji je identifikovan prema pronalasku ili njegovog dela i (ii) MHC molekul za koji se vezuje pomenuti antigen povezan sa tumorom koji je identifikovan prema pronalasku ili njegov pomenuti deo, sa pomenutim antitelom koje se ne vezuje samo za (i) ili (ii). Antitelo prema pronalasku može biti monoklonsko antitelo. U sledećim primerima izvođenja, antitelo je himerično ili humanizovano antitelo ili fragment prirodnog antitela.
[0058] Otkrivanje se naročito odnosi na takav agens, a naročito antitelo, koje se specifično vezuje za peptid koji ima ili sadrži sekvencu koja je izabrana iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NOs: 17-19, 90-97, 100-102, 105, 106, 111-116, 120, 123, 124, 135-137, 139, i 142-150, njen deo ili derivat.
[0059] U pogledu claudina-18, pronalazak se takođe odnosi na agense, a naročito antitela koja se specifično vezuju za jednu varijantu claudina-18. U jednom primeru izvođenja, antitelo se specifično vezuje za varijantu claudin-18A1 (SEQ ID NO: 118). U sledećem primeru izvođenja, agens, a naročito antitelo se vezuje za varijantu claudin-18A2 (SEQ ID NO: 16). Takva specifična antitela mogu se dobiti, na primer, imunizacijom uz korišćenje peptida opisanih u Primeru 4.
[0060] Dalje, pronalazak se u pogledu claudina-18 odnosi na agense, a naročito antitela, koja se specifično vezuju za oblik claudina-18A2 koji ima specifičnu šemu glikozilacije. U jednom primeru izvođenja, agens, a naročito antitelo, se specifično vezuje za oblik claudina-18A2 koji nije glikozilovan na jednom ili više potencijalnih mesta glikozilacije. U sledećem primeru izvođenja, agens, a naročito antitelo, se specifično vezuje za oblik claudina-18A2 koji je glikozilovan na jednom ili više potencijalnih mesta glikozilacije. Prvenstveno se takvo potencijalno mesto glikozilacije odnosi na jednu ili više pozicija koje su izabrane iz grupe koja se sastoji od aminokiselinskih pozicija 37, 38, 45, 116, 141, 146 i 205 claudina-18A2. Dalje, takva potencijalna glikozilacija se prvenstveno odnosi na N glikozilaciju.
[0061] Agens koji je specifičan za varijantu ili oblik claudina-18, a naročito antitelo koje je specifično za varijantu ili oblik claudina-18, u ovom smislu znači da se agens ili antitelo vezuje jače za varijantu ili oblik za koji je on specifičan nego za drugu varijantu ili oblik. Agens, a naročito antitelo, se vezuje jače za prvu varijantu ili oblik ili prvi epitop u poređenju sa drugom varijantom ili oblikom ili drugim epitopom, ako se vezuje za prvu varijantu, odn. oblik ili prvi epitop sa konstantom disocijacije (KD) koja je manja od konstante disocijacije za drugu varijantu, odn. oblik ili drugi epitop. Prvenstveno je konstanta disocijacije (KD) za varijantu, odn. oblik ili epitop za koji se agens, a naročito antitelo specifično vezuje više od 10- struko, a prvenstveno više od 20- struko, još poželjnije više od 50- struko, čak još više od 100- struko, 200- struko, 500- struko ili 1000- struko manja od konstante disocijacije (KD) za varijantu, odn. oblik ili epitop za koji se agens ne vezuje specifično. Prvenstveno se agens, a naročito antitelo, ne vezuje ili u suštini se ne vezuje za varijantu, odn. oblik ili epitop za koji agens, a naročito antitelo, nije specifičan.
[0062] Gore opisani agensi, a naročito antitela i njihovi derivati koji su ovde opisani, a koji se specifično vezuju za varijantu ili oblik claudina-18 se takođe mogu primeniti u kompozicijama i metodama prema pronalasku.
[0063] Pronalazak se dalje odnosi na konjugat između agensa prema pronalasku koji se vezuje za antigen povezan sa tumorom koji je identifikovan prema pronalasku ili njegov deo ili na antitelo prema pronalasku i terapeutski ili dijagnostički agens ili supstancu. U jednom primeru izvođenja, terapeutski ili dijagnostički agens je toksin.
[0064] Prema sledećem aspektu, otkrivanje se odnosi na komplet za detekciju ekspresije ili abnormalne ekspresije antigena povezanog sa tumorom koji je identifikovan prema pronalasku, pri čemu taj komplet sadrži agense za detekciju (i) nukleinske kiseline koja kodira antigen povezan sa tumorom ili njegov deo, (ii) antigena povezanog sa tumorom ili njegovog dela, (iii) antitela koja se vezuju za antigen povezan sa tumorom ili njegov deo, i/ili (iv) T ćelija koja su specifična za antigen povezan sa tumorom ili njegov deo ili njegov kompleks sa MHC molekulom. U jednom primeru izvođenja, agensi za detekciju nukleinske kiseline ili njenog dela su molekuli nukleinske kiseline za selektivnu amplifikaciju pomenute nukleinske kiseline, koji sadrže naročito sekvencu od 6-50, a naročito 10-30, 15-30 i 20-30, susednih nukleotida pomenute nukleinske kiseline.
DETALJAN OPIS PRONALASKA
[0065] Prema pronalasku su opisani geni koji su izraženi u tumorskim ćelijama selektivno ili aberantno i koji su antigeni povezani sa tumorom.
[0066] Prema pronalasku, ovi geni i/ili njihovi genski proizvodi i/ili njihovi derivati i/ili delovi su poželjne ciljne strukture za terapeutske pristupe. Konceptualno pomenuti terapeutski pristupi mogu ciljati na inhibiciju aktivnosti selektivno izraženog genskog proizvoda povezanog sa tumorom. Ovo je korisno ako je pomenuta aberantna, odgovarajuća selektivna ekspresija funkcionalno važna u patogenosti tumora i ako je njena ligacija praćena sa selektivnim oštećenjem odgovarajućih ćelija. Drugi terapeutski koncepti razmatraju antigene povezane sa tumorom kao markere koji pokreću efektorske mehanizme koji imaju potencijal za oštećivanje ćelija selektivno za tumorske ćelije. Ovde je funkcija samog ciljnog molekula i njegova uloga u razvoju tumora potpuno irelevantna.
[0067] "Derivat" nukleinske kiseline prema pronalasku znači da su u pomenutoj nukleinskoj kiselini prisutne pojedinačne ili višestruke nukleotidne supstitucije, delecije i/ili adicije. Pored toga, izraz "derivat" takođe obuhvata hemijsku derivatizaciju nukleinske kiseline na nukleotidnoj bazi, na šećeru ili na fosfatu. Izraz "derivat" takođe obuhvata nukleinske kiseline koje sadrže nukleotide i nukleotidne analoge koji se ne javljaju u prirodi.
[0068] Prema pronalasku, nukleinska kiselina je prvenstveno dezoksiribonukleinska kiselina (DNK) ili ribonukleinska kiselina (RNK). Nukleinske kiseline prema pronalasku obuhvataju genomsku DNK, kDNK, iRNK, rekombinantno dobijene i hemijski sintetizovane molekule. Nukleinska kiselina može biti prisutna kao jednolančani ili kao dvolančani i kao linearni ili kovalentno cirkularno, odnosno kružno zatvoreni molekul.
[0069] Nukleinske kiseline koje su ovde opisane su prvenstveno izolovane. Izraz "izolovana nukleinska kiselina" znači da je nukleinska kiselina bila (i) amplifikovana in vitro, na primer, lančanom reakcijom polimeraze (PCR), (ii) rekombinantno dobijena kloniranjem, (iii) prečišćena, na primer, sečenjem i gelelektroforetičkom frakcionisanjem, ili (iv) sintetizovana, na primer, hemijskom sintezom. Izolovana nukleinska kiselina je nukleinska kiselina koja je dostupna za manipulaciju tehnikama rekombinantne DNK.
[0070] Nukleinska kiselina je "komplementarna" sa drugom nukleinskom kiselinom ako su dve sekvence sposobne da se međusobno hibridizuju i formiraju stabilni dupleks, pri čemu se hibridizacija prvenstveno izvodi pod uslovima koji omogućavaju specifičnu hibridizaciju između polinukleotida (visoko specifični uslovi). Visoko specifični uslovi su opisani, na primer, u Molecular Cloning: A Laboratory Manual, J. Sambrook et al., urednici, 2. izdanje, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989 ili Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel et al., urednici, John Wiley & Sons, Inc., New York i odnose se, na primer, na hibridizaciju na 65°C u hibridizacionom puferu (3,5 x SSC, 0,02% Ficoll, 0,02% polivinilpirolidon, 0,02% goveđi serumski albumin, 2,5 mM NaH2PO4(pH 7), 0,5% SDS, 2 mM EDTA). SSC je 0,15 M natrijum hlorid/0,15 M natrijum citrat, pH 7. Posle hibridizacije, membrana na koju je preneta DNK se ispira, na primer, u 2 X SSC na sobnoj temperaturi, pa onda u 0,1-0,5 X SSC/0,1 X SDS na temperaturama do 68°C.
[0071] Prema pronalasku, komplementarne nukleinske kiseline imaju najmanje 40%, a naročito najmanje 50%, najmanje 60%, najmanje 70%, najmanje 80%, najmanje 90% i prvenstveno najmanje 95%, najmanje 98% ili najmanje 99%, identičnih nukleotida.
[0072] Nukleinske kiseline koje kodiraju antigene povezane sa tumorom mogu biti prisutne same ili u kombinaciji sa drugim nukleinskim kiselinama, a naročito heterologim nukleinskim kiselinama. U poželjnim primerima izvođenja, nukleinska kiselina je funkcionalno vezana za ekspresione kontrolne sekvence ili regulatorne sekvence koje mogu biti homologe ili heterologe u odnosu na pomenutu nukleinsku kiselinu. Kodirajuća sekvenca i regulatorna sekvenca su međusobno "funkcionalno" povezane, ako su međusobno kovalentno vezane tako da je ekspresija ili transkripcija pomenute kodirajuće sekvence pod kontrolom ili pod uticajem pomenute regulatorne sekvence. Ako se kodirajuća sekvenca translira u funkcionalni protein, onda, sa regulatornom sekvencom funkcionalno povezanom sa pomenutom kodirajućom sekvencom, indukcija pomenute regulatorne sekvence rezultuje transkripcijom pomenute kodirajuće sekvence, bez uzrokovanja promene okvira u kodirajućoj sekvenci ili pomenuta kodirajuća sekvenca ne može da se translira u željeni protein ili peptid.
[0073] Izraz "ekspresiona kontrolna sekvenca" ili "regulatorna sekvenca" sadrži promotore, pojačavače i druge kontrolne elemente koji regulišu ekspresiju gena. U posebnim primerima izvođenja, može biti regulisana ekspresija kontrolnih sekvenci. Tačna struktura regulatornih sekvenci može varirati kao funkcija vrste ili tipa ćelija, ali generalno sadrži 5’netranskribovane i 5’netranslirane sekvence koje su uključene u započinjanje transkripcije i translacije, respektivno, kao što su TATA „box“ (kutija), pokrovna sekvenca, CAAT sekvenca, i slično. Preciznije, 5’netranskribovane regulatorne sekvence sadrže promotorski region koji obuhvata promotorsku sekvencu za transkripcionu kontrolu funkcionalno povezanog gena. Regulatorne sekvence mogu takođe sadržati pojačavačke sekvence ili ushodne aktivatorske sekvence.
[0074] Shodno tome, sa jedne strane se antigeni povezani sa tumorom koji su ovde ilustrovani mogu kombinovati sa bilo kojom ekspresionom kontrolnom sekvencom i promoterima. Međutim, sa druge strane, promoteri genski proizvodi koji su ovde ilustrovani prema pronalasku, mogu biti kombinovani sa bilo kojim drugim genima. Ovo omogućava da se iskoristi selektivna aktivnost ovih promotera.
[0075] Prema pronalasku, nukleinska kiselina može dalje biti prisutna u kombinaciji sa drugom nukleinskom kiselinom koja kodira polipeptid koji kontroliše izlučivanje proteina ili peptida kodiranog pomenutom nukleinskom kiselinom iz ćelije domaćina. Nukleinska kiselina takođe može biti prisutna u kombinaciji sa drugom nukleinskom kiselinom koja kodira polipeptid koji izaziva da se kodirani protein ili polipeptid zakači na ćelijskoj membrani ćelije domaćina ili kompartmentalizuje u posebnim organelama pomenute ćelije. Slično tome, moguća je kombinacija sa nukleinskom kiselinom koja predstavlja reporter gen ili bilo koji "tag".
[0076] U jednom poželjnom primeru izvođenja, rekombinantni DNK molekul je, na primer, vektor, ako je podesno sa promotorom, koji kontroliše ekspresiju nukleinske kiseline, na primer, nukleinske kiseline koja kodira antigen povezan sa tumorom koji je identifikovan prema pronalasku. Izraz "vektor" se ovde upotrebljava u svom najopštijem značenju i obuhvata bilo koji intermedijerni nosač za nukleinsku kiselinu koji omogućava da pomenuta nukleinska kiselina, na primer, bude uvedena u prokariotske i/ili eukariotske ćelije i, ako je podesno, da bude integrisana u genom. Vektori ove vrste se prvenstveno repliciraju i/ili izražavaju u ćelijama. Intermedijerni nosač može biti adaptiran, na primer, za primenu u elektroporaciji, u bombardovanju sa mikroprojektilima, lipozomalnoj primeni, u transferu pomoću agrobakterija ili u inserciji pomoću DNK ili RNK virusa. Vektori obuhvataju plazmide, fagemide, ili virusne genome.
[0077] Nukleinske kiseline koje kodiraju antigen povezan sa tumorom koji je identifikovan prema pronalasku se mogu upotrebljavati za transfekciju ćelija domaćina. Nukleinske kiseline ovde označavaju i rekombinantnu DNK i RNK. Rekombinantna RNK se može dobiti pomoću in-vitro transkripcije DNK obrasca. Dalje, ona se može modifikovati stabilizovanjem sekvenci, pokrivanjem i poliadenilacijom pre primene.
[0078] Prema pronalasku, izraz "ćelija domaćin" se odnosi na bilo koju ćeliju koja se može transformisati ili transfektovati sa egzogenom nukleinskom kiselinom. Izraz "ćelije domaćini" prema pronalasku obuhvata prokariotske (npr. E. coli) ili eukariotske ćelije (npr. dendritske ćelije, B ćelije, CHO ćelije, COS ćelije, K562 ćelije, ćelije kvasca i ćelije insekata). Posebna prednost se daje sisarskim ćelijama, kao što su ćelije ljudi, miševa, hrčaka, svinja, koza, primata. Ćelije mogu poticati od velikog broja tipova tkiva i obuhvataju primarne ćelije i ćelijske linije. Specifični primeri obuhvataju keratinocite, leukocite periferne krvi, matične ćelije koštane srži i embrionalne matične ćelije. U sledećim primerima izvođenja, ćelija domaćin je ćelija koja prezentuje antigen, a naročito dendritska ćelija, monocit ili makrofag. Nukleinska kiselina može biti prisutna u ćeliji domaćinu u obliku samo jedne kopije ili više kopija i, u jednom primeru izvođenja, je izražena u ćeliji domaćinu.
[0079] Prema pronalasku, izraz "ekspresija" se upotrebljava u svom najopštijem značenju i obuhvata dobijanje RNK ili RNK i proteina. On takođe obuhvata delimičnu ekspresiju nukleinske kiseline. Dalje, ekspresija se može izvršiti prolazno ili stabilno. Poželjni ekspresioni sistemi u sisarskim ćelijama obuhvataju pcDNK3.1 i pRc/CMV (Invitrogen, Karlsbad, CA), koji sadrže selektabilni marker, kao što je gen koji prenosi otpornost na G418 (i na taj način omogućava da budu selekcionisane stabilno transfektovane ćelijske linije) i pojačavačko-promotorske sekvence citomegalovirusa (CMV).
[0080] U onim slučajevima u kojima HLA molekul prezentuje antigen povezan sa tumorom ili njegov deo, ekspresioni vektor takođe može sadržati sekvencu nukleinske kiseline koja kodira pomenuti HLA molekul. Sekvenca nukleinske kiseline koja kodira HLA molekul može biti prisutna na istom ekspresionom vektoru kao nukleinska kiselina koja kodira antigen povezan sa tumorom ili njegov deo, ili obe nukleinske kiseline mogu biti prisutne u različitim ekspresionim vektorima. U zadnje pomenutom slučaju, dva ekspresiona vektora mogu biti kotransfektovana u ćeliji. Ako ćelija domaćin ne izražava antigen povezan sa tumorom, ni njegov deo, niti HLA molekul, onda nukleinske kiseline koje ih kodiraju mogu biti transfektovane u ćeliju bilo na istom ekspresionom vektoru ili na različitim ekspresionim vektorima. Ako ćelija već izražava HLA molekul, onda u ćeliju može biti transfektovana samo sekvenca nukleinske kiseline koja kodira antigen povezan sa tumorom ili njegov deo.
[0081] Pronalazak se takođe odnosi na kitove, odn. komplete za amplifikaciju nukleinske kiseline koja kodira antigen povezan sa tumorom. Takvi kompleti sadrže, na primer, par amplifikacionih prajmera koji se hibridizuju sa nukleinskom kiselinom koja kodira antigen povezan sa tumorom. Prajmeri prvenstveno sadrže sekvencu od 6-50, a naročito od 10-30, 15-30 i 20-30 susednih nukleotida nukleinske kiseline i oni se ne preklapaju da bi se izbeglo formiranje dimera prajmera. Jedan od prajmera će se hibridizovati sa jednim lancem nukleinske kiseline koja kodira antigen povezan sa tumorom, a drugi prajmer će se hibridizovati sa komplementarnim lancem u rasporedu koji omogućava amplifikaciju nukleinske kiseline koja kodira antigen povezan sa tumorom.
[0082] "Antisens molekuli" ili "antisens nukleinske kiseline" se mogu koristiti za regulisanje, a naročito smanjenje ekspresije nukleinske kiseline. Izraz "antisens molekul" ili "antisens nukleinska kiselina" se odnosi na oligonukleotid koji je oligoribonukleotid, oligodezoksiribonukleotid, modifikovani oligoribonukleotid ili modifikovani oligodezoksiribonukleotid i koji se hibridizuje pod fiziološkim uslovima sa DNK koja sadrži određen gen ili sa iRNK pomenutog gena, čime se inhibira transkripcija pomenutog gena i/ili translacija pomenute iRNK. "Antisens molekul" takođe sadrži konstrukt koji sadrži nukleinsku kiselinu ili njen deo u obrnutoj, odnosno reverznoj orijentaciji u odnosu na njegov prirodni promotor. Antisens transkript nukleinske kiseline ili njenog dela može formirati dupleks sa prirodnom iRNK koji određuje enzim i na taj način sprečava akumulaciju ili translaciju iRNK u aktivni enzim. Sledeća mogućnost je upotreba ribozima za inaktivaciju nukleinske kiseline. Antisens oligonukleotidi koji su poželjni imaju sekvencu od 6-50, a naročito od 10-30, 15-30 i 20-30, susednih nukleotida ciljne nukleinske kiseline i prvenstveno su potpuno komplementarni sa ciljnom nukleinskom kiselinom ili njenim delom.
[0083] U poželjnim primerima izvođenja, antisens oligonukleotid se hibridizuje sa N-terminalnim ili 5’ ushodnim mestom, kao što je mesto početka translacije, mesto početka transkripcije ili promotorsko mesto. U sledećim primerima izvođenja, antisens oligonukleotid se hibridizuje sa 3’netransliranim regionom ili iRNK splajsnim mestom.
[0084] U jednom primeru izvođenja, ovde opisani oligonukleotid se može sastojati od ribonukleotida, dezoksiribonukleotida ili njihove kombinacije. Pri tome su 5’ kraj jednog nukleotida i 3’ kraj drugog nukleotida međusobno povezani fosfodiestarskom vezom. Ovi oligonukleotidi se mogu sintetizovati na uobičajeni način ili dobiti rekombinantno.
[0085] U poželjnim primerima izvođenja, oligonukleotid je "modifikovani" oligonukleotid. Ovde, oligonukleotid može biti modifikovan na veoma različite načine, bez smanjivanja njegove sposobnosti da se veže za svoje ciljno mesto, sa ciljem da se poveća, na primer, njegova stabilnost ili terapeutska efikasnost. Izraz "modifikovani oligonukleotid" označava oligonukleotid u kome su (i) najmanje dva od njegovih nukleotida međusobno povezana sintetičkom internukleozidnom vezom (tj. internukleozidnom vezom koja je fosfodiestarska veza) i/ili (ii) hemijska grupa koja se obično ne nalazi u nukleinskim kiselinama je kovalentno vezana za oligonukleotid. Poželjne sintetičke internukleozidne veze su fosforotioati, alkil fosfonati, fosforoditioati, fosfatni estri, alkil fosfonotioati, fosforamidati, karbamati, karbonati, fosfatni triestri, acetamidati, karboksimetil estri i peptidi.
[0086] Izraz "modifikovani oligonukleotid" takođe sadrži oligonukleotide koji imaju kovalentno modifikovanu bazu i/ili šećer. "Modifikovani oligonukleotidi" obuhvataju, na primer, oligonukleotide sa šećernim ostacima koji su kovalentno vezani za organske grupe male molekulske težine bez hidroksilne grupe na 3’ poziciji i bez fosfatne grupe na 5’ poziciji. Modifikovani oligonukleotidi mogu sadržati, na primer, 2’-O-alkilovani ostatak riboze ili drugi šećer umesto riboze, kao što je arabinoza.
[0087] Proteini i peptidi koji su opisani prema pronalasku su prvenstveno izolovani. Izraz "izolovani protein" ili "izolovani peptid" znači da je protein ili peptid bio izolovan iz svoje prirodne sredine. Izolovani protein ili peptid može da bude u suštini u prečišćenom stanju. Izraz "u suštini prečišćen" znači da je protein ili peptid u suštini bez drugih supstanci sa kojima se nalazi u prirodi ili in vivo.
[0088] Takvi proteini i peptidi mogu se koristiti, na primer, za dobijanje antitela i u imunološkom ili dijagnostičkom testu ili kao lekovi. Proteini i peptidi koji su opisani prema pronalasku mogu biti izolovani iz bioloških uzoraka, kao što su homogenati tkiva ili ćelija i takođe mogu biti izraženi rekombinantno u velikom broju pro- ili eukariotskih sistema za ekspresiju.
[0089] Kada se koriste u smislu ovog opisa, "derivati" proteina ili peptida ili aminokiselinske sekvence obuhvataju varijante aminokiselinskih insercija, varijante aminokiselinskih delecija i/ili varijante aminokiselinskih supstitucija.
[0090] Varijante aminokiselinskih insercija obuhvataju amino- i/ili karboksi-terminalne fuzije, a takođe i insercije jedne ili više aminokiselina, a naročito aminokiselinske sekvence. U slučaju varijanti aminokiselinske sekvence koje imaju inserciju, jedan ili više aminokiselinskih ostataka je insertovan u određeno mesto u aminokiselinskoj sekvenci, mada je takođe moguća i slučajna insercija sa odgovarajućim skriningom rezultujućeg proizvoda. Varijante aminokiselinskih delecija su karakterisane odstranjivanjem jedne ili više aminokiselina iz sekvence. Varijante aminokiselinskih supstitucija su karakterisane sa odstranjivanjem najmanje jednog ostatka u sekvenci i insertovanjem drugog ostatka na njegovo mesto. Prednost se daje modifikacijama na pozicijama u aminokiselinskoj sekvenci koje nisu konzervativne između homologih proteina ili peptida. Prednost se daje zameni aminokiselina sa drugima koje imaju slična svojstva kao što su hidrofobnost, hidrofilnost, elektronegativnost, zapremina bočnog lanca i slično (konzervativna supstitucija). Konzervativne supstitucije se odnose, na primer, na zamenu jedne aminokiseline sa drugom aminokiselinom između dole navedenih iz iste grupe u kojoj se nalazi aminokiselina koja treba da bude supstituisana:
1. mali alifatični, nepolarni ili blago polarni ostaci: Ala, Ser, Thr (Pro, Gly)
2. negativno naelektrisani ostaci i njihovi amidi: Asn, Asp, Glu, Gln
3. pozitivno naelektrisani ostaci: His, Arg, Lys
4. veliki alifatični, nepolarni ostaci: Met, Leu, Ile, Val (Cys)
5. veliki aromatični ostaci: Phe, Tyr, Trp.
[0091] Zbog njihove posebne uloge u arhitekturi proteina, tri ostatka su prikazana u zagradama. Gly je jedini ostatak bez bočnog lanca i zato obezbeđuje fleksibilnost lanca. Pro ima neuobičajenu geometriju koja znatno ograničava lanac. Cys može obrazovati disulfidni most.
[0092] Varijante aminokiselina koje su gore opisane mogu se lako dobiti uz pomoć poznatih tehnika sinteze peptida, kao što su, na primer, „sinteza čvrste faze“ (Merrifield, 1964) i slični metodi ili manipulacijom rekombinantne DNK.
[0093] Tehnike za uvođenje supstitucionih mutacija na unapred određenim mestima u DNK koja ima poznatu ili delimično poznatu sekvencu su dobro poznate i obuhvataju, na primer, M13 mutagenezu. Manipulacija DNK sekvencama radi dobijanja proteina i peptida koji imaju supstitucije, insercije ili delecije je detaljno opisana, na primer, u Sambrook et al. (1989).
[0094] Prema pronalasku, "derivati" proteina, polipeptida i peptida takođe obuhvataju pojedinačne ili višestruke supstitucije, delecije i/ili adicije bilo kojih molekula povezanih sa enzimom, kao što su ugljeni hidrati, lipidi i/ili proteini, polipeptidi ili peptidi. Izraz "derivat" se takođe proteže na sve funkcionalne hemijske ekvivalente pomenutih proteina, polipeptida ili peptida.
[0095] Prema pronalasku, deo ili fragment antigena povezanog sa tumorom prvenstveno ima funkcionalno svojstvo polipeptida od koga potiče. Takva funkcionalna svojstva sadrže interakciju sa antitelima, interakciju sa drugim polipeptidima ili proteinima, selektivno vezivanje nukleinskih kiselina i enzimsku aktivnost. Posebno svojstvo je sposobnost da obrazuju kompleks sa HLA molekulima i, ako je podesno, da generišu imunu reakciju. Ova imuna reakcija može biti bazirana na stimulaciji citotoksičnih ili T pomoćnih ćelija. Deo ili fragment antigena povezanog sa tumorom prema pronalasku prvenstveno sadrži sekvencu od najmanje 6, a naročito najmanje 8, najmanje 10, najmanje 12, najmanje 15, najmanje 20, najmanje 30 ili najmanje 50, uzastopnih aminokiselina antigena povezanog sa tumorom.
[0096] Deo ili fragment nukleinske kiseline koja kodira antigen povezan sa tumorom se odnosi na deo nukleinske kiseline, koji kodira bar antigen povezan sa tumorom i/ili deo ili fragment pomenutog antigena povezanog sa tumorom, kao što je gore definisano.
[0097] Izolacija i identifikacija gena koji kodiraju antigene povezane sa tumorom takođe omogućava dijagnozu bolesti koja je karakterisana ekspresijom jednog ili više antigena povezanih sa tumorom. Ove metode obuhvataju određivanje jedne ili više nukleinskih kiselina koje kodiraju antigen povezan sa tumorom i/ili određivanje kodiranih antigena povezanih sa tumorom i/ili peptida poreklom od njih.
Nukleinske kiseline se mogu odrediti na uobičajeni način, uključujući lančanu reakciju polimeraze ili hibridizaciju sa obeleženom probom. Antigeni povezani sa tumorom ili peptidi poreklom od onih se mogu odrediti skriningom pacijentovih antiseruma u cilju prepoznavanja antigena i/ili peptida. Oni se takođe mogu odrediti skriningom T ćelija pacijenta radi nalaženja specifičnosti koje odgovaraju antigenu povezanom sa tumorom.
[0098] Predmetni pronalazak takođe omogućava da se izoluju ovde opisani proteini koji se vezuju za antigene povezane sa tumorom, uključujući antitela i ćelijske partnere za vezivanje pomenutih antigena povezanih sa tumorom.
[0099] Prema pronalasku, posebni primeri izvođenja treba da obuhvate realizaciju "dominantno negativnih" polipeptida poreklom od antigena povezanih sa tumorom. Dominantno negativni polipeptid je neaktivna varijanta proteina koja, putem interakcije sa celularnom mašinerijom, uklanja aktivni protein iz njegove interakcije sa celularnom mašinerijom ili koji se takmiči sa aktivnim proteinom, čime smanjuje efekat pomenutog aktivnog proteina. Na primer, dominantno negativni receptor koji se vezuje za ligand, ali ne generiše bilo kakav signal kao reakciju na vezivanje za ligand, može smanjiti biološki efekat pomenutog liganda. Slično tome, dominantna negativna katalitički neaktivna kinaza, koja obično sadejstvuje sa ciljnim proteinima, ali ne fosforiluje pomenute ciljne proteine može smanjiti fosforilaciju pomenutih ciljnih proteina kao reakciju na ćelijski signal. Slično tome, dominantno negativni faktor transkripcije koji se vezuje za promotersko mesto u kontrolnom regionu gena, ali ne povećava transkripciju pomenutog gena, može smanjiti efekat normalnog faktora transkripcije zauzimanjem mesta vezivanja promotera, bez povećanja transkripcije.
[0100] Rezultat ekspresije dominantno negativnog polipeptida u ćeliji je smanjenje funkcije aktivnih proteina. Stručnjak iz odgovarajuće oblasti može pripremiti dominantno negativne varijante proteina, na primer, uobičajenim metodama mutageneze i evaluacijom dominantnog negativnog efekta varijante polipeptida.
[0101] Pronalazak takođe obuhvata supstance, kao što su polipeptidi, koji se vezuju za antigene povezane sa tumorom. Takve supstance za vezivanje se mogu upotrebiti, na primer, u skrining testovima za detekciju antigena povezanih sa tumorom i kompleksa antigena povezanih sa tumorom sa njihovim partnerima za vezivanje, kao i u prečišćavanju antigena povezanih sa tumorom i kompleksa antigena povezanih sa tumoroa sa njihovim partnerima za vezivanje. Takve supstance se takođe mogu upotrebiti za inhibiciju aktivnosti antigena povezanih sa tumorom, na primer, vezivanjem za takve antigene.
[0102] Pronalazak zato sadrži supstance za vezivanje, kao što su, na primer, antitela ili fragmenti antitela, koji mogu da se selektivno vezuju za antigene povezane sa tumorom. Antitela obuhvataju poliklonska i monoklonska antitela koja se proizvode na uobičajeni način.
[0103] Takva antitela mogu prepoznati proteine u prirodnom i/ili denaturisanom stanju (Anderson et al., J. Immunol.143: 1899-1904, 1989; Gardsvoll, J. Immunol. Methods 234: 107-116, 2000; Kayyem et al., Eur. J. Biochem.208: 1-8, 1992; Spiller et al., J. Immunol. Methods 224: 51-60, 1999).
[0104] Antiserumi koji sadrže specifična antitela koja se specifično vezuju za ciljni protein mogu se dobiti različitim standardnim procesima; vidi, na primer, "Monoclonal Antibodies: A Practical Approach" autora Philip Shepherd, Christopher Dean ISBN 0-19-963722-9; "Antibodies: A Laboratory Manual" autora Ed Harlow, David Lane, ISBN: 0879693142 i "Using Antibodies: A Laboratory Manual: Portable Protocol NO" autora Edward Harlow, David Lane, Ed Harlow ISBN 0879695447. Na taj način je takođe moguće da se generišu afinitetna i specifična antitela koja prepoznaju složene membranske proteine u njihovom prirodnom obliku (Azorsa et al., J. Immunol. Methods 229: 35-48, 1999; Anderson et al., J. Immunol.143: 1899-1904, 1989; Gardsvoll, J. Immunol. Methods 234: 107-116, 2000). Ovo je naročito važno za dobijanje antitela koja treba da se primene terapeutski, ali takođe za mnoge dijagnostičke primene. U tom pogledu, moguće je vršiti imunizaciju sa celim proteinom, sa ekstracelularnim delimičnim sekvencama, kao i sa ćelijama koje izražavaju ciljni molekul u fiziološki savijenom obliku.
[0105] Monoklonska antitela se tradicionalno dobijaju korišćenjem tehnologije hibridoma (za tehničke detalje vidi: "Monoclonal Antibodies: A Practical Approach" autora Philip Shepherd, Christopher Dean ISBN 0-19-963722-9; "Antibodies: A Laboratory Manual" autora Ed Harlow, David Lane ISBN: 0879693142; "Using Antibodies: A Laboratory Manual: Portable Protocol NO" autora Edward Harlow, David Lane, Ed Harlow ISBN: 0879695447).
[0106] Poznato je da je samo mali deo molekula antitela, paratop, uključen u vezivanje antitela za njegov epitop (upor. Clark, W.R. (1986), The Experimental Foundations of Modern Immunology, Wiley & Sons, Inc., New York; Roitt, I. (1991), Essential Immunology, 7. izdanje, Blackwell Scientific Publications, Oxford). pFc’ i Fc regioni su, na primer, efektori kaskade komplementa, ali nisu uključeni u vezivanje antigena. Antitelo iz koga je enzimski odstranjen pFc’ region ili koje je dobijeno bez pFc’ regiona, koje se naziva F(ab’)2fragment, nosi oba mesta za vezivanje antigena kompletnog antitela. Slično tome, antitelo iz koga je enzimski odstranjen Fc region ili koje je dobijeno bez pomenutog Fc regiona, koje se naziva Fab fragment, nosi jedno mesto za vezivanje antigena molekula intaktnog antitela. Dalje, Fab fragmenti se sastoje od kovalentno vezanog lakog lanca antitela i dela teškog lanca pomenutog antitela, koji se naziva Fd. Fd fragmenti su glavne determinante specifičnosti antitela (samo jedan Fd fragment može biti povezan sa do deset različitih lakih lanaca, bez promene specifičnosti antitela) i Fd fragmenti, kada se izoluju, zadržavaju sposobnost da se vezuju za epitop.
[0107] Unutar dela antitela za vezivanje antigena su lokalizovani regioni koji određuju komplementarnost (engl. complementary-determining regions, skr. CDRs), koji sadejstvuju direktno sa epitopom antigena i okvirnim regionima (engl. framework regions, skr. FRs), koji zadržavaju tercijarnu strukturu paratopa. Fd fragment teškog lanca i laki lanac IgG imunoglobulina sadrže četiri okvirna regiona (FR1 do FR4) koji su uvek razdvojeni sa tri regiona koji određuju komplementarnost (CDR1 do CDR3). CDRs, a naročito CDR3 regioni, te posebno CDR3 region teškog lanca su u velikoj meri odgovorni za specifičnost antitela.
[0108] Poznato je da ne-CDR regioni sisarskog antitela mogu da se zamene sličnim regionima antitela sa istom ili različitom specifičnosti, uz zadržavanje specifičnosti za epitop originalnog antitela. Ovo je omogućilo razvoj "humanizovanih" antitela, kod kojih su nehumani CDRs kovalentno vezani za humane FR i/ili Fc/pFc’ regione da bi se dobilo funkcionalno antitelo.
[0109] Ovo se primenjuje u takozvanoj "SLAM" tehnologiji, pri čemu se izoluju B ćelije iz cele krvi i te ćelije se monokloniraju. Onda se supernatant pojedinačnih B ćelija analizira u pogledu njegove specifičnosti za antitelo. Nasuprot tehnologiji hibridoma, varijabilni region gena antitela se amplifikuje korišćenjem PCR za pojedinačne ćelije i klonira se u podesni vektor. Na taj način se ubrzava dobijanje monoklonskih antitela (de Wildt et al., J. Immunol. Methods 207: 61-67, 1997).
[0110] Kao sledeći primer, u WO 92/04381 su opisani proizvodnja i primena humanizovanih mišijih RSV antitela u kojima je bar deo mišijih FR regiona bio zamenjen sa FR regionima ljudskog porekla. Antitela ove vrste, uključujući fragmente intaktnih antitela sa sposobnošću vezivanja antigena, se često nazivaju "himerična" antitela.
[0111] Prema pronalasku se dobijaju takođe i F(ab’)2-, Fab-, Fv-, i Fd- fragmenti antitela, himerična antitela, kod kojih su Fc i/ili FR i/ili CDR1 i/ili CDR2 i/ili CDR3 regioni lakog lanca bili zamenjeni sa homologim humanim ili nehumanim sekvencama, antitela himeričnog F(ab’)2-fragmenta u kojima su FR i/ili CDR1 i/ili CDR2 i/ili CDR3 regioni lakog lanca bili zamenjeni sa homologim humanim ili nehumanim sekvencama, himerični Fab fragment antitela kod koga su FR i/ili CDR1 i/ili CDR2 i/ili CDR3 regioni lakog lanca bili zamenjeni sa homologim humanim ili nehumanim sekvencama, i antitela himeričnog Fdfragmenta kod kojih su FR i/ili CDR1 i/ili CDR2 regioni bili zamenjeni sa homologim humanim ili nehumanim sekvencama. Prema pronalasku takođe su obuhvaćena takozvana jednolančana antitela.
[0112] Prema pronalasku obuhvaćeni su takođe polipeptidi koji se specifično vezuju za antigene povezane sa tumorom. Materije za vezivanje polipeptida se mogu dobiti, na primer, pomoću biblioteka degenerisanih peptida koje se mogu jednostavno pripremiti u rastvoru u imobilizovanom obliku ili kao biblioteke za prikazivanje faga. Isto tako je moguće da se dobiju kombinatorne biblioteke peptida sa jednom ili više aminokiselina. Takođe se mogu dobiti biblioteke peptida i nepeptidnih sintetičkih ostataka.
[0113] Prikazivanje faga može biti posebno efektivno u identifikaciji peptida koji se vezuju prema pronalasku. U vezi toga se, na primer, priprema biblioteka faga (korišćenjem, na primer, m13-, fd- ili lambda-faga) koji prezentuju inserte dužine od 4 do oko 80 aminokiselinskih ostataka. Onda se vrši selekcija faga koji nose inserte koji se vezuju za antigen povezan sa tumorom. Ovaj proces se može ponoviti u dva ili više ciklusa reselekcija faga koji se vezuju za antigen koji je povezan sa tumorom. Ponovljeni ciklusi rezultuju koncentracijom faga koji nose posebne sekvence. Može se izvršiti analiza DNK sekvenci da bi se identifikovale sekvence izraženih polipeptida. Može se odrediti najmanji linearni deo sekvence koji se vezuje za antigen povezan sa tumorom. "Dvohibridni sistem" kvasca se takođe može upotrebiti za identifikaciju polipeptida koji se vezuju za antigen povezan sa tumorom. Antigeni povezani sa tumorom koji su opisani prema pronalasku ili njihovi fragmenti se mogu primeniti za skrining biblioteka peptida, uključujući biblioteke za prikazivanje faga, da bi se identifikovali i selektovali partneri antigena povezanih sa tumorom koji se vezuju za peptide. Takvi molekuli se mogu primeniti, na primer, za skrining testove, protokole prečišćavanja, za remećenje funkcije antigena povezanog sa tumorom i za druge svrhe koje su poznate stručnjaku iz odgovarajuće oblasti.
[0114] Gore opisana antitela i drugi molekuli za vezivanje takođe se mogu primeniti, na primer, za identifikaciju tkiva koje izražava antigen povezan sa tumorom. Antitela takođe mogu biti kuplovana sa specifičnim dijagnostičkim supstancama radi prikazivanja ćelija i tkiva koja izražavaju antigene povezane sa tumorom. Ona dalje takođe mogu biti kuplovana na terapeutski korisne supstance.
Dijagnostičke supstance obuhvataju, na neograničavajući način, barijum sulfat, jocetaminsku kiselinu, jopansku kiselinu, kalcijum ipodat, natrijum diatrizoat, meglumin diatrizoat, metrizamid, natrijum tiropanoat i radio dijagnostike, uključujući emitere pozitrona kao što je fluor-18 i ugljenik-11, gama emitere kao što su jod-123, tehnecijum-99m, jod-131 i indijum-111, nuklide za nuklearnu magnetnu rezonancu, kao što su fluor i gadolinijum. Prema pronalasku, izraz "terapeutski korisna supstanca" označava bilo koji terapeutski molekul koji se selektivno dovodi do ćelije koja izražava jedan ili više antigena povezanih sa tumorom, a obuhvata antikancerske agense, jedinjenja obeležena radioaktivnim jodom, toksine, citostatike ili citolitičke lekove itd. Antikancerski agensi obuhvataju, na primer, aminoglutetimid, azatioprin, bleomicin sulfat, busulfan, karmustin, hlorambucil, cisplatin, ciklofosfamid, ciklosporin, citarabidin, dakarbazin, daktinomicin, daunorubin, doksorubicin, taksol, etopozid, fluorouracil, interferon-a, lomustin, merkaptopurin, metotreksat, mitotan, prokarbazin HCl, tiogvanin, vinblastin sulfat i vinkristin sulfat. Drugi antikancerski agensi su opisani, na primer, u Goodman i Gilman, "The Pharmacological Basis of Therapeutics", 8. izdanje, 1990, McGraw-Hill, Inc., a naročito u Poglavlju 52 (Antineoplastic Agents (Paul Calabresi i Bruce A. Chabner). Toksini mogu biti proteini kao što je antivirusni protein iz vinobojke (lat. Phytolacca americana), toksin kolere, toksin velikog kašlja, ricin, gelonin, abrin, egzotoksin difterije ili egzotoksin Pseudomonasa. Ostaci toksina takođe mogu biti radionuklidi koji emituju visoku energiju, kao što je kobalt-60.
[0115] Izraz "pacijent" označava ljudsko biće, nehumanog primata ili drugu životinju, a naročito sisara, kao što je krava, konj, svinja, ovca, koza, pas, mačka ili glodar, kao što su miš i pacov. U posebno poželjnom primeru izvođenja, pacijent je ljudsko biće.
[0116] Prema pronalasku, izraz "bolest" se odnosi na bilo koje patološko stanje kod koga su antigeni povezani sa tumorom izraženi ili abnormalno izraženi. "Abnormalna ekspresija" prema pronalasku znači da je ekspresija promenjena, a prvenstveno je povećana u poređenju sa stanjem kod zdrave jedinke. Povećanje ekspresije znači povećanje od najmanje 10%, a naročito najmanje 20%, najmanje 50% ili najmanje 100%. U jednom primeru izvođenja, antigen povezan sa tumorom je izražen samo u tkivu bolesne jedinke, dok je kod zdrave jedinke ekspresija suzbijena. Jedan primer takve bolesti je kancer, pri čemu izraz "kancer" prema pronalasku obuhvata leukemije, seminome, melanome, teratome, gliome, kancer bubrega, kancer nadbubrežnih žlezda, kancer štitne žlezde, intestinalni kancer, kancer jetre, kancer kolona, kancer želuca, gastrointestinalni kancer, kancer limfnih čvorova, kancer jednjaka, kolorektalni kancer, kancer pankreasa, kancer uha, grla i nosa (ORL, nem. HNO, engl. ENT), kancer dojke, kancer prostate, kancer materice, kancer jajnika i kancer pluća i njihove metastaze.
[0117] Prema pronalasku, biološki uzorak može biti uzorak tkiva i/ili uzorak ćelija i može se dobiti na uobičajeni način, kao što je biopsijom tkiva, uključujući probojnu biopsiju, i uzimanjem krvi, bronhijalnog aspirata, ispljuvka, urina, fecesa ili drugih telesnih tečnosti, za primenu u različitim ovde opisanim metodama.
[0118] Prema pronalasku, izraz "imunoreaktivna ćelija" označava ćeliju koja može da sazri u imunu ćeliju (kao što je B ćelija, T pomoćna ćelija, ili citolitička T ćelija) uz pogodnu stimulaciju.
Imunoreaktivne ćelije obuhvataju CD34<+>hematopoetske matične ćelije, nezrele i zrele T ćelije i nezrele i zrele B ćelije. Ako je poželjna proizvodnja citolitičkih ili T pomoćnih ćelija koje prepoznaju antigen povezan sa tumorom, onda se imunoreaktivna ćelija dovodi u kontakt sa ćelijom koja izražava antigen povezan sa tumorom pod uslovima koji stimulišu stvaranje, diferencijaciju i/ili selekciju citolitičkih, kao i T pomoćnih ćelija. Diferencijacija prekursora T ćelija u citolitičke T ćelije, kada su izloženi antigenu, je slična klonskoj selekciji imunog sistema.
[0119] Neki terapeutski metodi su bazirani na reakciji imunog sistema pacijenta, koja rezultuje lizom ćelija koje prezentuju antigen, kao što su ćelije kancera, koje prezentuju jedan ili više antigena povezanih sa tumorom. U vezi toga, na primer, autologi citotoksični T limfociti specifični za kompleks antigena povezanog sa tumorom i MHC molekula se daju pacijentu koji ima celularnu abnormalnost. Poznata je proizvodnja takvih citotoksičnih T limfocita in vitro. Jedan primer metoda diferencijacije T ćelija se može naći u WO-A-9633265. Generalno, uzorak koji sadrži ćelije, kao što su ćelije krvi, se uzima od pacijenta i ćelije se dovode u kontakt sa ćelijom koja prezentuje kompleks i koja može izazvati propagaciju citotoksičnih T limfocita (npr. dendritskih ćelija). Ciljna ćelija može biti transfektovana ćelija, kao što je COS ćelija. Ove transfektovane ćelije prezentuju željeni kompleks na svojoj površini i, kada se dovedu u kontakt sa citotoksičnim T limfocitima, stimulišu propagaciju zadnje pomenutih. Onda se pacijentu daju klonski ekspandovani autologi citotoksični T limfociti.
[0120] U sledećem metodu selekcije citotoksičnih T limfocita specifičnih za antigen, fluorogeni tetrameri MHC molekulskih/peptidnih kompleksa klase I se upotrebljavaju za dobijanje specifičnih klonova citotoksičnih T limfocita (Altman et al., Science 274:94-96, 1996; Dunbar et al., Curr. Biol.8:413-416, 1998). Molekuli klase I rastvorljivih MHC se savijaju in vitro u prisustvu β2mikroglobulina i peptidnog antigena koji se vezuje za pomenuti molekul klase I. Kompleksi MHC/peptid se prečišćavaju, a zatim se obeležavaju sa biotinom. Tetrameri se formiraju mešanjem biotinilovanih kompleksa peptid-MHC sa obeleženim avidinom (npr. fikoeritrinom) u molskom odnosu 4:1. Tetrameri se onda dovode u kontakt sa citotoksičnim T limfocitima, kao što je periferna krv ili limfni čvorovi. Tetrameri se vezuju za citotoksične T limfocite koji prepoznaju peptidni kompleks antigen/MHC klase I. Ćelije koje se vezuju za tetramere se mogu sortirati fluorescencijom kontrolisanim sortiranjem ćelija da bi se izolovali reaktivni citotoksični T limfociti. Izolovani citotoksični T limfociti se onda mogu propagirati in vitro.
[0121] Kod terapeutskih metoda koje su poznate kao adoptivni transfer (Greenberg, J. Immunol.
136(5):1917, 1986; Riddel et al., Science 257:238, 1992; Lynch et al., Eur. J. Immunol.21:1403-1410, 1991; Kast et al., Cell 59:603-614, 1989) se ćelije koje prezentuju željeni kompleks (npr. dendritske ćelije) kombinuju sa citotoksičnim T limfocitima pacijenta koji treba da se leči, što rezultuje propagacijom specifičnih citotoksičnih T limfocita. Onda se pacijentu koji ima celularnu anomaliju koja je naročito karakterisana abnormalnim ćelijama koje prezentuju specifični kompleks daju propagirani citotoksični T limfociti. Zatim citotoksični T limfociti liziraju abnormalne ćelije, čime se ostvaruje željeni terapeutski efekat.
[0122] Često se od repertoara T ćelija pacijenta mogu propagirati samo T ćelije sa niskim afinitetom za specifični kompleks ove vrste, pošto se one sa visokim odstranjuju usled razvoja tolerancije.
Alternativno tome, može biti izvršen transfer samog receptora T ćelija. Za te svrhe takođe mogu biti kombinovane ćelije koje prezentuju željeni kompleks (npr. dendritske ćelije) sa citotoksičnim T limfocitima zdravih jedinki ili drugih vrsta (npr. miša). Ovo rezultuje propagacijom specifičnih citotoksičnih T limfocita sa visokim afinitetom, ako su T limfociti dobijeni iz organizma donora koji nije prethodno bio u kontaktu sa specifičnim kompleksom. Visoko-afinitetni T ćelijski receptor ovih propagiranih specifičnih T limfocita se klonira.
Ako su visoko-afinitetni T ćelijski receptori klonirani od drugih vrsta, onda oni mogu biti humanizovani do različite mere. T ćelijski receptori dobijeni na ovaj način se zatim mogu transdukovati transferom gena, na primer, korišćenjem retrovirusnih vektora, u T ćelije pacijenata. Onda može biti izvršen adoptivni transfer ovih genski promenjenih T limfocita (Stanislawski et al., Nat Immunol.2:962-70, 2001; Kessels et al., Nat Immunol.2:957-61, 2001).
[0123] Gore navedeni terapeutski aspekti polaze od činjenice da bar neke od abnormalnih ćelija pacijenta prezentuju kompleks antigena povezanog sa tumorom i HLA molekul. Takve ćelije se mogu identifikovati na način koji je poznat kao takav. Čim se ćelije koje prezentuju kompleks identifikuju, one se mogu sjediniti sa uzorkom pacijenta koji sadrži citotoksične T limfocite. Ako citotoksični T limfociti liziraju ćelije koje prezentuju kompleks, onda se može pretpostaviti da je prezentovan antigen povezan sa tumorom.
[0124] Adoptivni transfer nije jedini oblik terapije koji se može primeniti prema pronalasku. Takođe se mogu generisati citotoksični T limfociti in vivo na način koji je poznat kao takav. Prema jednom metodu se upotrebljavaju neproliferativne ćelije koje izražavaju kompleks. Ćelije koje se ovde upotrebljavaju će biti one koje obično izražavaju kompleks, kao što su ozračene ćelije tumora ili ćelije transfektovane sa jednim ili oba gena neophodna za prezentaciju kompleksa (tj. antigenog peptida i prezentujućeg HLA molekula). Mogu biti upotrebljeni različiti tipovi ćelija. Dalje, moguće je upotrebiti vektore koji nose jedan ili oba gena od interesa. Posebna prednost se daje virusnim ili bakterijskim vektorima. Na primer, nukleinske kiseline koje kodiraju antigen povezan sa tumorom ili njegov deo mogu biti funkcionalno vezane za promoter i pojačavačke sekvence koje kontrolišu ekspresiju pomenutog antigena povezanog sa tumorom ili njegovog fragmenta, a naročito u određenim tipovima tkiva ili ćelija. Nukleinska kiselina može biti inkorporirana u vektor ekspresije. Vektori ekspresije mogu biti nemodifikovane ekstrahromozomske nukleinske kiseline, plazmidi ili virusni genomi u koje mogu biti insertovane egzogene nukleinske kiseline. Nukleinske kiseline koje kodiraju antigen povezan sa tumorom mogu takođe biti insertovane u retrovirusni genom, čime se omogućava da nukleinska kiselina bude integrisana u genom ciljnog tkiva ili ciljnu ćeliju. U ovim sistemima, mikroorganizam, kao što je vakcinija virus, virus boginja, herpes simpleks virus, retrovirus ili adenovirus, nosi gen od interesa i de fakto "inficira" ćelije domaćine. Sledeći poželjni oblik je uvođenje antigena povezanog sa tumorom u obliku rekombinantne RNK. On se može uvesti u ćelije, na primer, putem lipozomskog transfera ili elektroporacije. Rezultujuće ćelije prezentuju kompleks od interesa i njih prepoznaju autologni citotoksični T limfociti, koji se onda propagiraju.
[0125] Sličan efekat se može ostvariti kombinovanjem antigena povezanog sa tumorom ili njegovog fragmenta sa adjuvansom da bi se omogućilo ugrađivanje u ćelije koje prezentuju antigen in vivo. Antigen povezan sa tumorom ili njegov fragment može biti prezentovan kao protein, DNK (npr. unutar vektora) ili RNK. Antigen povezan sa tumorom se obrađuje tako da proizvede peptidni partner za HLA molekul, dok njegov fragment može biti prezentovan bez potrebe za daljom obradom. Zadnje pomenuto važi naročito, ako ovi mogu da se vezuju za HLA molekule. Prednost se daje oblicima za primenu u kojima se kompletan antigen obrađuje in vivo pomoću dendritskih ćelija, pošto se time takođe mogu ostvariti reakcije T pomoćnih ćelija. One su potrebne za efektivnu imunu reakciju (Ossendorp et al., Immunol Lett.74:75-9, 2000; Ossendorp et al., J. Exp. Med.187:693-702, 1998). Generalno, moguće je davati efektivnu količinu antigena povezanog sa tumorom pacijentu, na primer, intradermalnom injekcijom. Međutim, injekcija se može takođe dati intranodalno u limfni čvor (Maloy et al., Proc Natl Acad Sci USA 98:3299-303, 2001). Ovo se takođe može izvesti u kombinaciji sa reagensima koji olakšavaju resorpciju u dendritskim ćelijama. Poželjni antigeni povezani sa tumorom obuhvataju one koji reaguju sa alogenskim kancerskim antiserumima ili sa T ćelijama mnogih pacijenata sa kancerom. Međutim, od posebnog interesa su oni kod kojih ne postoje prethodno spontane imune reakcije.
Evidentno je da je moguće protiv istih indukovati imune reakcije koje mogu lizirati tumore (Keogh et al., J. Immunol.167:787-96, 2001; Appella et al., Biomed Pept Proteins Nucleic Acids 1:177-84, 1995; Wentworth et al., Mol. Immunol.32:603-12, 1995).
[0126] Farmaceutske kompozicije opisane prema pronalasku mogu se takođe primeniti kao vakcine za imunizaciju. Prema pronalasku, izrazi "imunizacija" ili "vakcinacija" se prvenstveno odnose na povećanje ili aktivaciju imune reakcije na antigen. Za testiranje imunizujućeg efekta na kancer korišćenjem antigena povezanog sa tumorom ili nukleinske kiseline koja ga kodira je moguće primeniti životinjske modele. Na primer, humane ćelije kancera se mogu uvesti u miša da bi se generisao tumor, i može im se dati jedna ili više nukleinskih kiselina koje kodiraju antigene povezane sa tumorom. Može se izmeriti efekat na ćelije kancera (na primer, smanjenje veličine tumora) kao mera efektivnosti imunizacije nukleinskom kiselinom.
[0127] Kao deo kompozicije za imunizaciju, prvenstveno se jedan ili više antigena povezanih sa tumorom ili njihovih stimulišućih fragmenata daju zajedno sa jednim ili više adjuvanasa radi indukovanja imune reakcije ili radi pojačanja imune reakcije. Adjuvans je supstanca koja je ugrađena u antigen ili se daje zajedno za zadnje pomenutim i koja pojačava imunu reakciju. Adjuvansi mogu pojačati imunu reakciju obezbeđivanjem rezervoara antigena (ekstracelularno ili u makrofagima), aktiviranjem makrofaga i/ili stimulisanjem posebnih limfocita. Adjuvansi su poznati i na neograničavajući način obuhvataju monofosforil lipid A (MPL, SmithKline Beecham), saponine, kao što su QS21 (SmithKline Beecham), DQS21 (SmithKline Beecham; WO 96/33739), QS7, QS17, QS18 i QS-L1 (So et al., Mol. Cells 7:178-186, 1997), nekompletni Frojndov adjuvans, kompletni Frojndov adjuvans, vitamin E, montanid, stipsu, CpG oligonukleotide (upor. Kreig et al., Nature 374:546-9, 1995) i različite emulzije voda-u-ulju pripremljene od biološki razgradivih ulja, kao što su skvalen i/ili tokoferol. Peptidi se prvenstveno daju u smeši sa DQS21/MPL. Odnos DQS21 prema MPL je obično oko 1:10 do 10:1, a prvenstveno oko 1:5 do 5:1 i naročito oko 1:1. Za davanje ljudima, formulacija vakcine obično sadrži DQS21 i MPL u opsegu od oko 1 μg do oko 100 μg.
[0128] Takođe se mogu davati druge supstance koje stimulišu imunu reakciju kod pacijenta. Moguće je, na primer, koristiti citokine za vakcinaciju, zahvaljujući njihovim regulatornim svojstvima za limfocite. Takvi citokini obuhvataju, na primer, interleukin-12 (IL-12), za koji je pokazano da pojačava zaštitna dejstva vakcina (upor. Science 268:1432-1434, 1995), GM-CSF i IL-18.
[0129] Postoji više jedinjenja koja pojačavaju imunu reakciju i koja se zato mogu koristiti za vakcinaciju. Ona sadrže kostimulišuće molekule, koji imaju oblik proteina ili nukleinskih kiselina. Takvi kostimulišući molekuli su, na primer, B7-1 i B7-2 (CD80 i CD86, respektivno), koji se izražavaju na dendritskim ćelijama (DC) i sadejstvuju sa CD28 molekulom izraženim na T ćelijama. Ova interakcija obezbeđuje kostimulaciju (signal 2) antigenom/MHC/TCR stimulisane (signal 1) T ćelije, čime se povećava propagacija pomenute T ćelije i efektorska funkcija. B7 takođe sadejstvuje sa CTLA4 (CD152) na T ćelijama, a studije koje uključuju CTLA4 i B7 ligande pokazuju da B7-CTLA4 interakcija može povećati antitumorski imunitet i CTL propagaciju (Zheng, P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95(11):6284-6289 (1998)).
[0130] B7 obično nije izražen na tumorskim ćelijama, tako da one nisu efektivne antigen-prezentujuće ćelije (APCs) za T ćelije. Indukcija B7 ekspresije bi omogućila da tumorske ćelije efikasnije stimulišu propagaciju citotoksičnih T limfocita i efektorsku funkciju. Kostimulacija sa kombinacijom B7/IL-6/IL-12 otkriva indukciju IFN-gama i Th1-citokinskog profila u populaciji T ćelija, što rezultuje sa još većom aktivnosti T ćelija (Gajewski et al., J. Immunol.154:5637-5648 (1995)).
[0131] Potpuna aktivacija citotoksičnih T limfocita i potpuna efektorska funkcija zahtevaju uključivanje T pomoćnih ćelija putem interakcije između CD40 liganda na pomenutim T pomoćnim ćelijama i CD40 molekula izraženih od strane dendritskih ćelija (Ridge et al., Nature 393:474 (1998), Bennett et al., Nature 393:478 (1998), Schönberger et al., Nature 393:480 (1998)). Mehanizam ovog kostimulišućeg signala se verovatno odnosi na povećanje proizvodnje B7 i sa njom povezane proizvodnje IL-6/IL-12 od strane pomenutih dendritskih ćelija (antigen-prezentujuće ćelije). Zato interakcija CD40-CD40L upotpunjuje interakciju signala 1 (antigen/MHC-TCR) i signala 2 (B7-CD28).
[0132] Očekivalo bi se da primena anti-CD40 antitela na stimulaciju dendritskih ćelija direktno pojača reakciju na tumorske antigene, koji su obično izvan opsega zapaljenske reakcije ili koji su prezentovani od strane neprofesionalnih antigen-prezentujućih ćelija (tumorskih ćelija). U ovim situacijama nisu obezbeđeni T-pomoćni i B7-kostimulišući signali. Ovaj mehanizam bi se mogao primeniti u vezi sa terapijama baziranim na antigenom-pulsiranim dendritskim ćelijama.
[0133] Pronalaskom je takođe realizovano davanje nukleinskih kiselina, polipeptida ili peptida.
Polipeptidi i peptidi se mogu davati na način koji je poznat kao takav. U jednom primeru izvođenja, nukleinske kiseline se daju ex vivo metodama, tj. uzimanjem ćelija od pacijenta, genskom modifikacijom pomenutih ćelija da bi se ugradio antigen povezan sa tumorom i ponovnim uvođenjem promenjenih ćelija u pacijenta. Ovo generalno obuhvata uvođenje funkcionalne kopije gena u ćelije pacijenta in vitro i ponovno uvođenje genski promenjenih ćelija u pacijenta. Funkcionalna kopija gena je pod funkcionalnom kontrolom regulatornih elemenata koji omogućavaju da gen bude izražen u genski promenjenim ćelijama. Metodi transfekcije i transdukcije su poznati stručnjaku iz odgovarajuće oblasti. Pronalaskom je takođe realizovano davanje nukleinskih kiselina in vivo korišćenjem vektora, kao što su virusi i ciljno kontrolisani lipozomi.
[0134] U poželjnom primeru izvođenja, virusni vektor za davanje nukleinske kiseline koja kodira antigen povezan sa tumorom je izabran iz grupe koja se sastoji od adenovirusa, virusa povezanih sa adenovirusima, virusa boginja, uključujući vakcinija virus i oslabljene viruse boginja, Semliki Forest virus, retroviruse, Sindbis virus i čestice slične Ty virusu. Posebna prednost se daje adenovirusima i retrovirusima. Retrovirusi su obično deficijentni u pogledu replikacije (tj. oni ne mogu da generišu infektivne čestice).
[0135] Mogu se primeniti različiti postupci za uvođenje nukleinskih kiselina u ćelije in vitro ili in vivo. Takvi postupci obuhvataju transfekciju nukleinske kiseline sa CaPO4-talozima, transfekciju nukleinskih kiselina povezanu sa DEAE, transfekciju ili infekciju sa gore navedenim virusima koji nose nukleinske kiseline od interesa, lipozomima posredovanu transfekciju i slično. U posebnim primerima izvođenja daje se prednost usmeravanju nukleinske kiseline u posebne ćelije. U takvim primerima izvođenja, nosač koji se upotrebljava za davanje nukleinske kiseline ćeliji (npr. retrovirus ili lipozom) može imati vezani ciljni kontrolni molekul. Na primer, molekul kao što je antitelo specifično za protein na površini membrane na ciljnoj ćeliji ili ligand za receptor na ciljnoj ćeliji, može biti ugrađen u nosač nukleinske kiseline ili vezan na njega. Poželjna antitela sadrže antitela koja se selektivno vezuju za antigen povezan sa tumorom. Ako je poželjno davanje nukleinske kiseline putem lipozoma, onda proteini koji se vezuju za protein na površini membrane povezan sa endocitozom mogu biti ugrađeni u formulaciju lipozoma da bi se omogućila ciljna kontrola i/ili apsorpcija. Takvi proteini sadrže kapsidne proteine ili njihove fragmente koji su specifični za određen tip ćelije, antitela za proteine koji se internalizuju, proteine koji su usmereni na intracelularno mesto i slično.
[0136] Terapeutske kompozicije prema pronalasku mogu se davati u farmaceutski kompatibilnim preparatima. Takvi preparati mogu obično sadržati farmaceutski kompatibilne koncentracije soli, puferskih supstanci, konzervanasa, nosača, suplementirajućih supstanci koje pojačavaju imunitet, kao što su adjuvansi, npr. CpG i citokini, i, ako je podesno, druga terapeutski aktivna jedinjenja.
[0137] Terapeutski aktivna jedinjenja prema pronalasku mogu se davati bilo kojim uobičajenim putem, uključujući injekciju ili infuziju. Davanje se može vršiti, na primer, oralno, intravenski, intraperitonealno, intramuskularno, subkutano ili transdermalno. Prvenstveno se antitela terapeutski daju u obliku aerosola za pluća. Antisens nukleinske kiseline se prvenstveno daju sporom intravenskom primenom.
[0138] Kompozicije prema pronalasku se daju u efektivnim količinama. "Efektivna količina" se odnosi na količinu koja ostvaruje željenu reakciju ili željeni efekat sama ili zajedno sa dodatnim dozama. U slučaju lečenja određene bolesti ili određenog stanja karakterisanog ekspresijom jednog ili više antigena povezanih sa tumorom, željena reakcija se prvenstveno odnosi na inhibiciju toka bolesti. Ovo obuhvata usporavanje napredovanja bolesti i, naročito, prekid napredovanja bolesti. Željena reakcija u lečenju bolesti ili stanja takođe može biti odlaganje pojave ili prevencija pojave pomenute bolesti ili pomenutog stanja.
[0139] Efektivna količina kompozicije prema pronalasku će zavisiti od stanja koje treba da se leči, od ozbiljnosti bolesti, individualnih parametara pacijenta, uključujući starost, fiziološko stanje, visinu i težinu, trajanje lečenja, tip prateće terapije (ako postoji), specifični način primene i slične faktore.
[0140] Farmaceutske kompozicije prema pronalasku su prvenstveno sterilne i sadrže efektivnu količinu terapeutski aktivne supstance radi generisanja željene reakcije ili željenog efekta.
[0141] Doze kompozicija prema pronalasku koje se daju mogu zavisiti od različitih parametara, kao što je tip primene, stanje pacijenta, željeni period primene itd. U slučaju da je reakcija pacijenta na početnu dozu nedovoljna, mogu se primeniti veće doze (ili efektivno veće doze koje se ostvaruju drugačijim, lokalizovanijim načinom primene).
[0142] Generalno se formulišu i primenjuju radi lečenja ili radi generisanja ili pojačanja imune reakcije doze antigena povezanog sa tumorom od 1 ng do 1 mg, a prvenstveno od 10 ng do 100 μg. Ako je poželjna primena nukleinskih kiselina (DNK i RNK) koje kodiraju antigene povezane sa tumorom, onda se formulišu i primenjuju doze od 1 ng do 0,1 mg.
[0143] Farmaceutske kompozicije prema pronalasku se generalno daju u farmaceutski kompatibilnim količinama i u farmaceutski kompatibilnim kompozicijama. Izraz "farmaceutski kompatibilan" se odnosi na netoksični materijal koji ne utiče na dejstvo aktivne komponente farmaceutske kompozicije.
[0144] Preparati ove vrste mogu obično sadržati soli, puferske supstance, konzervanse, nosače i, ako je podesno, druga terapeutski aktivna jedinjenja. Kada se upotrebljavaju u medicini, onda bi soli trebale da budu farmaceutski kompatibilne. Međutim, soli koje nisu farmaceutski kompatibilne se mogu primeniti za dobijanje farmaceutski kompatibilnih soli i obuhvaćene su pronalaskom. Farmakološki i farmaceutski kompatibilne soli ove vrste obuhvataju, na neograničavajući način, one koje su dobijene od sledećih kiselina: hlorovodonične, bromovodonične, sumporne, azotne, fosforne, maleinske, sirćetne, salicilne, limunske, mravlje, malonske, ćilibarne kiseline i sličnih. Farmaceutski kompatibilne soli se mogu takođe pripremiti kao soli alkalnih metala ili soli zemnoalkalnih metala, kao što su natrijumove soli, kalijumove soli ili kalcijumove soli.
[0145] Farmaceutska kompozicija prema pronalasku može sadržati farmaceutski kompatibilni nosač. Prema pronalasku, izraz "farmaceutski kompatibilan nosač" se odnosi na jedan ili više kompatibilnih čvrstih ili tečnih punilaca, razređivača ili inkapsulirajućih supstanci, koje su podesne za davanje ljudima. Izraz "nosač" se odnosi na organsku ili neorgansku komponentu, prirodnog ili sintetičkog porekla, u kojoj je kombinovana aktivna komponenta da bi se olakšala primena. Komponente farmaceutske kompozicije prema pronalasku su obično takve da ne dolazi do interakcije koja u suštini smanjuje željenu farmaceutsku efikasnost.
[0146] Farmaceutske kompozicije prema pronalasku mogu sadržati podesne puferske supstance, kao što su sirćetna kiselina u soli, limunska kiselina u soli, borna kiselina u soli i fosforna kiselina u soli.
[0147] Farmaceutske kompozicije takođe mogu, ako je podesno, sadržati podesne konzervanse, kao što su benzalkonijum hlorid, hlorobutanol, paraben i timerosal.
[0148] Farmaceutske kompozicije su obično pripremljene u obliku ujednačene doze i mogu se pripremiti na način koji je poznat kao takav. Farmaceutske kompozicije prema pronalasku mogu biti, na primer, u obliku kapsula, tableta, lozengi, suspenzija, sirupa, eliksira ili u obliku emulzije.
[0149] Kompozicije koje su podesne za parenteralno davanje obično sadrže sterilni vodeni ili nevodeni preparat aktivnog jedinjenja, koji je prvenstveno izotoničan u krvi primaoca. Primeri kompatibilnih nosača i rastvarača su Ringerov rastvor i izotonični rastvor natrijum hlorida. Pored toga, obično se upotrebljavaju sterilna, fiksirana ulja kao medijum za rastvaranje ili suspendovanje.
[0150] Predmetni pronalazak je detaljno opisan na osnovu slika i primera u nastavku, koji su upotrebljeni isključivo radi ilustracije i ne treba ih smatrati ograničavajućim. Na osnovu opisa i primera, stručnjaku iz odgovarajuće oblasti su dostupni drugi primeri izvođenja, koji su isto tako obuhvaćeni pronalaskom.
SLIKE NACRTA:
FIG.1. Ekspresija claudina-18A2.1 u želucu i jednjaku, kao i tumorima želuca i pankreasa
[0151] RT-PCR ispitivanja sa prajmerima specifičnim za claudin-18A2.1 (SEQ ID NO: 39, 40) je prema pronalasku pokazala u 8/10 biopsija tumora želuca, kao i u 3/6 biopsija tumora pankreasa izraženu ekspresiju claudina-18A2.1. U normalnim tkivima želuca i jednjaka je isto tako uočena jasna ekspresija. Nasuprot tome, u jajniku i tumorima jajnika nije detektovana ekspresija.
FIG.2. Šematski prikaz konformacije claudina-18
[0152] Prema pronalasku, polipeptid claudin-18A2 može postojati na ćeliji u dve konformacije. U konformaciji 1, protein je prisutan kao molekul membrane koji ima četiri transmembranska domena (TM) i dva posebna, ekstracelularno lokalizovana domena. U konformaciji 2, dva hidrofobna regiona u sredini (h-phob) ne vrše funkciju transmembranskog domena. Shodno tome, u ovoj konformaciji, u poređenju sa konformacijom 1, dodatni peptidni regioni su locirani ekstracelularno. Pored toga, dodatno mesto N glikozilacije rezultuje u ovoj konformaciji na poziciji 116 (deblja strelica). Svi prognozirani domeni glikozilacije su prikazani u donjem delu slike. Ex1: ekstracelularni domen 1, Ex2: ekstracelularni domen 2, TM: transmembranski domen, H-phob: ekstracelularni hidrofobni region.
FIG.3. Kvantitativna ekspresija claudina-18, varijanta A1
[0153] Claudin-18A1 je detektabilan u nenormalnom tkivu, izuzev plućnog i želudačnog tkiva. Claudin-18A1 je veoma izražen u velikom broju tumorskih tkiva. Posebno snažna ekspresija je otkrivena kod tumora želuca, tumora pluća, tumora pankreasa i tumora jednjaka.
FIG.4. Kvantitativna ekspresija claudina-18, varijanta A2
[0154] Claudin-18A2 je detektabilan u nenormalnom tkivu, izuzev želudačnog tkiva. Claudin-18A2 je veoma izražen u velikom broju tumorskih tkiva, a naročito u tumorima želuca, tumorima pluća, tumorima pankreasa i tumorima jednjaka.
FIG.5. Primena claudin-18A2-specifičnih antitela (ekstracelularni domen)
[0155]
A: bojenje ćelija tumora želuca pozitivnih na claudin-18A2 (SNU-16, fiksirano metanolom) sa antitelom, koje je dobijeno imunizacijom sa peptidom (SEQ ID NO: 17). Došlo je do posebno jakog bojenja membrane u regionima interakcije ćelija/ćelija. Protein se nakupio u žarišnim regionima membrane.
B, C, D: detekcija specifičnosti antitela kolokalizacionom analizom u claudin-18A2-GFP-transfektovanim-293T-ćelijama. B: GFP-fluorescencija; C: anti-claudin-18A2; D: interakcija.
FIG.6. Primena claudin-18A2-specifičnih antitela (ekstracelularni domen)
[0156] Membransko bojenje ćelija claudin-18A2-pozitivnih tumora želuca (SNU-16) sa antitelom koje je bilo proizvedeno imunizacijom sa peptidom (SEQ ID NO: 113, N-terminalno locirani ekstracelularni domen). Monoklonsko antitelo koje je usmereno protiv E-kadherina je bilo upotrebljeno za kontrabojenje. A: claudin-18A2 antitelo; B: anti-E-kadherinsko kontra-bojenje; C: interakcija.
FIG.7. Primena antitela protiv C-terminalnog ekstracelularnog domena claudina-18
[0157]
Leve slike: Membransko bojenje ćelija claudin-18A2-pozitivnih tumora želuca (SNU-16) sa antitelom koje je bilo proizvedeno imunizacijom sa peptidom (SEQ ID NO: 116, C-terminalno locirani ekstracelularni domen). Monoklonsko antitelo koje je usmereno protiv E-kadherina je bilo upotrebljeno za kontra-bojenje (desne slike).
FIG.8. Primena claudin-18A1-specifičnih antitela
[0158]
Gore: Slabo do odsutno bojenje ćelija tumora želuca (SNU-16; claudin18A2 pozitivne) sa antitelom koje je bilo proizvedeno imunizacijom sa claudin-18A1-specifičnim peptidom (SEQ ID NO: 115). A: anti-E-kadherin; B: anti-claudin-18A1; C: superimpozicija.
Dole: Demonstracija specifičnosti antitela analizom kolokalizacije u claudin-18A1-GFP-transfektovanim 293T ćelijama. A: GFP fluorescencija; B: anti-claudin-18A1; C: superimpozicija.
FIG.9. Detekcija claudina-18A2 u Vestern blotu.
[0159] Vestern blotiranje sa lizatima od različitih zdravih tkiva sa claudin-18A2-specifičnim antitelom usmerenim protiv epitopa sa SEQ ID NO: 17. Normalna tkiva 1: želudac; 2: testis; 3: koža; 4: dojka; 5: jetra; 6: kolon; 7: pluća; 8: bubreg; 9: limfni čvor.
FIG.10. Claudin-18A2 Vestern blotiranje sa uzorcima želuca i tumora želuca, kao i različite tumorske ćelijske linije
[0160] Lizati od želuca i tumora želuca (A, B) i tumorske ćelijske linije (C, D) su bili blotirani i testirani uz korišćenje claudin-18A2-specifičnog antitela protiv epitopa koje je imalo SEQ ID NO: 17. Tumori želuca ispoljavaju manje glikozilovani oblik claudina-18A2. Tretman lizata želuca sa PNGase F dovodi do formiranja slabo-glikozilovanog oblika.
A: 1: normalno tkivo želuca #A; 2: tumor želuca #A; 3: normalno tkivo želuca #B; 4: tumor želuca #B
B: 1: normalno tkivo želuca #A; 2: normalno tkivo želuca #B; 3: normalno tkivo želuca #B+PNGase F; 4: tumor želuca #C; 5: tumor želuca #D; 6: tumor želuca #D+PNGase F
C: 1: normalno tkivo želuca; 2: MDA-MB-231; 3: SK-MEL-37; 4: AGS; 5: SNU-1; 6: SNU-16; 7: EF027; 8: TOV-112D; 9: OVCAR. Vidi se da tumorske ćelijske linije izražavaju deglikozilovanu varijantu claudina-18A2.
D: Zbirna tabela Vestern blot podataka za selekciju ćelijskih linija koje su bile testirane uz korišćenje claudin-18A2 specifičnog antitela.
FIG.11. Ekspresija claudina-18 kod tumora pluća
[0161] Slabo glikozilovane claudin-18A2 varijante su bile detektovane kod tumora pluća prema FIG.30.
1: normalno tkivo želuca; 2: tumor želuca; 3-9: tumori pluća.
FIG.12. Imunohistohemijska analiza claudina-18 uz korišćenje claudin-18A2-specifičnih antitela kod normalnih tkiva
[0162] Kod želudačne mukoze su obojene samo diferencirane epitelne ćelije na ulaznom otvoru, kao i na dnu žlezda. Claudin-18A2 nije detektabilan u matičnim ćelijama želuca. Sva druga ispitivana normalna tkiva takođe ne izražavaju ovaj gen, kao što je na primer, pokazano za bubreg, pluća i kolon.
FIG.13. Rezultati imune histologije uz korišćenje claudin-18A2 specifičnog poliklonskog antiseruma.
[0163]
A: Primeri za specifično bojenje tkiva tumora pluća. Vidi se da normalno tkivo pluća koje izražava varijantu claudin-18A1 nije prepoznalo claudin-18A2 specifični antiserum.
B: Primeri za specifično bojenje tumora jednjaka. Vidi se da zdrave ćelije u blizini nisu obojene. C: Primeri za specifično bojenje tumora želuca. Ovde zdrave ćelije u blizini takođe nisu obojene. D: Zbirna tabela primera sa imunohistohemijskim podacima uz korišćenje claudin-18A2 specifičnih antitela. AdenoCa: adenokarcinom; SCC: karcinom skvamoznog epitela; RCC: karcinom bubrežnih ćelija.
FIG.14. Sekvence
[0164] Prikazane su sekvence na koje se ovde vrši poziv.
FIG.15. Određivanje ekstracelularnih regiona claudina-18A2
[0165] Bila su pripremljena tri konstrukta, pri čemu je svaki imao markersku sekvencu (myc ili HA tag) u jednom od domena EX1 (=ekstracelularni domen 1), EX2 (=ekstracelularni domen 2) ili D3 (=domen 3) (gore). Onda su oni bili transfektovani u ćelijske linije, a zatim je bilo testirano da li se antitelo usmereno protiv ovih markerskih sekvenci vezuje za nepermeabilizovane ćelije. Ovo zahteva da odgovarajući region proteina bude topološki ekstracelularan. Protočna citometrija je pokazala da su sva tri regiona molekula pristupačna antitelu (dole).
FIG.16. Topologija membrane za claudin-18A2
[0166] Prema našim podacima, claudin-18A2 može postojati u konformaciji 2 u kojoj dva unutrašnja hidrofobna domena ne prolaze integralno kroz ćelijsku membranu. Zbog toga su veći regioni ovog molekula ekstracelularni. Ovde su takođe locirani domeni glikozilacije koji su, prema našim podacima, glikozilovani u normalnom tkivu, želuca, ali ne i u tumorima. Shodno tome, pojavljuju se epitopi koji su specifični za tumorsko tkivo.
FIG.17. FACS analiza za određivanje ekstracelularne lokalizacije claudina-18.
[0167] Slika prikazuje analizu protočnom citometrijom sa nepermeabilizovanim ćelijama transfektovanim sa claudinom-18A1 cele dužine, claudinom-18A2 i blanko transfektovane, kao i transfektovane sa delovima claudina-18A2. Pokazano je da antitela mAB1 i mAB2 prepoznaju specifično claudin-18A2 (leva kolona) i ekstracelularni domen 2 (Ex2, treća kolona) na površini ćelije, dok su claudin-18A1 (druga kolona) i negativna kontrola (poslednja kolona) negativne. Antitelo mAB1 za razliku od mAB2 se takođe specifično vezuje za ekstracelularni domen 1 (Ex1, četvrta kolona). Primeri:
Materijali i metode
[0168] Izrazi "in silico", "elektronski" i "virtualno kloniranje" se odnose isključivo na primenu metoda na bazi baza podataka, koje se takođe mogu primeniti za simulaciju laboratorijskih eksperimentalnih procesa.
[0169] Osim ako eksplicitno nije definisano drugačije, svi drugi izrazi i termini se koriste onako kao što bi ih razumeo stručnjak iz odgovarajuće oblasti. Tehnike i metode koje su ovde pomenute su izvedene na način koji je poznat kao takav i opisane su, na primer, u Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. izdanje (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. Sve metode, uključujući primenu kompleta i reagenasa, su izvedene prema informacijama proizvođača.
Strategija bazirana na analizi podataka radi određivanja novih gena povezanih sa tumorom
[0170] Bile su kombinovane dve in silico strategije, i to GenBank pretraga po ključnim rečima i cDNAxProfiler. Primena NCBI ENTREZ Search and Retrieval System (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Entrez), GenBank pretrage je bila izvedena za gene kandidate za koje se smatralo da su specifično izraženi u specifičnim tkivima (Wheeler et al., Nucleic Acids Research 28:10-14, 2000).
Vršenjem upita sa ključnim rečima, kao što su "kolon-specifični gen", "želudac-specifični gen" ili "bubreg-specifični gen", su iz baza podataka bili izdvojeni geni kandidati (GOI, geni od interesa).
Pretraživanje je bilo ograničeno na deo celokupnih informacija u ovim bazama podataka korišćenjem ograničenja "homo sapiens", za organizam, i "iRNK", za tip molekula.
Utvrđeno je da je lista GOI bila precizna pri utvrđivanju različitih naziva za istu sekvencu i za eliminaciju takvih redundancija.
Svi geni kandidati dobijeni pretragom po ključnim rečima su bili dalje proučeni u pogledu svoje raspodele u tkivu pomoću metoda "electronic Northern" (eNorthen). eNorthern je baziran na poravnanju sekvence GOI sa bazom podataka EST (tag izražene sekvence, engl. expressed sequence tag) (Adams et al., Science 252:1651, 1991) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST). Poreklo tkiva svakog EST za koji je bilo utvrđeno da je homolog sa insertovanim GOI se može odrediti, a na taj način zbir svih EST-ova daje preliminarnu procenu raspodele GOI u tkivu. Dalje studije su bile izvedene samo sa onim GOI koji nisu imali homologije sa EST iz normalnih tkiva koja nisu bila specifična za organe. Ova procena je takođe uzela u obzir da javni domen sadrži pogrešno označene kDNK biblioteke (Scheurle et al., Cancer Res.60:4037-4043, 2000) (www.fau.edu/cmbb/publications/cancergenes6.htm). Drugi metod analize podataka koji je primenjen je bio cDNA xprofiler iz the NCBI Cancer Genome Anatomy Project (http://cgap.nci.nih.gov/Tkiva/xProfiler) (Hillier et al., Genome Research 6:807-828, 1996; Pennisi, Science 276:1023-1024, 1997). Ovo omogućava da se pulovi transkriptoma deponovanih u bazama podataka dovedu u međusobnu relaciju pomoću logičkih operatora. Mi smo definisali pul A kome su bile dodeljene sve ekspresione biblioteke dobijene, na primer, od kolona, uz isključivanje mešovitih biblioteka. Sve kDNK biblioteke dobijene od normalnih tkiva drugačijih od kolona su bile dodeljene pulu B. Generalno, sve kDNK biblioteke su bile korišćene nezavisno od upotrebljenih metoda dobijanja, ali su bile dozvoljene samo one sa veličinom >1000. Pul B je bio digitalno oduzet od pula A pomoću operatora ALI NE. Skup GOI pronađenih na ovaj način je takođe bio podvrgnut eNorthern studijama i validiran ispitivanjem literature. Ova kombinovana analiza podataka obuhvata sve od oko 13 000 gena cele dužine u javnom domenu i na osnovu ovih gena potencijalnu ekspresiju specifičnu za organe.
[0171] Svi drugi geni su prvo bili procenjeni u normalnim tkivima pomoću specifične RT-PCR. Svi GOI za koje je dokazano da se izražavaju u normalnim tkivima koja nisu specifična za organe su smatrani za lažno pozitivne i bili su isključeni iz daljih studija. Preostali su bili proučeni u velikom panelu sa mnoštvom različitih tumorskih tkiva. Pokazalo se da se dole opisani antigeni aktiviraju u tumorskim ćelijama.
Ekstrakcija RNK, pripremanje poli-d(T) prajmirane kDNK i uobičajena RT-PCR analiza
[0172] Ukupna RNK je ekstrahovana iz materijala prirodnog tkiva korišćenjem gvanidijum izotiocijanata kao haotropnog agensa (Chomczynski & Sacchi, Anal. Biochem.162:156-9, 1987). Posle ekstrakcije sa kiselim fenolom i taloženjem sa izopropanolom, pomenuta RNK je bila rastvorena u vodi tretiranoj sa DEPC.
Sinteza prvog lanca kDNK od 2-4 μg ukupne RNK je bila izvedena u 20 μl reakcione smeše pomoću Superscripta II (Invitrogen), prema informacijama proizvođača. Upotrebljeni prajmer je bio dT(18) oligonukleotid. Integritet i kvalitet kDNK su provereni amplifikacijom p53 u 30 ciklusa PCR (sensni CGTGAGCGCTTCGAGATGTTCCG, antisensni CCTAACCAGCTGCCCAACTGTAG, temperatura hibridizacije 67°C).
Arhiva prvog lanca kDNK je bila pripremljena od više normalnih tkiva i tumorskih entiteta. Za studije ekspresije je bilo amplifikovano 0,5 μl ovih kDNK u 30 μl reakcione smeše, korišćenjem GOI-specifičnih prajmera (vidi dole) i 1 U HotStarTaq DNK polimeraze (Qiagen). Svaka reakciona smeša je sadržala 0.3 mM dNTPs, 0.3 μM svakog prajmera i 3 μl 10 x reakcionog pufera.
Prajmeri su izabrani tako da budu locirani na dva različita egzona, a eliminacija interference kontaminirajuće genomske DNK kao razlog za lažne pozitivne rezultate je potvrđena testiranjem nereverzno-transkribovane DNK kao obrasca. Posle 15 minuta na 95°C da bi se aktivirala HotStarTaq DNK polimeraza, izvedeno je 35 ciklusa PCR (1 min na 94ºC, 1 min na konkretnoj temperaturi hibridizacije, 2 min na 72ºC i finalno izduživanje na 72ºC tokom 6 min).20 μl ove reakcione smeše je frakcionisano, pa je analizirano na etidijum bromidom obojenom agaroznom gelu.
[0173] Za analizu ekspresija odgovarajućih antigena na navedenoj temperaturi hibridizacije su bili upotrebljeni sledeći prajmeri.
Claudin18A1 (64ºC)
[0174]
Sensni: 5'-GAGGCAGAGTTCAGGCTTCACCGA-3' (SEQ ID NO: 109)
Antisensni: 5'-TGTTGGCTTTGGCAGAGTCC-3' (SEQ ID NO: 110)
Claudin18A2 (68ºC)
[0175]
Sensnil: 5'-GGTTCGTGGTTTCACTGATTGGGATTGC-3' (SEQ ID NO: 39)
Antisensnil: 5'-CGGCTTTGTAGTTGGTTTCTTCTGGTG-3' (SEQ ID NO: 40)
Sensni2: 5'-TGTTTTCAACTACCAGGGGC-3' (SEQ ID NO: 107)
Antisensni2: 5'-TGTTGGCTTTGGCAGAGTCC-3' (SEQ ID NO: 108)
Priprema kDNK prajmirane slučajnim heksamerom i kvantitativna PCR u realnom vremenu
[0176] Ekspresija nekoliko gena je kvantifikovana pomoću PCR u realnom vremenu. PCR proizvodi su detektovani korišćenjem SYBR Green kao interkalirajuće reporter boje. Reporter fluorescencija SYBR Green je suprimirana u rastvoru, a boja je bila aktivna tek posle vezivanja dvolančanih fragmenata DNK. Povećanje SYBR Green fluorescencije kao rezultat specifične amplifikacije uz korišćenje GOIspecifičnih prajmera posle svakog ciklusa PCR je primenjeno za kvantifikaciju. Ekspresija ciljnog gena je kvantifikovana apsolutno ili relativno u odnosu na ekspresiju kontrolnog gena, sa konstantnom ekspresijom u ispitivanim tkivima. Ekspresija je izmerena posle standardizacije uzoraka protiv 18s RNK kao takozvanog pripremnog gena korišćenjem ΔΔ-Ctmetoda (PE Biosystems, USA). Reakcije su izvršene u dva ponavljanja, a određene su u tri ponavljanja. QuantiTect SYBR Green PCR komplet (Qiagen, Hilden) je upotrebljen prema instrukcijama proizvođača. Sinteza kDNK je bila izvršena sa High Capacity cDNA Archive Kit (PE Biosystems, USA) uz primenu heksamernih prajmera prema instrukcijama proizvođača. Po 5 μl kDNK je upotrebljeno u ukupnoj zapremini od 25 μl za PCR: sens prajmer 300 nM, antisens prajmer 300 nM; početna denaturacija 95°C u trajanju od 15 min; 95°C u trajanju od 30 sec; spajanje u trajanju od 30 sec; 72°C u trajanju od 30 sec; 40 ciklusa. Sekvence upotrebljenih prajmera su navedene u odgovarajućim primerima.
Kloniranje i sekvencijalna analiza
[0177] Kloniranje celih gena i fragmenata gena je izvedeno uobičajenim metodama. Da bi se odredila sekvenca, odgovarajući antigeni su bili amplifikovani korišćenjem ispravljačke polimeraze pfu (Stratagene). Posle završetka PCR, adenozin je vezan pomoću HotStarTaq DNK polimeraze za krajeve amplikona radi kloniranja fragmenata prema instrukcijama proizvođača u TOPO-TA vektoru.
Sekvenciranje je izvršeno komercijalnim putem. Sekvence su bile analizirane korišćenjem uobičajenih programa i algoritama za predviđanje.
Vestern blotiranje
[0178] Ćelije iz ćelijske kulture (endogena ekspresija ciljnog gena ili sinteza ciljnog proteina posle transfekcije vektora ekspresije koji kodira ciljni protein) ili uzoraka tkiva koje bi mogle sadržati ciljni protein se liziraju u 1% SDS rastvoru. SDS denaturiše proteine koji su prisutni u lizatu. Lizati eksperimentalne smeše se frakcionišu prema veličini pomoću elektroforeze na 8-15% denaturišućim poliakrilamidnim gelovima (koji sadrže 1% SDS) u zavisnosti od očekivane veličine proteina (SDS poliakrilamidna gel elektroforeza, SDS-PAGE). Onda se proteini prenose polusuvim metodom elektroblotiranja (Biorad) na nitroceluloznu membranu (Schleicher & Schüll) na kojoj se može detektovati željeni protein. Za ove svrhe se membrana inicijalno blokira (npr. sa mlekom u prahu), pa se onda inkubira sa specifičnim antitelom u razređenju od 1:20-1:200 (u zavisnosti od specifičnosti antitela) tokom 60 minuta. Posle koraka ispiranja, membrana se inkubira sa drugim antitelom koje je kuplovano sa markerom (npr. enzimi, kao što su peroksidaza ili alkalna fosfataza) i koje prepoznaje prvo antitelo. Posle sledećeg koraka ispiranja se sledstveno ciljni protein vizuelizuje u reakciji bojenja ili hemiluminescencije na membrani pomoću enzimske reakcije (npr. ECL, Amersham Bioscience).
Rezultat se dokumentuje fotografisanjem sa podesnim fotoaparatom.
[0179] Analiza modifikacija proteina se obično vrši Vestern blotiranjem. Glikozilacije, koje obično imaju veličinu od nekoliko kDa, dovode do veće ukupne mase ciljnog proteina, koji se može frakcionisati u SDS-PAGE. Da bi se detektovale specifične O- i N-glikozidne veze, lizati proteina iz tkiva ili ćelija se inkubiraju pre denaturacije pomoću SDS sa O- ili N-glikozidazama (u skladu sa odgovarajućim instrukcijama njihovog proizvođača, npr. PNgazom, endoglikozidazom F, endoglikozidazom H, Roche Diagnostics). Ovo je praćeno Vestern blotiranjem kao što je gore opisano. Shodno tome, ako postoji smanjenje veličine ciljnog proteina posle inkubacije sa glikozidazom, onda je moguće detektovati specifičnu glikozilaciju i, na taj način, takođe analizirati tumorsku specifičnost modifikacije. Tačna pozicija glikozilovane aminokiseline se može predvideti pomoću algoritama i programa za predikciju.
Imunofluorescencija
[0180] Koriste se ćelije definisanih ćelijskih linija koje sintetizuju ciljni protein endogeno (detekcija RNK u RT-PCR ili proteina Vestern blotiranjem) ili su još transfektovane sa plazmidnom DNK pre IF. Dobro je poznato mnoštvo različitih metoda (npr. elektroporacija, lipozomima posredovana transfekcija, taloženje kalcijum fosfata) za transfekciju ćelijskih linija sa DNK (npr. Lemoine et al. Methods Mol. Biol.
1997; 75: 441-7). Transfektovani plazmid može u imunofluorescenciji kodirati nemodifikovani protein ili se još može kuplovati sa različitim aminokiselinskim markerima sa ciljnim proteinom. Najvažniji markeri su, na primer, fluorescentni "zeleni fluorescentni protein" (GFP) u svojim različitim diferencijalno fluorescentnim oblicima i kratke peptidne sekvence od 6-12 aminokiselina za koje su rapoloživa visokoafinitetna i specifična antitela. Ćelije koje sintetizuju ciljni protein se fiksiraju sa paraformaldehidom, saponinom ili metanolom. Onda se ćelije mogu, ako je potrebno, permeabilizovati inkubacijom sa deterdžentima (npr.0.2% Triton X-100). Posle fiksacije/permeabilizacije, ćelije se inkubiraju sa primarnim antitelom koje je usmereno protiv ciljnog proteina ili protiv jednog od kuplovanih markera. Posle koraka ispiranja, smeša se inkubira sa drugim antitelom kuplovanim sa fluorescentnim markerom (npr. fluorescinom, Texas Red, Dako), koji se vezuje za prvo antitelo. Ćelije koje su obeležene na ovaj način se onda pokrivaju slojem glicerola i analiziraju uz pomoć fluorescentnog mikroskopa u skladu sa instrukcijama proizvođača. Specifične emisije fluorescencije se ostvaruju u ovom slučaju specifičnom pobudom u zavisnosti od upotrebljenih supstanci. Analiza normalno omogućava pouzdanu lokalizaciju ciljnog proteina, a kvalitet antitela i ciljnog proteina su potvrđeni dvostrukim bojenjima da bi se pored toga obojio ciljni protein koji je takođe kuplovan sa aminokiselinskim markerima ili drugim markerskim proteinima čija lokalizacija je bila opisana u literaturi. GFP i njegovi derivati predstavljaju specijalni slučaj kada se mogu direktno pobuditi i sami imati fluorescenciju, tako da za detekciju nisu neophodna antitela.
Imunohistohemija
[0181] IHC služi specifično za (1) omogućavanje procene količine ciljnog proteina u tumorskim i normalnim tkivima, (2) analizu koliko ćelija u tumorskom i zdravom tkivu sintetizuje ciljni gen, i/ili (3) definisanje tipa ćelija u tkivu (tumorske, zdrave ćelije) u kojima se može detektovati ciljni protein. Moraju se primeniti različiti protokoli u zavisnosti od pojedinog antitela (npr. "Diagnostic Immunohistochemistry by David J., MD Dabbs ISBN: 0443065667" ili u "Microscopy, Immunohistochemistry, and Antigen Retrieval Methods: For Light and Electron Microscopy ISBN: 0306467704").
[0182] Imunohistohemija (IHC) na specifičnim uzorcima tkiva služi za detekciju proteina u odgovarajućem tkivu. Cilj ovog metoda je da se identifikuje lokalizacija proteina u funkcionalno intaktnom agregatu tkiva. IHC služi specifično za (1) omogućavanje procene količine ciljnog proteina u tumorskim i normalnim tkivima, (2) analizu koliko ćelija u tumorskom i zdravom tkivu sintetizuju ciljni gen, i (3) definisanje tipa ćelija u tkivu (tumorske, zdrave ćelije) u kojima se može detektovati ciljni protein. Alternativno tome, količine proteina ciljnog gena se mogu kvantifikovati imunofluorescencijom tkiva uz korišćenje digitalnog fotoaparata i podesnog softvera (npr. Tillvision, Till-photonics, Nemačka). Ova tehnologija je bila često publikovana, pa se zato detalji bojenja i mikroskopije mogu naći, na primer, u "Diagnostic Immunohistochemistry" autora David J., MD Dabbs ISBN: 0443065667 ili "Microscopy, Immunohistochemistry, and Antigene Retrieval Methods: For Light and Electron Microscopy" ISBN: 0306467704. Treba naglasiti da zbog svojstava antitela moraju da se primene različiti protokoli (jedan primer je opisan dole) da bi se dobio validan rezultat.
[0183] Obično se koriste histološki definisana tumorska tkiva i, kao referenca, uporediva zdrava tkiva u IHC. Pored toga je moguće da se kao pozitivne i negativne kontrole upotrebe ćelijske linije u kojima je prisustvo ciljnog gena poznato zahvaljujući RT-PCR analizama. Uvek mora biti uključena bazična kontrola.
[0184] Fiksirano tkivo (npr. fiksiranje sa supstancama koje sadrže aldehid, formaldehid, paraformaldehid ili u alkoholnim rastvorima) ili trenutno zamrznuti komadi tkiva debljine od 1-10 μm se postavljaju na stakleni nosač. Uzorci smešteni u parafinu se oslobađaju od parafina, na primer, sa ksilenom. Uzorci se ispiraju sa TBS-T, pa se blokiraju u serumu. Ovo je praćeno inkubacijom sa prvim antitelom (razređenje: 1:2 do 1:2000) tokom 1-18 sati, pri čemu se normalno koriste afinitetno prečišćena antitela. Korak ispiranja je praćen inkubacijom sa drugim antitelom koje je kuplovano sa alkalnom fosfatazom (alternativno: na primer, peroksidazom), i usmereno je protiv prvog antitela, tokom oko 30-60 minuta. Ovo je praćeno reakcijom sa korišćenjem obojenih supstrata koji se konvertuju pomoću vezanih enzima (upor. na primer, Shi et al., J. Histochem. Cytochem.39: 741-748, 1991; Shin et al., Lab. Invest.64: 693-702, 1991). Da bi se demonstrirala specifičnost antitela, reakcija se može blokirati prethodnom dodavanjem imunogena.
Imunizacija
[0185] (Vidi takođe Monoclone Antibodies: A Practical Approach by Philip Shepherd, Christopher Dean ISBN 0-19-963722-9; Antibodies: A Laboratory Manual by Ed Harlow, David Lane ISBN: 0879693142; Using Antibodies: A Laboratory Manual: Portable Protocol NO. autori Edward Harlow, David Lane, Ed Harlow ISBN: 0879695447).
[0186] Proces za dobijanje antitela je ukratko opisan u nastavku, a detalji se mogu naći u citiranim publikacijama. Životinje (npr. zečevi) se prvo imunizuju prvom injekcijom željenog ciljnog proteina. Imuna reakcija životinja na imunogen se može pojačati drugom ili trećom imunizacijom u toku definisanog perioda (oko 2-4 nedelje posle prethodne imunizacije). Ponovo se posle različitih definisanih perioda (prvo uzimanje krvi posle 4 nedelje, a onda na oko 2 nedelje, sa ukupno do 5 uzimanja uzoraka), uzima krv od životinja, a od nje se dobija imuni serum.
[0187] Životinje se obično imunizuju jednom od četiri dobro poznate metode, pri čemu su raspoložive takođe i druge metode. Pored toga je moguća imunizacija sa peptidima koji su specifični za ciljni protein, sa kompletnim proteinom ili sa ekstracelularnim parcijalnim sekvencama proteina koje se mogu identifikovati eksperimentalno ili pomoću programa za predikciju.
(1) U prvom slučaju, peptidi (dužina: 8-12 aminokiselina) konjugovani sa KLH
(hemocijanin iz prilepka Megathura crenulata, engl. Keyhole limpet hemocyanin) se sintetizuju standardizovanim in vitro metodom, pa se ovi peptidi koriste za imunizaciju. Obično se vrše 3 imunizacije sa koncentracijom od 5-1000 μg/imunizaciji. Imunizacija se takođe može izvršiti uslužno od strane pružalaca usluga.
(2) Alternativno tome, imunizacija se može izvršiti sa rekombinantnim proteinima. Za ove svrhe se klonirani DNK ciljnog gena klonira u vektor ekspresije, pa se onda ciljni protein sintetizuje po analogiji sa uslovima određenog proizvođača (npr. Roche Diagnostics, Invitrogen, Clontech, Qiagen), na primer, bez ćelija in vitro, u bakterijama (npr. E. coli), u kvascu (npr. S. pombe), u insektnim ćelijama ili u sisarskim ćelijama. Posle sinteze u jednom od sistema, ciljni protein se prečišćava, pri čemu se prečišćavanje u ovom slučaju obično izvodi standardizovanim hromatografskim metodama. Pri tome se takođe za imunizaciju mogu primeniti proteini koji imaju molekulsko sidro kao pomoć pri prečišćavanju (npr. His tag, Qiagen; FLAG tag, Roche Diagnostics; Gst fuzioni proteini). Veliki broj protokola se može naći, na primer, u "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons Ltd., Wiley Interscience.
(3) Ako se može nabaviti ćelijska linija koja sintetizuje željeni protein endogeno, onda se ova ćelijska linija takođe može primeniti za proizvodnju specifičnog antiseruma. U ovom slučaju, imunizacija se vrši u 1-3 injekcije, sa po oko 1-5x10<7>ćelija.
(4) Imunizacija se takođe može izvesti sa injekcijom DNK (DNK imunizacija). Za ove svrhe se ciljni gen inicijalno klonira u vektor ekspresije, tako da je ciljna sekvenca pod kontrolom jakog eukariotskog promotera (npr. CMV promotera). Posle toga se 5-100 μg DNK prenosi kao imunogen uz korišćenje "genskog pištolja"/u kapilarne regione sa jakom cirkulacijom krvi u organizmu (npr. miš, zec). Preneta DNK se resorbuje od strane ćelija životinje, pa se ciljni gen izražava, a životinja konačno razvija imunu reakciju na ciljni gen (Jung et al., Mol Cells 12:41-49, 2001; Kasinrerk et al., Hybrid Hybridomics 21:287-293, 2002).
Kontrola kvaliteta poliklonskog seruma, odn. antitela
[0188] Testovi bazirani na ćelijskoj kulturi sa sledstvenim Vestern blotiranjem su najpodesniji za demonstraciju specifičnosti (različite varijacije su opisane, na primer, u "Current Protocols in Proteinchemistry", John Wiley & Sons Ltd., Wiley InterScience). Za demonstraciju, ćelije su transfektovane sa kDNK, koja je pod kontrolom jakog eukariotskog promotera (npr. citomegalovirusnog promotera), za ciljni protein. Mnoštvo različitih metoda (npr. elektroporacija, lipozomima posredovana transfekcija, taloženje kalcijum fosfata) su dobro poznati za transfekciju ćelijskih linija sa DNK (npr. Lemoine et al., Methods Mol. Biol.75:441-7, 1997). Takođe je, alternativno tome, moguće upotrebiti ćelijske linije koje izražavaju ciljni gen endogeno (demonstracija pomoću za ciljni gen specifične RT-PCR). Kao kontrola, u idealnom slučaju se homologi geni takođe transfektuju u eksperimentu, da bi se mogla demonstrirati specifičnost analiziranog antitela u sledstvenom Vestern blotu.
[0189] U sledstvenom Vestern blotu, ćelije iz ćelijske kulture ili uzoraka tkiva koje bi mogle sadržati ciljni protein se liziraju u 1% SDS rastvoru, a time se denaturišu proteini. Lizati se frakcionišu prema veličini pomoću elektroforeze na 8-15% denaturišućim poliakrilamidnim gelovima (sadrže 1% SDS) (SDS poliakrilamidna gel elektroforeza, SDS-PAGE). Onda se proteini prenose pomoću jedne od mnoštva metoda za blotiranje (npr. polusuvi elektroblot; Biorad) na specifičnu membranu (npr. nitroceluloza, Schleicher & Schüll). Željeni protein se može vizuelizovati na ovoj membrani. Za ove svrhe, membrana se prvo inkubira sa antitelom koje prepoznaje ciljni protein (razređenje oko 1:20-1:200, u zavisnosti od specifičnosti antitela) tokom 60 minuta. Posle koraka ispiranja, membrana se inkubira sa drugim antitelom koje se kupluje sa markerom (npr. enzimima kao što su peroksidaza ili alkalna fosfataza) i koje prepoznaje prvo antitelo. Onda je moguće u reakciji bojenja ili hemiluminescencije vizuelizovati ciljni protein na membrani (npr. ECL, Amersham Bioscience). Antitelo sa visokom specifičnosti za ciljni protein bi u idealnom slučaju trebalo da prepoznaje samo sam željeni protein.
[0190] Različite metode se koriste za potvrđivanje membranske lokalizacije ciljnog proteina identifikovanog u pristupu in silico. Važni i dobro definisani metod uz korišćenje gore opisanih antitela je imunofluorescencija (IF). Za to se koriste ćelije definisanih ćelijskih linija koje ili sintetizuju ciljni protein (detekcija RNK u RT-PCR ili proteina u Vestern blotu) ili su transfektovane sa plazmidnom DNK. Dobro je poznato mnoštvo različitih metoda (npr. elektroporacija, lipozomima posredovana transfekcija, taloženje kalcijum fosfata) za transfekciju ćelijskih linija sa DNK (npr. Lemoine et al., Methods Mol. Biol.75:441-7, 1997). Plazmid transfektovan u ćelije može u imunofluorescenciji kodirati nemodifikovani protein ili takođe može kuplovati različite aminokiselinske markere na ciljni protein. Glavni markeri su, na primer, fluorescentni "zeleni fluorescentni protein" (GFP) u svojim različitim fluorescentnim oblicima, kratke peptidne sekvence od 6-12 aminokiselina za koje se na raspolaganju nalaze visoko-afinitetna i specifična antitela, ili kratka aminokiselinska sekvenca Cys-Cys-X-X-Cys-Cys, koja se preko svog cisteina može vezivati za specifične fluorescentne supstance (Invitrogen). Ćelije koje sintetizuju ciljni protein se fiksiraju, na primer, sa paraformaldehidom ili metanolom. Onda ćelije mogu, ako je potrebno, biti permeabilizovane inkubacijom sa deterdžentima (npr.0.2% Triton X-100). Onda se ćelije inkubiraju sa primernim antitelom koje je usmereno protiv ciljnog proteina ili protiv jednog od kuplovanih markera. Posle koraka ispiranja, smeša se inkubira sa drugim antitelom, koje je kuplovano sa fluorescentnim markerom (npr. fluorescinom, Texas Red, Dako) i koje se vezuje za prvo antitelo. Označene ćelije su onda na ovaj način pokrivene slojem glicerola i analizirane su uz pomoć fluorescentnog mikroskopa u skladu sa instrukcijama proizvođača. Specifične fluorescentne emisije su u ovom slučaju ostvarene specifičnim pobuđivanjem u zavisnosti od upotrebljenih supstanci. Ova analiza obično dozvoljava pouzdanu lokalizaciju ciljnog proteina, dok su kvalitet antitela i ciljnog proteina potvrđeni dvostrukim bojenjem, a pored toga je ciljni protein takođe kuplovan sa aminokiselinskim markerima ili drugim markerskim proteinima čija lokalizacija je već bila opisana u literaturi. GFP i njegovi derivati predstavljaju specijalan slučaj, pošto se mogu pobuditi direktno i sami su fluorescentni. Propustljivost, odn. permeabilnost membrane, koja se može kontrolisati korišćenjem deterdženata, u imunofluorescenciji dozvoljava demonstraciju da li je imunogeni epitop lociran unutar ćelije ili izvan nje. Predikcija izabranih proteina se onda može podržati eksperimentalno. Alternativna mogućnost za detekciju ekstracelularnih domena je protočna citometrija. Za ove svrhe se ćelije fiksiraju pod nepermeabilizujućim uslovima (npr. sa PBS/Na azidom/2% FCS/5 mM EDTA), pa se analiziraju u protočnom citometru u skladu sa instrukcijama proizvođača. U ovom metodu, antitelo koje treba da bude analizirano može prepoznati samo ekstracelularne epitope. Razlika u odnosu na imunofluorescenciju je ta što je moguće razlikovati mrtve i žive ćelije korišćenjem, na primer, propidijum jodida ili Tripan plave, i na taj način izbeći lažne pozitivne rezultate.
Afinitetno prečišćavanje
[0191] Prečišćavanje poliklonskih seruma je u slučaju peptidnih antitela bilo izvršeno u potpunosti, ili u slučaju antitela protiv rekombinantnih proteina delimično, kao usluga kompanija sa kojima je sklopljen ugovor. Za ove svrhe, u oba slučaja, odgovarajući peptidni ili rekombinantni protein je bio kovalentno vezan za matricu, a kasnije je bio, posle kuplovanja, izbalansiran sa prirodnim puferom (PBS: fosfatni puferovani slani rastvor, engl. phosphate buffered saline) i onda je bio inkubiran sa sirovim serumom. Posle sledećeg koraka ispiranja sa PBS, antitelo je bilo eluirano sa 100 mM glicina, pH 2.7, pa je eluat bio odmah neutralizovan u 2M TRIS, pH 8. Antitela koja su bila prečišćena na ovaj način su onda mogla biti upotrebljena za specifičnu detekciju ciljnih proteina bilo Vestern blotiranjem, bilo imunofluorescencijom.
Priprema GFP transfektanata
[0192] Za imunofluorescentnu mikroskopiju heterologo izraženih antigena povezanih sa tumorom su kompletni ORF antigena bili klonirani u pGFP-C1 i pGFP-N3 vektorima (Clontech). CHO i NIH3T3 ćelije su kultivisane na nosačima objekata sa odgovarajućim plazmidnim konstruktima uz korišćenje Fugene reagensa za transfekciju (Roche), u skladu sa instrukcijama proizvođača i, posle 12-24 h, su analizirane imunofluorescentnom mikroskopijom.
Protočna citometrija
[0193] Merenja protočnom citometrijom su bila izvršena na način koji je poznat kao takav (npr.
Robinson (urednik) Handbook of flow cytometry methods. Wiley-Liss, New York, 1993).
Primer 1
Identifikacija splajsnih varijanti claudin-18A1 i claudin-18A2 kao dijagnostičkih i terapeutskih kancerskih ciljeva
[0194] Claudin-18 gen kodira molekul na površini membrane koji ima 4 hidrofobna regiona. Prema programima za predikciju (TMHMM, TMPred) i u skladu sa topologijom koja je opisana za mnoge druge članove ove familije, claudin-18 ima četiri transmembranska domena i dva ekstracelularna domena EX1 i EX2, čija ekstracelularna lokalizacija (konformacija 1) je prikazana na FIG.2. Domen D3, koji je lociran između dva ekstracelularna epitopa za claudin-18 i druge članove ove familije, je opisan u literaturi kao intracelularno lociran i ovo su takođe predvideli uobičajeno korišćeni programi za predikciju. N i C terminusi su intracelularni. Niimi i kolege (Mol. Cell. Biol.21:7380-90, 2001) su opisali da se dve splajsne varijante mišijeg i humanog claudina-18 izražavaju selektivno u plućnom tkivu (claudin-18A1) i u želudačnom tkivu (claudin-18A2). Ove varijante se razlikuju na N terminusu.
[0195] Prema pronalasku je ispitivano kako se splajsne varijante claudin-18A2 (SEQ ID NO:7) i claudin-18A1 (SEQ ID NO:117), kao i njihovi odgovarajući proizvodi translacije (SEQ ID NO:16 i 118), mogu primeniti kao markerske ili terapeutske ciljne strukture za tumore. Kvantitativna PCR koja može razlikovati dve varijante je bila izvedena selekcijom A1-specifičnog (SEQ ID NO:109, 110) i A2-specifičnog (SEQ ID NO:107, 108) para prajmera. A2 splajsna varijanta je bila dodatno testirana sa drugim parom prajmera u uobičajenoj PCR (SEQ ID NO:39, 40). Opisano je da je A1 varijanta bila aktivna samo u zdravom plućnom tkivu. Međutim, prema pronalasku je kao iznenađujuće otkriveno da je A1 varijanta takođe aktivna u želudačnoj mukozi (FIG.3). Želudac i pluća su jedina normalna tkiva koja ispoljavaju značajnu aktivaciju. Sva druga normalna tkiva su negativna za claudin-A1. Pri ispitivanju tumora, kao iznenađujuće je otkriveno da je claudin-A1 visoko aktivan u velikom broju tumorskih tkiva. Posebno snažna ekspresija se može naći u tumorima želuca, tumorima pluća, tumorima pankreasa, tumorima jednjaka (FIG.3), ORL tumorima i tumorima prostate. Nivoi ekspresije claudina-A1 u ORL tumorima, prostate, pankreasa i jednjaka su 100-10000 viši od nivoa koji odgovaraju normalnim tkivima. Oligonukleotidi koji su upotrebljeni za ispitivanje claudin-A2 splajsne varijante specifično omogućavaju da se ovaj transkript amplifikuje (SEQ ID NO:39, 40, odn.107, 108). Ispitivanja su otkrila da A2 splajsna varijanta nije izražena ni u jednom od više od 20 normalnih tkiva koja su ispitivana, osim želudačne mukoze i u maloj meri takođe u tkivu testisa (FIG.4). Otkrili smo da je i A1 varijanta, isto kao i A2 varijanta, aktivirana u mnogim tumorima (FIG.4). Ovi obuhvataju tumore želuca, tumore pankreasa, tumore jednjaka i tumore jetre. Mada aktivacija claudina-18A2 nije detektabilna u zdravim plućima, kao iznenađujuće je otkriveno da neki tumori pluća izražavaju A2 splajsnu varijantu.
TABELA 1A. Ekspresija claudina-18A2 u normalnim i tumorskim tkivima
TABELA 1B. Ekspresija claudina-18A1 u normalnim i tumorskim tkivima
[0196] Uobičajena PCR kao nezavisno kontrolno ispitivanje je takođe potvrdila rezultate kvantitativne PCR. Oligonukleotidi (SEQ ID NO:39, 40) koji su upotrebljeni za to dozvolili su specifičnu amplifikaciju A2 splajsne varijante. Prema pronalasku je pokazano da je većina tumora želuca i polovina testiranih tumora pankreasa ispoljila snažnu ekspresiju ove splajsne varijante (FIG.1). Nasuprot tome, ekspresija nije detektabilna u drugim tkivima pomoću konvencionalne PCR. Naročito nije bilo ekspresije u važnim normalnim tkivima kao što su ona od pluća, jetre, krvi, limfnih čvorova, dojke i bubrega (Tab.1). Shodno tome, splajsne varijante prema pronalasku predstavljaju visoko specifične molekulske markere za tumore gornjeg gastrointestinalnog trakta, kao i za tumore pluća, ORL tumore, tumore prostate i njihove metastaze. Ovi molekulski markeri prema pronalasku se mogu primeniti za detekciju tumorskih ćelija. Prema pronalasku je moguća detekcija tumora sa opisanim oligonukleotidima (SEQ ID NO:39, 40, 107-110). Posebno podesni oligonukleotidi su parovi prajmera od kojih se najmanje jedan vezuje pod stringentnim, odn. specifičnim uslovima za segment transkripta koji ima dužinu od 180 parova baza i specifičan je za jednu (SEQ ID NO:8) ili drugu splajsnu varijantu (SEQ ID NO:119).
[0197] Ovi genski proizvodi su atraktivne terapeutske ciljne strukture, pošto se zbog činjenice da one nedostaju u organima koji su najrelevantni za toksičnost ne očekuju neželjeni efekti na tim organima, dok se zbog snažne aktivacije u ćelijama pomenutih kancerskih tipova može očekivati snažno vezivanje za te ćelije i posredovanje odgovarajućih efekata za oštećivanje ćelija.
[0198] Da bi se potvrdili ovi podaci na nivou proteina, bila su generisana claudin-specifična antitela i imuni serumi putem imunizacije životinja.
Po sekvenci N-terminalnog ekstracelularnog domena EX1 razlikuju se dve splajsne varijante A1 i A2 (SEQ ID NO:111 za A1 i SEQ ID NO:112 za A2). C-terminalni ekstracelularni domen EX2 je identičan za obe varijante (SEQ ID NO:137). Do danas nisu bila opisana nikakva antitela koja se vezuju za ekstracelularne domene claudina-18. Takođe do sada nisu bila opisana antitela koja mogu da specifično razlikuju A1 i A2 varijante. Prema pronalasku, peptidni epitopi i fragmenti protein koji su locirani ekstracelularno i specifični su za varijantu A1 ili A2 ili se pojavljuju u obe varijante su bili izabrani za imunizaciju da bi se proizvela antitela. Sledeći peptidi, između ostalog, su bili izabrani za imunizaciju da bi se proizvela antitela:
SEQ ID NO:17: DQWSTQDLYN (N-terminalni ekstracelularni domen, A2-specifičan, vezivanje nezavisno od glikozilacije)
SEQ ID NO:18: NNPVTAVFNYQ (N-terminalni ekstracelularni domen, A2-specifičan, vezivanje uglavnom za neglikozilovani oblik, N37)
SEQ ID NO:113: STQDLYNNPVTAVF (N-terminalni ekstracelularni domen, A2-specifičan, vezivanje samo za neglikozilovani oblik, N37)
SEQ ID NO:114: DMWSTQDLYDNP (N-terminalni ekstracelularni domen, A1-specifičan) SEQ ID NO:115: CRPYFTILGLPA (N-terminalni ekstracelularni domen, uglavnom specifičan za A1) SEQ ID NO:116: TNFWMSTANMYTG (C-terminalni ekstracelularni domen, prepoznaje i A1, i A2).
[0199] Između ostalog, mogli smo da proizvedemo antitela koja selektivno prepoznaju N terminalni domen splajsne varijante claudina-18A1, ali ne i A2 varijante (FIG.8). Korišćenjem epitopa za imunizacije koji su locirani u C terminalnom ekstracelularnom domenu, koji je identičan u obe splajsne varijante, mogla bi se proizvesti antitela koja prepoznaju obe varijante (FIG.7).
[0200] Podaci za A2-specifično antitelo proizvedeno imunizacijom sa SEQ ID NO:17 su prikazani kao primer. Specifično antitelo se može primeniti pod različitim uslovima fiksacije za imunofluorescentna ispitivanja. Sa poredbenim bojenjima RT-PCR-pozitivnih i negativnih ćelijskih linija, u količini koja se može lako detektovati, odgovarajući protein se može specifično detektovati, između ostalog, u ćelijskim linijama tumora želuca, tumora jednjaka i tumora pankreasa kao pozitivan (FIG.5). Endogeni protein je lociran na membrani i obrazuje relativno velike žarišne agregate na membrani (FIG.5). Ovo antitelo je bilo upotrebljeno za imunohistohemijska bojenja ljudskih tkiva. Selektivna raspodela ovog proteina u tkivu je bila ispitivana, a u većini od njih claudin-18A2 protein nije bio detektabilan, kao na primer za jetru, pluća, bubreg i kolon. Aktivacija ovog proteina je bila nađena samo u normalnom želudačnom tkivu (FIG.12). Kao iznenađujuće, A2 varijanta claudina-18 je bila detektabilna u diferenciranim ćelijama želudačne mukoze, ali ne i u matičnim ćelijama. Diferencirane ćelije želudačne mukoze su predmet stalne regeneracije. Fiziološki, celokupni epitel želuca se kontinualno zamenjuje zahvaljujući matičnim ćelijama želuca. Ovo podržava korisnost A2 varijante kao terapeutske ciljne strukture, pošto je prema pronalasku pokazano da matične ćelije, kao neophodna ćelijska populacija želudačne mukoze ne sadrže A2 varijantu, kao ni svi drugi zdravi organi i da zato nisu napadnute supstancom koja je specifično usmerena protiv A2 varijante. Korišćenjem ovog antitela je detektovana A2 varijanta claudina-18 u nizu humanih tumora (FIG.13), a naročito u tumorima želuca, jednjaka i pluća, koji su već privlačili pažnju u RT-PCR ispitivanjima. Prema pronalasku, ovi tumori su terapeutski dostupni.
[0201] Gore opisano antitelo je bilo dodatno primenjeno za detekciju proteina u Vestern blotiranju. Kao što je očekivano, protein je detektovan samo u želudačnom i ni u jednom drugom normalnom tkivu, čak ni u plućima, gde je aktivirana samo A1 varijanta (FIG.9). Poredbeno bojenje tumora želuca i susednog normalnog želudačnog tkiva pacijenata je kao iznenađujuće otkrilo da je claudin-18 A2 imao manju masenu težinu kod svih tumora želuca, kod kojih je ovaj protein detektovan (FIG.10, levo). Prema pronalasku je otkriveno u nizu eksperimenata da se traka takođe pojavljuje na ovoj poziciji kada se lizat normalnog želudačnog tkiva tretira sa agensom za deglikozilaciju PNGase F (FIG.10, desno). Dok je isključivo detektabilan glikozilovani oblik A2 varijante u svim normalnim želudačnim tkivima, A2 je detektabilan kao takav u više od 60% ispitivanih tumora želuca, a naročito isključivo u deglikozilovanom obliku. Mada A2 varijanta claudina-18 nije detektovana u normalnim plućima čak ni na nivou proteina, otkriven je u tumorima bronhija, kao i prethodno u kvantitativnoj RT-PCR. Još jednom, prisutna je samo deglikozilovana varijanta (FIG.11).
[0202] Claudin-18 je visoko selektivan diferencijacioni antigen želuca (varijanta A2) ili pluća i želuca (varijanta A1). Naši podaci ukazuju da je on očigledno podvrgnut izmenama mehanizma glikozilacije povezanim sa tumorom i da se u tumorima proizvodi specifični oblik varijante A2 koji je deglikozilovan. Rezultati tretmana sa PNGaseF pokazuju da se claudin-18A2 razlikuje po svojoj N glikozilaciji u tumorskom i normalnom tkivu.
[0203] Glikozilacija epitopa može sprečiti vezivanje antitela specifično za ovaj epitop i u predmetnom slučaju može doprineti nemogućnosti takvog antitela da se vezuje za claudin-18A2 u normalnim tkivima, već da se vezuje isključivo za neglikozilovani oblik u kancerskim ćelijama. Da bi se proizvela antitela prema pronalasku koja se selektivno vezuju za neglikozilovane epitope, ovo se razmatra pri izboru imunogena. Prema pronalasku su bili identifikovani različiti regioni claudina-18A2 koji mogu biti prisutni u tumorskom i normalnom tkivu u diferencijalno glikozilovanom obliku. Izm. ost. regioni koji sadrže aminokiseline 37, 38, 45, 116, 141, 146, 205 claudina-18A2 su bili identifikovani kao potencijalna mesta glikozilacije za claudin-18A2 (FIG.2, dole). Prema pronalasku, tumorske ćelije i normalna tkiva se razlikuju po glikozilaciji na jednoj ili više ovih pozicija. Većina ovih regiona ne predstavlja klasično mesto glikozilacije, već sadrži asparagin, serin i treonin, koji takođe, ne baš često, mogu biti glikozilovani (predviđanje na FIG.2, dole). Obe varijante claudina-18 imaju jedinstveni klasični motiv glikozilacije u D3 domenu, za koji se u literaturi i u obično korišćenim algoritmima za predviđanje smatra da je lociran intracelularno. Međutim, za PMP 22, koji je tetraspanin, koji je strukturno sličan claudinu-18, je bilo pokazano da se hidrofobni membranski domeni 2 i 3 od PMP 22 ne pružaju u potpunosti kroz ćelijsku membranu, već da su samo delimično umetnuti u ćelijsku membranu (Taylor et al., J. Neurosc. Res.62:15-27, 2000). Iz ovog razloga, celi region između dva spoljašnja transmembranska domena od PMP22 je lociran ekstracelularno.
[0204] Mi smo pretpostavili mogućnost takve topologije za claudin-18A2 i ispitali je. Za te svrhe, bila su pripremljena tri konstrukta, pri čemu je svaki nosio markersku sekvencu (His ili HA tag) u jednom od EX1, EX2 ili D3 domena (FIG.15, gore). Oni su bili transfektovani u ćelijske linije, pa je bilo testirano da li se antitelo usmereno protiv ove markerske sekvence vezuje za nepermeabilizovane ćelije, što zahteva da odgovarajući region proteina bude lociran topološki ekstracelularno. Pošto je protočnom citometrijom bilo utvrđeno da su sva tri regiona molekula ekstracelularna (FIG.15, dole), bilo je potvrđeno da claudin-18A2 može postojati u konformaciji koja ima dva transmembranska domena i jedan veliki ekstracelularno locirani domen (FIG.2, konformacija 2). Ova konformacija je biohemijski i terapeutski relevantna, pošto sadrži dodatna mesta vezivanja za terapeutska antitela (SEQ ID NO: 142, 143).
[0205] Prema pronalasku i prvenstveno se mogu proizvesti antitela koja se razlikuju od glikozilovanih i neglikozilovanih varijanti claudina-18A2. Ona imaju posebno visoku specifičnost za tumorske ćelije. Pri pripremanju antitela koja su specifična za glikozilaciju pored glikozilacionih domena su takođe uzete u obzir i ove mogućnosti različitih konformacija.
[0206] Prvenstveno, ali ne isključivo fragmenti proteina iz D3 regiona claudina-18A2 su podesni za imunizaciju životinja. Ovo je prikazano za dva antitela mAB1 i mAB2 pomoću primera (FIG.17). Bila su ispitana svojstva vezivanja ovih antitela za ćelijske linije koje izražavaju A1 ili A2 varijantu claudina-18. Bilo je pokazano da je claudin-18A2 dostupan antitelima na ćelijskoj površini. Prema pronalasku, takva antitela su specifična za A2 varijantu i ne vezuju se za A1 varijantu (FIG.17). Kratke strane sekvence (myc tag) su bile uvedene u svaki region ekstracelularnih domena Ex1 i Ex2 (FIG.43). Na primer, za mAB1 je pokazano da to nije uticalo na svojstva vezivanja antitela i da je aktuelni epitop lociran u D3 domenu. Generisana antitela se mogu primeniti dijagnostički, kao i terapeutski. Imuni serumi, kao što je onaj koji je ovde opisan (usmeren protiv peptida SEQ ID NO: 17) se može primeniti dijagnostički, na primer, za Vestern blotiranje. Prema pronalasku, antitela koja se ne vezuju za glikozilovani epitop se mogu proizvesti imunizacijom sa peptidima koji sadrže najmanje jedan od ovih regiona (na primer, peptid SEQ ID NO: 113 (FIG.6), peptid SEQ ID NO: 142-145). Proizvedena su antitela koja se uopšte ne mogu vezivati za glikozilovani epitop na tumorskim ćelijama. Prema pronalasku, takva antitela se specifično vezuju za deglikozilovane epitope na tumorskim ćelijama. Nedostajuća glikozilacija u poređenju sa normalnim tkivima na jednoj od pomenutih pozicija bi takođe mogla biti usled sekundarne endogene deglikozilacije u tumorskim ćelijama. Takva deglikozilacija je povezana sa Asn (N)→Asp (D) transformacijom odgovarajuće aminokiseline. Za proizvodnju antitela protiv varijanti povezanih sa tumorom, koje su modifikovane na takav način, shodno tome se mogu primeniti peptidi dobijeni od claudina-18A2 prema pronalasku u kojima je aminokiselina Asn (N) na najmanje jednoj od pozicija 37, 38, 45, 116, 141, 146, 205 claudin-18A2 peptida supstituisana sa Asp (D) (npr. SEQ ID NO: 146-150). Naročito je moguće primeniti takva antitela terapeutski, jer su ona visoko selektivna za tumorske ćelije. Proizvedena antitela se mogu takođe direktno koristiti za proizvodnju himeričnih ili humanizovanih rekombinantnih antitela. Ovo se takođe može izvesti direktno sa antitelima dobijenim od zečeva (u vezi ovoga, vidi J Biol. Chem.5. maj 2000; 275(18):13668-76 autori Rader C, Ritter G, Nathan S, Elia M, Gout I, Jungbluth A A, Cohen L S, Welt S, Old L J, Barbas C F 3rd. "The rabbit antibody repertoire as a novel source for the generation of therapeutic human antibodies"). Za ove svrhe se čuvaju limfociti imunizovanih životinja. Aminokiseline 1-47 (SEQ ID NO:19 i 120) takođe predstavljaju posebno dobre epitope za imunoterapeutske metode, kao što su vakcine i adoptivni transfer T limfocita specifičnih za antigen.
PROTOKOL SEKVENCI

Claims (8)

Patentni zahtevi
1. Antitelo koje se vezuje za protein ili polipeptid, pri čemu je protein ili polipeptid kodiran nukleinskom kiselinom koja sadrži sekvencu nukleinske kiseline prema SEQ ID NO: 7 ili 8, pri čemu se antitelo vezuje za mesto vezivanja u SEQ ID NO: 142 ili 143, za primenu u dijagnostičkom ili terapeutskom metodu.
2. Antitelo za primenu prema zahtevu 1, pri čemu je antitelo monoklonsko, antitelo.
3. Antitelo za primenu prema zahtevu 1 ili 2, pri čemu je antitelo himerično ili humanizovano antitelo ili fragment antitela za koji se selektivno vezuje protein ili polipeptid.
4. Antitelo za primenu prema bilo kom od zahteva 1 do 3, pri čemu je antitelo kuplovano sa terapeutskim ili dijagnostičkim agensom.
5. Farmaceutska kompozicija za primenu u terapeutskom metodu, pri čemu kompozicija sadrži antitelo prema bilo kom od zahteva 1 do 4.
6. Farmaceutska kompozicija za primenu prema zahtevu 5 za lečenje kancerske bolesti naznačena ekspresijom antigena povezanog sa tumorom.
7. Antitelo prema zahtevu 4 za primenu u metodu lečenja, dijagnoze ili praćenja kancerske bolesti naznačeno ekspresijom antigena povezanog sa tumorom, pri čemu metod sadrži administraciju antitela, a antiten povezan sa tumorom ima sekvencu koja je kodirana nukleinskom kiselinom koja sadrži sekvencu nukleinske kiseline prema SEQ ID NO: 7 ili 8.
8. Farmaceutska kompozicija za primenu prema zahtevu 6 ili antitelo za primenu prema zahtevu 7, pri čemu je bolest tumor pluća, tumor jednjaka ili tumor pankreasa.
RS20170619A 2004-05-18 2005-05-18 Genski proizvodi koji su diferencijalno izraženi u tumorima i njihova primena RS56140B1 (sr)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE102004024617A DE102004024617A1 (de) 2004-05-18 2004-05-18 Differentiell in Tumoren exprimierte Genprodukte und deren Verwendung
EP11002017.9A EP2380903B1 (de) 2004-05-18 2005-05-18 Differentiell in Tumoren exprimierte Genprodukte und deren Verwendung

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS56140B1 true RS56140B1 (sr) 2017-10-31

Family

ID=34968689

Family Applications (4)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20180754A RS57437B1 (sr) 2004-05-18 2005-05-18 Genski proizvodi koji su diferencijalno izraženi u tumorima i njihova primena
RS20170619A RS56140B1 (sr) 2004-05-18 2005-05-18 Genski proizvodi koji su diferencijalno izraženi u tumorima i njihova primena
RS20210121A RS61395B1 (sr) 2004-05-18 2005-05-18 Genski proizvodi koji su diferencijalno eksprimirani u tumorima i njihove primene
RS20160921A RS55357B1 (sr) 2004-05-18 2005-05-18 Genski proizvodi koji su diferencijalno izraženi u tumorima i njihova primena

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20180754A RS57437B1 (sr) 2004-05-18 2005-05-18 Genski proizvodi koji su diferencijalno izraženi u tumorima i njihova primena

Family Applications After (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20210121A RS61395B1 (sr) 2004-05-18 2005-05-18 Genski proizvodi koji su diferencijalno eksprimirani u tumorima i njihove primene
RS20160921A RS55357B1 (sr) 2004-05-18 2005-05-18 Genski proizvodi koji su diferencijalno izraženi u tumorima i njihova primena

Country Status (19)

Country Link
US (4) US9044382B2 (sr)
EP (7) EP2371849A1 (sr)
JP (5) JP5242160B2 (sr)
AU (1) AU2005245593B2 (sr)
CA (2) CA2984563A1 (sr)
CY (4) CY1118271T1 (sr)
DE (1) DE102004024617A1 (sr)
DK (4) DK2380903T3 (sr)
ES (4) ES2847025T3 (sr)
HR (4) HRP20161449T1 (sr)
HU (4) HUE035289T2 (sr)
LT (4) LT2371848T (sr)
ME (2) ME02889B (sr)
PL (4) PL1749027T3 (sr)
PT (4) PT1749027T (sr)
RS (4) RS57437B1 (sr)
SI (4) SI2380903T1 (sr)
TR (1) TR201809165T4 (sr)
WO (1) WO2005113587A2 (sr)

Families Citing this family (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE10254601A1 (de) 2002-11-22 2004-06-03 Ganymed Pharmaceuticals Ag Differentiell in Tumoren exprimierte Genprodukte und deren Verwendung
DE102004024617A1 (de) * 2004-05-18 2005-12-29 Ganymed Pharmaceuticals Ag Differentiell in Tumoren exprimierte Genprodukte und deren Verwendung
EP1790664A1 (en) * 2005-11-24 2007-05-30 Ganymed Pharmaceuticals AG Monoclonal antibodies against claudin-18 for treatment of cancer
AU2016202322B2 (en) * 2005-11-24 2018-03-08 Astellas Pharma Inc. Monoclonal antibodies against claudin-18 for treatment of cancer
EP2060583A1 (en) 2007-10-23 2009-05-20 Ganymed Pharmaceuticals AG Identification of tumor-associated markers for diagnosis and therapy
AU2010217160C1 (en) * 2009-02-25 2015-07-02 Diagnocure Inc. Method for detecting metastasis of GI cancer
WO2013167153A1 (en) 2012-05-09 2013-11-14 Ganymed Pharmaceuticals Ag Antibodies useful in cancer diagnosis
WO2013174404A1 (en) 2012-05-23 2013-11-28 Ganymed Pharmaceuticals Ag Combination therapy involving antibodies against claudin 18.2 for treatment of cancer
KR102643443B1 (ko) 2012-11-13 2024-03-06 비온테크 에스이 클라우딘 발현 암 질환의 치료제
WO2014127785A1 (en) 2013-02-20 2014-08-28 Ganymed Pharmaceuticals Ag Combination therapy involving antibodies against claudin 18.2 for treatment of cancer
WO2014146672A1 (en) 2013-03-18 2014-09-25 Ganymed Pharmaceuticals Ag Therapy involving antibodies against claudin 18.2 for treatment of cancer
CN120137055A (zh) 2014-07-17 2025-06-13 恺兴生命科技(上海)有限公司 靶向cld18a2的t淋巴细胞及其制备方法和应用
WO2016165762A1 (en) * 2015-04-15 2016-10-20 Ganymed Pharmaceuticals Ag Drug conjugates comprising antibodies against claudin 18.2
WO2016180468A1 (en) * 2015-05-11 2016-11-17 Biontech Cell & Gene Therapies Gmbh Claudin-18.2-specific immunoreceptors and t cell epitopes
WO2019170147A1 (zh) 2018-03-09 2019-09-12 科济生物医药（上海）有限公司 用于治疗肿瘤的方法和组合物
EP3891183A4 (en) * 2018-12-07 2022-08-31 Zlip Holding Limited ANTI-CLAUDIN ANTIBODIES AND USES THEREOF
EP3917564A4 (en) 2019-02-01 2022-12-21 NovaRock Biotherapeutics, Ltd. ANTI-CLAUDINE 18 ANTIBODIES AND THEIR METHODS OF USE
WO2021111003A1 (en) 2019-12-06 2021-06-10 SOTIO a.s. Humanized cldn18.2 antibodies
PE20221830A1 (es) 2019-12-23 2022-11-29 Sotio Biotech A S Anticuerpos especificos contra la claudina 18.2 tumoral
WO2022122709A1 (en) 2020-12-07 2022-06-16 Sotio Biotech A.S. Antibody-drug conjugates based on humanized cldn18.2 antibodies
EP4267194A1 (en) 2020-12-23 2023-11-01 SOTIO Biotech a.s. Tumor-specific claudin 18.2 antibody-drug conjugates

Family Cites Families (204)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US1998A (en) 1841-03-12 Refrigerator
US4475196A (en) 1981-03-06 1984-10-02 Zor Clair G Instrument for locating faults in aircraft passenger reading light and attendant call control system
US4447233A (en) 1981-04-10 1984-05-08 Parker-Hannifin Corporation Medication infusion pump
US4439196A (en) 1982-03-18 1984-03-27 Merck & Co., Inc. Osmotic drug delivery system
US4522811A (en) 1982-07-08 1985-06-11 Syntex (U.S.A.) Inc. Serial injection of muramyldipeptides and liposomes enhances the anti-infective activity of muramyldipeptides
US4447224A (en) 1982-09-20 1984-05-08 Infusaid Corporation Variable flow implantable infusion apparatus
US4487603A (en) 1982-11-26 1984-12-11 Cordis Corporation Implantable microinfusion pump system
US4486194A (en) 1983-06-08 1984-12-04 James Ferrara Therapeutic device for administering medicaments through the skin
US4596556A (en) 1985-03-25 1986-06-24 Bioject, Inc. Hypodermic injection apparatus
US5374548A (en) 1986-05-02 1994-12-20 Genentech, Inc. Methods and compositions for the attachment of proteins to liposomes using a glycophospholipid anchor
MX9203291A (es) 1985-06-26 1992-08-01 Liposome Co Inc Metodo para acoplamiento de liposomas.
GB8601597D0 (en) 1986-01-23 1986-02-26 Wilson R H Nucleotide sequences
US4954617A (en) 1986-07-07 1990-09-04 Trustees Of Dartmouth College Monoclonal antibodies to FC receptors for immunoglobulin G on human mononuclear phagocytes
US4946778A (en) 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
US5260203A (en) 1986-09-02 1993-11-09 Enzon, Inc. Single polypeptide chain binding molecules
US4881175A (en) 1986-09-02 1989-11-14 Genex Corporation Computer based system and method for determining and displaying possible chemical structures for converting double- or multiple-chain polypeptides to single-chain polypeptides
EP0307434B2 (en) 1987-03-18 1998-07-29 Scotgen Biopharmaceuticals, Inc. Altered antibodies
US5013653A (en) 1987-03-20 1991-05-07 Creative Biomolecules, Inc. Product and process for introduction of a hinge region into a fusion protein to facilitate cleavage
US5132405A (en) 1987-05-21 1992-07-21 Creative Biomolecules, Inc. Biosynthetic antibody binding sites
US5258498A (en) 1987-05-21 1993-11-02 Creative Biomolecules, Inc. Polypeptide linkers for production of biosynthetic proteins
US5091513A (en) 1987-05-21 1992-02-25 Creative Biomolecules, Inc. Biosynthetic antibody binding sites
WO1988009344A1 (en) 1987-05-21 1988-12-01 Creative Biomolecules, Inc. Targeted multifunctional proteins
US4790824A (en) 1987-06-19 1988-12-13 Bioject, Inc. Non-invasive hypodermic injection device
US4941880A (en) 1987-06-19 1990-07-17 Bioject, Inc. Pre-filled ampule and non-invasive hypodermic injection device assembly
GB8717430D0 (en) 1987-07-23 1987-08-26 Celltech Ltd Recombinant dna product
GB8809129D0 (en) 1988-04-18 1988-05-18 Celltech Ltd Recombinant dna methods vectors and host cells
US5108921A (en) 1989-04-03 1992-04-28 Purdue Research Foundation Method for enhanced transmembrane transport of exogenous molecules
US6020145A (en) 1989-06-30 2000-02-01 Bristol-Myers Squibb Company Methods for determining the presence of carcinoma using the antigen binding region of monoclonal antibody BR96
US5312335A (en) 1989-11-09 1994-05-17 Bioject Inc. Needleless hypodermic injection device
US5064413A (en) 1989-11-09 1991-11-12 Bioject, Inc. Needleless hypodermic injection device
WO1991009974A1 (en) 1989-12-27 1991-07-11 The United States Of America, As Represented By The Secretary, U.S. Department Of Commerce Diagnostic probe for detecting human stomach cancer
US6255458B1 (en) 1990-08-29 2001-07-03 Genpharm International High affinity human antibodies and human antibodies against digoxin
GB9019812D0 (en) 1990-09-11 1990-10-24 Scotgen Ltd Novel antibodies for treatment and prevention of infection in animals and man
US5383851A (en) 1992-07-24 1995-01-24 Bioject Inc. Needleless hypodermic injection device
GB9223377D0 (en) 1992-11-04 1992-12-23 Medarex Inc Humanized antibodies to fc receptors for immunoglobulin on human mononuclear phagocytes
US5589579A (en) 1994-07-19 1996-12-31 Cytoclonal Pharmaceutics, Inc. Gene sequence and probe for a marker of non-small cell lung carinoma
WO2001016318A2 (en) * 1999-09-01 2001-03-08 Genentech, Inc. Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
WO2000075316A1 (en) 1999-06-02 2000-12-14 Genentech, Inc. Methods and compositions for inhibiting neoplastic cell growth
US6121022A (en) 1995-04-14 2000-09-19 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US5677139A (en) 1995-04-21 1997-10-14 President And Fellows Of Harvard College In vitro differentiation of CD34+ progenitor cells into T lymphocytes
UA56132C2 (uk) 1995-04-25 2003-05-15 Смітклайн Бічем Байолоджікалс С.А. Композиція вакцини (варіанти), спосіб стабілізації qs21 відносно гідролізу (варіанти), спосіб приготування композиції вакцини
CN1211279A (zh) 1996-01-10 1999-03-17 科里克萨有限公司 用于治疗和诊断乳腺癌的组合物和方法
US6277375B1 (en) 1997-03-03 2001-08-21 Board Of Regents, The University Of Texas System Immunoglobulin-like domains with increased half-lives
US20070224663A1 (en) 1997-03-07 2007-09-27 Human Genome Sciences, Inc. Human Secreted Proteins
US7368531B2 (en) * 1997-03-07 2008-05-06 Human Genome Sciences, Inc. Human secreted proteins
US7411051B2 (en) 1997-03-07 2008-08-12 Human Genome Sciences, Inc. Antibodies to HDPPA04 polypeptide
WO2000078961A1 (en) 1999-06-23 2000-12-28 Genentech, Inc. Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
US20020127584A1 (en) 1997-09-18 2002-09-12 Genentech, Inc. Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
US20030022298A1 (en) 1997-09-15 2003-01-30 Genentech, Inc. Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
US20030073129A1 (en) 1998-09-01 2003-04-17 Genentech, Inc. Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
US20030027272A1 (en) 1997-09-18 2003-02-06 Genentech, Inc. Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
US20030166110A1 (en) 1997-09-18 2003-09-04 Genentech, Inc. Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
US20030166104A1 (en) 1997-09-18 2003-09-04 Genentech, Inc. Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
US20030008352A1 (en) 1997-09-18 2003-01-09 Genentech, Inc. Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
US20050196832A1 (en) 1997-09-18 2005-09-08 Genentech, Inc. Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
US7160985B2 (en) * 1997-10-29 2007-01-09 Genentech, Inc. Pro180 polypeptide
US6194551B1 (en) 1998-04-02 2001-02-27 Genentech, Inc. Polypeptide variants
US20030022835A1 (en) 1998-04-29 2003-01-30 Genesis Research And Development Corporation Limited Compositions isolated from skin cells and methods for their use
US20030040471A1 (en) 1998-04-29 2003-02-27 Watson James D. Compositions isolated from skin cells and methods for their use
JP3428441B2 (ja) 1998-05-15 2003-07-22 エーザイ株式会社 タイトジャンクション構成膜蛋白質クローディンファミリー
US7319008B2 (en) 1998-06-02 2008-01-15 Genentech, Inc. Nucleic acid underexpressed in melanoma
US7351543B2 (en) 1998-06-02 2008-04-01 Genentech, Inc. Antibodies to a polypeptide encoded by a nucleic acid underexpressed in melanoma
JP2002517222A (ja) * 1998-06-11 2002-06-18 スミスクライン ビーチャム コーポレーション Ｇｐｒ３５ａ受容体
JP3524061B2 (ja) 1998-08-04 2004-04-26 ダイアデクスアス・インコーポレーテッド 肺がんを診断し、モニターし、病期決定し、画像化し、そして処置する新規な方法
US20030166132A1 (en) 1998-08-26 2003-09-04 Genentech, Inc. Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
US7026448B2 (en) 1998-09-01 2006-04-11 Genentech, Inc. Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
NZ531664A (en) 1998-09-01 2005-07-29 Genentech Inc Pro1317 polypeptides and sequences thereof with homology to the semaphorin B glycoprotein family
US20030187191A1 (en) 1998-09-01 2003-10-02 Genentech, Inc. Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
US20030082626A1 (en) 1998-09-01 2003-05-01 Genentech, Inc. Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
US20050181478A1 (en) 1998-09-01 2005-08-18 Baker Kevin P. Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
JP2002524103A (ja) 1998-09-16 2002-08-06 ザイモジェネティクス，インコーポレイティド 胃ポリペプチドｚｓｉｇ２８
IL141535A0 (en) 1998-09-16 2002-03-10 Genentech Inc Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
HK1039783A1 (zh) 1998-10-06 2002-05-10 Curagen Corporation 新的分泌型蛋白和编码它们的多核苷
US7399834B2 (en) 1998-10-07 2008-07-15 Genentech, Inc. Anti-PRO1558 antibodies
US6235481B1 (en) * 1998-10-21 2001-05-22 Arch Development Corporation & Board Of Regents Polynucleotides encoding calpain 10
US20030190669A1 (en) 1998-12-30 2003-10-09 Genentech, Inc. Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
US7026449B2 (en) 1999-01-05 2006-04-11 Genentech, Inc. Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
US7507404B2 (en) 1999-03-08 2009-03-24 Genentech, Inc. Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
JP2004513602A (ja) 1999-03-08 2004-05-13 ジェネンテック・インコーポレーテッド 分泌及び膜貫通ポリペプチドとそれをコードしている核酸
KR100553300B1 (ko) 1999-03-08 2006-02-20 제넨테크, 인크. 혈관신생 및 심혈관형성의 촉진 또는 억제 방법
KR100504305B1 (ko) 1999-03-23 2005-07-28 제넨테크, 인크. 분비 및 막횡단 폴리펩티드 및 이를 코딩하는 핵산
WO2000058473A2 (en) 1999-03-31 2000-10-05 Curagen Corporation Nucleic acids including open reading frames encoding polypeptides; 'orfx'
US20080286821A1 (en) 1999-05-14 2008-11-20 Eaton Dan L Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
WO2003014303A2 (en) 2001-08-03 2003-02-20 Arbor Vita Corporation Molecular interactions in cells
AU3246100A (en) 1999-06-02 2000-12-28 Genentech Inc. Methods and compositions for inhibiting neoplastic cell growth
EP1210418B1 (en) 1999-06-02 2010-08-18 Genentech, Inc. Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
ES2287020T3 (es) 1999-06-02 2007-12-16 Genentech, Inc. Procedimiento y composiciones para inhibir el crecimiento de celulas neoplasicas.
EP1208195A2 (en) 1999-06-15 2002-05-29 Genentech Inc. Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
AU2883900A (en) 1999-07-07 2001-01-30 Genentech Inc. Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
WO2001027257A1 (en) 1999-10-14 2001-04-19 The Board Of Trustees Of The University Of Arkansas Tumor antigen derived gene-16 (tadg-16): a novel extracellular serine protease and uses thereof
EP1672070A3 (en) 1999-12-01 2006-10-04 Genentech, Inc. Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
US6380362B1 (en) 1999-12-23 2002-04-30 Genesis Research & Development Corporation Ltd. Polynucleotides, polypeptides expressed by the polynucleotides and methods for their use
JP4280444B2 (ja) 2000-01-06 2009-06-17 ジェネンテック・インコーポレーテッド 腫瘍性細胞成長阻害のための組成物及び方法
CA2396719A1 (en) 2000-01-31 2001-08-02 Human Genome Sciences, Inc. 22 human secreted proteins
CA2393002A1 (en) 2000-01-31 2001-08-02 Human Genome Sciences, Inc. Nucleic acids, proteins, and antibodies
US20030044890A1 (en) 2000-01-31 2003-03-06 Rosen Craig A. Nucleic acids, proteins, and antibodies
WO2001055326A2 (en) 2000-01-31 2001-08-02 Human Genome Sciences, Inc. Nucleic acids, proteins, and antibodies
NZ521430A (en) 2000-02-22 2004-04-30 Corixa Corp Compositions comprising 1-4 antigenic peptide fragments of the Wilms' tumour gene product for treatment or prevention of malignant mesothelioma
AU6802801A (en) 2000-03-01 2001-09-24 Genentech Inc Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
WO2001070979A2 (en) 2000-03-21 2001-09-27 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Genes, compositions, kits, and method for identification, assessment, prevention and therapy of ovarian cancer
US6436703B1 (en) 2000-03-31 2002-08-20 Hyseq, Inc. Nucleic acids and polypeptides
AU2001261024A1 (en) 2000-04-12 2001-10-30 Delta Biotechnology Limited Albumin fusion proteins
AU2001260847A1 (en) 2000-05-24 2001-12-03 Genesis Research And Development Corporation Limited Compositions isolated from skin cells and methods for their use
AU2001271589A1 (en) 2000-06-30 2002-01-14 Zymogenetics Inc. Mammalian secreted proteins
CA2422155A1 (en) 2000-08-03 2002-02-14 Wim Van Schooten Production of humanized antibodies in transgenic animals
ES2284678T3 (es) 2000-08-15 2007-11-16 Immunex Corporation Polipeptidos de claudinas.
JP2004512029A (ja) 2000-08-16 2004-04-22 カイロン　コーポレイション ヒト遺伝子および遺伝子発現産物
CA2418680A1 (en) * 2000-08-18 2002-02-28 Human Genome Sciences, Inc. 11 human secreted proteins
US7442765B2 (en) 2000-08-24 2008-10-28 Genentech, Inc. Secreted transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
JP2004520814A (ja) 2000-08-28 2004-07-15 ディアデクサス インコーポレーテッド 肺特異的遺伝子に関する組成物および方法
EP2298789B1 (en) 2000-09-08 2012-03-14 Schering Corporation Mammalian genes; related reagents and methods
JP2004526411A (ja) 2000-09-18 2004-09-02 トマス・ジエフアーソン・ユニバーシテイ 胃および食道癌細胞を同定および標的とするための組成物および方法
KR100857943B1 (ko) 2000-11-30 2008-09-09 메다렉스, 인코포레이티드 인간 항체의 제조를 위한 형질전환 트랜스염색체 설치류
WO2002061087A2 (en) 2000-12-19 2002-08-08 Lifespan Biosciences, Inc. Antigenic peptides, such as for g protein-coupled receptors (gpcrs), antibodies thereto, and systems for identifying such antigenic peptides
WO2002068579A2 (en) 2001-01-10 2002-09-06 Pe Corporation (Ny) Kits, such as nucleic acid arrays, comprising a majority of human exons or transcripts, for detecting expression and other uses thereof
US20030133939A1 (en) 2001-01-17 2003-07-17 Genecraft, Inc. Binding domain-immunoglobulin fusion proteins
US7754208B2 (en) 2001-01-17 2010-07-13 Trubion Pharmaceuticals, Inc. Binding domain-immunoglobulin fusion proteins
CA2440008A1 (en) 2001-01-29 2002-08-29 Phase-1 Molecular Toxicology, Inc. Rat toxicologically relevant genes and uses thereof
CN1516706A (zh) * 2001-02-26 2004-07-28 阿伦纳药品公司 人g蛋白偶联受体的内源性和非内源性形式
US20030152939A1 (en) 2001-04-09 2003-08-14 Glennda Smithson Novel secreted proteins and polynucleotides encoding them
US20060084794A1 (en) 2001-04-12 2006-04-20 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins
JP2003000249A (ja) 2001-05-10 2003-01-07 Daiichi Fine Chemical Co Ltd クローディンによるＭＴ−ＭＭＰｓを介したｐｒｏＭＭＰ−２活性化
AU2002330714A1 (en) * 2001-05-30 2003-01-02 Biomedical Center In silico screening for phenotype-associated expressed sequences
CA2450236A1 (en) 2001-07-06 2003-01-16 Genentech, Inc. Phage displayed pdz domain ligands
US20040142325A1 (en) * 2001-09-14 2004-07-22 Liat Mintz Methods and systems for annotating biomolecular sequences
US20040002587A1 (en) 2002-02-20 2004-01-01 Watkins Jeffry D. Fc region variants
AU2003211398A1 (en) * 2002-02-28 2003-09-09 Sankyo Company, Limited Markers for predicting pathological conditions in haert failure and method of using the same
CA2379661A1 (en) 2002-03-28 2003-09-28 Kursad Turksen Paracellular drug delivery system
WO2003101283A2 (en) 2002-06-04 2003-12-11 Incyte Corporation Diagnostics markers for lung cancer
EP3321282A1 (en) 2002-09-27 2018-05-16 Xencor, Inc. Optimized fc variants and methods for their generation
PT1558648E (pt) 2002-10-17 2012-04-23 Genmab As Anticorpos monoclonais humanos contra cd20
CA2505479A1 (en) 2002-11-14 2004-06-03 Arbor Vita Corporation Molecular interactions in neurons
DE10254601A1 (de) 2002-11-22 2004-06-03 Ganymed Pharmaceuticals Ag Differentiell in Tumoren exprimierte Genprodukte und deren Verwendung
EP1430902A1 (en) 2002-12-20 2004-06-23 Mondobiotech Laboratories Anstalt Pharmaceutical composition of interferon gamma with molecular diagnostics for the improved treatment of asthma bronchiale
JP2006524039A (ja) 2003-01-09 2006-10-26 マクロジェニクス，インコーポレーテッド 変異型Ｆｃ領域を含む抗体の同定および作製ならびにその利用法
WO2004063355A2 (en) 2003-01-10 2004-07-29 Protein Design Labs, Inc. Novel methods of diagnosis of metastatic cancer, compositions and methods of screening for modulators of matastatic cancer
JP2007516693A (ja) 2003-06-09 2007-06-28 ザ・リージェンツ・オブ・ザ・ユニバーシティ・オブ・ミシガン 癌の治療および診断のための組成物および方法
WO2005032495A2 (en) 2003-10-03 2005-04-14 Bayer Pharmaceuticals Corporation Gene expression profiles and methods of use
DE10354601B3 (de) 2003-11-21 2005-06-23 Chiropro Gmbh Gelenkprothese für Fingerglieder
WO2005052182A2 (en) 2003-11-26 2005-06-09 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem A method of analyzing plasma membrane protein content of cells
US20080119412A1 (en) 2003-12-23 2008-05-22 Nono Inc. Polypeptides for Modulating Binding of Trp Channel Proteins and Trp- Associated Proteins
WO2005076939A2 (en) 2004-02-09 2005-08-25 University Of Kentucky Research Foundation Assay and method for diagnosing and treating alzheimer’s disease
EP1732582A2 (en) 2004-02-26 2006-12-20 Ohio University Diagnosis of hyperinsulinemia and type ii diabetes and protection against same based on genes differentially expressed in muscle cells
US20050255041A1 (en) 2004-05-13 2005-11-17 Arius Research, Inc. Cancerous disease modifying antibodies
DE102004024617A1 (de) 2004-05-18 2005-12-29 Ganymed Pharmaceuticals Ag Differentiell in Tumoren exprimierte Genprodukte und deren Verwendung
DE602005013670D1 (de) 2004-05-21 2009-05-14 Inst Systems Biology Zusammensetzungen und verfahren zur quantifizierung von serumglykoproteinen
WO2006023121A1 (en) 2004-07-27 2006-03-02 Ohio University Diagnosis of hyperinsulinemia and type ii diabetes and protection against same based on genes differentially expressed in white adipose tissue (13)
DE102004042822A1 (de) 2004-08-31 2006-03-16 Technische Universität Dresden Verbindungen und Methoden zur Behandlung, Diagnose und Prognose bei Pankreaserkrankungen
FR2876705B1 (fr) 2004-10-19 2008-12-12 Biomerieux Sa Procede pour le diagnostic d'une intolerance a l'aspirine
US20070072175A1 (en) 2005-05-13 2007-03-29 Biogen Idec Ma Inc. Nucleotide array containing polynucleotide probes complementary to, or fragments of, cynomolgus monkey genes and the use thereof
CA2613482A1 (en) 2005-07-01 2007-02-15 Arbor Vita Corporation Methods and compositions for diagnosis and treatment of influenza
EP1922410A2 (en) 2005-08-15 2008-05-21 Genentech, Inc. Gene disruptions, compositions and methods relating thereto
EP1929003A4 (en) 2005-08-31 2009-04-29 Cell Signaling Technology Inc REAGENTS FOR DETECTION OF PROTEIN PHOSPORYLATION IN CARCINOMA SIGNALING PATHWAYS
CA2623425A1 (en) 2005-09-19 2007-03-29 Veridex, Llc Methods for diagnosing pancreatic cancer
US20070099251A1 (en) 2005-10-17 2007-05-03 Institute For Systems Biology Tissue-and serum-derived glycoproteins and methods of their use
EP1790664A1 (en) 2005-11-24 2007-05-30 Ganymed Pharmaceuticals AG Monoclonal antibodies against claudin-18 for treatment of cancer
KR20080106946A (ko) 2006-03-29 2008-12-09 제넨테크, 인크. 종양의 진단 및 치료
WO2008013948A2 (en) 2006-07-27 2008-01-31 Cell Signaling Technology, Inc. Tyrosine phosphorylation sites
CA2660286A1 (en) 2006-08-09 2008-02-21 Homestead Clinical Corporation Organ-specific proteins and methods of their use
US8450057B2 (en) 2006-08-14 2013-05-28 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Diagnostic tests using gene expression ratios
MX2009002936A (es) 2006-09-19 2009-04-01 Novartis Ag Biomarcadores de la modulacion de objetivo, eficacia, diagnostico, y/o pronostico para los inhibidores de raf.
AU2007306542B2 (en) 2006-10-11 2013-08-01 Max-Planck-Gesellschaft Zur Forderung Der Wissenschaften E.V. Influenza targets
WO2008073303A2 (en) 2006-12-07 2008-06-19 Switchgear Genomics Transcriptional regulatory elements of biological pathways, tools, and methods
AU2007333106A1 (en) 2006-12-08 2008-06-19 Asuragen, Inc. miR-20 regulated genes and pathways as targets for therapeutic intervention
EP2125034A4 (en) 2007-02-01 2010-01-27 Veridex Llc METHOD AND MATERIALS FOR IDENTIFYING THE ORIGIN OF A CARCINOMA OF UNKNOWN PRIMARY ORIGIN
EP2145902A3 (en) 2007-04-19 2010-09-29 Peter Hornbeck Tyrosine phosphorylation sites and antibodies specific for them
EP1997832A1 (en) 2007-05-29 2008-12-03 Ganymed Pharmaceuticals AG Monoclonal antibodies against Claudin-18 for treatment of cancer
AU2008261951A1 (en) 2007-06-08 2008-12-18 Asuragen, Inc. miR-34 regulated genes and pathways as targets for therapeutic intervention
WO2008152822A1 (ja) 2007-06-15 2008-12-18 Medinet Co., Ltd. 医薬
US20100292303A1 (en) 2007-07-20 2010-11-18 Birrer Michael J Gene expression profile for predicting ovarian cancer patient survival
WO2009035497A2 (en) 2007-08-08 2009-03-19 Savidge Tor C Disease related cysteine modifications and uses thereof
EP2036987A1 (en) 2007-09-17 2009-03-18 Siemens Healthcare Diagnostics GmbH Molecular markers for tumor cell content in tissue samples
WO2009038090A1 (ja) 2007-09-19 2009-03-26 Suntory Holdings Limited セサミン類とアラキドン酸類を含有する組成物
JP2011501662A (ja) 2007-10-12 2011-01-13 ザ・プロウボウスト・フェロウズ・アンド・スカラーズ・オブ・ザ・カレッジ・オブ・ザ・ホリー・アンド・アンデバイデッド・トリニティ・オブ・クイーン・エリザベス・ニア・ダブリン タイト結合を開放するための方法
WO2009102367A2 (en) 2007-11-19 2009-08-20 The Regents Of The University Of Colorado Tight junction protein modulators and uses thereof
KR20110018930A (ko) 2008-06-02 2011-02-24 엔에스에이비피 파운데이션, 인크. 암 치료에서 예후적 및 예견적 마커의 확인 및 용도
US20110190380A1 (en) 2008-10-23 2011-08-04 Elena Feinstein Methods for delivery of sirna to bone marrow cells and uses thereof
CN101381524A (zh) 2008-10-24 2009-03-11 南开大学 单层氧化石墨与水溶性高分子增强复合材料
GB0904957D0 (en) 2009-03-23 2009-05-06 Univ Erasmus Medical Ct Tumour gene profile
US20120028816A1 (en) 2009-03-31 2012-02-02 Warren Stephen T Methods and systems for screening for and diagnosing dna methylation associated with autism spectrum disorders
CN101584860A (zh) 2009-04-27 2009-11-25 西安杰诺瓦生物科技有限公司 重组人Claudin18.2肿瘤疫苗及其制备方法
WO2010141093A2 (en) 2009-06-04 2010-12-09 The University Of Maryland, Baltimore Co-signaling methods for treating cancers
WO2011038461A1 (en) 2009-10-01 2011-04-07 Chipdx Llc System and method for classification of patients
AU2010326066A1 (en) 2009-12-01 2012-06-21 Compendia Bioscience, Inc. Classification of cancers
EP2547695B1 (en) 2010-03-16 2018-05-09 Biontech Protein Therapeutics GmbH Tumor vaccination involving a humoral immune response against self-protein cldn18.2
EP2366709A1 (en) 2010-03-16 2011-09-21 BioNTech AG Tumor vaccination involving a humoral immune response against self-proteins
US8945847B2 (en) 2010-05-24 2015-02-03 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Ltd. Methods and kits for ascertaining biosafety of an agent
WO2011149493A1 (en) * 2010-05-26 2011-12-01 Regents Of The Unviversity Of Minnesota Single -chain variable fragment anti-cd133 antibodies and uses thereof
CN103119176A (zh) 2010-06-07 2013-05-22 霍夫曼-拉罗奇有限公司 用于预测对白介素-6受体抑制性单克隆抗体药物治疗的响应的基因表达标记
US20130157891A1 (en) 2010-06-24 2013-06-20 Xiao-Jun Li Organ specific diagnostic panels and methods for identification of organ specific panel proteins
WO2012070014A2 (en) 2010-11-26 2012-05-31 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Ltd. Identification of novel cell surface markers for pancreatic progenitor cells and definite endodermal cells
WO2012096272A1 (ja) 2011-01-12 2012-07-19 森永乳業株式会社 免疫調節作用を有する乳を産生する食餌のスクリーニング法
DE102011005235B4 (de) 2011-03-08 2017-05-24 Sirs-Lab Gmbh Verfahren zum Identifizieren einer Teilmenge von Polynucleotiden aus einer dem Humangenom entsprechenden Ausgangsmenge von Polynucleotiden zur in vitro Bestimmung eines Schweregrads der Wirtsantwort eines Patienten
HK1206601A1 (en) 2012-04-02 2016-01-15 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides for the production of biologics and proteins associated with human disease
WO2013167153A1 (en) 2012-05-09 2013-11-14 Ganymed Pharmaceuticals Ag Antibodies useful in cancer diagnosis
WO2013174404A1 (en) 2012-05-23 2013-11-28 Ganymed Pharmaceuticals Ag Combination therapy involving antibodies against claudin 18.2 for treatment of cancer
WO2013174403A1 (en) 2012-05-23 2013-11-28 Ganymed Pharmaceuticals Ag Combination therapy involving antibodies against claudin 18.2 for treatment of cancer
WO2014025199A2 (ko) 2012-08-09 2014-02-13 주식회사 한독 스테필로코칼 엔테로톡신 유래의 초항원 변이체 및 이에 표적 특이적 폴리펩타이드가 연결된 융합단백질 및 그 용도
WO2014025198A2 (ko) 2012-08-09 2014-02-13 주식회사 한독 Lfa3 변이체 및 상기 변이체 또는 lfa3 cd2 결합영역과 이에 표적 특이적 폴리펩타이드가 연결된 융합단백질 및 그 용도
EP2888391A4 (en) 2012-08-24 2016-09-14 Univ Utah Res Found COMPOSITIONS AND METHODS RELATING TO BLOOD-BASED BIOMARKERS FOR BREAST CANCER
US20140073524A1 (en) 2012-09-07 2014-03-13 Institute For Systems Biology Markers and methods for detecting posttraumatic stress disorder (ptsd)
US9856532B2 (en) 2012-09-07 2018-01-02 Institute For Systems Biology Markers and methods for detecting posttraumatic stress disorder (PTSD)
WO2014127785A1 (en) 2013-02-20 2014-08-28 Ganymed Pharmaceuticals Ag Combination therapy involving antibodies against claudin 18.2 for treatment of cancer
WO2014146672A1 (en) 2013-03-18 2014-09-25 Ganymed Pharmaceuticals Ag Therapy involving antibodies against claudin 18.2 for treatment of cancer

Also Published As

Publication number Publication date
CA2563666A1 (en) 2005-12-01
HUE056422T2 (hu) 2022-02-28
US9775785B2 (en) 2017-10-03
PL2371848T3 (pl) 2018-12-31
JP5242160B2 (ja) 2013-07-24
JP2008508861A (ja) 2008-03-27
ES2601149T3 (es) 2017-02-14
CA2563666C (en) 2017-11-14
JP6223488B2 (ja) 2017-11-01
JP2015096504A (ja) 2015-05-21
LT1749027T (lt) 2016-11-10
US20150315287A1 (en) 2015-11-05
CA2984563A1 (en) 2005-12-01
AU2005245593A1 (en) 2005-12-01
ES2675558T3 (es) 2018-07-11
US20170240646A1 (en) 2017-08-24
HUE035289T2 (en) 2018-05-02
EP3401327B1 (de) 2021-01-13
JP5793133B2 (ja) 2015-10-14
EP2392593B1 (de) 2018-08-01
RS61395B1 (sr) 2021-02-26
ME02889B (me) 2018-04-20
PT3401327T (pt) 2021-02-11
JP2016185943A (ja) 2016-10-27
US9044382B2 (en) 2015-06-02
SI1749027T1 (sl) 2017-01-31
DK3401327T3 (da) 2021-04-06
EP3401327A1 (de) 2018-11-14
SI2371848T1 (sl) 2018-10-30
EP1749027A2 (de) 2007-02-07
HUE030620T2 (en) 2017-06-28
EP2392593A2 (de) 2011-12-07
ES2847025T3 (es) 2021-07-30
DE102004024617A1 (de) 2005-12-29
US20210145700A1 (en) 2021-05-20
EP2380903A1 (de) 2011-10-26
CY1119233T1 (el) 2018-02-14
PL2380903T3 (pl) 2017-10-31
JP2013121346A (ja) 2013-06-20
WO2005113587A2 (de) 2005-12-01
PT2380903T (pt) 2017-07-12
CY1118271T1 (el) 2017-06-28
EP2371848B1 (de) 2018-04-18
TR201809165T4 (tr) 2018-07-23
EP2392593A3 (de) 2012-06-06
DK2380903T3 (en) 2017-07-17
AU2005245593B2 (en) 2011-10-20
EP2380903B1 (de) 2017-04-05
EP2371848A1 (de) 2011-10-05
JP6218881B2 (ja) 2017-10-25
LT2380903T (lt) 2017-07-10
EP1749027B1 (de) 2016-08-10
PT1749027T (pt) 2016-11-07
LT2371848T (lt) 2018-07-25
ES2627962T3 (es) 2017-08-01
DK2371848T3 (en) 2018-07-23
HRP20170879T1 (hr) 2017-12-01
EP2383288A2 (de) 2011-11-02
EP2371849A1 (de) 2011-10-05
EP2383288A3 (de) 2012-02-15
HRP20161449T1 (hr) 2016-12-16
PT2371848T (pt) 2018-07-16
LT3401327T (lt) 2021-02-25
SI3401327T1 (sl) 2021-05-31
JP2016189775A (ja) 2016-11-10
HRP20210494T1 (hr) 2021-05-14
PL3401327T3 (pl) 2021-05-04
PL1749027T3 (pl) 2017-01-31
HUE040399T2 (hu) 2019-03-28
JP6080831B2 (ja) 2017-02-15
CY1120789T1 (el) 2019-12-11
US20080166350A1 (en) 2008-07-10
HRP20181013T1 (hr) 2018-08-24
CY1123733T1 (el) 2022-05-27
WO2005113587A3 (de) 2006-05-18
SI2380903T1 (sl) 2017-08-31
ME02653B (me) 2017-06-20
RS57437B1 (sr) 2018-09-28
DK1749027T3 (en) 2016-12-05
EP2371848B8 (de) 2018-06-06
RS55357B1 (sr) 2017-03-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US10414824B2 (en) Genetic products differentially expressed in tumors and the use thereof
US20210145700A1 (en) Genetic products differentially expressed in tumors and the use thereof
AU2016203425B2 (en) Genetic products differentially expressed in tumors and the use thereof
AU2017201358B2 (en) Genetic products differentially expressed in tumors and the use thereof
AU2013260709B2 (en) Genetic products differentially expressed in tumors and the use thereof
AU2012233044B2 (en) Genetic products differentially expressed in tumors and the use thereof
AU2011256897B2 (en) Genetic products differentially expressed in tumors and the use thereof