[go: up one dir, main page]

RS56680B1 - Kompozicije i postupci za lečenje kancera - Google Patents

Kompozicije i postupci za lečenje kancera

Info

Publication number
RS56680B1
RS56680B1 RS20171325A RSP20171325A RS56680B1 RS 56680 B1 RS56680 B1 RS 56680B1 RS 20171325 A RS20171325 A RS 20171325A RS P20171325 A RSP20171325 A RS P20171325A RS 56680 B1 RS56680 B1 RS 56680B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
wee1
cancer
inhibitor
patient
treatment
Prior art date
Application number
RS20171325A
Other languages
English (en)
Inventor
Stuart Denham Shumway
Original Assignee
Merck Sharp & Dohme
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Merck Sharp & Dohme filed Critical Merck Sharp & Dohme
Publication of RS56680B1 publication Critical patent/RS56680B1/sr

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A61K31/505—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim
    • A61K31/519—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim ortho- or peri-condensed with heterocyclic rings
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/573—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for enzymes or isoenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/106—Pharmacogenomics, i.e. genetic variability in individual responses to drugs and drug metabolism
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/91—Transferases (2.)
    • G01N2333/91005—Transferases (2.) transferring one-carbon groups (2.1)
    • G01N2333/91011—Methyltransferases (general) (2.1.1.)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Description

Opis
OBLAST PRONALASKA
[0001] Predmetni pronalazak se uopšteno odnosi na identifikaciju biomarkera čiji nivo ekspresije je koristan za predviđanje odgovora pacijenta na lečenje antiproliferativnim sredstvom, naročito inhibitorom WEE1. Nivo ekspresije biomarkera može da se koristi da bi se predvideo pacijent sa kanceroznim stanjem koje je posredovano inhibicijom apoptoze i koji će verovatno odgovoriti na lečenje inhibitorom WEE1.
OSNOVA PRONALASKA
[0002] Mnogi anti-kancerski lekovi koji se uobičajeno koriste neselektivno ciljno deluju na DNK u ćelijama koje se dele i na kraju dovode do oštećenja DNK. Ovo, za uzvrat, predstavlja okidač za aktivaciju kontrolnih tačaka ćelijskog ciklusa koje zaustavljaju napredovanje ćelijskog ciklusa (u G1, S, ili G2/M fazama) kako bi se obezbedilo vreme za popravku DNK pre nego što ćelija podlegne replikaciji DNK ili deobi. Sa terapeutske tačke gledišta, inhibicija kinaza kontrolnih tačaka koje posreduju u zaustavljanju ćelijskog ciklusa bi mogla da primora tumorske ćelije da nastave da se dele pre nego što hemijski indukovano oštećenje DNK bude popravljeno, izazivajući na kraju apoptozu ili mitotsku katastrofu (Medema, R.H. and Macurek, L., Oncogene, 2012, 31(21):2601-2613). Ispitivanja na ćelijskim linijama podržavaju ovu hipotezu i pokazuju hemosenzibilizaciju i radiosenzibilizaciju pomoću farmakološkog ili genetskog narušavanja aktivnosti kinaza kontrolne tačke uključujući CHK1, WEE1, ATR, i ATM. Inhibitori ovih kinaza su u različitim stadijumima predkliničkog i kliničkog razvoja u smislu njihove sposobnosti da senzibilišu tumorske ćelije na terapeutsko oštećenje DNK.
[0003] Kinaza kontrolne tačke WEE1 katalizuje inhibitornu fosforilaciju CDK1 (CDC2) i CDK2 na tirozinu 15 (Parker, L. L. and Piwnica-Worms, H., Science, 1992, 257(5078):1955-1957; Watanabe, N., et al., Embo J., 1995, 14(9):1878-1891). Inhibicija CDK1 i CDK2 zavisna od WEE1 zaustavlja ćelijski ciklus kao odgovor na spolja izazvano oštećenje DNK (Hamer, P.C.D., et al., Clin. Cancer Res., 2011, 17(13):4200-4207). Aktivnost WEE1 je takođe od suštinskog značaja za neporemećeni ćelijski ciklus (Mcgowan, C.H. and Russell, P., Embo J., 1993, 12(1):75-85; Tominaga, Y., et al., Intl. J. Biol. Sci., 2006, 2(4):161-170). Ispitivanja ćelijske sinhronizacije u normalnim humanim fibroblastima su otkrila da se slične količine WEE1 proteina detektuju u S i G2/M fazama, ali da je njegova najveća aktivnost u S fazi ćelijskog ciklusa (Watanabe, N., 1995). Dalje, pri uslovnom isključivanju WEE1 u mišjim embrionskim fibroblastima (MEF), ćelije pružaju dokaz genomske nestabilnosti, loše funkcionisanje kontrolnih tačaka i preuranjenu mitozu (Tominaga, et al., 2006). Ovaj fenotip je delimično objašnjen nedavnim otkrićima koja pokazuju ključnu ulogu WEE1 u sintezi DNK. Isključivanje WEE1, u odsustvu sredstava koja oštećuju DNK, vodi brzoj i izraženoj detekciji dvolančanih prekida DNK posebno u S-fazi ćelija koje podležu replikaciji DNK (Beck, H., et al., J. Cell Biol., 2010, 188(5):629-638; Dominguez-Kelly, R., et al., J. Cell Biol., 2011, 194(4):567-579). Podaci podržavaju model genomske stabilnosti zavisne od WEE1 u kome isključivanje ili inhibicija WEE1 vodi nenormalno visokoj aktivnosti CDK 1 i 2, rezultuje u vremenski neprikladnom aktiviranju prekomernih oridžina replikacije DNK što brzo smanjuje pulove nukleotida i dovodi do zastoja replikativnih viljuški koje su, u odsustvu aktivnosti WEE1, supstrati za DNK egzonukleaze i rezultuju u dvolančanim prekidima DNK (Beck, H., et al., 2012).
[0004] Smatra se da je deregulisana ekspresija ili aktivnost WEE1 znak patologije kod nekoliko tipova kancera. WEE1 je često prekomerno eksprimiran u glioblastomima i njegova aktivnost štiti ovaj tip tumora od mitotske katastrofe tako da su visoki nivoi WEE1 povezani sa lošom prognozom (Mir, S.E., et al., Cancer Cell, 2010, 18(3):244-257). Visoka ekspresija WEE1 je nađena u malignom melanomu i korelisana sa slabim preživljavanjem bez pojave bolesti u ovoj populaciji (Magnussen, G.I., et al., Plos One, 2012, 7(6)). Nenormalna ekspresija WEE1 je uključena u druge tipove tumora kao što je hepatocelularni karcinom (Masaki, T., et al., Hepatology, 2003, 37(3):534-543), kancer dojke (Iorns, E., et al., Plos One, 2009, 4(4)), karcinom kolona (Backert, S., et al., Intl., J. Cancer, 1999, 82(6):868-874)), karcinom pluća (Yoshida, T., et al., Annals of Oncology, 2004, 15(2):252-256) i karcinom skvamoznih ćelija glave i vrata (Wu, Z.X., et al., Mol. & Cell. Proteomics, 2011, 10(12)). Uznapredovali tumori sa povećanim nivoom genomske nestabilnosti mogu da zahtevaju funkcionalne kontrolne tačke kako bi se omogućila popravka takvog letalnog oštećenja DNK. Kao takav, WEE1 predstavlja privlačan cilj u uznapredovalim tumorima u kojima njegova inhibicija, kako se smatra, rezultuje nepopravljivim oštećenjem DNK (Sorensen, C.S. and Syljuasen, R.G., Nuc. Acids Res., 2012, 40(2):477-486).
[0005] Postoji potreba za biomarkerima koji mogu da se koriste za predviđanje koji pacijenti su podložni lečenju specifičnim terapijama, posebno za pacijente koji ne odgovaraju na lečenje ili za koje je verovatno da će postati otporni na terapije prve linije. Cilj ovog pronalaska je, prema tome, obezbeđivanje prognostičkog biomarkera za izbor pacijenata za koje je verovatno da će odgovoriti na lečenje inhibitorom WEE1.
[0006] US 20120172370 opisuje određene inhibitore WEE1 i i njihovu upotrebu u lečenju kancera.
REZIME PRONALASKA
[0007] Predmetni pronalazak se uopšteno odnosi na identifikaciju prognostičkog biomarkera čiji nivo ekspresije je koristan za procenu i klasifikovanje pacijenata za lečenje inhibitorom WEE1. U jednom primeru izvođenja pronalaska prognostički biomarker, PKMYT1, koristi se za identifikovanje pacijenata za koje je verovatno da će odgovoriti na lečenje inhibitorom WEE1, gde inhibitor WEE1 predstavlja WEE1-1. U drugom primeru izvođenja, pronalazak je inhibitor WEE1 za upotrebu u lečenju pacijenta kome je dijagnostikovan kancer povezan sa WEE1, pri čemu se kancerske ćelije pomenutog pacijenta karakterišu niskom ekspresijom PKMYT1. U još jednom primeru izvođenja, pronalazak je inhibitor WEE1 za upotrebu u lečenju pacijenta sa kancerom koji je osetljiv na lečenje inhibitorom WEE1, gde se kancerske ćelije pomenutog pacijenta karakterišu nivoom ekspresije PKMYT1 koji je ispod referentne vrednosti. U drugom primeru izvođenja, pronalazak je postupak za identifikovanje inhibitora WEE1 za upotrebu u lečenju kancera povezanog sa WEE1 kinazom.
KRATAK OPIS CRTEŽA
[0008]
Slika 1 je grafička ilustracija poremećaja ćelijske proliferacije u različitim linijama tumorskih ćelija inhibitorom WEE1. Proliferacija u prozoru od 96 časova ispitivana je u triplikatu za 522 linije kancerskih ćelija tretiranih sa WEE1-1 titriranim u 9 tačaka. Podaci o odgovoru ćelijske linije su razdvojeni prema tkivu iz koga potiče tumor i predstavljeni kao frakcija vijabilnosti (u odnosu na kontrolne ćelije tretirane sa DMSO) u funkciji koncentracije WEE1-1.
Slike 2A i 2B su ilustracije oštećenja DNK u S fazi koje je posledica lečenja inhibitorom WEE1, u kome su ćelije ES-2, A2058, A431, A427, KNS62, i NCI-H460 tretirane sa DMSO (-) ili rastućim koncentracijama WEE1-1 tokom 2 časa. Proteinski lizati su ispitivani metodom Western blotting sa antitelima protiv fosforilisanog CHK1S345, fosforilisanog CDK1Y15, fosforilisanog CDK1T14 , ili aktinom kao kontrolom nanošenja uzorka (slika 2A). Ćelije TOV-21G su tretirane sa DMSO ili 150 nM WEE1-1 tokom do 2 ili 6 časova (slika 2B). Ćelije su impulsno obeležene jedan čas pre sakupljanja sa BrdU da bi se obeležile ćelije u S fazi u kojima se aktivno odvija replikacija DNK. Ćelije su ispitivane protočnom citometrijom na dvolančane prekide DNK (γH2AX) nasuprot ukupnom sadržaju DNK (slika 2B, levi paneli) ili γH2AX nasuprot preuzimanju BrdU (slika 2B, desni paneli). Procenat ćelija koje se boje sa γH2AX predstavlja populaciju ćelija koje sadrže dvolančane prekide DNK i naznačen je za svaki uslov tretmana i razdvojen prema BrdU statusu na desnim panelima.
Slike 3A-3C su ilustracija odlaganja u napredovanju S faze koja su posledica tretmana sa inhibitorom WEE1. Ćelije ES-2 su sinhronizovane nakon 36-časovnog izuzimanja seruma. Na slikama 3A i 3B, ćelije su stimulisane da nastave ciklus sa 20% FBS u dodatnom prisustvu ili vehikuluma (DMSO) u trakama 1-6 ili 500 nM WEE1-1 u trakama 7-11. Vreme sakupljanja ćelija nakon stimulacije sa FBS je naznačeno. Jedan čas pre sakupljanja, ćelije su impulsno obeležene sa BrdU i procenat ćelija koje su obojene sa BrdU je prikazan na gornjem panelu. Proteinski lizati iz ES-2 ćelija koje su paralelno tretirane su sakupljeni i ispitani pomoću metode Western blotting sa naznačenim antitelima. U poređenju sa kontrolom tretiranom vehikulumom, tretman sa WEE1-1 odlaže napredovanje kroz S fazu (slika 3A, gornji panel, i slika 3B) i preuzimanje BrdU u S fazi (slika 3A, gornji panel), što ukazuje na usporavanje replikacije DNK. Tretman sa WEE1-1 odlaže ekspresiju ciklina A i indukuje signalizaciju oštećenja DNK što dokazuje pChk1<S345>(slika 3A, donji levi panel). Slika 3B prikazuje ispitivanje odabranih uzoraka protočnom citometrijom (4, 12, i 24 časa tretmana) iz dela A upoređujući bojenje sa BrdU i sadržaj DNK. Podaci na slici 3C predstavljaju ES-2 ćelije izgladnjivane nedostatkom seruma kojima je dodato 500 nM WEE1-1 u prisustvu ili odsustvu 20% FBS. Dvadeset četiri časa kasnije, sadržaj DNK i γH2AX (dvolančani prekidi DNK) je analiziran protočnom citometrijom. Procenti od ukupne populacije ćelija su dati u tabeli (slika 3C), pokazujući da WEE1-1 indukuje dvolančane prekide DNK u više ćelija kada je populacija stimulisana sa 20% FBS.
Slike 4A i 4B ilustruju da preuranjena mitoza nije neophodna za indukciju citotoksičnosti inhibicijom WEE1. Ćelije A2058, HT-29, i LoVo su tretirane 24 časa ili sa DMSO (- WEE1-1) ili sa WEE1-1 primenom EC90koncentracija leka. Protočna citometrija je korišćena za identifikaciju populacije ćelija pozitivnih na mitotski marker fosforilisani histon H3 (pHH3S10, slika 4A) ili marker γH2AX za dvolančani prekid DNK (slika 4B). Na gornjim panelima, ograda sa desne strane pokazuje očekivanu mitotsku populaciju (sadržaj 4N DNK) a ograda na levoj strani pokazuje ćelije pozitivne za pHH3 sa manjim sadržajem 4N DNK.
Slike 5A - 5D su ilustracije in vivo efikasnosti lečenja sa WEE1-1 kao pojedinačnim sredstvom, gde su miševi koji nose ksenograft A427 primili dozu vehikuluma (0.5% metilceluloze) ili 60 mg/kg WEE1-1. Doziranje je i za vehikulum i za jedinjenje bilo BID tokom 28 uzastopnih dana. Zapremine ksenograftskog tumora su merene dva puta nedeljno i grafički prikazivane (srednja vrednost zapremine -/+ SEM) nasuprot danima tretmana za vehikulum (n=10) i tretmana miševa lečenih sa WEE1-1 (n=10) (slika 5A). Slika 5B prikazuje grafički prikaz finalne zapremine tumora pojedinačnih ksenografta A427 tretiranih 28 dana vehikulumom ili sa MK-1775. Srednja zapremina tumora na početku ispitivanja bila je 164 mm<3>i naznačena je isprekidanom linijom. Slike 5C i 5D ilustruju dodatna ispitivanja in vivo efikasnosti izvedena na SK-MES-1 (C) i LoVo (D) ksenograftskim modelima kao što je opisano za sliku 5A sa izuzetkom što je lečenje sa WEE1-1 zaustavljeno 13. dana u LoVo ksenograftskom ispitivanju (označeno zvezdicom) i zapremine tumora su merene dodatne 2 nedelje.
Slike 6A i 6B ilustruju da je isključivanje PKMYT1 selektivno povećalo osetljivost na WEE1-1 i smanjilo inhibitornu fosforilaciju CDK1. Slika 6A ilustruje da je PKMYT1 isključen u dve ćelijske linije koje ispoljavaju relativnu otpornost na WEE1-1, H460 i KNS62. Ćelije su transficirane pulovima siRNK koji sadrže kontrolu bez ciljnog delovanja (CT) ili PKMYT1 sekvence. Ćelije su tretirane sa WEE1-1, karboplatinom, inhibitorom MEK (PD0325901), ili doksorubicinom 72 časa pre ispitivanja proliferacije ViaLight ATP testom. Isključivanje PKMYT1 je smanjilo EC50proliferacije za sam WEE1-1, ali ne i za druga ispitivana jedinjenja. Na slici 6B ćelije KNS62 su transficirane pulovima siRNK sa kontrolom bez ciljnog delovanja (CT) ili PKMYT1 i tretirane sa 400 nM WEE1-1 tokom naznačenih vremena.
Slike 7A i 7B ilustruju da niska ekspresija PKMYT1 povećava osetljivost na WEE1-1. Na slici 7A, relativna ekspresija PKMYT1 (baza podataka CCLE, Broad-Novartis) je grafički prikazana nasuprot odgovoru na lečenje sa 400 nM WEE1-1 u 305 ćelijskih linija, gde je svaka predstavljena pojedinačnom tačkom. Odgovor na WEE1-1 (x-osa) je prilagođena vrednost zasnovana na 96-časovnom testu proliferacije gde vrednost 1 označava da nema promene u brzini rasta u odnosu na ćelije tretirane sa DMSO i vrednost od 0.25 (vertikalna isprekidana linija) ili manje označava negativnu brzinu rasta, ili ćelijsku smrt. Srednja vrednost relativne ekspresije PKMYT1 u 305 ćelijskih linija je 413. Slika 7B ilustruje proliferativni odgovor na WEE1-1, meren vrednostima EC50(µM), predstavljen na grafiku nasuprot ekspresiji PKMYT1 iRNK (levi panel) ili PKMYT1 proteina (desni panel) za trinaest ćelijskih linija koje nisu uključene u analizu na slici 7A gore u tekstu.
Slike 8A i 8B ilustruju da inhibicija WEE1 pomoću WEE1-1 vodi povećanju aktivnosti CDK1 i 2. Ćelije ES-2 su tretirane 24 časa ili sa DMSO, ili sa 250 nM WEE1-1, sakupljene, i lizirane za test Western blot. Na slici 8A lizati su ispitani sa pojedinačnim antitelima protiv WEE1 supstrata (pCDK1<Y15>), DDR markera (pCHK1S345), ili CDK1 i 2 supstrata (pStathminS38 i pLaminA/CS22 , redom). Na slici 8B lizati su ispitani sa antitelom protiv pan motiva CDK supstrata.
Slike 9A i 9B ilustruju da oštećenje DNK, indukovano tretmanom sa WEE1-1, zahteva mitogenu stimulaciju. Ćelije ES-2 su izgladnjivane bez seruma 36 časova i nakon toga su ili ostavljene nestimulisane ili su tretirane sa 20% FBS. Ćelije gajene pod oba uslova su primale DMSO ili 500 nM WEE1-1 tokom 24 časa pre sakupljanja za ispitivanje sadržaja DNK pomoću protočne citometrije (7-AAD) i dvolančanih prekida DNK (γH2AX). Slika 9A ilustruje histogram raspodele ćelijskog ciklusa. Slika 9B ilustruje grafikon rasipanja sa ogradama koje označavaju populaciju γH2AX. Procenat ukupnih ćelija je naznačen ili u fazi ćelijskog ciklusa ili kao γH2AX pozitivne ćelije.
DETALJAN OPIS PRONALASKA
[0009] Mnogi anti-kancerski tretmani deluju putem oštećivanja DNK, koje zatim pokreće odgovor na oštećenje DNK (DDR) i aktivira kinaze kontrolne tačke da bi se deoba zaustavila dok se DNK ne popravi. DDR aktivira WEE1, tirozin kinazu, da fosforiliše i inhibira ciklin zavisne kinaze (CDK) 1 i 2 i, na taj način, zaustavi ćelijsku deobu. Inhibicija WEE1 pojačava tretmane koji oštećuju DNK ukidanjem zaustavljanja ćelijskog ciklusa i ispravne popravke DNK.
[0010] WEE1-1, takođe poznat kao 2-alil-1-[6-(1-hidroksi-1-metiletil)piridin-2-il]-6-{[4-(4-metilpiperazin-1-il)fenil]amino}-1,2-dihidro-3H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-3-on, je snažan (IC50= 5.2 nM) i selektivan mali molekul inhibitor WEE1 koji kompetira sa ATP (Hirai, H., et al., Mol. Cancer Ther., 2009, 8(11):2992-3000) koji je trenutno u fazi kliničkog razvoja kao antitumorsko sredstvo u kombinaciji sa hemoterapeuticima koji predstavljaju standard nege (SOC) (Stathis, A. and Oza A., Drug News & Perspectives, 2010, 23(7):425-429; Schellens, J.H.M., et al., J. Clin.Oncol., 2011, 29:2011 (suppl; abstr 3068); Mizuarai, S., et al., Mol. Cancer, 2009, 8:34). Prethodna ispitivanja WEE1-1 su pokazala njegov potencijal kao dodatka ili senzibilizatora za trenutno korišćene hemoterapeutike koji predstavljaju standard nege (SOC) zbog njegove sposobnosti da nametne neplaniranu mitozu koja na kraju rezultuje u apoptozi ili mitotskoj katastrofi (Hirai, H., et al., Cancer Biol. & Ther., 2010, 9(7):514-522; Aarts, M., et al., Cancer Discovery, 2012,; Indovina, P. and Giordano A., Cancer Biol. & Ther., 2010, 9(7);523-525; Wang, Y.L., et al., Cancer Biol., & Ther., 2004, 3(3):305-313). Međutim, moguće terapeutsko dejstvo inhibicije WEE1 u odsustvu SOC hemoterapije je manje definisano. Isključivanje WEE1 pomoću RNKi je inhibiralo proliferaciju kancerskih ćelijskih linija (Iorns, E., et al., Cancer Targets, 2009, Plos One, 4(4); Murrow, L.M., et al., Breast Cancer Research and Treatment, 2010, 122(2):347-357) i nedavno je pokazano da WEE1-1 samostalno može da indukuje apoptozu u ćelijskim linijama sarkoma tretiranim in vitro (Kreahling, J.M., et al., Mol. Cancer Ther., 2012, 11(1):174-182).
[0011] Podnosioci prijave ovde pokazuju da je farmakološka inhibicija samog WEE1, upotrebom WEE1-1 kao jedinog sredstva, bila citotoksična za široki panel tumorskih ćelijskih linija i snažno indukovala dvolančane prekide DNK. Primetno, WEE1-1 je indukovao oštećenje DNK koje je nezavisno od SOC hemoterapije ili radioterapije, koje se dogodilo u S-fazi ćelije, i koje se oslanjalo na aktivnu replikaciju DNK. U tolerantnim dozama, terapija pojedinačnim sredstvom WEE1-1 dovodi do inhibicije rasta ili do regresije ksenograftskog tumora. Isključivanje PKMYT1, kinaze koja je funkcionalno povezana sa WEE1, selektivno je senzibilizovalo kancerske ćelije na WEE1-1, ali ih nije senzibilizovalo na druga citotoksična sredstva. Kao što je ovde opisano, ekspresija PKMYT1 je bila ispod prosečne u otprilike tri četvrtine kancerskih ćelijskih linija koje su imale najveći odgovor na WEE1-1. Selekcijom ćelijskih linija koje imaju niske nivoe ekspresije PKMYT1 mogla se predvideti in vitro osetljivost ovih ćelijskih linija na WEE1-1. Ukupno uzevši, ovi nalazi obezbeđuju osnovu za upotrebu inhibicije WEE1 kao snažne anti-kancerske terapije sa jednim sredstvom i upotrebu niske ekspresije PKMYT1 za identifikovanje i odabir pacijenata koji će najverovatnije odgovoriti na terapiju sa WEE1-1 kao jedinim sredstvom.
[0012] U skladu sa tim, predmetni pronalazak se odnosi na inhibitor WEE1 za upotrebu u lečenju kancera, gde inhibitor WEE1 predstavlja WEE1-1 ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, ili WEE1-2 ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so. U drugom primeru izvođenja, pronalazak se odnosi na prognostički biomarker, PKMYT1, čija ekspresija je osetljiva na inhibiciju WEE1 inhibitorom WEE1. U još jednom primeru izvođenja, pronalazak se odnosi na inhibitor WEE1 za upotrebu u lečenju pacijenta kod koga je dijagnostikovan kancer povezan sa WEE1 kinazom, kome je lečenje potrebno, pri čemu se kancerske ćelije pomenutog pacijenta odlikuju niskom ekspresijom PKMYT1, i pri čemu pomenuti inhibitor WEE1 predstavlja WEE1-1 ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, ili WEE1-2 ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so. U još jednom primeru izvođenja, pronalazak je inhibitor WEE1 za upotrebu u lečenju pacijenta sa kancerom koji je osetljiv na lečenje inhibitorom WEE1, pri čemu se kancerske ćelije pomenutog pacijenta odlikuju nivoom ekspresije PKMYT1 koji je ispod referentne vrednosti, i pri čemu pomenuti inhibitor WEE1 predstavlja WEE1-1 ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, ili WEE1-2 ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so. U drugom primeru izvođenja, pronalazak je postupak za identifikaciju inhibitora PKMYT1 za upotrebu u lečenju kancera povezanog sa WEE1 kinazom. U još jednom primeru izvođenja, pronalazak je kit za identifikaciju pacijenata za koje je verovatno da će odgovoriti na lečenje inhibitorom WEE1 koji sadrži reagense koji reaguju sa PKMYT1.
[0013] U jednom primeru izvođenja pronalaska, inhibitor WEE1 je WEE1-1 ili njegova farmaceutski prihvatljiva so.
[0014] U drugom primeru izvođenja pronalaska, inhibitor WEE1 se primenjuje u dozi između 100 mg na dan i 200 mg na dan. U jednom primeru izvođenja pronalaska, inhibitori WEE1 mogu da se doziraju dva puta dnevno (BID) tokom dva i po dana (ukupno 5 doza) ili jednom dnevno (QD) tokom dva dana (ukupno 2 doze).
[0015] Termin "kancer" kako je navedeno u ovom opisu uključuje različite sarkome i karcinome i uključuje solidni kancer i hematopetski kancer. Solidni kancer kao što je ovde navedeno uključuje, na primer, kancer mozga, cervikocerebralni kancer, ezofagealni kancer, tiroidni kancer, sitnoćelijski kancer pluća, nesitnoćelijski kancer pluća, kancer dojke, endometrijalni kancer, kancer pluća, kancer želuca, kancer žučne kese/žučnih puteva, kancer jetre, kancer pankreasa, kancer debelog creva, rektalni kancer, kancer jajnika, horiokarcinom, kancer tela materice, uterocervikalni kancer, kancer renalnog pelvisa/uretera, kancer bešike, kancer prostate, kancer penisa, kancer testisa, fetalni kancer, Vilmsov tumor, kancer kože, maligni melanom, neuroblastom, osteosarkom, Juingov tumor, sarkom mekih tkiva. Sa druge strane, hematopoetski kancer uključuje, na primer, akutnu leukemiju, hroničnu limfatičnu leukemiju, hroničnu mijelocitnu leukemiju, policitemiju veru, maligni limfom, multipli mijelom, Hočkinov limfom, non-Hočkinov limfom.
[0016] Termin "kancer povezan sa WEE1 kinazom" kako je navedeno u ovom opisu označava kancer povezan sa aktivnošću ili inhibicijom WEE1 kinaze uključujući, ali bez ograničenja, kancer mozga, cervikocerebralni kancer, ezofagealni kancer, tiroidni kancer, sitnoćelijski kancer pluća, nesitnoćelijski kancer pluća, kancer dojke, kancer pluća, kancer želuca, kancer žučne kese/žučnih puteva, kancer jetre, kancer pankreasa, kancer debelog creva, rektalni kancer, kancer jajnika, horiokarcinom, kancer tela materice, uterocervikalni kancer, kancer renalnog pelvisa/uretera, kancer bešike, kancer prostate, kancer penisa, kancer testisa, fetalni kancer, Vilmsov tumor, kancer kože, maligni melanom, neuroblastom, osteosarkom, Juingov tumor, sarkom mekih tkiva, akutnu leukemiju, hroničnu limfatičnu leukemiju, hroničnu mijelocitnu leukemiju, Hočkinov limfom, ili kao senzibilizatori za hemoterapiju ili zračnu terapiju ovih kancera. Posebno, inhibitori WEE1 pronalaska su korisni kao lekovi, na primer, za kancer dojke, kancer pluća, kancer pankreasa, kancer debelog creva, kancer jajnika, akutnu leukemiju, hroničnu limfatičnu leukemiju, hroničnu mijelocitnu leukemiju, Hočkinov limfom, ili kao senzibilizatori za hemoterapiju ili zračnu terapiju ovih kancera.
[0017] Termin "lečenje kancera" kako je navedeno u ovom opisu označava da se antikancersko sredstvo primenjuje kod pacijenta sa kancerom tako da inhibira rast kancerskih ćelija kod pacijenta. Poželjno, lečenje rezultuje u nekom obliku regresije rasta kancera ili tako da lečenje odlaže ili sprečava ponovno javljanje kancera. Poželjnije, lečenje rezultuje u potpunom nestanku kancera.
[0018] Termin "pacijent" ili "subjekt" kako je navedeno u ovom opisu označava recipijenta kome je potrebna medicinska intervencija ili lečenje. Uključeni su pacijenti ili subjekti koji su sisari i koji nisu sisari.
[0019] Termin "prognostički biomarker" kako je navedeno u ovom opisu označava gen marker čija ekspresija je u korelaciji sa odgovorom na dato terapeutsko sredstvo ili klasu
1
terapeutskih sredstava. Kako se ovde koristi, termin se odnosi na PKMYT1, čija ekspresija je u korelaciji sa terapeutskim dejstvom inhibitora WEE1. U jednom primeru izvođenja ovde, inhibitor WEE1 je WEE1-1.
[0020] "Polinukleotidi izvedeni iz markera" označava RNK transkribovanu sa marker gena, bilo koju cDNK ili cRNK proizvedenu od njih i bilo koju nukleinsku kiselinu izvedenu od njih, kao što je sintetska nukleinska kiselina koja ima sekvencu izvedenu iz gena koji odgovara marker genu.
[0021] Termini "kontrola", "kontrolni nivo", "referentni nivo", ili "unapred određeni referentni nivo" označavaju odvojeni bazalni nivo meren u uporedivoj kontrolnoj ćeliji, koja može, ili ne mora da bude bez bolesti. Ona može da bude od istog pojedinca ili od drugog pojedinca koji je normalan ili ne ispoljava istu bolest od koje je uzorak za bolest ili ispitivani uzorak dobijen. Tako, "referentna vrednost" može da bude apsolutna vrednost, opseg vrednosti, prosečna vrednost, medijana vrednosti, srednja vrednost, ili vrednost u odnosu na određenu kontrolnu ili bazalnu vrednost. Referentna vrednost može da se zasniva na vrednosti pojedinačnog uzorka, kao što je vrednost dobijena iz uzorka od pojedinca sa kancerom povezanim sa WEE1 kinazom, ali u nekoj ranijoj vremenskoj tački ili pre lečenja, ili vrednost dobijena iz uzorka od pacijenta kome je dijagnostikovan kancer povezan sa WEE1 kinazom koji nije pojedinac koji je ispitivan, ili "normalnog" pojedinca, što predstavlja pojedinca kome nije dijagnostikovan kancer povezan sa WEE1 kinazom. Referentna vrednost može da se zasniva na brojnim uzorcima, kao od brojnih pacijenata kojima je dijagnostikovan kancer posredovan sa WEE1, ili normalnih pojedinaca, ili zasnovan na pulu uzoraka uključujući ili isključujući uzorak koji treba da se ispita.
[0022] Termin "PKMYT1" kako je navedeno u ovom opisu označava gen koji kodira CDK1 inhibitornu kinazu specifičnu za tirozin i treonin povezanu sa membranom, protein koji je član familije serin/treonin protein kinaza (Liu, F., et al., Mol. Cell. Biol., 1997, 17(2):571-583), čija sekvenca je prikazana u NCBI referentnim brojevima sekvenci NM_004203 (SEQ ID NO: 1) i NP_004194 (SEQ ID NO: 2).
[0023] Termin "niska ekspresija PKMYT1" ili "niska PKMYT1 ekspresija" kako je navedeno u ovom opisu označava ćeliju, dobijenu iz ćelijske linije koja je tako okarakterisana, ili od pacijenta sa dijagnozom kancera, koje imaju nižu DNK, iRNK, ili proteinsku ekspresiju PKMYT1, ili smanjenje broja kopija gena za PKMYT1, u odnosu na ćeliju, dobijenu iz ćelijske linije koja je tako okarakterisana, ili od pacijenta kome nije dijagnostikovan kancer, ili kontrolnu ćeliju.
[0024] Kako se ovde koristi, termini "merenje nivoa ekspresije", "merenje nivoa genske ekspresije" ili "dobijanje nivoa ekspresije" i slično, uključuju postupke za kvantitativno određivanje nivoa ekspresije ciljnog gena predstavljenog transkriptom gena, uključujući mikroRNK (miRNK) ili protein kodiran genom, kao i postupke za određivanje da li se gen od interesa uopšte eksprimira. Tako, test koji daje "da" ili "ne" rezultat, bez nužnog obezbeđivanja kvantitativnog određivanja iznosa ekspresije, je test koji "meri ekspresiju" kako se taj termin ovde koristi. Alternativno, termin može da uključuje kvantitativno određivanje nivoa ekspresije ciljnog gena izraženo kao kvantitativna vrednost, na primer, umnožak promene ekspresije, naviše ili naniže, u odnosu na kontrolni gen ili u odnosu na isti gen u drugom uzorku, ili logaritam odnosa ekspresije, ili bilo koji njihov vizuelni prikaz, kao što je, na primer, "toplotna mapa" gde intenzitet boje predstavlja detektovanu ekspresiju gena. Primeri postupaka za detekciju nivoa ekspresije gena uključuju, ali nisu ograničeni na, Northern blotting, dot ili slot blot, matricu reporter gena (videti, na primer, US 5,569,588), test zaštite od nukleaze, RT-PCR, profilisanje na čipu, diferencijalni prikaz, SAGE (Velculescu et al., (1995), Science 270:484-87), digitalni sistem za ekspresiju gena (videti WO2007076128; WO2007076129 ), multipleksni test iRNK (Tian et al., (2004), Nucleic Acids Res. 32:e126), PMAGE (Kim et al., (2007), Science 316:1481-84), test hibridizacije, selekcije, ekstenzije i ligacije posredovane sa cDNK (DASL, Bibikova, et al., (2004), AJP 165:1799-807), multipleksni test razgranate DNK (Flagella et al., (2006), Anal. Biochem.
352:50-60), 2D gel elektroforeza, SELDI-TOF, ICAT, enzimski test, test sa antitelima, i slično.
Inhibitori WEE1
[0025] U jednom primeru izvođenja pronalaska, inhibitor WEE1 predmetnog pronalaska je WEE1-1, čija je struktura prikazana ispod.
[0026] WEE1-1 je inhibitor WEE1 koji je koristan za lečenje kancera. WEE1-1 je takođe poznat kao 2-alil-1-[6-(1-hidroksi-1-metiletil)piridin-2-il]-6-{[4-(4-metilpiperazin-1-il)fenil]amino}-1,2-dihidro-3H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-3-on. WEE1-1 je opisan u SAD patentu br. 7,834,019 i u PCT međunarodnim objavama WO2007/126122, WO 2007/126128 i WO2008/153207. Kristalni oblici WEE1-1 su opisani u SAD objavi US2010-0124544 i PCT međunarodnoj objavi WO2011/034743.
[0027] U jednom primeru izvođenja pronalaska, inhibitor WEE1 predmetnog pronalaska je WEE1-2, čija je struktura prikazana ispod.
[0028] WEE1-2 je inhibitor WEE1 koji je koristan za lečenje kancera. WEE1-2 je takođe poznat kao 3-(2,6-dihlorofenil)-4-imino-7-[(2'-metil-2',3'-dihidro-1'H-spiro[ciklopropan-1,4'-izokvinolin]-7'-il)amino]-3,4-dihidropirimido[4,5-d]pirimidin-2(1H)-on. WEE1-2 je opisan u PCT međunarodnoj objavi WO2008/153207 i SAD objavi US2011-0135601. Kristalni oblici WEE1-2 su opisani u međunarodnoj objavi WO2009/151997 i SAD objavi US2011-0092520.
[0029] Jedinjenja predmetnog pronalaska mogu da imaju asimetrične centre, hiralne ose i hiralne ravni (kao što je opisano u: E.L. Eliel and S.H. Wilen, Stereochemistry of Carbon
1
Compounds, John Wiley & Sons, New York, 1994, stranice 1119-1190), i da se javljaju kao racemati, racemske smeše, i kao pojedinačni dijastereomeri, sa svim mogućim izomerima i njihovim smešama, uključujući optičke izomere, gde su svi takvi stereoizomeri uključeni u predmetni pronalazak. Dodatno, ovde opisana jedinjenja mogu da postoje kao tautomeri i oba tautomerna oblika su obuhvaćena obimom pronalaska, čak i kada je samo jedna tautomerna struktura prikazana.
[0030] U jedinjenjima opisanim u predmetnom pronalasku, atomi mogu da ispolje svoje prirodne zastupljenosti izotopa, ili jedan ili više od atoma može da bude veštački obogaćen određenim izotopom koji ima isti atomski broj, a atomsku masu ili maseni broj drugačiji od atomske mase ili masenog broja koji je dominantan u prirodi. Predmetni pronalazak je predviđen da obuhvata sve pogodne izotopske varijante ovde opisanih jedinjenja. Na primer, različiti izotopski oblici vodonika (H) uključuju protijum (1H) i deuterijum (2H). Protijum je dominantni izotop vodonika nađen u prirodi. Obogaćivanje deuterijumom može da pruži određene terapeutske prednosti, kao što je povećanje in vivo polu-života ili smanjenje potrebnih doza, ili može da obezbedi jedinjenje korisno kao standard za karakterizaciju bioloških uzoraka. Izotopski obogaćena jedinjenja koja su ovde opisana mogu da se pripreme bez preteranog eksperimentisanja konvencionalnim tehnikama dobro poznatim stručnjacima u oblasti ili postupcima analognim onim koji su ovde opisani u odeljku Šeme i primeri korišćenjem odgovarajućih izotopski obogaćenih reagenasa i/ili intermedijera.
[0031] Inhibitori WEE1 predmetnog pronalaska mogu takođe da postoje kao različiti kristali, amorfne supstance, farmakološki prihvatljive soli, hidrati i solvati. Dalje, inhibitori WEE1 predmetnog pronalaska mogu da budu obezbeđeni kao prolekovi. Uopšteno, takvi prolekovi su funkcionalni derivati inhibitora WEE1 predmetnog pronalaska koji mogu lako da se pretvore u jedinjenja koja su potrebna živim organizmima. Prema tome, u lečenju različitih kancera u pronalasku, termin "primena" uključuje ne samo primenu specifičnog jedinjenja već i primenu jedinjenja koje, nakon što se primeni kod pacijenata, može da se pretvori u specifično jedinjenje u živim organizmima. Uobičajeni postupci za selekciju i proizvodnju pogodnih derivata prolekova su opisani, na primer, u "Design of Prodrugs", ed. H. Bundgaard, Elsevier, 1985, koji se ovde pominje. Metaboliti jedinjenja mogu da uključuju aktivna jedinjenja koja se proizvode stavljanjem jedinjenja u biološko okruženje, i nalaze se u okviru jedinjenja pronalaska.
Određivanje nivoa ekspresije biomarkera
A. Postupci za merenje biomarkera
[0032] U jednom primeru izvođenja pronalazak je prognostički biomarker, PKMYT1, čija ekspresija je osetljiva na inhibiciju WEE1 inhibitorom WEE1. Nivoi ekspresije prognostičkog biomarkera u uzorku mogu da se odrede na bilo koji način poznat u stanju tehnike. Nivo ekspresije može da se odredi izdvajanjem i određivanjem nivoa (tj., količine) nukleinske kiseline transkribovane sa biomarkera. Alternativno, ili dodatno, može da se odredi nivo specifičnih proteina kodiranih biomarkerom.
[0033] Nivo ekspresije biomarkera može da se utvrdi određivanjem količine iRNK, ili polinukleotida koji potiču od njega, prisutnih u uzorku. Bilo koji postupak za određivanje nivoa RNK može da se koristi. Na primer, RNK se izdvaja iz uzorka i razdvaja na agaroznom gelu. Razdvojena RNK se zatim prenosi na čvrstu podlogu, kao što je filter. Probe nukleinske kiseline koje predstavljaju jedan ili više markera se zatim hibridizuju na filteru pomoću Northern hibridizacije, i određuje se količina RNK izvedene iz markera. Takvo određivanje može da bude vizuelno, ili pomoću aparata, na primer, upotrebom denzitometra. Drugi postupak za određivanje nivoa RNK je upotrebom dot-blot ili slot-blot metode. U ovoj metodi, RNK, ili nukleinska kiselina koja potiče od nje iz uzorka se obeležava. RNK ili nukleinska kiselina koja potiče od nje zatim hibridizuje sa oligonukleotidima izvedenim iz jednog ili više marker gena sadržanim na filteru, pri čemu su oligonukleotidi smešteni na filteru na odvojenim mestima koja se lako identifikuju. Hibridizacija, ili njen nedostatak, obeležene RNK sa oligonukleotidima vezanim za filter se određuje vizuelno ili pomoću denzitometra. Polinukleotidi mogu da se obeleže korišćenjem radioaktivnih oznaka ili fluorescentnih (tj., vidljivih) oznaka.
[0034] Ekspresija gena biomarkera u brojnim uzorcima tkiva može da se okarakteriše korišćenjem "matrice uzoraka tkiva" (Kononen et al., Nat. Med, 1998, 4(7):844-847). U matrici uzoraka tkiva, višestruki uzorci tkiva mogu da se procene na istom čipu. Matrica uzoraka tkiva omogućava in situ detekciju nivoa RNK i proteina; uzastopni odeljci omogućavaju istovremenu analizu brojnih uzoraka.
[0035] Drugi postupci za određivanje zastupljenosti RNK su poznati u stanju tehnike.
1
B. Mikročipovi
[0036] U nekim primerima izvođenja, polinukleotidni mikročipovi mogu da se koriste za merenje ekspresije tako da se status ekspresije svakog biomarkera procenjuje istovremeno. Kada se koristi ovaj postupak za merenje, mikročip poželjno sadrži najmanje 2, 3, 4, 5 ili više biomarkera, ili sve biomarkere, ili bilo koju kombinaciju biomarkera, identifikovanih kao informativni za klasifikaciju u podskupu subjekata. Konkretan broj informativnih biomarkera koje mikročip sadrži će varirati u zavisnosti od određenog stanja od interesa, broja identifikovanih biomarkera, i, izborno, broja informativnih biomarkera za koje je nađeno da rezultuju u najmanje grešaka tipa I, grešaka tipa II, ili grešaka tipa I i tipa II pri određivanju krajnjeg ishoda fenotipa. Kako se ovde koristi, "greška tipa I" označava lažno pozitivan i "greška tipa II" označava lažno negativan; na primeru predviđanja pacijentovog terapeutskog odgovora na izlaganje inhibitoru CDK, greška tipa I je pogrešno karakterisanje osobe sa terapeutskim odgovorom na inhibitor CDK kao neresponsivne na lečenje inhibitorom CDK, i greška tipa II je pogrešno karakterisanje osobe bez odgovora na lečenje inhibitorom CDK kao nekoga sa terapeutskim odgovorom.
[0037] Kada se koristi u specifičnom primeru izvođenja, pronalazak obezbeđuje polinukleotidne matrice u kojima biomarkeri identifikovani za određeni podskup subjekata sadrže najmanje 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95% ili 98% proba u pomenutoj matrici. U drugom specifičnom primeru izvođenja, mikročip sadrži mnoštvo proba, gde pomenuto mnoštvo proba sadrži probe koje su komplementarne i mogu da hibridizuju sa najmanje 75% biomarkera inhibitora WEE1 informativnih u smislu izlaganja/predviđanja, identifikovanih za određeni podskup pacijenata. Mikročipovi pronalaska, naravno, mogu da sadrže probe komplementarne sa, i koje su sposobne da hibridizuju sa, biomarkerima za inhibitor WEE1 informativnim u smislu predviđanja/procene za mnoštvo podskupova subjekata, ili za svaki podskup subjekata, identifikovan za konkretno stanje. U njihovom unapređenju, mikročip pronalaska sadrži mnoštvo proba komplementarnih sa, i koje hibridizuju sa najmanje 75% biomarkera za inhibitor WEE1 informativnih za predviđanje/procenu za svaki podskup subjekata identifikovan za stanje od interesa, i gde pomenute probe, ukupno, predstavljaju najmanje 50% proba na pomenutom mikročipu.
[0038] U još jednom specifičnom primeru izvođenja, mikročip je komercijalno dostupan cDNK mikročip koji sadrži najmanje dva biomarkera identifikovana postupcima koji su ovde opisani. Poželjno, komercijalno dostupan cDNK mikročip sadrži sve biomarkere
1
identifikovane postupcima koji su ovde opisani kao informativne za podskup pacijenata za konkretno stanje. Međutim, takav mikročip može da sadrži bar 1, 2, 3, 4 ili 5 takvih markera, sve do maksimalnog broja identifikovanih markera.
[0039] Bilo koji od ovde opisanih mikročipova može da bude obezbeđen u zapečaćenom kontejneru u kitu.
C. Polinukleotidi korišćeni za merenje proizvoda prognostičkog biomarkera
[0040] Polinukleotidi sposobni da se specifično ili selektivno vežu za transkripte iRNK koji kodiraju polipeptidni prognostički biomarker, PKMYT1, pronalaska su takođe obuhvaćeni. Na primer: oligonukleotidi, cDNK, DNK, RNK, proizvodi PCR reakcije, sintetska DNK, sintetska RNK, ili druge kombinacije prirodnih ili modifikovanih nukleotida koji specifično i/ili selektivno hibridizuju sa jednim ili više RNK proizvoda prognostičkog biomarkera pronalaska su korisni prema pronalasku.
[0041] U poželjnom primeru izvođenja, koriste se oligonukleotidi, cDNK, DNK, RNK, proizvodi PCR reakcije, sintetska DNK, sintetska RNK, ili druge kombinacije prirodnih ili modifikovanih nukleotida koji i specifično i selektivno hibridizuju sa jednim ili više RNK proizvoda prognostičkog biomarkera pronalaska.
[0042] Da bi se odredio (visok ili nizak) nivo ekspresije PKMYT1 pri praktikovanju predmetnog pronalaska, može da se koristi bilo koji postupak poznat u stanju tehnike. U jednom primeru izvođenja pronalaska, koristi se ekspresija zasnovana na detekciji RNK koja hibridizuje sa genom koji je ovde identifikovan i opisan. Ovo se lako izvodi bilo kojim postupcima za detekciju ili amplifikaciju RNK poznatim ili prepoznatim kao ekvivalentnim u stanju tehnike kao što su, ali bez ograničenja, reverzna transkripcija-PCR, i postupci za detekciju prisustva, ili odsustva sekvenci koje stabilizuju ili destabilizuju RNK.
[0043] Alternativno, može da se koristi ekspresija zasnovana na detekciji statusa DNK. Detekcija DNK identifikovanog gena može da se koristi za gene koji imaju povišenu ekspresiju u korelaciji sa određenim ishodom. Ovo može lako da se izvede postupcima zasnovanim na PCR reakciji poznatim u stanju tehnike, uključujući, ali bez ograničenja, Q-PCR. Nasuprot tome, detekcija DNK identifikovanog gena kao amplifikovanog može da se koristi za gene koji imaju povišenu ekspresiju u korelaciji sa određenim ishodom lečenja. Ovo može lako da se izvede postupcima zasnovanim na PCR reakciji, fluorescentnoj in situ
1
hibridizaciji (FISH) i hromozomskoj in situ hibridizaciji (CISH) koji su poznati u stanju tehnike.
D. Tehnike za merenje RNK proizvoda biomarkera
1. PCR u realnom vremenu
[0044] U praksi, testovi za ekspresiju zasnovani na genskoj ekspresiji bazirani na malom broju gena, tj., oko 1 do 3000 gena mogu da se izvedu sa relativno malo napora korišćenjem postojeće kvantitativne tehnologije PCR reakcije u realnom vremenu uobičajene za kliničke laboratorije. Kvantitativni PCR u realnom vremenu meri nakupljanje proizvoda PCR reakcije preko dvojno obeležene probe koja stvara fluorescenciju. Mnoštvo postupaka za normalizaciju može da se koristi, kao što je interni kompetitor za svaku ciljnu sekvencu, gen za normalizaciju sadržan u uzorku, ili osnovni gen. Dovoljno RNK za PCR u realnom vremenu može da se izoluje iz niskih miligramskih količina uzetih od subjekta. Kvantitativni amplifikatori mogu sada da se koriste sa karticama sa mikro-fluidima na koje su prethodno naneti reagensi čineći rutinsku kliničku upotrebu multigenskih testova zasnovanih na ekspresiji realnim ciljem.
[0045] Genski markeri inventivnog prognostičkog biomarkera ili njihov podset, koji se ispituju u skladu sa predmetnim pronalaskom, su tipično u obliku ukupne RNK ili iRNK ili reverzno transkribovane ukupne RNK ili iRNK. Opšti postupci za ekstrakciju opšte i iRNK su dobro poznati u stanju tehnike i opisani su u standardnim udžbenicima molekularne biologije, uključujući Ausubel et al., Current Protocols of Molecular Biology, John Wiley and Sons (1997). Izolovanje RNK može takođe da se izvede korišćenjem kita za prečišćavanje, kompleta pufera i proteaze od komercijalnih proizvođača, kao što je Qiagen (Valencia, CA) i Ambion (Austin, TX), prema uputstvima proizvođača.
[0046] TAQman kvantitativna PCR reakcija u realnom vremenu može da se izvede korišćenjem komercijalno dostupnih reagenasa za PCR (Applied Biosystems, Foster City, CA) i opreme, kao što je sistem za detekciju sekvence ABI Prism 7900HT (Applied Biosystems) prema uputstvima proizvođača. Sistem se sastoji od amplifikatora, lasera, uređaja vezanog za punjenje (CCD), kamere i kompjutera. Sistem amplifikuje uzorke u formatu sa 96 bunarčića ili 384 bunarčića u amplifikatoru. Tokom amplifikacije, fluorescentni signal indukovan laserom se sakuplja u realnom vremenu putem optičkih
1
kablova za svih 96 bunarčića, i detektuje na CCD uređaju. Sistem uključuje kompjuterski program za pokretanje instrumenta i za analizu podataka.
[0047] Na osnovu prognostičkog biomarkera identifikovanog u predmetnom pronalasku, test PCR reakcije u realnom vremenu TAQman može da se koristi za merenje genske ekspresije i izvođenje postupaka za klasifikaciju koji su ovde opisani. Kao što je stručnjaku u oblasti očigledno, širok spektar oligonukleotidnih prajmera i proba koje su komplementarne sa, ili hibridizuju sa prognostičkim biomarkerom pronalaska može da se izabere na osnovu sekvence transkripta prognostičkog biomarkera.
2. Hibridizacija na matrici
[0048] Polinukleotid koji se koristi za merenje RNK proizvoda pronalaska može da se koristi kao nukleinska kiselina koja predstavlja komponentu matrice stabilno povezana sa podlogom kako bi sačinila matricu prema jednom aspektu pronalaska. Dužina nukleinske kiseline kao komponente matrice može da varira od 8 do 1000 nukleotida u dužini i bira se tako da bude specifična za RNK proizvode prognostičkog biomarkera pronalaska. U jednom primeru izvođenja, ove komponente su selektivne za RNK proizvode pronalaska. Nukleinske kiseline kao komponente matrice mogu da budu jednolančane ili dvolančane, i/ili mogu da budu oligonukleotidi ili PCR fragmenti umnoženi sa cDNK. Poželjno oligonukleotidi su dugi približno 20-30 nukleotida. EST su poželjno duge 100 do 600 nukleotida. Stručnjaku u oblasti će biti jasno da delovi eksprimiranih regiona prognostičkog biomarkera pronalaska mogu da se koriste kao proba na matrici. Konkretnije, oligonukleotidi komplementarni sa genima pronalaska i cDNK ili EST izvedeni iz gena pronalaska su korisni. Za matrice zasnovane na oligonukleotidu, izbor odgovarajućih oligonukleotida za gen od interesa koji su korisni kao probe je dobro poznat u stanju tehnike. Konkretnije, važno je odabrati regione koji će dozvoliti hibridizaciju sa ciljnim nukleinskim kiselinama. Faktori kao što je Tm oligonukleotida, procentualni sadržaj GC, stepen sekundarne strukture i dužina nukleinske kiseline su važni faktori. Videti na primer SAD pat. br.6,551,784.
3. Konstrukcija matrice nukleinske kiseline
[0049] U predloženim postupcima, matrica nukleinskih kiselina kao komponenti stabilno povezanih sa površinom čvrste podloge, dovodi se u kontakt sa uzorkom koji sadrži ciljne nukleinske kiseline pod uslovima za hibridizaciju dovoljnim da se proizvede obrazac hibridizacije kompleksa komplementarnih nukleinskih kiselina kao komponenti
1
matrice/ciljnih molekula u kojima jedna ili više komplementarnih nukleinskih kiselina kao komponenti matrice na jedinstvenim pozicijama na matrici specifično hibridizuje sa ciljnim nukleinskim kiselinama. Identitet ciljne nukleinske kiseline koja hibridizuje može da se odredi u odnosu na položaj nukleinskih kiselina kao komponenti matrice na matrici.
[0050] Nukleinske kiseline kao komponente matrice mogu da se proizvedu korišćenjem uspostavljenih tehnika kao što su lančana reakcija polimerizacije (PCR) i reverzna transkripcija (RT). Ovi postupci su slični onima trenutno poznatim u stanju tehnike (videti, na primer, PCR Strategies, Michael A. Innis (Editor), et al., 1995 i PCR: Introduction to Biotechniques Series, C. R. Newton, A. Graham, 1997). Amplifikovane nukleinske kiseline se prečišćavaju postupcima dobro poznatim u stanju tehnike (npr., prečišćavanje na koloni ili taloženjem alkoholom). Nukleinska kiselina se smatra čistom kada je izolovana tako da bude suštinski bez prajmera i nekompletnih proizvoda nastalih tokom sinteze željene nukleinske kiseline. Poželjno, prečišćena nukleinska kiselina će takođe biti suštinski bez kontaminanata koji mogu da ometaju ili drugačije maskiraju specifičnu aktivnost vezivanja molekula.
[0051] Matrica, prema jednom aspektu pronalaska, sadrži mnoštvo nukleinskih kiselina pričvršćenih za jednu površinu podloge pri gustini koja prelazi 20 različitih nukleinskih kiselina/cm2 , gde je svaka nukleinska kiselina pričvršćena za površinu podloge u unapred određenom regionu koji nije identičan (npr. mikročip). Svaki povezani uzorak na matrici sadrži kompoziciju nukleinske kiseline, poznatog identiteta, obično poznate sekvence, kao što je kasnije detaljnije opisano. U predmetnom pronalasku može se koristiti bilo koji supstrat koji može da se smisli.
[0052] U jednom primeru izvođenja, nukleinska kiselina pričvršćena za površinu podloge je DNK. U jednom primeru izvođenja, nukleinska kiselina pričvršćena za površinu podloge je cDNK ili RNK. U drugom primeru izvođenja, nukleinska kiselina pričvršćena za površinu podloge je cDNK sintetizovana pomoću lančane reakcije polimerizacije (PCR). Obično, nukleinska kiselina kao komponenta na matrici, prema pronalasku, duga je najmanje 10, 25, 50, 60 nukleotida. U jednom primeru izvođenja, nukleinska kiselina kao komponenta matrice duga je najmanje 150 nukleotida. Poželjno, nukleinska kiselina kao komponenta matrice duga je manje od 1000 nukleotida. Poželjnije, nukleinska kiselina kao komponenta matrice duga je manje od 500 nukleotida.
[0053] U matricama pronalaska, kompozicije nukleinske kiseline su stabilno povezane sa površinom podloge, pri čemu podloga može da bude fleksibilna ili rigidna. Pod "stabilno
2
povezana" podrazumeva se da svaka nukleinska kiselina kao komponenta matrice zadržava jedinstveni položaj u odnosu na podlogu pod uslovima hibridizacije i pranja. Kao takvi, uzorci su nekovalentno ili kovalentno stabilno povezani sa površinom podloge. Primeri nekovalentne veze uključuju nespecifičnu adsorpciju, vezivanje zasnovano na elektrostatičkim interakcijama (npr., interakcije jonskog para), hidrofobne interakcije, interakcije vodonične veze, specifično vezivanje putem člana para specifičnog vezivanja kovalentno vezanih za površinu podloge, i slično. Primeri kovalentnog vezivanja uključuju kovalentne veze obrazovane između nukleinske kiseline i funkcionalne grupe prisutne na površini rigidne podloge (npr., --OH), gde funkcionalna grupa može da bude prirodna ili prisutna kao član uvedene grupe za povezivanje, kao što je kasnije detaljnije opisano.
[0054] Količina nukleinske kiseline prisutne u svakoj kompoziciji biće dovoljna da obezbedi odgovarajuću hibridizaciju i detekciju ciljnih sekvenci nukleinske kiseline tokom testa u kome se koristi matrica. Uopšteno, količina svake nukleinske kiseline kao komponente matrice stabilno povezane sa podlogom matrice je najmanje oko 0.001 ng, poželjno najmanje oko 0.02 ng i poželjnije najmanje oko 0.05 ng, pri čemu količina može biti tako velika kao 1000 ng ili veća, ali obično neće prelaziti oko 20 ng. Kada je nukleinska kiselina kao komponenta matrice "naneta kao tačka" na podlogu u tački koja je celokupna kružnog oblika, prečnik "tačke" će uopšteno biti u opsegu od oko 10 do 5000 µm, obično od oko 20 do 2 000 µm i češće od oko 100 do 200 µm.
[0055] Kontrolne nukleinske kiseline kao komponenta matrice mogu da budu prisutne na matrici uključujući nukleinske kiseline kao komponente matrice koje sadrže oligonukleotide ili nukleinske kiseline koje odgovaraju genomskoj DNK, osnovnim genima, vektorskim sekvencama, sekvencama biljne nukleinske kiseline, negativne i pozitivne kontrolne gene, i slično. Kontrolne nukleinske kiseline kao komponenta matrice kalibrišući ili kontrolni geni čija uloga nije da pokažu da li je određeni "ključni" gen od interesa eksprimiran, već radije da obezbede druge korisne informacije, kao što je pozadinski ili bazalni nivo ekspresije.
[0056] Druge kontrolne nukleinske kiseline se nanose u vidu tačke na matricu i koriste kao ciljne kontrolne nukleinske kiseline za ekspresiju, i kontrolni nukleotidi za pogrešno sparivanje, za praćenje nespecifičnog vezivanja ili unakrsne hibridizacije sa nukleinskom kiselinom u uzorku koja nije ona ciljna prema kojoj je proba usmerena. Pogrešno sparene probe na taj način ukazuju na to da li je hibridizacija specifična ili ne. Na primer, ako je ciljni molekul prisutan, savršeno sparene probe treba da budu dosledno svetlije od pogrešno sparenih proba. Pored toga, ako su sva kontrolna pogrešna sparivanja prisutna, probe za pogrešno sparivanje se koriste za detekciju mutacije.
[0057] Brojni postupci mogu da se koriste za pričvršćivanje nukleinskih kiselina kao komponenti matrice pronalaska za supstrat (postupak označen kao "nanošenje tačaka"). Na primer, nukleinske kiseline se pričvršćuju korišćenjem tehnika iz, na primer SAD pat. br.
5,807,522, koji je ovde obuhvaćen referencom za objašnjenje postupaka pričvršćivanja polimera. Alternativno, nanošenje tačaka može da se izvede korišćenjem tehnologije kontaktne štampe kao što je poznato u stanju tehnike.
[0058] Merenje ekspresije RNK proizvoda pronalaska može da se uradi korišćenjem onih polinukleotida koji su specifični i/ili selektivni za RNK proizvode pronalaska da bi se kvantitativno odredila ekspresija RNK proizvoda. U specifičnom primeru izvođenja pronalaska, polinukleotidi koji su specifični i/ili selektivni za RNK proizvode su probe ili prajmeri. U jednom primeru izvođenja, ovi polinukleotidi su u obliku proba nukleinske kiseline koji mogu da se nanesu u vidu tačaka na matricu da bi se merila RNK iz uzorka pojedinca koji treba da se izmeri. U drugom primeru izvođenja, mogu da se koriste komercijalne matrice za merenje ekspresije RNK proizvoda. U još jednom primeru izvođenja, polinukleotidi koji su specifični i/ili selektivni za RNK proizvode se koriste u obliku proba i prajmera u tehnikama kao što je kvantitativni RT PCR u realnom vremenu, korišćenjem na primer SYBR®Green, ili korišćenjem TaqMan® tehnika ili tehnika molekularnog svetionika, gde se korišćeni polinukleotidi koriste u obliku direktnog prajmera, reverznog prajmera, TaqMan obeležene probe, ili obeležene probe za tehniku molekularnog svetionika.
[0059] U primerima izvođenja u kojima samo jedan ili dva gena treba da budu analizirana, nukleinska kiselina koja potiče iz uzorkovane ćelije(a) može da bude prvenstveno umnožena upotrebom odgovarajućih prajmera tako da se samo geni koji treba da se analiziraju umnožavaju da bi se smanjili pozadinski signali drugih gena eksprimiranih u ćeliji dojke. Alternativno, i tamo gde višestruki geni treba da budu analizirani ili gde se koristi veoma malo ćelija (ili jedna ćelija), nukleinska kiselina iz uzorka može da bude globalno umnožena pre hibridizacije sa imobilisanim polinukleotidima. Naravno da njihova komplementarna RNK, ili cDNK može da bude direktno obeležena i korišćena, bez amplifikacije, postupcima poznatim u stanju tehnike.
4. Upotreba mikročipa
[0060] "Mikročip" je linearna ili dvodimenzionalna matrica poželjno odvojenih regiona, od kojih svaki ima definisanu površinu, obrazovana na površini čvrste podloge kao što je, ali bez ograničenja, staklo, plastika, ili sintetska membrana. Gustina odvojenih regiona na mikročipu se određuje pomoću ukupnog broja imobilisanih polinukleotida koji treba da se detektuju na površini podloge sa jednom čvrstom fazom, poželjno najmanje oko 50/cm<2>, poželjnije najmanje oko 100/cm2 , čak poželjnije najmanje oko 500/cm<2>, ali poželjno ispod oko 1,000/cm2. Poželjno, matrice sadrže manje od oko 500, oko 1000, oko 1500, oko 2000, oko 2500, ili oko 3000 imobilisanih polinukleotida ukupno. Kako se ovde koristi, DNK mikročip je matrica oligonukleotida ili polinukleotida smeštenih na čip ili druge površine koji se koriste za hibridizaciju sa amplifikovanim ili kloniranim polinukleotidima iz uzorka. Budući da je položaj svake određene grupe prajmera na matrici poznat, identiteti polinukleotida uzorka mogu da se odrede na osnovu njihovog vezivanja na određenom položaju na mikročipu.
[0061] Određivanje nivoa genske ekspresije može da se postigne korišćenjem mikročipova. Uopšteno, mogu da budu uključeni sledeći koraci: (a) dobijanje uzorka iRNK od subjekta i pripremanje obeležene nukleinske kiseline iz njega ("ciljne nukleinske kiseline" ili "ciljnih molekula"); (b) dovođenje u kontakt ciljne nukleinske kiseline sa matricom pod uslovima adekvatnim da se ciljne nukleinske kiseline vežu za odgovarajuće probe na matrici, na primer, hibridizacijom ili specifičnim vezivanjem; (c) izborno uklanjanje nevezanih ciljnih molekula sa matrice; (d) detekcija vezanih ciljnih molekula, i (e) analiza rezultata, na primer, korišćenjem kompjuterskih analitičkih postupaka. Kako se ovde koristi, "probe nukleinske kiseline" ili "probe" su nukleinske kiseline pričvršćene za matricu, dok su "ciljne nukleinske kiseline" nukleinske kiseline koje hibridizuju sa matricom.
[0062] Uzorak nukleinske kiseline može da se dobije od subjekta koji se ispituje korišćenjem ili "invazivnog" ili "neinvazivnog" sredstva za uzorkovanje. Za sredstvo za uzorkovanje se kaže da je "invazivno" ako uključuje sakupljanje nukleinske kiseline iz unutrašnjosti kože ili organa životinje (uključujući miša, čoveka, ovcu, konja, govedo, svinju, psa ili mačku). Primeri invazivnog sredstva za uzorkovanje uključuju, sakupljanje krvi, sakupljanje semena, biopsiju iglom, pleuralnu aspiraciju, biopsiju pupčane vrpce. O primerima ovakvih postupaka se raspravlja kod Kim, et al., J. Virol., 1992, 66:3879-3882, Biswas, et al., Ann. NY Acad. Sci., 1990, 590:582-583, i Biswas, et al., J. Clin. Microbiol., 1991, 29:2228-2233.
2
[0063] Nasuprot ovome, "neinvazivno" sredstvo za uzorkovanje je ono u kome se molekuli nukleinske kiseline izdvajaju sa unutrašnje ili spoljašnje površine životinje. Primeri "neinvazivnog" sredstva za uzorkovanje uključuju, uzimanje brisa, sakupljanje suza, pljuvačke, urina, fekalnog materijala, ili slično.
[0064] U jednom primeru izvođenja predmetnog pronalaska, jedna ili više ćelija, tj. uzorak, od subjekta koji treba da se ispita je dobijen i RNK je izolovana iz ćelije. Takođe je moguće dobiti uzorak ćelije od subjekta, a zatim obogatiti uzorak željenim tipom ćelija. Na primer, ćelije mogu da se odvoje od drugih ćelija korišćenjem raznih tehnika, kao što je izolacija sa antitelom koje se vezuje za epitop na površini ćelije na željnom tipu ćelije. Kada su željene ćelije u čvrstom tkivu, konkretne ćelije mogu da se razdvoje, na primer, mikro-disekcijom ili laserskom mikro-disekcijom (LCM) (videti, npr., Bonner, et al., Science, 1997, 278:1481, Emmert-Buck, et al., Science, 1996, 274:998, Fend, et al., Am. J. Path., 1999, 154:61, i Murakami, et al., Kidney Hit., 2000, 58:1346.
[0065] RNK može da se ekstrahuje iz uzoraka tkiva ili ćelije različitim postupcima, na primer, lizom sa guanidijum tiocijanatom praćenom centrifugiranjem na CsCl (Chirgwin, et al., Biochemistry, 1979, 18:5294-5299). RNK iz jedne ćelije može da se dobije kao što je opisano u postupcima za pripremanje cDNK biblioteka iz jedne ćelije (videti, npr., Dulac, Curr. Top. Dev. Biol., 1998, 36:245, i Jena, et al., J. Immunol. Postupci, 1996, 190:199).
[0066] Uzorak RNK može dodatno da se obogati određenom vrstom. U jednom primeru izvođenja, na primer, poly(A)+RNK može da se izoluje iz uzorka RNK. U drugom primeru izvođenja, populacija RNK može da se obogati sekvencama od interesa pomoću prajmerspecifične sinteze cDNK, ili višestrukih ciklusa linearne amplifikacije zasnovanih na sintezi cDNK i in vitro transkripciji usmerenoj šablonom (videti, npr., Wang, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, 86:9717; Dulac, et al., supra; Jena, et al., supra). Pored toga, populacija RNK, obogaćena, ili ne, određenim vrstama ili sekvencama, može dodatno da se umnoži različitim amplifikacionim postupcima uključujući, PCR, lančanu reakciju ligaze (LCR) (videti, npr., Wu and Wallace, Genomics, 1989, 4:560; Landegren, et al., Science, 1988, 241:1077), samoodrživu replikaciju sekvence (SSR) (videti, npr., Guatelli, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1990, 87:1874), amplifikaciju sekvence zasnovanu na nukleinskoj kiselini (NASBA) i transkripcionu amplifikaciju (videti, npr., Kwoh, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, 86:1173). Postupci PCR tehnologije su dobro poznati u stanju tehnike (videti, npr., PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification, ed. H. A.
Erlich, Freeman Press, N.Y., N.Y., 1992; PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, eds. Innis, et al., Academic Press, San Diego, Calif., 1990; Mattila, et al., Nucleic Acids Res., 1991, 19:4967; Eckert, et al., PCR Methods and Applications, 1991, 1:17; PCR, eds. McPherson et al., IRL Press, Oxford; i U.S. Pat. No.4,683,202 ). Postupci za amplifikaciju su opisani, na primer, kod Ohyama, et al., BioTechniques, 2000, 29:530; Luo, et al., Nat. Med., 1999, 5:117; Hegde, et al., BioTechniques, 2000, 29:548; Kacharmina, et al., Meth. Enzymol., 1999, 303:3; Livesey, et al., Curr. Biol., 2000, 10:301; Spirin, et al., Invest. Ophtalmol. Vis. Sci., 1999, 40:3108; i Sakai, et al., Anal. Biochem., 2000, 287:32. Amplifikacija RNK i sinteza cDNK mogu takođe da se izvedu u ćelijama in situ (videti, npr., Eberwine, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1992, 89:3010).
[0067] U još jednom primeru izvođenja pronalaska, sve ili deo opisanih marker sekvenci mogu da budu amplifikovane i detektovane postupcima kao što je lančana reakcija polimerizacije (PCR) i njene varijacije, kao što su, ali bez ograničenja, kvantitativna PCR (Q-PCR), reverzna transkripcija PCR (RT- PCR), i PCR u realnom vremenu, izborno RT-PCR u realnom vremenu. Takvi postupci bi koristili jedan ili dva prajmera koji su komplementarni delovima opisane sekvence, pri čemu se prajmeri koriste za započinjanje sinteze nukleinske kiseline.
[0068] Novosintetisane nukleinske kiseline se izborno obeležavaju i mogu da se detektuju neposredno ili hibridizacijom sa polinukleotidom pronalaska.
[0069] Molekuli nukleinske kiseline mogu da se obeleže tako da omoguće detekciju hibridizacije molekula nukleinske kiseline sa mikročipom. To znači da proba može da sadrži komponentu sistema koji proizvodi signal, i na taj način je detektabilna, bilo neposredno, ili kroz kombinovano delovanje sa jednom ili više dodatnih komponenti sistema koji proizvodi signal. Na primer, nukleinske kiseline mogu da budu obeležene sa fluorescentno obeleženim dNTP (videti, npr., Kricka, Nonisotopic DNA Probe Techniques, Academic Press San Diego, Calif., 1992), biotinilizovanim dNTP ili rNTP, nakon čega se dodaje obeleženi streptavidin, hemiluminiscentne oznake, ili izotopi. Još jedan primer oznaka uključuje "molekularne svetionike" kao što je opisano kod Tyagi and Kramer, Nature Biotech., 1996, 14:303. Novosintetisane nukleinske kiseline mogu da se dovedu u kontakt sa polinukleotidima (koji sadrže sekvence) pronalaska pod uslovima koji omogućavaju njihovu hibridizaciju. Hibridizacija može takođe da se odredi, na primer, metodom rezonancije plazmona (videti, npr., Thiel, et al., Anal. Chem., 1997, 69:4948).
2
[0070] U jednom primeru izvođenja, mnoštvo, na primer, dva seta ciljnih nukleinskih kiselina se obeleže i koriste u jednoj reakciji hibridizacije ("multipleks" analiza). Jedan set nukleinskih kiselina može da odgovara RNK iz jedne ćelije, a drugi set nukleinskih kiselina može da odgovara RNK iz druge ćelije. Mnoštvo setova nukleinskih kiselina može da se obeleži različitim oznakama, kao što su različite fluorescentne oznake (npr., fluorescein i rodamin), koje imaju razdvojene emisione spektre tako da mogu da se razlikuju. Setovi mogu zatim da se pomešaju i hibridizuju istovremeno sa jednim mikročipom (videti, npr., Shena, et al., Science, 1995, 270:467-470).
[0071] Brojne različite konfiguracije mikročipova i postupci za njihovu proizvodnju su poznati stručnjacima u oblasti i opisani su u SAD pat. br: 5,242,974; 5,384,261; 5,405,783; 5,412,087; 5,424,186; 5,429,807; 5,436,327; 5,445,934; 5,556,752; 5,405,783; 5,412,087; 5,424,186; 5,429,807; 5,436,327; 5,472,672; 5,527,681; 5,529,756; 5,545,531; 5,554,501; 5,561,071; 5,571,639; 5,593,839; 5,624,711; 5, 700,637; 5,744,305; 5,770,456; 5,770,722; 5,837,832; 5,856,101; 5,874,219; 5,885,837; 5,919,523; 6,022,963; 6,077,674; i 6,156,501; Shena, et al., Tibtech 16:301, 1998; Duggan, et al., Nat. Genet. 21:10, 1999; Bowtell, et al., Nat. Genet.21:25, 1999; Lipshutz, et al., 21 Nature Genet.20-24, 1999; Blanchard, et al., 11 Biosensors i Bioelectronics, 687-90, 1996; Maskos, et al., 21 Nucleic Acids Res. 4663-69, 1993; Hughes, et al., Nat. Biotechol. (2001) 19:342; Patenti koji opisuju postupke korišćenja matrica za različite primene uključuju: SAD pat. br. 5,143,854; 5,288,644; 5,324,633; 5,432,049; 5,470,710; 5,492,806; 5,503,980; 5,510,270; 5,525,464; 5,547,839; 5,580,732; 5,661,028; 5,848,659; i 5,874,219.
[0072] U jednom primeru izvođenja, matrica oligonukleotida može da se sintetiše na čvrstoj podlozi. Primeri čvrstih podloga uključuju staklo, plastike, polimere, metale, metaloide, keramike, organike, itd. Korišćenjem tehnologija prekrivanja čipa i fotoprotektivne hemije, moguće je stvoriti tražene matrice proba nukleinske kiseline. Ove matrice, koje su poznate kao, na primer, "DNK čipovi" ili matrice imobilisanih polimera veoma velike razmere ("VLSIPS®" matrice), mogu da uključuju milione definisanih regiona proba na supstratu koji ima površinu od oko 1 cm<2>do nekoliko cm<2>, uključujući na taj način od nekoliko proba do miliona proba (videti, npr., SAD pat. br.5,631,734).
[0073] Da bi se uporedili nivoi ekspresije, obeležene nukleinske kiseline mogu da se dovedu u kontakt sa matricom pod uslovima koji omogućavaju vezivanje ciljne nukleinske kiseline i probe na matrici. U jednom primeru izvođenja, uslovi hibridizacije mogu da se odaberu tako
2
da obezbede željeni nivo specifičnosti hibridizacije; što znači uslove dovoljne za se hibridizacija odigra između obeleženih nukleinskih kiselina i proba na mikročipu.
[0074] Hibridizacija može da se izvede u uslovima koji dozvoljavaju suštinski specifičnu hibridizaciju. Dužina i sadržaj GC nukleinske kiseline će odrediti tačku topljenja i time, uslove hibridizacije neophodne za dobijanje specifične hibridizacije probe sa ciljnom nukleinskom kiselinom. Ovi uslovi su dobro poznati stručnjaku u oblasti, i mogu takođe da se ispitaju u testovima. Obiman vodič za hibridizaciju nukleinske kiseline može da se nađe kod Tijssen, et al., Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Vol. 24: Hybridization with Nucleic Acid Probes, P. Tijssen, ed. Elsevier, N.Y., 1993.
[0075] Postupci koji su gore opisani će rezultovati u proizvodnji obrazaca hibridizacije obeleženih ciljnih nukleinskih kiselina na površini matrice. Nastali obrasci hibridizacije obeleženih nukleinskih kiselina mogu da se vizuelizuju ili detektuju na različite načine, sa konkretnim načinom detekcije odabranim na osnovu konkretne oznake ciljne nukleinske kiseline. Reprezentativni načini detekcije uključuju scintilaciono brojanje, autoradiografiju, merenje fluorescencije, kalorimetrijsko merenje, merenje emisije svetlosti, rasipanje svetlosti, i slično.
[0076] Jedan takav postupak za detekciju koristi skener matrice koji je komercijalno dostupan (Affymetrix, Santa Clara, Calif.), na primer, 417® Arrayer, 418® Array Scanner, ili Agilent GeneArray® Scanner. Ovaj skener je kontrolisan kompjuterskim sistemom sa korisničkim programom i programskim alatima jednostavnim za upotrebu. Izlaz može neposredno da se uveze ili neposredno očita pomoću različitih softverskih aplikacija. Primeri uređaja za skeniranje su opisani, na primer, u SAD pat. br.5,143,854 i 5,424,186.
Doziranje i putevi primene
[0077] Što se tiče inhibitora WEE1 pronalaska, mogu da budu odabrani različiti oblici preparata, i njihovi primeri uključuju oralne preparate kao što su tablete, kapsule, prahovi, granule ili tečnosti, ili sterilizovani tečni parenteralni preparati kao što su rastvori ili suspenzije, supozitorije, masti i slično. Inhibitori WEE1 su dostupni kao farmaceutski prihvatljive soli. Inhibitori WEE1 pronalaska se pripremaju sa farmaceutski prihvatljivim nosačima ili razblaživačima.
[0078] Termin "farmaceutski prihvatljiva so" kako je navedeno u ovom opisu označava običnu, farmaceutski prihvatljivu so. Na primer, kada jedinjenje ima hidroksilnu grupu, ili
2
kiselu grupu kao što su karboksilna grupa i tetrazolil grupa, tada ono može da obrazuje baznu adicionu so na hidroksilnoj grupi ili kiseloj grupi; ili kada jedinjenje ima amino grupu ili baznu heterocikličnu grupu, tada može da obrazuje kiselu adicionu so na amino grupi ili baznoj heterocikličnoj grupi.
[0079] Bazne adicione soli uključuju, na primer, soli alkalnih metala kao što su natrijumove soli, kalijumove soli; soli zemnoalkalnih metala kao što su kalcijumove soli, magnezijumove soli; amonijumove soli; i soli organskih amina kao što su soli trimetilamina, soli trietilamina, soli dicikloheksilamina, soli etanolamina, soli dietanolamina, soli trietanolamina, soli prokaina, soli N,N'-dibenziletilendiamina.
[0080] Kisele adicione soli uključuju, na primer, soli neorganskih kiselina kao što su hidrohloridi, sulfati, nitrati, fosfati, perhlorati; soli organskih kiselina kao što su maleati, fumarati, tartrati, citrati, askorbati, trifluoroacetati; i sulfonate kao što su metansulfonati, isetionati, benzensulfonati, p-toluensulfonati.
[0081] Termin "farmaceutski prihvatljivi nosač ili razblaživač" odnosi se na ekscipijense, (npr., masti, pčelinji vosak, polu-čvrste i tečne poliole, prirodna ili hidrogenizovana ulja, itd.), vodu (npr., destilovanu vodu, posebno destilovanu vodu za injekcije, itd.), fiziološki rastvor, alkohol (npr., etanol), glicerol, poliole, vodeni rastvor glukoze, manitol, biljna ulja, itd), i aditive (npr., sredstvo za punjenje, sredstvo za raspadanje, vezivno sredstvo, lubrikant, sredstvo za kvašenje, stabilizator, emulzifikator, sredstvo za dispergovanje, konzervans, zaslađivač, sredstvo za bojenje, začinsko sredstvo ili sredstvo za davanje arome, sredstvo za koncentrovanje, razblaživač, puferska supstanca, rastvarač ili sredstvo za poboljšanje rastvorljivosti, hemikalije za postizanje efekta skladištenja, so za modifikovanje osmotskog pritiska, sredstvo za oblaganje ili antioksidans, i slično).
[0082] Čvrsti preparati mogu da budu pripremljeni u obliku tablete, kapsule, granule i praha bez ikakvih aditiva, ili pripremljeni korišćenjem odgovarajućih nosača (aditiva). Primeri takvih nosača (aditiva) mogu da uključuju saharide kao što su laktoza ili glukoza; skrob kukuruza, pšenice ili pirinča; masne kiseline kao što je stearinska kiselina; neorganske soli kao što su magnezijum metasilikat aluminat ili anhidrovani kalcijum fosfat; sintetske polimere kao što su polivinilpirolidon ili polialkilen glikol; alkohole kao što su stearil alkohol ili benzil alkohol; sintetske celulozne derivate kao što su metilceluloza, karboksimetilceluloza, etilceluloza ili hidroksipropilmetilceluloza; i druge uobičajeno korišćene aditive kao što su želatin, talk, biljno ulje i guma arabika.
2
[0083] Čvrsti preparati kao što su tablete, kapsule, granule i prahovi mogu uopšteno da sadrže, na primer, 0.1 do 100% po težini, i poželjno 5 do 98% po težini, inhibitora WEE1, u odnosu na ukupnu težinu svakog preparata.
[0084] Tečni preparati se proizvode u obliku suspenzije, sirupa, injekcije i infuzije kap po kap (intravenska tečnost) korišćenjem odgovarajućih aditiva koji se uobičajeno koriste u tečnim preparatima, kao što su voda, alkohol ili ulje dobijeno iz biljaka kao što je sojino ulje, ulje od kikirikija i susamovo ulje.
[0085] Naročito, kada se preparat primenjuje parenteralno u obliku intramuskularne injekcije, intravenske injekcije ili subkutane injekcije, odgovarajući rastvarač ili razblaživač može da predstavlja destilovana voda za injekcije, vodeni rastvor lidokain hidrohlorida (za intramuskularnu injekciju), fiziološki rastvor, vodeni rastvor glukoze, etanol, polietilen glikol, propilen glikol, tečnost za intravensku injekciju (npr., vodeni rastvor limunske kiseline, natrijum citrat i slično) ili elektrolitički rastvor (za intravensku infuziju kapanjem i intravensku injekciju), ili njihov mešani rastvor.
[0086] Takva injekcija može da bude u obliku preliminarno rastvorenog rastvora, ili u obliku praha po sebi ili praha povezanog sa pogodnim nosačem (aditivom) koji se rastvara u vreme upotrebe. Injekcija tečnosti može da sadrži, na primer, 0.1 do 10% po težini aktivnog sastojka u odnosu na ukupnu težinu svakog preparata.
[0087] Tečni preparati kao što su suspenzija ili sirup za oralnu primenu mogu da sadrže, na primer, 0.1 do 10% po težini aktivnog sastojka u odnosu na ukupnu težinu svakog preparata.
[0088] Svaki preparat u pronalasku može da pripremi osoba sa prosečnim iskustvom u struci prema konvencionalnim postupcima ili uobičajenim tehnikama. Na primer, priprema može da se izvede, ako je preparat oralni preparat, na primer, mešanjem odgovarajuće količine jedinjenja pronalaska sa odgovarajućom količinom laktoze i punjenjem smeše u čvrste želatinske kapsule koje su pogodne za oralnu primenu. Sa druge strane, priprema može da se izvede, ako je preparat koji sadrži jedinjenje pronalaska injekcija, na primer, mešanjem odgovarajuće količine jedinjenja pronalaska sa odgovarajućom količinom 0.9% fiziološkog rastvora i punjenjem ove smeše u fiole za injekciju.
[0089] Jedinjenja ovog pronalaska mogu da se primene kod sisara, uključujući ljude, bilo sama ili, u kombinaciji sa farmaceutski prihvatljivim nosačima, ekscipijensima ili razblaživačima, u farmaceutskoj kompoziciji, u skladu sa standardnom farmaceutskom
2
praksom. Komponente mogu da se primene oralno ili parenteralno, uključujući intravenske, intramuskularne, intraperitonealne, subkutane, rektalne i topikalne puteve primene.
[0090] Odgovarajuće doze su poznate medicinskim radnicima i zavisiće, naravno, od konkretnog stanja bolesti, specifične aktivnosti kompozicije koja se primenjuje, i konkretnog pacijenta koji se leči. U nekim slučajevima, da bi se postigla željena terapeutska količina, može da bude neophodno obezbediti ponovljenu primenu, tj., ponovljene pojedinačne primene određene nadgledane ili izmerene doze, pri čemu se pojedinačne primene ponavljaju dok se ne postigne željena dnevna doza ili dejstvo. Dodatna informacija u vezi sa pogodnim dozama je obezbeđena dole u tekstu.
[0091] Termin "primena" i njegove varijante (npr., "primena" jedinjenja) u odnosu na komponentu pronalaska označava uvođenje komponente ili proleka komponente u sistem životinje kojoj je lečenje potrebno. Kada je komponenta pronalaska ili njen prolek obezbeđen u kombinaciji sa jednim ili više dodatnih aktivnih sredstava (npr., inhibitor WEE1), podrazumeva se da "primena" i njene varijante uključuju istovremeno i uzastopno uvođenje komponente ili njenog proleka i drugih sredstava.
[0092] Kako se ovde koristi, termin "kompozicija" je namenjen da obuhvati proizvod koji sadrži specificirane sastojke u specificiranim količinama, kao i bilo koji proizvod koji rezultuje, neposredno ili posredno, iz kombinacije specificiranih sastojaka u specificiranim količinama.
[0093] Termin "terapeutski efikasna količina" kako se ovde koristi označava količinu aktivnog jedinjenja ili farmaceutskog sredstva koje dovodi do biološkog ili medicinskog odgovora u tkivu, sistemu, životinji ili čoveku, koji je zapazio istaživač, veterinar, doktor medicine ili drugi kliničar. Ovo uključuje kombinovanu terapiju koja obuhvata upotrebu višestrukih terapeutskih sredstava, kao što su kombinovana količina prvog i drugog tretmana, pri čemu će kombinovana količina postići željeni biološki odgovor. Željeni biološki odgovor je delimična ili potpuna inhibicija, odlaganje ili prevencija napredovanja kancera uključujući metastazu kancera; inhibicija, odlaganje ili prevencija recidiva kancera uključujući metastazu kancera; ili prevencija pojave ili razvoja kancera (hemoprevencija) kod sisara, na primer čoveka.
[0094] Pogodna količina inhibitora WEE1 se primenjuje kod pacijenta koji je podvrgnut lečenju kancera. U jednom primeru izvođenja, inhibitor WEE1 se primenjuje u dozama u opsegu od oko 100 mg na dan do 250 mg na dan. U jednom primeru izvođenja pronalaska, inhibitor WEE1 se primenjuje dva puta dnevno (BID), tokom dva i po dana, za ukupno 5 doza. U drugom primeru izvođenja pronalaska, inhibitor WEE1 se primenjuje jednom dnevno (QD) tokom dva dana, za ukupno 2 doze.
[0095] U jednom primeru izvođenja pronalaska, inhibitor WEE1 može da se primeni 5 puta nedeljno. U drugom primeru izvođenja pronalaska, inhibitor WEE1 može da se primeni 2 puta nedeljno.
Indikacije
[0096] U jednom primeru izvođenja, pronalazak je ovde inhibitor WEE1 za upotrebu u lečenju pacijenta kome je dijagnostikovan kancer povezan sa WEE1, pri čemu je pomenuti pacijent okarakterisan time što ima nisku ekspresiju PKMYT1. Inhibitor WEE1 pronalaska ima inhibitorno dejstvo na kinazu, naročito ima ima inhibitorno dejstvo na WEE1 kinazu, i, kao takav, koristan je kao lek za različite kancere povezane sa WEE1 kinazom. Primeri kancera povezanog sa WEE1 kinazom uključuju, kancer mozga, cervikocerebralni kancer, ezofagealni kancer, tiroidni kancer, sitnoćelijski kancer, nesitnoćelijski kancer, kancer dojke, kancer pluća, kancer želuca, kancer žučne kese/žučnog pita, kancer jetre, kancer pankreasa, kancer debelog creva, rektalni kancer, kancer jajnika, horiokarcinom, kancer tela materice, uterocervikalni kancer, kancer renalnog pelvisa/uretera, kancer mokraćne bešike, kancer prostate, kancer penisa, kancer testisa, fetalni kancer, Vilmsov kancer, kancer kože, maligni melanom, neuroblastom, osteosarkom, Juingov tumor, sarkom mekih tkiva, akutnu leukemiju, hroničnu limfatičnu leukemiju, hroničnu mijelocitnu leukemiju, Hočkinov limfom, ili kao senzibilizatori za hemoterapiju ili zračnu terapiju ovih kancera.
[0097] Naročito, inhibitori WEE1 pronalaska su korisni kao lekovi, na primer, za kancer dojke, kancer pluća, kancer pankreasa, kancer debelog creva, kancer jajnika, akutnu leukemiju, hroničnu limfatičnu leukemiju, hroničnu mijelocitnu leukemiju, Hočkinov limfom, ili kao senzibilizatori za hemoterapiju ili zračnu terapiju ovih kancera.
[0098] Pored lečenja kancera povezanih sa WEE1 kinazom koji su gore navedeni, inhibitor WEE1 može da bude koristan i za lečenje sledećih kancera: srca: sarkom (angiosarkom, fibrosarkom, rabdomiosarkom, liposarkom), miksom, rabdomiom, fibrom, lipom i teratom; pluća: bronhogeni karcinom (skvamoznih ćelija ili epidermoidni, nediferencirani karcinom malih ćelija, nediferencirani karcinom velikih ćelija, adenokarcinom), alveolarni
1
(bronhiolarni) karcinom, bronhijalni adenom, sarkom, limfom, hondromatozni hamartom, mezoteliom; gastrointestinalni: ezofagusa (karcinom skvamoznih ćelija, adenokarcinom, leiomiosarkom, limfom), želuca (karcinom, limfom, leiomiosarkom), pankreasa (duktalni adenokarcinom, insulinom, glukagonom, gastrinom, karcinoidni tumor, vipom), tankog creva (adenokarcinom, limfom, karcinoidni tumori, Karpošijev sarkom, leiomiom, hemangiom, lipom, neurofibrom, fibrom), debelog creva (adenokarcinom, tubularni adenom, adenom vilusa, hamartom, leiomiom), kolona, kolorektalni, rektuma; genitourinarnog trakta: bubrega (adenokarcinom, Vilmsov tumor [nefroblastom], limfom, leukemija), mokraćne bešike i uretre (karcinom skvamoznih ćelija, karcinom prelaznih ćelija, adenokarcinom), prostate (adenokarcinom, sarkom), testisa (seminom, teratom, embrionalni karcinom, teratokarcinom, horiokarcinom, sarkom, karcinom interstitialnih ćelija, fibrom, fibroadenom, adenomatoidni tumori, lipom); jetre: hepatom (hepatocelularni karcinom), holangiokarcinom, hepatoblastom, angiosarkom, hepatocelularni adenom, hemangiom; kosti: osteogeni sarkom (osteosarkom), fibrosarkom, maligni fibrozni histiocitom, hondrosarkom, Juingov sarkom, maligni limfom (sarkom retikularnih ćelija), multipli mijelom, maligni tumor hordoma sa gigantskim ćelijama, osteohronfrom (koštano-hrskavičave egzostoze), benigni hondrom, hondroblastom, hondromiksofibrom, osteoidni osteom i tumori gigantskih ćelija; nervnog sistema: lobanje (osteom, hemangiom, granulom, ksantom, osteitis deformans), meningi (meningiom, meningiosarkom, gliomatoza), mozga (astrocitom, meduloblastom, gliom, ependimom, germinom [pinealom], multiformni glioblastom, oligodendrogliom, švanom, retinoblastom, kongenitalni tumori), kičmene moždine (neurofibrom, meningiom, gliom, i sarkom); ginekološki: materice (endometrijalni karcinom), cerviksa (cervikalni karcinom, pretumorska cervikalna displazija), jajnika (karcinom jajnika [serozni cistadenokarcinom, mukozni cistadenokarcinom, neklasifikovani karcinom], tumori granulozno-tekalnih ćelija, tumori Sertoli-Leydig-ovih ćelija, disgerminom, maligni teratom), vulve (karcinom skvamoznih ćelija, intraepitelijalni karcinom, adenokarcinom, fibrosarkom, melanom), vagine (karcinom bistrih ćelija, karcinom skvamoznih ćelija, botrioidni sarkom (embrionalni rabdomiosarkom), Falopijevih tuba (karcinom); hematološki: krvi (mijeloidna leukemija [akutna i hronična], akutna limfoblastna leukemija, hronična limfocitna leukemija, mijeloproliferativne bolesti, multipli mijelom, mijelodisplastični sindrom), Hočkinova bolest, non-Hočkinov limfom, [maligni limfom]; i kože: maligni melanom, karcinom bazalnih ćelija, karcinom skvamoznih ćelija, Karpošijev sarkom, displastični mladeži, lipom, angiom, dermatofibrom. Prema tome, termin "kancerska ćelija", kako se ovde koristi, odnosi se na ćeliju pogođenu bilo kojim od gore identifikovanih stanja.
2
[0099] U oblast pronalaska dalje je uključen inhibitor WEE1 za upotrebu u lečenju ili prevenciji bolesti u koju je uključena angiogeneza, koje se sastoji od primene kod sisara kome je takvo lečenje potrebno terapeutski efikasne količine kombinacije predmetnog pronalaska. Očne neovaskularne bolesti su primer stanja u kojima mnogo nastalog oštećenja tkiva može da se pripiše aberantnoj infiltraciji krvnih sudova u oko ( WO 2000/30651). Neželjena infiltracija može da bude pokrenuta ishemičnom retinopatijom, kao što je ona koja rezultuju iz dijabetičke retinopatije, prematurne retinopatije, okluzije retinalnih vena, itd, ili degenerativnim bolestima, kao što je horoidalna neovaskularizacija primećena kod makularne degeneracije povezane sa starenjem. Inhibicija rasta krvnih sudova primenom predmetnih jedinjenja bi prema tome sprečila infiltraciju krvnih sudova i sprečila ili lečila bolest u koje je uključena angiogeneza, kao što su očne bolesti kao retinalna vaskularizacija, diabetička retinopatija, makularna degeneracija povezane sa starenjem, i slično.
[0100] U oblast pronalaska dalje je uključen inhibitor WEE1 za upotrebu u lečenju ili prevenciji nemaligne bolesti u koju je uključena angiogeneza. Takve bolesti uključuju: očne bolesti (kao što su retinalna vaskularizacija, dijabetička retinopatija, makularna degeneracija povezane sa starenjem), ateroskleroza, artritis, psorijaza, gojaznost i Alchajmerova bolest (Dredge, et al., Expert Opin. Biol. Ther., 2002, 2(8):953-966). U drugom primeru izvođenja, inhibitor WEE1 za upotrebu u lečenju ili prevenciji bolesti u koju je uključena angiogeneza. Takve bolesti uključuju: očne bolesti (kao što su retinalna vaskularizacija, dijabetička retinopatija, makularna degeneracija povezane sa starenjem), aterosklerozu, artritis, psorijazu.
[0101] U oblast pronalaska dalje je uključen inhibitor WEE1 za upotrebu u lečenju hiperproliferativnih poremećaja, kao što su restenoza, inflamacija, autoimunske bolesti, i alergija/astma.
[0102] U oblast pronalaska dalje je uključena upotreba predmetne kombinacije za oblaganje stentova i, prema tome, upotreba predmetnih jedinjenja na obloženim stentovima za lečenje i/ili prevenciju restenoze ( WO 2003/032809).
[0103] U oblast pronalaska dalje je uključena upotreba predmetne kombinacije za lečenje i/ili prevenciju osteoartritisa ( WO 2003/035048).
[0104] U oblast pronalaska dalje je uključen inhibitor WEE1 za upotrebu u lečenju hipoinsulinizma.
[0105] Primer pronalaska je upotreba inhibitora WEE1 opisan koji je gore u tekstu u pripremi leka za lečenje kancera povezanog sa WEE1.
Dodatna antikancerska sredstva
[0106] Inhibitor WEE1 primenjen u postupcima predmetnog pronalaska takođe je koristan u kombinaciji sa dodatnim terapeutskim, hemoterapeutskim i antikancerskim sredstvima. Dodatna kombinacija inhibitora WEE1 predmetnog pronalaska sa terapeutskim, hemoterapeutskim i antikancerskim sredstvima pripada oblasti pronalaska. Primeri takvih sredstava mogu da se nađu u Cancer Principles and Practice of Oncology od V.T. Devita and S. Hellman (urednici), 6. izdanje (15. februar 2001.), Lippincott Williams & Wilkins Publishers. Osoba sa uobičajenim znanjem u oblasti bi mogla da raspozna koje kombinacije sredstava bi bile korisne na osnovu konkretnih svojstava lekova i kancera koji je u pitanju. Takva dodatna sredstva uključuju sledeće: modulatore estrogenskog receptora, modulatore androgenog receptora, modulatore retinoidnog receptora, citotoksična/citostatska sredstva, antiproliferativna sredstva, inhibitore prenil-protein transferaze, inhibitore HMG-CoA reduktaze i druge inhibitore angiogeneze, inhibitore HIV proteaze, inhibitore reverzne transkriptaze, inhibitore ćelijske proliferacije i signalizacije preživljavanja, bisfosfonate, inhibitore aromataze, terapeutike na bazi siRNK, inhibitore γ-sekretaze, sredstva koja interferiraju sa receptorskim tirozin kinazama (RTK) i sredstva koja interferiraju sa kontrolnim tačkama ćelijskog ciklusa. Kombinacija inhibitora mTOR i antagonista αvβ3integrina predmetnog pronalaska može da bude posebno korisna kada se primenjuje zajedno sa zračnom terapijom.
[0107] Izraz "modulatori estrogenskog receptora" odnosi se na jedinjenja koja interferiraju sa, ili inhibiraju vezivanje estrogena za receptor, bez obzira na mehanizam. Primeri modulatora estrogenskog receptora uključuju, ali nisu ograničeni na, tamoksifen, raloksifen, idoksifen, LY353381, LY117081, toremifen, fulvestrant, 4-[7-(2,2-dimetil-1-oksopropoksi-4-metil-2-[4-[2-(1-piperidinil)etoksi]fenil]-2H-1-benzopiran-3-il]-fenil-2,2-dimetilpropanoat, 4,4'-dihidroksibenzofenon-2,4-dinitrofenil-hidrazon i SH646.
[0108] Izraz "modulatori androgenog receptora" odnosi se na jedinjenja koja interferiraju sa, ili inhibiraju vezivanje androgena za receptor, bez obzira na mehanizam. Primeri modulatora androgenog receptora uključuju finasterid i druge inhibitore 5α-reduktaze, nilutamid, flutamid, bikalutamid, liarozol i abirateron acetat.
4
[0109] Izraz "modulatori retinoidnog receptora" odnosi se na jedinjenja koja interferiraju sa, ili inhibiraju vezivanje retinoida za receptor, bez obzira na mehanizam. Primeri takvih modulatora retinoidnog receptora uključuju beksaroten, tretinoin, 13-cis-retinoinsku kiselinu, 9-cis- retinoinsku kiselinu, α-difluorometilornitin, ILX23-7553, trans-N-(4'-hidroksifenil) retinamid i N-4-karboksifenil retinamid.
[0110] Izraz "citotoksična/citostatska sredstva" se odnosi na jedinjenja koja izazivaju ćelijsku smrt ili inhibiraju proliferaciju ćelija primarno neposrednom interferencijom sa funkcionisanjem ćelije ili inhibiraju ili interferiraju sa ćelijskom mejozom, uključujući alkilirajuća sredstva, faktore nekroze tumora, interkalatore, jedinjenja aktivirana hipoksijom, inhibitore mikrotubula/sredstva koja stabilizuju mikrotubule, inhibitore mitotskih kinezina, inhibitore histonske deacetilaze, inhibitore kinaza uključenih u progresiju mitoze, inhibitore kinaza uključenih u faktor rasta i citokinske puteve prenosa signala, antimetabolite, modifikatore biološkog odgovora, hormonalna/antihormonalna terapeutska sredstva, hematopoetske faktore rasta, terapeutska sredstva ciljna za monoklonsko antitelo, inhibitore topoizomeraze, inhibitore proteozoma, inhibitore ubikvitin ligaze, i inhibitore aurora kinaze.
[0111] Primeri citotoksičnih/citostatskih sredstava uključuju, sertenef, kahektin, ifosfamid, tasonermin, lonidamin, karboplatin, altretamin, prednimustin, dibromodulcitol, ranimustin, fotemustin, nedaplatin, oksaliplatin, temozolomid, heptaplatin, estramustin, improsulfan tozilat, trofosfamid, nimustin, dibrospidijum hlorid, pumitepa, lobaplatin, satraplatin, profiromicin, cisplatin, irofulven, deksifosfamid, cis-amindihloro(2-metilpiridin)platina, benzilguanin, glufosfamid, GPX100, (trans, trans, trans)-bis-mu-(heksan-1,6-diamin)-mu-[diamin-platina(II)]bis[diamin(hloro)platina (II)]tetrahlorid, diarizidinilspermin, arsenik trioksid, 1-(11-dodecilamino-10-hidroksiundecil)-3,7-dimetilksantin, zorubicin, idarubicin, daunorubicin, bisantren, mitoksantron, pirarubicin, pinafid, valrubicin, amrubicin, antineoplaston, 3'-deamino-3'-morfolino-13-deokso-10-hidroksikarminomicin, anamicin, galarubicin, elinafid, MEN10755, 4-demetoksi-3-deamino-3-aziridinil-4-metilsulfonildaunorubicin (videti WO 00/50032 ), inhibitore Raf kinaze (kao što su Bay43-9006) i inhibitore mTOR, kao što su ridaforolimus, everolimus, temsirolimus, sirolimus ili analog rapamicina.
[0112] Primer jedinjenja aktiviranog hipoksijom je tirapazamin.
[0113] Primeri inhibitora proteozoma uključuju laktacistin i MLN-341 (Velcade).
[0114] Primeri inhibitora mikrotubula/sredstva koja stabilizuju mikrotubule uključuju paklitaksel, vindesin sulfat, 3',4'-didehidro-4'-deoksi-8'-norvinkaleukoblastin, docetaksel, rizoksin, dolastatin, mivobulin izetionat, auristatin, cemadotin, RPR109881, BMS184476, vinflunin, kriptoficin, 2,3,4,5,6-pentafluoro-N-(3-fluoro-4-metoksifenil) benzen sulfonamid, anhidrovinblastin, N,N-dimetil-L-valil-L-valil-N-metil-L-valil-L-prolil-L-prolin-t-butilamid, TDX258, epotiloni (videti na primer SAD pat. br. 6,284,781 i 6,288,237) i BMS188797. U primeru izvođenja epotiloni nisu uključeni u inhibitora mikrotubula/sredstva koja stabilizuju mikrotubule.
[0115] Neki primeri inhibitora topoizomeraze su topotekan, hikaptamin, irinotekan, rubitekan, 6-etoksipropionil-3',4'-O-ekso-benziliden-hartreusin, 9-metoksi-N,N-dimetil-5-nitropirazolo[3,4,5-kl]akridin-2-(6H) propanamin, 1-amino-9-etil-5-fluoro-2,3-dihidro-9-hidroksi-4-metil-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':b,7]-indolizino[1,2b]kvinolin-10,13(9H,15H)dion, lurtotekan, 7-[2-(N-izopropilamino)etil]-(20S)kamptotecin, BNP1350, BNPI1100, BN80915, BN80942, etopozid fosfat, tenipozid, sobuzoksan, 2'-dimetilamino-2'-deoksi-etopozid, GL331, N-[2-(dimetilamino)etil]-9-hidroksi-5,6-dimetil-6H-pirido[4,3-b]karbazol-1-karboksamid, asulakrin, (5a, 5aB, 8aa,9b)-9-[2-[N-[2-(dimetilamino)etil]-N-metilamino]etil]-5-[4-hidro0ksi-3,5-dimetoksifenil]-5,5a,6,8,8a,9-heksohidrofuro(3',4':6,7) nafto(2,3-d)-1,3-dioksol-6-on, 2,3-(metilendioksi)-5-metil-7-hidroksi-8-metoksibenzo[c]-fenantridinijum, 6,9-bis[(2-aminoetil)amino]benzo[g]izoguinolin-5,10-dion, 5-(3-aminopropilamino)-7,10-dihidroksi-2-(2-hidroksietilaminometil)-6H-pirazolo[4,5,1-de]akridin-6-on, N-[1-[2(dietilamino)etilamino]-7-metoksi-9-okso-9H-tioksanten-4-ilmetil]formamid, N-(2-(dimetilamino)etil)akridin-4-karboksamid, 6-[[2-(dimetilamino)etil]amino]-3-hidroksi-7H-indeno[2,1-c]kvinolin-7-on i dimesna.
[0116] Primeri inhibitora mitotskih kinezina, i posebno humanog mitotskog kinezina KSP, opisani su u objavama WO 2003/039460, WO 2003/050064, WO 2003/050122, WO 2003/049527, WO 2003/049679, WO 2003/049678, WO 2004/039774, WO 2003/079973, WO 2003/099211, WO 2003/105855, WO 2003/106417, WO 2004/037171, WO 2004/058148, WO 2004/058700, WO 2004/126699, WO 2005/018638, WO 2005/019206, WO 2005/019205, WO 2005/018547, WO 2005/017190, US 2005/0176776. U jednom primeru izvođenja inhibitori mitotskih kinezina uključuju inhibitore KSP, inhibitore MKLP1, inhibitore CENP-E, inhibitore MCAK, i inhibitore Rab6-KIFL.
[0117] Primeri "inhibitora histonske deacetilaze" uključuju SAHA, TSA, oksamflatin, PXD101, MG98 i skriptaid. Dodatne reference za druge inhibitore histonske deacetilaze mogu da se nađu u sledećem rukopisu; Miller, T.A., et al., J. Med. Chem., 2003, 46(24):5097-5116.
[0118] "Inhibitori kinaze uključene u progresiju mitoze" uključuju inhibitore aurora kinaze, inhibitore Polo-slične kinaze (PLK; naročito inhibitore PLK-1), inhibitore bub-1 i inhibitore bub-R1. Primer "inhibitora aurora kinaze" je VX-680.
[0119] "Antiproliferativna sredstva" uključuju antisens RNK i DNK oligonukleotide kao što su G3139, ODN698, RVASKRAS, GEM231, i INX3001, i antimetabolite kao što su enocitabin, karmofur, tegafur, pentostatin, doksifluridin, trimetreksat, fludarabin, kapecitabin, galocitabin, citarabin okfosfat, fosteabin natrijum hidrat, raltitreksed, paltitreksid, emitefur, tiazofurin, decitabin, nolatreksed, pemetreksed, nelzarabin, 2'-deoksi-2'-metilidencitidin, 2'-fluorometilen-2'-deoksicitidin, N-[5-(2,3-dihidrobenzofuril)sulfonil]-N'-(3,4-dihlorofenil)urea, N6-[4-deoksi-4-[N2-[2(E),4(E)-tetradekadienoil]glicilamino]-L-glicero-B-L-mano-heptopiranozil]adenin, aplidin, ekteinascidin, troksacitabin, 4-[2-amino-4-okso-4,6,7,8-tetrahidro-3H-pirimidino[5,4-b][1,4]tiazin-6-il-(S)-etil]-2,5-tienoil-L-glutaminska kiselina, aminopterin, 5-flurouracil, alanozin, 11-acetil-8-(karbamoiloksimetil)-4-formil-6-metoksi-14-oksa-1,11-diazatetraciklo(7.4.1.0.0)-tetradeka-2,4,6-trien-9-il estar sirćetne kiseline, svainsonin, lometreksol, deksrazoksan, metioninaza, 2'-cijano-2'-deoksi-N4-palmitoil-1-B-D-arabino furanozil citozin, 3-aminopiridin-2-karboksaldehid tiosemikarbazon i trastuzumab.
[0120] Primeri terapeutskih sredstava sa ciljnim monoklonskim antitelom uključuju ona terapeutska sredstva koja imaju citotoksična sredstva ili radioizotope vezane za monoklonsko antitelo specifično za kancersku ćeliju ili specifično za ciljnu ćeliju. Primeri uključuju Bexxar.
[0121] "Inhibitori HMG-CoA reduktaze" se odnose na inhibitore 3-hidroksi-3-metilglutaril-CoA reduktaze. Primeri inhibitora HMG-CoA reduktaze koji mogu da se koriste uključuju, lovastatin (MEVACOR®; videti SAD patent br. 4,231,938, 4,294,926 i 4,319,039), simvastatin (ZOCOR®; videti SAD patent br. 4,444,784, 4,820,850 i 4,916,239), pravastatin (PRAVACHOL®; videti SAD patent br. 4,346,227, 4,537,859, 4,410,629, 5,030,447 i 5,180,589), fluvastatin (LESCOL®; videti SAD patent br. 5,354,772, 4,911,165, 4,929,437, 5,189,164, 5,118,853, 5,290,946 i 5,356,896), atorvastatin (LIPITOR®; videti SAD patent br.
5,273,995, 4,681,893, 5,489,691 i 5,342,952) i cerivastatin (takođe poznat kao rivastatin i BAYCHOL®; SAD patent br. 5,177,080). Strukturne formule ovih i dodatnih inhibitora HMG-CoA reduktaze koji mogu da se koriste u predmetnim tretmanima opisani su na stranici 87 u M. Yalpani, Cholesterol Lowering Drugs, Chemistry & Industry, 1996, pp. 85-89, i SAD patent br. 4,782,084 i 4,885,314. Termin inhibitor HMG-CoA reduktaze kako se ovde koristi uključuje sve farmaceutski prihvatljive laktonske i oblike otvorene kiseline (tj., kada je prsten laktona otvoren tako da obrazuje slobodnu kiselinu) kao i oblici soli i estra jedinjenja koja ispoljavaju inhibitornu aktivnost na HMG-CoA reduktazu, i prema tome je upotreba takvih soli, estara, oblika otvorene kiseline i laktona uključena u obim ovog pronalaska.
[0122] Izraz "inhibitor prenil-protein transferaze" odnosi se na jedinjenje koje inhibira bilo koju ili svaku kombinaciju enzima prenil-protein transferaze, uključujući farnezil-protein transferazu (FPTaza), geranilgeranil-protein transferazu tipa I (GGPTaza-I), i geranilgeranilprotein transferazu tipa-II (GGPTaza-II, takođe nazvanu Rab GGPTaza).
[0123] Primeri inhibitora prenil-protein transferaze mogu da se nađu u sledećim objavama i patentima: WO 96/30343, WO 97/18813, WO 97/21701, WO 97/23478, WO 97/38665, WO 98/28980, WO 98/29119, WO 95/32987, SAD patent br. 5,420,245, SAD patent br.
5,523,430, SAD patent br. 5,532,359, SAD patent br. 5,510,510, SAD patent br. 5,589,485, SAD patent br. 5,602,098, evropska patentna objava 0 618 221, evropska patentna objava 0 675 112, evropska patentna objava 0 604 181, evropska patentna objava 0 696 593, WO 94/19357, WO 95/08542, WO 95/11917, WO 95/12612, WO 95/12572, WO 95/10514, SAD patent br. 5,661,152, WO 95/10515, WO 95/10516, WO 95/24612, WO 95/34535, WO 95/25086, WO 96/05529, WO 96/06138, WO 96/06193, WO 96/16443, WO 96/21701, WO 96/21456, WO 96/22278, WO 96/24611, WO 96/24612, WO 96/05168, WO 96/05169, WO 96/00736, SAD patent br. 5,571,792, WO 96/17861, WO 96/33159, WO 96/34850, WO 96/34851, WO 96/30017, WO 96/30018, WO 96/30362, WO 96/30363, WO 96/31111, WO 96/31477, WO 96/31478, WO 96/31501, WO 97/00252, WO 97/03047, WO 97/03050, WO 97/04785, WO 97/02920, WO 97/17070, WO 97/23478, WO 97/26246, WO 97/30053, WO 97/44350, WO 98/02436, i SAD patent br. 5,532,359. Kao primer uloge inhibitora prenilprotein transferaze u angiogenezi, videti, European J. of Cancer, 1999, 35(9):1394-1401.
[0124] Izraz "inhibitori angiogeneze" odnosi se na jedinjenja koja inhibiraju obrazovanje novih krvnih sudova, bez obzira na mehanizam. Primeri inhibitora angiogeneze uključuju, inhibitore tirozin kinaze, kao što su inhibitori receptora tirozin kinaze Flt-1 (VEGFR1) i Flk1/KDR (VEGFR2), inhibitore faktora rasta izvedenih iz epiderma, fibroblasta, ili trombocita, inhibitore MMP (matriks metaloproteaze), blokatore integrina, interferon-α, interleukin-12, pentozan polisulfat, inhibitore ciklooksigenaze, uključujući nesteroidna antiinflamatorna sredstva (NSAID), kao aspirin i ibuprofen, kao i selektivne inhibitore ciklooksigenaze-2 kao celekoksib i rofekoksib (PNAS, 1992, 89:7384; JNCI, 1982, 69:475; Arch. Opthalmol., 1990, 108:573; Anat. Rec., 1994, 238:68; FEBS Letters, 1995, 372:83; Clin, Orthop., 1995, 313:76; J. Mol. Endocrinol., 1996, 16:07; Jpn. J. Pharmacol., 1997, 75:105; Cancer Res., 1997, 57:1625; Cell, 1998, 93:705; Intl. J. Mol. Med., 1998, 2:715; J. Biol. Chem., 1999.
274:9116), steroidna antiinflamatorna sredstva (kao što su kortikosteroidi, mineralokortikoidi, deksametazon, prednizon, prednizolon, metilpred, betametazon), karboksiamidotriazol, kombretastatin A-4, skvalamin, 6-O-hloroacetil-karbonil)-fumagilol, talidomid, angiostatin, troponin-1, antagoniste angiotenzina II (videti, Fernandez, et al., J. Lab. Clin. Med., 1985, 105:141-145), i antitela prema VEGF (videti, Nature Biotechnology, 1999, 17:963-968); Kim, et al., Nature, 1993, 362:841-844; WO 2000/44777; i WO 2000/61186).
[0125] Druga terapeutska sredstva koja modulišu ili inhibiraju angiogenezu i mogu takođe da se koriste u kombinaciji sa jedinjenjima predmetnog pronalaska, uključuju sredstva koja modulišu ili inhibiraju sisteme koagulacije i fibrinolize (videti, pregled u Clin. Chem. La. Med., 2000, 38:679-692). Primeri takvih sredstava koja modulišu ili inhibiraju puteve koagulacije i fibrinolize uključuju, ali nisu ograničeni na, heparin (videti, Thromb. Haemost., 1998, 80:10-23), heparine male molekulske težine i inhibitore karboksipeptidaze U (takođe poznate kao inhibitore aktivnog trombinom aktiviranog inhibitora fibrinolize [TAFIa]) (videti, Thrombosis Res., 2001, 101:329-354). TAFIa inhibitori su opisani u PCT međunarodnoj objavi WO 2003/013526. Izraz "sredstva koja interferiraju sa kontrolnim tačkama ćelijskog ciklusa" odnosi se na jedinjenja koja inhibiraju protein kinazu koja prenosi signale kontrolne tačke ćelijskog ciklusa, senzibilišući tako kancersku ćeliju na sredstva koja oštećuju DNK. Takva sredstva uključuju inhibitore ATR, ATM, i CHK1 kinaze i inhibitore cdk i cdc kinaze i specifično su predstavljena 7-hidroksi-staurosporinom, flavopiridolom, CYC202 (Cyclacel) i BMS-387032.
[0126] Izraz "sredstva koja interferiraju sa receptorskim tirozin kinazama (RTK)" odnosi se na jedinjenja koja inhibiraju RTK i na taj način mehanizme uključene u onkogenezu i napredovanje tumora. Takva sredstva uključuju inhibitore c-Kit, Eph, PDGF, Flt3 i c-Met.
Dodatna sredstva uključuju inhibitore RTK kao što je opisano kod Bume-Jensen and Hunter, Nature, 2001, 411:355-365.
[0127] Izraz "inhibitori ćelijske proliferacije i signalnog puta preživljavanja" odnosi se na jedinjenja koja inhibiraju signalne kaskade nishodno od receptora ćelijske površine. Takva sredstva uključuju inhibitore serin/treonin kinaza (uključujući inhibitore Akt kao što su oni opisani u WO 02/083064, WO 02/083139, WO 02/083140, US 2004-0116432, WO 02/083138, US 2004-0102360, WO 03/086404, WO 03/086279, WO 03/086394, WO 03/084473, WO 03/086403, WO 2004/041162, WO 2004/096131, WO 2004/096129, WO 2004/096135, WO 2004/096130, WO 2005/100356, WO 2005/100344, US 2005/029941, US 2005/44294, US 2005/43361, WO 2006/135627, WO 2006/091395, WO 2006/110638), inhibitore Raf kinaze (na primer BAY-43-9006), inhibitore MEK (na primer CI-1040 i PD-098059), inhibitore mTOR (na primer Wyeth CCI-779), i inhibitore PI3K (na primer LY294002).
[0128] Specifična anti-IGF-1R antitela uključuju, dalotuzumab, figitumumab, ciksutumumab, SHC 717454, Roche R1507, EM164 ili Amgen AMG479.
[0129] Kao što je gore opisano, kombinacije sa NSAID su usmerene na upotrebu NSAID koji su snažna sredstva za inhibiciju COX-2. U svrhu ove specifikacije NSAID je snažan ako poseduje IC50za inhibiciju COX-2 od 1µM ili manje, mereno ćelijskim ili mikrozomalnim testovima.
[0130] Pronalazak takođe obuhvata kombinacije sa NSAID koje su selektivni inhibitori za COX-2. U svrhu ove specifikacije NSAID koji su selektivni inhibitori za COX-2 se definišu kao oni koji poseduju specifičnost za inhibiciju COX-2 prema COX-1 od najmanje 100 puta mereno odnosom IC50za COX-2 prema IC50za COX-1 procenjeno ćelijskim ili mikrozomalnim testovima. Takva jedinjenja uključuju, ali nisu ograničena na, ona opisana u SAD patentu 5,474,995, SAD patentu 5,861,419, SAD patentu 6,001,843, SAD patentu 6,020,343, SAD patentu 5,409,944, SAD patentu 5,436,265, SAD patentu 5,536,752, SAD patentu 5,550,142, SAD patentu 5,604,260, SAD patentu 5,698,584, SAD patentu 5,710,140, WO 94/15932, SAD patentu 5,344,991, SAD patentu 5,134,142, SAD patentu 5,380,738, SAD patentu 5,393,790, SAD patentu 5,466,823, SAD patentu 5,633,272 i SAD patentu 5,932,598.
4
[0131] Inhibitori COX-2 koji su posebno korisni u predmetnom postupku za lečenje su: 3-fenil-4-(4-(metilsulfonil)fenil)-2-(5H)-furanon; i 5-hloro-3-(4-metilsulfonil) fenil-2-(2-metil-5-piridinil)piridin, ili njihova farmaceutski prihvatljiva so.
[0132] Jedinjenja koja su opisana kao specifični inhibitori COX-2 i kao takva su korisna u predmetnom pronalasku uključuju, sledeće: parekoksib, BEXTRA® i CELEBREX® ili njihovu farmaceutski prihvatljivu so.
[0133] Drugi primeri inhibitora angiogeneze uključuju, endostatin, ukrain, ranpirnazu, IM862, 5-metoksi-4-[2-metil-3-(3-metil-2-butenil)oksiranil]-1-oksaspiro[2,5]okt-6-il(hloroacetil)karbamat, acetildinanalin, 5-amino-1-[[3,5-dihloro-4-(4-hlorobenzoil)fenil]metil]-1H-1,2,3-triazol-4-karboksamid, CM101, skvalamin, kombretastatin, RPI4610, NX31838, sulfatirani manopentaoza fosfat, 7,7-(karbonilbis[imino-N-metil-4,2-pirolokarbonilimino[N-metil-4,2-pirol]-karbonilimino]-bis-(1,3-naftalen disulfonat), i 3-[(2,4-dimetilpirol-5-il)metilen]-2-indolinon (SU5416).
[0134] Kako se gore koristi, "blokatori integrina" odnosi se na jedinjenja koja selektivno antagonizuju, inhibiraju ili sprečavaju vezivanje fiziološkog liganda za αvβ3integrin, na jedinjenja koja selektivno antagonizuju, inhibiraju ili sprečavaju vezivanje fiziološkog liganda za αvβ5integrin, na jedinjenja koja antagonizuju, inhibiraju ili sprečavaju vezivanje fiziološkog liganda i za αvβ3integrin i za αvβ5integrin, i na jedinjenja koja antagonizuju, inhibiraju ili sprečavaju aktivnost određenog(ih) integrina eksprimiranu na kapilarnim endotelijalnim ćelijama. Termin se takođe odnosi na antagoniste αvβ6, αvβ8, α1β1, α2β1, α5β1, α6β1, i α6β4integrina. Termin se takođe odnosi na antagoniste bilo koje kombinacije αvβ3, αvβ5, αvβ6, αvβ8, α1β1, α2β1, α5β1, α6β1, i α6β4integrina.
[0135] Neki specifični primeri inhibitora tirozin kinaze uključuju N-(trifluorometilfenil)-5-metilizoksazol-4-karboksamid, 3-[(2,4-dimetilpirol-5-il)metilidenil)indolin-2-on, 17-(alilamino)-17-demetoksigeldanamicin, 4-(3-hloro-4-fluorofenilamino)-7-metoksi-6-[3-(4-morfolinil)propoksil]kvinazolin, N-(3-etinilfenil)-6,7-bis(2-metoksietoksi)-4-kvinazolinamin, BIBX1382, 2,3,9,10,11,12-heksahidro-10-(hidroksimetil)-10-hidroksi-9-metil-9,12-epoksi-1H-diindolo[1,2,3-fg:3',2',1'-kl]pirolo[3,4-i][1,6]benzodiazocin-1-on, SH268, genistein, STI571, CEP2563, 4-(3-hlorofenilamino)-5,6-dimetil-7H-pirolo[2,3-d]pirimidinmetan sulfonat, 4-(3-bromo-4-hidroksifenil)amino-6,7-dimetoksikvinazolin, 4-(4'-hidroksifenil)amino-6,7-dimetoksikvinazolin, SU6668, STI571A, N-4-hlorofenil-4-(4-piridilmetil)-1-ftalazinamin i EMD121974.
[0136] Kombinacije sa jedinjenjima koja nisu antikancerska jedinjenja su takođe obuhvaćene predmetnim postupcima. Na primer, kombinovanje kombinacije inhibitora mTOR i antagonista αvβ3integrina predmetnog pronalaska sa agonistima PPAR-γ (tj., PPAR-gama) i agonistima PPAR-δ (tj., PPAR-delta) je korisno u lečenju određenih malingniteta. PPAR-γ i PPAR-δ su nuklearni receptori aktivirani proliferatorima peroksizoma γ i δ. Ekspresija PPAR-γ na endotelijalnim ćelijama i njegova umešanost u angiogenezu je opisana u literaturi (videti, J. Cardiovasc. Pharmacol., 1998, 31:909-913; J. Biol. Chem., 1999, 274:9116-9121; Invest. Ophthalmol Vis. Sci., 2000, 41:2309-2317). Nedavno, pokazano je da agonisti PPAR-γ inhibiraju angiogeni odgovor na VEGF in vitro; troglitazon i rosiglitazon maleat inhibiraju razvoj retinalne neovaskularizacije kod miševa (Arch. Ophthamol., 2001; 119:709-717). Primeri agonista PPAR-γ i agonista PPAR- y/a uključuju, tiazolidindione (kao što su DRF2725, CS-011, troglitazon, rosiglitazon, i pioglitazon), fenofibrat, gemfibrozil, klofibrat, GW2570, SB219994, AR-H039242, JTT-501, MCC-555, GW2331, GW409544, NN2344, KRP297, NP0110, DRF4158, NN622, GI262570, PNU182716, DRF552926, 2-[(5,7-dipropil-3-trifluorometil-1,2-benzizoksazol-6-il)oksi]-2-metilpropionsku kiselinu (opisanu u USSN 09/782,856) i 2(R)-7-(3-(2-hloro-4-(4-fluorofenoksi) fenoksi)propoksi)-2-etilhroman-2-karboksilnu kiselinu (opisanu u USSN 60/235,708 i 60/244,697).
[0137] Drugi primer izvođenja predmetnog pronalaska je upotreba trenutno opisanih jedinjenja u kombinaciju sa genskom terapijom za lečenje kancera. Za pregled genetičkih strategija za lečenje kancera, videti, Hall, et al., Am. J. Hum. Genet., 1997, 61:785-789 i Kufe, et al., Cancer Medicine, 5th Ed,, B.C. Decker, Hamilton, 2000, pp 876-889. Genska terapija može da se koristi za dostavu bilo kog tumor supresivnog gena. Primeri takvih gena uključuju, p53, koji može da se dostavi putem rekombinantnog genskog transfera posredovanog virusom (videti, SAD patent br. 6,069,134), antagonist uPA/uPAR (Gene Therapy, 1998, 5(8):1105-13), i interferon gama (J. Immunol., 2000, 164:217-222).
[0138] Jedinjenja predmetnog pronalaska mogu takođe da se primene u kombinaciji sa inhibitorom inherentne višestruke rezistencije (MDR), posebno MDR povezane sa visokim nivoima ekspresije proteina transportera. Takvi inhibitori MDR uključuju inhibitore pglikoproteina (P-gp), kao što su LY335979, XR9576, OC144-093, R101922, VX853 i PSC833 (valspodar).
[0139] Jedinjenje predmetnog pronalaska može da se koristi zajedno sa antiemeticima za lečenje mučnine ili povraćanja, uključujući akutno, odloženo, kasno-fazno, i predviđeno povraćanje, koje može da bude rezultat upotrebe jedinjenja predmetnog pronalaska, samog ili sa zračnom terapijom. Za prevenciju ili lečenje povraćanja, jedinjenje predmetnog pronalaska može da se koristi zajedno sa drugim antiemetičkim sredstvima, naročito antagonistima neurokinin-1 receptora, antagonistima 5HT3 receptora, kao što su ondansetron, granisetron, tropisetron, i zatisetron, agonistima GABAB receptora, kao što su baklofen, kortikosteroidom kao što je Decadron (deksametazon), Kenalog, Aristocort, Nasalide, Preferid, Benecorten ili drugi kao što je opisano u SAD patent br. 2,789,118, 2,990,401, 3,048,581, 3,126,375, 3,929,768, 3,996,359, 3,928,326 i 3,749,712, antidopaminergici, kao što su fenotiazini (na primer, prohlorperazin, flufenazin, tioridazin i mezoridazin), metoklopramid ili dronabinol. U drugom primeru izvođenja, vezana terapija sa antiemezičkim sredstvom odabranim od antagonista neurokinin-1 receptora, antagonista 5HT3 receptora i kortikosteroida je opisana za lečenje ili prevenciju povraćanja koje može da rezultira iz primene predmetnih jedinjenja.
[0140] Antagonisti receptora za neurokinin-1 za upotrebu zajedno sa jedinjenjima predmetnog pronalaska su u potpunosti opisani, na primer, u SAD patentima br. 5,162,339, 5,232,929, 5,242,930, 5,373,003, 5,387,595, 5,459,270, 5,494,926, 5,496,833, 5,637,699, 5,719,147; evropskim patentnim objavama br. EP 0360 390, 0 394 989, 0 428 434, 0 429 366, 0 430 771, 0 436 334, 0 443 132, 0 482 539, 0 498 069, 0 499 313, 0512 901, 0512 902, 0 514 273, 0 514 274, 0 514 275, 0 514 276, 0 515 681, 0 517 589, 0520 555, 0522 808, 0 528 495, 0 532 456, 0 533 280, 0 536 817, 0 545 478, 0 558 156, 0 577 394, 0 585 913, 0 590 152, 0 599 538, 0 610 793, 0 634 402, 0 686 629, 0 693 489, 0 694 535, 0 699 655, 0699 674, 0707 006, 0708 101, 0709 375, 0709 376, 0714 891, 0723 959, 0733 632 i 0 776 893; PCT međunarodnim patentnim objavama br. WO 90/05525, 90/05729, 91/09844, 91/18899, 92/01688, 92/06079, 92/12151, 92/15585, 92/17449, 92/20661, 92/20676, 92/21677, 92/22569, 93/00330, 93/00331, 93/01159, 93/01165, 93/01169, 93/01170, 93/06099, 93/09116, 93/10073, 93/14084, 93/14113, 93/18023, 93/19064, 93/21155, 93/21181, 93/23380, 93/24465, 94/00440, 94/01402, 94/02461, 94/02595, 94/03429, 94/03445, 94/04494, 94/04496, 94/05625, 94/07843, 94/08997, 94/10165, 94/10167, 94/10168, 94/10170, 94/11368, 94/13639, 94/13663, 94/14767, 94/15903, 94/19320, 94/19323, 94/20500, 94/26735, 94/26740, 94/29309, 95/02595, 95/04040, 95/04042, 95/06645, 95/07886, 95/07908, 95/08549, 95/11880, 95/14017, 95/15311, 95/16679, 95/17382, 95/18124, 95/18129, 95/19344, 95/20575, 95/21819, 95/22525, 95/23798, 95/26338, 95/28418, 95/30674, 95/30687, 95/33744, 96/05181, 96/05193, 96/05203, 96/06094, 96/07649, 96/10562, 96/16939, 96/18643, 96/20197, 96/21661,
4
96/29304, 96/29317, 96/29326, 96/29328, 96/31214, 96/32385, 96/37489, 97/01553, 97/01554, 97/03066, 97/08144, 97/14671, 97/17362, 97/18206, 97/19084, 97/19942 i 97/21702; i u britanskim patentnim objavama br.2 266 529, 2268 931, 2269 170, 2269 590, 2 271 774, 2292 144, 2 293 168, 2 293 169, i 2 302 689. Preparat od takvih jedinjenja je u potpunosti opisan u gore pomenutim patentima i objavama.
[0141] U jednom primeru izvođenja, antagonist receptora za neurokinin-1 za upotrebu zajedno sa jedinjenjima predmetnog pronalaska je odabran od: 2-(R)-(1-(R)-(3,5-bis (trifluorometil)fenil)etoksi)-3-(S)-(4-fluorofenil)-4-(3-(5-okso-1H,4H-1,2,4-triazolo) metil) morfolina, ili njegove farmaceutski prihvatljive soli, što je opisano u SAD patentu br.
5,719,147.
[0142] Inhibitor WEE1 predmetnog pronalaska može takođe da se primeni sa sredstvom korisnim u lečenju anemije. Takvo sredstvo za lečenje anemije je, na primer, kontinuirani aktivator receptora eritropoeze (kao što je Epoetin alfa).
[0143] Inhibitor WEE1 predmetnog pronalaska može takođe da se primeni sa sredstvom korisnim u lečenju neutropenije. Takvo sredstvo za lečenje neutropenije je, na primer, hematopoetski faktor rasta koji reguliše proizvodnju i funkciju neutrofila kao što je humani faktor stimulacije kolonija granulocita, (G-CSF). Primeri G-CSF uključuju filgrastim.
[0144] Inhibitor WEE1 predmetnog pronalaska može da se primeni sa lekom za poboljšanje imuniteta, kao što su levamizol, izoprinozin i Zadaxin.
[0145] Inhibitor WEE1 predmetnog pronalaska može takođe da bude koristan za lečenje ili prevenciju kancera, uključujući kancer kosti, u kombinaciji sa bisfosfonatima (podrazumevano uključuju bisfosfonate, difosfonate, bisfosfonske kiseline i difosfonske kiseline). Primeri bisfosfonata uključuju, ali nisu ograničeni na: etidronat (Didronel), pamidronat (Aredia), alendronat (Fosamax), rizedronat (Actonel), zoledronat (Zometa), ibandronat (Boniva), inkadronat ili cimadronat, klodronat, EB-1053, minodronat, neridronat, piridronat i tiludronat uključujući bilo koju i sve farmaceutski prihvatljive soli, derivate, hidrate i njihove smeše.
[0146] Inhibitor WEE1 predmetnog pronalaska može takođe da bude koristan za lečenje ili prevenciju kancera dojke u kombinaciji sa inhibitorima aromataze. Primeri inhibitora aromataze uključuju, ali nisu ograničeni na: anastrozol, letrozol i eksemestan.
[0147] Inhibitor WEE1 predmetnog pronalaska može takođe da bude koristan za lečenje ili prevenciju kancera u kombinaciji sa terapeuticima na bazi siRNK.
[0148] Inhibitor WEE1 predmetnog pronalaska može takođe da se primeni u kombinaciji sa inhibitorima γ-sekretaze i/ili inhibitorima signalnog puta NOTCH. Takvi inhibitori uključuju jedinjenja opisana u WO 01/90084, WO 02/30912, WO 01/70677, WO 03/013506, WO 02/36555, WO 03/093252, WO 03/093264, WO 03/093251, WO 03/093253, WO 2004/039800, WO 2004/039370, WO 2005/030731, WO 2005/014553, USSN 10/957,251, WO 2004/089911, WO 02/081435, WO 02/081433, WO 03/018543, WO 2004/031137, WO 2004/031139, WO 2004/031138, WO 2004/101538, WO 2004/101539 i WO 02/47671 (uključujući LY-450139).
[0149] Inhibitor WEE1 predmetnog pronalaska može takođe da bude koristan za lečenje ili prevenciju kancera u kombinaciji sa inhibitorima Akt. Takvi inhibitori uključuju jedinjenja opisana u sledećim objavama: WO 02/083064, WO 02/083139, WO 02/083140, US 2004-0116432, WO 02/083138, US 2004-0102360, WO 03/086404, WO 03/086279, WO 03/086394, WO 03/084473, WO 03/086403, WO 2004/041162, WO 2004/096131, WO 2004/096129, WO 2004/096135, WO 2004/096130, WO 2005/100356, WO 2005/100344, US 2005/029941, US 2005/44294, US 2005/43361, WO 2006/135627, WO 2006091395, WO 2006/110638 ).
[0150] Inhibitor WEE1 predmetnog pronalaska može takođe da bude koristan za lečenje ili prevenciju kancera u kombinaciji sa inhibitorima PARP.
[0151] Zračna terapija sama po sebi predstavlja uobičajeni metod u oblasti lečenja kancera. Za zračnu terapiju, mogu se koristiti različita zračenja kao što su X-zraci, γ-zraci, neutronski zraci, elektronski snop, protonski snop; i izvori zračenja. U najuobičajenijoj zračnoj terapiji, koristi se linearni akcelerator za zračenje spoljnim zračenjem, γ-zracima.
[0152] Inhibitor WEE1 predmetnog pronalaska može takođe da bude koristan za lečenje kancera u dodatnim kombinacijama sa terapeutskim sredstvima koja su navedena u nastavku: abareliks (Plenaxis depot®); abirateron acetat (Zytiga®); (Actiq®); aldesleukin (Prokine®); Aldesleukin (Proleukin®); Alemtuzumab (Campath®); alfuzosin HCl (UroXatral®); alitretinoin (Panretin®); alopurinol (Zyloprim®); altretamin (Hexalen®); amifostin (Ethyol®); anastrozol (Arimidex®); (Anzemet®); (Anexsia®); aprepitant (Emend®); arsenik trioksid (Trisenox®); asparaginaza (Elspar®); azacitidin (Vidaza®); bendamustin hidrohlorid
4
(Treanda®); bevacuzimab (Avastin®); beksaroten kapsule (Targretin®); beksaroten gel (Targretin®); bleomicin (Blenoxane®); bortezomib (Velcade®); (Brofenac®); busulfan intravenski (Busulflex®); busulfan oralni (Myleran®); kabazitaksel (Jevtana®); kalusteron (Methosarb®); kapecitabin (Xeloda®); karboplatin (Paraplatin®); karmustin (BCNU®, BiCNU®); karmustin (Gliadel®); karmustin sa Polifeprosan 20 Implantom (Gliadel Wafer®); celekoksib (Celebrex®); cetuksimab (Erbitux®); hlorambucil (Leukeran®); cinakalcet (Sensipar®); cisplatin (Platinol®); kladribin (Leustatin®, 2-CdA®); klofarabin (Clolar®); ciklofosfamid (Cytoxan®, Neosar®); ciklofosfamid (Cytoxan Injekcija®); ciklofosfamid (Cytoxan Tablet®); citarabin (Cytosar-U®); citarabin lipozomalni (DepoCyt®); dakarbazin (DTIC-Dome®); daktinomicin, aktinomicin D (Cosmegen®); Darbepoetin alfa (Aranesp®); dasatinib (Sprycel®); daunorubicin lipozomalni (DanuoXome®); daunorubicin, daunomicin (Daunorubicin®); daunorubicin, daunomicin (Cerubidine®); decitabin (Dacogen®); degareliks (Degarelix®); Denileukin diftitoks (Ontak®); denosumab (Xgeva®); deksrazoksan (Zinecard®); docetaksel (Taxotere®); doksorubicin (Adriamycin PFS®); doksorubicin (Adriamycin®, Rubex®); doksorubicin (Adriamycin PFS Injection®); doksorubicin lipozomalni (Doxil®); dromostanolon propionat (dromostanolone®); dromostanolon propionat (masterone injection®); Elliott-ov B rastvor (Elliott's B Solution®); epirubicin (Ellence®); Epoetin alfa (epogen®); eribulin mezilat (Halaven®); erlotinib (Tarceva®); estramustin (Emcyt®); etopozid fosfat (Etopophos®); etopozid, VP-16 (Vepesid®); everolimus (Afinitor®); eksemestan (Aromasin®); fentanil bukalni (Onsolis®); fentanil citrat (Fentora®); fentanil sublingualne tablete (Abstral®); Filgrastim (Neupogen®); floksuridin (intraarterial) (FUDR®); fludarabin (Fludara®); fluorouracil, 5-FU (Adrucil®); flutamid (Eulexin®); fulvestrant (Faslodex®); gefitinib (Iressa®); gemcitabin (Gemzar®); gemtuzumab ozogamicin (Mylotarg®); goserelin acetat (Zoladex Implant®); goserelin acetat (Zoladex®); granisetron (Kytril Solution®) (Sancuso®); histrelin acetat (Histrelin implant®); bivalentna vakcina protiv humanog papilomavirusa (Cervarix®); hidroksiurea (Hydrea®); Ibritumomab Tiuksetan (Zevalin®); idarubicin (Idamycin®); ifosfamid (IFEX®); imatinib mezilat (Gleevec®); interferon alfa 2a (Roferon A®); Interferon alfa-2b (Intron A®); ipilimumab (Yervoy®); irinotekan (Camptosar®); (Kadian®); iksabepilon (Ixempra®); lapatinib (Tykerb®); lenalidomid (Revlimid®); letrozol (Femara®); leukovorin (Wellcovorin®, Leucovorin®); Leuprolid Acetat (Eligard®); (Lupron Depot®); (Viadur®); levamizol (Ergamisol®); levoleukovorin (Fusilev®); lomustin, CCNU (CeeBU®); mekloretamin, azotni iperit (Mustargen®); megestrol acetat (Megace®); melfalan, L-PAM (Alkeran®); merkaptopurin, 6-MP
4
(Purinethol®); mesna (Mesnex®); mesna (Mesnex tabs®); metotreksat (Methotrexate®); metokssalen (Uvadex®); mitomicin C (Mutamycin®); mitomicin C (Mitozytrex®); mitotan (Lysodren®); mitoksantron (Novantrone®); nandrolon fenpropionat (Durabolin-50®); nelarabin (Arranon®); nilotinib hidrohlorid monohidrat (Tasigna®); Nofetumomab (Verluma®); ofatumumab (Arzerra®); ondansetron (Zuplenz®); Oprelvekin (Neumega®); (Neupogen®); oksaliplatin (Eloxatin®); paklitaksel (Paxene®); paklitaksel (Taxol®); paklitaksel čestice vezane za protein (Abraxane®); palifermin (Kepivance®); palonozetron (Aloxi®); pamidronat (Aredia®); panitumumab (Vectibix®); pazopanib (Votrient®); pegademaza (Adagen (Pegademase Bovine)®); pegaspargaza (Oncaspar®); Pegfilgrastim (Neulasta®); peginterferon alfa-2B (Sylatron®); pemetreksed dinatrijum (Alimta®); pentostatin (Nipent®); pipobroman (Vercyte®); pleriksafor injekcija (Mozobil®); plikamicin, mitramicin (Mithracin®); porfimer natrijum (Photofrin®); pralatreksat injekcija (Folotyn®); prokarbazin (Matulane®); (Quadramet®); kvadrivalentna rekombinantna vakcina protiv humanog papilomavirusa (tipovi 6, 11, 16, 18) (Gardasil®); kvinakrin (Atabrine®); raloksifen hidrohlorid (Evista®); Rasburikaza (Elitek®); Rituksimab (Rituxan®); romidepsin (Istodax®); sargramostim (Leukine®); Sargramostim (Prokine®); sekretin (SecreFlo®); sipuleucel-T (Provenge®); sorafenib (Nexavar®); streptozocin (Zanosar®); sunitinib maleat (Sutent®); talk (Sclerosol®); tamoksifen (Nolvadex®); temozolomid (Temodar®); temsirolimus (Torisel®); tenipozid, VM-26 (Vumon®); (Temodar®); testolakton (Teslac®); talidomid (Thalomid®); tioguanin, 6-TG (Thioguanine®); tiotepa (Thioplex®); topotekan (Hycamtin®); toremifen (Fareston®); Tositumomab (Bexxar®); Tositumomab/I-131 tositumomab (Bexxar®); Trastuzumab (Herceptin®); (Trelstar LA®); tretinoin, ATRA (Vesanoid®); triptorelin pamoat (Trelstar Depot®); (UltraJect®); Uracil Iperit (Uracil Mustard Capsules®); valrubicin (Valstar®); vandetanib (Vandetanib®); vinblastin (Velban®); vinkristin (Oncovin®); vinorelbin (Navelbine®); vorinostat (Zolinza®); (Zofran ODT®); i zoledronat (Zometa®).
PRIMERI
Primer 1
Priprema WEE1-1
[0153]
4
Proizvodnja 2-alil-1-[6-(1-hidroksi-1-metiletil)piridin-2-il]-6-{[4-(4-metilpiperazin-1-il)fenil]amino}-1,2-dihidro-3H-pirazolo[3,4-d]pirimidi-3-ona
Korak 1) Proizvodnja 2-(6-bromo-2-piridinil)-2-propanola:
[0154] U atmosferi azota, dodato je 30 mL 3 M metilmagnezijum jodida/dietil etra u 300 mL rastvora 8.72 g metil 6-bromopiridin-2-karboksilata u dietil etru. Voda i 2 N hlorovodonična kiselina su dodate reakcionoj tečnosti, i urađena je ekstrakcija sa etil acetatom. Ovo je oprano zasićenim vodenim rastvorom natrijum hidrogenkarbonata i zasićenim slanim vodenim rastvorom, i osušeno anhidrovanim magnezijum sulfatom. Rastvarač je isparen pod sniženim pritiskom da bi se dobio sirovi 2-(6-bromo-2-piridinil)-2-propanol kao žuta uljasta supstanca.
1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 7.56 (1H, t, J=7.8 Hz), 7.38 (1H, dd, J=7.8, 1.0 Hz), 7.36 (1H, dd, J=7.8, 1.0 Hz), 1.55(6H, s). ESI-MS zabeleženo: m/z[M+H]+ 216, 218.
Korak 2) Proizvodnja 2-alil-1-[6-(1-hidroksi-1-metiletil)-2-piridinil]-6-(metiltio)-1,2-dihidro-3H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-3-ona:
[0155] Jedinjenje iz naslova je dobijeno na isti način kao u preparativnom primeru 1-1, za šta je, međutim, jedinjenje dobijeno u gore opisanoj reakciji korišćeno umesto 2-jodopiridina korišćenog u preparativnom primeru 1-1.<1>H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 8.95 (1H, s), 7.91 (1H, t, J=8.0 Hz), 7.76 (1H, d, J=7.3 Hz), 7.40 (1H, dd, J=7.8, 1.0 Hz), 5.70 (1H, ddt, J=17.1, 10.2, 6.3 Hz), 5.06 (1H, dd, J=10.2, 1.0 Hz), 4.93 (1H, dd, J=17.1, 1.2 Hz), 4.81 (2H, d, J=6.3 Hz), 2.59 (4H, s), 1.59 (6H, s). ESI-MS zabeleženo: m/z[M+H]+ :358.
Korak 3) Proizvodnja 2-alil-1-[6-(1-hidroksi-1-metiletil)piridin-2-il]-6-{[4-(4-metilpiperazin-1-il)fenil]amino}-1,2-dihidro-3H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-3-ona:
[0156] 817 mg m-hloroperbenzojeve kiseline (> 65%) dodato je toluenskom (20 mL) rastvoru 1.10 g gore navedenog proizvoda, i mešano 20 minuta. Reakcionoj tečnosti je dodato 1.61 mL N,N-diizopropiletilamina i 706 mg 4-(4-metilpiperazin-1-il)anilina, i mešano preko
4
noći. Reakcionoj tečnosti je dodat zasićeni vodeni rastvor natrijum hidrogenkarbonata, ekstrahovana je etil acetatom, oprana zasićenim slanim vodenim rastvorom, i osušena anhidrovanom magnezijum sulfatom. Rastvarač je isparen, i ostatak prečišćen pomoću hromatografije na koloni baznog silika gela (heksan/etil acetat = 1/1 do 0/1, etil acetat/etanol = 98/2). Nakon koncentrovanja, urađena je rekristalizacija iz etil acetata da bi se dobilo naslovno jedinjenje kao kao čvrsta supstanca žute boje.<1>H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 8.83 (1H, s), 7.86 (1H, dd, J=8.0, 7.8 Hz), 7.75 (1H, d, J=7.3 Hz), 7.49 (1H, brs), 7.48 (2H, d, J=9.0 Hz), 7.34 (1H, d, J=7.4 Hz), 6.93 (2H, d, J=9.0 Hz), 5.70 (1H, ddt, J=17.2, 10.0, 6.5 Hz), 5.04 (1H, d, J=10.0 Hz), 4.94 (1H, d, J=17.2 Hz), 4.74 (2H, d, J=6.5 Hz), 3.26 (4H, t, J=4.8 Hz), 2.73 (4H, brs), 2.44 (3H, s), 1.59 (6H, s). ESI-MS zabeleženo: m/z[M+H]+ 501.
Preparativni primer 1-1
Proizvodnja 2-alil-6-(metiltio)-1-piridin-2-il-3H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-3-ona:
[0157] 2.4 mL N,N'-dimetiletilendiamina je dodato rastvoru 4.44 g 2-alil-6-(metiltio)-1,2-dihidro-3H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-3-ona, 3.80 g bakar(I) jodida, 5.33 g 2-jodopiridina i 3.80 g kalijum karbonata u 1,4-dioksanu (50 mL), i mešano preko noći na 95°C. Reakciona tečnost je ohlađena, dodat joj je vodeni amonijak i ekstrahovana je etil acetatom, oprana zasićenim slanim vodenim rastvorom, i osušena anhidrovanom magnezijum sulfatom. Rastvarač je isparen pod sniženim pritiskom, i izvedena je kristalizacija sa etil acetatom da bi se dobilo naslovno jedinjenje kao bela čvrsta supstanca.<1>H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 8.94 (1H, s), 8.52 (1H, d, J=5.1 Hz), 7.90 (2H, d, J=3.5 Hz), 7.29-7.25 (1H, m), 5.68 (1H, ddt, J=17.0, 10.2, 6.3 Hz), 5.05 (1H, d, J=10.2 Hz), 4.91 (1H, d, J=17.0 Hz), 4.85 (1H, d, J=6.3 Hz), 2.58 (3H, s).
Primer 2
Priprema WEE 1-2
[0158]
4
Proizvodnja 3-(2,6-dihlorofenil)-4-imino-7-[(2'-metil-2',3'-dihidro-1'H-spiro [ciklopropan-1,4'-izokvinolin]-7'-il)amino]-3,4-dihidropirimido[4,5-d]pirimidin-2(1H)-ona
[0159] Rastvor 1.5 g 7-hloro-3-(2,6-dihlorofenil)-4-imino-3,4-dihidropirimido[4,5-d]pirimidin-2(1H)-ona dobijenog u preparativnom primeru 2-1 u 1-butanolu, 1 g 2'-metil-2',3'-dihidro-1'H-spiro[ciklopropan-1,4'-izokvinolin]-7'-amina dobijenog u preparativnom primeru 2-2, i 0.83 g monohidrata p-toluen sulfonske kiseline je mešano na 90°C tokom 15 minuta. Reakciona tečnost je ohlađena, razblažena hloroformom, i organski sloj je opran zasićenim vodenim rastvorom natrijum bikarbonata i zatim zasićenim slanim vodenim rastvorom, i osušen anhidrovanom magnezijum sulfatom, filtriran, i rastvarač je isparen. Tako dobijeni, grubo prečišćeni proizvod je prečišćen pomoću hromatografije na koloni baznog silika gela da bi se dobio 3-(2,6-dihlorofenil)-4-imino-7-[(2'-metil-2',3'-dihidro-1'H-spiro[ciklopropan-1,4'-izokvinolin]-7'-il)amino]-3,4-dihidropirimido[4,5-d]pirimidin-2(1H)-on. Ovo je rastvoreno u mešanom rastvaraču hloroform/metanol, i tome je dodat 1.5 ekvivalent vodenog rastvora hlorovodonične kiseline, i smeša je mešana na sobonj temperaturi 5 minuta. Zatim, rastvarač je isparen, i ostatak je opran etil acetatom da bi se dobio 3-(2,6-dihlorofenil)-4-imino-7-[(2'-metil-2',3'-dihidro-1'H-spiro[ciklopropan-1,4'-izokvinolin]-7'-il)amino]-3,4-dihidropirimido[4,5-d]pirimidin-2(1H)-on dihidrohlorid kao čvrsta žuta supstanca.<1>H-NMR(400MHz, DMSO-d6)δ:11.83(1H,brs), 10.05 (1H, brs), 9.10 (1H, s), 8.88 (1H, s), 7.79-7.68 (1H, m), 7.63-7.59 (2H, m), 7.47 (1H, t, J=8.2 Hz), 7.38 (1H, d, J=8.3 Hz), 6.63 (1H, d, J=8.5 Hz), 3.59 (2H, s), 2.44 (2H, s), 2.32 (3H, s), 0.90-0.81 (4H, m) ESI-MS zabeleženo: m/z [M+H]<+>494
Preparativni primer 2-1
[0160]
Proizvodnja 7-hloro-3-(2,6-dihlorofenil)-4-imino-3,4-dihidropirimido[4,5-d]pirimidin-2(1H)-ona
[0161] 1.12 g natrijum hidrida je dodato rastvoru 3.0 g 4-amino-2-hloropirimidin-5-karbonitrila u N,N-dimetilformamidu (35 mL), i mešano na sobnoj temperaturi tokom 5 minuta. 4.38 g 2,6-dihlorofenil izocijanata je dodato reakcionoj tečnosti, i mešano na sobnoj temperaturi 1 čas. Etil acetat i 1 N vodeni rastvor hlorovodonične kiseline su dodati reakcionom rastvoru, i organski sloj je izdvojen. Ovo je oprano zasićenim slanim vodenim rastvorom, osušeno anhidrovanim magnezijum sulfatom, i rastvarač je isparen. Staloženi čvrsti ostatak je očvrsnut mešanim rastvaračem metanol/etil acetat i odbačen pomoću filtracije da bi se dobilo naslovno jedinjenje kao bela čvrsta supstanca.<1>H-NMR(400 MHz, DMSO-d6) δ: 9. (1H, s), 7.66 (2H, d, J=8.2 Hz), 7.53 (1H, t, J=8.2 Hz) ESI-MS zabeleženo: m/z [M+H] 342
Preparativni primer 2-2
Proizvodnja 2'-metil-2',3'-dihidro-1'H-spiro[ciklopropan-1,4'-izokvinolin]-7'-amina
[0162]
Korak 1) Proizvodnja metil 1-(2-cijanofenil)ciklopropankarboksilata:
[0163] 1.5 g tetra-n-butilamonijum bromida, 6.5 g 1,2-dibromoetana i 20 mL 50% vodenog rastvora natrijum hidroksida je dodato toluenskom (40 mL) rastvoru 4.0 g metil 2-cijanofenilacetata, i mešano na sobnoj temperaturi 1 čas. Reakcionoj tečnosti je dodata voda, i ekstrahovana je etil acetatom. Organski sloj je opran slanim vodenim rastvorom, osušen anhidrovanim magnezijum sulfatom, i rastvarač je isparen pod sniženim pritiskom. Sirovi proizvod je prečišćen pomoću hromatografije na koloni silika gela (heksan/etil acetat) da bi se dobilo naslovno jedinjenje u vidu bezbojnog jedinjenja. 1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 7.66 (1H, dd, J=7.6, 1.2 Hz), 7.55 (1H, td, J=7.6, 1.2 Hz), 7.43-7.36 (2H, m), 3.66 (3H, s), 1.82 (2H, q, J=3.7 Hz), 1.30 (2H, q, J=3.7 Hz) ESI-MS zabeleženo: m/z [M+H] 202
1
Korak 2) Proizvodnja metil 1-[2-(aminometil)fenil]ciklopropankarboksilat monohidrohlorida:
[0164] 1.6 g 10% paladijum-ugljenika dodato je rastvoru 2.95 g jedinjenja dobijenog u gore prikazanoj reakciji koraka 1) u etanolu (50 mL), i mešano u atmosferi vodonika pod pritiskom od 2 atmosfere, na sobnoj temperaturi 3 časa. Paladijum-ugljenik je uklonjen filtracijom, filtrat je koncentrovan pod sniženim pritiskom, i sirovi proizvod je opran dietil etrom da bi se dobilo naslovno jedinjenje kao čvrsta bezbojna supstanca.<1>H-NMR (DMSO-d6) δ: 8.47 (2H, s), 7.55 (1H, d, J=6.8 Hz), 7.38 (3H, td, J=7.2, 2.1 Hz), 7.36-7.29 (2H, m), 4.04 (2H, d, J=4.9 Hz), 3.54 (3H, s), 1.61-1.56 (2H, m), 1.33-1.29 (2H, m) ESI-MS zabeleženo: m/z [M+H] 206
Korak 3) Proizvodnja 1',2'-dihidro-3'H-spiro[ciklopropan-1,4'-izokvinolin]-3'-ona:
[0165] 4 mL 5 N vodenog rastvora natrijum hidroksida je dodato rastvoru 3.2 g jedinjenja dobijenog u gore prikazanoj reakciji koraka 2) u metanolu (50 mL), i mešano na sobnoj temperaturi 30 minuta. Ovo je neutralisano dodatkom 1 N vodenog rastvora hlorovodonične kiseline, i metanol je isparen pod sniženim pritiskom. Ostatak je razblažen vodom, i ekstrahovan tri puta etil acetatom. Organski sloj je opran slanim vodenim rastvorom, osušen anhidrovanim magnezijum sulfatom, i rastvarač je isparen pod sniženim pritiskom da bi se dobilo naslovno jedinjenje kao bezbojna čvrsta supstanca.<1>H-NMR (CDCl3) δ: 7.23 (1H, td, J=7.8, 1.1 Hz), 7.18 (1H, td, J=7.3, 1.1 Hz), 7.10 (1H, dd, J=7.3, 1.0 Hz), 6.73 (1H, dd, J=7.8, 1.0 Hz), 4.69 (2H, d, J=1.5 Hz), 1.85 (2H, q, J=3.7 Hz), 1.24 (2H, q, J=3.7 Hz) ESI-MS zabeleženo: m/z [M+H] 174
Korak 4) Proizvodnja 7'-nitro-1',2'-dihidro-3'H-spiro[ciklopropan-1,4'-izokvinolin]-3'-ona:
[0166] 1.3 g kalijum nitrata je postepeno dodato rastvoru 2.1 g jedinjenja dobijenog u gore prikazanoj reakciji koraka 3) u sumpornoj kiselini (60 mL), tokom 5 minuta, i dalje mešano
2
na sobnoj temperaturi 10 minuta. Reakciona tečnost je sipana u ledenu vodu, staloženi kristal je izdvojen filtracijom, i opran vodom da bi se dobilo naslovno jedinjenje kao čvrsta žuta supstanca. 1H-NMR (CDCl3) δ: 8.09 (1H, dd, J=8.8, 2.4 Hz), 8.01 (1H, t, J=2.4 Hz), 6.86 (1H, d, J=8.8 Hz), 6.30 (1H, s), 4.78 (2H, d, J=1.5 Hz), 2.01 (2H, q, J=4.1 Hz), 1.35 (2H, q, J=4.1 Hz) ESI-MS zabeleženo: m/z [M+H] 219
Korak 5) Proizvodnja 7'-nitro-1',2'-dihidro-3'H-spiro[ciklopropan-1,4'-izokvinolina]:
[0167] Uz hlađenje ledom, 6.3 g kompleksa boron trifluorid-dietil etar je dodato suspenziji 1.3 g natrijum borohidrida u tetrahidrofuranu, i mešano 1 čas. Rastvor 2.4 g jedinjenja dobijenog u gore prikazanoj reakciji koraka 4) u tetrahidrofuranu (100 ml) je dodat reakcionoj tečnosti, i zagrevan pod refluksom tokom 2 časa. Reakciona tečnost je ohlađena, i zatim neutralisana zasićenim vodenim rastvorom natrijum bikarbonata. Rastvarač je isparen pod sniženim pritiskom, ostatak je rastvoren u etanolu, dodata je 5 N hlorovodonična kiselina, i smeša zagrevana pod refluksom tokom 1 časa. Reakciona tečnost je ohlađena, zatim je rastvarač isparen pod sniženim pritiskom, i ostatak je neutralisan vodenim rastvorom kalijum karbonata. Vodeni sloj je ekstrahovan hloroformom, organski sloj je osušen anhidrovanim magnezijum sulfatom, i rastvarač je isparen pod sniženim pritiskom da bi se dobilo naslovno jedinjenje. ESI-MS zabeleženo: m/z [M+H] 205
Korak 6) Proizvodnja 2'-metil-7'-nitro-2',3'-dihidro-1'H-spiro[ciklopropan-1,4'-izokvinolina]:
[0168] 1.5 g natrijum cijanoborohidrida je dodato metanolskom (50 mL) rastvoru jedinjenja (2.3g) dobijenog u gore prikazanoj reakciji koraka 5), 2.7 mL vodenog rastvora 37% formaldehida i 0.7 mL sirćetne kiseline, i mešano na sobnoj temperaturi 15 časova. Reakciona tečnost je neutralisana zasićenim vodenim rastvorom natrijum bikarbonata, i metanol je isparen pod sniženim pritiskom. Ostatak je razblažen vodom i ekstrahovan tri puta hloroformom. Organski sloj je osušen anhidrovanim magnezijum sulfatom, rastvarač je isparen pod sniženim pritiskom, i sirovi proizvod je prečišćen pomoću hromatografije na koloni silika gela (heksan/etil acetat) da bi se dobilo naslovno jedinjenje kao bezbojna čvrsta supstanca. 1H-NMR (CDCl3) δ: 7.97 (1H, dd, J=8.8, 2.4 Hz), 7.91 (1H, d, J=2.4 Hz), 6.78 (1H, d, J=8.8 Hz), 3.77 (2H, s), 2.57 (2H, s), 2.48 (3H, s), 1.16-1.12 (2H, m), 1.10-1.06 (2H, m) ESI-MS zabeleženo: m/z [M+H] 219
Korak 7) Proizvodnja 2'-metil-2',3'-dihidro-1'H-spiro[ciklopropan-1,4'-izokvinolin]-7'-amina:
[0169] 800 mg 10% paladijum-ugljenika je dodato rastvoru 1.7 g jedinjenja dobijenog u gore prikazanoj reakciji koraka 6) u etanolu (20 mL), i mešano u atmosferi vodonika pod pritiskom od 1 atmosfere na sobnoj temperaturi 15 časova. Paladijum-ugljenik je uklonjen filtracijom, filtrat je koncentrovan pod sniženim pritiskom, i sirovi proizvod je prečišćen pomoću hromatografije na koloni baznog silika gela (heksan/etil acetat) da bi se dobilo naslovno jedinjenje kao bezbojna čvrsta supstanca.<1>H-NMR (CDCl3) δ: 6.50-6.48 (2H, m), 6.38-6.36 (1H, m), 3.61 (2H, s), 3.50 (2H, s), 2.49 (2H, s), 2.42 (3H, s), 0.91 (2H, dd, J=6.3, 4.6 Hz), 0.81 (2H, dd, J=6.3, 4.6 Hz) ESI-MS zabeleženo: m/z [M+H] 189
Primer 3
Opšti materijali i postupci
A. Ćelijska kultura, proliferacioni testovi, i isključivanje gena pomoću MYT1 siRNK
[0170] Sve kancerske ćelijske linije su gajene u medijumu koji je preporučio prodavac ćelijske linije (ATCC). Medijum za kulturu tkiva, serum, i dodaci su nabavljeni od Sigma-Aldrich® (St. Louis, MO). Za skrining pomoću testa proliferacije (slika 1), ćelije su zasejane u ploče za kulturu tkiva sa 384 bunarčića i gajene pod tretmanom sa jedinjenjem ili vehikulumom. Nakon 96 časova, za približnu procenu sadržaja ćelija korišćen je CellTiter-Glo (Promega, Madison, WI) prema protokolu proizvođača. Uzorci su obrađeni u triplikatu i rast je izračunat kao neobrađena vrednost CellTiter-Glo za tretirane uzorake u odnosu na kontrolne bunarčiće tretirane vehikulumom.
4
[0171] Za ispitivanja isključivanja gena, NCI-H460 i KNS62, dve ćelijske linije nesitnoćelijskog kancera pluća, iz američke kolekcije kultura sojeva, Manassas, VA, transficirane su pulovima siRNK (SMARTpool, Dharmacon, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) sa kontrolom koja nema ciljno delovanje ili sa PKMYT1 sekvencama. Ćelije su zasejane 48 časova nakon transfekcije u ploče za kulturu tkiva sa 96 bunarčića i sledećeg dana je započet tretman jedinjenjem ili vehikulumom u trajanju od 72 časa. Za približnu procenu sadržaja ćelija korišćen je ViaLight (Lonza, Basel, Switzerland) prema protokolu proizvođača. Uzorci su obrađeni u triplikatu i rast je izračunat određivanjem procenta od neobrađene vrednosti za kontrolu za svaki tretman.
B. Western Blotting
[0172] Ćelije su lizirane u reagensu za ekstrakciju sisarskih proteina (MPER, Thermo Fisher 78505, Waltham, MA) i zatim podvrgnute SDS-PAGE i prenete na nitrocelulozne ili PVDF membrane. Antitela korišćena za Western blotting su nabavljena iz sledećih izvora: ukupna CDK1, pCDKlY15, pCDK1T14 , pCHK1S345, pStathminS38, pLaminA/CS22 , motiv supstrata pCDK, γH2AX, Ciklin A, i ukupni PKMYT1 od Cell Signaling Technologies (Beverly, MA); aktin-HRP od Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA); sekundarna HRP-konjugovana anti-mišja i zečja antitela od GE Healthcare (Waukesha, WI). Blotovi su izloženi sa SuperSignal West Femto hemiluminiscentnim supstratom (Thermo Fisher Pierce, Waltham, MA).
C. Protočna citometrija
[0173] Za detekciju dvolančanih prekida DNK, ćelije su obojene sa FITC-konjugovanim antiγH2AX (S139) antitelom (kit 17-344, Millipore, Billerica, MA) nakon fiksiranja reko noći u ledeno-hladnom 70% etanolu. Rastvor propidijum jodid (PI)/RNaza (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ) je korišćen za detekciju ukupnog sadržaja DNK. Za studije koje ispitaju preuranjenu mitozu, dodato je anti-pHH3-Alexa 647 antitelo (BD Biosciences 558217).
[0174] Za studije sinhronizacije, ćelije su inkubirane u medijumu bez seruma 36 časova, nakon čega je dodat 20% FBS. Jedan čas pre svakog sakupljanja, ćelije su aktivirane sa 10 µM bromodeoksiuridina (BrdU). Ćelije su fiksirane i obojene za određivanje sadržaja BrdU i DNK sa anti-BrdU FITC-konjugovanim antitelom i 7- aminoaktinomicin-D (7-AAD) bojom, redom, prema uputstvima u kitu BD Pharmingen™ FITC BrdU Flow Kit (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ). Svi citometrijski podaci su dobijeni pomoću protočnog citometra BD LSR II korišćenjem programa BD FACS Diva™ (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ), i rezultati su analizirani u programu FlowJo version 7.5.
D. In Vivo ispitivanja efikasnosti
[0175] Ženke miševa CD-1 Nu/Nu starosti 5-6 nedelja su dobijene od Charles River Laboratories (Wilmington, DE) i čuvane u objektu za brigu o životinjama podnosioca prijave u standardnim laboratorijskim uslovima i hranjene 2018S autoklavibilnom dijetom (Harlan Laboratories, Indianapolis, IN) i vodom po želji. Protokol je odobrio in-house komitet za brigu o životinjama i njihovu upotrebu podnosioca prijave. Miševi su inokulisani ćelijama (1:1 Matrigel:PBS) subkutano (SC) u desni bok. Kada je zapremina tumora dostigla 200 mm3 (+/-50) miševi su bili razvrstani tako da svaka grupa ima sličnu srednju vrednost i standardnu devijaciju. Zapremina tumora i telesne težine su beležene dvonedeljno. Miševi su primili četiri ciklusa lečenja sa doziranjem dva puta dnevno (BID) tokom dva dana, primajući ili vehikulum ili WEE1-1 (60 mpk).
Primer 4
Inhibicija WEE 1 remeti ćelijsku proliferaciju u različitim tumorskim ćelijskim linijama
[0176] Gubitak ekspresije WEE 1 kod miševa pomoću metode ciljanja gena je letalan, remećenjem razvoja čak pre nego što embrion dostigne stadijum blastocista (pre-embrionski dan 3.5). Ovaj fenotip je izazvan apoptozom i preuranjenim mitozama u embrionima kao i oštećenjem DNK u mišjim embrionskim fibroblastima kojima nedostaje WEE1 gen (Tominaga, Y., et al., J. Biol. Sciences, 2006, 2(4):161-170). Dodatno, utišavanje WEE1 posredovano sa RNKi vodi narušenoj vijabilnosti u brojnim transformisanim humanim ćelijskim linijama. WEE1-1 je snažan ATP-kompetitivni inhibitor WEE 1 i sensibiliše kancerske ćelije na egzogeno oštećenje DNK (Hirai, H., et al., Mol. Cancer Ther., 2009, 8(11):2992-3000). Podnosioci prijave su koristili ovaj mali molekul inhibitor da ispitaju dejstva farmakološke inhibicije WEE 1 na različitim panelima humanih tumorskih ćelijskih linija (slika 1).
[0177] Širok opseg odgovora je zapažen kada su 522 kancerske linije, koje predstavljaju 16 različitih tipova tumora, ispitane sa WEE1-1 u testu ćelijske proliferacije (slika 1). Vrednosti EC50su varirale od ≤ 0.1 µM u 2% (9/522) do ≥ 1µM u 19% (98/522) ispitivanih ćelijskih linija. Poređenje srednjih vrednosti EC50različitih tipova tumora otkrilo je da su, kao grupa, ćelijske linije kolorektalnog kancera bile manje osetljive (srednja vrednost EC50= 1.16 µM, n = 66, opseg 0.17 do >10 µM), a tumorske ćelijske linije neuroblastoma su bile u proseku osetljivije na lečenje sa WEE1-1 (srednja vrednost EC50= 0.28 µM, n = 7, opseg 0.12 do 0.45 µM). Veličina uzorka za drugu grupu je bila ograničena, ali je nalaz da ćelije neuroblastoma imaju tendenciju da daju bolji odgovor na inhibiciju WEE1 konzistentan sa nedavnim saznanjima (Russell et al., podneti rukopis). Bilo je primetno da mnoge ćelijske linije nastavljaju da rastu i dele se čak i u prisustvu viših koncentracija WEE1-1. Ovi podaci pokazuju antiproliferativni potencijal farmakološke inhibicije WEE1 i raznolikost među humoralnim tumorskim ćelijskim linijama.
Primer 5
Inhibicija WEE1 aktivira odgovor na oštećenje DNK
[0178] Funkcionalna genomska ispitivanja i validacione studije su pokazale da isključivanje WEE1 vodi nastanku dvolančanih prekida DNK i aktvaciji odgovora na oštećenje DNK (DDR). Podnosioci prijave su koristili pCHK1S345 kao marker aktiviranog DDR za ispitivanje dejstva farmakološke inhibicije WEE1 u šest ćelijskih linija različite osetljivosti na WEE1-1: ES-2 (EC50= 256 nM), A2058 (EC50= 225 nM), A431 (EC50= 170 nM), A427 (EC50= 116 nM), KNS62 (EC50= 487 nM), i NCI-H460 (EC50= 535 nM). Western blotovi za pCHK1S345 su pokazali dozno-zavisnu aktivaciju DDR u svih šest ćelijskih linija i pružili dokaz za povišeni pCHK1<S345>pri tako malo kao 50 nM WEE1-1 u osetljivijim ćelijskim linijama, tj., ES-2, A2058, A431, i A427 (slika 2A). Povišena aktivnost CDK kao rezultata tretmana sa WEE1-1 je potvrđena u ES-2 ćelijama (slika 8A). Kao što je i očekivano, prateće doznozavisno smanjenje pCDK1Y15 je takđe primećeno u svih šest ćelijskih linija, obezbeđujući vezu između indukcije DDR i povišene aktivnosti CDK kao rezultat inhibicije WEE1. Takođe je poznato da fosforilacija CDK1 i CDK2 na T14 pomoću PKM<YT1>ometa aktivnost CDK1/2 kinaze i WEE1-1 inhibira PKMYT1 in vitro na otprilike 100 puta višim koncentracijama od onih koje su potrebne za inhibiciju WEE1 (Hirai, H., et al., 2009). Podnosioci prijave su ispitivali da li su na nivoe pCDK1T14 uticale koncentracije WEE1-1 koje indukuju oštećenje DNK. Sa mogućim izuzetkom A427 ćelijske linije, podnosioci prijave nisu zapazili dejstvo na pCDK1T14 koje zavisi od WEE1-1 (slika 2A).
Primer 6
Inhibicija WEE1 remeti dinamiku S-faze i celovitost DNK replikacije
[0179] Da bi se razumelo gde dolazi do oštećenja DNK zavisnog od WEE1-1, podnosioci prijave su analizirali kancerske ćelije jajnika TOV21G pomoću protočne citometrije. Kod ćelija TOV21G u eksponencijalnom rastu, 1% do 2% populacije se bojilo pozitivno na marker γH2AX za dvolančana oštećenja DNK. Međutim, samo dva časa tretmana sa WEE1-1 je rezultovalo u 23% ćelija koje se pozitivno boje za γH2AX (slika 2B, levi panel). Hromozomski sadržaj pozitivnih ćelija za γH2AX bio je >2N, ukazujući na to da se oštećenje DNK koje nastaje zbog inhibicije WEE1 događa tokom, ili nakon inicijacije DNK replikacije u S-fazi. Kada su ćelije TOV21G tretirane sa WEE1-1 i pulsno-obeležene sa BrdU, oštećenje DNK je detektovano skoro isključivo u ćelijama pozitivnim na BrdU (95% za 2 časa, 92% za 6 časova) što podržava zapažanje podnosilaca prijave da su dvolančani prekidi DNK posledica inhibicije WEE1 tokom DNK replikacije (slika 2B, desni panel).
[0180] Očekuje se da hromozomski prekidi u S-fazi aktiviraju kontrolnu tačku DNK replikacije i uspore napredovanje kroz S-fazu. Ispitivanja sinhronizacije ćelija su izvedena da bi se potvrdilo ovo očekivanje. ES-2 ćelijska linija je odabrana za ova ispitivanja jer je bila pogodnija od drugih ćelijskih linija za G1 sinhronizaciju indukovanu uklanjanjem mitogena nakon smanjenja količine seruma (podaci nisu prikazani). Drugi pristupi sinhronizaciji u S-fazi (npr. blok dvostrukog-timidina, afidikolin, hidroksiurea, aktinomicin D, itd) nisu korišćeni jer ovi postupci mogu nezavisno da indukuju oštećenje DNK i poremete dinamiku DNK replikacije. Kao što je prikazano na slici 3A, uklanjanje seruma na 36 časova nije potpuno zaustavilo ES-2 ćelije u G1. Međutim, dodatak 20% FBS je uzrokovao da ćelije ES-2 tretirane vehikulumom uvećaju svoju populaciju u S-fazi na oko 40% za 8 časova i dostignu pik na 50% za 12 do 14 časova. Nasuprot tome, kada je tretman sa WEE1-1 bio uključen uz dodatak 20% FBS, nije bilo detektabilnih promena u populaciji u S-fazi za 8 časova i nivoi pika (oko 50%) su bili odloženi do 24 časa nakon dodatka FBS (slika 3A). Čak i na svom piku, srednja vrednost intenziteta fluorescencije ugrađenog BrdU bila je daleko niža u ćelijama tretiranim sa WEE1-1 u poređenju sa onim tretiranim vehikulumom, sugerišući usporenu DNK replikaciju u populaciji pozitivnoj na BrdU. Western blot testovi prikazani na slici 3A su potvrdili odloženo napredovanje S-faze (ciklin A), bržu i snažniju aktivaciju DDR (pCHK1S345), i inhibiciju WEE1 kinazne aktivnosti (pCDK1Y15) kod ćelija tretiranih sa WEE1-1 u odnosu na ćelije tretirane vehikulumom. Interesantno, fosforilacija pCDK1Y15 se povećala tokom vremena od 24 časa u ES-2 ćelijama. Stepen dvolančanih prekida DNK (γH2AX) indukovanih 24-časovnim tretmanom sa WEE1-1 bio je primetno veći pod uslovima mitogene stimulacije gde je primećeno naglo povećanje DNK replikacije u poređenju sa ćelijama koje nisu ponovo stimulisane (slika 3B i slika 9).
Primer 7
Oštećenje DNK kao primarna citotoksična posledica inhibicije WEE1
[0181] WEE1 je potreban je za vremensku aktivaciju oba, i CDK2 i CDK1 kinaze u S i G2 fazama ćelijskog ciklusa, redom. Očekivano je da inhibicija WEE1, prema tome, vodi defektima S faze (dvolančani prekidi DNK tokom DNK replikacije) i defektima G2-M faze (preuranjena mitoza). Da bi se procenilo da li je bilo koji, ili su oba ova dejstva neophodna ili dovoljna za osetljivost na WEE1-1, ispitivan je γH2AX i fosforilisani histon H3 (pHH3), marker za mitozu, pri citotoksičnim (EC90) koncentracijama WEE1-1 u tri osetljive ćelijske linije, A2058, HT-29, i LoVo. Nakon 24 časa tretmana sa WEE1-1, procenat pHH3 pozitivnih ćelija je porastao u sve tri ćelijske linije (slika 4). Od tri linije, samo HT-29 ćelije su sadržale suštinsku mitotsku populaciju, 43% sa 4N DNK i 23% sa <4N DNK, što ukazuje da ćelije sa prevremenom mitozom iz S-faze nisu završile DNK replikaciju. Međutim, ćelijska populacija suštinski pozitivna na H2AX primećena je u sve tri ćelijske linije nakon tretmana sa WEE1-1 (8% u A2058, 59% u HT-29, 27% u LoVo). Bez vezivanja za bilo kakvu teoriju, ovi podaci sugerišu da su dvolančani prekidi DNK (γH2AX), pre nego preuranjena mitoza (pHH3), primarna citotoksična posledica inhibicije WEE1 sa WEE1-1 u osetljivim ćelijskim linijama.
Primer 8
Anti-tumorska aktivnost in vivo koja potiče od inhibicije WEE1
[0182] Da bi se odredilo dejstvo monoterapijskog lečenja sa WEE1-1 na rast tumora in vivo u tolerisanim dozama, maksimalna tolerisana doza (MTD) je ustanovljena na 60 mg po kg za doziranje dva puta dnevno (BID). Srednja vrednost gubitka telesne težine tokom ispitivanja u trajanju od 28 dana pri ovoj dozi i rasporedu nije prešlo 5% u tretiranoj grupi (podaci nisu prikazani). WEE1-1 je inhibirao proliferaciju u ćelijskoj liniji A427 nesitnoćelijskog kancera pluća pri niskim koncentracijama (EC50= 116 nM) i lako indukovao odgovor na oštećenje DNK (slika 2A). U A427 ksenograftskom modelu, tretman sa WEE1-1 je izazvao regresiju do otprilike 50% od početne srednje zapremine tumora (slika 5A). Analiza pojedinačnih tumora pokazala je da je 9 od 10 vehiklumom tretiranih A427 tumora poraslo između 2 do 6 puta u odnosu na svoju polaznu zapreminu (slika 5B). Nasuprot tome, finalne zapremine za svih 10 tumora tretiranih sa WEE1-1 su bile manje od njihovih polaznih zapremina (slika 5B). Delovanje protiv rasta tumora WEE1-1 kao pojedinačnog sredstva za lečenje je primećeno u dodatnim ksenograftskim modelima (slika 5C): inhibicija rasta tumora (TGI) bila je 92% u SK-MES-1 NSCLC modelu, 13% tumorske regresije u LoVo modelu kolorektalnog tumora, 88% TGI u A431 modelu epidermoidnog tumora, i 64% TGI u NCI-H2122 NSCLC modelu. Procenat TGI je izračunat kao 100- (100 * ΔT/ΔC) ako je ΔT > 0 gde je ΔT = finalna srednja zapremina - polazna srednja zapremina tretirane grupe i ΔC = finalna srednja zapremina - polazna srednja zapremina kontrolne grupe tretirane vehikulumom. Ukupno uzevši, ovi podaci su pokazali antitumorski terapeutski potencijal inhibicije WEE1 pri dobro tolerisanim dozama WEE1-1.
Primer 9
Osetljivost na inhibitor WEE1 pod uticajem ekspresije PKMYT1
[0183] Ekspresija WEE1 je suštinska za vijabilnost embriona (Tominaga, Y., et al., 2006) i većina ispitivanih kancerskih ćelijskih linija pokazala je bar neki stepen osetljivosti na tretman sa WEE1-1 (slika 1). Međutim, nisu sve ćelijske linije bile jednako podložne inhibiciji WEE1 i vrednosti EC50za antiproliferativno dejstvo su varirale najmanje desetostruko (slika 1). Podnosioci prijave su ovde našli da je potencijalna determinanta osetljivosti na inhibiciju WEE1 aktivnost funkcionalno povezane CDK-inhibitorne kinaze, PKMYT1. Fosforilacija CDK1 ili CDK2 na bilo kom od dva N-terminalna mesta, T14 ili Y15, izaziva inaktivaciju ove kinaze uprkos prisustvu ciklinskog vezujućeg partnera koji inače ima aktivirajuće dejstvo (ciklin B ili ciklin A, redom). Poznato je da WEE1 fosforiliše Y15 u CDK1 i CDK2, i pokazano je da PKMYT1 na sličan način inhibira CDK1 i CDK2 putem fosforilacije na T14 i/ili Y15 (Mueller, P.R., et al., Science, 1995, 270(5233):86-90).
[0184] Podnosioci prijave ovde su koristili isključivanje gena pomoću siRNK da bi procenili da li ekspresija PKMYT1 može specifično da izmeni odgovor na inhibiciju WEE1 u dve ćelijske linije, NCI-H460 i KNS62. Ove linije su odabrane jer su pokazale relativnu neosetljivost na tretman sa WEE1-1 i imaju relativno visoku ekspresiju PKMYT1 (podaci nisu prikazani). Ćelije su transficirane pulom od četiri odvojene siRNK, koje sve ciljno deluju na PKMYT1, i ispitivane u testovima proliferacije na osetljivost na različita citotoksična sredstva (slika 6A). Kao što je prikazano na slici 6A, vrednosti EC50za antiproliferativno dejstvo WEE1-1 za NCI-H460 (n = 3) i KNS62 (n = 2) su se promenile od 677 nM na 104 nM i od 487 nM na 93 nM, redom, kada je PKMYT1 isključen. Primetno, na maksimalno dejstvo tretmana sa WEE1-1 nije uticalo osiromašenje PKMYT1. Korišćenjem umnoška promene EC50kao mere potencijacije, PKMYT1 je pojačao dejstvo WEE1-1 u proseku 4.7 puta u NCI-H460 ćelijama (n=3) i 4.9 puta u KNS62 ćelijama (n=2). Specifičnost senzibilizacije na WEE1-1 zavisne od PKMYT1 je potvrđena identičnim krivama dozaodgovor i u kontrolnim (CT) i u ćelijama transficiranim sa PKMYT1 siRNA tretiranim karboplatinom, MEK inhibitorom (PD-0325901), ili doksorubicinom (slika 6A). Western blot testovi KNS62 ćelija (slika 6B) su ukazali na to da je isključivanje PKMYT1 rezultovalo u neznatno nižoj bazalnoj fosforilaciji CDK1 i 2 na Y15 i značajno smanjenoj bazalnoj fosforilaciji na T14 (traka 9 nasuprot trakama 1 i 5). Isključivanje PKMYT1 je takođe vodilo ukupnom povećanju oba, i pCHK1<S345>i γH2AX. Ovo je konzistentno sa zapažanjima da citotoksičnost posredovana sa WEE1-1 rezultuje iz oštećenja DNK (slike 4A i 4B) i da je isključivanje PKMYT1 povećalo osetljivost na WEE1-1 i njegovo antiproliferativno dejstvo (slika 6B).
[0185] Po tome što isključivanje PKMYT1 vodi povećanoj osetljivosti na WEE1-1, podnosioci prijave su pretpostavili da niska ekspresija PKMYT1 takođe može da bude prognostička za ćelijsku liniju sa najvećim odogovorom na WEE1-1. Da bi se proverila ova pretpostavka, panel od 522 ćelijske linije za nivoe iRNK za PKMYT1 je procenjen korišćenjem Broad-Novartis Cancer Cell Line Encyclopedia (CCLE), javno dostupne baze podataka za ćelijske linije, iz saradnje između Broad Institute (Cambridge, MA) i Novartis Institute for Biomedical Research (Cambridge, MA) i njegovog Genomics Institute of the Novartis Research Foundation (San Diego, CA) (Stransky, B. C., et al., Nature, 2012, 483:603-807). Od 522 kancerske ćelijske linije kod kojih je ispitivana osetljivost na WEE1-1, podaci o ekspresiji PKMYT1 su bili dostupni za 305 linija. Grafik relativne PKMYT1 ekspresije iz baze podataka CCLE nasuprot zapaženom odgovoru ćelijske linije na 450 nM WEE1-1 nije pokazao korelaciju između PKMYT1 iRNK i osetljivosti na WEE1-1 (slika 7A). Međutim, 24 od 33 ćelijske linije (73%) koje su bile ubijene pri tretiranju sa 450 nM WEE1-1 (odgovor < 0.25 na prilagođenoj skali, naznačen isprekidanom linijom na slici 7A) imalo je manje od srednjeg nivoa ekspresije, tj., 413 ± 154, za PKMYT1 iRNK.
[0186] Kako bi se dodatno ispitala pretpostavka da je ekspresija PKMYT1 bila prognostička za osetljivost na WEE1-1, iz baze podataka CCLE izabrano je 13 dodatnih ćelijskih linija koje nisu prethodno tretirane sa WEE1-1. Vrednosti EC50za antiproliferativno dejstvo za WEE1-1 u ovih 13 ćelijskih linija su bile u korelaciji i sa ekspresijom iRNK (slika 7B, levi panel) i sa nivoima proteina (slika 7B, desni panel) PKMYT1. Ukupno uzevši, ovi podaci
1
podržavaju pretpostavku da je niska ekspresija PKMYT1 prognostička za WEE1-1 responsivnu ćelijsku liniju, tj. osetljivost na lečenje sa WEE1-1.
2

Claims (13)

Patentni zahtevi
1. Inhibitor WEE1 za upotrebu u lečenju pacijenta kome je dijagnostikovan kancer povezan sa WEE1 kinazom, pri čemu upotreba obuhvata:
(a) merenje nivoa genske ekspresije PKMYT1 u biološkom uzorku koji sadrži kancerske ćelije dobijene od pomenutog pacijenta i u kontrolnom uzorku; (b) određivanje da li je nivo genske ekspresije u pomenutom pacijentovom uzorku iznad ili ispod nivoa genske ekspresije u pomenutom kontrolnom uzorku; (c) odabir pomenutog pacijenta za lečenje inhibitorom WEE1, gde je nivo prognostičkog biomarkera iz pomenutog pacijentovog uzorka ispod onog u kontrolnom uzorku; i
(d) primenu inhibitora WEE 1 kod odabranog pacijenta.
2. Inhibitor WEE1 za upotrebu prema patentnom zahtevu 1, gde je pomenuti kontrolni uzorak dobijen od jednog ili više subjekata koji nemaju bolest ili kod kojih nije dijagnostikovan kancer povezan sa WEE1 kinazom.
3. Inhibitor WEE1 za upotrebu prema patentnom zahtevu 1, gde pomenuti inhibitor WEE1 predstavlja WEE1-1, ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, ili WEE1-2, ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so.
4. Inhibitor WEE1 za upotrebu prema patentnom zahtevu 3, gde pomenuti inhibitor WEE1 predstavlja WEE1-1 ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so.
5. Inhibitor WEE1 za upotrebu prema patentnom zahtevu 3, gde pomenuti inhibitor WEE1 predstavlja WEE1-2 ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so.
6. Inhibitor WEE1 za upotrebu u lečenju pacijenta obolelog od kancera osetljivog na lečenje inhibitorom WEE1 koja sadrži:
(a) merenje nivoa genske ekspresije PKMYT1 u biološkom uzorku koji sadrži kancerske ćelije dobijene od pomenutog pacijenta i u kontrolnom uzorku; (b) određivanje da li je nivo genske ekspresije u pomenutom pacijentovom uzorku iznad ili ispod nivoa genske ekspresije u pomenutom kontrolnom uzorku; (c) identifikovanje pomenutog osetljivog pacijenta za lečenje inhibitorom WEE1, gde je nivo PKMYT1 iz pomenutog pacijentovog uzorka ispod onog u kontrolnom uzorku; i
(d) primenu inhibitora WEE1 kod osetljivog pacijenta.
7. Inhibitor WEE1 za upotrebu prema patentnom zahtevu 6, gde je pomenuti kontrolni uzorak dobijen od jednog ili više subjekata koji nemaju bolest ili kod kojih nije dijagnostikovan kancer povezan sa WEE1 kinazom.
8. Inhibitor WEE1 za upotrebu prema patentnom zahtevu 6, gde pomenuti inhibitor WEE1 predstavlja WEE1-1, ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, ili WEE1-2, ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so.
9. Inhibitor WEE1 za upotrebu prema patentnom zahtevu 8, gde pomenuti inhibitor WEE1 predstavlja WEE1-1, ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so.
10. Inhibitor WEE1 za upotrebu prema patentnom zahtevu 8, gde pomenuti inhibitor WEE1 predstavlja WEE1-2, ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so.
11. Inhibitor WEE1 za upotrebu prema patentnom zahtevu 6, gde pomenuti kancer predstavlja kancer povezan sa WEE1 kinazom odabran iz grupe koja se sastoji od kancera dojke, kancera pluća, kancera pankreasa, kancera debelog creva, kancera jajnika, akutne leukemije, hronične limfatične leukemije, hronične mijelocitne leukemije i Hočkinovog limfoma.
12. Inhibitor WEE1 za upotrebu u lečenju pacijenta sa kancerom povezanim sa WEE1 kinazom, gde inhibitor WEE1 predstavlja WEE1-1 ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, ili WEE1-2 ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, i gde su kancerske ćelije pomenutog pacijenta koji treba da se leči naznačene niskom ekspresijom PKMYT1.
13. Inhibitor WEE1 za upotrebu prema patentnom zahtevu 12 gde inhibitor WEE1 predstavlja WEE1-1 ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so.
4
RS20171325A 2012-11-28 2013-11-22 Kompozicije i postupci za lečenje kancera RS56680B1 (sr)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201261730795P 2012-11-28 2012-11-28
PCT/US2013/071377 WO2014085216A1 (en) 2012-11-28 2013-11-22 Compositions and methods for treating cancer
EP13858495.8A EP2925888B1 (en) 2012-11-28 2013-11-22 Compositions and methods for treating cancer

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS56680B1 true RS56680B1 (sr) 2018-03-30

Family

ID=50828365

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20171325A RS56680B1 (sr) 2012-11-28 2013-11-22 Kompozicije i postupci za lečenje kancera

Country Status (23)

Country Link
US (1) US9655899B2 (sr)
EP (1) EP2925888B1 (sr)
JP (1) JP6290237B2 (sr)
KR (1) KR102161331B1 (sr)
AU (1) AU2013352568B2 (sr)
BR (1) BR112015012295A8 (sr)
CA (1) CA2892361A1 (sr)
CY (1) CY1119676T1 (sr)
DK (1) DK2925888T3 (sr)
ES (1) ES2651347T3 (sr)
HR (1) HRP20180002T1 (sr)
HU (1) HUE035662T2 (sr)
LT (1) LT2925888T (sr)
ME (1) ME02925B (sr)
MX (1) MX363243B (sr)
NO (1) NO2941224T3 (sr)
PL (1) PL2925888T3 (sr)
PT (1) PT2925888T (sr)
RS (1) RS56680B1 (sr)
RU (1) RU2660349C2 (sr)
SI (1) SI2925888T1 (sr)
SM (1) SMT201700595T1 (sr)
WO (1) WO2014085216A1 (sr)

Families Citing this family (41)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8754114B2 (en) 2010-12-22 2014-06-17 Incyte Corporation Substituted imidazopyridazines and benzimidazoles as inhibitors of FGFR3
PE20190736A1 (es) 2012-06-13 2019-05-23 Incyte Holdings Corp Compuestos triciclicos sustituidos como inhibidores del receptor del factor de crecimiento de fibroblastos (fgfr)
WO2014026125A1 (en) 2012-08-10 2014-02-13 Incyte Corporation Pyrazine derivatives as fgfr inhibitors
US9266892B2 (en) 2012-12-19 2016-02-23 Incyte Holdings Corporation Fused pyrazoles as FGFR inhibitors
KR102269032B1 (ko) 2013-04-19 2021-06-24 인사이트 홀딩스 코포레이션 Fgfr 저해제로서 이환식 헤테로사이클
US10851105B2 (en) 2014-10-22 2020-12-01 Incyte Corporation Bicyclic heterocycles as FGFR4 inhibitors
MA41551A (fr) 2015-02-20 2017-12-26 Incyte Corp Hétérocycles bicycliques utilisés en tant qu'inhibiteurs de fgfr4
US9580423B2 (en) 2015-02-20 2017-02-28 Incyte Corporation Bicyclic heterocycles as FGFR4 inhibitors
ES2895769T3 (es) 2015-02-20 2022-02-22 Incyte Corp Heterociclos bicíclicos como inhibidores de FGFR
US20180325902A1 (en) * 2015-11-06 2018-11-15 The Penn State Research Foundation Compositions and methods relating to cancer
US10280348B2 (en) * 2017-01-31 2019-05-07 Prc-Desoto International, Inc. Low density aerospace compositions and sealants
AR111960A1 (es) 2017-05-26 2019-09-04 Incyte Corp Formas cristalinas de un inhibidor de fgfr y procesos para su preparación
AU2018347307A1 (en) 2017-10-09 2020-04-23 Nuvation Bio Inc. Heterocyclic compounds and uses thereof
WO2019074979A1 (en) 2017-10-09 2019-04-18 Girafpharma, Llc HETEROCYCLIC COMPOUNDS AND USES THEREOF
SI3788047T1 (sl) 2018-05-04 2024-11-29 Incyte Corporation Trdne oblike inhibitorja fgfr in postopki priprave le-teh
SG11202010882XA (en) 2018-05-04 2020-11-27 Incyte Corp Salts of an fgfr inhibitor
WO2020185532A1 (en) 2019-03-08 2020-09-17 Incyte Corporation Methods of treating cancer with an fgfr inhibitor
EP3952878A4 (en) * 2019-04-09 2023-01-04 Nuvation Bio Inc. HETEROCYCLIC COMPOUNDS AND THEIR USES
EP3952879A4 (en) * 2019-04-09 2023-01-04 Nuvation Bio Inc. HETEROCYCLIC COMPOUNDS AND THEIR USES
CN113939296A (zh) 2019-04-09 2022-01-14 诺维逊生物股份有限公司 杂环化合物及其用途
US11591329B2 (en) 2019-07-09 2023-02-28 Incyte Corporation Bicyclic heterocycles as FGFR inhibitors
WO2021067374A1 (en) 2019-10-01 2021-04-08 Incyte Corporation Bicyclic heterocycles as fgfr inhibitors
US11607416B2 (en) 2019-10-14 2023-03-21 Incyte Corporation Bicyclic heterocycles as FGFR inhibitors
US11566028B2 (en) 2019-10-16 2023-01-31 Incyte Corporation Bicyclic heterocycles as FGFR inhibitors
EP4069696A1 (en) 2019-12-04 2022-10-12 Incyte Corporation Tricyclic heterocycles as fgfr inhibitors
WO2021113462A1 (en) 2019-12-04 2021-06-10 Incyte Corporation Derivatives of an fgfr inhibitor
BR112022012286A2 (pt) * 2019-12-20 2022-08-30 Recurium Ip Holdings Llc Combinações
WO2021127041A1 (en) * 2019-12-20 2021-06-24 Recurium Ip Holdings, Llc Combinations
WO2021146424A1 (en) 2020-01-15 2021-07-22 Incyte Corporation Bicyclic heterocycles as fgfr inhibitors
MX2022012181A (es) * 2020-04-01 2023-01-30 Engine Biosciences Pte Ltd Metodos y composiciones para tratar cancer.
WO2022221170A1 (en) 2021-04-12 2022-10-20 Incyte Corporation Combination therapy comprising an fgfr inhibitor and a nectin-4 targeting agent
WO2022261160A1 (en) 2021-06-09 2022-12-15 Incyte Corporation Tricyclic heterocycles as fgfr inhibitors
WO2022261159A1 (en) 2021-06-09 2022-12-15 Incyte Corporation Tricyclic heterocycles as fgfr inhibitors
CN113735863A (zh) * 2021-09-29 2021-12-03 武汉九州钰民医药科技有限公司 Wee1抑制剂adavosertib的制备工艺
PT118269A (pt) 2022-10-20 2024-04-22 Univ Aveiro Pkmyt1 for use in regenerative medicine
TW202508595A (zh) 2023-05-04 2025-03-01 美商銳新醫藥公司 用於ｒａｓ相關疾病或病症之組合療法
WO2025034702A1 (en) 2023-08-07 2025-02-13 Revolution Medicines, Inc. Rmc-6291 for use in the treatment of ras protein-related disease or disorder
WO2025080946A2 (en) 2023-10-12 2025-04-17 Revolution Medicines, Inc. Ras inhibitors
WO2025171296A1 (en) 2024-02-09 2025-08-14 Revolution Medicines, Inc. Ras inhibitors
WO2025217307A1 (en) 2024-04-09 2025-10-16 Revolution Medicines, Inc. Methods for predicting response to a ras(on) inhibitor and combination therapies
WO2025240847A1 (en) 2024-05-17 2025-11-20 Revolution Medicines, Inc. Ras inhibitors

Family Cites Families (393)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3126375A (en) 1964-03-24 Chioacyl
US2789118A (en) 1956-03-30 1957-04-16 American Cyanamid Co 16-alpha oxy-belta1, 4-pregnadienes
US2990401A (en) 1958-06-18 1961-06-27 American Cyanamid Co 11-substituted 16alpha, 17alpha-substituted methylenedioxy steroids
US3048581A (en) 1960-04-25 1962-08-07 Olin Mathieson Acetals and ketals of 16, 17-dihydroxy steroids
US3749712A (en) 1970-09-25 1973-07-31 Sigma Tau Ind Farmaceuti Triamcinolone acetonide esters and process for their preparation
SE378110B (sr) 1972-05-19 1975-08-18 Bofors Ab
SE378109B (sr) 1972-05-19 1975-08-18 Bofors Ab
US3996359A (en) 1972-05-19 1976-12-07 Ab Bofors Novel stereoisomeric component A of stereoisomeric mixtures of 2'-unsymmetrical 16,17-methylenedioxy steroid 21-acylates, compositions thereof, and method of treating therewith
US4231938A (en) 1979-06-15 1980-11-04 Merck & Co., Inc. Hypocholesteremic fermentation products and process of preparation
US4294926A (en) 1979-06-15 1981-10-13 Merck & Co., Inc. Hypocholesteremic fermentation products and process of preparation
US4319039A (en) 1979-06-15 1982-03-09 Merck & Co., Inc. Preparation of ammonium salt of hypocholesteremic fermentation product
US4444784A (en) 1980-08-05 1984-04-24 Merck & Co., Inc. Antihypercholesterolemic compounds
DK149080C (da) 1980-06-06 1986-07-28 Sankyo Co Fremgangsmaade til fremstilling af derivater af ml-236b-carboxylsyre
JPS5889191A (ja) 1981-11-20 1983-05-27 Sankyo Co Ltd ３−ヒドロキシ−ｍｌ−２３６ｂ誘導体の製造法
US5354772A (en) 1982-11-22 1994-10-11 Sandoz Pharm. Corp. Indole analogs of mevalonolactone and derivatives thereof
US4911165A (en) 1983-01-12 1990-03-27 Ethicon, Inc. Pliabilized polypropylene surgical filaments
US4683202A (en) 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
US4681893A (en) 1986-05-30 1987-07-21 Warner-Lambert Company Trans-6-[2-(3- or 4-carboxamido-substituted pyrrol-1-yl)alkyl]-4-hydroxypyran-2-one inhibitors of cholesterol synthesis
US5525464A (en) 1987-04-01 1996-06-11 Hyseq, Inc. Method of sequencing by hybridization of oligonucleotide probes
US5202231A (en) 1987-04-01 1993-04-13 Drmanac Radoje T Method of sequencing of genomes by hybridization of oligonucleotide probes
US4782084A (en) 1987-06-29 1988-11-01 Merck & Co., Inc. HMG-COA reductase inhibitors
US4885314A (en) 1987-06-29 1989-12-05 Merck & Co., Inc. Novel HMG-CoA reductase inhibitors
US4820850A (en) 1987-07-10 1989-04-11 Merck & Co., Inc. Process for α-C-alkylation of the 8-acyl group on mevinolin and analogs thereof
US5030447A (en) 1988-03-31 1991-07-09 E. R. Squibb & Sons, Inc. Pharmaceutical compositions having good stability
US5700637A (en) 1988-05-03 1997-12-23 Isis Innovation Limited Apparatus and method for analyzing polynucleotide sequences and method of generating oligonucleotide arrays
US4916239A (en) 1988-07-19 1990-04-10 Merck & Co., Inc. Process for the lactonization of mevinic acids and analogs thereof
EP0360390A1 (en) 1988-07-25 1990-03-28 Glaxo Group Limited Spirolactam derivatives
GB8822228D0 (en) 1988-09-21 1988-10-26 Southern E M Support-bound oligonucleotides
US5118853A (en) 1988-10-13 1992-06-02 Sandoz Ltd. Processes for the synthesis of 3-disubstituted aminoacroleins
US5290946A (en) 1988-10-13 1994-03-01 Sandoz Ltd. Processes for the synthesis of 3-(substituted indolyl-2-yl)propenaldehydes
MX18467A (es) 1988-11-23 1993-07-01 Pfizer Agentes terapeuticos de quinuclidinas
US4929437A (en) 1989-02-02 1990-05-29 Merck & Co., Inc. Coenzyme Q10 with HMG-CoA reductase inhibitors
US5164372A (en) 1989-04-28 1992-11-17 Fujisawa Pharmaceutical Company, Ltd. Peptide compounds having substance p antagonism, processes for preparation thereof and pharmaceutical composition comprising the same
US5189164A (en) 1989-05-22 1993-02-23 Sandoz Ltd. Processes for the synthesis of syn-(E)-3,5-dihydroxy-7-substituted hept-6-enoic and heptanoic acids and derivatives and intermediates thereof
US5242974A (en) 1991-11-22 1993-09-07 Affymax Technologies N.V. Polymer reversal on solid surfaces
US6551784B2 (en) 1989-06-07 2003-04-22 Affymetrix Inc Method of comparing nucleic acid sequences
US5547839A (en) 1989-06-07 1996-08-20 Affymax Technologies N.V. Sequencing of surface immobilized polymers utilizing microflourescence detection
US5424186A (en) 1989-06-07 1995-06-13 Affymax Technologies N.V. Very large scale immobilized polymer synthesis
US5143854A (en) 1989-06-07 1992-09-01 Affymax Technologies N.V. Large scale photolithographic solid phase synthesis of polypeptides and receptor binding screening thereof
US5527681A (en) 1989-06-07 1996-06-18 Affymax Technologies N.V. Immobilized molecular synthesis of systematically substituted compounds
US5744101A (en) 1989-06-07 1998-04-28 Affymax Technologies N.V. Photolabile nucleoside protecting groups
FI94339C (fi) 1989-07-21 1995-08-25 Warner Lambert Co Menetelmä farmaseuttisesti käyttökelpoisen /R-(R*,R*)/-2-(4-fluorifenyyli)- , -dihydroksi-5-(1-metyylietyyli)-3-fenyyli-4-/(fenyyliamino)karbonyyli/-1H-pyrroli-1-heptaanihapon ja sen farmaseuttisesti hyväksyttävien suolojen valmistamiseksi
DE3924454A1 (de) 1989-07-24 1991-02-07 Cornelis P Prof Dr Hollenberg Die anwendung von dna und dna-technologie fuer die konstruktion von netzwerken zur verwendung in der chip-konstruktion und chip-produktion (dna chips)
PH27357A (en) 1989-09-22 1993-06-21 Fujisawa Pharmaceutical Co Pyrazole derivatives and pharmaceutical compositions comprising the same
FI97540C (fi) 1989-11-06 1997-01-10 Sanofi Sa Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisten, aromaattisesti substituoitujen piperidiini- ja piperatsiinijohdannaisten valmistamiseksi
FR2654725B1 (fr) 1989-11-23 1992-02-14 Rhone Poulenc Sante Nouveaux derives de l'isoindolone, leur preparation et les compositions pharmaceutiques qui les contiennent.
FR2654726B1 (fr) 1989-11-23 1992-02-14 Rhone Poulenc Sante Nouveaux derives de l'isoindolone et leur preparation.
EP0430881A3 (en) 1989-11-29 1991-10-23 Ciba-Geigy Ag Photochromic compounds, process for their preparation and their use
GB8929070D0 (en) 1989-12-22 1990-02-28 Fujisawa Pharmaceutical Co Peptide compounds,processes for preparation thereof and pharmaceutical composition comprising the same
WO1991009844A1 (en) 1990-01-04 1991-07-11 Pfizer Inc. Substance p antagonists
US5232929A (en) 1990-11-28 1993-08-03 Pfizer Inc. 3-aminopiperidine derivatives and related nitrogen containing heterocycles and pharmaceutical compositions and use
EP0515681A4 (en) 1990-02-15 1993-12-29 Fujisawa Pharmaceutical Co., Ltd. Peptide compound
US5288644A (en) 1990-04-04 1994-02-22 The Rockefeller University Instrument and method for the sequencing of genome
US5420245A (en) 1990-04-18 1995-05-30 Board Of Regents, The University Of Texas Tetrapeptide-based inhibitors of farnesyl transferase
US5451586A (en) 1990-06-01 1995-09-19 Pfizer Inc. 3-amino-2-aryl quinuclidines
US5422354A (en) 1990-07-23 1995-06-06 Pfizer Inc Quinuclidine derivatives
ES2071334T3 (es) 1990-09-28 1995-06-16 Pfizer Analogos de anillos fusionados de nitrogeno conteniendo heterociclos no aromaticos.
GB9023116D0 (en) 1990-10-24 1990-12-05 Fujisawa Pharmaceutical Co Peptide compounds,processes for preparation thereof and pharmaceutical composition comprising the same
US5177080A (en) 1990-12-14 1993-01-05 Bayer Aktiengesellschaft Substituted pyridyl-dihydroxy-heptenoic acid and its salts
DK0498069T3 (da) 1990-12-21 1995-12-04 Fujisawa Pharmaceutical Co Ny anvendelse af peptidderivat
FI933167A7 (fi) 1991-01-10 1993-07-09 Pfizer N-alkyylikinuklidiniumsuolat aineen P antagonisteina
EP0499313B1 (en) 1991-02-11 1997-06-11 MERCK SHARP &amp; DOHME LTD. Azabicyclic compounds, pharmaceutical compositions containing them and their use in therapy
DE69200921T2 (de) 1991-03-01 1995-05-04 Pfizer 1-azabicyclo[3.2.2]nonan-3-aminderivate.
US5747469A (en) 1991-03-06 1998-05-05 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods and compositions comprising DNA damaging agents and p53
PL169993B1 (pl) 1991-03-26 1996-09-30 Pfizer Sposób wytwarzania podstawionych piperydyn PL PL PL PL
FR2677361A1 (fr) 1991-06-04 1992-12-11 Adir Nouveaux peptides et pseudopeptides, derives de tachykinines, leur procede de preparation et les compositions pharmaceutiques qui les contiennent.
FR2676055B1 (fr) 1991-05-03 1993-09-03 Sanofi Elf Composes polycycliques amines et leurs enantiomeres, procede pour leur preparation et compositions pharmaceutiques les contenant.
FR2676053B1 (fr) 1991-05-03 1993-08-27 Sanofi Elf Nouveaux composes dialkylenepiperidino et leurs enantiomeres, procede pour leur preparation et compositions pharmaceutiques les contenant.
FR2676443B1 (fr) 1991-05-17 1993-08-06 Rhone Poulenc Rorer Sa Nouveaux derives de perhydroisoindole et leur preparation.
FR2676446B1 (fr) 1991-05-17 1993-08-06 Rhone Poulenc Rorer Sa Nouveaux derives du thiopyranopyrrole, leur preparation et les compositions pharmaceutiques qui les contiennent.
FR2676442B1 (fr) 1991-05-17 1993-08-06 Rhone Poulenc Rorer Sa Nouveau derives de perhydroisoindole, leur preparation et les compositions pharmaceutiques qui les contiennent.
FR2676447B1 (fr) 1991-05-17 1993-08-06 Rhone Poulenc Rorer Sa Nouveaux derives du thiopyranopyrrole et leur preparation.
US5292726A (en) 1991-05-22 1994-03-08 Merck & Co., Inc. N,N-diacylpiperazines
RU2092486C1 (ru) 1991-05-22 1997-10-10 Пфайзер Инк. Замещенные 3-аминохинуклидины
DE122006000066I2 (de) 1991-05-31 2007-12-06 Pfizer Chinuclidinderivate
GB9113219D0 (en) 1991-06-19 1991-08-07 Fujisawa Pharmaceutical Co Peptide compound,processes for preparation thereof and pharmaceutical composition comprising the same
BR9206161A (pt) 1991-06-20 1995-10-31 Pfizer Derivados fluoroalcoxibenzilamino de heterociclos contendo nitrogénio
TW202432B (sr) 1991-06-21 1993-03-21 Pfizer
US5288730A (en) 1991-06-24 1994-02-22 Merck Sharp & Dohme Limited Azabicyclic compounds, pharmaceutical compositions containing them and their use in therapy
DE69208088T2 (de) 1991-07-05 1996-11-14 Merck Sharp & Dohme Aromatische verbindungen, diese enthaltende pharmazeutische zusammensetzungen und ihre therapeutische anwendung
EP0536817A1 (en) 1991-07-05 1993-04-14 MERCK SHARP &amp; DOHME LTD. Azabicyclic compounds as tachykinin antagonists
WO1993001169A2 (en) 1991-07-05 1993-01-21 Merck Sharp & Dohme Limited Aromatic compounds, pharmaceutical compositions containing them and their use in therapy
JPH06509090A (ja) 1991-07-10 1994-10-13 メルク　シヤープ　エンド　ドーム　リミテツド 芳香族化合物、それらを含む組成物、及び治療におけるそれらの使用
WO1993001159A1 (en) 1991-07-10 1993-01-21 Merck Sharp & Dohme Limited Fused tricyclic compounds, pharmaceutical compositions containing them and their use in therapy
MY110227A (en) 1991-08-12 1998-03-31 Ciba Geigy Ag 1-acylpiperindine compounds.
WO1993004040A1 (en) 1991-08-20 1993-03-04 Merck Sharp & Dohme Limited Azacyclic compounds, processes for their preparation and pharmaceutical compositions containing them
PT533280E (pt) 1991-09-20 2001-01-31 Glaxo Group Ltd Novas utilizacoes medicas para antagonistas de taquiquinina
CZ59394A3 (en) 1991-09-26 1994-11-16 Pfizer Condensed tricyclic heterocycles containing nitrogen as antagonists of p substance receptor, process of their preparation, intermediates, pharmaceutical preparations in which they are comprised and use
WO1993009116A1 (fr) 1991-11-07 1993-05-13 Yoshitomi Pharmaceutical Industries, Ltd. Compose a base de quinuclidine et utilisation dudit compose en medecine
DK0613458T3 (da) 1991-11-12 1998-02-09 Pfizer Acykliske ethylendiaminderivater som substans P receptorantagonister
US5384261A (en) 1991-11-22 1995-01-24 Affymax Technologies N.V. Very large scale immobilized polymer synthesis using mechanically directed flow paths
US5324633A (en) 1991-11-22 1994-06-28 Affymax Technologies N.V. Method and apparatus for measuring binding affinity
US5412087A (en) 1992-04-24 1995-05-02 Affymax Technologies N.V. Spatially-addressable immobilization of oligonucleotides and other biological polymers on surfaces
CA2083891A1 (en) 1991-12-03 1993-06-04 Angus Murray Macleod Heterocyclic compounds, compositions containing them and their use in therapy
HU9203780D0 (en) 1991-12-12 1993-03-29 Sandoz Ag Stabilized pharmaceutical products of hmg-coa reductase inhibitor and method for producing them
GB9200535D0 (en) 1992-01-10 1992-02-26 Fujisawa Pharmaceutical Co New compound
GB9201179D0 (en) 1992-01-21 1992-03-11 Glaxo Group Ltd Chemical compounds
US5328927A (en) 1992-03-03 1994-07-12 Merck Sharpe & Dohme, Ltd. Hetercyclic compounds, processes for their preparation and pharmaceutical compositions containing them
JP2656702B2 (ja) 1992-03-23 1997-09-24 ファイザー製薬株式会社 ペプチド性キヌクリジン
DE69322266T2 (de) 1992-04-03 1999-06-02 Perkin-Elmer Corp., Foster City, Calif. Proben zusammensetzung und verfahren
FR2689888B1 (fr) 1992-04-10 1994-06-10 Rhone Poulenc Rorer Sa Nouveaux derives de perhydroisoindole, leur preparation et les compositions pharmaceutiques qui les contiennent.
CA2133077A1 (en) 1992-04-15 1993-10-28 Raymond Baker Azacyclic compounds
GB2266529A (en) 1992-05-01 1993-11-03 Merck Sharp & Dohme Tetrahydroisoquinoline derivatives
CA2134964C (en) 1992-05-18 1997-12-30 Manoj C. Desai Bridged aza-bicyclic derivatives as substance p antagonists
GB9211193D0 (en) 1992-05-27 1992-07-08 Merck Sharp & Dohme Therapeutic agents
US5637699A (en) 1992-06-29 1997-06-10 Merck & Co., Inc. Process for preparing morpholine tachykinin receptor antagonists
US5719147A (en) 1992-06-29 1998-02-17 Merck & Co., Inc. Morpholine and thiomorpholine tachykinin receptor antagonists
CA2099233A1 (en) 1992-06-29 1993-12-30 Conrad P. Dorn Morpholine and thiomorpholine tachykinin receptor antagonists
US5612336A (en) 1992-07-13 1997-03-18 Merck, Sharp & Dohme Ltd. Heterocyclic amide derivatives as tachykinin antagonists
EP0786522A2 (en) 1992-07-17 1997-07-30 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. Enzymatic RNA molecules for treatment of stenotic conditions
GB2268931A (en) 1992-07-22 1994-01-26 Merck Sharp & Dohme Azabicyclic tachykinin-receptor antagonists
AU675447B2 (en) 1992-07-28 1997-02-06 Merck Sharp & Dohme Limited Carboxamidomethyl piperidine and analogues
GB2269170A (en) 1992-07-29 1994-02-02 Merck Sharp & Dohme Azatricyclic tachykinin antagonists
AU4718093A (en) 1992-07-31 1994-03-03 Merck Sharp & Dohme Limited Substituted amines as tachykinin receptor antagonists
CA2141051A1 (en) 1992-08-04 1994-02-17 Terry J. Rosen Substituted nitrogen-containing heterocycles
GB9216911D0 (en) 1992-08-10 1992-09-23 Merck Sharp & Dohme Therapeutic agents
DK0655055T3 (da) 1992-08-13 2001-01-02 Warner Lambert Co Tachykininantagonister
EP1114823A3 (en) 1992-08-19 2001-07-18 Pfizer Inc. Substituted benzylamino nitrogen containing non-aromatic heterocycles
US5387595A (en) 1992-08-26 1995-02-07 Merck & Co., Inc. Alicyclic compounds as tachykinin receptor antagonists
NO179904C (no) 1992-09-04 1997-01-08 Takeda Chemical Industries Ltd Kondenserte heterocykliske forbindelser og deres anvendelse
AU4973693A (en) 1992-09-10 1994-03-29 Merck Sharp & Dohme Limited Alcohols and ethers with aromatic substituents as tachykinin-antagonists
GB9220286D0 (en) 1992-09-25 1992-11-11 Merck Sharp & Dohme Therapeutic agents
JP2656699B2 (ja) 1992-10-21 1997-09-24 ファイザー製薬株式会社 置換ベンジルアミノキヌクリジン
GB9222262D0 (en) 1992-10-23 1992-12-09 Merck Sharp & Dohme Therapeutic agents
GB9222486D0 (en) 1992-10-26 1992-12-09 Merck Sharp & Dohme Therapeutic agents
WO1994010165A1 (en) 1992-10-28 1994-05-11 Merck Sharp & Dohme Limited 4-arylmethyloxymethyl piperidines as tachykinin antagonists
JP2656700B2 (ja) 1992-10-28 1997-09-24 ファイザー製薬株式会社 置換キヌクリジン誘導体
US5554501A (en) 1992-10-29 1996-09-10 Beckman Instruments, Inc. Biopolymer synthesis using surface activated biaxially oriented polypropylene
US5554627A (en) 1992-10-30 1996-09-10 Merck, Sharp & Dohme Ltd. Tachykinin antagonists
US5503980A (en) 1992-11-06 1996-04-02 Trustees Of Boston University Positional sequencing by hybridization
ES2096312T3 (es) 1992-11-12 1997-03-01 Pfizer Derivado de quinuclidina como antagonista de la sustancia p.
US5261188A (en) 1992-11-23 1993-11-16 The Standard Products Company Belt weatherstrip with bulb
PT675886E (pt) 1992-12-10 2000-12-29 Pfizer Heterociclos nao aromaticos com substituintes aminometileno e sua utilizacao como antagonistas da substancia p
US5604260A (en) 1992-12-11 1997-02-18 Merck Frosst Canada Inc. 5-methanesulfonamido-1-indanones as an inhibitor of cyclooxygenase-2
JPH08504435A (ja) 1992-12-14 1996-05-14 メルク シヤープ エンド ドーム リミテツド タキキニン受容体拮抗剤としての４−アミノメチル／チオメチル／スルホニルメチル−４−フェニルピペリジン
GB9226581D0 (en) 1992-12-21 1993-02-17 Merck Sharp & Dohme Therapeutic agents
CA2111902A1 (en) 1992-12-21 1994-06-22 Jack Beuford Campbell Antitumor compositions and methods of treatment
GB9300051D0 (en) 1993-01-04 1993-03-03 Merck Sharp & Dohme Therapeutic agents
CA2152792C (en) 1993-01-15 2000-02-15 Stephen R. Bertenshaw Novel 3,4-diaryl thiophenes and analogs thereof having use as antiinflammatory agents
EP0610793A1 (en) 1993-02-08 1994-08-17 Takeda Chemical Industries, Ltd. Tetracyclic morpholine derivatives and their use or analgesics
JPH08506823A (ja) 1993-02-18 1996-07-23 メルク シヤープ エンド ドーム リミテツド アザ環式化合物、該化合物を含む組成物及びタキキニン拮抗剤としての該化合物の使用
AU6140694A (en) 1993-02-22 1994-09-14 Merck Sharp & Dohme Limited Aromatic compounds, compositions containing them and their use in therapy
WO1994019357A1 (en) 1993-02-23 1994-09-01 Merrell Dow Pharmaceuticals Inc. Farnesyl:protein transferase inhibitors as anticancer agents
US5298627A (en) 1993-03-03 1994-03-29 Warner-Lambert Company Process for trans-6-[2-(substituted-pyrrol-1-yl)alkyl]pyran-2-one inhibitors of cholesterol synthesis
US5688806A (en) 1993-03-04 1997-11-18 Pfizer Inc. Spiroazacyclic derivatives as substance P antagonists
US5409944A (en) 1993-03-12 1995-04-25 Merck Frosst Canada, Inc. Alkanesulfonamido-1-indanone derivatives as inhibitors of cyclooxygenase
CA2118985A1 (en) 1993-04-02 1994-10-03 Dinesh V. Patel Heterocyclic inhibitors of farnesyl protein transferase
DE4311230C2 (de) 1993-04-02 1996-12-19 Mannesmann Ag Nicht-spurgebundenes Fahrzeug mit Elektromotor
US5496833A (en) 1993-04-13 1996-03-05 Merck Sharp & Dohme Limited Piperidine tachykinin receptor antagonists
EP0696280B1 (en) 1993-05-06 1997-09-24 Merrell Pharmaceuticals Inc. Substituted pyrrolidin-3-yl-alkyl-piperidines useful as tachykinin antagonists
WO1994026723A2 (en) 1993-05-14 1994-11-24 Genentech, Inc. ras FARNESYL TRANSFERASE INHIBITORS
US5602098A (en) 1993-05-18 1997-02-11 University Of Pittsburgh Inhibition of farnesyltransferase
IL109646A0 (en) 1993-05-19 1994-08-26 Pfizer Heteroatom substituted alkyl benzylamino-quinuclidines
US5380738A (en) 1993-05-21 1995-01-10 Monsanto Company 2-substituted oxazoles further substituted by 4-fluorophenyl and 4-methylsulfonylphenyl as antiinflammatory agents
AU680020B2 (en) 1993-06-07 1997-07-17 Merck & Co., Inc. Spiro-substituted azacycles as neurokinin antagonists
US5474995A (en) 1993-06-24 1995-12-12 Merck Frosst Canada, Inc. Phenyl heterocycles as cox-2 inhibitors
GB9602877D0 (en) 1996-02-13 1996-04-10 Merck Frosst Canada Inc 3,4-Diaryl-2-hydroxy-2,5- dihydrofurans as prodrugs to cox-2 inhibitors
US5436265A (en) 1993-11-12 1995-07-25 Merck Frosst Canada, Inc. 1-aroyl-3-indolyl alkanoic acids and derivatives thereof useful as anti-inflammatory agents
US5837832A (en) 1993-06-25 1998-11-17 Affymetrix, Inc. Arrays of nucleic acid probes on biological chips
EP0634402A1 (en) 1993-07-14 1995-01-18 Takeda Chemical Industries, Ltd. Isochinolinone derivatives, their production and use
ES2121213T3 (es) 1993-07-15 1998-11-16 Pfizer Benciloxiquinuclidinas como antagonistas de la sustancia p.
GB9315808D0 (en) 1993-07-30 1993-09-15 Merck Sharp & Dohme Therapeutic agents
TW365603B (en) 1993-07-30 1999-08-01 Rhone Poulenc Rorer Sa Novel perhydroisoindole derivatives, their preparation and pharmaceutical compositions which contain them
GB9317987D0 (en) 1993-08-26 1993-10-13 Glaxo Group Ltd Chemical compounds
DE69433744T2 (de) 1993-09-17 2004-10-14 Pfizer Inc. 3-amino-5-carboxy-substituierte piperidine und 3-amino-4-carboxy-substituierte pyrrolidine als tachykinin-antagonisten
EP0719266A1 (en) 1993-09-17 1996-07-03 Pfizer Inc. Heteroarylamino and heteroarylsulfonamido substituted 3-benzylaminomethyl piperidines and related compounds
WO1995008542A1 (en) 1993-09-22 1995-03-30 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Farnesyltransferase inhibitor
IS4208A (is) 1993-09-22 1995-03-23 Glaxo Group Limited 3-(tetrazólýl-benzyl)amínó-piperadidín afleiður
US5719148A (en) 1993-10-15 1998-02-17 Schering Corporation Tricyclic amide and urea compounds useful for inhibition of g-protein function and for treatment of proliferative diseases
ES2164717T3 (es) 1993-10-15 2002-03-01 Schering Corp Compuestos triciclicos de sulfonamida utiles para inhibir la funcion de la proteina-g y para el tratamiento de enfermedades proliferativas.
ATE210652T1 (de) 1993-10-15 2001-12-15 Schering Corp Tricyclische carbamat-derivate zur inhibierung der g-protein funktion und für die behandlung von proliferativen erkrankungen
IL111235A (en) 1993-10-15 2001-03-19 Schering Plough Corp Medicinal preparations for inhibiting protein G activity and for the treatment of malignant diseases, containing tricyclic compounds, some such new compounds and a process for the preparation of some of them
US5721236A (en) 1993-10-15 1998-02-24 Schering Corporation Tricyclic carbamate compounds useful for inhibition of G-protein function and for treatment of proliferative diseases
US5661152A (en) 1993-10-15 1997-08-26 Schering Corporation Tricyclic sulfonamide compounds useful for inhibition of G-protein function and for treatment of proliferative diseases
US5472672A (en) 1993-10-22 1995-12-05 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Apparatus and method for polymer synthesis using arrays
US5470710A (en) 1993-10-22 1995-11-28 University Of Utah Automated hybridization/imaging device for fluorescent multiplex DNA sequencing
KR100378615B1 (ko) 1993-10-25 2003-10-10 파크데이비스앤드캄파니 단백질:파르네실트랜스퍼라제의치환된테트라및펜타펩티드억제제
US6156501A (en) 1993-10-26 2000-12-05 Affymetrix, Inc. Arrays of modified nucleic acid probes and methods of use
AU7947594A (en) 1993-10-27 1995-05-22 Merck Sharp & Dohme Limited Substituted amides as tachykinin antagonists
US5429807A (en) 1993-10-28 1995-07-04 Beckman Instruments, Inc. Method and apparatus for creating biopolymer arrays on a solid support surface
US5344991A (en) 1993-10-29 1994-09-06 G.D. Searle & Co. 1,2 diarylcyclopentenyl compounds for the treatment of inflammation
US5783593A (en) 1993-11-04 1998-07-21 Abbott Laboratories Inhibitors of squalene synthetase and protein farnesyltransferase
WO1995012572A1 (en) 1993-11-04 1995-05-11 Abbott Laboratories Cyclobutane derivatives as inhibitors of squalene synthetase and protein farnesyltransferase
KR100362338B1 (ko) 1993-11-05 2003-04-08 워너-램버트 캄파니 단백질:파르네실트랜스퍼라아제의치환디-및트리펩티드억제제
US6403577B1 (en) 1993-11-17 2002-06-11 Eli Lilly And Company Hexamethyleneiminyl tachykinin receptor antagonists
US5466823A (en) 1993-11-30 1995-11-14 G.D. Searle & Co. Substituted pyrazolyl benzenesulfonamides
IT1271462B (it) 1993-12-03 1997-05-28 Menarini Farma Ind Antagonisti delle tachichinine,procedimento per la loro preparazione e loro impiego in formulazioni farmaceutiche.
US5484799A (en) 1993-12-09 1996-01-16 Abbott Laboratories Antifungal dorrigocin derivatives
IL111960A (en) 1993-12-17 1999-12-22 Merck & Co Inc Morpholines and thiomorpholines their preparation and pharmaceutical compositions containing them
JPH09506898A (ja) 1993-12-21 1997-07-08 イーライ・リリー・アンド・カンパニー 非ペプチドタキキニン受容体アンタゴニスト
KR100286412B1 (ko) 1993-12-29 2001-04-16 더블유. 지. 콜 치환된 모르폴린 유도체, 이의 제조방법 및 이를 포함하는 약제학적 조성물
DE69416869T2 (de) 1993-12-29 1999-07-01 Pfizer Inc., New York, N.Y. Diazabicyclische neurokinin antagonisten
JPH09507500A (ja) 1994-01-13 1997-07-29 メルク シヤープ エンド ドーム リミテツド ｇｅｍ二置換アザシクロ系のタキキニン拮抗薬
WO1995020575A1 (en) 1994-01-28 1995-08-03 Merck Sharp & Dohme Limited Aralkylamino substituted azacyclic therapeutic agents
US5393790A (en) 1994-02-10 1995-02-28 G.D. Searle & Co. Substituted spiro compounds for the treatment of inflammation
US5631734A (en) 1994-02-10 1997-05-20 Affymetrix, Inc. Method and apparatus for detection of fluorescently labeled materials
GB9402688D0 (en) 1994-02-11 1994-04-06 Merck Sharp & Dohme Therapeutic agents
US5610165A (en) 1994-02-17 1997-03-11 Merck & Co., Inc. N-acylpiperidine tachykinin antagonists
IL112778A0 (en) 1994-03-04 1995-05-26 Merck & Co Inc Substituted heterocycles, their preparation and pharmaceutical compositions containing them
WO1995024612A1 (de) 1994-03-07 1995-09-14 International Business Machines Corporation Verfahren und vorrichtung zur schnellen interpolation von zwischenwerten aus periodischen phasenverschobenen signalen und zur erkennung von defekten in einem drehkörper
FI963597L (fi) 1994-03-15 1996-11-14 Eisai Co Ltd Isoprenyylitransferaasi-inhibiittoreita
FR2718136B1 (fr) 1994-03-29 1996-06-21 Sanofi Sa Composés aromatiques aminés, procédé pour leur obtention et compositions pharmaceutiques les contenant.
HUT72440A (en) 1994-03-31 1996-04-29 Bristol Myers Squibb Co Imidazole-containing inhibitors of farnesyl protein transferase and pharmaceutical compositions containing them
US5523430A (en) 1994-04-14 1996-06-04 Bristol-Myers Squibb Company Protein farnesyl transferase inhibitors
US5610145A (en) 1994-04-15 1997-03-11 Warner-Lambert Company Tachykinin antagonists
PE27997A1 (es) 1994-04-29 1997-09-20 Lilly Co Eli Antagonistas de receptores de taquicininas
US5747491A (en) 1994-05-05 1998-05-05 Merck Sharp & Dohme Ltd. Morpholine derivatives and their use as antagonists of tachikinins
JPH09512806A (ja) 1994-05-07 1997-12-22 ベーリンガー インゲルハイム コマンディトゲゼルシャフト 新規なアミノ酸誘導体、その製造方法及びこれらの化合物を含む医薬組成物（ｉｉ）
US5510510A (en) 1994-05-10 1996-04-23 Bristol-Meyers Squibb Company Inhibitors of farnesyl protein transferase
US5571639A (en) 1994-05-24 1996-11-05 Affymax Technologies N.V. Computer-aided engineering system for design of sequence arrays and lithographic masks
US5563255A (en) 1994-05-31 1996-10-08 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense oligonucleotide modulation of raf gene expression
JPH10501228A (ja) 1994-06-06 1998-02-03 ワーナー−ランバート・コンパニー タキキニン（ｎｋ▲下１▼）受容体アンタゴニスト
EP0686629A3 (en) 1994-06-10 1999-02-10 Eli Lilly And Company Cyclohexyl tachykinine receptor antagonists
CN1150419A (zh) 1994-06-10 1997-05-21 罗纳-布朗克罗莱尔股份有限公司 新的法呢基转移酶抑制剂、其制法及其药物组合物
US5807522A (en) 1994-06-17 1998-09-15 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods for fabricating microarrays of biological samples
US5571792A (en) 1994-06-30 1996-11-05 Warner-Lambert Company Histidine and homohistidine derivatives as inhibitors of protein farnesyltransferase
CZ288434B6 (en) 1994-07-12 2001-06-13 Lilly Co Eli Dihydrochloride trihydrate of (R)-3-(1H-indol-3-yl)-1-[N-(2-methoxybenzyl)acetylamino]-2-[N-/2-(4-piperid-1-yl)piperid-1-yl)acetyl/-amino]propane, pharmaceutical preparation in which it is comprised and use thereof
CA2154116A1 (en) 1994-07-22 1996-01-23 Philip Arthur Hipskind 1-aryl-2-acetamidopentanone derivatives for use as tachykinin receptor antagonists
GB9415997D0 (en) 1994-08-08 1994-09-28 Merck Sharp & Dohme Therapeutic agents
GB9415996D0 (en) 1994-08-08 1994-09-28 Merck Sharp & Dohme Therapeutic agents
WO1996005529A1 (en) 1994-08-09 1996-02-22 Micron Optics, Inc. Temperature compensated fiber fabry-perot filters
TW432061B (en) 1994-08-09 2001-05-01 Pfizer Res & Dev Lactams
CA2155448A1 (en) 1994-08-11 1996-02-12 Katerina Leftheris Inhibitors of farnesyl protein transferase
WO1996005168A1 (en) 1994-08-11 1996-02-22 Banyu Pharmaceutical Co., Ltd. Substituted amide derivative
WO1996005169A1 (en) 1994-08-12 1996-02-22 Banyu Pharmaceutical Co., Ltd. N,n-disubstituted amic acid derivative
WO1996005181A1 (en) 1994-08-15 1996-02-22 Merck Sharp & Dohme Limited Morpholine derivatives and their use as therapeutic agents
DE4429506B4 (de) 1994-08-19 2007-09-13 Degussa Gmbh Verfahren zur Extraktion natürlicher Carotinoid-Farbstoffe
DE4429653C2 (de) 1994-08-20 1997-04-03 Anton Dr More Konverter und Verfahren zum Frischen von Metallschmelzen insbesondere von Roheisen zu Stahl
WO1996006094A1 (en) 1994-08-25 1996-02-29 Merrell Pharmaceuticals Inc. Novel substituted piperidines useful for the treatment of allergic diseases
ATE158568T1 (de) 1994-08-29 1997-10-15 Akzo Nobel Nv Verfahren zur herstellung von quaternären diestern
GB9417956D0 (en) 1994-09-02 1994-10-26 Merck Sharp & Dohme Therapeutic agents
GB9418545D0 (en) 1994-09-15 1994-11-02 Merck Sharp & Dohme Therapeutic agents
US5457107A (en) 1994-09-16 1995-10-10 Merck & Co., Inc. Polymorphic form of a tachykinin receptor antagonist
CA2198382A1 (en) 1994-09-30 1996-04-11 Novartis Ag 1-acyl-4-aliphatylaminopiperidine compounds
TW397825B (en) 1994-10-14 2000-07-11 Novartis Ag Aroyl-piperidine derivatives
FR2725986B1 (fr) 1994-10-21 1996-11-29 Adir Nouveaux derives de piperidine, leur procede de preparation et les compositions pharmaceutiques qui les contiennent
US5556752A (en) 1994-10-24 1996-09-17 Affymetrix, Inc. Surface-bound, unimolecular, double-stranded DNA
EP0709375B1 (en) 1994-10-25 2005-05-18 AstraZeneca AB Therapeutic heterocycles
GB9421709D0 (en) 1994-10-27 1994-12-14 Zeneca Ltd Therapeutic compounds
WO1996016443A1 (en) 1994-11-22 1996-05-30 Philips Electronics N.V. Semiconductor device with a carrier body on which a substrate with a semiconductor element is fastened by means of a glue layer and on which a pattern of conductor tracks is fastened
EP0714891A1 (en) 1994-11-22 1996-06-05 Eli Lilly And Company Heterocyclic tachykinin receptor antagonists
FR2727411B1 (fr) 1994-11-30 1997-01-03 Rhone Poulenc Rorer Sa Nouveaux derives de perhydroisoindole, leur preparation et les compositions pharmaceutiques qui les contiennent
CA2204144A1 (en) 1994-12-09 1996-06-13 Francis J. Tinney Substituted tetra- and pentapeptide inhibitors of protein:farnesyl transferase
IL116323A0 (en) 1994-12-13 1996-03-31 Sandoz Ag Tachykinin antagonists their preparation and pharmaceutical compositions containing them
GB9426103D0 (en) 1994-12-23 1995-02-22 Merck Sharp & Dohme Therapeutic agents
WO1996021701A2 (en) 1995-01-09 1996-07-18 Magla International Ltd. Wear resistant image printing on latex surfaces
AU4915796A (en) 1995-01-12 1996-07-31 University Of Pittsburgh Inhibitors of prenyl transferases
ATE279406T1 (de) 1995-01-12 2004-10-15 Glaxo Group Ltd Piperidinderivate mit tachykinin-antagonistischer wirkung
FR2729390A1 (fr) 1995-01-18 1996-07-19 Rhone Poulenc Rorer Sa Nouveaux inhibiteurs de farnesyl transferase, leur preparation et les compositions pharmaceutiques qui les contiennent
FR2729951B1 (fr) 1995-01-30 1997-04-18 Sanofi Sa Nouveaux composes heterocycliques, procede pour leur preparation et compositions pharmaceutiques en contenant
FR2730492B1 (fr) 1995-02-09 1997-03-14 Rhone Poulenc Rorer Sa Nouveaux inhibiteurs de farnesyl transferase, leur preparation et les compositions pharmaceutiques qui les contiennent
FR2730491B1 (fr) 1995-02-09 1997-03-14 Rhone Poulenc Rorer Sa Nouveaux inhibiteurs de farnesyl transferase, leur preparation et les compositions pharmaceutiques qui les contiennent
US5633272A (en) 1995-02-13 1997-05-27 Talley; John J. Substituted isoxazoles for the treatment of inflammation
GB9505492D0 (en) 1995-03-18 1995-05-03 Merck Sharp & Dohme Therapeutic agents
GB9505491D0 (en) 1995-03-18 1995-05-03 Merck Sharp & Dohme Therapeutic agents
US5554641A (en) 1995-03-20 1996-09-10 Horwell; David C. Nonpeptides as tachykinin antagonists
GB9505692D0 (en) 1995-03-21 1995-05-10 Glaxo Group Ltd Chemical compounds
US5684013A (en) 1995-03-24 1997-11-04 Schering Corporation Tricyclic compounds useful for inhibition of g-protein function and for treatment of proliferative diseases
TW394773B (en) 1995-03-24 2000-06-21 Takeda Chemical Industries Ltd Cyclic compounds for antagonizing tachykinin receptor, substance p receptor and neurokinin a receptor, their production and pharmaceutical composition
US5700806A (en) 1995-03-24 1997-12-23 Schering Corporation Tricyclic amide and urea compounds useful for inhibition of G-protein function and for treatment of proliferative diseases
IL117580A0 (en) 1995-03-29 1996-07-23 Merck & Co Inc Inhibitors of farnesyl-protein transferase and pharmaceutical compositions containing them
US5565568A (en) 1995-04-06 1996-10-15 Eli Lilly And Company 2-acylaminopropanamides as tachykinin receptor antagonists
IL117798A (en) 1995-04-07 2001-11-25 Schering Plough Corp Tricyclic compounds useful for inhibiting the function of protein - G and for the treatment of malignant diseases, and pharmaceutical preparations containing them
US5712280A (en) 1995-04-07 1998-01-27 Schering Corporation Tricyclic compounds useful for inhibition of G-protein function and for treatment of proliferative diseases
US5891872A (en) 1995-04-07 1999-04-06 Schering Corporation Tricyclic compounds
CA2217351C (en) 1995-04-07 2003-03-18 Schering Corporation Carbonyl-piperazinyl and piperidinyl compounds which inhibit farnesyl protein transferase
AU700693B2 (en) 1995-04-13 1999-01-14 Aventis Pharmaceuticals Inc. Novel substituted piperazine derivatives having tachykinin receptor antagonists activity
US5831115A (en) 1995-04-21 1998-11-03 Abbott Laboratories Inhibitors of squalene synthase and protein farnesyltransferase
US5624711A (en) 1995-04-27 1997-04-29 Affymax Technologies, N.V. Derivatization of solid supports and methods for oligomer synthesis
IL118101A0 (en) 1995-05-03 1996-09-12 Abbott Lab Inhibitors of farnesyltransferase
HUP9900822A3 (en) 1995-05-25 1999-11-29 Fujisawa Pharmaceutical Co Piperazine derivatives, process for producing them, pharmaceutical compositions containing them and method for treating tachykinin-mediated diseases
US5545531A (en) 1995-06-07 1996-08-13 Affymax Technologies N.V. Methods for making a device for concurrently processing multiple biological chip assays
WO1997000252A1 (en) 1995-06-16 1997-01-03 Warner-Lambert Company Tricyclic inhibitors of protein farnesyltransferase
GB9513118D0 (en) 1995-06-28 1995-08-30 Merck Sharp & Dohme Therapeutic agents
GB9513121D0 (en) 1995-06-28 1995-08-30 Merck Sharp & Dohme Therapeutic agents
GB9513117D0 (en) 1995-06-28 1995-08-30 Merck Sharp & Dohme Therapeutic agents
US6180647B1 (en) 1995-07-07 2001-01-30 Pfizer Inc. Substituted benzolactam compounds as substance P antagonists
FR2736641B1 (fr) 1995-07-10 1997-08-22 Rhone Poulenc Rorer Sa Nouveaux inhibiteurs de farnesyl transferase, leur preparation et les compositions pharmaceutiques qui les contiennent
AT402617B (de) 1995-07-11 1997-07-25 Datacon Schweitzer & Zeindl Gm Anlage zum automatisierten, hermetischen anlage zum automatisierten, hermetischen verschliessen von gehäusen verschliessen von gehäusen
FR2736638B1 (fr) 1995-07-12 1997-08-22 Rhone Poulenc Rorer Sa Nouveaux inhibiteurs de farnesyl transferase, leur preparation et les compositions pharmaceutiques qui les contiennent
CH690163A5 (fr) 1995-07-28 2000-05-31 Symphar Sa Dérivés gem-diphosphonates substitués utiles en tant qu'agents anti-cancers.
US5569588A (en) 1995-08-09 1996-10-29 The Regents Of The University Of California Methods for drug screening
TW340842B (en) 1995-08-24 1998-09-21 Pfizer Substituted benzylaminopiperidine compounds
US5661028A (en) 1995-09-29 1997-08-26 Lockheed Martin Energy Systems, Inc. Large scale DNA microsequencing device
US6020343A (en) 1995-10-13 2000-02-01 Merck Frosst Canada, Inc. (Methylsulfonyl)phenyl-2-(5H)-furanones as COX-2 inhibitors
JP2002534955A (ja) 1995-10-18 2002-10-15 メルク エンド カンパニー インコーポレーテッド シクロペンチルタキキニン受容体アンタゴニスト
CA2235986C (en) 1995-11-06 2006-09-12 University Of Pittsburgh Inhibitors of protein isoprenyl transferases
DE19541283A1 (de) 1995-11-06 1997-05-07 Boehringer Ingelheim Kg Neue Aminosäurederivate, Verfahren zu ihrer Herstellung und diese Verbindungen enthaltende pharmazeutische Zusammensetzungen
GB9523244D0 (en) 1995-11-14 1996-01-17 Merck Sharp & Dohme Therapeutic agents
US6288237B1 (en) 1995-11-17 2001-09-11 Gesellschaft Fur Biotechnologische Forschung Mbh (Gbf) Epothilons C and D, preparation and compositions
EP0862435A4 (en) 1995-11-22 1999-02-03 Merck & Co Inc Inhibitors of farnesyl-protein transferase
US6060469A (en) 1995-11-23 2000-05-09 Merck Sharp & Dohme Ltd. Spiro-piperidine derivatives and their use as tachykinin antagonists
GB9524157D0 (en) 1995-11-25 1996-01-24 Pfizer Ltd Therapeutic agents
HU224225B1 (hu) 1995-12-01 2005-06-28 Sankyo Co. Ltd. Tachikinin receptor antagonista hatású heterociklusos vegyületek, ezek előállítási eljárása és alkalmazásuk gyógyszerkészítmények előállítására
EE03484B1 (et) 1995-12-08 2001-08-15 Janssen Pharmaceutica N.V. Farnesüülproteiintransferaasi inhibeerivad (5-imidasolüül)metüül-2-kinolinooni derivaadid ja nende kasutamine
GB9525296D0 (en) 1995-12-11 1996-02-07 Merck Sharp & Dohme Therapeutic agents
US6022963A (en) 1995-12-15 2000-02-08 Affymetrix, Inc. Synthesis of oligonucleotide arrays using photocleavable protecting groups
EP1380581A1 (en) 1995-12-22 2004-01-14 Schering Corporation Tricyclic amides useful for inhibition of G-protein function and for treatment of proliferative diseases
WO1997026246A1 (en) 1996-01-16 1997-07-24 Warner-Lambert Company Substituted histidine inhibitors of protein farnesyltransferase
US6673927B2 (en) 1996-02-16 2004-01-06 Societe De Conseils De Recherches Et D'applications Scientifiques, S.A.S. Farnesyl transferase inhibitors
US5744349A (en) * 1996-03-05 1998-04-28 Washington University DNA sequences encoding human Myt1 kinase
CA2249601A1 (en) 1996-04-03 1997-10-23 Thorsten E. Fisher Inhibitors of farnesyl-protein transferase
BR9708574A (pt) 1996-04-12 1999-08-03 Searle & Co Derivados benzeno sulfonamida substituídos como pródrogas de inibidores cox-2
EP0938494A1 (en) 1996-05-22 1999-09-01 Warner-Lambert Company Inhibitors of protein farnesyl transferase
EP0918771A4 (en) 1996-07-15 2001-02-07 Bristol Myers Squibb Co THIADIOXOBENZODIAZEPINES FOR USE AS FARNESYL PROTEIN TRANSFERASE INHIBITORS
US5861419A (en) 1996-07-18 1999-01-19 Merck Frosst Canad, Inc. Substituted pyridines as selective cyclooxygenase-2 inhibitors
US6020194A (en) * 1996-10-04 2000-02-01 California Institute Of Technology DNA encoding a Myt1 polypeptide
US6242469B1 (en) 1996-12-03 2001-06-05 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Synthesis of epothilones, intermediates thereto, analogues and uses thereof
CA2276150A1 (en) 1996-12-30 1998-07-09 Steven D. Young Inhibitors of farnesyl-protein transferase
JP2002511054A (ja) 1996-12-30 2002-04-09 メルク エンド カンパニー インコーポレーテッド ファルネシル蛋白トランスフェラーゼ阻害薬
ID29970A (id) 1998-11-23 2001-10-25 Novartis Ag Metode untuk mengobati penyakit neovaskuler okuler
CA2361553A1 (en) 1999-01-29 2000-08-03 Zhenping Zhu Antibodies specific to kdr and uses thereof
GB9904387D0 (en) 1999-02-25 1999-04-21 Pharmacia & Upjohn Spa Antitumour synergistic composition
AU4972900A (en) 1999-04-08 2000-11-14 Arch Development Corporation Use of anti-vegf antibody to enhance radiation in cancer therapy
US6077674A (en) 1999-10-27 2000-06-20 Agilent Technologies Inc. Method of producing oligonucleotide arrays with features of high purity
JP2003528076A (ja) 2000-03-20 2003-09-24 メルク シャープ エンド ドーム リミテッド スルホンアミド置換架橋ビシクロアルキル誘導体
GB0012671D0 (en) 2000-05-24 2000-07-19 Merck Sharp & Dohme Therapeutic agents
GB0025173D0 (en) 2000-10-13 2000-11-29 Merck Sharp & Dohme Therapeutic agents
JP3880051B2 (ja) 2000-11-02 2007-02-14 メルク シャープ エンド ドーム リミテッド γ−セクレターゼ阻害剤としてのスルファミド
UA74849C2 (en) 2000-11-17 2006-02-15 Lilly Co Eli Lactam
GB0108592D0 (en) 2001-04-05 2001-05-23 Merck Sharp & Dohme Therapeutic agents
GB0108591D0 (en) 2001-04-05 2001-05-23 Merck Sharp & Dohme Therapeutic agents
WO2002083140A1 (en) 2001-04-10 2002-10-24 Merck & Co., Inc. Inhibitors of akt activity
AU2002251266A1 (en) 2001-04-10 2002-10-28 Merck Sharp And Dohme Limited Inhibitors of akt activity
WO2002083139A1 (en) 2001-04-10 2002-10-24 Merck & Co., Inc. Inhibitors of akt activity
ATE400274T1 (de) 2001-04-10 2008-07-15 Merck & Co Inc Hemmstoffe der akt aktivität
WO2002083064A2 (en) 2001-04-10 2002-10-24 Merck & Co., Inc. A method of treating cancer
GB0119152D0 (en) 2001-08-06 2001-09-26 Merck Sharp & Dohme Therapeutic agents
WO2003013526A1 (en) 2001-08-08 2003-02-20 Merck & Co. Inc. Anticoagulant compounds
JP3711131B2 (ja) 2001-08-21 2005-10-26 メルク シャープ エンド ドーム リミテッド 新規のシクロヘキシルスルホン
AU2002332122A1 (en) 2001-10-15 2003-04-28 The Medstar Research Institute Modulation of akt-dependent response to prevent restenosis
WO2003035048A2 (en) 2001-10-26 2003-05-01 Novartis Ag Methods for the treatment of osteoarthritis and compositions thereof
US7060705B2 (en) 2001-11-07 2006-06-13 Merck & Co., Inc. Mitotic kinesin inhibitors
US7378411B2 (en) 2001-12-06 2008-05-27 Merck & Co., Inc. Substituted thienopyrimidinones as a mitotic kinesin inhibitor
EP1481077B1 (en) 2001-12-06 2009-11-04 Merck & Co., Inc. Mitotic kinesin inhibitors
JP4391825B2 (ja) 2001-12-06 2009-12-24 メルク エンド カムパニー インコーポレーテッド 有糸分裂キネシン阻害剤
CA2467916A1 (en) 2001-12-06 2003-06-19 Merck & Co., Inc. Mitotic kinesin inhibitors
US7244723B2 (en) 2001-12-06 2007-07-17 Merck & Co., Inc. Substituted furopyrimidinones as a mitotic kinesin inhibitors
CA2478068C (en) 2002-03-08 2011-02-08 Merck & Co., Inc. Dihydropyrazole compounds useful for treating or preventing cancer
US7273869B2 (en) 2002-04-08 2007-09-25 Merck & Co., Inc. Inhibitors of Akt activity
WO2003086279A2 (en) 2002-04-08 2003-10-23 Merck & Co., Inc. Inhibitors of akt activity
WO2003086403A1 (en) 2002-04-08 2003-10-23 Merck & Co., Inc. Inhibitors of akt activity
WO2003086394A1 (en) 2002-04-08 2003-10-23 Merck & Co., Inc. Inhibitors of akt activity
WO2003084473A2 (en) 2002-04-08 2003-10-16 Merck & Co., Inc. Method of treating cancer
GB0209991D0 (en) 2002-05-01 2002-06-12 Merck Sharp & Dohme Therapeutic agents
ATE435219T1 (de) 2002-05-01 2009-07-15 Merck Sharp & Dohme Heteroaryl substituierte spirocyclische sulfamide zur hemmung von gamma sekretase
GB0209997D0 (en) 2002-05-01 2002-06-12 Merck Sharp & Dohme Therapeutic agents
GB0209995D0 (en) 2002-05-01 2002-06-12 Merck Sharp & Dohme Therapeutic agents
CA2485343A1 (en) 2002-05-23 2004-05-13 Merck & Co., Inc. Mitotic kinesin inhibitors
AU2003231799A1 (en) 2002-05-23 2003-12-12 Merck & Co., Inc. Mitotic kinesin inhibitors
JP4377323B2 (ja) 2002-06-14 2009-12-02 メルク エンド カムパニー インコーポレーテッド 有糸分裂キネシン阻害剤
JP4463679B2 (ja) 2002-06-14 2010-05-19 メルク エンド カムパニー インコーポレーテッド 有糸分裂キネシン阻害剤
GB0223038D0 (en) 2002-10-04 2002-11-13 Merck Sharp & Dohme Therapeutic compounds
GB0223039D0 (en) 2002-10-04 2002-11-13 Merck Sharp & Dohme Therapeutic compounds
GB0223040D0 (en) 2002-10-04 2002-11-13 Merck Sharp & Dohme Therapeutic compounds
EP1556052A4 (en) 2002-10-18 2006-11-02 Merck & Co Inc MITOTIC KINESINE HEMMER
US7399764B2 (en) 2002-10-30 2008-07-15 Merck & Co., Inc. Inhibitors of Akt activity
US20040102360A1 (en) 2002-10-30 2004-05-27 Barnett Stanley F. Combination therapy
GB0225474D0 (en) 2002-11-01 2002-12-11 Merck Sharp & Dohme Therapeutic agents
GB0225475D0 (en) 2002-11-01 2002-12-11 Merck Sharp & Dohme Therapeutic agents
AU2003295843A1 (en) 2002-12-06 2004-06-30 Pharmacia Corporation Mitoneet polypeptide from mitochondrial membranes, modulators thereof, and methods of using the same
EP1581497A4 (en) 2002-12-20 2009-03-18 Merck & Co Inc INHIBITORS OF MITOTIC KINESINE
WO2004058700A2 (en) 2002-12-20 2004-07-15 Merck & Co., Inc. Mitotic kinesin inhibitors
GB0308318D0 (en) 2003-04-10 2003-05-14 Merck Sharp & Dohme Therapeutic agents
CN100422158C (zh) 2003-04-24 2008-10-01 麦克公司 Akt活性抑制剂
AU2004233828B2 (en) 2003-04-24 2009-05-28 Merck Sharp & Dohme Corp. Inhibitors of Akt activity
EP1631548B1 (en) 2003-04-24 2009-10-28 Merck & Co., Inc. Inhibitors of akt activity
US7638530B2 (en) 2003-04-24 2009-12-29 Merck & Co., Inc. Inhibitors of Akt activity
MXPA05012323A (es) 2003-05-16 2006-01-30 Merck Sharp & Dohme Sulfonamidas ciclicas para la inhibicion de gama-secretasa.
JP2007501863A (ja) 2003-06-12 2007-02-01 メルク　エンド　カムパニー　インコーポレーテッド 有糸分裂キネシン阻害剤
CA2686618A1 (en) 2003-07-17 2005-01-17 At&T Corp. Method and apparatus for windowing in entropy encoding
GB0318447D0 (en) 2003-08-05 2003-09-10 Merck Sharp & Dohme Therapeutic agents
KR100536215B1 (ko) 2003-08-05 2005-12-12 삼성에스디아이 주식회사 플라즈마 디스플레이 패널
CA2533435A1 (en) 2003-08-13 2005-03-03 Merck & Co., Inc. Mitotic kinesin inhibitors
CN1835756A (zh) 2003-08-15 2006-09-20 默克公司 有丝分裂驱动蛋白抑制剂
CA2534729A1 (en) 2003-08-15 2005-02-24 Merck & Co., Inc. Mitotic kinesin inhibitors
US20060234984A1 (en) 2003-08-15 2006-10-19 Coleman Paul J Mitotic kinesin inhibitors
AR045342A1 (es) 2003-08-15 2005-10-26 Merck & Co Inc Inhibidores de quinesina mitotica
CA2539042A1 (en) 2003-09-24 2005-04-07 Merck Sharp & Dohme Limited Gamma-secretase inhibitors
US7294640B2 (en) 2004-02-06 2007-11-13 Merck & Co., Inc. Mitotic kinesin inhibitors
AU2005233569B2 (en) 2004-04-09 2010-08-19 Merck Sharp & Dohme Corp. Inhibitors of Akt activity
CA2561311A1 (en) 2004-04-09 2005-10-27 Merck & Co., Inc. Inhibitors of akt activity
WO2006091395A2 (en) 2005-02-14 2006-08-31 Merck & Co., Inc. Inhibitors of akt activity
EP1871376A4 (en) 2005-04-12 2010-04-28 Merck Sharp & Dohme HAMMER OF ACT ACTIVITY
PL1898903T3 (pl) 2005-06-10 2013-08-30 Merck Sharp & Dohme Inhibitory aktywności Akt
EP1963531B1 (en) 2005-12-23 2011-09-21 Nanostring Technologies, Inc. Nanoreporters and methods of manufacturing and use thereof
AR060635A1 (es) 2006-04-27 2008-07-02 Banyu Pharma Co Ltd Derivados de 1,2-dihidro-3h-pirazolo[3,4-d]pirimidin-3-ona, composiciones farmaceuticas que los comprenden y su uso en el tratamiento del cancer
JP5411847B2 (ja) * 2007-04-25 2014-02-12 Ｍｓｄ株式会社 Ｗｅｅｌキナーゼインヒビターとしてのジヒドロピラゾロピリミジノン誘導体の多形
MX2009013728A (es) 2007-06-15 2010-01-25 Banyu Pharma Co Ltd Derivados de bicicloanilina.
EP2303885B1 (en) * 2008-06-12 2013-07-03 Merck Sharp & Dohme Corp. Process for producing bicycloaniline derivatives
US8703779B2 (en) * 2009-09-15 2014-04-22 Merck Sharp & Dohme Corp. Preparation of crystalline forms of dihydropyrazolopyrimidinone
EP2640386B1 (en) * 2010-11-16 2017-01-18 Array Biopharma Inc. Combination of checkpoint kinase 1 inhibitors and wee 1 kinase inhibitors
WO2013039854A1 (en) * 2011-09-15 2013-03-21 Merck Sharp & Dohme Corp. Compositions and methods for treating cancer

Also Published As

Publication number Publication date
EP2925888B1 (en) 2017-10-25
KR20150088257A (ko) 2015-07-31
WO2014085216A1 (en) 2014-06-05
HK1209798A1 (en) 2016-04-08
JP6290237B2 (ja) 2018-03-07
ES2651347T3 (es) 2018-01-25
NO2941224T3 (sr) 2018-07-28
US20160008361A1 (en) 2016-01-14
MX2015006729A (es) 2015-08-14
KR102161331B1 (ko) 2020-09-29
RU2660349C2 (ru) 2018-07-05
LT2925888T (lt) 2018-01-10
BR112015012295A2 (pt) 2017-07-11
EP2925888A4 (en) 2016-05-11
CA2892361A1 (en) 2014-06-05
MX363243B (es) 2019-03-14
DK2925888T3 (en) 2017-12-18
AU2013352568A1 (en) 2015-04-30
AU2013352568B2 (en) 2019-09-19
EP2925888A1 (en) 2015-10-07
HUE035662T2 (en) 2018-05-28
PT2925888T (pt) 2017-12-13
RU2015125575A (ru) 2017-01-10
SMT201700595T1 (it) 2018-03-08
SI2925888T1 (en) 2018-02-28
ME02925B (me) 2018-04-20
US9655899B2 (en) 2017-05-23
HRP20180002T1 (hr) 2018-02-09
PL2925888T3 (pl) 2018-03-30
BR112015012295A8 (pt) 2023-03-14
CY1119676T1 (el) 2018-04-04
JP2016500110A (ja) 2016-01-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP2925888B1 (en) Compositions and methods for treating cancer
EP2755482B1 (en) Combination of mk-1775 and mk-8776 for treating cancer
WO2014062454A1 (en) Compositions and methods for treating cancer
JP2020073520A (ja) Ｗｅｅ１阻害剤を用いた癌を処置する方法
US20160130659A1 (en) Compositions and methods for treating cancer
US9023865B2 (en) Compounds that are ERK inhibitors
US20130287763A1 (en) Combination therapy for treating cancer comprising an igf-1r inhibitor and an akt inhibitor
EP2608669A1 (en) NOVEL PYRAZOLO[1,5-a]PYRIMIDINE DERIVATIVES AS mTOR INHIBITORS
EP2632462A1 (en) Novel heteroaryl-carboxamide derivatives as pdk1 inhibitors
EP2822557B1 (en) Preparation and use of bicyclic himbacine derivatives as par-receptor antagonists
CA2714087A1 (en) Inhibitors of checkpoint kinases
US7550477B2 (en) Inhibitors of checkpoint kinases
HK1209798B (en) Compositions and methods for treating cancer
WO2012058174A1 (en) Novel thiazole-carboxamide derivatives as pdk1 inhibitors
EP2616451A1 (en) Novel thiazol-carboximide derivatives as pdk1 inhibitors
WO2010002955A2 (en) Stemness signature biomarkers and methods of use