RS56743B1

RS56743B1 - Humani c-fms antigen vezujući proteini

Info

Publication number: RS56743B1
Application number: RS20171242A
Authority: RS
Inventors: Kenneth Allan Brasel; Stephen Foster; Douglas Pat Cerretti; Jilin Sun; James F Smothers; Christopher Mehlin
Original assignee: Amgen Inc
Priority date: 2007-08-21
Filing date: 2008-08-19
Publication date: 2018-03-30
Also published as: AR068347A1; EP2592093A1; PE20091004A1; AU2008288974A1; DK2188313T3; EA023555B1; BRPI0815368A2; NO2188313T3; EA201591355A1; US20090155164A1; EP2589610A1; ES2650224T3; CN101802008A; EP3330292A1; US20120230987A1; AU2008288974B2; US8513199B2; CN101802008B; CL2008002444A1; HUE037265T2

Description

Opis

POZADINA

[0001] Mnoge humane i mišje tumorske ćelijske linije luče citokin CSF-1 (Faktor stimulacije kolonija-1, takođe poznat kao Makrofag-Faktor stimulacije kolonija, M-CSF) koji sa druge strane privlači, promoviše opstanak, i aktivira monocit/makrofag ćelije putem receptora c-fms (Mačji McDonough Soj). Makrofagi povezani sa tumorom (TAM-ovi) (takođe poznat kao tumor infiltrirajući makrofagi (TIM-ovi)) mogu biti glavna komponenta strome tumora koja obuhvata čak i do 50% ćelijske mase tumora. Kelly et al., 1988, Br. J. Kancer 57:174-177; Leek et al., 1994, J. Leukoc. Biol.56:423-435. U proučavanjima primarnih humanih tumora, postoji široko raspostranjen dokaz za CSF-1 mRNK ekspresija. Dodatno, mnoga ispitivanja su pokazala da su povišeni CSF-1 u serumu, broj TAM-ova, ili prisustvo tkiva CSF-1 i/ili c-fms povezani sa slabom prognozom za pacijenta koji je oboleo od kancera.

[0002] TAM-ovi podržavaju rast tumora, metastaze i opstanak na razne načine, uključujući direktnu mitogenu aktivnost na ćelije tumora putem lučenja PDGF, TNF-β i EGF i metastaze putem proizvodnje ECM-degradirajućih enzima (revidirano u Leek and Harris, 2002, J. Mammary Gland Biol and Neoplasia 7:177-189, i Lewis and Pollard, 2006, Cancer Res 66:605-612). Jos jedno bitno sredstvo tumorske podrške TAM-ovima je učešće u neo-vaskularizaciji tumora putem proizvodnje raznih proangiogenih faktora kao što je COX-2, VEGF-ovi, FGF-ovi, EGF, azot oksid, angiopoietini, i MMP-ovi. Dranoff et al., 2004, Nat. Rev. Cancer 4:11-22; MacMicking et al., 1997, Annu. Rev. Immunol.15:323-350; Mantovani et al., 1992, Immunol. Today 13:265-270. Dodatno, CSF-1-izvedeni makrofagi mogu biti imunosupresivni kroz proizvodnju raznih faktora kao što su prostaglandini, indolamin 2,3 dioksigenaza, azot oksid, IL-10, i TGFβ̃. MacMicking et al., 1997, Annu. Rev. Immunol.15:323-350; Bronte et al, 2001, J. Immunother. 24:431-446.

[0003] CSF-1 je eksprimiran i kao membranski povezan i kao rastvorljivi citokin (Cerretti et al., 1988, Mol. Immunol.25:761-770; Dobbin et al., 2005, Bioinformatics 21:2430-2437; Wong et al., 1987, Biochem. Pharmacol.36:4325-4329) i reguliše opstanak, proliferaciju, hemotaksu i aktivaciju makrofaga i njihovih prekursora (Bourette et al., 2000, Faktor rastas 17:155-166; Cecchini et al.,1994, Development 120:1357-1372; Hamilton, 1997, J. Leukoc. Biol.62:145-155; Hume, 1985, Sci. Prog.69:485-494;

Sasmono and Hume, in: The innate immune odgovor to infection (eds. Kaufmann, S., Gordon, S. & Medzhitov, R.) 71-94 (ASM Press, New York, 2004); Ross and Auger, in: The macrophage (eds. Burke, B. & Lewis, C.) (Oxford University Press, Oxford, 2002)).

[0004] Srodni receptor, koji je c-fms proto-onkogen (takođe poznat kao M-CSFR, CSF-1R ili CD115), je 165-kD glikoprotein sa povezanom tirozin kinaza aktivnošću i pripada klasi III receptor tirozin kinaza porodici koja uključuje PDGFR-α, PDGFR-β, VEGFR1, VEGFR2, VEGFR3, Flt3 i c-kit. Blume-Jensen and Hunter, 2001, Nature 411:355-365; Schlessinger and Ullrich, 1992, Neuron 9:383-391; Sherr et al., 1985 Cell 41:665-676; van der Geer et al., 1994, Annu. Rev. Cell. Biol.10:251-337. Onkogeni oblici c-fms, vfms, koji su nošeni McDonough sojem mačijeg sarkoma virusa mutiran je kako bi se konstituisala aktivnost aktivirane protein kinaze (Sherr et al., 1985, Cell 41:665-676; Roussel and Sherr, 2003, Cell Cycle 2: 5-6). Ekspresija c-fms u normalnim ćelijama ograničena je mijelomonocitnim ćelijama (uključujući monocite, makrofage tkiva, Kupffer ćelije, Langerhans ćelije, mikroglijalne ćelije i osteoklaste), hematopoietičnim prekursorim i trofoblastima. Arai et al., 1999, J. Exp. Med.190:1741-1754; Dai et al., 2002, Blood 99:111-120; Pixley and Stanley, 2004, Trends Cell Biol.14:628-638.

Ekspresija c-fms takođe je pokazana u nekim ćelijama tumora (Kirma et al., 2007, Cancer Res 67:1918-1926). Razna in vitro ispitivanja i analize mutant miševa pokazala su da je CSF-1 ligand za c-fms (videti, npr., Bourette and Rohrschneider, 2000, Faktor rastas 17:155-166; Wiktor-Jedrzejczak et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.87:4828-4832; Yoshida et al., 1990, Nature 345:442-444; van Wesenbeeck i van Hul, 2005, Crit. Rev. Eukaryot. Gene Expr.15:133-162).

[0005] Dodavanjem membranom vezanog c-fms, rastvorljivog c-fms, ili monoklonalnog anti-c-fms antitela iz pacova ili miša u leukemijsku ćelijsku liniju J6-1 (ćelije koje eksprimiraju i c-fms i CSF-1) inhibira se ćelijska proliferacija i formacija klastera, ali se i stimuliše prianjanje tih ćelija za ploče za uzgajanje (Zheng et al., 2000, Leukemia Research, 24(5):375-383). Vezivanje CSF-1 za c-fms indukuje autofosforilaciju receptora na određenim mestima što rezultira kao nizvodna aktivacija aktivacija signalizirajućih putanja uključujući PI3-K/AKT i Ras/Raf/MEK/MAPK, a diferencijacija makrofaga primarno je posredovana putem istrajne MEK aktivnosti (Gosse et al., 2005, Cellular Signaling 17:1352-1362). Veoma skorašnji dokaz ukazuje da je interleukin-34 (IL-34) takođe ligand za c-fms (Lin, et al.2008, Science 320:807-811).

SUŠTINA

[0006] Ovde su opisani antigen-vezujući proteini koji vezuju c-fms, uključujući humani c-fms. Pronađeno je da humani c-fms antigen-vezujući proteini inhibiraju, ometaju, ili modulišu najmanje jedan od bioloških odgovora povezanih sa c-fms, i, kao takvi, korisni su za ublažavanje efekata c-fms-povezanih bolesti ili poremećaji. Prema tome, vezivanje određenih antigen-vezujućih proteina za c-fms može imati jednu ili više sledećih aktivnosti: inhibiranje, ometanje, ili modulisanje c-fms-CSF-1 vezivanja ili signaliziranja, inhibiranje c-fms-IL-34 vezivanja ili signaliziranja, redukovanje migracije monocita u tumore, i/ili redukovanje akumulacije makrofaga povezanih sa tumorom (TAM-ovi).

[0007] Ovaj pronalazak definisan je u patentnim zahtevima.

[0008] Opisani su ekspresioni sistemi, uključujući ćelijske linije, za proizvodnju c-fms receptor antigen vezujućih proteina i postupci za dijagnostikovanje i lečenje bolesti povezanih sa humanim c-fms.

[0009] Neki od izolovanih antigen-vezujućih proteina koji su opisani obuhvataju (A) jedan ili više komplementarno određujućih regiona teškog lanca (CDRH-ova) odabrani iz grupe koju čine: (i) CDRH1 odabran iz grupe koju čine SEQ ID NO:136-147; (ii) CDRH2 odabran iz grupe koju čine SEQ ID NO:148-164; (iii) CDRH3 odabran iz grupe koju čine SEQ ID NO:165-190; i (iv) CDRH iz (i), (ii) i (iii) koji sadrži jednu ili više aminokiselinskih supstitucija, delecija ili umetanja koje ukupno broje ne više od četiri aminokiseline; (B) jedan ili više komplementarno određujućih regiona lakog lanca (CDRL-ova) odabrani iz grupe koju čine: (i) CDRL1 odabran iz grupe koju čine SEQ ID NO:191-210; (ii) CDRL2 odabran iz grupe koju čine SEQ ID NO:211-224; (iii) CDRL3 odabran iz grupe koju čine SEQ ID NO:225-246; i (iv) CDRL iz (i), (ii) i (iii) koji sadrži jednu ili više aminokiselinskih supstitucija, delecija ili umetanja koje ukupno broje ne više od četiri aminokiseline; ili (C) jedan ili više CDRH-ova teškog lanca iz (A) i jedan ili više CDRL-ova lakog lanca iz (B).

[0010] U jednom aspektu, izolovani antigen-vezujući protein može da obuhvata najmanje jedan ili dva CDRH prethodno pomenutog (A) i najmanje jedan ili dva CDRL prethodno pomenutog (B). U još jednom aspektu, izolovani antigen-vezujući protein uključuje CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2 i CDRL3.

[0011] U određenim antigen vezujućim proteinima, CDRH prethodno pomenutog (A) dalje je odabran iz grupe koju čine: (i) CDRH1 odabran iz grupe koju čine SEQ ID NO:136-147; (ii) CDRH2 odabran iz grupe koju čine SEQ ID NO:148-164; (iii) CDRH3 odabran iz grupe koju čine SEQ ID NO:165-190; i (iv) CDRH iz (i), (ii) i (iii) koji sadrži jednu ili više aminokiselinskih supstitucija, delecija ili umetanja od ne više od dve aminokiseline; CDRL prethodno pomenutog (B) odabran iz grupe koju čine: (i) CDRL1 odabran iz grupe koju čine SEQ ID NO:191-210; (ii) CDRL2 odabran iz grupe koju čine SEQ ID NO:211-224; (iii) CDRL3 aminokiselinska sekvenca odabrana iz grupe koju čine SEQ ID NO:225-246; i (iv) CDRL iz (i), (ii) i (iii) koji sadrži jednu ili više aminokiselinskih supstitucija, delecija ili umetanja od ne više od dve aminokiseline; ili (C) jedan ili više CDRH-ova teškog lanca iz (A) i jedan ili više CDRL-ova lakog lanca iz (B).

[0012] U još jednom aspektu, izolovani antigen-vezujući protein može da obuhvata (A) CDRH odabran iz grupe koju čine (i) CDRH1 odabran iz grupe koju čine SEQ ID NO:136-147; (ii) CDRH2 odabran iz grupe koju čine SEQ ID NO:148-164; i (iii) CDRH3 odabran iz grupe koju čine SEQ ID NO:165-190; (B) CDRL odabran iz grupe koju čine (i) CDRL1 odabran iz grupe koju čine SEQ ID NO:191-210; (ii) CDRL2 odabran iz grupe koju čine SEQ ID NO:211-224; i (iii) CDRL3 odabran iz grupe koju čine SEQ ID NO:225-246; ili (C) jedan ili više CDRH-ova teškog lanca iz (A) i jedan ili više CDRL-ova lakog lanca iz (B). U jednom primeru izvođenja, izolovani antigen-vezujući protein može da uključi (A) CDRH1 iz SEQ ID NO:136-147, CDRH2 iz SEQ ID NO:148-164, i CDRH3 iz SEQ ID NO:165-190, i (B) CDRL1 iz SEQ ID NO:191-210, CDRL2 iz SEQ ID NO:211-224, i CDRL3 iz SEQ ID NO:225-246. U još jednom primeru izvođenja, varijabilni teški lanac (VH) ima najmanje 90% sekvencijalnog identiteta sa aminokiselinskom sekvencom odabranom iz grupe koju čine SEQ ID NO:70-101, i/ili varijabilni laki lanac (VL) ima najmanje 90% sekvencijalnog identiteta sa aminokiselinskom sekvencom odabranom iz grupe koju čine SEQ ID NO:102-135. U daljem primeru izvođenja, VHodabran je iz grupe koju čine SEQ ID NO:70-101, i/ili VLodabran je iz grupe koju čine SEQ ID NO:102-135.

[0013] U još jednom aspektu, obezbeđen je izolovani antigen vezujući protein koji se specifično vezuje za epitop koji sadrži c-fms subdomene 1-1 nalik Ig i 1-2 nalik Ig humanog c-fms.

[0014] U još jednom aspektu, obezbeđen je izolovani antigen vezujući protein koji vezuje c-fms koji obuhvata: (A) jedan ili više CDR-ova teškog lanca (CDRH-ova) odabrani iz grupe koju čine (i) CDRH1 sa najmanje 80% sekvencijalnog identiteta sa SEQ ID NO:136-147; (ii) CDRH2 sa najmanje 80% sekvencijalnog identiteta sa SEQ ID NO:148-164; i (iii) CDRH3 sa najmanje 80% sekvencijalnog identiteta sa SEQ ID NO:165-190; (B) jedan ili više CDR-ova lakog lanca (CDRL-ova) odabrani iz grupe koju čine: (i) CDRL1 sa najmanje 80% sekvencijalnog identiteta sa SEQ ID NO:191-210; (ii) CDRL2 sa najmanje 80% sekvencijalnog identiteta sa SEQ ID NO:211-224; i (iii) CDRL3 sa najmanje 80% sekvencijalnog identiteta sa SEQ ID NO:225-246; ili (C) jedan ili više CDRH-ova teškog lanca iz (A) i jedan ili više CDRL-ova lakog lanca iz (B). U jednom primeru izvođenja, izolovani antigen-vezujući protein uključuje (A) jedan ili više CDRH-ova odabrano iz grupe koju čine: (i) CDRH1 sa najmanje 90% sekvencijalnog identiteta sa SEQ ID NO:136-147; (ii) CDRH2 sa najmanje 90% sekvencijalnog identiteta sa SEQ ID NO:148-164; i (iii) CDRH3 sa najmanje 90% sekvencijalnog identiteta sa SEQ ID NO:165-190; (B) jedan ili više CDRL-ova odabrano iz grupe koju čine: (i) CDRL1 sa najmanje 90% sekvencijalnog identiteta sa SEQ ID NO:191-210; (ii) CDRL2 sa najmanje 90% sekvencijalnog identiteta sa SEQ ID NO:211-224; i (iii) CDRL3 sa najmanje 90% sekvencijalnog identiteta sa SEQ ID NO:225-246; ili (C) jedan ili više CDRH-ova teškog lanca iz (A) i jedan ili više CDRL-ova lakog lanca iz (B).

[0015] Još jedan aspekt je izolovani antigen-vezujući protein koji vezuje c-fms, pri čemu taj antigenvezujući protein uključuje jedan ili kombinaciju CDR-ova sa konsenzus sekvencama opisane u nastavku. Grupe A, B, i C odnose se na sekvence izvedene iz filogenetski povezanih klonova. U jednom aspektu, CDR-ovi iz različitih grupa mogu se mešati i uparivati. U još jednom aspektu, antigen vezujući protein obuhvata dva ili više CDRH-ova iz jedne i iste grupe A, B, ili C. U još jednom aspektu, antigen vezujući protein obuhvata dva ili više CDRL-ova iz iste grupe A, B, ili C. U još jednom aspektu, antigen vezujući protein obuhvata najmanje dva ili tri CDRH-a, i/ili najmanje dva ili tri CDRL-a iz iste grupe A, B, ili C. Konsenzus sekvence za različite grupe su kako sledi:

[0016] Grupa A: (a) CDRH1 generičke formule GYTX1TSYGIS (SEQ ID NO:307), u kojoj X1je odabran iz grupe koju čine F i L; (b) CDRH2 generičke formule WISAYNGNX1NYAQKX2QG (SEQ ID NO:308), u kojoj X1je odabran iz grupe koju čine T i P, i X2je odabran iz grupe koju čine L i F; (c) CDRH3 generičke formule X1X2X3X4X4X5FGEX6X7X8X9FDY (SEQ ID NO:309), u kojoj X1je odabran iz grupe koju čine E i D, X2je odabran iz grupe koju čine S i Q, X3je odabran iz grupe koju čine G i ni jedna aminokiselina, X4je odabran iz grupe koju čine L i ni jedna aminokiselina, X5je odabran iz grupe koju čine W i G, X6je odabran iz grupe koju čine V i L, X7je odabran iz grupe koju čine E i ni jedna aminokiselina, X8je odabran iz grupe koju čine G i ni jedna aminokiselina, i X9je odabran iz grupe koju čine F i L; (d) CDRL1 generičke formule KSSX1GVLX2SSX3NKNX4LA (SEQ ID NO:310), u kojoj X1je odabran iz grupe koju čine Q i S, X2je odabran iz grupe koju čine D i Y, X3je odabran iz grupe koju čine N i D, i X4je odabran iz grupe koju čine F i Y; (e) CDRL2 generičke formule WASX1RES (SEQ ID NO:311), u kojoj X1je odabran iz grupe koju čine N i T; i (f) CDRL3 generičke formule QQYYX1X2PX3T (SEQ ID NO:312), u kojoj X1je odabran iz grupe koju čine S i T, X2je odabran iz grupe koju čine D i T, i X3je odabran iz grupe koju čine F i P.

[0017] Grupa B: (a) CDRH1 generičke formule GFTX1X2X3AWMS (SEQ ID NO:313), u kojoj X1je odabran iz grupe koju čine F i V, X2je odabran iz grupe koju čine S i N, i X3je odabran iz grupe koju čine N i T; (b) CDRH2 generičke formule RIKX1KTDGX2TX3DX4AAPVKG (SEQ ID NO:314), u kojoj X1je odabran iz grupe koju čine S i T, X2je odabran iz grupe koju čine G i W, X3je odabran iz grupe koju čine T i A, i X4je odabran iz grupe koju čine Y i N; (c) CDRH3 generičke formule X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13YYGX14DV (SEQ ID NO:315), u kojoj X1je odabran iz grupe koju čine E, D i G, X2je odabran iz grupe koju čine Y, L i ni jedna aminokiselina, X3je odabran iz grupe koju čine Y, R, G i ni jedna aminokiselina, X4je odabran iz grupe koju čine H, G, S i ni jedna aminokiselina, X5je odabran iz grupe koju čine I, A, L i ni jedna aminokiselina, X6je odabran iz grupe koju čine L, V, T, P i ni jedna aminokiselina, X7je odabran iz grupe koju čine T, V, Y, G, W i ni jedna aminokiselina, X8je odabran iz grupe koju čine G, V, S i T, X9je odabran iz grupe koju čine S, T, D, N i G, X10je odabran iz grupe koju čine G, F, P, i Y, X11je odabran iz grupe koju čine G, Y i N, X12je odabran iz grupe koju čine V i Y, X13je odabran iz grupe koju čine W, S i Y, i X14je odabran iz grupe koju čine M, T i V; (d) CDRL1 generičke formule QASQDIX1NYLN (SEQ ID NO:316), u kojoj X1je odabran iz grupe koju čine S i N; (e) CDRL2 generičke formule DX1SNLEX2(SEQ ID NO:317), u kojoj X1je odabran iz grupe koju čine A i T, i X2je odabran iz grupe koju čine T i P; i (f) CDRL3 generičke formule QQYDX1LX2T (SEQ ID NO:318), u kojoj X1je odabran iz grupe koju čine N i D, i X2je odabran iz grupe koju čine L i I.

[0018] Grupa C: (a) CDRH1 generičke formule GFTFX1SYGMH (SEQ ID NO:319), u kojoj X1je odabran iz grupe koju čine S i I; (b) CDRH2 generičke formule VIWYDGSNX1YYADSVKG (SEQ ID NO:320), u kojoj X1je odabran iz grupe koju čine E i K; (c) CDRH3 generičke formule SSX1X2X3YX4MDV (SEQ ID NO:321), u kojoj X1je odabran iz grupe koju čine G, S i W, X2je odabran iz grupe koju čine N, D i S, X3je odabran iz grupe koju čine Y i F, i X4je odabran iz grupe koju čine D i G; (d) CDRL1 generičke formule QASX1DIX2NX3LN (SEQ ID NO:322), u kojoj X1je odabran iz grupe koju čine Q i H, X2je odabran iz grupe koju čine S i N, i X3je odabran iz grupe koju čine F i Y; (e) CDRL2 generičke formule DASNLEX1(SEQ ID NO:323), u kojoj X1je odabran iz grupe koju čine T i I; i (f) CDRL3 generičke formule QX1YDX2X3PX4T (SEQ ID NO:324), u kojoj X1je odabran iz grupe koju čine Q i R, X2je odabran iz grupe koju čine N i D, X3je odabran iz grupe koju čine L i F, i X4je odabran iz grupe koju čine F, L i I.

[0019] U još jednom aspektu, izolovani antigen vezujući protein koji je prethodno opisan obuhvata prvu aminokiselinsku sekvencu koja obuhvata najmanje jedan CDRH i drugu aminokiselinsku sekvencu koja obuhvata najmanje jedan CDRL. U jednom aspektu, prva i druga aminokiselinska sekvenca kovalentno su povezane jedna za drugu. U daljem aspektu, prva aminokiselinska sekvenca izolovanog antigenvezujućeg proteina uključuje CDRH3 iz SEQ ID NO:165-190, CDRH2 iz SEQ ID NO:148-164, i CDRH1 iz SEQ ID NO:136-147, a druga aminokiselinska sekvenca izolovanog antigen vezujućeg proteina obuhvata CDRL3 iz SEQ ID NO:225-246, CDRL2 iz SEQ ID NO:211-224, i CDRL1 iz SEQ ID NO:191-210.

[0020] U jednom aspektu, izolovani antigen-vezujući proteini koji su ovde obezbeđeni mogu biti monoklonalno antitelo, poliklonalno antitelo, rekombinantno antitelo, humano antitelo, humanizovano antitelo, himerno antitelo, multispecifično antitelo, ili njihov fragment antitela. U još jednom aspektu, fragment antitela izolovanih antigen-vezujućih proteina može biti Fab fragment, Fab' fragment, F(ab')2fragment, Fv fragment, dijatelo, ili molekul jednolančanog antitela. U daljem primeru izvođenja, izolovani antigen vezujući protein je humano antitelo i može biti IgG1-, IgG2-, IgG3-, ili IgG4-tipa.

[0021] U još jednom aspektu, izolovani antigen-vezujući protein može ući u kompeticiju za vezivanje sa ekstracelularnim delom humanog c-fms sa antigen vezujućim proteinom jednog od izolovanih antigenvezujućih proteina koji je obezbeđen. U jednom primeru izvođenja, izolovani antigen vezujući protein može redukovati monocitnu hemotaksu, inhibirati migraciju monocita u tumore, inhibirati akumulacije makrofaga povezanog sa tumorom u nekom tumoru ili inhibirati akumulacije makrofaga u bolesnom tkivu kada se daje pacijentu.

[0022] U daljem aspektu, takođe su obezbeđeni izolovani molekuli nukleinske kiseline koji kodiraju antigen-vezujuće proteine koji se vezuju za c-fms. U nekim slučajevima, izolovani molekuli nukleinske kiseline operativnos u vezani za kontrolnu sekvencu.

[0023] U još jednom aspektu, takođe su obezbeđeni ekspresioni vektori i ćelije domaćini transformisani ili transfektovani sa ekspresionim vektorima koji obuhvataju prethodno pomenute izolovane molekule nukleinske kiseline koji kodiraju antigen-vezujuće proteine koji se mogu vezati za c-fms.

[0024] U još jednom aspektu, takođe su obezbeđeni postupci pripremanja antigen-vezujućih proteina koji uključuju fazu pripremanja antigen vezujućeg proteina iz ćelije domaćina koja luči taj antigenvezujući protein.

[0025] U još jednom aspektu, obezbeđena je farmaceutska kompozicija koja obuhvata najmanje jedan od prethodno pomenutih obezbeđenih antigen-vezujućih proteina i farmaceutski prihvatljiv ekscipijens. U jednom aspektu, farmaceutska kompozicija može da obuhvata dodatni aktivni agens koji je odabran iz grupe koju čine radioizotop, radionuklid, toksin, ili neki terapeutik i neka hemioterapeutska grupa.

[0026] Ovde je opisan postupak za lečenje ili prevenciji nekog stanja povezanog sa c-fms kod pacijenta, koji obuhvata davanje pacijentu efektivne količine najmanje jednog izolovanog antigen-vezujućeg proteina. To stanje može biti kancer koji je odabran iz grupe koju čine kancer dojke, kancer prostate, kolorektalni kancer, endometrijalni adenokarcinom, leukemija, limfom, melanom, kancer ezofagealnih skvamoznih ćelija, gastrični kancer, astrocitni kancer, endometrijalni kancer, kancer grlića materice, kancer bešike, kancer bubrega, kancer bešike, kancer pluća, i kancer jajnika.

[0027] Takođe je opisan postupak inhibiranja vezivanja CSF-1 za ekstracelularni deo c-fms kod pacijenta, koji obuhvata davanje efektivne količine najmanje jednog antigen-vezujućeg proteina koji je ovde obezbeđen.

[0028] Ovde je takođe opisan postupak inhibiranja autofosforilacije humanog c-fms kod pacijenta, koji obuhvata davanje efektivne količine najmanje jednog antigen vezujućeg proteina koji je ovde obezbeđen.

[0029] Ovde je takođe opisan postupak redukovanja monocitne hemotakse kod pacijenta, koji obuhvata davanje efektivne količine najmanje jednog antigen vezujućeg proteina.

[0030] U jednom aspektu, ovde je opisan postupak inhibiranja migracije monocita u tumore kod pacijenta, koji obuhvata davanje efektivne količine najmanje jednog antigen vezujućeg proteina.

[0031] U još jednom aspektu, ovde je takođe opisan postupak inhibiranja akumulacije makrofaga povezanog sa tumorom u nekom tumoru kod pacijenta, koji obuhvata davanje efektivne količine najmanje jednog antigen vezujućeg proteina.

[0032] Ovi i drugi aspekti biće detaljnije opisani u nastavku. Svaki od obezbeđenih aspekata može da obuhvati razne aspekte koji su ovde obezbeđeni. Stoga je očekivano da svaki od aspekata koji uključuje jedan element ili kombinaciju elemenata može biti uključen u svaki opisani aspekt. Ostale karakteristike, ciljevi, i prednosti ovde opisanog, postaju očigledne u detaljnom opisu koji sledi.

KRATAK OPIS CRTEŽA

[0033]

FIG.1A prikazuje poređenje sekvenci varijabilnih regiona teškog koje su ovde obezbeđene. FIG.1B prikazuje poređenje sekvenci varijabilnih regiona lakog koje su ovde obezbeđene. Indikovani su CDR i okvirni regioni.

FIG.2 prikazuje rodnu analizu za 29 anti-c-fms hibridome. Aminokiselinske sekvence koje odgovaraju bilo varijabilnom teškom (VH) ili varijabilnom lakom (VL) domenu svih kloniranih hibridoma poravnate su i upoređene jedna sa drugom kako bi se razrešila različitost antitela. Prikazani su dendrogrami koji predstavljaju ova komaparativna poravnanja u kojima horizontalna dužina grane odgovara relativnom broju Supstitucija (razlike) između bilo koje dve sekvence ili klada sekvenci (grupe blisko povezanih sekvenci). Indikovane su sekvence grupisane zajedno radi određivanja konsenzus sekvenci.

FIG.3 demonstrira inhibicijau AML-5 proliferacije upotrebom hibridom anti-c-fms supernatanata. FIG.

3A prikazuje AML-5 Bioogled sa hibridom anti-c-fms supernatantima. FIG.3B prikazuje AML-5 bioogled sa prečišćenim rekombinantnim anti-c-fms antitelima. AML-5 ćelije inkubirane su sa 10 ng/ml CSF-1 u prisustvu antitela opadajuće koncentracije. Nakon 72 sata, proliferacija ćelija izmerena je upotrebom Alamar Plavo.

FIG.4 prikazuje CynoBM ogled sa titracijom c-fms antitela u CSF-1. Prikazana je inhibicija proliferacije ćelija CSF-1-obogaćene cinomolgus koštane srži upotrebom hibridom anti-c-fms supernatanata. Ćelije cinomolgus koštane srži inkubirane su sa 10 ng/ml CSF-1 u prisustvu antitela opadajuće koncentracije. Nakon 72 sata, proliferacija ćelija izmerena je upotrebom Alamar Plavo.

FIG.5 prikazuje inhibiciju ligand-indukovog pTyr-c-fms pomoću IgG2mAb-ova (PT, roditeljski oblici). 293T/c-fms ćelijama uskraćen je serum tokom 1h i tretirane su sa IgG2mAb-ovima, 1.109, 1.2 ili 2.360 (PT) i kontrolnim mAb-ovima anti-c-fms 3-4A4 (neblokirajući) i anti-h-CD39 M105 (nespecifični) u titracionim serijama (1.0 do 0.0001 µg/ml) ili pri 1.0 µg/ml (kontrole). Ćelije su zatim stimulisane sa 50 ng/ml CSF-1 tokom 5 min na 37 °C. Celi ćelijski lizati su imunoistaloženi sa anti-c-fms C20 kako je opisano. Western blotovi ispitivani su bilo sa anti-pTyr 4G10 (gornji panel) ili anti-c-fms C20 (donji panel) radi detektovanja pTyr/c-fms i ukupnog c-fms, respektivno.

FIG.6 poredi inhibiciju ligand-indukovanog pTyr-c-fms pomoću IgG2mAb-ova (PT versus SM (izlečen somatskom mutacijom) oblici).293T/c-fms ćelijama uskraćen je serum tokom 1h i tretirane su sa IgG2mAb-ovima, 1.109, 1.2 ili 2.360 (oba PT ili SM) i kontrolnim mAb-ovima anti-c-fms 3-4A4 (neblokirajući) pri 1.0 i 0.1 µg/ml. Ćelije su zatim stimulisane sa 50 ng/ml CSF-1 tokom 5 min na 37 °C i Celi ćelijski lizati su imunoistaloženi sa anti-c-fms C20 kako je opisano. Western blotovi ispitivani su bilo sa anti-pTyr 4G10 (gornji panel) ili anti-c-fms C20 (donji panel) radi detektovanja pTyr/c-fms i ukupno c-fms, respektivno. FIG.7 prikazuje western blot imunotaloženja c-fms pomoću IgG2mAb-ova (PT versus SM oblici). Celi ćelijski lizati nestimulisanih 293T/c-fms ćelija imunoistaloženi su preko noći na 4 °C upotrebom IgG2mAb-ova, 1.109, 1.2 ili 2.360 (oba PT ili SM oblici) i anti-c-fms C20 pri 2.5 µg/ml. Western blot ispitan je sa anti-c-fms C20 i anti-zečji IgG/HRP.

FIG.8 prikazuje amino sekvencu (SEQ ID NO:1) regiona esktracelularnog domena humanog c-fms. FIG.9 prikazuje western blotove imunotaloženja c-fms SNP-ovi. Ekspresioni konstrukti indikovanih c-fms SNP-ova konstruisani su i tranzitno eksprimirani u 293T/c-fms ćelijama. Nestimulisani celi ćelijski lizati zatim su imunoistaloženi sa svakim mAb i kontrolnim Abs. Western blotovi ispitivani su sa c-fms H300 i anti-zečji IgG/HRP.

FIG.10 prikazuje dijagram humanog c-fms ECD (ekstracelularni domen) i skraćene konstrukte. Avidin oznaka fuzionisana je u okviru na N terminusu c-fms. Prve i zadnje četiri aminokiseline indkovane su za svaki od c-fms konstrukata.

FIG.11 demonstrira vezivanje FITC obeleženog anti-avidin, 1.109, 1.2 i 2.360 c-fms antitela za c-fms ECD i skraćeni avidin fuzioni protein.

FIG.12 prikazuje vezivanje anti-avidin FITC, kontrolnog antitela i anti-c-fms antitela (FITC obeleženog) sa c-fms pune dužine i petlje 2 nalik Ig (sama) fuzionog proteina.

FIG.13 pokazuje ogled kompeticije sa 20x neobeleženim 1.109, 1.2, i 2.360 c-fms antitelima, praćeno sa 1µg/ml koncentracijom FITC obeleženog 1.109.

FIG.14 prikazuje ogled kompeticije sa 20X neobeleženim 1.109, 1.2, i 2.360 c-fms antitelima, praćeno sa 1µg/ml koncentracijom FITC obeleženog 1.2.

FIG.15 prikazuje ogled kompeticije sa 20X neobeleženim 1.109, 1.2, i 2.360 c-fms antitelima, praćeno sa 1µg/ml koncentracijom of FTTC obeleženog 2.360.

FIG.16 prikazuje inhibiciju rasta MDAMB231 ksenografta adenokarcinoma dojke anti-mišjim c-fms antiteloom merenjem zapremine tumora i procenta nekroze svakog tumora. Procenat nekroze svakog tumora zatim je izračunat iz ovih merenja i prikazan na FIG.16

FIG.17 prikazuje inhibiciju rasta utvrđenih NCIH1975 ksenografta adenokacinoma pluća. Prikazani su dani merenja tumora i dani tretiranja, što potvrđuje da anti-mišje c-fms antitelo može da inhibira rast utvrđenog NCIH1975 ksenografta adenokarcinoma pluća.

DETALJAN OPIS

[0034] Naslovi sekcija koji se ovde upotrebljavaju namenjeni su samo ta organizacione svrhe i nisu konstruisani da ograničavaju opisanu predmetnu temu.

[0035] Ukoliko nije drugačije naznačeno, naučni i tehnički izrazi koji se koriste u vezi sa ovom prijavom, imaju značenje koje se uobičajeno koristi od strane stručnjaka iz ove oblasti. Dalje, ukoliko nije drugačije zahtevano od strane konteksta, termini u jednini uključivaće i množine, a termini u množini uključivaće jedninu.

[0036] Generalno, nomenklature koje se koriste u vezi sa, i tehnike, kultivisanjem ćelija i tkiva, molekularnom biologijom, imunologijom, mikrobiologijom, genetikama i hemijama proteina i nukleinske kiseline i hibridizacijom ovde opisani, jesu jedan koje su dobro poznate i uobičajeno korišćene u struci. Postupci i tehnike ove prijave generalno se izvode u skladu sa koncencionalnim postupcima dobro poznatim u struci i kako je opisano u raznim opštim i specifičnijim referencama koje su navedene i obrađene kroz ovu specifikaciju ukoliko nije drugačije naznačeno. Videti, npr., Sambrook et al., Molecular Kloniranje: A Laboratory Manual, 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2001), Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates (1992), i Harlow and Lane Antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1990). Enzimatske reakcije i tenike prečišćavanja izvode se u skladu sa specifikacijama proizvođača, kako se inače izvodi u struci ili kako je ovde opisano. Terminologija koja se koristi u vezi sa, i laboratorijske procedure za, analitičku hemiju, sintetičku organsku hemiju, i medicinsku i farmaceutsku hemiju ovde opisane, predstavljaju jedan dobro poznate i uobičajeno korišćene u struci. Standardne tehnike mogu se primeniti za hemijske sinteze, hemijhske analize, farmaceutsko pripremanje, foemulisanje, i dostavu, i lečenje pacijenata.

[0037] Ovaj pronalazak definisan je patentnim zahtevima, i prikazan povezaniom metodologijom, protokolima i reagensima, itd., koji su ovde opisani. Ovde korišćena terminologija upotrebljena je samo u cilju opisivanja određenih primera ostvarenja.

[0038] Osim u radnim primerima, ili gde je drugačije naznačeno, svi upotrebljeni brojevi koji izražavaju količine sastojaka ili reakcionih stanja treba da budu shvaćeni kao modifikovani u svim slučajevima sa izrazom "oko." Izraz "oko" kada se koristi u vezi sa procentima može imati značenje ±1%.

Definicije

[0039] Izraz "polinukleotid" ili "nukleinska kiselina" uključuje i jednolančane i dvolančane nukleotidne polimere. Nukleotidi koji obuhvataju polinukleotid mogu biti ribonukleotidi ili deoksiribonukleotidi ili modifikovan olik bilo kog tipa nukleotida. Pomenute modifikacije uključuje osnovne modifikacije kao što su bromouridin i inozin derivati, riboza modifikacije kao što su 2',3'-dideoksiriboza, i modifikacije internukleotid veze kao što su fosforotioat, fosforoditioat, fosforoselenoat, fosforodiselenoat, fosforoanilotioat, fosforaniladat i fosforoamidat.

[0040] Izraz "oligonukleotid" označava polinukleotid koji obuhvata 200 ili manje nukleotida. U nekim primerima izvođenja, oligonukleotidi su 10 do 60 baza u dužinu. U drugim primerima izvođenja, oligonukleotidi su 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, ili 20 do 40 nukleotida u dužinu. Oligonukleotidi mogu biti jednolančani ili dvolančani, npr., za upotrebu u konstrukciji mutant gena. Oligonukleotidi mogu biti sens ili antisens oligonukleotidi. Oligonukleotid može da uključi oznaku, uključujući radiooznaku, fluorescentnu oznaku, hapten ili antigensku oznaku, u detekcionim ogledima. Oligonukleotidi se mogu primeniti, primera radi, kao PCR prajmeri, klonirajući prajmeri ili hibridizaciona ispitivanja.

[0041] "izolovani molekul nukleinske kiseline" označava DNK ili RNK genomskog, mRNK, cDNK, ili sintetičkog porekla ili neke njihove kombinacije koja nije povezana sa svim ili delom polinukleotida u kojoj se izolovani polinukleotid nalazi u prirodi, ili je vezan za polinukleotid za koji nije povezan u prirodi. U cilju ovog opisa, treba uzeti u obzir da "molekul nukleinske kiseline koji obuhvata" određenu nukleotidnu sekvencu ne obuhvata intaktne hromozome. Izolovani molekuli nukleinske kiseline "koji obuhvataju" određene sekvence nukleinske kiseline mogu da uključuju, pored te određene sekvence, kodirajuće sekvence za do deset ili čak do dvadeset drugih proteina ili njihovih delova, ili mogu da uključuju operativno povezane regulatorne sekvence koje kontrolišu ekspresiju kodirajućeg regiona navedenih sekvenci nukleinske kiseline, i/ili mogu da uključuju vektorske sekvence.

[0042] Ukoliko nije drugačije određeno, levi kraj bilo koje jednolančane polinukleotidne sekvence koja je ovde opisana je 5' kraj; levi pravac dvolančane polinukleotidnih sekvenci odnosi se na 5' pravac.

Pravac od 5' do 3' pored rođenih RNK transkripcija odnosi se na pravc transkripcije; sekvencioni regioni na DNK lancu koji ima istu sekvencu kao i RNK transkript koji su 5' do 5' kraj RNK transkripta, odnose se na "uzvodne sekvence;" sekvencioni regioni na DNK lancu koji ima istu sekvencu kao i RNK transkript koji je 3' do 3' kraj RNK transkripta odnosi se na "nizvodne sekvence."

[0043] Izraz "kontrolna sekvenca" odnosi se na polinukleotidnu sekvencu koja može da utiče na ekspresiju i obrađivanje kodirajućih sekvenci za koje se vezuje. Priroda takvih kontrolnih sekvenci može da zavisi od organizma domaćina. U određenim primerima izvođenja, kontrolne sekvence za prokariote mogu da uključuju sekvence promoter, ribozomalno mesto vezivanja, i sekvencu transkripcione terminacije. Primera radi, kontrolne sekvence za eukariote mogu da uključuju promotere koji obuhvataju jedno ili više mesta prepoznavanja za transkripcione faktore, sekvence za osnaživanje transkripcije, i sekvencu transkripcione terminacije. "Kontrolne sekvence" mogu da uključe vodeće sekvence i/ili fuzione partner sekvence.

[0044] Izraz "vektor" odnosi se na bilo koji molekul ili entitet (npr., nukleinska kiselina, plazmid, bakteriofag ili virus) koji se koristi za transfer protein kodirajuće informacije u ćeliju domaćin.

[0045] Izraz "ekspresioni vektor" ili "ekspresioni konstrukt" odnosi se na vektor koji je pogodan za transformaciju ćelije domaćina i sadrži sekvence nukleinske kiseline koje usmeravaju i/ili kontrolišu (u konjukciji sa ćelijom domaćinom) ekspresiju jednog ili više heterolognih kodirajućih regiona operativno vezan za njih. Ekspresioni konstrukt može da uključi, ali bez ograničenja, sekvence koje utiču ili kontrolišu transkripciju, translaciju, i, ukoliko su prisutni introni, utiče na RNK spajanje kodirajućeg regiona operativno u njemu.

[0046] Kako se ovde koristi, "operativno vezan" označava da su komponente za koje se ovaj izraz upotrebljava u vezi koja im omogućava da izvedu svoje inherentne funkcije pod pogodnim uslovima. Primera radi, kontrolna sekvenca u vektoru koja je "operativno vezana" za protein kodirajuću sekvencu, vezana je sa njom tako da se ekspresija protein kodirajuće sekvence postiže pod uslovima kompatibilnim sa transkripcionim aktivnostima kontrolnih sekvenci.

[0047] Izraz "ćelija domaćin" označava ćeliju koja je transformisana, ili je sposobna za dube transformisana, sa sekvencom nukleinske kiseline, a čime se eksprimira gen od interesa. Izraz uključuje potomstvo roditeljske ćelije, bilo da je ili nije to potomstvo identično u morfologiji ili genetskom doterivanju u originalnoj roditeljskoj ćeliji, dokle god je gen od interesa prisutan.

[0048] Izraz "transdukcija" odnosi se na transfer gena iz jedne bakterije do druge, obično bakteriofagom. "Transdukcija" se takođe odnosi na akviziciju i transfer eukariotskih ćelijskih sekvenci replikacijom defektivnih retrovirusa.

[0049] Izraz "transfekcija" onosi se na preuzimanje strane ili egzogene DNK od strane ćelije, i ćelija je "transfektovana" kada se egzogena DNK uvede unutar ćelijske membrane. Brojne transfekcione tehnike dobro su poznate u struci i ovde su opisane. Videti, npr., Graham et al., 1973, Virology 52:456; Sambrook et al., 2001, Molecular Kloniranje: A Laboratory Manual, gore; Davis et al., 1986, Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier; Chu et al., 1981, Gene 13:197. Takve tehnike mogu se koristi za uvođenje jednog ili više egzogenih DNK ostataka u pogodne ćelije domaćine.

[0050] Izraz "transformacija" odnosi se na promenu u ćelijskim genetskim karakteristikama, a ćelija je transformisana kada je modifikovana da sadrži novu DNK ili RNK. Primera radi, ćelija je transformisana kada je genetski modifikovana iz svog prirodnog stanja uvođenjem novog genetskog materijala putem transfekcije, transdukcije, ili drugim tehnikama. Praćeno transfekcijom ili transdukcijom, transformišuća DNK može biti rekombinovana sa onom ćelijskom fizičkim integrisanjem u hromozom te ćelije, ili se može održati tranzitna kao epizomalni element bez replikovanja, ili se može replikovati nezavisno kao plazmid. Smatra se da je ćelija "stabilno transformisana" kada se transformišuća DNK replikuje sa divizijom ćelije.

[0051] Izrazi "polipeptid" ili "protein" ovde se koriste naizmenično kako bi označili polimer aminokiselinskih ostataka. Izrazi se takođe primenjuju na aminokiselinske polimere u kojima je jedan ili više aminokiselinskih ostataka analog ili mimetik odgovarajuće prirodno javljajuće aminokiseline, kao i prirodno javljajući aminokiselinski polimeri. Izrazi takođe mogu da obuhvate aminokiselinske polimere koji su modifikovani, npr., dodavanjem ugljenohidratnih ostataka kako bi se obrazovali glikoproteini, ili fosforilovali. Polipeptidi i proteini mogu se proizvesti prirodno javljajućom i ne-rekombinantnom ćelijom; ili je proizveden genetski-dzajniranom ili rekombinantnom ćelijom, i obuhvataju molekule sa aminokiselinskom sekvencom nativnog proteina, ili molekula sa delecijom iz, dodavanjima u, i/ili supstitucijama jednog ili više aminokiselina nativne sekvence. Izrazi "polipeptid" i "protein" specifično obuhvataju c-fms antigen-vezujuće proteine, antitela, ili sekvence koje imaju deleciju iz, dodavanja u, i/ili Ssupstitucije jedne ili više aminokiselina antigen-vezujućeg proteina. Izraz "polipeptidni fragment" odnosi se na polipeptid koji ima amino-terminalnu deleciju, karboksil-terminalnu deleciju, i/ili unutrašnju deleciju u poređenju sa proteinom pune dužine. Takvi fragmenti mogu takođe da sadrže modifikovane aminokiseline u poređenju sa proteinom pune dužine. U određenim primerima izvođenja, fragmenti su oko pet do 500 aminokiselina dugi. Primera radi, fragmenti mogu biti najmanje 5, 6, 8, 10, 14, 20, 50, 70, 100, 110, 150, 200, 250, 300, 350, 400, ili 450 aminokiselina dugi. Korisni polipeptid fragmenti uključuju imunološki funkcionalne fragmente antitela, uključujući vezujuće domene. U slučaju c-fms-vezujućeg antitela, korisni fragmenti uključuju, ali bez ograničenja, CDR region, varijabilni domen teškog ili lakog lanca, deo lanca antitela ili samo njegov varijabilni region uključujući dva CDR-ova, i slično.

[0052] Izraz "izolovani protein" odnosi se na sredstvo kojim predmetni protein (1) je oslobođen od najmanje nekih drugih proteina sa kojima bi uobičajeno bio pronađen, (2) suštinski je oslobođen od drugih proteina istog izvora, npr., iz istih vrsta, (3) eksprimiran je od strane ćelije iz različitih vrsta, (4) odvojen je od najmanje oko 50 procenata polinukleotida, lipida, ugljenohidrata, ili drugih materijala sa kojima je povezan u prirodi, (5) operativno je povezan (kovalentnom ili nekovalentnom interakcijom) sa polipeptidom sa kojim nije povezan u prirodi, ili (6) ne javlja se u prirodi. Tipično, "izolovani protein" čini najmanje oko 5%, najmanje oko 10%, najmanje oko 25%, ili najmanje oko 50% datog uzorka. Genomska DNK, cDNK, mRNK ili druga RNK, sintetičkog porekla, ili bilo koja njihova kombinacija mogu da kodiraju takav izolovani protein. Poželjno, izolovani protein suštinski je slobodan od proteina ili polipeptida ili drugih kontaminanata koji se mogu naći u njegovom prirodnom okruženju koje mogu ometati njegovu terapeutsku, dijagnostičku, profilaktičku, istraživačku ili drugu upotrebu.

[0053] "Varijanta" polipeptida (npr., antigen vezujući protein, ili antitelo) obuhvata aminokiselinsku sekvenca u kojoj je jedan ili više aminokiselinskih ostataka umetnuto u, obrisano iz i/ili supstituisano u aminokiselinsku sekvencu u odnosu na drugu polipeptidnu sekvencu. Varijante uključuju fuzione proteine.

[0054] "Derivat" polipeptida je polipeptid (npr., antigen vezujući protein, ili antitelo) koji je hemijski modifikovan na neki način različit od varijante umetanja, brisanja, ili supstitucije, npr., putem konjugacije u neki drugi hemijski ostatak.

[0055] Izraz "koji se javlja u prirodi" kako se koristi kroz ovu specifikaciju u vezi sa biološkim materijalima kao što su polipeptidi, nukleinske kiseline, ćelije domaćini, i slično, odnosi se na materijale koji se mogu naći u prirodi.

[0056] "Antigen vezujući protein" kako se ovde koristi označava protein koji specifično vezuje određeni ciljani antigen, kao što su c-fms ili humani c-fms.

[0057] Pomenuto je da antigen vezujući protein "specifično vezuje" svoj ciljani antigen kada je konstanta disociacije (KD) ≤10<-8>M. Antitelo specifično vezuje antigen sa "visokim afinitetom" kada je KD≤5x 10<-9>M, i sa "voma visokim afinitetom" kada je KD≤5x 10<-10>M. U jednom primeru izvođenja, antitelo ima KDod ≤10<-9>M i off-stopa od oko 1x 10<-4>/sec. U jednom primeru izvođenja, off-stopa je oko 1x 10-

<5>/sec. U drugim primerima izvođenja, antitela se vezuju za c-fms, ili humani c-fms sa KDof između oko 10<-8>M i 10<-10>M, a u još jednom primeru izvođenja vezaće se sa KD≤2x 10<-10>.

[0058] "Antigen vezujući region" označava protein, ili deo proteina, koji se specifično vezuje za određeni antigen. Primera radi, taj deo antigen vezujućeg proteina koji sadrži aminokiselinske ostatke koji ulaze u interakciju sa antigenom i poverava antigen vezujućem proteinu svoju specifičnost i afinitet ka antigenu i odnosi se na "antigen vezujući region." Antigen vezujući region tipično uključuje jedan ili više "regiona komplementarnog vezivanja" ("CDR-ova"). Određeni antigen vezujući regioni takođe uključuju jedan ili više "okvirnih" regiona. "CDR" je aminokiselinska sekvenca koja doprinosi antigen vezujućoj specifičnosti i afinitetu. "Okvirni" regioni mogu da pomognu u održavanju pravilne konformacije CDR-ova kako bi se promovisalo vezivanje između antigen vezujućieg regiona i antigena.

[0059] U određenom aspektu, obezbeđeni su rekombinantni antigen vezujući proteini koji vezuju c-fms protein, ili humani c-fms. U tom kontekstu, "rekombinantni protein" je protein dobijen upotrebom rekombinantnih tehnika, tj., kroz ekspresiju rekombinantne nukleinske kiseline kako je ovde opisano. Postupci i tehnike za proizvodnju rekombinantnih proteina dobro su poznati u struci.

[0060] Izraz "antitelo" odnosi se na intaktni imunoglobulin bilo kog izotipa, ili njegov fragment koji može ući u kompeticiju sa intaktnim antitelom za specifično vezivanje za ciljani antigen, i uključuje, na primer, himerna, humanizovana, potpuno humana, i bispecifična antitela. "Antitelo" kao takvo je vrsta antigen vezujućeg proteina. Intaktno antitelo generalno obuhvata najmanje dva teška lanca pune dužine i dva laka lanca pune dužine, ali u nekim slučajevima može da uključi manje lance kao što su antitela koja se prirodno javljaju kod kamila koja mogu da obuhvataju samo teške lance. Antitela mogu biti izveden isključivo iz jednog izvora, ili mogu biti "himerna," to jest, različiti delovi antitela mogu biti izvedeni iz dva različita antitela kako je opisano u nastavku. Antigen vezujući proteini, antitela, ili vezujući fragmenti mogu biti proizvedeni u hibridomima, rekombinantnim DNK tehnikama, ili enzimatskim ili hemijskim cepanjem intaktnih antitela. Ukoliko nije drugačije naznačeno, izraz "antitelo" uključuje, pored antitela koje obuhvata dva teška lanca pune dužine i dva laka lanca pune dužine, njegove derivate, varijante, fragmente, i mutacije, čiji su primeri opisani u nastavku.

[0061] Izraz "laki lanac" uključuje laki lanac pune-dužine i njegove fragmente koji ima dovoljnu sekvencu varijabilnog regiona kako bi se dodelila vezivajuća specifičnost. Laki lanac pune-dužine uključuje domen varijabilnog regiona, VL, i domen konstantnog regiona, CL. Domen varijabilnog regiona lakog lanca je na amino-terminusu polipeptida. Laki lanci uključuju kapa lance i lambda lance.

[0062] Izraz "teški lanac" uključuje teški lanac pune-dužine i njegove fragmente koji imaju dovoljnu sekvencu varijabilnog regiona kako bi se dodelila vezivajuća specifičnost. Teški lanac pune-dužine uključuje domen varijabilnog regiona, VH, i tri domena konstantnog regiona, CH1, CH2, i CH3. VHdomen je na amino-terminusu polipeptida, a CHdomeni su na karboksil-terminusu, pri čemu je CH3 najbliži karboksi-terminusu polipeptida. Teški lanci mogu biti bilo kog izotipa, uključujući IgG (uključujući IgG1, IgG2, IgG3 i IgG4 podtipove), IgA (uključujući IgA1 i IgA2 podtipove), IgM i IgE.

[0063] Izraz "imunološki funkcionalan fragment" (ili jednostavno "fragment") antitela ili imunoglobulinski lanac (teški ili laki lanac), kako se ovde koristi, je antigen vezujući protein koji obuhvata deo (nebitno kako je taj deo dobijen ili sintetizovan) antitela kojem nedostaju najmanje neke od aminokiselina prisutne u lancu pune-dužine, ali koje je sposobno za specifično vezivanje za antigen. Takvi fragmenti su biološki aktivni u smislu da se vezuju specifično za ciljani antigen i mogu ući u kompeticiju sa drugim antigen vezujućim proteinima, uključujući intaktna antitela, za specifično vezivanje za dati epitop. U jednom aspektu, takav fragment zadržava najmanje jedan CDR prisutan u lakom ili teškom lancu pune dužine, a u nekim primerima izvođenja obuhvataju jedan teški lanac i/ili laki lanac ili njihov deo. Ovi biološki aktivni fragmenti mogu biti proizvedeni rekombinantnim DNK tehnikama, ili mogu biti proizvedeni enzimatskim ili hemijskim cepanjem antigen vezujućeg proteina, uključujući intaktna antitela. Imunološki funkcionalni imunoglobulinski fragmenti uključuju, ali nisu ograničeni na, Fab, Fab', F(ab')2, Fv, domen antitela i jednolančana antitela, i mogu biti izvedeni iz bilo kog izvora sisara, uključujući ali ne ograničavajući se na humani, mišji, pacova, kamile ili zečji. Dalje je razmotreno da funkcionalan deo antigen vezujućeg proteina koji je ovde opisan, primera radi, jedan ili više CDR-ova, može biti kovalentno vezan za drugi protein ili za mali molekul kako bi se stvorio terapeutski agens usmeren ka određenom cilju u telu, posedujući bifunkcionalne terapeutske osobine, ili sa produženim poluživotom u serumu.

[0064] “Fab fragment" se sastoji od jednog lakog lanca i CH1 i varijabilnog regiona nekog teškog lanca. Teški lanac Fab molekula ne može da obrazuje disulfidnu vezu sa još jednim molekulom teškog lanca.

[0065] “Fc" region sadrži dva fragmenta teškog lanca koji obuhvataju CH1i CH2 domene antitela. Ta dva fragmenta teškog lanca drže se zajedno pomoću dve ili više disulfidnih veza i pomoću hidrofobnih interakcija CH3 domena.

[0066] “Fab' fragment" sadrži jedan laki lanac i deo jednog teškog lanca koji sadrži VHdomen i CH1 domen, a takođe i region između CH1 i CH2 domena, tako da se može obrazovati međulančana disulfidna veza između dva teška lanca dva Fab' fragmenta kako bi obrazovali F(ab')2molekul.

[0067] “F(ab')2fragment" sadrži dva laka lanca i dva teška lanca koja sadrže deo konstantnog regiona između CH1 i CH2 domena, tako da se obrazuje međulančana disulfidna veza između ta dva teška lanca. F(ab')2fragment je prema tome sastavljen od dva Fab' fragmenta koji se drže zajedno disulfidnom vezom između ta dva teška lanca.

[0068] "Fv region" obuhvata varijabilne regione iz oba i teških i lakih lanaca, ali kojem nedostaju konstantni regioni.

[0069] "Jednolančana antitela" su Fv molekuli u kojima su varijabilni regioni teškog i lakog lanca povezani fleksibilnim veznikom radi obrazovanja jednog polipeptidnog lanca, što obrazuje antigenvezivajući region. Jednolančana antitela opisana su detaljnije Međunarodnoj Patentnoj Prijavi Objava Br. WO 88/01649 i US patentima Br.4,946,778 i No.5,260,203.

[0070] “Domensko antitelo" je imunološki funkcionalan imunoglobulinski fragment koji sadrži samo varijabilni region teškog lanac ili varijabilni region lakog lanca. U nekim slučajevima, dva ili više VHregiona kovalentno su spojeni peptidnim veznikom kako bi se stvorilo bivalentno domensko antitelo. Dva VHregiona bivalentnog domenskog antitela može da cilja iste ili različite antigene.

[0071] “Bivalentni antigen vezujući protein" ili "bivalentno antitelo" obuhvata dva antigen vezujuća mesta. U nekim slučajevima, ta dva vezivajuća mesta imaju iste antigen specifičnosti. Bivalentni antigen vezujući proteini i bivalentna antitela mogu biti bispecifična, videti, niže.

[0072] Multispecifični antigen vezujući protein" ili "multispecifično antitelo" je onaj koji cilja više od jednog antigena ili epitopa.

[0073] “Bispecifični," "dvostruko-specifični" ili "bifunkcionalan" antigen vezujući protein ili antitelo je hibrid antigen vezujući protein ili antitelo, respektivno, sa dva različita antigen vezujuća mesta.

Bispecifični antigen vezujući proteini i antitela su vrste multispecifičnog antigen vezujućeg proteina ili multispecifičnog antitela i mogu biti proizvedeni raznim postupcima uključujući, ali ne ograničavajući se na, fuziju hibridoma ili vezivanje Fab' fragmenata. Videti, npr., Songsivilai and Lachmann, 1990, Clin. Exp. Immunol.79:315-321; Kostelny et al., 1992, J. Immunol.148:1547-1553. Ta dva vezivajuća mesta bispecifičnog antigen vezujućeg proteina ili antitela vezaće se za dva različita epitopa, koji mogu boraviti na istim ili različitim proteinskim metama.

[0074] Izraz "neutrališući antigen vezujući protein" ili "neutrališuće antitelo" odnosi se na antigen vezujući protein ili antitelo, respektivno, koji se vezuje za veznik, sprečava vezivanje veznika sa svojim vezivajućim partnerom i prekida biološki odgovor koji bi drugačije rezultirao iz vezivanja vaznika sa svojim vezivajućim partnerom. U procenjivanju vezivanja i specifičnosti antigen vezujućeg proteina, npr., antitelo ili njegov imunološki funkcionalan fragment, antitelo ili fragment će suštinski inhibirati vezivanje veznika sa svojim vezivajućim partnerom kada višak antitela redukuje količinu vezujućeg partnera vezanog za ligand sa najmanje oko 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 99% ili više (kako je izmereno u in vitro ogledu kompetitivnog vezivanja). U slučaju c-fms antigen vezujućih proteina, kao što je neutrališući molekul, će smanjiti sposobnost c-fms da se veže sa CSF-1. U nekim primerima izvođenja, neutrališuće antitelo inhibira sposobnost c-fms da se veže sa IL-34. U drugim primerima izvođenja, neutrališuće antitelo inhibira sposobnost c-fms da se veže sa CSF-1 i IL-34.

[0075] Izraz "ući u kompeticiju" kada se koristi u kontekstu antigen vezujućeg proteina (npr., neutrališući antigen vezujući proteini ili neutrališuća antitela) koji ulazi u kompeticiju za isti epitop, označava da je kompeticija između antigen vezujućih proteina određena ogledom u kojima antigen vezujući protein (npr., antitelo ili njegov imunološki funkcionalan fragment) koji se ispituje sprečava ili inhibira specifično vezivanje referentnog antigen vezujućeg proteina (npr., veznik, ili referentno antitelo) sa zajedničkim antigenom (npr., c-fms ili njihov fragment). Moguse primeniti brojne vrste ogleda kompetitivnog vezivanja, primera radi: direktan ili indirektan radioimunoogled čvrste faze (RIA), direktan ili indirektan enzimski imunoogled čvrste faze (EIA), sendvič ogled kompeticije (videti, npr., Stahli et al., 1983, Methods in Enzymology 9:242-253); direktan biotin-avidin čvrste faze EIA (videti, npr., Kirkland et al., 1986, J. Immunol.137:3614-3619) direktan obeleženi ogled čvrste faze, direktan obeleženi sendvič ogled čvrste faze (videti, npr., Harlow and Lane, 1988, Antitela, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press); direktna obeležavanje RIA čvrste faze upotrebom I-125 oznaka (videti, npr., Morel et al., 1988, Molec. Immunol.25:7-15); direktan biotin-avidin EIA čvrste faze (videti, npr., Cheung, et al., 1990, Virology 176:546-552); i direktan obeleženi RIA (Moldenhauer et al., 1990, Scand. J. Immunol.32:77-82). Tipično, takav neki ogled uključuje upotrebu prečišćenog antigena vezanog za čvrstu površinu ili ćelijske nosače bilo kog od njih, neobeležen test antigen vezujući protein i obeleženi referentni antigen vezujući protein. Kompetitivna inhibicija meri se određivanjem količine oznake vezane za čvrstu površinu ili ćelije u prisustvu test antigen vezujućeg proteina. Uobičajeno, test antigen vezujući protein je prisutan u višku. Antigen vezujući proteini identifikovani ogledom kompeticije (antigen vezujući proteini koji ulaze u kompeticiju) uključuju vezivanje antigen vezujućih proteina sa istim epitopom kao i referentni antigen vezujući proteini, i vezivanje antigen vezujućih proteina sa susednim epitopom dovoljno blizu epitopu vezanom referentnim antigen vezujućim proteinom kako bi se dogodila prostorna prepreka. Dodatni detalji u pogledu postupaka za određivanje kompetitivnog vezivanja, obezbeđeni su u primera u nastavku. Uobičajeno, kada je antigen vezujući protein koji ulazi u kompeticiju prisutan u višku, on će inhibirati specifično vezivanje referentnog antigen vezujućeg proteina sa zajedničkim antigenom za najmanje 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70% ili 75%. U nekim slučajevima, vezivanje se inhibira za najmanje 80%, 85%, 90%, 95%, ili 97% ili više.

[0076] Izraz "antigen" odnosi se na molekul ili deo molekula sposoban za vezivanje od strane agenasa za selektivno vezivanje, kao što je antigen vezujući protein (uključujući, npr., antitelo ili njegov imunološki funkcionalan fragment), i dodatno sposoban da se primeni na životinjama radi proizvodnje antitela sposobnog za vezivanje sa tim antigenom. Antigen može da poseduje jedan ili više epitopa koji su sposobni da uđu u interakciju sa različitim antigen vezujućim proteinima, npr., antitelima.

[0077] Izraz "epitop" je deo molekula to jest vezan antigen vezujućim proteinom (primera radi, antitelom). Izraz uključuje bilo koju determinantu sposobnu za specifično vezivanje za antigen vezujući protein, kao što je antitelo ili za T-ćelijski receptor. Epitop can be susedan ili ne-susedan (npr., kod polipeptida, aminokiselinski ostaci koji nisu susedni jedan u odnosu na drugi u polipeptidnoj sekvenci, ali koji su unutar koteksta tog molekula vezani antigen vezujućim proteinom). U određenom aspektu, epitopi mogu biti mimetični u tome što obuhvataju trodimenzionalne strukture to jest slične epitopu koji se koristi za generisanje antigen vezujućeg proteina, ali ne obuhvataju ni jedan ili samo neke od aminokiselinskih ostataka pronađenih u tom epitopu koji se koristi za generisanje antigen vezujućeg proteina. Najčešće, epitopi borave na proteinima, ali u nekim slučajevima mogu da borave na drugim vrstama molekula, kao što su nukleinske kiseline. Epitopne determinante mogu da uključuju hemijski aktivne površinske grupacije molekula kao što su aminokiseline, bčni lanci šećera, fosforil ili sulfonil grupe, i i mogu imati specifične trodimenzionalne strukturalne karakteristike, i/ili specifične karakteristike nalektrisanja. Generalno, antitela specifična za određeni ciljni antigen preferencijalno će prepoznati epitop na ciljanom antigenu u kompleksnoj mešavini proteina i/ili makromolekula.

[0078] Izraz "identitet" odnosi se na odnos između sekvence dva ili više polipeptidna molekula ili dva ili više molekula nukleinske kiseline, kako je određeno usklađivanjem i poređenjem sekvenci. "Procentualni identitet" označava procenat identičnih ostataka između aminokiseline ili nukleotida u upoređenim molekulima i izračunava se na osnovu veličine najmanjeg molekula koji se poredi. Za ova izračunavanja, praznine u poravnanjima (ukoliko ih ima) moraju biti adresirane određenim matematičkim modelom u kompjuterskim programom (tj., "algoritmom"). Postupci koji mogu da se koriste za izračunavanje identiteta poravnatih nukleinskih kiselina ili polipeptida uključuju jedan opisane u Computational Molecular Biology, (Lesk, A. M., ed.), 1988, New York: Oxford University Press; Biocomputing Informatics and Genome Projects, (Smith, D. W., ed.), 1993, New York: Academic Press; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, (Griffin, A. M., and Griffin, H. G., eds.), 1994, New Jersey: Humana Press; von Heinje, G., 1987, Sequence Analysis in Molecular Biology, New York: Academic Press; Sequence Analysis Example, (Gribskov, M. And Devereux, J., eds.), 1991, New York: M. Stockton Press; i Carillo et al., 1988, SIAM J. Applied Math.48:1073.

[0079] U izračunavanju procentualnog identiteta, sekvence koje se porede su poravnate na način da daje najveće poklapanje između tih sekvenci. Kompjuterski program koji se koristi za određivanje procentualnog identiteta je GCG programski paket, koji uključuje GAP (Devereux et al., 1984, Nucl. Acid Res.12:387; Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, WI). Kompjuterski algoritam GAP je onaj koji se koristi za poravnavanje dva polipeptida ili polinukleotida za koje treba da se odredi procenat sekvencijalnog identiteta. Sekvence su poravnavate za optimalno poklapanje njihovih respektivnih aminokiselina ili nukleotida ("upareni raspon", kako je određeno algoritmom). Penal za otvaranje praznine (koji se izračunava kao 3x prosečna dijagonala, gde "prosečna dijagonala" označava prosek dijagonale upoređujuće matrice koja se koristi; "dijagonala" je zbir ili broj određen svakom savršenom poklapanju aminokiseline od strane određene upoređujuće matrice) i penal za produženje praznine (koji je uobičajeno 1/10 puta penal za otvaranje praznine), kao i upoređujuća matrica kao što je PAM 250 ili BLOSUM 62 koriste se u konjukciji sa algoritmom. U određenom aspektu, standardna upoređujuća matrica (videti, Dayhoff et al., 1978, Atlas of Protein Sequence and Structure 5:345-352 za PAM 250 upoređujuću matricu; Henikoff et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.89:10915-10919 za BLOSUM 62 upoređujuću matricu) takođe se koristi tim algoritmom.

[0080] Preporučeni parameteri za određivanje procentualnog identiteta za polipeptidne ili nukleotidne sekvence upotrebom GAP program su kako sledi:

Algoritam: Needleman et al., 1970, J. Mol. Biol.48:443-453;

Upoređujuća matrica: BLOSUM 62 od Henikoff et al., 1992, gore;

Penal za prazninu: 12 (ali bez penala za krajnje praznine)

Penal za dužinu praznine: 4

Prag sličnosti: 0

[0081] Određene poravnjavajuće šeme za poravnavanje dve aminokiselinske sekvence mogu da rezultiraju u poklapanju samo kratkog regiona dve sekvence, a taj mali region poravnavanja može da ima veoma visok sekvencijalni identitet čak iako nema značajne veze između dve sekvence pune dužine. Shodno tome, odabran postupak za poravnanje (GAP program) može biti podešen ako je to potrebno kako bi se dobilo poravnanje koje obuhvata najmanje 50 susednih aminokiselina ciljanog polipeptida.

[0082] Kako se ovde koristi, "suštinski čist" označava da je opisana vrsta molekula predominantna vrsta prisutna, to jest, na molarnoj bazi je mnogo više u izobilju u odnosu na bilo koju drugu pojedinačnu vrstuu istoj mešavini. U određenim primerima izvođenja, suštinski čist molekul je kompozicija u kojoj ciljna vrsta obuhvata najmanje 50% (na molarnoj bazi) makromolekularne vrste prisutne. U drugim primerima izvođenja, suštinski čista kompozicija će obuhvatati najmanje 80%, 85%, 90%, 95%, ili 99% svih makromolekularnih vrsta prisutnih u kompoziciji. U drugim primerima izvođenja, ciljne vrste su prečišćene do suštinske homogenosti u kojoj kontaminirajuče vrste ne mogu biti detektovane u kompoziciji konvencionalnim postupcima detektovanja, a čime se kompozicija sastoji od jedne detektabilne makromolekularne vrste.

[0083] Izraz "lečenje" odnosi se na bilo koju indikaciju uspeha u lečenju ili poboljšanju povrede, patologije ili stanja, uključujući bilo koji objektivan ili subjektivan parametar kao što je smanjenje; remisija; umanjenje simptoma ili čineći povredu, patologiju ili stanje podnošljivije za pacijenta; usporavanje brzine degeneracije ili nazadovanja; čineći finalnu tačku degeneracije manje iznurujuće; poboljšavanje fizičkog ili psihičkog blagostanja pacijenta. Lečenje ili poboljšanje simptoma može biti na osnovu objektivnih ili subjektzivnih parametara; uključujući rezultate fizičkih pregleda, neuropsihijatrijskih pregleda, i/ili procene fizijatra. Primera radi, određeni ovde prisutni postupci uspešno leče kancer smanjivanjem incidence kancera, izazivajući remisiju kancera i/ili ublažavanje simptoma povezanih sa kancerom ili zapaljenskom bolešću.

[0084] “Efektivna količina" generalno je količina dovoljna da redukuje ozbiljnost i/ili frekventnost simptoma, eliminiše simptome i/ili skriveni uzrok, spreči pojavljivanje simptoma i/ili njihovog skrivenog uzroka, i/ili poboljša ili sanira oštećenje koje je rezultat ili je povezano sa kancerom. U nekim primerima izvođenja, efektivna količina je terapeutski efektivna količina ili profilaktički efektivna količina.

"Terapeutski efektivna količina" je količina dovoljna da izleči stanje bolesti (npr. kancer) ili simptome, naročito stanje ili simptome povezane sa tim stanjem bolesti, ili drugim rečima da prevenira, spreči, uspori ili unazadi progresiju tog stanja bolesti ili bilo kog drugog neželjenog simptoma povezanog sa bolesti na bilo koji način. "Profilaktički efektivna količina" je količina farmaceutske kompozicije koja, kada se da subjektu, ima nameravani profilaktički efekat, npr., prevencija ili odlaganje početka (ili ponovnog pojavljivanja) kancera, ili redukovanje verovatnoče pojavljivanja (ili ponovnog pojavljivanja) kancera ili simptoma kancera. Potpuno terapeutski ili profilaktički efekat ne mora nužno da se pojavi davanjem jedne doze, i može se pojaviti samo nakon davanja serija doza. Prema tome, terapeutski ili profilaktički efektivne količine mogu se dati u jednom ili više davanja.

[0085] "Aminokiselina" uključuje njeno uobičajeno značenje u struci. Dvadeset prirodno javljajućih aminokiselina i njihove skraćenice prate uobičajenu upotrebu. Videti, Immunology-A Synthesis, 2nd Edition, (E. S. Golub and D. R. Green, eds.), Sinauer Associates: Sunderland, Mass. (1991), inkorporirani ovde kao referenca u bilo kojoj svrsi. Stereoizomeri (npr., D-aminokiseline) dvadeset koncencionalnih aminokiselina, neprirodne aminokiseline kao što je [alfa]-, [alfa]-disupstituisane aminokiseline, N-alkil aminokiseline, i druge nekonvencionalne aminokiseline takođe mogu biti pogodne komponente za polipeptide i uključene su u frazu "aminokiselina." Primeri nekonvencionalnih aminokiselina uključuju: 4-hidroksiprolin, [gama]-karboksiglutamat, [epsilon]-N,N,N-trimetillizin, [epsilon]-N-acetillizin, O-fosfoserin, N-acetilserin, N-formilmetionin, 3-metilhistidin, 5-hidroksilizin, [sigma]-N-metilarginin, i druge slične aminokiseline i imino kiseline (npr., 4-hidroksiprolin). U polipeptidnoj notaciji koja je ovde koriščena, levi pravac je amino terminalni pravac, a desni pravac je karboksil-terminalni pravac, u skladu sa standardnom upotrebom i konvencijom.

Opšti pregled

[0086] Ovde su obezbeđeni antigen-vezujući proteini koji vezuju c-fms protein, uključujući humani c-fms (hc-fms) protein. Obezbeđeni antigen vezujući proteini su polipeptidi u koje su ugrađeni i/ili spojeni jedan ili više komplementarno određujućih regiona (CDR-ova), kako je ovde opisano,. Kod nekih antigen vezujućih proteina, CDR-ovi su ugrašeni u "okvirni" region, koji orijentiše CDR(ove) tako da se postižu pravilne antigen vezujuće karakteristike CDR(ovi). Generalno, antigen vezujući proteini koji su obezbeđeni mogu da ometaju, blokiraju, redukuju ili modulišu interakciju između CSF-1 i c-fms.

[0087] Određeni antigen vezujući proteini opisani ovde su antitela ili su izvedeni iz antitela. U određenim primerima izvođenja, polipeptidna struktura antigen vezujućeg proteina bazirana je na antitelima, uključujući, ali ne ograničavajući se na, monoklonalna antitela, bispecifična antitela, minitela, domenska antitela, sintetička antitela (ovde se ponekad nazivaju i "mimetici antitela"), himerna antitela, humanizovana antitela, humana antitela, fuzije antitela (ovde se ponekad nazivaju i " konjugati antitela"), i njihovi fragmenti. Razne strukture dalje su opisane u nastavku.

[0088] Pokazano je da se ovde obezbeđeni antigen vezujući proteini vezuju sa ekstracelularnim domenom c-fms, određenije humanim c-fms. Kako je dalje opisano u primerima koji slede, određeni antigen vezujući proteini su testirani i pronađeno je a se vezuju sa epitopima različitim od onih koji se vezuju sa brojnim drugim anti-c-fms antitelim. Antigen vezujući proteini koji su obezbeđeni, ulaze u kompeticiju sa CSF-1 čime sprečavaju da se CSF-1 veže sa svojim receptorom. U određenom aspektu, antigen vezujući proteini inhibiraju vezivanje između IL-34 i c-fms. U drugim aspektima, antigen vezujući proteini inhibiraju sposobnost c-fms da se veže i sa CSF-1 i sa IL-34. Kao posledica, ovde obezbeđeni antigen vezujući proteini sposobni su da inhibiraju c-fms aktivnost. Određenije, antigen vezujući proteini koji se vezuju za ove epitope mogu imati jednu ili više od sledećih aktivnosti: inhibiranje, između ostalog, c-fms autofosforilaciju, indukovanje c-fms signalnih transdukcionih putanja, c-fms indukovan rast ćelija, akumulacija monocitne hemotakse makrofaga povezanih sa tumorom u nekom tumoru ili u stromi tumora, proizvodnja tumor-pomovišućih faktora i drugih fizioloških efekata indukovanih od strane c-fms nakon CSF-1 vezivanja. Antigen vezujući proteini koji su ovde opisani imaju različite upotrebe. Neki od antigen vezujućih proteina, na primer, korisni su u ogledima specifičnog vezivanja, afinitetnog prečišćavanja c-fms, određenije hc-fms ili njegovih liganda i u skrining ogledi kako bi se identifikovali drugi antagonisti c-fms aktivnosti. Neki od antigen-vezujućih proteina korisni su za inhibiranje vezivanja CSF-1 za c-fms, ili inhibiranje autofosforilacije c-fms.

[0089] Antigen-vezujući proteini mogu se primeniti u raznim aplikacijama lečenja, kako je ovde objašnjeno. Primera radi, određeni c-fms antigen-vezujući proteini su korisni za lečenje stanja povezanog sa c-fms, kao što je redukovanje monocitne hemotakse kod pacijenta, inhibiranje migracije monocita u tumore, inhibiranje akumulacije makrofaga povezanog sa tumorom u nekom tumoru ili inhibiranje angiogeneze, kako je dalje opisano. U određenom aspektu, antigen vezujući proteini inhibiraju sposobnost TAM-ova da promovišu rast tumora, progresiju i/ili metastaze. Dodatno, u slučajevima u kojem same ćelije tumora eksprimiraju i koriste c-fms, antitelo koje se vezuje za c-fms može inhibirati njihov rast/opstanak. Druge upotrebe za antigen vezujuće proteine uključuju, primera radi, dijagnozu c-fms-povezanih bolesti ili stanja i skrining oglede radi određivanja prisustva ili odsustva c-fms. Neki, ovde opisani antigen vezujući proteini korisni su u lečenju posledica, simptoma, i/ili patologija povezanih sa c-fms aktivnošću. Oni uključuju, ali nisu ograničeni na, razne tipove kancera i zapaljenske bolesti kao i kaheksija usled kancera. U nekim aspektima, antigen vezujući proteini su za upotrebu za lečenje raznih poremećaja kostiju.

C-fms

[0090] Faktor stimulacije kolonija 1 (CSF-1) promoviše opstanak, proliferaciju, i diferencijaciju of mononuklearne fagocitne linije. CSF-1 ispoljava svoje aktivnosti vezivanjem za celijsku površinu c-fms receptora, što za rezultat ima autofosforilaciju od strane receptor c-fms kinaze i naknadnu kaskadu intracelularnih signala.

[0091] Izrazi "c-fms," "c-fms receptor," "humani c-fms", i "humani c-fms receptor" odnose se na receptor ćeliske površine koji se vezuje za veznik, uključujući, ali ne ograničavajući se na, CSF-1, a kao rezultat inicijalizuje putanju signalne transdukcije unutar ćelije. U nekim primerima izvođenja, taj receptor može se vezati za IL-34 ili i za CSF-1 i za IL-34. Ovde opisani antigen vezujući proteini vezuju se za c-fms, određenije humani c-fms. Primerni ekstracelularni domen aminokiselinske sekvence humanog c-fms prikazan je u SEQ ID NO:1. Kako je opisano u nastavku, c-fms proteini takođe mogu da uključe fragmente. Kako se ovde koriste, ovi izrazi se koriste naizmenično kako bi označili receptor, određenije humani receptor koji se vezuje specifično za CSF-1.

[0092] Izraz humani c-fms (h-cfms) receptor kako se ovde koristi takođe uključuje prirodno javljajuće alele, uključujući mutacije A245S, V279M i H362R. Izraz c-fms takođe uključuje post-translacione modifikacije c-fms aminokiselinske sekvence. Primera radi, ekstracelularni domen (ECD) humanog c-fms (ostaci 20-512 receptora) imaju jedanaest mogućih N-vezanih mesta glikolizacije u toj sekvenci. Prema tome, antigen vezujući proteini mogu se vazati za ili biti generisani iz proteina glikozilovan na jednom ili više tih položaja.

[0093] Putanja signalne transdukcije c-fms pozitivno je regulisana kod brojnih humanih patologija koje uključuju hroničnu aktivaciju populacija makrofaga tkiva. Povećavanja u CSF-1 proizvodnji takođe su povezana sa akumulacijom makrofaga tkiva viđenih kod mnogih zapaljenskih bolesti kao što je zapaljenska bolest creva. Dodatno, rast nekoliko vrsta tumora povezan je preteranom ekspresijom CSF-1 i c-fms receptorom u kancer ćelijama i/ili tumor stromama.

C-fms receptor antigen vezujući proteini

[0094] Obezbeđeni su razni agensi za selektivno vezivanje korisni za regulaciju aktivnosti c-fms. Ovi agensi uključuju, na primer, antigen vezujuće proteine koji sadrže antigen vezujući domen (npr., jednolančana antitela, domenska antitela, imunoadhezije, i polipeptide sa antigen vezujućim regionom) i koji se specifično vezuju za c-fms polipeptid, određenije humani c-fms. Neki od tih agenasa, primera radi, korisni su u inhibiranju vezivanja CSF-1 za c-fms, te se prema tome mogu koristiti za inhibiranje, ometanje ili modulisanje jedne ili više aktivnosti povezanih sa c-fms signaliziranjem. U određenom aspektu, antigen vezujući proteini mogu se koristiti za inhibiranje vezivanja između IL-34 i c-fms. U nekim aspektima, antigen vezujući proteini ometaju sposobnost c-fms da se veže sa oba CSF-1 i IL-34.

[0095] Generalno, antigen vezujući proteini koji su obezbeđeni, tipično obuhvataju jedan ili više CDR-ova kako je ovde opisano (npr., 1, 2, 3, 4, 5 ili 6). U nekim slučajevima, antigen vezujući protein obuhvata (a) polipeptidnu strukturu i (b) jedan ili više CDR-ova koji su umetnuti u i/ili spojeni sa polipeptidnom strukturom. Polipeptidna strukturu može preuzeti mnoštvo različitih oblika. Primera radi, može biti, ili obuhvatati, okvir prirodno javljajućeg antitela, ili njegov fragment ili varijanta, ili može biti potpuno sintetički u prirodi. Primeri raznih polipeptidnih struktura dalje su opisani u nastavku.

[0096] U određenom aspektu ovog opisa, polipeptidna struktura antigen vezujućih proteina je antitelo ili je izvedena iz antitelo, uključujući, ali ne ograničavajući se na, monoklonalna antitela, bispecifična antitela, minitela, domen antitela, sintetička antitela (ovde se ponekad nazivaju i "mimetici antitela"), himerna antitela, humanizovana antitela, fuzije antitela (nekada se nazivaju i "konjugati antitela"), i delovi ili fragmenti svakog pomenutog, respektivno. U nekim slučajevima, antigen vezujući protein je imunološki fragment antitela (npr., Fab, Fab', F(ab')2, ili scFv). Razne strukture su dalje opisane i definisane.

[0097] Određeni antigen vezujući proteini kao oni koji su ovde obezbeđeni, specifično se vezuju za humani c-fms. U specifičnom primeru izvođenja, antigen vezujući protein specifično se vezuje za humani c-fms protein sa aminokiselinskom sekvencom od SEQ ID ID NO:1.

[0098] U aspektima u kojima se antigen vezujući protein upotrebljava za terapeutske primene, antigen vezujući protein može da inhibira, ometa ili moduliše jedan ili više bioloških aktivnosti c-fms. U tom slučaju, antigen vezujući protein specifično se vezuje i/ili suštinski inhibira vezivanje humanog c-fms sa CSF-1 kada višak antitela redukuje količinu humanog c-fms vezanog za CSF-1, ili obrnuto, za najmanje oko 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 99% ili više (primera radi merenjem vezivanja u in vitro ogledu kompetitivnog vezivanja). C-fms ima mnoge distinktivne biološke efekte, koji se mogu meriti u mnogim različitim ogledima na različitim vrstama ćelija; primeri takvih ogleda ovde su obezbeđeni.

Struktura prirodno javljajućeg antitela

[0099] Neki od antigen vezujućih proteina koji su ovde obezbeđeni, imaju strukturu tipično povezanu sa prirodno javljajućim antitelima. Strukturne jedinice ovih antitela tipično obuhvataju jedan ili više tetramera, od kojih je svaki sastavljen od dva identična cupleta polipeptidnih lanaca, iako neke vrste sisara takođe proizvode antitela sa samo jednim teškim lancem. Kod uobičajenog antitela, svaki par ili kuplet uključuje jedan „laki“ lanac pune dužine (u određenim primerima izvođenja, oko 25 kDa) i jedan „teški“ lanac pune dužine (u određenim primerima izvođenja, oko 50-70 kDa). Svaki pojedinačni imunoglobulinski lanac sastavljen je od nekoliko "imunoglobulinski domena", od kojih se svaki sastoji od grubo 90 do 110 aminokiselina i eksprimiraju karakteristike savijajućeg obrasca. Ovi domeni su bazne jedinice od kojih su sastavljeni polipeptidi antitela. Amino-terminalni deo svakog lanca tipično uključuje varijabilni domen koji je odgovoran za prepoznavanje antigena. Karboksi-terminalni deo je konzervativniji evolucijski nego drugi kraj lanca i naziva se "konstantni region" ili "C region". Humani laki lanci generalno su klasifikovani kao kapa i lambda laki lanci, a svaki od njih sadrži jedan varijabilni domen i jedan konstantan domen. Teški lanci su tipično klasifikovani kao mu, delta, gama, alfa, ili epsilon lanci, a oni definišu izotip antitela kao IgM, IgD, IgG, IgA, i IgE, respektivno. IgG ima nekoliko podtipova, uključujući, ali ne ograničavajući se na, IgG1, IgG2, IgG3, i IgG4. IgM podtipovi uključuju IgM, i IgM2. IgA podtipovi uključuju IgA1 i IgA2. Kod ljudi, IgA i IgD izotipovi sadrže četiri teška lanca i četiri laka lanca; IgG i IgE izotipovi sadrže dva teška lanca i dva laka lanca; a IgM izotip sadrži pet teških lanaca i pet lakih lanaca. C region teškog lanca tipično obuhvata jedan ili više domena koji mogu biti odgovorni za efektorsku funkciju. Broj domena konstantniog regiona teškog lanca zavisiće od izotipa. IgG teški lanci, primera radi, svaki sadrže tri domena C regiona poznati kao CH1, CH2 i CH3. Antitela koja su obezbeđena mogu imati bilo koji od ovih izotipova i podtipova. U određenim primerima izvođenja, c-fms antitelo je IgG1, IgG2, ili IgG4 podtip.

[0100] Kod lakih i teških lanaca pune dužine, varijabilni i konstantni regioni spojeni su "J" regionom od oko dvanaest ili više aminokiselina, pri čemu teški lanac takođe uključuje "D" region od oko deset i više aminokiselina. Videti, npr., Fundamental Immunology, 2nd ed., Ch.7 (Paul, W., ed.) 1989, New York: Raven Press. Varijabilni regioni svakog od laki/teški lanac par, tipično formira mesto vezivanja antigena.

[0101] Jedan primer IgG2 teškog konstantanog domena primernog c-fms monoklonalnog antitela ima aminokiselinsku sekvencu:

[0102]

[0103] Jedan primer kapa lakog konstantnog domena primernog c-fms monoklonalnog antitela ima aminokiselinsku sekvencu:

[0105] Varijabilni regioni imunoglobulinskih lanaca generalno pokazuju istu ukupnu strukturu, koja obuhvata relativno konzervativan okvirni regioni (FR) spojen sa tri hipervarijabilna regiona, koji se češće nazivaju "regioni koji određuju komplementarnost" ili CDR-ovi. CDR-ovi iz ova dva lanca svakog prethodno pomenutog para teški lanac/laki lanac tipično su poravnati okvirnim regionima kako bi formirali strukturu koja se specifično vezuje sa specifičnim epitopom na ciljanom proteinu (npr., c-fms). Od N-terminalnog do C-terminalog, prirodno javljajući varijabilni regioni lakog i teškog lanca oba su tipično u skladu sa sledećim redosledom ovih elemenata: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 i FR4. Sistem numeracije je osmišljen za određivanje brojeva za aminokiseline koje zauzimaju položaje u svakom od ovih domena. Ovaj sistem numeracije definisan je u Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest (1987 and 1991, NIH, Bethesda, MD), ili Chothia & Lesk, 1987, J. Mol. Biol.196:901-917; Chothia et al., 1989, Nature 342:878-883.

[0106] Razni varijabilni regioni teškog lanca i lakog lanca koji su ovde obezbeđene, prikazani su u TABELI 2. Svaki od ovih varijabilnih regiona mogu biti pričvršćeni za gornje konstantne regione teškog i lakog lanca kako bi formirali kompletne teške i lake lance antitela, respektivno. Dalje, svaka od tako generisanih sekvenci teškog i lakog lanca mogu se kombinovati kako bi formirali kompletnu strukturu antitela. Podrazumeva se da varijabilni regioni teškog i lakog lanca koji su ovde obezbeđeni takođe mogu biti pričvršćeni za druge konstantne domene sa različitim sekvencama od prethodno navedenih primernih sekvenci.

[0107] Specifični primeri nekih lakih i teških lanaca pune dužine antitela koja su obezbeđena i njihovih odgovarajućih aminokiselinskih sekvenci, sumirani su u TABELI 1.

TABELA 1: Primerni teški i laki lanci

[0108] Ponovo, svaki od primernih teških lanaca (H1, H2, H3 itd.) navedeni u TABELI 1 mogu se kombinovati sa bilo kojim od primernih lakih lanaca prikazanih u TABELI 1 kako bi formirali antitelo.

Primeri takvih kombinacija uključuju H1 kombinovan sa bilo kojim od L1 do L34; H2 kombinovan sa bilo kojim od L1 do L34; H3 kombinovan sa bilo kojim od L1 do L34, i tako dalje. U nekim slučajevima, antitela uključuju najmanje jedan teški lanac i jedan laki lanac od ovih navedenih u TABELI 1. U nekim slučajevima, antitela obuhvataju dva različita teška lanca i dva različita laka lanca navedena u TABELI 1. U drugim slučajevima, antitela sadrže dva identična laka lanca i dva identična teška lanca. Na primer, antitelo ili imunološki funkcionalan fragment mogu da uključuju dva H1 teška lanca i dva L1 laka lanca, ili dva H2 teška lanca i dva L2 laka lanca, ili dva H3 teška lanca i dva L3 laka lanca i druge slične kombinacije parova lakih lanaca i parova teških lanaca kakvi su navedeni u TABELI 1.

[0109] Drugi antigen vezujući proteini koji su obezbeđeni, predstavljaju varijante antitela formiranih kombinacijom teških i lakih lanaca prikazanih na TABELI 1 i obuhvataju lake i/ili teške lance koji svaki ima najmanje 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97% ili 99% identiteta sa aminokiselinskim sekvencama ovih lanaca. U nekim slučajevima, takva antitela uključuju najmanje jedan teški lanac i jedan laki lanac, pri dok u drugim slučajevima varijantni oblici sadrže dva identična laka lanca i dva identična teška lanca.

Varijabilni domeni antitela

[0110] Takođe su obezbeđeni antigen vezujući proteini koji sadrže varijabilni region teškog lanca antitela odabran iz grupe koju čine VH1, VH2, VH3, VH4, VH5, VH6, VH7, VH8, VH9, VH10, VH11, VH12, VH13, VH14, VH15, VH16, VH17, VH18, VH19, VH20, VH21, VH22, VH23, VH24, VH25, VH26, VH27, VH28, VH29, VH30, VH31, i VH32, i/ili varijabilni region lakog lanca antitela odabran iz grupe koju čine VL1, VL2, VL3, VL4, VL5, VL6, VL7, VL8, VL9, VL10, VL11, VL12, VL13, VL14, VL15, VL16, VL17, VL18, VL19, VL20, VL21, VL22, VL23, VL24, VL25, VL26, VL27, VL28, VL29, VL30, VL31, VL32, VL33, i VL34, kako je prikazano u TABELI 2 ispod, i imunološki funkcionalni fragmenti, derivati, muteinskei i varijante ovih varijabilnih regiona lakog lanca i teškog lanca.

[0111] Poravnanja sekvenci raznih varijabilnih regiona teškog i lakog lanca, respektivno, obezbeđena su na FIG.1A i 1B.

[0112] Antigen vezujući proteini ovog tipa generalno se mogu označiti formulom " VHx/ VLy," u kojoj "x" odgovara broju varijabilnih regiona teškog lanca, a "y" odgovara broju varijabilnih regiona lakog lanca (generalno, x i y su svaki 1 ili 2) kako je navedeno u TABELI 2:

TABELA 2: Primerni VHi VLlanci

[0113] Svaki od varijabilnih regiona teškog lanca navedeni u TABELI 2 mogu se kombinovati sa bilo kojim od varijabilnih regiona lakog lanca prikazani u TABELI 2 kako bi se obrazovao antigen vezujući protein.

Primeri takvih kombinacija uključuju VH1 kombinovan sa bilo kojim od VL1, VL2, VL3, VL4, VL5, VL6, VL7, VL8, VL9, VL10, VL11, VL12, VL13, VL14, VL15, VL16, VL17, VL18, VL19, VL20, VL21, VL22, VL23, VL24, VL25, VL26, VL27, VL28, VL29, VL30, VL31, VL32, VL33, ili VL34; VH2 kombinovan sa bilo kojim od VL1, VL2, VL3, VL4, VL5, VL6, VL7, VL8, VL9, VL10, VL11, VL12, VL13, VL14, VL15, VL16, VL17, VL18, VL19, VL20, VL21, VL22, VL23, VL24, VL25, VL26, VL27, VL28, VL29, ili VL30, ili VH3 kombinovan sa bilo kojim od VL1, VL2, VL3, VL4, VL5, VL6, VL7, VL8, VL9, VL10, VL11, VL12, VL13, VL14, VL15, VL16, VL17, VL18, VL19, VL20, VL21, VL22, VL23, VL24, VL25, VL26, VL27, VL28, VL29, VL30, VL31, VL32, VL33, ili VL34, i tako dalje.

[0114] U nekim slučajevima, antigen vezujući protein uključuje najmanje jedan varijabilni region teškog lanca i/ili jedan varijabilni region lakog lanca od onih navedenih u TABELI 2. U nekim slučajevima, antigen vezujući protein uključuje najmanje dva različita varijabilna regiona teškog lanca i/ili varijabilna regiona lakog lanca od onih navedenih u TABELI 2. Primer takvih antigen vezujućih proteina obuhvata (a) jedan VH1, i (b) jedan od VH2, VH3, VH4, VH5, VH6, VH7, VH8, VH9, VH10, VH11, VH12, VH13, VH14, VH15, VH16, VH17, VH18, VH19, VH20, VH21, VH22, VH23, VH24, VH25, VH26, VH27, VH28, VH29, VH30, VH31, ili VH32. Još jedan primer obuhvata (a) jedan VH2, i (b) jedan od VH1, VH3, VH4, VH5, VH6, VH7, VH8, VH9, VH10, VH11, VH12, VH13, VH14, VH15, VH16, VH17, VH18, VH19, VH20, VH21, VH22, VH23, VH24, VH25, VH26, VH27, VH28, VH29, VH30, VH31, ili VH32. Još jedan primer obuhvata (a) jedan VH3, i (b) jedan od VH1, VH2, VH4, VH5, VH6, VH7, VH8, VH9, VH10, VH11, VH12, VH13, VH14, VH15, VH16, VH17, VH18, VH19, VH20, VH21, VH22, VH23, VH24, VH25, VH26, VH27, VH28, VH29, VH30, VH31, ili VH32 itd.

[0115] Još jedan primer takvog antigen vezujućeg proteina obuhvata (a) jedan VL1, i (b) jedan od VL2, VL3, VL4, VL5, VL6, VL7, VL8, VL9, VL10, VL11, VL12, VL13, VL14, VL15, VL16, VL17, VL18, VL19, VL20, VL21, VL22, VL23, VL24, VL25, VL26, VL27, VL28, VL29, VL30, VL31, VL32, VL33, ili VL34. Još jedan primer takvog antigen vezujućeg proteina obuhvata (a) jedan VL2, i (b) jedan od VL1, VL3, VL4, VL5, VL6, VL7, VL8, VL9, VL10, VL11, VL12, VL13, VL14, VL15, VL16, VL17, VL18, VL19, VL20, VL21, VL22, VL23, VL24, VL25, VL26, VL27, VL28, VL29, VL30, VL31, VL32, VL33, i VL34. Još jedan primer takvog antigen vezujućeg proteina obuhvata (a) jedan VL3, i (b) jedan od VL1, VL2, VL4, VL5, VL6, VL7, VL8, VL9, VL10, VL11, VL12, VL13, VL14, VL15, VL16, VL17, VL18, VL19, VL20, VL21, VL22, VL23, VL24, VL25, VL26, VL27, VL28, VL29, VL30, VL31, VL32, VL33, ili VL34, itd.

[0116] Razne kombinacije varijabilnih regiona teškog lanca mogu se kombinovati sa bilo kojim od raznih kombinacija varijabilnih regiona lakog lanca.

[0117] U drugim slučajevima, antigen vezujući protein sadrži dva identična varijabilna regiona lakog lanca i/ili dva identična varijabilna regiona teškog lanca. Na primer, antigen vezujući protein može biti antitelo ili imunološki funkcionalan fragment koji uključuje dva varijabilna regiona lakog lanca i dva varijabilna regiona teškog lanca u kombinacijama parova varijabilnih regiona lakog lanca i parova varijabilnih regiona teškog lanca kakvi su navedeni u TABELI 2.

[0118] Neki antigen vezujući proteini koji su obezbeđeni obuhvataju varijabilni domen teškog lanca koji obuhvata sekvencu aminokiselina koja se razlikuje od sekvence varijabilnog domena teškog lanca odabrana od VH1, VH2, VH3, VH4, VH5, VH6, VH7, VH8, VH9, VH10, VH11, VH12, VH13, VH14, VH15, VH16, VH17, VH18, VH19, VH20, VH21, VH22, VH23, VH24, VH25, VH26, VH27, VH28, VH29, VH30, VH31, i VH32 na samo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ili 15 aminokiselinskih ostataka, pri čemu je svaka takva razlika u sekvenci nezavisno ili delecija, umetanje ili supstitucija jedne aminokiseline, pri čemu ta delecija, umetanje i/ili supstitucija rezultiraju kao ne više od 15 aminokiselinskih promena u odnosu na prethodne sekvence varijabilnog domena. Varijabilni region teškog lanca kod nekih antigen vezujućih proteina obuhvata sekvencu aminokiselina koja ima najmanje 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97% ili 99% sekvencijalnog identiteta sa aminokiselinskim sekvencama varijabilnog regiona teškog lanca od VH1, VH2, VH3, VH4, VH5, VH6, VH7, VH8, VH9, VH10, VH11, VH12, VH13, VH14, VH15, VH16, VH17, VH18, VH19, VH20, VH21, VH22, VH23, VH24, VH25, VH26, VH27, VH28, VH29, VH30, VH31, i VH32.

[0119] Određeni antigen vezujući proteini obuhvataju varijabilni domen lakog lanca koji obuhvata sekvencu aminokiselina koja se razlikuje od sekvence varijabilnog domena lakog lanca odabrana od VL1, VL2, VL3, VL4, VL5, VL6, VL7, VL8, VL9, VL10, VL11, VL12, VL13, VL14, VL15, VL16, VL17, VL18, VL19, VL20, VL21, VL22, VL23, VL24, VL25, VL26, VL27, VL28, VL29, VL30, VL31, VL32, VL33, ili VL34 na samo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ili 15 aminokiselinskih ostataka, pri čemu je svaka takva razlika u sekvenci nezavisno ili delecija, umetanje ili supstitucija jedne aminokiseline, pri čemu ta delecija, umetanje i/ili supstitucija rezultiraju kao ne više od 15 aminokiselinskih promena u odnosu na prethodne sekvence varijabilnog domena. Varijabilni region lakog lanca kod nekih antigen vezujućih proteina obuhvata sekvencu aminokiselina koja ima najmanje 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97% ili 99% sekvencijalnog identiteta sa aminokiselinskim sekvencama varijabilnog regiona lakog lanca od VL1, VL2, VL3, VL4, VL5, VL6, VL7, VL8, VL9, VL10, VL11, VL12, VL13, VL14, VL15, VL16, VL17, VL18, VL19, VL20, VL21, VL22, VL23, VL24, VL25, VL26, VL27, VL28, VL29, VL30, VL31, VL32, VL33, ili VL34.

[0120] Još dalji antigen vezujući proteini, npr., antitela ili imunološki funkcionalni fragmenti, uključuju varijantne oblike varijante teškog lanca i varijante lakog lanca kako je upravo opisano.

CDR-ovi

[0121] Ovde opisani antigen vezujući proteini su polipeptidi u koje su jedan ili više CDR-ova, graftovani, umetnuti i/ili spojeni. Antigen vezujući protein mogu imati 1, 2, 3, 4, 5 ili 6 CDR-ova. Antigen vezujući protein tako mogu imati, primera radi, jedan teški lanac CDR1 ("CDRH1"), i/ili jedan teški lanac CDR2 ("CDRH2"), i/ili jedan teški lanac CDR3 ("CDRH3"), i/ili jedan laki lanac CDR1 ("CDRL1"), i/ili jedan laki lanac CDR2 ("CDRL2"), i/ili jedan laki lanac CDR3 ("CDRL3"). Neki antigen vezujući proteini uključuju oba i CDRH3 i CDRL3. Specifični CDR-ovi teškog i lakog lanca identifikovani su u TABELAMA 3A i 3B, respektivno.

[0122] Regioni koji određuju komplementarnost (CDR-ovi) i okvirni regioni (FR) datog antitela mogu biti identifikovani upotrebom sistema opisanog od strane Kabat et al. u Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed., US Dept. Of Health and Human Services, PHS, NIH, NIH Publication no.

91-3242, 1991. Određena antitela koja su ovde opisana, obuhvataju jednu ili više aminokiselinskih sekvenci koje su identične ili imaju suštinski sekvencijalni identitet sa aminokiselinskim sekvencama jednog ili više CDR-ova prisutnih u TABELI 3A (CDRH-ovi) i TABELA 3B (CDRL-ovi).

TABELA 3A: Primerne CDRH Sekvence

[0123] Struktura i karakteristike CDR-ova unutar prirodno javljajućeg antitela je opisana, gore. Ukratko, kod konvencionalnog antitela, CDR-ovi su ugrađene unutar okvira u varijabilnom regionu teškog i lakog lanca gde konstituišu regione zadužene za antigen vezivanje i prepoznavanje. Varijabilni region obuhvata najmanje tri CDR-a teška ili laka lanca, videti, gore (Sequences of Proteins of Immunological Interest, Public Health Service N.I.H., Bethesda, MD; videti takođe Chothia and Lesk, 1987, J. Mol. Biol.196:901-917; Chothia et al., 1989, Nature 342: 877-883), unutar okvirnog regiona (označeni okvirni regioni 1-4, FR1, FR2, FR3, i FR4, od strane Kabat et al., 1991, gore; videti takođe Chothia and Lesk, 1987, gore). Međutim, CDR-ovi koji su ovde obezbeđeni, ne moraju biti samo za upotrebu u definisanju antigen vezujućeg domena strukture tradicionalnog antitela, već mogu biti ugrađeni u raznim drugim polipeptidnim strukturama, kako je ovde opisano.

[0124] U jednom aspektu, obezbeđeni CDR-ovi su (a) CDRH odabran iz grupe koju čine (i) CDRH1 odabran iz grupe koju čine SEQ ID NO: 136-147; (ii) CDRH2 odabran iz grupe koju čine SEQ ID NO:148-164; (iii) CDRH3 odabran iz grupe koju čine SEQ ID NO:165-190; i (iv) CDRH iz (i), (ii) i (iii) koji sadrži jednu ili više aminokiselinskih supstitucija, delecija ili umetanja od ne više od pet, četiri, tri, dve, ili jedne aminokiseline; (B) CDRL odabran iz grupe koju čine (i) CDRL1 odabran iz grupe koju čine SEQ ID NO:191-210; (ii) CDRL2 odabran iz grupe koju čine SEQ ID NO:211-224; (iii) CDRL3 odabran iz grupe koju čine SEQ ID NO:225-246; i (iv) CDRL iz (i), (ii) i (iii) koji sadrži jednu ili više aminokiselinskih supstitucija, delecija ili umetanja od ne više od pet, četiri, tri, dve, ili jedne aminokiseline aminokiseline.

[0125] U još jednom aspektu, antigen vezujući protein uključuje 1, 2, 3, 4, 5, ili 6 varijantnih oblika CDR-ova navedenih u TABELAMA 3A i 3B, od koji svaki ima najmanje 80%, 85%, 90% ili 95% sekvencijalnog identiteta sa CDR sekvencom navedenom u TABELAMA 3A i 3B. Neki antigen vezujući proteini uključuju 1, 2, 3, 4, 5, ili 6 CDR-ova navedenih u TABELAMA 3A i 3B, od kojih se svaki razlikuje za ne više od 1, 2, 3, 4 ili 5 aminokiseline iz CDR-ova navedenih u ovim tabelama.

[0126] U još jednom aspektu, CDR-ovi ovde opisani uključuju konsenzus sekvence izvedene iz grupe povezanog monoklonalnog antitela. Kako je ovde opisano, "konsenzus sekvenca" odnosi se na aminokiselinske sekvence sa konzervativnim aminokiselinama koje su uobičajene među brojnim sekvencama i varijabilnim aminokiselinama koje variraju unutar datih aminokiselinskih sekvenci. CDR konsenzus sekvence ovde obezbeđene uključuju CDR-ove koji odgovaraju svakom od CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2 i CDRL3.

[0127] Konsenzus sekvence određuju se upotrebom standardnih filogenih analiza CDR-ova koji odgovaraju VHi VLanti-c-fms antitela. Konsenzus sekvence određuju se održavanjem CDR-ovi jedan do drugog unutar iste sekvence koja odgovara VHili VL. Ukratko, aminokiselinske sekvence koje odgovaraju celokupnim varijabilnim domenima ili VHili VLkonvertovane su u FASTA formatiranju radi lakšeg obrađivanja komparativnih poravnanja i zaključenih filogenija. Dalje, okvirni regioni ovih sekvenci zamenjeni su veštačkom vezivnom sekvencom ("GGGAAAGGGAAA" (SEQ ID NO:325)) tako da se ispitivanje samih CDR-ova može izvesti bez uvođenja bilo koje pristrasnosti aminokiselinskog položaja ponderisanja usled slučajnih događaja (npr., kao što su nepovezana antitela koja slučajno dele zajednički nasledni embrionski okvir) i dalje zadržavajući CDR-ove mneđusobno blizu iste sekvenca koje odgovaraju za VHili VL. VHili VLsekvence ovog formata zatim su podvrgnute ispitivanju poravnavajuće sličnosti sekvenci upotrebom programa koji uključuje standardni ClutalW-like algoritam (videti, Thompson et al., 1994, Nucleic acids Res.22:4673-4680). Penal stvaranja praznine penal od 8.0 uposlen je zajedno sa penalom za produženje praznine od 2.0. Ovaj program isto tako generiše filograme (ilustracije filogen stabla) na osnovu poravnanja sličnosti sekvenci upotrebom ili UPGMA (postupak neizmerene grupe para upotrebom aritmetičkih proseka) ili Neighbor-Joining postupaka (videti, Saitou and Nei, 1987, Molecular Biology and Evolution 4:406-425) na konstruktu i ilustruje sličnost i distinktivnost grupe sekvenci putem poređenja dužine grane i grupisanja. Oba postupka proizvode slične rezultate, ali su na kraju korišćena UPGMA-izvedena stabla budući da taj postupak upošljava jednostaniji i konzervativniji set pretpostavki. UPGMA-izvedena stabla prikazana su na FIG.2 gde su slične grupe sekvenci definisane tako da imaju manje od 15 supstitucija na 100 ostataka (videti, legendu u ilustraciji stabla za skalu) među individualnih sekvenci unutar te grupe i koji su upotrebljeni za definisanje zbirki konsenzus sekvenca.

[0128] Kako je prikazano na FIG.2, rodna analiza različitih antigen vezujućih proteina koji su ovde obezbeđeni, rezultira u tri grupe blisko povezanih filogenih klonova, označene kao Grupe A, B, i C.

[0129] Konsenzus sekvence raznih CDR regiona Grupe A su:

a. CDRH1 generičke formule GYTX1TSYGIS (SEQ ID NO:307), u kojoj X1je odabran iz grupe koju čine F i L;

b. CDRH2 generičke formule WISAYNGNX1NYAQKX2QG (SEQ ID NO:308), u kojoj X1je odabran iz grupe koju čine T i P, a X2je odabran iz grupe koju čine L i F;

c. CDRH3 generičke formule X1X2X3X4X4X5FGEX6X7X8X9FDY (SEQ ID NO:309), u kojoj X1je odabran iz grupe koju čine E i D, X2je odabran iz grupe koju čine S i Q, X3je odabran iz grupe koju čine G i ni jedna aminokiselina, X4je odabran iz grupe koju čine L i ni jedna aminokiselina, X5je odabran iz grupe koju čine W i G, X6je odabran iz grupe koju čine V i L, X7je odabran iz grupe koju čine E i ni jedna aminokiselina, X8je odabran iz grupe koju čine G i ni jedna aminokiselina, i X9je odabran iz grupe koju čine F i L;

d. CDRL1 generičke formule KSSX1GVLX2SSX3NKNX4LA (SEQ ID NO:310), u kojoj X1je odabran iz grupe koju čine Q i S, X2je odabran iz grupe koju čine D i Y, X3je odabran iz grupe koju čine N i D, i X4je odabran iz grupe koju čine F i Y;

e. CDRL2 generičke formule WASX1RES (SEQ ID NO:311), u kojoj X1je odabran iz grupe koju čine N i T; i

f. CDRL3 generičke formule QQYYX1X2PX3T (SEQ ID NO:312), u kojoj X1je odabran iz grupe koju čine S i T, X2je odabran iz grupe koju čine D i T, i X3je odabran iz grupe koju čine F i P.

[0130] Konsenzus sekvence raznih CDR regiona Grupe B su:

a. CDRH1 generičke formule GFTX1X2X3AWMS (SEQ ID NO:313), u kojoj X1je odabran iz grupe koju čine F i V, X2je odabran iz grupe koju čine S i N, i X3je odabran iz grupe koju čine N i T;

b. CDRH2 generičke formule RIKX1KTDGX2TX3DX4AAPVKG (SEQ ID NO:314), u kojoj X1je odabran iz grupe koju čine S i T, X2je odabran iz grupe koju čine G i W, X3je odabran iz grupe koju čine T i A, i X4je odabran iz grupe koju čine Y i N;

c. CDRH3 generičke formule X1X2X3X4XSX6X7XSX9X10X11X12X13YYGX14DV (SEQ ID NO:315), u kojoj X1je odabran iz grupe koju čine E, D i G, X2je odabran iz grupe koju čine Y, L i ni jedna aminokiselina, X3je odabran iz grupe koju čine Y, R, G i ni jedna aminokiselina, X4je odabran iz grupe koju čine H, G, S i ni jedna aminokiselina, X5je odabran iz grupe koju čine I, A, L i ni jedna aminokiselina, X6je odabran iz grupe koju čine L, V, T, P i ni jedna aminokiselina, X7je odabran iz grupe koju čine T, V, Y, G, W i ni jedna aminokiselina, X8je odabran iz grupe koju čine G, V, S i T, X9je odabran iz grupe koju čine S, T, D, N i G, X10je odabran iz grupe koju čine G, F, P, i Y, X11je odabran iz grupe koju čine G, Y i N, X12je odabran iz grupe koju čine V i Y, X13je odabran iz grupe koju čine W, S i Y, i X14je odabran iz grupe koju čine M, T i V;

d. CDRL1 generičke formule QASQDIX1NYLN (SEQ ID NO:316), u kojoj X1je odabran iz grupe koju čine S i N;

e. CDRL2 generičke formule DX1SNLEX2(SEQ ID NO:317), u kojoj X1je odabran iz grupe koju čine A i T, i X2je odabran iz grupe koju čine T i P; i

f. CDRL3 generičke formule QQYDX1LX2T (SEQ ID NO:318), u kojoj X1je odabran iz grupe koju čine N i D, i X2je odabran iz grupe koju čine L i I.

[0131] Konsenzus sekvence raznih CDR regiona Grupe C su:

a. CDRH1 generičke formule GFTFX1SYGMH (SEQ ID NO:319), u kojoj X1je odabran iz grupe koju čine S i I;

b. CDRH2 generičke formule VIWYDGSNX1YYADSVKG (SEQ ID NO:320), u kojoj X1je odabran iz grupe koju čine E i K;

c. CDRH3 generičke formule SSX1X2X3YX4MDV (SEQ ID NO:321), u kojoj X1je odabran iz grupe koju čine G, S i W, X2je odabran iz grupe koju čine N, D i S, X3je odabran iz grupe koju čine Y i F, i X4je odabran iz grupe koju čine D i G;

d. CDRL1 generičke formule QASX1DIX2NX3LN (SEQ ID NO:322), u kojoj X1je odabran iz grupe koju čine Q i H, X2je odabran iz grupe koju čine S i N, i X3je odabran iz grupe koju čine F i Y;

e. CDRL2 generičke formule DASNLEX, (SEQ ID NO:323), u kojoj X1je odabran iz grupe koju čine T i I; i f. CDRL3 generičke formule QX1YDX2X3PX4T (SEQ ID NO:324), u kojoj X1je odabran iz grupe koju čine Q i R, X2je odabran iz grupe koju čine N i D, X3je odabran iz grupe koju čine L i F, i X4je odabran iz grupe koju čine F, L i I.

[0132] U nekim slučajevima antigen vezujući protein obuhvata najmanje jedan CDRH1, CDRH2, ili CDRH3 sa jednom od gornjih konsenzus sekvenci. U nekim slučajevima, antigen vezujući protein obuhvata najmanje jedan CDRL1, CDRL2, ili CDRL3 sa jednom od gornjih konsenzus sekvenci. U drugim slučajevima, antigen vezujući protein obuhvata najmanje dva CDRH-a u skladu sa gornjim konsenzus sekvencama, i/ili najmanje dva CDRL-a u skladu sa gornjim konsenzus sekvencama. U jednom aspektu, CDRH-ovi i/ili CDRL-ovi izvedeni su iz različitih grupa A, B, i C. U drugim slučajevima, antigen vezujući protein obuhvata najmanje dva CDRH-a iz iste grupe A, B, ili C, i/ili najmanje dva CDRL-a iz iste grupe A, B, ili C. U drugim aspektima, antigen vezujući protein obuhvata CDRH1, CDRH2, i CDRH3 sekvencu iz istih od gornjih grupa A, B, ili C, i/ili CDRL1, CDRL2, i CDRL3 sekvencu iz istih od gornjih grupa A, B, ili C.

[0133] Tako, neki antigen vezujući proteini koji su obezbeđeni, uključuju 1, 2, 3, 4, 5 ili svih 6 CDR-ova iz Grupe A konsenzus sekvenci. Tako određeni antigen vezujući proteini, na primer, uključuju CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2 i CDRL3 iz Grupe A konsenzus sekvenci kako je prethodno navedeno. Drugi antigen vezujući proteini koji su obezbeđeni, uključuju 1, 2, 3, 4, 5 ili svih 6 CDR-ova iz Grupe B konsenzus sekvenci. Tako određeni antigen vezujući proteini uključuju, na primer, CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2 i CDRL3 iz Grupe B konsenzus sekvenci kako je prethodno navedeno. Dalji antigen vezujući proteini koji su obezbeđeni, uključuju 1, 2, 3, 4, 5 ili svih 6 CDR-ova iz Grupe C konsenzus sekvenci. Tako određeni antigen vezujući proteini uključuju, na primer, CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2 i CDRL3 iz Grupe A konsenzus sekvenci kako je prethodno navedeno.

Primerni antigen vezujući proteini

[0134] U skladu sa jednim aspektom, obezbeđen je izolovani antigen-vezujući protein koji vezuje c-fms koji obuhvata (A) jedan ili više komplementarno određujućih regiona teškog lanca (CDRH-ova) odabrani iz grupe koju čine: (i) CDRH1 odabran iz grupe koju čine SEQ ID NO:136-147; (ii) CDRH2 odabran iz grupe koju čine SEQ ID NO:148-164; (iii) CDRH3 odabran iz grupe koju čine SEQ ID NO:165-190; i (iv) CDRH iz (i), (ii) i (iii) koji sadrži jednu ili više aminokiselinskih supstitucija, delecija ili umetanja od ne više od pet, četiri, tri, četiri, dve ili jedne aminokiseline; (B) jedan ili više komplementarno određujućih regiona lakog lanca (CDRL-ova) odabrani iz grupe koju čine: (i) CDRL1 odabran iz grupe koju čine SEQ ID NO:191-210; (ii) CDRL2 odabran iz grupe koju čine SEQ ID NO:211-224; (iii) CDRL3 odabran iz grupe koju čine SEQ ID NO:225-246; i (iv) CDRL iz (i), (ii) i (iii) koji sadrži jednu ili više aminokiselinskih supstitucija, delecija ili umetanja od ne više od pet, četiri, tri, četiri, dve ili jedne aminokiseline; ili (C) jedan ili više CDRH-ova teškog lanca iz (A) i jedan ili više CDRL-ova lakog lanca iz (B).

[0135] U još jednom aspektu izolovani antigen-vezujući protein može da obuhvata (A) CDRH odabran iz grupe koju čine (i) CDRH1 odabran iz grupe koju čine SEQ ID NO:136-147; (ii) CDRH2 odabran iz grupe koju čine SEQ ID NO:148-164; i (iii) CDRH3 odabran iz grupe koju čine SEQ ID NO:165-190; (B) CDRL odabran iz grupe koju čine (i) CDRL1 odabran iz grupe koju čine SEQ ID NO:191-210; (ii) CDRL2 odabran iz grupe koju čine SEQ ID NO:211-224; i (iii) CDRL3 odabran iz grupe koju čine SEQ ID NO:225-246; ili (C) jedan ili više CDRH-ova teškog lanca iz (A) i jedan ili više CDRL-ova lakog lanca iz (B). U jednom aspektu, izolovani antigen-vezujući protein može da uključi (A) CDRH1 iz SEQ ID NO:136-147, CDRH2 iz SEQ ID NO:148-164, i CDRH3 iz SEQ ID NO:165-190, i (B) CDRL1 iz SEQ ID NO:191-210, CDRL2 iz SEQ ID NO:211-224, i CDRL3 iz SEQ ID NO:225-246.

[0136] U još jednom aspektu, varijabilni teški lanac (VH) ima najmanje 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97% ili 99% sekvencijalnog identiteta sa aminokiselinskom sekvencom odabranom iz grupe koju čine SEQ ID NO:70-101, i/ili varijabilni laki lanac (VL) ima najmanje 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97% ili 99% sekvencijalnog identiteta sa aminokiselinskom sekvencom odabranom iz grupe koju čine SEQ ID NO:102-135. U daljem aspektu, VH odabran iz grupe koju čine SEQ ID NO: 70-101, i/ili VL odabran iz grupe koju čine SEQ ID NO: 102-135.

[0137] U još jednom aspektu, takođe je obezbeđen izolovani antigen vezujući protein koji se specifično vezuje za epitop koji sadrži c-fms poddomene 1-1 nalik Ig i 1-2 nalik Ig od c-fms.

[0138] U daljem aspektu, obezbeđen je izolovani antigen-vezujući protein koji vezuje c-fms, pri čemu taj antigen-vezujući protein uključuje CDRH3 odabran iz grupe koju čine (1) CDRH3 odabran iz grupe koju čine SEQ ID NO:165-190, (2) CDRH3 koji se razlikuje u aminokiselinskoj sekvenci od CDRH3 iz (i) za aminokiselinsko dodavanje, deleciju ili supstituciju ne više od dve aminokiseline; i (3) CDRH3 aminokiselinska sekvenca odabrana iz grupe koju čine (a) X1X2X3X4X4X5FGEX5X7X8X9FDY (SEQ ID NO:309), u kojoj X1je odabran iz grupe koju čine E i D, X2je odabran iz grupe koju čine S i Q, X3je odabran iz grupe koju čine G i ni jedna aminokiselina, X4je odabran iz grupe koju čine L i ni jedna aminokiselina, X5je odabran iz grupe koju čine W i G, X6je odabran iz grupe koju čine V i L, X7je odabran iz grupe koju čine E i ni jedna aminokiselina, X8je odabran iz grupe koju čine G i ni jedna aminokiselina, i X9je odabran iz grupe koju čine F i L (CDRH3 konsenzus sekvenca izvedena iz prethodno opisane filogenetske Grupe A); (b) X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13YYGX14DV (SEQ ID NO:315), u kojoj X1je odabran iz grupe koju čine E, D i G, X2je odabran iz grupe koju čine Y, L i ni jedna aminokiselina, X3je odabran iz grupe koju čine Y, R, G i ni jedna aminokiselina, X4je odabran iz grupe koju čine H, G, S i ni jedna aminokiselina, X5je odabran iz grupe koju čine I, A, L i ni jedna aminokiselina, X6je odabran iz grupe koju čine L, V, T, P i ni jedna aminokiselina, X7je odabran iz grupe koju čine T, V, Y, G, W i ni jedna aminokiselina, X8je odabran iz grupe koju čine G, V, S i T, X9je odabran iz grupe koju čine S, T, D, N i G, X10je odabran iz grupe koju čine G, F, P, i Y, X11je odabran iz grupe koju čine G, Y i N, X12je odabran iz grupe koju čine V i Y, X13je odabran iz grupe koju čine W, S i Y, i X14je odabran iz grupe koju čine M, T i V (CDRH3 konsenzus sekvenca izvedena iz prethodno opisane filogenetske Grupe B); i (c) SSX1X2X3YX4MDV (SEQ ID NO:321), u kojoj X1je odabran iz grupe koju čine G, S i W, X2je odabran iz grupe koju čine N, D i S, X3je odabran iz grupe koju čine Y i F, i X4je odabran iz grupe koju čine D i G (CDRH3 konsenzus sekvenca izvedena iz prethodno opisane filogenetske Grupe C); ili (B) laki lanac komplementarno određujući region (CDRL) odabran iz grupe koju čine (1) CDRL3 odabran iz grupe koju čine SEQ ID NO:225-246, (2) CDRL3 koji se razlikuje u aminokiselinskoj sekvenci od CDRL3 iz (i) za aminokiselinsko dodavanje, deleciju ili supstituciju ne više od dve aminokiseline; i (3) CDRL3 aminokiselinska sekvenca odabrana iz grupe koju čine (a) QQYYX1X2PX3T (SEQ ID NO:312), u kojoj X1je odabran iz grupe koju čine S i T, X2je odabran iz grupe koju čine D i T, i X3je odabran iz grupe koju čine F i P (CDRL3 konsenzus sekvenca izvedena iz prethodno opisane filogenetske Grupe A); (b) QQYDX1LX2T (SEQ ID NO:318), u kojoj X1je odabran iz grupe koju čine N i D, i X2je odabran iz grupe koju čine L i I (CDRL3 konsenzus sekvenca izvedena iz prethodno opisane filogenetske Grupe B); i (c) QX1YDX2X3PX4T (SEQ ID NO:324), u kojoj X1je odabran iz grupe koju čine Q i R, X2je odabran iz grupe koju čine N i D, X3je odabran iz grupe koju čine L i F, i X4je odabran iz grupe koju čine F, L i I (CDRL3 konsenzus sekvenca izvedena iz prethodno opisane filogenetske Grupe C).

[0139] U jednom aspektu, antigen vezujući protein koji vezuje c-fms obuhvata CDRH3 u skladu sa konsenzus sekvencom iz grupa A, B, ili C, i/ili CDRL3 u skladu sa konsenzus sekvencom iz grupa A, B, ili C, i CDRH1 i/ili CDRH2 bilo koje prethodne grupe, i/ili CDRL1 i/ili CDRL2 bilo koje prethodne grupe.

[0140] U jednom aspektu, izolovani antigen vezujući protein koji vezuje c-fms obuhvata CDRH3 i/ili CDRL3 Grupe A, videti, gore, i CDR odabran iz grupe koju čine:

(1) CDRH1 odabran iz grupe koju čine (a) CDRH1 iz SEQ ID NO:136-147; (b) CDRH1 koji se razlikuje u aminokiselinskoj sekvenci od CDRH1 iz (a) za aminokiselinsko dodavanje, deleciju ili supstituciju ne više od dve aminokiseline; i (c) CDRH1 aminokiselinska sekvenca odabrana iz grupe koju čine GYTX1TSYGIS (SEQ ID NO:307), u kojoj X1je odabran iz grupe koju čine F i L;

(2) CDRH2 odabran iz grupe koju čine (a) CDRH2 iz SEQ ID NO:148-164; (b) CDRH2 koji se razlikuje u aminokiselinskoj sekvenci od CDRH2 iz (a) za aminokiselinsko dodavanje, deleciju ili supstituciju ne više od dve aminokiseline; i (c) CDRH2 aminokiselinska sekvenca odabrana iz grupe koju čine WISAYNGNX1NYAQKX2QG(SEQ ID NO:308), u kojoj X1je odabran iz grupe koju čine T i P, i X2je odabran iz grupe koju čine L i F;

(3) CDRL1 odabran iz grupe koju čine (a) CDRL1 iz SEQ ID NO:191-210; (b) CDRL1 koji se razlikuje u aminokiselinskoj sekvenci od CDRL1 iz (a) za aminokiselinsko dodavanje, deleciju ili supstituciju ne više od dve aminokiseline; i (c) CDRL1 aminokiselinska sekvenca odabrana iz grupe koju čine KSSX1GVLX2SSX3NKNX4LA (SEQ ID NO:310), u kojoj X1je odabran iz grupe koju čine Q i S, X2je odabran iz grupe koju čine D i Y, X3je odabran iz grupe koju čine N i D, i X4je odabran iz grupe koju čine F i Y; i

(4) CDRL2 odabran iz grupe koju čine: (a) CDRL2 iz SEQ ID NO:211-224; (b) CDRL2 koji se razlikuje u aminokiselinskoj sekvenci od CDRL2 iz (a) za aminokiselinsko dodavanje, deleciju ili supstituciju ne više od dve aminokiseline; i (c) CDRL2 aminokiselinska sekvenca odabrana iz grupe koju čine WASX1RES (SEQ ID NO:311), u kojoj X1je odabran iz grupe koju čine N i T.

[0141] U jednom aspektu, izolovani antigen vezujući protein koji vezuje c-fms obuhvata CDRH3 i/ili CDRL3 Grupe B, videti, gore, i CDR odabran iz grupe koju čine:

(1) CDRH1 odabran iz grupe koju čine (a) CDRH1 iz SEQ ID NO:136-147; (b) CDRH1 koji se razlikuje u aminokiselinskoj sekvenci od CDRH1 iz (a) za aminokiselinsko dodavanje, deleciju ili supstituciju ne više od dve aminokiseline; i (c) CDRH1 aminokiselinska sekvenca odabrana iz grupe koju čine GFTX1X2X3A WMS (SEQ ID NO:313), u kojoj X1je odabran iz grupe koju čine F i V, X2je odabran iz grupe koju čine S i N, i X3je odabran iz grupe koju čine N i T;

(2) CDRH2 odabran iz grupe koju čine (a) CDRH2 iz SEQ ID NO:148-164; (b) CDRH2 koji se razlikuje u aminokiselinskoj sekvenci od CDRH2 iz (a) za aminokiselinsko dodavanje, deleciju ili supstituciju ne više od dve aminokiseline; i (c) CDRH2 aminokiselinska sekvenca odabrana iz grupe koju čine RIKX1KTDGX2TX3DX4AAPVKG (SEQ ID NO:314), u kojoj X1je odabran iz grupe koju čine S i T, X2je odabran iz grupe koju čine G i W, X3je odabran iz grupe koju čine T i A, i X4je odabran iz grupe koju čine Y i N;

(3) CDRL1 odabran iz grupe koju čine (a) CDRL1 iz SEQ ID NO:191-210; (b) CDRL1 koji se razlikuje u aminokiselinskoj sekvenci od CDRL1 iz (a) za aminokiselinsko dodavanje, deleciju ili supstituciju ne više od dve aminokiseline; i (c) CDRL1 aminokiselinska sekvenca odabrana iz grupe koju čine QASQDIX1NYLN (SEQ ID NO:316), u kojoj X1je odabran iz grupe koju čine S i N; i

(4) CDRL2 odabran iz grupe koju čine (a) CDRL2 iz SEQ ID NO:211-224; (b) CDRL2 koji se razlikuje u aminokiselinskoj sekvenci od CDRL2 iz (a) za aminokiselinsko dodavanje, deleciju ili supstituciju ne više od dve aminokiseline; i (c) CDRL2 aminokiselinska sekvenca odabrana iz grupe koju čine DX1SNLEX2(SEQ ID NO:317), u kojoj X1je odabran iz grupe koju čine A i T, i X2je odabran iz grupe koju čine T i P.

[0142] U jednom aspektu, izolovani antigen vezujući protein koji vezuje c-fms obuhvata CDRH3 i CDRL3 Grupe C, videti, gore, i CDR odabran iz grupe koju čine

(1) CDRH1 odabran iz grupe koju čine (a) CDRH1 iz SEQ ID NO:136-147; (b) CDRH1 koji se razlikuje u aminokiselinskoj sekvenci od CDRH1 iz (a) za aminokiselinsko dodavanje, deleciju ili supstituciju ne više od dve aminokiseline; i (c) CDRH1 aminokiselinska sekvenca odabrana iz grupe koju čine GFTFX1SYGMH (SEQ ID NO:319), u kojoj X1je odabran iz grupe koju čine S i I;

(2) CDRH2 odabran iz grupe koju čine (a) CDRH2 iz SEQ ID NO:148-164; (b) CDRH2 koji se razlikuje u aminokiselinskoj sekvenci od CDRH2 iz (a) za aminokiselinsko dodavanje, deleciju ili supstituciju ne više od dve aminokiseline; i (c) CDRH2 aminokiselinska sekvenca odabrana iz grupe koju čine VIWYDGSNX1YYADSVKG (SEQ ID NO:320), u kojoj X1je odabran iz grupe koju čine E i K;

(3) CDRL1 odabran iz grupe koju čine (a) CDRL1 iz SEQ ID NO:191-210; (b) CDRL1 koji se razlikuje u aminokiselinskoj sekvenci od CDRL1 iz (a) za aminokiselinsko dodavanje, deleciju ili supstituciju ne više od dve aminokiseline; i (c) CDRL1 aminokiselinska sekvenca odabrana iz grupe koju čine QASX1DIX2NX3LN (SEQ ID NO:322), u kojoj X1je odabran iz grupe koju čine Q i H, X2je odabran iz grupe koju čine S i N, i X3je odabran iz grupe koju čine F i Y;

(4) CDRL2 odabran iz grupe koju čine (a) CDRL2 iz SEQ ID NO:211-224; (b) CDRL2 koji se razlikuje u aminokiselinskoj sekvenci od CDRL2 iz (a) za aminokiselinsko dodavanje, deleciju ili supstituciju ne više od dve aminokiseline; i (c) CDRL2 aminokiselinska sekvenca odabrana iz grupe koju čine DASNLEX1(SEQ ID NO:323), u kojoj X1je odabran iz grupe koju čine T i I.

[0143] U još jednom aspektu, izolovani antigen vezujući protein koji je prethodno opisan obuhvata prvu aminokiselinsku sekvencu koje obuhvata najmanje jedan od prethodnih CDRH konsenzus sekvenci, i drugu aminokiselinsku sekvencu koje obuhvata najmanje jedan od prethodnih CDRL konsenzus sekvenci. U jednom aspektu, prva aminokiselinska sekvenca obuhvata najmanje dve od prethodnih CDRH konsenzus sekvenci, i/ili druga aminokiselinska sekvenca obuhvata najmanje dve od prethodnih konsenzus sekvenci. U još jednom aspektu, prva aminokiselinska sekvenca obuhvata najmanje dva CDRH-a iste od prethodnih grupa A, B, ili C, i/ili druga aminokiselinska sekvenca obuhvata najmanje dva CDRL-a iste od prethodnih grupa A, B, ili C. U daljim aspektima, prva i druga aminokiselinska sekvenca obuhvataju najmanje jedan CDRH i jedan CDRL, respektivno, iste od prethodnih grupa A, B, ili C. U još daljem aspektu, prva aminokiselinska sekvenca obuhvata CDRH1, CDRH2, i CDRH3 iste od prethodnih grupa A, B, ili C, i/ili druga aminokiselinska sekvenca obuhvata CDRL1, CDRL2, i CDRL3 iste od prethodnih grupa A, B, ili C.

[0144] U određenom aspektu, prva i druga aminokiselinska sekvenca kovalentno su povezane jedna za drugu.

[0145] U daljem aspektu, prva aminokiselinska sekvenca izolovanog antigen-vezujućeg proteina uključuje CDRH3 iz SEQ ID NO:165-190, CDRH2 iz SEQ ID NO:148-164, i CDRH1 iz SEQ ID NO:136-147, i/ili druga aminokiselinska sekvenca izolovanog antigen vezujućeg proteina obuhvata CDRL3 iz SEQ ID NO:225-246, CDRL2 iz SEQ ID NO:211-224, i CDRL1 of SEQ NO:191-210.

[0146] U daljem aspektu, antigen vezujući protein obuhvata najmanje dve CDRH sekvence sekvenci teškog lanca H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15, H16, H17, H18, H19, H20, H21, H22, H23, H24, H25, H26, H27, H28, H29, H30, H31, ili H32, kako je prikazano u TABELI 4A. U još jednom daljem aspektu, antigen vezujući protein obuhvata najmanje dve CDRL sekvence sekvenci lakog lanca L1, L2, L3, L4, L5, L6, L7, L8, L9, L10, L11, L12, L13, L14, L15, L16, L17, L18, L19, L20, L21, L22, L23, L24, L25, L26, L27, L28, L29, L30, L31, L32, L33, ili L34, kako je prikazano u TABELI 4B. U još jednom daljem aspektu, antigen vezujući protein obuhvata najmanje dve CDRH sekvence sekvenci teškog lanca H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15, H16, H17, H18, H19, H20, H21, H22, H23, H24, H25, H26, H27, H28, H29, H30, H31, ili H32, kako je prikazano u TABELI 4A, i najmanje dva CDRL-a sekvenci lakog lanca L1, L2, L3, L4, L5, L6, L7, L8, L9, L10, L11, L12, L13, L14, L15, L16, L17, L18, L19, L20, L21, L22, L23, L24, L25, L26, L27, L28, L29, L30, L31, L32, L33, ili L34, kako je prikazano u TABELI 4B.

[0147] U još jednom aspektu, antigen vezujući protein obuhvata CDRH1, CDRH2, i CDRH3 sekvence sekvenci teškog lanca H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15, H16, H17, H18, H19, H20, H21, H22, H23, H24, H25, H26, H27, H28, H29, H30, H31, ili H32, kako je prikazano u TABELI 4A. U još jednom aspektu, antigen vezujući protein obuhvata CDRL1, CDRL2, i CDRL3 sekvence sekvenci lakog lanca L1, L2, L3, L4, L5, L6, L7, L8, L9, L10, L11, L12, L13, L14, L15, L16, L17, L18, L19, L20, L21, L22, L23, L24, L25, L26, L27, L28, L29, L30, L31, L32, L33, ili L34, kako je prikazano u TABELI 4B.

[0148] U još jednom aspektu, antigen vezujući protein obuhvata svih šest CDR-ova od H1 i L1, ili H1 i L2, ili H2 i L31, ili H2 i L33, ili H3 i L3, ili H4 i L4, ili H5 i L5, ili H6 i L6, ili H7 i L7, ili H8 i L8, ili H8 i L9, ili H9 i L32, ili H9 i L34, ili H10 i L10, ili H11 i L11, ili H12 i L12, ili H13 i L12, ili H14 i L13, ili H15 i L14, ili H16 i L15, ili H17 i L16, ili H18 i L17, ili H19 i L18, ili H20 i L20, ili H21 i L19, ili H22 i L21, ili H24 i L22, ili H25 i L23, ili H26 i L24, ili H27 i L25, ili H28 i L26, ili H29 i L27, ili H30 i L28, ili H31 i L29, ili H32 i L30, kako je prikazano u TABELAMA 4A i 4B.

[0149] Informacije o sekvencama za specifična antitela pripremljena i identifikovana kako je opisano u Primerima ispod, sumirane su u TABELI 4C. Radi lakšeg prepoznavanja, u nekim slučajevima ovde se koristi skraćeni oblik referentnog broja gde je poslednji broj reference izbačen. Tako, na primer, 1.109.1 ponekad je jednostavno označen kao 1.109; 1.109.1 SM označen je kao 1.109 SM; 1.2.1 označen je kao 1.2; 1.2.1 SM označen je kao 1.2 SM; 2.360.1 označen je kao 2.360, 2.360.1 SM označen je kao 2.360 SM; itd.

[0150] U jednom aspektu, izolovani antigen-vezujući proteini koji su ovde obezbeđeni mogu biti monoklonalno antitelo, poliklonalno antitelo, rekombinantno antitelo, humano antitelo, humanizovano antitelo, himerno antitelo, multispecifično antitelo, ili njihov fragment antitela.

[0151] U još jednom primeru izvođenja, fragment antitela izolovanih antitela prema ovom pronalasku može biti Fab fragment, Fab' fragment, F(ab')2fragment, Fv fragment, dijatelo, ili molekul jednolančanog antitela.

[0152] U daljem primeru izvođenja, izolovani antigen vezujući protein koji je ovde obezbeđen je humano antitelo i može biti IgG1-, IgG2-, IgG3- ili IgG4-tipa.

[0153] U ovde opisanom aspektu, antigen vezujući protein sastoji se samo od polipeptida lakog ili teškog lanca kako je navedeno u TABELAMA 4A-4C. U nekim ovde opisanim aspektima, antigen vezujući protein sastoji se samo od varijabilnog lakog domena ili varijabilnog teškog domena kao što su oni navedeni u TABELAMA 4A-4C. Takvi antigen vezujući proteini mogu biti pegilisani jednim ili više PEG molekula.

[0154] U još jednom aspektu, izolovani antigen-vezujući protein koji je ovde obezbeđen može biti kuplovan za grupu za obeležavanje i može ući u kompeticiju za vezivanje za ekstracelularni deo humanog c-fms sa antigen vezujućim proteinom jednog od izolovanih antigen-vezujućih proteina koji je ovde obezbeđen. U jednom aspektu, izolovani antigen vezujući protein koji je ovde obezbeđen može redukovati monocitnu hemotaksu, inhibirati migraciju monocita u tumore ili inhibirati akumulacije i funkciju makrofaga povezanog sa tumorom u nekom tumoru kada se daje pacijentu.

[0155] Stručnjak ce ceniti da je za bilo koji antigen vezujući protein sa više od jednom CDR iz prikazanih sekvenci, bilo koja kombinacija CDR-ova nezavisno odabrana iz prikazanih sekvenci korisna. Prema tome, može se generisati antigen vezujući proteini sa jedan, dva, tri, četiri, pet ili šest nezavisno odabranih CDR-ova. Međutim, kako će biti cenjeno od strane stručnjaka iz ove oblasti, specifični aspekti generalno koriste kombinacije CDR-ova koje su ne-repetitivne, npr., antigen vezujući proteini generalno nisu izrađeni od dva CDRH2 regiona, itd.

[0156] Neki od obezbeđenih antigen vezujućih proteina, opisani su detaljnije u nastavku.

Antigen vezujući proteini i vezujući epitopi i vezujući domeni

[0157] Kada se kaže da se antigen vezujući protein vezuje sa nekim epitopom unutar određenih ostataka, kao što je c-fms, ili ekstracelularni domen c-fms, primera radi, misli se da se taj antigen vezujući protein specifično vezuje sa određenim delom c-fms. U nekim aspektima, antigen vezujući protein specifično se vezuje sa polipeptidom koji se sastoji od određenih ostataka (npr., određeni segment c-fms). Takav antigen vezujući protein tipično ne dolazi u kontakt sa svakim ostatkom unutar cfms, ili ekstracelularnog domena c-fms. Niti svaka pojedinačna aminokiselinska supstitucija ili delecija unutar c-fms, ili ekstracelularnog domena c-fms, nužno značajno ne utiče na afinitet vezivanja.

[0158] Specifičnost epitopa i vezujući domen(i) antigen vezujućeg proteina mogu se odrediti raznim postupcima. Neki postupci, primera radi, mogu primeniti skraćene delove antigena. Drugi postupci koriste antigen mutiran na jednom ili više specifičnih ostataka.

[0159] Što se tiče postupaka koji primenjuju skraćene delove antigena, u jednom primernom pristupu, može se primeniti kolekcija preklapajućih peptida. peklapajući peptidi sastoje se od oko 15 aminokiselina koje obuhvataju sekvencu antigena i rzlikuju se u inkrementima malog broja aminokiselina (npr., tri aminokiseline). Peptidi su imobilizovani u bazenčićima mikrototarskog suda ili na različitim lokacijama na membrani. Imobilizacija može se izvesti biotinilisanjem jednog terminusa peptida.

Opciono, različiti uzorci istog peptida mogu biti biotinilisani na amino- i karboksi-terminusu i imobilisani u odvojenim bazenčićima radi poređenja. To je korisno za identifikovanje krajnje specifičnih antigen vezujućih proteina. Opciono, dodatni peptidi mogu da uključe prekidanje na određenoj aminokiselini od interesa. Ovaj pristup je koristan za identifikovanje krajnje specifičnih antigen vezujućih proteina u unutrašnjim fragmentima c-fms (ili ekstracelularnom domenu c-fms). Antigen vezujući protein ili imunološki funkcionalan fragment skrinovan je za specifično vezivanje sa raznim peptidima. Epitop je definisan da se javlja sa segmentom aminokiseline koja je zajednička za sve peptide sa kojima antigen vezujući protein prikazuje specifično vezivanje. Detalji u vezi sa specifičnim pristupom za definisanje epitopa, navedeni su u Primeru 12.

[0160] Kako je prikazano u Primeru 12, antigen vezujući proteini koji su ovde obezbeđeni sposobni su za vezivanje polipeptida koji uključuje domen 1 nalik Ig i domen 2 nalik Ig u kombinaciji; međutim, oni ne vezuju polipeptid koji sadrži primarno domen 1 nalik Ig ili primarno domen 2 nalik Ig sam. Vezujući epitopi takvih antigen vezujućih proteina tako su sastavljeni tro-dimenzionalno od domena nalik Ig 1 i domena nalik Ig 2 u kombinaciji. Kako je podvučeno na FIG.8, ova dva domena obuhvataju aminokiseline 20 preko 223 c-fms ekstracelularnog domena, koji ima sledeću aminokiselinsku sekvencu:

[0161] Aminokiselinska sekvenca upotrebljena je u Primeru 12 kako bi predstavljala domen 1 nalik Ig odgovara aminokiselinama 20-126 sekvence prikazane na FIG.8 (tj., aminokiseline 20-126 iz SEQ ID NO:1, tačnije IPVIEPSVPELVVKPGATVTLRCVGNGSVEWDGPPSPHWTLYSDGSSSILSTNNATFQNTGTYRCT EPGDPLGGSAAIHLYVKDPARPWNVLAQEVWFEDQDALLP). Aminokiselinska sekvenca koja je primenjena da predstavlja domen 2 nalik Ig sam odgovarala je aminokiselinama 85-223 sekvence prikazane na FIG.8 (tj., aminokiseline 85-223 iz SEQ ID NO:1, tačnije TEPGDPLGGSAAIHLYVKDPARPWNVLAQEVVVFEDQDALLPCLLTDPVLEAGVSLVRVRGRPL MRHTNYSFSPWHGFTIHRAKFIQSQDYQCSALMGGRKVMSISIRLKVQKVIPGPPALTLVPALVRI RGEAAQIV).

[0162] Na taj način, antigen vezujući protein može se vezati ili specifično vezati za region unutar cfms proteina (npr., zreli protein pune dužine), gde region ima aminokiselinsku sekvencu određenu u SEQ ID NO:326. U nekim aspektima, antigen vezujući protein vezuje se ili se specifično vezuje za polipeptid koji se suštinski sastoji od aminokiselinskih ostataka kako je navedeno u SEQ ID NO:326.

[0163] U još jednim aspektima, antigen vezujući protein može da se veže ili se specifično vezuje za polipeptid koji se sastoji od SEQ ID NO:326 ali ne za polipeptid koji se sastoji od aminokiselina 20-126 sekvence prikazane na FIG.8 (tj., aminokiseline 20-126 iz SEQ ID NO:1). U još jednom aspektu, antigen vezujući protein može da se veže ili se specifično vezuje za polipeptid koji se sastoji od SEQ ID NO:326 ali ne za polipeptid koji se sastoji od aminokiselina 85-223 sekvence prikazane na FIG.8 (tj., aminokiseline 85-223 iz SEQ ID NO:1). U još jednim aspektima, antigen vezujući protein može da se veže ili se specifično vezuje za polipeptid koji se sastoji od SEQ ID NO:326 ali ne za polipeptid koji se sastoji od aminokiselina 20-126 sekvence prikazane na FIG.8 (tj., aminokiseline 20-126 iz SEQ ID NO:1) ili za polipeptid koji se sastoji od aminokiselina 85-223 sekvence prikazane na FIG.8 (tj., aminokiseline 85-223 iz SEQ ID NO:1).

[0164] U još jednom pristupu, domen(i)/region(i) koji sadrži ostatke koji su u kontaktu sa ili su zakopani od strane antitela mogu se identifikovati mutiranjem specifičnih ostataka u antigenu (npr., antigen divljeg-tipa) i odrediti da li antigen vezujući protein može vezati mutirani protein. Izvođenjem određenog broja pojedinačnih mutacija, mogu se identifikovati ostaci koji igraju direktnu ulogu u vezivanju ili koji su u dovoljno bliskoj blizini anititela tako da mutacija može da utiče na vezivanje između antigen vezujućeg proteina i antigena. Poznavanjem ovih aminokiselina, mogu se razjasniti domen(i) ili region(i) antigena koji sadrže ostatke u kontaktu sa antigen vezujućim proteinom ili koji su prekriveni antitelom. Takav domen tipično uključuje vezujući epitop antigen vezujućeg proteina. Jedan specifične primer ovog opšteg pristupa primenjuje protokol skeniranja argininska/glutaminsa kiselina (videti, npr., Nanevicz, T., et al., 1995, J. Biol. Chem., 270:37, 21619-21625 i Zupnick, A., et al., 2006, J. Biol. Chem., 281:29, 20464-20473). Generalno, argininske i glutamisnke kiseline supstituisane su (tipično pojedinačno) za aminokiselinu u divljem-tipu polipeptida budući da su ove aminokiseline naeleketrisane i glomazne te imaju potencijal da prekinu vezivanje između antigen vezujućeg proteina i antigena u regionu antigena u kojem se uvodi mutacija. Arginini i lizini koji postoje u antigenu divljeg-tipa zamenjeni su glutaminskom kiselinom. Obezbeđeni su mnogi takvi pojedinačni mutanti, a sakupljeni rezultati vezivanja analizirani radi određivanja koji ostaci utiču na vezivanje.

[0165] Primer 14 opisuje argininska/glutaminska kiselina skeniranje humanog c-fms za c-fms vezujuće proteine koji su ovde obezbeđeni. Serije od 95 mutant humanih c-fms antigena su kreirane, pri čemu svaki mutant antigen ima jednu mutaciju. Vezivanje svakog mutant c-fms antigena sa odabranim c-fms antigen vezujućim proteinima koji su ovde obezbeđeni, izmereno je i upoređeno sa sposobnošću ovih odabranih vezujućih proteina da se vežu sa c-fms antigenom divljeg-tipa (SEQ ID NO:1). Smanjenje u vezivanju između antigen vezujućeg proteina i mutant c-fms antigena kako se ovde koristi, označava da postoji smanjene u afinitetu vezivanja (npr., kako je izmereno poznatim postupcima kao što je Biacore testiranje kako je opisano u primerima) i/ili smanjenje u ukupnom kapacitetu vezivanja antigen vezujućeg proteina (npr., što je potvrđeno smanjenjen u Bmax u grafičkim podacima za koncentraciju antigen vezujućeg proteina naspram koncentracije antigena). Značajno smanjenje u vezivanju ukazuje da je mutirani ostatak direktno uključen u vezivanje za antigen vezujući protein ili je u bliskoj blizini vezujućeg proteina kada je vezujući protein vezan za antigen.

[0166] U nekim primerima izvođenja, značajno smanjenje u vezivanju označava da je afinitet vezivanja i/ili kapacitet između antitelo i mutant c-fms antigena redukovan za više od 50 %, više od 55 %, više od 60 %, više od 65 %, više od 70 %, više od 75 %, više od 80 %, više od 85 %, više od 90% ili više od 95% u odnosu na vezivanje između vezujućeg proteina i c-fms antigena divljeg tipa (npr., ekstracelularni domen prikazan na SEQ ID NO:1). U određenim primerima izvođenja, vezivanje je redukovano ispod detektujućih granica. U nekim primerima izvođenja, značajno smanjenje u vezivanju potvrđeno je kada je vezivanje manje od 50% (npr., manje od 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15% ili 10%) vezivanja pimećeno između antigen vezujućeg proteina i c-fms antigena divljeg-tipa (npr., ekstracelularni domen prikazan na SEQ ID NO:1). Takvo merenje vezivanja može se izvesti upotrebom raznih ogleda vezivanja poznatih u struci. Specifični primer jednog takvog ogleda opisan je u Primeru 14.

[0167] U nekim aspektima, obezbeđeni su antigen vezujući proteini koji pokazuju značajno niže vezivanje za mutant c-fms antigen u kojem je ostatak u c-fms antigenu divljeg-tipa (npr., SEQ ID NO:1) supstituisan argininskom ili glutaminskom kiselinom. U još jedno takvom aspektu, vezivanje antigen vezujućeg proteina značajno je redukovano za mutant c-fms antigen sa bilo kojom jednom ili više (npr., 1, 2, 3 ili 4) sledećih mutacija: E29R, Q121R, T152R, i K185E u poređenju sa c-fms divljeg-tipa (npr., SEQ ID NO:1). U skraćenicama koje se ovde koriste, format je: statak divljeg tipa: Položaj u polipeptidu: Mutant ostatak, sa brojnim ostacima kako je indikovano u SEQ ID NO:1. U nekim primerima izvođenja, vezivanje antigen vezujućeg proteina značajno je redukovano za mutant c-fms antigen sa bilo kojom jednom ili više (npr., 1, 2, 3, 4 ili 5sledećih mutacija: E29R, Q121R, S172R, G274R, i Y276R u poređenju sa c-fms divljeg-tipa (npr., SEQ ID NO:1). U još jednom aspektu, antigen vezujući protein eksprimira značajno niže vezivanje za mutant c-fms antigen koji sadrži bilo koju jednu ili više (npr., 1, 2, 3, 4, 5 itd. pa do 23 sledećih mutacija: R106E, H151R, T152R, Y154R, S155R, W159R, Q171R, S172R, Q173R, G183R, R184E, K185E, E218R, A220R, S228R, H239R, N240R, K259E, G274R, N275R, Y276R, S277R, i N282R u poređenju sa c-fms divljeg-tipa (npr., SEQ ID NO:1). U daljim aspektima, vezivanje antigen vezujućeg proteina značajno je smanjeno za mutant c-fms antigen koji sadrži bilo koju jednu ili više (npr., 1, 2, 3, 4 ili 5 sledećih mutacija: K102E, R144E, R146E, D174R, i A226R u poređenju sa vezivanjem za c-fms divljegtipa (npr., SEQ ID NO:1). U još daljim aspektima, antigen vezujući protein eksprimira značajno smanjeno vezivanje za mutant c-fms antigen koji sadrži bilo koju jednu ili više (npr., 1.2, 3, 4, 5, 6, 7 ili 8 sledećih mutacija: W50R, A74R, Y100R, D122R, T130R, G161R, Y175R, i A179R u poređenju sa c-fms divljeg-tipa (npr., SEQ ID NO:1).

[0168] Iako su mutant oblici samo navedeni kao referentni u odnosu na divlji-tip sekvence ekstracelularnog domena prikazana na SEQ ID NO:1, biće cenjeno da u alelnoj varijanti c-fms, aminokiselina u indikovanom položaju može se razlikovati. Antigen vezujući proteini koji pokazuju značajno niže vezivanje za takve alelne oblike c-fms takođe su uzeti u obzir. Shodno tome, u jednom aspektu, antigen vezujući protein ima značajno smanjeno vezivanje za alelni c-fms antigen u poređenju sa c-fms divljeg-tipa (npr., SEQ ID NO:1) kod kojeg su jedan ili više sledećih ostataka (npr., 1, 2, 3 ili 4) alelnog antigena zamenjeni sa argininskom ili glutamisnkom kiselinom kako je indikovano: 29R, 121R, 152R, i 185E (Položaj u polipeptidu: Mutant ostatak, sa brojnim ostacima kako je indikovano u SEQ ID NO:1). U nekim aspektima, antigen vezujući protein eksprimira značajno smanjeno vezivanje za alelni cfms antigen u kojima su jedan ili više (npr., 1, 2, 3, 4 ili 5) sledećih ostataka zamenjeni sa argininskom ili glutamisnkom kiselinom kako je indikovano: 29R, 121R, 172R, 274R, i 276R u poređenju sa njegovom sposobnošću da se veže sa c-fms divljeg-tipa (npr., SEQ ID NO:1). U još jednom aspektu, antigen vezujući protein prikazuje značajno smanjeno vezivanje za alelni c-fms antigen u kojima je jedan ili više (npr., 1, 2, 3, 4, 5 itd. pa do 23) sledećih ostataka zamenjeno sa argininskom ili glutamisnkom kiselinom kako je indikovano: 106E, 151R, 152R, 154R, 155R, 159R, 171R, 172R, 173R, 183R, 184E, 185E, 218R, 220R, 228R, 239R, 240R, 259E, 274R, 275R, 276R, 277R, i 282R u poređenju sa njegovom sposobnošću da se veže sa c-fms divljeg-tipa (npr., SEQ ID NO:1). U daljim aspektima, antigen vezujući protein ima značajno smanjeno vezivanje za alelni c-fms antigen u kojima je bilo koji jedan ili više (npr., 1, 2, 3, 4 ili 5) sledećih ostataka zamenjeno sa argininskom ili glutamisnkom kiselinom kako je indikovano: 102E, 144E, 146E, 174R, i 226R u poređenju sa njegovom sposobnošću da se veže sa c-fms divljeg-tipa (npr., SEQ ID NO:1). U još daljim aspektima, antigen vezujući protein eksprimira značajno smanjeno vezivanje za alelni c-fms antigen u kojima je bilo koji jedan ili više (npr., 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ili 8) sledećih ostataka zamenjeno sa argininskom ili glutamisnkom kiselinom kako je indikovano: 50R, 74R, 100R, 122R, 130R, 161R, 175R, i 179R u poređenju sa njegovom sposobnošću da se veže sa c-fms divljeg-tipa (npr., SEQ ID NO:1).

[0169] U nekim aspektima, vezivanje antigen vezujućeg proteina značajno je smanjeno za mutant c-fms antigen u kojima je ostatak na odabranom položaju u c-fms antigenu divljeg-tipa mutirab u bilo koji drugi ostatak. Na primer, u jednom aspektu, antigen vezujući protein eksprimira značajno smanjeno vezivanje za mutant c-fms antigen koji sadrži jednu aminokiselinsku supstituciju u jednom ili više (npr., 1, 2, 3 ili 4) od položaja 29, 121, 152, i 185 (de su položaji kako je indikovano u SEQ ID NO:1) u poređenju sa njegovom sposobnošću da se veže sa c-fms divljeg-tipa (npr., SEQ ID NO:1). U nekim aspektima, antigen vezujući protein ima značajno smanjeno vezivanje za mutant c-fms antigen koji sadrži single Aminokiselinska Supstitucija at jedan ili više (npr., 1, 2, 3, 4 ili 5) od položaja 29, 121, 172, 274 i 276 iz SEQ ID NO:1 u poređenju sa njegovom sposobnošću da se veže sa c-fms divljeg-tipa (npr., SEQ ID NO:1). U još jednom aspektu, vezivanje antigen vezujućeg proteina značajno je smanjeno za mutant c-fms antigen koji sadrži jednu aminokiselinsku supstituciju na jednom ili više (npr., 1, 2, 3, 4, 5 itd. pa do 23) od položaja 106, 151, 152, 154, 155, 159, 171, 172, 173, 183, 184, 185, 218, 220, 228, 239, 240, 259, 274, 275, 276, 277, i 282 iz SEQ ID NO:1 u poređenju sa vezivanjem za c-fms divljeg-tipa iz SEQ ID NO:1. U daljim aspektima, antigen vezujući protein ima značajno niže vezivanje za mutant c-fms antigen koji sadrži jednu aminokiselinsku supstituciju na jednom ili više (e.g, 1, 2, 3, 4 ili 5) od položaja 102, 144, 146, 174, i 226 iz SEQ ID NO:1 u poređenju sa njegovom sposobnošću da se veže sa c-fms divljeg-tipa (npr., SEQ ID NO:1). U još daljim aspektima, antigen vezujući protein ima značajno niže vezivanje za mutant cfms antigen koji sadrži jednu aminokiselinsku supstituciju na jednom ili više (npr., 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ili 8) od položaja 50, 74, 100, 122, 130, 161, 175, i 179 u poređenju sa njegovom sposobnošću da se veže sa cfms divljeg-tipa (npr., SEQ ED NO:1).

[0170] Kako je prethdono navedeno, ostaci direktno uključen u vezivanju ili pekriven antigen vezujućim proteinom mogu biti identifikovani iz rezultata skeniranja. Ovi ostaci prema tome mogu da obezbede indikovanje domena ili regiona SEQ ID NO:1 koji sadrže vezivajući region(i) za koji se antigen vezujući proteini vezuju. Kako se može videti iz rezultata sumiranih u Primeru 14, antigen vezujući protein vezuje se za domen koji sadrži aminokiseline 29-185 iz SEQ ID NO:1. U još jednom aspektu, antigen vezujući protein se vezuje sa region koji sadrži aminokiseline 29-276 iz SEQ ID NO:1. U drugom aspektu, antigen vezujući protein se vezuje sa region koji sadrži aminokiseline 106-282 iz SEQ ID NO:1. U još daljim aspektima, antigen vezujući protein vezuje se za region koji sadrži aminokiseline 102-226 iz SEQ ID NO:1. U još jednom aspektu, antigen vezujući protein se vezuje sa region koji sadrži aminokiseline 50-179 iz SEQ ID NO:1. U nekim aspektima, antigen vezujući proteini vezuje se za prethodne regione unutar fragmenta sekvence pune dužine iz SEQ ID NO:1. U drugim aspektima, antigen vezujući proteini vezuju se za polipeptide koji se sastoje od ovih regiona. U određenom aspektima, antigen vezujući protein se vezuje sa regionom koji sadrži aminokiseline 90-282 iz SEQ ID NO:1. U još jednom aspektu, antigen vezujući protein vezuje se za jedan ili oba od sledećih regiona: aminokiseline 90-185 i aminokiseline 217-282 iz SEQ ID NO:1. U još jednom aspektu, antigen vezujući protein vezuje se za jedan ili oba od sledećih regiona: aminokiseline 121-185 i aminokiseline 217-277 iz SEQ ID NO:1.

Antigen vezujući proteini koji ulaze u kompeticiju

[0171] U još jednom aspektu, prikazani su antigen vezujući proteini koji ulaze u kompeticiju sa jednim od primernih antitela ili funkcionalnim fragmentima vezivajući se za epitop opisan gore za specifično vezivanje za c-fms. Takvi antigen vezujući proteini takođe mogu da se vezuju za isti epitop kao jedan od ovde primernih antigen vezujućih proteina, ili peklapajući epitop. Antigen vezujući proteini i fragmenti koji ulaze u kompeticiju sa ili vezuju se za isti epitop kao što su primerni antigen vezujući proteini, očekuje se da pokazuju slične funkcionalne karakteristike. Primerni antigen vezujući proteini i fragmenti uključuju one opisan iznad, uključujući one sa teškim i lakim lancima, domenima varijabilnog regiona i CDR-ovima uključenim TABELAMA 1, 2, 3, i 4A-C. Prema tome, kao specifičan primer, antigen vezujući proteini koji su opisani uključuju one koji ulaze u kompeticiju sa antitelom koje ima:

(a) svih 6 CDR-ova navedenih za antitelo navedeno u TABELI 4C;

(b) VH i VL navedeni za antitelo navedeno u TABELI 4C; ili

(c) dva laka lanca i dva teška lanca kako je određeno za antitelo navedeno u TABELI 4C.

Monoklonalna antitela

[0172] Obezbeđeni su antigen vezujući proteini, uključuju monoklonalna antitela koja se vezuju za cfms. Monoklonalna antitela mogu biti proizvedena upotrebom bilo koje tehnike poznate u struci, npr., tako što se ćelije slezine sakupljene iz transgene životinje nakon završenog imunizacionog rasporeda, učine besmrtnim. Ćelije slezine mogu se učiniti besmrtnim upotrebom bilo koje tehnike poznate u struci, npr., njihovim fuzionisanjem sa ćelijama mijeloma radi proizvodnje hibridoma. Ćelije mijeloma za upotrebu u hibridom-proizvodnim fuzioni procedurama poželjno su ne-antitelo-proizvodne, imaju visoku fuzionu efikasnost, i deficijencije enzima koje ih čine nesposobnim za rast u određenim selektivnim medijima koji podržavaju rast samo željenih fuzionisanih ćelija (hibridomi). Primeri pogodnih ćelijskih linija za upotrebu u mišjim fuzijama uključuju Sp-20, P3-X63/Ag8, P3-X63-Ag8.653, NS1/1.Ag 41, Sp210-Ag14, FO, NSO/U, MPC-11, MPC11-X45-GTG 1.7 i S194/5XXO Bul; primeri ćelijskih linija koje se koriste u pacovskim fuzijama uključuju R210.RCY3, Y3-Ag 1.2.3, IR983F i 4B210. Ostale ćelijske linije korisne za ćelijske fuzije su U-266, GM1500-GRG2, LICR-LON-HMy2 i UC729-6.

[0173] U nekim slučajevima, hibridom ćelijska linija proizvedena je imunizovanjem životinja (npr., transgene životinje koje imaju humane imunoglobulinske sekvence) c-fms imunogenom; sakupljanjem ćelija slezine iz imunizovane životinje; fuzionisanjem sakupljenih ćelija slezine sa mijelom ćelijskom linijom, čime se generišu hibridom ćelije; utvrđivanjem hibridom ćelijskih linija iz hibridom ćelija, i identifikovanje hibridom ćelijske linije koja proizvodi antitelo koje se vezuje za c-fms polipeptid. Takve hibridom ćelijske linije, i anti-c-fms monoklonalna antitela proizveden od njih, predstavljaju aspekte ove prijave.

[0174] Monoklonalna antitela izlučena od strane hibridom ćelijske linije mogu biti prečišćena upotrebom bilo koje tehnike poznate u struci. Hibridomi ili mAb-ovi mogu biti dalje skrinovani kako bi se identifikovali mAb-ovi sa određenim karakteristikama, kao što je sposobnost da se blokira Wnt indukovana aktivnost. Primeri takvoh skrinova obezbeđeni su na u primerima ispod.

Himerna i humanizovana antitela

[0175] Takođe su obezbeđena himerna i humanizovana antitela na bazi prethodnih sekvenci.

Monoklonalna antitela za upotrebu kao terapeutski agensi mogu biti modifikovana na razne načine pre upotrebe. Jedan primer je himerno antitelo, pri čemu je antitelo sastavljeno od proteinskih segmenata iz različitih antitela koja su kovalentno spojena kako bi proizvela funkcionalne imunoglobulinske lake ili teške lance ili njihove imunološki funkcione delove. Generalno, deo teškog lanca i/ili lakog lanca identična je ili homologna sa onim koji odgovara sekvenci u antitelu izvedenom iz određena vrste ili koje pripada određenoj klasi ili potklasi antitela, dok je/su ostatak lanca(aca) identični sa ili homologni sa onima koji odgovaraju sekvenci u antitelu izvedenom iz još jedne vrste ili koji pripada još jednoj klasi ili potklasi antitela. Za postupke u vezi sa himernim antitelima, videti, primera radi, US Patent Br.

4,816,567; i Morrison et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855. CDR graftovanje je opisano, primera radi, u US Patentima Br.6,180,370, Br. 5,693,762, Br. 5,693,761, Br. 5,585,089, i Br.5,530,101.

[0176] Generalno, cilj pravljenja himernog antitela je kako bi se nap0ravila himera u kojoj je broj aminokiselina iz namenjene vrste pacijenta maksimizovan. Jedan primer je "CDR-graftovano" antitelo, kod kojeg antitelo obuhvata jedan ili više regiona koji određuju komplementarnost (CDR-ovi) iz određene vrste ili koji pripada određenoj klasi antitela ili potklasi, dok je/su ostatak lanca(aca) antitela identičan sa ili homologan sa onima koji odgovaraju sekvenci u antitelu izvedenom iz još jedne vrste ili koji pripada još jednoj klasi ili potklasi antitela. Za upotrebu kod ljudi, varijabilni region ili odabrani CDR-ovi iz antitelo glodara često su graftovani u humano antitelo, čime se zamenjuju prirodno javljajući varijabilni regioni ili CDR-ovi humanog antitela.

[0177] Jedna korisna vrsta himernog antitela je "humanizovano" antitelo. Generalno, humanizovano antitelo je proizvedeno iz monoklonalnog antitela koje je inicijalno uzgajano u ne-humanoj životinji. Određeni aminokiselinski ostaci kod ovog monoklonalnog antitela, tipično iz ne-antigen prepoznavajućih delova antitela, modifikovani su da budu homologni sa onima koja odgovaraju ostacima u humanom antitelu koje odgovara ovom izotipu. Humanizovanje se može izvesti, primera radi, upotrebom raznih postupaka supstituisanjem najmanje dela varijabilnog regiona glodara koji odgovaraju regioni humanog antitela (videti, npr., US Patent Br.5,585,089, i Br.5,693,762; Jones et al., 1986, Nature 321:522-525; Riechmann et al., 1988, Nature 332:323-27; Verhoeyen et al., 1988, Science 239:1534-1536),

[0178] U jednom aspektu, CDR-ovi varijabilnih regiona lakog i teškog lanca antitela koje je ovde obezbeđeno (videti, TABELA 3) graftovani su na okvirne regione (FR-ovi) iz antitela iste, ili različite, filogene vrste. Primera radi, CDR-ovi varijabilnih regiona teškog i lakog lanca VH1, VH2, VH3, VH4, VH5, VH6, VH7, VH8, VH9, VH10, VH11, VH12, VH13, VH14, VH15, VH16, VH17, VH18, VH19, VH20, VH21, VH22, VH23, VH24, VH25, VH26, VH27, VH28, VH29, VH30, VH31, i VH32, i/ili VL1, VL2, VL3, VL4, VL5, VL6, VL7, VL8, VL9, VL10, VL11, VL12, VL13, VL14, VL15, VL16, VL17, VL18, VL19, VL20, VL21, VL22, VL23, VL24, VL25, VL26, VL27, VL28, VL29, VL30, VL31, VL32, VL33 i VL34 mogu biti graftovani za konsenzus humane FR-ovi. Kako bi se stvorio konsenzus humani FR-ovi, FR-ovi iz nekoliko humanih aminokiselinskih sekvenci teškog lanca ili lakog lanca mogu biti poravnati kako bi se identifikovala konsenzus aminokiselinska sekvenca. U drugim primerima izvođenja, FR-ovi teškog lanca ili lakog lanca koji su ovde opisani, zamenjeni su sa FR-ovima iz različitog teškog lanca ili lakog lanca. U jednom aspektu, retke aminokiseline u FR-ovima teških i lakih lanaca anti-c-fms antitela nisu zamenjene, dok su ostale FR aminokiseline zamenjene. "retka aminokiselina" je specifična aminokiselina koja je u položaju u kojem se ova određena aminokiselina uobičajeno ne nalazi u FR. Alternativno, graftovani varijabilni regioni iz jednog teškog ili lakog lanca mogu se upotrebiti sa konstantnim regionom koji je različit od konstantnog regiona tog određenog teškog ili lakog lanca kako je ovde opisano. U drugim primerima izvođenja, graftovani varijabilni regioni deo su jednolančanog Fv antitela.

[0179] U određenim primerima izvođenja, konstantni regioni iz vrste različite od humane mogu se promeniti zajedno sa humanim varijabilnim regionom(ima) kako bi se proizvela hibridna antitela.

Potpuno humana antitela

[0180] Takođe su obezbeđena potpuno humana antitela. Dostupni su postupci za proizvodnju potpuno humanih antitela specifičnih za dati antigen bez izlaganja ljudi antigenu ("potpuno humana antitela"). Jedno specifično sredstvo za implementiranje proizvodnje potpuno humanih antitela koje je obezbeđeno je "humanizovanje" mišjeg humoralnog imunog sistema. Uvođenje humanog imunoglobulinskih (Ig) lokusa u miševe u kojima su endogeni Ig geni inaktivirani predstavlja jedno srestvo za proizvodnju potpuno humanih monoklonalnih antitela (mAb-ovi) kod miševa, životinje koja može biti imunizovana bilo kojim željenim antigenom. Upotrebom potpuno humanih antitela mogu se minimozovati imunogeni i alergijski odgovori koji se nekada mogu izazvati davanjem ljudima mišjih ili miš-izvedenih mAb-ova kao terapeutskih agenasa.

[0181] Potpuno humana antitela mogu se proizvesti imunizovanjem transgenih životinja (uobičajeno miševa) koji su sposobni za proizvodnju repertoar humanog antitela u odsustvu endogene imunoglobulinske proizvodnje. Antigeni za ovu svrhu tipično imaju šest ili više susednih aminokiselina, i opciono su konjugovane u nosač, kao što je hapten. Videti, npr., Jakobovits et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2551-2555; Jakobovits et al., 1993, Nature 362:255-258; i Bruggermann et al., 1993, Year in Immunol.7:33. U jednom primeru takvog postupka, transgene životinje su proizvedene onesposobljavanjem endogenih mišjih imunoglobulinskih lokusa koji kodiraju mišje teške i lake imunoglobulinske lance u njima, i umetanjem u mišji genom velikih fragmenata humanog genoma DNK koji sadrži lokuse koji kodiraju proteine humanog teškog i lakog lanca. Delimično modifikovane životinje, koje imaju manje od potpuno kompletnih humanih imunoglobulinskih lokusa, zatim su ukršteni kako bi se dobila životinja sa svim željenim modifikacijama imunog sistema. Kada se daje kao imunogen, ove transgene životinje proizvode antitela koja su imunospecifična za imunogen, ali koja imaju humane, a ne mišje aminokiselinske sekvence, uključujući varijabilne regione. Za više detalja ovakvih postupaka, videti, primera radi, WO96/33735 i WO94/02602. Dodatni postupci koji su povezani sa transgenim miševima za izradu humaih antitela, opisani su u US Patentu Br.5,545,807; Br.6,713,610; Br.6,673,986; Br.

6,162,963; Br.5,545,807; Br.6,300,129; Br.6,255,458; Br.5,877,397; Br.5,874,299 i Br.5,545,806; u PCT objavama WO91/10741, WO90/04036, i u EP 546073B1 i EP 546073A1.

[0182] Transgeni miševi prethodno opisani, koji se ovde nazivaju "HuMab" miševi, sadrže humani imunoglobulinski genski minilokus koji kodira nepoređane humane imunoglobulinske sekvence teškog ([mu] i [gama]) i [kapa] lakog lanca, zajedno sa ciljanim mutacijama koje inaktiviraju endogene lokuse [mu] i [kapa] lanca (Lonberg et al., 1994, Nature 368:856-859). Shodno tome, miševi pokazuju redukovanu ekspresiju mišjeg IgM ili [kapa], a kao odgovor na imunizaciju, i uvedene humane transgene teškog i lakog lanca koji su podvrgnuti kasnim menjanjem i somatskim mutacijama kako bi se generisala humana IgG [kapa] monoklonalna antitela sa visokim afinitetom (Lonberg et al., gore.; Lonberg and Huszar, 1995, Intern. Rev. Immunol.13: 65-93; Harding and Lonberg, 1995, Ann. N.Y Acad. Sci.764:536-546). Pripremanje HuMab miševa detaljnije je opisano u Taylor et al., 1992, Nucleic Acid Research 20:6287-6295; Chen et al., 1993, International Immunology 5:647-656; Tuaillon et al., 1994, J. Immunol.

152:2912-2920; Lonberg et al., 1994, Nature 368:856-859; Lonberg, 1994, Handbook of Exp.

Pharmacology 113:49-101; Taylor et al., 1994, International Immunology 6:579-591; Lonberg i Huszar, 1995, Intern. Rev. Immunol.13:65-93; Harding and Lonberg, 1995, Ann. N.Y Acad. Sci.764:536-546; Fishwild et al., 1996, Nature Biotechnology 14:845-851. Videti, dalje US Patent Br.5,545,806; Br.

5,569,825; Br.5,625,126; Br.5,633,425; Br.5,789,650; Br.5,877,397; Br.5,661,016; Br.5,814,318; Br.

5,874,299; i Br.5,770,429; kao i US Patent Br.5,545,807; Međunarodne objave Br. WO 93/1227; WO 92/22646; i WO 92/03918. Tehnologija koja se primenjuje za proizvodnju humanih antitela kod ovih transgenih miševa, opisana je takođe u WO 98/24893, i Mendez et al., 1997, Nature Genetics 15:146-156. Primera radi, sojevi HCo7 i HCo12 transgenih miševa mogu koristiti za generisanje anti-c-fms antitela. Dalji detalji koji se tiču proizvodnjr humanog antitela upotrebom transgenih miševs obezbeđeni su u primerima koji slede.

[0183] Upotrebom hibridom thnologije, antigen-specifični humani mAb-ovi sa ćeljenom specifičnošću mogu se proizvesti i odabrati od transgenih miševa kao što su oni opisani ovde. Takva antitela mogu biti klonirana i eksprimirana upotrebom pogodnog vektora i ćelija domaćina, ili se antitela mogu sakupiti iz kultivisanih hibridom ćelija.

[0184] Potpuno humana antitela takođe mogu biti izvedena iz faga-prikaznih biblioteka (kako je opisano u Hoogenboom et al., 1991, J. Mol. Biol.227:381; i Marks et al., 1991, J. Mol. Biol.222:581). Faga prikazne tehnike imitiraju imunu selekciju putem prikazivanja repertoara antitela na površini filamentoznog bakteriofaga, i naknadne selekcije faga njihovim vezivanjem za izborni antigen. Jedna takva tehnika opisana je u PCT Objavi Br. WO 99/10494, koja opisuje izolovanje funkcionalnih agonističnih antitela sa visokim afinitetom za MPL- i msk-receptore upotrebom takvog pristupa.

Bispecifični ili bifunkcionalni antigen vezujući proteini

[0185] Antigen vezujući proteini koji su obezbeđeni takođe uključuju bispecifična i bifunkcionalna antitela koja uključuju jedan ili više CDR-ova ili jedan ili više varijabilnih regiona kako je opisano iznad. Bispecifično ili bifunkcionalno antitelo u nekim slučajevima je veštačko hibridno antitelo sa dva različita para teškog/lakog lanca i dva različita vezivajuća mesta. Bispecifična antitela mogu biti proizvedena raznim postupcima uključujući, ali ne ograničavajući se na, fuzionisanje hibridoma ili linkovanjem Fab' fragmenata. Videti, npr., Songsivilai and Lachmann, 1990, Clin. Exp. Immunol.79:315-321; Kostelny et al., 1992, J. Immunol.148:1547-1553.

Razni drugi oblici

[0186] Neki obezbeđeni antigen vezujući proteini su varijantni oblici antigen vezujućeg proteina koji je prethodno opisan (npr., oni sa sekvencama navedenim u TABELAMA 1-4). Na primer, neki antigen vezujući proteini imaju jednu ili više konzervativnih aminokiselinskih supstitucija u jednom ili više teških ili lakih lanaca, varijabilnim regionima ili CDR-ovima navedenim u TABELAMA 1-4.

[0187] Prirodno javljajuće aminokiseline mogu se podeliti u klase na osnovu zajedničkih karakteristika bočnih lanaca:

1) hidrofobne: norleucin, Met, Ala, Val, Leu, Ile;

2) neutralno hidrofilne: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;

3) kisele: Asp, Glu;

4) bazne: His, Lys, Arg;

5) ostaci koji utiču na orijentaciju lanca: Gly, Pro; i

6) aromatične: Trp, Tyr, Phe.

[0188] Konzervativne aminokiselinske supstitucije mogu da uključe izmenjivanje člana jedne od ovih klasa sa još jednim članom iste klase. Konzervativne aminokiselinske supstitucije mogu da obuhvate neprirodno javljajuće aminokiselinskr ostatke, koji su tipično inkorporirani hemijskom peptidnom sintezom pre nego sintezom u biološkim sistemima. Oni uključuju peptidomimetike i druge reverzne ili invertne oblike aminokiselinskih ostataka.

[0189] Ne-konzervativne supstitucije mogu da uključe izmenjivanje člana jedne od pomenutih klasa sa članom iz još jedne klase. Takvi supstituisani ostaci mogu biti uvedeni u regione antitela koji su homologni sa humanim antitelima, ili na ne-homolognim regionima molekula.

[0190] U izvođenju takvih promena, u skladu sa određenim ostvarenjima, hidropatski indeks aminokiselina može biti uzet u obzir. Hidropatski profil proteina izračunava se određivanjem numeričke vrednosti ("hidropatijski indeks") za svaku aminokiselinu, a zatim repetitivn uprosečavanjem ovih vrednosti duž peptidnog lanca. Svakoj aminokiselini je određen hidropatski indeks na osnovu njene hidrofobičnosti i karakteristika nalektrisanja. One su: izoleucin (+4.5); valin (+4.2); leucin (+3.8); fenilalanin (+2.8); cistein/cistin (+2.5); metionin (+1.9); alanin (+1.8); glicin (-0.4); treonin (-0.7); serin (-0.8); triptofan (-0.9); tirozin (-1.3); prolin (-1.6); histidin (-3.2); glutamat (-3.5); glutamin (-3.5); aspartat (-3.5); asparagin (-3.5); lizin (-3.9); i arginin (-4.5).

[0191] Važnost hidropatskog profila u dodeljivanju interaktivne biološke funkcije proteinu dobro je poznata u struci (videti, npr., Kyte et al., 1982, J. Mol. Biol.157:105-131). Poznatoje da određene aminokiseline mogu biti supstituisane sa drugim aminokiselinama sa sličnim hidropatskim indeksom ili rezultatom i da im i dalje ostane slična biološka aktivnost. U izvođenju promena na osnovu hidropatskog indeksa, u određenim primerima izvođenja, uključena je supstitucija aminokiselina čiji su hidropatski indeksi unutar ±2. U nekim aspektima, uključeni su oni koji su unutar ±1, i u drugim aspektima, uključeni su oni unutar ±0.5.

[0192] Takođe se podrazumevau struci da supstitucija sličnih aminokiselina može biti izvedena efektivno na bazi hidrofilnosti, određenije gde su biološki funkcionalan protein ili peptide tako kreirani namenjeni za upotrebu u imunološkim primerima izvođenja, kao što je u ovom slučaju. U određenim primerima izvođenja, najveća lokalna prosečna hidrofilnost proteina, kako je upravljano hidrofilnošću njihovih susednih aminokiselina, u korelaciji je sa njihovom imunogeničnošću i antigen-vezivanjem ili imunogeničnošću, to jest, sa biološkom karakteristikom proteina.

[0193] Sledeće vrednosti hidrofilnosti određene su za sledeće aminokiselinske ostake: arginin (+3.0); lizin (+3.0); aspartat (+3.0±1); glutamat (+3.0±1); serin (+0.3); asparagin (+0.2); glutamin (+0.2); glicin (0); treonin (-0.4); prolin (-0.5±1); alanin (-0.5); histidin (-0.5); cistein (-1.0); metionin (-1.3); valin (-1.5); leucin (-1.8); izoleucin (-1.8); tirozin (-2.3); fenilalanin (-2.5) i triptofan (-3.4). U izvođenju promena na osnovu sličnih hidrofilnih vrednosti, u određenim primerima izvođenja, uključene su supstitucije aminokiselina čije su hidrofilne vrednosti unutar ±2, u drugim primerima izvođenja, uključene su one koje su unutar ±1, i u još daljim primerima izvođenja, uključene su one unutar ±0.5. U nekim slučajevima, takođe se mogu identifikovati epitopi iz primarnih aminokiselinskih sekvenci na bazi hidrofilnosti. Ovu regioni takođe se nazivaju " regioni epitopskog jezgra."

[0194] Primerne konzervativne aminokiselinske supstitucije navedene su u TABELI 5.

TABELA 5: Konzervativne Aminokiselinske Supstitucije

[0195] Stručnjak će lako odrediti pogodne varijante polipeptida kako je ovde već navedeno, upotrebom dobro poznatih tehnika. Stručnjak će moći da identifikuje pogodne oblasti molekula koje se mogi izmeniti bez uništavanja aktivnosti ciljanjem regiona za koje se veruje da nisu bitni za tu aktivnost. Stručnjak će takođe moći da identifikuje ostatke i delove molekula koji su konzervativni među sličnim polipeptidima. U daljim primerima izvođenja, čak i oblasti koje mogu biti važne za biološku aktivnost ili za strukturu mogu biti podvrgnute konzervativnim aminokiselinskim supstitucijama bez uništavanja biološke aktivnosti ili bez štetnog uticanja na polipeptidnu strukturu.

[0196] Dodatno, stručnjak može pregledati strukturno-funkcionalna ispitivanja koja identifikuju ostatke u sličnim polipeptidima koji su bitni za aktivnost ili strukturu. U pogledu takve komparacije, može se predvideti važnost aminokiselinskih ostataka u proteinu koji odgovara aminokiselinskim ostacima bitnim za aktivnost ili strukturu kod sličnih proteina. Stručnjak se može odlučiti za hemijski slične aminokiselinske supstitucije za takve previđene važne aminokiselinske ostatke.

[0197] Stručnjak taklođe može analizirati 3-dimenzionalne strukture i aminokiselinsku sekvencu u vezi sa tom strukturom kod sličnih polipeptida. U pogledu ovih informacija, stručnjak može predvideti poravnjavajuće aminokiselinske ostatke antitela u odnosu na njegove trodimenzionalne strukture. Stručnjak može izabrati da ne izvodi radikalne promene na aminokiselinskim ostacima predviđenim da budu na površini proteina, budući da takvi ostaci mogu biti uključeni u važne interakcije sa ostalim molekulima. Štaviše, stručnjak može generisati test varijante koje sadrže jednu aminokiselinsku supstituciju na svakom željenom aminokiselinskom ostatku. Ove varijante mogu zatim biti skrinovane uotrebom ogleda za c-fms neutrališuću aktivnost, (videti primere ispod) čime se dobija informacija koja se odnosi na to koje aminokiseline se mogu promeniti , a koje se ne smeju promeniti. Drugim rečima, na osnovu informacija sakupljenih iz takvih rutisnkih eksperimenata, stručnjak može lako odrediti aminokiselinske položaje u kojima bi se dalje supstitucije trebalo ozbeći bilo same bilo u kombinaciji sa drugim mutacijama.

[0198] Brojne naučne publikacije posvećene su predviđanju sekundarnih struktura. Videti, Moult, 1996, Curr. Op. in Biotech.7:422-427; Chou et al., 1974, Biochem.13:222-245; Chou et al., 1974, Biochemistry 113:211-222; Chou et al., 1978, Adv. Enrymol. Relat. Areas Mol. Biol.47:45-148; Chou et al., 1979, Ann. Rev. Biochem.47:251-276; i Chou et al., 1979, Biophys. J.26:367-384. Štaviše, kompjuterski programi trenutno su dostupni koji potpomažu previđanje sekundarnih struktura. Postupak previđanja sekundarne strukture baziran je na homolognom modelovanju. Primera radi, dva polipeptida ili proteina koja imaju sekvencijalni identitet od više od 30%, ili sličnost od više od 40% mogu imati slične strukturne topologije. Obezbeđen je nedavni rast baze podataka proteinskih struktura (PDB) čime se obezbeđuje predvidljivost sekundarne strukture, uključujući potencijalni broj savijanja polipeptidnih ili proteinskih struktura. Videti, Holm et al., 1999, Nucl. Acid. Res.27:244-247. Predloženo je (Brenner et al., 1997, Curr. Op. Struct. Biol.7:369-376) da postoji ograničen broj savijanja na datom polipeptidu ili proteinu i

da kada se razreši kritičan broj struktura, strukturalno predviđanje postaće dramatično tačnije.

[0199] Dodatni postupci predviđanja sekundarne strukture uključuju "nizanje" (Jones, 1997, Curr. Opin. Struct. Biol.7:377-387; Sippl et al., 1996, Structure 4:15-19), "analiza profila" (Bowie et al., 1991, Science 253:164-170; Gribskov et al., 1990, Meth. Enzym.183:146-159; Gribskov et al., 1987, Proc. Nat. Acad. Sci.84:4355-4358), i "evolucionarna veza" (Videti, Holm, 1999, gore; i Brenner, 1997, gore).

[0200] U nekim primerima izvođenja, aminokiselinske supstitucije izvedene su tako da: (1) smanjuju osetljivost na proteolizu, (2) smanjuju osetljivost na oksidaciju, (3) menjaju afinitet vezivanja za formiranje proteinskih komplekasa, (4) menjaju ligand ili antigen vezujuće afinitete, i/ili (4) dodeljuju ili modifikuju druge fizičkohemijske ili funkcionalne karakteristike na takvim polipeptidima. Primera radi, pojedinalne ili višestruke aminokiselinske supstitucije (u određenim primerima izvođenja, konzervativne aminokiselinske supstitucije) mogu se izvesti na prirodno javljajućoj sekvenci. Supstitucije se mogu izvesti u delu antitela koji leži izvan domena(a) koji formira intermolekularne kontakte). U takvim primerima izvođenja, konzervativne aminokiselinske supstitucije mogu se koristiti da suštinski ne promene strukturne karakteristike roditeljske sekvence (npr., jedna ili više zamenskih aminokiselina koje ne remete sekundarne strukture koje karakterišu roditeljski ili nativni antigen vezujući protein). Primeri u struci poznatih polipeptidnih sekundarnih i tercijarnih struktura, opisani su u Proteins, Structures and Molecular Principles (Creighton, Ed.), 1984, W. H. New York: Freeman and Company; Introduction to Protein Structure (Branden and Tooze, eds.), 1991, New York: Garland Publishing; and Thornton et al., 1991, Nature 354:105.

[0201] Dodatne poželjene varijante antitela uključuju cistein varijante gde su jedan ili više cistein ostataka u roditeljskoj ili nativnoj aminokiselinskoj sekvenci are obrisani iz ili supstutuisani još jednom aminokiselinom (npr., serin). Cistein varijante su korisne, između ostalog kada se antitela moraju ponovo saviti u biološki aktivnu konformaciju. Cistein varijante mogu imati manje cisteinskih ostataka od nativnog antitela, a tipično imaju jednak broj kako bi minimizirali interakcije koje su rezultat neuparenih cisteina.

[0202] Teški i laki lanci, domeni varijabilnih regiona i CDR-ovi koji su ovde opisani mogu se koristiti za pripremu polipeptida koji sadrže antigen vezujući region koji se može specifično vezati za c-fms polipeptid. Primera radi, jedan ili više CDR-ova navedenih u TABELAMA 3 i 4 mogu biti inkorporirani u molekul (npr., polipeptid) kovalentno ili nekovalentno kako bi se izvela imunoadhezija. Imunoadhezija može inkorporirati CDR(ove) kao deo većeg polipeptidnog lanca, može kovalentno povezati CDR(ove) sa još jednim polipeptidnim lancem, ili može inkorporirati CDR(ove) nekovalentno. CDR(ovi) omogućavaju da se imunoadhezija veže specifično za određeni antigen od interesa (npr., c-fms polipeptid ili njegov epitop).

[0203] Ovde su takođe obezbeđeni i mimetici (npr., "peptidni mimetici" ili "peptidomimetici") na bazi domena varijabilnog regiona i CDR-ova koji su ovde opisani. Ovi analozi mogu biti peptidi, ne-peptidi ili kombinacije regiona peptida i ne-peptida. Fauchere, 1986, Adv. Drug Res.15:29; Veber i Freidinger, 1985, TINS p.392; i Evans et al., 1987, J. Med. Chem.30:1229. Peptidni mimetici koji su strukturno slični terapeutski korisnim peptidima mogu se koristi za proizvodnju sličnog terapeutskog ili profilaktičkog efekat. Takva jedinjenja često se razvijaju pomoću kompjuterizovanog molekularnog modelinga.

Generalno, peptidomimetici su proteini koji su strukturno slični antitelu koji pokazuje željenu biološku aktivnost, kao što je ovde sposobnostz da se specifično veže c-fms, ali imaju jednu ili više peptidnih veza opciono zamenjenih vezom odabranom od: -CH2NH-, -CH2S-, -CH2-CH2-, -CH-CH-(cis i trans),-COCH2-, -CH(OH)CH2-, i -CH2SO-, postupcima poznatim u struci. Sistematična supstitucija jedne ili više aminokiselina konsenzus sekvence sa D-aminokiselinom istog tipa (npr., D-lizin umesto L-lizin) može biti upotrebljena u određenim primerima izvođenja za generisanje stabilnijih proteina. Dodatno, ograničeni peptidi koji obuhvataju konsenzus sekvencu ili suštinski identičnu varijaciju konsenzus sekvence, mogu biti generisani postupcima poznatim u ovoj oblasti (Rizo i Gierasch, 1992, Ann. Rev. Biochem.61:387), primera radi, dodavanjem umutrašnjih cisteinskih ostataka sposobnih za formiranje intramolekularnih disulfidnih mostova sa ciklizovanjem peptida.

[0204] Takođe su obezbeđeni ovde opisani derivati antigen vezujućeg proteina. Derivatizovani antigen vezujući proteini mogu da obuhvataju bilo koji molekul ili supstancu koja daje željenu karakteristiku antitelu ili fragmentu, kao što povećan polu-život u određenoj upotrebi. Derivatizovan antigen vezujući protein može da obuhvata, primera radi, detektabilnu (ili obeležavajuću) grupu (npr., radioaktivni, kolometrijski, antigeni ili enzimatski molekul, detektabilnu perlicu (kao što je magnetna ili elektro gusta (npr., zlatna) perlica), ili molekul koji se vezuje za još jedan molekul (npr., biotin ili streptavidin)), terapeutsku ili dijagnostičku grupu (npr., radioaktivnu, citotoksičnu, ili farmaceutski aktivnu grupu), ili a molekul koji povešćava pogodnost antigen vezujućeg proteina za određenu upotrebu (npr., davanje subjektu, kao što je humani subjekt, ili druge in vivo ili in vitro upotrebe). Primeri molekula koji se može koristiti za derivatizovanje antigen vezujućeg proteina uključuju albumin (npr., humani albumin u serumu) i polietilen glikol (PEG). Albumin-vezan i PEGilovani derivati antigen vezujućeg proteina mogu se pripremiti upotrebom tehnike dobro poznate u ovoj oblasti. Određeni antigen vezujući proteini uključuju pegilovan jednolančani polipeptid kako je ovde opisan. U jednom primeru izvođenja, antigen vezujući protein je konjugovan ili drugačije vezan za transtiretin (TTR) ili TTR varijantu. TTR ili TTR varijanta može biti hemijski modifikovan sa, primera radi, hemikalijom odabranom iz grupe koju čine dextran, poli(n-vinil pirolidon), polietilen glikoli, propropilen glikol homopolimeri, polipropilen oksid/etilen oksid ko-polimeri, polioksietilizovani polioli i polivinil alkoholi.

[0205] Drugi derivati uključuju klovalentne ili agregativne konjugate c-fms antigen vezujućih proteina sa drugim proteinima ili polipeptidima, kao što je ekspresijom rekombinantno fuzionih proteina koji obuhvataju heterologne polipeptide fuzionisan za N-terminus ili C-terminus c-fms antigen vezujućeg proteina. Primera radi, konjugovan peptid može biti heterologni signal (ili lider) polipeptid, npr., alfafaktor lider kvasca, ili peptid kao što je epitopna oznaka. Fuzioni proteini koji sadrže C-fms antigen vezujući protein mogu da obuhvataju peptide dodate da olakšaju prečišćavanje ili identifikaciju c-fms antigen vezujućeg proteina (npr., poli-His). c-fms antigen vezujući protein takođe može biti vezan za FLAG peptid kako je opisano u Hopp et al., 1988, Bio/Technology 6:1204; i US patent Br.5,011,912. FLAG peptid je veoma antigen i obezbeđuje epitop reverzibilno vezan specifičnim monoklonalnim antitelom (mAb), omogućavajući rapidno ispitivanje i olakšano prečišćavanje eksprimiranog rekombinantnog proteina. Reagensi korisni za pripremanje fuzionih proteina u kojima je FLAG peptid fuzionisan za dati polipeptid, komercijalno su dostupni (Sigma, St. Louis, MO).

[0206] Oligomeri koji sadrže jedan ili više c-fms antigen vezujućih proteina mogu se uposliti kao c-fms antagonisti. Oligomeri mogu biti u obliku kovalentno-vezanih ili ne-kovalentno-vezanih dimera, trimera, ili visokih oligomera. Oligomeri koji obuhvataju dva ili više c-fms antigen vezujuća proteina razmatrani su za upotrebu, od čega je jedan primer homodimer. Drugi oligomeri uključuju heterodimere, homotrimere, heterotrimere, homotetramere, heterotetramere, itd.

[0207] Jedan primer izvođenja usmeren je ka oligomerima koji obuhvataju višestruko c-fms-vezivanje antitela prema ovom pronalasku spojeni putem kovalentnih ili ne-kovalentnih interakcija između peptidnih ostataka fuzionisan za c-fms antigen vezujuće proteine. Takvi peptidi mogu biti peptidni veznici (razmakivači), ili peptidi koji imaju svojstvo pomovisanja oligomerizacije. Leucinski zatvarači i određeni polipeptidi izvedeni iz antitela su među peptidima koji mogu da promovišu oligomerizaciju cfms antigen vezujućih proteina prikačenih za njih, kako je detaljnije opisano u nastavku.

[0208] U određenim primerima izvođenja, oligomeri obuhvataju od dva do četiri c-fms antigen vezujuća proteina. Ostaci c-fms antigen vezujućeg antitela oligomera mogu biti u bilo komo ovde opisanom obliku, npr., varijante ili fragmenti. Poželjno, oligomeri obuhvataju c-fms antigen vezujuće proteine koji imaju c-fms vezujuću aktivnost.

[0209] U jednom primeru izvođenja, oligomer se priprema upotrebom polipeptida izvedenog iz imunoglobulina. Pripremanje fuzionih proteina koji obuhvataju određene heterologne polipeptide fuzionisane za razne delove antitelo-izvedenih polipeptida (uključujući Fc domen) opisano je, npr., od strane Ashkenazi et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:10535; Byrn et al., 1990, Nature 344:677; i Hollenbaugh et al., 1992 " Construction of Immunoglobulin Fusion Proteins ", u Current Protocols in Immunology, Suppl.4, pages 10.19.1-10.19.11.

[0210] Jedan aspekt ovog opisa usmeren je ka dimeru koji obuhvata dva fuzioni proteina pripremljena fuzionisanjem c-fms antigen vezujućeg proteina za Fc region antitela. Taj dimer može biti izrađen, primera radi, umetanjem genske fuzije koja kodira fuzioni protein u pogodan ekspresioni vektor, koji eksprimira gensku fuziju u ćelije domaćine transformisane rekombinantnim ekspresionim vektorom, i koja omogućava da se eksprimirani fuzioni protein sastavi poput molekula antitela, nakon čega se međulančane disulfidne veze formiraju između Fc ostataka kako bi se formirao dimer.

[0211] Izraz "Fc polipeptid" kako se ovde koristi uključuje nativne i muteinske oblike polipeptida izvedenih iz Fc regiona antitela. Takođe su uključeni skraćeni oblici takvih polipeptida koji sadrže region šarke koji promoviše dimerizaciju. Fuzioni proteini koji obuhvataju Fc ostatke (i oligomere od njih formirane) pružaju prednost olakšavanja prečišćavanja afinitetnom hromatografijom preko Protein A ili Protein G kolona.

[0212] Jedan pogodan Fc polipeptid, opisan u PCT prijavi WO 93/10151 i US Patentu Br.5,426,048 i Br.

5,262,522, je jednolančani polipeptid koji se pruža od N-terminalnog region šarke do nativnog C-terminusa Fc regiona humanog IgG1 antitela. Još jedan korisni Fc polipeptid je Fc mutein opisan u US Patentu Br.5,457,035, i u Baum et al., 1994, EMBO J.13:3992-4001. Aminokiselinska sekvenca ovog muteina identična je onoj od nativne Fc sekvence opisane u WO 93/10151, osim što je aminokiselina 19 promenjena iz Leu u Ala, aminokiselina 20 je promenjena iz Leu u Glu, a aminokiselina 22 je promenjena iz Gly u Ala. Mutein eksprimira redukovani afinitet za Fc receptore.

[0213] U drugim aspektima, varijabilni deo teškog i/ili lakog lanca c-fms antigen vezujućeg proteina kao što je ovde opisan, može biti supstituisan za varijabilni deo antitela teškog i/ili lakog lanca.

[0214] Alternativno, oligomer je fuzioni protein koji obuhvata višestruko c-fms antigen vezujuće proteine, sa ili bez peptidnih veznika (peptidni razmakivač). Među pogodnim peptidnim veznicima nalaze se oni opisani u US Patentu Br.4,751,180 i Br.4,935,233.

[0215] Još jedan postupak za pripremanje oligomernih derivata c-fms antigen vezujućeg proteina uključuje upotrebu Leucinskog zatvarača. Domeni Leucinskog zatvarača su peptidi koji promovišu oligomerizaciju proteina u kojima su pronađeni. Leucinski zatvarači su originalno identifikovani u nekoliko DNK-vezujućih proteina (Landschulz et al., 1988, Science 240:1759), i od tada se mogu naći u raznim različitim proteinima. Među poznatim Leucinskim zatvaračima su prirodno javljajući peptidi i njihovi derivati koji se dimerizuju ili trimerizuju. Primeri domena Leucinskog zatvarača pogodni za proizvodnju rastvorljivih oligomernih proteina, opisani su u PCT prijavi WO 94/10308, a Leucinski zatvarač izveden površinskog plućnog proteina D (SPD) opisan je u Hoppe et al., 1994, FEBS Letters 344:191. Upotreba modifikovanog Leucinskog zatvarača koji omogućava stabilnu trimerizaciju heterolognog proteina koji je za njega fuzionisan, opisana je u Fanslow et al., 1994, Semin. Immunol.

6:267-278. U jednom pristupu, rekombinantni fuzioni proteini koji obuhvataju fragment ili derivat c-fms antigen vezujućeg proteina fuzionisan za paptidni Leucinski zatvarač eksprimirani su u pogodnoj ćeliji domaćinu, a rastvorni oligomerni fragmenti ili derivati c-fms antigen vezujućeg proteina koji se formira prisutni su u supenatantu kulture.

[0216] Neki antigen vezujući proteini koji su obezbeđeni imaju uključenu-stopu (ka) za c-fms od najmanje 10<4>/ M x sekunde, najmanje 10<5>/M x sekunde, najmanje 10<6>/M x sekunde izmereno, na primer, kako je opisano u primerima ispod. Određeni antigen vezujući proteini koji su obezbeđeni imaju sporu stopu disocijacije ili prekinutu-stopu. Neki antigen vezujući proteini, na primer, imaju kd(prekinuta-stopa) od 1x 10<-2>s<-1>, ili 1x 10<-3>s<-1>, ili 1x 10<-4>s<-1>, ili 1x 10<-5>s<-1>. U određenim primerima izvođenja, antigen vezujući protein ima KD(ekvilibrijum afiniteta vezivanja) od manje od 25 pM, 50 pM, 100 pM, 500 pM, 1 nM, 5 nM, 10 nM, 25 nM ili 50 nM.

[0217] Još jedan aspekt obezbeđuje antigen-vezujući protein sa polu-životom od najmanje jednog dana in vitro ili in vivo (npr., kada se daje humanom subjektu). U jednom aspektu, antigen vezujući protein ima polu-život od najmanje tri dana. U još jednom primeru izvođenja, antitelo ili njegov deo imaju poluživot od četiri dana ili duži. U još jednom primeru izvođenja, antitelo ili njegov deo iaju polu-život od osam dana ili duži. U još jednom primeru izvođenja, antitelo ili antigen-vezivanje njegov deo derivatizovani su ili modifikovani tako da imaju duži polu-život u poređenju sa nederivatizovanim ili nemodifikovanim antitelom. U još jednom aspektu, antigen vezujući protein sadrži tačkaste mutacije kako bi povećao polu-život u serumu, kako je opisano u WO 00/09560, objavljeno Feb.24, 2000.

Glikozilacija

[0218] Antigen-vezujući protein može imati glikozilacioni obrazac koji je različiti ili izmenjen od onog pronađenog kod nativne vrste. Kako je poznato u struci, glikozilacioni obrasci mogu da zavidse i od sekvence proteina (npr., prisustvo ili odsustvo određenih glikozilacionih aminokiselinskih ostataka, koji su opisani u nastavku), ili ćelije domaćina ili organizma u kojem je protein proizveden. Određeni sistem ekspresije opisan je u nastavku.

[0219] Glikozilacija polipeptida tipično je ili N-vezana ili O-vezana. N-vezana odnosi se na pričvršćivanje ugljenohidratne grupe za bočni lamac asparaginskog ostatka. Tro-peptidne sekvence asparagin-X-serin i asparagin-X-treonin, u kojima X je bilo koja aminokiselina osim prolina, predstavljaju sekvence prepoznavanja za enzimatsko pričvršćivanje ugljenohidratne grupe za asparaginski bočni lanac. Prema tome, prisustvo ili ove tri-peptidne sekvence u polipeptidu stvara potencijalno mesto glikozilacije. O-vezana glikozilacija odnosi se na pričvršćivanje jednog od šećera N-acetilgalaktozamina, galaktoze, ili ksiloze, za hidroksiaminokiselinu, najčešće serin ili treonin, iako se mogu koristiti i 5-hidroksiprolin ili 5-hidroksilizin.

[0220] Dodavanje glikozilacionih mesta antigen vezujućem proteinu pogodno se izvodi menjanjem aminokiselinske sekvence tako da ona sadrži jednu ili više prethodno opisanih tro-peptidnih sekvenci (za N-vezan glikozilaciona mesta). Menjanje se takođe može izvesti dodavanjem , ili supstitucijom, jednim ili više serinskih ili treoninskih ostataka u početnoj sekvenci (za O-vezana glikozilaciona mesta).

Jednostavnije, aminokiselinska sekvenca antigen vezujućeg proteina može se izmeniti putem promena na nivou DNK, određenije mutiranjem DNK koja kodira ciljani polipeptid pri prethodno odabranim bazama tako da se generišu kodoni koji će ih prevesti u željene aminokiseline.

[0221] Još jedan način povećavanja broja ugljenohidratnih ostataka na antigen vezujućem proteinu je hemijskim ili enzimatskim kuplovanjem glikozida za protein. Ove procedure su poželjne jer ne zahtevaju proizvodnju proteina u ćeliji domaćinu koja ima glikozilacione sposobnosti za N- i O-vezan glikozilaciju. U zavisnosti od načina kuplovanja koji se koristi, šećer(i) se može prikačiti za (a) arginin i histidin, (b) slobodne karboksil grupe, (c) slobodne sulfidril grupe kao što su one cisteinske, (d) slobodne hidroksil grupe kao što je serinska, treoninska, ili hidroksiprolinska, (e) aromatični ostaci kao što su fenilalanin, tirozin, ili triptofan, ili (f) amidna grupa glutamina. Ovi postupci su opisani u WO 87/05330 objavljena Sep.11, 1987, i u Aplin and Wriston, 1981, CRC Crit. Rev, Biochem., pp.259-306.

[0222] Uklanjanje ugljenohidratnih ostataka prisutnih na početnom antigen vezujućem proteinu može se izvsti hemijski ili enzimatski. Hemijska deglikozilacija zahteva izlaganje proteina jedinjenju trifluorometansulfonske kiseline, ili ekvivalentnom jedinjenju. Ovo lečenje rezultira u cepanju većeg dela ili svih šećera osim veznog šećera (N-acetilglukozamin ili N-acetilgalaktozamin), ostavljajući polipeptid netaktnut. Hemijska deglikozilacija je opisana od strane Hakimuddin et al., 1987, Arch. Biochem.

Biophys.259:52 i od strane Edge et al., 1981, Anal. Biochem.118:131. Enzimatsko cepanje ugljenohidratnih ostataka na polipeptidima može se postići upotrebom raznih endo- i egzo-glikozidaza kako je opisano od strane Thotakura et al., 1987, Meth. Enzymol.138:350. Glikozilacija na potencijalnim glikozilacionim mestima može se sprečiti upotrebom jedinjenja tunikamicin kako je opisano od strane Duskin et al., 1982, J. Biol. Chem.257:3105. Tunicamyicin blokira formiranje protein-N-glikozidnih veza.

[0223] Tako, aspekti uključuju glikozilacione varijante antigen vezujućeg proteina gde je broj i/ili vrsta glikozilacionog meta(a) izmenjen u odnosu na aminokiselinske sekvence roditeljskog polipeptida. U određenim primerima izvođenja, proteinske varijante antitela obuhvataju veći ili manji broj N-vezanih glikozilacionih mesta u odnosu na nativno antitelo. N-vezano glikozilaciono mesto okarakterisano je sekvencom: Asn-X-Ser ili Asn-X-Thr, gde aminokiselinski ostatak označen kao X može biti bilo koji aminokiselinski ostatak osim prolina. Supstitucija aminokiselinskih ostataka kako bi se stvorila ova sekvenca obezbeđuje potencijalno novo mesto za dodavanje N-vezanog ugljenohidratnog lanca.

Alternativno, supstitucije koje elimišu ili menjaju ovu sekvencu, sprečiće dodavanje N-vezanog ugljenohidratnog lanca prisutnog u nativnom polipeptidu. Primera radi, glikozilacija može biti redukovana delecijom Asn ili supstituisanjem Asn sa različitim aminokiselinama. U drugim primerima izvođenja, jedan ili više N-vezanih mesta je stvoreno. Antitela tipično imaju N-vezano glikozilaciono mesto u Fc regionu.

Oznake i efektorske grupe

[0224] U nekim aspektima, antigen-vezivanje obuhvata jednu ili više oznaka. Izraz "obeležavajuća grupa" ili "oznaka" odnosi se na bilo koju detektabilnu oznaku. Primeri pogodne obeležavajuće grupe uključuju, ali nisu ograničeni na, sledeće: radioizotope ili radionuklide (npr.,<3>H,<14>C,<15>N,<35>S,<90>Y,<99>Tc,

<111>In,<125>I,<131>I), fluorescentne grupe (npr., FITC, rodamin, lantanid fosfori), enzimatske grupe (npr., peroksidaza rena, β-galaktozidaza, luciferaza, alkalna fosfataza), hemiluminescentne grupe, biotinilovane grupe, ili prethodno određeni polipeptidni epitopi prepoznati od strane sekundarnog reportera (npr., sekvence para Leucinskog zatvarača, vezivajuća mesta za sekundarna antitela, metal vezujući domeni, epitopne oznake). U nekim primerima izvođenja, grupa za obeležavanje kuplovana je za antigen vezujući protein putem razmaknjivačkih kraka raznih dužina kako bi se redukovala potenciojalna sterična prepreka. Razni postupci za obeležavanje proteina, poznati su u struci i mogu se primeniti kao što se pokazano.

[0225] Izraz "efektorska grupa" odnosi se na bilo koju grupu kuplovanu za antigen vezujući protein koji deluje kao citotoksični agens. Primeri za pogodne efektor grupe su radioizotopi ili radionuklidi (npr.,<3>H,

<14>C,<15>N,<35>S,<90>Y,<99>Tc,<111>In,<125>I,<131>I). Druge pogodne grupe uključuju toksine, terapeutske grupe, ili hemoterapeutske grupe. Primeri pogodnih grupa uključuju kaliheamicin, auristatini, geldanamicin i majtanzin. U nekim primerima izvođenja, efektor grupa je kuplovana sa antigen vezujućim proteinom putem razmaknjivačkih kraka raznih dužina kako bi se redukovala potencijalna sterična prepreka.

[0226] Generalno, oznake koje potpadaju u razne klase, u zavisnosti od ogleda u kojima treba da se detektuju: a) izotopne oznake, koje mogu biti radioaktivni ili teški izotopi; b) magnetne oznake (npr., magnetne čestice); c) redoks aktivni ostaci; d) optičke boje; enzimatske grupe (npr. peroksidaza rena, βgalaktosidaza, luciferaza, alkalinna fosfataza); e) biotinilisane grupe; i f) prethodno određeni polipeptidni epitopi prepoznati od strane sekundarnog reportera (npr., sekvenca para Leucinskog zatvarača, vezivajuća mesta za sekundarna antitela, vezujući domeni metala, epitopne oznake, itd.). U nekim primerima izvođenja, grupa za obeležavanje kuplovana je sa antigen vezujućim proteinom putem razmakivačkih kraka raznih dužina kako bi se redukovala potencijalna sterična prepreka. Razni postupci za obeležavanje proteina poznati su u struci.

[0227] Specifične oznake uključuju optičke boje, uključujući, ali ne ograničavajući se na, hromofore, fosfore i fluorofore, pri čemu su poslednji specifične po više osnova. Fluorofori mogu biti ili fluori "malog molekula", ili proteinski fluori.

[0228] Pod "fluorescentna oznaka" podrazumeva se bilo koji molekul koji može biti detektovan putem njegove inherentne fluorescentne karakteristike. Pogodne fluorescentne oznake uključuju, ali nisu ograničene na, fluorescein, rodamin, tetrametilrodamin, eozin, eritrozin, koumarin, metil-koumarini, piren, Malacit zelena, stilben, Lucifer Žuta, Kaskada PlavoJ, Teksas crveno, IAEDANS, EDANS, BODIPY FL, LC Crveno 640, Cy 5, Cy 5.5, LC crveno 705, Oregon zeleno, Alexa-Fluor boje (Alexa Fluor 350, Alexa Fluor 430, Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 546, Alexa Fluor 568, Alexa Fluor 594, Alexa Fluor 633, Alexa Fluor 660, Alexa Fluor 680), Kaskada Plavo, Kaskada Žuto i R-fikoeritrin (PE) (Molecular Probes, Eugene, OR), FITC, Rodamin, i Teksas crveno (Pierce, Rockford, IL), Cy5, Cy5.5, Cy7 (Amersham Life Science, Pittsburgh, PA). Pogodne optičke boje, uključujući fluorofore, opisane su u MOLECULAR PROBES HANDBOOK od Richard P. Haugland.

[0229] Pogodne proteinske fluorescentne oznake takođe uključuju, ali nisu ograničene na, zeleni fluorescentni protein, uključujući Renilla, Ptilosarcus, ili Aequorea vrste GFP (Chalfie et al., 1994, Science 263:802-805), EGFP (Clontech Labs., Inc., Genbank Accession Number U55762), plavo fluorescentni protein (BFP, Quantum Biotechnologies, Inc., Quebec, Canada; Stauber, 1998, Biotechniques 24:462-471; Heim et al., 1996, Curr. Biol.6:178-182), pojačano žuti fluorescentni protein (EYFP, Clontech Labs., Inc.), luciferaza (Ichiki et al., 1993, J. Immunol.150:5408-5417), β galaktozidaza (Nolan et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.85:2603-2607) i Renilla (WO92/15673, WO95/07463, WO98/14605, WO98/26277, WO99/49019, US Patenti Br.5292658, Br.5418155, Br.5683888, Br.5741668, Br.5777079, Br.

5804387, Br.5874304, Br.5876995, Br.5925558).

Nukleinske kiseline koje kodiraju C-fms antigen vezujuće proteine

[0230] Ovde su takođe obezbeđene nukleinske kiseline koje kodiraju ovde opisane antigen vezujuće proteine, ili njihovi delovi, uključujući nukleinske kiseline koje kodiraju jedan ili oba lanca antitela, ili njegov fragment, derivat, mutein, ili varijantu, polinukleotidi koji kodiraju varijabilni regioni teškog lanca ili samo CDR-ove, polinukleotidi dovoljni za upotrebu kao hibridizacione probe, PCR prajmeri ili sekvencioni prajmeri za identifikovanje, analiziranje, mutiranje ili pojačavanje polinukleotida koji kodira polipeptid, antisens nukleinske kiseline za inhibiranje ekspresije polinukleotida, i njihove komplementarne sekvence. Nukleinske kiseline mogu biti bilo koje dužine. One mogu biti, primera radi, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 750, 1,000, 1,500, 3,000, 5,000 ili više nukleotida u dužinu, i/ili mogu da obuhvataju jednu ili više dodatnih sekvenci, primera radi, regulatorne sekvence, i/ili biti deo veće nukleinske kiseline, primera radi, vektor.

Nukleinske kiseline mogu biti jednolančane ili dvolančane i mogu da obuhvataju RNK i/ili DNK nukleotide, i njihove veštačke varijante (npr., peptidne nukleinske kiseline). TABELA 6 prikazuje primerne sekvence nukleinske kiseline koje kodiraju IgG2 konstantni region teškog lanca i IgG2 konstantni region kapa lakog lanca. Bilo koji varijabilni region koji je ovde obezbeđen može se pričvrstiti za ove konstantne regione radi formiranja potpune selvence teškog i lakog lanca. Međutim, podrazumeva se da sekvence konstantnih regiona ovde su obezbeđeni samo kao specifičan primer. U nekim primerima izvođenja, sekvence varijabilnih regiona spojene su sa drugom sekvencom konstantnog regiona koje su poznate u struci. Primerne sekvence nukleinske kiseline koje kodiraju varijabilne regione teškog i lakog lanca obezbeđene su u TABELI 7.

TABELA 6:Primerne sekvence nukleinske kiseline koje kodiraju konstantne regione teškog i lakog lanca

[0231] TABELA 7 prikazuje primerne sekvence nukleinske kiseline koje kodiraju varijabilni regioni teškog lanca i lakog lanca, u koje su ugrađene razne CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2, i CDRL3 sekvence.

TABELA 7: Primerne sekvence nukleinske kiseline koje kodiraju varijabilne regione teškog i lakog lanca

[0232] Nukleinske kiseline koje kodiraju određene antigen vezujuće proteine, ili njihove delove (npr., antitelo pune dužine, teški ili laki lanac, varijabilni domen, ili CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2, ili CDRL3) mogu biti izolovani iz B-ćelija miševa koji su imunizovani sa c-fms ili imunogenom njegovog fragmenta. Nukleinska kiselina može biti izolovana konvencionalnim procedurama kao što je polimerazna lančana reakcija (PCR). Prikazivanje faga je još jedan primer poznate tehnike kojom se mogu pripremiti derivati antitela i drugi antigen vezujući proteini. U jednom pristupu, polipeptidi koji su komponente antigen vezujućeg proteina od interesa, eksprimirani su u bilo kom pogodnom rekombinantnom ekspresionom sistemu, a eksprimirani polipeptidi ostavljeni su d ase sastave kako bi obrazovali molekule antigen vezujućeg proteina.

[0233] Nukleinske kiseline obezbeđen u TABELAMA 6 i 7 samo su primerne. Zbog degeneracije genetskog koda, svaka polipeptidna sekvenca navedena u TABELAMA 1-4 ili ovde drugačije prikazana takođe je kodirana velikim brojem drugih sekvenci nukleinske kiseline pored onih obezbeđenih.

Stručnjak će ceniti što ova prijava daje ovakav adekvatan pisani opis i primere ostvarenja za svaku segenerišuću nukleotidnu sekvencu koja koja kodira svaki antigen vezujući protein.

[0234] Aspekt koji dalje obezbeđuje nukleinske kiseline koje se hibridizuju u druge nukleinske kiseline (npr., nukleinske kiseline koje obuhvataju nukleotidnu sekvencu navedene u TABELI 6 i TABELI 7) pod određenim hibridizacionim uslovima. Postupci za hibridizaciju nukleinske kiseline dobro su poznati u struci. Videti, npr., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6. Kako je definisano, umereno strogi hibridizacioni uslov primenjuje rastvor za pretpranje koji sadrži 5x natrijum hlorid/natrijum citrat (SSC), 0.5% SDS, 1.0 mM EDTA (pH 8.0), hibridizacioni pufer od oko 50% formamida, 6x SSC, i hibridizacionu temperaturu od 55°C (ili druge slične hibridizacioni rastvori, kao što je jedan koji sadrži oko 50% formamida, sa hibridizacionom temperaturom od 42°C), i uslovi pranja od 60°C, u 0.5x SSC, 0.1% SDS. Srogi hibridizacioni uslov hibridizuje se u 6x SSC na 45°C, praćeno jednim ili više pranja u 0.1x SSC, 0.2% SDS na 68°C. Dalje, stručnjak iz ove oblasti može da manipuliše hibridizacione i/ili uslove pranja kako bi povećao ili smanjio strogoću hibridizacije tako da nukleinske kiseline koje obuhvataju nukleotidne sekvence koje su najmanje 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% ili 99% međusobno identične, ostaju međusobno hibridizovane.

[0235] Osnovni parametri koji utiču na odabir hibridizacionih uslova i smernice za izradu pogodnih uslova utvrđeni su od strane, primera radi, Sambrook, Fritsch, and Maniatis (2001, Molecular Kloniranje: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., gore; i Current Protocols in Molecular Biology, 1995, Ausubel et al., eds., John Wiley & Sons, Inc., sekcije 2.10 i 6.3-6.4), i stručnjak ih lako može odrediti na osnovu, npr., dužine i/ili osnovne kompozicije nukleinske kiseline.

[0236] Primene se mogu uvesti mutacijom u nukleinskoj kiselini, čime dolazi do promena u aminokiselinskoj sekvenci polipeptida (npr., antitelo ili derivat antitela) koji kodira. Mutacije se mogu uvesti upotrebom bilo koje tehnike poznate u struci. U jednom primeru izvođenja, jedan ili više određenih aminokiselinskih ostataka promenjeni su upotrebom, primera radi, ka mestu usmerenog protokola mutageneze. U još jednom primeru izvođenja, jedan ili više nasumično odabranih ostataka promenjen je upotrebom, primera radi, nasumičnog protokola mutageneze. Kako god da je napravljen, mutant polipeptid može biti eksprimiran i skrinovan za željenu osobinu.

[0237] Mutacije se mogu uvesti u nukleinsku kiselinu bez značajnog menjanja biološke aktivnosti polipeptida koji kodira. Primera radi, nukleotidne supstitucije mogu se izvesti koje vode ka aminokiselinskim supstitucijama na ne-esencijalnim aminokiselinskim ostacima. Alternativno, jedna ili više mutacija može biti uvedeno u nukleinsku kiselinu koja selektivno menja biološku aktivnost polipeptida koji kodira. Primera radi, ta mutacija može kvantitativno ili kvalitativno izmeniti biološku aktivnost. Primeri kvanititavnih promena uključuju povećavanje, redukovanje ili eliminisanje aktivnosti. Primeri kvalitativnih promena uključuju menjanje antigen specifičnosti antitela. U jednom primeru izvođenja, nukleinska kiselina koja kodira bilo koji antigen vezujući protein opisane ovde može mutirati u izmenjenu aminokiselinsku sekvencu upotrebom tehnika molekularne biologije koje su dobro utvrđene u struci. Primer 4, na primer, opisuje kako sekvence nukleinske kiseline (videti Tabelu 6) mutiraju kako bi se uvele jednu ili više aminokiselinskih supstitucija u određene antigen vezujuće proteine kako bi proizvele antigen vezujuće proteine 1.2 SM 1.109 SM i 2.360 SM. Dodatni antigen vezujući proteini koji sadrže druge mutacije mogu se proizvesti na sličan način.

[0238] Još jedan aspekt obezbeđuje molekule nukleinske kiseline koji su pogodni za upotrebu kao prajmeri ili hibridizacione probe za detektovanje sekvenci nukleinske kiseline. Molekul nukleinske kiseline može da obuhvata samo deo sekvence nukleinske kiseline koja kodira polipeptid pune-dužine, primera radi, fragment koji se može koristiti kao proba ili prajmer ili fragment koji kodira aktivni deo (npr., c-fms vezujući deo) polipeptida.

[0239] Probe na bazi sekvence nukleinske kiseline mogu biti one koje se koriste za detektovanje te nukleinske kiseline ili sličnih nukleinskih kiselina, primera radi, transkripti koji kodiraju polipeptid. Ta proba može da obuhvata obeležavajuću grupu, npr., radioizotop, fluorescentno jedinjenje, enzim, ili enzimski ko-faktor. Takve probe mogu se koristiti za identifikovanje ćelije koja eksprimira taj polipeptid.

[0240] Još jedan aspekt obezbeđuje vektore koji obuhvataju nukleinsku kiselinu koja kodira polipeptid ili njegov deo (npr., fragment koji sadrži jedan ili više CDR-ova ili jedan ili više domena varijabilnog regiona). Primeri vektora uključuju, ali nisu ograničeni na, plazmide, virusne vektore, ne-epizomalne sisarske vektore i ekspresione vektore, primera radi, rekombinantni ekspresioni vektori. Ti rekombinantno ekspresioni vektori mogu da obuhvataju nukleinsku kiselinu u obliku pogodnom za ekspresiju nukleinske kiseline kod ćelije domaćina. Ti rekombinantno ekspresioni vektori uključuju jednu ili više regulatornih sekvenci, odabrane na bazi ćelija domaćina koje se primenjuju za ekspresiju, koja je operativno vezana za sekvencu nukleinske kiseline koja se eksprimira. Regulatorne sekvence uključuju one koje usmeravaju konstitutivnu ekspresiju nukleotidne sekvence u mnogim vrstama ćelija domaćina (npr., SV40 pojačivač ranih gena, Rous sarkom virus promoter i citomegalovirus promoter), onim koje usmerava ekspresija nukleotidne sekvence samo u određenim ćelijama domaćinima (npr., tkivospecifične regulatorne sekvence, videti, Voss et al., 1986, Trends Biochem. Sci.11:287, Maniatis et al., 1987, Science 236:1237), i onim koje usmeravaju inducibilnu ekspresiju nukleotidne sekvence u odgovoru na određeno lečenje ili stanje (npr., metalotionin promoter u ćelijama sisara i tet-odzivan i/ili streptomicin odzivan promoter na oba prokariotskim i eukariotskim sistemima (videti, id.). Stručnjak ce ceniti da dizajn ekspresionog vektora može zavisiti od takvih faktora kao što je odabir ćelije domaćina koj se transformišu, nivo ekspresije željenog proteina, itd. Ekspresioni vektori mogu se uvesti u ćelije domaćine kako bi tamo proizveli proteine ili peptide, uključujući fuzione proteine ili peptide, kodirani nukleinskim kiselinama kako je ovde opisano.

[0241] Još jedan aspekt obezbeđuje ćelije domaćine u koje je uveden rekombinantno ekspresioni vektor. Ćelija domaćin može biti bilo koja prokariotska ćelija (primera radi, E. coli) ili eukariotska ćelija (primera radi, kvasac, insekt, ili sisarske ćelije (npr., CHO ćelije)). Vektorska DNK može e uvesti u prokariotske ili eukariotske ćelije putem konvencionalnih tehnika transformacije ili transfekcije. Za stabilnu transfekciji ćelija sisara, poznato je da, u zavisnosti od primenjenog ekspresionog vektora i transfekcione tehnike, samo mala frakcija ćelija može integrisati stranu DNK u njihov genom. Kako bi se identifikovali i odabrali ovi integranti, gen koji kodira selektivan marker (npr., za rezistentnost na antibiotike) generalno se uvodi u ćelije domaćine zajedno sa genom od interesa. Poželjni selektivni markeri uključuju one koji savladavaju otpornost na lekove, kao što su G418, higromicin i metotreksat. Ćelije stabilno transfektovane sa uvedenom nukleinskom kiselinom mogu se identifikovati odabirom leka (npr., ćelije koje imaju inkorporiran gen selektivnog markera će preživeti, dok će ostale ćelije umreti), pored ostalih postupaka.

Pripremanje antigen vezujućeg proteina

[0242] Ne-humana antitela koja su ovde obezbeđena mogu biti, primera radi, izvedena iz bilo koje životinje koja proizvodi antitelo, kao što je miš, pacov, zec, koza, majmun, ili ne-humani primat (kao što je majmun (npr., cinomologus ili rezuz majmun) ili primat (npr., šimpanza)). Ne-humana antitela mogu se koristiti, na primer, u in vitro ćelijskom uzgajanju ili primenama na bazi ćelijskog uzgajanja, ili bilo kojoj primeni u kojoj se imuni odgovor na antitelo ne javlja ili je beznačajan, može se sprečiti, nije od značaja, ili je poželjan. U određenom aspektima, antitela mogu biti proizvedena imunizovanjem sa c-fms pune dužine ili with ekstracelularnim domenom c-fms. Alternativno, određena ne-humana antitela mogu biti se podići imunizovanjem sa aminokiselinama koje su segmenti c-fms koji obrazuju deo epitopa za koja se vezuju određena antitela koja su ovde obezbeđena (videti niže). Ta antitela mogu biti poliklonalna, monoklonalna, ili mogu biti sintetizovana u ćelijama domaćinima koje eksprimiraju rekombinantnu DNA.

[0243] Potpuno humana antitela mogu se pripremiti kako je opisano iznad, imunizovanjem transgenih životinja koje sadrže humani imunoglobulinske lokuse ili biranjem biblioteke prikazivanja faga koja izražava repertoar humanog antitela.

[0244] Monoklonalna antitela (mAb-ovi) mogu se proizvesti raznim tehnikama, uključujući konvencionalnu metodologiju monoklonalnog antitela, npr., standarda somatska ćelijska hibridizaciona tehnika od Kohlera i Milsteina, 1975, Nature 256:495. Alternativno, mogu se uposliti druge tehnike za proizvodnju monoklonalnih antitela, primera radi, virusne ili onkogene transformacije B-limfocita.

Pogodan životinjski sistem za pripremanje hibridoma je mišji sistem, koji je veoma dobro utvrđena procedura. Imunizacioni protokoli i tehnike za izolovanje imunizovanih splenocita za fuziju, poznati su u struci. Za takve procedure, B ćelije iz imunizovanih miševa fuzionisane su sa pogodnim obesmrtljenim fuzionim partnerom, kao što ćelijska linija mišjeg mijeloma. Ukoliko je poželjno, pacovi i ostali sisari mogu biti imunizovani umesto miševa i B ćelije iz drugih životinja mogu biti fuzionisane sa ćelijskom linijom mišjeg mijeloma kako bi se obrazovali hibridomi. Alternativno, mijelom ćelijska linija iz izvora koji je različit od miša, može se koristiti. Fuzione procedure za proizvodnju hibridoma takođe su poznate.

[0245] Ovde obezbeđena jednolančana antitela mogu biti formirana vezivanjem fragmenata varijabilnog domena teškog i lakog lanca (Fv region) putem aminokiselinskog mosta (kratki peptidni veznik), što rezultira kao jedan polipeptidni lanac. TAKVI jednolančani Fv-ovi (scFvs) mogu se pripremiti fuzionisanjem DNK koja kodira peptidni veznik između DNK koje kodiraju dva popeptida varijabilnog domena (VLi VH). Rezultujući polipeptidi mogu se ponovo presaviti na njima samima kako bi obrazovali atigen-vezujuće monomere, ili mogu formirati multimere (npr., dimere, trimere, ili tetramere), u zavisnosti od dužine fleksibilnog linkera između dva varijabilna domeni (Kortt et al., 1997, Prot. Eng. 10:423; Kortt et al., 2001, Biomol. Eng.18:95-108). Kombinovanjem različitih polipeptida koji obuhvataju VLi VH, mogu se formirati multimerni scFvs koji se vezuju za različite epitope (Kriangkum et al., 2001, Biomol. Eng.18:31-40). Tehnike razvijene za proizvodnju jednolančanih antitela uključuju one koje su opisane u U.S. Pat. Br.4,946,778; Bird, 1988, Science 242:423; Huston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.85:5879; Ward et al., 1989, Nature 334:544, de Graaf et al., 2002, Methods Mol Biol.178:379-387. Jednolančana antitela izvedena iz antitela koja su ovde obezbeđena uključuju, ali nisu ograničena na scFvs koji obuhvata kombinacije varijabilnog domena varijabilnih regiona teškog i lakog lanca prikazane u TABELI 2, ili kombinacije varijabilnih domena lakih i teških lanaca koji uključuju CDR-ove prikazane u TABELAMA 3 i 4.

[0246] Antitela koja su ovde obezbeđena koja su jedne potklase mogu se promeniti u antitela iz različite potklase upotrebom postupaka menjanja klasa. Prema tome, IgG antitela mogu se izvesti iz IgM antitela, primera radi, i obrnuto. Takve tehnike omogućavaju pripremanje novih antitela koja poseduju antigen vezujuće karakteristike datog antitela (roditeljskog antitela), ali takođe pokazuju biološke karakteristike povezane sa izotipom antitela ili potklasom različitom od one koje je roditeljsko antitelo.

Rekombinantne DNK tehnike mogu se uključiti. Klonirana DNK koja kodira određene polipeptide antitela mogu se uključiti u takvim procedurama, npr., DNK koja kodira konstantan domen antitela željenog izotipa. Videti, npr., Lantto et al., 2002, Methods Mol. Biol.178:303-316.

[0247] Shodno tome, antitela koja su obezbeđena, uključuju ona koja obuhvataju, primera radi, kombinacije varijabilnog domena opisan, gore., sa željenim izotipom (primera radi, IgA, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgE, i IgD) kao i Fab ili F(ab')2njegovi fragmenti. Štaviše, ako je poželjan IgG4, takođe može biti poželjno da se uvede tačkasta mutacija (CPSCP->CPPCP) u region šarke kako je opisano u Bloom et al., 1997, Protein Science 6:407) kako bi se zaobišla tendencija da se formiraju disulfidne veze intra-H lanca koje mogu da dovedu do heterogeničnosti u IgG4 antitelima.

[0248] Štaviše, tehnike za izvođenje antitela sa različitim karakteristiksma (tj., raznim afinitetima za antigen za koja se vezuju) takođe su poznate. Jedna takva tehnika, koja se takođe naziva i mešanje lanaca, uključuje prikazivanje imunoglobulinskih repertoara gena varijabilnog domena na površini filamentoznog bakteriofaga, što se često naziva prikazivanje faga. Mešanje lanaca se koristi za pripremanje antitela sa visokim afinitetom premae hapten 2-feniloksazol-5-onu, kako je opisano od strane Marks et al., 1992, BioTechnology 10:779.

[0249] Konzervativne modifikacije mogu se izvesti na varijabilnim regionima teškog i lakog lanca opisanim u TABELI 2, ili CDR-ovima opisanim u TABELI 3 i 4 (i odgovarajuće modifikacije na kodirajućim nukleinskim kiselinama) radi proizvodnje c-fms antigen vezujućeg proteina sa funkcionalnim i biohemijskim karakteristikama. Postupci za postizanje takvih modifikacija opisani su iznad.

[0250] C-fms antigen vezujući proteini mogu se dalje modifikovati na razne načine. Primera radi, ukoliko se koriste za terapeutske svrhe, oni mogu biti konjugovani sa polietilen glikolom (pegilovan) kako bi se produžio polu-život u serumu ili kako bi se ojačala dostava proteina. Alternativno, V region predmetnog antitela ili njegovih fragmenata mogu biti fuzionisani sa Fc regionom različitog molekula antitela. Fc region koji se koristi za ove svrhe može biti modifikovan tako da ne vezuje komplement, čime se redukuje verovatnoća indukovanja ćelijske lizije kod pacijenta kada se koristi fuzioni protein kao terapeutski agens. Dodatno, predmetna antitela ili njihovi funkcionalni fragmenti mogu biti konjugovani sa humanim serum albuminom kako bi se ojačao polu-život antitela u serumu ili njihov fragment. Još jedan korisni fuzioni partner za antigen vezujuće proteine ili njegove fragmente je transtiretin (TTR). TTR ima kapacitet da formira tetramer, čime antitelo-TTR fuzioni protein može formirati multivalentno antitelo koje može da poveća njegovu težnju za vezivanjem.

[0251] Alternativno, suštinske modifikacije u funkcionalnim i/ili biohemijskim karakteristikama antigen vezujućeg proteina opisani ovde mogu biti pričvršćene kreiranjem supstitucija u aminokiselinskoj sekvenci teških i lakih lanaca koje se razlikuju značajno u njihovom efektu u održavanju (a) strukture molekularne kičme u oblsti supstitucije, primera radi, u obliku lista ili spirale, (b) naelektrisanja ili hidrofobičnosti molekula na ciljanom mestu, ili (c) glomaznosti bočnog lanca. "Konzervativne aminokiselinske supstitucije" mogu da uključe supstituciju nativninog aminokiselinskog ostatka sa nenativnim ostatkom koji ima malo ili nimalo efekta na polaritet ili naelektrisanje aminokiselinskog ostatka na tom položaju. Videti, TABELU 3, gore. Dalje, bilo koji nativni ostatak u polipeptidu takođe može biti supstituisan alanininom, kako je prethodno opisano za alaninsko skeniranje mutageneze.

[0252] Aminokiselinske supstitucije (bilo konzervativne ili ne-konzervativne) predmetnog antitela mogu biti implementirane od strane stručnjaka primenjivanjem rutinskih tehnika. Aminokiselinske supstitucije mogu se koristi za identifikovanje bitnih ostataka antitela koji je ovde obezbeđen, ili kako bi se povećao afinitet ovih antitela ka humanim c-fms ili za modifikovanje afiniteta vezivanja drugih ovde opisanih antigen-vezujućih proteina.

Postupci eksprimiranja antigen vezujućih proteina

[0253] Ekspresioni sistemi i konstrukti u obliku plazmida, ekspresionih vektora, transkripcionih ili ekspresionih kaseta koji obuhvataju najmanje jedan polinukleotid kako je opisano iznad ovde su takođe obezbeđeni, kao i domaćini koji obuhvataju takve ekspresione sisteme ili konstrukte.

[0254] Antigen vezujući proteini koji su ovde obezbeđeni mogu se pripremiti bilo kojom od brojnih konvencionalnih tehnika. Primera radi, c-fms antigen vezujući proteini mogu biti proizvedeni rekombinantnim ekspresionim sistemima, upotrebom bilo koje tehnike poznate u struci. Videti, npr., Monoclonal Antibodies, Hybridomas: A New Dimension in Biological Analyses, Kennet et al. (eds.) Plenum Press, New York (1980); i Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow and Lane (eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1988).

[0255] Antigen vezujući proteini mogu biti eksprimirani u hibridom ćelijskim linijama (npr., određenije antitela mogu biti eksprimirana u hibridomima) ili u ćelijskim linijama različitim od hibridoma.

Ekspresioni konstrukti koji kodiraju antitela koja se mogu koristiti za transformisanje ćelija domaćina sisara, insekta ili mikroba. Transformacija se može izvesti upotrebom bilo kog poznatog postupka za uvođenje polinukleotida u ćeliju domaćina, uključujući, primera radi pakovanje polinukleotida u virusnu ili bakteriofagnu i transdukcionu ćeliju domaćina sa konstruktom transfekcionim procedurama poznatim u struci, kako je opisano u na US Patentu Br.4,399,216; Br.4,912,040; Br.4,740,461; Br.4,959,455. Optimalna transformaciona procedura koja se koristi zavisiće od tipa ćelije domaćina koji se transformiše. Postupci za uvođenje heterolognih polinukleotida u ćelije sisara dobro su poznate u struci i uključuju, ali nisu ograničene na, dekstran-posredovana transfekcija, kalcijum fosfat taloženje, polibren posredovana transfekcija, protoplast fuzija, elektroporation, enkapsuliranje polinukleotida(a) u lipozome, mešanje nukleinske kiseline sa sa pozitivno-naelektrisanim lipidima, i direktno mikroubrizgavanje DNK u nukleuise.

[0256] Rekombinantno ekspresioni konstrukti tipično obuhvataju molekul nukleinske kiseline koja kodira polipeptid koji obuhvata jedan ili više sledećih: jedan ili više CDR-ova koji su ovde obezbeđeni; konstantni region lakog lanca; varijabilni region lakog lanca; konstantni region teškog lanca (npr., CH1, CH2 i/ili CH3); i/ili još jedan deo konstrukcije c-fms antigen vezujućeg proteina. Ove sekvence nukleinske kiseline umetnute su u pogodne ekspresioni vektor upotrebom standardnih ligacinoh tehnika. U jednom primeru izvođenja, teški ili konstantni region lakog lanca doat je C-terminusu anti-c-fms-specifičnom varijabilnom regionu teškog ili lakog lanca i liziran za ekspresioni vektor. Vektor je tipično odabran da bude funkcionalan u određenoj ćeliji domaćinu koja je uposlena (tj., vektor je kompatibilan sa mašinerijom ćelije domaćina, dozvoljavajući amplifikaciju i/ili ekspresiju gena koji se može pojaviti). U nekim primerima izvođenja, koriste se vektori koji upošljavaju oglede protein-fragment komplementacije upotrebom proteinskih reportera, kao što je dihidrofolate reduktaza (videti, primera radi, U.S. Pat. Br.6,270,964). Pogodni ekspresioni vektori mogu se kupiti, primera radi, od Invitrogen Life Technologies ili BD Biosciences (nekadašnji "Clontech"). Ostali korisni vektori za kloniranje i eksprimiranje antitela i fragmenata uključuju one opisane u Bianchi and McGrew, 2003, Biotech.

Biotechnol. Bioeng.84:439-44. Dodatni pogodni ekspresioni vektori opisani su, primera radi, u Methods Enrymol., vol.185 (D. V. Goeddel, ed.), 1990, New York: Academic Press.

[0257] Tipično, ekspresioni vektori koji se koriste u bilo kojoj od ćelija domaćina, sadržaće sekvence za održavanje plazmida i za kloniranje i ekspresiju egzogenih nukleotidnih sekvenci. Takve sekvence, koje se kolektivno nazivaju "flankirajuće sekvence" u određenim primerima izvođenja tipično uključuju jednu ili više sledećih nukleotidnih sekvenci: promoter, jednu ili više pojačivačkih sekvenci, poreklo replikacije, transkripciona terminaciona sekvenca, potpuna intron sekvenca koja sadrži donora i mesto prihvatanja splajsovanja, sekvencu koja kodira lider sekvencu za lučenje polipeptida, mesto vezivanja ribozoma, poliadenilacionu sekvencu, polilinker region za umetanje nukleinske kiseline koja kodira polipeptid koji se eksprimira, i element selektivnog markera. Svaka od ovih sekvenci opisana je u nastavku ispod.

[0258] Opciono, vektor može da sadrži "oznaku"-koja kodira sekvencu, tj., oligonukleotidni molekul smešten na 5' ili 3' kraju kodirajuće sekvence c-fms antigen vezujućeg proteina; oligonukleotidna sekvenca kodira poliHis (kao što je heksaHis), ili još jedna "oznaka" kao što je FLAG®, HA (hemaglutinin influenza virus), ili myc, za koji postoje komercijalno dostupna antitela. Ova oznaka tipično je fuzionisana za polipeptid nakon ekspresije polipeptida, i može da služi kao sredstvo za afinitetno prečišćavanje ili detektovanje c-fms antigen vezujućeg proteina iz ćelije domaćina. Afinitetno prečišćavanje može se izvesti, primera radi, hromatografijom na koloni upotrebom antitela protiv oznake kao neki afinitetni miks. Opciono, oznaka se može naknadno ukinuti iz prečišćenog c-fms antigen vezujućeg proteina raznim sredstvimakao što je upotrebom određenih peptidaza za cepanje.

[0259] Flankirajuće sekvence mogu biti homologne (tj., iz iste vrste i/ili soja kao i ćelija domaćin), heterologne (tj., iz vrste različite od vrste ili soja ćelije domaćina), hibridne (tj., kombinacija flankirajućih sekvenci iz više od jednog izvora), sintetičke ili nativne. Kao takve, izvor flankirajućih sekvenci može biti bilo koji prokariotski ili eukariotski organizam, bilo koji kičmenjački ili bilo koji beskičmenjački organizam, ili bilo koja biljka, pod uslovom da je flankirajuća sekvenca funkcionalna u, i može se aktivirati, mašinerijom ćelija domaćina.

[0260] Flankirajuće sekvence korisne u vektorima mogu se dobiti bilo kojim od nekoliko postupaka koji su dobro poznati u ovoj oblasti. Tipično, ovde korisne flankirajuće sekvence prethodno će biti identifikovane mapiranjem i/ili restrikcijom endonukleaza digestije i prema tome mogu biti izolovani iz pravog tkivnog izvora upotrebom pogodnih restrikcionih endonukleaza. U nekim slučajevima, potpuna nukleotidna sekvenca flankirajuće sekvence može biti poznata. Ovde, flankirajuća sekvenca može biti sintetizovana upotrebom ovde opisanih postupaka za sintezu ili kloniranje nukleinske kiseline.

[0261] Bilo da su poznate sve ili samo deo flankirajuće sekvence, ona se može dobiti upotrebom polimerazne lančane reakcije (PCR) i/ili skriningom gemonske biblioteke sa pogodnom probom kao što je oligonukleotid i/ili fragment flankirajuće sekvence iz jedne ili druge vrste. Kada flankirajuća sekvenca nije poznata, fragment DNK koji sadrži flankirajuću sekvencu može biti izolovan iz većeg dela DNK koji može da sadrži, primera radi, kodirajuću sekvencu ili čak još jedan gen ili gene. Izolovanje se može postići restrikcionom endonukleaza digestijom kako bi se proizveo pravilan DNK fragment praćen izolovanjem upotrebom prečišćavanja primenom agaroza gela, Qiagen® hromatografije na koloni (Chatsworth, CA), ili drugih postupaka poznatih stručnjaku. Odabir pogodnih enzima radi izvršenja ove svrhe, očigledan je stručnjaku iz ove oblasti.

[0262] Poreklo replikacije tipično je deo onih prokariotskih ekspresionih vektora komercijalno nabavljenih, a poreklo potpomaže amplifikaciju vektora u ćeliji domaćinu. Ukoliko odabrani vektor ne sadrži poreklo mesta replikacije, ono se može hemijski sintetizovati na osnovu poznate sekvence, i lizirati za vektor. Primera radi, poreklo replikacije iz plazmida pBR322 (New England Biolabs, Beverly, MA) pogodno je za većinu gram-negativnih bakterija, a razna virusna porekla (npr., SV40, poliom, adenovirus, vezikularni stomatitus virus (VSV), ili papilomavirusi kao što je HPV ili BPV) korisni su za kloniranje vektora u ćelijama sisara. Generalno, poreklo replikacionih komponenti nije potrebno za sisarske ekspresioni vektore (primera radi, SV40 poreklo često se koristi samo zbog toga što sadrži virus rani promoter).

[0263] Transkripciono prekidajuća sekvenca tipično je smeštena 3' do kraja polipeptida kodirajućeg regiona i služi da se prekine transkripcija. Uobičajeno, transkripciono prekidajuća sekvenca u prokariotskim ćelijama je G-C rbogat fragment praćen sa poli-T sekvencom. Dok se takva sekvenca lako klonira iz biblioteke ili čak i komercijalno kupuje kao deo vektora, ona se lako može sintetizovati upotrebom postupaka za sintezu nukleinske kiseline kao što su oni ovde opisani.

[0264] Selektivni marker gen kodira protein potreban za opstanak i rast ćelija domaćina koje su uzgajane u selekcionom medijumu kulture. Tipični selekcioni marker geni kodiraju proteine koji (a) pružaju otpor rezistenciji na antibiotike ili druge toksine, npr., ampicillin, tetraciklin, ili kanamicin za prokariotske ćelije domaćine; (b) upotpunjavaju auksotrofične deficijencije ćelije; ili (c) snabdevaju kritične nutrijente koji nisu dostupni iz kompleksa ili definisanog medija. Specifični selektivni markeri su kanamicin rezistentni gen, ampicilin rezistentni gen, i tetraciklin rezistentni gen. Pogodno, neomicin rezistentni gen takođe se može koristiti za selekciju i u prokariotskim i eukariotskim ćelijama domaćinima.

[0265] Drugi selektivni geni mogu se koristiti za amplifikaciju gena koji treba da se eksprimiraju.

Amplifikacija je proces u kojem se geni koji su potrebni za proizvodnju proteinakritičnih za rast i opstanak ćelija, ponavljaju u tandemu sa hromozomima naknadnih generacija rekombinantnih ćelija. Primeri pogodnih selektivnih markera za ćelije sisara uključuju gene dihidrofolat reductaze (DHFR) i timidin kinaze bez promotera. Sisarske ćelijske transformacije smeštene su pod selekcioni pritisak pod kojim su samo transformacije jedinstveno adaptirane da prežive na osnovu selektivnog gena prisutnog u vektoru. Selekcioni pritisak je nametnut kultivisanjem transformisanih ćelija pod uslovima u kojima se koncentracija selekcionog agensa u medijumu sukcesivno povećava, čime se dovodi do amplifikacije i selektivnog gena i DNK koja kodira još jedan gen, kao što je antigen vezujući protein koji se vezujeza cfms polipeptid. Kao rezultat, povećane količine polipeptida kao što je antigen vezujući protein sintetizovane su iz amplifikovane DNK.

[0266] Ribozom-vezivajuće mesto uobičajeno je potrebno za translataciju inicijacije mRNK i okarakterisano je Shine-Dalgarno sekvencom (prokarioti) ili Kozak sekvencom (eukarioti). Taj element je tipično smešten 3' ka promoteru i 5' ka kodirajućoj sekvenci polipeptida koji treba da se eksprimira.

[0267] U nekim slučajevima, kao tamo gde je glikozilacija poželjna u ekspresionom sistemu eukariotskih ćelija domaćina, može se manipulisati razni pre- ili pro-sekvencama kako bi se poboljšala glikozilacija ili prinos. Primera radi, peptidaza mesto cepanja određenog signalnog peptida može se izmeniti, ili dodati prosekvence, što takođe utiče na glikozilaciju. Finalni proteinski proizvod može imati, u -1 poziciji (u odnosu na prvu aminokiselinu zrelog proteina), jedno ili više dodatnih aminokiselinskih pojavljivanja do ekspresije, koje ne moraju biti potpuno uklonjene. Primera radi, finalni proteinski proizvod može imati jedan ili dva aminokiselinska ostatka pronađena u peptidaza mestu cepanja, pričvršćeni za aminoterminus. Alternativno, upotreba nekih enzim mesta cepanja može rezultirati u nešto kraćem obliku željenog polipeptida, ukoliko se taj enzim preseca u toj oblasti unutar zrelog polipeptida.

[0268] Ekspresija i kloniranje tipično sadrže promoter koji je prepoznat od strane organizma domaćina i operativno vezan za molekul koja kodira c-fms antigen vezujući protein. Promoteri su netranskriptovane sekvence smeštene uzvodne (tj., 5') od početnog kodona strukturnog gena (generalno unutar oko 100 do 1000 bp) što kontroliše transkripciju strukturnog gena. Promoteri su konvencionalano grupisani u jednu od dve klase: inducibilni promoteri i konstitutivni promoteri. Inducibilni promoteri iniciraju povećane nivoe transkripcije iz DNK pod njihovom kontrolom u odgovoru na neke promene u uslovima kultivisanja, kao što su prisustvo ili odsustvo nutrienta ili promne u temperaturi. Konstitutivni promoteri, sa druge strane, uniformno transkriptuju gen za koji su operativno vezani, to jest, sa malo ili ni malo kontrole nad ekspresijom gena. Poznat je veliki broj promotera koji su prepoznati od strane raznih potencijalnih ćelija domaćina. Pogodni promoter operativno je vezan za DNK koja kodira teški lanac ili laki lanac koji obuhvataju c-fms antigen vezujući protein uklanjanjem promotera iz izvora DNK by restrikcionom enzimskom digestijom i umetanjem željene promoterske sekvence u vektor.

[0269] Pogodni promoteri za upotrebu sa domaćinima kvasca takođe su dobro poznati u ovoj oblasti. Osnaživači kvasca pogodno se koriste sa promoterima kvasca. Pogodni promoteri za upotrebu sa sisarskim ćelijama domaćinima dobro su poznati i uključuju, ali nisu ograničeni na, one dobijene od genoma virusa kao što je polioma virus, virus boginja pernate živine, adenovirus (kao što je Adenovirus 2), goveđi papiloma virus, avijan sarkom virus, citomegalovirus, retrovirusi, hepatitis-B virus, i Simian Virus 40 (SV40). Ostali pogodni sisarske promoteri uključuju heterologne sisarske promotere, primera radi, promoteri toplotnog šoka i promoter aktina.

[0270] Dodatni promoteri koji mogu biti od interesa uključuju, ali nisu ograničeni na: SV40 rani promoter (Benoist and Chambon, 1981, Nature 290:304-310); CMV promoter (Thomsen et al., 1984, Proc. Natl. Acad. U.S.A.81:659-663); promoter sadržan u 3' dugom terminalnom ponavljanju Rous sarkom virusa (Yamamoto et al., 1980, Cell 22:787-797); herpes timidin kinaza promoter (Wagner et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.78:1444-1445); promoter i regulatorne sekvence iz metalotionin gena (Prinster et al., 1982, Nature 296:39-42); i prokariotski promoteri kao što je beta-laktamaza promoter (Villa-Kamaroff et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.75:3727-3731); ili tac promoter (DeBoer et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.80:21-25). Takođe su od interesa sledeći životinjski transkripcioni kontrolni regioni, koji pokazuju tkivnu specifičnost i koriste se kod transgenih životinja: kontrolni region elastaza I gena koji je aktivan u ćelijama pankreasnog acinusa (Swift et al., 1984, Cell 38:639-646; Ornitz et al., 1986, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol.50:399-409; MacDonald, 1987, Hepatology 7:425-515); kontrolni region insulinskog gena koji je aktivan pankreasnim beta ćelijama (Hanahan, 1985, Nature 315:115-122); kontrolni region imunoglobulinskog gena koji je aktivan u limfoidnim ćelijama (Grosschedl et al., 1984, Cell 38:647-658; Adames et al., 1985, Nature 318:533-538; Alexander et al., 1987, Mol. Cell. Biol.7:1436-1444); kontrolni region virusa mišjeg tumora dojke koji je aktivan u ćelijama testisa, dojke, limfoida i mastocitnim ćelijama (Leder et al., 1986, Cell 45:485-495); kontrolni region albumin gena koji je aktivan u jetri (Pinkert et al., 1987, Geni i Devel.1 :268-276); kontrolni region alfafeto-protein gena koji je aktivan u jetri (Krumlauf et al., 1985, Mol. Cell. Biol.5:1639-1648; Hammer et al., 1987, Science 253:53-58); kontrolni region alfa 1-antitripsin gena koji je aktivan u jetri (Kelsey et al., 1987, Geni i Devel.1:161-171); kontrolni region beta-globin gena koji je aktivan u mijeloidnim ćelijama (Mogram et al., 1985, Nature 315:338-340; Kollias et al., 1986, Cell 46:89-94); kontrolni region mijelin baznog protein gena koji je aktivan u oligodendrocitnim ćelijama u mozgu (Readhead et al., 1987, Cell 48:703-712); kontrolni region gena miozina lakog lanca-2 koji je aktivan u skeletalnim mišićima (Sani, 1985, Nature 314:283-286); i kontrolni region gena hormonskog gonadotropičnog oslobađanja koji je aktivan u hipotalamusu (Mason et al., 1986, Science 234:1372-1378).

[0271] Pojačivačka sekvenca može biti umetnuta u vektor kako bi se povećala transkripcija DNK koja kodira laki lanac ili teški lanac koji obuhvataju humani c-fms antigen vezujući protein pomoću viših eukariota. Pojačivači su cis-delujući elementi DNK, uobičajeno oko 10-300 bp u dužini, koji deluju na promoter kako bi se povećala transkripcija. Pojačivači su relativno orijentisani i postavljeni nezavisno, pri čemu su pronađeni na položajima i 5' i 3' do transkripcione jedinice. Poznato je nekoliko pojačivačkih sekvenci dostupnih iz sisarskih gena (npr., globin, elastaza, albumin, alfa-feto-protein i insulin).

Međutim, tipično se koriste pojačivači iz virusa. SV40 pojačivač, pojačivač ranog promotera citomegalovirusa, polioma pojačivač, i pojačivači adenovirusa poznati u struci predstavljaju primerne pojačivačke elemente za aktivaciju eukariotskih promotera. Dok neki pojačivač može biti postavljen u vektoru bilo 5' ili 3' do kodirajuće sekvence, on je tipično smešten na mestu 5' od promotera. Sekvenca koja kodira pogodnu nativnu ili heterolognu signalnu sekvencu (lider sekvenca ili signalni peptid) može se inkorporirati u ekspresioni vektor, kako bi promovisala ekstracelularno lučenje antitela. Odabir signalnog peptida ili lidera zavisi od vrste ćelija domaćina u kojima se antitelo proizvodi, a heterologna signalna sekvenca može se zameniti nativnnom signalnom sekvencom. Primeri signalnih peptida koji su funkcionalni u sisarskim ćelijama domaćinima, uključuju sledeće: signalna sekvenca za interleukin-7 (IL-7) opisan u US Patentu Br.4,965,195; signalna sekvenca za interleukin-2 receptor opisana u Cosman et al., 1984, Nature 312:768; signalni peptid za interleukin-4 receptor opisan u EP Patentu Br.0367566; signalni peptid tip I interleukin-1 receptor opisan u U.S. Patentu Br.4,968,607; signalni peptid za tip II interleukin-1 receptor opisan u EP Patentu Br.0460846.

[0272] Eekspresioni vektori koji su obezbeđeni mogu biti konstruisani od početnog vektora kao što je komercijalno dostupan vektor. Takvi vektori mogu i ne moraju da sadrže sve željene flankirajuće sekvence. Kada jedna ili više ovde opisanih flankirajućih sekvenci nisu već prisutne u vektorima, one mogu biti pojedinačno dobiojene i lizirane u vektor. Postupci koji se primenjuju za dobijanje svake od flankirajućih sekvenci dobro su poznati stručnjaku.

[0273] Nakon što je vektor konstruisan, a molekul nukleinske kiseline koja kodira laki lanac, teški lanac, ili laki lanac i teški lanac koji obuhvataju c-fms antigen vezujuću sekvencu je umetnut na pravilno mesto vektora, kompletirani vektor može se umetnuti u pogodnu ćeliju domaćina za amplifikaciju i/ili polipeptidnu ekspresiju. Transformacija ekspresionog vektora za antigen-vezujući protein u odabranoj ćeliji domaćinu može se izvesti dobro poznatim postupcima uključujući transfekciju, infekciju, kalcijum fosfat zajedničko-taloženje, elektroporaciju, mikroubrizgavanje, lipofekciju, DEAE-dekstran posredovanu transfekciju, ili druge poznate tehnike. Taj odabrani postupak delom će biti funkcija tipa ćelije domaćina koja se koristi. Ovi postupci i drugi pogodan postupci dobro su poznati stručnjaka, i kako je već navedeno, primera radi, u Sambrook et al., 2001, gore.

[0274] Ćelija domaćin, kada se kultiviše pod pogodnim uslovima, sintetizuje antigen vezujući protein koji se može naknadno sakupiti iz medijuma kulture (ukoliko ga ćelija domaćin izluči u taj medijum) ili direktno iz ćelija domaćina koja ga proizvodi (ukoliko još nije izlučen). Selekcija pogodne ćelije domaćina zavisiće od raznih faktora, kao što su željeni nivoi ekspresije, polipeptidnih modifikacija koje su poželjne ili neophodne za aktivnost (kao što je glikozilacija ili fosforilacija) i lako savijanje u biološki aktivan molekul.

[0275] Sisarske ćelijske linije dostupne kao domaćini dobro su poznate u struci i uključuju, ali nisu ograničene na, obesmrćene ćelijske linije dostupne iz Američke tipske kolekcije kultura (ATCC), uključujući ali ne ograničavajući se na (CHO) ćelije jajnika Kineskog hrčka, HeLa ćelije, (BHK) ćelije bubrega beba hrčaka, ćelije (COS) bubrega majmuna, humane hepatocelularne karcinom ćelije (npr., Hep G2), i brojne druge ćelijske linije. U određenim primerima izvođenja, ćelijske linije mogu biti odabrana određivanjem koje ćelijske linije imaju velike nivoe ekpresije i konstitutivno proizvode antitela sa c-fms vezivajućim karakteristikama. U još jednom primeru izvođenja, može biti odabrana ćelijska linija iz B ćelijske linije koja ne proizvodi svoje sopstveno antitelo, ali ima kapacitet da proizvede i luči heterologno antitelo.

Upotreba humanih C-fms antigen vezujućih proteina za dijagnostičke i terapeutske svrhe

[0276] Antigen vezujući proteini su korisni za detektovanje c-fms u biološkim uzorcima i identifikaciji ćelija ili tkiva koje proizvode c-fms. Na primer, c-fms antigen vezujući proteini mogu se koristiti u dijagnostičkim ogledima, npr., ogledi vezivanja radi detektovanjat i/ili kvantifikovanja c-fms eksprimiranog u tkivu ili ćeliji. Antigen vezujući proteini koji se specifično vezuju za c-fms takođe se mogu primeniti u lečenju bolesti povezanih sa c-fms kod pacijenta kome je to potrebno. Dodatno, c-fms antigen vezujući proteini mogu se koristi za inhibiranje c-fms iz formiranja kompleksa sa njegovim ligandom CSF-1, čime se moduliše biološka aktivnost c-fms u ćeliji ili tkivu. Primeri aktivnosti koja se može modulisati uključuju, ali nisu ograničeni na, inhibiranje autofosforilacije c-fms, redukovanje monocitne hemotakse, inhibiranje migracije monocita, inhibiranje akumulacije makrofaga povezana sa tumorom u nekom tumoru ili bolesnom tkivu i/ili inhibiranje angiogeneze. Antigen vezujući proteini koji se vezuju za c-fms tako mogu modulisati i/ili blokirati interakciju sa drufim komponentama vezivanja i kao takvi mogu imati terapeutsku upotrebu u ublažavanju bolesti povezanih sa c-fms.

Indikacije

[0277] Mnoge ćelije tumora luče CSF-1 koji, sa druge strane, privlači, promoviše opstanak, i aktivira monocitne/makrofagne ćelije putem srodnog receptora c-fms. Pokazano je da je nivo CSF-1 kod humanih tumora u pozitivnoj korelaciji sa brojem TAM-ova prisutnim u tim tumorima (Murdoch et al., 2004, Blood 104:2224-2234). Nekoliko ispitivanja povezana su sa visokim TAM brojevima sa redukovanim osptankom kod pacijenata sa raznim oblicima kancera. Nedavne studije pokazale su postojanje autokrine petlje u ćelijama tumora. Druga istraživanja pokazuju da c-fms igra ulogu u raznim zapaljenskim bolestima. Prema tome, regulacija c-fms-CSF-1 signaliziranja humanim c-fms antigenvezujućim proteinima koji su ovde obezbeđeni, može inhibirati, ometati, ili modulisati najmanje jedan od bioloških odgovora povezanih sa c-fms, i, kao takvi, korisni su za ublažavanje efekata c-fms-povezanih bolesti ili stanja. C-fms vezujući proteini koji su ovde obezbeđeni takođe mogu da se upotrebe za dijagnostikovanje, prevenciju ili lečenje takvih bolesti ili stanja.

[0278] Bolest ili stanje povezani sa humanim c-fms uključuju bilo koju bolest ili stanje čiji je početak kod pacijenta izazvan, najmanje delom, interakcijom c-fms sa CSF-1 ligandom i/ili IL-34. Ozbiljnost te bolesti ili stanja takođe se može povećati ili smanjiti interakcijom c-fms sa CSF-1 i/ili IL-34. Primeri bolesti i stanja koja se mogu tretirati antigen vezujućim proteinima uključuju razne kancere, zapaljenske bolesti i poremećaje kostiju. Antigen vezujući proteini se takođe mogu koristiti za lečenje ili prevenciju metastaza kancera i osteolize kostiju povezane sa metastazama kancera u kostima. [0325] Visok nivo TAM-ova povezan je da rastom tumora kod raznik kancera, uključujući: dojke (Tsutsui et al., 2005, Oncol. Rep.14:425-431; Leek et al., 1999, Br. J. Cancer 79:991-995; Leek and Harris, 2002, J. Mammary Gland Biol i Neoplasia 7:177-189), prostate (Lissbrant et al.2000, Int. J. Oncol.17:445-451), endometrijalni (Ohno et al., 2004, Anticancer Res.24:3335-3342), bešike (Hanada et al., 2000, Int. J. Urol 7:263-269), bubrega (Hamada et al.; 2002, Anticancer Res.22:4281-4284), ezofagealni (Lewis and Pollard, 2006, Cancer Res.66(2):606-612), skvamoznih ćelija (Koide et al., 2004, Am. J. Gastroenterol.99:1667-1674), uveal melanom (Makitie et al., 2001, Invest. Ophthalmol. Vis. Sci.42 :1414-1421), folikularni limfom (Farinha et al., 2005, Blood 106 :2169-2174), renalni i cervikalni (Kirma et al., 2007, Cancer Res 67 : 1918-1926). U slučaju kancera dojke, kancera prostate, endometrijalnog kancera, kancera bešike, kancera bubrega, ezofagealnog kancera, karcinoma skvamoznih ćelija, uvealnog melanoma, folikularnih limfoma i kancera jajnika, visoki nivoi TAM-ova takođe ukazuju na redukovan opstanak pacijenta. Prema tome, c-fms antigen vezujući proteini koji su ovde obezbeđeni mogu se koristiti za inhibiranje upošlajvanja u i smanjenje opstanka i funkcije TAM-ova u tumoru, čime se negativno utiče na rast tumora, i povećava opstanak pacijenta.

[0279] Ostali kanceri koji se mogu tretirati uključuju, ali nisu ograničeni na, čvrste tumore generalno, kancer pluća, kancer jajnika, kolorektalni kancer, mozga, pankreasa, glave, vrata, jetre, leukemija, limfom i Hočkinova bolest, multiple mijelom (Farinha et al., 2005, Blood 106:2169-2174), melanom, gastrični kancer, astrocitni kancer, adenokarcinom želuca, i pluća. Ishigami et al., 2003, Anticancer Research 23:4079-4083; Caruso et al., 1999, Modern Pathology 12:386-390; Witcher et al., 2004, Research Support 104:3335-3342; Haran-Ghera et al.1997, Blood 89:2537-2545; Hussein et al., 2006 International Journal of Eksperimentalna Pathology 87:163-76; Lau et al.2006 British Journal of Cancer.

94:1496-1503, Leung et al.1997, Acta Neuropathologica.93:518-527, Giraudo et al., 2004, Journal of Clinical Investigation 114:623-633; Kirma et al., 2007, Cancer Research 67:1918-26, van Ravenswaay et al., 1992, Laboratory Investigation 67:166-174.

[0280] Antigen vezujući proteini takođe se mogu primeniti za inhibiranje rasta tumora, progresije i/ili metastaza. Takva inhibicija može se pratiti upotrebom raznih postupaka. Na primer, inhibicija može da rezultira kao redukovana veličina tumora i/ili smanjenje u metaboličkoj aktivnosti unutar tumora. Oba ova parametra mogu se meriti MRI ili PET skenovima, na primer. Inhibicija se takođe može pratiti biopsijom utvrđenog nivoa nekroze, smrti čelija tumora i nivoom prokrvljenosti unutar tumora. Širenje metastaza i osteolize kostiju povezane sa metastazama mogu se pratiti upotrebom poznatih postupaka.

[0281] Dokaz postojanja autokrine petlje ukazuje da inhibicija c-fms aktivnosti ima uticaj na makrofage povezane sa tumorom, ali i na ćelije tumora. Na taj način, u jednom primeru izvođenja, tumori koji imaju autokrinu petlju su ciljani kao primarna meta. U drugim primerima izvođenja, oba i TAM-ovi i tumor su ciljani radi kombinovanog efekta. U još daljim primerima izvođenja, ciljani su tumori koji koriste parakrinu petlju ili autokrinu i parakrinu petlju.

[0282] Humani c-fms antigen vezujući proteini koji su ovde obezbeđeni mogu se u određenim aspektima davati sami, ali se isto tako mogu upotrebiti u kombinaciji sa jednom ili više drugih opcija za lečenje kancera, kao što je, primera radi, hemoterapija, radijaciona terapija, ili operacija. Ukoliko se daju hemoterapeutski, antigen vezujući protein može se dati pre ili nakon hemoterapeutskog agensa ili u isto vreme (npr., kao deo iste kompozicije).

[0283] Hemoterapijska lečenja koja se mogu primeniti kombinaciji sa ovde obezbešenim antigen vezujućim proteinima, uključuju, ali nisu ograničena na, anti-neoplastične agense koji uključuju alkilirajuće agense koji uključuju: azotni iperiti, kao što je mehloretamin, ciklofosfamid, ifosfamid, melfalan i hlorambucil; nitrozouree, kao što je karmustin (BCNU), lomustin (CCNU), i semustin (metil-CCNU); Temodal™ (temozolamid), etilenimini/metilmelamin kao što je trietilenmelamin (TEM), trietilen, tiofosforamid (tiotepa), heksametilmelamin (HMM, altretamin); alkil sulfonatei kao što je busulfan; triazini kao što je dakarbazin (DTIC); antimetaboliti koji uključuju analoge fen kiseline kao što je metotreksat i trimetreksat, analoge pirimidina kao što je 5-fluorouracil (5FU), fluorodeoksiuridin, gemcitabin, citozin arabinozid (AraC, citarabin), 5-azacitidin, 2,2'-difluorodeoksicitidin, analoge purina kao što je 6-merkaptopurin, 6-tiogvanin, azatioprin, 2'-deoksicoformicin (pentostatin), eritrohidroksinoniladenin (EHNA), fludarabin fosfat, i 2-hlorodeoksiadenozin (kladribin, 2-CdA); prirodni proizvodi koji uključuju antimitotične lekove kao što je paklitaksel, vinka alkaloidi koji uključuju vinblastin (VLB), vinkristin, i vinorelbin, taksoter, estramustin, i estramustin fosfat; pipodofilotoksini kao što je etopozid i tenipozid; antibiotici kao što je aktimomicin D, daunomicin (rubidomicin), doksorubicin, mitoksantron, idarubicin, bleomicini, plikamicin (mitramicin), mitomicinC, i actinomicin; enzimi kao što je L-asparaginaza; modifikatori biološkog odgovora kao što je interferon-alfa, IL-2, G-CSF i GM-CSF; razni agensi koji uključuju koordinacione komplekse platine kao što je cisplatin i karboplatin, antracenedioni kao što je mitoksantron, supstituisana urea kao što je hidroksiurea, derivati metilhidrazina koji uključuju N-metilhidrazin (MIH) i prokarbazin, adrenokortikodine supresante kao što je mitotan (o,p-DDD) i aminoglutetimid; hormoni i antagonist koji uključuju adrenokortikosteroidni antagonisti kao što je prednizon i ekvivalenti, deksametazon i aminoglutetimid; Gemzar™ (gemcitabin), progestin kao što je hidroksiprogesteron kaproat, medroksiprogesteron acetat i megestrol acetat; estrogen kao što je dietilstilbestrol i etinil estradiol ekvivalenti; antiestrogen kao što je tamoksifen; irogeni koji uključuju testosteron propionat i fluoksimesteron/ekvivalenti; antiandrogeni kao što je flutamid, gonadotropinoslobađajući hormon analog i leuprolid; i ne-steroidni antiandrogeni kao što je flutamid. Terapije koje ciljaju epigenetski mehanizam koje uključuju, ali se ne ograničavaju na, inhibitore histon deacetilaze, demetilacioni agensi (npr., Vidaza) i terapije oslobađanja transkripcione represije (ATRA) takođe se mogu kombinovati sa antigen vezujućim proteinima.

[0284] Kancer terapije, koje se mogu primenjivati sa antigen vezujućim proteinom, takođe uključuju, ali nisu ograničene na, ciljane terapije. Primeri ciljanih terapija uključuju, ali nisu ograničeni na, upotrebu terapeutskih antitela. Primerna terapeutska antitela, uključuju, ali nisu ograničena na, mišja, mišhumana himerna, CDR-graftovana, humanizovana i potpuno humana antitela, i sintetička antitela, uključujući, ali ne ograničavajući se na, ona odabrana od strane skrining antitelo biblioteka. Primerna antitela uključuju, ali nisu ograničena na, ona koja se vezuju za ćelijski površinske proteine Her2, CDC20, CDC33, glikoprotein nalik mucinu, i receptor epidermalnog faktora rasta (EGFR) prisutan na ćelijama tumora, i opciono indukuju citostatik i/ili citotoksični efekat na ćelijama tumora koje pokazuju ove proteine. Primerni antitela takođe uključuju HERCEPTIN™ (trastuzumab), koji koji se mogu koristiti za tretiranje kancera dojke i drugih oblika kancera, i RITUXAN™ (rituksimab), ZEVALIN™ (ibritumomab tiuksetan), GLEEVEC™, i LYMPHOCIDE™ (epratuzumab), koji se mogu koristiti za tretiranje ne-Hočkinovog limfoma i drugih oblika kancera. Određena primerna antitela takođe uključuju ERBITUX™ (IMC-C225); ertinolib (Iressa); BEXXAR™ (jodin 131 dositumomab); KDR (receptor kinaza domena) inhibitori; anti VEGF antitela i antagonisti (npr., Avastin™ i VEGAF-TRAP); anti VEGF receptor antitela i antigen vezujući regioni; anti-Ang-1 i Ang-2 antitela i antigen vezujući regioni; antitela za Tie-2 i druge Ang-1 i Ang-2 receptore; Tie-2 ligande; antitela protiv Tie-2 kinaza inhibitora; inhibitore Hif-1a, i Campath™ (Alemtuzumab). U određenim primerima izvođenja, agensi za tretiranje kancera su polipeptidi koji selektivno indukuju apoptozu u ćelijama tumora, uključujući, ali ne ograničavajući se na, TNF-povezani polipeptid TRAIL.

[0285] Dodatni specifični primeri hemoterapeutskih agenasa uključuju, taksol, taksene (npr., docetaksel i Taxoter), modifikovani paklitaksel (npr., Abraxan i Opaxio) doksorubicin, Avastin®, Sutent, Neksavar, i drugi inhibitori multikinaze, cisplatin i karboplatin, etopozid, gemcitabin, i vinblastin. Specifični inhibitori drugih kinaza takođe se mogu primeniti u kombinaciji sa antigen vezujućim proteinima, uključujući ali ne ograničavajući se na, inhibitori MAPK putanje (npr., inhibitori ERK, JNK i p38), PI3kinaza/AKT inhibitori i Pim inhibitori. Drugi inhibitori uključuju Hsp90 inhibitore, inhibitori proteazoma (npr., Velcade) i inhibitori višestrukog mehanizma aktivnosti kao što je Trisenox.

[0286] U određenom aspektu, antigen vezujući protein kakav je ovde obezbeđen je upotrebljen u kombinaciji sa jednim ili više anti-angiogenig agenasa koji smanjuju angiogenezu. Određeni takvi agensi uključuju, ali nisu ograničeni na, IL-8 antagonisti; Campath, B-FGF; FGF antagonisti; Tek antagonisti (Cerretti et al., U.S. Objava Br.2003/0162712; Cerretti et al., U.S. Pat. Br.6,413,932, i Cerretti et al., U.S. Pat. Br.6,521,424); anti-TWEAK agensi (koji uključuju, ali nisu ograničeni na, antitela i antigen vezujuće regione); rastvorljivi TWEAK receptor antagonisti (Wiley, U.S. Pat. Br.6,727,225); ADAM distintegrin domen za antagonisanje vezivanja integrina za njegove ligande (Fanslow et al., U.S. Objava Br.

2002/0042368); anti-ef receptor i anti-efrin antitela; antigen vezujući regioni, ili antagonisti (U.S. Pat. Br.

5,981,245; 5,728,813; 5,969,110; 6,596,852; 6,232,447; 6,057,124 i njihovi članovi patentne familije); anti-VEGF agensi (npr., antitela ili antigen vezujući regioni koji specifično vezuju VEGF, ili njihovi rastvorljivi VEGF receptori ili ligand vezivajući regioni) kao što je Avastin™ ili VEGF-TRAP™, i anti-VEGF receptor agensi (npr., antitela ili antigen vezujući regioni koji se specifično vezuju za njih), EGFR inhibitorni agensi (npr., antitela ili antigen vezujući regioni koji se specifično vezuju za njih) kao što je panitumumab, IRESSA™ (gefitinib), TARCEVA™ (erlotinib), anti-Ang-1 i anti-Ang-2 agensi (npr., antitela ili antigen vezujući regioni koji se specifično vezuju za njih ili njihove receptore, npr., Tie-2/TEK), i anti-Tie-2 kinaza inhibitorni agensi (npr., antitela ili antigen vezujući regioni koji se specifično vezuju i inhibiraju aktivnost faktora rasta, kao što su antagonisti hepatociznog faktora rasta (HGF, takođe poznat kao Scatter Faktor), i antitela ili antigen vezujući regioni koji se specifično vezuju za svoj receptor "c-met"; anti-PDGF-BB antagonisti; antitela i antigen vezujući regioni za PDGF-BB ligande; i PDGFR inhibitori kinaze.

[0287] Drugi anti-angiogeni agensi koji se mogu primeniti u kombinaciji sa antigen vezujućim proteinom uključuju agense kao što su MMP-2 (matriks-metaloproteinaza 2) inhibitori, MMP-9 (matriksmetaloproteinaza 9) inhibitori, i COX-II (ciklooksigenaza II) inhibitori. Primeri korisnih COX-II inhibitora uključuju CELEBREX™ (celekoksib), valdekoksib, i rofekoksib.

[0288] U određenim primerima izvođenja, agensi za tretiranje kancera su inhibitori angiogeneze.

Određeni takvi inhibitori uključuju, ali nisu ograničeni na, SD-7784 (Pfizer, USA); cilengitid. (Merck KGaA, Germany, EPO 770622); pegaptanib oktanatrijum, (Gilead Sciences, USA); Alfastatin, (BioActa, UK); M-PGA, (Celgene, USA, U.S. Pat. Br.5,712,291); ilomastat, (Arriva, USA, U.S. Pat. Br.5,892,112); semaksanib, (Pfizer, USA, U.S. Pat. Br.5,792,783); vatalanib, (Novartis, Switzerland); 2-metoksiestradiol, (EntreMed, USA); TLC ELL-12, (Elan, Ireland); anecortav acetat, (Alcon, USA); alfa-D148 Mab, (Amgen, USA); CEP-7055, (Cephalon, USA); anti-Vn Mab, (Crucell, Netherlands) DAC:antiangiogeni, (ConjuChem, Canada); Angiocidin, (InKine Farmaceutska, USA); KM-2550, (Kyowa Hakko, Japan); SU-0879, (Pfizer, USA); CGP-79787, (Novartis, Switzerland, EP 970070); ARGENT technology, (Ariad, USA); YIGSR-Stealth, (Johnson & Johnson, USA); fibrinogen-E fragment, (BioActa, UK); inhibitor angiogeneze, (Trigen, UK); TBC-1635, (Encysive Pharmaceuticals, USA); SC-236, (Pfizer, USA); ABT-567, (Abbott, USA); Metastatin, (EntreMed, USA); inhibitor angiogeneze, (Tripep, Sweden); maspin, (Sosei, Japan); 2-metoksiestradiol, (Oncology Sciences Corporation, USA); ER-68203-00, (IVAX, USA); Benefin, (Lane Labs, USA); Tz-93, (Tsumura, Japan); TAN-1120, (Takeda, Japan); FR-111142, (Fujisawa, Japan, JP 02233610); platelet faktor 4, (RepliGen, USA, EP 407122); antagonist vaskularnog endotelijalnog faktora rasta, (Borean, Denmark); kancer terapija, (University of South Carolina, USA); bevacizumab (pINN), (Genentech, USA); inhibitori angiogeneze, (SUGEN, USA); XL 784, (Exelixis, USA); XL 647, (Exelixis, USA); MAb, alfa5beta3 integrin, druga generacija, (Applied Molecular Evolution, USA and MedImmune, USA); genska terapija, retinopatija, (Oxford BioMedica, UK); enzastaurin hidrohlorid (USAN), (Lilly, USA); CEP 7055, (Cephalon, USA and Sanofi-Synthelabo, France); BC 1, (Genoa Institute of Cancer Research, Italy); inhibitor angiogeneze, (Alchemia, Australia); VEGF antagonist, (Regeneron, USA); rBPI 21 i BPI-izvedeni antiangiogeni, (XOMA, USA); PI 88, (Progen, Australia); cilengitid (pINN), (Merck KGaA, German; Munich Technical University, Germany, Scripps Clinic and Research Foundation, USA); cetuksimab (INN), (Aventis, France); AVE 8062, (Ajinomoto, Japan); AS 1404, (Cancer Research Laboratory, New Zealand); SG 292, (Telios, USA); Endostatin, (Boston Childrens Hospital, USA); ATN 161, (Attenuon, USA);

ANGIOSTATIN, (Boston Childrens Hospital, USA); 2-metoksiestradiol, (Boston Childrens Hospital, USA); ZD 6474, (AstraZeneca, UK); ZD 6126, (Angiogene Pharmaceuticals, UK); PPI 2458, (Praecis, USA); AZD 9935, (AstraZeneca, UK); AZD 2171, (AstraZeneca, UK); vatalanib (pINN), (Novartis, Switzerland and Schering AG, Germany); inhibitori putanje tkivnog faktora, (EntreMed, USA); pegaptanib (Pinn), (Gilead Sciences, USA); ksantorizol, (Yonsei University, South Korea); vakcina, bazirana na genima, VEGF-2, (Scripps Clinic and Research Foundation, USA); SPV5.2, (Goretek, Canada); SDX 103, (University of California at San Diego, USA); PX 478, (ProIX, USA); METASTATIN, (EntreMed, USA); troponin 1, (Harvard University, USA); SU 6668, (SUGEN, USA); OXI 4503, (OXiGENE, USA); o-gvanidini, (Dimensional Pharmaceuticals, USA); motuporamin C, (British Columbia University, Canada); CDP 791, (Celltech Group, UK); atiprimod (PINN), (GlaxoSmithKline, UK); E 7820, (Eisai, Japan); CYC 381, (Harvard University, USA); AE 941, (Aeterna, Canada); vakcina, angiogeneza, (EntreMed, USA); inhibitor plazminogen aktivatora urokinaze, (Dendreon, USA); oglufanid (pINN), (Melmotte, USA); HIF-1alfa inhibitori, (Xenova, UK); CEP 5214, (Cephalon, USA); BAY RES 2622, (Bayer, Germany); Angiocidin, (InKine, USA); A6, (Angstrom, USA); KR 31372, (Korea Research Institute of Hemijska Technology, South Korea); GW 2286, (GlaxoSmithKline, UK); EHT 0101, (ExonHit, France); CP 868596, (Pfizer, USA); CP 564959, (OSI, USA); CP 547632, (Pfizer, USA); 786034, (GlaxoSmithKline, UK); KRN 633, (Kirin Brewery, Japan); sistem za dostavu leka, intraokularno, 2-metoksiestradiol, (EntreMed, USA); angineks, (Maastricht University, Netherlands, and Minnesota University, USA); ABT 510, (Abbott, USA); ML 993, (Novartis, Switzerland); VEGI, (Proteom Tech, USA); alfa inhibitori faktira tumor nekroze, (National Institute on Aging, USA); SU 11248, (Pfizer, USA i SUGEN USA); ABT 518, (Abbott, USA); YH16, (Yantai Rongchang, China); S-3APG, (Boston Childrens Hospital, USA and EntreMed, USA); MAb, KDR, (ImKlon Systems, USA); MAb, alfa5 beta1, (Protein Design, USA); KDR kinaza inhibitor, (Celltech Group, UK, and Johnson & Johnson, USA); GFB 116, (South Florida University, USA and Yale University, USA); CS 706, (Sankyo, Japan); kombretastatin A4 prolek, (Arizona State University, USA); hondroitinaza AC, (IBEX, Canada); BAY RES 2690, (Bayer, Germany); AGM 1470, (Harvard University, USA, Takeda, Japan, and TAP, USA); AG 13925, (Agouron, USA); Tetratiomolibdat, (University of Michigan, USA); GCS 100, (Wayne State University, USA) CV 247, (Ivy Medical, UK); CKD 732, (Chong Kun Dang, South Korea); MAb, vaskularni endotelijum faktor rasta, (Xenova, UK); irzogladin (INN), (Nippon Shinyaku, Japan); RG 13577, (Aventis, France); WX 360, (Wilex, Germany); skvalamin (pINN), (Genaera, USA); RPI 4610, (Sima, USA); kancer terapija, (Marinova, Australia); inhibitori heparanaza, (InSight, Israel); KL 3106, (Kolon, South Korea); Honokiol, (Emory University, USA); ZK CDK, (Schering AG, Germany); ZK Angio, (Schering AG, Germany); ZK 229561, (Novartis, Switzerland, and Schering AG, Germany); XMP 300, (XOMA, USA); VGA 1102, (Taisho, Japan); VEGF receptor modulatori, (Pharmacopeia, USA); VE-kaderin-2 antagonisti, (ImKlon Sistemi, USA); Vazostatin, (National Institutes of Health, USA); vakcina, Flk-1, (ImKlon Systems, USA); TZ 93, (Tsumura, Japan); TumStatin, (Beth Israel Hospital, USA); skraćeni rastvorljivi FLT 1 (receptor 1 vaskularnog endotelijalnog faktora rasta), (Merck & Co, USA); Tie-2 ligandi, (Regeneron, USA); trombospondin 1 inhibitor, (Allegheny Health, Education and Research Foundation, USA); 2-Benzensulfonamid, 4-(5-(4-hlorofenil)-3-(trifluorometil)-1H-pirazol-1-il)-; Arriva; i C-Met. AVE 8062 ((2S)-2-amino-3-hidroksi-N-[2-metoksi-5-[(1Z)-2-(3,4,5-tri- metoksifenil)etenil]fenil]propanamid monohidrohlorid); metelimumab (pINN)(imunoglobulinski G4, anti-(humani transformišući faktor rasta beta.1 (humani monoklonalni CAT 192.gama.4-lanac)), disulfidni sa humanim monoklonalnim CAT 192.kapa.-lanac dimerom); Flt3 ligand; CD40 ligand; interleukin-2; interleukin-12; 4-1BB ligand; anti-4-1BB antitela; TNF antagonisti i TNF receptor antagonisti koji uključuju TNFR/Fc, TWEAK antagoniste i TWEAK-R antagoniste koji uključuju TWEAK-R/Fc; TRAIL; VEGF antagonisti koji uključuju anti-VEGF antitela; VEGF receptor (koji uključuju VEGF-R1 i VEGF-R2, takođe poznat kao Flt1 i Flkl ili KDR) antagonisti; CD148 (takođe se naziva DEP-1, ECRTP, i PTPRJ, videti Takahashi et al., J. Am. Soc. Nephrol.

10: 213545 (1999) agonisti; trombospondin 1 inhibitor, i inhibitori jednog ili oba Tie-2 ili Tie-2 liganda (kao što je Ang-2). Brojni inhibitori Ang-2 poznati su u struci, uključujući anti-Ang-2 antitela opisana u objavljenoj U.S. Patentoj privaji Br.20030124129 (koje odgovaraju PCT prijavi objavljenoj kao Br.

WO03/030833), i U.S. Pat. Br.6,166,185. Dodatno, Ang-2 peptitela takođe su poznata u struci, i mogu se naći, primera radi, objavljena u U.S. Patentnoj prijavi Br.20030229023 (koje odgovaraju PCT prijavi objavljenoj kao Br. WO03/057134), i objavljeni uU.S. Patentnoj prijavi Br.20030236193.

[0289] Određeni agens za tretiranje kancera uključuju, ali nisu ograničeni na: talidomid i analozi talidomida (N-(2,6-diokso-3-piperidil)ftalimi- de); tekogalan natrijum (sulfatirani polisaharid peptidoglikan); TAN 1120 (8-acetil-7,8,9,10-tetrahidro-6,8,11-trihidroksi-1-metoksi-10-[[oktahidro-- 5-hidroksi-2-(2-hidroksipropil)-4,10-dimetilpirano[3,4-d]-1,3,6-dioksazocin-- 8-il]oksi]-5,12-naftacenedion); suradista (7,7'-[karbonilbis[imino(1-met- hil-1H-pirol-4,2-diil)karbonilimino(1-metil-1H-pirol-4,2-diil)karboni- limino]]bis-1,3-naftalendisulfonska kiselina tetranatrijum so); SU 302; SU 301; SU 1498 ((E)-2-cijano-3-[4-hidroksi-3,5-bis(1-metiletil)fenil]-N-(3- -fenilpropil)-2-pro penamid); SU 1433 (4-(6,7-dimetil-2-kvinoksalinil)-1- ,2-benzendiol); ST 1514; SR 25989; rastvorljivi Tie-2; SERM derivati, Pharmos; semaksanib (pINN)(3-[(3,5-dimetil-1H-pirol-2-il)metilen]-1,3-- dihidro-2H-indol-2-on); S 836; RG 8803; RESTIN; R 440 (3-(1-metil-1H-indol-3-il)-4-(1-metil-6-nitro-1H-indol-3-il)-1H-pirol- -2,5-dion); R 123942 (1-[6-(1,2,4-tiadiazol-5-il)-3-piridazinil]-N-[3-(t- rifluorometil)fenil]-4-piperidinamin); prolil hidroksilaza inhibitor; progresija povišenih gena; prinomastat (INN) ((S)-2,2-dimetil-4-[[p-(4-piridiloksi)fenil]sulfonil]-3-tiomorfolinkarbohidroksamska kiselina); NV 1030; NM 3 (8-hidroksi-6-metoksi-alfa-metil-1-okso-1H-2-benzopiran-3-sirć- etna kiselina); NF 681; NF 050; MIG; METH 2; METH 1; manasantin B (alfa-[1-[4-[5-[4-[2-(3,4-dimetoksifenil)-2-hidroksi-1-metiletoksi]-3-metoksifenil]tetrahidro-3,4-dimetil-2-furanil]-2-metoksifenoksi]etil]-1,- 3-benzodioksol-5-metanol); KDR monoklonalno antitelo; alfa5beta3 integrin monoklonalno antitelo; LY 290293 (2-amino-4-(3-piridinil)-4H-nafto[1,2-b]- piran-3-karbon itril); KP 0201448; KM 2550; integrin-specifični peptidi; INGN 401; GYKI 66475; GYKI 66462; zelenistatin (101-354-plazminogen (humani)); genska terapija za reumatoidni artritis, kancer prostate, kancer jajnika, gliom, endostatin, kolorektalni kancer, ATF BTPI, antiangiogenezni geni, angiogenezni inhibitor, ili angiogeneza; gelatinaza inhibitor, FR 111142 (4,5-dihidroksi-2-heksenova kiselina 5-metoksi-4-[2-metil-3-(3-metil-2- -butenil)oksiranil]-1-oksaspiro[2.5]okt-6-il estar); forfenimeks (PINN) (S)-alfa-amino-3-hidroksi-4-(hidroksimetil)benzensirćetna kiselina); fibronektin antagonist (1-acetil-L-prolil-L-histidil-L-seril-L-cisteinil-- L-aspartamid); inhibitor receptora faktora rasta fibroblasta; antagonist faktora rasta fibroblasta; FCE 27164 (7,7'-[karbonilbis[imino(1-metil-1H-- pirol-4,2-diil)karbonilimino(1-metil-1H-pirol-4,2-diil)karbonilimino]- ]bis-1,3,5-naftalentrisulfonska kiselina heksanatrijum so); FCE 26752 (8,8'[karbonilbis[imino(1-metil-1H-pirol-4,2-diil)karbonilimino(1-met- hil-1H-pirol-4,2-diil)karbonilimino]]bis-1,3,6-naftalentrisulfonska kiselina); endotelijalni monocit aktivirajući polipeptid II; VEGFR antisens oligonukleotid; anti-angiogeni i trofični faktori; ANCHOR angiostatični agens; endostatin; Del-1 angiogeni protein; CT 3577; kontortrostatin; CM 101; hondroitinaza AC; CDP 845; CanStatin; BST 2002; BST 2001; BLS 0597; BIBF 1000; ARRESTIN; apomigren (1304-1388-tip XV kolagen (humani genski COL15A1 alfa1-lančani preckursor)); angioinhibin; aaATIII; A 36; 9alfa-fluoromedroksiprogesteron acetat ((6-alfa)-17-(acetiloksi)-9-fluo- ro-6-metil-pregn-4-en-3,20-dion); 2-metil-2-ftalimidino- glutarna kiselina (2-(1,3-dihidro-1-okso-2H-izoindol-2-il)-2-metilpentandiojska kiselina); Yttrium 90 obeleženo monoklonalno antitelo BC-1; Semaksanib (3-(4,5-Dimetilpirol-2-ilmetilen)indolin-2-on)(C15 H14 N2 O); PI 88 (fosfomanopentaoza sulfat); Alvocidib (4H-1-Benzopiran-4-on, 2-(2-hlorofenil)-5,7-dihidroksi-8-(3-hidroksi-1-metil-4-piperidinil)-cis- -(-)-) (C21-H20 Cl N 05); E 7820; SU 11248 (5-[3-Fluoro-2-okso-1,2-dihidroi- ndol-(3Z)-ilidenemetil]-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (2-dietilaminoetil)amid) (C22 H27 F N402); Skvalamin (holestan-7,24-diol, 3-[[3-[(4-aminobutil)aminopropil]amino]-, 24-(hidrogen sulfat), (3.beta.,5.alfa.,7.alfa.)-) (C34 H65 N3 O.sub.5 S); Eriohrom Crno T; AGM 1470 (Karbaminska kiselina, (hloroacetil)-, 5-metoksi-4-[2-metil-3-(3-metil-2-butenil)oksiranil]-1-oksaspiro[2,5]okt-- 6-il estar, [3R-[3alfa, 4alfa(2R, 3R), 5beta, 6beta]]) (C19 H28 Cl N 06); AZD 9935; BIBF 1000; AZD 2171; ABT 828; KS-interleukin-2; Uteroglobin; A 6; NSC 639366 (1-[3-(Dietilamino)-2-hidroksipropilamino]-4- -(oksiran-2-ilmetilamino)antrakvinon fumerat) (C24 H29 N304. C4 H404); ISV 616; anti-ED-B fuzioni proteini; HUI 77; Troponin I; BC-1 monoklonalno antitelo; SPV 5.2; ER 68203; CKD 731 (3-(3,4,5-Trimetoksifeni- 1)-2(E)-propenska kiselina (3R,4S,5S,6R)-4-[2(R)-metil-3(R)-3(R)-(3-metil-2--butenil)oksiran-2-il]-5-metoksi-1-oksaspiro[2.5]okt-6-il estar) (C28 H38 O8); IMC-1C11; aaATIII; SC 7; CM 101; Angiocol; Kringle 5; CKD 732 (3-[4-[2-(Dimetilamino)etoksi]fenil]-2(E)-propenska kiselina)(C29 H41 N O6); U 995; Canstatin; SQ 885; CT 2584 (1-[11-(Dodecilamino)-10-hidroksiun- decil]-3,7-dimetilksantin)(C30 H55 N503); Salmosin; EMAP II; TX 1920 (1-(4-Metilpiperazino)-2-(2-nitro-1H-1-imidazoil)-1-etanon) (C10 H15 N503); Alfa-v Beta-x inhibitor; CHIR 11509 (N-(1-Propinil)glicil-[N-(2-naftil)]glicil-[N-(karbamoilmetil)]glicin bis(4-metoksifenil)metilam- ide)(C36 H37 N506); BST 2002; BST 2001; B 0829; FR 111142; 4,5-Dihidroksi-2(E)-heksenova kiselina (3R,4S,5S,6R)-4-[1(R),2(R)-epoksi-1,5-dim- etil-4-heksenil]-5-metoksi-1-oksaspiro[2.5]oktan-6-il estar (C22 H3407); i inhibitori kinaze uključujući, ali ne ograničavajući se na, N-(4-hlorofenil)-4-(4-piridinilmetil)-1-ftalazinamin; 4-[4-[[[[4-hloro-3-(trifluorometil)fenil]amino]karbonil]amino]fenoksi]- -N-metil-2-piridinekarboksamid; N-[2-(dietilamino)etil]-5-[(5-fluoro-1,- 2-dihidro-2-okso-3H-indol-3-iliden)metil]-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksamid; 3-[(4-bromo-2,6-difluorofenil)metoksi]-5-[[[[4-(1-pirolidinil)bu- til]amino]karbonil]amino]-4-izotiazolekarboksamid; N-(4-bromo-2-fluorofenil)-6-metoksi-7-[(1-metil-4-piperidinil)metoksi]-- 4-kvinazolinamin; 3-[5,6,7,13-tetrahidro-9-[(1-metiletoksi)metil]-5-okso- -12H-indeno[2,1-a]pirolo[3,4-c]karbazol-12-il]propil estar N,N-dimetil-glicin; N-[5-[[[5-(1,1-dimetiletil)-2-oksazolil]metil]ti- o]-2tiazolil]-4-piperidinkarboksamid; N-[3-hloro-4-[(3-fluorofenil)me- toksi]fenil]-6-[5-[[[2-(metilsulfonil)etil]amino]metil]-2-furanil]4-kv- inazolinamin; 4-[(4-Metil-1-piperazinil)metil]-N-[4-metil-3-[[4-(3-pir- idinil)-2-pirimidinil]amino]-fenil]benzamid; N-(3-hloro-4-fluorofenil)- -7-metoksi-6-[3-(4-morfolinil)propoksi]-4-kvinazolinamin; N-(3-etinilfenil)-6,7-bis(2-metoksietoksi)-4-kvinazolinamin; N-(3-((((2R)-1-metil-2-pirolidinil)metil)oksi)-5-(trifluorometil)feni- 1)-2-((3-(1,3-oksazol-5-il)fenil)amino)-3-piridinekarboksamid; 2-(((4-fluorofenil)metil)amino)-N-(3-((((2R)-1-metil-2-pirolidinil)metil)oksi)-5-(trifluorometil)fenil)-3-piridinekarboksamid; N-[3-(Azetidin-3-ilmetoksi)-5-trifluorometil-fenil]-2-(4-fluoro-benzila- mino)-nikotinamid; 6-fluoro-N-(4-(1-metiletil)fenil)-2-((4-piridinilme- til)amino)-3-piridinekarboksamid; 2-((4-piridinilmetil)amino)-N-(3-(((2S-)-2-pirolidinilmetil)oksi)-5-(trifluorometil)fenil)-3-piridinekarboksami- d; N-(3-(1,1-dimetiletil)-1H-pirazol-5-il)-2-((4-piridinilmetil)amino)- -3-piridinekarboksamid; N-(3,3-dimetil-2,3-dihidro-1-benzofuran-6-il)-2-(- (4-piridinilmetil)amino)-3-piridinekarboksamid; N-(3-((((2S)-1-metil-2-pirolidinil)metil)oksi)-5-(trifluorometil)fenil)-2-((4-piridinilmetil)a- mino)-3-piridinekarboksamid; 2-((4-piridinilmetil)amino)-N-(3-((2-(1-pir- olidinil)etil)oksi)-4-(trifluorometil)fenil)-3-piridinekarboksamid; N-(3,3-dimetil-2,3-dihidro-1H-indol-6-il)-2-((4-piridinilmetil)amino)-3- -piridinekarboksamid; N-(4-(pentafluoroetil)-3-(((2S)-2-pirolidinilmeti-1)oksi)fenil)-2-((4-piridinilmetil)amino)-3-piridinekarboksamid; N-(3-((3-azetidinilmetil)oksi)-5-(trifluorometil)fenil)-2-((4-piridinil- metil)amino)-3-piridinekarboksamid; N-(3-(4-piperidiniloksi)-5-(trifluorom- etil)fenil)-2-((2-(3-piridinil)etil)amino)-3-piridinekarboksamid; N-(4,4-dimetil-1,2,3,4-tetrahidroisokvinolin-7-il)-2-(1H-indazol-6-ilami- no)-nikotinamid; 2-(1H-indazol-6-ilamino)-N-[3-(1-metilpirolidin-2-ilme- toksi)-5-trifluorometil-fenil]-nikotinamid; N-[1-(2-dimetilaminoaceti- 1)-3,3-dimetil-2,3-dihidro-1H-indol-6-il]-2-(1H-indazol-6-ilamino)-nikotinamid; 2-(1H-indazol-6-ilamino)-N-[3-(pirolidin-2-ilmetoksi)-5-trifluoro- metil-fenil]-nikotinamid; N-(1-acetil-3,3-dimetil-2,3-dihidro-1H-indol- -6-il)-2-(1H-indazol-6-ilamino)-nikotinamid; N-(4,4-dimetil-1-okso-1,2,3,- 4-tetrahidroizokvinolin-7-il)-2-(1H-indazol-6-ilamino)-nikotinamid; N-[4-(tert-butil)-3-(3-piperidilpropil)fenil][2-(1H-indazol-6-ilamino)(3- - piridil)]karboksamid; N-[5-(tert-butil)izoksazol-3-il][2-(1H-indazol-6-ila- mino)(3-piridil)]karboksamid; i N-[4-(tert-butil)fenil][2-(1H-indazol-6- -ilamino)(3-piridil)]karboksamid, i inhibitori kinaze opisani u U.S. Pat. Br.6,258,812; 6,235,764; 6,630,500; 6,515,004; 6,713,485; 5,521,184;

5,770,599; 5,747,498; 5,990,141; U.S. Objava Br. U.S.20030105091; i Publikacija o ugovorima o patentnoj saradnji Br. WO 01/37820; WO 01/32651; WO 02/68406; WO 02/66470; WO 02/55501; WO 04/05279; WO 04/07481; WO 04/07458; WO 04/09784; WO 02/59110; WO 99/45009; WO 98/35958; WO 00/59509; WO 99/61422; WO 00/12089; i WO 00/02871.

[0290] Antigen vezujući protein kakav je ovde obezbeđen takođe se može primeniti u kombinaciji sa inhibitorom faktora rasta. Primeri takvih agenasa, uključuju, ali nisu ograničeni na, agense koji mogu da inhibiraju EGF-R (epidermalni receptor faktora rasta) odgovore, kao što su EGF-R antitela, EGF antitela, i molekule koji su EGF-R inhibitori; VEGF (vaskularni endotelijalni faktor rasta) inhibitori, kao što su VEGF receptori i molekuli koji mogu da inhibiraju VEGF; i erbB2 receptor inhibitori, kao što su organski molekuli ili antitela koja se vezuju za erbB2 receptor, primera radi, HERCEPTIN™ (Genentech, Inc.). EGF-R inhibitori opisani su u, primera radi u U.S. Pat. Br.5,747,498, WO 98/14451, WO 95/19970, i WO 98/02434.

[0291] Specifične primeri kombinacionih terapija uključuju, na primer, c-fms antigen vezujući protein sa taksolom ili takanima (npr., docetaxel ili Taxoter) ili modifikovanim paklitakselom (npr., Abraxane ili Opaxio), doksorubicin i/ili Avastin® za lečenje kancera dojke; humani c-fms antigen vezujući protein sa multi-kinaza inhibitorom, MKI,(Sutent, Nexavar, ili 706) i/ili doksorubicin za lečenje kancera bubrega; cfms antigen vezujući protein sa cisplatinom i/ili radiajacijom za lečenje karcinoma skvamoznih ćelija; cfms antigen vezujući protein sa taksolom i/ili karboplatinom za lečenje kancera pluća.

[0292] Pored primena u onkologiji, vezujući proteini koji su ovde obezbeđeni mogu se koristiti u lečenju ili detektovanju zapaljenske bolesti. Kod ovih zapaljenskih bolesti u kojima makrofagi doprinose patologiji bolesti, sposobnost c-fms antigen vezujućeg proteina da radukuje nivoe makrofaga u drugim ćelijskim odeljcima ukazuje na korisnu ulogu u lečenju ovih bolesti. Nekoliko studija je predložilo da humani c-fms antigen vezujući protein može igrati ulogu u modulisanju zapaljenskih bolesti, poput, primera radi, zapaljenskog artritisa, ateroskleroze, i multipla skleroze.

[0293] Dodatni bolesti koje se mogu tretirati uključuju, ali nisu ograničene na, zapaljensku bolest creva, Kronovu bolest, ulcerozni kolitis, reumatoidni spondilitis, ankilozni spondilitis, artritis, psoriatični artritis, reumatoidni artritis, osteoartritis, ekcem, kontaktni dermatitis, psorijazu, sindrom toksičnog šoka, sepsu, septični šok, endotoksični šok, astmu, hroničnu zapaljensku bolest pluća, silikozu, plućnu sarkoidozu, osteoporozu, restenozu, povredu srčane i renalne reperfuzije, trombozu, glomerulonefritis, dijabetes, reakcija graft vs domaćin, odbacivanje alografta, multipla sklerozu, mišićnu degeneraciju, mišićnu distrofiju, Alchajmerovu bolest i šlog.

[0294] Antigen vezujući proteini takođe se mogu primeniti za tretiranje kaheksije zato što se prozapaljenski citokini proizvedeni od strane makrofaga smatraju uključeni u patologiju kaheksije (Sweet et al., 2002, J. Immunol.168:392-399; Boddaert et al., 2006, Curr. Opin. Oncol.8:335-340 i Wang et al.

2006 J. Endocrinology 190:415-423).

[0295] Uzimajući u obzir sposobnost antigen vezujućeg proteina koji se koristi za tretiranje raznih zapaljenskih bolesti, oni se mogu koristiti ili kombinovati sa raznim drugim anti-zapaljenskim agensima.

Primeri takvih agenasa uključuju, ali nisu ograničeni na TNF-alfa inhibitore kao što su TNF lekovi (npr., HUMIRA™, REMICADE™) i imunoglobulinski molekuli TNF receptora (kao što je ENBREL™), IL-1 inhibitori, receptor antagonisti ili rastvorljivi IL-1ra (npr. Kineret ili ICE inhibitori), COX-2 inhibitori i inhibitori metaloproteaze kao što su oni prethodno opisani, i alfa-2-delta ligandi (npr., PREGABALIN™ i NEUROTIN™).

[0296] U određenom aspektu, antigen vezujući proteini takođe se mogu primeniti za tretiranje raznih bolesti kostiju u pogledu važne uloge c-fms u razvoju osteoklasta i aktivacije (npr., Rolf, F. et al. (2008) J. Biol. Chem.55:340-349, i Watarn, A. et al. (2006) J. Bone Mineral Metabolism 24:274-282). Antigen vezujući proteini prema tome mogu biti korisni za lečenje pacijenata koji boluje od raznih medicinskih poremećaja koji uključuju prekomeran koštani gubitak ili pacijenata kojima je potrebno formiranje nove kosti čak i kada ne mora nužno da postoji prekomerna aktivnost osteoklasta. Prekomerna aktivnost osteoklasta povezana je sa brojnim osteopenim poremećajima koji se mogu tretirati sa antigen vezujućim proteinima koji su obezbeđeni, uključujući ostopeniju, osteoporozu, periodontitis, Pagetovu bolest, koštani gubitak zbog imobilizacije, litičnu metastazu kostiju i artritis, uključujući reumatoidni artritis, psorijazni artritis, ankilozni spondilitis i druga stanja koja uključuju eroziju kostiju. Poznato je da neki kanceri povećavaju aktivnost osteoklasta i indukuju resorpciju kosti, kao što je kancer dojke i prostate. Multiple mijelom, koji se pojavljuje iz koštane srži, takođe je povezan gubitkom kosti.

[0297] Kada se radi o metastazama kancera u kostima, inhibicija CSF-1/c-fms ose kroz upotrebu antigen vezujućeg proteina koji je ovde obezbeđen može biti od terapeutske dobrobiti putem višestrukih mehanizama delovanja. Oni bi mogli da uključuju inhibiciju invazije i metastaza putem gubitka matriks degradirajućih enzima proizvedeni od strane TAM-ova, ometavanje zasejavanja ćelija tumora unutar koštane srži kroz gubitak brojeva i funkcije osteoklasta, inhibiciju metastatičnog rasta tumora kroz prethodno pomenuto smanjenje TAM-ova i inhibiciju koštane osteolize povezane sa metastatičnim koštanim lezijama (Ohno, H. et al.. (2008) Molecular Cancer Therapeutics.5:2634-2643). Antigen vezujući proteini takođe mogu imati terapeutski benefit za osteosarkom, koji predstavlja kancer kostiju.

[0298] Razna druga stanja povezana sa koštanom masom takođe se mogu tretirati razne oblike osteoporoze, uključujući ali ne ograničavajući se na, glukokortikoidom indukovana osteoporoza, osteoporoza indukovana nakon transplantacije, osteoporoza povezana sa hemoterapijom (tj., hemoterapijom indukovana osteoporoza), imobilizacijom indukovana osteoporoza, osteoporoza usled mehaničkog pražnjenja, i osteoporoza povezana sa upotrebom antikonvulzanata. Dodatne bolesti kostiju koje se mogu tretirati uključuju bolest kostiju povezanu sa otkazivanjem bubrega i nutriticione, gastrointestinalne i/ili hepatične bolesti kostiju.

[0299] Različiti oblici artritisa takođe se mogu tretirati, a njegovi primeri uključuju osteoartritis i reumatoidni artritis. Antigen vezujući proteini takođe se mogu primeniti za tretiranje sistemskog koštanog gubitka povezanog sa artritisom (npr., reumatoidni artritis). U lečenju artritisa, pacijentu se može pomoći perilezionim ili intralezionim injekcijama ovih antigen vezujućih proteina. Primera radi, antigen vezujući protein može se injektovati pored ili direktno u upaljeni zglob, čime se stimuliše oporavljanje oštećene kosti na tom mestu.

[0300] Ovde opisani antigen vezujući proteini takođe se mogu primeniti u raznim primenama za oporavak kostiju. Primera radi, oni mogu biti korisni u usporavanju osteolize usled produkata habanja povezane sa veštačkim zglobovima, ubrzavanju oporavka fraktura kostiju, i pojačavanju inkorporisanja koštanih graftova u okružujuću živu kost u koju su presađeni.

[0301] Antigen vezujući proteini koji su ovde obezbeđeni kada se koriste za tretiranje poremećaja kostiju mogu se davati sami ili u kombinaciji sa drugim terapeutskim agensima, primera radi, u kombinaciji sa agensom za tretiranje kancera, sa agensima koji inhibiraju aktivnost osteoklasta ili sa drugim agensima koji pojačavaju aktivnost osteoblasta. Primera radi, antigen vezujući proteini mogu se davati pacijentu koji je oboleo od kancera koji je pod radijacionom terapijom ili hemoterapijom.

Hemoterapija upotrebljena u kombinaciji sa antigen vezujućim proteinima može da uključi antracikline, taksol, tamoksifen, doksorubicin, 5-fluorouracil, oksaloplatin, Velcade® ([(1R)-3-metil-1-[[(2S)-1-okso-3-fenil-2-[(pirazinilkarbonil) amino]propil]amino]butil] boronsku kiselinu) i/ili druge lekove malog molekula koji se primenjuju u lečenju kancera.

[0302] Antigen vezujući proteini mogu se koristiti samo za lečenje prethodno navedenih stanja koja rezultiraju u gubitku koštane mase ili u kombinaciji sa terapeutski efektivnim količinama (anabolički) agensa za promovisanje rasta kostiju ili agensa za koštanu antiresorpciju koji uključuju ali se ne ograničavaju na: koštane morfogene faktore označene sa BMP-1 do BMP-12; transformišući faktor rastaβ i TGF-β familje; fibroblast faktori rasta FGF-1 do FGF-10; interleukin-1 inhibitori (uključujući EL-1ra, antitela za IL-1 i antitela za IL-1 receptore); TNFα inhibitori (uključujući etanercept, adalibumab i infliksimab); RANK ligand inhibitori (uključujući rastvorljivi RANK, osteoprotegerin i antagonistička antitela koja se specifično vezuju za RANK ili RANK ligand), Dkk-1 inhibitori (npr., anti-Dkk-1 antitela) paratiroidni hormon, prostaglandini E serije, bisfosfonate i koštano-pojačivačke minerale kao što je fluorid i kalcijum. Anabolički agensi koji se mogu primeniti u kombinaciji sa antigen vezujućim proteinima i njihovim funkcionalnim fragmentima uključuju parathiroidni hormon i insulin-nalik faktor rasta (IGF), gde je taj agens poželjno dopunjen sa IGF vezujućim proteinom. IL-1 receptor antagonist pogodan za takva kombinaciona lečenja opisan je u WO89/11540, a pogodan rastvorljivi TNF receptor-1 opisan je u WO98/01555. Primerni RANK ligand antagonisti opisani su, primera radi, u WO 03/086289, WO 03/002713, U.S. Patenti Br.6,740,511 i 6,479,635.

[0303] Antigen vezujući proteini takođe se mogu primeniti za inhibiranje angiogeneze (npr., kod tumora). Primera radi, antigen vezujući proteini mogu se koristi za snižavanje formiranja krvnih sudova u slučajevima u kojima je zapaljenska angiogeneza pogonjena primarno od strane FGF-2. U nekim aspektima, antigen vezujući proteini se koriste za inhibiranje angiogeneze u tumorima u kojima su VEGF nivoi niski, a vaskularna gustina tumora visoka.

Dijagnostički Postupci

[0304] Opisani antigen vezujući proteini mogu se koristiti u dijagnostičke svrhe da detektuju, dijagnostikuju ili prate bolesti i/ili stanja povezan sa c-fms. Opisani su obezbeđeni za detektovanje prisustva c-fms u uzorku upotrebom klasičnih imunohistoločkih postupaka poznati stručnjacima iz ove oblasti (npr., Tijssen, 1993, Practice and Theory of Enzime immunoassays, Vol 15 ( npr.,Tijssen, 1993, Practice and Theory of Enzyme Immunoassays, Vol 15 (Eds R.H. Burdon and P.H. van Knippenberg, Elsevier, Amsterdam); Zola, 1987, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, pp.147-158 (CRC Press, Inc.); Jalkanen et al., 1985, J. Cell. Biol.101:976-985; Jalkanen et al., 1987, J. Cell Biol.105:3087-3096). Detektovanje c-fms može se izvesti in vivo ili in vitro.

[0305] Dijagnostičke primene koje su ovde obezbeđene uključuju upotrebu antigen vezujućeg proteina za detektovanje ekspresije c-fms i vezivanje liganada za c-fms. Primeri postupaka korisnih u detektovanje peisustva c-fms uključuju imunooglede, kao što je enzim vezani imunosorbentni ogled (ELISA) i radioimunoogled (RIA).

[0306] Za dijagnostičke primene, antigen vezujući protein tipično je obeležen detektabilnom obeležavajućom grupom. Pogodne obeležavajuće grupe uključuju, ali nisu ograničene na, sledeće: radioizotopi ili radionuklidi (npr.,<3>H,<14>C,<15>N,<35>S,<90>Y,<99>Tc,<111>In,<125>I,<131>I), fluorescentne grupe (npr., FITC, rodamin, lantanid fosfori), enzimatske grupe (npr., peroksidaza rena, β-galaktosidaza, luciferaza, alkalin fosfataza), hemiluminescentne grupe, biotinil grupe, ili preodređeni polipeptidni epitopi prepoznati od strane sekundarnog reportera (npr., par sekvenci Leucinskog zatvarača, vezivajuća mesta za sekundarna antitela, metal vezujući domeni, epitopne oznake). U nekim primerima izvođenja, grupa za obeležavanje je kuplovana sa antigen vezujućim proteinom putem razmakivačkih kraka raznih dužina kako bi se redukovala potencijalna sterična prepreka. Razni postupci za obeležavanje proteina poznati su u struci i mogu se primeniti.

[0307] U još jednom aspektu, antigen vezujući protein može se koristi za identifikovanje ćelije ili ćelije koja eksprimira c-fms. U specifičnom aspektu, antigen vezujući protein je obeležen grupom za obeležavanje i detektuje se vezivanje obeleženog antigen vezujućeg proteina za c-fms. U daljem specifičnom primeru izvođenja, vezivanje antigen vezujućeg proteina za c-fms detektuje se in vivo. U daljem specifičnom aspektu, c-fms antigen vezujući protein je izolovan i izmeren upotrebom tehnike poznate u struci. Videti, primera radi, Harlow and Lane, 1988, Antibody: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor (ed.1991 i periodic supplements); John E. Coligan, ed., 1993, Current Protocols In Immunology New York: John Wiley & Sons.

[0308] Još jedan ovde opisani aspekt obezbeđen je za detektovanje prisustva test molekula koji ulazi u kompeticiju za vezivanje za c-fms sa obezbeđenim antigen vezujućim proteinima. Primer jednog takvog ogleda uključuje detektovanje količine slobodnog antigen vezujućeg proteina u rastvoru koji sadrži količinu c-fms u prisustvu ili odsustvu test molekula. Povećanje količine slobodnog antigen vezujućeg proteina (tj., antigen vezujućeg proteina koji nije vezan za c-fms) ukazuje da je test molekul sposoban da uđe u kompeticiju za c-fms vezivanje sa antigen vezujućim proteinom. U jednom aspektu, antigen vezujući protein je obeležen obelećavajućom grupom. Alternativno, test molekul je obeležen, a količina slobodnog test molekula prati se u prisustvu i odsustvu antigen vezujućeg proteina.

Postupci Lečenja: Farmaceutske formulacije, Putanje davanja

[0309] Postupci upotrebe antigen vezujućih proteina takođe su obezbeđeni. U nekim postupcima, antigen vezujući protein obezbeđen je pacijentu. Antigen vezujući protein inhibira vezivanje CSF-1 sa humanim c-fms. Davanje antigen vezujućeg proteina u nekim postupcima takođe može inhibirati autofosforilaciju humanog c-fms inhibiranjem vezivanja CSF-1 sa humanim c-fms. Dalje, u određenim postupcima, monocitna hemotaksa redukovana je davanjem efektivne količine najmanje jednog antigen vezujućeg proteina pacijentu. Migracija monocita u tumore u nekim postupcima inhibira se davanjem efektivne količine antigen vezujućeg proteina. Dodatno, akumulacije makrofaga povezane sa tumorom u nekom tumoru ili bolesnim tkivu može se inhibirati davanjem antigen vezujućeg proteina kakav je ovde obezbeđen.

[0310] Farmaceutske kompozicije koje obuhvataju terapeutski efektivne količine jednog ili više antigen vezujućih proteina i farmaceutski prihvatljiv razblaživač, nosač, sredstva za poboljšanje rastvaranja, emulzifikatora, prezervativ, i/ili adjuvans takođe su obezbeđeni. Dodatno, postupci lečenja pacijenta davanjem takve farmaceutske kompozicije takođe su uključeni. Izraz "pacijent" uključuje humane pacijente.

[0311] Prihvatljivi formulacioni materijali su netoksični za primaoca u dozama i koncentracijama koje se upošljavaju. U specifičnim primerima izvođenja, obezbeđene su farmaceutske kompozicije koje obuhvataju terapeutski efektivne količine humanog c-fms antigen vezujući proteina.

[0312] U određenim primerima izvođenja, prihvatljivi formulacioni materijali poželjno su netoksični za primaoca pri dozama i koncentracijama koje se upošljavaju. U određenim primerima izvođenja, farmaceutska kompozicija može da sadrži formulacione materijale za modifikovanje, održavanje ili prezervaciju, primera radi, pH, osmolarnosti, viskoznosti, bistroće, boje, izotoničnosti, mirisa, sterilnosti, stabilnosti, brzine rastvaranja ili oslobađanja, apsorpcije ili prodiranja kompozicije. U takvim primerima izvođenja, pogodni formulacioni materijali uključuju, ali nisu ograničeni na, aminokiseline (kao što je glicinska, glutaminska, asparaginska, argininska ili lizinska); antimikrobna sredstva; antioksidansi (kao što je askorbinska kiselina, natrijum sulfit ili natrijum hidrogen-sulfit); puferi (kao što su borat, bikarbonat, Tris-HCl, citrati, fosfati ili druge organske kiseline); agensi punjenja (kao što je manitol ili glicin); helirajući agensi (kao što je etilendiamin tetrasirćetna kiselina (EDTA)); agensi za formiranje kompleksa (kao što je ckafein, polivinilpirolidon, beta-ciklodekstrin ili hidroksipropil-beta-ciklodekstrin); punioci; monosaharidi; disaharidi; i drugi ugljenohidrati (kao što je glukoza, manoza ili dekstrini); proteini (kao što je serum albumin, želatin ili imunoglobulini); boje, arome i agensi za razblaživanje; emulzifikatori; hidrofilni polimeri (kao što je polivinilpirolidon); polipeptidi male molekularne mase; so-formirajući kontrajoni (kao što je natrijum); prezervativi (kao što je benzalkonijum hlorid, benzojeva kiselina, salicilnac kiselina, timerosal, fenetil alkohol, metilparaben, propilparaben, hlorheksidin, sorbinska kiselina ili hidrogen peroksid); rastvarači (kao što je glicerin, propilen glikol ili polietilen glikol); alkoholi šećera (kao što je manitol ili sorbitol); agensi za suspendovanje; surfaktanti ili ovlaživači (kao što je pluronici, PEG, sorbitan estri, polisorbati kao što je polisorbat 20, polisorbat, triton, trometamin, lecitin, holesterol, tiloksapal); agensi za pojačavanje stabilnosti (kao što je saharoza ili sorbitol); agensi za pojačavanje toničnosti (kao što su halogenidi alkalnih metala, poželjno natrijum ili kalijum hlorid, manitol sorbitol); nosači za dostavu; razblaživači; ekscipijensi i/ili farmaceutski adjuvansi. Videti, REMINGTON’S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 18" Edition, (A.R. Genrmo, ed.), 1990, Mack Publishing Company.

[0313] U određenim primerima izvođenja, optimalna farmaceutska kompozicija biže određena od strane stručnjaka u zavisnosti od, primera radi, nameravane putanje davanja, formata dostave i željene doze. Videti, primera radi, REMINGTON’S PHARMACEUTICAL SCIENCES, gore. U određenom aspektu, takve kompozicije mogu da utiču na fizičko stanje, stabilnost, brzinu in vivo oslobađanja i brzinu in vivo klirensa opisanog antigen vezujućeg proteina. U određenim primerima izvođenja, primarni prenosilac ili nosač u farmaceutskoj kompoziciji može biti ili vodene ili nevodene prirode. Primera radi, pogodan prenosilac ili nosač mogu biti voda za injektovanje, fiziološki slani rastvor ili veštačka cerebrospinalna tečnost, moguće dopunjen sa drugim materijalima uobičajenim u kompozicijama za parenteralno davanje. Neutralni puferovani slani rastvor ili slani rastvor pomešan sa serumskim albuminom predstavljaju dalje primere prenosilaca. U specifičnim primerima izvođenja, farmaceutske kompozicije obuhvataju Tris pufer od oko pH 7.0-8.5, ili acetatni pufer od oko pH 4.0-5.5, i mogu dalje da uključuju sorbitol ili pogodnu zamenu. U određenom aspektu, kompozicije humanog c-fms antigen vezujućeg proteina mogu se pripremiti za skladištenje mešanjem odabrane kompozicije sa željenim stepenom čistoće sa opcionim formulacionim agensima (REMINGTON’S PHARMACEUTICAL SCIENCES, gore) u obliku liofilizovanog kolača ili vodenog rastvora. Dalje, u određenom aspektu, humani c-fms antigen vezujući protein mo-e biti formulisan kao liofilizat upotrebom pogodnog ekscipijensa kao što je

[0314] Farmaceutske kompozicije mogu biti odabrane za perenteralnu dostavu. Alternativno, te kompozicije mogu biti odabrane za inhalaciju ili dostavu putem digestivnog trakta, kao što je oralno. Pripremanje takvih farmaceutski prihvatljivih kompozicija nalazi se u okviru sposobnosti stručnjaka iz ove oblasti.

[0315] Formulacione komponente prisutne su poželjno u koncentracijama koje su prihvatljive za mesto davanja. U određenim primerima izvođenja, puferi koji se koriste za održavanje u kompoziciji pri fiziološkoj pH ili neznatno nižoj pH, tipično unutar pH opsega od kko 5 do oko 8.

[0316] Kada se utvrdi parenteralno davanje, terapeutske kompozicije mogu biti obezbeđene u obliku oslobođenom od pirogena, parenteralnog prihvatljivog vodenog rastvora koji obuhvata željeni humani cfms antigen vezujući protein u farmaceutski prihvatljivom prenosiocu. Određenije pogodan prenosilac za parenteralne injekcije su sterilna u kojoj je humani c-fms antigen vezujući protein formulisan kao sterilni, izitinični rastvor, pravilno sačuvan. U određenim primerima izvođenja, pripremanje može da uključi formulaciju željenog molekula sa agensom, kao što su injektabilne mikrosfere, bio-erodibiln čestice, polimerna jedinjenja (kao što je polilaktička kiselina ili poliglikolna kiselina), perlice ili lipozomi, koji mogu da obezbede kontrolisano ili produženo oslobađanje proizvoda koji se može dostaviti putem depo injektovanja. U određenim primerima izvođenja, hijaluronska kiselina takođe se može koristiti, sa efektom promovisanja produženog trajanja u cirkulaciji. Implantacioni uređaji za dostavu leka mogu se koristiti za uvođenje željenog antigen vezujućeg proteina.

[0317] Određene farmaceutske kompozicije formulisane su za inhalaciju. U nekim primerima izvođenja, humani c-fms antigen vezujući proteini formulisani su kao suvi, inhalacioni prah. U specifičnim aspektima, inhalacioni rastvori humanog c-fms antigen vezujućeg proteina takođe se mogu formulisati sa propelantom za aerosolnu dostavu. U određenim primerima izvođenja, rastvori mogu biti nebulizovani. Davanje preko pluća i njihovi formulaconi postupci dalje su opisani u Međunarodnoj Patentnoj Prijavi objavljenoj kao WO 94/20069 A1 koja opisuje dostavu preko pluća hemijski modifikovanih proteina. Neke formulacije mogu se davati oralno. Humani c-fms antigen vezujući proteini koji se daju na ovaj način mogu se formulisati sa ili bez nosača koji se uobičajeno koriste u izrađivanju čvrstih doznih oblika kao što su tablete i kapsule. U određenim primerima izvođenja, kapsula može biti napravljena da oslobađa aktivni deo formulacije u tački u gastrointestinalnom traktu kada je biodostupnost maksimizirana, a pred-sistemska razgradnja minimizirana. Dodatni agensi mogu biti uključeni kako bi se olakšala apsorpcija humanog c-fms antigen vezujućeg proteina. Razblaživači, arome, voskovi niske tačke topljenja, biljna ulja, maziva, agensi za suspendovanje, agensi za razgradnju tableta, i veziva takože mogu biti uposleni.

[0318] Neke farmaceutske kompozicije obuhvataju efektivnu količinu jednog ili više humanih c-fms antigen vezujućih proteina u mešavini sa ne-toksičnim ekscipijensima koji su pogodni za proizvodnju tableta. Ratvaranjem tableta u sterilnoj vodi, ili nekom drugom pogodnom prenosiocu, rastvori mogu biti pripremljeni u jediničnom doznom obliku. Pogodani ekscipijensi uključuju, ali nisu ograničeni na, inertne razblaživače, kao što je kalcijum karbonat, natrijum karbonat ili bikarbonat, laktoza, ili kalcijum fosfat; ili vezivajući agensi, kao što je skrob, želatin, ili akacia; ili agensi za podmazivanje kao što je magnezijum stearat, sterainska kiselina, ili talk.

[0319] Dodatne farmaceutske kompozicije biže očigledne stručnjaku, uključujući formulacije koje uključuju humane c-fms antigen vezujuće proteine u formulacijama sa produženom ili kontrolisanom dostavom. Tehnike formulisanja različitih sredstava za produženu ili kontrolisanu dostavu, kao što je lipozomski nosači, bio-erodiblne mikročestice ili porozne perlice i depo injekcije, takođe su poznate stručnjacima. Videti, primera radi, Međunarodnu Patentnu Prijavu objavljena kao Br. WO 93/15722 A1 koja opisuje kontrolisano oslobađanje poroznih polimernih mikročestica za dostavu farmaceutskih kompozicija. Prepearati sa produženim oslobađanjem mogu da uključuju polupropusne polimerne matrice u obliku oblikovanih produkata, npr., filmovi, ili mikrokapsule. Matrice sa produženim oslobađanjem mogu da uključuju poliestere, hidrogelove, polilaktide (kako je opisano u U.S. Patentu Br.

3,773,919 i Objavi Evropske Prijave Patenta Br. EP 058481), kopolimere L-glutaminske kiseline i gama etil-L-glutamat (Sidman et al., 1983, Biopolymers 2:547-556), poli (2-hidroksietil-inethakrilat) (Langer et al., 1981, J. Biomed. Mater. Res.15:167-277 i Langer, 1982, Chem. Tech.12:98-105), etilen vinil acetat (Langer et al., 1981, gore) ili poli-D(-)-3-hidroksibutirna kiselina (Objava Evropske Prijave Patenta Br. EP 133,988). Kompozicije sa produženim oslobađanjem takođe mogu da uključuju lipozome koji se mogu pripremiti bilo kojim od nekoliko postupaka poznatih u struci. Videti, npr., Eppstein et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.82:3688-3692; Objave Evropskih Prijava Patenata Br. EP 036,676; EP 088,046 i EP 143,949.

[0320] Farmaceutske kompozicije koje se koriste za in vivo davanje tipično su obezbeđene kao sterilni preparati. Sterilizacija se može izvesti filtriranjem kroz sterilne filtracione membrane. Kada je kompozicija liofilizovana, sterilizacija upotrebom ovog postupka može se sprovesti ili pre ili nakon liofilizacije i rekonstitucije. Kompozicije za parenteralno davanje mogu se uskladištiti u liofilizovanom obliku ili u rastvoru. Parenteralne kompozicije generalno su smeštene u kontejner sa sterilnim pristupnim portom, primera radi, kesica ili bočica sa intravenoznim rastvorom sa stoperom koji se može probušiti hipodermnom injekcionom iglom.

[0321] U određenom aspektu, ćelije koje eksprimiraju rekombinantni antigen vezujući protein kakav je ovde opisan, enkapsulirane su za dostavu (videti, Invest. Ophthalmol Vis Sci 43:3292-3298, 2002 i Proc. Natl. Acad. Sciences 103:3896-3901, 2006).

[0322] U određenim formulacijama, antigen vezujući protein ima koncentraciju od najmanje 10 mg/ml, 20 mg/ml, 30 mg/ml, 40 mg/ml, 50 mg/ml, 60 mg/ml, 70 mg/ml, 80 mg/ml, 90 mg/ml, 100 mg/ ml ili 150 mg/ml. Neke formulacije sadrže pufer, saharozu i polisorbat. Primer formulacije je jedna koja sadrži 50-100 mg/ml antigen vezujućeg proteina, 5-20 mM natrijum acetata, 5-10% w/v saharoze, i 0.002 - 0.008% w/v polisorbata. Određenije, formulacije, na primer, sadrže 65-75 mg/ml antigen vezujućeg proteina u 9-11 mM natrijum acetatnom puferu, 8-10% w/v saharoze, i 0.005-0.006% w/v polisorbata. pH određenih takvih formulacija je u opsegu od 4.5-6. Ostale formulacije imaju pH od 5.0-5.5 (npr., pH od 5.0, 5.2 ili 5.4).

[0323] Kada je farmaceutska kompozicija formuilisana, ona se može odložiti u sterilne bočice kao rastvor, suspenzija, gel, emulzija, čvsrta materija, kristal, ili kao dehidrirani ili liofilizovani prah. Takve formulacije mogu se odložiti ili u obliku koji je odmah spreman za upotrebu ili u obliku (npr., liofilizovanom) koji se rekonstituiše pre davanja. Kitovi za proizvodnju jedno-dozne jedinice za davanje takođe su obezbeđeni. Određeni kitovi sadrže prvi kontejner sa isušenim proteinom i drugi kontejner sa vodenom formulacijom. U određenim primerima izvođenja, obezbeđeni su kitovi koji sadrži prethodno napunjenje špriceve za jednomcili više komora (npr., šriceve sa tečnošću i špriceve sa liofilizovanim materijalom). Terapeutski efektivne količine farmaceutske kompozicije koja sadži humani c-fms antigen vezujući protein koje se upošljavaju, zavisiće od, primera radi, terapeutskog konteksta i ciljeva.

Stručnjaku će biti jasno da će pogodni dozni nivoi za lečenje varirati u zavisnosti od, delom, molekula koji se dostavlja, indikacije za koju se koristi humani c-fms antigen vezujući protein, putanje davanja, i veličine (telesna masa, površina tela ili veličina organa) i/ili stanja (starost i opšte zdravlje) pacijenta. Kliničar može titerovati dozu i modifikovati putanju davanja kako bi obezbedio optimalan terapeutski efekat.

[0324] Tipičan dozni opseg može se kretati od oko 1 µg/kg to pa do oko 30 mg/kg ili više, u zavisnosti od ovde pomenutih faktora. U specifičnim primerima izvođenja, dozna može varirati od 10 µg/kg pa do oko 30 mg/kg, opciono od 0.1 mg/kg pa do oko 30 mg/kg, alternativno od 0.3 mg/kg pa do oko 20 mg/kg. U nekim primenama, doza je od 0.5 mg/kg do 20 mg/kg. U nekim slučajevima, antigen vezujući protein je doziran pri 0.3 mg/kg, 0.5mg/kg, 1 mg/kg, 3 mg/kg, 10 mg/kg, ili 20 mg/kg. Dozni raspored u nekim režimima lečenja je u dozi od 0.3 mg/kg qW, 0.5mg/kg qW, 1 mg/kg qW, 3 mg/kg qW, 10 mg/kg qW, ili 20 mg/kg qW.

[0325] Učestalost doziranja zavisiće od farmakokinetičkih parametara određenog humanog c-fms antigen vezujućeg proteina u formulaciji koja se koristi. Tipično, kliničar daje kompoziciju dok se ne postigne doza koja postiže željeni efekat. Kompozicija prema tome može da se daje kao pojedinačna doza, ili kao dve ili više doza (koje mogu i ne moraju da sadrže istu količinu željenog molekula) tokom određenog vremena, ili kao kontinualna infuzija putem implantacionog uređaja ili katetera. Pogodne doze mogu se utvrditi kroz upotrebu odgovarajućih podataka doznog odgovora. U određenom aspektu, antigen vezujući proteini mogu se davati pacijentu tokom produženog vremenskog perioda. Hronično davanje antigen vezujućeg proteina minimizira štetan imuni ili alergijski odgovor ubičajeno povezan sa antigen vezujućim proteinima koji nisu potpuno humani, na primer antitelo koje je uzgajano protiv humanog antigena u ne-humanoj životinji, primera radi, ne-potpuno humano antitelo ili ne-humano antitelo proizvedeno u ne-humanim vrstama.

[0326] Putanja davanja farmaceutske kompozicije je u skladu sa poznatim postupcima, npr., oralno, putem ubrizgavanjem intravenoznim, intraperitonealnim, intracerebralnim (intra-parenhimski), intracerebroventrikularnim, intramuskularnim, intra-okularnim, intraarterijalnim, intraportalnim, ili intralezionim putanjama; pomoću sistema sa produženim oslobađanjem ili pomoću implantacionih uređaja. Kompozicije se mogu davati bolus injekcijom ili kontinulano infuzijom, ili implantacionim uređajem.

[0327] Kompozicija se takođe može dati lokalno putem implantacije membrane, sunđera ili nekog drugog pogodnog materijala na koji se željeni molekul apsorbovan ili enkapsuliran. Kada se koristi implantacioni uređaj, taj uređaj može biti implantiran u bilo koje pogodno tkivo ili organ, a dostava željenog molekula može biti putem difuzionog, vremesnki-oslobađajućeg bolus, ili kontrinulanog davanja.

[0328] Takođe može biti poželjno da se upotrebe farmaceutske kompozicije humanog c-fms antigen vezujućeg proteina u skladu sa opisanim ex vivo. U takvim slučajevima, ćelije, tkiva ili organi koji su uklonjeni iz pacijenta, izloženi su farmaceutskim kompozicijama sa humanim c-fms antigen vezujućim proteinom nakon čega se ćelije, tkiva i/ili organi naknadno implantiraju nazad u pacijenta.

[0329] Određenije, humani c-fms antigen vezujući proteini mogu se dostaviti implantiranjem određenih ćelija koje su genetski dzajnirane, upotrebom postupaka kao što su oni opisani ovde, kako bi se eksprimirao i izlučio polipeptid. U određenom aspektu, takve ćelije su ćelije za upotrebu u postupcima lečenja, i mogu biti životinjske ili humane ćelije, i mogu biti autologne, heterologne, ili ksenogene. U određenom aspektu, ćelije mogu biti obesmrćene. U drugim aspektima, kako bi se smanjila šansa za imunološki odgovor, ćelije mogu biti enkapsulirane kako bi se zaobišla infiltracija okružujućeg tkiva. U daljim aspektima, enkapsulirajući materijali tipično su biokompatibilne, polu-propusne polimerne kapusle ili membrane koje omogućavaju oslobađanje proteinskog proizvoda(a), ali sprečavaju destrukciju ćelija od strane imunog sistema pacijenta ili od strane drugih štetnih faktora iz okružujućeg tkiva.

[0330] Sledeći primeri, uključujući sprovedene eksperimente i postignuti rezultati, obezbeđeni su samo u ilustrativne svrhe.

PRIMERI

Ogledi

AML-5 Ogledi

[0331] Kako bi se odredilo da li se antitela usmerena protiv c-fms mogu vezati i pokazati funkcionalnu aktivnost u blokiranju c-fms/CSF-1 ose, izveden je bioogled na bazi ćelija. Ovaj ogled kvantitativno meri CSF-1-pogonjenu proliferaciju humane mijelomonocitne ćelijske linije zavisne od faktora rasta, AML5 (University Health Nedvark, Toronto, Ontario). Tako, ovaj ogled meri inhibiciju te proliferacije uvođenjem agenasa koji blokiraju tu putanju. U ovom ogledu, AML-5 ćelije inkubirane su sa 10 ng/ml CSF-1 u prisustvu antitelo opadajuće koncentracije. Nakon 72 sata, proliferacija ćelija izmerena je upotrebom Alamar Plavo™ (Biosource), indirektno merenje proliferacije na osnovu metaboličke aktivnosti ćelija.

Ispitivanja koštane srži

[0332] U sličnom ogledu za određivanje da li antitela mogu ući u unakrsnu reakciju sa c-fms cinomolgus majmuna, antitela su testirana u CSF-1-pogonjenoj proliferaciji monocitnih ćelija iz primarne koštane srži majmuna. Slično AML-5 proliferacionom ogledu, ćelije cinomolgus koštane srži inkubirane su sa 10 ng/ml CSF-1 u prisustvu antitela opadajuće koncentracije. Nakon 72 sata, proliferacija ćelija izmerena je upotrebom Alamar Plavo.

Klonovi antitela korišćeni u eksperimentima

[0333] Sledeći eksperimenti uključuju upotrebu tri klona antitela, označeni kao 1.109, 1.2, 2.360, koji su svi tetrameri uključujući dva kompletno teška i dva kompletno laka lanaca. Klon 1.109 obuhvata dva teški lanca H1 (SEQ ID NO:4) i dva laka lanca L1 (SEQ ID NO:36), klon 1.2 obuhvata dva teška lanca H8 (SEQ ID NO:11) i dva laka lanca L8 (SEQ ID NO:43), i klon 2.360 obuhvata dva teška lanca H24 (SEQ ID NO:27) i dva laka lanca L22 (SEQ ID NO:57).

Primer 1: Pripremanje C-fms Hibridoma

[0334] Primeri izvođenja mogu da uposle XenoMouse® tehnologiju kako bi se razvila potpuno humana monoklonalna antitela usmerena protiv humanog c-fms. U cilju imunizacije, c- fms-Fc, humani c-fms ekstracelularni domen (ostaci 1-512, videti, FIG.8; SEQ ID: 1) sa C-terminalnim humanim Fc domenom je uposlen. Dodatno, c-fms-LZ, humani c-fms ekstracelularni domen (ostaci 1-512) sa C-terminalnim domenom Leucinskog zatvarača (Amgen Lot #45640-43) i 293T/c-fms ćelijska linija, humani adenovirus tip 5-transformisana humana embrionska ćelijska linija bubrega transfektovana sa humanim c-fms pune dužine, upotrebljeni su za skrinovanje anti-c-fms antitela.

[0335] Kohorta 1 (IgG1) i kohorta 2 (IgG2) XenoMice® imunizovane/dopunjene su sa c-fms-Fc. Titri seruma izmereni su enzim-vezanim imunoapsorpcioni ogled (ELISA), a slezine iz obe kohorte 1 i 2 miševa fuzionisane su za generisanje hibridoma. Rezultujući poliklonalni supernatanti skrinovani su za vezivanje sa c-fms-LZ pomoću ELISA i 293T/c-fms ćelija tehnologijom fluorometrijskog mikrozapreminskog ogleda (FMAT). Ukupno 828 positivnih supernatanata testirano je za inhibiciju CSF-1 vezivanja za c-fms/293T ćelije fluorescencijom-aktiviranog ćelijskog sortiranja (FACS). Rezultujući 168 pozitivni supernatanti dalje su testirani za inhibiciju CSF-1-indukovane proliferacije ćelije akutne mijelogene leukemije (AML)-5. Na osnovu skrininga, 33 hibridoma je identifikovano kao antagonistično ka CSF-1 aktivnosti i odabrano ili klonirano.

Primer 2: Karakterizacija anti-C-fms hibridoma

[0336] Od 33 odabrana hibridoma, 29 (19 IgG1 i 10 IgG2 izotipovi) je sukcesivno klonirano, a supernatanti ovih klonova testirani su na inhibiciju CSF-1 vezivanja za 293T/c-fms ćelije i inhibiciju CSF-1 indukovane proliferacije AML-5 ćelija. Biacore ogled vezivanja niske rezolucije upotrebom monomernog c-fms proteina ukazuje da je KDovih 29 anti-c-fms hibridoma u opsegu od 0.1-43 nM (videti TABELU 8). Anti-humani IgG je imobilisan na sve četiri ćelije toka senzorskog čipa upotrebom aminskog kuplovanja. Sirovi hibridom uzorci razblaženi su na polovine i zarobljeni na anti-IgG površini. Monomerni c-fms (ostaci 1-512)-pHis je analit pri koncentraciji od 125 nM. Analize linija sekvenci takođe su izvedene na 29 hibridoma (videti, FIG.2).

TABELA 8: Rezultati Biacore vezivanja niske rezolucije za anti-C-fms hibridome

[0337] Na osnovu ogleda inhibicije vezivanja i inhibicije proliferacije, 16 od 29 supernatanata (jedanaest IgG1 i pet IgG2 izotipova) odabrani su za dalju karakterizaciju. Unakrsna-reaktivnost na mišji i cinomolgus c-fms testirana je inhibicijom CSF-1-indukovane proliferacije mišje DRM ( ras- i mycobesmrćenih monocitnih ćelijskih linija izvedenih iz Dexter tipa kulture mišje koštane srži) ćelije i primarne ćelije cinomolgus koštane srži, respektivno. U pogledu proliferacije ćelija, ni jedan od supernatanata nije inhibirao proliferaciju mišjih DRM ćelija (podaci nisu prikazani) dok je 13 od 16 supernatanata inhibiralo proliferaciju ćelija cinomolgus koštane srži. Supernatanti su takođe testirani na inhibiciju CSF-1-indukovane proliferacije CD14<+>monocita izvedenih iz humane periferne krvi i ponovo testirani u humanom AML-5 bioogledu (videti sekciju Ogled iznad), čiji su rezultati prikazani na TABELAMA 9 i 10.2-4A5 antitelo (Biosource), koje je anti-humanu c-fms antitelo pacova, korišćeno je kao pozitivna kontrola.

[0338] Četiri IgG1izotipa antitela imalo je <10 pM potenciju u AML-5 bioogledu, a troje od antitela, Klon ID Br.1.2.1, 1.109.3, i 1.134.1, inhibirali su proliferaciju ćelija cinomolgus koštane srži. Od troje antitela, klonovi 1.2.1 i 1.109.3 imali su najveći afinitet za c-fms u Biacore ogledu vezivanja. Dva IgG2izotip antitela, 2.103.3 i 2.360.2, pokazala su veliku potenciju u ogledima AML-5 i cinomolgus koštane srži, i slične afinitete za c-fms u Biacore ogledu. Pet antitela koja su pokazala veliku potenciju u bioogledima AML-5 i cinomolgus koštane srži takođe su pokazala različitost u sekvenci. Na osnovu ovih faktora potencije, afiniteta, i različitosti, klonovi 1.2.1, 1.109.3, i 2.360.2 odabrani su za dodatni razvoj i karakterizaciju.

TABELA 9: Kratak pregled rezultata bioogleda za anti-C-fms hibridom supernatante

NA = Bez aktivnosti, nisu ušli u unakrsnu reakciju; *ND = Nezavršeni ;TABELA 10: Sinopsis rezultata bioogleda za anti-c-fms hibridom supernatante ; ; ;;; Primer 3: Ekspresija i karakterizacija antitela ;[0339] Geni teškog i lakog lanca za klonove antitela 1.2, 1.109, i 2.360 izolovani su i klonirani u konstruktima za ekspresiju kao IgG2teški lanci i kapa laki lanci. Antitela su eksprimirana tranzijentnom ekspresijom u COS/PKB ćelijama i prečišćene Protein A hromatografijom. Prinosi antitela iznosili su 3.6 -7.4 mg/l, što je unutar očekivanog opsega za ovaj ekspresioni sistem. ;;[0340] Aktivnost kloniranih antitela i hibridom-eksprimiranih antitela poređene su u AML-5 proliferacionom ogledu. AML-5 ćelije inkubirane su sa 10 ng/ml CSF-1 u prisustvu antitela opadajuće koncentracije. Nakon 72 sata, proliferacija ćelija izmerena je upotrebom Alamar Plavo (videti, FIG.3). Rekombinantna antitela pokazuju sličnu neutrališuću aktivnost kao hibridom supernatanti, a konverzija 1.2 i 1.109 iz IgG1 do IgG2 nije imala značajan efekat. Rekombinantna antitela takođe pokazuju dobru neutrališući aktivnost u cinomolgus proliferacionom ogledu kako je prikazano na FIG.4. Slično AML-5 proliferacionom ogledu, ćelije cinomolgus koštane srži inkubirane su sa 10 ng/ml CSF-1 u prisustvu antitela opadajuće koncentracije. Nakon 72 sata, proliferacija ćelija izmerena je upotrebom Alamar Plave. ;;[0341] Karakterizacija prečišćenih antitela pomoću SDS-PAGE i ekskluzione hromatografije na osnovu veličine (SEC) dala je tipične rezultate, sa izuzetkom od klona 1.109 lakog lanca, koji je migrirao dalje od očekivanog u SDS-PAGE. Ovaj izuzetak nije nio neočekivan jer je sekvenca N-vezanog glikozilacionog mesta pretjodno zabeležena u CDR1. Veća od očekivane migracije ukazala je da je ovo glikozilaciono mesto zauzeto. ;;[0342] N-terminalno sekvencioniranje antitela potvrđeno je da su signalni peptidi obrađeni kako je očekivano i da su N-terminalni glutamin ostaci teškog lanca vrlo verovatno ciklizovani u piroglutaminsku kiselina kako je i očekivano. Masena spektometrija izvedena je na pojedinačnim lancima antitela praćeno enzimatskom deglikozilacijom. Mase teških lanaca potvrdile su da su ostaci N-terminalnog glutamina ciklizovani u piroglutaminsku kiselinu i da su C-terminalni lizinski ostaci bili odsutni. Nisu primećene nikakve druge post-translacione modifikacije. Mase lakih lanaca klona 1.2 SM i 2.360 potvrdile su da su netaknuti bez post-translacionih modifikacija. Masa nije dobijena za laki lanac klona 1.109, verovatno jer je glikozilaciono mesto bilo otporno na enzimatsko uklanjanje te prema tome nije bilo moguće dobiti tačnu masu. ;;Primer 4: Korekcija somatskih mutacija (SM-je) ;[0343] Poređenje sekvenci IgG2 klona 1.2, 1.109 i 2.360 antitela sa poznatom sekvencom klične linije otkrila je sledeće somatske mutacije, kako je prikazano u TABELI 11, pri čemu je numeracija u tabeli u odnosu na zrelu sekvencu kako je prikazano na FIG.1A i 1B. ;;TABELA 11: Somatske mutacije u odnosu na najbližu sekvencu klične linije ; ;;; [0344] Kako bi se testirale, somatske mutacije mogu se konvertovati u ostatke klične linije, pri čemu su relevantni konstrukti generisani, a antitela eksprimirana tranzijentnom ekspresijom u COS/PKB ćelijama i prečišćene Protein A hromatografijom. Ova antitela označena su kao IgG2klon 1.2 SM, 1.109 SM, i 2.360 SM (SM = izlečen somatskom mutacijom). Za 1.109 LC, dva konstrukta su pripremljena. U prvom konstruktu, Asn-28 je konvertovan u Asp-28 kako bi se eliminisalo N-vezano glikozilaciono mesto, a u drugom konstruktu, Asn-28 je konvertovan u Asp-28, a Asn-45 konvertovan je u Lys-45. Prinosi su iznosili 1.7-4.5 mg/l, koji su unutar očekivanog opsega za ovaj ekspresioni sistem. ;;[0345] Karakterizacija prečišćenih antitela pomoću SDS-PAGE i sekskluzione hromatografije po veličini (SEC) dalo je tipične rezultate. SDS-PAGE dva oblika IgG2klona 1.109 SM pokazala je da laki lanac migrira brže od lakog lanca roditeljskog antitela, što potvrđuje da je N-vezano glikozilaciono mesto eliminisano. N-terminalno sekvencioniranje pokazalo je da su lanci N-terminalnih antitela bili intaktni, a masena spektometrija je pokazala da su somatske mutacije konvertovane u ostatke klične linije. ;;Primer 5: Karakterizacija korigovanih antitela somatskom mutacijom ;[0346] Praćeno korekcijom somatskih mutacija, prečišćena IgG2antitela ponovo su testirana u proliferacionim ogledima AML-5 i cinomolgus koštane srži. IC50u AML-5 proliferacioni ogled nije se promenio za IgG2klon 1.2 SM ili 1.109 SM (SM = izlečen somatskom mutacijom) u odnosu na roditeljska IgG2antitela, ali postojao je 10-struki gubitak u potenciji za IgG2klon 2.360 SM antitelo (videti, TABELU 12). ;;[0347] Afiniteti vezivanja somatskim mutacijama korigovanih antitela u monomerni c-fms protein mereni su rezonancijom površinskog plazmona upotrebom Biacore 3000 instrumenta. Afinitet IgG2klon 1.2 SM antitela suštinski je nepromenjen od roditeljskog antitela, pri čemu su afiniteti IgG2klon 1.109 SM i 2.360 SM antitela iznosili ∼2-puta manje od respektivnog roditeljskog antitela (videti, TABELU 12). ;;[0348] Roditeljska (PT) i SM IgG2antitela daje su testirana na sposobnost da inhibiraju vezivanje<125>I-hCSF-1 sa AML-5 ćelijama. Očigledan afinitet vezivanja<125>I-hCSF-1 sa AML-5 ćelijama prvo je određeno kao 46 pM, a KIneobeleženog hCSF-1 bilo je 17.8 pM (videti, Primer 10). Kako je prikazano u TABELI 12, KIvrednost za antitelo 1.2 bila je u liniji sa IC50vrednosti u AML-5 bioogledu, a 1.2 SM dao je slične rezultate. KIvrednost za antitelo 1.109 takođe je bila u liniji sa IC50vrednosti, a nije bilo promena sa 1.109 SM antitelom i pored 2-strukog gubitka u afinitetu za monomerne c-fms kako je izmereno pomoću Biacore. Antitelo 2.360 nije inhibiralo kao i antitela 1.2 i 1.109, a 2.360 SM inhibiralo je manje dobro od roditeljskog antitela. ;;TABELA 12: Karakteristike Roditeljskih (PT) Versus Kličnih linija Antitela (SM) ;; ;; [0349] Aktivnost 1.2 SM antitelo je dalje ispitano u proliferacionim ogledima upotrebom humanih ili monocitnih ćelija cinomologus koštane srži. Za humani ogled, humane ćelije inkubirane su sa 11.1 ng/ml rekombinantnog humanog CSF-1 u prisustvu antitela opadajuće koncentracije 1.2 SM. Za cinomolgus ogled, cinomolgus ćelije inkubirane su sa 29.63 ng/ml rekombinantnog humanog CSF-1 u prisustvu antitela opadajuće koncentracije 1.2 SM. Humano IgG2 antitelo upotrebljeno je u kontrolnim eksperimentima. Nakon 7 dana, proliferacija ćelija izmerena je upotrebom CellTiter-Glo (Promega, Madison WI) do određivanja nivoa ATP. Nelinearna poklapanje regresione krive izvedena je za određivanje IC50 antitela. TABELA 13 prikazuje rezultate tri seta eksperimenata. ;;TABELA 13: Aktivnost klon 1.2 SM antitela u ogledu proliferacije ćelija ;;C ;; ;; Primer 6: Inhibicija C-fms Tirozin Fosforilacije ;[0350] Kako bi se pokazalo da su anti-c-fms IgG2mAb-ovi, 1.109, 1.2 i 2.360, sposobni za potpunu ili skoro potpunu inhibiciju fosfotirozin (pTyr)-odgovora, 293T/c-fms ćelije tretirane su ovim mAb-ovima tokom 1 sata pri raznim koncentracijama na 37 °C pre CSF-1 stimulacije. ;;[0351] Razne koncentracije IgG2mAb-ova upotrebom titracionih razblaženja bile su pri 1.0, 0.1, 0.01, 0.001 i 0.0001 µg/ml. Kao kontrole, upotrebljena su neblokirajuće anti-c-fms monoklonalno antitelo, mAb 3-4A4 (BioSource, Intl.) i ne-relevantno antitelo, hCD39 M105, svaki pri 1.0 µg/ml. Serum-ispošćene 293T/c-fms ćelije tretirane su svakim od IgG2(PT) mAb-ova upotrebom raznih koncentracija kako je prethodno pomenuto, a svaka koncentracija varirala je u deset-ostrukom razblaživanju pre peto minutne CSF-1 stimulacije na 50 ng/ml tokom 5 minuta. Posle stimulacije, celi-ćelijski lizati su sakupljeni, imunoistaloženi na 4 °C preko noći sa anti-c-fms C20 poliklonalnim antitelom (Santa Cruz Biotechnology, Inc.) i ispitani upotrebom Western blota u kojem je blot imunoispitan generičnim anti-pTyr antitelom, 4G10 (Upstate Biotechnology), i anti-c-fms C20 antitelom za nivoe tirozin fosforilacije c-fms i samog cfms, respektivno. ;;[0352] Kao bi se uzgajale 293T/c-fms ćelije u sudovima 24x10 cm, na 37 °C u 5% CO2, jedanaest T175 bočica (∼50-60% slivajuće) sakupljeno je putem 4 ml tripsin/bočica (Gibco-Invitrogen) i transferovano u 70 ml DMEM (Gibco)/10% FBS (JRH Biosciences). Svaki 10 cm sud zatim je obogaćen sa 10 ml medijuma i inokulisan sa 2 ml sakupljenih ćelija. DMEM/-FBS medijum pripremljen je tokom 1 sata na 37 °C. ;Medijum kulture iz 10 cm sudovi uklonjeni su putem pažljive aspiracije, uklanjajući što je više moguće medijuma koji sadrži FBS. Deset ml DMEM/-FBS dodato je, a mešavina je inkubisana tokom 1 sata na 37 °C. ;;[0353] Nakon serumskog ispošćivanja tokom 1h na 37 °C, medijum je uklonjen. Tretiranja sa antitelom i minus-Ab kontrole postavljene su bilo sa 4.0 ml serijski razblaženim uzorcima koji sadrže Ab ili samim DMEM/-FBS, i dalje inkubisani tokom dodatnog 1 sata na 37 °C kako bi se obezbedilo ukupno 2 sata serusmkog ispošćivanja. Pred-tretiranje antitelom i ligand stimulacija prikazani su u TABELI 14. ;;;TABELA 14 ;; ; ;;; [0354] Sveža fiola sa CSF-1 (R&D Systems/216-MC/Lot CC093091) pri 50 ng/µl (25 µg/fiola) rekonstruisana je u 500 µl PBS (Gibco)/0.1% BSA (Sigma) i držana na ledu.1:1000 razblaženje CSF-1 sadržaja (60 µl) pripremljeno je u DMEM/-FBS (60 ml) približno 5 minuta pre kraja Ab-tretiranja.293T/cfms ćelije inkubirane su sa 50 ng/ml of CSF-1 tokom 5 minuta na 37 °C. Supernatanti su uklonjeni i dodato je 2 ml hladnog lizionog pufera (100 ml PBS/1% Triton, 100 (µl 0.5 M EDTA, 100 µl 1.0 M NaF, 200 µl 0.5 M beta-glicerol fosfata, 500 µL natrijum vanadata (100x), 10.0 µL okadainske kiseline (10,000x), i 4 tablete Potpunog Inhibitora Proteaze). Lizati (2.0 ml) su kombinovani sa 30 µl 50% Protein A/G Sefarozom (Amersham) i inkubisani tokom 1 sata na 4 °C na ljuljajućoj platforma kako bi se predthodno očistili nespecifični vezujući proteini. Nakon vrtenja frakcija, supernatanti su odsuti u sveže 15 ml epruvete. ;;[0355] Celi ćelijski lizati su imunoistaloženi sa 2.5 µg/ml anti-c-fms C20 (25 µl; pri 0.2 µg/µl). Mešavine ćelijskih lizata antitela inkubirani su preko noći na 4 °C na ljuljajućoj platforma kako bi se ispitali ukupni c-fms. Anti-zečji IgG magarca/HRP (1:10,000 u blokirajućem rastvoru; Jackson) dodati su i dalje inkubisani tokom još jedno 30 min na 4 °C. Imunokompleksi su provučeni kroz SDS-PAGE i imunoblot. Western blotovi ispitivani su bilo sa anti-pTyr 4G10 ili anti-c-fms C20 radi detektovanja pTyr c-fms i ukupnog c-fms, respektivno. ;;[0356] Kako je prikazano na FIG.5, IgG2klonovi (PT) 1.109, 1.2 i 2.360 pokazali su stabilnost u inhibiranju ligand-indukovanih pTyr/c-fms u 293T3/c-fms oglednom sistemu. Tretiranje sa 0.1 µg/ml (8.3 nM) IgG2klon (PT) 1.109 ili 1.2 tokom 1 sata pre CSF-1 stimulacije redukovalo je fosfotirozin signal do pozadinskih nivoa. Sa druge strane, IgG2klon (PT) 2.360 proizveo je jednaku inhibiciju pri 1.0 µg/ml (83 nM). Međutim, tretiranje bilo kog antitela pri 0.01 µg/ml (0.83 nM) ili manje nije rezultiralo u pTyr inhibiciji. Nausprot tome, neblokirajući anti-c-fms 3-4A4 i ne-relevantno hCD39 M105 antitelo, pri najvišim dozama (1.0 µg/ml) nisu imala efekat na ligand-indukovan pTyr signal u poređenju sa -mAb/+CSF-1 kontrolom. Tako, inhibicija pTyr formacije direktno je povezana sa blokiranjem CSF-1 vezivanja. ;;[0357] Pos pretpostavkom da 293T/c-fms transfektanti korišćeni u ovim ogledima, zadržavaju prethodno izmerenu ćelijsko-površinksu c-fms gustinu ∼30,000 receptori/ćelija, -3 miliona ćelija nosilo bi ∼90x 10<6>c-fms, značajno manje od ∼5.0x 10<11>mAb u 4.0 ml predtretiranju pri 0.1 µg/ml. ;Prevazilaženje mAb-a trenutnog stanja tehnike od ∼10,000 puta u odnosu na cilj, čini zasićenje dostupnog c-fms moguće. To ukazuje da 8.3 nM klon (PT) 1.109 ili 1.2 efektivno blokiraju signaliziranje CSF-1 pri 50 ng/ml ili 1.0 nM, ili u približno 10:1 (mAb:c-fms) molarnom odnosu. Prag efektivnosti za klonove (PT) 1.109 i 1.2 verovatno potpada između 0.1 i 0.01 µg/ml (0.83 - 8.3 nM) u ovom oglednom sistemu. ;;[0358] Tretiranje sa 1.0 µg/ml IgG2(PT) mAb-ovima u odsustvu CSF-1 dodavanja nije dalo pTyr signal iznad pozadinskih nivoa. Prethodni eksperimenti sa sva tri IgG2(PT) oblika korišćena pri 10 µg/ml takođe nisu otkrili nikakv pTyr signal pod istim uslovima. Nije izmerena nikakva agonistička aktivnost povezana sa ovim mAb-ovima. ;;Primer 7: Inhibicija ligand-indukovanih pTyr/c-fms upotrebom IgG2PT i SM oblika ;[0359] Cilj ovog ispitivanja je određivanje da li postoje bilo kakve funkcionalne promene u kličnom linijom-vraćenim (SM) oblicima IgG2klonova 1.109, 1.2 i 2.360, u poređenju sa njihovim respektivnim roditeljskim oblicima (PT). Kako bi se pripremile 293T/c-fms ćelije za ovaj eksperiment, ćelijsko uzgajanje od pet T175 (∼80-90% konfluentni) sakupljeno je putem 4 ml tripsin/bočica i transferovane u 75 ml DMEM sa 10% FBS. U svaki 24X 10 cm sud, dodato je 9 ml medijuma i inukolisano sa 3 ml sakupljenih ćelija. DMEM/-FBS medijum je pripremljen, i/ili zagrejan tokom 1 sata na 37 °C. Medijum kulture je uklonjen iz 10 cm sudovi putem pažljive apspiracije kako bi se uklonilo što je moguće više medijuma koji sadrži FBS. DMEM/-FBS (10 ml) je dodat i mešavina je inkubisana tokom 1 sata na 37 °C. Pripremljen je hladan lizioni pufer i održavan na ledu. ;;[0360] Titracije monoklonalnog antitela, kako je prikazano u TABELI 15, pripremljene su i održavane na sobnoj temperaturi. ;;TABELA 15: Titracija IgG2C-fms monoklonalnih antitela ;; ; ;;; [0361] Serije serijskog razblaženja antitela (300 µL 2.7 ml DMEM/-FBS) testirane su unutar opsega od 1.0 µg/ml do 0.1 µg/ml za svaki mAb. Nakon 1 sata serumskog ispošćavanja na 37 °C, medijum je uklonjen, s antitelo pred-tretirano, a minus-Ab kontrole pripremljene su na sličan način kako je opisano u TABELI 13. Pred-tretiranja antitela i ligand stimulacija opisani su u TABELI 16 koja sledi: ;;;TABELA 16 ;; ; ;;; [0362] Ligand-indukovan pTyr od strane anti-c-fms mAb-ova (SM oblici) izvedeno je kako je opisano u Primeru 6 za PT oblike. ;;[0363] Eksperimenti koji su koristili 293T/c-fms ćelije za određivanje efekata PT versus SM oblika tri IgG2mAb-a pri 1.0 i 0.1 µg/ml otkrili su da ne postoje razlike u sposobnosti da se inhibira ligand-indukovani pTyr/C-fms (videti FIG.6). Klonovi 1.109 i 1.2 (oba PT i SM oblika) pokazali su inhibiciju pri nižim koncentracijama u odnosu na 2.360 (PT i SM oblici). ;;[0364] Klonovi 1.109 i 1.2 (PT ili SM) su imali sposobnost da spreče ligand-indukovano pTyr/c-fms in vitro kada su 293T/c-fms ćelije tretirane sa 0.1 µg/ml (8.3 nM) ili više mAb-a tokom 1 sata na 37 °C pre dodavanja CSF-1 pri 50 ng/ml (1.0 nM). Sposobnost ovih monoklonalnih antitela da blokiraju formiranje pTyr/c-fms dovelo bi do inhibicije CSF-1 signaliziranja, migracije monocita i, naknadno, akumulacije TAM-ova. Čini se da ni jedna agonistička sktivnost nije povezana sa ovim mAb-ovima, kako bi se zaobišao aktivirajući receptor na ne-CSF-1 zavisan način. mAb-ovi nisu pokazali nikakvu agonističku aktivnost kada su korišćeni pri koncentraciji od 1.0 µg/ml i visokim kao 10 µg/ml (podaci nisu prikazani). ;;[0365] Shodno tome, mAb-ovi su bili sposobni da spreče ligand-indukovano pTyr/c-fms in vitro. ;;Primer 8: Imunotaloženje C-fms od strane anti-c-fms mAb-ova ;[0366] Sposobnost IgG2anti-c-fms mAb-ova da se vežu sa i imunoistaloženim c-fms postignuto je upotrebom stabilno-transfektovanih 293T/c-fms ćelija kako je prethodno opisano. Celi-ćelijski lizati nestimulisanih ćelija su imunoistaloženi preko noći pri čemu je svako mAb (PT i SM) i anti-c-fms C20 antitelo i ispitano putem Western blota sa C20 Ab (Santa Cruz Biotechnology, Inc.) kao proba radi detektovanja c-fms. C-fms je imunoistaložen od strane monoklonalnih antitela. Lizati stabilno transfektovanog 293T/c-fms uzgajani na 37 °C/5% CO2do ∼75% konfluencije, pripremljeni su i kombinovani sa monoklonalnim antitelima, kako je prikazano u TABELI 17. ;;;TABELA 17 ;; ;;; [0367] Eksperimenti imunotaloženja koji koristili su netretirane cele-ćelijske lizate stabilnih 293T/c-fms pokazali su sposobnost raznih mAb-ova (osim 2.360 SM) da se vežu sa i talože c-fms, u poređenju sa poliklonalnom anti-c-fms C20 kontrolom; sa druge strane, klon 2.360-SM, pokazuje redukovan kapacitet u ovom ogledu (videti FIG.7). ;;Primer 9: Imunotaloženje SNP-Varijanti od strane IgG2mAb-ova ;[0368] Pojedinačne nukleotidne polimorfizme ili SNP-ovi predstavljaju DNK sekvencione varijacije koje se javljaju kada je jedan nukleotid (A, G, T, ili C) u genomskoj sekvenci promenjen. SNP-ovi se mogu javiti u oba i kodirajućim i ne-kodirajućim regionima humanog genoma. Mnogi SNP-ovi nemaju uticaj na ćelijsku funkciju, ali naučnici smatraju da bu drugi SNP-ovi mogli da predisponiraju ljude na bolest ili imaju efekat u njihovom drugom odgovoru. Varijacije u DNK sekvenci mogu da imaju glavni uticaj na to kako osoba reaguje na bolest, napade iz okruženja (npr., bakterije, virusi, toksini, i hemikalije), lekove i druge terapije. Iz ovog razloga, SNP-ovi su od velike važnosti za biomedicinkso istraživanje, razvoj farmaceutskih proizvoda, i medicinske dijagnoze. Dalje, SNP mape omogućavaju naučnicima identifikaciju višestrukih gena koji su povezani sa kompleksnim bolestima kao što je kancer, dijabetes, i vaskularne bolesti. ;;[0369] Ekstracelularni region humanog c-fms može se podeliti na pet ponovljenih domena (označeni sa A do E) nalik imunoglobulinima (Ig). Videti, primera radi, Hampe, A. et al. (1989) Oncogene Res.4:9-17 for a discussion of human domens. Videti, primera radi, Wang, et al. (1993) Molecular and Cell Biology 13:5348-5359 za odgovarajuće domene u mišjem proteinu. Pokazano je da domeni A-C obuhvataju CSF-1 vezivajući region, dok je pokazano da domen D pomaže u regulisanju receptor dimerizacije nakon vezivanja liganda. Tri prirodno javljajuće SNP-varijante humanog c-fms su pripremljene, tačnije, A245S, V279M u Ig-Domenu C i H362R u Ig-Domenu D (videti FIG.8 za aminokiselinsku sekvencu esktracelularnog domena c-fms). Ovi SNP-ovi pronađeni su ili u ili blizu CSF-1 vezivajućeg regiona, a ispitivanje Western blotova ispitano je sa anti-c-fms H-300 (zečje poliklonalno antitelo uzgajano protiv aminokiselina 11-310 koje mapiraju blizu N-terminusa humanog c-fms/CSF-1R; Santa Cruz Biotech., Inc., Kat. Br. sc-13949). ;;[0370] Kako bi se ispitalo kako humane c-fms SNP varijante ulaze u interakciju sa raznim c-fms Abs koji su ovde obezbeđeni, tranzitno-transfektovane 293T ćelije koje eksprimiraju tri tips c-fms SNP varijante, kako je prethodno opisano, i divlji tip (WT) c-fms (kao i irelevantna, vektor-poklapajuća kontrola) korišćene su za određivanje sposobnosti svakog anti- c-fms mAb-a da se veže sa SNP-varijantama putem imunotaloženja. ;;[0371] 293T ćelije transfektovane su u duplikatima 10-cm sudova sa c-fms A245S, V279M, H362R, WT cfms i irelevantnim kontrolnim konstruktom u sisarskom ekspresionom vektoru pCIneo i uzgajane tokom 48 sati na 37 °C/5% CO2. Ćelijski lizati pripremljeni su kako je prethodno opisano. Anti-c-fms mAb-ovi i poliklonalni anti-c-fms C20 ili anti-c-kit C19 pri 2.5 µg/ml u 1.0 ml alikvotima dodati su u svaki lizat kako je ilustovano u TABELI 18. ;;;TABELA 18 ;; ; ; ;;; [0372] Ćelije su inkubirane preko noći na 4 °C na mešaču kako je opisano u Primeru 6. ;;[0373] Antitela nisu pokazala nikakav gubitak sposobnosti da se veže sa SNP oblicima u poređenju sa WT kontrolom (FIG.9). Pokazalo se da mAb-ovi imaju sposobnost vezivanja za spektar prirodno javljajućih c-fms varijanti. ;;[0374] Imunotaloženje iz netretiranih celih-ćelijskih lizata stabilnog 293T/c-fms pokazalo je jednaku sposobnost svih raznih mAb-ova (osim 2.360 SM) da se veže sa i istaloži c-fms u poređenju sa poliklonalnom anti-c-fms kontrolom; klon 2.360 SM pokazuje jasno redukovan kapacitet u ovom ogledu. Ispitivanje sposobnosti raznih mAb-ova na imunotaloženje c-fms i SNP varijante iz tranzitnotransfektovanih 293T/c-fms ćelija pokazalo je da nema gubitka u sposobnosti da se veže sa SNP oblicima. Sposobnost raznih mAb-ova da se vežu sa c-fms SNP-ovima ukazuje da oni prepoznaju c-fms proteine kroz spektar varijanti poznate da postoje za ljude. ;;Primer 10: Inhibicija<125>I-hCSF-1 vezivanja od strane anti-c-fms mAb-ova ;[0375] Afinitet anti-c-fms mAb-ova ka ćelijsko površinski eksprimiranim humanim c-fms određeno je merenjem inhibicije<125>I-hCSF-1 vezivanja za AML-5 ćelije. ;;[0376] Rekombinantni hCSF-1 (Amgen) jodiran je upotrebom<125>I (Amersham) i IODO-GEN® (Pierce). Sedamdeset pet µl PBS, 10 µg hCSF-1, i 1 mCi<125>I dodati su u IODO-GEN® prethodno obložene jodinacioonbe epruvete i ostavljene na ledu tokom 15 minuta. Mešavina je transferovana u ekvilibrisanoj 2 ml P6 koloni u kojoj je<125>I-hCSF-1 odvojen od slobodnog<125>I gel filtracijom. Frakcije koje sadrže jodirane hCSF-1 su sakupljene, zatim razblažene do koncentracije od 100 nM u vezujućem medijumu (RPMI-1640 sa 2.5% goveđom albumin Frakcijom V, 20 mM Hepesom, i 0.2% natrijum azidom, pH 7.2). Specifična aktivnost 4.8 x 10<15>cpm/mmol izračunata je na osnovu inicijalne proteinske koncentracije hCSF-1 i ponovnog dobijanja od 80% iz kontrolnog eksperimenta u kojima je alikvot od<125>I-hCSF-1 podvrgnut jodinacionom protokolu sa propuštanjem dodatnog<125>I. ;;[0377] Eksperiment saturacionog radilogand vezivanja izvedeno je u konjukciji sa svakim inhibicionim ogledom kako bi se odredila oba KDi KIza hCSF-1 vezivanje sa c-fms eksprimirani na površini AML-5 ćelija. Mešavine su smeštene u mikrotitarske ploče sa ravnim dnom sa 96-bazenčića sa ukupnim zapreminama od 150 µl/bazenčić. Svi reagensi razblaženi su u vezivajućem medijumu koji sadrži 0.2% natrijum azid i eksperimenti su sprovedeni na 4°C kako bi se minimizirala potencijalna receptor internalizacija i odvajanje. ;;[0378] Za ispitivanj saturacionog vezivanja,<125>I-hCSF-1 serijski je razblažen 2-puta, počevši od koncentracije od ∼1.7 nM i podizanjem 12 bazenčića do koncentracije od ∼1.5 pM. Nespecifično vezivanje izmereno je pri jednoj koncentraciji<125>I-hCSF-1 (∼80 pM, i triplikatu) u prisustvu 1,000-strukom molarnom višku neobeleženog hCSF-1, i smatra se da je linearna funkcija koncentracije radioobeleženog hCSF-1 prisutna. ;;[0379] Za<125>I-hCSF-1 inhibicioni ogled, neobeleženi hCSF-1 postavljen je pri početnoj koncentraciji od 5 nM. Početne koncentracije za anti-c-fms 1.2, 1.109, i 2.360 (PT i SM za svaki) iznosile su 0.312 nM, 1.25 nM, i 20 nM, respektivno. Svaki uzorak serijski je razblažen 2-puta iz 15 bazenčića. Triplikati samog vezivajućeg medijuma bazenčića i triplikata 1,000-strukog molarnog viška u baenčićima za neobeležene hCSF-1 određeni su na početku, sredini i kraju ogleda kao kontrole za određivanje procenta inhibicije. Jedna koncentracija<125>I-HCSF-1 (∼9 pM) dodata je u svaki bazenčić. ;;[0380] AML-5 ćelije dvaputa su oprane sa PBS, i dodate u svaku ispitnu ploču pri 1 x 10<5>ćelije/ bazenčić neposredno pre inkubisanja. ;;[0381] Oba ogleda inkubirana su na 4°C na miniorbitalnom tresaču tokom 4 sata, vremenskom periodu potreban da se dostigne ekvilibrijum kako je određeno tokom eksperimenata. Dva 60 µl alikvota za svaku inkubacionu mešavinu transferovana su u rashlađenim 400 µl polietilen centrifugnim epruvetama koje sadrže 200 µl ftalatnog ulja i okretane tokom 1.5 minuta na 4°C vrhu mikrosentrifuge (Sorvall,) pri 9615x g kako bi se razdvojila ćelija povezana sa<125>I-hCSF-1 od slobodnog<125>I-hCSF-1. Uljane epruvete su odstranjene, a svaki ćelijski pelet i supernatant sakupljeni su u pojedinačnim 12 x 75 mm staklenim epruvetama i uvedene na COBRA gama brojač (Packard Instrument Company) za cpm merenja. Cpm iz dupliranih alikvota uzeti iz svakog bazenčića uprosečeni su radi analiziranja. ;;[0382] Podaci saturacionog vezivanja odgovarali su ekvotaciji 1-mesta vezivanja putem nelinearne regresije u Prizma verziji 3.03 (GraphPad Software, Inc.) kako bi se dobila očigledna srednja vrednost KDza 46 pM za<125>I-hCSF-1 vezivanje za ćelijsko površinski eksprimirani humani c-fms. Inhibicioni podaci odgovarali su ekvotaciji kompetitivne inhibicije jednog mesta putem nelinearne regresije u Prizmi upotrebom KDvrednosti za<125>I-hCSF-1 dobijena u konkurentnom ogledu vezivanja za generisanje KIvrednosti za neobeležene hCSF-1 (očigledna srednja vrednost KI= 17.8 pM) kao i svaki anti-c-fms mAb. Prikazana je srednja vrednost KIvrednosti iz 2 eksperimenta (videti, ;;[0383] TABELU 13). ;;Primer 11: Određivanje brzine i konstanti afiniteta za monomerno C-fms vezivanje za snti-c-fms mAbove ;[0384] Afinitet humanog c-fms (1-512).pHIS (Amgen) za anti-c-fms mAb-ove izmerena je pomoću Biacore. Eksperimenti su sprovedeni na 25°C upotrebom Biacore 3000 instrumenta (Biacore AB) opremljenog sa CM4 sensorskim čipom. Sensorski čipovi, amin kuplujući reagensi (EDC (1-etil-3(3-dimetilaminopropil)-karbodiimid hidrohlorid), NHS (N-hidroksisukcinimid), i etanolamin-HCl, pH 8.5), 10 mM natrijum acetat, pH 5.5, HBS-EP (0.01 M HEPES pH 7.4, 0.15 M NaCl, 3 mM EDTA, 0.005% v/v Surfaktant P20), i 10 mM glicin-HCl, pH 1.5, kupljeni su od Biacore AB. Albumin iz goveđeg seruma (BSA, Bovuminar Standard Powder) kupljen je od Serological Corporation. AffiniPure kozji anti-humani IgG, Fcγ Fragment Specifičan kupljen je od Jackson ImmunoResearch Laboratories. ;;[0385] Anti-humani IgG, Fcγ specifično uhvaćeno antitelo kovalentno je imobilisano za CM4 čip upotrebom standardne amin-kuplujuće hemije sa HBS-EP kao radni pufer. Ukratko, svaka protočna ćelija aktivirana je tokom 7 minuta sa 1:1 (v/v) mešavinom 0.1 M NHS i 0.4 M EDC pri brzini protoka od 5 µl/min. Kozji anti-humani IgG pri 28 µg/ml u 10 mM natrijum acetatu, pH 5.5 imobilisan je pri gustini od ∼2700 RUs. Preostale reaktivne površine deaktivirane su sa 7 minutnim ubrizgavanjem 1 M etanolamina pri 5 µl/min. Tri 50 µl injekcije 10 mM glicinske HCl, pH 1.5 pri 100 µl/min korišćene su za uklanjanje bilo kojeg nekovalentno vezanog uhvaćenog antitela i radi kondicioniranja svake površine. Radni pufer je premešten u HBS-EP sa 0.1 mg/ml BSA za sve preostale faze. ;;[0386] Anti-c-fms 1.2 ili 1.2 SM pri 0.25 µg/ml injektovan je preko kozjeg anti-humanog IgG, Fcγ u jednoj protočnoj ćliji tokom 2 minuta na 10 µl/min kako bi se dobila površinska gustina od ∼47 RUs. Još jedna protočna ćelija sa kozjim anti-humanim IgG, Fcγ samo, primenjena je kao referentna površina. Svaki ogled počeo je sa deset ciklusa pufera kako bi analit stabilizovao signal. Humani monomerni c-fms (1-512).pHIS uzorci pripremljeni su pri koncentracijama od 30, 10, 3.33, 1.11, 0.37, i 0.12 nM u triplikatu i injektovani zajedno sa 6 praznih pufera u nasumičnom redosledu pri 100 µl/min preko oba i uhvaćenog anti-c-fms i referentnih površina. Svaki kompleks je ostavljen da se asocira tokom 2 minuta, i disocira tokom 5 minuta. Površine su regenerisane posle svakog c-fms ili puferskog ubrizgavanja sa 30sekundarnog pulsiranja 10 mM glicinske HCl, pH 1.5 pri 100 µl/min, praćeno sa 30-sekundarnim ubrizgavanjem pufera. ;;[0387] Druga anti-c-fms antitela testirana su na sličan način, ali su unete izmene u protokolu na račun razlike u karakteristikama vezivanja. Anti-c-fms 1.109 i 1.109 SM svako je injektovano preko kozjeg antihumanog IgG pri 0.5 µg/ml tokom 1.5 minuta na 10 µL/min kako bi se dobile površinske gustine od 59 i 91 RUs, respektivno. Humani c-fms (1-512).pHIS uzorci pripremljeni su pri koncentracijama od 10, 3.33, 1.11, 0.37, 0.12, i 0.041 nM za anti-c-fms 1.109 vezivanje, a isti set sa izuzetkom 0.041 nM uzorka, pripremljen je za anti-c-fms 1.109 SM vezivanje. Humani monomerni c-fms (1-512).pHIS ostavljen je da se disocira od anti-c-fms 1.109 tokom 20 min, i 1.109 SM tokom 15 min. Anti c-fms 2.360 i 2.360 SM svaki su ubrizgani preko kozijeg anti-humanog IgG, Fcγ pri 1 µg/ml tokom 1.5 ili 2 minuta, respektivno, pri 10 µl/min kako bi se dobile površinske gustine od ∼100 RUs. Humani c-fms (1-512)/pHIS uzorci pripremljeni su pri koncentracijama od 30, 10, 3.33, 1.11, i 0.37 nM za anti-c-fms 2.360 vezivanje, a isti set sa dodavanjem 0.12 nM uzorka pripremljen je za anti-c-fms 2.360 SM vezivanje. Humani monomerni c-fms (1-512).pHIS ostavljen je da se disocira od anti-c-fms 2.360 tokom 8 min, i 2.360 SM tokom 5 min. ;;[0388] Podaci su dvostruko referencirani oduzimanjem referentnih površinskih odgovora kako bi se uklonile promene masivnog refraktivnog indeksa, a zatim oduzimanjem prosečnih odgovora iz praznih pifera kako bi se uklonili sistemski artifakti iz eksperimentalnih protočnih ćelija. Podaci su obrađeni i globalno se podudaraju sa 1:1 interakcionom modelom sa lokalnim Rmax u BIAevaluaciji (verzija 4.1, Biacore AB) kako bi se dobile konstante kinetičke stope kai kd. Kroz podatke iz triplikata uzoraka pri svakoj koncentraciji c-fms koji je sakupljen, samo se podaci iz duplikata mogu analizirati zbog ograničenja broja parametara svojstveni BIAevaluacionom softveru. KDje izračunat iz kvotijenta kd/ka. Rezultati su prikazani u TABELI 19. Podaci iz raznih primera obezbeđenih iznad sumirani su u TABELI 20. ;;TABELA 19: Afinitet vezivanja za Anti-c-fms mAb-ove prema rastvorljivom monomernom C-fms proteinu kako je izmereno primenom Biacore 3000 ;; ; ;;; TABELA 20: Rezime mAb-ova 1.2,1.109, i 2.360 ;;; ;;; Primer 12. Epitopno mapiranje anti C-fms antitelo IgG2klonova 1.109, 1.2 i 2.36 ;Pripremanje C-fms-avidin fuzionih konstrukata ;[0389] c-fms avidin fuzioni ekspresioni konstrukti prikazani su na FIG.10. Kako bi se eksprimirao svaki fuzioni protein, kodirajuća sekvenca za humani c-fms ekstracelularni domen PCR amplifikovana je i klonirana u pCEP4-Avidin(N), tako da je c-fms sekvenca spojena sa C-terminusom pileće avidin sekvence upotrebom restrikcionog enzima XhoI. Signalna sekvenca c-fms nije uključena, budući da je signalna sekvenca za pileći avidin ostavljena netaknuta u pCEP4-avidin(N) vektoru. ;;[0390] Kako je prethdono navedeno, ekstracelularni domen sadrži pet različitih regiona nalik Ig. Opisani su različiti domeni u humanim c-fms, primera radi, u Hampe et al., 1989, Oncogene Res.4:9-17. Ra diskusiju koja odgovara domenima u mišjem c-fms, videti, primera radi, Wang et al., 1993, Molecular and Cell Biology 13:5348-5359. Sledeći različiti avidin konstrukti pripremljeni su kako bi odgovarali indikovanom domenu nalik nalik Ig (videti, FIG.8 za ekstracelularni domen aminokiselinske sekvence; SEQ ID No 1). ;Signal: aminokiseline 1-19 ;domen 1 nalik Ig: aminokiseline 20-126 ;domen 1-2 nalik Ig: aminokiseline 20-223 ;domen 1-3 nalik Ig: aminokiseline 20-320 ;domen 1-4nalik Ig: aminokiseline 20-418 ;domen 1-5 nalik Ig: aminokiseline 20-512 ;samo domen 2 nalik Ig: aminokiseline 85-223. ;;[0391] Na taj načuin, kako bi se stvorili specifični regioni humanog c-fms (skraćena) za epitopno mapiranje, PCR amplifikacija izvedena je radi ciljanja sledećih aminokiselina: petlja1nalik Ig (IPVI-ALLP), petlje 1 i 2 nalik Ig (IPVI-AQIV), petlje 1-3 nalik Ig (IPVI-EGLN), petlje 1-4 nalik Ig (IPVI-GTLL), i petlje 1-5 nalik Ig (IPVI-PPDE), kao i ma petlja 2 nalik Ig (TEPG-AQIV). Sekvence identifikovane u zagradama ukazuju na početnu i završnu sekvencu respektivno za svaki domen (videti FIG.8). Neki od indikovanih regiona odabrani su da održe cisteinske ostatke uključene u formiranju disulfidne veze, budući da su ove veze važne u održavanju nativne tro-dimenzionalne strukture tih domena. Dalje, konstrukt za samu petlju 2 nalik Ig uključuje neku sekvencu iz petlje 1 nalik Ig iz istog raszloga. Kao posledica, početne i krajnje aminokiseline domena koji su navedeni, razlikuju se donekle od domenskih regiona određeni u člancima koje su napisali Hampe i Wang navedeni gore. ;;Ekspresija avidin fuzionog proteina ;[0392] Ekspresija avidin fuzionih proteina postignuta je tranzijentnom transfekcijom humanih 293T adherentnih ćelija u T75 bočicama za uzgajanje tkiva. Ćelije su uzgajane i održavane u DMEM-u (visoko glukozan) sa 10% dijalizovanim FBS i 1x Pen-strep-glutaminom (medijum rasta), na 37°C i 5% CO2. ;Približno 3x10<6>293T ćelija inokulisano je u T75 bočicama koje sadrži 15 ml medijuma rasta i ostavljene da rastu preko noći tokom približno 20 sati. Ćelije su zatim transfektovane sa pCEP4-Avidin(N)- c-fms konstruktima. U svakoj bočici, 15 µg DNK umešano je sa 75 µl Lipofektamina 2000 (Invitrogen) u prisustvu Opti-MEM medijuma (Invitrogen), a kompleks je inkubisan tokom 20 minuta. Transfekcioni kompleks je inokulisan u odgovarajućim bočicama i inkubisana na 37°C tokom 4-5 sati u Opti-MEM medijumu. Na kraju inkubacije, Opti-MEM medijum zamenjen je svežim medijumom rasta. Približno 48 sata nakon transfekcije, kondicioniran medijum sakupljen je i centrifugiran pri 2000x g tokom 10 minuta na 4°C kako bi se uklonile ćelije i otpaci, i transferovan u 50 ml epruvete. Kontrolna bočica je takođe pripremljena prateći isti protokol, ali bez korišćenja DNK (lažna transfekcija), dajući negativni kontrolni kondicionirani medijum za eksperimente vezivanja. ;;Detektovanje fuzionih proteina ;[0393] Koncentracija svakog c-fms avidin fuzionog proteina određena je upotrebom ogleda na bazi kvanititativne FACS. c-fms avidin fuzioni proteini uhvaćeni su na 6.7 µm biotin polistirenskim perlicama (Spherotech, Inc., Libertyville Ill.).1X kondicionirani medijum (20 i 200 µl) dodati su u 5 µl (-3.5 x 10<5>) perlice, i inkubisani tokom 1h na sobnoj temperaturi uz rotiranje. Kondicionirani medijum je uklonjen centrifugiranjem , a uzorci su oprani sa PBS koji sadrži 0.5% BSA (BPBS). Avidin perlice su obojene sa 200 µl rastvora 0.5 µg/ml kozjeg FITC-obeleženog anti-avidin antitela (Vektor Labs, Burlingame, CA) u BPBS tokom 45 minuta na sobnoj temperaturi pekriveni folijom. Nakon inkubacije, perlice su ponovo sakupljene centrifugiranjem, oprane sa BPBS, i resuspendovane za analizu u 0.5 ml BPBS. FITC fluorescencija detektovana je upotrebom FACScan (Becton Dickinson Bioscience, Franklin Lakes, NJ). Signal je konvertovan u proteinsku masu upotrebom standarne krive izvedene sa rAvidinom. Za epitop mapiranje, biotin perlice su napunjenje sa ∼100 ng c-fms avidin fuzionog proteina po 3.5x 10<5>perlica i dovedene do zapremine sa medijumom rasta. ;;Vezivanje antitela FACS Ogled ;[0394] Biotinom-obložene polistirenske perlice (Spherotech, Inc.) ispunjene sa normalizovanim količinama c-fms subdomenskim fuzionim proteinima umešane su sa 1 µg FITC konjugovanog anti c-fms monoklonalnog antitela (1.109, 1.2 i 2.36) u 0.2 ml BPBS. Nakon inkubacije tokom 1h na sobnoj temperaturi, dodato je 3 ml pufera za pranje (BPBS), a kompleksi antitelo-perlice sakupljeni su centrifugiranjem tokom 5 min pri 750x g. Pelat je opran u 3 ml BPBS. Antitelo vezano za komplekse avidin-perlica detektovano je pomoću FACS (Becton Dickinson) analize. Srednja vrednost (X) inteziteta fluorescencije usnimljen je za svaki uzorak. ;;Ogled kompeticije antitela ;[0395] Kako bi se pripremila za obeležavanje sa fluoresceinom, monoklonalna antitela su dijalizovana ili resuspendovana pri koncentraciji od 1 mg/ml u PBS (pH 7.4). Oznaka ([6-fluorescein-5- (i-6)-karboksamido] heksanojska kiselina, sukcinimidil estar 5(6)-SFX) umešani izomeri od Molecular Probes (F-2181) dodata je proteinu pri molarnom odnosu 9.5:1 (oznaka: protein) iz zalihe oznaka od 5mg/ml u DMSO. Mešavina je inkubisana na sobnoj temperaturi tokom 1 sata u tami. Obeleženo antitelo odvojeno je od slobodne oznake dijalizom u PBS. Za svaki kompeticioni eksperiment, sastavljena je vezujuća reakcija koja je sadržavala 20-struki višak (20µg/ml) neobeleženog kompetitorskog antitela, 3.5x 10<5>biotin perlice obložene sa avidin fuzionim proteinom u BPBS. FITC-obeleženo antitelo (1 µg/ml) dodato je nakon 30 min pred-inkubacije neobeleženog kompetitorskog antitela. Ovaj postupak je praćen postupkom bojenja od ove tačke ka napred. ;;[0396] Svi fuzioni proteini (FIG.11) eksprimirani u 293T ćelijama mogu se detektovati sa FITCobeleženim anti-avidin antitelom pomoću FACScan. Kako bi se odredilo koji c-fms domen nalik Ig je antitelo-vezivajuće mesto, svih šest fuzionih proteina upotrebljeno je u ogledu vezivanja. Klonovi 1.109, 1.2 i 2.36 antitela vezuju se za humane c-fms fuzione proteine subdomena nalik Ig1-2, nalik Ig1-3, nalik Ig1-4 i nalik Ig1-5. Oni se ne vezuju za c-fms fuzione proteine jednog domena nalik Ig1 i nalik Ig2. Za poređenje, humani c-fms ECD upotrebljen je kao pozitivna kontrola (FIG.11 i 12). Ovi rezultati ukazuju da su epitopi ova tri antitela uglavnom smeštena na N-terminusu petlje1 nalik Ig i petlje2 nalik Ig humanog c-fms, i zahtevaju prisustvo regiona i petlje 1 nalik Ig i petlje 2 nalik Ig. Rezultati takođe ukazuju da antitelo ne može direktno da blokira visoko afinitetno mesto vezivanja veznika koje je uglavnom locirano na petlji3 nalik Ig. Ono može indirektno da utiče na ligand vezivanje zbog petlji 1 i 2 nalik Ig, od koje su obe kritični regioni za ligand vezivanje (Wang, et al., 1993, Molecular Cell Biology 13:5348-5359). ;;[0397] Među tri antitela, klon 1.109 ima najviši signal vezivanja u poređenju sa ostala dva antitela ispod 1µg/ml Podaci kompeticije ukazuju da tri antitela mogu da blokiraju jedno grude sa 20-strukim viškom neobeleženog antitela (videti, FIG.13, 14 i 15). Podaci kompeticije takođe ukazuju da su epitopi ova tri antitela slični ili bliski unutar petlji 1 i 2 nalik Ig. ;;Primer 13: Epitop mapiranje anti-c-fms antitela 1.2 SM versus komercijalna antitela ;[0398] Ovaj eksperiment sproveden je radi određivanja da li određena ovde opisana humana antitela vezuju iste ili različite epitope odnosu na brojna komercijalno-dostupna antitela. ;;Materijali i postupci: Testirana komercijalna C-fms antitela ;[0399] Antitela pacova i miša koja su testirana, prikazana su TABELI 21 i Tabeli 22. ;;TABELA 21: Antitela pacova ;; ;;; TABELA 22: Mišja antitela ; ;;; C-fms -avidin fuzioni konstrukti i ekspresija avidin fuzionih proteina ;[0400] Humani c-fms avidin fuzioni ekspresioni konstrukti pripremljeni su kako je opisano u Primeru 12. Ekspresija avidin fuzionih proteina postignuta je tranzijentnom transfekcijom humanih 293T adherentnih ćelija u 10 cm ploče za uzgajanje tkiva. Ćelije su ostavljene da rastu i održavane u DMEM (visoko glukozni) koji sadrži 5% kvalifikovanog FBS i dopunjen sa 1x Pen-strep-glutaminom (Invitrogen), 1x neesencijalnim aminokiselinama (Invitrogen) i 1x natrijum piruvatom (Invitrogen) (medijum rasta), na 37°C i 5% CO2. Približno 2.5x10<6>293T ćelija inokulisano je u 10 cm pločama koje sadrže 10 ml medijuma rasta i ostavljene da rastu preko noći tokom približno 20 sata. Ćelije su zatim transfektovane sa pCEP4-Avidin(N)- c-fms konstruktima. Za svaku transfekciju, 7.5 µg DNK umešano je sa 45µl FuGene6 (Roche) u prisustvu DMEM medijuma bez suplemenata (Invitrogen), a kompleks je inkubisan tokom 20 minuta. Transfekcioni kompleks je dodat u odgovarajuću ploču i inkubisan na 37°C preko noći. Sledeće jutro, ćelije su oprane dva puta sa 1X Dulbecco's Fosfatnim Puferovanim Slanim rastvorom (PBS) (Invitrogen) i dopunjene sa 5 ml DMEM-a bez seruma koji sadrži prethodno pomenute suplemente plus Insulin, Transferin, Selenijum-X (ITS-X) (Invitrogen). Približno 48 sati posle transfekcije, kondicionirani medijum sakupljen je i centrifugiran na 2000x g tokom 10 minuta na 4°C kako bi se ukinule ćelije i nečistoće, i transferovan je u 15 ml epruvete. Kontrolna ploča je takođe pripremljena prateći isti protokol, ali nije korišćenaDNK (lažna transfekcija), dajući negativan kontrolni kondicionirani medijum za eksperimente vezivanja. ;;Detektovanje fuzionih proteina ;[0401] Koncentracija svakog c-fms avidin fuzionog proteina određeno je upotrebom ogleda na bazi kvanititativne FACS. Avidin fuzioni proteini uhvaćeni su na 6.7µm biotin polistirenskim perlicama (Spherotech, Inc., Libertyville Ill.).1X kondicionirani medijum (2, 20 i 200 µl) dodati su u 5µl (∼3.5x 10<5>) perlice, i inkubisani tokom 1h na sobnoj temperaturi uz rotiranje. Kondicionirani medijum je uklonjen centrifugiranjem, a uzorci su oprani sa PBS koji sadrži 2% FBS (FPBS). Avidin perlice su obojene sa 500 µl rastvora 1.0 µg/ml FITC-obeleženog kozjeg anti-avidin antitela (Vektor Labs, Burlingame, CA) u FPBS tokom 30 minuta na sobnoj temperaturi uz rotiranje. Nakon inkubacije, perlice su ponovo sakupljene centrifugiranjem, oprane sa FPBS, i resuspendovane za analizu u 0.5 ml FPBS. FITC fluorescencija detektovana je upotrebom FACScan (Becton Dickinson Bioscience, Franklin Lakes, NJ). Signal je konvertovan u proteinsku masu upotrebom standarne krive izvedene sa rAvidinom. Za epitop mapiranje, biotin perlice su napunjenje sa -200 ng c-fms avidin fuzionog proteina po 3.5x 10<5>perlicama i doveden do zapremine sa FPBS. ;;FACS ogled vezivanja antitela ;[0402] Biotinom-obložene polistirenske perlice (Spherotech, Inc.) ispunjene sa normalizovanim količinama c-fms subdomenskim fuzionim proteinima umešane su sa 1 µg ili humanog anti c-fms monoklonalnog antitela (1.2) mišjeg anti-c-fms monoklonalnog antitela (MAB 329, MAB 3291 i MAB3292 [R&D Systems]) ili anti-c-fms monoklonalnog antitela pacova (2-4A5-2 [Invitrogen], O.N.178 i 5J15 [U.S. Biological]) u 0.2 ml FPBS. Nakon inkubacije tokom 1h na sobnoj temperaturi, kompleksi antitelo-perlice oprani su tri puta sa 1.25 ml pufera za pranje (FPBS) sa kolekcionim centrifugiranjem tokom 1 min pri 18,000x g između pranja. Antitela su zatim obojena sa vrstama pogodnog kozjeg sekundarnog antitela konjugovanog za FITC (Southern Biotech) pri 1.0 µg/ml tokom 30 min. Faze pranja su ponovljene, a kompleksi antitelo-perlice resuspendovani u 0.5 ml FPBS radi analiziranja. Antitelo vezano za komplekse avidin-perlica detektovano je pomoću FACS (Becton Dickinson) analize. Srednja vrednost (X) inteziteta fluorescencije usnimljena je za svaki uzorak. ;;Ogled kompeticije antitela ;[0403] Kako bi se pripremila za obeležavanje sa fluoresceinom, monoklonalna antitela su dijalizovana ili resuspendovana pri koncentraciji od 1 mg/ml u PBS (pH 7.4). Oznaka ([6-fluorescein-5- (i-6)-karboksamido] heksanojska kiselina, sukcinimidil estar 5(6)-SFX]) umešani izomeri od Molecular Probes (F-2181) dodata je proteinu pri 10:1 molarnom odnosu (oznaka: protein) iz zalihe od 10 mg/ml u DMSO. Mešavina je inkubisana na sobnoj temperaturi tokom 1 sata u tami. Obeleženo antitelo odvojeno je od slobodne oznake NAP 5 hromatografijom na koloni u PBS praćeno sa 0.2 µm filtracijom. Za svaki kompeticioni eksperiment, sastavljena je vezujuća reakcija koja je sadržavala 25-struki višak (25 µg/ml) neobeleženog kompetitorskog antitela, 3.5x 10<5>biotin perlice obložene sa avidin fuzionim proteinom u FPBS. FITC-obeleženo antitelo (1µg/ml) dodato je nakon 15 min pred-inkubacije. Ovaj postupak je praćen postupkom bojenja od ove tačke ka napred. ;;Rezultati i diskusija ;[0404] Svi fuzioni proteini eksprimirani u 293T ćelijama mogu se detektovati sa FITC-obeleženim antiavidin antitelom pomoću FACScan. Kako je opisano u Primeru 12, nekoliko testiranih antitela vezuju slične epitope koji zahtevaju prisustvo regiona i petlje 1 nalik Ig i petlje 2 nalik Ig pronađenih u Ig1-2 avidin fuzionom konstruktu. Kao posledica, eksperimenti vezivanja i kompeticije izvedeni su sa jednim od ovde obezbeđenim humanim antitelima, komercijalno dostupnim anti-humanim c-fms antitelim i odabranim članovima panela avidin fuzionih konstrukata. ;;[0405] Sva komercijalna antitela bila su sposobna da se sukcesivno vezuju za c-fms ECD Ig1-5 konstrukt pune dužine kako je očekivano. Od šest komercijalnih antitela, jedno (MAB 3291) je bilo sposobno da se veže sa Igl-2 konstruktom, što ukazuje na mogućeg kompetitora za humane anti-c-fms epitope. Dalji eksperimenti vezivanja izvedeni su upotrebom Ig1 konstrukta. MAB3291 je pokazao da se vezuje sa Ig1 konstruktom, što ukazuje da je njegov epitop lociran u potpunosti unutar domena nalik Igl. Blag signal primećen za MAB329 u Ig1 i Igl-2 konstruktima potvrđen je da je kičma vezivanja antitela za perlice. ;;[0406] Podaci kompeticije ukazuju that ni jedno komercijalno dostupno antitelo ne može da blokira reprezentativno humano antitelo čak i pri 25 strukim viškom kompetitorskog antitela. ;;[0407] Kombinovani podaci iz eksperimenata vezivanja i kompeticije pokazali su da se komercijalno dostupna antitela vezuju za epitope koja nius upotrebljena od strane humanih anti-c-fms antitela. ;;Primer 14: Epitop mapiranje anti C-fms antitela skeniranjem c-fms sa argininskom/glutaminskom kiselinom ;[0408] Strategija skeniranja argininskom/glutaminskom kiselinom korišćena je za mapu vezivanja antitela za c-fms. Bočni lanci argininske i glutaminske kiseline su naelektrisani i masivni, i mogu da poremete vezivanje antitela za c-fms. Ovaj postupak tako može da indikuje ostatke koji kada mutiraju negativno utiču na vezivanje antigen vezujućeg proteina za c-fms. To ukazuje da odgovarajući ostaci u nemutiranim antigen vezujućem proteinu može biti u kontaktu sa antigen vezujućim proteinom ili blizini antitela tako da je supstitucija sa argininskom ili glutaminskom kiselinom dovoljna da utiče na vezivanje. ;;Konstrukcija, ekspresija, i karakterizacija mutanata argininske/glutaminske kiseline ;[0409] Devedeset pet aminokiselina distribuiranih kroz prva tri Ig domenia c-fms, odabrano je za mutaciju. Selekcija je bila naklonjena prema naelektrisanim ili polarnim aminokiselinama, sa izuzetkom od cisteina i prolina kako bi se redukovala mogućnost mutacije koja rezultira u nesavijenom proteinu. Neargininske aminokiseline mutirane su u arginin; arginin i lizin mutirani su u glutaminsku kiselinu. ;;[0410] Sens i anti-sens oligonukleotidi koji sadrže mutirane ostatke sintetizovani su u formatu sa 96-bazenčića. Mutageneza c-fms ekstracelularnog domen-Flag-His-obeleženog konstrukta ("divlji tip") izvedena je upotrebom Quikchange II kita (Stratagene, #200523). Svi mutant konstrukti Flag-Hisobeleženog c-fms u pTT5 vektoru, eksprimirani su u tranzitno transfektovanim 293-6E suspenzionim ćelijama (NRCC) u pločama sa 96-bazenčića. Ekspresioni nivoi i integritet rekombinantnog proteina u kondicioniranom medijumu okarakterisane su western blotom protiv His-oznake praćeno sa anti-izotip Alexa-fluor antitelom. Naknadni eksperimenti epitop mapiranja izvedeni su upotrebom protein u kondicioniranom medijumu. ;;[0411] Mutant ekspresija je okarakterisana upotrebom supernatanata iz svakog bazenčića na ePage SDS-PAGE elektroforeza uređaju (Invitrogen), blotovanjem i ispitivanjem sa anti-His antitelom (Novagen) praćeno sa anti-izotip Alexa-fluor antitelom. Svaki mutant konstrukt bio je eksprimiran. ;;Određivanje konformacionih epitopa ;[0412] Kako bi se odredilo da li su anti-c-fms antitela vezana za konformacioni epitop na c-fms, tri antic-fms antitela (1.2 SM, 1.109 SM i 2.360) i c-fms pojedinačno su upotrebljena u western blotovima pod redukovanim i ne-redukovanim uslovima. Pokazano je da su se antitela 1.2 SM i 2.360 vezala sa konformacionim epitopom kako je potvdrđeno manjkom traka u western blotovima pod redukovanjim uslovima, dok je bleda traka primećena sa antitelom 1.109 SM, što ukazuje da se ono može vezati za linearni epitop. ;;Ogled BioPlex vezivanja ;[0413] Multipleksiran ogled na bazi perlica primenjen je za merenje vezivanja antitela za 95 c-fms mutanata, divlji tip, i negativnu kontrolu jednovremeno. Sto setova bojom-kodiranih streptavidinom obloženih LumAvidin perlica (Luminex) vezane su biotinilisanim anti-pentaHis antitelom (Qiagen, #1019225) tokom 1 sata na sobnoj temperaturi (RT), a zatim oprane. Svaki bojom-obložen set perilica zatim je ostavljen da se veže sa c-fms mutantom, divljim-tipom, ili negativnom kontrolom u 100 µl supernatanta tokom 1 sata na RT i oprane. ;;[0414] Sakupljeni su bojom obloženi setovi perlica, svaki povezan za specifičan protein. Odmerene perlice alikvotirane u u 96 bazenčića filter ploče sa 96-bazenčića (Millipore, #MSBVN1250).100 µl anti-cfms antitela (1.2 SM, 1.109 SM i 2.360) u 3-strukom razblaženju dodato je u tri kolone za triplicirane tačke i inkubisan 1 sat na RT i opran.100 µl 1:200 razblaženja fikoeritrin (PE)-konjugovani anti-humani IgG Fc (Jackson Immunoresearch, #109-116-170) dodato je u svaki bazenčić i inkubisano tokom 1 sata na RT i oprano. ;;[0415] Perlice su resuspendovane u 1 % BSA u PBS, protresane 10 minuta i iščitane na BioPlex instrumentu (Bio-Rad). Taj instrument identifikovao je svaku perlicu po njenom obojenom boja-kodu i izmerena je količina antitela vezana za perlice u skladu sa intezitetom fluorescencije PE boje. Vezivanje antitela za svaki mutant poređeno je direktno sa njegovim vezivanjem za divlji tip u istoj skupnini. ;;Identifikovanje vezivanja antitela za mutant c-fms ;[0416] Varijabilnost oglednog sistema i značaja promena u vezivanju određuju se empirijski. Perlica-doperlice i bazenčić-do-bazenčića varijabilnost ekspremintalno je određena vezivanjem c-fms divljeg-tipa sa svih 100 setova bojom-kodiranih perlica. Perlice su dispergovane u svaki bazenčić ploče sa 96-bazenčića i ispitane sa anti-c-fms antitelom 1.2 SM u 3-strukom razblaženju u svakoj koloni te ploče, preko svih 12 kolona ploče. EC50 su izvedeni upotrebom poklapanja krive iz merenja varijabilnosti maksimalnih signala, minimalnih signala i nagiba. Merenja varijabilnosti primenjena su za određivanje da li je promena magnitude u EC50s bila značajna. ;;[0417] Srednja vrednost fluorescencionog inteziteta (MFI) vezivanja antitela grafički je prikazana upotrebom odmerena poklapanja 4 Parametar logističke krive (4PL sa VarPower u Splus). ;Eksperimentalna varijabilnost određena je upotrebom tri divljeg tipa kontrole u svakoj grupi. Vezivanje antitela sa mutant antigenom upoređeno je sa svakom kontrolom divljeg tipa. Prijavljen je 99 % interval poverenja (CI) EC50 promene savijanja između mutanta i svake kontrole divljeg tipa izračunato je i upoređeno sa kontrolom divljeg tipa koja daje veću p-vednost. Primenjeno je višestruko podešavanje upotrebom kontrole Benjamini-Hochberg Lažne stope otkrivanja (FDR). Mutacije čiji je 99 % CI za EC50 is značajno različit od divljeg tipa EC50, to jest sa FDR podešenom p-vrednosti od 0.02 ili manje, smtrale su se značajnim u reakciji specifičnog vezivanja između proteinskog antigen i antigen vezujućeg proteina. Dodatno, mutacije koje su smanjile vezivanje kao dokaz smanjenjem u maksimalnom MFI signalu do 30 % ili manje divljeg tipa smatrale su se da značajno utiču na vezivanje između proteinskog antigena i antigen vezujućeg proteina. Tabela 23 sumira "pogotke" ili pozicije mutacija koje značajno redukuju sposobnost 1.2 SM, 1.109, i 2.36 antitela da se veže sa ekstracelularnim domenom humanog c-fms. Upotrebljena je sledeće notacija u TABELI 23: (divlji-tip ostatak:položaj u polipeptidu:mutant ostatak), pri čemu je numeracija kakva je prikazana na SEQ ID NO:1. ;;TABELA 23: Rezime mutacija koje utiču na vezivanje antitela. ;; ; ;;; [0418] Kako je vezivanje najmanje jednog antitela održavano u prisustvu određenih mutacija ikazanih u TABELI 23, malo je verovatno da će biti grubo propušteni ili nagomilani zbog uvedene mutacije. Ovo takođe važi i za one mutacije koje izazivanu EC50 pomeranje za sva antitela budući da su ta antitela i dalje sposobna da se vežu za antigen. Iako se svako od testiranih antitela vezuje za sličan region kako je pokazano analizama bininga, svako antitelo može se istaći mutacijama koje inhibiraju vezivanje antitela za mutant antigen. To što neke mutacije utiču na višestruka antitela konzistentno je sa činjenicom da ta antitela pripadaju sličnim košarama. ;;Primer 15: Inhibicija rasta MDAMB231 ksenografta adenokarcinoma dojke ;[0419] Kako se antigen vezujući proteini koji su ovde obezbeđeni vezuju za humani c-fms, ali ne mišji cfms, serije od in vivo eksperimenata sprovedene su sa antitelom koje se vezuje za mišji c-fms kako bi se pokazala upotrebljivost anti-cfms antitela u tretiranju kancera. ;;[0420] Atinjskim golim miševima subkutano je implantirano 10 miliona MDAMB231 humanih ćelija adenokarcinoma dojke u prisustvu Matrigela (1:1). Počevši unutar jednog dana implantacije ćelija tumora, miševima je ubrzigano intraperitonealno ili 400 µg anti-mišjeg c-fms antitela ili 400 µg kontrolnog anti-miš IgG pacova u 100 µl PBS 3 puta nedeljno tokom trajanja ispitivanja. Merenje tumora i dani tretiranja prikazani su na FIG.16. Nakon 51 dana miševi su eutanazirani, tumori sakupljeni i fiksirani u formalinu. Procenjene su H&E obojene sekcije i F4/80 (makrofag marker) sekcije ciljane imunohistohemije. Sva ocenjivana izvedena su na slepo u odnosu na tretiranje i grupu. Sekcije iz miševa tretiranih sa anti-mišjem c-fms antitelom pokazale su značajno manje obojenje u odnosu na miševe tretirane kontrolom, čime se ukazuje na značajno smanjenje u broju makrofaga povezanih sa tumorom. Kako bi se objektivnije ocenila proširenje nekroze, uslikane su digitalne slike AFOG obojenih sekcija upotrebom Metavue softvera, pri čemu su izmereni cela površina poprečnog preseka i nekrotična površina poprečnog preseka tumora. Procenat nekroze svakog tumora zatim je izračunat iz ovih merenja i prikazan na FIG.16. Ovi rezultati pokazuju da anti-c-fms antitelo može da smanji makrofage povezane sa tumorom, povećaju nekrozu i inhibiraju rast MDAMB231 ksenograftova adenokarcinoma dojke. ;Primer 16: Inhibicija rasta utvrđenog NCIH1975 Ksenograft adenokarcinoma pluća ;[0421] Atinjskim golim miševima subkutano je implantirano 10 milion NCIH1975 humanih ćelija adenocarkinoma pluća u prisustvu Matrigela (1:1). Pošto je dozvoljeno da tumori porastu do 250-300 mm<3>, miševima je ubrzigano intraperitonealno ili 400 µg anti-mišjeg c-fms antitela ili 400 µg kontrolnog anti-miš IgG pacova u 100 µl PBS 3 puta nedeljno tokom trajanja ispitivanja. Treća grupa miševa retirana je sa 30 mg/kg Taksotera (pozitivna kontrola) jednom nedeljno. Merenje tumora i dani tretiranja prikazani su FIG.17 koja pokazuje da anti-cfms antitelo može da inhibira rast utvrđenog NCIH1975 ksenografta adenokarcinoma pluća. ;;[0422] Prethodni modeli tumora pokazuju upotrebljivost anti-cfms antitela koje inhibira aktivnost CSF-1/cfms ose, kao što je ovde opisano, za upotrebu u lečenju kancera. Sposobnost takvih antitela da smanje infiltriranje makrofaga u bolesnom tkivo znači da se ta antitela takođe mogu primeniti u mateboličkim i zapaljenskim bolestima. ;;Primer 17: Modulacija CSF-1/CSF-1R interakcije sa kontrolnom angiogenezom ;[0423] Kako bi se ispitalo da li CSF-1 posredovano upošljavanje, diferencijacija i stimulacija makrofaga može biti uključeno u pomovisanju angiogeneza kod tumora ili drugim normalnim tkivima, dva različita neutrališuća anti-mišja CSF-1R monoklonalna antitela pacova (M279 generisano je interno; drugo, FS98, dobijeno od Ebiosciences), procenjena su na njihov efekat na mišju angiogeneza rožnjače in vivo. Na dan peti nakon jedne sistemske doze kontrolnog mAb, M279 ili AFS98, izmereni su sledeći parameteri i analizirani: 1)vaskularna gustina povezana sa odgovorom na mišju angiogenezu rožnjače, 2) cirkulacioni nivoi mišjeg CSF-1, i 3) nivoi infiltriranja makrofaga u rožnjači i drugim tkivima. ;;Ispitivanje džepa rožnjače miša ;[0424] 4 mm PVA sunđer (M-PACT Worldwide, Eudora, KS) precizno je isečen na dva jednaka dela i uronjen u 8 µl PBS-a koji sadrži 2.4 µg rekombinantnog humanog FGF-2 ili 48 µg rekombinantnog humanog VEGF (R&D Systems, Minneapolis, MN). Sunđer je dalje aseptički obrađen u 48 slično dovedenih na veličinu mini-sunđer fragmenata (peleta) pogodni za implantaciju u džepove rožnjače. Svaki sunđerasti fragment sadržao je približno 50 ng rekombinantnog humanog FGF-2 ili 1 µg rekombinantnog humanog VEGF. Ženke C57 BL/6 miševi (7-10 nedelja stare) anestezirane su upotrebom sistemske anestezije, i oči su pripremljene za zasecanje rožnjače incision smeštanjem jedne kapi Proparakainskog topikalnog anestetika u svako oko. Fini rez je izveden u sredini rožnjače i stvoren je otvor ("džep") u stromi rožnjače praćeno zakrivljenjem oka približno 1 mm od limbusa. Peleti koji sadrže PBS, VEGF ili FGF-2 smešteni su u džepove rožnjače i životinje su tretirane sa IgG pacova (Sigma, St. ;Louis, MO) IP pri dozi od 250 µg u 200 µl PBS bez pirogena, ili sa 250 µg prečišćenog anti-mišjeg CSF-1R pacova. Na dan 5 nakon implantacije peleta, miševi su anestezirani sa sistemskom anestezijom i svako oko (rožnjača) snimljeno je pod stereomikroskopom opremljenim sa Insight Spot digitalnom kamerom oprenljenom sa vertikalnim iluminatorom na blizu pri početnim uglom od 45 stepeni od polarne ose u meridijanu koji sadrži pelet. Ovako pribavljene digitalne slike obrađene su subtraktivnim kolor filterima (Adobe Photoshop) i analizirane upotrebom softvera za analizu slika Bioquant (Nashville, TN) do određivanja frakcije piksela unutar ukupne gustine perimetra rožnjače koji je prešao prag koji se poklapa sa vidljivim kapilarima. Ukupna vaskularna gustina rožnjače određena je upotrebom frakcije piksela, čiji je rezultat izražen kao odnos broja površine krvnih sudova prema broju piksela površine celog oka. ;;Mišja CSF-1 ELISA ;[0425] Serumski nivoi mišje CSF-1 određuju se kao biomarker aktivnosti anti CSF-1R antitela upotrebom DUOSET antitelo ELISA sistema (R&D Systems) u skladu sa instrukcijama proizvođača. ;;Imunolokalizacija makrofaga i krvnih sudova u tkivu jetre i rožnjače miševa ;[0426] Za određivanje efekata anti-mišjeg CSF-1R antitela na makrofagu i krvnim sudovima u tkivu, anti-mišju F4/80 pacova (glikoprotein makrofag-ograničene ćelijske površine), konjugovano sa Alexa 488, klon BM8 (1:1000) koriščeno je za detektovanje tkivnih makrofaga. CD31, anti-mišji PECAM-1 IgG2a pacova, konjugovan sa PE, klon 390 (upotreba 1 µg/ml) korišćen je za detektovanje endotelijalnih ćelija. Nakon što je tkivo sakupljeno, zamrznuto je u OCT za dalje obrađivanje.5 mikrona sekcije ili jetre ili rožnjače fiksirano je sa hladnim acetonom tokom 15 min na sobnoj temperaturi i zatim oprano dva puta sa PBS. Nakon pranja, sekcije su inkubirane u blokirajućem rastvoru (BS) tokom 30 min na sobnoj temperaturi. Oba F4/80-488 i CD31-PE dodata su u višim koncentracijama u BS, a sekcije su inkubisane 30 minutes na sobnoj temperaturi praćeno sa dva pranja sa PBS. Slajdovi su monirani u montirajućem medijumu, a fluorescentne slike su pribavljene sa Leica-Hamamutsu-Openlab sistemom. ;;Rezultati i zaključak: ;[0427] Anti-muCSF-1R neutrališući antitela pacova, M279 i AFS98, značajno inhibirano FGF-2, ali ne VEGF-indukovana mišja angiogeneza rožnjače za približno 80 % (P<0.01). Jedna doza 250 µg M279 ili AFS98, značajno je povećala muCSF-1 serumske nivoe u poređenju sa nivoima primećenim u IgG pacovatretiranim miševima (45-83 struko povećanje). Imunofluorescentno bojenje / lokalizacioni (IMF) rezultati u sekcijama mišje rožnjače pokazali su je implantacija FGF-2 i VEGF peleta povećala infiltraciju makrofaga u rožnjači u poređenju sa samom hirurškom/implantacijom PBS peleta. M279 lečenje robusno je smanjilo stimulus-indukovanu (oba FGF-2 i VEGF) infiltraciju makrofaga rožnjače u poređenju sa kontrolnim tretiranjem sa IgG pacova za približno 85 do 96 procenata. IMF rezultati u sekcijama mišje jetre takođe su pokazali da je tretiranje sa M279 ili AFS98 značajno smanjilo broj F4/80 pozitivnih makrofaga za približno 60% u jetri miševa dok nije značajno izmenilo vaskularnu gustinu kako je procenjeno sa CD31 IMF (P <0.01). Makrofagi prate mrežu krvnih sudova, ali generalno ne sarađuju sa mikrosudovima u prokrvljenoj rožnjači miša. ;;[0428] Kada su procenjivana oba angiogena stimulusa (FGF-2 i VEGF), blokiranje CSF-1/CSF-1R interakcije smanjilo je infiltraciju makrofaga u tkivu dok je inhibiralo samo FGF-2 angiogenezu na bazi snimanja snimanja gustine suda rožnjače. Na osnovu ovih rezultata, čini se da zapaljenska okolina diktira kada CSF-1 odzivno tkivo makrofaga može olakšati / promovisati angiogenezu, dok u isto vreme pokazuje da tkivo makrofaga na višestruko zapaljenim mestima zahteva CSF-1/CSF-1R interakcije u toku kako bi održao njihovo prisustvo u zapaljenskim lezijama. Rezultati ukazuju da u slučajevima u kojima je zapaljenska angiogeneza pokretana primarno sa FGF-2 koji inhibira CSF-1/CSF-1R interakciju može biti dobro u smanjivanju novie formacije krvnih sudova, naročito u tumorima u kojima VEGF nivoi nisu visoki, ali vaskularna gustina tumora jeste. ;;Primer 18: Toksikološka ispitivanja na Cinomolgus majmunima ;[0429] Na Cinomolgus majmune primenjeno je 1.2 SM antitelo i izmereni su farmakodinamički markeri. Kohorta koja se koristi za ispitivanje efekata c-fms antigen vezujućeg proteina prikazana je u TABELI 24. Antitelo 1.2 SM je dato nedeljno intravenoznim ubrizgavanjem u Cinomolgus majmune tokom 4 nedelje praćeno sa periodom od 11-nedelja oporavka, sa terminalnom nekropsijom na dan 29 i oporavljajućom nekropsijom na 3 meseca. Farmakodinamički markeri koji uključujući serum CSF-1 nivoe, koncentracije Tartrat-rezistentne kisele fosfataze 5b (Trap5b) i količinu makrofaga debelog creva su mereni. Kako je opisano detaljnije u nastavku, merenje svakog od ovih markera pokazalo je sposobnost antitela da se veže sa c-fms i inhibira c-fms/CSF-1 osu. Nivo markera takođe je bilo u korelaciji sa nivoima antitela u krvi. ;;TABELA 24: Kohorta za toksikološko ispitivanje ;; ; Odgovor serum CSF-1 nivoa na tretiranje sa antitelom 1.2 SM ;[0430] Serum CSF-1 nivoi obezbeđuju biomarker za prisustvo i aktivnost anti-c-fms antitela. Ovo je dokazano selektivnom degradacijom od strane makrofaga<125>I-obeleženog CSF-1 u miševima (Tushinski RJ et al. Cell (1982) 28:71-81); opservacijama da CSF-1 je povišen u serumu c-fms nok out miševima (Dai XM et al. Blood (2002) 99:111-120); i demonstracijama da su serumski CSF-1 nivoi povišen kod miševa tretiranih sa anti-mišjim c-fms antitelom. ;;[0431] Relativne koncentracije Cinomolgus CSF-1 određuju se za serumske vrste sakupljene na -7, 8, 29, 57, 85, i 99 dana. Uzorci su analizirani upotrebom enzim-vezanog imunosorbentnog ogleda (ELISA) praćeno protokolom obezbeđenim od strane proizvođača ogleda (R&D Systems Humani CSF-1 DuoSet ELISA kit; Minneapolis, MN). Cinomolgus CSF-1 koncentracije određuju poređenjem sa humanom CSF-1 standardnom krivom. ;;[0432] Kako bi se izmerila koncentracija antitela 1.2 SM u serumu, mišje anti- 1.2 SM antitelo pasivno je apsorbovano u bazenčićima Maxisorp mikroploče (Nunc). Bazenčići mikroploče blikorani su sa SuperBlock®T20 (Pierce, Rockford, IL) nakonon uklanjanja viška mišjeg anti- 1.2 SM antitela. Standardi i kontrole kvaliteta (QC-ovi) pripremljeni su spajkovanjem antitela 1.2 SM u 100% Cinomolgus majmun serumskom bazenu. Bazenčići mikroploče su oprani praćeno blokiranjem. Standardi, prazna matrica (NSB), QC-ovi, i ispitni uzorci odleđeni su na sobnoj temperaturi, a zatim uvedeni u bazenčiće mikroploče nakon predtretiranja 1/50 sa SuperBlock®T20. Antitelo 1.2 SM u uzorcima uhvaćeno je od strane imobilisanog mišjeg anti- 1.2 SM antitela. Nevezano antitelo 1.2 SM uklonjeno je pranjem bazenčića mikroploče. Nakon pranja, drugo peroksidazom rena (HRP) konjugovano mišje anti- 1.2 SM antitelo dodato je u bazenčiće mikroploče radi vezivanja sa uhvaćenim antitelom 1.2 SM. Nevezano HRP konjugovano antitelo je uklonjeno pranjem.2-komponenti 3,3',5,5'-Tetrametilbenzidin (TMB) supstracioni rastvor dodat je u bazenčiće. TMB supstratski rastvor uveden je u reakciju sa peroksidom, i u prisustvu HRP kreiranog kolometrijskog signala koji je bio proporcionalan količini antitela 1.2 SM vezanog reagensom za hvatanje iz inicijalne faze. Razvoj boje je zaustavljen, a intenzitet boje (optička gustina, OD) izmerena je pri 450 nm do 650 nm. Podaci su redukovani upotrebom Watson-a verzija 7.0.0.01 redukcionog paketa upotrebom Logističkog (auto-procenjivačkog) (4 parametar logistika; 4-PL) regresionog modela sa težinskim faktorom od 1/Y. ;;[0433] Tretiranje majmuna sa antitelom 1.2 SM rezultiralo je u značajnom povećanju CSF-1 nivoa u serumu, a to je bilo u vezi sa koncentracijom antitela u serumu. Prema tome, pronađeno je da su se CSF-1 nivoi u serumu povećali nakon davanja antitela i njegove akumulacije u serumu, a zatim da su se smanjila kada je davanje završeno i nivoi antitela u serumu se se smanjili. Ova zapažanja su konzistentna sa aktivnošću antitela na c-fms/CSF-1 osu. ;;Odgovor Trap5b nivoa na tretiranje sa antitelom 1.2 SM ;[0434] Trap5b nivoi obezbeđuju marker za anti-c-fms antitela. Trap5b je specifično eksprimiran od strane osteoklasta i predstavlja indikator broja osteoklasta. Osteoklasti, koji su izvedeni iz mijeloidne linije hematopoietičnih ćelija eksprimiraju c-fms i koriste CSF-1. U skladu sa tim jei zapažanje da gubitak CSF-1 rezultira u smanjenju osteolastova i nivoima Trap5b u CSF-1 nok out (op/op) miševima (Dai XM et al., Blood (2002) 99:111-120). ;;[0435] BoneTRAP® ogled (Immunodiagnostic SystemsLimited, Fountain Hills, AZ) korišćen je za kvanitifikovanje TRAP5b kod subjekata. Koncentracije antitela 1.2 SM u serumu određuju se kako je prethodno opisano. Nivoi TRAP5b i antitela 1.2 SM u serumu određuju se za serumske for serum uzorske sakupljene na dane -7, 8, 29, 57, 85, i 99. ;;[0436] Na dan 29 dozirajuće faze, svi subjekti koji su tretirani 1.2 SM antitelom imali su smanjen Trap5b. Nakon tretiranja sa antitelom 1.2 SM, koncentracije u serumu za Trap5b su se povećali kako se koncentracije antitela u serumu smanjivale. Tretiranje sa antitelom 1.2 SM bilo je u korelaciji sa smanjenim koncentracijama Trap5b u serumu. ;;Odgovor makrofaga na tretiranje sa antitelom 1.2 SM ;[0437] Kao dodatni indikator aktivnosti antitela 1.2 SM u Cinomolgus majmunima, broj makrofaga prisutan tkuvu debelog creva kvantifikovan je citometrijom laserskog skeniranja (LSC) CD-68-obojenog tkiva. Uzorci debelog creva sakupljeni su od 3 životinje/pol/grupa na dan 29 nekropsije i 2 životinje/pol/grupa na dan 100 nekropsije. Uzorak svakog tkiva sakupljen je u OCT (Optimalna temperatura sečenja) medijumu (Sakura Finetek, Torrance, California) i zamrznut u suvi led/butan kupki. Makrofagi su obojeni upotrebom konvencionalne imunohistohemije sa anti-CD68 ili izotipom antitela. Diaminobenzidin (DAB) pozitivni događaji nabrojani su upotrebom citometrije laserskog skeniranja (LSC). ;2 postupak skniranja je upotrebljen u kojem je apsorpcija laserskog zraka kvantifikovana fotojodnim detektorom iznad faze. Prvi prolazak niske rezolucije identifikovao je položaj sekcije na slajderu, a naknadni prolaz visoke rezolucije obezbedio je slike polja. Kvanititativna analiza DAB bojenja izvedena je upotrebom LSC-povezanog iCyte softvera. ;;[0438] TABELA 25 sumira promene u broju kakrofaga debelog creva odmah nakon tretiranja (Dan 29) i naknadno uperiodu oporavka u kojem se antitelo 1.2 SM nije više primenjivalo (Dan 99). kako se može videti iz ove tabele, davanje antitela 1.2 SM redukovalo je broj makrofagne kolonije, dok je broj makrofaga smanjen nakon lečenja prekinut, čime se potvrđuje aktivnost antitela. ;;TABELA 25: Efekat antitela 1.2 SM na populaciju makrofaga ;; ;;; Primer 19: Tretiranje tumora kod pacijenta upotrebom c-fms vezujućeg proteina ;[0439] Humanom pacijentu dijagnostikovan je maligni tumor. Pacijent je tretiran efektivnim količinama c-fms vezujućeg proteina koji je ovde opisan. Nakon davanja c-fms vezujućeg proteina, izmerena je veličina i/ili metabolička aktivnost tumora (npr., pomoću MRI ili PET skenera). Značajna smanjenja u veličini i/ili metaboličkoj aktivnosti ili drugih indikatora rasta tumora, vijabilnosti, metastaza pronađena su kao odgovor na davanje c-fms vezujućeg proteina. ;;Primer 20: Smanjenje TAM-ova kod pacijenta sa malignim tumorom upotrebom c-fms vezujućeg proteina ;[0440] Humanom pacijentu je dijagnostikovan maligni tumor. Pacijent je tretiran efektivnim količinama c-fms vezujućeg proteina koji je ovde opisan. Nakon davanja c-fms vezujućeg proteina, broj TAM-ova je izmeren. Pronađena su značajna smanjenja u broju TAM-ova kao odgovor na davanje c-fms vezujućeg proteina. ;;Primer 21: Tretiranje kaheksije upotrebom c-fms vezujućeg proteina ;[0441] Humanom pacijentu dijagnostikovan je kancer. Pacijent je tretiran efektivnim količinama ovde opisanog c-fms vezujućeg proteina. Nakon davanja c-fms vezujućeg proteina, nivo kaheksije je određen. Značajno smanjenje u nivou kaheksije pronađeno je kao odgovor na davanje c-fms vezujućeg proteina. ;;Primer 22: Smanjenje vaskularizacije upotrebom c-fms vezujućeg proteina ;[0442] Humanom pacijentu dijagnostikovan je maligni tumor. Pacijent je tretiran efektivnim količinama ovde opisanog c-fms vezujućeg proteina. Nakon davanja c-fms vezujućeg proteina, uzeta je biopsija tumora i određen je nivo vaskularizacije. Značajno smanjenje u nivou i/ili funkciji tumorne vaskularizacije pronađeno je kao odgovor na davanje c-fms vezujućeg proteina. ;;Primer 23: Tretiranje zapaljenskog artritisa upotrebom c-fms vezujućeg proteina ;[0443] Humanom pacijentu dijagnostikovan je zapaljenski artritis. Pacijent je tretiran efektivnim količinama ovde opisanog c-fms vezujućeg proteina. Nakon davanja c-fms vezujućeg proteina, određen je nivo zapaljenja i/ili gustine kostiju. Značajno smanjenje u nivou zapaljenja i/ili osteolize kostiju pronađeno je kao odgovor na davanje c-fms vezujućeg proteina. ;;[0444] Sve izjave do današnjeg datuma ili prezentacije koje se tiču sadržaja patenata i drugih publikacija koje su ovde identifikovane, zasnovane su na informacijama koje su dostupne podnosiocima prijava i ne predstavljaju prihvatanje u pogledu ispravnosti datuma ili sadržaja ovih dokumenata. ;;LISTA SEKVENCI ;[0445] ;; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; *

Claims

Patentni zahtevi

1. Antitelo odabrano iz grupe koju čini antitelo koje obuhvata regione koji određuju komplementarnost (CDR-ovi) CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2, i CDRL3, pri čemu pomenuti CDR-ovi obuhvataju aminokiselinske sekvence kakve su navedene u nastavku:

(a) CDRH1 obuhvata SEQ ID NO:147, CDRH2 obuhvata SEQ ID NO:163, CDRH3 obuhvata SEQ ID NO:186, CDRL1 obuhvata SEQ ID NO:193, CDRL2 obuhvata SEQ ID NO:214, i CDRL3 obuhvata SEQ ID NO:228, (b) CDRH1 obuhvata SEQ ID NO:137, CDRH2 obuhvata SEQ ID NO:150, CDRH3 obuhvata SEQ ID NO:166, CDRL1 obuhvata SEQ ID NO:198, CDRL2 obuhvata SEQ ID NO:216, i CDRL3 obuhvata SEQ ID NO:233, (d) CDRH1 obuhvata SEQ ID NO:147, CDRH2 obuhvata SEQ ID NO:163, CDRH3 obuhvata SEQ ID NO:186, CDRL1 obuhvata SEQ ID NO:195, CDRL2 obuhvata SEQ ID NO:214, i CDRL3 obuhvata SEQ ID NO:228, (e) CDRH1 obuhvata SEQ ID NO:137, CDRH2 obuhvata SEQ ID NO:152, CDRH3 obuhvata SEQ ID NO:170, CDRL1 obuhvata SEQ ID NO:198, CDRL2 obuhvata SEQ ID NO:216, i CDRL3 obuhvata SEQ ID NO:233, (f) CDRH1 obuhvata SEQ ID NO:147, CDRH2 obuhvata SEQ ID NO:163, CDRH3 obuhvata SEQ ID NO:186, CDRL1 obuhvata SEQ ID NO:194, CDRL2 obuhvata SEQ ID NO:214, i CDRL3 obuhvata SEQ ID NO:228, (g) CDRH1 obuhvata SEQ ID NO:141, CDRH2 obuhvata SEQ ID NO:156, CDRH3 obuhvata SEQ ID NO:172, CDRL1 obuhvata SEQ ID NO:209, CDRL2 obuhvata SEQ ID NO:223, i CDRL3 obuhvata SEQ ID NO:245, (i) CDRH1 obuhvata SEQ ID NO:140, CDRH2 obuhvata SEQ ID NO:155, CDRH3 obuhvata SEQ ID NO:169, CDRL1 obuhvata SEQ ID NO:202, CDRL2 obuhvata SEQ ID NO:218, i CDRL3 obuhvata SEQ ID NO:236, (j) CDRH1 obuhvata SEQ ID NO:140, CDRH2 obuhvata SEQ ID NO:155, CDRH3 obuhvata SEQ ID NO:169, CDRL1 obuhvata SEQ ID NO:201, CDRL2 obuhvata SEQ ID NO:218, i CDRL3 obuhvata SEQ ID NO:236, (k) CDRH1 obuhvata SEQ ID NO:143, CDRH2 obuhvata SEQ ID NO:158, CDRH3 obuhvata SEQ ID NO:190, CDRL1 obuhvata SEQ ID NO:199, CDRL2 obuhvata SEQ ID NO:219, i CDRL3 obuhvata SEQ ID NO:237, (L) CDRH1 obuhvata SEQ ID NO:137, CDRH2 obuhvata SEQ ID NO:151, CDRH3 obuhvata SEQ ID NO:167, CDRL1 obuhvata SEQ ID NO:199, CDRL2 obuhvata SEQ ID NO:217, i CDRL3 obuhvata SEQ ID NO:233, (m) CDRH1 obuhvata SEQ ID NO:137, CDRH2 obuhvata SEQ ID NO:150, CDRH3 obuhvata SEQ ID NO:173, CDRL1 obuhvata SEQ ID NO:198, CDRL2 obuhvata SEQ ID NO:216, i CDRL3 obuhvata SEQ ID NO:233, (n) CDRH1 obuhvata SEQ ID NO:142, CDRH2 obuhvata SEQ ID NO:157, CDRH3 obuhvata SEQ ID NO:187, CDRL1 obuhvata SEQ ID NO:206, CDRL2 obuhvata SEQ ID NO:221, i CDRL3 obuhvata SEQ ID NO:242, (o) CDRH1 obuhvata SEQ ID NO:143, CDRH2 obuhvata SEQ ID NO:158, CDRH3 obuhvata SEQ ID NO:177, CDRL1 obuhvata SEQ ID NO:200, CDRL2 obuhvata SEQ ID NO:216, i CDRL3 obuhvata SEQ ID NO:235, ili (p) CDRH1 obuhvata SEQ ID NO:142, CDRH2 obuhvata SEQ ID NO:157, CDRH3 obuhvata SEQ ID NO:176, CDRL1 obuhvata SEQ ID NO:207, CDRL2 obuhvata SEQ ID NO:224, i CDRL3 obuhvata SEQ ID NO:243; i pri čemu se pomenuto antitelo vezuje za humani c-fms sa KDod manje od 10<-8>M, izmereno kako je ovde opisano.

2. Antitelo prema zahtevu 1, u kojem to antitelo obuhvata varijabilni teški lanac (VH) i varijabilni laki lanac (VL), gde VH i VL obuhvataju aminokiselinske sekvence navedene u nastavku:

(a) VH obuhvata SEQ ID NO:77, a VL obuhvata SEQ ID NO:109;

(b) VH obuhvata SEQ ID NO:77, a VL obuhvata SEQ ID NO:110;

(c) VH obuhvata SEQ ID NO:78, a VL obuhvata SEQ ID NO:133;

(e) VH obuhvata SEQ ID NO:80, a VL obuhvata SEQ ID NO:112;

(f) VH obuhvata SEQ ID NO:84, a VL obuhvata SEQ ID NO:115;

(g) VH obuhvata SEQ ID NO:85, a VL obuhvata SEQ ID NO:116;

(h) VH obuhvata SEQ ID NO:86, a VL obuhvata SEQ ID NO:117;

(j) VH obuhvata SEQ ID NO:70, a VL obuhvata SEQ ID NO:102;

(k) VH obuhvata SEQ ID NO:70, a VL obuhvata SEQ ID NO:103;

(l) VH obuhvata SEQ ID NO:73, a VL obuhvata SEQ ID NO:105;

(m) VH obuhvata SEQ ID NO:74, a VL obuhvata SEQ ID NO:106;

(n) VH obuhvata SEQ ID NO:89, a VL obuhvata SEQ ID NO:121;

(o) VH obuhvata SEQ ID NO:93, a VL obuhvata SEQ ID NO:123;

(p) VH obuhvata SEQ ID NO:94, a VL obuhvata SEQ ID NO:124;

(q) VH obuhvata SEQ ID NO:97, a VL obuhvata SEQ ID NO:127; ili

(r) VH obuhvata SEQ ID NO:98, a VL obuhvata SEQ ID NO:128.

3. Antitelo prema zahtevu 1 ili zahtevu 2, gde je vezivanje između pomenutog antitela i mutanta humanog c-fms manje od 50% vezivanja između pomenutog antitela i humanog c-fms sa aminokiselinskom sekvencom navedenom u SEQ ID NO:1, i pri čemu pomenuti mutant humani c-fms ima aminokiselinsku sekvencu odabranu od:

(a) aminokiselinske sekvence navedene u SEQ ID NO:1 gde je prisutna najmanje jedna mutacija odabrana od K102E, R144E, R146E, D174R, i A226R,

(b) aminokiselinske sekvence navedene u SEQ ID NO:1 gde je prisutna najmanje jedna mutacija odabrana od E29R, Q 121R, T152R, i K185E,

(c) aminokiselinske sekvence navedene u SEQ ID NO:1 gde je prisutna najmanje jedna mutacija odabrana od E29R, Q121R, S172R, G274R, i Y276R, ili

(d) aminokiselinske sekvence navedene u SEQ ID NO:1 gde je prisutna najmanje jedna mutacija odabrana od R106E, H151R, T152R, Y154R, S155R, W159R, Q171R, S172R, Q173R, G183R, R184E, K185E, E218R, A220R, S228R, H239R, N240R, K259E, G274R, N275R, Y276R, S277R, i N282R.

4. Antitelo prema bilo kom od zahteva 1 do 3, pri čemu je pomenuto antitelo sposobno da veže polipeptid koji se sastoji od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO:326, pri čemu pomenuto antitelo ne vezuje polipeptid koji se sastoji od aminokiselina 20-126 iz SEQ ID NO:1, i ne vezuje polipeptid koji se sastoji od aminokiselina 85-223 iz SEQ ID NO:1.

5. Antitelo prema zahtevu 2 koje obuhvata dva identična VH i dva identična VL.

6. Antitelo prema zahtevu 2 ili zahtevu 5, pri čemu pomenuto antitelo obuhvata potpun teški lanac i potpun laki lanac, pri čemu pomenuti potpun teški lanac i potpun laki lanac obuhvataju aminokiselinske sekvence navedene u nastavku:

(a) potpun teški lanac obuhvata SEQ ID NO:11 , a potpun laki lanac obuhvata SEQ ID NO:43;

(b) potpun teški lanac obuhvata SEQ ID NO:11 , a potpun laki lanac obuhvata SEQ ID NO:44;

(c) potpun teški lanac obuhvata SEQ ID NO:12 , a potpun laki lanac obuhvata SEQ ID NO:67;

(e) potpun teški lanac obuhvata SEQ ID NO:14 , a potpun laki lanac obuhvata SEQ ID NO:46;

(f) potpun teški lanac obuhvata SEQ ID NO:18 , a potpun laki lanac obuhvata SEQ ID NO:49;

(g) potpun teški lanac obuhvata SEQ ID NO:19 , a potpun laki lanac obuhvata SEQ ID NO:50;

(h) potpun teški lanac obuhvata SEQ ID NO:20 , a potpun laki lanac obuhvata SEQ ID NO:51;

(j) potpun teški lanac obuhvata SEQ ID NO:4 , a potpun laki lanac obuhvata SEQ ID NO:36;

(k) potpun teški lanac obuhvata SEQ ID NO:4 , a potpun laki lanac obuhvata SEQ ID NO:37;

(l) potpun teški lanac obuhvata SEQ ID NO:7 , a potpun laki lanac obuhvata SEQ ID NO:39;

(m) potpun teški lanac obuhvata SEQ ID NO:8 , a potpun laki lanac obuhvata SEQ ID NO:40;

(n) potpun teški lanac obuhvata SEQ ID NO:23 , a potpun laki lanac obuhvata SEQ ID NO:55;

(o) potpun teški lanac obuhvata SEQ ID NO:27 , a potpun laki lanac obuhvata SEQ ID NO:57;

(p) potpun teški lanac obuhvata SEQ ID NO:28 , a potpun laki lanac obuhvata SEQ ID NO:58;

(q) potpun teški lanac obuhvata SEQ ID NO:31 , a potpun laki lanac obuhvata SEQ ID NO:61; ili

(r) potpun teški lanac obuhvata SEQ ID NO:32 , a potpun laki lanac obuhvata SEQ ID NO:62.

7. Antitelo prema bilo kom od zahteva 1, 2, 5, ili 6, u kojem:

(a) CDRH1 obuhvata SEQ ID NO:147, CDRH2 obuhvata SEQ ID NO:163, CDRH3 obuhvata SEQ ID NO:186, CDRL1 obuhvata SEQ ID NO:193, CDRL2 obuhvata SEQ ID NO:214, i CDRL3 obuhvata SEQ ID NO:228; (b) CDRH1 obuhvata SEQ ID NO:140, CDRH2 obuhvata SEQ ID NO:155, CDRH3 obuhvata SEQ ID NO:169, CDRL1 obuhvata SEQ ID NO:202, CDRL2 obuhvata SEQ ID NO:218, i CDRL3 obuhvata SEQ ID NO:236; (c) CDRH1 obuhvata SEQ ID NO:140, CDRH2 obuhvata SEQ ID NO:155, CDRH3 obuhvata SEQ ID NO:169, CDRL1 obuhvata SEQ ID NO:201, CDRL2 obuhvata SEQ ID NO:218, i CDRL3 obuhvata SEQ ID NO:236; ili (d) CDRH1 obuhvata SEQ ID NO:142, CDRH2 obuhvata SEQ ID NO:157, CDRH3 obuhvata SEQ ID NO:187, CDRL1 obuhvata SEQ ID NO:206, CDRL2 obuhvata SEQ ID NO:221, i CDRL3 obuhvata SEQ ID NO:242.

8. Antitelo prema bilo kom od zahteva 1, 2, 5, 6, ili 7, u kojem je to antitelo odabrano iz grupe koju čini antitelo u kojem:

(a) VH obuhvata SEQ ID NO:77, a VL obuhvata SEQ ID NO:109,

(b) VH obuhvata SEQ ID NO:77, a VL obuhvata SEQ ID NO:110,

(c) VH obuhvata SEQ ID NO:70, a VL obuhvata SEQ ID NO:102,

(d) VH obuhvata SEQ ID NO:70, a VL obuhvata SEQ ID NO:103,

(e) VH obuhvata SEQ ID NO:93, a VL obuhvata SEQ ID NO:123, ili

(f) VH obuhvata SEQ ID NO:94, a VL obuhvata SEQ ID NO:124.

9. Antitelo prema bilo kom od zahteva 1, 2, 5, 6, 7 ili 8, u kojem je to antitelo odabrano iz grupe koju čini antitelo u kojem:

(a) potpun teški lanac obuhvata SEQ ID NO:11 , a potpun laki lanac obuhvata SEQ ID NO:43,

(b) potpun teški lanac obuhvata SEQ ID NO:11 , a potpun laki lanac obuhvata SEQ ID NO:44,

(c) potpun teški lanac obuhvata SEQ ID NO:4 , a potpun laki lanac obuhvata SEQ ID NO:36,

(d) potpun teški lanac obuhvata SEQ ID NO:4 , a potpun laki lanac obuhvata SEQ ID NO:37,

(e) potpun teški lanac obuhvata SEQ ID NO:27 , a potpun laki lanac obuhvata SEQ ID NO:57, ili

(f) potpun teški lanac obuhvata SEQ ID NO:28 , a potpun laki lanac obuhvata SEQ ID NO:58.

10. Antitelo prema bilo kom od zahteva 1 do 9 koje je:

(a) monoklonalno antitelo, rekombinantno antitelo, humano antitelo, himerno antitelo, bispecifično antitelo, multispecifično antitelo, ili njihov fragment;

(b) IgG1, IgG2, IgG3, ili IgG4 podtipa;

(c) humano antitelo IgG1, IgG2, IgG3, ili IgG4 podtipa;

(d) Fab fragment, Fab' fragment, F(ab')2fragment, Fv fragment, dijatelo, domensko antitelo, ili molekul jednolančanog antitela; ili

(e) imunološki funkcionalan fragment imunoglobulina, a izveden iz humanog izvora.

11. Nukleinska kiselina koja kodira antitelo prema bilo kom od zahteva 1 do 10, opciono gde je pomenuta nukleinska kiselina operativno vezana za kontrolnu sekvencu.

12. Vektor koji obuhvata nukleinsku kiselinu prema zahtevu 11.

13. Ćelija domaćin koja obuhvata vektor prema zahtevu 12 i/ili nukleinsku kiselinu prema zahtevu 11.

14. Farmaceutska kompozicija koja obuhvata najmanje jedno antitelo prema bilo kom od zahteva 1 do 10, i farmaceutski prihvatljiv ekscipijens.

15. Farmaceutska kompozicija prema zahtevu 14, koja dalje obuhvata:

(a) neki dodatni aktivni agens; ili

(b) neki dodatni aktivni agens odabran iz grupe koju čine neki radioizotop, neki radionuklid, neki toksin, neki terapeutik i neka hemioterapeutska grupa.

16. Antitelo prema bilo kom od zahteva 1 do 10 za upotrebu u terapiji.

17. Antitelo prema bilo kom od zahteva 1 do 10 za upotrebu u lečenju ili prevenciji nekog stanja povezanog sa c-fms kod pacijenta, pri čemu je to stanje odabrano od kancera, bolesti kostiju, i zapaljenske bolesti.

18. Antitelo za upotrebu prema zahtevu 17, gde je zapaljenska bolest odabrana iz grupe koju čine zapaljenski artritis, ateroskleroza, multipla skleroza, zapaljenska bolest creva, Kronova bolest, ulcerozni kolitis, reumatoidni spondilitis, ankilozni spondilitis, artritis, psoriatični artritis, reumatoidni artritis, osteoartritis, ekcem, kontaktni dermatitis, psorijaza, sindrom toksičnog šoka, sepsa, septični šok, endotoksični šok, astma, hronična zapaljenska bolest pluća, silikoza, plućna sarkoidoza, restenoza, povreda srčane i renalne reperfuzije, tromboza, glomerulonefritis, dijabetes, reakcija graft vs domaćin, odbacivanje alografta, multipla skleroza, mišićna degeneracija, mišićna distrofija, Alchajmerova bolest, šlog, i kaheksija.

19. Antitelo za upotrebu prema zahtevu 17, gde je kancer odabran iz grupe koju čine kancer dojke, kancer prostate, kolorektalni kancer, endometrijalni adenokarcinom, leukemija, limfom, melanom, kancer ezofagealnih skvamoznih ćelija, gastrični kancer, astrocitni kancer, endometrijalni kancer, kancer grlića materice, kancer bešike, kancer bubrega, kancer pluća i kancer jajnika.

20. Antitelo za upotrebu prema zahtevu 17, gde je bolest kostiju odabrana iz grupe koju čine:

(a) medicinski poremećaji koji uključuju prekomeran koštani gubitak;

(b) medicinski poremećaji koji zahtevaju formiranje nove kosti;

(c) osteopeni poremećaji koji uključuju prekomernu aktivnost osteoklasta;

(d) sistemski koštani gubitak povezan sa artritisom; i

(e) bolest kostiju povezana sa otkazivanjem bubrega.

21. Antitelo za upotrebu prema zahtevu 20, u kojem:

(a) antitelo je za upotrebu prema zahtevu 20(a), a gde je medicinski poremećaj odabran od kancera dojke, kancera prostate, multiple mijeloma i osteosarkoma; ili

(b) antitelo je za upotrebu prema zahtevu 20(c), gde je osteopeni poremećaj odabran iz grupe koju čine osteopenija, osteoporoza, periodontitis, Pagetova bolest, koštani gubitak zbog imobilizacije, litične metastaze kostiju, i artritis.

22. Antitelo za upotrebu prema zahtevu 20(d) ili zahtevu 21(b), gde je artritis odabran iz grupe koju čine osteoartritis, reumatoidni artritis, psorijazni artritis, i zapaljenski artritis.

23. Antitelo za upotrebu prema zahtevu 17, gde je stanje bolest kostiju, i gde je ta bolest kostiju poremećaj kostiju; u kojem se to antitelo primenjuje u kombinaciji sa:

(a) nekim daljim terapeutskim agensom; ili

(b) nekim daljim terapeutskim agensom odabranim od agensa za tretiranje kancera, agensa koji inhibira aktivnost osteoklasta, i agensa koji pojačava aktivnost osteoblasta.

24. Antitelo za upotrebu prema zahtevu 23, gde je pacijent pacijent oboleo od kancera koji je pod radijacionom terapijom ili hemioterapijom.

25. Antitelo za upotrebu prema bilo kom od zahteva 17 i 19-23, gde je stanje kancer ili bolest kostiju; pri čemu se to antitelo primenjuje u kombinaciji sa agensom za tretiranje kancera.

26. Antitelo za upotrebu prema bilo kom od zahteva 17, 20, i 21, gde je stanje bolest kostiju koja rezultira u gubitku koštane mase, pri čemu se to antitelo primenjuje u kombinaciji sa daljim terapeutskim agensom odabranim od (anaboličkog) agensa za promovisanje rasta kostiju i koštanog antiresorptivnog agensa.

27. Antitelo za upotrebu prema bilo kom od zahteva 17, 18, i 22, gde je stanje zapaljenska bolest; a pri čemu se to antitelo primenjuje u kombinaciji sa anti-zapaljenskim agensom.

28. Farmaceutska kompozicija prema zahtevu 14 ili zahtevu 15 za upotrebu u lečenju pacijenta, gde je farmaceutski prihvatljiv ekscipijens odabran od farmaceutski prihvatljivog razblaživača, nosača, sredstva za poboljšanje rastvaranja, emulzifikatora, prezervativa, i/ili adjuvansa; i gde je pacijent humani pacijent.

29. Postupak pripremanja antitela prema bilo kom od zahteva 1 do 10, koji obuhvata fazu pripremanja pomenutog antitela iz ćelije domaćina koja luči pomenuto antitelo.