[go: up one dir, main page]

RS20080362A - PEPTIDI KOJI SPREČAVAJU VEZIVANJE IgG ZA FcRn - Google Patents

PEPTIDI KOJI SPREČAVAJU VEZIVANJE IgG ZA FcRn

Info

Publication number
RS20080362A
RS20080362A RSP20080362A RS20080362A RS 20080362 A RS20080362 A RS 20080362A RS P20080362 A RSP20080362 A RS P20080362A RS 20080362 A RS20080362 A RS 20080362A
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
peptide
amino acid
group
bridge
igg
Prior art date
Application number
Other languages
English (en)
Inventor
Adam R. Mezo
Alfredo Castro
Kevin A. Mcdonnell
Cristina Tan A. Hehir
Original Assignee
Syntonix Pharmaceuticals Inc.,
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Syntonix Pharmaceuticals Inc., filed Critical Syntonix Pharmaceuticals Inc.,
Publication of RS20080362A publication Critical patent/RS20080362A/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/70539—MHC-molecules, e.g. HLA-molecules
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/06—Antiasthmatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/04—Antipruritics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A61P21/04—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system for myasthenia gravis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/06—Antianaemics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/10—Antioedematous agents; Diuretics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/70535—Fc-receptors, e.g. CD16, CD32, CD64 (CD2314/705F)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/06—Linear peptides containing only normal peptide links having 5 to 11 amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/08—Linear peptides containing only normal peptide links having 12 to 20 amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/70503—Immunoglobulin superfamily, e.g. VCAMs, PECAM, LFA-3
    • G01N2333/70535—Fc-receptors, e.g. CD16, CD32, CD64 (CD2314/705F)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Cardiology (AREA)

Abstract

Predmetni pronalazak se odnosi na peptide koji se vezuju za humani FcRn i inhibiraju vezivanje Fc regiona IgG za FcRn, čime menjaju koncentraciju IgG u serumu. Opisani preparati i postupci mogu da se koriste, na primer, za lečenje autoimunih bolesti i zapaljenskih poremećaja. Predmetni pronalazak se, takođe, odnosi na postupke upotrebe i postupke dobijanja peptida prema predmetnom pronalasku.

Description

Peptidi koji sprečavaju vezivanje IgG za FcRn
Srodne prijave
Ova prijava ima prioritet nad Uslovnim prijavama SAD br. 60/774,853, podnetom 17. 02. 2006. i 60/805,634, podnetom 23. 06. 2006, čiji sadržaji su ovde inkorporirani u potpunosti po referenci.
Oblast pronalaska
Predmetni pronalazak se, uopšteno posmatrano, odnosi na oblast imuno-modulatora. Konkretnije, predmetni pronalazak se odnosi na peptide koji se vezuju za neonatalni receptor za Fc (FcRn) i inhibiraju vezivanje FcRn za Fc region imunoglobulina G (IgG), čime menjaju koncentraciju IgG u serumu. Pronalazak se dalje odnosi na peptidne modulatore aktivnosti FcRn koji mogu da spreče FcRn da vrši svoju funkciju u ćelijskim mehanizmima koji se odnose na održavanje koncentracije IgG u serumu, lekove koji sadrže takve peptide i postupke lečenja pacijenta od bolesti i poremećaja koji mogu da budu ublaženi smanjivanjem koncentracije IgG u serumu primenom takvih lekova.
Pozadina pronalaska
Najzastupljeniji izotop antitela u serumu je IgG, koji igra presudnu ulogu u prenošenju zaštite od patogena, kao i u alergijskim i zapaljenskim odgovorima koji ubrzavaju dopremanje različitih delova imunog sistema u tkiva, sluzokožu i kožu. Junghans,Immunologic Research16(1): 29 (1997). Staviše, IgG je i ključni sastojak različitih autoimunih bolesti.
U normalnim uslovima, poluživot IgG u serumu je duži od poluživota drugih proteina plazme. Na primer, poluživot IgG u serumu je 5 do 7 dana kod miševa, a 22 do 23 dana kod ljudi. Roopenianet al, ./. Immunology170: 3528 (2003); Junghans & Anderson,Proc. Natl.Acad. Sci. USA93: 5512 (1996). S jedne strane, ovako dugačak poluživot IgG je posledica njegovog vezivanja za Fc receptor, FcRn. FcRn se vezuje za konstantni region IgG, poznat kao Fc. Iako je FcRn prvobitno opisan kao neonatalni transportni receptor za majčinski IgG, kod odraslih jedinki on štiti IgG od degradacije. FcRn se vezuje za pinocitirani IgG i štiti ga od degradativnih lizozoma, da bi ga na kraju vratio u vanćelijski odeljak. Junghans & Anderson,Proc. Natl. Acad. Sci. USA93: 5512 (1996), Roopenianet al, J. Immunology170: 3528 (2003). Ukoliko koncentracija IgG dostigne nivo koji prelazi koncentraciju dostupnog FcRn, nevezani IgG neće biti zaštićen od degradativnih mehanizama, te će stoga imati kraći poluživot u serumu. Brambellet. al, Nature203: 1352 (1964). Štaviše, iako se FcRn eksprimira na površini ćelije, smatra se da se veći deo FcRn nalazi unutar ćelije, vezan za membrane endoplazmatičnih vezikula, a interakcija IgG i FcRn se odvija u ćeliji nakon što se IgG unese u ćeliju pinocitozom.
Strukturno, FcRn je heterodimer koji se sastoji od jednog lakog lanca, koji se naziva beta (|3) lanac i jednog nekovalentno vezanog teškog lanca, koji se naziva alfa (a) lanac. Laki lanac FcRn, koji je bolje poznat pod nazivom P2-mikroglobulin (pVn), takođe je deo glavnog kompleksa histokompatibilnosti (Major Histocompatibilitv Complex) I (MHC I). Alfa lanac FcRn je protein mase 46 kD, koji se sastoji od vanćelijskog domena koji je podeljen u tri poddomena, al, a.2 i a3; transmembranskog domena i relativno kratkog citoplazmatskog dela. Burmeisteret al, Nature372: 336 (1994).
FcRn je prvobitno identifikovan u stomaku novorođenih pacova, u kom je njegova funkcija da posreduje pri apsorpciji IgG antitela iz majčinog mleka i da olakšava njihov prenos do sistema za cirkulaciju. Leachet al, J. Immunology157: 3317 (1996). FcRn je izolovan i iz humane placente, gde posreduje u apsorpciji i prenosu majčinog IgG u fetalnu cirkulaciju. Kod odraslih, FcRn se eksprimira u u epitelijalnim tkivima (U.S. Patenti br. 6.030,613 i 6,086,875), kao što su, ali bez ograničenja, pluća (Israeli et al.,Immunology 92:69 (1997)), epitel creva i proksimalnih tubula bubrega (Kobavashi et al.,Am. J. Physiol
(2002);Renal Physiol.282: F358 (2002)), kao i u nazalnim, vaginalnim i površinama bilijarnog trakta. Uz to, rasprostranjenost ekspresije FcRn na endotelijalnim ćelijama ukazuje na njegov značaj u homeostazi IgG. Ward et al,International Immunology15 (2): 187
(2002); Ghetie et al.,Eur. J. Immunology26: 690 (1996).
Uopšteno posmatrano, uloga FcRn u homeostazi IgG je da deluje kao antagonist katabolizmu IgG vezujući se za Fc deo IgG. Kada je jednom unesen pinocitozom, IgG je zarobljen u unutarćelijskimn vakuolama koje počinju da se spajaju sa kiselim ranim endozomima. Kristalografske studije ukazuju da se, stehiometrijski, kompleks FcRn-IgG sastoji od dva molekula FcRn na svaki molekul IgG (Burmeisteret al, Nature372: 336
(1994)). Smatra se da se vezivanje ova dva molekula odvija na Fc regionu IgG, blizu mesta sustreta CH2 i CH3 domena (Burmeisteret al, Nature372: 379 (1994)). Spajanje sa endozomom predstavlja jedan stadijum u lizozomalnom degradativnom putu, u kome se kompleksni biomolekuli koji se nalaze u endozomu degradiraju ili katabolišu u sastavne supstance. Nizak pH sredine unutar ranog endozoma pospešuje vezivanje FcRn za IgG, kao i otpuštanje bilo kog antigena koji je vezan za IgG. Samim tim, antigen se degradira, a FcRn-IgG kompleks izbegava degradaciju i na kraju se reciklira nazad na površinu ćelije, gde fiziološki pH vanćelijske sredine pospešuje otpuštanje IgG od FcRn.
Kako bi se ispitao doprinos FcRn homeostazi IgG, genetskim mžinjeringom je dobijen soj miševa kod kojih je bar jedan deo gena koji kodiraju P2111i teški lanac FcRn izbačen, tako da se ovi proteini ne eksprimiraju (WO 02/43658; Junghans & Anderson,Proc. Natl. Acad. Sci. USA93: 5512 (1996)). U obe ove linije miševa sa izbačenim genima, poluživot i koncentracija IgG u serumu su značajno smanjeni, što ukazuje daje mehanizam koji reguliše homeostazu IgG zavisan od FcRn. Inhibicija vezivanja IgG za FcRn smanjuje poluživot IgG u serumu tako što sprečava recikliranje IgG. Stoga, sredstva koja su antagonisti ili zaustavljaju vezivanje IgG za FcRn mogu da se koriste u postupcima regulacije, lečenja ili sprečavanja poremećaja koji obuhvataju reakcije imunog sistema, kao što su, na primer, autoimune i zapaljenske bolesti i poremećaji koji se odlikuju prisustvom neodgovarajuće eksprimiranih IgG antitela. Jedan primer postupka sprečavanja vezivanja IgG za FcRn podrazumeva dobijanje antitela na FcRn koja će sprečiti takvo vezivanje. Antitela koja su u stanju da spreče vezivanje FcRn sa IgG su dobijena korišćenjem linije miševa kod kojih je izbačen gen za teški lanac FcRn (WO 02/43658). U skorije vreme, identifikovani su peptidi koji se vezuju za komplekse FcRn (Koloninet al, Proc. Natl Acad. Sci. USA99 (20): 13055-60 (2002); Patent S.A.D. br. 6,212,022). Međutim, u ovom trenutku postoji potreba za dodatnim sredstvima za regulaciju, lečenje ili sprečavanje stanja, bolesti i poremećaja koji se odlikuju reakcijama imunog sistema.
Kratak opis pronalaska
Shodno tome, predmetni pronalazak obezbeđuje peptide koji se specifično vezuju za FcRn i inhibiraju vezivanje IgG Fc za FcRn, čime sprečavaju recikliranje IgG na taj način što sprečavaju FcRn da vrši svoju funkciju i sprečava degradaciju IgG u lizozomima. U nekim rešenjima, peptidi se vezuju za FcRn i inhibiraju vezivanje IgGl, IgG2, IgG3 i IgG4 podklasa Fc za FcRn.
U nekim rešenjima, peptidi prema predmetnom pronalasku sadrže sekvencu:
gdeje:
- Xćizabran iz grupe koja se sastoji od pozitivno naelektrisanih aminokiselina, aromatičnih aminokiselina, pozitivno naelektrisanih aromatičnih aminokiselina i njihovih analoga; - X7izabran iz grupe koja se sastoji od fenilalanina i analoga fenilalanina; - X8i X9su, svaki nezavisno, izabrani iz grupe koja se sastoji od glicina, sarkozina, asparaginske kiseline, D-amino kiselina, oc-aminoizobuterne kiseline i njihovih analoga, ili Xg, kada se posmatra zajedno sa Xg, gradi mimetik dipeptida; - Xioizabran iz grupe koja se sastoji od aminokiselina i njihovih analoga, ili Xio, kada se posmatra zajedno sa Xg, gradi mimetik dipeptida;
- Xnizabran iz grupe koja se sastoji od tirozina i analoga tirozina.
Alternativno, peptidi prema predmetnom pronalasku mogu da sadrže sekvencu:
u kojoj:
- Riima formulu Xi-X2-X3-X4-
gdeje:
- Xiizabran iz grupe koja se sastoji od vodonika, acil grupe ili zaštitne grupe za aminokiseline; - X2nedostaje ili je izabran iz grupe koja se sastoji od aminokiselina i peptida koji su dugački od 2 do 15 aminokiselinskih ostataka, kao i njihovih analoga; - X3nedostaje ili je aminokiselina ili analog aminokiseline koji je u stanju da gradi most sa Xio, Xi2ili Xn, gde je taj most izabran iz grupe koja se sastoji od mosta od amino terminusa do karboksi terminusa, mosta od bočnog lanca do osnovnog lanca i mosta od bočnog lanca do bočnog lanca; a - X4nedostaje ili je izabran iz grupe koja se sastoji od aminokiselina, peptida dužine od 2 do 15 aminokiselina i njihovih analoga;
-X6, -X7, -Xg, -X9, -Xioi Xn odgovaraju prethodnim definicijama, a
- R2ima formulu Xi2-Xi3-Xi4-Xi5
gde:
- Xi2nedostaje ili je aminokiselina ili njen analog; - Xn nedostaje ili je aminokiselina ili njen analog; - Xu nedostaje ili je izabran iz grupe koja se sastoji od aminokiselina, peptida dužine od 2 do 15 aminokiselina i njihovih analoga; a
- Xi5 je amino grupa ili karboksi zaštitna grupa.
Peptidi prema predmetnom pronalasku obično su dužine od najmanje 7, a čak i do 50 aminokiselinksih ostataka. Peptidi prema predmetnom pronalasku mogu da postoje u obliku multimera, kao što su, na primer, dimer, trimer ili tetramer. U nekim rešenjima, peptidi prema predmetnom pronalasku mogu da budu podložniji pinocitozi, čime se omogućava brže vezivanje peptida, a samim tim manje izlučivanje preko bubrega. Predmetni pronalazak se dalje odnosi na farmaceutske preparate koji sadrže jedan ili više peptida prema predmetnom pronalasku.
Peptidi prema predmetnom pronalasku mogu da sadrže:
a) aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od:
b) aminokiselinsku sekvencu koja je u značajnoj meri identična jednoj, ili većem broju sekvenci odabranih iz grupe koja se sastoji od sekvence sa ID brojem: 1, sekvence sa ID brojem: 2, sekvence sa ID brojem: 3, sekvence sa ID brojem: 4 i sekvence sa ID brojem: 5; c) aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 80% identična jednoj, ili većem broju sekvenci odabranih iz grupe koja se sastoji od sekvence sa ID brojem: 1, sekvence sa ID brojem: 2, sekvence sa ID brojem: 3, sekvence sa ID brojem: 4 i sekvence sa ID brojem: 5; d) sekvencu sa ID brojem: 1, sekvencu sa ID brojem: 2, sekvencu sa ID brojem: 3, sekvencu sa ID brojem: 4 ili sekvencu sa ID brojem: 5 modifikovanu prisustvom jedne, dve,
tri, četiri ili pet delecionih, supstiticionih ili adicionih mutacija;
e) sekvencu sa ID brojem: 1, sekvencu sa ID brojem: 2, sekvencu sa ID brojem: 3, sekvencu sa ID brojem: 4 ili sekvencu sa ID brojem: 5 modifikovanu najmanje jednom
aminokiselinskom supstitucijom, gde je najmanje jedna aminokiselina supstituisana aminokiselinom koja se javlja u prirodi;
f) sekvencu sa ID brojem: 1, sekvencu sa ID brojem: 2, sekvencu sa ID brojem: 3, sekvencu sa ID brojem: 4 ili sekvencu sa ID brojem: 5 modifikovanu najmanje jednom
aminokiselinskom supstitucijom, gde je najmanje jedna aminokiselina supstituisana D-aminokiselinom ili njenim analogom;
g) sekvencu sa ID brojem: 1, sekvencu sa ID brojem: 2, sekvencu sa ID brojem: 3, sekvencu sa ID brojem: 4 ili sekvencu sa ID brojem: 5 modifikovanu najmanje jednom
aminokiselinskom supstitucijom, gde je najmanje jedna aminokiselina supstituisana N-metilovanom aminokiselinom;
h) sekvencu sa ID brojem: 1, sekvencu sa ID brojem: 2, sekvencu sa ID brojem: 3, sekvencu sa ID brojem: 4 ili sekvencu sa ID brojem: 5 modifikovanu najmanje jednom
aminokiselinskom supstitucijom, gde je najmanje jedna aminokiselina supstituisana aminokiselinom koja se ne javlja u prirodi;
i) sekvencu sa ID brojem: 1, sekvencu sa ID brojem: 2, sekvencu sa ID brojem: 3, sekvencu sa ID brojem: 4 ili sekvencu sa ID brojem: 5 modifikovanu najmanje jednom aminokiselinskom supstitucijom, gde je najmanje jedna aminokiselina supstituisana mimetikom aminokiseline.
Predmetni pronalazak se dalje odnosi na postupak regulisanja koncentracije IgG u serumu pacijenta koji podrazumeva primenu, kod tog pacijenta, terapeutski delotvorne količine preparata koji sadrži jedan ili veći broj peptida prema predmetnom pronalasku koji su u stanju da se vežu za FcRn i time spreče njegovo vezivanje za Fc region molekula IgG. U nekim rešenjima, postupci prema predmetnom pronalasku se koriste za smanjenje poluživota rastvornog IgG u serumu pacijenta. Rezultat primene preparata prema predmetnom pronalasku je da je poluživot rastvornog IgG u serumu pacijenta smanjen, u poređenju sa poluživotom IgG u serumu pacijenta pre primene peptida.
Predmetni pronalazak dalje obezbeđuje postupak inhibicije vezivanja Fc regiona humanog IgG za FcRn čime se izaziva smanjenje koncentracije Fc regiona IgG za FcRn u poređenju sa koncentracijom IgG pre tretmana. Postupak smanjenja koncentracije IgG u serumu podrazumeva primenu, kod pacijenta, terapeutski delotvorne količine preparata koji sadrži jedan ili veći broj peptida prema predmetnom pronalasku koji su u stanju da se vežu za FcRn i spreče FcRn da se veže za Fc region molekula IgG. U jednom rešenju. smanjenje u koncentraciji humanog IgG u serumu je najmanje 5%, kao što je smanjenje od najmanje 15% ili smanjenje u koncentraciji IgG u humanom serumu od najmanje 25%.
Jedno rešenje predmetnog pronalaska obezbeđuje postupak lečenja pacijenta koji ima najmanje jednu autoimunu bolest, koji podrazumeva primenu, kod pacijenta, terapeutski delotvorne količine preparata koji sadrži jedan ili veći broj peptida prema predmetnom pronalasku koji su u stanju da se vežu za FcRn i spreče FcRn da se veže za Fc region molekula IgG. Drugo rešenje predmetnog pronalaska obezbeđuje postupak lečenja pacijenta koji pati od najmanje jednog zapaljenskog poremećaja primenom, kod tog pacijenta, terapeutski delotvorne količine preparata koji sadrži jedan ili veći broj peptida prema predmetnom pronalasku koji su u stanju da se vežu za FcRn i spreče FcRn da se veže za Fc region molekula IgG. U drugim rešenjima, postupci prema predmetnom pronalasku mogu da se koriste za prevenciju, lečenje ili regulisanje imunog odgovora na terapeutski protein ili na vektor genske terapije.
Dodatna rešenja, ciljevi i prednosti predmetnog pronalaska dati su delom u opisu koji sledi, a delom će biti očigledni iz opisa, ili se mogu otkriti primenom pronalaska. Ova rešenja, ciljevi i prednosti predmetnog pronalaska mogu da se realizuju i dostignu primenom elemenata i kombinacija koje su konkretno navedene u priloženim patentnim zahtevima.
Podrazumeva se da su i prethodni opšti opis, kao i detaljni opis koji sledi, samo primeri dati kao objašnjenje, te da ni na koji način ne ograničavaju opseg i duh zaštite predmetnog pronalaska u skladu sa patentnim zahtevima.
Kratak opis slika
Na slici 1 prikazane su sekvence cDNK humanog FcRn pune dužine i otvoreni okviri čitanja(" open reading frarnes",prim. prev., ORF) humanog beta-2-mikroglobulina ((32m).
Na slici 2 prikazanje pregled sinteze peptidnih monomera sa aldehidima na N kraju (sekvenca sa ID brojem: 319).
Na slici 3 prikazan je pregled sinteze dimera peptida reduktivnim alkilovanjem. Sinteza peptida br. 270 prikazana je kao ilustrativni primer.
Na slici 4 prikazana je sinteza peptidnih dimera korišćenjem peptida koji sadrži bis-tiol vezu i bromacetilovanog peptida. Sinteza peptida br. 100 navedena je kao ilustrativni primer. Horizontalne zagrade koje se nalaze iznad sekvence peptida ukazuju na prisustvo mosta (sekvenca sa ID brojem: 320).
Na slici 5 prikazana je sinteza peptidnih dimera korišćenjem peptida koji sadrži tiol vezu i bromacetilovanog peptida. Sinteza peptida br. 122 navedena je kao ilustrativni primer. Horizontalne zagrade koje se nalaze iznad sekvence peptida ukazuju na prisustvo mosta (sekvenca sa ID brojem: 320).
Na slici 6 prikazana je sinteza peptidnih dimera korišćenjem vezivnog molekula ("linkera") koji sadrži dve kiselinske grupe. Sinteza peptida br. 283 navedena je kao ilustrativni primer. Horizontalne zagrade koje se nalaze ispod sekvence peptida ukazuju na prisustvo mosta (sekvenca sa ID brojem: 321).
Na slici 7 prikazana je sinteza peptidnih dimera korišćenjem vezivnog molekula koji sadrži amin. Sinteza peptida br. 280 navedena je kao ilustrativni primer. Horizontalne zagrade koje se nalaze ispod sekvence peptida ukazuju na prisustvo mosta (sekvenca sa ID brojem: 321).
Na slici 8 prikazana je sinteza fuzionisanih kompleksa peptida i Fc korišćenjem peptidnog aldehida i proteina CysFc. Sinteza peptida br. 252-Fc navedena je kao ilustrativni primer. Horizontalne zagrade koje se nalaze ispod sekvence peptida ukazuju na prisustvo mosta.
Na slici 9 prikazana je kinetika katabolizma humanog IgG u TG32B miševima (miševimaKoji su genetskim inžinjeringom izmenjeni da eksprimiraju humani FcRn i humani Pim, ali ne i mišji FcRn ili P2IT1).
Na slici 10 se vidi daje kinetika katabolizma biotinilovanog humanog IgG kod makaki majmuna ubrzana nakon intravenske injekcije peptida br. 270. Na slici 11 prikazane su koncentracije endogenog IgG kod makaki majmuna nakon intravenske injekcije peptida br. 270.
Slika 12 je prikaz rezultata prikazanih na slici 11, pri čemu je koncentracija endogenog IgG makaki majmuna normalizovana do Tokoncentracija.
Na slici 13 prikazane su koncetracije endogenog serum albumina kod makaki majmuna nakon intravenske injekcije peptida br. 270.
Na slici 14 prikazane su koncetracije endogenog IgM kod makaki majmuna nakon intravenske injekcije peptida br. 270.
Na slici 15 prikazana je kinetika katabolizma humanog IgG u TG32B miševima nakon intravenske injekcije peptida br. 231, peptida br. 274 i peptida br. 252-Fc.
Na slici 16 prikazana je kinetika katabolizma humanog IgG u TG32B miševima nakon intravenske injekcije peptida br. 270.
Na slici 17 prikazana je kinetika katabolizma humanog IgG u TG32B miševima nakon intravenske injekcije peptida br. 283.
Na slici 18 prikazana je molekulska masa peptida br. 289 određena SDS-PAGE analizom prečišćenog peptida br. 289 na 4-20% tris-Gly gelu. U traci 1 se nalaze molekulski markeri. U traci 2 se nalaze nekonjugovani polazni materijali PEG30kDa- U traci 3 se nalazi sirova reakciona smeša. U traci 4 se nalazi prečišćeni peptid br. 289.
Na slici 19 prikazana je kinetika katabolizma humanog IgG u TG32B miševima nakon intravenske injekcije peptida br. 289.
Na slici 20 je prikazana kinetika katabolizma biotinilovanog humanog IgG kod makaki majmuna ubrzana nakon intravenske injekcije 5 mg/kg peptida br. 283.
Na slici 21 je prikazana kinetika katabolizma biotinilovanog humanog IgG kod makaki majmuna ubrzana nakon intravenske injekcije 1 mg/kg peptida br. 283.
Na slici 22 prikazano je dejstvo peptida br. 283 (5 mg/kg) na koncentraciju IgG kod makaki majmuna.
Na slici 23 prikazano je dejstvo peptida br. 283 (1 mg/kg) na koncentraciju IgG kod makaki majmuna.
Na slici 24 prikazano je dejstvo peptida br. 283 (5 mg/kg, 3 puta nedeljno, i.v.) na koncentraciju albumina kod makaki majmuna.
Opis rešenja predmetnog pronalaska
I Definicije
"Afinitet" se odnosi na odlike interakcije vezivanja između dva biološki aktivna molekula, kojim se ukazuje na snagu interakcije vezivanja. Mera afiniteta izražava se preko konstante disocijacije (KD), koja je koncentracija, koja se obično izražava u nM, pM ili fM, u rastvoru koji sadrži biološki aktivne molekule, pri kojoj dati biološki aktivni molekul prestaje da vezuje svog partnera pod navedenim uslovima. Afinitet je obrnuto proporcionalan vrednosti Ko-
Izraz "aminokiselina", kada se koristi u predmetnoj prijavi, ukazuje na jedinjenje koje sadrži karboksilnu grupu i aminogrupu. Na primer, aminokiselina može da ima strukturnu formulu H2N-[C(R)(R')]n-C(0)OH, gde je n ceo broj koji je veći ili jednak jedinici, a R i R' su, nezavisno jedan od drugog, izabrani iz grupe koja se sastoji od vodonika i bočnih lanaca aminokiselina, i gde R i R' mogu zajedno da grade karbociklični ili heterociklični prsten. Na primer, kada je n jednak jedinici, aminokiselina formule H2N-[C(R)(R')]-C(0)OH je alfa aminokiselina, a kada je n jednako dva, aminokiselina prema formuli H2N-C(Ri)(Ri')-C(R2)(R2')-C(0)OH je beta aminokiselina, gde su Ri, Ri', R2i R2', nezavisno jedan od drugog, izabrani iz grupe koja se sastoji od bočnih lanaca aminokiselina, i gde R i R', ili R2i R2', mogu zajedno da grade karbociklični ili heterociklični prsten. Izraz "aminokiselinski ostatak", kada se koristi u predmetnoj prijavi, označava aminokiselinu koja je deo peptida ili proteina, a koja ima formulu -N(H)-[C(R)(R')]n-C(0)-. Izraz "bočni lanac aminokiseline", kada se koristi u predmetnoj prijavi, označava bilo koji bočni lanac aminokiseline koja se javlja u prirodi, kao i sintetički dobijene aminokiseline. Na primer, metil grupa se može nazvati bočnim lancem alanina, a 2-amino-l-etil grupa bočnim lancem 2,4-diaminobutanske kiseline.
Aminokiselina može da ima R ili S konfiguraciju na bilo kom hiralnom atomu. Za određivanje hiralnosti nekog alfa amino ugljenika u alfa aminokiselinama koristi se Fišerova konvencija, L- ili D- ukoliko je alfa amino ugljenikov atom hiralan. "D-aminokiselina" je aminokiselina koja ima D konfiguraciju alfa ugljenikovog atoma. Ukoliko nije precizirana konfiguracija, stručnjaku u ovoj oblasti će biti jasno da je reč0L-aminokiselini. Aminokiseline koje su ovde opisane mogu da budu i u obliku racemskih, neracemskih i dijastereomernih smeša.
Aminokiseline, na primer, mogu da budu odabrane iz grupe koja se sastoji od dvadeset kodiranih aminokiselina i njihovih analoga. kao i od, na primer, drugih a-aminokiselina, p<1->aminokiselina, y-aminokiselina, 5-aminokiselina i co-aminokiselina. Nekodirane aminokiseline su dobro poznate u polju izučavanja peptida, kao što su one opisane u M. Bodanszkv,Principles of Peptide Synthesis,1. i 2. revidirano izdanje, Springer-Verlag, New York, N.Y. (1984) i (1983) i Stevvart & Young,Solid Phase Peptide Synthesis, 2.izdanje, Pierce Chemical Co. Rockford, 111. (1984). Kodirane i nekodirane aminokiseline i analozi aminokiselina mogu da se nabave komercijalno, npr. od Novabiochem; Bachem; Sigma Chemical Co.; Advanced Chemtech, ili da se sintetišu primenom postupaka koji su poznati u struci.
Aminokiselina može da bude izabrana iz grupe koja se sastoji od, npr. alanina, p-alanina, a-aminoadipinske kiseline, 2-aminobutanske kiseline, 4-aminobutanske kiseline, 1-aminociklopcntankarboksilne kiseline, 6-aminoheksanske kiseline, 2-aminoheptandikarboksilne kiseline, 7-aminoheptanske kiseline, 2-aminoizobuterne kiseline, aminometilpirol karboksilne kiseline, 8-amino-3,6-dioksa-oktanske kiseline, aminopiperidinkarboksilne kiseline, 3-aminopronanske kiseline, aminoserina, aminotetrahidropiran-4-karboksilne kiseline, arginina, asparagina, asparaginske kiseline, azetidin karboksilne kiseline, benzotiazolilalanina, butilglicina, karnitina, 4-hlorfenilalanina, citrulina, cikloheksilalanina, cikloheksilstatina, cisteina, 2,4-diaminobutanske kiseline, 2,3-diaminopropanske kiseline, dihidroksifenilalanina, dimetiltiazolidin karboksilne kiseline, glutaminske kiseline, glutamina, glicina, histidina, bomoserina, hidroksiprolina, izoleucina, izonipekotinske kiseline, leucina, lizina, metanprolina, metionina, norleucina, norvalina, ornitina, p-aminobenzoeve kiseline, penicilamina, fenilalanina, fenilglicina, piperidinilalanina, piperidinilglicina, prolina, pirolidinilalanina, sarkozina, selencisteina, serina, statina, tetrahidropiranglicina, tienilalanina, treonina, triptofana, tirozina, valina, alo-izoleucina, alo-treonina, 2,6-diamino-4-heksanske kiseline, 2,6-diaminopimelinske kiseline, 2,3-diaminopropanske kiseline, dikarboksidina, homoarginina, homocitrulina, homocisteina, homofenilalanina, homoprolina i 4-hidrazinbenzoeve kiseline.
Aminokiseline se obično klasifikuju prema osobinama bočnog lanca, u četiri grupe: kisele, bazne, hidrofilne (polarne) i hidrofobne (nepolarne). Aminokiseline koje su ovde opisane mogu da se identifikuju prema svojim punim imenima ili prema odgovarajućim standardnim oznakama od jednog ili tri slova. Oznake od jednog malog slova koriste se da se označi d-hiralnost.
'Analog aminokiseline" je aminokiselina, ili mali molekul koji je mimetik aminokiseline, koji ima zajedničke hemijske odlike, naelektrisanje, sterne odlike ili neke
druge odlike sa navedenom aminokiselinom. Na primer, analozi alanina obuhvataju, npr: (3-alanin, etilglicin, ct-aminoizobuternu kiselinu i D-alanin; analozi cisteina obuhvataju, npr. homocistein, D-cistein i penicilamin; analozi fenilalanina obuhvataju npr. 3-fluorfenilalanin, 4-metilfenilalanin, fenilglicin, 1-naftilalanin i 3,3-difenilalanin, 4-aminofenilalanin, pentafiuorfenilalanin, 2-pirilidilalanin, 3-pirilidilalanin, 4-nitrofenilalanin, 2-pirolidinilalanin, 3-piperidilalanin, 4-piperidilalanin; a analozi histidina obuhvataju, npr. 1-metilhistidin, 2,4-diaminobuternu kiselinu, tiazolilalanin, 2,3-diaminopropionsku kiselinu, guanilalanin, 2-pirilidilalanin, 3-pirilidilalanin, 4-pirilidilalanin, tienilalanin, ornitin, 4-guanilfenilalanin i 4-aminofenilalanin.
"Amino zaštitna grupa", kada se koristi u predmetnoj prijavi, označava bilo koji supstituent koji može da se koristi da spreči da neka amino grupa na određenom molekulu stupi u neku hemijsku reakciju, dok se hemijska promena odvija na nekom drugom delu tog molekula. Amino zaštitna grupa može da se ukloni pod odgovarajućim hemijskim uslovima. Brojne amino zaštitne grupe poznate su stručnjacima u ovoj oblasti, a primeri amino zaštitnih grupa, postupci njihove adicije i postupci za njihovo uklanjanje mogu da se nađu u T.W. Green,Protective Groups in Organic Synthesis,John Wiley & sons, New York, 1991; poglavlje 7, M. Bodanszky,Principles of Peptide Synthesis,1. i 2. revidirano izdanje, Springer-Verlag, New York, N.Y. (1984) i (1983) i Stevvart & Young,Solid Phase Peptide Synthesis, 2.izdanje, Pierce Chemical Co. Rockford, 111. (1984), čiji je sadržaj ovde inkorporiran po referenci. Pod izrazom "zaštićena (monosupstituisana)amino" podrazumeva se da postoji amino zaštitna grupa na (monosupstituisanom)amino atomu azota. Uz to, pod pojmom "zaštićena karboksiamidna" podrazumeva se da postoji amino zaštitna grupa na karboksamidnom atomu azota. Primeri ovakvih amino zaštitnih grupa obuhvataju formil ("For") grupu, tritil grupu, ftalimidogrupu, trihloracetil grupu, hloracetil, bromacetil i jodacetil grupe, blokirajuće grupe tipa uretana, kao što su 1-butoksikarbonil ("Boe"), 2-(4-bifenilil)propil-2-oksikarbonil ("Bpoc"), 2-fenilpropil-2-oksikarbonil ("Poc"), 2-(4-ksenil)izopropoksikarbonil, 1,1 -difeniletil-1 -oksikarbonil, 1,1 -difenilpropil-1 -oksikarbonil, 2-(3,5-dimetoksifenil)propil-2-oksikarbonil ("Ddz"), 2-(p-toluil)propil-2-oksikarbonil, ciklopentaniloksikarbonil, 1-metilciklopentaniloksikarbonil, cikloheksaniloksikarbonil, 1-metilcikloheksaniloksikarbonil, 2-metilcikloheksaniloksikarbonil, 2-(4-toluilsulfonil)-etoksikarbonil, 2-(metilsulfonil)etoksikarbonil, 2-(trifenilfosfino)-etoksikarbonil, 9-fluorenilmetoksikarbonil ("Fmoc"). 2-(trimetilsilil)etoksikarbonil, aliloksikarbonil, 1-(trimetilsililmetil)prop-l-eniloksikarbonil. 5-benzizoksalilmetoksikarbonil, 4-acetoksibenzil-oksi karboni 1, 2.2,2-trihloretoksikarbonil, 2-etinil-2-propoksikarbonil.
ciklopropilmetoksikarbonil, izoborniloksikarbonil, 1-piperidiloksikarbonil, benziloksikarbonil ("Cbz"), 4-fenilbenziloksikarbonil, 2-metilbenziloksikarbonil, a-2,4,5-tetrametilbenziloksikarbonil ("Tmz"), 4-metoksibenziloksikarbonil, 4-fluorbenziloksikarbonil, 4-hlorbenziloksikarbonil, 3-hlorbenziloksikarbonil, 2-hlorbenziloksikarbonil, 2,4-dihlorbenziloksikarbonil, 4-brombenziloksikarbonil, 3-brombenziloksikarbonil, 4-nitrobenziloksi-karbonil, 4-cijanobenziloksikarbonil, 4-(decikloksi)benziloksikarbonil i slične; benzoilmetilsulfonil grupa, ditiasukcinoil ("Dts"), 2-(nitro)fenilsulfenil grupa ("Nps"), difenil-fosfin oksid grupa i slične amino zaštitne grupe. Na primer, amino zaštitne grupe mogu da budu odabrane iz grupe koja se sastoji od Boe, Cbz i Fmoc. Moguće je upotrebiti više od jedne vrste aminozaštitnih grupa, sve dok je derivatizovana aminogrupa stabilna u uslovima reakcija koje će uslediti i sve dok može da se ukloni u odgovarajućem trenutku bez uticaja na ostatak jedinjenja.
Izraz "aromatičan", kada se koristi u predmetnoj prijavi, označava mono-, bi- ili druge multikarbociklične aromatične sisteme prstenova. Aromatična grupa može, opciono, da bude fuzionisana sa jednim ili većim brojem prstenova izabranih iz grupe koja se sastoji od aromatičnih, cikloalkilnih i heterocikličnih prstenova. Aromatične grupe mogu da imaju prstenove od 5 do 14 članova, kao što su, na primer, aromatične grupe sa prstenovima od 5 do 10 članova. Jedan ili veći broj vodonikovih atoma može, takođe, da bude supstituisan grupom koja je izabrana iz grupe koja se sastoji od acil, acilamino, aciloksi, alkenil, alkoksi, alkil, alkinil, amino, aromatičnih, ariloksi, azido, karbamoil, karboalkoksi, karboksi, karboksiamido, karboksiamino, cijano, cikloalkil, disupstituisanih amino, formil, guanidino, halo, heteroaril, heterociklil, hidroksi, iminoamino, monosupstituisanih amino, nitro, okso, fosfonamino, sulfmil, sulfonamino, sulfonil, tio, tioacilamino, tioureido i ureido grupa. Neograničavajući primeri aromatičnih grupa obuhvataju fenil, naftil, indolil, bifenil i antracenil grupe.
Pod izrazom "aromatična aminokiselina", u predmetnoj prijavi se podrazumeva aminokiselina čiji bočni lanac obuhvata aromatični prsten. Aromatične kiseline obuhvataju, na primer, histidin, tirozin, triptofan, fenilalanin, 1-naftilalanin i 4-piridilalanin.
Izraz "karboksi-zaštitna grupa" odnosi se na jedan od estarskih derivata karboksilnih kiselina koji se često koriste da blokiraju ili zaštite karboksilnu grupu dok se reakcije vrše na drugim mestima na jedinjenju. Primeri takvih zatitnih grupa za karboksilne kiseline obuhvataju t-butil, 4-nitrobenzil, 4-metoksibenzil, 3,4-dimetoksibenzil, 2,4-dimetoksibenzil, 2,4,6-trimetoksibenzil, 2,4,6-trimetilbenzil. pentametilbenzil, 3,4-metilenedioksibenzil, benzidril, 4,4'-dimetoksitritil, 4,4',4"-trimetoksitritil, 2-fenilpropil, trimetilsilil, t-butildimetilsilil, fenacil, 2,2,2-trihloretil, p-(trimetilsilil)etil, .beta.-(di(n-butil)metilsilil)etil, p-toluensulfoniletil, 4-nitrobenzilsulfoniletil, allil, cinnamil, l-(trimetilsililmetil)-propenil i slične ostatke. Vrsta karboksi-zaštitne grupe koja se primenjuje nije od velike važnosti, sve dok je derivatizovana karboksilna kiselina stabilna u uslovima reakcija koje slede, te dok može da se ukloni u koraku u kom je to potrebno bez da poremeti ostatak molekula. Dalji primeri ovakvih grupa mogu da se pronađu u E. Haslam,Protective Groups in Organic Chemistry,J.«G. W. McOmie, urednik, Plenum Press, New York, N.Y. (1973), poglavlje 5, i T. W. Greene,Protective- Groups in Organic Synthesis,2. izdanje, John Wiley & Sons, New York. N.Y. (1991), poglavlje 5. Srodan pojam je "zaštićena karboksi" koji se odnosi na karboksi grupu koja je supstituisana jednom od prethodno opisanih karboksi-zaštitnih grupa.
"Vezati", "vezujući" i "vezan" se odnose na nekovalentne interakcije između polipeptida i još nekog biološki aktivnog molekula, koje zavise od sterne i hemijske komplementarnosti data dva molekula. Sterna i hemijska komplementarnost polipeptida određena je specifičnom aminokiselinskom sekvencom.
"Biološki aktivni molekuli" je izraz koji se odnosi na peptide, nukleinske kiseline i/ili male molekule, kao što su mali organski ili neorganski molekuli, kao i na njihove fragmente, koji su u stanju da leče bolest ili stanje time što vrše određenu funkciju ili imaju određeno dejstvo, ili koji stimulišu ili odgovaraju na neku funkciju, dejstvo ili reakciju, u biološkom smislu (npr. u organizmu, ćeliji, ili nekomin vitromodelu organizma ili ćelije).
"Most" jc izraz koji se odnosi na kovalentnu vezu između dve nesusedne aminokiseline, analoga aminokiselina, ili drugih hemijskih ostataka u peptidu. Most može da bude most "osnovni lanac ("kičma") - osnovni lanac", "bočni lanac - osnovni lanac", ili "bočni lanac - bočni lanac". Most može da se dobije reakcijom ciklizacije koja dovodi do stvaranja nove amidne, estarske, etarske, tioetarske, alkenske ili disulfidne veze. Most "osnovni lanac - osnovni lanac", na primer, dobija se građenjem laktama na N i C krajevima.
Izraz "ciklični peptid" se odnosi na peptid koji ima unutarmolekulsku vezu koja premošćava dve nesusedne aminokiseline.
Izraz "peptidni dimer", kada se koristi u predmetnoj prijavi, odnosi se na molekul koji sadrži prvi i drugi peptidni lanac, koji mogu da budu isti ili različiti. Dimer može, dalje, da sadrži najmanje jedan opcioni vezivni molekul ("linker") za koji su ta dva peptida vezana kovalentnim vezama.
"Mimetik dipeptida" je značajno sličan (npr. značajno izostereomeran, ili. sa značajno sličnom orijenatcijom ili položajem) nekom dipeptidu. kao što je, na primer, glicilglicin. Mimetik dipeptida može da sadrži bilo koju kombinaciju redno vezanih molekula, dokle god
su ispoštovana strukturna ograničenja koja su prethodno opisana. Mimetici dipeptida mogu da imaju jednu ili više peptidnih veza koje su opciono zamenjene vezama izabranim iz grupe koja se sastoji od, na primer: -CH2NH-, -CH2S-, -CH2-CH2-, -CH=CH- (cis i trans) -COCH2-CH(OH)CH2- i -CH2SO-, postupcima koji su dobro poznati u struci. Stručnjak u ovoj oblasti će znati da dipcptidni mimetici, takođe, obuhvataju, na primer, mimetike P-petlje. Videti R.M.Friedinger, J. Med. Chem.46:5553-5566 (2003) i S. Hanessian,Tetrahedron53:12789-12854
(1997).
Primeri dipeptidnih mimetika, koji nisu ograničavajući ni na koji način, obuhvataju:
(D, L-Frajdingerov laktam);
(L, L-Frajdingerov laktam);
- (3S)-3-amino-2-okso-l-piperidin-sirćetnu kiselina i (3R)-3-amino-2-okso-l-
piperidin-sirćetnu kiselina; - (3S)-3-amino-2-okso-l-azepin sirćetnu kiselina i (3R)-3-amino-2-okso-l-azepin sirćetnu kiselina; - (3S)-3-amino-2-okso-l-pirolidin sirćetnu kiselina i (3R)-3-amino-2-okso-l-pirolidin sirćetnu kiselina;
- (3R)-3-amino-l-karboksimetil-valerolaktam; i
- 3-amino-N-l-karboksimetil-2,3,4,5-tetrahidro-lH-[l]-benzazepin-2-on.
Izraz "disulfidni most" se odnosi na kovalentnu vezu koja nastaje između sulfhidrilnih (tj. tiolnih ili merkaptanskih) grupa dve aminokiseline (kao što su, na pr. cistein, penicilamin i homocistein) pri oksidaciji. Disulfidni most može da nastane između dve aminokiseline koje se nalaze u istom linearnom peptidu, čime dolazi do ciklizacije takvog peptida. Disulfidni most može da nastane i između dva peptida, dajući peptidni dimer.
"Domen" je deo jednog, ili većeg broja peptida koji ima jasno određeni fizički oblik ili ulogu, na primer, struktura koja je nezavisno savijena a obuhvata jedan deo peptidnog lanca. Domen može da se vezuje za drugi domen, koji je isti ili različit. Domen može da sadrži sekvencu koja ima jasno određene fizičke osobine peptida, ili može da sadrži deo sa istom fizičkom osobinom koja mu omogućava da zadrži svoje osobine vezivanja (t.j. taj deo može da se veže za drugi domen).
"Delotvorna doza", "delotvorna količina", "terapijski delotvorna količina" i slični izrazi odnose se na količinu datog sredstva koja je dovoljna da dovede do željene fiziološke, farmakološke i/ili kognitivne promene koja može da se razlikuje u zavisnosti od pacijenta, bolesti ili tretmana. Data količina može da bude ili doza za tretman pacijenta za koga se veruje da ima neki konkretan poremećaj, u kom slučaju bi trebalo da dovede do značajnog poboljšanja ili olakšanja simptoma tog stanja ili poremećaja, ili može da bude doza za profilaksu, u kom slučaju bi trebalo da bude dovoljna da spreči, delimično ili potpuno, pojavu simptoma kod datog pacijenta.
Kada se koristi u predmetnoj prijavi, izraz "fuzija" se odnosi na kovalentni konjugat peptida predmetnog pronalaska i još nekog molekula, koji može da bude, npr. protein, peptid, mali molekul, polimer (npr. polietilen glikol ili polisaharid) ili nukleinska kiselina. Fuzija peptida i malog molekula ili peptida i polimera može da se dobije hemijskom konjugacijom, ili ekspresijom u odgovarajućoj ćeliji - domaćinu.
Izrazi "moduliše", "modulišući" i "modulacija" se odnose na rastuću ili opadajući!koncentraciju aktivnog peptida. Modulacija može da bude posredna i neposredna.
Kada se koristi u predmetnoj prijavi, izraz "multimer" se odnosi na molekul koji sadrži više polipeptidnih lanaca, koji mogu da budu isti ili različiti. Multimer može, dalje, da sadrži najmanje jedan opcioni vezivni molekul, za koji su najmanje dva peptida kovalentno vezana. Multimer može da bude, npr. dimer, trimer ili tetramer. Vezivni molekul može da bude, npr. bis-tiol vezivni molekul, tris-tiol vezivni molekul, tetratiol vezivni molekul, vezivni molekul koji je dikarboksilna kiselina, vezivni molekul koji je trikarboksilna kiselina, vezivni molekul koji je tetrakarboksilna kiselina, aminski vezivni molekul, triaminski vezivni molekul ili tetraaminski vezivni molekul.
Izraz "peptidi" se odnosi na molekule koji sadrže aminokiseline, npr. L i D aminokiseline, koje su međusobno linearno povezane amidnim vezama. Peptidi mogu, dodatno, da sadrže derivate aminokiselina ili ostatke koji nisu ostaci aminokiselina, kao što su, na primer, mimetici dipeptida. Dužina peptida prema predmetnom pronalasku može da bude u rasponu od npr. 2 do 100, 5 do 30, 7 do 50, 10 do 30 ili 10 do 50 aminokiselina (inkluzivno), kao što je na primer od 11 do 35 aminokiselina. Peptidi dalje mogu da sadrže modifikacije, kao što su, npr. glikozilacija, acetilacija, fosforilacija, PEGilacija, lipidacija ili konjugacija sa organskim ili neorganskim molekulom.
Izraz "pozitivno naelektrisan", kada se koristi u predmetnoj prijavi, označava aminokiselinu, mimetik aminokiseline, ili hemijski ostatak koji je pozitivno naelektrisan pri pH vrednosti većoj od 6, kao što je, npr. pH od 6 do 8, od 6 do 9, od 7 do 8 ili od 7 do 9. Na primer, pozitivno naelektrisane aminokiseline obuhvataju lizin, arginin i 2,4-diaminobuternu kiselinu.
Izraz "pozitivno naelektrisana aromatična aminokiselina" se odnosi na aminokiselinu koja je pozitivno naelektrisana pri pH vrednosti većoj od 6, kao što je, npr. pH od 6 do 8, od 6 do 9, od 7 do 8 ili od 7 do 9. Na primer, pozitivno naelektrisane aromatične aminokiseline obuhvataju histidin, 4-aminofenilalanin i 4-guanilfenilalanin.
Sekvenca aminokiselina koja je "u značajnoj meri identična" sa datom sekvencom može da bude, npr. najmanje 60%, 64%, 70%, 75%, 76%, 80%, 82%, 85%, 88%, 90%, 94%, 95%, 97%, 98%o, ili 99% identična datoj sekvenci. Ona može da se dobije iz date sekvence skraćivanjem s kraja, delecijom, supstitucijom ili adicijom najmanje jedne aminokiseline i/ili može da se razlikuje od date sekvence po, npr. adiciji, deleciji ili supstituciji najmanje 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ili 8 aminokiselina.
"Lečiti", "lečenje" i "tretman" su izrazi koji se odnose na smanjenje ozbiljnosti ili trajanja bolesti ili stanja; poboljšanje jednog ili većeg broja simptoma koji su u vezi sa datom bolešću ili stanjem; obezbeđivanje blagotvornih dejstava kod pacijenta koji pati od neke
bolesti ili stanja, pri čemu nije neophodno da pritom dolazi do izlečenja date bolesti ili stanja; ili prevencija neke bolesti ili stanja.
Peptidni "trimer" je molekul koji sadrži prvi, drugi i treći peptidni lanac, koji mogu da budu isti ili različiti. Peptidni trimer može, dalje, da sadrži najmanje jedan opcioni linker, za koji su kovalentnom vezom vezana najmanje dva od tih peptida.
Peptidi prema predmetnom pronalasku
Peptidi prema predmetnom pronalasku su ocenjeni na osnovu relativnog afiniteta za FcRn i sposobnosti da spreče vezivanje Fc dela IgG za FcRn. Peptidi koji pokazuju sposobnost da se vežu za FcRn i/ili da spreče vezivanje FcRn za Fc region IgG, imaju određene zajedničke osobine i sličnosti u sekvenci. Tako jedno rešenje prema predmetnom pronalasku obezbeđuje peptid koji je u stanju da sprcči vezivanje Fc regiona humanog IgG za humani neonatalni receptor za Fc, koji sadrži sledeću sekvencu:
gde je:
- Xćodabran iz grupe koja se sastoji od pozitivno naelektrisanih aminokiselina, aromatičnih aminokiselina, pozitivno naelektrisanih aromatičnih aminokiselina i njihovih analoga;
- X7odabran iz grupe koja se sastoji od fenilalanina i analoga fenilalanina,
- Xg i - Xg su, nezavisno jedan od drugog, odabrani iz grupe koja se sastoji od glicina, sarkozina, asparaginske kiseline, D-aminokiselina, a-aminoizobuterne kiseline i njihovih analoga, ili X8i X9zajedno grade mimetik dipeptida; - Xioje odabran iz grupe koja se sastoji od aminokiselina i njihovih analoga, ili Xi0i X9zajedno grade mimetik dipeptida;
- Xn odabran iz grupe koja se sastoji od tirozina i analoga tirozina; j
U nekim rešenjima, dužina datog peptida se kreće u rasponu od 7 do 50 aminokiselina i on se vezuje za humani FcRn, sprečavajući FcRn da veže humani IgG.
U jednom primeru rešenja, peptid prema predmetnom pronalasku sadrži sekvencu
U drugom rešenju, peptidi prema predmetnom pronalasku mogu da se predstave formulom:
gde:
- Riima formulu Xi-X2-X3-X4, gde je:
- Xiodabran iz grupe koja se sastoji od vodonika, acil ili aminokiselinskih zaštitnih grupa; - X2nedostaje ili je izabran iz grupe koja se sastoji od aminokiselina i peptida dužine od 2 do 15 aminokiselina; - X3nedostaje ili je aminokiselina koja je u stanju da izgradi most sa Xio, Xi2ili Xn, gde je taj most odabran iz grupe koja se sastoji od mosta amino kraj - karboksi kraj, mosta bočni lanac - osnovni lanac i mosta bočni lanac - bočni lanac; - X4nedostaje ili je izabran iz grupe koja se sastoji od aminokiselina i peptida koji su dugački od 2 do 15 aminokiselina;
- X6, -X7j -Xg. -X9> -Xio i -Xii odgovaraju prethodnim definicijama; i
- R2ima formulu Xi2-Xi3-Xi4-Xi5, gde:
- Xi2nedostaje ili je aminokiselina; - Xn nedostaje ili je aminokiselina; - Xi4nedostaje ili je izabran iz grupe koja se sastoji od aminokiselina i peptida dužine od 2 do 15 aminokiselina; i
- Xi5 je aminogrupa ili karboksi zaštitna grupa.
Izraz "aminokiselina", kada se koristi za definisanje peptida prema predmetnom pronalasku, obuhvata i analoge aminokiselina.
U jednom rešenju,X& jepozitivno naelektrisana aminokiselina izabrana iz grupe koja se sastoji od lizina, ornitina, 2,4-diaminobuterne kiseline, 2,3-diaminopropionske kiseline, arginina, guanilalanina i njihovih analoga. U još jednom rešenju, Xćje aromatična aminokiselina izabrana iz grupe koja se sastoji od tirozina, triptofana, fenilalanina i njihovih analoga. U još jednom rešenju, X6 je pozitivno naelektrisana aminokiselina izabrana iz grupe koja se astoji od histidina, 1-metilhistidina, 2-piridilalanina, 3-piridilalanina, 4-piridilalanina, 4-aminofenilalanina, 4-guanilfenilalanina, tiazolilalanina i njihovih analoga. U još jednom rešenju, X6 je 4-guanilfenilalanin. U još jednom rešenju, X6 je izabran iz grupe koja se sastoji od histidina, 3-piridilalanina, 4-piridilalanina, 4-guanilfenilalanina i njihovih analoga.
Primeri analoga histidina izabrani su iz grupe koja se sastoji od: diaminobuterne kiseline; tiazolilalanina; 2,3-diaminopropionske kiseline; guanilalanina; 2-piridilalanina; 3-piridilalanina; ticnilalanina; ornitina; 4-guanilfenilalanina; 1-metilhistidina; 4-aminofenilalanina; 2-pirrolidinilalanina; 3-piperdilalanina i 4-piperidilalanina, ali nisu ograničeni samo na ta jedinjenja.
Primeri derivata fenilalanina mogu da budu izabrani iz grupe koja se sastoji od 4-amino fenilalanina; pentafluorfenilalanina; 2-piridilalanina; 3-piridilalanina; 4-nitrofenilalanina; 1-naftilalanina; homofenilalanina; fenilglicina; 2-metilfenilalanina; 3-metilfenilalanina; 4-metilfenilalanina; 2-hlorfenilalanina; 3-hlorfenilalanina; 4-hlorfenilalanina; 3,3-di-fenilalanina; 4,4-bi-fenilalanina; 4-t-butilfenilalanina; cikloheksilalanina; (4-aminoacetil)-fenilalanina;L-l,2,3,4-tetrahidroizokvinolin-3-karboksilne kiseline; D-betametilfenilalanina iL-betametilfenilalanina, ali nisu ograničeni samo na ta jedinjenja.
U jednom rešenju, Xjo je izabran iz grupe koja se sastoji od neutralnih i hidrofobnih aminokiselina i njihovih analoga.
U jednom rešenju, X2je izabran iz grupe koja se sastoji od amino kiseline i peptida od 2 ili 3 aminokiseline. U jednom rešenju, X2obuhvata najmanje jednu hidrofobnu aminokiselinu. U još jednom rešenju, X2 je aminokiselina ili peptid od 2 do 15 aminokiselina, kod kojeg je karboksi terminalna aminokiselina hidrofobna aminokiselina.
U jednom rešenju, X4je aminokiselina ili peptid od 2 do 15 aminokiselina, kod kojeg je aminokiselina na karboksi kraju N-metilovana.
U jednom rešenju, peptid je linearan. U još jednom rešenju, najmanje jedan od Xio, Xn ili Xn aminokiselina koja može da gradi most sa X3, gde je taj most izabran iz grupe koja se sastoji od mosta od amino kraja do terminalnog kraja, mosta od bočnog lanca do glavnog lanca i mosta od bočnog lanca do bočnog lanca. U jednom rešenju, ovaj most je most od bočnog lanca do bočnog lanca, koji može da bude disulfidni most, etarski most, tioetarski most, alkenski most ili amidni most.
U jednom rešenju, ovaj most od bočnog lanca do bočnog lanca je disulfidni most između: cisterna i cisteina; cisteina i homocisteina; cisteina i penicilamina; homocisteina i homocisteina; homocisteina i penicilamina; ili penicilamina i penicilamina. U još jednom rešenju, ovaj most od bočnog lanca do bočnog lanca je most između: asparaginske kiseline i lizina, asparaginske kiseline i ornitina; asparaginske kiseline i 2,4-diaminobuterne kiseline; asparaginske kiseline i 2,3-diaminopropionske kiseline; glutaminske kiseline i lizina; glutaminske kiseline i ornitina; glutaminske kiseline i 2,4-diaminobuterne kiseline; ili glutaminske kiseline i 2,3-diaminopropionske kiseline.
U jednom rešenju, peptid sadrži najmanje jedan cistein (npr. u poziciji X3) ili analog cisteina izabran iz grupe koja se sastoji od: homocisteina, D-cisteina i penicilamina.
U jednom rešenju, najmanje jedan od X8i X9 je D-aminokiselina ili je izabran iz grupe koja se sastoji od: glicina, oc-aminoizobuterne kiseline i sarkozina.
U jednom rešenju, X8, zajedno sa X9gradi mimetik dipeptida koji je izabran iz grupe koja se sastoji od:
- beta-alanina
- 4-aminobuterne kiseline
- 5-aminopentanske kiseline
- 3-(aminomentil)benzoeve kiseline
- 4-(aminometil)benzoeve kiseline
- 3-(aminofenil)sirćetne kiseline
- 4-(aminofenil)sirćetne kiseline
- 3-amino-2-okso-l-piperidinsirćetne kiseline
- (3S)-3-amino-2-okso-l-piperidinsirćetne kiseline i (3R)-3-amino-2-okso-l-piperidinsirćetne kiseline - (3S)-3-amino-2-okso-l-azepinsirćetne kiseline i (3R)-3-amino-2-okso-l-azepinsirćetne kiseline - (3S)-3-amino-2-okso-l-pirolidinsirćetne kiseline i (3R)-3-amino-2-okso-l-pirolidinsirćetne kiseline
- (3R)-3-amino-l-karboksimetil-valerolaktama i
- 3-amino-N-l-karboksimetil-2,3,4,5-tetrahidro-lH-[l]-benzazepin-2-ona.
U nekim rešenjima, peptid sadrži najmanje jedan fenilalanin, analog fenilalanina izabran iz grupe koja se sastoji od: triptofana, tirozina, 2-aminofenilalanina, 3-aminofenilalanina, 4-aminofenilalanina, pentafluorfenilalanina, 2-piridilalanina, 3-piridilalanina, 4-nitro fenilalanina, 1-naftilalanina, homo fenilalanina, fenilglicina, 2-metilfenilalanina, 3-metilfenilalanina, 4-metilfenilalanina, 2-hlorfenilalanina, 3-hlorfenilalanina, 4-hlorfenilalanina, 3,3-difenilalanina, 4,4'-bifenilalanina, 4-t-butilfenilalanina, cikloheksilalanina, (4-aminoacetil)fenilalanina, L-1,2,3,4-tetrahidroizokvinolin-3-karboksilne kiseline, D-beta-metilfenilalanina i L-beta-metilfenilalanina.
U nekim rešenjima, peptid sadrži najmanje jedan analog tirozina izabran iz grupe koja se sastoji od: fenilalanina, 4-aminofenilalanina, 4-metoksifenilalanina, pentafluorfenilalanina, 2-piridilalanina, 3-piridilalanina, 4-piridilalanina, 4-nitrofenilalanina, 2-nitrotirozina i 4-fluorfenilalanina.
U jednom rešenju, X9i Xiozajedno grade mimetik dipeptida izabran iz grupe koja se sastoji od:
- D,L-Frajdingerovog laktama - L,L-Frajdingerovog laktama
U nekim rešenjima, peptid prema predmetnom pronalasku sadrži najmanje jedan analog histidina izabran iz grupe koja se sastoji od: 2,4-diaminobuterne kiseline, tiazolilalanina, 2,3-diaminopropionske kiseline, guanilalanina, 2-piridilalanina, 3-piridilalanina, 4-piridilalanina, tienilalanina, ornitina, lizina, arginina, 4-guanilfenilalanina, 1-metilhistidina, 3-metilhistidina, 1,3-dimetilhistidina, 4-aminofenilalanina, 2-pirolidinilalanina, 3-piperdilalanina i 4-piperidilalanina.
U nekim rešenjima, broj aminokiselina između aminokiselina koje grade most kreće se u opsegu od 6 do 12. U drugim rešenjima, između aminokiselina koje grade most postoji osam ili devet aminokiselina.
U nekim rešenjima, peptidi prema predmetnom pronalasku dugi su najmanje sedam aminokiselina, a mogu da budu dugi i do 50. U drugim rešenjima, peptidi su dugi od 11 do 35 aminokiselina.
U nekim rešenjima, peptidi prema predmetnom pronalasku postoje u obliku multimera, kao što je dimer, trimer ili tetramer. Peptidi unutar multimernog kompleksa mogu da budu isti ili različiti.
U jednom rešenju, peptid je dimer, kao, na primer, dimer koji je proizvod reduktivnog alkilovanja. U još jednom rešenju, dimer je proizvod reakcije između pojedinačnih peptidnih monomera i multivalentnog vezivnog molekula ("linkeia"). U jednom rešenju, multivalentni vezivni molekul je izabran iz grupe koja se sastoji od tiolnih, kiselinskih, alkoholnih i aminskih vezivnih molekula. U još jednom rešenju, dimer je proizvod reakcije alkilovanja, kao što je, npr. reakcija alkilovanja tiola i alkil halida.
U jednom rešenju, peptidi se sintetišu na smoli, a potom multimerizuju (npr. dimerizuju) reakcijom sa multivalentnim linkerom, kao, npr. kiselinskim ili aminskim multivalentnim linkerom, kao što je opisano u primeru 15.
U nekim rešenjima, peptid prema predmetnom pronalasku sadrži najmanje dve modifikacije kao one koje su prethodno opisane.
U nekim rešenjima, peptidi prema predmetnom pronalasku sadrže:
a) aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od:
b) aminokiselinsku sekvencu koja je u značajnoj meri identična jednoj ili većem
broju sekvenci izabranih iz grupe koja se sastoji od sekvence čiji je ID broj: 1, sekvence čiji je
ID broj: 2, sekvence čiji je ID broj: 3, sekvence čiji je ID broj:4 i sekvence čiji je ID broj: 5.
U nekim rešenjima, peptid sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 64%, najmanje 70%, najmanje 76%>, najmanje 82%>, najmanje 88%, najmanje 94%> ili najmanje 100% identična jednoj, ili većem broju sekvenci izabranih iz grupe koja se sastoji od sekvence čiji je ID broj: 1, sekvence čiji je ID broj: 2, sekvence čiji je ID broj: 3, sekvence čiji je ID broj:4 i sekvence čiji je ID broj: 5. U drugim rešenjima, peptid prema predmetnom pronalasku može da sadrži sekvencu čiji je ID broj: 1, sekvencu čiji je ID broj: 2, sekvencu čiji je ID broj: 3, sekvencu čiji je ID broj: 4 ili sekvencu čiji je ID broj: 5 koja ima najmanje 1 ili čak i do pet delecionih, supstitucionih ili adicionih mutacija. Svi peptidi prema predmetnom pronalasku inhibiraju vezivanje humanog FcRn za IgG.
U nekim rešenjima, peptid prema predmetnom pronalasku može da sadrži sekvencu čiji je ID broj: 1, sekvencu čiji je ID broj: 2, sekvencu čiji je ID broj: 3, sekvencu čiji je ID broj: 4 ili sekvencu čiji je ID broj: 5 koja je modifikovana najmanje jednom konzervativnom aminokiselinskom supstitucijom. U nekim rešenjima, peptid prema predmetnom pronalasku može da sadrži sekvencu čiji je ID broj: 1, sekvencu čiji je ID broj: 2, sekvencu čiji je ID broj: 3, sekvencu čiji je ID broj: 4 ili sekvencu čiji je ID broj: 5 koja je modifikovana najmanje jednom aminokiselinskom supstitucijom, gde je aminokiselina supstituisana aminokiselinom koja se javlja u prirodi. U nekim rešenjima, peptid prema predmetnom pronalasku može da sadrži sekvencu čiji je ID broj: 1, sekvencu čiji je ID broj: 2, sekvencu čiji je ID broj: 3, sekvencu čiji je ID broj: 4 ili sekvencu čiji je IĐ broj: 5 koja je modifikovana najmanje jednom aminokiselinskom supstitucijom gde je aminokiselina supstituisana D-aminokiselinom. U nekim rešenjima, peptid prema predmetnom pronalasku može da sadrži sekvencu čiji je ID broj: 1, sekvencu čiji je ID broj: 2, sekvencu čiji je ID broj: 3, sekvencu čiji je ID broj: 4 ili sekvencu čiji je ID broj: 5 koja je modifikovana najmanje jednom aminokiselinskom supstitucijom, gde je aminokiselina supstituisana N-metilovanom aminokiselinom. U nekim rešenjima, peptid prema predmetnom pronalasku može da sadrži sekvencu čiji je ID broj: 1, sekvencu čiji je ID broj: 2, sekvencu čiji je ID broj: 3, sekvencu čiji je ID broj: 4 ili sekvencu čiji je ID broj: 5 koja je modifikovana najmanje jednom aminokiselinskom supstitucijom, gde je aminokiselina supstituisana aminokiselinom koja se ne javlja u prirodi. U nekim rešenjima, peptid prema predmetnom pronalasku može da sadrži sekvencu čiji je ID broj: 1, sekvencu čiji je ID broj: 2, sekvencu čiji je ID broj: 3, sekvencu čiji je ID broj: 4 ili sekvencu čiji je ID broj: 5 koja je modifikovana najmanje jednom aminokiselinskom supstitucijom, gde je aminokiselina supstituisana mimetikom aminokiseline.
Alternativno, peptidi prema predmetnom pronalasku mogu da sadrže aminokiselinsku sekvencu izabranu iz tabele 1, koja je u stanju da se veže za FcRn i na taj način spreči da se FcRn veže za Fc deo molekula IgG. Predmetni pronalazak dalje obuhvata peptide koji sadrže varijante sekvenci navedenih u tabeli 1, gde te varijante obuhvataju, ali nisu ograničene na: skraćene sekvence, peptide koji dele najmanje 68%, 72%, 76%, 80%, 84%, 88%, 92% ili 96% identičnosti sa najmanje jednim od peptida u tabeli 1. Varijante takođe obuhvataju peptide koji sadrže sekvencu navedenu u tabeli 1, a koja sadrži najmanje jednu aminokiselinsku supstituciju, gde je aminokiselina supstituisana aminokiselinom koja se javlja u prirodi. aminokiselinom koja se ne javlja u prirodi, analogom aminokiseline ili mimetikom aminokiseline.
U jednom rešenju, peptidi prema predmetnom pronalasku mogu da sadrže aminokiselinsku sekvencu navedenu u tabeli 1, koja sadrži 1, 2, 3, 4, 5, 6, ili više konzervativnih aminokiselinskih sekvenci. U još jednom rešenju, peptidi prema predmetnom pronalasku mogu da sadrže aminokiselinsku sekvencu navedenu u tabeli 1 koja je supstituisana 1, 2, 3, 4, 5, 6 ili većim brojem aminokiselina koje se javljaju u prirodi.
U nekim rešenjima, peptidi prema predmetnom pronalasku mogu da sadrže neku od sekvenci navedenih u tabeli 1, koja je supstituisana 1, 2, 3, 4, 5, 6 ili većim brojem aminokiselina koje se ne javljaju u prirodi. U još jednom rešenju, peptidi prema predmetnom pronalasku mogu da sadrže neku od sekvenci navedenih u tabeli 1, koja je supstituisana 1, 2, 3, 4, 5, 6 ili većim brojem N-metilovanih aminokiselina. U još jednom rešenju, peptidi prema predmetnom pronalasku mogu da sadrže neku od sekvenci navedenih u tabeli 1, koja je supstituisana 1, 2, 3, 4, 5, 6 ili većim brojem aminokiselina sa D konfiguracijom. U još jednom daljem rešenju, peptidi prema predmetnom pronalasku mogu da sadrže neku od sekvenci navedenih u tabeli 1, koja je supstituisana 1, 2, 3, 4, 5, 6 ili većim brojem mimetika aminokiselina.
Primeri rešenja predmetnog pronalaska navedeni su u daljem tekstu. Mnoga od ovih rešenja podrazumevaju aminokiselinske sekvence navedene u tabeli 1, modifikovane jednom ili većim brojem aminokiselinskih supstitucija. Iako ova rešenja predstavljaju primere odgovarajućih supstitucija, treba da bude jasno da predmetni pronalazak obuhvata i druge supstitucije koje ne poništavaju biološku aktivnost peptida.
U jednom primeru rešenja, peptid prema predmetnom pronalasku sadrži aminokiselinsku sekvencu datu kao Sekvencu čiji je ID broj: 6 modifikovanu supstitucijom penicilamina umesto cisteina u položaju 6 i sarkozina umesto glicina u položaju 12 (gde su položaji aminokiselina dati prema obeležavanju redosleda aminokiselina u sekvenci čiji je ID broj: 6). U još jednom rešenju, peptid sadrži aminokiselinsku sekvencu datu kao sekvencu čiji je ID broj: 6 modifikovanu supstitucijom penicilamina umesto cisteina u položaju 6 i N-metillcucina umesto leucina u položaju 13.
U još jednom rešenju, peptid prema predmetnom pronalasku može da sadrži aminokiselinsku sekvencu datu kao Sekvencu čiji je ID broj: 6 modifikovanu supstitucijom cisteina u penicilamin u položaju 6, supstitucijom oba glicina u položajima 11 i 12, redom, pojedinačnim (3R)-amino-l-karboksimetil-2-valerolaktamom; te supstitucijom leucina N-metilleucinom u položaju 13.
U jednom rešenju, peptid prema predmetnom pronalasku može da sadrži aminokiselinsku sekvencu datu kao sekvencu čiji je ID broj: 6 modifikovanu supstitucijom cisteina u penicilamin u položaju 6, supstitucijom glicina sarkozinom u položaju 12 i supstitucijom leucina N-metilleucinom u položaju 13. U drugom rešenju. peptid prema predmetnom pronalasku može da sadrži aminokiselinsku sekvencu datu kao sekvencu čiji je ID broj: 6 modifikovanu supstitucijom cisteina u penicilamin u položaju 6, supstitucijom oba glicina u položajima 11 i 12, redom, pojedinačnim (3R)-amino-l-karboksimetilkaprolaktamom i supstitucijom leucina N-metilleucinom u položaju 13.
U jednom rešenju, peptid prema predmetnom pronalasku može da sadrži aminokiselinsku sekvencu datu kao Sekvencu čiji je ID broj: 6 modifikovanu supstitucijom cisteina u penicilamin u položaju 6, supstitucijom histidina 3-piridilalaninom u položaju 9, supstitucijom glicina sarkozinom u položaju 12 i supstitucijom leucina N-metilleucinom u položaju 13. U drugom rešenju, peptid prema predmetnom pronalasku može da sadrži aminokiselinsku sekvencu datu kao sekvencu čiji je ID broj: 6 modifikovanu supstitucijom cisteina u penicilamin u položaju 6, supstitucijom histidina u 4-guanilfenilalanin u položaju 9, supstitucijom glicina sarkozinom u položaju 12 i supstitucijom leucina N-metilleucinom u položaju 13. U još jednom daljem rešenju, peptid prema predmetnom pronalasku može da sadrži aminokiselinsku sekvencu datu kao sekvencu čiji je ID broj: 6 modifikovanu supstitucijom cisteina u penicilamin u položaju 6, supstitucijom histidina u 4-piridilalanin u položaju 9, supstitucijom glicina sarkozinom u položaju 12 i supstitucijom leucina N-metilleucinom u položaju 13.
U nekim rešenjima, peptidi prema predmetnom pronalasku mogu da postoje u obliku multimera, kao što je dimer, trimer ili tetramer. Peptidi u okviru multimera mogu da budu isti ili različiti. Peptidi mogu da se povežu u multimere na način koji je opisan u prethonom tekstu kao i u primerima koji slede.
U jednom rešenju, afinitet peptida prema predmetnom pronalsku za FcRn biće predstavljen vrednošću KDu opsegu od 50 fM do 1 mM. U drugom rešenju, afinitet peptida prema predmetnom pronalsku za FcRn biće predstavljen vrednošću Kdu opsegu od 50 fM do 100 pM, ili vrednošću u opsegu od 50 fM do 1 nM, ili vrednošću u opsegu od 1 pM do 1 nM. U još jednom rešenju, preparat koji sadrži najmanje jedan od peptida prema predmetnom pronalasku modulisaće koncentraciju IgG u serumu. U jednom rešenju, peptidi prema predmetnom pronalasku mogu da spreče vezivanje konstantnog regiona IgG za FcRn na taj . način što će se vezati za najmanje jednu aminokiselinu koja specifično interaguje sa konstantnim regionom IgG.
IIIPostupci dobijanja peptida prema predmetnom pronalasku
1. Opšti postupci sinteze peptida prema predmetnom pronalasku
Peptidi prema predmetnom pronalasku mogu da se sintetišu korišćenjem tehnika koje su u struci dobro poznate. Na primer, peptidi prema predmetnom pronalasku koji se sastoje samo od aminokiselina koje se javljaju u prirodi mogu da se sintetišu rekombinantnim postupcima unutar ćelija, korišćenjem polinukleotida koji kodiraju peptid. Videti, npr. Sambrook et al.,Molecular Cloning A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratorv, N.Y. (1989) i Ausubel et al.,Current Protocols in Molecular Biology,Greene Publishing Associates & Wiley Interscience, N.Y. (1989). Alternativno, peptidi prema predmetnom pronalasku mogu da se sintetišu pomoću poznatih postupaka sinteze kao što je sinteza na čvrstoj fazi. Videti, npr. Merrifield,Chemical Polypeptides,Katsovannis & Panavotis urednici, str. 335-61 (1973); Merrifield,J. Am. Chem. Soc.85:2149 (1963); Daviš et al.,Biochem. Intl.10:394 (1985); Finn et al.,The Proteins(3. izdanje) 2:105 (1976); Erikson et al.,The Proteins(3. izdanje) 2:257 (1976). Mogu da se koriste standardni protokoli Fmoc/tBu, kao što je to opisano u W. C. Chan & P. D. White, urednici,Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical ApproachOxford University Press Inc. New York (2000) i u U.S. Patentu br. 3,941,763. Alternativno, himerni proteini prema predmetnom pronalasku mogu da se sintetišu primenom kombinacije rekombinantnih i sintetskih postupaka.
2. Postupci za sintezu peptidnih analoga peptida prema predmetnom pronalasku
Kada se koriste u predmetnoj prijavi, dvadeset konvencionalnih aminokiselina i njihove skraćenice koriste se na konvencionalan način. VidetiImmunology— A Synthesis, 2.izdanje, E. S. Golub & D. R. Gren, urednici, Sinauer Associates, Sunderland, Mass (1991). Stereoizomeri (npr. D-aminokiseline) dvadeset konvencionalnih aminokiselina, neprirodne aminokiseline kao što su a-, a-disupstituisane aminokiseline, N-alkil aminokiseline, N-metilaminokiseline, mlečna kiselina i druge nekonvencionalne aminokiseline takođe mogu da budu odgovarajući sastojci polipeptida prema predmetnom pronalasku. Primeri nekonvencionalnih aminokiselina obuhvataju: aminoizobuternu kiselinu, 3-amino-l-karboksimetilvalerolaktam, 4-guanilfenilalanin, 5-aminopentansku kiselinu, 4-hidroksiprolin, y-karboksiglutamat, c-N,N,N-trimetillizin, e-N-acetillizin, O-fosfoserin, N-acetilserin, N-formilmetionin, 3-metilhistidin, 5-hidroksilizin, a-N-metilarginin, penicilamin, sarkozin, kao i druge slične aminokiseline i iminokiseline (npr. 4-hidroksiprolin). Kod obeležavanja polipeptida u predmetnom pronalasku, smer u levo je smer ka amino kraju dok je smer u desno smer ka karboksi kraju, u skladu sa standardnom primenom konvencija.
Konzervativne aminokiselinske supstitucije mogu da obuhvate aminokiselinske ostatke koji se ne javljaju u prirodi, a koji se obično ugrađuju hemijskom sintezom peptida a ne sintezom u biološkim sistemima. Oni obuhvataju peptidomimetike i druge obrnute ili invertne oblike aminokiselinskih ostataka.
Ostaci koji se javljaju u prirodi mogu da se podele u grupe na osnovu zajedničkih osobina bočnih lanaca: 1. hidrofobne: norleucin, Met, Ala, Val, Leu, Ile; 2. neutralne hidrofilne: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln; 3. kisele: Asp, Glu; 4. bazne: His, Lys, Arg;
5. ostatke koji utiču na orijentaciju lanca: Gly, Pro; i
6. aromatične: Trp, Tyr, Phe.
Na primer, nekonzervativne supstitucije mogu da obuhvataju supstituciju nekog od članova jedne od ovih grupa za jedan od članova iz neke druge grupe.
Kod uvođenja ovakvih promena, prema nekim rešenjima, može se uzeti u obzir hidropatički indeks aminokiselina. Svakoj aminokiselini dodeljen je hidropatički indeks na osnovu njene hidrofobnosti i naelektrisanja. Ov indeksi su: izoleucin (+4,5), valin (+4,2), leucin (+3,8), fenilalanin (+2,8), cistein/cistin (+2,5), metionin (+1,9), alanin (+1,8), glicin (-0,4), treonin (-0,7), serin (-0,8), triptofan (-0,9), tirozin (-1,3), prolin (-1,6), histidin (-3,2), glutamat (-3,5), glutamin (-3,5), aspartat (-3,5), asparagin (-3,5), lizin (-3,9) i arginin (-4,5).
Značaj hidropatskog indeksa aminokiselina u predavanju interaktivne biološke funkcije proteinu dobro je objašnjen u struci; Kyte et al.,J. Mol. Biol.157:105-131 (1982). Poznato je da neke aminokiseline mogu da se supstituišu drugim aminokiselinama koje imaju sličan hidropatski indeks ili broj a da i dalje zadrže sličnu biološku aktivnost. Kada se uvode promene na osnovu hidropatskog indeksa, u nekim rešenjima, obuhvaćena je supstitucija aminokiselina čiji se hidropatski indeksi nalaze u opsegu vrednosti od ±2. U nekim rešenjima, uključene su one koje se nalaze u opsegu od ±1, a u nekim rešenjima, one koje se nalaze u opsegu od ±0,5.
Takođe se podrazumeva u struci da supstitucija sličnih aminokiselina može efektno da se izvrši na osnovu hiđrofilnosti, posebno u onim slučajevima u kojima je biološki funkcionalni protein ili peptid koji nastaje na takav način namenjen za upotrebu u vezivanju za specifičan protein.
Ovim aminokiselinskim ostacima dodeljene su sledeće vrednosti hiđrofilnosti: arginin (+3,0), lizin (+3,0), aspartat (+3,0 ± 1), glutamat (+3,0 ± 1), serin (+0,3). asparagin (+0,2), glutamin (+0,2), glicin (0), treonin (-0,4), prolin (-0,5 ± 1), alanin (-0,5), histidin (-0,5), cistein (-1,0), metionin (-1,3), valin (-1,5), leucin (-1,8), tirozin (-2,3), fenilalanin (-2,5) i triptofan (-3,4). Kada se unose promene zasnovane na sličnoj hiđrofilnosti, u nekim rešenjima, obuhvaćena je supstitucija aminokiselina čije se hiđrofilnosti nalaze u opsegu vrednosti od ±2, u nekim rešenjima, uključene su one koje se nalaze u opsegu od ±1, a u nekim rešenjima, one koje se nalaze u opsegu od ±0,5.
Stručnjak u ovoj oblasti će biti u stanju da odredi odgovarajuće varijante polipeptida, kao što je ovde opisano, koristeći dobro poznate tehnike. U nekim rešenjima, stručnjak u ovoj oblasti će moći da odredi pogodne delove molekula, koje će biti moguće promeniti bez narušavanja aktivnosti, na taj način što će kao ciljne oblasti biti izabrane one za koje se veruje da nemaju uticaja na aktivnost. U nekim rešenjima, moguće je identifikovati ostatke i delove molekula koji su slični među sličnim polipeptidima. U nekim rešenjima, čak i oblasti koje bi mogle da budu važne za biološku aktivnost ili strukturu mogu da se podvrgnu konzervativnim aminokiselinskim supstitucijama bez narušavanja biološke aktivnosti ili bez nepoželjnih uticaja na strukturu polipeptida.
Uz to, stručnjak u ovoj oblasti može da pregleda studije odnosa strukture i funkcije, u kojima se identifikuju ostaci u sličnim peptidima važni za aktivnost ili strukturu. Imajući u vidu takvo poređenje, moguće je predvideti značaj aminokiselinskih ostataka u peptidu, koji odgovaraju aminokiselinskim ostacima koji su važni za aktivnost ili strukturu u sličnim peptidima. Stručnjak u ovoj oblasti može da se odluči za supstituciju hemijski sličnim aminokiselinama, za te aminokiselinske ostatke za koje se pretpostavlja da su značajni.
Stručnjak u ovoj oblasti takođe može da analizira trodimenizionalu strukturu i aminokiselinsku sekvencu u odnosi na tu strukturu kod sličnih peptida. Stručnjak u ovoj oblasti može da dobije varijante za ispitivanja, koje sadrže supstituciju pojedinačne aminokiseline na svakom željenom aminokiselinskom ostatku. Ove varijante potom mogu da se ispitaju pomoću testova aktivnosti koji su poznati stručnjacima u ovoj oblasti. Na primer, ukoliko se otkrije da supstitucija nekog konkretnog aminokiselinskog ostatka dovodi do nestanka, nepoželjnog narušavanja aktivnosti ili neodgovarajuće aktivnost, varijante koje sadrže takvu supstituciju mogu da se izbegnu. Drugim recima, na osnovu informacija dobijenih takvim rutinskim eksperimentima, osoba stručna u ovoj oblasti može lako da utvrdi koji su to aminokiselinski ostaci čiju supstituciju treba izbegavati, bilo samu ili u kombinaciji sa drugim mutacijama.
Prema nekim rešenjima, aminokiselinske supstitucije mogu da budu takve da: (1) smanjuju podložnost proteolizi, (2) smanjuju podložnost oksidaciji, (3) menjaju afinitet vezivanja koji je u vezi sa biološkom funkcijom i/ili (4) daju ili menjaju druga fizičko-hemijska ili funkcionalna svojstva takvih polipeptida. Prema nekim rešenjima, pojedinačne ili višestruke aminokiselinske supstitucije (u nekim rešenjima, konzervativne aminokiselinske supstitucije) mogu da se uvedu u sekvencu koja se javlja u prirodi (u nekim rešenjima, u delu polipeptida izvan domena koji gradi(e) međumolekulske kontakte). U nekim rešenjima, konzervativna aminokiselinska supstitucija tipično ne mora da dovede do značajne promene u strukturnim osobinama originalne sekvence (npr. aminokiselina koja je uvedena kao supstitucija ne bi trebalo da teži da naruši heliks koji se javlja u originalnoj sekvenci, ili da naruši druge vidove sekundarne strukture koji odlikuju originalnu sekvencu). Primeri sekundarnih i tercijarnih struktura poznatih u struci dati su uProteins, Structures and Molecular Principles,Creighton, urednik. W. H. Freeman & Companv, Nevv York (1984);Iniroduction to Protein Structure,C Branden & J. Tooze, urednici, Garland Publishing, Nevv York,N.Y. (1991); iThornton et al, Nature 354:105(1991).
U nekim rešenjima, derivati aminokiselina sadrže kovalcntnc modifikacije, koje obuhvataju, ali nisu ograničene na, hemijske veze sa polimerima, lipidima ili drugim organskim ili neorganskim ostacima. U nekim rešenjima, hemjski modifikovano sredstvo za specifično vezivanje može da ima duži poluživot u cirkukaciji od sredstva za specifično vezivanje koje nije hemijski modifikovano. U nekim rešenjima, hemijski modifikovano sredstvo za specifično vezivanje može da ima poboljšan kapacitet za odabir ciljnih ćelija, tkiva i/ili organa. U nekim rešenjima, derivat sredstva za specifično vezivanje je modifikovan tako da obuhvata jedan ili veći broj vezanih polimera, rastvornih u vodi, uključujući, ali se ne ograničavajući na, polietilen glikol, polioksietilen glikol ili propilen glikol. Videti, npr. U.S. patente br. 4,640,835; 4,496,689; 4,301,144; 4,670,417; 4,791,192; i 4,179,337. U nekim rešenjima, derivat sredstva za specifično vezivanje sadrži jedan ili veći broj polumera, koji obuhvataju, ali nisu ograničeni na, monometoksi polietilen glikol, dekstran, celulozu ili druge ugljenohidratne polimere, poli-(N-vinilpirolidon)-polietilen glikol, homopolimere propilen glikola, kopolimer polipropilen oksida/etilen oksida, polioksietilovane poliole (npr. glicerol) i polivinil alkohol, kao i smeše takvih polimera.
3. Postupci za sintezu analoga peptida prema predmetnom pronalasku
Analozi peptida se često koriste u farmaceutskoj industriji kao nepeptidni lekovi sa svojstvima analognim onim koje ima peptid koji je korišćen kao osnova za dobijanje analoga. Ove vrste nepeptidnih jedinjenja nazvane su "peptidni mimetici" ili "peptidomimetici". Fauchere,J. Adv. Drug Res.15:29 (1986); Veber & Freidinger,TINSstr. 392 (1985); i Evans et al.,J. Med. Chem.30:1229 (1987), koji su ovde inkorporirani u potpunosti po referenci. Ovakva jedinjenja se često razvijaju uz pomoć računarskog molekulskog modelovanja. Peptidni mimetici koji su strukturno slični terapeutski korisnim peptidima mogu da se koriste za postizanje sličnih terapeutskih ili profilaktičkih dejstava. Uopšteno posmatrano, peptidomimetici su strukturno slični polipeptidu koji je korišćen kao model (t.j. polipeptidu koji ima biohemijsku ili farmakološku aktivnost), kao što je humano antitelo, ali imaju jedan ili veći broj peptidnih veza opciono zamenjenih vezom izabranom iz grupe koja se sastoji od : -CH2NH-, -CH2S-, -CH2-CH2-, -CfUCH- (cis i trans), -COCH2-, - CH(OH)CH2- i -CFI2 SO-, postupcima koji su poznati u struci. Sistematska supstitucija jedne ili većeg broja aminokiselina u koncenzus sekvenci D-aminokiselinom iste vrste (npr. D-lizin umesto L-lizina) može da se koristi u nekim rešenjima za dobijanje stabilnijih peptida. Uz to, spregnuti proteini koji sadrže koncenzusnu sekvencu ili varijantu sekvence koja je značajno identična koncenzusnoj sekvenci mogu da se dobiju postucima koji su poznati u struci (Rizo and Gierasch,Ann. Rev. Biochem.61:387 (1992), koja je ovde inkorporirana u potpunosti po referenci), kao što je, na primer, dodavanje unutrašnjih ostataka cisteina koji su u stanju da grade unutarmolekulske disulfidne mostove, čime peptid ciklizuje.
Dimerizacija ili oligomerizacija peptida može da pojača aviditet peptidne sekvence za određeni receptor. Videti, npr. Johnson, et al.,Chem. Biol.12:939 (1997). Smatra se da dimeri i viši multimeri peptida prema predmetnom pronalasku mogu da se sintetišu upotrebom različitih postupaka poznatih u struci. Dimeri ili multimeri mogu da se sintetišu neposredno na peptidnom sintetajzeru kao neprekidna peptidna sekvenca. Alternativno, peptidni multimeri mogu da se sintetišu u reakciji pojedinačnih peptidnih monomera i multivalentnog vezivnog molekula ("linkera"). Videti, npr. Rose,J. Am. Chem. Soc.116:30 (1994). Još jedan primer sinteze peptidnih multimera je uvođenjem razgranatih vezivnih grupa pre sinteze peptidne sekvence, kao u sintezi "višestrukih antigenih peptida" ("multiple antigenic peptides", MAP). D. Posnett et. al.,J. Biol. Chem.263:1719 (1988). Predmetni pronalazak obezbeđuje novi postupak za dobijanje ovih peptidnih dimera koji podrazumeva reakciju N-terminalnog kraja peptida, dok su još na smoli, sa molekulom za povezivanje, na primer, ćilibarnom kiselinom, tako da će susedni peptidi na smoli (čvrstoj fazi) reagovati jedan sa drugim i graditi dimer peptida povezanih svojim N-terminalnim krajevima. Kasnije odvajanje sa smole daje peptidni dimer povezan na N-terminalnim krajevima.
4. Dobijanje ekspresionih vektora za ekspresiju peptida prema predmetnom
pronalasku
Nukleinske kiseline koje kodiraju peptide prema predmetnom pronalasku mogu da se sintetišu pomoću standardnih postupaka poznatih u struci, npr. pomoću automatizovanog sintetajzera za DNK (kakvi mogu da se nabave komercijalno preko Biosearch, Applied Biosvstems itd.). Dodatni postupci sinteze nukleinskih kiselina poznati su u struci. Videti, npr. U.S. patente br. 6,015,881; 6,281,331; 6,469,136. Za proizvodnju peptida prema predmetnom pronalasku pomoću rekombinantnih tehnika, polinukleotidne sekvence koje kodiraju peptide se uvode u odgovarajuće nosioce za ekspresiju, t.j. vektore, koji sadrže neophodne elemente za transkripciju i translaciju uvedene kodirajuće sekvence, ili, u slučaju virusnog RNK vektora, neophodne elemente za replikaciju i translaciju. Nukleinske kiseline koje kodiraju peptide prema predmetnom pronalasku uvode se u vektor u odgovarajućem okviru čitanja.
Vektori koji se koriste u transformaciji će obično sadržati marker na osnovu kojeg može da se vrši selekcija kojim se identifikuju transformanti. U bakterijskim sistemima, ovi markeri mogu da obuhvataju gen za rezistenciju na neki antibiotik, kao što je ampicilin ili kanamicin. Markeri na osnovu kojih je moguće vršiti selekciju, za upotrebu sa kulturama sisarskih ćelija obuhvataju gene koji donose rezistenciju na lekove, kao što su neomicin, higromicin i metotreksat. Marker za selekciju može da bude marker za selekciju koji je moguće amplifikovati. Jedan od markera za selekciju koje je moguće amplifikovati je DHFR gen ili DHFR cDNK. Simonsen and Levinson,Proc. Nail. Acad. Sci. USA80:2495 (1983). Pregled markera za selekciju dat je u Thilly( Mammalian Cell Technology,Buttervvorth Publishers, Stoneham, MA (1986)) a izbor markera za selekciju je u okviru uobičajene prakse i znanja stručnjaka u ovoj oblasti. Markeri za selekciju takođe mogu da se uvedu u ćeliju na odvojenom plazmidu u isto vreme kada i ciljni gen, ili oba gena mogu da se unesu na istom plazmidu. Ukoliko se nalaze na istom plazmidu, marker za selekciju i ciljni gen mogu da budu pod kontrolom različitih promotora ili istog promotora, pri čemu ovaj poslednji način organizacije daje bicistronsku poruku. Sistemi ovog tipa poznati su u struci (npr. U.S. Patent br. 4,713,339).
Ekspresioni elementi u ekspresionom sistemu razlikuju se po svojoj snazi i specifičnosti. U zavisnosti od sistema domaćina/vektora koji se koristi, u ekspresionom vektoru može se upotrebiti bilo koji od velikog broja pogodnih transkripcionih i translacionih elemenata, uključujući konstitutivne i inducibilne promotere. Na primer, kada se kloniranje vrši u bakterijskom sistemu, inducibilni promoteri kao što su pL bakteriofagaX,mogu da se koriste plac, ptrp, ptac (ptrp-lac hibridni promoter) i slični; kada se kloniranje vrši u sistemima ćelija insekata, mogu da se koriste promoteri kao što je promoter polihedronskog bakulovirusa; ako se kloniranje vrši u sistemima biljnih ćelija, mogu da se koriste promoteri izvedeni iz genoma biljnih ćelija (npr. promoteri toplotnog šoka, promoter za malu podjedinicu RUBISCO, promoter za vezivni protein za hlorofil a/b) ili iz biljnih virusa (npr. 35S RNK promoter CaMV, promoter proteina omotača TMV); kada se kloniranje vrši u sistemima ćelija sisara, mogu da se koriste promoteri izvedeni iz genoma ćelija sisara (npr. metalotionein promoter) ili virusa koji napadaju sisare (npr. kasni promoter adenovirusa, 7,5 K promoter vakcinija virusa); kada se proizvode ćelijske linije koje sadrže višestruke kopije proizvoda namenjenog ekspresiji, mogu da se koriste vektori zasnovani na SV40-, BPV- i EBV- uz odgovarajući marker za selekciju.
U slučajevima u kojima se koriste biljni ekspresioni vektori, ekspresija sekvenci koje kodiraju linearne ili neciklizovane oblike himernih proteina prema predmetnom pronalasku može da bude pod kontrolom bilo kog broja promotera. Na primer, mogu da se koriste virusni promteri kao što su 35S RNK i 19S RNK promoteri CaMV (Brisson et al.,Nature310:511-514 (1984)), ili promoter proteina omotača TMV (Takamatsu et al.,EMBOJ.6:307-311
(1987)); alternativno, mogu da se koriste biljni promoteri kao što su promoter za malu podjedinicu RUBISCO (Coruzzi et al.,EMBOJ.3:1671-1680 (1984); Broglie et al.,Science224:838-843 (1984)), ili promoteri proteina toplotnog šoka npr. hspl7.5-E ili hspl7.3-B iz soje (Gurley et al.,Mol. Cell. Biol.6:559-565 (1986)). Ovi konstrukti mogu da se uvedu u ćeliju pmoću Ti plazmida, Ri plazmida, vektora biljnih virusa, direktnom transformacijom DNK, mikroinjekcijom, elektroporacijom itd. Weissbach & Weissbach,Methods far Plant Molecular Biology,Academic Press, NY, Section VIII, str. 421-463 (1988) i Grierson & Corey,Plant Molecular Biology,2. izdanje, Blackie, London, poglavlja 7-9 (1988).
U jednom ekspresionom sistemu insekata koji može da se koristi za dobijanje himernih proteina prema predmetnom pronalasku, kao vektor za ekspresiju stranih gena koristi se nuklearni polihidrozni virusAutographa californica(AcNPV). Virus raste u ćelijamaSpodoptera Frugiperda.Kodirajuća sekvenca može da se klonira u ne-esencijalne delove (npr. u polihedronski gen) virusa i da se stavi pod kontrolu AcNPV promotera (na primer, polihedronskog promotera). Uspešno ubacivanje kodirajuće sekvence dovodi do inaktivacije polihedronskog gena i proizvodnje rekombinantnog virusa bez omotača (t.j. virusa koji nema proteinski omotač koji kodira polihedronski gen). Ovi rekombinantni virusi se potom koriste za infekciju ćelijaSpodoptera frugiperdau kojima se ubačeni gen eksprimira (videti, npr. Smith et al.,J. Virol.46:584 (1983); U.S. Patent br. 4,215,051). Dalji primeri ovog ekspresionog sistema mogu da se nađu u Ausubel et al., urednici, Current Protocols in Molecular Biology, tom 2, Greene Publish. Assoc. & Wiley Interscience (1989).
Još jedan sistem koji može da se koristi za ekspresiju peptida prema predmetnom pronalasku je ekspresioni sistem gena za glutamin sintetazu, koji se još naziva i "GS ekspresioni sistem" (Lonza Biologics PLC, Berkshire, Velika Britanija). Ovaj ekspresioni sistem detaljno je opisan u U.S. Patentu br. 5,981,216.
Veći broj ekspresionih sistema zasnovanih na virusima može da se koristi u sisarskim ćelijama - domaćinima. U onim slučajevima u kojima se kao vektor koristi adenovirus, kodirajuća sekvenca može da se veže za kontrolni kompleks transkripcije/translacije adcnovirusa, npr. kasni promoter i trodelnu vodeću sekvencu. Ovaj himerni gen može da se ubaci u genom adenovirusa pomoću in vitro ili in vivo rekombinacije. Ubacivanje neesencijalnog regiona viralnog genoma (npr. regiona El ili E3) dovodi do nastanka rekombinatnog virusa koji može da preživi i koji je u stanju da eksprimira dati peptid u inficiranim domaćinima. Videti, npr. Logan & Shenk, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3655
(1984). Moguće je, takođe, upotrebiti i 7.5 K promoter vakcinije, videti, npr. Mackett et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:7415 (1982); Mackett et al., J. Virol. 49:857 (1984); Panicali et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:4927 (1982).
5.Ekspresija peptida prema predmetnom pronalasku u pogodnoj ciljnoj ćeliji
Vehikulumi za ekspresiju mogu da se transficiraju ili ko-transficiraju u odgovarajuću ciljnu ćeliju, kako bi se eksprimirali polipeptidi prema predmetnom pronalasku. Tehnike za transfekciju koje su poznate u struci obuhvataju, ali nisu ograničene na, taloženje kalcijum fosfatom (Wigler et al.,Cell 14:725(1978)), elektroporaciju (Neumann et al,EMBO, J.1:841
(1982)) i reagense na sa lipozomskom osnovom. Različiti sistemi za ekspresiju domaćin-vektor mogu da se koriste za ekspresiju himernih proteina koji su ovde opisani, uključujući i prokariotske i eukariotske ćelije. One obuhvataju, ali nisu ograničene na, mikroorganizme kao što su bakterije (npr.E. coli)transformisane rekombinantnom DNK bakteriofaga ili DNK plazmidnog ekspresionog vektora koji sadrži odgovarajuću kodirajuću sekvencu; ekspresione vektore za kvasac ili filamentozne gljive koji sadrže odgovarajuću sekvencu; sisteme ćelija insekata inficirane ekspresionim vektorima rekombinantnih virusa (npr. bakulovirus) koji sadrže odgovarajuću kodirajuću sekvencu; sisteme biljnih ćelija inficirane ekspresionim vektorima rekombinantnih virusa (npr. mozaični virus karfiola ili mozaični virus duvana) ili transformisane plazmidnim rekombinantnim ekspresionim vektorima (npr. Ti plazmidom) koji sadrže odgovarajuću sekvencu; ili sisteme životinjskih ćelija, uključujući ćelije sisara (npr. CHO, Cos, HeFa ćelije).
6. Postupci sinteze fuzionisanih molekula koji sadrže peptide prema predmetnom pronalasku
U nekim rešenjima, peptidi prema predmetnom pronalasku postoje u obliku fuzionisanih proteina - fuzija, koji sadrže peptid prema predmetnom pronalasku i fuzioni partner. U jednom rešenju, fuzioni partner donosi osobine, kao što su jedna ili veći broj sledećih osobina: produženi poluživot, stabilnost, poboljšani transport peptida prema predmetnom pronalasku i/ili može da poboljšava efikasnostin vivoiliin vitro.
Uz to, heterologi polipeptidi prema predmetnom pronalasku mogu da se kombinuju sa delovima konstantnog domena imunoglobulina (IgG), čime se dobijaju himerni polipeptidi. Ovi konkretni fuzionisani molekuli olakšavaju prečišćavanje i pokazuju duži poluživotin vivo.Ovo je pokazano, na primer, kod himernih proteina koji se sastoje od prva dva domena humanog CD4 polipeptida i različitih domena konstantnih regiona teškog ili lakog lanca sisarskih imunoglobulina. EP 0 394 827; Traunecker et al.,Nature,331:84-86 (1988). Fuzionisani molekuli koji imaju disulfidno vezanu dimernu strukturu, u nekim slučajevima mogu, zahvaljujući svom IgG delu, da budu efikasniji u vezivanju i neutralizaciji drugih molekula od, na primer, monomernog polipeptida ili samoh polipeptidnog fragmenta. Videti, npr. Fountoulakis et al.,./Biochem.270:3958-3964 (1995).
Predmetni pronalazak, takođe, obezbeđuje polinukleotid koji kodira fuzionisani molekul bilo kog od peptida koji su prethodno opisani. Ovaj polinukleotid može da bude deo vektora koji takođe sadrži regulatornu sekvencu za transkripciju polinukleotida. Predmetni pronalazak dalje obezbeđuje ćeliju domaćina koja sadrži bilo koji od fuzionisanih molekula koji su prethodno opisani, polinukleotid koji kodira fuzionisani molekul bilo kog od ovih peptida, ili vektor koji sadrži polinukleotid koji kodira fuzionisani molekul bilo kog od ovih peptida i regulatornu sekvencu za transkripciju tog polinukleotida. Predmetni pronalazak, dalje, obezbeđuje preparat koji sadrži bilo koji od fuzionisanih molekila ili nukleotida koji su prethodno opisani i/ili bilo koji od vektora ili ćelija domaćina koji su prethodno opisani i pufer ili farmaceutski prihvatljivi nosilac.
a.Fuzionisani molekuli koji sadrže Fc domene antitela
U jednom rešenju, peptid prema predmetnom pronalasku može da bude konjugovan sa Fc domenom IgG da bi produžio njegov poluživot u cirkulaciji. U nekim rešenjima, peptidi su kovalentno vezani za Fc domen. Postupci dobijanja himernih proteina koji sadrže Fc domen imunoglobulina, upotrebom rekombinantnih tehnika, kao i polu-sintetski, dobro su poznati stručnjaku u ovoj oblasti. Na primer, u derivat peptida može da se ugradi aldehid, koji potom stupa u reakciju sa Fc proteinom uz upotrebu reakcije reduktivnog alikovanja koje je selektivno zaN-kraj Fc.Kinstler, Adv. Drug Del. Rev.54:477 (2002). Alternativno, moguće je izvesti reakciju između peptidnog tioestra i Fc koji nosi ostatak cisteina na N kraju, Oawson &KerA, Ann. Rev. Biochem.69:923 (2000).
Ovakvi fuzioni derivati peptid-Fc mogu da imaju pojačanu sposobnost sprečavanja interakcije IgG-FcRn usled toga što imaju dva dodatna mesta za vezivanje FcRn na Fc domenu. Ovakve peptid-Fc fuzije takođe mogu da štite peptid od degradacije i time pojačaju njegovu delotvornostin vivo.Fuzionisani proteini koji imaju disulfidno vezanu dimernu strukturu zahvaljujući svom IgG delu takođe mogu da budu efikasniji u vezivanju i neutralizaciji drugih molekula, nego što je to slučaj sa peptidima prema predmetnom pronalasku, na primer, kao stoje to opisano u Fountoulakis el al., J. Biochem., 270:3958-3964
(1995).
U rešenjima u kojima je peptid prema predmetnom pronalasku deo fuzionisanog proteina sa IgG Fc domenom, humani Ig Fc može da sadrži region šarke, CH2 i CH3 domene humanog IgG, kao što su humani IgGl, IgG2 i IgG4. Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje fuzionisani molekul koji sadrži peptid prema predmetnom pronalasku i varijantu Fc polipeptida ili fragment varijante Fc polipeptida, gde ta Fc sadrži region šarke, CH2 i CH3 domene humanog IgG, sa Pro331 Ser mutacijom, kao što je opisano u U.S. patentu br. 6,900,292.
Odgovarajući Fc domeni za konjugaciju sa peptidima prema predmetnom pronalasku obuhvataju one koji imaju imitirane aminokiseline u odabranim položajima Fc regiona, koje prigušuju njegove efektorske funkcije (uključujući citotoksičnost zavisnu od antitela i citotoksičnost zavisnu od komplementa). Na primer, Fcy2varijanta sa Pro331Ser mutacijom ima manju aktivnost prema komplementu nego prirodni Fcy2i ne vezuje se za FcyR. IgG4 Fc ne aktivira kaskadu komplementa a njegov afinitet za vezivanje za FcyR je za red veličine niži od afiniteta najaktivnijeg izotopa IgGl. U jednom rešenju, peptid prema predmetnom pronalasku je konjugovan ta Fcy4varijantu sa mutacijom Leu235Ala koja pokazuje minimalne efektorske funkcije kada se uporedi sa prirodnim FcY4. U još jednom rešenju, peptid prema predmetnom pronalasku je konjugovan Fcyisa mutacijama Leu234Val, Leu235Ala i Pro331Ser koje takođe pokazuju manju efektorsku funkciju od prirodnog Fcyi.
b. Fuzionisani molekuli koji sadrže albumin
U nekim rešenjima, peptidi prema predmetnom pronalasku mogu da budu konjugovani za ostatke koji vezuju albumin. Ovakvi konjugati peptida i ostataka koji vezuju albumin mogu da imaju duže poluživotein vivoi stoga mogu da zahtevaju primenu niže doze peptida za postizanje željenog terapeutskog dejstva. Chuang et al.,Pharm. Res.19:569 (2002); U.S. Patent br. 6,685,179. Tako, jedno rešenje prema predmetnom pronalasku obezbeđuje fuzionisani molekul koji sadrži peptid prema predmetnom pronalasku sa albuminskim fuzionim partnerom, koji sadrži albumin, jedan ili veći broj fragmenata albumina, peptid koji vezuje albumin i/ili molekul koji je u konjugaciji sa lipidom ili drugim molekulom koji vezuje albumin.
Postupci za dobijanje fuzionisanih proteina koji sadrže albumin su poznati u struci. Na primer, pokazano je da peptidi modifikovani reagensima za dodavanje hidrofobnih aromatičnih grupa na krajevima molekula nekovalentno vezuju albumin i produžavaju poluživot peptida kod zečeva Zobel et. al.,Bioorg. Med. Chem. Lett.13:1513 (2003). Kao još jedan primer, pokazano je da se peptidi modifikovani reaktivnim tiolnim grupama kovalentno vezuju za jedan slobodni ostatak cisteina na serum albuminu Kim et. al,Diabetes52:751 (2003).
c. Fuzionisani molekuli sa pegilovanim ostacima
U jednom rešenju, peptid prema predmetnom pronalasku može da bude pegilovan, tako da sadrži mono- ili poli- PEG ostatke (npr. 2 do 4). Pegilacija može da se izvrši pomoću bilo koje od reakcija pegilacije koje su poznate u struci. Postupci za dobijanje pegilovanih proteinskih proizvoda, uopšteno posmatrano, podrazumevaju (a) reakciju između polipeptida i polietilen glikola (kao što je reaktivni estarski ili aldehidni derivat PEG), pod uslovima u kojima se peptid prema predmetnom pronalasku vezuje za jednu ili više PEG grupa; i (b) dobijanje proizvoda reakcije. Uopšteno posmatrano, optimalni reakcioni uslovi za reakcije određivaće se za svaki slučaj posebno, na osnovu poznatih parametara i željenog rezultata.
Postoji nekoliko postupaka za dodavanje PEG koji su dostupni stručnjacima u ovoj oblasti, koji su opisani u, na primer, EPO 401 384; Malik et al.,Exp. Hematol,20:1028-1035
(1992); Francis,Focus on Growth Factors,3(2):4-10 (1992); EP 0 154 316; EP 0 401 384; WO 92/16221; i WO 95/34326. Na primer, korak pegilacije peptida prema predmetnom pronalasku može da se izvrši pomoću reakcije acilovanja ili alkilovanja sa reaktivnim molekulom polietilen glikola.
Tako, peptidi prema predmentom pronalasku obuhvataju pegilovane peptide gde su jedna ili veći broj PEG grupa vezani preko acil ili alkil grupa. Ovakvi peptidi mogu da budu monopegilovani ili polipegilovani (na primer, mogu da sadže 6 ili od 2 do 5 PEG grupa). PEG grupe su obično vezane za peptid na a- ili s- amino grupama aminokiselina, ali smatra se da PEG grupe mogu da budu vezane za bilo koju aminogrupu na peptidu koja je dovoljno reaktivna da se veže za PEG grupu u pogodnim reakcionim uslovima.
Pegilacija acilovanjem obično podrazumeva reakciju između reaktivnog derivata polietilen glikola (PEG) i peptida prema predmetnom pronalasku. Za reakcije acilovanja, odabrani polimeri obično imaju jednu reaktivnu estarsku grupu. Za izvođenje reakcije pegilovanja može da se koristi bilo koji poznati reaktivni molekul PEG, kao i bilo koji molekul PEG koji ćc tek biti otkriven. Primer pogodnog aktiviranog estra PEG jc PEG esterifiovan za N-hidroksisukcinimid (NHS). Kada se koristi u predmetnoj prijavi, pod acilovanjem se podrazumevaju, bez ograničavanja, sledeće vrste veza između peptida prema predmetnom pronalasku i polimera kao što je PEG: amidna, karbamatna, uretanska i slične. Videti, npr. Chamovv,Bioconjugate Chem.,5:133-140 (1994). Uslovi reakcije mogu da se izaberu između svih reakcionih uslova koji su poznati u oblasti pegilacije ili svih reakcionih uslova koji će tek biti otkriveni, ali bi trebalo izbegavati uslove kao što su temperatura, rastvarač ili pH koji bi doveli do inaktivacije peptida prema predmetnom pronalasku.
Pegilacija acilovanjem će obično dati polipegilovani peptid prema predmetnom pronalasku. Veza za povezivanje dva molekula može da bude amidna. Dobijeni proizvod može suštinski da bude samo (npr. 95%) mono, di ili tripegilovan. Ipak, neki molekuli sa većim stepenom pegilacije mogu da se dobiju u količinama koje će zavisiti od specifičnih reakcionih uslova koji se koriste. Ukoliko je poželjno, veći broj čistih pegilovanih vrsta mogu da se izdvoje iz smeše (posebno molekula koji nisu izreagovali) pomoću standardnih tehnika prečišćavanja, uključujući, između ostalih, dijalizu, isoljavanje, ultrafiltraciju, jonoizmenjivačku hromatografiju, gel filtraciju i elektroforezu.
Pegilacija alkilovanjem podrazumeva reakciju između derivata PEG sa terminalnom aldehidnom grupom, sa peptidom prema predmetnom pronalasku, u prisustvu redukcionog sredstva. Za redukcionu reakciju alkilacije, odabrani polimer(i) bi trebalo da ima(ju) samo jednu reaktivnu aidehidnu grupu. Primer reaktivnog PEG aldehida, je polietilenglikol propionaldehid, koji je stabilan u vodi, ili njegovi mono Cl do CIO alkoksi ili ariloksi derivati. Videti, npr. U.S. patent br. 5.252,714.
7. Prečišćavanje biološki eksprimiranih peptida prema predmetnom pronalasku
U zavisnosti od ekspresionog sistema koji se koristi, eksprimirani peptid prema predmetnom pronalasku se potom izoluje prema procedurama koje su dobro poznate u struci (npr. afinitetna hromatografija, ekskluziona hromatografija na osnovu veličine, j onoizmenj ivačka hromatografij a).
Ekspresioni vektori mogu da kodiraju dodatke (obeleživače, "tags" prim. prev.) koji omogućavaju lako prečišćavanje rekombinantno prečišćenog himernog proteina. Primeri obuhvataju, ali nisu ograničeni na, vektor pUR278 (Ruther et al.,EMBOJ.2:1791 (1983)) u kojem je DNK koja kodira peptid prema predmetnom pronalasku vezana za vektor u istom ramu sa lac z kodirajućim regionom, tako da se dobija hibridni protein; pGEX vektori mogu da se koriste za ekspresiju himernih proteina predmetnog pronalaska sa glutation S-transferaznim (GST) obeleživačem. Ovi proteini su obično rastvorni i mogu lako da se prečiste iz ćelija adsorpcijom na glutation-agarozne granule, nakon čega se eluiraju u prisustvu slobodnog glutationa. Vektori obuhvataju mesta za isecanje (trombinom ili Faktor Xa proteazom, ili PreScission Protease™ (Pharmacia, Peapack, NJ.)) za lako uklanjanje obeleživača nakon prečišćavanja.
Da bi se povećala efikasnost proizvodnje, polinukleotidi mogu da budu napravljeni tako da kodiraju veći broj jedinica peptida prema predmetnom pronalasku, razdvojenih mestima za isecanje enzimima. Dobijeni polipeptid može da se iseče (dejstvom odgovarajućeg enzima) kako bi se dobile peptidne jedinice. Na ovaj način povećava se prinos peptida koji se nalaze pod kontrolom jednog promotora. Kada se koriste u pogodnim virusnim ekspresionim sistemima, translacijom svakog od peptida prema predmetnom pronalasku kodiranom na mRNK upravlja se interno, u transkriptu, npr. njom upravlja interno ulazno mesto na ribozomu (IRES). Na taj način, policistronski konstrukt upravlja transkripcijom pojedinačne, velike policistronske mRNK koja, opet, upravlja translacijom većeg broja pojedinačnih polipeptida. Ovaj pristup eliminiše proizvodnju i enzimsku obradu poliproteina i može značajno da poveća prinos peptida prema predmetnom pronalasku koji su pod kontrolom pojedinačnog promotera.
Ćelije domaćini koje sadrže DNK konstrukte koji kodiraju peptide prema predmetnom pronalasku mogu da se gaje u odgovarajućoj hranljivoj podlozi, t.j. u podlozi koja sadrži hranljive sastojke neophodne za rast ćelija. Hranljivi sastojci neophodni za rast ćelija mogu da obuhvataju izvor ugljenika, izvor azota, esencijalne aminokiseline, vitamine, minerale i faktore rasta. Podloga može opciono da sadrži goveđi serum teleta ili fetalni serum teleta. U jednom rešenju, podloga suštinski ne sadrži IgG. Hranljiva podloga će, uopšteno posmatrano, vršiti selekciju onih ćelija koje sadrže posmatrani konstrukt DNK, na osnovu, na primer, selekcije na osnovu leka, ili nedostatka esencijalnog hranljivog satojka koji je nadomešten genom za selekciju koji se ili nalazi na DNK konstruktu ili je transficiran zajedno sa DNK konstruktom. Ćelije sisara u kulturi se obično gaje na komercijalno dostupnim podlogama koje sadrže ili ne sadrže serum (npr. MEM, DMEM). Odabir odgovarajuće podloge za rast konkretne ćelijske linije je u okviru uobičajeniih sposobnosti i znanja stručnjaka u ovoj oblasti.
Peptidi prema predmetnom pronalasku mogu da se proizvode u transgenim životinjama, kao što su glodari, krave, svinje, ovce, koze ili druge životinje, različite od ljudi, kod kojih je strani genom ugrađen u njihov genom. Obzirom daje ovaj gen prisutan u polnim tkivima, prenosi se sa roditelja na potomstvo. Strani (egzogeni) geni se unose u jednoćelijske embrione (Brinster et al.,Proc. Nad. Acad. Sci. USA82:4438, 1985). Postupci dobijanja transgenih životinja poznati su u struci, uključujući transgene životinje koje proizvode molekule imunoglobulina. Wagner et al.,Proc. Nali. Acad. Sci. USA78:6376 (1981): McKnight et al,Cell34:335 (1983); Srinster et al.,Nature306:332 (1983); Ritchie et al.,Nature312:517 (1984); Baldassarre et al,Theriogenology59:831 (2003); Robi et al.,Theriogenology59:107 (2003); Malassagneetal., Xenotransplantation10(3):267 (2003).
8. Postupci za testiranje i otkrivanje peptida koji vezuju FcRn i sprečavaju interakciju FcRn-IgG
Peptidi koji se vezuju za FcRn mogu da se identifikuju pomoću fagnih biblioteka za prikazivanje gena. Fagne biblioteke za prikazivanje gena mogu lako da se dobiju kao što je opisano u Smith & Petrneko,Chem. Rev.87:391 (1997). Alternativno, fagne biblioteke za prikazivanje gena mogu da se dobiju iz komercijalnih izvora, kao što su, npr. Dyax Corp.
(Cambridge, MA). U zavisnosti od uslova testiranja, fag može da se prepozna pomoću širokog spektra različitih osobina. Da bi se prepoznali peptidi koji vezuju FcRn (te time kompetiraju sa IgG za vezivanje za FcRn), fagna biblioteka može da se testira na vezivanje za FcRn i na kompeticiju sa IgG. Peptidi koji se vezuju za alternativne receptore mogu, opciono, da budu uklonjeni iz biblioteke inkubiranjem fagne biblioteke sa jednim ili većim brojem alternativnih receptora. Na taj način, fagi koji vezuju drugi(e) receptor(e) bi bili uklonjeni iz skupa poželjnih faga. Sekvenciranjem DNK klonova faga koji su u stanju da se vežu za FcRn, mogu da se prepoznaju peptidi koji su u stanju da se vežu za FcRn i spreče vezivanje IgG-FcRn.
Primeri drugih postupaka za identifikaciju peptida koji vezuju FcRn uključuju: prikazivanje mRNK (Roberts & Szostak,Proc. Nat. Acad. Sci. USA94:12297 (1997), prikazivanje na osnovu ćelija (Boder & Wittrup,Nat. Biotechnol.15:553 (1997), i bibilioteke sintetičkih peptida (Lam,Nature354:82 (1991); Houghten et. al.,Nature354:84(1991)).
9. Postupci za testiranje peptida koji se vezuju za FcRn i sprečavaju interakciju FcRn-IgG
Postoji veći broj postupaka koji mogu da se koriste za procenu sposobnosti peptida ili peptidomimetika da se veže za FcRn i spreči interakciju FcRmlgG. Na primer, površinska plazmonska rezonancija (SPR, "Surface Plasmon Resonance") je postupak koji je dobro poznat u struci za procenu vezivanja (Biacore AB, Uppsala, Švedska). U ovom postupku, jedan od partnera u vezivanju (FcRn ili IgG) se imobiliše na senzorski čip SRP dok se drugi patner prevlaci preko čipa, te se prati dobijem signal. U istom eksperimentu, peptid koji se ocenjuje kao kompetitor interakcije između IgG i FcRn se prevlaci preko čipa. Bilo kakvo smanjenje signala može da se tumači kao mera sposobnosti tog peptida da spreči interakciju između FcRn i IgG.
U struci su, takođe, dobro poznati i drugi postupci za ispitivanje potencijalnih peptidnih inhibitora interakcije FcRn:IgG. Jedan takav postupak je IgG kompetitivni test u formatu ploče sa 96 polja. U ovom primeru testa, rastvorni humani FcRn na ploči sa 96 polja se izlaže IgG-u i posmatranom peptidu. Preostali vezani IgG, koji se detektuje pomoću anti-IgG antitela i standardnih ELISA reagenasa za vizuelizaciju, ukazuje na meru sposobnosti tog peptida da spreči interakciju između FcRn i IgG.
Sposobnost peptida da spreči vezivanje FcRn i IgG može da se ispoljava i na ćelijama transficiranim sa DNK koje kodiraju humani FcRn, kako bi se dobila ćelijska linija koja je u stanju da eksprimira humani FcRn na svojoj površini. Test kompetitivnog vezivanja može da se primeni u onim slučajevima u kojima peptidi koji inhibiraju vezivanje IgG-FcRn kompetiraju sa fluorescentno označenim IgG molekulom. Koncentracija preostalog IgG vezanog za ćeliju može, na taj način, da se meri upotrebom standardnog sortera za ćelije koji se aktivira fluorescencijom (FACS).
d. Upotreba peptida prema predmetnom pronalasku
Peptidi prema predmetnom pronalasku se vezuju za FcRn i sprečavaju vezivanje Fc dela konstantnog regiona IgG za FcRn, čime dovode do pojačanog katabolizma IgG u poređenju sa katabolizmom IgG u odsustvu peptida prema predmetnom pronalasku. U primerima rešenja predmetnog pronalaska, konstantni region IgG je iz IgGl, IgG2, IgG3 ili IgG4 podklase. U konkretnim rešenjima, konstantni region IgG je iz IgGl, IgG2 ili IgG4 podklase. Peptidi prema predmetnom pronalasku su stoga korisni u lečenju bilo koje bolesti ili stanja, gde je poželjan pojačani katabolizam IgG. Na primer, peptidi prema predmetnom pronalasku mogu da se koriste za lečenje autoimunog oboljenja, zapaljenskog poremećaja, kardiovaskularne bolesti sa zapaljenskom etiologijom (npr. arterijska skleroza), odbacivanja transplanta i/ili bolesti graft protiv fomaćina (GVHD, "Graft Versus Host Disease"). Peptidi prema predmetnom pronalasku takođe mogu da se koriste za detekciju FcRn kod pacijenta ili u biološkom uzorku (npr. uzorku telesne tečnosti, tkiva ili ćelija, supernatantu iznad kulture ćelija). Peptidi prema predmetnom pronalasku takođe mogu da se koriste za prečišćavanje FcRn iz biološkog uzorka (npr. uzorka telesne tečnosti, tkiva ili ćelija, supernatanta iznad kulture ćelija).
Stoga, predmetni pronalazak obezbeđuje postupak regulisanja bolesti koja se odlikuje neodgovarajuće eksprimiranim IgG antitelima ili nepoželjnim koncentracijama ili količinama IgG. koji podrazumeva primenu terapeutski delotvorne količine peptida prema predmetnom pronalasku. U jednom rešenju, ta bolest je izabrana iz grupe koja se sastoji od zapaljenskih bolesti, autoimunih bolesti i kancera. U drugim rešenjima, predmetni pronalazak obezbeđuje postupak regulisanja bolesti pomoću modulacije koncentracije IgG u serumu. U nekim rešenjima, postupci prema predmetnom pronalasku mogu da se koriste za lečenje, prevenciju ili regulisanje reakcije imunog sistema na terapeutski protein, kao što je, npr. eritropojetin, enzim skladištenja u lizozomima ili faktor zgrušavanja krvi, kao što je, npr. fibrinogen, protrombin, faktor V, faktor VII, faktor VIII, faktor IX, faktor X, faktor XI, faktor XII, faktor XIII ili Von Vilebrandov faktor. U drugim rešenjima, postupci prema predmetnom pronalasku mogu da se koriste za lečenje, prevenciju ili regulisanje reakcije imunog sistema na vektor genske terapije.
1. Autoimune bolesti
Peptidi prema predmetnom pronalasku mogu da se koriste za lečenje bolesti koje obuhvataju, ali nisu ograničene na, alopecia areata, ankilozujući spondilitis, Antifosfolipidni sindrom, autoimunu Adisonovu bolest, autoimunu hemolitičku anemiju, autoimuni hepatitis, autoimuni limfoproliferativni sindrom (ALPS), autoimunu trombocitopenijsku purpuru (ATP), Beketovu bolest, bulozni pemfigoid, karđiomiopatiju, gluten-senzitivna enteropatija - Dermatitis Herpetiformis, sindrom imune disfunkcije koji dovodi do hroničnog zamora (CFIDS), hroničnu zapaljensku demijelinizujuću polineuropatiju, pemphigoides cicatricalis, CREST sindrom, bolest hladnog aglutinina, Kronovu bolest, Degosovu bolest, dermatomiozitis, juvenilni dermatomiozitis, diskoidni lupus, esencijalnu mešanu krioglobulinemiju, fibromijalgiju - fibromiozitis, Grejvsovu bolest, Gijan-Bare-Hašimotov tiroiditis, idiopalsku pulmonarnu fibrozu, idiopatsku trombocitopeniju purpuru (ITP), IgA nefropatiju, insulin zavisni dijabetes, juvenilni artritis, Lichen Planus, lupus, Menijerovu bolest, mešnu bolest vezivnih tkiva, multiplu sklerozu, mijasteniju gravis (MG), Pemphigus, Pemphigus Vulgaris, pernikoznu anemiju, Polvarteritis Nodosa, polihondritis, poliglandularne sindreme, reumatsku polimijalgiju, polimiozitis i dermatomiozitis, primarnu agamaglobulinemiju, primaru cirozi žučne kese, psorijazu, Rejnodov fenomen, Rejterov sindrom, reumatsku groznicu, reumatski artritis, sarkoidozu, sklerodermu, Sjogrenov sindrom, sindrom Stif-Man, Takajasuov arteritis, temporalni arteritis/arteritis džinovskih ćelija, odbacivanje transplanta, ulcerativni Colitis Uveitis, vaskulitis, vitiligo i Vernerovu granulomatozu.
U jednom rešenju, autoimuna bolest izabrana je iz grupe koja se sastoji od buloznog pemfigoida, idiopatske trombocitopenije purpure (ITP), mijastenije gravis (MG), pemfigusa (npr. pemphigus vulgaris) i odbacivanja transplanta.
U još jednom rešenju, peptidi prema predmetnom pronalasku mogu da se koriste u kombinaciji sa steroidima za imunosupresiju.
2. Zapaljenske bolesti
Peptidi prema predmetnom pronalasku mogu da se koriste za lečenje zapaljenskih poremećaja uljučujući, ali se ne ograničavajući na astmu, ulcerativni koltis i zapaljenski sindrom creva, alergiju, uključujući alergijski rinitis/sinusitis, kožne alergije (urtikariju/koprivnjaču, angioedem, atopijski dermatitis), alergije na hranu, alergije na lekove, alergije na insekte, mastocitozu, artritis, uključujući osteoartritis, reumatoidni artritis i spondiloartropatije.
3. Bolesti ili stanja koja zahtevaju primenu terapeutskog proteina
Kod bolesti ili stanja koja zahtevaju primenu terapeutskog proteina, često se dešava da pacijent razvije antitela protiv terapeutskog proteina, što sprečava da terapeutski protein bude dostupan da vrši svoju terapeutsku svrhu za koju je namenjen. Samim tim, peptidi prema predmetnom pronalasku mogu da se koriste u kombinaciji sa terapeutskim proteinom da pojačaju dobrobit koju donosi terapeutski protein, time što smanjuju koncentraciju IgG, gde su IgG antitela odgovorna za smanjenje biološke dostupnosti terapeutskog proteina.
Shodno tome, jedno rešenje obezbeđuje postupak regulisanja, lečenja ili prevencije stanja, bolesti ili poremećaja koji je rezultat imunog odgovora na faktor koagulacije, koji podrazumeva dovođenje ćelije u dodir sa terapijski delotvornom količinom bilo kog od peptida koji su ovde opisani, gde je faktor koagulacije izabran iz grupe koja se sastoji od fibrinogena, protrombina, faktora V, faktora VII, faktora VIII, faktora IX, faktora X, faktora XI, faktora XII, faktora XIII ili Von Vilebrandovog faktora. Ovaj postupak može da se koristi za regulisanje ili lečenje ili prevenciju imunog odgovora na faktor koagulacije kod pacijenta koji pati od, npr. hemofilije A ili hemofilije B. U jednom rešenju. peptidi prema predmetnom pronalasku blokiraju inhibitore faktora VIII. U još jednom rešenju, postupak može da se koristi za regulaciju ili lečenje ili prevenciju imunog odgovora na npr. terapeutski eritropojetin kod pacijenta koji pati od aplazije čisto crvenih ćelija (PRCA).
4. Bolestiilistanja koja zahtevaju genskuterapiju
Prepreke uspešnoj implementaciji genske terapije za lečenje bolesti ili stanja takođe obuhvataju razvoj antitela specifična za terapeutski protein koji kodira transgen, a moguće je da se takva antitela razviju i prema vektoru koji se koristi za dopremanje transgena. Shodno tome, peptid prema predmetnom pronalasku može da se primenjuje u kombinaciji sa genskom terapijom, kako bi pojačao dobrobiti kodiranog terapeutskog proteina, smanjujući koncentraciju IgG. Ovi postupci su posebno korisni u situacijama u kojima su IgG antitela odgovorna za smanjenu biodostupnost vektora genske terapije ili kodiranog terapeutskog proteina. Vektor genske terapije može da bude, npr. virusni vektor kao što je adenovirus i virus povezan sa adenovirusom. Bolesti koje mogu da se leče primenom genske terapije obuhvataju, ali nisu ograničene na, cističnu fibrozu, hemofiliju, PRCA, mišićnu distrofiju ili bolesti skladištenja u lizozornima, kao što su, npr. Gaučerova bolest i Fabrijeva bolest.
5. In vivosnimanje i detekcija FcRn
Peptidi prema predmetnom pronalasku mogu da se koriste i u testovima za detekciju FcRn. U nekim rešenjima, test je test vezivanja koji otkriva vezivanje peptida prema predmetnom pronalasku sa FcRn. U ovim testovima, bilo FcRn bilo peptidi prema predmetnom pronalasku mogu da budu imobilisani, dok se drugi partner (bilo FcRn bilo peptidi prema predmetnom pronalasku) prevlači preko imobilisanog partnera u vezivanju. Bilo FcRn bilo peptidi prema predmetnom pronalasku mogu da budu obeleženi na način koji omogućava detekciju. Odgovarajući obeleživači obuhvataju radioizotope, uključujući, ali se ne ograničavajućina64Cu,<67>Cu,<90>Y, mln, 124I, 125I, 131I, 137Cs, 186Re,211 At, 2,2Bi,<213>Bi,<223>Ra,<24l>Am,<244C>m i 99mTc-MDP; enzime koji daju proizvode koje je moguće detektovati (na primer, luciferaza, peroksidaza, alkalna fosfataza, p-galaktozidaza i slične); fluorescentne supstance i fluorescentne obeleživače; na primer, fluorescein izotiocijanat, rodamin, fikoeritrin, fikocijanin, alofikocijanin, o-ftaldehid i fluorescamin; metale koji fluoresciraju, na primer<L>^<2>Eu, ili druge iz serije lantanida, vezane za peptide prema predmetnom pronalasku preko metal-helatnih grupa kao što su EDTA; hemiluminescentna jedinjenja, na primer luminol, izoluminol, teromatski akridinijum estar, soli akridinijuma, imiđazol i jedinjenja koja daju oksalatne estre; i bioluminescentna jedinjenja, na primer, luciferin ili ekvorin (zeleni fluorescentni protein), molekule sa specifičnim vezivanjem i, na primer, magnetske čestice, mikrosfere, nanosfere, luminescentne nanokristale sa kvantnim tačkama, i slične.
Alternativno, mogu da se koriste parovi koji se specifično međusobno vezuju, koji podrazumevaju, na primer, antitelo za drugi korak ili reagens koji je obeležen na način koji omogućava detekciju i koji može da amplifikuje signal. Na primer, peptidi prema predmetnom pronalasku mogu da budu konj ugovani za biotin, a da se, kao reagens u drugom koraku, dodaje straptavidin konjugovan za peroksidazu iz rena (HRP). Još jedan pogodan par sa specifičnim vezivanjem predstavljaju digoksin i antidigoksin. U drugim rešenjima, antitelo u drugom koraku može da bude konjugovano za enzim, kao što je peroksidaza, u kombinaciji sa supstratom koji, u prisustvu peroksidaze, menja boju. Odsustvo.ili prisustvo vezivanja između peptida prema predmetnom pronalasku i FcRn može da se odredi primenom različitih postupaka, uključujući protočnu citometriju ćelija koje nisu vezane, mikroskopiju, radiografiju, fluorimetriju, hromogenu detekciju, fosforno snimanje, detekciju hemiluminescencije na filmu i scintilacione brojače. Ovakvi reagensi i postupci za njihovu upotrebu dobro su poznati u struci.
U dijagnostičkoj primeniin vivo,specifična tkiva ili čak specifični ćelijski poremećaji koji se odlikuju, bar donekle, ekspresijom FcRn, mogu da se snimaju primenom dovoljne količine označenog peptida prema predmetnom pronalasku.
Širok spektar različitih metalnih jona pogodnih za snimanje tkivain vivotestiran je i nalazi se u kliničkoj primeni. Za snimanje pomoću radioizotopa, uopšteno posmatrano, poželjne su sledeće osobine: (a) niska doza zračenja pacijenta; (b) visok prinos fotona koji omogućava izvođenje nuklearne medicinske procedure u kratkom vremenskom periodu; (c) mogućnost proizvodnje u dovoljnim količinama; (d) prihvatljiva cena; (e) jednostavna priprema za primenu i (f) da ne zahteva izolaciju pacijenta nakon primene. Ove osobine mogu se. uopšteno posmatrano, predstaviti na sledeći način: (a) izlaganje najkritičnijeg organa zračenju je manje od 5 rad; (b) moguće je dobiti pojedinačnu sliku nekoliko časova nakon infuzije; (c) dati radioizotop se ne oslobađa čestice prilikom raspada; (d) dati izotop se lako detektuje i (e) poluživot je kraći od 4 dana (Lamb & Kramer, "Commercial Production of Radioisotopes for Nuclear Medicine",u Radiotracers For Medical Applications,tom 1, Ravudu (urednik), CRC Press, Inc., Boca Raton, str. 17-62). U jednom rešenju, ovaj metal je tehnetijum-99m.
Shodno tome, predmetni pronalazak obezbeđuje postupak dobijanja slike unutrašnjeg regiona tela pacijenta koji podrazumeva primenu, kod tog pacijenta, delotvorne količine preparata koji sadrži najmanje jedan od peptida prema predmetnom pronalasku koji sadrži metal, gde je taj metal radioaktivan, te snimanje scintigrafske slike koja se dobija raspadom radioaktivog metala. Isto tako, predmetni pronalazak obezbeđuje postupak pojačavanja slike dobijene magnetnom rezonancom (MR) unutrašnjeg regiona tela pacijenta koji podrazumeva primenu, kod tog pacijenta, delotvorne količine preparata koji sadrži najmanje jedan od peptida prema predmetnom pronalasku koji sadrži metal, gde je taj metal paramagnetičan, te smnimanje slike pomoću MR unutrašnjeg regiona tela datog pacijenta.
Drugi postupci koje obezbeđuje predmetni pronalazak obuhvataju postupak pojačavanja slike unutrašnjeg regiona tela pacijenta dobijene ultrazvukom, koji podrazumeva primenu, kod tog pacijenta, delotvorne količine preparata koji sadrži najmanje jedan od peptida prema predmetnom pronalasku koji sadrži metal, te snimanje ultrazvučne slike unutrašnjeg regiona tela datog pacijenta. U ovoj primeni, metal može da bude bilo koji netoksičan jon teškog metala. Takođe je obezbeđen postupak pojačavanja slike unutrašnjeg regiona tela pacijenta dobijene primenom rentgena, koji podrazumeva primenu, kod tog pacijenta, peptidnog preparata koji sadrži metal, te snimanje rentgenske slike unutrašnjeg regiona tela datog pacijenta. Može da se primeni radioaktivan, netoksični jon teškog metala.
Peptidi prema predmetnom pronalasku mogu da budu vezani za helatore, kao što su oni opisani u U.S. patentu br. 5,326,856. Kompleks peptid-helator može da bude radioaktivno obeležen kako bi obezbedio sredstvo za snimanje, za dijagnozu ili lečenje bolesti ili stanja koje podrazumevaju regulaciju koncentracije IgG. Peptidi prema predmetnom pronalasku mogu, takođe, da se koriste u postupcima koji su opisani u U.S. patentu br. 5,449,761 za dobijanje radioaktivno obeleženog peptida za upotrebu u snimanjima ili radioterapiji.
6. Doziranje i modaliteti tretmana
Peptidi prema predmetnom pronalasku mogu da se primenjuju intravenski, potkožno, intramuskularno, oralno, sublingvalno, bukalno, sublingvalno, nazalno, rektalno, vaginalno ili pulmonarnim putem. Peptidi prema predmetnom pronalasku mogu da budu ugrađeni u, ili vezani za, čvrsti biopolimerni nosač koji omogućava sporo otpuštanje himernog proteina do željenog mesta.
Doze peptida prema predmetnom pronalasku razlikovaće se u zavisnosti od bolesti ili stanja koje se leči, intenziteta te bolesti ili stanja, pacijenta, uključujući njegov pol, uzrast, telesnu masu i željeni ishod lečenja, kao i od odabranog puta primene. Doze mogu da se kreću u rasponu od 0,1 do 100.000 ug/kg telesne mase. U jednom rešenju, opseg doza je od 1 do 10.000 u.g/kg. U još jednom rešenju, opseg doza je od 10 do 1.000 u.g/kg. U još jednom rešenju, opseg doza je od 100 do 500 p.g/kg. Peptid prema predmetnom pronalasku može da se primenjuje kontinualno ili u zadatim vremenskim intervalima. Mogu da se primenein vitrotestovi kako bi se odredili optimalni opsezi doza i/ili rasporedi primene. Stručnjak u ovoj oblasti koji poseduje uobičajena znanja, može lako da odredi i druge delotvorne doze, kroz rutinske oglede u kojima se određuju krive odgovora u zavisnosti od doze, na primer, količina peptida prema predmetnom pronalasku koja je neophodna za smanjenje ili povećanje koncentracije IgG može da se izračuna iz eksperimenatain vivo.Stručnjaci u ovoj oblasti će lako shvatiti da doza može da se razlikuje u zavisnosti od konkretnog jedinjenja, ozbiljnosti simptoma i podložnosti pacijenta neželjenim dejstvima, a stručnjaci u ovoj oblasti mogu lako da odrede poželjne doze za konkretno jedinjenje, upotrebom različitih sredstava. Na primer, da bi izračunali dozu peptida prema predmetnom pronalasku, stručnjaci u ovoj oblasti mogu da koriste lako dostupne informacije koje se odnose na količinu koja je neophodna za postizanje željenog dejstva, u zavisnosti od konkretnog sredstva koje se koristi.
7. Farmaceutski preparati
Predmetni pronalazak se takođe odnosi na farmaceutski preparat koji sadrži najmanje jedan od peptida prema predmetnom pronalasku i farmaceutski prihvatljiv nosilac ili ekscipijent. Primeri pogodnih farmaceutskih nosilaca su opisani uRemington' s Pharmaceutical Sciencesod E.W. Martin-a. Primeri ekscipijenata obuhvataju škrob, glukozu, laktozu, saharozu, želatin, slad, pirinač, brašno, kredu, silika gel, natrij um stearat, glicerol monostearat, talk, natrijum hlorid, obrano mleko u prahu, glicerol, propilen, glikol, vodu, etanol i slične. Preparat može da sadrži i pufere za održavanje pH, kao i sredstva za vlaženje ili emulzifikatore.
Za oralnu primenu, farmaceutski preparat može da se javi u obliku tableta ili kapsula koje se dobijaju na uobičajen način. Preparat može, takođe, da bude pripremljen u obliku tečnosti, na primer kao sirup ili suspenzija. Tečnost može da obuhvata sredstva za suspendovanje (npr. sorbitol sirup, derivate celuloze ili hidrogenizovane jestive masti), emulzifikatore (lecitin ili akaciju), ne-vodene nosioce (npr. bademovo ulje, uljane estre, etil alkohol, ili frakcionisana biljna ulja) i konzervanse (npr. metil ili propil-p-hidroksibenzoate ili sorbinsku kiselinu). Preparati mogu takođe da sadrže arome, boje i zaslađivače. Alternativno, preparat može da bude dostupan u obliku suvog proizvoda kome se kasnije dodaje voda ili neki drugi pogodan nosilac.
Za bukalnu i sublingvalnu primenu, preparat može da se javi u obliku tableta ili dražeja, prema uobičajenim protokolima.
Za primenu inhalacijom, jedinjenja za upotrebu prema predmetnom pronalasku se pogodno dostavljaju u obliku spreja aerosola u pakovanju pod pritiskom ili nebulizeru (npr. u PBS), sa odgovarajućim propelentom, kao što su npr. dihlordifluormetan, trihlorfluormetan, dihlortetrafluormetan, ugljen dioksid ili neki drugi odgovarajući gas. U slučaju aerosola pod pritiskom, dozna jedinica može da se utvrdi postavljanjem ventila koji će oslobađati tačno određenu količinu preparata. Kapsule i punjenja od npr. želatina za upotrebu u inhalatorima ili insuflatorima mogu da se pripreme tako da sadrže smešu jedinjenja u prahu i odgovarajuće praskaste osnove, kao što su laktoza ili škrob.
Farmaceutski preparat može da se pripremi za parenteralnu primenu (t.j. intravensku ili intramuskularnu) putem bolus injekcije. Formulacije za injekcije mogu da se pakuju u pojedinačne dozne oblike, npr. u ampule, ili u sudove koji sadrže više doza uz dodatak konzervansa. Preparati mogu da budu u obliku suspenzija, rastvora ili emulzija u uljima ili vodenim nosiocima i mogu da sadrže sredstva za formulisanje kao što su sredstva za suspendovanje, stabilizaciju i/ili disperziju. Alternativno, aktivni sastojak može da bude u obliku praha za rekonstituciju sa odgovarajućim nosiocem, npr. vodom u kojoj nema pirogena.
Farmaceutski preparati takođe mogu da budu formulisani za rektalnu primenu u obliku supozitorija ili retencionih klistira, npr. tako da sadrže uobičajene osnove za supozitorije kao što su kakao puter ili drugi gliceridi.
Peptidi prema predmetnom pronalasku mogu da budu vezani za helatore, kao što su oni opisani u U.S. patentu br. 5,326,856. Kompleks peptid-helator može da bude radioaktivno obeležen kako bi obezbedio sredstvo za snimanje, za dijagnozu ili lečenje bolesti ili stanja koje podrazumevaju regulaciju koncentracije IgG. Peptidi prema predmetnom pronalasku mogu, takođe, da se koriste u postupcima koji su opisani u U.S. patentu br. 5,449,761 za dobijanje radioaktivno obcleženog peptida za upotrebu u radioterapiji.
8.Prečišćavanje FcRn
Peptidi prema predmetnom pronalasku takođe mogu da se koriste za prečišćavanje FcRn. U nekim rešenjima, peptid je kovalentno vezan za odgovarajući nosač (matriks) za hromatografiju, tako da čini efikasno sredstvo za odvajanje FcRn. Rastvor koji sadrži FcRn se potom propušta kroz nosač za hromatografiju, čime dolazi do nekovalentnog vezivanja FcRn za njegov imobilisani partner u vezivanju. Rastvori koji sadrže FcRn mogu da budu biološki uzorci, kao što su uzorci telesne tečnosti, tkiva ili ćelija, kao i supernatant kulture ćelija. FcRn se prečišćava ispiranjem imobilisanog kompleksa peptid:FcRn odgovarajućim rastvorom kako bi se uklonile nečistoće a potom oslobađanjem FcRn iz nosača za hromatografiju odgovarajućim rastvorom za eluiranje.
Peptidi prema predmetnom pronalasku mogu da se vežu za pogodne nosače (matrikse) za hromatografiju upotrebom većeg broja hemijskih pristupa koji su dobro poznati stručnjacima u ovoj oblasti. Na primer, peptidi prema predmetnom pronalasku mogu da se vežu za nosače koji sadrže odgovarajuće reaktivne grupe, kao što su tioli, amini, karboksilne kiseline, alkoholi, aldehidi, alkil halidi, N-alkil-maleimidi, N-hidroksi-sukcinimidil estri, epoksidi, hidroksilamini, hidrazidi.
U drugim rešenjima, peptidi prema predmetnom pronalasku mogu da budu modifikovani tako da sadrže hemijske ostatke ili peptidne sekvence koje se nekovalentno vezuju za odgovarajuće nosače za hromatografiju. Na primer, peptidi bi mogli da budu modifikovani biotinskim ostatkom i mogli bi da budu nekovalentno vezani za hromatografski nosač koji sadrži protein avidin. Alternativno, modifikovani peptid bi mogao da se inkubira sa rastvorom FcRn, nakon čega se dobijena smeša propušta kroz odgovarajući hromatografski nosač kako bi se izolovao kompleks FcRmpeptid.
Primeri slične primene peptida za afinitetno prečišćavanje mogu da se nađu u Kellev et al, "Development and Validation of an Affinitv Chromatographv Step Using a Peptide Ligand for cGMP Production of Factor VIII", u Biotechnologv & Bioengineering, tom 87, br. 3, Wiley InterScienc, 2004, str. 400-412 i u U.S. Patentu br. 6,197,526.
Primeri
Primeri, koji su namenjeni samo da ilustruju primere predmetnog pronalaska i stoga ne bi trebalo da se smatra da na bilo koji način ograničavaju predmetni pronalazak, takođe detaljno opisuju aspekte i rešenja predmetnog pronalaska koji su prethodno razmatrani. Navedeni primeri ne predstavljaju ni sve, ni jedine eksperimente koji su izvedeni. Učinjen je svaki napor da se obezbedi tačnost brojčanih podataka koji su korišćeni (npr. količine, temperature) ali treba uzeti u obzir mogućnost postojanja eksperimentalnih greški i odstupanja. Osim ukoliko je drugačije naznačeno, delovi su delovi prema masi, molekulska masa je maseni prošek molekulske mase. temperatura je data u stepenima Celzijusove skale a pritisak je jednak ili blizak atmosferskom pritisku.
Primer 1: Ekspresija rastvornog humanog FcRn (shFcRn)
cDNK za rastvorni humani FcRn je klonirana, eksprimirana i prečišćena kako je to opisano u literaturi, upotrebom ekspresionog sistema glutamin sintetaze u ćelijama jajnika kineskog hrčka (CHO ćelijama), videti U.S. patent br. 5,623,053. Stop kodon je postavljen nakon aminokiselinskog položaja 274, u proteinskoj sekvenci humanog FcRn., kako bi se uklonio transmembranski region.
Primer 2:TransfekcijaHEK 293 ćelija humanim FcRn
Humane embrionske ćelije bubrega (HEK ćelije) br. 293 (ATCC, Manassas, VA) transficirane su upotrebom SuperFect reagensa za transfekciju (OJagen, Valencia, CA) prema protokolu koji preporučuje proizvođač. FcRn cDNK konstrukt pune dužine, prikazan na slici 1 (CM. Story et al.,J. Exp. Med.180:2377-2381 (1994), N.E. Simister et al.,Eur. J. Immunol.26:1527-1531 (1996)) prvo je kloniran u pcDNA6 (Invitrogen, Carlsbad, CA) kao plazmidni vektor, kako bi se dobio ekspresioni vektor FcRn, FcRn:pCDNA6. Humani p?m cDNK konstrukt, koji je takođe prikazan na slici 1, prvobitno je kloniran u pcDNA3 (Invotrogen) kao plazmidni vektor za dobijanje ekspresionog vektora za humani P2IU, P2in:pcDNA3 (D. Gussovvet.al., J. Immunol.139:3132-3138 (1987)).
Dan pre transfekcije, HEK293 ćelije zasejane su pri koncentraciji od 0,5 do 2,5 x IO<6>ćelija po šolji od 100 mm i inkubirane na 37°C i 5% CO216 časova u cDMEM podlozi. Sastav cDMEM je 1 L DMEM (Invitrogen #11995-065); 10 ml 1 M HEPES, pH 7,55; 10 ml MEM rastvora aminokiselina (Invitrogen #11 130-051); 10 ml MEM rastvora neesencijalnih aminokiselina (Invitrogen #11140-050); 10 ml 100 mM natrijum piruvata (Invitrogen #11360-070); 10 ml tečnosti penicilin streptomicin (Invitrogen #15140-148); 10 ml rastvora L-glutamina (Invitrogen #25030-081); 1 ml rastvora 2-merkaptoetanola u 55 mM Oulbecco fiziloškom rastvoru puferovanom fosfatom (DPBS) (Invitrogen #21985-023); 100 ml fetalnog goveđeg seruma inaktiviranog toplotom (FBS) (Invitrogen). Na dan transfekcije, 5 pg FcRn:pCONA6 konstrukta i 5 ug p2m:pCDNA3 DNK dodato je u 290 ul DMEM (Invitrogen). Rastvor je mešan nekoliko sekundi a potom centrifugiran. Nakon toga, 60 p.1 SuperFect reagensa za transfekciju (Qiagen) je dodato u rastvor, nakon čega je on mešan na vorteksu 10 sekundi. Rastvor DNKVSuperFect je inkubiran 5 do 10 minuta na sobnoj temperaturi; tokom ovog vremena, podloga iz šolje sa ćelijama je aspirirana a ćelije su isprane jednom sa 4 ml PBS. Nakon inkubacije DNK/SuperFect od 5 do 10 minuta, 3 ml potpune hranljive podloge (cDMEM) dodato je u rastvor DNK/SuperFect, rastvor je promešan i odmah potom dodat ćelijama u šolji od 100 mm.
Ćelije su inkubirane sa rastvorom DNK/SuperFect 2 do 3 časa na 37°C i pri 5% C02. Podloga koja sadrži DNK/SuperFect rastvor uklonjena je iz ćelija, a ćelije su isprane tri puta u PBS nakon čega je ćelijama dodata sveža CDMEM. Nakon inkubacije od 48 časova, podloga je ispitana pomoću imunoblot analize kako bi se utvrdilo da li je došlo do prolazne ekspresije FcRn/pSm kompleksa. Uz to, ćelije su prebačene, pri odnosu 1:4, u cDMEM koji sadrži 250 u.g/1 geneticina (Invotrogen) kao antibiotika i 5 u.g/1 blasticidina za selekciju blasticidin-rezistentnih stabilnih trans fektanata. Nakon 4 nedelje selekcije pomoću antibiotika, preživele ćelije su zasejane na ploče za gajenje kultura sa po 96 polja, pri gustini od 1 ćelije po polju. Na kraju, odabrano je 12 klonova, svaki od njih je gajen, a potom je ispitano da li dolazi do ekspresije pomoću imunoblot analize na FcRn i |32m. Ova analiza identifiovala je klon 11 ćelije 293, koji eksprimira FcRn i (32m, kao klon koji ima najviši nivo ekspresije, te je taj klon korišćen u kasnijim testovima.
Primer 3: Testiranje fagnih biblioteka na inhibitore FcRn-IgG
Peptidi koji su u stanju da inhibiraju vezivanje Fc dela IgG za FcRn identifikovani su ispitivanjem filamentoznih fagnih biblioteka za izlaganje, licenciranih od strane Dyax Corp.
(Cambridge, MA). Konkretnije, sledeće tri biblioteke korišćene su u kombinaciji; TN-9-IV, TN10-X, TN-11-1 i TN-12-1 korišćene su u ispitivanju. Ukupan broj pojedinačnih vijabilnih faga sadržanih u svakoj biblioteci ogledao se u broju transformanata ustanovljenih za svaku biblioteku, kada su biblioteke eksprimirane uE. colii zasejane pri razblaženju klonova koje je opisano u Dyax protokolu. Broj transformanata za TN-9-IV, TN10-X, TN-11-1 i TN-12-1 bio je 3,2 x IO9, 2 x IO9, 2,7 x IO<9>i 1,4 x IO<9>, redom. Još jedan način da se izrazi apsolutni broj vijabilnih faga u datoj zapremini je pomoću jedinica koje daju plake (pfu) po jedinici zapremine.
A.Puferi korišćeni za ispitivanje faga
Sledeći puferi korišćeni su za ispitivanje peptida koji vezuju FcRn.
1. NZCYM za bač: 10 g NZ amina-A; 5 g natrijum hlorida; 5 g Bacto ekstrakta kvasca (Difco); 1 g kazaminokiselina; 1 g anhidrovanog magnezijum sulfata u prahu; sastojci su rastvoreni u 800 ml vode, čiji je pH podešen na 7,5 pomoću IN natrijum hidroksida, a potom dopunjeni vodom do ukupne zapremine od 1 1, te sterilisani u autoklavu 20 minuta. 2. Pufer za.vezivanje (BB): PBS, pH 6 i 10 mM EDTA.C. NZCTM-T:
NZCYM za bač i 12,5 u-g/ml tetraciklina.
3. HBSS-E: Henkov uravnoteženi fiziološki rastvor (Hank's Balanced
Saline Solution) (Invitrogen) i 10 mM EDTA (Invitrogen).
4. Min A soli: 10,5 g K2HP04(dvobaznog kalijum fosfata); 4,5 g KH2P04(monobaznog kalijum fosfata); 1,0 g (NH4)2SCH (amonijum sulfata) i 0,5 g natrijum citrata rastvoreni u 1 1 vode. 5. LB za bač: 10 g Bacto triptona; 5 g Bacto ekstrakta kvasca; 10 g natrijum hlorida rastvoreni u 1 1 vode a potom sterilisani u autoklavu 20 minuta. 6. CBS pH 2: 50 mM natrijum citrata; 150 mM natrijum hlorida; pufer je podešen na pH 2 pomoću HC1 a potom sterilisan pomoću filtera. 7. LB Agar: 30 g Bacto triptona; 15 g Bacto ekstrakta kvasca; 30 g natrijum hlorida rastvoreni u 3 1 vode a potom sterilisani u autoklavu 20 minuta. 8. LB meki agar: 20 g Bacto triptona; 10 g Bacto ekstrakta kvasca; 20 g natrijum hlorida; 14 g Bacto agara rastvoreni u 2 1 vode uz blago zagrevanje, bez ključanja.
9. TE pufer: 10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7.
B. Protokol za testiranje: prvi krug
Približno po 100 slučajno izabranih ekvivalenata biblioteka, za svaku biblioteku, spojeno je prema njihovom titru, što je podrazumevalo: 24 p.1 TN9-IV (1,3 x IO10pfu/u.1), 12,5 ul TN10-X (1,6 x IO10 pfu/u.1), 225 ul TN11-I (1,2 x IO<9>pfu/ul) i 48,7 ul TN12-I (2,9 x IO<9>pfu/u.1) pomešani su sa 189 ul PBS, 75 ul ledeno hladnog 17% polietilen glikola (PEG)
(prosečne molekulske mase: 8000 Da, Sigma Aldrich, Sr. Louis, MO) i 75 jal 3 mM natrijum hlorida, te ohlađeni na ledu 30 minuta. Jedna T75 boca klona 11 ćelija 293 (Primer 2) podeljena je u odnosu 1:3 sa HBSS-E. Ćelije su prebačene u 1 ml kivetu za mikrocentrifugu, isprane jednom hladnim puferom za vezivanje a supernatant je uklonjen. Ćelije su inkubirane sa fagima 1,5 čas na 4°C na rotatoru. Nakon inkubacije, ćelije su isprane pet puta sa 1 ml ledeno hladnog BB, pri čemu su nakon svakog ispiranja ćelije centrifugirane na 1400 rpm 2 minuta. Snažno vezani fagi eluirani su dodatkom 66 pM humanog IgG (Calbiochem, San Diego, CA) koji je prethodno dijalizom prebačen u BB. Smeša faga-IgG inkubirana je sa ćelijama 1 čas na 4°C. Nakon koraka centrifugiranja (1400 rpm, 2 minuta) talog ćelija je prvo ispran sa 200 u.1 66 pM IgG, centrifugiran (1400 rpm, 2 minuta) i ispran poslednji put sa 100 ul IgG. Rastvori dobijeni ispiranjem sa IgG su spojeni sa IgG eluatom do konačne zapremine od 500 u.1. Određen je titar faga u eluentu, nakon čega je on amplifikovan, kao što će biti objašnjeno u daljem tekstu.
C. Titar faga
Rastvori faga razblaženi su u koracima od po 100 puta. Obično je 2 u.1 rastvora faga dodato u 198 ul NZCYM za bač, serijski, kako bi se dobila razblaženja do 10"<10>. Razblaženi fagi dodati su u kulturu XL1 Blue MRF'E. colićelija, kada su XL1 Blue MRF'E. coligajene u log fazi rasta i dostigle optičku gustinu od 0,5 na A 600 (UV apsorbancija na 600 nm). Kultura je inkubirana na sobnoj temperaturi 10 minuta. Nakon toga, 0,5 ml inficiranih ćelija dodato je u 3,5 ml agara kome je površinski sloj istopljen (smeša 50/50 LB za bač i Lb agara) na približno 55 °C, koji je potom razvučen na standardnu agarnu ploču i inkubiran preko noći na 37 stepeni. Titar je izračunat sa ploče koja sadrži 30 do 300 plaka. Za ploču koja sadrži 50 plaka, zasejanu iz razblaženja faga od IO"<8>, to izračunavanje bi izgledalo ovako: 50 plaka / 500 ul inficiranih ćelija x lOstruko razblaženje tokom infekcije x 10 razblaženje faga~10 jedinica koje daju plake po ul.
Tamo gde je bilo neophodno za dalje fagne ELISA testove i sekvencijalnu analizu, pomoću pasterovih pipeta sterilisanih u autoklavu vađeni su pojedinačni čepovi agara koji sadrže fagne plake. Čepovi su postavljeni u sterilne ploče za kulture sa po 96 polja sa udubljenim dnom (Greiner), kojima je dodato 100 ul polju TE. Fagi su eluirani iz plaka 2 časa na 37°C ili preko noći na 4°C.
D. AmpHfikacija faga
Kultura XL1 Blue MRF'E. colićelija gajena je u NZCYM-T za bač, iz razblaženja 1/100 zasićene kulture gajene preko noći, dok kultura nije dostigla optičku gustinu od 0,5 na A600. Ćelije su koncentrisane centrifugiranjem 15 minuta na 3500 rpm, nakon čega su resuspendovane u Min A solima do 1/20 prvobitne zapremine. Fagi koji su eluirani sa ćelija nakon jednog kruga selekcije razblaženi su do konačne zapremine od 1 ml u Min A solima, te su dodati u 1 ml koncentrovane bakterijske kulture. Nakon inkubacije u vodenom kupatilu, 15 minuta na 37°C, smeša faga i ćelija dodata je u 2 ml 2 x NZCYM za bač, te je razmazivana preko velike NUNC ploče sa NZCYM i 50 pg/ml ampicilina, dok se nije osušila. Ploče su inkubirane 14 do 18 časova na 37°C. Kolonije koje su nastale preko noći su nežno sastrugane pomoću štapića za razmazivanje u prisustvu 20 ml PBS. PBS koji sadrži bakterije i fage sakupljen je u kivetu za centrifugu. Bakterije koje su zaostale na ploči su ponovo sastrugane u prisustvu 10 ml PBS i sakupljene. Usledilo je poslednje ispiranje ploče sa još 10 ml PBS, koji su nakon toga pripojeni prethodno sakupljenom materijalu. Bakterijske ćelije su istaložene centrifugiranjem (15 minuta na 3500 rpm) nakon čega je bistri supernatant presut u čistu kivetu za centrifugiranje, ponovo izbistren i, na kraju, ponovo dekantovan. Nakon toga, u supernatant je dodato 0,15 ml 17% PEG + 3M NaCl, koji je mešan i držan preko noći na 4°C. Istaloženi fagi sakupljeni su centrifugiranjem (8500 x g 30 minuta), nakon čega je supernatant odbačen. Talog faga je resuspendovan u maloj količini PBS, izbistren kratkim okretanjem, nakon čega je ponovo istaložen u 0,15 zapremini 17% PEG + 3M NaCl. Konačni talog je resuspendovan u PBS, te mu je, kao priprema za sledeći krug selekcije, određen titer.
E.Drugi krug
Amplifikovana fagna bibiloteka je razblažena tako da su samo 10 slučajno izabranih ekvivalenata biblioteke razblaženi u 1 ml pufera za vezivanje. Jedna trećina T75 boce netransficiranih ćelija br. 293 isprana je jednom hladnim puferom za vezivanje. Korak izdvajanja faga iz biblioteke koja je eksprimirala peptide koji su bili u stanju da se vežu za ćelije koje nisu eksprimirale FcRn ponovljen je dva puta, inkubacijom faga sa netransficiranim ćelijama 15 minuta. Supernatant je sakupljen. Nakon toga, jedna trećina T75 boce klona 11 ćelije br. 293 isprana je jednom hladnim puferom za vezivanje, nakon čega je usledila inkubacija sa fagom 1,5 čas na 4°C u rotatoru. Ćelije su isprane i centrifugirane (1400 rpm, 2 minuta) pet puta u 1 ml hladnog pufera za vezivanje nakon čega je čvrsto vezani fag eluiran pomoću 200 ul 66 uM humanog IgG (dijalizovanog u pufer za vezivanje), inkubiranjem smeše faga, ćelija i IgG 1 čas na 4°C. Nakon centrifugiranja (1400 rpm, 2 minuta), sakupljen je supernatant a talog je ispran sa 200 u.1 66 uM humanog IgG a potom sa još 100 u.1 66 uM humanog IgG. Određen je titar faga u eluentu, nakon čega je fag amplifikovan kao što je opisano u tekstu koji sledi u odeljcima pod naslovima titar faga i amplifikacija faga.
F. Treći krug
Ovaj krug izveden je kao što je prethodno opisano za drugi krug. Na kraju trećeg kurga, određen je titar faga u eluentu, te je eluent ispitan na inhibitore IgG-FcRn pomoću fagnog ELISA testa.
G. Fagni ELISA
Sledeći koraci sprovedeni su kako bi se identifikovali fagi koji kodiraju peptide koji su u stanju da se vežu za FcRn, pomoću testa imunosorbenta vezanog za enzim ("ELISA, Envzme linked imunosorbent assay"). Prvo su pripremljeni sledeći rastvori:
Pufer A:PBS + 0,1% Tvveen + 0,5% BSA
Pufer B:100 mM MES, pH 5,5 + 150 mM NaCl + 0,1% Tvveen
PuferC: 50 mM MES, pH 6,0 + 150 mM NaCl + 0,1% Tvveen
KulturaE. coliXL1 blue MRF' za propagaciju faga koji je pokazao sposobnost vezivanja za FcRn gajena je do optičke gustine od 0,5 pri A 600 iz razblaženja 1:100 kulture gajene preko noći. Nakon toga, po 10 ul eluata svake fagne plake, koji su pripremljeni kao što je prethodno opisano, dodato je u 30 ul XL1 blue MRF'E. colićelija, u ploču sa 96 polja, te inkubirano 15 minuta na sobnoj temperaturi. Nakon toga, u svako polje dodato je po 130 ul NZCYM za bač koji sadrži 50 ug/ml ampicilina, te su ploče inkubirane preko noći na 37 °C.
Mikrotiter ploča blokirana pomoću BSA i obložena streptavidinom (Pierce) pripremljena je ispiranjem sa po 200 ul po polju pufera A, a potom impregnirana preko noći sa 1 mg/ml biotinilovanog rastvornog humanog FcRn (Primer 4, odeljak A) u puferu A. Pufer koji sadrži FcRn je odbačen a ploča je isprana dva puta puferom C. Nakon toga, 70 ul pufera B dodato je u svako polje na ploči, nakon čega je dodato još po 30 ul bakterijske kulture koja sadrži fag. Nakon 1 čas na sobnoj temperaturi, ploča je isprana 5 puta sa po 200 ul pufera C. Nakon toga, u svako polje je dodato po 100 ul pufera C koji sadrži anti-M13 antitelo konjugovano za HRP (peroksidaza iz rena, prim. prev.) pri razblaženju od 1:10000. Ploča je inkubirana na sobnoj temperaturi jedan čas. Nakon toga, ploče su isprane 9 puta puferom C, razvijene sa TMB iz jednog koraka (KPL), reakcija je zaustavljena posle 5 do 15 minuta pomoću 2M sumporne kiseline, nakon čega je očitavana apsorbanca na 450 nm pomoću Spectra Max Plus čitača za ploče (Molecular devices).
H. Amplifikacija fagne DNK pomoću PCR
Fagi eluirani iz plaka u TE amplifikovani su za sekvenciranje pomoću kompleta PCR Ćore Svstem II, prema uputstvima proizvođača (Promega). Nakon toga, 5 ml eluiranih faga dodato je u reakcionu smešu koja sadrži po 200 pM svakog dNTP, 500 nM prajmera 3PCRUP (5'-CGGCGCAACTATCGGTATCAAGCTG-3') (sekvenca čiji je ID br.: 11), 500 nM prajmera 3PCRDN (5'-CATGTACCGTAACACTGAGTTTCGTC-3') (sekvenca čiji je ID br.: 12), 1 X pufer za Taq DNK polimerazu (10x: 500 mM KC1, 100 mM Tris-HCl pH 9,0 na 25°C, 1% Triton X-100, 15 mM MgCl2) i 1,25 jedinica enzima Taq DNK polimeraze. Reakcione smeše podvrgnute su sledećem programu na termalnom ciklizatoru MJ Research PCT-200: 5 minuta na 94 °C, 30 ciklusa koji se sastoje od po 15 sekundi na 94°C, 30 sekundi na 55°C i 60 sekundi na 72 °C, nakon čega sledi 7 minuta na 72°C. Dobijeni proizvod je prečišćen pomoću kompleta QiaQuick PCR Prep kit (Qiagen) prema uputstvima proizvođača, količina je određena pomoću apsorbance na A260 a sekvenciranje je izvršeno uz primenu prajmera 3SEO-80 (5'-GATAAACCGATACAATTAAAGGCTCC-3') (sekvenca čiji je ID br.: 13).
Sekvenciranje faga koji je amplifikovan, nakon 3 kruga testiranja, ukazalo je na DNK sekvence koje kodiraju aminokiselinske sekvence na slici 1. Ovi "fagni pogodci" upotrebljeni su, svi zajedno, za identifikaciju koncenzusne peptidne sekvence, koja se definiše aminokiselinskom sekvencom G-H-F-G-G-X-Y (sekvenca čiji je ID br.: 14).
Primer4: Kompetitivni ELISA test za par peptid-IgG
Kako bi se odredilo da li su peptidi prema predmetnom pronalasku, koji su dobijeni pomoću ispitivanja filamentoznih fagnih biblioteka za prikazivanje, takođe u stanju da spreče vezivanje IgG za FcRn, sledeći ELISA test je zamišljen i izvršen.
A. Biotinilacija humanog shFcRn
Rastvor rastvornog humanog FcRn (shFcRn) u Tris puferu je dijalizovan dva puta, svaki put po 3 časa u 2 litra PBS pH 8,0. Količina ovako dobijenog shFcRn određena je merenjem apsorbance na 280 nm. Koncentracija shFcRn je dobijena množenjem očitane apsorbance sa ekstinkcionim koeficijentom za shFcRn koji je s = 85880 tvf1 cm"<1>. Biotinilacija shFcRn je izvršena tako što je dijalizovani shFcRn izložen dejstvu dvostrukog molarnog viška Sulfo-NHS-LC-Biotina (Invitrogen, Carlsbad, CA) 2 časa na 4 °C. Nakon toga, reakciona smeša shFcRn i Sulfo-NHS-LC-Biotina je dijalizovana dva puta u 21 hladnog PBS, nakon čega je usledilo još jedno čitanje apsorbance kako bi se utvrdila koncentracija preostalog proteina. Biotinilovani shFcRn je čuvan na 4 °C sa 0,1% natrijum azida, do upotrebe.
B. Kompeticioni ELISA za par peptid-IgG
Ploče sa po 96 polja ReactiBind obložene neutravidinom i blokirane pomoću BSA (Pierce, Rockford, IL) isprane su sa po 200 pl/polju pufera A (Pufer A: PBS pH 7,4 (Gibco, 14040), 0,5%) BSA slobodan od prisustva IgG, 0, 05% Tween-20). Polja su impregrirana sa po 100 pl/polju biotinilovanog shFcRn u puferu A. Ploča je zatvorena i inkubirana na 37 °C 2 časa. Nakon toga, ploča je isprana sa 200 pl/polju pufera B (Pufer B: 100 mM MES pH 6, 150 mM NaCl, 0,5% BSA slobodan od prisustva IgG (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA), 0,05% Tween-20). Nakon toga, dodato je 50 pl/polju 6 nM humanog IgG (Calbiochem, San Diego, CA) u puferu B, kao i 50 pl/polju različitih peptidnih kompetitiora (u različitim koncentracijama), tako da je konačna koncentracija IgG u poljima bila 3 nM. Da bi se omogućilo mešanje, ploča je mućkana na mućkalici za ploče 2 minuta, zatvorena a potom inkubirana na 37 °C 2 časa. Nakon inkubacije, tečnost je aspirirana iz ploče te je dodato 100 pl/polju F(ab')2fragmenta kozjeg anti-humani IgG antitela specifičnog za F(ab') fragment konjugovanog sa peroksidazom, razblaženog 1: 10000 (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA) u puferu B. Ploče su pokrivene, inkubirane 30 minuta na sobnoj temperaturi i isprane 4 puta sa po 200 pl/polju ledeno hladnog pufera B. Rastvor supstrata SureBlueTMB (100 pl/polju, KPL, Gaithersburg, MD) ostavljen je da se inkubira na sobnoj temperaturi dok se boja nije razvila, što je trajalo 5 do 10 minuta. Kada se boja razvila, 100 pl/polju TMB stop rastvora (KPL, Gaithersburg, MD) je dodato a apsorbanca je merena na 450 nm. Podaci su predstavljeni na grafiku zavisnosti apsorbance od koncentracije peptida, kako bi se odredila vrednost 50% inhibitorne koncentracije (IC50).
Primer 5: Kompeticioni FACS test para peptid-IgG
Uz primenu pristupa koji podrazumeva ELISA, koji je opisan u primeru 4, da bi se odredilo da li su peptidi prema predmetnom pronalasku, koji su dobijeni ispitivanjem filamentoznih fagnih biblioteka za izlaganje, takođe u stanju da spreče vezivanje IgG za FcRn na ćelijama, sledeći test ćelijskog sortiranja aktiviranog fluorescencijom (FACS) je zamišljen i sproveden.
A. Obeležavanje Svnagis® pomoću Alexa-FIuor-488
Humanizovani IgGl (Svnagis®, Medlmmune, Gaithersburg, MD) je obeležen pomoću kompleta za obeležavanje proteina Alexa Fluor 488 Protein Labeling Kit (Molecular Probes/Invitrogen, Carlsbad, CA) prema protokolu koji predlaže proizvođač. Ukratko, 50 pl IM natrijum bikarbonata, pH 9,0, dodato je u 500 pl rastvora IgG u PBS koncentracije 2 mg/ml. Ovaj rastvor proteina je potom dodat u Alexa Fluor 488 sukcinimidil estar (suvi prah) i inkubiran na sobnoj temperaturi 1 čas. Protein je prečišćen hromatografijom ekskluzije na osnovu veličine, upotrebom kolone koja je deo kompleta (Bio-Rad BioGel P-30 smola za prečišćavanje putem ekskluzije na osnovu veličine, za male veličine). Uzorak je nanesen na kolonu i eluiran pomoću PBS. Prva obojena traka nosila je obeleženi protein. Stepen obeležavanja je određen merenjem apsorbance eluiranog IgG na 280 nm i na 494 nm. Molarna koncentracija proteina određena je primenom formule: koncentracija proteina (M) =
[A28o-(A494x 0,1 1) x faktor razblaženjaj/203,000. Uz to, formula koja se koristi za dobijanje mola boje po molu proteina je = A494x faktor razblaženja/71,000 x koncentracija proteina (M). Obično je inkorporirano 4 do 7 mola Alexa-Fluor 488 po molu IgG.
B. Kompeticioni FACS test za par IgG-peptid u kome su korišćeni klonovi 11
ćelija 293
U toku pripremanja testa, klonovi 11 HEK 293 ćelija (Primer 2) u potpunoj DMEM podlozi (Gibco, Carlsbad, CA) koja sadrži 5 pg/ml Blasticidina i 250 pg/ml G148 (Gibco, Carlsbad, CA) su centrifugirani a potom resuspendovani u puferu C (pufer C: Dulbecco PBS (Gibco, Carlsbad, CA) koji sadrži 10 mM EDTA (Gibco)), u koncentraciji od 3 x IO<6>ćelija/ml. Ćelije (0,1 ml) su pipetirane u ploče za testiranje sa 96 polja, nakon čega su ploče centrifugirane na 2600 rpm 5 minuta pomoću Sorvall RT7 stone centrifuge. Supernatanti su polako odliveni a ploča je osušena papirnim ubrusom. Peptidi kompetitori (90 pl), rastvoreni u puferu C u različitim koncentracijama, dodati su u polja na ploči i mešani pomoću pipete sa više kanala. 10 pl Svnagis® obeleženog pomoću Alexa 488, dodato je u svako polje na ploči, tako da je konačna koncentracija Svnagis® obeleženog pomoću Alexa 488 bila 100 nM. Ploča je umotana u foliju, ostavljena na ledu 1 čas a potom centrifugirana na 2600 rpm 5 minuta u Sorvall RT7 stone centrifugi, nakon čega je isprana jedan put sa 100 pl pufera C, nakon čega je uslcdio drugi korak centrifugiranja. Ćelije su resuspendovane u 200 pl pufera C i analizirane na protočnom citometru Beckman Coulter EPICS XL.
Primer 6: Postupci za određivanje konstanti ravnoteže vezivanja(Kd)peptida pomoću rezonance površinskih plazmona(SPR)
Sledeći koraci su izvedeni kako bi se unakrsno vezali rastvorni humani FcRn ili FcRn makaki majmuna za dekstransku površinu senzorskog čipa CM5 (Biacore AB, Uppsala, Švedska), u reakciji kuplovanja amina, u kojoj učestvuju l-etil-(3-dimetilaminopropil)-karbodiimid hidrohlorid (EDC) (Biacore AB, Uppsala, Švedska) i N-hidroksisukcinimid (NHS) (Biacore AB, Uppsala, Švedska), prema preporuci Biacore (BiApplications Handbook, verzija AB, odeljak 4.2, Biacore AB, Uppsala, Švedska). Protein FcRn razblaženje u 50 mM natrijum acetatu, pH 4,5 (Biacore AB, Uppsala, Švedska) do koncentracije od 10 do 30 pg/ml, a potom korišćen za oblaganje jedne protočne ćelije na senzorskom čipu. Preostala mesta na protočnoj ćeliji za FcRn blokirana su pomoću IM etanolamin hidrohlorida pH 8,5 (Biacore AB, Uppsala, Švedska). Kontrolna protočna ćelija blokirana je etanolaminom da bi služila kao referentna vrednost. Za analizu monomernih peptida, FcRn je impregniran do konačne gustine od 4000-5000 jedinica odgovora (RU). Za analizu peptidnih dimera, FcRn je impregniran do konačne gustine od 2000-2500 RU. Sva SPR merenja su vršena pomoću instrumenta Biacore 3000 (Biacore AB, Uppsala, Švedska). Za merenja koja su vršena bilo na pH 6 bilo na pH 7,4, eksperimenti su izvođeni u 50 mM fosfatu, 100 mM natrijum hloridu, 0,01% surfaktanta P20 (Biacore AB, Uppsala, Švedska).
A. Primer procedure za određivanje konstante vezivanja za monomerne peptide
Deset dvostrukih razblaženja peptida ubrizgano je preko FcRn-CM5 čipa brzinom od 20 ul/min u toku 2 minuta. Peptid je odvajan od čipa 2,5 minuta puferom. Sav preostali peptid je uklonjen sa čipa injekcijom HBS-P pufera (Biacore AB, Uppsala, Švedska) od 30 sekundi, pri brzini od 30 ul/min. Generisani su sensorgrami, koji su potom analizirani pomoću BiaEval programa, verzija 3.1 (Biacore AB, Uppsala, Švedska). Izrađen je grafik zavisnosti ravnotežne RU dobijene za svaku injekciju od koncentracije. Ravnotežne vrednosti Kddobijene su analizom ovih grafika, primenom modela afiniteta pri stabilnom stanju, koji je deo BiaEval programa.
B. Primer procedure za određivanje konstante vezivanja dimernih peptida
Deset dvostrukih razblaženja peptida ubrizgano je preko FcRn-CM5 čipa brzinom od 30 ul/min u toku 10 minuta. Peptidi su odvajani od čipa 10 minuta pomoću pufera. Svi preostali peptidi uklonjeni su sa čipa pomoću dve injekcije rastvora koji sadrži 50 mM Tris-hidrohlorida, 100 mM NaCl, 0,01 % surfaktanta P20, pH 9,0 pri brzini od 100 ul/min, u trajanju od 60 sekundi.
Generisani su sensorgrami, koji su potom analizirani pomoću BiaEval programa, verzija 3.1 (Biacore AB, Uppsala, Švedska). Izrađen je grafik zavisnosti ravnotežne RU dobijene za svaku injekciju od koncentracije. Ravnotežne vrednosti Kddobijene su analizom ovih grafika, primenom modela afiniteta pri stabilnom stanju, koji je deo BiaEval programa.
Primer 7: Sinteza monomernih peptida koji sadrže đisulfidne veze
Sinteza monomernih peptida izvršena je primenom sinteze peptida na čvrstoj fazi, bilo ručno, pomoću staklene boce sa zaobljenim dnom, bilo pomoću uređaja za sintezu Advanced
Chemtech 396-omega svnthesizer (Advanced Chemtech, Louisville, KY). Korišćeni su standardni protokoli Fmoc/tBu (W. C. Chan & P. D. White, urednici,Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical ApproachOxford University Press Inc. New York (2000)), u kombinaciji sa Rink amidnom smolom (Novabiochem, San Diego, CA) ili PAL-PEG-PS (Applied Biosvstems, Foster City, CA) čime se, nakon hidrolize, dobijaju C-terminalni amidi. Reagensi za kuplovanje bili su 2-(lH-benzotriazol-l-il)-l,l,3,3-tetrametiluronijum heksafluorfosfat (HBTU) i N-hidroksibenzotriazol (HOBt) (Novabiochem, San Diego, CA). Kao baza je korišćen diizopropiletilamin (DIEA) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), a kao rastvarač N,N-dimetilformamid (DMF) (EM Science, Kansas City, MO). Tipičan ciklus sinteze podrazumevao je 2 koraka uklanjanja zaštitnih grupa po 10 minuta, u kojima je korišćen 20% piperidin u DMF-u, 2x30 minuta aminokiselinskog kuplovanja sa HOBt/HBTU i 10 minutni korak dodavanja krajnje grupe pomoću acetanhidrida/HOBt. Peptidi su uklonjeni sa smole dejstvom 95% trifluorsirćetne kiseline, 2,5% taneditiola, 1,5% triizopropilsilana i 1% vode, u toku 2 časa, a potom istaloženi ledeno hladnim etrom, centrifugirani i fino sprašeni tri puta u etru.
Sirovi peptidi koji sadrže cistein oksidovani su u odgovarajuće disulfide rastvaranjem peptida u smeši sirćetne kiseline i vode (EM Science, Kansas City, MO), 4:1, do koncentracije od 1 mg/ml. Deset molarnih ekvivalenata joda (IM rastvor u vodi, Sigma Aldrich, St. Louis, MO) dodato je u rastvor, te je reakciona smeša mešana jedan čas na sobnoj temperaturi. Reakcija je zaustavljena postepenim dodavanjem 1 M natrijum tiosulfata (Sigma Aldrich, St. Louis, MO), sve dok se rastvor nije razbistrio. Reakciona smeša koncentrovana je u vakuumu a potom prečišćena pomoću sistema za reverzno-faznu HPLC Waters Prep600 (Miliford, MA) opremljenog Phenomenex (Torrence, CA) C18 kolonom od 250mm x 21,2 mm. Eluent koji je odabran za korak prečišćavanja pomoću HPLC bio je gradijent acetonitrila u vodi koji sadrži 0,l%o (vv/v) TFA. Odgovarajuće frakcije su sakupljene, spojene i liofilizovane. Identitet i čistoća su potvrđeni reverzno-faznom analitičkom HPLC u kombinaciji sa Cl8 kolonom od 250mm x 2 mm (Phenomenex, Torrence, CA), kuplovanom sa masenom spektrometrijom sa elektrosprejem (Mariner ES-MS) (Applied Biosvstems, Foster City, CA).
U tabeli 2 dat je popis originalnih fagnih peptidnih sekvenci dobijenih ispitivanjem biblioteka ekspresije proteina, korišćenog kako bi se identifikovali peptidi sa visokim afinitetom za humani FcRn i sposobnošću da spreče interakciju IgG-FcRn. U koloni 1 data je identifikacija peptida. U koloni 2 data je aminokiselinska sekvenca peptida. U koloni 3 data je IC50vrednost za svaki peptid, određena pomoću kompeticionog ELISA testa sa IgG opisanog u primeru 4. U kolonama 4 i 5 date su KDvrednosti za svaki peptid, određene pri pH 6 i pH 7,4, redom, pomoću Biacore analize opisane u primeru 6.
U tabeli 3 dat jc popis mogućih skraćivanja peptida Sekvence čiji je ID br.: 6. Prikazan je uticaj skraćivanja na parametre vezivanja ovih peptida za humani FcRn. U koloni 1 data je identifikacija peptida. U koloni 2 data je aminokiselinska sekvenca peptida. U koloni 3 data je IC50vrednost za svaki peptid, određena pomoću kompeticionog ELISA testa sa IgG opisanog u primeru 4. U kolonama 4 i 5 date su KDvrednosti za svaki peptid, određene pri pH 6 i pH 7,4, redom, pomoću Biacore analize opisane u primeru 6.
U tabeli 4 dat je popis peptida i analoga peptida izvedenih iz Sekvence čiji je ID br.: 1, u kojoj je svaka pojedinačna aminokiselina supstituisana alaninom (alaninski test). Prikazan je uticaj supstitucije na parametre vezivanja ovih peptida za humani FcRn. U koloni 1 data je identifikacija peptida. U koloni 2 data je aminokiselinska sekvenca peptida. U koloni 3 data je IC50vrednost za svaki peptid, određena pomoću kompeticionog ELISA testa sa IgG opisanog u primeru 4. U kolonama 4 i 5 date su Kdvrednosti za svaki peptid, određene pri pH 6 i pH 7,4, redom, pomoću Biacore analize opisane u primeru 6.
U tabeli 5 dat je popis peptida i analoga peptida izvedenih iz Sekvence čiji je ID br.: 1, u kojima su izvršene supstitucije cisteina sa derivatima cisteina. Prikazanje uticaj supstitucije na parametre vezivanja ovih peptida za humani FcRn. U koloni 1 data je identifikacija peptida. U koloni 2 data je aminokiselinska sekvenca peptida. U koloni 3 data je IC5ovrednost za svaki peptid, određena pomoću kompeticionog ELISA testa sa IgG opisanog u primeru 4. U kolonama 4 i 5 date su KDvrednosti za svaki peptid, određene pri pH 6 i pH 7,4, redom, pomoću Biacore analize opisane u primeru 6.
U tabeli 6 dat je popis peptida izvedenih iz Sekvence čiji je ID br.: 1 i peptida br. 32 kod kojih je pojedinačna aminokiselina supstituisana N-metil amino kiselinama. Prikazan je uticaj supstitucije na parametre vezivanja ovih peptida za humani FcRn. U koloni 1 data je identifikacija peptida. U koloni 2 data je aminokiselinska sekvenca peptida. U koloni 3 data je IC50vrednost za svaki peptid, određena pomoću kompeticionog ELISA testa sa IgG opisanog u primeru 4. U kolonama 4 i 5 date su KDvrednosti za svaki peptid, određene pri pH 6 i pH 7,4, redom, pomoću Biacore analize opisane u primeru 6.
U tabeli 7 dat je popis skraćenih varijanti derivata peptida izvedenih iz peptida br. 32. Dat je prikaz uticaja skraćivanja ovih peptida na njihove parametre vezivanja za humani FcRn. U koloni 1 data je identifikacija peptida. U koloni 2 data je aminokiselinska sekvenca peptida. U koloni 3 data je IC50vrednost za svaki peptid, određena pomoću kompeticionog ELISA testa sa IgG opisanog u primeru 4. U kolonama 4 i 5 date su Kdvrednosti za svaki peptid, određene pri pH 6 i pH 7,4, redom, pomoću Biacore analize opisane u primeru 6.
U tabeli 8 dat je popis peptida i analoga peptida izvedenih iz peptida br. 32, u kojima su uvedene supstitucije različitim aminokiselinama i aminokiselinskim derivatima, na mestima gde se obično nalazi sekvenca Gly-Gly-Leu. U koloni 1 data je identifikacija peptida. U koloni 2 data je aminokiselinska sekvenca peptida. U koloni 3 data je IC5Cvrednost za svaki peptid, određena pomoću kompeticionog ELISA testa sa IgG opisanog u primeru 4. U kolonama 4 i 5 date su Kdvrednosti za svaki peptid, određene pri pH 6 i pH 7,4, redom, pomoću Biacore analize opisane u primeru 6.
U tabeli 9 dat je popis peptida i analoga peptida dobijenih iz peptida br. 32, u kojima su uvedene supstitucije različitim aminokiselinama i aminokiselinskim derivatima, na mcstima gde se obično nalazi sekvenca Arg-Phe-Penicilamin. U koloni 1 data je identifikacija peptida. U koloni 2 data je aminokiselinska sekvenca peptida. U koloni 3 data je IC50vrednost za svaki peptid, određena pomoću kompeticionog ELISA testa sa IgG opisanog u primeru 4. U kolonama 4 i 5 date su Kdvrednosti za svaki peptid, određene pri pH 6 i pH 7,4, redom, pomoću Biacore analize opisane u primeru 6.
U tabeli 10 dat je popis peptida i analoga peptida dobijenih iz peptida br. 32, u kojima su uvedene supstitucije različitim aminokiselinama i aminokiselinskim derivatima, na mestima gde se obično nalazi sekvenca Penicilamin-Thr-Gly. U koloni 1 data je identifikacija peptida. U koloni 2 data je aminokiselinska sekvenca peptida. U koloni 3 data je IC50vrednost za svaki peptid, određena pomoću kompeticionog ELISA testa sa IgG opisanog u primeru 4. U kolonama 4 i 5 date su KDvrednosti za svaki peptid, određene pri pH 6 i pH 7,4, redom, pomoću Biacore analize opisane u primeru 6.
U tabeli 11 dat je popis peptida i analoga peptida dobijenih iz peptida br. 187, u kojima su uvedene supstitucije različitim aminokiselinama i aminokiselinskim derivatima, na mestima gde se obično nalazi sekvenca Phe-Gly-Sarkozin. U koloni 1 data je identifikacija peptida. U koloni 2 data je aminokiselinska sekvenca peptida. U koloni 3 data je IC50vrednost za svaki peptid, određena pomoću kompeticionog ELISA testa sa IgG opisanog u primeru 4. U kolonama 4 i 5 date su KDvrednosti za svaki peptid, određene pri pH 6 i pH 7,4, redom, pomoću Biacore analize opisane u primeru 6.
U tabeli 12 dat je popis peptida i analoga peptida dobijenih iz peptida br. 32, u kojima su uvedene supstitucije različitim aminokiselinama i aminokiselinskim derivatima, na mestima gde se obično nalazi sekvenca His-Phe-Gly. U koloni 1 data je identifikacija peptida. U koloni 2 data jc aminokiselinska sekvenca peptida. U koloni 3 data je hemijska struktura analoga bočnog lanca Phe. U koloni 4 data je IC50vrednost za svaki peptid, određena pomoću kompeticionog ELISA testa sa IgG opisanog u primeru 4. U kolonama 4 i.5 date su Kdvrednosti za svaki peptid, određene pri pH 6 i pH 7,4, redom, pomoću Biacore analize opisane u primeru 6.
U tabeli 13 dat je popis različitih peptida i analoga peptida kod kojih su pojedinačne aminokiseline zamenjene tirozinom. Dat je i uticaj supstitucija na parametre vezivanja ovih peptida sa humanim FcRn. U koloni 1 data je identifikacija peptida. U koloni 2 data je aminokiselinska sekvenca peptida. U koloni 3 data je hemijska struktura bočnog lanca analognog tirozinu. U koloni 4 data je IC50vrednost za svaki peptid, određena pomoću kompeticionog ELISA testa sa IgG opisanog u primeru 4. U kolonama 4 i 5 date su Kdvrednosti za svaki peptid, određene pri pH 6 i pH 7,4, redom, pomoću Biacore analize opisane u primeru 6.
U tabeli 14 dat je popis peptida i analoga peptida dobijenih iz peptida br. 32, u kojima su uvedene supstitucije različitim aminokiselinama i aminokiselinskim derivatima, na mestima gde se obično nalazi sekvenca Gly-Leu. U koloni 1 data je identifikacija peptida. U koloni 2 data je aminokiselinska sekvenca peptida. U koloni 3 data je IC50vrednost za svaki peptid, određena pomoću kompeticionog ELISA testa sa IgG opisanog u primeru 4. U kolonama 4 i 5 date su KDvrednosti za svaki peptid, određene pri pH 6 i pH 7,4, redom, pomoću Biacore analize opisane u primeru 6.
U tabeli 9 dat je popis peptida i analoga peptida dobijenih iz peptida br. 32, u kojima su uvedene supstitucije glicina i leucina zajedno za jedan mimetik dipeptida, na mestima gde se normalno nalazi sekvenca Gly-Leu. U koloni 1 data je identifikacija peptida. U koloni 2 data je aminokiselinska sekvenca peptida. U koloni 3 dat je opis za identitet X u datoj sekvenci. U koloni 4 data je hemijska struktura analoga obeleženog kao X. U koloni 5 data je IC5ovrednost za svaki peptid, određena pomoću kompeticionog ELISA testa sa IgG opisanog u primeru 4. U koloni 6 date su KDvrednosti za svaki peptid, određene pri pH 6 pomoću Biacore analize opisane u primeru 6.
Primer 8: Sinteza peptida koji sadrže analoge histidina
Modifikovani analozi histidina (tabela 16) sintetisani su kao što je opisano u primeru 7 za sintezu monomernih peptidnih disulfida, osim sledećih modifikovanih analoga histidina. Peptid br. 259 sintetisan je suspenzijom smole koja sadrži potpuno zaštićen peptid analogan peptidu br. 99, u čistom metil jodidu u toku 15 časova. Nakon toga, smola je isprana dihlormetanom a peptid je odvojen od smole, oksidovan i prečišćen pomoću HPLC, kao što je prethodno opisano, čime se dobija peptid sa monometilovanim histidinom, peptid br. 259.
Peptid br. 260 sintetisan je suspenzijom smole koja sadrži potpuno zaštićen peptid analogan peptidu br. 99, u čistom metil jodidu u toku 72 časa. Nakon toga, smola je isprana dihlormetanom a peptid je odvojen od smole, oksidovan i prečišćen pomoću HPLC, kao stoje prethodno opisano, čime se dobija peptid sa dimetilovanim histidinom, peptid br. 260.
Peptid br. 269 sintetisan je suspenzijom smole koja sadrži potpuno zaštićen peptid analogan peptidu br. 248, u dihlormetanu, pod atmosferom azota. U suspenziju je dodato deset molarnih ekvivalenata 2,4,6-tri-terc-butilpiridina (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), te 5 molarnih ekvivalenata metil-trifluormetan sulfonata (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Reakcija je tekla 4 časa, uz mešanje na mešalici. Usledilo je ispiranje dimetilformamidom i na kraju ponovo dihlormetanom. Peptid je odvojen od smole, oksidovan i prečišćen pomoću HPLC, kao što je prethodno opisano, čime se dobija peptid sa N-metil-tiazolijumom, peptid br. 269.
Peptid br. 271 je sintetisan u reakciji u kojoj je peptid br. 261 tretiran sa 30 ekvivalenata bakar sulfata, 30 ekvivalenata askorbinske kiseline i 10 ekvivalenata natrijum azida u rastvoru 100 mM natrijum fosfatnog pufera pH 7,5 sa 33% etanola, 10% acetonitrila, 10%o N,N-dimetilformamida. Reakcija je trajala 2 časa, nakon čega je smeša prečišćena pomoću HPLC kao što je prethodno opisano, kako bi se dobio peptid koji sadrži 1,2,3-tiazolni bočni lanac, peptid br. 271.
U tabeli 16 dat je popis različitih peptida i analoga peptida kod kojih je pojedinačna aminokiselina supstituisana histidinom. Prikazan je, takođe, uticaj supstitucije na parametre vezivanja ovih peptida za humani FcRn. U koloni 1 data je identifikacija peptida. U koloni 2 data je aminokiselinska sekvenca peptida. U koloni 3 data je hemijska struktura bočnog lanca analoga His. U koloni 4 data je IC30vrednost za svaki peptid, određena pomoću kompeticionog ELISA testa sa IgG opisanog u primeru 4. U kolonama 4 i 5 date su Kdvrednosti za svaki peptid, određene pri pH 6 i pH 7,4, redom, pomoću Biacore analize opisane u primeru 6.
Primer 9: Pinteza peptida koji sadrže peptidomimetike - analoge sekvence Gly-Gly
Svi aminokiselinski mimetici Gly-Gly (tabela 17) ugrađeni su u obliku svojih aminokiselina čija je amino grupa zaštićena pomoću Fmoc i bili su komercijalno dostupni osim ukoliko je naznačeno drugačije (Chem-Impex, Wood Dale, IL). Peptidi koji sadrže 3(R)-3-amino-2-okso-l-piperidin-sirćetnu kiselinu sintetisani su ugradnjom N-Fmoc derivata 3(R)-3-amino-2-okso-l-piperidin-sirćetne kiseline u peptid br. 227, prema protokolu opisanom u R.M. Freidinger et. al., J.Org. Chem. Al:104-109 (1982). Peptidi koji sadrže 3(R)-3-amino-2-okso-l-pirolidin-sirćetnu kiselinu sintetisani su ugradnjom N-Fmoc derivata 3(R)-3-amino-2-okso-l-pirolidin-sirćetne kiseline u peptid br. 214, prema protokolu opisanom u R.M. Freidinger et. al., J.Org. Chem.47: 104-109 (1982). Peptidi koji sadrže 5,5-biciklični mimetik dipeptida sintetisani su ugradnjom tog 5,5-bicikličnog mimetika dipeprida u peptid br. 197 ili peptid br. 198, prema protokolu koji je opisan u N.L. Subasinghe et. al.,J. Med. Chem. 36:2356-2361 (1993), s tim izuzetkom što su korišćene D aminokiseline. Peptidi koji sadrže 6,5-biciklični mimetik dipeptida sintetisani su ugradnjom tog 6,5-bicikličnog mimetika dipeprida u peptid br. 204, prema protokolu koji je opisan u F.A. Etzkorn et. al.,J. Am. Chem. Soc. 116:10412 (1994), s tim izuzetkom što su korišćene D aminokiseline. Peptidi koji sadrže (D,L)-Frajdingerov laktam sintetisani su ugradnjom tog (D,L)-Frajdingerovog laktama u peptid br. 216, prema protokolu koji je opisan u R.M. Freidinger et. al., J.Org. Chem.47: 104-109 (1982), s tim izuzetkom što je umesto D-metionina korišćen L-metionin.
U tabeli 17 dat je popis peptida i analoga peptida izvedenih iz Sekvence čiji je ID br.: 1, u kojima su uvedene supstitucije različitim aminokiselinama i derivatima aminokiselina, na mestima gde se obično nalazi sekvenca dva uzastupna glicina, Gly-Gly. U koloni 1 data je identifikacija peptida. U koloni 2 data je aminokiselinska sekvenca peptida. U koloni 3 data je IC50vrednost za svaki peptid, određena pomoću kompeticionog ELISA testa sa IgG opisanog u primeru 4. U kolonama 4 i 5 date su KDvrednosti za svaki peptid, određene pri pH 6 i pH 7.4. redom, nomoćn Riacore analize onisane u nrimeru 6.
U tabeli 18 dat je popis peptida i analoga peptida izvedenih iz peptida br. 99, u kojima su uvedene supstitucije dva glicina koja su zjedno supstituisana peptidnim analogom, na mestima gde se normalno nalazi sekvenca Gly-Gly. U koloni 1 data je identifikacija peptida. U koloni 2 data je aminokiselinska sekvenca peptida. U koloni 3 dat je opis za identifikaciju peptidomimetičkog analoga koji je u sekvenci označen kao X. U koloni 4 data je hemijska struktura analoga označenog kac X. U koloni 5 data je IC50vrednost za svaki peptid, određena pomoću kompeticionog ELISA testa sa IgG opisanog u primeru 4. U koloni 6 date su KDvrednosti za svaki peptid, određene pri pH 6 pomoću Biacore analize opisane u primeru 6.
Primer 10: Sinteza peptida koji su ciklizovani preko laktamskog mosta
Peptidi koji su ciklizovani preko laktama (tabela 19) sintetisani su pomoću sinteze peptida na čvrstoj fazi kao što je prethodno navedeno u primeru 7, s tim što su sledeće aminokiseline korišćene za supstituciju različitih cisteina: Fmoc-Lys(Aloc)-OH, Fmoc-Om(Aloc)-OH, Fmoc-Dab(Aloc)-OH i Fmoc-Dap(Aloc)-OH, Fmoc-Glu(OAIil)-OK i Fmoc-Asp(OAIil)-OH (Bachem, Torrance, CA). Nakon što je proces dobijanja potpuno zaštićenog peptida na smoli završen, smola je ostavljena da nabubri u dihlormetanu, pročišćena azotom i tretirana sa 0,1 molarnih ekvivalenata tetrakis-(trifenilofsfm)paladijuma(0) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) i 30 molarnih ekvivalenata fenilsilana (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), pri čemu je reakcija trajala 3 časa. Smola je isprana prvo dihlormetanom, zatim DMF-om te, na kraju, još pet puta rastvorom u kome je 1% (v/v) trietilamina i 1% (w/v) dietilditiokarbaminske kiseline u DMF-u. Usledio je još jedan dodatni korak ispiranja u DMF-u, a potom je smola tretirana benzotriazol-l-il-oksi-tris-pirolidino-fosfonijum heksafluorfosfatom (PyBOP) (Novabiochem, San Diego, CA) i DIEA u toku 16 časova. Peptidi su odvojeni od smole i prečišćeni kao što je opisano u primeru 7.
U tabeli 19 dat je popis različitih peptida prema predmetnom pronalasku sa aminokiselinskim supstitucijama ostataka cisteina za aminokiseline i analoge aminokiselina koji bi omogućili ciklizaciju datog peptida preko laktamskog mosta. Dat je i uticaj supstitucija na parametre vezivanja ovih peptida za humani FcRn. U koloni 1 data je identifikacija peptida. U koloni 2 data je aminokiselinska sekvenca peptida. U koloni 3 data je IC50vrednost za svaki peptid, određena pomoću kompeticionog ELISA testa sa IgG opisanog u primeru 4. U kolonama 4 i 5 date su Kdvrednosti za svaki peptid, određene pri pH 6 i pH 7,4, redom, pomoću Biacore analize opisane u primeru 6.
'Postoji amidna veza između bočnih lanaca podvučenih aminokiselina; Dab - 1,3-diaminobuterna kiselina; Dap = 1,2-diaminopropionska kiselina; Orn = ornitin.
Primer11:Sinteza linearnih analoga peptida
Linearni analozi peptida sintetisani su kao što je prethodno opisano u primeru 7, s tim izuzetkom što su aminokiseline koje grade disulfide supstituisane kao što je opisano u tabelama 20 i 21.
U tabeli 20 dat je popis peptida i analoga peptida prema predmetnom pronalasku izvedenih iz Sekvence čiji je ID br.: 1. Dati su i parametri vezivanja ovih peptida za humani FcRn. U koloni 1 data je identifikacija peptida. U koloni 2 data je aminokiselinska sekvenca peptida. U koloni 3 data je IC50vrednost za svaki peptid, određena pomoću kompeticionog ELISA testa sa IgG opisanog u primeru 4. U kolonama 4 i 5 date su KDvrednosti za svaki peptid, određene pri pH 6 i pH 7,4, redom, pomoću Biacore analize opisane u primeru 6.
U tabeli 21 dat je popis peptida i analoga peptida izvedenih iz peptida br. 236. u kojima su uvedene supstitucije različitim peptidomimetičkim analozima, na mestima gde se normalno nalazi sekvenca glicin-sarkozin (Giy-Sar). U koloni 1 data je identifikacija peptida. U koloni 2 data je aminokiselinska sekvenca peptida. U koloni 3 dat je opis za identifikaciju peptidomimetičkog analoga koji je u sekvenci označen kao X. U koloni 4 data je hemijska struktura peptidomimetičkog analoga označenog kao X. U koloni 5 data je IC50vrednost za svaki peptid, određena pomoću kompeticionog ELISA testa sa IgG opisanog u primeru 4. U koloni 6 date su Kdvrednosti za svaki peptid, određene pri pH 6 pomoću Biacore analize opisane u primeru 6.
Primer 12: Sinteza peptidnih dimera redukcionim alkilovanjem
Peptidni dimeri (tabela 22) dobijeni su redukcionim alkilovanjem peptidnog aldehida i amina na amino (N) ili karboksi (C) kraju peptida.
N-terminalni peptidni amini sintetisani su kao što je prethodno opisano u primeru 7 za sintezu monomernih peptidnih disulfida, osim što je korišćena 1,2-diaminoetanska smola (Novabiochem, San Diego, CA) u koraku sinteze. Samim tim, odvajanje sa smole dalo je C-terminalni etilamin.
N-terminalni peptidni aldehidi (slika 2) sintetisani su u reakciji nezaštićenog amina iz N-terminalne aminokiseline i 5 ekvivalenata anhidrida ćilibarne kiseline (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) u prisustvu DIEA u DMF-u u toku 2 časa. Usledila je reakcija sa 2,2-dimetil-l,3-dioksolan metaminom (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) u prisustvu PyBOP i DIEA u toku 2 časa, dajući zaštićenu diolnu smolu. Odvajanjem sirovog peptida sa smole, nakon čega je usledila oksidacija cisteina i prečišćavanje kao što je prethodno opisano u primeru 7 za sintezu monomernih peptidnih disulfida, dobijen je peptidni diol. Diol je rastvoren u 33% sirćetnoj kiselini, nakon čega je dodato 2 ekvivalenta natrijum perjodata (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) te je reakcija ostavljena da traje 5 minuta. Reakciona smeša ugašena je pomoću 20 ekvivalenata (u odnosu na diol) etilen glikola (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) te je, nakon deset minuta, sirova reakciona smeša razblažena tri puta vodom i prečišćena na C18 Sep-Pak koloni (Waters Corp., Milford, MA) uz pomoć rastućeg gradijenta acetonitrila u vodi koja sadrži 0,1% TFA. Peptidni aldehid je liofilizovan i, nakon tečne hromatografije (Applied Biosvstems, Foster Citz, CA) analiziran masenom spektroskopijom (Mariner ES-MS), kao što je opisano u primeru 7. C-terminalni aldehidi peptida sintetisani su kao što je prethodno opisano u primeru 7 za sintezu monomernih peptidnih disulfida, osim što je, umesto Rink amidne smole, korišćena Fmoc-l-amino-2,3-propandiol-2'-hlortritil smola (Novabiochem, San Diego, CA). Samim tim, dobijena peptidna smola sadržala je maskirani C-terminalni diol. Nakon odvajanja sa smole, diol je oksidovan do aldehida, kao što je prethodno opisano za N-terminalne aldehide.
Peptidni monomeri za sintezu peptida koji su ciklizovani preko laktama, kao što je peptid br. 275, sintetisani su prema postupku koji je prethodno opisan u primeru 10, za sintezu peptida ciklizovanih preko laktamskog mosta, gde je ciklizacija Asp-Lys izvršena dok je peptid bio na smoli, pre nego što je od nje odvojen.
Peptidni dimeri su sintetisani (slika 3) u reakciji jednog ekvivalenta peptidnog aldehida sa jednim ekvivalentom peptida koji sadrži amin, u koncentraciji od 40 mg/ml u DMF-u koji sadrži 2% sirćetne kiseline. Nakon 60 minuta, dodato je 2 ekvivalenta natrijum cijanoborhidrida (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) te je reakcija ostavljena, na mućkalici, 1 čas. Reakciona smeša je razblažena 10 puta vodom i prečišćena pomoću HPLC, a potom, nakon tečne hromato grafije (Applied Biosvstems, Foster Citz, CA) analiziran masenom spektroskopijom (Mariner ES-MS), kao što je opisano u primeru 7.
U tabeli 22 dat je popis dimernih peptida prema predmetnom pronalasku koji su sintetisani redukcionim alkilovanjem. U koloni 1 data je identifikacija peptida. U koloni 2 data je aminokiselinska sekvenca peptida. U koloni 3 data je IC50vrednost za svaki peptid, određena pomoću kompeticionog ELISA testa sa IgG opisanog u primeru 4. U kolonama 4 i 5 date su Kdvrednosti za svaki peptid, određene pri pH 6 i pH 7,4, redom, pomoću Biacore analize opisane u primeru 6. U koloni 6 data je IC50vrednost za svaki peptid, određena pomoću kompeticione FACS analize vezivanja za IgG, opisane u primeru 5.
Primer 13: Sinteza peptidnih dimera povezanih preko tiolnih vezivnih molekula i
bromacetilovanih peptida
Peptidni dimeri (tabela 23) sintetisani su još i u reakciji bromacetilovanih peptida i tiolnih vezivnih molekula ("linkera"). Bromacetilovani peptidi su sintetisani (slika 4) u reakciji slobodne oc-amino grupe zaštićene peptidne smole sa 4 ekvivalenta bromacetil bromida (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) i 8 ekvivalenata DIEA (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) u DMF-u. Nakon 1 časa, smola je isprana DMF-om, potom DCM-om a zatim je peptid odvojen od smole kao što je prethodno opisano u primeru 7. U slučajevima u kojima su peptidi ciklizovani preko laktama dimerizovani pomoću bis-tiol linkera, korak ciklizacije na smoli izvršenje pre koraka bromacetilovanja. U slučajevima u kojima su peptidi koji sadrže disulfide dimerizovani preko bis-tiol linkera, korak oksidacije jodom izvršen je nakon odvajanja sa smole kao što je prethodno opisano u primeru 7.
Bis-tiol linkeri su sintetisani (slika 4) u reakciji NH2-Gly-2-hlortritilne smole (Novabiochem, San Diego, CA) sa 2 ekvivalenta N,N-bis(N'-Fmoc-3-aminopropil)gIicin kalijum hemisulfata (Chem-Impex, Wood Dale, IL) u prisustvu 2 ekvivalenta PyBOP (Novabiochem, San Diego, CA) i DIEA u DMF-u 18 časova. Fmoc zaštitna grupa uklonjena je pomoću dva desetominutna tretmana 20% piperidinom u DMF-u. U nekim jedinjenjima koja su korišćena kao linkeri, ugrađeni su i beta-alanini kao jedinice za udaljavanje ("spejseri"). Fmoc-beta-Ala-OH (Novabiochem) je kuplovan sa smolom kao što je prethodno objašnjeno, uz pomoć PyBOP i DIEA. Nakon što je Fmoc grupa uklonjena pomoću 20%> pipcridina u DMF-u, ugrađena je ili jedna dodatna alaninska jedinica za udaljavanje ili je bis-tiol vezivni molekul ugrađen u reakciji slobodnog N-terminalnog amina na smoli sa dva ekvivalenta N-sukcinimidil-S-acetiltiopropionata (SATP, Pierce, Rockford, IL) i 4 ekvivalenta DIEA, 18 časova.
Nakon toga, S-acetil zaštitna grupa uklonjena je reakcijom između 0,05 mmola peptidne smole sa rastvorom iz koga je uklonjen gas, a koji sadrži 1 ml DMF-a i 0,4 ml pufera A (pufer A: IM hidroksilamin hidrohlorid (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), 40 mM natrijum fosfat pH 7,5, 50 mM EDTA (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)), pri čemu je reakcija trajala 18 časova. Smole su isprane DMF-om, nakon toga DCM-om, a zatim je peptid odvojen od smole primenom 50% rastvora TFA u DCM-u sa 2% triizopropilsilana, u toku 15 minuta. Sirovi linkeri su obrađeni i prečišćeni kao stoje prethodno opisano u primeru 7.
Peptidni dimeri dobijeni su primenom bis-tiol linkera (slika 4), tako što je izvršena reakcija između jednog ekvivalenta prečićenog bis-tiol linkera sa dva ekvivalenta bromacetilovanog N-terminalnog peptida u DMF-u, sa 10% vode i 50% 100 mM natrijum fosfata, pH 7,5. Nakon 18 časova, sirova reakciona smeša je prečišćena reverzno-faznom HPLC u koloni kao što je prethodno opisano u primeru 7.
Peptid br. 122 je sintetisan (slika 5) u reakciji u kojoj bromacetilovani peptid reaguje sa peptidom koji je derivatizovan pomoću SATP. Ukratko, sirova peptidna smola sa slobodnim N-terminalnim aminom reagovala je sa 2 ekvivalenta SATP u DMF-u 2 časa. S-acetil zaštitna grupa uklonjena je kao što je prethodno opisano, nakon čega su usledili koraci odvajanja sa smole a potom i prečišćavanja, takođe kao što je prethodno opisano.
U tabeli 23 dat je popis dimernih peptida prema predmetnom pronalasku koji su sintetisani uz pomoć tiolnih linkera. U koloni 1 data je identifikacija peptida. U koloni 2 data je aminokiselinska sekvenca peptida. U koloni 3 data je IC50vrednost za svaki peptid, određena pomoću kompeticionog ELISA testa sa IgG opisanog u primeru 4. U kolonama 4 i 5 date su KDvrednosti za svaki peptid, određene pri pH 6 i pH 7,4, redom, pomoću Biacore analize opisane u primeru 6. U koloni 6 data je IC50vrednost za svaki peptid, određena pomoću kompeticione FACS analize vezivanja za IgG, opisane u primeru 5.
Primer 14: Sinteza peptidnih trimera putem reduktivne alkilacije: peptid br. 247
Peptidni trimeri (tabela 22) sintetisani su redukcionim alkilovanjem peptidnog aldehida i peptidnog amino N-terminalnog amina.
N-terminalni peptidni amini su sintetisani kao što je prethodno opisano u primeru 7 za sintezu monomernih peptidnih disulfida, s tim što je na N-terminalni kraj dodata krajnja grupa ("poklopac"), bifunkcionalni aminski molekul za povezivanje kao što je bis-aminopropil glicin (BAPG; koristi se kao Bis-Fmoc-BAPG nabavljen preko Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), nakon čega je usledilo kuplovanje sarkozina. N-terminalni peptidni aldehidi (slika 2) sintetisani su kao što je opisano u primeru 12. Peptidni trimeri sintetisani su (kao na slici 3) u reakciji dva ekvivalenta peptidnog aldehida sa jednim ekvivalentom peptida koji sadrži amin u koncentraciji od 40 mg/ml u DMF-u koji sadrži 2% sirćetne kiseline. Nakon 60 minuta, dodata su 4 ekvivalenta natrijum cijanoborhidrida (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) nakon čega je reakciona smeša ostavljena na mućkalici 1 čas. Reakciona smeša je potom desetostruko razblažena vodom te prečišćena pomoću HPLC, te nakon tečne hromatografije (Applied Biosvstems, Foster City, CA) analizirana masenom spektroskopijom (Mariner ES-MS), kao što je opisano u primeru 7.
Primer 15: Sinteza peptidnih dimera pomoću dikiselina i aminskih linkera
Dimeri vezani preko aminskih povezujućih grupa (linkera) (tabela 24) sintetisani su ili u reakciji N-terminalnog kraja dva peptidna monomera koja se nalaze na smoli sa bifunkcionalnim kiselinskim vezivnim molekulom, ili sintezom peptida na smoli koja sadrži bifunkcionalni aminski vezivni molekul, čime se povezuju dva C-terminalna kraja peptidnih monomera na smoli.
N-terminalno povezani peptidni dimeri sintetisani su kao što je prethodno opisano u primeru 7 za sintezu monomernih peptidnih disulfida, uz sledeće izmene: pre nego što su peptidi odvojeni od smole, N-terminalni krajevi dva peptidna monomera spajaju se preko bilunkcionalne kiselinske povezujuće grupe - vezivnog molekula ("linkera"). Na primer, peptid br. 238 se sintetiše u reakciji peptidne smole koja sadrži peptidnu sekvencu analognu peptidu br. 235 sa nezaštićenim N- krajem, sa 0,5 ekvivalenata ćilibame kiseline (Sigma-Aldrich. St. Louis, MO) u prisustvu 1 ekvivalenta PvBOP i 2 ekvivalenta DIEA. Ovim se dva susedna peptida na smoli kovalentno povezuju jedan sa drugim preko amidnih veza na njihovim N-krajevima.
Dobijeni peptidni dimer se odvaja od smole i prečišćava kao što je opisano u primeru 7, osim što se peptidni disulfidi ne oksiduju pre prečišćavanja pomoću HPLC. Prečišćeni redukovani peptid se rastvara do koncentracije od oko 0,1 mg/ml u 10 mM natrijum fosfatu, pH 7,5 sa 20% DMSO, te se tri dana meša na sobnoj temperaturi. Ovaj korak oksidacije omogućava nastanak disulfidnih veza u okviru jednog peptidnog monomera u dimeru, umesto između dva monomera u datom dimeru. Reakciona smeša se razblaži vodom do koncentracije peptida od 0,05 mg/ml i prečisti na Cl8 Sep-Pak koloni (Waters Corp, Milford, MA) uz upotrebu rastućeg gradijenta acetonitrila u vodi koja sadrži 0,1 %> TFA. Peptidni dimer je liofilizovan, te nakon tečne hromatografije (Applied Biosvstems, Foster Citv, CA) analiziran masenom spektroskopijom (Mariner ES-MS), kao što je opisano u primeru 7 (videti sliku 6). U slučaju peptida br. 283, raspored disulfidnih veza potvrđen je hidrolizom peptida tripsinom tokom 30 minuta te analizom ovako dobijenih peptida pomoću LCMS. Poznato je da tripsin hidrolizujc veze nakon ostataka arginina i lizina, te hidrolizuje peptid br. 283 na mestu veze arginin-fenilalanin. Glavni proizvod LCMS peptida br. 283 je NH2-[Phe Phe-Pen-Thr-Gly-His-Phe-Gly-Sar-NMeLeu-Tyr-Pro-Cys]-CONH2(disulfid) (LCMS: M+H = 1355,6 Da), što ukazuje da se disulfidna veza u peptidu br. 283 gradi između svih peptidnih monomera od po 13 aminokiselinskih ostataka.
Peptid br. 201 sintetisan je kao peptid br. 283 osim što je peptidna sekvenca bila analogna peptidu br. 32, dikiselinski vezivni molekul koji je korišćen bio je etilen glikol bis(N-hidroksisukcinimidni estar ćilibarne kiseline) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) a za reakciju kuplovanja korišćen je PyBOP.
Peptid br. 279 sintetisan je kao peptid br. 283 osim što je kao dikiselinski vezivni molekul korišćen bis-dPEG6-N-hidroksisukcinimidni estar (Quanta Biodesigns Ltd.) a za reakciju kuplovanja korišćen je PyBOP.
Peptid br. 281 sintetisan je kao peptid br. 283 osim što je peptidna smola izložena dejstvu velikog viška anhidrida ćilibarne kiseline (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) što dovodi do toga da svi peptidi koji se nalaze na smoli imaju N- kraj na kome se nalazi sukcinat kao "poklopac". Smola je izložena dejstvu 0,5 ekvivalenata N,N'-dimetiletil-endiamina (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) u prisustvu 1 ekvivalenta PyBOP i 2 ekvivalenta DIEA. Koraci koji slede, odvajanje od smole, prečišćavanje i oksidacija, izvršeni su kao i kod peptida br. 283.
Peptid br. 282 sintetisan je kao peptid br. 283 osim što je kao dikiselinski vezivni molekul korišćena N-metil-iminodisirćetna kiselina (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO).
Peptid br. 284 sintetisan je kao peptid br. 283 osim što je kao dikiselinski vezivni molekul korišćena 3,3-dimetilglutarna kiselina (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO).
Peptid br. 285 sintetisan je kao peptid br. 283 osim što je kao dikiselinski vezivni molekul korišćen Boc-Asp(OH)-OH (Novabiochem, San Diego, CA).
Peptid br. 286 sintetisan je kao peptid br. 283 osim što je kao dikiselinski vezivni molekul korišćen Boc-Glu(OH)-OH (Novabiochem, San Diego, CA).
Peptidni dimeri vezani preko svojih C- krajeva sintetisani su kao što je prethodno opisano u primeru 7 za sintezu monomernih peptidnih disulfida, s tim izuzetkom što je bifunkcionalni aminski vezivni molekul kuplovan za smolu pre sinteze peptida. Na ovaj način dobijaju se peptidni dimeri čiji su C-terminalni krajevi kovalentno vezani aminskim vezama. Na primer, peptid br. 280 sintetisan je tako što je prvo Fmoc-Lys(Fmoc)-OH (Novabiochem, San Diego, CA) kuplovan za smolu, nakon čega je usledilo kuplovanje aminokiselina kojim se dobija sekvenca analogna peptidu br. 235. Na ovaj način dobijaju se peptidi koji su kovalentno vezani međusobno još dok se sintetišu na smoli. Dobijeni peptidni dimer se uklanja sa smole, prečišćava i oksiduje, kao što je to prethodno opisano za dimere koji su povezani preko svojih N- krajeva (videti sliku 7).
Peptid br. 287 sintetisan je kao i peptid br. 280, s tom razlikom što je ostatak glicina (Gly) ubačen između sekvence peptida br. 235 i račvastog lizinskog vezivnog molekula.
Peptid br. 288 sintetisan je kao i peptid br. 280, s tom razlikom što su dva ostatka glicina (Gly-Gly) ubačena između sekvence peptida br. 235 i račvastog lizinskog vezivnog molekula.
U tabeli 24 dat je popis dimernih peptida prema predmetnom pronalasku koji su sintetisani pomoću amino veza. U koloni 1 data je identifikacija peptida. U koloni 2 data je aminokiselinska sekvenca peptida. U koloni 3 data je IC5ovrednost za svaki peptid, određena pomoću kompeticionog ELISA testa sa IgG opisanog u primeru 4.
Primer 16: Sinteza fuzionisanih molekula peptid-Fc pomoću redukcionog
alkilovanja
N-terminalni peptidni aldehidi peptid br. 252, peptid br. 229 i peptid br. 232 (tabela 25) sintetisani su kao što je opisano u primeru 12. Svi ovi fuzionisani molekuli peptid-Fc sintetisani su pomoću istog protokola (slika 8): CysFc (Fc domen koji ima N-terminalni cistein) i 4,5 ekvivalenta peptidnog aldehida inkubirani su na ledu u 80 mM natrijum acetatu pH 5,5 1 čas. Dodat je natrijum cijanoborhidrid do konačne koncentracije od 20 mM nakon čega je reakciona smeša inkubirana 16 časova na 4°C. Reakciona smeša analizirana je pomoću SDS-PAGE kako bi se obezbedilo da se Fc proteinu dodaje uglavnom pojedinačan peptid. Smeša proteina je dijalizovana dva puta u PBS-u i ispitana nainMitroaktivnost sprečavanja vezivanja (tabela 25). U slučaju peptida br. 252-Fc, protein je ocenjen i primenom modela katabolizma IgG kod TG32B miševa (slika 15). CysFc može da se sintetiše kao stoje opisano u U.S. Patentnoj prijavi br. US 2005/0027109, gde je opis sinteze CysFc ovde inkorporiran po referenci.
U tabeli 25 dat je popis fuzionisanih proteina peptid-Fc prema predmetnom pronalasku koji su sintetisani pomoću CysFc i peptidnih aldehida. U koloni 1 dat je redni broj fuzionisanog proteina peptid-Fc. U koloni 2 data je aminokiselinska sekvenca peptida. U koloni 3 data je IC50vrednost za svaki peptid, određena pomoću kompeticionog ELISA testa sa IgG opisanog u primeru 4.
Primer 17: Transgeni miševi
Transgeni miševi dobijeni su od Dr. Rupenijana iz Džekson laboratorije u Bar Harbor, ME. Endogeni mišji geni za FcRn i p2m inaktivirani su insercijom (ugradnjom, prim. prev.) strane polinukleotidne sekvence homologom rekombinacijom, te transgeno zamenjeni humanim FcRn i humanim p2m genima (muFcRn (-/-), mup2m (-/-), +huFcRn, +hup2m). Ovi miševi označeni su prema imenu soja, TG32B.
Primer 18: Dejstvo peptida br. 270 na katabolizam humanog IgG kod TG32B
miševa pri primeni5 mg/kg i10mg/kg
Odraslim TG32B miševima ubrizgano je, intravenskom injekcijom, 500 mg/kg humanog IgG (MP Biomedicals, Irvine, CA) u trenutku t = 0 časova (T0). U 24, 48, 96 i 120. času miševima je ubrizgano, intravenskom injekcijom, bilo 5 mg/kg bilo 10 mg/kg peptida br. 270. U svakom od ovih trenutaka ubrizgavane su i kontrolne injekcije, koje su sadržale PBS nosilac sa 15 mM natrijum acetatom, pH 5. Pre injekcija u svakom trenutku merenja uzimani su uzorci krvi, kao i nakon 168 časova. Serum je pripremljen i čuvan na -20°C dok nije izvršen ELISA test (slika 9).
Za detekciju nivoa humanog IgG u serumu u svakom trenutku merenja korišćen je ELISA test specifičan za Fc domen IgG. Ukratko, 30 pl koncentrovanog ("štok") rastvora koncentracije 10 pg/ml kozjeg anti-humani IgG antitela (Pierce, Rockford, IL) razblaženo je sa 6 ml 0,05M natrijum bikarbonata, pH 9,6 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Ploča sa 96 polja obložena je sa po 50 pl/polju ovog rastvora te inkubirana 1 čas na 37 °C. Rastvor za oblaganje je uklonjen, te je ploča isprana jednom PBST-om (fiziološki rastvor puferisan fosfatom sa 0,05% Tween-20). Nakon toga, dodato je 200 pl/polju 2%> koncentrovanog rastvora goveđeg serum albumina (BSA) u PBS-u, te je ploča inkubirana 1 čas na 37 °C. Polja su isprana tri puta sa PBST te je izrađena standardna kriva, u triplikatu, tako stoje napravljena serija razblaženja u koracima od 2,5 puta, počev od koncentracije 50 ng/ml hlgGl. Nakon toga, u polja je dodato po 100 pl bilo standardnog rastvora bilo rastvora uzoraka, te je ploča inkubirana 1 čas na 37 °C. Zatim je ploča isprana još tri puta u PBST-u, nakon čega je dodato 100 pl konjugata kozji anti-humani IgG-HRP, razblaženog 1:10000 (Pierce, Rockford, IL) u PBS-u koji sadrži 2% BSA. Ploča je ostavljena da se inkubira 1 čas na 37 °C, nakon čega je isprana PBST-om, te je u svako polje dodato po 100 pl TMB jednokomponentnog supstrata (BioFX, Ovvings Mills, MD). Razvijanje boje prekinuto je posle 5 minuta dodatkom 100 pl 0,25 M sumporne kiseline u svako polje. UV apsorbancija merena je u svakom polju na 450 nm, a za izradu grafika zavisnosti koncentracije IgG u serumu od vremena eksperimenta korišćena je kalibraciona kriva.
Primer 19: Dejstvo peptida br. 231, peptida br.274 ipeptida 252-Fc na katabolizam humanog IgGu serumuTG32B miševa
Odraslim TG32B miševima ubrizgano je, intravenskom injekcijom, 500 mg/kg humanog IgG (MP Biomedicals, Irvine, CA) u trenutku t = 0 časova (T0). U 24, 48, i 72. času miševima je ubrizgano, intravenskom injekcijom, bilo 1 mg/kg peptida br. 231, 1 mg/kg peptida br. 274 ili 20 mg/kg peptida br. 252-Fc. U svakom od ovih trenutaka ubrizgavane su i kontrolne injekcije, koje su sadržale 15 mM natrijum acetatom, pH 5 i koje su služile kao nosilac za sve injekcije. Pre injekcija u svakom trenutku merenja uzimani su uzorci krvi, kao i nakon 30, 96 i 144 časova. Serum je pripremljen i čuvan na -20°C dok nije izvršen ELISA test.
Koncentracija humanog IgG u serumu u svakom trenutku merenja određena je kao što je opisano u primeru 18 (slika 15).
Primer 20: Uticaj peptida br. 270 na katabolizam humanog IgG kao i endogenog
IgG, IgM i albumina kod Makaki majmuna
Trojici odraslih Makaki majmuna prosečne telesne mase 4,8 kg ubrizgana je, intravenskom injekcijom, doza od 5 mg/kg biotinilovanog humanog IgG (MP Biomedicals, Irvine, CA) u trenutku označenom kao 0 časova. Nakon 24, 48, 72 i 96 časova, životinjama je intravenskom injekcijom, pri brzini od 1 ml/min, ubrizgano bilo 10 mg/kg peptida br. 270 bilo ista zapremina nosioca (30 mM natrijum acetat, pH 5). Nakon 120 časova, životinji označenoj kao C06215 ubrizgana je petina doze od 10 mg/kg peptida br. 270. Uzorci krvi uzimani su pre svake injekcije, kao i nakon 120, 168, 192 i 244 časa i nakon 30 dana. Serum je pripremljen i čuvan na -20°C dok nije izvršen ELISA test (slike 10 do 12).
Obeleživač biotin-hlgG detektovan je pomoću streptavidinskog ELISA specifičnog za Fc. Ploče impregnirane streptavidinom (Pierce, Rockford, IL, kat. br. #15121) isprane su tri puta PBST-om (fiziološki rastvor puferisan fosfatom + 0,05% Tween-20). Uzorci seruma i standardi razblaženi su pomoću PBSB (PBS + 2% BSA). U opsegu od 1,56 ng/ml do 200 ng/ml izrađena je standardna kriva. U polja su dodati razblaženi uzorci (100 pl) ili standardi, te inkubirani dva časa na sobnoj temperaturi. Nakon toga, polja su isprana tri puta PBST-om (300 pl/polju). Kozji anti-humani Fc-HRP (Pierce, Rockford, IL, kat. br. #31416) razblaženje 1:25000 PBSB-om te je u svako polje dodato po 100 pl nakon čega su ploče inkubirane 30 minuta na sobnoj temperaturi. Ploča je isprana tri puta PBST-om (300 pl/polju) i razvijena sa po 100 pl/polju BioFX Supersensitive TMB supstrata (BioFX, Owing Mills, MD) približno pet minuta na sobnoj temperaturi. Reakcija razvijanja zaustavljena je dodatkom 100 pl-polju 0,25 M sumporne kiseline, te je merena apsorbanca u svakom polju na talasnoj dužini od 450 nm.
Endogeni IgG Makaki majmuna detektovan je prema sledećem ELISA protokolu. Prvo je zečje anti-majmunski IgG antitelo razblaženo do 2 pg/ml u puferu za oblaganje (pufer za oblaganje = 1 karbonat-bikarbonat kapsula, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, kat. br. #C-3041, rastvorena u 100 ml vode). Zatim je ploča sa 96 polja (Costar/Corning) obložena sa po 100 pl/polju rastvora zečjeg anti-majmunski IgG antitela koncentracije 2 pg/ml (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) i inkubirana jedan čas na 37°C. Ploča je isprana četiri puta PBST-om (PBS sa 0,05 Tween-20) i blokirana jedan čas na 37°C sa 200 pl/polju PBSB (1% BSA u PBS-u, razblažen iz koncentrovanog rastvora ("stoka") 10% BSA u PBS-u; KPL). Ploča je ponovo isprana četiri puta u PBST. Uzorci seruma i standardi razblaženi su pomoću PBSB. U opsegu od 2000 ng/ml do 1,9 ng/ml IgG majmuna (Antibodies Incorporated, Daviš, CA) izrađena je standardna kriva. Nakon toga, 100 pl/polju svakog od uzoraka inkubirano je jedan čas na 37°C. Ploča je isprana tri puta PBST-om. U svako polje dodato je 100 pl/polju 1:30000 razblaženog rastvora zečjeg anti-majmunski IgG-HRP (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) te su ploče inkubirane jedan čas na 37°C. Ploča je isprana tri puta PBST-om te razvijana sa po 100 pl/polju SureBlue TMB supstrata (KPL, Gaithersburg, MD) približno 5 minuta na sobnoj temperaturi. Reakcija razvijanja zaustavljena je sa po 100 pl/polju TMP rastvora za zaustavljanje (KPL, Gaithersburg, MD) te je merena apsorbanca u svakom polju na talasnoj dužini od 450 nm.
Endogeni serum albumin Makaki majmuna detektovan je preko sledećeg protokola za ELISA. Prvo je zečje anti-majmunski serum-albumin antitelo razblaženo do 5 pg/ml u puferu za oblaganje (pufer za oblaganje = 1 karbonat-bikarbonat kapsula, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, kat. br. #C-3041, rastvorena u 100 ml vode). Zatim je ploča sa 96 polja (Costar/Corning) obložena sa po 100 pl/polju rastvora zečjeg anti-majmunski serum-albumin antitela koncentracije 5 pg/ml (Nordic Immunologv, Holandija, kat. br. RAMon/Alb) i inkubirana jedan čas na 37°C. Ploča je isprana četiri puta PBST-om (PBS sa 0.05 Tween-20) i blokirana jedan čas na 37°C sa 300 pl/polju 5% "štok" rastvora ribljeg želatina (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, kat. br. #G-7765). Ploča je ponovo isprana četiri puta u PBST. Uzorci seruma i standardi razblaženi su pomoću PBSB. U opsegu od 200 ng/ml do 0,39 ng/ml serum-albumina majmuna (Nordic Immunologv, Holandija, kat. br. Mon/Alb serija#6082) izrađena je standardna kriva. Nakon toga, 100 pl/polju svakog od uzoraka inkubirano je jedan čas na 37°C. Ploča je isprana šest puta PBST-om. U svako polje dodato je 100 pl/polju 1:30000 razblaženog rastvora konjugata kozjeg anti-humani albumin-HRP (Academv Bio-Medical, Inc., Houston, TX, kat. br. #AL10H-Gla) u PBSB te su ploče inkubirane jedan čas na 37°C. Ploča je isprana šest puta PBST-om te razvijana sa po 100 pl/polju SureBlue TMB supstrata (KPL, Gaithersburg, MD) približno 5 minuta na sobnoj temperaturi. Reakcija razvijanja zaustavljena je sa po 100 pl/polju TMP rastvora za zaustavljanje (KPL, Gaithersburg, MD) te je merena apsorbanca u svakom polju na talasnoj dužini od 450 nm (slika 13).
Endogeni IgM Makaki majmuna detektovan je prema sledećem ELISA protokolu. Prvo je kozje anti-majmunski IgM antitelo razblaženo do 5 pg/ml u puferu za oblaganje (pufer za oblaganje = 1 karbonat-bikarbonat kapsula, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, kat. br. #C-3041, rastvorena u 100 ml vode). Zatim je ploča sa 96 polja (Costar/Corning) obložena sa po 100 pl/polju rastvora kozjeg anti-majmunski IgM antitela koncentracije 5 pg/ml (KPL, Gaithersburg, MD, kat. br. #071-11-031) i inkubirana jedan čas na 37°C. Ploča je isprana četiri puta PBST-om (PBS sa 0,05 Tween-20) i blokirana jedan čas na 37°C sa 200 pl/polju PBSB (1% BSA u PBS-u, razblažen iz koncentrovanog rastvora ("Stoka") 10% BSA u PBS-u; KPL). Ploča je ponovo isprana četiri puta u PBST. Uzorci seruma i standardi razblaženi su pomoću PBSB. U opsegu od 2000 ng/ml do 15,6 ng/ml majmunskog IgM (Alpha Diagnostic International, San Antonio, TX, kat. br. 2001301) izrađena je standardna kriva. Nakon toga, 100 pl/polju svakog od uzoraka inkubirano je jedan čas na 37°C. Ploča je isprana četiri puta PBST-om. U svako polje dodato je 100 pl 1:10000 razblaženog rastvora konjugata kozjeg anti-majmunski IgM-HRP (RDI, Concord, MA, kat. br. #61703007) u PBSB te su ploče inkubirane jedan čas na 37°C. Ploča je isprana četiri puta PBST-om te razvijana sa po 100 pl/polju SureBlue TMB supstrata (KPL, Gaithersburg, MD) približno 5 minuta na sobnoj temperaturi. Reakcija razvijanja zaustavljena je sa po 100 pl/polju TMP rastvora za zaustavljanje (KPL, Gaithersburg, MD) te je merena apsorbanca u svakom polju na talasnoj dužini od 450 nm (slika 14).
Primer 21: Uticaj peptida br. 270 na katabolizam humanog IgG kod TG32B miševa pri upotrebi različitih rasporeda primene
Odraslim TG32B miševima ubrizgano je, intravenskom injekcijom, 500 mg/kg humanog IgG (MP Biomedicals, Irvine, CA) u trenutku t = 0 časova (T0). Jednoj grupi od četiri miša ubrizgano je, intravenskom injekcijom, 5 mg/kg peptida br. 270 u trenutku t = 24 časa; drugoj grupi od četiri miša ubrizgano je, intravenskom injekcijom, 5 mg/kg peptida br. 270 u t = 24 i 72 časa; trećoj grupi od četiri miša ubrizgano je, intravenskom injekcijom, 2,5 mg/kg peptida br. 270 u t = 24, 48, 72 i 96 časova. U svakom od ovih trenutaka ubrizgavane su i kontrolne injekcije, koje su sadržale PBS nosilac sa 15 mM natrijum acetatom, pH 5, kod odvojene kontrolne grupe miševa. Pre injekcija u svakom trenutku merenja uzimani su uzorci krvi, kao i nakon 168 časova. Serum je pripremljen i čuvan na -20°C dok nije izvršen ELISA test, kao u primeru 18 (slika 16).
Primer 22: Dodatni eksperimenti sa TG32B miševima
Izvedeni su dodatni eksperimenti sa peptidom br. 270 kod TG32B miševa. Primenom istog protokola kao u eksperimentu 18, pronađeno je da je peptid br. 270 delotvoran u ubrzavanju katabolizma IgG, primenjen potkožnim (SC) i intraperitonealnim (IP) putem primene. Pronađeno je da pet dnevnih doza od 5 mg/kg peptida 270, počev od t = 24 časa, smanjuju poluživot IgG do 56 časova, nakon primene i potkožnih (SC) i intraperitonealnih (IP) injekcija peptida br. 270. Ovaj poluživot je značajno kraći od onog koji se obično sreće u kontrolnim grupama, kod kojih je poluživot IgG od 80 do 100 časova. Uz to, koncentracija hlgG smanjena je za 56% (SC) i 66% (IP) nakon 168 časova primenom peptida br. 270, u poređenju sa kontrolnom grupom.
I peptid br. 230 je testiran kod TG32B miševa pomoću istog protokola opisanog u primeru 18. Dvadeset četiri časa nakon intravenske injekcije humanog IgG, primene su intravenske (IV) injekcije od 5mg/kg peptida br. 230 svaki dan, pet dana. Poluživot hlgG je smanjen do 39 časova, u poređenju sa poluživotom kod kontrolne grupe koji je iznosio 92 časa. Uz to, koncentracija hlgG smanjena je za 76% nakon 168 časova, u poređenju sa kontrolnom grupom.
Peptid br. 230 testiran je i u dva eksperimenta namenjena za procenu uticaja pojedinačne doze, u poređenju sa primenom tri dnevne doze peptida. Pomoću eksperimentalnog protokola opisanog u primeru 18, dvadeset četiri časa nakon IV injekcije humanog IgG, jednoj grupi životinja ubrizgana je pojedinačna IV doza od 5 mg/kg peptida br. 230, dok je drugoj grupi životinja ubrizgano po tri dnevne IV doze od po 5 mg/kg peptida br. 230, tri dana za redom. Nakon 120 časova, pojedinačna doza peptida br. 230 smanjila je koncentraciju hlgG kod miševa za 41%. U grupi miševa koji su primili po tri dnevne doze peptida br. 230, koncentracija hlgG nakon 120 časova smanjena je 61%.
Primer 23: Uticaj peptida br. 283 na katabolizam humanog IgG kod TG32B miševa
Odraslim TG32B miševima ubrizgano je, intravenskom injekcijom. 500 mg/kg humanog IgG (MP Biomedicals, Irvine, CA) u trenutku t = 0 časova (T0). U 24, 48, 72 i 96. času miševima je ubrizgano, intravenskom injekcijom, bilo 0,5, 1. 2,5. 5 ili 10 mg/kg peptida br. 283. U svakom od ovih trenutaka ubrizgavane su i kontrolne injekcije, koje su sadržale 15 mM natrijum acetata, pH 5, koje su služile kao nosilac za sve injekcije. Pre injekcija u svakom trenutku merenja uzimani su uzorci krvi, kao i nakon 120 i 168 časova, te i nakon 30 dana. Serum je pripremljen i čuvan na -20°C dok nije izvršen ELISA test.
Koncentracija humanog IgG u serumu u svakom trenutku merenja određena je kao što je prethodno opisano u primeru 18 (slika 17).
Primer 24: Sinteza pegilovanog peptida br. 289
Peptid br. 285 rastvoren je u 10 mM fosfatnom puferu pH 7,7 te tretiran jednim ekvivalentom PEG30kDa- sukcinimidil estra (NOF Corp, Japan, Sunbright MEGC-30TS) 18 časova. Sirova reakciona smeša je prečišćena na C4 koloni (Jupiter, Phenomenex) kao što je opisano u primeru 7, potom liofilizovana i ponovo prečišćena katjonskom jonoizmenjivačkom hromatografijom (Factorprep SO3", kat. br. 1.17972, EMD Chemicals Ine, Gibbstovvn, NJ) u kojoj je peptid vezan na smolu u 10 mM natrijum acetatu pH 5, smola je ispranalO mM natrijum acetatom pK 5 a peptid eluiran 100 mM natrijum hloridom u 10 mM natrijum acetatu pH 5. Rastvor peptida je dijalizovan naspram 1% sirćetne kiseline i liofilizovan. Pprečišćeni peptid je analiziran pomoću SDS-PAGE, pri čemu se javila obojena traka peptida na oko50 kDa, te pomoću HPLC, čime je pokazano da nema preostalog slobodnog peptida (slika 18).
Primer 25: Uticaj peptida br. 289 na katabolizam humanog IgG kod TG32B
miševa
Odraslim TG32B miševima ubrizgano je, intravenskom injekcijom, 500 mg/kg humanog IgG (MP Biomedicals, Irvine, CA) u trenutku t = 0 časova (T0). U 24. času miševima je ubrizgano, intravenskom injekcijom, 25 mg/kg peptida br. 289. U 24, 48, 72, 96, 120 i 168. času uzeti su uzorci krvi. Serum je pripremljen i čuvan na -20°C dok nije izvršen ELISA test. Koncentracija humanog IgG u serumu u svakom trenutku merenja određena je kao što je prethodno opisano u primeru 18 (slika 19).
Primer 26: Uticaj peptida br. 283 na katabolizam hlgG i koncentracije endogenog
IgG, IgM i albumina kod Makaki majmuna
Osamnaest Makaki majmuna podeljeno je u šest grupa od po tri životinje, te je svim životinjama dato 5 mg/kg biotinilovanog humanog IgG (MP Biomedical) u trenutku t = -3 dana. Od trenutka t - 0, životinje su četiri nedelje tretirane peptidom br. 283, prema sledećem doznom režimu: 1) 1 mg/kg 3x/nedeljno intravenski; 2) 1 mg/kg lx/nedeljno potkožno; 3) 1 mg/kg 3x/nedeljno potkožno; 4) 5 mg/kg 3x/nedeljno intravenski; 5) 5 mg/kg lx/nedeljno potkožno; 6) 5 mg/kg 3x/nedeljno potkožno. Treba uzeti u obzir daje poslednja doza peptida data grupi 4 16. dana. Uzorci seruma uzeti su u danima -3d, -15min, ld, 2d, 3d, 4d, 5d, 7d, 9d, lld, 14d, 16d, 18d, 21 d, 23d, 25d, 28d, 30d, 32d, 35d, 42d, 49d, 77d. Koncentracija biotinilovanog humanog IgG i albumina određene su kao što je opisano u primeru 20 i prikazano na slikama 20 do 24.
Ova specifikacija se najbolje razume ukoliko se imaju u vidu zaključci referenci koji su navedeni u okviru specifikacije. Rešenja u okviru specifikacije obezbeđuju ilustraciju rešenja prema predmetnom pronalasku, te ne treba, ni na koji način, da se smatra da ograničavaju obim zaštite predmetnog pronalaska. Stručnjak u ovoj oblasti će odmah prepoznati daje i veliki broj drugih rešenja obuhvaćen predmetnim pronalaskom. Sve publikacije i patenti koji su navedeni u predmetnoj prijavi inkorporirani su u potpunosti po referenci. Ukoliko postoji kontradiktornost ili nedoslednost materijala inkorporiranog po referenci sa specifikacijom navedenom u predmetnoj prijavi, prednost ima specifikacija. Navođenje bilo koje reference u predmetnoj prijavi nije priznanje da dotična prijava spada u stanje tehnike u odnosu na predmetni pronalazak.
Osim ukoliko je drugačije naznačeno, sve brojeve koji označavaju količine sastojaka, reakcione uslove itd. koji se koriste u specifikaciji, uključujući patentne zahteve, treba tumačiti kao da su modifikovani izrazom "približno". Shodno tome, osim ukoliko je drugačije naznačeno, numerički parametri su približne vrednosti i mogu da se menjaju u zavisnosti od željenih svojstava koje je poželjno ostvariti primenom predmetnog pronalaska. U najmanju ruku, i ne kao pokušaj da se ograniči primena doktrine ekvivalenata na obim zaštite patentnih zahteva, svaki brojčani parametar treba da se tumači u smislu broja značajnih cifara i uobičajenih pristupa zaokruživanju.
Osim ukoliko je naznačeno drugačije, izraz "najmanje" pre serije elemenata treba tumačiti tako da se odnosi na svaki element u datoj seriji. Stručnjaci u ovoj oblasti će prepoznati, ili će biti u stanju da utvrde, primenom samo rutinskih eksperimenata, mnoge ekvivalente specifičnih rešenja predmetnog pronalaska koji su ovde opisani. Namera je da i ovi ekvivalenti budu obuhvaćeni patentnim zahtevima koji slede.

Claims (76)

1. Peptid koji je u stanju da inhibira vezivanje Fc dela humanog imunoglobulina (IgG) za humani neonatalni receptor za Fc (FcRn) naznačen time što sadrži sekvencu: gdeje: - X6izabran iz grupe koja se sastoji od pozitivno naelektrisanih aminokiselina, aromatičnih aminokiselina, pozitivno naelektrisanih aromatičnih aminokiselina i njihovih analoga; - X7izabran iz grupe koja se sastoji od fenilalanina i analoga fenilalanina; - Xg i X9su, svaki nezavisno, izabrani iz grupe koja se sastoji od glicina, sarkozina, asparaginske kiseline, D-amino kiselina, a-aminoizobuterne kiseline i njihovih analoga, ili X$, kada se posmatra zajedno sa Xy, gradi mimetik dipeptida; - Xioizabran iz grupe koja se sastoji od aminokiselina i njihovih analoga, ili Xio, kada se posmatra zajedno sa Xg, gradi mimetik dipeptida; - Xnizabran iz grupe koja se sastoji od tirozina i analoga tirozina, i gde je dužina tog peptida u opsegu od 7 do 50 aminokiselina i gde taj peptid inhibira vezivanje humanog FcRn za humani IgG.
2. Peptid prema zahtevu 1, naznačen time što sadrži sekvencu: gde: - Riima formulu Xi-X2-X3-X4- gdeje: - Xiizabran iz grupe koja se sastoji od vodonika, acila ili zaštitne grupe za aminokiseline; - X2nedostaje ili je izabran iz grupe koja se sastoji od aminokiselina i peptida koji su dugački od 2 do 15 aminokiselina, kao i njihovih analoga; - Xsnedostaje ili je aminokiselina ili njen analog koji je u stanju da gradi most sa Xi0, Xj2ili X]3, gde je taj most izabran iz grupe koja se sastoji od mosta od amino terminusa do karboksi terminusa. mosta od bočnog lanca do osnovnog lanca i mosta od bočnog lanca do bočnog lanca; - X4nedostaje ili je izabran iz grupe koja se sastoji od aminokiselina, peptida dužine od 2 do 15 aminokiselina i njihovih analoga; - R.2ima formulu -Xi2-Xi3-Xi4-Xi5 gde: - Xi2 nedostaje ili je aminokiselina ili njen analog; - Xn nedostaje ili je aminokiselina ili njen analog; - Xu nedostaje ili je izabran iz grupe koja se sastoji od aminokiselina, peptida dužine od 2 do 15 aminokiselina i njihovih analoga; a - Xi5 je amino grupa ili karboksi zaštitna grupa.
3. Peptid prema zahtevu 1, naznačen time što sadrži sekvencu:
4. Peptid prema zahtevu 3, naznačen time što je daj peptid linearan.
5. Peptid prema zahtevu 2, naznačen time što je najmanje jedan od X10, X12 ili X13 aminokiselina ili njen analog, koji je u stanju da gradi most sa X3, gde je taj most izabran iz grupe koja se sastoji od mosta od amino terminusa do karboksi terminusa, mosta od bočnog lanca do osnovnog lanca i mosta od bočnog lanca do bočnog lanca.
6. Peptid prema zahtevu 5, naznačen time što X3 gradi most sa X10, X12 ili X13.
7. Peptid prema zahtevu 6, naznačen time što X3 gradi most sa X10.
8. Peptid prema zahtevu 6, naznačen time što X3 gradi most sa XI2.
9. Peptid prema zahtevu 6, naznačen time što X3 gradi most sa X13.
10. Peptid prema zahtevu 6, naznačen time što postoji devet aminokiselina između aminokiselina koje grade most.
11. Peptid prema zahtevu 6, naznačen time što je most most od amino terminusa do karboksi terminusa.
12. Peptid prema zahtevu 6, naznačen time što je taj most most od bočnog lanca do osnovnog lanca.
13. Peptid prema zahtevu 6, naznačen time što je taj most most od bočnog lanca do bočnog lanca.
14. Peptid prema zahtevu 13, naznačen time što je most od bočnog lanca do bočnog lanca disulfidni most, etarski most, tioetarski most, alkenski most ili amidni most.
15. Peptid prema zahtevu 14, naznačen time što je most od bočnog lanca do bočnog lanca disulfidni most između: - cisteina i cisteina; - cisteina i homocisteina; - cisteina i penicilamina; - homocisteina i homocisteina; - homocisteina i penicilamina; i - penicilamina i penicilamina.
16. Peptid prema zahtevu 14, naznačen time što je most od bočnog lanca do bočnog lanca amidni most između: - asparaginske kiseline i lizina; - asparaginske kiseline i ornitina; - asparaginske kiseline i 2,4-diaminobuterne kiseline; - asparaginske kiseline i 2,3-diaminopropionske kiseline; - glutaminske kiseline i lizina; - glutaminske kiseline i ornitina; - glutaminske kiseline i 2,4-diaminobuterne kiseline; - glutaminske kiseline i 2,3-diaminopropionske kiseline.
17. Peptid prema zahtevu 2, naznačen time što sadrži najmanje jedan cistein.
18. Peptid prema zahtevu 17, naznačen time što je najmanje jedan cistein analog cisteina izabran iz grupe koja se sastoji od: - homocisteina; - D-cisteina; i - penicilamina.
19. Peptid prema zahtevu 1 ili 2, naznačen time što je najmanje jedan od X8i X9izabran iz grupe koja se sastoji od: - glicina; - D-aminokiselina; - a-aminoizobuterne kiseline; i - sarkozina.
20. Peptid prema zahtevima 1 ili 2, naznačen time što Xg, kada se posmatra zajdeno sa X9, gradi mimetik dipeptida izabran iz grupe koja se sastoji od: - beta-alanina; - 4-aminobutanske kiseline; - 5-aminopentanske kiseline; - 3-(aminometil)benzoeve kiseline; - 4-(aminometil)benzoeve kiseline; - 3-(aminofenil)sirćetne kiseline; - 4-(aminofenil)sirćetne kiseline; i - 3-amino-2-okso-l-piperidin-sirćetne kiseline; - (3R)-3-amino-2-okso-l-piperidin-sirćetne kiseline; - (3R)-3-amino-2-okso-l-azepin-sirćetne kiseline; - (3R)-3-amino-2-okso-l-pirolidin-sirćetne kiseline; - (3R)-3-amino-l-karboksimetil-valerolaktama; i - 3-amino-N-l-karboksimetil-2,3,4,5-tetrahidro-lH-[l]-benzazepin-2-ona.
21. Peptid prema zahtevima 1 ili 2, naznačen time što je najmanje jedan od fenilalanina analog fenilalanina, gde je svaki među tim najmanje jednim analogom fenilalanina nezavisno izabran iz grupe koja se sastoji od: - triptofana; - tirozina; - 2-aminofenilalanina; - 3-aminofenilalanina; - 4-aminofenilalanina; - pentafluorfenilalanina; - 2-piridilalanina; - 3-piridilalanina; - 4-nitrofenilalanina; - 1-nafti lalanina; - homofenilalanina; - fenilglicina; - 2-metilfenilalanina; - 3-metilfenilalanina; - 4-metilfenilalanina; - 2-hlorfenilalanina; - 3-hlorfenilalanina; - 4-hlorfenilalanina; - 3,3-difenilalanina; - 4,4'-bifenilalanina; - 4-t-butilfenilalanina; - cikloheksilalanina; - (4-aminoacetil)fenilalanina; - L-l,2,3,4-tetrahidroizokvinolin-3-karboksilne kiseline; - D-beta-metilfenilalanina; i - L-beta-metilfenilalanina.
22. Peptid prema zahtevima 1 ili 2, naznačen time što je najmanje jedan tirozin analog tirozina, gde je svaki među tim najmanje jednim analogom tirozina nezavisno izabran iz grupe koja se sastoji od: - fenilalanina; - 4-aminofenilalanina; - 4-metoksifenilalanina; - pentafluorfenilalanina; - 2-piridilalanina; - 3-piridilalanina; - 4-piridilalanina; - 4-nitrofenilalanina; - 2-nitrotirozina; i - 4-fluorfenilalanina.
23. Peptid prema zahtevima 1 ili 2, naznačen time što Xg i Xio, posmatrani zajedno, grade mimetik dipeptida izabran iz grupe koja se sastoji od: - D,L-Frajdingerovog laktama - L,L-Frajdingerovog laktama
24. Peptid prema zahtevima 1 ili 2, naznačen time što je najmanje jedan histidin analog histidina, gde je svaki među tim najmanje jednim analogom histidina nezavisno izabran iz grupe koja se sastoji od: - 2,4-diaminobuterne kiseline; - tiazolilalanina; - 2,3-diaminopropionske kiseline; - guanilalanina; - 2-piridilalanina; - 3-piridilalanina; - 4-piridilalanina; - tienilalanina; - ornitina; - lizina; - arginina; - 4-guanilfenilalanina; - 1-metilhistidina; - 3-metilhistidina; - 1,3-dimetilhistidina; - 4-aminofenilalanina; - 2-pirolidinilalanina; - 3-piperdilalanina; i - 4-piperidilalanina.
25. Peptid prema zahtevu 2, naznačen time što je X2izabran iz grupe koja se sastoji od aminokiseline, peptida dužine 2 ili 3 aminokiseline i njihovih analoga.
26. Peptid prema zahtevima 1 ili 2, naznačen time što je X6 pozitivno naelektrisana aminokiselina ili njen analog izabran iz grupe koja se sastoji od lizina, ornitina, 2,4-diaminobuterne kiseline, 2,3-diaminopropionske kiseline, arginina, guanilalanina i njihovih analoga.
27. Peptid prema zahtevima 1 ili 2, naznačen time što je X6 aromatična aminokiselina ili njen analog izabran iz grupe koja se sastoji od tirozina, triptofana, fenilalanina i njihovih analoga.
28. Peptid prema zahtevima 1 ili 2, naznačen time što je X6 pozitivno naelektrisana aminokiselina izabrana iz grupe koja se sastoji od histidina, 1-metilhistidina, 2-piridilalanina, 3-piridilalanina, 4-piridilalanina, 4-aminofcnilalanina, 4-guanilfenilalanina, tiazolilalanina i njihovih analoga.
29. Peptid prema zahtevu 28, naznačen time što je X6 4-guanilfenilalanin ili njegovi analozi.
30. Peptid prema zahtevima 1 ili 2, naznačen time što je X6 izabran iz grupe koja se sastoji od histidina, 3-piridilalanina, 4-piridilalanina, 4-guanilfenilalanina i njihovih analoga.
31. Peptid prema zahtevu 30, naznačen time što je X6 izabran iz grupe koja se sastoji od histidina i njegovih analoga.
32. Peptid prema zahtevima 1 ili 2, naznačen time što je XI0 izabran iz grupe koja se sastoji od neutralnih i hidrofobnih aminokiselina i njihovih analoga.
33. Peptid prema zahtevima 1 ili 2, naznačen time što je taj peptid multimer.
34. Peptid prema zahtevu 33, naznačen time što je taj peptid dimer, trimer ili tetramer.
35. Peptid prema zahtevu 34, naznačen time što je taj peptid dimer.
36. Peptid koji je u stanju da inhibira vezivanje Fc dela humanog imunoglobulina (IgG) za humani neonatalni receptor za Fc (FcRn), naznačen time što sadrži: a) aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od: b) aminokiselinsku sekvencu koja je u značajnoj meri identična sa a); c) aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 80% identična sa a); d) aminokiselinsku sekvencu koja ima jednu, dve, tri, četiri ili pet delecionih, supstitucionih ili adicionih mutacija u poređenju sa a); e) aminokiselinsku sekvencu iz a) modifikovanu najmanje jednom aminokiselinskom supstitucijom, gde je ta najmanje jedna aminokiselina supstituisana aminokiselinom koja se javlja u prirodi; f) aminokiselinsku sekvencu iz a) modifikovanu najmanje jednom aminokiselinskom supstitucijom, gde je ta najmanje jedna aminokiselina supstituisana D-aminokiselinom ili njenim analozima; g) aminokiselinsku sekvencu iz a) modifikovanu najmanje jednom aminokiselinskom supstitucijom, gde je ta najmanje jedna aminokiselina supstituisana N-metilovanom aminokiselinom; h) aminokiselinsku sekvencu iz a) modifikovanu najmanje jednom aminokiselinskom supstitucijom, gde je ta najmanje jedna aminokiselina supstituisana aminokiselinom koja se ne javlja u prirodi; i i) aminokiselinsku sekvencu iz a) modifikovanu najmanje jednom aminokiselinskom supstitucijom, gde je ta najmanje jedna aminokiselina supstituisana mimetikom aminokiseline; gde taj peptid inhibira vezivanje humanog FcRn za humani IgG.
37. Peptid prema zahtevu 36, naznačen time što je aminokiselinska sekvenca iz c) najmanje 90% identična onoj pod a).
38. Dimer naznačen time što sadrži peptid iz zahteva 36.
39. Dimer prema zahtevu 35 ili 38, naznačen time što je taj dimer proizvod redukcionog alkilovanja.
40. Dimer prema zahtevu 35 ili 38, naznačen time što je taj dimer proizvod reakcije između pojedinačnih peptidnih monomera i multivalentnog linkera.
41. Dimer prema zahtevu 40, naznačen time što je taj multivalentni linker izabran iz grupe koja se sastoji od tiolnog kiselinskog, alkoholnog i aminskog linkera.
42. Peptid prema zahtevu 36, naznačen time što je taj peptid trimer.
43. Peptid prema bilo kojem od zahteva 1, 2 ili 36, naznačen time što se taj peptid specifično vezuje za humani FcRn.
44. Peptid prema zahtevu 43, naznačen time što je afinitet tog peptida za humani FcRn u opsegu od 50 fM do 1 mM.
45. Peptid prema zahtevu 43, naznačen time što je afinitet tog peptida za humani FcRn u opsegu od 500 fM do 100 pM.
46. Peptid prema zahtevu 43, naznačen time što je afinitet tog peptida za humani FcRn u opsegu od 5 pM do 1 pM.
47. Peptid prema bilo kom od zahteva 1, 2 ili 36, naznačen time što taj peptid inhibira vezivanje humanog FcRn za humani IgG i ima IC50u opsegu od 50 fM do 1 mM.
48. Peptid naznačen time što sadrži sledeću strukturu: (Sekvenca čiji je ID br.: 319)
49. Fuziju naznačim time što sadrži peptid iz bilo kog od zahteva 1, 2 ili 36 sa još jednim molekulom.
50. Fuziju prema zahtevu 49, naznačenu time što je taj molekul izabran iz grupe koja se sastoji od polietilen glikola (PEG), albumina, transferina i Fc dela imunoglobulina.
51. Fuziju prema zahtevu 50, naznačenu time što je taj molekul Fc deo imunoglobulina.
52. Fuziju prema zahtevu 51, naznačenu time što je taj imunoglobulin izabran iz grupe koja se sastoji od IgGl, IgG2, IgG3 i IgG4.
53. Farmaceutski preparat naznačen time što sadrži terapeutski delotvornu količinu peptida iz bilo kog od zahteva 1, 2 ili 36.
54. Preparat prema zahtevu 53, naznačen time što je ta terapeutski delotvorna količina peptida u stanju da smanju koncentraciju humanog IgG u serumu u poređenju sa koncentracijom humanog IgG u serumu pre tretmana tim peptidom.
55. Preparat prema zahtevu 54, naznačen time što je smanjenje koncentracije humanog IgG u serumu najmanje 5%.
56. Preparat prema zahtevu 55, naznačen time što je smanjenje koncentracije humanog IgG u serumu najmanje 15%.
57. Preparat prema zahtevu 56, naznačen time što je smanjenje koncentracije humanog IgG u serumu najmanje 25%.
58. Postupak za regulisanje bolesti naznačen time što podrazumeva dovođenje u. dodir ćelije sa peptidom iz terapeutski delotvorne količine peptida iz bilo kog od zahteva 1, 2 ili 36.
59. Postupak prema zahtevu 58, naznačen time što data ćelija eksprimira FcRn.
60. Postupak prema zahtevu 58, naznačen time što dalje sadrži regulisanje bolesti modulacijom koncentracije IgG u serumu.
61. Postupak prema zahtevu 60, naznačen time što je IgG specifičan za terapeutski protein.
62. Postupak prema zahtevu 61, naznačen time što je terapeutski protein eritropojetin.
63. Postupak prema zahtevu 60, naznačen time što je IgG specifičan za vektor genske terapije.
64. Postupak prema zahtevu 58, naznačen time što je data bolest odabrana iz grupe koja se sastoji od zapaljenskih bolesti, autoimunih oboljenja i kancera.
65. Postupak prema zahtevu 64, naznačen time što je autoimuno oboljenje izabrano iz grupe koja se sastoji od alopecia areata, ankilozujućeg spondilitisa, antifosfolipidnog sindroma, autoimune Adisonove bolesti, autoimune hemolitičke anemije, autoimunog hepatitisa, autoimunog limfoproliferativnog sindroma (ALPS), autoimune trmbocitopenijske purpure (ATP), Beketove bolesti, buloznog pemfigoida, kardiomiopatije, gluten-senzitivne enteropatije - Dermatitis Herpetiformis, sindroma imune disfunkcije koji dovodi do hroničnog zamora (CFIDS), hronične zapaljenske demijelinizujuće polineuropatije, Pemphigoides cicatricalis, CREST sindroma, bolesti hladnog aglutinina, Kronove bolesti, Degosove bolesti, dermatomiozitisa, juvenilnog dermatomiozitisa, diskoidnog lupusa, esencijalne mešane krioglobulinemije, fibromijalgije - fibromiozitisa, Grejvsove bolesti, Gijan-Bare-Hašimotovog tiroiditisa, idiopatske pulmonarne fibroze, idiopatske trombocitopenije purpure (ITP), IgA nefropatije, insulin zavisnog dijabetesa, juvenilnog artritisa, Lichen Planus, lupusa, Menijerove bolesti, mešne bolesti vezivnih tkiva, multiple skleroze, mijastenije gravis (MG), Pemphigus, Pemphigus Vulgaris, pernikozne anemije, Polvarteritis Nodosa, polihondritisa, poliglandularnog sindroma, reumatske polimijalgije, polimiozitisa i dermatomiozitisa, primarne agamaglobulinemije, primare ciroze žučne kese, psorijaze, Rejnodovog fenomena, Rejterovog sindroma, reumatske groznice, reumatskog artritisa, sarkoidoze, skleroderme, Sjogrenovog sindroma, sindroma Stif-Man, Takajasuovog arteritisa, temporalnog arteritisa/arteritisa džinovskih ćelija, odbacivanja transplanta, ulcerativnog Colitis Uveitis, vaskulitisa, vitiliga i Vegenerove granulomatoze.
66. Postupak prema zahtevu 64, naznačen time što je autoimuno oboljenje izabrano iz grupe koja se sastoji od buloznog pemfigoida, idiopatske trombocitopenije purpure (ITP), mijastenije gravis (MG), pemfigusa i odbacivanja transplanta.
67. Postupak prema zahtevu 66, naznačen time što je pemfigus pemphigus vulgaris.
68. Postupak prema zahtevu 64, naznačen time što je bolest izabrana između zapaljenskih bolesti.
69. Postupak prema zahtevu 68, naznačen time što je zapaljenska bolest izabrana iz grupe koja se sastoji od astme, ulcerativnog kolitisa i alergije zapaljenskog sindroma creva, uključujući alergijski rinitis/sinusitis, kožne alergije (urtikarij a/kopri vnjača, angioedema, atopijski dermatitis), alergije na hranu, alergije na lekove, alergije na insekte, mastocitozu, artritis, uključujući osteoartritis, reumatoidni artritis i spondiloartropatije.
70. Postupak prema zahtevu 61, naznačen time što je terapeutski protein faktor koagulacije.
71. Postupak prema zahtevu 70, naznačen time što je faktor koagulacije izabran iz grupe koja se sastoji od fibrinogena, protrombina, faktor V, faktora VII, faktora VIII, faktora IX, faktora X, faktora XI, faktora XII, faktora III ili von Vilderbrandovog faktora.
72. Postupak prema zahtevu 70, naznačen time što je faktor koagulacije faktor VIII.
73. Postupak detekcije FcRn naznačen time što podrazumeva: označavanje peptida iz bilo kog od zahteva 1, 2 ili 36 obeleživačem koji je moguće detektiovati, izabranim iz grupe koja se sastoji od radioizotopa, enzima koji daju proizvode koje je moguće detektovati, fluorofora, hemiluminescentnih jedinjenja, magnetnih čestica, mikrosfera, nanosfera, biotina, streptavidina i digoksina.
74. Postupak prema zahtevu 73, naznačen time što je postupak detekcije obuhvaćen dijagnostičkim kompletom.
75. Postupak sinteze peptidnog dimera naznačen time što podrazumeva prvi korak sinteze peptida na čvrstoj fazi, drugi korak tretiranja smole čvrste faze molekulom koji može da reaguje sa i poveže dva susedna peptida; i treći korak oslobađanja vezanih peptida sa smole.
76. Postupak prečišćavanja FcRn, naznačen time što podrazumeva: (a) imobilizaciju peptida iz bilo kog od zahteva 1, 2 ili 36 na čvrstu podlogu, (b) dovođenje rastvora koji sadrži FcRn u dodir sa peptidom imobilisanim na čvrstoj podlozi; i (c) prečišćavanje FcRn razdvajanjem rastvora od navedene čvrste podloge.
RSP20080362 2006-02-17 2007-02-16 PEPTIDI KOJI SPREČAVAJU VEZIVANJE IgG ZA FcRn RS20080362A (sr)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US77485306P 2006-02-17 2006-02-17
US80563406P 2006-06-23 2006-06-23
PCT/US2007/062349 WO2007098420A2 (en) 2006-02-17 2007-02-16 Peptides that block the binding of igg to fcrn

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS20080362A true RS20080362A (sr) 2009-07-15

Family

ID=38291305

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RSP20080362 RS20080362A (sr) 2006-02-17 2007-02-16 PEPTIDI KOJI SPREČAVAJU VEZIVANJE IgG ZA FcRn

Country Status (16)

Country Link
US (2) US8101186B2 (sr)
EP (1) EP1991572A2 (sr)
JP (1) JP2009527499A (sr)
KR (1) KR20080106432A (sr)
AU (1) AU2007217042A1 (sr)
BR (1) BRPI0707920A2 (sr)
CA (1) CA2638867A1 (sr)
EA (1) EA200870274A1 (sr)
IL (1) IL193101A0 (sr)
ME (1) MEP7408A (sr)
MX (1) MX2008010327A (sr)
NO (1) NO20083712L (sr)
RS (1) RS20080362A (sr)
TR (2) TR200807263T1 (sr)
TW (1) TW200745163A (sr)
WO (1) WO2007098420A2 (sr)

Families Citing this family (67)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2385474T3 (es) * 2003-04-22 2012-07-25 Trisa Holding Ag Cabezal de cepillo para un cepillo de dientes eléctrico
TW200745163A (en) 2006-02-17 2007-12-16 Syntonix Pharmaceuticals Inc Peptides that block the binding of IgG to FcRn
EP4218801A3 (en) 2006-03-31 2023-08-23 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antibody modification method for purifying bispecific antibody
CA2694824A1 (en) * 2007-08-09 2009-02-12 Syntonix Pharmaceuticals, Inc. Immunomodulatory peptides
US20100048488A1 (en) * 2008-08-01 2010-02-25 Syntonix Pharmaceuticals, Inc. Immunomodulatory peptides
EP2437767B1 (en) 2009-06-01 2015-07-08 MedImmune, LLC Molecules with extended half-lives and uses thereof
MX2012005859A (es) * 2009-11-23 2012-12-17 Palatin Technologies Inc Peptidos lineales especificos del receptor de melanocortina-1.
EP4303237A3 (en) 2010-11-30 2024-03-27 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Cytotoxicity-inducing therapeutic agent
KR102168733B1 (ko) 2011-10-31 2020-10-23 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 중쇄와 경쇄의 회합이 제어된 항원 결합 분자
DK2818183T3 (da) 2012-02-24 2020-06-15 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Antigen-bindende molekyle til at fremme forsvinden af antigen ved hjælp af Fc RIIB
GB201208370D0 (en) 2012-05-14 2012-06-27 Ucb Pharma Sa Antibodies
JP6608288B2 (ja) 2013-03-15 2019-11-20 アフィボディ・アーベー 新しいポリペプチド
US9527890B2 (en) 2013-06-18 2016-12-27 The Brigham And Womens's Hospital, Inc. FC receptor (FcRn) binding peptides and uses thereof
GB201320066D0 (en) 2013-11-13 2013-12-25 Ucb Pharma Sa Biological products
LT3087095T (lt) 2013-12-24 2019-09-10 Argenx Bvba Fcrn-antagonistai ir naudojimo būdai
CN118440206A (zh) 2014-04-07 2024-08-06 中外制药株式会社 免疫活化抗原结合分子
CN106459954A (zh) 2014-05-13 2017-02-22 中外制药株式会社 用于具有免疫抑制功能的细胞的t细胞重定向的抗原结合分子
CA2956471C (en) 2014-07-31 2024-09-10 Amgen Res Munich Gmbh OPTIMIZED CONSTRUCTIONS OF SINGLE-CATENAL, BI-SPECIFIC, AND CROSS-SPECIFIC ANTIBODY
DK3193930T3 (da) 2014-09-17 2019-08-26 Affibody Ab Nye polypeptider
MA40764A (fr) 2014-09-26 2017-08-01 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Agent thérapeutique induisant une cytotoxicité
US10729660B2 (en) * 2014-12-22 2020-08-04 Consiglio Nazionale Delle Richerche Istituto Nazionale Per L'assicurazione Products for the delivery of therapeutic/diagnostic compounds to the heart
KR102720769B1 (ko) 2015-03-09 2024-10-22 아르제넥스 비브이 FcRn 길항제를 사용하여 Fc-함유된 제제의 혈청 수준을 감소시키는 방법
PL3283524T3 (pl) 2015-04-17 2023-06-12 Amgen Research (Munich) Gmbh Konstrukty biswoistego przeciwciała dla cdh3 i cd3
TW202346349A (zh) 2015-07-31 2023-12-01 德商安美基研究（慕尼黑）公司 Dll3及cd3抗體構築體
EA039859B1 (ru) 2015-07-31 2022-03-21 Эмджен Рисерч (Мюник) Гмбх Биспецифические конструкты антител, связывающие egfrviii и cd3
TWI829617B (zh) 2015-07-31 2024-01-21 德商安美基研究（慕尼黑）公司 Ｆｌｔ３及ｃｄ３抗體構築體
TWI717375B (zh) 2015-07-31 2021-02-01 德商安美基研究（慕尼黑）公司 Ｃｄ７０及ｃｄ３抗體構築體
TWI796283B (zh) 2015-07-31 2023-03-21 德商安美基研究（慕尼黑）公司 Ｍｓｌｎ及ｃｄ３抗體構築體
TWI744242B (zh) 2015-07-31 2021-11-01 德商安美基研究（慕尼黑）公司 Egfrviii及cd3抗體構築體
EP3378488A4 (en) 2015-11-18 2019-10-30 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha METHOD FOR IMPROVING THE HUMORAL IMMUNE REACTION
WO2017086367A1 (ja) 2015-11-18 2017-05-26 中外製薬株式会社 免疫抑制機能を有する細胞に対するｔ細胞リダイレクト抗原結合分子を用いた併用療法
MX2018007781A (es) 2015-12-28 2018-09-05 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Metodo para promover la eficiencia de purificacion del polipeptido que contiene la region de fragmento cristalizable (fc).
TN2018000266A1 (en) 2016-02-03 2020-01-16 Amgen Res Munich Gmbh Psma and cd3 bispecific t cell engaging antibody constructs.
TW202214700A (zh) 2016-03-14 2022-04-16 日商中外製藥股份有限公司 用於癌之治療的細胞傷害誘導治療劑
CN106771251B (zh) * 2017-01-10 2019-03-15 柏荣诊断产品（上海）有限公司 兼顾特异性和灵敏度的免疫球蛋白G4亚型IgG4检测试剂盒
TN2020000015A1 (en) 2017-08-03 2021-10-04 Amgen Inc Interleukin-21 muteins and methods of treatment
CA3075046A1 (en) 2017-09-08 2019-03-14 Amgen Inc. Inhibitors of kras g12c and methods of using the same
CN107903302B (zh) * 2017-11-22 2021-05-14 韶远科技（上海)有限公司 一种γ-内酰胺桥联二肽类化合物的制备方法
US11512111B2 (en) * 2017-11-27 2022-11-29 The University Of Hong Kong Yeats inhibitors and methods of use thereof
MA51032A (fr) 2017-12-08 2021-03-17 Argenx Bvba Utilisation d'antagonistes de fcrn pour le traitement de la myasthénie grave généralisée
CN111727197A (zh) 2018-01-12 2020-09-29 美国安进公司 抗pd-1抗体和治疗方法
EP3802590A2 (en) 2018-06-08 2021-04-14 Argenx BVBA Compositions and methods for treating immune thrombocytopenia
US11692031B2 (en) 2018-08-03 2023-07-04 Amgen Research (Munich) Gmbh Antibody constructs for CLDN18.2 and CD3
WO2020227341A1 (en) 2019-05-06 2020-11-12 9 Meters Biopharma, Inc. Compositions and methods for treating sjogren's syndrome
SG11202112010RA (en) 2019-06-07 2021-12-30 Argenx Bvba PHARMACEUTICAL FORMULATIONS OF FcRn INHIBITORS SUITABLE FOR SUBCUTANEOUS ADMINISTRATION
HUE068401T2 (hu) 2019-11-11 2024-12-28 Amgen Res Munich Gmbh A BCMA elleni hatóanyagok adagolási rendje
EP4454711A3 (en) 2020-01-08 2025-01-08 argenx BV Methods for treating pemphigus disorders
US20230093169A1 (en) 2020-01-22 2023-03-23 Amgen Research (Munch) Gmbh Combinations of antibody constructs and inhibitors of cytokine release syndrome and uses thereof
EP4093436A4 (en) * 2020-01-22 2024-03-27 Spark Therapeutics, Inc. COMPOSITIONS AND METHODS FOR INCREASE OR IMPROVE TRANSDUCTION OF GENE THERAPY VECTORS AND FOR REMOVAL OR DECREASE IMMUNOGLOBULINS
TW202200615A (zh) 2020-03-12 2022-01-01 美商安進公司 用於治療和預防患者的crs之方法
JP2023527293A (ja) 2020-05-19 2023-06-28 アムジエン・インコーポレーテツド Ｍａｇｅｂ２結合構築物
US20230220069A1 (en) 2020-06-17 2023-07-13 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions and methods for treatment of gene therapy patients
MX2023005323A (es) 2020-11-06 2023-05-19 Amgen Inc Construcciones polipeptidicas que se unen a cd3.
AU2021373318A1 (en) 2020-11-06 2023-05-25 Amgen Inc. Antigen binding domain with reduced clipping rate
EP4240770A1 (en) 2020-11-06 2023-09-13 Amgen Research (Munich) GmbH Polypeptide constructs selectively binding to cldn6 and cd3
TW202233682A (zh) 2020-11-10 2022-09-01 美商安進公司 用於投與ＢＣＭＡｘＣＤ３結合分子之方法
US20240050521A1 (en) * 2021-01-11 2024-02-15 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions for treating friedreich's ataxia
CN117580857A (zh) 2021-06-23 2024-02-20 美国政府(由卫生和人类服务部的部长所代表) Apoc-ii短模拟肽及使用方法
EP4450081A4 (en) * 2021-12-16 2025-05-07 Shanghai Bao Pharmaceuticals Co., Ltd. Anti-immunoglobulin-degrading enzyme-fermented FC variant
EP4469478A1 (en) 2022-01-26 2024-12-04 Mabswitch Inc. Bispecific molecule with tunable affinity to a targetted antigen
WO2023215838A1 (en) 2022-05-05 2023-11-09 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Short apolipoprotein e mimetic peptides and methods of use
EP4540282A1 (en) 2022-06-15 2025-04-23 argenx BV Fcrn/antigen-binding molecules and methods of use
WO2024200573A1 (en) 2023-03-27 2024-10-03 LAVA Therapeutics N.V. Nectin-4 binding agents and methods of use
WO2025012118A2 (en) 2023-07-07 2025-01-16 LAVA Therapeutics N.V. 5t4 binding agents and methods of use
WO2025073871A1 (en) 2023-10-03 2025-04-10 Bicycletx Limited Bicyclic peptide ligand complexes specific for tfr1
GB202318512D0 (en) * 2023-12-04 2024-01-17 argenx BV Methods of determining potency
EP4653010A1 (en) 2024-05-14 2025-11-26 35Pharma Inc. Activin receptor type iib traps for use in improving body composition

Family Cites Families (66)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4179337A (en) * 1973-07-20 1979-12-18 Davis Frank F Non-immunogenic polypeptides
US3941763A (en) * 1975-03-28 1976-03-02 American Home Products Corporation PGlu-D-Met-Trp-Ser-Tyr-D-Ala-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2 and intermediates
JPS6023084B2 (ja) * 1979-07-11 1985-06-05 味の素株式会社 代用血液
US4215051A (en) * 1979-08-29 1980-07-29 Standard Oil Company (Indiana) Formation, purification and recovery of phthalic anhydride
US4640835A (en) * 1981-10-30 1987-02-03 Nippon Chemiphar Company, Ltd. Plasminogen activator derivatives
US4671958A (en) * 1982-03-09 1987-06-09 Cytogen Corporation Antibody conjugates for the delivery of compounds to target sites
US4867973A (en) * 1984-08-31 1989-09-19 Cytogen Corporation Antibody-therapeutic agent conjugates
US4713339A (en) * 1983-01-19 1987-12-15 Genentech, Inc. Polycistronic expression vector construction
US4496689A (en) * 1983-12-27 1985-01-29 Miles Laboratories, Inc. Covalently attached complex of alpha-1-proteinase inhibitor with a water soluble polymer
DE3572982D1 (en) 1984-03-06 1989-10-19 Takeda Chemical Industries Ltd Chemically modified lymphokine and production thereof
US5981216A (en) * 1985-04-01 1999-11-09 Alusuisse Holdings A.G. Transformed myeloma cell-line and a process for the expression of a gene coding for a eukaryotic polypeptide employing same
EP0206448B1 (en) * 1985-06-19 1990-11-14 Ajinomoto Co., Inc. Hemoglobin combined with a poly(alkylene oxide)
US4791192A (en) * 1986-06-26 1988-12-13 Takeda Chemical Industries, Ltd. Chemically modified protein with polyethyleneglycol
US5888512A (en) * 1987-01-30 1999-03-30 Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Lymphocyte activity regulation by HLA peptides
CA2006596C (en) 1988-12-22 2000-09-05 Rika Ishikawa Chemically-modified g-csf
EP0394827A1 (en) 1989-04-26 1990-10-31 F. Hoffmann-La Roche Ag Chimaeric CD4-immunoglobulin polypeptides
US6552170B1 (en) 1990-04-06 2003-04-22 Amgen Inc. PEGylation reagents and compounds formed therewith
US5677440A (en) * 1990-07-16 1997-10-14 Howard Florey Institute Of Experimental Physiology And Medicine Oligonucleotide-polyamide conjugates
WO1992008790A1 (en) * 1990-11-14 1992-05-29 Cargill, Incorporated Conjugates of poly(vinylsaccharide) with proteins for the stabilization of proteins
US5252714A (en) * 1990-11-28 1993-10-12 The University Of Alabama In Huntsville Preparation and use of polyethylene glycol propionaldehyde
DK0575545T3 (da) 1991-03-15 2003-09-15 Amgen Inc Pegylering af polypeptider
US5623053A (en) * 1992-01-10 1997-04-22 California Institute Of Technology Soluble mammal-derived Fc receptor which binds at a pH ranging from about 5.5 to 6.5 and releases at a pH ranging from about 7.5 to 8.5
US5326856A (en) * 1992-04-09 1994-07-05 Cytogen Corporation Bifunctional isothiocyanate derived thiocarbonyls as ligands for metal binding
US5449761A (en) * 1993-09-28 1995-09-12 Cytogen Corporation Metal-binding targeted polypeptide constructs
US6086875A (en) * 1995-01-17 2000-07-11 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Receptor specific transepithelial transport of immunogens
US6030613A (en) * 1995-01-17 2000-02-29 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Receptor specific transepithelial transport of therapeutics
US6121022A (en) * 1995-04-14 2000-09-19 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
KR19990063761A (ko) 1995-09-26 1999-07-26 엘. 데이예를 카렌. 헤르페스 비루스에 속하는 rfhv/kshv 아과의 당단백질b
US7141676B1 (en) * 1996-02-08 2006-11-28 University Of Washington Water soluble multi-biotin-containing compounds
WO1997043316A1 (en) 1996-05-10 1997-11-20 Beth Israel Deaconess Medical Center, Inc. Physiologically active molecules with extended half-lives and methods of using same
US6214795B1 (en) * 1996-11-12 2001-04-10 Praecis Pharmaceuticals, Inc. Peptide compounds useful for modulating FGF receptor activity
WO1998023289A1 (en) 1996-11-27 1998-06-04 The General Hospital Corporation MODULATION OF IgG BINDING TO FcRn
US6128119A (en) * 1997-01-10 2000-10-03 Asahi Kogaku Kogyo Kabushiki Kaisha Beam shaping optical system
ES2335557T3 (es) * 1997-01-21 2010-03-29 Sanofi Pasteur Conjugados de peptido-polisacarido.
US6281331B1 (en) * 1998-03-23 2001-08-28 Trimeris, Inc. Methods and compositions for peptide synthesis
US6362371B1 (en) * 1998-06-08 2002-03-26 Advanced Medicine, Inc. β2- adrenergic receptor agonists
US6660843B1 (en) 1998-10-23 2003-12-09 Amgen Inc. Modified peptides as therapeutic agents
US6197526B1 (en) * 1999-01-04 2001-03-06 Dyax Corp. Polypeptides for binding human factor VIII and fragments of human factor VIII
US7473528B2 (en) 1999-01-06 2009-01-06 Genenews Inc. Method for the detection of Chagas disease related gene transcripts in blood
US20040241727A1 (en) 1999-01-06 2004-12-02 Chondrogene Limited Method for the detection of schizophrenia related gene transcripts in blood
US6469136B1 (en) * 1999-07-07 2002-10-22 Trimeris, Inc. Methods and composition for peptide synthesis
ES2307534T3 (es) * 1999-09-28 2008-12-01 Bayer Corporation Agonistas de receptores 3 (r3) del peptido activador de la adenilato ciclasa hipofisiaria (pacap) y sus metodos de uso farmacologicos.
AU2001259432B2 (en) 2000-05-03 2005-04-21 Amgen Inc. Modified peptides, comprising an FC domain, as therapeutic agents
MXPA02012434A (es) 2000-06-16 2004-09-06 Cambridge Antibody Tech Anticuerpos que se unen inmunoespecificamente a estimulador de linfocitos ii.
US6992234B2 (en) * 2000-11-06 2006-01-31 The Jackson Laboratory FcRn-based therapeutics for the treatment of auto-immune disorders
JP2002214374A (ja) * 2001-01-15 2002-07-31 Agilent Technologies Japan Ltd 位置決め装置及び位置決め方法
US6867283B2 (en) 2001-05-16 2005-03-15 Technion Research & Development Foundation Ltd. Peptides capable of binding to MHC molecules, cells presenting such peptides, and pharmaceutical compositions comprising such peptides and/or cells
US6900292B2 (en) * 2001-08-17 2005-05-31 Lee-Hwei K. Sun Fc fusion proteins of human erythropoietin with increased biological activities
US20040081653A1 (en) 2002-08-16 2004-04-29 Raitano Arthur B. Nucleic acids and corresponding proteins entitled 251P5G2 useful in treatment and detection of cancer
CA2514303C (en) 2002-11-13 2012-09-18 The Uab Research Foundation Synthetic single domain polypeptides mimicking apolipoprotein e and methods of use
US20050009136A1 (en) 2003-02-19 2005-01-13 Dyax Corporation PAPP-A ligands
TWI353991B (en) 2003-05-06 2011-12-11 Syntonix Pharmaceuticals Inc Immunoglobulin chimeric monomer-dimer hybrids
WO2004108885A2 (en) 2003-05-06 2004-12-16 Syntonix Pharmaceuticals, Inc. Fc chimeric proteins with anti-hiv drugs
US7348004B2 (en) 2003-05-06 2008-03-25 Syntonix Pharmaceuticals, Inc. Immunoglobulin chimeric monomer-dimer hybrids
US20050037947A1 (en) 2003-05-06 2005-02-17 Bitonti Alan J. Inhibition of drug binding to serum albumin
EP1660128A4 (en) * 2003-08-08 2009-01-21 Univ New York State Res Found ANTI-CORR ANTI-BODIES FOR THE TREATMENT OF AUTO / ALLO-IMMUNE DISORDERS
US7662928B2 (en) * 2003-08-08 2010-02-16 The Research Foundation Of State University Of New York Anti-FcRn antibodies for treatment of auto/allo immune conditions
US7232805B2 (en) * 2003-09-10 2007-06-19 Inflabloc Pharmaceuticals, Inc. Cobalamin conjugates for anti-tumor therapy
US7968684B2 (en) 2003-11-12 2011-06-28 Abbott Laboratories IL-18 binding proteins
US7176185B2 (en) * 2003-11-25 2007-02-13 Tsrl, Inc. Short peptide carrier system for cellular delivery of agent
BRPI0506771A (pt) * 2004-01-12 2007-05-22 Applied Molecular Evolution anticorpo, e, composição farmacêutica
DE102004031579B4 (de) * 2004-06-29 2012-12-27 Forschungsverbund Berlin E.V. Peptide zur Inhibition der Interaktion von Proteinkinase A und Proteinkinase A-Ankerproteinen, diese umfassendes Nukleinsäuremolekül, Vektor, Wirtszelle, gegen diese gerichtetes Erkennungsmolekül, diese enthaltende pharmazeutische Zusammensetzung, diese enthaltender Kit und deren Verwendung
JP5137814B2 (ja) * 2005-04-06 2013-02-06 ジェンザイム・コーポレーション 治療ターゲティングのための酸不安定リンカーを介するｐｅｇおよびポリシアルリソソーム酵素のコンジュゲート
TW200745163A (en) 2006-02-17 2007-12-16 Syntonix Pharmaceuticals Inc Peptides that block the binding of IgG to FcRn
CA2694824A1 (en) 2007-08-09 2009-02-12 Syntonix Pharmaceuticals, Inc. Immunomodulatory peptides
US20100048488A1 (en) 2008-08-01 2010-02-25 Syntonix Pharmaceuticals, Inc. Immunomodulatory peptides

Also Published As

Publication number Publication date
BRPI0707920A2 (pt) 2011-05-17
IL193101A0 (en) 2009-02-11
EA200870274A1 (ru) 2009-02-27
US8101186B2 (en) 2012-01-24
AU2007217042A1 (en) 2007-08-30
US20070254831A1 (en) 2007-11-01
WO2007098420A3 (en) 2008-01-17
KR20080106432A (ko) 2008-12-05
JP2009527499A (ja) 2009-07-30
NO20083712L (no) 2008-10-20
MX2008010327A (es) 2009-01-26
EP1991572A2 (en) 2008-11-19
WO2007098420A8 (en) 2009-09-11
MEP7408A (xx) 2010-02-10
AU2007217042A2 (en) 2009-04-23
US9012603B2 (en) 2015-04-21
CA2638867A1 (en) 2007-08-30
WO2007098420A2 (en) 2007-08-30
US20110059889A1 (en) 2011-03-10
TR200807263A2 (tr) 2009-03-23
TR200807263T1 (tr) 2009-02-23
TW200745163A (en) 2007-12-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
RS20080362A (sr) PEPTIDI KOJI SPREČAVAJU VEZIVANJE IgG ZA FcRn
US8906844B2 (en) Immunomodulatory peptides
CA2862516C (en) Compositions and methods of use for treating metabolic disorders
ES2994374T3 (en) Antibody molecule-drug conjugates and uses thereof
WO2010014909A1 (en) Immunomodulatory peptides
JP6469590B2 (ja) Ｋｖ１．３アンタゴニスト及び使用方法
CA2747678A1 (en) Soluble polypeptides for use in treating autoimmune and inflammatory disorders
HRP960256A2 (en) Peptides and compounds that bind to a receptor
RS52815B (sr) Vezivna sredstva koja inhibiraju miostatin
CN107074928A (zh) 新型猫促红细胞生成素受体激动剂
US20240034757A1 (en) Tick chemokine binding proteins for use in therapy and diagnosis
Coteur et al. Peptidoglycan recognition proteins with amidase activity in early deuterostomes (Echinodermata)
EP2776458B1 (en) Protease activated receptor-1 (par1) derived cytoprotective polypeptides and related methods
US20220017585A1 (en) Cxcr3 ligand
CN101421297A (zh) 阻断lgG对FcRn的结合的肽
EP3424957A1 (en) Fusion protein
US8841253B2 (en) Viral/bacterial toxin polypeptides and methods of using same
KR20130103299A (ko) Ｒｔｋ에 특이적으로 결합하는 ｒｔｋ―ｂｐｂ
HK1241391A1 (en) Compositions for regulating iron homeostasis and methods of using same
WO2016184784A1 (en) Peptides including binding domain of plasmodium falciparum proteins (cbp1 and cbp2) to chemokine cx3cl1
WO2014014816A2 (en) Methods of treating glucose metabolism disorders