RS50754B - Upotreba t-kadherina kao ciljnih struktura - Google Patents

Abstract

Rastvorljivi oblik T-kadherina za lečenje metaboličkog pormećaja, što je naznačeno time da je navedeni rastvorljivi oblik odabran iz grupe koja se sastoji od:a) polipeptida koji se sastoji od amino kiselina 23 do 292 iz SEQ ID NO. 1b) polipeptida koji se sastoji od fragmenta najmanje 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600 ili 650 amino kiselina pod (a)c) mutein pod (a) ili (b) što je naznačeno time da je sekvenca amino kiseline najmanje 90%, 95%, 96%, 98% ili 99% identična kao i najmanje jedna sekvenca pod (a) ili (b);d) mutein pod (a) ili (b) koji enkodira nukleinska kiselina koja dovodi do hibridizacije u komplement DNK sekvence koja enkodira (a) ili (b) pod veoma strogim uslovima; ie) mutein pod (a) ili (b) što je naznačeno time da su sve promene u sekvencama amino kiselina konzervativne supstitucije amino kiselina sekvenci amino kiselina pod (a) ili (b).Prijava sadrži još 1 zavisni patentni zahtev.

Description

UPOTREBA T-KADHERINA KAO

CILJNIH STRUKTURA

Polje tehnike

Ovaj pronalazak se odnosi na upotrebu polipeptida T- kadherina za lečenje nekog metaboličkog poremećaja. Metabolički poremećaji koji se mogu lečiti upotrebom modulatora prema ovom pronalasku uključuju, npr., gojaznost, dijabetes tipa II, insulinsku rezistentnost, hiperholesterolemiju, hiperlipidemiju, dislipidemiju, sindrom X, anoreksiju i kaheksiju.

Stanje tehnike

1.T-kadherin

Kadherini čine jednu veliku porodici proteina na ćelijskoj površini koji učestvuju u interakcijama između ćelija i signalizaciji koje su posredovane kalcijumom. Kadherini ispoljavaju specifičnost prema tipu ćelija i razvojnu specifičnost pri ekspresiji i oni su aberentno regulisani kod nekoliko humanih maligniteta (videti npr., Conacci-Sorrell i sar., 2002).

T- kadherin, takođe poznat kao H- kadherin ili kadherin-13, je zakačen za membranu preko GPI veze na C-terminalnom kraju (Tanihara i sar., 1994). U poređenju sa drugim članovima porodice kadherina, T- kadherinu nedostaje transmembranski domen i on se oslobađa sa ćelijske površine kada se ćelije tretiraju fosfatidilinozitol fosfolipazom-C. T- kadherin je inicijalno opisan u nervnom sistemu, ali njegova distribucija u tkivima je šira sa najvećom ekspresijom u kardiovaskularnom sistemu i nižim nivoima u mišićima. U vaskulaturi, on je lokalizovan na intmu mediju i eksprimira se na endotelijalne i ćelije glatkih mišića (Ivanov i sar., 2001).

Na ćelijskoj površini su nađena dva oblika T- kadherina. Jedan od njih, polipeptid od 135 kDa, se čepa u blizini N-terminusa kako bi se formirao drugi 105 kDa oblik (Tkachuk i sar., 1998). Oba oblika proteina se nalaze na ćelijskoj površini, gde mogu da se vezuju za čestice LDL asocijacijom GPI veze sa lipoproteinima (Niermann i sar., 2000).

Iako nema poznatih signalizacionih puteva koji bi uključivali T- kadherin, ukazano je da T-kadherin može da učestvuje u signalizacije svojom asocijacijom sa drugim proteinima membrane i inkorporacijom u specifične lipidne domene ćelijske membrane (Doyle i sar., 1998). Pokazano je da T- kadherin može da reguliše rast ćelija u nervnom sistemu (Takeuchi i sar., 2000). Takođe, T-kadherin suprimira rast astrocita i on je redukovan u ćelijskim lozama glioblastoma (Huang i sar., 2003). Takođe je ukazano da T- kadherin može da učestvuje u kontroli normalne vaskularne arhitekture i njenom remodelovanju tokom aterogeneze (Ivanov i sar., 2001).

US 6358920 otkriva ogroman broj kratkih peptida izvedenih iz više od 20 različitih kadherina. On se samo neznatno bavi lečenjem metaboličkih poremećaja kod dijabetesa i gojaznosti modulacijom agenasa koji čine jedan oktapeptid koji predstavlja sekvencu aminokiseline koja prepoznaje ćelijsku adheziju.

VV099/19477 navodi da ovi peptidi koji se cepaju iz Pro-kadherina dok se prerađuju u odgovarajuće kadherine, predstavljaju takozvane "regione faktora rasta kadherina" (CGFRs) i da se aktivnosti ovih CGFRs mogu koristiti u terapijske svrhe. U tom kontekstu, on otkriva CGFR T-kadherin za lečenje metaboličkog poremećaja. Ovaj CGFR se sastoji od amino kiselina 23-138 of SEQ ID NO: 1.

WO2004/096272 otkriva rastvorljive oblike T- kadherina, što je naznačeno time da su ti rastvorljivi oblici polipeptidi koji se sastoje od fragmenata do 118 amino kiselina jednog polipeptida koji se sastoji od amino kiselina 23 do 692 SEQ ID NO.: 1. On takođe otkiva medicinske primene ovih rastvorljivih oblika kod metaboličkih poremećaja.

2. Gojaznost

2.1.Simptomi

Gojaznost predstavlja nakupljanje prekomerne telesne masti. Težina gojaznosti se određuje merenjem visine i težine. Ova merenja se često pretvaraju u indeks telesne mase (BMI): težina u kilogramima podeljena sa kvadratom visine. Vrednost of 25 do 29.9 ukazuje na prekomernu težinu ili blagu gojaznost a vrednost od 30 ili viša ukazuje na gojaznost i potrebu za tretmanom. U Sjedinjenim Državama, prekomerna težina i gojaznost danas pogađaju više od 50% odraslih, što odražava brzo povećavanje prevalence.

Gojaznost je rezultat konzumiranja više kalorija nego što telo potroši. Genetski i faktori iz životne sredine utiču na telesnu težinu ali precizan način njihove interakcije kako bi odredili težinu neke osobe još uvek nije jasan. Novija istraživanja ukazuju da genetski doprinos iznosi oko 33 procenta telesne težine. Povećanje veličine ili broja masnih ćelija ili oba povećava količinu mati koja se deponuje u telu. Gojazni ljudi, posebno onih koji su postali gojazni u detinjstvu mogu imati i do pet puta više ćelija masti od ljudi sa normalnom težinom. Obzirom da se broj ćelija ne može smanjiti, težina se može smanjiti samo smanjenjem količine masti u svakoj ćeliji.

Akumulacija viška masti ispod dijafragme i u grudnom košu može da dovede do pritiska na pluća dovodeći do otežanog disanja i kratkog daha čak i pri minimalnoj fizičkoj aktivnosti. Otežano disanje može ozbiljno da utiče na spavanje izazivajući kratkotrajne prekide disanja (apneja tokom spavanja), što dovodi do pospanosti tokom dana i drugih komplikacija. Gojaznost može takođe da izazove različite ortopedske probleme, poremećaje kože i oticanje stopala i skočnih zglobova. Teške komplikacije gojaznosti uključuju daleko veći rizik od poremećaja koronarnih arterija kao i njene najvažnije faktore rizika dijabetes tipa II, hiperlipidemiju i hipertenziju. Veliki deo morbiditeta udruženog sa gojaznošću udružen je sa dijabetesom tipa II, obzirom da loše kontrolisan dijabetes i gojaznost dovode do jedne konstelacije simptoma koji su zajedno poznati kao sindrom X, ili metabolički sindrom (videti, npr. Roth i sar., 2002).

2.2. Tretman

Većina programa za kontrolu telesne težine se zasniva na promeni ponašanja. Držanje dijete se obično smatra manje važnim od sprovođenja trajnih promena navika ishrane i fizičke aktivnosti. Lekari sve više prepisuju lekove kao što su orlistat ili sibutramin za smanjenje telesne težine. Takav lek može da smanji telesnu težinu za oko 10% u roku od 6 meseci a izgubljena težina se održava sve dok se lek uzima. Međutim, kada se prekine sa uzimanjem leka težina se brzo vraća pa su dugoročni efekti današnjih tretmana za gojaznost razočaravajući. Iako je postignut značajan napredak kako bi se pomoglo ljudima da oslabe, oni obično vrate izgubljenu težinu u roku od 3 godine. Mnoge ozbiljne komplikacije gojaznosti čine njen tretman važnim a hirurški tretman postaje sve češći kod slučajeva teške gojaznosti.

3. Dijabetes

3.1. Simptomi

Dijabetes je poremećaj kod koga su nivoi glukoze u krvi abnormalno visoki zato što telo ne oslobađa ili ne koristi insulin na adekvatan način. Dijabetes se javlja kada telo ne proizvodi dovoljno insulina kako bi se održao normalna nivo šećera u krvi ili kada ćelije ne reaguju adekvatno na insulin.

Osobe sa dijabetesom tipa I, (insulin-zavisan dijabetes) proizvode malo insulina ili ga uopšte ne proizvode. Iako 6% populacije SAD ima neki oblik dijabetesa, samo oko 10% svih dijabetičara ima dijabetes tipa I. Kod većine ljudi koji imaju dijabetes tipa I ovaj poremećaj se razvio pre 30 godine. Kod dijabetesa tipa I više od 90 % ćelija pankreasa koje proizvode insulin (beta ćelije) su trajno uništene. Posledični nedostatak insulina je težak a da bi preživela, osoba sa dijabetesom tipa I mora redovno da dobija injekcije insulina.

Kod dijabetesa tipa II (insulin nezavisan dijabetes), pankreas nastavlja da proizvodi insulin, ponekad Čak i u količinama višim od normalnih, međutim, telo postaje rezistentno na njegovo dejstvo što dovodi do relativnog nedostatka insulina. Dijabetes tipa II može da se javi kod dece i adolescenata ali obično počinje posle 30 godine i progresivno postaje sve češće sa godinama: oko 15 % ljudi starijih od 70 godina ima dijabetes tipa II. Gojaznost je faktor rizika za dijabetes tipa II, i

80 do 90 % ljudi sa ovim poremećajem je gojazno.

Ostali redi uzroci dijabetesa su abnormalno visoki nivoi kortikosteroida, trudnoća (gestacioni dijabetes), lekovi i otrovi koji uriču na proizvodnju i dejstvo insulina što dovodi do visokog nivoa šećera u krvi.

Osobe sa dijabetesom tipa II ne moraju da imaju nikakve simptome godinama ili decenijama. Kada dođe do progresije nedostatka insulina mogu da se jave simptomi. Povećano

* * v j.. . i _ ^ i ■ 1. _ l _ i * : i: Ukoliko nivo šećera u krvi postane veoma visok (često preko 1,000 mg/dl), kod takve osobe može doći do teške dehidracije koja može da dovede do mentalne konfuzije, ošamućnosti, konvulzija i neketotičke hiperglikemijske-hiperosmolarne kome.

Tokom vremena povišen nivo šećera dovodi do oštećenja krvnih sudova, nerava i drugih unutrašnjih struktura. Složene supstance na bazi šećera se nakupljaju na zidovima malih krvnih sudova, dovodeći do njihovog zadebljavanja i curenja. Usled zadebljanja, oni dovode sve manje i manje krvi, posebno u kožu i nerve. Loša kontrola šećera u krvi takođe može da dovede do povećanja nivoa masnoća u krvi što dovodi do ubrzane aterosklcroze (nagomilavan]a plaka u krvnim sudovima). Ateroskleroza je između dva i šest puta češća kod dijabetičara u odnosu na osobe koje nemaju dijabetes i ona se javlja i kod muškaraca i kod žena. Loša cirkulacija kroz velike i male krvne sudove može da ošteti srce, mozak, noge, oči, bubrege, nerve i kožu i dovodi do usporenog zarastanja rana.

Iz svih ovih razloga kod ljudi sa dijabetesom mogu da se jave mnoge ozbiljne dugoročne komplikacije. Srčani napadi i moždani udari su češći. Oštećenje krvnih sudova u oku može da izazove gubitak vida (dijabetska retinopatija). Može da dođe do disfunkcije bubrega koja će dovesti do bubrežne insuficijenciju koja iziskuje dijalizu. Oštećenje nerava može da se manifestuje na nekoliko načina. Ukoliko dođe do disfunkcije jednog nerva (mononeuropatija), može doći do iznenadne slabosti ruke ili noge. Ukoliko dođe do oštećenja nerava šaka, nogu i stopala (dijabetska polineuropatija), osećaji mogu postati abnormalni i može se javiti osećaj trnjenja ili pečenja praćen bolom u rukama ili nogama. Oštećenje nerava kože povećava verovatnoću ponavljanja povreda zato što takva osoba ne oseća promene pritiska ili temperature. Slabo snabdevanje kože krvlju može takođe da dovede do ulceracija a sve rane sporo zarastaju. Ulceracije na stopalima mogu postati tako duboke i inficirane i da zarastaju toliko sporo da amputacija noge može biti neophodna.

3.2. Tretman

Glavni cilj tretmana dijabetesa je da se nivo šećera u krvi koliko god je to moguće drži unutar normalnog opsega. Potpuno normalne nivoe je teško održavati ali što su oni bliži normalnim vrednostima manja je verovatnoća da će doći do privremenih ili dugoročnih komplikacija. Glavni problem u pokušaju da se dobro kontroliše nivo šećera u krvi je povećana verovatnoća predoziranja što će dovesti do niskih nivoa šećera u krvi (hipoglikemija).

Tretman dijabetesa nalaže da se pažnja posveti kontroli težine, fizičkoj aktivnosti i ishrani. Mnogim gojaznim osobama sa dijabetesom tipa II neće biti potrebni lekovi ukoliko oslabe i redovno se bave fizičkom aktivnošću. Međutim, kako je gore pomenuto, smanjenje težine je teško. Stoga je često potrebna terapija nadoknade insulina ili primena oralnih hipoglikemijskih lekova. Oralni hipoglikemici kao što su glipizid, gliburid, tolbutamid i hlorpropamid mogu neadekvatno da snize nivo šećera u krvi kod osoba sa dijabetesom tipa II stimulišući pankreas da oslobađa insulin i povećavajući njegovu efikasnost. Druga vrsta oralnog leka, metformin, povećava odgovor organizma na svoj sopstveni insulin. Još jedan lek, akarboza, deluje tako što usporava apsorpciju glukoze u tankom crevu. Ukoliko ovi oralni hipoglikemici ne mogu dovoljno dobro da kontrolišu šećer u krvi, neophodna je terapija nadoknade insulina.

Terapija nadoknade insulina se može postići samo svakodnevnim injekcijama insulina i stoga predstavlja težak oblik terapije. Novi oblici insulina, kao što je nazalni sprej se trenutno ispituju. Do danas ovi novi oblici nisu dobro delovali zbog različitih stopa njihove apsorpcije što dovodi do problema sa određivanjem doze.

4. Acrp30

Adipozno tkivo, za koje se već dugo zna da ima sposobnost skladištenja masti, ima važnu ulogu kao izvor jednog broja hormona i parakrinih medijatora, uključujući rezistin, adipsin, leptin, i TNF-a. Zbirno se ovi molekuli nazivaju adipokini, da bi se istakla njihova uloga kao hormona i mesta sinteze. Acrp30, koji se takođe naziva adiponektin ili ApM-1, je jedan od takvih adipokina i njega isključivo proizvodi adipozno tkivo.

Mišji Acrp30 je po prvi put identifikovan 1995. (Scherer i sar., 1995), i pokazano je da dolazi do njegove više neko stostruke uzlazne regulacije tokom diferencijacije adipocita. Humani homolog je identifikovan 1996. (Maeda i sar., 1996). Acip30 sadrži jednu amino-terminalnu signalnu sekvencu, posle koje sledi centralni region koji se sastoji od kolagenih repeticija i jednog karboksil-terminalnog domena sa homologijom sa globularnim komplementnim faktorom Clq. Kako je ovde korišćen, termin "Acrp30" sc odnosi kako na humane tako i na mišje proteine i njihove homologe kod bilo koje druge vrste.

4. 1. Uloga Acrp30 kod gojaznosti i dijabetesa tipa II

Nekoliko studija je dokazalo da je Acrp30 povezan sa gojaznošću i dijabetesom tipa II. Genetske studije su pokazale povezanost dijabetesa tipa II sa nekodiranjem polimorfizama pojedinačnog nukleotida (SNPs) koji se nalaze u Acrp30 genu kod japanskog kohorta pacijenata (Hara i sar., 2002). Dalje je dokazano da su mutacije koje dovode do kodiranja različite amino kiseline koje utiču na globularnu glavu u korelaciju sa serumskim nivoima Acrp30 (Kondo i sar., 2002).

Osim toga, serumski nivoi Acrp30 su smanjeni na nekoliko modela gojaznosti, uključujući miševe sa deficijencijom leptina, miševe sa deficijencijom receptora leptina kao i na modelima majmuna (videti, npr., Hu i sar., 1996; Yamauchi i sar., 2001). U humanim studijama, nivoi Acrp30 su bili u obrnutoj korelaciji kako sa dijabetesom tako i sa gojaznošću a dalje su se smanjivali kod pacijenata sa poremećajima koronarnih arterija (Arita i sar.. 1999). Dodatne dokaze o uzročnoj vezi između smanjenih nivoa Acrp30 i razvoja insulinske rezistentnosti i dijabetesa tipa II dali su Lindsav i sar.. (2002), pokazavši da kod populacije Pima Indijanaca koja je imala niže serumske nivoe Acrp30 postoji veća verovatnoća za razvoj dijabetesa tipa II u odnosu na one sa višim nivoima.

Eksperimenti sa disrupcijom gena dali su dodatne dokaze koji potvrđuju učešće Acrp30 kod gojaznosti i dijabetesa tipa II. Maeda i sar. (2002) o tome da kod homozigotnih miševa sa deficijencijom Acrp30 nije bilo hiperglikemije ukoliko su normalno hranjeni međutim kod njih se ispoljio smanjeni klirens serumskih slobodnih masnih kiselina. Kada su prebačeni na ishranu sa visokim sadržajem masti i visokim sadržajem saharoze, oni su ispoljili tešku insulinsku rezistentnost i kod njih je došlo do povećanog dobijanja na težinu u odnosu na kontrolne životinje.

Osim njegove ključne uloge kod gojaznosti i dijabetesa, pokazano je da Acrp30 igra određenu ulogu kod drugih poremećaja kao što su npr. sindrom policističnog ovarijuma (Panidis i sar., 2003), karcinom endometrijuma (Petridou i sar., 2003), preeklampsija (Ramsav i sar., 2003), masna jetra (Xu i sar., 2003) i nefrotski sindrom (Zoccali i sar., 2003). Takođe je pokazano da Acrp30 ispoljava antiinflamatorna svojstva (Yokota i sar., 2000).

U svetlu gore pomenutih studija, egzogeni Acrp30 predstavlja obećavajuću terapiju za lečenje različitih poremećaja, uključujući metaboličke poremećaje kao što su gojaznost i dijabetes tipa II, ginekološki poremećaji, poremećaji jetre i hronični inflamatorni poremećaji.

4.2. Različite vrste Acrp30

Acrp30 je prisutan u serumu u visokim koncentracijama (5-10 ug/ml) i postoji u više pulova različite prividne molekulske težine (Scherer i sar., 1995).

Strukturu ovih vrsta različite prividne molekulske težine istraživali su Tsao i sar.. (2002, 2003). Kada je eksprimiran kod bakterija kao fuzioni protein pune dužine posle separacije gel-filtracionom hromatografijom, utvrđene su tri vrste Acrp30: heksameri i dve vrste trimera. Studije ekspresije eukariotskih ćelija pokazale su tri vrste Acrp30: vrstu sa visokom molekulskom težinom (HMW), koja nije viđena kod proteina koje proizvode bakterije, vrstu koja odgovara heksamerima i jednu vrstu trimera.

Nekoliko studija se fokusiralo na polipeptide koji čine globularnu glavu Acrp30, koja se u daljem tekstu naziva gAcrp30. Postoje razlike u aktivnostima Acrp30 i gAcrp30 in vivo, iako ova dva polipeptida imaju i nekoliko sličnosti. Posle dugoročnog tretmana rekombinantnim proteinom dolazi do većeg smanjenja težine posle injekcije gAcrp30 u poređenju sa Acrp30, uprkos istom unosu hrane (Fraebis i sar., 2001). Sa druge strane, Acrp30 je smanjivao proizvodnju glukoze sinergistički sa insulinom dok gAcrp30 u ovom eseju nije imao nikakvu aktivnost (Berg i sar., 2001).

Da bi se odredila potencijalna aktivnost ovih različitih vrsta, analiziran je jedan broj elemenata transkripcionog odgovora na C2C12 miocitima, ćelijama za koje se zna da reaguju na Acrp30, koji podstiču ekspresiju reporterskog gena luciferaze (Tsao i sar., 2003). NF-KB-responzivan promoter E-selektina pokazao je povećanu aktivnost u vidu odgovora na dodavanje Acrp30. Bile su aktivni samo frakcionisani heksameri i HMVV vrste, dok su gAcrp30 i trimer u ovom eseju bili neaktivni. Visoke nivoe IL-6, čiju ekspresiju povećava NF-kB u miotubama C2C12, proizvode skeletni mišići tokom fizičke aktivnosti i smatra se da on inicira povećanu proizvodnju masnih kiselina i glukoze u adipoznom tkivu u jetri tako obezbeđujući povećanje cirkulišućeg "goriva" koje će koristiti mišići (Febbraio i sar., 2002; Kosmidou i sar., 2002). To znači da heksamerne i HMW vrste Acpr30 mogu indirektno da stimulišu lipolizu iz masnog tkiva putem oslobađanja IL-6 iz skeletnih mišića koje izaziva NF-kB (Tsao i sar., 2003).

Obzirom da Acrp30 učestvuje u gojaznosti i dijabetesu tipa II, modulacija proteinskog signalizacionog puta za Acrp30 predstavlja terapijsku opciju za metaboličke poremećaje kao što su gojaznost, dijabetes tipa II, insulinska rezistentnost, hiperholesterolemija, hiperlipidemija, dislipidemija, sindrom X, anoreksija i kaheksija. Međutim, pokazalo se da je izolovanje receptora Acrp30 teško. Vezivanje Acrp30 za kolagene i za humane endotelijalne ćelije aorte (HAECs) je opisano in vitro (Okamoto i sar., 2000). Nedavno su opisana dva receptora za globularni i Acrp30 pune dužine čija je funkcija nepoznata i oni su nazvani AdipoRl i AdipoR2 (Yamauchi i sar., 2003). Predviđa se da ova dva Acrp30 receptora sadrže sedam transmembranskih domena, ali da se strukturno i funkcionalno razlikuju od receptora sparenih sa G proteinom. Međutim, receptori za heksamerne i HMW vrste Acrp30 nisu opisani u naučnoj literaturi.

Kratak prikaz pronalaska

Ovaj pronalazak je rezultat otkrića jednog novog Acrp30 receptora. Preciznije, u okviru, ovog pronalaska je pokazano da je T- kadherin receptor za heksamerne vrste Acrp30 i vrste sa visokom molekulskom težinom (HMW).

To znači da se prvi aspekt ove specifikacije odnosi na upotrebu polipeptida T-kadherina kao mete za skrining kandidata modulatora za lekove kandidate za lečenje nekog poremećaja odabranog iz grupe koja se sastoji od metaboličkog poremećaja, ginekološkog poremećaja, hroničnog inflamatornog poremećaja i poremećaja jetre ili bubrega, što je naznačeno time da je navedeni kandidat lek modulator T- kadherina.

Drugi aspekt se odnosi na upotrebu modulatora polipeptida T- kadherina za pripremu medikamenta za lečenje nekom poremećaja odabranog iz grupe koja se sastoji od metaboličkog poremećaja, ginekološkog poremećaja, hroničnog inflamatornog poremećaja i poremećaja jetre ili bubrega.

Treći aspekt se odnosi na upotrebu polipeptida T-kadherina kao cilja za skrining prirodnih partnera za vezivanje, što je naznačeno time da je navedeni prirodni partner za vezivanje lek kandidat za lečenje nekog poremećaja odabranog iz grupe koja se sastoji od metaboličkog poremećaja, ginekološkog poremećaja, hroničnog inflamatornog poremećaja i poremećaja jetre ili bubrega.

Četvrti aspekt se odnosi na upotrebu rastvorljivog oblika T-kadherina kao medikamenta.

Peti aspekt, koji predstavlja ovaj pronalazak, se odnosi na upotrebu rastvorljivog oblika T-kadherina za pripremu medikamenta za lečenje metaboličkog poremećaja.

Šesti aspekt se odnosi na metodu procene efikasnosti modulatora polipeptida T-kadherina za lečenje gojaznosti, a navedena metoda uključuje administraciju navedenog modulatora na životinjskom modelu radi gojaznosti, što je naznačeno time da nalaz da navedeni modulator ublažava reprezentativnu karakteristiku gojaznosti na navedenom životinjskom modelu ukazuje da je navedeni modulator lek za lečenje gojaznosti.

Sedmi aspekt se odnosi na metodu procene efikasnosti modulatora polipeptida T-kadherina za lečenje dijabetesa tipa II, a navedena metoda uključuje administraciju navedenog modulatora na životinjskom modelu za dijabetes tipa II, što je naznačeno time da nalaz da navedeni modulator ublažava reprezentativnu karakteristiku dijabetesa tipa II na navedenom životinjskom modelu ukazuje daje navedeni modulator lek za lečenje dijabetesa tipa II.

Kratak opis crteža

Slika 1 prikazuje rezultat eseja vezivanja sa sortiranjem ćelija aktiviranog fluorescencijom C2C12, CRO i Bj/F3 ćelije, kako je objašnjeno na Primeru 2.

Slika 2 prikazuje rezultat of eseja vezivanja sa sortiranjem ćelija aktiviranog fluorescencijom i esej vezivanja kontrolnih Ba/F3 ćelija i T-kadherina koji eksprimira Ba/F3 ćelije, kako je objašnjeno na Primeru 4.2.

Slika 3A pokazuje ELISA analizu vezivanja različitih vrsta Acrp30 za CHOGFP ćelije, kako je objašnjeno na Primeru 4.3.

Slika 3B pokazuje ELISA analizu vezivanja različitih vrsta Acrp30 za T- kadherin koji eksprimira CHO ćelije, kako je objašnjeno na Primeru 4.3.

Slika 4 pokazuje aktivaciju NF-kB u C2C12 ćelijama, kako je objašnjeno na Primeru 5.

Kratak opis sekvenci

SEQIDNO: 1 odgovara humanom prekursoru T-kadherina pune dužine.

SEQ ID NO: 2 odgovara humanom Acrp30 prekursoru pune dužine.

SEQ ID NO: 3 odgovara mišjem Acrp30 prekursoru pune dužine.

SEQ ID NO: 4 odgovara mišjem prekursoru T-kadherina pune dužine.

SEQ ID NO: 5-18 odgovara sekvencama prajmera.

Detaljni opis pronalaska

Ovaj pronalazak se oslanja na otkriće jednog novog Acrp30 receptora. Preciznije, u okviru ovog pronalaska je pokazano da je T- kadherin receptor za heksamerne vrste Acrp30 i vrste sa velikom molekulskom težinom (HMW). Dati su dodatni podaci koji pokazuju da prekomerna ekspresija T- kadherina suprimira Acrp30-indukovanu NF-kB-posredovanu transkripciju. Shodno tome, ova specifikacija obezbeđuje sredstvo za identifikaciju jedinjenja korisnih za lečenje metaboličkih poremećaja kao što su npr. gojaznost, dijabetes tipa II, insulinska rezistentnost, hiperholcsterolemija, hiperlipidemija, dislipidemija, sindrom X, anoreksija i kaheksija. Preciznije, ova specifikacija se odnosi na upotrebu polipeptida T-kadherina kao ciljeva za skrining njihovih modulatora. Upotreba navedenih modulatora za lečenje metaboličkih poremećaja predstavlja još jedan aspekt ove specifikacije.

Prvi aspekt ove specifikacije je usmeren na upotrebu polipeptida T-kadherina kao cilja za skrining modulatora kandidata za lekove kandidate za lečenje nekog poremećaja odabranog iz grupe koja se sastoji od metaboličkog poremećaja, ginekološkog poremećaja, hroničnog inflamatornog poremećaja i poremećaja jetre ili bubrega, što je naznačeno time daje navedeni lek kandidat neki modulator T-kadherina.

Kako je korišćen u celoj ovoj specifikaciji, termin " Polipeptid T- kadherina" se odnosi kako na proteine T-kadherina pune dužine tako i na njihove biološki aktivne fragmente. Polipeptid T-kadherina može biti humanog ili životinjskog porekla. Preferentno, polipeptidi T-kadherina su humanog porekla.

Najpreferentnije, humani polipeptidi T-kadherina su odabrani grupe koja se sastoji od:

a) polipeptida koji uključuje SEQ ID NO: 1; b) polipeptida koji uključuje amino kiselinu 23 do 713 iz SEQ ED NO: 1; c) polipeptida koji uključuje amino kiselinu 23 do 693 iz SEQ ID NO: 1; d) polipeptida koji uključuje amino kiseline 140 do 713 iz SEQ ID NO: 1; e) polipeptida koji uključuje amino kiseline 140 do 693 iz SEQ ID NO: 1; f) bilo koji mutein od (a) do (e), što je naznačeno time da sekvenca amino kiselina ima najmanje 95%, 96%, 97%, 9S% ili 99% identičnost sa najmanje jednom od tih sekvenci M (a) do (e); g) bilo koji mutein od (a) do (e) koji enkodira neka nukleinska kiselina koja se hibridizuje u komplement DNK sekvence, koja enkodira neki od (a) do (e)

pod veoma strogim uslovima; i

h) bilo koji mutein od (a) do (e) stoje naznačeno time da bilo koja promena sekvence amino kiselina predstavlja konzervativne supstitucije amino kiselina sekvencama amino kiselina od (a) do

(e).

Termin "polipeptid T-kadherina" obuhvata polipeptide koji se prirodno javljaju kao i rekombinantne, himerne, sintetičke i hemijski sintetisane polipeptide. Termin polipeptid "T-kadherina" takođe obuhvata fragmente najmanje 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600 ili 650 amino kiselina T-kadherina. "Termin 'Polipeptid T-kadherina" dalje obuhvata muteine T-kadherina. Kako je ovde korišćen, termin "muteini" se odnosi na analoge T-kadherina, kod kojih je jedan ili više ostataka amino kiselina prirodnih T- kadherina zamenjen ostatcima različitih amino kiselina ili su oni obrisani ili jc jedan ili više ostataka amino kiselina dodat u prirodnu sekvencu T-kadherina, bez značajnog snižavanja aktivnosti dobijenih proizvoda u odnosu na T-kadherin divljeg tipa: Ovi muteini su pripremljeni uz pomoć poznatih tehnika sinteze i/ili mutageneze usmerene na dato mesto ili uz pomoć bilo koje druge poznate tehnike koja je za to pogodna.

Muteini T-kadherina koji se mogu koristiti u skladu sa ovom specifikacijom uključuju ograničenu grupu značajno sličnih sekvenci kao supstitucionih peptida ili polinukleotida koji rutinski može da dobije stručnjak iz date oblasti bez nepotrebnog eksperimentisanja, na osnovu činjenica i smernica koje su ovde prikazane i koje su poznate u ovoj stručnoj oblasti.

Polipeptid T-kadherina u skladu sa ovom specifikacijom uključuje proteine koje enkodira neka nukleinska kiselina, kao što su DNK ili RNK, koji se hibridizuju u DNK ili RNK, koja enkodira T- kadherin, u skladu sa ovim pronalaskom, pod umereno strogim ili veoma strogim uslovima. Termin "strogi uslovi" se odnosi na hibridizaciju i naknadne uslove ispiranja, koje stručnjaci iz ove oblasti obično nazivaju "strogim" (videti, npr., Sambrook i sar., 1989).

Između ostalog, primeri strogih uslova uključuju uslove ispiranja 12-20°C ispod izračunate Tm hibrida koja se ispituje u npr., 2 x SSC i 0.5% SDS tokom 5 minuta, 2 x SSC i 0.1% SDS tokom 15 minuta; 0.1 x SSC i 0.5% SDS na 37°C tokom 30-60 minuta i zatim 0.1 x SSC i 0.5% SDS na 68°C tokom 30-60 minuta. Stručnjaci iz ove oblasti razumeju da uslovi strogosti takođe zavise od dužine sekvenci DNK, oligonukleotidnih proba (kao što su baze 10-40) ili mešovitih oligonukleotidnih proba. Ukoliko se koriste mešovite probe, preferentno se koristi tetrametil amonijum hlorid (TMAC) umesto SSC.

Polipeptidi T-kadherina koji se mogu koristiti u skladu sa ovom specifikacijom uključuju muteine koji imaju sekvencu amino kiselina koja je najmanje 50% identična, preferentnije najmanje 60% identična, a još preferentnije više od 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identična T- kadherinu iz SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO: 4 ili nekom njihovom fragmentu. Polipeptid koji ima sekvencu amino kiseline koja je, na primer, 95% "identična" ispitivanoj sekvenci amino kiseline iz ovog pronalaska, treba da ima sekvencu amino kiseline datog polipeptida koja je identična kao ispitivana sekvenca osim što data sekvenca polipeptida može da uključuje do pet alteracija amino kiselina na svakih 100 amino kiselina od ispitivanih sekvenci aminokiselina Drugim recima, da bi se dobio polipeptid koji ima sekvencu amino kiselina koja je najmanje 95% identična sekvenci ispitivane amino kiseline, moguće je insercija, delecija ili supstitucija do 5% (5 od 100) ostataka amino kiselina nekom drugom amino kiselinom.

Kod sekvenci kod kojih nema tačne korespondencije, "% identičnosti" se može odrediti. In generalno, dve sekvence koje treba uporediti se tako postavljaju da daju maksimalnu korelaciju između sekvenci. To uključuje i ubacivanje "praznina" u jednu od ili obe sekvence kako bi se povećao stepen podudarnosti položaja. Procenat identičnosti se može odrediti ćelom dužinom svake od sekvenci koje se porede (takozvano globalno podudaranje), što je posebno pogodno kod sekvenci iste ili veoma slične dužine, ili na kraćim, definisanim dužinama (takozvano lokalno podudaranje), što je pogodnije za sekvence nejednake dužine.

Preferentne promene muteina koji se mogu koristiti u skladu sa ovom specifikacijom su one koje su poznate kao "konzervativne" supstitucije. Konzervativne supstitucije amino kiselina polipeptida T-kadherina, mogu da uključuju sinonimne amino kiseline unutar neke grupe koja ima dovoljno slična fizičkohemijska svojstva da će se posle supstitucije između članova iste grupe biološka funkcija molekula ostati očuvana (Grantham, 1974). Jasno je da insercije i delecije amino kiselina mogu takođe da se vrše u gore-pomenutim sekvencama bez promene njihove funkcije, posebno ukoliko insercije ili delecije uključuju samo nekolicinu amino kiselina, npr. manje od trideset a preferentno manje od deset, i bez uklanjanja ili izmeštanja amino kiselina koje su ključne za funkcionalnu konformaciju npr. ostataka cisteina. Proteini i muteini koji se proizvode takvim delecijama i/ili insercijama spadaju u domen ove specifikacije.

Preferentno, grupe sinonimnih amino kiselina su one koje su definisane na Tabeli I. Još preferentnije grupe sinonimnih amino kiselina su one definisane u Tabeli II; a najpreferentnije grupe sinonimnih amino kiselina su one koje su definisane na Tabeli III.

Primeri proizvodnje supstitucija amino kiselina u proteinima koji se mogu koristiti za dobijanje muteina T-kadherina, polipeptida koji se koriste u ovom pronalasku, uključuju sve poznate korake metode kao što su oni prikazani u patentima SAD 4,959,314,4.58S.585 i 4,737,462, Mark i sar.; 5,116,943 Koths i sar., 4,965,195 Namen et at; 4,879,111 Chong i sar.; i 5,017,691 Lee i sar.; lap i proteina sa supstitucijom lizina prikazanim u SAD patentu br. 4,904,5S4 (Shaw i sar.).

Preferentno, muteini iz ove specifikacije ispoljavaju supstancijalno istu biološku aktivnost kao i polipeptid T-kadherina kojima on odgovara, muteini iz ovog pronalaska ispoljavaju pojačanu biološku aktivnost kao polipeptid T-kadherina koji mu odgovara.

Kako je ovde korišćen, termin " modulator" se odnosi na jedinjenje koja povećava ili smanjuje aktivnost polipeptida T-kadherina. Kako je ovde korišćen, termin " Modulator T-kadherina" se odnosi na jedinjenje koja povećava ili smanjuje aktivnost polipeptida T-kadherina i/ili na jedinjenje koje povećava ili smanjuje nivo transkripcije T- kadherina u RNK. Termin "modulator" uključuje i agoniste i antagoniste.

Kako je ovde korišćen,termin " agonist T- kadherina" se odnosi na jedinjenje koje deluje u istom pravcu na aktivnost T- kadherina kao i Acrp30. Jedinjenje koje ima " dejstvo u istom pravcu" na aktivnost T-kadherina kao Acrp30 se odnosi na jedinjenje koje (i) kada se testira u istom eseju u kome Acrp30 pojačava aktivnost T-kadherina, pomenuto jedinjenje pojačava aktivnosti T-kadherina i/ili (i) kada se testira u eseju u kome Acrp30 smanjuje aktivnost T-kadherina, navedeno jedinjenje smanjuje aktivnost T-kadherina. Termini "agonist" i "aktivator" se smatraju sinonimima i mogu se koristiti paralelno u ćelom ovom tekstu pronalaska.

Kako je ovde korišćen," antagonist T- kadherina " se odnosi na jedinjenje koje ima suprotan efekat na aktivnost T-kadherina u poređenju sa Acrp30. Jedinjenje koje ima " suprotan efekat" na aktivnost T-kadherina u odnosu na Acrp30 se odnosi na jedinjenje koje (i) kada se testira u eseju u kome Acrp30 pojačava aktivnost T-kadherina, navedeno jedinjenje smanjuje Aktivnost T-kadherina; i/ili (i) kada se testira u eseju u kome Acrp30 smanjuje aktivnost T-kadherina, navedeno jedinjenje povećava aktivnost T-kadherina. Termini "antagonist" i "inhibitori" se smatraju sinonimima i mogu se koristiti paralelno u ćelom tekstu ovog pronalaska.

Metode za određivanje da li neki modulator ima dejstvo u istom pravcu ili suprotan efekat na aktivnost T-kadherina u odnosu na Acrp30 su u donjem tekstu detaljnije prikazane.

Metode koje se mogu koristiti za testiranje modulatora po pitanju njihove sposobnosti da povećavaju ili smanjuju aktivnost polipeptida T-kadherina ili da povećavaju ili smanjuju ekspresiju mRNK T- kadherina su dobro poznate u ovoj stručnoj oblasti i o njima će više reči biti u donjem tekstu. Ovi eseji se mogu vršiti in vitro ili in vivo.

Modulatori kandidati prema ovoj specifikaciji uključuju jedinjenja koja se prirodno javljaju i sintetička jedinjenja. U takva jedinjenja spadaju, npr. prirodni ligandi, mali molekuli, aptameri, antisens mRNK, male interferentne RNK, rastvorljivi oblici T-kadherina i antitela. Takva jedinjenja se nazivaju "jedinjenja kandidati" ili "modulatori kandidati" u ovoj specifikaciji. U preferentne agoniste kandidate spadaju prirodni ligandi, mali molekuli i aptameri. U preferentne antagoniste kandidate spadaju prirodni ligandi, mali molekuli, aptameri, antisens mRNK, male interferentne RNK, rastvorljivi oblici T-kadherina i antitela. Najpreferentniji antagonisti kandidati su rastvorljivi

oblici of T-kadherina.

Kako je ovde korišćen, termin "prirodni ligand" se odnosi na bilo koji signalizacioni molekul koji se vezuje za T- kadherin in vivo i uključuje molekule kao što su npr. lipidi, nukleotidi, polinukleotidi, amino kiseline, peptidi, polipeptidi, proteini, ugljeni hidrati i neorganski molekuli.

Kako je ovde korišćen, termin " mali molekul" se odnosi na neorganski molekul relativno male težine. Preferentno, mali molekul sadrži manje od 200 atoma. Najpreferentnije, mali molekul sadrži između oko 50 atoma i 80 atoma.

Kako je ovde korišćen, termin "antitelo" se odnosi na protein koji proizvode ćelije imunog sistema ili na neki njihov fragment koji se vezuje za neki antigen. Antitela prema ovoj specifikaciji mogu biti poliklonska ili monoklonska, himerna, humanizovana, ili čak potpuno humana. Rekombinantna antitela i njihove fragmente karakteriše visoko afinitetno vezivanje za polipeptid T-kadherina in vivo i niska toksičnost. Antitela koja se mogu koristiti u ovoj specifikaciji karakteriše njihova sposobnost da omogućavaju tretman pacijenata tokom perioda koji je dovoljan da bi se postigla dobra ili izvanredna regresija ili poboljšanje patološkog stanja ili bilo kog simptoma ili grupe simptoma koji su u vezi sa nekim patološkim stanjem kao i niska toksičnost. Neutrališuća antitela se brzo javljaju kod životinja kao što su zečevi, koze ili miševi posle imunizacije polipeptidom T-kadherina. Imunizovani miševi su posebno korisni za obezbeđivanje izvora B ćelija za proizvodnju hibridoma, koji se za uzvrat kultivišu kako bi se proizvele velike količine anti-T-kadherinskih monoklonskih antitela. Himerna antitela su imunoglobulinski molekuli koje karakterišu dva ili više segmenata ili dela izvedenih iz različitih životinjskih vrsta. Generalno, različiti region humanog antitela se izvodi iz ne-humanih antitela sisara, kao što mišja monoklonska antitela, a konstantni imunoglobulinski region se izvodi iz molekula humanog imunoglobulina. Preferentno, oba regiona i kombinacije imaju nisku imunogenost kako je rutinski utvrđeno (Elliott i sar., 1994). Humanizovana antitela su molekuli imunoglobulina stvoreni tehnikama genetskog inžinjeringa kod kojih su mišji konstantni regioni zamenjeni humanim pandanima dok su zadržani mišji regioni koji vezuju antigen. Dobijeno mišje-humano himerno antitelo preferentno ima smanjenu imunogenost i bolju farmakokinetiku kod ljudi (Knight i sar., 1993). Ovo antitelo može biti potpuno humano. Tehnologija za proizvodnju humanih antitela je detaljno opisana npr. u WO 00/76310, WO 99/53049, US 6,162,963 i AU 5,336,100. Jedna metoda za pripremu potpuno humanog antitela se sastoji od "humanizacije" mišjeg humoralnog imunog sistema, i.e. proizvodnje mišjih sojeva koji mogu da proizvode humani Ig (Ksenomiševi), uvođenjem lokusa humanog imunoglobulina (Ig) u miševe kod kojih su endogeni Ig geni inaktivirani. Ovi Ig lokusi su složeni kako po svojoj fizičkoj strukturi tako i po prerasporedu gena i procesima ekspresije koji su potrebni za krajnu proizvodnju širokog imunog odgovora. Do različitih antitela se primarno dolazi kombinatorikom u preraspoređivanju različitih V, D, i J gena prisutnih u Ig lokusima. Ovi lokusi takođe sadrže međusobno isprepletane regulatorne elemente, koji kontrolišu ekspresiju antitela, ekskluziju alela, promenu klase i afinitetnu maturaciju. Uvođenje ne-preraspoređenih humanih Ig transgena u miševe je dokazalo da je mehanizam mišje rekombinacije kompatibilan sa humanim genima. Takođe, specifičan hu-mAbs koji vrši sekreciju hibridoma različitih izotipova može se dobiti imunizacijom Ksenomiševa imunizacijom sa antigenom. Potpuno humana antitela i metode za njihovu proizvodnju su poznate u ovoj stručnoj oblasti (videti npr. WO 98/24893).

Kako je ovde korišćen, termin " antisens mRNK" se odnosi na RNK molekul koji je komplementaran sa lancem koji se normalno prerađuje u mRNK i translatira u RNK molekul komplementaran sa njegovim regionom.

Kako je ovde korišćen, termin " aptamer" se odnosi na neki veštački ligand nukleinske kiseline (videti npr. Ellington i Szostak, 1990).

Kako je ovde korišćen, termin " male interfer entne RNK" se odnosi na RNK dvostrukog lanca koja izaziva posttranslaciono isključivanje gena specifično za određenu sekvencu (videti, npr. Elbashiri sar., 2001).

Kako je ovde korišćen, termin " rastvorljiv oblik T- kadherina" se odnosi na polipeptid T-kadherina koji nije zakačen za membranu. Polipeptide T-kadherina koji nisu zakačeni za membranu mogu lako da proizvodu stručnjaci iz ove oblasti mutacijom GPI-mesta vezivanja polipeptida T-kadherina. Na primer, glicin na položaju 693 of SEQ ID NO: 1 može da se promeni u drugu amino kiselinu. Umesto toga, rastvorljiv oblik može biti neki fragment T-kadherina kome nedostaje GPI-mesto vezivanja. Rastvorl jiv oblik T- kadherina prema ovom pronalasku je odabran iz grupe koja se sastoji od: a) polipeptida koji se sastoji od amino kiselina 23 do 692 iz SEQ ID NO: 1; b) polipeptida koji se sastoji od fragmenta najmanje 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600 ili 650 amino kiselina (a); c) bilo kog muteina (a) ili (b), što je naznačeno time da sekvenca amino kiselina ima najmanje 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičnost sa najmanje jednom od tih sekvenci u (a) ili (b); d) bilo koji muteina (a) ili (b), koji enkodira neka nukleinska kiselina koja se hibridizuje u komplement of a DNK sekvence koja enkodira bilo (a) ili (b), pod veoma strogim uslovima; i e) bilo kog muteina (a) ili (b), što je naznačeno time da bilo koja promena sekvence amino kiselina predstavlja konzervativne supstitucije amino kiselina sekvenci amino kiselina u (a) ili (b).

Preferentno, pomenuti rastvorljivi oblik T-kadherina vezuje Acrp30. Preferentno, navedeni rastvorljiv oblik T-kadherina vezuje heksamerne i/ili HMW vrste Acrp30.

Kako je ovde korišćen, termin " HMW vrste Acrp30" se odnosi na jedan kompleks Acrp30 polipeptida koji uključuje više od šest Acrp30 polipeptida. Prividna molekulska masa mišjih HMB vrsta Acrp30 je oko 630 fcDa. Kako je ovde korišćen, termin "heksamerne vrste Acrp30" se odnosi na jedan kompleks od šest Acrp30 polipeptida. Prividna molekularna masa mišjih heksamernih vrsta je oko 410 kDa. Takvi multimerni ili heksamerni kompleksi se mogu purifikovati i/ili separisati npr. gel filtracijom kako su opisali Tsao i sar. (2002).

Rastvorljivi oblici T-kadherina u skladu sa ovom specifikacijom dalje uključuju himerni polipeptid T-kadherina koji uključuju T- kadherin ili neki njegov fragment fuzionisan sa heterolognim polipeptidom.

U skladu sa ovom specifikacijom navedeni rastvorljivi oblik T-kadherina uključuje T-kadherin ili neki njegov fragment fuzionisan sa celim ili delom nekog imunoglobulina. Metode za stvaranje imunoglobulinskih fuzionih proteina su dobro poznate u ovoj stručnoj oblasti, kao što su one opisane u WO 01/03737, na primer. Stručnjak iz ove oblasti će razumeti da dobijeni fuzioni protein iz ovog pronalaska zadržava biološku aktivnost T-kadherina, posebno vezivanje za heksamerne i/ili HMW vrste Acrp30. Ova fuzija može biti direktna ili preko jednog kratkog veznog peptida koji može da bude tako kratak da u svojoj dužini sadrži 1 do 3 ostatka amino kiselina ili duži, na primer da ima 13 ostataka amino kiselina u svojoj dužini. Pomenuti vezani peptid može biti tripeptid sa sekvencom E-F-M (Glu-Phe-Met), na primer, ili sekvencom od 13-amino kiselina koje uključuju Glu-Phe-Gly-Ala-Gly-Leu-Val-Leu-Gly-Gly-Gln-Phe-Met i koje su uvedene između sekvence T- kadherina i sekvence imunoglobulina. Dobijeni fuzioni protein ima poboljšana svojstva, kao što su duže vreme boravka u telesnim tečnostima (polu-život), povećana specifična aktivnost, viši nivo ekspresije ili purifikacija fuzionog proteina može biti olakšana. Preferentno, T-kadherin ili neki njegov fragment je fuzionisan sa konstantnim regionom nekog Ig molekula. Preferentno, on je fuzionisan sa regionima teškog lanca, kao što su na primer CH2 i CH3 domeni humanog IgGl. Ostali izoformi Ig molekula su takođe pogodni za stvaranje fuzionih proteina prema ovoj specifikaciji, kao što su izoformi IgG2 ili IgG4, ili druge klase Ig, kao što su na primer IgM ili IgA. Fuzioni proteini mogu biti monomerni ili multimerni, hetero- ili homomultimerni.

Rastvorljiv oblik T-kadherina može biti himerni molekul koji povezuje rastvorljivi region T-kadherina i ceo Acrp30 ili njegov deo. Takvi himeri su opisani kod IL-6 i njegovog receptora IL-6R (Chebath i sar., 1997, WO 99/02552 i WO 97/32891). IL-6R/IL-6 himer se vezuje sa većom efikasnošću za svoj ćelijski receptor in vitro nego mešavina IL-6 sa rastvorljivim IL-6R (Kollet i sar., 1999). T- kadherin može na primer da bude fuzionisan ćelom dužinom sa Acrp30. Umesto toga, T- kadherin može biti fuzionisan sa centralnim regionom Acrp30 koji obuhvata kolagenske repeticije. Očekuje se da takvi himeri formiraju heksamerne i HMW solubilne himerne molekule.

Lekovi kandidati se mogu dobiti primenom bilo kog od brojnih pristupa iz biblioteke kombinacija koje su poznate u ovoj stručnoj oblasti, uključujući, npr. biološke biblioteke, prostorno dostupne paralelne biblioteke solidne faze i solubilne faze i metode sintetičke biblioteke uz upotrebu afinitetne hromatografske selekcije. Pristup sa biološkom bibliotekom se generalno koristi kod peptidnih biblioteka, dok se druga četiri pristupa koriste za peptide, ne-peptidne oligomere, aptamere ili biblioteke malih molekula jedinjenja.

Jedan primer metode koja se može koristi za skrining jedinjenja kandidata za neki modulator je metoda koja se sastoji od koraka:

a) dovođenja u kontakt polipeptida T-kadherina sa jedinjenjem kandidatom; i

b) testiranja aktivnosti pomenutog polipeptida T-kadherina u prisustvu navedenog jedinjenja

kandidata;

što je naznačeno time da razlika ili promena aktivnosti navedenog polipeptida T-kadherina u prisustvu navedenog jedinjenja ukazuje da je to jedinjenje modulator navedenog polipeptida T-kadherina. Preferentno, takva metoda dodatno uključuje korak poređenja aktivnosti navedenog polipeptida T-kadherina u prisustvu navedenog jedinjenja sa aktivnošću navedenog polipeptida T-kadherina u odsustvu navedenog jedinjenja. Takođe preferentno, takva metoda takođe uključuje korak testiranja aktivnosti navedenog polipeptida T-kadherina u odsustvu pomenutog jedinjenja kandidata.

Umesto toga, ovaj esej može biti ćelijski zasnovan esej koji obuhvate korake:

a) dovođenja u kontakt ćelije koja eksprimira polipeptid T-kadherina sa jedinjenjem kandidatom; i b) testiranje aktivnosti navedenog polipeptida T-kadherina u prisustvu navedenog jedinjenja kandidata;

što je naznačeno time da razlika ili promena aktivnosti navedenog polipeptida T-kadherina u prisustvu navedenog jedinjenja ukazuje da je to jedinjenje modulator navedenog polipeptida T-kadherina. Preferentno, takva metoda dodatno uključuje korak poređenja aktivnosti navedenog polipeptida T-kadherina u prisustvu navedenog jedinjenja sa aktivnošću navedenog polipeptida T-kadherina u odsustvu navedenog jedinjenja. Takođe preferentno, takva metoda takođe uključuje korak testiranja aktivnosti navedenog polipeptid T-kadherina u odsustvu navedenog jedinjenja kandidata.

Modulator može biti neki inhibitor ili neki aktivator. Inhibitor može smanjiti aktivnost T-kadherina za npr., 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% ili 100% u poređenju sa aktivnošću T-kadherina u odsustvu navedenog inhibitora. Aktivator može povećati aktivnost T-kadherina za npr., 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% ili 100% u poređenju sa aktivnošću T-kadherina u odsustvu navedenog aktivatora.

Modulator može da moduliše svaku aktivnost navedenog polipeptida T-kadherina. Modulator može na primer da moduliše ekspresiju mRNK T- kadherina unutar ćelije,da moduliše vezivanje polipeptida T-kadherina za prirodnog partnera za vezivanje kao što je npr. Acrp30 ili da

moduliše ćelijski rast.

Aktivnost polipeptida T-kadherina se može proceniti merenjem vezivanja navedenog polipeptida T-kadherina za Acrp30. Eseji za merenje vezivanja polipeptida T-kadherina za Acrp30 su poznati stručnjacima iz ove oblasti. Na primer, mogu da se koriste FACS esej opisan u Primeru 4.2. ili ELISA esej opisan u Primeru 4.3. ove specifikacije. Takav esej može na primer da uključuje korake: a) dovođenje u kontakt polipeptida T-kadherina koji vrši ekspresiju ćelija sa jedinjenjem kandidatom i sa Acrp30; i b) testiranje vezivanja navedenog polipeptida T-kadherina za Acrp30 u prisustvu navedenog jedinjenja kandidata; što je naznačeno time da razlika ili promena u vezivanju

navedenog polipeptida T-kadherina sa Acrp30 u prisustvu navedenog jedinjenja ukazuje da je to jedinjenje modulator navedenog polipeptida T-kadherina. Preferentno, takva metoda dodatno uključuje korak poređenja vezivanja navedenog polipeptida T-kadherina sa Acrp30 u prisustvu navedenog jedinjenja sa vezivanjem navedenog polipeptida T-kadherina za Acrp30 u odsustvu navedenog jedinjenja. Takođe preferentno, takva metoda takođe uključuje korake:

c) dovođenje u kontakt polipeptida T-kadherina koji vrši ekspresiju ćelija sa Acrp30; i

d) testiranje vezivanja navedenog polipeptida T-kadherina to Acrp30 u odsustvu

navedenog jedinjenja kandidata.

Acrp30 može biti neka heksamerna vrsta Acrp30. Umesto toga, Acrp30 može biti HMW vrsta Acrp30.

Aktivnost polipeptida T-kadherina se takođe može proceniti merenjem nivoa mRNK T-kadherina unutar ćelije. Aktivnost se na primer može meriti upotrebom Northern blots, RT-PCR, kvantitativne RT-PCR sa prajmerima i probama specifičnim za mRNK T- kadherina. Umesto toga, ekspresija mRNK T- kadherina se meri na nivou polipeptida, upotrebom obeleženih antitela koja se specifično vezuju za polipeptid T-kadherina u imunoesejima kao što su ELISA eseji ili RIA eseji,

Western blot ili imunohistohemijski eseji.

Umesto toga aktivnost polipeptida T-kadherina se može proceniti merenjem regulacije ćelijskog rasta. Preferentne ćelije su ćelije nervnog sistema kao što su astrociti. Ostale preferentne ćelije su C2C12 miotube. Takvi eseji se mogu sprovoditi na primer na način kako su opisali Takeuchi i sar. (2000) ili Huang i sar. (2003).

Kako je korišćen u celoj ovoj specifikaciji, termin " metabolički poremećaj" uključuje gojaznost, dijabetes tipa II, insulinsku rezistentnost, hiperholesterolemiju, hiperlipidemiju, dislipidemiju, sindrom X, aterosklerozu, anoreksiju i kaheksiju. Termini " gojaznost", " dijabetes tipa II", " insulinska rezistentnost", " hiperholesterolemija", " hiperlipidemija", " dislipidemija" i "ateroskleroza" se odnose na stanje koja su definisana u "Merkovom priručniku - drugo izdanje"

(Izdavač: Merck & Co). Termin " sindrom X" se odnosi na konstelaciju faktora rizika od ateroskleroze, uključujući insulinsku rezistentnost, hiperinsulinemiju, dislipidemiju, hipertenziju i gojaznost (videti npr. Roth i sar., 2002). Termin "kaheksija" se odnosi na stanje koje karakteriše gubitak masti. Kako je ovde korišćen, termin "kaheksija" uključuje slabljenje koje je u vezi sa AIDS-om ili karcinomom. Termin " anoreksija" se odnosi na stanje koje karakteriše iskrivljena slika o telu, strah od gojaznosti i nemogućnost održavanje minimalne normalne telesne težine.

Kako je korišćen u celoj ovoj specifikaciji, termin " ginekološki poremećaj" se odnosi na poremećaje koji utiču na ženski reproduktivni sistem i/ili poremećaje koji su u vezi sa trudnoćom. Takvi poremećaju uključuju npr. sindrom policističnog ovarijuma, karcinom endometrijuma, karcinom dojke, preektampsiju i eklampsiju. Kako je korišćen u celoj ovoj specifikaciji, termin "poremećaj jetre ili bubrega" uključuje npr. masnu jetru, nefrotski sindrom i hronični renalni sindrom. Kako je korišćen u celoj ovoj specifikaciji, termin " hronični inflamatorni poremećaj" se odnosi na hroničnu patološku upalu nekog tkiva ili organa kod neke osobe. U hronične inflamatorne bolesti spadaju npr. psorijaza, psorijatični artritis, reumatoidni artritis, astma, inflamatorni poremećaj definisane u "The Merck Manual—Second Home Edition" (Publisher Merck & Co). Ostali poremećaji koji se mogu tretirati uz pomoć modulatora i rastvorljivih oblika T-kadherina iz ove specifikacije uključuju sve karcinome udružene sa gojaznošću i/ili insulinskom rezistentnošću kao što je npr. karcinom endometrijuma.

Prema ovom pronalasku, poremećaj je metabolički poremećaj.

Prema još jednom preferentnom aspektu, poremećaj je metabolički poremećaj odabran iz grupe koja se sastoji od gojaznosti, dijabetesa tipa II, insulinske rezistentnosti, hiperholesterolemije, hiperlipidemije, dislipidemije i sindroma X. Polipeptid T-kadherina se može koristiti kao cilj za skrining modulatora kandidata za lekove kandidate za lečenje gojaznosti, što je naznačeno time da je navedeni lek kandidat neki modulator T-kadherina. Umesto toga polipeptid T-kadherina se može koristiti kao cilj za skrining modulatora kandidata za lekove kandidate za lečenje dijabetesa tipa II, što je naznačeno time daje navedeni lek kandidat modulator T-kadherina. Osim toga polipeptid T-kadherina se može koristiti kao cilj za skrining modulatora kandidata za lekove kandidate za lečenje sindroma X, što je naznačeno time daje navedeni lek kandidat neki modulator T-kadherina.

Preferentni lekovi kandidati za lečenje nekog poremećaja odabranog iz grupe koja se sastoji od gojaznosti, dijabetesa tipa II, insulinske rezistentnosti, hiperholesterolemije, hiperlipidemije, dislipidemije i sindroma X su agonisti T-kadherina. Tako se polipeptid T-kadherina može koristiti kao cilj za skrining jedinjenja kandidata za lekove kandidate za lečenje nekog poremećaja odabranog iz grupe koja se sastoji gojaznosti, dijabetesa tipa II, insulinske rezistentnosti, hiperholesterolemije, hiperlipidemije, dislipidemije i sindroma X, što je naznačeno time da je navedeni lek kandidat agonist T-kadherina. Preferentno, navedena jedinjenja kandidati su odabrana

iz grupe koja se sastoji od prirodnih liganda, malih molekula i aptamera.

Određivanje da li je neki modulator T-kadherina agonist T-kadherina ili antagonist T-kadherina može se na primer proceniti upotrebom eseja koji je opisan u Primeru 5. Takav jedan esej može na primer da uključuje korake: a) dovođenje u kontakt polipeptida T-kadherina koji vrši ekspresiju ćelija sa nekim modulatorom; i b) testiranje NF-kB-posredovane transkripcije u prisustvu navedenog modulatora; što je naznačeno time da odrednica da navedeni modulator ima dejstvo u istom pravcu na NF-kB-posredovane transkripcije kao i Acrp30 ukazuje da je to jedinjenje agonist navedenog polipeptida T- kadherina i što je naznačeno time đa odrednica da navedeni modulator ima suprotan efekat na NF-kB-posredovane transkripcije u poređenju sa Acrp30 ukazuje da je to jedinjenje antagonist navedenog polipeptida T-kadherina. Preferentno, takva metoda dodatno uključuje korake:

c) dovođenja u kontakt polipeptida T-kadherina koji vrši ekspresiju ćelija sa Acrp30; i

d) testiranje NF-kB-posredovane transkripcije u prisustvu Acrp30 i u odsustvu navedenog

modulatora.

U takvom jednom eseju, Acrp30je preferentno neka heksamerna vrsta ili HMW vrsta Acrp30. U takvom jednom eseju, ćelije koje eksprimiraju polipeptid T-kadherina mogu biti npr. ćelijska loza C2C12 ili C2C12 ćelija koja prekomerno eksprimira T- kadherin. Takav jedan esej se može takođe sprovoditi sa jedinjenjima kandidatima radi skriniga agonista T-kadherina ili antagonista T- kadherina. IL-6, koji skeletni mišići tokom fizičke aktivnosti proizvode na visokom nivou, inicira povećaju proizvodnju masne kiseline i glukoze iz adipoznog tkiva . Za Acrp30 se smatra da igla određenu ulogu u oslobađanju IL- 6 iz skeletnih mišića aktivacijom NF-kB (videti, npr., Tsao et at, 2003). Shodno tome, određivanje da li je neki modulator T-kadherina agonist T-kadherina ili antagonist T- kadherin može se proceniti merenjem ekspresije gena IL- 6 i/ili oslobađanja IL-6 iz skeletnih mišića ćelije. Takav jedan esej može na primer da uključuje korake: a) dovođenje u kontakt polipeptida T-kadherina koji vrši ekspresiju ćelija sa modulatorom; i b) testiranje ekspresij3 IL-6 gena i/ili Oslobađanja IL-6 iz skeletnih mišića ćelija u prisustvu

navedenog modulatora;

što je naznačeno time da odrednica da navedeni modulator ima dejstvo u istom pravcu na ekspresiju IL-6 gena i/ili oslobađanje IL-6 iz skeletnih mišića ćelije kao i Acrp30 ukazuje daje to jedinjenje agonist navedenog polipeptida T-kadherina, i što je naznačeno time da nalaz da navedeni modulator ima suprotan efekat na ekspresiju IL-6 gena i/ili IL- 6 oslobađanje iz skeletnih mišića ćelije u poređenju sa Acrp30 ukazuje da je to jedinjenje antagonist navedenog polipeptida T-

kadherina. Preferentno, takva metoda dodatno uključuje korake:

c) dovođenja u kontakt polipeptida T-kadherina koji vrši ekspresiju ćelija sa Acrp30; i

d) testiranje ekspresije IL- 6 gena i/ili oslobađanja IL-6 iz skeletnih mišića ćelije u prisustvu

Acrp30 i u odsustvu navedenog modulatora.

U takvom jednom eseju, Acrp30 je preferentne Acrp30 neke heksamerne vrste ili HMW vrste.

Umesto toga, nalaze da li je neki modulator T-kadherina agonist T-kadherina ili antagonist T- kadherina može se proceniti bilo kojim poznatim in vivo esejom za procenu aktivnosti Acrp30.

Poremećaj može biti anoreksija ili kaheksija. To znači da se polipeptid T-kadherina može koristiti kao cilj za skrining modulatora kandidata za lekove kandidate za lečenje anoreksije ili kaheksija, što je naznačeno time da je navedeni lek kandidat neki modulator T-kadherina. Preferentni lekovi kandidati za lečenje of kaheksije ili anoreksije su antagonisti T- kadherina.

Umesto toga poremećaj može biti ginekološki poremećaj, hronični inflamatorni poremećaj ili neki poremećaj jetre ili bubrega. Preferentni lekovi kandidati za lečenje kaheksije ili anoreksije su agonisti T-kadherina.

Dodatni aspekt ove specifikacije je usmeren na upotrebu modulatora polipeptida T-kadherina za pripremu leka za lečenje nekog poremećaja odabranog iz grupe koja se sastoji od metaboličkog poremećaja, ginekološkog poremećaja, hroničnog inflamatornog poremećaja i poremećaja jetre ili bubrega. Preferentno, navedeni poremećaj je metabolički poremećaj. Takav lek uključuje navedeni modulator polipeptida T-kadherina u kombinaciji sa bilo kojim fiziološki prihvatljivim nosačem. Fiziološki prihvatljivi nosači se mogu pripremiti bilo kojom metodom koja je poznata stručnjacima iz ove oblasti. Fiziološki prihvatljivi nosači uključuju između ostalog one koji su opisani u Remingtonovim farmaceutskim naukama (Remington's Pharmaceutical Sciences)

(Mack Publishing Companv, Easton, USA, 1985). Farmaceutski sastojci koji čine prihvatljivim modulator polipeptida T-kadherina i neki fiziološki prihvatljiv nosač mogu biti npr. za intravensku, lokalnu, rektalnu, inhalacionu, subkutanu, intradermalnu, intramuskularnu, oralnu, intracerebralnu i intratekalnu upotrebe. Ovi sastojci mogu biti u tečnom (npr. rastvori, suspenzije), čvrstom obliku (npr., pilule, tablete, supozitorije) ili polu-čvrstom (npr. kreme, gelovi) obliku. Doze koje treba primeniti zavise od individualnih potreba, od željenog efekata kao i od odabranog načina primene.

Takav lek koji sadrži modulator T-kadherina može da se koristi u kombinaciji sa bilo kojim poznatim lekom za lečenje navedenog poremećaj. Na primer, kada se tretira gojaznost, modulator se može davati u kombinaciji sa Orlistatom, Sibutraminom, Rimonabantom, Aksokinom, Fluasteronom i/ili Famoksinom. Kada se leči dijabetes tipa II, modulator se može davati na primer u kombinaciji sa Akarbozom, Acetoheksamidom, Hlorpropamidom, Glimepiridom, Glipizidom, Gliburidom, Metforminom, Tolazamidom, Tolbutamidom, Nateglinidom, Insulinom, Insulin Aspartom, Insulin glarginom, Miglitolom, V-411, Reoaglinidom, Rosiglitazonom i/ili Pioglitazonom. Lekovi koji čine modulator T-kadherina se mogu takođe davati u okviru neke dijete.

Modulator polipeptida T-kadherina se može koristiti za pripremu leka za lečenje nekog metaboličkog poremećaja odabranog iz grupe koja se sastoji gojaznosti, dijabetes tipa II, insulinske rezistentnosti, hiperholesterolemije, hiperlipidemije, dislipidemije i sindroma X. Navedeni modulator je preferentno neki agonist.

Umesto toga modulator polipeptida T-kadherina se može koristiti za pripremu medikamenta za lečenje kaheksije ili anoreksije. Navedeni modulator je preferentno neki antagonist.

Osim toga modulator polipeptida T-kadherina se može koristiti za pripremu medikamenta za lečenje ginekološkog poremećaja, hroničnog inflamatornog poremećaja ili nekog poremećaja jetre ili bubrega. Navedeni modulator je preferentno neki agonist.

Dodatni aspekt ove specifikacije je usmeren na upotrebu polipeptida T-kadherina kao cilja za skrining prirodnih partnera za vezivanje, što je naznačeno time da je navedeni partner za vezivanje lek kandidat za lečenje nekog poremećaja odabranog iz grupe koja se sastoji od metaboličkog poremećaja, ginekološkog poremećaja, hroničnog inflamatornog poremećaja i poremećaja jetre ili bubrega. Navedeni poremećaj je preferentno neki metabolički poremećaj. Navedeni metabolički poremećaj je preferentno odabran iz grupe koja se sastoji od gojaznosti, dijabetesa tipa II, insulinske rezistentnosti, hiperholesterolemije, hiperlipidemije, dislipidemije, sindroma X, anoreksije i kaheksije. Upotreba polipeptida T-kadherina kao cilja ima veliku korist za identifikaciju proteina koji učestvuju u nekom metaboličkom poremećaju kao i za nove pronalaske u lečenju takvog poremećaja. Takve metode za skrining prirodnih partnera za vezivanje polipeptida T-kadherina su dobro poznate u ovoj stručnoj oblasti.

Jedna metoda za skrining nekog kandidata polipeptida koji je u interakciju sa polipeptidom T-kadherina uključuje sledeće korake: a) obezbeđivanje polipeptida koji se sastoji od polipeptida T-kadherina; b) dobijanje nekog kandidata polipeptida;

c) dovođenje u kontakt navedenog polipeptida sa navedenim kandidatom polipeptida; i

d) detekcija kompleksa koji se formiraju između navedenog polipeptida i navedenog

kandidata polipeptida.

Kod ove metode skrininga koja je gore definisana, kompleksi formirani između polipeptida i kandidata polipeptida se mogu dalje inkubirati u prisustvu nekog poliklonskog ili monoklonskog antitela koje se specifično vezuje za polipeptid T-kadherina. Umesto toga, kompleksi formirani između tog polipeptida i kandidata polipeptida se mogu detektovati uz pomoć FACS eseja

vezivanja

Kod ove metode skrininga, kandidat može da bude proizvod ekspresije insercije DNK koja je sadržana u vektoru. Na primer, takva metoda skrininga može se sprovesti kako je opisano u Primerima 1 i 2 ove specifikacije.

Kod ove metode skrininga, partner za vezivanje se može identifikovati putem dvohibridnog skrining eseja. Ovakav dvohibridni sistem sa kvascem je dizajniran za ispitivanje interakcija protein-protein in vivo (Fields i Song, 19S9) i on se oslanja na fuziju proteina mamca vezujućim domenom DNK Gal4 proteina kvasca. Ova tehnika je takođe opisana u SAD Patentima br. 5,667,973 i 5,283,173. Generalno procedura skrininga biblioteke uz pomoć ovog dvohibridnog eseja može na primer da se sprovede onako kako su opisali Fromont- Račine i sar.. (1997), a polipeptid mamac se sastoji od polipeptida T-kadherina. Preciznije, polinukleotid T- kadherina je fuzionisan u ram sa polinukleotidom koji enkodira vezujući domen DNK na GAL4 proteinu, a fuzionisana nukleotidna sekvenca je ubačena u pogodan vektor za ekspresiju, na primer pAS2 ili pM3.

Kod ove metode skrininga, partner za vezivanje se takođe može identifikovati putem afinitetne hromatografije. Polipeptid T-kadherina se može spojiti sa kolonom upotrebom konvencionalnih tehnika uključujući hemijsko spajanje sa pogodnom matricom kolone (npr. agaroza, AFFI GEL, itd.). Kod nekih aspekata ove metode, afinitetna kolona sadrži himerne proteine gde je polipeptid T-kadherina, ili neki njegov fragment, fuzionisan sa glutationom S transferaze (GST). Mešavina ćelijskih proteina ili pula eksprimiranih proteina se kako je gore opisano nanosi na afinitetnu kolonu. Polipeptidi koji stupaju u interakciju sa polipeptidom T-kadherina spojenim sa kolonom se tada mogu izolovati i analizirati npr. na 2-D gelu za elektroforezu kako su opisali Rasmunsen i sar. (1997). Umesto toga, proteini zadržani na afinitetnoj koloni se mogu purifikovati metodom na bazi elektroforeze i sekvencioniranjem.

Kod ove metode skrininga, partner za vezivanje se takođe može identifikovati putem metode sa optičkim biosenzorom (videti, npr. Edvvards i Leatherbarrow, 1997). Ova tehnika omogućava detekciju interakcija između molekula u stvarnom vremenu bez potrebe za obeleženim molekulima.

Preferentno, svi eseji koji čine korak testiranja vezivanja polipeptida T-kadherina za jedinjenja kandidate, modulator kandidat ili kandidat prirodnog partnera za vezivanje se obavljaju u prisustvu nekog divalentnog katjona. Najpreferentnije, takvi eseji se vrše u prisustvu Ca<2>+.

Ovaj pronalazak je usmeren na upotrebu rastvorljivog oblika T-kadherina za pripremu medikamenta za lečenje metaboličkog poremećaja. Rastvorljivi oblici T-kadherina mogu lako da se dobiju na način koji je gore opisan. Rastvorljiv oblik T-kadherina može da se ponaša kao agonist T-kadherina.

Dodatni aspekt ove specifikacije je usmeren na metodu procene efikasnosti modulatora polipeptida T-kadherina za lečenje nekog poremećaja odabranog iz grupe koja se sastoji od metaboličkog poremećaja, ginekološkog poremećaja, hroničnog inflamatornog poremećaja i poremećaja jetre ili bubrega, a navedena metoda uključuje administraciju navedenog modulatora na životinjskom modelu navedenog poremećaja, što je naznačeno time da odrednica da navedeni modulator ublažava reprezentativnu karakteristiku navedenog poremećaja na navedenom životinjskom modelu ukazuje da je navedeni modulator lek za lečenje navedenog poremećaja. Navedeni poremećaj je preferentno neki metabolički poremećaj. Navedeni metabolički poremećaj je preferentno odabran iz grupe koja se sastoji gojaznosti, dijabetesa tipa II, insulinske rezistentnosti, hiperholesterolemije, hiperlipidemije, dislipidemije, sindroma X, anoreksije i kaheksije.

Preferentno, taj poremećaj je gojaznost. Jedan primer metode koja se može koristiti za skrining lekova za lečenje gojaznosti i/ili za procenu efikasnosti modulatora polipeptida T-kadherina za lečenje gojaznosti je metoda koja uključuje korak administracije navedenog modulatora na životinjskom modelu gojaznosti, što je naznačeno time da odrednica da navedeni modulator ublažava reprezentativnu karakteristiku gojaznosti na navedenom životinjskom modelu ukazuje da je navedeni modulator lek za lečenje gojaznosti.

Životinjski modeli gojaznosti i eseji za određivanje da li dato jedinjenje ublažava reprezentativnu karakteristiku gojaznosti na takvim životinjskim modelima poznati su stručnjacima iz ove oblasti. Preferentni životinjski model gojaznosti uključuje fa/fa pacove, ob/ob miševe, db/db miševe, miševi sa deficijencijom leptina i miševe sa deficijencijom receptora leptina (videti, npr., Pellevmounter i sar.., 1995; Ogawa i sar., 1995; Hu i sar., 1996; Piercv i sar.., 2000; Yamauchi i sar., 2001).

U ispitivanju gojaznosti, reprezentativna karakteristika može biti npr. Indeks telesne mase (BMI), telesna težina, i/ili procenat masti u telu. Preferentno, reprezentativna karakteristika je Indeks telesne težine. Metode za merenje ovih karakteristikama su dobro poznate stručnjacima iz ove oblasti.

Nalaz da modulator polipeptida T-kadherina smanjuje telesnu težinu na životinjskom modelu gojaznosti može da ukazuje da je navedeni modulator lek za lečenje gojaznosti. Preferentno, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50% ili veće smanjenje telesne težine ukazuje da je navedeni modulator lek za lečenje of psorijaze. Najpreferentnije, smanjenje telesne težine za 10% ili više ukazuje daje navedeni modulator lek za lečenje gojaznosti.

Preferentno, taj poremećaj je dijabetes tipa II. Jedan primer metoda koje se mogu koristiti za skrining lekova za lečenje dijabetesa tipa II i/ili za procenu efikasnosti nekog modulatora polipeptida T-kadherina za lečenje dijabetesa tipa II je metoda koja uključuje korak administracije navedenog modulatora na životinjskom modelu dijabetesa tipa II, što je naznačeno time da tvrdnja da navedeni modulator ublažava reprezentativnu karakteristiku dijabetesa tipa II na navedenom životinjskom modelu ukazuje daje navedeni modulator lek za lečenje dijabetesa tipa II.

Životinjski modeli za dijabetes tipa II i eseji za određivanje da li to jedinjenje ublažava reprezentativnu karakteristiku dijabetesa tipa II na takvim životinjskim modelima poznati su stručnjacima iz ove oblasti. Preferentni životinjski modeli za dijabetes tipa II uključuju C57/BLKsJ dijabetične miševe, KKA(y) miševe, Nagoya-Shibata-Yasuda (NSY) miševe, i gojazne dijabetične (db/db) miševe (videti, npr. Castle i sar., 1993; Piercy i sar., 1998; Piercy i sar., 2000; Ueda i sar., 2000).

Da li modulator ublažava reprezentativnu karakteristiku dijabetesa može se utvrditi primenom nekoliko metoda koje postoje u ovoj stručnoj oblasti. Na primer, reprezentativna karakteristika može da bude nivo glukoze u plazmi, serumu ili krvi. Prema jednom aspektu, reprezentativna karakteristika je nivo glukoze u plazmi posle gladovanja (FPG). Umesto toga reprezentativna karakteristika je postprandijalni nivo glukoze. Reprezentativna karakteristika može takođe da bude nivo fruktozamina i gliciranog hemoglobina (HbAlc). I nivoi HbAllc i nivoi FPG su često korišćena merila u kliničkim studijama tretmana dijabetesa tipa II (videti npr Holman i sar., 1999). Umesto toga, reprezentativna karakteristika može da bude nivo ukupnog holesterola, HDL holesterola, LDL holesterola i/ili triglicerida (videti npr. Feinglos i sar.., 1997). Metode koje se koriste za merenje gore navedenih reprezentativnih karakteristika su dobro poznate u ovoj stručnoj oblasti.

Tvrdnja da modulator polipeptida T-kadherina smanjuje nivo HbAlc za najmanje 0.5%, 0.6%, 0.7%, 08%, 0.9%, 1%, 2%, 5%, 10%, 15%, 20% ili više u odnosu na placebo može da ukazuje da je navedeni modulator lek za lečenje dijabetesa tipa II. Kako je ovde korišćen, termin " placebo" se odnosi na životinjski model kod koga navedeni modulator polipeptida T-kadherina nije primenjivan.

Pozivanje na poznate korake neke metode, uobičajene korake neke metode, poznate metode ili uobičajene metode ni na koji način ne znači priznanje daje bilo koji aspekt, opis ili metoda iz ovog pronalaska otkrivena ili navedena u relevantnoj oblasti.

Primeri

Primer 1: Konstrukcija i ekspresija of obeleženog Acrp30

Celokupna kodirajuća sekvenca mišjeg Acrp30 (SEQ ID NO: 3) je ubačena u pCDNK3.1 vektor. pcDNK3.1 vektor je dobijen od Invitrogena (Carlsbad, CA). Vektor pCDNK3.1 uključuje CMV promoter koji reguliše ekspresiju kloniranog gena.

Kodirajuća sekvenca Flag epitopa (Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys) je ubačena PCR mutagenezom između predviđenog mesta cepanja signalne sekvence Acrp30 (amino kiselina na položaju 17 SEQ ID NO: 3) i amino-terminalnog regiona. Ova konstrukcija je označena kao 5'FlagAcrp30. PCR mutageneza je sprovedena upotrebom prajmera iz SEQ ID NO. 5 do 8. Prajmeri SEQ ED NO. 6 i 7 sadrže sekvencu koja enkodira Flag epitop i Acrp30 sekvence i oni su korišćeni kod PCR sa preklapanjem kako bi se uvela kratka osnovna sekvenca posle signalne sekvence. SEQ ID NO. 5 i 8 sadrže Acrp30 sekvence na 5' odnosno 3' završecima gena a takođe sadrže i EcoRI mesto koje se koristi za subkloniranje u pCDNK3.1.

Druga konstrukcija, označena kao 3'Flag-Acrp30, je takođe konstruisana insercijom uz pomoć PCR mutageneze kodirajuće sekvence za Flag epitop neposredno pre zaustavnog kodona Acrp30 cDNK kako bi se dobio deo sa karboksil-terminalnim proteinom. PCR mutageneza je sprovedena uz pomoć prajmera SEQ ID NO: 9, koji sadrži Acrp30-5' sekvence kojima prethodi jedno EcoRI mesto, i SEQ ID NO: 10, koji sadrži Acrp30-3' sekvence kojima nedostaje zaustavni kodon, a taj zaustavni kodon je zamenjen jednom sekvencom koja enkodira Flag epitop posle čeka odmah sledi zaustavni kodoni i jedno EcoRI mesto.

Ove dve Flag-Acip30 konstrukcije su sekvencionirane kako bi potvrdile da nije došlo do bilo kakvih grešaka uvedenih sa PCR.

Da bi se dobili rekombinantni Flag-Acrp30 proteini, HEK ćelije su prolazno podvrgnute transfekciji sa ovim konstruktima. Posle prenošenja ovih ćelija u medijume bez seruma, prikupljeni su supernatanti. Koncentracija proteina je određena poređenjem sa poznatim količinama purifikovanog Flag-tagged Acrp30 fuzionog proteina eksprimiranog od strane bakterija uz pomoć VVestern blot eseja. Supernatanti su sadržali približno 5 u.g/ml sekretovanog obeleženog Acrp30.

Ovi supernatanti su dalje purifikovani precipitacijom amonijum sulfata posle čega je sledila hromatografija sa izmenom FPLC anjona (HiQ, Bio-Rad) resuspendovanih proteina. Posle anjonskc hromatografije, nativna gel-elektroforeza i imunobloting Flag epitopa pokazali su rezoluciju eksprimiranog proteina dve vrste: prva je pretežno sadržala trimerni 5'Flag-Acrp30, dok je druga sadržala heksamerne 5'Flag-Acrp30 i sa višom molekulskom težinom. Čistoća ovih preparata je procenjena na približno 50 % uz pomoć SDS-PAGE i Coomassie prebojavanja.

Primer 2: Vezivanje Flag- Acrp30 polipeptida za C2C12 miocite, CHO ćelije i Ba/ F3

ćelije

Sposobnost Flag-Acrp30 polipeptida sadržanih u gore pomenutim supematantima da se vezuju za nediferencirane C2C12 miocite, CHO ćelije i Ba/F3 ćelije je ispitivana sa sortiranjem ćelija aktiviranim fluorescencijom (Fluorescence-activated cell-sorter (FACS) esejima vezivanja.

Adherentne ćelije (C2C12 i CHO) ili ćelije iz suspenzije (Ba/F3) su prenete u medijumbez seruma tokom dva sata a zatim na 4°C tokom trideset minuta kako bi se blokirala endocitoza. Ova ćelije su inkubirane u 1% BSA u PBS koji je sadržao 0.9mM CaCfe i 0.5mM MgCfe (PBS++) na 4°C tokom trideset minuta kako bi se blokirala nespecifična mesta vezivanja. Svi naknadni koraci su sprovedeni na 4°C. Ove ćelije su inkubirane u rastvoru 1:1 kondicioniranog medijuma iz HEK ćelija i rastvora za blokiranje tokom dva sata, dva puta su isprane u PBS++, i inkubirane jedan sat sa monoklonskim antitelom koje prepoznaje Flag epitop konjugovan sa fluorescentnom bojom APC (Phyco Link). Antitela koja prepoznaju Flag epitope su nabavljena od kompanije Sigma (St. Louis, MO). Posle dva ispiranja u PBS++, adherentne ćelije su sastrugane i resuspendovane u PBS koji je sadržao 10% FBS i 0.5 ug/ml propidijum jodida (PI), markera ćelijske permeabilnosti i analizirane su uz pomoć FACS. Određena je srednja fluorescentnost živih, Pl-negativnih ćelija.

Slika 1 prikazuje rezultat FACS eseja vezivanja. Prikazana je srednja fluorescentnost ćelija za svaki tip ćelija. Loze 1-3 odgovaraju eseju vezivanja sprovedenog sa pufer kontrolama. Loze 4-6 odgovaraju eseju vezivanja sprovedenom sa kondicioniranim medijumom iz HEK ćelija podvrgnutih transfekciji samo sapCDNK3.1 vektorom, bez cDNK insercije (kontrolne ćelije). Loze 7-9 odgovaraju eseju vezivanja sprovedenom sa kondicioniranim medijumom iz HEK ćelija transfektovanih sa 5'Flag-Acrp30. Loze 10-12 odgovaraju eseju vezivanja sprovedenom sa kondicioniranim medijumom iz HEK ćelija transfektovanih sa 3'Flag-Acrp30. Sprovedena su dva nezavisna eksperimenta. Kondicionirani medij um se odnosi na nepurifikovane supernatante dobijene kako je opisano u Primeru 1.

Kako je prikazano na Slici 1, Ba/F3 ćelije nisu se značajnije vezivale za 5'FlagAcrp30 (loza 9) ili 3'FlagAcrp30 (Loza 12). Dobijeni signal je bio sličan onome koji je dobijen sa bilo kojom kontrolom transfektovanih supernatanta (loza 6), ili onda kada je dodat samo rastvor za blokiranje (loza 3). CHO ćelije dale su nešto veći signal kada su inkubirane u kondicioniranom medijumu koji je sadržao 5'Flag-tagged Acrp30 (loza 8) ili 3'Flag-tagged Acrp30 (loza 11), u poređenju sa kontrolom koja je sadržala samo blokirajući protein (loza 3) ili kontrolom transfektovanog supernatanta (loza 5). C2C12 ćelije su međutim pokazale dvostruko povećanje signala kada su inkubirane u kondicioniranom medijumu koji je sadržao 5'Flag-Acrp30 (loza 7) ili 3'Flag-Acrp30 (loza 10), u poređenju sa rastvorom ta blokiranje (loza 1) ili kontrolnim transfektovanim supernatantom (loza 4).

Ovi rezultati ukazuju da C2C12 ćelije, ali ne i Ba/F3 ćelije, specifično vezuju Acrp30.

Primer 3: Kloniranje jednog novog Acrp30 receptora

3.1. Konstrukcija C2C12 cDNK biblioteke

Celijska loza C2C12 je odabrana za konstrukciju biblioteke ekspresije cDNK obzirom da se ona vezuje za nepurifikovane Flag-Acrp30 polipeptide i kako je prethodno pokazano da bi se povećala oksidacija masnih kiselina u vidu odgovora na Acrp30 (Fruebis i sar., 2001).

Biblioteka ekspresije nediferenciranih C2C12 cDNK je napravljena u jednom bicistroničnom retrovirusnom vektoru pBI-GFP. Ovaj vektor sadrži kodirjuću sekvencu zelenog fluorescentnog proteina (GFP) pod kontrolom internog mesta ulaska ribozoma (IRES) (Bogan i sar.., 2001). Ekspresija kloniranog gena ili cDNK insercije je proporcionalna sa ekspresijom GFP u pojedinačnoj ćeliji

Kvalitet mRNK je verifikovan Northern blot analizom |3-aktin gena. Posle ligacije obrnuto transkribovane cDNK u retrovirusni vektor, karakterizacija neamplifikovane biblioteke otkrila jc približno 0.5-1x107 nezavisnih transformacija. Restrikcionom digestijom plazmida pripremljenih od individualnih klonova iz primarne biblioteke, 95 % je sadržalo insercije prosečne veličine 1.5 kb. Infektivne virusne cDNK čestice su proizvedene transfekcijom plazmida u ćelijsku lozu za punjenje (Naviaux et at, 1996). Dobijeni supernatant koji je sadržao viruse korišćen je za inficiranje približno 5 % populacije od 2x108 naivnih Ba/F3 ćelija.

3.2.Priprema magnetnih perli

Magnetne perle koje sadrže tosil-reaktivne grupe (M280 Dvnalperle, Dynal) su inkubirane sa anti-Flag antitelom (M2, Sigma) kako bi se spojilo antitelo sa perlama. Posle spajanja, perle su blokirane u rastvoru PBS++ koji je sadržao 1% BSA tokom jednog sata, dodate su u 40 ml kondicioniranog medijuma iz HEK ćelija transfektovanih sa 5'Flag-Acrp30. i inkubirane su preko noći na 4°C. Kontrolne perle su inkubirane sa supernatantima HEK ćelija transfektovanih sa praznim vektorom pCDNK3.1. Posle vezivanja za supernatante, perle su dva puta isprane u PBS++ koji je sadržao 0.1% BSA i čuvane su u sterilnim uslovima u istom puferu.

3.3.Prosejavanje magnetnihperli

Ba/F3 ćelije inficirane sa C2C12 cDNK ekspresionom bibliotekom su ekspandovane tokom dva do tri dana pre nego što su podvrgnute vezivanju za. Ove ćelije su pripremljene i blokirane kako je opisano na Primeru 2, osim što je u korak blokiranja uključeno 0.1 mg/ml mišjeg IgG (Sigma). Svi naknadni koraci su sprovedeni na 4°C kako bi se sprečila internalizacija perli.

Ove ćelije su prethodno prečišćene kako bi se eliminisale nespecifično vezane ćelije i to inkubacijom 30 ml ćelija (2.4x107/ ml) sa 30 ul kontrolnih magnetnih perli tokom jednog sata. Vezane ćelije su odvojene upotrebom magneta a neadherentne ćelije su ponovo prošle kroz dva dodatna ciklusa vezivanja za kontrolne perle. Neadherentne ćelije su inkubirane sa 75 ul 1 5'Flag-Acrp30 perli tokom jednog sata posle čega su adherentne ćelije odvojene magnetom i isprane tri puta (pet minuta u 10 ml PBS++ sa 0.1% BSA.) Vezane ćelije su ekspandirane u kulturi; u kasnijim ciklusima vezivanja, prethodno prečišćavanje je izvršeno dva puta sa 15 ul kontrolnih perli pre dodavanja30 ul 5'Flag-Acrp30 perli. Posle svakog ciklusa vezivanja i ekspanzije, alikvoti ćelija su analizirani uz pomoć FACS kako bi se utvrdila ekspresija GFP i pratilo obogaćenje ćelija koje su sadržale integrisani retrovirus.

Obzirom da je ekspresija GFP iz IRES iz integrisanog retrovirusnog vektora proporcionalna sa ekspresijom insercije klonirane cDNK u individualnim ćelijama (Liu i sar., 2000), obogaćenje GFP ekspresije u ćelijskoj populaciji posle vezivanja za 5'Flag-Acrp30 povezano je sa obogaćenjem klonirane cDNK koja prenosi vezivanje.

3.4. FACS analiza obogaćenih ćelijskih pulova

Posle jednog ciklusa vezivanja za perle, 2.4 % ćelija purifikovanih na kontrolnim perlama i 1.6 % ćelija purifikovanih na 5'Flag-Acrp30 perlama bile su GFP-pozitivne u odnosu na neinficirane ćelije.

Posle drugog ciklusa vezivanja, 1.7 % ćelija purifikovanih na kontrolnim perlama i 7.8 % ćelija purifikovanih na 5 'Flag-Acrp30 perlama bile su GFP-pozitivne.

Posle trećeg sortiranja, ćelijsko vezivanje za kontrolne perle nije bilo obogaćeno u poređenju sa prvim sortiranjem obzirom da je 2.3 % bilo GFP-pozitivno. Sa druge strane, 73 % ćelije vezanih za 5'Flag-Acrp30 perle bilo je GFP-pozitivno, što ukazuje da je ova populacija obogaćena ćelijama koje su sadržale integrisani retrovirusni cDNK klon.

Obzirom da se ćelije vezane za kontrolne perle nisu obogatile sa GFP tokom trećeg sortiranja, epigenetski efekti zbog obogaćenja ćelija vezanih za 5'Flag-Acrp30 perle su isključeni. To znači da obogaćena ćelijska populacije verovatno sadrži cDNK koja enkodira neki receptor Acrp30.

3.5. Amplifikacija obogaćenog cDNK inserta

Genomska DNK je pripremljena od različitih ćelijskih pulova dobijenih posle trećeg sortiranja i podvrgnuta je PCR amplifikaciji uz primenu retrovirusnih specifičnih prajmera sa bočne strane mesta kloniranja cDNK iz retrovirusnog vektora pBI-GFP. Ovi različiti ćelijski pulovi odgovarali su naivnim Ba/F3 ćelijama ili Ba/F3 ćelijama inficiranim sa cDNK bibliotekom i vezanim za magnetne perle koje su prethodno inkubirane supernatantom (i) HEK ćelija transfektovanih samo sa pcDNK3.1 vektorom; (ii) 5'FlagAcrp30 koji eksprimira HEK ćelije; ili (ii) 5'FlagAcrp30 koji eksprimira HEK ćelije. U ćelijama inkubiranim sa 5'Flag-Acrp30 koji sadrži perle, za razliku od kontrolnih ćelija ili naivnih Ba/F3 ćelija, zabeležena je jedan specifičan opseg od 2.5 kb.

Ovaj opseg je subkloniran u vektor pCRII-Topo i krajevi su sekvencionirani uz pomoć prajmera specifičnih za vektor. Ova sekvenca je bila identična kao mišji T- kadherin (GenBank pristupni broj BC021628). Da bi se dobila sekvenca celokupne insercije, prajmeri SEQ ID NO: 11 do 18 su dizajnirani iz poznate sekvence T-kadherina kako bi se omogućilo sekvencioniranje celokupne insercije. Ovo je potvrdilo identitet obogaćenog klona kao T-kadherina pune dužine.

Shodno tome, T- kadherin je potencijalni Acrp30 receptor. Činjenica da je T- kadherin receptor Acrp30 potvrđena je na način kako je u daljem tekstu opisano.

Primer4: Vezivanje Acrp30 za T- kadherin

4.1. Prekomerna ekspresija T-kadherina u ćeliji

cDNK mišjeg T- kadherina pune dužine je dobijena kao deo jedne eksprimirane sekvence (SLIKA klon ID 3987627) i klonirana u pCDNK3.1 vektor kako bi se dobila pCDNK-Tcad konstrukcija. Dobijene su tri ćelijske loze sa prekomernom ekspresijom T- kadherina.

CHO ćelije su prolazno transfektovane sa pCDNK-Tcad. Ove prolazno transfektovane CHO ćelije pokazale su povećano vezivanje za 5'Flag-Acrp30 u poređenju sa kontrolnim supernatantima u kulturi tkiva pri primeni FACS eseja vezivanja koji je prethodno opisan.

Celokupna sekvenca koja kodira T- kadherine klonirana u retrovirusnom pBI-GFP vektoru kako bi se dobila pBI-GFP-Tcad konstrukcija. I naivne Ba/F3 i CHO-ER ćelije su podvrgnute transfekciji sa pBI-GFP-Tcad. CHO-ER ćelijska loza stabilno eksprimira receptor retrovirusnog vektora i može se identifikovati ektopijskim virusima (poklon Dr. M. Krieger, MIT).

4.2. Analiza vezivanja Acrp30 za T- kadherin putem FACS

Gore navedene ćelijske loze su potom korišćena za FACS eseje vezivanja, kako je pokazano na Slici 2. Paneli 1 do 3 odgovaraju FACS eseju vezivanja kontrolnih Ba/F3 ćelija. Paneli 4 do 9 odgovaraju FACS eseju vezivanja retrovirusnog inficiranog T- kadherina (pBI-GFP-Tcad) koji eksprimira Ba/F3 ćelije. Vezivanje je ispitivano kod: - 0 nM (paneli 1 i 4), 6 nM (paneli 2 i 5, 7-9), ili 60 nM (paneli 3 i 6) 5'Flag-Acrp30 heksamera; - 60 nM Acrp30 heksamer (panel 7);

- 10 mM EDTA (panel 8); i

- 10ug/mlClq (panel 9).

Kontrolne, neinficirane Ba/F3 ćelije ispoljile su slabo vezivanje za 6 nM (panel 2) ili 60 nM (panel 3) 5'Flag-Acrp30 heksamera, dok su Ba/F3 ćelije koje su eksprimirale T- kadherin pokazale povećano vezivanje sa 6 nM (panel 5, i paneli 7-9 ili 60 nM (panel 6) 5'Flag-Acrp30 heksamer (koncentracija eksprimirna kao trimerni ekvivalenti). Pozadinsko vezivanje u odsustvu Uganda bilo je nisko (panel 4). Uključivanje 60 nM eukariotski proizvedenog, neobeleženog Acrp30 heksamera inhibiralo je vezivanje 6 nM 5'FlagAcrp30, (panel 7), što ukazuje na specifično vezivanje između Acrp30 i T-kadherina. Da bi se ispitale potrebe divalentnih katjona, 10 mM EDTA su dodati u reakciju vezivanja. Ovo je potpuno blokiralo vezivanje (panel 8), što ukazuje da su divalentni katjoni potrebni za vezivanje. Clq, molekul koji ima istu homologiju kao Acrp30, nije uticao na vezivanje pri 20-strukom višku (težinskom) kada je koinkubiran sa 6 nM 5'Flag-Acrp30 heksamerom (panel 9), što ukazuje da se Clq verovatno ne vezuje za isti receptor kao Acrp30.

U paralelnim eksperimentima nije zabeleženo značajnije vezivanje gAcrp30 koga eksprimiraju bakterije ni za ćelijske loze koje eksprimiraju T- kadherin ni za preparat trimernih 5'Flag-Acrp30 proizvedenih od strane ćelija sisara.

Ovaj eksperiment potvrđuje da se T- kadherin ne vezuje za Flag epitop, čime se isključuje trivijalno objašnjenje vezivanja za 5'Flag-Acrp30. Osim toga, ovaj rezultat ukazuje da je T-specifičan receptor za heksamerne i HMW vrste Acrp30 pune dužine, ali on ne vezuje globularne ili trimerne vrste Acrp30.

4.3. Analiza vezivanja Acrp30 za T- kadherin uz pomoć ELISA eseja

ELISA eseji su dodatno sprovedeni kako bi pokazali direktno vezivanje Acrp30 za ćelije koje eksprimiraju T- kadherin.

CHO-ER ćelijske loze inficirane bicistroničnom retrovirusnom konstrukcijom pBI-GFP-Tcad (koji se naziva CHO-T- kadherin) i kontrolne ćelije inficirane sa pBI-GFP (koje se nazivaju CHO-GFP) su gajene na pločicama sa po 96 udubljenja. Jedan dan posle stavljanja na pločice (1.5 xl (//udubljene), ove ćelije su inkubirane u medijumu bez seruma tokom jednog sata, držane na 4°C tokom trideset minuta i blokirane u PBS++ koji je sadržao 4 % dehidriranog mleka tokom trideset minuta. Flag-tagged globularni-Acrp30 pune dužine ili purifikovani trimerni ili heksamerni i HMW 5'FIag-Acrp30 proizveden u HEK ćelijama inkubirani su sa tim ćelijama jedan sat u puferu za blokiranje u povišenim koncentracijama. Polipeptidi koje eksprimira HEK su proizvedeni i purifikovani precipitacijom sa amonijum sulfatom i hromatografijom sa izmenom jona. Pulovi koji su sadržali trimerni ili kombinaciju heksamernog i HMW 5'Flag-Acrp30 identifikovani su nativnom gel elektroforezom i imunoblottingom sa Flag antitelom. Čistoća ovih preparata je ocenjena na približno 50 % uz pomoć Coomassie PAGE analize. Koncentracija proteina je određena uz pomoć BCA eseja (Pierce). Koncentracija purifikovanih bakterijskih eksprimiranih proteina je određena apsorbancom na 280 nm a izračunati koeficijent ekstinkcije izveden je iz sekvence primarnih amino kiselina (Protean; DNAStar). Posle dva ispiranja u PBS ++, monoklonska antitela na Flag epitop (M2; 4 ug/ml) je dodavano tokom jednog sata; ispiranje je ponovljeno a potom je usledila inkubacija u sekundarnom antitelu konjugovanom u peroksidazi iz rena (magareći anti-mišji;. Jackson), i razvijen je sa kolorimetrijskim TMB supstratom (Pierce). Apsorbanca na 450 nm je izmerena sa čitačem pločica.

Rezultati su pokazani na Slikama 3A i 3B. Slika 3A pokazuje ELISA analizu vezivanja nekoliko preparata Acrp30 za CHO-GFP kontrolu. Slika 3B pokazuje ćelijske loze koje eksprimiraju CHO-T- kadherin. gAcrp se odnosi na 3'Flag-gAcrp30 koji eksprimiraju bakterije. Acrp pune dužine se odnosi na 3'Flag-Acrp30 koji eksprimiraju bakterije. TRI se odnosi na trimerni 5'FlagAcrp30 koji proizvodi HEK. HEX i HMW se odnosi na heksamerne i 5'FlagAcrp30 visoke molekulske težine koje proizvodi HEK. Sprovedena su četiri nezavisna eksperimenta.

Kako se vidi na Slici 3 A, kontrolne ćelije nisu vezivale nijedan od ispitivanih proteina. Kako se vidi na Slici 3B, CHO ćelije koje eksprimiraju T- kadherin ispoljile su vezivanje samo za heksamerne i HMW, ali ne i za trimerne oligomere 5'FlagAcrp30. Procenjena polu-maksimalna koncentracija vezivanja je 25-50 nM (koncentracija eksprimirana u vidu ekvivalenata trimera). Nije bilo vezivanja globularnih ili bakterijski proizvedenih proteina pune dužine za CHO ćelije koje eksprimiraju T- kadherin, što ukazuje da prepoznavanje Acrp30 uz pomoć T- kadherina može da iziskuje post-translacione modifikacije Acrp30 i malo je verovatno da uključuje globularni domen. Shodno tome, T- kadherin može da se vezuje za heksamerne i HMW vrste Acrp30, ali ne i za globularne ili trimerne vrste.

Primer 5:EfekatT- kadherina na NF- xB- posredovane transkripcije

Da bi se utvrdilo da li ćelije sa prekomernom ekspresijom T- kadherina imaju izmenjeni NF-kB odgovor na stimulaciju Acrp30, NF-KB-posredovane transkripcije u ćelijama prolazno transfektovanih sa kontrolnim pCDNK3.1 plazmidom ili pCDNK-T- kadherin plazmidom (pCDNK-Tcad) su ispitivane kako su opisali Tsao i sar. (2002).

Da bi se sproveo esej NF-kB aktivnosti, pCDNK-Tcad je ko-transfektovan sa plazmidom koji sadrži sekvencu koja kodira luciferazu pod kontrolom promotera E-selektina koji enkodira neki element odgovora NF-kB. Konstrukcija E-selektin luciferaza je dobijena insercijom promotera E-selektina u pGL2-bazični vektor koji sadrži gen luciferaze (Promega) kako su opisali Schindler i Baichvval (1994). Treći plazmid koji eksprimira P-galaktozidazu pod kontrolom CMV promotera je ko-transfektovan takođe i korišćen je za normalizaciju nivoa ekspresije. Ovi plazmidi su transfektovani u ćelije na pločicama sa 24 udubljenja. Narednog dana ove ćelije su inkubirane šest sati u medijumu koji sadrži naznačena jedinjenja. Luciferaza i P-galaktosidazna enzimska aktivnost ćelijskih lizata su određene uz pomoć eseja na bazi luminometra (Promega). Signal luciferaze je normalizovan do aktivnosti (3-galaktosidaze i stavljen u funkciju višestruke stimulacije u odnosu na nestimulisane ćelije transfektovane sa identičnim konstruktima.

Slika 4 pokazuje višestruku stimulaciju NF-kB-posredovane transkripcije u nediferenciranim C2C12 miocitima. Izmerena je aktivnost luciferaze. Kolona 1 pokazuje višestruku stimulaciju posle 6 h tretmana samo sa medijumom. Kolona 2 pokazuje višestruku stimulaciju sa dodavanjem 2 ug/ml heksamerne Acrp30. Kolona 3 pokazuje višestruku stimulaciju sa dodavanjem 300 ng/ml LPS. Kolona 4 pokazuje višestruku stimulaciju sa dodavanjem 50 ng/ml TNF-a. Sprovedena su tri nezavisna eksperimenta.

Kolona 1 pokazuje da ekspresija T- kadherina suprimira bazalne NF-icB-posredovane transkripcije na 37 % NF-kB-posredovanih transkripcija kod kontrolnih ćelija. Acrp30 heksamer (kolona 2) u koncentraciji od 2 ug/ml stimuliše NF-kB-posredovane transkripcije za 1.8-puta. Kod ćelija koje eksprimiraju T- kadherin, ova stimulacija je potpuno suprimirana obzirom daje nivo NF-kB-posredovanih transkripcija isti kao kod netretiranih ćelija koje eksprimiraju T- kadherin. Kolone 3 i 4 pokazuju C2C12 ćelije tretirane sa 300 ng/ml LPS (kolona 3) ili 50 ng/ml TNF-a (kolona 4). U oba slučaja, postoji slična četvorostruka stimulacija kontrole transfektovanih ćelija i u oba slučaja ta stimulacije je smanjena ekspresijom T- kadherina. Međutim, T- kadherin je smanjio stimulaciju samo do bazalnog nivoa kontrolnih transfektovanih ćelija. Nije bilo dodatne supresijc kao što je to bio slučaj kod ćelija tretiranih sa heksamernom Acrp30. Ekspresija p-galaktosidaze nije bila promenjena između pCDNK i T- kadherin transfektovanih ćelijska loza, što ukazuje da prekomerna ekspresija T-kadherina nije dovodila do nespecifične transkripcione supresije.

Da zaključimo, prekomerna ekspresija T-kadherina suprimira NF-kB-posredovane transkripcije koje inicira nekoliko različitih stimulansa, uključujući NF-icB-posredovane transkripcije koje inicira Acrp30.

Claims (2)

1. Rastvorljivi oblik T-kadherina za lečenje metaboličkog pormećaja, što je naznačeno time da je navedeni rastvorljivi oblik odabran iz grupe koja se sastoji od: a) polipeptida koji se sastoji od amino kiselina 23 do 292 iz SEQ ID NO. 1 b) polipeptida koji se sastoji od fragmenta najmanje 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600 ili 650 amino kiselina pod (a) c) mutein pod (a) ili (b) što je naznačeno time da je sekvenca amino kiseline najmanje 90%, 95%, 96%, 98% ili 99% identična kao i najmanje jedna sekvenca pod (a) ili (b); d) mutein pod (a) ili (b) koji enkodira nukleinska kiselina koja dovodi do hibridizacije u komplement DNK sekvence koja enkodira (a) ili (b) pod veoma strogim uslovima; i e) mutein pod (a) ili (b) što je naznačeno time da su sve promene u sekvencama amino kiselina konzervativne supstitucije amino kiselina sekvenci amino kiselina pod (a) ili (b).

2. Upotreba zahteva 1, što je naznačeno daje navedeni metabolički poremećaj neki metabolički poremećaj odabran iz grupe koja se sastoji od gojaznosti, dijabetesa tipa II, insulinske rezistentnosti, hiperholesterolemije, hiperlipidemije, dislipidemije, sindroma X, anoreksije i kaheksije. US 6358920 otkriva veliki broj kratkih peptida izvedenih iz više od 20 različitih kadherina. On se samo neznatno odnosi na lečenje metaboličkih poremećaja dijabetesa i gojaznosti putem modulacije agenasa koji čine jedan oktapeptid koji predstavlja sekvencu amino kiseline koja prepoznaje ćelijsku adheziju. W099/19477 ukazuje da peptidi koji se cepaju iz Pro-kadherina dok se prerađuju u odgovarajuće kadherine predstavljaju takozvane "regione faktora rasta kadherina" (CGFRs) i da se aktivnosti ovih CGFRs mogu koristiti u terapijske svrhe. U ovom kontekstu, on otkriva d CGFR T-kadherina u lečenju metaboličkog poremećaja. Ovaj CGFR se sastoji od amino kiselina 23-138 iz SEQ ID NO. 1. WO2004/096272 otkriva solubilne forme T-kadherina, što je naznačeno time da su te solubilne forme polipeptidi koji se sastoje od fragmenata do 118 amino kiselina polipeptida koji se sastoji od amino kiselina 23-292 iz SEQ ID. NO. 1. On takođe otkriva medicinsku upotrebu ovih solubilnih formi kod metaboličkih poremećaja.