[go: up one dir, main page]

RS55605B1 - Imunogene kompozicije - Google Patents

Imunogene kompozicije

Info

Publication number
RS55605B1
RS55605B1 RS20170051A RSP20170051A RS55605B1 RS 55605 B1 RS55605 B1 RS 55605B1 RS 20170051 A RS20170051 A RS 20170051A RS P20170051 A RSP20170051 A RS P20170051A RS 55605 B1 RS55605 B1 RS 55605B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
toxin
seq
amino acids
proximal end
repeat
Prior art date
Application number
RS20170051A
Other languages
English (en)
Inventor
Cindy Castado
Original Assignee
Glaxosmithkline Biologicals Sa
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=46168484&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=RS55605(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Glaxosmithkline Biologicals Sa filed Critical Glaxosmithkline Biologicals Sa
Publication of RS55605B1 publication Critical patent/RS55605B1/sr

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/08—Clostridium, e.g. Clostridium tetani
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/33—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Clostridium (G)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/12—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria
    • C07K16/1267—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-positive bacteria
    • C07K16/1282—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-positive bacteria from Clostridium (G)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/57—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2
    • A61K2039/575—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2 humoral response
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/40—Fusion polypeptide containing a tag for immunodetection, or an epitope for immunisation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/55—Fusion polypeptide containing a fusion with a toxin, e.g. diphteria toxin

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Description

IMUNOGENE KOMPOZICIJE
OBLAST TEHNIKE
[0001]Ovaj pronalazak se odnosi na antigene izClostridium difficile.Naročito se pronalazak odnosi na rekombinantne proteinske antigene koje sadrže fragmente toksina A i/ili toksina B. Pronalazak se dodatno odnosi na imunogene kompozicije ili vakcine koje sadrže ove antigene, i upotrebu vakcina i imunogenih kompozicija pronalaska u profilaksi i terapiji. Pronalazak se takođe odnosi na postupke imunizacije korišćenjem kompozicija pronalaska, i upotrebu kompozicija pronalaska u proizvodnji medikamenta.
OSNOVA
[0002]C. difficileje najvažniji uzročnik nozokomijalnih intestinalnih infekcija i glavni je uzrok pseudomembranoznog kolitisa kod ljudi (Bartlett et al Am. J. Clin. Nutr. 11 suppl:2521-6 (1980)). Izračunato je da je ukupna povezana stopa mortaliteta za pojedince inficirane saC. difficile5.99% unutar 3 meseca od dijagnoze, sa višim mortalitetom povezanim sa starijim osobama, gde je 13.5% kod pacijenata preko 80 godina (Karaš et al Journal of Infection 561:1-9 (2010)). Trenutni tretman za infekciju saC. difficile jeprimena antibiotika (metronidazol i vankomicin), međutim postoje dokazi o sojevima rezistentnim na ove antibiotike (Shah et al, Expert Rev. Anti Infect. Ther. 8(5), 555-564 (2010)). Shodno tome postoji potreba za imunogenim kompozicijama sposobnim da indukuju antitela na, i/ili zaštitni imuni odgovor protiv,C. difficile.
REZIME
[0003]EnterotoksičnostC. difficile jeprimarno usled dejstva dva toksina, toksina A i toksina B. Oba su potentni citotoksini (Lyerly et al Current Microbiologv 21:29-32 (1990). C-terminalni domeni toksina A i toksina B sadrže ponavljajuće jedinice, na primer C-terminalni domen toksina A je sastavljen od neprekidnih ponavljajućih jedinica (Dove et al Infect. Immun. 58:480-499 (1990)), iz kog razloga se C-terminalni domen može označiti kao'ponavljajući domen'. Ovi ponavljajući delovi mogu se dalje razdvojiti u kratke ponovke (SRs) i duge ponovke (LRs) kao što je opisano u Ho et al (PNAS 102:18373-18378 (2005)).
[0004]Određena je struktura 127-ak fragmenta iz ponavljajućeg domena C terminusa toksina A (Ho et al PNAS 102:18373-18378 (2005)). Ovaj fragment je formirao savijenu strukturu sličnu p-solenoidu, pretežno sastavljenu od (3 lanaca sa malim udelom a heliksa.
[0005]Pokazano je da fragmenti toksina A, naročito fragmenti C-terminalnog domena, mogu dovesti do zaštitnog imunog odgovora kod hrčka (Lyerly et al Current Microbiology 21:29-32
(1990)), WO96/12802 i WO00/61762.
[0006]Poznato je da postoje teškoće pri dizajniranju fuzionih proteina koji se korektno savijaju tokom ekspresije. Polipeptidi ovog pronalaska su fuzioni proteini u kojima je održana nativna struktura slična P solenoidu, i za koje je uočeno da obezbeđuju imuni odgovor i protiv toksina A i toksina B kod miševa.
[0007]U prvom aspektu pronalaska obezbeđen je polipeptid koji sadrži prvi fragment i drugi fragment, gde
(i) prvi fragment je fragment ponavljajućeg domena toksina A; (ii) drugi fragment je fragment ponavljajućeg domena toksina B; (iii) prvi fragment ima prvi proksimalni kraj;
(iv) drugi fragment ima drugi proksimalni kraj; i
gde su prvi fragment i drugi fragment razdvojeni sa manje od ili tačno 5 aminokiselina u primarnoj strukturi, gde polipeptid izaziva antitela koja neutrališu i toksin A i toksin B, gde je prvi proksimalni kraj unutar kratkog ponovka, drugi proksimalni kraj je unutar kratkog ponovka i prvi proksimalni kraj i drugi proksimalni kraj ne remete kratki ponovak-dugi ponovak-kratki ponovak delove.
[0008]U drugom aspektu pronalaska obezbeđen je polinukleotid koji kodira polipeptid pronalaska.
[0009]U trećem aspektu pronalaska obezbeđen je vektor koji sadrži polinukleotid pronalaska povezan sa inducibilnim promotorom.
[0010]U četvrtom aspektu pronalaska obezbeđena je ćelija domaćin koja sadrži vektor pronalaska ili polinukleotid pronalaska.
[0011]U petom aspektu pronalaska obezbeđena je imunogena kompozicija koja sadrži polipeptid pronalaska i farmaceutski prihvatljiv ekscipijent.
[0012]U šestom aspektu pronalaska obezbeđena je vakcina koja sadrži imunogenu kompoziciju pronalaska.
ai
[00131U sedmom aspektu pronalaska obezbeđena je imunogena kompozicija pronalaska ili vakcina pronalaska za upotrebu u tretmanu ili prevenciji bolesti izazvane saC. difficile.
KRATAK OPIS CRTEŽA
[0014]
SL. 1 - Listing sekvenci polipeptida pronalaska.
SL. 2 - Ilustracija C-terminalnih domena ToxA i ToxB, sa prikazanim SR ponovcima kao belim poljima i LR prikazanim kao crnim poljima.
SL. 3 - Ilustracija spajanja između trćeg SR VIII iz ToxA i četvrtog SR II iz Tox B korišćenog u Fuziji 1.
SL. 4 - Ilustracija spajanja između drugog SR VIII iz ToxA i trećeg SR II iz Tox B korišćenog u Fuziji 2.
SL.5 - Ilustracija spajanja između LRVII iz ToxA i LRII iz ToxB korišćenog u Fuziji 3 (sadrži samo deo LRVII iz ToxA i deo LR II iz ToxB).
SL.6 - Ilustracija spajanja između drugog SR VIII iz ToxA i trećeg SR I iz ToxB korišćenog u Fuziji 4.
SL.7 - Ilustracija spajanja koje sadrži glicinski linker između poslednjeg ostatka ToxA proteinske sekvence i početka četvrtog SRII iz ToxB korišćenog u Fuziji 5.
SL.8 - Grafici koji opisuju distribuciju C.difficileToxA-ToxB fuzija 1-5 kao što je određeno brzinom sedimentacije preko analitičkog ultracentrifugiranja. Panel a) opisuje distribuciju Fuzije 1, panel b) opisuje distribuciju Fuzije 2, panel c) opisuje distribuciju Fuzije 3, panel d) opisuje distribuciji Fuzije 4 i panel e) opisuje distribuciju Fuzije 5.
SL.9 - Grafik koji opisuje daleki-UV spektar Fuzija, 2, 3, 4, i 5 meren korišćenjem cirkularnog dihroizma. Spektar za fuziju 2 je predstavljen linijom sa tačkama predstavljenim malim kvadratima, spektar za fuziju 3 je predstavljen linijom sa tačkama prikazanim kao mali dijamanti, fuzija 4 je predstavljena linijom sa tačkama predstavljenim krugovima, i fuzija 5 je predstavljena linijom sa tačkama predstavljenim kao krstići.
SL.10 - Grafik opisuje bliski-UV spektar Fuzije 2, 3, 4, i 5 meren korišćenjem cirkularnog dihroizma. Spektar za fuziju 2 je predstavljen linijom sa tačkama predstavljenim krstićima, spektar za fuziju 3 je predstavljen linijom sa tačkama predstavljenim krugovima, spektar za fuziju 4 je predstavljen linijom sa tačkama predstavljenim trouglovima, i spektar za fuziju 5 je predstavljen linijom sa tačkama predstavljenim oblikom dijamanta.
;i
SL.ll - Grafik koji prikazuje anti-ToxA imunogenost kod miševa imunizovanih sa fragmentom C-terminusa toksina A (ak 2387-2706), fragmentom C-terminusa toksina B (ak 1750-2360), ili fuzijama 1, 2, 3, 4 ili 5.
SL.12 - Grafik prikazuje inhibiciju hemaglutinacije kod miševa imunizovanih sa fragmentom C-terminusa toksina A (ak 2387-2706), fragmentom C-terminusa toksina B (ak 1750-2360), ili fuzijama 1, 2, 3, 4 ili 5.
SL.13 - Grafik koji prikazuje anti-ToxB imunogenost kod miševa imunizovanih sa fragmentom C-terminusa toksina A (ak 2387-2706), fragmentom C-terminusa toksina B (ak 1750-2360), ili fuzijama 1, 2, 3, 4 ili 5.
SL.14 - Titri inhibicije citotoksičnosti miševa imunizovanih sa fragmentom C-terminusa toksina A (ak 2387-2706), fragmentom C-terminusa toksina B (ak 1750-2360), ili fuzijama 1, 2, 3, 4 ili 5.
SL.15 - Grafici koji opisuju distribuciju C.difficileToxA-ToxB fuzija F52New, F54Gly, F54New i F5ToxB kao što je određeno brzinom sedimentacije analitičkim ultracentrifugiranjem. Panel a) opisuje distribuciju F52New, panel b) opisuje distribuciju F54Gly, panel c) opisuje distribuciju F54New i panel d) opisuje distribuciju F5ToxB.
SL.16 - Grafik opisuje daleki-UV spektar fuzija F52New, F54Gly, F54New i F5ToxB meren korišćenjem cirkularnog dihroizma. Spektar F52New je predstavljen linijom sa tačkama predstavljenim kao dvostruki krstići, spektar F54Gly je predstavljen linijom sa tačkama predstavljenim trouglovima, F54New je predstavljen linijom sa tačkama predstavljenim kvadratima, i F5ToxB je predstavljen linijom sa tačkama predstavljenim krstićima.
SL.17 - Grafik prikazuje bliski-UV spektar fuzija F52New, F54Gly, F54New i F5ToxB meren korišćenjem cirkularnog dihroizma. Spektar F52New je predstavljen linijom sa tačkama predstavljenim kao dvostruki krstići, spektar F54Gly je predstavljen linijom sa tačkama predstavljenim trouglovima, F54New je predstavljen linijom sa tačkama predstavljenim kvadratima, i F5ToxB je predstavljen linijom sa tačkama predstavljenim krstićima.
SL.18 - Grafik koji prikazuje anti-ToxA ELISA rezultate za miševe imunizovane sa F2, F52New, F54Gly, G54New ili F5ToxB fuzijama.
SL.19 - Grafik koji prikazuje anti-ToxB ELISA rezultate za miševe imunizovane sa F2, F52New, F54Gly, F54New ili F5ToxB fuzijama.
SL.20 - Grafik koji prikazuje inhibiciju hemaglutinacije kod miševa imunizovanih sa F2, F52New, F54Gly, F54New ili F5ToxB fuzijama.
a
SL.21 - Grafik koji prikazuje titre citotoksičnosti kod HT29 ćelija od miševa imunizovanih sa F2, F52New, F54Gly, F54New ili F5ToxB fuzijama.
SL.22 - Grafik koji prikazuje titre citotoksičnosti kod IMR90 ćelija od miševa imunizovanih sa F2, F52New, F54Gly, F54New ili F5ToxB fuzijama.
DETALJAN OPIS
POL1PEPTID1
[0015]Pronalazak se odnosi na polipeptid koji sadrži prvi fragment i drugi fragment, gde
(i) prvi fragment je fragment ponavljajućeg domena toksina A; (ii) drugi fragment je fragment ponavljajućeg domena toksina B; (iii) prvi fragment ima prvi proksimalni kraj;
(iv) drugi fragment ima drugi proksimalni kraj; i
gde su prvi fragment i drugi fragment razdvojeni sa manje od ili tačno 5 aminokiselina u primarnoj strukturi, gde polipeptid izaziva antitela koja neutrališu i toksin A i toksin B, gde je prvi proksimalni kraj unutar kratkog ponovka, drugi proksimalni kraj je unutar kratkog ponovka i prvi proksimalni kraj i drugi proksimalni kraj ne remete kratki ponovak-dugi ponovak-kratki ponovak delove.
[0016]Termin polipeptid se odnosi na kontinuiranu sekvencu aminokiselina.
[0017]Termin ponavljajući domen toksina A' odnosi se na C-terminalni domen proteina toksina A iz C.difficile,koji sadrži ponavljajuće sekvence. Ovaj domen odnosi se na aminokiseline 1832-2710 toksina A iz soja VPI10463 (ATCC43255) i njihovih ekvivalenata u različitom soju, sekvenca aminokiselina 1832-2710 iz soja VPI10463 (ATCC43255) odgovara aminokiselinama 1832-2710 iz SEQ DD NO:l.
[0018]Termin 'ponavljajući domen toksina B' odnosi se na C-terminalni domen proteina toksina B iz C.difficile.Ovaj domen se odnosi na aminokiseline 1834-2366 iz soja VPI10463 (ATCC43255) i njihove ekvivalente u drugom soju, sekvenca aminokiselina 1834-2366 iz soja VPI10463 (ATCC43255) odgovara aminokiselinama 1834-2366 iz SEQ ID NO:2.
[0019]Toksini A i B iz C.difficilesu konzervativni proteini, međutim sekvenca se malo razlikuje između sojeva, dodatno aminokiselinska sekvenca za toksin A i B kod različitih sojeva može se razlikovati u više aminokiselina.
[0020]Stoga u pronalasku se termin ponavljajući domeni toksina A i/ili ponavljajući domeni toksina B odnose na sekvencu koja je varijanta sa 90%, 95%>, 98%, 99% ili 100% identičnosti sekvence sa aminokiselinama 1832-2710 iz SEQ ID NO:l ili varijanta sa 90%, 95%, 98%, 99% ili 100%o identičnosti sekvence sa aminokiselinama 1834-2366 iz SEQ ID NO:2. U jednom primeru izvođenja'varijanta' je polipeptid koji varira u odnosu na referentne polipeptide u odnosi na supstituciju konzervativnih aminokiselina, gde je ostatak susptituisan drugim sa istim fizičko-hemijskim osobinama. Tipično su takve supstitucije između Ala, Val, Leu i Ile; između Ser i Thr; između kiselih ostataka Asp i Glu; između Asn i Gln, i između baznih ostataka Lys i Arg ili aromatičnih ostataka Phe i Tyr. U jednom primeru izvođenja 'fragment' je polipeptid koji sadrži kontinuirani deo od najmanje 250 aminokiselina polipeptida.
[0021]Dodatno numeracija aminokiselina može se razlikovati između C-terminalnih domena toksina A (ili toksina B) iz jednog soja i toksina A (ili toksina B) iz drugog soja. Iz tog razloga se termin 'ekvivalenti u različitom soju' odnosi na aminokiseline koje odgovaraju onima kod referentnog soja (npr.,C. difficileVP110463), ali koje se nalaze u toksinu različitog soja i koji stoga mogu biti različito numerisani. Region 'ekvivalentnih' aminokiselina može biti određen poravnanjem sekvenci toksina iz različitih sojeva. Brojevi aminokiselina obezbeđeni ovde odnose se na one od soja VP110463.
[0022]Termin 'fragment' polipeptida ili proteina odnosi se na kontinuirani deo od najmanje 100, 200, 230, 250, 300, 350, 380, 400, 450, 480, 500, 530, 550, 580 ili 600 aminokiselina polipeptida ili proteina. Termin 'prvi fragment' odnosi se na kontinuirani deo od najmanje 100, 250, 300, 350, 380, 400, 450, 480, 500, 530, 550, 580 ili 600 aminokiselina ponavljajućeg domena toksina A. Termin 'drugi fragment' odnosi se na kontinuirani deo od najmanje 100, 200, 230, 250, 280, 300, 350, 400, 450 ili 500 aminokiselina ponavljajućeg domena toksina B.
[0023]Termin 'prvi proksimalni kraj' odnosi se na kraj prvog fragmenta (Tox A fragment) koji je kovalentno vezan sa drugim fragmentom (ToxB fragment) ili kovalentno vezan sa linker sekvencom između prvog i drugog fragmenta i najbliži je drugom fragmentu u primarnoj strukturi. Termin 'drugi proksimalni kraj' odnosi se na kraj drugog fragmenta koji je kovalentno vezan za prvi fragment (ToxA fragment) ili kovalentno vezan za linker sekvencu između prvog i drugog fragmenta i najbliži je prvom fragmentu u primarnoj strukturi.
[0024]Polipeptid može biti deo većeg proteina kao što je prekusor ili fuzioni protein. Obično je prednost uključivanje dodatne aminokiselinske sekvence koja sadrži sekvence koje pomažu pri prečišćavanju kao što su višestruki histidinski ostaci, ili dodatna sekvenca za stabilnost tokom rekombinantne proizvodnje. Dodatno, takođe se uzima u obzir i dodavanje egzogenog polipeptidnog ili lipidnog repa ili polinukleotidnih sekvenci da bi se povećao imunogeni potencijal finalnog molekula.
[0025] Fragmenti mogu biti pozicionirani tako daje N-terminus prvog fragmenta susedan C-terminusu drugog fragmenta, alternativno C-terminus prvog fragmenta može biti susedan N-terminusu drugog fragmenta, ili C-terminus prvog fragmenta može biti susedan C-terminusu drugog fragmenta, ili N-terminus prvog fragmenta može biti susedan N-terminusu drugog fragmenta.
[0026] Reč 'susedan' označava razdvojen sa manje od ili tačno 5, 2, 1 ili 0 aminokiselina u primarnoj strukturi.
[0027] Polipeptid pronalaska izaziva antitela koja neutrališu toksin A ili toksin B ili oba. U jednom primeru izvođenja polipeptid izaziva antitela koja neutrališu toksin A. U sledećem primeru izvođenja polipeptid izaziva antitela koja neutrališu toksin B. U sledećem primeru izvođenja polipeptid izaziva antitela koja neutrališu toksin A i toksin B.
[0028] Da li polipeptid izaziva antitela protiv toksina može se meriti imunizacijom miševa imunogenom kompozicijom koja sadrži polipeptid, sakupljanjem seruma i analizom anti-toksin titara seruma korišćenjem ELISA. Serume treba uporediti sa referentnim uzorkom dobijenim od miševa koji nisu bili imunizovani. Primer ove tehnike može se naći u primeru 6. Polipeptid pronalaska izaziva antitela koja neutrališu toksin A ukoliko serumi protiv polipeptida daju ELISA očitavanje od 10%, 20%, 30%, 50%, 70%, 80%, 90%, ili 100% veće od referentnog uzorka.
[0029] U sledećem primeru izvođenja polipeptid pronalaska izaziva zaštitni imuni odgovor kod sisara domaćina protiv sojevaC. difficile.U jednom primeru izvođenja sisar domaćin je izabran iz grupe koja se sastoji od miša, zeca, zamorčeta, ne-humanog primata, majmuna i čoveka. U jednom primeru izvođenja sisar domaćin je miš. U sledećem primeru izvođenja sisar domaćin je čovek.
[0030] Da li polipeptid izaziva zaštitni imuni odgovor kod sisara domaćina protiv sojeva C.difficilemože se odrediti upotrebom testa imunizacije. U takvom testu sisar domaćin je vakcinisan sa polipeptidom i imunizovan izlaganjemC. difficile,vreme koje sisar preživi nakon imunizacije se poredi sa vremenom u kom preživljava referentni sisar koji nije imunizovan sa polipeptidom. Polipeptid izaziva zaštitni imuni odgovor ukoliko sisar imunizovan sa polipeptidom preživljava najmanje 10%, 20%>, 30%, 50%>, 80%, 80%>, 90%, ili 100% duže od referentnog sisara koji nije bio imunizovan nakon izlaganja C.difficile.
[0031] Nativna struktura C-terminalnih domena iz toksina A i B sastoji se od produžene strukture slične (3 solenoidu. Ova struktura se primarno sastoji od (3 nabranih ploča, uz minimum a heliksa kao što je uočeno u Ho et al (PNAS 102:18373-18378 (2005)). Prisutne sekundarne strukture mogu se odrediti upotrebom cirkularnog dihroizma. Na primer merenjem oblika i veličine CD spektra u dalekom-UV regionu (190-250nm) i poređenjem rezultata sa onima kod poznatih struktura. Ovo se može izvesti korišćenjem optičkog puta od O.Olcm od 178 do 250nm, sa lnm rezolucijom i protokom na Jasco J-720 spektropolarimetru, na primer kao što je uočeno u primeru 5 u nastavku.
[0032]U jednom primeru izvođenja prvi fragment sadrži manje od 25%, 23%, 20%, 18%, 15%o, 10%, ili 1% sekundarne strukture alfa heliksa. U jednom primeru izvođenja drugi fragment sadrži manje od 28%, 25%, 23%, 20%, 18%, 15%, 10%, ili 7% sekundarne strukture alfa heliksa. U sledećem primeru izvođenja i prvi i drugi fragment sadrže manje od 28%, 25%, 23%, 20%, 18%, 15%, 10%, ili 7% sekundarne strukture alfa heliksa.
[0033]U jednom primeru izvođenja prvi fragment sadrži više od 20%, 25%, 28%, 30%>, 33%, 35%, 38%, 40%, ili 42% strukture beta nabrane ploče. U jednom primeru izvođenja drugi fragment sadrži više od 20%, 25%, 28%, 30%, 33%, 35%, 38%, 40%, ili 42% strukture beta nabrane ploče. U sledećem primeru izvođenja i prvi i drugi frament sadrže više od 20%, 25%, 28%, 30%, 33%, 35%, 38%, 40%, ili 42% strukture beta nabrane ploče.
[0034]Slika 2 prikazuje organizaciju C-terminalnih domena ToxA i ToxB. C-terminalni domen toksina čini 8 ponavljajućih delova (označeni kao ponavljajući deo I, ponavljajući deo II, ponavljajući deo III, ponavljajući deo IV, ponavljajući deo V, ponavljajući deo VI, ponavljajući deo VIT i ponavljajući deo VTTT) svaki od ovih ponavljajućih delova može se dalje podeliti u kratke ponovke (SRs) koji su prikazani kao bela polja na slici 2 i duge ponovke (LRs) koji su prikazani kao crna polja na slici 2 (izuzev za Tox A ponovljeni deo VIII koji nema dugi ponovak). Svaki od dugih ponovaka ima neke strukturne sličnosti i sličnosti u sekvenci sa drugim dugim ponovcima. Slično tome kratki ponovci međusobno imaju sličnosti u strukturi i sekvenci. C-terminalni domen toksina B čini 5 ponavljajućih delova podeljenih u SRs i LRs. Svaki ponavljajući deo sadrži jedan LR i između 2 i 5 SRs (izuzev za Tox B ponavljajući deo V koji nema dugi ponovak). U svrhu opisa izraz 'ponavljajući deo' odnosi se na jedan od osam ponovljenih delova ToxA (označenih I, II, III, IV, V, VI, VII, i VIII) ili jedan od pet ponavljajućih delova ToxB (označenih I, II, III, IV ili VI). Kao što je ovde korišćeno termin 'prvi ponavljajući deo' odnosi se na ponavljajući deo (ili delimično ponavljajući deo) iz ponavljajućeg domena toksina A. Termin 'drugi ponavljajući deo' odnosi se na ponavljajući deo (ili delimično ponavljajući deo) iz ponavljajućeg domena toksina B. U svrhu opisa termin 'dugi ponovak' označava jedan od LR domena prikazanih kao crna polja na Slici 2. U svrhu opisa termin 'kratki ponovak' odnosi se na jedan od SR domena prikazanih kao bela polja na Slici 2.
[0035]Stoga na primer, ponavljajući deo I ToxA sadrži tri SRs i jedan LR, koji se mogu označiti kao prvi SRI ToxA, drugi SRI ToxA, treći SRI ToxA i LRI ToxA, respektivno.
[0036]Smatra se da je prvi proksimalni kraj unutar 'ponavljajućeg dela' ukoliko se prvi fragment završava aminokiselinom koja je unutar tog ponavljajućeg dela (tj., prvi proksimalni kraj sadrži samo deo sekvence ponavljajućeg dela). Slično tome, smatra se da je drugi proksimalni kraj unutar 'ponavljajućeg dela' ukoliko se drugi fragment završava aminokiselinom koja je unutar tog ponavljajućeg dela. Na primer prvi proksimalni kraj je unutar 'ponavljajućeg dela I ToxA' ukoliko se prvi fragment završava sa bilo kojom od aminokiselina 1832-1924 (uključujući) VPI10463 ili njihovim ekvivalentom u drugom soju. Prvi proksimalni kraj nije unutar kratki ponovak-dugi ponovak-kratki ponovak dela ukoliko se prvi fragment završava sa aminokiselinom koja nije unutar tog kratki ponovak-dugi ponovak-kratki ponovak dela.
[0037]Aminokiselinske pozicije svakog domena definisane su za toksin A i toksin B iz soja VPI10463 (ATCC43255). One su kao što sledi
f?
[0038]Iz tog razloga termin 'ponavljajući deo' može se odnositi na aminokiseline 1832-1924, 1925-2058, 2059-2192, 2193-2306, 2307-2440, 2441-2553, 2554-2644 ili 2645-2710 toksina A (SEQ ID NO:l), ili aminokiseline 1834-1926, 1927-2057, 2058-2189, 2190-2323 ili 2324-2366 toksina B (SEQ ID NO:2) ili njihove ekvivalente u drugom sojuC. difficile.
[0039]Iz tog razloga termin 'kratki ponovak' može se odnositi na aminokiseline 1832-1852, 1853-1873, 1874-1893, 1925-1944, 1945-1965, 1966-1986, 1987-2007, 2008-2027, 2059-2078, 2079-2099, 2100-2120, 2121-2141, 2142-2161, 2193-2212, 2213-2233, 2234-2253, 2254-2275, 2307-2326, 2327-2347, 2348-2368, 2369-2389, 2390-2409, 2441-2460, 2461-2481, 2482-2502, 2503-2522, 2554-2573, 2574-2594, 2595-2613, 2645-2664, 2665-2686 ili 2687-2710 toksina A (SEQ ID NO:l) ili aminokiseline 1834-1854, 1855-1876, 1877-1896, 1927-1946, 1947-1967, 1968-1987, 1988-2007, 2008-2027, 2058-2078, 2079-2099, 2100-2119, 2120-2139, 2140-2159, 2190-2212, 2213-2233, 2234-2253, 2254-2273, 2274-2293, 2324-2343 ili 2344-2366 toksina B (SEQ ID NO:2) ili njihove ekvivalente u drugom soju C.
difficile.
[0040]Slično tome termin 'dugi ponovak' se može odnositi na aminokiseline 1894-1924, 2028-2058, 2162-2192, 2276-2306, 2410-2440, 2523-2553 ili 2614-2644 toksina A (SEQ ID NO:l) ili aminokiseline 1897-1926, 2028-2057, 2160-2189 ili 2294-2323 toksina B (SEQ ID NO:2) ili njihove ekvivalente u drugom sojuC. difficile.
[0041]Slično tome termin 'kratki ponovak-dugi ponovak-kratki ponovak deo' može se odnositi na aminokiseline 1874-1944, 2008-2078, 2142-2212, 2254-2326, 2390-2460, 2503-2573, ili 2595-2664 toksina A (SEQ ID NO:l) ili aminokiseline 1877-1946, 2008-2078, 2140-2212 ili 2274-2343 toksina B (SEQ ID NO:2) ili njihove ekvivalente u drugom sojuC. difficile.Termin 'ne remeti kratki ponovak-dugi ponovak-kratki ponovak deo' označava daje proksimalni kraj u regionu koji ne remeti strukturu kratki ponovak-dugi ponovak-kratki ponovak dela, generalno ovo znači da proksimalni kraj nije unutar dugogo ponovka i nije unutar kratkih ponovaka koji čine kratki ponovak-dugi ponovak-kratki ponovak deo, izuzev što proksimalni kraj može biti u regionu 1, 2, 3, 4, 5 ili 6 aminokiselina kratkog ponovka koje su najdalje u sekvenci od dugog ponovka. U jednom primeru izvođenja termin 'ne remeti kratki ponovak-dugi ponovak-kratki ponovak deo' označava da proksimalni kraj nije unutar kratki ponovak-dugi ponovak-kratki ponovak dela.
[0042]U jednom primeru izvođenja prvi proksimalni kraj nije unutar aminokiselina 1878-1940, 2146-2208, 2012-2074, 2258-2322, 2394-2456, 2507-2569, 2599-2660 ili 2593-2660 toksina A (SEQ ID NO:l) ili njihovih ekvivalenata u drugom sojuC. difficile.U drugom primeru izvođenja drugi proksimalni kraj nije unutar aminokiselina 1881-1942, 2012-2074, 2144-2208, ili 2278-2339 toksina B (SEQ ID NO:2) ili njihovih ekvivalenata u drugom sojuC. difficile.U sledećem primeru izvođenja prvi proksimalni kraj nije unutar aminokiselina 1878-1940, 2146-2208, 2012-2074, 2258-2322, 2394-2456, 2507-2569, 2599-2660 ili 2593-2660 toksina A (SEQ ID NO:l) ili njihovih ekvivalenata u drugom sojuC. difficilei drugi proksimalni kraj nije unutar aminokiselina 1881-1942, 2012-2074, 2144-2208, ili 2278-2339 toksina B (SEQ ID NO:2) ili njihovih ekvivalenata u drugom sojuC. difficile.
[0043]U jednom primeru izvođenja prvi proksimalni kraj je unutar ponavljajućeg dela V (aminokiseline 2307-2440 iz SEQ ID NO:l ili njihov ekvivalent u drugom soju), VI (aminokiseline 2441-2553 iz SEQ ID NO:l ili njihov ekvivalent u drugom soju), VII (aminokiseline 2554-2644 iz SEQ TD NO:l ili njihov ekvivalent u drugom soju) ili VTTT (aminokiseline 2645-2710 iz SEQ ID NO:l ili njihov ekvivalent u drugom soju) toksina A. U sledećem primeru izvođenja prvi proksimalni kraj je unutar ponavljajućeg dela VII (aminokiseline 2554-2644 iz SEQ ID NO:l ili njihov ekvivalent u drugom soju) toksina A. U sledećem primeru izvođenja prvi proksimalni kraj je unutar ponavljajućeg dela VIII (aminokiseline 2645-2710 iz SEQ ID NO:l ili njihov ekvivalent u drugom soju) toksina A.
[0044]U jednom primeru izvođenja drugi proksimalni kraj je unutar ponavljajućeg dela I (aminokiseline 1834-1926 iz SEQ ID NO:2 ili njihov ekvivalent u drugom soju), II (aminokiseline 1927-2057 iz SEQ ID NO:2 ili njihov ekvivalent u drugom soju), ili III (aminokiseline 2058-2189 iz SEQ ID NO:2 ili njihov ekvivalent u drugom soju) toksina B. U sledećem primeru izvođenja drugi proksimalni kraj je unutar ponavljajućeg dela II (aminokiseline 1927-2057 iz SEQ ID NO:2 ili njihov ekvivalent u drugom soju) toksina B. U sledećem primeru izvođenja drugi proksimalni kraj je unutar ponavljajućeg dela I (aminokiseline 1834-1926 iz SEQ ID NO:2 ili njihov ekvivalent u drugom soju) toksina B.
[0045]U jednom primeru izvođenja prvi proksimalni kraj je unutar ponavljajućeg dela VIII (aminokiseline 2645-2710 iz SEQ ID NO:l ili njihov ekvivalent u drugom soju) toksina A i drugi proksimalni kraj je unutar ponavljajućeg dela I (aminokiseline 1834-1926 iz SEQ ID NO:2 ili njihov ekvivalent u drugom soju) toksina B. U sledećem primeru izvođenja prvi proksimalni kraj je unutar ponavljajućeg dela VIII (aminokiseline 2645-2710 iz SEQ ID NO:l), ili njihov ekvivalent u drugom soju) toksina A i drugi proksimalni kraj je unutar ponavljajućeg dela II (aminokiseline 1927-2057 iz SEQ ID NO:2 ili njihov ekvivalent u drugom soju) toksina B. U sledećem primeru izvođenja prvi proksimalni kraj je unutar ponavljajućeg dela VII (aminokiseline 2554-2644 iz SEQ ID NO:l ili njihov ekvivalent u drugom soju) toksina A i drugi proksimalni kraj je unutar ponavljajućeg dela I (aminokiseline 1834-1926 iz SEQ ID NO:2 ili njihov ekvivalent u drugom soju) toksina B. U sledećem primeru izvođenja prvi proksimalni kraj je unutar ponavljajućeg dela VII (aminokiseline 2554-2644 iz SEQ ID NO:l ili njihov ekvivalent u drugom soju) toksina A i drugi proksimalni kraj je unutar ponavljajućeg dela II (aminokiseline 1927-2057 iz SEQ ID NO:2 ili njihov ekvivalent u drugom soju) toksina B. U sledećem primeru izvođenja prvi proksimalni kraj je unutar ponavljajućeg dela VI (aminokiseline 2441-2553 iz SEQ ID NO:l ili njihov ekvivalent u drugom soju) i drugi proksimalni kraj je unutar ponavljajućeg dela I (aminokiseline 1834-1926 iz SEQ ID NO:2 ili njihov ekvivalent u drugom soju) toksina B. U sledećem primeru izvođenja prvi proksimalni kraj je unutar ponavljajućeg dela VI (aminokiseline 2441-2553 iz SEQ TD NO:l ili njihov ekvivalent u drugom soju) i drugi proksimalni kraj je unutar ponavljajućeg dela II (aminokiseline 1927-2057 iz SEQ ID NO:2 ili njihov ekvivalent u drugom soju) toksina B. U sledećem primeru izvođenja prvi proksimalni kraj je unutar ponavljajućeg dela V (aminokiseline 2307-2440 iz SEQ ID NO:l ili njihov ekvivalent u drugom soju) i drugi proksimalni kraj je unutar ponavljajućeg dela I (aminokiseline 1834-1926 iz SEQ ID NO:2 ili njihov ekvivalent u drugom soju) toksina B. U sledećem primeru izvođenja prvi proksimalni kraj je unutar ponavljajućeg dela V (aminokiseline 2307-2440 iz SEQ ID NO:l ili njihov ekvivalent iz drugog soja) i drugi proksimalni kraj je unutar ponavljajućeg dela II (aminokiseline 1927-2057 iz SEQ ID NO:2 ili njihov ekvivalent u drugom soju) toksina B.
[0046]U jednom primeru izvođenja prvi proksimalni kraj je unutar aminokiselina 2690-2710, ili 2695-2710, ili 2700-2710 iz SEQ ID NO:l ili njihov ekvivalent u drugom soju. U sledećem primeru izvođenja prvi proksimalni kraj je unutar aminokiselina 2670-2700, ili 2675-2695, ili 2680-2690 iz SEQ ID NO:l ili njihov ekvivalent u drugom soju. U jednom primeru izvođenja drugi proksimalni kraj je unutar aminokiselina 1860-1878 toksina B ili njihov ekvivalent u drigom soju. U jednom primeru izvođenja drugi proksimalni kraj je unutar aminokiselina 1950-1980, 1955-1975 ili 1960-1970 iz SEQ ID NO:2 ili njihov ekvivalent u drugom soju. U sledećem primeru izvođenja drugi proksimalni kraj je unutar aminokiselina 1978-2008, 1983-2003 ili 1988-1998 iz SEQ ID NO:2 ili njihov ekvivalent u drugom soju. U sledećem primeru izvođenja drugfi proksimalni kraj je unutar aminokiselina 1860-1878, 1854-1876, 1857-1887, 1862-1882, ili 1867-1877 iz SEQ ID NO:2 ili njihov ekvivalent u drugom soju.
[0047]U jednom primeru izvođenja prvi fragment se sastoji od celog ponavljajućeg domena toksina A (aminokiseline 1832-2710). U jednom primeru izvođenja drugi fragment se sastoji od celog ponavljajućeg domena toksina B (aminokiseline 1833-2366).
[0048]U jednom primeru izvođenja prvi proksimalni kraj je unutar kratkog ponovka 3 ponavljajućeg dela VIII toksina A (aminokiseline 2687-2710 iz SEQ ID NO:l ili njihovih ekvivalenata u drugom soju) i drugi proksimalni kraj je unutar kratkog ponovka 4 ponavljajućeg dela II toksina B (aminokiseline 1988-2007 iz SEQ ID NO:2 ili njhovih ekvivalentata u drugom soju). U jednom primeru izvođenja prvi proksimalni kraj je unutar kratkog ponovka 3 ponavljajućeg dela VIII toksina A (aminokiseline 2687-2710 iz SEQ ID NO:l ili njihovih ekvivalenata u drugom soju) i drugi proksimalni kraj je unutar kratkog ponovka 3 ponavljajućeg dela II toksina B (aminokiseline 1968-1987 iz SEQ ID NO:2 ili njhov ekvivalent u drugom soju). U jednom primeru izvođenja prvi proksimalni kraj je unutar kratkog ponovka 3 ponavljajućeg dela VIII toksina A (aminokiseline 2687-2710 iz SEQ ID NO:l ili njihov ekvivalent u drugom soju) i drugi proksimalni kraj je unutar kratkog ponovka 2 ponavaljućeg dela II toksina B (aminokiseline 1947-1967 iz SEQ ID NO:2 ili njihov ekvivalent u drugom soju). U jednom primeru izvođenja prvi proksimalni kraj je unutar kratkog ponovka 3 ponavljajućeg dela VIII toksina A (aminokiseline 2687-2710 iz SEQ ID NO:l ili njihov ekvivalent u drugom soju) i drugi proksimalni kraj je unutar kratkog ponovka 3 ponavljajućeg dela I toksina B (aminokiseline 1877-1896 iz SEQ ID NO:2 ili njihov ekvivalent u drugom soju). U jednom primeru izvođenja prvi proksimalni kraj je unutar kratkog ponovka 3 ponavljajućeg dela VIII toksina A (aminokiseline 2687-2710 iz SEQ ID NO:l ili njihov ekvivalent u drugom soju) i drugi proksimalni kraj je unutar kratkog ponovka 2 ponavljajućeg dela I toksina B (aminokiseline 1855-1876 iz SEQ ID NO:2 ili njihov ekvivalent u drugom soju). U jednom primeru izvođenja prvi proksimalni kraj je unutar kratkog ponovka 3 ponavljajućeg dela VIII toksina A (aminokiseline 2687-2710 iz SEQ ID NO:l), ili njihov ekvivalent u drugom soju) i drugi proksimalni kraj je unutar kratkog ponovka 1 ponavljajućeg dela I toksina B (aminokiseline 1834-1854 iz SEQ ID NO:2 ili njihov ekvivalent u drugom soju). U jednom primeru izvođenja prvi proksimalni kraj je unutar kratkog ponovka 2 ponavljajućeg dela VIII toksina A (aminokiseline 2665-2686 iz SEQ ID NO:l ili njihov ekvivalent u drugom soju) i drugi proksimalni kraj je unutar kratkog ponovka 4 ponavljajućeg dela II toksina B (aminokiseline 1988-2007 iz SEQ ID NO:2 ili njihov ekvivalent u drugom soju). U jednom primeru izvođenja prvi proksimalni kraj je unutar kratkog ponovka 2 ponavljajućeg dela VIII toksina A (aminokiseline 2665-2686 iz SEQ ID NO:l ili njihov ekvivalent u drugom soju) i drugi proksimalni kraj je unutar kratkog ponovka 3 ponavljajućeg dela II toksina B (aminokiseline 1968-1987 iz SEQ ID NO:2 ili njihov ekvivalent u drugom soju). U jednom primeru izvođenja prvi proksimalni kraj je unutar kratkog ponovka 2 ponavljajućeg dela VIII toksina A (aminokiseline 2665-2686 iz SEQ ID NO:l ili njihov ekvivalent u drugom soju) i drugi proksimalni kraj je unutar kratkog ponovka 2 ponavljajućeg dela II toksina B (aminokiseline 1947-1967 iz SEQ ID NO:2 ili njihov ekvivalent u drugom soju). U jednom primeru izvođenja prvi proksimalni kraj je unutar kratkog ponovka 2 ponavljajućeg dela VIII ili toksina A (aminokiseline 2665-2686 iz SEQ ID NO:l ili njihov ekvivalent u drugom soju) i drugi proksimalni kraj je unutar kratkog ponovka 3 ponavljajućeg dela I toksina B (aminokiseline 1877-1896 toksina B ili njihov ekvivalent u drugom soju). U jednom primeru izvođenja prvi proksimalni kraj je unutar kratkog ponovka 2 ponavljajućeg dela VIII toksina A (aminokiseline 2665-2686 iz SEQ ID NO:l ili njihov ekvivalent u drugom soju) i drugi proksimalni kraj je unutar kratkog ponovka 2 ponavljajućeg dela I toksina B (aminokiseline 1855-1876 iz SEQ ID NO:2 ili njihov ekvivalent u drugom soju. U jednom primeru izvođenja prvi proksimalni kraj je unutar kratkog ponovka 2 ponavljajućeg dela VIII toksina A (aminokiseline 2665-2686 iz SEQ ID NO:l ili njihov ekvivalent u drugom soju) i drugi proksimalni kraj je unutar kratkog ponovka 1 ponavljajućeg dela I toksina B (aminokiseline 1834-1854 iz SEQ ID NO:2 ili njihov ekvivalent u drugom soju). U jednom primeru izvođenja prvi proksimalni kraj je unutar kratkog ponovka 2 ponavljajućeg dela VII toksina A (aminokiseline 2574-2594 iz SEQ ID NO:l ili njihov ekvivalent u drugom soju) i drugi proksimalni kraj je unutar kratkog ponovka 4 ponavljajućeg dela II toksina B (aminokiseline 1988-2007 iz SEQ ID NO:2 ili njihov ekvivalent u drugom soju). U jednom primeru izvođenja prvi proksimalni kraj je unutar kratkog ponovka 2 ponavljajućeg dela VII toksina A (aminokiseline 2574-2594 iz SEQ ID NO:l ili njihov ekvivalent u drugom soju) i drugi proksimalni kraj je unutar kratkog ponovka 3 ponavljajućeg dela II toksina B (aminokiseline 1668-1987 iz SEQ ID NO:2 ili njihov ekvivalent u drugom soju). U jednom primeru izvođenja prvi proksimalni kraj je unutar kratkog ponovka 2 ponavljajućeg dela VII toksina A (aminokiseline 2574-2594 iz SEQ ID NO:l ili njihov ekvivalent u drugom soju) i drugi proksimalni kraj je unutar kratkog ponovka
2 ponavljajućeg dela II toksina B (aminokiseline 1947-1967 iz SEQ ID NO:2 ili njihov ekvivalent u drugom soju). U jednom primeru izvođenja prvi proksimalni kraj je unutar kratkog ponovka 2 ponavljajućeg dela VII toksina A (aminokiseline 2574-2594 iz SEQ ID NO:l ili njihov ekvivalent u drugom soju) i drugi proksimalni kraj je unutar kratkog ponovka 2 ponavljajućeg dela I toksina B (aminokiseline 1855-1876 iz SEQ ID NO:2 ili njihovih ekvivalenata u drugom soju). U jednom primeru izvođenja prvi proksimalni kraj je unutar kratkog ponovka 2 ponavljajućeg dela VII toksina A (aminokiseline 2574-2594 iz SEQ ID NO:l ili njihov ekvivalent u drugom soju) i drugi proksimalni kraj je unutar kratkog ponovka 1 ponavljajućeg dela I toksina B (aminokiseline 1834-1854 iz SEQ ID NO:2 ili njihov ekvivalent u drugom soju). U jednom primeru izvođenja prvi proksimalni kraj je unutar kratkog ponovka 3 ponavljajućeg dela VI toksina A (aminokiseline 2482-2502 iz SEQ ID NO:l ili njihov ekvivalent u drugom soju) i drugi proksimalni kraj je unutar kratkog ponovka 4 ponavljajućeg dela II toksina B (aminokiseline 1988-2007 iz SEQ ID NO:2 ili njihov ekvivalent u drugom soju). U jednom primeru izvođenja prvi proksimalni kraj je unutar kratkog ponovka 3 ponavljajućeg dela VI toksina A (aminokiseline 2482-2502 iz SEQ ID NO:l ili njihov ekvivalenta u drugom soju) i drugi proksimalni kraj je unutar kratkog ponovka 3 ponavljajućeg dela II toksina B (aminokiseline 1968-1987 iz SEQ ID NO:2 ili njihov ekvivalent u drugom soju). U jednom primeru izvođenja prvi proksimalni kraj je unutar kratkog ponovka 3 ponavljajućeg dela VI toksina A (aminokiseline 2482-2502 iz SEQ TD NO:l ili njihov ekvivalent u drugom soju) i drugi proksimalni kraj je unutar kratkog ponovka 2 ponavljajućeg dela II toksina B (aminokiseline 1947-1967 iz SEQ ID NO:2 ili njihov ekvivalent u drugom soju). U jednom primeru izvođenja prvi proksimalni kraj je unutar kratkog ponovka 3 ponavljajućeg dela VI toksina A (aminokiseline 2482-2502 iz SEQ ID NO:l ili njihov ekvivalent u drugom soju) i drugi proksimalni kraj je unutar kratkog ponovka 2 ponavljajućeg dela I toksina B (aminokiseline 1855-1876 iz SEQ ID NO:2 ili njihov ekvivalent u drugom soju). U jednom primeru izvođenja prvi proksimalni kraj je unutar kratkog ponovka 3 ponavljajućeg dela VI toksina A (aminokiseline 2482-2502 iz SEQ ID NO:l ili njihov ekvivalent u drugom soju) i drugi proksimalni kraj je unutar kratkog ponovka 1 ponavljajućeg dela I toksina B (aminokiseline 1834-1854 iz SEQ ID NO:2 ili njihov ekvivalent u drugom soju). U jednom primeru izvođenja prvi proksimalni kraj je unutar kratkog ponovka 2 ponavljajućeg dela VI toksina A (aminokiseline 2461-2481 iz SEQ ID NO:l ili njihov ekvivalent u drugom soju) i drugi proksimalni kraj je unutar kratkog ponovka 4 ponavljajućeg dela II toksina B (aminokiseline 1988-2007 iz SEQ ID NO:2 ili njihov ekvivalent u drugom soju). U jednom primeru izvođenja prvi proksimalni kraj je unutar kratkog ponovka 2 ponavljajućeg dela VI toksina A (aminokiseline 2461-2481 iz SEQ ID NO:l ili njihov ekvivalent u drugom soju) i drugi proksimalni kraj je unutar kratkog ponovka 3 ponavljajućeg dela II toksina B (aminokiseline 1968-1987 iz SEQ ID NO:2 ili njihov ekvivalent u drugom soju). U jednom primeru izvođenja prvi proksimalni kraj je unutar kratkog ponovka 2 ponavljajućeg dela VI toksina A (aminokiseline 2461-2481 iz SEQ ID NO:l), ili njihov ekvivalent u drugom soju) i drugi proksimalni kraj je unutar kratkog ponovka 2 ponavljajućeg dela II toksina B (aminokiseline 1947-1967 iz SEQ ID NO:2 ili njihov ekvivalent u drugom soju). U jednom primeru izvođenja prvi proksimalni kraj je unutar kratkog ponovka 2 ponavljajućeg dela VI toksina A (aminokiseline 2461-2481 iz SEQ ID NO:l ili njihov ekvivalent u drugom soju) i drugi proksimalni kraj je unutar kratkog ponovka 2 ponavljajućeg dela I toksina B (aminokiseline 1855-1876 iz SEQ ID NO:2 ili njihov ekvivalent u drugom soju). U jednom primeru izvođenja prvi proksimalni kraj je unutar kratkog ponovka 2 ponavljajućeg dela VI toksina A (aminokiseline 2461-2481 iz SEQ ID NO:l ili njihov ekvivalent u drugom soju) i drugi proksimalni kraj je unutar kratkog ponovka 1 ponavljajućeg dela I toksina B (aminokiseline 1834-1854 iz SEQ ID NO:2 ili njihov ekvivalent u drugom soju).
[0049]U jednom primeru izvođenja prvi proksimalni kraj je unutar aminokiselina 2690-2710, ili 2695-2710, ili 2700-2710 iz SEQ ID NO:l ili njihov ekvivalent u drugom soju i drugi proksimalni kraj je unutar aminokiselina 1950-1980, 1955-1975 ili 1960-1970 iz SEQ ID NO:2 ili njihov ekvivalent u drugom soju. U jednom primeru izvođenja prvi proksimalni kraj je unutar aminokiselina 2690-2710, ili 2695-2710, ili 2700-2710 iz SEQ ID NO:l ili njihov ekvivalent u drugom soju i drugi proksimalni kraj je unutar aminokiselina 1978-2008, 1983-2003 ili 1988-1998 iz SEQ ID NO:2 ili njihov ekvivalent u drugom soju. U jednom primeru izvođenja prvi proksimalni kraj je unutar aminokiselina 2690-2710, ili 2695-2710, ili 2700-2710 iz SEQ ID NO:l ili njihov ekvivalent u drugom soju i drugi proksimalni kraj je unutar aminokiselina 1857-1887, 1862-1882, ili 1867-1877 iz SEQ ID NO:2 ili njihov ekvivalent u drugom soju. U jednom primeru izvođenja prvi proksimalni kraj je unutar aminokiselina 2670-2700, ili 2675-2695, ili 2680-2690 iz SEQ ID NO:l ili njihov ekvivalent u drugom soju i drugi proksimalni kraj je unutar aminokiselina 1950-1980, 1955-1975 ili 1960-1970 iz SEQ ID NO:2 ili njihov ekvivalent u drugom soju. U jednom primeru izvođenja prvi proksimalni kraj je unutar aminokiselina 2670-2700, ili 2675-2695, ili 2680-2690 iz SEQ ID NO:l ili njihov ekvivalent u drugom soju i drugi proksimalni kraj je unutar aminokiselina 1978-2008, 1983-2003 ili 1988-1998 iz SEQ ID NO:2 ili njihov ekvivalent u drugom soju. U jednom primeru izvođenja prvi proksimalni kraj je unutar aminokiseline 2670-2700, ili 2675-2695, ili 2680-2690 iz SEQ ID NO:l ili njihov ekvivalent u drugom soju i drugi proksimalni kraj je unutar aminokiselina 1857-1887, 1862-1882, 1860-1878 ili 1867-1877 iz SEQ ID NO:2 ili njihov ekvivalent u drugom soju. [00501U jednom primeru izvođenja prvi fragment sadrži najmanje 100, 200, 300, 400 ili 450 aminokiselina. U jednom primeru izvođenja drugi fragment sadrži najmanje 100, 200, 300 ili 400 aminokiselina.
[0051]U jednom primeru izvođenja polipeptid dodatno sadrži linker. Ovaj linker može biti između prvog proksimalnog kraja i drugog proksimalnog kraja, alternativno linker može povezivati distalne krajeve prvog fragmenta i/ili drugog fragmenta sa dodatnom aminokiselinskom sekvencom.
[0052]Može se upotrebiti peptidna linker sekvenca da razdvoji prvi fragment i drugi fragment. Takva peptidna linker sekvenca je inkorporisana u fuzioni protein korišćenjem standardnih tehnika dobro poznatih u tehnici. Pogodne peptidne linker sekvence mogu se izabrati na osnovu sledećih faktora: (1) njihove sposobnosti da usvoje fleksibilnu produženu konformaciju; (2) njihove nesposobnosti da usvoje sekundarnu strukturu koja bi mogla interagovati sa funkcionalnim epitopima na prvom fragmentu i/ili drugim fragmentima; i (3) odsustvo hidrofobnih ili naelektrisanih ostataka koji mogu reagovati sa Tox A i/ili ToxB funkcionalnim epitopima. Peptidne linker sekvence mogu sadržati Gly, Asn i Ser ostatke. Druge bliske neutralne aminokiseline, kao što su Thr i Ala mogu se takođe koristiti u linker sekvenci. Aminokiselinske sekvence koje se mogu korisno upotrebiti kao linkeri uključuju one opisane u Maratea et al., Gene 40:39-46 (1985); Murphy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:8258-8262 (1986); U.S. Patent No. 4,935,233 i U.S. Patent No. 4,751,180.
[0053]U jednom primeru izvođenja linker sadrži između 1-19, 1-15, 1-10, 1-5, 1-2, 5-20, 5-15, 5-15, 10-20, ili 10-15 aminokiselina. U jednom primeru izvođenja linker je glicin linker, linker može sadržati višestruke (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 18 ili 19) kontinuirane glicinske ostatke, ili alternativno linker može sadržati neke glicinske ostatke i neke ostatke drugih aminokiselina kao što je alanin. U sledećem primeru izvođenja linker sadrži jedan glicinski ostatak.
[0054]U jednom primeru izvođenja polipeptid pronalaska je deo većeg fuzionog proteina. Fuzioni proteini mogu dalje sadržati aminokiseline koje kodiraju imunogeni deo dodatnog proteinskog antigena. Na primer fuzioni protein može dodatno sadržati imunogeni deo proteinskog antigena dobijen ili izveden iz bakterije izabrane iz grupe koja se sastoji od
S. pneumoniae, H. influenzae, N. meningitidis, E. coli, M. cattarhalis, C. tentani, C. diphtheriae,
B. pertussis, S. epidermidis,enterococci,S. aureus,iPseudomonas aeruginosa.U ovom slučaju linker može biti između prvog fragmenta ili drugog fragmenta i dodatnog imunogenog dela proteinskog antigena.
[0055]Termin "njegov imunogeni deo" ili 'imunogeni fragment' odnosi se na fragment polipeptida gde fragment sadrži epitop koji je prepoznat od strane citotksičnih T limfocita, helper T limfocita ili B ćelija. Pogodno, imunogeni deo će sadržati najmanje 30%, pogodno najmanje 50%, naročito najmanje 75% i naročito najmanje 90% (npr. 95% ili 98%) aminokiselina u referentnoj sekvenci. Imunogeni deo će pogodno sadržati sve regione epitopa referentne sekvence.
[0056]U jednom primeru izvođenja polipeptid sadrži imunogeni fragment iz SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:25 ili SEQ ID N027. U jednom primeru izvođenja polipeptidi sadrže imunogeni fragment od najmanje 500, 550, 600, 650, 700, 750, 780, 800, 830, 850, 880, 900, 920, ili 950 aminokiselina iz SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:25 ili SEQ ID N027. U sledećem primeru izvođenja polipeptid sadrži varijantu iz SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:25 ili SEQ ID N027, u sledećem primeru izvođenja polipeptid sadrži varijantu koja ima najmanje 80%>, 85%, 90%>, 92%, 95%, 98%, 99%, ili 100% identičnosti sekvence sa SEQ ID NO:3-SEQ ID NO:7.
[0057] U jednom primeru izvođenja polipetid sadrži više od 450, 475, 500, 525, 575, 600, 625, 650, 675, 700, 725, 750, 775, 800, 825 ili 850 aminokiselina iz toksina A. U jednom primeru izvođenja polipeptid sadrži manje od 850, 825, 800, 775, 750, 725, 700, 675, 650, 625, ili 600 aminokiselina iz toksina A. U jednom primeru izvođenja polipeptid sadrži više od 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500 ili 525 aminokiselina od toksina B. U jednom primeru izvođenja polipeptid sadrži manje od 525, 500, 475, ili 450 aminokiselina iz toksina B.
[0058]Termin 'identičnost' je poznat u tehnici, to je odnos između dve ili više polipetidnih sekvenci ili dve ili više polinukleotidnih sekvenci, kao što može biti slučaj, kao što je određeno poređenjem sekvenci. U tehnici, "identičnost" takođe označava stepen srodnosti sekvence između polipetidnih ili polinukleotidnih sekvenci, kao što može biti slučaj, kao što je određeno preko pokalapanja nizova takvih sekvenci. "Identičnost" se može lako izračunati poznatim postupcima, uključujući ali se ne ograničavajući na one opisane u (Computational Molecular Biologv, Lesk, A.M., ed., Oxford Universitv Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analvsis of Sequence Data, Part I, Griffin, A.M., and Griffin, H.G., eds., Humana Press, New Jersev, 1994; Sequence Analvsis in Molecular Biologv, von Heine, G., Academic Press, 1987; i Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991; i Carillo, H., and Lipman, D., SIAM J. Applied Math., 48: 1073 (1988). Postupci za određivanje identičnosti su dizajnirani da daju najveće poklapanje između testiranih sekvenci. Dodatno, postupci za određivanje identičnosti su kodirani u javno dostupnim kompjuterskim programima. Postupci kompjuterskih programa za određivanje identičnosti između dve sekvence uključuju, ali nisu ograničeni na, Needle program BLASTP, BLASTN (Altschul, S.F. et al., J. Molec. Biol. 215: 403-410 (1990), i FASTA( Pearson and Lipman Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85; 2444-2448 (1988). BLAST familija programa je javno dostupna od NCBI i drugih izvora (BLAST Manual, Altschul, S., et al, NCBI NLM NIH Bethesda, MD 20894; Altschul, S., et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410
(1990). Dobro poznati Smith Waterman algoritam se takođe može koristiti da se odredi identičnost.
[0059] Parametri za poređenje polipetidnih sekvenci uključuju sledeće:
Algoritam: Needleman and Wunsch, J. Mol Biol. 48: 443-453 (1970)
Matrica za poređenje: BLOSSUM62 od Henikoff and Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89:10915-10919(1992)
"Gap Penaltv": 10
"Gap extensionpenalty":0.5
Koristan program sa ovim parametrima je javno dostupan kao 'needle' program iz EMBOSS paketa (Rice P.et al, Trends in Genetics 2000 col.l6(6):276-277). Prethodno navedeni parametri su podrazumevani parametri za poređenje peptida (zajedno sa "no penalty" za "end gaps").
[0060] Da bi se odredila identičnost referentne sekvence sa SEQ ID NO:l, u jednom primeru izvođenja identičnost sekvence je izračunata duž cele referentne sekvence. U sledećem primeru izvođenja identičnost sekvence je izračunata duž cele sekvence u SEQ ID NO:l. Da bi se odredila identičnost referentne sekvence sa SEQ ID NO:2, u jednom primeru izvođenja identičnost sekvence je izračunata duž cele referentne sekvence. U sledećem primeru izvođenja identičnost sekvence je izračunata duž cele sekvence u SEQ ID NO:2.
[0061] Ovde je takođe opisan polipeptid koji sadrži (i) SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33 ili SEQ ID NO:34 ili SEQ ID NO:35, (ii) varijanta koja ima najmanje 80%, 85%, 88%, 90%, 92%, 95%, 98%, 99% ili 100% identičnosti sa SEQ ID NO: 10-19 ili (iii) fragment od najmanje 100, 200, 230, 250, 300, 350, 380, 400, 450, 480, 500, 530, 550, 580 ili 600 aminokiselina iz SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:ll, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33 ili SEQ ID NO:34 ili SEQ ID NO:35. U sledećem primeru izvođenja polipetid sadrži SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:ll, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33 ili SEQ ID NO:34 ili SEQ ID NO:35, ii) varijanta koja ima najmanje 80%, 85%, 88%, 90%, 92%, 95%, 98%, 99% ili 100% identičnosti sa SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO:ll, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33 ili SEQ ID NO:34 ili SEQ ID NO:35; ili (iii) fragment sa najmanje 100, 200, 230, 250, 300, 350, 380, 400, 450, 480, 500, 530, 550, 580 ili 600 aminokiselina iz SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:ll, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33 ili SEQ ID NO:34 ili SEQ ID NO:35. U sledećem primeru izvođenja polipeptid sadrži SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:ll, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ TD NO:28, SEQ TD NO:29, SEQ TD NO:30, SEQ TD NO:31, SEQ TD NO:32, SEQ TD NO:33 ili SEQ ID NO:34 ili SEQ ID NO:35, ii) varijanta koja ima najmanje 80%, 85%, 88%, 90%, 92%, 95%, 98%, 99% ili 100% identičnosti sa SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:l 1, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33 ili SEQ ID NO:34 ili SEQ ID NO:35; ili (iii) fragment sa najmanje 100, 200, 230, 250, 300, 350, 380, 400, 450, 480, 500, 530, 550, 580 ili 600 aminokiselina iz SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:ll, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33 ili SEQ ID NO:34 ili SEQ ID NO:35.
[0062]U jednom primeru izvođenja polipeptid sadrži više od 450, 475, 500, 525, 575, 600, 625, 650, 675, 700, 725, 750, 775, 800, 825 ili 850 aminokiselina iz toksina A. U jednom primeru izvođenja polipeptid sadrži manje od 850, 825, 800, 775, 750, 725, 700, 675, 650, 625, ili 600 aminokiselina iz toksina A. U jednom primeru izvođenja polipeptid sadrži više od 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500 ili 525 aminokiselina iz toksina B. U jednom primeru izvođenja polipeptid sadrži manje od 525, 500, 475, ili 450 aminokiselina iz toksina B.
[0063] U sledećem primeru izvođenja polipeptid izaziva neutrališuća antitela koja neutrališu toksin A ili toksin B ili oba. U sledećem primeru izvođenja polipeptid izaziva antitela koja neutrališu toksin A. U sledećem primeru izvođenja polipetid izaziva antitela koja neutrališu toksin B. U sledećem primeru izvođenja polipeptid izaziva antitela koja neutrališu toksin A i toksin B. Polipeptid pronalaska izaziva antitela koja neutrališu toksin A ukoliko serumi protiv polipeptida daju ELISA očitavanja veća od 10%, 20%, 30%, 50%, 70%, 80%, 90% ili 100% viših od referentnog uzorka.
[0064] U sledećem primeru izvođenja polipeptid pronalaska izaziva zaštitini imuni odgovor kod sisara domaćina protiv sojevaC. difficile.U jednom primeru izvođenja sisar domaćin je izabran iz grupe koja se sastoji od miša, zeca, zamorčeta, majmuna, ne-humanog primata i čoveka. U jednom primeru izvođenja sisar domaćin je miš. U sledećem primeru izvođenja sisar domaćin je čovek.
[0065] Da li polipeptid izaziva zaštitni imuni odgovor kod sisara domaćina protiv sojeva C.difficilemože se odrediti testom imunizacije. U takvom testu sisar domaćin je vakcinisan sa polipeptidom i imunizovan izlaganjemC. difficile,vreme koje sisar preživi nakon imunizacije se poredi sa vremenom u kojem preživljava referentni sisar koji nije bio imunizovan sa polipeptidom. Polipeptid izaziva zaštitni imuni odgovor ukoliko sisar imunizovan sa polipeptidom preživljava najmanje 10%, 20%, 30%, 50%, 70%, 80%, 90%, ili 100% duže od referentnog sisara koji nije bio imunizovan nakon izlaganjaC. difficile.U jednom primeru izvođenja polipeptid pronalaska izaziva zaštitni imuni odgovor protiv sojevaC. difficilekod sisara izabranog iz grupe koja se sastoji od miša, zamorčeta, majmuna i čoveka. U jednom primeru izvođenja sisar je miš, u sledećem primeru izvođenja sisar je čovek.
[0066] Nativna struktura C-terminalnih (ponavljajućih) domena iz toksina A i B sastoji se od produženom p solenoidu slične strukture. Ova struktura se primarno sastoji od P nabranih ploča, uz minorni deo a heliksa kao što je uočeno u Ho et al (PNAS 102:18373-18378
(2005)). Prisutne sekundarne strukture mogu se odrediti korišćenjem cirkularnog dihroizma. Na primer merenjem oblika i veličine CD spektra u dalekom-UV regionu (190-250nm) i poređenjem rezultata sa onima kod poznatih struktura. Ovo se može izvesti korišćenjem optičkog puta od 0.0lem od 178 do 250nm, sa lnm rezolucijom i protokom na Jasco J-720 spektropolarimetrom, na primer kao što je uočeno u primeru 5 u nastavku.
[0067]U jednom primeru izvođenja polipeptid sadrži manje od 25%, 23%, 20%>, 28%>, 15%>, 10%o, ili 7%> alfa heliks sekundarne strukture. U sledećem primeru izvođenja polipeptid sadrži više od 20%, 25%, 28%, 30%, 33%, 35%, 38%, 40%, ili 42% strukture beta nabrane ploče.
POLINUKLEOTIDI
[0068]Pronalazak dalje obezbeđuje polinukleotid koji kodira polipeptid pronalaska. Za svrhe pronalaska termin 'polinukleotid(i)' generalno se odnosi na bilo koji poliribonukleotid ili polideoksiribonukleotid, koji može biti nemodifikovana RNK ili DNK ili modifikovana RNK ili DNK uključujući jednolančane ili dvolančane regione/oblike.
[0069]Termin "polinukleotid koji kodira peptid" kao što je ovde korišćeno obuhvata polinukleotide koji uključuju sekvencu koja kodira peptid ili polipeptid pronalaska. Termin takođe obuhvata polinukleotide koji uključuju jedan kontinuirani region ili diskontinuirane regione koji kodiraju peptid ili polipeptid (na primer, polinukleotidi prekinuti sa integrisanim fagom, integrisanom umetnutom sekvencom, integrisanom vektor sekvencom, integrisanom transpozon sekvencom, ili usled RNK uređivanja ili reorganizacije genomske DNK) zajedno sa dodatnim regionima, koji takođe mogu sadržati kodirajuće i/ili nekodirajuće sekvence.
[0070]Stručnjaku će biti jasno da, kao rezultat degenerisanosti genetskog koda, postoje mnoge nukleotidne sekvence koje kodiraju polipeptid kao što je ovde opisano. Neki od ovih polinukleotida imaju minimalnu sličnost sa nukleotidnom sekvencom bilo kognativnog(tj. onog koji se javlja u prirodi) gena. Pored toga, polinukleotidi kojivarirajuusled razlika u korišćenju kodona su specifično predviđeni ovim pronalaskom, na primer polinukleotidi koji su optimizovani za selekciju humanih i/ili primata i/iliE. colikodona.
[0071]Sekvence koje kodriaju željeni polipeptid mogu se sintetisati, u celini ili delimično, korišćenjem hemijskih postupaka dobro poznatih u tehnici( viđetiCaruthers, M. H. et al, Nucl. Acids Res. Symp. Ser. pp. 215-223 (1980), Horn et al., Nucl. Acids Res. Symp. Ser. pp. 225-232 (1980)). Alternativno, sam protein se može proizvesti korišćenjem hemijskih postupaka da bi se sintetisala aminokiselinska sekvenca polipeptida, ili njen deo. Na primer, sinteza peptida se može izvesti korišćenjem različitih tehnika čvrste faze (Roberge et al., Science 269:202-204 (1995)) i automatizovana sinteza se može postići, na primer, korišćenjem ASI 431 A Peptide Svnthesizer (Perkin Elmer, Palo Alto, CA).
[0072]Dodadtno, polinukleotidne sekvence ovog pronalaska mogu se dobiti postupcima inženjeringa generalno poznatim u tehnici da bi se izmenile sekvence koje kodiraju polipeptide iz različitih razloga, uključujući, ali se ne ograničavajući na, izmene koje modifikuju kloniranje, obradu, i/ili ekspresiju genskog proizvoda. Na primer, DNK mešanje slučajnom fragmentacijom i ponovno sastavljanje genskih fragmenata sa PCR i sintetički oligonukleotidi mogu se koristiti za inženjering nukleotidnih sekvenci. Dodatno, mutageneza usmerena na mesto može se koristiti da bi se ubacila nova restrikciona mesta, izmenili obrasci glikozilacije, izmenila preferenca kodona, proizvele spjals varijante, ili uvele mutacije, i tako dalje.
VEKTORI
[0073]U sledećem aspektu pronalaska ovaj pronalazak se odnosi na vektor koji sadrži polinukleotid pronalaska povezan sa inducibilnim promotorom tako da kada je promotor imdukovan eksprimira se polipeptid kodiran polinukleotidom.
[0074]Dodatni aspekt pronalaska sadrži pomenuti vektor gde je inducibilni promotor aktiviran dodavanjem dovoljne količine IPTG (Izopropil P-D-l-tiogalaktopiranozida) poželjno u medijum za rast. Izborno ovo je na koncentraciji od između 0.1 i lOmM, 0.1 i 5mM, 0.1 i 2.5mM, 0.2 i lOmM, 0.2 i 5mM, 0.2 i 2.5mM, 0.4 i lOmM, 1 i lOmM, 1 i 5mM, 2.5 i lOmM, 2.5 i 5mM, 5 i lOmM. Alternativno promotor može biti indukovan pramenom temperature ili pH.
ĆELIJE DOMAĆINI
[0075]Za rekombinantnu proizvodnju polipeptida pronalaska, ćelije domaćini mogu biti stvoreni genetskim inženjeringom da bi inkorporisali ekspresione sisteme ili njihove delove ili polinukleotide pronalaska. Uvođenje polinukleotida u ćeliju domaćina može se izvesti postupcima opisanim u mnogim standardnim laboratorijskim priručnicima, kao što su Daviš, et al., BASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, (1986) i Sambrook, et al, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratorv Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989), kao što je, transfekcija sa kalcijum fosfatom, DEAE-dekstran posredovana transfekcija, trasvekcija, mikroinjekcija, katjonski lipid-posredovana transfekcija, elektroporacija, konjugacija, transdukcija, uvođenje struganjem, balistička introdukcija i infekcija.
[0076]Reprezentativni primeri odgovarajućih domaćina uključuju gram negativne bakterijske ćelije, kao što su ćelije,E. coli,Acinetobacter, Actinobacillus, Bordetella, Brucella, Campvlobacter, Cvanobacteria, Enterobacter, Envinia, Franciscella, Helicobacter, hemophilus, Klebsiella, Legionella, Moraxella, Neisseria, Pasteurella, Proteus, Pseudomonas, Salmonella, Serratia, Shigella, Treponema, Vibrio, Yersinia. U jednom primeru izvođenja ćelija domaćin je ćelija Escherichia coli. Alternativno se takođe mogu koristiti gram pozitivne bakterijske ćelije. Veoma različiti ekspresioni sistemi se mogu koristiti da proizvedu polipeptide pronalaska. U jednom primeru izvođenja vektor je izveden iz bakterijskih plazmida. Generalno bilo koji sistem ili vektor pogodan da održi, propagira ili eksprimira polinukleotide i/ili da eksprimira polipeptid u domaćinu može se koristiti za ekspresiju u tom smislu. Odgovarajuća DNK sekvenca može se ubaciti u ekspresioni sistem bilo kojim od različitih dobro poznatih i rutinskih tehnika, kao što su, na primer, one date u Sambrook et al.,
MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL, (supra).
IMUNOGENE KOMPOZICIJE IVAKCINE
[0077]Dodatno je obezbeđena imunogena kompozicija koja sadrži polipeptid pronalaska i farmaceutski prihvatljiv ekscipijent.
[0078]U jednom primeru izvođenja imunogena kompozicija dalje sadrži ađuvant. Izbor pogodnog ađuvanta koji će se pomešati sa bakterijskim toksinima ili konjugatima stvorenim upotrebom procesa pronalaska je unutar znanja stručnjaka. Pogodni ađuvanti uključuju so aluminijuma kao aluminijum hidroksid gel ili aluminijum fosfat ili stipsa, ali takođe mogu biti soli drugih metala kao što su one kalcijuma, magnezijuma, gvožđa ili cinka, ili mogu biti nerastvorljive suspenzije acilovanog tirozina, ili acilovanih šećera, katjonski ili anjonski derivatizovanih saharida, ili polifosfazeni.
[0079]U jednom primeru izvođenja imunogena kompozicija dalje sadrži dodatne antigene. U jednom primeru izvođenja dodatni antigeni su antigeni izvedeni iz bakterije izabrane iz grupe koja se sastoji od S.pneumoniae, H.influenzae, N.meningitidis, E.coli, M.cattarhalis, tetanus, diphtheria, pertussis, S.epidermidis, enterococci, S.aureus, i Pseudomonas aeruginosa. U sledećem primeru izvođenja imunogena kompozicija pronalaska može sadržati dodatne antigene iz C.difficilena primer proteine S-sloja (WO01/73030).
[0080]Dodatno je obezbeđena vakcina koja sadrži imunogenu kompoziciju, ova vakcina može dalje sadržati farmaceutski prihvatljiv ekscipijent.
[0081]Pripreme vakcine koja sadrži imunogenu kompoziciju ovog pronalaska mogu se koristiti da se zaštiti sisar osetljiv na infekciju sa C.difficileili da se tretira sisar saC. difficileinfekcijom, putem primene pomenute vakcine preko sistemskog ili mukoznog puta. Ove primene mogu uključiti injekciju preko intramuskularnog, intraperitonealnog, intradermalnog ili potkožnog puta; ili preko mukozne primene u oralni/alimentarni, respiratorni, urogenitalni trakt. Iako vakcina pronalaska može biti primenjena kao jedna doza, njene komponente takođe mogu biti ko-primenjene zajedno u isto vreme ili u različita vremena (na primer konjugati saharida pneumokoka mogu se primeniti zasebno, u isto vreme ili 1-2 nedelje nakon primene bilo koje komponente bakterijskog proteina vakcine za koordinaciju imunih odgovora jednog u odnosu na drugi). Dodatno jednom putu primene, mogu se koristiti 2 različita puta primene. Na primer, saharidi ili konjugati saharida mogu se primeniti intramuskularno (IM) ili intradermalno (ID) i bakterijski proteini mogu se primeniti intranazalno (IN) ili intradermalno (ID). Dodatno, vakcine pronalaska mogu se primeniti IM za prajming doze i IN za buster doze.
[0082]Sadržaj toksina u vakcini će tipično biti u opsegu l-250ug, poželjno 5-50|ug, najtipičnije u opsegu 5 - 25|ug. Nakon inicijalne vakcinacije, subjekti mogu primiti jednu ili nekoliko buster imunizacija u odgovarajućem razmaku. Priprema vakcine je generalno opisana u Vaccine Design ("The subunit and adjuvant approach" (eds Powell M.F. & Newman M.J.) (1995) Plenum Press New York). Inkapsulacija unutar lipozoma je opisana od strane Fullerton, US Patent 4,235,877.
[0083]Jedna primena pronalaska je komplet vakcine, koji sadrži vijalicu koja sadrži imunogenu kompoziciju pronalaska, izborno u liofilizovanom obliku, i dodatno sadrži vijalicu koja sadrži ađuvant kao što je ovde opisano. Predviđeno je da će u ovom aspektu pronalaska, ađuvant biti korišćen da se rekonstituiše liofilizovana imunogena kompozicija.
[0084]Sledeća primena pronalaska je postupak za prevenciju ili tretman infekcije sa C.difficilekoji sadrži primenu na domaćina imunoprotektivne doze imunogene kompozicije ili vakcine ili kompleta pronalaska. U jednom primeru izvođenja obezbeđen je postupak za prevenciju ili tretiranje primarnih i/ili rekurentnih epizoda infekcije saC. difficilekoji sadrži primenu na domaćina imunoprotektivne doze imunogene kompozicije ili vakcine ili kompleta pronalaska.
[0085]Aspekt pronalaska je imunogena kompozicija ili vakcina pronalaska za upotrebu u tretmanu ili prevenciji bolesti izazvane saC. difficile.U jednom primeru izvođenja obezbeđena je imunogena kompozicija pronalaska za upotrebu u tretmanu ili prevenciji primarnih i/ili rekurentnih epizoda bolesti izazvane sa C.difficile.
[0086]Dodatna primena pronalaska je upotreba imunogene kompozicije ili vakcine ili kompleta pronalaska u proizvodnji medikamenta za tretman ili prevenciju bolesti izvane sa C.difficile.U jednom primeru izvođenja obezbeđena je imunogena kompozicija pronalaska za upotrebu u proizvodnji medikamenta za tretman ili prevenciju primarnih i/ili rekurentnih epizoda bolestiC. difficile.
[0087]"Oko" ili "približno" su definisani kao unutar 10% manje ili više od datog broja za svrhe ovog pronalaska.
[0088]Namera pronalazača je da ovde termini "sadrži" i "koji sadrži" budu izborno zamenjivi sa terminima "sastoji se od" i "sastoji se", respektivno, u svakom slučaju. Termin "sadrži" označava "uključuje." Stoga, ukoliko kontekst ne zahteva drugačije, biće jasno da reč "sadrži," i varijacije kao što je "koji sadrži" podrazumavaju uključivanje navedenog jedinjenja ili kompozicije (npr., nukleinske kiseline, polipeptida, antigena) ili koraka, ili grupe jedinjenj a ili koraka, ali ne do isključivanja bilo kojih drugih jedinjenja, kompozicija, koraka, ili njihovih grupa. Skraćenica, "npr. (e.g.)" je izvedena iz latinskog exempli gratia, i ovde je korišćena da označi neograničavajući primer. Stoga, skraćenica "npr. e.g." je sinonim sa terminom "na primer."
[0089]Ovde dati primeri izvođenja koji se odnose na "kompozicije vakcina" pronalaska takođe su primenjivi na primere izvođenja koji se odnose na "imunogene kompozicije" pronalaska, i obrnuto.
[0090]Ukoliko nije drugačije objašnjeno, svi tehnički i naučni termini koji su ovde korišćeni imaju ista značenja uobičajena za stručnjaka u oblasti tehnike kojoj ovaj opis pripada. Definicije uobičajenih termina u molekularnoj biologiji mogu se naći u Benjamin Lewin, Genes V, objavljeno od strane Oxford University Press, 1994 (ISBN 0-19-854287-9); Kendrew et al. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, published by Blackwell Science Ltd., 1994 (ISBN 0-632-02182-9); i Robert A. Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, objavljen od strane VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8).
[0091]Termini u jednini uključuju referentne množine osim ukoliko kontekst jasno ne ukazuje drugačije. Slično tome, namera je da reč "naš" uključuje "i" osim ukoliko kontekst jasno ne ukazuje drugačije. Termin "množina" odnosi se na dva ili više. Dodatno se podrazumeva da sve veličine baza ili veličine aminokiselina, i sve molekulske težine ili vrednosti molekulske mase, date za nukleinske kiseline ili polipeptide su približne, i obezbeđene su zbog opisa. Dodatno, numerička ograničenja data u odnosu na koncentracije ili nivoe supstance, kao što je antigen, mogu biti približne.
[0092]Sve reference ili patentne prijave citirane unutar ove patentne specifikacije su uključene ovde na osnovu reference u svojoj celini.
[0093]Da bi se ovaj pronalazak bolje razumeo, dati su sledeći primeri. Ovi primeri su dati samo kao ilustracija, i ne treba ih smatrati kao ograničavajuće za obim pronalaska na bilo koj način.
PRIMERI
Primer1:Dizajniranje petC . difificileToxA- ToxB fuzija
[0094]Dizajnirani su fuzioni proteini koji sadrže fragmente C-terminalnih ponavljajućih domena ToxA i ToxB. Ove fuzije su sadržale fragment C-terminalnog ponavljajućeg domena ToxA i fragment C-terminalnog ponavljajućeg domena ToxB, i spoj između C-terminalnog kraja ToxA fragmenta i N terminalnog kraja ToxB fragmenta. Razvijene su dve strategije, u prvoj strategiji; fuzija je dizajnirana tako da je održana duga solenoidna struktura na spoju između dva fragmenta. U drugoj strategiji, dva fragmenta fuzije su razdvojena linkerom da bi se omogućilo njihovo nezavisno korektno savijanje.
[0095]C-terminalni deo ToxA i B je sastavljen od ponavljajućih sekvenci: kratkih ponovaka (SR) i dugih ponovaka (LR) (PNAS 2005 vol 102 : 18373-18378).
[0096]Delimična poznata 3D struktura za C-terminalni domen ToxA (PNAS 2005 Greco et al., vol 102 : 18373-18378 ; Nature Structural & Molecular biology 2006 vol 13(5): 460-461; PDB codes : 2F6E, 2G7C and 2QJ6).
[0097]Pronalazači su predvideli da postoje dve vrste važnih interakcija između ostataka C-terminalnog dela ToxA i ToxB. Prva interakcija se odigrava između ostataka koje se nalaze u LR i njihovim prethodnim SR i važno je održati strukturu sličnu solenoidu. Drugi tip interakcije odigrava se između ostataka koji se nalaze u LR i narednim SR i ova reakcija posreduje ugljenohidratnu vezujuću funkciju toksina.
[0098]Definisan je novi "strukturno-funkcionalani" ponovak SR-LR-SR. Struktura ovog ponovka je održavana intaktnom u našim dizjaniranim fuzijama.
[0099]Slika 2 predstavlja C-terminalne domene ToxA i ToxB i definisana "SR-LR-SR" polja.
[0100]Pozicije kratkih (SR) i dugačkih ponovaka (LR) ToxA i ToxB ponovaka predstavljene su u tabeli 1.
[0101]Spisak "SR-LR-SR" polja sadržanih u C-terminalnom domenu ToxA i ToxB je predstavljen u Tabeli 2.
[0102]Konačno, broj SRs između dva LRs biće održavan u dizajniranim fuzijama da bi se održala dugačka struktura u obliku solenoida.
[0103]Pre dizajna spojeva za fuzije, definisane su dve radne hipoteze: prva hipoteza, što su fuzije kraće, veća je verovatnoća da fuzije budi stabilno prekomerno eksprimirane; druga hipoteza, prema konceptu "SR-LR-SR" polja, početna pozicija se mora izabrati da bi se obezbedilo korektno savijanje prvog SR ovog prethodno definisanog SR-LR-SR polja. Stoga fuzije počinju na početku SR koji prethodi SR-LR-SR polju. Korišćenjem ove dve hipoteze, analizirane su tri početne pozicije: ostaci 2370, 2234 i 2121 ToxA.
[0104]Početna pozicija 2370 je isključena. Početna pozicija 2234 je takođe isključena jer je jedan od ostataka uključen u interakcije važne za strukturnu stabilnost proteina nije konzervativan. Na taj način, odlučeno je da sve dizajnirane fuzije počinju na ostatku 2121 ToxA.
[0105]Sve fuzije će se završiti na poslednjem ostatku ToxB.
[0106]Četiri fuzije (Fl-4) dizajnirane su da bi se održala cela fuzija u dugačkoj solenoidnu sličnoj strukturi između dva fuziona fragmenta.
[01071Fuzije 1 (Fl) i 2 (F2) su dizajnirane korišćenjem iste hipoteze. Sve SR proteinske sekvence ToxA i ToxB poređene su korišćenjem programa za višestruko poravnanje (ClustalW - Thompson JD et al. (1994) Nucleic Acids Res., 22, 4673-4680). Sličnije sekvence
su bile treća SR VIII ToxA i treća SR II ToxB i treća SR III ToxB. Da bi se napravio izbor između ova dva SR ToxB, izvedeno je modelovanje strukturne homologije (korišćenjem SwissModel interface - Arnold K et al. (2006) Bioinformatics, 22, 195-201) na C-terminalnom kraju ToxB korišćenjem poznate 3D strukture delimičnog ToxA C-terminalnog domena (PDB code : 2QJ6). Korišćenjem trećeg SR VIII of ToxA, najbolje lokalno strukturno poklapanje (izvedeno korišćenjem SwissPDBViewer - Guex N et al. (1997), Electrophoresis 18, 2714-2723) dobijeno je sa trećim SR II ToxB. Stoga, dva spoja su dizajnirana: prvi je između trećeg SR VI ToxA i četvrtog SR II ToxB (Fl) i drugi je između drugog SR VIII ToxA i trećeg SR II ToxB (F2). Ovi spojevi su predstavljeni na slici 3 i 4 respektivno.
[0108] Da bi se dizajnirala fuzija 3 (F3), globalno strukturno poklapanje je izvedeno između poznate strukture delimičnog C-terminalnog domena ToxA i predviđene strukture C-terminalnog domena ToxB (korišćenjem SwissModel i SwissPDBViewer programa). Najbolje poklapanje je pronađeno između LR VII ToxA i LR II ToxB. Stoga, odlučeno je da se napravi spoj u ovom sličnom LR. Spoj je izveden prvo u regionu gde je sekvenca konzervisana između ToxA i ToxB, nakon toga da bi se da bi se održao unutra ToxA deo fuzije, ostaci u interakciji sa prethodnim SR i na kraju, da bi se održao unutra ToxB deo, ostaci u interakciji sa narednim SR. Ovaj spoj je prikazan na slici 5.
[0109] Za dizajniranje fuzije 4 (F4), C-terminalni domen ToxB je podeljen na 4 fragmenta i na njima je izvedeno preciznije modelovanje homologije (SwissModel). Podela je izvršena da bi se održala intaktnim "SR-LRSR" polja (svaki domen završava se na kraju SR koji sledi LR). Urađeno je strukturno poklapanje između predviđenih struktura ovih fragmenata i poznate strukture 3D strukture i najbolje strukturno poklapanje je dobijeno za treći SR ToxB (SR I) i poslednji SR ToxA (treći SR VIII). Stoga, spoj je urađen između drugog SR VIII ToxA i trećeg SRI ToxB. Ovaj dizajn je predstavljen na slici 6.
[0110] Poslednja fuzija (F5) je dizajnirana da bi se omogućilo nezavisno korektno savijanje dva fragmenta fuzije. Linker je dodat između poslednjeg ostatka ToxA proteinske sekvence i početka četvrtog SR II ToxB (uvek uzimajući u obzir važnost intaktnog "SR-LR-SR" polja). Samo jedan egzogeni ostatak (Glicin) je dodat kao linker i lociran između dva postojeća Glicina. Stoga, linker se takođe može opisati kao sastavljen od 3 Glicina okružena sa poznatim (za ToxA) i predviđenim (za ToxB) beta-lancem. Ovaj poseldnji dizajn je prikazan na slici 7.
Primer 2: Ekspresija klonova i prečišćavanje fuzionih proteina
Ekspresioni plazmid i rekombinantni soj
[0111]Geni koji kodiraju fuzione proteine delimičnih C-terminalnih domena ToxA i ToxB (SEQ ID NO:3, 4, 5, 6 i 7) i His tag klonirani su u pET24b(+) ekspresioni vektor (Novagen) korišćenjem NdeI/XhoI restrikcionih mesta korišćenjem standardnih procedura. Finalni konstrukt je generisan transformacijomE. colisoja BLR (DE3) sa rekombinantnim ekspresionim vektorom prema standardnom postupku sa CaCh-tretiranim ćelijama (Hanahan D. « Plasmid transformation by Simanis. » In Glover, D. M. (Ed), DNA cloning. IRL Press London. (1985): p. 109-135.).
Soj domaćina:
[0112]BLR(DE3). BLR je recA derivat BL21. Sojevi označeni (DE3) su lizogeni za A profag koji sadrži IPTG inducibilnu T7 RNK polimerazu. DE3 lizogeni su dizajnirani za proteinsku ekspresiju iz pET vektora. Ovaj soj je takođe deficijentan u odnosu naToniompT proteaze.Genotip:E. coliBLR::DE3 soj, F-ompT hsdSB{ rB-mB-)gol dcm ( DE3)A(srl-recA)3O6::Tn70(TetR)
Ekspresija rekombinantnih proteina:
[0113]E. colitransformant je skinut sa agarne ploče i korišćeni za inokulaciju 200 ml LBT buljona ± 1% (w/v) glukoza + kanamicin (50 ug/ml) da bi se dobila O.D.600nm između 0.1 - 0.2. Kulture su inkubirane preko noći na 37 °C, 250 RPM.
[0114]Ova prekonoćna kultura je razblažena do 1:20 u 500 ml LBT medijuma koji sadrži kanamicin (50 ug/ml) i uzgajana na 37°C na brzini mešanja od 250 rpm dok je O.D.620 dostigla 0.5/0.6.
[0115]Na O.D.600nm oko 0.6, kultura je ohlađena pre indukcije ekspresije rekombinantnog proteina dodavanjem 1 mM izopropil |3-D-l-tiogalaktopiranozida (IPTG; EMD Chemicals Inc., kataloški broj: 5815) i inkubirani preko noći na 23 °C, 250 RPM.
[0116]Nakon indukcije preko noći (oko 16 časova), O.D.600nm je procenjena nakon indukcije i kultura je centrifugirana na 14 000 RPM 15 minuta i talog je zamrznut na -20°C zasebno.
Prečišćavanje:
[0117]Bakterijski talog je resuspendovan u 20 mM bicin puferu (pH 8.0) koji sadrži 500 mM NaCl i smešu inhibitora proteaze (Complete, Roche). Bakterije su lizirane korišćenjem French Press svstem 20 000 PSI. Rastvorljive (supernatant) i nerastvorljive (talog) komponente su razdvojene centrifugiranjem na primer na 20 OOOg 30 min na 4°C.
[0118]6-His tagovani-protein je prečišćen pod nativnim uslovima na IMAC. Rastvorljive komponente su napunjene na GE kolonu (na primer 15 ml) (Ni napunjena) pre-ekvilibrisana sa istim puferom korišćenim za bakterijsku resuspenziju. Nakon punjenja na kolonu, kolona je isprana sa istim puferom. Eluiranje je izvedeno korišćenjem 20mM bicin pufera (pH 8.0) koji sadrži 500 mM NaCl i različite koncentracije imidazola (5-600 mM). Nakon analize gela, čistije frakcije su izabrane, koncentrovane i napunjene za SEC hromatografiju za dalji korak prečišćavanja.
[0119]Frakcije koje sadrže fuzione proteine su izabrane na osnovu čistoće sa SDS-PAGE i dijalizirane sa bicin puferom (20mM Bicine, 150 mM NaCl, sa ili bez 5mM EDTA pH8.0), Koncentracija proteina je određena korišćenjem DC Protein Assay od BioRad. Proteini su time pulovani, sterilno-filtrirani na 0.22 um, uskladišteni na -80°C.
[0120]Alternativno, IMAC prečišćavanju je prethodio korak DEAE prečišćavanja korišćenjem 2mM bicin pufera (pH 8.0) za punjenje i ispiranje, i eluirano korišćenjem gradijenta sa istim puferom ali sa dodatkom 1 M NaCl.
Primer 3-Ekspresija klonova i prečišćavanje zasebnihC . difficileToxAi Tox B
fragmenata
Ekspresioni plazmid i rekombinatni soj.
[0121]Geni koji kodiraju proteinske fragmente ToxA i ToxB (SEQ ID NO:8 i SEQ ID NO:9) i His tag klonirani su u pET24b(+) ekspresioni vektor (Novagen) korišćenjem NdeI/XhoI restirkcionih mesta korišćenjem standardnih procedura. Finalni konstrukt je stvoren transformacijomE. colisoja BLR (DE3) sa rekombinantnim ekspresionim vektorom prema standardnom postupku sa CaCh-tretiranim ćelijama (Hanahan D. « Plasmid transformation by Simanis. » In Glover, D. M. (Ed), DNA cloning. IRL Press London. (1985): p. 109-135.).
Soj domaćina:
[0122]BLR(DE3). BLR je recA derivat BL21. Sojevi označeni (DE3) su lizogeni za A profag koji sadrži IPTG inducibilnu T7 RNK polimerazu. DE3 lizogeni su dizajnirani za ekspresiju proteina iz pET vektora. Ovaj soj je takođe deficijentan u odnosu naIoniomprproteaze.Genotip :E. coliBLR::DE3 soj, F-ompT hsdSB( xB-mB-)gal dcm ( DE3)A(srl-recA)306::TniO(TetR)
Ekspresija rekombinantnih proteina:
[0123]E. colitransformant je skinut sa agarne ploče i iskorišćen za inokulaciju 200 ml LBT buljona ± 1% (w/v) glukoza + kanamicin (50 ug/ml) da bi se dobila O.D.600nm između 0.1 - 0.2. Kulture su inkubirane preko noći na 37 °C, 250 RPM.
[0124]Ova prekonoćna kultura je razblažena do 1:20 u 500 ml LBT medijuma koji sadrži kanamicin (50 |xg/ml) i uzgajane na 37°C sa brzinom mešanja od 250 rpm dok je O.D.620 dostigla 0.5/0.6.
[0125]Na O.D. na 600nm od oko 0.6, kultura je ohlađena pre indukcije ekspresije rekombinantnog proteina dodavanjem 1 mM izopropil P-D-l-tiogalaktopiranozid (IPTG; EMD Chemicals Inc., kataloški broj: 5815) i inkubirana preko noći na 23 °C, 250 RPM.
[0126]Nakon indukcije preko noći (oko 16 časova), O.D. na 600nm je procenjena nakon indukcije i kultura je centrifugirana na 14 000 RPM 15 minuta i talog je zamrznut na -20°C zasebno.
Prečišćavanje:
[0127]Bakterijski talog je resuspendovan u 20 mM bicin pufera (pH 8.0) koij sadrži 500 mM NaCl sa dodatkom smeše inhibitora proteaze (Kompletan bez EDTA, Roche cat 11873580001) i benzonaze. (Roche cat 1.01695.0001). Bakterije su lizirane korišćenjem French Press svstem 2 X 20 000 PSI. Rastvorljive (supernatant) i nerastvorljive (talog) komponente su razdvojene centrifugiranjem na 34 OOOg ili 48 OOOg 25-30 min na 4°C. Supernatant je sakupljen i filtriran na 0.22 um filteru.
[0128]6-His tagovani-protein je prečišćen pod nativnim uslovima na IMAC. Rastvorljive komponente su napunjene na GE kolonu (na primer 15ml) (Ni napunjena) pre-ekvilibrisane sa istim puferom korišćenim za bakterijsku resuspenziju. Nakon punjenja, kolona je isprana sa istim puferom.
Za ToxA:
[0129JEluiranje je izvedeno korišćenjem 20mM bicin pufera (pH 8.0) koji sadrži 500 mM NaCl i različite koncentracije imidazola (5-100 mM). Nakon analize gela, izabrane su čistije frakcije, koncentrovane i napunjene za SEC hromatografiju (SUPERDEX™ 75) za dalji korak prečišćavanja u istom puferu bez imidazola.
Za ToxB:
[0130]Drugo ispiranje je izvedeno sa 20mM bicin puferom (pH 8.0) koji sadrži 500 mM NaCl i 0.5 % deoksiholat ili isti pufer sa 150 mM NaCl. Eluiranje je izvedeno korišćenjem 20mM bicin pufera (pH 8.0) koji sadrži 500 mM NaCl i različite koncenttracije imidazola (10-500 mM). Nakon analize gela, izabrane su čistije frakcije, sa dodatkom 5 mM EDTA i napunjene za SEC hromatografiju (SUPERDEX™ 200) za dalji korak prečišćavanja u istom puferu sa 5 mM EDTA.
[0131]Frakcije koje sadrže ToxA ili ToxB fragmente su izabrane na osnovu čistoće sa SDS-PAGE i dijalizirane sa bicin puferom (20mM Bicin, 150 mM NaCl, pH8.0), koncentracija proteina je određena korišćenjem RCDC Protein Assay od BioRad. Proteini su time pulovani, sterilno-filterirani na 0.22 um, uskladišteni na -80°C.
Primer4 -Procena molekulske težine petC . difificileToxA- ToxB fuzija
[0132]Analitičko ultracentrifugiranje je korišćeno da bi se odredila homogenost i distribucija veličine čestica u rastvoru različitih vrsta unutar proteinskog uzorka merenjem stope kojom se molekuli kreću u odnosu na centrifugalnu silu. Ovo je zasnovano na izračunavanju koeficijenata sedimentacije različitih vrsta koje su dobijene eksperimentom sa brzinom sedimentacije, koji zavisi od njihovog molekulskog oblika i mase. 1. Proteinski uzorci su centrifugirani u Beckman-Coulter PROTEOMELAB™ XL-1 anallitičkoj ultracentrifugi na 42 000RPM nakon što je AN-60Ti rotor ekvilibrisan na 15°C.
a. Fl fuzioni protein, 500ug/ml, 20mM Bicin, 150mM NaCl, pH8,0
b. F2 fuzioni protein, 500|ug/ml, 20mM Bicin, 150mM NaCl, pH8,0
c. F3 fuzioni protein, 500ug/ml, 20mM Bicin, 150mM NaCl, pH8,0
d. F4 fuzioni protein, 500|ng/ml, 20mM Bicin, 150mM NaCl, pH8,0
e. F5 fuzioni protein, 500iig/ml, 20mM Bicin, 150mM NaCl, pH8,0
2. Za sakupljanje podataka, 160 skenova je snimljeno na 280nm svakih 5 minuta.
3. Analiza podataka je izvedena korišćenjem programa SEDFIT za određivanje C(S) distribucije. Određivanje parcijalne specifične zapremine proteina izvedeno je sa SEDNTERP programom iz njihove aminokiselinske sekvence. SEDNTERP je takođe korišćen da bi se odredila viskoznost i gustina pufera. 4. Molekulska težina različitih vrsta je određena iz grafika C(S) distribucije (koncentracija vs koeficijent sedimentacije), smatrajući da bolje predstavlja sirove podatke od C(M) distribucije (koncentracija vs molekulska težina) da bi se okarakterisala distribucija veličine čestica smeše.
[0133] Slika 8 opisuje distribuciju ToxA-ToxB fuzija kao što su određene analitičkim ultracentrifugiranjem brzine sedimentacije.
[0134] Molekulska težina glavnih vrsta detektovanih iz C(S) distribucije svih ToxA-ToxB fuzionih proteina odgovara njihovim monomernom obliku. Najbolje fitovani frikcioni odnosi određeni za pet fuzija su svi između 2 i 2,2. Ovo može ukazati na to da su proteini prisutni u rastvoru u izduženom obliku, što bi bilo konzistentno sa strukturom proteina.
Primer 5 - procena sekundarnih i tercijernih strukturaC . difificileToxA- ToxB fuzija sa
cirkularnim dihroizmom i fluorescentnom spektroskopijom
[0135] Cirkularni dihroizam je korišćen da bi se odredio sastav sekundarne strukture proteina merenjem razlike u apsorpciji levo polarizovanog svetla nasuprot desno polarizovanog svetla što je usled strukturne asimetrije. Oblik i veličina CD spektra u dalekom-UV regionu (190-250nm) su različiti ukoliko protein pokazuje beta nabranu ploču, alfa heliks ili spiralu savijenu po proncipu slučajnosti. Relativna zastupljenost svakog tipa sekundarne strukture u datom proteinskom uzorku može se izračunati poređenjem sa referentnim spektrom.
[0136] Tercijerna struktura proteinskog uzorka može se odrediti procenom imobilizacije aromatične aminokiseline. Uočavanje CD signal u bliskom-UV regionu (250-50nm) može se pripisati polarizaciji ostataka fenilalanina, tirozina i triptofana i dobra je indikacija da je protein savijen u dobro definisanu strukturu.
[0137] Korišćen je sledeći protokol: 1. Daleki UV spektri su mereni korišćenjem optičkog puta od 0,01 cm od 178 do 250nm, sa lnm rezolucijom i protokom na Jasco J-720 spektropolarimetru. Temperatura ćelije je održavana na 23 °C sa Peltier termostat RTE-111 ćelijskim blokom. Održavanje protok azota od lOL/min tokom merenja. 2. Bliski-UV spektri su mereni korišćenjem optičkog puta od 0,0lem od 250 do 300nm, sa lnm rezolucijom i protokom na Jasco J-720 spektropolarimetrom. Temperatura ćelije je održavana na 23 °C sa Peltier termostat RTE-111 ćelijskim blokom. Održavanje protok azota od 6L/min tokom merenja.
[0138] Uočavanje dalekog-UV spektra (slika 9) za svih pet ToxA-ToxB fuzionih proteina sugeriše mali sadržaj struktura alfa heliksa i visok sadržaj struktura beta nabrane ploče. Takođe, svi proteini pokazali su maksimum na 230nm, što je neobično za rastvorljive globularne proteine. Ovo je naročito dobro okarakterisano u literaturi i povezano je sa malom grupom proteina poznatih po odsustvu alfa heliksa i njihovog visokog sadržaja beta nabranih ploča i aromatičnih kiselina (Zsila, Analvtical Biochemistry,391( 2009) 154-156). Ove osobenosti su koherentne sa strukturom koja je očekivana za ToxA-ToxB fuzione proteine. Poređene su kristalne strukture 13 proteina koji pokazuju karkateristične CD spektre sa pozitivnim signalom na 230nm (Protein Data Bank). Prosečni sadržaj sekundarne strukture ovih proteina je 42% beta nabrane ploče ±9% i 7% alpha helix ±6%>. Ovo snažno ukazuje da je spektralna signatura ToxA-ToxB fuzionih proteina dijagnostika proteina sa visokim sadržajem beta nabranih ploča i niskim sadržajem alfa heliksa.
[0139] Uočavanje oblika bliskog-UV spektara (slika 10) za svih pet fuzionih proteina ukazuje da su najmanje neke od aromatičnih aminokiselina imobilisane, što je snažna indikacija kompaktne i specifične tercijerne strukture. Dodatno, tretman proteina sa denaturišućom koncentracijom uree uzrokovalo je nestanak bliskog-UV signala, što je dodatna indikacija da je ovaj karakteristični spektar usled savijanja proteina.
Primer 6 - Imun izaći i a miševa sa Tox A ili Tox B fragmentima i ToxA- ToxB fuzijama
[0140]Balb/C miševi su imunizovani sa konstruktima opisanim u primerima 2 i 3.
Imunizacija miševa
[0141]Grupe od 15 ženki Balb/c miševa je imunizovano IM na dane 0, 14 i 28 sa 3|ug ili 10 ixg zasebnih fragmenata toxA i toxB (videti primer 2) kao i sa ToxA-ToxB fuzionim proteinima (videti primer 3) sa ađuvantom AS03B. Kontrolna grupa od 10 miševa je vakcinisana samo sa AS03B.
[0142]Anti-ToxA i anti-ToxB ELISA titri su određeni u pojedinačnim serumima sakupljenim na dan 42 (post III).
[0143]Titri inhibicije hemaglultinacije su određeni u pulovanim Post III serumima.
Anti- ToxA i anti- ToxB ELISA odgovor: Protokol
[0144]Uzorci toxA ili toxB fragmenata obloženi su sa 1 ug/ml u fosfatno puferovanom fiziološkom rastvoru (PBS) na visokovezujućim mikrotitrskim pločama (Nunc MAXISORP™), preko noći na 4° C. Ploče su blokirane sa PBS-BSA 1% 30 min na RT uz agitaciju. Mišji antiserumi su prethodno razblaženi 1/500 u PBS-BSA0.2%-TWEEN™ 0.05%. i zatim, napravljena su dodatna dvostruka razblaženja na mikropločama i inkubirane na RT 30 min uz agitaciju. Nakon ispiranja, vezana mišja antitela su detektovana korišćenjem Jackson ImmunoLaboratories Inc. peroksidaza-konjugovanim affiniPure kozjim anti mišjim IgG (H+L) (ref: 115-035-003) razblaženo 1:5000 u PBS-BSA0.2%-tween 0.05%. Detekciona antitela su inkubirana 30 min. na sobnoj temepraturi (RT) uz agitaciju. Boja se razvila korišćenjem korišćenjem 4 mg O-fenilendiamina (OPD) + 5 ml H2O2per 10 ml pH 4.5 0.1M citratnog pufera 15 minuta u mraku na sobnoj temperaturi. Reakcija je zaustavljena sa 50 ul HC1, i optička gustina (OD) je očitana na 490 nm u odnosu na 620 nm.
[0145]Nivo anti-ToxA ili anti-ToxB antitela prisutnih u serumu je izražena u srednjim titrima. GMT je izračunat za 15 uzoraka u svakoj tretiranoj grupi (10 za kontrolnu grupu).
Test inhibicije hemaglutinacije: Protokol
[0146]Serijska dvostruka razblaženja pulovanih mišjih antiseruma (25 uf) izvedena su u fosfatno puferovanom fiziološkom rastvoru (PBS) u 96-komornim mikropločama sa U-dnom.
[0147]25 ul nativnog Toksina A (0,2 iig/komorici) je zatim dodato i ploče su inkubirane na sobnoj temperaturi 30 minuta.
[0148]Nakon inkubacije, 50 ul prečišćenih zečjih eritrocita razblaženih do 2% dodato je u svaku komoru. Ploče su inkubirane na 37°C 2 časa.
[0149]Ploče su analizirane vizuelno, sa hemaglutinacijom prisutnom kao difuzne crvene ćelije u komorici i inhibicija hemaglutinacije je uočena kao nepokretna crvena tačka u komorici.
[0150]Titri inhibicije su definisani kao recipročna vrednost najvećeg razblaženja serum inhibirajuće hemaglutinacije.
Test citotoksičnosti
[0151] 1MR90 fibroblast ćelije su kultivisane na 37°C sa 5% C02, u EMEM + 10% fetalnog goveđeg seruma + 1% glutamina + 1%> antibiotika (penicilin-streptomicin-amfotericin) i zasejane su u 96-komorne ploče za kulturu tkiva sa gustinom od 5.104 ćelija/komorici.
[0152] Nakon 24č, ćelijski medijum je uklonjen iz komorica.
[0153] Serijska dvostruka razblaženja mišjeg pulovanog antiseruma (50ul) su izvedena u ćelijskom medijumu.
[0154] 50 ul nativnog Toksina B (0.5ng/ml) je zatim dodato i ploče su inkubirane na 37°C sa 5% C0224 časa.
[0155] Ćelije su posmatrane nakon 24 časa, i proporcija zaobljenih ćelija je određena.
[0156] Inhibicioni titri su definisani kao recipročna vrednost najvećeg razblaženja serum inhibirajućeg 50%> ćelijskog zaokruživanja.
Rezltati:
[0157] Elisa rezultati, korišćenjem Tox A antitela opisani su na slici 11. Anti-Tox A antitela bila su indukovana nakon imunizacije samo sa ToxA, ali takođe sa svakom od 5 fuzija.
[0158] Funkcionalne osobine ovih antitela testirane su u testu hemaglutinacije. Ovaj test je prilagođen samo za Tox A procenu jer hemaglutinacija nije uočena sa ToxB.
[0159] Titri inhibicije hemaglutinacije su opisani na slici 12. Inhibicija hemaglutinacije je uočena sa anti-Tox A fragment serumima ili serumima usmerenim protiv svake od ToxA-ToxB fuzija.
[0160] ELISA korišćenjem ToxB antitela je takođe izvedena; ovi rezultati su ilustrovani na Slici 13. Anti-Tox B antitela su indukovana nakon imunizacije samo sa ToxB fragmentom ali takođe sa F2, F3 i F4 fuzijama.
[0161] Titri inhibicije citotoksičnosti opisani su na Slici 14. Titri inhibicije dobijeni korišćenjem seruma iz miševa imunizovanih sa ToxB fragmentom ili ToxA-ToxB fuzijama bili su veći od onih dobijenih korišćennjem komntrolnog seruma.
Primer 7 - Dizajn, kloniranje, ekspresija i prečišćavanje 4 dodatna fuziona proteina
[0162]Četiri dodatna fuziona proteina su dizajnirana korišćenjem principa dizajna opisanih u primeru 1, i nazvani su F54 Gly (SEQ ID NO:21), F54 New (SEQ ID NO:23), F5 ToxB (SEQ ID NO:25) i F52 New (SEQ ID NO:27).
[01631 Ovi fuzioni proteini su eksprimirani prema proceduri opisanoj u primeru 2.
Primer 8 - Procena molekulske težineC . difficileToxA- ToxB fuzija opisanih u SEQ ID
NO:21, SEO ID NO;23, SEO ID NO:25, i SEO ID NO:27
[0164] Molekulske težine fuzija opisanih u SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:25, i SEQ ID NO:27 određene su kao što je opisano u primeru 4.
[0165] Slika 15 opisuje distribuciju ova četiri dodatna fuziona proteina kao što je određeno analitičkim ultracentrifugiranjem brzine sedimentacije.
[0166] Molekulska težina glavnih vrsta određena iz C(S) distribucije sve četiri proteinske fuzije opisane u SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:25, i SEQ ID NO:27 odgovaraju njihovom monomernom obliku i svi proteini prikazuju sedimentacione osobine slične Fl do F5 fuzijama.
Primer 9 - procena tercijernih i sekundarnih strukturaC . difificileToxA- ToxB fuzija
opisanih u SEO ID NO:21, SEO ID NO:23, SEO ID NO:25, i SEO ID NO:27
[0167] Sekundarne i tercijerne strukture fuzija opisanih u SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:25, i SEQ ID NO:27 procenjene su prema postupku opisanom u primeru 5. Daleki UV CD za ove fuzione proteine može se naći na slici 16, a bliski UV spektri za ove fuzije mogu se naći na slici 17.
[0168] Analiza bliskih i dalekih UV CD spektara proteina opisanih u SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:25, i SEQ ID NO:27 pokazuje da sva četiri imaju isti visoki sadržaj beta nabranih ploča nego Fl do F5 fuzije. Dodatno, uočeni UV spektri pokazuju da nema značajne razlike u poziciji aromatične aminokiseline u tercijernoj strukturi u poređenju sa Fl do F5 fuzijama.
Primer 10 - imun izaći i a miševa sa Tox A- Tox B fuzijama
[0169]Balb/c miševi su imunizovani sa četiri konstrukta fuzionih proteina F54 Gly (SEQ ID NO:21), F54 New (SEQ ID NO:23), F5 ToxB (SEQ ID NO:25) i F52 New (SEQ ID NO:27) kao što je opisano u primeru 6. [01701ELISA je izvedena korišćenjem anti-ToxA i anti-ToxB ELISA odgovora: protokol opisan u primeru 6 osim što su ovde uzorci toxA ili toxB fragmenata obloženi na 2 ug/ml u fofatno puferovanom fiziološkom rastvoru na visokovezujućim mikrotitarskim pločama. Test inhibicije hemaglutinacije je izveden kao što je opisano u primeru 6. toxB test citotoksičnosti je izveden kao što je opisano u primeru 6. Dodatni toxA test citotoksičnosti je izveden kao što je opisano u nastavku.
ToxA test citotoksičnosti
[0171]HT29 ćelije su kultivisane na 37°C sa 5%C02u DMEM +10% fetalnog goveđeg seruma +1% glutamina +1% antibiotika (penicilin-streptomicin-amfotericin) i zasejane su na 96-komorne ploče za kulturu tkiva sa gustinom od 5.104 ćelija/komorici.
[0172]Nakon 24č, ćelijski medijum je uklonjen iz komorica.
[0173]Serijska dvostruka razblaženja mišjih pulovanih antiseruma (50 ul) izvedena su u ćelijskom medijumu.
[0174]50 ul nativnog Toxin B (0.15ng/ml) je zatim dodato i ploče su inkubirane na 37°C sa 5% C0248 časova.
[0175]Ćelije su posmatrane nakon 48 časova i proporcija zaokruženih ćelija je određena.
[0176]Rezultati anti-toxA ELISA, anti-toxB Elisa, inhibicije hemaglutinacije i testovi citotoksičnosti su opisani na Slikama 18, 19, 20, 21 i 22 respektivno.

Claims (40)

1. Polipeptid koji sadrži prvi fragment i drugi fragment, gde (i) prvi fragment je fragment ponavljajućeg domena toksina A; (ii) drugi fragment je fragment ponavljajućeg domena toksina B; (iii) prvi fragment ima prvi proksimalni kraj; (iv) drugi fragment ima drugi proksimalni kraj; i gde su prvi fragment i drugi fragment razdvojeni sa manje od ili tačno 5 aminokiselina u primarnoj strukturi, gde polipeptid izaziva antitela koja neutrališu i toksin A i toksin B, gde prvi proksimalni kraj je unutar kratkog ponovka, drugi proksimalni kraj je unutar kratkog ponovka i prvi proksimalni kraj i drugi proksimalni kraj ne remete kratki ponovak-dugi ponovak-kratki ponovak delove.
2. Polipeptid prema patentnom zahtevu 1 gde polipeptid izaziva zaštitni imuni odgovor kod sisara domaćina protiv sojevaC. difficile.
3. Polipeptid prema bilo kom od patentnih zahteva 1-2 gde prvi fragment i/ili drugi fragment sadrže manje od 25%, 20%>, 18% ili 15% alfa heliks strukture.
4. Polipeptid prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva gde prvi fragment i/ili drugi fragment sadrži više od 25%, 30%>, 35%, 38% ili 40%> strukture beta nabrane ploče.
5. Polipeptid prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva gde prvi proksimalni kraj nije unutar aminokiselina 1878-1940, 2012-2074, 2146-2208, 2258-2322, 2394-2456, 2507-2569 ili 2598-2660 toksina A.
6. Polipeptid prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva gde drugi proksimalni kraj nije unutar aminokiselina 1881-1942, 2012-2074, 2144-2208 ili 2278-2339 toksina B.
7. Polipeptid prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva gde prvi fragment sadrži najmanje 100, 250, 400 ili 450 aminokiselina.
8. Polipeptid prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva sa drugim fragmentom koji sadrži najmanje 100, 200, 300 ili 400 aminokiselina.
9. Polipeptid prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva gde prvi proksimalni kraj je unutar ponavljajućeg dela VIII (aminokiseline 2645-2710) toksina A.
10. Polipeptid prema bilo kom od patentnih zahteva 1-9 gde je prvi proksimalni kraj unutar aminokiselina 2700-2710 ili 2680-2690 toksina A.
11. Polipeptid prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva gde drugi proksimalni kraj je unutar ponavljajućeg dela I (aminokiseline 1834-1926) toksina B.
12. Polipeptid prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva gde drugi proksimalni kraj je unutar aminokiselina 1860-1878 ili 1854-1876 toksina B.
13. Polipeptid prema bilo kom od patentnih zahteva 1-10 gde je drugi proksimalni kraj unutar ponavljajućeg dela II (aminokiseline 1927-2057) toksina B.
14. Polipeptid prema bilo kom od patentnih zahteva 1-10 ili 13 gde je drugi proksimalni kraj unutar aminokiselina 1960-1970, 1988-1998 ili 1867-1877 toksina B.
15. Polipeptid prema bilo kom od patentnih zahteva 9, 10, 11 ili 12 gde je prvi proksimalni kraj unutar ponavljajućeg dela VIII (aminokiseline 2645-2710) toksina A i gde je drugi proksimalni kraj unutar ponavljajućeg dela I (aminokiseline 1834-1926) toksina B.
16. Polipeptid prema bilo kom od patentnih zahteva 9, 10, 13 ili 14 gde je prvi proksimalni kraj unutar ponavljajućeg dela VIII (aminokiseline 2645-2710) toksina A i gde je drugi proksimalni kraj unutar ponavljajućeg dela II (aminokiseline 1927-2057) toksina B.
17. Polipeptid prema bilo kom od patentnih zahteva 9, 10, 13 ili 14 gde je prvi proksimalni kraj unutar kratkog ponovka 3 ponavljajućeg dela VIII toksina A (aminokiseline 2687-2710) i drugi proksimalni kraj je unutar kratkog ponovka 4 ponavljajućeg dela II toksina B (aminokiseline 1988-2007).
18. Polipeptid prema bilo kom od patentnih zahteva 9, 10, 13 ili 14 gde je prvi proksimalni kraj unutar kratkog ponovka 2 ponavljajućeg dela VIII (aminokiseline 2665-2686) toksina A i drugi proksimalni kraj je unutar kratkog ponovka 3 ponavljajućeg dela II toksina B (aminokiseline 1968-1987).
19. Polipeptid prema bilo kom od patentnih zahteva 9, 10, 11 ili 12 gde je prvi proksimalni kraj unutar kratkog ponovka 2 ponavljajućeg dela VIII toksina A (aminokiseline 2665-2686) i drugi proksimalni kraj je unutar kratkog ponovka 3 ponavljajućeg dela I toksina B (1877-1896).
20. Polipeptid prema bilo kom od patentnih zahteva 1-8, 9, 10, 11, 12 i 15 gde je prvi proksimalni kraj unutar kratkog ponovka 3 ponavljajućeg dela VIII toksina A (aminokiseline 2645-2686) i drugi proksimalni kraj je unutar kratkog ponovka 1 ponavljajućeg dela I toksina B (aminokiseline 1834-1854).
21. Polipeptid prema bilo kom od patentnih zahteva 9, 10, 13 ili 14 gde je prvi proksimalni kraj unutar kratkog ponovka 3 ponavljajućeg dela VIII toksina A (aminokiseline 2687-2710) i drugi proksimalni kraj je unutar kratkog ponovka 4 ponavljajućeg dela II toksina B (aminokiseline 1988-2007).
22. Polipeptid prema patentnom zahtevu 16 gde je prvi proksimalni kraj unutar aminokiselina 2700-2710 toksina A i drugi proksimalni kraj je unutar aminokiselina 1960-1970 toksina B.
23. Polipeptid prema patentnom zahtevu 16 gde je prvi proksimalni kraj unutar aminokiselina 2680-2690 toksina A i drugi proksimalni kraj je unutar aminokiselina 1960-1970 toksina B.
24. Polipeptid prema patentnom zahtevu 16 gde je prvi proksimalni kraj unutar aminokiselina 2700-2710 toksina A i drugi proksimalni kraj je unutar aminokiselina 1988-1998 toksina B.
25. Polipeptid prema patentnom zahtevu 16 gde je prvi proksimalni kraj unutar aminokiselina 2680-2690 i drugi proksimalni kraj je unutar aminokiselina 1860-1878.
26. Polipeptid prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva gde je polipeptid deo većeg fuzionog proteina.
27. Polipeptid prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva gde polipeptid sadrži imunogeni fragment iz SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7 SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:25 ili SEQ ID NO:27.
28. Polipeptid prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva gde polipeptid sadrži imunogeni fragment od najmanje 500, 600, 700, 750, 800, 850 ili 900 aminokiselina iz SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7 SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:25 ili SEQ ID NO:27.
29. Polipeptid prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva gde polipetid sadrži više od 450, 475, 500, 525, 575, 600, 625, 650, 675, 700, 725, 750, 775, 800, 825 ili 850 aminokiselina iz toksina A.
30. Polipeptid prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva gde polipetid sadrži manje od 850, 825, 800, 775, 750, 725, 700, 675, 650, 625, ili 600 aminokiselina iz toksina A.
31. Polipeptid prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva gde polipeptid sadrži više od 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500 ili 525 aminokiselina iz toksina B.
32. Polipeptid prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva gde polipetid sadrži manje od 525, 500, 475, ili 450 aminokiselina iz toksina B.
33. Polinukleotid koji kodira polipeptid prema bilo kom od patentnih zahteva 1-32.
34. Vektor koji sadrži polinukleotid prema patentnom zahtevu 33 povezan sa inducibilnim promotorom.
35. Imunogena kompozicija koja sadrži polipeptid prema bilo kom od patentnih zahteva 1-32 i farmaceutski prihvatljiv ekscipijent.
36. Imunogena kompozicija prema patentnom zahtevu 35 koja dodatno sadrži ađuvant.
37. Imunogena kompozicija prema bilo kom od patentnih zahteva 35-36 koja dodatno sadrži dodatne antigene.
38. Imunogena kompozicija prema patentnom zahtevu 37 gde su dodatni antigeni antigeni izvedeni iz bakterije izabrane iz grupe koja se sastoji od ofS. pneumoniae, H. influenzae,N. meningitidis, E. coli, M. cattarhalis,tetanus, diphtheria, pertussis,S. epidermidis,enterococci, iS. aureus.
39. Vakcina koja sadrži imunogenu kompoziciju prema bilo kom od patentnih zahteva 35-38.
40.Imunogena kompozicija prema bilo kom od patentnih zahteva 35-38 ili vakcina prema patentnom zahtevu 39 za upotrebu u tretmanu ili prevenciji bolesti izazvane saC. difficile.
RS20170051A 2011-05-27 2012-05-25 Imunogene kompozicije RS55605B1 (sr)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201161490707P 2011-05-27 2011-05-27
US201161490734P 2011-05-27 2011-05-27
US201161490716P 2011-05-27 2011-05-27
PCT/EP2012/059805 WO2012163817A2 (en) 2011-05-27 2012-05-25 Immunogenic composition

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS55605B1 true RS55605B1 (sr) 2017-06-30

Family

ID=46168484

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20170051A RS55605B1 (sr) 2011-05-27 2012-05-25 Imunogene kompozicije

Country Status (25)

Country Link
US (5) US9290565B2 (sr)
EP (6) EP3564378B1 (sr)
JP (3) JP5952390B2 (sr)
KR (1) KR102014502B1 (sr)
CN (3) CN103732750A (sr)
BR (2) BR112013030395B1 (sr)
CA (2) CA2837393A1 (sr)
CY (3) CY1118599T1 (sr)
DK (4) DK2714910T3 (sr)
EA (1) EA030898B1 (sr)
ES (4) ES2615737T3 (sr)
FI (1) FI3564378T3 (sr)
HR (4) HRP20180339T1 (sr)
HU (4) HUE030823T2 (sr)
IL (1) IL229529B2 (sr)
LT (4) LT2714911T (sr)
ME (1) ME02600B (sr)
MX (1) MX346200B (sr)
PL (4) PL3564378T3 (sr)
PT (4) PT2714910T (sr)
RS (1) RS55605B1 (sr)
SG (1) SG195037A1 (sr)
SI (4) SI3138916T1 (sr)
SM (2) SMT201700110T1 (sr)
WO (3) WO2012163810A1 (sr)

Families Citing this family (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3167899B1 (en) 2010-09-03 2021-03-24 Valneva Austria GmbH Isolated polypeptide of the toxin a and toxin b proteins of c.difficile and uses thereof
MX391236B (es) 2011-04-22 2025-03-21 Wyeth Llc Composiciones relacionadas con una toxina de clostridium difficile mutante y sus metodos.
SG11201402375VA (en) 2011-12-08 2014-10-30 Novartis Ag Clostridium difficile toxin-based vaccine
BR122016023101B1 (pt) 2012-10-21 2022-03-22 Pfizer Inc Polipeptídeo, composição imunogênica que o compreende, bem como célula recombinante derivada de clostridium difficile
AU2013354186A1 (en) * 2012-12-05 2014-06-12 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Immunogenic composition
CA2910200A1 (en) * 2013-04-22 2014-10-30 Board Of Regents Of The University Of Oklahoma Clostridium difficile vaccine and methods of use
ES2870506T3 (es) 2015-02-19 2021-10-27 Immune Biosolutions Inc Antígeno y anticuerpo del epítopo de las toxinas a y/o b de clostridium difficile, y sus usos farmacéuticos
EP3810163A1 (en) * 2018-06-19 2021-04-28 GlaxoSmithKline Biologicals SA Immunogenic composition
WO2023020992A1 (en) 2021-08-16 2023-02-23 Glaxosmithkline Biologicals Sa Novel methods
WO2023020994A1 (en) 2021-08-16 2023-02-23 Glaxosmithkline Biologicals Sa Novel methods
WO2023020993A1 (en) 2021-08-16 2023-02-23 Glaxosmithkline Biologicals Sa Novel methods
GB202205833D0 (en) 2022-04-21 2022-06-08 Glaxosmithkline Biologicals Sa Bacteriophage
WO2023232901A1 (en) 2022-06-01 2023-12-07 Valneva Austria Gmbh Clostridium difficile vaccine
WO2024160901A1 (en) 2023-02-02 2024-08-08 Glaxosmithkline Biologicals Sa Immunogenic composition

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4235877A (en) 1979-06-27 1980-11-25 Merck & Co., Inc. Liposome particle containing viral or bacterial antigenic subunit
US4751180A (en) 1985-03-28 1988-06-14 Chiron Corporation Expression using fused genes providing for protein product
US4935233A (en) 1985-12-02 1990-06-19 G. D. Searle And Company Covalently linked polypeptide cell modulators
DE69535530D1 (de) * 1994-10-24 2007-08-16 Ophidian Pharm Inc Impfstoff und Antitoxine zur Behandlung und Vorbeugung von C. Difficile Krankheiten
ATE195878T1 (de) * 1995-07-07 2000-09-15 Oravax Inc Toxine und toxoide von clostridium difficile als schleimhautadjuvans
WO2000061762A1 (en) 1999-04-09 2000-10-19 Techlab, Inc. RECOMBINANT TOXIN A/TOXIN B VACCINE AGAINST $i(CLOSTRIDIUM DIFFICILE)
JP2002541808A (ja) 1999-04-09 2002-12-10 テクラブ， インコーポレイテッド ポリサッカリド結合体ワクチンのための組換えトキシンａタンパク質キャリア
WO2001073030A2 (en) 2000-03-28 2001-10-04 Diadexus, Inc. Compositions and methods of diagnosing, monitoring, staging, imaging and treating colon cancer
CA2733425A1 (en) * 2008-08-06 2010-02-11 Emergent Product Development Uk Limited Vaccines against clostridium difficile and methods of use
WO2011060431A2 (en) 2009-11-16 2011-05-19 University Of Maryland Baltimore Multivalent live vector vaccine against clostridium difficile-associated disease
EP3167899B1 (en) 2010-09-03 2021-03-24 Valneva Austria GmbH Isolated polypeptide of the toxin a and toxin b proteins of c.difficile and uses thereof
GB201016742D0 (en) * 2010-10-05 2010-11-17 Health Prot Agency Clostridium difficile antigens

Also Published As

Publication number Publication date
BR112013030395B1 (pt) 2022-11-01
CY1121936T1 (el) 2020-10-14
EA030898B1 (ru) 2018-10-31
DK3564378T3 (da) 2024-01-08
HRP20191291T1 (hr) 2019-10-18
DK3138916T3 (da) 2019-08-26
SMT201700110T1 (it) 2017-03-08
HRP20231749T1 (hr) 2024-03-15
HUE030823T2 (en) 2017-06-28
EP4296361A2 (en) 2023-12-27
PL2714910T3 (pl) 2018-06-29
EP2714910B1 (en) 2018-01-10
HUE044772T2 (hu) 2019-11-28
EP3327126A1 (en) 2018-05-30
US20160159867A1 (en) 2016-06-09
EP2714911B1 (en) 2016-11-30
PT3138916T (pt) 2019-09-17
EP3564378A1 (en) 2019-11-06
WO2012163817A3 (en) 2013-03-21
HRP20180339T1 (hr) 2018-03-23
EP3564378B1 (en) 2023-11-01
PT2714911T (pt) 2017-02-06
US20170362309A1 (en) 2017-12-21
DK2714911T3 (en) 2017-02-27
JP2014516532A (ja) 2014-07-17
SI2714910T1 (en) 2018-04-30
EP2714911A2 (en) 2014-04-09
DK2714910T3 (en) 2018-02-05
US9409974B2 (en) 2016-08-09
PT2714910T (pt) 2018-03-09
PL3138916T3 (pl) 2019-11-29
ES2743442T3 (es) 2020-02-19
IL229529A0 (en) 2014-01-30
JP5952390B2 (ja) 2016-07-13
WO2012163811A1 (en) 2012-12-06
US20170247421A1 (en) 2017-08-31
CN107098977A (zh) 2017-08-29
BR112013030396A2 (pt) 2016-12-13
MX346200B (es) 2017-03-10
SI2714911T1 (sl) 2017-03-31
LT3138916T (lt) 2019-08-26
SG195037A1 (en) 2013-12-30
BR112013030395A2 (pt) 2016-12-13
LT2714910T (lt) 2018-03-12
SI3564378T1 (sl) 2024-02-29
LT3564378T (lt) 2024-01-25
JP2017012160A (ja) 2017-01-19
ES2968455T3 (es) 2024-05-09
HRP20170094T1 (hr) 2017-03-24
DK3564378T5 (da) 2024-09-02
ES2660468T3 (es) 2018-03-22
HUE064492T2 (hu) 2024-03-28
CY1119916T1 (el) 2018-06-27
EP4296361A3 (en) 2024-02-28
CN103717742B (zh) 2018-05-22
CN103717742A (zh) 2014-04-09
EA201391548A1 (ru) 2014-06-30
EP3138916A1 (en) 2017-03-08
WO2012163817A2 (en) 2012-12-06
ES2615737T3 (es) 2017-06-08
IL229529B2 (en) 2023-05-01
MX2013013924A (es) 2013-12-16
US20140093529A1 (en) 2014-04-03
ME02600B (me) 2017-06-20
IL229529B1 (en) 2023-01-01
PT3564378T (pt) 2024-01-26
CA2837395A1 (en) 2012-12-06
CY1118599T1 (el) 2017-07-12
EP2714910A1 (en) 2014-04-09
SMT201700110B (it) 2017-03-08
CA2837393A1 (en) 2012-12-06
KR102014502B1 (ko) 2019-08-26
US10093722B2 (en) 2018-10-09
WO2012163810A1 (en) 2012-12-06
EP3138916B1 (en) 2019-06-19
KR20140019848A (ko) 2014-02-17
FI3564378T3 (fi) 2024-01-18
PL2714911T3 (pl) 2017-05-31
HUE037126T2 (hu) 2018-08-28
SI3138916T1 (sl) 2019-08-30
US9644024B2 (en) 2017-05-09
US10377816B2 (en) 2019-08-13
US9290565B2 (en) 2016-03-22
US20140178424A1 (en) 2014-06-26
LT2714911T (lt) 2017-02-10
CN103732750A (zh) 2014-04-16
JP2014522238A (ja) 2014-09-04
CA2837395C (en) 2021-05-18
PL3564378T3 (pl) 2024-03-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
RS55605B1 (sr) Imunogene kompozicije
US20240207383A1 (en) Minimal Sequons Sufficient for O-Linking Glycosylation
AU2016203241B2 (en) Immunogenic composition
AU2012264902A1 (en) Immunogenic composition