RS55914B1 - Modulacija aktivnosti proneurotrofina - Google Patents

Description

Opis

Oblast pronalaska

[0001] Ovaj pronalazak odnosi se na neko antitelo usmereno protiv nekog ekstracelularnog dela sortilina i sposobno da inhibira vezivanje nekog pro-neurotrofina na mestu vezivanja receptora sortilina, gde se to antitelo vezuje za vezujući motiv pro-neurotrofina prema SEQ ID NO: 25, 26, 27 ili 28 ili njihovim fragmentom. Ovde su dalje opisane kompozicije koje su korisne u inhibiranju proneurotrofinike aktivnosti, kao i postupci za njihovo pripremanje i upotrebu. Takođe su obezbeđeni postupci za skrinig agenasa za upotrebu u pomenutim kompozicijama.

Pozadina pronalaska

Neurotrofinska familija

[0002] Neurotrofini su dimerni peptidni hormoni. Prvi ćlan neurotrofinske familije koji je otkriven bio je faktor rasta nerava (NGF), koji igra važnu ulogu u procesima kao što su razvoj senzornih i simpatičkih nerava perifernog nervnog sistema (Levi-Montalcini, R. and Angeleeti, P.U:, Physiol. Rev.

48, 534-569 (1968)). Sledeći član neurotrofinske familije koji će biti izolovan, bio je neurotrofni moždani faktor (BDNF), takođe označen kao neurotrofin-2 (NT-2), čija sekvenca je objavljena od stran Leibrock, J. et al.1989 godine (Nature 341, 149-152).1990 godine nekoliko grupa je identifikovalo neurotrofni faktor koji se originalno nazivao neuronski faktor (NF), a sada naziva neurotrofin-3 (NT-3) (Ernfors et al., Proc.Natl:Acad.Sci. USA 87, 5454-5458 (1990); Hohn et al., Nature 344, 339; Mai-sonpierre et al., Science 247, 1446; Rosenthal et al., Neuron 4, 767; Jones i Reichardt, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 8060-8064; Kaisho et al., FEBS Lett.266, 187). Neurotrofini-4 i -5 zatim su dodati familiji (Neuron 6, 845-858 (1991); Berkmeier, L. R. et al., Neuron 7, 857-866 (1991); Ip et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 3060-3064 (1992)). Efekti neurotrofina zavise od njihovih nivoa dostupnosti, njihovog afiniteta vezivanja za transmembranske receptore i kasnije signalizirajuće kaskade koje se stimulišu nakon aktiviranja receptora.

Receptori za neurotrofinsku familiju

[0003] Slično ostalim polipeptidnim faktorima rasta, neurotrofini utiču na njihove ciljane ćelije putem interakcija sa ćelijskim površinskim receptorima. Prema trenutnim saznanjima, neurotrofini se vezuju za dva diskretna receptorska tipa koji se mogu razlikovati farmakološki: Trk i p75<NTR>neurotrofinski receptori. p75<NTR>je član Fas/tumor nekroza faktor (TNF) receptorske familije, i mogu međusobno delovati sa svim sisarskim članovima neurotrofinske familije jednakih afiniteta (Rodriguez-Tebar et al.1990, Neuron 4:487-492; Barker and Murphy, 1992, Mol. Cell. Biochem. 100:1-15). Ćelijsko eksprimiranje TrkA, receptora tirozinske kinaze originalno identifikovanog kao humani onkogen (Mltin-Zanca et al, Nature 319:743-748) vezuje se jedino za NGF i eksprimira značajno sporije disocijacione kinetike (Jing et al.1992, Neurol.9:1067-1079; Loeb and Greene, 1993, Neuroscience 13:2919-2929). BDNF vezuje se samo za TrkB receptor, a NT-3 može se vezati sa sva tri Trk (A, B i C) receptora, sa preferencijom ka TrkC. NT-4/5 može se vezati sa oba TrkA i TrkB (Ip et al. PNAS 89:3060-3064; Klein et al. Neuron 9:947-956). NT-7 ne ulazi u akciju sa TrkB ili TrkC, međutim može da indukuje tirozinsku fosforilaciju TrkA, što ukazuje na sličnu receptorsku specifičnost kao i NGF (Nilsson et al., FEBS Lett (1998) Mar 13;424(3):285-90). Rekombinantno prečišćeni NT-6 takođe poseduje spektar aktivnosti sličan NGF, ali niže potencije (Gotz et al., Nature (1994) Nov 17;372(6503):266-9).

Neurotrofinska familija: prekursorski proteini

[0004] Biologija neurotrofinske familije je kompleksna: neurotrofini se sintetišu intraćelijski kao 30-35 kDa prekursorski proteini, koji sadrže neki signalni peptid, prodomen i mesta glikolizacije. Tokom prerade, prekursorski proteini se takođe cepaju na dibaznom mestu cepanja kalcijum-zavisnim serinskim proteazim furinom i ostalim članovima familije prohormonske proteaze, unutar Golgi uređaja. 12-14 kDa C-terminalni proizvod ovog cepanja je zreli, biološki aktivan neurotrofin (Seidah et al, Biochem. J. (1996) 314:951-960).

Klinički relevantne uloge neurotrofinske familije

[0005] Neurotrofini su od kliničkog interesa jer igraju važnu ulogu u neuronskom ćelijskom preživljavanju i diferencijaciji (Thoenen 1991, Trends Neurosci.14: 165-170; Raffioni et al.1991, Ann. Rev. Biochem.62:823-850; Chao, 1992, Neuron 9:583-593; Barbacid 1993, Oncogene 8:2033-2042). Trk receptori transmituju signale koji promovišu neuronsko peživljavanje, pri čemu p75<NTR>može da indukuje neuronsku apoptozu kao i neuronsko peživljavanje u zavisnosti od ko-ekspresije Trk-a (Miller et al., Cell. Mol. Life Sci.58:1045-1053 (2001)). Zasigurno, pokazano je da aktivacija TrkA receptora može da negira proapoptotični efekat p75<NTR>u nekim, ali ne svim tkivima (Yoon et al., J. Neurosci. (1998) 18:3273-3281; Volosin et al., J. Neurosci. (2006) 26:7756-7766).

[0006] Pokazano je da propeptidi neurotrofina igraju važne biološke uloge: najmanje tri neurotrofinska prekursorska proteina, proNGF, proBDNF i proNT-3 i i njihovi proteolitički prerađeni i zreli kontradelovi, NGF, BDNF, NT-3 proizvode diferencijalno aktivirane pro- i anti- apoptične ćelijske odgovore putem preferencijalne aktivacije p75<NTR>i Trk receptora, respektivno - pro-NGF koji ima pojačan afinitet prema p75<NTR>receptorima i redukovan afinitet prema Trk receptorima u odnosu na zrele oblike NGF. Zaista, pokazano je da pro-NGF indukuje p75<NTR>-zavisnu apoptozu u kultivisanim neuronima sa minimalnom aktivacijom TrkA-posredovanom diferencijacijom ili peživljavanjem (Lee et al., Science (2001), 294:1945-1948).

[0007] Dodatno, neurotrofini su od kliničkog interesa budući da je poznato da se i regulacija neurotrofina na gore i povećana p75<NTR>ekspresija javljaju pod patološkim i zapaljenskim uslovima, naročito nakon povrede nerava i oštećenja u vaskularnom sistemu. Zaista, Soilu-Hanninen et al. Su pokazali da su proapoptične funkcije p75<NTR>direktno umešane u apoptozu indukovanu povredom (Soilu-Hanninen et al., J. Neurosci.19:4824-4838 (1999)). U skorije vreme, takođe je pokazano da proNGF indukuju p75 posredovanu smrt oligodendrocita i kortikospinalnih neurona praćeno povredom kičmene moždine (Beatty et al., Neuron (2002), vol.36, pp.375-386; Giehl et al, Proc.Natl.Acad.Sci USA (2004), vol.101, pp 6226-30) i smrt bazalnih neurona prednjeg mozga u odgovoru na napade indukovane kainičkom kiselinom (Volosin et al, J. Neuroscience (2006), vol.26, pp 7756-7766).

[0008] Postoji hipoteza da je neuravnoteženost između prekursorskog i zrelog oblika neurotrofnih faktora odgovorna za regeneraciju selektivne neuronske populacije budući da se pojavljuje u Parkinsonovoj bolesti, Alchajmerovoj bolesti i amiotrofičnoj lateralnoj sklerozi, i da primena odgovarajućeg neurotrofnog faktora može da spreči neuronsku degeneraciju [Appel, S. H., "A unifying hypothesis for the cause of amyotrophic lateral skleroza, parkinsonism, and Alzheimer’s bolest," Ann. Neurol.10:499-505 (1981), Cunello C and Bruno M.A., Neurochem. Res. (2007) 32:1041-45].

[0009] Još jedan od razloga ciljanja neurotrofinskih putanja radi terapije jeste da su ispitivanja obezbedila potkrepljujucí dokaz učešća neurotrofina u depresionoj i antidepresionoj aktivnosti (Duman et al. Arch Gen Psychiatry (1997) 54:597-606); na primer, infuzijom BDNF u hipokampusu proizvodi se neki anitdepresioni efekat u dva bihevioralna modela depresije (Shirayama et al. (2002), J Neurosci 22(8): 3251-3261). Štaviše, pronađeno je da je jedan nukleotidni polimorfizam u bdnf<genu koji vodi ka valin (Val) u metionin (Met) supstituciju na kodonu 66 u prodomenu (BDNF>Met<),>povezan sa povecánom osetljivosti kod ljudi heterozigotnih za polimorfizam do neuropsihijatrijskih poremećaja koji uključuju Alchajmerovu bolest, Parkinsonovu bolest, depresiju, i bipolarni poremećaj (Chen et al, J. Neuroscience (2005), vol.25:6156-6166; Kuipers i Bramham Curr. Opin..

Drug Discov. Devel. (2006) 9(5):580-6; Bath i Lee, Cogn. Affect. Behav. Neurosci (2006) 1:79-85). Pored toga, ljudi heterozigotni za BDNFMetpokazuju da imaju slabljenje memorije (Egan et al, Cell (2003)1 vol.112, pp 257-269).

Vps10p-domenska receptorska familija

[0010] Sortilin (ili NTR-3 ili GP95), (SEQ ID NO.1) je membranski receptor tipa I koji je eksprimiran u brojnim tkivima, koja uključuju mozak, kičmenu moždinu, testise i mišiće skeleta (Petersen et al., J. Biol. Chem., 272:3599-3605 (1997); Herman-Borgmeyer et al., Mol. Brain Res., 65:216-219 (1999)). Sortilin pripada familiji receptora koji obuhvataju Sortilin, SorLA (Jacobsen et al., J. Biol. Chem., 271:31379-31383 (1996)), SorCS1, SorCS2 i SorCS3. Svi receptori u ovoj familiji dele strukturalnu karakteristiku otprilike 600-aminokiselinskog N-terminalnog domena sa snažnom sličnošću prema svakom od dva domena koja konstituišu lumialni deo receptora sortiranja kvasca Vps10p (Marcusson, E.G ., et al., Cell, 77:579-586 (1994)). Vps10p-domen uključuje C-terminalni segment koji sadrži 10 očuvanih cisteina i N-terminalni propeptid 40-80 aminokiselina.

[0011] Kod Sortilina, propeptid pokazuje visok afinitet vezivanja za potpuno prerađen receptor. Prevencija propeptidnog cepanja suštinski inhibira vezivanje liganda za Sortilin, što ukazuje da taj propeptid prostorno ometa ligande da pristupe svojim mestima vezivanja na receptoru (Petersen et al., EMBO J., 18:595-604, 1999).

[0012] Načinjen je neki napredak u razumevanju uloge ove familije: postoji dokaz koji sugeriše da Sortilin najmanje sadrži YXXΦ i dileucinske motive, u skladu sa potentnim signalima za Golgiendozomno sortiranje (Nielsen et al., EMBO 20(9):2180-2190). Moguće je da drugi članovi ove familije ispune sličnu funkciju "sortiranja", ne manju jer oni svi pokazuju homologiju prema Vps10p, receptoru soritiranja za karboksipeptidazu Y (CPY) u kvascu. Samo mali deo receptora sortilina prisutan je na ćelijskoj površini (Mazella et al. J. Biol. Chem. (1998) 273, 26273-26276; Morris et al. J. Biol. Chem. (1998) 273:3582-3587), iako se ekspresija na površini membrane može unapred regulisati stimulansima koji uključuju insulin u 3T3-L1 adipocitima (Morris et al. J. Biol. Chem. (1998) 273:3582-3587) i neurotenzin u embrioničnim neuronima (Chabry et al., J. Biol. Chem. (1993), 286:17138-17144).

Inhibiranje aktivnosti proneurotrofina: trenutno stanje tehnike

[0013] Svakako, trenutno razumevanje bioloških uloga neurotrofina čini neurotrofinsku familiju atraktivnom metom za terapeutske intervencije, a neki postupci za modulaciju neurotrofinske aktivnosti su poznati:

Mehar M et al., Eur. J. Neruosci. (2006) 24:1575-1580 i Massa S.M. et al, J. Neurosci. (2006), 26:5288-5300 opisuje kako se p75 može primeniti kao usmeren lek kako bi se umešao u smrt indukovanu vezivanjem kasnijeg liganda (npr. proNGF) za p75.

[0014] WO 2004/056385 opisuje opšte postupke za inhibiranje vezivanja između Vps10-p domenskih receptora i neurotrofina/pro-neurotrofina, ali koji ne navodi specifično mesto vezivanja.

Suština pronalaska

[0015] Pronalazači su identifikovali meso vezivanja na receprotu sortilina za pro-neurotrofine.

[0016] Ovaj opis obezbeđuje najmanje jedan agens sposoban da inhibira vezivanje nekog proneurotrofina na mestu vezivanja receptora sortilina, gde se pomenuti pro-neurotrofin vezuje na mestu vezivanja za sortilin koji obuhvata neku aminokiselinu sekvencu koja je najmanje 70 % identična sa SEQ ID NO.25, i gde se pomenuti agens ili vezuje za pomenuto mesto vezivanja, ili obuhvata neku aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 70 % identična sa SEQ ID NO.25 ili njihovim fragmentom, u proizvodnji leka, za tretiranje i/ili prevenciju i/ili ublažavanje neuroloških, neuropsihijatrijskih, i/ili očnih bolesti, poremećaja i degeneracija, gojaznosti, dijabetesa, bola i/ili nocicepcije kod životinje.

[0017] U daljem aspektu, u ovom opisu, najmanje jedan agens vezuje za neku aminokiselinsku sekvencu sa najmanje 70% sekvencijalnog identiteta sa SEQ ID NO.26 i/ili SEQ ID NO.27 i/ili SEQ ID NO.28, čime se inhibira vezivanje nekog pro-neurotrofina za neki receptor sortilina.

[0018] U daljem aspektu, najmanje jedan agens se vezuje za neku aminokiselinsku sekvencu sa najmanje 70% sekvencijalnog identiteta sa pro-domenom nekog pro-neurotrofina, čime se inhibira vezivanje pomenutog pro-neurotrofina za neki receptor sortilina

[0019] U još jednom aspektu ovaj opis obezbeđuje najmanje jedan agens sposoban da inhibira vezivanje nekog pro-neurotrofina za neki receptor sortilina, pri čemu pomenuti najmanje jedan agens ima najmanje 90% sekvencijalnog identiteta sa bilo kojom od SEQ ID NO.14, SEQ ID NO.15, SEQ ID NO.16, SEQ ID NO.17, SEQ ID NO.18, SEQ ID NO.19, SEQ ID NO.24, SEQ ID NO.30, SEQ ID NO.31, SEQ ID NO.32, SEQ ID NO.33, SEQ ID NO.34, SEQ ID NO.35, SEQ ID NO.36, SEQ ID NO.37, SEQ ID NO.38, SEQ ID NO.39, SEQ ID NO.40, SEQ ID NO.41 i SEQ ID NO.42, u proizvodnji leka, za tretiranje i/ili prevenciju i/ili ublažavanje neuroloških, neuropsihijatrijskih, i/ili očnih bolesti, poremećaja i degeneracija, gojaznosti, dijabetesa, bola i/ili nocicepcije kod životinje.

[0020] U još jednom aspektu agensi iz ovog opisa su sposobni da inhibiraju aktivnost jednog ili više proneurotrofina kod životinje i postupcima za tretiranje bolesti ili poremećaja kod pojedinca inhibicijom aktivnosti neurotrofina. Shodno tome, u jednom aspektu ovaj opis odnosi se postupak za inhibiranje aktivnosti najmanje jednog pro-neurotrofina kod životinje, koji obuhvata davanje pomenutoj životinji dovoljne količine agensa sposobnog za

(i) vezivanje za receptor Vps10p-domenske receptorske familije i/ili

(ii) ometanje vezivanja između nekog receptora Vps10p-domenske receptorske familije i nekog proneurotrofina

i/ili

(iii) snižavanje ekspresije receptora Vps10p-domenske receptorske familije

[0021] U daljem aspektu agensi ovog opisa obezbeđuju agense za prevenciju fizičke interakcije između p75<NTR>i sortilina.

[0022] Još jedan aspekt ovog opisa odnosi se na postupak ili upotrebu najmanje jednog agensa sposobnog za snižavanje aktivnosti Vps10p-domenskih receptora u proizvodnji leka za tretiranje i/ili prevenciju i/ili ublažavanje neuroloških, neuropsihijatrijskih i/ili očnih bolesti, poremećaja, degeneracija, gojaznosti, dijabetesa, bola i/ili nocicepcije kod životinje.

[0023] Takođe su opisani postupci skrininga za agense sposobne za modulisanje aktivnosti proneurotrofina i agensi odabrani primenom ovih postupaka skrininga, kao i postupci za određivanje efekata agensa na jednom ili više proneurotrofina u ćelijama. Ovaj opis takođe se odnosi na postupke za modulisanje transporta jednog ili više proneurotrofina.

[0024] Takođe su opisane farmaceutske kompozicije koje obuhvataju agense ovog opisa i njihova upotreba za prevenciju, tretiranje i/ili ublažavanje bolesti povezanih sa proneurotrofinom.

Detaljan opis pronalaska

Definicije

[0025] Izraz inhibiranje kako se ovde koristi, odnosi se na prevenciju vezivanja između dve ili više komponenti. U ovom pronalasku obezbeđena su antitela sposobna da inhibiraju vezivanje između Vps10p-domenskog receptora i pro-neurotrofina.

[0026] Izraz "vezivanje" kako se ovde koristi, odnosi se na prolazno ili dugotrajno privlačenje ili vezivanje dva ili više ostataka jedan za drugi, posredovano fizičkim silama kao što su npr. elektrostatičke interakcije, hidrofobne interakcije, dipol-dipol interakcije i vodonične veze. Izraz "hidrofobna interakcija" kako se ovde koristi, odnosi se na bilo koju interakciju koja se javlja između suštinski ne-polarnih (hidrofobnih) komponenti smeštenih unutar opsega privlačenja jednog sa drugim u polarnom okruženju (npr. voda). Kako se ovde koristi, opseg privlačenja je na skali od oko 100 nm. Određena vrsta hidrofobne interakcije ispoljava se "Van der Waal-ovim silama", tj. silama privlačenja između ne-polarnih molekula koji se uzimaju u obzir od strane kvantne mehanike. Van der Waal-ove sile uopšteno su povezane sa trenutnim dipolnim momentima koji se indukuju susednim molekulima i koje uključuju promene u distribuciji elektrona. Izraz "vodonična veza" kako se ovde koristi, odnosi se na neku silu privlačenja, ili most, koja se može javiti između atoma vodonika koji je kovalentno povezan sa nekim elektronegativnim atomom, na primer, kiseonik, sumpor, ili azot, i neki drugi elektronegativan atom. Vodonična veza može se javiti između atoma vodonika u prvom molekulu i elektronegativnog atoma u drugom molekulu (intermolekularno vodonično vezivanje). Takođe, vodonična veza može se javiti između atoma vodonika i nekog elektronegativnog atoma koji su oba sadržana u jednom molekulu (intermolekularno vodonično vezivanje). Izraz "elektrostatička interakcija" kako se ovde koristi, odnosi se na bilo koju interakciju koja se javlja između naelektrisanih komponenti, molekula ili jona, usled sile privlačenja kada se komponente suprotnog električnog naelektrisanja međusobno privlače. Primeri uključuju, ali nisu ograničeni na: jonske interakcije, kovalentne interakcije, interakcije između nekog jona i nekog dipola (jon i polarni molekul), interakcije između dva dipola (delimična naelektrisanja polarnih molekula), vodonične veze i Londonove disperzione sile (indukovani dipolovi polarizujućih molekula). Tako se, na primer, "jonska interakcija" ili "elektrostatička interakcija" odnosi na privlačenje između prvog, pozitivno naelektrisanog molekula i drugog, negativno naelektrisanog molekula. Jonske ili elektrostatičke interakcije uključuju, na primer, privlačenje između negativno naelektrisanog bioaktivnog agensa (ulazni primeri relevantni za ovaj pronalazak). Izraz "dipol-dipol interakcija" kako se ovde koristi, odnosi se na privlačenje koje se može desiti između dva ili više polarnih molekula. Tako se, "dipol-dipol interakcija" odnosi na privlačenje nenaelektrisanog, delimično pozitivnog kraja prvog polarnog molekula ka nenaelektrisanom, delimično negativnom kraju drugog polarnog molekula. "Dipol-dipol interakcija" takođe se odnosi na intermolekularno vodonično vezivanje.

[0027] Funkcionalni ekvivalenti i varijante polinukleotida koji kodiraju modulator proneutrofinske aktivnosti i polipeptida koji obuhvataju takav modulator proneutrofinske aktivnosti: "funkcionalni ekvivalenti" i "varijante" ovde se koriste naizmenično. U jednom poželjnom aspektu ovog opisa takođe su obezbeđene varijante modulatora proneutrofinske aktivnosti i varijante njihovih fragmenata. Kada se radi o polipeptidima, varijante se određuju na osnovu njihovog stepena identiteta ili njihove homologije sa prethodno određenom aminokiselinskom sekvencom, pri čemu je pomenuta prethodno određena aminokiselinska sekvenca jedna od SEQ ID NO: modulator proneutrofinske aktivnosti, ili,kada je varijanta neki fragment, neki fragment bilo koje od gorepomenute aminokiselinske sekvence, respektivno.

[0028] Izraz inhibiciono vezivanje između nekog proneurotrofina i nekog receptora sortilina kako se ovde koristi odnosi se na postupak obezbeđivanja nekog agensa sposobnog za prevenciju vezivanja proneurotrofina za neki receptor sortilina i određenije vezivanje za deo receptora sortilina koji obuhvata bilo koji od SEQ ID NO.25 do 28 ili bilo koji njihov fragment ili varijantu ili vezivanje pomenutog agensa za pomenuti proneurotrofin, sprečavajući tako vezivanje pomenutog proneurotrofina sa SEQ ID NO.25, SEQ ID NO.26, SEQ ID NO.27 ili SEQ ID NO.28 ili bilo koji njihov fragment ili varijantu.

[0029] Shodno tome, varijante poželjno imaju najmanje 70% sekvencijalnog identiteta, na primer najmanje 72% sekvencijalnog identiteta, na primer najmanje 75% sekvencijalnog identiteta, na primer najmanje 80% sekvencijalnog identiteta, kao što je najmanje 85% sekvencijalnog identiteta, na primer najmanje 90% sekvencijalnog identiteta, kao što je najmanje 91% sekvencijalnog identiteta, na primer najmanje 91% sekvencijalnog identiteta, kao što je najmanje 92% sekvencijalnog identiteta, na primer najmanje 93% sekvencijalnog identiteta, kao što je najmanje 94% sekvencijalnog identiteta, na primer najmanje 95% sekvencijalnog identiteta, kao što je najmanje 96% sekvencijalnog identiteta, na primer najmanje 97% sekvencijalnog identiteta, kao što je najmanje 98% sekvencijalnog identiteta, na primer 99% sekvencijalnog identiteta sa bilo kojom od prethodno određenih sekvenci.

[0030] Sekvencijalni identitet se određuje u jednom ostvarenju sprovođenjem fragmenata peptida modulatora proneutrofinske aktivnosti koji obuhvataju najmanje 25 susednih aminokiselina i imaju neku aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 80%, kao što je 85%, na primer 90%, kao što je 95%, na primer 99% identična sa aminokiselinskom sekvencom bilo kog od SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27 i SEQ ID NO: 28 respektivno, gde se procentni identitet određuje algoritmom GAP, BESTFIT, ili FASTA u Wisconsin Genetics Softvera Package Oslobađanju 7.0, primenom uobičajenih težina useka.

[0031] Sledeći izrazi koriste se da opišu sekvencijalne odnose između dva ili više polinukleotida: "prethodno određena sekvenca", " prozor za poređenje ", "sekvencijalni identitet", "procenat sekvencijalnog identiteta", i "suštinski identitet".

[0032] "Prethodno određena sekvenca" je definisana sekvenca koja se koristi kao osnova za sekvencijalno poređenje; prethodno određena sekvenca može biti podskup veće sekvence, na primer, kao deo DNK pune dužine ili genske sekvence date u listi sekvenci, kao što je neka polinukleotidna sekvenca iz SEQ ID NO:1, ili može da obuhvata kompletnu DNK ili gensku sekvencu. Generalno, prethodno određena sekvenca je najmanje 20 nukleotida u dužini, najčešće najmanje 25 nukleotida u dužini, i često najmanje 50 nukleotida u dužini.

[0033] Kako dva polinukleotida svaki mogu da (1) obuhvataju neku sekvencu (tj., deo kompletne polinukleotidne sekvence) koja je slična između dva polinukleotida, i (2) mogu dalje da obuhvataju sekvencu koja se razlikuje između dva polinukleotida, pri čemu se poređenja sekvenci između dva (ili više) polinukleotida obično izvode poređenjem sekvenci dva polinukleotida putem "prozora za poređenje" kako bi se identifikovali i uporedili lokalni regioni sekvencijalne sličnosti. "Prozor za poređenje", kako se ovde koristi, odnosi se na konceptualni segment najmanje 20 susednih nukleotidnih položaja gde polinukleotidna sekvenca može da se poredi sa prethodno određenom sekvencom najmanje 20 susednih nukleotida i gde taj deo polinukleotidne sekvence u prozoru za poređenje može da obuhvata dodatke ili delecije (tj., useke) 20 procenata ili manje u odnosu na prethodno određenu sekvencu (koja ne obuhvata dodatke ili delecije) za optimalno poravnanje dve sekvence.

[0034] Optimalno poravnanje sekvenci za poravnavanje nekog prozora za poređenje mogu se sprovesti Smith i Vodaman algoritmom lokalne homologije (1981) Adv. Appl. Math.2: 482, Needleman i Wunsch algoritmom lokalne homologije (1970) J. Mol. Biol.48: 443, potragom sličnih postupaka od strane Pearson i Lip-man (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 85: 2444, kompjuterizovanom implementacijom ovih algoritama (GAP, BESTFIT, FASTA, i TFASTA u Wisconsin Genetics Softvera Package Oslobađanje 7.0, Genetics Computer Grupa, 575 Science Dr., Madison, Wis.), ili inspekcijom, a odabira se najbolje poravnanje (tj., koje rezultira kao najveći procenat homologije preko prozora za poređenje) generisano raznim postupcima.

[0035] Izraz "sekvencijalni identitet" označava da su dve polinukleotidne sekvence identične (tj., na nukleotid-do-nukleotid osnovi) preko prozora za poređenje. Izraz "procenat sekvencijalnog identiteta" izračunava se poređenjem dve optimalno poravnate sekvence preko prozora za poređenje, čime se određuje broj položaja u kojima se identična baza nukleinske kiseline (npr., A, T, C, G, U, ili I) pojavljuje u obe sekvence kako bi dala broj podudarajućih položaja, deljenjem broja podudarajućih položaja sa ukupnim brojem položaja u prozoru za poređenje (tj., veličina prozora), i množenjem rezultata sa 100 kako bi se dobio procenat sekvencijalnog identiteta. Izrazi "suštinski identitet" kako se ovde koristi označava karakteristiku polinukleotidne sekvence, gde the polinukleotid obuhvata sekvencu koja ima najmanje 85 procenata sekvencijalnog identiteta, poželjno najmanje 90 do 95 procenata sekvencijalnog identiteta, češcé najmanje 99 procenata sekvencijalnog identiteta u odnosu na prethodno određenu sekvencu preko prozora za poređenje najmanje 20 nukleotidnih položaja, najčešće preko prozora od najmanje 25-50 nukleotida, pri čemu se procenat sekvencijalnog identiteta izračunava poređenjem prethodno određene sekvence sa polinukleotidnom sekvencom koja može da uključi delecije ili dodavanja koja su ukupno 20 procenata ili manje od prethodno određene sekvence preko prozora za poređenje. Prethodno određena sekvenca može biti podskup veće sekvence, na primer, kao segment SEQ ID NO:1 polinukleotidne sekvence punog lanca koja je ovde prikazana.

[0036] Kada se primenjuje na polipeptidima, stepen identiteta aminokiselinskih sekvenci je funkcija broja identičnih aminokiselina na položajima koje dele aminokiselinske sekvence. Stepen homologije ili sličnosti aminokiselinskih sekvenci je funkcija broja aminokiselina, tj. strukturno povezanih, na položajima koje dele sa aminokiselinskim sekvencama.

[0037] Neka "nepovezana" ili "nehomologna" sekvenca deli manje od 40% identiteta, premda poželjno manje od 25% identiteta, sa jednim od modulatora proneutrofinske aktivnosti polipeptidne sekvence ovog opisa. Izraz "suštinski identitet" označava da dve peptide sekvence, kada su optimalno podvučene, kao što je pomoću programa GAP ili BESTFIT primenom uobičajenih težina useka, dele najmanje 80 procenata sekvencijalnog identiteta, poželjno najmanje 90 procenata sekvencijalnog identiteta, poželjnije najmanje 95 procenata sekvencijalnog identiteta ili više (npr., 99 procenata sekvencijalnog identiteta). Poželjno, položaji ostataka koji nisu identični, razlikuju se konzervativnim aminokiselinskim supstitucijama.

[0038] Konzervativne aminokiselinske supstitucije odnose se na uzajamnu zamenljivost ostataka sa sličnim bočnim lancima. Na primer, grupa aminokiselina koje imaju alifatične bočne lance je glicin, alanin, valin, leucin, i izoleucin; grupa aminokiselina koje imaju alifatične-hidroksil bočne lance je serin i treonin, grupa aminokiselina koje imaju amid-sadržavajuće bočne lance je asparagin i glutamin; grupa aminokiselina koje imaju aromatične bočne lance je fenilalanin, tirozin, i triptofan; grupa aminokiselina koje imaju bazne bočne lance je lizin, arginin, i histidin; i grupa aminokiselina koje imaju sumpor-sadržavajuće bočne lance je cistein i metionin. Poželjne konzervativne aminokiselinske supstitucione grupe su: valin-leucin-izoleucin, fenilalanin-tirozin, lizin-arginin, alaninvalin, i asparagin-glutamin.

[0039] Dodatno, takođe su određene varijante na bazi prethodno određenog broja konzervativnih aminokiselinskih supstitucija kako je definisano ovde u nastavku. Konzervativna aminokiselinska supstitucija kako se ovde koristi odnosi se na supstituciju jedne aminokiseline (unutar prethodno određene grupe aminokiselina) za neku drugu aminokiselinu (unutar iste grupe), gde aminokiseline pokazuju slične ili suštinski slične karakteristike.

[0040] Unutar značenja izraza "konzervativna aminokiselinska supstitucija" kako se ovde koristi, jedna aminokiselina može biti supstituisana nekom drugom unutar grupe aminokiselina naznačene ovde u nastavku:

i) Aminokiseline koje imaju polarne bočne lance (Asp, Glu, Lys, Arg, His, Asn, Gln, Ser, Thr, Tyr, i Cys,)

ii) Aminokiseline koje imaju nepolarne bočne lance (Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Phe, Trp, Pro, i Met) iii) Aminokiseline koje imaju alifatične bočne lance (Gly, Ala Val, Leu, Ile)

iv) Aminokiseline koje imaju ciklične bočne lance (Phe, Tyr, Trp, His, Pro)

v) Aminokiseline koje imaju aromatične bočne lance (Phe, Tyr, Trp)

vi) Aminokiseline koje imaju kisele bočne lance (Asp, Glu)

vii) Aminokiseline koje imaju bazne bočne lance (Lys, Arg, His)

viii) Aminokiseline koje imaju amidne bočne lance (Asn, Gln)

ix) Aminokiseline koje imaju hidroksi bočne lance (Ser, Thr)

x) Aminokiseline koje imaju sumpor-sadržavajući bočne lance (Cys, Met),

xi) Neutralne, blago hidrofobne aminokiseline (Pro, Ala, Gly, Ser, Thr)

xii) Hidrofilne, kisele aminokiseline (Gln, Asn, Glu, Asp), i

xiii) Hidrofobne aminokiseline (Leu, Ile, Val)

[0041] Shodno tome, neka varijanta ili njen fragment prema ovom opisu može da obuhvata, unutar iste varijante sekvence ili njenih fragmenata, ili među različitim varijantama sekvence ili njenih fragmenata, najmanje jednu supstituciju, kao što je više supstitucija uvedenih nezavisno jedna od druge.

[0042] Iz prethodno iznesenog jasno je da ista varijanta ili njen fragment mogu da obuhvataju više od konzervativne aminokiselinske supstitucije od više od jedne grupe konzervativnih aminokiselina kako je prethodno definisano.

[0043] Dodavanje ili delecija najmanje jedne aminokiseline može biti neko dodavanje ili delecija od poželjno 2 do 250 aminokiselina, kao što je od 10 do 20 aminokiselina, na primer od 20 do 30 aminokiselina, kao što je od 40 do 50 aminokiselina. Međutim, dodavanja ili delecije od više od 50 aminokiselina, kao što su dodavanja od 50 do 100 aminokiselina, dodavanje od 100 do 150 aminokiselina, dodavanje od 150-250 aminokiselina, takođe su sadržana u ovom opisu. Delecija i/ili dodavanje mogu - nezavisno jedan od drugog - biti delecija i/ili dodavanje unutar sekvence i/ili na kraju sekvence.

[0044] Polipeptidni fragmenti prema ovom opisu koji uključuju bilo koje njihove funkcionalne ekvivalente, mogu u jednom aspektu da obuhvataju manje od 250 aminokiselinskih ostataka, kao što je manje od 240 aminokiselinskih ostataka, na primer manje od 225 aminokiselinskih ostataka, kao što je manje od 200 aminokiselinskih ostataka, na primer manje od 180 aminokiselinskih ostataka, kao što je manje od 160 aminokiselinskih ostataka, na primer manje od 150 aminokiselinskih ostataka, kao što je manje od 140 aminokiselinskih ostataka, na primer manje od 130 aminokiselinskih ostataka, kao što je manje od 120 aminokiselinskih ostataka, na primer manje od 110 aminokiselinskih ostataka, kao što je manje od 100 aminokiselinskih ostataka, na primer manje od 90 aminokiselinskih ostataka, kao što je manje od 85 aminokiselinskih ostataka, na primer manje od 80 aminokiselinskih ostataka, kao što je manje od 75 aminokiselinskih ostataka, na primer manje od 70 aminokiselinskih ostataka, kao što je manje od 65 aminokiselinskih ostataka, na primer manje od 60 aminokiselinskih ostataka, kao što je manje od 55 aminokiselinskih ostataka, na primer manje od 50 aminokiselinskih ostataka.

[0045] "Funkcionalna ekvivalencija" kako se koristi u ovom opisu je, prema jednom poželjnom ostvarenju, utvrđena pozivom na odgovarajuću funkcionalnost prethodno određenog fragmenta sekvence.

[0046] Funkcionalni ekvivalenti ili varijante modulatora proneutrofinske aktivnosti može se shvatiti da pokazuje aminokiselinske sekvence koje su postepeno razlikuju od poželjne prethodno određene sekvence modulatora proneutrofinske aktivnosti, budući da se broj i obim unosa, delecija i supstitucija koje uključuju konzervativne supstitucije, povećava. Ova razlika se meri kao redukcija u homologiji između poželjne prethodno određene sekvence i fragmenta ili funkcionalnog ekvivalenta.

[0047] Svi fragmenti ili funkcionalni ekvivalenti iz SEQ ID NO: modulatora proneutrofinske aktivnosti uključeni su unutar obima ovog opisa bez obzira na stepen homologija koje pokazuju u odnosu na respektivne, prethodno određene sekvence modulatora proneutrofinske aktivnosti koje su ovde opisane. Razlog tome je što su neki regioni modulatora proneutrofinske aktivnosti verovatno već mutatabilni, ili sposobni za njihovo potpuno brisanje, bez bilo kakvog značajnog efekta na aktivnost vezivanja dobijenog fragmenta.

[0048] Funkcionalna varijanta dobijena supstitucijom može dobro da eksprimira neke oblike ili stepen aktivnosti nativnog modulatora proneutrofinske aktivnosti, a da bude manje homologna, ukoliko su ostaci koji sadrže funkcionalno slične aminokiselinske bočne lance supstituisani.

Funkcionalno slični u ovom smislu odnosi se na dominantne karakteristike bočnih lanaca kao što je hidrofobna, bazna, neutrala ili kisela, ili prisustvo ili odsustvo prostornog obima. Shodno tome, u jednom ostvarenju ovog opisa, stepen identiteta nije glavna mera nekog fragmenta koji je varijanta ili funkcionalni ekvivalent poželjnog prethodno određenog fragmenta prema ovom opisu.

[0049] Homologija između aminokiselinskih sekvenci može se izračunati primenom dobro poznatih matrica za ocenjivanje kao što je bilo koja od BLOSUM 30, BLOSUM 40, BLOSUM 45, BLOSUM 50, BLOSUM 55, BLOSUM 60, BLOSUM 62, BLOSUM 65, BLOSUM 70, BLOSUM 75, BLOSUM 80, BLOSUM 85, i BLOSUM 90.

[0050] Fragmenti koji dele homologiju sa fragmentima iz SEQ ID NO:1 do 42, respektivno, smatraju se da spadaju pod obim ovog opisa kada su poželjno najmanje oko 90 procenata homologni, na primer najmanje 92 procenata homologni, kao što je najmanje 94 procenata homologni, na primer najmanje 95 procenata homologni, kao što je najmanje 96 procenata homologni, na primer najmanje 97 procenata homologni, kao što je najmanje 98 procenata homologni, na primer najmanje 99 procenata homologni sa pomenutim prethodno određenim fragmentom sekvence, respektivno. Prema jednom ostvarenju ovog opisa, procenti homologije odnose se na procente identiteta.

[0051] Dodatni faktori koji se mogu uzeti u obzir kada se određuje funkcionalna ekvivalentnost prema ovde upotrebljenom značenju su i) sposobnost antiseruma da detektuje neki fragment modulatora proneutrofinske aktivnosti ili ii) sposobnost funkcionalno ekvivalentnog fragmenta modulatora proneutrofinske aktivnosti da uđe u kompeticiju sa odgovarajućim modulatorom proneutrofinske aktivnosti u ogledu. Jedan postupak određivanja sekvence imunološki aktivnih aminokiselina unutar poznate aminokiselinske sekvence, opisan je od strane Geysen u US 5,595,915.

[0052] Dalji pogodno prilagodljiv postupak za određivanje odnosa strukture i funkcije peptidnih fragmenata, opisan je u US 6,013,478. Takođe, postupci ispitivanja vezivanja neke aminokiselinske sekvence za receptorsku grupu poznati su stručnjacima iz ove oblasti.

[0053] Pored konzervativne supstitucije uvedene u bilo koji položaj poželjnog prethodno određenog modulatora proneutrofinske aktivnosti, ili njegovih fragmenata, takođe može biti poželjno uvesti nekonzervativne supstitucije u bilo kom jednom ili više položaja takvog modulatora proneutrofinske aktivnosti.

[0054] Ne-konzervativne supstitucije koje vode ka obrazovanju funkcionalno ekvivalentnog fragmenta modulatora proneutrofinske aktivnosti bi se na primer i) suštinski razlikovao u polaritetu, na primer ostatak sa ne-polarnim bočnim lancem (Ala, Leu, Pro, Trp, Val, Ile, Leu, Phe ili Met) supstituisan za ostatak sa polarnim bočnim lancem kao što je Gly, Ser, Thr, Cys, Tyr, Asn, ili Gln ili naelektrisana aminokiselina kao što je Asp, Glu, Arg, ili Lys, ili supstituisanje naelektrisanog ili polarnog ostatka za neki ne-polarni; i/ili ii) suštinski razlikovao u svom efektu na orijentaciju polipeptidne kičme kao što je supstitucija od ili za Pro ili Gly nekim drugim ostatkom; i/ili iii) suštinski razlikovao u električnom naelektrisanju, na primer supstitucija negativno naelektrisanog ostatka kao što je Glu ili Asp za pozitivno naelektrisan ostatak kao što je Lys, His ili Arg (i obrnuto); i/ili iv) suštinski razlikovao u prostornom volumenu, na primer supstitucija volumena ostatka kao što je His, Trp, Phe ili Tyr za neki koji imaju manji bočni lanac, npr. Ala, Gly ili Ser (i obrnuto).

[0055] Varijante dobijene supstitucijama aminokiseline mogu se u jednom poželjnom ostvarenju, ostvariti na osnovu vrednosti hidrofobnosti i hidrofilnosti i u odnosu na relativnu sličnost supstituenata aminokiselinskog bočnog lanca, koji uključuju naelektrisanje, veličinu, i slično.

Primerne aminokiselinske supstitucije koje uzimaju razne prethodno navedene karakteristike u obzir, dobro su poznate stručnjacima iz ove oblasti i uključuju: arginin i lizin; glutamat i aspartat; serin i treonin; glutamin i asparagin; i valin, leucin i izoleucin.

[0056] Pored ovde opisanih varijanti, sterično slične varijante mogu se obrazovati kako bi se imitirali ključni delovi strukture varijante i kako bi takva jedinjenja takođe mogla da se koriste na isti način kao i varijante ovog opisa. Ovo se može postići tehnikama modelovanja i hemijskog konstruisanja poznatih stručnjacima iz ove oblasti. Podrazumeva se da svi tako sterično slični konstrukti potpadaju pod obim ovog opisa.

[0057] U daljem ostvarenju, ovaj opis odnosi se funkcionalne varijante koje obuhvataju supstituisane aminokiseline koje imaju hidrofilne vrednosti ili hidropatske indekse koji su unutar /-4.9, na primer unutar /-4.7, kao što je unutar /-4.5, na primer unutar /-4.3, kao što je unutar /-4.1, na primer unutar /-3.9, kao što je unutar /-3.7, na primer unutar /- 3.5, kao što je unutar /-3.3, na primer unutar /- 3.1, kao što je unutar /-2.9, na primer unutar /- 2.7, kao što je unutar /-2.5, na primer unutar /- 2.3, kao što je unutar /- 2.1, na primer unutar /- 2.0, kao što je unutar /-1.8, na primer unutar /- 1.6, kao što je unutar /- 1.5, na primer unutar /- 1.4, kao što je unutar /-1.3 na primer unutar /- 1.2, kao što je unutar /- 1.1, na primer unutar /- 1.0, kao što je unutar /-0.9, na primer unutar /- 0.8, kao što je unutar /- 0.7, na primer unutar /- 0.6, kao što je unutar /-0.5, na primer unutar /- 0.4, kao što je unutar /-0.3, na primer unutar /- 0.25, kao što je unutar /- 0.2 vrednosti aminokiseline koja je supstituisana.

[0058] Važnost hidrofilnih i hidropatskih aminokiselinih indeksa u ispoljavanju interaktivne biološke funkcije na neki protein dobro je poznato u stanju tehnike (Kyte & Doolittle, 1982 i Hopp, U.S. Pat. Br.4,554,101.

[0059] Vrednosti aminokiselinskog hidropatskog indeks kako se ovde koriste su: izoleucin (+4.5); valin (+4.2); leucin (+3.8); fenilalanin (+2.8); cistein/cistin (+2.5); metionin (+1.9); alanin (+1.8); glicin (-0.4); treonin (-0.7); serin (-0.8 ); triptofan (-0.9); tirozin (-1.3); prolin (-1.6); histidin (-3.2); glutamat (-3.5); glutamin (-3.5); aspartat (-3.5); asparagin (-3.5); lizin (-3.9); i arginin (-4.5) (Kyte & Doolittle, 1982).

[0060] Vrednosti aminokiselinske hidrofilnosti su: arginin (+3.0); lizin (+3.0); aspartat (+3.0.+-.1); glutamat (+3.0.+-.1); serin (+0.3); asparagin (+0.2); glutamin (+0.2); glicin (0); treonin (-0.4); prolin (0.5.+-.1); alanin (-0.5); histidin (-0.5); cistein (-1.0); metionin (-1.3); valin (-1.5); leucin (-1.8); izoleucin (-1.8); tirozin (-2.3); fenilalanin (-2.5); triptofan (-3.4) (U.S.4,554,101).

[0061] Pored peptidilnih jedinjenja opisanih ovde, sterično slična jedinjenja mogu se formulisati kako bi imitirala neke ključne delove peptidne strukture i da se takva jedinjenja takođe mogu primeniti na isti način kao i peptidi ovog opisa.

[0062] Ovo se može postići tehnikama modelovanja i helijskog konstruisanja poznatih stručnjacima iz ove oblasti. Na primer, esterifikacija i druge alkilacije mogu se uposliti kako bi se modifikovali amino terminusi, npr., di-arginin peptidne kičme, kako bi se imitirala tetra peptidna struktura.

Podrazumeva se da svi tako sterično slični konstrukti potpadaju unutar obima ovog opisa. Peptidi sa N-terminalnim alkilacijama i C-terminalnim esterifikacijama takođe spadaju u obim ovog opisa. Funkcionalni ekvivalenti takođe obuhvataju glikozilovane i kovalentne ili agregativne konjugate obrazovane sa istim ili drugim fragmentima modulatora proneutrofinske aktivnosti i/ili molekulima modulatora proneutrofinske aktivnosti, koji uključuju dimere ili nepovezane hemijske ostatke. Takvi funkcionalni ekvivalenti pripremljeni su vezivanjem funkcionalnosti za grupe koje su pronađene u fragmentu koji je uključujen u bilo kom ili oba od N- i C-terminusa, sredstvima poznatim u stanju tehnike.

[0063] Funkcionalni ekvivalenti mogu tako da obuhvataju fragmente konjugovane za alifatične ili acilne estre ili amide karboksilnih terminusa, alkilamine ili ostatke koji sadrže karboksilne bočne lance, npr., konjugati kdo alkilamina na ostacima asparaginske kiseline; O-acil derivati ostataka koji sadrže hidroksil grupu i N-acil derivati amino terminalne aminokiseline ili ostaci koji sadrže amino grupu, npr. konjugati sa fMet-Leu-Phe ili imunogeni proteini. Derivati acil grupe su odabrani od grupe alkil-ostataka (koji uključuju C3 do C10 normalni alkil), čime se obrazuju alkanoilne vrste, i karbociklična ili heterociklična jedinjenja, čime se obrazuju aroil vrste. Reaktivne grupe poželjno su difunkcionalna jedinjenja poznata per se za upotrebu u umrežavanju proteina sa nerastvorljivim matricama putem reaktivnih bočnih grupa. Kovalentni ili agregativni funkcionalni ekvivalenti i njihovi derivati korisni su kao reagensi u imunoogledima ili za procedure afinitetnog prečišćavanja. Na primer, fragment modulatora proneutrofinske aktivnosti prema ovom opisu može biti nerastvoren kovalentnim vezivanjem sa sefarozom aktiviranom cijanogen bromidom postupcima poznatim per se ili apsorbovan na površinama poliolefina, bilo sa ili bez glutaraldehidnog umrežavanja, za upotrebu u ispitivanju ili prečišćavanju anti-neurotrofinske aktivnosti modulatora antitela ili receptora na površini ćelija. Fragmenti takođe mogu biti obeleženi detektabilnom grupom, npr., radiojodinisani primenom hloramin T procedure, kovalentno povezanom sa retkim zemno helatima ili konjugovana za neku grugu fluorescentu grupu za upotrebu u npr. dijagnostičkim testovima.

[0064] Mutageneza poželjnog prethodno određenog fragmenta modulatora proneutrofinske aktivnosti može se sprovesti izvođenjem aminokiselinskih umetanja, obično reda veličine oko od 1 do 10 aminokiselinskih ostataka, poželjno od oko 1 do 5 aminokiselinskih ostataka, ili delecija od oko od 1 do 10 ostataka, kao što je od oko 2 do 5 ostataka.

[0065] U jednom ostvarenju fragment modulatora proneutrofinske aktivnosti sintetizovan je automatizovanom sintezom. Bilo koji od komercijalno dostupnih tehnika čvrste faze mogu se uposliti, kao što je Merrifield postupak sinteze čvrste faze, u kojem se aminokiseline sekvencijalno dodaju rastućem aminokiselinskom lancu (videti Merrifield, J. Am. Chem. Soc.85:2149-2146,1963).

[0066] Oprema za automatizovanu sintezu polipeptida je komercijalno dostupna kod dobavljača kao što je Applied Biosystems, Inc. of Foster City, Calif., i može se generalno primenjivati prema isntrukcijama proizvođača. Sinteza čvrste faze će omogućiti inkorporiranje željenih aminokiselinskih supstitucija u bilo koji fragment modulatora proneutrofinske aktivnosti prema ovom opisu.

Podrazumeva se da supstitucije, delecije, umetanja ili bilo koja njihova podkombinacija mogu se kombinovati kako bi se postigla finalna sekvenca funkcionalnog ekvivalenta. Podrazumeva se da ova umetanja uključuju amino-terminalne i/ili karboksil-terminalne fuzije, npr. sa hidrofobnim ili imunogenim proteinom ili nekim nosačem kao što je bilo koja polipeptid ili struktura skele sposobna da posluži kao nosač.

[0067] Takođe su obezbeđeni i oligomeri koji uključuju dimere koji uključuju homodimere i heterodimere fragmenata modulatora proneutrofinske aktivnosti prema ovom opisu. Funkcionalni ekvivalenti i varijante modulatora proneutrofinske aktivnosti mogu se proizvesti kao homodimeri ili heterodimeri sa ostalim aminokiselinskim sekvencama ili sa nativnim sekvencama modulatora proneutrofinske aktivnosti. Heterodimeri uključuju dimere koji sadrže imunoreaktivne fragmente modulatora proneutrofinske aktivnosti kao i fragmente modulatora proneutrofinske aktivnosti koji ne moraju ili ispoljavaju bilo koju biološku aktivnost.

[0068] Fragmenti modulatora neurotrofinske aktivnosti prema ovom opisu mogu se sintetizovati i in vitro i in vivo. Postupak za in vitro sintezu su dobro poznati, a postupci koji su pogodni ili pogodno prilagodljivi sintezi in vivo modulatora proneutrofinske aktivnosti takođe su opisani u stanju tehnike.

Kada je sintetizovana in vivo, ćelija domaćin se transformiše sa vektorima koji sadrže DNK koja kodira modulator proneutrofinske aktivnosti ili njegov fragment. Vektor je definisan kao konstrukt replicirajuće nukleinske kiseline. Vektori se koriste da posreduju ekspresiju modulatora proneutrofinske aktivnosti. Neki ekspresioni vektor je reprikabilni DNK konstrukt u kojem je sekvenca nukleinske kiseline koja kodira fragment prethodno određenog modulatora proneutrofinske aktivnosti, ili bilo koji njegov funkcionalni ekvivalent koji se može eksprimirati in vivo, operativno povezana sa pogodnim kontrolnim sekvencama sposobne da utiču na ekspresiju fragmenta ili ekvivalenta u pogodnom domaćinu. Takve kontrolne sekvence dobro su poznate u stanju tehnike.

[0069] Kulture ćelija izvedenih od višećelijskih organizama predstavljaju poželjne ćelije domaćine. U principu, bilo koja viša eukariotska ćelijska kultura je pogodna, bilo da je od kultura kičmenjaka ili beskičmenjaka. Primeri korisnih ćelijskih linija domaćina su VERO i HeLa ćelije, ćelijske linije jajnika kineskog hrčka (CHO), i WI38, BHK, COS-7, 293 i MDCK ćelijske linije. Poželjne ćelije domaćini su eukariotske ćelije koje su poznate da sintetišu endogeni modulator proneutrofinske aktivnosti.

Kulture takvih ćelija domaćina mogu biti izolovane i koristiti se kao izvor fragmenta, ili se primenjivati u terapeutskim postupcima tretiranja, koji uključuju terapeutske postupke usmerene ka promovisanju ili inhibiranju stanja rasta, ili dijagnostički postupci izvedeni na ljudskom ili životinjskom telu.

[0070] Farmaceutski agens: izrazi "farmaceutski agens" ili "lek" ili "medikament" odnose se na bilo koji terapeutski ili profilaktički agens koji se može primeniti u tretiranju (koji uključuje prevenciju, dijagnozu, ublažavanje, ili izlečenje) problem, bol, stanje, bolest ili povredu kod pacijenta.

Terapeutski korisne genetske determinante, peptidi, polipeptidi i polinukleotidi mogu biti uključeni unutar značenja izraza farmaceutik ili lek. Kako je ovde definisano, neki "terapeutski agens," "farmaceutski agens" ili "lek" ili "medikament" je vrsta bioaktivnog agensa.

[0071] Izraz "bioaktivni agens" kako se ovde koristi, odnosi se na bilo koju supstancu koja se može primeniti u vezi sa primenom koja je terapeutska ili dijagnostička, kao što je, na primer, u postupcima za dijagnostikovanje prisustva ili odsustva bolesti kod pacijenta i/ili postupci za tretiranje bolesti kod pacijenta. "Bioaktivni agens" odnosi se na supstance, koje su sposobne za ispoljavanje nekog biološkog efekta in vitro i/ili in vivo. Bioaktivni agensi mogu biti neutralni, pozitivno ili negativno naelektrisani. Pogodni bioaktivni agensi uključuju, na primer, prolekove, dijagnostičke agense, terapeutske agense, farmaceutske agense, lekove, agense dostave kiseonika, zamene za krv, sintetičke organike molekule, polipeptide, peptide, vitamine, steroide, steroidne analoge i genetske determinante, koji uključuju nukleozide, nukleotide i polinukleotide.

[0072] Tretiranje: izraz "tretiranje" kako se ovde koristi, odnosi se na postupak koji uključuju terapiju koja uključuje operaciju kliničkog stanja kod pojedinca koji uključuje telo čoveka ili životinje. Terapija može biti ublažavajuća, kurativna ili profilaktička, tj. da smanjuje rizik od sticanja bolesti. antisenzitivna-RNK: RNK molekul sposoban za izazivanje utišavanja gena specifičnim vezivanjem za neki mRNK molekul od interesa.

antisenzitivna-DNK: DNK molekul sposoban za izazivanje utišavanja gena specifičnim vezivanjem za neki mRNK molekul od interesa.

siRNK: "mala uplićujuća RNK" (siRNK) je kratki (često, ali nije ograničen na, manje od 30 nukleotida dug) dvolančani RNK molekul sposoban za izazivanje gen-specifičnog utišavanja u ćelijama sisara Gensko "utišavanja": proces koji vodi ka redukovanoj ekspresiji endogenih gena. Gensko utišavanje poželjno je rezultat post-transkripcione redukcije genske ekspresije.

Pozitivna regulacija ekspresije: proces koji vodi ka povećanoj ekspresiji gena, poželjno endogenih gena.

In vitro/in vivo: izrazi se koriste u svoom uobičajenom značenju.

Polipeptid: Izraz "polipeptid" kako se ovde koristi, odnosi se na neki molekul koji obuhvata najmanje dve aminokiseline. Aminokiseline mogu biti prirodne ili sintetičke. Ovde definisani "oligopeptidi" definisani su kao polipeptidi dužine ne veće od 100 aminokiselina. Izraz "polipeptid" takođe je namenjen da uključi proteine, tj. funkcionalne bio-molekule koji obuhvataju najmanje jedan polipeptid; kada obuhvataju najmanje dva polipeptida, oni mogu obrazovati komplekse, biti kovalentno povezani ili mogu biti nekovalentno povezani. Polipeptidi u proteinu mogu biti glikozilovani i/ili lipidovani i/ili obuhvatati prostetske grupe.

[0073] "Polinukleotid" kako se ovde koristi, odnosi se na neki molekul koji obuhvata najmanje dve nukleinske kiseline. Nukleinske kiseline mogu biti prirodne ili modifikovane, kao što su zaključane nukleinske kiseline (LNK), ili peptidne nukleinske kiseline (PNK). Polinukleotid kako se ovde koristi generalno se odnosi na

i) polinukleotid koji obuhvata prethodno određenu kodirajuću sekvencu, ili

ii) polinukleotid koji kodira prethodno određenu aminokiselinsku sekvencu, ili

iii) polinukleotid koji kodira fragment polipeptida kodiranog polinukleotidima (i) ili (ii), gde pomenuti fragment ima najmanje jednu prethodno određenu aktivnost kako je ovde specificirano; i

iv) polinukleotid čiji se komplementarni lanac hibridizuje pod ogim uslovima sa polinukleotidom kakav je definisan u bilo kojoj od (i), (ii) i (iii), i kodira polipeptid, ili njegov fragment, koji ima najmanje jednu prethodno određenu aktivnost kakva je obde specificirana; i

v) polinukleotid koji obuhvata nukleotidnu sekvencu koja je degenerativna za nukleotidnu sekvencu polinukleotida (iii) ili (iv);

ili komplementarni lanac takvog polinukleotida.

[0074] "Prečišćeno antitelo" je neko antitelo čijih najmanje 60 masenih procenata je bez polipeptida i organikih molekula koji se prirodno javljaju sa kojima je prirodno povezano. Poželjno, pripremanje obuhvata antitelo u količini od najmanje 75 masenih procenata, poželjnije najmanje 90 masenih procenata, i najpoželjnije najmanje 99 masenih procenata.

Detaljan opis

[0075] Pronalazači su identifikovali da se proneurotrofini vezuju za receptor sortilina Vps10pdomenske receptorske familije što rezultira kao apoptoza kada se trojni kompleks obrazuje kovezivanjem p75<NTR>.

[0076] Shodno tome, ovaj opis odnosi se na modulaciju aktivnosti najmanje jednog proneurotrofina.

[0077] Bez vezivanja za teoriju, veruje se da je Vps10p-domenska receptorska familija uključena u jedan ili više sledećih mehanizama koji su povezani sa proneurotrofinima:

- Retrogradni transport, koji uključuju apsorpciju proneurotrofina i p75<NTR>

- Transport unutar biosintetičkih putanja, koji uključuju sortiranje proneurotrofina i transport od Golgi mreže

<�>Oslobađanje proneurotrofina

- Signaliziranje, koje uključuje modulaciju ćelijskog transporta i signaliziranja obrazovanjem trojnih kompleksa sa p75 i pro-neurotrofinom

[0078] Tako, jedan aspekt ovog opisa je postupak za modulisanje aktivnosti najmanje jednog proneurotrofina u jednoj ćeliji ili organizmu, koji uključuje neku životinju, koji obuhvata davanje pomenutoj životinji dovoljne količine agensa sposobnog za vezivanje za receptor Vps10p-domenske receptorske familije ili sposobnog za ometanje vezivanja između receptora Vps10p-domenske receptorske familije i proneurotrofina.

Receptori Vps10p-domenske receptorske familije

[0079] Izraz "receptor Vps1 Op familije" odnosi se na neku familiju receptora okarakterisana onima koji imaju neki N-terminalni Vps10p domen; pri čemu pomenuta Vpsp10p domenska familija obuhvata SorLA, Sortilin, SorCS1, SorCS2, ili SorCS3, videti Fig.1. U jednom ostvarenju ovog opisa bilo koji od receptora Vps10p domenske familije može se primeniti; poželjnije, receptor obuhvata Vps10p domen, 10CC modul, transmembranski segment kao i citoplazmični segment koji posreduje ćelijsko sortiranje i internalizaciju kao i koji posreduje vezivanjeza citoplazmične adaptere koji utiču na ćelijsko signaliziranje. Određenije, receptor koji se primenjuje je sortilin.

Neurotrofini/pro-neurotrofini

[0080] Izraz "neurotrofin" kako se ovde koristi, odnosi se na bilo kog člana neurotrofinske familije, pri čemu pomenuta neurotrofinska familija obuhvata faktor rasta nerava (NGF), neurotrofni moždani faktor (BDNF), neurotrofin-3 (NT-3) i neurotrofin-4/5 (NT-4/5). U jednom ostvarenju ovog opisa bilo koji član neurotrofinske familije može se primeniti; međutim, poželjnije je da je neurotrofin NGF ili BDNF.

[0081] Izraz "pro-neurotrofin" kako se ovde koristi može da se odnosi na bilo koju proneurotrofinsku familiju koja obuhvata neki prodomen operativno povezan sa odgovarajućim zrelim neurotrofinom, pri čemu pomenuta familija pro-neurotrofina obuhvata pro-NGF, pro-BDNF, pro-NT-3 i pro-NT-4/5. U jednom ostvarenju ovog opisa bilo koji pro-neurotrofin može se koristiti, međutim poželjnije je da je pro-neurotrofin pro-NGF ili pro-BDNF.

Inhibicija aktivnosti proneurotrofina

[0082] Izrazi "proneurotrofinom-posredovana" aktivnost, " proneurotrofinska aktivnost " ili "aktivnost proneurotrofina" odnose se na neku biološku aktivnost koja se normalno promoviše, bilo direktno ili indirektno, u prisustvu proneurotrofina ili neurotrofina. Pro-neurotrofinske aktivnosti uključuju, ali nisu ograničene na diferencijalno aktivirajuće i pro- i anti-apoptične ćelijske odgovore, putem preferencijalne aktivacije p75<NTR>ili TrkA receptora respektivno. Postoji hipoteza da je manjak neurotrofnskih faktora odgovorno za degeneraciju selektivne neuronske populacije budući da se pojavljuje kod Parkinsonove bolesti, Alchajmerove bolesti i amiotrofične lateralne skleroze.

[0083] U poželjnim ostvarenjima ovog opisa jedna ili više ovih aktivnosti proneurotrofina(a) inhibiraju se direktno ili indirektno davanjem agensa životinji.

[0084] Izrazi inhibicija ili inhibiran odnose se na bilo koje smanjenje u biološkoj aktivnosti bioaktivnog agensa, na primer proneurotrofina. U jednom ostvarenju ovog opisa kao što je inhibicija odnosi se na smanjenje u vezivanju proneurotrofina za Vps10p-domenski receptor, naročito vezivanje pro-NGF ili pro-BDNF za neki receptor sortilina. Efikasnost da inhibira efekat agenasa ovog opisa može se izmeriti kompetitivnim inhibitornim eksperimentima primenom BIAcore (rezonanca površinske membrane).

[0085] Agensi sposobni da inhibiraju vezivanje proneurotrofina za Vps10p-domenski receptor

[0086] U jednom poželjnom ostvarenju ovog opisa agens se daje životinji, pri čemu je pomenuti agens sposoban da inhibira vezivanje između receptora Vps10p-domenske receptorske familije i proneurotrofina.

[0087] U nekom drugom, jednako poželjnom ostvarenju, agens je sposoban za vezivanje za receptor Vps10p-domenske receptorske familije i/ili pro-neurotrofin čime ometa aktivnost proneurotrofina, bilo direktno ili indirektno.

[0088] Agens sposoban za eksprimiranje jednog ili više od prethodno pomenutih efekata može biti bilo koja vrsta agensa, na primer agens može biti odabran iz grupe koja obuhvata proteine, peptide, polipeptide ili organike molekule, U poželjnijem ostvarenju agens je neko antitelo, jedinjenje ili polipeptid, a agens je najpoželjnije polipeptid ili organiki molekul. Pomenuti agensi mogu se vezati za bilo koju od sledećih sekvenci:

Sortilin: RIFRSSDFAKNF

SorLA: YLWITFDFCNTL

SorCS1: SLLISSDEGATY

SorCS2: SLFLSADEGATF

SorCS3: SILISSDEGATY

[0089] Prethodno pomenute sekvence su sve podsekvence iz SEQ ID NO: 1 do 5 respektivno. Agensi ovog opisa inhibiraju vezivanje nekog pro-neurotrofina za prethodne sekvence tako da sprečavaju da pro-neurotrofin:Vps10p-domen receptor binarni kompleks izvede biološki ili fiziološki relevantnu aktivnost tako da se agensi ovog opisa mogu koristiti za sprečavanje bolesti i poremećaja koji su specificirani u nastavku.

[0090] U posebno poželjnom aspektu agens dat životinji je sposoban da inhibira vezivanje proneurotrofina za neki receptor sortilina tako da inhibira receptorsku aktivnost, pri čemu pomenuta aktivnost može biti, ali nije ograničena na, jedno ili više od sledećeg:

i) ćelijsko sortiranje receptora

ii) receptorsko vezivanje direktno ili indirektno premošćavanjem pomoću liganda do ostalih receptora, kao što su p75 i Trk receptori

iii) signaliziranje receptora sortilina

[0091] U jednom aspektu agens je sposoban da inhibira vezivanje nekog pro-neurotrofina za receptor Vps10p-domenske receptorske familije. Takva inhibicija može na primer biti usled vezivanja agensa bilo za pro-neurotrofin i/ili Vps10p-domenski receptor kao što je receptor sortilina.

[0092] U jednom aspektu agens je fragment ili varijanta Vps10p-domenskog receptora sortilina, pri čemu je pomenuti fragment ili varijanta sposobna za vezivanje pro-domena nekog pro-neurotrofina ili njegovog fragmenta ili njegove varijante. Određenije agens uključuje , ali nije ograničen na fragmente FANKNFV, RIFR i RIFRSSDF kako je prikazano na FIG.17 koja opisuje analizu dužine prodomen-BDNF vezivanja za sortilin peptide. Ovde su uključeni bilo koji fragment ili varijanta sposobna za vezivanje za pro-neurotrofin. Određenije, fragment je peptid koji obuhvata sekvencu koja odgovara bilo kojoj od SEQ ID NO: 25 do 28. Ovaj domen ovde se odnosi na pro-neurotrofinsko vezivanje motifa Vps10p domena. Peptidi koji obuhvataju SEQ ID NO: 25 do 28 mogu biti najmanje 3 ostatka dugi, kao što je 5 ostataka dugi, kao što je 7 ostataka dugi, kao što je 10 ostataka dugi, kao što je 13 ostataka dugi, kao što je 15 ostataka dugi, kao što je 20 ostataka dugi, kao što je 25 ostataka dugi, kao što je 30 ostataka dugi, kao što je 35 ostataka dugi, kao što je 40 ostataka dugi, kao što je 50 ostataka dugi, kao što je 60 ostataka dugi, kao što je 70 ostataka dugi, kao što je 80 ostataka dugi, kao što je najmanje 90 ostataka dugi, kao što je 100 ostataka dugi, kao što je 125 ostataka dugi kao što je 150 ostataka dugi, kao što je 175 ostataka dugi kao što je 200 ostataka dugi. Sekvence unutar takvog peptida identičnog sa SEQ ID NO:25 mogu ležati na početku pomenutog peptida, kraju, sredini ili bilo gde između. Pomenuti peptidi mgu dodatno biti varijante originalne SEQ ID NO:1 sekvence, varijante kakve su prethodno definisane. Poželjno varijanta obuhvata konzervativne aminokiselinske supstitucije ili druge, benigne izmene u odnosu na originalnu sekvencu. Poželjni peptid obuhvata SEQ ID NO: 26 i njene fragmente i varijante, kao što su sekvence identifikovane u SEQ ID NO: 27 i/ili SEQ ID NO: 28 i njihovim fragmentima i varijantama. Primeri varijanata takođe su dati u FIG.15 i 16, u kojima sekvenca koja podtpada pod SEQ ID NO: 25 predstavlja predmet supstitucione analize. Ovde je takođe potvrđeno da naročito relevantni delovi ovog vezujućeg motiva Vps10p domena potpada unutar sekvence opisane u SEQ ID NO: 26, a najsuštinskiji delovi ovog člana su ponovo sekvence identifikovane u SEQ ID NO: 27 i SEQ ID NO: 28. U vezi sa SEQ ID NO: 1, 25, 26, 27 ili 28, FIG.15 i 16 ukazuju da npr. R196 kako je izračunato primenom pre-pro-Sortilina (što odgovara R163 za proSortilin) može na način koji čuva sposobnost da veže BDNF biti supstituisan sa F, G, H, I, L, N, P, Q, T, V, W ili Y, a poželjno je supstituisan sa F, H, I, L, V, W ili Y. Isto tako, bilo koji od drugih ostataka SEQ ID NO: 1, 25, 26, 27 ili 28 može biti supstituisan. 1197 kako je izračunato primenom pre-pro-Sortilina (što odgovara 1164 proSortilin)tako je poželjno supstituisan A, F, G, H, P, R, S, T, V ili Y; F198 kako je izračunato primenom pre-pro-Sortilina (što odgovara F165 za proSortilin) poželjno je supstituisan sa I, L, R, ili W; R199 kako je izračunato primenom pre-pro-Sortilina (što odgovara R166 za proSortilin) poželjno je supstituisan sa A, D, F, G, H, I, L, S, T, V, W ili Y; F203 kako je izračunato primenom pre-pro-Sortilina (što odgovara F170 za proSortilin) poželjno je supstituisan sa L, P ili R; A204 kako je izračunato primenom pre-pro-Sortilina (što odgovara A171 za proSortilin) poželjno je supstituisan sa D, E, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W ili Y; K205 kako je izračunato primenom pre-pro-Sortilina (što odgovara K172 za proSortilin) poželjno je supstituisan sa A, F, G, H, I, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W ili Y; N206 kako je izračunato primenom pre-pro-Sortilina (što odgovara N173 za proSortilin) poželjno je supstituisan sa A, F, G, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, ili V; i F207 kako je izračunato primenom pre-pro-Sortilina (što odgovara F174 za proSortilin) poželjno je supstituisan sa H, I, K, L, N, P, Q, R, ili V. Bilo koja od ovih supstitucija može se izvesti sama ili u kombinaciji sa bilo kojom od drugih poželjnih supstitucija ili bilo kojim od drugih postupaka generisanja varijanti kakve su ovde navedene.

[0093] U nekom drugom ostvarenju agens je sposoban za vezivanje za receptor. Agens se može vezati za bilo koji deo receptoraa relevantan za inhibiranje vezivanja neurotrofina. Shodno tome, agens može biti sposoban da inhibira vezivanje pomenutog neurotrofina ili pomenutog proneurotrofina za receptor Vps10p-domenske receptorske familije vezivanjem za neki intracelularni deo receptora.

[0094] Cilj ovog opisa je da obezbede agensi koji su sami ili potpomognuti sa farmaceutskim agensom/formulacijom sposobni da prođu krvnu/moždanu barijeru.

[0095] Agens prema ovom pronalasku je neko antitelo usmereno protiv nekog ekstracelularnog dela receptora. U još poželjnijem ostvarenju, to antitelo je prečišćeno. Antitelo usmereno protiv nekog ekstracelularnog dela receptora, usmereno je protiv peptida koji obuhvata neku sekvencu koja odgovara vezujućem motivu Vps10p domena, pri čemu je pomenuti motiv definisan pomoću SEQ ID NO: 25, 26, 27 ili 28 ili njihovim fragmentom. Pomenuti fragment može da obuhvata između 3 i 31 amino ostataka, kao što je između 3 i 29 aminokiselinskih ostataka, na primer između 3 i 27 aminokiselinskih ostataka, kao što je između 3 i 25 aminokiselinskih ostataka, na primer između 3 i 23 aminokiselinska ostatka, kao što je između 3 i 21 aminokiselinska ostatka, na primer između 3 i 19 aminokiselinskih ostataka, kao što je između 3 i 17 aminokiselinskih ostataka, na primer između 3 i 15 aminokiselinskih ostataka, kao što je između 3 i 13 aminokiselinskih ostataka, na primer između 3 i 11 aminokiselinskih ostataka, kao što je između 3 i 9 aminokiselinskih ostataka, na primer između 3 i 7 aminokiselinskih ostataka, kao što je između 3 i 5 aminokiselinskih ostataka, na primer 4 aminokiselinska ostatka, kao što je između 5 i 31 aminokiselinskih ostataka, na primer između 7 i 31 aminokiselinskog ostatka, kao što je između 9 i 31 aminokiselinskog ostatka, na primer između 11 i 31 aminokiselinskih ostataka, kao što je između 13 i 31 aminokiselinskog ostatka, na primer između 15 i 31 aminokiselinskog ostatka, kao što je između 17 i 31 aminokiselinskog ostatka, na primer između 19 i 31 aminokiselinskog ostatka, kao što je između 21 i 31 aminokiselinskog ostatka, na primer između 23 i 31 aminokiselinskog ostatka, kao što je između 25 i 31 aminokiselinskog ostatka, na primer između 27 i 31 aminokiselinskog ostatka, kao što je između 29 i 31 aminokiselinskog ostatka, na primer 30 aminokiselinskih ostataka.

[0096] Određenije antitelo bi trebalo da je usmereno protiv nekog položaja u tom motivu tako da to antitelo sterično blokira vezivanje pro-neurotrofina za receptor.

[0097] U nekom drugom ostvarenju, jedinjenja ovog opisa tako sposobna da deluju kao inhibitori proneurotrofina za Vps10p domenske receptore, obuhvataju polipeptide od između 1 i 500 aminokiselinskih ostataka koji obuhvataju jednu ili više od SEQ ID NO: 25, 26, 27 i 28.

[0098] U još daljem ostvarenju agens je neki analog neurotenzina i/ili sistemski modulator neurotenzina koji uključuje, ali nije ograničen na SEQ ID NO.24 i SEQ ID NO.29 do 42. Neurotenzin i modulatori neurotenzinskog sistema vezuju se za Vps10-p domenske receptore na primer receptora sortilina ili njegovih fragmenata kao što je, a ne ograničavajući se na sekvence prikazane u FIG.17, čime sprečavaju bilo koji normalan i/ili prirodni ligand od vezivanja za sortilin čime deluju kao antagonisti na neurotrofine koji bi u suprotnom ušli u inetarkciju sa sortilinom i ovde opisanim njegovim fragmentima. Dodatno, pomenuti neurotenzin i modulatori neurotenzinskog sistema mogu se vezati na nekom alternativnom mestu vezivanja receptora sortilina indukujući konformacione promene koje utiču na afinitet vezivanja između neurotrofina i sortilina na antagonističi način.

Pomenuti neurotenzin i modulatori neurotenzinskog sistema poželjno su sposobni da prođu kroz krvno-moždanu barijeru i Vps10p-domenski receptori poželjno se vezuju za sortilin. U još jednom poželjnom ostvarenju, neurotenzin i modulatori neurotenzinskog sistema nemaju bilo kakav značajan afinitet vezivanja prema ili štetne efekete nakon vezivanja sa drugim Vps10p-domenskim receptorima ili ili potpuno različitim receptorima od sortilina.

[0099] Vps10p-domenski receptori, naročito sortilin, inicijalno identifikovan kao neurotenzinski receptor 3 (NTR-3) poseduje delimično preklapajuću supstracionu specifičnost sa neurotenzinskim receptorima 1 i 2 (NTR-1 i NTR-2) od koji se oba vezuju za NT(1-13) sa visokim afinitetom. Dodatno, brojni modulatori neurotenzinskog sistema su poznati ligandi NTR-1 i NTR-2. Njihovi primeri su peptidi NT66L (SEQ ID NO.15), NT67L (SEQ ID NO.16), NT69L (SEQ ID NO.17), Eisai (SEQ ID NO.18), JMV-449 (SEQ ID NO.19), PD-149163 (SEQ ID NO.20), PD-149598 (SEQ ID NO.21), PD-156425 strukture:

i PD-156556 (SEQ ID NO.23), CGX-1160 (SEQ ID NO.24), PD-147113 (SEQ ID NO 29), GZR-123 (SEQ ID NO 30), NT64D (SEQ ID NO.31), NT64L (SEQ ID NO.32), NT65L (SEQ ID NO.33), NT66D (SEQ ID NO.34), NT69L' (SEQ ID NO.35), NT71 (SEQ ID NO.36), NT72 (SEQ ID NO.37), NT73 (SEQ ID NO.38), NT74 (SEQ ID NO.39), NT75 (SEQ ID NO.40), NT76 (SEQ ID NO.41), NT77 (SEQ ID NO.42) i jedinjenja SR-142948A, SR-48692, UK-73093 i L-737631. Sva ova jedinjenja i peptidi su agensi prema ovom opisu Dodatno, derivati gornjih jedinjenja i varijanti ili fragmenti ili peptidi koji obuhvataju prethodno pomenute peptide, su agensi prema ovom opisu. Pod derivatima podrazumevaju se jedinjenja koja zadržavaju suštinski i/ili značajan deo strukture pomenutih jedinjenja, ali koja su supstituisana različitio, tj. koja obuhvataju druge supstituente. Derivati takođe mogu biti molekuli koji su sposobni za ulaženje u interakciju na isti način kao i roditeljska jedinjenja, tj. ulaženje u inetarkciju sa iszim ostacima na Vps10p-domenskom receptoru. Primeri takvih supstituenata obuhvataju , a nisu ograničeni na: Aliciklične grupe: izraz "aliciklične grupa" označava neku cikličnu ugljovodoničnu grupu koja ima osobine koje podsećaju na one od alifatične grupe. Alifatične grupe: u kontekstu ovog opisa izraz "alifatična grupa" označava neku zasićenu ili nezasićenu ravnu ili razgranatiu ugljovodoničnu grupu. Ovaj izraz se koristi da obuhvati alkil, alkenil, i alkinil grupe, na primer. Alkil grupe: izraz "alkil grupa" označava neku zasićenu ravnu ili razgranatu ugljovodoničnu grupu koja uključuju, na primer, metil, etil, izopropil, t-butil, heptil, dodecil, oktadecil, amil, 2-etilheksil, i slično. Alkenil grupe: izraz "alkenil grupa" označava neku nezasićenu, ravnu ili razgranatu ugljovodoničnu grupu sa jednom ili više ugljenik-ugljenik dvostrukih veza, kao što je vinil grupa. Alkinil grupe: izraz "alkinil grupa" označava neku nezasićenu, ravnu ili razgranatu ugljovodoničnu grupu sa jednom ili više ugljenik-ugljenik trostrukim vezama; Amfifili: substance koje sadržavaju i polarne, vodo-rastvorne i nepolarne, vodo-nerastvorne grupe. Aromatična grupa: izraz "aromatična grupa" ili "aril grupa" označava mono- ili poli-cikličnu aromatičnu ugljovodoničnu grupu. Ciklične grupe: izraz "ciklična grupa" označava ugljovodoničnu grupu zatvorenog prstena koja je klasifikovana kao neka aliciklična grupa, aromatična grupa, ili heterociklična grupa. Cikloalkenili: označava neki monovalentan nezasićen karbociklični radikal koji se sastoji od jednog, dva ili tri prstena, od tri do osam ugljenika po prstenu, koji opciono mogu biti supstituisani jednim ili dva supstituenata odabrana iz grupe koju čine hidroksi, cijano, niži alkenil, niži alkoksi, niži haloalkoksi, alkeniltio, halo, haloalkenil, hidroksialkenil, nitro, alkoksikarbonenil, amino, alkenilamino, alkenilsulfonil, arilsulfonil, alkenilaminosulfonil, arilaminosulfonil, alkilsulfonilamino, arilsulfonilamino, alkenilaminokarbonil, arilaminokarbonil, alkenilkarbonilamino i arilkarbonilamino. Cikloalkili: označavaju neki monovalentni zasićeni karbociklični radikal koji se sastoji jednog, dva ili tri prstena, od tri do osam ugljenika po prstenu, koji opciono mogu biti supstituisani jednim ili dva supstituenata odabrana iz grupe koju čine hidroksi, cijano, niži alkil, niži alkoksi, niži haloalkoksi, alkiltio, halo, haloalkil, hidroksialkil, nitro, alkoksikarbonil, amino, alkilamino, alkilsulfonil, arilsulfonil, alkilaminosulfonil, arilaminosulfonil, alkilsulfonilamino, arilsulfonilamino, alkilaminokarbonil, arilaminokarbonil, alkilkarbonilamino i arilkarbonilamino.

[0100] Katjonske grupe: Hemijska grupa sposobna funkcionisanje kao protonski donor kada se jedinjenje koje obuhvata hemijsku grupu rastvara u rastvaraču, poželjno kada se rastvara u vodi. Generalno "Grupa"/Ostatak/supstitucija dobro su poznati u ovoj oblasti, a velikiu stepen supstitucije ne samo da se toleriše, već je često i poželjan. Supstitucija se predviđa u odnosu na materijale ovog opisa.

[0101] Što se tiče pojednostavljivanja diskusije i navođenja određene terminologije koja se koristi kroz ovu prijavu, izrazi "grupa" i "ostatak" koriste se da bi napravili razliku između hemijske vrste koja omogućava supstituciju ili koja može biti supstituisana i između one koja ne dozvoljava ili se ne može supstituisati. Tako, kada se koristi izraz "grupa" on se koristi da opiše neki hemijski supstituent, pri čemu opisani hemijski materijal uključuje nesupstituisanu grupu i tu grupu sa O, N, ili S atomima, na primer, u lancu kao i karbonil grupe ili druge konvencionalne supstitucije. Kada se izraz "ostatak" koristi da opiše neko hemijsko jedinjenje ili supstituent, samo neki nesupstituisan hemijski materijal može se uključiti. Na primer, izraz "alkil grupa" namenjen je da uključi ne samo čiste zasićene ugljovodonične alkil supstituente otvorenog lanca, kao što je metil, etil, propil, t-butil, i slično, već i alkil supstituente koji nose dodatne supstituente poznate u stanju tehnike, kao što je hidroksi, alkoksi, alkilsulfonil, halogen atomi, cijano, nitro, amino, karboksil, itd. Tako, "alkil grupa" uključuje eter grupe, haloalkile, nitroalkile, karboksialkile, hidroksialkile, sulfoalkile, itd. Sa druge strane, izraz "alkilni ostatak" ograničen je na uključivanje samo čistih zasićenih ugljovodoničnih alkil supstituenta otvorenog lanca, kao što je metil, etil, propil, t-butil, i slično. Ista definicija primenjuje se i na "alkenil grupu" i "alkenil ostatak"; na "alkinil grupu" i "alkinil ostatak"; na "cikličnu grupu" i "ciklični ostatak; na "alicikličnu grupu" i "aliciklični ostatak"; na "aromatičnu grupu" ili "aril grupu" i na "aromatični ostatak" ili "aril ostatak"; kao i na "heterocikličnu grupu" i "heterociklični ostatak". Heterociklična grupa: izraz "heterociklične grupa" označava zatvoren prsten ugljovodonika u kojem je jedan ili više atoma u prstenu element različit od ugljenika (npr., azot, kiseonik, sumpor, itd.). Heterociklil označava monovalentan zasićeni ciklični radikal, koji se sastoji jednog do dva prstena, od tri do osam atoma po prstenu, koji obuhvataju jedan ili dva prstena heteroatoma (odabrani od N, O ili S(O)0-2, i koji opciono mogu biti supstituisani sa jednim ili dva supstituenata odabrana iz grupe koju čine hidroksil, okso, cijano, niži alkil, niži alkoksi, niži haloalkoksi, alkiltio, halo, haloalkil, hidroksialkil, nitro, alkoksikarbonil, amino, alkilamino, alkilsulfonil, arilsulfonil, alkilaminosulfonil, arilaminosulfonil, alkilsulfonilamino, arilsulfonilamino, alkilaminofarbonil, arilaminokarbonil, alkilkarbonilamino, ili arilkarbonilamino. Heteroaril označava monovalentni aromatični ciklični radikal koji ima jedan do tri prstena, od četiri do osam atoma po prstenu, koji uključuje jedan ili dva heteroatoma (odabrani od azota, kiseonika, ili sumpora) unutar prstena koji opciono mogu biti supstituisani sa jednom ili dva supstituenta odabrana iz grupe koju čine hidroksi, cijano, niži alkil, niži alkoksi, niži haloalkoksi, alkiltio, halo, haloalkil,-hidroksialkil, nitro, alkoksikarbonil, amino, alkilamino, alkilsulfonil, arilsulfonil, alkilaminosulfonil, arilaminosulfonil, alkilsulfonilamino, arilsulfonilamino, alkilaminokarbonil, arilaminokarbonil, alkilkarbonlamino i arilkarbonilamino. Supstituisan niži alkil označava neki niži alkil koji ima jedan do tri supstituenata odabrana iz grupe koju čine hidroksil, alkoksi, amino, amido, karboksilni, acil, halogen, cijano, nitro i tiol. Varijante, fragmenti ili peptidi koji obuhvataju peptide modulatora neurotenzinskog sistema mogu se generisati konzervativnom aminokiselinskom supstitucijom kako je prethodno definisano ili inkluzijom, i/ili supstitucijom bilo kog od ostataka za bilo koju prirodnu L-, D- ili aminokiselinu ili bilo koji sintetički aminokiselinski derivat. Dodatno, veze između ostataka u pomenutim aminokiselinama mogi se izmeniti obrazovanjem ne-amidne veze povezanih aminokiselinskih peptida.

[0102] Tako u jednom ostvarenju ovog opisa modulatori neurotenzinskog sistema kako su definisani u bilo kojoj od SEQ ID NO.10-11, 13-24, 29-42 i njihovi derivati ili varijante i jedinjenja SR-142948A, SR-48692, UK-73093 i L-737631 i njihovi derivati ili varijante su agensi ovog opisa. Dodatno, opisani fragmenti peptida takođe su agensi ovog opisa. Ovi fragmenti mogu biti kraći za jednu ili više aminokiselina u odnosu na peptide prema prethodno navedenim SEQ ID NO. Važno je da su peptidi koji ulaze u interakciju sa sortilinom zadržani u ovim fragmentima. Poželjne agensi su SR-48692, NT-69L i CGX-1160 i/ili njihove varijante.

[0103] U nekom drugom poželjnom ostvarenju ovog opisa agens je sposoban za vezivanje za neki intracelularni deo receptora i/ili transmembranski deo receptora Vps10p domenske receptorske familije. Određenije agens može biti sposoban za vezivanje za citoplazmični deo receptora Vps10p domenske receptorske familije, kao što je za deo sortilina koji odgovara SEQ ID NO: 1 ili njihovim fragmentom koji obuhvata bilo koju od SEQ ID NO: 25 do 28.

[0104] Određenije vezivanje agensa za intraćelijski i transmembranske delove receptora može voditi ka modulaciji aktivnosti proneurotrofina kroz modulaciju transporta najmanje jednog proneurotrofina od, u ili unutar ćelijskog eksprimiranja receptora Vps10p domenske receptorske familije kako je prethodno opisano.

[0105] U nekom drugom poželjnom ostvarenju, agens je sposoban za modulisanje ekspresije receptora Vps10p-domenske receptorske familije čime se ometa aktivnost najmanje jednog proneurotrofina. Modulacija može biti bilo inhibicija ili stimulacija ekspresije. Poželjni postupci za modulisanje ekspresije receptora uključuju, ali nisu ograničeni na:

(i) Blokiranje ili inhibiranje aktivnosti translacionih proizvoda jednog ili više Vps10p-domenskih receptorskih gena i/ili jednog ili više njegovih derivata, inhibiranjem mRNK translacije ili transkripcione aktivacije primenom antisenzitivnih nukleinskih kiselina.

(ii) Inaktiviranje mRNK ribozomima ciljanim ka mRNK koje kodiraju jedan ili više Vps10pdomenskih receptorskih gena i/ili jedan ili više njihovih derivata.

(iii) Inhibiciju intraćelijski prisutnih translacionih proizvoda Vps10p-domenskih receptorskih gena davanjem molekula koji imitiraju mete translacionih proizvoda jednog ili više Vps10p-domenskih receptorskih gena i/ili jedan ili više njihovih derivata čime ulaze u kompeticiju sa svojim prirodnim metama.

(iv) Stimulisanje ekspresije jednog ili više Vps10p-domenskih receptorskih gena i/ili jednog ili više njihovih derivata, na primer u jednom poželjnom ostvarenju, davanjem nekog agensa ćelijama in vitro ili in vivo. Takav neki agens može delovati bilo specifično ili ne-specifično. Takođe je poželjno da se aktiviraju geni odgovorni za dalji rast diferenciranog tkiva uvođenjem jednog ili više Vps10p-domenskih receptorskih gena i/ili jednog ili više njihovih derivata u respektivne ćelije i tkivo primenom genske terapije. U ovom cilju respektivne sekvnce nukleinskih kiselina mogu se staviti pod kontrolu jakog promotora, koji opciono može biti aktiviran i deaktiviran nakon davanja stimulansa ćeliji/tkivu.

(v) Stimulisanje ekspresija jednog ili više Vps10p-domenskih receptorskih gena i/ili jednog ili više njihovih derivata direktnim davanjem u respektivnu ćeliju/tkivo nekog translacionog proizvoda, bilo nekog peptida ili nekog proteina, koji j izveden iz jednog ili više Vps10p-domenskih receptorskih gena i/ili jednog ili više njihovih derivata. Zbog niske molekularna mase bilo kog od prethodno pomenutih translacionih proizvoda, ovi peptidi/proteini mogu se lako primeniti na ćeliji, na primer primenom enkapsulacionog sistema za isporuku.

[0106] Promena u nivou ekspresije receptora Vps10p-domenske receptorske familije može se ispitati upotrebom postupaka poznatim stručnjacima iz ove oblasti, koji uključuju, ali se ne ograničavaju na: DNK čipove ili mukročipove (Brazma i Vilo, FEBS Lett., 2000, 480, 17-24; Celis, et al., FEBS Lett., 2000, 480, 2-16), SAGE (serijska analiza genske ekspresije)(Madden, et al., Drug Discov. Today, 2000, 5, 415-425), READS (restrikciona enzimska amplifikacija svarenih cDNK) (Prashar i Weissman, Methods Enzymol., 1999, 303, 258-72), TOGA (analiza ukupne genske ekspresije) (Sutcliffe, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 2000, 97, 1976-81), proteinski čipovi i proteomici (Celis, et al., FEBS Lett., 2000, 480, 2-16; Jungblut, et al., Electrophoresis, 1999, 20, 2100-10), sekvencionisanje oznake eksprimirane sekvence (EST)(Celis, et al., FEBS Lett., 2000, 480, 2-16;

Larsson, et al., J. Biotechnol., 2000, 80, 143-57), substraktivni RNK fingerprintovanje (SuRF) (Fuchs, et al., Anal. Biochem., 2000, 286, 91-98; Larson, et al., Cytometry, 2000, 41, 203-208), substraktivno kloniranje, diferencijalni prikaz (DD) (Jurecic and Belmont, Curr. Opin. Microbiol., 2000, 3, 316-21), komparativna genomska hibridizacija (Carulli, et al., J. Cell Biochem. Suppl., 1998, 31, 286-96), FISH (fluorescentna in situ hibridizacija) tehnike (Going i Gusterson, Eur. J. Cancer, 1999, 35, 1895-904) i postupci masene spektrometrije (obrađeni u (To, Comb. Chem. High Throughput Screen, 2000, 3, 235-41).

Postupci za tretiranje bolesti ili poremećaja

[0107] Ovaj opis dalje obuhvata postupak za tretiranje neke bolesti ili poremećaja kod pojedinca. Pomenuti postupak obuhvata davanje pomenutom pojedincu, u nekom farmaceutski prihvatljivom nosaču, dovoljne količine agensa sposobnog za ometanje vezivanje između receptora Vps10pdomenske receptorske familije i proneurotrofina. Pod "dovoljna količina" ovde se podrazumeva neka doza koja proizvodi terapeutske efekte zbog kojih se daje. Tačna doza će zavisiti od poremećaja koji treba da se tretira, i može se utvrditi od strane stručnjaka iz ove oblasti primenom poznatih tehnika. Uopšteno, agens se daje životinji u nekoj količini od 1 µg/kg do oko 100 mg/kg na dan. Pored toga, kako je poznato u stanju tehnike, mogu biti potrebna podešavanja vezana za starost kao i telesnu težinu, opšte zdravlje, pol, dijetu, vreme davanja, interakciju lekova i ozbiljnost bolesti, a mogu se odrediti rutinskim eksperimentisanjem od strane stručnjaka iz ove oblasti.

[0108] Smatra se da su agensi ovog opisa korisni u promovisanju razvoja, održavanja, ili regeneracije neurona in vitro i in vivo, koji uključuju centralne (moždane i kičmene moždine), periferne (simpateične, parasimpateične, swnzitivne, i enterične neuroni), i motorne neurone. Shodno tome, agensi ovog opisa mogu se primeniti u postupcima za tretiranje raznih neuroloških bolesti, poremećaja i degeneracija. U poželjnijem ostvarenju, formulacije su date pacijentu radi tretiranja neurološkog poremećaja. Pod "neurološki poremećaji" ovde se podrazumevaju poremećaji centralnog i/ili perifernog nervnog sistema koji su povezani sa neuronskom degeneracijom ili oštećenjem. Specifični primeri neuronskih poremećaja uključuju, ali nisu ograničeni na, Alchajmerovu bolest, Parkinsonovu bolest, Huntington-ove drhtavice, šlog, ALS, periferne neuropatije, i druga stanja okarakterisana nekrozom ili gubitkom neurona, bilo centralnih, perifernih, ili motornih neurona, pored tretiranja oštećenih nerava usled traume, pada, disfunkcije bubrega ili povrede, disfunkcije pankreasa ili povrede, disfunkcija pluća ili povrede, povrede masnog tkiva, i toksičnih efekata hemoteraputika koji se koriste radi tretiranja kancera i SIDA. Na primer, periferne neuropatije povezane sa određenim stanjima, kao što su neuropatije povezane sa dijabetesom, SIDA, ili hemoterapijom mogu se tretirati primenom formulacija ovog opisa.

[0109] U raznim ostvarenjima ovog opisa agensi se daju pacijentima kod kojih je nervni sistem oštećen traumom, operacijom, šlogom, ishemijom, infekcijom, metaboličkom bolesti, nedostatkom nutrienata, malignitetom, ili toksičnim agensima, radi promovisanja peživljavanja ili rasta neurona, ili u bilo kojim uslovima koji se mogu tretirati sa NGF, NT-3, BDNF ili NT4-5. Na primer, agensi se mogu primeniti da promovišu peživljavanje ili rast motornih neurona koji su oštećeni traumom ili operacijom. Takođe, agensi se mogu koristiti radi tretiranja motornih neuronskih poremećaja, kao što je amiotrofična lateralna skleroza (Lu Gerigova bolest), Belova paraliza, i razna stanja koja uključuju atrofiju kičmenih mišića, ili paralize. Agensi mogu primeniti radi tretiranja humanih neurodegenerativnih poremećaja, kao što je Alchajmerova bolest, Parkinsonova bolest, epilepsija, multipla skleroza, Huntington-ove drhtavice, Daunov sindrom, gluvoća nerava, i Menierova bolest. Neurotrofini su esencijalni za zdravlje i dobrobit nervnog sistema. Na primer NGF (faktor rasta nerava), BDNF (neurotrofni moždani faktor), NT-3 (neurotrofin-3) i NT-4 (neurotrofin-4) takođe posreduju dodatne aktivnosti višeg reda, kao što je učenje, pamćenje i ponašanje, pored svojih utvrđenih funkcija za ćelijsko peživljavanje. Agensi ovog opisa tako se mogu koristiti kao kognitivni pojačivači, za pojačavanje učenja, posebno kod pacijenata koji boluju od demecije ili traume.

Alchajmerova bolest, za koju je identifikovano od strane Nacionalnog instituta starenja da je zaslužna za više od 50% demencije kod starijih, i da je takođe četvrti ili peti vodeći uzrok smrti kod amerikanaca iznad 65 godina starosti. Četiri miliona amerikanaca, 40% amerikanaca iznad 85 godina (najbrže rastući segment SAD populacije), imaju Alchajmerovu bolest. Dvadeset pet procenata svih pacijenata sa Parkinsonovom bolesti takođe boluje i od demencije nalik Alchajmerovoj bolesti. A kod oko 15% pacijenata sa demencijom, Alchajmerova bolest i multi-infarktna demencija koegzistiraju. Treći najčešći uzrok demencije, nakon Alchajmerove bolesti i vaskularne demencije, je kognitivno oštecénje zbog organike moždane bolesti povezane direktno sa alkoholizmom, koja pogađa skoro oko 10% alkoholičara. Međutim, najkonzistentnija abnormalnost za Alchajmerovu bolest, kao i za vaskularnu demenciju i kognitivno oštecénje usled organike moždane bolesti povezane sa alkoholizmom, je degeneracija holinergičnog sistema koja proizilazi iz bazalnog prednjeg mozga (BF) do oba i kodeksa i hipokampusa (Bigl et al. in Brain Cholinergic Systems, M. Steriade i D. Biesold, eds., Oxford University Press, Oxford, pp.364-386 (1990)). i postoji veliki broj neurotransmiterskih sistema na koje utiče Alchajmerova bolest (Davies Med. Res. Rev.3:221 (1983)). Međutim, kognitivno oštecénje, povezano na primer sa degeneracijom holinergičnog neurotransmiterskog sistema, nije ograničeno na pojedince koji boluju od demencije. Ono je takođe primećeno kod inače zdravih starijih pojedinaca i pacova. Ispitivanja koja porede stepen oštećenja u učenju sa stepenom redukovanog kortikalnom cerebralnom protoku krvi kod starih pacova pokazuje dobru korelaciju (Berman et al. Neurobiol. Starenje 9:691 (1988)). Kod hroničnog alkoholizma rezultujuća organski moždana bolest, kao Alchajmerova bolest i normalno starenje, takođe je okarakterisano ifuznim smanjenjem u kortikalnom cerebralnom protoku krvi u onim moždanim regionima u kojima se podižu holinergični neuroni (bazalni prednji mozak) i u kojima se projektuju (cerebralni korteks) (Lofti et al., Cerebrovasc. i Brain Metab. Rev 1:2 (1989)). Takve demencije mogu se tretirati davanjem agenasa ovog opisa.

[0110] Cilj ovog opisa je da se njegovi agensi upotrebe radi tretiranja multipla skleroze. Agensi ovog opisa mogu se koristiti sami ili u kombinaciji sa drugim medikamentima. Primeri takvih jedinjenja uključuju, a nisu ograničeni na: Interferon beta (npr. beta -1a i/ili beta-1b), glatiramer acetat (Copaxone, mešavina polipeptida koji mogu da zaštite važne mijelinske proteini svojom supstitucijom kada cilj imunog sistema napada), mitoksantron i natalizumab (Tysabri), kortikosteroidi, i monoklonalna antitela.

[0111] Pored toga, agensi ovog opisa mogu se koristiti u tretiranju povreda kičmene moždine i/ili u kombinaciji sa drugim tretiranjem primenjenim nakon povreda kičmene moždine. Trenutni primeri takvih ageansa uključuju, a nisu ograničeni na steroidni lek metilprednisolon koji je dat unutar prvih 8 sati nakon povrede radi redukovanja oštećenja u nervnim ćelijama.

[0112] Štaviše, agensi ovog opisa mogu se koristiti u tretiranju Parkinsonove bolesti (PD) i ili u kombinaciji sa drugim medikamentima datim u tretiranju Parkinsonove bolesti; takvi agensi uključuju, a nisu ograničeni na: levodop, karbidop, benserazid, talkopon, entakapon, mucuna pruriens, dopaminske agoniste kao što je bromokriptin, pergolid, pramipeksol, ropinirol, kabergolin, apomorfin, i lisurid, MAO-B inhibitorr kao što je selegilin i razagilin. Pored ostalih ne-farmakoloških tretiranja kao što su hirurške intevencije, terapija govora i fizičke vežbe pokazale su se umereno efektivne, a agensi ovog opisa mogu se koristiti u i kombinaciji sa ovim postupcima terapije.

Dodatno, agensi ovog opisa mogu se koristiti u kombinaciji sa postupcima koji upošljavaju gensku i/ili ćelijsku terapiju, kao što je implantacija ćelija genetski izrađenih radi prozvodnje dopaminskih ili matičnih ćelija koje se transformišu u ćelije koje proizvode dopamin ili se agensi mogu koristiti u kombinaciji sa GDNF (glial-izvedeni neurotrofni faktor) infuzijom. Ovo ukljuluje infuziju GDNF u bazalnu gangliju primenom hirurški implantiranog katetera. Takođe, tretiranje neuroprotektivnim agensima kao što su apoptični lekovi (CEP 1347 i CTCT346), lazaroidi, bioenergetici i/ili antiglutamatergični agensi u kombinaciji sa agensima ovde opisanim koji potpadaju unutar obima ovog opisa.

[0113] U još daljem ostvarenju, agensi ovog opisa mogu se koristiti u tretiranju šloga. Dodatno, agensi ovog opisa mogu se koristiti u kombinaciji sa medikamentima koji sekoriste u tretiranju šloga kao što je antiagregacioni lekovi (npr. aspirin, klopidogrel i dipiridamol) ili antikoagulantni lekovi kao što je varfarin ili tkivni plazminogenski aktivatori, tPA. Postupak čišćenja blokiranih krvnih sudova mehaničkom trombektomijom, takođe se mogu koristiri u kombinaciji sa agensima ovog opisa.

[0114] Dalje, agensi ovog opisa poželjno se primenjuju radi tretiranja neuropatije, i naročito periferne neuropatije. "Periferna neuropatija" odnosi se na neki poremećaj koji pogađa periferni nervni sistem, koji je najčešće manifestovan kao jedna ili kombinacija motorne, senzorne, senzorimotorne, ili autonomne nervne disfunkcije. Raznolikost morfologija koje pokazuje periferna neuropatija se svaka može pripisati jedinstveno jednako širokom broju uzroka. Na primer, periferna neuropatija može se steći genetski, može biti rezultat sistemske bolesti, ili može biti indukovana toksičnim agensom. Primeri uključuju, ali nisu ograničeni na, dijabetsku perifernu neuropatiju, distalnu senzomotornu neuropatiju, ili autonomnu neuropatiju kao što je smanjena pokretljivost gastrointestinalnog trakta ili atonija mokracńe bešike. Primeri neuropatije povezani sa sistemskom bolesti uključuju post-polio sindrom ili SIDA-povezanu neuropatiju; primeri nasledne neuropatije uključuju Charcot-Marie-Tooth-ovu bolest, Refsumova bolest, Abetalipoproteinemia, Tangierska bolest, Krabbe-ova bolest, metahromatska leukodistrofija, Daunov sindrom, Fabrijeva bolest, i Dejerine-Sottas-ov sindrom; a primeri neuropatije izazvane toksičnim agensom uključuju one izazvane tretiranjem sa hemoterapeutskim agensom kao što je vinkristin, cisplatin, metotreksat, ili 3'-azido-3'-deoksitimidin.

[0115] Dodatno, neuronska degeneracija kakva je primećena kod starenja ili biološkog starenja je cilj ovog opisa. Biološko starenje is kombinacija procesa pogoršanja koji prati period razvoja organizma i generalno je okarakterisano opadanjem sposobnosti da se odgovori na sters, povećavajući homeostatsku neravnotežu i povećan rizik od bolesti. Starenje samo po sebi neki gerontrolozi smatraju "bolešću" koja se može lečiti. U skladu sa tim, starenje je akumulacija oštećenja makromolekula, ćelija, tkiva i organa, tako da napredne biohemijske i molekularne tehnologije za oporavak mogu da se suprotstave oštećenju izazvanim biološkim starenjem. Agensi ovog opisa mogu se primeniti u postupcima za zaštitu ili prevenciju oštećenja indukovanog biološkim starenjem, naročito neuronske degeneracije usled biološkog starenja. U poželjnijem ostvarenju, formulacije ovog opisa daju se pacijentu radi tretiranja biološkog starenja povezanog sa neuronskom degeneracijom.

[0116] U okviru obima ovog opisa je da obezbedi agens za tretiranje, prevenciju i/ili poboljšanje neuropsihijatrijskih poremećaja. Od dole pomenutih stanja neka se takođe mogu odnositi na neurološke bolesti. Neuropsihijatrijske bolesti i poremećaji mogu biti podeljeni u tri glavne grupe: misleni/psihotični poremećaji (oni čine da ljudi teško razdvoje šta je stvarno od onoga što nije, npr. šizofrenija), poremećaji raspoloženja (utiču na to kako se osoba oseća; na primer, veoma tužna ili beznadežna. Ukoliko poremećaj postane ozbiljniji, može se pojaviti kao težak poremećaj, npr. bipolarni poremećaj i depresivni poremećaji), anksiozni poremećaji (čine da se čovek oseća nadmoćno anksiozan i ispunjen strahom, npr. panični poremećaj i opsesivno-kompulsivni poremećaj (OCD)). Primeri neuropsihijatrijskih poremećaja uključuju bilo koju neuropsihijatrijsku bolest ili poremećaj kao što je, ali bez ograničavanja: šizofrenija, bipolarni poremećaj, depresija, manija, zavisnost od i zloupotreba neke supstance (npr. zavisnost od alkohola), depresija, bipolarni poremećaj, Alchajmerova bolest, Parkinsonova bolest, psihotični poremećaji, šizofrenija, šizoafektivni poremećaj, anksiozni poremećaji, post-traumatski stresni poremećaj, opsesivno kompulzivni poremećaj, granični poremecáj ličnosti, šizotipni poremećaj ličnosti, anksiozna reakcija i antisocijalni poremećaj ličnosti. Patogeneza šizofrenije može se pripisati ranom malrazvoju moždanog tkiva. Sakupljanjem predkliničkih i kliničkih podataka ukazuje da disfunkcije neurotrofina, naročito faktora rasta nerava (NGF), moždano izvedenog neurotrofnog faktora (BDNF) i neurotrofina-3 (NT-3) može da doprinese smanjenom razvoju mozga, neuroplastičnosti i sinaptičkoj "diskonekciji" koja vodi ka šizofrenom sindromu. Dodatno, postoji nekoliko linija dokaza koje podržavaju ulogu neurotrofina i proneurotrofina u tretiranju depresije, hroničnog stresa i zloupotrebe supstance. Proširenje u neurološkoj podršci i povezano pojačanje sinaptičkoj plastičnosti i funkciji može obrazovati osnovu za anitdepresionu efikasnost. Na taj način, neuropsihijatrijske bolesti i poremećaji kao što je šizofrenija, depresija, hronični stres, i zloupotreba supstance mogu se tretirati, sprečiti i ublažiti davanjem ovde opisanih agenasa.

[0117] Ostali poremećaji, bolesti i degenerativna stanja kod sisara koja se mogu tretirati nekom terapeutski efektivnom količinom jednog ili više agenasa ovog opisa su bolesti, poremećaji i degeneracije oka. Stanja ovog tipa koja su od posebnog interesa mogu se podeliti na četiri kategorije: Stečene makularne bolesti (AMD), vaskularne bolesti mrežnjače, ablacija mrežnjače, i nasledne fundus distrofije. Poželjno, poremećaji su stečene makularne bolesti kao što je egzotativna i ne-egzotativna makularna degeneracija povezana sa starenjem, vaskularne bolesti mrežnjače kao što je dijabetska retinoplazija i krvni ugrušci u oku, i nasledne fundus distrofije kao što je leber. Ostali poremećaji specifično su povezani sa biološkim starenjem oka koje je u skladu sa većinom anatomskih i fizioloških procesa koji prate postepeno opadanje. Agensi ovog opisa su korisni u prevenciji ili poboljšanju patoloških stanja oka.

[0118] Pored toga, bol i nocicepcije su pokazatelji od značaja za agense ovog opisa. Bol je, a nocicepcije mogu biti, neko neprijatno osećanje, koje se po intezitetu kreće od blagog do ozbiljnog do neopisivog. Dok je bol subjektivni osećaj, nocicepcija je merljiv fiziološki događaj koji se može javiti bez osećanja bola. Fiziološki bol se može klasifikovati prema izvoru i njegovom poezanim neuronima za detektovanje bola (nociceptori) na kutani bol, somatski bol, visceralni bol, bol fantomskog uda i neuropatski bol. Kutani bol je izazvana povredom kože ili površinskog tkiva.

Somatski bol potiče od ligamenata, tetiva, kostiju, krvnih sudova, a čak i samih nerava. Visceralni bol potiče od utrobe tela, ili organa. Bol fantomskog uda je osećaj bola u udu koji je izgubljen ili od kog osoba više ne prima fizičke signale. Neuropatski bol, ili "neuralgia", može se javiti kao rezultat povrede ili bolesti nervnog tkiva samog po sebi.

[0119] Bol i/ili nocicepcije mogu nastati usled različitih uzroka, pri čemu je glavni trauma. Trauma se može se javiti u bolo kom delu tela, a bilo koja trauma koja izaziva bol ili nocicepcije je unutar obima ovog opisa. Ostali primeri bola i nocicepcija uključuju, ali nisu ograničeni na: povezani sa glavom i vratom: Vilica - temporalni arteritis (ozbiljan); Uho - otitis podloga (veoma česta naročito kod dece), otitis externa; Oko - glaukom; Glava - migrena, tenziona glavobolja, klaster glavobolja, kancer, cerebralna aneurizma, sinusitis, meningitis, Bol vrata - MI (netipičan); Grudni koš: leđa - kancer; Dojke - perimenstrualni, kancer; Grudi - MI (čest i fatalan), GERD (veoma čest), pancreatitis, Hijatalna hernija, disekcija aorte (retko), plucńa embolija (najčešće asimptomatično), Kostohondritis, Rame -holecistitis (desna strana), MSK; Abdomen: Abdominalne - levi i desni gornji kvadrant - bolest peptičkog ulkusa, gastroenteritis, hepatitis, pankreatitis, holecistitis, MI (atipično), Aneurizma abdominalne aorte, rak želuca, levi i desni niži kvadrant - upala slepog creva (ozbiljno), vanmaterična trudnocá (ozbiljne / samo žene), zapaljenska bolest karlice (samo žene), divertikulitis (uobičajeno kod starih), urolitijaza (kamen u bubregu), pijelonefritis, kancer (kolorektalni kancer najčešcé); Leđa: Leđa - MSK (mišićni soj), kancer, diskus hernija, degenerativna bolest diska, coccyx (coccidinia); Udovi: Ruka - MI (klasično levo, ponekad bilateralni), MSK; Noga - tromboza dubokih vena, oboljenje perifernih krvnih sudova (hramanje), MSK, diskus hernija, išijas; Zglobovi: Klasično mali zglobovi -osteoartritis (uobičajeno kod starih), reumatoidni artritis, sistemski lupus erimatozis, giht, pseudogiht; Klasično velikih zglobova (kuk, koleno) - osteoartritis (uobičajeno kod starih), septični artritis, hemartroza; Klasično leđa - ankilozni spondilitis, inflamatorne bolesti creva; Ostalo -psorijazni artritis, Reiter-ov sindrom. Agensi ovog pronalaska mogu da se koriste kao analgetici ili analgetska sredstva za lečenje i/ili ublažavanje bilo kog od navedenih vrsta bola i / ili nocicepcija.

[0120] Štaviše, gojaznost je značajan pokazatelj za agense ovog opisa. Gojaznost je stanje u kojem se prirodne energetske rezerve, uskladištene u masnom tkivu ljudi i oslatih sisara, povećavaju do tačke kada postoji rizik za određena zdravstvena stanja ili povećanim mortalitetom. Pokazalo se da je prekomerna telesna masa predisponitet za razne bolesti, naročito kardiovaskularne bolesti, apneju pri spavanju, osteoartritis i dijabetes mellitus koji nije zavisan od insulina. Gojaznost je jedini najfrekventniji potpomagač dijabetesa tipa 2. Dijabetes tipa 2 je metabolički poremećaj koji je izazvan insulinskom rezistencijom i relativnom insulinskom deficijencijom, i hroničnom hiperglikemijom. Rapidno se širi i procenjuje se da će se proširiti u epidemijskim razmerama. Vps10p domenski receptorski gen nedavno je povezan sa dijabetesom tipa 2 kod miševa i pacova. Ostali tipovi dijabetesa su dijabetes tip 1 i gestacijski dijabetes (GDM) koji se javlja tokom trudnoće i ostali tipovi. Tip 1 nastaje usled autoimune destrukcije ćelija koje proizvode insulin. Cilj ovog opisa je da obezbedi agense za tretiranje gojaznosti, dijabetesa tipa 1, 2, GDM i poremećaja povezanih sa dijabetesom.

[0121] Pored dijabetesa, gojaznost takođe povećava rizik od miokardijalnog infarkta usled ateroskleroze koja je predmet cilja agenasa ovog opisa.

[0122] Shodno tome, ovde je obezbeđen postupak tretiranja, prevencije i/ili ublažavanja nekog poremećaja, i bolest ili degeneracija povezani sa proneurotrofinom kod sisara koji obuhvata davanje sisaru terapeutski efektivnu količinu jednog ili više agenasa ovog opisa. Ove bolesti, poremećaji ili degeneraciona stanja povezana sa proneurotrofinom mogu biti bilo koja od prethodnih stanja kao što su neuronski poremećaji, neuronska degeneracija, neuropsihijatrijski poremećaji i bolesti, biološko starenje, bol i nocicepcije, očne bolesti, poremećaji ili degeneracija, gojaznost i bolesti povezane sa gojaznosti i dijabetes. Bol kako se ovde koristi odnosi se na periferni bol. Očne bolesti kako se ovde koriste, odnose se na retinalne bolesti, poremećaje i degeneracije mrežnjače.

[0123] Bilo koji od ovde opisanih agenasa može se koristiti sam ili u kombinaciji sa nekim drugim. Agensi se tako mogu davati simultano ili uzastopno. Agens se dodatno može koristiti sam ili u kombinaciji zajedno sa drugim aktivnim sastojkom. Ovi drugi aktivni sastojci mogu biti za tretiranje bilo koje od prethodno pomenute bolesti ili poremećaja, ili se može koristiti za druge svrhe.

[0124] Dalje su opisani kompleti delova, gde komplet uključuje najmanje jedan agens ili farmaceutsku kompoziciju kakva je ovde opisana, sredtsva za davanje pomenute vakcine i instrukcije za upotrebu. Komplet može da uključi višestruke doze istog agensa i/ili farmaceutske kompozicije ili nekoliko različitih agenasa i/ili farmaceutskih kompozicija. U poželjnijem ostvarenju komplet delova dalje obuhvata i drugi aktivni sastojak.

Postupci davanja

[0125] Agensi koji sekoriste u postupcima ovog opisa uopšteno su dati životinji u obliku pogodne farmaceutske kompozicije. Shodno tome, ovaj opis se takođe odnosi na farmaceutsku kompoziciju koja obuhvata neki agens kako je ovde definisan. Takve kompozicije obično sadrže agens i neki farmaceutski prihvatljiv nosač. Kako se ovde koristi izraz "farmaceutski prihvatljiv nosač" odnosi se na to da uključi bilo koju i sve rastvarače, disperzione podloge, premaze, antibakterijske i antigljivične agense, izotonične i agense za odlaganje apsorpcije, i slično, kompatibilni sa farmaceutskim davanjem. Upotreba takvih podloga i agenasa za farmaceutski aktivne supstance dobro su poznate u stanju tehnike. Osim ukoliko bilo koji konvencionalni medijum ili agens nije kompatibilan sa agesnom, njihova primena u preparatima se razmatra. Dopunska aktivna jedinjenja se takođe mogu inkorporirati u ove kompozicije.

[0126] Farmaceutska kompozicija je formulisana tako da je kompatibilna sa namenjenom putanjom davanja. Primeri pogodnih putanja uključuju parenteralnono, npr., intravenozno, intradermalno, subkutano, oralno (npr., inhalacija), transdermalno (topikalno), transmukozalno, i rektalno davanje. Rastvori ili suspenzije koje se koriste za parenteralno, intradermalno, ili subkutano davanje mogu da uključe sledeće komponente: sterilni razblaživač kao što je voda za injekcije, slani rastvor, fiksirana ulja, polietilen glikole, glicerin, propilen glikol ili druge sintetičke rastvarače; antibakterijske agense kao što je benzil alkohol ili metil parabeni; antioksidansi kao što je askorbinska kiselina ili natrijum bisulfit; helacione agense kao što je etilendiamintetra sircétna kiselina; pufere kao što su acetati, citrati ili fosfati i agensi podešavanje toničnosti kao što je natrijum hlorid ili dekstroza. pH se može podesiti kiselinama ili bazama, kao što je hlorovodonična kiselina ili natrijum hidroksid. Parenteralni preparat može se smestiti u ampule, špriceve za jednokratnu upotrebu ili bočice sa više doza izrađene od stakla ili plastike.

[0127] Farmaceutske kompozicije pogodne za injektabilnu upotrebu uključuju sterilne vodene rastvore (kada su rastvorljivi u vodi) ili disperzije i sterilne praškove za preparate bez pripreme sterilnih injektabilnih rastvora ili disperzija. Za intravenozno davanje, pogodni nosači uključuju fiziološki slani rastvor, bakteriostatičnu vodu, Cremophor EL.TM. (BASF, Parsippany, N.J.) ili fosfatne puferovane slane rastvore (PBS). U svim slučajevima, kompozicija mora biti sterilna i trebalo bi da je tečna do te mere da se može lako davati šricom. Mora biti stabilna pod uslovima proizvodnje i skladištenja i mora se sačuvati od kontaminiranja mikroorganizmima kao što su bakterije i gljive. Nosač može biti rastvarač ili disperziona podloga koja sadrži, na primer, vodu, etanol, poliol (na primer, glycerol, propilen glikol, i tečni polietilen glikol, i slično), i njihove pogodne mešavine.

Podesna tečljivost se može održavati, na primer, upotrebom prevlaka kao što je lecitin, održavanjem potrebne veličine čestica u slučaju disperzije i upotrebom surfaktanata. Prevencija aktivnosti mirkoorganizama može se postići raznim antibakterijskim i antigljivičnim agensima, na primer, parabenima, hlorobutanolom, fenolom, askorbinskom kiselinom, timerosalom, i slično. U mnogim slučajevima, poželjno je da se uključe izotonični agensi, na primer, šećeri, polialkoholi kao što je manitol, sorbitol, natrijum hlorid u kompoziciju. Produžena apsorpcija injektabilnih kompozicija može se izvesti uključivanjem u kompoziciju nekog agensa koji odlaže apsorpciju, na primer, aluminijum monostearat i želatin.

[0128] Sterilni injektabilni rastvori mogu se pripremiti uključivanjem agensa u željenoj količini u pogodnom rastvaraču sa jednim ili kombinacijom sastojaka koji su prethodno nabrojani, po potrebi, praćeno filtriranom sterilizacijom. Generalno, disperzije se pripremaju uključivanjem agensa u sterilno vozilo koje sadrži neki bazni disperzioni medijum i potrebne ostale sastojke od onoh prethodno nabrojanih. U slučaju sterilnih praškova za pripremu sterilnih injektabilnih rastvora, poželjni postupci pripreme su sušenje u vakuumu i sušenje zamrzavanjem koje daje prah aktivnog sastojka plus bilo kog dodatnog željenog sastojka od njihovog prethodno sterilno-filtriranog rastvora.

[0129] Oralne kompozicije generalno uključuju neki inertni razblaživač ili neki jestivi nosač. One mogu biti smeštene u želatinaste kapsule ili kompresovane u tablete. Za oralno terapeutsko davanje, agens može biti inkorporiran sa ekscipijensom i upotrebljen u obliku tableta, pastila, ili kapsula, oralne kompozicije takođe mogu biti pripremljene upotrebom nosača za upotrebu kao tečnost za ispiranje usta, gde se jedinjenje u tečnom nosaču primenjuje oralno i mućkanjem i iskašljavanjem ili gutanjem. Farmaceutski kompatibilni agensi za vezivanje, i/ili adjuvansni materijali mogu biti uključeni kao deo kompozicije. Tablete, pilule, kapsule, pastile i slično mogu da sadrže bilo koji od sledećih sastojaka, ili jedinjenja slične prirode: vezivo kao što je mikrokristalna celuloza, tranghtan gumu ili želatin; ekscipijens kao što je skrob ili laktoza, dezintegrišući agens kao što je alginska kiselina, Primogel, ili kukuruzni skrob; lubrikant kao što je magnezijum stearat ili Sterotes; sredstvo za klizanje kao što je koloidni silikon dioksid; zaslađivač kao što je saharoza ili saharin; ili aromu kao što je pepermint, metil salicilat, ili aroma pomorandže.

[0130] Za davanje inhalacijom, jedinjenja se dostavljaju u obliku aerosolnog spreja u kontejneru pod pritiskom ili dispenzeru koji sadrži pogodni propelant, npr., gas kao što je ugljen dioksid, ili nebulizatora.

[0131] Sistemsko davanje može takođe biti transmukozalnim ili transdermalnim sredstvima. Za transmukozalno ili transdermalno davanje, u formulaciji se koriste se penetrati pogodni za barijeru kroz koju treba da prodru. Takvi penetrati uopšteno su poznati u stanju tehnike, i uključuju, na primer, za transmukozalno davanje, deterdžente, žučne soli, i derivate fusidinske kiseline.

Transmukozalno davanje može se postići upotrebom nazalnih sprejeva ili supozitorija. Za transdermalno davanje, aktivna jedinjenja su formulisana u masti, meleme, gelove, ili kreme generalno poznate u stanju tehnike.

[0132] Agens se takođe može pripremiti u obliku supozitorija (npr., sa konvencionalnim supozitorionim bazama kao što je kakao buter i drugi gliceridi) ili klizmi za rektalnu dostavu.

[0133] U jednom ostvarenju, agens se priprema sa nosačima koji štite jedinjenje protiv rapidne eliminacije iz tela, kao što je formulacija sa kontrolisanim oslobađanjem, koji uključuju implante i mikroenkapsulirane sisteme dostave. Mogu se primeniti biodegradabilni, biokompatibilni polimeri, kao što je etilen vinil acetat, polianhidridi, poliglikolna kiselina, kolagen, poliortoestri, i polimlečna kiselina. Postupci za pripremanje takvih formulacija biće očigledni stručnjacima iz ove oblasti.

Materijali se takođe mogu dobiti komercijalno od Alza Corporation i Nova Pharmaceuticals, Inc. Lipozomalne suspenzije (koji uključuju lipozome ciljane za inficirane ćelije sa monoklonalnim antitelima ka virusnim antigenima) takođe se mogu primeniti kao farmaceutski prihvatljivi nosači. Oni se mogu pripremiti prema postupcima poznatim stručnjacima iz ove oblasti, na primer, kako je opisano u U.S. Pat. Br.4,522,811.

[0134] Naročito je pogodno je formulisati oralne ili parenteralne kompozicije u obliku dozne jedinice za davanje i uniformnost doziranja. Oblik dozne jedinice kako se ovde koristi, odnosi se na fizički diskretne jedinice koje odgovaraju unitarnim doziranjima za subjekta koji treba da se tretira; pri čemu svaka doza sadrži neku prethodno određenu količinu aktivnog jedinjenja izračunata radi proizvodnje željenog terapeutskog efekta u vezi sa željenim farmaceutskim nosačem. Specifikacija oblika doznih jedinica diktirana je od strane i direktno zavisno od jedinstvenih karakteristika aktivnog jedinjenja i određenog terapeutskog efekta koji treba da se postigne, i oganičenja inhetentnih u stanju tehnike za pripremanje takvog aktivnog jedinjenja za tretiranje pojedinaca.

[0135] Toksičnost i terapeutska efikasnost takvih jedinjenja može se odrediti standardnim farmaceutskim procedurama u ćelijskim kulturama ili eksperimentalnim životinjama, npr., za<određivanje LD>50<(doze letalne za 50% populacije) i ED>50<(doze terapeutski efektivne kod 50%>populacije). Dozni odnos između toksičnog i terapeutskog efekta je terapeutski indeks i može se izraziti kao odnos LD50 /ED50. Agensi koji inhibiraju velike terapeutske indekse su poželjni. Dok se mogu koristiti agensi koji pokazuju toksične efekte, treba obratiti pažnu na dizajn sistema za dostavu koji usmerava takve agense do mesta pogođenog tkiva kako bi se smanjilo potencijalno oštećenje ostalih ćelija čime se redukuju sporedni efekti.

[0136] Podaci dobijeni iz ogleda ćelijske kultre i ispitivanja na životinjama mogu se primeniti u formulisanju opsega doziranja za upotrebu na ljudima. Doziranje takvih jedinjenja poželjno leži unutar cirkulišućih koncentracija koje uključuju ED50 sa malo ili ni malo toksičnosti. Doziranje može da varira ovog opsega u zavisnosti od uposlenog doznog oblika i putanje davanja koja se primenjuje. Za bilo koji agens koji se koristi u postupku ovog opisa, inicijalno se može proceniti efektivna doza putem ogleda ćelijske kulture. Neka doza može biti formulisana u životinjskim modelima kako bi se postigao opseg cirkulišuće koncetracije u plazmi koji uključuje IC50(tj., koncentraciju test agensa koji dostiže polu-maksimalnu inhibiciju simptoma) kako je određeno u ćelijskoj kulturi. Takva informacija može se primeniti kako bi se približnije odredile korisne doze kod ljudi. Nivoi u plazmi mogu se izmeriti, na primer, tečnom hromatografijom visokih performasi. Kada se radi o inhibiciji sortilina, 10-20 µmol Neurotenzina koristi se za inhibiranje Sortilina u ćelijskoj kulturi.

[0137] Farmaceutske kompozicije mogu biti uključene u neki kontejner, pakovanje, ili dispanzer zajedno sa instrukcijama za davanje.

[0138] Agensi ovog opisa dalje mogu biti insertovani u vektore i primeniti se u genskoj terapiji. Vektorska genska terapija može se dostaiti subjektu, na primer, intravenoznom injekcijom, lokalnim davanjem (videti U.S. Pat. No 5,328,470) ili stereotaktnom injekcijom (videti npr., Chen et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:3054-3057). Preparat vektorske genske terapije može da uključi vektor genske terapije u prihvatljivom razblaživaču, ili može da obuhvata sporo oslobađajuću matricu u kojem je ugrađeno vozilo za dostavu gena. Alternativno, kada se kompletni vektor za dostavu gena može proizvesti netaktnut od rekombinantne ćelije, npr., retrovirusni vektori, farmaceutski preparat može da uključi jednu ili više ćelija koje proizvode sistem za dostavu gena.

[0139] Vektori pogodni za upotrebu u genskoj terapiji poznati su u stanju tehnike. Na primer, mogu se primeniti vektori izvedeni iz adenovirusa. Genom adenovirusa mogu se rukovoditi tako da kodiraju i eksprimiraju genski proizvod od interesa, ali je inaktiviran u uslovima njegove stabilnosti da se replicira u normalnom litičkog vurusnom životnom ciklusu. Videti na primer Berkner et al. (1988) BioTechniques 6:616; Rosenfeld et al. (1991) Science 252:431-434; i Rosenfeld et al. (1992) Cell 68:143-155. Pogodni adenovirusni vektori izvedeni iz adenovirusnog soja Ad tipa 5 dl324 ili drugih sojeva adenovirusa (npr., Ad2, Ad3, Ad7 itd.) dobro su poznati stručnjacima iz ove oblasti.

Rekombinantni adenovirusi mogu biti pogodni u određenim okolnostima u kojima oni nisu u moućnosti da inficiraju nedeljujuće ćelije. Dodatno, virusne čestice su relativno stabilne i podložne prečišćavanju i koncetrovanju, i kao što je navedeno, mogu se modifikovati tako da utiču na spektar infektivnosti. Dodatno, uvedena adenovirusna DNK (i strana DNK u njoj sadržana) nije integrisana u genom ćelije domaćina, već ostaje epizomalna, čime se zaobilaze potencijalni problemi koji se mogu pojaviti kao rezultat insercione mutageneze u situacijama kada uvedena DNK postaje integrisana u genomu domaćina (npr., retrovirusna DNK). Štaviše, kapacitet nošenja adenovirusni genom za stranu DNK je veći (čak do 8 kilobaza) u odnosu na oatale vektore za isporuku gena (Berkner et al. Gore navedeni; Haj-Ahmand i Graham (1986) J. Virol.57:267). Većina reprilaciono-defektivnih adenovirusnih vektora trenutno u upotrebi i stoga su poželjni u ovom opisu su obrisani na sve ili delove virusnih E1 i E3 gena, ali su zadržali čak do 80% adenovirusnog genetskog materijala (videti, npr., Jones et al. (1979) Cell 16:683; Berkner et al., gore; i Graham et al. In Methods in Moleclar Biology, E. J. Murray, Ed. (Humana, Clifton, N.J., 1991) vol.7, pp.109-127). Ekspresija gena od interesa obuhvaćeni u molekulu nukleinske kiseline mogu biti pod kontrolom, na primer, E1A promotera, glavnog kasnog promotera (MLP) i povezane glavne sekvence, E3 promotera, ili egzogeno dodatih promoterskih sekvenci.

[0140] Još jedan virusni vektorski sistem koristan za dosatvu agenasa ovog opisa je adeno-povezani virus (AAV). Adeno-povezani virus je prirodni defektivni virus koji zahteva neki drugi virus, kao što je neki adenovirus ili neki herpes virus, kao pomoćni virus za efikasnu replikaciju i produktivni ćelijski ciklus. (Za pregled videti Muzyczka et al. Curr. Topics in Micro. i Immunol. (1992) 158:97-129).

Adeno-povezani virusi eksprimiraju visoku frekventnost stabline integracije (videti na primer Flotte et al. (1992) Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol.7:349-356; Samulski et al. (1989) J. Virol.63:3822-3828; i McLaughlin et al. (1989) J. Virol.62:1963-1973). Vektori koji sadrži tako malo kao što je 300 baznih parova AAV može se upakovati i integrisati. Prostor za egzogenu DNK je ograničen na oko 4.5 kb. AAV vektor kao što je onaj opisan u Tratschin et al. (1985) Mol. Cell. Biol.5:3251-3260 može se primeniti za uvođenje DNK u T ćelije. Različite nukleinske kiseline uvedene su u različite ćelijske tipove primenom AAV vektora (videti na primer Hermonat et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6466-6470; Tratschin et al. (1985) Mol. Cell. Biol.4:2072-2081; Wondisford et al. (1988) Mol. Endocrinol.2:32-39; Tratschin et al. (1984) J. Virol.51:611-619; i Flotte et al. (1993) J. Biol. Chem. 268:3781-3790). Ostali virusni vektorski sistemi koji mogu biti korisni za dostavu agenasa ovog opisa izvedeni su od herpes virusa, virus kravljih boginja, i nekoliko RNK virusa.

[0141] Podrazumeva se da takva tretiranja takođe mogu da obuhvataju davanje od više od jednog agensa, u kojem slučaju ovi agensi mogu biti dati ili istovremeno i/ili odvojeno.

Životinje

[0142] U jednom aspektu ovog opisa agensi sposobni da inhibiraju vezivanje između nekog proneurotrofina i nekog Vps10p-domenskog receptora dati su životinji. Pomenuta životinja je poželjno bilo koja životinja koja eksprimira neki protein proneurotrofinske familije, poželjnije neki sisar, poželjnije domaća životinja, a najpoželjnije čovek.

Postupci skrininga za neko jedinjenje koje menja vezivanje najmanje jednog pro-neurotrofina za receptor Vps10p-domenske receptorske familije

[0143] Ovde je dalje opisan in vitro postupak skrininga za neko jedinjenje koje menja vezivanje najmanje jednog pro-neurotrofina za receptor Vps10p-domenske receptorske familije, pri čemu pomenuti postupak poželjno obuhvata faze:

a) obezbeđivanje ogleda za merenje vezivanja nekog pro-neurotrofina za mesto vezivanja receptora Sortilina koji obuhvata SEQ ID NO.25 ili bilo koju njenu varijantu ili fragment (koji uključuju SEQ ID NO: 26 do 28,

b) dodavanje jedinjenja koje trea da se testira u taj ogled, i

c) određivanja količine nekog pro-neurotrofina ezanog za receptor Vps10p-domenske receptorske familije, i

d) poređenja količine određene u fazi c) sa nekom količinom izmerenom u odsustvu jedinjenja koje treba da se testira,

e) gde se razlika u dve količine identifikuje kao jedinjenje koje menja vezivanje pro-neurotrofina za receptor Vps10p-domenske receptorske familije.

[0144] U jednom poželjnom ostvarenju ovog postupka skrininga, pro-neurotrofin može biti odabran od pro-NGF, pro-BDNF, pro-NT-3 ili pro-NT-4/5. Poželjnije, pro-neurotrofin je pro-NGF ili pro-BDNF. U jednom poželjnom ostvarenju ovog postupka skrininga, receptor je odabran od SorLA, Sortilina, SorCS1, SorCS3, ili SorCS2. Još poželjnije, receptor je Sortilin. U nekom drugom ostvarenju ovog postupka skrininga, proneurotrofin je sposoban za vezivanje za neki ekstracelularni deo receptora. Receptor u jednom ostvarenju može biti neki receptor koji se eksprimira u ćeliji, unutar plazma membrane i/ili prisutan na plazma membrani. Ćelija upotrebljena u ovom postupku skrininga poželjno može biti odabrana od primarno kultivisanih neuronskih ćelija, neuron-izvedenih ćelijskih linija, transfektovanih ćelija sposobnih za ekspresiju receptora Vps10p-domenske receptorske familije, perifernih neurona i centralnih neurona. Poželjno, ćelije su imortalizovane ćelijske linije.

[0145] Ogledi koji se mogu primeniti za merenje vezivanja nekog pro-neurotrofina za receptor Vps10p-domenske receptorske familije dobro su poznati stručnjacima iz ove oblasti i uključuju, ali nisu ograničeni na, dvo-hibridni ogledi sa kvascem, postupci kompetitivnog vezivanja, kao što je RIAs, ELISAs, i slično. Ostali testovi su Fluorescentno rezonantni transfer energije (FRET), Površinska plazmatska rezonanca (Biacore), Western bloting, imunohistohemija. Rezultati ispitivanja vezivanja mogu se analizirati primenom bolo koje konvencionalne grafičke reprezentacije podataka vezivanja, kao što je Scatchard-ova analiza (Scatchard, Ann. NY Acad. Sci., 51:660-672 [1949]; Goodwin et al., Cell, 73:447-456 [1993]), i slično.

[0146] Dalje je opisan postupak koji je obezneđen za određivanje efekta agensa na aktivnost proneurotrofina u ćelijama koje predstavljaju neki receptor Vps10p-domenske receptorske familije. Pomenuti postupak obuhvata faze:

b) davanja pomenutog agensa sisaru koji eksprimira receptor,

c) merenja aktivnosta pro-neurotrofina u pomenutom sisaru,

d) poređenja merenja faze b) sa merenjima dobijenim u odsustvu jedinjenja koje treba da se testira, e) gde razlika u dva merenja identifikuje efekat pomenutog agensa na aktivnost proneurotrofina na ćelije koje predstavljaju receptore Vps10p-domenske receptorske familije.

[0147] Sisar može da eksprimira receptor prirodno ili može biti transfektovan sa receptorskim genom divljeg tipa.

[0148] Aktivnost pomenutih pro-neurotrofina u pomenutom sisaru može se izmeriti jednim ili više od sledećih merenja:

a) merenje nivoa ekspresije gena koji odgovara na ciljanje proneurotrofina, kao što je mRNK ili protein u tkivima sisara,

b) merenje nivoa ekspresije receptora kako je ovde definisan, kao što je mRNK ili protein u tkivima sisara

c) merenje receptor-posredovanog vezivanja ili transporta pro-neurotrofina vezanog za receptor, d) merenje apsorpcije pro-neurotrofina u ćelije pomenutog sisara,

e) merenje signalne transdukcije pomenutog receptora ili povezanog receptora u ćelijama pomenutog sisara,

[0149] Povezani receptor može biti p75 receptor ili TrkA receptor.

[0150] U poželjnijem ostvarenju pomenutog postupka, postupak dalje obuhvata davanje pomenutog agensa sisaru kojem nedostaje ekspresija pomenutog receptora. Pomenuti sisar kome nedostaje ekspresija pomenutog receptora može da nedostaje ekspresija pomenutog receptora samo u jednom ili više odabranih tkiva, i/ili može da ima snižene nivoe ekspresije pomenutog receptora.

[0151] Postupci za merenje ekspresije receptora mRNK ili proteina u tkivima sisara dobro su poznati stručnjacima iz ove oblasti i opisani su u nastavku. Postupci za merenje receptor-posredovanog vezivanja ili transporta neurotrofina i/ili pro-neurotrofina vezanog za receptor takođe su dobro poznati stručnjacima iz ove oblasti: pomenuti postupci uključuju, ali nisu ograničene na, dvo-hibridni skrining kvasca, Biacore RTM skrining, UV umrežavanje, i imunotaloženje.

[0152] Postupci za merenje apsorpcije pro-neurotrofina u ćelijama sisara takođe su poznati stručnjacima iz ove oblasti: pomenuti postupci uključuju ali nisu ograničeni na postupak gde se proneurotrofinska apsorpcija meri u ćelijama koje predstavljaju receptor i ćelijama koje ne predstavljaju receptor. Proneurotrofin je poželjno obeležen, kao što je radioaktivno ili fluorescentno obeležen.

[0153] Further, postupak je obezbeđen za modulisanje transporta najmanje jednog neurotrofina i/ili pro-neurotrofina iz, ili u ćelijsku liniju ili neuron neke životinje, pri čemu pomenuti postupak obuhvata davanje pomenutoj životinji dovoljne količine agensa sposobnog za vezivanje receptora Vps10p-domenske receptorske familije. Pomenuta modulacija može da obuhvata povećanje u anterogradnom transportu neurotrofina i/ili pro-neurotrofina u neuronu. Modulacija može alternativno da obuhvata smanjenje u anterogradnom transportu neurotrofina i/ili pro-neurotrofina u neuronu. U nekom drugom poželjnom ostvarenju, modulacija obuhvata povećanje u retrogradnom transportu neurotrofina i/ili pro-neurotrofina u neuronu. U nekom drugom poželjnom ostvarenju, modulacija obuhvata smanjenje u retrogradnom transportu pro-neurotrofina u neuronu. Modulacija se može sprovesti nekim agensom kako je prethodno objašnjeno.

Biblioteka agenasa

[0154] U ovom opisu, biblioteke jedinjenja mogu se koristiti za skrinovanje agenasa sposobnih da inhibiraju vezivanje između Vps10p-domenskog receptora i pro-neurotrofina.

[0155] Kako se ovde koristi, izraz "biblioteka" označava kolekciju molekularnih entiteta ili test jedinjenja koja se ovde takođe označavaju kao "članovi biblioteke".

[0156] U poželjnim ostvarenjima biblioteka je kombinatorijalna biblioteka. Neograničavajući primeri kombinatorijalnih biblioteka koje se mogu koristiti i postupci proizvodnje takvih biblioteka dati su u: Comprehensive Survey of Combinatorial Library Synthesis: 1998 Roland E. Dolle and Kingsley H. Nelson, Jr. J. Comb. Chem., 1999, pp 235 - 282; Comprehensive Survey of Combinatorial Library Synthesis: 1999 Roland E. Dolle J. Comb. Chem., 2000, pp 383 - 433; Comprehensive Survey of Combinatorial Library Synthesis: 2000 Roland E. Dolle J. Comb. Chem.,2001, pp 477 - 517;

Comprehensive Survey of Combinatorial Library Synthesis: 2001 Roland E. Dolle J. Comb.

Chem.,2002, pp 369 - 418 and Comprehensive Survey of Combinatorial Library Synthesis: 2002 Roland E. Dolle J. Comb. Chem.,2003, pp 693 - 753. Stručnjaku će biti jasno da se ovi protokoli mogu lako prilagoditi specifičnoj potrebi određenog ostvarenja ovog opisa.

[0157] U jednom ostvarenju, ovi molekularni entiteti mogu biti prirodni oligomeri (oligomeri gradivnih blokova koji se javljaju u prirodi) kao što su peptidi, glikopeptidi, lipopeptidi, nukleinske kiseline (DNK ili RNK), ili oligosaharidi. Kao primer, prirodni oligomer može biti bilo koji peptid koji se sastoji od prirodne aminokiseline, čak iako pomenuti peptid obuhvata sekvencu koja nije prisutna u prirodi. Biblioteke mogu da obuhvataju različite prirodne oligomere ili biblioteke koje mogu da obuhvataju samo jednu vrstu prirodnog oligomera, na primer biblioteka može biti neka peptidna biblioteka. U nekom drugom ostvarenju, one mogu biti neprirodni oligomeri (oligomeri koji obuhvataju jedan ili više gradivnih blokova koji se ne javljaju u prirodi) kao što su hemijski modifikovani peptidi, glikopeptidi, nukleinske kiseline (DNK ili RNK), ili, oligosaharidi, i slično.

Pomenuta hemijska modifikacija može biti na primer upotreba neprirodnih gradivnih blokova povezani prirodnim vezom koja povezuje jedinice (na primer, peptidno amidna veza), upotreba prirodnih gradivnih blokova sa modifikovanim povezujućim jedinicama (na primer, oligouree kako je objašnjeno u Boeijen et al, 2001, J. Org. Chem., 66: 8454-8462; oligosulfonamidi kako je objašnjeno u Monnee et al, 2000, Tetrahedron Lett., 41: 7991-95), ili njihove kombinacije (na primer, statin amidi kako je objašnjeno u Dolle et al, 2000, J. Comb. Chem., 2: 716-31.). Poželjni neprirodni oligomeri uključuju oligomere koji obuhvataju neprirodne gradivne blokove međusobno povezane prirodno što se javlja u veznom povezivanju. Pomenuti oligomeri tako mogu da obuhvataju mešavinu prirodnih i neprirodnih gradivnih blokova povezanih jedan sa drugim prirodno što se javlja kao veza. Kao šrimer, oligomer može da obuhvata prirodne aminokiseline i neprirodne gradivne blokove povezane peptidnim vezama f.x. PNK ili LNK.Tako, u jednom ostvarenju poželjni oligomeri obuhvataju modifikovane aminokiseline ili aminokiselinske mimike). Drugi poželjni neprirodni oligomeri uključuju, na primer oligouree, poli azatide, aromatične C-C povezane oligomere i aromatične C-N povezane oligomere. Dalji poželjni oligomeri obuhvataju mešavinu prirodnih i neprirodnih gradivnih blokova i prirodne i neprirodne vezne veze. Na primer, neprirodni oligomer može biti bilo koji od oligomera pomenuti u skorijim radovima, videti: Graven et al., 2001, J. Comb. Chem., 3: 441-52; St. Hilaire et al., 2000, Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 39: 1162-79; James, 2001, Curr. Opin. Pharmacol., 1: 540-6; Marcaurelle et al., 2002, Curr. Opin. Chem. Biol., 6: 289-96; Breinbauer et al., 2002, Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 41: 2879-90. Biblioteke takođe mogu da obuhvataju ciklične oligomere, na primer ciklične prirodne oligomere, kao što su ciklični peptidi ili ciklični neprirodni oligomeri. U određenim ostvarenjima, biblioteke cikličnih oligomera mogu biti poželjni za upotrebu u čvrstoj strukturi. Ovo može rezultirati većom selektivnošću i afinitetom.

[0158] U još daljem ostvarenju, molekularni entiteti mogu da obuhvataju ne-oligomerne molekule kao što su peptidomimetici ili drugi mali organski molekuli. Peptidomimetici su jedinjenja koja imitiraju aktivnost peptidnog glasnika, kao što su biciklični tiazolidinski laktam peptidomimetici L-proplil-L-leucil-glicinamida (Khalil et al, 1999, J. Med. Chem., 42: 2977-87). U poželjnijem ostvarenju biblioteka obuhvata ili je poželjnije sastavljena od malih organskih molekula. Mali organski molekuli su ne-oligomerna jedinjenja od manje od oko 600 masenih jedinica koje sadržavaju bilo koji od raznih mogućih funkcionalnih grupa i koji su proizvod hemijske sinteze, ili izolovani iz prirode, ili izolovani iz prirode, a zatim hemijski modifikovani, i uključuju, na primer, Kinaza inhibitore na bazi Bajerove uree (Smith et al., 2001, Bioorg. Med. Chem. Lett., 11: 2775-78). Mala organska jedinjenja mogu na primer biti odabrana iz grupe koju čine alkoholi, etri, karboksilnie kiseline, ariloksi, aciloksi, tiol, alkiltio, ariltio, heteroariltio, sulfonil, sulfoksi, amino, alkilamino, dialkilamino, acilamino, diacilamino, alkoksikarbonilamino, amidi, alkil, razgranati alkil, aril, heteroaril, nitro, cijano, halogeno, sililoksi, keto, heterocikli, fuzionisani sistemi prstena, fuzionisani heterocikli i njihove mešavine, gde svaki od prethodno navedenih može biti supstituisan nezavisno od položaja sa jednom ili više grupe odabranih iz grupe koju čine -H, -OH, -SH, halogen, karboksil, karbonil, alkoksi, ariloksi, aciloksi, alkiltio, ariltio, heteroariltio, sulfonil, sulfoksi, amino, alkilamino, dialkilamino, acilamino, diacilamino, alkoksikarbonilamino, amidi, alkil, aril, heteroaril, nitro, cijano, halogeno, sililoksi, keto, heterocikli, fuzionisani sistemi prstena, i fuzionisani heterocikli.

[0159] Neograničavajući primeri biblioteka malih organskih molekula koje se mogu koristiti i postupci njihove proizvodnje mogu se naći u na primer Thompson et al., 1996, Chem. Rev., 96: 555-600; Al-Obeidi et al., 1998, Mol. Biotechnol., 9: 205-23; Nefzi et al., 2001, Biopolimers, 60: 212-9; Dolle, 2002, J. Comb. Chem., 4: 369-418.

[0160] Biblioteke mogu da obuhvataju najmanje 20, kao što je najmanje 100, na primer najmanje 1000, kao što je najmanje 10,000, na primer najmanje 100,000, kao što je najmanje 1,000,000 različitih test jedinjenja. Poželjno, biblioteke obuhvataju u opsegu od 20 do 10<7>, poželjnije 50 do 7,000,000, čak poželjnije 100 do 5,000,000, čak poželjnije 250 do 2,000,000 različitih jedinjenja. U veoma poželjnom ostvarenju biblioteke obuhvataju u opsegu od 1000 do 20,000, kao što je u opsegu od 20,000 do 200,000 različitih test jedinjenja. U poželjnim ostvarenjima biblioteka obuhvata u opsegu od 10,000 do 1,000,000 različitih test jedinjenja.

[0161] Odabir pogodnih biblioteka zavisi od specifičnog ostvarenja ovog opisa. Na primer, potpuno nasumična biblioteka dizajnirana da sadrži veoma različita jedinjenja može se koristiti za skrining agenasa ovog opisa. Prednost ovog pristupa je da ishod ovog skrininga nije ugrožen na bilo koji specifičan način.

Alternativno, manja, usmerena biblioteka (sto do hiljadu jedinjenja) može se primeniti, na primer, počevši od poznatog jedinjenja ili jedinjenja, i obezbeđivanjem brojnih varijacija ovih poznatih jedinjenja za usmereno ciljanje. Alternativno, manje usmerena biblioteka jedinjenja koja imitira neko jedinjenje poznato da inhibira vezivanje između nekog pro-neurotrofina i nekog Vps-10pdomenskog receptora kao što je neki receptor sortilina može biti pripremljena, na primer primenom kompjuterskog pomoćnog modelovanja praćeno hemijskom sintezom. Manja, usmerena biblioteka takođe može da obuhvata nasumične molekule.

[0162] Dalje su opisani postupci sintetizovanja biblioteka test jedinjenja, gde su pomenute biblioteke određenije korisne za skrining za gense sposobne da inhibiraju vezivanje između proneurotrofina i receptora sortilina naročito SEQ ID NO: 25 pomenutog receptora sortilina ili bilo kojeg fragmenta ili varijante pomenute SEQ ID NO.25, pomenutog fragmenta sa najmanje 70% sekvencijalnog identiteta sa SEQ ID NO.25.

[0163] Biblioteke mogu da se koriste opštim postupkom skrininga opisan u primeru 5. Primenom robota za pipetisanje, postupak omogućava skrining veoma velikih biblioteka za identifikaciju agenasa sposobnih da inhibiraju vezivanje između pro-neurotrofina i Sortilina. Agensi mogu biti bilo koji agens prema ovom opisu.

Opis crteža

[0164]

FIG.1: Primeri Vps10p-domenskih receptora. Pokazana je njihova strukturna kompozicija.

FIG.2: Karakterizacija NGF vezivanja za p75, TrkA, i Sortilin izmereno je površinskom analizom rezonance plazmona (BIAcore). Vezivanje 50-500 nM NGF izmereno je do 91.5 fmol/mm<2>imobilizovanog p75-IgG-Fc himernog proteina (gornji panel), do 66 fmol/mm<2>imobilizovanog TrkA-IgG-Fc (srednji panel), i do 51 fmol/mm<2>prečišćenog Sortilin extraćelijskog domena (donji panel). Uključene i isključene brzine - 100 do 600 sekundi i 600 do 1000 sekundi, respektivno - zabeležene su , a Kd vrednosti za NGF vezivanje izračunate su za ∼ 1 nM za p75, ∼2 nM za TrkA, i ∼ 8 nM za Sortilin. Zreli mišji NGF nabavljen od Austral Biologicals (San Ramon, CA), rekombinantni humani p75 neurotrofin receptor/Fc i humani TrkA/Fc himere bile su od R&D systems (Oxon, UK). Humani Sortilin proizveden je u stabilno transfektovanim CHO-ćelijama i prečišćeni kako je drugde opisano (Munck Petersen et al, EMBO J. (1999) 18:595-604).

Svi podaci obezbeđeni na ovom crtežu, dobijeni su merenjima tehnologijom rezonancije površinskog plazmona (Biacore analiza).

FIG.3: Karakterizacija proNGF vezivanja za p75, TrkA, i Sortilin izmerena je površinskom analizom rezonance plazmona (Biacore). Vezivanje 25-500 nM proNGF izmereno je do 91.5 fmol/mm<2>imobilizovanog p75-IgG-Fc himernog proteina (gornji panel), do 66 fmol/mm<2>imobilizovanog TrkA-IgG-Fc (srednji panel), i do 51 fmol/mm<2>prečišćenog extraćelijskog domena Sortilina (donji panel). Uključene i isključene brzine - 100 do 600 sekundi i 600 do 1000 sekundi, respektivno - zabeležene su , a Kd vrednosti za proNGF vezivanje izračunate su za ∼ 12 nM za p75, -15 nM za TrkA, i ∼ 5 nM za Sortilin. Humani rekombinantni proNGF proizveden je i prečišćeni u E. coli kako je opisano (Rattenholl et al, Eur. J. Biochem. (2001) 268:3296-3303). Svi ostali reagensi bili su kako je opisano u legendi na FIG.2. Svi podaci obezbeđeni na ovom crtežu, dobijeni su merenjima tehnologijom rezonancije površinskog plazmona (Biacore analiza)

FIG.4: Karakterizacija vezivanja proNGF propeptida za p75, TrkA, i Sortilin izmereno je površinskom analizom rezonance plazmona (Biacore). Vezivanje 25-500 nM propeptida izmereno je do 91.5<fmol/mm2 imobilizovanog p75-IgG-Fc himernog proteina (gornji panel), do 66 fmol/mm2>imobilizovanog TrkA-IgG-Fc (srednji panel), i do 51 fmol/mm<2>prečišćenog Ekstraćelijskog domena Sortilina (donji panel). Uključene i isključene brzine - 100 do 600 sekundi i 600 do 1000 sekundi, respektivno - zabeležene su , a Kd vrednosti za proNGF propeptid vezivanje izračunate su za ∼ 8 nM za Sortilin. Nije primećeno vezivanje za p75 i TrkA. Humani NGF-propeptid eksprimiran u E.Coli obezbeđen je od strane Elisabeth Schwarz, Martin-Luther-Universitat Halle-Wittenberg, Halle/Saale, Germany. Svi ostali reagensi bili su kako je opisano u čegendama na FIG.2 i 3. Svi podaci obezbeđeni na ovom crtežu, dobijeni su merenjima tehnologijom rezonancije površinskog plazmona (Biacore analiza)

FIG.5: Ovaj referentni primer koji nije deo ovog pronalaska pokazuje da je moguće inhibiranje vezivanja nekog pro-neurotrofina za neki Vps10p-domenski receptor. Referentni primerni crtež pokazuje inhibiciju proNGF vezivanja radi imobilizovanja Sortilina neurotenzinom kako je izmereno Biacore analizom. Vezivanje 200 nM proNGF za 51 fmol/mm<2>imobilizovanog Sortilins inhibirano je ∼45% praćeno koinjekcijom sa 10 µM neurotenzina. Vezivanje samog neurotenzina pokazano je radi poređenja. Neurotenzin je dobijen od Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). Svi ostali proizvodi su kao što je prethodno indikovano. Svi podaci obezbeđeni na ovom crtežu, dobijeni su merenjima tehnologijom rezonancije površinskog plazmona (Biacore analiza)

FIG.6: Ovaj referentni primer koji nije deo ovog pronalaska pokazuje da je moguće inhibiranje vezivanja nekog pro-neurotrofina za neki Vps10p-domenski receptor. Referentni primerni crtež pokazuje proNGF vezivanje za imobilizovani Sortilin pomoću RAP (receptor-povezanog proteina), propeptida proNGF, i Sortilin propeptida. Inhibitori su prethodno vezani za Sortilin praćeno koinjekcijom sa 200 nM proNGF. Osnovne linije su korigovane za signale dobijene u prisustvu svakog od inhibitora. Maksimalno proNGF vezivanje izmereno je bez pedinkubacije sa respektivnim inhibitorima. Vezivanje 200 nM proNGF za 51 fmol/mm<2>imobilizovani Sortilin inhibirano je ∼65% pomožu 10 µM RAP, ∼85% pomoću 5 µM proNGF propeptida i ∼65% pomoću 5 µM Sortilin propeptida. Svi podaci obezbeđeni na ovom crtežu, dobijeni su merenjima tehnologijom rezonancije površinskog plazmona (Biacore analiza)

FIG.7: Karakterizacija vezivanja BDNF i pro-domena proBDNF za prečišćeni Sortilin kako je izmereno površinskom rezonancom plazmona (Biacore). Zreli rekombinantni humani BDNF nabavljen od Promega (#G1491) i pro-domen humanog BDNF fuzonisan sa GST (glutaciona S-transferaza) proizveden je u E. coli i prečišćen glutaciono-sefarozno afinitetnom hromatografijom. Vezivanje prodomena proBDNF (GST-fuzioni protein, gornji panel) ili BDNF (donji panel) izmereno je do 94 fmol/mm2 imobilizovanog prečišćenog ekstraćelijskog domena Sortilina. Eksperiment je izveden suštinski kako je opisano za FIG.2-4. Uključene i isključene brzine - 100 do 600 sekundi i 600 do 10000 sekundi, respektivno - zabeležene su , a Kd vrednosti za ligand vezivanje izračunate su za -58 nM za GST-pro-domen proBDNF, i -40 nM za zreli BDNF. Ostale pripteme zrelog BDNF pokazale su Kd vrednosti za ligand vezivanje pri 10 nM. Svi podaci obezbeđeni na ovom crtežu, dobijeni su merenjima tehnologijom rezonancije površinskog plazmona (Biacore analiza)

FIG.8: Funkcionalna karakterizacija rekombinantnih pro-domena his-S-obeleženog neurotrofina. A. Komasi bojenje prečišćenih polipeptida pro-dom-NGF (ostataka Glu<1>- Arg<102>) i pro-dom-BDNF (ostataka Ala<1>-Arg<110>) kloniran u pET-30 fXa/LIC vektor (Novagen) koji dodaje dve N-terminalna polihistidinske i S-peptidne oznake. B, C. Prisustvo obe oznake verifikovano je Western blot analizom i detekcijom primenom primarnog antitela protiv histidina praćeno inkubacijom sa HRP-konjugovanim sekundarnim antitelom (B) ili sa direktno HRP-konjugovanom verzijom S-proteina (C). D, E. Analiza površinske rezonance plazmona vezivanja bakterijskih pro-domena NGF (D) i BDNF (E) do imobilizovanog extraćelijskog domena sortilina.

FIG.9: Poravnanje aminokiselinskih sekvenci četiri sisarska neurotrofina. Poravnanje sekvence NGF, BDNF, NT-3, i NT-4/5, pokazuje visok stepen konzervacije za zreli deo, i znatno manje sekvencione konzervacije među pro-domenima. Striktno konzervirani ostaci obeleženi su na crnoj pozadini, a delimično konzervirani ostaci na sivoj pozadini.

FIG.10: SPOT analiza pro-dom-NGF/BDNF vezivanja za Vps10p receptore koji uključuju sortilin i detekcija sa HRP-S-proteinom. Membrane koje sadrže preklapajuće 16-mer peptide pet humanih Vps10p-domen sadržavajućih receptora (Sortilin, SorLA, SorCS1, SorCS2, i SorCS3) inkubisani su bilo u prisustvu pro-dom-NGF (20 µg/mL, A) ili pro-dom-BDNF (20 µg/mL, B) ili u odsustvu liganda (C). Vezani ligand detektovan je inkubisanjem membrane sa HRP-konjugovanim S-proteinom, koji se takođe vezuje specifično sa kontrolnim peptidima prisutnim u gornjem levom i donjem desnom uglu svakog diseciranog receptora. Specifično mesto vezivanja za pro-domene neurotrofina prikazane su u odeljku koji se sastoji od tri uzastopna sortilin vezivanja peptida (SPOTs 67-68-69), ali nije viđeno za detekciju upotrebom samo HRP-S-proteina.

FIG.11: SPOT analiza pro-dom-BDNF vezivanja za sortilin primenom anti-histidin imunodetekcije. Ponovljena analiza pro-dom-BDNF vezivanja za peptidnu biblioteku, ali detekcija primenom primarnog antitela protiv poli-histidina praćeno HRP-konjugovanim anti-mišjim sekundarnim antitelom, pokazalo je znatan pomeraj ka specifičnoj interakciji sa peptidima 64-65-66 (B), koji nije identifikovan kada membrana nije inkubisana sa ligandom pre detekcije (A). SPOTs koje odgovaraju 22-25 predstavljaju vezivanje detekcionog sistema nezavisnog od pro-dom-BDNF.

FIG.12: Nezavisna potvrda pro-dom-BDNF vezivanja za SPOTs 67-68-69 pomoću HRP-S-proteinske detekcije. Nova membrana je sintetizovana i ispitana za novo proizvedenu seriju pro-dom-BDNF koja pokazuje specifično vezivanje za SPOTs 67-68-69 na 1 min izlaganja (A) kako bi se verifikovalo vezivanje za ostatak oko ove sortilinske sekvence. Nakon 5min izlaganja, nekoliko dodatnih peptida takođe je pokazalo manje interakcije.

FIG.13: Aminokiselinska sekvenca SPOTs 64-69.16-mer sortilin sekvence koje odgovaraju SPOTs 64-69 verovatno gaje glavno mesto vezivanja za pro-domene neurotrofina.

FIG.14: Poravnanje Vps10p domena sortilina. Ponovljeno prisustvo Asp-kutijastog motiva (S/T-X-D-X-G-X-X-W/F) iskorišćeno je kako bi se izvelo poravnanje koje pokazuje internalnu sekvencionu repeticiju pronađenu u npr. domenima koji imaju neko beta-propeler savijanje, gde su ostaci smešteni oko ovog motiva prisutni na molekularnoj površini. Striktno konzervirani ostaci su obeleženi na crnoj pozadini, a delimično konzervirani ostaci na sivoj pozadini.

FIG.15: Supstituciona analiza RIFRSSDFAKNFVQTD peptida. Analiza Pro-dom-BDNF vezivanja za neki peptid sa divljim tipa sortilin sekvence RIFRSSDFAKNFVQTD naveden na levoj strani membrane. Vezivanje za mutantne peptide gde je svaka aminokiselina supstituisana sa svakim od 20 prirodnih aminokiselina primenjena za identifikaciju specifinih ostataka bitnih za interakciju sa nezrelim delom neurotrofina. Detekcija koja koristi bilo koji HRP-S-protein (A) ili anti-histidin imunospecifičan postupak (B) identifikuje virtuelno identične ostatke za ovaj postupak. C, D. Grafički prikaz varijacije vezivanja nakon aminokiselinske supstitucije. Ovaj postupak može biti pogodan za identifikaciju super-vezujućij peptida.

FIG.16: Supstituciona analiza pro-dom-BDNF vezivanja za RIFRSSDF i FAKNFVQTD peptide. A, B. Deljenje peptida prikazano na FIG.8 obezbeđuje dokaz da duži peptid sadrži dva nezavisna motiva vezivanja za pro-dom-BDNF vezivanje Supstituciona analiza jasno identifikuje dve sekvence RIFR (A) i FAKNF (B) kao specifična mesta za pro-domene BDNF. C. Potvrda supstitucionom analizom da FAKNF motiv nije C-terminalno produžen.

FIG.17: Analiza dužine pro-dom-BDNF vezivanja za peptide sortilina. Delecijom pojedinačnih aminokiselinskih ostataka, pri čemu se određuje dužina minimalno funkcionalnog peptida sortilina, potvrđuje da male npr. tetramerne sekvence imaju visok afinitet za pro-dom-BDNF (obeleženo belom bojom na crnoj pozadini).

FIG.18: Analiza površinske rezonance plazmona za vezivanje peptida sortilina za pro-dom-NGF i -BDNF. Direktna interakcija između peptida sortilina (kako je identifikovano SPOT analizom) i prodomena NGF i BDNF verifikovana je površinskom analizom rezonance plazmona primenom imobilizovanog pro-dom-NGF i -BDNF. Koncetracione serije RSSDFAKNFVQTDLPF peptida (A) (koje sadrže samo jedan of dva potencijalna mesta vezivanja koja su nastanjena u ovom regionu) ili RIFRSSDFAKNF (B) potvrđuju rezultat direktnog vezivanja kako je viđeno u analizi imobilizovanog peptida na SPOT membrani. Poređenjem kriva vezivanja (senzogrami) za pojedinačnu koncentraciju peptida za protok ćelija koje sadrže identične količine imobilizovanog pro-dom-NGF i -BDNF, može se primetiti veći afinitet peptida ka BDNF u odnosu na NGF, u liniji sa prethodnim izveštajima koji opisuju slične obrasce za vezivanje pro-BDNF i pro-NGF za sortilin pune dužine, što podržava koncept da ovi peptidi sadrže glavni epitop vezivanja. Numeracija na ovom crtežu odnosi se na zreli deo sortilina.

FIG.19: Analiza površinske rezonance plazmona za ispitivanja kompeticije peptidima sortilina.

Rekombinantni sortilin prečišćen je iz 293 ćelije, i iskorišćen za ispitivanja vezivanja za imobilizovani pro-dom-BDNF (-peptid; RSSDFAKNFVQTDLPF), i vezivanje je značajno inhibirano u prisustvu identifikovanih peptida sortilina (+peptid). Umetak ukazuje na sličan efekat na peptidu u kompeticiji vezivanja sortilina za imobilizovani pro-dom-NGF, a kvalitet primenjenog sortilina indikovan je u desno srebno obojenom SDS-PAGE analizom.

FIG.20: Termalna hipoalgezija kod miševa kojima fali Sortilin kako je određeno ogledom vruće ploče. Testiranje vrućom ploče izveden je kako sledi. Divlji tip (sortilin+/+) i sortilin knockout miševi (sortilin-/-) smešteni su na termoregulisanu Plactronic vruću ploču podešenu na 55 °C. Svaka životinja je naknadno posmatrana na lizanje zadnjih umova ili skakanje kao odgovor na vrelinu. Prvi odgovor registrovan je po životinji.30 sekundni prekid uključen je radi sprečavanja oštećenja tkiva. FIG.21: Reprezentativni senzogrami pro-dom-NGF vezivanja pri sličnim koncetracionim serijama od 10, 20, 30, 40, i 50 nM u biosenzor čipovima koji sadrže imobilizovani sortilin wt ili pojedinačne preostale mutacije kako je indikovano. Svaki sortilin konstrukt imobilizovan je na sličnoj površinskoj gustini koja omogućava direktno poređenje među različitim receptorskim domenima.

FIG.22: Analiza površinske rezonance plazmona 50 nM GST-pro-dom-NGF vezivanja za imobilizovani sortilin wt ili sortilin kvatro mutant (koji sadrži učetvorostručenu supstituciju na R163A, F165A, R166A, F170A) kako je indikovano. Vezivanje je ozbiljno narušeno pošto je mutacija obrisala celokupan RIFR motiv i proksimalni fenilalanin ostatak FAKNF motiva kako je primećeno znatno nižim nivoom odgovora.

Primeri

Primer 1 - Materijali i proteini

[0165] Kako bi se dobili obeleženi oblici pro-domena neurotrofina spremni za detekciju u SPOT analizi, konstrukti su pripremljeni za svaki omogućavajući dodavanje N-terminalnog S-peptida i polihistidinskih oznaka. Uzorak cDNK za humani NGF i BDNF bili su ATCC kloni primenjeni za generisanje fragmenata koji obuhvataju ostatke Glu1-Arg102 NGF i Ala1-Arg110 BDNF primenom parova prajmera

sa kompatibilnim ispustima za ligaciono nezavisno kloniranje u pET-30 Xa/LIC vektor od Novagen (kat.br.70073-3) i amplifikaciju primenom Fuzione DNK polimeraze i praćeno protokolom koji je obezbedio proizvođač. Proteini su eksprimirani u BL21/DE3 soju E. coli, efikasno ekstraktovani iz bakterijskih inkluzionih tela primenom Bugbuster reagenasa od Novagen (kat.br.70921) sa dodatom benzonazom (Novagen, kat.br.70750), i prečišćeni standardnom Ni<2+>-NTA afinitetnom hromatografijom u 500 mM NaCl, 5 mM Imidazolu, i 20 mM Tris-HCl, pH 8.0. Proteinsko eluiranje izvedeno je u puferu dopunjen sa 20 mM EDTA. Verifikacija intaktno obeleženih verzija pro-domen-NGF i pro-domen-BDNF izvedena je SDS-PAGE analizom praćeno komasi bojenjem ili Western blot analizom upotrebom bilo kod antitela protiv histidinske oznake od Sigma (H-1029) i sekundarnim HRP-konjugovanim anti-mišjim antitelom od Calbiochem (kat.br.401207), ili alternativno direktnim vezivanjem HRP-konjugovanog S-proteina od Novagen (kat.br.69047-3)

[0166] Za proizvodnju ektodomena sortilina, konstrukt koji obuhvata celokupan kodirajući region N-terminalnog dela humanog Sortilina koji uključuje endogeni signalni peptid i praćeno C-terminalnom poli-histidin oznakom insetovana u pCEP-Pu vektor, obezbeđno je od strane D. Militz, Berlin. DNK j transfektovana u EBNA293 ćelije koje su odabrane od G418 (Gibco kat.br.10131-027, 300 ug/mL) i Puromicin od Sigma (kat.br. P8833, 1 ug/mL) pre nego što su proteini sakupljeni iz podloge kondicionirane tokom 48 h, i primenjeni za prečišćavanje nanošenjem na Ni<2+>-NTA Sefarozu.

Sekretovani rekombinantni polipeptidni lanac Sortilina koji obuhvata celokupan extraćelijski domen humanog Sortilina tako se završava na Ser725 (+AMIEGRGVGHHHHHH koji sadže fXa mesto i polihistidinsku oznaku). Kvalitet proteina testiran je srebrnim bojenjem SDS-PAGE analize. Peptidi za vezivanje i kompeticiona ispitivanja sintetizovani su na licu mesta, ili od Eurogentec.

Primer 2 - Analiza površinske rezonance plazmona

[0167] Određivanje direktnog vezivanja liganda za imobilizovani protein izvedeno je na Biacore2000 instrumentu (Biacore, Sweden) primenom CaHBS kao standarnog radnog pufera (10 mM HEPES, pH 7.4, 140 mM NaCl, 2 mM CaCl2, 1 mM EGTA, i 0.005% Tween-20). Biosenzorski čip od Biacore (CM5, kat.br. BR-1000-14) aktiviran je primenom NHS/EDC postupka kako je opisano od strane dobavljača praćeno oblaganjem sa Sortilinom pri gustini proteina od 79 fmol/mm2, i primenjen za afinitetna merenja rekombinantnih pro-domena NGF i BDNF. Regeneracija protočne ćelije nakon svakog ciklusa eksperimenta vezivanja liganda izvedeno je pomoću dva 10 uL impulsa regeneracijonog pufera (10 mM glicin-HCl, pH 4.0, 500 mM NaCl, 20 mM EDTA, i 0.005% Tween-20) i jedne injekcije 0.001% SDS. Podešavanje senzograma za procene afiniteta izvedeno je upotrebom Biaevaluavije verzija 3.1.

[0168] Nakon sličnih protokola, imobilizacija pro-dom-NGF ili pro-dom-BDNF takođe je izvedena na CM5 biosenzornom čipu upotrebom NHS/EDC kompleta za kuplovanje prema instrukcijama proizvođača (Biacore, Sweden), dajući slične površinske gustine imobilizovanog proteina (-300 fmol/mm2). Prečišćeni peptidi nanešeni su na čip pri povećavajućim koncetracijama radi verifikovanja direktnog vezivanja pro-neurotrofnih domena za ravne peptide Sortilina. Ovaj čip je naknadno upotrebljen za ispitivanje vezivanja domena 390 nM divljeg tipa Sortilina u CaHBS puferu pri protoku od 5 uL/min, koje je u odsustvu bilo kog kompeticionog peptida dalo -300 RU signal. Zar kompeticionu upotrebu 300 uM peptida, samo 1/3 Sortilina može se vezati sa imobilizovanim prodom-BDNF (što pokazuje ∼66% inhibicije peptidom).

Primer 3 – Pripremanje celulozne membrane

[0169] Peptidne biblioteke generisane su za sve članove Vps10p-domenske receptorske genske familije ili specifične peptidne varijacije u uslovima supstitucije ili dužine identifikovanih Sortilin vezujućih peptida. Ukupno 2181 peptida upotrebljeno je za reprezentaciju Sortilin genske familije što odgovara 273 peptida za Sortilin (pristupni kod: CAA66904), 734 peptida za SorLA (pristupni kod: NP_003096), 389 peptida za SorCS1 (pristupni kod: NP_001013049), 382 peptida za sorCS2 (pristupni kod: Q96PQ0), i 403 peptida za SorCS3 (pristupni kod: CAI64579), sa 13 aminokiselinskim preklapanjem 16-mers.

[0170] Celulozna podloga pripremljena je kao N-modifikovana celuloza-amino-hidroksilpropil etar membrana, i sve sve runde sinteze počinju sa SPOT definicijom 9-fluorenil-methoksikarbonil-βalanin-pentafluoofenil estrom koji kreira alaninski linker između peptida i membrane. Zatim nakon automatizovane ravne sinteze stepenastog dodavanja različitih aminokiselina zaštićenih na njihovim amino teminalnom 9-fluorenil-metoksikarbonilom i pogodnom zaštitom bočnog lanca za rast peptidnog lanca. Obrazac deprotekcije, aktivacije, i kuplovanja nastavljen je dok nisu proizvedeni 16-mer peptidi, što je rezultiralo u jednako distribuiranim ted nizom kovalentno pričvršćenih peptida za celuloznu podlogu na njihovom C-terminalnom i N-terminalnom slobodnom kraju. Membrana je konačno blokirana u blokirajućem puferu od Sigma (kat.br. B6429) razblažen u TBS i dopunjen sa 5% saharozom (Merck, kat.br. K32055087422) tokom 2 h pre nego što je prethodno definisana peptidna biblioteka bila spremna za analizu vezivanja liganda.

Primer 4 – Ogledi cezivanja celulozom vezanih peptida

[0171] Membranom vezane biblioteke inkubisane su sa kombinovanim S-peptidom i poli-histidinobeleženim pro-domenima (10 ug/mL) u blokirajućem puferu tokom noći na 4 C, praćeno i drugom inkubacijom sa 1 ug/mL HRP-konjugovanim S-proteinom od Novagen (kat.br.69047-3) takođe u blokirajućem puferu ali tokom 3 h na sobnoj temperaturi. Naknadno, membrana je oprana tri puta tokom 10 min sa TBS pre nego što je izvedena kvantitativna karakterizacija vezanog liganda upotrebom UptiLight hemoluminescencionog supstrata od Uptima (kat.br. UP99619A) i Lumil-mager instrumenta od Roche Diagnostics, obezbeđivajući SPOT signalne intezitete u Boehringer Svetlećim Jedinicama (BLUs). Alternativno, detekcija vezanih liganda izvedena je imunohemijskim ogledom, gde je antitelo protiv histidinske oznake nabavljeno od Sigma (H-1029), a sekundarno HRP-konjugovano anti-mišje antitelo nabavljeno je od Calbiochem (kat.br.401207). Inkubacije su praćene standardnim procedurama Western blota i SPOT detekcijom kako je navedeno.

[0172] Postupak supstitucione analize i analize dužine radi identifikovanja unikatnih pojedinačnih aminokiselinskih ostataka i radi određivanja minimalne peptidne sekvence, respektivno, za efikasno vezivanje prodomen-neurotrofina za Sortilin peptid, praćeno je sličnim protokolima kao i za inicijalno testiraje vezivanja liganda za SPOT membranu.

Primer 5 – Ispitivanje radioligandima

[0173] Rekombinantni Sortilin (38 pmol) obeležen je sa [<125>I] upotrebom lodogen jodinacionog reagensa od Pierce (kat.br.28600) za specifičnu aktivnost od ∼5 x10<18>cpm/mol Sortilina. Pro-dom-NGF (or -BDNF) je obložen u maksisorpcionim mikrotitarskim bazenčićima od Nunc (kat.br.439454) inkubacijom tokom 16 h na 4 C u 50 mM NaHCO3, pH 9.6. Nakon blokiranja upotrebom albumina u 5% goveđem serumu (Sigma, kat.br. A9647) tokom 2 h na sobnoj temperaturi, bazenčići su oprani tri puta sa MB puferom (10 mM HEPES, pH 7.4,140 mM NaCl, 2 mM CaCl2, i 1 mM MgCl2) pre inkubacije sa<125>I-Sortilinom omogućavajući potpuno vezivanje od ∼2.000 cpm/bazenčić i u zavisnosti od količine kompeticionog peptida izvedena su konvetrovanja tokom 16 h na 4°C u MB puferu dopunjen sa albuminom u 2% goveđem serumu. Nakon pranja sa MB puferom, vezana radioaktivnost je oslobađena dodavanjem 10% SDS. Nespecifično vezivanje tragača u bazenčićima obloženim samo sa albuminom u goveđem serumu je određena i oduzeta od vrednosti određenih u eksperimentima vezivanja. Podešavanje podata koji ukazuju na jednačine vezivanje upotrebom Prism softvera od GraphPad, verzija 4, učinilo je procenu IC50 konstanti.

Primer 6 – Ispitivanje antagonističkih karakteristika

[0174] Ispitivanje osobina peptida kao nekog in vivo antagonista pro-neurotrofinskog vezivanja za Sortilin u životinjskom modelu nervenih lezija u zečijem mozgu.

i) Određivanje IC50 vrednosti za peptid pune dužine kao i manje peptide kako je identifikovano našom skorijom analizom dužine illustruje da se 4-mer peptidi (npr. RIFR) vezuju veoma snažno za pro-domene pro-NGF i pro-BDNF. Ovo se može izvesti:

i-a)<125>I-obeležavanjem sortilina i kompeticionim ogledima čvrstog stanja upotrebom imobilizovanog pro-domen-NGF/BDNF u maksisorpcionim mikrotitarskim bazenčićima, praćeno kompeticionim ispitivanjem upotrebom povećavajućih nivoa raznih peptida kako bi se uporedile inhibitorne karakteristike.

i-b) Upotrebom analize površinske rezonance plazmona za koncetracione serije raznih peptida slični rezultatima prikazanim za pojedinačnu koncetraciju A2 peptida.

ii) Testiranjem uticaja esencijalnih ostataka kako je identifikovano supstitucionom analizom za njihov doprinos u pro-neurotrofinskom vezivanju. Upotrebom EBNA293 ekspresionog sistema za rekombinantnu proizvodnju ektodomena sortilina (srebrno oboje gel uključen je u jedan od crteža), pojedinačni-ostaci alaninskih mutanata domena Sortilina trenutno su proizvedeni upotrebom na mestu usmerene mutageneze. Sledećih 7 mutanata je testirano: R160A, R163A, F165A, R166A, F170A, K172A, F174A kako su nemrisani prema pro-Sortilinu specificiranom u pregledu sekvenci. Zbog pokazanog prisustva dva mesta vezivanja unutar ovog regiona Sortilina, proizvodnja duplih, troduplih, itd. mutanata za verifikaciju mesta vezivanja u kontekstu celokupnog Sortilin Vps10p domena može biti potrebno.

iii) Uzimajući u obzir da je moguće identifikovanje ostataka iz (ii),što je esencijalno za interakciju između Sortilina i pro-domena pro-NGF/BDNF, biće izvedeno pripremanje ekspresionih vektora (u pcDNA3.1/invitrogen) za protein Sortilina pune dužine koji nosi takve mutacije. Upotreba ovih konstrukata (zajedno sa p75<NTR>) za ćelijsku transfekciju trebalo bi da proizvede ćelije neosetljive na pro-NGF posredovanu ćelijsku smrt u poređenju sa Sortilinom divljeg tipa, budući da je putanja prekinuta.

iv) Nanošenjem peptida (ili njihovih derivata) na sistem ćelijske kulture za neuronsku ćelijsku smrt, radi verifikovanja da peptidi rade kao funkcionalni inhibitori.

v) Uzimajući u obzir da se može izvesti identifikacija uspešnih inhibitora, oni se mogu primeniti za eksperimente spašavanja u eksperimentima nervnih lezija za mozak pacova.

Primer 7 – Ogledi vezivanja mutanata usmerenih ka nekom mestu

[0175] Mutageneza usmerena ka nekom mestu izvedena za sve bitne ostatke unutar peptidne sekvence kako je identifikovano supstitucionom analizom u SPOT postupku, upotrebom pCepPU ekspresionih vektora za sortilin kao uzorak. Tako generisani mutantni konstrukti upotrebljeni su zajedno sa HEK293 ćelijama kako bi se proizveli pojedinačni preostali mutanti his-obeleženog sortilin luminalnog domena, da bi se dobili proteini R163A, F165A, R166A, F170A, K172A, i F174A nuemrisani prema pro-Sortilin kako je specificirano u pregledu sekvenci. Kao kontrolni protein, mutant R160A smešten N-terminalno u sekvencu za prepoznavanje, proizveden je kako bi se dobio protein sa neizmenjenim afinitetom za NGF-prodomen.

[0176] Nakon prečišćavanja standarnom Ni<2+>-NTA hromatografijom, svaki sortilinski mutant je imobilizovan na sličnoj površinskoj gustini na Biacore CM5 čipovima. Vezivanje je testirano upotrebom koncetracionim serijama prethodno opisanog GST-NGF-pro-domenskog fuzionog proteina (Nykjær et al., Nature 2004), koji može da renderuje viši odgovor upotrebom SPR sistema pri niskoj koncetraciji. Tako koncetrovane serije od 10, 20, 30, 40, i 50 nM GST-prodomena NGF nanešene su na svaku površinu čipova, i podaci su podešeni na 1:1 model vezivanja upotrebom standardnog BIAevaluation softvera. Reprezentativni senzogrami predstavljeni su na FIG.21, a parametri vezivanja obezbeđeni su u Tabeli 1 u nastavku.

Tabela 1: R<163>IFRSSDFAKNF<174>Parametri kinetika za reakciju vezivanja GST-pro-dom-NGF (testiran pri koncetracijama od 10-50nM) za mutante sortilina kako je prikazano na FIG.21. Krive vezivanja podešene su upotrebom BIAevaluation 3.1 softvera, poazujući da svi proizvedeni pojedinačni preostali mutanti eksprimiraju slični afinitet prema pro-neurotrofinskom domenu kao što i nemutirani receptor, iako se F170A i F174A varijante vezuju sa nižim kapacitetom kao što je viđeno od strane nižeg očitavanja na krivama sa FIG.21. Numeracija je prema pro-Sortilinu kako je specificirano u pregledu sekvenci.

* ova dva mutanta eksprimiraju redukovan kapacitet vezivanja – ali sličan afinitet.

[0177] Kako je opisano u eksperimentima analize dužine, čini se da peptid nosi dva nezavisna motiva vezivanja, jedan napravljen pomoću RIFR i jedan pomoću FAKNF, budući da su mali peptidi RIFRSSDF i FAKNFVQTD pokazali efikasno vezivanje prodomen-NGF i pro-domen-BDNF u SPOT analizi. Ovaj model je dalje podržan prethodnim podacima u supstitucionoj analizi, gde je jači efekat nakon mutacija primećen kada su upotrebljeni peptidi sadržavali samo jedan motiv vezivanja, u poređenju sa mutantima koji obuhvataju oba motiva. Shodno tome, odlučeno je da se "ukloni" čitav motiv pre supstitucija unutar drugog motiva i kako bi se posmatralo kako će to uticati na vezivanje liganda. Proizvedena je varijanta sortilina koja sadrži učetvorostručene supstitucije (R163A, F165A, R166A, i F170A) u sličnoj proceduri upotrebom HEK293 ćelija koje su primenjeni za pojedinačne preostale mutante. Primećeno je da se ovaj protein sekretuje u medijum HEK293 ćelija što pokazuje da je kvatro mutant i dalje sposoban da se savije u rastvorljivom proteinu.

[0178] Kako bi se odredio kapacitet vezivanja liganda, kvatro protein je paraleno kuplovan sa sortilinom divljeg tipa na novom Biacore čipu, a vezivanje GST-pro-NGF izmereno je na sličan način kao u analizi pojedinačnih preostalih mutanata (Fig.21). Pronađen je snažno redukovan afinitet za domen vezivanja pro-neurotrofina, što podržava zaključak da je glavno mesto vezivanja za ligande sadržano u RGGRIFRSSDFAKNF peptidu.

[0179] Vezivanje ostalih liganda kao što je neurotenzin i sortilinov pro-peptid mogu se ispitati na način analogan onom koji je prethodno opisan.

Primer 8 - Identifikacija mesta vezivanja pro-neurotrofina na receptoru sortilina

[0180] Kako bi se identifikovali antagonisti za pro-domensko mesto vezivanja neurotrofina u sortilinu (tj. RGGRIFRSSDFAKNF peptidu), izvden je sledeći set eksperimenata:

Obeležavanje pro-NGF i pro-dom-NGF izvedeno je upotrebom IODOGEN postupka i<125>I od Amersham Biosciences. HEK293 ćelije transfektovane su sa ekspresionim vektorom sortilina upotrebom HIFECT transfekcionih reagenasa kako bi se optimizovala efikasnost.24 sata posle transfekcije, ćelije su inkubisane na 4°C tokom 2 sata pre nanošenja radio-liganda tokom 16 sati na 4°C u 10mM HEPES, pH 7,4150mM NaCl, 2mM CaCl2, i 1mM MgCl2 oba u odsustvu i u prisustvu kandidatnih antagonista. Vezivanje liganda za sortilin određuje se kao ćelijski-povezana radioaktivnost. U sličnom eksperimentu sprovedenom na 37° C, biće izmerena količina degradiranog liganda kao brojanja izlučena u ćelijsku podlogu tokom perioda od 16 sati. Sposobnost kandidatnih antagonista da zaštite protiv pro-NGF indukovane apoptoze, sprovedena je kako je opisano (Jansen et al., Nature Neurosci., 2007).

[0181] Prečišćavanje his-obeleženog ekstraćelijskog domena Sortilina izvedeno je kako je drugde opisano, i kuplovano sa Nikl helatnim (His-oznaka) PS SPA scintilacione perle za snimanje prema protokolu proizvođača (GE Healthcare Life Sciences).

Homogeni ogled u jednom bazenčiću koji je upotrebljen je za direktnu kvantifikaciju kandidat agonist-indukovane ili inverzno indukovane<125>I-pro-NGF ili<125>I-pro-dom-NGF aktivnosti vezivanja za receptore kuplovane sa scintilacionim perlama izveden je po smernica kakve su date od strane GE Healthcare Life Sciences.

[0182] Antagonistička svojstva testirana su u kompeticionim eksperimentima upotrebom ogleda scintilacione brzine u reverznoj postavci. Prodomen NGF fuzonisan sa GST (opisano u Nykjær, Nature, 2007) kuplovan je sa glutacionim imobilizovanim scintilacionim perlama (GE Healthcare Life Sciences), a inhibicija je određena upotrebom radio-obeleženog<125>I-RGGRIFRSSDFAKNF ili<125>I-obeleženog netaktnutog ekstraćelijskog domena Sortilina koji se vezuje za perle pomoću kandidatnih antagonista kako je prethodno opisano.

[0183] Identifikovani su antagonisti koji se vezuju direktno sa RGGRIFRSSDFAKNF motivom (kako takvi molekuli vrlo verovatno mogu da se umešaju u interakciju određenog liganda ka netaktnutom sortilinu). Peptid je sintetizovan upotrebom Eurogentec, Liege, Belgium, i imobilizovan na CM5 biacore senzornom čipu (kat.br. BR-1000-14) upotrebom NHS/EDC kompleta za kuplovanje (Biacore, Sweden). Karakteristike vezivanja kandidatnih molekula procenjene su skriningom njihovog vezivanja za receptor/peptid pri različitim koncetracijama u 10mM HEPES, pH 7,4, 150mM NaCl, 2mM CaCl2, 0.005% Tween-20 kao radnom puferu.

Pregled sekvenci

[0184]

SEQ ID NO 1: Sortilin

SEQ ID NO 2: SorLA

SEQ ID NO 3: SorCS1

SEQ ID NO 4: SorCS2

SEQ ID NO 5: SorCS3

SEQ ID NO 6: pre-pro-NGF

SEQ ID NO 7: pre-pro-BDNF

SEQ ID NO 8: Neurotrofin-3

SEQ ID NO 9: Neurotrofin-4/5

SEQ ID NO 10: Neurotenzin (1-13)

SEQ ID NO 11: Neuromedin

SEQ ID NO 12: Receptor vezani peptid (RAP) SEQ ID NO 13: pro-Neurotenzin/pro-Neuromedin SEQ ID NO 14: NT(8-13)

SEQ ID NO 15: NT66L

SEQ ID NO 16: NT67L

SEQ ID NO 17: NT69L

SEQ ID NO 18: Eisai

SEQ ID NO 19: JMV-449

SEQ ID NO 20: PD-149163

SEQ ID NO 21: PD-149598

SEQ ID NO 22: PD-156425

SEQ ID NO 23: PD-156556

SEQ ID NO 24: CGX-1160

SEQ ID NO 25: Zreli Sortilin G113-M143

pro-Sortilin G157-M187

pre-pro-Sortilin G190-M220 SEQ ID NO 26: Zreli Sortilin R196-F207

pro-Sortilin G163-M187

pre-pro-Sortilin G196-M220 SEQ ID NO 27: Zreli Sortilin G119-M122

pro-Sortilin G163-M166

pre-pro-Sortilin G196-M199 SEQ ID NO 28: Zreli Sortilin G126-M130

pro-Sortilin G170-M174

pre-pro-Sortilin G203-M207 SEQ ID NO 29: PD-47113

SEQ ID NO 30: GZR-123

SEQ ID NO.31: NT64D

SEQ ID NO.32: NT64L

SEQ ID NO.33:NT65L

SEQ ID NO.34: NT66D

SEQ ID NO.35:NT69L'

SEQ ID NO.36: NT71

SEQ ID NO.37: NT72

SEQ ID NO.38: NT73

SEQ ID NO.39: NT74

SEQ ID NO.40:NT75

SEQ ID NO.41: NT76

SEQ ID NO.42: NT77

SEQ ID NO.43: Signalni peptid sortilina

<222> (1)..(43)

<223> Sortilin

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (35)..(712)

<223> Ekstracelularni deo sortilina <220>

<221> zreli_peptid

<222> (44)..(798)

<223> Sortilin

<220>

<221> TRANSMEM

<222> (713)..(735)

<223> Sortilin

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (736)..(788)

<223> Intracelularni deo sortilina <400> 1

<211> 2214

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<220>

<221> SIGNAL

<222> (1)..(28)

<223> SorLA

<220>

<221> PROPEP

<222> (29)..(81)

<223> SorLA

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (29)..(2214)

<223> pro-SorLA

<220>

<221> zreli_peptid

<222> (82)..(2214)

<223> SorLA

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (82)..(2137)

<223> Ekstracelularni deo SorLA <220>

<221> TRANSMEM

<222> (2138)..(2158) <223> SorLA

<220>

<221> MISC_FEATURE <222> (2159)..(2214) <223> Intracelularni deo SorLA <400> 2

<211> 1168

<212> PRT

<213> Homo Sapiens <400> 3

<211> 907

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<211> 1222

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<211> 241

<212> PRT

<213> Homo Sapiens <220>

<221> SIGNAL <222> (1)..(18) <223> NGF

<220>

<221> PROPEP <222> (19)..(121) <223> NGF

<220>

<221> zreli_peptid <222> (122)..(241) <223> NGF

<400> 6

<211> 246

<212> PRT

<213> Homo Sapiens <220>

<221> SIGNAL <222> (1)..(18) <223> BDNF

<221> PROPEP <222> (19)..(127) <220>

<221> zreli_peptid <222> (128)..(246) <223> BDNF <400> 7

<211> 257

<212> PRT

<213> Homo Sapiens <220>

<221> SIGNAL <222> (1)..(16) <220>

<221> PROPEP <222> (17)..(140) <220>

<221> zreli_peptid <222> (141)..(257) <223> NT3

<400> 8

<211> 210

<212> PRT

<213> Homo Sapiens <220>

<221> SIGNAL <222> (1)..(24)

<221> PROPEP <222> (25)..(80) <220>

<221> zreli_peptid <222> (81)..(210) <400> 9

<211> 13

<212> PRT

<213> Homo Sapiens <400> 10

<210> 11

<211> 5

<212> PRT

<213> Homo Sapiens <400> 11

<210> 12

<211> 357

<212> PRT

<213> Homo Sapiens <400> 12

<211> 170

<212> PRT

<213> Homo Sapiens <400> 13

<211> 6

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<400> 14

<210> 15

<211> 6

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca <220>

<223> Sintetički generisan peptid <220>

<221> VARIJANTA

<222> (1)..(1)

<223> Xaa = D-Lys

<220>

<221> VARIJANTA

<222> (4)..(4)

<223> Xaa = L-neo-Trp

<220>

<221> VARIJANTA

<222> (5)..(5)

<223> Xaa = tert-Leu

<400> 15

<210> 16

<211> 6

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca <220>

<223> Sintetički generisan peptid <221> VARIJANTA

<222> (1)..(1)

<223> Xaa = D-Lys

<220>

<221> VARIJANTA

<222> (4)..(4)

<223> Xaa = L-neo-Trp

<400> 16

<210> 17

<211> 6

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca <220>

<223> Sintetički generisan peptid <220>

<221> VARIJANTA

<222> (1)..(1)

<223> Xaa = N-metil-Arg <220>

<221> VARIJANTA

<222> (4)..(4)

<223> Xaa = L-neo-Trp

<220>

<221> VARIJANTA

<222> (5)..(5)

<223> Xaa = tert-Leu

<400> 17

<210> 18

<211> 6

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca <220>

<223> Sintetički generisan peptid <220>

<221> VARIJANTA

<222> (1)..(1)

<223> Xaa = N-metil-Arg <220>

<221> VARIJANTA

<222> (5)..(5)

<223> Xaa = tert-Leu

<400> 18

<210> 19

<211> 6

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca <220>

<223> Sintetički generisan peptid <220>

<221> VARIJANTA

<222> (1)..(1)

<223> Xaa = H-Lys-psi-(CH2NH) <220>

<221> VARIJANTA

<222> (6)..(6)

<223> Xaa = Leu-OH

<400> 19

<210> 20

<211> 0

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca <220>

<223> Sintetički generisan peptid <400> 20

000

<210> 21

<211> 0

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca <220>

<223> Sintetički generisan peptid <400> 21

000

<210> 22

<211> 0

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca <220>

<223> Sintetički generisan peptid <400> 22

000

<210> 23

<211> 0

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca <220>

<223> Sintetički generisan peptid <400> 23

000

<210> 24

<211> 76

<212> PRT

<213> Conus geographus

<210> 25

<211> 31

<212> PRT

<213> Homo Sapiens <400> 25

<210> 26

<211> 12

<212> PRT

<213> Homo Sapiens <400> 26

<210> 27

<211> 4

<212> PRT

<213> Homo Sapiens <400> 27

<210> 28

<211> 5

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<400> 28

<210> 29

<211> 0

<212> PRT

<213> Nepoznato

<220>

<223> Sintetički generisan peptid <400> 29

000

<210> 30

<211> 0

<212> PRT

<213> Nepoznato

<220>

<223> Sintetički generisan peptid <400> 30

000

<210> 31

<211> 6

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca <220>

<223> Sintetički generisan peptid <220>

<221> VARIJANTA

<222> (4)..(4)

<223> Xaa = D-neo-Trp

<400> 31

<211> 6

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> Sintetički generisan peptid

<220>

<221> VARIJANTA

<222> (4)..(4)

<223> Xaa = L-neo-Trp

<400> 32

<210> 33

<211> 6

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> Sintetički generisan peptid

<220>

<221> misc_feature

<222> (4)..(4)

<223> Xaa može biti bilo koja prirodna aminokiselina <400> 33

<210> 34

<211> 6

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> Sintetički generisan peptid

<220>

<221> VARIJANTA

<222> (1)..(1)

<223> Xaa = D-Lys

<220>

<221> VARIJANTA

<222> (4)..(4)

<223> Xaa = D-neo-Trp

<220>

<221> VARIJANTA

<222> (5)..(5)

<223> Xaa = tert-Leu

<400> 34

<210> 35

<211> 6

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca <220>

<223> Sintetički generisan peptid <220>

<221> VARIJANTA

<222> (1)..(1)

<223> Xaa = N-metil-Arg <220>

<221> VARIJANTA

<222> (4)..(4)

<223> Xaa = L-neo-Trp

<220>

<221> VARIJANTA

<222> (5)..(5)

<223> Xaa = tert-Leu

<400> 35

<211> 6

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> Sintetički generisan peptid <220>

<221> VARIJANTA

<222> (1)..(1)

<223> Xaa = N-metil-Arg

<220>

<221> VARIJANTA

<222> (2)..(2)

<223> Xaa = Diaminobuterna kiselina <220>

<221> VARIJANTA

<222> (4)..(4)

<223> Xaa = L-neo-Trp

<220>

<221> VARIJANTA

<222> (5)..(5)

<223> Xaa = tert-Leu

<400> 36

<210> 37

<211> 5

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> Sintetički generisan peptid <220>

<221> VARIJANTA

<222> (1)..(1)

<223> Xaa = D-Lys

<221> VARIJANTA

<222> (3)..(3)

<223> Xaa = L-neo-Trp

<220>

<221> VARIJANTA

<222> (4)..(4)

<223> Xaa = tert-Leu

<400> 37

<210> 38

<211> 5

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca <220>

<223> Sintetički generisan peptid <220>

<221> VARIJANTA

<222> (1) .. (1)

<223> Xaa = D-Lys

<220>

<221> VARIJANTA

<222> (3) .. (3)

<223> Xaa = L-neo-Trp

<400> 38

<210> 39

<211> 5

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca <220>

<223> Sintetički generisan peptid <221> VARIJANTA

<222> (1) .. (1)

<223> Xaa = Diaminobuterna kiselina <220>

<221> VARIJANTA

<222> (3) .. (3)

<223> Xaa = L-neo-Trp

<220>

<221> VARIJANTA

<222> (4) .. (4)

<223> Xaa = tert-Leu

<400> 39

<210> 40

<211> 5

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> Sintetički generisan peptid <220>

<221> MOD_RES

<222> (1) .. (1)

<223> Dbu

<220>

<221> VARIJANTA

<222> (3) .. (3)

<223> Xaa = L-neo-Trp

<400> 40

<210> 41

<211> 6

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca <220>

<223> Sintetički generisan peptid <220>

<221> MOD_RES

<222> (2) .. (2)

<223> Orn

<220>

<221> MOD_RES

<222> (2) .. (2)

<223> Xaa = D-Orn

<220>

<221> VARIJANTA

<222> (4)..(4)

<223> Xaa = L-neo-Trp

<400> 41

<210> 42

<211> 6

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca <220>

<223> Sintetički generisan peptid <220>

<221> MOD_RES

<222> (2) .. (2)

<223> D-Orn

<220>

<221> VARIJANTA

<222> (4) .. (4)

<223> Xaa = L-neo-Trp

<220>

<221> VARIJANTA

<222> (5) .. (5)

<223> Xaa = tert-Leu

<400> 42

<210> 43

<211> 33

<212> PRT

<213> Homo sapiens <220>

<221> SIGNAL

<222> (1) .. (33)

<223> Signalni peptid sortilina <400> 43

Claims (2)

Patentni zahtevi

1. Antitelo usmereno protiv nekog ekstracelularnog dela sortilina i sposobno da inhibira vezivanje nekog pro-neurotrofina na mestu vezivanja receptora sortilina, pri čemu se to antitelo vezuje za vezujući motiv za pro-neurotrofin prema SEQ ID NO: 25, 26, 27 ili 28 ili njihovim fragmentom.

2. Antitelo prema zahtevu 1, gde pomenuti fragment obuhvata između 3 i 7 aminokiselinskih ostataka ili između 3 i 5 aminokiselinskih ostataka.