RS51793B - Polimerni konjugati hmgb1 box-a i varijanti hmgb1 box-a - Google Patents

Abstract

Polimerni konjugat, naznačen time, što je polimerni konjugat visokoafinitetno vezujućeg domena humanog i/ili nehumanog divljeg tipa HMGB1 Bоx-A (HMGB1 Box-A) ili biološki aktivnog fragmenta HMGB1 Bоx-A.Prijava sadrži još 20 patentnih zahteva.

Description

[0001]Predmetni pronalazak odnosi se na nove polimeme konjugate visokoaifnitetnog vezujućeg domena HMGB1 - Box-A (HMGB1 Box-A), ili biološki aktivnog fragmenta HMGB1 Box-A. Dalje, pronalazak se odnosi na nove polimeme konjugate polipeptidnih varijanti visokoafinitetnog vezujućeg domena HMGB1, Box-A (HMGB1 Box-A) ili biološki aktivnih fragmenata HMGB1 Box-A. Pored toga, predmetni pronalazak bavi se upotrebom pomenutih polimemih konjugata u dijagnostikovanju, prevenciji, ublažavanju i/ili lečenju patologija udruženih sa vanćelijskim HMGB1 i/ili udruženih sa povišenom ekspresijom

RAGE.

[0002]Protein HMGB1 pripada familiji 'high mobilitv group' (visokomobilna grupa, HMG) proteina. HMG proteini, tako nazvani zbog svoje visoke elektroforetske mobilnosti na poliakrilamidnim gelovima, najprisutniji su nehistonski proteini udruženi sa izolovanim hromatinom eukariotskih ćelija. Ovi proteini imaju opštu ulogu "održavanja arhitekture" pri savijanju DNK, stvaranju petlji, nabiranju i pakovanju, pošto oni izvijaju, savijaju ili modifikuju DNK strukture i komplekse sa transkripcionim faktorima ili histonima (Anderssonet cd..,2002; Agrestiet al.,2003; Degrvseet al.,2003).High mobility group1 (HMGB1) protein obično je nukleusni faktor, posebno transkripcioni regulatorni molekul koji prouzrokuje savijanje DNK i olakšava vezivanje nekoliko transkripcionih kompleksa.

[0003]Strukturno, HMGB1 protein je protein od približno 25 kDa, sa sekvencom koja je visokokonzervirana među sisarima, i u kojoj 2 od 214 amino-kiselina imaju konzervativne supstitucije kod svih sisarskih vrsta. HMGB1 je prisutan u nukleusima svih kičmenjaka, a posebno se može naći u fibroblastima, neuronima, hepatocitima, glijskim ćelijama i ćelijama koje vode poreklo od hematopoetskih matičnih ćelija, uključujući monocite/makrofage, neutrofile i krvne pločice. Molekul HMGB1 ima trodelnu strukturu sačinjenu od tri zasebna domena: dva DNK-vezujuća domena nazvana HMG Box-A i Box-B, i kiseli karboksi-terminus, čime se dobija bipolarno naelektrisanje.

[0004]Dva HMGB1 boksa uključena su u funkciju proteina kao arhitekturni DNK-vezujući elementi nespecifični za sekvencu, dajući mu sposobnost vezivanja za DNK u njenoj prepoznatljivo izvijenoj strukturi i stabilišući sklapanje nukleozoma, remodeliranje i klizanje. A- i B-HMG boksovi izgrađeni su od 84 visokokonzervirane aminokiselinske rezidue, nose jako pozitivno naelektrisanje i aranžirani su u tri a-heliksa sa sličnim naborom L-oblika. Duga ručica "L" sadrži N-terminalni izduženi niz i heliks III (Anderssonet al,2002; Agrestiet al.,2003; Thomas, J. O. 2001), dok kratka ručica sadrži helikse I i II. Strukturno-runkcionalne analize pokazale su da proinflamatorno-citokinski domen HMGB1 jeste B-Box, posebno sekvenca koja se sastoji od njegovih prvih 20 amino-kiselina. A-Box je izuzetno slab agonist za oslobađanje inflamatornih citokina koje se pokreće sa HMGB1 i komeptitivno inhibira proinflamatorne aktivnosti B-Box-a i čitavog proteina. Prema tome, sa farmakološke tačke gledišta, A-Box deluje kao antagonist patoloških stanja koja se indukuju i/ili održavaju B-Box-om i HMGB1.

[0005]Treći domen, karboksi-terminus ili kiseli rep, izuzetno je negativno naelektrisan pošto sadrži 30 ponavljajućih rezidua asparaginske i glutaminske kiseline, a vezanje za boksove baznim regionom od oko 20 rezidua.. Mišji i pacovski HMGB1 razlikuju se od humane forme po samo dve supstitucije koje su locirane u ovom kontinuiranom C-terminalnom nizu.

[0006]Pored lokacije u nukleusu i uloge regulatora transkripcionih faktora, HMGB1 je takođe nađen u vanćelijskoj sredini gde ga aktivno oslobađaju pobuđene ćelije imunog sistema (monociti i makrofagi) ili gde se pasivno oslobađa iz oštećenih ili nekrotičnih ćelija (Anderssonet al.,2002; Scaffidiet al,2002; Bonaldiet al,2002; Taniguchiet al,2003; Friedmanet al,2003; Palumboet al,2004).

[0007]Kada se nađe izvan ćelija, HMGB1 deluje kao snažni citokin i izuzetno snažni faktor stimulacije makrofaga. HMGB1 deluje direktno, vezivanjem za ćelijsku membranu, indukujući signale i hemotaksiju, i tako ispoljava funkciju sličnu hemokinima (Yanget al,2001), i dalje, dejstvuje indirektno tako što pozitivno reguliše ekspresiju i sekreciju proinflamatornih citokina. Ovo čini da HMGB1, kada se nađe izvan ćelije, postane snažan hemotaksički i imunoregulatorni protein koji pokreće efikasan zapaljenski imuni odgovor. Pored toga, drugi proteini koji propadaju familiji HMG proteina i koji su sposobni da savijaju DNK, oslobađaju se zajedno sa HMGB1 u vanćelijsku sredinu. Ovi proteini su,inter alia,HMGB2, HMGB3, HMG-1 LIO, HMG-4L i SP100-HMG. Oni sa HMGB1 imaju zajedničke visokohomologe aminokiselinske sekvence. Kao HMGB1, i oni pokreću/održavaju zapaljenske patologije, interagujući sa istim receptorima, vodeći ka istim nishodnim putevima interakcija.

[0008]U zdravim ćelijama, HMGB1 migrira u citoplazmu pasivnim i aktivnim transportom, Međutim, u svim ćelija u kulturi i mirujućim monocitima, najveći deo HMGB1 nalazi se u nukleusu, što ukazuje daje u bazalnim uslovima import mnogo efikasniji nego eksport. Ćelije mogu da transportuju HMGB1 iz nukleusa acetilacijom lizinskih rezidua koje su brojne u HMGB1, neutrališući time njihovo bazno naelektrisanje i čineći ih nesposobnim da funkcionišu kao nukleusni lokalizujući signali. Nukleusna HMGBl-hiperacetilacija određuje premeštanje ovog proteina iz nukleusa u citoplazmu (u fibroblastima, na primer) ili njegovo nagomilavanje u sekretornim endolizozomima (u aktiviranim monocitima i makrofagima, na primer), i potom preusmeravanje ka oslobađanju putem neklasičnih sekretornih puteva posredovanih vezikulama. Sekrecija HMGB1 iz već aktiviranih monocita se tada pokreće bioaktivnim lizofosfatidiliholinom( lysophosphatidylcholine,LPC) koji se stvara kasnije na mestu zapaljenja, od fosfatidil-holina, delovanjem sekretorne fosfolipaze sPLA2 koju su monociti proizveli nekoliko sati posle aktivacije. Prema tome, izgleda da sekreciju HMGB1 indukuju dva signala (Bonaldiet al,2003) i da se ona odvija u tri koraka: prvo, zapaljenski signal pokreće acetilaciju HMGB1 i njegovo premeštanje iz nukleusa u citoplazmu (korak 1) i skladištenje u citoplazminim sekretnim vezikulama (korak 2); zatim signal za sekreciju (vanćelijski ATP ili lizofosfatidilholin) pokreće egzocitozu (treći korak) (Anderssonet al.,2002; Scaffidiet al.2002; Gardellaet al,2002; Bonaldiet al,2003; Friedmanet al,2003).

[0009]Oslobođeni HMGB1 identifikovan je kao jedan od liganada koji se vezuju za RAGE receptor. Ovaj receptor se eksprimira u većini tipova ćelija, a u visokom nivou uglavnom u endotelskim ćelijama, u vaskularnim glatkim mišićnim ćelijama, u monocitima i makrofagima i mononukleusnim fagocitima. Prepoznavanje podrazumeva C-terminus HMGB1. Interakcija HMGB1 i RAGE pokreće produženje perioda aktivacije ćelije, posredovano pozitivnom regulacijom RAGE i prenosom signala zavisnim od receptora. Posebno, interakcija HMGB1 i RAGE aktivira nekoliko unutarćelijskih puteva za prenos signala, uključujući mitogenima aktivirane protein-kinaze( mitogen- activated protein kinases,MAPKs), Cdc-42, p21ras, Rac i nukleusni translokacioni faktorkB( nuclear translocation factorkB, NF-kB), transkripcioni faktor koji se klasično povezuje sa zapaljenskim procesima (Schmidtet al,2001).

[0010]Prema dokazima dobijenim u nekoliko eksperimenata, oslobođeni HMGB1 može da interaguje i sa receptorima koji pripadaju jednoj ili više subklasa familije Toll-like receptora. Dalje, HMGB1 takođe može da interaguje sa funkcionalnim N-terminalnim lektinu sličnim domenom (Dl) trombomodulina. Zbog sposobnosti funkcionalnog Dl domena trombomodulina da presretne i veže se sa cirkulišućim HMGB1, interakcija sa RAGE receptorima i Toll-like receptorima je sprečena.

[0011]Kada se oslobodiin vivo,HMGB1 je izuzetno snažan citokin i snažan faktor stimulacije makrofaga. U stvari, kao i drugi citokinski medijatori endotoksemija, HMGB1invitroaktivira kaskadu više proinflamatornih citokina (TNF, IL-la, IL-lp1, IL-IRa, IL-6, IL-8, MTP-la i MIP-ip), iz humanih makrofaga. Prema tome, HMGB1 deluje kao kasni medijator tokom akutnog zapaljenja i učestvuje, kao važan faktor, u patogenezi sistemskog zapaljenja, pošto prođe odgovor zavisan od ranih medijatora.

[0012]Štaviše, zapažena pozitivna regulacija RAGE u proinflamatornim sredinama i pokazana povećana ekspresija ovog receptora u različitim akutnim i hroničnim zapaljenskim oboljenjima, podržava daje RAGE privlačan cilj za buduće medicinske intervencije u vezi sa zapaljenjem.

[0013]Zapaženi proinflamatorni efekti HMGB1in vitroi korelacija između nivoa HMGBl u cirkulaciji i razvijanja niza patogenih događaja u sistemskom zapaljenjuin vi'vo,ukazuju da bi usmeravanje terapije ka ovom citokinu-sličnom molekulu imalo klinički relevantnu vrednost, čime se sugerišu novi terapijski pristupi putem "kasne" primene (selektivnih) antagonista/inhibitora vanćelijskih aktivnosti HMGBl.

[0014]Prema tome, učinjeno je nekoliko pokušaja da se blokira ovaj vanćelijski HMGBl hemo-citokinski protein. Razmatrano je nekoliko važnih pristupa u vezi sa primenom antitela protiv HMGB1 ili antitela protiv fragmenata HMGB1 (na primer HMGB1 boksovi), antitela na RAGE, solubilnog RAGE (sRAGE) ili etil-piruvata (Czuraet al.,2003; Lotzeet al.,2003) i N-terminalnog lektinu-sličnog domena (Dl) trombomodulina.

[0015]HMGB 1 A-Box, jedan od dva DNK-vezujuća domena u HMGB 1, identifikovan je kao specifični antagonist HMGBl; visokoprečišćeni rekombinantni A-Box štitio je miševe od letalne eksperimentalne sepse čak i kada je početak lečenja zaostajao 24 časa za indukovanjem patološkog procesa, što dalje sugeriše da antagonisti HMGB1 mogu sa uspehom da se primene u širem klinički relevantnom okviru od onog koji važi za druge poznate citokine (Yanget al.,2004).

[0016]Strukturno-funkcionalana analiza skraćenih HMGBl mutanata pokazala je da A-Box domen HMGBl kompetitivno sprečava vezivanje do zasićenja HMGBl za makrofage, specifično antagonizujući aktivnosti HMGBl. Kako smo već videli za zaštitnu aktivnost anti-HMGB1 antitela, primena A-Box-a spašava miševe od sepse čak i kada je početak lečenja zaostajao 24 časa za hirurškom indukcijom sepse (Yang H.et al.,2004). Antagonisti ili inhibitori HMGBl, odabrani iz grupe antitela ili fragmenata antitela, koji se vezuju za HMGBl protein, besmislene sekvence HMGBl gena, i antagonisti receptora za HMGBl, poznati su iz US 6,468,533, WO 02/074337 i US 2003/0144201.

[0017]Obećavajući pokušaj inhibiranja i/ili antagonizovanja vanćelijskog HMGBl hemo-citokinskog proteina se, prema tome, zasniva na eksperimentalnim dokazima da dva visokoafinitetna DNK-vezujuća domena,i. e.HMGBl Box-A i HMGBl Box-B, prisutna u molekulu HMGBl, imaju suprotne uloge u proteinu oslobođenom u vanćelijski prostor. Glavna aktivnost HMGBl Box-B je da posreduje u proinfiamatornim aktivnostima koje se pripisuju HMGBl proteinu. Sa druge strane, HMGBl Box-A je antagonist koji je u kompeticiji sa proinflamatornom aktivnošću domena Box-B.

[0018]Patentna prijava WO 2006/024547 otkriva polipeptidne varijante HMGBl Box-A, ili biološki aktivnih fragmenata HMGBl Box-A, koje su dobijene sistematskim mutacijama pojedinačnih amino-kiselina divljeg tipa HMGBl Box-A proteina. Prema tome, WO 2006/024547 daje nova sredstva koja deluju kao selektivni inhibitori i/ili antagonisti vanćelijskog HMGBl, kao i njihovu upotrebu u prevenciji, ublažavanju i/ili lečenju širokog spektra patoloških stanja udruženih sa, i indukovanih vanćelijskim HMGB 1 hemokinom i/ili kaskadom više inflamatomih citokina izazvanom oslobađanjem HMGBl hemokinskih proteina iz ćelija.

[0019]Efikasnost primene sintetskih proteinskih lekova može biti ometenain vivofaktorima kao što su rastvorljivost na fiziološkom pH, brza eliminacija glomerularnom filtracijom, ćelijski klirens i metabolizam, kao i brza apsorpcija. Efikasnost oralne primene je, na primer, ometena pošto se proteini uneti oralno, vare. Efikasnost sistemske primene, sa druge strane, ometena je jer se proteini ispod 65-70 kDa brzo uklanjaju iz tela. U mnogim slučajevima, ovakvi nedostaci dovode do smanjene saradljivosti pacijenata i do redukovanja efikasnosti leka, a time i do sprečavanja efikasne terapijske upotrebe ovakvih proteinskih sredstava.

[0020]Uspešna strategija za poboljšanje efikasnosti i trajanja efekata proteinskog sredstva i za redukovanje mogućih toksičnih efekata jeste kovalentno vezivanje biološki aktivnog proteinskog sredstva za različite polimere. Jedan od polimera koji se u struci najčešće upotrebljavaju za poboljšanje farmakoloških i toksikoloških osobina aktivnog sredstva je polietilen-glikol( polyethylene- glycol),skraćeno PEG. Polietilenglikolni (PEG) polimeri su amfifilni, netoksični i imunološki inertni i mogu da se konjuguju sa farmaceuticima kako bi se upravljalo mnogim njihovim farmakokinetičkim i toksikološkim osobinama.

[0021]U struci, saopštene su mnoge kovalentne modifikacije terapijski korisnih proteina etilen-glikolom (PEG). Kovalentno prikačinjanje PEG za protein ("pegilacija") korisno je za produženje poluživota proteina u cirkulaciji, jer se time povećava efektivna veličina proteina i smanjuje brzina odstranjivanja iz tela. Štaviše, modifikacija proteina PEG-om povećava njegovu rastvorljivost i stabilnost i smanjuje imunogenost.

[0022]Problem koji se nalazi u osnovi ovog pronalaska stoga, jeste obezbeđivanje novog terapijski efikasnog proteinskog sredstva koje deluje kao selektivni antagonist i/ili inhibitor vanćelijskog HMGBl. Cilj predmetnog pronalaska je, prema tome, iskoristiti posebne karakteristike nekih polimera, posebno PEG, da bi se razvile nove forme za primenu domena HMGBl sa visokim afinitetom vezivanja, Box-A (HMGBl Box-A) koje pokazuju istu ako ne i višu farmakološku aktivnost i, pored toga, poboljšane farmakokinetičke i toksikološke osobine u poređenju sa nekonjugovanim HMGBl Box-A polipeptidom, i koje dopuštaju postizanje najbolje raspoloživosti HMGBl Box-A ili njegovog biološki aktivnog fragmenta, pri različitim mogućim putevima primene.

[0023]Predmetni pronalazak se, prema tome, odnosi na novi polimerni konjugat visokoafinitetno vezujućeg domena humanog i/ili nehumanog divljeg tipa HMGBl, Box-A (HMGB 1 Box-A) ili biološki aktivnog fragmenta HMGB 1 Box-A. Aminokiselinska sekvenca humanog HMGBl Box-A prikazana je u SEQ ID NO: 1. Poželjni nehumani HMGBl Box-A jeste HMGBl Box-AAnopheles gambia,čija sekvenca je prikazana u SEQ ID NO: 301.

[0024]Dalji aspekt predmetnog pronalaska odnosi se na polimerni konjugat polipeptidne varijante visokoafinitetno vezujućeg domena Box-A humanog i/ili nehumanog HMGBl ili biološki aktivnog fragmenta HMGBl Box-A, pri čemu se aminokiselinska sekvenca pomenute polipeptidne varijante razlikuje od aminokiselinske sekvence divljeg tipa HMGBl Box-A po mutaciji jedne ili više pojedinačnih amino-kiselina

[0025]U kontekstu predmetnog pronalaska "HMGBl" uključuje neacetilisane forme i/ili acetilisane forme HMGBl. Tsto tako, "proteini homologi sa HMGBl" uključuju neacetilisane forme i/ili acetilisane forme proteina homologih HMGBl. Poželjni proteini homologi HMGBl suHMGB2, HMGB3, HMG-1 LIO, HMG-4Li/ili SP100-HMG.

[0026]Novi polimerni konjugati predmetnog pronalaska pokazuju povećanu rastvorljivost u vodi, poboljšanu mogućnost farmaceutskog rukovanja, poboljšanu farmakokinetiku i bioraspoloživost i/ili smanjenu toksičnost i/ili imunogenost u poređenju sa nekonjugovanim HMGBl polipeptidom ili polipeptidnom varijantom. Pored toga, iznenađujuće, nađeno je da konjugacija HMGBl Box-A polipeptida ili varijante polipeptida i/ili fragmenta ne menja biološku aktivnost proteina.

[0027]Polimerna komponenta prema predmetnom pronalasku treba da je biokompatibilna, može biti prirodnog, ili polusintetskog, ili sintetskog porekla i može imati linearnu ili granatu strukturu. Primeri polimera uključuju, bez ograničavanja, polialkilen-glikole, polialkilen-okside, poliakrilnu kiselinu, poliakrilate, poliakrilamid ili N-alkil derivate toga, polimetakrilnu kiselinu, polimetakrilate, polietilakrilnu kiselinu, polietilakrilate, polivinilpirolidon, poli(vinil-alkohol), poliglikolnu kiselinu, polilmlečnu kiselinu, poli (mlečnu-ko-glikolnu) kiselinu, dekstran, hitozan, poliamino-kiseline.

[0028]U veoma poželjnoj formi predmetnog pronalaska, polimer je polietilen-glikol (PEG) u kome terminalna OH grupa može opciono biti modifikovana,e. g.sa C1-C5alkil grupama ili C1-C5acil grupama, poželjno sa Ci-, C2- ili C3alkil grupama ili Cp, C2- ili C3acil grupama. Poželjno, modifikovani polietilen-glikol je metoksi-polietilen-glikol (mPEG).

[0029]Polimer koji se koristi prema predmetnom pronalasku, ima molekulsku težinu od 100 do 100 000 Da, poželjno od 5 000 to 50 000 Da. U veoma poželjnoj formi pronalaska, polimer je PEG koji poželjno ima terminalnu OH i/ili metoksi grupu, i molekulsku težinu od 10 000 to 40 000 Da, i poželjno od 20 000 do 40 000 Da. U najpoželjnijoj formi, u predmetnom pronalasku se koristi PEG, prevashodno sa terminalnom OH i/ili metoksi grupom, sa prosečnom molekulskom težinom od 20 000 Da ili od 40 000 Da.

[0030]Polimerna komponenta polimernog konjugata pronalaska konjugovana je kovalentnom hemijskom vezom sa HMGBl polipeptidom ili polipeptidnom varijantom, kako bi se obezbedio stabilan konjugat.

[0031]Poželjna mesta konjugacije na HMGBl Box-A komponenti biraju se između lizinske, cisteinske, histidinske, argininske, tirozinske, serinske, treoninske, aspartatne i glutamatne rezidue ili N-terminalne amino grupe proteinske komponente. Polimerni konjugat predmetnog pronalaska može biti mono-, di- i multi-pegilisan konjugat. Poželjno, polimerni konjugati pronalaska su monopegilisani.

[0032]Polimerna komponenta je obično kovalentno vezana za HMGBl Box-A komponentu preko linkerske grupe. Posebno, u kontekstu predmetnog pronalaska, termin 'linkerska grupa' označava grupu koja se dobija hemijskom reakcijom između polipeptidne komponente i polimeme komponente. Linkerska grupa može biti bilo koja rezidua poznata stručnjacima u oblasti konjugacije polimera, dobijena reakcijom aktivne grupe na aminokiselinskoj rezidui HMGBl Box-A komponente i polimera ili polimera aktiviranog reaktivnom grupom. Primeri linkerskih grupa uključuju, bez ograničavanja, alkilensku, amino, amidnu, karbamatnu, karboksilatnu, karbonilnu, estarsku, etarsku, tioetarsku i disulfidnu grupu. Poželjno, linkerska grupa je amino veza koja se dobija reakcijom N-terminalne aminokiselinske rezidue sa polimemom komponentom aktiviranom aldehidnom reaktivnom grupom i zatim redukcijom.

[0033]Pored toga. linkerska grupa može opciono sadržati jednu ili više rastavljajućih ("spacer", spejser) grupa. U kontekstu predmetnog pronalaska, rastavljajuća grupa se definiše kao bifunkcionalna grupa koja na oba kraja ima reaktivnu funkcionalnu krajnju grupu. Jednom reaktivnom krajnjom grupom, rastavljajuća grupa reaguje sa polimernom komponentom ili sa reaktivnom grupom na polimernoj komponenti. Drugom funkcionalnom grupom na drugom kraju, rastavljajuća grupa vezuje se za funkcionalnu grupu na aminokiselinskoj rezidui HMGBl Box-A komponente. Pogodne rastavljajuće grupe poznate su stručnjacima u oblasti. Primeri rastavljajućih grupa uključuju, ali se ne ograničavaju na hetero-, bifunkcionalne male molekule ili polimere. Na primer, rastavljajuća grupa može biti predstavljena bifunkcionalnimC^- Cnalkil grupama, ili heterobifunkcionalnim alkil grupama koje sadrže 1-3 heteroatoma koji se biraju između N, S i O, ili intermedijarno kratkim bifunkcionalnim PEG lancem.

[0034]Kovalentno povezivanje polimera za HMGBl Box-A komponentu, da bi se dobio polimerni konjugat pronalaska, može se obaviti poznatim tehnikama hemijske sinteze. Na primer, u jednoj formi za primer predmetnog pronalaska, konjugacija polimera može da se obavi reakcijom N-sukcinimidnog polimera( es.NHS-PEG) sa slobodnim amino-grupama na aminokiselinskim reziduama, poželjno lizinskim reziduama, ili na N-terminalnoj amino-kiselini HMGBl Box-A polipeptida. Alternativno, konjugacija polimera postiže se reakcijom PEG aldehida sa N-terminusom polipeptida, reduktivnom aminacijom. Dalje, polimerni konjugati mogu da se dobiju i reakcijom PEG-maleimida sa Cys reziduom HMGBl Box-A polipeptida ili polipeptidne varijante.

[0035]U kontekstu predmetnog pronalaska, pojam "HMGB 1 Box-A komponenta" označava polipeptidnu komponentu polimernog konjugatnog jedinjenja. Tako, ovaj pojam se odnosi na divlji tip HMGBl Box-A i na njegove biološki aktivne fragmente, kao i na polipeptidne varijante HMGBl Box-A i njegovih biološki aktivnih fragmenata.

[0036]U kontekstu predmetnog pronalaska, kada se koristi izraz "HMGBl Box-A ili aminokiselinska sekvenca HMGB 1 Box-A", time se označava humani i nehumani HMGB 1 Box-A. U poželjnoj formi predmetnog pronalaska, HMGBl Box-A komponenta izvedena je iz divljeg tipa humanog HMGBl Box-A proteina i iz divljeg HMGBl Box-A proteina

Anopheles gambia.

[0037]Izraz "biološki aktivni fragmenti HMGBl Box-A", kako se ovde koristi, treba da obuhvati delove poznatog divljeg tipa HMGBl Box-A proteina kod kojih se može zapaziti bar jedna od bioloških aktivnosti odgovarajućeg zrelog proteina, kada se koriste poznati testovi. Poželjno, fragment zrelog proteina razmatra se kao biološki aktivan ako mu se može odrediti antagonistička aktivnost prema proinflamatornoj aktivnosti HMGBl B-Box i HMGBl proteina kao celine. Biološki aktivni fragmenti nativnog HMGBl Box-A su fragmenti od bar 20, 25, 30, 35, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75 ili 80 amino-kiselina. Poželjni biološki aktivni fragmenti nativnog HMGBl Box-A u kontekstu predmetnog pronalaska uključuju fragmente od bar 77 ili bar 54 amino-kiseline, respektivno.

[0038]Pojam "mutacija", kako se koristi u kontekstu predmetnog pronalaska, može da se shvati kao supstitucija, delecija i/ili adicija pojedinačne amino-kiseline u ciljnoj sekvenci. Poželjno, mutacija ciljne sekvence u predmetnom pronalasku je supstitucija. Supstitucija se može izvršiti sa različitim genetički kodiranim amino-kiselinama ili negenetički kodiranim amino-kiselinama. Primeri amino-kiselina koje nisu kodirane genima su homocistein, hidroksiprolin, ornitin, hidroksilizin, citrulin, karnitin, itd.

[0039]U najpoželjnijoj formi predmetnog pronalaska, polipeptidne varijante HMGBl Box-A ili njegovog biološki aktivnog fragmenta, dobijaju se korišćenjem procesa usmerene evolucije koji je tehnološki detaljno opisan u WO 2004/022593 i nekoliko drugih patentnih prijava (PCT/FR00/03503 PCT/FR01/01366, US 10/022,249, US 10/022,390, US 10/375,192, US 60/409,898, US 60/457,135, US 60/410,258 i US 60/410,263), sve u ime Nautilus Biotech S.A. (Pariš, France).

[0040]Polipeptidne varijante predmetnog pronalaska, dobijene korišćenjem tehnologije usmerene evolucije, mutantni su proteini koji se razlikuju od aminokiselinske sekvence divljeg tipa HMGBl Box-A po mutaciji jedne ili više pojedinačnih amino-kiselina. U veoma poželjnoj formi predmetnog pronalaska, u sekvenci nativnog proteina sreće se samo jedna aminokiselinska zamena. Predmet datog pronalaska je, međutim, i to da nativni protein može biti dalje optimizovan zamenom većeg broja,e. g.zamenom dve ili više, amino-kiselina. Modifikovane polipeptidne se, prema tome, mogu razlikovati od sekvence divljeg tipa proteina po aminokiselinskim zamenama na 1-10, poželjno 2, 3, 4, 5 i 6 različitih aminokiselinskih ciljnih pozicija.

[0041]Posebno, veoma poželjne polipeptidne varijante HMGBl Box-A ili njegovog aktivnog fragmenta upotrebljene kao HMGBl Box-A komponenta polimernih konjugata pronalaska jesu one koje su opisane u prijavi WO 2006/024547.

[0042]U skladu sa tim, u jednoj poželjnoj formi pronalaska, the HMGBl Box-A komponenta polimernog konjugata izvedena je iz humanog HMGBl Box-A. Posebno, jedna grupa polipeptidnih varijanti izvedena je uvođenjem pojedinačnih mutacija u kompletnu aminokiselinsku sekvencu (84 amino-kiseline) humanog HMGBl Box-A (SEQ ID NO: 1)

(SI. la). Ove poželjne polipeptidne varijante definisane su sekvencama SEQ ID NO: 2-116 (SI. lb).

(0043]Druge poželjne polipeptidne varijante dobij ene su od biološki aktivnih fragmenata humanog HMGBl Box-A od 77 amino-kiselina (SEQ ID NO: 117) (SI. 2a) i 54 amino-kiseline (SEQ ID NO: 223) (SI. 3a), respektivno. Polipeptidne varijante fragmenta humanog HMGBlBox-A od 77 amino-kiselina definisane su sekvencama SEQ ID NO: 118 do 222 (SI. 2b). Polipeptidne varijante fragmenta humanog HMGBl Box-A od 54 amino-kiselina definisane su sekvencama SEQ ID NO: 224 do 300 (SI. 3b).

[0044]U daljoj poželjnoj formi pronalaska HMGBl Box-A komponenta polimernog konjugata izvedena je iz HMGBl Box-AAnopheles gambia.Posebno, jedna grupa polipeptidnih varijanti izvedena je uvođenjem pojedinačnih mutacija u aminokiselinsku sekvencu pune dužine (84 amino-kiseline) HMGB 1 Box-AAnopheles gambia(SEQ ID NO: 301) (SI. 4a). Ove polipeptidne varijante identifikovane su sekvencama SEQ ID NO: 302 do 418 (SI. 4b). Druge poželjne polipeptidne varijante stvorene su od biološki aktivnih fragmenata HMGBl Box-AAnopheles gambiaod 77 amino-kiselina (SEQ ID NO: 419) (SI. 5a) i 54 amino-kiseline (SEQ ID NO: 529) (SI. 6a), respektivno. Polipeptidne varijante fragmenta HMGBl Box-A od 77 amino-kiselina definisane su sekvencama SEQ ID NO: 420 do 528 (Fig 5b). Polipeptidne varijante fragmenta HMGBl Box-AAnopheles gambia(XP_311154) od 54 amino-kiseline definisane su sekvencama SEQ ID NO: 530 do 610 (S. 6b).

[0045]Da bi se identifikovale najpoželjnije polipeptidne varijante HMGBl Box-A upotrebljene kao HMGBl Box-A komponenta polimernih konjugata pronalaska, sprovedena su ispitivanja za određivanje polipeptidnih varijanti koje pokazuju sličnu ili čak poboljšanu aktivnost i povećanu rezistenciju na proteaze u poređenju sa divljim tipom HMGBl Box-A proteina. U tu svrhu, aktivnost polipeptidnih varijanti Box-A humanog HMGBl Box-A SEQ ID NO: 1 u inhibiciji HMGBl-indukovane NIH/3T3 migracije ćelija, određivana je testom hemotaksije i upoređivana sa antagonističkom aktivnošću divljeg tipa humanog HMGBl Box-A (Primer 1 i Slike 7.1 do 7.9). Pored toga, za ove polipeptidne varijante koje pokazuju sličnu ili čak višu antagonističku aktivnost nego nativni HMGBl Box-A protein SEQ ID NO: 1, određivana jein vitrorezistencija na digestiju proteazama, inkubacijom svake od ovih polipeptidnih varijanti sa smešom tripsina, a-himotripsina, endoproteaze Asp-N i endoproteaze Glu-C (Sigma). Testovi rezistencije na proteaze opisani su u Primeru 2, a rezultati profila rezistencije na proteaze pomenutih varijanti u poređenju sa nativnim HMGBl Box-A pokazani su na Slikama 9.1 do 9.67.

[0046]Na osnovu rezultata može se sumirati da poželjne polipeptidne varijante HMGBl Box-A, korisne kao HMGBl Box-A komponenta polimernog konjugata predmetnog pronalaska jesu one varijante koje pokazuju sličnu ili višu antagonističku aktivnost, zajedno sa povećanom rezistencijom na proteaze. Posebno, poželjne polipeptidne varijante su one sa SEQ ID NO: 33, 35, 37-39, 42-45, 47-49, 52, 55, 57, 59, 62, 64, 67, 69 i 104. Među ovim poželjnim polipeptidnim varijantama, najpoželjnije varijante su one koje su definisane SEQ ID NO: 45, 49, 52, 55, 59, 64 i 67. Ove veoma poželjne polipeptidne varijante pokazuju dramatično poboljšani profil rezistencije na delovanje proteinaza u poređenju sa divljim tipom humanog HMGBl Box-A SEQ ID NO: 1 (up. rezultati Primera 2).

[0047]Napominje se da su amino-kiseline koje se zapažaju u različitim amiokiselinskim sekvencama koje se ovde pojavljuju, označene po svojoj dobropoznatoj šifri koja se sastoji od jednog slova. Dalje, treba napomenuti da sve sekvence aminokiselinskih rezidua, ovde predstavljene jednoslovnom šifrom, imaju orijentaciju sleva nadesno u uobičajenoj usmerenosti amino-terminusa ka karboksi-terminusu.

[0048]U predmetnom pronalasku, iznenađujuće je nađeno da gore opisani polimerni konjugati pokazuju poboljšane farmakokinetičke i toksikološke osobine, što dovodi do poboljšane bioraspoloživosti u poređenju sa nekonjugovanom HMGBl Box-A polipeptidnom komponentom. Posebno povoljni efekti konjugacije polimera HMGBl Box-A polipeptida i njihovih varijanti i, posebno, pegilacije ovih polipeptida, u odnosu na nekonjugovanu formu, jesu povećanje hidrodinamične zapremine proteina. Pošto se time izbegava klirens putem bubrega,i. e.smanjenjuje glomerularna filtracija, ovo dovodi do značajnog i neočekivanog poboljšanja farmakokinetičkih osobina konjugovanih jedinjenja.

[0049]Pored toga, polimerni konjugati pronalaska pokazuju povećanu rezistenciju na proteolitičku aktivnost proteaza i/ili peptidaza, posebno, pokazuju povećanu rezistenciju na proteolitičku aktivnost humanih proteaza i/ili peptidaza, posebno humanih serum-proteaza i/ili humanih gastrointetstinalnih proteaza ili peptidaza.

[0050]Posebno, rezistencija na proteolizu je bar 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 70%, 80%, 90%, 95% ili viša, u poređenju sa nekonjugovanim HMGBl Box-A. Rezistencija na proteaze merena je u različitim vremenskim intervalima (od 5 minuta do 8 sati), na 25°C, posle inkubacije 20 ug divljeg tipa Box-A ili varijanti sa smešom proteaza pri 1% tež./tež. ukupnih proteina. Smeša proteaza pripremana je sveža za svaki test, od stok-rastvora endoproteaze Glu-C (Sigma), 200 (ig/ml; tripsina (Sigma) 400 Pg/ml i a-himotripsina (Sigma), 400 u.g/ml. Posle inkubacije sa proteazama, reakcija se zaustavlja dodavanjem 10 ul antiproteaznog rastvora (Roche) i uzorci se skladište na -20°C za dalje testove biološke aktivnosti.

[0051]Kao posledica povećane stabilnosti usled povećane rezistencije na aktivnost proteaza, polimerni konjugati predmetnog pronalaska takođe pokazuju duži poluživot u telesnim tečnostima u poređenju sa nekonjugovanim HMGBl Box-A. Posebno, poluživot u serumu i/ili serumu i/ili u krvi povećanje, pri čemu je zapažen porast od bar 10 minuta, 20 minuta, 30 minuta, 60 minuta ili čak i više, u poređenju sa nekonjugovanim HMGBl Box-A.

[0052]Zbog porasta hidrodinamičke zapremine proteina i zbog povećane rezistencije na proteolizu, a time povećane stabilnosti, polimerni konjugati pronalaska pokazuju i poboljšane terapijske i biološke osobine i aktivnost. U stvari, oni pokazuju povoljniji farmakokinetički i farmakodinamički profil nego nekonjugovani HMGBl Box-A protein i proteinske varijante.

[0053]Pronalazak je prema tome usmeren na upotrebu gorepomenutih polimernih konjugata HMGBl Box-A kao aktivnih sastojaka lekova.

[0054]Dalji aspekt pronalaska je, prema tome, upotreba polimernih konjugata izuma, za spravljanje lekova za prevenciju i/ili lečenje patologija udruženih sa vanćelijskim HMGBl ili patologijama udruženim sa proteinima homologim HMGBl. Posebno, patologije udružene sa HMGBl su patologije posredovane kaskadom više inflamatornih citokina.

[0055]Brojna patološka stanja indukovana HMGBl hemokinom i kaskadom inflamatornih citokina izazvanom HMGBl, grupisana su u sledeće kategorije: zapaljenska oboljenja, autoimune bolesti, sindrom sistemskog zapaljenskog odgovora, reperfuziona povreda posle transplantacije organa, kardiovaskularni poremećaji, oboljenja u opstetrici i ginekologiji, infektivne (virusne i bakterijske) bolesti, alergijska i atopična oboljenja, patologije vezane za solidne i nesolidne tumore, bolesti odbacivanja transplantata, kongenitalne bolesti, dermatološka oboljenja, neurološka oboljenja, kaheksija, oboljenja bubrega, uslovi jatrogene intoksikacije, metabolička i idiopatska oboljenja

[0056]Patologije udružene sa HMGB 1 prema predmetnom pronalasku, poželjno su patološka stanja posredovana aktivacijom kaskade inflamatornih citokina. Neograničavajući primeri stanja koja se mogu lečiti upotrebom predmetnog pronalaska uključuju veliki broj patoloških stanja indukovanih HMGBl hemokinom i kaskadom inflamatornih citokina izazvanom HMGBl, i grupisana su u sledeće kategorije: restenoza i druge kardiovaskularne bolesti, reperfuziona povreda, zapaljenske bolesti kao što su zapaljenska bolest creva, sindrom sistemskog zapaljenskog odgovora,e. g.sepsa, sindrom respiratornog distresa kod odraslih, itd., autoimune bolesti kao što su reumatoidni artritis i osteoartritis, bolesti u opstetrici i ginekologiji, infektivne bolesti, atopične bolesti kao što su astma, ekcem, itd., tumorske patologijee. g.solidni i nesolidni tumori, bolesti udružene sa transplantacijom tkiva ili organa, kao što je reperfuziona povreda posle transplantacije organa, odbacivanje organa, bolest kalema protiv domaćina, kongenitalne bolesti, dermatološke bolesti kao što su psorijaza ili alopecija, neurološke bolesti, oftalmološke bolesti, bubrežne, metaboličke ili idiopatske bolesti i stanja intoksikacije,e. g.jatrogena toksičnost i Behcet-ova bolest, gde su gornje bolesti izazvane, udružene sa, i/ili se javljaju zajedno sa oslobađanjem HMGBl proteina.

[0057JPosebno, patologije koje pripadaju zapaljenskim i autoimunim bolestima uključuju reumatoidni artritis/seronegativne artropatije, osteoartritis, zapaljensku bolest creva, Chron-ovu bolest, infarkt creva, sistemski lupus eritematozus, iriditis/uveitis, optički neuritis, idiopatsku plućnu fibrozu, sistemski vaskulitis/Wegenerovu granulomatozu, sarkoidozu, orhitis/vazektomijske procedure premeštanja, sistemsku sklerozu i sklerodermu. Sistemski zapaljenski odgovor uključuje septički sindrom (uključujući gram-pozitivnu sepsu, gram-negativnu sepsu, kultura-negativnu sepsu, gljivičnu sepsu, neutropenijsku groznicu, urosepsu, septički konjuktivitis), meningokokemiju, traumatsku hemoragiju, šumove, izlaganje jonizujućem zračenju, akutni i hronični prostatitis, akutni i hronični pankreatitis, apendicitis, peptični, gastrični i duodenusni čir, peritonitis, ulcerativni, pseudomembranozni, akutni i ishemični kolitis, divertikulitis, ahalaziju, holangitis, holecistitis, enteritis, sindrom respiratornog distresa odraslih( aduti respiratory distress syndrome,ARDS). Reperfuzione povrede uključuju sindrom posle korišćenja mašine srce-pluća (kod operacija na otvorenom srcu) i ishemično-reperfuzione povrede. Kardiovaskularne bolesti uključuju sindrom ošamućenog miokarda, infarkt miokarda, i ishemiju miokarda, aterosklerozu, tromboflebitis, endokarditis, perikarditis, kongestivnu srčanu insuficijenciju i restenozu. Opstetrična i ginekološka oboljenja uključuju prevremeni porođaj, endometriozu, spontani pobačaj, vaginitis i neplodnost. Infektivna oboljenja uključuju HIV-infekciju/HIV-neuropatiju, meningitis, hepatitis B i C, infekcije virusom herpes simpleks, septički artritis, peritonitis, infekcijuE. coli0157:H7, pneumoniju, epiglotitis, hemolitički uremijski sindrom/trombolitičku trombocitopeniju purpura, kandidijazu, filarijazu, amebijazu, malariju, denga hemoragičnu groznicu, lejšmanijazu, lepru, sindrom toksičnog šoka, streptokokni miozitis, gasnu gangrenu, infekcije koje izazivajuMycobacterium tuberculosis, Mycobacterium avium intracellulare,pneumoniju izazvanuPneumocystis carinii,zapaljensku bolest karlice, orhitis/epididimitis, oboljenje koje izazivaLegionella,Lyrne-sku bolest,

influencu A, oboljenja izazvana Epstein-Barr virusom, citomegalovirusima, hemiafagocitni sindrom udružen sa virusnom infekcijom, virusni encefalitis/aseptični meningitis. Alergijske i atopijske bolesti uključuju astmu, alergiju, anafilaktički šok, oboljenje imunih kompleksa, polensku groznicu, alergijski rinitis, ekcem, alergijski kontaktni dermatitis, alergijski konjuktivitis, hipersenzitivni pneumonitis. Maligniteti, patologije solidnih i nesolidnih tumora) uključuju ALL, AML, CML, CLL, Hodgkin-ovu bolest, ne-Hodgkin-ov limfom, Kaposi-jev sarkom, kolorektalni karcinom, nazofaringealni karcinom, malignu histiocitozu i paraneoplastični sindrom/hiperkalcemiju maligniteta. Bolesti transplantacije uključuju odbacivanje transplantiranog organa, i bolest kalema protiv domaćina. Kongenitalne bolesti uključuju cističnu fibrozu, porodičnu hematofagocitnu limfohistiocitozu i srpastu anemiju. Dermatološke bolesti uključuju psorijazu, psorijatični artritis, i alopeciju. Neurološke bolesti uključuju neurodegenerativne bolesti (multiplu sklerozu, migrenu, glavobolju, patologije vezane za amiloid, prionske bolesti/Creutzfeld-Jacob-ovu bolest, Alzheimer-ovu i Parkinson-ovu bolest, amiotrofičnu lateralnu sklerozu) i periferne neuropatije, migrenu, glavobolju. Bubrežne bolesti uključuju nefrotski sindrom, hemodijalizu i uremiju. Stanja jatrogene intoksikacije uključuju OKT3 terapiju, anti-CD3 terapiju, terapiju citokinima, hemoterapiju, radijacionu terapiju i hroničnu intoksikaciju salicilatima. Metabolička i idiopatska oboljenja obuhvataju WiIson-ovu bolest, hemohromatozu, alfa-1 antitripsinsku deficijenciju, dijabetes i komplikacije dijabetesa, gubitak težine, anoreksiju, kaheksiju, gojaznost, Hashimoto-ov tiroiditis, osteoporozu, evaluaciju hipotalamo-hipofizno-adrenalne osovine i primarnu žučnu cirozu. Oftalmološke bolesti uključuju glaukom, retinopatije i suve oči. Različite druge patologije obuhvataju: sindrom multilple disfunkcije organa, mišićnu distrofiju, septični meningitis, aterosklerozu, epiglotitis, Whipple-ovu bolest, astmu, alergiju, alergijski rinitis, nekrozu organa, groznicu, septikemiju, endotoksični šok, hiperpireksiju, eozinofilni granulom, granulomatozu, sarkoidozu, septični abortus, uretritis, emfizem, rinitis, alveolitis, bronhiolitis, faringitis, disfunkciju epitelnih barijera, pneumoultramikroskopsku silikovulkanokoniozu, pleuritis, sinuzitis, influencu, respiratone sincicijalne virusne infekcije, diseminovanu bakterijemiju, hidatidne ciste, dermatomiozitis, opekotine, opekotine od sunca, koprivnjaču, bradavice, urtikarijske papule, vaskulitis, angiitis, miokarditis, arteritis, nodozni periarteritis, reumatsku groznicu, celijačnu bolest, encefalitis, cerebralnu emboliju, Guillame-Barre-ov sindrom, neuritis, neuralgiju, jatrogene komplikacije/lezije perifernih nerava, povrede kičmene moždine, paralizu, uveitis, artriditis, artralgije, osteomijelitis, fasciitis, Paget-ovu bolest, giht, periodontnu bolest, sinovitis, mijasteniju gravis, Goodpasture-ov sindrom, Behcets-ov sindrom, ankilozni spondilitis, Barger-ovu bolest, Retier-ov sindrom, bulozni dermatitis (bulozni pemfigoidni), pemfigus i pemfigus vulgaris i alopeciju.

[0058]U daljoj poželjnoj formi, polimerna jedinjenja pronalaska koriste se kao aktivna sredstva za prevenciju, ublažavanje i/ili lečenje patologija vezanih za RAGE. Patologije vezane za RAGE definišu se kao patološka stanja udružena sa povećanom ekspresijom

RAGE.

[0059]RAGE( receptor far advanced glycation endproducts,receptor za završne produkte uznapredovale glikozilacije) je multiligandski član imunoglobulinske superfamilije ćelijskih površinskih molekula. Sastoji se od tri imunoglobulinu slična regiona (jedan imunoglobulinski domen V-tipa, praćen sa dva imunoglobulinska domena C-tipa), transmembranskog domena i visokonaelektrisanog kratkog citosolnog repa koji je od esencijalne važnosti za post-RAGE prenos signala. RAGE je identifikovan 1992. god. kao ciljno mesto vezivanja za AGE, neenzimski glikozilovane i oksidisane proteine koji se akumuliraju u vaskularnom tkivu tokom starenja i povećanom brzinom u dijabetesu. RAGE se eksprimira na većem broju ćelija, uključujući endotelske ćelije, glatke mišićne ćelije, mononuklearne fagocite i neurone. Dok je tokom razvića prisutan u visokoj meri, posebno u centralnom nervnom sistemu, njegov nivo opada u zrelom dobu.. [0060|Kao što je gore rečeno, RAGE je prvi identifikovani receptor za vanćelijski HMGBl. Vezivanje HMGBl za površinu ćelije indukuje pozitivnu transkripcionu regulaciju RAGE. Primeri patologija vezanih za RAGE su dijabetes i poremećaji udruženi sa dijabetesom kao što su dijabetična vaskulopatija, neuropatija, retinopatija, kao i drugi poremećaji, uključujući Alzheimer-ovu bolest i imune/inflamatorne reakcije na zidovima krvnih sudova. Veoma poželjan primer patologije povezane sa RAGE u ovom kontekstu je dijabetes tipa I i/ili tipa II.

[0061]U daljem aspektu pronalaska, upotreba polimernih konjugata HMGBl Box-A opisanih gore, u kombinaciji je sa drugim aktivnim sredstvom.

[0062]Drugo sredstvo je, poželjno, sredstvo sposobno da inhibira rani medijator kaskade inflamatornih citokina. Poželjno, ovo sredstvo je antagonist ili inhibitor citokina odabranog iz grupe koja se sastoji od TNF, IL-la, IL-ip, IL-Ra, IL-6, TL-8, TL-10, IL 13, IL-18, IFN-y MlP-la, MIF-ip, MIP-2, MIF i PAF.

[0063]Drugo sredstvo upotrebljeno u kombinaciji sa polimemim konjugatom može da bude i inhibitor RAGE,e. g.antitelo usmereno ka RAGE, nukleinska kiselina ili analog nukleinske kiseline sposoban da inhibira ekspresiju RAGE,e. g.besmisleni molekul, ribozim ili RNK-interferentni molekul, ili mali sintetski molekul antagonist inteakcije HMGBl sa RAGE, poželjno interakcije neacetilisane i/ili acetilisane forme HMGBl sa RAGE, ili solubilni RAGE (sRAGE). Antitelo na RAGE je poželjno monoklonsko antitelo, poželjnije himerno ili humanizovano antitelo ili rekombinantno antitelo, kao što je jednolančano antitelo ili antigen-vezujući fragment takvog antitela. Solubilni RAGE analog može opciono biti predstavljen kao fuzioni proteine. g.sa Fc domenom humanog antitela. Mali sintetski molekulski antagonist interakcije HMGBl sa RAGE poželjno ima molekulsku težinu manju od 1000 Daltona. Mali sintetski molekulski antagonist poželjno inhibira interakciju RAGE sa neacetilisanom formom i/ili sa acetilisanom formom HMGBl i sa neacetilisanom formom i/ili sa acetilisanom formom HMGBl homologih proteina, posebno HMGB2, HMGB3, HMG-1 LIO, HMG-4L i/ili SP100-HMG. (0064]Dalje sredstvo koje se koristi u kombinaciji sa polimernim konjugatom može takođe da bude inhibitor interakcije Toll-like receptora (TLR),e. g.TLR2, TLR4, TLR7, TLR8 ili/i TLR9, sa HMGBl, koji, inhibitor, poželjno jeste monoklonsko ili poliklonsko antitelo, nukleinska kiselina ili analog nukleinske kiseline sposoban za inhibiciju ekspresije TLR,e. g.besmisleni molekul, ribozim ili molekul RNK-interferencije, ili sintetski molekul koji poželjno ima veličinu ispod 1000 Daltona. Inhibitor može da bude poznati inhibitor Toll-like receptora, posebno TLR2, TLR4, TLR7, TLR8 ili/i TLR9. Inhibitor poželjno inhibira interakciju Toll-like receptora sa neacetilisanom formom ili/i acetilisanom formom HMGBl. U još jednoj formi, dalje sredstvo je funkcionalni N-terminalni lektinu sličan domen (Dl) trombomodulina. Dl domen trombomodulina sposoban je da presretne neacetilisanu formu i/ili acetilisanu formu oslobođenog HMGBl i proteina homologih oslobođenom HMGBl, posebno HMGB2, HMGB3, HMG-1L10, HMG-4L i/ili SP100-HMG, sprečavajući tako njihovu interakciju sa RAGE i Toll-like receptorima. Dl domen trombomodulina može biti nativan ili mutiran, da bi se učinio rezistentnim na proteaze.

[0065]Dalje sredstvo može da bude sintetska dvolančana nukleinska kiselina ili analogni molekul nukleinske kiseline, savijenog oblika, posebno, dvolančana savijena DNA, PNA ili DNA/PNA himer ili hibrid ili dvolančana kruciformna DNA, PNA ili DNA/PNA himerna ili hibridna struktura, sposobna za vezivanje sa proteinom HMGBl. Poželjne nukleinske kiseline i molekuli nukleinskih analoga objavljeni su u suvlasničkoj i zajednički podnetoj međunarodnoj patentnoj prijavi No. WO2006/002971, podnetoj 4. jula 2005. (uz zahtevanje prioriteta nad prethodnoj US prijavi No. 60/584,678 podnetoj 2. jula 2004). Sintetski dvolančani molekul nukleinske kiseline ili analoga nukleinske kiseline, savijenog oblika, poželjno je sposoban za vezivanje sa neacetilisanom ili acetilisanom formom HMGBl i neacetilisanom ili/i acetilisanom formom HMGBl homologih proteina, posebno HMGB2, HMGB3, HMG-1 LIO, HMG4L ili/i SP100-HMG.

[0066]U još jednoj formi, drugo sredstvo upotrebljeno u kombinaciji sa polimernim konjugatom je K-252a ili/i njegova so ili derivat ili polimerni konjugat K-252a ili/i njegov derivat. Upotreba K-252a ili polimernog konjugata K-252a i njegovog derivata objavljena je u suvlasničkoj i zajednički podnetoj međunarodnoj patentnoj prijavi br. WO2007/02299 podnetoj 25. avgusta 2005.

[0067]Prema tome, dalji aspekt predmetnog pronalaska je farmaceutska smeša koja uključuje efikasnu količinu bar jednog polimernog konjugata HMGBl Box-A polipeptida, ili polipeptidne varijante, ili njihovog biološki aktivnog fragmenta, kao aktivnog sastojka za lečenje patologija udruženih sa HMGBl i farmaceutski prihvatljive nosače, razblaživače i/ili adjuvanse. Farmaceutska smeša predmetnog pronalaska je, poželjno, pogodna za lečenje patologija udruženih sa neacetilisanom i/ili acetilisanom formom HMGBl i/ili proteina homologih HMGBl. U daljoj poželjnoj formi, farmaceutska smeša predmetnog pronalaska koja uključuje bar jedan polimerni konjugat, takođe uključuje dalje sredstvo kako je gore definisano. Farmaceutska smeša predmetnog pronalaska može se koristiti za dijagnostičku ili terapijsku primenu.

[0068]Tačnu formulaciju, put primene i doze, može odabrati lekar u skladu sa stanjem pacijenta. Primena se može obaviti u jednoj dozi ili u dozama koje se ponavljaju sa razmakom. Dozne količine i razmaci između njih mogu se individualno prilagođavati da bi se obezbedio terapijski efekat koji dovodi do poboljšanja simptoma ili produženog preživljavanja pacijenta. Količina smeše koja će se primeniti zavisiće, naravno, od subjekta koji se leči, od njegove težine, jačine bolesti, načina primene i procene ordinirajućeg lekara. Pogodna dnevna doza biće između 0.001 i 10 mg/kg, posebno od 0.1 do 5 mg/kg.

[0069]Primena se može vršiti poznatim metodima,e. g.injekcijom, posebno intravenskom, intramuskularaom, transmukoznom, subkutanom ili intraperitonealnom injekcijom i/ili površinskom, oralnom, nazalnom, inhalacionom, aerosolnom i/ili rektalnom primenom, itd. Primena može biti lokalna ili sistemska.

[0070]Pored toga, polimerni konjugati Box-A of HMGBl komponente kao objekta ovog pronalaska mogu se reverzibilno imobilisati i/ili adsorbovati za površinu i/ili unutrašnjost medicinskih uređaja ili sistema za oslobađanje/prenošenje leka (mikrosfere). Medicinski uređaji i mikrosfere mogu reverzibilno da se napune polimernim konjugatima pronalaska vezivanjem, impregnacijom i/ili adsorpcijom na površinu medicinskog uređaja ili mikrosfere, ili na sloj koji oblaže njegovu površinu. Kada medicinski uređaj ili mikrosfera dođe u kontakt sa biološkim tečnostima, dolazi do oslobađanja reverzibilno imobilisanog polimernog konjugata. Prema tome, medicinski uređaj i mikrosfera deluju kao alatka za oslobađanje leka sa koje se spira molekulski objekt ovog pronalaska tako da kinetika njegovog oslobađanja može da se kontroliše, čime se osigurava kontrolisano ili produženo oslobađanje, kako to lečenje zahteva. Metodi oblaganja/impregnacije medicinskog uređaja i punjenje mikrosfera dobro su poznati stručnjacima u ovoj oblasti tehnologije.

[0071]Tako je dalji aspekt ovog pronalaska upotreba polimernih konjugata HMGBl Box-A, gde su konjugovani molekuli reverzibilno imobilisani na površini medicinskih uređaja ili mikrosfera, ili su adsorbovani unutar njih. Ovi medicinski instrumenti su, poželjno, hirurške alatke, implanti, kateteri ili stentovi, na primer stentovi za angioplastiku i, posebno, lekoviti stentovi sa kojih se spira lek.

[0072]Drugi aspekt pronalaska bavi se medicinskim uređajem koji je reverzibilno obložen bar jednim polimernim konjugatom pronalaska. Takav uređaj može da se odabere između hirurških instrumenata, implanata, katetera ili stentova. Takav uređaj može biti koristan za angioplastiku.

[0073]Pronalazak je dalje ilustrovan sledećim slikama: SI. la pokazuje aminokiselinsku sekvencu nativnog humanog HMGBl Box-A sačinjenog od 84 aminokiselinske rezidue (SEQ ID NO: 1). SI. lb pokazuje tip aminokiselinskih zamena na respektivnim ciljnim pozicijama koje su odabrane za generisanje polipeptidne varijante humanog HMGBl Box-A pune dužine. Dalje, specifične aminokiselinske sekvence generisanih polipeptidnih varijanti prikazane su u SEQ ID NO: 2 do 116. SI. 2a pokazuje aminokiselinsku sekvencu biološki aktivnog fragmenta humanog HMGBl Box-A sačinjenog od 77 aminokiselinskih rezidua (SEQ ID NO: 117). SI. 2b pokazuje tip aminokiselinskih zamena na respektivnim ciljnim pozicijama koje su odabrane za generisanje polipeptidne varijante humanog HMGBl Box-A sačinjenog od 77 aminokiselinskih rezidua. Dalje, specifične aminokiselinske sekvence generisanih polipeptidnih varijanti prikazane su u SEQ ID NO: 118 do 222. SI. 3a prikazuje aminokiselinsku sekvencu biološki aktivnog fragmenta humanog HMGBl Box-A sačinjenog od 54 aminokiselinske rezidue (SEQ ID NO: 223). SI. 3b pokazuje tip aminokiselinskih zamena na respektivnim ciljnim pozicijama koje su odabrane za generisanje polipeptidne varijante biološki aktivnog fragmenta humanog HMGBl Box-A sačinjenog od 54 aminokiselinske rezidue. Dalje, specifične aminokiselinske sekvence generisane polipeptidne varijante prikazane su u SEQ ID NO: 224 do 300. SI. 4a prikazuje aminokiselinsku sekvencu nativnog HMGBl Box-AAnopheles gambiasačinjenog od 84 aminokiselinske rezidue (SEQ ID NO: 301). SI 4b pokazuje tip aminokiselinskih zamena na respektivnim ciljnim pozicijama koje su odabrane za generisanje polipeptidne varijante HMGBl Box-AAnopheles gambiapune dužine. Dalje, specifične aminokiselinske sekvence generisane polipeptidne varijante prikazane su u SEQ ID NO: 302 do 418. SI. 5a prikazuje aminokiselinsku sekvencu biološki aktivnog fragmenta HMGBl Box-A Anopheles gambiasačinjenog od 77 aminokiselinskih rezidua (SEQ ID NO: 419). SI. 5b pokazuje tip aminokiselinskih zamena na respektivnim ciljnim pozicijama koje su odabrane za generisanje polipeptidne varijante biološki aktivnog fragmenta HMGBlBox-A Anopheles gambiasačinjenog od 77 aminokiselinskih rezidua. Dalje, specifične sminokiselinske sekvence generisanih polipeptidnih varijanti prikazane su u SEQ ID NO: 420 do 528. SI. 6a prikazuje aminokiselinsku sekvencu biološki aktivnog fragmenta HMGB 1 Box-AAnopheles gambiasačinjenog od 54 aminokiselinske rezidue (SEQ ID NO: 529). SI. 6b pokazuje tip aminokiselinskih zamena na respektivnim ciljnim pozicijama koje su odabrane za generisanje polipeptidne varijante biološki aktivnog fragmenta HMGBlBox-A Anopheles gambiasačinjenog od 54 aminokiselinske rezidue. Dalje, specifične sminokiselinske sekvence generisane polipeptidne varijante prikazane su u SEQ TD NO: 530 do 610. Slike i Tabele 7.1 do 7.9 pokazuju rezultate testa hemotaksije kao opis Primera 1, sprovedenog na HMGBl Box-A polipeptidnim varijantama SEQ ID NO: 2 do SEQ ID NO: 116, upotrebljenim kao HMGBl Box-A komponenta polimernih konjugata predmetnog pronalaska. Na svakoj slici, aktivnost seta polipeptidnih varijanti i inhibicija migracije NIH/3T3 ćelija indukovane HMGBl testirana je u poređenju sa aktivnošću divljeg tipa humanog HMGB 1 Box-A fragmenta pune dužine iz SEQ ID NO: 1. Svaka slika pokazuje tabelu koja saopštava numeričke podatke statističke analize i histogram koji pokazuje rezultate testa hemotaksije. Slika 7.1 i Tabela 7.1 pokazuju stubasti grafikon i statističke podatke testa hemotaksičke migracije koji rezultuje inhibicijom HMGB 1-indukovanih NIH/3T3 ćelija divljim tipom humanog HMGBl Box-A, SEQ ID NO: 1 (CT500) i polipeptidnim varijantama SEQ ID NO: 2 do 15 (identifikovane u Tabelama i Slikama šiframa CT501, CT568, CT569, CT570, CT571, CT502, CT572, CT503, CT573, CT504, CT574, CT575, CT576 i CT505, respektivno). Slika 7.2 i Tabela 7.2 pokazuju stubasti grafikon i statističke podatke testa hemotaksičke migracije koji rezultuje inhibicijom HMGB 1-indukovanih NIH/3T3 ćelija divljim tipom humanog HMGBl Box-A, SEQ ID NO: 1 (CT500) i polipeptidnim varijantama SEQ ID NO: 16-23 i 25-29 (identifikovane u Tabelama i Slikama šiframa CT577, CT578, CT506, CT579, CT580, CT581, CT507, CT582, CT584, CT508, CT509, CT510 i CT585, respektivno). Slika 7.3 i Tabela 7.3 pokazuju stubasti grafikon i statističke podatke testa hemotaksičke migracije koji rezultuje inhibicijom HMGBl-indukovanih NIH/3T3 ćelija divljim tipom humanog HMGBl Box-A, SEQ ID NO: 1 (CT500) i polipeptidnim varijantama SEQ ID NO: 30-35 i 37-43 (identifikovane u Tabelama i Slikama šiframa CT511, CT512, CT513, CT514, CT586, CT515, CT516, CT517, CT518, CT519, CT520, CT521 i CT522, respektivno). Slika 7.4 i Tabela 7.4 pokazuju stubasti grafikon i statističke podatke testa hemotaksičke migracije koji rezultuje inhibicijom HMGB 1-indukovanih NIH/3T3 ćelija divljim tipom humanog HMGBl Box-A, SEQ ID NO: 1 (CT500) i polipeptidnim varijantama SEQ ID NO: 44-57 (identifikovane u Tabelama i Slikama šiframa CT523, CT524, CT525, CT526, CT527, CT528, CT588, CT529, CT530, CT589, CT590, CT531, CT591 i CT532, respektivno). Slika 7.5 i Tabela 7.5 pokazuju stubasti grafikon i statističke podatke testa hemotaksičke migracije koji rezultuje inhibicijom HMGB 1-indukovanih NIH/3T3 ćelija divljim tipom humanog HMGBl Box-A, SEQ ID NO: 1 (CT500) i polipeptidnim varijantama SEQ ID NO: 58-67 i 69-71 (identifikovane u Tabelama i Slikama šiframa CT592, CT533, CT593, CT534, CT535, CT536, CT537, CT594, CT538, CT539, CT540, CT541 i CT542, respektivno). Slika 7.6 i Tabela 7.6 pokazuju stubasti grafikon i statističke podatke testa hemotaksičke migracije koji rezultuje inhibicijom HMGB 1-indukovanih NIH/3T3 ćelija divljim tipom humanog HMGBl Box-A, SEQ ID NO:l (CT500) i polipeptidnim varijantama SEQ ID NO: 72-85 (identifikovane u Tabelama i Slikama šiframa CT596, CT597, CT598, CT599, CT600, CT601, CT602, CT603, CT543, CT544, CT545, CT546, CT547 i CT604, respektivno). Slika 7.7 i Tabela 7.7 pokazuju stubasti grafikon i statističke podatke testa hemotaksičke migracije koji rezultuje inhibicijom HMGB 1-indukovanih NIH/3T3 ćelija divljim tipom humanog HMGBl Box-A, SEQ ID NO:l (CT500) i polipeptidnim varijantama, SEQ ID NO: 86-99 (identifikovane u Tabelama i Slikama šiframa CT548, CT549, CT605, CT606, CT607, CT608, CT609, CT610, CT550, CT551, CT611, CT552, CT553 i CT554, respektivno). Slika 7.8 i Tabela 7.8 pokazuju stubasti grafikon i statističke podatke testa hemotaksičke migracije koji rezultuje inhibicijom HMGBl-indukovanih NIH/3T3 ćelija divljim tipom humanog HMGBl Box-A, SEQ IDNO:l (CT500) i polipeptidnim varijantama, SEQ ID NO: 100-113 (identifikovane u Tabelama i Slikama šiframa CT555, CT556, CT557, CT558, CT559, CT612, CT560, CT561, CT613, CT562, CT563, CT564, CT565 i CT566, respektivno). Slika 7.9 i Tabela 7.9 pokazuju stubasti grafikon i statističke podatke testa hemotaksičke migracije koji rezultuje inhibicijom HMGB 1-indukovanih NIH/3T3 ćelija divljim tipom humanog HMGBl Box-A, SEQ ID NO: 1 (CT500) i polipeptidnim varijantama, SEQ ID NO: 114-116 (identifikovane u Tabelama i Slikama šiframa CT567, CT614 i CT615, respektivno). SI. 8 pokazuje izgled Tricine SDS-PAGE gela napunjenog divljim tipom humanog HMGBl Box-A, SEQ ID NO: 1 (CT500) u različitim vremenskim tačkama, posle digestije proteazama, tokom ispitivanja rezistencije na proteaze opisanog u Primeru 2. Divlji tip Box-A proteina testiran na rezistenciju prema proteazama je His-obeleženi protein. Posle 5 minuta digestije, CT500 pokazuje dve glavne trake, jednu koja odgovara originalnom proteinu u uzoku i drugu koja odgovara proteinu od 84 amino-kiseline bez N-terminalnog His-obeležja (na slici naznačeno strelicom). Profil ove druge trake pokazuje rezistenciju na proteaze u trajanju od 30 minuta. Male trake prisutne na ovom i drugim gelovima na SI. 9.1 do 9.67 odgovaraju digestovanim fragmentima Box-A. SI. 9.1 do SI. 9.67 pokazuju izgled Tricine SDS-PAGE gela napunjenog polipeptidnim varijantama HMGBl Box-A komponente polimernih konjugata predmetnog pronalaska, u različitim vreenskim tačkama, posle digestije proteazama tokom ispitivanja rezistencije na proteaze opisanog u Primeru 2. Polipeptidne varijante Box-A testirane na rezistenciju na proteaze su His-obeleženi proteini. Posle 5 minuta digestije, SDS-PAGE gel slika polipeptidnih varijanti pokazuje dve glavne trake, jednu koja odgovara originalnoj varijanti proteina u uzorku i drugu koja odgovara proteinskoj varijanti Box-A proteina od 84 amino-kiseline, bez N-terminalnog His-obeležja. SI. 9.1 pokazuje Tricine SDS-PAGE polipeptidne varijante SEQ ID NO: 2 (CT501) u različitim vremenskim tačkama, posle digestije proteazama. SI. 9.2 pokazuje Tricine SDS-PAGE polipeptidne varijante SEQ ID NO: 7 (CT502) u različitim vremenskim tačkama, posle digestije proteazama. SI. 9.3 pokazuje Tricine SDS-PAGE polipeptidne varijante SEQ ID NO: 9 (CT503) u različitim vremenskim tačkama, posle digestije proteazama. SI. 9.4 pokazuje Tricine SDS-PAGE polipeptidne varijante SEQ ID NO: 11 (CT504) u različitim vremenskim tačkama, posle digestije proteazama. SI. 9.5 pokazuje Tricine SDS-PAGE polipeptidne varijante SEQ ID NO: 15 (CT505) u različitim vremenskim tačkama, posle digestije proteazama. SI. 9.6 pokazuje Tricine SDS-PAGE polipeptidne varijante SEQ ID NO: 18 (CT506) u različitim vremenskim tačkama, posle digestije proteazama. SI. 9.7 pokazuje Tricine SDS-PAGE polipeptidne varijante SEQ ID NO: 22 (CT507) u različitim vremenskim tačkama, posle digestije proteazama. SI. 9.8 pokazuje Tricine SDS-PAGE polipeptidne varijante SEQ ID NO: 26 (CT508) u različitim vremenskim tačkama, posle digestije proteazama. SI. 9.9 pokazuje Tricine SDS-PAGE polipeptidne varijante SEQ ID NO: 27 (CT509) u različitim vremenskim tačkama, posle digestije proteazama. SI. 9.10 pokazuje Tricine SDS-PAGE polipeptidne varijante SEQ ID NO: 28 (CT510) u različitim vremenskim tačkama, posle digestije proteazama. SI. 9.11 pokazuje Tricine SDS-PAGE polipeptidne varijante SEQ ID NO: 30 (CT511) u različitim vremenskim tačkama, posle digestije proteazama. SI. 9.12 pokazuje Tricine SDS-PAGE polipeptidne varijante SEQ ID NO: 31 (CT512) u različitim vremenskim tačkama, posle digestije proteazama. SI. 9.13 pokazuje Tricine SDS-PAGE polipeptidne varijante SEQ ID NO: 32 (CT513) u različitim vremenskim tačkama, posle digestije proteazama. SI. 9.14 pokazuje Tricine SDS-PAGE polipeptidne varijante SEQ ID NO: 33 (CT514) u različitim vremenskim tačkama, posle digestije proteazama. SI. 9.15 pokazuje Tricine SDS-PAGE polipeptidne varijante SEQ ID NO: 35 (CT515) u različitim vremenskim tačkama, posle digestije proteazama. SI. 9.16 pokazuje Tricine SDS-PAGE polipeptidne varijante SEQ ID NO: 37 (CT516) u različitim vremenskim tačkama, posle digestije proteazama. SI. 9.17 pokazuje Tricine SDS-PAGE polipeptidne varijante SEQ TD NO: 38 (CT517) u različitim vremenskim tačkama, posle digestije proteazama. SI. 9.18 pokazuje Tricine SDS-PAGE polipeptidne varijante SEQ ID NO: 39 (CT518) u različitim vremenskim tačkama, posle digestije proteazama. SI. 9.19 pokazuje Tricine SDS-PAGE polipeptidne varijante SEQ ID NO: 40 (CT519) u različitim vremenskim tačkama, posle digestije proteazama. SI. 9.20 pokazuje Tricine SDS-PAGE polipeptidne varijante SEQ ID NO: 41 (CT520) u različitim vremenskim tačkama, posle digestije proteazama. SI. 9.21 pokazuje Tricine SDS-PAGE polipeptidne varijante SEQ ID NO: 42 (CT521) u različitim vremenskim tačkama, posle digestije proteazama. SI. 9.22 pokazuje Tricine SDS-PAGE polipeptidne varijante SEQ ID NO: 43 (CT522) u različitim vremenskim tačkama, posle digestije proteazama. SI. 9.23 pokazuje Tricine SDS-PAGE polipeptidne varijante SEQ ID NO: 44 (CT523) u različitim vremenskim tačkama, posle digestije proteazama. SI. 9.24 pokazuje Tricine SDS-PAGE polipeptidne varijante SEQ ID NO: 45 (CT524) u različitim vremenskim tačkama, posle digestije proteazama. SI. 9.25 pokazuje Tricine SDS-PAGE polipeptidne varijante SEQ ID NO: 46 (CT525) u različitim vremenskim tačkama, posle digestije proteazama. SI. 9.26 pokazuje Tricine SDS-PAGE polipeptidne varijante SEQ ID NO: 47 (CT526) u različitim vremenskim tačkama, posle digestije proteazama. SI. 9.27 pokazuje Tricine SDS-PAGE polipeptidne varijante SEQ ID NO: 48 (CT527) u različitim vremenskim tačkama, posle digestije proteazama. SI. 9.28 pokazuje Tricine SDS-PAGE polipeptidne varijante SEQ ID NO: 49 (CT528) u različitim vremenskim tačkama, posle digestije proteazama. SI. 9.29 pokazuje Tricine SDS-PAGE polipeptidne varijante SEQ ID NO: 51 (CT529) u različitim vremenskim tačkama, posle digestije proteazama. SI. 9.30 pokazuje Tricine SDS-PAGE polipeptidne varijante SEQ ID NO: 52 (CT530) u različitim vremenskim tačkama, posle digestije proteazama. SI. 9.31 pokazuje Tricine SDS-PAGE polipeptidne varijante SEQ ID NO: 55 (CT531) u različitim vremenskim tačkama, posle digestije proteazama. SI. 9.32 pokazuje Tricine SDS-PAGE polipeptidne varijante SEQ ID NO: 57 (CT532) u različitim vremenskim tačkama, posle digestije proteazama. SI. 9.33 pokazuje Tricine SDS-PAGE polipeptidne varijante SEQ ID NO: 59 (CT533) u različitim vremenskim tačkama, posle digestije proteazama. SI. 9.34 pokazuje Tricine SDS-PAGE polipeptidne varijante SEQ ID NO: 61 (CT534) u različitim vremenskim tačkama, posle digestije proteazama. SI. 9.35 pokazuje Tricine SDS-PAGE polipeptidne varijante SEQ ID NO: 62 (CT535) u različitim vremenskim tačkama, posle digestije proteazama. SI. 9.36 pokazuje Tricine SDS-PAGE polipeptidne varijante SEQ ID NO: 63 (CT536) u različitim vremenskim tačkama, posle digestije proteazama. SI. 9.37 pokazuje Tricine SDS-PAGE polipeptidne varijante SEQ ID NO: 64 (CT537) u različitim vremenskim tačkama, posle digestije proteazama. SI. 9.38 pokazuje Tricine SDS-PAGE polipeptidne varijante SEQ ID NO: 66 (CT538) u različitim vremenskim tačkama, posle digestije proteazama. SI. 9.39 pokazuje Tricine SDS-PAGE polipeptidne varijante SEQ ID NO: 67 (CT539) u različitim vremenskim tačkama, posle digestije proteazama. SI. 9.40 pokazuje Tricine SDS-PAGE polipeptidne varijante SEQ ID NO: 69 (CT540) u različitim vremenskim tačkama, posle digestije proteazama. SI. 9.41 pokazuje Tricine SDS-PAGE polipeptidne varijante SEQ ID NO: 70 (CT541) u različitim vremenskim tačkama, posle digestije proteazama. SI. 9.42 pokazuje Tricine SDS-PAGE polipeptidne varijante SEQ ID NO: 71 (CT542) u različitim vremenskim tačkama, posle digestije proteazama. SI. 9.43 pokazuje Tricine SDS-PAGE polipeptidne varijante SEQ TD NO: 80 (CT543) u različitim vremenskim tačkama, posle digestije proteazama. SI. 9.44 pokazuje Tricine SDS-PAGE polipeptidne varijante SEQ ID NO: 81 (CT544) u različitim vremenskim tačkama, posle digestije proteazama. SI. 9.45 pokazuje Tricine SDS-PAGE polipeptidne varijante SEQ ID NO: 82 (CT545) u različitim vremenskim tačkama, posle digestije proteazama. SI. 9.46 pokazuje Tricine SDS-PAGE polipeptidne varijante SEQ TD NO: 83 (CT546) u različitim vremenskim tačkama, posle digestije proteazama. SI. 9.47 pokazuje Tricine SDS-PAGE polipeptidne varijante SEQ ID NO: 84 (CT547) u različitim vremenskim tačkama, posle digestije proteazama. SI. 9.48 pokazuje Tricine SDS-PAGE polipeptidne varijante SEQ ID NO: 86 (CT548) u različitim vremenskim tačkama, posle digestije proteazama. SI. 9.49 pokazuje Tricine SDS-PAGE polipeptidne varijante SEQ ID NO: 87 (CT549) u različitim vremenskim tačkama, posle digestije proteazama. SI. 9.50 pokazuje Tricine SDS-PAGE polipeptidne varijante SEQ ID NO: 94 (CT550) u različitim vremenskim tačkama, posle digestije proteazama. SI. 9.51 pokazuje Tricine SDS-PAGE polipeptidne varijante SEQ ID NO: 95 (CT551) u različitim vremenskim tačkama, posle digestije proteazama. SI. 9.52 pokazuje Tricine SDS-PAGE polipeptidne varijante SEQ ID NO: 97 (CT552) u različitim vremenskim tačkama, posle digestije proteazama. SI. 9.53 pokazuje Tricine SDS-PAGE polipeptidne varijante SEQ ID NO: 98 (CT553) u različitim vremenskim tačkama, posle digestije proteazama. SI. 9.54 pokazuje Tricine SDS-PAGE polipeptidne varijante SEQ ID NO: 99 (CT554) u različitim vremenskim tačkama, posle digestije proteazama. SI. 9.55 pokazuje Tricine SDS-PAGE polipeptidne varijante SEQ ID NO: 100 (CT555) u različitim vremenskim tačkama, posle digestije proteazama. SI. 9.56 pokazuje Tricine SDS-PAGE polipeptidne varijante SEQ ID NO: 101 (CT556) u različitim vremenskim tačkama, posle digestije proteazama. SI. 9.57 pokazuje Tricine SDS-PAGE polipeptidne varijante SEQ ID NO: 102 (CT557) u različitim vremenskim tačkama, posle digestije proteazama. SI. 9.58 pokazuje Tricine SDS-PAGE polipeptidne varijante SEQ ID NO: 103 (CT558) u različitim vremenskim tačkama, posle digestije proteazama. SI. 9.59 pokazuje Tricine SDS-PAGE polipeptidne varijante SEQ ID NO: 104 (CT559) u različitim vremenskim tačkama, posle digestije proteazama. SI. 9.60 pokazuje Tricine SDS-PAGE polipeptidne varijante SEQ ID NO: 106 (CT560) u različitim vremenskim tačkama, posle digestije proteazama. SI. 9.61 pokazuje Tricine SDS-PAGE polipeptidne varijante SEQ ID NO: 107 (CT561) u različitim vremenskim tačkama, posle digestije proteazama. SI. 9.62 pokazuje Tricine SDS-PAGE polipeptidne varijante SEQ ID NO: 109 (CT562) u različitim vremenskim tačkama, posle digestije proteazama. SI. 9.63 pokazuje Tricine SDS-PAGE polipeptidne varijante SEQ ID NO: 110 (CT563) u različitim vremenskim tačkama, posle digestije proteazama. SI. 9.64 pokazuje Tricine SDS-PAGE polipeptidne varijante SEQ ID NO: 111 (CT564) u različitim vremenskim tačkama, posle digestije proteazama. SI. 9.65 pokazuje Tricine SDS-PAGE polipeptidne varijante SEQ ID NO: 112 (CT565) u različitim vremenskim tačkama, posle digestije proteazama. SI. 9.66 pokazuje Tricine SDS-PAGE polipeptidne varijante SEQ ID NO: 113 (CT566) u različitim vremenskim tačkama, posle digestije proteazama. SI. 9.67 pokazuje Tricine SDS-PAGE polipeptidne varijante SEQ ID NO: 19 (CT567) u različitim vremenskim tačkama, posle digestije proteazama. SI. 10 pokazuje tabelu u kojoj su sumirani rezultati Tricine SDS-PAGE. Krstić ukazuje na prisusutvo, na gelu, trake koja odgovara proteinskom fragmentu dugom 84 amino-kiseline divljeg tipa HMGBl Box-A ili HMGB 1 Box-A polipeptidnoj varijanti. SI. 11 pokazuje srednju vrednost koncentracije u plazmi/vremenu, posle pojedinačne subkutane primene divljeg tipa (WT) Box-A i Box-A varijante broj 64 (64), pri dozi od 1 mg/kg. Podaci su prikazani kao sr. vredn. ± SEM. SI. 12 pokazuje srednju vrednost koncentracije u plazmi/vremenu, posle pojedinačne subkutane primene divljeg tipa (WT) Box-A i Box-A varijante broj 64 (64), pri dozi od 1 mg/kg i PEGilisanog divljeg tipa (PEG-WT) Box-A i PEGilisane Box-A varijante broj 64 (PEG-64), pri dozi od 5 mg/kg. Podaci su prikazani kao sr. vredn. ±

SEM.

PRIMERI

1. TESTIRANJEIN VITROAKTIVNOSTI: TEST MIGRACIJE NIH/373 ĆELIJA

[0074]Svrha ovog ispitivanja bila je da se proceni aktivnost svake od HMGBl Box-A polipeptidnih varijanti definisanih u SEQ ID NO: 2-116 i da se uporedi njihova aktivnost sa aktivnošću divljeg tipa humanog HMGBl Box-A fragmenta pune dužine, SEQ ID NO:l, kako bi se odabrale sve one varijante koje imaju sličnu ili bolju aktivnost nego divlji tip. Aktivnost HMGBl Box-A procenjivana jein vitrokao inhibicija HMGB 1-indukovane migracije NIH/3T3 ćelija.

1.1 Materijali:

[0075]

• HMGBl Box-A divlji tip i varijante (Nautilus Biotech)

• NIH/3T3 ćelije (ATCC n. CRL-1658)

• D-MEM medijum (GIBCO; kat. br. 31966-021)

• fetalni goveđi serum (GIBCO; kat. br. 10270-106)

• penicilin-streptomicin 10,000 U/ml (GIBCO; kat. br. 15140-122)

• L-glutamin 200 mM (GIBCO; kat. br. 25030-024)

• TrvpLE Select (GIBCO; kat. br. 12563-011)

• slani rastvor puferisan fosfatima (0.138 M NaCl, 0.0027 M KC1, 0.01 M fosfatni pufer, pH 7.4)

• filteri bez PVP (8 um veličina pora; 13 mm ukupni prečnik) (Neuro Probe; kat. br.. PFA8)

• humani fibronektin (Roche; kat. br. 1080938)

• komore sa slepim bunarčićem za praćenje hemotaksije (Neuro Probe; kat. br. BW25)

• modifikovana GIEMSA boja (Sigma; kat. br. GS1 L)

1.2 Pripremanje filtera

[0076]Polikarbonatni membranski filteri bez PVP (8 um veličina pora; 13 mm ukupni prečnik), pripreme se oko 1 sat pre eksperimenta tako što se oblože rastvorom od 50 ug/ml fibronektina, u količini od 30 ul/filter, dispendovanog na neprozirnu stranu filtera. Stok-rastvor fibronektina priprema se rastvaranjem liofilizovnaog fibronektina u ddEkO do finalne koncentracije od 1 mg/ml i držanjem rastvora oko 1 sat na 37°C, do potpunog rastvaranja. Ovaj rastvor treba da se čuva na -20°C.

[0077]Filteri se zatim ostave da se osuše pod laminamim fluksom, u digestoru (oko 1 sat)

1.3 Pripremanje ćelija

[0078]NIH/3T3 ćelije zaseju se dan pre eksperimenta (približno 22-24 sata pre obavljanja eksperimenta), IO<6>ćel./ploči. Kada su filteri spremni za upotrebu, ćelije se odvoje od podloge tripsinom, broje i resuspenduju, IO<6>ćel./ml, u medijumu za kulturu koji ne sadrži serum.

1.4 Test hemotaksije

[0079]U svakom eksperimentu hemotaksije, testirano je 14 različitih polipeptidnih varijanti humanog HMGBl Box-A fragmenta pune dužine, SEQ ID NO: 1. Medijum za rast ćelija, bez dodavanja seruma (w/o FBS) korišćen je za negativnu kontrolu i predstavljao je spontanu migraciju. Kao pozitivna kontrola korišćen je lnM HMGBl. Divlji tip HMGBl Box-A ili testirane polipeptidne varijante, 0.5/1 nM, dodaju se u lnM HMGBl, da inhibiraju HMGB1-indukovanu migraciju NTH/3T3 ćelija. Negativna kontrola (w/o FBS) i pozitivna kontrola (1 nM HMGBl) testirane su u triplikatu u svakom eksperimentu. Aktivnost divljeg tipa HMGBl Box-A (SEQ ID NO: 1) u inhibiranju HMGBl-indukovane migracije ćelija testirana je u triplikatu u svakom eksperimentu. Svaka od HMGBl Box-A polipeptidnih varijanti (SEQ ID NO: 2 to 116) testirana je u duplikatu. Upotrebljene su komore sa slepim bunarčićem. Čisti, suvi donji bunarčić svake komore napuni se sa 50 ul DMEM, bez FBS, odgovarajućim hemotaktičkim sredstvom i inhibitorima. Kada se bunarčić napuni treba da se formira blago pozitivni meniskus; ovo pomaže da ne dođe do zadržavanja mehurića vazduha kada se nanese filter. Malom pincetom filter se stavi na napunjeni bunarčić (strana sa fibronektinom okrenuta nagore), pažljivo da se ne bi zadržali mehurići vazduha i da se filter ne dodirne prstima. Držač filtera se zavrne rukom. Suspenzija ćelija (50 000 ćel/50 ul) pipetira se u gornji bunarčić i doda se 150 ul medijuma bez seruma da se ispuni gornji bunarčić komore. Puna komora inkubira se 3 sata (37 °C, 5% C02) da bi došlo do migracije ćelija. Posle inkubacije, ukloni se tečnost sa filtera. Držač se odvrne i uroni u hladnu destilovanu vodu. Filter se podigne pomoću pincete, stavi na čistu površinu (čvrsti parafin) (strana sa ćelijama koje su migrirale okrenuta nagore) i fiksira špenadlom (postavljenom na periferiju).

1.5 GIEMSA bojenje ćelija koje su migrirale

[0080]Filteri se fiksiraju etanolom, jedna promena, i isperu tri puta tekućom vodom. Radni rastvor modifikovane GIEMSA boje razblažen 1:10 in ddH20 priprema se neposredno pre upotrebe. Posle ispiranja filtera, boja se dodaje i inkubira 20 minuta. Ispiranje boje obavlja se tekućom vodom. Filteri se zatim stave na pločice, okrenuti stranom sa ćelijama koje su migrirale nadole, a strana se ćelijama koje nisu migrirale blago se prebriše vlažnom vatom na štapiću (dva puta, koristeći dva štapića ili oba kraja štapića sa dva komadića vate), pažljivo da se filter ne pomeri. Posle čišćenja, pokrovna pločica se stavi na filter i ćelije se broje pod mikroskopom na uveličanju od 40x, na 10 slučajno odabranih polja po svakom filteru.

1.6 Prikazivanje podataka i statistička analiza

[0081]Rezultati testa migracije NIH/3T3 ćelija dati su u tabelama i na stubastim grafikonima na Slikama i Tabelama od 7.1 do 7.9.

Podaci prikazani stubićima srednja su vrednost ±95% CI (interval pouzdanosti).

Primenjene statističke analize su jednosmema ANO VA praćena Dunnett-ovim testom (stubići sa kontrolnim podacima: uzorak 1 nM HMGBl + uzorak HMGBl Box-A WT).

Posle evaluacije rezultata, varijante HMGBl Box-A koje su u Dunnett-ovom testu imale vrednosti p<0.05, smatrane su za značajno različite od divljeg tipa HMGBl Box-A. Ako je srednja vrednost rezultata za Box-A polipeptidnu varijantu viša nego za divlji tip Box-A stubić je obojen crveno na grafikonima eksperimenta, prikazanim na Slikama 7.1 do 7.9. Ovi crveni stubići predstavljaju polipeptidne varijante HMGBl Box-A koje pokazuju manju aktivnost nego divlji tip u inhibiranju HMGB 1-indukovane migracije ćelija.

Ako je srednja vrednost rezultata za polipeptidne varijante niža nego za divlji tip Box-A onda je stubić obojen svetloplavo na grafikonima eksperimenta, prikazanim na Slikama 7.1 do 7.9. Te varijante predstavljaju HMGBl Box-A varijante koje pokazuju veću aktivnost nego divlji tip HMGBl Box-A u inhibiranju HMGBl-indukovane migracije ćelija.

Podaci za varijante HMGBl Box-A sa vrednostima p > 0.05 u Dunnett-ovom testu razmatraju se kao da nisu značajno različite od divljeg tipa HMGBl Box-A. Stubići ovih varijanti obojeni su zeleno. Ove varijante predstavljaju varijante HMGBl Box-A koje pokazuju istu aktivnost kao divlji tip u inhibiranju HMGBl-indukovane migracije ćelija.

1.7 Rezultati

[0082]Aktivnost polipeptidnih varijanti humanog HMGBl visokoafinitetno vezujućeg domena Box-A SEQ ID NO: 2 do 116 ispitivana je u poređenju sa divljim tipom humanog HMGBl Box-A SEQ ID NO: 1 kao inhibicija migracije ćelija indukovane pomoću HMGBl, da bi se odredile poželjne polipeptidne varijante korisne kao HMGBl Box-A komponente poželjnog polimernog konjugata predmetnog pronalaska. Rezultati testova hemotaksije pokazali su (Slike 7.1 do 7.9) da kod 26 polipeptidnih varijanti, mutacija u skladu sa predmetnim pronalaskom dovodi do veće aktivnosti u pogledu inhibicije migracije ćelija, u poređenju sa aktivnošću divljeg tipa humanog HMGBl Box-A. Posebno, veću aktivnost u inhibiciji migracije ćelija pokazana je za polipeptidne varijante SEQ ID NO: 30-32, 35, 38, 40-41, 43, 48, 51, 57, 63-64, 69, 70, 94, 95, 100, 103-104, 106-107, 109-111 i 113. Pored toga, rezultati testova hemotaksije pokazali su (Slike 7.1 do 7.9) da 41 polipeptidna varijanta nije pokazala pormene u aktivnosti inhibicije HMGBl-indukovane migracije ćelija, u poređenju sa aktivnošću divljeg tipa Box-A polipeptida. Ovo je posebno slučaj za polipeptidne varijante SEQ ID NO: 2, 7, 9, 11, 15, 18, 22, 26-28, 33, 37, 39, 42, 44-47, 49, 52, 55, 59, 61, 62, 66-67, 71, 80-84, 86-87, 97-99, 101-102, 112 i 114. Sve ove polipeptidne varijante Box-A koje pokazuju sličnu ili višu aktivnost nego divlji tip Box-A testirane suin vitrona rezistenciju prema dejstvu proteaza, da bi se odabrale one koje imaju najveću otpornost, a koje su aktivne bar onoliko koliko divlji tip Box-A (vidi test rezistencije na proteaze u Primeru 2)

2. IN VITROTESTIRANJE NA REZISTENCIJU PREMA DELOVANJU PROTEAZA

[0083]Svrha ovog ispitivanja bila je procenitiin vitrorezistenciju na proteaze HMGBl Box-A varijanti, pokazanih u Primeru 1, i uporediti je sa onom divljeg tipa HMGB 1 Box-A SEQ ID NO: 1, da bi se identifikovale varijante sa poboljšanom rezistencijom na proteaze u odnosu na divlji tip polipeptida.

2.1 Materijali

[0084]

• HMGBl His-obeleženi divlji tip Box-A i odabrane varijante (Nautilus biotech)

• Tripsin (Sigma; kat. br. T8658 ; br. part. 045K5113)

• a-himotripsin (Sigma; kat. br. C6423; br. part. 109H74858),

• Endoproteinaza Asp-N (Sigma; kat. br. P3303; br. part. 046K1049)

• Endoproteinaza Glu-C (Sigma; kat. br. P6181; br. part. 075K5100)

• Komplet, mini koktel proteaznih inhibitora bez EDTA (Roche; kat. br. 11836170 001)

• Trizma baza (Sigma; kat. br. T6066)

• Akrilamid/bis rastvor 40% u vodi (Sigma; kat. br. 01709)

• SDS (Sigma; kat. br. 71729)

• Glicerol 99% (Sigma; kat. br. G9012)

• Temed (Sigma; kat. br. 87689)

• APS (Sigma; kat. br. A 3678)

• Polipeptid SDS-PAGE Molecular Weight Standards (Bio-Rad; kat. br. 161-0326)

• Prethodno smešani 10x Tris/tricin/SDS pufer (Bio-Rad; kat. br. 161-0744)

• P-merkaptoetanol (Sigma; kat. br. M7154)

• Metanol (VWR; kat. br. 20864.320)

• Sirćetna kiselina (VWR; kat. br. 20104.323)

• Brilijant plavo R (Sigma; kat. br. B0149)

• Bromofenol plavo (Sigma; kat. br. BOI26)

• Hlorovodonična kiselina (Merck; kat. br. 1.00319.2511)

• 3X pufer za nanošenje uzoraka za Tricine gelove (sastav: 150 mM Tris-HCl, pH 6.8; 12% SDS; 36% glicerol; 6% 6-merkaptoetanol; 0.04% bromofenol plavo)

2.2. Pripremanje smeše proteaza

[0085]Korišćenaje smeša proteaza koja sadrži tripsin, a-himotripsin, endoproteinazu Asp-N i endoproteinazu Glu-C. Tabela 1 prikazuje specifičnost svake od proteaza korišćenih u ovom ispitivanju.

[0086]Svaka liofilizovana proteaza rastvori se prema uputstvu proizvođača da se dobije stok-rastvor koji se alikvotira i čuva na -80°C. 100 ug tripsina rastvori se u 100 ul dH20 da se dobije stok-rastvor od 1 ug/ul. 25 ug a-himotripsina rastvori se u rastvoru lmM HC1, 2 mM CaCl2, da se dobije stok-rastvor od 0.5 ug/ul. 2 ug endoproteinaze Asp-N rastvori se u 50 ul dH20 da se dobije stok-rastvor od 0.04 ug/ul. 25 ug endoproteinaze Glu-C rastvori se u 50 ul dH20 da se dobije stok rastvor od 0.5 ug/ul.

[0087]Pre izvođenja eksperimenta alikvot stok-rastvora svake proteaze stavi se na led da se otopi. Stok-alikvoti tripsina i endoproteinaze Glu-C razblaže se u dH20 da se dobije finalni radni rastvor od 0.1 ug/ul. Stok-alikvot cc-himotripsina razblaži se u rastvoru 1 mM HC1, 2 mM CaCl2da se dobije finalni radni rastvor od 0.1 ug/ul Alikvotirani rastvor endoproteinaze Asp-N koristi se bez razblaživanja. Neposredno pre izvođenja eksperimenta smeša proteaza koja sadrži 1% (težina/težini prema ukupnom Box-A u uzorku) svake proteaze se sveže pripremi i odmah doda HMGB 1 Box-A da ga digestuje.

2.3. Digestija divljeg tipa i varijanti HMGBl Box-A proteazama

[0088]18 ug ukupno, svakog HMGBl Box-A (divljeg tipa ili varijanti) digestuje se u svakom eksperimentu. HMGB 1 Box-A koji se testira ostavi se na ledu da se topi i uzme se zapremina koja odgovara 18 ug. Zapremina ovog rastvora se zatim pomoću dH20 dovede do finalne zapremine od 90 ul da bi se dobila ista finalna zapremina za svaki HMGBl Box-A koji se testira. 10 ul ovog rastvora (odgovara 2 ug HMGBl Box-A) uzme se pre dodavanja smeše proteaza. Ovaj uzorak odgovara nedigestiranom uzorku u "vremenu 0". Preostalom uzorku (16 ug HMGBl Box-A) doda se 8.8 ul (odgovara 0.16 ug svake proteaze u sveže pripremljenoj smeši; vidi 2,2) proteazne smeše za digestiju. Proteazna digestija se odvija na 25°C i pri zapremini koja odgovara 2 ug HMGBl Box-A (originalno prisutnog u smeši); uzorci se uzimaju u definisanim vremenskim razmacima. Digestija se prekida dodavanjem 4 ul rastvora kompletnog Mini koktela inhibitora proteaza bez EDTA (1 tableta se rastvori u 10 ml H20). Vremenske tačke za uzorkovanje su: 0.5 minuta, 15 minuta, 30 minuta, 1 sat, 1.5 sat, 2 sata i 4 sata. Ubrzo posle inhibicije proteaza, uzorcima se dodaje odgovarajuća količina pufera za nanošenje uzoraka 3X i obavi se inkubacija na 95°C, oko 3 minuta.

2.4. Tricin SDS-PAGE digestovanog divljeg tipa i varijanti HMGBl Box-A

[0089]Posle digestije proteazama i pripreme uzoraka, uzorci svakog HMGBl Box-A uzeti u određenim vremenskim tačkama nanose se na Tricine SDS-PAGE gel (za referencu vidi: Schagger and von Jagow, "Tricine-sodium dodecvl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis for the separation of proteins in the range from 1 to 100 kDa",Anal. Biochem.166, 368-379, 1987). 5 ul polipeptid-SDS-PAGE Molecular Weight Standards (Bio-Rad) nanese se kao uporedna vrednost na svaki gel. Svaki bunarčić gela napuni se sa 10 ul uzorka

(zapremina odgovara 1 ug of HMGBl Box-A pre digestije). Elektroforeza se obavlja na 30 V dok bromofenol plavo ne uđe u deo gela za separaciju, zatim na 120 V (Mini Protean 3 Svstem; Bio-Rad) do kraja prolaska. Gelovi se boje potapanjem u rastvor Coomassie-jevog brilijant plavog za bojenje (0.1% težVzapr. u 50% metanola, 10% sirćetna kiselina). Slke gelova dobijaju se pomoću Gel Doc 2000 (Bio-Rad) sistema za dobijanje slike.

2.5 Rezultati

[0090]U gore opisanim uslovima testa za kompletnu digestiju divljeg tip HMGBl proteina proteazama potrebno je oko 30 minuta. Na Slici 8, traka koja odgovara fragmentu pune dužine divljeg tipa HMGBl Box-A proteina od 84 amino-kiseline, SEQIDNO: 1, vidljiva je do 30 minuta od početka digestije proteazama. Dvadeset jedna testirana polipeptidna varijanta Box-A pokazuje povećanu rezistenciju na delovanje proteaza (Slika 10). U uslovima ovog testa te varijante se odupiru digestiji proteazama od 1 sata do 2 sata. Polipeptidne varijante SEQ ID NO: 33, 35, 37, 38, 39, 42, 43, 44, 47, 48, 57, 62, 69 i 104 pokazale su 1 sat rezistencije na digestiju proteazama. Slike 9.14, 9.15, 9.16, 9.17, 9.18, 9.21, 9.22, 9.23, 9.26, 9.27, 9.32, 9.35, 9.40 i 9.59 pokazuju traku koja odgovara ne-His-obeleženom proteinu od 84 amino-kiseline, koja je vidljiva do 1 sata od otpočinjanja digestije proteazama.

[0091]Polipeptidne varijante SEQ ID NOs: 45, 49, 52, 55 i 67 pokazale su rezistenciju od 1.5 sata na digestiju proteazama. Slike 9.24, 9.28, 9.30, 9.31 i 9.39 pokazuju traku koja odgovara proteinu od 84 amino-kiseline koji nije His-obeležen, koja je jasno vidljiva jedan i po sat posle otpočinjanja digestije proteazama. Polipeptidne varijante SEQ ID NO: 59 i 64 pokazuju čak do 2 sata rezistencije na digestiju proteazama. Slike 9.33 i 9.37 pokazuju traku koja odgovara proteinu od 84 amino-kiseline koji nije His-obeležen, koja je jasno vidljiva do 2 sata posle otpočinjanja digestije proteazama.

3. FARMAKOKINETIČKA STUDIJA BOX A (DIVLJT TIP I VARIJANTE) I PEGILISANOG BOX A (DIVLJI TIP I VARIJANTE) POSLE JEDNE SUBKUTANE PRIMENE KOD MIŠEVA

3.1. Cilj studije

[0092]Svrha ove studije bila je ispitati i uporediti farmakokinetičke profile Box A (divlji tip i varijante) i PEGilisanog Box A (divlji tip i varijante) posle jedne subkutane primene jedinjenja kod miševa.

3.2. Materijal i metodi

[0093]• Testni artikli: Box A divlji tip i varijante i odgovarajući PEGilisani molekuli. PEGilisani molekuli dobijeni su reakcijom linearnog mPEG-aldehida (40 kDa) sa N-završetkom respektivnog Box-A molekula, reduktivnom aminacijom.

3.3In vivoeksperiment

[0094]

• Životinje: miševi (Balb/c, mužjaci, 7-9 nedelja stari, nabavljeni od Charles River Laboratories Italia SpA, Calco, nedelju dana pre eksperimenta), prosečna telesna

težina 22.2-22.4 g u trenutku eksperimenta

• Držanje životinja: životinje su smeštene u ventilirajuće termostatičke komore podešene da održavaju temperaturu i relativnu vlažnost na 22°C±2°C i 55±15 % respektivno, sa 12-časovnim ciklusima svetio/mrak. U providnim polikarbonatnim kavezima (Techniplast, Buguggiate, Italy) bilo je do 10 miševa, koji su pili vodu preko boca za vodu i jeli komercijalnu hranu za laboratorijske glodare (4RF21, Mucedola

s.r.I., Settimo Milanese, Italy)ad libitum.

• Eksperimentalne<g>rupe: 4 (četiri testne stavke), 20 životinja/grupi, grupisane po principu slučajnosti. • Primeniena doza: Box A divlji tip i varijante primenjeni su u dozi od 1 mg/kg subkutano. PEGilisani divlji tip i varijante Box-A primenjeni su u dozi od 5 mg/kg

subkutano. Ove doze obezbedile su ekvimolarnost testnih jedinjenja

• Primena testnih stavki: testne stavke primenjen su subkutano korišćenjem insulinskog šprica sa iglom od 0.45x12 mm (26G x ."), u zapremini od 0.25 ml/mišu (10 ml/kg telesne težine).

• Formulacija testnog artikla: Rastvor fosfatom puferisanog slanog rastvora

Žrtvovanje životinja i uzimanje uzoraka krvi:

[0095]Uzorci krvi uzimani su u sledećim tačkama vremena od otpočinjanja tretmana: • Box A divlji tip i varijante: 5, 20 i 40 minuta, 1.5 i 2.5 sata posle primene testnih jedinjenja; • PEGilisani Box A divlji tip i varijante: 5, 40 minuta, 1.5, 5 i 10 sati posle primene testnih jedinjenja.

[0096]Različite tačke vremena u kojima su uzimani uzorci krvi za različita testna jedinjenja određene su na osnovu duže očekivane postojanosti PEGilisanih molekula u krvotoku.

[0097]Pri svakom uzimanju uzorka krvi, iz ventralne aorte svake životinje uzimano je 0.4 ml krvi, pomoću insulinskog šprica, u dubokoj etarskoj anesteziji, i krv je stavljana u polietilenske ependorfe sa 5 ul heparina (5000 Ul/ml), da bi se sprečilo zgrušavanje. Uzorci krvi držani su na ledu do centrifugiranja na 1400 g, 5 min, u rashladnoj centrifugi (2-4°C). Iz svakog ependorfa uzimani su uzorci plazme, stavljani u nove ependorfe i zamrzavani na

-80°C do analiziranja.

3.4 Analitičko određivanje

[0098]Koncentracije u plazmi Box A (divlji tip i varijante) i PEGilisanog Box A (divlji tip i varijante) određivane su u plazmi miševa ELISA metodom. Ukratko, rastvor za oblaganje priprema se razblaživanjem monoklonskog antitela na N-završetak Box-A, 10 ng/ml, u 100 mM karbonatno.bikarbonatnog pufera za oblaganje. 100 ul je alikvotirano u svaki bunarčić Nunc Maxisorp ELISA ploče, koja je onda inkubirana preko noći na 4°C. Ploča je isprana sa PBS 0.05% Tween, 6 puta i dodato je 300 ul 5% mleka u PBS 1% Tween u svaki bunarčić, da bi se blokirala preostala vezujuća mesta na ploči. Ploča je inkubirana 1 sat na sobnoj temperaturi na 300 rpm. Uzorci su razblaženi 1:20 u PBS 1% Tween, rpm. Ploča se ispere 6 puta i 100 ul standarda i razblaženi uzorci prenesu na označene bunarčiće obložene ploče i inkubiraju na sobnoj temperaturi 1 sat, na 300 rpm. Ploča se ponovo ispere 6 puta pre nego što se dodaju sekundarna antitela na C-terminus Box-A (1:200). Posle 1 sata inkubacije i 6 ispiranja, biotinizovani kozji antizečji konjugat u razblaženju 1:20 000 doda se svaki bunarčić (100 ul/bunarčiću). Posle 1 sata inkubacije (na sobnoj temperaturi, 300 rpm) i šest ispiranja, ploče se inkubiraju sa 100 ul/bunarčiću rastvora streptavidin-HRP, 1:100 000, 25 minuta na 300 rpm. Ploča se ispere 6 puta i u svaki bunarčić se doda 100 ul prethodno zagrejanog TMB supstrata. Signal se razvije na sobnoj temperaturi, na radnoj površini i, posle

30 minuta, doda se 100 ul/bunarčiću Stop rastvora i ploča se odmah očitava na 450 nm.

3.5 Rezultati

[0099]Izračunavaju se srednje koncentracije Box-A (divlji tip i varijante) i PEGilisanog Box-A (divlji tip i varijante) za svaki od prethodno opisanih PK uzoraka i određuje se farmakokinetički profil. Rezultati su pokazani na SI. 11 i 12. Kao primer, dole su saopšteni PK profili Box A divljeg tipa i varijante br. 64 (M511) i PEGilisanog Box-A i PEGilisanog Box-A varijante br. 64 (M511). Rezultati su prikazani kao srednja vrednost ± greška (SEM) (4 miša za svaku tačku vremena, analizirano u duplikatu). U tabeli koja sledi, prikazane su izračunate vrednosti AUCiast( Area Under the Curve calculated at the last experimental point,područje ispod krive izračunato za poslednju eksperimentalnu tačku) za krive Box-A divlji tip, Box-A varijantu broj 64, PEGilisani Box-A divlji tip i PEGilisani Box-A varijantu broj 64.

3.6 Diskusija

[0100]Relativno povećanje AUCiastkoje je WT stekao mutacijom je 1.68x (WT vs. 64), najverovatnije je rezultat veće rezistenstnosti na proteaze u subkutanom kompartmentu. Relativni porast AUCiastkoji je WT stekao PEGilacijom je lx (WT vs. PEG-WT), uglavnom kao rezulat ometene renalne filtracije. Mutacija i PEGilisanje zajedno daju relativno povećaje AUCiastod 37x (WT vs. PEG-64). Neočekivano, dve modifikacije zajedno imaju pozitivan efekat na izlaganje životinje proteinu koji je superioran u odnosu na zbir doprinosa pojedinačnih modifikacija( i. e.,37x > 1.68x+31 x). Prema tome, pojedinačna tačkasta mutacija i PEGilacija imaju sinergistički, kooperativni efekat na farmakokinetički profil nativnog proteina. Moguće objašnjenje ove pojave može biti to da PEGilisani proteini nisu potpuno zaštićeni od proteolize u subkutanom kompartmentu. Uvođenje jedne tačkaste mutacije dovodi do velikog porasta rezistencije u ovom kompartmentu, omogućavajući da veća količina proteina uđe u krvotok i da zatim masivnim PEG lancem bude zaštićena od filtracije u bubrezima.

REFERENCE CITIRANE U OPISU

Spisak referenci koje su aplikanti citirali namenjen je čitaocu samo kao olakšica. On ne predstavlja sastavni deo

evropskog patentnog dokumenta, lako je sastavljanju spiska referenci posvećena velika pažnja, greške ili

propusti ne mogu se isključiti i EPO odbacuje svaku odgovornost u tom pogledu.

Patentna dokumentacija citirana u opisu:

• US 6468533 B[0016]• WO 02074337 A[0016J• US20030144201 A [0016]• WO 2006024547 A[0018] |0041]• WO 2004022593 A[0039]• FR 0003503 W[0039] • FR 0101366 W [0039]• US 10022249 B[0039]•US 10022390 B[0039] • US 10375192 B [0039]• US 60409898 B[0039]• US 60457135 B[0039]• US 60410258 B[0039]• US 60410263 B[0039]• WO 2006002971 A[0065]• US 60584678 P[0065]• WO 200702299A |0066]

Claims (21)

1. Polimerni konjugat,naznačen time,što je polimerni konjugat visokoafinitetno vezujućeg domena humanog i/ili nehumanog divljeg tipa HMGBl Box-A (HMGBl Box-A) ili biološki aktivnog fragmenta HMGBl Box-A.

2. Polimerni konjugat polipeptidne varijante visokoafinitetno vezujućeg domena humanog i/ili nehumanog divljeg tipa HMGBl Box-A (HMGBl Box-A) ili biološki aktivnog fragmenta HMGB 1 Box-A,naznačen time,što se aminokiselinska sekvenca pomenute polipeptidne varijante razlikuje od aminokiselinske sekvence divljeg tipa HMGBl Box-A po mutaciji jedne ili više pojedinačnih amino-kiselina.

3. Polimerni konjugat iz zahteva 1 ili 2,naznačen time,što je polimer linearna ili granata polimerna komponenta iz grupe koja se sastoji od polialkilen-glikola, polialkilen-oksida, poliakrilne kiseline, poliakrilata, poliakrilamida ili N-alkil derivata toga, polimetakrilne kiseline, polimetakrilata, polietilakrilne kiseline, polietilakrilata, polivinilpirolidona, poli(vinil-alkohola), poliglikolne kiseline, polilmlečne kiseline, poli (mlečne-ko-glikolne) kiseline, dekstrana, hitozana ili poliamino-kiseline.

4. Polimerni konjugat iz zahteva 1 ili 2, naznačentime,što je polimer linearna ili granata polimerna komponenta odabrana između polietilen-glikola (PEG) ili metoksi-polietilen-glikola (m-PEG), poželjno sa prosečnom molekulskom težinom od 20 000 ili prosečnom molekulskom težinom od 40 000 Da.

5. Polimerni konjugat iz bilo kog od zahteva 1 do 4,naznačen time,što je polimerna komponenta kovalentno vezana za HMGBl Box-A polipeptid, HMGBl Box-A polipeptidnu varijantu ili njihov biološki aktivni fragment.

6. Polimerni konjugat iz bilo kog od zahteva 1 do 5,naznačentime, što je mesto konjugacije na HMGBl Box-A polipeptidu, polipeptidnoj varijanti ili njihovom biološki aktivnom fragmentu, odabrano između lizinske, cisteinske, histidinske, argininske, tirozinske, serinske, treoninske, aspartatne i glutamatne rezidue ili N-terminalne amino-grupe.

7. Polimerni konjugat iz zahteva 1 do 6,naznačen time,što se polipeptidna varijanta razlikuje od sekvence divljeg tipa HMGBl Box-A po mutaciji 1 do 10 amino-kiselina, poželjno po samo jednoj pojedinačnoj amino-kiselini.

8. Polimerni konjugat iz zahteva 7,naznačen time,što je mutacija supstitucija, delecija ili adicija pojedinačnih amino-kiselina.

9. Polimerni konjugat iz zahteva 8, naznačentime,što je supstitucija konzervativna ili nekonzervativna supstitucija dobijena različitim genetički kodiranim amino-kiselinama ili amino-kiselinama koje se ne kodiraju genetički.

10. Polimerni konjugat iz bilo kog od zahteva 1 do 9,naznačen time,što je polipeptidna varijanta humanog HMGBl Box-A odabrana iz grupe koja se sastoji od aminokiselinskih sekvenci kako je definisano u bilo kojoj od SEQ ID NO: 2 do 116.

11. Polimerni konjugat iz bilo kog od zahteva 1 do 9,naznačen time,što je biološki aktivan fragment divljeg tipa humanog HMGBl Box-A fragment od bar 77 ili bar 54 amino-kiseline, respektivno, i uključuje aminokiselinske sekvence kako je definisano u SEQ TD NO: 117 ili 223, respektivno, i gde je polipeptidna varijanta pomenutih biološki aktivnih fragmenata humanog HMGBl Box-A odabrana iz grupe koja se sastoji od aminokiselinskih sekvenci kako je definisano u bilo kojoj od SEQ ID NO: 118 do 222 ili 224 do 300.

12. Polimerni konjugat iz bilo kog od zahteva 1 do 9,naznačen time,što nehumani HMGBl Box-A jesteAnopheles gambiaHMGBl Box-A (SEQ ID NO: 301) i gde je nehumana polipeptidna varijanta pomenutogAnopheles gambiaHMGBl Box-A odabrana iz grupe koja se sastoji od aminokiselinskih sekvenci kako je definisano u bilo kojoj od SEQ TD NO: 302 do 418.

13. Polimerni konjugat iz bilo kog od zahteva 1 do 9 i 12,naznačen time,što je biološki aktivni fragment divljeg tipa HMGB 1 Box-AAnopheles gambiafragment od bar 77 ili bar 54 amino-kiseline, respektivno, i sadrži aminokiselinske sekvence kako je definisano u SEQ ID NO: 419 ili 529, respektivno i gde je polipeptidna varijanta pomenutih biološki aktivnih fragmenataAnopheles gambiaHMGBl Box-A odabrana iz grupe koja se sastoji od aminokiselinskih sekvenci kako je definisano u bilo kojoj od SEQ ID NO: 420 do 528 ili 530 do 610.

14. Farmaceutska smeša, naznačena time, što kao aktivno sredstvo uključuje efikasnu količinu bar jednog polimernog konjugata iz bilo kog od prethodnih zahteva i, opciono, farmaceutski prihvatljive nosače, adjuvanse, diluente i/ili aditive

15. Smeša iz zahteva 14, naznačena time, što ima dijagnostičku primenu i terapijsku primenu.

16. Upotreba polimernog konjugata iz bilo kog od zahteva 1 do 13, naznačena time, što se upotrebljava za izradu leka za prevenciju, ublažavanje ili lečenje patologija udruženih sa HMGBl ili patologija udruženih sa proteinima homologim HMGBl, posebno odabranih između patoloških stanja posredovanih aktivacijom kaskade inflamatornih citokina.

17. Upotreba iz zahteva 16, naznačena time, što su patološka stanja odabrana iz grupe koja se sastoji od zapaljenskih oboljenja, autoimunih oboljenja, sindroma sistemskog zapaljenskog odgovora, reperfuzione povrede posle transplantacije organa, kardiovaskularnih poremećaja, oboljenja u opstetrici i ginekologiji, infektivnih (virusnih i bakterijskih) bolesti, alergijskih i atopijskih bolesti, patologija solidnih i tečnih tumora, bolesti odbacivanja transplantata, kongenitalnih bolesti, dermatoloških bolesti, neuroloških bolesti, kaheksije, bubrežnih bolesti, stanja jatrogene intoksikacije, metaboličkih i idiopatskih bolesti i oftalmoloških oboljenja.

18. Upotreba polimernog konjugata iz bilo kog od zahteva 1 do 13, naznačena time, što se upotrebljava za izradu leka za prevenciju, ublažavanje ili lečenje patologija udruženih sa RAGE, posebno dijabetesa tipa T i/ili tipa II.

19. Upotreba iz bilo kog od zahteva 16 do 18 u kombinaciji sa drugim sredstvom koje je sposobno da inhibira rani medijator kaskade inflamatornih citokina,naznačenatime, što je drugo sredstvo posebno odabrano iz grupe koja sadrži: (i) antagonist ili inhibitor citokina odabran iz grupe koja se sastoji od TNF, IL-lct, IL-1B, IL-Ra, IL-6, IL-8, IL-10, IL-13, IL-18, IFN-y, MlP-la, MIF-ip, MIP-2, MIF i PAF; (ii) antitelo na RAGE, nukleinsku kiselinu ili analog nukleinske kiseline sposobne da inhibiraju ekspresiju RAGE,e. g.besmisleni molekul, ribozim ili RNK-interferentni molekul, ili mali sintetski molekulski antagonist inteakcije HMGBl sa RAGE, ili solubilni RAGE (sRAGE); (iii) inhibitor interakcije Toll-like receptora (TLR), posebno TLR2, TLR4, TLR7, TLR8 ili/i TLR9, sa HMGBl, poželjno monoklonsko ili poliklonsko antitelo, nukleinsku kiselinu ili analog nukleinske kiseline sposobne da inhobiraju ekspresiju TLR,e. g.besmisleni molekul, ribozim ili RNK-interferentni molekul, ili sintetski molekul koji ima veličinu manju od 1000 Da.

20. Smeša iz zahteva 14,naznačena time,što je bar jedan polimerni konjugat u kombinaciji sa bar jednim drugim sredstvom kako je definisano u zahtevu 19.

21. Medicinsko sredstvo,naznačeno time,što je reverzibilno obloženo bar jednim polimernim konjugatom iz bilo kog od zahteva 1 do 13.