RS56926B1 - Bakterijski soj domaćina koji izražava rekombinantnu dsbc - Google Patents

Description

Opis

[0001] Pronalazak se odnosi na rekombinantni bakterijski soj domaćina, naročito E. koli. Pronalazak se takođe odnosi na metod za proizvodnju proteina od interesa u takvoj ćeliji.

POZADINA PRONALASKA

[0002] Bakterijske ćelije, kao što je E. koli, su obično korišćene za proizvodnju rekombinantnih proteina koji ne zahtevaju glikozilaciju. Postoje mnoge prednosti u korišćenju bakterijskih ćelija, kao što je E. koli, za proizvodnju rekombinantnih proteina, naročito zbog svestrane prirode bakterijskih ćelija kao ćelija domaćina, dozvoljavajući umetanje gena putem plazmida. E. koli je korišćena da proizvede mnoge rekombinantne proteine uključujući humani insulin.

[0003] Uprkos mnogih prednosti korišćenja bakterijskih ćelija da proizvedu rekombinantne proteine, i dalje su značajna ograničenja uključujući slab fenotip ćelijskog zdravlja.

[0004] Prema tome, još uvek postoji potreba da se obezbede novi bakterijski sojevi koji pružaju povoljna sredstva za proizvodnju rekombinantnih proteina.

[0005] Generisanje humoralnog i ćelijski-posredovanog imuniteta je orkestrirano sa interakcijom aktivisanih pomagača T ćelija sa antigen-predstavljajućim ćelijama ("APCs") i efektorskim T ćelijama. Aktivacija pomoćnih T ćelija nije samo zavisna na interakciju antigen-specifičnog T-ćelijskog receptora ("TCR") sa njegovim srodnim-kognativnim peptid-MHC ligandom, ali takođe zahteva koordinatu vezivanja i aktivaciju od strane brojne ćelijske adhezije i kostimulatornih molekula.

[0006] Prirodni receptor vezivanja na CD40 je CD40 ligand (CD40-L = CD154) kritični kostimulatorni molekul koji je eksprimiran na površini CD4 T ćelija u zavisnosti od aktivacije, vremenski ograničenog načina. CD154 je takođe eksprimiran, nakon aktivacije, na podskup CD8 Tćelije, bazofilne, mastocite, eozinofilne, prirodne ubice ćelija, B ćelije, makrofage, dendritske ćelije i trombocite. CD40 je konstitutivno i široko eksprimiran na površini mnogih tipova ćelija, uključujući B ćelije i druge ćelije koje predstavljaju antigen.

[0007] Signaliziranje kroz CD40 nakon angažmana sa CD154 pokreće kaskadu ćelijskih događaja koji rezultiraju aktivacijom ćelija koje nose CD40 receptor i optimalni priming CD4 T ćelije. Preciznije, vezivanje CD154 na CD40 promoviše diferencijaciju B ćelija u ćelije koje izlučuju antitela i memorijske B ćelije.

[0008] Ključna uloga CD154 u regulisanju funkcije humoralnog i ćelijski-posredovanog imunog odgovora izazvala je veliko ineresovanje za upotrebu inhibitora ovog puta za terapijsku imunomodulaciju. Kao takva, anti-CD154 antitela su se pokazala korisnim u širokom rasponu modela imunog odgovora na druge terapijske proteine ili gensku terapiju, alergene, autoimunost i transplantaciju (videti npr., US 5,474,771 i WO 2008/118356).

[0009] U tehnici postoji potreba da se efikasno i ekonomično proizvedu velike količine antitela ili fragmenata antitela koji interferiraju kod CD40 i CD154 pogodnih za terapijske primene.

REZIME PRONALASKA

[0010] Predmetni pronalazak obezbeđuje rekombinantnu gram-negativnu bakterijsku ćeliju kao što je definisano u patentnim zahtevima 1-11. Predmetni pronalazak dalje obezbeđuje metod kao što je definisan u patentnim zahtevima 12-15 za proizvodnju antitela ili antigen vezujućeg fragmenta od njih, posebno vezujućeg na CD154. Ovde je otkrivena rekombinantna gram-negativna bakterijska ćelija koja sadrži:

a) rekombinantni polinukleotid koji kodira DsbC; i

b) jedan ili više polinukleotida koji kodiraju antitelo ili antigen vezujući fragment od njih posebno vezujućeg na CD154.

[0011] Preciznije, ovde je otkrivena rekombinantna gram-negativna bakterijska ćelija, naznačena time što ćelija:

a) sadrži rekombinantni polinukleotid koji kodira DsbC;

b) ima smanjenu aktivnost Tsp proteina u poređenjui sa ćelijom divljeg -tipa, i

c) jedan ili više polinukleotida koji kodiraju antitelo ili antigen vezujući fragment od njih, posebno vezan na CD154.

[0012] U jednom dodatnom otkriću ćelija sadrži divlji-tip spr gena ili mutirani spr gen, na primer sposoban

za suzbijanje smanjene aktivnosti Tsp fenotipa.

[0013] Gram-negativna bakterijska ćelija prema predmetnom pronalasku pokazuje povoljan rast i proteinsku produkciju fenotipova.

[0014] Preciznije, ovde je otkrivena rekombinantna gram-negativna bakterijska ćelija koja sadrži rekombinantni polinukleotid koji kodira DsbC polipeptid koji sadrži histidin (His)-tag, poželjno pri čemu DsbC polipeptid sadrži sekvencu hishis-his-his-his-his (6x histidin).

[0015] Preciznije, ovo otkriće obezbeđuje rekombinantnu gram-negativnu bakterijsku ćeliju koja sadrži rekombinantni polinukleotid koji sadrži polinukleotid sa sekvencom prema SEK ID BR: 45 ili SEK ID BR: 51.

[0016] Ovde je takođe otkriven ekspresioni vektor koji sadrži rekombinantni polinukleotid koji kodira DsbC i

antitelo ili antigen vezujući fragmentod njih, posebno vezujući na CD154.

[0017] Preciznije, ovde je otkriven ekspresioni vektor koji obuhvata kodiranje rekombinantnog polinukleotida DsbC polipeptida obuhvatajući histidin (His)-tag, poželjno pri čemu DsbC polipeptid obuhvata sekvencu his-his-his-his-his-his (6x histidin).

[0018] Preciznije, ovde je otkriven ekspresioni vektor koji sadrži rekombinantni polinukleotid obuhvatajući polinukleotid sa sekvencom prema SEK ID BR: 45 ili SEK ID BR: 51.

Ovde je takođe takođe otkriven metod za proizvodnju antitela ili antigen vezujućeg fragmenta od njih koji se posebno veže za CD154, obuhvatajući:

a) kultivisanje rekombinantne gram-negativne bakterijske ćelije kao što je definisano iznad u medijumu kulture pod uslovima efikasnim za ekspresiju antitela ili antigen vezujućeg fragmenta od njih, koji se posebno vezuje za CD154 i rekombinantni polinukleotid koji kodira DsbC; i

b) obnavljanje antitela ili antigen vezujućeg fragmenta od njih, specifično vezujući za CD154 iz periplazme rekombinantne gram-negativne bakterijske ćelije i/ili medijuma kulture.

KRATAK OPIS CRTEŽA

[0019]

Slika 1 prikazuje konstrukciju vektora za upotrebu u proizvodnji ćelije prema izvođenju predmetnog pronalaska.

Slika 2 prikazuje strukturu jedinjenja koje sadrži modifikovani Fabov fragment kovalentno vezan preko cisteinskog ostatka na lizil-maleimidnom linkeru, pri čemu je svaka amino grupa na lizil ostatku kovalentno pripojena za njega metoksi PEG ostatkom pri čemu je n između oko 420 do 450.

Slika 3 prikazuje profil rasta anti-CD154 Fabovog ekspresionog soja W3110 i profil rasta anti-CD154 Fabov i rekombinantnu DsbC eksprimirajućeg soja MXE016 (W3110 ΔTsp, spr C94A). Može se videti da MXE016 soj eksprimirajući rekombinantnu DsbC pokazuje poboljšani profil rasta i stopu rasta u početnoj serijskoj fazi u poređenju sa W3110 sojem.

Slika 4 prikazuje ukupan Fabov prinos (g/L) iz periplazme (zatvoreni simboli) i supernatanta (otvoreni simboli) iz MXE016 soja eksprimirajući rekombinantnu DsbC u poređenju sa kontrolnim sojem W3110. DsbC eksprimirajući soj pokazuje veću periplazmatsku Fabovu ekspresiju u odnosu na W3110. Dalje, MXE016 soj eksprimirajući DsbC pokazuje ekvivalentne ekstracelularne Fabove nivoe u poređenju sa sojem W3110.

Slika 5 prikazuje rezultate reverzne faze HPLC analize ekstrakcija fermentacije. Divlji-tip soja W3110 eksprimirajući anti-CD154 Fabove pokazuje visok nivo degradiranih Kappa lakih lanaca (laki lanac [LC] fragmenti). Nasuprot tome, soj MXE016 (W3110 ΔTsp, spr C94A) eksprimirajući rekombinantnu DsbC i anti-CD154 Fabove jedva pokazuje bilo koje fragmente lakog lanca zbog odsustva aktivnosti Tsp proteaze.

Slika 6 prikazuje prinos anti-CD154 Fabova (g/L) iz fermentacija u soju W3110 i u soju MXE016 (W3110 ΔTsp, spr C94A) eksprimirajući rekombinantnu DsbC. Prinos iz soja MXE016 (W3110 ΔTsp, spr C94A) eksprimirajući rekombinantnu DsbC je znatno veći i pokazuje znatno manji ekstracelularni Fabov što je korisno jer ekstracelularni Fabov je marker rizika ćelijske lize i ekstracelularni Fab nije lako obnovljen korišćenjem istog postupka koji se koristi za periplazmatske Fabove.

Slika 7 prikazuje vijabilnost-održivost (a) soja W3110 ćelija i (b) soja MXE016 (W3110 ΔTsp, spr C94A) ćelija eksprimirajući rekombinantnu DsbC u oba slučaja (a) i (b) eksprimirajući anti-CD154 Fab '(g /L). Soj MXE016 ćelija (W3110 ΔTsp, spr C94A) eksprimirajući rekombinantnu DsbC pokazuje veću vijabilnost-održivost.

Slika 8 prikazuje ukupni Fabov prinos (g/L) iz fermentacija MXE016 sojeva eksprimirajući Fabov anti-CD154. Desna traka predstavlja MXE016 soj eksprimirajući dodatno rekombinantnu DsbC. Soj MXE016 eksprimirajući rekombinantni DsbC soj pokazuje veći prinos.

Slika 9 prikazuje polinukleotidne i aminokiselinske sekvence regije unutar ptr gena koji je mutiran.

Slika 10 prikazuje polinukleotidne i aminokiselinske sekvence regije unutar Tsp gena koji je mutiran.

Slika 11 prikazuje polinukleotidne i aminokiselinske sekvence regije unutar DegP gena koji je mutiran.

KRATAK OPIS SEKVENCI

[0020]

SEK ID BR: 1 prikazuje aminokiselinsku sekvencu CDRH1 anti-CD154 antitela.

SEK ID BR: 2 prikazuje aminokiselinsku sekvencu CDRH2 anti-CD154 antitela.

SEK ID BR: 3 prikazuje aminokiselinsku sekvencu CDRH3 anti-CD154 antitela.

SEK ID BR: 4 prikazuje aminokiselinsku sekvencu CDRL1 anti-CD154 antitela.

SEK ID BR: 5 prikazuje aminokiselinsku sekvencu CDRL2 anti-CD154 antitela.

SEK ID BR: 6 prikazuje aminokiselinsku sekvencu CDRL3 anti-CD154 antitela.

SEK ID BR: 7 prikazuje polinukleotidnu i aminokiselinsku sekvencu varijabilnog lakog lanca (gL4) anti-CD154 antitela (342). SEK ID BR: 8 prikazuje aminokiselinsku sekvencu varijabilnog lakog lanca (gL4) anti-CD154 antitela (342).

SEK ID BR: 9 prikazuje polinukleotidnu i aminokiselinsku sekvencu varijabilnog teškog lanca (gH1) anti-CD154 antitela (342).

SEK ID BR: 10 prikazuje aminokiselinsku sekvencu varijabilnog teškog lanca (gH1) anti-CD154 antitela (342).

SEK ID BR: 11 prikazuje polinukleotidnu i aminokiselinsku sekvencu obuhvatajući varijabilnu i konstantnu regiju lakog lanca (gL4) fragmenta anti-CD154 antitela.

SEK ID BR: 12 prikazuje aminokiselinsku sekvencu uključujući varijabilnu i konstantnu regiju lakog lanca (gL4) fragmenta anti-CD154 antitela.

SEK ID BR: 13 prikazuje polinukleotidnu i aminokiselinsku sekvencu fragmenta teškog lanca anti-CD154 antitela uključujući varijabilnu i CH1 regiju sa delecijama u zglobnoj regiji.

SEK ID BR: 14 prikazuje aminokiselinsku sekvencu fragmenta teškog lanca anti-CD154 antitela uključujući varijabilnu i CH1 regiju sa delecijama u zglobnoj regiji.

SEK ID BR: 15 prikazuje polinukleotidnu i aminokiselinsku sekvencu fragmenta teškog lanca anti-CD154 antitela obuhvatajući varijabilnu, CH1 i zglobnu regiju.

SEK ID BR: 16 prikazuje aminokiselinsku sekvencu fragmenta teškog lanca anti-CD154 antitela uključujući varijabilnu, CH1 i zglobnu regiju.

SEK ID BR: 17 prikazuje polinukleotidnu i aminokiselinsku sekvencu kappa lakog lanca anti-CD154 antitela (342) uključujući signalni peptid (aminokiseline 1-22).

SEK ID BR: 18 prikazuje aminokiselinsku sekvencu kappa lakog lanca anti-CD154 antitela (342) uključujući signalni peptid (aminokiseline 1-22).

SEK ID BR: 19 prikazuje polinukleotidnu i aminokiselinsku sekvencu celog teškog lanca aglikozilovanog IgG4anti-CD154 antitela.

SEK ID BR: 20 prikazuje aminokiselinsku sekvencu celog teškog lanca aglikozovanog IgG4anti-CD154 antitela.

SEK ID BR: 21 prikazuje polinukleotidnu sekvencu kodirajuću za gL4 i gH1 bez zgloba).

SEK ID BR: 22 prikazuje polinukleotidnu sekvencu kodirajuću za gL4 i gH1.

SEK ID BR: 23 prikazuje polinukleotidnu i aminokiselinsku sekvencu za divlji-tip E. koli spr (GenBank pristupni br. D86610). SEK ID BR: 24 prikazuje aminokiselinsku sekvencu za divlji-tip E. koli spr (GenBank pristupni br. D86610).

SEK ID BR: 25 prikazuje polinukleotidnu i aminokiselinsku sekvencu za divlji-tip E. koli Tsp sa signalnom sekvencom (GenBank pristupni br. M75634).

SEK ID BR: 26 prikazuje aminokiselinsku sekvencu za divlji-tip E. koli Tsp sa signalnim peptidom (GenBank. pristupni br. M75634).

SEK ID BR: 27 prikazuje aminokiselinsku sekvencu za divlji-tip E. koli DsbC (NCBl Referentna Sekvenca AP_003452).

SEK ID BR: 28 prikazuje polinukleotidnu sekvencu za nokaut mutirani Tsp gen.

SEK ID BR: 29 prikazuje polinukleotidnu i aminokiselinsku sekvencu za divlji-tip E. koli DegP.

SEK ID BR: 30 prikazuje aminokiselinsku sekvencu za divlji-tip E. koli DegP.

SEK ID BR: 31 prikazuje polinukleotidnu i aminokiselinsku sekvencu za DegP uključujući tačku mutacije S210A i Ase l restrikcioni marker.

SEK ID BR: 32 prikazuje aminokiselinsku sekvencu za for DegP obuhvatajući tačku mutacije S210A i Ase l

restrikcioni marker.

SEK ID BR: 33 do 36 prikazuje distronske intergenske sekvence (IGS) IGS1, IGS2, IGS3 i IGS4, respektivno.

SEK ID BR: 37 prikazuje polinukleotidnu i aminokiselinsku sekvencu za divlji-tip E. koli OmpT.

SEK ID BR: 38 prikazuje aminokiselinsku sekvencu za divlji-tip E. koli OmpT.

SEK ID BR: 39 prikazuje polinukleotidnu i aminokiselinsku sekvencu za nokaut mutiranu E. koli OmpT.

SEK ID BR: 40 prikazuje aminokiselinsku sekvencu za za nokaut mutiranu E. koli OmpT.

SEK ID BR: 41 prikazuje polinukleotidnu i aminokiselinsku sekvencu mutirane E. koli OmpT uključujući tačku mutacija D210A i H212A.

SEK ID BR: 42 prikazuje aminokiselinsku sekvencu E. koli OmpT uključujući tačku mutacija D210A i H212A.

SEK ID BR: 43 prikazuje polinukleotidnu i aminokiselinsku sekvencu divljeg-tipa E. koli DsbC.

SEK ID BR: 44 prikazuje aminokiselinsku sekvencu divljeg-tipa E. koli DsbC.

SEK ID BR: 45 prikazuje polinukleotidnu i aminokiselinsku sekvencu of E. koli DsbC bez EcoRl restrikcionog mesta sa Histag.

SEK ID BR: 46 prikazuje aminokiselinsku sekvencu E. koli DsbC bez EcoRl restrikcionog mesta sa His-tag.

SEK ID BR: 47 prikazuje polinukleotidnu sekvencu prajmera 6283 Tsp 3’.

SEK ID BR: 48 prikazuje polinukleotidnu sekvencu prajmera 6283 Tsp 5’.

SEK ID BR: 49 prikazuje polinukleotidnu i aminokiselinsku sekvencu divljeg-tipa E. koli ptr (proteaza lll prema GenBank pristupni broj X06227).

SEK ID BR: 50 prikazuje aminokiselinsku sekvencu divljeg-tipa E. koli ptr (proteaza lll prema GenBank pristupni broj X06227).

SEK ID BR: 51 prikazuje polinukleotidnu i aminokiselinsku sekvencu divljeg-tipa E. koli DsbC sa His-tag.

SEK ID BR: 52 prikazuje aminokiselinsku sekvencu divljeg-tipa E. koli DsbC sa His-tag.

DETALJAN OPIS POŽELJNIH IZVOĐENJA PRONALASKA

[0021] Tsp (takođe poznat kao Prc) je 60 kDa periplazmatska proteaza. Prvi poznati supstrat Tsp bio je Penicilin-vezujući protein-3 (PBP3) (Određivanje mesta cepanja uključenog u C-terminalnu obradu penicilin-vezujućeg proteina 3 Ešerihije koli (Hara et al. 4799-813;Nagasawa et al. 5890-93), ali je kasnije otkriveno da je Tsp takođe bio u stanju da cepa proteine fagovog repa i zbog toga je preimenovan kao Repna specifična proteaza (Tsp) (Silber, Keiler, and Sauer 295-99;Silber and Sauer 237-40) opisuje prc delecioni soj (KS1000) pri čemu je mutacija stvorena zamenom segmenta prc gena sa fragmentom koji sadrži Kan<r>marker.

[0022] Smanjenje aktivnosti Tsp (prc) je poželjno da se smanji-redukuje proteoliza proteina od interesa. Fab proteoliza se može se manifestovati kao prisustvo nečistoća kao što je fragment koji se može odnositi na nečistoću lakog lanca.

[0023] Međutim, pronađeno je da ćelije koje nemaju proteazu prc pokazuju termosenzitivni rast pri niskoj osmolarnosti. Hara et al izolovani termorezistentni revertanti koji sadrže mutacije ekstragenskog supresora (spr) (Hara et al. 63-72). Spr je 18kDa membranski vezana periplazmatska proteaza i supstrati spr su Tsp i peptidoglikani u spoljnoj membrani uključeni u hidrolizu ćelijskog zida tokom ćelijske deobe. Spr gen je označen kao UniProtKB/Swiss-Prot P0AFV4 (SPR_ECOLI).

[0024] Proteinska disulfid izomeraza je enzim koji katalizuje formiranje i razbijanje disulfidnih veza između ostataka cisteina unutar proteina dok se savijaju. Poznata je ko-ekspresija proteina koji katalizuju stvaranje disulfidnih veza radi poboljšanja ekspresije proteina u ćeliji domaćina. WO 98/56930 otkriva metod za proizvodnju heterolognih polipeptida koji sadrže disulfidnu vezu u bakterijskim ćelijama pri čemu je prokariotska disulfidna izomeraza, kao što je DsbC ili DsbG koekspresirana sa eukariotskim polipeptidom. US 6,673,569 otkriva veštački operon koji sadrži polinukleotide koji kodiraju svaki od DsbA, DsbB, DsbC i DsbD za upotrebu u proizvodnji stranog proteina. EP0786009 otkriva postupak za proizvodnju heterolognog polipeptida u bakteriji pri čemu ekspresija nukleinske kiseline koja kodira DsbA ili DsbC je indukovana pre indukcije ekspresije nukleinske kiseline kodirajući heterologni polipeptid.

[0025] DsbC je prokariotski protein pronađen u periplazmi E. koli koji katalizuje formiranje disulfidnih veza u E. koli. DsbC ima dužinu aminokiselinske sekvence od 236 (uključujući signalni peptid) i molekularnu težinu od 25.6 KDa (UniProt Br. P0AEG6). DsbC je prvi put identifikovan 1994. godine (Missiakas, Georgopoulos, and Raina 2013-20;Shevchik, Condemine, and Robert-Baudouy 2007-12).

[0026] Iznenađujuće je pronađeno da preterana-ekspresija DsbC u gram-negativnoj bakterijskoj ćeliji smanjuje lizu za vreme-tokom kultivacije-gajenja ćelija bez proteaze Tsp. Prema tome, postojeći pronalazači su obezbedili novi soj koji ima povoljna svojstva za proizvodnju proteina od interesa.

[0027] Gram-negativna bakterijska ćelija koja ima iznad navedenu specifičnu kombinaciju genetskih modifikacija pokazuje prednost rasta i proteinsku proizvodnju fenotipova.

[0028] U jednom izvođenju, genom ćelije je poželjno izogen prema bakterijskoj ćeliji divljeg-tipa, osim modifikacije potrebne da smanji aktivnost Tsp proteina u poređenju sa ćelijom divljeg-tipa.

[0029] U daljem izvođenju ćelija prema predmetnom pronalasku ima smanjenu Tsp proteinsku aktivnost u poređenju sa ćelijom divljeg-tipa i sadrži rekombinantni polinukleotid koji kodira DsbC i izmenjen spr protein. U ovom izvođenju genom ćelije je poželjno izogen bakterijskoj ćeliji divljeg-tipa, osim za mutirani spr gen i modifikaciju koja dovodi do smanjene ili odsutne ekspresije Tsp proteina u u poređenju sa ćelijom-divljeg tipa.

[0030] Termini "protein" i "polipeptid" se ovde koriste naizmenično, osim ako kontekst ne ukazuje drugačije. "Peptid" se odnosi na 20 ili manje aminokiselina.

[0031] Termin"polinukleotid" uključuje gen, DNA, cDNA, RNA, mRNA i analoge od njih, uključujući, ali bez ograničenja na zaključanu nukleinsku kiselinu (LNA), peptidnu nukleinsku kiselinu (PNA), morfolino nukleinsku kiselinu, glikolnu nukleinsku kiselinu (GNA) i treoznu nukleinsku kiselinu (TNA), itd. osim ako kontekst ne ukazuje drugačije.

[0032] Kao što se ovde koristi, pojam "obuhvatajući" u kontekstu ove specifikacije treba tumačiti kao "uključujući".

[0033] Ne-mutirana ćelija ili kontrolna ćelija u kontekstu predmetnog pronalaska znači ćeliju istog tipa kao što je rekombinantna gram-negativna ćelija iz pronalaska, pri čemu ćelija nije modifikovana da nosi rekombinantni polinukleotid koji kodira DsbC i jedan ili više polinukleotida koji kodiraju antitelo ili antigen vezujući fragment od njih, specifično se vezujući za CD154. Na primer, ne-mutirana ćelija može biti ćelija divljeg-tipa i može biti izvedena iz iste populacije ćelija domaćina kao i ćelije iz pronalaska pre modifikacije da uvede bilo koji rekombinantni polinukleotid (polinukleotide).

[0034] Izrazi "ćelija", " ćelijska linija", "ćelijska kultura" i "soj" su korišćeni naizmenično.

[0035] Termin "izogen" u kontekstu predmetnog pronalaska znači da ćelija sadrži istu ili suštinski istu sekvencu (sekvence) nukleinske kiseline u poređenju sa ćelijom divljeg-tipa, osim za elemente inkorporisane u njima koji karakterišu pronalazak, na primer rekombinantni polinukleotid kodirajući DsbC i jedan ili više polinukleotida kodirajući antitelo ili antigen vezujući fragmentod njih, specifično se vezujući za CD154 i opcionu modifikaciju koja dovodi do smanjene ili odsutne ekspresije Tsp proteina i opciono mutiranog spr gena. U ovom izvođenju ćelija prema predmetnom pronalasku ne sadrži dalje ne-prirodne ili genetski modifikovane promene na svom genomu.

[0036] U daljnjem tekstu otkrivena je ćelija pri čemu polinukleotid kodirajući DsbC i/ili jedan ili više polinukleotida kodirajući antitelo ili antigen vezujući fragment od njih su umetnuti u genom ćelije, ćelija prema predmetnom pronalasku može imati suštinski istu genomsku sekvencu u poređenju sa divljim-tipom ćelije, osim polinukleotida koji kodira DsbC i/ili jedan ili više polinukleotida koji kodiraju antitelo ili antigen vezujući fragment od njih i opciono modifikaciju koja rezultira smanjenom ili odsutnom ekspresijom Tsp proteina ili ekspresijom Tsp proteina sa smanjenom aktivnošću proteaze, i opciono mutiranim spr genom koji kodira protein sa redukovanom aktivnošću u poređenju sa divljim tipom, uzimajući u obzir bilo koje prirodne mutacije koje se mogu pojaviti. U jednom izvođenju, pri čemu polinukleotid kodirajući DsbC i/ili jedan ili više polinukleotida koji kodiraju antitelo ili antigen vezujući fragment od njih su umetnuti u genom ćelije, ćelija prema predmretnom pronalasku može imati tačno istu genomsku sekvencu u poređenju sa divljim-tipom ćelije, osim polinukleotida koji kodira DsbC i/ili jedan ili više polinukleotida koji kodiraju antitelo ili antigen vezujući fragment od njih.

[0037] Polinukleotid koji kodira DsbC može biti prisutan na pogodnom ekspresionom vektoru transformisan u ćeliji i/ li integrisan u genom ćelije domaćina. Gde je polinukleotid koji kodira DsbC umetnut u genom ćelije domaćina, ćelija iz ovog pronalaska se razlikuje se od divljeg-tipa ćelije zbog umetnutog polinukleotida koji kodira DsbC. U ovom slučaju, genom ćelije domaćina može biti izogen u poređenju sa genomom divljeg-tipa ćelije osim rekombinantnog polinukleotida koji kodira DsbC.

[0038] Poželjno, polinukleotid koji kodira DsbC je u ekspresionom vektoru u ćeliji, time uzrokujući minimalni poremećaj genoma ćelije domaćina.

[0039] Jedan ili više polinukleotida koji kodiraju antitelo ili antigen vezujući fragmentod njih, specifično se vezujući za CD 154, mogu biti sadržani u pogodnom ekspresionom vektoru transformisani u ćeliji i/ili integrisani u genom ćelije domaćina. U izvođenju gde polinukleotid kodirajući antitelo ili antigen vezujući fragment od njh, specifično se vezujući za CD 154, je umetnut u genom ćelije domaćina, ćelija predmetnog pronalaska se razlikuje od divljeg-tipa ćelije zbog umetnutog polinukleotida (više polinukleotida) kodirajući antitelo ili antigen vezujući fragment od njih. U ovom izvođenju, genom ćelije domaćina može biti izogen u poređenju sa genomom divljeg-tipa ćelije osim za polinukleotid (polinukleotide) koji kodiraju antitelo ili antigen vezujući fragment od njih. Poželjno, polinukleotid koji kodira protein od interesa je u ekspresionpm vektoru u ćeliji, time uzrokujući minimalni poremećaj ćelijskog genoma domaćina.

[0040] Ovde je dalje otkrivena ćelija pri čemu rekombinantni polinukleotid kodirajući DsbC i polinukleotid kodirajući antitelo ili antigen vezujući fragment od njih, specifično se vezujući za CD 154, su umetnuti u genom domaćina. U ovom slučaju, otkrivena ćelija se razlikuje od divljeg-tipa ćelije zbog umetnutog rekombinantnog polinukleotida koji kodira DsbC i jednog ili više polinukleotida koji kodiraju antitelo ili antigen vezujući fragment od njih, i opciono modifikacije koja rezultira smanjenom ili odsutnom ekspresijom Tsp proteina ili ekspresijom Tsp proteina sa smanjenom aktivnošću proteaze, i opciono mutiranog spr gena koji kodira protein sa redukovanom aktivnošću u poređenju sa divljim-tipom. U ovom slučaju, ćelijski genom domaćina može biti izogen u poređenju sa genomom divljeg-tipa, osim za rekombinantni polinukleotid koji kodira DsbC i jedan ili više polinukleotida koji kodiraju antitelo ili antigen vezujući fragment od njih.

[0041] U poželjnom izvođenju rekombinantni polinukleotid koji kodira DsbC i polinukleotid koji kodira antitelo ili antigen vezujući fragment od njih, specifično vezujući za CD 154, su prisutni u istim ili različitim ekspresionim vektorima u ćeliji i time uzrokuju minimalni poremećaj genoma ćelije domaćina. Dalje, otkriven ovde je slučaj gde genom ove ćelije može biti suštinski isti ili tačno isti u poređenju sa genomom divljeg-tipa ćelije.

[0042] U jednom izvođenju obezbeđena je rekombinantna ćelija E. koli koja ima smanjenu Tsp aktivnost i opciono spr gen ili mutant od njih, pri čemu se izvršavaju modifikacije Tsp aktivnosti i bilo koja mutacija u spr genu kroz promene u genomu ćelija. Ćelija prema ovom izvođenju može biti transformisana sa vektorom kao što je plazmid koji kodira vektor DsbC i antitelo ili vezujući fragment od njih koji se specifično vezuje na CD 154. U jednom izvođenju vektor ili plazmid nije integrisan u genom ćelije.

[0043] Termin "divlj-tip" u kontekstu predmetnog pronalaska označava soj gram-negativne bakterijske ćelije kao što se može pojaviti u prirodi ili može biti izolovan iz okoline, koji ne nosi nikakav rekombinantni polinukleotid ili genetski modifikovane mutacije. Primer divljeg-tipa soja E. koli je soj K-12 i njegov soj sa poreklom W3110. E. koli soj K-12 je u kultivaciji već 90 godina (Bachmann 525-57). E. coli soj K-12 i njegovi sojevi sa poreklom kao što je W3110 su dobro poznati u tehnici. Soj W3110 je dostupan na primer iz American Tissue Culture Collection (ATCC) u katalogu br. 27325. W3110 ima genotip: F-, λ-, IN(rrnD-rrnE)1, rph-1.

[0044] Predmetni pronalazači su obezbedili rekombinantnu gram-negativnu bakterijsku ćeliju pogodnu za ekspresiju antitela ili antigen vezujućeg fragmenta od njih specifično vezujućeg na CD 154, koji sadrži rekombinantni polinukleotid kodirajući DsbC.

[0045] Ćelije prema predmetnom pronalasku sadrže rekombinantni polinukleotid koji kodira DsbC. Kao što se ovde koristi, "rekombinantni polipeptid" se odnosi na protein koji je konstruisan ili proizveden upotrebom rekombinantne DNA tehnologije. Polinukleotid koji kodira DsbC može biti identičan endogenom polinukleotidu koji kodira DsbC nađenom u divljem tipu bakterijskih ćelija. Alternativno, rekombinantni polinukleotid koji kodira DsbC je mutirana verzija divljeg-tipa DsbC polinukleotida, na primer promenjena tako da se restrikciono mesto ukloni iz DsbC proteina, kao što je EcoRI mesto i/ili his-tag. Primer modifikovanog DsbC polinukleotida za upotrebu u predmetnom pronalasku je prikazan je u SEK ID BR: 45, koji kodira his-obeleženu DsbC sekvencu prikazanu u SEK ID BR: 46.

[0046] DsbC je karakterisana prisustvom aktivnog mesta koje sadrži aminokiseline -CXXC-pri čemu XX predstavlja aminokiseline GY. Varijante DsbC uključuju pri čemu svaki X predstavlja nezavisno izabranu aminokiselinu (pod uslovom da XX ne predstavlja GY). Primeri XX uključuju NY, SF, TF, MF, GF, HH, VH, SH, RF, FA, GA, MA, GI ili AV.

[0047] U jednom izvođenju, ćelija domaćin iz pronalaska sadrži varijantu DsbC, na primer gde je aktivno mesto promenjeno, posebno kao što je opisano iznad.

[0048] U jednom izvođenju, varijanta DsbC ima najmanju biološku aktivnost divljeg tipa proteina, na primer

kao što je izmereno in vitro testom.

[0049] U jednom izvođenju, varijanta DsbC ima veću biološku aktivnost od proteina divljeg tipa, na primer

kao što je izmereno u in vitro tesu.

[0050] U jednom izvođenju, varijanta DsbC ima izmenu na aktivnom mestu -CXXC-pri čemu XX predstavlja NY, SF, TF, MF, GF, HH, VH, SH.

[0051] U jednom izvođenju, DsbC je divlji-tip.

[0052] Predmetni pronalazači su identifikovali da selekcija ekspresije rekombinantnog polinukleotida koji kodira DsbC u bakterijskoj ćeliji, obezbeđuje poboljšanu ćeliju domaćina za ekspresiju antitela ili antigen vezujućeg fragmenta od njih posebno vezujućeg za CD154. Ćelije obezbeđene predmetnim pronalaskom imaju poboljšano zdravlje ćelija i fenotip rasta u poređenju sa bakterijskim ćelijama divljeg-tipa.

[0053] Poboljšano zdravlje ćelije kao što je ovde korišćeno ima za cilj da se odnosi na jedno ili više poboljšanih svojstava u poređenju sa ćelijama koje nemaju karakteristike prema predmetnom pronalasku, na primer nižu sklonost za lizu ćelije u fazi rasta ili posle indukcije ekspresije heterolognog proteina u ćeliji ili drugim korisnim svojstvima poznatim prosečnom stručnjaku.

[0054] Ćelije prema predmetnom pronalasku pokazuju poboljšani protein, kao što je antitelo ili fragment antitela, proizvodni prinos u poređenju sa bakterijskim ćelijama divljeg-tipa. Poboljšani prinos proteina može biti brzina proizvodnje proteina i/ili trajanje proizvodnje proteina iz ćelije. Poboljšani prinos proteina može biti prinos periplazmatskog proteina i/ili supernatantni prinos proteina. Rekombinantne bakterijske ćelije mogu biti sposobne za bržu stopu proizvodnje proteina, kao što je antitelo ili njegov fragment, i zbog toga ista količina proteina od interesa može biti proizvedena u kraćem vremenu u poređenju sa ne-mutiranom bakterijskom ćelijom. Brža stopa proizvodnje proteina od interesa može biti naročito značajna tokom početnog perioda rasta ćelije, na primer preko prvih 5, 10, 20 ili 30 sati posle indukcije ekspresije proteina.

[0055] Ćelije prema predmetnom pronalasku poželjno izražavaju prinos u periplazmi i/ili medijumu od približno 1.0g/L, 1.5g/L, 1.8g/L, 2.0g/L, 2.4g/L, 2.5g/L, 3.0g/L, 3.5g/L ili 4.0g/L antitela.

[0056] Povoljno smanjena aktivnost Tsp proteina i/ili ko-ekspresija DsbC dovodi do smanjenog generisanja

neželjene nečistoće koja se ovde spominje kao fragment lakog lanca (LC), videti na primer Sliku 5.

[0057] Stručna osoba bi lako mogla da testira klon kandidata ćelije da vidi da li ima željeni prinos proteina od interesa korišćenjem metoda dobro poznatih u tehnici, uključujući metod fermentacije, ELIZA test i protein G HPLC. Pogodne metode fermentacije su opisane u Humphreys et al. 193-202; Backlund et al. 358-65. Stručna osoba bi takođe mogla da lako testira izlučene proteine da vidi da li je protein ispravno savijen korišćenjem metoda dobro poznatih u tehnici, kao što je protein G HPLC, cirkularni dihroizam, NMR, rendgenska kristalografija i metode merenja afiniteta epitopa.

[0058] Dodatno otkrivena ovde je ćelija prema predmetnom pronalasku koja takođe eksprimira ili prekomerno eksprimira u poređenju sa odgovarajućom ćelijom divljeg-tipa, kao što je npr. E. koli W3110 K-12 soj, jedan ili više daljih proteina kao što sledi:

• jedan ili više proteina sposobnih olakšavanju proteinskog savijanja, FkpA, Skp, SurA, PPiA i PPiD; i/ili

• jedan ili više proteina sposobnih olakšavanju proteinske sekrecije ili translokacije, kao što su SecY, SecE, SecG, SecYEG, SecA, SecB, FtsY i Lep; i/ili

• jedan ili više proteina sposobnih olakšavanju formiranja disulfidne veze, kao što su DsbA, DsbB, DsbD, DsbG.

[0059] Jedan od više iznad navedenih proteina može biti integrisan u genom ćelije i/ili umetnut u ekspresioni vektor.

[0060] Ovde, takođe otkrivena ćelija prema predmetnom pronalasku se ne eksprimira ili eksprimira na nivou koji je najmanje 50%, 75% ili 90% niži od nivoa odgovarajuće ćelije divljeg-tipa, kao što je npr. E. koli W3110 K-12 soj, jedan ili više od daljih proteina:

• jedan ili više proteina sposobnih olakšavanju proteinskog savijanja, FkpA, Skp, SurA, PPiA i PPiD;

• jedan ili više proteina sposobnih olakšavanju proteinske sekrecije ili translokacije, kao što su SecY, SecE, SecG, SecYEG, SecA, SecB, FtsY i Lep; i

• jedan ili više proteina sposobnih olakšavanju formiranja disulfidne veze, kao što su DsbA, DsbB, DsbD, DsbG.

[0061] Dalje otkrivena ovde je ćelija prema predmetnom pronalasku koja takođe eksprimira jedan ili više daljih proteina izabranih od FkpA, Skp i kombinacije od njih.

[0062] Dalje otkrivena ovde je ćelija koja dalje sadrži jedan ili više od sledećih mutiranih gena:

a) mutirani spr gen;

b) mutirani Tsp gen, pri čemu mutirani Tsp gen kodira Tsp protein koji ima smanjenu aktivnost proteaze ili je nokaut mutirani Tsp gen;

c) mutirani DegP gen koji kodira DegP protein koji ima šaperon aktivnost i smanjenu aktivnost proteaze;

d) mutirani ptr gen, pri čemu mutirani ptr gen kodira Proteazu III protein koji ima smanjenu aktivnost proteaze ili je nokaut mutirani ptr gen; i

e) mutirani OmpT gen, pri čemu mutirani OmpT gen kodira OmpT protein koji ima smanjenu aktivnost proteaze na primer kao što je prikazano u SEK ID BR: 42 ili je nokaut mutirani OmpT gen na primer kao što je prikazano u SEK ID BR: 40.

[0063] U osnovnoj objavi gram-negativna bakterijska ćelija ne nosi nokaut mutirani Tsp gen, kao što je nedostatak u hromozomskoj Tsp.

[0064] Poslednja mutacija je naročito važna u proizvodnji antitela i njihovih fragmenata specifično se vezujući za CD154, jer aktivnost Tsp proteaze može rezultirati cepanjem produkta antitela u tzv. ̎ elbow ̎ -regijama lakta, čime se stvara nusprodukt u značajnim količinama i smanjuje prinos željenog produkta.

[0065] Tako opisana ovde je ćelija prema predmetnom pronalasku koja sadrži mutirani Tsp gen, pri čemu mutirani Tsp gen kodira Tsp protein koji ima smanjenu aktivnost proteaze ili je nokaut mutirani Tsp gen i takođe kodira DsbC protein pored antitela ili specifičaog fragmenta za CD154.

[0066] U dodatnoj objavi ćelija dalje sadrži mutirani spr gen. Spr protein je periplazmatska proteaza vezana za membranu E. koli.

[0067] Divlji-tip aminokiselinske sekvence Spr proteina je prikazan u SEK ID BR: 24 sa signalnom sekvencom na N-terminusu (aminokiseline 1-26 prema UniProt Accession Number P0AFV4). Označavanje aminokiselina Spr proteinske sekvence u predmetnom pronalasku uključuje signalnu sekvencu. Prema tome, aminokiselina 1 od Spr proteina je prva aminokiselina (Met) prikazana u SEK ID BR: 24.

[0068] Dodatno ovde otkrivena ćelija sadrži mutirani spr gen, mutirani spr gen je poželjno ćelijski hromozomski spr gen. Mutirani spr gen kodira Spr protein sposoban za suzbijanje nepovoljnog fenotipa povezanog sa ćelijom koja sadrži mutirani Tsp gen. Ćelije koje nose mutirani Tsp gen mogu imati dobru stopu rasta ćelije, ali jedno ograničenje ovih ćelija je njihova sklonost da se liziraju, posebno kod velikih gustina ćelije. Prema tome, fenotip ćelije koja sadrži mutirani TSp gen je sklonost lizanju, posebno pri velikoj gustini ćelije.

[0069] Ćelije koje nose mutirani Tsp gen pokazuju termosenzitivni rast pri niskoj osmolarnosti. Međutim, spr mutacije koje nose ćelije predmetnog pronalaska, kada se unose u ćeliju koja ima smanjenu aktivnost Tsp, potiskuju ovaj fenotip termosenzitivnog rasta pri niskoj osmolarnosti, i ćelija pokazuje smanjenu lizu, naročito pri velikoj gustini ćelije. Ovaj "termosenzitivni rast" fenotipa ćelije može biti lako izmerin od strane stručnjaka sa ovog područja tehnike za vreme trešenja laboratorijske boce ili tehnikom fermentacije. Suzbijanje ćelijske lize je vidljivo iz poboljšane brzine rasta i/ili rekombinantne proizvodnje proteina, naročito u periplazmi, pokazano od strane ćelije koja nosi spr-mutant i imajući smanjenu Tsp aktivnost u poređenju sa ćelijom koja nosi Tsp mutant i divlji- tip spr.

[0070] Poželjno, ćelije koje su ovde otkrivene sadrže mutirani spr gen koji kodira spr protein imajući promenu jedne ili više aminokiselina izabranih od N31, R62, I70, Q73, C94, S95, V98, Q99, R100, L108, Y115, D133, V135, L136, G140, R144, H145, G147, H157 i W174, poželjnije na jednoj ili više aminokiselina izabranih od C94, S95, V98, Y115, D133, V135, H145, G147, H157 i W174. Poželjno, mutant spr gen kodira spr protein koji ima promenu jedne ili više aminokiselina izabranih od N31, R62, I70, Q73, C94, S95, V98, Q99, R100, L108, Y115, D133, V135, L136, G140, R144, H145, G147 i H157, poželjnije na jednoj ili više aminokiselina izabranih od C94, S95, V98, Y115, D133, V135, H145, G147 i H157. U takvom slučaju spr protein poželjno nema nikakve dalje promene aminokiselina. Poželjno, mutant spr gen kodira spr protein koji ima promenu jedne ili više aminokiselina izabranih od N31, R62, I70, Q73, S95, V98, Q99, R100, L108, Y115, D133, V135, L136, G140, R144 i G147, poželjnije na jednoj ili više aminokiselina izabranih od S95, V98, Y115, D133, V135 i G147. U ovom slučaju, spr protein poželjno nema dalje promene aminokiseline.

[0071] Predmetni pronalazači su identifikovali promene koje su sposobne suzbijanju rasta fenotipa ćelije koja sadrži mutirani Tsp gen.

[0072] Pronalazači su takođe iznenađujuće našli da ćelije koje nose rekombinantni DsbC gen, mutirani spr gen i imaju smanjenu aktivnost Tsp proteina u poređenju sa ćelijom divljeg-tipa pokazuju povećanu brzinu rasta i povećano trajanje preživljenja ćelije u poređenju sa ćelijom koja sadrži mutirani Tsp gen. Specifično, ćelije koje nose rekombinantni DsbC gen, promenu spr proteina i imajući smanjenu aktivnost Tsp proteina pokazuju smanjenu lizu ćelije za vreme kultivacije u poređenju sa ćelijama koje nose mutirani Tsp gen.

[0073] Promena jedne ili više iznad navedenih spr aminokiselina može biti rezultat bilo koje pogodne misenske mutacije na jedan, dva ili tri nukleotida koji kodiraju aminokiselinu. Mutacija menja aminokiselinski ostatak na bilo kojoj pogodnoj aminokiselini koja rezultira u mutiranomm spr proteinu sposobnom suzbijanju fenotipa ćelije koja sadrži mutirani Tsp gen. tzv. ̎ missense ̎-misenska mutacija može promeniti aminokiselinu u jednu koja je različite veličine i/ili ima različita hemijska svojstva u poređenju sa divljim-tipom aminokiseline.

[0074] Dalje je ovde otkrivena promena u odnosu na jednu, dve ili tri katalitičke trijade aminokiselinskih ostataka od C94, H145, i H157 (Aramini et al. 9715-17).

[0075] Prema tome, mutirani spr gen može sadržavati:

• mutaciju koja pogađa aminokiselinu C94; ili

• mutaciju koja pogađa aminokiselinu H145; ili

• mutaciju koja pogađa aminokiselinu H157; ili

• mutaciju koja pogađa aminokiseline C94 i H145; ili

• mutaciju koja pogađa aminokiseline C94 i H157; ili

• mutaciju koja pogađa aminokiseline H145 i H157; ili

• mutaciju koja pogađa aminokiseline C94, H145 i H157.

[0076] U ovom slučaju, spr protein poželjno nema nikakve dalje promene aminokiselina.

[0077] Jedan, dva ili tri od C94, H145 i H157 mogu biti promenjeni u bilo koju pogodnu aminokiselinu koja rezultira spr proteinu sposobnom suzbijanju fenotipa ćelije koja sadrži mutirani Tsp gen. Na primjer, jedan, dva ili tri od C94, H145 i H157 mogu biti promenjeni u malu aminokiselinu kao što je Gly ili Ala. Prema tome, spr protein može imati jednu, dve ili tri mutacije koje su rezultirale u C94A (tj. cistein na poziciji 94 promenjen u alanin), H145A (tj. histidin na poziciji 145 promenjen u alanin) i H157A (tj. histidin na poziciji 157 promenjen u alanin). Poželjno, spr gen obuhvata tzv. ̎ missense ̎-misensku mutaciju koja vodi do H145A, za koji je nađeno da proizvodi spr protein sposoban suzbijanju fenotipa ćelije koja sadrži mutirani Tsp gen.

[0078] Oznaka za mutant supstituciju se ovde sastoji odslova praćenim brojem praćenim slovom. Prvo slovo označava aminokiselinu u divljem- tipu proteina. Broj se odnosi na poziciju aminokiseline gde je izvršena supstitucija aminokiseline, i drugo slovo označava aminokiselinu koja se koristi za zamenu divljeg-tipa aminokiseline.

[0079] Dalje otkriven ovde je mutant spr protein koji uključuje promenu jedne ili više aminokiselina izabranih od N31, R62, I70, Q73, S95, V98, Q99, R100, L108, Y115, D133, V135, L136, G140, R144 i G147, poželjno promenu jedne ili više aminokiselina izabranih od S95, V98, Y115, D133, V135 i G147. U ovom izvođenju, spr protein poželjno nema nijednu dalju mutaciju. Prema tome, mutirani spr gen može sadržavati:

• mutaciju koja pogađa aminokiselinu N31; ili

• mutaciju koja pogađa aminokiselinu R62; ili

• mutaciju koja pogađa aminokiselinu 170; ili

• mutaciju koja pogađa aminokiselinu Q73; ili

• mutaciju koja pogađa aminokiselinu S95; ili

• mutaciju koja pogađa aminokiselinu V98; ili

• mutaciju koja pogađa aminokiselinu Q99; ili

• mutaciju koja pogađa aminokiselinu R100; ili

• mutaciju koja pogađa aminokiselinu L108; ili

• mutaciju koja pogađa aminokiselinu Y115; ili

• mutaciju koja pogađa aminokiselinu D133; ili

• mutaciju koja pogađa aminokiselinu V135; ili

• mutaciju koja pogađa aminokiselinu L136; ili

• mutaciju koja pogađa aminokiselinu G140; ili

• mutaciju koja pogađa aminokiselinu R144; ili

• mutaciju koja pogađa aminokiselinu G147.

[0080] U jednom otkriću mutant spr gen sadrži višestruke mutacije koje utiču na aminokiseline:

• S95 i Y115; ili

• N31, Q73, R100 i G140 ; ili

• Q73, R100 i G140; ili

• R100 i G140; ili

• Q73 i G140; ili

• Q73 i R100; ili

• R62, Q99 i R144;ili

• Q99 i R144.

[0081] Jedna ili više od aminokiselina N31, R62, I70, Q73, S95, V98, Q99, R100, L108, Y115, D133, V135, L136, G140, R144 i G147 može biti promenjena u bilo koju pogodnu aminokiselinu koja rezultira u spr proteinu sposobnom suzbijanju fenotipa ćelije koja sadrži mutirani Tsp gene. Na primer, jedna ili više od N31, R62, I70, Q73, S95, V98, Q99, R100, L108, Y115, D133, V135, L136, G140 i R144 mogu biti promenjene u malu aminokiselinu kao što je Gly ili Ala.

[0082] Dalje otkriven ovde, spr protein sadrži jednu ili više od sledećih promena : N31Y, R62C, I70T, Q73R, S95F, V98E, Q99P, R100G, L108S, Y115F, D133A, V135D ili V135G, L136P, G140C, R144C i G147C. Poželjno, spr protein sadrži jednu ili više od sledećih promena: S95F, V98E, Y115F, D133A, V135D ili V135G i G147C. U ovom slučaju, spr protein poželjno nema nikakve dalje promene aminokiselina.

[0083] U jednom slučaju spr protein ima samo jednu aminokiselinsku promenu izabranu od N31Y, R62C, I70T, Q73R, C94A, S95F, V98E, Q99P, R100G, L108S, Y115F, D133A, V135D or V135G, L136P, G140C, R144C i G147C, naročito C94A. U ovom izvođenju, spr protein poželjno nema nikakve dalje promene aminokiselina.

[0084] Dalje otkriven ovde spr protein ima višestruke promene izabrane od:

• S95F i Y115F

• N31Y, Q73R, R100G i G140C;

• Q73R, R100G i G140C;

• R100G i G140C;

• Q73R i G140C;

• Q73R i R100G;

• R62C, Q99P i R144C; ili

• Q99P i R144C.

[0085] Poželjno, mutant spr gen kodira spr protein koji ima promenu aminokiselina izabranih od C94A, D133A, H145A i H157A, naročito C94A.

[0086] U daljem otkrivenom slučaju mutirani spr gen kodira spr protein koji ima promenu aminokiseline W174R. U alternativnom otkriću spr protein nema promenu aminokiseline W174R.

[0087] Ćelija prema predmetnom pronalasku ima smanjenu aktivnost Tsp proteina u poređenju sa ćelijom divljeg-tipa. Ekspresija "smanjene aktivnosti Tsp proteina u poređenju sa ćelijom divljeg-tipa" znači da je Tsp aktivnost ćelije smanjena u poređenju sa aktivnošću Tsp divljeg-tipa ćelije. Ćelija može biti modifikovana bilo kojim pogodnim sredstvima da se smanji aktivnost Tsp.

[0088] U jednom izvođenju smanjena aktivnost Tsp je iz modifikacije endogenog polinukleotida kodirajući Tsp i/ili pridružene sekvence regulatorne ekspresije. Modifikacija može smanjiti ili zaustaviti transkripciju Tsp gena i translaciju ili može obezbediti eksprimirani Tsp protein koji ima smanjenu aktivnost proteaze u poređenju sa divljim-tipom Tsp proteina.

[0089] U jednom izvođenju pridružena sekvenca regulatorne ekspresije je modifikovanada da se smanji ekspresija Tsp. Na primer, promoter za Tsp gen može biti mutiran da spreči ekspresiju gena.

[0090] U poželjnojm izvođenju ćelija prema predmetnom pronalasku nosi mutirani Tsp gen koji kodira Tsp protein imajući smanjenu aktivnost proteaze ili nokaut mutirani Tsp gen. Poželjno hromozomski Tsp gen je mutiran.

[0091] Kao što se ovde koristi, "Tsp gen" označava gen koji kodira Tsp proteazu (takođe poznata kao Prc) koja je periplazmatska proteaza sposobna delovanju na Penicilin-vezujući protein-3 (PBP3) i tzv. ̎phage tail proteins ̎–proteine krajnjeg faga. Sekvenca Tsp gena divljeg-tipa je prikazana u SEK ID BR: 25, i sekvenca Tsp proteina divljeg tipa je prikazana u SEK ID BR: 26.

[0092] Referenca za mutirani Tsp gen ili mutirani Tsp gen koji kodira Tsp, se odnosi i na mutirani Tsp gen koji kodira Tsp protein imajući smanjenu aktivnost proteaze ili nokaut mutirani Tsp gen, osim ako nije drugačije naznačeno.

[0093] Izraz "mutirani Tsp gen koji kodira Tsp protein koji ima smanjenu aktivnost proteaze" u kontekstu predmetnog pronalaska znači da mutirani Tsp gen nema punu aktivnost proteaze u poređenju sa divljim- tipom ne-mutiranog Tsp gena.

[0094] Poželjno, mutirani Tsp gen kodira Tsp protein koji ima 50% ili manje, 40% ili manje, 30% ili manje, 20% ili manje, 10% ili manje ili 5% ili manje aktivnosti proteaze divlje-tipa ne-mutiranog Tsp proteina. Poželjnije, mutirani Tsp gen kodira Tsp protein koji nema aktivnost proteaze. U ovom izvođenju ćelija nema nedostatak u hromozomskoj Tsp tj. sekvenca Tsp gena nije izbrisana ili mutirana da spreči ekspresiju bilo kojeg oblika Tsp proteina.

[0095] Bilo koja pogodna mutacija može biti uvedena u Tsp gen u cilju da se proizvde protein koji ima smanjenu aktivnost proteaze. Aktivnost proteaze Tsp proteina izražena iz gram-negativne bakterije može biti lako testirana od strane stručnjaka sa ovog područja tehnike bilo kojom pogodnom metodom u tehnici, kao što je metoda opisana u Keiler et al. (Keiler and Sauer 28864-68) pri čemu je testirana aktivnost Tsp proteaze.

[0096] Tsp je objavljen u Keiler et al (iznad) kao što ima aktivno mesto sadržavajuće ostatke S430, D441 i K455, i ostaci G375, G376, E433 i T452 su važni za održavanje strukture Tsp. Keiler et al (iznad) izveštava o nalazima da mutirani Tsp geni dovodeći do promena aminokiseline S430A, D441A, K455A, K455H, K455R, G375A, G376A, E433A i T452A nisu imali detektabilnu aktivnost proteaze. Dalje je objavljeno da mutirani Tsp gen vodeći do S430C pokazuje oko 5-10% aktivnosti divljeg-tipa. Prema tome, mutacija Tsp da bi proizvela protein koji ima smanjenu aktivnost proteaze može sadržavati mutaciju, kao što je tzv.̎ missense ̎ -misenska mutacija koja dovodi do promene jednog ili više ostataka S430, D441, K455, G375, G376, E433 i T452. Poželjno mutacija Tsp da bi proizvela protein koji ima smanjenu aktivnost proteaze može sadržavati mutaciju, kao što je . missense̎ -misenska mutacija utičući na jedan, dva ili sva tri aktivna mesta ostataka S430, D441 i K455.

[0097] Prema tome, mutirani Tsp gen može sadržavati:

• mutaciju koja pogađa aminokiselinu S430; ili

• mutaciju koja pogađa aminokiselinu D441; ili

• mutaciju koja pogađa aminokiselinu K455; ili

• mutaciju koja pogađa aminokiseline S430 i D441; ili

• mutaciju koja pogađa aminokiseline S430 i K455; ili

• mutaciju koja pogađa aminokiseline D441 i K455; ili

• mutaciju koja pogađa aminokiseline S430, D441 i K455.

[0098] Jedan ili više ostataka S430, D441, K455, G375, G376, E433 i T452 mogu biti promenjeni u bilo koju pogodnu aminokiselinu koja rezultira u proteinu koji ima smanjenu aktivnost proteaze. Primeri pogodnih promena su S430A, S430C, D441A, K455A, K455H, K455R, G375A, G376A, E433A i T452A. Mutirani Tsp gen može sadržavati jednu, dve ili tri mutacije dovodeći do promena ostataka aktivnog mesta, na primer gen može sadržavati:

• S430A ili S430C; i/ili

• D441A; i/ili

• K455A ili K455H ili K455R.

[0099] Poželjno, Tsp gen ima mutaciju koja vodi do S430A ili S430C.

[0100] Izraz "nokaut mutirani Tsp gen" u kontekstu predmetnog pronalaska znači da Tsp gen sadrži jednu ili više mutacija koja sprečava ekspresiju Tsp proteina kodiranog genom divljeg-tipa da bi se obezbedio ćelijski nedostatak u Tsp proteinu. Nokaut gen može biti delimično ili potpuno transkribovan, ali nije preveden u kodirani protein. Nokaut mutirani Tsp gen može biti mutiran na bilo koji pogodan način, na primer sa jednom ili više mutacija, delecijom, insercijom-umetanjem, tačkom, missense, besmislenom i mutacijom pomeranja okvira čitanja u sekvenci, da ne izazove ekspresiju proteina. Na primer, gen može biti nokautiran umetanjem sekvence strane DNA, kao što je antibiotski rezistentan marker, u gen kodirajuću sekvencu.

[0101] U poželjnom izvođenju, Tsp gen nije mutiran umetanjem strane DNA sekvence, kao što je antibiotski rezistentan marker, u gen kodirajuću sekvencu koja kodira gen. U jednom izvođenju Tsp gen sadrži mutaciju na start kodonu gena i/ili jednom ili više stop kodona pozicioniranih nizvodno od start kodona gena i uzvodno od stop kodona gena, time sprečavajući ekspresiju Tsp proteina. Mutacija na start kodonu može biti tzv. ̎ missense ̎ misenska mutacija jednog, dva ili sva tri nukleotida start kodona. Alternativno ili dodatno start kodon može biti mutiran umetanjem ili brisanjem mutacije pomeranja okvira čitanja. Tsp gen sadrži dva ATG kodona na 5 '-om kraju kodirajuće sekvence, jedan ili oba ATG kodona mogu biti mutirana pomoću promašene mutacije. Tsp gen može biti mutiran na drugom ATG kodonu (kodon 3) na TCG, kao što je prikazano na Slici 10. Tsp gen može alternativno ili dodatno sadržati jedan ili više stop kodona pozicioniranih nizvodno od start kodona gena i uzvodno od stop kodona gena. Poželjno, nokaut mutirani Tsp gen sadrži i tzv. ̎ missense ̎ misensku mutaciju na start kodonu i jednom ili više umetnutih stop kodona. U poželjnom izvođenju Tsp gen je mutiran da bi se izbrisao "T" iz petog kodona i na taj način uzrokujući mutaciju pomeranja okvira čitanja koja rezultira u stop kodonima , na kodonima 11 i 16, kao što je prikazano na Slici 10. U poželjnom izvođenju Tsp gen je mutiran da ubaci Ase l restrikciono mesto da stvori treće u-okviru stop kodona na kodonu 21, kao što je prikazano na Slici 10.

[0102] U poželjnom izvođenju, nokaut mutirani Tsp gen ima DNA sekvencu od SEK ID BR: 25, koja uključuje 6 nukleotida ATGAAT uzvodno od start kodona. Mutacije koje su napravljene u nokaut mutiranoj Tsp sekvenci od SEK ID BR: 25 su prikazane na Slici 10. U jednom izvođenju, mutirani Tsp gen ima DNA sekvencu od nukleotida 7 do 2048 od SEK ID BR: 25.

[0103] Dalje otkrivena ovde je ćelija koja dodatno sadrži mutirani DegP gen. Kao što se ovde koristi, "DegP" označava gen koji kodira DegP protein (također poznat kao HtrA), koji ima dvojnu funkciju kao šaperon i proteaza. Sekvenca divljeg-tipa DegP gena je prikazana u SEK ID BR: 29 i sekvenca ne-mutiranog DegP proteina je prikazan u SEK ID BR: 30.

[0104] Na niskim temperaturama, DegP funkcioniše kao šaperon i na visokim temperaturama DegP ima prednost da funkcioniše kao proteaza.

[0105] Dalje otkrivena ovde je ćelija koja sadrži DegP mutaciju, gde DegP mutaciju u ćeliji obezbeđuje mutirani DegP gen koji kodiraDegP protein imajući aktivnost šaperona, ali ne punu aktivnost proteaze.

[0106] Izraz "imajući aktivnost šaperona" u kontekstu predmetnog otkrića znači da mutirani DegP protein ima istu ili suštinski istu aktivnost šaperona u poređenju sa divljim tipom ne-mutiranog DegP proteina. Poželjno, mutirani DegP gen kodira DegP protein koji ima 50% ili više, 60% ili više, 70% ili više, 80% ili više, 90% ili više ili 95% ili više aktivnosti šaperona od divljeg tipa ne-mutiranog DegP proteina. Poželjnije, mutirani DegP gen kodira DegP protein koji ima istu aktivnost šaperona u poređenju sa divljim-tipom DegP.

[0107] Izraz "imajući smanjenu aktivnost proteaze" u kontekstu predmetnog otkrića znači da mutirani DegP protein nema punu aktivnost proteaze u poređenju sa divljim tipom ne-mutiranog DegP proteina. Poželjno, mutirani DegP gen kodira DegP protein koji ima 50% ili manje, 40% ili manje, 30% ili manje, 20% ili manje, 10% ili manje ili 5% ili manje aktivnosti proteaze od divljeg tipa ne-mutiranog DegP proteina. Poželjnije, mutirani DegP gen kodira DegP protein koji nema aktivnost proteaze. Ćelija nije deficijentna u hromozomskom DegP-u, tj. DegP genske sekvence nisu izbrisane ili mutirane da se spreči ekspresija bilo kojeg oblika DegP proteina.

[0108] Bilo koja pogodna mutacija može biti uvedena u DegP gen kako bi se proizveo protein koji ima aktivnost šaperona i smanjenu aktivnost proteaze. Proteazna i šaperon aktivnost DegP proteina eksprimirana iz gram-negativne bakterije može biti lako testirana od strane stručnjaka sa ovog područja tehnike bilo kojim pogodnom metodom, npr. pri čemu su proteazna i šaperon aktivnost DegP ispitane na MalS, prirodnom supstratu od DegP.

[0109] DegP je serinska proteaza i ima aktivni centar koji se sastoji od katalitičke trijade amino kiselinskih ostataka His105, Asp135 i Ser210. DegP mutacija da proizvode protein koji ima aktivnost šaperona i smanjenu aktivnost proteaze može obuhvatiti mutaciju, kao što je tzv. ̎ missense ̎ -misenska mutacija koja utiče na jedan, dva ili tri His105, Asp135 i Ser210.

[0110] Prema tome, mutirani DegP gen može sadržavati:

• mutaciju koja pogađa aminokiselinu His105; ili

• mutaciju koja pogađa aminokiselinu; ili

• mutaciju koja pogađa aminokiselinu; ili

• mutaciju koja pogađa aminokiseline His105 i Asp135; ili

• mutaciju koja pogađa aminokiseline His105 i Ser210; ili

• mutaciju koja pogađa aminokiseline Asp135 i Ser210; ili

• mutaciju koja pogađa aminokiseline His105, Asp135 i Ser210.

[0111] Jedan, dva ili tri od His105, Asp135 i Ser210 mogu biti promenjeni u bilo koju pogodnu aminokiselinu koja rezultira u protein koji ima aktivnost šaperona i smanjenu aktivnost proteaze. Na primer, jedan, dva ili tri od His105, Asp135 i Ser210 mogu biti promenjeni u malu aminokiselinu kao što je Gly ili Ala. Dalja pogodna mutacija je promena jedne, dve ili tri od His 105, Asp135 i Ser210 u aminokiselinu sa suprotnim svojstvima kao što je Asp135 koja se menja u Lys ili Arg, polar His105 se menja u ne-polarnu aminokiselinu kao što je Gly, Ala, Val ili Leu i mala hidrofilna Ser210 je promenjena u veliki ili hidrofobni ostatak kao što je Val, Leu, Phe ili Tyr. Poželjno, DegP gen obuhvata promenu S210A, kao što je prikazano na Slici 11, za koju je nađeno da proizvodi protein koji ima aktivnost šaperona, ali ne aktivnost proteaze.

[0112] DegP ima dve PDZ domene, PDZ1 (ostaci 260-358) i PDZ2 (ostaci 359-448), koji posreduju interakciji proteinprotein. U jednom izvođenju predmetnog pronalaska, DegP gen je mutiran da se izbriše PDZ1 domen i/ili PDZ2 domen. Brisanje PDZ1 i PDZ2 dovodi do potpunog gubitka proteazne aktivnosti DegP proteina i smanjene aktivnosti šaperona u poređenju sa divljim-tipom DegP proteina dok brisanje bilo PDZ1 ili PDZ2 rezultira u 5% aktivnosti proteaze i sličnu aktivnost šaperona u poređenju sa divljim-tipom DegP proteina.

[0113] Mutirani DegP gen takođe može sadržavati tiho, koje se ne javlja prirodno restrikciono mesto, kao što je Ase l da bi pomogli u identifikaciji i metodama skrininga, na primer kao što je prikazano na Slici 11.

[0114] Poželjna sekvenca mutiranog DegP gena sadržavajući tačku mutacije S210A i Ase l restrikciono marker mesto je obezbeđena u SEK ID BR: 31, i kodirana sekvenca proteina je prikazana u SEK ID BR: 27. Mutacije koje su napravljene u mutiranoj DegP sekvenci od SEK ID BR: 32 su prikazane na Slici 11.

[0115] U daljim otkrićima ovde, ćelija sadrži mutirani DegP gen koji kodira DegP protein imajući aktivnost šaperona i smanjenu aktivnost proteaze, jedna ili više ćelija obezbeđene predmetnim pronalaskom mogu omogućiti poboljšani prinos ispravno savijenih proteina iz ćelije u odnosu na mutirane ćelije pri čemu je DegP gen mutiran do nokaut DegP sprečavajući ekspresiju DegP, kao što je hromozomski manjak DegP. U ćeliji koja sadrži nokaut mutirani DegP gen sprečavajući ekspresiju DegP-a, šaperon aktivnost DegP je potpuno izgubljena dok je u ćeliji prema predmetnom otkriću, šaperon aktivnost DegP zadržana dok je puna aktivnost proteaze izgubljena. U ovim izvođenjima, jedna ili više ćelija prema predmetnom otkriću imaju nižu aktivnost proteaze da se spreči proteoliza proteina uz održavanje aktivnosti šaperona da bi se omogućilo ispravno savijanje i transport proteina u ćeliji domaćina.

[0116] Dalje otkrivena ovde je gram-negativna bakterijska ćelija koja prema otkrićima iznad ne nosi nokaut mutirani OmpT gen, kao što je nedostatak u hromozomskoj OmpT SEK ID BR: 39.

[0117] Dalje otkrivena ovde je gram-negativna bakterijska ćelija kao što je opisano u prethodnim paragrafima koja ne nosi nokaut mutirani DegP gen, kao što je nedostatak u hromozomskom DegP. Dalje otkrivena ovde je gram-negativna bakterijska ćelija prema prethodnim paragrafima koja ne nosi mutirani DegP gen.

[0118] Dalje otkrivena ovde je gram-negativna bakterijska ćelija prema prethodnim paragrafima koja ne nosi nokaut mutirani ptr gen, kao što je nedostatak u hromozomskom ptr.

[0119] Dalje otkrivena ovde je gram-negativna bakterijska ćelija prema prethodnim paragrafima koja ne nosi mutirani spr gen.

[0120] Bilo koja pogodna gram-negativna bakterija može biti upotrebljena kao roditeljska ćelija za proizvodnju rekombinantne ćelije predmetnog pronalaska. Pogodna gram-negativna bakterija uključuje Salmonelu tifimurium, Pseudomonas fluorescens, Erviniu karotovoru, Šigelu, Klebsijelu pneumonie, Legionelu pneumofilu, Pseudomonas aeruginozu, Akinetobakter baumani i E. koli. Poželjno, roditeljskaa ćelija je E. koli. Bilo koji pogodnan soj E. koli može biti korišćen u predmetnom pronalasku ali poželjno je da se koristi divlji- tip W3110 soja, kao što je K-12 W3110.

[0121] Nedostatak povezan sa sojevima prethodno stvorenim i korišćenim za ekspresiju rekombinantnih proteina uključuje upotrebu mutacija gena koji su uključeni u metabolizam ćelija i replikaciju DNA kao što su, na primer, phoA, fhuA, lac, rec, gal, ara, arg, thi i pro u sojevima E. koli. Ove mutacije mogu imati mnoge štetne efekte na ćeliju domaćina, uključujući efekte na rast ćelije, stabilnost, periplazmatsku propustljivost, prinos ekspresije rekombinantnog proteina i toksičnost. Sojevi koji imaju jednu ili više ovih genomskih mutacija, naročito sojevi koji imaju velik broj ovih mutacija, mogu pokazati gubitak sposobnosti koji smanjuje brzinu bakterijskog rasta na nivo koji nije pogodna za industrijsku proizvodnju proteina. Dalje, bilo koja od iznad navedenih genomskih mutacija može uticati na druge gene u cis i/ili u trans u nepredvidivim štetnim načinima, čime se menja fenotip, sposobnost i profil proteina. Dalje, upotreba jako mutiranih ćelija nije uglavnom pogodna za proizvodnju rekombinantnih proteina za komercijalnu upotrebu, naročito terapeutike, jer takvi sojevi generalno imaju defektne metaboličke puteve i zbog toga mogu rasti slabo ili uopšte ne u minimalnom ili hemijski definisanom medijumu.

[0122] U poželjnom izvođenju, ćelije nose samo minimalne mutacije za uvođenje rekombinantnog polinukleotida koji kodira DsbC i jedan ili više polinukleotida koji kodiraju antitelo ili antigen-vezujući fragment od njih i mutaciju koja rezultira u smanjenoj aktivnosti Tsp proteaze i spr-mutantu od njih.

[0123] U jednom izvođenju, pri čemu polinukleotid koji kodira DsbC i/ili jedan ili više polinukleotida koji kodiraju antitelo ili antigen vezujući fragment od njih su umetnuti u ćelijski genom samo minimalne mutacije su napravljenene u genomu ćelije da uvedu rekombinantni polinukleotid koji kodira DsbC i/ili antitelo. U daljem izvođenju pri čemu rekombinantni polinukleotid koji kodira DsbC i polinukleotid koji kodira antitelo su prisutni u istim ili različitim ekspresionim vektorima, genom je poželjno izogen u odnosu na divlj-tip genoma ćelije.

[0124] Dalje otkrivene ovde ćelije ne nose nikakve druge mutacije koje mogu imati štetne efekte na rast ćelija i/ili sposobnost da eksprimiraju protein od interesa. Prema tome, jedna ili više rekombinantnih ćelija domaćina iz predmetnog pronalaska može pokazati poboljšanu ekspresiju proteina i/ili poboljšane karakteristike rasta u poređenju sa ćelijama koje sadrže genetski modifikovane mutacije na genomskoj sekvenci. Ćelije obezbeđene predmetnim pronalaskom su takođe pogodnije za upotrebu za proizvodnju terapijskih proteina u poređenju sa ćelijama koje uključuju poremećaje na genomu ćelije.

[0125] U poželjnom izvođenju, ćelija je izogena za ćelije E. koli divljeg-tipa osim za rekombinantni polinukleotid koji kodira DsbC i jedan ili više polinukleotida koji kodiraju antitelo ili antigen vezujući fragment od njih, specifično vezujući na CD 154 i mutaciju koja rezultira u smanjenj aktivnosti Tsp proteaze i spr mutant gena od njih.

[0126] U jednom izvođenju je obezbeđena ćelija izogena za E. koli soj W3110, osim sa smanjenom Tsp aktivnošću i sprmutanta, za upotrebu sa plazmidom pogodnim za ekspresiju DsbC i antitela ili antigen vezujućeg fragmenta od njih specifično vezujući na CD 154.

[0127] Dalje otkrivena ovde je ćelija koja je izogena za E. koli soj W3110, osim za rekombinantni polinukleotid koji kodira DsbC i jedan ili više polinukleotida koji kodiraju antitelo ili antigen vezujući fragment od njih specifično vezujući na CD 154.

[0128] Ćelija obezbeđena predmetnim pronalskom sadrži jedan ili više polinukleotida koji kodiraju fragment antitela koji veže antigen sa specifičnošću za CD 154.

[0129] Sadržavajuća ćelija kao što je ovde upotrebljena je namenjena da se odnosi na mesto gde je dotični entitet integrisan u genom ćelije ili gde ćelija sadrži vektor kao što je sadržavajući plazmid i uopšteno za eksprimiranje entiteta.

[0130] Antitelo ili fragment antitela može biti multi-valentni, multi-specifični, humanizovani, potpuno humani ili himerni. Antitelo ili fragment antitela može biti iz bilo koje vrste, ali je poželjno izveden iz monoklonalnog antitela, humanog antitela ili humanizovanog fragmenta. Fragment antitela može biti izveden iz bilo koje klase (npr. IgG, IgE, IgM, IgD ili IgA) ili podklase imunoglobulinskog molekula i može biti dobijen iz bilo koje vrste uključujući, na primer, miša, pacova, ajkulu, zeca, svinju, hrčka, lamu, kozu ili čoveka. Delovi fragmenta antitela mogu biti dobijeni iz više od jedne vrste, na primer, fragmenti antitela mogu biti himerni. U jednom primeru konstantne regije su iz jedne vrste i varijabilne regije iz druge.

[0131] Fragment antitela može biti VH, VL, VHH, Fab, modifikovani Fab, Fab ', F(ab')2ili Fv fragment; laki lanac ili teški lanac monomera ili dimera; kao i dvostruko antitelo; trostruko antitelo; četvorostruko antitelo; mini antitelo; domensko antitelo ili antitelo sa jednostrukim lancem, npr., jednostruki lanac Fv u kojem se varijabilne domene teškog i lakog lanca pridružene peptidnim povezivačem-linkerom, Fab-Fv ili dvostruko specifično antitelo, kao što je Fab-dAb, kao što je opisano u WO 2009/040562. Slično, varijabilne regije teškog i lakog lanca mogu biti kombinovane sa drugim domenama antitela, prema potrebi. Fragmenti antitela su poznati u tehnici (Holliger and Hudson 1126-36).

[0132] Antitelo koje se specifično vezuje za CD154, je poželjno antitelo 342 opisano u WO 2008/118356 ili

obuhvata CDRs ili varijabilne regije teškog i lakog lanca antitela 342 opisanog u WO 2008/118356. Fragment antitela koji je specifično vezan za CD154, je poželjno izveden iz antitela 342 opisanog u WO 2008/118356 i/ili sadrži CDRs ili varijabilne regije teškog i lakog lanca pomenutog antitela.

[0133] U jednom izvođenju antitelo ili fragment antitela koji se specifično veže na CD 154, sadrži teški lanac pri čemu varijabilni domen sadrži tri CDRs pri čemu su CDRs izabrani od SEK ID BR: 1 za CDRH1, SEK ID BR: 2 za CDRH2 i SEK ID BR: 3 za CDRH3.

[0134] U jednom izvođenju antitelo ili fragment antitela koji se specifično veže na CD 154, sadrži laki lanac pri čemu varijabilni domen sadrži tri CDRs pri čemu su CDRs izabrani od SEK ID BR: 4 za CDRL1, SEK ID BR: 5 za CDRL2 i SEK ID BR: 6 za CDRL3.

[0135] U jednom izvođenju antitelo ili fragment antitela koji se specifično veže na CD 154, sadrži teški lanac uključujući sekvencu SEK ID BR:1 za CDRH1, sekvencu SEK ID BR: 2 za CDRH2 i sekvencu SEK ID BR: 3 za CDRH3.

[0136] U jednom izvođenju, antitelo ili fragment antitela koji se specifično veže za CD154 sadrži laki lanac uključujući sekvencu SEK ID BR: 4 za CDRL1, sekvencu SEK ID BR: 5 za CDRL2 i sekvencu SEK ID BR: 6 za CDRL3.

[0137] U jednom izvođenju, antitelo ili fragment antitela koji se specifično veže za CD154 sadrži teški lanac uključujući sekvencu SEK ID BR: 1 za CDRH1, sekvencu SEK ID BR: 2 za CDRH2 i sekvencu SEK ID BR: 3 za CDRH3 i laki lanac uključujući sekvencu SEK ID BR: 4 za CDRL1, sekvencu SEK ID BR: 5 za CDRL2 i sekvencu SEK ID BR: 6 za CDRL3.

[0138] Antitelo je poželjno CDR-graftovani molekul antitela i tipično varijabilni domen sadrži akceptorske okvirne regije humanog akceptora i ne-humane donora CDRs.

[0139] Poželjno, antitelo sadrži varijabilni domen lakog lanca (SEK ID BR: 7) i varijabilni domen teškog lanca (SEK ID BR: 9).

[0140] Poželjno, je antitelo Fab fragment. Poželjno, Fab fragment ima teški lanac koji uključuje ili se sastoji od sekvence date kao SEK ID BR: 14 i laki lanac koji uključuje ili se sastoji od sekvence date kao SEK ID BR: 12. Aminokiselinske sekvence date u SEK ID BR: 14 i SEK ID BR: 12 su poželjno kodirane pomoću nukleotidnih sekvenci datih u SEK ID BR: 13 i SEK ID BR: 11, respektivno.

[0141] Alternativno, poželjno je da je fragment antitela modifikovani Fab fragment, pri čemu je modifikacija dodatak na C-terminalnom kraju njegovog teškog lanca jedne ili više aminokiselina da se omogući pripajanje efektorskog ili reporterskog molekula. Poželjno, dodatne aminokiseline formiraju modifikovanu zglobnu regiju koja sadrži jedan ili dva cisteinska ostatka na koje se može pripojiti efektorski ili reporterski molekul, kao što je poznato u tehnici (videti npr. WO 98/25971).

[0142] Ćelija prema predmetnom pronalasku sadrži DNA sekvencu koja kodira antitelo. Poželjno, DNA sekvenca kodira teški i laki lanac antitela.

[0143] U jednom poželjnom izvođenju, DNA sekvenca kodira laki lanac i sadrži sekvencu prikazanu ovde.

[0144] Sekvenca DNA može sadržavati sintetsku DNA, na primer proizvedenu hemijskom obradom, cDNA, genomskom DNA ili bilo kojom kombinacijom od njih.

[0145] Domene konstantne regije antitela, ako su prisutne, mogu biti izabrane imajući u vidu predloženu funkciju molekula antitela, a naročito funkcije efektora koje mogu biti potrebne. Na primer, domene konstantne regije mogu biti humane lgA, lgD, lgE, lgG ili lgM domene. Naročito, mogu biti korišćene domene konstantne regije humanog lgG, posebno izotipova lgG1i lgG3, kada je molekul antitela namenjen za terapijsku upotrebu i potrebne su funkcije efektora antitela. Alternativno, izotipovi lgG2i lgG4mogu biti upotrebljeni kada je molekul antitela namenjen za terapijske svrhe, a funkcije efektora antitela nisu potrebne, npr. za jednostavno blokiranje CD154 aktivnosti.

[0146] Antitelo može biti korisno u lečenju bolesti ili poremećaja uključujući inflamatorne bolesti i poremećaje, imune bolesti i poremećaje, fibrozne poremećaje i kancere.

[0147] Termin "inflamatorna bolest" ili "autoimuni poremećaj" i "imunološka bolest ili poremećaj" uključuju reumatoidni artritis, psorijazni artritis, ankilozirajući spondilitis, juvenilni artritis, Stilovu bolest, Hašimotov tiroiditis, Gravesovu-Grejvs-Bazedovljevu bolest, Sjogrenov sindrom, Gudpasterov sindrom, Adisonovu bolest, vaskulitis, uključujući ANCA-povezani vaskulitis i Vegenerovu granulomatozu, primarnu bilijarnu cirozu, sklerozirajući holangitis, autoimuni hepatitis polimialgia reumatika, Gijen-Bareov sindrom, antifosfolipidni sindrom, idiopatsku trombocitopeniju, autoimunu hemolitičku anemiju, pernicioznu anemiju, pemfigus vulgars, dermatomiozitis, bulozni pemfigoid, tzv. ̎ Henoch-Schönlein ̎ purpuru, tzv. ̎ Muckle Wells ̎ bolest, psorijazu, Kronovu bolest, ulcerozni kolitis, SLE (sistemski eritemski lupus), celijačnu bolest, astmu, alergijski rinitis, atopijski dermatitis, multiplu sklerozu, vaskulitis, dijabetes melitus tipa I, transplantaciju i graft-verzus-host bolest.

[0148] Termin fibrozni poremećaj", kao što se ovde koristi, se odnosi na poremećaj karakterisan formiranjem ili razvojem viška fibroznog vezivnog tkiva u organu ili tkivu, često kao reparativni ili reaktivni proces. Fibrotski poremećaj može uticati na pojedinačne organe, kao što su pluća (na primer bez ograničenja idiopatska plućna fibroza, intersticijalna bolest pluća), jetra, creva, bubreg, srce ili koža ili uticati na više organa, na primer bez ograničenja u sistemskoj sklerozi. Termin fibrotski poremećaj takođe se odnosi na ožiljke kože. Ožiljak kože uključuje, ali nije ograničen na, keloidne ožiljke, ožiljke koji se javljaju iz kontrakcije, na primer bez ograničenja posle opekotine kože, hipertrofične ožiljke i ožiljke od akni.

[0149] Ćelija domaćina pronalaska može takođe sadržavati dodatni polinukleotid koji kodira jedan ili više dodatnih proteina od interesa.

[0150] Rekombinantna gram-negativna bakterijska ćelija prema predmetnom pronalasku može biti proizvedena bilo kojim pogodnim sredstvima.

[0151] Stručnjak zna pogodne tehnike koje mogu biti upotrebljene za umetanje rekombinantnog polinukleotida koji kodira DsbC i polinukleotida koji kodira antitelo. Rekombinantni polinukleotid koji kodira DsbC i/ili polinukleotid koji kodira antitelo može biti integrisan u genom ćelije korišćenjem pogodnog vektora kao što je pKO3 opisan u Link et al. (Link, Phillips, and Church 6228-37).

[0152] Alternativno ili dodatno, rekombinantni polinukleotid koji kodira DsbC i/ili polinukleotid koji kodira antitelo može biti ne-integrisan u rekombinantnoj ekspresionoj kaseti. U jednom izvođenju, upotrebljena je ekspresiona kaseta u predmetnom pronalasku da nosi polinukleotid koji kodira DsbC i/ili polinukleotid koji kodira antitelo koje tipično sadrži proteinsku kodirajuću sekvencu koja kodira DsbC, jednu ili više proteinskih kodirajućih sekvenci koje kodiraju antitelo i jednu ili više regulatornih ekspresionih sekvenci. Jedna ili više regulatornih ekspresionih sekvenci mogu uključiti promoter. Jedna ili više regulatornih ekspresionih sekvenci mogu takođe uključiti 3 'netranslantovanu regiju, kao što je terminaciona sekvenca. Pogodni promoteri su detaljnije razmotreni u nastavku.

[0153] U jednom izvođenju gen koja kodira DsbC i/ili antitelo ili fragment od njih je integrisan u genom ćelije domaćina da bi se stvorila stabilna ćelijska linija.

[0154] U jednom izvođenju, ćelija prema predmetnom pronalasku sadrži jedan ili više ekspresionih vektora,

kao što je plazmid. Vektor poželjno sadrži jednu ili više ekspresionih kaseta kao što je definisano iznad. Ćelija domaćina poželjno sadrži ekspresioni vektor uključujući DNA koja kodira antitelo ili antigen vezujući fragment od njih, specifično vezujući na CD154, kao što je opisano iznad. Poželjno ekspresioni vektor sadrži polinukleotidnu sekvencu koja kodira laki lanac i polinukleotidnu sekvencu koja kodira teški lanac antitela ili antigen vezujući fragmentod njih, posebno vezujući za CD 154.

[0155] U poželjnom izvođenju, ekspresioni vektor je ekspresioni vektor E. koli.

[0156] U jednom izvođenju polinukleotidna sekvenca koja kodira antitelo i polinukleotid koji kodira DsbC

su umetnuti u odvojene ekspresione vektore.

[0157] Za proizvodnju proizvoda koji sadrže teške i lake lance, ćelijska linija može biti transformisana sa dva vektora, prvog vektora koji kodira polipeptid lakog lanca i drugog vektora koji kodira polipeptid teškog lanca. Alternativno, može biti upotrebljen jedan vektor, vektor uključujući sekvence koje kodiraju polipeptide lakog lanca i teškog lanca.

[0158] Alternativno, polinukleotidna sekvenca koja kodira antitelo i polinukleotid koji kodira DsbC su umetnuti u jedan vektor. Poželjno, vektor obuhvata sekvence koje kodiraju polipeptide lakog i teškog lanca antitela.

[0159] Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje ekspresioni vektor koji sadrži rekombinantni polinukleotid kodirajući DsbC i antitelo ili antigen vezujući fragment od njih, posebno vezujući za CD154. Ekspresioni vektor je multi-cistronski vektor sadržavajući polinukleotidnu sekvencu koja kodira DsbC i polinukleotidnu sekvencu koja kodira antitelo.

[0160] Multicistronski vektor može biti proizveden pomoću povoljne metode kloniranja koja omogućava ponovljeno sekvencionalno kloniranje polinukleotidnih sekvenci u vektoru. Metoda koristi kompatibilne kohezivne krajeve para restrikcionih mesta, kao što su "AT" krajevi Ase l i Nde l restrikciona mesta. Polinukleotid koji sadrži kodirajuću sekvencu i ima kompatibilne kohezivne krajeve, kao što je Asel-Ndel fragment, može biti kloniran u restrikciono mesto u vektoru, kao što je Nde l. Umetanje polinukleotidne sekvence uništava 5 'restrikciono mesto, ali stvara novo 3' restrikciono mesto, kao što je Ndel, koje zatim može biti upotrebljeno da se umetne dalja polinukleotidna sekvenca koja sadrži kompatibilne kohezivne krajeve. Postupak može zatim biti ponovljen za umetanje daljih sekvenci. Svaka polinukleotidna sekvenca umetnuta u vektor sadrži ne-kodirajuću sekvencu 3 ' do stop kodona koji može sadržavati Ssp l mesto za skrining, sekvencu za vezivanje ribozoma tzv. ̎ Shine Dalgarno ̎, A bogatog razmaka i Ndel mesta kodirajućeg start kodona.

[0161] Na Slici 1. je prikazan dijagramski prikaz stvaranja vektora koji sadrži polinukleotidnu sekvencu koja kodira laki lanac antitela (LC), teški lanac antitela (HC), DsbC polinukleotidnu sekvencu i dalje polinukleotidnu sekvencu.

[0162] Ćelija prema predmetnom pronalasku poželjno sadrži ekspresioni vektor kao što je definisano iznad.

[0163] Dalje otkrivena ovde je ćelija, pri čemu ćelija takođe eksprimira jedan ili više daljih proteina kao što sledi:

• jedan ili više proteina sposobnih za olakšavanje savijanja proteina, kao što su FkpA, Skp, SurA, PPiA i PPiD; i/ili • jedan ili više proteina sposobnih za olakšavanje sekrecije proteina ili translokacije, kao što su SecY, SecE, SecG, SecYEG, SecA, SecB, FtsY i Lep; i/ili

• jedan ili više proteina sposobnih za olakšavanje formiranja disulfidnih veza, kao što su DsbA, DsbB, DsbD, DsbG;

jedan ili više daljih proteina mogu biti eksprimirani iz jednog ili više polinukleotida umetnutih u isti vektor kao što je polinukleotid koji kodira DsbC i/ili jedan ili više polinukleotida koji kodiraju antitelo ili antigen vezujući fragment od njih, specifično vezujući za CD154. Alternativno, jedan ili više polinukleotida mogu biti umetnuti u odvojene vektore.

[0164] Ekspresioni vektor može biti proizveden umetanjem jedne ili više ekspresionih kaseta kao što je definisano iznad u pogodan vektor. Alternativno, regulatorne ekspresione sekvence za usmeravanje ekspresije polinukleotidne sekvence mogu biti sadržane u ekspresionom vektoru i zbog toga samo regija kodiranja polinukleotida može biti potrebna da bi se kompletirao ekspresioni vektor.

[0165] Polinukleotid koji kodira DsbC i/ili polinukleotid koji kodira antitelo ili antigen vezujući fragment od njih, specifično vezujući za CD154, je pogodno umetnut u repliciran vektor, obično autonomno replicirajući ekspresioni vektor, za ekspresiju u ćeliji pod kontrolom pogodnog promotera za ćeliju. Mnogi vektori su poznati u tehnici za ovu svrhu i selekcija odgovarajućeg vektora može zavisiti od veličini nukleinske kiseline i konkreno tipa ćelije.

[0166] Primeri ekspresionih vektora koji mogu biti upotrebljeni da transformišu ćeliju domaćina sa polinukleotidom prema pronalasku uključuju:

• plazmid, kao što je pBR322 ili pACYC184, i/ili

• virusni vektor kao što je bakterijski fag

• transpozabilni genetički element kao što je transpozon

[0167] Takvi ekspresioni vektori obično obuhvataju plazmidno poreklo replikacije DNA, selektivni marker za antibiotike, promoter i transkripcioni terminator odvojen mestom za multikloniranje (ekspresiona kaseta) i DNA sekvencu koja kodira mesto vezanja ribozoma.

[0168] Promoteri upotrebljeni u predmetnom pronalasku mogu biti direktno povezani sa relevantnim polinukleotidom ili alternativno biti smešteni na odgovarajućoj poziciji, na primer u vektoru tako da kada je relevantni polipeptid umetnut, relevantni promoter može delovati na isti način. U jednom izvođenjui promoter se nalazi pre kodirajućeg dela polinukleotida na kojem deluje, na primer relevantan promoter pre svakog kodurajućeg dela polinukleotida. "Pre", kao što se ovde koristi, ima za cilj da podrazumeva da je promoter smešten na 5 prioritetnom kraju u odnosu na kodirajući polinukleotidni deo.

[0169] Promoteri mogu biti endogeni ili egzogeni za ćelije domaćina. Pogodni promoteri uključuju lac, tac, trp, phoA, lpp, Arab, tet i T 7.

[0170] Jedan ili više primenjenih promotera mogu biti inducibilni promoteri. U izvođenju gde polinukleotid koji kodira DsbC i polinukleotid koji kodira antitelo su umetnuti u jedan vektor, nukleotidne sekvence koje kodiraju DsbC i antitelo mogu biti pod kontrolom jednog promotera ili odvojenih promotera. U izvođenju pri čemu su nukleotidne sekvence koje kodiraju DsbC i antitelo pod kontrolom odvojenih promotera, promoter može biti nezavisno inducibilni promoter.

[0171] Promoteri za upotrebu u bakterijskim sistemima takođe uopšteno sadrže tzv.̎ Shine-Dalgamo ̎ (S.D.) sekvencu operabilno povezanu na DNA koja kodira polipeptid od interesa. Promoter može biti uklonjen iz DNA bakterijskog izvora restrikcionim enzimskim razlaganjem i umetnut u vektor koji sadrži željenu DNA.

[0172] Ekspresioni vektor poželjno takođe sadrži dicistronsku poruku za proizvodnju antitela ili antigen vezujućeg fragmenta od njih kao što je opisano u WO 03/048208 ili WO 2007/039714. Poželjno, uzvodni cistron sadrži DNA koja kodira za laki lanac antitela, i nizvodni cistron sadrži DNA koja kodira za odgovarajući teški lanac, i dicistronska intergenska sekvenca (IGS) poželjno sadrži sekvencu izabranu od lGS1 (SEK lD BR: 33), lGS2 (SEK lD BR: 34), lGS3 (SEK lD BR: 35) i lGS4 (SEK lD BR: 36).

[0173] Poželjno ekspresioni vektor sadrži tricstronsku poruku za proizvodnju lakog lanca i teškog lanca antitela ili antigen vezujućeg fragmenta od njih kao što je opisano iznad i poruku za proizvodnju rekombinantnog DsbC, poželjno sadržavajući his-tag.

[0174] Terminatori mogu biti endogeni ili egzogeni za ćelije domaćina. Pogodan terminator je rrnB.

[0175] Dalji pogodni transkripcioni regulatori uključujući promotere i terminatore i metode ciljanja proteina mogu se naći u Makrides et al. koji je ovde inkorporiran referencom u celosti (Makrides 512-38).

[0176] DsbC polinukleotid umetnut u ekspresioni vektor poželjno sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira DsbC signalnu sekvencu i DsbC kodirajuću sekvencu. DsbC protein takođe može biti usmeren na periplazmu pod genetskom fuzijom na druge signalne peptide, na primer kao one iz proteina: OmpA, MalB, PelB, PhoA, PhoS, LppA, DsbA. Vektor poželjno sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja omogućuje vektoru da replicira u jednoj ili više izabranih ćelija domaćina, poželjno da replicira nezavisno od hromozoma domaćina. Takve sekvence su dobro poznate za razne bakterije.

[0177] U jednom izvođenju DsbC i/ili protein od interesa sadrži histidin-tag na N-terminusu i/ili C-terminusu.

[0178] Molekul antitela može iti izlučen iz ćelije ili ciljan na periplazmu pogodnim signalnim sekvencama. Alternativno, molekuli antitijela mogu akumulirati unutar ćelijske citoplazme. Poželjno, molekul antitela je ciljan na periplazmu.

[0179] Polinukleotid koji kodira antitelo može biti izražen kao fuzija sa drugim polipeptidom, poželjno signalnom sekvencom ili drugim polipeptidom koji ima specifično mesto cepanja na N-terminusu zrelog polipeptida. Izabrana heterologna signalna sekvenca trebala bi biti ona koja je prepoznata i obrađena od strane ćelije domaćina. Za prokariotske ćelije domaćina koje ne prepoznaju i obrađuju nativnu ili eukariotsku polipeptidnu signalnu sekvencu, signalna sekvenca je supstituisana sa prokariotskom signalnom sekvencom. Pogodne signalne sekvence uključuju OmpA, PhoA, LamB, PelB, DsbA i DsbC. U jednom izvođenju gde ćelija sadrži polinukleotid koji kodira teški lanac antitela i polinukleotid koji kodira laki lanac antitela, svaki polinukleotid može sadržavati signalnu sekvencu, kao što je OmpA.

[0180] Konstrukcija pogodnih vektora koji sadrže jednu ili više gore navedenih komponenti se koristi standardnim tehnikama vezivanja. Izolovani plazmidi ili fragmenti DNA su cepani, prilagođavani i ponovo vezani u obliku koji je poželjan da se dobiju potrebni plazmidi. Opšte metode pomoću kojih vektori mogu biti konstruisani, metode transfekcije i metode kulture su dobro poznate stručnjacima sa ovog područja tehnike.

[0181] Standardne tehnike molekularne biologije mogu biti korišćene za pripremu DNA sekvenci koje kodiraju za antitelo. Željene sekvence DNA mogu biti sintetisane potpuno ili delimično koristeći tehnike sinteze oligonukleotida. Po potrebi se može koristiti usmerena mutageneza i tehnike polimerazne lančane reakcije (PCR).

[0182] Izvođenja predmetnog pronalaska opisana ovde sa referencom na polinukleotidu se primenjuju jednako na alternativnim izvođenjima pronalaska, na primer vektorima, ekspresionim kasetama i/ili ćelijama domaćina koje sadrže komponente koje se upotrebljavaju u onoj meri koliko god se relevantni aspekt može primeniti na isti.

[0183] Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje metod za proizvodnju antitela ili antigen vezujećeg fragmenta od njih, specifično vezujući na CD154, uključujući:

kultivisanje rekombinantne gram-negativne bakterijske ćelije kao što je iznad definisano u medijumu za kulturu pod uslovima koji su efikasni da eksprimiraju antitelo ili antigen vezujući fragment od njih, specifično vezujući na CD154 i rekombinantni polinukleotid koji kodira DsbC; i obnavljanje antitela ili antigen vezujećeg fragmenta od njih, specifično vezujući na CD154 iz periplazme rekombinantne gram-negativne bakterijske ćelije i/ili medijuma za kulturu.

[0184] Gram negativna bakterijska ćelija i antitelo, poželjno upotrebljeni u metodi predmetnog pronalaska, su detaljno opisani iznad.

[0185] Rekombinantni polinukleotid koji kodira DsbC i polinukleotid koji kodira antitelo ili antigen vezujući fragment od njih, specifično vezujući na CD154, može biti inkorporiran u ćeliju domaćina korišćenjem bilo kojih pogodnih sredstava poznatih u tehnici. Kao što je razmatrano iznad, tipično polinukleotid koji kodira DsbC i polinukleotid koji kodira antitelo su uključeni kao deo istih ili odvojenih ekspresionih vektora koji su transformisani u ćeliju.

[0186] Polinukleotid koji kodira DsbC i polinukleotid koji kodira antitelo ili antigen vezujući fragment od njih, specifično vezujući na CD154, može biti transformisan u ćeliju koristeći standardne tehnike, na primer primenom rubidijum hlorida, PEG-a ili elektroporacije.

[0187] Metod prema predmetnom pronalasku može takođe primeniti sistem selekcije da olakša selekciju stabilnih ćelija koje su uspešno transformisane sa polinukleotidom koji kodira protein od interesa. Sistem selekcije obično koristi kotransformaciju polinukleotida koji kodira selekcioni marker. U jednom izvođenju, svaki polinukleotid transformisan u ćeliju dalje sadrži polinukleotid koji kodira jedan ili više selektivnih markera. Prema tome, transformacija polinukleotida koji kodiraju DsbC i antitelo ili antigen vezujući fragment od njih, specifično vezujući na CD154 i jedan ili više polinukleotida koji kodiraju marker, javljaju se zajedno i selektivni sistem može biti upotrebljen da izabere one ćelije koje proizvode željene proteine.

[0188] Ćelije sposobne da eksprimiraju jedan ili više markera su sposobne da prežive/rastu/umnožavaju se pod određenim veštačko nametnutim uslovima, na primer dodavanjem toksina ili antibiotika, zbog svojstava koje daje polipeptid/gen ili polipeptidna komponenta selekcionog sistema inkorporirana u njih (npr. rezistencija na antibiotike). One ćelije koje ne mogu eksprimirati jedan ili više markera ne mogu da prežive/rastu/umnožavaju se u veštačko nametnutim uslovima. Veštački nametnuti uslovi mogu biti izabrani da budu više ili manje snažni, po potrebi.

[0189] Bilo koji pogodni selekcioni sistem može biti upotrebljen u predmetnom pronalasku. Tipično, selekcioni sistem može biti baziran na uključivanju u vektor jednog ili više gena koji obezbeđuje rezistenciju na poznati antibiotik, na primer tetraciklin, hloramfenikol, kanamicin ili gena za rezistenciju na ampicilin. Ćelije koje rastu u prisustvu relevantnog antibiotika mogu biti izabrane jer eksprimiraju i gen koji daje rezistenciju na antibiotik i željeni protein.

[0190] U predmetnom pronalasku može biti upotrebljen inducibilni ekspresionii sistem ili konstitutivni promoter za ekspresiju antitela i/ili DsbC. Pogodni inducibilni ekspresioni sistemi i konstitutivni promoteri su dobro poznati u tehnici.

[0191] U jednom izvođenju, pri čemu polinukleotid koji kodira DsbC i polinukleotid koji kodira antitelo su pod kontrolom istih ili odvojenih inducibilnih promotera, ekspresija polinukleotida (više polinukleotida ) koji kodiraju antitelo i rekombinantni polinukleotid koji kodira DsbC je indukovan dodavanjem induktora u medijumu za kulturu.

[0192] Bilo koji pogodni medijum može biti korišćen za kulturu transformisane ćelije. Medijum može biti prilagođen za specifični selekcioni sistem, na primer medijum može sadržavati antibiotik, da bi se omogućile samo one ćelije koje su uspešno transformisane da rastu u medijumu.

[0193] Ćelije dobijene iz medijuma mogu biti podvrgnute daljem skriningu i/ili prečišćavanju po potrebi. Metod može dalje sadržavati jedan ili više koraka za ekstrakciju i prečišćavanje proteina od interesa po potrebi.

[0194] Antitelo ili antigen vezujući fragment od njih može biti obnovljen i prečišćen iz soja, uključujući iz citoplazme, periplazme ili supernatanta. Pogodne metode uključuju frakcionisanje na imunoafinitetu ili kolonama jonske izmene; taloženje etanola; HPLC reverzne faze; hidrofobnu- interakcijsku hromatografiju; hromatografiju na silku; hromatografiju na smoli za razmenu jona kao što je tzv. ̎ S-SEPHAROSE i DEAE ̎; hromatofokusiranje; amonijum sulfatnu precipitaciju; i gel filtraciju.

[0195] Dalje otkriven ovde je metod koji dalje sadrži odvajanje antitela ili antigen vezujućeg fragmenta od njih iz DsbC.

[0196] Antitela ili antigen vezujući fragmenti od njih mogu biti pogodno izdvojeni iz medijuma za kulturu i/ili ekstrakta citoplazme i/ili ekstrakta periplazme uobičajenim postupcima prečišćavanja antitela kao što su, na primer, protein A-Sefaroza, hromatografija proteina G, hromatografija proteina L, tiofilina, smola u pomešanom modu, His-tag, FLAGTag, hidroksilapatitna hromatografija, elektroforeza gela, dijaliza, afinitetna hromatografija, amonijum sulfat, etanol ili PEG frakcijacija/precipitacija, membranska jonska izmena, adsorpciona hromatografija ekspandiranog sloja (EBA) ili simulirana hromatografija pokretnog sloja.

[0197] Metoda može takođe uključiti dalji korak merenja količine ekspresije proteina od interesa i selektujućih ćelija koje imaju visoke nivoe ekspresije proteina od interesa.

[0198] Jedan ili više koraka metode opisane ovde mogu biti izvedeni u kombinaciji u pogodnom spremniku kao što je bioreaktor.

[0199] Posle ekspresije, antitelo može dalje biti obrađeno, na primer konjugacijom na drugi entitet, kao što je efektorski molekul. Prema tome, metoda prema predmetnom pronalasku može sadržavati dalji korak pripajanja efektorskog molekula na antitelo.

[0200] Termin efektor molekula, kao što se ovde koristi, uključuje, na primer, antineoplastične agense, lekove, toksine (kao što su enzimski aktivni toksini bakterijskog ili biljnog porekla i fragmenti od njih, npr. ricin i njegovi fragmenti) biološki aktivne proteine, na primer enzime, druga antitela ili fragmente antitela, sintetičke ili prirodne polimere, nukleinske kiseline i fragmente od njih, npr. DNA, RNA i fragmente od njih, radionuklide, naročito radio-jodid, radioizotope, helirane metale, nanočestice i reporterske grupe kao što su fluorescentna jedinjenja ili jedinjenja koja mogu biti detektovana pomoću NMR ili ESR spektroskopije. Molekularni efektor može biti pripojen za antitelo ili njegov fragment bilo kojom pogodnom metodom, na primer, fragment antitela može biti modifikovan da bi se pripojio sa najmanje jednim efektorskim molekulom, kao što je opisano u WO 2005/003171 ili WO 2005/003170. WO 2005/003171 ili WO 2005/003170 takođe opisuju pogodne efektorske molekule.

[0201] Antitelo može imati makrocikl, za heliranje atoma teškog metala ili toksina, kao što je ricin, pripojen kovalentnom strukturom premošćivanja. Alternativno, postupci rekombinantne DNA tehnologije mogu biti upotrebljeni da proizvedu molekul antitela u kome je Fc fragment (CH2, CH3 i zglobne domene), CH2 i CH3 domena ili CH3 domen komletnog molekula imunoglobulina je zamenjen, ili je pripojen tu sa peptidnom vezom, funkcionalnim ne-imunoglobulinskim proteinom, kao što je enzim ili molekul toksina. U izvođenju pri čemu je antitelo modifikovani Fab fragment koji ima na C-terminalnom kraju svog teškog lanca jednu ili više aminokiselina da bi se omogućilo povezivsanje molekula efektora ili reportera, dodatne aminokiseline poželjno formiraju modifikovanu zglobnu regiju koja sadrži jedan ili dva cisteinska ostatka na koja mogu biti pripojeni molekul efektora ili reportera.

[0202] Poželjna efektorska grupa je molekul polimera, koji može biti pripojen na modifikovani Fab fragment da bi se povećalo njegovo vreme poluraspada in vivo.

[0203] Molekul polimera može uopšteno biti sintetski ili prirodni polimer, na primer opciono supstituisani pravi ili razgranati lanac polialkilena, polialkenilena ili polioksialkilenski polimer ili razgranati ili nerazgranati polisaharid, npr., homo- ili heteropolisaharid.

[0204] Određeni opcioni supstituenti koji mogu biti prisutni na iznad-pomenutim sintetičkim polimerima uključuju jednu ili više hidroksi, metil ili metoksi grupa. Određeni primeri sintetičkih polimera uključuju opciono supstituisani pravi ili razgranati lanac poli (etilenglikola), poli (propilenglikola) poli(vinilalkohola) ili derivata od njih, posebno opciono supstituisani poli(etilenglikol) kao što je metoksipoli(etilenglikol) ili derivati od njih. Određeni prirodni polimeri uključuju laktozu, amilozu, dekstran, glikogen ili derivate od njih. "Derivati", kao što se ovde koriste, su namenjeni da uključuju reaktivne derivate, na primer tiol-selektivne reaktivne grupe kao što su maleimidi. Reaktivna grupa može biti direktno povezana ili preko segmenta linkera za polimer. Biće jasno da će ostatak takve grupe u nekim slučajevima biti deo produkta kao povezujuća grupa između fragmenta antitela i polimera.

[0205] Veličina polimera može se menjati po želji, ali će uopšteno biti u prosečnoj molekularnoj težini od 500 Da do 50000 Da, poželjno od 5000 Da do 40000 Da, i poželjnije od 25000 Da do 40000 Da. Veličina polimera može biti naročito izabrana na osnovu namenjene upotrebe produkta. Tako, na primer, gde je produkt namenjen da napusti cirkulaciju i prodre u tkivo, na primer za upotrebu u lečenju inflamacije, može biti korisno upotrebiti polimer male molekularne težine, na primer sa molekularnom težinom od oko 5000 Da. Za aplikacije gde produkt ostaje u cirkulaciji, može biti korisno upotrebiti polimer veće molekularne težine, na primer koji ima molekularnu težinu u rasponu od 25000 Da do 40000 Da.

[0206] Naročito poželjni polimeri uključuju polialkilenski polimer, kao što je poli(etilenglikol) ili, posebno, metoksipoli(etilenglikol) ili derivat od njih, i posebno sa molekularnom težinom u rasponu od oko 25000 Da do oko 40000 Da.

[0207] Svaki molekul polimera pripojen za modifikovani fragment antitela može biti kovalentno vezan na atom sumpora cisteinskog ostatka smeštenog u fragmentu. Kovalentna veza će uopšteno biti disulfidna veza ili, naročito, sumpor-ugljenik veza.

[0208] Gde je poželjno, fragment antitela može imati jedan ili više efektorskih ili reporterskih molekula pripojenih na njega. Efektorski ili reporterski molekuli mogu biti pripojeni na fragment antitela kroz bilo koji dostupni amino kiselinski bočni lanac ili funkcionalnu grupu terminalne aminokiseline smeštene u fragmentu, na primer bilo koju slobodnu amino, imino, hidroksilnu ili karboksilnu grupu. Jedan ili više efektorskih ili reporterskih molekula mogu biti pripojeni na aminokiselinu na ili prema C-terminalnom kraju teškog lanca i/ili lakog lanca antitela.

[0209] Aktivirani polimer može biti upotrebljen kao polazni materijal u pripremi polimer-modifikovanih fragmenata antitela modifikovanih polimerom kao što je opisano iznad. Aktivirani polimer može biti bilo koji polimer koji sadrži tiol reaktivnu grupu kao što je α-halokarboksilna kiselina ili estar, npr. jodocetamid, imid, npr. maleimid, vinil sulfon ili disulfid. Takvi polazni materijali mogu biti dobijeni komercijalno (na primer od Shearwater Polymers Inc., Huntsville, AL, USA ) ili mogu biti pripremljeni iz komercijalno dostupnih polaznih materijala korišćenjem konvencionalnih hemijskih postupaka.

[0210] Gde je poželjno dobiti fragment antitela povezan na molekul efektora ili reportera, ovo može biti pripremljeno standardnim hemijskim ili postupcima rekombinantne DNA u kojima je fragment antitela povezan ili direktno ili putem pripajanja agensa efektorskog ili reporterskog molekula bilo pre ili posle reakcije sa aktiviranim polimerom prema potrebi. Određeni hemijski postupci uključuju, na primer, one opisane u WO 93/62331 i WO 92/22583. Alternativno, gde je efektorski ili reporterski molekul protein ili polipeptid, povezivanje se može postići primenom postupaka rekombinantne DNA, na primer kao što je opisano u WO 86/01533 i EP-A-0392745.

[0211] Poželjno, modifikovani Fab fragment obezbeđen postupkom prema predmetnom pronalasku je PEGiliran (tj. ima PEG (poli (etilenglikol) kovalentno pripojen) prema metodi opisanoj u EP-A-0948544. Poželjno antitelo je PEGilirani modifikovani Fab fragment, kao što je prikazano na Slici 2. Kao što je prikazano na Slici 2, modifikovani Fab fragment je pripojen na jedan od cisteinskih ostataka na C-terminalnom kraju modifikovane zglobne regije teškog lanca lizil-maleimidizvedene grupe pri čemu je svaka od dve amino grupe lizil ostatka kovalentno povezana na njemu metoksipoli(etilenglikol)ostatkom imajući molekularnu težinu od oko 20000 Da, tako da je ukupna prosečna molekularna težina ostataka metoksipoli(etilenglikola) oko 40000 Da, poželjnije lizil-maleimid-izvedena grupa je [1-[[[2-[[3-(2,5-diokso-1-pirolidinil)-1-oksopropil] amino]etil]amino]karbonil]-1,5-pentandiil]bis(iminokarbonil). Ostatak lizina je kovalentno vezan na maleimidnu grupu. Na svaku od aminskih grupa na ostatku lizina je pripojen metoksipoli (etilenglikol) polimer imajući molekularnu težinu od približno 20000 Da. Ukupna molekularna težina celog efektorskog molekula je zbog toga približno 40000 Da.

[0212] Prema tome, metod prema predmetnom pronalasku poželjno sadrži pripajanje na jedan od cisteinskih ostataka na C-terminalnom kraju teškog lanca lizil-maleimidne grupe, pri čemu je svaka amino grupa lizil ostatka kovalentno vezana na njega metoksipoli(etilenglikol)ostatkom imajući molekularnu težinu od oko 20000 Da.

[0213] U jednom izvođenju fizička svojstva kontaminirajućeg proteina domaćina je izmenjena dodatkom tag amino kiseline na C-terminusu ili na N-terminusu. U poželjnom izvođenju fizičko svojstvo koje je izmenjeno je izoelektrična tačka i aminokiselinski tag je poli-asparaginske kiseline tag pripojen na C-terminus. U jednom izvođenju proteini E. koli izmenjeni dodatkom pomenutog tag su dipeptidno vezujući protein (DppA), maltoza vezujući protein (MBP), tioredoksin i fosfat vezujući protein (PhoS/PstS). U jednom specifičnom izvođenju pl od E. koli fosfat vezujućeg proteina (PhoS/PstS) je smanjen od 7.2 do 5.1 dodatkom poli-asparaginske kiseline tag (poliD), sadržavajući 6 ostataka asparaginske kiseline na C-terminusu.

[0214] Takođe je poželjna modifikacija specifičnih ostataka kontaminirajućeg proteina E.koli da se menjaju njegova fizička svojstva, bilo samostalno ili u kombinaciji sa dodatkom N ili C terminalnih tag. Takve promene mogu uključiti umetanja ili brisanja da se promeni veličina proteina ili supstitucije aminokiseline da se promenu pl ili hidrofobnost. U jednom izvođenju, ovi ostaci se nalaze na površini proteina. U poželjnom izvođenju površinski ostaci PhoS proteina su izmenjeni da bi se smanjio pl proteina. Poželjno je da se izbegnu ostaci za koje je implicirano da su važni u vezivanju fosfata (US 5,304,472) u cilju da bi se održao funkcionalni PhoS protein.

PRIMERI

Ćelijske linije

[0215] Za sve eksperimente, E. koli ćelijska linija W3110 je korišćena kao roditeljska ćelijska linija divljeg- tipa.

[0216] Stvorene su ćelijske linije koje nose sledeće mutacije:

a. mutiranog Tsp gena;

b. mutiranog Tsp gena i noseće rekombinantne DsbC;

c. mutiranog Tsp gena i mutiranog spr gena;

d. mutiranog Tsp gena i mutiranog spr gena i noseće rekombinantne DsbC.

Primer 1: Generisanje ćelijske linije koja nosi mutirani Tsp gen MXE001 (ΔTsp)

Soj MXE001 je generisan kao što sledi:

[0217] Tsp kaseta je pomerena kao Sal l, Ne l restrikcioni fragmenti u slične restrikcione pKO3 plazmide. PKO3 plazmid koristi temperaturno senzitivnii mutant pSC101 porekla replikacije (RepA) zajedno sa markerom hloramfenikola da se prisil i izabere za hromozomske integracione događaje. sacB gen koji kodira za levanshararozu je letalan za E. koli gajenu na saharozi i zbog toga (zajedno sa hloramfenikol markerom i pSC101 poreklom) se koristi da se forsira i izabere za deintegraciju i događaje za plazmidno lečenje. Ova je metodologija prethodno opisana (Hamilton et al. 4617-22;Blomfield et al. 1447-57). pKO3 sistem uklanja sve selektivne markere iz genoma domaćina, osim umetnutog gena.

Izrađeni su sledeći plazmidi:

[0218] pMXE 191 sadržavajući nokaut mutirani Tsp gen kao što je prikazano u SEK ID BR: 28 koji sadrži EcoR l i Ase l restrikcione markere.

[0219] Plazmid je zatim transformisan u elektro-kompetentne kompetentne E. koli W3110 ćelije pripremljene korišćenjem metode nađene u Miller i Nickoloff, koji je ovde uključen referencom u celini (Miller and Nickoloff 105-13).

Dan 1: 40 µl ćelija E.koli su pomešani sa (10 pg) 1 µl pKO3 DNA u rashlađenoj BioRad 0.2 cm elektroporacijskoj kiveti pre elektroporacije na 2500V, 25 mF i 200Ω. 1000 µl 2xPY je odmah dodato, ćelije su oporavljene mućkanjem pri 250 rpm u inkubatoru na 30°C tokom 1 sata. Ćelije su serijski 1/10 razblažene u 2xPY pre nego što su alikvoti od 100 µl stavljeni na 2xPY agar ploče sadržavajući hloramfenikol pri 20 µg/ml prethodno zagejan na 30°C i 43°C. Ploče su inkubirane preko noći na 30°C i 43°C.

Dan 2: Broj kolonija gajenih na 30°C je dalo procenu efikasnosti elektroporacije dok kolonije koje prežive rast na 43°C predstavljaju potencijalne integracone događaje. Pojedine kolonije iz ploče od 43°C su sakupljene i ponovo suspenovane u 10 ml 2xPY. 100 µl ovoga je stavljeno na 2xPY agar ploče koje sadrže 5% (w/v) saharozu prethodno zagejanu na 30°C da se generišu pojedinačne kolonije. Ploče su inkubirane preko noći na 30°C.

Dan 3: Kolonije ovde predstavljaju potencijalne simultane de-integracije i događaje plasmidnog lečenja. Ako su se deintegracija i događaji stvrdnjavanja dogodili rano u rastu, tada će najveći deo kolonije biti klonski. Pojedine kolonije su sakupljene i ponovo smeštene na 2xPY agaru koji sadrži i horamfenikol na 20 µg/ml ili 5% (w/v) saharoze. Ploče su inkubirane preko noći na 30°C.

Dan 4: Kolonije koje rastu na saharozi i umiru na hloramfenikolu predstavljaju potencijalne hromozomske zamene i događaje plazmidnog stvrdnjavanja. Ovi su pokupljeni i pretraženi pomoću PCR sa mutacijom specifičnog oligonukleotida. Kolonije koje su generisale pozitivnu PCR traku pravilne veličine bile su izbačene da bi se proizvele pojedinačne kolonije na 2xPY agaru koji sadrži 5% (w/v) saharoze, i ploče su inkubirane preko noći na 30°C.

Dan 5: Pojedinačne kolonije PCR pozitivne, hloramfenikol-osetljive i saharozu rezistentne E. koli su korišćene za stvaranje zaliha glicerola, hemijski kompetentnih ćelija i deluju kao PCR šabloni za PCR reakciju sa 5 ' i 3' bočnim oligonukleotidnim prajmerima da se generiše PCR produktza direktno sekvenciranje DNA korišćenjem Taq polimeraze.

[0220] Ćelijski soj MXE001 je testiran da bi se potvrdila uspešna modifikacija genomske DNA koja nosi mutirani Tsp gen putem PCR amplifikacije regije Tsp gena sadržavajući ne-prirodno javljanje Ase l restrikcionog mesta, (SEK ID BR: 28), korišćenjem oligonukleotidnih prajmera. Pojačane regije DNA su zatim analizirane pomoću gel elektroforeze pre i posle inkubacije sa Ase l restrikcionim enzimom da bi se potvrdilo prisustvot ne-prirodnog javljanja Ase l restrikcionog mesta u mutiranim genima. Ova metoda je izvedena kao što sledi:

Sledeći oligonukleotidi su korišćeni da pojačaju, korišćenjem PCR, genomsku DNA iz pripremljenih lizata E. koli iz MXE001 i W3110:

6284 Tsp 3’ 5’-GCATCATAATTTTCTTTTTACCTC-3’ (SEK ID BR: 47)

6283 Tsp 5’ 5’-GGGAAATGAACCTGAGCAAAACGC-3’ (SEK ID BR: 48)

[0221] Lizati su pripremljeni zagrevanjem jedne kolonije ćelija tokom 10 minuta na 95°C u 20 µl 1 x PCR pufera. Smeša je ostavljena da se ohladi do sobne temperature, zatim centrifugirana na 13.200 rpm tokom 10 minuta. Supernatant je uklonjen i označen kao 'ćelijski lizat'.

[0222] Svaki soj je pojačan korišćenjem Tsp oligonukleotidnog para.

[0223] DNA je pojačana korišćenjem standardnog postupka PCR.

5 mµl Pufer x10 (Roche)

1 µl dNTP miks (Roche, 10mM miks)

1.5 µl 5’ oligo (5 pmol)

1.5 µl 3’ oligo (5 pmol)

2 µl Ćelijski lizat

0.5 µl Taq DNA polimeraza (Roche 5 U/µl)

38.5 µl H2O

PCR ciklus

94°C 1 minuta

94°C 1 minuta

55°C 1 minuta (ponovljeno tokom 30 ciklusa)

72°C 1 minuta

72°C 10 minuta

[0224] Nakon završetka reakcije 25 µl je uklonjeno u novu mikrofugovu cevčicu za digestiju sa Ase l. U 25 µl PCR reakcije, 19 µl H2O, 5 µl pufera 3 (New England Biolabs®), 1 µl Ase l( New England Biolabs®), je dodato, mešano i inkubirano na 37°C tokom 2 sata.

[0225] U preostalu PCR reakciju dodato je 5 mµl pufera za punjenje (x6) i 20 mµl je napunjeno na 08% TAE 200 ml agaroznog gela (Invitrogen®) plus etidijum bromid (5 mµl od 10 mg/ml zaliha) i radilo na 100V tokom 1 sata. 10 µl markera veličine (Perfect DNA marker 0.1-12Kb, Novagen®) je napunjeno u konačnu traku.

[0226] Nakon završetka digestije Ase l, 10 µl pufera za punjenje (x6) je dodato i 20 µl je napunjeno na 0.8% TAE agarozni gel (Invitrogen plus etidium bromid (5 µl od 10 mg / ml zalihe) i radilo na 100 V tokom 1 sata. 10 µl markera veličine (Perfect DNA marker 0.1-12 Kb, Novagen®) je napunjeno u konačnu traku. Oba gela su vizualizovana korišćenjem UV transluminanaora.

[0227] Pojačani genomski fragment pokazao je ispravnu veličinu trake od 2.8 kb za Tsp. Nakon digestije-varenja sa Ase l ovo je potvrdilo prisustvo uvedenih Ase l mesta u Tsp deficijentnom soju MXE001, ali ne u kontrolnom W3110.

[0228] MXE001: genomska DNA pojačana korišćenjem Tsp seta prajmera i dobijena DNA je digestirana sa Ase l da se proizvede 2.2 i 0.6 Kbps trake.

[0229] W3110 PCR amplifikovana DNA nije digestirana pomoću Ase l restrikcionog enzima.

Primer 2 Generisanje ćelijskih linija koje nose mutirani spr gen i ćelijskih linija koje nose mutirani Tsp gen i mutirani spr gen

[0230] spr mutacije su generirane i izabrane za korišćenje analize komplementacije.

[0231] spr gen (SEK ID BR: 23) je mutiran korišćenjem tzv.“ Clontech® random mutagenisis diversity PCR kit “ koji je uveo 1 do 2 mutacije po 1000 bp. Mutirana spr PCR DNA je klonirana u inducibilni ekspresioni vektor [pTTO CDP870] koji eksprimira CDP870 Fab' (kao što je opisano u WO 01/94585) zajedno sa spr mutantom. Ova ligacija je zatim elektrotransformisana u soj E.coli koji sadrži varijantu brisanja Tsp (ΔTsp) (dizajniran MXE001) pripremljen korišćenjem metode nađene u Miller et al. (Miller and Nickoloff 105-13). Sledeći protokol je korišćen, 40 µl elektrokompetentnog MXE001, 2.5 µl ligacije (100 pg DNA) je dodato u elektroporacijsku kivetu od 0.2 cm, elektrotransformacija je izvedena korišćenjem tzv.“ BioRad® Genepulser Xcell®“ sa sledećim uslovima, 2500 V , 25 µF i 200Ω. Pole elektro-transformacije dodat je 1 ml S.OC. medijuma (Invitrogen® katalog: 18045-088) (prethodno zagrejan do 37°C) i ćelije su ostavljene da se obnove na 37°C tokom 1 sata sa blagom mešanjem.

[0232] -Ćelje su nanesene na hipotonični agar (ekstrakt kvasca od 5 g/L, 2.5 g/L Triptona, 15 g /L Agara (sve Difco®)] i inkubirane na 40°C. Ćelije koje su formirale kolonije su ponovo nanesene u HLB na 43°C da bi se potvrdila obnova sposobnosti rasta pod niskim osmotskim uslovima pri visokoj temperaturi do soja MXE001. Plazmid DNA je pripremljen od izabranih klonova i sekvencioniran da identifikuje mutacije spr.

[0233] Koristeći ovu metodu izolovano je osam pojeinačnih, jedna dvostruka mutacija i dve višestruke mutacije u spr proteinu koje su dopunile fenotip ΔTsp kao što sledi:

1. V98E

2. D133A

3. V135D

4. V135G

5. G147C

6. S95F i Y115F

7. I70T

8. N31T, Q73R, R100G, G140C

9. R62C, Q99P, R144C

10. L108S

11. L136P

[0234] Inividualne mutacije 1 do 5 identifikovane iznad i tri katalitičke trijadne mutacije spr (C94A, H145A, H157A) i W174R su korišćene da generišu nove sojeve upotrebom i soja W3110 E. koli divljeg-tipa (genotip: F-LAM-IN ( rrnD-rrnE) 1 rph1 (ATCC kataloški broj 27325) da stvore spr mutirane sojeve ili MXE001 soj iz Primera 1 da naprave kombinovane ΔTsp/mutantne sojeve spr.

[0235] Sledeći mutantni sojevi E. koli ćelije su generisani korišćenjem vektorskog sistema zamene gena korišćenjem pKO3 homologne rekombinacije/zamene plazmida (Link et al., supra), kao što je opisano u Primeru 1 za generisanje MXE001.

Tabela 1

[0236] Mutantne spr-integracione kasete su premeštene kao Sal l, Ne l restrikcioni fragmenti u slično restriktivnim pKO3 plazmidima.

[0237] Za sve eksperimente ćelijska linija E.koli W3110 je korišćena kao ćelijska linija-divljeg tipa i E.koli ćelijska linija W3110 ΔTsp, spr C94A (MX016).

Primer 3 – Generisanje plazmida za ekspresiju Fabovog anti-CD154 i DsbC

[0238] Konstruisan je plazmid koji sadrži sekvence teškog i lakog lanaca anti-CD154 Fab (SEK ID BRs: 13 i 11 respektivno) i sekvencu koja kodira DsbC (SEK ID BR: 27).

[0239] Plazmid pMXE351 (pTTOD_DsbC), ekspresioni vektor za anti-CD154 Fab i DsbC (periplazmatski polipeptid) je konstruisan korišćenjem konvencionalnih metodologija restrikcije kloniranja. Plazmid pMXE351 je sadržavao sledeće karakteristike; jak tac promoter i lac operator sekvencu. Kao što je prikazano na Slici 1, plazmid je sadržavao jedinstveno EcoRl restrikciono mesto posle kodiranja regije Fabovog teškog lanca, praćeno ne-kodirajućom sekvencom, i zatim jedinstveno Ndel restrikciono mesto. DsbC gen je PCR kloniran korišćenjem W3110 sirove hromozomske DNA kao šablona. EcoRl mesto je uklonjeno iz divljeg tipa DsbC sekvence pomoću produžetka preklapanja PCR, tako da je PCR produkt kodiran za 5' EcoRl mesto praćeno jakim mestom vezivanja ribozoma, praćeno nativnim početnim kodonom, signalnom sekvencom i zrelom sekvencom DsbC, završavajući u C-terminalnom His tag i konačno ne-kodirajućem Ndel mestu. EcoRl-Ndel PCR fragment je bio ograničen i povezan u ekspresioni vektor tako da su sva tri polipeptida: Fabov laki lanac, Fabov teški lanac i DsbC kodirani na jednoj policistironskoj mRNA.

[0240] Fab laki lanac, geni teškog lanca i DsbC gen su transkribovani kao jedna policistronska poruka. DNA koja kodira signalni peptid iz E. koli OmpA proteina je fuzionisana na 5' kraju genskih sekvenci oba lakog i teškog lanaca, koji su usmeravali translokaciju polipeptida na periplazmu E. koli. Transkripcija je prekinuta upotrebom dvojnog transkripcijskog terminatora rrnB t1t2. laclq gen je kodirao konstitutivno izraženi Lac l represorski protein. Ovo je potisnuta transkripcija iz tac promotera dok de-represija nije indukovana prisustvom alolaktoze ili lPTG. Poreklo upotrebljene replikacije je bilo p15A, što je zadržalo mali broj kopija. Plazmid je sadržavao tetraciklinski rezistentan gen za selekciju antibiotika.

Primer 4 - Ekspresija Fabovog anti-CD154 i DsbC u E. koli W3110 i MXE016 ( E. koli W3110 ΔTsp, spr C94A)

Ekspresija Fabovog anti-CD154 DsbC u E. koli W3110 Δ Tsp, spr C94A

[0241] E.koli W3110 ΔTsp, spr C94A ćelijskii soj (MXE016) je transformisan sa plazmidom pMXE351 generisanim u Primeru 3. Transformacija sojeva je izvedena korišćenjem metode nađene u Chung C.T et al. (Chung, Niemela, and Miller 2172-75).

Ekspresija Fabovog anti-CD154 E. koli W3110

[0242] Ćelijski soj E. koli W3110 je transformisan sa plazmidom pTTOD, ekspresionim vektorom za Fabov anti-CD154, koji je konstruisan pomoću konvencionalnih metodologija restrikcije kloniranja. Plazmid pTTOD je sadržavao sledeće karakteristike; jak tac promoter i lac operator sekvencu. Fab geni lakog i teškog lanca su traskribovani kao jedna dicistronska poruka. DNA koja kodira signalni peptid iz E. koli OmpA proteina je bila je fuzionisana na 5' kraju genskih sekvenci oba lakog i teškog lanca, koji su usmeravali translokaciju polipeptida na periplazmu E. koli. Transkripcija je prekinuta upotrebom dvojnog transkripcijskog terminatora rrnB t1t2. laclq gen je kodirao konstitutivno izraženi Lac l represorski protein. Ovo je potisnuta transkripcija iz tac promotora dok de-represija nije indukovana prisustvom alolaktoze ili lPTG. Poreklo upotrebljene replikacije je bilo p15A, što je zadržalo mali broj kopija. Plazmid je sadržavao tetraciklinski rezistentan gen za selekciju antibiotika. Transformacija sojeva je izvedena korišćenjem metode nađene u Chung C.T et al. (Chung, Niemela, and Miller 2172-75).

Primer 5 - Rast mutiranih sojeva E. koli i ekspresija Fabovog anti-CD154 Fab 'u mutiranim sojevima E. koli korišćenjem fermentacija visoke gustoće

[0243] Sojevi proizvedeni u Primeru 4 su ispitani u eksperimentima fermentacije upoređujući rast i ekspresiju anti-CD154 Fab ':

Koraci rasta medijuma, inokulacije i fermentacije. Postupak fermentacije je iniciran pripremanjem inokuluma iz bočice banke ćelije i pojačavanjem kroz nekoliko faza prethodne kulture (laboratorijske boce i reaktora) pre pohranjivanja proizvodnog fermentera. U proizvodnom fermenteru, ćelije su gajene u definisanom medijumu do velike gustoće u tzv. batch ̎ i ̎ fedbatch ̎ načinu punjenja. Kad je postignuta željena gustoća ćelije, Fabova ekspresija je indukovana dodatkom IPTG. Fabova ekspresija je usmerena na periplazmatski prostor E. koli, gde Fab' akumulira kroz tok faze indukcije. U fazi indukcije primenjuje se izvor hrane ugljenika za kontrolu ekspresije i ćelijskog rasta. Temperatura, rastvoreni kiseonik (pO2) i pH su kontrolisani da bi se održala kultura u optimalnim uslovima kulture.

[0244] Merenje koncentracije biomase i brzine rasta. Koncentracija biomase je određena je merenjem optičke gustoće kultura na 600 nm.

[0245] Periplazmatska ekstrakcija. Ćelije su sakupljene iz uzoraka kulture centrifugiranjem. Supernatantna frakcija je zadržana (na -20°C) za dalju analizu. Frakcija ćelijskog peleta je resuspendovana do originalne zapremine kulture u ekstrakcionom puferu (100 mM Tris-HCl, 10 mM EDTA, pH 7.4). Nakon inkubacije na 60°C tokom približno 10 do 16 sati, ekstrakt je razbistren centrifugiranjem i frakcija supernatanta je upotrebljena sveža ili zadržana (na -20°C) za analizu.

[0246] Fabova kvantifikacija. Fabove koncentracije u periplasmatskim ekstraktima i kulturi supernatanta su određene upotrebom Protein G HPLC. HiTrap® Protein-G HP kolona od 1 ml (GE-Healthcare® ili ekvivalent) je napunjena sa analitom (otprilike neutralna pH, 30°C, filtriran 0.2 µm) pri 2 ml/min, kolona je isprana sa 20 mM fosfatom, 50 mM NaCl pH 7.4, i zatim Fabov eluiran upotrebom injekcije 50 mM Glicina/HCl pH 2.7. Eluirano Fabov je meren sa A280 na Agilent® 1100 ili 1200 HPLC sistemu i kvantifikovan referencom prema standardnoj krivi prečišćenog Fabovog proteina poznate koncentracije.

Primer 6 – Nivo fragmenata lakog lanca u ekstrakcijama fermentacije mutiranih sojeva E. koli

[0247] Fermentacije prikazane u Primeru 2 su ispitane na nivou fragmenta lakog lanca anti-CD 154 Fab ' u periplazmatskim ekstrakcijama.

[0248] Kvantifikacija fragmenta lakog lanca. Kvantitativna procena Fabovog nivoa i Fabovih proteolitičkih fragmenata je postignuta sa visokom temperaturom HPLC reverzne faze. Separacija je izvedena na koloni reverzne faze Poroshell® 300SB-C8 (Agilent Technologies®, Product No. 660750-906)) na temperaturi od 80°C. Ravnotežni rastvarač je HPLC voda, 0.1% (v/v) TFA, a rastvarač za ispiranje je 80:20 (v/v) 1-propanol: acetonitril, 0.03% (v/v) TFA. Separacija je izvedena pri brzini protoka od 2.0 mL/min, pomoću linearnog gradijenta od 16-38% rastvarača B u 4.4 min. Detekcija je bila UV apsorbancijom pri 214 nm. Podaci su obrađeni ručnom integracijom, a količina Fab proteolitičkih fragmenata izražena kao % površine maksimuma u odnosu na netaknuti Fab maksimum.

[0249] Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje terapijsku ili dijagnostičku kompoziciju koja sadrži antitelo proizvedeno metodom predmetnog pronalaska u kombinaciji sa farmaceutski prihvatljivim ekscipijentom, razblaživačem ili nosačem.

[0250] Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje postupak pripreme terapijske ili dijagnostičke kompozicije koji obuhvata mešanje antitela proizvedenog metodom predmetnog pronalaska zajedno sa farmaceutski prihvatljivim ekscipijentom, razblaživačem ili nosačem.

Lista Referenci

[0251]

Aramini, J. M., et al. "Solution NMR structure of the NlpC/P60 domain of lipoprotein Spr from Escherichia coli: structural evidence for a novel cysteine peptidase catalytic triad." Biochemistry. 47.37 (2008): 9715-17.

Bachmann, B. J. "Pedigrees of some mutant strains of Escherichia coli K-12." Bacteriol.Rev. 36.4 (1972): 525-57.

Backlund, E., et al. "Fedbatch design for periplasmic product retention in Escherichia coli." J.Biotechnol. 135.4

(2008): 358-65.

Blomfield, I. C., et al. "Allelic exchange in Escherichia coli using the Bacillus subtilis sacB gene and a temperaturesensitive pSC101 replicon." Mol.Microbiol. 5.6 (1991): 1447-57.

Chung, C. T., S. L. Niemela, and R. H. Miller. "One-step preparation of competent Escherichia coli: transformation and storage of bacterial cells in the same solution." Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 86.7 (1989): 2172-75.

Hamilton, C. M., et al. "New method for generating deletions and gene replacements in Escherichia coli." J.Bacteriol.

171.9 (1989): 4617-22.

Hara, H., et al. "Overproduction of penicillin-binding protein 7 suppresses thermosensitive growth defect at low osmolarity due to an spr mutation of Escherichia coli." Microb.Drug Resist. 2.1 (1996): 63-72.

Hara, H., et al. "Cloning, mapping, and characterization of the Escherichia coli prc gene, which is involved in Cterminal processing of penicillin-binding protein 3." J.Bacteriol. 173.15 (1991): 4799-813.

Holliger, P. and P. J. Hudson. "Engineered antibody fragments and the rise of single domains." Nat Biotechnol 23.9 (2005): 1126-36.

Humphreys, D. P., et al. "Formation of dimeric Fabs in Escherichia coli: effect of hinge size and isotype, presence of interchain disulphide bond, Fab’ expression levels, tail piece sequences and growth conditions." J.Immunol.Methods. 209.2 (1997): 193-202.

Keiler, K. C. and R. T. Sauer. "Identification of active site residues of the Tsp protease." J.Biol.Chem. 270.48 (1995):

28864-68.

Link, A. J., D. Phillips, and G. M. Church. "Methods for generating precise deletions and insertions in the genome of wild-type Escherichia coli: application to open reading frame characterization." J.Bacteriol. 179.20 (1997): 6228-37. Makrides, S. C. "Strategies for achieving high-level expression of genes in Escherichia coli." Microbiol.Rev. 60.3 (1996): 512-38.

Miller, E. M. and J. A. Nickoloff. "Escherichia coli electrotransformation." Methods Mol.Biol. 47:105-13. (1995):

105-13.

Missiakas, D., C. Georgopoulos, and S. Raina. "The Escherichia coli dsbC (xprA) gene encodes a periplasmic

protein involved in disulfide bond formation." EMBO J. 13.8 (1994): 2013-20.

Nagasawa, H., et al. "Determination of the cleavage site involved in C-terminal processing of penicillin-binding

protein 3 of Escherichia coli." J.Bacteriol. 171.11 (1989): 5890-93.

Shevchik, V. E., G. Condemine, and J. Robert-Baudouy. "Characterization of DsbC, a periplasmic protein of Erwinia chrysanthemi and Escherichia coli with disulfide isomerase activity." EMBO J. 13.8 (1994): 2007-12.

Silber, K. R., K. C. Keiler, and R. T. Sauer. "Tsp: a tail-specific protease that selectively degrades proteins with nonpolar C termini." Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 89.1 (1992): 295-99.

Silber, K. R. and R. T. Sauer. "Deletion of the prc (tsp) gene provides evidence for additional tail-specific proteolytic activity in Escherichia coli K-12." Mol.Gen.Genet. 242.2 (1994): 237-40.

LISTA SEKVENCI

[0252]

Claims (15)

Patentni zahtevi

1. Rekombinantna gram-negativna bakterijska ćelija koja uključuje:

a) ekspresioni vektor uključujući rekombinantni polinukleotid koji kodira DsbC; i

b) jedan ili više polinukleotida koji kodiraju antitelo ili antigen vezujući fragment od njih, posebno vezujući za CD154;

c) mutirani Tsp gen koji kodira Tsp protein imajući 50% ili manje aktivnost proteaze divljeg-tipa ne-mutiranog Tsp proteina kao što je prikazano u SEK ID BR: 26 i;

d) mutirani spr gen koji kodira spr protein čija je sekvenca divljeg-tipa prikazana u SEK ID BR: 24 uključujući mutaciju koja utiče na aminokiselinu C94; i

pri čemu je pomenuta gram-negativna bakterijska ćelija izabrana od sojeva E. koli K12 i W3110, i pri čemu je bakterijska ćelija izogena za pomenute sojeve, osim za rekombinantni polinukleotid koji kodira DsbC, jedan ili više polinukleotida koji kodiraju antitelo ili antigen vezujući fragment od njih, posebno se vezujući za CD154 i mutirani Tsp gen i mutirani spr gen.

2. Gram-negativna bakterijska ćelija prema patentnom zahtevu 1, pri čemu DsbC uključuje histidin–tag na N-terminusu ili C-terminusu.

3. Gram-negativna bakterijska ćelija prema patentnom zahtevu 1 ili 2, pri čemu ekspresioni vektor uključuje polinukleotid koji ima sekvencu datu u SEK ID BR: 45 ili SEK ID BR: 51.

4. Gram-negativna bakterijska ćelija prema bilo kojem od patentnih zahteva 1 do 3, pri čemu antitelo ili antigen vezujući fragment od njih uključuje varijabilni domen teškog lanca, uključujući tri CDRs imajući sekvencu datu u SEK ID BR: 1 za CDRH1, SEK ID BR: 2, za CDRH2 i SEK ID BR: 3 za CDRH3 i varijabilni domen lakog lanca uključujući tri CDR-a imajući sekvencu datu u SEK ID BR: 4 za CDRL1, SEK ID BR: 5 za CDRL2 i SEK ID BR: 6 za CDRL3.

5. Gram-negativna bakterijska ćelija prema patentnom zahtevu 4, pri čemu jedan ili više polinukleotida kodiraju antitelo koje sadrži sekvencu varijabilne regije lakog lanca datu u SEK ID BR: 8 i varijabilnu regiju teškog lanca datu u SEK ID BR: 10.

6. Gram-negativna bakterijska ćelija prema bilo kojem od patentnih zahteva 1 do 5, pri čemu je antitelo Fab ili Fabov fragment.

7. Gram-negativna bakterijska ćelija prema patentnom zahtevu 6, pri čemu Fab ili Fabov fragment sadrži laki lanac imajući sekvencu datu u SEK ID BR: 12 i teški lanac, imajući sekvencu datu u SEK ID BR: 14 ili 16.

8. Gram-negativna bakterijska ćelija prema bilo kojem od patentnih zahteva 1 do 7, pri čemu gram-negativna bakterijska ćelija sadrži prvi ekspresioni vektor uključujući rekombinantni polinukleotid koji kodira DsbC i drugi ekspresioni vektor uključujući jedan ili više polinukleotida koji kodiraju antitelo ili antigen vezujući fragment od njih, posebno vezujući CD154.

9. Gram-negativna bakterijska ćelija prema bilo kojem od patentnih zahteva 1 do 7, pri čemu ekspresioni vektor, uključujući rekombinantni polinukleotid koji kodira DsbC, dodatno sadrži jedan ili više polinukleotida koji kodiraju antitelo ili antigen vezujući fragment od njih posebno vezujući CD154.

10. Gram-negativna bakterijska ćelija prema bilo kojem od prethodnih patentnih zahteva, pri čemu mutacija u spr genu kodirajući spr protein, rezultira u promeni aminokiselinskog cisteina u alanin na poziciji 94 (C94A).

11. Gram-negativna bakterijska ćelija prema bilo kojem od patentnih zahteva 1 do 10, koja sadrži ekspresioni vektor uključujući rekombinantni polinukleotid koji kodira DsbC i dicistronsku poruku za proizvodnju antitela ili antigen vezujućeg fragmenta od njih, posebno vezujući CD154, u kojem uzvodni cistron sadrži DNA kodirajući laki lanac antitela i nizvodni cistron sadrži DNA kodirajući odgovarajući teški lanac, naznačen time da dicistronska poruka sadrži sekvencu izabranu od IGS1 (SEK ID BR: 33), IGS2 (SEK ID BR:34), IGS3 (SEK ID BR: 35) i IGS4 (SEK ID BR: 36).

12. Metod za proizvodnju antitela ili antigen vezujućeg fragmenta od njih posebno vezujući za CD154, uključujući: a) kultivisanje rekombinantne gram-negativne bakterijske ćelije kao što je definisano u bilo kojem od patentnih zahteva 1 do 11 u medijumu kulture pod uslovima efikasnim da eksprimiraju antitelo ili antigen vezujući fragment od njih, posebno se vezujući za CD154 i rekombinantnog polinukleotida koji kodira DsbC; i b) obnavljanje antitela ili antigen vezujućeg fragmenta od njih, specifično se vezujući za CD154 iz periplazme rekombinantne gram-negativne bakterijske ćelije i/ili medijuma kulture.

13. Metod prema patentnom zahtevu 12, pri čemu metod dalje obuhvata korak spajanja efektorskog molekula na aminokiselinu na ili prema C-terminalnom kraju teškog lanca i/ili lakog lanca antitela.

14. Metod prema patentnom zahtevu 13, pri čemu efektorski molekul sadrži poli (etilenglikol) ili metoksipoli (etilenglikol).

15. Metod prema patentnom zahtevu 14, pri čemu metod obuhvata vezivanje na jedan od cisteinskih ostataka na C-terminalnom kraju teškog lanca lizil-maleimidne grupe, pri čemu svaka amino grupa lizil ostatka ima kovalentno povezan sa njim metoksipoli (etilenglikol) ostatak imajući molekularnu težinu od oko 20,000 Da.