RS55533B1 - Isporuka terapijskih agenasa u centralni nervni sistem - Google Patents

Description

POZADINA

[0001]Terapija izmene enzima (TZE) uključuje sistemsku administraciju prirodnih ili rekombinantno dobijenih proteina i/ili enzima subjektu. Odobrene terapije tipično se administriraju subjektima intravenozno i generalno su efikasne u tečenju somatskih simptoma kod nedostatka fundamentalnog enzima. Lečenje bolesti koja ima CNS etiologiju je poseban izazov zato što intravenozno administrirani proteini i/ili enzimi neadekvatno prolaze kroz krvno-moždanu barijeru kao rezultat ograničene distribucije intravenozno administriranog proteina i/ili enzima u ćelije i tkiva centralnog nervnog sistema (CNS).

[0002]Krvno-moždana barijera je strukturni sistem koji se sastoji od endotelnih ćelija koje imaju funkciju da štite centralni nervni sistem (CNS) od delecionih supstanci u krvotoku, kao što su bakterije, makromolekuli (npr. proteini) i drugi hidrofilni molekuli, ograničavajući difuziju ovih supstanci kroz krvno-moždanu barijeru i u osnovnu cerebrospinalnu tečnost i CNS.

[0003]Postoji nekoliko načina zaobilaženja krvno-moždane barijere kako bi se povećalo otpuštanje terapeutskog agensa u mozgu uključujući direktno intrakranijalno injektiranje, nestalnu peneabilizaciju krvno-moždane barijere i modifikaciju aktivne komponente kako bi se izmenila distribucija tkiva. Na primer, Lee et al. FASEB 1 21, 2520-2527 (2007) pokazuju da pojedinačna doza intracerebroventrikularnom administracijom galaktocerebrozidaze poboljšava preživljavanje kod miševa sa Krabbeovom bolešću. Direktno injektiranje terapeutskog agensa u moždano tkivo potpuno zaobilazi vaskularni sistem, ali primarno trpi zbog rizika od komplikacija (infekcije, oštećenje tkiva, imuni odgovor) nastalih intrakranijalnim injektiranjem i slabom difuzijom aktivnih agenasa sa mesta administracije. Do danas, direktna administracija proteina u supstancu mozga nije postigla značajni terapeutski efekat zbog difuzionih barijera i ograničene zapremine leka koji može da se administrira. Difuzija vezana za konvektivni prenos mase proučavana je preko katetera postavljenih u parenhim mozga koristeći sporu, dugotrajnu infuziju (Bobo, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 91, 2076-2080 (1994); Nguyen, et al. ]. Neurosurg. 98, 584-590 (2003)), ali nijedna odobrena terapija trenutno ne koristi ovaj pristup za dugotrajnu terapiju. Dodatno, postavljanje intracerebralnih katetera je veoma invazivna i manje poželjna kao klinička alternativa.

[0004]Takođe je bilo pokušaja sa intratekalnim injektiranjem (IT) ili administracijom proteina u cerebrospinalnu tečnost, što još uvek nije dovelo do uspeha u terapiji. Na primer, US 2009/017005 objavljuje IT administraciju farmaceutske kompozicije koja sadrži pufer natrijum fosfata pri koncentraciji od oko 10-50 mM. Primer farmaceutske kompozicije od 0,58 mg/ml iduronidaze formulisana je u puferu koji sadrži 100 mM natrijum fosfata, 150 mM NaCI i 0,001% polisorbata 80. Veliki izazov kod ovog tretmana bila je tendencija vezivanja aktivne komponente veoma čvrsto za komoru pokrivenom ependimom što je sprečavalo subsekventnu difuziju. Trenutno, nema dozvoljenih proizvoda za lečenje moždanih genetskih bolesti direktnom administacijom u cerebralnospinalnu tečnost.

[0005]U stvari, mnogi veruju da su barijera za difuziju na površini mozga, kao i nedostatak efikasnih i pogodnih metoda otpuštanja prevelike prepreke kako bi se postigao terapeutski efekat u mozgu za bilo koju bolest.

[0006]Mnogi poremećaji skladištenja lizozoma utiču na nervni sistem i stoga predstavljaju jedinstvene izazove u lečenju ovih bolesti tradicionalnim terapijama. Često je veliko nagomilavanje glikozaminoglikana (GAG) u neuronima i moždanim opnama obolelih individua što vodi do različitih formi CNS simptoma. Do danas, nijedan CNS simptom dobijen iz lipozomnih poremećaja nije uspešno lečen svim raspoloživim sredstvima.

[0007]Stoga, ostaje velika potreba za efektivnim otpuštanjem terapeutskih agenasa u mozak. Preciznije, postoji velika potreba za efektivnijim otpuštanjem aktivnih agenasa u centralni nervni sistem za lečenje poremećaja skladištenja lizozoma.

REZIME

[0008]Predmetni pronalazak obezbeđuje efikasan i manje invazivan pristup za direktno otpuštanje terapeutskih agenasa u centralni nervni sistem (CNS). Ovaj pronalazak, delom je baziran na neočekivanom otkriću, da zamena enzima za bolesti skladištenja lizozoma može direktno da se uvodi u cerebrospinalnu tečnost subjektu kome je potrebno lečenje pri visokim koncentracijama (npr. višim od 3 mg/ml, 4 mg/ml, 5 mg/ml, 10 mg/ml ili više) takvim da enzim efikasno i obimno difunduje preko različitih površina i penetrira različite delove mozga, uključujući duboke delove mozga. Više iznenađuje, da su istraživači pokazali da ovako visoka koncentracija otpuštanja proteina može da se dostigne koristeći proste rastvore ili formulacije bazirane na puferima i bez uvođenja supstancijalnih neželjenih efekata, kao što su ozbiljni imuni odgovor kod subjekta. Stoga, ovaj pronalazak sadrži pristup koji je jako efikasan, klinički poželjan i pogodan za pacijente za direktno otpuštanje u CNS za lečenje različitih bolesti i poremećaja koji imaju CNS komponente, posebno, bolesti

skladištenja lizozoma. Ovaj pronalazak predstavlja značajan napredak u polju CNS obeležavanja i terapije izmene enzima.

[0009]Između ostalog, predmetni pronalazak obezbeđuje metode intratekalne (U) administracije terapeutskog agensa (npr. izmena enzima) subjektu kome je lečenje potrebno. U nekim oblicima, enzim izmene može da bude rekombinantni, genski aktiviran ili prirodni enzim. Kao što je ovde navedeno, pojmovi „intratekalna administracija", „intratekalno injektiranje", „intratekalno otpuštanje" ili gramatički ekvivalenti odnose se na injektiranje u kičmeni kanal (intratekalni prostor koji okružuje kičmenu moždinu). U nekim oblicima, „intratekalna administracija" ili „intratekalno otpuštanje" prema predmetnom pronalasku odnose se na U administraciju ili otpuštanje preko stabinskog dela ili segmenta npr. slabinska IT administracija ili otpuštanje. Kao što je ovde navedeno, pojmovi „slabinski segment" ili „slabinski deo" odnose se na površinu između trećeg i četvrtog slabinskog (donji deo leđa) pršljena uključujući i L2-S1 segment kičme. Smatra se da se slabinska IT administracija ili otpuštanje razlikuje više od cisterna magna otpuštanja (npr. injektiranje preko prostora oko i ispod cerebeluma kroz otvore između lobanje i vrha kičme) i pri takvoj lumbalnoj IT administraciji iti otpuštanju prema predmetnom pronalasku obezbeđeno je bolje i efikasnije otpuštanje u distalni kičmeni kanal.

[0010]Pronalazak je usmeren na vodene rastvore farmaceutskih kompozicija koje sadrže enzim koji je zamena za lizozomski enzim, pufer, surfaktant i tonicifier (reguliše osmotski pritisak rastvora) za upotrebu u metodi koja sadrži korak administriranja kompozicije intratekalno subjektu koji pati od ili je podložan lizozomskim bolestima nakupljanja koje su povezane sa sniženim nivoom ili aktivnošću lizozomskih enzima okarakterisanih tako da kompozicija ima pH vrednostod 5,5 do 7,0. Ovaj enzim prisutan je pri koncentraciji većoj od oko 10 mg/ml, a pufer je natrijum fosfat do 5 mM. U jednom aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje metode uključujući i korak intratekalne administracije subjektu koji pati od ili je podložan lizozomskim bolestima nakupljanja koje su povezane sa sniženim nivoom ili aktivnošću lizozomskih enzima okarakterisanih tako da kompozicija sadrži enzim izmene za lizozomski enzim pri koncentraciji većoj od oko 10 mg/ml (npr. 15 mg/ml, 20 mg/ml, 25 mg/ml, 30 mg/ml, 40 mg/ml, 50 mg/ml, 75 mg/ml, or 100 mg/ml).

[0011]U nekim oblicima, kompozicije imaju pH vredost otprilike od 6,0 do 7,0 (npr. 6,5-7,0 ili od 5,5-6,5). U nekim oblicima kompozicije sadrže enzim izmene u formulaciji koja nije sintetički CSF.

[0012]U nekim oblicima, kompozicija je administrirana u pojedinačnoj dozi čija je zapremina manja od oko 15 ml (npr. manja od oko 10 ml, 9 ml, 8 ml, 7 ml, 6 ml, 5 ml, 4 ml, 3 ml, 2 ml, 1,5 ml, 1,0 ml, ili 0,5 ml).

[0013]U nekim oblicima, intratekalna administracija kompozicije ne rezultuje u adaptivnom imunom odgovoru posredovanom T-ćelijama.

[0014]U još jednom aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje metode uključujući korak administriranja subjektu koji pati ili je podložan lizozomskim bolestima nakupljanja koje su povezane sa sniženim nivoom ili aktivnošću lizozomskih enzima. Kompozicija sadrži enzim izmene za lizozomski enzim, čije administriranje uključuje intratekalnu administraciju kompozicije u odsustvu konkurentne imunosupresivne terapije. U nekim oblicima, metod ne uključuje uvođenje imune tolerancije kod subjekta koji se leči. U određenim oblicima, metod ne uključuje predtretman ili preduslov subjekta koristeći imunosupresivni agens T-ćelija.

[0015]U daljem aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje metode koje uključuju korak intratekalnog administriranja subjektu koji pati ili je podložan lizozomskim bolestima nakupljanja koje su povezane sa sniženim nivoom ili aktivnošću lizozomskih enzima gde kompozicija sadrži enzim izmene lizozomskog enzima pri efektivnoj terapeutskoj dozi i intervalu administracije najmanje od oko 10% (npr. najmanje oko 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, ili 95%) i dostižu se normalne vrednosti ili aktivnosti lizozomskih enzima u jednom ili više moždanim tkivima, kičmenoj moždini i perifernim organima.

[0016]U nekim oblicima, jedno ili više moždanih tkiva kojima se dovodi enzim sadrže moždane opne. U nekim oblicima, moždane opne su izabrane iz grupe koju čine unutrašnja, meka moždana opna (pia mater); spoljašnja, tvrda moždana opna (dura mater); i paučinasta moždana opna (arachnoidea).

[0017]U nekim oblicima, jedno ili više moždanih tkiva kojima se dovodi enzim sadrže tkivo velikog mozga (cerebrum). U određenim oblicima, tkivo cerebruma je površina ili šuplje tkivo. U određenim oblicima, površina ili šuplje tkivo cerebruma izabrano je iz grupe koju čine pia mater, cerebralna kortikalna tkiva promene (eng. cerebral cortical ribbon tissues), hipokampus, tkiva za 4 mm od površine cerebeluma, Virchovv Robinov prostor, krvni sudovi u oviru VR prostora, hipokampus, deo hipotalamusa na inferior površini mozga, optički nervi i traktovi, mirisni delovi velikog mozga i projekcije i njihove kombinacije.

[0018]U nekim oblicima, tkivo cerebruma kome se dovodi enzim je duboko tkivo cerebruma. U određenim oblicima, duboko tkivo cerebruma izabran je iz grupe koju čine cerebralna kortikalna tkiva promene (eng. cerebral cortical ribbon), tkiva 4 mm od površine cerebruma, tkiva 6 mm ispod površine cerebruma, tkiva 10 mm od površine cerebruma, međumozak (diencephalon), hipotalamus, talamus, pretalamus, subtalamus, mezencefalon, pedunkuli, crveno jedro, jedro trećeg kranijalnog nerva, duboka siva masa, lentiformno jedro, bazalne ganglije, caudate, putamen, amigdala, globus pallidus, i njihove kombinacije.

[0019]U nekim oblicima, jedno ili više moždanih tkiva kojima se dovodi enzim sadrže tkivo cerebeluma. U određenim oblicima, tkivo cerebeluma izabrano je iz grupe koju čine tkiva molekulskog sloja, sloj Purkinjeovih ćelija, sloj zrnastih ćelija, pedunkula i njihova kombinacija. U nekim oblicima, tkivo cerebeluma je duboko tkivo. U određenim oblicima, duboko tkivo cerebeluma izabrano je iz grupe koju čine stoj Purkinjeovih ćelija, sloj zrnastih ćelija, bela masa cerebeluma i jedra malog mozga (cerebelluma).

[0020]U nekim oblicima, jedno ili više moždanih tkiva kojima se dovodi enzim sadrže tkivo moždanog stabla. U određenim oblicima, tkivo moždanog stabla izabrano je iz grupe koju čine bela masa moždanog stabla i/ili jedra moždanog stabla.

[0021]U nekim oblicima, jedno ili više tkiva kičmene moždine kojima se dovodi enzim je površina ili šupljina kičmene moždine. U određenim oblicima, površina ili šupljina kičmene moždine izabran) su iz grupe koju čine pia mater, bela masa t tkivo na 4 mm od površine kičmene moždine. U nekim oblicima, jedno ili više tkiva kičmene moždine je duboko tkivo kičmene moždine. U određenim oblicima, duboko tkivo kičmene moždine izabrano je iz grupe koju čine siva masa i ependimalne ćelije i tkivo 4 mm od površine kičmene moždine.

[0022]U nekim oblicima, jedno ili više moždanih tkiva kojima se dovodi enzim sadrži površinu ili šuplja tkiva. U određenim oblicima, površina ili šuplja tkiva izabrana su iz grupe koju čine pia mater, dura mater i arachnoidna tkiva moždane opne, pia mater, cerebralna kortikalna tkiva promene (eng. cerebral cortical ribbon tissues), tkiva na 4 mm od površine cerebruma i njihova kombinacija.

[0023]U nekim oblicima, tkiva kojima se dovodi enzim sadrže duboka tkiva. U određenim oblicima, duboko moždano tkivo izabrano je kao duboka bela masa cerebruma, duboka siva masa kičmene moždine, corpus callosum, periventrikulamo tkivo, talamus, bazalna ganglija, diencefalon, fimbrija, tkiva ispod , cerebralna kortikalna tkiva promene (eng. cerebral cortical ribbon tissues), tkiva na 4 mm od površine cerebruma, tkiva na 6 mm od površine cerebruma, tkiva na 10 mm od površine cerebruma, sloj Purkinjeovih ćelija, sloj zrnastih ćelija, duboka cerebelarna bela masa i duboka cerebelarna jedra i njihova kombinacija.

[0024]U nekim oblicima, opsezi terapeutske efektivne doze idu od 0,005 mg/kg težine mozga do 100 mg/kg težine mozga. U određenim oblicima, terapeutski efektivna doza je veća od 1 mg/kg težine mozga (npr. veća od 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 ili 50 mg/kg težine mozga). U određenim oblicima, terapeutski efektivna doza je veća od 10 mg/kg težine mozga. U određenim oblicima, terapeutski efektivna doza je veća od 30 mg/kg težine mozga.

[0025]U nekim oblicima, interval administracije je jednom u dve nedelje. U nekim oblicima, interval administracije je jednom mesečno. U nekim oblicima, interval administracije je na svaka dva meseca. U nekim oblicima, interval administracije je dvaput mesečno. U nekim oblicima, interval administracije je jednom nedeljno. U nekim oblicima, interval administracije je dvaput ili više puta nedeljno. U nekim oblicima, administracija je kontinualna, kao kroz kontinualnu perfuzionu pumpu.

[0026]U još jednom aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje metode uključujući korak administriranja subjektu koji pati ili je podložan lizozomskim bolestima nakupljanja povezanim sa sniženim nivoom ili aktivnošću lizozomskih enzima. Kompozicija koja sadrži enzim izmene lizozomskog enzima koji se administrira intratekalno tako da je enzim izmene doveden do dubokog moždanog tkiva, najmanje 5 mm ispod spoljašnje površine (npr. najmanje 6 mm, 7 mm, 8 mm, 9 mm, 10 mm, 11 mm, 12 mm, ili dublje ispod spoljašnje površine). U nekim oblicima, enzim izmene doveden je duboko u moždano tkivo najmanje 10 mm ispod spoljašnje površine. U određenim oblicima, enzim izmene je specifično doveden do ćelija lizozoma dubokog moždanog tkiva.

[0027]U nekim oblicima, duboka moždana tkiva kojima je doveden enzim izabrana su kao bela masa cerebruma, siva masa kičmene moždine, corpus collosum, periventrikulamo tkivo, talamus, fimbrija, tkivo ispod , cerebralnog kortikalnog tkiva promene (eng. cerebral cortical ribbon tissues), tkivo 4 mm ispod površine cerebruma, tkivo 6 mm ispod površine cerebruma, tkivo 10 mm ispod površine cerebruma, sloj Purkinjeovih ćelija, sloj zrnastih ćelija, cerebralna jedra i njihova kombinacija.

[0028]U još jednom aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje metode uključujući korak intratekalnog administriranja subjektu koji pati ili je podložan lizozomskim bolestima nakupljanja povezanim sa sniženim nivoom ili aktivnošću lizozomskih enzima. Kompozicija koja sadrži enzim izmene lizozomskog enzima proizveden je iz humanih ćelija.

[0029]U nekim oblicima, lizozomske bolesti nakupljanja izabrane su iz grupe koju Čine aspartilglukozaminurija, bolest nakupljanja estra holesterola, Wolmanova bolest, cistinoza, Danonova bolest, Fabrijeva bolest, Farberova lipogranulomatoza, Farberova bolest, fukozidoza, galaktozialidoza tip I/II, Gaucherova bolest tipovi I/II/III, Krabbeova bolest (globoidna ćelijska leukodistrofija), bolest nakupljanja glikogena II, Pompeova bolest, GMl-gangliozidoza tipovi I/II/III, GM2-gangliozidoza tip I, Tay Sachsova bolest, GM2 gangliozidoza tip II, Sandhoffova bolest, GM2-gangliozidoza, a-manozidoza tipovi I/II, B-manozidoza, metahromatska leukodistrofija, mukolipidoza tip I, sialidoza tipovi I/II, mukolipidoza tipovi II/III, mukolipidoza tip IV, bolest I-ćelije, mukolipidoza tip IIIC pseudo-Hurlerova polidistrofija, mukopolisaharidoza tip I, mukopolisaharidoza tip II, Hunterov sindrom, mukopolisaharidoza tip IIIA, Sanfilippov sindrom tip A, B, ili D (mukopolisaharidoza tip IIIB, mukopolisaharidoza tip IIIC, mukopolisaharidoza tip IIID), mukopolisaharidoza tip IVA, Morquiov sindrom, mukopolisaharidoza tip IVB, mukopolisaharidoza tip VI, mukopolisaharidoza tip VII, Slyev sindrom, mukopolisaharidoza tip IX, deficijencija multipla sulfataze, neuronska ceroidna lipofuscinoza, CLN1 Battenova bolest, CLN2 Battenova bolest, Niemann-Pickova bolest tipovi A/B, Niemann-Pickova bolest tip Cl, Niemann-Pickova bolest tip C2, piknodisostoza, Schindlerova bolest tipovi I/II, Gaucherova bolest i bolest nagomilavanja sijalinske kiseline.

[0030]U nekim oblicima, lizozomske bolesti nakupljanja izabrane su iz grupe koju čine Hunterov sindrom, bolest metahromatske leukodistroflje, Sanfilippov sindrom tip A, Sanfiiippov sindrom tip B i bolest globoidne ćelijske leukodistrofije (GLD). U određenim oblicima, enzim izmene izabran je iz grupe koju čine rekombinantna iduronat-2-sulfataza (I2S), arilsulfataza A (ASA), heparan N-sulfataza (HNS), alfa-N-acetilglukozaminidaza (Naglu) i p-galaktozidaza (GLC). U nekim oblicima, enzim izmene sadrži ostatke manoza-6-fosfata (M6P). U nekim oblicima, enzim izmene je vezivni protein koji sadrži ciljani lizozomski ostatak.

[0031]U nekim oblicima, enzim izmene dovodi se neuronima, giijalnim ćelijama, perivaskularnim ćelijama i/ili ćelijama moždane opne. U određenim oblicima, enzim izmene dalje se dovodi neuronima u kičmenoj moždini.

[0032]U nekim oblicima, intratekalna administracija dalje rezultuje u sistemskom otpuštanju enzima izmene u ciljanom perifernom tkivu. U određenim oblicima, ciljana periferna tkiva izabrana su iz jetre, bubrega i/ili srca, endotela, koštane srži, ćelija dobijenih iz koštane srži, slezine, pluća, limfnih čvorova, kosti i hrskavice, jajnika i testisa.

[0033]U nekim oblicima, intratekalna administracija rezultuje u lizozomskoj lokalizaciji enzima izmene u ciljanom moždanom tkivu, neuronima kičmene moždine i/ili ciljanom perifernom tkivu. U nekim oblicima, intratekalna administracija rezultuje u redukciji GAG nagomilavanja u ciljanom moždanom tkivu, neuronima kičmene moždine i/ili ciljanom perifernom tkivu. U određenim oblicima, GAG nagomilavanje redukovano je najmanje za 20%, 40%, 50%, 60%, 80%, 90%, 1-put, 1,5-put ili 2-puta u poređenju sa kontrolom.

[0034]U nekim oblicima, intratekalna administracija rezultuje u redukovanoj vaukolizaciji kod neurona. U nekim oblicima, neuroni sadrže Purkinjeove ćelije.

[0035]U nekim oblicima, intratekalna administracija rezultuje u povećanju enzimske aktivnosti izmene enzima u ciljanom moždanom tkivu, neuronima kičmene moždine i/ili ciljanom periferalnom tkivu. U određenim oblicima, enzimska aktivnost povećava se najmanje 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ili 10 puta u poređenju sa kontrolom. U određenim oblicima, povećana aktivnost enzima je najmanje oko 10 nmol/hr/mg, 20 nmoi/h/mg, 40 nmol/h/mg, 50 nmol/h/mg, 60 nmol/h/mg, 70 nmol/h/mg, 80 nmol/h/mg, 90 nmol/h/mg, 100 nmol/h/mg, 150 nmol/h/mg, 200 nmol/h/mg, 250 nmol/h/mg, 300 nmol/h/mg, 350 nmol/h/mg, 400 nmol/h/mg, 450 nmol/h/mg, 500 nmol/h/mg, 550 nmol/h/mg ili 600 nmol/h/mg.

[0036]U nekim oblicima, aktivnost enzima povećana je u slabinskom segmentu. U određenim oblicima, povećana aktivnost enzima u slabinskom segmentu je najmanje oko 500 nmol/h/mg, 600 nmol/h/mg, 700 nmol/h/mg, 800 nmol/h/mg, 900 nmol/h/mg, 1000 nmol/h/mg, 1500 nmol/h/mg, 2000 nmol/h/mg, 3000 nmol/h/mg, 4000 nmol/h/mg, 5000 nmol/h/mg, 6000 nmol/h/mg, 7000 nmol/h/mg, 8000 nmol/h/mg, 9000 nmol/h/mg ili10,000 nmol/h/mg.

[0037]U nekim oblicima, lizozomske bolesti nakupljanja povezane su sa perifernim simptomima, a metod dalje sadrži intravenozno administriranje enzima izmene subjektu. U određenim oblicima, intravenozna administracija nije češća od jednom nedeljno (npr. nije frekventnija od dve nedeije, jednom mesečno, jednom u dva meseca, jednom u tri meseca, jednom u Četiri meseca, jednom u pet mesed ili jednom u šest meseci). U određenim oblicima, intravenozna administracija nije češća od mesečne administracije, kao što je dvaput nedeljno, jednom nedeljno, svake druge nedeije ih dvaput mesečno. U nekim oblicima, intravenozna i intratekalna administracija vrši se u istom danu. U nekim oblicima, intravenozna i intratekalna administracija ne vrše se istovremeno u određenom vremenskom periodu, barem na 2, 3, 4, 5, 6, 7 dana ili barem jednom nedeljno. U nekim oblicima, intravenzona i intratekalna administracija vrše se naizmenično, kao što je naizmenična administracija jednom nedeljno, svake druge nedeije, dvaput mesečno ili mesečno. U nekim oblicima, intratekalna administracija zamenjuje intravenoznu administraciju pri rasporedu administracije tako što se intravenozna vrši jednom nedeljno, svake druge nedeije, dvaput mesečno ili jednom mesečno i svaka treća, četvrta ili peta administracija u tom rasporedu može da bude zamenjena intratekalnom administracijom. U nekim oblicima, intravenozna administracija zamenjuje intratekalnu administraciju u rasporedu administracije, tako da se intratekalno administrira jednom nedeljno, svake druge nedeije, dvaput mesečno ili jednom mesečno i svaka treća, četvrta ili peta administracija u tom rasporedu može da bude zamenjena intravenoznom administracijom umesto intratekalnom. U nekim oblicima, intravenozna i intratekalna administracija vrše se sekvencijalno, kao što je korišćenje prvo intravenozne administracije (npr. jednom nedeljno, svake druge nedeije, dvaput mesečno ili mesečno doziranje više od dve nedeije, mesec dana, dva, tri, četiri, pet, šest meseci, godinu dana ili više). U nekim oblicima, intratekalna administracija se izvodi prva (npr. jednom nedeljno, svake druge nedeije, dvaput mesečno, jednom mesečno, jednom u dva meseca, jednom na svaka tri meseca dozira se dve nedeije, mesec dana, dva, tri, Četiri, pet, šest meseci, godinu dana ili više) praćeno intravenoznom administracijom (npr. jednom nedeljno, svake druge nedeije, dvaput mesečno ili mesečno doziranje više od dve nedeije, mesec dana, dva, tri, četiri, pet, šest meseci, godinu dana ili više).

[0038]U nekim oblicima, lizozomske bolesti nakupljanja povezane su sa perifernim simptomima i metod uključuje administriranje enzima izmene intratekalno, ali ne uključuje intravenozno administriranje enzima izmene subjektu. U određenim oblicima, intratekalna administracija izmene enzima poboljšava ili redukuje jedan ili više perifernih simptoma deficijencije izmene enzima kod subjekta.

[0039]U još jednom aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje metode lečenja Hunterovog sindroma uključujući korak intratekalne administracije rekombinantnog enzima iduronat-2-sulfataze (I2S) subjektu kome je potreban tretman pri terapeutski efektivnoj dozi i intervalu administracije tako da se najmanje jedan simptom ili svojstvo Hunterovog sindroma redukuje u intenzitetu, ozbiljnosti, frekvenciji ili je odložen početak. U nekim oblicima, najmanje jedan simptom ili svojstvo Hunterovog sindroma su kognitivno oštećenje; lezije bele mase; prošireni perivaskulami prostor u parenhimu mozga, ganglije, corpus callosum i/ili moždano stablo; atrofija; i/ili ventrikulomegalija.

[0040]U još jednom aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje metode za lečenje metahromatske leukodistrofije (MLD) uključujući korak intratekalne administracije rekombinantnog enzima arilsulfataze A (ASA) pri terapeutski efektivnoj dozi i intervalu administracije tako da je najmanje jedan simptom ili svojstvo MLD-a redukovano u intenzitetu, ozbiljnosti, frekvenciji ili je odložen početak. U nekim oblicima, najmanje jedan simptom ili svojstvo MLD-a je povećan intrakranijalni pritisak, hidrocefalija, akumulirani sulfatni glikolipidi u mijelinskim omotačima u centralnom i perifernom nervnom sistemu i u visceralnim organima, progresivna demijelinacija, aksonski gubitak unutar CNS-a o PNS-a i/ili motorna i kognitivna disfunkcija.

[0041]U daljem aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje metode lečenja Sanfilippovog sindroma tipa A (Sanfilippo A) uključujući intratekalnu administraciju rekombinantnog enzima N sulfataze subjektu kome je lečenje potrebno pri terapeutski efektivnoj dozi i intervalu administracije tako da je najmanje jedan simptom ili svojstvo Sanfilippo A redukovano u intenzitetu, ozbiljnosti, frekvenciji ili je odložen početak.

[0042]U daljem aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje metode lečenja Sanfilippovog sindroma B (Sanfilippo B) uključujući korak intratekalne administracije rekombinantnog enzima aifa-N-acetilglukozaminidaze (Naglu) subjektu kome je potrebno lečenje pri terapeutski efektivnoj dozi i intervalu administracije tako da je najmanje jedan simptom ili svojstvo Sanfilippo B redukovano u intenzitetu, ozbiljnosti, frekvenciji ili je odložen početak.

[0043]U nekim oblicima, najmanje jedan simptom ili svojstvo Sanfilippa A ili Sanfilipa Bje gubitak sluha, oštećen razvoj govora, deficit motornih sposobnosti, motorička hiperaktivnost, progresivno kognitivno oštećenje, agresivnost i/ili poremećaj spavanja.

[0044]U nekim oblicima, rekombinantni Naglu enzim je fuzioni protein koji sadrži Naglu i ciljani lizozomski ostatak. U određenim oblicima ciljani lizozomski ostatak je IGF-II.

[0045]U narednom aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje metode lečenja Krabbeove bolesti uključujući korak intratekalne administracije rekombinantnog enzima |3-galaktozidaze (GLC) subjektu kome je potrebno lečenje pri terapeutski efektivnoj dozi i intervalu administracije tako da je najmanje jedan simptom ili svojstvo Krabbeove bolesti redukovano u intenzitetu, ozbiljnosti, frekvenciji ili je odložen početak. U nekim oblicima, najmanje jedan simptom ili svojstvo Krabbeove bolesti su razdražljivost, konvulzije, narušen mentalni razvoj, gluvoća, slepilo, mioklonični napadi, preteran mišični tonus, zaostatak u razvoju, regresija razvojnih sposobnosti, hipersenzitivnost, trernor, ataksija, grčevi, epizodno jako povraćanje, leukodistrofija, cerebralna atrofija, smanjen razvoj globoidnih ćelija i/ili demijelinacija.

[0046]U narednom aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje uređaje za intratekalnu administraciju uključujući port za ulaz fluida; šuplje telo ima otvor koji povezuje primarni protok sa portom za ulaz fluida, a otvor za sekundarni protok konfigurisan je za insertaciju u kičmenu moždinu; i obezbeđivanje mehanizma za obezbeđivanje insertacije šupljeg tela u kičmenu moždinu. U nekim oblicima, mehanizam obezbeđivanja sadrži jedan ili više otvora montiranih na površinu šupljeg tela sa prstenovima koji mogu da se podešavaju preko jednog ili više otvora. U nekim oblicima, port za ulaz fluida sadrži rezervoar. U određenim oblicima, ulazni port fluida je implantabilan. U nekim oblicima, port za ulaz fluida je mehanička pumpa.

[0047]Kao što je korišćeno u ovom patentu, pojmovi "oko" i "približno" korišćeni su kao sinonimi. Svaka numeracija korišćena u patentu sa ili bez oko/približno imaju za cilj da pokriju svaku normalnu fluktuaciju ocenjenu od strane stručnjaka u relevantnoj praksi.

[0048]Druge odlike, predmeti i prednosti predmetnog pronalaska očigledni su u detaljnom opisu koji sledi. Treba razumeti, međutim, da detaljni opis koji ukazuje na oblike predmetnog pronalaska je dat samo u ilustrativne svrhe, bez ograničenja. Različite promene i modifikacije postaće očigledne stručnjacima u praksi iz detaljnog opisa.

KRATAK OPIS SLIKA

[0049]Slike su prikazane samo u ilustrativne svrhe, ne za ograničenje.

Slika 1 opisuje primer dijagrama uređaja za intratekalno otpuštanje leka sa zaštitnim mehanizmom.

Slika 2A prikazuje primere mesta na telu pacijenta gde može da se postavi uređaj za intratekalno otpuštanje leka; Slika 2B prikazuje različite komponente uređaja za intratekalno otpuštanje; i slika 2C prikazuje primer mesta insertacije u telu pacijenta za IT-lumbalno injektiranje.

Slika 3 prikazuje primere sumiranih rezultata testiranja inertnih medijuma kod majmuna.

Slika 4 prikazuje rezultate koji ilustruju termalni prikaz hGalC zavisnosti stabilnosti hGalC od pH vrednosti.

Slika 5 prikazuje rezultate koji ilustruju zavisnost specifične aktivnosti hGalC od pH vrednosti.

Slika 6 prikazuje rezultate koji ilustruju termalni prikaz zavisnosti hGalC od koncentracije soli.

Slika 7 prikazuje rezultate koji ilustruju brzinu sedimentacije GalC poredeći različite jonske jačine u 5 mM Na fosfatnom puferu na pH vrednosti od 6,0. Slika 7A prikazuje rezultate koristeći 50mM NaCI i hGalC. Slika 7B prikazuje rezultate koji ilustruju 150mM NaCI i hGalC. Slika 7C prikazuje rezultate koji ilustruju 500mM NaCI i hGalC. Slika 7D prikazuje rezultate koji ilustruju 150mM NaCI i mišji GalC.

Slika 8 prikazuje rezultate koji ilustruju zavisnost GalC AUC profila od koncentracije soli (lmg/ml GalC, 5mM Na fosfat, pH 6,0)(Y osa = s<*>g(s<*>); X osa = s<*>).

Slika 9 prikazuje rezultate koji ilustruju seriju razblaženja hGalC u univerzalnom puferu, pH 6,0 (Y-osa =

<g(s<*>)/Co>(l/svedberg); X-osa = s<*>(svedbergs)).

Slika 10 prikazuje rezultate koji ilustruju zavisnost GalC AUC profila od pH vrednosti (lmg/ml, 3mM citratni, fosfatni i boratni pufer sa 50mM NaCI).

Slika 11 prikazuje rezultate koji ilustruju početna očitavanja iz WDA analize pri najvišoj koncentraciji na pH vrednosti od 6,0, u 5mM Na fosfatu i 150mM NaCI.

Slika 12 prikazuje rezultate koji ilustruju očitavanje stresa iz WDA analize pri najvišoj koncentraciji na pH vrednosti od 6,0, u 5mM Na fosfatu i 150mM NaCI.

Slika 13 grafički upoređuje i poklapa početne i GalC uzorke izazvane stresom.

Slika 14 prikazuje rezultate koji ilustruju seriju razblaživanja hGalC u prisustvu 1% NaTC.

Slika 15 prikazuje rezultate koji ilustruju seriju razblaživanja hGalC u prisustvu 1% NaTC (l,0mg/rnl i 0,3mg/ml).

Slika 16 prikazuje rezultate koji ilustruju unutrašnju fluorescenciju hGalC (lmg/ml) u različitim puferima i pri različitim pH vrednostima.

Slika 17 prikazuje rezultate koji ilustruju zavisnost cirkularnog dihroizma hGalC od pH vrednosti.

Slika 18 prikazuje rezultate koji ilustruju grupu srednjih vrednosti koncentracija radioaktivnosti u serumu, krvi i crvenim krvnim zrncima mužjaka Sprague-Dawley pacova praćeno pojedinačnom intratekalnom dozom<1!5>I-hGalC.

Slika 19 prikazuje rezultate koji ilustruju grupu srednjih vrednosti koncentracija radioaktivnosti u serumu, srcu, bubrezima, jetri, plućima, slezini mužjaka Sprague-Dawley pacova praćeno pojedinačnom intratekalnom dozoml25I-hGalC.

Slika 20 prikazuje rezultate koji ilustruju grupu srednjih vrednosti koncentracija radioaktivnosti u serumu, srcu, bubrezima, jetri, plućima, slezini mužjaka Sprague-Dawley pacova praćeno pojedinačnim intravenoznim bolusnim injektiranjem "sI-hGalC.

Slika 21 prikazuje rezultate koji ilustruju grupu srednjih vrednosti koncentracija radioaktivnosti u serumu, srcu, bubrezima, jetri, plućima, slezini mužjaka Sprague-Dawley pacova praćena pojedinačnom intratekalnom dozom i intravenoznim bolusnim injektiranjem '<25>I-hGalC.

Slika 22 prikazuje rezultate koji ilustruju grupu srednjih vrednosti koncentracija radioaktivnosti u serumu i različitim tkivima (adipozno tkivo (masno tkivo bubrega), nadbubrežne žlezde, kosti (femur), mišići (skeletni), ištjadični živac)) mužjaka Sprague-Dawley pacova praćena pojedinačnom intratekalnom dozom<12S>I-hGalC.

Slika 23 prikazuje rezultate koji ilustruju grupu srednjih vrednosti koncentracija radioaktivnosti u serumu i različitim tkivima (adipozno tkivo (masno tkivo bubrega), nadbubrežne žlezde, kosti (femur), mišići (skeletni), išijadični živac)) mužjaka Sprague-Dawley pacova praćeno pojedinačnom intravenoznim bolusnim injektiranjem 1251-hGalC.

Slika 24 prikazuje rezultate koji ilustruju grupu srednjih vrednosti koncentracija radioaktivnosti u serumu i različitim tkivima (adipozno tkivo (masno tkivo bubrega), nadbubrežne žlezde, kosti (femur), mišići (skeletni), išijadični živac)) mužjaka Sprague-Dawley pacova praćeno pojedinačnom intratekalnom dozom i intravenoznim bolusnim injektiranjem<liS>I-hGalC.

Slika 25 prikazuje rezultate koji ilustruju srednje vrednosti koncentracija radioaktivnosti u serumu, cerebrospinalnoj tečnosti i različitim tkivima mužjaka Sprague-Dawley pacova praćene pojedinačnom intratekalnom dozom 12!I-hGalC.

Slika 26 prikazuje rezultate koji ilustruju srednje vrednosti koncentracija radioaktivnosti u serumu, cerebrospinalnoj tečnosti i različitim tkivima mužjaka Sprague-Dawley pacova praćene pojedinačnom intravenoznim bolusnim injektiranjem

'"IhGalC.

Slika 27 prikazuje rezultate koji ilustruju srednje vrednosti koncentracija radioaktivnosti u serumu, cerebrospinalnoj tečnosti i različitim tkivima mužjaka Sprague-Dawley pacova praćene pojedinačnom intratekalnom dozom i intravenoznim bolusnim injektiranjem 1Z5I-hGalC.

Slika 28 prikazuje rezultate koji ilustruju srednje vrednosti koncentracija radioaktivnosti u serumu, tkivima mužjaka Sprague-Dawley pacova praćene pojedinačnom intratekalnom dozom<l25>I-hGalC.

Slika 29 prikazuje rezultate koji ilustruju srednje vrednosti koncentracija radioaktivnosti u serumu, tkivima mužjaka Sprague-Dawley pacova praćene pojedinačnim intravenoznim bolusnim injektiranjem "<5>I-hGalC.

Slika 30 prikazuje rezultate koji ilustruju srednje vrednosti koncentracija radioaktivnosti u serumu, tkivima mužjaka Sprague-Dawley pacova praćene pojedinačnom intratekalnom dozom i intravenoznim bolusnim injektiranjem<1Z5>I-hGalC.

Slika 31 prikazuje rezultate koji ilustruju IP administraciju rmGalC koji redukuje nivo psihozina u mozgu kod miševa sa grčevitim trzajima. Podaci pokazuju srednju vrednost ± SEM za n=4miševa po grupi koja se tretira.

Slika 32 prikazuje rezultate koji ilustruju povećano preživljavanje samo sa ICV terapijom i ICV/IP rmGalC terapijom.

Slika 33 prikazuje rezultate koji ilustruju to da je psihozin u mozgu značajno redukovan posle ICV i ICV/IP injektiranja rmGalC kod miševa sa grčevitim trzajima.

Slika 34 prikazuje rezultate koji ilustruju poboljšanje histoloških markera posmatranim kod miševa sa grčevitim trzajima tretiranim sa 40 ug rmGalC. Glijalni fibrilarni kiselinski protein (GFAP) korišćen je kao astrocitni marker. Iba 1 korišćen je kao mikroglijalni/makrofagni marker. Lizozomska povezana membrana protein-1 (LAMP-1) korišćena je kao lizozomski marker.

Slika 35 prikazuje rezultate koji ilustruju reakumulaciju psihozina praćenu pojedinačnim ICV injektiranjem rmGalC ili inertnim medijumom.

Slika 36 prikazuje rezultate koji ilustruju procenat preživljavanja kod miševa sa grčevitim trzajima tretiranim sa pojedinačnim ICV injektiranjem rmGalC na PND19/20. Podaci pokazuju n= 8 po grupi.

Slika 37 prikazuje rezultate koji ilustruju procenat preživljavanja miševa tretiranih pomoću ICV/IP sa rmGalC i rhGalC.

Slika 38 prikazuje rezultate koji ilustruju analizu retanja miševa tretiranih ICV injektiranim rmGalC i rhGalC.

Slika 39 prikazuje rezultate koji ilustruju antigeni odgovor na rmGalC ili rhGalC kod miševa sa grčevitim trzajima.

Slika 40 prikazuje rezultate koji ilustruju nivoe psihozina u cerebrospinalnoj tečnosti običnih pasa i rhGaIC-tretiranih GLD pasa.

Slika 41 prikazuje rezultate koji ilustruju IHC obojenje IT injektiranog GalC u cerebrumu sa grupom 1 poliklonskih antitela.

Slika 42 prikazuje rezultate koji ilustruju IHC obojenje IT injektiranog GalC u cerebrumu sa grupom 2 antitela.

Slika 43 prikazuje rezultate koji ilustruju IHC obojenje IT injektiranog GalC u cerebrumu sa mišjim monoklonskim antitelom.

Slika 44 prikazuje rezultate koji ilustruju IHC obojenje IT injektiranog GalC u cerebrumu sa mišjim monoklonskim antitelom.

Slika 45 prikazuje rezultate koji ilustruju IHC obojenje IT injektiranog GalC u jetri sa mišjim monoklonskim antitelom.

Slika 46 prikazuje rezultate koji ilustruju IHC obojenje TT injektiranog GalC u jetri sa grupom 2 poliklonskih antitela.

Slika 47 prikazuje rezultate koji ilustruju srednju aktivnost GalC u mozgu.

Slika 48 prikazuje rezultate koji ilustruju srednju GalC aktivnost u jetri.

Slika 49 prikazuje rezultate koji ilustruju GalC imuno obojenje u mozgu pri uvećanju od 10X.

Slika 50 prikazuje rezultate koji ilustruju GalC imuno obojenje u mozgu pri uvećanju od 40X.

Slika 51 prikazuje rezultate koji ilustruju Iba obojenje aktiviranih mikroglija pri uvećanju od 40X.

Slika 52 prikazuje rezultate koji ilustruju LFB/PAS obojenje u mozgu pri uvećanju od 10X.

Slika 53 ilustruje primere I2S IHC koji pokazuju I2S detektovan u neuronima (pokazani strelicom) cerebralnom i cerebelarnom korteksu uključujući sloj ćelija moždane opne koje pokrivaju površinu mozga (vrh strelice ukazuje na njih) praćeno intratekalnom injektiranjem 3 doze I2S. Obojenje I2S IHC u 2 doze koji je injektiran u mozak je slabije (slika to ne pokazuje). Nije bilo primećeno pozitivno I2S obojenje za bilo koji tip ćelija u mozgu životinja kontrolisanih inertnim medijumom. 40X.

Slika 54 prikazuje primer reverzne patologije u mozgu IKO miševa posle intratekalnog-slabinskog I2S injektiranja. H&E obojenje tkiva mozga pokazalo je brojne ćelijske vakuole nakupljanja (prikazano strelicama) u životinjama kontrolisanih inertnim medijumom. Ćelijska vakuolizacija redukovana je kroz mozak u obe doze (slika nije prikazana) i kod treće doze koja je injektirana mišu. Ciljana redukcija nađena je u 3 doze koje su injektirane. 40X.

Slika 55 prikazuje primer imunohistohemijskog obojenja LAMP-1, gde je ciljana redukcija lizozomske aktivnosti u mozgu nakon 2 doze (slika nije prikazana) i treće doze I2S tretmana u poređenju sa miševima kontrolisanim inertnim medijumom. Redukcija je okarakterisana smanjenjem broja LAMP-1 pozitivnih ćelija i svetlijim obojenjem moždanih segmenata. 40X.

Slika 56 prikazuje primer rezultata morfometrije poređenjem srednje vrednosti LAMP-1 pozitivne površine "divljeg tipa"

(WT), netretiranog inertnog medijuma i I2S (2 i 3 doze), cerebralnog korteksa miševa (Korteks), caudate nucleus (CP), talamusa (TH), bele mase (WM) i cerebeluma (CBL) potvrđujući da postoji znatna redukcija u LAMP-1 pozitivnom obojenju na svim površinama mozga koje se procenjuju. Rezultati su prikazani kao srednja vrednost ± s.d. # = P<0,05;

<*>= P<0,01;<**>= P<0,001.

Slika 57 prikazuje primer elektronskih mikrografa moždanih ćelija koje su pokazale patološka poboljšanja na ultrastrukturnom nivou. Neuroni miševa tretiranih inertnim medijumom imali su lamelarne inkluzije, strukture nalik na zebrinim šarama i vakuole koje sadrže granularni materijal nagomilavanja (insert) koji je redukovan injektiranjem I2S miševima. Oligodendrociti miševa koji su tretirani inertnim medijumom pokazali su velike vakuole nakupljanja koje su transparentne za elekrone (prikazane strelicom), dok oligodendrociti kod miševa sa injektiranim I2S imaju minimalnu vakuolizaciju. Red veličina: kod neurona, 2 pm; kod oligodendrocita, 500 nm.

Slika 58 prikazuje primer imunohistohemijskih rezultata koji pokazuju I2S detekciju u sinusnim ćelijama jetre praćenu intratekalnim injektiranjem 3 doze I2S. 2S IHC obojenje u 2 doze injektovane u jetru je slabije (slika nije prikazana). Nije posmatrano pozitivno I2S obojenje u jetri životinja kontrolisanih inertnom medijumu. 40X.

Slika 59 prikazuje primer tkiva iz jetre. Ozbiljna ćelijska vakuolizacija i abnormalno visoka aktivnost lizozoma otkrivena je pomoću H&E obojenja i uočeno je jako LAMP-1 imunoobojenje kod životinja kontrolisanim u inertnom medijumu u poređenju sa onima "divljeg tipa". Obeležena redukcija ćelijske vakuolizacije i LAMP-1 imunoobojenja nađeno je posle intratekalnog tretmana sa 3 ili 2 doze (slika nije prikazana) tretmana sa I2S. H&E obojenjem otkriveno je da intracitoplazmična vakuolizacija skoro potpuno nestaje sa skoro normalnom ćelijskom strukturom jetre. H&E, 40X; LAMP-1, 20X.

Slika 60 prikazuje primer tkiva koji pokazuje cerebrum grupe životinja tretiranih sa 3 mg. Pozitivno I2S obojenje posmatrano je u ćelijama moždane opne. 4X.

Slika 61 prikazuje primer tkiva koji pokazuje cerebrum grupe životinja tretiranih sa 30 mg. Pozitivno I2S obojenje posmatrano je u neuronima i ćelijama moždane opne. 4X.

Slika 62 prikazuje primer tkiva koji pokazuje cerebrum grupe životinja tretiranih sa 100 mg. Pozitivno I2S obojenje posmatrano je u neuronima i ćelijama moždane opne jače je nego kod životinja tretiranih sa 3 i 30 mg. 4X.

Slika 63 prikazuje primer tkiva koji pokazuje cerebrum grupe životinja tretiranih sa 150 mg. Posmatrana je velika populacija neurona kao I2S pozitivnih zajedno sa jako pozitivnim ćelijama moždane opne.

Slika 64 prikazuje primer tkiva koja pokazuju I2S pozitivne neurone i glijalne ćelije, zajedno sa ćelijama moždane opne sa slojem I cerebruma kod grupe životinja tretiranih sa 30 mg. 40X.

Slika 65 prikazuje primer tkiva koji pokazuju I2S pozitivne neurone, glijalne ćelije, zajedno sa perivaskularnim ćelijama sa slojem III cerebruma kod grupe životinja tretiranih sa 30 mg. 40X.

Slika 66 prikazuje primer tkiva koja pokazuju I2S pozitivne neurone i glijalne ćelije zajedno sa slojem VI cerebruma koji se nalazi oko bele mase kod grupe životinja tretiranih sa 30 mg. 40X.

Slika 67 prikazuje primer tkiva koji pokazuje jako pozitivno I2S obojenje u neuronima (cerebruma) kod grupe životinja tretiranih sa 150 mg. 100X.

Slika 68 prikazuje primer tkiva koji pokazuje I2S imunoobojenje vratnih pršljenova kod grupe životinja tretiranih sa 150 mg. 4X.

Slika 69 prikazuje primer tkiva koji pokazuje I2S imunoobojenje slabinskih pršljenova kod grupe životinja tretiranih sa 150 mg. 4X.

Slika 70 prikazuje primer tkiva koji pokazuju jako pozitivno I2S imunoobojenje ćelija moždane opne, glijalnih ćelija i epi/peri/endoneurium (vezivne ćelije) u slabinskom segmentu kod grupe životinja tretiranih sa 150 mg. 40X.

Slika 71 prikazuje sliku koja pokazuje da su neuroni u slabinskim kičmenim pršljenovima jako I2S pozitivni kod grupe životinja tretiranih sa 150 mg. 40X.

Slika 72 prikazuje primer rezultata jetre kod grupe životinja tretiranih sa 3 mg. Samo sinusne ćelije su I2S pozitivne. 40X.

Slika 73 prikazuje primer rezultata jetre kod grupe životinja tretiranih sa 30 mg. Sinusne ćelije i hepatociti su I2S pozitivni. 40X.

Slika 74 prikazuje primer rezultata jetre kod grupe životinja tretiranih sa 100 mg. I2S imunoobojenje je bilo jako kod sinusnih ćelija i hepatocita. 40X.

Slika 75 prikazuje primer rezultata jetre kod grupe životinja tretiranih sa 150 mg. Jako pozitivno I2S obojenje bilo je identifikovano kod sinusnih ćelija i hepatocita. 40X.

Slika 76 prikazuje primer rezultata za srce kod grupe životinja tretiranih sa 3 mg. I2S imunoobojenje bilo je negativno. 40X.

Slika 77 prikazuje primer rezultata za srce kod grupe životinja tretiranih sa 30 mg. Intersticijalne ćelije bile su I2S pozitivne. 40X.

Slika 78 prikazuje primer rezultata za srce kod grupe životinja tretiranih sa 100 mg. Posmatrano je pozitivno obojenje intersticijalnih ćelija za I2S. 40X.

Slika 79 prikazuje primer rezultata za srce kod grupe životinja tretiranih sa 150 mg. Posmatrano je jako pozitivno obojenje intersticijalnih ćelija za I2S. 40X,

Slika 80 prikazuje primer rezultata za bubreg kod grupe životinja tretiranih sa 3 mg. I2S imunoobojenje je bilo negativno. 40X.

Slika 81 prikazuje primer rezultata za bubreg kod grupe životinja tretiranih sa 30 mg. Glomerularne i intersticijalne ćelije bile su I2S pozitivne.

Slika 82 prikazuje primer za bubreg kod grupe životinja tretiranih sa 100 mg. Posmatrano je povećano glomeluralno i intersticijalno obojenje ćelija za I2S. 40X.

Slika 83 prikazuje primer za bubreg kod grupe životinja tretiranih sa 150 mg. Posmatrano je pozitivno I2S obojenje proksimalnih tubularnih, glomerularnih i intersticijalnih ćelija. 40X.

Slika 84 prikazuje rezultate imunohistohemijskih (IHC) studija ocenjujući CNS tkiva kod cinomolgus majmuna kojima je administrirana doza idunorat-2-sulfataze (I2S) jednom nedeljno. Kao što je određeno pomoću (IHC), bilo je odbacivanja I2S iz ćelije kroz CNS. U sivoj masi, I2S detektovana je u neuronima cerebruma, cerebeluma, moždanog stabla i kičmene moždine svih grupa koje zavise od doze. Na površini sive mase pri većim dozama, veliki broj cerebralnih neurona bio je pozitivan na I2S obojenje na površini korteksa (Slika 84A). I2S takođe je detektovan u neuronima talamusa (Slika 84B), hipokampusa (Slika 84C), caudate nucleus (Slika 84D) i kičmene moždine (Slika 84E). Ćelije moždane opne i perivaskularne ćelije takođe su bile pozitivne na I2S obojenje (Slika 84F). Identifikovani red veličine odgovara 25um.

Slika 85 grafički prikazuje poređenje kJirens idunorat-2-sulfataze (I2S) kod kranijalnih "pools" i kičmenih "pools" ucrtavajući količinu I2S u ovakvim "pools" relativnih za vreme koje prati administraciju.

Slika 86 prikazuje zavisnost izbacivanja iz sive mase od intratekalno administrirane doze idunorat-2-sulfataze (I2S) kod primata u periodu od preko šest meseci. Prikazan intenzitet obojenja odgovara akumulaciji idunorat-2-sulfataze u talamusu. Na ovoj slici 86, nukleus (jedro) je obojeno sa dodatkom kontrasta pomoću DAPI i plavi protein (I2S) pokazuje se kao zeleni.

Slika 87 prikazuje zavisnost akumulacije intratekalno administrirane idunorat-2-sulfataze (I2S) od doze kod primata praćeno pojedinačnim i višestrukim injektiranjem u periodu od preko šest meseci. Prikazan intenzitet obojenja odgovara akumulaciji I2S proteina u cerebralnom korteksu.

Slika 88 prikazuje ćelijsku lokalizaciju idunorat-2-sulfataze (I2S) kroz cerebrum primata.

Slika 88A prikazuje poprečni presek tkiva mozga izvađenog iz cerebruma primata.

Slika 88B pokazuje određene površine segmenta kojima odgovaraju tri površine: tkiva bele mase (označene kao Wl, W2 i W3), bela masa blizu ventrikule (VW) i površine tkiva sive mase (SG) segmenta identifikovanog na slici 88A.

Slike 89A - D prikazuju neuronsko inkorporiranje i inkorporiranje oligodendrocita i aksonsku povezanost intratekalno administrirane idunorat-2-sulfataze (I2S) kod primata praćeno mesečnim injektiranjem u periodu od preko šest meseci. Naročito, slike 89A, 89B, 89C i 89D su primeri obojenja filamenta tkiva cerebruma kod primata kojima je intratekalno administrirana idunorat-2-sulfataza (I2S) i respektivno odgovara površinama bele mase (Wl, W2 i W3) i sive mase (SG) identifikovanim na slici 87B. Slika 89A prikazuje inkorporiranje oligodendrocita i aksonsku povezanost intratekalno administriranog I2S u W2 i W3 tkivu bele mase, respektivno. Slika 89D prikazuje neuronsko inkorporiranje intratekalno administriranog I2S na površini sive mase (SG).

Slika 90 prikazuje identifikaciju idunorat-2-sulfataze u ćelijama bele mase blizu ventrikule (VW) kod primata (strelica u gornjem levom uglu). Kao što je prikazano na superimponiranoj slici, strelice u donjem desnom uglu), iduronat-2-sulfataza nije povezana sa mijelinom (gore desno). Na slici 90, nukleusi su obojeni dodatkom kontrasta pomoću DAPI (dole levo) i protein (I2S) javlja se u gornjem levom delu slike.

Slika 91 prikazuje obojenje tkiva kod zdravih pasa rase brgl kojima je intracerebroventrikularno (ICV) i intratekalno (IT) administrirana pojedinačna doza idunorat-2-sulfataze (I2S). Kao stoje prikazano na slikama a-h, I2S se široko distribuira kroz sivu masu, i IT i ICV grupe koje su određene imunohistohemijski (IHC). Slike a i b pokazuju da su u cerebralnom korteksu neuroni pozitivni na I2S u svih šest neuronskih slojeva, od površine molekulskog sloja do dubokog unutrašnjeg sloja kod obe, IT i ICV grupe. Slike c i d pokazuju da je u cerebralnom korteksu IT i ICV grupa detektovana I2S kod neurona, uključujući Purkinjeove ćelije. Slično, slike e i f pokazuju da je kod obe, IT i ICV grupe, velika populacija neurona u hipokampusu pozitivna na I2S. Konačno, slike g i h pokazuju da su I2S pozitivni neuroni takođe pronađeni u talamusu i caudate nucleus kod obe, IT i ICV grupe. Na slici 91,12S obojenje prikazano je strelicama.

Slika 92 prikazuje poređenje corpus callosum tkiva idunorat-2-sulfataze "knock-out" (IKO) miševa koji su ili netretirani ili im je administrirana I2S intratekalno. Kao što je prikazano, tretirani IKO miševi pokazali su redukciju ćelijske vakuolizacije karakteristične za poremećaje nagomilavanja lizozoma u corpus callosum i tkivu moždanog luka (lat. fornix) kod IKO miševa tretiranih sa I2S.

Slika 93A prikazuje označenu redukciju u prisustvu lizozomski povezane membrane proteina 1 (LAMPI), patološki biomarker lizozomskih bolesti na površini cerebralnog korteksa tretiranih IKO miševa (slika 93A) povezanih sa netretiranim IKO kontrolisanim miševima (slika 93B) pod uvećanjem od 20 i 40 puta.

Slika 94 prikazuje primer uređaja za intratekalnu dostavu leka (IDDD).

Slika 95 prikazuje PORT-A-CATH<®>intratekalni sistem implementacije niskog profila.

Slika 96 prikazuje primer uređaja za intratekalnu dostavu leka (IDDD).

Slika 97 prikazuje primer uređaja za intratekalnu dostavu leka (IDDD), koji omogućava kućnu administraciju za CNS terapiju izmene enzima (ERT).

Slika 98 prikazuje primer uticaja vakuolizacije nakon pojedinačnog intracerebralnog injektiranja idursulfaze u neurone (Purkinjeove ćelije).

Slika 99 prikazuje I2S aktivnost u mozgu prema broju doza i prema regionu.

Slika 100 prikazuje rezultate imunohistohemijske lokalizacije idursulfaze pri različitim dubinama cerebralnog korteksa.

Slika 101 prikazuje primer I2S aktivnosti u kičmenoj moždini majmuna praćeno intratekalnom dozom sa idursulfazom.

Slika 102 prikazuje primer I2S aktivnosti u jetri, srcu i bubrezima majmuna nakon intratekalne doze sa idursulfazom.

Slika 103 prikazuje primer šematskog prikaza eskalacije Hunter-IT programa istraživanja.

Slika 104 prikazuje primer merenja I2S koncentracija u različitim segmentima tkiva mozga nakon doze od 30 mg. Različite krive odgovaraju različitim vremenima merenja.

Slika 105 prikazuje primer merenja koncentracije I2S nakon administracije u određenom vremenu putem različitih načina administracije za proizvode različitih koncentracija.

Slika 106 prikazuje PET slike 124I-obeležene idursulfaze-IT kod cinomolgus majmuna pri t=5 sati prateći IV,

IT-L ili ICV doziranje.

Slika 107 prikazuje primere koji pokazuju rezultate ASA koncentracije u serumu nakon intravenozne administracije.

Slika 108 prikazuje primere koji pokazuju rezultate ASA koncentracije u serumu nakon IT-slabinske administracije.

Slika 109 prikazuje ASA koncentraciju u CSF nakon IV administracije.

Slika 110 prikazuje primere koji pokazuju rezultate ASA koncentracije u CSF nakon IT-slabinske administracije.

Slika 111 prikazuje foto-mikrografički primer moždanog tkiva, moždanih opni, koji se infiltriraju nakon tretmana (grupe srednjih i visokih doza, za oba pola).

Slika 112 prikazuje još jedan foto-mikrografički primer moždanog tkiva, moždanih opni, koji se infiltriraju nakon tretmana (grupe srednjih i visokih doza, za oba pola).

Slika 113 prikazuje još jedan foto-mikrografički primer moždanog, perivaskularnog tkiva, koji se infiltriraju nakon tretmana (srednja doza za mužjake; visoka doza za ženke).

Slika 114 prikazuje primer "Alcian" plavog obojenja kičmene moždine imunotolerantnih MLD miševa tretiranih sa rhASAl i rezultati predstavljaju redukciju sulfatida kao što je određeno "Alcian" plavim obojenjem vratnih pršljenova kod životinja koje su primale rhASA intratekalnim injetiranjem prvog, osmog, petnaestog i dvadesetdrugog dana pri dozi od 520 mg/kg težine mozga ili su kontrolisane inertnim medijumom. Kao što je pokazano, lečenje intratekalnim injektiranjem rhASA rezultuje u redukciji sulfatida nakupljenih u kičmenoj moždini, uključujući vratni segment kičmene moždine.

Slika 115 prikazuje primer morfometrijske analize "Alcian" plavog obojenja segmenata kičmene moždine MLD miševa tretiranih sa rhASAl i rezultujući primerima optičke gustine "Alcian" plave u celokupnoj kičmenoj moždini (T-kičmena moždina), celokupnoj sivoj masi (T-GM), slabinskoj sivoj masi (L-GM), vratnoj sivoj masi (C-GM), celokupnoj beloj masi (T-WM), slabinskoj beloj masi (L-WM) i vratnoj beloj masi (C-WM) što je određeno morfometrijskom analizom. Kao što je prikazano, statistički značajna redukcija "Alcian" plavog obojenja posmatrana je kod životinja tretiranih sa rhASA u poređenju sa onima kontrolisanim inertnim medijumom.

Slika 116 prikazuje primer redukcije LAMP obojenja u beloj masi (Fimbrta) imunotolerantnih MLD miševa tretiranih sa rhASAl što prikazuje rezultate LAMP-1 nivoa u beloj masi kao što je određeno tmunohistohemijski. Uvećanje = 20X. Kao što je pokazano, tretman sa intratekalno injektiranom rhASA rezultuje u redukciji LAMP-1 u cerebralnoj beloj masi.

Slika 117 prikazuje primere morfometrijske analize LAMP obojenja mozga imunotolerantnih MLD miševa tretiranih sa rhASAl i rezultujući u intenzitetu obojenja LAMP-1 u corpus collosum (CC), fimbria (F), cerebelarnoj beloj masi (CB-WM) i moždanom stablu (BS) životinja tretiranih sa 20 mg/kg intravenozno rhASA, 300 mg/kg težine mozga intratekalnim rhASA, 520 mg/kg težine mozga intravenoznim rhASA ili kontrolisani inertnim medijumom.

Slika 118 prikazuje primere koncentracije ASA u uzorcima mozga doziranih u inertnom medijumu mladih cinomolgus majmuna praćeno IT doziranjem svake druge nedeije u vremenskom periodu od 6 meseci (glavna autopsija).

Slika 119 prikazuje primere koncentracije ASA u uzorcima mozga mladih cinomolgus majmuna praćeno IT doziranjem svake druge nedeije pri dozi rhASAl od 1,8 mg/dozi u vremenskom periodu od 6 meseci (glavna autopsija).

Slika 120 prikazuje primere koncentracija ASA u uzorcima mozga mladih cinomolgus majmuna praćeno IT doziranjem svake druge nedeije pri dozi rhASAl od 6,0 mg/dozi u vremenskom periodu od 6 meseci (osnovna nekropsija).

Slika 121 prikazuje primere koncentracija rhASA u uzorcima mozga mladih cinomolgus majmuna praćeno IT doziranjem svake druge nedeije pri dozi rhASAl od 18,6 mg/dozi u vremenskom periodu od 6 meseci (osnovna autopsija).

Slika 122 prikazuje primere koncentracija rhASA u uzorcima mozga mladih cinomolgus majmuna praćeno IT doziranjem (PBS-kontrola) u vremenskom periodu od 6 meseci (osnovna nekropsija).

Slika 123 prikazuje primere koncentracija rhASA u uzorcima mozga mladih cinomolgus majmuna praćeno IT doziranjem inertnog medijuma svake druge nedeije u vremenskom periodu od 6 meseci (osnovna nekropsija).

Slika 124 prikazuje primere koncentracije rhASA u uzorcima mozga mladih cijanomolgus majmuna praćeno IT doziranjem 1,8 mg/dozi rhASAl svake druge nedeije u vremenskom periodu od 6 meseci (osnovna nekropsija).

Slika 125 prikazuje primere koncentracije rhASA u uzorcima mozga mladih cijanomolgus majmuna praćeno IT doziranjem 6,0 mg/dozi rhASAl svake druge nedeije u vremenskom periodu od 6 meseci (osnovna nekropsija).

Slika 126 prikazuje primere koncentracije rhASA u uzorcima mozga mladih cijanomolgus majmuna praćeno IT doziranjem 18,6 mg/dozi rhASAl svake druge nedeije u vremenskom periodu od 6 meseci (osnovna nekropsija).

Slika 127 prikazuje primer koncentracije rhASA u izabranim uzorcima sa površine mozga za kontrolu uređajem, inertni medijum, 1,8 mg, 6,0 mg i 18,6 mg tretiranih životinja, (odvojeno mužjaci i ženke, podaci za kontrolu uređajem su iz nekropsije regeneracije, svi ostali podaci su iz osnovne nekropsije).

Slika 128 prikazuje primer koncentracije rhASA kod izabranih uzoraka sa površine duboke bele mase za kontrolu uređajem, inertni medijum, 1,8 mg, 6,0 mg i 18,6 mg tretiranih životinja, (odvojeno mužjaci i ženke, podaci za kontrolu uređajem su iz nekropsije regeneracije, svi ostali podaci su iz osnovne nekropsije).

Slika 129 prikazuje primer koncentracije rhASA kod izabranih uzoraka sa površine duboke sive mase za kontrolu uređajem, inertni medijum, 1,8 mg, 6,0 mg i 18,6 mg tretiranih životinja, (odvojeno mužjaci i ženke, podaci za kontrolu uređajem su iz nekropsije regeneracije, svi ostali podaci su iz osnovne nekropsije).

Slika kod izabranih uzoraka iz različitih regiona za kontrolu uređajem, inertni medijum, 1,8 mg, 6,0 mg i 18,6 mg tretiranih životinja, (odvojeno mužjaci i ženke, podaci za kontrolu uređajem su iz nekropsije regeneracije, svi ostali podaci su iz osnovne nekropsije).

Slika 131 prikazuje primere koncentracije rhASA u segmentima kičmene moždine mladih cijanomolgus majmuna praćeno IT doziranjem 18,6 mg/dozi rhASAl svake druge nedeije u vremenskom periodu od 6 meseci (osnovna nekropsija).

Slika 132 prikazuje primere koncentracije rhASA u jetri mladih cijanomolgus majmuna praćeno IT doziranjem svake druge nedeije u vremenskom periodu od 6 meseci (047-021) (nekropsija regeneracije).

Slika 133 prikazuje primere anatomskih lokacija uzoraka mozga u subkortikalnoj beloj masi, periventrikularnoj beloj masi (i dubokoj beloj masi) i subkortikalnoj beloj masi.

Slika 134 prikazuje primer anatomskih lokacija uzoraka mozga u corpus callosum i perikalosalnoj subkortikalnoj beloj masi, unutrašnjoj kapsuli - GPi, unutrašnjoj kapsuli - caudate nucleus, dubokoj beloj masi, subkortikalnoj beloj masi i korteksu, putamenu i temporalnoj subkortikalnoj beloj masi i korteksu.

Slika 135 prikazuje anatomske lokacije uzoraka mozga u dubokoj sivoj masi, dubokoj beloj masi (frontalna periventirkularna i subkortikalna) i subkortikalna i korteks - superficial sagittal.

Slika 136 prikazuje primer anatomskih lokacija uzoraka mozga u corpus callosum i perikalosalnoj subkortikalnoj beloj masi, dubokoj sivoj masi, periventrikularnoj beloj masi, subkortikalnoj beloj masi i hipokampusu.

Slika 137 prikazuje primer anatomskih lokacija uzoraka mozga u corpus callosum i dubokoj beloj masi.

Slika 138 prikazuje primer anatomskih lokacija uzoraka mozga u subkortikalnoj beloj masi - potiljačnom režnju i cerebralnoj beloj masi, uključujući dentate nukleus (bela masa).

Slika 139A-G prikazuje koncentraciju rekombinantne humane arilsulfataze A (ASA) u ekstrahovanom uzorku tkiva iz tkiva mozga odraslih i mladih cinomolgus majmuna kojima je administriran ili inertni medijum, l,8mg rhASA ili 18,6mg rhASA. Svaka od slika odgovara regionu moždanog tkiva prikazanog na slici 134.

Slike 140A i 140B prikazuju poređenje koncentracija rekombinantne arilsulfataze A (ASA) detektovane u dubokoj beloj masi (slika 140A) ili u dubokoj sivoj masi (slika 140B) moždanog tkiva odraslih i mladih cinomolgus majmuna kojima je intratekalno (IT) ili intracerebroventrikularno (ICV) administrirana rhASA.

Slika 141A prikazuje primer koji prikazuje koncentracije ASA detektovane u nekoliko uzoraka tkiva dobijenih od mladih (mlađi od 12 meseci) cinomolgus majmuna kojima je IT administrirana doza od 18,6 ili 1,8 mg rekombinantne humane arilsulfataze A (rhASA). Kao što je prikazano na obe slike 140A-B, koncentracija ASA dostavljena je tkivima zajedno ili se inače prekoračuje ciljana terapeutska koncentracija od 2,5 ng/mg rhASA. Anatomski regioni moždanog tkiva koji odgovaraju svakom broju uzorka prikazani su na slikama 140A i 140B i oni su: subkortikalna bela masa (1); periventrikularna bela masa i duboka bela masa (2); subkortikalna bela masa (3); subkortikalna bela masa (4); unutrašnja kapsula (5); unutrašnja kapsula caudate nucleus (6); duboka bela masa (7); subkortikalna bela masa i korteks (8); putamen (9); temporalna subkortikalna bela masa i korteks (10), duboka siva masa (11), duboka siva masa (12), frontalna periventrikularna i subkortikalna (13); subkortikalna bela masa, korteks superficial perifalxian (14); corpus callosum i perikalosalna subkortikalna bela masa (15); duboka subkortikalna bela masa (16); duboka siva masa (17); duboka siva masa (18); periventrikularna bela masa (19); duboka subkortikalna bela masa (20); hipokampus (21); corpus callosum (22); duboka bela masa (23); subkortikalna bela masa, potiljačni režanj (24); i cerebelarna bela masa (25).

Slika 142A prikazuje površinu tkiva duboke bele mase ekstrahovane iz cinomolgus majmuna kojima je IT administrirano l,8mg ASA. Slika 142B prikazuje imunoobojenje tkiva duboke bele mase i distribuciju ASA u relevantne ćelije. Na slici 142B, protein (ASA) prikazan je u desnom donjem uglu. Slika 142C prikazuje daUadministrirana ASA pokazuje kolokalizaciju organela u tkivu duboke bele mase cinomolgus majmuna, posebno u lizozomima. Na slici 142C, ASA imunoobojenje prikazano je u levom gornjem uglu.

Slika 143 upoređuje distribuciju<Ufl>I-obeležene arilsulfataze A (ASA) koristeći PET skeniranje 24 sata praćeno ili IT ili ICV administraciju ovako obeleženih ASA cinomolgus majmuna.

Slika 144 prikazuje distribuciju<12>,|I-obeleženih ASA koji su odmah praćeni ICV administracijom cinomolgus majmuna i porede distribuciju IT administriranth lz"I-obeleženih ASA u roku od 2-5 sati. Kao Što je prikazano, IT administracija dostavila je 124I-obe!eženu ASA istim inicijalnim segmentima (cisternae i proksimalni deo kičme) kao što je pokazano za ICV administraciju.

Slika 145 prikazuje primer ICV i IT administraciju kod modela miševa.

Slika 146A prikazuje primer zavisnosti CSF koncentracija HNS od vremena pri dozama od 1,5, 4,5 i 8,3mg praćeno doziranjem u toku 6 meseci. Slika 146B prikazuje koncentracije Anti-HNS antitela u CSF nakon 6 meseci IT administracije doza od 1,5, 4,5 i 8,3mg kod majmuna. Prikazani su kombinovani podaci i za mužjake i za ženke. Slika 146C prikazuje koncentracije Anti-HNS antitela u CSF nakon 6 meseci IT administracije doza od 1,5, 4,5 i 8,3mg kod majmuna prateći svih 6 meseci doziranja. Prikazani su kombinovani podaci i za mužjake i za ženke. Dve najveće koncentracije (32,205 ng/ml i 15,467 ng/ml) nakon IT doze 6 od 8,3 mg HNS isključene su sa grafika zato što nijedan CSF uzorak nije uzet pre doze 6.

Slika 147 prikazuje reprezentativne slike segmenata tkiva moždanih opni i parenhima mozga obojenih hematoksilinom i eozinom. Slika 147A prikazuje pri malim uvećanjem neutrofilne akumulacije lokalizovane za IT kateter kod DC majmuna. Slika 147B prikazuje eozinofilne akumulacije pri velikim uvećanjem u moždanoj opni pri visokoj dozi (8,3mg/dozi) majmuna; sveobuhvatna ozbiljnost akumulacije slična je grupi kojoj se daje srednja doza (4,5 mg/dozi) (nije prikazano). Slika 147C prikazuje niske doze pod velikim uvećanjem (1,5 mg/dozi) majmuna pokazujući eozinofile u perivaskularnom prostoru (parenhim mozga). Slika 147D prikazuje rezultate kod majmuna kojima je data niska doza (1,5 mg/dozi) pokazujući eozinofile u perivaskularnom prostoru i na granici parenhima. Slika 147E prikazuje eozinofile u kičmenoj moždini parenhima (pokazano strelicama) kod grupe životinja kojima je data niska doza; neuroni na ovoj površini su normalni. Slika 147F prikazuje eozinofile i površinu mikroglioza (strelice pokazuju eozinofile; uokvireno kvadratom površinu mikroglioza) kod majmuna kojima je davana niska doza (l,5mg/dozi). Postoji nekoliko velikih neurona na površini od kojih su svi normalni. Red veličina: 200 um.

Slika 148 prikazuje aktivnost HNS enzima kod kičmene moždine i mozga majmuna. Slike 148A/B prikazuju aktivnosti u kičmenoj moždini (A) mužjaka i (B) ženki majmuna. Pršljen -3 = slabinski, presek 3, 6 = grudni i pršljen 9 = vratni; 0 = vrh katetera. Slike 148C/D prikazuju rezultate HNS aktivnosti u mozgu (C) mužjaka i (D) ženki majmuna. Pršljenovi su numerisani od rostralnog ka kaudalnom (3 do 15). Svi uzorci tkiva skupljeni su otprilike 24 sata nakon poslednje doze ili 4 nedeije nakon poslednje doze za regeneraciju životinja. DC, kontrolisano uređajem. Podaci predstavljaju ± SEM za n = 4 majmuna po grupi za tretman.

Slika 149 prikazuje rezultate aktivnosti enzima u mozgu i jetri majmuna. Slika 149A prikazuje rezultate distribucije HNS aktivnosti mozga majmuna kod grupe sa visokom dozom (8,3 mg/dozi). Prikazana je višestruka (eng. fold) pramena u aktivnosti za površinu, duboke i veoma duboke (periventrikularne površine) mozga u poređenju sa endogenim nivoima (DC grupa). Prikazana je višestruka promena u aktivnosti na površini, dubokim i veoma dubokim (periventrikularnim) delovima mozga u poređenju sa endogenim nivoima (DC grupa). Svi uzorci tkiva skupljaju se otprilike u roku od 24 sata nakon poslednje doze ili 4 nedeije nakon poslednje doze i oporavka životinja. Rezultati predstavljaju srednju vrednost ± SEM za n = 6 majmuna (oba pola), moždani presek 6 i 9. Rezultati za dva majmuna nisu uključeni; pri nekropsiji nije nađeno da su kateteri bili na mestu. Slika 149B pokazuje HNS aktivnost u jetri majmuna. Svi uzorci tkiva sakupljeni su u roku od 24 sata nakon poslednje doze ili 4 nedeije nakon poslednje doze i oporavka životinja. DC, kontrolisano uređajem. Rec, regeneracija. Rezultati predstavljaju srednju vrednost ± SEM za n = 4 majmuna prema grupi koja se tretira osim grupe ženki (n = 3) kojima je data mala doza (4,5 mg/dozi).

Slika 150 prikazuje HNS lokalizaciju cerebeluma mladih cinomolgus majmuna: ciljna grupa, stari 3 meseca. Slika 150A prikazuje cerebelum životinje kontrolisane inertnim medijumom (0 mg/dozi) negativan na HNS imunoobojenje; uvećanje 20x. Slika 150B prikazuje cerebelum životinje koja dobija malu dozu (1,5 mg/dozi) i pokazuje minimalno pozitivno obojenje ograničeno na molekulski sloj; uvećanje 20x. Slika 150C prikazuje cerebelum životinje koja dobija srednju dozu (4,5 mg/dozi) i pokazuje minimalno obojenje spoljašnjeg granularnog sloja; uvećanje 20x. Slika 150D prikazuje blago obojenje u cerebelumu kod životinje koja dobija veliku dozu (8,3 mg/dozf) uključujući molekulske, spoljašnje granularne slojeve i Purkinjeove ćelije; uvećanje 20x.

Slika 151 prikazuje zavisnost HNS koncentracije od vremena u prvih 20 minuta nakon IT doziranja<124>I-HNS na 1 i 10 mg/kg.

Slika 152 prikazuje zavisnost HNS koncentracije u mozgu od vremena nakon IT doziranja<IJ4>I-HNS na 1 i 10 mg/kg.

Slika 153 prikazuje zavisnost HNS koncentracije u mozgu od vremena nakon IT doziranja 124I-HNS na 1 i 10 mg/kg.

Slika 154 prikazuje zavisnost HNS koncentracije u regionu glave od vremena nakon IT doziranja<U4>I-HNS na 1 i 10 mg/kg.

Slika 155 prikazuje zavisnost HNS koncentracije u proksimalnom delu kičme od vremena nakon IT doziranja "1-HNS na 1 i 10 mg/kg.

Slika 156 prikazuje zavisnost HNS koncentracije u središnjem delu kičme od vremena nakon U doziranja<124>I-HNS na 1 i 10 mg/kg.

Slika 157 prikazuje zavisnost HNS koncentracije u distalnom delu kičme od vremena nakon IT doziranja<U4>I-HNS na 1 i 10 mg/kg.

Slika 158 prikazuje zavisnost HNS koncentracije u jetri od vremena nakon IT doziranja 121I-HNS na 1 i 10 mg/kg.

Slika 159 prikazuje zavisnost HNS koncentracije u mozgu od vremena nakon IT doziranja<I24>I-HNS na 1 i 10 mg/kg, individualno (vrh) i srednja vrednost ±SD (dno).

Slika 160 prikazuje zavisnost hepatičke HNS koncentracije od vremena nakon IT doziranja<124>I-HNS na 1 i 10 mg/kg, individualno (vrh) i srednja vrednost ±SD (dno).

Slika 161 prikazuje zavisnost HNS koncentracije bubrega od vremena nakon IT doziranja<124>I-HNS na 1 i 10 mg/kg, individualno (vrh) i srednja vrednost ±SD (dno).

Slika 162 prikazuje zavisnost HNS koncentracije srca od vremena nakon IT doziranja 12,I-HNS na 1 i 10 mg/kg, individualno (vrh) i srednja vrednost ±SD (dno).

Slika 163 prikazuje zavisnost HNS koncentracije kože od vremena nakon IT doziranja 1S4I-HNS na 1 i 10 mg/kg, individualno (vrh) i srednja vrednost ±SD (dno).

Slika 164 prikazuje zavisnost HNS koncentracije u mozgu od vremena nakon IT doziranja<lJ4>I-HNS na 1 i 10 mg/kg (vrh) i poređenje nedeljivih PK parametara u mozgu (dno).

Slika 165 prikazuje zavisnost HNS koncentracije u jetri od vremena nakon IT doziranja 124I-HNS na 1 i 10 mg/kg(vrh) poređenje nedeljivih PK parametara u mozgu (dno).

Slika 166 prikazuje ćelije primarnih fibroblasta zdravih ljudi koje su korišćene za studiju internalizacije ćelija rhNaglu i Naglu-IGFII. Ćelijski unos rhNaglu bio je minimalan, dok je ćelijski unos Naglu-IGFII bio mnogo izraženiji. Kriva zasićenja Naglu-IGFII internalizacije pokazuje da je unos posredovan receptorom. Ovaj unos inhibiran je sa IGRI, ali ne i manoza-6-fosfatom.

Slika 167 prikazuje konfokalna mikroskopska istraživanja koristeći ćelije fibroblasta subjekta koji ima Sanfilippo B (GM01426). Posmatrana je ekstenzivna internalizacija Naglu-IGFII i kolokalizacija Naglu-IGFII sa Lamp-l.

Slika 168 prikazuje Naglu aktivnost kod miševa "divljeg tipa" (WT), Naglu -/- (KO) i heterozigotnih Naglu +/- (Het) miševa. Ukupna deficijenđja Naglu kod Sanfilippo B miševa posmatrana je u mozgu, jetri, bubrezima i slezini.

Slika 169 prikazuje pogled spreda i lateralni pogled mozga miševa koji pokazuju mesto intracisternog injektiranja (IC) i plan seciranja za histološke analize. Srednji mikrograf predstavlja transverzalni presek mozga miša i posmatran je pri uvećanju od lx. Površina uokvirena kvadratom označava polja 4x uvećane mikroskopske slike u dnu mikrografa. Mikrograf na dnu predstavlja sliku histološke analize uvećanu 4x. Okviri A i B označavaju polje uvećanja od 40x mikroskopske slike na slikama 170 i 171.

Slika 170 prikazuje imunokistohemiju cerebralnog korteksa kod Sanfilippo B miševa 7 dana nakon intracisternog injektiranja (IC) 40x. Oba, rhNaglu i Naglu-IGFII predstavljaju obimni ćelijski unos u neuronima kao i u glijalnim ćelijama i šabloni ćelijskog unosa i distribucije su veoma slični između dva proteina, (antihumana Naglu monoklonska antitela).

Slika 171 predstavljaju LAMP-1 imunoobojenje cerebralnog korteksa pri uvećanju od 40x. Poređenjem mozga miševa "divljeg tipa", posmatrano je povećano nakupljanje lizozoma u mozgu Sanfilippo B miševa tretiranih inertnim medijumom što je prikazano povećanjem pozitivnih tačkica LAMP-1 imunoobojenja. Mozak oba, rhNaglu i Naglu-IGFII tretiranih Sanfilippo B miševa predstavlja redukciju nakupljanja lizozoma što je veoma slično WT miševima.

Slika 172A prikazuje rasprostranjenu redukciju ćelijske vakuolizacije u tkivima bele mase miševa koji imaju manjak Naglu, Uje administriran Naglu vezanim za miševe sa manjkom Naglu koji su administrirani u inertni medijum. Slika 172B predstavlja obeleženu redukciju u lizozomski sličnoj membrani proteina 1 (LAMPI) imunoobojenja u tkivu bele mase kod miševa sa manjkom Naglu, intratekalno je administriran Naglu vezan za isti Naglu koji nedostaje miševima koji su administrirani u inertnom medijumu.

Slika 173 kvantitativno predstavlja i poredi koncentracije izmerenog LAMP u cerebralnom korteksu, caudate nucleus i putamenu (CP), talamusu (TH), cerebelumu (CBL) i beloj masi (WM) miševa u manjku Naglu kojima je administriran Naglu povezan sa oba, miševima "divljeg tipa" i miševima koji su u manjku sa Naglu, a koji su administirani u inertni medijum. LAMP pozitivne površine u svakom delu moždanog tkiva analizirane su i dalje redukovane prateći intratekalnu administraciju tri doze Naglu u toku sedam dana (slika 173A) koje su vezane za dve doze Naglu u toku vremenskog perioda od dve nedeije (Slika 173B).

Slika 174 prikazuje srednje sagitalni anatomski dijagram humanog CNS-a koji je korišćen kao referenca na ovoj slici, kako bi pokazao IT mesto kod pacova "divljeg tipa" sa kanilom. Strelica pokazuje približnu anatomsku lokaciju IT injektiranja u kičmenu moždinu u region cerebralnog korteksa čije tkivo je uzeto za imunohistohemijska istraživanja.

Slika 175 prikazuje Naglu aktivnost u mozgu nakon IT injektiranja. Naglu aktivnost je značajno viša u mozgu sa injekitranim Naglu-TAT i Naglu-IGFII kod WT pacova.

Slika 176 prikazuje Naglu imunoobojenje cerebralnog korteksa rhNaglu, Naglu-TAT, Naglu-IGFII, Naglu-kif i PerT-Naglu tretiranih WT pacova sa kanilom 24 sata nakon IT injektiranja, 20x. Naglu-IGFII je jedini protein koji je dobro predstavio ekstenzivnu distribuciju u parenhimu mozga. Ćelijski unos u neurone i glijalne ćelije takođe je evidentan kod pacova tretiranih sa Naglu-IGFII. Sa druge strane, kod rhNaglu, Naglu-TAT, Naglu kif i PerT-Naglu tretiranih grupa, protein je ostao u moždanim opnama (M).

Slika 177 prikazuje uvećanje visoke rezolucije izabranih slajdova sa slike 176. Gornji panel, kod WT pacova sa kanilom tretiranih sa rhNaglu, rhNaglu ostaje u moždanoj opni (M) i nije uočeno pozitivno obojenje u parenhimu mozga. Donji panel, kod WT pacova sa kanilom tretiranih sa Naglu-IGFII dobro je posmatrana ekstenzivna distribucija u parenhimu mozga i ćelijski unos posmatran je u neuronima i glijalnim ćelijama.

Slika 178 prikazuje Naglu aktivnost u mozgu i jetri 24 sata nakon IT injektiranja. Među tri tretirane grupe, Naglu aktivnost u mozgu nije pokazala značajne razlike. Isto važi i za Naglu aktivnost u jetri. Ovaj rezultat pokazuje da je detektovana Naglu aktivnost u mozgu i jetri u velikoj meri zbog poslednjeg injektiranja koje se javlja 24 sata pre žrtvovanja.

Slika 179 predstavlja primer ukupnih GAG nivoa u mozgu i jetri nakon IT injektiranja Naglu-IGFII. Ukupan GAG u mozgu Sanfilippo B miševa tretiranih inertnim medijumim pokazali su progresivni porast kao odraz efekta akumulacije zbog starenja Sanfilippo B miševa. Statistički značajna redukcija GAG u mozgu posmatrana je u 3x grupi za injektiranje

(p<0,05). Statistički značajna redukcija GAG u jetri posmatrana je u grupi za injektiranje 2x i 3x (p<0,05). Što je brža i drastičnija promena GAG nivoa u jetri nego u mozgu to predstavlja fenomen koji je takođe posmatran u IT dostavi 125 za Hunterov sindrom.

Slika 180 predstavlja biodistribuciju Naglu u mozgu Sanfilippo 8 miševa nakon IT injektiranja. Naglu imunofluorescentno obojenje otkriva Naglu-IGFII protein moždane opne (M) i parenhima mozga. Ćelijski unos posmatran je u 2x i 3x grupama za injektiranje. G:glijalne ćelije.

Slika 181 prikazuje koronalnu sekciju mišjeg mozga. Uokvireni kvadrati predstavljaju slike gde je izvršeno LAMP-1 imunoobojenje. Za demonstriranje produžetka distribucije proteina i efikasnosti, cerebralni korteks i subkortikalna tkiva kao što su caudate nucleus, talamus i bela masa izabrani su za LAMP-1 imunoobojenje.

Slika 182 prikazuje LAMP-1 imunoobojenje cerebralnog korteksa pri uvećanju od 40x. Poredeći mozgove miševa "divljeg tipa", posmatrano je povećano lizozomsko nakupljanje u mozgu Sanfilippo B miševa tretiranih inertnim medijumom, što je uočeno povećanjem broja pozitivnih tačaka LAMP-1 imunoobojenja. Redukcija lizozomskog nakupljanja nakon Naglu-IGFII IT injektiranja evidentna je redukovanjem veličina pozitivnih tačaka injektiranjem 2x tretiranim mozgovima Sanfilippo B miševa i redukovanjem veličina pozitivnih tačaka injektiranjem 3x tretiranim mozgovima Sanfilippo B miševa.

Slika 183 prikazuje primer LAMP-1 imunoobojenja caudate nucleus, subkortikalni nukleus (40x). Slično viđeno kao i kod cerebralnog korteksa, posmatrano je povećano lizozomsko nakupljanje u mozgu Sanfilippo miševa tretiranih inertnim medijumom, što je uočeno povećanjem LAMP-1 pozitivnih tačaka imunoobojenja. Redukcija lizozomskog nakupljanja nakon Naglu-IGFII IT injektiranja evidentna je redukovanjem veličina pozitivnih tačaka dvostrukim injektiranjem u tretirane mozgove Sanfilippo B miševa i redukovanjem veličina pozitivnih tačaka trostrukim injektiranjem u tretirane mozgove Sanfilippo B miševa.

Slika 184 prikazuje LAMP-1 imunoobojenje talamusa, diencefalonskog nukleusa (40x). Redukcija lizozomskog nakupljanja nakon Naglu-IGFII IT injektiranja evidentna je redukovanjem veličina pozitivnih tačaka dvostrukim injektiranjem u tretirane mozgove Sanfilippo B miševa i redukovanjem veličina pozitivnih tačaka trostrukim injektiranjem u tretirane mozgove Sanfilippo B miševa.

Slika 185 prikazuje LAMP-1 imunoobojenje bele mase (40x). Longitudinalno praćenje neurona, aksonskih vlakana razlikuje belu od sive mase prikazane na slikama 181-184. Pored toga, isti šablon povećanja lizozomskog nakupljanja može da se vidi kod Sanfilippo B miševa tretiranih inertnim medijumom kada se poredi sa miševima "divljeg tipa". Redukcija lizozomskog nakupljanja nakon IT injektiranja Naglu-IGFII evidentna je redukovanjem veličine i broja pozitivnih tačaka kod 2x i 3x injektiranja u mozak Sanfilippo B tretiranih miševa,

Slika 186 prikazuje LAMP-1 imunoobojenje cerebralnog korteksa. Morfologija cerebralnog korteksa evidentna je zbog gusto populisanih granularnih neurona, hipoćelijskih molekulskih ćelija i pojedinačnih slojeva Purkinjeovih neurona između granularnih neurona i molekulskog sloja. Purkinjeovi neuroni identifikovani su pomoću velike citoplazme i povremenih dendtrita koji se javljaju kao izbočine u molekulskom sloju.

Slika 187 prikazuje primer Naglu obojenja u mozgu, kičmenoj moždini i jetri. U mozgu i kičmenoj moždini, injektovani Naglu detektovan je u moždanoj opni (M) samo pomoću IHC i nije detektovano nijedno Naglu pozitivno obojenje u drugim regionima. U jetri, sinusoidalne ćelije (S) bile su Naglu pozitivne, a nikakvo Naglu nakupljanje nije nađeno u hepatocitima (H).

Slika 188 prikazuje LAMP imunoobojenje i H&E obojenje jetre i kičmene moždine. Poređeno sa životinjama u inertnom medijumu, LAMP obojenje opada kroz obe jetre i kičmene moždine tretirane pomoću Naglu. H&E obojenje pokazuje da je ćelijska vakuolizacija u hepatocitima redukovana kod tretiranih grupa u poređenju sa životinjama tretiranim inertnim medijumom.

Slike 189A i 189B prikazuju H&E obojenje mozga i morfološki napredak mozga nakon 6 IT injektiranja Naglu svake druge nedeije u periodu od 3 meseca. U tretiranom mozgu, ćelijska vakuolizacija (prikazano strelicama) u svim pregledanim regionima opada u poređenju sa grupom tretiranom inertnim medijumom.

Slike 190A i 190B prikazuju LAMP imunoobojenje u različitim regionima mozga nakon 6 U Naglu injektiranja u periodu od 3 meseca. Poređenjem grupe tretirane inertnim medijumom, Naglu IT administracija Sanfilippo B miševima rezultuje u redukciji lizozomske aktivnosti svih pregledanih regiona otkrivenih LAMP imunoobojenjem. Ova redukcija okarakterisana je smanjenjem broja LAMP pozitivnih ćelija, manjom veličinom ćelija i svetlijim obojenjem. Obeležena redukcija uočena je u cerebelumu i moždanom stablu, koja je lokalizovana u caudate delu mozga, blizu kičmene moždine u poređenju sa drugim regionima mozga. Čista redukcija takođe je nađena u dubokim regionima mozga, uključujući belu masu, hipokampus i talamus.

Slike 191A i 190B prikazuju Iba IHC u različitim regionima mozga nakon 6 IT Naglu injektiranja u periodu od 3 meseca, čime je otkrivena aktivacija mikroglijalnih ćelija. U poređenju sa grupom tretiranom inertnim medijumom, uočeno je da nema smanjenja u broju pozitivnih ćelija i intenziteta obojenja u grupi tretiranoj pomoću Naglu. Međutim, ćelijska morfologija pozitivnih mikroglijalnih ćelija promenjena je redukovanjem veličine ćelija kod svih pregledanih regiona mozga u poređenju sa velikim i vakuolizovanim ćelijama grupe tretirane inertnim medijumom (inserti).

Slike 192A i 192B prikazuju GFAP IHC u različitim regionima mozga nakon 6 IT Naglu injektiranja u periodu od 3 meseca, čime je otkrivena astrocitična aktivacija. U poređenju sa grupom tretiranom inertnim medijumom, GFAP pozitivno obojenje opada u cerebelumu i moždanom stablu i za nijansu opada u drugim posmatranim regionima.

DEFINICIJE

[0050]U cilju da bi se predmetni pronalazak bolje razumeo, prvo su definisani određeni pojmovi ispod. Dodatne definicije za prateće pojmove i druge pojmove navedene su u specifikaciji.

[0051]Približno ili oko: kao stoje ovde korišćeno, pojmovi "približno" ili "oko" vezuju se za jednu ili više vrednosti od interesa i odnose se na vrednost koja je slična utvrđenoj referentnoj vrednosti. U određenim oblicima, pojmovi "približno" ili "oko" odnose se na opseg vrednosti koje spadaju u 25%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11 %, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, ili manje u bilo kom smeru (veće od ili manje od) utvrđene referentne vrednosti ukoliko nije drugačije naglašeno ili evidentirano iz konteksta (izuzev gde ovakvi brojevi prelaze 100% moguće vrednosti).

[0052]Poboljšanje: Kao što je ovde korišćeno, pojam "poboljšanje" označavao je prevenciju, redukciju ili palijaciju stanja ili poboljšanje stanja subjekta. Poboljšanje uključuje, ali ne zahteva kompletan oporavak ili kompletnu prevenciju stanja subjekta. U nekim oblicima, poboljšanje uključuje povećanje nivoa relevantnog proteina ili njegove aktivnosti koji je u manjku zaraženih tkiva.

[0053]Biološka aktivnost: Kao što je ovde korišćeno, fraza "biološki aktivno" odnosi se na karakteristike bilo kog agensa koji ima aktivnost u biološkom sistemu i parcijalno u organizmu. Na primer, agens koji, kada je administriran u organizam ima biološki efekat na njega, smatran je za biološki aktivan. U određenim oblicima, gde je protein ili polipeptid biološki aktivan, porcija proteina ili polipeptida koja deli najmanje jednu biološku aktivnost tipično se odnosi na "biološki aktivnu" porciju.

[0054]Bulking agens: Kao što je ovde korišćeno, pojam "bulking agens" odnosi se na jedinjenje koje povećava masu liofilizovanoj smeši i doprinosi fizičkoj strukturi liofilizovane pogače (npr. olakšava proizvodnju esencijalne uniformne liofilizovane pogače koja se održava kao porozna struktura). Primeri bulking agenasa uključuju manitol, glicin, natrijum hlorid, hidroksietil škrob, laktozu, sukrozu, trehalozu, polietilen glikol i dekstran.

[0055]Katjon nezavisni receptor manoza-6-fosfata (CI-MPR): Kao što je ovde korišćeno, pojam "katjon nezavisni receptor manoza-6-fosfata (CI-MPR)" odnosi se na ćelijski receptor koji vezuje manozu-6-fosfat (M6P) za prekursore kisele hidrolaze u Goldžijevom aparatu koji je namenjen za transport lizozoma. U dodatku manoza-6-fosfata, CI-MPR takođe vezuju druge proteine uključujući IGF-II. CI-MPR takođe je poznat i kao "M6P/IGF-II receptor", "CI-MPR/IGF-II receptor," "IGF-II receptor" ili "IGF2 Receptor." Ovi pojmovi i njihove skraćenice ovde se koriste naizmenično.

[0056]Konkurentna imunosupresivna terapija: Kao Što je ovde korišćeno, pojam "konkurentna imunosupresivna terapija" uključuje bilo koju imunosupresivnu terapiju korišćenu kao predtretman, predstanje ili paralelno za metodom tretmana.

[0057]Rastvarač: Kao što je ovde korišćeno, pojam "rastvarač" odnosi se na farmaceutski prihvatljive (npr. bezbedne i netoksične za administraciju kod ljudi) supstance za rastvaranje, korisne u pripremi rekonstutivne formulacije. Primeri rastvarača uključuju sterilnu vodu, bakteriostatičku vodu za injektiranje (BWFI), pH rastvor pufera (npr. rastvor fosfatnog pufera), sterilni fiziološki rastvor, Ringerov rastvor ili rastvor dekstroze.

[0058]Forma doze: kao što je ovde korišćeno, pojam "forma doze" i "jedinica forme doze" odnosi se na fizički diskretne jedinice terapeutskog proteina za pacijente koji se leče. Svaka jedinica sadrži prethodno određen kvantitet aktivne supstance izračunate tako da proizvodi željeni terapeutski efekat. Razume se, međutim, da će ukupna doza kompozicije da bude određena od strane lekara u skladu sa medicinskom procenom.

[0059]Terapija izmene enzima (ERT): kao što je ovde korišćeno, pojam "terapija izmene enzima (ERT)" odnosi se na terapeutsku strategiju koja ispravlja defidjenciju enzima obezbedujući enzim koji nedostaje. U nekim oblicima, enzim koji nedostaje obezbeđen je intratekalnom administracijom. U nekim oblicima, enzim koji nedostaje obezbeđen je pomoću infuzije u krvotok. Jednom administriran, enzim je skupljen od strane ćelija i transportovan do lizozoma, gde ima ulogu da eliminiše materijal koji je akumuliran u lizozomima zbog enzimske deficijencije. Tipično, za terapiju izmene enzima lizozoma, da bi bila efikasna, terapeutski enzim dostavljen je lizozomima u odgovarajućim ćelijama ciljanog tkiva gde je defekt nakupljanja manifestovan.

[0060]Poboljšanje, povećanje, ili redukovanje: Kao što je ovde korišćeno, pojmovi "poboljšanje", "povećanje", "redukovanje" ili odgovarajući sinonimi, ukazuju na vrednosti koje su vezane za osnovna merenja, kao što su merenja u istoj individui pre uvođenja tretmana koji je ovde opisan ili merenje u kontrolisanoj individui (ili više kontrolisanih individua) u odsustvu tretmana koji je ovde opisan. "Kontrolisana individua" je individua pogođena istom formom bolesti nakupljanja lizozoma kao i individua koja se tretira, koja je otprilike isto godište kao i individua koja se tretira (kako bi se osiguralo da stadijumi bolesti mogu da se porede kod tretiranih individua i kontrolisanih individua).

[0061]Individua, subjekat, pacijent: kao što je ovde korišćeno, pojmovi "subjekat", "individua" ili pacijent odnose se na ljude ili na druge sisare. Individua (takođe se odnosi na "individuu" ili "subjekat") koja pati od bolesti leci se kao pojedinac (fetus, novorođenče, dete, adolescent ili odrastao čovek).

[0062]Intratekalna administracija: kao što je ovde korišćeno, pojam "intratekalna administracija" ili "intratekalno injektiranje" odnosi se na injektiranje u kičmeni kanal (intratekalni prostor koji okružuje kičmenu moždinu. "Intratekalna administracija" ili "intratekalna dostava" prema predmetnom pronalasku odnosi se na IT administraciju ili dostavu preko slabinske površine ili segmenta, npr. slabinska IT administracija ili dostava. Kao što je ovde korišćeno, pojam "slabinski segment" ili "slabinska površina" odnosi se na površinu između trećeg i četvrtog pršljena (donji deo leđa) i uključujući, L2-S1 segment kičme.

[0063]Struktura vezivanja: kao što je ovde korišćeno, pojam "struktura vezivanja" odnosi se na, u vezivnom proteinu, sekvencu aminokiseline i pored toga javlja se na određenoj poziciji u prirodnom proteinu i generalno je napravljena da bude fleksibilna ili da se umetne u strukturu, kao što je a-heliks, između dva proteinska ostatka. Struktura vezivanja takođe se odnosi i na spejser.

[0064]Lioprotektant: Kao što je ovde korišćeno, pojam "lioprotektant" odnosi se na molekul koji sprečava ili redukuje hemijsku i/ili fizičku nestabilnost proteina ili druge supstance tokom liofilizacije i subsekventnog nakupljanja. Primer lioprotektanata uključuje šećere kao što su sukroza ili trehaloza; aminokiseline kao što su mononatrijum glutamat ili histidin; metilamin kao što je betain; liotropske soli kao Što su magnezijum sulfat: polioli kao što su trohidroksilni alkoholi ili polihidroksilni šećerni alkoholi, npr. glicerin, eritritol, glicerol, arabitol, ksilitol, sorbitol i manitol; propilen glikol; polietilen glikol; pluronici; i njihove kombinacije. U nekim oblicima, lioprotektanti su neredukujući šećeri kao što su trehaloza ili sukroza.

[0065]Lizozomski enzimi: Kao što je ovde korišćeno, pojam "lizozomski enzim" odnosi se na bilo koji enzim koji je sposoban za redukovanje akumulisanih materijala kod lizozoma sisara ili može da ukloni ili ublaži jedan ili više simptoma bolesti nakupljanja lizozoma. Lizozomski enzimi pogodni za predmetni pronalazak uključuju i lizozomske enzime "divljeg tipa" i modifikovane lizozomske enzime i mogu da se proizvedu koristeći rekombinantne i sintetske metode ili prečišćavanjem iz prirodnih izvora. Primeri lizozomskih enzima prikazani su u tabeli 1.

[0066]Deficijencija lizozomskih enzima: kao što je ovde korišćeno, "deficijencija lizozomskih enzima" odnosi se na grupu genetskih poremećaja koji rezultuju u deficijenciji najmanje jednog enzima koji je potreban za razbijanje makromolekula (npr. supstrati enzima) do peptida, aminokiselina, monosaharida, nukleinskih kiselina i masnih kiselina u lizozomima. Kao rezultat, individue koje pate od deficijencije lizozomskih enzima imaju akumulisan materijal u različitim tkivima (npr. CNS-u, jetri, slezini, crevima, zidovima krvnih sudova i drugim organima).

[0067]Lizozomske bolesti nakupljanja: kao što je ovde korišćeno, pojam "lizozomske bolesti nakupljanja" odnosi se na bilo koju bolest koja rezultuje u deficijenciji jednog ili više lizozomskih enzima neophodnih za metabolizam prirodnih makromolekula. Ove bolesti tipično rezultuju u akumulaciji nedegradiranih molekula u lizozomima, rezultujući u povećanom broju granula koje se nakupljaju (takođe se nazivaju i vezikule nakupljanja). Ove bolesti detaljnije su opisane ispod.

[0068]Polipeptid: kao što je ovde korišćeno, "polipeptid", generalno govoreći je veza najmanje dve amino kiseline koje su međusobno vezane peptidnom vezom. U nekim oblicima, polipeptid može da uključi najmanje od 3 do 5 aminokiselina, od kojih je svaka vezana za drugu najmanje jednom peptidnom vezom. Stručnjaci u praksi nekad uključuju "veštačke" aminokiseline ili druge entitete koji su pored toga sposobni za integraciju u polipeptidni lanac, opciono.

[0069]Enzim izmene: kao što je ovde korišćeno, "enzim izmene" odnosi se na bilo koji enzim koji može da ima ulogu izmene barem delom enzima u manjku ili nedostajućeg enzima kod bolesti koja se leči. U nekim oblicima, enzim izmene je sposoban za redukovanje akumulisanih materijala kod lizozoma sisara ili može da regeneriše ili poboljša jedan ili više simptoma lizozomskih bolesti nakupljanja. Enzimi izmene pogodni za predmetni pronalazak uključuju oba, i lizozomske enzime "divljeg tipa" i modifikovane lizozomske enzime i mogu da se proizvode koristeći rekombinantne i sintetske metode ili prečišćavanjem iz prirodnih izvora.

[0070]Rastvorljivo: kao što je ovde korišćeno, pojam "rastvorljivo" odnosi se na sposobnost terapeutskog agensa da formira homogeni rastvor. U nekim oblicima, rastvorljivost terapeutskog agensa u rastvoru u koji je administriran i pomoću koga se transportuje do ciljanog mesta (npr. ćelije i tkiva mozga) je dovoljna da bi se dozvolila dostava terapeutski efektivne količine terapeutskog agensa na ciljano mesto. Nekoliko faktora može da utiče na rastvorljivost terapeutskih agenasa. Na primer, bitni faktori koji mogu da imaju uticaja na rastvorljivost proteina uključuju jonsku jačinu, sekvence aminokiselina i prisustvo drugih kosolubilnih agenasa ili soli (npr. kalcijumove soli). U nekim oblicima, farmaceutske kompozicije formulisane su tako da su kalcijumove soli isključene iz ovakvih kompozicija. U nekim oblicima, terapeutski agensi u saglasnosti sa predmetnim pronalaskom su rastvorni u svojim odgovarajućim predmetnim kompozicijama. Podrazumeva se da, dok su izotonični rastvori generalno poželjni za parenteralnu administraciju lekova, upotreba izotoničnih rastvora može da ograniči adekvatnu rastvorljivost nekih terapeutskih agenasa i određenih proteina i/ili enzima. Blago hipertonični rastvori (npr. do 175 mM natrijum hlorida u 5 mM natrijum fosfatu na pH vrednosti od 7,0) i rastvori koji sadrže šećer (npr. do 2% sukroze u 5 mM natrijum fosfata pri pH vrednosti od 7,0) pokazano je da su dobro tolerisani kod majmuna. Na primer, najčešće odobrena kompozicija CNS bolusne formulacije je fiziološki rastvor (150mM NaCI u vodi).

[0071]Stabilnost: kao što je ovde korišćeno, pojam "stabilnost" odnosi se na sposobnost terapeutskog agensa (npr. rekombinantni enzim) da se održi terapeutska efikasnost (npr. većina njene biološke aktivnosti i/ili fizikohemijske snage) nakon produženog vremenskog perioda. Stabilnost terapeutskog agensa i sposobnost farmaceutske kompozicije da održi stabilnost ovog terapeutskog agensa, mogu da budu procenjeni u produženom vremenskom periodu (npr. barem 1, 3, 6, 12, 18, 24, 30, 36 meseci ili više). Generalno, farmaceutske kompozicije opisane ovde formulisane su tako da su sposobne za stabilizaciju ili alternativno, usporavanje ili prevenciju degradacije jednog ili više terapeutskog agensa formulisane sa tim (npr. rekombinantni proteini). U kontekstu formulacije, stabilna formulacija je jedna od onih u kojoj terapeutski agens u suštini zadržava svoju fizičku i/ili hemijsku snagu i biološku aktivnost u toku nakupljanja i tokom procesa (kao što su smrzavanje/topljenje, mehaničko mešanje i liofilizacija). Za stabilnost proteina, može da se meri formacijom agregata velike molekulske mase, gubitkom enzimske aktivnosti, generacijom peptidnih fragmenata i promenom profila naelektrisanja.

[0072]Subjekat: kao što je ovde korišćeno, pojam "subjekat" označava bilo kog sisara, uključujući i ljude. U određenim oblicima predmetnog pronalaska subjekat je odrastao, adolescent ili novorođenče. Takođe je razmatrana administracija farmaceutske kompozicije i/ili upotreba metoda lečenja u materici prema predmetnom pronalasku.

[0073]Supstancijalna homologija: fraza "supstancijalna homologija" ovde se odnosi na poređenje između aminokiselina i sekvenci nukleinskih kiselina. Kao što cene stručnjaci u praksi, dve sekvence se generalno smatraju da su "supstancijalno homologne" ako sadrže homologni ostatak na odgovarajućim pozicijama. Homologni ostaci mogu da budu identični ostaci. Alternativno, homologni ostaci mogu da budu različiti ostaci i biće odgovarajuće slični strukturi i/ili funkcionalnim karakteristikama. Na primer, kao što je dobro poznato stručnjacima u praksi, određene aminokiseline su tipično klasifikovane kao "hidrofobne" ili "hidrofilne" aminokiseline i/ili imaju "polarne" ili "nepolarne" sporedne lance. Supstitucija jedne aminokiseline drugom istog tipa često se smatra "homolognom" supstitucijom.

[0074]Kao što je dobro poznato u praksi, aminokiselina ili sekvenca nukleinske kiseline mogu da se porede koristeći različite algoritme, uključujući one dostupne u komercijalnim kompjuterskim programima kao Što su BLASTN i BLASTP za nukleotidne sekvence, "gapped" BLAST i PSI-BLAST za sekvence aminokiselina. Primeri ovih programa opisani su u Altschul, et al., Basic local alignment search tool, J. Mol. Biol., 215(3): 403-410, 1990; Altschul, et al., Methods in Enzymology; Altschul, et al., "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs", Nucleic Acids Res. 25:3389-3402, 1997; Baxevanis, et al., Bioinformatics : A Practical Guide to the Analvsis of Genes and Proteins, Wiley, 1998; and Misener, et al., (eds.), Bioinformatics Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology, Vol. 132), Humana Press, 1999. U dodatku identifikovanja homolognih sekvenci, programi spomenuti iznad tipično obezbeđuju stepen indikacije homologije. U nekim oblicima, smatra se da su dve sekvence supstancijalno homologne ako barem 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili više njihovih odgovarajućih ostataka homologni preko relevantnih "stretch" ostataka. U nekim oblicima, relevantni "stretch"je ukupna sekvenca. U nekim oblicima, relevantni "stretch" je barem 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500 ili više ostataka.

[0075]Supstancijalni identitet: fraza "supstancijalni identitet" ovde korišćena odnosi se na poređenje između aminokiselina i sekvenci nukleinskih kiselina. Kao što cene stručnjaci u praksi, dve sekvence generalno smatraju se "supstancijalno identičnim" ako sadrže identične ostatke u odgovarajućim pozicijama. Kao što je poznato u praksi, aminokiseline i sekvence nukleinskih kiselina mogu da se porede koristeći različite algoritme, uključujući one dostupne u komercijalnim kompjuterskim programima kao što su BLASTN i BLASTP za nukleotidne sekvence, "gapped" BLAST i PSI-BLAST za sekvence aminokiselina. Primeri ovih programa opisani su u Altschul, et al., Basic local alignment search tool, 1 Mol. Biol., 215(3): 403-410,1990; Altschul, et al., Methods in Enzymology; Altschul, et al., "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs", Nucleic Acids Res. 25:3389-3402, 1997; Baxevanis, et al., Bioinformatics : A Practical Guide to the Analysis of Genes and Proteins, Wiley, 1998; and Misener, et al., (eds.), Bioinformatics Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology, Vol. 132), Humana Press, 1999. U dodatku za identifikovanje identičnih sekvenci, programi pomenuti iznad tipično obezbeđuju stepen indikacije identiteta. U nekim oblicima, dve sekvence smatraju se da su supstancijalno identične ako barem 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili više njihovih odgovarajućih ostataka homologni preko relevantnih stretch ostataka. U nekim oblicima, relevantni stretch je ukupna sekvenca. U nekim oblicima, relevantni stretch je barem 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95,100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500 ili više ostataka.

[0076]Sintetska CSF: kao što je ovde korišćeno, pojam "sintetska CSF" odnosi se na rastvore koji imaju pH, kompoziciju elektrolita, sadržaj glukoze i osmolaritet u skladu sa cerebrospinalnom tečnošću. Sintetska CSF takođe se naziva i veštačka CSF. U nekim oblicima, sintetska CSF je Elliottov B rastvor.

[0077]Pogodno za CNS dostavu: kao što je ovde korišćeno, fraza "pogodno za CNS dostavu" ili "pogodno za intratekalnu dostavu" koja se odnosi na farmaceutske kompozicije predmetnog pronalaska, generalno se odnosi na osobine kao što su stabilnost, tolerantnost i rastvorljivost ovakvih kompozicija kao i na sposobnost za dostavu efektivne količine terapeutskog agensa na ciljano mesto dostave (npr. CSF ili mozak).

[0078]Ciljana tkiva: kao što je ovde korišćeno, pojam "ciljana tkiva" odnosi se na bilo koje tkivo pogođeno lizozomskim bolestima nakupljanja koje treba da se leči ili bilo koje tkivo u kome je deficijencija lizozomskih enzima normalno izražena. U nekim oblicima, ciljana tkiva uključuju ona tkiva u kojima je detektovana ili abnormalno velika količina enzima supstrata, na primer nakupljena u lizozomskim ćelijama tkiva kod pacijenata koji pate od ili su podložni lizozomskim bolestima nakupljanja. U nekim oblicima, ciljano tkivo uključuje ona tkiva koja pokazuju patologiju vezanu za bolest, simptom ili neku odliku bolesti. U nekim oblicima, ciljana tkiva uključuju ona tkiva u kojima je deficijent lizozomskih enzima normalno izražen na povišenom nivou. Kao što je ovde korišćeno, ciljano tkivo može da bude moždano tkivo, tkivo kičmene moždine i/ili periferalno tkivo. Primer ciljanih tkiva detaljno su opisani ispod.

[0079]Terapeutski ostatak: kao što je ovde korišćeno, pojam "terapeutski ostatak" odnosi se na porciju molekula koji doprinosi terapeutskom efektu molekula. U nekim oblicima, terapeutski ostatak je polipeptid koji ima terapeutsku aktivnost.

[0080]Terapeutski efektivna količina: kao Što je ovde korišćeno, pojam "terapeutski efektivna količina" odnosi se na terapeutski protein (npr. enzim izmene) koji povećava terapeutski efekat na subjekat koji je tretiran pri razumnom odnosu koristi/rizika primenljivim na bilo koji medicinski tretman. Terapeutski efekat može da bude objektivan (npr. merljiv nekim testom ili markerom) ili subjektivan (npr. subjekat daje indikaciju ili osećaj efekta). Posebno, "terapeutski efektivna količina" odnosi se na količinu terapeutskog proteina ili kompozicije efikasne za lečenje, ublažavanje ili prevenciju željene bolesti ili stanja ili se odnosi na mogućnost detektovanja terapeutskog ili preventivnog efekta kao što su ublažavanje simptoma povezanih sa bolešću, prevencija ili odlaganje početka bolesti i/ili takođe smanjivanja ozbiljnosti ili frekvencije simptoma bolesti. Terapeutski efektivna količina često se administrira u režimu doza koji može da sadrži višestruke jedinice doza. Za bilo koji posebni terapeutski protein, terapeutski efektivna količina (i/ili pogodna jedinica doze sa efektivnim režimom doziranja) može da varira, na primer, u zavisnosti od načina administracije, od kombinacije sa drugim farmaceutskim agensima. Takođe, specifična terapeutski efektivna količina (i/ili jedinica doze) za nekog posebnog pacijenta može da zavisi od različitih faktora uključujući poremećaje koji se tretiraju i ozbiljnost poremećaja; aktivnost specifičnog farmaceutskog agensa je upotrebljena; specifična kompozicija je upotrebljena; godište, telesna težina, opšte zdravlje, pol i ishrana pacijenta; vreme administracije, način administracije i/ili odnos izlučivanja ili metabolizma specifične fuzije proteina je upotrebljeno; vreme trajanja tretmana; i si. faktori koji su poznati u medicinskoj praksi.

[0081]Tolerantan: kao što je ovde korišćeno, pojmovi "tolerantan" i "tolerantnost" odnose se na sposobnost farmaceutskih kompozicija predmetnog pronalaska da ne izazovu neželjene efekte kod subjekta kome je kompozicija administrirana ili alternativno da ne izazove ozbiljne neželjene efekte kod subjekta kome je kompozicija administrirana. U nekim oblicima, farmaceutske kompozicije predmetnog pronalaska su dobro tolerisane kod subjekta kome je kompozicija administrirana.

[0082]Tretman: kao što je ovde korišćeno, pojam "tretman" (takođe "lečenje") odnosi se na bilo koju administraciju terapeutskog proteina (npr. lizozomski enzim) koji parcijalno ili u celosti ublažava, poboljšava, olakšava, inhibira, odlaže početak, redukuje ozbiljnost i/ili redukuje učestalost jednog ili više simptoma ili odlika određene bolesti, poremećaja i/ili stanja (npr. Huntersov sindrom, Sanfilippo sindrom tip B). Ovakvi tretmani mogu da budu na subjektu koji ne ispoljava znake relevantne bolesti, poremećaja i/ili stanja i/ili na subjektu koji ispoljava samo rane znake bolesti, poremećaja i/ili stanja. Alternativno ili dodatno, ovakav tretman može da bude na subjektu koji ispoljava jedan ili više znakova relevantne bolesti, poremećaja i/ili stanja.

DETALJAN OPIS

[0083]Predmetni pronalazak obezbeđuje, između ostalog, poboljšane metode za efikasnu direktnu dostavu terapeutskog agensa centralnom nervnom sistemu (CNS). Kao stoje diskutovano iznad, predmetni pronalazak baziran je na neočekivanom otkriću da enzim izmene za lizozomske bolesti nakupljanja može direktno da bude uveden u cerebrospinalnu tečnost (CSF) subjektu kome je potreban tretman pri visokim koncentracijama bez izazivanja supstancijalnih neželjenih efekata. Još je više iznenađujuće to da sz istraživači predmetnog pronalaska pronašli da enzim izmene može da bude dostavljen u prostom fiziološkom rastvoru ili formulaciji baziranoj na puferu bez korišćenja sintetske CSF. Takođe je iznenađujuće da intratekalna dostava predmetnog pronalaska ne rezultuje u neželjenim efektima kao što su ozbiljni imuni odgovor subjekta. Stoga, u nekim oblicima, intratekalna dostava prema predmetnom pronalasku može da bude korišćena u odsustvu konkurentne imunosupresivne terapije (npr. bez izazivanja imune tolerancije pomoću predtretmana ili pred stanja).

[0084]U nekim oblicima, intratekalna dostava prema predmetnom pronalasku dozvoljava efikasnu difuziju kroz različita tkiva mozga rezultujući u efektivnoj dostavi enzima izmene u različitim ciljanim moždanim tkivima na površini, plitkim i/ili dubokim regionima mozga. U nekim oblicima, intratekalna dostava prema predmetnom pronalasku rezultuje u dovoljnoj količini enzima izmene koji ulaze u perifernu cirkulaciju. Kao rezultat, u nekim slučajevima, intratekalna dostava prema predmetnom pronalasku rezultuje u dostavi enzima izmene u perifernim tkivima, kao Što su jetra, srce i bubrezi. Ovo otkriće bilo je neočekivano i može naročito da bude korisno za tretman lizozomskih bolesti nakupljanja koje imaju i CNS i periferne komponente koje obično zahtevaju i intratekalnu i intravenoznu administraciju. Razmatrano je da intratekalna dostava prema predmetnom pronalasku može da dozvoli redukovanu dozu i/ili frekvenciju IV injektiranja tako da ne ugrožava terapeutske efekte u tretiranju perifernih simptoma.

[0085]Predmetni pronalazak obezbeđuje različite neočekivane i korisne odlike koje dozvoljavaju efikasnu i pogodnu dostavu enzima izmene različitim ciljanim moždanim tkivima, rezultujući u efektivnom tretmanu lizozomskih bolesti nakupljanja koje imaju CNS indikacije.

[0086]Različiti aspekti predmetnog pronalaska detaljno su opisani u sledećim sekcijama. Korišćenje sekcija ne namerava da ograniči predmetni pronalazak. Svaka sekcija može da se primeni na bilo koji aspekat pronalaska. U ovoj aplikaciji, upotreba "ili" znači "i/ili" ukoliko nije drugačije naglašeno.

Lizozomske bolesti nakupljanja i izmene enzima

[0087]Farmaceutske kompozicije prema predmetnom pronalasku mogu da se koriste u tretiranju bilo koje lizozomske bolesti nakupljanja, posebno onih koje imaju CNS etiologiju i/ili simptome, uključujući, ali nisu ograničeni na njih, aspartilglukozaminuriju, bolest nakupljanja estara holesterola, VVolmanovu bolest, cistinozu, Danonovu bolest, Fabrvijevu bolest, Farberovu lipogranulomatozu, Farberovu bolest, fukozidozu, galaktozialidozu tipovi I/II, Gaucherovu bolest tipovi I/II/III, globoidnu ćelijsku leukodistrofiju, Krabbeovu bolest, glikogensku bolest nakupljanja II, Pompeovu bolest, GM1-gangliozidozu tipovi I/II/III, GM2-gangliozidozu tip I, Tay Sachsovu bolest, GM2-gangliozidozu tip II, Sandhoffovu bolest, GM2-gangliozidozu, a-manozidozu tipovi I/II, beta-manozidozu, metahromatsku leukodistrofiju, mukolipidozu tip I, sialidoza tipovi I/II, mukolipidoza tipovi II/III, I-ćelijsku bolest, mukolipidozu tip IIIC, pseudo-Hurlerovu polidistrofiju, mukopolisaharidozu tip I, mukopolisaharidozu tip II, Hunterov sindrom, mukopolisaharidozu tip IIIA, Sanfilippov sindrom (tip A, B, C ili D), mukopolisaharidozu tip IIIB, mukopolisaharidozu tip IIIC, mukopolisaharidozu tip I1ID, mukopolisaharidozu tip IVA, Morquiov sindrom, mukopolisaharidozu tip IVB, mukopolisaharidozu tip VI, mukopolisaharidozu tip VII, Slvev sindrom, mukopolisaharidozu tip IX, deficijenciju multipla sulfataze, neuronsku ceroidnu lipofuscinozu, CLN1 Battenovu bolest, CLN2 Battenovu bolest, Niemann-Pickovu bolest tipovi A/B, Niemann-Pickovu bolest tip Cl, Niemann-Pickovu bolest tip C2, piknodizostozu, Schindlerovu bolest tipovi I/II, Gaucherovu bolest i bolest nakupljanja sijalinske kiseline.

[0088]U nekim oblicima, lizozomske bolesti nakupljanja kao Što su Hunterov sindrom, metahromatska leukodistrofija (MLD), Sanfilippov sindrom tipa A, Sanfilippov sindrom tipa B i globoidna ćelijska leukodistrofija (GLD) tretiraju se koristeći farmaceutske kompozicije predmetnog pronalaska.

[0089]Detaljan prikaz genetske etiologije, kliničkih manifestacija i molekularne biologije lizozomskih bolesti nakupljanja opisani su u Scriver et al., eds., The Metabolic and Molecular Basis of Inherited Bolest, Zsup.th Ed., Vol. II, McGraw Hill,

(1995). Stoga, deficijencija enzima kod gore napomenutih bolesti poznata je u praksi, neke od njih prikazane su primerima u tabeli ispod:

Enzimi izmene

[0090]Farmaceutske kompozicije prema predmetnom pronalasku mogu da se koriste za dostavu bilo kog enzima izmene. Kao što je ovde korišćeno, enzimi izmene pogodni za predmetni pronalazak mogu da uključe bilo koji enzim koji može da zameni barem parcijalnu aktivnost lizozomskog enzima koji je u manjku ili koji nedostaje kod lizozomskih bolesti nakupljanja koje se leče. U nekim oblicima, enzim izmene je sposoban za redukovanje nakupljene supstance u lizozomima ili može da spreči ili ublaži jedan ili više simptoma lizozomskih bolesti nakupljanja.

[0091]U nekim oblicima, pogodni enzim izmene može da bude bilo koji lizozomski enzim za koji se zna da je povezan sa lizozomskim bolestima nakupljanja koje se leče. U nekim oblicima, pogodni enzim izmene je enzim izabran kao enzim iz tabele 1. U nekim oblicima, enzim izmene za predmetni pronalazak je iduronat-2-sulfataza (I2S), arilsulfataza A (ASA), neparan N-sulfataza (HNS), alfa-N-acetilglukozaminidaza (Naglu) ili B-galaktozdaza (GLC).

[0092]U nekim oblicima, enzim izmene pogodan za predmetni pronalazak može da ima sekvence "divljeg tipa" ili sekvence koje se prirodno javljaju. U nekim oblicima, enzim izmene pogodan za predmetni pronalazak može da ima modifikovane sekvence koje imaju supstancijalnu homologiju ili su identifikovane kao sekvence "divljeg tipa" ili sekvence koje se prirodno javljaju (npr. imaju barem 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% sekvence identifikovane kao one "divljeg tipa" ili sekvence koje se prirodno javljaju).

[0093]Enzim izmene pogodan za predmetni pronalazak može da bude proizveden na bilo koji dostupni način. Na primer, enzimi izmene mogu rekombinantno da se proizvode koristeći inženjerizovane ćelije domaćina kako bi se ispoljila izmena enzim-šifrovana nukleinska kiselina. Alternativno ili dodatno, enzim izmene može da se proizvede aktiviranjem endogenih gena. Alternativno ili dodatno, enzim izmene može parcijalno ili potpuno da se pripremi hemijskim sintezama. Alternativno ili dodatno, enzim izmene takođe može da se prečišćava iz prirodnih izvora.

[0094]Tamo gde su enzimi rekombinantno proizvedeni, može da se koristi bilo koji ekspresioni sistem. Nekoliko primera koji uključuju sistemi ekspresije su jaja, bakulovirus, biljke, kvasac ili ćelije sisara.

[0095]U nekim oblicima, pogodni enzimi predmetnog pronalaska proizvedeni su u ćelijama sisara. Nelimitirajući primeri ćelija sisara koje mogu da se koriste u skladu sa predmetnim pronalaskom uključuju BALB/c mišje mijeloma linije (NSO/1, ECACC No: 85110503); humane retinoblaste (PER.C6, CruCell, Leiden, The Netherlands); CV1 linije bubrega majmuna transformisanih pomoću SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); humane embrionske linije bubrega (293 ili 293 ćelije subklonirane za rast u suspenzionoj kulturi, Graham et al., J. Gen Virol., 36:59,1977); humane fibrosarkoma ćelijske linije (npr. HT1080); ćelije bubrega mladunaca hrčka (BHK, ATCC CCL 10); jajne ćelije kineskog hrčka +/- DHFR (CHO, Urlaub and Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216, 1980); mišje sertolijeve ćelije (TM4, Mather, Biol. Reprod., 23:243-251, 1980); ćelije bubrega majmuna (CV1 ATCC CCL 70); ćelije bubrega afričkih zelenih majmuna (VERO-76, ATCC CRL-1 587); humane cervikalne karcinoma ćelije (HeLa, ATCC CCL 2); ćelije bubrega pasa (MDCK, ATCC CCL 34); ćelije jetre bufalo pacova (BRL 3A, ATCC CRL 1442); humane ćelije pluća (W138, ATCC CCL 75); humane ćelije jetre (Hep G2, HB 8065); mišji tumor dojke (MMT 060562, ATCC CCL51); TRI ćelije (Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci., 383:44-68, 1982); MRC 5 ćelije; FS4 ćelije; i humane hepatoma linije (Hep G2).

[0096]U nekim oblicima, farmaceutske kompozicije prema predmetnom pronalasku korišćene su za dostavu enzima izmene proizvedenih u humanim ćelijama. U nekim oblicima, farmaceutske kompozicije prema predmetnom pronalasku korišćene su za dostavu enzima izmene proizvedenih Iz CHO ćelija.

[0097]U nekim oblicima, enzimi izmene dostavljeni su koristeći metode predmetnog pronalaska koje sadrže ostatak koji se vezuje za receptor na površini moždanih ćelija kako bi se olakšao ćelijski unos i/ili lizozomsko ciljano mesto. Na primer, ovakvi receptori mogu da budu katjon nezavisni manoza-6-fosfat receptori (CI-MPR) koji vezuju ostatak manoza-6-fosfata (M6P). U dodatku, CI-MPR takođe vezuje druge proteine uključujući IGF-II. U nekim oblicima, enzim izmene pogodan za predmetni pronalazak sadrži M6P ostatke na površini proteina. U nekim oblicima, enzim izmene pogodan za predmetni pronalazak može da sadrži bis-fosforilovane oligosaharide koji imaju viši afinitet vezivanja za CI-MPR. U nekim oblicima, pogodni enzim sadrži u prošeku barem 20% bis-fosforitovanih oligosaharida po enzimu. U drugim oblicima, pogodni enzim može da sadrži oko 10%, 15%, 18%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60% bis-fosforilovanih oligosaharida po enzimu. Dok ovakvi bis-fosforilovani oligosaharidi mogu da budu prirodno prisutni u enzimu, treba da se napomene da enzimi mogu da budu modifikovani tako da poseduju ove oligosaharide. Na primer, pogodni enzimi izmene mogu da budu modifikovani pomoću određenih enzima koji su sposobni za katalizovanje prelaza N-acetilglukozamin-L-fosfata sa UDP-GIcNAc na poziciju 6' a-l,2-vezane manoze na lizozomskim enzimima. Metode i kompozicije za proizvodnju i korišcenje ovakvih enzima opisane su, na primer, u Canfield et al. in U.S. Pat. No. 6,537,785, and U.S. Pat. No. 6,534,300.

[0098]U nekim oblicima, enzimi izmene za upotrebu u predmetnom pronalasku mogu da budu konjugovanje ili vezane za lizozomski ciljani ostatak koji je sposoban za vezivanje za receptor na površini ćelija mozga. Pogodni lizozomski ciljani ostatak može da bude IGF-I, IGF-II, RAP, p97, i varijante, homolozi ili njihovi fragmenti (npr. uključujući one peptide koji imaju sekvence sa barem 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, ili 95% identični zrelim humanim peptidnim sekvencama "divljeg tipa" IGF-I, IGF-II, RAP, p97).

[0099]U nekim oblicima, enzimi izmene pogodni za predmetni pronalazak nisu modifikovani kako bi povećali dostavu ili transport ovakvih agenasa duž krvno-moždane barijere (BBB) i u CNS.

Intratekalna dostava

[0100]Prema predmetnom pronalasku, enzim izmene dostavljen je u CNS administriranjem u cerebrospinalnu tečnost (CSF) subjekta kome je potrebno lečenje. Intratekalna administracija korišćena je za dostavu željenog enzima izmene u CSF. Kao što je ovde korišćeno, intratekalna administacija (takođe se odnosi i na intratekalno injektiranje) odnosi se na injektiranje u kičmeni kanal (intratekalni prostor koji okružuje kičmenu moždinu). Poznate su različite tehnike uključujući lateralno cerebroventrikularno injektiranje u otvorenu lobanju (trepanacija) ili cisterne ili slabinske otvore i si. Primeri metoda opisani su u Lazorthes et al. Advances in Drug Đeliverv Svstems and Applications in Neurosurgerv, 143-192 and Omava et al., Cancer Drug Deliverv, 1: 169-179.

[0101]Prema predmetnom pronalasku, enzim može da bude injektiran intratekalno u bilo koji region koji okružuje kičmeni kanal. U nekim oblicima, enzim je injektiran intratekalno u slabinski deo ili u cisterna magnu. Kao što je ovde korišćeno, pojam "slabinski region" ili "slabinska površina" odnosi se na površinu između trećeg i četvrtog slabinskog pršljena (donji deo leđa), uključujući i L2-S1 segment kičme.Tipično, intratekalno injektiranje preko slabinskog regiona ili slabinske površine takođe se odnosi na "slabinski IT dostavu" ili "slabinsku IT administraciju". Pojam "cisterna magna" odnosi se na prostor oko i ispod cerebeluma preko otvora između lobanje i vrha kičme. Tipično, intratekalno injektiranje preko cisterna magne takođe se odnosi i na "cisterna magna dostavu". Pojam "cerebralna komora" odnosi se na šupljine u mozgu koje se nastavljaju na centralni kanal kičmene moždine. Tipično, injektiranje preko šupljina cerebralnih komora takođe se odnosi i na intraventrikularnu cerebralnu (ICV) dostavu.

[0102]"Intratekalna administracija" ili "intratekalna dostava prema predmetnom pronalasku odnosi se na slabinsku IT administraciju ili dostavu, na primer, dostava između trećeg i četvrtog pršljena (donji deo leđa) uključujući i L2-S1 segment kičme. Posmatrano je da se slabinska IT administracija ili dostava razlikuje od cisterna magna dostave prema predmetnom pronalasku i da obezbeđuje bolju i efikasniju dostavu distalnom kičmenom kanalu, dok cisterna magna dostava, između ostalog, tipično ne vrši dobru dostavu distalnom kičmenom kanalu.

Stabilne formulacije za IT dostavu

[0103]U nekim oblicima, željeni enzimi dostavljeni su u stabilnim formulacijama za intratekalnu dostavu. Određeni oblici predmetnog pronalaska bazirani su, barem delom, na otkriću da različite formulacije ovde opisane olakšavaju efektivnu dostavu i distribuciju jednog ili više enzima ciljanom tkivu, ćelijama i/ili organelama CNS-a. Između ostalog, formulacije opisane ovde sposobne su za rastvaranje enzima visokih koncentracija i pogodne su za dostavu ovakvih enzima CNS-u subjektima za lečenje bolesti koje imaju CNS komponentu i/ili etiologiju. Kompozicija opisana ovde dalje je okarakterisana poboljšanom stabilnošću i poboljšanom tolerancijom kada je administirana u CNS subjekta kome je potrebna (npr. intratekalno).

[0104]Pre predmetnog pronalaska, uobičajeni izotonični rastvor bez pufera i Elliottov 8 rastvor koji je veštačka CSF, obično su korišćeni za intratekalnu dostavu. Poređenje opisanih kompozicija CSF povezanih sa Elliottovim B rastvorom uključeno je u tabeli 2 ispod. Kao što je prikazano u tabeli 2, koncentracija Elliottovog B rastvora blisko se podudara sa koncentracijama CSF-a. Međutim, Elliottov B rastvor sadrži veoma nisku koncentraciju pufera i prema tome ne može da obezbedi adekvatni kapacitet pufera koji je pogodan za stabilizaciju proteina, posebno u dužem vremenskom periodu (npr. tokom nakupljanja). Dalje, Elliottov B rastvor sadrži određene soli koje mogu da budu inkompatibilne sa formulacijama namenjenim za dostavu nekim enzimima. Na primer, kalcijumove soli prisutne u Elliottovom B rastvoru sposobne su za posredovanje taloženja proteina i stoga za smanjivanje stabilnosti formulacije.

[0105]Stoga, u nekim oblicima, formulacije pogodne za intratekalnu dostavu prema predmetnom pronalasku nisu sintetska ili veštačka CSF.

[0106]U nekim oblicima, formulacije za intratekalnu dostavu formulisane su tako da su sposobne za stabilizovanje ili alternativno za usporavanje ili prevenciju degradacije jednog ili više rekombinantnih proteina. Kao stoje ovde korišćeno, pojam "stabilan" odnosi se na sposobnost rekombinantnog enzima da održi svoju terapeutsku efikasnost (npr. sav ili veliki deo njene biološke aktivnosti i/ili fizičko-hemijski osobine) u toku produženog vremenskog perioda. Stabilnost rekombinantnog enzima i sposobnost farmaceutske kompozicije da održi stabilnost ovakvog rekombinantnog enzima mogu da budu procenjeni u toku dužeg vremenskog perioda (npr. poželjno barem 1, 3, 6, 12, 18, 24, 30, 36 meseci ili duže). U kontekstu formulacije, stabilna formulacija je ona u kojoj terapeutski agens u suštini zadržava svoje fizičke i/ili hemijske osobine i biološku aktivnost tokom nakupljanja i u toku procesa (kao što su zamrzavanje/odmrzavanje, mehaničko mešanje i liofilizacija). Za stabilnost proteina, može da se meri formacija agregata velike molekulske mase, gubitak aktivnosti enzima, generacija peptidnih fragmenata i pramena profila naelektrisanja.

[0107]Stabilnost terapeutskog agensa je od velike važnosti. Stabilnost terapeutskog agensa može dalje da se ocenjuje u odnosu na biološku aktivnost ili fizičko-hemijske osobine terapeutskog agensa u dužem vremenskom periodu. Na primer, stabilnost u određenom trenutku vremena može da se poredi sa stabilnošću u prethodnom trenutku vremena (npr. pri formulisanju, dan 0) ili sa neformulisanim terapeutskim agensom i rezultat ovih poređenja izražen je u procentima. Poželjno, farmaceutske kompozicije predmetnog pronalaska održavaju barem 100%, 99%, 98%, 97% 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 50% biološke aktivnosti ili fizičko-hemijskih osobina terapeutskog agensa u dužem vremenskom periodu (npr. mereno je barem na 6-12 meseci, na sobnoj temperaturi ili pod uslovima nakupljanja).

[0108]U nekim oblicima, željeni enzim rastvoran je u formulacijama predmetnog pronalaska. Pojam "rastvoran" koji se vezuje za enzime predmetnog pronalaska odnosi se na sposobnost ovih enzima da formiraju homogeni rastvor. Poželjno, rastvorljivost enzima u rastvoru u koji je administriran i pomoću koga je transportovan do ciljanog mesta (npr. ćelije i tkiva mozga) dovoljna je da dozvoli dostavu terapeutski efektivne količine terapeutskog agensa na ciljano mesto. Nekoliko faktora može da utiče na rastvorljivost enzima. Na primer, relevantni faktori koji mogu da utiču na rastvorljivost proteina uključuju jonsku jačinu, sekvence aminokiselina i druge kosolubilne agense ili soli (npr. kalcijumove soli). U nekim oblicima, farmaceutske kompozicije su formulisane tako da su kalcijumove soli isključene iz ovakvih kompozicija.

[0109]Stoga, pogodne formulacije za intratekalnu administraciju mogu da sadrže terapeutski agens (npr. enzim) od interesa pri različitim koncentracijama. U nekim oblicima, pogodne formulacije mogu da sadrže protein ili enzim od interesa pri koncentraciji i do oko 300 mg/ml (npr. do oko 250 mg/ml, 200 mg/ml, 150 mg/ml, 100 mg/ml, 90 mg/ml, 80 mg/ml, 70 mg/ml, 60 mg/ml, 50 mg/ml, 40 mg/ml, 30 mg/ml, 25 mg/ml, 20 mg/ml, 10 mg/ml). U nekim oblicima, pogodne formulacije mogu da sadrže protein ili enzim od interesa pri koncentraciji u opsegu od oko 10-100 mg/ml (npr. oko 10-80 mg/ml, 10-70 mg/ml, 1-60 mg/ml, 1-50 mg/ml, 10-150 mg/ml, 1-30 mg/ml). U nekim oblicima, formulacije pogodne za intratekalnu dostavu mogu da sadrže protein od interesa pri koncentraciji od oko 10 mg/ml, 15 mg/ml, 20 mg/ml, 25 mg/ml, 50 mg/ml, 75 mg/ml, 100 mg/ml, 150 mg/ml, 200 mg/ml, 250 mg/ml ili 300 mg/ml.

[0110]U nekim oblicima, korišćeni su izotonični rastvori. U nekim oblicima, blago hipertonični rastvori (npr. do oko 300 mM (npr. do oko 250 mM, 200 mM, 175mM, 150 mM, 125 mM) natrijum hlorid u 5mM natrijum fosfata pri pH vrednosti od 7,0) i rastvori koji sadrže šećer (npr. do oko 3% (npr. do oko 2,4%, 2,0%, 1,5%, 1,0%) sukroza u 5mM natrijum fosfata pri pH vrednosti 7,0) pokazano je da su dobro tolerisani kod majmuna. U nekim oblicima, pogodna kompozicija CNS bolusne formulacije je fiziološki rastvor (npr. 150 mM NaCI u vodi).

[0111]Mnogi enzimi predmetnog pronalaska, zahtevaju kontrolisanu pH vrednost i specifične ekscipijense kako bi se održala njihova rastvorljivost i stabilnost u farmaceutskim kompozicijama predmetnog pronalaska. Tabela 3 ispod identifikuje određene primere aspekata formulacije proteina koje se smatraju važnim za održavanje rastvorljivosti i stabilnosti enzima predmetnog pronalaska.

[0112]pH vrednost farmaceutske kompozicije je dodatni faktor koji je sposoban za menjanje rastvorljivosti terapeutskog agensa (npr. enzim ili protein) u vodenom rastvoru farmaceutske kompozicije. U nekim oblicima, farmaceutske kompozicije predmetnog pronalaska sadrže jedan ili više pufera. U nekim oblicima, kompozicije prema predmetnom pronalasku sadrže dovoljnu količinu pufera za održavanje optimalne pH vrednosti pomenute kompozicije između oko 6,0-7,0. U drugim oblicima, pufer sadrži do oko 5 mM natrijum fosfata.

[0113]U nekim oblicima, formulacije sadrže izotonični agens kako bi se formulacija održala izotoničnom. Kao što je korišćeno u vezi sa IT dostavom, pod "izotoničnim" misli se na formulaciju od interesa koja u suštini ima isti osmolaritet kao CSF ljudi. Izotonične formulacije generalno imaju osmolaritet od oko 240 mOsm/kg do oko 350 mOsm/kg. Izotoničnost može da se meri koristeći, na primer, osmometre sa pritiskom pare ili sa tačkom mržnjenja. Primeri izotoničnih agenasa uključuju, ali nisu ograničeni na njih, glicin, sorbitol, manitol, natrijum hlorid i arginin. U nekim oblicima, pogodni izotonični agensi mogu da budu prisutni u formulacijama pro koncentraciji od oko 0.01-5 % (npr., 0,05; 0,1; 0,15; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5; 0,75; 1,0; 1,25; 1,5; 2,0; 2,5; 3,0; 4,0 ili 5,0%) od težine.

[0114]U nekim oblicima, formulacije mogu da sadrže agens za stabilizaciju kako bi se zaštitio protein. Tipično, pogodni agens za stabilizaciju je neredukujući šećer kao što su sukroza, rafinoza, trehaloza ili aminokiseline kao što su glicin,

arginin i metionin. Količina agensa za stabilizaciju u formulaciji je generalno takva da je izotonična. Međutim, hipertonične formulacije takođe mogu da budu pogodne. Dodatno, količina agensa za stabilizaciju ne srne da bude premala, da se ne bi javila neprihvatljiva količina degradacije/agregacije terapeutskog agensa. Primer koncentracija agensa za stabilizaciju u formulaciji može da bude u opsegu od oko 1 mM do oko 400 mM (npr. 30-300 i 50-100mM) ili alternativno od oko 0,1% do 15% (npr. od 1-10%, 5-15%, 5-10%) prema težini. U nekim oblicima, odnos količine mase agensa za stabilizaciju i terapeutskog agensa može da bude oko 0,1:1, 0,2:1, 0,25:1, 0,4:1, 0,5:1, 1:1, 2:1, 2,6:1, 3:1, 4:1, 5:1, 10;1 ili 20:1. U nekim oblicima, pogodnim za liofilizaciju, agensi za stabilizaciju su takođe lioprotektanti.

[0115]Farmaceutska kompozicija predmetnom pronalaska korišćena je za dostavu proteina i enzima subjektu koji pati od poremećaja lizozomskih nakupljanja.

[0116]U nekim oblicima, poželjno je da se formulaciji dodaju surfaktanti. Primeri surfaktanata uključuju nejonske surfaktante kao što su polisorbati (npr. polisorbati 20 ili 80); poloksameri (npr. poloksameri 188); triton; natrijum dodecil sulfat (SDS); natrijum laurel sulfat, natrijum oktil glikozid; lauril-, miristil-, linoleil- ili stearil-sulfobetain; lauril-, miristil-, linoleil- ili stearil-sarkozin; linoleil-, miristil-, ili cetil-betain; lauroamidopropil-, kokamidopropil-, linoleamidopropil-, miristamidopropil-, palmidopropil- ili izostearamidopropil-betain (npr. lauroamidopropil); miristamidopropil-, palmidopropil-ili izostearamidopropil-dimetilamin; natrijum metil kokoil-, ili dinatrijum metilofeiltaurat; i MONAQUAT™ serije (Mona Industries, Inc., Paterso<p>, NJ.), polietil glikol, polipropil glikol i kopolimeri etilen i propilen glikola (npr. Pluronici, PF68, itd.). Obično, dodata količina surfaktanta je takva da smanjuje agregaciju proteina i umanjuje formiranje čestica ili pene. Na primer, surfaktant može da bude prisutan u formulaciji na koncentraciji od oko 0,005%, 0,01 %, 0,02%, 0,1%, 0,2%, 0,3%, 0,4% ili 0.5% itd.

[0117]U nekim oblicima, pogodne formulacije mogu dalje da uključe jedan ili više bulking agenasa, posebno, za liofilizovane formulacije. "Bulking agent" je jedinjenje koje dodaje masu liofilizovanoj smeši i doprinosi fizičkoj strukturi liofilizovane pogače (npr. uniformna liofilizovana pogača). Pogodan "bulking agent" uključuje, ali nije ograničen na njih, natrijum hlorid, laktozu, manitol, glicin, sukrozu, trehalozu, hidroksietil škrob. Primer koncentracije bulking agenasa su od 1% do oko 10% (npr. 1,0%, 1,5%, 2,0%, 2,5%, 3,0%, 3,5%, 4,0%, 4,5%, 5,0%, 5,5%, 6,0%, 6,5%, 7,0%, 7,5%, 8,0%, 8,5%, 9,0%, 9,5% i 10,0%).

[0118]Formulacije prema predmetnom pronalasku mogu da se procenjuju bazirane na kvalitativnoj analizi proizvoda, vremenu rekonstitucije (ako je liofilizovana), kvalitet rekonstitucije (ako je liofilizovana), velikoj molekulskoj masi, vlazi i temperaturi reverzibilne tranzicije kod amorfnih materijala (eng. glass transition temperature. Obično, kvalitet proteina i analiza proizvoda uključuje analize brzine degradacije proizvoda koristeći metode koje uključuju siže exclusion HPLC (SE-HPLC), katjon exchange-HPLC (CEX-HPLC), difrakciju X-zraka (XRO), modulisanu diferencijalnu skening kalorimetriju (mDSC), reverznu fazu HPLC (RP-HPLC), višeugaono rasipanje svetlosti (MALS), fluorescenciju, ultraljubiČastu apsorpciju, nefelometriju, kapilarnu elektroforezu (CE), SDS-PAGE i njihove kombinacije. U nekim oblicima, evaluacija proizvoda prema predmetnom pronalasku može da uključi korak izgleda vrednovanja (javljanja u vidu tečnosti ili u vidu pogače).

[0119]Generalno, formulacije (liofilizovana ili vodena faza) može da se čuva u produženom vremenskom periodu na sobnoj temperaturi. Temperatura skladištenja tipično je u opsegu od 0°C do 45°C (npr. 4°C, 20°C, 25°C, 45°C itd.). Formulacije mogu da se čuvaju mesecima, pa i godinama. Vreme skladištenja generalno biće 24, 12, 6, 4, 5, 3, 2 ili 1 mesec. Formulacije mogu direktno da se čuvaju u bočicama za administraciju eliminišući korake transfera.

[0120]Formulacije mogu da se čuvaju direktno u bočicama za liofilizaciju (ako su liofilizovane) koji takođe mogu da funkcioniŠu kao rekonstitucioni sud, koji eliminiše korake transfera. Alternativno, formulacije liofilizovanih proizvoda mogu da budu izmerene u manjim punjenjima za skladištenje. Skladištenje treba generalno da izbegava okolnosti koje dovode do degradacije proteina, uključujući, ali nisu ograničeni na njih, izlaganje Sunčevim zracima, UV radijaciju, druge oblike elektromagnetske radijacije, prekomerno zagrevanje ili hlađenje, brz termalni šok i mehanički šok.

[0121]Formulacije prema predmetnom pronalasku su u obliku vodenog rastvora.

[0122]Farmaceutske kompozicije predmetnog pronalaska okarakterisane su njihovom tolerancijom. Kao što je ovde korišćeno, pojmovi "tolerantni" ili "tolerancija" odnose se na sposobnost farmaceutskih kompozicija predmetnog pronalaska da ne izazivaju neželjene efekte kod subjekta kome se ove kompozicije administriraju ili alternativno da ne izazivaju ozbiljne neželjene efekte kod subjekta kome se ove kompozicije administriraju. U nekim oblicima, farmaceutske kompozicije predmetnog pronalaska su dobro tolerisane od strane subjekta kome se kompozicije administriraju.

Uređaj za intratekalnu dostavu

[0123]Različiti uređaji mogu da se koriste za intratekalnu dostavu prema predmetnom pronalasku. U nekim oblicima, uređaji za intratekalnu administraciju sadrže port za unos tečnosti (npr. port za injektiranje); šuplje telo (npr. kateter) koji ima otvor za primarni protok tečnosti koji je u vezi sa portom za injektiranje i otvorom za sekundarni protok tečnosti podešen za insertaciju u kičmenu moždinu. Kao što je prikazano nelimitirajućim primerom prikazanim na slici 1, pogodni mehanizam zaštite sadrži jedno ili više "ispupčenja" (eng. nob) nameštenih na površinu šupljeg tela (npr. katetera) i nakačen prsten koji je podesiv preko jednog ili više ispupčenja kako bi se sprečilo ispadanje iz kičmene moždine. U različitim oblicima port za pristup fluida sadrži rezervoar. U nekim oblicima, port za pristup fluida sadrži mehaničku pumpu (npr. infuzionu pumpu). U nekim oblicima, implantirani kateter povezan je ili na rezervoar (npr. za bolusnu dostavu) ili na infuzionu pumpu. Port za pristup fluida može da bude implantiran ili da bude eksterni.

[0124]U nekim oblicima, intratekalna administracija može da se vrši ili lumbalnom punkcijom (npr. spori bolus) ili preko port-kateter sistema dostave (npr. infuzija ili bolus). U nekim oblicima, kateter je insertovan između laminae i slabinskog pršljena i vrh je stavljen u tekalni prostor na željenoj visini (generalno L3-L4) (slika 2).

[0125]Vezano za intravenoznu administraciju, zapremina pojedinačne doze pogodna za intratekalnu administraciju obično je mala. Obično, intratekalna dostava prema predmetnom pronalasku održava ravnotežu kompozicije CSF-a kao i intrakranijalni pritisak subjekta. U nekim oblicima, intratekalna dostava vrši se u odsustvu odgovarajućeg uklanjanja CSF-a iz subjekta. U nekim oblicima, pogodna pojedinačna doza može da bude manja od oko 10 ml, 8 ml, 6 ml, 5 ml, 4 ml, 3 ml, 2 ml, 1,5 ml, 1 ml ili 0,5 ml. U nekim oblicima, pogodna zapremina pojedinačne doze može da bude oko 0,5-5 ml, 0,5-4 ml, 0,5-3 ml, 0,5-2 ml, 0,5-1 ml, 1-3 ml, 1-5 ml, 1,5-3 ml, 1-4 ml ili 0,5-1,5 ml. U nekim oblicima, intratekalna dostava prema predmetnom pronalasku uključuje korak uklanjanja željene količine CSF prvo. U nekim oblicima, manje od oko 10 ml (npr. manje od oko 9 ml, 8 ml, 7 ml, 6 ml, 5 ml, 4 ml, 3 ml, 2 ml, 1 ml) pre IT administracije prvo se uklanja CSF. U ovim slučajevima, pogodna pojedinačna zapremina doze može da bude na primer, više od 3 ml, 4 ml, 5 ml, 6 ml, 7 ml, 8 ml, 9 ml, 10 ml, 15 ml ili 20 ml.

[0126]Razni drugi uređaji mogu da se koriste za ostvarivanje intratekalne administracije terapeutske kompozicije. Na primer, formulacije koje sadrže željene enzime mogu da se navedu koristeći "Ommava" rezervoar koji je u čestoj upotrebi za intratekalnu administraciju lekova za karcinomatozu moždanih opni (Lancet 2: 983-84, 1963). Specifičnije, u ovoj metodi, ventrikularna cev je ubačena kroz rupu formiranu u anteriornom rogu i povezana je za Omnava rezervoar instaliran ispod skalpa i rezervoar je subkutaneo probušen za intratekalnu dostavu određenog enzima koji se izmenjuje, koji je injektovan u rezervoar. Drugi uređaji za intratekalnu administraciju terapeutske kompozicije formulacija individui opisani su u U.S. Pat. No. 6,217,552. Alternativno, lek može da bude dat intratekalno, na primer, kao pojedinačna doza ili višestruka doza.

[0127]Za injektiranje, formulacije pronalaska formulisane su u tečnim rastvorima. Injektiranje enzima može da bude, na primer, u formi bolusnog injektiranja ili kontinualne infuzije (npr. koristeći infuzione pumpe).

[0128]Enzim može da bude administriran lateralnim cerebroventrikularnim injektiranjem u mozak subjekta. Injektiranje može da bude izvršeno kroz, na primer, malu rupu (eng. burr hole) u lobanji subjekta ili kroz hirurški ubačeni šant u cerebralnu komoru subjekta. Na primer, injektovanje može da se izvrši kroz lateralne komore, koje su veće ili kroz treću i četvrtu manju komoru.

[0129]Prema predmetnom pronalasku, farmaceutske kompozicije koje su ovde korišćene administrirane su intratekalno injektiranjem u cisterna magna ili slabinski deo subjekta.

[0130]U narednom obliku metode pronalaska, farmaceutski prihvatljiva formulacija obezbeđuje usporenu dostavu, npr. "sporo otpuštanje" enzima ili druge farmaceutske kompozicije korišćene u predmetnom pronalasku subjektu barem jednu, dve, tri, četiri nedeije ili u dužim vremenskim periodima nakon što je farmaceutski prihvatljiva formulacija administrirana subjektu.

[0131]Kao što je ovde korišćeno, pojam "sporo otpuštanje" odnosi se na kontinualnu dostavu farmaceutske formulacije predmetnog pronalaska in vivo u toku vremenskog perioda, poželjno barem nekoliko dana, nedelju dana ili nekoliko nedelja praćeno administracijom. Odloženo otpuštanje kompozicije može da se prikaže pomoću, na primer, kontinualnim terapeutskim efektom enzima u toku vremena (npr. odloženo otpuštanje enzima može da se pokaže kontinualnim smanjenjem količine nakupljenih granula u subjektu). Alternativno, odloženo otpuštanje enzima može da se prikaže pomoću detektovanja prisutnog enzima in vivo u toku vremena.

Dostava ciljanim tkivima

[0132]Kako je razmatrano iznad, jedan od iznenađujućih i važnih odlika predmetnog pronalaska je ta da su enzimi izmene administrirani koristeći kompozicije predmetnog pronalaska u mogućnosti da efektivno i ekstenzivno difunduju kroz površinu mozga i penetriraju različite slojeve ili regione mozga, uključujući duboke regione mozga. U dodatku, kompozicije predmetnog pronalaska efektivno dostavljaju enzime izmene različitim tkivima, neuronima ili ćelijama kičmene moždine, uključujući slabinski deo koji je teško dostići postojećim CNS metodama dostave kao što su ICV injektiranje. Štaviše, kompozicije predmetnog pronalaska dostavljaju dovoljne količine, npr. enzima izmene u krvotok i u različite periferne organe i tkiva.

[0133]Stoga, u nekim oblicima, enzim izmene dostavljen je centralnom nervnom sistemu subjekta. U nekim oblicima, enzim izmene dostavljen je jednom ili više ciljanim tkivima mozga, kičmenoj moždini i/ili perifernim organima. Kao što je ovde korišćeno, pojam "ciljano tkivo" odnosi se na bilo koje tkivo koje je zahvaćeno lizozomskim bolestima nakupljanja i koje treba da se leči ili bilo koje tkivo u kome je deficijencija lizozomskog enzima normalno izražena. U nekim oblicima, ciljana tkiva uključuju ona tkiva u kojima može da se detektuje ili je abnormalno visoka količina enzima supstrata, na primer, nakupljenih u ćelijskim lizozomima tkiva, kod pacijenata koji pate od ili su podložni lizozomskim bolestima nakupljanja. U nekim oblicima, ciljana tkiva uključuju ona tkiva koja pokazuju patologiju povezanu sa bolešću, simptomom ili neke odlike. U nekim oblicima, ciljana tkiva uključuju ona tkiva u kojima je deficijent lizozomskog enzima normalno izražen na povišenom nivou. Kao što je ovde korišćeno, ciljano tkivo može da bude moždano ciljano tkivo, tkivo kičmene moždine i/ili periferno ciljano tkivo. Primeri ciljanih tkiva detaljnije su prikazani ispod.

Ciljana tkiva mozga

[0134]Generalno, mozak može da bude podeljen u različite regione, slojeve i tkiva. Na primer, tkivo moždane opne je sistem membrana koji prekriva centralni nervni sistem, uključujući i mozak. Moždane opne sadrže tri sloja, unutrašnje, meke moždane opne (pia mater); spoljašnje, tvrde moždane opne (dura mater); i paučinaste moždane opne (arachnoidea). Generalno, primarna funkcija moždane opne cerebrospinalne tečnosti je da može da zaštiti centralni nervni sistem. U nekim oblicima, terapeutski protein u skladu sa predmetnim pronalaskom dostavljen je jednom ili u više slojeva moždane opne.

[0135]Mozak ima tri primarna odseka, uključuju cerebrum, cerebelum i moždano stablo. Cerebralne hemisfere, nalaze se iznad većine drugih moždanih struktura i prekrivene su kortikalnim slojem. Ispod cerebruma leži moždano stablo, koje podseća na stablo za koji je vezan cerebrum. U zadnjem delu mozga, ispod cerebruma i iza moždanog stabla je cerebelum.

[0136]Diencefalon, koji je lociran blizu medijalne linije mozga i iznad mezencefalona, sadrži talamus, metatalamus, hipotalamus, epitalamus, pretalamus i pretektum. Mezencefalon, takođe poznat i kao srednji mozak, sadrži tektum, tegumentum, moždani akvadukt (ventrikulska mesocoelia) i cerebralne pedunkule, crveno jedro i jedro III kranijalnog nerva. Mezencefalon povezan je sa vidom, sluhom, motorikom, spavanjem/budnošću, opreznošću i regulacijom temperature.

[0137]Regioni tkiva centralnog nervnog sistema, uključujući i mozak, okarakterisani su na bazi dubine tkiva. Na primer, tkiva CNS-a (npr. mozak) mogu da budu okarakterisana kao površina ili šuplja tkiva, srednje duboka tkiva i/ili duboka tkiva.

[0138]Prema predmetnom pronalasku, enzim izmene može da bude dostavljen bilo kom odgovarajućem ciljanom moždanom tkivu povezanim sa određenim bolestima koje se leče kod subjekta. U nekim oblicima, enzim izmene prema predmetnom pronalasku dostavljen je površini ili ciljanom šupljem moždanom tkivu. U nekim oblicima, terapeutski protein prema predmetnom pronalasku dostavljen je u srednju dubinu ciljanog moždanog tkiva. U nekim oblicima, terapeutski protein prema predmetnom pronalasku dostavljen je u kombinaciji površine ili plitkog ciljanog moždanog tkiva, ciljanog moždanog tkiva srednje dubine i/ili dubokog ciljanog moždanog tkiva. U nekim oblicima, terapeutski protein prema predmetnom pronalasku dostavljen je moždanom tkivu na barem 4 mm, 5 mm, 6 mm, 7 mm, 8 mm, 9 mm, 10 mm ili više ispod (ili interne) eksterne površine mozga.

[0139]U nekim oblicima, enzimi su dostavljeni jednoj ili više površinama ili plitkim tkivima cerebruma. U nekim oblicima, ciljana površina ili plitko tkivo cerebruma locirano je na 4 mm od površine cerebruma. U nekim oblicima, ciljane površine ili plitka tkiva cerebruma izabrana su kao pia mater tkiva,, cerebralna kortikalna tkiva promene (eng. cerebral cortical ribbon tissues), hipokampus, Virchovv Robinov prostor, krvni sudovi zajedno sa VR prostorom, hipokampus, porcije hipotalamusa na inferior površini mozga, optički nervi i trakti, mirisni mozak i projekcije i njihove kombinacije.

[0140]U nekim oblicima, enzimi se dostavljaju jednom ili više dubokim tkivima cerebruma. U nekim oblicima, ciljana površina ili šuplje tkivo cerebruma locirana je na 4 mm (npr. 5 mm, 6 mm, 7 mm, 8 mm, 9 mm, or 10 mm) ispod (ili u unutrašnjosti) površine cerebruma. U nekim oblicima, ciljana duboka tkiva cerebruma uključuju , cerebralnog kortikalnog tkiva promene (eng. cerebral cortical ribbon tissues). U nekim oblicima, ciljana duboka tkiva cerebruma uključuju jedan ili više delova diencefalona (npr. hipotalamus, talamus, pretalamus, subtalamus itd.), mezencefalon, lentiform nukleus, bazalnu gangliju, caudate, putamen, amigdalu, globus pallidus i njihovu kombinaciju.

[0141]U nekim oblicima, enzimi su dostavljeni jednom ili u više tkiva cerebeluma. U određenim oblicima, ciljano jedno

ili više tkiva cerebeluma izabrani su iz grupe koju čine tkiva molekulskog sloja, tkiva sloja Purkinjeovih ćelija, tkiva granularnog ćelijskog sloja, cerebralni pedunkuli i njihova kombinacija. U nekim oblicima, enzimi se dostavljaju jednom ili više dubokim tkivima cerebeluma uključujući, ali nisu ograničeni na njih, tkiva sloja Purkinjeovih ćelija, tkiva granularnog ćelijskog sloja, dubokog tkiva cerebelarne bele mase (npr. duboka odnosi se na granularni ćelijski sloj) i duboka cerebelarna tkiva nukleusa.

[0142]U nekim oblicima, enzimi su dostavljeni jednom ili više tkivima moždanog stabla. U nekim oblicima, ciljano jedno ili više tkiva moždanog stabla uključuju belu masu moždanog stabla i/ilt tkiva nukleusa moždanog stabla.

[0143]U nekim oblicima, enzimi dostavljeni različitim tkivima mozga, uključuju, ali nisu ograničeni na njih, sivu masu, belu masu, periventrikularne površine, pia-arachnoid, moždane opne, neokorteks, cerebelum, duboka tkiva u cerebralnom korteksu, molekulski sloj, caudate/putamen region, srednji mozak, duboke regione ponsa i medulle i njihovu kombinaciju.

[0144]U nekim oblicima, enzimi dostavljeni različitim ćelijama mozga uključuju, ali nisu ograničeni na njih, neurone, glijalne ćelije, perivaskularne ćelije i/ili ćelije moždanih opni. U nekim oblicima, terapeutski protein dostavljen je oligodendrocitima duboke bele mase.

Kičmena moždina

[0145]Generalno, segmenti tkiva kičmene moždine mogu da budu okarakterisani na osnovu dubine tkiva. Na primer, tkiva kičmene moždine mogu da budu okarakterisana kao površina ili Šuplja tkiva, srednje duboka tkiva i/ili duboka tkiva.

[0146]U nekim oblicima, enzimi su dostavljeni jednoj ili više površinama ili šupljem tkivu kičmene moždine. U nekim oblicima, ciljana površina ili šuplje tkivo kičmene moždine likalizovano je na 4 mm od površine kičmene moždine. U nekim oblicima, ciljana površina ili šuplje tkivo kičmene moždine sadrži pia mater i/ili deo bele mase.

[0147]U nekim oblicima, enzimi su dostavljeni jednom ili više dubokim tkivima kičmene moždine. U nekim oblicima, obeležena duboka tkiva kičmene moždine lokalizovana su interno 4 mm od površine kičmene moždine. U nekim oblicima, ciljano duboko tkivo kičmene moždine sadrži sivu masu i/ili ependimalne ćelije.

[0148]U nekim oblicima, enzimi su dostavljeni neuronima kičmene moždine.

Periferna ciljana tkiva

[0149]Kao što je ovde korišćeno, periferni organi ili tkiva odnose se na bilo koje organe ili tkiva koji nisu deo centralnog nervnog sistema (CNS). Periferna ciljana tkiva mogu da uključe, ali nisu ograničeni na njih, krvni sistem, jetru, bubrege, srce, endotel, koštanu srž i ćelije dobijene iz koštane srži, slezinu, pluća, limfne čvorove, kosti, hrskavicu, jajnike i testise. U nekim oblicima, enzim izmene prema predmetnom pronalasku dostavljen je jednom ili više ciljanim tkivima.

Biodistribucija i bioraspoloživost

[0150]U različitim oblicima, kada je jednom dostavljen ciljanom tkivu, enzim izmene je lokalizovan intracelularno. Na primer, enzim može da bude lokalizovan u eksonima, aksonima, lizozomima, mitohondrijama ili vakuolama ciljane ćelije (npr. neuroni kao što su Purkinjeove ćelije). Na primer, u nekim oblicima intratekalno administrirani enzimi predstavljaju dinamiku translokacija kao što su pomeraji enzima u perivaskularnom prostoru (npr. pulsiranje uz pomoć konventivnih mehanizama). U dodatku, aktivni aksonski transportni mehanizmi koji se odnose na vezu administriranog proteina ili enzima sa neurofilamentima takođe mogu da doprinesu ili na neki drugi način da olakšaju distribuciju intratekalno administriranih proteina ili enzima u dublja tkiva centralnog nervnog sistema.

[0151]U nekim oblicima, enzim izmene dostavljen prema predmetnom pronalasku može da dostigne terapeutske ili klinički efektivne nivoe ili aktivnosti u različitim ciljanim tkivima koji su ovde opisani. Kao što je ovde korišćeno, terapeutski ili klinički efektivni nivo ili aktivnost je na nivou ili aktivnosti dovoljnoj da dodeli terapeutski efekat u ciljanom tkivu. Terapeutski efekat može da bude objektivan (npr. merljiv nekim testom ili markerom) ili subjektivan (npr. subjekat daje znake ili oseća efekte). Na primer, terapeutski ili klinički efikasni nivoi ili aktivnosti mogu da budu enzimski nivoi ili aktivnosti koji su dovoljni da ublaže simtome povezane sa bolešću u ciljanom tkivu. (npr. GAG nakupljanje).

[0152]U nekim oblicima, enzim izmene dostavljen prema predmetnom pronalasku može da dostigne enzimski nivo ili aktivnost koja je barem 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% od normalnog nivoa ili aktivnosti odgovarajućeg lizozomskog enzima u ciljanom tkivu. U nekim oblicima, enzim izmene dostavljen prema predmetnom pronalasku može da dostigne enzimski nivo ili aktivnost koja je narasla barem 1-pu, 2-put, 3-put, 4-puta, 5-puta, 6-puta, 7-puta, 8-puta, 9-puta ili 10-puta u poređenju sa kontrolom (npr. endogeni nivoi ili aktivnosti bez tretmana). U nekim oblicima, enzim izmene dostavljen prema predmetnom pronalasku može da dostigne povećane enzimske nivoe ili aktivnosti barem za oko 10 nmol/h/mg, 20 nmol/h/mg, 40 nmol/h/mg, 50 nmol/h/mg, 60 nmol/h/mg, 70 nmol/h/mg, 80 nmol/h/mg, 90 nmol/h/mg, 100 nmol/h/mg, 150 nmol/h/mg, 200 nmol/h/mg, 250 nmol/h/mg, 300 nmol/h/mg, 350 nmol/h/mg, 400 nmol/h/mg, 450 nmol/h/mg, 500 nmol/h/mg, 550 nmol/h/mg ili 600 nmol/h/mg u ciljanom tkivu.

[0153]U nekim oblicima, farmaceutske kompozicije prema predmetnom pronalasku posebno su korisne za ciljanje u slabinskom regionu. U nekim oblicima, enzim izmene dostavljen prema predmetnom pronalasku može da dostigne povećane enzimske nivoe ili aktivnosti u slabinskom regionu barem za oko 500 nmol/h/mg, 600 nmol/h/mg, 700 nmol/h/mg, 800 nmol/h/mg, 900 nmol/h/mg, 1000 nmol/h/mg, 1500 nmol/h/mg, 2000 nmol/h/mg, 3000 nmol/h/mg, 4000 nmol/h/mg, 5000 nmol/h/mg, 6000 nmol/h/mg, 7000 nmol/h/mg, 8000 nmol/h/mg, 9000 nmol/h/mg ili 10 000 nmol/h/mg.

[0154]Generalno, enzimi izmene dostavljeni prema predmetnom pronalasku imaju dovoljno dugo poluvreme u CSF i ciljanom tkivu mozga, kičmenoj moždini i perifernim organima. U nekim oblicima, terapeutski agens (npr. enzim izmene) dostavljen prema predmetnom pronalasku može da ima poluživot barem oko 30 minuta, 45 minuta, 60 minuta, 90 minuta, 2 sata, 3 sata, 4 sata, 5 sati, 6 sati, 7 sati, 8 sati, 9 sati, 10 sati, 12 sati, 16 sati, 18 sati, 20 sati, 25 sati, 30 sati, 35 sati, 40 sati, do 3, 7, 14 do 21 dan ili do mesec dana. U nekim oblicima, enzimi izmene dostavljeni prema predmetnom pronalasku mogu da zadrže detektabilne nivoe ili aktivnost u CSF ili kn/otoku nakon 12 sati, 24 sata, 30 sati, 36 sati, 42 sata, 48 sati, 54 sata, 60 sati, 66 sati, 72 sata, 78 sati, 84 sata, 90 sati, 96 sati, 102 sata ili celu nedelju prateći administraciju. Detektabilni nivoi ili aktivnost mogu da budu određene koristeći različite metode poznate u praksi.

[0155]U određenim oblicima, enzim izmene dostavljen prema predmetnom pronalasku dostiže koncentraciju od barem 30mg/ml u tkivu CNS-a i ćelijama subjekta koju prati administracija (npr. nedelju dana, 3 dana, 48 sati, 36 sati, 24 sata, 18 sati, 12 sati, 8 sati, 6 sati, 4 sata, 3 sata, 2 sata, 1 sat, 30 minuta, ili manje, praćeno intratekalnom administracijom farmaceutske kompozicije subjektu). U određenim oblicima, enzim izmene dostavljen prema predmetnom pronalasku dostiže koncentraciju od barem 20mg/ml, 15mg/ml, lOmg/ml, 7,5mg/ml, 5mg/ml, 2,5mg/ml, l,0mg/ml ili 0,5mg/ml u ciljanom tkivu ili ćelijama subjekta (npr. tkivu mozga ili u neurone) praćeni administracijom ovim subjektima (npr. nedelju dana, 3 dana, 48 sati, 36 sati, 24 sata, 18 sati, 12 sati, 8 sati, 6 sati, 4 sata, 3 sata, 2 sata, 1 sat, 30 minuta ili manje praćeno intratekalnom administracijom ovih farmaceutskih kompozicija subjektu).

Lečenje lizozomskih bolesti nakupljanja intratekalnom administracijom

[0156]Lizozomske bolesti nakupljanja predstavljaju grupu relativno retkih naslednih metaboličkih poremećaja koje rezultuju u defektima lizozomske funkcije. Lizozomske bolesti su okarakterisane akumulacijom nesvarenih makromolekula, uključujući one enzime supstrata u lizozomima (videti tabelu 1), koja rezultuje u povećanju veličine i broja ovakvih lizozoma i na kraju do disfunkcije ćelija i kliničke abnormalnosti.

[0157]Farmaceutske kompozicije ovde opisane mogu povoljno da olakšaju dostavu jednog ili vise enzima izmene do ciljanih organela. Na primer, zbog lizozomskih poremećaja nakupljanja kao što su Hunterov sindrom koji je okarakterisan akumulacijom glikozaminoglikana (GAG) u lizozomima zahvaćenih ćelija, lizozomi predstavljaju željene ciljane organele za tretman lizozomskih poremećaja nakupljanja.

[0158]Kompozicije predmetnog pronalaska posebno su korisne u lečenju onih bolesti koje imaju CNS etiologiju ili komponentu. Lizozomske bolesti nakupljanja koje imaju CNS etiologiju ili komponentu, uključuju, na primer, bez ograničenja Sanfilippov sindrom tipa A, Sanfilippov sindrom tipa B, Hunterov sindrom, metahromatsku leukodistrofiju i globoidnu ćelijsku leukodistrofiju. Pre predmetnog pronalaska, uobičajene terapije bile su ograničene tako da mogu da se administriraju subjektu intravenozno i uopšte, da su samo efikasne u lečenju somatskih simptoma osnovne deficijencije enzima. Kompozicije i metode predmetnog pronalaska mogu povoljno da budu administrirane direktno u CNS subjekta koji pati od bolesti koji ima ovakvu CNS etiologiju i stoga dostižu terapeutsku koncentraciju u zahvaćenim ćelijama i tkivima CNS-a (npr. mozga), stoga prevazilazeći ograničenja povezana sa uobičajenom sistemskom administracijom ovakvih terapeutskih agenasa.

[0159]U nekim oblicima, kompozicije predmetnog pronalaska korisne su za lečenje i neuroloških i somatskih posledica

ili simptoma lizozomskih poremećaja nakupljanja. Predmetni pronalazak vezuje se za kompozicije za intratekalnu dostavu jednog ili više terapeutskih agenasa u CNS subjekta za lečenje CNS ili neuroloških posledica i ispoljavanja lizozomskih bolesti nakupljanja, dok se takođe tretiraju sistemske i somatske manifestacije lizozomske bolesti nakupljanja. Na primer, neke kompozicije predmetnog pronalaska mogu da se administriraju subjektu intratekalno, time dostavljajući jedan ili više terapeutskih agenasa CNS-u subjekta i lečenju neuroloških posledica, kuplovanih sa intravenoznom administracijom jednog ili više terapeutskih agenasa za njihovu dostavu u ćelije i u tkiva sistemske cirkulacije (npr. ćelije i tkiva srca, pluća, jetra, bubreg ili limfni čvorovi) i time leče somatske posledice. Na primer, subjekat koji ima ili je na neki drugi način zahvaćen lizozomskom bolešću nakupljanja (npr. Hunterov sindrom) može da mu bude administrirana intratekalno farmaceutska kompozicija koja sadrži jednu ili više terapeutskih agenasa (npr. idunorat-2-sulfatazu) barem jednom nedeljno, na dve nedeije, mesečno, na dva meseca ili duže za lečenje neuroloških posledica, dok je drugačiji terapeutski agens administriran subjektu intravenozno mnogo češće (npr.jednom dnevno, svaki drugi dan, tri puta nedeljno ili jednom nedeljno) za lečenje sistemskih ili somatskih manifestacija bolesti.

[0160]Na primer, pacijenti koji pate od Hunterovog sindroma pokazuju histološke promene u mozgu koje mogu da uključe atrofiju, kortikalno neuronsko oticanje, smanjenje cerebralne bele mase, proširenje perivaskularnih prostora i oticanje dendrita Purkinjeovih ćelija. Studije skeniranja/spektroskopije magnetne rezonance pokazale su da teške difuzne lezije uključuju belu masu, atrofiju mozga i hidrocefalus i mnogo su češće kod pacijenata sa kognitivnim oštećenjem u poređenju sa onima bez oštećenja (Vedolin, L., et al., AJNR Am J Neuroradiol (2007) 28, 1029-1033). Čak i pacijenti bez ekstremno neuroloških posledica kao što su mentalna retardacija ili zaostatak u razvoju pokazali su da imaju abnormalnosti mozga koje uključuju atrofiju, ventrikulomegaliju i uvećane perivaskularne prostore (Matheus, MG, et al., Neuroradiology (2004) 46, 666-672.)

[0161]Kao nelimitirajući primer, mukopolisaharidoza tipa IIIA (MPS IIIA; Sanfilippov sindrom tipa A) je najozbiljnija forma Sanfilippovog sindroma tipa A i zahvata otprilike jednog u 100 000 ljudi širom sveta. Sanfilippov sindrom tipa A (Sanfilippo A) okarakterisan je deficijencijom enzima heparan N-sulfataze (HNS), eksosulfataze koja je uključena u lizozomski katabolizam glikozaminoglikan (GAG) heparan sulfata (Neufeld EF, et al. The Metabolic and Molecular Bases of Inherited Disease (2001) pp. 3421-3452). U odsustvu ovog enzima, GAG heparan sulfat akumulira se u lizozomima neurona i glijalnim ćelijama, sa manjom akumulacijom van mozga.

[0162]Kao nelimitirajući primer, mukopolisaharidoza tipa IIIB (MPS IIIB; Sanfilippov sindrom tipa B) je autozomno recesivni poremećaj koji je okarakterisan deficijencijom enzima alfa-N-acetil-glukozaminidaze (Naglu). U odsustvu ovog enzima, GAG heparan sulfat akumuliše se u lizozomima neurona i glijalnim ćelijama sa manjom akumulacijom van mozga.

[0163]Kao nelimitirajući primer, globoidna ćelijska leukodistrofija (GLD) je redak autozomno recesivni poremećaj lizozomskog nakupljanja izazvan nepravilnom funkcijom galaktocerebrozidaze (GALC). GALC je rastvorljiv enzim hidrolaze lizozomske kiseline koji degradira galaktozilceramid, sastavnu komponentu mijelina, u galaktozu i sfingozin. GALC deficijencija dovodi do neurološke povrede centralnog i perifernih nervnih sistema (CNS i PNS, respektivno) u dve vezane, ali odvojene putanje. Prva putanja vodi do prevelike akumulacije psihozina sa apoptozom koja proističe od mijelinacije ćelija. U drugoj putanji, galaktozilceramid se akumuliše i fagocitovan je pri aktiviranju mikroglija, proizvodeći karakteristične globoidne ćelije po kojima je bolest i dobila naziv. Suprotno ostalim lizozomskim bolestima nakupljanja koje akumulišu nedegradiran supstrat, generalno nema porasta ukupnog galaktozilceramida u prirodnom tkivu.

[0164]Definicija kliničke odlike ovog poremećaja je degeneracija centralnog nervnog sistema (CNS), što rezultuje u gubitku ili neuspehu da dostigne glavni napredak u razvoju. Progresivno kognitivno opadanje kulminira u demenciji i preranoj smrti. Bolest može da se manifestuje kod male dece (rani početak GLD-a) ili kod individua bilo kojih godina (kasni početak GLD-a). Životni vek individue zahvaćene ranim početkom GLD-a obično nije više od dve godine. Kasni početak GLD-a može da se javi kod individua u bilo kom uzrastu i progresija bolesti može prilično da varira.

[0165]Bolest metahromatska leukodistrofija (MLD) je autozomno recesivni poremećaj koji je rezultat deficijencije enzima arilsulfataze A (ASA). ASA, koja je kodirana ARSA genom u ljudima, je enzim koji razlaže cerebrozid 3-sulfat ili

sfingolipid 3-O-sulfogalaktozilceramid (sulfatid) na cerebrozid i sulfat. U odsustvu enzima, sulfatidi se akumulišu u nervni sistem (npr. mijelinski omotači, neuroni i glijalne ćelije) i u manjoj meri u visceralnim organima. Posledice ovih molekula i ćelijskih događaja su progresivna demijelinacija i aksonski gubitak u CNS i PNS koji je praćen klinički ozbiljno motornom i kognitivnom disfunkcijom.

[0166]Definicija kliničkih odlika ovog poremećaja je degeneracija centralnog nervnog sistema (CNS) koja rezultuje u kognitivnim oštećenjima (npr. mentalna retardacija, nervni poremećaji i slepilo između ostalog).

[0167]Kao nelimitirajući primer, MLD može da se manifestuje kod male dece (kasni infantilni oblik), gde pogođena deca obično počinju da pokazuju simptome odmah nakon prve godine života (npr. 15-24 meseca starosti) i generalno ne dozive više od 5 godina. MLD može da se manifestuje kod dece (maloletnički oblik), gde zahvaćena deca tipično pokazuju kognitivno oštećenje od treće do desete godine i životni vek može da varira (npr. u opsegu od 10-15 godina nakon javljanja simptoma). MLD može da se manifestuje kod odraslih (početni oblik kod odraslih) i može da se javi kod individua bilo kojih godina (npr. obično u šesnaestoj godini ili kasnije) i progresija bolesti može prilično da varira.

[0168]Stoga, u nekim oblicima, kompozicije predmetnog pronalaska dostavljaju jedan ili više enzima izmene jednoj ili više organeli (npr. lizozomima) ciljanog tkiva i ćelijama u mozgu, kičmenoj moždini i/ili perifernim organima kako bi uticalo na lečenje različitih lizozomskih bolesti nakupljanja. Kao što je ovde korišćeno, pojmovi "lečenje" ili "tretman" odnose se na ublažavanje jednog ili više simptoma povezanih sa bolešću, prevenciju ili odlaganje početka jednog ili više simptoma bolesti i/ili smanjivanje ozbiljnosti jednog ili više simptoma bolesti.

[0169]U nekim oblicima, lečenje se odnosi na parcijalno ili potpuno olakšavanje, ublažavanje, inhibiciju, odlaganje početka, redukovanje ozbiljnosti i/ili učestalosti neurološkog oštećenja kod pacijenata koji pate od ili su podložni lizozomskim bolestima. Kao što je ovde korišćeno, pojam "neurološko oštećenje" uključuje različite simptome povezanih sa oštećenjem centralnog nervnog sistema (npr. mozga i kičmene moždine). Simptomi neuroloških oštećenja mogu da uključe, na primer, zaostatak u razvoju, progresivno kognitivno oštećenje, gubitak sluha, neadekvatan razvoj govora, manjak motornih sposobnosti, hiperaktivnost, agresivnost i/ili između ostalog poremećaji spavanja.

[0170]U nekim oblicima, lečenje se odnosi na smanjivanje lizozomskog nakupljanja (npr. nakupljeni makromolekuli kao što je GAG) u različitim tkivima. U nekim oblicima, lečenje se odnosi na smanjivanje lizozomskog nakupljanja u tkivima mozga, neuronima kičmene moždine i/ili perifernim ciljanim tkivima. U određenim oblicima, lizozomsko nakupljanje smanjeno je za oko 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100% ili više u poređenju sa kontrolom. U nekim oblicima, lizozomsko nakupljanje smanjeno je za barem 1-put, 2- put, 3-put, 4-puta, 5- puta, 6- puta, 7- puta, 8- puta, 9- puta ili 10- puta u poređenju sa kontrolom. U nekim oblicima, lizozomsko nakupljanje mereno je u prisustvu lizozomskih granula nakupljanja (npr. morfologija šara zebre).

[0171]U nekim oblicima, tretman se odnosi na redukovanu vakuolizaciju u neuronima (npr. neuroni koji sadrže Purkinjeove ćelije). U određenim oblicima, vakuolizacija u neuronima opala je za oko 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100% ili više u poređenju sa kontrolom. U nekim oblicima, vakuolizacija je opala za najmanje 1-put, 2- put, 3-put, 4-puta, 5- puta, 6- puta, 7- puta, 8- puta, 9- puta ili 10- puta u poređenju sa kontrolom.

[0172]U određenim oblicima, lečenje prema predmetnom pronalasku rezultuje u redukciji (npr. oko 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 90%, 95%, 97.5%, 99% ili više), u potpunoj eliminaciji ili alternativno akumulaciji jednog ili više patoloških ili bioloških markera koji su povezani sa lizozomskim bolestima nakupljanja. Ovakva redukcija ili eliminacija posebno dolazi do izražaja u ćelijama i tkivima CNS-a (npr. neuroni i oligodendrociti). Na primer, u nekim oblicima, pri administraciji farmaceutske kompozicije predmetnog pronalaska subjektu pokazuje ili dostiže redukciju akumulacije biomarkera LAMPI (eng. Ivsosomal associated membrane protein 1) u ćelijama i tkivima CNS-a subjekta (npr. u cerebralnom korteksu, cerebelumu, caudate nucleus i putamenu, beloj masi i/ili talamusu). LAMPI je glikoprotein jako izražen u lizozomskim membranama i njegovo prisustvo je povišeno kod mnogih pacijenata sa lizozomskim poremećajima nakupljanja (Meikle, etal. Clin Chem. (1997)43:1325-1335.)

[0173]Prema tome, neki oblici predmetnog pronalaska odnose se na metode redukovanja, odnosno eliminacije prisustva ili akumulacije jednog ili više patoloških ili bioloških markera povezanih sa bolešću (npr. lizozomske bolesti nakupljanja). Slično, neki oblici predmetnog pronalaska odnose se na metode koje povećavaju degradaciju (ili brzinu degradacije) jednog ili više patoloških ili bioloških markera (npr. LAMPI) povezanim sa lizozomskim bolestima nakupljanja.

[0174]U nekim oblicima, lečenje se odnosi na smanjivanje progresije gubitka kognitivne sposobnosti. U određenim oblicima, progresija gubitka kognitivne sposobnosti opada za oko 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100% ili više u poređenju sa kontrolom. U nekim oblicima, lečenje se odnosi na smanjivanje zaostatka u razvoju. U određenim oblicima, zaostatak u razvoju smanjen je za oko 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100% ili više u poređenju sa kontrolom.

[0175]U nekim oblicima, lečenje se odnosi na povećanje stope preživljavanja (npr. vreme preživljavanja). Na primer, lečenje može da rezultuje u povećanju očekivanog trajanja života pacijenata. U nekim oblicima, tretman prema predmetnom pronalasku rezultuje u povećanom trajanju života od očekivanog kod pacijenata barem za otprilike više od 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 105%, 110%, 115%, 120%, 125%, 130%, 135%, 140%, 145%, 150%, 155%, 160%, 165%, 170%, 175%, 180%, 185%, 190%, 195%, 200% ili više, stoje poređenosa srednjim životnim vekom jednog ili više kontrolisanih individua sa sličnom bolešću bez tretmana. U nekim oblicima, lečenje prema predmetnom pronalasku rezultuje u povećanom životnom veku od očekivanog kod pacijenata za otprilike više od 6 meseci, 7 meseci, 8 meseci, 9 meseci, 10 meseci, 11 meseci, 12 meseci, oko 2 godine, 3 godine, 4 godine, 5 godina, 6 godina, 7 godina, 8 godina, 9 godina, 10 godina ili više, što je poređeno sa srednjim očekivanim životnim vekom jedne ili više kontrolisanih individua sa sličnom bolešću bez lečenja. U nekim oblicima, lečenje prema predmetnom pronalasku rezultuje u dugoročnom preživljavanju pacijenta. Kao što je ovde korišćeno, pojam "dugoročno preživljavanje" odnosi se na vreme preživljavanja ili životni vek duži otprilike od 40 godina, 45 godina, 50 godina, 55 godina, 60 godina ili duže.

[0176]Pojmovi, "poboljšanje", "povećanje" ili "redukovanje" koji su ovde korišćeni, pokazuju vrednosti koje se odnose na kontrolu. U nekim oblicima, pogodna kontrola je osnovno merenje, kao što je merenje u istoj individui pre primene tretmana koji je ovde opisan ili merenje u kontrolisanoj individui (ili višestruke kontrole individua) u odsustvu tretmana koji je ovde opisan. "Kontrolisana individua" je individua pogođena istom bolešću, otprilike je isto godište i/ili pola kao i individua koja se tretira (kako bi se osiguralo da su stadijumi bolesti tretirane individue i kontrolisane individue poredivi).

[0177]Individua (takođe poznata i kao "pacijent" i "subjekat") tretira se kao pojedinac (fetus, novorođenče, dete, adolescent ili odrastao čovek) koji ima bolest ili ima potencijala za razvoj bolesti. Individua može da ispoljava ostatak endogenog lizozomskog enzima i/ili aktivnost ili da ima nemerljivu aktivnost. Na primer, individua koja ima Sanfilippov sindrom tipa A može da ispoljava HNS nivoe koji su manji od oko 30-50%, 25-30%, 20-25%, 15-20%, 10-15%, 5-10%, 0,1-5% od normalne ekspresije HNS nivoa.

Imuna tolerancija

[0178]Generalno, intratekalna administracija izmene enzima prema predmetnom pronalasku ne rezultuje u ozbiljnim neželjenim efektima kod subjekta. Kao što je ovde korišćeno, ozbiljni neželjeni efekti izazivaju, ali nisu ograničeni na njih, supstancijalni imuni odgovor, toksičnost ili smrt. Kao što je ovde korišćeno, pojam "supstancijalni imuni odgovor" odnosi se na teške ili ozbiljne imune odgovore, kao što su imuni odgovori adaptivnih T-ćelija.

[0179]Stoga, u mnogim oblicima, intratekalna administracija izmene enzima prema predmetnom pronalasku ne uključuje konkurentnu imunosupresivnu terapiju (npr. bilo koju imunosupresivnu terapiju korišćenu kao predtretman/predstanje ili paralelnu metodi). U nekim oblicima, intratekalna administracija izmene enzima prema predmetnom pronalasku ne uključuje uvođenje imune tolerancije kod subjekta koji se tretira. U nekim oblicima, intratekalna administracija izmene enzima prema predmetnom pronalasku ne uključuje predtretman ili predstanje subjekta koristeći imunosupresivni agens T-ćelija.

[0180]U nekim oblicima, intratekalna administracija terapeutskog agensa može da poveća imuni odgovor nasuprot ovih agenasa. Stoga, u nekim oblicima, može da bude korisno učiniti da subjekat prima enzim izmene tolerantan na terapiju izmene enzima. Imuna tolerancija može da bude izazvana koristeći različite metode poznate u praksi. Na primer, početni režim od 30 do 60 dana agensom imunosupresivnih T ćelija kao što su ciklosporin A (CsA) i antiproliferativni agens, kao što je azatioprin (Aza), može da se koristi u kombinaciji sa nedeljnom intratekalnim infuzijama niskih doza željenog enzima izmene.

[0181]Bilo koji imunosupresivni agens poznat stručnjacima u praksi može da se koristi zajedno u kombinaciji sa terapijom predmetnog pronalaska. Ovi imunosupresivni agensi uključuju, ali nisu ograničeni na njih, ciklosporin, FK506, rapamicin, CTLA4-Ig, i anti-TNF agense kao što su etanercept (videti npr. Moder, 2000, Ann. Allergv Asthma Imnunol. 84, 280-284; Nevins, 2000, Curr. Opin. Pediatr. 12, 146-150; Kurlberg et al., 2000, Scand. J. Immunol. 51, 224-230; Ideguchi et al., 2000, Neuroscience 95, 217-226; Potteret al., 1999, Ann. N.Y. Acad. Sci. 875, 159-174; Slavik et al., 1999, Immunol. Res. 19, 1-24; Gaziev et al., 1999, Bone Marrow Transplant. 25, 689-696; Henrv, 1999, Clin. Transplant. 13, 209-220; Gummert et al., 1999, J. Am. Soc. Nephrol. 10, 1366-1380; Qi et al., 2000, Transplantation 69, 1275-1283). Anti-IL2 receptor (.alfa.-podjedinica) antitelo daklizumab (npr. Zenapax.TM.), koji se pokazao efikasnim kod pacijenata kojima je vršena transplantacija, takođe može da se koristi kao imunosupresivni agens (videti npr. VViseman et al., 1999, Drugs 58, 1029-1042; Beniaminovitz et al., 2000, N. Engl J. Med. 342, 613-619; Ponticelli et al., 1999, Drugs R. D. 1, 55-60; Berard etal., 1999, Phannacotherapy 19, 1127-1137; Eckhoff et al., 2000, Transplantation 69,1867-1872; Ekberg et al., 2000, Transpl. Int. 13, 151-159). Dodatni imunosupresivni agensi uključuju, ali nisu ograničeni na njih, anti-CD2 (Branco et al., 1999, Transplantation 68, 1588-1596; Przepiorka et al., 1998, Blood 92, 4066-4071), anti-CD4 (Marinova-Mutafchieva et al., 2000, Arthritis Rheum. 43, 638-644; Fishvvild et al., 1999, Clin. Immunol. 92, 138-152) i anti-CD40 ligand (Hong et al., 2000, Semin. Nephrol. 20, 108-125; Chinnule et al., 2000, J. Virol. 74, 3345-3352; Ito et al., 2000, J. Immunol. 164,1230-1235).

Administracija

[0182]Pojedinačna kao i višestruka administracija terapeutski efektivne količine enzima izmene koje su ovde opisane su razmatrane. Enzimi izmene mogu da budu administrirani pri regularnim intervalima, što zavisi od prirode, ozbiljnosti i stepena lizozomske bolesti nakupljanja kod subjekta. U nekim oblicima, terapeutski efikasna količina enzima izmene predmetnog pronalaska može periodično da bude intratekalno administrirana pri regularnim intervalima (npr. jednom godišnje, jednom na svakih šest meseci, jednom na svakih pet meseci, jednom na svaka 3 meseca, na svaka dva meseca, jednom na svake dve nedeije, jednom nedeljno).

[0183]U nekim oblicima, intratekalna administracija može da se koristi zajedno sa drugim načinima administracije (npr. intravenozno, subkutaneo, intramuskulatorno, parenteralno, transdermalno ili transmukozno (npr. oralno ili nazalno)). U nekim oblicima, ovi drugi načini administracije (npr. intravenozna administracija) mogu da se izvode ne češće od dvaput nedeljno, jednom mesečno, jednom na svaka dva meseca, jednom na svaka tri meseca, jednom na svaka četiri meseca, jednom na svakih pet meseci, jednom na svakih šest meseci ili administracija svake godine.

[0184]Kao što je ovde korišćeno, pojam terapeutski efektivna količina" je u velikoj meri osnova ukupne količine terapeutskog agensa koji je sadržan u farmaceutskim kompozicijama predmetnog pronalaska. Generalno, terapeutski efektivna količina je dovoljna da dostigne značajnu korist kod subjekta (npr. tretiranje, modulisanje, lečenje, prevenciju i/ili poboljšanje osnovne bolesti ili stanja). Na primer, terapeutski efektivna količina može da bude dovoljna količina za postizanje željenog terapeutskog i/iti profilaktičkog efekta, kao što je količina dovoljna da rnoduliše receptore lizozomskih enzima ili njihovu aktivnost i na taj način leči ove lizozomske bolesti nakupljanja ili njene simptome (npr. redukcija ili eliminacija u prisustvu ili odsustvu "zebrinih šara" ili ćelijska vakuolizacija praćena administracijom kompozicija predmetnog pronalaska kod subjekta). Generalno, količina terapeutskog agensa (npr. rekombinantni lizozomski enzim) administriran subjektu kome je to potrebno zavisiće od karakteristika subjekta. Ove karakteristike uključuju stanje, ozbiljnost bolesti, opšte zdravlje, godine, pol i teiesnu težinu subjekta. Stručnjak u praksi spremno je u mogućnosti da odredi odgovarajuće doze u zavisnosti od ovih i drugih srodnih faktora. Dodatno, i objektivni i subjektivni testovi mogu opciono da se koriste za identifikovanje optimalnih opsega doza.

[0185]Terapeutski efektivna količina često je administrirana u režimu doza koji može da sadrži višestruke doze. Za određeni terapeutski protein, terapeutski efektivna količina (i/ili pogodna doza u efektivnom režimu) može da varira, na primer, u zavisnosti od načina administracije, u kombinaciji sa drugim farmaceutskim agensima. Takođe, specifična terapeutski efektivna količina (i/ili jedinica doze) za nekog određenog pacijenta može da zavisi od različitih faktora uključujući poremećaj koji se tretira i ozbiljnost poremećaja; uvodi se aktivnost specifičnog farmaceutskog agensa; uvodi se specifična kompozicija; godine, telesna težina, opšte zdravlje, pol i ishrana pacijenta; uvodi se vreme administracije, način administracije i/ili brzina izlučivanja ili metabolizam specifičnog fuzionog proteina; trajanje tretmana; i si. faktori koji su dobro poznati u medicinskoj praksi.

[0186]U nekim oblicima, opsezi terapeutske efektivne doze su oko 0,005 mg/kg do 500 mg/kg težine mozga, npr. od oko 0,005 mg/kg do 400 mg/kg težine mozga, 0,005 mg/kg do 300 mg/kg težine mozga, od 0,005 mg/kg do 200 mg/kg težine mozga, 0,005 mg/kg do 100 mg/kg težine mozga, 0,005 mg/kg do 90 mg/kg težine mozga, 0,005 mg/kg do 80 mg/kg težine mozga, 0,005 mg/kg do 70 mg/kg težine mozga, 0,005 mg/kg do 60 mg/kg težine mozga, 0,005 mg/kg do 50 mg/kg težine mozga, 0,005 mg/kg do 40 mg/kgtežine mozga, 0,005 mg/kg do 30 mg/kg težine mozga, 0,005 mg/kg do 25 mg/kg težine mozga, 0,005 mg/kg do 20 mg/kg težine mozga, 0,005 mg/kg do 15 mg/kg težine mozga, 0,005 mg/kg do 10 mg/kg težine mozga.

[0187]U nekim oblicima, terapeutski efektivna doza veća je od 0,1 mg/kg težine mozga, 0,5 mg/kg težine mozga, 1,0 mg/kg težine mozga, 3 mg/kg težine mozga, 5 mg/kg težine mozga, 10 mg/kg težine mozga, 15 mg/kg težine mozga, 20 mg/kg težine mozga, 30 mg/kg težine mozga, 40 mg/kg težine mozga, 50 mg/kg težine mozga, 60 mg/kg težine mozga, 70 mg/kg težine mozga, 80 mg/kg težine mozga, 90 mg/kg težine mozga, 100 mg/kg težine mozga, 150 mg/kg težine mozga, 200 mg/kg težine mozga, 250 mg/kg težine mozga, 300 mg/kg težine mozga, 350 mg/kg težine mozga, 400 mg/kg težine mozga, 450 mg/kg težine mozga, 500 mg/kg težine mozga.

[0188]U nekim oblicima, terapeutski efektivna doza takođe može da bude defintsana pomoću mg/kg težine mozg3. Prema proceni stručnjaka u praksi, težina mozga i telesna težina mogu da se korelišu. Dekaban AS. "Changes in brain vveights during the span of human life: relation of brain weights to body heights and body vveights," Ann Neurol 1978; 4:345-56. Stoga, u nekim oblicima, doze mogu da se konvertuju kao što je prikazano u tabeli 4.

[0189]U nekim oblicima, terapeutski efektivna doza takođe može da bude definisana pomoću mg/15 cc CSF. Kao što stručnjaci u praksi cene, terapeutski efektivna doza bazirana na težini mozga i telesnoj težini može da se konvertuje do mg/15 cc CSF. Na primer, zapremina CSF-a kod odraslih ljudi je otprilike 150 ml (Johanson CE, et al. "Multiplicitv of cerebrospinal fluid functions: New challenges in health and disease," Cerebrospinal Fluid Res. 2008 Mav 14;5:10). Stoga, pojedinačna doza injektiranja od 0,1 mg do 50 mg proteina za odrasle bila bi otprilike od 0,01 mg/15 cc CSF-a (0,1 mg) do 5,0 mg/15 cc CSF-a (50 mg).

[0190]Dalje se razume da za neki određeni subjekat, specifični režimi doza treba da budu podešeni u toku vremena prema individui kojoj je to potrebno i prema profesionalnoj proceni ljudi koji administriraju ili nadgledaju administraciju terapije enzimske izmene i da su opsezi doza navedeni ovde samo primeri.

Oprema

[0191]Oprema i drugi artikli za manufakturu mogu da sadrže formulaciju predmetnog pronalaska i obezbeđuju uputstva za njihovo korišćenje. Oprema ili drugi artikli manufakture mogu da uključe posuđe, IDDD, kateter i bilo koje druge artikle, uređaje ili opremu korisnu za intratekalnu administraciju kao i za hirurgiju. Pogodno posuđe uključuje, na primer, flašice, bočice, špriceve (npr. prethodno napunjeni špricevi), ampule, kertridže, rezervoare ili Lyo-Jecte. Posuda može da bude napravljena od različitih materijala kao što su staklo ili plastika. U nekim oblicima, posuda je prethodno napunjen špric. Pogodni prethodno napunjeni Špricevi uključuju, ali nisu ograničeni na njih, borosilikatne staklene špriceve sa silikatnom oblogom, borosilikatni stakleni špric poprskani silikonom ili plastični špric od smole bez silikona.

[0192]Uobičajeno, posude mogu da čuvaju formulacije i da budu obeležene, ili povezane sa posudama koje mogu da ukazuju na uputstva za rekonstituciju i/ili primenu. Na primer, oznaka može da ukazuje na to da je formulacija rekonstituisana do koncentracija proteina kao što je opisano iznad. Oznaka dalje može da ukazuje na to da je formulacija korisna ili namenjena za IT administraciju. U nekim oblicima, posude mogu da sadrže pojedinačnu dozu stabilne formulacije koja sadrži enzim izmene. U različitim oblicima, pojedinačna doza stabilne formulacije prisutna je u zapremini manjoj od oko 15 ml, 10 ml, 5,0 ml, 4,0 ml, 3,5 ml, 3,0 ml, 2,5 ml, 2,0 ml, 1,5 ml, 1,0 ml ili 0,5 ml. Alternativno, posuda koja sadrži formulaciju može da bude bočica za višestruku upotrebu, što dozvoljava ponovljenu administraciju formulacije (npr. od 2 do 6 administracija). Oprema ili drugi artikli proizvodnje mogu dalje da uključe drugu posudu koja sadrži pogodan rastvarač (npr. BWFI rastvor, puferski rastvor). U toku mešanja rastvarača i formulacije, krajnja koncentracija proteina u rekonstituisanoj formulaciji generalno će da bude barem l mg/ml (npr. najmanje 5 mg/ml, 10 mg/ml, 25 mg/ml, 50 mg/ml, 75 mg/ml, 100 mg/ml). Oprema ili drugi artikli proizvodnje mogu da uključe druge materijale koji su pogodni sa komercijalne i korisnikove tačke gledišta, uključujući druge pufere, rastvarače, filtere, igle, IDDD, katetere, špriceve i umetke sa uputstvom za upotrebu.

[0193]Pronalazak će biti u potpunosti razumljiv prema referencama sledećih primera.

PRIMERI

Primeri IT dostave GalC proteina

PRIMER 1: FIZIČKO-HEMJJSKE KARAKTERISTIKE GALC FORMULACIJE ZA INTRATEKALNU DOSTAVU

[0194]Ovaj primer opisuje fizičko-hemijsku karakterizaciju GalC koji ima za cilj razumevanje njegovog ponašanja i stabilnosti pod različitim uslovima tokom intratekalne (IT) dostave proteina.

[0195]Između ostalog, ovaj primer opisuje GalC formulaciju koja je važna za uspesnu IT dostavu GalC. U nekim oblicima, formulacija uključuje 5 mM Na fosfata + 150 mM NaCI, pH 6,0 + 0,005% polisorbata 20. U nekim oblicima, ova formulacija uključuje <5 mM, <10 mM, <15 mM and <20 mM Na fosfata. U nekim oblicima, formulacije uključuju pH<>>5,5 i < pH 7,0 sa 150 mM NaCI.

[0196]PBS dostava inertnih medijuma različitih molariteta fosfata i pH vrednosti testirani su kod odraslih cinomologous majmuna (slika 3). 5 mM fosfata u opsegu pH vrednosti od 5,5-7,0 nije pokazalo neželjene efekte, dok je 20 mM fosfata na pH između 7,0-7,5 i 10-20 mM fosfata na pH između 7,5-8,0 pokazalo neželjene efekte kod majmuna (slika 3). Termalna stabilnost hGalC (lmg/ml) u 3 mM citratnom, fosfatnom i boratnom puferu sa 50 mM NaCI, ispitivana je kao zavisnost pH u opsegu od 5,0-8,0 (slika 4). Specifična aktivnost hGalC merena je u početnom stanju (20-25°C) i nakon 2 nedeije na 40°C sa najvišom specifičnom aktivnošću koja je zadržana između pH od 6,0 do 6,5 (slika 4). Specifična aktivnost hGalC dodatno je merena nakon tri meseca na 5°C sa najvišom specifičnom aktivnošću koja je zadržana u pH opsegu od 6,0-6,5 (slika 5). Temperatura topljenja hGalc merena je kao funkcija pH (tabela 5) i takođe merena nezavisno u različitim formulacijama (tabela 6).

[0197]Termalna stabilnost hGalC kao što je određeno retencijom specifične aktivnosti hGalC na -3 nedeije na 5°C i 2 nedeije na 40°C, takođe je ocenjena kao zavisnost od koncentracije soli (slika 6). Rezultati su prikazali da je hGalC zadržala visoku specifičnu aktivnost nakon tri nedeije na 5°C pri različitim koncentracijama soli u opsegu od 5 mM fosfata + 50 mM NaCI (skraćenica 5+50) do 50 mM fosfata + 150 mM NaCI (skraćenica 50+150) pri pH vrednosti od 6,5 (slika 6).

Analiza sedimentacije hGalC

[0198]Sedimentacija brzina je analitička ultracentrifugalna (AUC) metoda koja meri brzinu pri kojoj se molekuli pomeraju pod dejstvom centrifugalnih sila koje su proizvedene u centrifugi. Tehnika je korisna za određivanje stanja proteina u rastvoru. Prva serija brzine sedimentacije je razblažena serija humanog GalC u 5 mM Na fosfatu, pH 6,0 sa 150 mM NaCI (slika 7) kako bi se procenio uzorak na intramolekulsko vezivanje i/ili neidealnost. Serija rastvora prikazana je normalizovanom krivom (g(s<*>) prema s<*>) pri svakoj koncentraciji. Generalno pomeranje krivih na niže s vrednosti u toku rastvaranja pokazuje disocijaciju i ovo je brz, reverzibilni sistem intramolekulskog vezivanja. Poredeći različite jonske jačine (slika 7A, B i C), očigledno je da set pomeranja krivih do nižih s vrednosti tokom rasta jonske jačine ukazuje na jonske interakcije koje su takođe uključene u proces asocijacije i da je intramolekulsko vezivanje smanjeno pri višim koncentracijama soli.

[0199]Mišji GalC takođe se pušta u isto vreme na 150 mM NaCI kako bi se poredilo sa hGalC. Poređenjem odgovarajućih jonskih jačina (150 mM NaCI), očigledno je da je slobodna energija imtramolekulskog vezivanja mGalC manja od one kod hGalC. Krive na slici 7 su prekinute na oko 20S kako bi se disocijacija jasnije prikazala; međutim, kada su ove simulacije analizirane koristeći analizu široke distribucije (VVDA) i rezultati prikazani na logaritamskoj skali, veće nagomilavanje (s<*>>20S) može jasnije da se vidi. Nagomilavanje viših oligomera (slika 8) posebno je vidljivo na 50 mM NaCI, nešto malo opada na 10 mM NaCI i značajno je redukovano, ali prisutno na 500 mM NaCI pri pH vrednosti od 6,0. VVDA kriva najviše koncentracije za svaku jonsku jačinu prikazana je na slici 8.

Intramolekulsko vezivanje u univerzalnom puferu na pH vrednosti od 6,0

[0200]Pod ovim uslovima u univerzalnom puferu, intramolekulsko vezivanje javlja se tako da ima skoro iste dimenzije kao i u fosfatnom puferu, pH vrednost 6,0, kao što se vidi na slici 9. Takođe je istraživan efekat pH vrednosti na energetsku vrednost hGalC intramolekulskog vezivanja u univerzalnom puferu. Serija rastvora vrši se na pH vrednostima od 4,5; 5,0; 6,0; 6,5; 7,0 i 7,5. Uzorci na pH od 4,5 i 5,0 bili su nerastvorni u suštini u 100% hGalC i imajući talog koji ne ostavlja ništa za merenje u supernatantu.

[0201]Efekat pH vrednosti jasno je prikazan na slici 10 gde je posmatrana najmanja količina intramolekulskog vezivanja pri pH vrednosti od 7,5 i znatno intramolekulsko vezivanje posmatrano je pri pH od 6,0. Trend je sličan onom viđenom sa varijacijama jonske jačine sa višom pH vrednošću. Povećanje i jonske jačine i pH pomera ravnotežu u korist manjih oligomera na najvišoj koncentraciji (sve oko 1,0 mg/ml). Opadanje koncentracije za jednu trećinu u seriji razblaživanja (videti sliku 7) pomera ravnotežu prema najmanjim vrstama koje imaju koeficijent sedimentacije od oko 5,2S. Pik koji se javlja na oko 10-13S verovatno predstavlja tetramer 5S vrsta. Napori da se ovi podaci fituju u model intramolekulskog vezivanja do sada bili su neuspešni i to verovatno zbog inherentne mikroheterogenosti nastale od različitih stepena glikozilacije.

Intramolekulsko vezivanje u univerzalnom puferu na pH vrednosti od 6,0

[0202]Podvrgnuti stresom i osnovni uzorci GalC u 5mM Na fosfatu, pH 6,0 sa 150mM NaCI poređeni su u seriji eksperimenata razblaženja (crvena-»plava-*zelena-+crna). Rezultati za najnižu koncentraciju (crnu)~0,03mg/ml "ispeglani" su (eng. smoothed) što pokazuje zašto kriva ima manji šum. U uzorku podvrgnutom stresu postoji nakupljanje oko ln(s<*>) =3.0 (~20S) koje je prisutno pri znatno višoj koncentraciji nego u osnovnom uzorku. Predstavlja približno konstantnu frakciju uzorka što je evidentirano njenom otpornošću prema razblaživanju na normalizovanim graftcima (slike 11, 12, 13). Stoga je ireverzibilno nagomilavanje sa molarnom masom od najmanje 500 kg/mol.

hGalC sa natrijum tauroholatom u rastvoru

[0203]U natrijum tauroholatu (NaTC)(l%), intramolekulsko vezivanje značajno je smanjeno. Glavna granica pomerena je tako da su smanjene s vrednosti i visoka oligomerizacija je smanjena (slika 14).

hGalC sa 5% dekstroze

[0204]Dodatak 5% dekstroze u GalC u 5mM Na fosfat, na pH vrednosti od 6,0 rezultuje u formaciji velikih agregata (slika 15). Pik na 18S odgovara minimalnoj molarnoj masi od oko 440 kDa, a pik na 56S odgovara minimalnoj molarnoj masi od 2,4 MDa sa delom koji se produžava iza 150S koji odgovara molarnim masama većim od 10,0 MDa. Postoji jako mala pramena u ovom šablonu tokom razblaživanja od 1,0 do 0,3 mg/ml ukazujući na to da su ovi oligomeri većinom ireverzibilni na vremenskoj skali sedimentacionog eksperimenta u periodu od 5-6 sati.

hGalC unutrašnja fluorescencija

[0205]Studije unutrašnje fluorescencije hGalC (koristeći 23 Trp) vrše se kako bi se ocenile uloge pH vrednosti i koncentracije soli na molekulske interakcije (slike 16 i 17). Molekulske interakcije su najmanje (najviša relativna fluorescencija između 330nm-350nm) ili u 500mM NaCI ili 1% NaTC (slika 16). Posmatrana je mala promena u sekundarnoj strukturi u zavisnosti od pH vrednosti. Taloženje je posmatrano na pH od 4,5 i 5,0 (slika 17).

Rezime

[0206]Za ocenu relativne rastvorljivosti hGalC i mGalC, korišćen je pristup polietilen glikol (PEG) indukovane čvrste faze (Middaugh etal., J. Biol. Chem. 1979, 254, 367-370). Ovaj pristup dozvoljava da se relativna rastvorljivost proteina meri na kvantifikovani način. Merenja rastvorljivosti izvršena su uvođenjem puferskih rastvora (5 mM natrijum fosfat sa 150 mM NaCI, pH 6,0) svakog GalC pri različitim koncentracijama PEG (lOkDa). Grafici logaritamske zavisnosti rastvorljivosti proteina prema PEG koncentracijama pokazuju linearni trend. Ekstrapolacija vidljive rastvorljivosti do nulte PEG koncentracije urađena je kako bi se posmatrala relativna rastvorljivost svakog proteina. Relativna rastvorljivost mGalC prema hGalC nije pokazana nikakva razlika. U eksperimentima rastvorljivosti hGalC, nije uočeno taloženje ili gubitak aktivnosti nakon 3 nedeije na 2-8°C (u 5mM natrijum fosfata sa različitim koncentracijama soli, pH 6,0-6,5). Rastvorljivost na -30 mg/ml dostignuta je sa formulacijom 5 mM Na fosfata + 150 mM NaCI, pH 6,0, i nije uočeno taloženje nakon 50 dana na 2-8°C.

[0207]AUC podaci predlažu da je "nativno" stanje GalC koncentracija zavisna reverzibilna asocijacija od oligomera višeg reda. Bioflzički podaci predlažu da možda postoji funkcionalna i strukturalna važnost oligomera višeg reda. Pri višim pH vrednostima, ima manje retencije aktivnosti, niže Trn vrednosti i homogeniji sistem kao što je određeno pomoću AUC. U 5 mM natrijum fosfata sa 150 mM NaCI, pH 6,0, verovatno postoji ravnoteža između monomera, tetramera i drugih vrsta višeg reda. Dalje, pH ne utiče drastično na AUC profile u opsegu pH vrednosti od 6,5-7,5, Uopšte, GalC sistem je rapidno reverzibilni, visoko intramolekulsko vezujući sistem u testiranim puferima.

PRIMER 2: FARMAKOKINETIKA I DISTRIBUCIJA TKIVA RADIOAKTIVNOSTI KOD SPRAGUE-DAWLEY

PACOVA PRAĆENO POJEDINAČNOM INTRATEKALNOM DOZOM ILI POJEDINAČNIM INTRAVENOZNIM

BOLUSNIM INJEKTIRANJEM 125IHGALC

[0208]Ovaj primer prikazuje primer rezultata farmakokinetike i distribucije tkiva '"IhGALC kod mužjaka Sprague-Davvlev pacova praćeno pojedinačnom intratekalnom dozom ili pojedinačnim intravenoznim bolusnim injektiranjem. Koncentracija i sadržaj radioaktivnosti u krvi, serumu, crvenim krvnim zrncima, cerebrospinalnoj tečnosti (CSF) i tkivima su mereni i izvršene su nedeljive farmakokinetičke analize na dobijenim rezultatima. Intratekalni i intravenozni načini administracije izabrani su jer su namenjeni za administraciju kod ljudi. Nivoi doza izabrani su na osnovu potencijalnog izlaganja ljudi, postojeće toksičnosti i farmakokinetičkih podataka i bilo kog ograničenja nametnutog u testu. Pacov je izabran za studiju zato što je prihvaćena vrsta za upotrebu u farmakokinetičkim i studijama distribucije tkiva. Broj životinja korišćenih u studiji je najmanji broj potreban za adekvantu procenu očekivanih promena u svakom trenutku vremena i za ispunjavanje eksperimentalnih ciljeva.

Materijali i metodeS

Test sistemi

[0209]82 mužjaka Sprague-Davvlev pacova (Rattus norvegicus) dobijeni su od Charles River Canada Inc. (St. Constant, Quebec, Canada) 15. aprila 2009. Na početku lečenja, životinje su bile otprilike stare 10-11 nedelja. Narednih 9 mužjaka pacova dobijeno je od Charles River Canada 28. aprila 2009; ove životinje bile su otprilike stare 9 nedelja kada su stigle i bilo je potrebno da se osigura da je dostupan dovoljan broj životinja sa kanilom u cilju završetka doziranja u studiji.

[0210]Telesna težina mužjaka pacova bila je u opsegu od 342 do 453 g na početku tretmana. Telesna težina svih osim jednog mužjaka pacova pri doziranju bila je veća od opsega koji je naveden u protokolu (250-350 g), međutim mala devijacija nije uzeta u obzir, tako da nije uticala na studiju ili dobijene podatke pošto su životinje bile zdrave i njihova stvarna telesna težina je kon'Šćena za administriranje doze.

Kontrolisanje životinja

[0211]Sledeći dolazak na PCS-MTL, sve životinje podvrgnute su opštem fizičkom pregledu od strane kvalifikovanog veterinarskog osoblja. Nisu detektovane značajne anomalije kod dobijenih životinja. Životinje su čuvane pojedinačno, u kavezima od nerđajućeg čelika sa žičanim dnom i automatskim ventilom za vodu. Program obogaćivanja okoline je u skladu sa prikladnim SOP. Svaki kavez jasno je obeležen obojenim karticama sa kodom koje pokazuju studiju, grupu, broj životinje i pol. Svaka životinja pojedinačno je identifikovana koristeći AIMS' sistem obeležavanja. Ustavi okoline tokom studije sprovođeni su kontrolisanjem temperature i relativne vlažnosti vazduha od 19 do 25°C i 30 do 70%, respektivno. Fotoperiod bio je 12 sati na svetiu i 12 sati u mraku osim ako nije prekinuto prema rasporedu aktivnosti.

Ishrana

[0212]Sve životinje imale su slobodan pristup standardnoj sertifikovanoj peletiranoj komercijalnoj laboratorijskoj ishrani (PMI sertifikovana ishrana za glodare 5002: PMI Nutrition International Inc.) osim tokom određenih procedura. Maksimalno dozvoljene koncentracije kontaminanata u ishrani (npr. teški metali, aflatoksini, organofosfati, hlorisani ugljovodonici, PCB) kontrolisane su i rutinski analizirane od strane proizvođača. Voda iz česme (iz gradskog vodovoda), pogodna za ljudsku upotrebu (filtrirana kroz 0,5 um bakteriostatični polikarbonatni filter) bila je dostupna životinjama po volji osim tokom određenih procedura. Smatra se da nije bilo poznatih kontaminanata u materijalima ishrane koji mogu da utiču na ciljeve ove studije.

Aklimacija i randomizacija

[0213]Barem 6 dana (za životinje dobijene 15. aprila 2009.) ili 3 dana (za 9 dodatnih životinja dobijenih 28. aprila 2009.) dozvoljeno je između prijema životinja i operacije za postavljanje intratekalne kanile kako bi se dozvolilo životinjama da se aklimatizuju na fizičke i uslove okoline. Tokom perioda aklimatizacije, sve životinje su merene i uzete nasumično, koristeći kompjuterski baziranu proceduru randomizacije. Randomizacija se vrši prateći stratifikaciju i koristeći telesnu težinu kao parametar. Životinje u opsegu ekstremne telesne težine nisu dodeljene grupama.

[0214]Životinje dodeljene su grupi studije kao što sledi:

Svaki pacov iz grupa 1 i 2 primio je nominalnu radiohemijsku dozu od otprilike 3 pCi/životinji. Svaki pacov u grupi 3 primio je nominalnu radiohemijsku dozu od otprilike 6 pCi/životinji.

Formulacija intratekalne doze

[0215]Formulacija intratekalne doze pripremljena je na dan prve administracije intratekalne doze. Dovoljna količina rastvora 1JSI-hGALC izmerena je i dodata dovoljnoj količini neobeleženog hGALC rastvora. Dodata je izmerena zapremina inertnog medijuma i sve se pažljivo meša. Pripremljen je rastvor koncentracije 3 mg/ml pri ciljanom nivou radioaktivnosti od oko 150 pCi/ml. Dobijena formulacija isfiltrirana je kroz filter koji slabo vezuje proteine (0,22 pm GV PVDF filterske jedinice) u sterilni sud i držana je u frižideru (2-8°C), gde čeka upotrebu za doziranje.

Formulacija intravenozne doze

[0216]Formulacija intravenozne doze pripremljena je na dan prve administracije intravenozne doze. Dovoljna količina rastvora<125>I-hGALC izmerena je i dodata dovoljnoj količini neobeleženog hGALC rastvora. Dodata je izmerena zapremina inertnog medijuma i sve je pažljivo mešano. Pripremljen je rastvor koncentracije 0,3 mg/ml pri ciljanom nivou radioaktivnosti od oko 3 pCi/ml. Dobijena formulacija isfiltrirana je kroz filter koji slabo vezuje proteine (0,22 pm GV PVDF filterske jedinice) u sterilni sud i držana je u frižideru (2-8°C), gde čeka upotrebu za doziranje.

Analiza formulacije doza

[0217]Svaka radioobeležena formulacija doze analizirana je na PCS-MTL svakog dana doziranja pomoću tečne sintilacione spektroskopije kako bi se odredila koncentracija radiokativnosti pre i posle tretmana. Koncentracija radioaktivnosti određena je pripremanjem odgovarajućih rastvora formulacije doze u inertnom medijumu gde se dva uzorka svakog rastvora analiziraju. Ostatak formulacija doze odbacuje se nakon završetka analize (uključujući i ponovljene analize).

Proračun specifične aktivnosti test subjekta

[0218]Specifična aktivnost test subjekta u formulacijama doza izračunata je (pre i posle doze) kao srednja vrednost merenih nivoa radioaktivnosti i ukupnoj masi test subjekta (baziranih na dobijenim koncentracijama) u formulacijama doza.

Klinička ispitivanja

[0219]Sve životinje pregledane su dvaput dnevno na smrtnost, znake bolesti i reakcije na tretman tokom aklimacije i perioda studije, izuzev dana pristizanja životinja i završetka studije. Tih dana životinje su pregledane samo jednom. Detaljan pregled vršen je jednom nedeljno.

Telesna težina

[0220]Individualna telesna težina merena je jednom tokom aklimacije , pre operacije i na dan pre administracije doze. Samo telesna težina zabeležena dan pre administracije doze je objavljena.

Operacija

[0221]Minimum 6 dana (ili 3 dana za dodatnih 9 životinja) između prijema životinja i operacije dozvoljeno je životinji da se navikne na uslove okoline laboratorije. Sve životinje, uključujući i rezervne, dobile su jednu intramuskulatornu injekciju antibiotika benzatin penicilin G + prokain penicilin G na dan operacije i opet 2 dana nakon operacije. Generalno, buprenorfin 0,05 mg/kg administriran je subkutaneo pre operacije i otprilike 8 sati nakon prve administracije ako se smatra potrebnim. Nekim životinjama, buprenorfin je administriran otprilike 6 sati nakon prve administracije umesto na 8 do 12 sati. Uzimajući u obzir poluživot buprenorfina u pacovima, ovo odstupanje od protokola ne utiče na zdravlje ovih životinja i stoga nema uticaja na validnost podataka dobijenih u ovoj studiji.

[0222]Životinje se pripremaju za operaciju brijanjem od lobanje do leđno-grudnog regiona vrata. Životinje su anestezirane gasom izofluran/kiseonik pre operacije i anestezija se održava pod gasom izoflurana tokom hirurške procedure. Pre operacije i na kraju hirurške procedure, dok je pod anestezijom, blag oftamološki lubrikant administriran je svakom oku. Pre operacije kao i u druge dve prilike otprilike u intervalima od 24 časa praćeno prvom administracijom, svaka životinja dobila je antiinflamatorni (karprofen na 5 mg/kg) subkutaneo injekcijom.

[0223]Životinja je pozicionirana na stereotaksični sto. Rez na koži, od oko 2 cm, napravljen je od kaudalne ivice lobanje do vrata. Dorsalni mišići vrata razdvojeni su kako bi se otkrila atlanto-ocipitalna membrana. Retraktor je korišćen kako bi se olakšao pristup membrani. Atlanto-ocipitalna membrana je prerezana i intratekalni kateter se polako ubacuje kaudalno, dok se ne locira u slabinski region. Višak tečnosti se uklanja koristeći štapiće sa pamukom na vrhu i atlanto-ocipitalna membrana se suši. Odmah nakon toga, adheziv se koristi kako bi se učvrstio balon katetera za membranu. Jednom kada se lepak osuši i kada se kateter solidno pričvrsti, retraktori se uklanjaju. Mala petlja se pravi sa kateterom na kranijumu i balon je vezan koristeći šavove od neapsorbujućeg materijala, jednom kada je kateter obezbeđen, prenosi se na dorsalni vratni segment gde je napravljen rez u koji se postavlja prilazni port. To mesto se ušiva koristeći neapsorbujući materijal.

[0224]Pre zatvaranja vratnih mišića, rana se spira sa 2 ml toplog fiziološkog rastvora (npr. na oko 37,5°C). Mišići se zatvaraju koristeći proste tekuće šavove. Masti u vidu topikalnih antibiotika administrirani su na hirurške rezove posle operacije i jednom dnevno nakon operacije dokle god se smatra potrebnim.

[0225]Mrtve zapremine katetera i port za pristupanje određeni su za vreme operacije. Provera prohodnosti vrši se jednom tokom perioda predtretmana između dana operacije i dana lečenja.

Lečenje

[0226]Period od najmanje 7 dana između implantacije katetera/pristupnog porta dozvoljen je za adekvatan oporavak pre početka lečenja. Pre intratekalnog doziranja, površina za pristupni port je obrijana, ako je to potrebno. Mesto uboda očišćeno je koristeći hlorheksidin glukonat i vodu, i mesto se briše gazom natopljenom sterilnom vodom praćeno sa 3 dela 10% povidon joda. Pristupni port probušen iglom povezan je za špric za doziranje i administriran je polako u test subjekat. Nakon doziranja, mesto se briše jodom što ima za cilj da se ograniči kontaminacija.

[0227]Prvi dan studije, životinjama iz grupe 1 administrirana je formulacija '"I-hGALC laganim bolusnim intratekalnim injektiranjem u subkutaneo lumbalni pristupni port praćeno spiranjem fiziološkim rastvorom od 0,04 ml kako bi se dostavila ciljana doza na nivou od 60 mg/životinji i radioaktivna doza od oko 3 pCi/životinji.

[0228]Drugog dana studije, životinjama iz grupe 3 administrirana je formulacija 125I-hGALC laganim bolusnim intratekalnim injektiranjem u subkutaneo lumbalni pristupni port praćeno spiranjem fiziološkim rastvorom od 0,04 ml kako bi se dostavila ciljana doza na nivou od 60 mg/životinji i radioaktivna doza od oko 3 pCi/životinji. U toku 5 minuta laganog bolusnog intratekalnog injektiranja, životinje iz grupe 3 takođe su primile intravenozno preko intravenoznog katetera u veni na repu (3,33 ml/kg) praćeno spiranjem 0,6 ml fiziološkim rastvorom kako bi se dostavio ciljani nivo doze od 1 mg/kg, sa približnim nivoom radioaktivnosti od 3 uCi/životinji.

[0229]Trećeg dana studije, životinjama iz grupe 2 administrirana je formulacija<1JS>I-hGALC intravenoznim injektiranjem preko intravenoznog katetera u veni na repu (3,33 ml/kg) praćeno spiranjem 0,6 ml fiziološkim rastvorom kako bi se dostavio ciljani nivo doze od 1 mg/kg, sa približnim nivoom radioaktivnosti od 3 uCi/životinji.

[0230]Administrirana zapremina bazirana je na najnove izmerenoj telesnoj težini svake životinje. Beleži se težina špriceva napunjenih formulacijom<1Z5>I-hGALC i praznih nakon administracije. Dostavljena doza svakoj životinji izmerena je na bazi neto težine formulacije koja se izbacuje iz šprica i merena je koncentracija radioaktivnosti u formulisanoj dozi.

[0231]Tokom doziranja, gaze su dostupne da apsorbuju bilo koju malu količinu refluksa doze formulacije i gubitak kod test subjekta vezan je za tečno sintilaciono brojanje prema posebnom postupku projekta. Špricevi i intravenozni kateteri korišćeni za administraciju formulacije test subjektima su zadržani. Intravenozni kateteri i izabrani intratekalni prilazni portovi/kateteri analizirani su na nivo radioaktivnosti prema posebnom postupku projekta.

Sakupljanje uzoraka

Krv/serum i tkiva

[0232]Krajnji uzorci krvi (maksimalna moguća zapremina) sakupljeni su na 10 minuta, 30 minuta i 1, 3, 6, 24, 48 i 96 sati iz 3 životinje/vremenu iz grupa od 1 do 3 nakon doziranja. Intratekalna administracija prethodi intravenoznoj administraciji u grupi 3 i tajming za krajnje uzorke krvi baziran je na vremenu intravenozne administracije. Krajnji uzorci krvi sakupljeni su iz abdominalne aorte pacova (grupe 1, 2 i 3, i 3 rezervne životinje) koji su anestezirani pod izofluranom krvarenjem abdominalne aorte. Otprilike 3 ml krvi (grupe 1,2 i 3) prebačene su u pogodne epruvete koje sadrže K3-EDTA, kako bi se krvni uzorci održali i čuvani su na mokrom ledu čekajući dalje procesuiranje. Za grupe 2 i 3, i rezervne životinje, dodatnih 1,5 ml krvi prebačeno je u epruvete koje sadrže natrijum citrat za analizu vremena protrombina (PTT), aktivniranog parcijalnog vremena tromboplastina (APTT) i fibrinogena. Uzorci krvi čuvani su na mokrom ledu, čekajući centrifugiranje na 2700 RPM 15 minuta na 4°C. Uzorci plazme čuvani su zamrznuti na oko -80°C pre slanja na analizu u laboratoriju. Plazma iz rezervnih životinja predstavlja šlepu probu za analize PTT, APTT i fibrinogena. Ako je posmatrana zapremina krvi nedovoljna za vršenje analiza (grupe 1, 2 i 3) onda krv ima prednost za radioaktivne analize.

[0233]Ostatak krvi (grupe 1, 2 i 3 i 3 rezervne životinje) prebacuju se u epruvete koje sadrže aktivator koagulacije za proizvodnju seruma i dozvoljeno je da se zgrušava, na sobnoj temperaturi, u vremenskom periodu od otprilike 30 minuta pre centrifugiranja. Uzorci prikupljeni iz rezervnih životinja korišćeni su za procenu zgrušanih krvnih uzoraka netretiranih životinja.

[0234]Prateći iskrvavljenost, sledeća tkiva su sakupljena iz 3 životinje/vremenu iz grupa od 1 do 3: adipozno tkivo (masno tkivo bubrega), adrenalne žlezde, kosti (femur), mozak, oči, srce, bubrezi, debelo crevo, sadržaj debelog creva, jetra, pluća, mišići (skeletalni), išijadični nerv, tanko crevo, sadržaj tankog creva, kičmena moždina (slabinski, grudni i vratni pršljenovi), slezina, želudac, sadržaj želuca, tiroidna/paratiroidna žlezda, sadržaj mokraćne bešike.

[0235]Nakon prikupljanja, tkiva su izmerena i onda su procesuirana i analizirana za ukupnu radioaktivnost. Sva tkiva pomenuta iznad, kao i krajnja krv i serum, takođe su skupljeni iz rezervnih životinja i korišćene su da se odrede pozadinski nivoi radioaktivnosti. Ostaci leševa životinja čuvaju se smrznuti (-10°C do -20°C) u označenom zamrzivaču kako bi se omogućio radioaktivni raspad pre nego što se biološki otpad baci. Ostaci prve životinje u svakom trenutku iz grupa od 1 do 3 vade se iz zamrzivača, otapaju i uklanjaju se pristupni port i kateter, spiraju vodom i proveravaju na ostatak radioaktivnosti,

Cerebrospinalna tečnost

[0236]Uzorci cerebrospinalne tečnosti (CSF) sakupljaju se iz svih životinja pri nekropsiji neposredno pre eutanazije. Nad tri životinje u određenom vremenskom trenutku iz grupa od 1 do 3 izvršena je eutanazija 10 minuta, 30 minuta i 1, 3, 6, 24, 48 i 96 sati nakon doziranja. Uzorak (maksimalna moguća zapremina) CSF-a uklanja se pomoću cisterna magna, koristeći stereotaksični sto pri čemu je neophodno da se glava drži ravno. CSF se prebacuje u čistu epruvetu i postavlja na mokar led. Porcija (otprilike 20 pl) procesuira se i analizira na ukupni sadržaj radioaktivnosti. CSF, takođe se skuplja iz rezervnih životinja i koristi se za određivanje pozadinskih nivoa radioaktivnosti.

Određivanje pozadinskih nivoa radioaktivnosti

[0237]Krv, serum i tkiva sakupljena iz rezervne životinje, koriste se za određivanje pozadinskih nivoa radioaktivnosti za krv, serum i tkiva životinja u grupama 1, 2 i 3. CSF sakupljena iz rezervnih životinja korišćena je za određivanje pozadine nivoa radioaktivnosti za CSF.

Procesuirani uzorci za merenje radioaktivnosti

[0238]Svi uzorci su izmereni prateći sakupljanje, osim krvi, plazme, seruma i CSF-a. Za sve grupe, dvostruko izmereni vodeni rastvor od 100 ul od ukupno sakupljene krvi u K3-EDTA uzet je za analizu radioaktivnosti. Taloženje proteina koristeći trihloroacetatnu kiselinu (TCA) od ukupne krvi vršeno je kao što sledi: ekvivalentna zapremina 15% vodenog rastvora TCA dodat je dvostruko izmereni 100 pl vodeni rastvor ukupne krvi. Uzorci (100 pm ukupne krvi + 100 pm TCA) mešani su na vorteksu i onda su centrifugirani na 4°C otprilike 15 minuta na lOOOOrpm i supernatant je isceđen u zasebnu epruvetu. Oba, i supernatant i pelet analizirani su na ostatke radioaktivnosti.

[0239]Krv za sakupljanje seruma čuvana je na sobnoj temperaturi na oko 30 minuta, kako bi se dozvolilo zgrušavanje pre centrifugiranja na 4°C na 2700 rpm (1250 ref) i za otprilike 10 minuta odvaja se serum. Uzorci seruma onda se čuvaju na mokrom ledu čekajući da se veći deo analizira na radioaktivnost (2 x 100 pl izmerenog uzorka). Pakovana krvna zrnca (dobijena nakon separacije seruma) čuvaju se na mokrom ledu čekajući procesuiranje za radioaktivnu analizu. Ostatak seruma čuva se zamrznut (-10°C do -20°C). Dvostruko izmereni veći deo uzorka od 100 pl ukupne krvi i crvenih krvnih zrnaca (dobijenih nakon separacije seruma, pomešanih sa istom zapreminom dejonizovane vode (w/v) i homogenizovanih sa politron emulzifikatorom) rastvoreni su u Soluen-350, obezbojeni vodonik peroksidom (30% w/v) i mešani sa tečnom sintilacionom tečnošću za analizu radioaktivnosti.

[0240]TCA krvni ostatak peleti rastvoren je u 35% tetraetilamonijum hidroksidu (TEAH), obezbojen vodonik peroksidom (30% w/v) i mešan tečnom sintilacionom tečnošću za merenje radioaktivnosti. Sadržaji mokraćne bešike, TCA krvni supernatant, dvostruko mereni veći detovi formulacija doze (razblaŽeni) i serum mešani su direntno sa tečnim sintilacionim fluidom za merenja radioaktivnosti. Dvostruko izmreren alikvotCSF (oko 10 pl/alikvotu) rastvoren je u 35% TEAH pre mešanja sa tečnim sintilacionim fluidom za merenja radioaktivnosti.

[0241]Uzorci tkiva rastvoreni su u 35% TEAH. Dvostruki alikvoti su onda mešani sa tečnim sintilacionim fluidom pre merenja radioaktivnosti. Sadržaji debelog creva homogenizovani su u poznatoj zapremini vode. Dvostruko izmereni alikvoti homogenog sadržaja debelog creva, sadržaj želuca (STC) i sadržaj tankog creva (SINC) rastvoreni su u 35% TEAH i mešani su sa tečnim sintilacionim fluidom za radioaktivna merenja.

Merenje radioaktivnosti

[0242]Merenja radioaktivnosti sprovedena su tečnom sintilacionom spektroskopijom prema "Standard Operating Procedures" (SOP). Svaki uzorak brojen je 5 minuta ili do dva-sigma greške od 0,1% koje god da se pn/o javi. Sva brojanja konvertovana su do apsolutne radioaktivnosti (DPM) automatskom "quench" korekcijom baziranom na promenama spektra za eksterni standard. Pogodne pozadinske DPM vrednosti oduzete su od svih uzoraka DPM vrednosti. Prateći pozadinsko oduzimanje, uzorci su pokazali manju ili jednaku radioaktivnost sa pozadinskim vrednostima i smatrane su za nulu za sve subsekventne manipulacije.

Analiza podataka

Radioaktivna koncentracija

[0243]Sva merenja radioaktivnosti unose se u kompjutersku bazu podataka (Debra Version 5.2) za računanje koncentracija radioaktivnosti (dpm/g i masa eq/g) i procenata administrirane radioaktivnosti u uzorku. Krv, serum, tkiva i CSF koncentracije radioaktivnosti u dpm/g i masa eq/g izračunate su na osnovu merenja specifične aktivnosti (dpm/mg ili pogodna jedinica mase) radioobeleženog test subjekta u rastvoru doze. Koncentracija radioaktivnosti u krvnim uzorcima konvertovana je do mase eq/ml na bazi gustine krvi pacova. Ukupan sadržaj tkiva izračunat je za ukupnu težinu organa.

Farmakokinetika

[0244]Farmakokinetički profil (PK) ukupne radioaktivnosti u krvi, serumu, CSF-u i tkivima karakterisan je nedeljivim analizama koncentracija nasuprot vremenu koristeći validiran kompjuterski softver (VVinNonlin, version 3.2, Pharsight Corp., Mountain View, California, USA). Modeli su izabrani na osnovu intravenoznog i ekstravaskularnog načina administracije. Vrednosti koncentracija pokazanih kao nedetektabilne ili kvantifikovane nisu procenjene; tretirani su kao odsutni uzorci. Podaci za koncentracije dobijeni iz različitih životinja u svakom trenutku vremena i srednje vrednosti korišćene su da bi se dobio farmakokinetički profil kompozita. Desetominutno uzorkovanje za grupu 1 (životinja nos. 1001, 1002, 1003) i grupu 2 (životinja nos. 2001, 2002, 2003), i 48-časovno za grupu 1 (životinja nos. 1019, 1020) odstupalo je više od 10% ili 6 minuta od nominalnog vremenskog trenutka. Ovo odstupanje od protokola nije uticalo na validnost studije ili na dobijene podatke pošto je izračunato srednje vreme i korišćeno je u farmakokinetičkim analizama.

[0245]Površina na krivoj zavisnosti koncentracije radioaktivnosti od vremena (AUC) izračunata je koristeći linearni trapezni metod (linearnu interpolaciju). Kada je moguće, faza terminalne eliminacije PK profila identifikovana je na bazi najboljeg fitovanja (R<J>) koristeći najmanje tri konačne posmatrane vrednosti koncentracija. Nagib faze terminalne eliminacije izračunat je koristeći log-linearnu regresiju koristeći podatke neizmerenih koncentracija. Parametri koji se oslanjaju na određivanje keinisu objavljeni ako je koeficijent određivanja (R<2>) manji od 0,8 ili ako je ekstrapolaclja AUC do beskonačnosti pokazala više od 20% ukupne površine.

Rezultati

Analiza formulacije doziranja (tabela 8)

[0246]Svakog dana doziranja, alikvoti svake formulacije analizirani su tečnom sintilacionom spektroskopijom pre doziranja i za vreme administracije doze svim grupama i specifična aktivnost test subjekata izračunata je iz ovih analiza. Ukupna srednja vrednost koncentracije radioaktivnosti (±S.D.) u formulaciji za intratekalnu administraciju bila je 345,4 x IO<6>± 4,92 x IO<6>dpm/g (155,60 pCi/g) za grupu 1 i 334,4 x IO<6>± 5.87 x IO<6>dpm/g (150,62 uCi/g) za grupu 3. Ukupna srednja vrednost koncentracije radioaktivnosti u formulaciji za intravenoznu administraciju bila je 4,4 x 10<6>± 4,22 x 10<5>dpm/g (1,97 uCi/g) za grupu 2 i 4,7 x IO<6>± 2.,31 x 10<s>dpm/g (2,11 pCi/g) za grupu 3. Specifična aktivnost test subjekta u intratekatnoj formulaciji izračunata je kao 51,16 pCi/mg za dozu grupe 1 i 49,53 uCi/mg za dozu grupe 3. Specifična aktivnost test subjekta u intravenoznoj formulaciji izračunata je kao 6,53 pCi/mg za dozu grupe 2 i 6,99 uCi/mg za dozu grupe 3.

Telesna težina životinja i administrirane doze (tabela 9)

[0247]Srednja vrednost telesne težine pacova iz grupa 1, 2 i 3 na dan pre doziranja bila je 405 g (opseg od 373 g do 452 g), 410 g (opseg od 367 g do 453 g) i 395 g (opseg od 342 g do 444 g), respektivno. Izračunata srednja vrednost doze 125IhGALC administirane intratekalno životinjama iz grupe 1 bila je 41 ± 0,014 pg/životinji što je ekvivalent radiohemijskoj dozi od 2,12 ± 0,72 pCi/životinji. Srednja vrednost doze U5I-hGALC administrirane na intravenozni način životinjama iz grupe 2 bila je 1,00 ± 0.02 ug/kg (2.69 ± 0.14 pCi/životinji). Za grupu 3, izračunata srednja vrednost doze<125>I-hGALC administrirane intratekalno i intravenozno bila je 1,08 ± 0.04 pg/kg (5.72 ± 0,31 pCi/životinji).

[0248]Srednja vrednost hemijske doze i radiohemijske doze administrirane parovima iz grupe 1 niža je (otprilike 32% i 29%, respektivno) od nivoa ciljane doze i ovime je ustanovljeno odstupanje od protokola. Međutim, pošto se aktuelne doze administrirane životinjama koriste u proračunima, smatra se da ove niže vrednosti ne utiču na validnost studija ili dobijene podatake.

Klinička posmatranja

[0249]Nijedan tretman koji se odnosi na kliničku sliku nije posmatran kod pacova kojima je administiran<li5>I-hGALC intratekalno na 60 pg/životinji i/ili intravenozno na 1 mg/kg.

Određivanje koagulacije

[0250]U ranijim vremenskim periodima (10 minuta do 6 sati nakon doze) zabeleženo je da se krv sakupljena od životinja nije potpuno zgrušala u roku od dozvoljenih 30 minuta. Međutim, krv sakupljena od 3 netretirana rezervna pacova zgrušala se brzo, što ukazuje na smetnje u procesu zgrušavanja kod test subjekata. Vreme zgrušavanja kraće ili duže od 30 minuta stvorilo je odstupanje u protokolu. Međutim, nekim uzorcima potrebno je duže vreme zgrušavanja kako bi obezbedili serum za analize. Pregledom rezultata koji su dobijeni otkriveno je da nema korelacije između vrednosti koncentracija dobijenih u serumu i dužine vremena koje je potrebno da bi se krv zgrušala. Stoga, ovo produženo ili skraćeno vreme zgrušavanja, nije uticalo na validnost studije ili na dobijene podatke.

Farmakokinetika ukupne radioaktivnosti u krvi, serumu, crvenim krvnim zrncima, CSF-u i tkivima

Ukupna koncentracija radioaktivnosti u krvi, serumu i crvenim krvnim zrncima (tabele 10, 11, 12, slike 18-21)

[0251]Srednja vrednost koncentracija radioobeleženog materijala u serumu mužjaka pacova praćeno intratekalnim i/ili intravenoznim dozama U5I-hGALC data je u tabeli 10. Srednja vrednost koncentracija radioobeleženog materijala u krvi i crvenim krvnim zrncima prikazana je u tabeli 11. Srednja vrednost podataka prikazana je grafički na slici 18. Srednja vrednost procenata radioaktivnosti prečišćena u supernatantu i peletima krvi praćena TCA precipitacijom prikazana je u tabeli 12.

Grupa 1 (intratekalna srednja doza od 41 ug/životinji)

[0252]Prateći intratekalno doziranje, najviša srednja koncentracija (Cmax) radioobeleženog materijala u serumu i krvi posmatrana je 3 sata u toku doze (0,108 ± 0,026 pg eq/g i 0,093 ± 0,023 ug eq/g, respektivno). Nivoi radioaktivnosti u krvi ostaju relativno konstantni između 3 i 6 sati nakon doze nakon čega nivoi radioaktivnosti u serumu blago opadaju. Nakon toga, koncentracije radioaktivnosti u serumu i krvi opadaju i 48 sati nakon doziranja opadaju ispod limita kvantifikacije (LOQ). Za crvena krvna zrnca, C™, posmatrana je 6 sati nakon doze i bila je 0,089 ± 0,024 pg eq/g. Nakon toga, koncentracija radioaktivnosti crvenih krvnih zrnaca opada i bila je ispod LOQ 48 sati nakon doziranja. Srednja vrednost krvi prema odnosu seruma praćeno intratekalnim doziranjem bila je manja od 1 tokom perioda studije (opseg od 0,7 do 0,9), ukazujući na to da radioobeleženi materijal nije naročito povezan sa krvnim zrncima. Vrednosti crvenih krvnih zrnaca prema odnosu seruma (opseg od 0,8 do 0,9) takođe zauzima to da radioaktivnost nije supstancijalno povezana sa krvnim zrncima. Procenat doze nađene u krvi procenjena je, koristeći standardnu zapreminu krvi/telesnu težinu (npr. 64,0 ml/kg). Pri t? (vreme u kome se javlja najviša radioaktivnost), otprilike je 6% administrirane doze povezano sa krvlju.

Grupa 2 (intravenozna srednja vrednost doze od 1,00 mg/kg)

[0253]Prateći intravenoznu administraciju, najviša srednja vrednost koncentracije (Cm«) radioobeleženog materijala u serumu (14,864 ± 0,853 pg eq/g) i krvi (10,228 ± 0,447 pg eq/g) posmatrana je na 10 minuta prateći doziranje (npr. analiziranje prve vremenske tačke). Nakon toga, koncentracija radioaktivnosti u serumu i krvi polako opada, ali je i dalje detektibilna 96 sati nakon doze (serum: 0,088 ± 0,006 pg eq/g, 0,59% od C«; krv: 0,051 ± 0,002 pg eq/g, 0,50% od C™„)isa procenjenim procentualnim opadanjem doze sa 68,4% na 0,3%. Za crvena krvna zrnca, C™* od 5,136 ± 1,529 pg eq/g posmatrano je 10 minuta nakon doze. Nakon toga, koncentracija radioaktivnosti crvenih krvnih zrnaca opala je i bila je ispod LOQ 96 sati nakon doze. Srednja vrednost krvi prema odnosu seruma praćena intravenoznim doziranjem bila je manja od 1 tokom perioda studije (opseg od 0,6 do 0,8), pokazujući da radioobeleženi materijal nije naročito povezan sa krvnim zrncima. Vrednosti crvenih krvnih zrnaca prema odnosu seruma (opseg od 0,4 do 0,6) takođe podržava to da radioaktivnost nije supstancijalno povezana sa krvnim zrncima.

Grupa 3 (intratekalno praćeno intravenoznim doziranjem: 1,08 mg/kg (kombinovana doza))

[0254]Prateći intratekalno doziranje (ciljano 60 pg/životinji) i intravenozno doziranje (1 mg/kg), najviša srednja vrednost koncentracije (Gr««) radioobeleženog materijala u serumu (14,675 ± 0,810 pg eq/g) i krvi (9,974 ± 0,558 pg eq/g) posmatrano je 10 minuta nakon doziranja (npr. analiza prve vremenske tačke). Nakon toga koncentracija radioaktivnosti u serumu i krvi sporo opada, ali je i dalje detektibilna 96 sati nakon doze (serum: 0,077 ± 0,010 pg eq/g, 0,52% od Cm«; krv: 0,037 ± 0,033 pg eq/g, 0,37% od Cmaa), sa ekstrapoliranim procentualnim opadanjem doza u krvi sa 32,6% na 0,1%. Za crvena krvna zrnca, posmatran je G™, od 6,113 ± 1,748 pg eq/g 10 minuta nakon doziranja. Nakon toga, koncentracije radioaktivnosti crvenih krvnih zrnaca opadale su i bile ispod limita kvantifikacije 96 sati nakon doziranja. Radioobeleženi materijal nije naročito povezan sa krvnim zrncima kao što je pokazano srednjom vrednošću krvi do seruma i odnosima crvenih krvnih zrnaca prema serumu čiji je odnos manji od 1 (u opsegu od 0,7 do 0,8 i 0,4 do 0,7, respektivno).

Tabela 10a - Srednja vrednost koncentracije radioaktivnosti grupe mužjaka Sprague-Davvlev pacova praćena pojedinačnim intratekalnim doziranjem '"I-hGALC

Tabela 10b - Srednja vrednost koncentracije radioaktivnosti u serumu grupe mužjaka Sprague-Davvlev pacova praćena pojedinačnim intravenoznim bolusnim injektiranjem<lJ5>I-hGALC Tabela 10c - Srednja vrednost koncentracije radioaktivnosti u serumu grupe mužjaka Sprague-Davvlev pacova praćena pojedinačnim intratekalnim i intravenoznim bolusnim injektiranjem "<5>I-hGALC Tabela 11a - Srednja vrednost koncentracije i sadržaja radioaktivnosti u krvi i u odnosu krvi prema serumu mužjaka Sprague-Davvlev pacova praćena pojedinačnom intratekalnom dozom<1JS>I-hGALC

Tabela 11b - Srednja vrednost koncentracije i sadržaja radioaktivnosti u krvi i u odnosu krvi prema serumu mužjaka

Sprague-Davvlev pacova praćena pojedinačnim intravenoznim bolusnim injektiranjem<1!S>I-hGALC

Table 11c - Srednja vrednost koncentracije i sadržaja radioaktivnosti u krvi i u odnosu krvi prema serumu mužjaka Sprague-Davvlev pacova praćena pojedinačnom intratekalnom dozom i intravenoznim bolusnim injektiranjem<1Z5>I-hGALC Tabela llđ - Srednja vrednost koncentracije i sadržaja radioaktivnosti u crvenim krvnim zrncima i odnosu crvenih krvnihzrnaraiserumagrupemužjakaSprague-Davvlev pacova praćena pojedinačnom intratekalnom dozom<125>I-<hGALC> Table lle - Srednja vrednost koncentracije i sadržaja radioaktivnosti u crvenim krvnim zrncima i odnosu crvenih krvnih zrnaca i seruma grupe mužjaka Sprague-Davvlev pacova praćena pojedinačnim intravenoznim bolusnim injektiranjem<1J5>I-hGALC Group Tabela llf - Srednja vrednost koncentracije i sadržaja radioaktivnosti u crvenim krvnim zrncima i odnosu crvenih krvnih zrnaca i seruma grupe mužjaka Sprague-Davvlev pacova praćena pojedinačnom intratekalnom dozom i intravenoznim bolusnim injektiranjem<1Z5>I-hGALC

Tabela 12a - Srednja vrednost radioaktivnosti u procentima regenerisane iz supernatanta i peleti krvi kod mužjaka

Sprague-Davvlev pacova praćena pojedinačnom intratekalnom dozom<1Z5>I-hGALC

Tabela 12b - Srednja vrednost radioaktivnosti u procentima regenerisane iz supernatanta i peleti krvi kod mužjaka

Sprague-Davvlev pacova praćena pojedinačnim intravenoznim bolusnim injektiranjem 125I-hGALC

Table 12c - Srednja vrednost radioaktivnosti u procentima regenerisane iz supernatanta i peleti krvi kod mužjaka Sprague-Davvlev pacova praćena pojedinačom intratekalnom dozom i intravenoznim bolusnim injektiranjem<U5>I-hGALC

(Tabela 12)

[0255]Srednje vrednosti za regeneraciju radioaktivnosti u peleti i supernatantu praćene precipitacijom u ćelom krvotoku pomoću trihloroacetatne kiseline (TCA) za grupe 1, 2 i 3 i sumirane su u tabeli 12. Kada se koristi 15% vodeni rastvor TCA kako bi se nataložili proteini u krvotoku, radioaktivnost se uglavnom regeneriše u peletima krvi (u opsegu od 100% do 67% za grupu 1; 100% do 91 % za grupu 2; 100% do 88% za grupu 3) ukazujući na to da najveći deo cirkulišuće radioaktivnosti vezan za protein i stoga ne odražava slobodni '"I.

Koncentracija radioaktivnosti u tkivima i cerebrospinalnoj tečnosti (CSF)

(Tabele 13, 14, 15, slike 19 - 30)

[0256]Srednja vrednost koncentracije radioaktivnosti u tkivima i CSF-u pacova praćena pojedinačnim intratekalnim i/ili intravenoznim doziranjem<1JS>I-hGALC data je u tabeli 13. Srednja vrednost podataka prikazana je grafički na slikama 19-30. Srednja vrednost tkiva prema odnosu seruma prikazana je u tabeli 14 i regeneracija administrirane doze u tkiva, CSF, gastrointestinalni trakt i mokraćnu bešiku dati su u tabeli 15.

Tabela 13a - Srednja vrednost koncentracija u tkivima, cerebrospinalnoj tečnosti grupe mužjaka Sprague-Davvlev pacova praćena pojedinačnim intratekalnim doziranjem "5I-hGALC

Tabela 13b - Srednja vrednost koncentracija u tkivima, cerebrospinalnoj tečnosti grupe mužjaka Sprague-Davvlev pacova praćena pojedinačnim intravenoznim bolusnim injektiranjem '"T-hGALC Tabela 13c - Srednja vrednost koncentracija u tkivima, cerebrospinalnoj tečnosti grupe mužjaka Sprague-Dawley pacova praćena pojedinačnim intratekalnim doziranjem i intravenoznim bolusnim injektiranjem 125I-hGALC Tabela 14a - Srednja vrednost tkiva i odnosa cerebrospinalne tečnosti i seruma kod grupe mužjaka Sprague-Davvlev pacova praćene pojedinačnim intratekalnim doziranjem<liS>I-hGALC Tabela 14b - Srednja vrednost tkiva, odnosa cerebrospinalne tečnosti i radioaktivnosti u serumu kod grupe mužjaka Sprague-Davvlev pacova praćena pojedinačnim intravenoznim bolusnim injektiranjem 125I-hGALC Tabela 14c - Srednja vrednost tkiva, odnosa cerebrospinalne tečnosti i seruma grupe mužjaka Sprague-Davvlev pacova praćena pojedinačnom intratekalnom dozom i intravenoznim bolusnim injektiranjem 125I-hGALC Tabela 15a - Srednja vrednost sadržaja radioaktivnosti u tkivima, cerebrospinalnoj tečnosti, gastrointestinalnom traktu i mokraćnoj bešici grupe mužjaka Sprague-Davvlev pacova praćena pojedinačnim intratekalnom doziranjem<U5>I-hGALC Tabela 15b - Srednja vrednost sadržaja radioaktivnosti u tkivima, cerebrospinalnoj tečnosti, gastrointestinalnom traktu i mokraćnoj bešici grupe mužjaka Sprague-Dawley pacova praćena pojedinačnim intravenoznim bolusnim injektiranjem<125>I-hGALC Tabela 15c - Srednja vrednost sadržaja radioaktivnosti u tkivima, cerebrospinalnoj tečnosti, gastrointestinalnom traktu i mokraćnoj bešici grupe mužjaka Sprague-Davvlev pacova praćena pojedinačnom intratekalnom dozom i pojedinačnim intravenoznim bolusnim injektiranjem li5I-hGALC

Grupa 1 (intratekalna srednja vrednost doze od 41 ug/zivotinji)

[0257]Prateći intratekalno doziranje, postoji opšta distribucija 125I-obeleženog materijala u sva tkiva koja se pregledaju, međutim, nivoi radioaktivnosti u CSF-u bili su ispod LOQ. Najviša srednja vrednost koncentracija<121>I obeleženog materijala u tkivima mužjaka pacova posmatrana je 48 sati nakon doze u tiroidnoj/paratiroidnoj žlezdi (4,127 ± 1,635 pg eq/g) i tri sata nakon doze u želucu (0,203 ± 0,101 pg eq/g), bubrezima (0,096 ± 0,014 pg eq/g) i plućima (0,058 ± 0,014 pg eq/g). Nivoi su bili manji u ostalim tkivima sa tm„ vrednostima generalno posmatranim između 3 i 6 sati nakon doze. Najniža vrednost G™* uočena je u mozgu (0,005 ± 0,001 pg eq/g) i u masnom tkivu bubrega (0,006 ± 0,000 pg eq/g). 48 i 96 sati nakon doze nivoi radioaktivnosti u većini tkiva su ispod granice detekcije, sa izuzecima tiroidne/paratiroidne žlezde, bubrega i želuca. Na 96 satu nakon doze, najviša srednja vrednost koncentracije uočena je kod tiroidne/paratiroidne žlezde (1,927 ± 1,585 pg eq/g, 46,7% od Cma>) praćena bubrezima (0,005 ± 0,001 pg eq/g, 5,2% od G™,) i želucem (0,002 ± 0,001 pg eq/g, 1 % od C™„).

[0258]Odnosi tkiva i seruma generalno su manji od 1 za tkiva do 24 sata nakon intratekalne doze. Izuzeci su bili tiroidna/paratiroidna žlezđa, bubrezi i želudac. Najviši odnosi, do sada, uočeni su kod tiroidne/paratiroidne žlezde. 48 i 96 sati nakon doze, odnosi tkiva prema serumu nisu mogli da budu izračunati jer je koncentracija seruma bila ispod LOQ.

[0259]Nivoi radioaktivnosti regenerisani u svim tkivima bili su manji od 1% od administrirane doze sa najvećim

proporcijama uočenim u jetri (0,91%) 3 sata nakon doze. Sat vremena nakon doze, proporcije veće od 1% nađene su u sadržini želuca (1,8%). Tri sata nakon doze, proporcije veće od 1% administrirane doze detektovane su u sadržini tankog creva (2,6%), sadržini želuca (5,0%) i u sadržaju mokraćne bešike (1,2%). Šest sati nakon doze, proporcije veće od 1% administrirane doze nađene su u sadržaju tankog creva (1,7%) i sadržaju želuca (4,0%). 96 sati nakon doze, mala količina radioaktivnosti koja potiče od 125I-hGALC (manja od 0,1%) još uvek je regenerisana u bubrezima, tiroidnoj/paratiroidnoj žlezdi, želucu i sadržaju mokraćne bešike, sa najvišom regeneracijom uočenoj u tiroidnoj/paratiroidnoj žlezdi (0,09%).

Grupa 2 (intravenozna srednja vrednost doze od 1,00 mg/kg)

[0260]Prateći intravenoznu administraciju, najviša srednja vrednost koncentracije (Cma,) radioobeleženog jedinjenja u tkivima pacova iz grupe 2 posmatrana je u tiroidnim/paratiroidnim žlezdama (294,521 ± 52,953 pg eq/g; 48 sati nakon doze), praćeno plućima (20,629 ± 2,125 pg eq/g; 30 minuta nakon doziranja), jetrom (11,335 ± 1,436 pg eq/g; 10 minuta nakon doziranja), adrenalnim žlezdama (8,827 ± 2,435 pg eq/g; 10 minuta nakon doziranja), slezinom (6,595 ± 0,625 pg eq/g; 10 minuta nakon doziranja) i bubrezima (3,027 ± 0,330 pg eq/g; 10 minuta). Vrednosti t™, za tkiva koje se javljaju između 10 minuta i 3 sata nakon doze osim za tiroidne/paratiroidne žlezde (48 sati nakon doze). Najmanja srednja vrednost radioaktivnosti Cma«uočena je u masnom tkivu bubrega (0,158 ± 0,019 pg eq/g), CSF-u (0,210 ± 0,363M9eq/9)/mozgu (0,252 ± 0,041 pg eq/g), skeletnim mišićima (0,275 ± 0,025 pg eq/g) i kičmenoj moždini (0,293 ± 0,028 pg eq/g). 96 sati nakon doziranja, radioaktivnost je još uvek detektovana u 7 od 18 analiziranih tkiva sa najvišim srednjim vrednostima koncentracija koje su detektovane u tiroidnim/paratiroidnim žlezdama (218,917 ± 45,098 pg eq/g, 74.3% ođ Ci,«), praćeno jetrom (0,126 ± 0,014 pg eq/g, 1.1% od Cmax), slezinom (0,111 ± 0,009 pg eq/g, 1.7% od C™.) i bubrezima (0,099 ± 0,010 pg eq/g, 33% od Cm*).

[0261]Deset minuta nakon doziranja, srednja vrednost odnosa tkivo-serum bila je manja od 1 za sva analizirana tkiva. Trideset minuta i 1 sat nakon doziranja, srednja vrednost odnosa tkivo-serum bila je veća od 1 za pluća i tiroidnu/paratiroidnu žlezdu. Tri i šest sati nakon doziranja, srednja vrednost odnosa tkivo-serum bila je veća od 1 za jetru, pluća i tiroidnu/paratiroidnu žlezdu. 24 i 48 sati nakon doziranja, jetra, pluća, slezina i tiroidna/paratiroidna žlezda imale su su srednju vrednost odnosa tkivo-serum veću od 1. Nakon 96 sati od doziranja, srednja vrednost odnosa tkivo-serum bila je veća od 1 za bubrege, jetru, slezinu i tiroidnu/paratiroidnu žlezdu. Najviši odnosi serum-tkivo uočeni su kod tiroidne/paratiroidne žlezde (2485 na 96 sati), pluća (6,5 na 24 sata) i jetre (2,2 na 24 sata).

[0262]Pod uslovima proporcije radioaktivnosti koja je administrirana, uočena je najviša srednja vrednost u jetri (41,7%, 10 minuta nakon doziranja), plućima (7,0%, 30 minuta nakon doziranja), bubrezima (2,2%, 10 minuta nakon doziranja), tankom crevu (1,5%, 1 sat nakon doziranja) i tiroidnoj/paratiroidnoj žlezdi (1,4%, 48 sati nakon doziranja). U sadržaju gastrointestinalnog trakta, najviše srednje vrednosti bile su 10,3% od doze u sadržaju želuca (3 sata nakon doziranja), 5,4% u sadržaju tankog creva (3 sata nakon doze) i 1,1% u sadržaju debelog creva (6 sati). 96 sati nakon doziranja, najviše proporcije administrirane doze detektovane su u tiroidnoj/paratiroidnoj žlezdi (1,0%), jetri (0,5% i bubrezima (0,1%). u ovom vremenskom trenutku nakon doze, manje od 0,01% administrirane doze ostaje u želucu i sadržaju mokraćne bešike.

Grupa 3 (intratekalno praćeno intravenoznim doziranjem: 1,08 mg/kg (kombinovana doza))

[0263]Prateći intratekalno t intravenozno doziranje, najviša srednja koncentracija (C™») radioobeleženog materijala u

tkivima pacova iz grupe 3 uočena je u tiroidnoj/paratiroidnoj žlezdi (296,957 ± 57,793 pg eq/g; 24 sata nakon doziranja), praćeno jetrom (10,181 ± 0,600 pg eq/g; 10 minuta nakon doziranja), adrenalnim žlezdama (9,567 ± l,678pg eq/g; 10 minuta nakon doziranja), plućima (5,305 ± 0,194 pg eq/g; 1 sat nakon doziranja), slezinom (5,042 ± 0,902 pg eq/g; 10 minuta nakon doziranja), želucem (4,454 ± 1,455 pg eq/g; 3 sata nakon doziranja), bubrezima (3,390±0,183 pg eq/g; 1 sat nakon doziranja) i CSF (2,087 ± 2,912ug eq/g; 10 minuta nakon doziranja). Vrednosti tTO*za tkiva uočena su između 10 minuta i 3 sata nakon doziranja osim za debelo crevo (6 sati nakon doziranja) i tiroidnu/paratiroidnu žlezdu (24 sata nakon doziranja). Najniža srednja vrednost radioaktivnosti G™ uočena je kod masnog tkiva bubrega (0,188 ± 0,020 pg eq/g), mozga (0.283 ± 0.062 pg eq/g), kičmene moždine (0,327 ± 0,062 pg eq/g) i skeletnih mišića (0,411 ± 0,009 pg eq/g). 96 sati nakon doziranja, radioaktivnost je i dalje detektovana u 8 od 18 analiziranih tkiva, sa najvišom srednjom koncentracijom koja je detektovana u tiroidnoj/paratiroidnoj žlezdi (43,962 ± 23,164 pg eq/g, 14.8% od C™), praćeno (0,137 ± 0,018 pg eq/g, 1.3% od Gr«), bubrezima (0,124 ± 0,005 pg eq/g, 3,7% od Cm*), slezinom (0,083 ± 0,009 pg eq/g, 1,6% od C™,) i adrenalnim žlezdama (0,069 ± 0,016 pg eq/g, 0,7% od C«),

[0264]Deset minuta nakon doziranja, srednja vrednost odnosa tkivo-serum bila je manja od 1 za sva analizirana tkiva. Trideset minuta i 1 sat nakon doziranja, srednja vrednost odnosa tkivo-serum bila je veća od 1 za tiroidnu/paratiroidnu žlezdu. Tri sata i 6 sati nakon doze, srednje vrednosti odnosa tkivo-serum bile su veće od 1 za želudac i tiroidnu/paratiroidnu žlezdu. 24 sata nakon doziranja, jetra i tiroidna/paratiroidna žlezda imale su odnos tkivo-serum iznad 1. 48 i 96 sati nakon doziranja, srednja vrednost odnosa tkivo-serum bila je veća od 1 za bubrege, jetru, tiroidnu/paratiroidnu žlezdu i za slezinu (nakon 96 sati). Najviši odnosi tkivo-serum uočeni su u tiroidnoj/paratiroidnoj žlezdi (854 nakon 48 sati), jetri (1,8 nakon 48 sati) i bubrezima (1,6 nakon 96 sati).

[0265]Pod uslovima proporcije administrirane radioaktivnosti, najviša srednja vrednost u tkivima uočena je u jetri (19,0%, 10 minuta nakon doziranja), bubrezima (1,2%, 1 sat nakon doziranja) i tankom crevu (1,2%, 3 sata nakon doziranja). U sadržaju gastrointestinalnog trakta, najviše srednje vrednosti bile su 8,8% od doze u sadržaju želuca (3 sata nakon doziranja), 4,3% u sadržaju tankog creva (3 sata nakon doziranja) i 1,0% u sadržaju debelog creva (6 sati nakon doziranja). 96 sati nakon doziranja, najviše proporcije administrirane doze detektovane su u jetri (0,3%), tiroidnoj/paratiroidnoj žlezdi (0,1%) i bubrezima (0,05%). U ovom vremenskom trenutku nakon doziranja, manje od 0,01% administrirane doze je ostalo u adrenalnim žlezdama, srcu, plućima, slezini, želucu i sadržaju mokraćne bešike.

Farmakokinetika radioaktivnosti u krvi, serumu, crvenim krvnim zrncima, CSF-u i tkivima

(Tabele 16 i 17)

[0266]Srednja vrednost farmakokinetičkih parametara za radioaktivnost u krvi, serumu, crvenim krvnim zrncima, CSF-u i tkivima pacova prateći pojedinačnu intratekalnu i/ili intravenoznu dozu '"I-hGALC data je u tabelama 16 i 17.

Tabela 16: dispozicija kinetike ukupne radioaktivnosti u serumu, krvi i crvenim kivnim zrncima mužjaka Sprague-Davvlev pacova praćeni pojedinačnom intratekalnom dozom 12SI-hGALC

Tabela 16b - Dispozicija kinetike ukupne radioaktivnosti u serumu, krvi i crvenim krvnim zrncima mužjaka Sprague-Davvlev pacova praćena pojedinačnim intravenoznim bolusnim injektiranjem<12S>I-hGALC Tabela 16c - Dispozicija kinetike ukupne radioaktivnosti u serumu, krvi i crvenim krvnim zrncima mužjaka Sprague-Davvlev pacova praćena pojedinačnim intratekalnim doziranjem i intravenoznim bolusnim injektiranjem<12S>I-hGALC Tabela 17a - Dispozicija kinetike ukupne radioaktivnosti u tkivima i cerebrospinalnoj tečnosti mužjaka Sprague-Davvlev pacova praćena pojedinačnom intratekalnom dozom 125I-hGALC Tabela 17b - Dispozicija kinetike ukupne radioaktivnosti u tkivima i cerebrospinalnoj tečnosti mužjaka Sprague-Davvlev pacova praćena pojedinačnim intravenoznim bolusnim injektiranjem<1JS>I-hGALC

Tabela 17c - Dispozicija kinetike ukupne radioaktivnosti u tkivima i cerebrospinalnoj tečnosti mužjaka Sprague-Davvlev pacova praćena pojedinačnom intratekalnom dozom i pojedinačnim intravenoznim bolusnim injektiranjem<I25>I-hGALC

Krv, serum i crvena krvna zrnca

[0267]Prateći intratekalnu dozu (grupa 1: 41 pg/životinji), srednja vrednost izračunate površine u zavisnosti od krivih koncentracije radioaktivnosti od vremena, od nule do poslednje tačke vremena na kojoj se meri (AUGnua) za serum, celokupni krvotok i crvena krvna zrnca bila je 1,48 pg eq-h/g, 1,33 pg eq-h/g i 1,24 pg eq-h/g, respektivno. Očigledne krajnje tw vrednosti objavljene za radioaktivnost u serumu, celokupnom krvotoku i crvenim krvnim zrncima bile su 5,34, 5,02 i 4,08 sati, respektivno. Eliminaciona konstanta, k, izračunata je kao 0,130 h"<1>, 0,138 h'<1>i 0.170 h"<1>u serumu, celokupnom krvotoku i crvenim krvnim zrncima, respektivno. AUQ>. n, izračunat je kao 1,54 pg eq-h/g, 1,37 pg eq-h/g i 1,25 mg eqh/g u serumu, celokupnom krvotoku i crvenim krvnim zrncima, respektivno. Eliminacione faze radioaktivnosti iz seruma, celokupnog krvotoka i crvenih krvnih zrnaca dobro su definisane što je evidentirano veoma malim procentom ekstrapoliranih vrednosti (4,0, 3,2 i 1,4%, respektivno) potrebnih za izračunavanje AUCo-,m.

[0268]Prateći intravenozno doziranje (grupa 2: 1,00 mg/kg), srednje vrednosti AUCg-ia«za serum, celokupni krvotok i crvena krvna zrnca bile su 71,1 pg eq-h/g, 51,2 pg eq-h/g i 33,9 pg eq-h/g, i očigledne krajnje vrednosti tm bile su 30,7,27,1 i 10,9 sati, respektivno. Vrednosti k izračunate su za serum, celokupni krvotok i crvena krvna zrnca i iznose 0,0226 h'<1>, 0,0256 h i 0,0635 h"<1>, respektivno. Eliminacione faze radioaktivnosti za serum, celokupni krvotok i crvena krvna zrnca dobro su definisane i AUCo«f je izračunat kao 75,0 pg eq-h/g (ekstrapolacija 5,21%), 53,2 pg eq'h/g (ekstrapolacija 3,75%) i 35,7 pg eq-h/g (ekstrapolacija 4,94%) za serum, celokupni krvotok i crvena krvna zrnca, respektivno. Očigledno, zapremina distribucije (Vz) bila je najveća u celokupnom krvotoku (735 ml/kg), praćena serumom (591 ml/kg) i crvenim krvnim zrncima (441 ml/kg). Klirens test subjekata procenjen je na 13,3 ml/h/kg iz seruma i 18,8 ml/h/kg za celokupan krvotok.

[0269]Prateći intratekalne i intravenozne doze (kombinovane 1,08 mg/kg) za grupu 3 životinja, srednje vrednosti AUG> na« za serum, celokupni krvotok i crvena krvna zrnca bile su 89,8 pg eq-h/g, 66,9 pg eq'h/g i 49,2 mg eq h/g, respektivno. Očigledne krajnje ti« vrednosti objavljene za radioaktivnost u serumu, celokupnom krvotoku i crvenim krvnim zrncima bile su 25,5, 20,9 i 9,61 sati, respektivno, sa k vrednostima od 0,0272 h<!>, 0,0332 h'<1>i 0,0721 h~\ Još jednom, eliminacione faze za sve tri matrice dobro su definisane, sa AUCo.„,( izračunatim kao 92,6 pg eq-h/g, 68,0 pg eq-h/g i 51,0 pg eq-h/g (ekstrapolacija od 3,06%, 1,64% i 3,69%) u serumu, celokupnom krvotoku i crvenim krvnim zrncima, respektivno. VJe veća u celokupnom krvotoku (478 ml/kg) praćena serumom (429 ml/kg) i crvenim krvnim zrncima (293 ml/kg). Vrednosti klirensa bile su 15,9 ml/h/kg za celokupni krvotok i 11,7 ml/h/kg za serum.

Tkiva

[0270]Najviša AUGxjast vrednost u tkivima pacova, praćena intratekalnim doziranjem<us>I-hGALC (grupa 1:41 pg/životinji) uočena je kod tiroidne/paratiroidne žlezde (313 pg eq h/g), praćene želucem (2,60 pg eqh/g) i bubrezima (1,84 pg eq-h/g). Za nekoliko tkiva nije moguće odrediti k ili bilo koji parametar izveden iz k (npr. twi AUcVim-) pošto je % ekstrapolacije AUC do beskonačnosti veći od 20% ili zbog nedostatka podataka u terminalnoj fazi. Za ona tkiva kod kojih može da se odredi (oči, srce, bubrezi, debelo crevo, pluća, tanko crevo i želudac), k je u opsegu od 0,01 do 0,17 h1 i ti« generalno je u opsegu od 4 do 6 h sa izuzetkom bubrega gde je 58,6 h i želuca gde je 39,1 h.

[0271]Praćeno intravenoznim doziranjem (grupa 2: 1,00 mg/kg), najviše vrednosti za AUCo-um uočene su u tiroidnoj/paratiroidnoj žlezdi (24989 pg eq'h/g), praćeno plućima (165 pg eq-h/g), jetrom (100 pg eq-h/g), slezinom (56,1 pg eq-h/g), adrenalnim žlezdama (43,1 pg eq-h/g) i bubrezima (40,7 pg eq h/g). Najniže vrednosti AUCou«t uočene su kod masnog tkiva bubrega (0,617 pg eq'h/g) i mozga (0,735 pg eq h/g). Parametri izvedeni iz k nisu objavljeni za tkiva kod kojih je eliminaciona faza slabo definisana (tiroidna/paratiroidna žlezda i CSF) ili gde je ekstrapolacija AUCo„>r bila veća od 20% (bubrezi i mozak). Samo AUCo w( vrednosti za jetru i pluća bile su veće nego one u serumu (75 mg eq-h/g). Najviše uočene AUQ>.,„r vrednosti bile su za pluća (167 pg eq-h/g; ekstrapolacija 0,832%), praćene jetrom (105 pg eq-h/g; ekstrapolacija 4,15%), slezinom (61,2 pg eq-h/g; ekstrapolacija 8,33%), adrenalnim žlezdama (46,8 pg eq-h/g; ekstrapolacija 7,89%) i bubrezima (46,7 pg eq-h/g; ekstrapolacija 12,7%).

[0272]Najniža objavljena vrednost za AUCo-mizračunata je za kičmenu moždinu (2,51 pg eq-h/g; ekstrapolacija 4,87%) praćena mišićima (2,69 pg eq-h/g; ekstrapolacija 1,93%) i očima (5,64 pg eq-h/g; ekstrapolacija 5,19%). Najduže izračunljivotl/ 2u tkivima bilo je 41,6 sat za bubrege, praćeno sa 34,6 sati adrenalnih žlezda i 31,8 sat za slezinu. Najkraće uočeno ti/ibilo je 4,18 sati za iŠijadični nerv.

[0273]Za grupu 3, nakon intratekalnog i intravenoznog doziranja (1,08 mg/kg, kombinovana doza), najviša vrednost za AUCodast uočena je kod tiroidne/paratiroidne žlezde (16776 pg eq'h/g) praćena jetrom (96,5 pg eq-h/g), želucem (72,1 pg eq-h/g), bubrezima (57,9 pg eq-h/g), slezinom (46,9 pg eq-h/g), plućima (44,1 pg eq-h/g) i adrenalnim žlezdama (43,9 pg eq h/g). Najniže vrednosti AUCotiM uočene su kod masnog tkiva bubrega (0,954 pg eq-h/g) i mozga (1,03 pg eq-h/g). Parametri izvedeni iz k nisu objavljeni za tkiva gde je ekstrapolacija AUC^ bila veća od 20% (masno tkivo bubrega i mozak) ili R<3>manje od 0,8 (CSF). Samo AUCo-mf vrednosti za tiroidnu/paratiroidnu žlezdu i jetru veće su od onih u serumu (92,6 pg eq-h/g). Najviša uočena AUCo-inr vrednost za tiroidnu/paratiroidnu žlezdu (18390 pg eq h/g; ekstrapolacija 8,78%), praćena je jetrom (102 pg eq-h/g; ekstrapolacija 5,0%), želucem (72,6 pg eq-h/g; ekstrapolacija 0,766%), bubrezima (64,4 pg eq-h/g; ekstrapolacija 10,1 %), slezinom (49,3 pg eq'h/g; ekstrapolacija 4,85%), adrenalnim žlezdama (45,8 pg eq-h/g; ekstrapolacija 4,25%) i plućima (45,4 pg eq'h/g; ekstrapolacija 2,88%). Najniža objavljena vrednost za AUCo-,nfizračunata je za kičmenu moždinu (3,77 pg eq h/g; ekstrapolacija 6,55%) praćena mišićima (4,66 pg eq-h/g; ekstrapolacija 6,25%). Najduže Un koje može da se izračuna u tkivima bilo je 36,4 sati za bubrege, praćeno 27,5 sati za pluća, 25,7 sati za jetru i 25,4 sati za tiroidnu/paratiroidnu žlezdu. Najkraće zabeleženo ti« bilo je 4,71 sati za išijadični nerv.

Diskusija

[0274]Prateći intratekalnu administraciju, najviša srednja vrednost koncentracije radioaktivnosti u serumu i celokupnom krvotoku posmatrana je 3 sata nakon doziranja što ukazuje na relativno brzu distribuciju određenog materija u sistemsku cirkulaciju. Prateći intravenoznu administraciju, najviša srednja vrednost koncentracije radioaktivnosti u serumu i celokupnom krvotoku posmatrana je u prvoj tački merenja. Koncentracije u serumu su bile uvek više od onih u celokupnom krvotoku što se ogleda u odnosima krv-serum koji su manji od 1. Ovo ukazuje da materijal koji se odnosi na dozu nije naročito povezan sa krvnim zrncima bilo koje grupe u bilo kom trenutku vremena nakon doze. Prateći TCA precipitat krvi proteina, radioaktivnost se prvenstveno regeneriše u peletima ukazujući na to da je najveći deo cirkulišuće radioaktivnosti povezano sa proteinom što pokazuje da posmatrana distribucija radioaktivnosti u maloj meri održava dispoziciju slobodnogI25I.

[0275]Kada se porede grupa 2 (intravenozna doza od 1,00 mg/kg) i grupa 3 (intratekalna i intravenozna kombinovana doza od 1,08 mg/kg), čini se da su koncentracije seruma i celokupnog krvotoka grupe 3 generalno slične onima grupe 2. Uklanjanje radioaktivnosti u obe matrice za obe grupe, takođe je bio veoma sličan i procenjen je odnosima krv-serum. Poredeći AUCo^sti AUCo.inrza grupe 2 i 3 seruma i krvi, što ukazuje na to da je izlaganje materijalu vezanog za dozu malo veće za grupu 3 životinja.

[0276]U grupi 1, nivoi radioaktivnosti u CSF-u bili su veoma niski, otkriće koje se ne javlja u skladu sa administracijom direktno u intratekalni prostor subjekta iako su veoma niski nivoi uočeni u mozgu. Međutim, radioaktivnost posmatrana u sistemskoj cirkulaciji i sistemskim tkivima, kratko prateći doziranje, ukazuje na to da su materijali doze sasvim brzo distribuirani iz intratekalnog prostora prateći administraciju. Viši nivoi u želucu i intestinalnom sadržaju ukazuju na to da je materijal doze izlučen preko fecesa iako direktna merenja izlučenja nisu vršena u studiji. Dodatno, visoki nivoi u sadržaju mokraćne bešike takođe ukazuju na izlučivanje putem urina. Osim visokih nivoa u tiroidnoj/paratiroidnoj žlezdi, koji se ogledaju u gubitku obeleženog joda i održavanja obeležavanja u ovom tkivu pre nego distribucija/održavanje samog test subjekta, visoki nivoi radioaktivnosti posmatrani su u jetri, plućima, adrenalnim žlezdama, slezini i bubrezima; tkiva koja će gotovo sigurno da budu uključena u metabolizam i/ili ekskreciju test subjekta.

[0277]Distribucija radioaktivnosti generalno je rasprostranjena prvi put nakon doze u grupama 2 i 3. Najviše koncentracije generalno su povezane sa jetrom, plućima, bubrezima, slezinom, adrenalnim žlezdama i naročito sa tiroidnom/paratiroidnom žlezdom. Stoga, šablon distribucije radioaktivnosti u tkivima sve tri grupe je veoma sličan. Još jednom, visoki nivoi radioaktivnosti posmatrani u tiroidnoj/paratiroidnoj žlezdi svih životinja, naročito uzimajući u obzir porast obeležene koncentracije sa povećanjem vremena nakon doze, verovatno ukazuje na gubitak obeleženog joda i održavanje obeležavanja u ovom tkivu pre nego distribucija/održavanje samog test subjekta. CSF nivoi bili su viši u ovim grupama u poređenju sa grupom 1, u ranim vremenskim trenucima nakon doze ukazujući na to je radioobeleženo jedinjenje bilo u stanju da prođe krvno-moždanu barijeru. Malo viši nivoi posmatrani u matriksu grupe 3, u poređenju sa grupom 2, opet u ranim trenucima nakon doze, ukazuje na to da je ova koncentracija činila materijal vezan za test subjekat distribuirajući ga iz intravenozne doze i direktno injektirajući materijal u intratekalni prostor. Vrednosti ispod LOQ posmatrane za grupu 1 mogu, stoga, da budu posledica veoma niske koncentracije u veoma malom uzorku zapremine i mogu da budu ispod moguće kvantifikacije ovim analitičkim metodom.

[0278]Odnosi tkivo-serum generalno su bili manji od 1 u većini tkiva svih grupa do % sati nakon doze, ukazujući na to da je materijal doze distribuiran u tkiva i da je generalno brži klirens kod tkiva nego iz seruma. Za sve grupe, izlaganje većine tkiva materijalu doze (kao što je procenjeno sa AUCo-u**) manje je nego izlaganje seruma.

Zaključak

[0279]Prateći administraciju pojedinačne intatekalne (nominalne 60 ug/životinji) i/ili intravenozne bolusne doze<125>IhGALC kod mužjaka pacova (nominalna koncentracija od 1 mg/kg) određene su koncentracije radioaktivnosti u krvi, serumu, crvenim krvnim zrncima, CSF-u i tkivima.

[0280]Najviša uočena koncentracija radioaktivnosti i u serumu i celokupnom krvotoku javila se 3 sata nakon intratekalne doze, pokazujući relativno brzu distribuciju u sistemsku cirkulaciju ili u prvoj vremenskoj tački nakon intravenozne doze (10 minuta). Koncentracije u serumu bile su više nego u krvi što ukazuje da materijal doze test subjekta nije naročito povezan sa krvnim zrncima. Distribucija radioaktivnosti u tkiva generalno je rasprostranjena u početnim vremenskim tačkama nakon doze i, uopšte, šablon distribucije tkivima bio je sličan za sve tri grupe. Za sve grupe, izlaganje najvećeg broja tkiva materijalu doze (Što je ocenjeno pomoću AUCo-mm) bilo je manje od onog u serumu. Smatrano je da visoke koncentracije u tiroidnoj/paratiroidnoj žlezdi za sve tri grupe ukazuju na gubitak obeleženog joda pre nego na distribuciju i održavanje materijala doze u ovom tkivu. 96 sati nakon intravenoznog doziranja, radioaktivnost je još uvek detektovana u nekoliko ispitivanih tkiva.

PRIMER 3: PREDKLINIČKA STUDIJA ICV I ICV/IP RMGALC INJEKTIRANJA I PRODUŽENO PREŽIVLJAVANJE MIŠEVA SA GRČEVITIM TRZAJIMA

[0281]Ovaj primer pokazuje jedan oblik predkliničke studije koji ilustruje produženo preživljavanje kod miševa sa trzajima kojima je obezbeđeno nedeljno IP injektiranje rmGALC. U ovom obliku, posmatrana je poboljšana mijelinacija u išijadičnom nervu, zajedno sa redukovanim nivoima psihozina i poboljšanjem loših motornih funkcija (npr. hod). U nekim oblicima, miševi sa trzajima tretirani sa pojedinačnim ICV ili ICV/IP rmGALC injektiranjem pokazali su povećano preživljavanje i do 63% redukcije nivoa psihozina u mozgu. Pozitivni rezultati na važnim krajnjim tačkama (npr. preživljavanje, nivoi psihozina u mozgu) praćeni sa pojedinačnom ICV administracijom nnGALC zajedno sa veoma malim naretkom u ovim krajnjim tačkama praćeno adicijom sistemske administracije (ICV/IP) ukazuju da je za CNS jedini režim održiva klinička opcija za lečenje GLD-a.

Uvod

[0282]Globoidna ćelijska leukodistrofija (GLD) je autozomni recesivni poremećaj lizozomskog nakupljanja koji se javlja otprilike na 1:100 000 rođenih (1,9:100 000 u skandinavskim zemljama). Progresivni poremećaj perifernog (PNS) i centralnog (CNS) nervnog sistema, GLD je rezultat genetske mutacije koju izaziva manjak enzimske aktivnosti enzima galaktocerebrozidaze (GALC) za degradiranje supstratnih lipida (npr. galaktozilceramida do galaktoze i keramida; galaktozilsfingozina (psihozin) do galaktoze i sfingozina). Ovaj poremećaj okarakterisan je kompletnim gubitkom oligodendrocita i mijelina kao i prisustvom makrofaga ispunjenih galaktozilkeramidom ("globoidne" ćelije).

[0283]Kliničke odlike ove bolesti prisutne su u dva oblika: infantilnom i kasnom početku. Infantilni oblik GLD-a (takođe poznat i kao Krabbeova bolest) javlja se u 90% slučajeva kod svih pacijenata sa dijagnostikovanom GALC deficijencijom i simptomi se obično uočavaju 3-6 meseci nakon rođenja; postoje izveštaji o simptomima koji su se rano manifestovali na 2-3 nedeije starosti (VVenger, D.A. et al., 2001, Galactosvlceramide Lipidosis: Globoid Cell Leukodvstrophv (Krabbe Disease), in The Metabolic and Molecular Bases of Inherited Disease, C.R. Scriver, Beaudet, A. L., Siv, W.S., and Valle, D, Editor. 2001, McGraw-Hill. p. 3669-3687). Varijanta kasnog početka ove bolesti obično se javlja klinički do desete godine života, međutim, bilo je i pacijenata kojima je bolest dijagnostikovana u 40oj godini života (VVenger, D.A. et al., 2001, Galactosvlceramide Lipidosis: Globoid Ćeli Leukodvstrophv (Krabbe Disease), in The Metabolic and Molecular Bases of Inherited Disease, C.R. Scriver, Beaudet, A. L, Siv, W.S., and Valle, D, Editor. 2001, McGraw-Hill. p. 3669-3687). Opadanje funkcije kod pacijenata sa kasnim početkom bolesti nastavlja se postepeno u vremenskom periodu od nekoliko godina.

[0284]Sistemska terapija izmene enzima (ERT) obezbedila je korist za pacijente koji pate od poremećaja lizozomskih nakupljanja (LSD) kao što su Gaucherova bolest, Fabrvijeva bolest i Hunterov sindrom (VVenger, D.A. et al., 2001, Galactosvlceramide Lipidosis: Globoid Cell Leukodvstrophv (Krabbe Disease), in The Metabolic and Molecular Bases of Inherited Disease, C.R. Scriver, Beaudet, A. L., Sly, W.S., and Valle, D, Editor. 2001, McGraw-Hill. p. 3669-3687; Neufeld, E.F., 2004, Enzyme Replacement therapv. Lvsosomal disorders of the Brain, ed. F.M.a.VV. Platt, S.V. 2004: Oxford University Press. 327-338; Desnick, RJ., 2004. J. Inherit. Metab. Dis., 27(3): p. 385-410). ERT za GLD ne prate neprijatna stanja, verovatno zato što bolest utiče i na PNS i na CNS. Aktuelni tretmani za pacijente sa GLD-om uključuju hematopoetsku transplantaciju ćelija (HCT), međutim ova procedura ima svoja ograničenja zbog značajnih neželjenih efekata (npr. 30% tretmana vezano je za smrtnost, imunosupresivna terapija tokom celog života) i efikasna je samo kod pacijenata pre javljanja simptoma.

[0285]Miševi sa trzajima su najčešći eksperimentalni modeli životinja korišćeni za studije GLD-a i predstavljaju obiman eksperimentalni rad na ovoj bolesti (VVenger, D.A., 2000, Mol. Med. Todav, 6(11): p. 449-451), ali postoje i drugi životinjski modeli GLD-a koji se javljaju u prirodi sa različitim stepenima karakterizacije. Spontane mutacije postoje kod zapadnoškotskih belih i kerni terijera (Kobavashi T, et al., 1980, Brain Res., 202:479-83), dorset ovaca (Pritchard D., et al., 1980, Vet. Pathol.., 17:399-405), domaćih mačaka (Johnson «., 1970, J. Am. Vet. Med. Assoc., 157:2057-64) i nehumanih primata Rhesus macaque (Baskin G., et al., 1998, Lab Anim. Sci., 48:476-82).

[0286]Inicijalne studije nervnog alografta pokazale su da je sposobnost za poboljšanje funkcije perifernog nerva Schvvannovih ćelija miševa sa trzajem posredovano enzimskom izmenom u alograft trzajućih ćelija in situ i da je dugoročni oporavak povređenih trzajućih perifernih mijelizovanih ćelija moguć. Ova tehnologija, međutim, ne može da bude generalizovana kao terapija za sve miševe sa trzajima (Baskin G., et al., 1998, Lab Anim. Sci., 48:476-82). U zahvaćenim miševima, HCT pokazao je značajni napredak u životnom veku i dobijanju na težini zahvaćenih životinja, međutim, promenljiva efikasnost posmatrana je sa kvalitetom života dokumentovanim između 44 i više od 100 dana (kod miševa sa mijeloreduktivnim kondicioniranjem (Lin, D., et al., 2007, Mol. Ther., 15(1): p. 44-52; Hoogerbrugge, P.M., et al., 1998, J. Clin. Invest, 81(6): p. 1790-4). Tipični životni vek netretiranih miševa u ovim istraživanjima bio je oko 40 dana.

[0287]U ovim i drugim studijama, ni brzina remijelinacije ni postojeća patologija mozga nije napredovala u lečenju miševa nasuprot netretiranim (Yeager A., et al., 1984, Science, 225:1052-4; Tovoshima, E., et al., 1986, J. Neurol. Sci., 74(2-3), p. 307-18). Inhibicija supstrata koja obeležava sintezu sfingozina koristeći L-cikloserin, ili sama ili u kombinaciji sa HCT-om, povećava životni vek miševa sa trzajima (LeVine S., et al., 2000, J. Neurosci. Res., 60:231-6; Bisvvas S., et al., 2003, Neurosci. Lett, p347:33-6). L-cikloserin je previše toksičan za ljudsku upotrebu, za razliku od njegovog enantiomera D-ciklosporina koji ukazuje na lečenje anksioznosti. Eksperimenti genske terapije pokazali su sposobnost za generisanje enzima u transfekovanim ćelijama i za povećanje životnog veka kod miševa sa trzajima, ili monoterapijom ili u kombinaciji sa HCT-om (Lin, D., et al., 2007,Mol. Ther., 15(1): p. 44-52). Redukcija supstrata, HCT i genska terapija, omogućavaju najznačajniju efikasnost kada se koriste kod životinja pre javljanja simptoma. Kod životinja sa simptomima nemaju ili imaju ograničeni uticaj na bolest. Stoga, ERT može da obezbedi održivu opciju u tretmanu GLD-a, posebno kada je data pacijentima pre početka simptoma.

[0289]Miševi tretirani IP sa rmGALC koriste se kod testiranja kretanja i histopatologija išijadičnog nerva je poboljšana u poređenju sa netretiranim ili životinjama tretiranim inertnim medijumom. Periferno administrirani (IP) rmGALC minimalno je dostavljen mozgu rezultujući u blagom opadanju psihozina u njemu. Međutim, nije se javila nikakva promena u histopatologiji mozga. Stoga, rezultati posmatrani kod miševa sa trzajem tretiranih repetitivno jednom nedeljno sistemskom administracijom (IP) nnGALC (5 mg/kg) pokazuju poboljšanje preživljavanja, blagi pad nivoa psihozina u mozgu i poboljšanju loših motornih funkcija.

Pojedinačna ICV i kombinovana ICV/IP rmGALC kod miševa sa trzajem

[0290]Rezultati ukazuju da je grupa tretirana visokom dozom ICV/IP preživela u prošeku 50 dana (120 pg/5 mpk), a životinje tretirane inertnim medijumom preživele su samo 36 dana (slika 32). Miševi tretirani sa ICV rmGALC pokazali su samo srednju vrednost preživljavanja od 42 dana (40 pg) i 48 dana (120 pg). Pojedinačno ICV injektiranje od 120 pg redukuje nivoe psihozina u mozgu (63%) gde pojedinačno ICV injektiranje od 40 pg nnGALC rezultuje u opadanju psihozina od 39% (slika 33). Iako ICV/IP administracija ne obezbeđuje nikakvu dodatnu korist u redukciji psihozina u poređenju samo sa ICV, posmatrana redukcija nivoa psihozina od 48% sa kombinovanim režimom bila je znatno niža od one posmatrane samo kod nedeljnih IP tretmana (15%). U dodatku, poboljšanje histologije mozga na distalnim mestima do mesta za injektiranje posmatrano je sa ICV tretmanima na nivou od 40 pg (slika 34). Ovi rezultati potvrđuju aktivnost i biodistribuciju rmGALC u mozgu praćene direktnim ICV injektiranjem. Međutim, miševi tretirani samo sa ICV nnGALC nisu uspeli da pokažu obnavljanje morfologije vlakna išijadičnog nerva ili mijelinacije i pokazali su samo blago poboljšanje loših motornih sposobnosti (npr. analiza kretanja). Značajna poboljšanja u ključnim krajnjim tačkama (npr. preživljavanje, nivoi psihozina u mozgu) praćeni pojedinačnom ICV administracijom nnGALC sugerišu na nedostatak potrebne koncentracije enzima u sistemskoj cirkulaciji.

Klinički parametri doziranja: brzina reakumulacije psihozina kod miševa sa trzajima

[0291]Sledeće studije su vršene kod modela miševa sa trzajima pomoću kojih se trudi da se definiše odgovarajući opseg kliničke doze:

- Brzina reakumulacije psihozina u mozgu kod miševa sa trzajima praćena je pojedinačnim ICV injektiranjem na PND19

- Studije za nalaženje odgovarajuće doze koriste nnGALC intraperitonealno (IP) + intracerebroventnkutarno (ICV) injektiranje kod miševa sa trzajima.

[0292]U cilju procenjivanja brzine reakumulacije psihozina u centralni nervni sistem, miševi sa trzajima tretirani su pojedinačnim ICV injektiranjem rmGALC od 12 pg ili 40 pg na PND19. Grupe miševa (n = 3) žrtvovani su 24 sata nakon injektiranja (PND20) i onda zatim na tri dana. Tkiva mozga su uklonjena i podvrgnuta analizi na psihozin, histopatologiji i analizi aktivnosti enzima. Podset životinja posmatran je na preživljavanje (n = 8) i motorne funkcije (analize kretanja) su analizirane na PND 40.

[0293]Nivoi psihozina u homogenatu mozga koje prati ICV injektiranje analizirani su masenom spektrometrijom (LCMS Ltd., North Carolina) i sugerišu na brzo opadanje psihozina u roku od 24 sata pri nnGALC administraciji (slika 35). Trend redukcije psihozina održan je u vremenskom periodu od 24 dana nakon administracije enzima. Dodatno, opadanje koncentracije psihozina javlja se u zavisnosti doze od ovog vremenskog perioda u poređenju sa životinjama tretiranim inertnim medijumom: tretirane inertnim medijumom (u prošeku: 4,5 ng/ml psihozina) nasuprot 12 pg nnGALC (u prošeku: 2,5 mg/ml psihozina) nasuprot 40 pg/ml nnGALC (u prošeku: 1,6 ng/ml psihozina). Povišeni nivoi psihozina od interesa posmatrani u obe dozirane grupe na kraju studija (dani 28-32 nakon tretmana) sugerišu da ERT možda ne bude uspeŠna ako je administirana na mesečnom nivou. Možda može da bude potreban frekventniji raspored doza. Zbog malog broja životinja pri uzorkovanju u svakoj vremenskoj tački, evidentna je različitost rezultata. Međutim, bazirano na rezultatima, evidentno je da se reakumulacija psihozina javlja otprilike na 4 nedeije (28 dana).

[0294]Kada je analizirano vreme preživljavanja, rezultati su pokazali da su obe grupe tretirane sa nnGALC od 12 pg i 40 pg/ml imale srednje vreme preživljavanja od 48 dana (12 pg/ml) i 50,5 dana (40 pg/ml), a životinje tretirane inertnim medijumom preživljavanje od 40 dana (slika 36). Neočekivano, miševi tretirani sa 40 pg humanog GALC (rhGALC) pokazali su poboljšanje preživljavanja na samo 42 dana u poređenju sa životinjama tretiranih inertnim medijumom koje imaju preživljavanje od 40 dana. Razlozi za redukovanje efikasnosti sa rhGALC nisu poznati, ali biće diskutovani u narednom delu. Međutim, iz rezultata ove studije, očigledno je da se čak i pri niskim dozama rmGALC pokazuje poboljšanje preživljavanja kod miševa sa trzajima.

Klinički parametri doziranja: studija opsega doza rmGALC i rhGALC kod miševa sa trzajima

[0295]Prethodni rezultati ukazivali su na to da su miševi sa trzajima tretirani sa nnGALC ICV/IP (120M9i 5 mpk) živeli 14 dana duže nego životinje tretirane inertnim medijumom. Međutim, miševi sa trzajem tretirani samo sa direktnim CNS injektiranjem pokazati su poboljšano reagovanje na dozu pri srednjem vremenu preživljavanja od 12 dana (120 pg ICV) i 6 dana (40 pg ICV). Doza od 120 pg u mozgu miševa prevodi se na dozu od 300 mg/kg kada je u pitanju mozak

pacijenta; stoga je onda važno da se istraži efikasnost nižih doza rmGALC. Dodatno, rana količina rhGALC ispitivana je na efikasnost kod miševa sa trzajima. Grupe miševa tretirane su nedeljno IP injektiranjem (5 mg/kg) nnGALC počevši sa 10 i više i sa pojedinačnim ICV injektiranjem od ili 12 pg (30 mg/kg težine mozga) ili 26 pg (60 mg/kg težine mozga) nnGALC ili rhGALC na PND19. Na PND39, podset miševa (n=3/grupi) žrtvovani su za skupljanje tkiva (moždanog, išijadičnog

nerva, jetre, seruma). Moždano tkivo podvrgnuto je analizi na psihozin, histopatologiji i kvantifikaciji aktivnosti enzima. Preostale preživele životinje (n=8) posmatrane su na vreme preživljavanja i analizu kretanja.

Diskusija

[0296]Rezultati doze ove studije pokazuju korist u preživljavanju za nnGALC administraciju sa trendom zavisnosti doze (slika 37). Kombinacija doza nnGALC od 12 pg/5 mpk i 26 pg/5 mpk produžila je srednji životni vek miševa sa trzajima na 44,5 i 45,5 dana, respektivno u poređenju sa 40,5 dana za životinje tretirane inertnim medijumom. Nije bilo koristi preživljavanja za doze rhGALC od 12 pg/5 mpk (38 dana) i 26 pg/5 mpk (39,5 dana). rhGALC doza od 26 pg/5 mpk produžila je životni vek zahvaćenih miševa sa trzajima za 1,5 dan, međutim nijedna doza rhGALC nije dostigla broj dana preživljavanja životinja tretiranih inertnim medijumom (slika 37). Kao što je prethodno posmatrano kod životinja sistematski tretiranih (IP) sa nnGALC, poboljšanje u analizi kretanja posmatrano je za sve životinje koje su dobijale rmGALC kombinovanom administracijom ICV/IP, dok su životinje tretirane pojedinačnim ICV injektiranjem pokazale manje koristi u motornim funkcijama (slika 38). Kao što je posmatrano za korist životnog veka, nikakva korist nije uočena u analizama kretanja miševa tretiranih sa rhGALC. Međutim, nađeno je da je specifična aktivnost rhGALC oko 33% od nnGALC in vitro aktivnosti (tabela 19). Stoga, ovi trenutni rezultatu sugerišu na to da i pri niskim dozama rmGALC, postoji korist i kod preživljavanja i kod motornih funkcija koja pojačava mogućnost za ERT za lečenje GLD-a. Evidentno je da se reakumulacija psihozina javlja otprilike na 4 nedeije (28 dana).

Antigenost nnGALC i rhGALC očekuje se kod miševa sa trzajima u nultom modu (npr. oni su u cross reagovanju sa imunološkim materijalom (CRIM)-negativ). Ukupno, maksimalni titar serumskih antitela u rhGALC tretiranim miševima (ICV/IP režim) znatno je viši nego kod miševa tretiranih sa komparativnim ICV/IP rmGALC režimom (slika 39). Iako su atitela takođe prisutna kod miševa tretiranih sa direktnim CNS injektiranjem, maksimalni titar je nekoliko puta niži nego kod životinja koje su primale ICV/IP tretman. Postoji mogućnost da se neutralisana antitela mogu generisati.

[0297]Studija sa GALC-deficitarnim očnjacima inicirana je za karakterizaciju antigenosti rhGALC. U ovoj studiji, zahvaćene životinje (6 nedelja nakon rođenja) tretirane su nedeljno sa 2 mg/kg IV i/ili 2,25 mg (30 mg/kg težine mozga) IT administracijom humanog GALC ili samo inertnog medijuma. Dodatni tretmani administrirani su na 8 nedelja i jednom mesečno kao podsetnik studije (do - 16 nedelja nakon rođenja). CSF je uklonjena pre eutanazije i analizirana je na formiranje antitela i na nivoe psihozina (slika 40).

[0298]Prethodne studije sa rekombinantnom humanom heparin N-sulfatazom u modelu MPSIIIA novozelandskog ovčara pokazanog markiranog odgovora antitela na egzogene enzime rezultuju u potrebi tolerizacije životinja u studiji. Međutim, preliminarni rezultati pregledajući CSF iz netretiranih i rhGALC tretiranih pasa pokazali su vidnu redukciju nivoa psihozina u poređenju sa netretiranim životinjama (slika 40).

PRIMER 4: HISTOLOGIJA MOZGA I JETRE/OBELEŽAVANJE IT-INJEKTIRANOG GALC KOD MIŠEVA

[0299]Ovaj primer opisuje jedan oblik IT-injektiranog hGalC i mGalC kod miševa i odgovarajuću detekciju i lokalizaciju GalC antitela u različitim tkivima.

Plan eksperimenta

[0300]

Sakupljanje tkiva i histologija obojenja

[0301]Bile su samo tri životinje dostupne za histološku analizu iz grupa B i C, respektivno. Uzorci iz mozga i jetre fiksirani su u 10% neutralnom puferu formalina za sledeće ugrađivanje parafina. Parafinske sekcije od pet pm bile su pripremljene za imunohistohemiju (IHC) I2S za detektovanje injektiranih proteina. Tri anti-GalC antitela korišćena su za IHC obojenje GalCA.

1. Monoklonska antitela miševa (dobijena u laboratoriji dr Ekmana)

2. Poliklonska antitela zečeva (dobijena iz grupe 1)

3. Poliklonska antitela zečeva (dobijena iz grupe 2)

[0302]Visoko senzitivni metod ABC + tiramid fluorescentne amplifikacije korišćen je u obeležavanju ciljanog proteina. Rezultati obojenja pokazali su GalC pozitivne ćelije kao zelene, sa nukleusom kao DAPI plavim kontrastnim obojenjem, a površinu pozadine kao crnu.

R ezultati

[0303]Grupa 1 poliklonskih antitela imala je jaku kros reakciju sa endogenim proteinima u mozgu miševa. Čak i u mozgovima kontrolisanim inertnim medijumom, sve CNS ćelije imale su jako pozitivno obojenje. Injektirani proteini nisu bili identifikovani sa ovako jakom pozadinom (slika 41). Grupa 2 poliklonskih antitela imala je slabiju kros reaciju sa endogenim proteinima u mozgovima miševa, ali CNS ćelije u mozgovima kontrolisanim sa inertnim medijumom i dalje su bile pozitivne. Injektirani proteini nisu bili detektovani iznad pozadine (slika 42). Monoklonsko antitelo miša imalo je prihvatljivu specifičnost, sa mnogo nižim signalima u mozgovima kontrolisanim inertnim medijumom (podaci nisu prikazani). Nakon U injektiranja, svi proteini bili su detektovani u moždanim opnama na površini mozga. Oba, hGalC, grupe 1 i grupe 2 detektovana su u CNS ćelijama (neuronima i glijalnim ćelijama) u regionima ispod moždanih opni, sa relativno jačim signalima hGalC grupe 1 tretiranih životinja. Nisu detektovani pozitivni neuroni i glijalne ćelije u mGalC tretiranim mozgovima (slika 43). U cerebelumu, hGalC proizvela je obojenje moždanih opni i na površini granularne zone gde mGalC nije (slika 44). Monoklonska antitela miša delovala su u njegovom mozgu, ali su pokazala jaku kros reaktivnost sa sinusoidalnim ćelijama u jetri i nisu mogla da budu korišćena za procenu unosa u ćelije IT injektiranog proteina u jetru (slika 45). Grupa 2 poliklonskih antitela pokazala je specifičnost u tkivima jetre sa mnogo nižim signalima u mozgovima kontrolisanim inertnim medijumom. Svi IT injektirani proteini detektovani su i u sinusoidalnim ćelijama i hepatocitima u jetri nakon tretmana, sa manje pozitivnim ćelijama i slabijim signalima hGalC grupe 1 tretiranih životinja (slika 46). Iako nije pronađena veća GalC aktivnost u bilo kojoj tretiranoj grupi, pozitivno obojenje nađeno je u moždanim opnama i u regionima koji okružuju CNS ćelije, ukazujući na to da je IHC osetljiv u detektovanju injektiranih proteina koji su uzeti na ćelijskom nivou (slika 47). U jetri, mGalC pokazalo je višu aktivnost, međutim, IHC preko grupe 2 Ab detektovana je veoma mala razlika između mGalC i hGalC (slika 48). Slabo detektibilna aktivnost sa grupoml Ab u hGalC bila je konzistentna sa posmatranim niskim nivoima IHC.

Rezime

[0304]Nakon IT injektiranja, svi injektirani proteini detektovani su u moždanim opnama cerebruma preko IHC. Ćelijsko poboljšanje injektiranog hGalC u obe grupe, i 1 i 2, detektovano je u ćelijama CNS-a (neuronima i glijalnim ćelijama), sa relativno jačim signalima u hGalC tretiranim mozgovima iz grupe 1. Nisu detektovani pozitivni neuroni i glijalne ćelije u mozgovima tretiranim sa mGalC. U cerebelumu, u dodatku pozitivnim signalima moždanih opni, injektiran hGalC u grupe 1 i 2 pronađen je u slojevima ćelija na površini granularne zone. U jetri svih tretiranih grupa, detektovani su injektirani proteini u sinusoidalnim ćelijama i hepatocitima ukazujući na eventualni unos intratekalnog I2S u cirkulatorni sistem. mGalC i hGalC grupe 2 imale su slično jako obojenje signala u odnosu na hGalC grupe 1.

PRIMER 5: HISTOLOGDA MOZGA/OBELEŽAVANJE IT INJEKTIRANOG GALC KOD PASA

[0305]Ovaj primer opisuje jedan oblik IT injektiranog GalC kod pasa i odgovarajuću detekciju i lokalizaciju GalC antitela u mozgu. U ovom obliku, IT injektiran protein detektovan je u moždanim opnama i u regionima površine korteksa ispod moždanih opni. ICV injektiran protein pronađen je u periventrikularnim regionima (slika 49). GalC IHC pokazao je difuzioni ekstracelularni šablon obojenja u korteksu nakon U injektiranja sa negativnim signalima u neuronima (zaokruženo na slici) (slika 50). Ograničeno opadanje aktiviranih mikroglijalnih ćelija sa pozitivnim Iba obojenjem posmatrano je u ICV injektiranim periventrikularnim regionima i IT injektiranom korteksu (slika 51). Nisu pronađene morfološke promene (globoidnih ćelija) u korteksu sa LFB/PAS u grupi inertnog medijuma i nije uočena razlika između grupa. Globoidne ćelije (prikazane strelicom) označene Iba obojenjem opadale su nakon ICV tretmana u 4 ograničene površine periventrikularnih regiona (slika 52).

Primeri IT dostave I2S proteina

PRIMER 6: BIODISTRIBUCLJA IT DOSTAVLJENOG I2S

[0306]Glavni cilj ove studije bio je određivanje da li rekombinantni humani I2S može da bude dostavljen mozgu odraslih MPS II miševa intratekalnim-slabinskim načinom administracije.

MATERIJALI I METODE

Životinje:

[0307]Miševi su čuvani u grupama od po 4 miša po kavezu u sobi za kolonije pod dvanaesto časovnim ciklusom svetlo-tama. Ishrana glodara (LabDiet-5001, St Louis, MO) i voda (Lexington, MA voda iz česme prečišćena reverznom osmozom) bile su dostupne po volji tokom eksperimenta. Briga o životinjama vršena je u skladu sa uputstvima opisanim u "Guide for the Care and Use of Laboratorv Animals" (National Academv Press, VVashington D.C., 1996). Trenutna IKO kolonija koja se uzgaja dobijena je od Četiri ženki miševa nosilaca heterozigota za IKO mutaciju koje su dobijene od dr Jozefa Mencera (Universitv of North Carolina). Ženke nosioci pareni su sa mužjacima miševa sa pozadinom soja C57BL/6 (C57BL/6NTac, Taconic, Hudson, NY), proizvodea heterozigotne ženke i hemizigotne mužjake "knock out" miševa, kao i mužjake "divljeg tipa" i ženki litenata. Svi potomci su genotipovi tkiva DNK određeni pomoću PCR analize. Svi miševi korišćeni u ovom eksperimentu su mužjaci identifikovani ili kao hemizigotni IKO (70) ili miševi "divljeg tipa" (VVT) litenata između 8 i 12 nedelja starosti.

Idursulfaza:

[0308]Dvadeset dva ml I2S (rekombinantna humana idursulfaza) dijalizirana je nasuprot četiri promene 21 rastvora fosfatnog pufera (PBS), I2S je onda koncentrovan Vivaspin kolonom i resuspendovan u krajnjoj zapremini 1 ml PBS-a, praćeno sterilnom filtracijom koristeći 0,2 pm filter. Krajnja koncentracija bila je 51 mg/ml.

Intratekalno-lumbalno injektiranje:

[0309]Odrasli miševi anestezirani su koristeći 1,25% 2,2,2 tribromoetanola (Avertin) na 200-300 pl/10 grama telesne težine (250-350 mg/kg) pomoću intraperitonealnog injektiranja. Dlake sa leđa uklonjene su između baze repa i lopatica i obrijani prostor je očišćen povidonom/betadinom praćeno izopropil alkoholom. Mali rez na koži (srednja linija bilateralne simetrije, 1-2 cm) napravljen je preko lumbosakralnog dela kičme i preseka dorsalne medijalne linije i kranijalnog aspekta identifikovan je singular ileum. Mišić u iliac fossa (gluteus medius) je mišić u obliku srca i dve strane na vrhu "srca" otprilike predstavljaju lokaciju singular ileum. Igla promera 32 povezana je za stakleni HarniItonov špric ispunjen gasom sa 10-20 pl i drži se ubačena, dok se ne oseti otpor od osnovne kosti. Vrši se injektiranje od 10 pl test subjektu pri brzini od oko 2 pl/20 sekundi (10 pl/2 minuta). Rez na koži se zatvara odgovarajućim kopčama i dozvoljeno je da se životinja oporavi u komori za oporavak pre nego što se vrati u odgovarajući kavez.

Histološke procedure:

[0310]Životinje su žrtvovane sat vremena nakon poslednjeg injektiranja.

[0311]Tkiva mozga i jetre sakupljena su i fiksirana u 10% neutralnom puferu formalina, onda su obrađeni i stavljeni u parafin. Delovi od 5 pm pripremljeni su za hematoksilinsko/eozinsko (H&E) i imunohistohemijsko (IHC) obojenje.

Hematoksilinsko i eozinsko obojenje:

[0312]Delovi mozga i jetre obojeni su sa H&E. Rezultati obojenja pokazali su da je jedro obojeno u ljubičasto, a citoplazma u nijansi od roze ka crvenoj. H&E obojeni slajdovi korišćeni su za procenu histopatološke morfologije.

Imunohistohemiia

[0313]Za procenu I2S biodistribucije, deparafinišani i rehidrirani delovi mozga i jetre inkubirani su preko noći sa monoklonskim antitelom miša 2C4-2B2 (Maine Biotechnoiogv Services, Portland, ME) nasuprot rekombinantnog humanog I2S kako bi se detektovao injektirani I2S (ili irelevantni mišji IgG kao negativno kontrolisano antitelo; Vector Laboratories, Burlingame, CA). Prateći inkubaciju preko noći na 2-8°C, dodat je sekundarni kozji anti-mišji IgG konjugovan sa peroksidazom rena. Nakon dodatnih 30 minuta inkubacije na 37°C, dodat je rastvor za obeležavanje"Tyramide-Alexa Fluor 488" (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA) na još 10 minuta inkubacije. Delovi su prekriveni koristeći antifade medijum (VectaShield; Vector Laboratories) koji sadrži 1,5 pg/ml 4'-6-diamidino-2-fenilindola (DAPI) kao nuklearno kontraobojenje i posmatrano je višestrukim kanalom Nikon fluorescentnim mikroskopom. Rezultati obojenja pokazali su I2S pozitivne ćelije kao zelene, nukleusom kao plavim i površinu pozadine kao crnom.

[0314]Za efikasnu analizu, delovi mozga i jetre obojeni su pacovskim anti-LAMP-1 (Ivsosomal associated membrane protein kao lizozomski marker) IgG (Santa Cruz Biotechnoiogv, Santa Cruz, California) kao primarnim antitelom. Pacovski IgG kao irelevantno antitelo korišćeno je kao negativna kontrola. ABC metod (kitovi avidin biotin kompleksa od Vector Labs, Burlingame, California) korišćen je da pojača obeležen marker.

[0315]Ukratko, deparafinisani delovi rehidrirani su i inkubirani sa primarnim antitelom. Prateći inkubaciju preko noći na 2-8°C, dodat je sekundarni biotinilizovan zečji anti-pacovski IgG (Vector Labs, Burlingame, California) i inkubirano je još 30 minuta na 37°C, onda su uzorci isprani i tretirani kompleksom avidin-biotin-peroksidaze (Vector Laboratories) 30 minuta. Za razvoj boje, korišćen je 3,3-diaminobenzidin tetrahidrohlorid (DAB) kao hromagen. Delovi su onda kontrastno obojeni hematoksilinom i pokriveni. Rezultati obojenja pokazali su LAMP-1 pozitivne ćelije kao braon i nukleuse kao plave.

[0316]Uzete su reprezentativne slike i površina LAMP-1 pozitivnih ćelija analizirana je pomoću "Image-Pro Plus" softvera (Media Cybernetics, Inc., Bethesda, MD) i statistike se upoređuju koristeći studentov t-test.

Metode elektronskog mikroskopa:

[0317]Moždana tkiva od 3 doze I2S tretiranih životinja fiksirana su u 2,5% PFA/2,5% glutaraldehidu u 0.1 M natrijum kakodilinskom puferu pH 7,4 na 4°C preko noći. Onda su uzorci sprani u kakodilinskom puferu (0,1M, pH 7,4) i nakon toga fiksirani u osmijum tetroksidu, dehidrogenuju u alkoholima i propilen oksidu i ugrađeni u Epon smolu. Ultra tanki delovi isečeni su na lOOnm, obojeni olovo citratom i pregledani na Tecnai™ "G2 Špirit BioTVvTN" transmisionom elektronskom mikroskopu.

Rezultati

[0318]Kao što je određeno imunohistohemijski (IHC) u mozgu nije nađen I2S kod životinja kontrolisanih inertnim medijumom. Suprotno, ćelije moždanih opni, neuroni cerebruma i cerebeluma pozitivno su obojeni za I2S u I2S injektiranim životinjama. Signal obojenja jači je kod životinja kojima su administrirane 3 doze (slika 53).

[0319]U moždanom tkivu IKO miševa tretiranih inertnim medijumom pronađena je ćelijska vakuolizacija, histopatološka naznaka lizozomskih bolesti nakupljanja u mozgovima u poređenju sa životinjama "divljeg tipa". U I2S tretiranim IKO miševima postoji rasprostranjena redukcija ćelijske vakuolizacije sa površine cerebralnog korteksa, caudate nucleus, talamusa, cerebeluma do bele mase u poređenju sa netretiranim životinjama (slika 54). Abnormalno visoka aktivnost lizozoma pronađena je pomoću LAMP-1 obojenja kao indikatora lizozomske aktivnosti i stanja bolesti u mikroglijalnim, ćelijama moždane opne i perivaskularnim ćelijama IKO miševa tretiranih inertnim medijumom kada se porede sa životinjama "divljeg tipa" (slika 55). Intratekalno tretirani miševi sa I2S imaju označenu redukciju u vidu LAMP-1 imunoobojenja. Ova redukcija je okarakterisana opadanjem broja LAMP-1 pozitivnih ćelija i svetlijim obojenjem. Redukcija je pronađena od površine cerebralnog korteksa, caudate nucleus, talamusa, cerebeluma do bele mase (slika 56) i kod životinja tretiranih sa 2 i 3 doze I2S. Morfometrijska analiza LAMP-1 imunoobojenja različitih regiona mozga potvrdila je da postoji značajna redukcija LAMP-1 pozitivnog obojenja na svim površinama mozga koje su ocenjivane (slika 56).

[0320]Pregledi moždanih ćelija elektronskom mikroskopijom kod IKO miševa tretiranih inertnim medijumom otkrili su uvećane vakuole koje sadrže amorfni granularni materijal nakupljanja i uključuje lamelarne i "zebraste" strukture. Ove tipične patološke odlike lizozomskog nakupljanja na ultrastrukturnom nivou redukovane su kod miševa sa injektiranim I2S intratekalno-lumbalnom administracijom (slika 57).

[0321]U jetri, nije bilo pozitivnog obojenja I2S kod životinja tretiranih inertnim medijumom. Kod miševa sa intratekalno injektiranim I2S, velika količina injektiranog I2S lepo se vidi u sinusoidalnim ćelijama (slika 58), koja ukazuje da je injektirani I2S u intratekalni prostor cirkulisao sa CSF-om i da je onda apsorbovan kroz arahnoidnu granulaciju u cirkulatorni sistem.

[0322]U tkivu jetre IKO miševa tretiranih inertnim medijumom, prikazane su ozbiljna ćelijska vakuolizacija i abnormalno visoka aktivnost lizozoma pomoću H8tE obojenja i jako LAMP-1 imunoobojenje uočeno je u poređenju sa miševima "divljeg tipa". Obeležena redukcija ćelijske vakuolizacije i LAMP-1 imunoobojenje u jetri pronađeno je nakon intratekalnog tretmana sa I2S. H&E obojenje otkrilo je intracitoplazmatičnu vakuolizaciju koja skoro potpuno nestaje sa skoro normalnom ćelijskom strukturom jetre (slika 59).

[0323]Kod IKO miševa, rekombinantni humani I2S dostavljen je mozgu intratekalno-lumbalnim načinom administracije i injektovani I2S izaziva rasprostranjen histopatološki napredak u različitim regionima mozga.

• Injektovani I2S detektovan je u ćelijama moždane opne i u neuronima mozga.

• Ćelijska vakuolizacija redukovana je u mogu i pri svetlosnoj i elektronskoj mikroskopiji.

• Redukovani su LAMP-1 lizozomski markeri duž mozga.

• Intratekalno injektirani I2S ulazi u perifernu cirkulaciju i poboljšava morfologiju jetre i histološki marker.

PRIMER 7: TOKSIKOLOGIJA IT DOSTAVE I2S

[0324]Ovaj primer pokazuje kliničke znake povezane sa idursulfazom preko mesečne bolusne intratekalne lumbalne doze kod cinomolgus majmuna. Kako bi se ovo postiglo, 14 mužjaka cinomolgus majmuna nasumično je podeljeno u 5 grupa za lečenje kao što je prikazano u tabeli 21.

[0325]Životinjama iz svih grupa data jed doza tri puta mesečno IT administracijom na nivou kičmene moždine. Zapremina od 1 ml doze pušta se u kateterski sistem sa 0,3 ml PBS-a. Jedan do dva dana pre svakog doziranja, otprilike 2 ml CSF-a skuplja se IT lumbalnom punkcijom na nivou cisterna magna. Uzorci krvi (2 ml) takođe se uzimaju u ovom vremenskom periodu. Krv (2 ml) i CSF (0,1 ml) sakupljaju se iz grupe 5 životinja pre doze i 0,5, 1, 2, 4, 8, 24 i 48 sati nakon prve doze. Klinička slika beležena je najmanje dvaput dnevno. Autopsija je izvršena otprilike 24 sata nakon treće doze i odabrana tkiva skupljena su i sačuvana.

[0326]Prvog dana, sve tri životinje iz grupe 4 (150 mg) pokazale su minimalnu tendenciju u poslednjim četvrtinama, 3-12 minuta nakon doze, u trajanju od 5-15 minuta; ovaj pokazatelj smatra se vezanim za test subjekat. Nije bilo promena u telesnoj težini, uzimanju hrane i pregledanim neurološko/fizičkim parametrima koji se smatraju vezanim za test subjekat.

[0327]Prikazane su analize seruma i uzoraka CSF-a i analize doziranja rastvora. Posmatrana je aktivnost endogene idursulfaze u različitim tkivima cinomolgus majmuna; mozak i kičmena moždina imali su veću endogenu aktivnost nego drugi pregledani periferni organi uključujući jetru, srce i bubrege. Administracija idursulfaze povezana je sa porastima idursulfaze u zavisnosti od doze u različitim regionima mozga, kao i moždanom stablu i kičmenoj moždini. IT dostava nije rezultovala u primetnoj razlici u distribuciji između leve i desne hemisfere mozga. Postoji jasan porast aktivnosti idursulfaze koji zavisi od doze u sledećim organima: mozgu, jetri, srcu i bubrezima. Imunoobojenje idursulfaze u mozgu pokazalo je porast u vidu pojačanog intenziteta obojenja. U grupi od 3 mg, posmatrane su ćelije moždane opne i obojenje ograničenih glijalnih ćelija ispod moždane opne; obojenje neurona nije evidentno kod životinja sa tretmanom iz grupe 3 mg. Obojenje idursulfaze bilo je pozitivno i zavisno od doze u kičmenoj moždini, sa najvišim intenzitetom obojenja u slabinskom regionu gde je došlo do IT administracija idursulfaze. Intenzitet obojenja idursulfaze u jetri, bubrezima i srcu zavisi od doze i konzistentno je sa porastom aktivnosti idursulfaze u ovim organima.

[0328]U zaključku, IT administracija idursulfaze pri dozama do 150 mg dostavljene u mesečnim intervalima nemaju neželjenih efekata. Stoga, nije došlo do neželjenih efekata (NOAEL) na nivou od 150 mg, što je najviša testirana doza u studiji. Administracija idursulfaze povezane sa porastom aktivnosti sulfaze u CNS-u koja zavisi od doze rezultovala je u sistemskim nivoima u jetri, bubrezima i srcu.

[0329]Test subjektu, idursulfaza je dostavljena u vidu rastvora, 154 mM NaCI, 0,005% polisorbat 20, pH 5,3 - 6,1. Nominalne koncentracije dostavljenog rastvora bile su 0, 3, 30 ili 150 mg/ml. Test subjekat čuvan je u zamrzivaču na -82°C do -79°C. Rastvor fosfatnog pufera (PBS), pH 7,2, korišćen je kao agens za izbacivanje nakon što su doze administrirane i nakon serijskog sakupljanja CSF-a. PBS je dobijen od Gibco, Invitrogen Corporation.

Pripremanje doziranja test subjektu

[0330]Prvog dana doziranja za svaki vremenski interval, jedna bočica od svake koncentracije uklonjena je iz zamrzivača sandučara sa -80°C i dozvoljeno je da se otopi na radnoj površini do sobne temperature. Jednom kada se otopi, bočice iz grupa 1, 2 i 3 se obeležavaju, mere i 1 ml se propušta kroz filter od 0,22 pm za svaku životinju koja je u rasporedu za doziranje. Nakon što su sve doze administrirane, bočice se ponovo mere i ostavljaju u frižideru.

[0331]Sledećeg dana (dan za doziranje životinji 003, grupama 4 i 5) rastvori za doziranje grupama 1 i 4 uklanjaju se iz frižidera i postavljaju na radnu površinu kako bi dostigli sobnu temperaturu. Kada se jednom dostigne sobna temperatura, bočice za grupe 1 i 4 su izmerene i 1 ml je propušten kroz filter za svaku životinju koja je raspoređena za doziranje u grupama 1 i 4. Rastvor za doziranje grupe 5 onda je pripremljen injektiranjem odgovarajuće količine grupe 4 rastvora za doziranje i grupe 1 (inertni medijum) u sterilnu polipropilensku bočicu. Onda su zabeležene količine dodate iz grupa 1 i 4. Rastvor je mešan laganim okretanjem bočice i 2-1 ml od doze provučeno je kroz filter za životinje iz grupe. Bočice izjjrupe 1 i 4 ponovo su tzmerene nakon završetka doziranja i sve bočice (grupe 1-5) ostavljene su u zamrzivač.

[0332]Četrnaest životinja nasumično je dodeljeno grupama koje se tretiraju kao što je opisano u tabeli 21.

[0333]IT način administracije izabran je zato što je namenjen za ljudsku administraciju. Doze idursulfaze koje su izabrane za ovu studiju (3, 30, 100 i 150 mg/ml) izabrane su kako bi se ocenila biodistribucija različitih nivoa doza enzima kod centralnog nervnog sistema (CNS) nehumanih primata nakon tri uzastopna meseca bolusnog IT lumbalnog injektiranja.

Klinička posmatranja

[0334]Ukupni slučaj kliničkih znakova bio je minimalan. Nijedna od životinja iz grupe 1 (kontrolisane), grupe 2 (3 mg), grupe 3 (30 mg) ili grupe 5 (100 mg) nije davala kliničke znake koji mogu da se smatraju vezanim za test subjekat u bilo kom vremenskom periodu tokom studije.

[0335]Prvog dana, sve tri životinje iz grupe 4 (150 mg) (012-014) pokazale su minimalnu tendenciju u poslednoj četvrtini 3-12 minuta nakon doze, u trajanju od 5-15 minuta. Ovaj znak smatra se vezanim za test subjekat i nije posmatran ni u jednoj grupi sa nižom dozom. Odmah nakon prve doze nije bilo drugih kliničkih znakova ili nakon slededh dana koji prate administraciju test subjektu. Jedini drugi znak uočen je kod životinja grupe 4 bila je izolovana epizoda povraćanja za životinju 013, 35og dana.

[0336]Administracija test subjekta kao pojedinačna, mesečna intratekalna bolusna doza nije povezana ni sa jednim neželjenim pogoršanjem ili mikroskopskom pramenom kada se uzimaju u obzir nerazdvojive promene sa implantiranim uređajem za dostavu leka. Sve grupe, uključujući i kontrolisanu grupu, imale su mikroskopske promene u moždanim opnama ukazujući na inflamatorne reakcije prema sistemu za dostavu lekova. U životinjama koje su primile doze od 30 mg i više, imale su tendenciju za inflamatornu reakciju u moždanim opnama da imaju više izraženu eozinofilnu komponentu, ali ova razlika ne smatra se biološki značajnom.

[0337]Zbog toga što su razlike između kontrolisanih i tretiranih test subjekata životinja toliko neznatne, nisu uočeni neželjeni efekti (NOAEL) pri dozi od 150 mg, koja je najviša doza testirana u ovoj studiji.

[0338]Ukupna inflamatorna reakcija u moždanim opnama kod svih grupa (uključujući i kontrolisane) blago je izraženija nego što se generalno sreće kod intratekalnih studija u ovom trajanju kod majmuna. Međutim, ovo je uzeto u obzir kao mogućnost da postoji veza nekih karakteristika inertnog medijuma ili akta doziranja 24 sata pre autopsije.

[0339]Obojenje idursulfaze u mozgu bilo je pozitivno kod svih tretiranih životinja osim jedne životinje iz grupe sa 3 mg, sa najvećim intenzitetom obojenja nađenim u grupi od 150 mg (slike 60, 61, 62 i 63). U grupi od 3 mg, samo ćelije moždanih opni i nekoliko glijalnih ćelija ispod moždanih opni bile su pozitivne; injektirana idursulfaza nije detektovana u neuronima. U grupama sa višim dozama (30, 100 i 150 mg), velika populacija cerebralnih neurona bila je jako pozitivna na obojenje idursulfaze, zajedno sa ćelijama moždanih opni, glijalnim ćelijama i perivaskularnim ćelijama. Imunoobojenje idursulfaze otkrilo je široku distribuciju injektirane idurslufaze u cerebralne neurone iz neurona u sklopu sloja I na površini blizu moždanih opni, do onih dublje unutar sloja VI vezanih za belu masu (slike 64, 65 i 66). Obeležena obojenja neurona takođe su uočena za grupu doza od 150 mg (slika 67). U svim životinjama (grupe doza od 30 - 150 mg), nije izražena razlika u neuronskom obojenju idursulfaze između frontalnog, srednjeg i zadnjeg segmenta mozga.

[0340]Obojenje idursulfaze bilo je pozitivno u kičmenoj moždini svih životinja, sa najvišim intenzitetom obojenja u slabinskom regionu (slike 68 i 69). Imunoobojenje idursulfaze takođe je bilo zavisno od doze. Neuroni, ćelije moždane opne, glijalne ćelije, perivaskularne ćelije i epi/peri/endoneurijum (ćelije vezivanja) koje okružuju nervna vlakna jako su pozitivne na obojenje idursulfaze u grupi od 150 mg (slike 70 i 71).

[0341]U jetri, pozitivno obojenje idursulfaze uočeno je u sinusoidalnim ćelijama (Kupfferove ćelije i endotelne ćelije) svih životinja. Idursulfaza, međutim, nije detektovana u hepatocitima za grupu tretmana od 3 mg (slika 72), dok je pozitivno obojenje idursulfaze uočeno u hepatocitima u grupama sa višim dozama, sa najvećim intenzitetom obojenja u grupi tretmana od 150 mg (slike 73, 74 i 75).

[0342]Nije bilo pozitivnog obojenja za idursulfazu kod životinja iz grupe za tretiranje sa 3 mg (slika 76). Suprotno, intersticijalne ćelije pozitivno su obojene za idursulfatazu u grupama od 30, 100 i 150 mg sa izraženim obojenjem uočenim kod grupe od 150 mg pod uslovima pozitivnog broja ćelija i intenziteta obojenja (slike 77, 78 i 79).

Bubreg

[0343]Malo ili uopšte nije detektovana idursulfaza u životinjama iz grupe za doziranje od 3 mg (slika 80). Pozitivno obojenje idursulfaze, međutim, uočeno je u glomerularnim ćelijama i intersticijalnim ćelijama kod grupa sa 30 i 100 mg (slike 81 i 82). U grupi od 150 mg, imunoobojenje idursulfaze dodatno pokazuje obojenje idursulfaze proksimalnih tubularnih ćelija, zajedno sa izraženim obojenjem glomeluralnih i intersticijalnih ćelija (slika 83).

DISKUSIJA

[0344]Nije bilo kliničkih znakova vezanih za test subjekt ili uticaja na telesnu težinu, uzimanje hrane, nalaze fizičkih pregleda i nalaze neuroloških pregleda. Prvog dana, životinje iz grupe 4 (150 mg) pokazale su minimalnu tendenciju u poslednjoj četvrtini, 3-12 minuta nakon doziranja, u trajanju od 5 do 15 minuta; ovo je znak da je vezano sa test subjekt.

[0345]Administracija idursulfaze bila je povezana sa povećanjem aktivnosti idursulfaze koja zavisi od doze u različitim

regionima mozga kao i sa moždanim stablom i kičmenom moždinom. Najviši nivo intenziteta obojenja u kičmenoj moždini bio je u slabinskom regionu, gde se javila U administracija idursulfaze. IT administracija idursulfaze takođe je rezultovala u sistemskom izlaganju sa intenzitetom obojenja zavisnog od doze u jetri, bubrezima i srcu. Životinje koje su primile dozu test subjekta od 30 mg ili više imaju tendenciju za inflamatornu reakciju u moždanim opnama kako bi imale izraženiju

eozinofilnu komponentu.

[0346]IT administracija idursulfaze pri dozi od 150 mg dostavljena u mesečnim intervalima nije imala neželjene efekte. Stoga, nisu uočeni nivoi neželjenih efekata (NOAEL) na 150 mg, najvišoj dozi testiranoj u ovom primeru. Administracija idursulfaze povezane sa povećanjem aktivnosti idursulfaze zavisne od doze u CNS-u rezultovana je u sistemskim nivoima u jetri, bubrezima i srcu.

PRIMER S: PK (Serum I CSF) IT dostavljenog I2S

[0347]Ovaj primer obezbeđuje analize seruma i cerebrospinal ne tečnosti (CSF) povezane sa šestomesečnom studijom toksičnosti administrirane sulfataze putem mesečnog bolusnog intratekalnog lumbalnog injektiranja i nedeljnog bolusnog intravenoznog injektiranja cijanomolgus majmunima za koncentracije test subjekata (TA).

EKSPERIMENTALNI PLAN

[0348]Cilj t bio je da se proceni ponovljena doza intratekalne (IT) administracije idursulfaze (12s) sa toksikološke i bezbedonosne farmakološke perspektive u periodu od preko šest meseci. Plan studije prikazan je u tabeli 22.

Lek koji se testira

[0349]

Identifikacija: idursulfaza IV doziranje - Lot No. FDC06-001 (2,0 mglml)

U doziranje - idursulfaza (0 mg/ml)

idursulfaza (3 mg/ml)

idursulfaza (30 mg/ml)

idursulfaza (100mg/ml)

Metode testa:

[0350]Analize su izvršene koristeći ELISA test ("Enzvme Linked Immunosorbent Assav") za određivanje koncentracije idursulfaze. Granica detekcije (LOD) = 1,25 ng/ml određena je pre množenja sa faktorom razblaživanja. Uzorci su prikazani pri razblaženju od 1:50, stoga je osetljivost testa 62,5 ng/ml. Uzorci koji potpadaju ispod visokog kraja kalibracione krive dalje se razblažuju i ponovo testiraju pri odgovarajućem razblaženju koje rezultuje u vrednosti koji je u opsegu krive. Izabrani uzorci dodatno su analizirani koristeći test aktivnosti enzima. LOD za ovaj test je 0,18 mU/ml pri najmanjem razblaživanju od 1:150.

[0351]Životinje iz grupa 1 i 2 kojima je doziran fiziološki rastvor ili inertni medijum, respektivno, sve su imale serum sa nivoima idursulfaze u opsegu između 138 ng/ml i < 62,5 ng/ml (ili <t_OD) tokom perioda IV i IT doziranja. Od 200 CSF uzoraka testiranih iz grupe 1 i 2, 62 su pokazala nivoe I2S iznad LOD testa. Od ovih, 7 vrednosti su bile više (>1000 ng/ml). Još jedan sakupljen CSF uzorak pre IT doze testiran je na iznad 1000 ng/ml I2S. Uzorci su onda testirani na aktivnost idursulfaze. U svakom slučaju, rezultati aktivnosti ukazali su na prisustvo I2S i kada je približna koncentracija I2S izračunata, bazirana na nivoima aktivnosti, rezultati su bili 20% od onih dobijenih pomoću antigen ELISA testa (videti tabelu 23). Dodatni, nasumično izabrani CSF uzorci sa antigen ELISA rezultatima <LOD takođe su testirani koristeći testove enzimske aktivnosti kako bi se isključila bilo kakva nespecifična aktivnost.

[0352]U ovoj studiji, uzorci seruma i CSF-a analizirane su za koncentraciju idursulfaze. Uzorci seruma sakupljeni su prema sledećem rasporedu:

IV doze: pre doze i 2 sata nakon doza od 1 do 10, pre doze i 4 sata nakon doze od 11 do 23, i pri autopsiji.

IT Doze: pre doze i 2 sata nakon doze 1 i 2, pre doze i 4 sata nakon doze od 3 do 6 i pri autopsiji. CSF uzorci sakupljeni su prema sledećem rasporedu:

IV Doze: pre doze i 2 sata nakon doze 1 i 4 sata nakon doze od 3 do 6.

IT Doze: pre doze i 2 sata nakon doze od 1 do 2, pre doze i 4 sata nakon doze od 3 do 6 i pri autopsiji.

[0353]Generalno, čini se da idursulfaza u serumu ima bolji klirensod CSF idursulfaze. Nivoi idursulfaze u serumu u grupama 1 i 2 životinja kojima je doziran fiziološki rastvor ili inertni medijum, respektivno, bili su manji ili jednaki od 138 ng/ml u svakom vremenskom trenutku koji je testiran. Neke životinje imale su nivoe ispod granice detekcije (LOD).

[0354]Manje CSF uzoraka iz grupa 1 i 2 bilo je iznad LOD, sa 7 značajnih izuzezaka koji rezultuju u visokim (>1000 ng/ml) nivoima. Jedan CSF uzorak sakupljen iz životinje pre IT doze 3, takođe su pokazali iznad 1000 ng/ml idursulfaze.

[0355]Uzorci koji daju rezultate koji ne prate trend su ponovo testirani i potvrđeni. U dodatku, ovi uzorci su testirani na enzimsku aktivnost idursulfaze. Ovi rezultati aktivnosti takođe su potvrdili visoke nivoe idursulfaze sa 20% od onih već potvrđenih masenim testom idursulfaze (tabela 23).

[0356]Testovi specifične aktivnosti validirani su iz uzoraka ciljane grupe nasumično testirajući CSF uzorke sa jedinicama mase idursulfaze ispod LOD i potvrđujući da su nivoi idursulfaze u ovim uzorcima bili zaista LOD (podaci nisu prikazani).

PRIMER 9. BIODISTRIBUCUA IT DOSTAVLJENOG I2S

[0357]Nakon uspeŠne demonstracije da je intratekalna administracija efikasni način dostavljanja I2S tkivima CNS-a, dodatne studije vođene su kako bi se utvrdilo da li je IT administriran I2S sposoban za distribuciju u duboka tkiva mozga i da postoji ćelijska lokalizacija IT administriranog I2S. Rekombinantna formulacija humane idunorat-2-sulfataze (I2S) pripremljena je i formulisana u inertnom medijumu od 154 mM NaCI, 0,005% polisorbatu 20 na pH od 6,0.

[0358]Nehumanim primatima administrirano je 3mg, 30mg ili lOOmg I2S na mesečnom nivou putem implantiranog intratekalnog porta šest meseci uzastopno. Plan studije sumiran je u tabeli 24 ispod.

[0359]Ponavljana mesečna administracija I2S nehumanim primatima u periodu od šest meseci dobro je tolerisana na najvišoj testiranoj dozi i nije povezana sa nekim značajnim neželjenim toksikološkim efektima. Dvadeset četiri sata nakon administriranja šeste i poslednje doze I2S, subjekat nehumanih primata žrtvovan je i CNS tkiva ovih primata su pregledana.

[0360]Kao što je određeno imunohistohemijski (IHC), postoji rasprostranjeno taloženje I2S kroz ćelije i tkiva CNS-a. I2S protein detektovan je u svim tkivima mozga IHC-om, sa gradijentom taloženja od cerebralnog korteksa do ventrikularne bele mase. U sivoj masi detektovan je I2S u neuronima cerebruma, cerebeluma, moždanom stablu i kičmenoj moždini svih grupa koje su zavisne od doze. Na površini sive mase grupa sa višom dozom, veliki broj cerebralnih neurona pozitivan je na I2S obojenje na površini korteksa (slika 84A). I2S takođe je detektovan u neuronima u talamusu (slika 84B), hipokampusu (slika 84C), caudate nucleus (slika 84D) i kičmenoj moždini (slika 84E). Ćelije moždanih opni i perivaskularne ćelije bile su takođe pozitivne na I2S obojenje (slika 84F).

[0361]Kao što je prikazano na slikama 85 i 86, distribucija IT administriranog I2S u tkiva CNS-a i parcijalno taloženje u sivoj masi, talamusu i cerebralnom korteksu subjekata nehumanih primata su evidentni. Dalje, slike 86 i 87 pokazuju da se IT administriran I2S akumulira u prikazanim CNS tkivima subjekta nehumanih primata u zavisnosti od doze. Kolokalizovanim obojenjem takođe je otkriveno da je IT administracija I2S povezana i sa neuronima i sa oligodendrocitima. IT administrirani I2S takođe se distribuira i lokalizuje kroz cerebrum subjekta nehumanih primata kao što je evidentirano slikom 88. Naročito, slike 89A-D ilustruju neuronski unos i vezu aksona sa I2S praćeno IT administracijom nehumanim primatima, kao stoje demonstrirano obojenjem filamenata. Takođe od naročitog značaja, ove studije ilustruju to da je I2S selektivan za neuronske ćelije i ovakve neuronske ćelije olakšavaju distribuciju intratekalno administriranog I2S u duboka tkiva mozga i izgleda da je povezan sa strukturama aksona, što ukazuje na normalni aksonski transport I2S.

[0362]Tabela 25 ispod predstavlja farmakokinetičke podatke različitih načina administracije i doze za odvojene studije životinja.

[0363]<124>l-obeleženi I2S administriran je test životinjama kao što je prikazano ispod u tabeli 26, a PET rezultati skeniranja prikazani su na slici 106.

[0364]Ove studije takođe pokazuju ćelijsku identifikaciju IT administriranog I2S u tkivu bele mase blizu ventrikula subjekata nehumanih primata praćenu IT administracijom. Dok je gustina obojenja I2S u beloj masi generalno niža nego u sivoj masi, I2S detektovan je u oligodendrocitima (slika 9). Posebno, slika 90 prikazuje ćelijsku identifikaciju I2S u beloj masi moždanog tkiva i dalje prikazuje da se I2S ne dovodi u vezu sa mijelinom.

[0365]U dodatku demonstriranja distribucije IT admnistriranog I2S duboko u tkivu mozga, ove studije takođe su potvrdile lokalizaciju I2S u ciljanim organelama i još važnije, lokalizaciju I2S u lizozome koji utiču na organele u lizozomskim bolestima nakupljanja kao što je Hunterov sindrom. Posebno, I2S je lokalizovan sa lizozomima, a takođe i detektovan u aksonima. Slika 90 prikazuje lokalizaciju TT administriranog I2S u lizozome oligodendrocita subjekata nehumanih primata, stoga potvrđujući da je IT administrirani I2S sposoban za distribuiranje u duboka tkiva mozga i za ćelijsku lokalizaciju.

[0366]Da bi se razlikovalno da li dostavljeni I2S ostaje biološki aktivan, nivoi I2S u mozgu mereni su koristeći test specifične aktivnosti. Aktivnost u mozgu 3 mg IT grupe, 24 sata nakon poslednje doze očigledno nije drugačiji od početnih nivoa kontrolisanih uređajem i životinja kontrolisanih inertnim medijumom. Aktivnost enzima u mozgu od 30 mg i 100 mg ITdoziranih životinja bio je iznad osnovne linije pri autopsiji (24 sata nakon doze).

[0367]Dalji testovi na životinjama da bi razlikovali lokaciju I2S dostave u mozgu prikazane su na slici 104 i u tabeli 27 ispod.

PRIMER 10. BIODISTRIBUCLJA IT DOSTAVE KOD PASA RASE BIGL

[0368]Šabloni 125 distribucije posmatrani u gorepomenutim primerima takođe su ponovljeni kod zdravih Bigl pasa kojima je data pojedinačna IT ili ICV doza. Mužjaci Bigla nasumično su podeljeni u dve grupe koristeći kompjuterski generisane brojeve (grupa 1 (ICV), N=3; grupa 2 (IT); N=4). Svi oni su imali katetere implantirane u subarahnoidni prostor na lumbalnom delu kičme ili u levu lateralnu cerebralnu komoru (za doziranje) i u cisterna magna (za uzorkovanje). Svi kateteri na kraju su imali subkutaneo titanijumski ulazni port. Dodatni, netretirani pas korišćen je kao hirurška kontrola.

[0369]Pojedinačno bolusno injektiranje od 1 ml I2S (30 mg/ml u 20 mM natrijum fosfata, pH 6,0; 137 mM natrijum hlorida; 0,02% polisorbata-20) administirano je IT ili ICV putem, praćeno 0,3 ml spiranjem rastvorom fosfatnog pufera (PBS; pH 7,2). Klinički znaci su praćeni i žrtvovanje je nastupilo 24 sata nakon doze. Tkiva mozga i kičmene moždine su sakupljena za kvantitativne I2S analize koje su određene pomoću ELISA, I2S enzimske aktivnosti i IHC i rezultati su poređeni između grupa studija.

[0370]I2S je široko distribuiran kroz sivu masu i IT i ICV grupe kao što je određeno IHC-om. U cerebralnom korteksu, neuroni su bili pozitivni na I2S i svih šest neuronskih slojeva, od površine molekulskog sloja do dubokog unutrašnjeg sloja kod obe, IT i ICV grupe, kao što je prikazano na slici 91 (slike a i c). U cerebralnom korteksu IT i ICV grupa, 12S detektovan je i neuronima, uključujući Purkinjeove ćelije, kao što je prikazano na slici 91 (slike c i d). I kod IT i ICV grupa velika populacija neurona u hipokampusu bila je pozitivna na I2S kao što je prikazano na slici 91 (slike e i f). I2S pozitivni neuroni takođe su nađeni u talamusu i caudate nucleus kod obe grupe, kao što je prikazano na slici 91 (slike g i h).

[0371]Trenutne studije stoga potvrđuju sposobnost IT administriranih enzima da za distribuciju u duboke ćelije i tkiva mozga i podržavaju korisnost IT administriranih enzima kao što je I2S za tretman CNS manifestacija koje su povezane sa lizozomskim bolestima nakupljanja kao što je Hunterov sindrom.

PRIMER 11. IN VIVO EFIKASNOST U DOSTAVI I2S

Modeli miševa sa manjkom iduronat-2-sulfataze

[0372]Pošto je pokazano da je IT administracija I2S sposobna za distribuciju u duboka tkiva mozga i ćelijsku lokalizaciju I2S, dalje studije su sprovedene kako bi se odredila terapeutska efikasnost IT administriranog I2S. Genetski inženjerizovana idunorat-2-sulfataza kod Hunterovog sindroma "knock out" modela miševa (IKO) razvijena je kako bi se proučavala sposobnost IT administriranog I2S kako bi se izmenila progresija bolesti. I2S "knock-out" mišji model razvijen je koristeći ciljani prekid I2S lokusa koji rezultuje u akumulaciji glikozaminoglikana (GAG) u tkivima i organima. IKO model miševa pokazuje mnoge fizičke karakteristike Hunterovog sindroma koje su viđene kod ljudi, uključujući grube karakteristike i skeletne defekte. Dodatno, IKO model miševa pokazuje povišene nivoe glikozaminoglikana (GAG) u urinu i tkivima kroz telo, kao i rasprostarnjenost ćelijske vakuolozacije koja je posmatrana histopatološki.

[0373]U ovoi studiji, komercijalno dostupan I2S (Elaprase<®>) koncentrovan je i resuspendovan u rastvoru fosfatnog pufera (PBS). Sest grupa mužjaka IKO miševa, starih od 8 do 12 nedelja, tretirani su sa I2S (lOpI; 26 mg/ml). Grupama A i B (N=3) intratekalno su administrirane tri doze od 260pg (prvog, osmog i petnaestog dana) i dve doze od 260pg (prvog i osmog dana) I2S, respektivno. Grupa D takođe je tretirana sa tri intratekalno administrirane doze od 260pg prvog, osmog i petnaestog dana. Grupe C i E (N=3) su netretirane kontrolne grupe i grupa F (N=3) bila je netretirana kontrolna grupa "divljeg tipa". Kontrolnim miševima administriran je inertni medijum bez I2S. Miševi su bili žrtvovani sat vremena nakon poslednjeg injektiranja, praćeno pripremom tkiva za imunohistohemijske (IHC) i histopatološke analize.

[0374]Prateći treće injektiranje, postojala je rasprostranjena redukcija ćelijske vakuolizacije na površini cerebralnog korteksa, caudate nucleus, talamusa i cerebeluma kod miševa tretiranih sa I2S u poređenju sa miševima tretiranim inertnim medijumom. Redukcije u ćelijskoj vakuolizaciji takođe su uočene u beloj masi nakon IT tretmana. Distribucija I2S u moždano tkivo IKO miševa očigledna je prateći IT administraciju.

[0375]Tronedeljna IT administracija I2S IKO miševima takođe je pokazala ciljanu redukciju u CNS ćelijskoj vakuolizaciji i na svetlosnom i na elektronskom mikroskopu. Prateći IT administraciju I2S, redukcija ćelijske vakuolozacije evidentno se odnosi na netretirane IKO miševe, predlažući da je IT administracija I2S sposobna za izmenu progresije bolesti. Kao što je prikazano na slici 92, redukcija ćelijske vakuolizacije evidentna je u corpous callosum i forniksu IKO miševa prateći IT administraciju I2S.

[0376]Dodatno, elektronski mikroskop pokazao je redukciju u prisustvu nakupljanja u neuronima u sivoj masi i vakuolizaciju u oligodendrocitima u beloj masi. Posebno, IKO miševima kojima je IT administriran I2S takođe su pokazali redukciju u palisadnim lamelarnim telima ("zebrasto telo") što jesu karakteristike određenih lizozomskih bolesti nakupljanja. Naročito, slika 57 predstavlja sliku elektronskog mikroskopa koja pokazuje redukciju karakterističnog zebrastog tela u neuronima IKO miševa kojima je administran I2S koja se odnosi i na netretirane IKO miševe. Slično, slika 57 prikazuje sliku elektronskog mikroskopa oligodendrocita u corpus callosum.

[0377]Dodatno, IT administracija I2S IKO miševima takođe je demonstrirana ciljanom redukcijom u patološkim biomarkerima lizozomskih bolesti, imunoobojenjem LAMPI, indikatorom lizozomske aktivnosti i stanjem bolesti na površini cerebralnog korteksa, u caudate nucleus, talamusu, cerebelumu i beloj masi. Kao što je prikazano na slici 93A, ciljana redukcija u LAMPI imunoobojenju evidentna je kod tkiva površine cerebralnog korteksa tretiranih IKO miševa u odnosu na tkiva površine cerebralnog korteksa netretiranin IKO kontrolnih miševa prikazanih na slici 93B, pokazujući poboljšanje u patologiji bolesti.

[0378]Slika 56 kvantitativno ilustruje i poredi koncentracije LAMPI merene na mm<J>površinama moždanog tkiva. Morfometrijske analize LAMP-1 imunoobojenja različitih regiona mozga potvrdile su postojanje značajne redukcije LAMP-1 pozitivnog obojenja na svim površinama mozga koje se procenjuju. Kao što je prikazano na slici 56 u svakoj površini mozga koji je ocenjen (korteks, caudate nucleus i putamen (CP), talamus (TH), cerebelum (CBL) i bela masa (WM)) LAMP-pozitivna površina redukovana je u tretiranim IKO miševima u odnosu na netretirane IKO kontrolne miševe i prišlo se LAMP-pozitivnoj površini miševa "divljeg tipa". Naročito značajno je to da su LAMP-pozitivne površine u svakom delu moždanog tkiva analizirane i dalje su redukovane u nastavku trajanja lečenja.

[0379]Redukcija abnormalno visoke lizozomske aktivnosti je u korelaciji sa iznenadnim morfološkim napretkom na svim površinama mozga. Ovi rezultati potvrđuju da je TT administrirani I2S sposoban za promenu progresije lizozomskih bolesti nakupljanja kod genetički inženjerizovanih IKO modela miševa, dalje potvrđujući sposobnost IT administriranih enzima kao što je I2S za tretiranje CNS ispoljavanja povezanih sa lizozomskih bolestima nakupljanja kao što je Hunterov sindrom.

PRIMER 12 - LEČENJE PACDENATA SA HUNTEROVOM BOLEŠĆU

[0380]Direktna administracija u CNS, npr. IT dostavom može da bude korišćena za efektivno lečenje pacijenata sa Hunterovom bolešću. Ovaj primer pokazuje studiju eskalacije multicentrične doze napravljene tako da ocenjuje bezbednost davanja do 3 doze svake druge nedeije u ukupnom periodu od 40 nedelja u kome se pacijentima sa kasnom infantilnom Hunterovom bolešću administrira I2S preko uređaja za intratekalnu dostavu lekova. Primeri različitih uređaja za intratekalnu dostavu lekova pogodnih za lečenje ljudi prikazano je na slikama od 89 do 92.

[0381]Biće uključeno do 20 pacijenata:

Grupa 1: 5 pacijenata (najniža doza)

Grupa 2: 5 pacijenata (srednja doza)

Grupa 3: 5 pacijenata (najviša doza)

Pet pacijenata nasumično će biti izabrana da ne dobijaju lečenje.

[0382]Pacijenti izabrani za ovu studiju bazirani su na sledećim kriterijumima: (1) javljanje prvih simptoma pre dostizanja uzrasta od 30 meseci; (2) pokretnost za vreme skeniranja (definisano je kao sposobnost da može sam da ustane i hoda napred 10 koraka pri čemu se jedna ruka pridržava); (3) prisustvo neuroloških znakova za vreme skeniranja. Obično je istorija bolesti transplantacije hematopoetskih stem ćelija isključena.

[0383]Određena je sigurnost rasta doza administriranog I2S IT injektiranjem u periodu od 40 nedelja kod dece sa kasnom infantilnom Hunterovom bolešću. Dodatno, procenjene su klinička aktivnost I2S na loše motorne funkcije, farmakokinetika u serumu pojedinačne i ponovljene doze i koncentracija u cerebrospinalnoj tečnosti (CSF).

IT dostava rhASA proteina

PRIMER 13: TOKSIKOLOŠKA STUDIJA IT DOSTAVLJENOG REKOMBINANTNOG ASA

[0384]Kako bi se procenila sposobnost drugih intratekalno administriranih rekombinantih enzima za distribuciju u ćelije i tkiva CNS-a, GLP studija sprovedena je kako bi se procenilo ponavljanje doze intratekalno administriranom rekombinantno pripremljenom humanom arilsulfatazom A (rhASA) sa toksikološke i bezbedonosne farmakološke perspektive u vremenskom periodu od preko mesec dana kod mladih (mlađih od 12 meseci) cinomolgus majmuna. Formulacija rhASA pripremljena je i formulisana u inertnom medijumu od 154 mM NaCI, 0,005% polisorbat 20 na pH od 6,0.

[0385]Kako bi se ovo postiglo, devet mužjaka i devet ženki mladih cinomolgus majmuna nasumično su podeljeni prema telesnoj težini u jednu od tri grupe za lečenje kao Što je prikazano ispod u tabeli 28. Životinje (sa izuzetkom jednog mužjaka za prvu dozu) primile su kratkotrajnu IT infuziju od 0,6 ml sa 0, 3 ili 31 mg/ml rhASA (ukupna doza od 0, 1,8 ili 18,6 mg) svake druge nedeije, ukupno tri doze po životinji. Praćene su telesna težina, klinička posmatranja, neurološki i fizički pregledi, oftamološki pregledi i toksokinetičko uzorkovanje. Nad svim životinjama vršena je autopsija 29, 30 ili 31og dana (-24 sata nakon poslednje IT doze). Odabrana tkiva su sakupljena, sačuvana i pregledana mikroskopski.

[0386]Koncentracija rhASA detektovana u CNS tkivima cinomolgus majmuna analizirana je pomoću ELISA testa i u poređenju sa terapeutskim ciljem od 10% normalne humane rhASA koncentracije odgovara otprilike 2,5ng/mg tkiva. Uzorci tkiva ekstrahovani su iz različitih površina mozga cinomolgus majmuna i dalje su analizirani u prisustvu rhASA. Slike od 133 do 138 prikazuju tkiva sa kojih je uzorak ekstrahovan. Uzorkovano tkivo ogleda se u porastu koncentracije rhASA kao što je prikazano na slikama 139A-G sa gradijentom taloženja iz cerebralnog korteksa do duboke bele mase i duboke sive mase.

[0387]Koncentracija rhASA detektovana je koristeći iste uzorke iz IT i ICV načina administracije za šest majmuna kojima je administrirana doza rhASA od 18,6 mg kao stoje prikazano na slikama 140A-B. Koncentracije rhASA detektovane u dubokoj beloj masi (slika 140A) i u dubokoj sivoj masi (slika 140B) moždanog tkiva odraslih i mladih cinomolgus majmuna intratekalno (IT) ili intracerebroventrikularno (ICV) administrirane rhASA bile su poredive.

[0388]Uzorkovana tkiva ekstrahovana iz mozgova odraslih i mladih cinomolgus majmuna su onda analizirana kako bi se odredile koncentracije rhASA u ekstrahovanom tkivu uzorka i kako bi se poredile ove koncentracije sa ciljanim terapeutskim koncentracijama od 2,5ng rhASA po mg proteina (odgovara 10% od normalne koncentracije rhASA u zdravom subjektu). Kao što je prikazano na slici 141A, u svakom uzorkovanom tkivu analizirana je doza od 18,6mg intratekalno administriranog rhASA što je rezultovalo u rhASA koncentraciji koja je premašila ciljanu terapeutsku koncentraciju od 2,5ng/mg proteina. Slično, kada je doza od l,8mg rhASA IT administrirana mladim cinomolgus majmunima, svako uzorkovano tkivo koje je analizirano pokazalo je koncentraciju rhASA u opsegu ili premašivanjem terapeutske koncentracije od 2,5ng/mg proteina i srednja vrednost rhASA koncentracija bila je iznad terapeutski ciljane za sve uzorke tkiva koji su testirani (slika 141B).

[0389]Kako bi se odredilo da li je IT administrirana rhASA distribuirana do relevantnih ćelija, tkivo je analizirano iz duboke bele mase cinomolgus majmuna kojima je IT administrirano l,8mg rhASA, sa površina prikazanih na slici 142A. Imunoobojenjem duboke bele mase otkrivena je distribucija rhASA kod cinomolgus majmuna u ćelije oligodendrocita kao što je prikazano na slici 142B. Slično, slika 142C prikazuje da je IT administrirana rhASA pokazala kolokalizaciju u dubokim tkivima bele mase cinomolgus majmuna. Naročito, pod obojenjem kolokalizacije u ciljanim organelama, kao što su lizozomi je očigledno (slika 142C), podržavajući zaključak da je IT administrirana rhASA sposobna za distribuciju u relevantne ćelije, tkiva i organele CNS-a, uključujući lizozome oligodendrocita.

PRIMER 14. ICV NASUPROT U ADMINISTRACIJI

[0390]rhASA obeležena pozitronskim emiterom<12>,I pripremljen je i formulisan u inertnom medijumu 154 mM NaCI, 0,005% polisorbat 20 na pH od 6,0. Zapremina formulacije ekvivalentna za rhASA od 3 mg (odgovarajući do otprilike 3 do 8 mg/kg mozga) administrirana je odraslim cinomolgus majmunima intracerebroventrikularnim (ICV) i intratekalnim načinom administracije. Cinomolgus majmuni podvrgnuti su PET skeniranju visoke rezolucije (mikroPET P4) kako bi se odredila distribucija administriranog '"I-obeleženog rhASA.

[0391]PET skeniranje podataka (slika 143) prikazuje tako da je i ICV i IT administrirana<12l>I-obeležena rhASA efektivno distribuirana tkivima CNS-a i naročito je 124I-obeležena rhASA administrirana kroz IT-lumbalni kateter pri čemu se odmah i uniformno širi u cerebrospinalnoj tečnosti (CSF) duž cele kičme. Naročito, kao što je opisano na slici 143, praćeno ICV i IT administracijom, terapeutska koncentracija mI-obeležene rhASA detektovana je u tkivima CNS-a subjekta cinomolgus majmuna, uključujući mozak, kičmenu moždinu i CSF. Koncentracija rhASA detektovana u ovakvim CNS tkivima, a posebno u tkivima mozga, premašila je terapeutsku ciljanu koncentraciju od 2,5ng/mg proteina.

[0392]Dok je distribucija rhASA proteina porediva u IT i ICV načinu administracije, ICV rezultuje u značajno manjem nakupljanju u kičmeni stub što je evidentirano na slici 143.

[0393]Dvadeset četiri sata nakon administracije formulacije i u ICV i IT administriranom<U4>I-obeleženom rhASA efektivno je distribuirana u tkivo CNS-a. Naročito, 24 sata nakon IT administracije, 12,4% administrirane doze bilo je u kranijalnom regionu, u poređenju sa 16,7% ICV administrirane doze. Prema tome, koncentracije rhASA detektovane u ovim CNS tkivima, naročito u tkivu mozga, gde kada je rhASA IT administrirana približava se onim koncentracijama detektovanim nakon ICV administracije iste doze.

[0394]ICV injektirana 1MI-obeležena rhASA rezultuje u trenutnom transferu injektiranje zapremine u cisterna magnu, cisterna pontis, cisterna interpeduncularis i proksimalni deo kičme kao što je prikazano na slici 144. Takođe, kao što je prikazano na slici 144, u roku od 2-5 sati IT administracijom dostavljena je<124>I-obeležena rhASA istim inicijalnim segmentima (cisternae i proksimalni deo kičme) kao što je prikazano za ICV administraciju. Dvadeset četiri sata nakon distribucije ICV i TT administracijom 1Z4I-obeležene rhASA bilo je poredivo u cisterna i proksimalnom delu kičme kao što je prikazano na slici 145.

[0395]Ovi rezultati potvrđuju da rhASA može da bude dostavljena subjektu koristeći manje invazivni IT način administracije i stoga da dostigne terapeutske koncentracije u ciljanim ćelijama i tkivima.

[0396]Lizozomske bolesti nakupljanja predstavljaju familiju genetskih poremećaja izazvanih defektnim enzimima ili enzimima koji nedostaju što rezultuje u abnormalnoj akumulaciji supstrata. Dok periferni simptomi povezani sa nekoliko ovih bolesti mogu efektivno da budu ublaženi intravenoznom administracijom rekombinantnih enzima, nije očekivano da intravenozna administracija ovakvih rekombinantnih enzima značajno utiče na manifestovanje CNS-a povezanih sa velikim brojem lizozomskih bolesti nakupljanja. Na primer, rekombinantna humana idunorat-2-sulfataza (Idursulfaza, Elaprase<*>; Shire Human Genetic Therapies, Inc. Lexington, MA) odobrena je za lečenje somatskih simptoma Hunterovog sindroma, ali nema farmakološke terapije za lečenje neuroloških manifestacija Hunterovog sindroma što može da ima za posledicu zaostatak u razvoju i mentalno oštećenje. Ovo je delom zbog prirode I2S koji je veliki, visoko glikozilovani enzim sa molekulskom težinom od oko 76kD i koji ne prolazi kroz krvno moždanu barijeru praćeno intravenoznom administracijom.

[0397]Naučnici su, stoga, pokrenuli program za istraživanje intratekalne (IT) dostave formulacije rekombinantnih humanih enzima, kao što su, npr. idunorat-2-sulfataza (I2S), arilsulfataza A (rhASA) i alfa-N-acetilglukozaminidaza (Naglu). Rezultati ovde predstavljeni pokazuju da IT lumbalna administracija rekombinantnih lizozomskih proteina rezultuje u dostavi značajnog dela administriranog proteina mozgu, a naročito rezultuje u rasprostranjenom uklanjanju ovih proteina u neuronima mozga i kičmenoj moždini i kod cinomolgus majmuna i kod pasa. Imunohistohemijske analize CNS tkiva pokazale su da je protein ciljan za lizozom, mesto patološke akumulacije glikozaminoglikana u lizozomskim poremećajima nakupljanja. Dalje, morfološka poboljšanja prikazana su u IKO modelima miševa Hunterovog sindroma, Naglu-deficitarnim modelima miševa Sanfilippo sindroma tipa B i ASA "knockout" modelima miševa metahromatske leukodistrofije (MLD) i pojačavaju zapažanje da je IT administrirani enzim distribuiran odgovarajućem tkivu i transportovan odgovarajućim ćelijskim segmentima i organelama.

[0398]Sličnosti posmatrane u šablonu distribucije mozgu nakon IT lumbalne i ICV administracije I2S ukazuju na veliki protok i aktivno ponovno mešanje CSF-a. Stoga, u kliničkom podešavanju i IT i ICV načini administracije su potencijalno izvodljivi, međutim, posmatrano taloženje I2S u kičmenoj moždini praćeno IT administracijom obezbeđuje čistu ^prednost u sprečavanju posledica po kičmu i komponenata lizozomskih bolesti nakupljanja kao Što je Hunterov sindrom. Staviše, kičmeni injekcioni portovi su manje invazivni i očekuje se da budu pogodniji za hroničnu upotrebu posebno kod pedijatrijskih subjekata.

[0399]Dokaz iz perivaskularnog ćelijskog obojenja i posmatrane dinamike translokacije proteina gorepomenutim studijama PET slika, ukazuju da se enzimi pomeraju unutar perivaskularnog prostora, verovatno pulsirajućim konvektivnim mehanizmima. Dodatni mehanizmi transporta predloženi su posmatranjem povezanosti I2S sa neurofilamentima, koji pokazuju aktivni aksonski transport. Kasnije verovatno počinje interakcija proteina sa neuronskim receptorima manoza-6-fosfatom (M6P) koji je široko izražen u ćelijama kičmene moždine i mozga i koji tokom direktne administracije u parenhim mozga može da izazove da I2S enzim bude trenutno apsorbovan u ciljanim ćelijama (Beglev, et al., Curr Phann Des (2008) 14: 1566-1580).

[0400]Dok je aksonski transport lizozomskih enzima vršen indirektnim metodama in vivo i "imaging" in vitro, trenutne studije obezbeđuju prvi direktni dokaz aksonskog transporta nevirusog ili izraženog enzima dostave preko CSF-a. Stoga, dostava proteina iz CSF-a na površinu mozga i dublje u tkiva mozga izgleda da zavisi od procesa aktivnog transporta od kojih nijedan nije prethodno opisan ili objašnjen za dostavu proteina ili enzima ćelijama, tkivima i organelama mozga.

[0401]Suprotno od tačke gledišta koja govori da dinamika protoka intersticijuma parenhima i CSF-da može da spreči distribuciju IT-lumbalno administriranih proteina u belu masu mozga, ove studije jasno pokazuju da IT dostava lizozomskih enzima rezultuje u distribuciji proteina i akumulaciji u svim tkivima mozga i u ukljanjanju ciljanih ćelija iz lizozomskih odeljaka koje su mesto patološke akumulacije glikozaminoglikana. (Videti, npr. Fenstennacher et al., Ann N Y Acad Sci (1988) 531:29-39 and DiChiro et al., Neurologv (1976) 26:1-8.). Zajedno sa manje invazivnom prirodom IT lumbalne dostave, ovaj način administracije nudi klinički relevantne načine dostavljanja bioloških terapeutika u mozgu, posebno kod dece.

PRIMER 15: TOKSIKOLOGIJA

[0402]Ovi primeri prikazuju ponavljanje doze intratekalne (IT) administracije rhASA sa toksikološke i sigurnosne farmakološke perspektive u periodu od preko šest meseci. IT test jedinjenje za ovu studiju bila je rhASA. Trideset Šest mužjaka i 36 ženki cinomolgus majmuna nasumično je podeljeno u pet grupa za lečenje. Životinje u grupi 1 bile nisu bile tretirane implantiranim uređajem (portom i kateterom) i nije im doziran inertni medijum ni test jedinjenje; međutim, ovim životinjama dozirano je 0,6 ml PBS-a prema rasporedu koji odgovara doziranju test jedinjenja. Životinje u grupama od 2 do 5 dobijale su 0,6 ml IT infuziju sa 0, 3, 10 ili 31 mg/ml rhASA (ukupna doza od 0, 1,8, 6,0 ili 18,6 mg) svake druge nedeije (ukupno 12 doza). Nad životinjama je vršena autopsija nakon 6 meseci (24 sata nakon poslednje IT doze) i nad preostale 4 životinje/pol/grupa vršena je nekropsija na kraju četvoronedeljnog perioda oporavka. Odabrana tkiva su sakupljena, sačuvana i pregledana na mikroskopu.

[0403]Generalno, test jedinjenje odnosi se na promene koje mogu da se kategorizuju na dva glavna tipa i prisutna su na svim nivoima doza (1,8, 6,0 i 18,6 mg/dozi). Povećanje infiltrata (belih krvnih zrnaca, obično sa istaknutom eozinofilnom komponentom) javlja se u moždanim opnama, parenhimu mozga, parenhimu kičmene moždine, trigeminalnom ganglionu i povremeno u korenu kičmenog nerva/ganglije (ili epineriumu koji okružuje ove strukture). Ovo povećanje je intrepretirano zbog prisustva test jedinjenja (proteina) u intratekalnom prostoru i u tkivima nervnog sistema. Blago, fokalno povećanje mikroglijalnih ćelija u kičmenoj moždini i mozgu javlja se povremeno kod životinja (mikroglioza nije posmatrana ni u jednoj životinji sa visokom dozom). Obe kategorije morfoloških promena protumačene su kao odgovor na trenutno test jedinjenje. Nije bilo dokaza neuronske nekroze u bilo kojoj životinji. Nijedno od test jedinjenja vezanih za promene ne odnosi se bilo koji biološki neželjeni efekat u mozgu, kičmenoj moždini, korenu kičmenog nerva ili ganglijama. Posebno, nije bilo pokazivanja neuronske nekroze ili važnog biološkog glijalnog odgovora. Nijedno test jedinjenje nije vezano za lezije u tkivima van nervnog sistema.

[0404]Prateći jednomeseČni period oporavka (period bez doziranja), test jedinjenje koje se odnosi na promene ili se u potpunosti rastvara ili je ograničeno na ostatke prethodnog porasta inflamatornog odgovora koji je povezan sa prisustvom test jedinjenja. Nije bilo neželjenih morfoloških efekata kod oporavka životinja. Kao što je bazirano na mikroskopskom pregledu koji dodeljuje semi-kvantitativni rezultat obojenja, imunohistohemijsko obojenje za arilsulfatazu A (rhASA; test jedinjenje) povećavano je u mozgu i kičmenoj moždini u različitim tipovima ćelija, osim u neuronima za sva test jedinjenja tretiranih grupa do konačnog žrtvovanja. Ovo povećanje takođe je prisutno u Kupfferovim ćelijama u jetri. Prateći jednomeseČni period oporavka, rhASA obojenje u test jedinjenju tretiranih životinja (sve grupe za doziranje) vratilo se na kontrolisani nivo (kontrola uređajem i/ili inertnim medijumom). U jednoj niskoj dozi mužjaka koji se oporavljao bilo je višestrukog lokalizovanja astrocitoze i neuronskog gubitka, ukazujući na višestruke površine pre ishemije u cerebralnom korteksu. Iako tačna patogeneza ovih lezija u životinjama nije očigledna, manjak sličnih lezija u bilo kom test jedinjenju kojima su tretirane životinje, uključujući i one životinje koje su dobijale visoku dozu što je 10x više od obične doze, ukazuje na to da lezije nemaju veze sa test jedinjenjem.

[0405]U test jedinjenje za ovu studiju bilo je rhASA. Trideset šest mužjaka i 36 ženki cinomolgus majmuna nasumično su podeljeni u pet grupa za lečenje. Životinje u grupi 1 nisu bile tretirane inplantiranim uređajem (port i kateter) i nije im bio doziran inertni medijum ili test jedinjenje; međutim, ovim životinjama dozirano je 0,6 ml PBS-a prema rasporedu koji odgovara rasporedu doziranja test jedinjenja. Životinje u grupama od 2 do 5 primile su 0,6 ml IT infuzije od 0, 3, 10 ili 31 mg/ml rhASA (ukupna doza od 0, 1,8, 6,0 ili 18,6 mg) svake druge nedeije (ukupno 12 doza). Životinjama je rađena autopsija nakon 6 meseci (24 sata nakon poslednje IT doze) i nad preostale 4 životinje/pol/grupa vršena je autopsija na kraju četvoronedeljnog perioda oporavka. Izabrana tkiva su sakupljena, sačuvana i pregledana mikroskopski. Tabela ispod predstavlja plan studije, a takođe se odnosi i na patološki aspekt studije.

[0406]U trenutku žrtvovanja, mozak je isečen u moždani matriks otprilike debljine od 3 mm koronalnog preseka. Prvi deo i svaki drugi deo nakon toga fiksiran je u formalinu za histopatološku evaluaciju i imunohistohemijske analize. Mozak je ceo obrađen u koronalnim segmentima. Ovi segmenti uključeni su u najmanju ruku sa sledećim regionima mozga. • Neokorteks (uključujući frontalni, parietalni, temporalni i potiljačni režanj): segmenti mozga od 1 do 8 (i presek 9 ako je prisutan)

• Paleokorteks (mirisni deo velikog mozga (bulbus olfactorius) i/ili piriformni korteks): segmenti mozga od 1 do 3

• Bazalna ganglija (uključujući caudate i putamen): segmenti mozga 3 i 4

• Limbički sistem (uključujući hipokampus i cingulate gyri): segmenti mozga 4 i 5

• Talamus/hipotalamus i srednji regioni mozga uključujući substantia nigra: segmenti mozga 4 i 5

• Cerebelum, pons i medulla oblongata: segmenti mozga od 6 do 8 (i presek 9 ako je prisutan).

[0407]Segmenti mozga izlistani su u tabelama kao segmenti od 1 do 8/9 (segment 9 obezbeđen je za testiranje nekih životinja). Segmentiranje blago varira između životinja. Segmenti mozga (1 do 8/9) obezbeđeni iznad predstavljaju približnu lokaciju različitih anatomskih površina. Segmenti mozga izlistani su u tabelama kao pojedinačni segmenti sa dijagnozom pacijenta za tu sekciju kako bi se olakšala potencijalna buduća revizija (ako je bude bilo). Tokom prikazivanja podataka, pojedinačna anatomska mesta u mozgu (kao što je izlistano iznad) poređena su u cilju identifikacije bilo kog jedinstvenog test jedinjenja (npr. jedinstven u određenom regionu mozga). Na TPS, svi segmenti mozga iz svih životinja stavljeni su u parafin, isečeni na 5 mikrona, obojeni hematoksilinom i eozinom (H&E) i pregledani mikroskopski. Dodatno, mozgovi kontrolnih i životinja kojima je data visoka doza obojene su sa "Fluoro-Jade B" (obojenje koje povećava osetljivost evaluacije mozga na neuronske degeneracije) i srebrno obojenje Bielschowskyog (procedura koja dozvoljava direktnu vizuelizaciju aksona, dendrita i neuronskih filamenata) i pregledani su.

[0408]Kičmena moždina (vratni, grudni i slabinski pršljenovi) isečeni su na sekcije od lem. Prvi deo i svaki sledeći deo fiksiran je u formalinu za histopatološku evaluaciju i imunohistohemijsku analizu. Sekcije kičmene moždine (vratni, grudni (uključujući vrh katetera) i slabinski pršljenovi) iz svih životinja podeljene su u sekcije od približno 5 mikrona, obojene su H&E i pregledane sa transverznim i poprečnim presekom uzetim na svim nivoima. Serije sekcija kičmene moždine iz kontrolnih i grupa sa visokom dozom dodatno su obojene srebrnim Bielschowsky obojenjem i sa anti-GFAP (imunohistohemijsko obojenje koje dozvoljava direktnu vizuelizaciju astrocita i njihovih procesa).

[0409]Leđni kičmeni nervni koreni i ganglion (uzeti iz srednjeg vratnog, srednjeg grudnog i srednjeg slabinskog pršljena) stavljeni su u parafin, sa serijom obojenja sekcija pomoću H&E. Dodatno, serijske sekcije kontrolnih i grupa sa visokom dozom obojene su srebrnim Bielschowsky obojenjem.

[0410]Za išijadnične, tibijalne i suralne nervne sekcije svih životinja: Longitudinalna sekcija svakog nerva stavljena je u parafin, isecirana na približno 5 mikrona i obojena H&E. Poprečni presek svakog nerva je postfiksiran u osmijumu, stavljen u Spurrovu smolu, seciran na približno 1 do 2 mikrona i obojen toluidin plavim. Postfiksacija u osmijum i ugrađivanje smole obezbeđuje superiorno očuvanje mijelina u perifernim nervima i stoga je mnogo detaljniji pregled nerava.

[0411]Sva sakupljena tkiva kao i štetne lezije za vreme autopsije od svih životinja takođe su stavljena u parafin, obojena H&E i pregledana mikroskopski. Histopatološko procesuiranje i evaluacije kao i imunohistohemijske analize izvršene su pomoću TPS.

Metode: obojenje arilsulfataze A (rhASA)

[0412]Pozitivni kontrolni slajdovi dobijeni su od sponzora studije. Slajdovi su bili sekcije jetre iz miševa kojima je

injektovana rhASA. Pozitivni kontrolni slajdovi svi su pokazali obimnu pojavu rhASA u Kupfferovim ćelijama (sinusoidalne makrofage) u jetri. Pozitivni kontrolni slajdovi čuvani su sa ostalim slajdovima ove studije. Sve evaluacije obojenja sekcija sa rhASA inicijalno su sprovedene naslepo životinjama u grupi za tretiranje. Ovo je postignuto tako Što patolog inicijalno pročita slajdove rhASA obojenja sa brojem životinja na nalepnici (pomoću asistenta koji zna koja se životinja tačno procenjuje), diktirajući rezultat (ocena ozbiljnosti) tokom evaluacije. Takođe, asistent odmah beleži rezultat obojenja (ocena ozbiljnosti) u tabele sa podacima. ID životinja se onda verifikuje i od strane neuropatologa i asistenta kako bi se garantovao tačan unos podataka. Procedura je sprovedena tako da se ne uključuje nikakva predrasuda u prosuđivanju ukupnog intenziteta obojenja sa imunohistohemijskim obojenjem za detekciju intracelularnog rhASA. Relativni stepen obojenja neurona, meningealnih makrofaga, perivaskularnih makrofaga i glijalnih ćelija (astrociti i mikroglijalne ćelije, ali verovatno pretežno mikroglijalne ćelije) ocenjene su u svim segmentima mozga i kičmene moždine. Srednja vrednost ozbiljnosti na svakom moždanom nivou i nivou kičmene moždine za svaku grupu određena je (po grupi) i zabeležena kao ukupna nad tkivom mozga, generalno, rhASA obojenje i kičmena moždina, generalno, rhASA obojenje.

[0413]Generalno, rhASA obojenje u neuronima mozga mereno je na neuronima u cerebralnom korteksu i drugim nuklearnim površinama u mozgu. rhASA obojenje u makrofagama moždanih opni dokaz je unosa test jedinjenja pomoću makrofaga moždanih opni i/ili endogene rhASA u makrofagama moždanih opni. rhASA obojenje perivaskularnih makrofaga mereno je unosom rhASA pomoću makrofaga u mozak/kičmenu moždinu (ili endogenu rhASA), iako treba da bude napomenuto da se perivaskularni prostor u mozgu i kičmenoj moždini (Virchovv-Robinsov prostor) nastavlja na moždane opne. Generalno, ocenjivanje rhASA obojenja u glijalnim ćelijama pretežno je mera unosa test jedinjenja/penetracije test jedinjenja u sivu i/ili belu masu, posebno u cerebralni korteks (corona radiata je bela masa ispod cerebralnog korteksa). rhASA obojenje u beloj masi javlja se u astrodtima i mikroglijalnim ćelijama.

[0414]Naredna Šema ocenjivanja korišćena je za prikazivanje rezultata stepena rhASA obojenja u različitim tipovima ćelija (neuronima, glijalnim ćelijama, makrofagama).

Objašnjenje ocenjivanja (% mogućeg obojenja ćelija)

[0415]

1 manje od 10%

2 više od 10 do 25%

3 više od 25 do 50%

4 više od 50 do 75%

5 više od 75%

[0416]Napomena: ova šema nije striktno kvantitativna. Korišćena je kao efikasna, semi-kvantitativna metoda za procenu stepena obojenja mozga i kičmene moždine pomoću rhASA. Napomenuto je od strane neuropatologa studije da sve neuronske površine nemaju jednako rhASA obojenje. Takođe je napomenuto da je u nekim kontrolnim životinjama bilo endogeno neuronsko obojenje i da ćelije horoidnog pleksusa i neuroni leđnog korena ganglije imaju tendenciju jakog obojenja za rhASA čak i u kontrolnim životinjama. Obojenje horoidnog pleksusa i dorsalnog korena ganglija nije ocenjeno, ali je napomenuto od strane neuropatologa studije da bude istaknuto čak i kod kontrolnih životinja.

[0417]Napomena: sve grupe za doziranje: niska doza = 1,8 mg/dozi; srednja doza = 6,0 mg/dozi; visoka doza = 18,6 mg/dozi. Nije bilo test jedinjenja vezanog za lezije u tkivu van nervnog sistema, osim za povećanje rhASA obojenja u jetri svih grupa za doziranje (mužjaci i ženke; videti ispod).

KONAČNO ŽRTVOVANJE ŽIVOTINJA (NAKON 6 MESECI, DOZIRANJE SVAKE DRUGE NEDELJE): rhASA SEKCIJE OBOJENJA

[0418]Postoji povećanje rhASA obojenja u sledećim tkivima/tipovima ćelija. Kada se uzima u razmatranje efekat test jedinjenja na stepen rhASA obojenja u određenim tipovima ćelija u određenim grupama za doziranje, nivoi obojenja u konkurentnom kontrolnom inertnom medijumu i kontrolnom uređaju (žrtvovanje nakon oporavka životinja) smatra se poredivim.

[0419]Mozak, moždane opne, makrofage (sve grupe za doziranje, mužjaci i ženke)

• Mozak, perivaskularne, makrofage (sve grupe za doziranje, mužjaci i ženke)

• Mozak, glijalne ćelije (sve grupe za doziranje, mužjaci i ženke)

• Kičmena moždina, moždane opne, makrofage (sve grupe za doziranje, mužjaci i ženke)

• Kičmena moždina, perivaskularne, makrofage (sve grupe za doziranje, mužjaci i ženke)

• Kičmena moždina, glijalne ćelije (srednje i visoke doze za mužjake i ženke)

• Jetra, Kupfferove ćelije (sve grupe za doziranje, mužjaci i ženke)

[0420]Zbog endogenog obojenja, nivoi ARSA obojenja u neuronima mozga i kičmene moždine su najteži za specifično definisanje. rhASA obojenje predstavlja konzistentno povećanje nivoa rhASA u moždanim opnama i moždanim i perivaskularnim makrofagama kičmene moždine takođe i sa glijalnim ćelijama. Nije bilo detektabilnih razlika rhASA obojenja u neuronima kontrolnih životinja i životinja tretiranih sa test jedinjenjem.

REGENERACIJA ŽIVOTINJA ZA ŽRTVOVANJE (DOZIRANJE SVAKE DRUGE NEDEIJE U PERIODU OD 6 MESECI PRAĆENO JEDNOMESEČNIM PERIODOM BEZ DOZIRANJA)

[0421]Generalno, test jedinjenje koje se odnosi na promene bilo je ili potpuno rastvoreno ili naročito smanjeno u onim životinjama kojima je dozvoljen period od mesec dana bez doziranja pre autopsije. Prateće mikroskopske promene prisutne su pri učestalosti ili indikaciji na moguću vezu sa test jedinjenjem.

[0422]Test jedinjenja vezanih za mikroskopske promene (regeneracija životinja)

• Mozak, moždane opne, ubacivanje (grupe sa srednjom i visokom dozom, oba pola) (slike 111 i 112)

• Mozak, moždane opne, ubacivanje, % eozinofili (srednja doza za mužjake; visoka doza za ženke)

• Mozak, perivaskularne, ubacivanje (srednja doza za mužjake; visoka doza za ženke) (slika 113)

• Mozak, perivaskularne, ubacivanje, % eozinofili (srednja doza za mužjake; visoka doza za ženke)

• Mozak, Siva masa, ubacivanje (sve grupe za doziranje, oba pola)

• Mozak, Siva masa, ubacivanje, % eozinofili (niska doza za mužjake)

• Mozak, Siva masa, eozinofili, nekroza (niska doza za mužjake)

• Kičmena moždina, moždane opne, ubacivanje (srednja doza za mužjake; niska i visoka doza za ženke)

• Kičmena moždina, moždane opne, ubacivanje, % eozinofili (srednja doza2a mužjake; niska doza za mužjake)

• Kičmena moždina, sva masa, ubacivanje (niska doza za ženke)

• Kičmena moždina, siva masa, ubacivanje, % eozinofili (niska doza za ženke)

• Leđni koren gangliona i koreni, epineurium, ubacivanje (srednja doza za ženke)

• Kičmeni nervni koren i ganglija, ubacivanje, eozinofili (srednje i visoke doze za mužjake; sve doze za ženke)

• Trigeminalni ganglion, ubacivanje, eozinofili (srednja doza mužjacima i ženkama)

[0423]Sve ove promene su interpretirane tako da predstavljaju ostatke povišenih inflamatornih promena zabeleženim kod konačno žrtvovanih životinja. Kod terminalnog žrtvovanja životinja, ne postoje dokazi povećanog ubacivanja inflamatornih ćelija koje su još uvek prisutne u nekim životinjama koje se regenerišu i predstavljene su morfološkim promenama koje izazivaju bilo kakve neželjene efekte. Nijedno test jedinjenje nema veze sa lezijama van tkiva nervnog sistema.

REGENERACIJA ŽIVOTINJA ZA ŽRTVOVANJE (DOZIRANJE SVAKE DRUGE NEDELJE U PERIODU OD 5 MESECI PRAĆENO JEDNOMESEČNIM PERIODOM BEZ DOZIRANJA): ARSA OBOJENJE

[0424]Nije bilo indikacije povišenja rhASA obojenja u regeneraciji mužjaka i ženki što je poređeno sa životinjama

kontrolisanim uređajem i/ili inertnim medijumom. U mozgovima mužjaka koji se regenerišu i kojima je data niska, srednja i visoka doza zapravo postoji indikacija opadanja rhASA obojenja u nekim tipovima ćelija (ovo varira od grupe za lečenje) u poređenju sa životinjama kontrolisanim uređajem i/ili inertnim medijumom. Razlog za ovo, uključujući da li zapravo ima ili nema efekta nije poznat. Jedno moguće objašnjenje bilo bi da administracija egzogene rhASA može da izazove neko

opadanje u proizvodnji endogene rhASA. Slično otkriće nije prisutno u kičmenoj moždini mužjaka. U regeneraciji mužjaka i ženki, obojenje u jetri bilo je slično kao kod kontrolnih životinja.

[0425]Generalno, test jedinjenje koje se odnosi na promene može da bude kategorizovano u dva glavna tipai da bude prisutno na nivou svih doza (1,8, 6,0 i 18,6 mg/dozi).

[0426]Povećanje ubacivanja (belih krvnih zrnaca, obično sa upadljivom eoztnofilnom komponentom) u moždane opne, parenhim mozga, parenhim kičmene moždine, trigeminalne ganglione i povremeno u koren kičmenog nerva/ganglija (ili epineurtjuma koji okružuje ove strukture). Ovo povećanje interpretirano je zbog prisustva test jedinjenja (proteina) u intratekalnom prostoru i u tkivima nervnog sistema.

[0427]Blago, fokalno povećanje mikroglijalnih ćelija u kičmenoj moždini i mozgu povremeno je kod životinja (mikroglioza nije posmatrana kod životinja kojima je data visoka doza). Obe kategorije morfoloških promena interpretirane su kao odgovor prisutnog test jedinjenja. Nije bilo dokaza neuronske nekroze kod bilo koje životinje. Evaluacija rhASA obojenih sekcija je na čekanju zbog pisanja ovog izveštaja. Nijedno od test jedinjenja nije vezano za promene koje se odnose na bilo koje biološke neželjene reakcije u mozgu, kičmenoj moždini, korenu kičmenog nerva ili ganglijama. Specifično, nije bilo dokaza neuronske nekroze ili biološki važnog glijalnog odgovora. Nijedno test jedinjenje nije vezano za lezije u tkivima van nervnog sistema. Prateći jednomeseČni period oporavka (period bez doziranja), test jedinjenje vezano za promene je ili potpuno rastvoreno ili je ograničeno na ostatak prethodno povišenog inflamatornog odgovora vezanih za prisustvo test jedinjenja. Nije bilo neželjenih morfoloških efekata kod regeneracije životinja.

[0428]Kao što je bazirano na mikroskopskim pregledima, dodeljuje se rezultat semi-kvantitativnog obojenja i imunohistohemijsko obojenje za arilsulfatazu A (rhASA; test jedinjenje) koji raste u mozgu i kičmenoj moždini u različitim tipovima ćelija, osim u neuronima za sve grupe tretirane test jedinjenjem. Ovo povećanje takođe je očigledno u Kupfferovim ćelijama jetre. Prateći jednomeseČni period oporavka, rhASA obojenje kod životinja tretiranim test jedinjenjem (sve grupe za doziranje) vraćeno je na nivo kontrolnih životinja (kontrola uređajem/inertnim medijumom). Kod mužjaka u oporavku kome je data niska doza, postoje višestruke lokalizacije astrocitoze i gubitka neurona što ukazuje na višestruke površine pre ishemije u cerebralnom korteksu. Iako tačna patogeneza lezija kod ovih životinja nije očigledna, manjak sličnih lezija u bilo kom test jedinjenju tretiranih životinja, uključujući životinje kojima je data najviša doza, 10x od pojedinačne doze, ukazuje da ove lezije nemaju veze sa test jedinjenjem. U vreme objavljivanja preliminarnog izveštaja baziranih striktno na bruto i mikroskopskim nalazima (unutar parafina, sekcije obojene hematoksilinom i eozinom) u ovoj studiji, nezabeleženi nivo neželjenih efekata (NOAEL) bio je 18,6 mg.

PRIMER 16 - FARMAKOKINETIČKI PODACI

Šestomesečni podaci za životinje

[0429]Ovaj primer obezbeđuje interpretativnu analizu seruma i CSF koncentracija rhASA i anti-rhASA serumskih antitela od Northern Biomedical Research, Inc.

[0430]Predmet primera bio je da evaluira ponovljenu dozu intratekalne (IT) administracije rhASA sa toksikološkog i bezbednog farmakološkog aspekta kod mladih (<12 meseci starosti) cinomolgus majmuna. Ukupno je dato 12 doza u periodu od šest meseci. Nad životinjama je vršena autopsija 24 sata ili mesec dana nakon poslednje doze. Plan studije prikazan je u tabeli 29.

Metode testa- analize antitela

[0431]Kvantifikacija anti-rhASA antitela u serumu i CSF-u cinomolgus majmuna sprovedena je koristeći odgovarajuće metode. Ukratko, test počinje blokiranjem ploče obložene MSD streptavidinom, praćeno inkubacijom biotin obeležene rhASA. Posle koraka spiranja, SULFO TAG obeleženi lek dodat je i inkubiran. Izvršen je krajnji korak spiranja i dodat je MSD pufer za očitavanje. Pločice se čitaju istog trenutka. Podaci signala u relativnim jedinicama luminiscencije (RLU) analizirane su koristeći SOFTMax Pro šablone.

Serum i CSF koncentracija

[0432]Kvantifikacija rhASA u serumu i CSF-u cinomolgus majmuna sprovedena je koristeći odgovarajuće metode. Metod je baziran na ELISA tehnologiji. Ukratko, mikrotitarska pločica obložena je zečjim poliklonskim antitelom (SH040) nasuprot rekombinantne humane arilsulfataze A (rhASA). Nakon inkubacije sa rhASA referentnim standardima i test uzorcima, veza rhASA proteina detektovana je u peroksidazi rena (HRP) konjigovanoj sa anti-ASA monoklonskim antitelom (klon 19-16-3). Pločica je onda inkubirana sa supstratom za HRP, TMB peroksidazom. Ova enzim-supstrat reakcija zaustavljena je adicijom 2N sumporne kiseline (H2SO^) i apsorbanc3 svakog udubljenja je izmerena na talasnoj dužini od 450 nm sa referentnom talasnom dužinom od 655 nm. Koncentracije rhASA u uzorcima izračunate su koristeći rhASA kalibracionu krivu iste pločice.

[0433]Kratak pregled koncentracije seruma rhASA prikazan je u tabeli 30.

[0434]Kratak pregled koncentracije CSF-a rhASA prikazan je u tabeli 31.

[0435]Kratak pregled koncentracija anti-rhASA antitela seruma prikazan je u tabeli 32.

[0436]Kratak pregled koncentracija anb- rhASA CSF antitela prikazan je u tabeli 33.

[0437]Učestalost antitela prema grupi i polu prikazan je u tabeli 36.

[0438]Granica kvantifikovanja za rhASA u serumu cinomolgus majmuna je 39,1 ng/ml i svi uzorci seruma iz grupa 1 i 2 bili su ispod kvantifikacionog nivoa (BQL), videti tabelu 30. Nivoi rhASA u serumu testirani su pre i 24 sata nakon doza 2, 4, 6, 8, 10 i 12 (autopsija nakon šest meseci), na sredini perioda oporavka i pre autopsije regenerisanih životinja. rhASA nivoi nisu bili detektabilni u grupi 3 (1,8 mg/doze), grupi 4 (6,0 mg/dozi) i grupi 5 (18,6 mg/dozi) pre doza 2, 4, 6, 8, 10 i 12, nakon doze 12, na sredini perioda oporavka i autopsije regenerisanih životinja. Nakon doze 2, nivoi rhASA u serumu su bili zavisni od doze. Nakon doze 4 (grupa 3), doze 6 (grupe 3 i 4) i doze 8 i 10 (grupe 3, 4, 5 mužjaka) rhASA nivoi nisu mogli da se detektuju. Nivoi rhASA u serumu opali su u grupi 4 (6,0 mg/dozi) nakon doze 4 u grupi 5 (18,6 mg/dozi) i nakon doza 4 i 6 kod mužjaka i doza 4, 6, 8 i 10 kod ženki. Očigledno opadanje rhASA nivoa u serumu može da bude vezano sa povećavanjem koncentracije anti-rhASA antitela. Nije bilo očiglednih razlika nivoa rhASA u serumu kod polova s obzirom na različitost uzoraka i malog broja grupa u ovoj studiji.

[0439]Granica kvantifikovanja za rhASA u CSF-u cinomolgus majmuna je 19,5 ng/ml i svi uzorci CSF-a iz grupa 1 i 2 bili su ispod kvantifikacionog nivoa (BQL), videti tabelu 31. rhASA bila je detektabilna u CSF-u pre i nakon doza 2, 4, 6, 8,10 i 12 (autopsija nakon šest meseci) u svim grupama za doziranje. Nivoi su bili viši nakon doze (otprilike 24 sata nakon doze) i bili su vezani za dozu. Nivoi u CSF-u bili su mnogo veći nego oni u serumu. Nije bilo očiglednih razlika među polovima u nivoima rhASA u CSF-u s obzirom na različite uzorke i na mali broj grupa u ovoj studiji. rhASA nije detektabilna na sredini puta oporavka ni pre autopsije kod regenerisanih životinja u svim grupama za doziranje. Nivoi rhASA u sakupljenom CSF-u pri dozi 12 (autopsija) bili su manji nakon doza 8 i 11. Mogući razlozi za niže rhASA nivoe pri autopsiji uključuju uzetu veću zapreminu (-2,25 ml ukupno izbrojane ćelije, herniju, rhASA i anti-RHASA antitelo) pri autopsiji naprema onima uzetim u intervalu doze u životu (do 0,5 ml pre ili nakon doze koncentracije rhASA). Dodatno, neke životinje nisu imale vezan kateter pri autopsiji i uzorci su uzeti preko CM cevi radije nego preko katetera. Ovaj način konstantno je davao prinos manjih koncentracija rhASA u poređenju sa uzorcima preko katetera. Ovo je verovatno zbog ograničenog rostrokaudalnog puta velikog protoka u CSF-u koji je potvrđen da se javlja kod vertikalno orijentisanih životinja kao što su majmuni i ljudi (npr. dobro je poznato da konstituenti CSF-a pokazuju obeležene rostrokaudalne gradijente u toku životnog veka individue).

[0440]Anti-rhASA antitela u serumu detektovana su u svakoj životinji tretiranoj sa rhASA u nekom trenutku vremena, videti tabelu 32. Životinje su definisane kao pozitivne na anti-rhASA antitela, ako je nivo anti-rhASA antitela iznad granice kvantifikacije (78,1 ng/ml). Životinje ostaju pozitivne na anti-rhASA antitela kada jednom dostignu serumsku vrednost. Nijedna životinja nije pozitivna na anti-rhASA antitela u vremenskom periodu pre doze 2. Sve rhASA životinje osim mužjaka br. 026 (grupa 4; 6,0 mg/dozi) bile su pozitivne na serumska anti-rhASA antitela u vremenskom periodu pre doze 4. Mužjak br. 026 bio je pozitivan na serumsko antitelo u vremenskom periodu pre doze 6. U grupi 5 (18,6 mg/kg), uzeti uzorci pri autopsiji imali su niži nivo antitela. Ovo očigledno opadanje može da bude zbog prisustva rhASA koji se meša u testu. Titar je generalno viši kod grupa sa srednjim i visokim dozama (6,0 i 18,6 mg/dozi) nego kod životinja sa niskim dozama (1,8 mg/dozi). Prisustvo anti-rhASA antitela je očekivani rezultat u lečenju cinomolgus majmuna rekombinantnim humanim proteinima. S obzirom na varijabilnost u rezultatima, nije bilo očiglednih razlika među polovima.

[0441]Sve životinje sa detektabilnim anti-rhASA antitelima u CSF-u imale su takođe i detektabilna rhASA antitela u serumu, sa izuzetkom ženki br. 049 (grupa 3; 1,8 mg/dozi)j 057 (grupa 4; 6,0 mg/dozi). Varijabilnost u koncentraciji antitela i učestalost uvode određivanje odgovora na dozu. Životinje su definisane kao pozitivne na anti-rhASA antitela, ako je nivo anti-rhASA antitela iznad granice kvantifikacije (78,1 ng/ml).

[0442]Kombinovane vrednosti mužjaka i ženki rhASA nivoa u serumu i CSF-u i za anti-rhASA antitela prikazane su u tabelama 34 i 35. Kombinovani rezultati mužjaka i ženki slični su među polovima što je diskutovano iznad.

PRIMER 17 - EFIKASNOST

[0443]U ovom primeru, 11 kontrolnih miševa "divljeg tipa" (mASA +/+ hASA -/-) dodeljeni su grupi A i nisu dobili nikakav tretman. Trideset četiri (34) hASAC69S/ASA -/- miševa dodeljeno je svakoj od 5 grupa za doziranje i dobili su inertni medijum (grupa B) rhASA pri dozi od 20 mg/kg (intravenozno [IV]; grupa C) ili 0,04, 0,12 i 0,21 mg (grupe D, E i F, respektivno) 1, 9, 15/16 i 22og dana. Sve IV doze administrirane su preko vene na repu. Sve intratekalne (IT) doze administrirane su kao infuzija sa zapreminom od 12 ml na približnoj brzini od 2 ml/20 sekundi (tabela 37).

[0444]ASA "knockout" miš hASAC69S/ASA(-/-) je prihvaćen model MLD i korišćen je za testiranje potencijalnih tretmana ovih bolesti. Intratekalni način administracije namenjen je administraciji ljudima. Intravenozni način administracije testiran je na ova i slična jedinjenja MLD miševa. Grupa kontrolisana intravenozno dodata je kao pozitivna kontrola za histološke promene očekivane u perifernim organima. Životinje su primile 100, 300 ili 520 mg/kg od težine mozga (0,04, 0,12, 0,21 mg, respektivno) rhASA. Normalizovani nivoi doza izabrani na osnovu težine mozga izabrani za ovu studiju odgovaraju dozama za koje je planirano da se koriste kod ljudi ili su korišćene u toksikološkim studijama ili u prethodnim efikasnim modelima lizozomskih bolesti nakupljanja. Nije očekivano da ove doze pokazuju bilo kakvu toksičnost.

[0445]Po dolasku, svaka životinja je pregledana kako bi se procenio njen zdravstveni status.

Čuvanje

[0446]Životinje su čuvane u polikarbonatnim kavezima visoke temperature sa filterom na vrhu, postavljenim sa "CareFresh" papirom i flašicama za vodu. Svaki kavez je jasno obeležen karticom za kavez koja ukazuje na projekat, grupu i broj životinje i pol. Svaka životinja je jedinstveno identifikovana koristeći sistem bušenja uva (eng. ear punch svstem)

[0447]Ciljani uslovi vezani za okolinu i fotoperiod životinja slede ispod:

[0448]Sve dostupne životinje divljeg tipa (11) dodeljene su grupi A i numerisane su od 35 do 45. ASA (-/-) hASA (+/-) životinjama dodeljeni su uzastopni brojevi (od 1 do 34) čim se uklone iz kaveza, izmereni su i obeleženi bušenjem uva. Životinje su onda dodeljene grupi za tretiranje koristeći "Research Randomizer" (www.randomizer.org) 3.1.2011. i prvih 9 brojeva dodeljeno je grupi B, narednih 5 grupi C, narednih 5 grupi D, narednih 5 grupi E i poslednjih 10 grupi F. Životinje su dodeljene kao što sledi:

Test jedinjenje i inertni medijum

[0449]

Priprema inertnog medijuma

[0450]Inertni medijum korišćen je kao što je obezbeđen. Inertni medijum oslabljen je pri pogodnim uslovima na radnoj površini u laboratoriji (uslovi okoline). Jednom kada je inertni medijum oslabljen, meša se blagim okretanjem. Bočice nisu vorteksovane. Bočice su osušene pre stavljanja materijala. Svaki ostatak inertnog medijuma vraćen je u frižider (1°C - 8°C).

Reparacije formulacija doza

[0451]rhASA je razblažen inertnim medijumom kako bi se postigla neophodna koncentracija. Test jedinjenje oslabljeno je pri pogodnim uslovima na radnoj površini u laboratoriji (ambient). Jednom kada je test jedinjenje oslabljeno, materijal je mešan se blagim okretanjem. Bočice nisu vorteksovane.

Boje za praćenje injektiranja:

[0452]Infracrvena boja (kao što je IRDye<s>, LI-COR Biosciences, Lincoln, NE) korišćena je za praćenje injektiranja. Boje kao su ove korišćene su u intratekalnom injektiranju kao procedure preživljavanja nakon intratekalne administracije. Boja je pomešana sa test jedinjenjem pre administracije; 1 nmol boje u 1 pl dodat je test jedinjenju, U dodatku infracrvenoj boji, 1 pl plave #1 (0,25%) korišćeno je za praćenje injektiranja. Plava boja je Čest aditiv hrani, stoga se smatra bezbednim i netoksičnim.

Lumbosakralno IT injektiranje rhASA ili inertnog medijuma

[0453]Životinje u grupama B, D, E i F primale su intratekalne injekcije 1, 9, 15 ili 16 i 22og dana.

[0454]Odrasli miševi su anestezirani koristeći 1,25% 2,2,2 tribromoetanol (Avertin) po 200-300 pl/10 grama telesne težine (250-350 mg/kg) pomoću intraperitonealnog injektiranja. Dlaka sa leđa uklonjena je između početka repa i lopatica koristeći makaze. Obrijana površina očišćena je povidin/betadin brisom praćeno izopropil alkoholom. Mali rez na sredini (l-2cm) načinjen je preko lumbosakralnog dela kičme i identifikovan je presek dorsalne medijalne linije i kranijalnog aspekta lopatica singular ileum. Mišić u iliac fossa (gluteus medius) je mišić u obliku srca. Dve strane na vrhu "srca" približno predstavljaju lokaciju lopatica ilea. Igla promera 32 koja je povezana za Hamiltonov špric ispunjen gasom 10-20 pl ubačena je sve dok se ne oseti pritisak od osnovne kosti. Injektiranje test jedinjenja od 10 pl, lml infracrvene boje i 1 pl FD&C plave #1 (ukupna zapremina injektiranja 12 pl) vrši se otprilike na brzini od 2 ul/20 sekundi (12 pl/2 minutu). Rez na koži zatvoren je koristeći kopče. Uspeh injektiranja prosuđen je skeniranjem kako bi se odredilo da li je infracrvena boja distribuirana kroz CNS, kao i vidljiva plava boja. Nakon skeniranja, životinjama je dozvoljen oporavak u sobi za oporavak.

Intravenozno injektiranje rhASA

[0455]Životinje u grupi C primile su intravenozne injekcije 1, 9, 15 i 22og dana.

[0456]Za IV injektiranje, životinje su anestezirane koristeći izofluran, ako je to potrebno, i postavljene su u stegu (eng. restrainer) pri čemu ne mogu da se pomeraju. Vena na repu je proširena laganim ispravljanjem repa prstom. Mesto injektiranja je onda obrisano sa 70% etanolom. Alternativno, životinja je postavljena u toplu komoru (40°C) na 1-1,5 minut. Za injektiranje test materijala korišćene su igle promera od 28 do 30. Zapremina injektiranja bila je 5-10 ml/kg.

[0457]Otprilike 24 sata nakon četvrte doze, životinje iz grupa od B do F sueutanazirane. Životinje su podvrgnute različitim procedurama sakupljanja tkiva kao što je detaljnije opisano ispod. Životinje iz grupe A nisu tretirane; međutim, nad njima je izvršena eutanazija 27. ili 28. januara 2011. i podvrgnute su različitim procedurama sakupljanja tkiva što je detaljnije opisano ispod.

Serum (sve životinje)

[0458]Krajnji uzorci krvi (otprilike 0,5 ml) sakupljeni su iz svih životinja (grupe A-F) preko retroorbitalne punkcije pod anestezijom izoflurana. Staklena cevčica postavljena je u očnu šupljinu, lagano penetrirajući površinu iza oka i stoga ometajući drenažu vene locirane iza oka. Krv je sakupljena kapilarom i/ili gravitacionim tokom. Prateći sakupljanje krvi, primenjen je pritisak kako bi se zaustavilo krvarenje u očnoj šupljini.

[0459]Ukupni krvni uzorci su procesuirani do seruma i zamrznuti na manje od -80°C. Serum je skladišten na -80°C i analiziran na antitela.

Tkiva za istraživanja svetlosnom mikroskopijom (Grupe A-F; 5 miševa po grupi)

[0460]Nakon sakupljanja krvi, životinje su eutanazirane gušenjem pomoću C02. Deo repa je odrezan i sakupljen pre perfuzije i zamrznut za moguću genotipizaciju. Perikardijalna šupljina bila je izložena. Tri (3) miša po grupi su transkardijalno preliveni sa heparinizovanim fiziološkim rastvorom (1 U/ml natrijum heparin u 0,9% NaCI, sterilno filtriran), ohlađeni u ledeno hladnoj vodi i onda sa 4% paraformaldehidom na otprilike 4°C. Mozak je uklonjen, i želudac je isečen kako bi se dalje izložili unutrašnji organi. Mozak i leš životinje stavljeni su u paraformaldehid, osim odrezanog deta repa koji je zamrznut.

Tkiva za lipidnu analizu (grupe A, B i F; životinja 6, 4i5, respektivno)

[0461]Nakon sakupljanja krvi, životinje su eutanazirane gušenjem pomoću C02. Deo repa je odrezan i sakupljen pre perfuzije i zamrznut za moguću genotipizaciju. Perikardijalna šupljina bila je izložena. Za lipidne analize, 4-6 miševa po grupi bili su transkardijalno preliveni ledeno hladnim (prethodno ohlađenim) heparinizovanim fiziološkim rastvorom (1 U/ml natrijum heparin u 0,9% NaCI, sterilno filtriran).

[0462]Tokom sakupljanja, tkiva su izmerena i onda zamrznuta ili suvim ledom ili postavljanjem u zamrzivač na -80°C. Mozak je podeljen na levu i desnu hemisferu. Desna je korišćena za lipidnu analizu pomoću MS. Leva je analizirana na moguće N-acetil-L-aspartat (NAA) analize. Tkiva su čuvana na -80°C do početka analiza.

[0463]rhASA redukovala je nakupljanje sulfida u kičmenoj moždini MLD miševa, posebno u beloj masi, slika 114. Morfometrijske analize kičmene moždine pokazale su da je optička gustina alkijanski plavog obojenja statistički značajno redukovana nakon doziranja rhASA, slika 115. MLD miševi tretirani sa rhASA takođe su pokazali smanjenu lizozomsku aktivnost u mozgu, slika 116. Ovo smanjenje je statistički značajno kod grupa kojima je data visoka doza (0,21mg - 520 mg/kg težine mozga) u poređenju sa životinjama tretiranih inertnim medijumom, slika 117.

[0464]Imunotolerantni MLD (hASAC69S/ASA(-/-)) miševi starosti preko godinu dana primili su rhASA intratekalno-lumbalnom administracijom jedanput svake nedeije u periodu od 4 nedeije (ukupno 4 doze). Doze su bile u inertnom medijumu (154 mM NaCI, 0,005% polisorbat 20, pH - 6,0), 0,04, 0,12, 0,21 mg/dozi {normalizovane doze bile su 100, 300 i 520 mg/kg težine mozga, respektivno). U krajnjim vremenskim tačkama efikasnost je procenjena imunohistohemijskom procenom klirensa sulfatida i lizozomske aktivnosti u mozgu i kičmenoj moždini. Segmenti kičmene moždine i mozga su obojeni koristeći alkijansko plavo obojenje koje obeležava sulfatide u tkivima. Segmenti mozga su takođe obojeni u prisustvu lizozomski vezane membrane proteina (LAMP) kao indikator lizozomskog procesa. Dodatno, morfometrijske analize vršene su nad sekcijama sa alkijansko plavim i LAMP obojenjem kičmene moždine (vratni, grudni i slabinski pršljen) i mozga.

[0465]Ovi preliminarni rezultati pokazuju efikasnost intratekalne lumbalne administracije rhASA. U poređenju sa miševima kontrolisanim inertnim medijumom, MLD miševi tretirani sa rhASA prikazuju dokaz napretka u histološkim markerima bolesti, kao što je redukovanje nakupljanja sulfatida (zabeleženo alkijanski plavim obojenjem) i lizozomska aktivnost u mozgu. Ove histopatološke promene posmatrane su blizu mesta administracije (slabinski deo kičmene moždine) u distalnom delu kičmene moždine kao i distalnim delovima mozga.

PRIMER 18 - BIODISTRIBUCIJA 2

Pregled

[0466]U ovoj studiji, 36 mužjaka i 36 ženki mladih cinomolgus majmuna (mlađi od 12 meseci na početku), svaki je dodeljen jednoj od 5 grupa za doziranje i data im je rhASA pri dozama od (kontrola uređajem; životinjama je dozirano 0,6 ml PBS-a), 0 (kontrolisano inertnim medijumom), 1,8, 6,0 ili 18,6 mg (grupe 1, 2, 3, 4 i 5, respektivno) svake druge nedeije u periodu od 6 meseci za ukupno 12 doza. Sve doze administrirane su infuzijom zapremine 0,6 ml, praćeno ispuštanjem 0,5 ml PBS-a datim preko 10 minuta (tabela 41).

MATERIJALI I METODE

Sakupljanje tkiva

[0467]Mozgovi su isečeni u moždani matriks pri debljini koronalnih delova od 3 mm. Svaki mozak je ceo iseciran na koronalne delove uključujući: neokorteks (uključujući frontalni, parijetalni, temporalni i potiljačni režanj), paleokorteks (mirisni deo velikog mozga i/ili piriformni režanj), bazalne ganglije (uključujući caudate i putamen), limbički sistem (uključujući hipokampus i cingulate gyri), talamus/hipotalamus, regione srednjeg mozga (uključujući substantia nigra), cerebelum, pons i produženu moždinu. Lokacije sa kojih se uzorkuju pojedinačna tkiva (preko 4-mm uzoraka biopsije) prikazane su na slikama 133-138. Delovi na slikama od 133-138 su University of VVisconsin and Michigan State Comparative Mammalian Brain Collections, (takođe National Museum of Health and Medicine). Uzorak 22 nije sakupljen i ova struktura nije prisutna tokom autopsije. Svi uzorci mozga zamrznuti su i čuvani na -60°C ili niže pre analiza za rhASA koristeći ELISA test.

[0468]Prvi moždani presek i svaki drugi nakon toga fiksiran je u formalinu za histopatološku i imunohistohemijsku evaluaciju. Drugi moždani presek i svaki naredni zamrznut je za analizu koncentracija test jedinjenja. Pre zamrzavanja, uzorci mozga uzeti su iz desne porcije, numerisane parnim brojevima, analize test jedinjenja preseka mozga za analize biodistribucije. Lokacije uzoraka mozga fotografisane su pri autopsiji i zabeležen je broj preseka mozga. Uzorci su dobijeni koristeći ili 4 mm cirkular ili isečak skaplelom kako bi se optimizovala količina sakupljene bele mase. Svi uzorci zamrznuti su i čuvani na -60°C ili na nižoj temperaturi za moguće analize test jedinjenja.

[0469]Kičmena moždina (vratni, grudni i slabinski pršljen) isečena je na sekcije od po 1 cm. Prvi presek i svaki naredni fiksiran je u formalinu za histopatološke i imunohistohemijske analize. Drugo parče kičmene moždine i svako naredno parče zamrznuto je na -60°C ili na nižoj temperaturi za analizu test jedinjenja. Distribucija ovih parčića prilagođena je tako da su delovi sa vrhom intratekalnog katetera (presek 0) fiksirani u formalinu i analizirani na histopatologiju.

Priprema mozga, jetre, kičmenih produžetaka i određivanje koncentracije rhASA

[0470]Preseci mozga, kičmene moždine i uzorci jetre analizirani su koristeći validirane metode u saglasnosti sa "United States Food and Drug Administration" (FDA), regulacijom dobre laboratorijske prakse (GLP) 21 CFR, deo 58 i sa primenljivim "Midvvest BioResearch" standardnim operativnim procedurama. Uzorci tkiva su homogenizovani u puferu za liziranje, centrifugirani kako bi se uklonili ostaci bilo kojih tkiva i čuvani na -80°C, dok ne počnu testovi. rhASA koncentracija u rastvorljivim frakcijama homogenata određene su ELISA testom koristeći poliklonska zečja antitela SH040 kao "capture" antitelo i HRP (peroksidaza rena) konjugovano anti-ASA monoklonsko antitelo 19-16-3 kao antitelo za detektovanje. Nakon koraka spiranja kako bi se uklonili nevezani materijali, rastvor tetrametilbenzidin (TMB) supstrata reagovao je sa peroksidom u prisustvu HRP konjugovanog antitela kako bi proizveo kolorimetrijski signal koji je proporcionalan sa količinom rhASA vezane za anti ASA antitelo u inicijalnom koraku. Rezultujuća količina rhASA u svakom tkivu homogenat3 interpolirana je iz standardne krive.

[0471]Uzorci su takođe analizirani testom određivanja proteina bicinhonininske kiseline (BCA) kako bi se dobila koncentracija proteina u uzorku. Koncentracija proteina za svaki uzorak određena je interpolacijom standardne krive albumina. Rezultati koncentracije rhASA su onda normalizovani do ukupne količine proteina u ekstraktima tkiva kao što je određeno testovima bicinhonininske kiseline.

[0472]rhASA nivoi svih uzoraka za inertni medijum, grupe doza od 1,8 mg/dozi, 6,0 mg/dozi i 18,6 mg/dozi prikazane su na slikama 118, 119, 120 i 121, respektivno. rhASA nivoi svih uzoraka za oporavak životinja za kontrolu uređajem, inertni medijum, grupe doza od 1,8 mg/dozi, 6,0 mg/dozi i 18,6 mg/dozi prikazani su na slikama 122, 123, 124, 125 i 126, respektivno.

[0473]rhASA nivoi za izabrane uzorke koji su uzeti blizu površine (moždane opne) mozga prikazani su na slici 127. rhASA nivoi za izabrane uzorke za koje se smatra da sadrže uglavnom duboku belu masu prikazani su na slici 128. Bela masa je izgrađena od snopova mijelinizovanih nervnih ćelija (ili aksona). Izabrani uzorak koji sadrži uglavnom materijal iz duboke sive mase prikazan je na slici 129. Siva masa sadrži neuronske ćelije tela suprotno od bele mase. Vrednosti rhASA u odabranim uzorcima sa površine, iz duboke bele i sive mase prikazani su za svaku grupu za doziranje na slici 130.

[0474]Podaci koncentracije kičmene moždine prikazani su na slici 131.

[0475]Podaci za koncentraciju jetre prikazani su na slici 132.

[0476]Nivoi koncentracije rhASA u jetri, kičmenoj moždini i mozgu uređaja i kontrolnih grupa doziranih inertnim medijumom su bile merljive u nekim slučajevima. Nivoi u jetri i kičmenoj moždini bili su niži nego u bilo kojoj grupi tretiranoj sa rhASA. Nivoi rhASA mereni u životinjama kontrolisanim uređajem i životinjama doziranim inertnim medijumom predstavljaju unakrsnu reaktivnost (eng. cross reactivitv) između anti-rhASA antitela korišćenih u ELISA testu sa nativnim proteinom cinomolgus majmuna. Objavljene prednosti u tkivima životinja kontrolisanih uređajem i životinja doziranim inertnim medijumom ne predstavljaju kvantitativne vrednosti za rhASA u tkivima cinomolgus majmuna zato što stepen unakrsne reaktivnosti između antitela i cinomolgus ASA nije poznat i zbog činjenice da je kao standard u testu korišćena rhASA. Međutim, varijacija u nivoima detektovane rhASA između tkiva kontrolisanih uređajem i tkiva doziranih inertnim medijumom može da se interpretira kao varijabilnost relativnih količina rhASA kod cinomolgus majmuna u različitim tkivima i anatomskim regionima.

[0477]rhASA nivoi u delovima kičmene moždine bili su u opsegu 160-2352, 1081-6607 i 1893-9252 ng/mg proteina kod mužjaka i 0-3151, 669-6637 i 1404-16424 ng/mg proteina kod ženki za grupe kojima se dozira 1,8, 6,0 i 18,6 mg/dozi, respektivno (slika 127). Nivoi rhASA bili su viši u slabinskom regionu kičme nego u vratnom. Nivoi rhASA proteina detektovani u jetri reagovali su na dozu u grupama tretiranim sa rhASA i bili su veoma niski u grupama sa inernim medijumom. Srednje vrednosti nivoa rhASA bile su 88, 674 i 2424 kod mužjaka i 140, 462 i 1996 ng/mg proteina kod ženki za grupe kojima je dozirano 1,8, 6,0 i 18,6 mg/dozi, respektivno (slika 128).

[0478]Ukupno, nivoi rhASA izgleda da su povezani sa dozom u uzorcima pripremljenim iz delova kičmene moždine i jetre grupa kojima je dozirana rhASA. Mnogi testirani regioni mozga pokazali su čist odnos doza između rhASA nivoa i rhASA administracije, dok su drugi bili više nepouzdani. Generalno, nivoi rhASA u mozgu povećani su doziranjem rhASA.

PRIMER 19: FARMAKOKINETIKA (PK) I BIODISTRIBUCDA IT NASUPROT IV ADMINISTRIRANE rhASA

[0479]Cilj ove studije je da se oceni farmakokinetika (PK) i biodistribucija različitih terapeutskih enzima izmene nakon intratekalne (IT) i intravenozne (IV) administracije cinomolgus majmunima.

[0480]U ovoj studiji, ukupno 12 mužjaka i 12 ženki cinomolgus majmuna sa intratelano-lumbalnim (IT-L) kateterima nasumično su podeljeni u četiri grupe za lečenje prema telesnoj težini za fazu la (I2S administracija) i fazu lb (rhASA administacija).

[0481]Krv i CSF (iz IT-CM katetera) su sakupljeni u specifičnim intervalima nakon doziranja u obe faze. Nakon poslednjeg sakupljenog uzorka iz faze la, životinjama je dozvoljen period ispiranja od 7 dana pre početka faze lb.

[0482]Nakon poslednjeg uzorka sakupljenog iz faze lb, životinjama je dozvoljen period ispiranja od 7 dana pre početka faze 2. Ukupno 12 mužjaka i ženki cinomolgus majmuna iz faze lb nasumično su podeljeni u 12 grupa za lečenje I2S prema telesnoj težini (grupe la-6a) i rhASA (grupe lb-6b).

[0483]Apsolutna bioraspoloživost rhASA u serumu praćena IT-L administracijom je -30 do 40%. Suprotno tome, samo 0,5% IV doze je bioraspoloživo u CSF-u.

[0484]Izlaganje rhASA u serumu raste na više nego proporcionalan način prateći IT-L administraciju.

[0485]Prateći IT-L administraciju, izlaganje rhASA u CSF-u raste na više nego proporcionalan način što više doza raste.

[0486]Bioraspoloživost rhASA u serumu praćeno IT-L administracijom je -30-40%. Suprotno, samo 0,5% od doze administrirane IV putem je bioraspoioživo u CSF-u.

PRIMER 20 - LEČENJE PACIJENATA KOJI PATE OD MLD

[0487]Direktna administracija u CNS npr. IT dostavom može da bude korišćena za efikasno lečenje pacijenata koji pate od MLD. Ovi primeri ilustruju studiju multicentrične eskalacije doze namenjene za ocenjivanje bezbednosti za davanje do 3 nivoa doze administriranjem rhASA putem uređaja za intratekalnu dostavu lekova svake druge nedeije u periodu od 40 nedelja pacijentima sa kasnim infantilnim MLD-om. Različiti primeri uređaja za intratekalnu dostavu lekova pogodnih za lečenje ljudi prikazane su na slikama 94, 95, 96 i 97.

[0488]Biće uključeno do 20 pacijenata:

Grupa 1: 5 pacijenata (najniža doza)

Grupa 2: 5 pacijenata (srednja doza)

Grupa 3: 5 pacijenata (najviša doza)

5 pacijenata biće nasumično izabrani za ne dobijanje tretmana.

[0489]Pacijenti za studiju izabrani su na osnovu sledećih kriterijuma koji uključuju: (1) pojavu prvih simptoma pre 30 meseci života; (2) pokretnost za vreme proveravanja (definisano kao sposobnost da sam ustane i hoda 10 koraka unapred pri čemu se drži jednom rukom); (3) prisustvo neuroloških znakova za vreme provere. Obično je isključena istorija transplantacije hematopoetskih stem ćelija.

[0490]Bezbednost povećanja doza administrirane rhASA IT injektiranjem u periodu od 40 nedelja kod dece sa kasnim infantilnim MLD-om je određena. Dodatno, ocenjen je uticaj kliničke aktivnosti rhASA na loše motorne sposobnosti kao i farmakokinetika pojedinačne i ponovljene doze u serumu i koncentracije u cerebrospinalnoj tečnosti (CSF).

Primeri IT dostave HNS

PRIMER 21: HRONIČNA INTRATEKALNA ADMINISTRACIJA HEPARAN N-SULFATAZE

[0491]Ovaj primer pokazuje da intratekalna administracija može da se koristi za efikasnu dostavu lizozomskog enzima, kao što je rekombinantna humana heparan N-sulfataza (rhHNS) u moždana tkiva za lečenje neuroloških simptoma mukopolisaharidoze IIIA (MPS IIIA, Sanfilippov sindrom tipa A), koja definiše kliničke odlike ovog poremećaja. Eksperimenti opisani u ovom primeru pokazuju to da je hronična IT administracija rhHNS dobro tolerisana sa aktivnošću enzima vezane za dozu koja je detektovana u mozgu, kičmenoj moždini i jetri.

[0492]Ukratko, intratekalna (IT) formulacija rekombinantne humane N-sulfataze (HNS) razvijena je za lečenje neuroloških simptoma mukopolisaharidoze IIIA (MPS IIIA; Sanfilippov sindrom tipa A), definisanih kliničkih odlika ovog poremećaja. Postoje proseČna starost pacijenata sa MPS IIIA 4,5 godine, izvršene su ključne toksikološke studije za HNS kod mladih cinomolgus majmuna kako bi se ocenili efekti na razvoj mozga. Majmunima su bili implantirani uređaji za intratekalnu (IT)-lumbalnu dostavu lekova i davana in je doza svake druge nedeije putem kratkotrajne infuzije (1,5, 4,5 ili 8,3 mg/dozi HNS-a u periodu od šest meseci; ukupno 12 doza) gde su životinje kontrolisane uređajem i inertnim medijumom dobijale rastvor fosfatnog pufera ili inertnog medijuma, respektivno. Nad osam životinja po grupi (4/polu) izvršena je autopsija na 3 i 6 meseci (kod grupe kontrolisane uređajem vršeno na 3 meseca) i nad 8 životinja iz grupe sa inertnim medijumom i sa 3 HNS doze mesec dana nakon poslednje IT doze. Nisu uočeni klinički znaci vezani za HNS ili loše lezije centralnog nervnog sistema. U poređenju sa kontrolom uređajem, bilo je prodiranja ćelija blage do minimalne ozbiljnosti u moždanim opnama/perineuriumu koji okružuju mozak/kičmenu moždinu u korelaciji sa nestalnim rastom leukocita cerebrospinalne tečnosti, pretežno eozinofila koji se u velikoj meri redukuju mesec dana nakon poslednje doze. Ove promene nisu povezane sa bilo kojim neželjenim morfološkim promenama u mozgu ili kičmenoj moždini. Izgleda da postoji trend vezan za dozu prema višim srednjim vrednostima CSF HNS nivoa i nivoa HNS aktivnosti u tkivima mozga, kičmene moždine i jetre. Nivo neželjenih efekata nije uočen na 8,3 mg/dozi datoj svake druge nedeije, što je najviša administrirana doza, ukazujući na to da je moguća bezbedna intratekalna administracija HNS-a pri različitim koncentracijama uključujući i one više od 8,3 mg/dozi.

Sanfilippov sindrom tipa A

[0493]Mukopolisaharidoza tipa IIIA (MPS IIIA; Sanfilippov sindrom tipa A), retki poremećaj lizozomske bolesti nakupljanja zahvata približno jednog u 100 000 ljudi širom sveta. Potiče od odsustva ili defektne funkcije heparan N sulfataze (HNS) (Neufeld EF, et al. The Metabolic and Molecular Bases of Inherited Disease (2001) pp. 3421-3452), egzosulfataze uključene u lizozomski katabolizam glikozaminoglikan (GAG) heparan sulfata. U odsustvu ovog enzima, GAG heparan sulfat akumuliše se u lizozomima neurona i glijalnih ćelija, sa manjom akumulacijom van mozga. Definisana klinička odlika ovog poremećaja je degeneracija centralnog nervnog sistema (CNS) koja rezultuje u gubitku ili nemogućnosti da dostigne glavni progred razvoja. Progresivno kognitivno opadanje dovodi do demencije i prerane smrti.

IT dostava rhHNS

[0494]Pošto je prosečna starost pacijenata sa MPS IIIA 4,5 godine, izvršene su ključne toksikološke studije HNS-a kod mladih cinomolgus majmuna (selekcija vrste je bazirana na genetičkim i anatomskim sličnostima sa ljudima) kako bi se ocenili efekti razvoja mozga. Jednakost godina majmuna i ljudi citirano iz literature je u opsegu od 7,6 meseci do 12,1 meseci, a za decu 30 do 40 meseci starosti (Hood RD, Developmental and Reproductive Toxicology; A practical approach

(2006) p. 276). Kao deo ovog rada, izvršena je šestomesečna toksikološka studija nad mladim cinomolgus majmunima kako bi se procenila IT slabinska administracija HNS-a. Podaci dobijeni od prethodne jednomesečne toksikološke studije nad mladim cinomolgus majmunima doveli su do selekcije nivoa doza i plana šestomesečne studije ponavljanja doza kod mladih cinomolgus majmuna. Prema saznanjima, ovo je prva studija koja uključuje hroničnu IT administraciju ERT mladim nehumanim primatima.

[0495]Pedeset šest mužjaka i 56 ženki mladih cinomolgus majmuna (Macaca fascicularis) starih oko 6 do 9 meseci i teških 0,82 do 1,81 kg korišćeni su u ovoj studiji. Majmuni su hranjeni sa 15 biskvita "PMI-Certified Primate Diet 5048"

(Richmond, IN) dnevno. Vodu su dobijali po volji preko sistema za automatsko filtriranje vode koji je bio stopiran u periodima sakupljanja uzoraka urina. Majmuni su grupno smešteni (dva po kavezu) u periodu od 2 do 4 nedeije po

dolasku u kavezima od nerđajućeg čelika izuzev tromesečnih majmuna; oni su individualno čuvani u kavezima od nerđajućeg čelika. Tokom trajanja studije, svi majmuni su smešteni u pojedinačne kaveze od nerđajućeg čelika u sobama sa kontrolisanom temperaturom i vlažnošću vazduha sa ciklusom od 12 sati u svetlu i 12 sati u mraku.

[0496]Pre početka studije, svim majmunima su hirurški implantirani SC portovi i IT kateteri. Pre operacije administrirani su prednizolon natrijum sukcinat (IV, 30 mg/kg) i fluniksin meglumin (intramuskulatorno [IM], 2 mg/kg). Majmuni su prethodno tretirani SCatropin sulfatom (0,04 mg/kg), sedatirani IM ketamin HCI; 8 mg/kg), intubirani i održavani na oko 1 l/min kiseonika i 2,0% izoflurana. Rez je napravljen preko dorzalnih procesa slabinskog dela kičme (U, U ili U) i izvršena je hemilaminektomija za insertaciju uskog poliuretanskog katetera (25 cm dužine, 0,9 mm spoljni prečnik x 0,5 mm unutrašnji prečnik, sa šest rupa sa strane prečnika od 0,33 mm) na L;, U ili L5. Kateter je insertovan kroz mali duralni rez i napredovao je otprilike 10 cm do površine torako-lumbalnog spoja. Titanijumski SC port bio je zakačen za IT kateter i implantiran u SC tkivo. Pravilno postavljanje katetera potvrđeno je mijelogramom koristeći Isovue-300 (0,8 ml; Bracco Diagnostics, Inc., Princeton, NJ). Posle oporavka od operacije, majmuni su primili butorfanol tartarat (IM, 0,05 mg/kg) i ceftiofur natrijum (IM, 5,0 mg/kg dvaput dnevno, 2 dana).

[0497]U ovom primeru, HNS je obezbeđen u IT formulaciji inertnog medijuma uključujući i 5 mM natrijum fosfata, 145 mM natrijum hlorida i 0,005% polisorbata 20 (pH vrednost 7,0). Doze HNS-a su administrirane svake druge nedeije kao kratkotrajne infuzije otprilike 11 minuta: 0,6 ml (4 minuta) praćeno spiranjem rastvora fosfatnog pufera (PBS) (7 minuta). Majmuni u grupi kontrolisanoj inertnim medijumom primili su samo IT formulaciju; DC majmuni primili su PBS (pH vrednost 7,2) IT.

Relativna učestalost bolesti i smrtnost

[0498]Nije bilo smrti ili ranih žrtvovanja vezanih za HNS. Nisu zabeleženi ni klinički znaci vezani za HNS pri doziranju ili tokom dnevnog posmatranja. Iščašenje, svrab, tremori i ataksija posmatrani tokom i nakon doziranja smanjeni su u roku od nekoliko minuta do oko 4 sata nakon administracije i smatrani su odgovorom vezanim za zapreminu pre nego za reakciju sa HNS-om ili inertnim medijumom. Klinički znaci posmatrani tokom i odmah nakom doziranja viđeni su kod učestalnosti kontrolnih grupa koje mogu da se porede (DC i/ili grupa dozirana inertnim medijumom); nije bilo dokaza reakcije na dozu. Generalno, učestalost kliničkih znakova pri doziranju padala je sa svakom sledećom dozom. Nije bilo promena vezanih za HNS u telesnoj težini, uzimanju hrane, fizičkim i neurološkim nalazima ili promenama u ECG ili oftamološkim pregledima.

Klinička patologija

[0499]Nije bilo promena u hematologiji, herniji seruma, koagulaciji ili parametara iz analize urina u bilo kom intervalu za koje se smatra da su povezane sa HNS-om.

CS F brojanje ćelija i hernija

[0500]Bilo je povećanja u srednjoj vrednosti broja CSF leukocita za sve grupe koje se odnose na dozu 24 sata nakon doziranja. Generalno, bilo je porasta broja leukocita sa svakom administriranom dozom. Sakupljena CSF od otprilike polovine majmuna pre doziranja pokazala je da ovi efekti opadaju za 2 nedeije od prethodne doze. Nakon doze 5, u dodatku povećanja leukocita, posmatrane su više srednje vrednosti u grupi ukupnog proteina i albumina u CSF-u kod mužjaka doziranih sa HNS-om u grupama koje dobijaju 4,5 i 8,3 mg/dozi (od 4- do 5- fold) u poređenju sa srednjom vrednošću pre doziranja (P <0,05naspram DC i grupe 0 mg/dozi); manji trend evidentan je kod ženki dozirane HNS-om.

HNS koncentracije i analiza antitela

[0501]Obično, srednja vrednost HNS nivoa u serumu bila je manja od granice detekcije (LOD) za sve test grupe u svim vremenskim tačkama. HNS koncentracija u CSF-u majmuna u kontrolnim DC i grupama doziranim inertnim medijumom generalno je bila ispod granice kvantifikacije (LOQ). Iako nisu izvršene statističke analize izgleda da postoji trend koji se odnosi na doze prema višim srednjim vrednostima nivoa HNS-a u CSF-u u grupama sa 1,5, 4,5 i 8,3 mg/dozi. Srednja vrednost HNS nivoa u CSF pre doziranja bila je znatno niža nego posle doziranja. Srednja vrednost HNS koncentracija za grupe (oba pola) nakon 6 meseci po završetku studije (osnovna i autopsija oporavljenih životinja) sumirana je u tabeli 46. Na datim nivoima doze, izgleda da se srednja vrednost koncentracija HNS-a u CSF-u održava u istom opsegu (slika 146A) uprkos nivoima anti-HNS antitela u serumu i CSF-u, koji nastavljaju da rastu tokom studije.

[0502]U periodu od 6 meseci/oporavku, nijedan od majmuna u grupi kontrolisanoj uređajem (samo PBS) ili doziran inertnim medijumom nije razvio anti-HNS antitela u serumu ili CSF-u u bilo kom vremenskom trenutku testiranja. Svi majmuni testirani u grupama od 1,5, 4,5 i 8,3 mg/dozi bili su negativni (<LOD) na anti-HNS antitela u serumu i CSF uzorcima koji su sakupljeni pre studije (za CSF) i pre doze 2. Do kraja studije, svi majmuni testirani su pozitivno na anti-HNS antitela u serumu.

[0503]Svi majmuni u grupama od 1,5 mg/dozi i 8,3 mg/dozi i šest od osam majmuna u grupi od 4,5 mg/dozi testirano je pozitivno na anti-HNS antitela u CSF-u u jednoj ili više vremenskih tačaka. Pošto za dva majmuna u grupi od 4,5 mg nisu sakupljeni uzorci ni u jednom trenutku vremena uključujući i autopsiju, izgleda da ovi rezultati ukazuju na to da svi majmuni kojima je doziran HNS proizvode odgovor antitela.

[0504]Na sva tri nivoa doza, koncentracije anti-HNS antitela u serumu su detektovane nakon doze 2 i nivoi su se primetno povećali nakon doze 4. Iako nisu izvršene statističke analize, izgleda da se javlja trend, prema višim koncentracijama antitela u serumu; do kraja studije, nivoi su bili komparativni preko 3 HNS grupama za doziranje (slika 146B). Nivoi anti-HNS antitela u serumu uvek su bili viši nego u CSF-u tokom vremenskog perioda ove studije (od 9 do 236-fold serum/CSF koncentracija antitela); najviši odnosi koncentracija u serumu prema CSF koncentracijama (98 i 236-fold) viđeni su pri nivoima doze od 8,3 mg u ranijim periodima doziranja (na 6 i 10 nedelja).

[0505]Koncentracije anti-HNS antitela u serumu povećane su 9-, 16- i 16-puta na nivoima doza od 1,5 mg, 4,5 mg i 8,3 mg/dozi, respektivno, u ranijim periodima doziranja ( od 6. do 14. nedeije). Tokom istog vremenskog perioda, koncentracije antitela u CSF-u povećane su 30-, 41- i 52-puta na nivoima doza od 1,5 mg, 4,5 mg i 8,3 mg/dozi, respektivno (slika 146B); supstancijalni nivoi ostaju nakon jednomesečne faze oporavka bez doziranja (tabela 47).

[0506]Anti-HNS antitela javljaju se kasnije u CSF-u nego u serumu (slika 146C). Nisu uočene očigledne razlike koncentracija antitela u serumu i CSF-u (statističke analize nisu izvršene zbog male količine uzorka); nisu bile uočljive razlike između mužjaka i ženki u odgovoru antitela.

[0507]U prisustvu anti-HNS antitela u CSF-u, srednja vrednost koncentracija HNS-a u CSF-u izgleda da se održava, sugerišud da prisustvo anti-HNS antitela u serumu i CSF ne menja nivo koncentracija IT doziranog HNS. Šestomesečne i analize oporavka grupa pri administraciji HNS-a pri ponavljanju doza u periodu od šest meseci ukazivalo je da su koncentracije anti-HNS antitela u privremenom tromesečnom i šestomesečnom žrtvovanju majmuna bile poredive (slika 146C).

Makroskopske pojave koje nastaju u toku bolesti i hlstopatološki nalazi

[0508]Na svim nivoima doza (iako ne u svim intervalima žrtvovanja, specifičnim za pol niti na način koji se odnosi na dozu) eozinofilni infiltrati (slika 147A) prisutni su u parenhimu mozga (pretežno u sivoj masi), kičmenoj moždini (siva i bela masa), dorsalnim kičmenim korenima nerava/ganglijama i trigeminalnim ganglijama (samo mužjaci sa srednjom dozom) (slike 147B-D). Infiltrati su tumačeni kao sekundarni infiltrati infiltrata moždanih opni/perineuriuma i/ili u prisustvu (penetriranom pomoću) HNS sa parenhimom tkiva. Iako je bilo brojnih tipova inflamatornih promena, majmuni su tolerisali administraciju HNS-a i nijedan od infiltrata ne smatra se da se odnosi na ili da izaziva neželjene morfološke promene u nervnom sistemu parenhima. Specifično, nije bilo dokaza neuronske nekroze/degeneracije niti glijalnog odgovora koji se odnosi na HNS administraciju.

[0509]Mikroglioza u sivoj masi mozga i kičmene moždine povezana sa ćelijskim infiltratima, pretežno eozinofilnim, bila je relativno Česta u prethodno izvršenim jednomesečnim toksikološkim studijama mladih majmuna; ove promene bile su relativno neuobičajene na 3 meseca pre žrtvovanja tokom šestomesečne studije, ali preostali dokaz ovakvog odgovora može i dalje da se vidi u šestomesečnoj grupi (slika 147F). Mikroglijalne reakcije nastoje da rano reaguju sa nekim (tipično baziranom na proteinima) centralno administriranim (ili centralno reaktivnim) test jedinjenjem. Eozinofilni inflitrati korelisali su sa brojem eozinofila u CSF-u HNS doziranih majmuna, iako ove ćelije nisu prisutne u dovoljnom broju da izazovu neželjenu reakciju.

[0510]Na svim nivoima doza, eozinofilni infiltrati posmatrani su u dorsalnom korenu kičmenog nerva/gangliji za većinu grupa doziranih sa HNS, bez obzira na pol. Infiltrati u različitim tkivima nervnog sistema tumačeni su kao sekundarni infiltrati infiltrata moždanih opni/perineuriuma i/ili u prisustvu (penetrirani pomoću) HNS-a u parenhimu tkiva. U oporavku životinja pre žrtvovanja, efekti vezani za HNS su generalno ili odsutni ili redukovani do kontrolnih nivoa. Neke promene, kao što je mikroglioza u kičmenoj moždini, potpuno su smanjene nakon perioda oporavka. Nijedna od promena vezana za HNS izgleda da nije povezana sa bilo kojim neželjenim strukturnim mikroskopskim promenama u mozgu ili kičmenoj moždini. Neuronska nekroza nije zabeležena u mozgu, kičmenoj moždini ili gangliji.

Aktivnost HNS enzima

[0511]U šestomesečnim/grupama oporavka, aktivnost HNS enzima u kičmenoj moždini i mozgu grupa dozirani inertnim medijumom (0,0-0,154 nmol/hr/mg proteinu) bila je slična nivoima prikazanim u tkivima privremenih tromesečnih grupa

(0,0-0,0.154 nmol/hr/mg proteinu). Nivoi aktivnosti enzima u kičmi bili su viši (približno za red veličina viši nego u slabinskom delu kičme) od nivoa izmerenih u mozgu ili jetri. Grupe sa 4,5 mg i 8,3 mg/dozi imaju slične nivoe. Aktivnosti HNS enzima u presecima kičmene moždine su bile u opsezima od 3,9-18,6, 13,1-67,1 i 3,6-69,2 nmol/hr/mg proteinu kod mužjaka (slika 148A) i 1,8-16,2, 4,5-61,2 i 21,1-66,0 nmol/hr/mg proteinu kod ženki (slika 148B) za grupe sa 1,5, 4,5 i 8,3 mg/dozi, respektivno. U kičmenom tkivu nakon jednomesečnog perioda oporavka, nivoi aktivnosti enzima vraćaju se na nivoe konzistentne vrednostima kod životinja kontrolisanih medijumom.

[0512]Aktivnost HNS enzima u presecima mozga u opsegu je od 0,03-16,0, 0,30-55,7 i 0,15-21,2 nmol/h/mg proteina kod mužjaka (slika 148C) i 0,04-5,1, 0,0-14,4 i 0,9-33,2 nmol/h/mg proteina kod ženki (slika 148D) za grupe od 1,5, 4,5 i 8,3 mg/dozi, respektivno. U tkivu mozga nakon oporavka, nivoi aktivnosti enzima vraćaju se na nivoe konzistentne vrednostima kod životinja kontrolisanih medijumom.

[0513]Fold-promena u aktivnosti različitih površina u mozgu poređena sa endogenim nivoima (DC grupa) prikazana je na slici 149A. Iako je trend ka porastu distribucije zabeležen u uzorcima površine, lumbalno U administrirani HNS mogao bi da penetrira u periventrikularne površine u mozgu.

[0514]U šestomesečnim grupama/grupama oporavka, srednja vrednost nivoa aktivnost u jetri bila je 0,50, 2,41 i 6,65 nmol/h/mg proteina kod mužjaka i 1,04, 4,15 i 7,62 nmol/h/mg proteina kod ženki za grupe od 1,5, 4,5 i 8,3 mg/dozi, respektivno (slika 149B). Nivoi kod majmuna kontrolisanih inertnim medijumom bili su 0,089 nmol/h/mg proteina za mužjake i 0,083 nmol/h/mg proteina za ženke. Prateći period oporavka, nivoi HNS aktivnosti u jetri bili su poredivi sa osnovnim kontrolnim nivoima za sve grupe doziranja.

Imunohistohemiia

[0515]HNS dostava u CNS bolusnim IT injektiranjem u privremenim tromesečnim grupama i šestomesečnim grupama/grupama za oporavak rezultovala je u dostavi imunoreaktivnog test jedinjenja pia-arahnoidnim tkivima kičmene moždine i mozga. Kod majmuna koji su primili HNS IT putem, imunoreaktivni materijal je konstantno prisutan u moždanim opnama i perivaskularnim makrofagama (mozak/kičmena moždina) i promenljivo prosutna u okolnim populacijama glijalnih i neuronskih ćelija. Manjak obojenja kod majmuna kontrolisanim inertnim medijumom (slika 150A) prikazuje specifičnost antitela za humani HNS. Generalno, imunoreaktivnost je vezana za dozu (npr. koristeći semi-kvantitativnu skalu ocenjivanja, povećano imunohistohemijsko obojenje uočeno je, generalno, na način zavisnosti od doze). HNS dostava CNS-u preko bolusnog IT rezultovalo je u pozitivnom imunoobojenju cerebralnog korteksa i cerebeluma (slike 150B-D); međutim, imunoreaktivnost nije stalno evidentna u caudate/putamen regionu, srednjem mozgu ili dubljim regionima ponsa ili medule. Imunoreaktivnost je evidentna u jetrama (u sinusoidalnim linijskim ćelijama uključujući Kupfferove ćelije, ali ne u hepatocitima) svih majmuna kojima je administriran HNS. Imunoreaktivnost nije evidentna kod jedne ženke žrtvovane ranije (grupa od 4,5 mg/dozi) zbog curenja katetera koji nije mogao da bude popravljen.

[0516]U grupi od 1,5 mg/dozi, u suštini je evidentan potpuni oporavak sa izuzetkom jetre, moždanih opni mozga i kičmene moždine gde su evidentni neki ostaci imunoreaktivnosti. Na višim dozama (4,5 i 8,3 mg/dozi), intenzitet i učestalost imunoreaktivnosti niži su nego na kraju doziranja. Na svim nivoima doziranja, nivoi HNS u kičmenoj moždini, mozgu i jetri približni su onima viđenim u životinjama kontrolisanim inertnim medijumom nakon jednomesečnog perioda oporavka.

[0517]U ovoj studiji, dostava HNS svake druge nedeije administrirana IT u perodu od šest meseci generalno je tolerisana. Nije uočena nikakva velika promena u telesnoj težini, kliničkom statusu, oftamološkim/neurološkim/fizičkim pregledima, ECG-u, težini organa ili pojavi promene organa. Nalazi su bili ograničeni na prolazne promene u kliničkoj promeni CSF-a koje prate blagi do srednji infiltrati moždanih opni i epiduralno zapaljenje sa skoro potpunim preokretom kod svih, ali grupe sa najvišom dozom praćene su periodom oporavka. Posmatrana je široko rasprostranjena distribucija HNS kroz mozak i kičmenu moždinu.

[0518]IT administracija HNS-a svake druge nedeije izazvala je inflamatorni odgovor okarakterisan ostatkom infiltracije leukocita i izlivanjem albumina zabeleženim 24 sata nakon doze i pri autopsiji. Bez želje da se vezuje za neku određenu teoriju, ovo se verovatno odlikuje nestalnim, lokalizovanim i nepotpunim otvaranjem krvno moždane barijere vezane za promene u čvrstim vezama blizu vrha katetera rezultujući ulaskom leukocita i proteina plazme u CSF (Simard JM, et al. Lancet Neurol. (2007) 6, 258-268; Stamatovic SM, et al. Curr. Neurophannacol. (2008) 6, 179-192). Ovo može da bude rezultat dve komponente: jedne koja se odnosi na procedure administracije doze i druge koja se odnosi na IT administraciju proteina.

[0519]Prolazne promene u permeabilnosti krvno moždane barijere (bez značajnih razlika između grupa za doziranje i kontrolisanje 24 sata nakon doze pri glavnoj autopsiji), nisu praćene nikakvim kliničkim znakovima.

[0520]Javlja se trend koji se odnosi na dozu za više srednje vrednosti HNS nivoa u CSF-u; na datom nivou doza, srednja vrednost koncetracija HNS-a u CSF-u održava se u istom opsegu uprkos rastu nivoa anti-HNS antitela u serumu i CSF-u.

[0521]Ćelijska infiltracija u moždane opne blago do minimalne ozbiljnosti posmatrana je u mozgu i kičmenoj moždini kod mladih majmuna doziranim HNS-om. Ove mikroskopske promene takođe su zabeležene u životinjama kontrolisanim inertnim medijumom, ukazujući da je neki od odgovora povezan sa postavljanjem U katetera kao I na nespecifični inflamatorni odgovor na strane proteine. Uvođenje biološkog proteina u IT prostor, posebno onaj koji penetrira u CNS, skoro uvek izaziva neki stepen inflamatornog odgovora (Hovland DN, et al. Toxicol. Pathol. (2007) 35, 1013-1029; Butt MT, Toxicol. Pathol. (2011) 39, 213-219), koji, ako je prisutan u broju koji oštećuje susedna tkiva, predstavlja neželjeni efekat. U trenutnoj studiji, međutim, ove ćelije (pretežno eozinofili) izgleda da predstavljaju marker tkiva reakcije/penetracije i nisu nađene u dovoljnoj količini da bi predstavljale neželjeni efekat. Nijedna od promena koja se odnosi na HNS nije povezana sa bilo kojim neželjenim strukturnim mikroskopskim promenama u mozgu ili kičmenoj moždini. Nije bilo neuronske nekroze zabeležene u mozgu, kičmenoj moždini ili gangliji.

[0522]Evaluacija antitela anti-test jedinjenja važan je aspekat studija toksičnosti zbog porendjalnog uticaja neutrališućih ili vezujućih antitela na klirens ili biodistribuciju test jedinjenja (Ponce RP, et al. Regul. Toxicol. Phannacol.

(2009) 54,164-182). U ovoj studiji, pošto su zabeleženi kvantitativno slični nivoi aktivnosti HNS enzima u mozgu i kičmenoj moždini privremenim tromesečnim grupama i šestomesečnim grupama i održavaju se srednje vrednosti koncentracija HNS-a u CSF-u u istom opsegu uprkos povećanju nivoa anti-HNS antitela u serumu i CSF-u, sugerišući na aktivnost neutralizacije.

[0523]Javlja se trend prema višim nivoima aktivnosti HNS enzima u kičmenoj moždini, mozgu i jetri koji su bili najviši

blizu mesta injektiranja u lumbalnom regionu kičmene moždine i uniformna u mozgu, bez značajnih razlika rostralnog do kaudalnog i između desne i leve hemisfere. Nije zabeležen dokaz HNS akumulacije u mozgu i tkivima kičmene moždine u poređenju šestomesečne grupe sa tromesečnom privremenom grupom, lako je trend prema rastu distribucije zabeležen na uzorcima sa površine, lumbalno administriran HNS penetriran je duboko, u periventrikularne površine mozga. Aktivnost HNS enzima u jetri sugeriše da je HNS redistribuiran sistemski nakon IT dostave; nisu uočeni nikakvi neželjeni efekti vezani za HNS u jetri nakon evaluacije kliničkih i anatomskih patoloških parametara u ključnim studijama toksičnosti.

[0524]Generalno, kod imunohistohemijskih rezultata potvrđenih u aktivnosti enzima u tkivu posmatrana je imunoreaktivnost koja se odnosi na doze u kičmenoj moždini i mozgu pia-arahnoidnih moždanih opni i nervnim tkivima (neuroni, glijalne ćelije) koji su u neposrednoj blizini moždanih opni. Bila je dobra penetracija u sivoj masi cerebruma i cerebeluma nakon bolusnog IT injektiranja ili kratkotrajne IT infuzije. Iako imunoreaktivnost nije evidentna u dubljim strukturama kao što su bazalne ganglije ili centralni regioni talamusa/hipotalamusa, srednjeg mozga ili ponsa/medule, rezultati aktivnosti enzima ukazuju na to da je lumbalno IT administriran HNS penetriran u duboke, periventrikularne površine mozga. Stoga, imunohistohemija može da bude manje senzitivna tehnika za detektovanje biodistribucije test jedinjenja. Imunoreaktivnost je evidentna u Kupfferovim ćelijama i endotelnim ćelijama (ćelije sposobne za fagocitozu) jetre, ali ne i ćelije parenhima (hepatocite).

[0525]Analize šestomesečnih grupa/grupa oporavka sa ponavljanjem IT doza u toksikološkoj studiji mladih majmuna ukazuje na to da su promene vezane za HNS i prevremenom tromesečnom i žtrvovanju majmuna nakon šest meseci bile komparativne, uključujući parametre životinja u životu, kliničku i anatomsku patologiju, koncentracije HNS i anti-HNS antitela u CSF-u i serumu i distribuciju/subćelijsku lokaciju HNS-a u kičmenoj moždini, mozgu i jetri. U oporavku žrtvovanih majmuna, HNS efekti ili nisu bili prisutni ili su značajno redukovani. Stoga nisu uočeni nivoi neželjenih efekata u šestomesečnoj studiji nad mladim majmunima sa 8,3 mg/dozi, što je najviša administrirana doza.

[0526]Posmatrane promene u CSF celularnosti i koncentracijama proteina javljaju se kao morfološke promene zabeležene pri histopatološkoj evaluaciji i može da bude korisno kod pacijenata tretiranih HNS-om IT putem; ove promene smatraju se očekivanom reakcijom na IT administrirani protein i u velikoj meri se razlazu nakon perioda oporavka. Ovi podaci iz modela životinja obezbeđuju samopouzdanje za dalje korišćenje IT terapije kao strategiju lečenja neuroloških manifestacija lizozomskih bolesti nakupljanja. Ove toksikološke studije mladih nehumanih primata pokazuju izvodljivost i toleranciju administriranja HNS-a preko uređaja za IT lumbalnu dostavu lekova pedijatrijskim pacijentima. Neštetna CNS patologija i nedostatak neželjenih kliničkih znakova podržava nedavna odobrenja medicinskih istraživanja proizvoda i ukazuju na to da IT administriran HNS može bezbedno i efektivno da leči CNS simptome Sanfilippo A sindroma.

MATERIJALI I METODE

[0527]Primeri materijala i metoda korišćene u različitim eksperimentima opisani su ispod.

Plan studije i HNS doziranje

[0528]Majmuni su nasumično podeljeni u pet grupa za lečenje; grupa 1 nije bila tretirana (implantirana kontrola uređajem [DC], port i kateter) i nije bila dozirana sa inertnim medijumom ili test jedinjenjem. Grupe od 2 do 5 primile su dozu od 0,6 ml sa 0, 2,5, 7,5 ili 13,8 mg/ml HNS IT, (npr. ukupna doza od 0, 1,5, 4,5 ili 8,3 mg) svake druge nedeije. Nad četiri majmuna/pol/grupa izvršena je autopsija na 3 meseca (prevremena autopsija; 24 sata nakon šeste doze), nad četiri majmuna/pol/grupa (osim onih u DC grupi, nad kojima je izvršena autopsija nakon 3 meseca) izvršena je autopsija nakon 6 meseci doziranja (osnovna autopsija; 24 sata nakon dvanaeste doze) i nad preostala četiri majmuna izvršena je autopsija na kraju jednomesečnog perioda oporavka. Pri autopsiji, izanrana tkiva se sakupljaju, procesuiraju i pregledaju mikroskopski.

[0529]HNS obezbeđen u IT formulaciji inertnog medijuma sadrži 5 mM natrijum fosfata, 145 mM natrijum hlorida i 0,005% polisorbata 20 (pH vrednost 7,0). Svake druge nedeije administrirane su doze HNS-a kao kratkotrajna infuzija u periodu od oko 11 minuta: 0,6 ml (4 minuta) praćeno spiranjem sa 0,5 ml fosfatnim rastvorom (PBS) (7 minuta). Majmuni u grupama kontrolisani inertnim medijumom primili su samo IT formulaciju; DC majmuni primili su PBS (pH vrednost 7,2) IT.

Klinička evaluacija

[0530]Posmatrani klinički znaci, relativna učestalost bolesti i smrtnost beieženi su najmanje dvaput dnevno počinjući sa prvom dozom. Telesne težine izmerene su pre operacije, na dan operacije, jednom nedeljno tokom studije i pri autopsiji. Uzimanje hrane praćeno je svakodnevno počinjući pre operacije. Fizički (rad srca, disanje, telesna temperatura, auskultacija, kretanje, dispozicija, abdominalna palpacija, limfni čvorovi i generalno zdravlje) i neurološki (nivo svesnosti, praćenje) pregledi izvršeni su pre početka studije, svakog meseca tokom studije i pre autopsije. Motorne sposobnosti, cerebralni refleksi (širenje ženica, treptanje i kornealni refleks) i spinalni refleksi (senzorno stopalo, refleks kolena, kutaneo, proprioceptive, i refleksi repa) takođe su procenjeni. Elektrokardiografski (ECG; vodi I, II i III) i oftamološki pregledi izvršeni su pre prve doze HNS-a i u nedelji pre prevremene (3 meseca) ili glavne autopsije. Oftamološki pregledi izvršeni su indirektno oftalmoskopom, majmuni su seđatirani ketamin HCI (IM, 8mg/kg) i ženice su raširene 1% tropikamidom.

Klinička patologija

[0531]Uzorci krvi sakupljeni su od čvrsto fiksiranih majmuna za hematologiju i herniju seruma pre početka studije, nakon IT doza 1, 3, 5, 7, 9 i 11, za vreme sredine oporavka i pri autopsiji. Uzorci urina sakupljani su pre doziranja, jednom mesečno tokom doziranja i perioda oporavka i pre autopsije. CSF uzorci sakupljeni su preko lumbalnog katetera za ukupan broj ćelija i hemijske analize za vreme operacije i 24 sata nakon IT doza 1, 3, 5, 7, 9, 11, za vreme sredine oporavka i pri autopsiji; tim povodom, uzorci nisu sakupljeni zbog parcijalne opstrukcije katetera. Zbog toga što je zabeležen veći broj leukocita u CSF-u nego stoje očekivano, doza 5 nakon 3 meseca sakupljena je iz CSF-a polovine majmuna u svakoj grupi pre doziranja i od preostalih majmuna 24 sata nakon doziranja. Sakupljanje uzorka pre doze javlja se najmanje 1 dan pre doziranja tako da ne menja značajno zapreminu CSF-a pre doziranja. Za majmune nakon 6 meseci i one koji se oporavljaju, CSF ukupnog broja ćelija i hernije sakupljen je od polovine majmuna u svakoj grupi pre doziranja i od ostalih majmuna 24 sata nakon doziranja. Ako je majmun imao kateter iz kog ne može da se uzorkuje zbog opstrukcije, cisterna magna izvedena je na autopsiji.

HNS analize

[0532]Uzorci krvi za HNS analize sakupljeni su iz periferalne vene pre i 24 sata nakon IT doza 2, 4, 6, 8, 10, 12; za vreme sredine oporavka i pri autopsiji. CSF uzorci sakupljeni su preko lumbalnog katetera pre i 24 sata nakon IT doza 2, 4, 6, 8, 10, 12, za vreme sredine oporavka i pri autopsiji. HNS koncentracije određene su ELISA testom. Antitelo zadržavanja bilo je poliklonsko zečje anti-HNS IgG i detekovano antitelo bila je peroksidaza rena konjugovana sa istim zečjim anti-HNS IgG. LOD bilo je 0,22 ng/ml; stoga, LOQ izračunato je da bude 0,66 ng/ml. Uzorci iz seruma i CSF-a snimljeni su u duplikatu pri odnosu rastvora 1:100 i 1:5; uzorci koji prelaze vrh kalibracione krive dalje se razblažuju i ponovo testiraju.

Analize anti-HNS antitela

[0533]Krv za analize na antitela sakupljena je iz periferne vene otprilike 1 nedelju pre IT doze 2, 4, 6, 8, 10, 12; za vreme sredine oporavka i pri autopsiji. CSF uzorci za analize antitela sakupljeni su za vreme operacije i preko lumbalnog katetera približno 1 nedelju pre IT doze 2, 4, 6, 8, 10, 12; za vreme sredine oporavka i pri autopsiji. "Meso Scale Discoverv" (MSD<*>) tehnologija elektrohemiluminiscentnog "bridge" testa korišćena je za detekciju anti-HNS antitela. Test je opšti, ali senzitivni metod skeniranja na anti-HNS antitela iz bilo koje vrste i svih imunoglobulinskih izotipova. LOD bio je 5 ng/ml i uzorci su skenirani dvaput pri rastvoru od 1:20, rezultujući u efektivnoj senzitivnosti testa od 100 ng/ml. Uzorci koji prelaze vrh kalibracione krive dalje se razblažuju i ponovo testiraju.

Autopsija i priprema tkiva

[0534]Majmuni podvrgnuti potpunoj autopsiji ili 24 sata nakon poslednje IT doze (glavna autopsija) ili na kraju jednomesečnog perioda oporavka (autopsija nakon oporavka). Svi majmuni su sedatirani ketamin HCI (IM, 8 mg/kg), održavani su u smeši izofluran/kiseonika i primili su IV bolusno heparin natrijum (200 IU/kg). Majmuni su perfuzovani preko leve srčane komore rastvorom natrijum nitrita od 0,001% u fiziološkom rastvoru na sobnoj temperaturi pri brzini od 200 ml/min, 12 min (-2400 ml). Nakon sakupljanja, uzorci tkiva su onda fiksirani u 10% neutralnom puferu formalina za histopatološke preglede/imunohistohemijske analize ili su bili zamrznuti na suvom ledu i čuvani na -60°C ili na nižoj temperaturi za analizu HNS aktivnosti.

[0535]Mozak je isečen u moždani matriks (MBM-2000C, ASI Instruments, Inc., VVarren, MI) pri debljini koronalnog preseka od 3 mm. Preseci su numerisanl, pri čemu je najrostralniji presek obeležen kao presek 1. Preseci 1, 4, 7, 10, 13 i 16 procesuirani su za histopatologiju, a preseci 2, 5, 8, 11, 14 i 17 (ako je dostupan) procesuirani su za imunohistohemiju. Preseci 3, 6, 9, 12 i 15 zamrznuti su za analizu HNS aktivnosti. Kičmena moždina (vratni, grudne i lumbalne porcije) isečene su na sekcije od 1 cm. Prvi presek i svaki treći presek nakon toga procesuiran je za histopatološku evaluaciju, a drugi presek i svaki treći nakon toga procesuiran je za imunohistohemijske analize. Treći presek i svaki treći presek nakon toga zamrznut je za HNS analize. Distribucija preseka prilagođena je tako da svaki presek sadrži vrh intratekalnog katetera (presek 0) i fiksirani su u formalinu i analizirani za histopatologiju. Duplirani uzorci jetre od -5 g uzeti su iz dva različita režnja i zamrznuti za HNS analize, a dodatni uzorak od - 5 g fiksiran je za imunohistohemijske analize.

Histopatologija

[0536]Mozgovi, kičmene moždine, dorsalni kičmeni koreni nerva/ganglioni, išijadični, tibijalni i suralni nervi, kompletna lista tkiva (tipično za predkliničke studije bezbednosti leka za određeno vreme trajanja u određenim vrstama) i svaka lezija sakupljeni su pri autopsiji kod svih majmuna. Segmenti tkiva stavljeni su u parafin i obojeni hematoksilinom i eozinom (u dodatku bilo kom specijalnom obojenju/procedurama ugrađivanja zabeleženim ispod) za obimnu mikroskopsku evaluaciju.

[0537]Segmenti mozga iz pripremljenih parafinskih blokova iz grupa kontrolisanih uređajem i inertnim medijumom i kod majmuna sa visokom dozom obojeni su sa "Fluoro-Jade B" (obojenje koje povećava senzitivnost evaluacije neuronske degeneracije) i srebrnim obojenjem Bielschovvskog (procedura koja dozvoljava direktnu vizuelizaciju aksona, dendrita i neuronskih filamenata). Pločice obojene "Fluoro-Jade B" obojenjem pregledane su pod fluorescentnim osvetljenjem koristeći fluorescentni izotiocijanatni filter blok.

[0538]Kičmene moždine secirane su serijski, sa transverzalnim i kosim segmentima uzetim u vratnom, grudnom i slabinskom regionu (jedan presek pregledan na svakom nivou) uključujući segmente sa vrhom katetera; dodatni transverzalni segment uzet je iz cauda equina regiona. Dorsalni kičmeni koreni i ganglije (srednje vratni, srednje grudni i srednje slabinski) procesuirani su i pregledani. Periferni nervi (išijadični, tibijalni i suralni) secirani su longitudinalno, stavljeni u parafin i obojeni hematoksilinom i eozinom (H8tE). Poprečni preseci nakon toga su fiksirani u osmijumu, stavljeni u Spurrovu smolu, secirani (2 mm) i obojeni toluidin plavim. Serijski preseci kičmene moždine kao i dorsalni kičmeni koreni i ganglije iz grupa kontrolisanih uređajem kao i inertnim medijumom i iz grupa sa visokom dozom obojeni su srebrnim obojenjem Bielschovvskog. Preseci kičmene moždine iz ovih grupa takođe su obojeni anti-glijalnim fubrilarnim kiselim proteinom, imunohistohemijskim obojenjem koji dozvoljava direktnu vizuelizaciju astrocita i njihovih procesa.

Priprema ekstrakata tkiva za kvantitativne analize

[0539]Zamrznuti preseci mozga 3, 6, 9, 12 i 15 secirani su odvajanjem leve i desne hemisfere. Tkivo sa površine je uzeto merenjem 4 mm od površine, a ostatak tkiva u svakoj hemisferi smatran je za duboko tkivo. Ako su prisutni (npr. preseci 6 i 9), dodatni periventrikularni uzorak isečen je iz koronalnih delova. Pošto je samo jedna polovina mozga (desna strana) procesuirana (leva strana ostala je smrznuta), seciranje je rezuttovalo u dva do tri uzorka po parčetu: desna površina, desna duboka i ako je prisutna desna periventrikularna (npr. ventrikularna duboka; Vdeep). Cerebelarne i moždane stem ćelije, kada su prisutne, izolovane su pre odvajanja hemisfera i procesuirane su nezavisno. Segmenti kičmene moždine pripremljeni su slično, izmereni i homogenizovani.

[0540]Uzorci tkiva homogenizovani su u puferu za liziranje (1 ml/0,25 g tkiva) formulisani su sa 10 mM Tris, 5 mM etilendiamintetracetatnom kiselinom, 0.1% Igepal suplementiranim sa "Alpha Complete protease inhibitor minitabtets"

(Roche Diagnostics, Indianapolis, IN) koristeći "TeenA Lvsing Matrix A" cevi ili konične polipropilenske cevi. Uzorci su procesuirani 40 sekundi u "Fastprep-24" automatskom homogenizatoru (MP Biomedicals, Solon, OH) ili "PovverGen Model 125" homogenizatoru (Omni International, Kennesavv, GA). Jednom homogenizovani, uzorci su podvrgnuti ciklusima smrzavanja-otapanja pet puta koristeći etanol/kupatilo suvog leđa i vodeno kupatilo na 37°C i onda centrifugirani na 4°C

dok se kuglice tkiva ne razbiju; supernatanti čuvaju se na -80°C, dok ne počnu testovi. HNS aktivnost određena je koristeći specifični supstrat (4- metilumbeliferil-a-D-N-sulfoglukozaminid) sa fuorometrijskim testom u 2 koraka.

Procesuiranje tkiva i imunohistohemijsko obojenje

[0541]Šest koronalnih preseka mozga u formalinu (broj preseka 2, 5, 8, 11, 14 i 17) debljine 3-mm iz svakog majmuna numerisani su od 1 do 6 od rostralnog ka kaudalnom. Generalno, preseci od 1 do 4 sadržali su bazni nukleus/talamus/srednji mozak i cerebrum i dva kaudalna preseka koji su sadržali cerebelum i moždane stem ćelije (medulla oblongata). Segmenti mozga, kičmene moždine i jetre (od istih parafinskih blokova kao oni korišćeni za H&E i različitih specijalnih obojenja) su imunihistohemijski obojeni za HNS. Specifično mišje monoklonsko antitelo (klon 2C7; Maine Biotech, Portland, ME) korišćeno je za detektovanje intraćelijskog unosa IT administriranog HNS-a; ovaj reagens nije pokazao unakrsnu reaktivnost sa endogenim HNS-om cinomolgus majmuna. Negativna kontrola izvršena je koristeći irelevantne miševe IgG. Deparafinisane pločice inkubirane su sa primarnim mišjim anti-HNS antitelom preko noći na 2 do 8°C. Sekundarni kozji anti-mišji biotinilizovan imunoglobulin G dodat je i inkubiran 30 minuta na 37°C. Kompleks avidin/biotininilizovane peroksidaze rena dodat je i inkubiran 30 minuta. Pločice su inkubirane u supstratu peroksidaze rastvora diaminobenzidina dok se ne razvije željeni intenzitet obojenja. Nukleusi su kontrastno obojeni hematoksilinom.

Statističke analize

[0542]Telesne težine, promene telesne težine, uzimanje hrane, disanje, telesna temperatura, rad srca, broj ćelija u CSF-u, hernija CSF, klinički patološki podaci, podaci urina i apsolutna i relativna težina organa analizirana je jednosmernom analizom varijanse i poređenjem grupa kontrolisanih uređajem i inertnim medijumom za svaku grupu doziranu HNS-om pomoću Dunnettovog testa. Dodatno, statističke analize porede međusobno dve kontrolne grupe. Analiza je bila u oba pravca za nivo značajnosti od 5% i 1%. Svi podaci predstavljeni su kao srednja vrednost ± standarnda devijacija.

PRIMER 22: BIODISTRIBUCIJA I FARMAKOKINETIČKE STUDDE HEPARAN N-SULFATASE

[0543]Eksperimenti u ovom primeru dizajnirani su da odrede distribuciju tkiva HNS-a kod pacova nakon pojedinačne intravenozne ili intratekalne doze (1 ili 10 mg/kg) HNS-a. Na primer, između ostalog, svrha ovih eksperimenata je da okarakteriše osobine biodistribucije (BD) HNS-a u pacovima koristeći pozitron emisionu tomografiju (PET), da uporedi šablone distribucije HNS-a kada je dat različitim načinima administracije (IV ili IT) pri različitim dozama (1 ili 10 mg/kg) i da odredi farmakokinetičke osobine HNS-a u svakom organu od interesa u ovim režimima doza.

[0544]Profili farmakokinetike (PK) i biodistribucije (BD)<l24>T-sulfamidaze (HNS) proučavani su pomoću PET skeniranja tkiva kod pacova nakon pojedinačne intravenozne (IV) ili intratekalne (IT) administracije od 1 ili 10 mg/kg 124I-HNS. Podaci vremena radioaktivnosti u regionu od interesa dobijene su iz dinamičkih slika u prvih 20 minuta i iz statičkih slika 0,05 (samo IT administracija) 1, 2, 4, 8, 24, 48, 96 i 192 sati nakon IV ili IT doziranja.

[0545]Četiri pacova iz svake od 4 grupa (1 mg/kg IV, 1 mg/kg IT, 10 mg/kg IV i 10 mg/kg U) korišćeno je u studiji.

Podaci o vremenu radioaktivnosti izmereni su u regionima glave, mozga (uključujući cerebrospinalnu tečnost, CSF), kičme i jetre nakon IT administracije; i u krvi, mozgu (uključujući CSF), jetri, bubrezima, srcu (uključujući pluća) i kožu nakon IV administracije. Podaci su ispravljeni raspadom poluživota "<4>I (100,2 sati), izraženi su kao procenat injektirane doze (%ID) u regionu od interesa ili %ID po gramu (%ID/g) skeniranog tkiva i onda je normalizovan za telesnu težinu od 200 grama. Ukupna količina (ug) ili koncentracije (ug/g) doziranog proteina u regionu od interesa izračunata je iz odgovarajućih

podataka %ID ili %ID/g.

[0546]U prvih 20 minuta nakon U doziranja, ukupna količina u HNS-u u regionu glave redukovana je pri konstantnoj brzini od 0,002/min - 0,011/min (Az) na 1 i 10 mg/kg. Brzina klirensa i distribucije zapremine nisu korišćene za farmakokinetička poređenja između dve doze i dva načina administracije u ovom izveštaju (videti rezultate sekcije za više informacija). Konstantna brzina eliminacije iz mozga bila je u suštini ista pri dve test doze (Az: 0,016/h naspram 0,014/h za 1 i 10 mg/kg, respektivno) sa sličnim poluživotom od oko dva dana kao što je određeno statičkim snimanjem do 192 sata nakon IT doziranja. Vrednosti Cmax i AUC (0-last ili 0-beskonačnosti) bile su proporcionalne sa administriranih dozama. Linearan trend PK ukazuje na to da su doze u opsegu od 1 do 10 mg/kg dat u ovim TT pojedinačnim režimima doziranja. Gradijenti koncentracije posmatrani su od proksimalnih do distalnih segmenata kičme pri oba nivoa doze.

[0547]NakonIT doziranja, HNS protein bio je merljiv u jetri do 96 sati na lmg/kg i do 192 sata na 10 mg/kg HNS-a. Koncentracija u jetri dostigla je pik nakon 2 sata na 1 mg/kg i 7 sati na 10 mg/kg. Eliminacija je bila 0,030 ± 0,01 l/h (srednja vrednost Az) na 1 mg/kg, i nije se značajno razlikovala od one na 10 mg/kg (Az 0,017 ± O/h) (p=0,10) sa odgovarajućim tl/2 (28 naprema 42 sata na dozama od 1 i 10 mg/kg, respektivno).

[0548]Nakon IV doziranja, eliminacija poluživota u jetri, bubregu, srcu i koži bila je 47 ± 10 i 38 ± 13 sati iz jetre, 54 ± 25 i 29 ± 16 sati iz bubrega, 36 ± 15 i 42 ± 19 sati iz srca i 40 ± 21 i 31 ± 13 sati sa kože na 1 i 10 mg/kg, respektivno; dok su poluživoti u mozgu bili 71 ± 23 i 60 ± 53 sati. Srednje vrednosti Cmax za jetru, kožu, bubreg, srce i mozak bile su 9,6, 0,30, 0,25, 0,22 i 0,08 ug/g na 1 mg/kg i 132, 7,9, 3,9, 3,7 11,8 ug/g na 10 mg/kg. Nakon što su Cmax vrednosti normalizovane za svaku pojedinačnu životinju, Cmax vrednosti doze na 10 mg/kg bile su značajno više nego one na 1 mg/kg u svim ovim organima (većina p vrednosti <0,05, p=0,06 za jetru). Vrednosti AUClast za jetru, kožu, bubreg, srce i mozak bile su 525, 16, 14, 9 i 7 h.ug/g na 1 mg/kg; i 6747, 276, 183, 201 i 86 hr.ug/g na 10 mg/kg. Nakon normalizacije, vrednosti AUClast/dozi na 10 mg/kg bile su značajno viša nego kod 1 mg/kg na koži (p<0,01), marginalno drugačija u srcu (p=0,06), i nije značajno drugačija u jetri, mozgu i bubrezima (sve p vrednosti >0,34).

[0549]Kada je ista doza HNS-a injektiranja, intratekalna administracija rezultovala je u tri-log višem izlaganju nego kod one sa intravenoznom administracijom. Eliminacija poluživota u mozgu bila je 2 dana pomoću IT i 3 dana IV administracijom. Međutim, hepatičko ispoljavanje nakon IT doziranja slična je onoj nakon IT doziranja iste doze HNS-a. Izlaganje (Cmax i AUClast) za jetru pomoću IT/IV i 1 mg/kg i 10 mg/kg bili su u opsegu 0,4 -1,2.

Eksperimentalni plan

[0550]Centralni nervni sistem (CNS) ranjiv je u većini lizozomskih bolesti nakupljanja i ozbiljno je oštećen u nekim tipovima bolesti, kao što su Sanfilippov sindrom tipa A ili B (mukopolisaharidoza III), metahromatska leukodistrofija (MLD) i Hunterov sindrom. Kao što je ovde opisano, razmatrano je da, zbog slabe penetracije kroz krvno moždanu barijeru kada je administrirano periferno, direktnom administracijom enzimskih proteina u CNS može da poveća njihove koncentracije u centralnim nervnim tkivima i dalje povećava njihov terapeutski efekat. Intratekalna (IT ili cisterna magna) administracija istraživana je i poređena sa IV administracijom pri različitim nivoima doza u ovoj studiji.

[0551]PET je neinvazivna, repetitivna i kvantitativna tehnologija za obezbeđivanje dinamičke promene koncentracije u organu od interesta tokom vremena. Dinamički podaci koncentracija-vreme iz ciljanih organa (aktivna mesta, radije nego u krvotoku) su đragocena i direktno povezana sa biološkom aktivnošću doziranog leka. Dalje, informacija o tkivima izloženim iz PET studije u životinjama može da bude korišćen tako da vodi izbor selekcije prve doze kod ljudi.

Materijali i metode

Test jedinjenja

[0552]Heparin N-sulfataza (HNS) formulisana je na koncentraciji od 20 mg/m HNS-a u 5mM puferu natrijum fosfata sa 145 mM natrijum hloridom na pH 7,0. Materijal je prečišćen pomoću RP-HPLC i sadrži 98,7% heparin N-sulfataze sa 99,9% dimera. HNS je obeležen sa134I.

Izvor uzorka

[0553]Slike radioaktivnosti iz pacova nakon IV i IT doziranja<1J4>I-H-N-sulfataze na 1 i 10 mg/kg.

Životinje

[0554]Šesnaest mužjaka Sprague-Dawley pacova kupljena je od Charles River Laboratories (190 ± 60 g, n = 16) i razdvojeni su na četiri grupe (n = 4). Pojedinačno IV ili IT injektiranje na dve različite doze (1 mg/kg i 10 mg/kg) dato je svakoj grupi ovih pacova (ukupno 4 grupe). Individualna doza i injektirana zapremina bazirana je na telesnoj težini svake životinje. U dve IV tretirane grupe, sedacija je ubačena IV injektiranjem natrijum pentobarbitala pri dozi od 35 mg/kg. Intravenozne doze su administrirane preko 1 minuta na nivou cisterna magna kroz atlanto-ocipitalnu membranu. Stvarno administrirana radioaktivnost izmerena je pomoću PET i data pri injektiranju doze.

Eksperimentalne i/ili metode testa

[0555]Dinamičke slike (svaka 2 min) dobijene su u prvih 20 minuta u regionima srca (uključujući pluća), jetre i bubrega nakon IV injektiranja; i u regionu glave nakon IT administracije obe doze. Statičke slike dobijene su u regionima koji uključuju mozak (uključujući cerebrospinalnu tečnost, CSF), jetru, bubrege, srce (uključujući i pluća), mišiće, kožu i kost u grupi tretiranoj sa IV; i u regionu glave, mozga (uključujući CSF) i jetre U tretiranih životinja na 0,05 (dostupno samo za IT grupe) 1, 2, 4, 8, 24, 48, 96 i 192 sati nakon doziranja. Slike su rekonstruisane i tri segmenta tela spojeno je u jednu sliku.

Analiza podataka

[0556]PET podaci izraženi su u nanokiri (nCi) jedinicama po litru {za tečnost) ili po gramu (za tkivo). Relativna aktivnost uočena je za mozak, jetru, bubrege, skeletne mišiće, želudac, srce (sa plućima) i regionima kože u statičkim slikama. Apsolutna aktivnost u celoj glavi ili regionima mozga uočena je za životinje koje su primile IT injekcije. Radioaktivnost po milimetru kičmenog stuba određena je kod IT injektiranih životinja na tri izabrana segmenta: proksimalnom (vrat), srednjem (uz gornju ivicu jetre) i distalnom (1 cm od distalnog kraja dela koji sadrži protein) delu kičme.

[0557]Svi podaci su ispravljeni raspadom poluživota 124I (100,2 sata) i normalizovani za registrovanje efikasnosti bazirane na kalibraciji sa izvorom<l24>I sa eksterno merenom aktivnošću. Podaci su izraženi u procentima injektirane doze (%ID) celokupnog regiona (glava i mozak) ili u %ID po gramu (%ID/g) tkiva i onda su normalizovani za telesnu težinu od 200 grama [podaci normalizacije: (%IO ili %ID/g) /telesnoj težini Životinje x 200]. Normalizacija je usvojena kako bi se redukovala varijabilnost podataka jer je samo četiri životinje korišćeno u svakoj grupi.

[0558]U ovom primeru, koncentracije ili količina HNS proteina izračunate su koristeći injektirane proteine u dozi svakoj životinji: koncentracija proteina (ug/g) = (%ID/g) x (mg/kg injektirane doze x 1000 x 0,2); ukupna količina u regionu od interesa (ug) = %ID x (mg/kg injektirane doze x 1000 x 0,2). Ovde je injektirana doza bila 1 mg/kg ili 10 mg/kg i 0,2 je normalizovan faktor telesne težine. Srednja vrednost grupe i standardna devijacija svakog PK parametra izračunata je na bazi individualnih nedeljivih podataka u svakoj od četiri grupe. Studentov t-test izvršen je kako bi se poredile vrednosti Az, tl/2, Cmax i AUC između dve test doze i dva načina administracije. Statistički značaj definisan je kao p vrednost manja od 0,05 (p<0,05).

Rezultati

[0559]Količine (ug) ili koncentracije (ug/g) HNS-a u narednim tabelama, slikama i PK analizama bile su izračunate množenjem injektirane doze proteina (1 mg/kg ili 10 mg/kg) sa odgovarajućom vrednostima %IO ili %ID/g.

Intratekalni tretman sa 124I- HNS na dozama od 1 i 10 ma/ kg

[0560]Količina doziranog proteina (ug) u regionu glave iz dinamičkih slika plotovana je kao funkcija vremena na slici 151. Koncentracija (ug/g) u regionima mozga iz statičkih slika plotovana je kao funkcija vremena 152. Ukupna količina injektiranog proteina (ug) u mozgu i regionima glave plotovana je sa vremenom na slikama 153 i 154, respektivno. Krive koncentracija-vreme (ug/mm) na proksimalnom, srednjem i distalnom delu kičme prikazane su na slikama od 155 do 157. Slika 158 pokazuje promene HNS koncentracije (ug/g) u jetri u vremenu nakon IT administracije 124I-HNS na 1 i 10 mg/kg.

[0561]Ukupni podaci količina-vreme (ug) ili koncentracija-vreme (ug/g) analizirani su pomoću nedeljivih modela (WinNonlin 5.2, Pharsight, Mountain View, CA). PK parametri, kao što su konstantna brzina eliminacije(A,),pik koncentracije (C«,«), terminalni poluživot (ti/2), površina ispod krive (AUGasti AUCo-.nO i drugi su procenjeni iz podataka za svaku pojedinačnu životinju.

[0562]Brzine klirensa i distribucija zapremine procenjeni su, međutim, nisu korišćeni za PK poređenja između dve doze i dva načina administracije u ovom izveštaju iz dva razloga: (1) ova studija fokusirana je na biodistribuciju HNS-a u čvrstim tkivima, pre nego u krvi PK; i (2) radioaktivnost u regionima mozga bila je suma onih iz moždanog tkiva (čvrsto) i CSF-a (tečno) koji nisu mogli da budu odvojeni jedan od drugog u studiji. Procenjena je A, i korišćena u poređenju, zato što ukazuje na procenat eliminacije injektirane doze po jedinici vremena.

[0563]Srednje vrednosti grupa i standardna devijacija (SD) izračunata je i poređena između dve test doze. Ovi PK parametri prikazani su ispod u tabeli 48.

[0564]U prvih 20 minuta nakon doziranja, ukupna količina (ug) HNS-a u regionu glave redukovana je pri konstantnoj brzini od 0,002 - 0,011 po min( K,0,005 ± 0,004/min) na 1 mg/kg i 0,003 - 0,010 po min (0,007 ± 0,003/min) na 10 mg/kg. Ove konstantne brzine eliminacije nisu značajno drugačije na nivoima za ove dve doze (p=0.57, slika 151).

[0565]Kriva koncentracija-vreme (ug/g od 0,05 do 192 sati) mozga ukazuje na dvofazni profil (slika 152). Rana faza traje oko dva sata. Krajnja faza prati kinetiku prvog reda. Konstantna brzina eliminacije iz mozga bila je veoma slična na dve testirane doze (0,0016 ± 0,003 i 0,014 ± 0,001 po satu) sa sličnim poluživotom od oko dva dana (45 ± 7 i 49 ± 4 sati na 1 i 10 mg/kg, respektivno). Vrednosti koncentracije pika (257 ± 90 i 2628±265 ug/g) i AUG351(8393 ± 2457 i 83962 ± 10083 hr.ug/g na 1 i 10 mg/kg, respektivno) povećavaju se otprilike 10 puta kada se doza poveća sa 1 na 10 mg/kg. Ova posmatranja ukazuju na PK linearni trend u dozama u opsegu od 1 do 10 mg/kg datim u ovim IT pojedinačnim režimima doziranja. Koncentracija pika javlja se u mozgu 3 minuta nakon IT doziranja (T™*).

[0566]Kriva ukupne količine-vremena (ug od 0,05 do 192 sata) u mozgu i regionima glave praćena je istim dvofaznim šablonom kao što je viđeno na krivama koncentracija-vreme (ug/g) u mozgu (slike 153 i 154). Vrednosti C™»u regionu mozga značajno su niže nego one u regionima glave (69 ± 8 naspram 200 ± 0 na 1 mg/kg, p<0,01; i 836 ± 117 naspram 1844 ± 314 ug, p<0,01 na 10 mg/kg, respektivno). Konstantni odnosi eliminacije bili su 0,017 ± 0,002/h i 0,014 ± 0,001/h za mozak i 0,016 ± 0,002 i 0,010 ± 0,001/h za region glave na 1 i 10 mg/kg, respektivno. Vrednosti srednjeg preostalog vremena bile su 42 ± 5 naspram 51 ± 5 sati za mozak (p=0,048) i 45 ± 7 naspram 70±9sati za glavu (p<0,01) na 1 i 10 mg/kg, respektivno. Ova zapažanja sugerišu da je dozirani protein eliminisan iz oba regiona mnogo brže na nižim dozama nego na višim. Srednja vrednost poluživota bila je u opsegu od 42 do 70 sati u ovim regionima nakon IT doziranja 1 mg/kg i 10 mg/kg HNS-a.

[0567]Gradijent koncentracije posmatran je za proksimalne, srednje i distalne segmente kičme na nivoima obe doze (podaci nisu prikazani). Nakon IT doziranja, pik koncentracije (ug/mm kičmenog stabla) uočen je na oko 30 minuta (0 do 1 sat) za proksimalni, 1 do 4 sata za srednji (osim za jednog pacova uočenim nakon 24 sata) i na 1 do 8 sati za distalni segment. Poluživoti ovih segmenata varirali su (srednja vrednost ti/2: 32 ± 13 i 45 ± 18 sati za proksimalni, 39 ± 16 i oko 50 sati za srednji i 30 ± 12 i oko 123 sata za distalni segment kičme na 1 mg/kg i 10 mg/kg, respektivno). Srednja vrednost koncentracije na kojima se javlja pik su ugrubo proporcionalne dozama u svakom od ova tri segmenta na 1 i 10 mg/kg ""I-HNS (0,5 naspram 6,0, 0,2 naspram 0.9 i 0,1 naspram 0,5 ug/mm u proksimalnom, srednjem i distalnom segmentu kičme, respektivno). Srednje vrednosti AUGMpratile su isti proporcionalni šablon što se vidi pri koncentraciji na kojoj se javlja pik (9,5 naspram 83, 6,8 naspram 35 i 2 naspram 38 .ug/mm u proksimalnom, srednjem i distalnom segmentu kičme, respektivno).

[0568]Iako HNS nije detektabilan u većini perifernih organa, merljiv je u jetri najranije na 1 sat (prvi vremenski period nakon doze na kome se beleži slika) do 96 sati (3 od 4 životinje) pri 1 mg/kg i do 192 sata (sva četiri pacova) pri 10 mg/kg nakon U doziranja (slika 158). Koncentracije u jetri dostigle su pik 2 sata nakon IT doziranja 1 mg/kg i 7 sati nakon IT doziranja 10 mg/kg, što je praćeno fazom eliminacije koja prati kinetiku prvog reda. Konstantna brzina eliminacije bila je brža na 1 mg/kg (A2 0,030 ± 0,01 l/h) nego na 10 mg/kg( K0,017 ± 0/h) (p=0,10), sa odgovarajućim kraćim tw(28 ± 16 naspram 42 ± 1 satima pri dozama od 1 i 10 mg/kg, respektivno, p=0,76). Vrednost AUCa«pri 1 mg/kg redukovana je oko 40 puta u poređenju sa onima na 10 mg/kg (204 ± 50 naspram 7987 ± 3276 ug/g, respektivno).

Intravenozni tretman sa 124I-HNS pri dozama od 1 i 10 mg/kg

[0569]Koncentracije u mozgu, jetri, bubrezima, srcu (uključujući plućno tkivo) i koži prikazane su na graficima kao zavisnost od vremena nakon IV doziranja 1 i 10 mg/kg HNS-a kao što je prikazano na slikama od 159 do 163, respektivno. Pošto je vreme u kome se javlja prva statička slika za ove organe jedan sat nakon doziranja, početna faza ovih krivih koncentracija-vreme ne može da bude posmatrana u ovoj studiji. Krive koncentracija-vreme za jetru, bubrege, srce i kožu pokazale su ravnu fazu od 1 do 8 sati nakon IV doziranja. Ova ravna faza trajala je 24 sata u mozgu nakon doziranja, sugerišući na to da je unos IV doziranog proteina u mozak sporiji nego onaj u perifernim organima. Preostali podaci ukazivali su na krajnju eliminacionu fazu sa kinetikom prvog reda.

[0570]Poluživot eliminacije u jetri, bubrezima, srcu i koži bio je 47 ± 10 i 38 ± 13 sati za jetru, 54 ± 25 i 29 ± 16 sati za bubreg, 36 ± 15 i 42 ± 19 sati za srce i 40 ± 21 i 31 ± 13 sati za kožu na 1 i 10 mg/kg, respektivno; dok su poluživoti u mozgu bili 71 ± 23 i 60 ± 53 sati (pacov 3 u 10 mg/kg grupi isključen je zbog nedovoljnog broja podataka za određivanje ti/2) na 1 i 10 mg/kg, respektivno. Nisu uočene statističke razlike između poluživota na 1 i 10 mg/kg u ovim organima, sa izuzetkom p vrednosti < 0,03 za bubreg.

[0571]Srednje vrednosti Cm? za jetru, kožu, bubrege, srce i mozak bile su 9,6, 0,3, 0,25, 0,22 i 0,08 ug/g na 1 mg/kg i 132, 7,9, 3,9, 3,7 i 1,8 ug/g na 10 mg/kg. Odnosi Cm3»na 10 mg/kg prema odgovarajućim vrednostima 1 mg/kg bile su 14, 26, 16, 17 i 23 za ove organe. Nakon što su vrednosti CniXza svaku životinju pojedinačno normalizovane za dozu, vrednosti Cm^/dozi na 10 mg/kg su značajno više nego one za 1 mg/kg u svim ovim organima (većina p vrednosti <0,05, p=0,06 za jetru). Vrednosti AUGm za jetru, kožu, bubrege, srce i mozak bile su 525, 16, 14, 9,3 i 7 h.ug/g na 1 mg/kg; i 6747, 276, 183, 201 i 86 h.ug/g na 10 mg/kg. Odnosi AUGaslna 10 mg/kg prema odgovarajućim vrednostima za AUG«i na 1 mg/kg bile su 13, 17, 13, 22 i 12 za ove organe, respektivno. Nakon normalizacije, vrednosti AUGWdozi na 10 mg/kg bile su znatno više nego one pri dozi od 1 mg/kg u koži (p<0,01), blago različitim u srcu (p=0,06), i bez značajne razlike u jetri, mozgu i bubrezima (sve p vrednosti >0,34).

[0572]Ova zapažanja sugerišu na to da su (1) poluživoti u većini organa bili oko 2 dana, sa izuzetkom u mozgu (oko 3 dana); (2) da je izlaganje po gramu u jetri bilo veće nego onom u koži, srcu i bubrezima, koji su veći od onog u mozgu; (3) da su sa povećanjem od 10 puta u dozi (10/1 mg/kg), vrednosti Cma»na 10 mg/kg iz svih testiranih organa bile više od 10 puta nego one za 1 mg/kg.

[0573]Koncentracija na kojoj se javlja pik u mozgu dostignuta je od 1 do 24 sata (T„,M) nakon IV doziranja.

Poređenje IV i IT tretmana

[0574]Krive koncentracija-vreme u mozgu i jetri nakon IV i IT administracije na 1 i 10 mg/kg poređeni su na slikama 164 i 165, respektivno. Odnosi C™*u mozgu pomoću IT/IV na 1 i 10 mg/kg bile su 3212 i 1501, respektivno. Ovi odnosi AUC0-192h bili su 1136 i 978. Ova zapažanja ukazivala su na to kada je injektirana ista doza HNS-a, intratekalna administracija rezultovala je u približno sa tri log većim izlaganjem u mozgu nego ono sa intravenoznom administracijom. Poluživot eliminacije u mozgu bio je 2 dana (45 i 49 sati na i i 10 mg/kg) pomoću IT i 3 dana (71 i 60 sati na 1 i 10 mg/kg) IV administracijom pri oba nivoa doze.

[0575]Međutim, izlaganje jetre nakon IT doziranja bilo je slično onom nakon IV doziranja pri istoj dozi HNS-a. Odnosi Cma, u jetri pomoću IT/IV na 1 mg/kg i 10 mg/kg bili su 0,5 i 0,8 i odnosi AUGm bili su 0,4 i 1,2, respektivno.

Zaključci

[0576]Farmakokinetika i biodistribucija profila 12'5I-sulfamidaze (HNS) proučavana je pomoću PET slika kod pacova nakon pojedinačne intravenozne ili intratekalne administracije 1 ili 10 mg/kg<1M>l-sulfamidaze. Podaci koncentracija-vreme dobijeni su i dinamički (prvih 20 minuta) i statički u regionima od interesa na 0,05, 1, 2, 4, 8, 24, 48, 96 i 192 sata nakon doziranja. Pomoću dinamičke slike nakon IT doziranja, ukupna količina HNS u regionu glave redukovana je pri sličnoj konstantnoj brzini od 0,005/min - 0,007/min (srednja vrednosth)u prvih 20 minuta. Statičkom slikom, brzina eliminacije iz mozga bila je u suštini ista na obe testirane doze (A,: 0,016/h naprema 0,014/h za 1 i 10 mg/kg, respektivno) sa sličnim poluživotom od otprilike dva dana.

[0577]Vrednosti Cm», i AUG«, bile su proporcionalne administriranim dozama i ukazuju na PK linearni trend u opsegu doza od 1 do 10 mg/kg u ovom režimu IT pojedinačnih doza.

[0578]Gradijenti koncentracija posmatrani su od proksimalnog do distalnog dela kičme pri oba nivoa doza.

[0579]Nakon IT doziranja, pik je viđen na koncentraciji na oko 20 minuta na proksimalnom, 1 do 4 sata na srednjem i 1 dp 8 sati na distalnom segmentu. Različiti segmenti kičme ukazali su na linearni PK trend.

[0580]Nakon IT doziranja, HNS protein bio je merljiv u jetri u vrlo ranom vremenskom periodu do 96 sati na 1 mg/kg i 192 sata na 10 mg/kg. Stopa eliminacije bila je brža za 1 mg/kg (A, 0.030/h) nego za 10 mg/kg(A,0.017/h), sa odgovarajućim kraćim ti^na nižoj dozi (28 ± 16 naspram 42 ± 1 sati za doze lmg/kg i lOmg/kg, respektivno).

[0581]Nakon IV doziranja, eliminacija poluživota u jetri, bubrezima, srcu i koži bila je 47 ± 10 and 38 ± 13 sati u jetri, 54 ± 25 i 29 ± 16 sati u bubrezima, 36 ± 15 i 42 ± 19 sati u srcu, 40 ± 21 i 31 ± 13 sati za kožu na 1 i 10 mg/kg, respektivno, dok su poluživoti u mozgu bili 71 ± 23 i 60 ± 53 sati. Srednje vredosti C™< za jetru, kožu, bubrege, srce i mozak bile su 9,6, 0,30, 0,25, 0,22, i 0,08 ug/g na 1 mg/kg i 132, 7,9, 3,9, 3,7 i 1,8 ug/g na 10 mg/kg. Nakon što su C™< vrednosti pojedinačnih životinja normalizovane za dozu, vrednosti C™K/dozi na 10 mg/kg bile su značajno više nego kod onih za 1 mg/kg u svim ovim organima (većina p vrednosti <0,05, p=0,06za jetru). Vrednosti AUCm za jetru, kožu, bubrege, srce i mozak bile su 525, 16, 14, 9,3 i 7 hr.ug/g na 1 mg/kg; i 6747, 276, 183, 201 i 86 hr.ug/g na 10 mg/kg. Nakon normalizacije, vrednosti AUCtast/dozi na 10 mg/kg značajno su više nego one na 1 mg/kg u koži (p<0,01), blago različite u srcu (p=0,06), i neznatno različite u jetri, mozgu i bubrezima (sve p vrednosti >0,34).

PRIMER 23: Tretman pacijenata sa Sanfilippovog sindroma tipa A (Sanfilippo A) HNS-om

[0582]Direktna administracija u CNS, npr. IT dostavom može da se koristi za efektivno lečenje pacijenata sa Sanfilippo A. Ovaj primer ilustruje studiju eskalacije multicentra doze dizajniranog za evaluaciju bezbednosti do 3 nivoa doze svake druge nedeije u periodu od ukupno 40 nedelja administriranog rhHNS preko intratekalnog uređaja za dostavu lekova pacijentima sa Sanfilippo A. Različiti primeri uređaja za intratekalnu dostavu lekova pogodnih za lečenje ljudi prikazani su na slikama od 94 do 97.

[0583]Do 20 pacijenata biće uključeno:

Grupa 1: 5 pacijenata (najniža doza)

Grupa 2: 5 pacijenata (srednja doza)

Grupa 3: 5 pacijenata (najviša doza)

5 nasumično izabranih pacijenata biće bez terapije.

[0584]Pacijenti su izabrani za ovu studiju na bazi sledećih kriterijuma:

[0585]Određena je bezbednost porasta doza administriranog HNS-a IT injektiranjem u periodu od 40 nedelja kod pacijenata sa Sanfilippo A. Dodatno, procenjeni su klinička aktivnost HNS-a na kognitivne funkcije, farmakokinetika pojedinačnih i ponovljenih doza u serumu i koncentracije u cerebrospinalnoj tečnosti (CSF).

PRIMERI IT DOSTAVE NAGLU-IGFII

PRIMER 24: In vitro studija rhNaglu i Naglu-IGFII

[0586]Mehanizam ćelijskog unosa putem svake Naglu varijante proučavano je koristeći dva soja fibroblastnih ćelija pacijenata sa Sanfilippo B, GM02391 (P359L) i GM 01426 (E153K) i normalne humane ćelijske linije fibroblasta. Ekspresija M6P receptora na ćelijsku liniju, ćelije fibroblasta su obično korišćene od strane istraživača za studije unosa lizozomskih enzima u ćelije.

[0587]Studije ćelijskog unosa izvršene su inkubacijom fibroblastnih ćelija sa rhNaglu ili Naglu-IGFII četiri sata na 37°C. Ćelije su sprane i lizirane nakon inkubacije i izmerena je enzimska aktivnost Naglu u liziranim ćelijama. Inkubacija rhNaglu sa fibroblastnim ćelijama rezultovala je u jedva detektabilnoj količini enzima unutar ćelije. Suprotno, inkubacija Naglu-IGFII sa fibroblastnim ćelijama rezultovala je u izraženom nivou enzima intracelularno (slika 166). Količina internalizovanog Naglu-IGFII dostigla je zasićenje pri rastu količine enzima korišćenog za inkubaciju. Unos zasićenja zavisan od doze tipičan je nalaz za receptore koji posreduju ćelijski unos. Dalje, internalizacija Naglu-IGFII nije inhibirana egzogenim M6P, ali je kompletno inhibirana egzogenim IGFII (slika 166). Ovaj rezultat ukazivao je na to da je internalizacija Naglu-IGFII u fibroblastne ćelije zavisna od M6P/IGFII receptora u maniru nezavisne glikozilacije.

[0588]Eksperiment je takođe izvršen za proučavanje dovođenja rhNaglu i Naglu-IGFII u lizozome. Fibroblastne ćelije (GM01426) kod pacijenata sa Sanfilippo B korišćene su u ovoj studiji. Detekcija rhNaglu i Naglu-IGFII pregledana je obojenjem ćelija anti-humanim Naglu poliklonskim antitelom nakon početne inkubacije proteina sa ćelijama. Imunofluorescentno obojenje LAMP-1 (eng. Ivsosomal associated membrane protein) korišćena je za detekciju lizozoma. Kolokalizacija rhNaglu i Naglu-IGFII sa lizozomima vidljiva je konfokalnom mikroskopijom (slika 167).

[0589]Obimna internalizacija Naglu-IGFII posmatrana je nakon 4 sata inkubacije proteina sa ćelijama i pokazana je kolokalizacija Naglu-IGFII sa lizozomima. Suprotno, rhNaglu nije uspela da pokaže internalizaciju u istom vremenskom okviru i nije uočena kolokalizacija sa lizozomima. Rezultati su dalje obezbedili dokaz da je Naglu-IGFII internalizovan u ćelije i transportovan do tačnog ćelijskog odeljka, do lizozoma. Poluživot internalizovanog Naglu-IGFII kod fibroblastnih ćelija pacijenata sa Sanfilippo B određen je da bude 1,5 dan (podaci nisu pokazani).

PRIMER 25: In vivo studije kod modela miševa

Pacovi "divljeg tipa" (wt) sa kanilom

[0590]U dodatku modelima miševa sa Sanfilippo B, wt pacovi sa kanilom, životinjski model koji nije u deficitu, takođe je korišćen za molekulski skrining in vivo. Wt pacovi sa kanilom imali su hirurški implantiranu kanilu u gornjem slabinskom i donjem grudnom regionu kičmene moždine i pojedinačno injektiranje 35ul u CSF izvršeno je kroz kanilu. Kriterijumi procenjeni za molekulski skrining koristeći ovaj model životinja bili su testovi Naglu aktivnosti i imunohistohemija mozga i kičmene moždine.

Modeli miševa sa Sanfilippovim sindromom tipa B

[0591]Model miševa sa Sanfilippovim sindromom tipa B (Naglu-/- miš, Sanfilippo B miš) generisan je od strane E. Neufeld and colleague (Li HH, et al., PNAS 96(25):14505-14510; 1999). Ekson 6 mišjeg Naglu gena prekinut je insertacijom selekcionog markera, rezistentnog gena neomicina. Rezultujući homozigot Naglu-/- miševa u potpunom je nedostatku sa Naglu (slika 168), i ima potpunu GAG akumulaciju u jetri i bubrezima. Uprkos celokupnom nedostatku Naglu, ovi miševi su generalno zdravi i imaju životni vek od 8 do 12 meseci. Promene ekspresije drugih lizozomskih enzima desile su se pri starosti od oko 5 meseci i ove promene uključuju kompenzacioni porast 6-galaktozidaze, a-glukozidaze, B-glukuronidaze i B-heksozaminidaze u jetri i mozgu, povećanje a-L-iduronidaze u jetri, ali ne u mozgu i redukciju neuraminidaze u jetri i mozgu. Smrt se obično javlja kao rezultat zadržavanja urina ili urinarne infekcije. Modeli miševa sa Sanfilippo B proučavani su dosta u literaturi kako bi opisali Sanfilippo B patološke promene. Fenotip vezan za CNS patologiju Naglu-/- miševa prijavljeno je da ima hipoaktivnost pri starosti od 4,5 meseca, ali je takođe uočena hiperaktivnost u drugim starosnim dobima.

[0592]Neuro-patološke promene kod Naglu-/- miševa opisane su kao vakuole i inkluzije tela u neuronima i makrofage i epitelne ćelije posmatrane su EM (elektronskom mikroskopijom). Ove patološke promene obično počinju na 33 danu starosti i progresivno se pogoršavaju kako životinja stari. Aktivirani astrociti i mikroglijalne ćelije takođe su prikazani histo-patološkim analizama. Biohemijske analize dva gangliozida, GM2 i GM3, prikazani su kao povećanje u mozgu od 5 i 9 puta (pošto GM2 i GM3 nisu direktno supstrati Naglu i mogli bi da predstavljaju izazov demonstriranja značajne redukcije nakon ERT u kratkom vremenskom periodu nisu korišćeni kao krajnji biomarkeri za POC).

[0593]Biohemijske analize izvršene su merenjem Naglu aktivnosti enzima i GAG nivoa. Histološke analize izvršene su anti-humanim Naglu antitelom, anti-LAMP-1 antitelom, anti-Iba-1 antitelom i anti-GFAP antitelom imunohistohemijski. Anti-humano Naglu antitelo korišćeno za ovu studiju bilo je mišje monoklonsko antitelo koje ne vezuje endogeni mišji Naglu kod wt miševa ili mutirani Naglu kod Sanfilippo B miševa. LAMP-1 imunoobojenje korišćeno je za vezivanje antitela za lizozomske membrane proteina, lizozomski vezana memrana proteina-1. Ibal obojenje korišćeno je za vezivanje antitela za jonizovani kalcijum vezujući adapter proteina koji je specifičan za mikroglijalne i ćelije makrofaga. GFAP obojenje korišćeno je za antitelo koje vezuje glijalni fibrilami kiseli protein koji je specifičan za astrocite.

Skrining in vivo bioloških aktivnosti intrakranijalnim (IC) injektiranjem u Sanfilippo B miševe

[0594]Cilj ove studije bio je da se proceni biološka aktivnost Naglu enzima in vivo. U ovoj studiji, proteini su administrirani IC injektiranjem u mozak Sanfilippo B miševa. Starost Sanfilippo B miševa za studiju približno je odgovarala starosti od 8 nedelja. IC način injektiranja nudi najbolji mogući scenario za procenu efikasnosti molekula. Naglu proteini su procenjeni na stabilnost inkorporiranja u neuronske ćelije i za redukovanje lizozomskog nakupljanja. Imunohistohemija je korišćena za procenu biodistribucije. Lizozomsko nakupljanje okarakterisano je brojem i veličinom pozitivnog obojenja koristeći LAMP-1 imunoobojenje.

[0595]IC injektiranje izvršeno je direktnim injektiranje kroz lobanju Sanfilippo B miševima u desni korteks cerebruma. Dva mikrolitara ili 35pg Naglu proteina injektiranja je u svaku životinju. Žrtvovanje životinja odigralo se 3, 7 i 14og dana nakon injektiranja. Iz pilot studije, određeno je da je 7 dana nakon injektiranja optimalno vreme za imunohistohemijsku studiju. Segmenti mozga isečeni su transverzalno (slika 169) i izvršena su Naglu i Lamp-1 imunoobojenja. Ćelijski unos u oba, i u neurone i glijalne ćelije u rhNaglu i Naglu-IGFII tretiranih Sanfilippo B miševa određen je imunohistohemijski koristeći anti-humano Naglu antitelo (slike 170 i 171). Nije bilo značajne razlike između rhNaglu i Naglu-IGFII tretiranih Sanfilippo B miševa u pogledu ćelijskog unosa koji je posmatran. Dodatno, LAMP-1 imunoobojenje moždanog tkiva i rhNAglu i Naglu-IGFII tretiranih miševa ukazuje značajni nivo redukcije lizozomskog nakupljanja. Redukcija nivoa lizozomskog nakupljanja i kod rhNaglu i kod Naglu-IGFII tretiranih grupa bila je skoro na istom nivou normalnih wt miševa.

[0596]Redukcija lizozomskog nakupljanja takođe je posmatrana sa Naglu-TAT, Naglu-Kif i PerT-Naglu testiranim Sanfilippo B miševima nakon IC injektiranja (podaci nisu prikazani). Ova studija pokazala je in vivo biološku aktivnost svih varijanti Naglu.

[0597]U odvojenoj studiji, Naglu-deficitarnim miševima IT je administriran inertni medijum ili alternativno jednom, dvaput ili triput nedeljno su dozirani rekombinantim Naglu-IgF-II proteinom za fuzionisanje (Naglu) u PBS-u. Netretirana grupa miševa "divljeg tipa" služila je kao kontrolna grupa "divljeg tipa" kojoj je administriran inertni medijum bez Naglu. Miševi su žrtvovani nakon 24 sata prateći poslednje injektiranje koje je praćeno pripremom tkiva za imunohistohemijske (IHC) i histopatološke analize.

[0598]Distribucija Naglu u tkiva mozgova Naglu-deficitarnih miševa evidentirana je prateći IT administraciju rekombinantnog Naglu. Kao Što je ilustrovano na slici 172A, IT administracija rekombinantnog Naglu u Naglu-deficitame miševe rezultovala je u široko rasprostranjenoj redukciji ćelijske vakuolizacije u tkivima bele mase u poređenju sa Naglu-deficitarnim miševima kojima je IT administriran inertni medijum. Slično je ilustrovano na slici 172B, morfometrijske analize otkrile su obeleženu redukciju u LAMPI imunoobojenju u tkivima bele mase tretiranih miševa koje se odnose na netretirane Naglu-deficitarne miševe odražava se na način poboljšanja patologije bolesti.

[0599]Kao Što je prikazano na slikama 173A-B u svakom delu moždanog tkiva koji je evaluiran (korteks, caudate nucleus i putamen (CP), talamus (TH), cerebelum (CBL) i bela masa (WM)) LAMP pozitivna površina redukovana je kod miševa tretiranih sa Naglu koji se odnose na netretirane Naglu deficitarne kontrolne miševe i na pristup LAMP pozitivnih površina miševa "divljeg tipa". Naročito je značajno to da su LAMP pozitivne površine u svakom delu moždanog tkiva analizirane i dalje redukuju prateći IT administraciju dve ili tri doze (slika 173B) relativne za pojedinačne doze (slika 173A) Naglu.

[0600]Ovi rezultati potvrđuju da je IT administriran Naglu sposoban za menjanje progresije lizozomskih bolesti nakupljanja kao što je Sanfilippov sindrom tipa B kod Naglu deficitarnih modela miševa, dalje potvrđujući sposobnost IT administriranih enzima kao što je Naglu za lečenje CNS manifestacija povezanih sa lizozomskim bolestima nakupljanja kao Što je Sanfilippov sindrom tipa B.

Skrining molekula intratekalnim (IT) injektiranjem u wt pacove sa kanilama

[0601]Ova studija direktno oponaša pristup vezan za portove za administaciju leka. Naglu protein administriran je IT injektiranjem u wt pacove sa kanilama kako bi se odredila biodistribucija u parenhim mozga.

[0602]U ovim životinjama, kanila je postavljena u gornji slabinski i donji grudni deo kičmene moždine (slika 174). Životinjama je injektirano 35pl ili 385 lpg rhNaglu, Naglu-TAT, Naglu-IGFII i PerT-Naglu, kroz kanilu (zbog ograničene rastvorljivosti, Naglu Kifvvas injektiran je samo sa 38,5 ug što je 10 puta manje nego ostatak Naglu). Žrtvovanje je izvršeno 4 h i 24 h nakon injektiranja.

[0603]Tkiva mozga i kičmene moždine sakupljeni su i izmereni testom Naglu aktivnosti. U mozgovima tretiranih životinja, životinje tretirane sa Naglu-TAT i Naglu-IGFII ispoljile su višu aktivnost nego one tretirane sa rhNaglu i svim ostalim Naglu varijantama (slika 175). Kao opšti trend, Naglu aktivnost bila je značajno viša u kičmenoj moždini nego u mozgu kod svih tretiranih životinja (podaci nisu prikazani). Ovaj fenomen može da ukazuje na to da su proteini bliži mestu IT injektiranja.

[0604]Imunohistohemijske analize ukazuju na to da je biodistribucija grupe tretirane sa Naglu-IGFII bila mnogo veća u mozgu nego kod grupa tretiranih sa drugim Naglu varijantama 24 sata nakon IT injektiranja (slike 176 i 177). Kod životinja tretiranih sa rhNaglu protein je uočen samo u moždanim opnama. U segmentu kičmene moždine, IHC ukazuje na mali ćelijski unos rhNaglu u neurone sive mase, ali u mnogo manjem obimu nego unos Naglu-IGFII u neurone kičmene moždine (podaci nisu prikazani).

[0605]Kod grupa kojima je IT injektiran Naglu-TAT, iako je najviša Naglu aktivnost posmatrana u tkivu mozga biohemijskim analizama, IHC nije uspela da ukaže na bilo kakvu Naglu-TAT penetraciju u parenhim mozga osim na ostatke u moždanim opnama. Pored Naglu-IGFII, ostale Naglu varijante nisu uspele da pokažu biodistribuciju iza moždanih opni, predstavljaju jak dokaz nezavisnosti M6P/IGFII receptora za ćelijski unos Naglu u mozgu nakon IT injektiranja. Ova studija ukazala je na Naglu-IGFII kao glavni molekul za razvoj leka protiv Sanfilippo B.

PRIMER 26: DOKAZ KONCEPTA STUDIJE KORISTEĆI NAGLU-IGFII

Plan eksperimenta

[0606]Dokaz koncepta studije dizajniran je da pokaže i biodistibuciju i suprotno od lizozomskog nakupljanja nakon IT injektiranja Naglu-IGFII kod Sanfilippo B miševa. Za ovu studiju, tri grupe Sanfilippo B miševa pri starosti od 8 nedelja tretirani su sa IT injektiranim Naglu-IGFII. Svako IT injektiranje sadržalo je zapreminu od lOul ili 260 ug Naglu-IGFII. Bile su tri tretirane grupe, lx injektirane, 2x injektirane i 3x injektirane grupe. Za lx injekdonu grupu, pojedinačna doza proteina administrirana je nultog dana. Životinje su žrtvovane 24 sata nakon injektiranja. Za 2x injekcione grupe, dve IT injekcije administrirane su nultog i sedmog dana i životinje su žrtvovane 24 sata nakon poslednjeg injektiranja. Za 3x injekcionu grupu, IT injekcije administrirane su nultog, sedmog i četrnaestog dana i životinje su žrtvovane 24 sata nakon poslednjeg injektiranja. Takođe su uključene tri grupe miševa tretirane inertnim medijumom. Za grupe kontrolisane inertnim medijumom, Sanfilippo B miševima injektiran je inertni medijum u istom vremenskom intervalu kao i tretiranim grupama i životinje su žrtvovane na isti način kao i one iz tretiranih grupa.

[0607]I biohemijske i histološke analize primenjene su za evaluaciju ishoda studije. Biohemijske analize uključuju test Naglu aktivnosti za merenje količine enzima u tkivu i ukupni GAG test za procenu redukcije lizozomskog nakupljanja. Jetra i mozak bila su dva tkiva podvrgnuta biohemijskim analizama (slike 178 i 179). Histološke analize uključuju H&E obojenje tkiva za morfološku evaluaciju (podad nisu prikazani) i imunohistohemijsko obojenje sa anti-humanim Naglu antitelom, LAMP, Iba i GFAP (podaci za Iba i GFAP obojenje nisu prikazani).

[0608]Anti-humano Naglu antitelo korišćeno za ovu studiju bilo je mišje monoklonsko antitelo koje ne vezuje endogeni mišji Naglu u wt miševima ili mutirani Naglu u Sanfilippo B miševima. LAMP-1 imunobojenje korišćeno kao antitelo vezuje lizozomski povezane membrane proteina. Iba-1 obojenje koristi antitelo da veže jonizovani kalcijum vezujući adaptor proteina koji je specifičan za mikroglijalne i ćelije makrofaga. GFAP obojenje korišćeno je kao antitelo koji se vezuje za glijalni fibrilarni kisele protein koji je specifičan za astrocite.

[0609]Reprezentativne mikroskopske slike Naglu imunofluorescencije prikazane su na slici 180. Slika 181 pokazuje reprezentativne šematske segmente mozga. Iako je Naglu-IGFII detektovan u cerebralnom korteksu koji je bliži moždanim opnama nije nađen u subkortikalnom regionu kao što je caudate nucleus, talamus i bela masa (podaci nisu prikazani). Pošto je imunobojenje LAMP-1, Iba-1 i GFAP istih subkortikalnih površina pokazalo suprotnost skladištenju lizozoma, veruje se da je negativno imunobojenje Naglu u dubokim moždanim površinama verovatno zbog senzitivnosti Naglu imunofluorescencije.

[0610]Reprezentativne mikroskopske slike LAMP-1 imunoobojenja prikazane su na slikama od 182 do 186. Kako bi se prikazao stepen distribucije proteina i efikasnost, cerebralni korteks i subkortikalni regioni, kao što su caudate nucleus, talamus, bela masa i cerebralni korteks izabrani su za imunohistološke analize. Rezultat od Iba-1 i GFAP imunoobojenja (podaci nisu prikazani) ukazuju da ono što je viđeno u LAMP-1 imunoobojenju je kombinovani efekat promena mikroglijalnih ćelija i astrocita, dva tipa ćelija koja za koje se tvrdi da utiču na Sanfilippo B modele miševa (Li 2002, Ohmi 2002) u dodatku neuronima. Zbog tehničkih ograničenja, LAMP-1 imunoobojenje nije bilo u mogućnosti da otkrije lizozomsko nakupljanje u neuronima. Za najbolje posmatranje lizozomske akumulacije u neuronima, kao što su vakuole i inkluzije obično je korišćena elektronska mikroskopija (EM nije uključena u trenutnu studiju).

[0611]Podrazumeva se da je identifikacija tipova ćelija ograničena na neurone i glijalne ćelije. Neuroni su tipično

identifikovani relativno velikim i bledim jedrom (nukleusom) koji sadrži jedno ili više gusto obojenih jedaraca i frekventno detektabilnu citoplazmu. Glijalne ćelije generalno su identifikovane malim gustim nukleusom i neupadljivom citoplazmom. Razlika između različitih tipova glijalnih ćelija, kao što su astrociti, mikroglijalne ćelije, epidermalne ćelije i oligodendrociti, tipično su najbolje obojeni specifičnim markerima ćelijskog tipa.

[0612]U dodatku redukciji lizozomskog nakupljanja prikazanim LAMP-1 imunoobojenjem, Iba-1 imunoobojenje ukazivalo je na redukciju veličine ćelija i broja procesa u mikroglijalnim ćelijama. GFAP imunoobojenje ukazivalo je na redukciju veličine ćelija i dužinu/broj procesa u astrođtima, cerebralnom korteksu, caudate nucleate, talamusu, beloj masi i cerebelumu nakon IT injektiranja Naglu-IGFII (podaci nisu prikazani). Dalje, histopatološke analize pomoću H&E obojenja (hematoksilin i eozin) moždanog tkiva iz iste površine kao za imunohistohemijske analize, pokazale su redukciju vakuola u glijalnim ćelijama nakon IT injektiranja Naglu-IGFII 3x. Svi rezultati pomenuti iznad takođe su ukazivali na efekte IT injektiranja Naglu-IGFII.

[0613]Biohemijske analize Sanfilippo B miševa nakon IT injektiranja Naglu-IGFII detektovale su Naglu aktivnost u mozgu i jetri. Efikasnost Naglu-IGFII predstavljena je potpunom GAG redukcijom u mozgu i jetri. Imunohistohemija predstavila je biodistribuciju Naglu-IGFII u parenhimu mozga. Imunoobojenja LAMP-1, Iba-1, GFAP i histopatološke analize pomoću H&E obojenja pokazali su redukciju veličine i proces pomoću mikroglijalnih ćelija i astrocita nije samo u cerebralnoj koritkalnoj površini mozga, već i na subkortikalnim površinama, beloj masi i ceberelarnom korteksu mozga.

Zaključak

[0614]Između ostalog, predstavljeno je da je difuzija proteina, Naglu-IGFII ispoljila enzimsku aktivnost in vitro prema supstratu koji ima sličnu strukturu kao nativni supstrat Naglu. Studija in vitro ćelijskog unosa predstavljena je tako da je molekul doveden u ćelije pomoću M6P/IGFII receptora na način koji je nezavisan od M6P glikozilacije. Internalizovani Naglu-IGFII prikazali su kolokalizaciju sa lizozomima. Naglu-IGFII pokazao je redukciju lizozomskog nakupljanja in vivo nakon IC injektiranja u Sanfilippo B miševe. U poređenju sa rhNaglu i drugim Naglu fuzionisanjem i modifikacijama, Naglu-IGFII premašila ih je sve u penetriranju u parenhim mozga wt pacova sa kanilom nakon IT injektiranja. Konačno, IT injektiranje Naglu-IGFII u Sanfilippo B miševe predstavljeno je obimnom distribucijom dalje od moždanih opni, i posmatran je suprotni efekat od lizozomskog nakupljanja u cerebralnom korteksu kao i u subkortikalnim regionima. Uzeti zajedno, ovi podaci ukazuju na to da je Naglu-IGFII lek kandidat za lečenje Sanfilippo B bolesti.

PRIMER 27: TOKSIČNOST, FARMAKOKINETIKA (PK) I STUDIJE BIODISTRIBUCIJE TKIVA IT DOSTAVLJENOG NAGLU-IGFII

Dokaz konceptnih studija kod miševa

[0615]Tri grupe (n=3) Naglu (-/-) miševa injektirane su sa 10 ul koji sadrži 260 ug Naglu-IGFII datim u pojedinačnoj bolusnoj IT lumbalnoj injekciji. 260 ug doze prevodi se u dozu od 520 mg/kg težine mozga (mozak miša = 0,0005 kg). Jedna grupa injektirana je nultog dana i žrrtvovana je 24 sata nakon poslednjeg injektiranja. Treća grupa injektirana je na dan 0, 7 i 14 i žrtvovana 24 sata nakon poslednjeg injektiranja. Svaka grupa dozirana sa Naglu-IGFII uparena je sa grupom kontrolisanom inertnim medijumom kako bi se kontrolisala starost/ozbiljnost bolesti.

[0616]Naglu enzimska aktivnost u mozgu i jetri bila je slična za tri grupe dozirane sa Naglu-IGFII. Poređenjem rhNaglu enzimske aktivnosti u jetri i mozgu, više od 10 puta rhNaglu enzimske aktivnosti bili su poredivi u mozgu i jetri nakon jednomesečnog, tromesečnog i šestomesečnog doziranja u pivotntm studijama toksičnosti kod pacova i mladih majmuna, neke porcije rhNaglu doze date su Naglu (-/-) miševima kojima nije dostavljen IT nego sistematski. Ipak, ukupni GAG nivoi u mozgu pokazali su statistički značajnu redukciju (p < 0,05) nakon 3 IT injektiranja. Trend koji se odnosi na dozu za ukupnu redukciju GAG nivoa uočen je u jetri koji je statistički značajan (p < 0,05) u grupama koje primaju 2 ili 3 doze.

[0617]Biodistribucija Naglu-IGFII nakon IT injektiranja uočena je iza moždanih opni u parenhimu mozga, ali duboki subkortikalni regioni bili su negativni za anti-Naglu antitelo imunoobojenje. Redukcija lizozomske aktivnosti pomoću imunoobojenja LAMP posmatrana je u grupama kojima su date 2 ili 3 doze. Površine redukcije lizozomske aktivnosti uključivale su cerebralni korteks i duboke subkortikalne regione caudate nucleus, talamusa i bele mase. Stoga, redukcija različitih parametara imunoobojenja kod Naglu-IGFII doziranih životinja ukazuje na to da terapeutski nivoi Naglu mogu da budu prisutni uprkos odsustva anti-Naglu imunoobojenja. Oslabljen inflamatorni odgovor dokazan je redukcijom astrocita obojenjem glijalno fibrilarnog kiselog proteina (GFAP) i redukcijom obojenja jonizovanog adaptora molekula koji vezuje kalcijum (Iba) migroglija/makrofaga grupama kojima su date 2 ili 3 doze. Površine analize uključivale su cerebralni korteks i duboke subkortikalne regione caudate nucleus, talamus i belu masu.

Studije na pacovima

[0618]S-D pacovi izabrani su kao vrsta glodara za toksikološku procenu IT administriranog Naglu-IGFII. Kao rezultat, šesnaest pacova (osam po polu) dozirani su sa rekombinantnim Naglu-IGFII na maksimalnoj mogućoj dozi (MMD) i na otprilike'Ai Vi MMD (niski i srednji nivoi doza, respektivno) svaka 4 dana za ukupno 8 doza.

[0619]Pojedinačna doza studije PK/distribucije kod S-D pacova izvršena je kako bi se odredila koncentracija CSF-a i seruma ili distribucija tkiva, respektivno, prateći IT-L administraciju mužjacima i ženkama životinja.

[0620]Toksikološke studije izvršene su za evaluaciju IT-L administracije Naglu-IGFII sa toksikološkog i bezbednog farmakološkog (neurološka, respiratorna i kardiovaskularna bezbednost) gledišta i kod mužjaka i kod ženki životinja. Toksikološka evaluacija u ovim studijama uključuje klinička posmatranja, telesnu težinu, uzimanje hrane, kliničku patologiju, odgovarajuće parmakološki bezbedonosne procene (fizičkim pregledom ili elektrokardiografijom), gross tkiva i mikroskopsku evaluaciju. Ograničen broj uzoraka CSF-a i seruma sakupljen je i analiziran na Naglu-IGFII i na antitela test jedinjenja. Naglu-IGFII distribucija tkiva i subćelijska lokalizacija kvantifikovane su pomoću testa enzimske aktivnosti i imunohistohemijski, respektivno. Dodatno, izabrane studije uključuju period oporavka kako bi se procenila reverzibilnost, potencijalno kašnjenje bilo kojih značajnih toksikoloških nalaza.

Studije na majmunima

[0621]Cinomolgus majmuni izabrani su kao neglodarske vrste za toksikološke evaluacije IT administriranog Naglu-IGFII zbog njihove genetske i anatomske sličnosti sa ljudima i stoga se smatra da su relevantnije vrste. S obzirom da su pacijenti planirani za klinička ispitivanja na Sanfilippo sindrom tipa B pedijatrijski, šestomesečna toksikološka studija kod mladih cinomolgus majmuna izvršena je administracijom Naglu-IGFII intratekalnim uređajem za dostavu lekova. Mladi cinomolgus majmuni generalno su stari manje od godinu dana na početku studije (otprilike 7-9 meseci) i težili su između 900 g i 1500 g na početku studije. Dobijeni podaci iz jednomesečnih ponovljenih doza mladih cinomolgus majmuna iz studije toksičnosti vode do izbora nivoa doza i plana šestomesečne studije nad mladim cinomolgus majmunima. Toksikološke studije ponovljenih doza izvršene su da oponašaju očekivani klinički način administriranja (IT-L bolusno) i frekventnost administracije (svake druge nedeije) u periodu od 1 do 6 meseci.

[0622]Kao što je opisano iznad, toksikološke studije su dizajnirane da ocene IT-L administraciju Naglu-IGFII sa toksikološkog i bezbednog farmakološkog (neurološka, respiratorna i kardiovaskularna bezbednost) gledišta i kod mužjaka i kod ženki životinja. Toksikološka evaluacija u ovim studijama uključuje klinička posmatranja, telesnu težinu, uzimanje hrane, kliničku patologiju, odgovarajuće parmakološki bezbedonosne procene (fizičkim pregledom ili elektrokardiografijom), gross tkiva i mikroskopsku evaluaciju. Ograničen broj uzoraka CSF-a i seruma sakupljen je i analiziran na Naglu-IGFII i na antitela test jedinjenja. Naglu-IGFII distribucija tkiva i subćelijska lokalizacija kvantifikovane su pomoću testa enzimske aktivnosti i imunohistohemijski, respektivno. Dodatno, izabrane studije uključuju period oporavka kako bi se procenila reverzibilnost, potencijalno kašnjenje bilo kojih značajnih toksikoloških nalaza.

PRIMER 28: INTRATEKALNA ADMINISTRACDA NAGLU-IGFII SVAKE DRUGE NEDELJE

[0623]Ovaj primer dizajniran je da odredi izvodljivost IT lumbalnog doziranja svake druge nedeije za 6 injektiranja (tromesečna studija) kod Naglu -/- modela miševa. Ovaj režim doza može da bude klinički relevantniji u poređenju sa doziranjem jednom nedeljno.

[0624]Osam nedelja stari mužjaci i ženke Naglu -/- miševa proučavani su prema sledećem eksperimentalnom planu:

[0625]

[0625]Izvršene su fiziološke studije, uključujući testove Naglu aktivnosti u jetri, mozgu i serumu, anti-Naglu antitelo testovi na serum i BCS testovi na jetru i mozak. Izvršene su histološke studije, uključujući Naglu IHC na mozak, kičmenu moždinu i jetru i Lamp obojenje na mozak i kičmenu moždinu.

[0626]Mozak, kičmena moždina i jetra sakupljeni su i fiksirani u 10% NBF. Sekcije u parafinu od 5 mm pripremljene su za histološko obojenje. Imunohistohemijsko (IHC) obojenje Naglu korišćeno je za detektovanje ćelijskog unosa injektiranog proteina. H&E obojenje korišćeno je za posmatranje morfoloških promena. LAMP, indikator lizozomske aktivnosti i stanja bolesti, GFAP i Iba-1, dva CNS patološka markera za aktivirane astrocite i mikroglijalne ćelije korišćene su za evaluaciju histopatološkog napretka.

[0627]Naglu imunoobojenje mozga, kičmene moždine i jetre miševa tretiranih sa inernim medijumom i Naglu-IGFII pokazalo je to da je u mozgu i kičmenoj moždini injektirani Naglu detektovan samo u moždanim opnama (M) samo pomoću IHC i nikakvo Naglu pozitivno obojenje nije đetektovano u drugim regionima (slika 187). U jetri, sinusoidalne ćelije (S) bile su Naglu pozitivne i nikakav Naglu unos nije pronađen u hepatocitima (H).

[0628]LAMP imunoobojenje i H&E obojenje jetre i kičmene moždine miševa tretiranih inertnim medijumom i Naglu-IGFII pokazalo je da, u poređenju sa inertnim medijumom životinja, LAMP obojenje opada u obe jetre i kičmene moždine tretiranih sa Naglu. H&E obojenje pokazalo je da je ćelijska vakuolizacija u hepatocitima evidentno redukovana kod tretiranih grupa u poređenju sa grupama tretiranih inertnim medijumom (slike 188 i 189).

[0629]H&E obojenje mozga miševa tretiranih inertnim medijumom i sa Naglu-IGFII pokazali su poboljšanje morfologije u mozgu nakon 6 U injektiranja Naglu-IGFII svake druge nedeije u periodu od 3 meseca. U tretiranom mozgu, ćelijska vakuolizacija (prikazana strelicama) u svim pregledanim regionima opadala je u poređenju sa grupom kontrolisanom inertnim medijumom (slika 190).

[0630]LAMP IHC u različitim regionima mozga nakon 6 IT Naglu injektiranja u periodu od 3 meseca pokazala je to da je, u poređenju sa grupama kontrolisanim inertnim medijumom, Naglu IT administracija SFB miševima rezultovala u

redukciji lizozomske aktivnosti u svim pregledanim regionima otkriveni LAMP imunoobojenjem (slika 190). Ova redukcija je okarakterisana opadanjem broja LAMP pozitivnih ćelija, manjoj veličini čestica i bleđem obojenju. Obeležena redukcija nađena je u cerebelumu i moždanom stablu, koji su locirani u caudate delu mozga blizu kičmene moždine u poređenju sa drugim regionima mozga. Cista redukcija takođe je uočena u dubokim regionima mozga uključujući belu masu, hipokampus i talamus.

[0631]Pomoću Iba IHC u različitim moždanim regionima nakon 6 IT Naglu injektiranja u periodu od 3 meseca otkrivena je aktivacija mikroglijalnih ćelija (slika 191). U poređenju sa grupama tretiranih inertnim medijumom nije uočeno opadanje broja pozitivnih ćelija i intenziteta obojenja u Naglu tretiranim grupama. Međutim, ćelijska morfologija pozitivnih mikroglijalnih ćelija promenjena je sa redukovanjem veličine ćelija u svim pregledanim regionima mozga u poređenju sa onima velikim i vakuolizovanim u grupama tretiranim inertnim medijumom (inserti).

[0632]GFAP IHC u različitim moždanim regionima nakon 6 IT Naglu injektiranja u toku 3 meseca otkrivena je astrocitna aktivacija (slika 192b). U poređenju sa grupom tretiranom inertnim medijumom, GFAP pozitivno obojenje smanjeno je u cerebelumu i moždanom stablu i blago je smanjeno u drugim pregledanim regionima.

[0633]Uzimajući u obzir ćelijski unos, ovi podaci pokazuju da je u mozgu i kičmenoj moždini Naglu detektovan u moždanim opnama samo nakon 6 puta Naglu-IGFII IT injektiranja svake druge nedeije u periodu od 3 meseca. Naglu nije bio detektovan IHC-om u bilo kom drugom regionu mozga i kičmene moždine. U jetri, Naglu pozitivno obojenje nađeno je u sinusoidalnim ćelijama.

[0634]U mozgu i kičmenoj moždini, nakon 6 puta Naglu-IGFII IT injektiranja svake druge nedeije u periodu od 3 meseca, histopatološka poboljšanja viđena su u mozgu i kičmenoj moždini iako injektirani Naglu nije bio detektibilan pomoću IHC. H&E obojenje pokazalo je redukciju ćelijske vakuolizacije u svim pregledanim regionima mozga. LAMP obojenje opadalo je kroz tretiranu kičmenu moždinu i u svim evaluiranim delovima mozga uključujući belu masu, hipokampus i talamus koji su u dubokim površinama mozga sa označenim opadanjem u cerebelumu i moždanom stablu u Naglu-IGFII tretiranim grupama. Smanjeni šablon GFAP obojenja za astrocite bili su konzistentni sa LAMP obojenjem, dok nisu drastično opadali kao LAMP. Iba-1 obojenje pokazalo je redukciju veličine ćelija mikroglijalnih ćelija u svim regionima mozga koji su pregledani. U jetri, H&E obojenje pokazalo je redukciju ćelijske vakuolizacije sa označenom redukcijom u

LAMP obojenju Naglu tretiranih grupa.

PRIMER 29: TRETMAN PACIJENATA SA SANFILIPPO B

[0635]Direktna CNS administracija npr. IT dostavom može da se koristi za efektivno lečenje Sanfilippovog sindroma tipa B (Sanfilippo B). Ovaj primer ilustruje studiju eskalacije doze u muiticentru osmišljene za evaluaciju bezbednog unosa 3 nivoa doza Naglu-IGFII i/ili rhNaglu svake druge nedeije (SDN) u periodu od 40 nedelja koji je administriran intratekalnim uređajem za dostavu lekova pacijentima sa Sanfilippo B sindromom. Različiti primeri uređaja za intratekalnu dostavu lekova pogodni za lečenje ljudi prikazani su na slikama 94-97.

[0636]Biće uključeno do 20 pacijenata:

Grupa 1: 5 pacijenata (najniža doza)

Grupa 2: 5 pacijenata (srednja doza)

Grupa 3: 5 pacijenata (najviša doza)

5 pacijenata biće nasumično izabrani za ne dobijanje tretmana.

[0637]Pacijenti su izabrani za studiju na bazi inkluzija koje prate sledeće kriterijume:

[0638]Određena je bezbednost povećavanja doza administriranog Naglu-IGFII IT injektiranjem u periodu od 40 nedelja kod pacijenata sa Sanfilippo B. Dodatno, procenjene su klinička aktivnost Naglu-IGFII i/ili rhNaglu na kognitivne funkcije i farmakokinetiku pojedinačnih i ponovljenih doza u serumu i koncentracija u cerebrospinalnoj tečnosti (CSF).

[0639]Obično, terapeutski efektivna količina Naglu-IGFII t/ili rhNaglu administrirana je intratekalno u regularnim intervalima, zaviseći od prirode i stepena efekata bolesti kontinuirano. Administracija na "intervalu", kao što je ovde korišćeno ukazuje na to da je terapeutski efektivna količina administrirana periodično (što je karakteristično za jednokratnu dozu). Interval može da bude određen standardnim kliničkim tehnikama. U nekim oblicima, Naglu-IGFII i/ili rhNaglu intratekalno je administriran je na dva meseca, jednom mesečno, na tri nedeije, na dve nedeije, jednom nedeljno, dvaput nedeljno, triput nedeljno ili jednom dnevno. Interval administracije za pojedinačni primer ne mora da bude fiksiran interval, ali može da varira sa vremenom u zavisnosti od potrebe individue. Na primer, za vreme fizičke bolesti ili stresa, ako anti-Naglu antitela postanu prisutna ili rastu ili ako su i simptomi bolesti pogoršani, interval između doza može da se smanji.

[0640]Dok su određena jedinjenja, kompozicije i metode opisane ovde sa specifičnošću u skladu sa određenim oblicima, prateći primere koji su služe samo da ilustruju jedinjenja pronalaska i ne ograničavaju isto.

[0641]Patentni zahtevi ili opisi koji uključuju "ili" između jednog ili više članova grupe smatraju se zadovoljavajućim ako su jedan, više od jednog ili svi članovi grupe prisutni u, ili su od koristi ili na neki drugi način relevantni za dati proizvod ili proces ukoliko nije naznačeno suprotno iz konteksta. Predmetni pronalazak uključuje oblike u kojima tačno jedan član grupe je prisutan ili je od koristi ili je drugačije relevantan datom prozvodu ili procesu. Predmetni pronalazak takođe uključuje oblike u kojima je više od jednog člana ili ceia grupa prisutna u, ili je od koristi ili je drugačije relevantan datom prozvodu ili procesu. Treba da bude jasno da, generalno, gde aspekti pronalaska sadrže određene elemente, odlike, određene oblike pronalaska ili aspekata pronalaska sadrže ili se sastoje u suštini od ovahvih elemenata, odlika, itd. Za potrebe jednostavnosti ovih oblika nisu u svakom slučaju posebno detaljno opisani ovde.

Claims (7)

1. Vodeni rastvor farmaceutske kompozicije sadrži enzim koji je zamena za lizozomski enzim, pufer agens, surfaktant i modifikator toničnog rastvora, za upotrebu u metodi koja sadrži korak administriranja kompozicije intratekalno subjektu koji pati ili je podložan lizozomskim bolestima nakupljanja povezani su sa redukovanim nivoom ili aktivnošću lizozomskog enzima naznačeno time da je pH vrednost od 5,5 do 7,0, a enzim je prisutan u koncentraciji većoj od oko 10 mg/ml i pufer agens je do 5 mM fosfata.

2. Kompozicija za upotrebu prema patentnom zahtevu 1, pri čemu je kompozicija administrirana u pojedinačnoj dozi čija je zapremina manja od 5 ml ili manja od 3 ml.

3. Kompozicija za upotrebu prema patentnom zahtevu 1 ili patentnom zahtevu 2, pri čemu intratekalna administracija ovih kompozicija ne rezultujuje u supstancijalnim neželjenim efektima kod subjekta.

4. Kompozicija za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva od 1 do 3, pri čemu je interval administracije jednom u svake dve nedeije, jednom mesečno ili jednom u dva meseca.

5. Kompozicija za upotrebu prema bilo kom od prethodnih prethodnih zahteva, gde je lizozomska bolest nakupljanja izabrana iz grupe koju sadrže Huntersov sindrom, bolest metahromatske leukodistrofije (MLD), Sanfilipp-ov sindrom tipa A i bolest globoidne ćelijske leukodistrofija (GLD).

6. Kompozicija za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva od 1 do 4, gde je enzim izmene opciono izabran iz grupe koju čine rekombinantna idunorat-2-sulfataza (I2S), arilsulfataza A (ASA), heparan N-sulfataza (HNS).

7. Kompozicija za upotrebu prema bilo kom od prethodnih zahteva, pri čemu postiže terapeutsku koncentraciju lizozomskog enzima unutar zahvaćenih ćelija i tkiva CNS-a, posebno mozga.