RS50851B - Novi karbamilovani epo i postupak za njegovu proizvodnju - Google Patents

Abstract

Postupak za proizvodnju karbamilovanog proteina eritropoetina koji ima manje od oko 40% nagomilanog proteina i manje od oko 40 tež.% prekomerno- i premalo-karbamilovanog proteina kao što je mereno pomoću ESI-masene spektrometrije, naznačen time što taj postupak sadrži dovođenje u kontakt količine eritropoetina sa količinom cijanata na temperaturi, pH vrednosti, i tokom vremenskog perioda koji su dovoljni da amino grupe na lizinima i N-terminalne aminokiseline eritropoetina postanu najmanje oko 90% karbamilovane.Prijava sadrži još 75 patentnih zahteva.

Description

Uvod

Predstavljeni pronalazak je usmeren na postupak za proizvodnju karbamilovanog EPO-jedinjenja. Jedinjenje, karbamilovani eritropoetin (CEPO), koje je okarakterisano time što je karbamilovano na svim ili većini primarnih amina lizina i na N-terminalnoj aminokiselini molekula, i pored toga ovo jedinjenje ima i nizak nivo karbamilacije primarnih amina drugih aminokiselina u molekulu. Pored toga, ovo jedinjenje je slobodno od nagomilanih proteina i polimera, i pogodno je za primenu u farmaceutskim kompozicijama za lečenje bolesti na primer, centralnog ili perifernog nervnog sistema, i drugih tkiva koja eksprimiraju centralni EPO receptor. Druga iznenađujuća prednost predstavljenog postupka proizvodnje je činjenica da taj postupak obezbeđuje proizvod koji sadrži manje nagomilanog proteina i manje polimera, od proizvoda dobijenih od drugih poznatih postupaka karbamilacije opisanih za eritropoetin.

Osnova pronalaska

Smanjenje biološke hematopoezne aktivnosti karbamilovanog EPO pokazali su Satake, R. et al. (1990) Biochimica et Biophysica Acta; 1038: 125-129 i Mun, K-C. and Golper, T.A. (2000) Blood Purif.; 18: 13-17. Brines et al. 2003, US patentna prijava 20030072737 pokazala je da gubitak hematopoezne aktivnosti ne utiče na osobine EPO koje se odnose na tkivnu zaštitu.

Karbamilacija proteina je široko poznata kao sporedan efekat primene uree u prečišćavanju proteina i kao rezultat visokih nivoa uree u serumu. Ovo je izazvano spontanim razlaganjem uree u cijanat. Cijanat je odgovoran za karbamilaciju primarnih amina proteina, stoga su N-terminalni kraj i lizini proteina podložni karbamilaciji (Slika 1). Dodatno, drugi potencijalni aminokiselinski ostaci podložni karbamilaciji su arginin, cistein, tirozin. asparaginska kiselina, glutaminska kiselina i histidin, reakcija je međutim zavisna od pH vrednosti i ne odvija se tako lako kao sa N-terminalnim i lizinskim ostatkom.

Ispitivanja usmerena ka otkrivanju da lije karbamilacija proteina mogla da poboljša ili umanji biološku aktivnost proteina, izveli su Horkko, S. et al. (1992) Kidnev International.; 41: 1175-1181, Plapp, B.V. et al. (1971) Jour. Biol. Chem.; 246(4): 939-945, Satake, R. et al.

(1990) Biochimicaet Biophvsica Acta; 1038: 125-129 and Mun, KC. and Golper, T.A. (2000) Blood Purif.; 18: 13-17. Oni su ispitivali biološki efekat karbamilacije proteina korišćenjem KCNO kao izvora cijanata. Oni su svi zabeležili opadanje ili promenu u biološkoj aktivnosti kao rezultat povećane karbamilacije. Procena stepena karbamilacije je zasnovana na dve analitičke metode: 1. Merenje opadanja broja slobodnih amino grupa primenom testa trinitrobenzolsulfonske kiseline (TNBS) i 2. Aminokiselinska analiza određivanjem lizina koji su prevedeni u homocitrulinske ostatke.

Horkko, S. et al. (1992), su karbamilovali lipoprotein niske gustine maksimalno 6 časova na 37° sa 2 M KCNO, ali nisu dobili potpuno karbamilovani protein kao što je mereno TNBS testom.

Plapp, B.V. et al. (1971), ispitivali su efekat vremena i dobili skoro potpuno karbamilovanu goveđu pankreasnu deoksiribonukleazu A posle 24 časa tretmana sa 1 M KCNO na 37°C.

Mun, K-C. and Golper, T.A. (2000) ispitivali su efekat vremena sa maksimumom od 6 časova reakcionog vremena primenom 2 M KCNO. Oni su takođe ispitivali efekat povećanja koncentracije KCNO, na 6 časova sve reakcije su bile na 37°C. Mun, K.C. and Golper, T.A.

(2000) nisu mogli, iz eksperimentalnog dizajna, da potvrde tačan stepen karbamilacije (videti stranicu 16, red 33-35).

Sada smo sa predstavljenim pronalaskom pronašli da karbamilacija EPO proizvodi polimere i agregate i stoga ih čini neprikladnim za biofarmaceutsko sredstvo. Pored toga, našli smo da je formiranje ovih polimera i agregata bilo zavisno od uslova izvođenja postupka karbamilacije. Stoga, potreban je razvoj postupka sa optimalnim parametrima u vezi sa pH vrednošću, vremenom, koncentracijom cijanata, temperaturom, koncentracijom proteina i najvažnije, stepenom polimerizacije proteina. Predstavljeni pronalazak sadrži optimalan postupak za karbamilaciju i daje proizvod sa niskim stepenom polimerizacije i agregacije. i pored toga, iznenađujuće, našli smo daje dobijen potpuno karbamilovani EPO usmeren ka N-terminalnom i svim lizinskim ostacima (poslednje navedeni se javlja u naznačenom pll-opsegu). Sledeći korak postupka prema pronalasku je napravljen u cilju uklanjanja formiranih agregata i polimera.

Prethodno je ilustrovano da stepen karbamilacije zavisi od koncentracije cijanata i vremena. Međutim, nije opisano kako dobiti skalabilan postupak karbamilacije za proizvodnju biofarmaceutskog sredstva.

Prisustvo agregata sub-optimalnom proizvodnjom povezano jc sa indukcijom antitela. Prema tome, prisustvo agregata ima za rezultat biofarmaceutski proizvod nepogodan za primenu kod ljudi.

Postupak karbamilacije i prečišćavanja opisan u predstavljenom pronalasku vodi ka proteinu koji je naznačen kao potpuno karbamilovan sa najnižim mogućim formiranjem polimera ili agregata i sa minimalnim gubitkom krajnjeg proizvoda, što ga čini ekonomičnim.

Dalja obrada karbamilovanog proteina daje proizvod koristan kao biofarmaceutsko sredstvo sa samo minimalnim rizikom za stvaranje imunološkog odgovora na protein kao posledica agregata i polimera.

Analitički postupci za procenu potpune karbamilacije se obavljaju pored aminokiselinske analize; TNBS za slobodne primarne amino grupe i konačno karakterizacija proizvoda i razloženog proizvoda pomoću MALDI-TOF.

Dobijeno jedinjenje koje je eritropoetin koji je potpuno karbamilovan na slobodnim amino grupama na N-terminalnim ostacima i lizinima molekula i dalje nije nagomilan i nije polimerizovan do sadržaja od preko 2.5%, i sadrži minimum prekomerno- ili premalo-karbamilovanog eritropoetina. može se koristiti za proizvodnju farmaceutskih kompozicija za lečenje bolesti koje su osetljive na neuroprotektivnc efekte nativnog eritropoetina.

Rezime pronalaska

Predstavljeni pronalazak se odnosi na skalabilan postupak karbamilacije proteina za proizvodnju biofarmaceutskih sredstava.

Postupak karbamilacije i prečišćavanja opisan u predstavljenoj prijavi vodi ka proteinu koji je naznačen kao potpuno karbamilovan sa najnižim mogućim formiranjem polimera ili agregata i sa minimalnim gubitkom krajnjeg proizvoda.

Postupak karbamilacije je optimizovan da bi se proizveo karbamilovani protein sa najnižom količinom polimera i agregata čineći ga ekonomičnim postupkom. Krajnji proizvod dodatno sadrži ograničene količine izoformi prekomerno- i/ili premalo-karbamilovanog eritropoetina (ispod ili iznad 9 karbamilacija po molekulu). Premalo karbamilovani EPO bi sadržao manje od 9 karbamil ostataka, tj., nisu svi od osam lizina i N-terminusa karbamilovani. Premalo karbamilovani EPO može imati mali broj, tj., 5 karbamil ostataka i da još uvek nema klasičnu eritropoeznu aktivnost, čineći ga pogodnim za primenu u predstavljenom pronalasku. Prekomerno karbamilovani EPO ima više od 9 karbamil ostataka i imao bi karbamilaciju na aminokiselinama osim osam lizinskih ostataka i N-terminusa. CE^PO može imati sve do 15 karbamil ostataka i da još uvek ima željeni efekat, tj., neklasičnu eritropoeznu aktivnost. Najmanje oko 90%, i najverovatnije 95%, CEPO izoformi su karbamil ovane samo na 8 lizinskih ostataka i N-terminusu.

Dalja obrada karbamilovanog proteina uklanja nagomilani i polimerizovani proizvod do nivoa od maksimalno 3% ili 2.5%, i time čini proizvod korisnim kao biofannaceutsko sredstvo sa samo minimalnim rizikom od stvaranja imunološkog odgovora na protein kao posledice agregata i polimera.

Analitički postupci za procenu karbamilacije su obavljani pored aminokiselinske analize; TNBS za slobodne primarne amino grupe i karkaterizacija proizvoda i razloženog proizvoda pomoću MALDI-TOF i LC-MS/MS.

Detaljan opis pronalaska

POSTUPAK PRIPREME

Šest koraka čini postupak za karbamilaciju proteina:

1. Koncentrovanje ultrafiltracijom

2. Modifikacija karbamilacijom

3. Odsoljavanje gel filtracijom

4. Prečišćavanje anjonskom-izmenom

5. Koncentrovanje i puferska izmena ultrafiltracijom i diafiltracijom

6. 0.22 um filtracija

Početni materijal predstavljenog postupka za karbamilaciju je korisno prečišćeni humani EPO, ali može biti bilo koji EPO oblik životinjskog ili humanog tipa, u neograničavajućem primeru on je sintetički, rekombinantni humani EPO ili biološki ili hemijski modifikovani humani EPO, kao što su asialo-EPO, mutanti humanog EPO, tj., molekul u koji su uvedene promene u aminokiselinskoj sekvenci, EPO fragmenti, peptidi EPO-a, drugi proteini, ili smeše proteina ako je potrebno nekoliko karbamilovanih proteina.

Prvi korak postupka obuhvata podešavanje koncentracije proteina preko ultrafiltracije. gde je koncentracija proteina podešena za svrhu održavanja niske zapremine postupka. Koncentracija proteina od 0.05-10 mg/ml ili 0.05 -8 mg/ml je poželjna varijanta. Poželjnija varijanta je 0.05-7 mg/ml i najpoželjnija je 2-5 mg/ml. Ako je koncentracija povećana, agregati se sve više formiraju. Ultrafiltracija je izvedena pomoću BioMax (Millipore) sa MWCO od 5 kDa. Mogu biti korišćeni i drugi filteri. Pored toga, rastvorljivost proteina može biti podešena dodavanjem stabilizatora.

Po završetku koraka koncentrovanja, rastvor proteina se meša sa K-borat tetrahidratom, K-cijanatom, sa pH vrednošću od 7-11 ili pH 7-10. U poželjnoj varijanti, pH vrednost je 8-10, i najpoželjnije je 9.0. Temperaturni opsezi su od 0°-60°C, 0°-50<c>C. 0°-40°C ili 0°-< 37°C, ali poželjna varijanta je temperaturni interval od 30-34°C, poželjno 32°C, za vremenski period od 10 minuta-30 dana, 30 minuta-30 dana. 1 čas-30 dana, 1 čas-20 dana. 1 čas-10 dana, 1 čas-5 dana, 1 čas-2 dana, 1 čas-26 časova, 18-26 časova ili poželjno 22 časa-26 časova, najpoželjnije 24 časa. Međutim, ovi poželjni intervali bi mogli biti promenjeni ako su drugi parametri postupka promenjeni, tj., temperatura, koncentracija cijanata i koncentracija proteina.

Ako je temperatura ispod granica, prinos će biti nizak jer će karbamilacija biti spora i neefikasna. Ako su temperaturne granice prekoračene, prinos će biti nizak kao posledica povećane agregacije. Sledeći presudan parametar je vreme, jer se karbamilacija neće završiti ako je vreme skraćeno, ili ako je vreme produženo zapaža se formiranje agregata što ima za rezultat manji prinos.

Prema tome, predstavljen je postupak sa koherentnim parametrima, tj., ako je temperatura snižena, smanjena rekcija karbamilacije može biti kompenzovana povećanjem koncentracije cijanata i/ili reakcionog vremena. Pored toga, ako je reakciono vreme skraćeno, smanjena reakcija karbamilacije može biti kompenzovana povećanjem temperature i/ili koncentracije cijanata. Konačno, u postupku sa smanjenom koncentracijom cijanata, smanjena reakcija karbamilacije može biti kompenzovana produženjem reakcionog vremena i/ili temperature.

Prema tome, u zaključku, jedna značajna promena jednog presudnog parametra (vreme, temperatura, koncentracija cijanata i koncentracija proteina) bi podrazumevala promenu u jednom ili više drugih presudnih parametara u cilju dobijanja potpuno karbamilovanog molekula sa niskim formiranjem agregata i polimera.

Koncentracija boratnog pufera može biti 0.05-2 M, ali u poželjnoj varijanti 0.1-1 M i najpoželjnije 0.5 M kako se cijanat inherentno hidrolizuje i polimerizuje prilikom unosa protona i nedostatak puferskog kapaciteta ima za rezultat promenu pH vrednosti rastvora.

Pored toga, koncentracija cijanata je poželjno u opsegu od 0.05-10 M, 0.05-8 M, 0.05-6 M, 0.05-4 M ili 0.05-2 M, poželjna varijanta je 0.05-1 M i najpoželjnije 0.5 M.

Koncentracija od 0.5 M boratnog pufera je potrebna za kontrolu promene pH vrednosti uzrokovane protonskim unosom od 0.5 M koncentracije cijanata u upotrebi. Može se koristili postupak primenom drugih soli cijanata i borata. Pored toga, mogu se koristiti drugi reakcioni puferi osim borata, npr., karbonatni pufer ili fosfatni pufer.

Odsoljavanje reakcione smeše proteina i cijanata se izvodi pomoću hromatografske gel filtracije. Koristi se G-25 Fine (Amersham Biosciences) matrica. Vreme zadržavanja pre nanošenja uzorka na kolonu se kontroliše i ne bi trebalo da prelazi 2 časa, jer bi ovo uzrokovalo dalju karbamilaciju i formiranje polimera. Odsoljavanje i puferska promena proteina mogu biti izvedeni dijalizom, dia-ultrafiltracijom ili pomoću hromatografske gel filtracije. Druge gel filtracione matrice mogu biti korišćene, kao što su na primer matrice unakrsno vezanih polisaharida ili unakrsno vezanih mešanih polisaharida, poliakrilamida, polistirena ili matrice keramičke prirode. Pored toga, visina kolone može biti menjana u ovom koraku.

Korak karbamilacije može biti podešen tako da se dobije proizvod sa manje od 40% agregata i polimera, manje od 30%, manje od 25%. manje od 20%o, manje od 15%, manje od 12.5%, manje od 10%, manje od 8% ili manje od 7%.

Uklanjanje agregata i polimera se izvodi pomoću koraka prečišćavanja primenom anjonske izmene. Zabeleženo je da ona može da razdvoji karbamilovani EPO od ostataka početnog materijala i od agregata/polimera. Pufer za razdvajanje - A je: 0.3% Tris (25 mM), 0.3% (50 mM) NaCl. pH 8.5 ± 0.2, i elucioni pufer B: 0.3% Tris (25 mM), 5.8% (1 M) NaCl. pH 8.5 ± 0.2. Gradijent je izveden sa 0-30% preko zapremine 20 kolona proizvodeći željeno razdvajanje. Korak prečišćavanja može imati za rezultat proizvod sa manje od 3% agregata i polimera, manje od 2.5%, manje od 2%, manje od 1.5%, manje od 1% ili manje od oko 0.5%.

Eluiranje, sakupljanje i udruživanje karbamilovanog EPO pika utiče na raspodelu hetergenosti, tj., izoformi, eluiranog proteina. Drugim rečima, količine prekomerno- i premalo-karbamilovanog CEPO zavisiće od postupka sakupljanja i udruživanja. Ograničeno udruživanje će voditi ka snižavanju sadržaja prekomerno- i/ili premalo-karbamilovanog eritropoetina. Povećavanje dužine gradijenta će omogućiti izbor definisanijeg proizvoda ostavljajući neke delove.

Sastav karbamilovanog EPO sa manje od oko 40 tež.% prekomerno- i premalo-karbamilovanih izoformi, kao što je mcreno pomoću ESI-masene spektrometrije je jedan rezultat pronalaska. Poželjniji aspekt je CEPO sa manje od oko 35 tež.% prekomerno- i premalo- karbamilovanih izoformi, kao što je mereno pomoću ESI-masene spektrometrije. Čak još poželjniji aspekt je CEPO sa manje od oko 30 tež.% prekomerno- i premalo-karbamilovanih izoformi, kao što je mereno pomoću ESI-masene spektrometrije. Čak još poželjniji aspekt je CEPO sa manje od oko 25 tež.% prekomerno- i premalo-karbamilovanih izoformi, kao što je mereno pomoću ESI-masene spektrometrije. Čak još poželjniji aspekt je CEPO sa manje od oko 20 tež.% prekomerno- i premalo-karbamilovanih izoformi, kao što je mereno pomoću ESI-masene spektrometrije. Čak još poželjniji aspekt je CEPO sa manje od oko 15 tež.% prekomerno- i premalo-karbamilovanih izoformi, kao što je mereno pomoću ESI-masene spektrometrije. Čak još poželjniji aspekt je CEPO sa manje od oko 10 tež.% prekomerno- i premalo-karbamilovanih izoformi, kao što je mereno pomoću ESI-masene spektrometrije. Čak još poželjniji aspekt je CEPO sa manje od oko 5 tež.% prekomerno- i premalo-karbamilovanih izoformi, kao što je mereno pomoću ESI-masene spektrometrije. Čak još poželjniji aspekt je CEPO sa manje od oko 2 tež.% prekomerno- i premalo-karbamilovanih izoformi, kao što je mereno pomoću ESI-masene spektrometrije. Najpoželjniji aspekt je CEPO sa manje od oko 1 tež.% prekomerno- i premalo-karbamilovanih izoformi, kao što je mereno pomoću ESI-masene spektrometrije.

Pored uticaja na ukupni sadržaj izoformi, sakupljanje i udruživanje karbamilovanog EPO pika utiče na raspodelu prekomerno-karbamilovanog CEPO. Poželjno je da količina prekomerno-karbamilovanih CEPO izoformi bude manja od oko 35 tež.%> kao što je mereno pomoću ESI-masene spektrometrije. Čak je još poželjnije da količina prekomerno-karbamilovanog CEPO bude manje od oko 30 tež.%, kao što je mereno pomoću ESI-masene spektrometrije, i čak je još poželjnije da količina prekomerno -karbamilovanog CEPO bude manja od oko 25 tež.%, i čak još poželjnije je da bude manje od oko 20 tež.%, i čak je još poželjnije da bude manja od oko 15 tež.%. Najpoželjnije, količina prekomerno-karbamilovanog EPO ne bi trebala da bude veća od oko 10 tež.%, oko 5 tež.% ili oko 1 tež.% ukupnog CEPO.

Drugi puferi za razdvajanje i elucioni puferi se mogu koristiti kao drugi anjonsko izmenjivački matriksi i mogu se koristiti napunjeni filteri. Matriksi u neograničavajućem primcru su od unakrsno vezanih polisaharida ili unakrsno vezanih mešanih polisaharida, poliakrilamida, polistirena ili matriksi keramičke prirode.

Pored toga, za prečišćavanje se mogu koristiti i katjonsko izmenjivačka hromatografija, hromatografija zasnovana na hidrofobnoj interakciji, reverzno fazna hromatografija, afmitetna hromatografija i ekskluziona hromatografija.

U sledećem koraku za podešavanje koncentracije i pufera, koristi se dia/ultrafiltraciona jedinica sa tangencijalnim protokom. Karbamilovani EPO je podešen do koncentracije > 0.5 mg/ml i pufer je promenjen u 20 mM citrat, 100 mM NaCl pufer. Promena koncentracije i pufera se izvodi pomoću BioMax (Millipore) sa MWCO od 5 kDa. Mogu se koristiti i drugi filteri.

Konačno, prečišćeni biofarmaceutski lek je 0.22 um filtriran primenom Millipak (Millipore) da bi se smanjio broj mikroorganizama. Može se koristiti bilo koji 0.22 pm filter.

Primenom postupka, potpuno karbamilovani EPO je dobijen sa manje od 3% ili poželjno manje od 2.5% agregata kao što je mereno pomoću SEC-HPLC. Potpuna karbamilacija 8 lizinskih ostataka je potvrđena primenom aminokiselinske analize određivanjem lizina koji su pretvoreni u homocitrulin. Pored toga, karbamilacija je praćena primenom TNBS testa za određivanje primarnih amina, na taj način pokazujući potpunu karbamilaciju lizina i N-terminalnog ostatka.

Pored toga, temeljna karakterizacija primenom MALDI-TOF odredila je promenu u intaktnoj masi i PNGazom tretiranog proteina i za protein sa N-glikanima. Pored toga, MALDI-TOF analiza jedinstvene mase peptida/LC-MS/MS, pokazala je da su svi od 8 lizina i N-terminalni ostatak karbamilovani. Nisu detektovane druge karbamilovane aminokiseline i nisu detektovane modifikacije glikana. Pored toga, sniženi sadržaj prekomerno- i premalo-karbamilovanih oblika EPO je dobijen u krajnjem proizvodu.

Jedan aspekt kao što je opisan ovde je kompozicija dobijena posle koraka karbamilacije, ali pre anjonsko izmenjivačkog prečišćavanja, koja sadrži karbamilovani EPO sa manje od oko 40 tež.% agregata i polimera, manje od oko 30 tež.%, manje od oko 25 tež.%, manje od oko 20 tež.%, manje od oko 15 tež.%, manje od oko 12.5 tež.%, manje od oko 10 tež.%, manje od oko 8 tež.% ili manje od oko 7 tež.%, i određenu količinu cijanata.

Jedan sledeći aspekt je kompozicija dobijena posle anjonsko izmenjivačkog prečišćavanja koje sadrži karbamilovani EPO sa manje od oko 3 tež.% agregata i polimera, ili manje od oko 2.5 tež.%, manje od oko 2 tež.%, manje od oko 1.5 tež.%. manje od oko 1 tež.% ili manje od oko 0.5 tež.%. Pored toga, ova kompozicija sadrži izoforme koje se sastoje od prekomerno- ili premalo-karbamilovanog EPO u količinama manje od oko 40 tež.% ukupnog karbamilovanog EPO, ili poželjnije manje od oko 35 tež.%, manje od oko 30 tež.%, manje od oko 25 tež.%, manje od oko 20 tež.%, manje od oko 15 tež.%, manje od oko 10 tež.%, manje od oko 7.5 tež.%, manje od oko 5 tež.%, ili manje od oko 2 tež.%, i najpoželjnije manje od oko 1 tež.%. Pored toga, količina prekomerno-karbamilovanog EPO u kompoziciji može biti manja od oko 35 tež.% ukupnog karbamilovanog EPO, ili poželjnije manja od oko 30 tež.%, ili manje od oko 25 tež.%, manje od oko 20 tež.%, manje od oko 15 tež.%, manje od oko 10 tež.%, manje od oko 7.5 tež.%, manje od oko 5 tež.%, ili manje od oko 2 tež.%, i najpoželjnije manje odo oko 1 tež.%.

FARMACEUTSKE KOMPOZICIJE

Jedan aspekt je primena jedinjenja kao Što su ovde opisana, koja proističu iz inventivnog postupka za proizvodnju farmaceutskih kompozicija za primenu kod ljudi ili sisara za lečenje stanja opisanih u daljem tekstu.

Jedan aspekt je farmaceutska kompozicija koja sadrži terapeutski efikasnu količinu karbamilovanog EPO, sa manje od oko 3 tež.% agregata i polimera, ili poželjnije manje od oko 2.5 tež.%, manje od oko 2 tež.%, manje od oko 1.5 tež.%, ili manje od oko 1 tež.%, i najpoželjnije, manje od oko 0.5 tež.% i pored toga, ova kompozicija sadrži izoforme koje se sastoje od prekomerno- ili premalo- karbamilovanog EPO u količinama manjim od oko 40 tež.% ukupnog karbamilovanog EPO, ili poželjnije manje od oko 35 tež.%, manje od oko 30 tež.%, manje od oko 25 tež.%, manje od oko 20 tež.%, manje od oko 15 tež.%, manje od oko 10 tež.%, manje od oko 5 tež.%, manje od oko 3 tež.%, ili manje od oko 2 tež.%, i najpoželjnije manje od oko 1 tež.%. Pored toga, količina prekomerno-karbamilovanog EPO u kompoziciji može biti manja od oko 35 tež.% od ukupnog karbamilovanog EPO, ili poželjnije manja od oko 30 tež.%, manja od oko 25 tež.%, manje od oko 20 tež.%, manje od oko 15 tež.%, manje od oko 10 tež.%, manje odo oko 5 tež.%, manje od oko 3 tež.%, ili manje od oko 2 tež.% i najpoželjnije manje od oko 1 tež.%.

U izvođenju jednog aspekta, farmaceutska kompozicija kao što je opisana u prethodnom tekstu koja sadrži jedinjenje kao što je ovdc opisano, koje nastaje iz inventivnog postupka, može biti primenljiva na sisara bilo kojim načinom koji obezbeđuje dovoljan nivo jedinjenja kao što je ovde opisano, koje nastaje iz inventivnog postupka, u vaskularnim strukturama da bi se obezbedilo prenošenje kroz endotelijalne ćelijske barijere i korisni efekti na osetljive ćelije. Kada se koristi za svrhu perfuzije tkiva ili organa, poželjni su slični rezultati. U slučaju gde su ćelije ili tkivo ne-vaksularizovani i/ili primena se izvodi pranjem ćelija ili tkiva kompozicijom, farmaceutska kompozicija obezbeđuje efikasnu, količinu jedinjenja kao što je ovde opisano koja je korisna za osetljivu ćeliju, koje nastaje iz inventivnog postupka. Endotelijalne ćelijske barijere kroz koje može da prolazi jedinjenje kao što je ovde opisano, a koje nastaje iz inventivnog postupka, obuhvataju čvrste veze, perforirane veze, fenestrirane veze, i sve druge tipove endotelijalnih barijera koje su prisutne kod sisara. Poželjna barijera je čvrsta veza endotelijalnih ćelija.

Prethodno navedeno jedinjenje kao što je ovde opisano, koje nastaje iz inventivnog postupka je korisno generalno za terapeutski ili profilaktički tretman humanih bolesti centralnog nervnog sistema ili perifernog nervnog sistema koje imaju primamo neurološke ili psihijatrijske simptome, oftalmičnih bolesti, kardiovaskularnih bolesti, kardiopulmonarnih bolesti, respiratornih bolesti, bolesti bubrega, urinamih i reproduktivnih bolesti, gastrointestinalnih bolesti, i endokrinih i metaboličkih abnormaliteta. Naročito, takva stanja i bolesti obuhvataju stanja hipoksije, koja štetno utiču na ekcitabilna tkiva, kao što su ekcitabilna tkiva u centralnom nervnom sistemu, u tkivu perifernog nervnog sistema, ili kardijačnom ili retinalnom tkivu kao što su, na primer, mozak, srce. ili mrežnjača/oko. Prema tome, jedinjenje kao što je ovde opisano, koje nastaje iz inventivnog postupka, može se koristiti za lečenje ili prevenciju oštećenja ekcitabilnog tkiva koje nastaje od hipoksičnih uslova u različitim uslovima i okolnostima. Neograničavajući primeri takvih uslova i okolnosti su obezbeđeni u tabeli u daljem tekstu.

U primeru zaštite od patologija nervnog tkiva koje se mogu tretirati kao što je ovde opisano, takve patologije obuhvataju one koje nastaju iz smanjene oksigenacije nervnih tkiva. Svako stanje koje smanjuje dostupnost kiseonika nervnim tkivima, koje ima za rezultat stres, oštećenje, i konačno, smrt nervne ćelije, može se lečiti ovde predstavljenim postupcima. Generalno označeni kao hipoksija i/ili ishemija, ova stanja nastaju od ili obuhvataju, ali bez ograničenja na. slog, vaskularnu okluziju, prenatalni ili postnatalni nedostatak kiseonika, gušenje, davljenje, zamalo davljenje, trovanje ugljen monoksidom, udisanje dima, traume, uključujući operaciju i radioterapiju, asfiksiju, epilepsiju, hipoglikemiju, hroničnu opstruktivnu bolest pluća, emiizem, adultni respiratorni distres sindrom, hipotenzivni šok, septički šok, anafilaktički šok, insulinski šok, krizu srpastih ćelija, prestanak rada srca, disritmiju, azotnu narkozu, i neurološke deficite uzrokovane procedurama srce-pluća bajpasa.

U jednom aspektu, na primer, specifične farmaceutske kompozicije koje sadrže kompoziciju mogu se primenivati za prevenciju povrede ili oštećenja tkiva koje nastaje od rizika od povrede ili oštećenja tkiva u toku hirurških procedura, kao što su, na primer, resekcija tumora ili lečenje aneurizme. Druge patologije uzrokovane sa ili koje su rezultat hipoglikemije koje se mogu lečiti pomoću postupaka koji su ovde opisani obuhvataju insulinsko predoziranje, takođe označeno kao jatrogena hiperinsulinemija, insulinom, nedostatak hormona rasta, hipokortizolizam, predoziranje lekom i određene tumore.

Druge patologije koje su rezultat oštećenja ekscitabilnog nervnog tkiva obuhvataju poremećaje tipa napada, kao što je epilepsija, konvulzije ili hronični poremećaji sa napadima. Druga stanja i bolesti koji se mogu lečiti obuhvataju, ali bez ograničenja na, bolesti kao što su slog (ishemični šlog, subarahnoidno krvarenje, intracerebralno krvarenje), multipla skleroza, hipotenzija, prestanak rada srca, Alzheimer-ova bolest, Parkinson-ova bolest, cerebralna paraliza, trauma mozga ili kičmene moždine, demencija povezana sa SIDA-om, gubitak kognitivne funkcije povezan sa starenjem, gubitak pamćenja, amiotrofna lateralna skleroza, poremećaji sa napadima, akoholizam, retinalna ishemija, oštećenje optičkog nerva koje je rezultat glaukoma, i gubitak neurona.

Specifična kompozicija kao što je ovde opisana i postupci prema predstavljenom pronalasku mogu se koristiti za lečenje inflamacije koja je rezultat bolesti ili različitih trauma, kao što je fizički ili hemijski indukovana inflamacija. Takve traume mogu da obuhvataju angitis, hronični bronhitis, pankreatitis, osteomijelitis, reumatoidni artritis, glomerulonefritis, optički neuritis, temporalni arteritis, eneefalitis, meningitis, transferzalni mijelitis, dermatomiozitis, polimiozitis, nekrotizujući fascilitis, hepatitis, i nekrotizujući enterokolitis.

Dokazi su pokazali da aktivirane astrocite mogu da deluju citotoksično na neurone proizvodnjom neurotoksina. Azot oksid, reaktivne kiseonične vrste i citokini se oslobađaju iz glijalnih ćelija kao odgovor na cerebralnu ishemiju (videti Becker, K.J. 2001. Targeting the central nervous system inflammatory response in ischemic stroke. Curr Opinion Neurol 14: 349-353 i Mattson, MP., Culmsee, C, and Yu, 2.F. 2000. Apoptotic and Antiapoptotic mechanisms in stroke. Cell TissueRes 301: 173-187.). Ispitivanja su dalje pokazala da u modelima neurodegeneracije, glijalna aktivacija i zatim proizvodnja inflamatornih citokina zavisi od primarnog nervnog oštećenja (videti Viviani, B., Corsini, E., Galli, C.L., Padovani, A., Ciusani, E., and Marinovich, M. 2000. Dying neural cells activate glia through the release of a protease product. Glia 32: 84-90 and Rabuffetti, M., Scioratti, C., Tarozzo, G., Clementi, E., Manfredi, A.A., and Beltramo, M. 2000. Inhibition of caspase-l-like activity by Ac-Tyr-Val-Ala-Asp-chloromethyl ketone includes long lasting neuroprotection in cerebral ischemia through apoptosis reduction and decrease of proinflammatory cytokines. J Neurosci 20: 4398-4404). Inflamacija i glijalna aktivacija je zajednička za različite oblike neurodegenerativnih poremećaja, uključujući cerebralnu ishemiju, traumu mozga i eksperimentalni alergijski encefalomijelitis, poremećaje u kojima eritropoetin ispoljava neuroprotektivni efekat. Inhibicija proizvodnje citokina eritropoetinom bi mogla, najmanje delimično, da posreduje njen zaštitni efekat. Međutim, za razliku od "klasičnih" anti-inflamatomih citokina kao što su IL-10 i IL-13, koji direktno inhibiraju proizvodnju faktora nekroze tumora, eritropoetin izgleda daje aktivan samo u prisustvu smrti nervnih ćelija.

Bez želje da se vežemo za bilo koju posebnu teoriju, čini se da ova anti-inflamatorna aktivnost može biti hipotetički objašnjena sa nekoliko neograničavajućih teorija. Prvo, s obzirom na to da eritropoetin sprečava apoptozu, inflamatomi događaji aktivirani apoptozom bi bili sprečeni. Pored toga, eritropoetin može da spreči oslobađanje molekularnih signala iz umirućih neurona koji stimulišu glijalne ćelije ili bi mogli direktno da utiču na glijalne ćelije smanjujući njihovu reakciju na ove proizvode. Druga mogućnost je da eritropoetin ciljno deluje na najproksimalnije članove inflamatorne kaskade (npr., kaspaza 1, reaktivni kiseonik ili azotni intermedijeri) koji aktiviraju apoptozu i inflamaciju.

Pored toga, eritropoetin izgleda da obezbeđuje anti-inflamatornu zaštitu bez naknadnog skoka koji je tipično povezan sa drugim anti-inflamatomim jedinjenjima kao što je deksametazon. Još jednom, bez želje da se vežemo za bilo koju teoriju, čini se kao da ovo može biti posledica uticaja eritropoetina na višenamenske neuro toksine kao što je azot oksid (NO). Iako aktivirani astrociti i mikroglija proizvode neurotoksične količine NO kao odgovor na različite traume, NO služi za mnoge svrhe unutar tela uključujući modulaciju osnovnih fizioloških funkcija. Na taj način, iako primena antiinflamatornih sredstava može da ublaži inflamaciju supresijom NO ili drugih neuro toksina, ako anti-inlfamatorno sredstvo ima predugačak polu-život, ono takođe može da utiče na ove uloge hemikalija u popravci oštećenja nastalog od traume koja je dovela do inflamacije. Pretpostavlja se da je jedinjenje predstavljenog pronalaska sposobno da ublaži inflamaciju bez uticaja na okrepljujuće sposobnosti neurotoksina kao što je NO.

Specifične kompozicije i postupci se mogu koristiti za lečenje stanja, i oštećenja, tkiva mrežnjače. Takvi poremećaji obuhvataju, ali bez ograničenja na, retinalnu ishemiju, makularnu degeneraciju, ablaciju retine, retinitis pigmentosa, arteriosklerotičnu retinopatiju, hipertenzivnu retinopatiju, zapušavanje retinalnih arterija, zapušenje retinalnih vena, hipotenziju i dijabetičnu retinopatiju.

U sledećoj varijanti, postupci i principi se mogu koristiti za zaštitu ili lečenje povreda koje su rezultat radijacionog oštećenja ili hemoterapijom indukovanog oštećenja ekscitabilnog tkiva. U neograničavajućem primeru, vrši se zaštita od oštećenja uzrokovanih jedinjenjima kao što su taksani, cisplatin i drugi hemoterapeutici sa potencijalom da indukuju periferne neuropatije. Sledeća primena postupaka je u lečenju trovanja neurotoksinom, kao što je trovanje domojnom kiselinom ljuskara, neurolatirizam, i Guam bolest, amiotrofna lateralna skleroza i Parkinson-ova bolest.

Kao što je navedeno u prethodnom tekstu, takođe je opisan postupak za povećanje funkcije ekscitabilnog tkiva kod sisara perifernom primenom jedinjenja kao što je opisano u prethodnom tekstu. Različite bolesti i stanja se mogu lečiti primenom ovog postupka, i dalje, ovaj postupak je koristan za povećanje kognitivne funkcije u odsustvu bilo kog stanja ili bolesti. Ove primene su detaljnije opisane u daljem tekstu i obuhvataju povećanje učenja i vežbanja i kod ljudi i kod drugih sisara.

Stanja i bolesti koje se mogu lečiti pomoću postupaka ovog aspekta koje su usmerene na centralni nervni sistem obuhvataju, ali bez ograničenja na. poremećaje raspoloženja, poremećaje anksioznosti, depresiju, autizam, poremećaj pažnje i hiperaktivnosti, i kognitivnu disfunkciju. Ova stanja imaju korist od povećanja neuronalne funkcije. Drugi poremećaji koji se mogu lečiti u skladu sa ovde predstavljenim navodima obuhvataju na primer, poremećaj sna, zastoje u disanju tokom sna. i poremećaje povezan sa putovanjem; subarahnoidna i aneurizmalna krvarenja, hipotenzivni šok, kontuzionu povredu, septički šok, analilaktički šok. i posledice različitih encefalitisa i meningitisa, na primer, cerebritisa vezanog za bolest vezivnog tkiva kao što je lupus. Druge primene obuhvataju prevenciju ili zaštitu od trovanja neurotoksinima, kao što je trovanje domojskom kiselinom ljuskara, neurolatirizam, i Guam bolest, amiotrofna lateralna skleroza, Parkinson-ova bolest; postoperativni tretman embolijske i ishemične povrede; zračenje celog mozga; krizu srpastih ćelija; i eklapsiju.

Sledeća grupa stanja koja se mogu lečiti pomoću postupaka obuhvata mitohondrijalnu disfunkciju, bilo nasledne ili stečene prirode, koja su uzrok različitih neuroloških bolesti za koje je tipična povreda i smrt neurona. Na primer, Leigh-ova bolest (subakutna nekrotizujuća encefalopatija) je okarakterisana progresivnim gubitkom vida i encefalopatijom, kao posledica disfunkcije neurona, i miopatije. U ovim slučajevima, nepravilan mitohondrijalni metabolizam ne uspeva da snabdeva dovoljno visoko energetskih supstrata da bi snabdeo gorivom metabolizam ekscitabilnih ćelija. Modulator receptorne aktivnosti eritropoetina optimizuje nedostatak funkcije kod niza mitohondrijalnih bolesti. Kao što je navedeno u prethodnom tekstu, hipoksični usiovi štetno utiču na ekscitabilna tkiva. Ekscitabilna tkiva obuhvataju, ali bez ograničenja na, tkivo centralnog nervnog sistema, tkivo perifernog nervnog sistema, i srčano tkivo. Pored stanja koja su navedena u prethodnom tekstu, ovi postupci su korisni u lečenju trovanja udisanjem, kao što je udisanje ugljen monoksida i dima, jaka astma, adultni respiratorni distres sindrom, gušenje i zamalo davljenje. Dalji usiovi koji stvaraju hiposkične uslove ili na drugi način indukuju oštećenje ekscitabilnog tkiva obuhvataju hipoglikemiju koja se može javiti kod neodgovarajućeg doziranja insulina, ili sa neoplazmma koje proizvodi insulin (insulinom).

Različiti neurofiziološki poremećaji za koje se veruje da potiču od oštećenja ekscitabilnog tkiva mogu se lečiti ovde predstavljenim postupcima. Hronični poremećaji u koje je uključeno oštećenje neurona i za koje je obezbeđen tretman obuhvataju poremećaje vezane za centralni nervni sistem i/ili periferni nervni sistem uključujući gubitak kognitivne funkcije i senilnu demenciju povezane sa starenjem, hronične poremećaje sa napadima, Alzheimer-ovu bolest, Parkinson-ovu bolest, demenciju, gubitak pamćenja, amiotrofnu lateralnu sklerozu, multiplu sklerozu, tuberoznu sklerozu, Wilson-ovu bolest, cerebralnu i progresivnu supranuklearnu paralizu, Guam bolest, demeciju Lewy-evih tela, prionsku bolest, kao što su spongiformne encefalopatije. npr., Creutzfeldt-Jakob bolest, Huntington-ovu bolest, miotoničnu distrofiju, Charcot-Marie-Tooth-ovu bolest, Freidrich-ovu ataksiju i druge ataksije, kao i Gilles de la Tourette-ov sindrom, poremećaje sa napadima kao što su epilepsija i hronični poremećaj sa napadima, šlog, trauma mozga i kičmene moždine, demencija povezana sa SIDA-om, alkoholizam, autizam, retinalnu ishemiju, glaukom, poremećaje autonomne funkcije kao što su hipertenzija i poremećaji sna, i neuropsihijatrijski poremećaji koji obuhvataju, ali bez ograničenja na, šizofreniju, šizoafektivni poremećaj, poremećaj pažnje i hiperaktivnosti, distimični poremećaj, veliki depresivni poremećaj, maniju, opsesivno-kompulzivni poremećaj, poremećaje zloupotrebe psihoaktivnih supstanci, anksioznost, panični poremećaj, kao i unipolarne i bipolarne afektvne poremećaje. Dodatni neuropsihijatrijski i neurodegenerativni poremećaji obuhvataju, na primer, one navedene u American Psvchiatric Associatioms Diagnostic and Statistica! Manual of Mental Disorders (DSM), najnovijoj verziji, IV, čija je referenca ovde navedena.

U sledećem aspektu, rekombinantni himerni molekuli toksina koji sadrže jedinjenje kao što je ovde opisano, koje nastaje iz inventivnog postupka može se koristiti za terapeutsku primenu toksina za lečenje proliferativnog poremećaja, kao što je kancer, ili virusnog poremećaja, kao što je subakutni sklerozni panencefalitis.

U Tabeli 1 navedeni su dodatni primeri neograničavajućih indikacija u pogledu na različita stanja i bolesti koja se mogu lečiti prethodno navedenim jedinjenjima kao što je ovde opisano, koja nastaju iz inventivnog postupka.

Kao što je navedeno u prethodnom tekstu, ove bolesti, poremećaji ili stanja samo ilustruju opseg koristi koje obezbeđuje predstavljeno jedinjenje. Prema tome, ovde je generalno opisan terapeutski ili profilaktički tretman posledica mehaničke traume ili humanih bolesti. Poželjni su terapeutski ili profilaktički tretman bolesti, poremećaja ili stanja CNS-a i/ili perifernog nervnog sistema. Obezbeđen je terapeutski ili profilaktički tretman za bolesti, poremećaje ili stanja koja imaju psihijatrijsku komponentu. Obezbeđen je terapeutski ili profilaktički tretman za bolesti, poremećaje ili stanja uključujući, ali bez ograničenja na, one koji imaju oftalmičku, kardiovaskularnu, kardiopulmonarnu, respiratornu, bubrežnu, urinamu, reproduktivnu, gastrointestinalnu, endokrinu ili metaboličku komponentu.

U jednom aspektu takva farmaceutska kompozicija koja sadrži jedinjenje kao što je ovde opisano, koje nastaje iz inventivnog postupka može se primenjivati sistemski za zaštitu ili jačanje ciljnih ćelija, tkiva ili organa. Takva primena može biti parenteralna, preko inhalacije, ili transmukozno, npr., oralno, nazalno, rektalno, intravaginalno, sublingvalno, submukozno ili transdermalno. Poželjno, primena je parenteralna, npr., preko intravenozne ili intraperitonealne injekcije, i takođe uključujući, ali bez ograničenja na, intra-arterijsku, intramuskularnu, intradermalnu i subkutanu primenu.

Za druge načine primene, kao što je primenom perfuzata, injekcije u organ, ili druge lokalne primene, biće obezbeđena farmaceutska kompozicija koja ima za rezultat slične nivoe jedinjenja kao što je ovde opisano, koje nastaje iz inventivnog postupka. Poželjan je nivo od oko 0.01 pM -30 nM.

Farmaceutske kompozicije kao što su ovde opisane, koje su rezultat inventivnog postupka mogu da sadrže terapeutski efikasnu količinu jedinjenja, i farmaceutski prihvatljiv nosač. U naročitoj varijanti, termin "farmaceutski prihvatljiv" označava odobren od strane kontrolne agencije Federalne ili savezne Vlade ili naveden u U.S. Farmakopeji ili opšte priznatoj farmakopeji za primenu na životinjama, i naročito na ljudima. Termin "nosač" označava razblaživač, adjuvant, inertni punilac, ili nosač sa kojim se primenjuje terapeutsko sredstvo. Takvi farmaceutski nosači mogu biti sterilne tečnosti, kao što su rastvori soli u vodi ili ulja, uključujući ona od nafte, životinjskog, biljnog ili sintetičkog porekla, kao što je ulje od kikirikija, sojino ulje, mineralno ulje, sezamovo ulje i slično. Rastvor soli je poželjno nosač kada se farmaceutska kompozicija primenjuje intravenozno. Rastvori soli i vodeni rastvori dekstroze i glicerola takođe se mogu koristiti kao tečni nosači, naročito za injektabilne rastvore. Pogodni farmaceutski inertni punioci obuhvataju škrob, glukozu, laktozu, saharozu, želatin, slad, pirinač, brašno, kredu, silika gel, natrijum stearat, glicerol monostearat, talk, natrijum hlorid, suvo obrano mleko, glicerol, propilen, glikol, vodu, etanol i slično. Kompozicija, ako je poželjno, može takođe da sadrži manje količine sredstava za vlaženje ili emulgatora, ili puferujućih sredstava. Ove kompozicije mogu da budu u obliku rastvora, suspenzija, emulzija, tableta, pilula, kapsula, praškova, formulacija sa produženim oslobađanjem i slično. Kompozicija može biti formulisana kao supozitorija, sa uobičajenim vezujućim sredstvima i nosačima kao što su trigliceridi. Jedinjenja prema pronalasku mogu biti formulisana kao neutralni ili oblici soli. Farmaceutski prihvatljive soli obuhvataju one koje su formirane sa slobodnim amino grupama kao što su one izvedene od hlorovodonične, fosforne, sirćetne, oksalne, vinske kiseline, itd., i one formirane sa slobodnim karboksil grupama kao što su one izvedene od natrijum, kalijum, amonijum, kalcijum. gvožđe (III) hidroksida, izopropilamina, trietilamina, 2-etilamino etanola, histidina, prokaina, itd. Primeri pogodnih farmaceutskih nosača su opisani u "Remington's Pharmaceutical Sciences" by E.W. Martin. Takve kompozicije će sadržati terapeutski efikasnu količinu jedinjenja, poželjno u prečišćenom obliku, zajedno sa pogodnom količinom nosača tako da se obezbedi oblik za pogodnu primenu na pacijenta. Formulacija bi trebalo da odgovara načinu primene.

Farmaceutske kompozicije prilagođene za oralnu primenu mogu biti obezbeđene kao kapsule ili tablete; kao praškovi ili granule; kao rastvori, sirupi ili suspenzije (u vodi ili ne-vodenim tečnostima); kao jestive pene ili kao emulzije. Tablete ili tvrde želatinozne kapsule mogu da sadrže laktozu, škrob ili njihove derivate, magnezijum stearat, natrijum saharin, celulozu, magnezijum karbonat, stearinsku kiselinu ili njene soli. Mekane želatinozne kapsule mogu da sadrže biljna ulja, voskove, masti, polu-čvrste ili tečne poliole itd. Rastvori i sirupi mogu da sadrže vodu, poliole i šećere.

Aktivno sredstvo namenjeno za oralnu primenu može biti obloženo sa ili pomešano sa materijalom koje odlaže razlaganje i/ili apsorpciju aktivnog sredstva u gastrointestinalnom traktu (npr., mogu se koristiti gliceril monostearat ili gliceril distearat). Na taj način, produženo oslobađanje aktivnog sredstva može se postići tokom većeg broja časova i, ako je neophodno, aktivno sredstvo može biti zaštićeno od razgradnje unutar želudca. Farmaceutske kompozicije za oralnu primenu mogu biti formulisane tako da olakšaju oslobađanje aktivnog sredstva na određenom mestu u gastrointestinalnom traktu kao posledica specifične pH vrednosti ili enzimatskih uslova.

Farmaceutske kompozicije prilagođene za transdermalnu primenu mogu biti obezbeđene kao posebni flasteri namenjeni da ostanu u bliskom kontaktu sa epidermisom primaoca tokom dužeg vremenskog perioda. Farmaceutske kompozicije prilagođene za topikalnu primenu mogu biti obezbeđene kao masti, kreme, suspenzije, losioni, praškovi. rastvori, paste, gelovi, sprejevi, aerosolovi ili ulja. Za topikalnu primenu na kožu. usta, oko ili druga spoljšanja tkiva, poželjno se koristi topikalna mast ili krema. Kada je formulisan u masti, aktivni sastojak se može koristititi sa bazom masti koja je ili parafinska ili koja se meša sa vodom. Alternativno, aktivni sastojak može biti formulisan u kremi sa bazom ulje-u-vodi ili voda-u-ulju. Farmaceutske kompozicije prilagođene za topikalnu primenu na oko obuhvataju kapi za oči. U ovim kompozicijama, aktivni sastojak može biti rastvoren ili suspendovan u pogodnom nosaču, npr., u vodenom rastvaraču. Farmaceutske kompozicije prilagođene za topikalnu primenu u ustima obuhvataju lozenge, pastile i tečnosti za ispiranje usta.

Farmaceutske kompozicije prilagođene za nazalnu i plućnu primenu mogu da sadrže čvrste nosače kao što su praškovi (koji poželjno imaju veličinu čestica u opsegu od 20 do 500 mikrona). Praškovi se mogu primenjivati na način gde se on ušmrkava, tj., brzim udisanjem kroz nos iz kontejnera praška koji se drži blizu nosa. Alternativno, kompozicije prilagođene za nazalnu primenu mogu da sadrže tečne nosače, npr.. nazalne sprejeve ili nazalne kapi. Alternativno, inhalacija direktno u pluća se može postići dubokim udisanjem ili instalacijom kroz adapter za usta u ždrelo. Ove kompozicije mogu da sadrže vodene ili uljane rastvore aktivnog sastojka. Kompozicije za primenu inhalacijom mogu biti snabdevene u specijalno prilagođenim uređajima uključujući, ali bez ograničenja na, aerosolove pod pritiskom, nebulizatore ili insuflatore, koji mogu biti konstruisani tako da obezbede unapred određene doze aktivnog sastojka. U poželjnom aspektu, farmaceutske kompozicije se primenjuju u nazalnu šupljinu direktno ili u pluća preko nazalne šupljine ili ždrela.

Farmaceutske kompozicije prilagođene za rektalnu primenu mogu biti obezbeđene kao supozitorije ili klistiri. Farmaceutske kompozicije prilagođene za vaginalnu primenu mogu biti obezbeđene kao materični ulošci, tamponi, kreme, gelovi, paste, pene ili sprej formulacije.

Farmaceutske kompozicije prilagođene za parenteralnu primenu obuhvataju vodene i nevodene sterilne injektabilne rastvore ili suspenzije, koje mogu da sadrže antioksidante, pufere, bakteriostate, i rastvorene supstance koje čine kompozicije značajno izotoničnim sa krvlju određenog primaoca. Druge komponente koje mogu biti prisutne u takvim kompozicijama obuhvataju vodu, alkohole, poliole, glicerin i biljna ulja, na primer. Kompozicije prilagođene za parenteralnu primenu mogu biti predstavljene u kontejnerima za jednu dozu ili za višestruke doze, na primer hermetički zatvorene ampule i bočice, i mogu biti čuvane u stanju osušenom zamrzavanjem (liofilizovanom) za koje je potrebno samo dodavanje sterilnog tečnog nosača, npr., sterilnog rastvora soli za injekcije, neposredno pre primene. Ekstemporalni rastvori i suspenzije za injekcije mogu biti pripremljeni od sterilnih praškova, granula i tableta. U jednom aspektu, autoinjektor koji sadrži injektabilni rastvor jedinjenja kao što je ovde opisano, koje nastaje iz inventivnog postupka, može biti obezbeđen za primenu u hitnim slučajevima u ambulantama, hitnoj službi i na ratištu, i čak za samostalnu primenu u kućnim uslovima, naročito u slučajevima gde postoji mogućnost za pojavu traumatske amputacije, kao što je neoprezna upotreba kosačice. Verovatnoća da će ćelije i tkiva u povređenom stopalu ili nožnom prstu preživeti posle ponovnog vezivanja može biti povećana primenom jedinjenja kao što je ovde opisano, koje nastaje iz inventivnog postupka, na višestruka mesta u povređenom delu što je pre moguće, čak pre dolaska medicinskog osoblja na mesto nesreće, ili dolaska povređene osobe sa pogođenim nožnim prstom u sobu za hitne slučajeve.

U poželjnom aspektu, kompozicija je formulisana u skladu sa rutinskim postupcima kao farmaceutska kompozicija prilagođena za intravenoznu primenu na ljude. Tipično, kompozicije za intravenoznu primenu su rastvori u sterilnom izotoničnom vodenom puferu. Tamo gde je neophodno, kompozicija može takođe da obuhvata sredstvo za povećanje rastvorljivosti i lokalni anestetik kao što je lidokain za olakšavanje bola na mestu injekcije. Generalno, sastojci se snabdevaju ili posebno ili pomešani zajedno u obliku jedinične doze, na primer, kao suvi liofilizovani prašak ili koncentrat bez vode u hermetički zatvorenom kontejneru kao što je ampula ili kesica na kojoj je naznačena količina aktivnog sredstva. Tamo gde se kompozicija primenjuje infuzijom, ona se može raspršiti pomoću infuzione bočice koja sadrži sterilnu vodu ili slani rastvor po farmaceutskom standardu. Tamo gde se kompozicija primenjuje injekcijom, ampula sterilnog slanog rastvora može biti obezbeđena tako da se sastojci mogu pomešati pre primene.

Supozitorije generalno sadrže aktivni sastojak u opsegu od 0.5% do 10 tež.%; oralne formulacije poželjno sadrže 10% do 95% aktivnog sastojka.

Kompozicija perfuzata može biti obezbeđena za primenu u kadicama za transplantirani organ, zain situperfuziju, ili za primenu na vaskularne strukture davaoca organa pre uzimanja organa. Takve farmaceutske kompozicije mogu da sadrže nivoe jedinjenja kao što je opisano ovde, koje nastaje iz inventivnog postupka, nisu pogodne za akutnu ili hroničnu, lokalnu ili sistemsku primenu na osobu, ali će služiti funkcijama koje su ovde određene kod leša, kadice za organe, perfuzat organa, iliin situpefuzat pre uklanjanja ili smanjenja nivoa jedinjenja kao stoje ovde opisano, koje nastaje iz inventivnog postupka koji je ovde sadržan, pre izlaganja ili vraćanja tretiranog organa ili tkiva u regularnu cirkulaciju.

Takođe je opisano farmaceutsko pakovanje ili komplet koji sadrži jedan ili više kontejnera napunjenih sa jednim ili više sastojaka farmaceutskih kompozicija. Izborno, takvim kontejnerom (kontejnerima) može biti povezano obaveštenje u obliku koji je propisan od strane državne agencije za regulisanje proizvodnje, primene ili prodaje farmaceutskih sredstava ili bioloških proizvoda, gde to obaveštenje prikazuje odobrenje od strane agencije za proizvodnju, primenu ili prodaju za humanu primenu.

U sledećem aspektu, na primer, jedinjenje kao Što je ovde opisano, koje nastaje iz inventivnog postupka, može se primeniti u sistemu sa kontrolisanim oslobađanjem. Na primer, polipeptid se može primenjivati upotrebom intravenozne infuzije, osmotske pumpe koja se može implantirati, transdermalnog flastera, lipozoma ili drugih načina primene. U jednom aspektu, može se koristiti pumpa (videti Langer, supra; Sefton, 1987, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14: 201; Buchvvald et al., 1980, Surgery 88: 507; Saudek et al., 1989, N. Engl. J. Med. 321: 574). U sledećem aspektu, jedinjenje se može primenjivati u vezikuli, naročito lipozomu (videti Langer, Science 249: 1527-1533 (1990); Treat et al., in Liposomes in the Therapv of Infectious Disease and Cancer, Lope-Berestein and Fidler (eds.), Liss, New York, pp. 353-365 (1989); WO 91/04014; U.S. Patent No. 4,704,355; Lopez-Berestein, ibid., pp. 317-327; videti generalno na istom mestu). U sledećoj varijanti, mogu se koristiti polimerni materijali (videti Medical Applications of Controlled Release, Langer and Wise (eds.), CRC Press: Boca Raton, Florida, 1974; Controlled Drug Bioavailabilitv, Drug Product Design and Performance, Smolen and Bali (eds.), Wiley: Nevv York (1984); Ranger and Peppas, J. Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23: 61, 1953; videti takođe Levy et al., 1985, Science 228: 190; During et al., 1989, Ann. Neurol. 25: 351; Hovvard et al., 1989, J. Neurosurg. 71: 105).

U sledećem aspektu, sistem sa kontrolisanim oslobađanjem može biti postavljen u blizinu mesta na koje se terapeutski deluje, tj., ciljnih ćelija, tkiva ili organa, na taj način zahtevajući samo frakciju sistemske doze (videti, npr., Goodson, pp. 115-138 in Medical Applications of Controlled Release, vol. 2, supra, 1984). Drugi sistemi sa kontrolisanim oslobađanjem su razmatrani u prikazu koji je dao Langer (1990, Science 249: 1527-1533).

U sledećem aspektu, jedinjenje kao što je ovde opisano, koje nastaje iz inventivnog postupka, kao prikladno formulisano, može se primenjivati nazalnom, oralnom, rektalnom, vaginalnom ili sublingvalnom primenom.

U naročitom aspektu, može biti poželjno primenjivati kompozicije lokalno na površinu kojoj je potreban tretman; ovo se može postići preko, na primer, i bez ograničenja na, lokalne infuzije tokom operacije, topikalne primene, npr., zajedno sa zavojem za rane posle operacije, injekcijom, preko katetera, pomoću supozitorije, ili pomoću implanta, pri čemu je navedeni implant od poroznog, ne-poroznog ili želatinoznog materijala, uključujući membrane, kao što su membrane od sintetičke silikozne gume, ili vlakna.

Izbor poželjne efikasne doze biće određen od strane stručnjaka iz date oblasti tehnike na osnovu razmatranja nekoliko faktora koji će biti poznati stručnjaku iz date oblasti. Takvi faktori obuhvataju naročiti oblik jedinjenja kao što je ovde opisano, koji nastaje iz inventivnog postupka, i njegove farmakokinetičke parametre kao što su biodostupnost, metabolizam, polu-život, itd.. koji će biti uspostavljeni u toku uobičajenih razvojnih postupaka koji se tipično koriste za dobijanje regulatomog odobrenja za farmaceutsko jedinjenje. Dodatni faktori koji se razmatraju kod doze obuhvataju stanje ili bolest koja se leči ili korist koja će se postići kod normalne osobe, telesnu masu pacijenta, način primene, da li je primena akutna ili hronična, prateće lekove, i druge faktore za koje je dobro poznato da postižu efikasnost primenjenih farmaceutskih sredstava. Na taj način, trebalo bi odrediti tačnu dozu prema mišljenju lekara i okolnostima vezanim za svakog pacijenta pojedinačno, npr., u zavisnosti od stanja i imunog statusa pojedinačnog pacijenta, i prema standardnim kliničkim tehnikama.

U sledećem aspektu, perfuzat ili perfuzioni rastvor je obezbeđen za perfuziju i čuvanje organa za transplantaciju, gde perfuzioni rastvor sadrži količinu jedinjenja kao što je ovde opisano, koje nastaje iz inventivnog postupka, koja je efikasna za zaštitu osetljivih ćelija i sa njima povezanih ćelija, tkiva ili organa. Transplant obuhvata, ali bez ograničenja na, ksenotransplantaciju, gde se organ (uključujući ćelije, tkivo ili druge delove tela) uzima od jednog davaoca i transplantira u drugog primaoca: i autotransplant, gde se organ uzima od jednog dela tela i menja za drugi, uključujući hirurške postupke, gde se organ može ukloniti, i dok jeex vivo,organ će se resecirati, popraviti, ili će se na drugi način manipulisati njime, kao što je za uklanjanje tumora, i zatim se vraća na njegovo originalno mesto. U jednom aspektu, perfuzioni rastvor je Universitv of VVisconsin (U W) rastvor (U.S. Patent br. 4,798,824) koji sadrži od oko 1 do oko 25 U/ml eritropoetina, 5% hidroksietil škroba (koji ima molekularnu težinu od oko 200,000 do oko 300,000 i značajno je bez etilen glikola, etilen hlorohidrina, natrijum hlorida i acetona); 25 mM KH2PO4; 3 mM glutation; 5 mM adenozin; 10 mM glukoza; 10 mM HEPES pufer; 5 mM magnezijum glukonat; 1.5 mM CaCE; 10 mM natrijum glukonat; 200,000 jedinica penicilina; 40 jedinica insulina; 16 mg deksametazona; 12 mg fenol crvenog; i ima pH vrednost od 7.4-7.5 i osmolarnost od oko 320 mOSm/1. Rastvor se koristi za održavanje bubrega i pankresa iz preminule osobe pre transplantacije. Primenom rastvora, čuvanje se može produžiti preko granice od 30 časova koja se preporučuje za čuvanje bubrega iz umrle osobe. Ovaj naročiti perfuzat je samo ilustracija određenog broja takvih rastvora koji se mogu prilagoditi za predstavljenu primenu uključenjem efikasne količine jedinjenja kao što je ovde opisano, koje nastaje iz inventivnog postupka. U sledećem aspektu, perfuzatni rastvor sadrži od oko 0.01 pg/ml do oko 400 ng/ml jedinjenja prema pronalasku, ili od oko 40 do oko 300 ng/ml jedinjenja kao što je ovde opisano, koje nastaje iz inventivnog postupka.

Dok je poželjni primalac jedinjenja kao što je ovde opisano, koje nastaje iz inventivnog postupka, za svrhe koje su ovde navedene - čovek, postupci koji su ovde dati se generalno odnose jednako i na druge sisare, naročito domaće životinje, životinje koje se gaje na farmama, prateće životinje i životinje u zoološkim vrtovima. Međutim, pronalazak nije tako ograničavajući i njegove koristi se mogu odnositi na bilo kog sisara.

TERAPEUTSKE 1 PREVENTIVNE PRIMENE OVDE PREDSTAVLJENIH JEDINJENJA

Kao što je navedeno u Primeru 1 u daljem tekstu, prisustvo receptora za eritropoetin na endotelu kapilara u mozgu čoveka ukazuje na to da su ciljna mesta delovanja za jedinjenja kao što su ovde opisana, koja nastaju iz inventivnog postupka, prisutna u ljudskom mozgu, i da se ispitivanja na životinjama o ovim jedinjenjima kao što su ovde opisana, koja nastaju iz inventivnog postupka, direktno mogu preneti na lečenje ili prevenciju ljudi.

U sledećem aspektu, postupci i kompozicije za povećanje vijabilnosti ćelija, tkiva ili organa koji nisu izolovani od vaskularnog sistema endotelnom ćelijskom barijerom obezbeđeni su izlaganjem ćelija, tkiva ili organa direktno farmaceutskoj kompoziciji koja sadrži jedinjenje kao što je ovde opisano, koje nastaje iz postupka prema pronalasku, ili primenom ili dovođenjem u kontakt sa jedinjenjem kao što je ovde opisano, koje nastaje iz inventivnog postupka, sadržanog u farmaceutskoj kompoziciji, sa vaskularnim sistemom tkiva ili organa. Povećana aktivnost osetljivih ćelija u tretiranom tkivu ili organu je odgovorna za ispoljene pozitivne efekte.

Kao što je opisano u prethodnom tekstu, predstavljeni opis je zasnovan, delimično, na otkriću da se molekuli eritropoetina mogu transportovati od površine lumena do površine bazalne membrane endotelijalnih ćelija kapilara organa sa čvrstom vezom endotelijalnih ćelija, uključujući, na primer, mozak, mrežnjaču i testis. Na taj način, osetljive ćelije preko barijere su prijemčiva ciljna mesta za korisne efekte jedinjenja kao što je ovde opisano, koje nastaje iz inventivnog postupka, i drugi ćelijski tipovi ili tkiva ili organi koji sadrže i u potpunosti ili delimično zavise od osetljivih ćelija sadržanih u njima su ciljna mesta za predstavljene postupke. Dok ne želimo da se vežemo za bilo koju naročitu teoriju, posle transcitoze jedinjenja kao što je ovde opisano, koje nastaje iz inventivnog postupka, jedinjenje kao što je ovde opisano, koje nastaje iz inventivnog postupka može da interaguje sa receptorom za eritropoetin na osetljivoj ćeliji, na primer, nervnoj ćeliji, ćeliji mrežnjače, mišićnoj ćeliji, ćeliji srca, pluća, jetre, bubega, tankog creva, korteksa nadbubrežne žlezde, medule nadbubrežne žlezde, endotela kapilara, testisa, jajnika, pankreasa, kosti, kože, ili endometrijalnoj ćeliji, i vezivanje za receptor može da započne kaskadu prenosa signala koja ima za rezultat aktivaciju programa genske ekspresije unutar osetljive ćelije ili tkiva, što ima za rezultat zaštitu ćelije, tkiva ili organa od oštećenja, kao što je toksinima, hemoterapeutskim sredstvima, radijacionom terapijom, hipoksijom, itd. Na taj način, postupci za zaštitu tkiva koje sadrži osetljive ćelije od povrede ili hipoksičnog stresa, i povećanje funkcije takvog tkiva su detaljno opisani u daljem tekstu. Kao što je navedeno u prethodnom tekstu, postupci su jednako primenljivi na ljude kao i na druge životinje.

U izvođenju jednog aspekta sisarski pacijent je podvrgnut sistemskoj hemoterapiji za lečenje kancera, uključujući radijacionu terapiju, koja obično ima štetne efekte kao što su oštećenje nerava, pluća, srca, jajnika ili testisa. Primena farmaceutske kompozicije koja sadrži jedinjenje kao što je opisano ovde, koje nastaje iz inventivnog postupka kao što je opisan u prethodnom tekstu, izvodi se pre i tokom hemoterapije i/ili radijacione terapije, za zaštitu različitih tkiva i organa od oštećenja hemoterapeutskim sredstvom, kao što je zaštita testisa. Tretman može biti nastavljen sve dok nivoi hemoterapeutskog sredstva u cirkulaciji ne padnu ispod nivoa potencijalne opasnosti za telo sisara.

U izvođenju sledećeg aspekta, planirano je da se različiti organi uzimaju od žrtve automobilske nesreće za transplantaciju u određen broj primaoca, za neke od kojih je potreban transport na veća rastojanja i duži vremenski period. Pre uzimanja organa, žrtvi je vršena infuzija farmaceutske kompozicije koja sadrži jedinjenje kao što je ovde opisano, koje nastaje iz inventivnog postupka kao što je ovde opisan. Uzeti organi za prevoz su perfuzionisani perfuzatom koji sadrži jedinjenje kao što je ovde opisano, i čuvani u kadici koja sadrži jedinjenje kao što je ovde opisano, koje nastaje iz inventivnog postupka. Određeni organi su kontinuirano perfuzionisani sa pulsirajućim perfuzionim uređajem, korišćenjem perfuzata koji sadrži jedinjenje. Minimalno pogoršanje funkcije organa javlja se tokom transporta i posle implantacije i reperfuzije organain silu.

U sledećem aspektu, za hiruršku proceduru za popravku srčanog zaliska potrebna je privremena kardioplegija i okluzija arterija. Pre operacije, pacijent je primio infuziju od 4 u.g jedinjenja na kg telesne težine. Takav tretman sprečava hipoksično ishemično ćelijsko oštećenje, naročito posle reperfuzije.

U sledećem aspektu, u svakom hirurškom postupku, kao što je u operaciji kardiopulmonarnog bajpasa, može se koristiti jedinjenje kao što je ovde opisano, koje nastaje iz inventivnog postupka. U jednoj varijanti, primena farmaceutske kompozicije koja sadrži jedinjenje kao što je ovde opisano, koje nastaje iz inventivnog postupka kao što je ovde opisan, izvodi se pre, tokom i/ili posle bajpas procedure, za zaštitu funkcije mozga, srca i drugih organa.

U prethodno navedenim primerima u kojima se jedinjenje kao što je ovde opisano, koje nastaje iz inventivnog postupka koristi zaex vivoprimene, ili za tretman osetljivih ćelija kao što su ćelije nervnih tkiva, tkiva mrežnjače, srca, pluća, jetre, bubrega, tankog creva, korteksa nadbubrežne žlezde, medule nadbubrežne žlezde, kapilarne endotelijalne, testisa, jajnika ili endometrijalne ćelije ili tkivo, obezbeđena je farmaceutska kompozicija u obliku jedinične doze prilagođena za zaštitu ili jačanje osetljivih ćelija, tkiva ili organa distalno u odnosu na vaskularni sistem koji sadrži, po jedinici doze, efikasnu ne-toksičnu količinu unutar opsega od oko 0.01 pg do 5 mg, 1 pg do 5 mg, 500 pg do 5 mg. 1 ng do 5 mg, 500 ng do 5 mg, 1 ?g do 5 mg, 500 pg do 5mg, ili 1 mg do 5 mg jedinjenja prema pronalasku i farmaceutski prihvatljiv nosač. U poželjnom aspektu, količina jedinjenja kao što je ovde opisano, koje nastaje iz inventivnog postupka je unutar opsega od oko 1 ng do 5mg.

U sledećem aspektu, nađeno je da primena EPO obnavlja kognitivnu funkciju kod životinja koje su imale traumu mozga. Jedinjenja kao što su ovde opisana, koja nastaju iz inventivnog postupka, očekivalo bi se da imaju iste ćelijske zaštitne efekte kao EPO. Posle odlaganja od ili 5 dana ili 30 dana, EPO je još uvek sposoban da obnovi funkciju u poređenju sa životinjama tretiranim kontrolom, što ukazuje na sposobnost EPO da regeneriše ili obnovi aktivnost mozga. Na taj način, opis je takođe usmeren na primenu jedinjenja kao što je ovde opisano, koje nastaje iz inventivnog postupka za pripremu farmaceutske kompozicije za lečenje traume mozga i drugih kognitivnih disfunkcija, uključujući tretman dosta vremena posle povrede (npr., tri dana, pet dana, nedelja, mesec, ili duže). Opis je takođe usmeren na postupak za lečenje kognitivne disfunkcije posle povrede primenom efikasne količine jedinjenja kao što je ovde opisano, koje nastaje iz inventivnog postupka. Svako jedinjenje kao što je ovde opisano, koje nastaje iz inventivnog postupka kao što je ovde opisan može se koristiti za ovaj aspekt.

Pored toga, ovaj obnavljajući aspekt je usmeren na primenu bilo kog od jedinjenja kao što su ovde opisana, koja nastaju iz invetivnog postupka za pripremu farmaceutske kompozicije za obnavljanje ćelijske, tkivne ili organske disfunkcije, pri čemu se tretman započinje posle, i dosta vremena posle, početne povrede koja je odgovorna za disfunkciju. Pored toga, tretman primenom jedinjenja kao što je ovde opisano, koje nastaje iz inventivnog postupka, može da obuhvati ceo tok bolesti ili stanja tokom akutne faze kao i hronične faze.

U slučaju gde jedinjenje ima eritropoeznu aktivnost, jedinjenje se može primenjivati sistemski u dozi između oko 1 ug i oko 100 ug/kg telesne težine, poželjno oko 5-50 ug/kg telesne težine, najpoželjnije oko 10-30 ug/kg telesne težine, po primeni. Ova efikasna doza bi trebalo da bude dovoljna da se postignu nivoi jedinjenja u serumu veći od oko 10,000, 15,000 ili 20,000 mU/ml seruma posle primene jedinjenja. Takvi nivoi u serumu se mogu postići na oko 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ili 10 časova posle primene. Takve doze se mogu ponavljati ako je neophodno. Na primer, primena se može ponavljati dnevno, sve dok je to klinički neophodno, ili posle odgovarajućeg intervala, npr., svakih 1 do 12 nedelja, ali poželjno, svake 1 do 3 nedelje. Efikasna količina jedinjenja i farmaceutski prihvatljiv nosač mogu biti pakovani u bočici ili kontejneru za jednu dozu. Jedinjenje kao što je ovde opisano, koje nastaje iz inventivnog postupka, je međutim, ne-eritropoezno, tj., sposobno je da ispoljava aktivnosti opisane ovde bez uzrokovanja povećanja koncentracije hemoglobina ili hematokrita. Takvo ne-eritropoezno jedinjenje je naročito poželjno u slučajevima gde su postupci namenjeni za hroničnu primenu. U sledećem aspektu, jedinjenje kao što je ovde opisano, koje nastaje iz inventivnog postupka, se daje u dozi većoj od odgovarajuće doze (tež./tež.) prirodnog eritropoetina koja bi bila neophodna da maksimalno stimuliše eritropoezu. Kao što je navedeno u prethodnom tekstu, jedinjenje kao što je ovde opisano, koje nastaje iz inventivnog postupka, nema eritropoeznu aktivnost, i prema tome prethodno navedene doze izražene u jedinicama su samo primeri za odgovarajuće količine prirodnog eritropoetina; u prethodnom tekstu su dati molarni ekvivalenti za doze koji su primenljivi na svako jedinjenje prema pronalasku.

PRIMERI

Predstavljeni pronalazak se može bolje razumeti u vezi sa sledećim neograničavajućim primerima, koji su dati kao primeri pronalaska. Sledeći primeri su predstavljeni u cilju potpunijeg ilustrovanja poželjnih varijanti pronalaska. Oni, ni na koji način ne bi trebalo da budu protumačeni, međutim, kao ograničavajući u odnosu na obim pronalaska.

Primer 1

Proizvodnja karbamilovanog eritropoetina

Početni materijal postupka u ovom primeru je prečišćeni rekombinantni humani EPO.

Prvo je koncentracija proteina podešena ultrafiltracijom za svrhe održavanja niske zapremine postupka. Koncentracija proteina je podešena do 3 mg/ml. Ultrafiltracija je izvedena pomoću BioMax (Millipore) sa MWCO od 5 kDa.

Posle završetka koraka koncentrovanja, rastvor EPO je pomešan sa 0.5 M K-borat tetrahidrata, 0.5 M K-cijanata, na pH vrednosti 9.0 rastvor je inkubiran na 32°C, 24 časa.

Odsoljavanje reakcione smeše EPO i cijanata je izvedeno gel filtracijom. Protein je odsoljavan u 25 mM Tris, 50 mM NaCl pH 8.5 puferu. Korišćena je G-25 Fine (Amersham Biosciences) smola.

Primenom protoka od 90 cm/h na približno 15 cm visokoj koloni nanošen je uzorak od približno 20% zapremine kolone.

Odsoljen karbamilovan EPO je sakupljen za dalju obradu.

• Na ovoj tački, sadržaj polimera/agregata bio je 7.3%.

Sledeći korak je uklanjanje agregata i polimera izveden korakom prečišćavanja primenom anjonske izmene. SOURCE 30Q (Amersham Biosciences) smola je korišćena za prečišćavanje. Približno 4.5 mg/ml karbamilovanog EPO je naneto na kolonu. Pufer za razdvajanje - A je bio: 25 mM Tris, 50 mM NaCl pH 8.5, i elucioni pufer je bio B: 25 mM Tris, 1 M NaCl pH 8.5. Gradijent je izveden sa 0-30% peko zapremina 20 kolona, glavni pik karbamilovanog EPO je sakupljen i udružen.

Udruženi materijal iz koraka prečišćavanja je podešen do koncentracije > 0.5 mg/ml i pufer je promenjen u 20 mM citrat, 100 mM NaCl pufer primenom dia/ultrafiltracione tangencijalne protočne filtracione jedinice. Koncentrovanje i puferska izmena su izvedeni na 0.1 m<2>BioMax (Millipore) sa MWCO od 5 kDa.

Konačno, prečišćeni lek je bio 0.22 pm filtriran primenom Millipak filtera (Millipore) da bi smanjio broj mikroorganizama.

Postupak je dao karbamilovani EPO sa osobinama koje ga čine korisnim kao biofarmaceutsko sredstvo;

• Sadržaj polimera/agregataje bio 0.5% kao što je određeno pomoću SEC-HPLC

• Karbamilovani lizini su bili 100% kao što je određeno aminokiselinskom analizom

• koncentracija je bila > 0.5 mg/ml

Izvedena je karakterizacija primenom MALDI-TOF za određivanje promene u intaktnoj masi kako PNGazom tretiranog proteina i za protein sa N-glikanima. Pored toga, MALDI-TOF analiza jedinstvene mase peptida/LC-MS/MS je izvedena na sledeći način: 1. CEPO i EPO su prečišćeni na POROS Rl koloni (POROS Rl materijal za reverzno faznu kolonu, PerSeptive Biosvstems (1-1259-06)). Materijal za kolonu je čuvan u 50% HiPerSolv za HPLC VWR 152525R pre primene. Rl kolona je ekvilibrisana i isprana u 5% mravljoj kiselini (33015, Riedl de Haen). Uzorci su eluirani iz kolone sa Agilent rastvorom matriksa MALDI HCCA kvaliteta (G2037A). Intaktna masa je određena analizom na Bruker Retlex IV MALDI-TOF instrumentu. 2. 0.3 pmol CEPO i/ili EPO jc tretirano preko noći sa I jedinicom PNGaze F i PNGaze F/O-glikozidaze. Ukupna masa je određivana primenom MALDI-TOF. 3. CEPO i EPO (L5 pmol) su redukovani u rastvoru sa 50 ul 10 mM DTT, 50 mM NH4CO3i zatim alkilovani u 50 ul 55 mM jodoacetamida. 50 mM NH4CO3. Uzorci su prečišćeni na POROS Rl koloni pre razlaganja tripsinom. Frakcija razloženog uzorka je prečišćena na POROS R2 kolonama pre MALDI-TOF analize (POROS 50 R2 PerSeptive Biosvstems (1-1159-05)). R2 kolona je ekvilibrisana i isprana u 0.1% trifluorosirćetnoj kiselini (99+% spektrometrijski stepen, Aldrich 3 02031-100 ml). Uzorci su eluirani iz kolone sa Agilent rastvorom matriksa MALDI HCCA kvaliteta (G2037A). Grupa peptida dobijenih razlaganjem tripsinom je tretirana sa PNGazom F i prečišćena preko POROS R2 kolona, i okarakterisana pomoću MALDI-TOF. 4. CEPO i EPO su redukovani u rastvoru sa DTT i alkilovani sa jodoacetamidom. Uzorci su prečišćeni na POROS Rl koloni pre Glu-C razlaganja. Frakcija razloženog uzorka je prečišćena na POROS R2 kolonama pre MALDI-TOF analize. Grupa peptida dobijena Glu-C razlaganjem je tretirana PNGazom F i prečišćena preko POROS R2 kolona. 5. Da bi se izbegla mogućnost od pojave delimično karbamilovanog CEPO, intaktni EPO i CEPO su razloženi sa Lys-C. Uzorci su analizirani primenom MALDI-TOF.

Zaključak je bio da su 8 lizina i N-terminus bili karbamilovani. Druge karbamilovane aminokiseline nisu detektovane i nisu detektovane modifikacije glikana.

Reference:

Opšta identifikacija proteina pomoćuMS:

Mann M, Hojrup P, Roepstorff P. (1993) Use of mass spectrometric molecular weight information to identify proteins in sequence databases, Biol Mass Spectrom 22, 338-345

Yates, J R, Speicher S, Griffin P R, Hunkapiller T. (1993) Peptide mass rnaps: a highly informative approach to protein identification. Anal Biochem 214, 397-408

Intaktnamasa:

Laugesen S, Roepstorff P. (2003) Combination of two matrices results in improved performance of MALDI MS for peptide mass mapping and protein analvsis. J Am Soc Mass Spectrom. 14 (9), 992-1002.

Izvod:

Larsen MR, Hojrup P, Roepstorff P. (2005) Characterization of gel-separated glvcoproteins using two-step proteolvtic digestion combined with sequential microcolumns and mass spectrometry. Mol Cell Proteomics. 4 (2), 107-19

Dodatna ispitivanja su izvedena za određivanje stepena i homogenosti karbamilacije EPO, specifičnosti karbamilacije i identiteta karbamilacionih mesta, i prisustva potencijalnih nespecifičnih modifikacija kao posledice sporednih reakcija postupka karbamilacije i prečišćavanja. Uzorci su analizirani analizom ukupne mase deglikozilovanih proteinskih uzoraka i peptidnim mapiranjem primenom endoproteaza LysC i tripsina za razgradnju i LC/MS analize za peptidnu procenu.

Primer 2

Analiza ukupnemase

Analiza je izvedena na tri EPO uzorka karbamilovana korišćenjem postupka iz Primera 1. Sva tri uzorka su prečišćena posle reakcije karbamilacije primenom jonske izmene, kao što je opisano u primeru 1. Jedan od CEPO uzoraka (označen kao CEPO-CMC) je pripremljen pomoću CMC Biotech, sa produkcione skale od 1 grama (koncentracija: 0.82 mg/ml; pufer: 20 mM Na-citrat, 0.3 mM limunska kiselina, 0.1 M NaCl, pH 6.9-7.3). Preostala dva uzorka, označena kao CEPO-1 i CEPO-2, su pripremljena od laboratorijske produkcione skale od 70 mg (koncentracija: 1.1 mg/ml; pufer: 25 mM Tris, 0.2.M NaCl. pH 8.3-8.7). Ovi CEPO uzorci su upoređivani sa nemodifikovanim ili početnim EPO (koncentracija: 0.82 mg/ml; pufer: 2 mM Na-citrat, 0.3mM limunska kiselina. 0.1 NaCl, pH 6.9-7.3) i imitacija CEPO (EPO koji je prošao kroz postupak karbamilacije bez dodavanja K-cijanata) (koncentracija: 0.38 mg/ml; pufer: 20mM Na-citrat, 0.3 mM limunska kiselina, 0.1 M NaCl, pH 6.9-7.3 ).

ESI- masena s<p>ektrometrija

Pre analize ukupne mase, uzorci su enzimatski deglikozilovani. Svaki uzorak je inkubiran preko noći sa 50 pg N-glikozidaze F (Prozvme from Glyko), rekombinantne neuraminidazeiz A. ureafaciensi O-glikozidaze na koncentraciji proteina od 0.5 mg/ml. Da li je reakcija deglikozilacije završena, proveravano je pomoću SDS-PAGE punjenjem 3 pg svakog uzorka na 12% Tris-glicin gelove. Preostali materijal od svakog uzorka je korišćen za masenu analizu.

Deglikozilovani uzorci su dovedeni do koncentracije od 4-5 M guanidinijum hidrohlorida dodavanjem odgovarajuće zapremine osnovnog rastvora guanidinijum hidrohlorida i zatim su odsoljeni u pufer koji sadrži 2% mravlju kiselinu i 40% acetonitril. Guanidinijum hidrohlorid je dodat u cilju osiguranja visokog dobitka deglikozilovanog EPO i CEPO za masenu spektrometrijsku analizu. Merenje mase je izvedeno sa VVaters ESIQ-Tof-ili VVaters ESl-LCT-masenim spektrometrom obezbeđenim sa ESI-nanosprej izvorom jonizacije. Procena rezultata je izvedena automatskom dekonvolucijom i manuelnom procenom specifičnih pikova od interesa pomoću Mass Lynx 4.0 softvera. Kvantitativno određivanje relativnih odnosa različito karbamilovanih CEPO vrsta je izvedeno izračunavanjem relativnih odnosa na osnovu intenziteta signala zabeleženih u m/z spektru.

Deglikozilacija uzoraka imala je za rezultat da su N-vezani šećeri potpuno uklonjeni. Međutim, oslobađanje O-vezanih šećera je bilo nepotpuno, naročito za CEPO uzorke.

Kao što je očekivano, kao posledica karbamilacije, uzorci CEPO su pokazali različite masene spektre u poređenju sa uzorcima EPO i imitacije CEPO. Kao što je prikazano u Tabeli 2, dekonvolucija spektara imala je za rezultat mase za glavne pikove kao što je teoretski očekivano za različite uzorke. U svim CEPO uzorcima, nađeni su samo visoko karbamilovani CEPO molekuli, sa glavnom izoformom koja je potpuno karbamilovana izoforma sa potpunom karbamilacijom 8 lizina i N-terminusa, tj., 9 karbamil ostataka. CEPO uzorci su pokazali heterogenost po tome što sadrže dodatne izoforme koje odgovaraju 8, 10 i 11 karbamil ostataka vezanih za CEPO. Vrste koje sadrže 8 karbamil ostataka bi bile označene kao premalo-karbamilovane, kojima nedostaje najmanje jedan karbamil ostatak. Vrste sa 10 i

11 karbamil ostataka bi bile označene kao prekomerno-karbamilovane, gde bi dodatni vezani karbamil ostaci bili vezani na ne-specifičan način za aminokisclinu osim lizina. Postojali su manji signali u spektru svih uzoraka, ali nijedan nije smatran ne-specifično modifikovanom vrstom. Neki od manjih signala su nađeni i u EPO i u CEPO uzorcima i smatraju se zagađenjem koje je već prisutno u početnom EPO.

Tabela 3 prikazuje relativne odnose različitih izoformi. Premalo-karbamilovani CEPO je u opsegu od oko 1.5 do 5.5% ukupnog CEPO u zavisnosti od uzorka i prekomerno-karbamilovani CEPO je u ospegu od oko 11 do 22% u zavisnosti od uzorka. CEPO-1 i CEPO-2 imaju slične raspodele izoformi, dok CEPO-CMC ima manje premalo-karbamilovanih vrsta u poređenju sa druga dva uzorka. Različite produkcione skale daju proizvode sa različitom raspodelom, ali kao što Tabela 3 prikazuje za laboratorijsku produkcionu skalu, proizvodnja može biti ponavljana sa sličnim ishodom. Kao što jc razmatrano ranije, na bilo kojoj produkcionoj skali, raspodela može biti podešena podešavanjem udruživanja iz anjonsko izmenjivačke kolone.

Brojevi u Tabeli 3 predstavljaju minimalan odnos premalo- i prekomerno-karbamilovanog CEPO. Razlog za ovo je što stepen karbamilacije (8-puta do 11-puta) ne mora da odredi tačan stepen premalo, potpuno ili prekomerno-karbamilovanog CEPO. Na primer, molekul CEPO koji sadrži 8 karbamil ostataka kao što je određeno masenom analizom može imati samo 7 karbamil grupe specifično vezane za lizine i preostali karbamil ostatak bi bio ne-specifično vezana druga aminokiselina. Ova situacija bi se smatrala samo kao premalo-karbamilovan, čak iako postoje ne-specifično vezane karbamil grupe. Obrnuto. CEPO molekul koji sadrži 10 karbamil ostataka mogao se vezati za samo 8 ostataka specifično i dva su vezana ne-specifično. U ovoj situaciji, CEPO izoforma se smatra samo prekomerno karbamilovanom, čak iako svi lizini nisu karbamilovani.

Primer 3

LysC Peptidno mapiranje

Analiza peptidnog mapiranja EPO i CEPO uzoraka izvedena je primenom endopeptidaza LysC i tripsina za fragmentaciju. Sve analize peptidnog mapiranja su izvedene sa deglikozilovanim peptidima. Enzimatska deglikozilacija peptida je izvedena istovremeno sa razlaganjem sa endoproteazom.

EPO i CEPO uzorci (oko 150 ug svaki) su denaturisani i redukovani inkubacijom sa guanidinijum hidrohloridom i DTT. Slobodne sulfhidril grupe su alkilovane sa jodosirćetnom kiselinom. Alkilovani uzorci su odsoljeni i pufer je izmenjen u odgovarajući pufer primenom gel filtracionih kolona za jednokratnu upotrebu.

Endoproteaza, N-glikozidaza i neuraminidaza su dodati istovremeno u uzorke alkilovanog EPO i CEPO. Uzorci su inkubirani preko noći na 37°C. Posle inkubacije, oko 5 pg svakog proizvoda razlaganja korišćeno je za RP-HPLC/MS analizu primenom Jupiter, Cl 8 RP-kolone iz Phenomenix spojene za ESI-LCT iz VVaters. Beleženi su UV signal na 220 nM i ukupan broj jona (TIC) u masenom spektrometru. Za identifikaciju i kvantitativno određivanje dobijenih peptida, procenjivan je TIC.

Zbog toga što LysC ne bi bio sposoban da razloži karbamilovane lizine, očekivalo bi se da se ne bi formirali fragmenti razlaganjem sa LysC ako su svi lizini karbamilovani, što ukazuje na specifičnost karbamilacije. U slučaju premale-karbamilacije, trebali bi se formirati specifični fragmenti CEPO. U Tabeli 4 navedeni su fragmenti teorijski formirani od LvsC razlaganja za EPO, potpuno i prekomerno-karbamilovani CEPO i premalo-karbamilovani

CEPO.

Kao što je očekivano, LysC peptidni obrasci dobijeni za EPO i CEPO uzorke razložene sa LysC bili su potpuno različiti. Razlaganje početnog EPO i imitacije CEPO sa LysC imalo je za rezultat peptidni obrazac kao što je očekivan. U oba uzorka, svi peptidi Kl do K9 bi mogli biti identifikovani. Peptidi K5 i Kl su delimično razloženi na nespecifičan način, u EPO i u imitaciji CEPO. Nisu se mogli identifikovati značajni dodatni pikovi, kao ni pikovi koji nedostaju u LysC mapi imitacije CEPO u poređenju sa početnim EPO. Iz ovih podataka, može se zaključiti da se nijedna značajna ne-specifična kovalentna modifikacija EPO proteina nije javila u toku postupka karbamilacije i prečišćavanja.

Peptidne mape CEPO uzoraka imale su različiti peptidni obrazac od početnog EPO. Postojao je jedan glavni pik i nekoliko manjih pikova. Kao stoje prikazano u Tabeli 5, mase dobijene iz pikova u dobroj su korelaciji sa masama koje su očekivane bilo za nerazloženi CEPO ili za fragmente iz LysC razdvajanja premalo-karbamilovanog CEPO. Glavni pik (A) sadržao je intaktni, deglikozilovani, potpuno karbamilovani CEPO (9 x karbamila) i prekomerno-karbamilovani CEPO (10 x karbamila) (Tabela 5). Četiri manja pika (B-E) sadržala su premalo-karbamilovani CEPO (8 x karbamila), sa različitim pikovima koji sadrže premalo-karbamilovani CEPO koji nije karbamilovan na određenim lizinima. Pikovi B i C su sadržali premalo-karbamilovani CEPO kome specifično nedostaje karbamilacija na Lys45, dok pikovi D i E sadrže premalo-karbamilovani CEPO kome specifično nedostaje karbamilacija na Lys97 (Tabela 5).

Postojale su izvesne razlike u relativnim odnosima pikova za različite uzorke CEPO. CEPO uzorci 1 i 2 imali su izraženije pikove D i E od CEPO-CMC, što ukazuje na to da su oni sadržali više premalo-karbamilovanih CEPO vrsta.

Bilo je teško kvantitativno odrediti manje pikove kao povezane sa glavnim pikom kao posledica tehničkih ograničenja. Međutim, primena površina pikova iz UV-detekcije kao gruba naznaka za relativne odnose različitih vrsta, može se proceniti da premalo-karbamilovani CEPO može da čini manje od 10% CEPO izoformi u uzorcima i da CEPO-1 i CEPO-2 imaju dvostruko veću količinu premalo-karbamilovanih izoformi od CEPO-CMC. Primenom istog postupka kao što je korišćen za analizu ukupne mase, kvantitativno određivanje prekomerno-karbamilovanih vrsta lociranih u piku A bilo je oko 21% za CEPO-CMC i 12% za CEPO-1 i CEPO-2.

Ukupno, podaci iz LysC peptidnog mapiranja su u skladu sa analizom ukupne mase opisanoj u Primeru 2. CEPO-CMC je sadržao manje premalo-karbamilovanih CEPO izoformi dok su CEPO-1 i CEPO-2 sadržali više prekomerno-karbamilovanih CEPO izoformi. Ovo peptidno mapiranje takođe je ukazalo na to da lizin 45 i lizin 97 mogu da predstavljaju mesta premale-karbamilacije.

Primer 4

Tripsin peptidno mapiranje

Razlaganje uzorka primenom tripsina opisano je u Primeru 3.

Razlaganje EPO i imitacije CEPO tripsinom imalo je za rezultat peptidni obrazac kao što je očekivano. U oba uzorka, većina peptida (TI do T21) kao što je očekivano za razgradnju tripsinom mogla bi biti identifikovana, osim nekih malih di- i tripeptida (kao stoje T21). Videti Tabelu 6. Kao što je bio slučaj sa LysC razlaganjem, nije bilo značajnih dodatnih pikova niti su pikovi nedostajali iz imitacije CEPO, u porcđenju sa početnim EPO. Iz ovih rezultata, zaključeno je da nije bilo ne-specifičnih kovalentnih modifikacija EPO proteina u toku postupka karbamilacije i prečišćavanja.

Peptidni obrasci CEPO uzoraka su se razlikovali od nemodifikovanog EPO. Tripsin normalno razdvaja na lizinu i argininu, na taj način bi se očekivalo da u slučaju potpuno karbamilovanog EPO samo fragmentacija bi se javila razdvajanjem arginina. Na taj način, pošto je peptidni obrazac dobijen sa tripsinom, specifična karbamilaciona mesta i nespecifično karbamilovani peptidi bi se mogli identifikovati. Peptidi koji su očekivani iz razlaganja tripsinom CEPO molekula koje predpostavlja razdvajanje samo na argininima (R) navedeni su u Tabeli 6. CEPO (pretpostavlja se razdvajanje samo na Arg (R) kao posledica potpune karbamilacije)

Svi peptidi očekivani iz razlaganja tripsinom su identifikovani kao glavni pikovi u svim CEPO uzorcima, sa izuzetkom C-terminalnog peptida R13. Ovaj peptid takođe nije nađen u početnom EPO ili imitaciji CEPO. Pikovi Rl do R12 koji su rezultat specifičnog razdvajanja samo arginina čine veliku količinu peptida detektovanih u CEPO uzorcima. Pored toga, svi peptidi koji sadrže lizin su detektovani skoro isključivo u potpuno karbamilovanom obliku. Ovi podaci ukazuju na visok stepen specifične karbamilacije na lizinima i N-terminusu.

Pored glavnog peptida, šest manjih peptida su takođe detektovani u svim CEPO uzorcima. Tri od manjih peptida su identifikovani analizom mase kao rezultat razlaganja tripsinom prekomerno-karbamilovanog CEPO i preostala tri su nastala od premalo-karbamilovanog CEPO.

U Tabeli 7 navedeni su svi peptidi identifikovani u triptinskim mapama tri analizirana CEPO uzorka. Visoko brojni peptidi, Rl do R12, formirani od potpuno i specifično karbamilovanog EPO su napisani običnim slovima, ispravno karbamilovani EPO je dodatno označen masnim slovima. Peptidi koji su najverovatnije formirani razdvajanjem premalo-karbamilovanog CEPO su označeni u italik slovima i peptidi formirani razdvajanjem prekomerno-karbamilovanog CEPO su označeni podvučenim slovima.

U vezi sa Tabelom 7, manji pikovi T9 i T10 koji sadrže peptide R6_al i R6_bl, redom, najverovatnije se izvode iz razlaganja premalo-karbamilovanih CEPO molekula, koji nisu karbamilovani na Lys97. Peptid R4 bl+lxkarb. je formiran ako Lys45 aminokiselina nije karbamilovana. Peptid R6_al (pik T9) je češći u CEPO-1 i CEPO-2 uzorcima od CEPO-CMC, što ukazuje na to da on može imati dvostruku količinu premalo-karbamilovanog CEPO. Peptidi R6_bl i R4_bl + lxkarb. su prisutni u jednakim količinama u svim CEPO uzorcima.

Izračunavanje relativnog sadržaja premalo-karbamilovanog CEPO iz ovih podataka je bilo teško zbog tehničkih ograničenja. Međutim, uzimajući sva zapažanja zajedno, procenjeno je da je premalo-karbamilovanih vrsta bilo oko 10% kao što je izvedeno iz analize ukupne mase i LysC peptidnog mapiranja.

Tri druga manja peptida koja su koeluirana sa drugim peptidima su interpretirana preko mase - da sadrže jedan dodatni karbamil ostatak, tj., prekomemo-karbamilovani CEPO. Peptidi R10_2xkarb. i R7_lxkarb. su detektovani u tragovima, gde je nađeno da R12_3xkarb. ima značajne intenzitete signala. CEPO-CMC je imao dva puta veći sadržaj prekomerno-karbamilovanih CEPO vrsta kao CEPO-1 i CEPO-2. Ovo je u skladu sa rezultatima iz analize ukupne mase. Iz ovih rezultata takođe može biti zaključeno daje aminokiselinska sekvenca 151-62 EPO mesto za nespecifičnu karbamilaciju.

Ponovo, iz istih razloga kao sa kvantitativnim određivanjem premalo-karbamilovanih vrsta, kvantitativno određivanje prekomerno-karbamilovanih vrsta je bilo teško. Međutim, uz pretpostavku da je efikasnost jonizacije peptida slična i da se razlikuje u stepenu karbamilacije, ona je izračunavana preko relativnog broja jona R12-derivata daje oko 3-7% CEPO prekomerno-karbamilovanih vrsta. Ovo je niže od količine prekomerno-karbamilovanih izoformi izračunate preko analize ukupne mase.

Uopšteno, slede zaključci iz analize ukupne mase i rezultata peptidnog mapiranja EPO i CEPO.

Iz analize ukupne mase, CEPO uzorci su izgleda karbamilovani do prilično visokog stepena. Oko 95-98% svih molekula su potpuno karbamilovani i sadrže najmanje 9 karbamil ostataka (videti Tabelu 3). Mapiranje pomoću LvsC i tripsina potvrđuju visok stepen karbamilacije na specifičnim mestima i da su najverovatnije preko 95% CEPO molekula potpuno karbamilovani na 8 lizina i N-terminusu.

Rezultati takođe pokazuju da je nađeno četiri izoforme CEPO. Vrste sa 8, 9, 10 i 11 karbamil ostataka su detektovane u analiziranim CEPO uzorcima, sa 9 karbamil izoformi koje su dominantne vrste. Manji deo CEPO molekula sadržao je 8 karbamil ostataka umesto 9 i smatra se premalo-karbamilovanim. Za CEPO-1 i CEPO-2 ove izoforme su bile oko 5% od ukupne količine i za CEPO-CMC, ova izoforma čini oko 1.5% ukupnih CEPO molekula.

Značajniji deo CEPO molekula je prekomerno-karbamilovan, tj., sadrži 10 ili 11 karbamil ostataka. Prekomerno-karbamilovani CEPO je u opsegu od oko 11% za EPO-1 i CEPO-2 do oko 22% u CEPO-CMC.

Rezultati iz peptidnog mapiranja pokazuju visok stepen specifičnosti karbamilacije na 8 lizina i N-terminusu. Pored toga, peptidno mapiranje generalno potvrđuje rezultate analize ukupne mase. Najmanje oko 90-95%> CEPO molekula je izgleda specifično modifikovano sa karbamil ostacima na svim lizinima i N-terminusu. Međutim, ovi rezultati takođe pokazuju premalo- i prekomerno-karbamilovane CEPO vrste. Kao posledica određenih tehničkih ograničenja, tačan odnos premalo-karbamilovanih vrsta se teško određuje, ali procenjeno je da je u opsegu do oko 10% što je u skladu sa brojevima nađenim u analizi ukupne mase. Pored toga, dva posebna položaja na EPO, Lys45 i Lys97, su identifikovani kao oni gde će se najverovatnije pojaviti nedostatak karbamilacije.

U obe grupe peptidnog mapiranja, takođe su nađene prekomerno-karbamilovane vrste. Ponovo, zbog tehničkih ograničenja, bilo je teško odrediti tačnu količinu prekomerno-karbamilovanih vrsta. Iz dobijenih rezultata, moglo bi se špekulisati da je premalo prekomerno-karbamilovanih vrsta detektovano u peptidnom mapiranju. Samo jedna trećina do jedna polovina količine prekomerno-karbamilovanih vrsta je identifikovana peptidnim mapiranjem u poređenju sa analizom ukupne mase. Razumno objašnjenje za ovo neslaganje je da nisu svi prekomerno-karbamilovani peptidi identifikovani ili da nisu identifikovani u tačnoj količini. U LysC mapi, nerazložene CEPO vrste koje sadrže 10 karbamil ostataka su detektovane u značajnim količinama i u tripsinskom mapiranju detektovana su tri peptida koja sadrže jedan dodatni karbamil ostatak. Dva od ovih fragmenata su detektovani samo u tragovima. Treći peptid, CEPO aminokiselina 152-162, blizu C-terminusa, izgleda da čini jednu trećinu prekomerno-karbamilovanih vrsta i može biti mesto za ne-specifičnu karbamilaciju u EPO.

Nikakve značajne količine drugih ne-specifičnih (nevezanih za karbamil) modifikacija nisu detektovane u CEPO uzorcima ili u uzorcima imitacije CEPO bilo kojom izvedenom analizom.

Claims (76)

1. Postupak za proizvodnju karbamilovanog proteina eritropoetina koji ima manje od oko 40% nagomilanog proteina i manje od oko 40 tež.% prekomerno- i premalo-karbamilovanog proteina kao što je mereno pomoću ESI-masene spektrometrije, naznačen time što taj postupak sadrži dovođenje u kontakt količine eritropoetina sa količinom cijanata na temperaturi, pH vrednosti, i tokom vremenskog perioda koji su dovoljni da amino grupe na lizinima i N-terminalne aminokiseline eritropoetina postanu najmanje oko 90% karbamilovane.

2. Postupak prema patentnom zahtevu 1, naznačen time što je karbamilovani protein eritropoetin humani eritropoetin.

3. Postupak prema patentnom zahtevu 1, naznačen time što karbamilovani protein eritropoetin ima manje od oko 30% nagomilanog proteina.

4. Postupak prema patentnom zahtevu 1, naznačen time što karbamilovani protein eritropoetin ima manje od oko 20% nagomilanog proteina.

5. Postupak prema patentnom zahtevu 1. naznačen time što karbamilovani protein eritropoetin ima manje od oko 10%> nagomilanog proteina.

6. Postupak prema patentnom zahtevu 1, naznačen time što karbamilovani protein eritropoetin ima manje od oko 30 tež.% prekomerno- i premalo-karbamilovanog proteina.

7. Postupak prema patentnom zahtevu 1, naznačen time što karbamilovani protein eritropoetin ima manje od oko 20 tež.% prekomerno- i premalo-karbamilovanog proteina.

8. Postupak prema patentnom zahtevu 1, naznačen time što karbamilovani protein eritropoetin ima manje odo oko 10 tež.% prekomerno- i premalo-karbamilovanog proteina.

9. Postupak prema patentnom zahtevu 1. naznačen time što karbamilovani protein eritropoetin ima manje od oko 30 tež.% prekomerno karbamilovanog proteina.

10. Postupak prema patentnom zahtevu 1, naznačen time što karbamilovani protein eritropoetin ima manje od oko 20 tež.% prekomerno karbalimovanog proteina.

11. Postupak prema patentnom zahtevu 1, naznačen time što karbamilovani protein eritropoetin ima manje od oko 10 tež.% prekomerno karbamilovanog proteina.

12. Postupak prema patentnom zahtevu 1, naznačen time što je koncentracija proteina eritropoetina koja je dovedena u kontakt sa cijanatom od oko 0.05 mg/ml do oko 10 mg /ml.

13. Postupak prema patentnom zahtevu 1, naznačen time što je koncentracija proteina eritropoetina koja je dovedena u kontakt sa cijanatom oko 2 mg/ml do oko 5 mg/ml.

14. Postupak prema patentnom zahtevu 1, naznačen time što je koncentracija cijanata od oko 0.05 M do oko 10 M.

15. Postupak prema patentnom zahtevu 1, naznačen time što je koncentracija cijanata od oko 0.05 M do oko 2 M.

16. Postupak prema patentnom zahtevu 1, naznačen time što je temperatura u opsegu od oko 0°C do oko 60°C.

17. Postupak prema patentnom zahtevu 1, naznačen time stoje temperatura u opsegu od oko 30°C do oko 34°C.

18. Postupak prema patentnom zahtevu 1, naznačen time što je pH vrednost od oko 7 do oko 11.

19. Postupak prema patentnom zahtevu 1, naznačen time što je pH vrednost od oko 8 do oko 10.

20. Postupak prema patentnom zahtevu 1, naznačen time što je vremenski period od oko 10 minuta do oko 30 dana.

21. Postupak prema patentnom zahtevu 1, naznačen time što je vremenski period od oko 1 časa do oko 5 dana.

22. Postupak prema patentnom zahtevu 1. naznačen time što je protein eritropoetin doveden u kontakt sa cijanatom u prisustvu pufera.

23. Postupak prema patentnom zahtevu 22, naznačen time što je pufer borat.

24. Postupak prema patentnom zahtevu 22, naznačen time što je koncentracija pufera od oko 0.05 M do oko 2 M.

25. Postupak prema patentnom zahtevu 22, naznačen time što je koncentracija pufera od oko 0.1 Mdo oko 1 M.

26. Postupak prema patentnom zahtevu 22, naznačen time što je koncentracija pufera oko 0.5M.

27. Postupak prema patentnom zahtevu 1, naznačen time što je koncentracija proteina eritropoetina koji je u kontaktu sa cijanatom od oko 0.05 mg/ml do oko 10 mg/ml, koncentracija cijanata je od oko 0.05 M do oko 10 M, temperatura je u opsegu od oko 0°C do oko 60°C, pH vrednost je od oko 7 do oko 11, i vreme je od oko 10 minuta do trideset dana.

28. Postupak prema patentnom zahtevu 1. naznačen time što je koncentracija proteina eritropoetina koji je u kontaktu sa cijanatom od oko 2 mg/ml do oko 5 mg/ml, koncentracija cijanata je od oko 0.05 M do oko 2 M, temperatura je u opsegu od oko 30°C do oko 34°C, pH vrednost je od oko 8 do oko 10, i vreme je od oko 1 časa do 5 dana.

29. Postupak prema patentnom zahtevu 1, naznačen time što je koncentracija proteina eritropoetina koji je u kontaktu sa cijanatom od oko 3 mg/ml, koncentracija cijanata je oko 0.5 M, temperatura je oko 32°C, pH vrednost je oko 9.0. i vremenski period je oko 24 časa.

30. Postupak za proizvodnju karbamilovanog proteina eritropoetina koji ima manje od oko 3% nagomilanog proteina i manje od oko 40 tež.% prekomerno- i premalo-karbamilovanog proteina kao što je mereno pomoću ESI-masene spektrometrije, naznačen time što sadrži prečišćavanje karbamilovanog eritropoetina primenom anjonske izmene, katjonske izmene, hromatografije zasnovane na hidrofobnim interakcijama, reverzno fazne hromatografije, afmitetne hromatografije ili ekskluzione hromatografije.

31. Postupak prema patentnom zahtevu 30, naznačen time što je karbamilovani protein eritropoetin humani eritropoetin.

32. Postupak prema patentnom zahtevu 30, naznačen time što je najmanje oko 90% amino ostataka na lizinima i N-terminalnoj aminokiselini eritropoetina karbamilovano.

33. Postupak prema patentnom zahtevu 30, naznačen time što karbamilovani protein eritropoetin ima manje od oko 2.5% nagomilanog proteina.

34. Postupak prema patentnom zahtevu 30, naznačen time što karbamilovani protein eritropoetin ima oko 0.5% ili manje nagomilanog proteina.

35. Postupak prema patentnom zahtevu 30, naznačen time što karbamilovani protein eritropoetin ima manje od oko 30 tež.% prekomerno- i premalo-karbamilovanog proteina.

36. Postupak prema patentnom zahtevu 30, naznačen time što karbamilovani protein eritropoetin ima manje od oko 20 tež.% prekomerno- i premalo-karbamilovanog proteina.

37. Postupak prema patentnom zahtevu 30, naznačen time što karbamilovani protein eritropoetin ima manje od oko 10 tež.% prekomerno i premalo karbamilovanog proteina.

38. Postupak prema patentnom zahtevu 30. naznačen time što karbamilovani protein eritropoetin ima manje od oko 30 tež.% prekomerno karbamilovanog proteina.

39. Postupak prema patentnom zahtevu 30, naznačen time što karbamilovani protein eritropoetin ima manje od oko 20 tež.% prekomerno-karbamilovanog proteina.

40. Postupak prema patentnom zahtevu 30, naznačen time što karbamilovani protein eritropoetin ima manje od oko 10 tež.% prekomerno karbamilovanog proteina.

41. Postupak za proizvodnju karbamilovanog proteina eritropoetina koji ima manje odo oko 3% nagomilanog proteina i manje od oko 40 tež.% prekomerno- i premalo-karbamilovanog proteina kao što je meeno pomoću ESI masene spektrometrije, naznačen time što taj postupak sadrži: (a) dovođenje u kontakt proteina eritropoetina sa količinom cijanata na temperaturi, pH vrednost, i tokom vremenskog perioda kojis u dovoljni da najmanje oko 90% amino ostataka na lizinu i N-terminalnim aminokiselinama eritropoetina postane karbamilovano; i (b) prečišćavanje karbamilovanog proteina eritropoetina primenom anjonske izmene, katjonske izmene, hromatografije zasnovane na hidrofobnim interakcijama, reverzno fazne hromatografije, afmitetne hromatografije ili ekskluzione hromatografije.

42. Postupak prema patentnom zahtevu 41, naznačen time što je karbamilovani protein eritropoetin humani eritropoetin.

43. Postupak prema patentnom zahtevu 41, naznačen time što karbamilovani protein eritropoetin ima manje od oko 2.5% nagomilanog proteina.

44. Postupak prema patentnom zahtevu 41, naznačen time što karbamilovani protein eritropoetin ima oko 0.5% ili manje nagomilanog proteina.

45. Postupak prema patentnom zahtevu 41, naznačen time što karbamilovani protein eritropoetin ima manje od oko 30 tež.% prekomerno- i premalo-karbamilovanog proteina.

46. Postupak prema patentnom zahtevu 41, naznačen time što karbamilovani protein eritropoetin ima manje od oko 20 tež.% prekomerno- i premalo-karbamilovanog proteina.

47. Postupak prema patentnom zahtevu 41, naznačen time što karbamilovani protein eritropoetin ima manje od oko 10 tež.% prekomerno- i premalo-karbamilovanog proteina.

48. Postupak prema patentnom zahtevu 41, naznačen time što karbamilovani protein eritropoetin ima manje od oko 30 tež.% prekomerno karbamilovanog proteina.

49. Postupak prema patentnom zahtevu 41, naznačen time što karbamilovani protein eritropoetin ima manje od oko 20 tež.% prekomerno karbamilovanog proteina.

50. Postupak prema patentnom zahtevu 41, naznačen time što karbamilovani protein eritropoetin ima manje od oko 10 tež.% prekomerno karbamilovanog proteina.

51. Postupak prema patentnom zahtevu 41, naznačen time što je koncentracija proteina eritropoetina koja je dovedena u kontakt sa cijanatom od oko 0.05 mg/ml do oko 10 mg/ml.

52. Postupak prema patentnom zahtevu 41, naznačen time što je koncentracija proteina eritropoetina koja je dovedena u kontakt sa cijanatom od oko 2 mg/ml do oko 5 mg/ml.

53. Postupak prema patentnom zahtevu 41, naznačen time što je koncentracija proteina eritropoetina koja je dovedena u kontakt sa cijanatom oko 3 mg/ml.

54. Postupak prema patentnom zahtevu 41, naznačen time što je koncentracija cijanata od oko 0.05 M do oko 10 M.

55. Postupak prema patentnom zahtevu 41, naznačen time što je koncentracija cijanata od oko 0.05 M do oko 2 M.

56. Postupak prema patentnom zahtevu 41, naznačen time što je koncentracija cijanata oko 0.5 M.

57. Postupak prema patentnom zahtevu 41, naznačen time što je temperatura u opsegu od oko 0°C do oko 60°C.

58. Postupak prema patentnom zahtevu 41, naznačen time što je temperatura u opsegu od oko 30°C do oko 34°C.

59. Postupak prema patentnom zahtevu 41, naznačen time što je temperatura oko 32°C.

60. Postupak prema patentnom zahtevu 41, naznačen time što je pH vrednost od oko 7 do oko 11.

61. Postupak prema patentnom zahtevu 41, naznačen time što je pH vrednost od oko 8 do oko 10.

62. Postupak prema patentnom zahtevu 41, naznačen time što je pH vrednost oko 9.

63. Postupak prema patentnom zahtevu 41, naznačen time što je vremenski period od oko 10 minuta do oko 30 dana.

64. Postupak prema patentnom zahtevu 41, naznačen time što je vremenski period od oko 1 časa do oko 5 dana.

65. Postupak prema patentnom zahtevu 41, naznačen time što je vremenski period od oko 24 časa.

66. Postupak prema patentnom zahtevu 41, naznačen time što je protein eritropoetin doveden u kontakt sa cijanatom u prisustvu pufera.

67. Postupak prema patentnom zahtevu 66, naznačen time što je pufer borat.

68. Postupak prema patentnom zahtevu 66, naznačen time što je koncentracija pufera od oko 0.05 M do oko 2 M.

69. Postupak prema patentnom zahtevu 66, naznačen time što je koncentracija pufera od oko 0.1 M do oko 1 M.

70. Postupak prema patentnom zahtevu 66, naznačen time što je koncentracija pufera oko 0.5M.

71. Postupak prema patentnom zahtevu 41, naznačen time što je koncentracija proteina eritropoetina koja je dovedena u kontakt sa cijanatom od oko 0.05 mg/ml do oko 10 mg/ml, koncentracija cijanata je od oko 0.05 M do oko 10 M, temperatura je u opsegu od oko 0°C do oko 60°C, pH vrednost je od oko 7 do oko 11, i vremnski period je od oko 10 minuta do trideset dana.

72. Postupak prema patentnom zahtevu 41. naznačen time što je koncentracija proteina eritropoetina koja je dovedena u kontakt sa cijanatom od oko 2 mg/ml do oko 5 mg/ml, koncentracija cijanata je od oko 0.05 M do oko 2 M, temperatura je u opsegu od oko 30°C do oko 34°C, pH vrednost je od oko 8 do oko 10, i vremenski period je od oko 1 časa do 5 dana.

73. Postupak prema patentnom zahtevu 34, naznačen time što je koncentracija proteina eritropoetina koji je u kontaktu sa cijanatom od oko 3 mg/ml, koncentracija cijanata je oko 0.5 M, temperatura je oko 32°C, pH vrednost je oko 9.0, i vremenski period je oko 24 časa.

74. Postupak za proizvodnju karbamilovanog proteina eritropoetina koji ima manje od oko 40% nagomilanog proteina i manje od oko 40 tež.% prekomerno- i premalo-karbamilovanog proteina, naznačen time što taj postupak sadrži dovođenje u kontakt količine eritropoetina sa količinom cijanata na temperaturi, pH vrednosti, i tokom vremenskog perioda koji su dovoljni da amino grupe na lizinima i N-terminalnim aminokiselinama eritropoetina postanu najmanje oko 90% karbamilovane i gde je eritropoetin doveden u kontakt sa cijanatom u prisustvu kalijum borata.

75. Postupak za proizvodnju karbamilovanog proteina eritropoetina koji ima manje od oko 40% nagomilanog proteina i manje od oko 40 tež.% prekomerno- i premalo-karbamilovanog proteina, naznačen time što taj postupak sadrži dovođenje u kontakt količine eritropoetina sa količinom cijanata na temperaturi od 30°C do 34°C, pH vrednosti, i tokom vremenskog perioda koji su dovoljni da amino grupe na lizinima i N-terminalnim aminokiselinama eritropoetina postanu najmanje oko 90% karbamilovane.

76. Postupak za proizvodnju karbamilovanog proteina eritropoetina koji ima manje od oko 40% nagomilanog proteina i manje od oko 40 tež.% prekomerno- i premalo-karbamilovanog proteina, naznačen time što taj postupak sadrži dovođenje u kontakt količine eritropoetina sa količinom cijanata na temperaturi, pH vrednosti, i tokom vremenskog perioda koji su dovoljni da amino grupe na lizinima i N-terminalnim aminokiselinama eritropoetina postanu najmanje oko 90% karbamilovane i gde je karbamilovani protein eritropoetin prečišćen primenom anjonsko izmenjivačke hromatografije uz istovremeno održavanje pH vrednosti pufera za razdvajanje i elucionog pufera na 8.5 ± 0.2.