RS56905B1 - Nova upotreba n,n-bis-2-merkaptoetil izoftalamida - Google Patents

Description

Opis

Oblast pronalaska

[0001] Ovaj pronalazak se odnosi na novu upotrebu poznatog jedinjenja helatora teškog metala.

Prethodno stanje i prethodno stanje tehnike

[0002] Hronična opstruktivna bolest pluda (COPD) je opstruktivna bolest pluda koja se karakteriše hronično malim prolaskom vazduha, kratkim dahom, kašljem, i proizvodnjom sputuma.

[0003] Procena je da COPD širom sveta pogađa blizu 600,000,000 individua. Ogromna vedina pacijenata koji imaju COPD su konzumenti cigareta ili bivši konzumenti cigareta.

[0004] Poznato je da COPD ima mnoge poznate uzroke, među kojima je najznačajniji konzumiranje cigareta. Drugi uzročnici uključuju zagađenje vazduha, posebno sagorevanjem goriva (npr. dim koji nastaje sagorevanjem drveta). Takođe se veruje da je u poremedaj uključena i genetička komponenta.

[0005] Razume se da je COPD prouzrokovan dugotrajnim izlaganjem ovim iritantima, pri čemu u pludima nastaje inflamatorni odgovor. Ovo dovodi do konstrukcije bronhija i narušavanja strukture tkiva pluda (emfizem).

[0006] Iako se smatra da je COPD bolest koja može lako da se spreči (na primer smanjenjem izlaganja patogenima koji je prouzrokuju), još uvek predstavlja tredi vodedi uzrok smrtnosti u svetu.

[0007] Lečenje bolesnika predstavlja značajan izazov. Trenutno zastupljeni tretmani uključuju inhaliranje bronhodilatatora i kortikosterosteroida. Međutim, smanjenje protoka vazduha kod COPD pacijenata generalno ne poboljšava značajno davanje trenutno dostupnih lekova, što znači da, je često, neophodno koristiti drastičnije mere, uključujudi terapiju kiseonikom čak i transplantaciju pluda. Pogoršanje simptoma često zahteva hospitalizaciju.

[0008] Zbog nedostatka efikasnih tretmana, ekonomsko opteredenje COPD-om je ogromno, procenjeno $2,1 trilliona u 2010. Soci-ekonomski trošak COPD-a de verovatno povedati dugovečnost u razvijenim i u svetu koji se razvija. U EU, direktan trošak lečenja 2 milona pacijenata koji su najteže pogođeni je oko €30Bn godišnje (€15.000 godišnje po pacijentu). Direktni troškovi lečenja drugih 20 miliona pogođenih je oko €10Bn (€500 godišnje po pacijentu). Ukupan trošak je prema tome € 40Bn, ne uključujudi dodatne indirektne troškove zbog gubitka produktivnosti. Komorbiditeti su veoma česti u COPD-u, što dodatno utiče na troškove lečenja.

[0009] Prema tome, postoji velika, klinički nezadovoljena potreba za novim i/ili boljim tretmanima COPD-a. Takođe postoji jasna potreba za unapređenim terapijama koje mogu da ciljaju ključne patološke procese sa potencijalom modifikovanja progresije bolesti, smanjenja broja pacijenata koji prolaze kroz ozbiljnije simptome u napredovanju bolesti.

[0010] N,N-bis-2-merkaptoetil izoftalamid (NBMI) je prvo prikazan u US patent broju US 6,586,600 B2. Njegova upotreba kao dijetetskog suplementa, i za oslobađanje od oksidativnog stresa je prikazana u US prijavi patenta 2010/0227812. NBMI je poznat kao modni helator teških metala, uključujudi, živu, kadmijum, i olovo. Vidi takođe Patel et al, Toxicology Mechanisms and Methods, 22, 383 (2012).

[0011] Analozi NBMI su prikazani u inter alia US 8,426,368 B2 i međunarodnim prijavama patenta WO 2011/038385 i WO 2012/121798.

[0012] Međutim, nijedan od prethodno pomenutih dokumenata ne prikazuje potencijalnu upotrebu NBMI ili srodnih jedinjenja u potencijalnom lečenju COPD.

[0013] Opšte je poznato da se u pludima dešava povedani oksidativni stres i sistemski kod COPD pacijenata, i kao rezultat oksidativnog opteredenja duvanskim dimom i povedanim oslobađanjem reaktivnih vrsta kiseonika (ROS) iz inflamatornih delija koje se kao rezultat aktiviraju.

[0014] Eukariotske delije intracelularno sadrže sistem enzima koji regenerišu askorbat iz njegovog oksidovanog proizvoda, dehidroaskorbata (DHA), sprečavajudi njegovu ireverzibilnu oksidaciju do nishodnih proizvoda koji nemaju antioksidansnu funkciju (vidi npr. Corti et al, Arch. Biochem. Biophys., 500, 107 (2010)). Ovaj mehanizam je, prema tome, od ključne važnosti za održavanje koncentracija delijskog askorbata i može da se događa ili enzimski kroz delovanje dehidroaskorbat reduktaza kao što je glutaredoksin (vidi Saaranen et al, Antioxid. Redox Signal., 12, 15 (2010)) i protein disulfid izomeraze (Nardai et al, J. Biol. Chem., 276, 8825 (2001)), kao i ne-enzimski kroz njegovu redukciju pomodu GSH (Winkler et al, Free Radic. Biol. Med., 17, 333 (1994)).

[0015] Nedavno istraživanje je pokazalo da infuzija askorbata povedava otpornost skelenih mišida na zamor kod pacijenata sa COPD-om (vidi npr. Rossman et al, Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol., 305, (2013)).

[0016] Mi smo pronašli, ne samo da NBMI može da inhibira otpuštanje ključnih antitinflamatirnih markera, kao što je interleukin-6 (IL-6), interleukin-8 (IL-8) i faktor nekroze tumora-alfa (TNF-α) za koje se zna da su eksprimirani kod COPD pacijenata (vidi, na primer, Rubini, et al, Inflamm. Allergy Drug Targets, 12, 315 (2013), Thorleifsson et al, Respir. Med., 103, 1548 (2009) and Tang, J. Interferon Cytokine Res., 34, 162 (2014) i Dadvand et al, Eur. Respir. J., (2014), Feb 20), ved je takođe, veoma iznenađujude, da NBMI može da regeneriše askorbat unutar tečnosti koja oblaže pluda. Dalje, pronađeno je da NBMI može da deluje na ovakav način zbog toga što funkcioniše kao donor elektrona za recikliranje askorbata. Takođe smo pronašli, iznenađujude, da NBMI može da se daje pacijentima za terapeutsko lečenje COPD ublažavanjem simptoma i modifikovanjem/sprečavanjem progresije bolesti, bez davanja značaja negativnivim sporednim efektima.

Prikaz pronalaska

[0017] Prema prvom aspektu pronalaska obezbeđen je NBMI, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so ili njegov derivat, za upotrebu u postupku lečenja COPD. Takva upotreba sadrži davanje farmaceutski efikasne količine NBMI pacijentu kome je potrebno za takvo lečenje.

[0018] Termin "COPD" treba razumeti da uključuje ona stanja koja se u literaturi različito nazivaju "hronična opstruktivna bolest pluda (COLD) ili hronična opstruktivna bolest disajnih puteva (COAD)", koja se karakteriše hronično niskim protokom vazduha, kratkim dahom, kašljem, i proizvodnjom sputuma.

[0019] Radi izbegavanje sumnje, u kontekstu predmetnog pronalaska, termini "tretman", "terapija" i "i postupak davanja terapije" uključuju terapeutski, ili p alijativni, tretman pacijenata kojima je to potrebno, COPD-a, ili drugih relevantnih stanja koja se ovde pominju. "Pacijenti" uključuju humane pacijente.

[0020] Farmaceutski prihvatljive soli NBMI koje mogu da budu pomenute uključuju zemnoalkalne, i poseno alkalne, metalne soli, kao što su soli litijuma, natrijuma, kalijuma, rubidijuma, cezijuma i francijuma.

[0021] Takve soli mogu da se obrazuju konvencionalnim načinima, na primer reakcijom NBMI sa jednim ili više ekvivalenata odgovarajude baze, opciono solventa, iliu medijumu u kome je so nerastvorljiva, nakon čega sledi uklanjanje solventa, ili pomenutog medijuma, upotrebom standardnih tehnika (npr. in vacuo, sušenjem zamrzavanjem ili ceđenjem). Soli takođe mogu da se dobiju izmenom kontra-jona aktivnog sastojka obliku soli sa drugim kontra-jonom, na primer upotrebom jonoizmenjivačake smole.

[0022] Farmaceutski prihvatljivi derivati NBMI uključuju glutation, cistein, alfadihidrolipoičnu kiselinu, cistamin, tiolfosfat, 5’-tioladenozin, L-homocistein, ko-enzim A, 2-merkaptoetanol, ditiotreitol, derivate jodoacetata, bromoacetata, fluoroacetata ili derivate hloroacetata. Takvi derivati mogu da se dobiju kao što se opisuje, an primer u, US prijavi patenta 2011/0237776.

[0023] NBMI, njegove farmaceutski prihvatljive soli, i farmaceutski prihvatljvi derivati se kolektivno ovde zajedno nazivaju sa "NBMI".

[0024] Prema daljem aspektu pronalaska obezbeđena je upotreba postupka za lečenja COPD kod pacijenata davanjem NBMI u dovoljnoj, farmaceutski efikasnoj dozi koja može da regeneriše askorbat (npr. sistemski) kod tog pacijenta.

[0025] Stručnjaku iz oblasti tehnike je jasno da "askorbat" u literaturi može različito da se opiše kao askorbinska kiselina, L-askorbinska kiseilna i/ili vitamin C.

[0026] Poznato je da je COPD povezan sa respiratornim morbiditetom i mortalitetom, rizik koji može, u skladu sa pronalaskom, da bude smanjen sa NBMI.

[0027] Prema daljem aspektu pronalaska obezbeđena je upotreba postupka za smanjenje rizika (tj. sprečavanja) respiratornog morbiditeta i mortaliteta kod pacijenata koja obuhvata davanje NBMI takvom pacijentu koji ispoljava simptome COPD.

[0028] Stručnjak iz oblasti tehnike razume da termin "morbiditet" uključuje bilo koji od najmanje delimično oslabljeno stanje bolesti, invaliditeta ili bolesti, i/ili generalno slabog zdravlja. "Respiratorni" morbiditet prema tome uključuje takva stanja koja se ispoljavaju kao posledica npr. COPD.

[0029] Pronađeno je da je NBMI koristan za olakšavanje simptoma COPD, uključujudi zamor (npr. skeletno mišidni zamor), kratak dah, kašalj i proizvodnju sputuma.

[0030] Prema daljem aspektu pronalaska obezbeđena je upoteba postupka za olakšavanje jednog ili više simptoma COPD kod pacijenata koji imaju COPD, koja obuhvata davanje NBMI takvim pacijentima.

[0031] Iako nisu ograničene kao takve, upotrebe tretmana prema pronalasku uključuju da mogu da se pomenu uključujudi one gde je pacijent konzument cigareta ili je bivši konzument cigareta.

[0032] U upotrebama koje se ovde opisuju, NBMI se poželjno daje lokalno ili sistemski, na primer oralno, intravenozno ili intraarterijalno (uključujudi intravaskularna ili druga perivaskularna sredstva/dozne oblike (npr. stentove)), intramuskularno, kutano, subkutano, transmukozno (npr. sublingvalno ilibukalno), rektalno, transdermalno, nazalno, pulmonarno (npr. inhalacijom, trahealno ili bronhijalno), topikalno, il bilo kojim drugim parenteralnim načinom, u obliku farmaceutskog preparata koji sadrži jedinjenje u farmaceutski prihvatljivom doznom obliku. Poželjni načini davanja uključuju oralni (posebno), intravenozni, kutani ili subkutani, nazalni, intramuskularni, ili intraperitonealni način davanja.

[0033] NBMI se generalno daje obliku jedne ili više farmaceutskih formulacija u smeši sa farmaceutski prihvatljivim adjuvansom, rastvaračem ili nosačem, koji mogu da se odaberu uzimajudi u obzir namenjen način davanja i standardnu farmaceutsku praksu. Takvi farmaceutski prihvatljivi nosači mogu da budu hemijski inertni u odnosu na aktivna jedinjenja i ne moraju da imaju neželjene štetne sporedne efekte ili toksičnost u uslovima upotrebe. Takvi farmaceutski prihvatljivi nosači mogu takođe da omogude trenutno, ili modifikovano, oslobađanje NBMI.

[0034] Pogodne farmaceutske formulacije mogu da budu komercijalno dostupne ili mogu da budu na drugi način opisane u literaturi, na primer, Remington The Science and Practice of Pharmacy, 19th ed., Mack Printing Company, Easton, Pennsylvania (1995) i Martindale - The Complete Drug Reference (35th Edition) i u dokumentima koji se u njima navode, relevantinm prikazima u svim dokumentima koji su ovde uključeni referencom. U suprotnom, dobijanje pogodnih formulacija može da se postigne ne-inventivno od strane stručnjaka iz oblasti tehnike upotrebom rutinskih postupaka.

Pogodne farmaceutske formulacija za upotrebu sa NBMI su takođe opisane u US prijavi patenta 2010/0227812.

[0035] Količina NBMI u formulaciji zavisi od ozbiljnosti stanja, i pacijenta, koji treba da se leči, kao i od jedinjenj(a) koje je/se koristi, ali može da se odredi ne-inventivno od strane stručnjaka iz oblasti tehnike.

[0036] U zavisnosti od pacijenta koji treba da se leči, kao i od načina davanja, NBMI može da se daje u različitim terapeutski efikasnim dozama pacijentu kome je to potrebno.

[0037] Međutim, doza koja se daje čoveku, u kontekstu predmetnog pronalaska treba da bude dovoljna da utiče na terapeutski odgovor u razumnom vremenskom roku (kao što se opisuje ovde u prethodno u tekstu). Stručanjak iz oblasti tehnike de prepoznati da odabir prave doze i kompozicije i najoptimalnijeg doznog režima de takođe biri pod uticajem „inter alia“ farmakoloških svojstava formulacije, prirode i ozbiljnosti stanja koje se leči, i fizičkog stanja i mentalnog stanja recipijenta, kao i starosnog doba, stanja, težine tela, pola i odgovora pacijent a koji se leči, i stanja/ozbiljnosti simptoma bolesti, kao i genetičkih razlika između pacijenata.

[0038] Davanje NBMI može da bude u kontinuitetu ili sa prekidima (npr. bolusnom injekcijom). Doza takođe može da se odredi podešavanjem vremena i učestalosti davanja.

[0039] Pogodne doze NBMI su prema tome u opsegu od oko 0,5 i oko 100,0 mg, uključujudi između oko 1 i oko 60 mg, na primer između oko 1,5 i oko 40 mg jedinjenja po kilogramu ukupne težine pacijenta po danu.

[0040] U bilo kom događaju, lekar, ili strugi stručnjak iz oblasti tehnike, de modi rutinski da odredi pravu dozu, koja najviše odgovara individualnom pacijentu. Gore navedene doze su primer prosečnog slučaja; što mogu, naravno, da budu pojedinačni slučajevi gde se mere viši ili niži dozni opsezi, i kao takvi se nalaze u okviru obima pronalaska.

[0041] U upotrebama koje se ovde opisuju, NBMI može takođe da bude kombinovan sa jednim ili više aktivnim sastojcima koje su potencijalno korisne, ili su bile namenjene za upotrebu, u lečenju COPD. Takvi pacijenti mogu prema tome takođe (i/ili ved) da primaju terapiju koja se zasniva na davanju jednog ili više takvih aktivnih sastojaka, što mislimo na primanje prepisane doze jednog ili više takvih aktivnih sastojaka koji se ovde pominju, pre, zajedno sa, i/ili nakon, tretmana sa NBMI.

[0042] Takvi aktivni sastojci uključuju bronhodilatatore sa kratkim dejstvom (kao što su salbutamol/albuterol, levosalbutamol/levalbuterol, pirbuterol, epinefrin, efedrin i terbutalin), bronhodilatatore sa dužim dejstvom (kao što su salmeterol, klenbuterol, formoterol, bambuterol i indakaterol), antiholinergici (kao što su tiotropijum i ipratropijum bromid), kortikosteroidi (ako što su flunizolid, flutikazon propionat, triamcinolon acetonid, beklometazon dipropionat i budezonid), i drugi lekovi koji se koriste za lečenje COPD, uključujudi antibiotike sa dužim dejstvom (npr. makrolide, kao štoje eritromicin), mukolitike i kiseonik.

[0043] NMBI može takođe da se zajedno daje sa antioksidansima ili helatorima, uključujudi vitamin-E, vitamin-D, cistein, cistin, glutation, glutation lipoinske kiseline (GSH), dihidrolipoinska kiselina (DLPA), lipoinska kiselina (LPA), N-acetilcistein (NAC), dimerkaptopropan sulfonat (DMPS), dimerkaptodilibarna kiselina (DMSA), etilendiamintetrasirdetna kiselina (EDTA), i njene smeše.

[0044] Farmaceutski prihvatljive soli drugih aktivnih sastojaka koji su korisni u tretmanu COPD koji mogu da budu pomenuti uključuju kisele adicione soli i bazne adicine soli. Takve soli mogu da se obrazuju konvencionalnim postupcima.

[0045] Pogodne doze drugih aktivnih sastojaka uključuju one koje su korisne u lečenju COPD koje su poznate stručnjacima iz oblasti tehnike i uključuju one koje se navode za lekove od pitanja u medicinskoj literaturi, koa što je Martindale - The Complete Drug Reference (35th Edition) i dokumentima koji se ovde navode, i relevantnim prikazima u svim dokumentima koji su ove uključeni referencom.

[0046] Gde god da se reč "oko" ovde koristi, na primer u kontektu količina (npr. doza ili aktivnih sastojaka), razume se da su takve vrednsoti probližne i da kao takve mogu da variraju do ± 10%, na primer ± 5% i poželjno ± 2% (npr. ± 1%) od brojeva koji se ovde navode.

[0047] Upotrebe koje su ovde opisane mogu da imaju prednsot da, u tretmanu COPD, mogu da budu pogodniji lekaru i/ili pacijentu od, mogu da budu efikasnije od, mogu da bud manje toksične od, mogu da imaju širok opseg aktivnosti od, mogu da budu potentnije od, da proizvode manje neželjenih sporednih efekata od, ili da mogu imati druga korisna farmakološka svojstva preko, sličnih upotreba (tretmana) koji su poznati u prethodnoj oblasti tehnike za upotrebu u takvoj terapiji.

[0048] Pronalazak se ilustruje slededim primerom, u kome:

Slika 1 prikazuje, u modelu oksidacije askorbata, oksidaciju askorbata do DHA pomodu 9,10-fenantrenhiinona (9, 10-PQ), nakon čega sledi recikliranje DHA pomodu NMBI i ditiotreitola (DTT).

Slika 2 prikazuje, u modelu oksidacije askorbata, oksidaciju askorbata do DHA pomodu CuSO4, nakon čega sledi sa NBMI i DTT recikliranje DHA zajedno sa 10, 20 i 30 minuta, sa oksidacijom askorbata i kinetike recikliranja koje su prikazane na panelu sa leve strane, i odgovarajudi trenutni skok i održivo povedanje u koncentraciji askorbata nakon dodavanja NBMI i DTT što je prikazano u panelu sa desne strane.

Primer 1

Inhibicija IL-6 i IL-8 upotrebom NBMI

[0049] Meri se sekrecija proinflamatornih citokina interleukina (IL)-6, IL-8 (kao i GM-CSF i MCP-1) u delijskom medijumu u odgovoru izlaganje česticama u A549 i BEAS-2B delijama upotrebom slededeg postupka.

[0050] Epitelne delije pluda su zasejane na 5 x 10<4>u ploče sa 24 bunarida. Nakon pre-inkubacije sa NBMI, anti-oksidansnim jedinjenjem, N-acetil-L-cistein (NAC), koje se koristi kao pozitivna kontrola, ili nosač, tokom 3 sata medijum je uklonjen.

[0051] Sveži medijum koji sadrži različite čestice (kao što se ispod navodi) u različitim koncentracijama je bio u ukupnoj zapremini od 0,5 ml dodatnih 24 časova. Nakon toga su supernatanti razdvojeni od delija centrifugiranjem.

[0052] IL-8, IL-6, GM-CSF i MCP-1 se mere u tečnosti koja je oslobođena od delija upotrebom DuoSet ELISA Development kit (R&D Systems, Abingdon, UK) prema uputstvu proizvođača.

[0053] Izlaganje medijumu služi samo kao negativna kontrola. Svaki eksperiment se izvodi dva puta sa 4 replikata.

[0054] Generalno, i titanijum dioksid tip P25 i gradska prašina (referenca SRM 1649 b) indukuju proizvodnju proinflamamtornih citokina u epitelnim delijskim linijama pluda A549 i BEAS-2B.

[0055] Efekat pre-inkubiranja sa 50 µM NBMI na obrazovanje citokina koji su indukovani česticama se testirana različitim koncentracijama relevantnih čestica.

[0056] Istraživanje pokazuje da NBMI može da smanji sekreciju pro-inflamatornih citokina koja se indukuje česticama kod obe delijske linije, pored toga što je smanjenje samo u nekim slučajevima smanjeno do osnovnog nivoa.

[0057] Najvede koncentracije IL-8 i IL-6 su dostignute u supernatantima A549 delija koje su izložene TiO2P25 na 75µg/cm<2>. Na ovoj dozi, 50 µM NBMI smanjuje sekreciju IL-8 sa 29% i IL-6 sa 38%.

[0058] Na 100 µg/cm<2>urbane prašine u A549 delijama, pre-inkubacija sa 50 µM NBMI smanjuje sekreciju IL-8 sa 30%, i IL-6 sa 38%.

[0059] Na 100 µg/cm<2>TiO2P25 u BEAS-2B delijama, pre-inkubacija sa 50 µM NBMI smanjuje sekreciju IL-8 sa 49%, i IL-6 sa 37%.

[0060] Na 100 µg/cm<2>urbane prašine u BEAS-2B delijama, pre-inkubacija sa 50 µM NBMI smanjuje sekreciju IL-6 sa 47%.

[0061] Pre-inkubacija sa 5 mM NAC je takođe efikasna u smanjenju sekrecije inflamatornih citokina.

Primer 2

Regeneracija askorbata upotrebom NBMI

[0062] NBMI se ispituje da se vidi da li može da funkcioniše kao donor elektrona za recikliranje askorbata.

[0063] Kinetike oksidacije askorbata, koje pomažu i 1µM 9, 10-PQ i 2 µM bakar sulfat (CuSO4), se ispituju upotrebom testa za iscrpljivanje askorbata (Kelly et al, Res. Rep. Health Eff. Inst., 163, 3 (2011).9, 10-PQ se koristi tako da delovanje NBMI može da se ispita izolovano od njegovih helirajudih svojstava.

[0064] Svi eksperimenti se izvode u triplikatu u UV pločama sa ravim dnom sa 96 bunarida (Greiner bio-one) finalne zapremine 200 µL. Izlaganja se iniciraju dodavanjem 20 µL koncentrovanog štoka askorbata (2 mM) u svaki bunarid koji sadrži 160 µL Chelex-100 smole koja je tretirana vodom (koja sadrži 10% DMSO), plus ili 10 µL vode, CuSO4štok rastvora na 4 mM ili 9, 10-PQ štok rastvora na 2 mM, i 10 µL NMBI (4 mM i 200 µL).

[0065] Svi rastvori se pripremaju u Chelex-100 smoli koja je tretirana vodom (koja sadrži 10% DMSO). Ovo rezultira konačnim koncentracijma u bunaridima 200 µL askorbata, 2 µM CuSO4, ili 1 µM 9,10-PQ i između 10 i 200 µM NBMI.

[0066] Odmah nakon dodavanja askorbata u svaki bunarid koji se ispituje, ploča se pre-inkubira 10 minuta na 37°C u čitaču za ploče (Spectra Max 190). Tokom izlaganja, ploča se održava na ovoj temperaturi. Nakon dodavanja askorbata, koncentracija koja ostaje u svakom bunaridu se prati svaka 2 minuta za vremeniski period u trajanju od dva sata merenjem apsorbancije na 265 nm. Koncentracija askorbata se određuje u odnosu na standardnu krivu, sa brzinom oksidacije askorbata koja se određuje izvođenjem linearne regresije kroz početni deo koncentracije u odnosu na vremenski grafički prikaz upotrebom Microcal Software Limited’s OriginLab (version 5.0). Ovo se izvodi za svaki od triplikata i brzina iscrpljivanja askorbata se konačno izražava kao srednja vrednsot mol s 1 x 10<-9>iscrpljivanja akrobata ± standardna devijacija.

[0067] Kod eksperimenata gde se meri uticaj dodavanja NBMI u askorbat, CuSO4i 9, 10-PQ testovi iscrpljivanja se ispituju kasnije tokom vremena. Ploče su postavljene sa 190 mL samo prvih 55-60 minuta, nakon čega se uklanjaju sa čitača za ploče i 10 mL ili NMBI ili poznatog sredstva za redukciju, DTT štok rastvora, ili se voda dodaje u svaki bunaridi. Ploča se nakon toga vrada na čitač za ploče i apsorbacija na 265 nm se prati tokom 60 minuta.

[0068] Trenutno oslobađanje u merenim koncentracijama askorbata se određuje i definiše se kao ’skok’, kao mera trenutnog kapaciteta recikliranja. Održano ’povedanje’ tokom preostalih 60 minuta inkubacije se takođe određuje. Razlika između njih odražava kapacitet dodatih jedinjenja da naknadno inhibiraju brzinu CuSO4- ili 9, 10-PQ-podržane oksidacije askorbata.

[0069] Slika 1 pokazuje kinetike oksidacije askorbata podržane inkubacijom sa 9,10-PQ tokom prvih 60 minuta eksperimenta. U ovom vremenu, dodaje se NMBI (200 µM) i pokazano je da dovodi do neposrednog porasta ponovno vezanog askorbata od 42,8 µM. U daljem tekstu, brzina oksidacije askorbata se smanjuje u odnosu na prvi period od 60 minuta.

[0070] Ovo povedanje vezivanja askorbata, što se navodi u recikliranju DHA nazad do askorbata, je iznenađujude, i značajno vede u poređenju sa onim koje se postiže upotrebom (DTT, 200 µM), postiže smanjeni trenutni oporavak askorbata, 5,1 µM, što takođe nije održivo.

[0071] Slika 2 pokazuje kapacitet NMBI da reciklira DHA u CuSO4modelaskorbata na 10, 20 i 30 minuta u inkubaciji. Fokusiranjem na ranije vremenske tačke, porast ponovnog vezivanja u askorbatu nakon dodavanja NMBI je najočigledniji u vedoj od dve testirane koncentracije, sa naknadnom brzinom oksidacije koja je zaustavljena, mogude zbog helirajudih svojstava jedinjenja.

[0072] Ovi eksperimenti se ponavljaju dodavanjem NMBI i DTT (oba na 200 µM) 60 minuta. Ovo otkriva trenutni ’skok’ u koncentraciji askorbata 7,93 ± 6,58 µM sa DTT u poređenju sa 24,98 ± 5,54 µM povedanjem NBMI. Tokom preostalih 60 minuta inkubacije, održano ’oslobađanje’ kod askorbata je bilo 10,79 ± 2,45 μM prema 25,45 ± 2,45 μM za DTT i NBMI redom.

[0073] Ovi rezultati ukazuju na dosad nepoznato i iznenađujde svojstvo NBMI, što ukazuje na to da može da reciklira DHA nazad do askorbata.

Primer 3

Tretman pacijenata sa COPD

[0074] Žena u penziji koja živi u USA, kojoj je prethodno nekoliko godina ranije dijagnostifikovan COPD, redovno ima napade kašlja dva do četiri puta tokom 24 časovnog vremenskog perioda, sa početkom u bilo kom satu tokom dana ili nodi i koji traju 40 do 75 minuta.

[0075] Kao posledica ovih napada kašlja, disanje pacijentkinje je plitko, njeno grlo je iritirano, njen glas je izmenjen, njeni nivoi energije su jako niski i njen kvalitet života je jako slab.

[0076] Tretman tri puta dnevno (u toku obroka) od 100 mg NBMI doza u kapsuli za period od osam dana dovodi do zančajnog poboljšanja u simptomima. Do osmog dana tretmana, pacijent ne prolazi kroz napade kašlja i ima značajno poboljšano disanje.

Primer 4

In vivo "Miš koji konzumira duvanski dim" Istraživanje I

[0077] Istraživanja su pokazala da duvanski dim može da indukuje inflamatorni odgovor u pludima i kod C57B1/6 i Balb/c miševa nakon izlaganja 5-6 cigareta tokom dana, 5 dana nedeljno (vidi npr. D’hulst et al, Eur. Respir. J., 26, 204 (2005) i Jung et al, BMC Complement. Altern.. Med., 13, 219 (2013)).

[0078] Razvijen je mišji model dejstva duvanskog dima (CS)-za indukciju bolesti disajnih puteva, u kome su četiri grupe BALB/c miševa izložene CS (samo preko nosa) upotrebom mašine za konzumiranje cigareta koja proizvodi kombinaciju bočnog protoka i glavnog protoka dima iz filtriranih cigareta za istraživanje, 7 dana nedeljno tokom 2 nedelje.

[0079] Kao deo 14-dnevnog ispitivanja uspostavljanje doze, tri grupe miševa su primile NMBI subkutano (5, 30 ili 150 mg/kg) pre svakoj pojedinačnog izlaganja CS. Izvedene su analize broja inflamatornih delija u bronhoalveolarnoj lavaži (BAL), analiza protočnom citofluorimetrijom (FACS) i analiza citokina iz BAL.

Materijali i postupci

[0080] U ovom istraživanju su korišdeni miševi BALB/c ženskog pola (Harlem laboratories, Netherlands). Oni su gajeni u plastičnim kavezima na materijalu koji ima upijajuda svojstva i pod 12 časovnom dnevnom ciklusu. Pristup hrani i vodi je omoguden ad libitum. Briga i eksperimentalni protokoli su odobreni od strane Regionalnog etičkog komiteta za vršenje eksperimenata na životinjama Umeĺ. Miševi su bili 12 nedelja starosti kada je počeo protokol izlaganja duvanskom dimu.

Protokol izlaganja CS

[0081] Životinje su izložene inhaliranju CS (i bočnom dimu i glavnom dimu). Izlaganje CS se izvodi u mašini za konzumiranje cigareta koju kontroliše mikroprocesor (TE-10, Teague Enterprises, CA, USA) koja proizvodi dim iz cigareta za istraživanje (1R5F, University of Kentucky, Lexington, KY, USA).

[0082] Cigarete se automatski ubacuju u točak, pale, nadimaju i izbacuju. Svaka cigareta se konzumira 10 minuta i protok vazduha kroz mašinu je podešen na 12 L/min. Cigarete se čuvajuna -20°C dok ne postanu potrebne. Miševi su izloženi dimu 4 cigarete svakih 10 minuta x 3 (tj.12 cigareta tokom 30 minuta), jednom dnevno, 7 dana nedeljno, tokom dve nedelje. Dim se prebacuje u dimni toranj (EMMS, UK) obezbeđujudi jednako i istovremeno izlaganje CS.

[0083] Miševi su postavljeni u plastične komore i izloženi CS pomodu "samo preko nosa" inhalaciji. Kontrolni miševi se održavaju svaki dan i udišu sobni vazduh, ali se ne iznose iz kaveza.

[0084] Prema tome, 5 tretman grupa su sledede:

1. Dnevno izlaganje čistom vazduhu (Placebo grupa)

2. Dnevno izlaganje CS (Izložena CS placebo grupa)

3. Dnevno izlaganje CS; tretirani sa NBMI sa 5 mg/kg doze (NBMI 5 mg/kg Grupa)

4. Dnevno izlaganje CS; tretirani sa NBMI sa 30 mg/kg doze (NBMI 30 mg/kg Grupa)

5. Dnevno izlaganje CS; tretirani sa NBMI sa 150 mg/kg doze (NBMI 150 mg/kg Grupa)

[0085] U danu 15, miševi su iskrvarili do smrti i izvršena je bronhoalveolarna lavaža (BAL). Četiri puta je izvršena lavaža pluda upotrebom trahealne cevi sa ukupnom zapreminom od 1 mL 3 x 1 mL Ca<2±>/Mg<2>+ slobodnim Henkovim ravnotežnim rastvorom soli (HBSS, Sigma-Aldrich, Steinheim, Germany).

[0086] BAL tečnost je odmah nakon toga centrifugrana (10 minuta, 4°C, 1750 oum). Nakon uklanjanja supernatanta do dalje analize, delijski pelet je resuspendovna i zatim razblažen sa 0,5 mL PBS. Leukociti se broje ručno u hemocitometru tako da 20,000 delija može da se postavi i centrifugira upotrebom Cytospin® centrifuge (Shandon ® cytospin 3 cyto-centrifuge, sistem za dobijanje delija).

[0087] Citocentrifugirani preparati se boje sa May-Grünwald-Giemsa reagensom i dobijaju se različiti brojevi delija inflamatornih delija pluda (makrofagi, neutrofili, limfociti, i eozinofili) upotrebom standardnog morfološkog kriterijuma i brojanjem 300 delija po citospin preparatu.

[0088] Inflamatoni medijatori u BAL-u i serumu se analiziraju za prisustvo interleukina (IL)- 1α, IL-1β, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-10, IL-12p40, IL-12p70, IL-13, IL17, Eotaksin, G-CSF, INFγ, GM-CSF, KC, MCP-1, MIP-1α, MIP-Iβ, RANTES i TNFα. Sve analize citokina se izvode istovremeno sa multipleks kitom (BioPlex™ Pro Mouse Cytokine 23-plex panel) prema uputstvima proizvođača (Bio-Rad) i analiziraju na Bio-Plex™ sistemu (Luminex Bio-Plex™ 200 System, Bio-Rad, Hercules, CA).

[0089] Leukociti iz BAL su analiziran pomodu protočne citofuotimetrije BD FACSort™ (Becton Dickinson, San Jose, CA). Delije od BAL se re-suspenduju u PBS-u kao što se opisuje gore u tekstu. Bojenje antitelima se izvodi u ploči sa 96 bunarida sa 2,0 x 10<5>delija/uzorku.

[0090] Delije su pre-inkubirane sa FcR blokirajudim At (ant-CD16/CD32; klon 2.4G2) za smanjenje nespecifičnog vezivanja. mAt-a koja se koriste za identifikovanje T delija su: CD3-FITC (kon 17A2), CD4-PE (klon H129.19) i CD8a-PECy5 (klon 53-6.7). Antitela koja odgovaraju izotipu se koriste kao negativna kontrola. Protočna citofluorimetrija se izvodi upotrebom BD FACSort™ (Becton Dickinson, San Jose, CA) prema standardnom postupku i analizira sa BD FACSDiva Softverom. Sva antitela su dobijena od BD Sciences Pharmingen (San Diego, CA). T delije se definišu kao CD3<+>.

[0091] Rezultati su predstavljeni kao srednja vrednost ± standardna greška srednje vrednosti (S.E.M). Statistički značaj je procenjen parametrijskim postupcima upotrebom dvosmerne analize varijanse (ANOVA) da se odrede razlike između grupa, zatim Bonferroni post hoc testom. Kada je mogude, koristi se jednosmerna ANOVA ili Studentov nezavisni t-test. Statistički rezultat sa p<0,05 se smatraznačajnim.

[0092] Statističke analize se izvode i grafici se dobijaju upotrebom GraphPad Prism (verzija 6,0 GraphPad software Inc., San Diego, CA, USA).

Rezultati

[0093] Svim životinjama je dnevno merena telesna težina od dana 1 do dana 15, 24 sati nakon poslednjeg izlaganja duvanskom dimu. Miševi nisu imali značajne razlike u telesnoj težini u danu 1. U danu 15, životinje u NBMI 5 mg/kg grupi imaj nižu konačnu telesnu težinu (19,5 ± 0,3 g) u odnosu na miševe koji su izloženi CS (20,3 ± 0,3 g, p<0,05). Svi miševi koji su izloženi CS bez obzira na dozu NBMI su imali značajan gubitak u telesnoj težini od dana 1 do dana 15.

[0094] Ukupan broj BAL delija kod životinja koje su izložene CS (dan 15) nije bio značajno vedi u odnosu na kontrolne grupe (296,700 ± 43,650 sa CS i 284,670 ± 63,200 delija/mL bez CS, p>0,05). Izlaganje CS indukuje značajno povedanje u neutrofilima u BAL tečnosti (940 ± 250 sa CS i 260 ± 160 delija/mL bez CS, p<0,05). U danu 15, životinje u grupi sa NBMI 150 mg/kg i grupi NBMI 30 mg/kg imaju značajno niže brojeve neutrofila u odnosu na miševe koji su CS.

[0095] Dve nedelje nakon izlaganja CS nije dovelo do značajnog povedanja u nivou inflamatornih medijatora osim za GCSF kod BAL. Grupa sa NBMI 5 mg/kg imaju niže nivoe MIP-1α u poređenju sa placebo grupom koja je izložena CS (p<0,05). Nije bilo drugih značajnih razlika između analiziranih inflamatornih medijatora.

[0096] Dve nedelje izlaganja CS nije značajno povedalo nivoe inflamatornih medijatora u serumu. Grupa sa NBMI 150 mg/kg je imala značajno smanjene nivoe IL-1β, IL-3, IL-6, Eotaksina, MIP-1α i RANTES u poređenju sa placebo grupom koja je izložena CS. Grupa sa NMBI 30 mg/kg Group ima povedane niove IL-10 u serumu. Nije bilo drugih značajnih razlika između analiziranih inflamatornih medijatora.

[0097] Dve nedelje izlaganja CS nije značajno povedalo nivoe ili CD4 delija ili CD8 delija u BAL tečnosti. Nije bilo značajnih razlika između bilo kojih grupa.

[0098] Miševi u grupi sa NBMI 150 mg/kg su imali rane na vratu. Dve druge grupe sa NBMI nisu pokazale znakove ulceracije, kao što nisu ni placebo grupe.

Primer 5

In vivo istraživanje II "Miš koji konzumira dim cigareta"

[0099] I na osnovu rezultata istraživanja koje se opisuje u primeru 4 gore u tekstu može da se zaključi da dve nedelje konzumiranja cigareta mogude nije dovoljno vreme za indukovanje inflamatornog odgovora.

[0100] U 14 danu istraživanja podešavanja doze sledi istraživanje od 90 dana korišdenjem u osnovi istog aparata i protokola kao što se opisuje u primeru 4 gore u tekstu.

[0101] Za ovaj slučaj, 5 tretman grupa je prema slededem:

1. Dnevno izlaganje čistom vazduhu (Placebo grupa, Gr.1)

2. Dnevno izlaganje CS (Izložena CS placebo grupa; Gr.2)

3. Dnevno izlaganje CS; tretirani sa NBMI sa 30 mg/kg dozi (NBMI 30 mg/kg Grupa; Gr.3)

4. Dnevno izlaganje CS; tretirani sa NBMI sa 60 mg/kg dozi (NBMI 60 mg/kg Grupa; Gr.4)

5. Dnevno izlaganje CS; tretirani sa NBMI sa 150 mg/kg dozi (NBMI 150 mg/kg Grupa; Gr.5)

[0102] U danu 91, izmerena je telesna težina životinja i data je anestezija upotrebom pentobarbital natrijuma (90 mg/kg telesne mase, i.p.). Miševi su traheotomizovani sa braunilom dijamera 18 mehanički ventilirani na kvazi-sinusoidalan način sa malim ventilatorom za upotrebu kod životinja (flexiVent™, SCIREQ®) na frekvenciji od 3 Hz i zapreminom disanja (VT) od 12 mL/kg telesne mase. Priemenjen je pritisak izdaha sa pozitivnim krajem od 3 cm H2O.

[0103] Kardijačni izlaz kod životinja se prati kroz procenu respiratorn mehanike. Miševi su paralizovni pomodu pankuronijumoma (0,1 mg/kg telesne mase, i.p. (lokalni dostavljači)) pre 4 manevra uzdaha na 3 x VT se izvode na početkiu eksperimenta da se uspostavi stabilna respiratorna mehanika osnovnog nivoa i da se osigura slična istorija zapremine pre početka eksperimenta.

[0104] Dinamika pludne mehanike se meri primenom sinusoidalnog standardnog disanja i analizira upotrebom modela sa jednim kompartmentom i višestrukom linearnom regresijom, što se dobija respiratorni otpor (RRS), elastancija (ERS) i popustljivost (CRS). Merenje RRS odražava i sužavanje vazdušnih puteva i promene u pludima. Merenje CRS i ERS odražava samo događaje na periferiji pluda, posebno zatvaranja vazdušnih puteva što vodi do de-regurtovanja u pludnoj jedinici. Suprotno, selektivna promena u CRS ukazuje na udaljenije mesto delovanja.

[0105] Detaljnija evluacija mehanike pluda se dobija upotrebom postupka forsirane oscilacije (FOT) prema Jonasson et al., Respir. Res., 9, 23 (2008) i Respir. Physiol. Neurobiol., 165, 229 (2009). Parametri koji se dobijaju od FOT merenja u ovom istraživanju su: Njutnov otpor (RN), prigušenje tkiva (G), koje je blisko u vezi sa tkivnim otporom i odražava energiju disipacije u pludnim tkivima; i tkivna elastancija (H), koju karakterišu rigidnost tkiva i odražava skladištenje energije u tkivima.

[0106] Dinamičke krive pritiska-zapremine (PV) se određuju pomodu naduvavanja pluda do maksimalnog pritiska od 30 cm H2O, što omogudava pasivne izdisaje upotrebom kompjuterom kontrolisanog Flexivent ventilatora za merenje zapremine i pritiska. Sakupljeni su individualni rezultati iz svake životinje. Sva PV merenja se izvode u tiplikatima. Kvazi-statičke PV petlje se dobijaju pomodu spore postepene inflacije i deflacije pluda. PV petlje se izvode za PEEPnivoe, 3 cm H2O. Faktor oblikovanja (k) opadajudeg dela PV petlje se računa uklapanjem podataka u Salazar-Knowles jednačinu. Veruje se da se vrednost parametra k menja karakteristično i sa fibrozom i emfizemom. Takođe je dobijena kvazi-statička usaglašenost (Cst) i elastancija (Est) i zapremina vazduha su dovoljni da se postigne 20 cm vode.

[0107] Bronhoalvolarna lavaža (BAL) se u osnovi izvodi kao što se opisuje u primeru 4 gore u tektu, kao i analiza delija protočnom citofluorimetrijom iz BAL i analiza inflamatonih delija iz BAL i seruma.

[0108] Zamrznuto tkivo pluda je homogenizovano zajedno sa 1 mL PBS u epruveti od 2 mL, upotrebom miksera za mešanje (Retch mm400) 2 minuta na 4°C. Odmah nakon homogenizacije epruveta je centrifugirana 15 minuta (1500 oum, 4°C). Supernatant je uklonjen i sačuvan za određivanje koncentracije proteina upotrebom NanoDrop spektrofotometra (Proteini A280). Nakon analize sadržaja proteina, jednake količine proteina iz svakog uzorka su sačuvane za analizu transformišudeg faktora rasta beta (TGFβ) 1-3. TGFβ 1-3 se analizira istovremeno upotrebom multipleks kita (Bio-Plex Pro TGF-β 3-Plex Imunotest) u homogenatu pludnog tkiva prema uputstvima proizvođača (Bio-Rad) i analizira na Bio-Plex™ sistemu (Luminex Bio-Plex™ 200 System, Bio-Rad, Hercules, CA).

[0109] Životinje koje su izložene histološkoj analizi nisu izložene testiranju respiratorne funkcije da bi se sačuvao tkivni integritet. Desni režanj pluda je uklonjen i fiksiran u 4% paraformaldehidu do ugradnje parafina. Nakon ugrađivanja u parafin, tkivo se seče u sekcije debljine 3 mm i montira na slajdove sa pozivinim naelektrisanjem. Da bi se procenila infiltracija inflamatornih delija, sekcije se oslobađaju parafina, dehidriraju, i boje hematoksilinom i eozinom. Histopatološka procena obojenih sekcija se izvodi od strane profesionalnog patologa koji je specijalizovan za rad sa malim životinjama u Nacionalnom veterinarskom institutu (SVA) u Upsali, Švedska.

[0110] Statistička analiza je izvedena u osnovi kao što se opisuje u priemru 4 gore u tekstu.

Rezultati

[0111] U tabeli 1 ispod, navedeni su brojevi miševa koji se koriste za različite analize. Krv je uzorkovana iz svih miševa.

Tabela 1

[0112] Tokom izlaganja u trajanju od 90 dana, 5 miševa je umrlo. U vedini slučajeva nad njima je izvršena eutanazija zbog pogoršanja zdravstvenog statusa kao što je veliki gubitak u telesnoj težini i prisustvo letargije, vidi tabelu 5. Tokom analize, 6 miševa je značajno iskakalo iz opsega istraživanja i prema tome su isključeni iz seta podataka (Tabela 2).

Tabela 2

[0113] Sve životinje koje su izložene CS su vidljivo pogođene ovim izlaganjem. Imali su neuređeno krzno i gubitak mišidne mase. Deluje da su životinje koje su dobile NBMI (Gr. 3 i Gr. 4.) bile do određenog stepena zdravije u odnosu na druge grupe koje su dobile placebo (opservacija tehničara koji brine o životinjama). Mesto za davanje injekcije NBMI s.c. se menja da bi se izbeglo stvaranje ožiljaka i ulceracije. Uprkos ovom naporu, miševi u Gr. 5 su imali rane i ispupčenja na vratu. Dve druge NBMI grupe nisu pokazale znake ulceracije, kao što nisu ni placebo grupe. Kontrolne životinje su dobile DMSO u istoj koncentraciji kao i NBMI u Gr.5.

[0114] Životinje koje su izložene CS pokazuju značajne razlike u telesnoj težini od kontrolnih životinja u danu 90. Kontrolni miševi su povedani za 15% u telesnoj masi (2,8 ± 0,2 g), dok miševi koi su izloženi CS nisu do značajnog stepena imali povedanje u telesnoj masi (-0,1 ± 0,3 g). Životinje koje su primile NBMI su sve dobile na težini u poređenju sa počenom težinom (Gr.3: 1,0 ± 0,4 g, Gr.4: 0,7 ± 0.2 g i Gr.5: 0,6 ± 0,2 g).

[0115] Ukupan broj BAL delija kod životinja koje su izložene CS u danu 90 je značajno vedi neko kod kontrolnih grupa (246,700 ± 21,980 delija/mL sa CS i 152,000 ± 20,540 delija/mL bez CS, p<0,01). Izlaganje CS-u indukuje značajno povedanje u broju makrofaga u BAL tečnosti (229,300 ± 21,400 delija/mL sa CS, i 134,200 ± 18,600 delija /mL bez CS, p<0,01).

[0116] Izlaganje CS nije povedalo broj infiltriranih neutrofila i limfocita u BAL tečnosti u poređenju sa kontolnom grupom (Gr. 1). Životinje koje su dobile NBMI (30, 60 i 150 mg/kg) nisu imale značajno niže brojeve makrofaga u BAL tečnosti. Međutim, postojala je tendencija za smanjenim brojem neutrofila u Gr.4 i Gr.5 i smanjenim brojem limfocita u grupama koje su tretirane sa NMBI.

[0117] Devedeset dana od izlaganja CS nije došlo doznačajnog povedanja u nivoima T pomodničkih (CD4+/CD3+) ili T citotoksičnim (CD8+/CD3+) limfocitima u BAL tečnosti koa što je prikazano FACS analizom. Procenat oba tipa limfocita nije značajno izmenjen nakon tretmana sa NBMI. Međutim, s obzirom da su limfociti smanjeni nakon tretmana sa NBMI, postoji značajno smanjenje T citotoksičnih (CD8+/CD3+) lymphocita u BAL tečnosti kod životinja koje su tretirane sa NBMI u poređenju sa Gr.2.

[0118] Devedeset dana od izlaganja CS indukuju se strukturne promene u pludima u poređenju sa kontrolnim životinjama (Gr.2 vs. Gr.1), što se manifestuje CS-indukovanim alteracijama i u manjim i u vedim vazdušnim putevima povedavanjem ERS i H zajedno sa smanjenjem CRS. CS-smanjeni koeficijent histereze η odražava smanjenje heterogenosti u pludima.

[0119] Vede doze NBMI (Gr.4 i Gr.5) povedavaju otpornost manjih i vedih vazdušnih puteva (RRS i G) značajno.

[0120] PV-krive se mere kod miševa koji su izloženi CS (Gr. 2) i poređeni su sa miševima koji su izloženi sobnom vazduhu (Gr.1). Izlaganje CS je značajno uticalo na rigidnost pluda i bio je potreban vedi pritisak da se pluda naduvaju. Životinje koje su dobile NBMI (30, 60 i 150 mg/kg) nisu pokazale značajno izmenjenu respiratornu funkciju u poređenju sa placebo grupo (Gr. 2). Cst, Est i k nisu pogođeni izlaganjem dimu cigareta.

[0121] Devedeset dana CS-izlaganja nije značajno povedalo nivoe inflamatornih medijatora u BAL i serumu. U grupi NBMI od 150 mg/kg (Gr. 5), nivoi MIP-1β (p<0,05) i GM-CSF (p<0,01) su sniženi u serumu u poređenju sa placebo grupom koja je izložena CS (Gr.2). Nije bilo drugih značajnih razllika između inflamatornih medijatora koji se analiziraju.

[0122] Životinje koje su izložene CS (Gr.2) ne pokazuju povedane nivoe TGFβ u homogenatu pluda u poređenju sa kontrolnom grupom (Gr. 1). Životinje koje su dobile NBMI nisu imale značajno promenjenu količinu TGFβ 1-3 u poređenju sa placebo grupom koja je dobila CS (Gr.2).

[0123] Bronhijalni lumeni i alveole u svim pludima pokazuju prisustvo nekoliko makrofaga. U tretiranim grupama, makrofagi su malo brojniji i ispoljavaju žudkasti pigment u citoplazmi ili granule sa crnim pigmentom. Crni pigment bi mogao da bude čađ od izlaganja duvanskom dimu cigarete i žudkasti pigment može da bude lipofuscin.

[0124] Nizak broj leukocita (neutrofila, eozinofila, monocita, makrofaga) se povremeno uočava u alveolarnim septama i takođe subpleularno na perifernom delu pluda kod životinja koje su izložene CS. Blago povedan broj makrogafa u grupama koje su izložene cigretama je bio suptilan i pluda su ostala ispod praga za inflamaciju. Uočene promene nisu dovoljno velikog intenziteta da proizvedu kliničke znake.

[0125] Kontrolne životinje u ovom istraživanju pokazuju značajno vede funkcionisanje disjnih puteva i vede dobijanje u telesnoj težini u odnosu na miševe koji su bili izloženi CS, ali povedanje mobilnih delija u BAL tečnosti se ne razlikuje značajno od Gr.2. Miševi iz kontrolne grupe su dobili isti tretman kao Gr.2 izuzev toga što nisu bili izloženi CS-dimu. Međutim, sve životinje dele isti smeštaj i uslove u laboratoriji.

Zaključak

[0126] Miševi koji su izloženi CS pokazuju gubitak u telesnoj težini (ili nedostatak povedanja telesne težine), povedanje u broju makrofaga, i rigidnosti pluda zajedno sa smanjenjem usklađenosti respiratornih organa.

[0127] Tretman sa NBMI (Gr. 3 i Gr. 4) poboljšava zdravstveno stanje kod miševa koji su izloženi CS dnevno u trajanju od 90 dana. Pozitivni efekat tretmana je podržan povedanom telesnom masom, i sklonosti ka smanjenom broju limfocita, i smanjenjem CD8+ delija, u BAL tečnosti u poređenju sa CS-izloženoj placebo grupi (Gr.2).

Claims (7)

Patenti zahtevi

1. N,N-bis-2-merkaptoetil izoftalamid, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, za upotrebu u lečenju hronične opstruktivne bolesti pluda.

2. Jedinjenje za upotrebu prema Zahtevu 1, što doza N,N-bis-2-merkaptoetil izoftalamida ili njegove soli koja se daje može sistemski da regeneriše askorbat.

3. Jedinjenje za upotrebu prema Zahtevu 1 ili Zahtevu 2, što tretman smanjuje rizik respiratonog morbiditeta i/ili mortaliteta kod pacijenta.

4. N,N-bis-2-merkaptoetil izoftalamid, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, za upotrebu u postupku ublažavanja jednog ili više simptoma hronične opstruktivne bolesti pluda kod pacijenta koji ima tu bolest.

5. Jedinjenje za upotrebu prema Zahtevu 4, što je simptom skeletno mišidni zamor i/ili kašalj/proizvodnja sputuma.

6. Jedinjenje za upotrebu kao što se navodi u bilo kom od zahteva 1 do 5, što je postupak lečenja za pacijenta koji konzumira cigarete ili je bivši konzument cigareta.

7. Jedinjenje za upotrebu kao što se navodi u Zahtevu 6, što pacijent takođe dobija terapiju koja sadrži davanje aktivnog sastojka koji se bira od bronhodilatora, antiholinergičnog leka, ili kortikosteroida.