RS56904B1

RS56904B1 - Humanizovna il-25 antitela

Info

Publication number: RS56904B1
Application number: RS20180208A
Authority: RS
Inventors: Juan Carlos Almagro; Patrick Branigan; Colleen Kane; William Strohl; Susann Taudte; Mark Tornetta; John Wheeler
Original assignee: Janssen Biotech Inc
Priority date: 2010-03-30
Filing date: 2011-03-30
Publication date: 2018-05-31
Also published as: CN103097416B; DK2552961T3; MY163133A; KR20130009999A; ECSP12012202A; KR101830181B1; AU2011235232A1; BR112012024786A2; CA2795043A1; JP2013523132A; WO2011123507A1; CR20120553A; JP5887337B2; CY1120468T1; GT201200266A; SI2552961T1; LT2552961T; NZ602720A; PT2552961T; HRP20180340T1

Description

Opis pronalaska

STANJE TEHNIKE

[0001] Interleukin-25 (IL-25), poznat i kao IL-17E, je citokin koji pripada IL-17 familiji citokina i koji sekretuju pomoćne T ćelije tipa 2 (Th2) i mast ćelije. IL-25 indukuje proizvodnju drugih citokina, uključujući IL-4, IL-5 i IL-13, u mnogim tkivima, a stimuliše i ekspanziju eozinofila.

[0002] Ukazano je na ulogu IL-25 u hroničnim inflamatornim stanjima gastrointestinalnog trakta, a IL-25 gen je identifikovan u hromozomskom regionu povezanom sa autoimunim oboljenjima creva poput inflamatorne bolesti creva (IBD od engl. inflammatory bowel disease). Konvencionalne terapije za lečenje IBD podrazumevaju primenu bilo antibiotika bilo lekova izvedenih iz steroida; međutim, navedene terapije trenutno nisu dovoljno efikasne u indukciji ili održavanju kliničke remisije kod pacijenata.

[0003] Pokazano je takođe da je IL-25 povećano eksprimiran u uzorcima pacijenata sa astmom, stanjem za koje je procenjeno da pogađa više od 300 miliona ljudi širom sveta, što sugeriše da prekomerna ekspresija ovog citokina doprinosi patologiji astme i srodnih stanja.

[0004] Anti-IL-25 antitela su opisana u Patentnim spisima WO2008/129263, WO2009/136976, EP2163625, publikacijama Ballantyne i saradnici (Journal of Allergy and Clinical Immunology 120(6):1324-1331) i Angkasekwinai i saradnici (Journal of Allergy and Clinical Immunology, 119(1):S134).

[0005] Prema tome, postoji potreba za efikasnim antagonistima IL-25 koji bi bili korisni u lečenju oboljenja i stanja koja karakteriše prekomerna ekspresija IL-25, uključujući astmu i inflamatornu bolest creva.

IZLAGANJE SUŠTINE PRONALASKA

[0006] Ovde su opisana antitela i njihovi fragmenti koji vezuju antigen, specifični za interleukin 25 (IL-25).

[0007] Ovde su opisane varijante antitela RH2.5_R71V, humanizovane (CDR-graftovane) verzije mišjeg 2C3 antitela, ovde označene terminima "huDDG91" i "M9". Jedna od navedenih varijanti je ovde označena kao "M6 antitelo" ili "M6". M6 ispoljava niz poboljšanih karakteristika in vitro i in vivo, uključujući, na primer, poboljšan afinitet vezivanja za IL-25 u odnosu na antitelo huDDG91 iz koga je izvedeno, poboljšanu sposobnost inhibicije IL-25 receptora u testovima inhibicije sa receptorima i na ćelijama u odnosu na originalno antitelo huDDG91, dok su poboljšane i druge karakteristike poput visokog nivoa ekspresije, visoke rastvoljivosti, nedostatka značajne agregacije proteina nakon prečišćavanja i odsustva neželjenih post-translacionih modifikacija, protein-proteinskih interakcija i oksidacije nakon prečišćavanja.

[0008] Ovde je takođe opisan molekul ciljanog vezivanja koji vezuje IL-25, pri čemu se navedeni molekul ciljanog vezivanja vezuje za jednu ili više aminokiselinskih sekvenci izabranih iz grupe koju čine aminokiselinski ostaci 46-63 iz sekvence navedene pod identifikacionim brojem (SEQ ID NO:) 17, aminokiselinski ostaci 66-84 iz SEQ ID NO:17 i aminokiselinski ostaci 129-135 iz SEQ ID NO:17. U jednom primeru primene predmetnog pronalaska, molekuli ciljanog vezivanja se vezuju za aminokiselinske ostatke 56-63 iz SEQ ID NO:17 i aminokiselinske ostatke 66-74 iz SEQ ID NO:17. U drugom primeru primene, molekul ciljanog vezivanja sadrži VL domen antitela koji sadrži CDR3 sa aminokiselinskom sekvencom QQYLAFPYTF (SEQ ID NO:8).

[0009] Predmetni pronalazak se odnosi na humanizovano antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen koji se vezuju za IL-25, gde antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen sadrže:

a) VL domen antitela koji sadrži CDR1 aminokiselinske sekvence SASQGISNYLN (SEQ ID NO:6), CDR2 domen aminokiselinske sekvence YTSSLHS (SEQ ID NO:7) i CDR3 aminokiselinske sekvence QQYLAFPYTF (SEQ ID NO:8); i

b) VH domen antitela koji sadrži CDR1 aminokiselinske sekvence GYTMN (SEQ ID NO:10), CDR2 aminokiselinske sekvence LINPYNGGTSYNQNFKG (SEQ ID NO:11) i CDR3 aminokiselinske sekvence EDYDGYLYFAMDY (SEQ ID NO:12),

pri čemu, antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen ispoljavaju afinitet vezivanja za IL-25 koji je manji ili jednak približno 53 pM.

U određenom primeru primene predmetnog pronalaska, humanizovano antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen sadrže VL domen koji sadrži SEQ ID NO:5 i VH domen koji sadrži SEQ ID NO:9.

[0010] U raznim primerima primene, predmetni pronalazak se dalje odnosi na izolovanu nukleinsku kiselinu koja sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira antitelo ili fragment koji vezuje antigen predmetnog pronalaska, ekspresioni vektor koji sadrži navedene nukleinske kiseline i ćeliju domaćina koja sadrži navedene ekspresione vektore.

[0011] U drugom primeru primene, pronalazak se odnosi na postupak proizvodnje antitela ili fragmenta koji vezuje antigen predmetnog pronalaska, postupak koji obuhvata gajenje ćelije domaćina predmetnog pronalaska u kulturi ćelija u uslovima pogodnim za proizvodnju antitela ili fragmenta koji vezuje antigen.

[0012] U daljem primeru primene, pronalazak obezbeđuje kompozicije koje sadrže antitelo ili fragment koji vezuje antigen predmetnog pronalaska i farmaceutski prihvatljiv nosač.

[0013] U narednom primeru primene, pronalazak obezbeđuje upotrebu antitela ili fragmenta koji vezuje antigen predmetnog pronalaska, na primer, u vidu farmaceutske kompozicije, za lečenje oboljenja ili stanja, uključujući inflamatorna stanja kao što su astma (uključujući alergijsku astmu) i inflamatorno oboljenje creva (npr. Kronova bolest i ulcerativni kolitis).

[0014] Ovde je takođe opisan molekul ciljanog vezivanja koji kompetira u vezivanju za IL-25 sa molekulom ciljanog vezivanja koji se vezuje za jednu ili za više aminokiselinskih sekvenci izabranih iz grupe koju čine aminokiselinski ostaci 46-63 iz SEQ ID NO:17, aminokiselinski ostaci 66-84 iz SEQ ID NO:17 i aminokiselinski ostaci 129-135 iz SEQ ID NO:17. U određenom primeru primene predmetnog pronalska, molekul ciljanog vezivanja ispoljava afinitet vezivanja za humani IL-25 koji je manji ili jednak približno 50 pM.

[0015] Ovde je opisan i molekul ciljanog vezivanja koji sadrži:

a) VL domen antitela koji sadrži aminokiselinsku sekvencu sa od 1 do približno 20 supstitucija aminokiselina u odnosu na aminokiselinsku sekvencu navedenu kao SEQ ID NO:5;

b) VH domen antitela koji sadrži aminokiselinsku sekvencu sa od 1 do približno 20 supstitucija aminokiselina u odnosu na aminokiselinsku sekvencu navedenu kao SEQ ID NO:9; ili

c) njihove kombinacije.

[0016] U još jednom primeru primene, predmetni pronalazak obezbeđuje postupak proizvodnje anti-IL-25 antitela ili fragmenta koji vezuje antigen, gde antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen ispoljavaju afinitet vezivanja za IL-25 koji je manji ili jednak približno 53 pM i vezuju jednu ili više sekvenci izabranih iz grupe koju čine aminokiselinski ostaci 56-63 iz SEQ ID NO:17, aminokiselinski ostaci 66-74 iz SEQ ID NO:17 i aminokiselinski ostaci 129-135 iz SEQ ID NO:17, postupak koji obuhvata:

(a) obezbeđivanje početnog repertoara nukleinskih kiselina koje kodiraju VL domen, gde nukleinske kiseline ili sadrže CDR3 kodirajući region koji je potrebno zameniti ili im nedostaje CDR3 kodirajući region;

(b) kombinovanje početnog repertoara sa donorskom nukleinskom kiselinom koja kodira VL CDR3 aminokiselinske sekvence QQYLAFPYTF (SEQ ID NO:8), gde je donorska nukleinska kiselina insertovana u jednu ili više nukleinskih kiselina navedenog repertoara da bi se obezbedio repertoar proizvoda nukleinskih kiselina koje kodiraju VL domen koji sadrži VL CDR3 aminokiselinske sekvence QQYLAFPYTF (SEQ ID NO:8);

(c) ekspresiju nukleinskih kiselina repertoara proizvoda da bi se obezbedili molekuli ciljanog vezivanja;

(d) odabir molekula ciljanog vezivanja koji se specifično vezuje za jednu ili za više sekvenci izabranih iz grupe koju čine aminokiselinski ostaci 56-63 iz SEQ ID NO:17, aminokiselinski ostaci 66-74 iz SEQ ID NO:17 i aminokiselinski ostaci 129-135 iz SEQ ID NO:17; i

(e) izdvajanje molekula ciljanog vezivanja ili nukleinske kiseline koja kodira molekul ciljanog vezivanja.

KRATAK OPIS CRTEŢA

[0017]

Slika 1 prikazuje nukleotidnu sekvencu kapa lakog lanca (SEQ ID NO:1) i aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO:2) antitela huDDG91/RH2.5_R71V. Položaji CDR regiona u sekvenci aminokiselina su podvučeni. Vodeća sekvenca nije prikazana.

Slika 2 prikazuje nukleotidnu sekvencu teškog lanca (SEQ ID NO:3) i aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO:4) antitela huDDG91/RH2.5_R71V. Položaji CDR regiona u sekvenci aminokiselina su podvučeni. Vodeća sekvenca nije prikazana.

Slika 3 predstavlja tabelu koja prikazuje karakteristike 9 kandidata monoklonskih antitela, uključujući M6, koji su identifikovana brzim pregledom (skriningom) kombinatorne 25-člane biblioteke bazirane na huDDG91/RH2.5_R71V antitelu. Brojevi dobijeni iz različitog skupa podataka su iskošeni. R71V G1 se odnosi na huDDG91 antitelo. U dve R71V G1 kolone su prikazana merenja iz dva različita skupa podataka. Ostaci sa povećanom hidrofobnošću su označeni žutom bojom.

Slika 4A prikazuje aminokiselinske sekvence lakog lanca antitela M6 (SEQ ID NO:5) i njegovih CDR regiona (SEQ ID NOS:6-8). Položaji CDR regiona u sekvenci aminokiselina su podvučeni. Vodeća sevenca nije prikazana. Aminokiselinski ostaci označeni podebljanim crvenim slovima ukazuju na aminokiseline koje su supstituisane u odnosu na originalnu sekvencu huDDG91/RH2.5_R71V antitela.

Slika 4B prikazuje sekvence aminokiselina teškog lanca antitela M6 (SEQ ID NO:9), kao i njegove CDR regione (SEQ ID NOS:10-12). Položaji CDR regiona u sekvenci aminokiselina su podvučeni. Vodeća sevenca nije prikazana.

Slika 5 je grafikon koji prikazuje da M6 suprimira IL-5/IL25-indukovanu proizvodnju IL-5 od strane naivnih humanih CD4+ T ćelija koje su 4 dana bile stimulisane autolognim dendritskim ćelijama u prisustvu rhIL-4 i rhIL-25, u obimu većem od supresije koju ispoljava huDDG91 (M9) antitelo. Izotip antitela IgG1 (izo) je upotrebljen kao kontrola. n=4 donora.

Slike 6A i 6B su grafikoni koji ukazuju na poboljšanu supresiju IL-25-indukovane proizvodnje GRO od strane antitela M6 u odnosu na huDDG91 (M9) antitelo u LS174T ćelijama koje su bile stimulisane rekombinantnim humanim IL-25 tokom 24 časa. Grafikoni na Slikama 6A i 6B predstavljaju podatke iz dva odvojena eksperimenta.

Slika 7A prikazuje mapu pokrivenosti sekvence aminokiselinskih ostataka 1-78 humanog IL-25 (SEQ ID NO:13) dobijenu pepsinskom digestijom i upotrebom rastvora za zaustavljanje reakcije sledećeg sastava: 2 M urea, 1 M TCEP, pH 3,0. Crna linija označava peptid koji je detektovan.

Slika 7B prikazuje mapu pokrivenosti sekvence aminokiselinskih ostataka 79-146 humanog IL-25 (SEQ ID NO:14) dobijenu pepsinskom digestijom i upotrebom rastvora za zaustavljanje reakcije sledećeg sastava: 2 M urea, 1 M TCEP, pH 3,0. Crna linija označava peptid koji je detektovan.

Slike 8A i 8B prikazuju razlike u nivoima deuterizacije različitih segmenata humanog IL-25 proteina (SEQ ID NO:15 i SEQ ID NO:16) nakon vezivanju M6 antitela u eksperimentima H/D izmene. Svaki blok predstavlja humani IL-25 peptid i sadrži podatke za šest vremenskih tačaka - 150 s i 500 s na pH 6, kao i 150 s, 500 s, 1.500 s i 5.000 na pH 7. Tamnoplava boja označava pozicije bez zaštite nakon vezivanja M6 antitela. Druge boje ukazuju na prisustvo veće količine deuterijuma nakon postupka izmene tipa "u-rastvoru/sa kolone" u odnosu na izmenu tipa "na-koloni/sa-kolone" shodno skali prikazanoj ispod, sa desne strane. Deuterijum vezan za bilo koji od prva dva aminokiselinska ostatka svakog jona je izgubljen tokom analize (digestija/razdvajanje/masena analiza u vodenoj sredini) što je dovelo do pojave malih praznina u obrascu H/D-Ex podataka.

Slike 9A-9F su grafikoni koji prikazuju sadržaj deuterijuma u različitim segmentima humanog IL-25 nakon postupaka H/D izmene na pH 6 i pH 7 i na temperaturi od 3°C, upotrebom kolone sa M6 antitelom. Plavom bojom su označeni rezultati izmene tipa "u-rastvoru/sa-kolone", dok su ljubičastom bojom označeni rezultati izmene tipa "na-koloni/sa-kolone". Sva vremena izmene su preračunata u ekvivalentne vrednosti za pH 7 i 23° C (npr. 150 s na pH 6 na 3°C je jednako 1,85 s na pH 7 i 23° C). Aminokiselinski ostaci humanog IL-25 svakog segmenta su naznačeni na vrhu svakog grafikona.

Slika 10 je prikaz aminokiselinske sekvence humanog IL-25 (SEQ ID NO:17).

DETALJAN OPIS PRONALASKA

[0018] Predmetni pronalazak se zasniva, delom, na identifikaciji humanog anti-IL-25 antitela sa visokim afinitetom koji je ovde označen kao "M6" (pogledati Primer 1), kao i na identifikaciji aminokiselinskih ostataka u humanom IL-25 za koje se vezuje M6 antitelo, što je utvrđeno vodonično-deuterijumskom (H/D) masenom spektrometrijom (pogledati Primer 3). U skladu sa navedenim, ovde je opisan molekul ciljanog vezivanja koji vezuje IL-25, gde molekul ciljanog vezivanja vezuje jednu ili više aminokiselinskih sekvenci izabranih iz grupe koju čine aminokiselinski ostaci 46-63, 66-84 i 129-135 humanog IL-25 (SEQ ID NO:17). Prema tome, ovde opisani molekuli ciljanog vezivanja se mogu vezati za aminokiselinske ostatke 46-63 iz SEQ ID NO:17, aminokiselinske ostatke 66-84 iz SEQ ID NO:17 ili aminokiselinske ostatke 129-135 iz SEQ ID NO:17, ili za bilo koju od njihovih kombinacija. U jednom primeru primene predmetnog pronalaska, molekuli ciljanog vezivanja koji su ovde opisani se vezuju za aminokiseline 56-63 iz SEQ ID NO:17 i aminokiseline 66-74 iz SEQ ID NO:17.

[0019] U tekstu se izraz "molekul ciljanog vezivanja" odnosi na bilo koji molekul koji sadrži protein ili peptid koji dalje sadrži barem deo molekula imunoglobulina sa najmanje jednim "regionom koji određuje kompementarnost" (CDR od engl. complementarity determining region) teškog ili lakog lanca, ili deo njegovog regiona koji vezuje ligand, koji se specifično vezuju za sisarski (npr. humani) IL-25 protein ili njegov deo. Navedeni molekuli ciljanog vezivanja mogu dalje sadržavati najmanje deo varijabilnog regiona teškog ili lakog lanca antitela, najmanje deo konstatnog regiona teškog ili lakog lanca antitela, najmanje deo uokvirujućeg (engl. framework) regiona antitela ili bilo koju od njihovih kombinacija. Navedeni molekuli ciljanog vezivanja modulišu, smanjuju, antagonizuju, ublažavaju, olakšavaju, blokiraju, inhibiraju, ukidaju i/ili interferiraju sa najmanje jednom od aktivnosti IL-25 ili sa njegovim vezivanjem, ili se efekti odražavaju na aktivnost ili vezivanje IL-25 receptora, in vitro, in situ i/ili in vivo. Pogodan molekul ciljanog vezivanja koji je ovde opisan se može vezati sa visokim afinitetom za inhibitorni i/ili neutrališući epitop humanog IL-25 koga prepoznaje M6 antitelo koje je ovde opisano.

[0020] Molekuli ciljanog vezivanja koji su ovde opisani nisu ograničeni na molekule koji se vezuju samo za aminokiselinske ostatke 46-63, aminokiselinske ostatke 66-84 i/ili aminokiselinske ostatke 129-135 iz SEQ ID NO:17. Prema tome, u pojedinim primerima primene, ovde opisani molekuli ciljanog vezivanja se mogu dodatno vezivati za jedan ili za više delova humanog IL-25 koji ne predstavljaju aminokiselinske ostatke 46-63, aminokiselinske ostatke 66-84 i/ili aminokiselinske ostatke 129-135 iz SEQ ID NO:17. U drugim slučajevima, molekuli ciljanog vezivanja koji su ovde opisani se mogu dodatno vezati za jedan ili za više aminokiselinskih ostataka humanog IL-25 koji se nalaze bočno u odnosu na aminokiselinske ostatke 46-63, aminokiselinske ostatke 66-84 i/ili aminokiselinske ostatke 129-135 iz SEQ ID NO:17.

[0021] Ovde su takođe opisani molekuli ciljanog vezivanja koji se vezuju za jedan ili za više delova humanog IL-25 koji se nalaze u okviru opsega aminokiselinskih ostataka 46-63, aminokiselinskih ostataka 66-84 i/ili aminokiselinskih ostataka 129-135 iz SEQ ID NO:17, kao što su, na primer, delovi IL-25 koji se sastoje od najmanje 5 aminokiselina u okviru aminokiselinskih ostataka 46-63, aminokiselinskih ostataka 66-84 i/ili aminokiselinskih ostataka 129-135 iz SEQ ID NO:17. Primeri delova IL-25 za koje se molekuli ciljanog vezivanja mogu vezati uključuju aminokiseline 56-63 i/ili aminokiseline 66-74 iz SEQ ID NO:17.

[0022] Region IL-25, ili epitop, za koga je vezan molekul ciljanog vezivanja koji je ovde opisan se može odrediti upotrebom bilo koje od nekoliko standardnih tehnika mapiranja epitopa koje su dobro poznate u oblasti tehnike. Navedene tehnike uključuju, na primer, pozicionu mutagenezu praćenu testom vezivanja, mapiranje epitopa upotrebom sintetskih imobilisanih peptida (peptide pins, npr. Geisen i saradnici, Peptides: Chemistry and Biological, Proceedings of the Twelfth American Peptide Symposium, p. 519-523, izd. G.R. Marshall, Escom, Leiden, 1988), rendgensku kristalografiju i tehnike vodonično-deuterijumske (H/D) izmene (npr. H/D-masenu spektrometriju).

[0023] Kao što je ovde opisano, H/D masena spektrometrija je upotrebljena za određivanje epitopa u humanom IL-25 koga(koje) prepoznaje i vezuje M6 antitelo (pogledati Primer 3 i Slike 8A, 8B i 9A-9F). Nakon prenošenje iz vode u sistem rastvarača koji sadrži deuterijum (teška voda), dolazi do porasta mase proteina pošto da se atomi vodonika u proteinu postepeno zamenjuju jonima deuterijuma (teškog izotopa vodonika). Verovatnoća događaja vodonično-deuterijumske izmene u velikoj meri je određena strukturom proteina i njegovom dostupnošću za rastvarač. H/D masena spektrometrija se dakle upotrebljava za određivanje stepena izmene i, posledično, strukture proteina, kao i njegove dostupnosti za rastvarač. Kada se mali molekul ili proteinski partnerski molekul veže za ciljni protein, stepen izmene u proteinu se menja na način koji se eksperimentalno može utvrditi. U regionima na površini, u kojima usled obrazovanja komleksa izostaje rastvarač, stepen izmene je znatno sporiji. Regioni u kojima tom prilikom rastvarač izostaje se mogu upotrebiti za izvođenje zaključka o lokalizaciji vezujućeg mesta. Na primer, u slučaju interakcije antigena i antitela, navedene promene ukazuju na lokaciju epitopa.

[0024] Uobičajeno je da ovde opisan molekul ciljanog vezivanja sadrži domen varijabilnog regiona lakog lanca (VL) uparen sa domenom varijabilnog regiona teškog lanca (VH) da bi se obezbedio domen vezivanja za IL-25. U pripremi predmetnog pronalaska je utvrđeno da je afinitet vezivanja huDDG91 antitela poboljšan promenom regiona koji određuje komplementarnost (CDR) u VL domenu huDDG91 antitela (SEQ ID NO:1), pre svega CDR3 regiona, u sekvencu QQYLAFPYTF (SEQ ID NO:8). U skladu sa navedenim, predmetna prijava razmatra VL domene koji sadrže SEQ ID NO:8 i molekule ciljanog vezivanja koji sadrže navedene VL domene. VL domeni ovde opisanih molekula ciljanog vezivanja takođe sadrže CDR1 (SASQGISNYLN (SEQ ID NO:6)) i CDR2 (YTSSLHS (SEQ ID NO:7)) regione M6 i huDDG91 antitela. Drugi VL CDR regioni koji su pogodni za uključivanje u ovde opisane molekule ciljanog vezivanja obuhvataju, ali nisu ograničeni na, bilo koji od VL CDR1 regiona koji su prikazani na Slici 3. U jednom primeru primene, ovde opisani molekuli ciljanog vezivanja sadrže SEQ ID NO:5 kao VL domen M6 antitela.

[0025] U pojedinim primerima primene, molekuli ciljnog vezivanja koji su ovde opisani takođe sadrže VH domen koji sadrži SEQ ID NOS:10-12 koje odgovaraju CDR regionima antitela M6 i huDDG91. Drugi pogodni VH CDR regioni koji se mogu uključiti u ovde opisane molekule ciljanog vezivanja obuhvataju, ali nisu ograničeni na, bilo koji od VH CDR3 regiona prikazanih na Slici 3. U prioritetnom primeru primene predmetnog pronalaska, molekuli ciljanog vezivanja koji su ovde opisani sadrže SEQ ID NO:9, VH domen M6 i huDDG91 antitela. VH domen može biti uparen sa više VL domena drugačijih od VL domena M6 antitela (SEQ ID NO:5). Prioritetno, VH domen je uparen sa VL domenom koji sadrži CDR3 region sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO:8.

[0026] Ovde opisane sekvence CDR regiona M6 antitela mogu biti modifikovane insercijama, supstitucijama ili delecijama i dalje uključene u molekul ciljanog vezivanja koji je ovde opisan u obimu kojim se obezbeđuje da molekul ciljanog vezivanja (npr. antitelo) sa modifikovanim CDR regionom(regionima) zadrži sposobnost vezivanja i inhibicije humanog IL-25. Za prosečno iskusnog stručnjaka je značajna napomena da se očuvanje navedenog može osigurati proverom aktivnosti u funkcionalnim testovima koje su ovde opisani. CDR region molekula ciljanog vezivanja koji je ovde opisan karakteriše, na primer, od približno 50% do približno 100% homologije, poželjno od približno 80% do približno 100% homologije i još poželjnije od približno 90% do približno 100% homologije sa odgovarajućim CDR regionom M6 antitela koji je naveden kao SEQ ID NO:6, 7, 8, 10, 11 ili 12. CDR molekula ciljanog vezivanja koji je ovde opisan može karakterisati homologija od približno 100% u odnosu na CDR M6 antitela koji je naveden kao SEQ ID NO:6, 7, 8, 10, 11 ili 12.

[0027] Molekul ciljanog vezivanja koji je ovde opisan može vezivati IL-25 sa afinitetom koji je suštinski sličan, ili pak veći, od afiniteta vezivanja ovde opisanog M6 antitela. Na primer, molekul ciljanog vezivanja koji je ovde opisan može ispoljavati afinitet vezivanja za IL-25 (npr. humani IL-25) od približno 50 pM (npr. približno 53 pM) ili manje, kao na primer, približno 45 pM, približno 40 pM, približno 35 pM, približno 30 pM, približno 25 pM ili približno 20 pM. Molekul ciljanog vezivanja će, u principu, biti specifičan za IL-25. Prema tome, molekul ciljanog vezivanja neće ispoljavati nikakvo značajno vezivanje za molekule drugačije od njegovog(njegovih) specifičnog(specifičnih) partnera. Na primer, utvrđeno je da ovde opisano M6 antitelo ne reaguje unakrsno sa IL-17A, IL-17C, IL-17D ili IL-17F. Izbegavanje navedne unakrsne reaktivnosti sa drugim citokinima za koje je pokazano da imaju ulogu u astmi i sličnim procesima, predstavlja poželjnu karakteristiku molekula ciljanog vezivanja koji su ovde opisani.

[0028] Afinitet ili aviditet molekula ciljanog vezivanja u odnosu na antigen se može eksperimentalno odrediti upotrebom bilo kog pogodnog postupka (pogledati, na primer, publikacije "Antibody-Antigen Interactions" u Fundamental Immunology, Paul, W. E., izd. Raven Press: New York, N.Y. (1984); Kuby, Janis, Immunology, W. H. Freeman and Company: New York, N.Y. (1992); i postupke koji su u njima opisani). Vrednosti merenja afiniteta određene interakcije antitela i antigena mogu varirati ukoliko se merenja sprovode pod drugačijim uslovima (npr. pri različitim koncentracijama soli, pH). Merenja afiniteta i drugih parametara vezivanja antigena (npr. KD, Ka, Kd) se stoga prioritetno sprovode upotrebom standardizovanih rastvora antitela i antigena, kao i sa standardizovanih pufera poput ovde opisanog pufera.

[0029] Na primer, specifičnost molekula ciljanog vezivanja se može, između ostalog, odrediti upotrebom testa vezivanja kao što je ELISA test i upotrebom repertoara antigena, kao i upotrebom Biacore i/ili Octet testa. Molekul ciljanog vezivanja može prepoznati IL-25 a ne druge članove IL-17 familije, posebno ne bilo koji od IL-17A, IL-17B, IL-17C, IL-17D i IL-17F; u jednom primeru primene predmetnog pronalaska, svih pet navedenih molekula. Vezivanje molekula ciljanog vezivanja za IL-25 se može sprečiti kompeticijom sa rekombinantnim IL-25.

[0030] Afinitet vezivanja i potencijal neutralizacije različitih molekula ciljanog vezivanja se mogu uporediti primenom odgovarajućih uslova.

[0031] Ovde je takođe opisan molekul ciljanog vezivanja koji kompetira u vezivanju za IL-25 sa molekulom ciljanog vezivanja koji se vezuje za jednu ili više aminokiselinskih sekvenci izabranih iz grupe koju čine aminokiselinski ostaci 46-63 iz SEQ ID NO:17, aminokiselini ostaci 66-84 iz SEQ ID NO:17 i aminokiselinski ostaci 129-135 iz SEQ ID NO:17. U određenom primeru primene predmetnog pronalaska, molekul ciljanog vezivanja ispoljava afinitet vezivanja za humani IL-25 koji je manji ili jednak približno 50 pM.

[0032] Testovi kompeticije sa molekulom ciljanog vezivanja (npr. antitelom) se mogu uraditi zarad određivanja koji proteini, antitela i drugi antagonisti kompetiraju u vezivanju za IL-25 sa molekulom ciljanog vezivanja koji je ovde opisan i/ili koji sadrži isti region epitopa. Navedeni testovi su dobro poznati prosečno iskusnim stručnjacima kao način utvrđivanja kompeticije između antagonista ili liganada za ograničeni broj mesta vezivanja na proteinu, npr. IL-25. Protein i/ili antitelo se prevode u imobilisano ili nerastvorno stanje, pre ili nakon testa kompeticije, a uzorak vezan za protein IL-25 se odvaja od uzorka koji nije vezan, na primer, dekantovanjem (kada se kompleks protein/molekul ciljanog vezivanja ne može rastvoriti) ili centrifugiranjem (kada se nakon reakcije kompeticije protein/antitelo taloži). Takođe, kompetitivno vezivanje se može utvrditi izmenom funkcije usled vezivanja, ili pak usled izostanka vezivanja, molekula ciljanog vezivanja za protein, npr. utvrđivanjem da li molekul ciljanog vezivanja inhibira ili potencira enzimsku aktivnost, na primer, reporterskog molekula. Moguća je upotreba ELISA testa i drugih funkcionalnih testova koji su dobro poznati u oblasti tehnike.

Antitela

[0033] Prioritetno, molekul ciljanog vezivanja koji je ovde opisan označava molekul antitela. Termin "antitelo" se upotrebljava sa namerom da se obuhvate celokupna antitela, njihovi fragmenti digestije, specifično definisane delove ili varijante, uključujući mimetike antitela ili delove antitela koji imitiraju strukturu i/ili funkciju antitela ili, pak, njegovog specifičnog fragmenta ili dela, kao i jednolančana antitela i njihove fragmente; svaki od navednih primera sadrži najmanje jedan CDR. Funkcionalni fragmenti podrazumevaju fragmente koji vezuju antigen koji se vezuju za IL-25 sisara. Na primer, fragmenti antitela sposobni da se vezuju za IL-25 ili njegove delove uključuju, ali nisu ograničeni na, Fab (npr. dobijen digestijom sa papainom), Fab’ (npr. dobijen digestijom sa pepsinom, delimičnim smanjenjem dužine) i F(ab')2(npr. dobijen digestijom sa pepsinom), facb (npr. dobijen digestijom sa plazminom), pFc’ (npr. dobijen digestijom sa pepsinom ili plazminom), Fd (npr. dobijen digestijom sa pepsinom, delimičnim smanjenjem dužine i reagregacijom), Fv ili scFv (npr. dobijene upotrebom molekularno-bioloških tehnika) fragmente i isti su obuhvaćeni predmetnim pronalaskom (pogledati npr. Colligan, i saradnici, izd., Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, Inc., NY (1994 - 2001); Colligan i saradnici, Current Protocols in Protein Science, John Wilei & Sons, NY, N.Y., (1997-2001)).

[0034] Navedeni fragmenti se mogu dobiti upotrebom enzimske digestije, sintetskih ili rekombinantnih tehnika, a kao što je poznato u oblasti tehnike i/ili opisano predmetnim pronalaskom. Antitela se takođe mogu proizvesti u vidu raznih skraćenih oblika upotrebom gena za antitela u koje su uvedeni jedan ili više stop-kodona ushodno od stop-kodona koji je originalno prisutan. Na primer, kombinovani gen koji kodira F(ab')2deo teškog lanca se može dizajnirati tako da sadrži DNK sekvence koje kodiraju CH1domen i/ili zglobni region teškog lanca. Različiti delovi antitela se mogu međusobno hemijski povezati upotrebom konvencionalnih tehnika ili se mogu pripremiti kao kontinualni protein upotrebom tehnika genetskog inženjeringa.

[0035] U tekstu pronalaska, termin "antitelo" se takođe upotrebljava sa namerom da se obuhvate "himerna" antitela i "humanizovana" antitela ili "CDR-graftovana" antitela koja sadrže bilo koju od kombinacija ovde opisanih CDR regiona M6 antitela sa jednim ili sa više proteina ili peptida poreklom iz antitela koje nije mišije, prioritetno, iz humanog antitela. U skladu sa predmetnim pronalaskom, obezbeđena su humanizovana antitela u kojima su CDR regioni izvedeni iz M6 antitela. Takođe su opisana himerna antitela u kojima su CDR regioni izvedeni iz M6 antitela. Prema tome, deo antitela koji je humanog porekla može sadržavati regione koji kod ljudi suštinski ne dovode do imunog odgovora. Regioni antitela koji su izvedeni iz humanih antitela ne moraju biti 100% identični humanim antitelima. U prioritetnom primeru primene predmetnog pronalaska, zadržava se što je moguće više aminokiselinskih ostataka humanog antitela da bi se imunogenost održala na zanemarljivom nivou, ali se navedeni aminokiselinski ostaci mogu modifikovati, ukoliko je to potrebno, da bi se održala struktura mesta vezivanja antigena koje obrazuju CDR regioni, a uz istovremeno svođenje humanizacije antitela na minimum. Navedene promene ili varijacije opciono mogu, što je poželjno, očuvati ili umanjiti imunogenost kod ljudi ili drugih vrsta u odnosu na nemodifikovana antitela. Humanizovano antitelo se može proizvesti u životinji koja je različita od čoveka ili u prokariotskoj ili eukariotskoj ćeliji sposobnoj da eksprimira funkcionalno preuređene gene humanog imunoglobulina (npr. teškog i/ili lakog lanca). Dalje, kada je antitelo jednolančano, ono može sadržavati "povezujući" (engl. linker) peptid koji se ne javlja u nativnom humanom antitelu. Na primer, Fv može sadržavat linkerski peptid, poput peptida od dva do približno osam aminokiselinskih ostataka glicina ili drugih aminokiselina, koji povezuje varijabilni region teškog lanca i varijabilni region lakog lanca. Smatra se da su navedeni povezujući peptidi humanog porekla.

[0036] Alternativno, celokupni varijabilni region teškog lanca i varijabilni region lakog lanca M6 antitela, prikazani na slikama 4A i 4B (SEQ ID NO:5 i 9), se mogu iskombinovati sa konstantnim i bočnim regionima humanog porekla da bi se obrazovali humanizovano antitelo ili fragment koji vezuje antigen predmetnog pronalaska.

[0037] Humani geni koji kodiraju konstantne (C) regione molekula ciljanog vezivanja predmetnog pronalaska se mogu dobiti upotrebom biblioteke jetre humanog fetusa, poznatim postupcima. Geni humanog C regiona se mogu izvesti i iz bilo koje humane ćelije uključujući ćelije koji eksprimiraju i proizvode humane imunoglobuline. Humani CH region može biti izveden iz bilo koje poznate klase ili izotipa humanog H lanaca, uključujući gama, mi, alfa, delta, epsilon lance i njihove podtipova kao što su G1, G2, G3 i G4. Uzimajući u obzir da je izotip H lanca odgovoran za razne efektorske funkcije antitela, izbor CH regiona će biti određen shodno poželjnim efektorskim funkcijama kao što su fiksacija komplementa ili aktivnost u ćelijskoj citotoksičnosti zavisnoj od antitela (ADCC od engl. antibody-dependent cellular cytotoxicity). U jednom primeru primene predmetnog pronalaska, CH region je izveden iz izotipa gama 1 (IgG1).

[0038] Humani CL region može biti izveden iz bilo kog od izotipova humanog L lanca, kapa ili lambda, prioritetno kapa.

[0039] Geni koji kodiraju humane imunoglobulinske C regione se mogu obezbediti iz humanih ćelija standardnim tehnikama kloniranja (npr. Sambrook i saradnici, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. izdanje, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989) i Ausubel i saradnici, editori, Current Protocols in Molecular Biology (1987, 1993)). Geni humanih C regiona su lako dostupni u okviru poznatih klonova koji sadrže gene za dve klase L lanaca, pet klasa H lanaca i njihove potklase. Himerni fragmenti antitela, poput F(ab1)2i Fab, se mogu pripremiti dizajniranjem himernog gena H lanca koji je adekvatno skraćen. Na primer, da bi se dobio skraćeni molekul, himerni gen koji kodira deo F(ab1)2fragmenta H lanca sarži DNK sekvenca koja kodira CH1domen i zglobni region H lanca nakon kojih sledi kodon za zaustavljanje translacije (stop-kodon).

[0040] U principu, u jednom primeru, himerna antitela, fragmenti i regioni koji su ovde opisani se proizvode kloniranjem DNK segmenta koji kodiraju regione vezivanja antigena H i L lanca M6 antitela, kao i povezivanjem navedenih DNK segmenata sa DNK segmentima koji kodiraju CH i CL regione, tim redom, da bi se dobio himerni gen koji kodira imunoglobulin.

[0041] Tako je, u jednom primeru primene predmetnog pronalaska, konstruisan fuzionisani himerni gen koji sadrži prvi DNK segment koji kodira najmanje region vezivanja antigena koji nije humanog porekla, kao što je funkcionalno preuređen V region sa povezujućim segmentom (J, od enlg. joining), povezan sa drugim DNK segmentom koji kodira najmanje deo humanog C regiona.

[0042] Sekvence varijabilnih regiona M6 antitela mogu biti modifikovane insercijama, supstitucijama i delecijama do obima koji omogućava da molekul ciljanog vezivanja zadrži sposobnost vezivanja i inhibicije humanog IL-25.

[0043] Zarad lakšeg pregleda, ovde je prilagođena numerička šema Kabata i saradnika. Aminokiselinski ostaci su označeni malim brojevima ili crticama ukoliko je potrebno da prikazane sekvence budu usklađene sa standardnom Kabat-ovom numerisanom sekvencom.

[0044] U slučaju CDR-graftovanog ili humanizovanog antitela u kome se CDR region M6 antitela kombinuje sa regionom humanog porekla, mogu se zadržati aminokiselinski ostaci u FR regionu koji su idiosinkratični u odnosu na originalno antitelo, npr. M6. Moguće je takođe zadržati aminokiselinska ostatke za koje je pokazano da su od kritičnog značaja u humanizaciji drugih antitela. Navedena uputsva se mogu pratiti do obima neophodnog za očuvanje mesta vezivanja antigena koga obrazuju CDR regioni uz istoremeno postizanje maksimalne humanizacije antitela.

[0045] Postupci inženjeringa ili humanizovanja antitela koja nisu humanog porekla ili humanih antitela se takođe mogu upotrebiti i dobro su poznati u oblasti tehnike. U principu, humanizovano ili genetskim inžinjeringom konstruisano antitelo sadrži jedan ili više aminokiselinskih ostataka iz izvora koji nije humanog porekla, npr., ali ne ograničavajući se na, miša, pacova, zeca, primata koji nije čovek ili drugog sisara. Navedeni humani aminokiselinski ostaci se često označavaju kao "importovani" ostaci, a uobičajeno je da se isti uzimaju iz "importovanog" varijabilnog, konstantnog ili drugog domena poznate humane sekvence. Ovde su opisane poznate humane IgG sekvence koje se mogu naći u, npr. brojnim javnim bazama podataka poput NCBI baze Američkog nacionalnog instituta za zdravlje ili u publikacijama kao što je Kabat i saradnici, Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Dept. Health (1983).

[0046] Navedene importovane sekvence se mogu upotrebiti za smanjenje imunogenosti ili smanjenje, poboljšanje ili modifikovanje vezivanja, afiniteta, brzine vezivanja, brzine uklanjanja, aviditeta, specifičnosti, poluživota i bilo kojih drugih pogodnih karakteristika, a kao što je poznato u oblasti tehnike. U pricipu, deo ili celokupne humane ili CDR sekvence koje nisu humanog porekla mogu biti očuvane, dok se sekvence varijabilnih i konstatnih regiona koje nisu humanog porekla mogu zameniti humanim ili drugim aminokiselinama. Antitela takođe opciono mogu biti humanizovana uz zadržavanje visokog afiniteta za antigen, kao i drugih pogodnih bioloških karakteristika. Da bi se postigao navedeni cilj, humanizovana antitela se opciono mogu pripremiti procesom analize originalnih sekvenci i raznih konceptualnih humanizovanih proizvoda upotrebom trodimenzionalnih modela originalnih i humanizovanih sekvenci. Trodimenzionalni modeli imunoglobulina su često dostupni i poznati su stručnjacima iz oblasti tehnike. Na raspolaganju su i kompjuterski programi koji ilustruju i prikazuju verovatne trodimenzionalne konformacione strukture izabranih kandidata imunoglobulinskih sekvenci. Pregled navedenih modela omogućava analizu verovatne uloge aminokiselinskih ostataka u funkcionisanju predložene imunoglobulinske sekvence, odnosno analizu uticaja navedenih ostataka na sposobnost predloženog imunoglobulina da se veže za svoj antigen. Na ovaj način se mogu selektovati i iskombinovati FR ostaci od konsenzusnih i importovanih sekvenci tako da se postignu poželjne karakteristike antitela poput povećanog afiniteta za ciljni anitgen(antigene). U principu, aminokiselinski ostaci CDR regiona su direktno uključeni i suštinski najviše određuju vezivanje antigena. Humanizacija ili genetski inženjering antitela predmetnog pronalaska se može izvesti upotrebom poznatih postupaka kao što su postupci opisani u publikacijama koje slede, ali ne ograničavajući se samo na njih: Jones i saradnici, Nature 321:522 (1986); Riechmann i saradnici, Nature 332:323 (1988); Verhoeyen i saradnici, Science 239:1534 (1988), Sims i saradnici, J. Immunol. 151:2296 (1993); Chothia i Lesk, J. Mol. Biol. 196:901 (1987); Carter i saradnici, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:4285 (1992); Presta i saradnici, J. Immunol. 151:2623 (1993), kao i u SAD patentnim spisima br.5.723.323, 5.976.862, 5.824.514, 5.817.483, 5.814.476, 5.763.192, 5.723.323, 5.766.886, 5.714.352, 6.204.023, 6.180.370, 5.693.762, 5.530.101, 5.585.089, 5.225.539; 4.816.567, i dalje u patentnim spisima PCT/US98/16280, US96/18978, US91/09630, US91/05939, US94/01234, GB89/01334, GB91/01134, GB92/01755; WO90/14443, WO90/14424, WO90/14430, EP 229246.

[0047] Konstantan region humanog porekla u molekulu ciljanog vezivanja koji je ovde opisan može biti bilo koje klase (IgG, IgA, IgM, IgE, IgD, itd.) ili izotipa i može sadržavati kapa ili lambda laki lanac. U jednom primeru primene predmetnog pronalaska, konstantan region sadrži IgG teški lanac ili njegov definisan fragment, na primer, najmanje jedan od izotipova IgG1, IgG2, IgG3 ili IgG4. U drugom primeru primene, molekul ciljanog vezivanja sadrži IgG1 teški lanac i IgG1 K laki lanac. Izolovan molekul ciljanog vezivanja koji je ovde opisan može sadržavati ovde opisanu aminokiselinsku sekvencu antitela koju kodira bilo koji pogodan polinukleotid. Prioritetno, molekul ciljanog vezivanja se vezuje za humani IL-25 i time delimično ili značajno neutrališe najmanje jednu biološku aktivnost proteina. Molekul ciljanog vezivanja ili njegov određen deo ili varijanta, delimično ili, prioritetno, značajno neutrališe najmanje jednu biološku aktivnost najmanje jednog IL-25 proteina ili fragmenta i na taj način inhibira aktivnosti posredovanu vezivanjem IL-25 za IL-25 receptor ili aktivnost posredovanu drugim mehanizmima koji zavise ili su posredovani sa IL-25. U tekstu predmetnog pronalaska, termin "neutrališuće antitelo" se odnosi na antitelo koje može inhibirati aktivnost koja zavisi od IL-25 za približno 20-100%, poželjno za najmanje oko 10, 20, 30, 40, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% ili više, u zavisnosti od tipa analize. Kapacitet molekula ciljanog vezivanja da inhibira aktivnost koja zavisi od IL-25 se prioritetno ispituje upotrebom najmanje jednog pogodnog testa za ispitivanje funkcije IL-25 proteina ili receptora, a kao što je ovde opisano i/ili poznato u oblasti tehnike.

[0048] Najmanje jedno antitelo predmetnog pronalaska se vezuje za najmanje jedan epitop koji je ovde definisan kao epitop za koji se vezuje M6 antitelo. Navedeni najmanje jedan epitop može sadržavati najmanje jedan region vezivanja antitela koji dalje sadrži najmanje jedan deo proteina, pri čemu epitop prioritetno sadrži najmanje jedan vanćelijski, solubilan, hidrofilni, spoljašnji ili citoplazmatski deo proteina. U principu, ovde opisan molekul ciljanog vezivanja sadrži region vezivanja za antigen koji sadrži najmanje jedan region koji određuje komplementarnost (CDR1, CDR2 i CDR3) iz Sekv. sa identif. br.10, 11 i 12 ili varijantu najmanje jedan varijabilni region teškog lanca i najmanje jednog regiona koji određuje komplementarnost (CDR1, CDR2 i CDR3) (SEQ ID NO:6, 7 i 8) ili varijantu najmanje jednog varijabilnog regiona lakog lanca.

[0049] Molekuli ciljanog vezivanja koji se vezuju za humani IL-25 i sadrže definisan varijabilni region ili CDR regione teškog ili lakog lanca se mogu pripremiti upotrebom odgovarajućih postupaka poput ekspresije u fagu (Katsube, Y., i saradnici, Int J. Mol. Med, 1(5):863-868 (1998)) ili postupaka u kojima se koriste transgene životinje, kao što je to poznato u oblasti tehnike i/ili ovde opisano. Na primer, antitelo, specifičan deo ili varijanta se mogu eksprimirati upotrebom odgovarajuće kodirajuće nukleinske kiseline ili njenog dela u pogodnoj ćeliji domaćinu.

[0050] Ovde su takođe opisana antitela, fragmenti koji vezuju antigen, imunoglobulinski lanci i CDR regioni koji sadrže aminokiseline u sekvencama koje su suštinski iste kao aminokiselinske sekvence M6 antitela koje su ovde opisane. Navedena anti-IL-25 antitela mogu sadržavati jednu ili više supstitucija, delecija ili adicija aminokiselina, bilo onih koje se javljaju u prirodi ili nakon humane manipulacije, kao što je ovde definisano. Prioritetno, navedena antitela ili fragmenti koji vezuju antigen, kao i antitela koja sadrže navedene lance ili CDR regione, se mogu vezivati za humani IL-25 sa visokim afinitetom (npr. KDje manja ili približno jednka 10-9 M). Aminokiselinske sekvence koje su suštinski iste kao sekvence koje su ovde opisane, obuhvataju sekvence u kojima su prisutne konzervativne aminokiselinske supstitucije, kao i delecije i/ili insercije. Konzervativna supstitucija aminokiselina se odnosi na zamenu prve aminokiseline drugom aminokiselinom koju karakterišu hemijska i/ili fizička svojstva (npr. naelektrisanje, struktura, polarnost, hidrofobnost/hidrofilnost) slična svojstvima prve aminokiseline. Konzervativne supstitucije podrazumevaju zamenu jedne aminokiseline drugom unutar sledećih grupa: lizin (K), arginin (R) i histidin (H); aspartat (D) i glutamat (E); asparagin (N), glutamin (Q), serin (S), treonin (T), tirozin (Y), K, R, H, D i E; alanin (A), valin (V), leucin (L), izoleucin (I), prolin (P), fenilalanin (F), triptofan (W), metionin (M), cistein (C) i glicin (G); F, W i Y; C, S i T.

[0051] Broj supstitucija aminokiselina koje stručnjak može sprovesti zavisi od mnogo faktora, uključujući i one koji su prethodno opisani. U principu, broj supstitucija, insercija ili delecija aminokiselina u bilo kom navedenom anti-IL-25 antitelu, fragmentu ili varijanti neće biti veći od 40, 30, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ili 1, a može biti i opsega 1-30 ili bilo kog opsega ili vrednostu unutar ovde definisanog okvira.

[0052] Aminokiseline u molekulu ciljanog vezivanja koji je ovde opisan koje su od suštinskog značaja za njegovu funciju, se mogu identifikovati postupcima poznatim u oblasti tehnike kao što su poziciona mutageneza ili alaninskenirajuća mutageneza (npr. Ausubel, navedeno prethodno, Poglavlja 8, 15; Cunningham i Wells, Science 244:1081-1085 (1989)). Drugonavedena procedura podrazumeva uvođenje pojedinačnih mutacija alaninom, redom na svaki aminokiselinski ostatak u molekulu. Potom sledi ispitivanje biološke aktivnosti dobijenog mutiranog molekula poput, ali bez ograničavanja na najmanje jednu neutrališuću aktivnost IL-25. Pozicije koje su bitne za vezivanje antitela se takođe mogu identifikovati strukturnim analizama poput kristalizacije, nuklearne magnetne rezonance ili fotoafinitetnog obeležavanja (Smith i saradnici, J. Mol. Biol.224:899-904 (1992) i de Vos i saradnici, Science 255:306-312 (1992)).

[0053] Molekuli ciljanog vezivanja koji su ovde opisani mogu sadržavati, ali bez ograničavanja na navedeno, najmanje jedan deo, sekvencu ili kombinaciju koja sadrži od 5 do ukupnog broja susednih aminokiselina u okviru najmanje jedne od SEQ ID NOS:5-12.

[0054] Molekul ciljanog vezivanja može dalje opciono sadržavati polipeptid od najmanje 70-100% susednih aminokiselina najmanje jedne od SEQ ID NO:5 ili 9.

[0055] U jednom primeru primene predmetnog pronalaska, aminokiselinska sekvenca imunoglobulinskog lanca ili njegovog dela (npr. varijabilnog regiona, CDR) je približno 70-100% identična (npr.70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100 ili bilo koji opseg ili vrednost u oviru navedenog) aminokiselinskoj sekvenci odgovarajućeg lanca najmanje jedne od SEQ ID NO:5 ili 9. Na primer, aminokiselinska sekvenca varijabilnog regiona lakog lanca se može uporediti sa sekvencom Sekv. ID br: 5 ili se aminokiselinska sekvenca varijabilnog regiona teškog lanca može uporediti sa SEQ ID NO:9. Prioritetno, identičnost aminokiselina od 70-100% (odnosno 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100 ili bilo koji opseg ili vrednost unutar navedenog) se određuje upotrebom odgovarajućeg kompjuterski generisanog algoritma kao što je poznato u oblasti tehnike.

[0056] Primeri sekvenci varijabilnih regiona teškog lanca i lakog lanca su obezbeđeni u vidu SEQ ID NO:5 i 9. Molekuli ciljanog vezivanja koji su ovde opisani, ili njihove specifične varijante, mogu sadržavati bilo koji broj bočnih aminokiselinskih ostataka antitela predmetnog pronalaska, pri čemu je navedeni broj izabran iz grupe celih brojeva u okviru opsega 10-100% od broja bočnih ostataka u molekulu ciljanog vezivanja. Opciono, navedne podsekvence bočnih aminokiselina označavaju najmanje približno 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 200, 210, 220, 230, 240, 250 ili više aminokiselina u dužini ili pak bilo koji oseg ili vrednost unutar navedenog. Dalje, broj navedenih podsekvenci može predstavljati ceo broj izabran iz grup koju čine brojevi od 1 do 20, a kao što je najmanje 2, 3, 4 ili 5.

[0057] Bitno je napomenuti da predmetni pronalazak obuhvata najmanje jedno biološki aktivno antitelo predmetnog pronalaska. Biološki aktivna antitela karakteriše specifična aktivnost od najmanje 20%, 30% ili 40%, prioritetno od najmanje 50%, 60% ili 70%, a najprioritetnije od najmanje 80%, 90%, 95% ili 100% u odnosu na aktivnost nativnog (nesintetskog), endogenog ili srodnog i poznatog antitela. Postupci ispitivanja i kvantifikacije enzimske aktivnosti i specifičnosti supstrata su dobro poznati stručnjacima.

[0058] Ovde su takođe opisani molekuli ciljanog vezivanja koji su modifikovani kovalentnim vezivanjem organske grupe. Navedenom modifikacijom se može proizvesti antitelo ili fragment koji vezuje antigen sa poboljšanim farmakokinetičkim svojstvima (npr. povećanim in vivo poluživotom u serumu). Organska grupa može biti linearna ili razgranata hidrofilna polimerna grupa, grupa masne kiseline ili estarska grupa masne kiseline. U određenim primerima primene, hidrofilna polimerna grupa može biti molekulske težine oko 800 do približno 120000 Daltona i može predstavljati polialkan glikol (npr. polietilen glikol (PEG), polipropilen glikol (PPG)), karbohidratni polimer, polimer aminokiselina ili polivinil pirolidona, a grupa masne kiseline ili estra grupa masne kiseline može sadržavati od približno osam do približno četrdeset atoma ugljenika.

[0059] Modifikovani molekuli ciljanog vezivanja koji su ovde opisani mogu da sadrže jednu ili više organskih grupa koje su direktno ili indirektno kovalentno vezane za antitelo. Svaka organska grupa koja je vezana za antitelo ili fragment koji vezuje antigen predmetnog pronalaska može nezavisno predstavljati hidrofilnu polimernu grupu, grupu masne kiseline ili estarsku grupu masne kiseline. Kao što se ovde upotrebljava, termin "masna kiselina" podrazumeva monokarboksilne i dikarboksilne kiseline. Izraz "hidrofilna polimerna grupa" se ovde upotrebljava da označi organski polimer koji je rastvorljiviji u vodi nego u oktanu. Na primer, polilizin je rastvorljiviji u vodi nego u oktanu. Tako, pronalazak obuhvata antitelo modifikovano kovalentnim vezivanjem polilizina. Hidrofilni polimeri pogodni za modifikovanje antitela predmetnog pronalaska mogu biti linearni ili razgranati i uključuju, na primer, polikalkan glikole (npr. PEG, monometoksi-polietilen glikol (mPEG), PPG i slične), ugljene hidrate (npr. dekstran, celulozu, oligosaharide, polisaharide i slične), polimere hidrofilnih aminokiselina (npr. polilizin, poliarginin, poliaspartat i slične), polialkanske okside (npr. polietilen oksid, polipropilen oksid i slične) i polivinil pirolidon. Prioritetno, hidrofilni polimer za modifikaciju antitela predmetnog pronalaska, kao odvojen molekulski entitet, je molekulske težine od oko 800 do oko 150 000 Daltona. Na primer, moguća je upotreba PEG5000i PEG20.000, pri čemu vrednost indeksa predstavlja prosečnu molekulsku težinu polimera u Daltonima. Hidrofilna polimerna grupa može biti supstituisana sa od jedne do šest alkilnih grupa, grupa masnih kiselina ili estara masnih kiselina. Hidrofilni polimeri supstituisani grupom masne kiseline ili estra masne kiseline mogu biti pripremljeni upotrebom odgovarajućih postupaka. Na primer, polimer koji sadrži amino grupu može biti kuplovan na karboksilat masne kiseline ili estra masne kiseline i aktiviran karboksilat (npr. aktiviran sa N,N-karbonil diimidazolom) masne kiseline ili estra masne kiseline može biti kuplovan na hidroksilnu grupu polimera.

[0060] Masne kiseline i estri masnih kiselina pogodni za modifikacije antitela predmetnog pronalaska mogu biti zasićeni ili mogu sadržavati jednu ili više jedinica nezasićenosti. Masne kiseline pogodne za modifikovanje antitela predmetnog pronalaska uključuju, na primer, n-dodekanoat (C12, laurat), n-tetradekanoat (C14, miristat), n-oktadekanoat (C18, stearat), n-ojkozanoat (C20, arahidat), n-dokozanoat (C22, behenat), n-triakontanoat (C30), n-tetrakontanoat (C40), cis-DELTA9-oktadekanoat (C18, oleat), sve cis-DELTA5,8,11,14-ojkozatetraenoate (C20, arahidonat), oktandionsku kiselinu, tetradekandionsku kiselinu, oktadekandionsku kiselinu, dokozandionsku kiselinu i slične. Pogodni esteri masnih kiselina obuhvataju mono-estre dikarboksilnih kiselina koji sadrže linearnu ili razgranatu nižu alkilnu grupu. Niža alkilna grupa može da sadrži od jednog do približno dvanaest, prioritetno od jednog do šest, atoma ugljenika.

[0061] Modifikovani molekuli ciljanog vezivanja mogu biti pripremljeni upotrebom pogodnih postupaka poput reakcije sa jednim ili sa više agenasa za modifikaciju. Termin "agens za modifikaciju" se ovde odnosi na pogodnu organsku grupu (npr. hidrofilni polimer, masnu kiselinu, estar masne kiseline) koji sadrži aktivirajuću grupu. Termin "aktivirajuća grupa" označava hemijsku strukturu ili funcionalnu grupu koja može, pod odgovarajućim uslovima, reagovati sa drugom hemijskom grupom obrazujući kovalentnu vezu između agensa za modifikaciju i druge hemijske grupe. Na primer, aktivirajuće grupe koje reaguju sa amino grupom podrazumevaju elektrofilne grupe poput tozilata, mezilata, halogenog radikala (radikala hlora, broma, fluora, joda), N-hidroksisukcinimidil estara (NHS) i sličnih. Aktivirajuće grupe koje mogu reagovati sa tiolima uključuju, na primer, maleimid, jodoacetil, akrilolil, piridil disulfide, tiol 5-tiol-2-nitrobenzoeve kiseline (TNB-tiol) i slične. Aldehidna funkcionalna grupa može biti kuplovana na molekule koji sadrže amino ili hidrazidnu grupu, a azidna grupa može reagovati sa trovalentnom fosfornom grupom da bi se obrazovale fosforamidatne ili fosforimidne veze. Odgovarajući postupci uvođenja aktivirajućih grupa u molekule su poznati u struci (pogledati, na primer, Hermanson, G. T., Bioconjugate Techniques, Academic Press: San Diego, Kalifornija (1996)). Aktivirajuća grupa se može direktno vezati za organsku grupu (npr. hidrofilni polimer, masnu kiselinu, estar masne kiseline) ili posredstvom povezujuće grupe, na primer, dvovalentne C1-C12grupe, pri čemu jedan ili više atoma ugljenika može biti zamenjen heteroatomom poput kiseonika, azota ili sumpora. Pogodne povezujuće grupe obuhvataju, na primer, tetraetilen glikol, --(CH2)3--, --NH--(CH2)6--NH--, --(CH2)2--NH-- i -CH2--O--CH2--CH2--O--CH2--CH2--O--CH--NH—grupe. Agensi za modifikaciju koji sadrže povezujuću grupu se mogu pripremiti, na primer, reakcijom mono-Boc-alkildiamina (npr. mono-Boc-etilendiamina, mono-Boc-diaminoheksana) sa masnom kiselinom u prisustvu 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)karbodiimida (EDC) da bi se obrazovala amidna veza između slobodnog amina i karboksilata masne kiseline. Boc zaštitna grupa se može ukloniti iz proizvoda tretmanom sa trifluorosirćetnom kiselinom (TFA) da bi se dobio primarni amin koji se dalje može kuplovati na druge karboksilate kao što je prethodno opisano, ili koji dalje može reagovati sa maleinskim anhidridom da bi se, ciklizacijom dobijenog proizvoda, dobio aktivirani maleimidni derivat masne kiseline (pogledati, na primer, Thompson i saradnici, WO 92/16221).

[0062] Modifikovani molekuli ciljanog vezivanja koji su ovde opisani se mogu pripremiti reakcijom humanog antitela ili fragmenta koji se vezuje za antigen sa agensom za modifikaciju. Na primer, organske grupe se mogu vezati za antitelo na način koji je nezavisan od pozicije, upotrebom agenasa koji reaguje sa aminom, na primer, NHS estrom PEG-a. Modifikovana humana antitela ili fragmenti koji vezuju antigen takođe mogu biti pripremljeni redukcijom disulfidnih veza (npr. intralančanih disulfidnih veza) antitela ili fragmenta koji vezuje antigen. Redukovano antitelo ili fragment koji vezuje antigen može dalje reagovati sa agensom za modifikaciju koji reaguje sa tiolom da se dobilo modifikovano antitelo predmetnog pronalaska. Modifikovana humana antitela i fragmenti koji vezuju antigen i koji sadrže organsku grupu vezanu za specifična mesta u antitelu predmetnog pronalaska se mogu pripremiti upotrebom pogodnih postupaka poput revezne proteolize (Fisch i saradnici, Bioconjugate Chem., 3:147-153 (1992); Werlen i saradnici, Bioconjugate Chem., 5:411-47 (1994); Kumaran i saradnici, Protein Sci. 6 (10):2233-2221 (1997); Itoh i saradnici, Bioorg. Chem., 24(1):59-68 (1996); Capellas i saradnici, Biotechnol. Bioeng., 56(4):456-463 (1997)), kao i postupcima opisanim u publikaciji Hermanson, G. T., Bioconjugate Techniques, Academic Press: San Diego, Kalifornija (1996).

[0063] Molekule ciljanog vezivanja koji se upotrebljavaju u postupcima i kompozicijama koji su ovde opisani, karakteriše vezivanje za IL-25 sa visokim afinitetom i, opciono, niska toksičnost. Preciznije, upotrebljiva se molekul ciljanog vezivanja koji je ovde opisan u kome komponente poput varijabilnog regiona, konstantnog i bočnog regiona, individualno i/ili zajedno, opciono i prioritetno ispoljavaju nisku imunogenost. Molekule ciljanog vezivanja koji se mogu koristiti opciono može karakterisati i njihova sposobnost da se pacijenti tretiraju tokom dužeg vremenskog perioda uz merljivo olakšanje simptoma i nisku i/ili prihvatljivu toksičnost. Niska ili prihvatljiva imunogenost i/ili visok afinitet, kao i druga pogodne karakteristike, mogu doprineti postizanju boljih terapijskih rezultata. "Niska imunogenost" se ovde definiše kao značano povećanje HAHA, HACA ili HAMA odgovora kod manje od približno 75% ili prioritetno manje od približno 50% pacijenata koji su tretirani i/ili kod kojih dolazi do povećanja niskih titara (manje od približno 300, prioritento manje od približno 100, određeno imunoesejem sa duplim antigenom, Elliott i saradnici, Lancet 344: 1125-1127 (1994)).

[0064] Moguća je i upotreba bispecifičnih, heterospecifičnih, heterokonjugovanih ili sličnih antitela koja su monoklonska, humanizovana antitela koja ispoljavaju specifičnosti vezivanja za najmanje dva različita antigena. U navedenom slučaju, jedno od specifičnih vezivanja podrazumeva vezivanje za najmanje jedan IL-25 protein, dok je drugo vezivanje specifično za bilo koji drugi antigen. Postupci pripreme bispecifičnih antitela su poznati u struci. Tradicionalno, rekombinantna proizvodnja bispecifičnih antitela se zasniva na istovremenoj ekspresiji dva para teških i lakih lanaca imunoglobulina, pri čemu dva teška lanca karakterišu različite specifičnosti (Milstein i Cuello, Nature 305: 537 (1983)). Zbog slučajnog asortimana teških i lakih lanaca imunoglobulina, navedeni hibridomi (kvadromi) proizvode potencijalnu mešavinu od 10 različitih molekula antitela od kojih samo jedna ima ispravnu bispecifičnu strukturu. Prečišćavanje navedenog ispravnog molekula, uobičajeno upotrebom koraka afinitetne hromatografije, je prilično zahtevno, a prinos proizvoda je nizak. Slične procedure su prijavljene, npr. u patentnim spisima WO 93/08829, SAD patentnim spisima br. 6.210.668, 6.193.967, 6.132.992, 6.106.833, 6.060.285, 6.037.453, 6.010.902, 5.989.530, 5.959.084, 5.959.083, 5.932.448, 5.833.985, 5.821.333, 5.807.706, 5.643.759, 5.601.819, 5.582.996, 5.496.549, 4.676.980, WO 91/00360, WO 92/00373, EP 03089, kao i u publikacijama Traunecker i saradnici, EMBO J.10:3655 (1991), Suresh i saradnici, Methods in Enzimology 121:210 (1986).

IL-25

[0065] IL-25, poznat u oblasti tehnike i kao IL-17E, je dostupan iz komercijalnih izvora (npr. od firme R&D Systems, MN, USA), ili se može klonirati ili sintetisati na onovu IL-25 sekvenci dostupnih u oblasti tehnike. Sekvenca humanog IL-25 (SEQ ID NO:17) je prikazana na Slici 3. Za proizvodnju antitela ili njihovu upotrebu u imunoanalizama, može biti uptorebljen bilo koji fragment ili kombinacija fragmenata IL-25 proteina (npr. rekombinantni protein IL-25), pre svega fragmenata koji su skraćeni na N-kraju. Na primer, komercijalno dostupni

1

rekombinantni humani IL-25 (IL-17E) sadrži sekvencu zrelog proteina Tyr 33 - Gli 177 (Pristupni broj Q9H293), dok komercijalno dostupan mišiji IL-25 sadrži ostatke Val 17 - Ala 169 mišijeg IL- 17E (Pristupni broj NP_542767).

Molekuli nukleinske kiseline

[0066] Upotrebom informacija koje su ovde obezbeđene, molekul nukleinske kiseline predmetnog pronalaska koji kodira najmanje jedno humanizovano antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen predmetnog pronalaska se može dobiti upotrebom postupaka koji su ovde opisani ili poznati u oblasti tehnike.

[0067] Molekuli nukleinske kiseline predmetnog pronalaska mogu biti u formi RNK, kao što su iRNK, hnRNK, tRNK ili bilo koji drugi oblik, ili pak u formi DNK, uključujući, ali ne ograničavajući se na, cDNK i genomsku DNK dobijenu kloniranjem ili proizvedenu sintetski, kao i bilo koju od navedenih kombinacija. DNK može biti trolančana, dvolančana ili jednolančana ili može predstavljati bilo koju od navedenih kombinacija. Bilo koji deo od najmanje jednog lanca DNK ili RNK može biti kodirajući, poznat i kao kodirajući lanac, ili isti može predstavljati nekodirajući lanac koji se označava i kao "anti-sens" lanac.

[0068] Izolovani molekuli nukleinskih kiselina predmetnog pronalaska mogu podrazumevati molekule nukleinskih kiselina koji sadrže "otvoreni okvir čitanja" (ORF od engl. open reading frame), opciono sa jednim ili sa više introna, poput, ali ne ograničavajući se na, najmanje jednog specifičanog dela najmanje jednog CDR regiona poput CDR1, CDR2 i/ili CDR3 najmanje jednog teškog lanca (npr. SEQ ID NOS:10-12) ili lakog lanca (npr. SEQ ID NOS:6-8); kao i molekule nukleinskih kiselina koji sadrže kodirajuću sekvencu varijabilnog regiona anti-IL-25 antitela (npr. SEQ ID NO:5 ili 9); i molekule nukleinskih kiselina koji sadrže nukleotidnu sekvencu bitno drugačiju od prethodno opisanih sekvenci koje, usled degeneracije genetičkog koda, ipak kodiraju najmanje jedno anti-IL-25 antitelo kao što je ovde opisano i/ili poznato u oblasti tehnike. Naravno, genski kod je dobro poznat u oblasti tehnike. Prema tome, sinteze navedenih varijanti degenerisane nukleinske kiseline koja kodira specifična anti-IL-25 antitela predmetnog pronalaska se smatra rutinskim postupkom za stručnjake iz oblasti. Pogledati npr. prethodno navedenu publikaciju Ausubel i saradnici. Navedene varijante nukleinske kiseline takođe pripadaju području premetnog pronalaska.

[0069] Kao što je ovde naznačeno, molekuli nukleinskih kiselina predmetnog pronalaska koji sadrže nukleinsku kiselinu koja kodira anti-IL-25 antitelo mogu sadržavati, ali bez ograničavanja na, molekule koji pojedinačno kodiraju aminokiselinsku sekvencu fragmenta antitela; kodirajuću sekvencu celokupnog antitela ili njegovog dela; kodirajuću sekvencu celokupnog antitela, njegovog fragmenta ili dela, kao i dodatne sekvence poput kodirajuće sekvence najmanje jednog signalnog ili fuzionog peptida, sa ili bez prethodno navednih dodatnih kodirajućih sekvenci poput najmanje jednog introna, zajedno sa dodatnim nekodirajućim sekvencama, uključujući, ali ne ograničavajući se na, nekodirajuće 5’ i 3' sekvence poput transkribovane, netranslatirajuće sekvence sa ulogom u transkripciji, obradi iRNK, kao i signale za obradu i poliadenilaciju RNK (na primer – za vezivanje za ribozom i stabilnost iRNK); dodatne su i kodirajuće sekvence koje kodiraju dodatne aminokiseline poput onih koje obezbeđuju dodatne funkcionalnosti. Stoga, sekvenca koja kodira antitelo može biti fuzionisana sa markerskom sekvencom kao što je kodirajuća sekvenca za peptid koji olakšava prečišćavanje fuzionog antitela koje sadrži fragment ili deo antitela.

Polinukleotidi koji selektivno hibridizuju sa polinukleotidom

[0070] Predmetni pronalazak obezbeđuje izolovane nukleinske kiseline koje, u striktnim uslovima, hibridizuju sa polinukleotidima koji su ovde opisani. Prema tome, polinuklotidi predmetnog primera primene se mogu upotrebiti za izolaciju, detekciju i/ili kvantifikaciju nukleinskih kiselina koje sadrže navedene polinukleotide. Na primer, polinukleotidi predmetnog pronalaska mogu biti upotrebljeni za identifikaciju, izolaciju ili umnožavanje parcijalnih ili klonova punih dužina u deponovanoj biblioteci. U pojednim primerima primene, polinukleotidi predstavaljaju izolovane genomske ili cDNK sekvence ili sekvence koje su na drugi način komplementarne cDNK iz biblioteke nukleinskih kiselina čoveka ili sisara.

[0071] Prioritetno, cDNK biblioteka sadrži najmanje 80% sekvenci pune dužine, prioritetnije najmanje 85% ili 90% sekvenci pune dužine, a još poželjnije najmanje 95% sekvenci pune dužine. Biblioteke cDNK mogu biti normalizovane da bi se povećala prezentacija retkih sekvenci. Uslovi hibridizacije niske ili umerene striktnosti se uobičajeno, ali ne isključivo, upotrebljavaju prilikom hibridizacije sekvenci sa redukovanim identitetom u odnosu na komplementarne sekvence. Umereno i visoko striktni uslovi se opciono mogu upotrebljavati za sekvence većeg identiteta. Uslovi niske striktnosti dozvoljavaju selektivnu hibridizaciju sekvenci koje su identične približno 70%, čime je moguća njihova upotreba u identifikaciji ortolognih i paralognih sekvenci.

[0072] Opciono, polinukleotidi koji su ovde opisani će kodirati najmanje deo antitela kodiranog polinukleotidima koji su ovde opisani. Polinukleotidi predmetnog pronalaska obuhvataju i sekvence nukleinskih kiselina koje se mogu upotrebiti za selektivnu hibridizaciju sa polinukleotidom koji kodira antitelo predmetnog pronalaska. Pogledati npr. prethodno navedene publikacije Ausubel i saradnici; Colligan.

Sinteza nukleinskih kiselina

[0073] Izolovane nukleinske kiseline predmetnog pronalaska se mogu pripremiti upotrebom (a) rekombinantnih postupaka, (b) sintetskih tehnika, (c) tehnika prečišćavanja, kao i njihovim kombinacijama, što je dobro poznato u oblasti tehnike.

[0074] Nukleinske kiseline konvencionalno mogu sadržavati dodatne sekvence pored polinukleotida predmetnog pronalaska. Na primer, u nukleinsku kiselinu može biti uvedeno višeznačno mesto kloniranja koje sadrži jedno ili više endonukleaznih restrikcionih mesta da bi se potpomogla izolacija polinukleotida. Takođe, moguće je i uvođenje sekvenci koje se mogu translatirati da bi se olašala izolacija translacijom prevedenih polinukleotida predmetnog pronalaska. Na primer, markerska sekvenca od šest histidina obezbeđuje pogodno sredstvo za prečišćavanje proteina predmetnog pronalaska. Nukleinska kiselina predmetnog pronalaska – ne uzimajući u obzir kodirajuću sekvencu - opciono može uključivati vektor, adaptersku ili linkersku sekvencu za kloniranje i/ili ekspresiju polinukleotida predmetnog pronalaska.

[0075] Dodatne sekvence se mogu nadovezati na navedene sekvence za kloniranja i/ili ekspresiju kako bi se optimizovala njihova funkcija prilikom kloniranja i/ili ekspresije i potpomogla izolacija polinukleotida, ili da bi se poboljšalo uvođenje polinukleotida u ćeliju. Upotreba klonirajućih vektora, ekspresionih vektora, adapterskih i linkerskih sekvenci je dobro poznata u oblasti tehnike (pogledati npr. prethodno navedene publikacije Ausubel i saradnici; Sambrook).

Postupci rekombinantne sinteze nukleinskih kiselina

[0076] Kompozicije izolovanih nukleinskih kiselina predmetnog pronalaska, kao što su RNK, cDNK, genomska DNK ili bilo koja od njihova kombinacija, se mogu dobiti iz bioloških izvora upotrebom bilo koje od brojnih metodologija kloniranja koje su dobro poznate stručnjacima iz oblasti tehnike. U pojedinim primerima primene premetnog pronalaska, oligonukleotidne probe koje selektivno hibridizuju, pod striktnim uslovima, sa polinukleotidima predmetnog pronalaska se upotrebljavaju za identifikaciju željenih sekvenci u cDNK ili genomskoj DNK biblioteci. Izolacija RNK, sinteza cDNK i genomskih biblioteka su takođe postuci koji su dobro poznati prosečno iskusnim stručnjacima (pogledati npr. prethodno navedene publikacije Ausubel i saradnici; Sambrook).

Brz pregled nukleinskih kiselina i postupci izolacije

[0077] Brzo pregledavanje (skrining) cDNK ili genomske biblioteke se može sprovesti upotrebom proba koje su sintetisane na osnovu sekvence polinukleotida predmetnog pronalaska kao što su probe koje su ovde opisane. Probe se mogu upotrebiti za hibridizaciju sa genomskim DNK ili sa cDNK sekvencama zarad izolacije homolognih gena u istim ili različitim organizmima. Za stručnjake je bitna napomena da se u ispitivanjima mogu upotrebiti različiti stepeni striktnosti uslova hibridizacije; kao i da medijum za hibridizaciju ili za ispiranje može određivati striktnost uslova hibridizacije. Što su uslovi hibridizacije striktniji, mora postojati veći stepen komplementarnosti probe i ciljnog molekula da bi se ostvarilo obrazovanje dvolančane strukture. Stepen striktnosti hibridizacije se može postići kontrolom jednog ili više faktora poput temperature, jonske jačine, pH i prisustva delimično denaturišućeg rastvarača kao što je formamid. Na primer, striktnost hibridizacije se uobičajeno podešava promenom polarnosti reaktantskog rastvora putem, na primer, promene koncentracije formamida u opsegu od 0% do 50%. Stepen komplementarnosti (identiteta sekvenci) potreban za vezivanje probe koje je moguće detektovati je različit, u zavisnosti od striktnosti hibridizacionog medijuma i/ili medijuma za ispiranje. Stepen komplementarnosti optimalno iznosi 100%, ili pak od 70 do 100%, a može predstavljati i bilo koji opseg ili vrednosti unutar navedenog raspona. Ipak, podrazumeva se da se manje varijacije u probama i prajmerima mogu kompenzovati smanjenjem striktnosti medijuma za hibridizaciju i/ili ispiranje.

[0078] Postupci umnožavanja RNK ili DNK su dobro poznati u oblasti tehnike i mogu se upotrebljavati u skladu sa predmetnim pronalaskom bez nepotrebnog eksperimentisanja, a na osnovu primera i uputstava koji su ovde navedeni. Poznati postupci amplifikacije DNK ili RNK obuhvatalu, ali se ne ograničavaju na, lančanu reakciju polimeraze (PCR) i srodne procese amplifikacije (pogledati npr. Patentne spise SAD br. 4.683.195, 4.683.202, 4.800.159, 4.965.188, Mullis i saradnici; Patentne spise SAD br. 4.795.699 i 4.921.794, Tabor i saradnici; SAD patentni spis br. 5.142.033, Innis; SAD patentni spis br. 5.122.464, Wilson i saradnici; SAD patentni spis br.

5.091.310, Innis; SAD patentni spis br. 5.066.584, Gyllensten i saradnici; SAD patentni spis br. 4.889.818, Gelfand i saradnici; SAD patentni spis br. 4.994.370, Silver i saradnici; SAD patentni spis br. 4.766.067, Biswas; SAD patentni spis br. 4.656.134, Ringold), kao i amplifikaciju posredovanu sa RNK u kojoj se kao matrica za sintezu dvolančane DNK upotrebljava anti-sens RNK lanac ciljne sekvence (SAD patentni spis br. 5.130.238, Malek i saradnici, zaštićen naziv NASBA) (pogledati npr. prethodno navedene publikacije Ausubel i saradnici; Sambrook).

[0079] Na primer, tehnologija lančane reakcije polimeraze (PCR) se može upotrebiti za amplifikaciju sekvenci polinukleotida predmetnog pronalaska i srodnih gena direktno iz biblioteka genomske DNK ili cDNK. PCR i drugi in vitro postupci amplifikacije takođe mogu biti od koristi, na primer, za kloniranje sekvenci nukleinskih kiselina koje kodiraju proteine koje je potrebno eksprimirati, odnosno da bi se proizvele nukleinske kiseline koje se mogu upotrebiti kao probe za detekciju prisustva željene iRNK u uzorcima, ali i za sekvenciranje nukleinskih kiselina ili u druge svrhe. Dovoljno primera same tehnike zarad upućivanja stručnjaka u detalje in vitro postupaka amplifikacije se može naći u prethodno navedenim publikacijama Berger; Sambrook; i Ausubel; kao i u: Mullis i saradnici, SAD patentni spis br. 4,683,202 (1987); Innis, i saradnici, PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, izd. Academic Press Inc., San Diego, Kalifornija (1990). Komercijalno dostupni kompleti za genomsku PCR amplifikaciju su poznati u oblasti tehnike. Pogledati, na primer, Advantage-GC Genomic PCR Kit (Clontech). Pored toga, moguća je i upotreba proteina 32 T4 gena (Boehringer Mannheim) zarad poboljšanja prinosa PCR proizvoda velike dužine.

Postupci hemijke sinteze za konstrukciju nukleinskih kiselina

[0080] Izolovane nukleinske kiseline predmetnog pronalaska se takođe mogu pripremiti direktnom hemijskom sintezom, upotrebom poznatih postupaka (pogledati npr. prethodno navedenu publikaciju Ausubel i saradnici). Hemijskom sintezom se u principu proizvode jednolančani oligonukleotidi koji se dalje mogu prevesti u dvolančanu DNK hibridizacijom sa komplementarnom sekvencom, ili pak polimerizacijom sa DNK polimerazom na osnovu jednolančane DNK kao matrice. Potrebna je ipak napomena da je hemijska sinteza DNK ograničena na sekvence od oko 100 ili više baza i da se duže sekvence se mogu dobijati ligacijom kraćih sekvenci.

Rekombinantne ekspresione kasete

[0081] Predmetni pronalazak dalje obezbeđuje rekombinantne ekspresione kasete koje sadrže nukleinsku kiselinu predmetnog pronalaska. Sekvenca nukleinske kiseline predmetnog pronalaska, na primer cDNK ili genomska sekvenca koja kodira antitelo predmetnog pronalaska, se može upotrebiti za konstrukciju rekombinantne ekspresione kasete koja se dalje može uvesti u najmanje jednu željenu ćeliju domaćina. Rekombinantna ekspresiona kaseta uobičajeno sadrži polinukleotid predmetnog pronalaska operativno vezan za regulatorne sekvence inicijacije transkripcije koje omogućavaju transkripciju polinukleotida u željenoj ćeliji domaćinu. Kao regulatorne sekvence koje omogućavaju ekspresiju nukleinskih kiselina predmetnog pronalaska se mogu upotrebiti i heterologni i neheterologni (tj. endogeni) promotori.

[0082] U pojedinim primerima primene predmetnog pronalaska, izolovane nukleinske kiseline koje mogu poslužiti kao promotori, pojačivači ili drugi regulatorni elementi se mogu uvesti na odgovarajuću poziciju (ushodno, nishodno ili unutar introna) u neheterologni oblik polinukleotida predmetnog pronalaska tako se poveća ili smanji ekpresija polinukleotida predmetnog pronalaska. Na primer, endogeni promotori mogu biti izmenjeni in vivo ili in vitro upotrebom mutacije, delecije i/ili supstitucije.

Vektori i ćelije domaćini

[0083] Predmetni pronalazak se odnosi i na vektore koji sadrže izolovane molekule nukleinskih kiselina predmetnog pronalaska, ćelije domaćine koje su genetski izmenjene upotrebom rekombinantnih vektora, kao i na proizvodnju najmanje jednog anti-IL-25 antitela rekombinantnim tehnikama koje su dobro poznato u oblasti tehnike. Pogledati npr. prethodno navedene publikacije Sambrook i saradnici; Ausubel i saradnici.

[0084] Polinukleotidi opciono mogu biti povezani sa vektorom koji sadrži selektivni marker umnožavanja u domaćinu. U principu, plazmidni vektor se uvodi u ćeliju domaćina u vidu precipitata poput precipitata kalcijum fosfata, ili u vidu kompleksa sa naelektrisanim lipidom. Ukoliko vektor predstavlja virus, on se može upakovati in vitro, upotrebom odgovarajuće ćelijske linije za pakovanje i kao takav uvesti postupkom transdukcije u ćelije domaćine.

[0085] Insertovana DNK bi trebala da bude operativno povezana sa odgovarajućim promotorom. Ekspresioni konstrukti dalje treba da sadrže mesta inicijacije transkripcije, zaustavljanja transkripcije, kao i, unutar traskribovanog regiona, mesto vezivanje za ribozom zarad translacije. Kodirajući deo zrelog transkripta koga eksprimira konstrukt bi prioritetno trebao da sadrži kodon inicijacije traslacije na početku i kodon završetka translacije (npr. UAA, UGA ili UAG) odgovarajuće pozicioniran na kraju iRNK koja se traslatira, pri čemu se za ekspresiju u ćelijama sisara ili eukariota prioritetnim smatraju kodoni UAA i UAG.

[0086] Poželjno je, mada je opciono, da ekspresioni vektori sadrže najmanje jedan selektivni marker. Navedeni markeri podrazumevaju na primer, ali nisu ograničeni na, gene rezistencije na metotreksat (MTX), dihidrofolat reduktazu (DHFR, SAD patentni spisi br. 4.399.216; 4.634.665; 4.656.134; 4.956.288; 5.149.636; 5.179.017), ampicilin, neomicin (G418), mikofenolnu kiselinu ili glutamin sintetazu (GS, SAD patentni spisi br. 5.122.464; 5.770.359; 5.827.739) u kulturama eukariotskih ćelija, dok u kulturama ćelija E.coli i drugih bakterija i prokariota ovakvi markeri označavaju gene rezistencije na tetraciklin ili ampicilin. Odgovarajući medijumi za kulturu ćelija i uslovi gajenja prethodno navedenih ćelija domaćina su poznati u oblasti tehnike. Pogodni vektori će takođe biti očigledni stručnjacima. Uvođenje vektorskog konstrukta u ćeliju domaćina se može izvršiti putem transfekcije kalcijum fosfatom, transfekcije posredovane DEAE-dekstranom, transfekcije posredovane katjonskim lipidom, elektroporacije, transdukcije, infekcije ili upotrebom drugih poznatih postupaka. Navedeni postupci su opisani u oblasti tehnike, na primer u prethodno navedenim publikacijama Sambrook i saradnici, poglavlja 14, 16-18; Ausubel i saradnici, poglavlja 1, 9, 13, 15, 16.

[0087] Najmanje jedno antitelo predmetnog pronalaska se može eksprimirati u modifikovanom obliku kao što je fuzioni protein, a koje može sadržavati ne samo signale sekrecije već i dodatne heterologne funkcionalne regione. Na primer, na N-kraj antitela može biti dodat region dodatnih aminokiselina, pre svega naelektrisanih aminokiselina, kako bi se poboljšala stabilnost i perzistencija u ćeliji domaćinu prilikom prečišćavanja ili tokom naknadnog rukovanja i skladištenja antitela. Takođe, peptidni ostaci se mogu dodati na antitelo predmetnog pronalaska da bi se olakšalo njegovo prečišćavanje. Navedeni regioni se mogu ukloniti pre finalne pripreme antitela ili najmanje jednog njegovog fragmenta. Navedeni postupci su opisani u mnogim standardnim laboratorijskim priručnicima poput Sambrook, prethodno naveden, poglavlja 17.29 - 17.42 i 18.1 - 18.74; Ausubel, prethodno naveden, poglavlja 16, 17 i 18.

[0088] Prosečno iskusnim stručnjacima su poznati brojni ekspresioni sistemi dostupni za ekspresiju nukleinske kiseline koja kodira protein predmetnog pronalaska.

1

[0089] Alternativno, nukleinske kiseline predmetnog pronalaska se mogu eksprimirati u ćeliji domaćinu aktivacijom (manipulacijom) ćelije domaćina koja sadrži endogenu DNK koja kodira antitelo predmetnog pronalaska. Navedeni postupci su dobro poznati u oblasti tehnike, npr. opisani su u SAD patentnim spisima br.

5.580.734, 5.641.670, 5.733.746 i 5.733.761.

[0090] Ilustrativni primeri tipova ćelija koje se mogu upotrebiti za proizvodnju antitela, njihovih određenih delova ili varijanti, su ćelije sisara. Sisarski ćelijski sistemi su najčešće u vidu ćelija u jednom sloju, iako se mogu upotrebljavati i suspenzije sisarskih ćelija ili bioreaktori. U oblasti tehnike je razvijen veliki broj odgovarajućih linija ćelija domaćina koje su sposobne da eksprimiraju intaktne glikozilovane proteine, uključujući, COS-1 (npr. ATCC CRL 1650), COS-7 (npr. ATCC CRL-1651), HEK293, BHK21 (npr. ATCC CRL-10), CHO (npr. ATCC CRL 1610) i BSC-1 (npr. ATCC CRL-26) ćelijske linije, kao i Cos-7 ćelije, CHO ćelije, hep G2 ćelije, P3X63Ag8.653, SP2/0-Ag14, 293 ćelije, HeLa ćelije i slične, koje su lako dostupne, na primer, od firme American Type Culture Collection, Manassas, Va. (www.atcc.org). Prioritetno, ćelije domaćini označavaju ćelije limfoidnog porekla kao što su ćelije mijeloma i limfoma. Posebno prioritetne ćelije domaćini su P3X63Ag8.653 ćelije (ATCC pristupni broj CRL-1580) i SP2/0-Ag14 ćelije (ATCC pristupni broj CRL-1851). U posebno prioritetnom primeru primene predmetnog pronalaska, rekombinantna ćelija označava ćeliju P3X63Ab8.653 ili SP2/0-Ag14.

[0091] Ekspresioni vektori za navedene ćelije mogu podrazumevati jednu ili više od sledećih regulatornih sekvenci ekspresije kao što su, bez ograničavanja na, mesto početka replikacije; promotor (npr. kasni ili rani SV40 promotori, CMV promotor (SAD patentni spisi br. 5.168.062; 5.385.839), HSVtk promotor, promotor pgk (fosfoglicerat kinaze), EF-1 alfa promotor (SAD patentni spis br. 5.266.491), najmanje jedan promotor imunoglobulina čoveka; pojačivač ("enhenser") i/ili mesto obrade informacija poput mesta vezivanja za ribozom, mesta obrade RNK, poliadenilaciona mesta (npr. SV40 mesto adicije dugog T Ag poli A lanca) i sekvence završetka transkripcije. Pogledati npr. prethodno navedene publikacije Ausubel i saradnici; Sambrook, i saradnici. Druge ćelije pogodne za proizvodnju nukleinskih kiselina ili proteina predmetnog pronalaska su poznate i/ili dostupne, na primer, iz kataloga ćelijskih linija i hibridoma firme American Type Culture Collection (www.atcc.org) ili iz drugih poznatih ili komercijalnih izvora.

[0092] Kada se upotrebljavaju eukariotske ćelije domaćini, uobičajeno je da su mesta poliadenlacije ili sekvence završetka transkripcije ugrađene u vektor. Primer sekvence za završetak transkripcije predstavlja poliadenilaciona sekvenca gena za hormona rasta govečeta. Moguće je uključiti i sekvence za preciznu obradu transkripta. Primer sekvenci obrade je VP1 intron iz SV40 (Sprague i saradnici, J. Virol. 45:773-781 (1983)). Dodatno, u vektor se mogu uključiti genske sekvence za kontrolu replikacije u ćeliji domaćinu kao što je to poznato u oblasti tehnike.

Kompozicije

[0093] Ovde je takođe opisana najmanje jedna kompozicija molekula ciljanog vezivanja koja sadrži najmanje jedan, najmanje dva, najmanje tri, najmanje četiri, najmanje pet, najmanje šest ili više molekula ciljanog vezivanja, kao što je ovde opisano i/ili poznato u oblasti tehnike, a da bi se obezbedile kompozicije, smeše i oblici koji nisu prisutni u prirodi. Procenti navedenih kompozicija su izraženi težinski, po zapremini, koncentraciji, molaritetu ili molalitetu i mogu biti vidu tečnih ili suvih rastvora, smeša, suspenzija, emulzija ili koloida, kao što je poznato u oblasti tehnike ili ovde opisano.

[0094] Kompozicije predmetnog pronalaska mogu dalje sadržavati najmanje jednu od bilo koje pogodne i efikasne količine kompozicije illi farmaceutske kompozicije koja sadrži najmanje jedan molekul ciljanog vezivanja za IL-25 u ćeliji, tkivu, organu, životinji ili pacijentu kojima je ovakva tip modulacije, lečenja ili terapije potreban, a opciono sadrži i najmanje jedan dodatni agens izabran iz grupe koju čine TNF antagonista (npr, ali ne ograničavajući se na, anti-TNF antitelo ili fragment, solubilni TNF receptor ili fragment, njegove fuzione proteine ili antagonistu TNF-a koji predstavlja mali molekul), antireumatici (npr. metotreksat, auranofin, aurotioglukoza, azatioprin, etanercept, zlato natrijum tiomalat, hidroksihlorokin sulfat, leflunomid, sulfasalzin), relaksant mišića, narkotik, nesteroidni anti-inflamatorni lek (NSAID), analgetik, anestetik, sedativ, lokalni anetetik, neuromuskularni blokator, antimikrobni agens (npr. aminoglikozid, antifungicid, antiparazitik, antivirusni agens, karbapenem, cefalosporin, flurorhinolon, makrolid, penicilin, sulfonamid, tetraciklin, drugi antimikrobni agensi), antipsoriatik, kortikosteroid, anabolički steroid, agens za lečenje dijabetesa, mineral, nutritivni agens, tiroidni agens, vitamin, hormon vezan za metabilizam kalcijuma, antidijaretik, antitusiv, antiemetik, antiulcerativ, laksativ, antikoagulans, eritropieitin (npr. epoetin alfa), filgrastim (npr. G-CSF, Neupogen), sargramostim (GM-CSF, Leukin), imunizacioni agens, imunoglobulin, imunosupresiv (npr. baziliksimab, ciklosporin, daklizumab), hormon rasta, supstituent hormona, modulator estrogenskog receptora, midriatik, cikloplegik, alkilirajući agens, antimetabolit, mitotski inhibitor, radiofarmaceutik, antidepresiv, antimanični agens, antipsihotik, anksiolitik, hipnotik, simpatomimetik, stimulans, donepezil, takrin, lek za astmu, beta agonista, inhalatorni steroid, inhibitor leukotriena, metilksantin, kromolin, epinefrin ili njegov analog, dornaza alfa (Pulmozyme), citokin ili antagonista citokina. Neograničavajući primeri navedenih citokina obuhvataju, ali nisu ograničeni na, bilo koji od interleukina od IL-1 do IL-23. Odgovarajuće doze su dobro poznate u oblasti tehnike. Pogledati npr. Wells i saradnici, Pharmacotherapy Handbook, 2. izdanje, Appleton i Lange, Stamford, Conn. (2000); PDR Pharmacopoeia, Tarascon Pocket Pharmacopoeia 2000, deluks izdanje, Tarascon Publishing, Loma Linda, Kalifornija (2000).

[0095] Navedeni agensi za lečenje kancera ili anti-infektivni agensi takođe mogu sadržavati molekule toksina koji su asocirani, vezani, koformulisani ili zajedno primenjeni sa najmanje jednim antitelom predmetnog pronalaska. Toksin opciono može delovati tako da selektivno ubija patološku ćeliju ili tkivo. Patološka ćelija može biti ćelija kancera ili druga ćelija. Navedeni toksini mogu predstavljati, ali nisu ograničeni na, prečišćene ili rekombinantne toksine ili fragmente toksina koji sadrže najmanje jedan funkcionalni citotoksični domen toksina, npr. izabran iz grupe koju čine ricin, toksin difterije, toksin životinjskog porekla ili bakterijski toksin. Termin toksin takođe podrazumeva i endotoksine i egzotoksine proizvedene od strane bilo kojih od bakterija ili virusa koji postoje u prirodi ili su mutirani ili rekombinantni, a koji kod ljudi i drugih sisara mogu izazvati bilo kakvo patološko stanje, uključujući toksični šok koji može dovesti do smrti. Navedeni toksini mogu podrazumevati, ali se ne ograničavaju na, enterotoksigeni termolabilan enterotoksin E.coli (LT), termostabilan enterotoksin (ST), citotoksin Shigella-e, enterotoksine Aeromonas-a, toksin-1 sindroma toksičnog šoka (TSST-1), stafilokokni enterotoksin A (SEA), B (SEB) ili C (SEC), streptokokne enterotoksine i slične. Navedene bakterije podrazumevaju, ali nisu ograničene na, sojeve vrsta enterotoksigenih E. coli (ETEC), enterohemoragičnih E. coli (npr. sojevi serotipa 0157:H7), vrste roda Staphilococcus (npr. Staphilococcus aureus, Staphilococcus pyogenes), vrste roda Shigella (npr. Shigella dysenteriae, Shigella flexneri, Shigella boydii i Shigella sonnei), vrste roda Salmonella (npr. Salmonella typhi, Salmonella cholera-suis, Salmonella enteritidis), vrste roda Clostridium (npr. Clostridium perfringens, Clostridium dificile, Clostridium botulinum), vrste roda Camphlobacter (npr. Camphlobacter jejuni, Camphlobacter fetus), vrste roda Heliobacter, (npr. Heliobacter pylon), vrste roda Aeromonas (npr. Aeromonas sobria, Aeromonas hydrophila, Aeromonas caviae), Pleisomonas shigelloides, Yersina enterocolitica, vrste roda Vibrios (npr. Vibrios cholerae, Vibrios parahemolyticus), vrste roda Klebsiella, Pseudomonas aeruginosa i vrste roda Streptococci. Pogledati npr. Stein, izd. INTERNAL MEDICINE, 3. izdanje, str. 1-13, Little, Brown and Co., Boston, (1990); Evans i saradnici, izd. Bacterial Infections of Humans: Epidemiology and Control, 2. izdanje, str.239-254, Plenum Medical Book Co., Njujork (1991); Mandell i saradnici, Principles and Practice of Infectious Diseases, 3. izdanje, Churchill Livingstone, N.Y. (1990); Berkow i saradnici, izd. The Merck Manual, 16. izdanje, Merck i Co; Rahway, N.J., 1992; Wood i sardnici, FEMS Microbiology Immunology, 76:121-134 (1991); Marrack i saradnici, Science, 248:705-711 (1990).

[0096] Kompozicije predmetnog pronalaska mogu dalje sadržavati najmanje jedan od bilo kojih pogodnih pomoćnih sredstava kao što su, ali ne ograničavajući se na, agens za razblaživanje, agens za povezivanje, stabilizator, puferi, soli, lipofilni rastvarači, konzervansi, adjuvans ili slični. Prioritetnim se smatraju farmaceutski prihvatljiva pomoćna sredstva. Neograničavajući primeri navedenih agenasa, kao i posutpaka pripreme navedenih sterilnih rastvora su dobro poznati u oblasti tehnike, kao što su, ali ne ograničavajući se na, agensi opisani u pubikaciji Gennaro, izd. Remington's Pharmaceutical Sciences, 18. izdanje, Mack Publishing Co. (Easton, Pa.) 1990. Farmaceutski prihvatljivi nosači mogu biti rutinski izabrani tako da budu pogodni za odgovarajući način primene, rastvorljivost i/ili stabilnost kompozicije sa anti-IL-25 molekulom ciljanog vezivanja, njegovim fragmentom ili varijantom, kao što je to poznato u oblasti tehnike ili ovde opisano.

[0097] Farmaceutski eksipijensi i aditivi koji se mogu upotrebiti u pripremi kompozicija predmetnog označavaju, ali nisu ograničeni na, proteine, peptide, aminokiseline, lipide i ugljene hidrate (npr. šećere, uključujući monosaharide, di-, tri-, tetra- i oligosaharide; derivatizovane šećere poput alditola, aldonske kiseline, esterifikovanih šećera i sličnih; i polisaharide ili polimere šećera) koji mogu biti prisutni pojedinačno ili u kombinaciji sa težinskom ili zapreminskom zastupljenošću u procentu od 1 do 99,99%, pojedinačno ili u kombinaciji. Primeri proteinskih ekscipijenasa su serumski albumin poput humanog albumina seruma (HSA), rekombinantnog humanog albumina (rHA), želatina, kazeina i sličnih. Reprezentativne komponente aminokiselina/antitela koje mogu uticati i na kapacitet puferisanja, podrazumevaju alanin, glicin, arginin, betain, histidin, glutaminsku kiselinu, asparaginsku kiselinu, cistein, lizin, leucin, izoleucin, valin, metionin, fenilalanin, aspartam i slične. Jedna od najprioritetnijih aminokiselina je glicin.

[0098] Ugljenohidratni ekscipijensi pogodni za upotrebu u predmetnom pronalasku obuhvataju, na primer, monosaharide poput fruktoze, maltoze, galaktoze, glukoze, D-manoze, sorboze i sličnih; disaharide poput laktoze, saharoze, trehaloze, celobioze i sličnih; polisaharide poput rafinoze, melezitoze, maltodekstrina, dekstrana, skrobova i sličnih; i alditole poput manitola, ksilitola, maltitola, laktitola, ksilitol sorbitola (glucitola), mioinozitola i sličnih. Prioritetni ugljenohidratni ekscipijensi za upotrebu u predmetnom pronalasku su manitol, trehaloza i rafinoza.

[0099] Kompozicije predmetnog pronalaska mogu takođe sadržavati pufere ili agense za podešavanje pH; uobičajeno je da pufer označava so pripremljenu od organske kiseline ili baze. Reprezentativni puferi obuhvataju soli organskih kiselina poput soli limunske kiseline, askorbinske kiseline, glukonske kiseline, karbonske kiseline, vinske kiseline, sukcinske kiseline, sirćetne kiseline ili ftalne kiseline; Tris, trometamin hidrohlorid ili fosfatni pufere. Prioritetni puferi za upotrebu u kompozicijama predmetnog pronalaska su soli organskih kiselina poput citrata.

[0100] Pored navedenog, kompozicije predmetnog pronalaska mogu sadržavati i polimerne ekscipijense/aditive kao što su polivinilpirolidoni, fikoli (polimerni šećer), dekstrati (npr. ciklodekstrini poput 2-hidroksipropil-betaciklodekstrina), polietilen glikoli, sredstva za ukus, antimikrobni agensi, zaslađivači, antioksidansi, antistatički agensi, surfaktanti (npr. polisorbati poput "TWEEN 20" i "TWEEN 80" agenasa), lipidi (npr. fosfolipidi, masne kiseline), steroidi (npr. holesterol) i helatorni agensi (npr. EDTA).

[0101] Navedeni i drugi poznati farmaceutski ekscipijensi i/ili aditivi pogodni za upotrebu u pripremi kompozicija predmetnog pronalaska su poznati u oblasti tehnike, npr. kao što je navedeno u publikacijama "Remington: The Science & Practice of Pharmacy", 19. izdanje, Williams & Williams, (1995), kao i "Physician’s Desk Reference", 52. izdanje, Medical Economics, Montvale, N.J. (1998). Prioritetni nosači ili ekscipijensni materijali su ugljeni hidrati (npr. saharidi i alditoli) i puferi (npr. citrat) ili polimerni agensi.

1

Terapijske primene

[0102] Ovde je takođe opisan postupak prevencije ili redukcije prekomernog odgovora disajnih puteva kod subjekta kod koga postoji potreba za lečenjem (npr. čoveka), postupak koji obuhvata primenu molekula ciljanog vezivanja subjektu, pre svega molekula antitela koje vezuje IL-25. Ovde je opisan i postupak prevencije, redukcije ili lečenja astme kod subjekta kod koga postoji potreba za lečenjem, postupka koji obuhvata primenu molekula ciljanog vezivanja subjektu, pre svega molekula antitela koje vezuje IL-25. Astma obuhvata i alergijsku astmu.

[0103] Prethodno navedeni postupci se mogu sprovesti upotrebom molekula ciljanog vezivanja (uključujući njihove kompozicije) koji su ovde opisani i koji su korisni za vezivanje i poželjno antagonizaciju delovanja IL25, obzirom da isti ispoljavaju značajan terapijski potencijal kod različitih oboljenja i poremećaja u kojima se pretpostavlja značajna uloga IL-25. Pored astme, ovakva oboljenja podrazumevaju i druga stanja koja su asocirana sa inflamacijom, poput inflamatorne bolesti creva (IBD), npr. Kronove bolesti i ulcerativnog kolitisa. Postupci se takođe mogu sprovesti upotrebom drugih molekula ciljanog vezivanja (uključujući njihove kompozicije) koji vezuju IL-25 i koji se mogu dobiti kao što je opisano u nastavku teksta u okviru pridruženih primera.

[0104] Molekuli ciljanog vezivanja (uključujući njihove kompozicije) koji su ovde opisani se mogu upotrebiti u postupku lečenja (uključujući profilaktičko lečenje) ili dijagnoze kod ljudi ili životinja. Navedeni postupak lečenja ili dijagnoze (koji može podrazumevati profilaktički tretman) može obuhvatati primenu efektivne količine molekula ciljanog vezivanja navedenom subjektu. Primeri oboljenja i poremećaja se razmatraju u tekstu koji sledi.

[0105] Ovde je opisana i upotreba molekula ciljanog vezivanja (uključujući njihove kompozicije) u proizvodnji medikamenta za primenu kod čoveka ili životinjskog subjekta.

[0106] Kliničke indikacije u kojima se anti-IL-25 molekul ciljanog vezivanja može koristiti da bi se obezbedila terapijska efikasnost podrazumevaju bilo koje stanje u kome IL-25 ispoljava patološku ulogu. Prema tome, u principu, molekul ciljanog vezivanja koji je ovde opisan se može upotrebiti u lečenju bilo kog stanja asociranog sa neželjenim Th2 ili odgovorom tipa 2. Na primer, molekul ciljanog vezivanja se može upotrebiti za lečenje alergije i astme, prioritetno astme.

[0107] Anti-IL-25 tretman se može sprovesti injeciranjem (npr. intravenozno) ili putem lokalnih postupaka isporuke. Anti-IL-25 se može isporučiti i putem genski-posredovanih tehnologija. Alternativne strategije formulisanja mogu obezbediti preparate pogodne za oralnu ili primenu supozitorijama. Način primene se može odrediti na osnovu fizičko-hemijskih karakteristika tretmana i precizne karakterizacije tipa oboljenja da bi se optimizovala efikasnost ili da bi se neželjena dejstva svela na minimum.

[0108] U skladu sa predmetnim pronalaskom, obezbeđene kompozicije se mogu primeniti pojedincima. Prioritetno je da primena bude u "terapijski efikasnoj količini" dovoljnoj za pojavu poboljšanja kliničke slike kod pacijenta. Navedena dobrobit može podrazumevati poboljšanje najmanje jednog simptoma. Precizna količina kompozicije, kao i stopa i vreme trajanja primene će zavisiti od vrste i kliničke težine stanja koje se leči. Popisano lečenje, odnosno odluka o dozi itd. ostaje u nadležnosti lekara opšte prakse i drugih lekara. Odgovarajuće doze antitela su dobro poznate u oblasti tehnike; pogledati publikaciju Ledermann J.A. i saradnici (1991) Int. J. Cancer 47:659-664; Bagshawe K.D. i saradnici (1991) Antibody, Immunoconjugates and Radiopharmaceuticals 4:915-922.

[0109] Precizna doza se određuje u zavisnosti od brojnih faktora, uključujući namenu antitela u dijagnostičke ili terapijske svrhe, koja je veličine i lokacije područja lečenja, kao i u zavisnosti od precizne prirode antitela (npr. da li je po sredi celokupno antitelo, fragment ili bispecifičmo antitelo), i vrste bilo kog detektabilnog obeleživača ili drugog molekula koji je vezan za antitelo. Uobičajena doza antitela će biti u opsegu od 0,5 mg do 1,0 g, a ista se može primeniti intravenozno u vidu bolusa ili kao infuzija, tokom nekoliko sati, da bi se postigla potrebna doza. Ostali načini primene obuhvataju intravensku infuziju tokom nekoliko sati zarad postizanja slične ukupne kumulativne doze. Navedeno podrazumeva dozu pojedinačnog lečenja odraslog pacijenta koja se može proporcionalno prilagoditi kod dece i odojčadi, kao i u skladu sa tipom oblika antitela, a shodno molekulskoj težini. Tretmani se mogu ponavljati u dnevnim, dvonedeljnim, nedeljnim ili mesečnim intervalima shodno režimu koga propisuje lekar.

[0110] Dalji način primene obuhvataju oblaganje, ili na drugi način ugrađivanje kompozicije u uređaje za njeno skladištenje, pri čemu se optimalna količina antitela koja se pakuje može odrediti odgovarajućim eksperimenatima.

[0111] U pojedinim prioritentim primerima primene predmetnog pronalaska, molekul antitela označava monomerni fragment poput F(ab) ili scFv. Prednost navednih fragmenata se ogleda u relativno kratkom poluživotu fragmenata i u smanjenju rizika aktivacije trombocita do koga može doći usled grupisanja receptora. Grupisanje receptora koje dovodi do aktivacije trombocita može biti, na primer, posledica vezivanja molekula IL-25 ili IL-25 sa FcγRII molekulima.

[0112] Ukoliko se upotrebljava antitelo u celini, poželjno je da ono bude u obliku koji nije u mogućnosti da aktivira i/ili razori trombocite. Poželjan izbor su antitela izotipa IgG4 ili alternativno "dizajnirani" izotipovi izvedeni iz IgG1 osnovnog lanca (novi Fc genski konstrukti WO99/58572, Clark, Armour, Williamson). Mogu se koristiti i manji fragmenti antitela poput F(ab')2. Pored toga, mogu se upotrebiti celokupna antitela ili njihovi fragmenti (npr. F(ab')2 ili dvovalentna antitela) sa dualnom specifičnošću za epitop (npr. za epitope koje prepoznaje scFv 2C3). Iako navedeni primeri primene mogu dovesti do povećanog grupisanja receptora, visok stepen udruživanja sa pojedinačnim receptorima može isključiti navedeni problem.

[0113] Molekuli ciljanog vezivanja koji su ovde opisani se obično primenjuju u obliku farmaceutske kompozicije koja, pored molekula ciljanog vezivanja, može sadržavati najmanje jednu komponentu.

1

[0114] Molekul ciljanog vezivanja se može primenjivati samostalno ili u kombinaciji sa drugim tretmanima, bilo istovremeno ili sekvencijalno, u zavisnosti od stanja koje se tretira. Drugi tretmani mogu podrazumevati primenu odgovarajućih doza lekova za otklanjanje bola poput nesteroidnih antiinflamatornih lekova (npr. aspirina, paracetamola, ibuprofena ili ketoprofena) ili opijata poput morfina; primenu antiemetika; ili primenu najmanje jednog drugog jedinjenja koje deluje na astmu, uglavnom bronhodilatornog agensa koji dovodi do opuštanja disajnih puteva ili poboljšanja klirensa sluzi poput npr. beta agonista (npr. salbutamola, salmeterola), dinatrijum kromoglikata, steroida ili inhibitora PDEIV.

Postupci testiranja

[0115] Ovde je takođe opisan postupak koji obuhvata prouzrokovanje ili omogućavanje vezivanja molekula ciljanog vezivanja za IL-25 na način koji je ovde opisan. Kao što je navedeno, ovakvo vezivanje se može odvijati in vivo, npr. nakon primene molekula ciljanog vezivanja ili nukleinske kiseline koja kodira molekul ciljanog vezivanja, ili se može odvijati in vitro, na primer u ispitivanjima u kojima se koriste ELISA, Biacore, Octet testovi, kao i u postupcima imunoblotovanja, imunocitohemije, imunoprecipitacije ili afinitetne hromatografije.

[0116] Količina vezanog molekula ciljanog vezivanja za IL-25 se može odrediti. Kvantitativna merenja mogu ukazati na količinu antigena u uzorku koji se ispituje, što može biti od dijagnostičkog značaja.

[0117] Reaktivnost antitela u uzorku se može odrediti na bilo koji odgovarajući način. Radioimunoesej (RIA) je jedna mogućnost. Radioaktivno obeležen antigen se meša sa neobeleženim antigenom (u uzorku koji se ispituje) i dozvoljava se njegovo vezivanje za antitelo. Vezani antigen se fizički odvaja od antigena koji nije vezan i određuje se količina radioaktivnog antigena vezanog za antitelo. Što je više antigena prisutno u uzorku koji se ispituje, manje će radioaktivnog antigena biti vezano za antitelo. Kompetitivni testovi vezivanja se takođe mogu sprovesti upotrebom neradioaktivnog antigena, odnosno upotrebom antigena ili njegov analoga koji je vezan za reporterski molekul. Reporterski molekul može biti fluorohrom, fosfor ili laserska boja sa spektralno izolovanim apsorpcijskim ili emisionim svojstvima. Pogodni fluorohromi obuhvataju fluorescein, rodamin, fikoeritrin i Teksas crvenu boju. Pogodna hromogena boja je diaminobenzidin.

[0118] Drugi reporterski molekuli uključuju makromolekulske koloidne čestice ili čestične materijale poput zrna lateksa koja su obojena, namagnetisana ili paranamagnetisana, kao i biološki ili hemijski aktivne agense koji mogu direktno ili indirektno dovesti do toga da se detektabilni signali vizuelno uoče, elektronski detektuju ili na drugi način snimaju. Navedeni molekuli mogu predstavljati enzime koji katalizuju reakcije u kojima, na primer, dolazi do razvijanja ili menjanja boje ili pak do promena u električnim svojstvima. Navedeni reporteri mogu biti ekscitabilni molekuli kod kojih prelaz elektrona između energetskih stanja dovodi do karakterističnih spektralnih absorpcija ili emisija. Navedeni molekuli mogu predstavljati hemijske entitete koje se koriste u kombinaciji sa biosenzorima. Moguća je upotreba detekcionih sistema poput biotin/avidinskog ili biotin/streptavidinskog sistema i alkalne fosfataze.

[0119] Signali proizvedni od strane pojedinačnih konjugata antitela i reporterskih molekula se mogu upotrebiti za dobijanje kvantitativnih, apsolutnih ili relativnih, podataka o relevantnom vezivanju antitela u uzorcima (normalnim i ispitivanim).

[0120] Ovde je takođe opisana prethodno navedena upotreba molekula ciljanog vezivanja za merenje nivoa antigena u kompetitvnom testu, odnosno postupak merenja nivoa antigena u uzorku, upotrebom molekula ciljanog vezivanja koja su ovde prijavljena u kompetitivnom testu. Navedeno se može sprovesti kada nije neophodno fizičko razdvajanje vezanih i antigena koji nisu vezani. Jedna od mogućnosti je povezivanje reporterskog molekula sa molekulom ciljanog vezivanja na način koji omogućava da dođe do fizičke ili optičke promene. Reporterski molekul može direktno ili indirektno dovesti do pojave signala koji se mogu detektovati, a poželjno je i izmeriti. Vezivanje reporterskih molekula može biti direktno ili indirektno, kovalentno, npr. peptidnom vezom, ili pak nekovalentno. Vezivanje peptidnom vezom može biti rezultat povezivanja rekombinantno eksprimiranog fuzionog gena koji kodira antitelo i reporterskog molekula.

[0121] Predmetna prijava takođe omogućava direktno merenje nivoa antigena, upotrebom molekula ciljanog vezivanja koji su ovde opisani, na primer, u biosenzorskom sistemu.

[0122] Stručnjaci iz oblasti mogu odabrati odgovarajući način ili tip vezivanja shodno njihovom afinitetu i opštem znanju.

Primeri

[0123] U nastavku teksta su navedeni primeri primene predmetnog pronalaska.

Primer 1: Generisanje M6 humanizovanog anti-IL-25 antitela sa visokim afinitetom

[0124] Antitelo huDDG91, humanizovana (CDR-graftovana) verzija mišijeg 2C3 monoklonskog anti-IL25 antitela, je izabrano kao originalni molekul za generisanje varijanti antitela sa poboljšanim afinitetom vezivanja za IL-25. Sekvenca kapa lakog lanca huDDG91, isključujući njenu lidersku sekvencu, je prikazana na Slici 1 (SEQ ID NO:2), gde su aminokiselinske sekvence CDR petlji, definisane od strane Kabata, podvučene. Sekvenca teškog lanca huDDG91 antitela (SEQ ID NO:4) je prikazana na Slici 2 i aminokiselinske sekvence CDR petlji, definisane od strane Kabata, su podvučene. Antitelo huDDG91 je poznato i kao RH2.5_R71V. Generisanje i karakterizacija

1

mišjeg 2C3 monoklonskog anti-IL25 antitela je opisano u Međunarodnoj patentnoj prijavi br: PCT/GB2008/001365, objavljenoj 30. oktobra 2008. godine kao WO2008/129263.

[0125] Da bi se sintetisale varijante huDDG91 antitela, konstruisane su biblioteke ekspresije u fagu zasnovane na huDDG91 sekvenci, upotrebom standardne metodologije. Fab biblioteke su pretražene za biotinizovan IL-25, pa su ELISA esejem odabrani Fab fragmenti sa afinitetom vezivanja koji je sličan ili bolji od afiniteta vezivanje huDDG91 (IgG4) antitela.

[0126] Fab fragmenti su prevedeni u monoklonska antitela na sledeći način. Dizajnirana je kombinatorna biblioteka od 5 različitih lakih i 5 različitih teških lanaca (uključujući lake i teške lance huDDG91). Laki i teški lanci upotrebljeni u biblioteci su se razlikovali jedan od drugog po aminokiselinskim sekvencama CDR1 i CDR3 lankih lanaca, kao i po sekvenci CDR 3 teškog lanca. Upotrebom navedenih lakih i teških lanaca, konstruisano je ukupno 25 monoklonskih antitela (IgG1) koja su eksprimirana u HEK293 ćelijama u maloj skali i koja su potom prečišćena. Za svako od monoklonskih antitela su ispitani afinitet vezivanja za IL-25, ćelijska inhibicija i inhibicija receptora na sledeći način:

● Afinitet vezivanja IL-25 je određen upotrebom standardnih IL-25 ELISA i Biacore testova vezivanja. Selektovana su antitela kandidati sa KDmanjom od 50 pM za humani IL-25 i KDvećom od 100 nM za humane IL-17A, C, D i F;

● Ćelijska inhibicija je procenjena standardnim testom zasnovanom na upotrebi TK-10 ćelija renalnog karcinoma čoveka (koje odgovaraju na IL-25; očitavanja IL-25 i IL-8; sposobna da detektuju razliku između solubilnog IL-25R i originalnog monoklonskog anitela), kao i testom na CD4+ T ćelijama. Za test sa TK-10 ćelijama su izabrana monoklonska antitla koja karakteriše IC50koji je manji u odnosu na IC50originalnog huDDG91 antitela, kao i inhibicija oslobađanja IL-25 >90% pri koncentraciji monoklonskog antitela od 10 nM. Za imunoesej sa CD4+ T ćelijama su izabrana monoklonska antitela koja dovode do inhibicije proizvodnje IL-5 koja je bila veća ili jednaka inhibiciji do koje dovodi originalno huDDG91 antitelo;

● Inhibicija receptora je procenjena upotrebom modifikovanog elektrohemiluminescentnog imunoeseja (ECLIA) u kome se upotrebljavaju zrnaste smole. Izabrana su antitela kandidati koji dovode do smanjenja IC50vezivanja IL-25 za receptor većeg od tri puta u odnosu na IC50originalnog huDDG91 pri koncentraciji od 10 nM monoklonskog antitela (mAt).

[0127] Na osnovu navedenih kriterijuma, izabrano je 9 kandidata monoklonskih antitela (Slika 3). Svi kandidati su ispoljili prihvatljive nivoe ekspresije i prikazali poželjne profile prilikom SE-HPLC i SDS-PAGE analiza, kada su eksprimirani u HEK293 ćelijama i prečišćeni standardnim protokolima. Navedenih 9 kandidata je zatim tranzientno eksprimirano u skali od 10L u ćelijama jajnika kineskog hrčka (CHO), pa su antitela prečišćena upotrebom Mab Select SuRe smole (GE Healthcare Life Sciences), pufer je zamenjen fosfatnim puferom (PBS puferom) i antitela su koncentrovana. Afinitet vezivanja za IL-25 za svaki od 9 kandidata monoklonskih antitela je značajno poboljšan u odnosu na huDDG91. Nivo ekspresije, identitet (SDS-PAGE), rastvorljivost, agregacija (SE-HPLC), post-translacione modifikacije, protein-proteinske interakcije i odksidacija su takođe ispitani za svako antitelo upotrebom rutinskih tehnika i testova. Nekoliko kandidata monoklonskih antitela se istaložilo prilikom koncentrovanja, a kod nekih je uočen nizak prinos i/ili neželjen profil SDS-PAGE i SE-HPLC podataka nakon ekspresije u CHO, prečišćavanja i procesuiranja pod standardnim uslovima.

[0128] Jedno od mAt, označeno kao M6, je odabrano za dalja istraživanja na osnovu superiornog nivoa ekspresije, visoke rastvorljivosti, nedostatka značajnijih proteinskih agregacija nakon prečišćavanja i na osnovu odsustva neželjenih post-translacionih modifikacija, protein-proteinskih interakcija i oksidacije nakon prečišćavanja.

Primer 2: Karakterizacija M6 antitela

Materijali i metode

Test sa LS 174T humanim epitelijalnim ćelijama kolona

[0129] Ćelijska linija LS 174T (CL-188) humanog epitela kolona je nabavljena od firme ATCC (Manassas, VA) i gajena u Dulbeck-ovom modifikovanom medijumu (DMEM) (Invitrogen, Carlsbad, CA) koji je sadržavao 10% FBS, penicilin i streptomicin, na 37° C u atmosferi sa 5% CO2. Ćelije su zasejane u mikrotitar ploče za kulturu ćelija u gustini od 1x105 ćelija/ml, u ukupnoj zapremini od 100μl, nakon čega je ćelijama dozvoljeno da se zalepe za podlogu preko noći. Anti-IL-25 antitela (M6 i M9) su prethodno uvedena u kompleks sa rekombinantnim IL-25 proteinom (Centocor) upotrebom konstantne količine proteina IL-25 (finalna koncentracija 10 ng/ml) koja je pomešana sa različitim količinama anti-IL-25 antitela, titriranog u trostrukoj seriji razblaživanja ili polu-log razblaženja, i potom inkubacijom na 37° C u trajanju od 1 sata. Medijum ćelijske kulture je dalje polako aspiriran i zamenjen kompleksom proteina IL-25 i anti-IL-25 antitela, nakon čega su ćelije inkubirane preko noći, odnosno od 18 do 22 sata. Ploče za kulturu ćelija su dalje centrifugirane na 1200 obrtaja/min tokom 2 minuta da bi se izbegao prenos ćelijskog debrisa, a supernatant je prikupljen i upotrebom ELISA imunoeseja je određena količina GRO (onkogena rasta, engl. Growth Related Oncogene) (R&D Systems, Minneapolis, MN).

1

Rezultati

[0130] Analiza M6 sekvence je ukazala na ukupan broj prisutnih supstitucija aminokiselina, preciznije tri supsitucije u odnosu na huDDG91 sekvencu, pri čemu su sve tri mutacije bile prisutne u CDR3 lakog lanca (pogledati Sliku 3). Aminokiselinske sekvence lakog (SEQ ID NO:5) i teškog (SEQ ID NO:9) lanaca M6 i njihovih CDR regiona su prikazane na Slici 4.

[0131] Upotrebom Biacore testa je utvrđeno da M6 karakteriše afinitet vezivanja za humani IL-25 koji je 3-5 puta veći od afiniteta huDDG91 antitela za humani IL-25 (Slika 3). Štaviše, M6 je ispoljio selektivnost za IL-25 obzirom da se nije vezao za humane IL-17A, C, D ili F. Unakrsna reaktivnost M6 između vrsta je ispitana upotrebom IL-25 poreklom iz makaki majmuna (cinomolgus, cinoIL-25) i IL-25 glodara (miša). Unakrsna rekativnost sa cinoIL-25 je ukazala na do 5 puta različit afinitet antitela u odnosu na afinitet za IL-25 čoveka, kao i na inhibiciju u testovima sa ligandima receptora i TK-10-ćelijama. Upotrebom navedenih kriterijuma je utvrđeno da se M6 vezuje i za cinoIL-25 i mišiji IL-25.

[0132] Upotrebom testova zasnovanih na ćelijama koji su opisani u Primeru 1, pokazano je da M6 ispoljava povećanu inhibiciju receptora u odnosu na huDDG91, ondosno da je smanjenje IC50veće za 3 puta u odnosu na smanjenje koje ispoljava huDDG91 antitelo (Slika 3). Pored toga, upotreba ćelijskih testova opisanih u Primeru 1 je ukazala da M6 ispoljava povećanu ćelijsku inhibiciju humanog IL25 u odnosu na huDDG91 (Slike 3 i 5). Navedeni rezultat je potvrđen i LS 174T esejem sa epitelnim ćelijama kolona čoveka (Slike 6A i 6B) koji je urađen kao što je prethodno opisano.

Primer 3: Mapiranja epitopa u humanom IL-25 koga prepoznaje M6 postupkom H/D-izmene

Sažetak

[0133] Potencijalni epitop u humanom IL-25 koji prepoznaje M6 antitelo je mapiran upotrebom ExSar™ vodonično-deuterijumske masene spektrometrije koja je urađena uslužno od strane ExSar korporacije (Monmouth Junction, New Jersey).

Materijali i metode

I. Digestija/razdvajanje/optimizacija IL-25

[0134]

(1) Na ledu je otopljen IL-25

(2) Razliveno je 18 x 100 μl alikvota i svi alikovoti, osim jednog, su zamrznuti

(3) Pomešano je 10 μl 0,28 mg/ml (16,6 μM) IL-25 sa 30 μl PBS pufera, pH 7,0 u vodi → [IL-25] = 0.07 mg/ml (4,2 μM)

(4) Po 40 μl rastvora iz koraka (3) je pomešano sa raznim tipovima rastvora za zaustavljanje rekacije (5) Injecirano je 55 μl smeše u ExSAR sistem

(6) Uzorak je propušten kroz imobilisanu kolonu sa pepsinom pri brzini protoka od 200 μl/min u puferu A (0,05% TFA u H2O)

(7) Fragmenti nastali pepsinskom digestijom su naneti na revezno-faznu kolonu za vezivanje, pa su soli isprane upotrebom pufera A uz brzinu protoka od 200 μl/min tokom 3 min

(8) Peptidi dobijeni pepsinskom digestijom su razdvojeni upotrebom C18 kolone, uz linearni gradijent elucije 13% → 40% pufera B (95% acetonitril, 5% H2O, 0,0025% TFA) tokom 23 min

(9) Peptidi su detektovani masenom spektrometrijom

II. Imobilizacija M6

4.1. Eksperimentalna procedura imobilizacije M6

[0135]

(1) Na ledu je otopljen 1,5 ml M6 koncentracije 0,96 mg/ml

(2) Upotrebljeno je 400 μl (neiskorišćen materijal je zamrznut)

(3) Dodato je 4 mg NaCNBH3(87,5 μmol) u bočicu sa navojem od 1,5 ml → 40 mg NaCNBH3na 1 g POROS AL smole

(4) Dodato je 400 μl rastvora antitela u bočicu

(5) Pre dodavanja POROS AL smole je provereno da je NaCNBH3rastvoren

(6) U bočicu je dodato 100 mg POROS AL smole

1

(7) Reakcija kuplovanja je inkubirana na sobnoj temperaturi tokom 3 h uz mućkanje

(8) Dodata je ukupna zapremina od 400 μl 2,8 M Na2SO4u 5 porcija od po 80 μl, jedna porcija na sat → [antitelo] = 0,48 mg/ml, [NaCNBH3] = 5,0 mg/ml, [Na2SO4] = 1,4 M.

(9) Smeša je mućkana na sobnoj temperaturi preko noći

(10) Smeša je isprana velikom količinom PBS pufera, pH 7,0, filtriranjem kroz levak

<Zaštita kolone (engl. capping)>

[0136]

(11) Rastvor za zaštitu kolone je pripremljen mešanjem 250 μl etanolamina (FW = 61,08; gustina = 1,012 g/ml; 8,3 mmol; ~ 1 M) sa 3,5 ml PBS pufera, pH 7,0 i podešavanjem pH navedenog rastvora do pH 7,2 upotrebom glacijalne sirćetne kiseline (~ 200 μl). Finalna zapremina rastvora je iznosila blizu 4 ml.

(12) U 500 μl rastvora za je rastvoreno 4 mg NaCNBH3 → [NaCNBH3] = 8 mg/ml, [etanolamin] = ~ 1 M. (13) Oprana i osušena smola je resuspendovana u rastvoru NaCNBH3

(14) Smeša je mućkana 2 sata na sobnoj temperaturi

(15) Smeša je profiltrirana i isprana obimnom količinom PBS pufera, pH 7,0, filtriranjem kroz levak.

(16) Smola je ponovo resuspendovana u 0,75 ml PBS pufera, pH 7,0.

(17) Konjugovan materijal je čuvan u frižideru na 4° C.

III. Eksperimentalna procedura za ispitivanje kapaciteta vezivanja M6 kolone

[0137]

(1) Pripremljen je 50 mM citrat, pH 6,0 u vodi

(2) Pripremljen je 50 mM citrat, 2 mM Foscholine-12, pH 6,0 u vodi

(3) Pripremljen je PBS, pH 7,0 u vodi

(4) Bilo koji od pufera pod (1), (2) ili (3) je korišćen kao "pufer H"

[0138]

(5) Kolona sa mAt (104 μl) je napakovana na 600 μl POROS smole kuplovane sa M6 antitelom upotrebom brzine protoka pufera A (0,05% TFA u H2O) od 500 μl/min i nosača kolone od nerđajućeg čelika dimenzija 2,1 mm x 30 mm

(6) Kolona antitela je postavljena u komoru za hlađenje podešenu na 3° C i dodati su nastavci za nanošenje na i prikupljanje reagensa sa kolone. Porozna ploča (frit) debljine 2 mikrometra je postavljena na ulaz kolone zarad filtriranja reagenasa i uzoraka.

(7) Kolona antitela je ekvilibrisana upotrebom 2 x 250 μl "pufera H". Za proveru pH rastvora na kraju protoka je upotrebljavan pH papir da bi se osigurao neutralan pH.

(8) Pomešano je 10 μl 0,28 mg/ml (16,6 μM) IL-25 sa 30 μl "pufera H" → [IL-25] = 4,1 μM (ekvivalentno 166 pmola)

(9) Prethodno pripremljena smeša je naneta injeciranjem na ekvilibrisanu kolonu sa antitelom.

(10) Na kolonu ohlađenu na 3° C je naneto 200 μl "pufera H" (Hamilton špricem zapremine 500 μl) upotrebom pumpe za injeciranje i prikupljeno je 5 frakcija pojedinačne zapremine 40 μl.

(11) Na kolonu ohlađenu na 3° C je zatim naneto 200 μl 0,8% mravlje kiseline upotrebom pumpe za injeciranje i prikupljeno je 5 frakcija zapremine po 40 μl.

(12) Kontrolno injeciranje je urađeno injeciranjem smeše pripremljene mešanjem 10 μl 0,28 mg/ml (16,6 μM) IL-25 sa 30 μl "pufera H" u staklenom insertu.

(13) Svi inserti koji su sadržavali frakcije ili kontrolni uzorak su centrifugirani da bi se spustila celokupna tečnost sa zidova inserta. Inserti su ubačeni u bočice koje su zatim zatvorene i obeležene.

(14) Neutralne i kisele frakcije, kao i kontrolni uzorak su držani na ohlađenom pladnju za skladištenje tipa 4 na neparnim pozicijama od 3 do 23 prema slecećem rasporedu: kontrolni uzorak, neutralna ispiranja 1, 2, 3, 4, 5 i ispranja sa kiselim puferom 1, 2, 3, 4, 5.

(15) Jedanaest praznih zatvorenih bočica je postavljeno na ohlađen pladanj tipa 4, na parne pozicije od 4 do 24.

(16) Svaka frakcija je pomešana sa 20 μl 2M uree, 1M TCEP, pH 3,0.

(17) Ubrizgano je 55 μl rastvora za zaustavljanje reakcije u ExSAR sistem bez pepsinskih kolona.

(18) Uzorak je nanet na kolonu u puferu A (0,05% TFA), uz brzinu protoka 200μl/min, a zatim su isprane soli tokom 3 min i kolona je eluirana linearnim gradijentom od 13% do 40% pufera B (95% acetonitril, 5% H20, 0,0025% TFA) tokom 23 min.

(19) Eluati su analizirani masenom spektrometrijom uz MS1:Centroid operativni način rada.

2

IV. Eksperimentalna procedura za izmenu tipa u-rastvoru/sa-kolone (engl. on-solution/off-column exchange) <Priprema pufera>

[0139]

(1) Pripremljen je 50 mM citrat, 2 mM Foscholine-12, pH 6,0 u H2O

(2) Pripremljen je PBS, 2 mM Foscholine-12, pH 7,0 u H2O

(3) Pripremljen je PBS, pH 7,0 u H2O

(4) Puferi (1) - (3) su upotrebljeni kao "puferi izmene H"

(5) Pripremljen je "pufer izmene HH" mešanjem 1 dela PBS pufera, pH 7,0 u H2O i 3 dela "pufera izmene H" (6) Pripremljen je 50 mM citrat, 2 mM Foscholine-12, pH 6,0 u D2O

(7) Pripremljen je PBS, 2 mM Foscholine-12, pH 7,0 u D2O

(8) Pripremljen je PBS, pH 7,0 u D2O

(9) Puferi (6) - (8) su upotrebljeni kao "puferi izmene D"

(10) Pripremljen je "pufer izmene HD" mešanjem 1 dela PBS pufera, pH 7,0 u H2O i 3 dela "pufera izmene D" <Faza izmene tipa u-rastvoru>

[0140]

(1) Kolona sa mAt (unutrašnje zapremine 104 μl) je pozicionirana i ekvilibrisana unutar hladne komore (3° C) (2) Kolona sa mAt je očišćena upotrebom 2 x 250 μl 0.8% mravlje kiseline

(3) Kolona sa mAt je isprana sa 2 x 250 μl "pufera izmene HD" zarad ekvilibracije kolone

(4) Pomešano je 10 μl 0,28 mg/ml (16,6 μM) IL-25 sa 30 μl "pufera izmene D" na 3° C → [IL-25] = 0,07 mg/ml (4,2 μM), [D2O] = 75% (uključen je tajmer za merenje vremena izmene tipa u-rastvoru)

(5) Smeša je inkubirana 150, 500, 1.500 ili 5.000 s na 3° C

(6) Smeša (40 μl) je naneta injeciranjem na kolonu sa mAt

(7) Kolona sa mAt je isprana sa 100 μl "pufera izmene HD" na 3° C <faza izmene tipa sa-kolone>

(8) Kolona sa mAt je isprana sa 200 μl ohlađenog "pufera izmene HH" (merenje vremena faze u-rastvoru je zaustavljeno i započeto je merenje vremena faze sa-kolone čim je H2O došla u kontakt sa kolonom)

(9) Inkubacija na 23° C je trajala 75250, 750 ili 2.500 s

[0141]

(10) Na kolonu sa mAt je injecirano 120 μl ohlađene 0.8% mravlje kiseline (merenje vremena faze sa-kolone je zaustavljeno čim je kiselina uvedena u kolonu)

(11) Injecirano je dodatnih 40 μl ohlađene 0,8% mravlje kiseline da bi se antigen eluirao sa kolone sa mAt (12) Navedena frakcija zapremine 40 μl je prikupljena upotrebom staklenog inserta

[0142]

(13) Dodato je 20 μl ohlađene 2M uree, 1M TCEP, pH 3,0 u frakciju zapremine 40 μl

(14) Po 55 μl uzorka, u kome je zaustavljena reakcija izmene, je injecirano u ExSAR sistem sa pepsinskom i C18 kolonom (pepsinska kolona unutrašnje zapremine 104 μl; stopa protoka kroz pepsinsku kolonu 200 μl/min; C18 gradijent 13% - 40% pufera B tokom 23 min). Vreme digestije je podešeno na 3min.

(15) Eluati su analizirani masenim spektrometrom upotrebom MS1:Profil operativnog načina rada.

V. Eksperimentalna procedura za izmenu tipa na-kolonu/sa-kolone

[0143]

(1) Kolona sa mAt (unutrašnje zapremine 104 μl) je pozicionirana je i ekvilibrisana unutar hladne komore (23° C)

(2) Kolona sa mAt je očišćena upotrebom 2 x 250 μl 0.8% mravlje kiseline

(3) Kolona sa mAt je isprana sa 2 x 250 μl "pufera izmene HH" zarad ekvilibracije kolone

(4) Pomešano je 10 μl 0,28 mg/ml (16,6 μM) IL-25 sa 30 μl "pufera izmene H" na 3° C → [IL-25] = 0,07 mg/ml (4,2 μM), [D2O] = 0%

(5) Smeša je injecirana na kolonu sa mAt

(6) Kolona sa mAt je isprana sa 100 μl "pufera izmene HH"

(7) Faza reakcije na-koloni je započeta propuštanjem 200 μl "pufera izmene HD" kroz kolonu sa mAt (započeto je merenje vremena faze izmene tipa na-koloni)

(9) Inkubacija na koloni sa mAt je trajala 150, 500, 1.500 ili 5.000 s na 3° C

<Faza sa-kolone> Postupak isti kao prethodno navedeni postupak 5.2

[0144]

<Elucija> Procedura ista kao prethodno navedena procedura IV, koraci 10-14.

<Analiza> Procedura ista kao prethodno navedena procedura IV, korak 15.

VI. Eksperimentalna procedura za eksperiment sa potpuno deuterizovanim uzorcima

[0145]

(1) Pomešano je 10 μl 0,28 mg/ml (16,6 μM) IL-25 sa 30 μl "pufera izmene D",

(2) Smeša je grejana na 60° C tokom 3 h

(3) Smeša je ohlađena do sobne temperature

(4) Na kolonu sa mAt je naneto injeciranjem 40 μl smeše

(5) Na kolonu sa mAt je naneo injeciranjem 100 μl "pufera izmene HD"

<Elution> Procedura ista kao prethodno navedena procedura IV, koraci 10-14.

<Analiza> Procedura ista kao prethodno navedena procedura IV, korak 15.

[0146] Bilo koja količina deuterijuma koji je bila vezana za prva dva aminokiselinska ostatka svakog jona je izgubljena tokom analize (digestija/razdvajanje/masena analiza u vodenoj sredini). Navedeno rezultuje pojavom malih praznina u obrascu H/D-Ex zapisa na Slikama 8A i 8B. Za svaki protein su urađeni eksperimenti bez deuterijuma, eksperimenti izmene tipa na-koloni i eksperimenti sa kompletno deuterizovanim uzorcima. Eksperimenti bez deuterijuma su upotrebljeni za identifikaciju jona, kao i precizno određivanje m/z parametra za svaki jon bez deuterijuma. Eksperimenti sa kompletno deuterizovanim uzorcima su se koristili za identifikaciju gubitka deuterijuma za svaki jon tokom analize (digestija/razdvajanje/masena analiza u vodenoj sredini). U navedenim tipovima eksperimenta, može biti izračunat broj deuterona pre LCMS analize i nakon izmena tipa nakoloni ili na-koloni/sa-kolone. Za eksperimente izmene na-koloni/sa-kolone, vreme izmene sa-kolone je iznosilo polovinu vremena od vremena faze na-koloni. Navedeno je posledica činjenice da je unutrašnja stopa H→D izmene iznosi polovinu stope D→H izmene kod očitavanja na istim pH vrednostima.

Rezultati

Digestija IL-25

[0147] IL-25 je podvrgnut digestiji pepsinom pod različitim uslovima. Najbolji stepen digestije IL-25 pepsinom je postignut kada je reakcija u kojoj su upotrebljena dva dela razblaženog rastvora IL-25 zaustavljena dodavanjem 1 dela 2 M uree, 1 M TCEP, pH 3,0 i kada je digestija sprovedena na pepsinskoj koloni pri protoku od 200 μl/min. Najbolji uslovi razdvajanja su postignuti upotrebom C18 kolone i linearnog gradijenta od 13% do 40% pufera B (95% acetonitril, 5% H2O i 0,0025% TFA) u puferu A tokom 23 min. Pokrivenost sekvence IL-25 nakon digestije pepsinom je iznosila 100% (= 146 /146; Slike 7A i 7B).

Imobilizacija M6 antitela i ispitivanje kapaciteta vezivanja M6 kolone

[0148] Uzorak IL-25 koji nije bio podvrgnut digestiji pepsinom karatkerisao je jedan hromatografski maksimum na 8,5 min. Uzorak je delovao čisto. M6 je uspešno konjugovan na POROS AL smolu upotrebom Schiff-ove baze. ExSAR analiza je poslužila za ispitivanje kapaciteta vezivanja M6 kolone u tri različita uslova eksperimenta, a kao što je prikazano u Tabeli 1. Praćen je neprekidan hromatografski pik sa m/z = 1875 (+18) i 1985 (+17). U svim uslovima ispitivanja koji su testirani, nije dolazilo od elucije IL-25 prilikom ispiranja sa neutralnim puferom, što je ukazalo da je IL-25 (166 pmol) koji je nanet ostao vezan za M6 kolonu u neutralnim uslovima. Moguće je da je IL-25 bio nespecifično vezan za M6 kolonu. Izdvojeno je samo 17-18% IL-25 koji je nanet na kolonu prilikom ispiranja sa kiselim puferom u odsustvu deterdženta. Takođe, povratni pritisak M6 kolone je postepeno rastao kako je IL-25 ponovno nanošen. Prinos je poboljšan dodavanjem agensa Foscholine-12.

Tabela 1. Uslovi upotrebljni za ispitivanje kapaciteta vezivanja kolone sa M6 antitelom

[0149] Kolona između kolona označenih kao "Temperatura" i "Neutralni pufer" je naslovljena kao "Pepsin".

Identifikacija epitopa

[0150] Eksperimenti izmene IL-25 u rastvoru su urađeni na temperature od 23° C pri pH 7. Pokazano je da je IL-25 relativno dinamičan protein.

[0151] Najjači stepen zaštite je uočen za segmente koji obuhvataju aminokiselinske ostatke 56-63 i 66-74 (Slike 8A i 9C, Tabela 2). Analogni segmenti koji obuhvataju aminokiselinske ostatke 46-63 i 66-84 su ispoljili konzistento slabu zaštitu (Slike 8A, 9C i 9D; Tabela 2). Granični nivo zaštite je utvrđen za segmente koji obuhvataju aminokiselinske ostatke 129-135 (Slike 8B, 9E i 9F: Tabela 2).

Tabela 2. Razlike u nivoima deuterizacije različitih segmenata humanog IL-25 nakon eksperimenata izmene tipa u-rastvoru/sa-kolone pri pH 7 i pH 8 na 23° C.

2

LISTA SEKVENCI

[0152]

2

Claims

Patentni zahtevi

1. Humanizovano antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen, koji se vezuju za IL-25, gde antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen sadrže:

a) VL domen antitela koji sadrži CDR1 aminokiselinske sekvence SASQGISNYLN (SEQ ID NO:6), CDR2 aminokiselinske sekvence YTSSLHS (SEQ ID NO:7) i CDR3 aminokiselinske sekvence QQYLAFPYTF (SEQ ID NO:8); i

pri čemu antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen ispoljavaju afinitet vezivanja za IL-25 koji je manji ili jednak 53 pM što je utvđeno upotrebom Biacore testa.

2. Humanizovano antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen prema patentnom zahtevu 1, pri čemu antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen ispoljavaju afinitet vezivanja za IL-25 koji je manji ili jednak približno 50 pM, približno 45 pM, približno 40 pM, približno 35 pM, približno 30 pM, približno 25 pM, približno 20 pM.

3. Humanizovano antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva koji sadrže VL domen lakog lanca antitela naveden kao SEQ ID NO:5.

4. Humanizovano antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva koji sadrže VH domen teškog lanca antitela naveden kao SEQ ID NO:9.

5. Humanizovano antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, pri čemu antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen sadrže fragment antitela izabran iz grupe koju čine Fab, Fab’, F(ab')2, Fv i scFv fragmenti.

6. Humanizovano antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, gde antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen sadrže konstantan region humanog porekla, opciono gde konstantan region humanog porekla sadrži teški lanac IgG izotipa poput IgG1, IgG2, IgG3 ili IgG4.

7. Izolovana nukleinska kiselina koja sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira antitelo ili fragment koji vezuje antigen prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva.

8. Ekspresioni vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu prema patentnom zahtevu 7, gde je nukleinska kiselina operativno vezana za promotor.

9. Ćelija domaćin koja sadrži ekspresioni vektor prema patetnom zahtevu 8.

10. Postupak proizvodnje antitela ili njegovog fragmenta koji vezuje antigen, postupak koji obuhvata gajenje ćelije domaćina prema patentnom zahtevu 9 u kulturi ćelija, u uslovima pogodnim za proizvodnju antitela ili njegovog fragmenta koji vezuje antigen, i koji opciono dalje obuhvata:

(i) izolaciju antitela ili njegovog fragmenta koji vezuje antigen; ili

(ii) formulisanje antitela ili njegovog fragmenta koji vezuje antigen u kompoziciju koja sadrži najmanje jednu dodatnu komponentu.

11. Kompozicija koja sadrži antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen prema bilo kom od patentnih zahteva 1-6 i farmaceutski prihvatljiv nosač, opciono gde kompozicija sadrži liofilizovan prah.

12. Antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen prema bilo kom od patentnih zahteva 1-6 za upotrebu u lečenju ili prevenciji astme, inflamatorne bolesti creva, opciono gde inflamatorna bolest creva označava ulcerativni kolitis ili Kronovu bolest.

13. Postupak proizvodnje anti-IL-25 antitela ili njegovog fragmenta koji vezuje antigen, gde antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen ispoljavaju afinitet vezivanja za IL-25 koji je manji ili jednak približno 53 pM i vezuju jednu ili više sekvenci izabranih iz grupe koju čine aminokiselinski ostaci 56-63 iz SEQ ID NO:17, aminokiselinski ostaci 66-74 iz SEQ ID NO:17 i aminokiselinski ostaci 129-135 iz SEQ ID NO:17, postupak koji obuhvata:

a) obezbeđivanje početnog repertoara nukleinskih kiselina koje kodiraju VL domen, gde nukleinske kiseline ili sadrže CDR3 kodirajući region koji će biti zamenjen ili im nedostaje CDR3 kodirajući region; b) kombinovanje početnog repertoara sa donorskom nukleinskom kiselinom koja kodira VL CDR3 aminokiselinske sekvence QQYLAFPYTF (SEQ ID NO:8), gde je donorska nukleinska kiselina insertovana u jednu ili više nukleinskih kiselina iz repertoara proizvoda da bi se obezbedio repertoar nukleinskih kiselina koje kodiraju VL domen sa VL CDR3 regionom aminokiselinske sekvence QQYLAFPYTF (SEQ ID NO:8);

c) ekspresiju nukleinskih kiselina repertoara proizvoda da bi se obezbedila antitela ili njihovi fragmenti koji vezuju antigen;

d) odabir antitela ili njegovog fragmenta koji vezuje antigen koji se specifično vezuju za jednu ili za više sekvenci izabranih iz grupe koju čine aminokiselinski ostaci 56-63 iz SEQ ID NO:17, aminokiselinski ostaci 66-74 iz SEQ ID NO:17 i aminokiselinski ostaci 129-135 iz SEQ ID NO:17; i

e) izdvajanje antitela ili njegovog fragmenta koji vezuje antigen ili nukleinske kiseline koja kodira navedeno antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen,

opciono, gde su nukleinske kiseline repertoara proizvoda istovremeno eksprimirane sa nukleinskim kiselinama koje kodiraju VH domen poput VH domena koji sadrži SEQ ID NO:9.

1