RS20080138A - Vakcine i metode lečenja influence kod canina - Google Patents

Abstract

Predmetni pronalazak odnosi se na dobijanje novih vakcina i lečenje bolesti povezanih sa canine influenca virusom. On obuhvata influenca viralne antigene, i metod prenosa ovih antigena caninima, posebno psima. Odnosi se na oslabljene i ubijene vakcine. Ovaj pronalazak odnosi se na eksperimentalno generisane canine i equine influenca viruse. Pronalazak takođe obuhvata influenca A, uključujući H3,N8, H3N8, H7N7 i viruse koji sadrže najmanje jedan genomski fragment iz canina ili equina influenca virusa. Ovaj pronalazak se takođe odnosi na upotrebu ovih virusa u terapeutskim jedinjenjima kako bi se zaštitili, a posebno psi, od bolesti izazvanih influenca virusima.

Description

VAKCINE I METODE LEČENJA INFLUENCE KODCANINA

OBLAST PONALASKA

[0001]Ovaj pronalazak odnosi se na dobijanje novih vakcina i lečenje bolesti vezanih za virus infhmce kodcanina.On razotkriva antigene viralne influence i metod za unošenje ovih antigenacaninima,posebno psima. Odnosi se na inaktivirane i ubijene vakcine. Ovaj pronalazak se odnosi na eksperimentalno dobijenecanineiequineinfluenca vakcine i viruse. Ovaj pronalazak takodje uključuje influenca A, H3, N8, H3N8 i H7N7 viruse koji sadrže bar jedan genomski fragmentcanineiecjuineinfluenca virusa. Ovaj pronalazak se takodje odnosi na upotrebu ovih virusa u preparatima za lečenje i zaštitucanina,naročito pasa od bolesti izazvanih virusima influence.

STANJE TEHNIKE

[0002]Eguineinfluenca virus je poznat kao glavni respiratorni patogen kod konja od 1956. Simptomi bolesti izazvaniecjuineinfluenca virusom mogu biti ozbiljni, i često su praćeni sekundarnim bakterijskim infekcijama. Prepoznata su dva podtipaequineinfluenca virusa, to su podtip-1, prototipaA/ Equine/ ?rague/\ l56(H7N7) i podtip-2, prototipaA/ Eqiiine/ M\ ami/\/ 63(H3N8). Trenutno , pretežan podtip virusa je podtip-2, H3N8 vrste. Veruje se da ova vrsta može da inficiracaninei može biti veoma virulentna i izrokovati uginućecaninau visini od 36% u pojedinim slučajevima.Moguće je da medjusobno prenošenje celokupnog ili delaenquineinfluenca virusa na psa rezultira u novu specifičnu vrstu influenca virusa povezanu sa akutnim disajnim oboljenjima. Videti. Transmission of F.quine Influenza to Dogs (P.C. Cravvford etal., Science 310, 482-485 (2005). Očigledna je i ubedljiva potreba za efektivnom vakcinom za lečenje i prevenciju novecanineinfluence.

KRATAK OPIS SLIKA

[0003] Slika1 pokazuje geometrijsku sredinu sporednih reakcija kod pasa na mestima vakcinisanjasa eguineantigen vakcinama.Slika2 predstavlja srednju vrednost u procentima stvrdnutih ufrušaka pluća kod životinja vakcinisanih sa Equina influenca virus vakcinama u poređenju sa inficiranim sacanineinfluenca virusom.

KRATAK OPIS PRONALASKA

[0004]Ovaj pronalazak obezbeđuje equine i canine influence antigene, vakcine i metod za upotrebu ovih vakcina za lečenje canina, posebno pasa, od infekcija, bolesti i simptoma izazvanih canine influencom. Pronalazak dalje obezbedjuje terapeuteka jedinjenja za zaštitu životinje od bolesti izazvanih influenca virusom. Metode za dobijanje vakcina i metode za lečenje životinja su opisani u ovom pronalasku. Antigeni iz ovog pronalaska mogu biti bilo koja identifikovana vrsta influenca virusa, iz bilo koje ptice ili sisara, uključujući ali nije ograničavajuće na influence koje imaju H3N8 antigenski podtip što se češće odnosi na H3N8 vrstu. Influenca može biti poreklom od bilo kog sisara, uključujući ali nije ograničavajuće na svinje, ptice, equine, canine poreklo. Equine i canine virus i odgovarajući antigeni su preferirani. Sojevi koji imaju proteine H3 i N8 tipa su uključeni. Sojevi koji imaju oba H3N8 su preferirani. Sojevi koji imaju proteine označene kao H7N7 su takođe uključeni.

[0005]Koncentracije antigena i dobijanje vakcina su opisani. Medium za uzgajenje ćelijskih kultura i uzgajanje virusa su opisani. Priprema vakcina od oslabljenih, ubijenih i inaktiviranih virusa kao i dodatci za vakcine. formulacije, oblici i nosači, način primene i probe su takođe opisani.

DETALJAN OPIS PRONALASKA

DEFINICIJE I SKRAĆENICE

[0006]Donje definicije odgovaraju ovom prilošku, reči koje nisu definisane imaju značenje koje je u uobičajenoj upotrebi kod ljudi iz struke.

[0007] "Oko", kada se upotrebljava u vezi sa merljivom numeričkom varijablom, odnosi se na dotičnu numeričku vrednost i na sve vrednosti varijable koje su u okviru eksperimentalne greške te varijable (npr.za interval pouzdanosti od 95% za srednju vrednost ili u okviru 10 procenata označene vrednosti, koja god od ove dve vrednosti daje veća).

[0008] "Aktivni imunitet" uključuje himoralni imunitet i/ili ćelijski -kontrolisan imunitet kod pasa.

[0009] "Antitelo" odnosi se na molekule imunoglobulina koji se mogu vezati za specifični antigen kao rezultat imunog odgovora na taj antigen. Imunoglobulini su serum proteini koji se satoje od "lakog" i "teškog" polipeptidnog niza koji imaju "konstantne" i "varirajuće" regione i podeljeni su u klase (npr., IGA, IgD, IgG i IgM) bazirane na sastavu konstantnih regiona. Antitelo koje je "specifično" za dati antigen označava to da varirajući regioni antitela prepoznaju i vezuju se isključivo za određeni antigen. Antitela mogu biti poliklonalna smeša ili monoklonalni. Antitela mogu biti intaktni imunoglobulini prirodnog porekla ili dobijeni rekombinacijom, ili mogu biti imunoreaktivne porcije intaktnih imunoglobulina. Antitela mogu da postoje u različitim oblicima uključujući, na primer, as, Fv, Fab', F(ab')2, kao i as u jednom nizu.

[0010] "Antigen" ili "imunogen" odnosi se na molekul koji sadrži jedan ili više epitopa (linearnih, konformacionih ili oba) koji nakon izloženosi subjektu uzrokuju imunološki odgovor koji je specifičan za taj antigen. Epitop je specifično mesto na antigenu koje se vezuje za T-ćelijski receptor specifičnog antitela, i tipično sadrži oko 3 amino kiselinska ostatka do oko 20 aminokiselinskih ostataka. Termin antigen se odnosi na podjedinične antigen-antigene odvojeno i različito od celine organizma sa kojim je antigen povezan u prirodi- kao što su ubijene, oslabljene ili inaktivne bakterije, virusi, gljive, paraziti ili drugi mikrobi. Termin antigen se takodje odnosi na antitela, ka što je anti-idiotip antitela ili njihovi fragmenti, i na sintetičke mimotope koji mogu da imitiraju antigen ili antigensku determinantu (epitop). Termin antigen se takodje odnosi na oligonukleotid ili polinukleotid koji izražava jedan antigen ili antigensku determinantu in vivo, kao što je u DNK imunizirajućim primenama.

[0011] "Antigenost" se odnosi na sposobnost proteina ili polipeptida da se imunospecifično veže za antitelo koje se prostire nasuprot proteinu ili polipeptidu.

[0012] " Canine"uključuje ono što se uobičajeno naziva pas, ali uključuje i članove familijeCanidae.

[0013] "Celularni Imuni Odgovor"- videti imuni Odgovor

[0014] "Pridružena životinja", ovde se koristi, na bilo koju ne-humanoidnu životinju koja nije slobodna i koja se smatra kućnim ljubimcem. Ovo može da bude ali nije ograničeno samo na , pse, mačke, konje, ovce, zečeve, majmune i glodare, uključujući miševe, pacove, hrčke, tvorove i lasice.

[0015] "Equine" uključuje ono što se obično naviva konj ali uključuje i ostale pripadnike vrsteEcjitidae.

[0016] "Ekscipijent" se odnosi na bilo koju komponentu vakcine koja nije antigen.

[0017] "Prva vakcina", "Druga vakcina", "Treća vakcina", i tom esločno , odnosi se na pojedinačne vakcine, koje mogu biti iste ili različite, i koje mogu biti date bilo kojim redosledom. To zanači da treća vakcina može biti data subjektu pre ili posle druge vakcine.

[0018] "Heterologni", kada se ovde koristi označava daje poreklom od različitih viralnih, rodova ili vrsta.

[0019] "Homologija". "Homologni", i tome slično kada se ovde koristi označava stepen identičnosti između polinukleotidnih ili polipeptidnih sekvenci.

[0020] "Homologni", kada se koristi u odnosu na viralni, vrste koje su istog viralnog roda ili soja.

[0021] "Ćelija domaćin", kada se ovde koristi označava bakteriju ili eukariotsku ćeliju, uključujući sisare, ptice ili insekte, koji skladište plazmid. virus ili drugi vektor.

[0022] "Humoralni Imuni Odgovor" - videti Imuni Odgovor

[0023] "Hibridoma" - videti Monoklonalno Antitelo

[0024] "Imuni Odgovor" u subjektu odnosi se na razvoj humoralnog imunog odgovora, celularnog imunog odgovora ili humoralnog i celularnog imunog odgovora na antigen. "Humoralni imuni odgovor" odnosi se na onaj koji se vrši preko antitela. "Celularni imuni odgovor" se odnosi na onaj koji se vrši preko T-limfocita ili drugih belih krvnih zrnaca ili oba, i uključuje proizvodnju citokina, hemokina i sličnih molekula proizvedenih od strane T-ćelija, belih krvnih zrnaca, ili oba. Imuni odgovori mogu se odrediti upotrebom standardnih imunoproba i neutralizacionih proba, koje su poznate u struci.

[0025] "Imunogenetika" se odnosi na kapacitet proteina ili polipeptida da proizvede imunološki odgovor usmeren specifično prema bakteriji ili virusu koji uzrokuje identifikovanu bolest.

[0026] "Imunološki zaštitna količina" ili "efikasna količina za proizvođenje imunološkog odgovora" nekog antigena je količina dovoljna da proizvede imunogeni odgovor kod recepijenta koji je adekvatan prevenciji ili umanjenju znakova ili simptoma bolesti, uključujući i sporedne efekte ili njihove komplikacije. Bilo humoralni biloćelijski - sproveden imunitet ili oba mogu biti indukovani. Imunogenetski odgovor životinje na sastav vakcine mogu se pratiti, npr. indirektno preko merenja količine antitela, povećanja limfocita ili direktno praćenjem znakova i simptoma nakon izloženosti divljem tipu soja. Zaštitni imunitet proizveden vakcinom može se pratiti, npr. smanjenjem kliničkih znakova kao što su uginuće, bolest, temperatura opšta fizička kondicija i ukupno zdravlje i ponašanje pacijenta. Imuni odgovor može da podrazumeva, bez ograničenja, indukciju ćelijskihi/ili humoralnog imuniteta. Količina vakcine koja je terapeutski efikasna može da varira u zavisnosti od virusa koji je korišćen, ili od stanja životinje koja je vakcinisana, i može je odrediti veterinar.

[0027] "Intranazalno" davanje, odnosi se na uvođenje supstance kao što je vakcina u subjekatovo telo kroz nos i uključuje transport supstance primarno kroz nazalnu sluzokožu.

[0028] "Izolovani" kada se ovde upotrebljava označava uklonjen iz prirodnog okruženja, ili sam ili u heterolognoj ćeliji domaćinu, ili hromozomu ili vektoru (npr., plazmid, fag i si.). "Izolovana bakterija", "izolovana anaerobna bakterija", "izolovana bakterijska vrsta", "izolovani virus", "izolovana vrsta virusa" i tome slično odnosi se na sastav u kojem je bakterija ili virus su supstancijalno oslobođeni od drugih mikroorganizama, npr., u kulturi, kao kada se izdvoji iz svoje prirodne sredine. "Izolovan", kada se koristi da se opiše bilo koja definisana supstanca, kao što je polinukleotid ili polipeptid, odnosi se na supstance odvojene iz svog ćelijskog okruženja u kojem se supstanca kao stoje polipeptid ili nukleinska kiselina obično mogu naći. Kao što se ovde koristi, a sada se navodi samo kao primer, rekombinantna ćelijska linija koja je konstruisana od polinukleotida iz ovog pronalaska dobija se od "izolovane" nukleinske kiseline. Alternativno, ukoliko neki protein ili specifični imunogeni fragment se naziva ili upotrebljava kao vakcina smatra se daje izolovan na osnovu toga što je identifikovan, izdvojen i u izvesnom stepenu prečišćen u odnosu na to u kom obliku se nalazi u prirodi. Ukoliko protein ili njegov specifični imunogeni fragment je proizveden u rekombinantnoj bakteriji ili eukariotnom ekspresionom vektoru koji proizvodi antigene smatra se da postoji kao izolovani protein ili nukleinska kiseliuna. Na primer, rekombinantna ćelijska linija konstruisana od polinukleotida dobija se od "izolovane" nukleinske kiseline.

[0029] "Svarljivo pomoćno sredstvo"- Dodatak koji se sastoji od komponenti koje su svarljive za ciljne vrste kao što su dodaci na bazi biljnih ulja. Svarljivi dodatci mogu biti svarljiva ulja. Svarljiva ulja su masti koje se pojavljuju u biljkama i životinjama i obično sadrže triacilglicerole. poznatiji kao trigliceridi ili neutralne masti. Ove, nepolarne, u vodi nerastvorljive supstance su triestri masnih kiselina i glicerola. Triacilgliceroli se razlikuju po vrsti i položaju ova tri ostatka masnih kiselina. Uporediti sa "Nesvarljiva pomoćna sredstva".

[0030] "Nesvarljiva pomoćna sredstva"- Dodatci koji se sastoje od komponenti koje se ne mogu svariti od strane životinje kojoj se daje emulzija. Nesvarljiva ulja primerena za upotrebu u emulzijama iz ovog pronalaska uključuju alkane, alkene, alkine, i njihove odgovarajuće kiseline i alkohole, njihove etre i estre i njihove smeše. Najpogodnije su individualne komponente ulja koje su laki ugljovodonici, npr. komponente koje sadrže 6 do 30 ugljenikovih atoma. Ulja se mogu dobiti sintetički ili prečišćavanjem naftnih derivata. Najpogodnija nesvarljiva ulja za upotrebu u emulzijama prema ovom pronalasku su mineralna ulja, parafinska ulja i cikloparafini, na primer. Termin "Mineralna ulja" se odnosi na nesvarljive dodatke koji su smeša tečnih ugljovodonika dobijenih destilacijom petroleja. Termin je sinonim za "tečni parafini", "tečni petrolej" i "vajs špirit". Termin se takođe odnosi na "laka mineralna ulja", npr., ulje koje na sličan način dobijeno od petroleja, ali koji ima nešto nižu specifičnu težinu od vajs špirita. Videti, npr Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition (Easton, Pa. : Mack Publishing Companv, 1990, na stranama 788 i 1323). Mineralna ulja mogu se dobili iz različitih komercijalnih izvora, na primer J.T. baker (Phillipsburg, PA), USB Corporation (Cleveland, OH). Najpogodnije mineralno ulje je lako mineralno ulje komercijalno dostupno pod nazivom DRAKEOL®.

[0031] "Monoklonalno antitelo" se odnosi na antitela proizvedena od strane jedne vrste hibridoma ćelija, koja su sva usmerena ka jednom epitopu na određenom antigenu. Antigen koji se koristi za monoklonalno antitelo može se dobiti kao izolovani protein patogena ili kao ceo patogen. "Hibridoma" je klonarna ćclijska linija koja se sastoji od hibridne ćelije formirane fuzijom mielomskih ćelija i specifičnog antitelo-proizvodnih ćelija. Uopšteno, monoklonalna antiteta su poreklom od miša; no monoklonalna antitela se takođe odnose na populaciju antitela napravljenih za određeni epitop antigena proizveden od tehnologijom putem faga ili metodom koji je ekvivalentan ovom ili iz hibridnih ćelija ne-mišjeg porekla.

[0032] "N dana" ili "M dana" koji prate neki eksperiment, odnosi se na bilo koje vreme N-tog ili M-tog dana nakon određenog događaja. Na primer, vakcinisanje nekog subjekta sa drugom vakcinom 14 dana nakon davanja prve vakcine, znači daje druga vakcina data u bilo koje vreme 14-og dana nakon prvr vakcine.

[0033] "ORF" - "Open reading frame", ili otvoreni okvir za čitanje je npr. deo gena za očitavanje.

[0034] "Oralno" ili "peroralano" davanje odnosi se na unošenje supstance, kao što je vakcina u telo subjekta kroz ili preko usta i uključuje gutanje ili transpor tpreko usne sluzokože (npr. sublingvalna ili bukalna resorpcija) ili oba. Intratrahealno je takođe vrsta oralne ili peroralnog davanja.

[0035] "Oronazalno" davanje se odnosi na unošenje supstance, kao što je vakcina u telo subjekta kroz ili ili preko nosa i usta, kao što je stavljanje kapi u nos. Oronazalno davanje uključuje procese transporta vezane za oralno i intranazalno davanje.

[0036] "Parenteralno davanje" odnosi se na unošenje supstance, kao što je vakcina, u telo subjekta kroz ili na način koji ne podrazumeva digestivni trakt. Parenteralno davanje uključuje subkutano davanje, intramuskularno, transkutano, intradermalno, intraperitonealno, intraokularno i intravenozno davanje. U cilju razlikovanja, parenteralno davanje isključuje načine davanja koji primarno uključuju transport supstance kroz mukozno tkivo u ustima, nosu, grlu i plućima. |0037| "Farmaceutski prihvatljiv" odnosi se na supstance, koje su u saglasnosti sa medicinskim merilima, podesne za upotrebu u kontaktu sa tkivom subjekta i nemaju toksično, iritirajuće, alergijsko i tome slično dejsto, odmerene u razumnim dobro kontrolisanim -ne toksičnim proporcijama, i efikasne za nameravanu upotrebu.

[0038] "Farmaceutski pihvatljiv nosač" odnosi se na medijum za prenošenje koji ne utiče na bioločku aktivnost aktivnih komponenti i nije toksičan za subjekat kojem se daje.

[0039] "Poliklonalno antitelo" odnosi se na mešovitu populaciju antitela napravljenu za određeni patogen ili antigen. Uopšteno, populacija sadrži različite grupe antitela, gde je svaka grupa usmerena prema određenom epitopu patogena ili antigena. Da bi se dobila poliklonalna antitela, ceo patogen ili izolovani antigen se uvodi u inokulacijom ili infekcijom u domaćina koji proizvodi antitela protiv patogena ili antigena.

|0040] " Prevencija infekcije" znači sprečavanje ili inhibicija replikovanja bakterija ili virusa koji uzrokuku identifikovanu bolest, inhibiranje prenosa bakterije ili virusa, ili sprečavanje bakterije ili virusa da se ukoreni u domaćinu, ili da razvije simptome bolesti prouzrokovane infekcijom. Lečenje se smatra uspcšnim ukoliko dođe do smanjenja količine bakterrija ili virusa.

[0041] "Zaštita", "Zaštitni", i tome slično, kada se ovde koristi vezano za vakcinu, označava da vakcina sprečava ili umanjuje simptome bolesti izazvane organizmom iz kojeg su dobijeni antigen(i) za vakcinu. Termin "zaštita " i "zaštitni" i tome slično, takođe znači da vakcina može da se koristi za "lečenje" bolesti ili jednog ili više simptoma bolesti koji već postoje u subjektu.

[0042] "Respiratorno" davanje odnosi se na unošenje supstance, kao što je vakcina, u telo subjekta kroz ili na način da se inhalira raspršene supstance. Kod respiratornog davanja, primarni mehanizam transporta uključuje apsorpciju raspršene supstance kroz sluzokožu grla, bronhija i pluća, tako daje različito od intranazalnog ili peroralnog davanja.

[0043] "Specifičan za", kada se koristi za opisivanjcantitela iz pronalaska, označava da promenjivi delovi antitela iz pronalaska prepoznaju i vezuju specifičnu H3N8 vrstu isključivo (npr. u stanju su da razlikuju određeni H3N8 protein od ostalih poznatih proteina u razmeri koja je merljiva kroz razliku u afinitetu za vezivanje, bez obzira na postojanje lokalne sličnosti u sekvencama, homologije ili sličnosti između H3N8 spoteina i ovakvih polipeptida). Biće razumljivo da specifična antitela mogu takođe da interaguju sa drugim proteinima ( ili drugim antitelima u ELISA tehnici) kroz interakciju sa sekvencama izvan promenjivih delova antitela a posebno u nepromenljivom delu molekula. Eksperimenti za praćenje i determinisanje specifičnog vezivanja antitela iz pronalaska su dobro poznati rutinski s e sprovode u praksi. Za svestranu raspravu o ovakvim eksperimentima videti Harlovv et al. (Eds.), Antibodies: A Laboratorv Manual; Cold Spring Harbor Laboratorv; Cold Spring Harbor, NY (1988), Chapter 6, Antitela iz ovog pronalaska mogu se dobiti upotrebom metoda koje su dobro poznate i rutinski se praktikuju u struci.

[0044]"Podjedinična vakcina" odnosi se na tip vakcine koji uključuje jedan ili više antigena, ali ne sve antigene, koji su proizašli ili homologni sa antigenima iz patogena od interesa, kao stoje virus, bakterija, parazit ili gljiva. Ovakvi oblici su supstancijalno slobodni od intaktnih patogenih ćelija ili delova patogena ili lizata ovakvih ćelija ili delova. Dakle, podjedinična vakcina se može dobiti od parcijalno prečišćenog ili potpuno prečišćenog, imunogenog polipeptida iz patogena ili njegovih analoga. Metod za dobijanje jednog ili više antigena u subjediničnoj vakcini uključuje standardne metode prečišćavanja, rekombinantno proizvodjenje ili hemijsku sintezu. "Subjedinična vakcina" se dakle odnosi na vakcinu koja se sastoji od definisane antigenske komponente ili komponenti iz celog viralnog. bakterijskog ili drugog imunogena.

[0045]"Specifični imunogeni fragment" znači porciju sekvence koja je prepoznatljiva za antitelo koje je specifično za sekvencu.

[0046]"Subjekt" se odnosi na bilo koju životinju koja ima imuni sistem, što uključuje sisare kao što su psi.

[0047]"TCID50" odnosi se na "infektivnu dozu tkivne kulture" i definiše se kao potrebno razblaženje virusa koje je dovoljno da inficira 50% date porcije uzgajane ćelijske kulture. Različite metode se mogu koristiti za izračunavanje TCID50uključujući Spearman-Karber-ov metod koji se koristi u ovoj specifikaciji. Za opis Spearman-Karber-ovog metoda videti B.W.Mathy&H.O. Kangro, Virology Methods Manual 25-46 (1996).

[0048]"Terapeutski agens" odnosi se na bilo koji molekuljedinjenje, virus ili metod, najpogodnije umrtvljeni ili mrtav virus, ili podjedinicu ili jedinjenje, koje učestvuje u lečenju virusne infekcije ili bolesti ili stanja koja su njima uzrokovana.

[0049] " Terapeutski efikasna količina", u kontekstu ove prijave, odnosi se na količinu antigena ili vakcine koja bi proizvela imuni odgovor u subjektu (npr. kod psa) primanjem antigena ili vakcine koja je adekvatna da spreči ili umanji znake ili simptome bolesti, uključujući neželjene efekte po zdravlje ili komplikacije, izazvane infekcijama sa patogenima kao što su virusi (npr, H3N8), bakterije paraziti ili gljive. Humoralni imunitet ili ćelijski uslovljen imunitet ili oba humoralni i ćelijsi-uslovljen imunitet mogu biti indukovani. Imunogeni odgovori životinje na vakcinu mogu se pratiti, npr. indirektno kroz merenje antitela u titru, proliferacije limfocita u probi, ili direktno kroz praćenje znaka i simptoma nakon poređenja sa divljim vrstama. Zaštitni imunitet proizveden vakcinom može se pratiti npr. smanjenjem kliničkih simptoma kao što je mortalitet, potištenost, temperatura i ukupno fizičko stanje i ukupno zdravlje i stanje subjekta.Količina vakcine koja je terapeutski efikasna može da varira u zavisnosti od datog virusa koji se koristi, od stanja subjekta, i može se determinisati od strane obučenih u struci.

[0050] "Prenosiv" označava virus koji se može prenositi sa prve životinje (pas) na drugu životinju (psa) gde drugi pas pokazuje serovonsku reakciju prema prenešenom virusu.

[0051] "Lečenje" se odnosi na okretanje, umanjivanje, inhibiciju razvoja, ili sprečavanje poremećaja, stanja ili bolesti na koji se termin primenjuje, ili sprečavanje jednog ili više simptoma ovakvog poremećaja, stanja ili bolesti.

[0052] "Tretman" se odnosi čin "lečenja" kao sto je prethodno objašnjeno.

[0053] "Vakcina" se odnosi na imunogeno jedinjenje izdvojeno iz virusa, ili modifikovano živo, umrtvljeno ili ubijeno, ili podjediničnu vakcinu, ili bilo koju kombinaciju prethodno spomenutih. Davanje vakcine subjektu uzrokuje imuni odgovor. Vakcina se može uvoditi direktno u subjekt bilo kojim putem, uključujući parenteralno, peroralno i tome slično.

[0054] DEO 1. ANTIGENI I VIRUS SOJEVI, NJIHOVO DOBIJANJE, PROIZVODNJA, FORMULACIJA I DAVANJE VAKCINA

[0055]Prema jednom od aspekata ovog pronalaska obezbedjnju se vakcine koje sadrže sledeće antigene koji služe za izazivanje imunogenog odgovora.

[0056] Korisni antigeni u pronalasku. Antigeni iz ovog pronalaska mogu biti bilo koji identifikovani influenca virusnog soja, iz bilo koje ptice ili sisara, uključujući ali nije ograničeno samo na, virus influence koji sadrži podtip H3 hemagglutin i podtip N8 neuraminidazu, ili H3N8 podtip ili poznatiji kao H3N8 virus. Ingfuenca može biti poreklom od bilo koje ptice ili sisara, uključujući ali nije ograničeno na , svinje, equine ili canine. Equine ili canine influenca antigeni su najomiljeniji. Soj koji ima podtip glikoproteine označene H3 ili N8 i još bolje soj koji ima oba H3 i N8.

[0057] Soj i varijeteti i mutanti i njihovi varijeteti se takođe koriste kao što je to opisano u Transmission ofEquine lnfluenza to Dogs (P.C.Cravvford et.al., Science 310, 482-485

(2005). Viralni HA je kritična determinanta vrste domaćina specifično za virus influence.

[0058] Influenca antigeni iz ovog pronalaska mogu biti izolovani iz pasa, konja, svinje i živine domaće ili divlje. Životinje odabrane za uzorkovanjc treba da pokazuju akutne i/ili sub-akutne kliničke sindrome koji mogu da uključuju blage ili jake respiratorne simptome i groznicu. Životinje mogu takođe da pokazuju znake anoreksije i letargije. Metode izolovanja virusa su dobro poznati ljudima iz struke uključujući: peleovanje mamilame ili avijalne ćelijske kulture, oplođenih jaja sa nasalnim ili faringalnim mukoznim uzorcima iz kliničkih sojeva, sakupljanje grebanjem nazalnog kanala ili grla ili sakupljanjem tkiva koa što je: slezina, pluća, krajnik i jetreni i plućne izlučevine.Citopatogeni efekat virusa može se pratiti u ćelijskoj kulturi i alantoinska tečnost ili ćelijskom lizatu, može se testirati po njihovoj sposobnosti da slepljuju humana, kokošja, ćureća ili od zamorca crvena krvna zrnca, što je dokaz za prisustvo influenca virusa.

[0059] Nomenklatura viralnih sojeva i mogućih antigena. Tip A influenza virus sojeva je podeljena na podtipove zasnovano na antigenskim karakteristikama njihovih glikoproteina na viralnoj površini. Ovi virusni glikoproteini su hemaglutinin (HA) i neuraminidaze (NA). Obično HA podtip se naziva prvim a NA drugim, tako II3N8 se odnosi na virus sa hemaglutininom podtipa 3 i neuraminidaze podtip 8. Podtip se zasniva na serološkim analizama HA i NA. Koristeći procedure koje su ovde opisane vakcina za bilo koji od ovih podtipova mogu se dobiti. Trenutno postoji 16 identifikovanih HA podtipova i 9 identifikovanih NA podtipova. Možda postoji još podtipova u prirodi koji još nisu identifikovani.Preciznije, identifikovani podtipovi uključuju H1,H2,H3,H4,H5,H6,H7,H8,H9,H10,H1 1,H12,H13,H14, Hl5 i H16 i NI, N2, N3, N4, N5,N6, N7, N8 i N9. Sve ove kombinacije podtipova, i bilo koja njihova kombinacija i bilo koji podtip u kombinaciji sa budućim podtipovima koji će se identifikovati u budućnosti koristeći postupke koji su ovde opisani ili su supstancijalno njima slični se smatraju korisnim antigenima za ovaj pronalazak. Sve druge HA i NA kombinacije podtipova su pokazane. Ovo uključuje ali nije ograničavajuće na najpogodnije podtipove H3N8 i H7N7.

[0060] Influenca virus hemaglutinin (HA) je viralni površinski glikoprotein kojim se virus vezuje za receptore na ćeliji domaćinu i spaja virusni omotač sa mambranama endocitnih nosača kako bi se inicirao infektivni proces. On je takođe virusna komponenta koja je najvažnija u stimulaciji i formiranju zaštitnih antitela. Aminokiselinska sekvenca HA i lokacija njegovih N-glikolizujućih mesta determinisana je virusnim genomom.

[0061] Segmentirani, negativni deo RNK genoma influenca virusa replikuje se preko jedne RNA- zavisne polimeraze kojoj nedostaje efikasna funkcija za proveru očitavanja, što dovodi do visokog stepena graešaka u očitavanju što može da dovede do zamene amino kiselina na površini glikoproteina HA i NA. Jedna od posledica velikog broja mutacija je ta da populacije virusa sadrže mutante koji se razlikuju od većine u broju i položaju N-vezanih glikanana HA. Strukture ovih oligosaharida mogu se odrediti preko njihovog položaja na HA i prema oblasti biosintetičkih i uređujućih enzima dobijenih od ćelija domaćina u kojem se virus uzgaja. Tako plastičnost viralnog genoma i domaćin-specifični glikolizujući mehanizam mogu , zajedno, da do proizvedu populaciju virusa koja je više heterogena po strukturi i funkciji nego u što bi bila u bilo kojem od ova dva procesa zasebno. Ova raznovrsnost smatra se zaslužnom za opstanak ovih virusa u različitim biološkim nišama i za njihovu sposobnost da pevaziđu inhibitorske efekte neutralizujućih antitela i antivirusnih agenasa. Mutacije u virusnom genomu različitih sojeva identifikovane su i ovi imitirani sojevi su takodje deo ovog pronalaska. Na primer, neki od ovih mutanata su opisani u Transmission of Equine Influenza to dogs (P.C.Cravvford et al., Science 310, 482-485 (2005) koja ovde služi kao referenca.

[0062] Ovaj pronalazak takođe obuhvata vakcinu napravljenu od specifičnog soja sakupljenog i identifikovanog kao Equine Influenza Strain A/Equine/2/Miami/l / 63. Ovaj soj se čuva u American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209 kao ATCC VR 317. Ovaj soj je prvobitno izolovan iz nazalnih ispiranja bolesnih konja u Majamiju 1963. godine. Virus je prenet 5 puta u pileći embrion. Virus je dalje klasifikovan kao H3N8.

[0063]Drugi primer Severno Američkog II3N8 influenca virusa proizačlog iz konja je A/Equine/Kentucky/1998. Dodatni primeri H3N8 proizašlih iz konja su A/Equine/Kentucky/15/2002, A/Equine/Ohio/1/2003, A/Equine/Kentucky/I/1994, A/Equine/Massachusetts/213/2003, A/Equine/Wisconsin/2003 i A/Equine/New Zork/1999. Još neki primeri bili bi Evropski H3N8 influenca virus proizašao iz A/Equine/rNevvmarket/A2/1993.

[0064]Ovaj pronalazak takođe obuhvata vakcine dobijene od specifičnih sojeva sakupljenih i identifikovanih kao Canine Influenza Strain A/canine/Iowa/l 3628/2005 i Strain A/canine/Iowa/9Al/B5/08/D12. Najnoviji soj, Strain A/canine/Iowa/9Al/B5/08/D12 je deponovan kao UC 25508, 29-og juna 2006. u American Tvpe Culture Collection, 10801 University Boulevard. Manassas, VA 20110-2209, ATCC pristupni broj je PTA-7694. Virus je dalje klasifikovan kao H3N8.

[0065]Kao prilog gornjim sojevima pridodajemo sojeve dobijene na sledeći način. Identifiku-je se pas ili grupa pasa koji pokazuju kliničke simptome respiratornih oboljenja, uzmu se uzorci oralnih ili nazalnih izlučevina ili uzorci dobijeni iz respiratornog tkiva ili tkiva unutrašnjih organa iz pasa, ispitaju se uzorci i identifikuje prisustvo H3N8 influenca virusa. Primenom metoda koje su ovde opisane, izoluju se, prečiste, uzgoje, izrastu, proizvedu, koncentruju ovi virusni antigeni i identifikuju ka Pfizer canine influenca virus. Adaptiraju se i prenesu ili u oplođeno jaje ili ćelije canine, identifikuju kao Master Seed, canine influenca H3N8 virus. Poželjniji je iz canina dobijeni H3N8 influenca virus. Equine ili svinjskog porekla H3N8 se može koristiti kao i influenca virus podtipa H3 ili N8. Prilažemo soj dobijen na sledeći način. Inficira se pas ili grupa pasa sa equine influenca H3N8. Od pasa koji pokazuju kliničke ili subkliničke simptome respiratornih bolesti, uzmu se uzorci oralnih ili nazalnih izlučevina, ili uzorci poreklom od respiratornog tkiva ili pluća ili unutrašnjih organa iz pasda, isprobati uzorke i identifikovati prisustvo H3N8 influenca virusa. Koristeći postupke koji su ovde opisani, izolovati, prečistiti, odgajiti, izrast, proizvesti, koncentrovati ovaj virusni antigen i identifikovati kao canine influenca virus. Prilagoditi i preseliti ili u oplođeno jaje ili canine ćelije ili oba, identifikovati Master Seed, canine influenca H3N8 virus. Poželjniji je iz canine dobijeni H3N8 influenca virus. Equine ili iz svinje dobijeni H3N8 može se takođe koristiti kao i influenca virus podtipa H3 ili N8. Iz svinje dobijeni H3N8 virus se tretira na isti način kao i equine ili canine dobijeni virus koji su ovde u potpunosti opisani.

DEO2. DETALJAN OPIS PROIZVODNJE, IZRADE I PRIMENE VAKCINA PROIZVEDENIH OD ANTIGENA IZ PRVOG DELA

[0066] Deo 2. a) Diskusija. Virusni antigeni iz prvog dela, mogu se preinačiti u korisna jedinjenja koja sadrže virusni antigen koji je modifikovan da smanji virulenciju i formulisan u korisnu formulaciju ili formulaciju vakcine. Sledeći opisi prikazuju detalje proizvodnje, izrade, formulacije i primene vakcina korisnih za prevenciju ili lečenje kliničkih znakova udruženih sa infekcijom influenca virusom u pasa ili za prevenciju bolesti u pasa koja je uzrokovana canine ili equine influenca virusom. Canine influenca koju treba lečiti može biti uzrokovana virusom equine influence ili može biti uzrokovan novim modifikovanim virusom canine influence koji je nastao od virusa equine influence. Postupci ovde opisani mogu se iskoristiti kao pomoć u prevenciji širenja canine ili equine virusa influence kod canine bolesti.

[0067] Ovde su opisani materijali i metode za lečenje i imunizaciju životinja, posebno pasa. vakcinom protiv virusa equine ili canine influence. Metod uključuje primenu terapeutski efikasne doze prve, druge ili treće vakcine u pasa koja je dovoljna da indukuje imuni odgovor posebno u pasa, a protiv H3N8 virusa influence. Vakcina iz ovog pronalaska je uopšteno namenjenaza profilaktički postupak kojim se psi imunizuju protiv oboljenja uzrokovanog virulentnim sojevima equine ili canine virusa influence.

[0068] Ovde opisujemo vakcinu koja obezbeđuje aktivni ili/i pasivni imunitet. Očekuje se da će, bilo cela vakcina bilo specifični imunogeni fragmenti njenih proteina, biti delotvorni kada se primenjuju u terapeutskom postupku protiv equine ili canine virusa influence. Imunitet na koji se ovaj pronalazak odnosi može biti bilo aktivni bilo pasivni, sa namerom da vakcina deluje bilo profilaktički bilo terapeutski. U jednom od aspekata ovog pronalaska, vakcina se odnosi na vakcinu za imunizaciju pasa protiv bilo kojeg oblika virusa canine ili equine influence.

[0069] Deo 2 b) Proizvodnja vakcine i koncentrisanje antigena. Vakcina opisana u ovom odeljku može biti proizvedena uzgojem izabranog virusa u ćelijama. Za prozvodnju virusa prednost se daje equine ili canine ćelijskim kulturama sisara. Prednost se daje i uzgoju i proizvodnji virusa (antigena) u jajima. Prednost sc daje i podlogama sa ćelijama psećeg bubrega. Propagacija virusa može biti u potpunosti sprovedena i na bilo kojem korisnom medijumu ili ćelijskoj podlozi koja se može dobiti izćelijskih linija ptica i sisara koje su dobijene iz ćelijskih linija mačaka, konja, goveda ili svinja. Vakcine uobičajeno sadrže između IO<3>i IO<9>TCID50nivoa virusa pre inaktivacije. Antigen koji se nalazi u virusnom preparatu, alternativno, može biti analiziran testom inhibicije hemaglutinacije (Hl), pojedinačnom radijalnom difuzijom ili testom hemaglutinacije i primenom ovog testa jedan bi prednost davao vakcinama s titrom između 10 i 10000 HA jedinica/ml, češće između 100 i 2000 HA jedinica/ml i neretko između 100 i 1000 HA jedinica/ml kao količinu primenjenu u jednoj dozi.

[0070] Uzgoj virusa: ćelijske linije i oplođena jaja.Za propagaciju virusa gripa prednost se daje ćelijskim linijama psećeg bubrega (DK). Ostale ćelijske linije koje mogu biti korišćene, uključuju osnovne i umrtvljenje ćelijske linije konjskog bubrega (EK), konjske kože (ED), testisa svinje (ST), svinjskog bubrega(PK). goveđeg bubrega (BK), mačjeg bubrega (FK), vero-ćelije i primarne i umrtvljene fibroblaste pilećeg embriona (CEF). Sistem ćelijskih kultura kojem se daje prednost za rast virusa gripa je tradicionalna adherentna jednoslojna kultura. Alternativno, suspenzije i mikronosač sistemi ćelijskih kultura mogu biti takođe korišćeni. Mikronosači kojima se daje prednost su kuglice Cytodex 3 mikronosač. (Amersham Biosciences Ltd.). Ostali primeri mikronosača uključuju kuglice sastavljene od stakla, silikona i dekstrana, DEAE, kolagcna, dckstrana ili želatina.

[0071]Valjkasta boca je sud kojem se daje prednost za rast ćelijskih linija i propagaciju virusa gripa i površina valjkaste boce kojoj se daje prednost je 1760 cm", ali ona može biti u opsegu od 490-4250cm<2.>Alternativno, ostali korisni formati ćelijskih kultura uključuju opletene boce (pljoske) (150cm<2->420cm<2>), kupaste oblike (21000cm<2->340000cm<2>) i pokretne cisterne (1.0L-900L). Umnožak infekcije kojem se daje prednost (MOI) je 0.001-0.1 ali može biti u opsegu od 0.0001-2.0. Prikupljanje virusa iz ćelijskih kultura se vrši 2 do 5 dana nakon infekcije, ali može da se vrši u periodu i od prvog do sedmog dana nakon infekcije.

[0072]Propagacija virusa, takođe, može biti potpuno izvedena inokulacijom oplođenih jaja. Za rast virusa uobičajeno se koriste oplođena jaja starosti 0-12 dana. Za rast virusa prednost se daje oplođenim jajima starosti 7-8 dana. Virus se inokulira u amnionsku šupljinu jajeta. Virus se umnožava u ćelijama amnionskc membrane i velike količine se nazad vraćaju u amnionsku šupljinu. 2-3 dana nakon inokulacije virus može da se prikupi iz amnionske tečnosti.

[0073] Medijumi ćelijskih kultura. Formulacije medijuma ćelijskih kultura, kojima se daje prednost za propagaciju virusa, uključuju, ali nisu ograničene samo na sledeće: Dulbeccov modifikovan orlovski medij um (DMEM), bazalno modifikovani orlovski medijumi, medijumi Optimem i Leibowitz-15 (L-15). Po pravilu medijum ćelijskih kultura jc dopunjen sa 0.1 do 10 jedinica tripsina. U ćelijskim kulturama za efikasnu propagaciju virusa, alternativno, mogu biti korišćeni i ekvivalenti tripsina dobijeni iz biljaka (npr. Accutase) u opsegu od 2-100 jedinica. Medijumi ćelijskih kultura mogu se koristiti u prisustvu ili odstustvu komponenti životinjskog porekla. Serum ozračen gama zracima konačne koncentracije u opsegu 0.5-10% je primer dodavanja komponente životinjskog porekla.

[0074] deo 2 c) Priprema, mrtve ili inaktivirane, podjedinice ili umrtvljene, žive-modifikovane vakcine.

[0075] Inaktivirana ili mrtva. U jednoj od aspekata ovog pronalaska vakcina se sastoji od inaktiviranih ili mrtvih virusa influenca H3N8 uključujući filtrat equine ili canine H3N8 izabranih od bilo kojeg konjskog ili psećeg infektivnog filtrata virusa influence. PogledatiEquine Influenca to đogs(P.C. Cravvford et al., Science 310,482-485 (2005). Vakcina se može sastojati od influenca H3N8 dobijenog iz svinja ili bilo kojeg influenca podtipa H3 ili N8. Inaktivisana vakcina se pravi metodama koje su iskustveno dobro poznate. Na primer, kada propagacija virusa jednom dostigne visoki titar. stručnjacima bi odmah trebalo da bude očigledno da masa virusnog antigena može biti dobijena metodama dobropoznatim u nauci. Na primer, masa virusnog antigena može se dobiti razblaživanjem, koncentracijom i ekstrakcijom. Svaka od ovih metoda je ukl jučena u dobijanje odgovarajuće mase virusnog antigena za proizvodnju vakcina. Virus može biti inaktiviran primenom formalina (e.g. 0.1-10%). betapropiolatona (BPL) (e.g. 0.01-10%) ili binarnim etilendiaminom (BEI)

(e.g.l-lOmM) kojem se ovde daje prednost ili primenom drugih metoda poznatih stručnjacima. Predloženi su najčešće korišćeni uslovi i agensi, ali i drugi agensi i koncentracije koje stručnjacima mogu biti očigledni.

[0076] Pored proizvodnje mrtvih virusa gore opisanih, mogući su različiti načini umrtvljavanja koji su dobro poznati, u nauci opisani i ovde primenljivi. Moguća je i umrtvljavanje koje dovodi do modifikacije žive vakcine. Neke od ovih tehnika su ovde ili ispod opisane. Oblici umrtvljavanja kojima se daje prednost su kontinuirana pasaža kroz ćelijske kulture, kontinuirana pasaža kroz životinje, različiti metodi stvaranja genetskih modifikacija i ultravioletna ili hcmijska mutageneza.

[0077] Podjedinična vakcina. Equine ili canine podjedinične vakcine protiv influence mogu biti proizvedene tehnikom rekombinantne ekspresije koja uključuje, ali nije ograničena samo na, heterologu prokariotsku ekspresiju (npr. E.coli, Pseudomonas, Salmonella itd.) i heterologu eukariotsku ekspresiju (npr. Kvasci [Pichia, Yarrovia], ćelije insekata [Baculovirus], i virusni vektori (npr. Pseći adenovirus, humani adenovirus, virus boginja i pseći herpes virus).

[0079] Umrtvljena i modifikovana živa. Atenuirana vakcina od canine virusa je pripremljena od virusa influence iz ćelijskih linija ili jajeta, a prednost se daje virusu influenca H3N8, koji je umrtvljen serijskim pasažama uključujući serijsku pasažu na sub-optimalnim temperaturama do stanja kada oni više ne mogu da uzrokuju bolest, ali još uvek imaju sposobnost da izazovu zaštitni imuni odgovor.

[0079] Umrtvljavanje virusa influence može biti postignuto serijskim pasažama sojeva divljeg tipa virusa influence u ćelijskim kulturama. Pasaža virusnih sojeva se može vršiti u različitim ćelijskim sistema sve dok ne izgube mogućnost da izazovu bolest, ali da su zadržali imunogene karakteristike. Jednom inokuliran u domaćina, virus može imati mogućnost umnožavanja do određenog nivoa. Odgovarajući umrtvljeni virusni sojevi se mogu dobiti i serijskim pasažama da bi dobili visoko umrtvljeni soj. Visoka umrtvljenost podrazumeva daje broj pasaža za umrtvljavanje u suštini veći nego što je uobičajeno potrebno za odstranjivanje patogenosti. Umrtvljeni virus zadržava antigenost nakon brojnih pasaža, tj. istovremeno zadržava i antigene hemaglutinina i neuraminidaze, tako da imunogena sposobnost nije oslabljena. Ovi sojevi ne produkuju pratično nikakve simptome ili sporedne efekte prilikom primene, tako da su vakcine bezbedne i efikasne.

[0080] Umrtvljavanje virusa influenca može biti postignuto adaptacijom sojeva virusa influenca na hladno. Filtrati virusa influenca koji su adaptirani na hladnoću mogu se dobiti metodama koje uključuju pasažu virusa gripa divljeg tipa i koju prati odabir virusa koji rastu na nižoj temperaturi. Virusi gripa koji su adaptirani na hladnoću mogu biti proizvedeni, na primer, pravilnom pasažom divljeg tipa virusa gripa kroz oplođena kokošja jaja na progresivno niskim temperaturama, tako izabranih od izvesnih članova virusne mešavine koja se stabilno replikuje na nižim temperaturama. Soj virusa influence adaptiran na hladnoću može eksponirati fenotip koji je osetljiv na temperaturu. Virus influence adaptiran na hladnoću koji je osetljiv na temperaturu, replikuje se na nižim temperaturama, ali se više ne replikuje niti obrazuje plakove na ćelijama kultura tkiva na nekim višim temperaturama u kojem će se divlji tip virusa replikovati i obrazovati plakove. Pod "permisivnom temperaturom" za viruse osetljive na temperaturu ovde podrazumevamo temperaturu na kojoj će temperaturno zavisni virusi rasti, a pod "nonpermisivnom" temperaturom za osetljivi virus podrazumevamo višu temperaturu na kojoj virus osetljiv na temperaturu neće rasti, ali na kojoj će rasti odgovarajući divlji tip virusa. Npr. neki virusi influence adaptirani na hladnoću i osetljivi na temperaturu replikuju se u oplođenim kokošjim jajima na temperaturi od 30° C ili nižoj, i obrazovaće plakove na ćelijskim kulturama tkiva na permisivnoj temperaturi od oko 34° C, ali neće obrazovati plakove na ćelijama kulturi tkiva, na nepermisivnim temperataturama od oko 37° C. Neki virusi influence adaptirani na hladnoću mogu imati dominantni interferentni fenotip. Zapravo, oni su dominantni pri istovremenoj infekciji ćelije sa drugim tipom virusa gripa i usporavaju rast drugih virusa. Virusi adaptirani na hladnoću mogu biti proizvedeni rekombinantnim metodama. U ovom pristupu, jedna ili više specifičnih mutacija, udružena sa identifikovanom adaptacijom na hladnoću, umrtvljavanjem. osetljivošću na temperaturu ili dominantni interferentni fenotipi su identifikovani i umetnuti su nazad u filtrat divljeg tipa virusa influence primenom povratnog genetskog pristupa. Povratni genetski pristup uključuje RNA polimeraza komplekse izolovane iz influenca virus - inficiranih ćelija da transkribuju veštački influenca virus segmente genoma koji sadrže mutacije, inkorporirajući RNA segment(e) u delove virusa upotrebom pomoćnog virusa, i zatim odabirom virusa koji sadrže željene promene.

[0081] Deo 2 d) Pomoćna sredstva za vakcine, formulacije, oblike i nosače. Komponente vakcina koje su ovde predstavljene obično sadrže jedno ili više pomoćnih sredstava. Pomoćna sredstva uključuju, ali nisu ograničavajuća, RIBI pomoćni sistem (Ribi Inc.) aluminijum soli, uključujući stipsu (0.5 -20%, najpogodnije je manje od 10%, a još bolje 2 i 5%), aluminijum fosfat (0.5 - 20%, najpogodnije je manje od 10%, a još bolje 2 i 5%), aluminijum hidroksid (Alvhidrogel ili Rehzdragel u razmeri od 0.5 do 20%, najpogodnije je manje od 10% a još bolje 2 do 5%), holesterol, vodeno-uljne emulzije kao što su npr. Freund komplentna ili nekompletna pomoćna sredstva, Block ko-polimer (CytRx, Atlanta GA), SAF-M (Chiron, Emervville CA), AMPH1GEN ® pomoćno sredstvo, saponini kao što su Quil A, QS-21 (Cambrige Biotech Inc. Cambrige MA=, GPI-0100 (Galenica Pharmaceuticals, Inc.. Birmingham, AL) sa sadržajem saponina od 10-100 mikrograma kao najpogodnijim i sa oko 50 mikrograma saponina koji je poželjan i drugim saponinskim frakcijama, monohidrofilnim lipidom A, Avridin lipid - amin pomoćnim sredstvom, termo-labilnim enterotoksin formom E.coli (rekombinantnom ili drugačijom), kolera toksinom, ili muramil dipcptidom, između ostalih. Imunogene formulacije mogu dalje da sadrže jedan ili više iminomodularnih agenasa kao što su interleukini, interferoni, ili drugi citokini. Imunogene formulacije mogu takođe da sadrže gentamicin i Marthiolat.

[0082] Komponente vakcine mogu biti farmaceutski prihvatljivi ekscipijenti, uključujući nosače, rastvarače i razblaživače, izotonirajuće agense, puferske agense, stabilizatore, konzervanse, imunomodulirajuće agense (npr. interkleukine, interferone i druge citokine), vazo-kontraktilne agense, antibakterijske agense, antigljivične agense, i tome slično. Tipični nosači, rastvarači i razblaživači uključuju vodu, natrijum hloridni rastvor, dekstrozu, etanol. glicerol i tome slično. Reprezentativni izotonirajući agensi uključuju natrijum hlorid, dekstrozu, manitol, sorbitol, laktozu i tome slično. Korisni stabilizatori su želatin, albumin i tome slično.

[0083] H3N8 influenca virus vakcine se dobijaju u različitim oblicima, u zavisnosti od načina davanja, zahteva čuvanja i tome slično. Tako na primer vakcine se mogu pripremiti u obliku vodenog rastvora ili disperziji koja je pogodna za davanje putem igle, u kapima, sprejevima itd. Ili se mogu dobiti kao liofilizovani prahovi, koji se obnavljaju u slanoj vodi HEPES puferu ili kao vodena, imunogena frakcija druge canine vakcine i tome slično, pre upotrebe.

[0084] Formulacije za bilo koji od aspekata ovog pronalaska je uobličen u bilo kojem farmaceutski prihvatljivom nosaču u zavisnosti od načina davanja., ljudi iz struke mogu lako formulisati vakcinu koja sadrži živi ili ubijeni equine ili canine influenca ili njihov imunogeni fragme, rekombinantni virus ili bakterijski vektor koji prepoznaje equine ili canine influenca, njihov specifični imunogeni fragment ili DNK molekul koji prepoznaje equine ili canine influenca ili njihov specifični imunogeni fragment.

[0085]U slučajevima kada je intramuskulamo davanje poželjno, izotonična formulacija ima prednost. Uopšteno, aditivi za izotoniziranje mogu da uključuju natrijum hlorid, dekstrozu, manitol, sorbitol i laktoza. U posebnim slučajevima, izotonični rastvori kao što je rastvor natrijum hlorida sa fosfatnim puferom. Formulacije mogu dalje da sadrže stabilizatore kao što su želatin i albumin. U pojedinim oblicima, vazo-konstriktivne agensi su dodati formulacijama. Farmaceutski oblici prema ovom pronalasku su sterilne i ne-zapaljive. Dobro je poznato ljudima iz struke da su najpoželjnije formulacije sa farmaceutski prihvatljivim nosačem koji sadrži vakcine iz ovog pronalaska oni farmaceutski nosači potvrđeni od strane pravilnika promovisanog od strane Američkog ministarstva za poljoprivredu, ili ekvivalentne vladine agencije u drugim zemljama kao što je Kanada ili Meksiko ili bilo koje Evropske zemlje za bilo koju canine vakcinu, polipeptid (antigen) podjedinične vakcine, rekombinantne virus vektor vakcine, i DNK vakcine. Tako da farmaceutski prihvatljiv nosač za komercijalnu proizvodnju vakcine iz ovog pronalaska je nosač koji je već potvrđen ili će biti potvrđen od strane vladine agencije u Sjedinjenim Američkim Državama ili drugim zemljama. Vakcine se dalje mogu mešati sa pomoćnim sredstvima koja su farmaceutski prihvatljiva. U određenim formulacijama vakcine iz ovog pronalaska, vakcina se kombinuje sa drugim canine vakcinama kako bi se dobila polivalentna vakcina, proizvod koji može da zaštiti canine protiv različitih bolesti uzrokovanih drugim canine patogenima.

[0086] Oblici vakcina mogu opcionalno da sadrže vakcinama kompatibilne farmaceutski prihvatljive (npr. sterilne i ne - toksične) tečnosti, polučvrste ili čvrste razblaživače koji služe kao farmaceutska veziva, eksipijenti ili medijumi. Razblaživači mogu biti voda, natrijum hloridni rastvor, dekstroza, etanol, glicerol i tome slično. Izotonirajući agensi mogu da budu natrijum hlorid , dekstroza, manitol, sorbitol i laktoza između ostalih. Stabilizatori uključuju albumin, između ostalog. Bilo koje pomoćno sredstvo koje je poznato u struci može se koristiti u formulisanju vakcine, uključujući metabolizujuća i ne-metabolizujuća pomoćna sredstva, pomoćna sredstva zasnovana na uljima kao što je Freund Complete Adjuvant i Freund Incomplete Adjuvant, mikolat-zasnovana pomoćna sredstva (npr. trehaloza dimikolat), bakterijski lipopolisaharid (LPS), peptidoglikani (npr. mureini, mukopeptidi ili glikoprotcini kao N-Opaca, muramil dipeptid [MDP], ili MDP analzi), proteoglikani (npr. ekstrahovani iz Klesiella pneumonie), preparati streptokoke (npr. OK432), Biostim ™ (npr., 01K2). "Iscoms" iz EP 109 942, EP 180 564 i EP 231 039, aluminijum hidroksid, saponin, DEAE-dekstran, neutralna ulja (kao migliol), biljna ulja (kao ulje od kikirikija), lipozomi i Pluronic® polioli.

[0087]imunogena jedinjenja iz ovog pronalaska mogu se napraviti u različitim oblicima u zavisnosti od načina davanja. Na primer, imunogena jedinjenja mogu se napraviti u obliku sterilnog vodenog rastvora ili disperzije pogodne za injektiranje ili da se naprave u liofilizujućem obliku upotrebom sušenja-zamrzavanjem. Liofilizujuća imunogena jedinjenja se obično čuvaju na 4°C, i mogu se obnoviti u stabilizujućem rastvoru, npr. rastvoru natrijum hlorida i/ili HEPES, sa ili bez dodataka.

[0088]Uz to, imunogena i jedinjenja za vakcine iz ovog pronalaska mogu da sadrže jedan ili više farmaceutski-prihvatljivih nosača. Kao što se ovde koristi "farmaceutski prihvatljivi nosač" uključuju bilo koji i sve rastvarače, medij um za dispergovanje, oblaganje, pomoćno sredstvo, stabilizujući agens, razblaživač. Konzervans, antibakterijski i antigljivični agens, izotonirajući agens, agens za usporavanje adsorpcije i tome slično. Nosač(i) mora biti

"prihvatljiv" u smislu da je kompatibilan sa jedinjenjima iz pronalaska i da nije štetan za subjekt kojem se daje. Obično, nosač je sterilan i nezapaljiv.

[0089] Deo2 e)Doziranje vakcina i probe.Veličine doza H3N8 influenca virusa vakcina obično su u zapreminama od oko 2.0 do 0.1 ml u zavisnosti načina davanja. Inaktivirane vakcine obično sadrže između 10<J>i IO<9>TCIDjo-nivoa virusa pre inaktivacije. Alternativno sadržaj antigena u virusnim preparatima trebao bi da bude u titru vakcine između 10 do 10 000 HA jedinica/ml, može da ima 100 do 2000 HA jedinica/ml, i najpogodnije između 100-1000 HA jedinica/ml kao količina koja se daje u pojedinačnoj dozi. Za vakcine koje koje sadrže modifikovane žive viruse ili umrtvljene viruse, terapeutski efikasne doze će da variraju od oko 103 TCIDsodo oko 10<x>TCID50 Za vakcine koje sadrže podjedinične antigene, kao stoje influenca H3 ili N8 proteini, terapeutski efikasna doza obično varira od oko 10 ug do oko 100 u.g. Dok se količine i koncentracije pomoćnog sredstva i aditiva korisnih u kontekstu ovog pronalaska Iako mogu odrediti od strane stručnjaka, u ovom pronalasku obuhvatajući farmaceutske oblike koji sadrže od oko 50 fig do oko 2000 (.ig pomoćnog sredstva a najpogodnije oko 500 ug/2 ml doze vakcine.

[0090] Probe.Influenca virus može se detektovati izolovanjem viralnog antigena, viralne RNA ili specifičnog metoda za detekciju antitela. Metode koje se koriste za detektovanje virusa ili virusnih jedinjenja uključuju imunoflorescenciju plućnog tkiva, nazalnih, epitelialnih ćelija ili bronhoalveolarnog sadržaja ispiranja, imunohistohemiju uzoraka tkiva, enzimski vezane imunosorbentne probe (ELISA), polimeraza lančane reakcije (PCR), ćelijske kulture i imunoperoksidaze, fluorescentno bojenje antitela za identifikaciju virusnog tipa i podtipa i brzi enzimske-imuno probe membranski testovi. Tkiva koja obično služe za ispitivanje influenca virusa uključuju pluća, sekret iz pluća, krajnike, grkljan, slezinu kao i serum. Monoklonalna antitela koja specifično ciljaju različite virusne epitope su takođe dostupna, kao hemaglutinin (HA) i neuraminidaza (NA) epitopi. Uobičajeni serološki test za dijagnostikovanje influence je hemaglutinin inhibicija (HI) proba. Jedna od njegovih prednosti je to da može da razlikuje izmedju različitih podtipova i antigenskih variansi u okviru podtipa. HI proba može se izvesti na equine, canine, svinjskom ili ptičjem serumu. Precizniji metod za merenje antitela je jedinična radijalna hemoliza (SRH) tehnika. SRH je osetljivija od HI proba i ima veći stepen preciznosti. 50% povećanje u zonalnoj oblasti predstavlja porast antitela i dokaz je za nedavnu infekciju.

[0091] Deo 2 f) Tajming i načini davanja. Vakcinisanje pasa se vrši kod pasa koji imaju 6 nedelja i više ili još bolje 8 nedelja i više. Psi bi trebali da prime dve doze, koje se obično daju u razmacima od 3-4 nedelje, najbolje 3 nedelje, preko subkutanih injekcija (SC) u zavisnosti od stanja psa i njegovog okruženja. Ovo sve kako bi se postigao pun, širok imunogeni odgovor. U drugom aspektu ovog pronalaska, pas se podvrgava seriji od 3 vakcine kako bi se postigao pun, široki imuni odgovor. Godišnja revakcinacija sa pojedinačnom dozom se preporučuje. Psima se može davati pojačanje na 3 i 6 meseci ukoliko je potrebno. Najpogodnije je subkutano davanje od oko 1 ml, ali intramuskularno (IM), od oko 1 ml ili intradermalno (ID), korišćenjem 0.1-0.3 ml, oralno, oronazalno ili nazalno davanje uz upotrebu 0.2 do 0.5 ml, se takođe primenjuje. U pojedinim slučajevima, mesto injektiranja, količina i način davanja odrediće osoba iz struke.

[0092] Način davanja bilo kog oblika vakcine iz ovog pronalaska uključuje, ali nije ograničeno samo na, intradermalno, intramuskularno, intraperitonealno, oralno, oronazalno i subkutano kao i inhalacije, supozitorijeili transdermalno davanje. Najčešći načini davanja su intradermalni, intramuskulami, intraperitonealni, oronazalni i subkutane injekcije. Vakcine se mogu davati na bilo koji način što uključuje, ali nije ograničavajuće, špriceve, raspršivače, kanile, igle za injekcije, ili mikroprojektile za bombardovanje gena u obliku pištolja (Bioli tičko bombardovanje).

DEO 3.SPECIFIČNI OPISPROIZVODNJE, IZRADE, FORMULACIJE I

PRIMENE ODABRANIH VAKCINA

[0093]Ovde ćemo pokazati detaljnije opise ubijenih ili inaktiviranih monovalentnih vakcina, za lečenje canine influence.

[0094] Deo3 a)Ubijeni ili inaktivirani Virus monovalentne canine influenca vakcineKoristeći bilo koji od antigena opisanih u Delu 1 prethodno, uključujući omiljeni influenca H3N8 antigen dobijen iz canina ili Equine influence, uključujući inaktivirane i pomoćne kulture H3N8 influenca virusa.

[0095] Ubijen ili inaktiviran virus bi-valentne canine influenca vakcine

[0096]Koristeći bilo koji od antigena opisan u Delu 1 gore, npr. influenca dobijen iz H3N8 antigena canine ili equine influence, inaktivirane i pomoćne kulture H3N8 influenca virusa. Kada je canine antigen dobijen iz canine influenca virusa i equine antigen dobijen iz jednog equine influenca virusa. Canine antigen može takođe da se sastoji od dva canine influenca virusa ili dva equine influenca virusa.

[0097] Ubijeni ili inaktivirani virus tri-valantni canine vakcine

[0098]Koristeći bilo koji od antigena opisanih u Delu 1 prethodno, ali najpoželjnije jedan influenca proizašao H3N8 antigen dobijen od canine ili equine influence, inaktivirane i pomoćne kulture H3N8 influenca virusa. Sledeće trivalentne vakcine su opisane: a) Canine antigen je dobijen od jednog canine influenca virusa ijedan equine antigen je dobijen iz dva equine influenca virusa, b) canine antigen je dobijen iz dva canine influenca virusa i jedan equine antigen je dobijen iz jednog equine influenca virusa, c) canine antigen je dobijen iz tri canine influenca virusa i ili jedan equine antigen je dobijen iz tri equine influenca virusa. Bilo koja kombinacija gornjih je opisana kako bi se dobile tri-valentne vakcine.

[0099] Deo3 b)Ubijene ili inaktivirane vakcine dobijanje i koncentrovanje antigena.

Vakcine opisane u ovom delu mogu se dobiti uzgajanjem odabranih virusa u ćelijama. Proizvodnja virusa je poželjna u equine ili canine ćelijskim kulturama sisara kao i uzgoj virusa (antigena) ili proizvodnja u jajima. Ćelijske linije bubrega pasa su poželjne. Viralni rast može se postići na bilo kojem korisnom medijumu, uključujući dozvoljene ćelijske linije, koje mogu biti iz ćelijskih linija mačaka, equine, goveda, ptičjeg ili svinjskog porekla. Vakcine treba da sardže između IO<3>i IO<8>TCID50nivoa virusa pre inaktivacije. Alternativno virusni preparat može se kontrolisati Hcmaglutinskom Inhibicijom (HI) i hemaglutinskim testom. Korišćenjem ovih testova, najpoželjnije su vakcine od titra između 10 do 10 000 HA jedinica/ml, tipično između 100 i 2000 HA jedinica/ml i često između 100 do 1000 HA jedinica/ml, kao količine za primenu.

[0100J Ubijeni ili inaktivirani virusni uzgoj: ćelijske linije i oplođena jaja Najpogodniji sistem uzgajanja ćelijske kulture influenca virusa je tradicionalni adherentna monoslojna kultura. Alternativno, sistemi suspenzija ili mikronosača ćelijskih kultura mogu se takođe koristiti. Najpogodniji mikronosač je Cytodex 3 mikronoseća zrna (Amercham Biosciences Ltd.). Omiljene posude za uzgoj ćelijskih linija i rast influeca virusa je bočica u obliku epruvete, najbolja većičina bočica je 1760 cm<2>površine ali može da varira od 850-4250 cm2. Omiljeni umnožak infektivnosti (MOI)je 0.001-0.1 ali može da varira od 0.0001-2.0. Najbolja žetva virusa postiže se drugog do petog dana nakon infekcije ali mode da varira od prvog do sedmog dana.

[0101] Medijum ćelijskih kultura: Najpogodniji medijum za uzgajanje ćelijskih kultura kako bi se postiglo uzgajanje virusa influenca uključuje ali nije ograničeno samo na : Dulbecco modified eagle media (DMEM). basal modified eagle media, Optimem and Leibovitz-15 (L-15) media. Obično je medijum za ćelijske kulture snabdeven sa 0.1 do 10 jedinica tripsina.

[0102] Deo 3 c) Ubijeni ili inaktivirani inaktivacija. Nakon proizvodnje virusa virus se može ubiti ili inaktivirati bilo kojom metodom poznatom u struci. Najpogodniji metod bio bi inaktivisanje virusnih tečnosti sa BEI, opisan niže. Takođe je korisno inaktiviviranje virusa koji sadrže tečnosti sa formalinom ili BPL.

[0103] Deo 3 d) Pomoćna sredsta,, formulacije, oblici i nosači za ubijene ili inaktivirane vakcine. Antigeni iz Dela 1 a posebno inaktivirani ili ubijeni virusi mogu biti u raznovrsnim oblicima kako bi se dobile korisne vakcine. Najpogodniji oblik je kombinacije ubijene vakcine i pomoćnog sredstva. Mnoga pomoćna sredstva mogu se koristiti sa vakcinama iz ovog pronalaska, a neka od njih su zabeležena. Količina pomoćnog sredstva tipično sadrži od oko 25 ug do oko 1000 ug, računajući na dozu od 1 ml. Posebno korisna pomoćna sredstva za canine influenca vakcine su sledeća, koja se mogu koristiti u kombinacijama, a sledeće kombinacije su zabeležane: aluminijumove soli, uključujući stipsu (0.5-20%, najpogodnije je manje od 10% a još bolje 2 do 5%>), aluminijum fosfat (0.5-20%, najpogodnije jc manje od 10% a još bolje 2 do 5%), aluminijum hidroksid (Alhidrogen ili rehidragel u razmeri od 0.5-20%, najpogodnije je manje od 10% a još bolje 2 do 5%), AMPH1GEN® pomoćno sredstvo, saponini (najpogodniji su Quil A ili QS-21 ili QS-21 u razmeri od 1-100 ug Cambrige Biotech Inc., Cambrige MA), GPI-0100 (Galenica Pharmaceuticals, Inc., Birmingham, AL) sa najpogodnijom koncentracijom saponina od 10-100 mikrograma i oko 50 mikrograma najpoželjnija, holesterol ili drugi sintetički polimeri, DEAEA dekstran, skvale itd.

[0104]Najpogodnija pomoćna sredstva i kombinacije su : 2,3,4 ili 5% stipse, bilo koja kombinacija stipse sa QuilA, holesterola, koja se koristi kao pomoćno sredstvo u komercijalnim vakcinama i formulacijama. Posebno su pogodni 2-5%, čiste stipse, Quil A čist i Quil A i holesterol poznatiji kao "QAC". QAC može se koristiti sam ili u kombinaciji sa dodatnim QuilA i holesterolom. Druga pomoćna sredstva takođe se mogu koristiti. Druge komponente vakcine mogu biti podešene tako da modifikuju fizičke i hemijske osobine vakcine. N aprimer pomoćna sredstva obično sadrže oko 25 u.g do oko 1000 p.g, računajući na 1 ml dozu. Slično , vakcine koje su ovde opisane mogu se kombinovati sa antibioticima, koji mogu da sadrže od oko 1 ug do oko 60 u.g računajući na 1 ml dozu. Drugi sastojci su takođe mogući.

[0105] Deo3 e)Ubijene i inaktivirane vakcine doziranjei probe. Veličina doza H3N8 influenca virus vakcina obično variraju od oko 2.0 do 0.1 ml, u zavisnosti od načina primene. Za vakcine koje sadrže modifikovane žive viruse ili umrtvljene viruse, terapeutski efikasna doza obično varira od oko 10<5>TCID50do oko 10<8>TCID50sadržaja. Za vakcine koje sadrže podjedinične antigene, kao sto je influenca H3 ili N8 proteini, terapeutski efikasna doza obično varira od oko 10 u,g do oko 100 u.g sadržaja. Za vakcine koje sadrže inaktivirani influenca virus, vakcine bi trebalo da sadrže između 10<3>i IO<9>TCID5o, nivoa virusa pre inaktiviranja. Vakcine bi trebalo da sadrže između 100-1000 HA jedinica/ml u pojedinačnim dozama za davanje. Najpogodnije je da to bude 640 HA po dozi.

[0106] Deo 3 f) Ubijene i inaktivirane, vreme i načini davanja. Videti Deo 2 f za vremenski raspored davanja vakcina. Najpogodniji način davanja su subkutane injekcije, SC, korišćenjem oko 1 ml, intramuskularno , IM, oko 1 ml ili intradermalno korišćenjem 1.0-0.2 ml i oronazalno i nazalno korišćenjem 0.2 do 0.5 ml što se takođe primenjuje.

DEO 4. KOMBINACIJE VAKCINA

[0107] Antigeni i vakcine iz ovog pronalaska mogu se kombinovati sa drugim proizvodima ili vakcinama. N aprimer, mogu se kombinovati ili u tečnoj ili u osušenoj frakciji sa Phizer-ovom Canine Vanguard® linijim, koja sadrži mnoge proizvode, i ili sa Phizer-ovom Vanguard Plus® linijom koja takođe sadrži mnoge proizvode, uključujući Vanguard Plus CCV/L4® i druge kombinacije kako bi se obezbedila potpuna zaštita od glavnih bolesti mladunaca. Equine ili canine influenca virus antigen mogu se kombinovati u različitim varijantama sa sledećim canine antigenima; canine parainfluenca (CPIV), canine uznemirujući virus (CDV), canine parvovirus (CPV), canine adenovirus -1 (CAV-1), canine adenovirus -2 (CAV-2), Leptospira canicola, Leptospira grippotvphosa, Leptospira icterohaemorrhagiae, Leptospira pomona, Leptospira bratislava, canine respiratorni coronavirus (CRCV), unutrašnji canine coronavirus (CCV), goveđi coronavirus (BCV) i Bordetella bronchiseptica antigen.

[0108] Uz to, equinc ili canine influenca virus antigeni i vakcine iz ovog pronalaska mogu se kombinovati sa Bordatella bronhiseptica (p68 ili Bronhicine® ili Canvac CCi® i/ili canine parainfluenca (CPIV) i/ili canine respiratorni coronavirus (CRCV) i/ili goveđi coronavirus (BCV) vakcinama kako bi se dobile preventivne vakcine za zaštitu od uobičajenih agenasa štenećeg kašlja. Inicijalne doze kombinovanih vakcina bile bi po 2 ml u razmacima od 3 nedelje, ijedno pojačanje od 1 ml može se dati pre uzastopnih davanja.

DEO 5. SPECIFIČNI PRIMERI VAKCINA

[0109] Sledeće vakcine se mogu obezbediti

Primeri 1-3 Uzgojene u ćelijama sisara

Dobijene iz ćelija Pfizer Equine H3N8 (A/Equine/2/Miami/l/1963 u a)2 do 5% stipse ili

b)u QAC

Primeri 4-6 Uzgojene u ćelijama sisara

Dobijene iz ćelija Pfizer klinički izdvojen canine H3N8 A/Canine/Iowa/9Al/B5/D8/D12 u

a) 2 do 5% stipse ili b) u OAC.

Primeri 7-9 Uzgojene u ptičjim jajima

Dobijene iz jaja Pfizer Equine H3N8 u a) 2 do 5% stipse ili b) u QAC

Primeri 10-11 Uzgojene iz ptičjih jaja

Dobijene iz jaja Pfizer klinički izolovane canine H3N8 u a) 2 do 5% stipse ili b)QAC

DEO6. SPECIFIČNI PRIMERI POSTUPAKA ZA TESTIRANJE VAKCINA

[0110] Vakcine iz ovog pronalaska mogu se evaluirati i potvrditi na sledeći način.

[0111] U svrhu istraživanja, psi od šest nedelja starosti ili stariji se podvrgavaju vakcinama koje su ovde opisane. Psi su podeljeni u grupe prema vakcinama koje se se sastoje od 5 do 20 pasa po grupi. Vakcine se daju u dozama od po 1 ml ili dve od po 0.5 ml u razmacima od po 3 nedelje, subkutano ili intramuslularno. Kontrolnim psima se daje placebo vakcina. Uzorci seruma se sakupljalju iz svakog psa prvog dana prve i druge vakcinacije i zatim nedeljno posle druge vakcinacije kao i posle davanja. Serum iz vakcinisanih pasa se testira na serokonverziju u virusni antigen putem HI (hemoglutinin inhibicijom) ili SRH (jediničnom radijalnom hemolizom . Psima se daje H3N8 virus putem aerosola ili u kapima intranazalno ili oralno (što uključuje i intratrahealni način davanja) na dan 14 ili dan 28 nakon druge vakcinacije. Psi se posmatraju nakon inficiranja na kliničke simptome bolesti praćenjem kliničkih simptoma kao što su respiratorni simptomi, groznica, anoreksija, letargija. Nazalni sekret se sakuplja grebanjem vakcinisanih pasa i ne-vakcinisanih kontrolnih grupa svakog drugog dana nakon inficiranja u trajanju od 10-14 dana kako bi se pratila količina infektivnog virusa. Prisustvo virusa se potvrđuje preko ćelijskog tkiva (najpogodnije je psećeg bubrega). Uzorci tkiva uključujući traheje, krajnike, pluća se sakupljaju iz psećeg subjekta nakon inficiranja. Prisustvo virusa u uzorcima psećeg tkiva se potvrđuje kao stoje opisano prethodno ili imunohistohemijskim analizama. Upoređivanjem opadanja infektivnog virusa i virusa u uzorcima tkiva, psi vakcinisani sa efikasnom vakcinom imaće manji sadržaj virusa u poređenju sa ne vakcinisanim kontrolnim psima. Efikana vakcina će rezultovati u manjem sadržaju virusa ili u manjoj količini virusa u vakcinisanih životinja i vakcinisane životinje će pokazivati smanjenje u kliničkim simptomima vezanim za infekciju influencom u poređenju sa ne-vakcinisanom kontrolnom grupom.

[0112] Specifični primeri

[0113] Infektivnost i studija efikasnosti canine influenca vakcina u pasa Psi. Razvoj equine influenca vakcine, ubujeni virus kako bi se dobila unakrsna zaštita u canina protiv infuenca virusa.

[0114]Kako bi se razvila serozaštita od equine influenca virusa; A/Equine/2/Miami/l/63 i A/Equine/Ohio/1/2003 vakcine koje sadrže viruse, 7-10 nedelja stari psi su podeljeni u jednu do devet grupa za testiranje (Tabela 2). Psi su vakcinisani sa 1.0 ml dozom, subkutano na Dan proučavanja 0 i 21. Krv iz seruma je sakupljena iz svih pasa uključenih u studiju na Dan pručavanja 0 (prva vakcinacija). 21 (druga vakcinacija) i 35 (14 dana posle druge vakcinacije). Svi uzorci seruma su isprobani na HAI na Miami63, Ohio03 i C1V. Podaci za serološke odgovore dati su u Tabeli 3. Statistički značajne razlike u serološkim titrima u poređenju sa ne-vakcinisanim životinjama prikazane su na Dan proučavanja 35 u slcdećim IVP grupama: T02, T03, T04.T06, T07, T08 i T09 (Tabela 3). Dodatno, statistički važne razlike su ustanovljene na Dan proučavanja 21 za sledeće IVP grupe: T06, T07, T08 i T09 (tabela 3).

[0115]Preliminarna zaštita

|0116]Pored merenja serološkog odgovora, preliminarna sigurnost vakcina je evaluirana u ovoj studiji. Sve u svemu, nisu primećene nikakve klinički značajne reakcije na vakcine u bilo kojoj od IVP proučavanih grupa. Nikakve za vakcine vezane sistemske reakcije nisu primećene u toku trajanja studije. Dodatno nije primećeno ni pravljenje otoka na mestima gde je davana injekcija u bilo kojoj od tretiranih grupa. Na Dan 21 (pre davanja druge vakcine, mali otoci primećeni su nakon palpacije mesta za davanje injekcije, kod 34 životinje iz pet tretiranih grupa. Od ovih grupa, četiri (T02,T03,T06 i T07) su kao pomoćno sredstvo imale 2% stipse, dok peta tretirana grupa (T09) je kao pomoćno sredstvo imala Quil-A/Cholesterol/Plus. Geometrijska sredina zapremine ovih otoka na Dan 21 je bila veličine od 0.07 do 0.24 cm<J>unakrsnim merenjem.

[0117]Nakon druge vakcinacije, Dan proučavanja 22-24, primećeni su otoci na mestima vakcinacije kod 57 od 87 životinja. Otoci su se pojavili 24 sata nakon vakcinacije (dan 22) i smanjivali su se do nestanka doDan pručavanja 24. Nijedno mesto vakcinacije nije bilo bolno ili toplo na dodir, i nije bilo znakova groznice.

[0118]Evaluacija equine influenca vakcine, ubijenog virusa kako bi se obezbedila unakrsna zaštita kod canina protiv influenca virusa nakon inficiranja [0119|Šest od devet tretiranih grupa isprobano je sa CIV: T01,T02,T03,T06,T07 i T09. Dan proučavanja 0, dan inficiranja, životinja 6 nedelja nakon druge vakcinacije sa HA od približno 1:8 u 50 ml predstavlja približno 6.9 logs po ml CIV. Psi su inficirani intratrahealno po modelu sličnom svinjskom influenca virus respiratornom modelu bolesti. Klinički simptomi vezani za respiratorna oboljenja su posmatrani dnevno na svim životinjama: nazalno pražnjenje, okularno pražnjenje, šmrkanje, gađenje, anoreksija. depresija ili kašljanje. Dodatno, timpane temperature i nazalni/faringalni tamponi za sakupljanje virusa su sakupljani dnevno.

[0120]Klinička ispitivanja su praćena i zapisivana dnevno sve dok oko 50% inficiranih životinja nije pokazalo kliničke simptome respiratornih bolesti. Pet dana nakon inficiranja, 31 od 59 inficiranih životinja pokazalo je jedan ili više sledećih simptoma: nazalno pražnjenje, okularno pražnjenje i/ili kašljanje. Zatim su Dana proučavanja 5, sve životinje ubijene i formiranje nekropsis. Očvrsli ostaci iz pluća su zabeleženi i uzeti su uzorci za izolovanje virusa.

[0121]Procenat konsolidovanih ostataka iz pluća pokazao je daje postignut zadovoljavajući stepen respiratornih bolesti u toku ove probe. U procentima kod svih životinjama konsolidacija je bila 60% u 9 životinja, do devet životinja sa 10 do 35% konsolidacije, 26 životinja koje pokazuju < 10% konsolidacije i 16 životinja koje ne pokazuju konsolidaciju (slika 2). Broj životinja sa konsolidacijom pluća u ispitivanim grupama predstavljen je u Tabeli 5. Dok je brojčana razlika primećena između tretiranih grupa i negativnih kontrola, statistički značajne razlike za konsolidaciju pluća, izolovanje virusa u plućima i tkivu krajnika nisu ustanovljene (Tabela 6). Iz uzoraka ispiranja pluća, statistički značajne razlike (P< =0.05) su detektovane u rezultatima izolovanja virusa između negativne kontrolnne grupe i T02,T07, i T09 (Tabela 7).

ZAKLJUČAK IZ SPECIFIČNIH OPISA

[0122] Podrazumeva se da su gornji opisi imali namenu da budu ilustrativni ali da nisu ograničavajući. Mnogi opisi biće očigledni i ljudima iz struke. Oblast ovog pronalaska , dakle definisana je u patentnim zahtevima, zajedno sa svim ekvivalentima na koje se ovi zahtevi odnose. Prilozi iz svih članaka i referenci , uključujući patente, patentne prijave u publikacije, su ovde priključeni kao reference u njihovoj celosti i za sve svrhe.

[0123] Sva jedinjenja i/ili metodi koji su ovde spomenuti i uneta u zahteve mogu se napraviti i dobiti bez bespotrebnih eksperimentisanja u svetlosti ovog pronalaska. Dok su jedinjenja i metode iz ovog pronalaska ovde opisani u smislu da su najpogodnija, biće očigledno ljudima iz struke da varijacije mogu biti primenjene na jedinjenja i /ili metode i u koracima ili u nizu koraka pojedinog metoda koji je ovde opisan a ne odstupajući od koncepta, duha i cilja ovog pronalaska. Još specifičnije, biće očigledno da određeni agensi koji su kako hemijski tako i fiziološki povezani, mogu biti zamenjeni sa agensima koji su ovde opisani uz postizanje istih ili sličnih rezultata. Sve ove slične zamene i modifikacije koje su očigledne ljudima iz struke smatraju se u duhu, cilju i konceptu ovog pronalaska kao što je definisano u patentnim zahtevima.

Claims (18)

1. Metod za imuniziranje pasa protiv influenca virusa, metod koji podrazumeva davanje psima terapeutski efikasne količine vakcine koji sadrži najmanje jedan umrtvljeni ili ubijeni influenca virus.

2. Metod prema zahtevu 1 gde rečeni virus je odabran iz grupe koja se sastoji od podtipa H3, N8 i ili H3N8, i bilo koju njihovu kombinaciju.

3. Metod prema zahtevu 2, gde rečeni virus je influenca subtip H3N8.

4. Metod prema zahtevu 3, gde rečeni virus je equine ili canine porekla.

5. Metod prema zahtevu 4, gde rečeni virus može ili ne može biti u stanju da pređe na psa.

6. Metod prema zahtevu 5, gde rečeni virus može biti prenet na psa.

7. Metod prema zahtevu 5, gde rečeni virus ne može biti prenet na psa.

8. Metod prema zahtevu 7, gd eje količina rečenog virusa od 10 do 10 000 11A jedinica.

9. Metod prema zahtevu 8, gd eje količina rečenog virusa od 10 do 10 000 HA jedinica.

10. Metod prema zahtevu 5, gde rečeni virus je equine porekla.

11. Metod iz zahteva 10, gde rečeni virus je equine influenca virus

12. Metod prema zahtevu 11, gde rečeni virus je dobijen iz antigena equine influenca soja A/Equine/2/Miami/1/63

13. Metod prema zahtevu 11, gde rečeni virus je odabran iz grupe koja se sastoji od , a) Equine influenca soja A/Equine/2/Miami/l/63, i ili b) Equine influenca soja A/Equine2/Miami/l/63, prenetog i sačuvanog soja Master Seed Virus, Lot 3 17-9, označenog kao Equine Flu A2,3 17-9 MSV, 11-21-86.

14. Metod prema zahtevu 5, gde rečeni virus je canine porekla.

15. Metod prema zahtevima 1-14, gde rečeni virus je ubijen.

16. Metod prema zahtevima od 1-14, gde rečena vakcina sadrži još i pomoćna sredstva i može se odabrati od a) metabolizujućih pomoćnih sredstava, b) ne-metabolizujućih pomoćnih sredstava, c) 2% stipse, d) 5% stipse, e) Ouil A, i f) Flolesterola ili bilo koje njihove kombinacije.

17. Postupak za dobijanje vakcina, gde rečena vakcina sadrži jedinjenja prema zahtevima 1-14.

18. Upotreba vakcina prema zahtevima 1-14 za dobijanje leka za imuniziranje pasa protiv influenca virusa, leka koji sadrži terapeutski efikasnu količinu vakcine koja sadrži najmanje jedan umrtvljeni ili ubijeni influenca virus.