RS56677B1

RS56677B1 - Proizvodnja i karakterizacija potpuno humanih terapeutskih antitela dobijenih hucal gold tehnologijom, specifičnih za humani cd38

Info

Publication number: RS56677B1
Application number: RS20171300A
Authority: RS
Inventors: Michael Tesar; Ute Jäger
Original assignee: Morphosys Ag
Priority date: 2005-10-12
Filing date: 2006-10-12
Publication date: 2018-03-30
Also published as: BRPI0618399B1; NO20081972L; US11939395B2; US20240309109A1; NZ566915A; KR101574920B1; IL190665B; KR20150139636A; PL2860192T3; JP2009511033A; EP2860192A2; AR055191A1; KR101472250B1; LT2860192T; US20120052078A1; ME02886B; BRPI0618399A2; HUE035250T2; SI2860192T1; TW200730624A

Description

Opis

Osnova pronalaska

[0001] Specifična anti-CD38 antitela su poznata u stanju tehnike. Videti, na primer, US 2002/164788 i EP 1174 440.

REZIME PRONALASKA

[0002] Predmetni pronalazak se odnosi na humano specifično anti-CD38 antitelo koje sadrži:

(i) H-CDR1, H-CDR2 i H-CDR3 region prikazan u SEQ ID NO: 21, i L-CDR1, L-CDR2 i L-CDR3 region prikazan u SEQ ID NO: 51;

(ii) varijabilni teški lanac sekvence SEQ ID NO: 21, i varijabilni laki lanac sekvence SEQ ID NO: 51; ili

(iii) varijabilni teški lanac kodiran sekvencom SEQ ID NO: 6, i varijabilni laki lanac kodiran sekvencom SEQ ID NO: 36.

[0003] U EP1174440 opisan je jednolančani fragment (scFv) UM16 specifičan za CD38. Međutim, u poređenju sa ovde opisanim antitelima, UM16 ne može da posreduje u ADCC i/ili CDC aktivnosti i dodatno se razlikuje po svojstvima vezivanja.

[0004] U dodatnom primeru izvođenja, ovde dati opis se odnosi na izolovano antitelo ili njegov funkcionalni fragment koji je specifičan za CD38, koji sadrži (i) varijabilni teški lanac prikazan u SEQ ID NO: 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105 ili 106 ili (ii) varijabilni teški lanac koji ima najmanje šezdeset procenata identičnosti sa varijabilnim teškim lancem prikazanim u SEQ ID NO: 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105 ili 106.

[0005] Dodatno, predmetni opis se odnosi na izolovani antigen-vezujući region koji je specifičan za CD38, koji sadrži (i) L-CDR3 region prikazan u SEQ ID NO: 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 109 ili 110, ili (ii) L-CDR3 region koji ima najmanje šezdeset procenata identičnosti sa L-CDR3 regionom prikazanim u SEQ ID NO: 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 109 ili 110.

[0006] Takođe, predmetni opis se odnosi na izolovano antitelo ili njegov funkcionalni fragment, koji sadrži (i) varijabilni laki lanac prikazan u SEQ ID NO: 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 109 ili 110 ili (ii) varijabilni laki lanac koji ima najmanje šezdeset procenata identičnosti sa varijabilnim lakim lancem prikazanim u SEQ ID NO: 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 109 ili 110.

[0007] Predmetni opis se dodatno odnosi na varijabilni teški lanac izolovanog antigenvezujućeg regiona koji je kodiran (i) sekvencom nukleinske kiseline koja sadrži SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90 ili 91, ili (ii) sekvencama nukleinske kiseline koje hibridizuju pod uslovima visoke strogosti sa komplementarnim lancem sekvence SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90 ili 91, gde je pomenuti antigen-vezujući region specifičan za CD38.

[0008] Predmetni opis se takođe odnosi na varijabilni laki lanac izolovanog antigenvezujućeg regiona koji je kodiran (i) sekvencom nukleinske kiseline koja sadrži SEQ ID NO: 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 107 ili 108, ili (ii) sekvencama nukleinske kiseline koje hibridizuju pod uslovima visoke strogosti sa komplementarnim lancem sekvence SEQ ID NO: 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 107 ili 108, gde je pomenuto antitelo ili njegov funkcionalni fragment specifično za CD38.

[0009] Dalje, predmetni opis se odnosi na izolovanu sekvencu nukleinske kiseline koja kodira antigen-vezujući region humanog antitela ili njegov funkcionalni fragment koji je specifičan za CD38.

[0010] Dodatno, opis se odnosi na sekvencu nukleinske kiseline koja kodira varijabilni teški lanac izolovanog antigen-vezujućeg regiona, koji sadrži (i) sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NOS: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90 i 91, ili (ii) sekvencu nukleinske kiseline koja hibridizuje pod uslovima visoke strogosti sa komplementarnim lancem sekvence SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90 ili 91, gde je pomenuti antigen-vezujući region specifičan za CD38.

[0011] Predmetni opis takođe se odnosi na sekvencu nukleinske kiseline koja kodira varijabilni laki lanac izolovanog antigen-vezujućeg regiona, koji sadrži (i) sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NOS: 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 107 i 108, ili (ii) sekvencu nukleinske kiseline koja hibridizuje pod uslovima visoke strogosti sa komplementarnim lancem sekvence SEQ ID NO: 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 107 ili 108, gde je pomenuti antigen-vezujući region specifičan za CD38.

[0012] Predmetni opis dodatno se odnosi na postupak za indukciju specifičnog uništavanja tumorskih ćelija koje eksprimiraju CD38, gde se pomenuto specifično uništavanje odvija pomoću unakrsnog vezivanja CD38, koji obuhvata korak inkubacije pomenutih ćelija u prisustvu dovoljne količine izolovanog humanog ili humanizovanog anti-CD38 antitela ili njegovog funkcionalnog fragmenta, gde pomenuto humano ili humanizovano anti-CD38 antitelo sadrži (i) sekvencu nukleinske kiseline koja kodira teški lanac prikazan u SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90 ili 91, ili (ii) sekvence nukleinske kiseline koje hibridizuju pod uslovima visoke strogosti sa komplementarnim lancem sekvence SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90 ili 91, gde je pomenuto antitelo ili njegov funkcionalni fragment specifično za CD38.

[0013] Dodatno, predmetni opis se odnosi na postupak za indukciju specifičnog uništavanja tumorskih ćelija koje eksprimiraju CD38, gde se pomenuto specifično uništavanje odvija pomoću unakrsnog vezivanja CD38, koji obuhvata korak inkubacije pomenutih ćelija u prisustvu dovoljne količine izolovanog humanog ili humanizovanog anti-CD38 antitela ili njegovog funkcionalnog fragmenta, gde pomenuto humano ili humanizovano anti-CD38 antitelo sadrži (i) sekvencu nukleinske kiseline koja kodira laki lanac prikazan u SEQ ID NO: 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 107 ili 108, ili (ii) sekvence nukleinske kiseline koje hibridizuju pod uslovima visoke strogosti sa komplementarnim lancem sekvence SEQ ID NO: 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 107 ili 108, gde je pomenuto antitelo ili njegov funkcionalni fragment specifično za CD38.

[0014] Takođe, predmetni opis se odnosi na postupak za indukciju specifičnog uništavanja tumorskih ćelija koje eksprimiraju CD38, gde se pomenuto specifično uništavanje odvija pomoću unakrsnog vezivanja CD38, koji obuhvata korak inkubacije pomenutih ćelija u prisustvu dovoljne količine izolovanog humanog ili humanizovanog anti-CD38 antitela, ili njegovog funkcionalnog fragmenta, gde pomenuto humano ili humanizovano anti-CD38 antitelo, ili njegov pomenuti funkcionalni fragment sadrži (i) aminokiselinsku sekvencu teškog lanca prikazanu u SEQ ID NO: 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105 ili 106, ili (ii) varijabilni teški lanac koji ima najmanje šezdeset procenata identičnosti sa varijabilnim teškim lancem prikazanim u SEQ ID NO: 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105 ili 106.

[0015] Takođe, predmetni opis se odnosi na postupak za indukciju specifičnog uništavanja tumorskih ćelija koje eksprimiraju CD38, gde se pomenuto specifično uništavanje odvija pomoću unakrsnog vezivanja CD38, koji obuhvata korak inkubacije pomenutih ćelija u prisustvu dovoljne količine izolovanog humanog ili humanizovanog anti-CD38 antitela, ili njegovog funkcionalnog fragmenta, gde pomenuto humano ili humanizovano anti-CD38 antitelo sadrži (i) i/ili aminokiselinsku sekvencu lakog lanca prikazanu u SEQ ID NO: 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 109 ili 110, ili (ii) varijabilni laki lanac koji ima najmanje šezdeset procenata identičnosti sa varijabilnim lakim lancem prikazanim u SEQ ID NO: 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 109 ili 110.

[0016] Dalje, predmetni opis se odnosi na postupak za detekciju specifičnog uništavanja tumorskih ćelija koje eksprimiraju CD38, pomoću unakrsnog vezivanja CD38, koji obuhvata korake:

(i) primene kod subjekta kome je to potrebno efikasne količine humanog ili humanizovanog anti-CD38 antitela ili njegovog funkcionalnog fragmenta, i

(ii) detekcije aktivnosti pomenutog humanog ili humanizovanog anti-CD38 antitela ili njegovog pomenutog funkcionalnog fragmenta u vidu specifičnog uništavanja.

[0017] Takođe, predmetni opis se odnosi na postupak za detekciju prisustva CD38 u tkivu ili ćeliji poreklom od mini-svinje, koji obuhvata korake:

(i) omogućavanja humanom ili humanizovanom anti-CD38 antitelu ili njegovom funkcionalnom fragmentu da dođe u dodir sa pomenutim CD38, i

(ii) detekcije specifičnog vezivanja pomenutog humanog ili humanizovanog anti-CD38 antitela, ili njegovog funkcionalnog fragmenta sa pomenutim CD38 ćelijama mini-svinje, gde je pomenuto antitelo ili njegov funkcionalni fragment takođe sposoban da se specifično veže za CD38 humanog porekla.

[0018] Osim toga, predmetni opis se odnosi na postupak za detekciju CD38 u eritrocitima koji ispoljavaju CD38, koji obuhvata korake:

(i) omogućavanja humanom ili humanizovanom anti-CD38 antitelu ili njegovom funkcionalnom fragmentu da dođe u dodir sa pomenutim eritrocitom koji ispoljava CD38, i

(ii) detekcije specifičnog vezivanja pomenutog humanog ili humanizovanog anti-CD38 antitela, ili njegovog funkcionalnog fragmenta sa pomenutim eritrocitima koji ispoljavaju CD38, gde je pomenuto antitelo ili njegov funkcionalni fragment takođe sposoban da se specifično veže za humani CD38 iz ćelije ili tkiva osim humanih eritrocita.

[0019] Predmetni opis takođe se odnosi na izolovano antitelo ili njegov funkcionalni fragment, koji sadrži (i) H-CDR3 region prikazan u SEQ ID NO: 21 ili 22, ili (ii) H-CDR3 region sa najmanje šezdeset procenata identičnosti sa njim, i koji je specifičan za humani CD38 i CD38 marmozet majmuna.

KRATAK OPIS SLIKA

[0020]

Slika 1a prikazuje sekvence nukleinske kiseline različitih varijabilnih regiona teškog lanca antitela.

Slika 1b prikazuje aminokiselinske sekvence različitih varijabilnih regiona teškog lanca antitela. CDR regioni HCDR1, HCDR2 i HCDR3 su označeni od N- do C-kraja podebljanim slovima.

Slika 2a prikazuje sekvence nukleinske kiseline različitih varijabilnih regiona lakog lanca antitela.

Slika 2b prikazuje aminokiselinske sekvence različitih varijabilnih regiona lakog lanca antitela. CDR regioni LCDR1, LCDR2 i LCDR3 su označeni od N- do C-kraja podebljanim slovima.

Slika 3 prikazuje aminokiselinske sekvence varijabilnih regiona teškog lanca različitih sekvenci master gena HuCAL antitela baziranih na konsenzusu. CDR regioni HCDR1, HCDR2 i HCDR3 su označeni od N- do C-kraja podebljanim slovima.

Slika 4 prikazuje aminokiselinske sekvence varijabilnih regiona lakog lanca različitih sekvenci master gena HuCAL antitela baziranih na konsenzusu. CDR regioni LCDR1, LCDR2 i LCDR3 su označeni od N- do C-kraja podebljanim slovima.

Slika 5 prikazuje aminokiselinsku sekvencu CD38 (SWISS-PROT primarni pristupni broj P28907).

Slika 6 prikazuje nukleotidne sekvence teških i lakih lanaca himernog OKT10.

Slika 7 prikazuje DNK sekvencu pMORPH® _h_IgG1_1 (bp 601-2100) (SEQ ID NO: 74): Vektor se zasniva na pcDNA3.1+ vektorima (Invitrogen). Aminokiselinska sekvenca VH-„stuffer“ sekvence je naznačena podebljanim slovima, dok su finalni okviri čitanja VH-lider sekvence i gena za konstantni region odštampani nepodebljanim slovima. Restrikciona mesta su naznačena iznad sekvence. Mesta vezivanja prajmera za sekvenciranje su podvučena.

Slika 8 prikazuje DNK sekvencu ekspresionog vektora pMORPH®_h_Igκ_1 za kapa laki lanac (bp 601-1400) Ig (SEQ ID NO: 75): Vektor se zasniva na pcDNA3.1+ vektorima (Invitrogen). Aminokiselinske sekvence Vκ-„stuffer“ sekvence su naznačene podebljanim slovima, dok su finalni okviri čitanja Vκ -lider sekvence i gena za konstantni region odštampani nepodebljanim slovima. Restrikciona mesta su naznačena iznad sekvence. Mesta vezivanja prajmera za sekvenciranje su podvučena. Slika 9 prikazuje DNK sekvencu vektora pMORPH<®>_h_Igλ_▪ za lambda laki lanac (bp 601-1400) HuCAL Ig (SEQ ID NO: 76): Aminokiselinska sekvenca Vλ▪-„stuffer“ sekvence je naznačena podebljanim slovima, dok su finalni okviri čitanja Vλ▪-lider sekvence i gena za konstantni region odštampani nepodebljanim slovima. Restrikciona mesta su naznačena iznad sekvence. Mesta vezivanja prajmera za sekvenciranje su podvučena.

Slika 10 prikazuje različite kombinacije teških i lakih lanaca u Fab/IgG formatu.

Slika 11 prikazuje ispitivanje ekspresije CD38 u limfocitima i eritrocitima dobijenim pomoću FACS metode. PBMC ćelije i eritrociti su izolovani iz pune krvi cinomolgus, rezus i marmozet majmuna centrifugiranjem u gradijentu gustine praćenim FACS-analizom korišćenjem anti-CD38 Fab antitela MOR03087 (A, desni histogrami, svetla strelica) i MOR03088 (B, desni histogrami, svetla strelica). Kao negativna kontrola korišćeno je irelevantno Fab-antitelo (A i B, levi histogrami; crna strelica).

Slika 12 prikazuje ispitivanje ekspresije CD38 u limfocitima i eritrocitima dobijenim pomoću FACS metode. PBMC ćelije i eritrociti su izolovani iz pune krvi čoveka, cinomolgus i marmozet majmuna centrifugiranjem u gradijentu gustine praćenim FACS-analizom korišćenjem anti-CD38 IgG1 MOR03087 (desni histogrami; bela strelica). Kao negativna kontrola korišćeno je irelevantno IgG1 kontrolno antitelo (A i B, levi histogrami; crna strelica).

Slika 13 prikazuje uporedni pregled unakrsne reaktivnosti različitih anti-CD38 antitela.

Slike 14(a) i 14(b) ističu CDR i FR regione za određena antitela i porede aminokiseline na datom položaju jedne sa drugim, i sa odgovarajućim konsenzus sekvencama.

DETALJAN OPIS PRONALASKA

[0021] Predmetni opis se zasniva na otkriću novih antitela i postupaka za upotrebu antitela koja su specifična za, ili imaju visok afinitet za CD38, i mogu da pruže terapeutsku korist subjektu. Antitela, koja mogu da budu humana ili humanizovana, mogu da se koriste u mnogim kontekstima, koji su ovde potpunije opisani.

[0022] "Humano" antitelo ili funkcionalni fragment humanog antitela se ovde definiše kao ono koje nije himerno (npr., nije "humanizovano") i ne potiče (bilo celo ili delom) od nehumane vrste. Humano antitelo ili funkcionalni fragment antitela može da bude dobijeno iz čoveka ili može da bude sintetsko humano antitelo. "Sintetsko humano antitelo" se ovde definiše kao antitelo koje ima sekvencu izvedenu, u celosti ili delom, in silico iz sintetskih sekvenci koje su zasnovane na analizi poznatih sekvenci humanih antitela. In silico dizajn sekvence humanog antitela ili njegovog fragmenta može da se postigne, na primer, analizom baze podataka sekvenci humanih antitela ili fragmenta antitela i osmišljavanjem polipeptidne sekvence korišćenjem podataka dobijenih iz njih. Drugi primer humanog antitela ili funkcionalnog fragmenta antitela, je ono koje je kodirano nukleinskom kiselinom izolovanom iz biblioteke sekvenci antitela humanog porekla (tj., takve biblioteke zasnovane na antitelima uzetim iz humanog prirodnog izvora).

[0023] "Humanizovano antitelo" ili funkcionalni fragment humanizovanog antitela se ovde definiše kao ono koje je (i) izvedeno iz nehumanog izvora (npr., transgenog miša koji nosi heterologni imunski sistem), pri čemu je antitelo zasnovano na sekvenci humane klicine linije; ili (ii) himerno, gde je varijabilni domen nehumanog porekla, a konstantni domen je humanog porekla; ili (iii) sa kalemljenim CDR regionima, gde su CDR regioni varijabilnog domena nehumanog porekla, dok je jedan ili više okvirnih regiona varijabilnog domena humanog porekla, i konstantni domen (ako je prisutan) je humanog porekla.

[0024] Kako se ovde koristi, antitelo "se specifično vezuje za," je "specifično prema/za" ili "specifično prepoznaje" antigen (ovde, CD38) ako je takvo antitelo sposobno da napravi razliku između takvog antigena i jednog ili više referentnog(ih) antigena, budući da specifičnost vezivanja nije apsolutno, već relativno svojstvo. U svom najopštijem obliku (i kada se ne pominje definisana referenca), "specifično vezivanje" se odnosi na sposobnost antitela da razlikuje antigen od interesa od nesrodnog antigena, određeno, na primer, u skladu sa jednim od sledećih postupaka. Takvi postupci obuhvataju Western blotove, ELISA-, RIA-, ECL-, IRMA-testove, FACS, IHC i peptidne skenove. Na primer, standardni ELISA test može da se sprovede. Bodovanje može da se obavi pomoću standardnog razvijanja boje (npr. sekundarno antitelo sa peroksidom rena i tetrametil benzidin sa vodonikperoksidom). Reakcija u pojedinim bunarčićima se boduje pomoću optičke gustine, na primer, na 450 nm. Tipičan pozadinski šum (=negativna reakcija) može da bude 0.1 OD; tipična pozitivna reakcija može da bude 1 OD. To znači da razlika pozitivno/negativno može da bude veća od 10-struke. Tipično, određivanje specifičnosti vezivanja se sprovodi korišćenjem ne jednog referentnog antigena, već niza od oko tri do pet nesrodnih antigena, kao što je mleko u prahu, BSA, transferin ili slično. Moguće je da antitelo bude "specifično prema" ili "specifično za" antigen iz 2 ili više ćelija/tkiva i/ili 2 ili više vrsta, obezbeđujući da antitelo ispunjava kriterijum vezivanja za svaku od takvih ćelija/tkiva i vrsta, na primer. Prema tome, antitelo može da se veže specifično za ciljni antigen CD38 na različitim ćelijskim tipovima i/ili tkivima, npr. eritrocitima, limfocitima izolovanim iz periferne krvi, slezine ili limfnih čvorova. Dodatno, antitelo može da bude specifično i za CD38 jedne vrste i za CD38 druge vrste.

[0025] "Specifično vezivanje" takođe može da se odnosi na sposobnost antitela da napravi razliku između ciljnog antigena i jednog ili više blisko povezanih antigena, koji se koriste kao referentne tačke npr. između CD38 i CD157. Dodatno, "specifično vezivanje" može da se odnosi na sposobnost antitela da razlikuje različite delove svog ciljnog antigena, npr. različite domene ili regione CD38, kao što su epitopi u N-terminalnom ili u C-terminalnom regionu CD38, ili jedan ili više ključnih aminokiselinskih ostataka ili nizova aminokiselinskih ostataka u CD38.

[0026] Takođe, kako se ovde koristi, "imunoglobulin" (Ig) se ovde definiše kao protein koji pripada klasi IgG, IgM, IgE, IgA, ili IgD (ili bilo kojoj njihovoj potklasi), i uključuje sva uobičajeno poznata antitela i njihove funkcionalne fragmente. "Funkcionalni fragment" antitela/imunoglobulina ovde se definiše kao fragment antitela/imunoglobulina (npr., varijabilni region IgG) koji zadržava antigen-vezujući region. "Antigen-vezujući region" antitela tipično se nalazi u jednom ili više hipervarijabilnih regiona antitela, tj., regionima CDR-1, -2, i/ili -3; međutim, varijabilni "okvirni" regioni mogu takođe da igraju važnu ulogu u vezivanju antigena, kao što je obezbeđivanje nosača za CDR regione. Poželjno, "antigenvezujući region" sadrži bar aminokiselinske ostatke 4 do 103 varijabilnog lakog (VL) lanca i 5 do 109 varijabilnog teškog (VH) lanca, poželjnije aminokiselinske ostatke 3 do 107 u VL i 4 do 111 u VH, i naročito poželjno su potpuni VL i VH lanci (aminokiselinske pozicije 1 do 109 u VL i 1 do 113 u VH; numerisano prema WO 97/08320). Poželjna klasa imunoglobulina za upotrebu u predmetnom pronalasku je IgG. "Funkcionalni fragmenti" opisa uključuju domen F(ab’)2fragmenta, Fab fragmenta i scFv. F(ab’)2ili Fab mogu da budu dizajnirani tako da međumolekulske disulfidne interakcije do kojih dolazi između CH1i CLdomena budu smanjene ili potpuno uklonjene.

[0027] Termin "parentalni vezujući protein" kako se koristi u vezi sa predmetnim opisom označava bilo koji vezujući protein koji nije pretrpeo postupak optimizacije. Postupak optimizacije je opisan na drugom mestu u predmetnoj specifikaciji.

[0028] Termin "vezujući protein", kako se koristi u vezi sa predmetnim opisom, može da se koristi kao sinonim termina "imunoglobulin" ili "antitelo".

[0029] Antitelo za upotrebu u pronalasku može da bude izvedeno iz biblioteke rekombinantnog antitela koja se zasniva na aminokiselinskim sekvencama koje su dizajnirane in silico i kodirane nukleinskim kiselinama koje su sintetički stvorene. In silico stvaranje sekvence antitela se postiže, na primer, analiziranjem baze podataka humanih sekvenci i osmišljavanjem polipeptidne sekvence korišćenjem podataka dobijenih iz njih. Postupci za dizajniranje i dobijanje in silico sekvenci opisani su, na primer, kod Knappik et al., J. Mol. Biol. (2000) 296:57; Krebs et al., J. Immunol. Methods. (2001) 254:67; i SAD patent br.

6,300,064 izdatom za Knappik et al.

Antitela za upotrebu u pronalasku

[0030] U ovom dokumentu, upućuje se na sledeća reprezentativna antitela za upotrebu u ovom pronalasku: "antitelo br." ili "LACS" ili "MOR" 3076 ili 03076, 3078 ili 03078, 3081 ili 03081, 3085 ili 03085, 3086 ili 03086, 3087 ili 03087, 3088 ili 03088, 3089 ili 03089, 3101 ili 03101, 3102 ili 03102, 3127 ili 03127, 3128 ili 03128, 3129 ili 03129, 3130 ili 03130, 3131 ili 03131, 6183 ili 06183, 6184 ili 06184, 6185 ili 06185, 6186 ili 06186, 6187 ili 06187, 6188 ili 06188, 6189 ili 06189, 6190 ili 06190, 6192 ili 06192, 6195 ili 06195, 6197 ili 06197, 6200 ili 06200, 6201 ili 06201, 6204 ili 06204, 6214 ili 06214, 6278 ili 06278, 6279 ili 06279. LAC 3076 predstavlja antitelo koje ima varijabilni teški region koji odgovara sekvenci SEQ ID NO: 1 (DNK)/SEQ ID NO: 16 (protein) i varijabilni laki region koji odgovara sekvenci SEQ ID NO: 31 (DNK)/SEQ ID NO: 46 (protein). LAC 3078 predstavlja antitelo koje ima varijabilni teški region koji odgovara sekvenci SEQ ID NO: 2 (DNK)/SEQ ID NO: 17 (protein) i varijabilni laki region koji odgovara sekvenci SEQ ID NO: 32 (DNK)/SEQ ID NO: 47 (protein). LAC 3081 predstavlja antitelo koje ima varijabilni teški region koji odgovara sekvenci SEQ ID NO: 3 (DNK)/SEQ ID NO: 18 (protein) i varijabilni laki region koji odgovara sekvenci SEQ ID NO: 33 (DNK)/SEQ ID NO: 48 (protein). LAC 3085 predstavlja antitelo koje ima varijabilni teški region koji odgovara sekvenci SEQ ID NO: 4 (DNK)/SEQ ID NO: 19 (protein) i varijabilni laki region koji odgovara sekvenci SEQ ID NO: 34 (DNK)/SEQ ID NO: 49 (protein). LAC 3086 predstavlja antitelo koje ima varijabilni teški region koji odgovara sekvenci SEQ ID NO: 5 (DNK)/SEQ ID NO: 20 (protein) i varijabilni laki region koji odgovara sekvenci SEQ ID NO: 35 (DNK)/SEQ ID NO: 50 (protein). LAC 3087 predstavlja antitelo koje ima varijabilni teški region koji odgovara sekvenci SEQ ID NO: 6 (DNK)/SEQ ID NO: 21 (protein) i varijabilni laki region koji odgovara sekvenci SEQ ID NO: 36 (DNK)/SEQ ID NO: 51 (protein). LAC 3088 predstavlja antitelo koje ima varijabilni teški region koji odgovara sekvenci SEQ ID NO: 7 (DNK)/SEQ ID NO: 22 (protein) i varijabilni laki region koji odgovara sekvenci SEQ ID NO: 37 (DNK)/SEQ ID NO: 52 (protein). LAC 3089 predstavlja antitelo koje ima varijabilni teški region koji odgovara sekvenci SEQ ID NO: 8 (DNK)/SEQ ID NO: 23 (protein) i varijabilni laki region koji odgovara sekvenci SEQ ID NO: 38 (DNK)/SEQ ID NO: 53 (protein). LAC 3101 predstavlja antitelo koje ima varijabilni teški region koji odgovara sekvenci SEQ ID NO: 9 (DNK)/SEQ ID NO: 24 (protein) i varijabilni laki region koji odgovara sekvenci SEQ ID NO: 39 (DNK)/SEQ ID NO: 54 (protein). LAC 3102 predstavlja antitelo koje ima varijabilni teški region koji odgovara sekvenci SEQ ID NO: 10 (DNK)/SEQ ID NO: 25 (protein) i varijabilni laki region koji odgovara sekvenci SEQ ID NO: 40 (DNK)/SEQ ID NO: 55 (protein). LAC 3127 predstavlja antitelo koje ima varijabilni teški region koji odgovara sekvenci SEQ ID NO: 11 (DNK)/SEQ ID NO: 26 (protein) i varijabilni laki region koji odgovara sekvenci SEQ ID NO: 41 (DNK)/SEQ ID NO: 56 (protein). LAC 3128 predstavlja antitelo koje ima varijabilni teški region koji odgovara sekvenci SEQ ID NO: 12 (DNK)/SEQ ID NO: 27 (protein) i varijabilni laki region koji odgovara sekvenci SEQ ID NO: 42 (DNK)/SEQ ID NO: 57 (protein). LAC 3129 predstavlja antitelo koje ima varijabilni teški region koji odgovara sekvenci SEQ ID NO: 13 (DNK)/SEQ ID NO: 28 (protein) i varijabilni laki region koji odgovara sekvenci SEQ ID NO: 43 (DNK)/SEQ ID NO: 58 (protein). LAC 3130 predstavlja antitelo koje ima varijabilni teški region koji odgovara sekvenci SEQ ID NO: 14 (DNK)/SEQ ID NO: 29 (protein) i varijabilni laki region koji odgovara sekvenci SEQ ID NO: 44 (DNK)/SEQ ID NO: 59 (protein). LAC 3131 predstavlja antitelo koje ima varijabilni teški region koji odgovara sekvenci SEQ ID NO: 15 (DNK)/SEQ ID NO: 30 (protein) i varijabilni laki region koji odgovara sekvenci SEQ ID NO: 45 (DNK)/SEQ ID NO: 60 (protein). Osim toga, optimizovani klonovi, koji su izvedeni iz parentalnih vezujućih proteina MOR03087 i MOR03088, sadrže sledeće: MOR06183 predstavlja antitelo koje ima varijabilni teški region koji odgovara sekvenci SEQ ID NO: 77 (DNK)/SEQ ID NO: 92 (protein). MOR06184 predstavlja antitelo koje ima varijabilni teški region koji odgovara sekvenci SEQ ID NO: 78 (DNK)/SEQ ID NO: 93 (protein). MOR06185 predstavlja antitelo koje ima varijabilni teški region koji odgovara sekvenci SEQ ID NO: 79 (DNK)/SEQ ID NO: 94 (protein). MOR06186 predstavlja antitelo koje ima varijabilni teški region koji odgovara sekvenci SEQ ID NO: 80 (DNK)/SEQ ID NO: 95 (protein). MOR06187 predstavlja antitelo koje ima varijabilni teški region koji odgovara sekvenci SEQ ID NO: 81 (DNK)/SEQ ID NO: 96 (protein). MOR06188 predstavlja antitelo koje ima varijabilni teški region koji odgovara sekvenci SEQ ID NO: 82 (DNK)/SEQ ID NO: 97. MOR06189 predstavlja antitelo koje ima varijabilni teški region koji odgovara sekvenci SEQ ID NO: 83 (DNK)/SEQ ID NO:98 (protein). MOR06190 predstavlja antitelo koje ima varijabilni teški region koji odgovara sekvenci SEQ ID NO: 84 (DNK)/SEQ ID NO: 99 (protein). MOR06192 predstavlja antitelo koje ima varijabilni teški region koji odgovara sekvenci SEQ ID NO: 85 (DNK)/SEQ ID NO: 100 (protein). MOR06195 predstavlja antitelo koje ima varijabilni teški region koji odgovara sekvenci SEQ ID NO: 86 (DNK)/SEQ ID NO: 101 (protein). MOR06197 predstavlja antitelo koje ima varijabilni teški region koji odgovara sekvenci SEQ ID NO: 87 (DNK)/SEQ ID NO: 102 (protein). MOR06200 predstavlja antitelo koje ima varijabilni teški region koji odgovara sekvenci SEQ ID NO: 88 (DNK)/SEQ ID NO: 103 (protein). MOR06201 predstavlja antitelo koje ima varijabilni teški region koji odgovara sekvenci SEQ ID NO: 89 (DNK)/SEQ ID NO: 104 (protein). MOR 06204 predstavlja antitelo koje ima varijabilni teški region koji odgovara sekvenci SEQ ID NO: 90 (DNK)/SEQ ID NO: 105 (protein). MOR06214 predstavlja antitelo koje ima varijabilni teški region koji odgovara sekvenci SEQ ID NO: 91 (DNK)/SEQ ID NO: 106 (protein). MOR06278 predstavlja antitelo koje ima varijabilni laki region koji odgovara sekvenci SEQ ID NO: 107 (DNK)/SEQ ID NO: 109 (protein). MOR 06279 predstavlja antitelo koje ima varijabilni laki region koji odgovara sekvenci SEQ ID NO: 108 (DNK)/SEQ ID NO: 110 (protein).

[0031] Antitela predmetnog opisa su okarakterisana u Fab i/ili IgG formatu i sadrže različite kombinacije lakih i teških lanaca optimizovanih i parentalnih vezujućih proteina. Slika 10 prikazuje nekoliko neograničavajućih kombinacija koje mogu da se koriste u vezi sa predmetnim opisom.

[0032] U jednom aspektu, predmetni opis obezbeđuje postupke za upotrebu antitela koja imaju antigen-vezujući region koji može da se veže specifično za, ili ima visok afinitet prema jednom ili više regiona CD38, čija je aminokiselinska sekvenca predstavljena sekvencom SEQ ID NO: 71. Kaže se da antitelo ima "visok afinitet" prema antigenu ako je mera afiniteta najmanje 100 nM (monovalentni afinitet Fab fragmenta). Antitelo ili antigen-vezujući region za upotrebu u predmetnom pronalasku poželjno može da se veže za CD38 sa afinitetom od oko manje od 600 nM. Poželjno, antitelo ili antigen-vezujući region za upotrebu u predmetnom pronalasku može da se veže za CD38 sa afinitetom od oko manje od 100 nM, poželjnije manje od oko 60 nM, i još poželjnije manje od oko 30 nM. Dodatno, poželjne su upotrebe antitela koja se vezuju za CD38 sa afinitetom manjim od oko 10 nM, i poželjnije manjim od oko 3 nM. Na primer, afinitet antitela za upotrebu u pronalasku prema CD38 može da bude oko 10.0 nM ili 2.4 nM (monovalentni afinitet Fab fragmenta).

[0033] Tabela 1 prikazuje rezime afiniteta reprezentativnih antitela, određenih pomoću rezonanacije površinskog plazmona (Biacore) i FACS Scatchard-ove analize:

Tabela 1: Afiniteti antitela

[0034] Pozivajući se na tabelu 1, afinitet LAC antitela je izmeren pomoću rezonanacije površinskog plazmona (Biacore) na humanoj CD38-Fc fuziji i pomoću postupka protočne citometrije korišćenjem humane Raji ćelijske linije koja eksprimira CD38. Ispitivanja Biacore su sprovedena na neposredno imobilizovanom antigenu (CD38-Fc fuzioni protein). Fab format LAC antitela ispoljava opseg monovalentnog afiniteta između oko 30 i 596 nM na imobilizovanom CD38-Fc fuzionom proteinu.

[0035] IgG1 format je korišćen za određivanje afiniteta na bazi ćelija (FACS Scatchard). Desna kolona tabele 1 prikazuje jačinu vezivanja LAC antitela u ovom formatu.

[0036] Još jedna poželjna karakteristika poželjnih antitela za upotrebu u predmetnom opisu je njihova specifičnost za oblast unutar N-terminalnog regiona CD38. Na primer, LAC antitela predmetnog opisa mogu specifično da se vežu za N-terminalni region CD38.

[0037] Optimizovana antitela predmetnog opisa su dodatno okarakterisana kao što je prikazano u tabelama 2 i 3. Prikazani su sumirani rezultati za afinitete određeni pomoću rezonanacije površinskog plazmona (Biacore) i FACS Scatchard-ove analize. Dodatno, urađena su i ispitivanja vezivanja za humane eritrocite pomoću FACS metode, i ispitivanja vezivanja za CD38 Fc-fuzioni protein pomoću ELISA testa. Karakterizacija je pokazala da nekoliko optimizovanih vezujućih proteina pokazuje smanjeno vezivanje za humane eritrocite i viši signal u ELISA testu, u poređenju sa parentalnim klonom. Pored toga, derivati MOR03088 imaju poboljšani afinitet, kao što je pokazano pomoću FACS Scatchard-ovih ispitivanja i određivanja afiniteta.

[0038] Tip epitopa za koji se antitelo za upotrebu u predmetnom opisu vezuje može da bude linearan (tj. jedan uzastopni niz aminokiselina) ili konformacioni (tj. višestruki nizovi aminokiselina). Kako bi odredio da li je epitop određenog antitela linearan ili konformacioni, stručnjak može da ispita vezivanje antitela za peptide koji se preklapaju (npr., 13-omerne peptide sa preklapanjem od 11 aminokiselina) koji pokrivaju različite domene CD38. LAC antitela mogu da prepoznaju prekinute ili linearne epitope u N-terminalnom regionu CD38. U kombinaciji sa ovde navedenim saznanjima, stručnjak u oblasti će znati kako da koristi jedan ili više izolovanih epitopa CD38 za proizvodnju antitela koja imaju antigen-vezujući region koji je specifičan za pomenute epitope (npr. korišćenjem sintetskih peptida epitopa CD38 ili ćelija koje eksprimiraju epitope CD38).

[0039] Antitelo za upotrebu u predmetnom opisu poželjno ispoljava unakrsnu reaktivnost među vrstama, prema humanoj i najmanje jednoj nehumanoj vrsti. Nehumane vrste mogu da budu nehumani primat, npr. rezus, babun i/ili cinomolgus majmun. Druge nehumane vrste mogu da budu mini svinja, zec, miš, pacov i/ili hrčak. Antitelo koje ispoljava unakrsnu reaktivnost prema bar jednoj dodatnoj vrsti pored humane može da obezbedi veću fleksibilnost i koristi u odnosu na poznata anti-CD38 antitela, u svrhu obavljanja in vivo ispitivanja kod više vrsta sa istim antitelom. Antitelo koje ispoljava unakrsnu reaktivnost prema mini-svinji i/ili zecu, na primer, može da bude kandidat za toksikološka i bezbednosna ispitivanja.

[0040] Poželjno, antitelo za upotrebu u predmetnom pronalasku nije sposobno da se veže samo za CD38, već je takođe sposobno da posreduje u uništavanju ćelije koja eksprimira CD38. Još specifičnije, antitelo za upotrebu u pronalasku može da ostvari svje terapeutsko dejstvo smanjenjem zastupljenosti CD38-pozitivnih (npr., malignih) ćelija putem efektorskih funkcija antitela. Ove funkcije uključuju ćelijsku citotoksičnost zavisnu od antitela (ADCC) i citotoksičnost zavisnu od komplementa (CDC).

[0041] Ekspresija CD38, međutim, nije nađena samo na imunskim ćelijama mijeloidne (npr. monocitima, granulocitima) i limfoidne linije (npr. aktiviranim B i T-ćelijama; plazma ćelijama), već takođe na odgovarajućim prekursorskim ćelijama. Budući da je važno da ove ćelije ne budu pogođene uništavanjem malignih ćelija posredovanim antitelom, poželjno je da antitela predmetnog pronalaska nisu citotoksična za prekursorske ćelije.

[0042] Pored njegovih katalitičkih dejstava kao ciklaze i hidrolaze ciklične ADP-riboze, CD38 ispoljava sposobnost prenosa signala od biološkog značaja (Hoshino et al., 1997; Ausiello et al., 2000). Ove funkcije mogu da se indukuju in vivo pomoću, npr. interakcija receptor-ligand ili unakrsnog vezivanja sa agonističkim anti-CD38 antitelima, što vodi, npr. mobilizaciji kalcijuma, proliferaciji limfocita i oslobađanju citokina. Poželjno, antitela predmetnog opisa su ne-agonistička antitela.

Varijante peptida

[0043] Predmetni opis takođe obuhvata upotrebu varijanti ovih polipeptida. Uzimajući u obzir predmetni opis i uobičajeno dostupne tehnologije i reference, stručnjak će biti u stanju da pripremi, ispita i koristi funkcionalne varijante ovde opisanih antitela, razumejući da varijante koje imaju sposobnost da posreduju u uništavanju ciljne CD38+ ćelije pripadaju obimu predmetnog opisa. Kako se koristi u ovom kontekstu, "sposobnost da posreduju u uništavanju ciljne CD38+ ćelije" označava funkcionalno svojstvo pripisano anti-CD38 antitelu za upotrebu u pronalasku. Sposobnost posredovanja u uništavanju ciljne CD38+ ćelije, dakle, uključuje sposobnost posredovanja u uništavanju ciljne CD38+ ćelije, npr. pomoću ADCC i/ili CDC, ili pomoću konstrukata toksina konjugovanih sa antitelom za upotrebu u pronalasku.

[0044] Varijanta može da uključuje, na primer, antitelo koje ima bar jedan izmenjen region za određivanje komplementarnosti (CDR) (hipervarijabilni) i/ili okvirni (FR) (varijabilni) domen/poziciju, u odnosu na peptidnu sekvencu koja je ovde opisana. Kako bi se bolje ilustrovao ovaj koncept, sledi kratak opis strukture antitela.

[0045] Antitelo je sačinjeno od dva peptidna lanca, od kojih svaki sadrži jedan (laki lanac) ili tri (teški lanac) konstantna domena i varijabilni region (VL, VH), pri čemu je poslednji u svakom slučaju sačinjen od četiri FR regiona i tri umetnuta CDR regiona. Antigen-vezujuće mesto je obrazovano pomoću jednog ili više CDR regiona, dok FR regioni obezbeđuju strukturni okvir za CDR regione i, stoga, igraju važnu ulogu u vezivanju antigena.

Menjanjem jednog ili više aminokiselinskih ostataka u CDR ili FR regionu, stručnjak rutinski može da proizvede mutirane ili izmenjene sekvence antitela, koje mogu da budu ispitane protiv antigena, za nova ili poboljšana svojstva, na primer.

[0046] Slike 14 a (VH) i 14 b (VL) ističu CDR i FR regione određenih antitela i upoređuju aminokiseline na datoj poziciji jednu sa drugom i sa odgovarajućim konsenzus ili "master gen" sekvencama (kao što je opisano u SAD patentu br.6,300,064).

[0047] Stručnjak će biti u stanju da dizajnira peptidne varijante. Poželjno je da se varijante konstruišu izmenom aminokiselina u jednom ili više CDR regiona; varijanta može takođe da ima jedan ili više izmenjenih okvirnih regiona. Izmene takođe mogu da se uvedu u okvirne regione. Na primer, peptidni FR domen može da se izmeni tamo gde postoji odstupanje aminokiselinskog ostatka u poređenju sa sekvencom klicine linije.

[0048] Osim toga, varijante mogu da se dobiju korišćenjem jednog LAC antitela kao polazne tačke za optimizaciju izmenom jednog ili više aminokiselinskih ostataka u LAC, poželjno aminokiselinskih ostataka u jednom ili više CDR regiona, i pomoću pretraživanja tako nastale kolekcije varijanti antitela za varijante sa poboljšanim svojstvima. Naročito poželjno je menjanje jednog ili više aminokiselinskih ostataka u CDR-3 u VL, CDR-3 u VH, CDR-1 u VL i/ili CDR-2 u VH. Uvođenje promene može da se uradi sintetisanjem kolekcije molekula DNK korišćenjem tehnologije trinukleotidne mutageneze (TRIM) (Virnekäs, B., Ge, L., Plückthun, A., Schneider, K.C., Wellnhofer, G., i Moroney S.E. (1994) Trinucleotide phosphoramidites: ideal reagents for the synthesis of mixed oligonucleotides for random mutagenesis. Nucl. Acids Res. 22, 5600).

Konzervativne aminokiselinske varijante

[0049] Polipeptidne varijante mogu da se naprave tako da očuvaju opštu molekularnu strukturu peptidne sekvence antitela kao što je ovde opisano. S obzirom na osobine pojedinačnih aminokiselina, stručnjak će prepoznati razložne supstitucije. Aminokiselinske supstitucije, tj., "konzervativne supstitucije," mogu da budu izvedene, na primer, na osnovu sličnosti polarnosti, naelektrisanja, rastvornosti, hidrofobnosti, hidrofilnosti, i/ili amfipatične prirode ostataka koji su u pitanju.

[0050] Na primer, (a) nepolarne (hidrofobne) aminokiseline uključuju alanin, leucin, izoleucin, valin, prolin, fenilalanin, triptofan i metionin; (b) polarne neutralne aminokiseline uključuju glicin, serin, treonin, cistein, tirozin, asparagin i glutamin; (c) pozitivno naelektrisane (bazne) aminokiseline uključuju arginin, lizin i histidin; i (d) negativno naelektrisane (kisele) aminokiseline uključuju asparaginsku kiselinu i glutaminsku kiselinu. Supstitucije tipično mogu da se izvedu unutar grupa (a)-(d). Dodatno, gicin i prolin mogu da budu supstituisani jedan drugim na osnovu njihove sposobnosti da naruše α-helikse. Slično, određene aminokiseline, kao što su alanin, cistein, leucin, metionin, glutaminska kiselina, glutamin, histidin i lizin se češće nalaze u α-heliksima, dok se valin, izoleucin, fenilalanin, tirozin, triptofan i treonin češće nalaze u β-naboranim pločama. Glicin, serin, asparaginska kiselina, asparagin i prolin se obično nalaze u prevojima. Neke poželjne supstitucije mogu da se izvedu između sledećih grupa: (i) S i T; (ii) P i G; i (iii) A, V, L i I. S obzirom na poznati genetski kod, i rekombinantne i sintetske DNK tehnike, stručnjak lako može da konstruiše DNK molekule koji kodiraju konzervativne aminokiselinske varijante. U jednom određenom primeru, aminokiselinska pozicija 3 u sekvencama SEQ ID NOS: 5, 6, 7, i/ili 8 može da se izmeni iz Q u E.

[0051] Kako se ovde koristi, "identičnost sekvence" dve polipeptidne sekvence označava procenat aminokiselina koje su identične između sekvenci. "Sličnost sekvence" označava procenat aminokiselina koje su ili identične ili koje predstavljaju konzervativne aminokiselinske supstitucije. Poželjne polipeptidne sekvence imaju identičnost sekvence u CDR regionima od najmanje 60%, poželjnije, najmanje 70% ili 80%, još poželjnije najmanje 90% i najpoželjnije najmanje 95%. Poželjna antitela takođe imaju sličnost sekvence u CDR regionima od najmanje 80%, poželjnije 90% i najpoželjnije 95%. Poželjne polipeptidne sekvence imaju identičnost sekvence u varijabilnim regionima od najmanje 60%, poželjnije, najmanje 70% ili 80%, još poželjnije najmanje 90% i najpoželjnije najmanje 95%. Poželjna antitela takođe imaju sličnost sekvence u varijabilnim regionima od najmanje 80%, poželjnije 90% i najpoželjnije 95%.

DNK molekuli pronalaska

[0052] Predmetni opis takođe se odnosi na upotrebe DNK molekula koji kodiraju antitelo. Ove sekvence uključuju molekule DNK prikazane na slikama 1a i 2a.

[0053] Stručnjak će prepoznati da DNK može da se koristi za identifikovanje svog komplementa i, budući da je DNK dvolančana, svog ekvivalenta ili homologa, upotrebom tehnika hibridizacije nukleinskih kiselina. Takođe će biti jasno da do hibridizacije može da dođe pri manje od 100% komplementarnosti. Međutim, imajući u vidu odgovarajući izbor uslova, tehnike hibridizacije mogu da se koriste za razlikovanje DNK sekvenci na osnovu njihove strukturne povezanosti sa određenom probom. Za uputstva o takvim uslovima videti, Sambrook et al., 1989 (Sambrook, J., Fritsch, E. F. and Maniatis, T. (1989) Molecular Cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, USA) i Ausubel et al., 1995 (Ausubel, F. M., Brent, R., Kingston, R. E., Moore, D. D., Sedman, J. G., Smith, J. A., & Struhl, K. eds. (1995). Current Protocols in Molecular Biology. New York: John Wiley and Sons).

[0054] Strukturna sličnost između dve polinukleotidne sekvence može da se izrazi u funkciji "strogosti" uslova pod kojima će dve sekvence hibridizovati jedna sa drugom. Kako se ovde koristi, termin "strogost" odnosi se na stepen u kome uslovi otežavaju hibridizaciju. Strogi uslovi snažno otežavaju hibridizaciju, i samo strukturno najsličniji molekuli će međusobno hibridizovati pod takvim uslovima. Obrnuto, uslovi koji nisu strogi olakšavaju hibridizaciju molekula koji ispoljavaju manji stepen strukturne povezanosti. Prema tome, strogost uslova hibridizacije je u direktnoj korelaciji sa strukturnim odnosima dve sekvence nukleinske kiseline. Sledeći odnosi su korisni u korelaciji hibridizacije i odnosa sekvenci (gde Tmpredstavlja temperaturu topljenja dupleksa nukleinske kiseline):

a.

b. Tmdupleksa DNK opada za 1°C sa svakim povećanjem broja pogrešno sparenih baznih parova od 1%.

c.

gde su µ1 i µ2 jonske snage dva rastvora.

[0055] Strogost uslova hibridizacije je funkcija mnogo faktora, uključujući ukupnu koncentraciju DNK, jonsku snagu, temperaturu, veličinu probe i prisustvo sredstava koja narušavaju vodoničnu vezu. Faktori koji pospešuju hibridizaciju uključuju visoke koncentracije DNK, velike jonske snage, niske temperature, veću dužinu probe i odsustvo sredstava koja narušavaju vodoničnu vezu. Hibridizacija tipično obuhvata dva koraka: korak "vezivanja" i korak "pranja".

[0056] Prvo, u koraku vezivanja, proba se vezuje za ciljnu sekvencu pod uslovima koji olakšavaju hibridizaciju. Strogost uslova se obično kontroliše u ovom koraku menjanjem temperature. Za uslove visoke strogosti, temperatura je obično između 65°C i 70°C, osim ako se koriste kratke (< 20 nt) oligonukleotidne probe. Tipični hibridizacioni rastvor sadrži 6X SSC, 0.5% SDS, 5X Denhardt-ov rastvor i 100 µg nespecifičnog nosača DNK. Videti Ausubel et al., odeljak 2.9, dodatak 27 (1994). Naravno, poznati su mnogi drugačiji, ali i dalje funkcionalno ekvivalentni puferski uslovi. Kada je stepen srodnosti niži, može da se izabere niža temperatura. Temperature vezivanja za manje stroge uslove su između oko 25°C i 40°C. Umereno strogi uslovi su između najmanje oko 40°C do manje od oko 65°C. Uslovi visoke strogosti iznose najmanje oko 65°C.

[0057] Drugo, višak probe se uklanja pranjem. U ovom koraku obično se primenjuju uslovi veće strogosti. Stoga, ovaj korak "pranja" je najvažniji u određivanju srodnosti pomoću hibridizacije. Rastvori za pranje tipično sadrže niže koncentracije soli. Tipičan rastvor za umereno stroge uslove sadrži 2X SSC i 0.1% SDS. Rastvor za uslove visoke strogosti sadrži ekvivalent (po jonskoj snazi) od manje od oko 0.2X SSC, dok rastvor za uslove poželjne strogosti sadrži 0.1X SSC. Temperature povezane sa uslovima različite strogosti su iste one koje su prethodno diskutovane za korak "vezivanja". Rastvor za pranje takođe se tipično menja više puta tokom pranja. Na primer, tipični uslovi pranja visoke strogosti obuhvataju pranje dva puta tokom 30 minuta na 55°C i tri puta tokom 15 minuta na 60°C.

[0058] Prema tome, predmetni opis uključuje upotrebu molekula nukleinske kiseline koji hibridizuju sa molekulima prikazanim na slikama 1a i 2a pod uslovima visoke strogosti vezivanja i pranja, gde takvi molekuli nukleinske kiseline kodiraju antitelo ili njegov funkcionalni fragment za upotrebe kao što je ovde opisano. Poželjni molekuli (sa stanovišta iRNK) su oni koji imaju najmanje 75% ili 80% (poželjno najmanje 85%, poželjnije najmanje 90% i najpoželjnije najmanje 95%) homologije ili identičnosti sekvence sa jednim od ovde opisanih molekula DNK.

Funkcionalno ekvivalentne varijante

[0059] Još jedna klasa varijanti DNK čija upotreba pripada oblasti opisa može da se opiše imajući u vidu proizvod koji kodiraju (videti peptide navedene na slikama 1b i 2b). Ovi funkcionalno ekvivalentni geni se karakterišu činjenicom da kodiraju iste peptidne sekvence kao one koje se nalaze na slikama 1b i 2b zbog degenerativnosti genetskog koda.

[0060] Jasno je da varijante molekula DNK koje su ovde obezbeđene mogu da se konstruišu na nekoliko različitih načina. Na primer, mogu da se konstruišu kao potpuno sintetske DNK. Postupci za efikasnu sintezu oligonukleotida u opsegu od 20 do oko 150 nukleotida su široko dostupni. Videti Ausubel et al., odeljak 2.11, dodatak 21 (1993). Oligonukleotidi koji se preklapaju mogu da se sintetišu i sklope na način koji je prvo objavljene kod Khorana et al., J. Mol. Biol. 72:209-217 (1971); videti takođe Ausubel et al., gore, odeljak 8.2. Sintetske DNK poželjno su dizajnirane sa pogodnim restrikcionim mestima projektovanim na 5’ i 3’ krajevima gena kako bi se olakšalo kloniranje u odgovarajući vektor.

[0061] Kao što je naznačeno, postupak za pravljenje varijanti treba započeti sa jednom od ovde opisanih DNK i zatim sprovesti mesto-usmerenu mutagenezu. Videti Ausubel et al., gore, poglavlje 8, dodatak 37 (1997). U tipičnom postupku, ciljna DNK se klonira u jednolančanu DNK bakteriofagnog prenosioca. Jednolančana DNK se izoluje i hibridizuje sa oligonukleotidom koji sadrži željenu nukleotidnu izmenu(e). Komplementarni lanac se sintetiše i dvolančani fag se uvodu u domaćina. Deo dobijenog potomstva će sadržati željeni mutant, što može da se potvrdi korišćenjem sekvenciranja DNK. Dodatno, dostupni su različiti postupci koji povećavaju verovatnoću da će potomstvo faga biti željeni mutant. Ovi postupci su dobro poznati stručnjacima u oblasti i kitovi za stvaranje takvih mutanata su komercijalno dostupni.

Rekombinantni DNK konstrukti i ekspresija

[0062] Predmetni opis dodatno obezbeđuje upotrebu rekombinantnih DNK konstrukata koji sadrže jednu ili više nukleotidnih sekvenci predmetnog pronalaska. Rekombinantni konstrukti se koriste zajedno sa vektorom, kao što je plazmidni ili viralni vektor, u koje je ubačen molekul DNK koji kodira antitelo za upotrebu u pronalasku.

[0063] Kodirani gen može da se proizvede tehnikama opisanim kod Sambrook et al., 1989, i Ausubel et al., 1989. Alternativno, DNK sekvence mogu da se sintetizuju hemijski korišćenjem, na primer, aparata za sintetisanje. Videti, na primer, tehnike opisane u OLIGONUCLEOTIDE SYNTHESIS (1984, Gait, ed., IRL Press, Oxford), koja je u celosti ovde uključena referencom. Rekombinantni konstrukti pronalaska su sadržani u ekspresionim vektorima koji su sposobni da eksprimiraju RNK i/ili proteinske proizvode kodirane(ih) DNK. Vektor može dodatno da sadrži regulatorne sekvence, uključujući promotor koji je operativno vezan za otvoreni okvir čitanja (ORF). Vektor može dodatno da sadrži sekvencu selektabilnog markera. Specifičani signali za inicijaciju i bakterijsku sekreciju mogu takođe da budu potrebni za efikasnu translaciju ubačenih sekvenci koje kodiraju ciljni gen.

[0064] Predmetni opis dodatno obezbeđuje upotrebe ćelija-domaćina koje sadrže najmanje jednu od ovde opisanih DNK. Ćelija-domaćin može da bude praktično bilo koja ćelija za koju su ekspresioni vektori dostupni. To može da bude, na primer, ćelija–domaćin višeg eukariota, kao što je sisarska ćelija, ćelija–domaćin nižeg eukariota, kao što je ćelija kvasca, ali je poželjno prokariotska ćelija, kao što je bakterijska ćelija. Uvođenje rekombinantnog konstrukta u ćeliju-domaćina može da se postigne transfekcijom pomoću kalcijum fosfata, DEAE, transfekcijom posredovanom dekstranom, elektroporacijom ili fagnom infekcijom.

Bakterijska ekspresija

[0065] Korisni ekspresioni vektori za upotrebu sa bakterijama se konstruišu ubacivanjem strukturne DNK sekvence koja kodira željeni protein zajedno sa pogodnim signalima za inicijaciju i terminaciju translacije u operativnoj fazi okvira čitanja sa funkcionalnim promotorom. Vektor će sadržati jedan ili više fenotipskih selektabilnih markera i oridžin replikacije da bi se osiguralo održavanje vektora i, ako je poželjno, da bi se obezbedila njegova amplifikacija u domaćinu. Pogodni prokariotski domaćini za transformaciju uključuju E. coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium i različite vrste rodova Pseudomonas, Streptomyces, i Staphylococcus.

[0066] Bakterijski vektori mogu da budu, na primer, na bazi bakteriofaga, plazmida ili fagmida. Ovi vektori mogu da sadrže selektabilni marker i bakterijski oridžin replikacije izveden iz komercijalno dostupnih plazmida koji tipično sadrže elemente dobro poznatog vektora za kloniranje pBR322 (ATCC 37017). Nakon transformacije pogodnog soja domaćina i rasta soja-domaćina do odgovarajuće gustine ćelija, obavlja se derepresija/indukcija odabranog promotora odgovarajućim sredstvima (npr., promenom temperature ili hemijskom indukcijom) i ćelije se gaje tokom dodatnog perioda. Ćelije se tipično sakupljaju centrifugiranjem, izaziva se njihovo raspadanje fizičkim ili hemijskim sredstvima, i nastali sirovi ekstrakt čuva za dalje prečišćavanje.

[0067] U bakterijskim sistemima, brojni ekspresioni vektori mogu da budu pogodno odabrani u zavisnosti od predviđene upotrebe proteina koji se eksprimira. Na primer, kada treba da se proizvede velika količina takvog proteina, za prozvodnju antitela ili za pregledanje peptidnih biblioteka, na primer, mogu da budu poželjni vektori koji upravljaju ekspresijom visokih nivoa fuzionih proteinskih proizvoda koji se lako prečišćavaju.

Terapeutski postupci

[0068] Terapeutski postupci uključuju primenu kod subjekta kome je lečenje potrebno terapeutski efikasne količine antitela obuhvaćenog predmetnim opisom. "Terapeutski efikasna" količina ovde je definisana kao koičina antitela koja je dovoljna da smanji broj CD38-pozitivnih ćelija u tretiranoj oblasti kod subjekta, ili u pojedinačnoj dozi ili u višedoznom režimu, sama, ili u kombinaciji sa drugim sredstvima, što dovodi do ublažavanja neželjenog stanja, pri čemu je ta količina i dalje toksikološki podnošljiva. Subjekat može da bude čovek ili životinja koja nije čovek (npr., zec, pacov, miš, majmun ili drugi primat nižeg reda).

[0069] Antitelo za upotrebu u pronalasku može da se primeni zajedno sa poznatim lekovima, i u nekim slučajevima antitelo može da bude modifikovano. Na primer, antitelo može da bude konjugovano sa imunotoksinom ili radioizotopom da bi mu se potencijalno dodatno povećala efikasnost.

[0070] Poremećaji i stanja posebno pogodni za lečenje antitelom su multipli mijelom (MM) i druge hematološke bolesti, kao što je hronična limfocitna leukemija (CLL), hronična mijeloidna leukemija (CML), akutna mijeloidna leukemija (AML) i akutna limfocitna leukemija (ALL). Antitelo takođe može da se koristi za lečenje inflamatorne bolesti kao što je reumatoidni artritis (RA) ili sistemski lupus eritematozus (SLE).

[0071] Za lečenje bilo kog od gore navedenih poremećaja, farmaceutske kompozicije za upotrebu u skladu sa predmetnim pronalaskom mogu da budu formulisane na uobičajeni način korišćenjem jednog ili više fiziološki prihvatljivih nosača ili ekscipijenasa. Antitelo za upotrebu u pronalasku može da se primeni na bilo koji pogodan način, što može da varira, u zavisnosti od tipa poremećaja koji se leči. Mogući putevi primene uključuju parenteralnu (npr., intramuskularnu, intravensku, intraarterijsku, intraperitonealnu, ili subkutanu), intrapulmonalnu i intranazalnu i, ako je poželjno lokalno imunosupresivno lečenje, intralezionalnu primenu. Dodatno, antitelo za upotrebu u pronalasku može da se primeni pomoću pulsne infuzije, sa, npr., opadajućim dozama antitela. Poželjno, doze se daju putem injekcija, najpoželjnije intravenskim ili subkutanim injekcijama, u zavisnosti delimično od toga da li je primena kratkotrajna ili hronična. Količina koja će se primeniti će zavisiti od različitih faktora kao što su klinički simptomi, težina pojedinca, od toga da li se primenjuju drugi lekovi. Stručnjak će shvatiti da će put primene varirati u zavisnosti od poremećaja ili stanja koje treba da se leči.

[0072] Određivanje terapeutski efikasne količine novog polipeptida uglavnom će zavisiti od svojstava konkretnog pacijenta, puta primene, i prirode poremećaja koji se leči. Opšte smernice se mogu naći, na primer, u publikacijama Međunarodne konferencije o harmonizaciji i u REMINGTON’S PHARMACEUTICAL SCIENCES, poglavlja 27 i 28, pp.

484-528 (18th ed., Alfonso R. Gennaro, Ed., Easton, Pa.: Mack Pub. Co., 1990). Specifičnije, određivanje terapeutski efikasne količine će zavisiti od takvih faktora kao što su toksičnost i efikasnost leka. Toksičnost može da se odredi korišćenjem postupaka dobro poznatih u stanju tehnike i nađenih u gore navedenim referencama. Efikasnost može da se odredi korišćenjem istih smernica zajedno sa postupcima koji su opisani u nastavku teksta u primerima.

Dijagnostički postupci

[0073] CD38 je visoko eksprimiran na hematološkim ćelijama kod određenih maligniteta; tako, anti-CD38 antitelo može da se koristi u cilju snimanja ili vizuelizacije mesta mogućeg nakupljanja malignih ćelija kod pacijenta. U tom pogledu, antitelo može da se obeleži tako da može da se detektuje, korišćenjem radioizotopa, afinitetnih oznaka (kao što je biotin, avidin, itd.) fluorescentnih oznaka, paramagnetskih atoma, itd. Postupci za takvo obeležavanje su dobro poznati u struci. Pregled kliničke primene antitela u dijagnostičkom snimanju dat je kod Grossman, H. B., Urol. Clin. North Amer. 13:465-474 (1986)), Unger, E. C. et al., Invest. Radiol. 20:693-700 (1985)), i Khaw, B. A. et al., Science 209:295-297 (1980)). Poželjna antitela ili antigen-vezujući regioni za upotrebu kao dijagnostičko jedinjenje sadrže sekvencu varijabilnog teškog lanca izabranu iz grupe koja se sastoji od sekvenci SEQ ID NO: 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105 i 106 i/ili sekvencu varijabilnog lakog lanca izabranu iz grupe koja se sastoji od sekvenci SEQ ID NO: 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 109 i 110.

[0074] Detekcija fokusa takvih detektabilno obeleženih antitela može da ukazuje na mesto razvoja tumora, na primer. U jednom primeru izvođenja, ovo ispitivanje se radi uzimanjem uzoraka tkiva ili krvi i inkubacijom takvih uzoraka u prisustvu detektabilno obeleženih antitela. U poželjnom primeru izvođenja, ova tehnika se radi na neinvazivan način upotrebom magnetnog snimanja, fluorografije, itd. Takvo dijagnostičko ispitivanje može da se koristi za praćenje uspeha u lečenju bolesti, tako da je prisustvo ili odsustvo CD38-pozitivnih ćelija relevantan pokazatelj. Opis takođe obuhvata upotrebu anti-CD38 antitela, kao što je ovde opisano, u dijagnostici u ex vivo okruženju.

Terapeutske i dijagnostičke kompozicije

[0075] Antitela za upotrebu u predmetnom pronalasku mogu da budu formulisana prema poznatim postupcima za pripremu farmaceutski korisnih kompozicija, u kojima se antitelo kombinuje u smešu sa farmaceutski prihvatljivim vehikulumom. Pogodni vehikulumi i njihove formulacije su opisane, na primer, u REMINGTON’S PHARMACEUTICAL SCIENCES (18th ed., Alfonso R. Gennaro, Ed., Easton, Pa.: Mack Pub. Co.,1990). Da bi se obrazovala farmaceutski prihvatljiva kompozicija pogodna za efikasnu primenu, takve kompozicije će sadržati efikasnu količinu jednog ili više antitela za upotrebu u predmetnom pronalasku, zajedno sa pogodnom količinom vehikuluma. Poželjna antitela ili antigenvezujući regioni opisa za upotrebu kao dijagnostičko jedinjenje sadrže sekvencu varijabilnog teškog lanca izabranu iz grupe koja se sastoji od sekvenci SEQ ID NO: 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105 i 106 i/ili sekvencu varijabilnog lakog lanca izabranu iz grupe koja se sastoji od sekvenci SEQ ID NO: 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 109 i 110.

[0076] Preparati mogu da budu pogodno formulisani da daju kontrolisano oslobađanje aktivnog jedinjenja. Kontrolisano oslobađanje preparata može da se ostvari upotrebom polimera koji obrazuju kompleks ili apsorbuju anti-CD38 antitelo. Kontrolisana dostava može da se postigne izborom pogodnih makromolekula (na primer poliestara, poliaminokiselina, polivinila, pirolidona, etilenvinil-acetata, metilceluloze, karboksimetilceluloze, ili protamina, sulfata) i koncentracija makromolekula, kao i postupaka sjedinjavanja u cilju kontrolisanja oslobađanja. Drugi mogući postupak za kontrolu trajanja delovanja pomoću preparata sa kontrolisanim oslobađanjem je ubacivanje anti-CD38 antitela u čestice polimernog materijala kao što su poliestri, poliaminokiseline, hidrogelovi, poli(laktična kiselina) ili kopolimeri etilen vinilacetata. Alternativno, umesto ubacivanja ovih sredstava u polimerne čestice, moguće je okružiti ove materijale mikrokapsulama pripremljenim, na primer, tehnikama koacervacije ili polimerizacijom na granici faza, na primer, hidroksi-metilceluloze ili želatinskih-mikrokapsula i mikrokapsula od poli(metilmetacilata), redom, ili koloidnim sistemima za dostavu leka, na primer, lipozomima, albumin mikrosferama, mikroemulzijama, nanočesticama i nanokapsulama ili u makroemulzijama. Takve tehnike su opisane u Remington’s Pharmaceutical Sciences (1980).

[0077] Jedinjenja mogu da budu formulisana za parenteralnu primenu injekcijom, npr., bolus injekcijom ili kontinuiranom infuzijom. Formulacije za injektovanje mogu da budu izvedene u jediničnom doznom obliku, npr., u ampulama, ili u multidoznim kontejnerima, sa dodatim konzervansom. Kompozicije mogu da budu u obliku suspenzija, rastvora ili emulzija u uljanim ili vodenim vehikulumima, i mogu da sadrže sredstva za formulaciju kao što su sredstva za suspendovanje, stabilizaciju i/ili dispergovanje. Alternativno, aktivni sastojak može da bude u obliku praha za konstituisanje sa pogodnim vehikulumom, npr., sterilnom vodom bez pirogena, pre upotrebe.

[0078] Kompozicije mogu, ako je poželjno, da budu izvedene u pakovanju ili u uređaju za doziranje, koji može da sadrži jedan ili više jediničnih doznih oblika koji sadrže aktivni sastojak. Pakovanje može na primer da sadrži metalnu ili plastičnu foliju, kao što je blister pakovanje. Pakovanje ili uređaj za doziranje može da bude praćeno uputstvom za upotrebu.

PRIMERI

Ćelijske linije

[0079] Sledeće ćelijske linije su dobijene iz Evropske kolekcije ćelijskih kultura (ECACC), Nemačke kolekcije mikroorganizama (DSMZ) ili Američke kolekcije kultura sojeva (ATCC): ćelijska linija hibridoma koja proizvodi CD38 mišje IgG1 monoklonsko antitelo OKT10 (ECACC, #87021903), Jurkat ćelije (DSMZ, ACC282), LP-1 (DSMZ, ACC41), RPMI8226 (ATCC, CCL-155), HEK293 (ATCC, CRL-1573), CHO-K1 (ATCC, CRL-61), Raji (ATCC, CCL-86), i OPM2 (DSMZ, ACC50).

Ćelije i uslovi gajenja

[0080] Sve ćelije su gajene pod standardizovanim uslovima na 37°C i 5% CO2 u inkubatoru sa povećanom vlažnošću. Ćelijske linije LP-1, RPMI8226, Jurkat i Raji su gajene u RPMI1640 (Pan biotech GmbH, #P04-16500) obogaćenom sa 10% FCS (PAN biotech GmbH, #P30-3302), 50 U/ml penicilina, 50 µg/ml streptomicina (Gibco, #15140-122) i 2 mM glutamina (Gibco, #25030-024) i, u slučaju ćelija Jurkat i Raji, moralo je da se doda još 10 mM Hepes (Pan biotech GmbH, #P05-01100) i 1 mM natrijum piruvata (Pan biotech GmbH, # P04-43100).

[0081] CHO-K1 i HEK293 ćelijske linije su rasle u DMEM (Gibco, #10938-025) obogaćenom sa 2 mM glutamina i 10% FCS. Stabilni CD38 CHO-K1 transfektanti su održavani u prisustvu G418 (PAA GmbH, P11-012) dok je za HEK293 bilo neophodno dodavanje 1mM natrijum-piruvata. Nakon prolazne transfekcije HEK293, 10% FCS je zamenjen sa Ultra low IgG FCS (Invitrogen, #16250-078). Ćelijska linija OKT10 je gajena u IDMEM (Gibco, #31980-022), obogaćenom sa 2 mM glutamina i 20% FCS.

Priprema jednoćelijskih suspenzija iz periferne krvi

[0082] Svi uzorci krvi su uzeti nakon informisanog pristanka. Mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC) su izolovane iz zdravih davalaca pomoću Histopaque®-1077 (Sigma) prema uputstvima proizvođača. Sadržaj crvenih krvnih ćelija je snižen u ovim ćelijskim suspenzijama inkubacijom u puferu za lizu ACK (0.15 M NH4Cl, 10 mM KHCO3, 0.1 M EDTA) tokom 5 min na RT ili u komercijalnom obliku pufera (Bioscience, #00-4333). Ćelije su oprane dva puta sa PBS i zatim dalje obrađene za protočnu citometriju ili ADCC (videti u nastavku teksta).

Protočna citomtrija ("FACS")

[0083] Sva bojenja su izvedena u pločama za kulturu sa 96 bunarčića okruglog dna (Nalge Nunc) sa 2 x 105 ćelija po bunarčiću. Ćelije su inkubirane sa Fab ili IgG antitelima u naznačenim koncentracijama u 50 µl FACS pufera (PBS, 3% FCS, 0.02% NaN3) tokom 40 minuta na 4°C. Ćelije su oprane dva puta i zatim inkubirane sa F(ab’)2fragmentom kozjeg antitela protiv humanog ili mišjeg IgG (H+L), (Jackson Immuno Research), konjugovanim sa R-fikoeritrinom (PE), razblaženim 1:200 u puferu za FACS, 30 minuta na 4°C. Ćelije su ponovo oprane, resuspendovane u 0.3 ml pufera za FACS i zatim ispitane protočnom citometrijom u uređaju FACSCalibur (Becton Dickinson, San Diego, CA).

Za Scatchard-ovu analizu pomoću FACS, RPMI8226 ćelije su obojene sa 12 različitih razblaženja (1:2<n>) počevši od 12.5 µg/ml finalne koncentracije (IgG). Najmanje dva nezavisna merenja su korišćena za svaku koncentraciju i vrednosti KDsu ekstrapolirane iz medijane intenziteta fluorescencije prema Chamow et al. (1994).

Rezonancija površinskog plazmona

[0084] Kinetičke konstante koni koffsu određene serijskim razblaženjima odgovarajućeg Fab koji se vezuje za kovalentno imobilisani CD38-Fc fuzioni protein upotrebom instrumenta BIAcore 3000 (Biacore, Uppsala, Sweden). Za kovalentnu imobilizaciju antigena korišćena je standardna hemijska reakcija kuplovanja amina preko EDC-NHS. Za direktno kuplovanje CD38 Fc-fuzionog proteina, senzorski čipovi CM5 (Biacore) su obloženi sa ∼600-700 RU u 10 mM acetatnom puferu, pH 4.5. Za referentnu protočnu ćeliju, korišćena je odgovarajuća količina HSA (humani serum albumin). Kinetička merenja su urađena u PBS (136 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10mM Na2HPO4, 1.76 mM KH2PO4pH 7.4) pri brzini protoka od 20 µl/min korišćenjem koncentracije Fab u opsegu od 1.5-500 nM. Vreme injektovanja za svaku koncentraciju bilo je 1 minut, praćeno fazom disocijacije od 2 minuta. Za regeneraciju je korišćeno 5 µl 10mM HCl. Svi senzogrami su fitovani lokalno korišćenjem programa BIA evaluation software 3.1 (Biacore).

PRIMER 1: Proizvodnja antitela iz biblioteka HuCAL

[0085] U cilju dobijanja terapeutskih antitela protiv CD38, sprovedene su selekcije sa bibliotekom prikaza na fagu MorphoSys HuCAL GOLD®. HuCAL GOLD® je biblioteka Fab koja se zasniva na konceptu HuCAL® (Knappik et al., 2000; Krebs et al., 2001), u kojoj je svih šest CDR regiona modifikovano, i koja koristi tehologiju CysDisplay™ za vezivanje Fab fragmenata na površinu faga (Löhning, 2001).

A. Izdvajanje fagmida, umnožavanje i prečišćavanje faga

[0086] Fagmidna biblioteka HuCAL GOLD® je amplifikovana u medijumu 2 x TY koji sadrži 34 µg/ml hloramfenikola i 1 % glukoze (2 x TY-CG). Posle infekcije helper fagom (VCSM13) pri OD600od 0.5 (30 minuta na 37°C bez mućkanja; 30 minuta na 37°C uz mućkanje na 250 obr/min), ćelije su centrifugirane (4120 g; 5 minuta; 4°C), resuspendovane u 2 x TY / 34 µg/ml hloramfenikola / 50 µg/ml kanamicina, i gajene preko noći na 22°C. Fagi su staloženi iz supernatanta pomoću PEG, resuspendovani u PBS / 20 % glicerola i skladišteni na -80°C. Umnožavanje faga između dva ciklusa selekcije prema afinitetu izvedeno je na sledeći način: TG1 ćelije u mid-log fazi su inficirane eluiranim fagima i zasejane na LB-agar obogaćen sa 1% glukoze i 34 µg/ml hloramfenikola (LB-CG). Nakon inkubacije preko noći na 30°C, kolonije su odvojene od podloge, podešene na OD600od 0.5 i dodati je helper fag kao što je prethodno opisano.

B. Selekcije prema afinitetu sa HuCAL GOLD®

[0087] Za selekcije, biblioteka antitela na fagima HuCAL GOLD® je podeljena na tri grupe koje odgovaraju različitim master genima za VH (grupa 1: VH1/5λκ, grupa 2: VH3▪ λκ, grupa 3: VH2/4/6 λκ). Na svakoj od ovih grupa pojedinačno sprovedena su 3 ciklusa selekcije prema afinitetu na celoj ćeliji na CHO-K1 ćelijama koje eksprimiraju CD38 praćena pH-elucijom i post-adsorpcionim korakom na CD38-negativnim CHO-K1-ćelijama za smanjenje količine faga sa irelevantnim antitelom. Najzad, preostali fagovi sa antitelom su upotrebljeni za infekciju TG1 ćelija E. coli. Nakon centrifugiranja, talog bakterija je resuspendovan u medijumu 2 x TY, zasejan na ploče sa agarom i inkubiran preko noći na 30°C. Selektovani klonovi su odvojeni od ploča, fagovi su izdvojeni i amplifikovani. Drugi i treći ciklus selekcija izvedeni su kao i polazni ciklus.

[0088] Inserti koji kodiraju Fab selektovanih HuCAL GOLD® fagova subklonirani su u ekspresioni vektor pMORPH®x9_Fab_FS (Rauchenberger et al., 2003) kako bi se olakšala brza ekspresija rastvornog Fab. DNK odabranih klonova je podvrgnuta digestiji sa XbaI i EcoRI isecajući na taj način insert koji kodira Fab (ompA-VLCL i phoA-Fd), i klonirana u vektor pMORPH®x9_Fab_FS isečen enzimima XbaI / EcoRI. Fab koji je eksprimiran u ovom vektoru nosi dve C-terminalne oznake (FLAG™ i Strep-tag<®>II) za detekciju i prečišćavanje.

PRIMER 2: Biološki testovi

[0089] Ćelijska citotoksičnost zavisna od antitela (ADCC) i citotoksičnost zavisna od komplementa (CDC) su merene u skladu sa objavljenim protokolom koji se zasniva na analizi protočnom citometrijom (Naundorf et al., 2002) kao što sledi:

ADCC:

[0090] Za merenja ADCC, ciljne ćelije (T) su podešene na koncentraciju od 2.0E+05 ćelija/ml i obeležene sa 100 ng/ml boje kalcein AM (Molecular Probes, C-3099) u medijumu RPMI1640 (Pan biotech GmbH) tokom 2 minuta na sobnoj temperaturi. Preostali kalcein je uklonjen u 3 koraka pranja u medijumu RPMI1640. Paralelno, pripremljene su PBMC ćelije kao izvor (ćelije prirodne ubice) efektorskih ćelija (E), podešene na koncentraciju od 1.0E+07 i pomešane sa obeleženim ciljnim ćelijama kako bi se dobio finalni odnos E:T od 50:1 ili manje, u zavisnosti od uslova testa. Ćelije su jednom oprane i mešavina ćelija je resuspendovana u 200 µl RPMI1640 medijuma koji sadrži odgovarajuće antitelo u različitim razblaženjima. Ploča je inkubirana 4 časa pod standardizovanim uslovima na 37°C i 5% CO2u inkubatoru sa povećanom vlažnošću. Pre FACS analize ćelije su obeležene propidijum jodidom (PI) i analizirane protočnom citometrijom (Becton-Dickinson). Za svaki test je izbrojano između 50.000 i 150.000 događaja.

[0091] Sledeća jednačina je dala aktivnost uništavanja ćelija [u %]:

gde su EDA = događaji pojave mrtvih ćelija (ćelije obojene kalceinom PI ), i ELA = događaji pojave živih ćelija (ćelije obojene kalceinom)

CDC:

[0092] Za merenja CDC, 5.0E+04 ćelija CHO-K1 transficiranih sa CD38 je dodato u mikrotitar ploču sa bunarčićima (Nunc) zajedno sa humanim serumom u razblaženju 1:4 (Sigma, #S-1764) i odgovarajućim antitelom. Svi reagensi i ćelije su bili razblaženi u medijumu RPMI1640 (Pan biotech GmbH) obogaćenom sa 10% FCS. Reakciona smeša je inkubitana 2 časa pod standardizovanim uslovima na 37°C i 5% CO2u inkubatoru sa povećanom vlažnošću. Kao negativne kontrole služili su ili komplement inaktivisan toplotom ili CD38-transfektanti bez antitela. Ćelije su obeležene sa PI i podvrgnute FACS analizi.

[0093] Ukupno 5000 događaja je izbrojano i broj mrtvih ćelija pri različitim koncentracijama antitela korišćen za određivanje vrednosti EC50. Sledeća jednačina je dala aktivnost uništavanja ćelija [u %]:

gde su EDC = događaji pojave mrtvih ćelija (ćelije obojene sa PI), i

ELC = događaji pojave živih ćelija (neobojene)

[0094] Vrednosti citotoksičnosti iz ukupno 12 različitih razblaženja antitela (1:2<n>) u triplikatima su korišćene u ADCC i u duplikatima u CDC za svako antitelo, u cilju dobijanja vrednosti EC-50 pomoću standardnog programa za analizu (PRISM®, Graph Pad Software).

PRIMER 3: Proizvodnja stabilnih CD38-transfektanata i CD38 Fc-fuzionih proteina

[0095] U cilju proizvodnje CD38 proteina za selekciju prema afinitetu i pretraživanje, uspostavljena su dva različita ekspresiona sistema. Prva strategija je uključivala proizvodnju fuzionog proteina CD38-Fc, koji je prečišćen iz supernatanta nakon prolazne transfekcije HEK293 ćelija. Druga strategija je uključivala proizvodnju stabilne CHO-K1-ćelijske linije za visoku površinsku ekspresiju CD38 za korišćenje u selekciji faga sa antitelom putem postupka selekcije prema afinitetu na celoj ćeliji.

[0096] Kao polazni korak, korišćene su Jurkat ćelije (DSMZ ACC282) za proizvodnju cDNK (Invitrogen) praćenu amplifikacijom cele sekvence koja kodira CD38 upotrebom prajmera komplementarnih sa prvih 7 i poslednjih 9 kodona u CD38, redom (prajmeri MTE001 i MTE002rev; tabela 4). Analiza sekvence inserta za CD38 potvrdila je objavljene aminokiselinske sekvence u Jackson et al. (1990), osim za poziciju 49 koja je pokazala glutamin umesto tirozina, kao što je opisano kod Nata et al. (1997). Za uvođenje restrikcionih mesta za endonukleazu i kloniranje u različite derivate ekspresionog vektora pcDNA3.1 (Stratagene), prečišćeni proizvod PCR rakcije je služio kao obrazac za ponovno umnožavanje celog gena (prajmeri MTE006 i MTE007rev, tabela 4) ili njegovog dela (prajmeri MTE004 i MTE009rev, tabela 4). U drugom slučaju, fragment koji kodira vanćelijski domen (ak 45 do 300) je umnožen i kloniran u okviru čitanja između lider sekvence humanog Vkapa i sekvence humanog Fc-gama 1. Ovaj vektor je služio kao ekspresioni vektor za proizvodnju rastvornog fuzionog proteina CD38-Fc. Drugi derivat pcDNA3.1 bez lider sekvence korišćen je za ubacivanje cele dužine gena za CD38. U ovom slučaju stop kodon smešten ispred regiona koji kodira Fc i nedostatak lider sekvence doveo je do površinske ekspresije CD38. Ćelije HEK293 su prolazno transficirane vektorom za Fc-fuzioni protein za proizvodnju rastvornog fuzionog proteina CD38-Fc i, u slučaju derivata pune dužine, za stvaranje ćelijske linije koja stabilno eksprimira CD38, transficirane su ćelije CHO-K1.

Tabela 4:

PRIMER 4: Kloniranje, ekspresija i prečišćavanje HuCAL<®>IgG1:

[0097] U cilju eksprimiranja IgG pune dužine, fragmenti varijabilnog domena teških (VH) i lakih lanaca (VL) su subklonirani iz ekspresionih vektora za Fab u odgovarajuće vektore MORPH® _hIg (videti slike 7 do 9). Parovi restrikcionih endonukleaza BlpI/MfeI (priprema inserta) i BlpI/EcoRI (priprema vektora) korišćeni su za subkloniranje fragmenta VH domena u pMORPH® _hIgG1. Enzimski parovi EcoRV/HpaI (lambda-insert) i EcoRV/BsiWI (kapainsert) korišćeni su za subkloniranje fragmenta VL domena u odgovarajuće vektore pMORPH<®>_hIgκ_1 ili pMORPH<®>_h_Igλ_1. Rezultujući konstrukti IgG su eksprimirani u HEK293 ćelijama (ATCC CRL-1573) prolaznom transfekcijom korišćenjem standardne koprecipitacione tehnike kalcijum fosfat-DNK.

[0098] Molekuli IgG su prečišćeni iz supernatanta ćelijskih kultura afinitetnom hromatografijom putem sefarozne kolone sa proteinom A. Dodatna nishodna obrada je uključivala izmenu pufera gel filtracijom i sterilnu filtraciju prečišćenog IgG. Kontrola kvaliteta je pokazala čistoću od >90% pomoću redukcione SDS-PAGE i >90% monomernog IgG, određeno analitičkom ekskluzionom hromatografijom. Sadržaj endotoksina u materijalu određen je kinetičkim LAL testom (Cambrex European Endotoxin Testing Service, Belgium).

PRIMER 5: Stvaranje i proizvodnja himernog OKT10 (chOKT10; SEQ ID NOS: 72 i 73)

[0099] U cilju konstruisanja chOKT10, mišji VH i VL regioni su umnoženi PCR reakcijom upotrebom cDNK koja je pripremljena iz mišje ćelijske linije hibridoma OKT10 (ECACC #87021903). Korišćen je set prajmera kao što je objavljeno (Dattamajumdar et al., 1996; Zhou et al., 1994). Proizvodi PCR rakcije su korišćeni za Topo-kloniranje (Invitrogen; pCRII-vector) i pojedinačne kolonije su podvrgnute analizi sekvence (reverzni prajmer M13) koja je otkrila dve različite sekvence kapa lakog lanca i jednu sekvencu teškog lanca. Prema poravnanju sekvence (baza podataka nukleotidnih sekvenci EMBL) i literaturnim podacima (Krebber et al, 1997) jedna od kapa-sekvenci pripada svojstvenom repertaru fuzionog partnera, tumorske ćelije X63Ag8.653, i stoga ne pripada antitelu OKT10. Prema tome, samo nova kapa sekvenca i pojedinačni fragment VH su korišćeni za dalje kloniranje. Oba fragmenta su ponovo umnožena za dodavanje restrikcionih mesta za endonukleazu i nakon toga klonirana u odgovarajuće vektore pMORPH<®>za ekspresiju IgG1. Sekvence za teški lanac (SEQ ID NO: 72) i laki lanac (SEQ ID NO: 73) su date na sl. 6. HEK293 ćelije su prolazno transficirane i supernatant je analiziran pomoću FACS za himerno OKT10 antitelo koje se vezuje za ćelijsku liniju Raji (ATCC) koja prekomerno eksprimira CD38.

PRIMER 6: Analiza unakrsne reaktivnosti pomoću FACS (MOR 03087 i MOR 03088)

1. Materijali i postupci:

[0100] Slike 11 i 12 prikazuju FACS analize limfocita i eritrocita: uzorci krvi obrađeni sa EDTA su dobijeni od zdravih osoba (nakon informisanog pristanka) i od nehumanih primata (rezus, cinomolgus i marmozet majmuni) i podvrgnuti su centrifugiranju u gradijentu gustine korišćenjem sistema za razdvajanje ćelija Histopaque prema uputstvima dobavljača (Sigma). Za FACS analizu, ćelije iz međufaze (frakcija PBMC) i taloga (frakcija eritrocita) su inkubirane sa anti-CD38 HuCAL® antitelima u različitim formatima. Pregled profila unakrsne reaktivnosti različitih anti CD38 antitela prikazan je na slici 13.

2. Rezime i zaključak:

[0101] Rezultati pokazuju da među svim CD38 antitelima samo MOR03087 i MOR03088 ispoljavaju unakrsnu reaktivnost prema PBMC ćelijama marmozet majmuna. Iznenađujuće, ekspresija CD38 na eritrocitima marmozeta je gotovo nedetektabilna u poređenju sa snažnom ekspresijom na eritrocitima cinomolgusa i rezusa. Prema tome, ekspresija CD38 na eritrocitima i PBMC ćelijama marmozeta više odražava situaciju kod čoveka, kod koga je ekspresija CD38 niska na eritrocitima i umerena do visoka na PBMC ćelijama. Marmozet majmun se prema tome smatra pogodnim modelom za ispitivanje toksičnosti molekula koji se vezuju za CD38.

[0102] Na osnovu ispitivanja prikazanog u prethodnom tekstu, odlučeno je da se dodatno optimizuju vezujuća antitela MOR 03087 i MOR 03088, kao što je opisano na drugom mestu u specifikaciji, videti npr. paragraf koji se odnosi na "Antitela za upotrebu u pronalasku". Stručnjak u oblasti bi očekivao da bi i derivati parentalnih antitela pokazivali uporediv profil unakrsne reaktivnosti.

LISTA SEKVENCI

Claims

Patentni zahtevi

1. Humano specifično anti-CD38 antitelo koje sadrži:

(i) H-CDR1, H-CDR2 i H-CDR3 region prikazan u sekvenci SEQ ID NO: 21, i L-CDR1, L-CDR2 i L-CDR3 region prikazan u sekvenci SEQ ID NO: 51;

2. Antitelo prema patentnom zahtevu 1, naznačeno time što antitelo predstavlja IgG, poželjno IgG1.

3. Kompozicija nukleinske kiseline koja sadrži sekvencu nukleinske kiseline ili mnoštvo sekvenci nukleinske kiseline koje kodiraju antitelo prema patentnom zahtevu 1 ili 2.

4. Vektorska kompozicija koja sadrži vektor ili mnoštvo vektora koji sadrže sekvencu nukleinske kiseline, ili mnoštvo sekvenci nukleinske kiseline, prema patentnom zahtevu 3.

5. Ćelija koja sadrži vektorsku kompoziciju prema patentnom zahtevu 4, gde je ćelija izborno bakterijska ćelija ili sisarska ćelija.

6. Farmaceutska kompozicija koja sadrži antitelo prema patentnom zahtevu 1 ili 2 i farmaceutski prihvatljiv nosač ili ekscipijens.

7. Antitelo prema patentnom zahtevu 1 ili 2 za upotrebu u lečenju hematološke bolesti ili inflamatorne bolesti.

8. Farmaceutska kompozicija koja sadrži antitelo prema patentnom zahtevu 1 ili 2 i farmaceutski prihvatljiv nosač ili ekscipijens za upotrebu u lečenju hematološke bolesti ili inflamatorne bolesti.

9. Antitelo, za upotrebu prema patentnom zahtevu 7 ili farmaceutska kompozicija za upotrebu prema patentnom zahtevu 8, naznačena time što je pomenuta hematološka bolest izabrana sa liste na kojoj se nalaze multipli mijеlom, hronična limfocitna leukemija, hronična mijeloidna leukemija, akutna mijeloidna leukemija i akutna limfocitna leukemija.

10. Antitelo, za upotrebu prema patentnom zahtevu 7 ili farmaceutska kompozicija za upotrebu prema patentnom zahtevu 8, naznačena time što je pomenuta inflamatorna bolest izabrana sa liste na kojoj se nalazе reumatoidni artritis i sistemski lupus eritematozus.

11. In vitro postupak za indukciju specifičnog uništavanja tumorskih ćelija koje eksprimiraju CD38, naznačen time što se pomenuto specifično uništavanje odvija putem unakrsnog vezivanja CD38, koji obuhvata korak inkubacije pomenutih ćelija u prisustvu dovoljne količine antitela prema patentnom zahtevu 1 ili 2.

12. Postupak za detekciju specifičnog uništavanja tumorskih ćelija koje eksprimiraju CD38, putem unakrsnog vezivanja CD38, kod subjekta kod koga je primenjeno antitelo prema patentnom zahtevu 1 ili 2, koji obuhvata korak in vitro detekcije specifične aktivnosti uništavanja kod pomenutog antitela, gde tumorske ćelije izborno potiču od čoveka, minisvinje ili zeca.

13. Postupak za detekciju prisustva CD38 u tkivu ili u ćeliji koja potiče od mini-svinje dovedenој u kontakt sa antitelom prema patentnom zahtevu 1 ili 2, koji obuhvata korak in vitro detekcije specifičnog vezivanja pomenutog antitela za pomenute CD38 ćelije minisvinje, gde je pomenuto antitelo takođe sposobno da se specifično veže za CD38 humanog porekla, pri čemu je izborno, CD38 poreklom od mini-svinje, sadržan u tipu izolovane ćelije izabranom iz grupe koja se sastoji od monocita periferne krvi, eritrocita, limfocita, timocita, mišićne ćelije, ćelije cerebeluma, ćelije pankreasa, ćelije limfnog čvora, ćelije tonzila, ćelije slezine, ćelije prostate, ćelije kože i ćelije retine.

14. Postupak za detekciju CD38 u eritrocitu koji eksprimira CD38 dovedenom u kontakt sa antitelom prema patentnom zahtevu 1 ili 2, koji obuhvata korak in vitro detekcije specifičnog vezivanja pomenutog antitela za pomenute eritrocite koji eksprimiraju CD38, naznačen time što je pomenuto antitelo takođe sposobno da se specifično veže za humani CD38 iz ćelije ili tkiva koje nisu humani eritrociti, gde je izborno antitelo takođe sposobno da se specifično veže za humani CD38 iz ćelije koja je humani limfocit.

15. Dijagnostička kompozicija koja sadrži antitelo prema patentnom zahtevu 1 ili 2 i prihvatljiv nosač ili ekscipijens.