RS54004A - Fotoprotein sa poboljšanom bioluminescencijom - Google Patents

Abstract

Otkriven je fotoprotein sa poboljšanom aktivnošću luminescencije, njegova upotreba kao indikatora kalcijuma i u ogledu zasnovanom na ćeliji za detektovanje i merenje unutar ćelijskog kalcijuma.

Description

FOTOPROTEIN SA POBOLJŠANOM BIOLUMINESCENCIJOM

Oblast pronalsaka

Predmetni pronalazak obezbeđuje himerični fotoprotein sa poboljšanom luminescentnom aktivnošću, njegovu upotrebu kao indikatora kalcijuma u reporter gen sistemu i u ćelijski zasnovanim ogledima za detekciju i merenje unutarćelijskog kalcijuma.

Stanje tehnike

Bioluminescencija je sposobnost živog organizma da emituje vidljivu svetlost preko različitih hemiluminescentnih reakcionih sistema. Bioluminescentne reakcije zahtevaju tri glavne komponente: luciferin, luciferazu i molekularni kiseonik. Međutim, mogu biti potrebne i druge komponente u nekim reakcijama, uključujući katjone (Ca<++>i Mg<++>) i kofaktore (ATP, NAD(P)H). Luciferaze su enzimi koji katalizuju oksidaciju supstrata, luciferin i proizvode nestabilni intermedijer. Svetlost se emituje kada se nestabilni intermedijer raspadne-do svog osnovnog oblika, generišući oksiluciferin. Postoji mnogo različitih nesrodnih tipova luciferina, i ako mnoge vrste iz najmanje sedam filuma koriste isti luciferin, poznat kao koelenterazin, koji sadrži prsten koji obrazuju tri amino kiseline (2 tirozina i fenilalanin). Kod nekih životinja (npr. meduza) luciferin/luciferin sistem može biti ekstrahovan u obliku stabilnog "fotoproteina" koji emituje svetlost nakon vezivanja kalcijuma. Fotoproteini se razlikuju od luciferaza u tome što stabilizuju oksidisane intermedijerne komplekse luciferaze i luciferina. Fotoproteini su prisutni kod mnogih morskih žarnjaka i omogućavaju ovim organizmima da emituju svetlost u različite svrhe uključujući parenje, ishranu i odbranu (1). Dok bakterije emituju svetlost kontinuirano, kod mnogih drgih organizama luminescencija se događa kao bljesci, tipično traju 0.1-1 sek. Ovo zahteva brzo uključivanje/ isključivanje enzimske reakcije i prisustvo reagenasa prikladno zarobljnih i spremnih na brzu mobilizaciju. Kod žarnjaka sjaj je uzrokovan ulaskom kalcijuma. Mesta fotoproteina za vezivanje kacijuma su homologa kalmodulinu. U prisustvu kalcijuma fotoproteini emituju vidljivu svetlost putem unutarmolekulske reakcije. Postoji mnogo luminescentnih organizama, ali samo sedam fotoproteina, naime do sada su izolovani: Talasikolin (2, 3), Ekuorin (4-6), Mitrokromin (sin. Halistaurin) (7, 8), Klitin (sin. sa Fialidin) (8, 9), Obelin (2, 6, 10, 11), Mnemiopsin (12, 13) i Berovin (12, 13). Svi ovi proteini su kompleksi apoproteina, imidazopirazin hromofora (celenterazin) i kiseonika. Njihove strukture su visoko konzervativne, posebno u području koje sadrži tri mesta za vezivanje kalcijum (EF-ruka srukture). Ove EF-ruka strukture su karakteristika kalcijum-vezujućih familija proteina. Fotoprotein emituje svetlost nakon reakcije sa kalcijumom koji se tesno vezuje za EF-ručni džep. Reakcija je događaj pojedinačnog preokreta i rezultira oslobađanjem C02i emisijom svetla u plavom području ( Xmax = 470 nm). Termin "fotoprotein" identifikuje luciferin vezujući polipeptid, koji je sposoban za luminescenciju, dok je "apofotoprotein" upotrebljen da naznači protein bez luciferina.

Najviše izučavani fotoproteini su Ekuorin, izolovan izAequorea victoria(14) i Obelin izolovan izObelia longissima(15). Nakon vezivanja Cat+ Ekuorin prolazi kroz konformacionu pramenu pretvarajući sebe u oksigenazu (luciferazu), koja zatim katalizuju oksidaciju celenterazina vezivanjem molekularnog kiseonika. Plavi fluorescentni protein je napravljen od celenteramida, koji je oksida-cioni produkt celenterazina, koji nije kovalentno vezan za apofotoprotein. Fotoprotein se može regenerisati iz apofotoproteina inkubiranjem sa celenterazinom, molekularnim kiseonikom, EDTA i 2-merkaptoetanolom ili ditiotreitolom. Pošto je celenterazin uobičajni luminescentni supstrat koji se koristi od strane fotoproteina Ekuonna. Mitrokomma. Khtma i Obelina. reakcija emitovanja svetlosti je verovatno ista kao kod ova 4 proteina (16). Nedavna akvizicija primarne strukture i kristalografskih podataka Ekuonna i Obelina dala je dodatne informacije o njihovoj funkciji. Prirodni Obelin iz hidroidaObelia longissimaje jednolančani protein od 195 aminokiselinskih članova (aa) sa odgovarajućom molekularnom masom od 20 kDa, koji sadrži ne kovalentno vezanu hromatofornu grupu celenterazina. Analiza primarne strukture Klitina pokazuje da on sadrži 189 aa i pripada familiji fotoproteina. Ca"'-vezujuci fotoprotein hidrozoa, međutim, razlikuje se od drugih Ca"-vezujućih proteina, kao što su kalmodulin i troponin C. po realativno visokom sadržaju cisteina. histidina. trptofana, prolina i ostataka tirozina.

Ispitivanja strukture i funkcije Obelina izneta su u Bondar VS i sar., Biochemistrv (2001). 66(9): 1014-8, Vysotski ES i sar., (2003), 42(20: 6013-24 i Deng L i sar., FEBS Lett. (2001), 506(3): 281-5. Dva poslednje, posebno, opisuju karakteristike biofuminescencije i emisije W92F mutanta obelina.

Fotoproteini se široko koriste u tehnologiji reporter gena da se prate ćeliski događaji vezani sa transdukcijom signala i ekspresijom gena.

Ispitivanje ćehjskih događaja i njihova regulacija zahteva osetljive. ne invazivne analitičke postupke. Fotoproteini i uopšte bioluminescencija su odličan reporterski sistem pošto gotovo da nemaju pozadinu nasuprot fluorescentnim sistemima.

Fotoproteini eksprimiraju se u sisarskim ćelijama da se prate promene kalcijuma u odgovoru na različite stimuluse. Koncentracija unutarćelijskog kalcijuma može se meriti dodavanjem kofaktora celenterazina sisarskim ćelijama koje eksprimiraju fotoprotein i detektovanjem emisije fotona. koja je naznaka unutarćelijske koncentracije kalcijuma.

Opis pronalaska

Sada je otkriveno da se himerizacijom proteina Obelina (Apcbelin) putem zamene njegovog regiona sadržanog između prva dva mesta vezivanja kalcijuma, sa odgovarajućim regionom fotoproteina odabranog od Klitina, Ekuorina, Talasikolina, Mitokromina, Mnemiopsoina i Berovma, može dobiti novi fotoprotein sa poboljšanom bioluminescencijom.

Onako kako se ovde koristi Obelin se može odnositi na bilo koji od fotoproteina izolovanih od različitih vrstaObelia,uključujućiObelia longissimaiObelia geniculata (17).Referenca nukleotida i sekvence amino kiseline Obelina date su u SEQ ID br. 1 i 2, respektivno. Referenca sekvence amino kiselin i nukleotidne sekvence Klitina, Mitokromina i Ekuorina deponovane su u GenBank prijavni brojevi O08121, P39047, AAA27720, i respektivno L13247, L31623, L29571, dok su sekvence za Talasikolin, Mnemiopsis i Berovin opisane u referencama 2, 3, 12 i 13.

"Odgovarajući region ili fragment" onako kako se ovde koristi, označava bilo koju sekvencu amino kiseline, u okviru odabranog fotoproteina, koja se poklapa sa sekvencom Obelina u odgova-rajućim poravnavanjima sekvence sa izuzetkom od najmanje 1, poželjno najmanje 5, još poželjnije najmanje 10 članova amino kiselina, koji nisu konzervirani u odgovarajućim proteinima (Obelin i odabrani fotoprotein), pomenuti region ili fragment poželjno spajaju članove 42-122, još poželjnije članove 50-95, kada se odnosi na Obelin sekvencu.

U skladu sa poželjnim oblikom pronalaska himerični protein je dobijen zamenom članova 50 do 94 sekvence amino kiseline Obelina sa fragmentom sekvence Klitina šireći se od člana 53 do 97. Tako dobijeni fotoprotein, koji je nazvan "Fotin", ima sekvencu amino kiseline SEQ ID br. 3.

Himenčni proteini pronalaska mogu se dalje modifikovati putem deleci|a, dodavanja ili zamena jednog ili više članova amino kiselina, pod uslovom da profil aktivnosti fotoproteina, u terminima emisi|e svetla i kalcijumskog odgovora, je očuvan ili povećan. Posebno su poželjne supstitucije na pozicijama 55. 66. 67. 73, 74, 75, 78, 83, 84. 87. 89 i 94. kada se odnose na sekvencu Obelina.

Kao što je pokazano u studijamain vitrofotin produkuje intenzivnu biolummescenciju u odgovoru na stimulaciju kalcijumom. koja je generalno viša od one zapažene sa prirodnim fotoprotemima.

Za pripremanje himeričnih fotoproteina konstrukt rekombinantne DNK koji nosi porcije kodirajućih sekvenci Obelina i odabrani lotoprotein koji nije Obelin pripremljen je koristeći konve-ncionalni genetički inženjering, nastali himenčni produkt je ubačen u vektor, ekspnmiran u pogodnom domaćinu i zatim izolovan i prečišćen. Na primer, cDNK, koje kodiraju Obelin i različite fotoproteine mogu biti amplifikovane sa PCR ili konstruisanein vitrosa sintetičkim oligonukleotidima i produkti mogu biti rekombinovani koristeći pogodna restrikciona mesta. prirodno se javljati ili veštački uneti u oligonukleotide upotrebljene za amplifikaciju ili za konstrukcijuin vitro.Ekspresioni vektor može sadržati, u dodatku na rekombinantni konstrukt, promotor, mesto vezivanja ribozoma, inicijacioni kodon, stopkodon ili konsenzus mesto za pojaćivaće transkripcije. Vektor može takođe sadržati selekcioni marker za izolaciju ćelija domaćina,koje sadrže konstrukt DNK. Pogodni vektori su na primer kvasac ili bakterijski plazmidi. bakteriofagi, virusi, retrovirusi ili DNK. Vektori koji nose rekombinantni konstrukt mogu se uvesti u domaćina putem konvencionalnih tehnika. Ćelije domaćina mogu biti prokariotske ili eukanotske. kao što su bakterije, kvasci ili sisarske ćelije. Poželjni domaćini za ekspresiju/ produkciju fototropina su sisarske ćelije, uključujući ćelije epitelijalnog ili limfoblastnog porekla, kao što su Hek-293, CHO-K1, HepG2 i HL60. Ove ćelije mogu ekspnmirati apofotoprotein u citoplazmi (18), u mitohondrijama. dodavanjem mitohondrijalne ciljne sekvence fotoproteinu. ili bilo koji drugi ćelijski odeljak (19-21). Alternativno, mogu se upotrebiti ne sisarske ćelije, kao što su bakterije ili gljive. Kada je jednom odabran tip ćelije domaćina genetički konstrukti mogu se uvesti putem taloženja kalcijum fosfata, elektroporacijom ili drugim konvencionalnim tehnikama. Nakon transfekcije ćelije su gajene na pogodnom medijumu i skrinovane za odgovarajuće aktivnosti. Fotoprotein pronalaska može se izolovati i prečistiti sa konvencionalnim procedurama, kao što su ekstrakcija, taloženje, hromatografije, afinitetna hromatografija, elektroforeza.

Tačkaste mutacije mogu se uvesti u himenčni produkt putem PCR-a proširenog preklapanja.

Da se proizvede Fotin, Ndel/Munl fragment gena Obelina je zamenjen sa fragmentom od 135 nukleotida koji odgovra kodirajućoj sekvenci Klitina, koja ima raspon nukleotida od 156-291.

U daljem aspektu pronalazak je usmeren na molekul nukiemske kiseline koji kodira himnerične proteine ovde otkrivene. Sekvence koje kodira DNK mogu biti modifikovane različitim degeneracijama genetičkog koda, na primer, menjanjem upotrebe kodona da se poboljša ekspresija u heterologim sistemima.

U poželjnom obliku pronalaska sekvenca DNK koja kodira protein Fotin odabrana je od SEQ ID br 4 i 5.

Da se ispita da li je himenčni produkt bio funkcionalan izvedeni suin vitroeksperimenti transkripcije i translacije u translacionom sistemu klica pšenice bez ćelija u prisustvu celenterazina. U ovim eksperimentima zabeleženo je formiranje aktivnog fotoproteina putem testiranja lumine-scencije iz translacione mešavine nakon dodavanja jona kalcijuma. Da se koreliše merena luminescencija sa količinom produkovanog proteina obavljena je translaciona reakcija u prisustvu<35>S-metionina. Količina novo sintetizovanog polipeptida je određena merenjem inkorporacije<35>S-metionina u trihlor sirćetnu nerastvorljivu frakciju. Rezultati ovih eksperimenata pokazuju da senziti-vnost i efektivnost Fotina u generisanju bioluminescencije u odgovoru na stimulaciju jona kalcijuma.

U daljem obliku pronalaska, himerični proteini koji su ovde obezbeđeni koriste se kao indikatori kalcijuma, posebno za merenje koncentracije unutarćelijskog kalcijuma. U uobičajenom ogledu, kofaktor kao što je celenterazin je dodan sisarskoj ćeliji koja eksprimira fotoprotein i zabe-ležena je emisija svetla postupcima poznatim u praksi, na primer koristeći komercijalno dostupni luminometar.

Ćelije koje eksprimiraju i fotoprotein i receptor uključen u mobilizaciju unutarćelijskog kalcijuma mogu se upotrebiti da se testiraju molekuli kandidati za njihove efekte na modulaciju receptora. Himerički fotoprotein pronalaska može se upotrebiti u mnoštvu funkcionalnih ogleda zaso-vanih na ćeliji koji koriste merenje unutarćelijskog kalcijuma da se proceni aktivnost proteina, posebno receptora spojenih sa G-proteinom (GPCR-ova) i jonske kanale plazma membrane. I ako veliki i brz porast koncentracije unutarćelijskog kalcijuma nakon GPCR-ova i stimulacije jonskog kanala može biti detektovan pomoću različitih reportera kao što su fluorescentne boje osetljive na kalcijum, upotreba bioluminescentnih fotoproteina (22)je preferirana pošto je njihova pozadina gotovo otsutna nasuprot fluorescentnim bojama; štaviše, merenje kalcijuma sa fotoproteinima, sem što produkuje brze signale, generiše visoki odnos signala prema šumu sa širokim rasponom osetljivosti detekcije (22, 23). Funlcionalni ogled zasnovan na ćelijama obično sadrži dodavanje odgovarajućeg agonista kulturi ćelija koje eksprimiraju i GPCR-ove i jonske kanale i fotoprotein, i zatim određuju bilo koje variranje koncentracije kalcijuma, na primer povećanje indukovano bilo sa brzim influksom iz izvanćelijskih mesta ili oslobađanje iz unutarćelijskih ostava (18), preko merenja aktivnosti fotoproteina.

Upotreba ćelija koje eksprimiraju i Fotin i receptor koji je uključen u modulaciju koncentracije unutarćelijskog kalcijuma validni sistem za skrining jedinjenja u odnosu na njihove efekte na oslobađanje unutarćelijskog kalcijuma. Visoka propusna moć skrining ogleda može se takođe dizajnirati koristeći fotoprotein u skladu sa pronalaskom kao reporter sistem. Osetl|ivost sistema kao i visoki odnos signala u odnosu na šum omogućuje upotrebu ogleda malih zapremina.

U daljem obliku, fotoprotein u skaldu sa pronalaskom je konjugovan za molekul od analitičkog, dijagnostičkog ili terapeutskog interesa i konjugacioni proizvod je upotrebljen u imunoogledu komparativne čvrste faze da se odredi količina molekula u biološkim uzorcima. Na primer, fotoprotein može biti hemijski konjugovan za protein hormon i upotrebljen u imunoogledu čvrste faze ša hormon specifičnim antitelima da se odrede nivoi hormona u pljuvačci (24). U još jednom obliku, fuzioni produkt između fotoproteina u skladu sa pronalaskom i različitim (poli)peptidom, kao što je hormon, antigenim peptidom, lakim ili teškim lancem imunoglobulina, avidinom, streptavidinom ili proteinom A. je produkovan poznatim tehnikama genetičkog inženjeringa, kao što je otkriveno u US6087476 (koji je ovde inkorporiran referencom), i upotrebljen u imunodijagnostičkim ili postupcima imidžinga.

Primeri koji slede ilustruju pronalazak sa više detalja.

OPISILUSTRACIJA

Slika 1. Bioluminescencija indukovana kalcijumom od novo sintetizovanih fotoproteina. Fotoproteini su translacirani u sistem klica pšenice bez ćelija u prisustvu celenterazina. Alikvoti svih translacionih mešavina su inkubirani tokom 2 časa u mraku na 30°C. Reakcija je napunjena sa 50 mM CaCl2i luminescencija je zabeležena tokom 10 sekundi.

Slika 2. Translacija DNK fotoproteina u prisustvu celenterazina, sa luminescencijom koja je merena razblaživanjem reakcione mešavine. AQ: Ekuorin, PH: Fotin, OB: Obelin.

Slika 3 (A) Emisija svetla zavisna od doze ATP nakon stimulacije endogenog receptora ATP izloženog CHO-K1 ćeliji transfektovanoj sa DNK Fotina. Transfekcija ćelije, prikupljanje i ekspresija Fotina su obavljeni kao što je opisano u pnmeru i. Ćelije su tretirane sa dve različite koncentracije ATP. (B) CHO-K1 ćelije transfektovane sa DNK Obelina upotrebljene su kao pozitivna kontrola. Luminescencija je izražena u RLU (relativne jedinice svetla).

Slika 4. Kriva aktivnosti Fotina zavisna od doze u CHO-K1 ćelijama transfektovanim i sa receptorom Endotelina A i Fotinom. Receptor je aktiviran injekcijom endotelina u koncentraciji od 100 i 500 nM.

Slika 5. Kriva zavisna cd doze dobijena od ćelija koje eksprimiraju fotoprotein Fotin i pacovski vaniloidni receptor 1 (VR1). Specifični agomst. kapsaicm je upotrebljen u koncentraciji od 10 i 50 uM

PRIMERI

1. Transkripcija/translacijaDNKfotoproteinain vitro

Translacija fotoproteina je obavljena u sistemu klica pšenice bez ćelija (TNT kit. Promega). sledeći opšta uputsta proizvođača. Približno 2 ug DNK je upotrebljeno za svaku reakcionu mešavmu transkripcija/translacija. Translaciona zapremina (50 ul) uključujući 25 ul ekstrakta klica pšenice, 2 ul reakcionog pufera, mešavinu amino kiselina sem metionina. rnasina i celenterazina (40 uM), T7 polimeraze. Mešavina je takođe sadržala<35>S-Metionin (specifična aktivnost 1000 Ci/mmol).<3=>S-Metionin je upotrebljen da se odredi količina fotoproteina sintetizovanogin vitro.Do tog trenutka, 5 u I iz svakog uzorka translacione mešavine je istaloženo TCA na ledu tokom 30 minuta, filtrirano, isprano sa hladnim 5% TCA, metanolom. osušeno i stavljeno u vijale za brojanje.

Količina proizvedenog Fotina i Obelina u sistemu bez ćelija prikazana je u tabeli I.

2. Ogled fototroproteina

5 i 10 pj translacione mešavine je direktno pomešano sa 95-90 ul rastvora PBS u ploči od 96 bunarčića koja je potopljna u luminometar (Berthold). Da se pobudi emisija svetla fotoproteina 50 ul rastvora (50 mM CaCI2) je ubrizgano u bunarčiće i luminescencija je beležena svakih 10 sekundi.

Rezultatiin vitrotranslacije DNK Fotina, Obelina i Ekuorina prikazani su na slici 1. Merenja lummescencije dobijena razblaživanjem fotoproteina translacionim reakcijamain vitroprikazana su na slici 2. Poređenja podataka lummescencije sa TCA brojanjima dobijenim tokom translacije dobijenim sa različitim količinama DNK Fotina i Obelina prikazana su u tabeli II (merenje luminescencije je proporcionalno količini novosintetizovanih fotoproteina.

3. Primeri ćelijski - zasnovanih funkcionalnih ogleda

31Fotin-ekspnmirajući klonovi su dobijeni transfekcijom CHO-K1 ćelija (Materijali i postupci). Dva dana nakon transfekcije ćelije su tripsinizirane i razblažene 10 ili 100 puta. Jednom kada ćelije odrastu u dobro izolovane klonove, klonovi se prenose na nove ploče i selkcionišu na bazi funkcionalnih odgovora (luminescentni signal) u različitim koncentracijama ATP, za koji je poznato da stimuliše CHO endogeni receptor i da povećava citoplazmatičnu koncentraciju Ca" Na kraju svakog eksperimenta, ćelije su lizirane perfuzijom rastvora koji sadrži TntonX-100 i CaCI2. Aktivni fotoprotein je rekonstituisan iskubacijom ćelija sa 10 f.iM celeterazina razblažnog u PBS koji sadrži 2 mM kalcijuma, u mraku na 37°C u 5% C02atmosferei tokom 3 sata. Za merenje emisije svetla ćelije su lizirane u prisustvu kalcijuma i zabeležena je emitovana luminescencija. Broj fotona emitovanih tokom prvih 10 sekundi je integrisan u luminometar i učinjen vidljivim na ekranu. Ćelije transfektovane sa praznim plazmidom ili nisu transfektovane (podaci nisu prikazani) ili nisu povećale emisiju fotona. Da se detektuju promene u koncentracijama kalcijuma 10. 50 i 100 uM ATP je ubrizgano i kinetika kalcijumskog odgovora je određena. Dobijena kriva je prikazana na slici 3 (A). Ćelijska linija koja je ekspnmirala fotoprotein Obelin upotrebljena je kao pozitivna kontrola slika 3 (B).

3.2 Ustanovljena je CHO ćelijska linija koja eksprimira receptor Endotelina A i Fotin. Nakon stimulacije sa agonistom ovaj receptor indukuje povećanje koncentracije unutarćelijskog kalcijuma koji se meri putem luminescencije Fotina. Ćelije su kultivisane kao jedan sloj u DMEN/F12 medijumu koji je sadržao 10% fetalni goveđi serum (FBS) u ploći sa 96 bunarčića. U danu eksperimenta medijum za kulturu je uklonjen i ćelije su inkubirane sa 10 uM celenterazina u PBS tokom najmanje 3 č. Peptin Endotelin je razblažen u PBS u koncentraciji od 100 i 500 nM. Približno 50 uL endotelina je ubrizgano u svaki bunarčić i izmeren je odgovor, Emitovano svetio je odmah beleženo tokom perioda od 30 sekundi. Odgovor zavisan od doze Endotelina je iznet na slici 4.

3.3 CHO ćelijska linija koja eksprimira i Apofotin i pacovski VR1 receptor kapsaicina-kalcijum propusni jonski kanal- je odgajena na 80-95% tečnosti u flašama za kulturu tkiva i prikupljena tripsinizacijom. Ćelije su podeljene na 10000 ćelija po bunarčiću u belim pločama od 96 bunarčića u medijumu za rast i inkubirane preko noći na 37°C u inkubatoru sa vlaženjem pri 5% C02. Za eksperimente luminescencije ćelije su napunjene sa 10 uM celenterazina tokom 3 č. na 37°C, 5% C02. Kalcijumski odgovor je stimulisan dodavanjem 10 i 50 uM kapsaicina svakom bunarčiću. Kinetika bljeska luminescencije je praćena koristeći Labsvstem Luminoscan Ascent, koji ubrizgava reagens i beleži emisiju svetla za svaki pojedinačni bunarčić. Dodavanje kapsaicina uzrokovao je brz i prolazni luminescentni signal u okviru 30 sekundi sa nivoom pika koji se javio u oko 10 sekundi (slika 5).

Materijali i postupci

Reagensi

Restnkcioni enzimi su dobavlieni od New England Bilabs i upotrebl|eni u skladu sa instrukcijama proizvođača. Rnasin i TNT kit zain vitrotranskripciju i translaciju bili su od Promega (Madison, Wl). Pfu Turbo polimeraza. reagensi za PCR i kompetentne ćelijeE. colisoieva XL-1Blue i BL21 bili su od Stratagene (La Jolla. CA). Oligonukleotidi su nabavljeni od Pnmm (Milan). Celenterazin je bio od Prolume Ltd (Pittsburg, PA). Sve druge hemikahje bile su iz standardnih izvora i bile su standardne čistoće ih bolje

Sastav PCR za sintezu sekvenci DNK Obelina u jednom koraku

Četiri koraka su potrebna za sastav PCR' oligosinteza. sastavljanje gena. amphfikacija gena i kloniranje. Mi smo sintetizovali 30 oligo, 40 nt u dužini, koji zajedno kodiraju oba lanca sekvence gena Obelina. Preklapanje komplementarnih oligo je 20 nt. Podjednake zapremine izvučene iz svakog od 30 oligo rastvora su kombinovane u konačnu koncentraciju od približno 250 mM pomešanih oligo. pre razbalženja od 250 puta u 20 ul Geneamp XL PCR mešavine (Perkin Elmer). Proces amplifikacije je obavljen u tri stupnja. Prvi korak je obavljen sa sakupljenim oligo na siedeći način: 40°C tokom 2 min., zatim dodavanjem polimeraze, 72°C tokom 10 sek . zatim 40 ciklusa (94°C tokom 15 sek., 40°C tokom 30 sek. i 72°C tokom 10 sek.), Reakciona mešavina je razblažena 3 puta sa svežim PCR i polimeraznom mešavinom. Drugi stupanj je bio: 25 ciklusa (94°C tokom 15 sek., 40°C tokom 30 sek. i 72°C tokom 45 sek.). reakcija je ponovo razbalažena tri puta u kompletnoj PCR mešavini. Uslovi za treći stupanj bili su 20 ciklusa (94°C tokom 15 sek.. 40°C tokom 30 sek. i 72°C tokom 70 sek.). Reakcioni produkti su analizirani putem i% elektroforeze na agaroznom gelu i specifični fragment je kloniran u pcrBlunt vektoru radi daljih koraka kloniranja. Plazmid je nazvan pcr-OB. Verodostojnost PCR reakcija je potvrđena sa dideoksi sekvenciranjem.

Konstrukcija himeričnog proteina

Četiri para oligo su dizajnirana iz sekvence Klitin gena. Regioni između EF-ruke I i EF-ruke II su odabrana za himerizaciju gena. Oligonukleotidni prajmeri bili su siedeći:

Isečeni oligo su klonirani u Ndel/Munl jedinstvena mesta u pcr-OB vektoru. Plazmid koji je sadržao himenčni genski product nazvan je pcr-fotin. DNK fotina je zatim dalje subklonirana u pcDNK3 vektor koji sadrži T7 promotor.

PCR-zasnovana izmena upotrebe kodona

Tehnika ekstenzije preklapanja PCR-a je upotrebljena da se produkuje mutant obelina. Šest parova prajmera bih su dizajnirani sa deset različitih tačkastih mutacija koje produkuju deset različitih promena upotrebe kodona. Da se amplifikuju fragmenti DNK upotrebljeni za ekstenziju preklaoanja, PCR reakcije su obavljene sa 2.5 jedinica Pfu polimeraze. 50 ng DNK matrice, 250 uM svakog od dNTP i 50 pmola svakog prajmera u ukupnoj zapremmi od 100 uL Parametri ciklusa koji su upotrebljeni bih su 94°C tokom 1 min., 45<J>C tokom 1 min i 72°C tokom 1 min. 30 sek. tokom prvih 10 ciklusa, nakon čega je sledilo još 20 ciklusa sa temperaturom isecanja od 50°C. Mutacije specifične za mesto su potvrđene preko sekvenciranja DNK izvedenog na 3 mM (Milan). Sve molekularne procedure bile su izvedene koristeći standardne protOKole

CHOkultura ćelija

Sve ćelije bile su kul'.ivisane u standardnim uslovima vlažnosti na 37°C i 5% CO,. CHO ćelije su održavane u DMEM/F12 + 10% FBS + Pen/Strep + G418 0.5 mg/ml + piruvat1.6 mM - NaHC030.2%. svi reagensi bili su od Life Technologies. Transfekcija DNK bila je obavljena kada su te ćelije porasle do 70% do 80% tečnosti u pločama.

Claims (24)

1 Himenčni fotoprotein. naznačen time što je dobijen zamenom regiona proteina Obelina sadržanim između prvog i drugog mesta vezivanja kalcijuma sa odgovarujućim regionom fotoproteina odabranim od Klitina. Ekuorina, Talasikohna. Mitokromina. Mnemiopsina i Berovma.

2. Himenčni fotoprotein prema zahtevu 1, naznačen time što se pomenuti odgovarajući region u okviru odabranog fotoproteina poklapa sa sekvencom Obelina u respektivnim pokalpanjima sekvenci sa izuzetkom od najmanje jednog člana amino kiseline.

3. Himenčni fotoprotein prema zahtevu 2. naznačen time što se pomenuti odgovarajući region u okviru odabranog fotoproteina poklapa sa sekvencom Obelina u respektivnim pokalpanjima sekvenci sa izuzetkom od najmanje 5 članova amino kiseline.

4. Himerični fotoprotein prema zahtevu 3. naznačen time što se pomenuti odgovarajući region u okviru odabranog fotoproteina poklapa sa sekvencom Obelina u respektivnim pokalpanjima sekvenci sa izuzetkom od najmanje 10 članova amino kiseline.

5. Himerični fotoprotein prema zahtevu 1, naznačen time što pomenuti region je od članova 42 do 122 od sekvence proteina Obelina.

6. Himenčni fotoprotein prema zahtevu 5, naznačen time što pomenuti region je od članova 50 do 94 od sekvence proteina Obelina.

7. Himerični fotoprotein prema zahtevu 6, naznačen time što su u njemu članovi 50 dc 94 proteina Obelina zamenjeni sa fragmentom sekvence Klitina od članova 53 do 97.

8. Himerični fotoprotein prema zahtevu 7, naznačen time što ima sekvencu amino kiseline SEQ ID br. 3.

9. Himerični fotoprotein prema zahtevu 1, naznačen time što dalje sadrži jednu ili više supstitucija amino kiseline na pozicijama 55, 66, 67, 73, 74. 75. 78, 83. 84. 87. 89 i 94 od sekvence Obelina.

10. Fuzioni protein, naznačen time što sadrži fotoprotein prema zahtevima 1-9

11. Konjugacioni proizvod, naznačen time što je između fotoprpteina prema zahtevima 1-6 i molekula za analitičku, dijagnostičku i terapeutsku upotrebu.

12. Izolovani molekul nukleinske kiseline, naznačen time što kodira himenčni fotoprotein prema zahtevima 1-9.

13. Izolovani molekul nukleinske kiseline prema zahtevu 12, naznačen time što kodira protein iz zahteva 8, koji ima sekvencu odabranu od SEQ ID br. 4 i SEQ ID br. 5.

14. Upotreba himeričnog fotoproteina prema zahtevima 1-9, naznačena time što je u kombinaciji sa supstratom luciferinom za detekciju jona kalcijuma.

15. Upotreba prema zahtevu 14. naznačena time što pomenuti supstrat luciferin je celenterazin.

16. Upotreba prema zahtevima 14-15, naznačena time što je za kvantitativno određivanje jona kalcijuma.

17. Upotreba prema zahtevima 14-15, naznačena time što je za određivanje unutarćelijske koncentracije kalcijuma.

18. Ćelija domaćin, naznačena time što nosi molekul nukleinske kiseline prema zahtevima 12-13.

19. Ćelijski domaćin prema zahtevu 18, naznačen time što je odabran od bakterije, kvasca, gljive, biljke, insekta i životinjskih ćelija.

20. Postupak za proizvodnju fotoproteina, naznačen time što sadrži rast ćelija domaćina prema zahtevima 18-19 u uslovima pogodnim za ekspresiju fotoproteina i oporavak ekspresionog proteina.

21. Postupak za skrining biološki aktivnih molekula, naznačen time što sadrži izlaganje ćelijskog domaćina prema zahtevima 18-19 drfinitivnoj količini pomenutih molekula i detektovanje bilo kakve varijacije koncentracije unutarćelijskog kalcijuma.

22. Postupak prema zahtevu 21, naznačen time što je ćelija domaćin transfektovana sa heterologim receptorom razdvojenim sa G-proteinom ili jonskim kanalom.

23. Upotreba konjugovanog produkta prema zahtevu 11 u imunoogledu kompetitivne čvrste faze, naznačena time što je za određivanje količine pomenutog molekula u biološkim uzorcima.

24. Sistem za prenos rezonantne energije bioluminescencije (BRET), naznačen time što sadrži fluorescentni protein i fotoprotein prema zahtevu 8.