RS20070166A - Prekursori seksualnih steroida sami ili u kombinaciji sa selektivnim modulatorom estrogenskog receptora i/ili sa inhibitorom cgmp fosfodiesteraze tipa 5 za prevenciju ili tretman isušenosti vaginalne sluzokože i seksualne disfunkcije kod žena u postmenopauzi - Google Patents

Abstract

Opisani su novi postupci za tretiranje ili smanjivanje verovatnoće nastanka vaginalnih disfunkcija, konkretno isušenosti vaginalne sluzokože i dispareunije, koj.i vode do seksualne disfunkcije i smanjenja seksualne želje i performanse, kod podložnih toplokrvnih životinja, uključujući ljude, a koji obuhvataju primenu prekursora seksualnih steroida. Dalje, specifično je opisana primena estrogena ili selektivnih modulatora estrogenskog receptora, posebno onih koji su izabrani iz grupe koju čine raloksifen, arzoksifen, tamoksifen, droloksifen, toremifen, jodoksifen, GW 5638, TSE-424, ERA-923 i lasofoksifen, a posebno jedinjenja koja imaju sledeću opštu strukturu: u cilju medicinskog tretmana i/ili inhibicije razvoja neke od gore-pomenutih oboljenja.Takođe su opisani farmaceutski preparati za dopremanje aktivnog sastojka (aktivnih sastojaka) i komplet (kompleti) koji su od koristi-za predmetni pronalazak.

Description

Prekursoriseksualnih steroida sami ili u kombinaciji sa selektivnim modulatorom estrogenskog receptora i/ili sa inhibitorom cGMP fosfodiesteraze tipa 5 za prevenciju ili tretman isušenosti vaginalne sluzokože i seksualne disfunkcije kod žena u postmenopauzi

Oblast pronalaska

Predmetni pronalazak se odnosi na postupak za tretiranje ili smanjenje verovatnoće nastanka problema koji zahvataju podsluzokožni (lamina propria) ili mišićni sloj (lamina muscularis) vagine korišćenjem prekursora seksualnih steroida samih ili u sastavu nove kombinovane teraoije koja se primenjuje na podložne toplokrvne životinje, uključujući ljude. Posebno, navedena kombinovana terapija obuhvata primenu selektivnog modulatora receptora za estrogen (SERM. - selective estrogen receptor modulator) i povišavanje nivoa prekursora seksualnih steroida kod pacijenta, pri čemu su navedeni prekursori izabrani iz grupe koju čine dehidroepiandrosteron (DHEA), dehidroepiandrosteron sulfat (DHEA-S) i androst-5-en-3p,17(3-diol (5-diol). Takođe, mogu se primeniti i estrogeni, da neutrališu potencijalne efekte nekih SERM u smislu pojave valunga i drugih simptoma menopauze. Takođe, može se primeniti i inhibitor fosfodiesteraze tipa 5 u cilju poboljšavanja seksualne aktivnosti. Predmetni pronalazak se takođe odnosi na komplete i farmaceutske preparate koji služe za primenjivanje ranije navedene terapijske kombinacije.

U patentu US 5,843,932 saopšteni su efekti DHEA na vaginalnu atrofiju tokom tretmana od jednog, tri ili šest meseci, koji je primenjen u dozi od 30 mg dva puta dnevno u rastvoru 50% etanola i 50% propilen glikola na površinu od 2 cm na koži leđa ovariektomisanih ženki pacova. Histopatološko ispitivanje je pokazalo proliferaciju i mucifikaciju vaginalnog epitela i povlačenje vaginalne atrofije kod ženki pacova tretiranih sa DHEA.

Ispitivanje koje je sprovedeno nad ženkama pacova primenom DHEA na kožu leđa tokom jednog, tri ili šest meseci je istražilo samo efekat na vaginalni epitel (Sourla et al., 1998, J. Steroid Biochem Mol Biol, 66(3): 137-149), a ne i na druga dva sloja zida vagine, konkretno na podsluzokožni i mišićni sloj. Tada je primećeno da DHEA ima oko 10 puta veči efekat na vaginalni epitel, ukoliko se primeni topijski, nego kada se primeni na kožu na mestu koje je udaljeno od vagine, što podrazumeva da svoje dejstvo ispolji putem sistemske apsorpcije.

U prethodnoj studiji efekta DHEA primenjenog na kožu kod žena u postmenopauzi tokom 12 meseci, u obliku kreme sa 10% DHEA, ispitivana je samo estrogenska aktivnost DHEA (Labrie et al., 1997, J Clin Endocrinol Metab, 82: 3498 - 3505). Naznačeno je (na str. 3500): "Sprovedeno je ekološko ispitivanje vagine, kao specifični parametar estrogenog dejstva DHEA". To je bila posledica postupka evaluacije, konkretno upotrebe vaginalnog brisa, koji je ograničen na ispitivanje površnih ćelija epitela koje se lako uklanjaju.

Predmetni pronalazak opisuje efekte DHEA i drugih komponenti na tri sloja vagine, konkretno na mišićni, podsluzokožni i epitelni sloj, uz praćenje novih korisnih dejstava u sva tri sloja. Veruje se da su povoljni efekti DHEA na podsluzokožni i mišićni sloj od velike važnosti za pozitivna dejstva inhibitora fosfodiesteraze cGMP tipa 5, kao što su vijagra i druga jedinjenja ili prostaglandin El.

Pozadina pronalaska

Isušenost vaginalne sluzokože pogađa oko 50% žena u postmenopauzi u dobi od 50 do 60 godina i oko 72% u dobi većoj od 70 godina (Rossin-Amar, 2000, Gvnecol Obstet Fertil, 28(3): 245 - 249). Oko 80% ovih žena pati od urogenitalnih poremećaja, posebno od vaginitisa i dispareunije (Pandit & Ouslander, 1997, Am J Med Sci, 314(4): 228 - 31). Pošto se veruje da su ovi problemi makar delimično povezani sa deficitom seksualnih steroida, treba razmotriti mogućnost upotrebe odgovarajuće lokalne hormonske supstitucione terapije. Skoro je otkriveno da žene u postmenopauzi nemaju samo deficit svih ovarijskih estrogena, već da imaju i progresivni deficit androgena koji potiču od periferne intrakrine transformacije dehidroepiandrosterona (DHEA) u androgene i estrogene (Labrie et al., 1991, Mol Cell Endocrinol, 78: Cl 13 - Cl 18; Labrie et al., 1995, Ann NY Acad Sci, 774: 16-28; Labrie et al., 2003, End Rev, 24(2): 152 - 182). U suštini, nivi serumskog DHEA i DHEA-S se progresivno smanjuju već u periodu od 30 do 40 godina (Labrie et al., 2003, End Rev, 24(2): 152 - 182; Orentreich et al., 1984, J Clin Endocrinol Metab, 59: 551 - 555; Labrie et al., 1997, J Clin Endocrinol Metab, 82: 2396 - 2402). Serija ispitivanja ukazuje da su niski nivoi DHEA i DHEA-S udruženi sa nizom poremećaja i oboljenja povezanih sa starenjem (Labrie et al., 1997, J Clin Endocrinol Metab, 82: 3498 - 3505; Helzlsouer et al., 1992, Cancer Res, 52(1): 1 - 4; Szathmari et al, 1994, Osteoporos Int, 4(2): 84 - 88; Thoman & Weigle, 1989, Adv Immunol, 46: 221 - 261; Barrett - Connor et al., 1999, J Reprod Med, 44(12): 1012 - 1020; Barrett-Connor et al, 1999, J Am Geriatr Soc, 47(6): 685 - 691).

Efikasan pristup otklanjanju isušenosti vaginalne sluzokože i drugih simptoma u menopauzi predstavlja upotreba hormonske supstitucione terapije (HRT - hormone replacement therapv) (Greendale & Judd, 1993, J Am Geriatr Soc, 41(4): 426 - 436; Studd et al., 1980, Pasetto, Paleotti & Ambrus (urednici), MT Press, Lancaster, str. 127 - 139). Skorašnje kliniče studije, međutim, pokazuju da kombinovanje estrogena i progestina povećava incidencu kancera dojke, uz potencijalni negativni uticaj na kardiovaskularni sistem (Colditz et al., 1995, N Eng J Med, 332: 1589 - 1593; Ross et al., 2000, J Natl Cancer Inst, 92(4): 328 - 332; Rosouvv wt al., 2002, JAMA, 288(3): 321 - 333). U međuvremenu, raste interesovanje za potencijalnom kombinovanom estrogen ' androgenom supstitucionom terapijom (Rosenberg et al., 1997, J Reprod Med, 42(7): 394 - 404; Burd et al., 2001, Curr Women Health rep, 1(3): 202 - 205), iako je upotreba estrogene komponente ograničena potenijalnim komplikacijama koje su pomenute u pređašnjem tekstu. Na osnovu skorašnjeg napretka u našem razumevanju fiziologije humanih seksualnih steroida, posebno kod žena u postmenopauzi (Labrie et al., 1991, Mol Cell Endocrinol, 78: Cl 13 - Cl 18; Labrie et al., 2003, End Rev, 24(2): 152 - 182), upotreba DHEA daje mogućnost da žene u postmenopauzi obezbede odgovarajuće nivoe androgena i estrogena u serumu koji se sintetišu u specifičnim tkivima intrakrinim mehanizmima, bez ispoljavanja sistemskih dejstava (Labrie et al., 1997, J Clin Endocrinol Metab, 82: 3498 - 3505; Labrie et al., 2003, End Rev, 24(2): 152 - 182; Labrie, 2001, Ref Gyn Obstet, 8: 317 - 322; Lasco et al., 2002, 145: 457 - 461). Ponovna pojava na androgene osetljivih elemenata u vaginalnom zidu bi, takođe, trebala da potpomogne dejstvo inhibitora cGMP fosfodiesteraze tipa 5 ili prostaglandina El.

Selektivni modulator receptora za estrogen (SERM) Akolbifen (EM-652) je benzopiranski derivat, koji je originalno razvijen za prevenciju i tretman kancera dojke (Gauthier et al., 1997, J Med Chem, 40: 2117 - 2122). Akolbifen je jedinjenje koje poseduje najveći afinitet od svih poznatih jedinjenja za 'receptor za estrogen (ER)

(Gauthier et al., 1997, J Med Chem, 40: 2117 - 2122; Labrie et al., 1999, J Steroid Biochem Mol Biol, 69(1-6): 51 - 84; Tremblay et al., 1997, Mol. Endocrinol, 11: 353 - 365) i ispoljava svoju aktivnost i na ERa i ER[5 (Tremblav et al., 1998, Endocrinologv, 139: 111 - 118). Ovo jedinjenjepokazuje čistu i jako izraženu antiestrogenu aktivnost u tkivu mlečne žlezde i u endometrijumu, i istovremeno smanjuje nivoe holesterola i triglicerida u serumu, a takođe sprečava gubitak koštanog tkiva, makar kod pacova (Labrie et al., 1999, J Steroid Biochem Mol Biol, 69(1-6): 51 - 84). Takođe, dokazano je da primena DHEA ne samo da ne interferira, već da pospešuje i ispoljava dodatni inhibitorni efekat ako se primeni sa čistim antiestrogenom Akolbifenom na rast humanog raka dojke u modelu bezdlakog miša (Dauvois et al., 1991, Cancer Res, 51: 3131 - 3135; Luo et al, 1997, Endocrinologv, 138: 4435 - 4444). Predloženo je da se kombinovani tretman sa DHEA i Akolbifenom koristi kao hemopreventivni i terapeutski pristup kod kancera dojke (Labrie, 2001, ref Gvnecol Obstet, 8: 317 - 322). U suštini, inhibitorni efekat DHEA na rast ksenografta humanog kancera dojke kod bezdlakih miševa podržava pretpostavku o njegovoj upotrebi u hormonskoj supstitucionoj terapiji (Dauvois et al., 1991, Cancer Res, 51: 3131 - 3135; Couillard et al., 1998, J Natl Cancer Inst, 90: 772 - 778).

Patent WO 99/63974 opisuje medicinske upotrebe selektivnog modulatora estrogenog receptora u kombinaciji sa prekursorima seksualnih steroida.

Suština pronalaska

Shodno izloženom, cilj predmetnog pronalaska je da obezbedi efikasne postupke za tretman vaginalnih problema, konkretno za isušenost vaginalne sluzokože, dispareunije i seksualne disfunkcije, što može da vodi smanjenju seksualne želje i aktivnosti, dok se istovremeno na minimum svode neželjeni sporedni efekti.

Drugi cilj predmetnog pronalaska jeste da obezbedi postupke za smanjivanje rizika od sticanja gore navedenih problema.

U jednom rešenju, predmetni pronalazak obezbeđuje postupak tretiranja ili smanjenja rizika od nastanka isušenosti vaginalne sluzokože, koji obuhvata povećavanje nivoa prekursora seksualnih steroida izabranih iz grupe koju čine dehidroepiandrosteron (DHEA), dehidroepiandrosteron-sulfat (DHEA-S) i androst-5-en-3p,17|3-diol (5-diol), kod subjekta ili pacijenta kome je potreban navedeni tretman ili navedeni prekursor steroida, a dalje obuhvata i primenu kod navedenog pacijenta terapijski efikasne količine selektivnog modulatora estrogenog receptora (SERM), kao dela kombinovane terapije.

U drugom rešenju, predmetni pronalazak podrazumeva dodatnu primenu estrogena, kako bi se neutralisalo dejstvo SERM na pojavu valunga i drugih simptoma menopauze.

U drugom rešenju, predmetni pronalazak obuhvata dodatnu primenu inhibitora cGMP fosfodiesteraze tipa 5 ili prostaglandina El u cilju poboljšanja seksualne aktivnosti.

Kao što se ovde koristi, pojam "selektivni modulator estrogenog receptora" označava jedinjenje koje bilo direktno, bilo posredstvom svog aktivnog metabolita, deluje kao antagonista estrogenog receptora ("antiestrogen") u tkivu dojke, pri čemu ispoljava estrogeno dejstvo ili dejstvo slično estrogenom dejstvu na tkivo kosti i na nivoe holesterola u serumu (tj., smanjuje nivo serumskog holesterola). Ne-steroidna jedinjenja koja deluju kao antagonisti estrogenog receptorain vitroili u tkivu dojke kod žene ili ženke pacova (posebno ukoliko jedinjenje deluje kao antiestrogen na ćelije humanog karcinoma dojke) verovatno deluju kao SERM. Suprotno tome, steroidni antiestrogeni imaju tendenciju da ne deluju kao SERM, jer nemaju tendenciju da ispoljavaju bilo kakav povoljan efekat na serumski holesterol. Predlagači su ispitivali nesteroidne antiestrogene i otkrili su da kao SERM deluju EM-800, EM-01538, Raloksifen, Tamoksifen, Droloksifen, Toremifen, Idoksifen, TSE-424, ERA-923, Lasoksifen (CP 336156), Arzoksifen (LY 353 381) i GW-5638. Predlagači su ispitivali i steroidni antiestrogen ICI 182,780 i otkrili su da on ne deluje kao SERM. SERM, shodno predmetnom pronalasku, mogu da se primene u onoj dozi koja je poznata u struci, onda kada se ova jedinjenja koriste kao antiestrogeni.

Bez namere vezivanja za bilo koju teoriju, veruje se da SERM, od kojih mnogi, poželjno, poseduju dva aromatična prstena povezana putem jednog ili dva ugljenikova atoma, interaguju sa receptorom za estrogen posredstvom napred navedenog dela molekula koji receptor najbolje prepoznaje. Poželjni SERM imaju bočne lance koji mogu selektivno da ispolje antagonistička svojstva u tkivu dojke, bez ispoljavanja značajnih antagonističkih svojstava u drugim tkivima. Stoga, SERM mogu poželjno da deluju kao antiestrogeni u dojci, dok iznenađujuće i poželjno deluju kao estrogeni (ili ispoljavaju aktivnost sličnu estrogenu) u kostima i na komponente krvi (gde poželjno utiču na koncentracije lipida i/ili holesterola). Poželjni efekat na holesterol i/ili lipide potencijalno se prevodi u poželjni inhibitorni efekat na aterosklerozu, za koju je poznato daje potencirana neodgovarajućim nivoima holesterola i lipida.

U drugom rešenju, predmetni pronalazak obezbeđuje farmaceutski preparat i komplet u kome selektivni modulator estrogenog receptora ima molekulsku formulu sledećih karakteristika: a) dva aromatična prstena razdvojena jednim ili sa dva umetnuta ugljenikova atoma, pri čemu su oba aromatična prstena ili nesupstituisana ili su supstituisani hidroksilnom grupom ili grupom koja sein vivoprevodi u hidroksilnu; b) bočni lanac koji poseduje aromatični prsten i tercijarnu aminsku funkcionalnu grupu ili njenu so.

Poželjno je da bočni lanac bude izabran iz grupe koju čine:

Takođe je poželjno da su oba aromatična prstena fenil grupe i da bočni lanac poseduje podjedinicu koja je izabrana iz grupe koju čine metin, metilen, -CO, -O- i -S-, aromatični prsten i tercijarna aminska grupa ili njena so.

U drugom rešenju, selektivni modulator estrogenog receptora je izabran iz grupe koju čine derivat benzotiofena, derivat trifeniletilena, derivat indola, derivat benzopirana, 5,6,7,8-tetrahidronaftalen i derivat centhromana.

U jednom rešenju, poželjno je da selektivni modulator estrogenskog receptora bude derivat benzotiofena sa sledećom formulom:

gde su Rii R2nezavisno izabrane iz grupe koju čine: vodonik, hidroksilna grupa i grupa koja sein vivoprevodi u hidroksilnu grupu; R3i R4su ili nezavisno izabrane iz grupe koju čine: C1-C4alkil grupa ili, R3, R4i atom azota za koji su povezane zajedno sačinjavaju bilo koju od sledećih struktura: pirolidino, dimetil-l-pirolidino, metil-1-pirolidinil, piperidino, heksametilenimino i morfolino grupu; A je izabrano iz grupe koju čine -CO-, -CHOH i -CH2-; B je izabrano iz grupe koju čine fenilen, piridiliden i - cikloC4H2N2- grupa.

Posebno, selektivni modulator estrogenskog receptora je izabran iz grupe koju čine Raloksifen, Arzoksifen (LY 353381) i LY 335563.

U drugom rešenju, poželjno je daje selektivni modulator estrogenskog receptora derivat trifeniletilena sa sledećom formulom:

gde D je -OCH2CH2N(R3)R4ili -CH=CH-COOH grupa (R3i R4su ili nezavisno izabrane iz grupe koju čine: C1-C4alkil grupa ili, R3, R4i atom azota za koji su povezane zajedno sačinjavaju neku od sledećih prstenastih struktura: pirolidino, dimetil-l-pirolidino, metil-1-pirolidinil, piperidino, heksametilenimino i morfolino grupu); E i K su nezavisno vodonik ili hidroksilna grupa; J je vodonik ili atom halogena.

Posebno, selektivni modulator estrogenskog receptora je Tamoksifen, OH-tamoksifen, droloksifen, tormifen, jodoksifen i GW 5638.

U drugom rešenju, poželjno je da je selektivni modulator estrogenskog receptora derivat indola sa sledećom formulom:

gde D je izabrano iz grupe koju čine -OCH2CH2N(R7)R8, -CH=CH-CON(R7)Rg, -CC-(CH2)n-N(R7)R8(R7i Rssu ili nezavisno izabrane iz grupe koju čine C\- C(, alkil grupa, ili R7, Rg i atom azota za koji su vezane zajedno formiraju neku od sledećih prstenastih struktura: pirolidino, dimetil-l-pirolidino, metil-1-pirolidinil, piperidino, heksametilenimino i morfolino grupu); X je izabrano iz grupe koju čine vodonik i Ci-Q alkil grupa; Ri, R2, R3, R4, R5i Rćsu nezavisno izabrane iz grupe koju čine vodonik, hidroksilna, Ci-Cćalkil grupa i grupa koja sein vivoprevodi u hidroksilnu grupu.

Posebno, selektivni modulatori estrogenskog receptora su TSE-424 i ERA-923.

U drugom rešenju, poželjno je daje selektivni modulator estrogenskog receptora jedinjenje sa sledećom formulom:

gde su Rii R2nezavisno izabrane iz grupe koju čine vodonik, hidroksilna grupa i grupa koja sein vivoprevodi u hidroksilnu grupu; R5i Rćsu nezavisno vodonik ili Ci-Cćalkil grupa; D je -OCH2CH2N(R3)R4grupa (R3i R4su ili nezavisno izabrane iz grupe koju

čine C1-C4alkil grupa ili R3, R4i atom azota za koji su povezane zajedno sačinjavaju neku od sledećih prstenastih struktura: pirolidino, dimetil-l-pirolidino, metil-1-pirolidinil, piperidino, heksametilenimino i morfolino grupu).

X je izabrano iz grupe koju čine -0- i -CH2-.

Posebno, jedinjenje je izabrano iz grupe koju čine: (-)-cis-(5R,6S)-6-fenil-5-[4-(2-pirolidin-1 -iletoksi)fenil]-5,6,7,8-tetrahidronaftalen-2-ol, D-(-)-tartaratna so (lasofoksifen) i (3,4-trans-2,2-dimetil-3-fenil-4-[4-(2-(2-(pirolidinil-l-il)etoksi)fenil]-7-metoksihroman).

U drugom rešenju, poželjno je da selektivni modulator estrogenskog receptora ima sledeću formulu:

gde su Rii R2nezavisno vodonik, hidroksilna grupa i grupa koja sein vivoprevodi u hidroksilnu grupu; Z je bivalentna zatvarajuća podjedinica, posebno, Z je izabrana iz grupe koju čine -O-, -NH-, -S- i -CH2- grupa; R100je bivalentna podjedinica koja razdvaka L od B- prstena pomoću 4-10 umetnutih atoma; L je bivalentna ili trivalentna polarna podjedinica izabrana iz grupe koju čine -SO-, -CON-, -N< i -SON<; Gije izabrana iz grupe koju čine vodonik, C1-C5ugljovodonik ili bivalentna podjedinica koja spaja G2i L kako bi se formirao petočlani do sedmočlani heterociklični prsten, ili njegovi halogeni ili nezasićeni derivati; G2je ili odsutna ili je izabrana iz grupe koju čine vodonik, C1-C5ugljovodonik ili bivalentna podjedinica koja spaja Gii L kako bi se formirao petočlani do sedmočlani heterociklični prsten ili njegovi halogeni ili nezasićeni derivati; G3je izabrana iz grupe koju čine vodonik, metil i etil grupa.

Posebno, poželjni su benzopiranski derivati sledeće opšte strukture:

gde D je -OCH2CH2N(R3)R4grupa (R3i R4su ili nezavisno izabrane iz grupe koju čine C1-C4alkil grupa ili R3, R4i atom azota za koji su povezane zajedno sačinjavaju neku od sledećih prstenastih struktura: pirolidino, dimetil-l-pirolidino, metil-1-pirolidinil, piperidino, heksametilenimino i morfolino grupu); Rii R2nezavisno izabrane iz grupe koju čine vodonik, hidroksilna grupa i grupa koja sein vivoprevodi u hidroksilnu grupu.

Takođe je poželjno da su benzopiranski derivati optički aktivna jedinjenja koja imaju apsolutnu konfiguraciju S na atomu ugljenika br. 2 ili su to farmaceutski prihvatljive soli ovih jedinjenja, pri čemu navedena jedinjenja poseduju sledeću molekulsku strukturu:

gde su Rji R2nezavisno izabrane iz grupe koju čine hidroksilna grupa i grupa koja sein vivoprevodi u hidroksilnu grupu; R3je podjedinica koja je izabrana iz grupe koju čine zasićena, nezasićena ili supstituisana pirolidinil grupa; zasićena, nezasićena ili supstituisana piperidino grupa; zasićena, nezasićena ili supstituisana piperidinil grupa; zasićena, nezasićena ili supstituisana morfolino grupa; ciklična grupa koja sadrži azot; policiklična grupa koja sadrži azot; i NRaRb(Rai Rbsu nezavisno vodonik, pravolančana ili razgranata C\- Ce alkil grupa, pravolančana ili razgranata C2-C6alkenil grupa, kao i pravolančana ili razgranata C2-C6alkinil grupa).

Poželjni selektivni modulatori estrogenskog receptora su:

kao i raloksifen, arzoksifen, tamoksifen, droloksifen, tormifen, jodoksifen, GW 5638, TSE-424, ERA-923 i lasofoksifen.

Kratak opis crteža

Slika 1 prikazuje podelu po longitudinalnoj osi vagine kod pacovki u sedam preseka, počevši od spoljašnjeg otvora vagine( ostium vaginae)do nivoa grlića materice (segment 7)( portio vaginalis uteri).

Slika 2 prikazuje histomorfologiju vaginalnog epitela iz segmenta 5, kod 9 grupa pacovki (crta na Slici J predstavlja 40 um).

(A) Višeslojni skvamozni epitel kod pacovki koje imaju normalni polni ciklus u estrusu se sastoji od četiri osnovna sloja (što, u stvari, oslikava dejstvo estrogena): jedan

sloj ćelija u okvirustratum basale(b); 6 do 7 slojeva ćelija u okvirustratum spinosum(s) i 5 do 6 slojeva ćelija u okvirustratum granulosum(g), koji je prekriven ćelijama izstratum corneum(c), koji sačinjavaju gusto složene pljosnate orožale ćelije.

(B) Pacovke sa normalnim polnim ciklusom u prosetrusu, koje se nalaze pod dejstvom estrogeno - progestagenog dejstva su iskorišćene za ilustraciju mucifikacije. U

najvećem broju segmenata od 2 do 7, jednoslojni sloj bazalnih ćelija (b) je prekriven sa 5 do 6 slojeva ćelija izstratum spinosum(s) i sa 3 - 4 sloja mukusnih ćelija, koje činestratum mucinosum(m). (C) U kontrolnoj grupi ovariektomisanih (OVX) pacovki, sloj bazalnih ćelija (b) je prekriven jednim slojem atrofičnih kubičnih ćelija (a). (D) Vaginalni epitel ovariektomisanih (OVX) pacovki, koje su tretirane dnevnom dozom akolbifena (2,5 mg/kg), pokazuje atrofiju, pri čemu spoljašnji sloj

niskih kolumnarnih mukusnih ćelija (m) prekriva sloj bazalnih ćelija (b).

(E) Vaginalni epitel ovariektomisanih (OVX) pacovki tretiranih dnevnom oralnom dozom Premarina (0,5 mg/kg). Atrofija je ustupila mesto estrogenom obrascu

građe epitela, koji je uporediv sa obrascem koji se može naći kod pacovki u estrusu.

(F) Kod ovariektomisanih (OVX) pacovki koje su dobijale Premarin i Akolbifen, predominira atrofija, pri čemu je morfologija slična onoj kod životinja koje

su tretirane Akolbifenom, iako se mogu videti krupnije mukusne ćelije.

(G) Nakon tretmana ovariektomisanih (OVX) pacovki kutanom primenom DHEA (80 mg/kg) jednom dnevno na površini kože leđa od 2*2 cm, primećen je

hipertrofični epitel sastavljen od 3 - 5 slojeva mukusnih ćelija (m), koji prepokrivaju sloj bazalnih ćelija (b). Nekoliko ispitivanja opisuje ovaj epitel (strelice).

(H) U najvećem broju područja vaginalnog epitela kod životinja koje primaju tretman sa DHEA i Akolbifenom, sloj mukusnih ćelija (m) počiva na sloju bazalnih

ćelija (b), dok u nekim područjima, mnogi slojevi mukusnih ćelija prekrivaju sloj bazalnih ćelija. Nekoliko ispitivanja opisuje ovaj epitel (strelice). (I) Tretman sa DHEA i Premarinom dovodi do pojave mešanog epitela, koji je sastavljen od višeslojnog skvamoznog epitela debljine 3 do 7 slojeva (s), koji prepokriva 3 do 5 slojeva mukusnih ćelija (m) kod tri životinje. Kod 2 životinje, područja višeslojnog skvamoznog epitela su bila predominantna (ubačena slika). Crtica na ubačenom delu slike označava 30 um.

(J) Kada se kombinuju DHEA, Premarin i Akolbifen, epitel je sličan onom kod grupe životinja tretirane sa DHEA i Akolbifenom.

Slika 3 prikazuje vaginalnu sluzokožu kod ovariektomisanih (OVX) pacovki, gde se na (A) slici vide ozbiljne inflarnatorne promene karakterisane fokalnom infiltracijom leukocita sa intraepitelnim mikroapscesima (M), a na slici (B) fokalna erozija (E se karakteriše smanjenom debljinom epitela i ulceracijom (U), koja se vidi kao potpun nedostatak epitela.

Na Slici 4, u cilju ilustracije efekta Akolbifena koji je sličan estrogenu na vaginalni epitel u segmentu 1 (spoljašnji otvor vagine), prikazana su poređenja odgovarajućih grupa životinja. Kod intaktnih pacovki u estrusu (A) i kod pacovki tretiranih Premarinom (D), epitel ima debljinu od 10 - 15 slojeva i keratinizovan je. U kontrolnoj grupi ovariektomisanih (OVX) pacovki (B), debljina epitela je smanjena na 4 do 6 slojeva, pri čemu on generalno nije keratinizovan (obratiti pažnju na odsustvostratum granulosum),dok je kod životinja tretiranih Akolbifenom (C) debljina vraćena na 9 - 11 slojeva, a epitel je keratinizovan.

Slika 5 prikazuje debljinu (|am) tri različita vaginalna dela u nivou petog segmenta vagine pacovki: a) epitel, b)lamina propria,c)lamina muscularisi d) ukupna debljina, nakon 36 nedelja tretmana ovariektomisanih (OVX) pacovki sa DHEA, Premarinom i Akolbifenom, samima ili u određenoj kombinaciji. Grupe označene istim slovima ne pokazuju statistički značajne razlike pri p<0,05.

Slika 6 prikazuje kompaktnost kolagenih vlakana izlamina propria,koja je ilustrovana u segmentu 5 kao niska (A), umerena (B) ili visoka (C).

Slika 7 predstavlja mikrofotografije tri vaginalna odeljka: (E) epitel, (L)lamina propriai (M)lamina muscularis,u nivou petog segmenta vagine pacovki, uz naglasak na relativnu debljinulamina muscularisu različitim grupama. Tri sloja vaginalnog zida su crtama razdvojeni na slikama, kako bi se na najbolji način procenila raspodela debljine između različitih grupa. A) Intaktne pacovke (nisu ovariektomisane), B) ovariektomisane (OVX) pacovke koje se ne tretiraju, C) OVX pacovke tretirane Akolbifenom, D) OVX pacovke tretirane Premarinom, E) OVX pacovke tretirane Premarinom i Akolbifenom, F) OVX pacovke tretirane sa DHEA, G) OVX pacovke tretirane sa DHEA i Akolbifenom, H) OVX pacovke tretirane sa DHEA i Premarinom, I) OVX pacovke tretirane sa DHEA, Premarinom i Akolbifenom.

Slika 8 prikazuje masu vagine koja je merena nakon 36 nedelja tretmana ovariektomisanih (OVX) životinja Akolbifenom, Premarinom i sa DHEA, samim ili u kombinacijama. Kao kontrole su korišćene intaktne (nisu ovariektomisane) životinje.

Slika 9 prikazuje imunohistohemijsku lokalizaciju ARm ERa i PR u (E) epitelu, (L)lamina propriai (M)lamina muscularisu nivou petog vaginalnog segmenta u različitim grupama životinja. Crtice označavaju granicu između tri sloja vagine.

Slike 10 i 11 prikazuju poređenje morfologije vaginalnog epitela nakon primene različitih SERM.

Slika 12 predstavlja mikroskopske preseke na kojima je prikazano 8 vaginalnih segmenata (čitav gornji red i deo u donjem desnom uglu slike), nakon toga 4 uterina segmenta (1 segment vrata uterusa i 3 segmenta iz dva roga uterusa - po 2 preseka po rogu) u redosledu koji odgovara njihovom originalnom anatomskom položaju. Segment 8 obuhvata lateralne svodove vagine, koji okružuju početak grlića materice.

Slika 13 prikazuje hormonsko dejstvo u estrusu (leva kolona) na vaginalni epitel kod intaktnih pacovki (nsiu ovariektomisane): epitel ima debljinu od 12 - 18 slojeva u segmentu 4 i 12 - 15 slojeva u segmentu 6.

U metestrusu (desna kolona) vaginalni epitel ima 6-10 slojeva u segmentu 4 i 5

- 7 slojeva u segmentu 6.

Slika 14 prikazuje morfološke osobine vaginalnog epitela kod ovariektomisanih netretiranih pacovki. U segmentu 4, vagina je obložena višeslojnim skvamoznim epitelom debljine 2-6 slojeva. U segmentu 6, primećuje se kompletna atrofija i debljina epitela je 2 - 3 sloja. Mogu se naći mali fokusi sa malim cilindričnim mukusnim ćelijama po čitavim vaginalnom epitelu.

Slika 15 prikazuje efekat placebo supozitorije. U poređenju sa grupom netretiranih ovariektomisanih (OVX) pacovki, višeslojni skvamozni epitel vagine kod placebo grupe je malo deblji, i segment 4 je debljine 4-8 slojeva. U segmentu 6 je prisutna ista morfologija kao kod netretiranih ovariektomisanih (OVX) pacovki, sa 2 - 3 ćelijska sloja. Po čitavom epitelu se mogu naći mali fokusi malih cilindričnih mukusnih ćelija, u nešto većoj meri nego kod netretiranih ovariektomisanih (OVX) životinja.

Slika 16 prikazuje efekat DHEA u dozi od 0,33 mg/supozitoriji. U segmentu 4, vaginalni epiel je tipa višeslojnog skvamoznog epitela sa 3 - 7 slojeva. Oko 20 - 60% vaginalnog epitela je prekriveno je prekriveno pravilno poredanim mukusnim ćelijama, koje se smenjuju sa epitelom koji je prekriven na površini od 15 - 50% sahipertrofisanim mukusnim ćelijama, koje prekrivaju u jednom ili u više slojeva višeslojni skvamozni vaginalni epitel; postoje i površine bez mukusnih ćelija. U segmentu 6, debljina epitela je smanjena na skoro na debljinu koja se može naći kod netretiranih ovariektomisanih (OVX) životinja; 2-5 slojeva epitela prekrivaju cilindrične mukusne ćelije. Primećena je velka varijacija u prisutnosti mukusnih ćelija, jer ove ćelije prekrivaju od 5 - 75% površine vaginalnog epitela, a prekrivena područja se smenjuju sa područjima bez mukusnih ćelija.

Slika 17 prikazuje efekat DHEA u dozi od 0,66 mg/supozitoriji. U segmentu 4, višeslojni skvamozni epitel ima debljinu od 3 - 6 slojeva. Oko 5 - 20% površine vaginalnog epitela je prekriveno pravilno poredanim mukusnim ćelijama, a ta područja se smenjuju sa područjima hipertrofisanih mukusnih ćelija koje prekrivaju površinu od 10 - 75% epitela, koji se sastoji od jednog ili više slojeva. Takođe su prisutne površine koje nisu prekrivene mukusnim ćelijama. U segmentu 6 debljina epitela je smanjena i sastoji se samo od 2 do 4 sloja, koji su prekriveni jednim slojem pravilno poredanih mukusnih ćelija. Površina prekrivena mukusnim ćelijama varira od 20 - 80% površine epitela, a između su nemucifikovane površine.

Slika 18 prikazuje efekat DHEA u dozi od 1 mg po supozitoriji. U segmentu 4, višeslojni skvamozni epitel se sastoji od 3 do 9 slojeva. Hipertrofisane mukusne ćelije prekrivaju površinu epitela od 50 - 70%, koji je debljine od 3 - 4 sloja, dok pravilno poredane mukusne ćelije prekrivaju površinu epitela od 5 - 30%. Nemucifikovana područja se nalaze između područja sa mukusnim ćelijama. U segmentu 6, debljina epitela je takođe smanjena i on se sastoji od 2 do 4 sloja ćelija. Hipertrofisane mukusne ćelije prekrivaju površinu epitela od oko 30 - 100%, koji je debljine od 1 - 3 sloja, dok pravilno poredane mukusne ćelije prekrivaju površinu epitela od 0 do 70%. Takođe je primećeno nekolik područja koja nisu mucifikovana.

Slika 19 je grafikon koji prikazuje efekat četrnaestodnevnog tretmana sa transvaginalno primenjenim DHEA (supozitorije) na telesnu masu ovariektomisanih (OVX) pacovki. U poređenju sa placebo grupom, telesna masa pacovki kojima je davan DHEA u dozama od 0,33 mg i 0,66 mg blago je smanjena, pri čemu je smanjenje izraženije u grupi koja je primala dozu od 1 mg.

Slika 20 predstavlja grafik serumske koncentracije DHEA nakon transvaginalne primene doza od 0,33 mg, 0,66 mg ili 1 mg kod ovariektomisanih (OVX) pacovki. Vrednosti površine ispod krive (AUG - Area under curve) nakon sedam časova od tretmana sa DHEA su iznosile 32 ± 4 ngxh/ml, 50 ± 7 ngxh/ml i 131 ±23 ngxh/ml, u slučajevima kada je DHEA davan u dozama 0,33 mg, 0,66 mg ili 1 mg, respektivno.

Detaljan opis pronalaska

Nakon prestanka sekrecije estrogena iz jajnika u menopauzi, praktično svi androgeni i estrogeni se sintetišu u perifernim ciljnim tkivima intrakrinim mehanizmima iz dehidroepiandrosterona (DHEA) adrenalnog porekla. U stvari, u odsustvu estrogena jajnika, verovatno je da postepeno smanjenje nivoa DHEA u serumu ima važnu ulogu u isušenosti vaginalne sluzokože, inflamaciji, dispareuniji i seksualnoj disfunkciji koja je često udružena sa menopauzom. U cilju procene specifičnih estrogenih i/ili androgenih efekata potencijalno nove hormonske supstitucione terapije, koja bi, između ostalih povoljnih dejstava, da otklanja isušenost vaginalne sluzokože, ispitivana je morfologija vagine pacovki osam meseci nakon ovariektomije (OVX) i tretmana ovariektomisanih (OVX) životinja sa DHEA, konjueovanim estroeenima (Premarin) i selektivnim modulatorom estrogenskog receptora Akolbifenom, koji su primenjeni sami ili u kombinaciji. Kod intaktnih životinja (nisu ovariektomisane) u estrusu i kod ovariektomisanih (OVX) pacovki tretiranih Premarinom, tipični estrogeni obrazac na vaginalni epitel je pojava keratinizovanog višeslojnog epitela. Ovariektomija dovodi do opšte atrofije udružene sa inflamatornim promenama, dok Akolbifen smanjuje incidencu inflamacije i povećava broj i veličinu mukusnih ćelija u vaginalnom epitelu. U dozama koje su korišćene, Premarin kompletno otklanja ovariektomijom izazvanu atrofiju epitela, dok je DHEA uklanja delimično. U stvari, vaginalni epitel kod ovariektomisanih (OVX) životinja koje su tretirane sa DHEA postaje hiperplastičan sa 3 . - 5 slojeva kolumnarnih mukusnih i peharastih ćelija, što je tipično za androgeni efekat. Dodatak Premarina na tretman sa DHEA dovodi do toga da epitel postaje deblji nego kod intaktnih životinja. Štaviše, kompaktnost kolagenih vlakanau lamina propriaje povećana dejstvom DHEA. Sa druge strane, tretman samo sa Akolbifenom pokazuje tendenciju za povećanje debljinelaminae propriae,koja dostiže debljinu kao kod intaktnih (neovariektomisanih) životinja onda kada se kombinuje sa DHEA.

Nakon ovariektomije, vaginalni mišićni sloj se smanjuje za 46%, što se za 41% i za 100% neutrališe primenom DHEA i Premarina, respektivno. Sa druge strane, smanjenje ukupne debljine yida vagine od 50% nakon ovariektomije se neutrališe za 42%) i za 93%o pomoću DHEA i Premarina, respektivno, dok kombinacija DHEA i Akolbifena vraća vrednost ukupne debljine zida vagine na vrednost koja nije značajno različita od debljine kod intaktnih (neoavriektomisanih) kontrolnih životinja.

Imunohistohemijska ispitivanja pokazuju izraženo bojenje na androgeni receptor (AR) kod svih životinja tretiranih sa DHEA. Sa druge strane, bojenje na estrogeni receptor tipa a (ERa) i na progesteronski receptor (PR) nije prisutno kod životinja iz grupe tretirane Akolbifenom.

U zaključku, tretman sa DHEA ili kombinacijom DHEA i Akolbifenom delimično ili u potpunosti sprečava pojavu atrofičnih promena indukovanih ovariektomijom, koje se mogu primetiti u različitim slojevima vaginalnog zida, i to putem predominantno androgenog efekta, koji se manifestuje mucifikacijom epitela i regulacijom AR na gore. Podaci kojima trenutno raspolažemo pokazuju posebno zanimljive efekte DHEA na građu tri sloja zida vagine, konkretno to su izražena mucifikacija epitela, povećanje kompaktnosti kolagenih vlakanau lamina propria,kao i povećanje ebljinelamina muscularis.Stoga, DHEA ispoljava i androgene i estrogene efekte na vaginalnu sluzokožu, čime se obezbeđuje supstituciona terapija koja je bliža normalnim fiziološkim uslovima. Iako svako od ispitivanih jedinjenja poseduje potencijalno povoljne efekte na vaginalnu funkciju, DHEA sam ili u kombinaciji može dobro i optimalno da otkloni isušenost vaginalne sluzokože i da povrati normalno fiziološko stanje vagine i da pomogne u otklanjanju seksualne disfunkcije koja je udružena sa menopauzom. DHEA i druge komponente mogu da se primene lokalno ili sistemski.

Selektivni modulator estrogenskog receptora prema predmetnom pronalasku ima molekulsku formulu sledećih osobina: a) dva aromatična prstena su razdvojena jednim ili sa dva umetnuta ugljenikova atoma, pri čemu su oba aromatična prstena ili nesupstituisana ili su supstituisani hidroksilnom grupom ili grupom koja sein vivoprevodi u hidroksilnu; i b) ima bočni lananac koji poseduje aromatični prsten i trecijarnu aminsku grupu koja je slobodna ili u obliku svoje soli.

Jedan pođeljni SERM prema predmetnom pronalasku je EM-800, koji je opisan u PCT/CA96/00097 (WO 96/26201). Molekulska struktura EM-800 je sledeća:

Drugi poželjni SERM prema predmetnom pronalasku je Akolbifen (EM-1538, koji je takođe označen i kao EM-652.HC1), koji je opisan u US 6,710,059 BI i koji ima sledeću strukturu:

i koji je hidrohloridna so moćnog antiestrogena EM-652. U poređenju sa EM-800, jedinjenje EM-1538 je sigurnije, jednostavnije i njegova so se lakše sintetiše. Veruje se da nakon primene bilo EM-800, bilo EM-1538in vivonastajeisto aktivno jedinjenje.

Drugi poželjni SERM je Lasoksifen (CP-336,156; D-(-)-tartaratna so (-)-cis-(5R,6S)-6-fenil-5-[4-(2-pirolidin-l-iletoksi)fenil]-5,6,7,8-tetrahidronaftalen-2-ola)

(dostupan od Pfizer Inc., SAD).

Drugi poželjni SERM prema predmetnom pronalasku obuhvata jedinjenja Tamoksifen ((Z)-2-[4-(l,2-difenil-l-butenil)]-N,N-dimetiletanamin) (dostupan od strane Zeneca, Velika Britanija), Toremifen (dostupan od strane Orion-Farmos Pharmaceutica, Finska ili Schering-Plough), Droloksifen i Raloksifen (Eli Lilly&Co., SAD), Arzoksifen (LY 335563) i LY 353381 (Eli Lilly&Co., SAD), Ospemifen (FC 1271) (dostupan od strane Orion-Farmos Pharmaceutica, Finska), Jodoksifen (SmithKline Beecham, SAD), Levormeloksifen ((3,4-trans-2,2-dimetil-3 -fenil-4- [4-(2-(2-(pirolidin-1 -il)etoksi)fenil] - 7-metoksihroman) (Novo Nordisk, A/S, Danska), koji je opisan u Shalmi et al., WO 97/25034, WO 97/25035, WO 97/25037, WO 97/25038; i u Korsgaard et al, WO 97/25036), GW-5638 (opisan od Wilson et al., 1997, Endocrinol 138(9): 3901 - 3011), SERM 3339 koji je u razvoju u kompaniji Aventis (Francuska) i derivati indola (opisani od strane Miller et al., EP 0802183A1) i TSE-424 i ERA-923, koje razvija Wyeth Ayers (SAD) koji je opisan u JP10036347 (American home products corporation) i nesteroidni estrogeni derivati opisani u WO 97/32837.

Može se upotrebiti bilo koji SERM koji se koristi ili zbog željene efikasnosti ili zbog preporuke proizvođača. Odgovarajuće doze su poznate u struci. Prema predmetnom pronalasku može a se upotrebi bilo koji komercijalno dostupan nesteroidni antiestrogen. Takođe, može se upotrebiti i bilo koje jedinjenje koje poseduje aktivnost sličnu onoj koju imaju SERM (na primer, može se koristiti Raloksifen).

SERM se poželjno primenjuju shodno predmetnom pronalasku u doznom opsegu od 0,01 - 10 mg/kg telesne mase na dan za oralnu upotrebu (poželjno od 0,05 - 1,0 mg/kg), pri čemu je za osobu prosečne telesne mase koja oralno uzima lek u ukupnoj dozi od 10 mg na dan, posebno u dozi od 20 mg na dan, poželjno da se doza podeli na dva jednaka dela; ili je dozni opseg između 0,003 - 3,0 mg/kg telesne mase na dan za parenteralnu upotrebu (poželjno od 0,015 - 0,3 mg/kg), pri čemu je za osobu prosečne telesne mase koja parenteralno (npr., intramuskularno, subkutano ili perkutano) uzima lek u ukupnoj dozi od 1,5 mg na dan, posebno u dozi od 3,0 mg na dan, poželjno da se doza podeli na dva jednaka dela. Poželjno je da se SERM primenjuju zajedno sa farmaceutski prihvatljivim diluentom ili nosiocem, koji su opisani u tekstu koji sledi.

Poželjni inhibitori cGMP fosfodiesteraze tipa 5 su Sildenafil, koji se prodaje pod zaštićenim imenom "Viagra" od strane Pfizer Inc. (SAD), Tadalafil, koji se prodaje pod zaštićenim imenom "Cialis" od strane Eli Lilly (SAD), vardenafil, koji se prodaje pod zaštićenim imenom "Levitra" od strane Bayer (Nemačka). Takođe su poželjni inhibitori cGMP fosfodiesteraze tipa 5 koji su trenutno u razvoju: DA-8159 od strane Dong-A Pharm Tech (Južna Koreja), EMR-62203 od strane Merck (Nemačka), TA-1790 od strane Tanabe Seivaku (Japan), SCH-446132 od strane Schering-Plough (SAD) i UK-371800 od strane Pfizer (SAD).

Jedan od poželjnih prostaglandina prema predmetnom pronalasku je alprostadil, koji se prodaje pod zaštićenim imenom "Alprox-TD" od strane NexMed (SAD).

Uz poštovanje svih doza koje su ovde preporučene, ordinirajući lekar treba da prati odgovor svakog pojedinačnog pacijenta i da shodno tome prilagodi dozu leka.

Primeri efikasnosti predmetnog pronalaska

Primer 1

Materijal i postupci

Životinje i tretmani

Korišćene su deset do dvanaest nedelja stare ženke Sprague-Dawley pacova (Crl:CD<®>(SD)Br VAF/Plus™) (Charles River Laboratory, St. Constant, Kanada) telesne mase od oko 220 - 270 g na početku eksperimenta. Životinje su aklimatizovane na uslove okruženja (temp. 22 ± 3 °C; vlažnost: 50 ± 20%; ciklusi svetio - tama od po 12 časova, svetio se uključuje u 07:15 č svakog jutra) tokom najmanje jedne nedelje pre početka eksperimenta. Životinje su bile smeštene individualno i dozvoljen im je slobodan pristup vodi i hrani za glodare (Lab Diet 5002, Ralston Purina, St. Louis, MO). Eksperiment je sproveden u odeljku za životinje koji je odobren od strane Kanadskog Veća za brigu o životinjama (CACC) i Udruženja za procenu i akreditaciju brige o laboratorijskim životinjama (AAALAC) shodno CCAC smernicama za brigu i upotrebu eksperimentalnih životinja.

Ukupno je 126 pacovki nasumično raspoređeno u 9 grupa po 14 životinja: 1) Intaktna kontrola (životinje nisu ovariektomisane), 2) ovariektomisana (OVX) kontrola (ne tretiraju se), 3) OVX pacovke tretirane Akolbifenom (2,5 mg/kg),4D) OVX pacovke tretirane Premarinom (0,5 mg/kg), 5) OVX pacovke tretirane Premarinom i Akolbifenom, 6) OVX pacovke tretirane sa DHEA (80 mg/kg), 7) OVX pacovke tretirane sa DHEA i Akolbifenom, 8) OVX pacovke tretirane sa DHEA i Premarinom, 9) OVX pacovke tretirane sa DHEA, Akolbifenom i Premarinom. Tokom prvog dana ispitivanja, životinje iz svih grupa (izuzev iz prve) su podvrgnute bilateralnoj ovariektomiji (OVX) u opštoj izofluranskoj anesteziji. Premarin i Akolbifen su primenjivani oralno putem tubusa (0,5 ml/pacovu) u obliku suspenzije u 0,4% metilcelulozi, dok je DHEA u rastvoru 50% etanola - 50%» propilen glikola (0,5 ml/pacovu) topijski primenjivan na kožu leđa koja je prethodno obrijana i čija je površina 2><2 cm. Izbor doznog opsega za Premarin odgovara minimalnoj dozi koja je dovoljna da se neutrališe atrofija materice uzrokovana ovariektomijom, dok je Akolbifen primenjivan u dozi koja je dovoljna da izazove atrofiju materice u meri koja je slična onoj nakon ovariektomije, nakon što je primenjen kod ovariektomisanih životinja tertiranih Premarinom. Doza DHEA koja je primenjivana uspostavlja nivo DHEA u krvi od 70 - 100 nmol/1. Tretmani su započeti tokom 2- dana ispitivanja, a jedinjenja su primenjivana jednom dnevno tokom 36 nedelja. Životinje iz intaktne kontrolne grupe i ovariektomisane kontrolne grupe su primale samo vehikulum.

Dvadeset četiri časa nakon primene poslednje doze, životinje kojima je obustavljeno davanje hrane preko noći su žrtvovane u opštoj izofluranskoj anesteziji putem iskrvarenja iz abdominalne aorte (po 9 životinja po grupi) ili putem intrakardijalne perfuzije sa 10% formalinom puferovanim do neutralne reakcije (5 životinja po grupi). Prikupljene su vagine od životinja žrtvovanih iskrvarenjem i izmerene su, dok su vagine prikupljene iz grupe životinja koja je žrtvovana intrakardijalnom perfuzijom označene crnim mastilom sa ventralne strane, a potom su obrađene kao što sledi.

Histološki postupci

Čitava vagina svake od perfundovanih životinja je naknadno fiksirana u 10%> formalinu puferovanom do neutralne reakcije. Svaka vagina je potom podeljena na sedam jednakih segmenata, kao što je ilustrovano na Slici 1, rutinski je obrađena i čitava potopljena u parafinski blok. Unutar parafinskog bloka, sedam cilindričnih vaginalnih segmenata je postavljeno u onom redosledu koji odgovara njihovom originalnom anatomskom položaju i orijentisano je upravno na površinu bloka, čime je omogućeno da segmenti budu isečeni u pravilne histološke preseke. Kod svake životinje načinjeni su parafinski preseci debljine od po 4 um, koji su obojeni hematoksilin - eozinom, radi morfološkog ispitivanja.

Histomorfometrij a

Merenja različitih slojeva vagine je izvedeno na petom segmentu (Slika 1), koji se otprilike nalazi između središnjeg regiona iportio vaginalis uteri(segment 7). Peti segment pokazuje reprezentativnu epitelnu površinu i dovoljnu debljinu glatko-mišićnog sloja. Slike su napravljene korišćenjem DC-330 3CCD fotoaparata u boji (Dage - MTI, Michigan City, IN, SAD) i kvantifikovane su korišćenjem programa Image-Pro Plus 3.0 (Media Cvbernetics, Silver Spring, MD, SAD). Tako su korišćenjem x5 objektiva (Leica Microsystems, Willowdale, Ontario, Kanada) izvedena po 3 - 4 merenja debljine po sloju iz reprezentativnih područja epitela ilaminae muscularis,kao i sva tri sloja vagine zajedno. Tako su izmereni ukupna debljina zida vagine, debljina epitela i debljina mišićnog sloja. Debljinalaminae propriaeje dobijena oduzimanjem debljine epitela i mišićnog sloja od ukupne debljine vaginalnog zida.

Imunohistohemii a

Imunološko bojenje je izvedeno korišćenjem Zymed SP kompleta (San Francisco, CA). Parafinski isečci (4 pm) su deparafinizovani u toluenu i rehidratisani su pomoću etanola. Endogena peroksidazna aktivnost je otklonjena preinkubacijom sa 3% H2O2u metanolu tokom 30 minuta. Primenjena je mikrotalasna tehnika preparacije uz korišćenje citratnog pufera (Tacha & Chen, 1994). Nakon hlađenja isečaka, nespecifično vezivanje je blokirano korišćenjem 10% kozijeg seruma tokom 20 minuta. Isečci su potom inkubirani tokom 1,5 časova na sobnoj temp. sa anti-ERa (AB-1, Calbiochem, CA), anti-AR (N-20, Santa Cruz Biotechnology, CA) ili anti-PR (Ab-4, NeoMarkers, CA) antitelima, u titru od 1 : 200, 1 : 250 i 1 : 250, respektivno. Nakon ispiranja sa PBS puferom, isečci su inkubirani sa biološki usitnjenim anti-zečijim sekundarnim antitelima tokom 10 minuta, a nakon toga sa streptavidin-peroksidazom tokom 10 minuta. Diamnobenzidin je korišćen kao hromogen, da bi se vizuelizovao biotin/streptavidin-peroksidazni kompleks, uz posmatranje mikroskopom. Kontra-bojenje je izvedeno korišćenjem #2 Gill-ovog hematoksilina tokom 30 sekundi. Radi kontrole, izvedena je imunoapsorpcija sa viškom peptida koji je koriščen da se podignu antitela, ili supstitucija sa neimunim zečijim IgG. Sprovedena je semikvantitativna analiza broja i intenziteta imunološki obojenih jedara, kao stoje naznačeno u Tabeli 2. E = morfologija epitela: KS (keratinizovani višeslojni skvamozni), LHM (velike hipertrofisane mukusne ćelije), SCM (male pravilno raspoređene kolumnarne ili kuboidne mukusne ćelije), MSM (mešoviti stratifikovani višeslojni epitel prekriven mukusnim ćelijama), A (atrofija; male kuboidne ćelije).

Dve različite oznake za dati segment označavaju dva različita obrsca, kao i da je prvi

od njih predominantan.

lL =debljinalaminae propriae:T (debeo), MT (umerene debljine), t (tanak)<2>Kompaktnost kolagenih vlakana: H (visoka), M (umerena), L (niska)

M = debljinalaminae muscularis:T (debela), M (umerene debljine), t (tanka), s (u tragovima)

Statistička analiza

Podaci su prikazani kao srednje vrednosti ± SEM za 8 - 9 životinja po grupi kod merenja vaginalne mase ili za 5 životinja po grupi kod merenja debljine vaginalnih slojeva. Statistička značajnost je određena pomoću Duncan - Kramer-ovog testa višestrukih rangova (Kramer, 1956, Biometrics, 12: 307 - 310).

Rezultati

Morfologija i debljina različitih slojeva vagine

Da bi se precizno i detaljno ispitala tri sloja zida vagine pacovki, konkretno epitel,lamina propriai/. muscularis,označeno je i potom ispitano sedam segmenata uzduž longitudinalne ose vagine (Slika 1). Iako su zapažene važne morfološke razlike između grupa, generalno, razlike su bile uniformne kod svih životinja iz iste grupe, a segmenti 2, 3, 4, 5, 6 i 7 su pokazali sličnu morfologiju epitela. Nekoliko izuzetaka koji su primećeni biće pomenuti kasnije. Stoga, segment 5 je korišćen da bi se prikazao efekat različitih tretmana na vaginalni epitel.

Epitel

U grupi ovariektomisanih životinja (OVX), odsustvo stimulacije iz jajnika je dovelo do atrofije vaginalnog epitela, koju karakteriše prisustvo nekih područja sa malim mukusnim ćelijama u svim segmentima (Tabela 1 i Slika 2C). Još je važnije napomenuti čest nalaz umerene ili izražene inflamacije sa mnogim fokusima intraepitelnih mikroapscesa (mala područja sa nakupljenim leukocitima unutar epitela). Ove promene su često udružene sa fokalnimerozijama (zone gde epitelni sloj delimično nedostaje) i ulceracijama (kompletan nedostatak epitelnog sloja) (Slika 3).

Kod ovariektomisanih (OVX) životinja tretiranih Akolbifenom, segment 1 pokazuje prisustvo keratinizovanog višeslojnog epitela koji je sličan onom kod grupe intaktnih životinja, sa izuzetkom da sadrži 9-11 slojeva ćelija u poređenju sa 10 - 15 slojeva koji se nalaze kod životinja u estrusu ili kod onih koje su ovariektomisane ali dobijaju tretman Premarinom (Slika 4). Debljina epitela kod životinja na Akolbifenu u segmentu 1 je tako veća nego kod ovariektomisanih pacovki, kod kojih je epitel debljine 4 - 6 slojeva. U drugim segmentima (Tabela 1), bazalni sloj ćelija je prekriven slojem niskih kolumnarnih mukusnih ćelija (Slika 2D), koje su više razvijene nego kod ovariektomisanih životinja. U grupi ovariektomisanih tretiranoj Akolbifenom, samo su tri od pet životinja pokazivale znake minimalne inflamacije, dok je nalaz umerene do izražene inflamacije bio opšti nalaz kod svih ovariektomisanih životinja.

U svim grupama, segment 1 je imao uporediv višeslojni skvamozni epitel, sa izuzetkom kod životinja iz grupe ovariektomisanih, gde je atrofija predominantna karakteristika (Slika 4). Štaviše, u grupi OVX + DHEA i OVX + DHEA + Akolbifen, mukusne ćelije često prate dominantni višeslojni skvamozni epitel segmenta 1 (nije prikazano).

Sedam segmenata vaginalnog epitela ovariektomisanih životinja koje su primale DHEA je sastavljen od velikih kolumnarnih mukusnih ćelija poredanih u više slojeva, sa razvučenim citoplazmatskim vakuolama, što je karakteristika koja je tipična za androgeni efekat (Tabela 1, Slika 2G). Nekoliko velikih invaginacija karakteriše epitel nakon tretmana sa DHEA. Slična morfologija epitela je pronađena u svim segmentima OVX + DHEA + Akolbifen grupe, s tim daje veličina mukusnih ćelija i broj njihovih slojeva bio smanjen (Tabela 1, Slika 2H). Kod životinja tretiranih sa DHEA i Premarinom, primećen je debeli višeslojni epitel "mešovitog" tipa sastavljen od skvamoznog epitela koji je prekriven slojevima mukusnih ćelija, koji su prisutni u različitim odnosima (Tabela 1, Slika 21) u području od drugog do petog segmenta, što otkriva kombinovane estrogene i androgene efekte. U ovoj grupi, tri životinje su pokazale mucifikaciju iznad gore navedenih segmenata, dok je kod druge dve životinje višeslojni skvamozni epitel primećen u svim segmentima (Tabela 1). Kada je Premarin kombinovan sa DHEA i Akolbifenom, epitel je bio sličan onom nađenom u grupi DHEA + Akolbifen, što ukazuje na blokadu proliferacije skvamoznih ćelija koja je indukovana estrogenom, od strane Akolbifena (Tabela 1 i Slika 2J).

Primena DHEA kod ovariektomisanih životinja povećava debljinu vaginalnog epitela do 38 ± 4 pm, dok dodavanje Akolbifena tretmanu sa DHEA ne menja debljinu epitela, koja ostaje na vrednosti 37 ± 5 nm. Kada se zajedno primenjuju Premarin i DHEA kod ovariektomisanih životinja, primećena je veća debljina epitela od 84 ± 6 um, što je vrednost koja nije statistički značajno različita od epitela životinja koje su primale samo Premarin. Na kraju, kombinacija Premarina, DHEA i Akolbifena je dovela do epitela debljine 32 ± 3 um, što je vrednost koja je slična onoj kod grupe koja je primala samo DHEA ili DHEA u kombinaciji sa Akolbifenom.

Lamina propria

Stepen kompaktnosti kolagenh vlakana u vagini je kategorizovan kao mala, umerena ili izražena (Slika 6) i posmatran je u području koje je proksimalno epitelu. "Mala" i "umerena" kompaktnost su udružene sa prisustvom grubih kolagenih vlakana koja su manje ili više gusto agregirana, respektivno, dok je "izražena" kompaktnost pojam kojim se opisuje gusto pakovana fina kolagena vlakna, koja imaju gladak, teksturisan izgled. Kod svih životinja, primećeno je relativno malo fibrocita u odnosu na

količinu kolagena, a i tada fibrociti izgledaju prevashodno spljošteni i sabijeni.

Pažljivo ispitivanje svake od životinja (Tabela 1) otkriva da je, generalno,

kompaktnost kolagenih vlakana u segmentu 1 umerena (sa izuzetkom nalaza male kompaktnosti kod pacovki u estrusu i kod ovariektomisanih životinja tretiranih Premarinom, ili nalaza izražene kompaktnosti kod ovariektomisanih bez tretmana i ovariektomisanih tretiranih sa DHEA), pri čemu se kompaktnost povećava u segmentima2 i 3, gde dostiže plato vrednost, koja generalno ostaje nepromenjena do segmenta 7. Stoga, uzduž longitudinalne ose vagine kod intaktnih životinja u estrusu kompaktnost kolagenih vlakana je bila mala u segmentima 1 - 3 i umerena u segmentima 4-7. Atrofija je često udružena sa povećanjem kompaktnosti kolagenih vlakana u grupi ovariektomisanih netretiranih i ovariektomisanih tretiiranih Akolbifenom (Tabela 1). Kod ovariektomisanih životinja tertiranih Premarinom, kompaktnost u segmentu 1 je mala, u segmentima 2 i 3 umerena, dok se u drugim segmentima kompaktnost kolagenih vlakana postepeno povećava , da bi postal izražena u segmentima 6 i 7.

Vizuelno ispitivanje debljinelaminaepropriae uzduž vagine upotrebom svetlosnog mikroskopa, generalno je pokazalo daje ona umerene debljine u segmentu 1, dok je tanja u segmentima 2 - 4. U segmentima 5-7, debljina se progresivno povećava do nivoa koji je sličan segmentu 1. Odgovarajuće srednje vrednosti debljinelaminae propriaekoja je merena u segmentu 5 (Slika 5) ukazuju da ovariektomija dovodi do značajnog smanjenja debljinelamina propria(76 ± 2 pm u poređenju sa 135 ± 28 um kod intaktne grupe), pri čemu smanjenje indukovano Akolbifenom (60 ± 8 um) nije značajno. Povećanje debljine koje je primećeno nakon Premarina ili tretmana Premarinom i Akolbifenom koji su primenjivani kod ovariektomisanih životinja ostaju ispod vrednosti kod intaktne grupe (100 ± 9 \ im i 90 ± 3 um, respektivno, u poređenju sa 135 ± 28 pm). Primena DHEA takođe dovodi do statistički beznačajnog povećanja u debljinilamina propria(96 ± 20 um), dok dodatak Akolbifena dovodi do daljeg povećanja debljine (136 ± 17um),što je vrednost koja dostiže onu kod intaktnih životinja. Tretman ovariektomisanih životinja Premarinom i DHEA značajno povećava debljinu (144 ± 14 pm) kada se poredi sa tretmanom samo sa DHEA. Konačno, životinje koje su tretirane Premarinom, DHEA i Akolbifenom pokazuju debljinu (99 ± 9 um) koja je slična onoj u grupi Premarin + DHEA, iako razlika nije statistički značajna.

DHEA indukuje umereno povećanje debljine/. muscularis(50 ± 2 um), koje je blago smanjeno dodavanjem Akolbifena (41 ± 3 um). Konačno, tretman Premarin + DHEA dovodi do značajnog povećanja debljine (62 ± 3 um), u poređenju sa vrednostima kod životinja tretiranih samo Akolbifenom. Kada se Akolbifen kombinuje sa Premarinom i DHEA, debljina/. muscularisse smanjuje (46 ± 5 pm) do vrednosti koja je uporediva sa onom kod životinja tretiranih sa DHEA i Akolbifenom.

Kada je merena ukupna debljina zida vagine (Slika 5D), spoljašnji tanki sloj vezivnog tkiva koje sačinjava adventiciju, nije bio uključen u merenje. Ovariektomija dovodi do izražene (za 51%) atrofije vaginalnog zida (128 ± 3 pm, u poređenju sa 262 ± 39 um kod intaktnih), a dodatak Akolbifena kod ovariektomisanih nema nikakav efekat (108 ± 8 um) (Slike 7A, B i C). Tretman Premarinom održava ukupnu debljinu na vrednosti (253 ± 10 pm) koja je slična onoj kod intaktnih životinja, dok dodavanje Akolbifena kod Premarinom tretiranih životinja neutrališe efekat Premarina (150 ± 4 um) (Slike 7D i E, respektivno). Ukupna debljina vaginalnog zida koja sepostiže uz tretman sa DHEA (184 ± 21 pm) je za oko 25%> niža od one koja je primećena u grupi tretiranjo samo Premarinom (Slika 7F). Sa druge strane, dodavanje Akolbifena kod tretmanu sa DHEA dovodi do povećanja debljine (213 ± 20 um) koje nije stat. značajno, i koje postaje beznačajno različito od vrednosti u grupi intaktnih (Slika 7G). Konačno, zajednička primena Premarina i DHEA kod ovariektomisanih životinja izraženo povećava debljinu (290 ± 13 pm) do vrednosti koja je slična onoj kod intaktnih životinja (Slika 7H). Dodatak Akolbifena tretmanu sa Premarinom i DHEA neutališe njihov efekat do vrednosti (176 ± 11pm)koja nije stat- značajno različita od vrednosti u grupi tretiranih samo sa DHEA (Slika 71).

Masa vagine

Nakon osam meseci tretmana, promene koje se primećujuu masi vagine između različitih grupa (Slika 8) generalono prate gore opisana morfološka posmatranja. Zaista, masa vagine nakon ovariektomije se smanjuje za oko 50% (101 ± 5 mg) u poređenju sa intaktnom grupom (205 ± 11 mg), dok tretman ovariektomisanih životinja samo Akolbifenom nema efekta na masu vagine. Sa druge strane, primena Premarina dovodi do povećanja mase vagine koja još uvek ne dostiže vrednost kao kod intaktnih životinja (180 ± 9 mg), dok dodavanje Akolbigena kod životinja tretiranih Premarinom neutrališe povećanje mase indukovano estrogenom do vrednosti koja je slična onoj kod ovariektomisanih životinja (96±4 mg). Suprotno od toga, kada je DHEA davan ovariektomisanim životinjama, masa vagine se povećala do vrednosti (171 ± 12 mg) koja je slična onoj kod grupe tretirane Premarinom, dok je kombinacija Akolbifena i DHEA dovela do smanjenja mase (135 ± 9 mg), pri čemu su vrednosti mase ostale iznad onih kod grupe ovariektomisanih. Konačno, zajednička primena Premarina i DHEA ko ovariektomisanih životinja dovodi do porasta mase vagine (179 ± 10 mg), pri čemu se dostižu vrednosti koje su slične onima u grupi ovariektomisanih tretiranih sa DHEA i u grupi ovariektomisanih tretiranih Premarinom. Dodavanje Akolbifena ovoj kombinaciji ne dovodi do značajnog efekta (194 ± 12 mg).

Tretman ovariektomisanih životinja sa DHEA dovodi izraženog imunološkog bojenja AR u mnogobrojnim jedrima u sva tri zida vagine, pri čemu se isti obrazac bojenja primećuje kada se koristi kombinacija DHEA + Akolbifen i DHEA + Premarin, s tim izuzetkom da se primećuje manji broj imunološki obojenih jedara u površnim slojevima epitela u ovoj drugoj grupi. Kombinacija DHEA, Prearina i Akolbifena takođe dovodi do izraženog bojenja većine jedara u sva tri sloja vagine.

Diskusija

Isušenost vaginalne sluzokože ili atrofični vaginitis, koji se takođe označava i kao urogenitalna atrofija, zajedno sa seksualnom disfunkcijom je uobičajen problem kod žena u postmenopauzi (Notelovitz, 2000, Menopause, 7(3): 140 - 142). Najčesšći simptomi su isušenost, peckanje, svrab, iritacija i dispareunija, što vodi smanjenju libida i kvaliteta života (Berman et al., 1999, Curr Opin Urol, 9(6): 563 - 568). S obzirom da se zna daje u ovo uključen gubitak estrogena, susptituciona terapija estrogenom (ERT - estrogen replacement therapy)i hormonska supstituciona terapija (HRT) su tretmani izbora. Međutim, pošto nove informacije iz oblasti fiziologije seksualnih steroida kod žena snažno sugerišu važnu ulogu androgena (Labrie et al., 2003, End Rev, 24(2): 152 - 182), predmetni pronalazak upoređuje ukupne hormonske efekte alternative za HRT ili ERT, konkretno, efekte samostalno primenjenog DHEA ili u kombinaciji sa čistim antiestrogenom Akolbifenom i takođe sa Premarinom, na morfologiju vagine i na ekspresiju receptora za seksualne steroide. DHEA je primenjivan perkutano, kako bi se izbegli efekti prvog prolaska kroz jetru (Labrie et al., 1996, Endocrinol, 150: S107 - S118).

Konačno, naši rezultati pokazuju značajno povećanje mase vagine nakon tretmana Premarinom, u poređenju sa masom kod ovariektomisanih životinja, pri čemu je ta vrednost slična onoj u grupi tretiranoj sa DHEA. Važno je prisetiti se da, iako se povećanje mase vagine i materice kod glodara obično uzima kao mera dejstva estrogena, ovi organi takođe mogu da odgovore na primenu progesterona i testosterona, između ostalih (Emmens & Martin, 1964, Dorfman (urednik), izdanje Academic Press NY:1).

U sklopu potencijalne trostruke kombinacije, konjski estrogen Premarin je namenjen da deluje na mozak, u cilju smanjenja vazomotornih simptoma. U stvari, povoljni efekti zajedničke primene čistog selektivnog antiestrogena Akolbifena i estrogena, u cilju neutralisanja neželjenih perifernih efekata estrogena, dobro su opisani od strane Labrie i saradnika (Labrie et al, 2003, Endocrinol, 144(11): 4700 - 4706). U predmetnoj studiji, prilikom primene Akolbifena kod ovariektomisanih životinja, najtipičnija morfološka karakteristika koja je indukovana ovim SERM je bila pojava površinskog sloja pravilno raspoređenih malih mukusnih ćelija koje prekrivaju sloj bazalnih ćelija, što je obrazac koji je nešto više izražen u grupi koja dobija Premarin + Akolbifen i koji ostaje dominantan u svim grupama tretiranim Akolbifenom, uključujući i situaciju kada je SERM korišćen sa DHEA. Mucifikacija vaginalnog epitela usled tretmana antiestrogenom je primećena i kod polno nezrelih pacovki (Anderson & Kang, 1975, Am J Anat, 144(2): 197 - 207) i kod odraslih pacovki (Yoshida et al., 1998, Cancer Lett, 134(1): 43 - 51). Iako je ovaj morfološki obrazac poređen sa mucifilacijom izazvanom progesteronom (Anderson & Kang, 1975, Am, J Anat, 144(2): 197 - 207), molekulski mehanizam kojim antiestrogen dovodi do pojave mucifikacije epitela ostaje nepoznat.

Opisani su mnogi povoljni efekti DHEA u grup žena u postmenopauzi (Labrie et al., 1997, J Clin Endocrinol Metab, 82: 3498 - 3505; Labrie et al., 1991, Mol Cell Ebdocrinol, 78: Cl 13 - Cl 18). S obzirom da nije kategorizovan poseban receptor za DHEA, morfološke promene koje se primećuju na vaginama pacovki nakon tretmana sa DHEA odslikavaju proces njegovog intrakrinog prevođenja u aktivne seksualne steroide koji imaju androgeni i/ili estrogeni efekat putem intrakrinih mehanizama (Labrie et al., 1991, Mol Cell Endocrinol, 78: Cl 13 - Cl88). Ove promene obuhvataju intenzivnu mucifikaciju epitela, izraženu kompaktnost delikatnih, fino upredenih kolagenih vlakanau lamina propria,kao i umereno povećanje debljine/. muscularisu poređenju sa vrednostima kod ovariektomisanih životinja. Prve dve morfološke promene su tipične za androgeni efekat, dok je treća aktivnost koja liči na estrogenu, što je dalje podržano istovremenim povećanjem ekspresije progesteronskog receptora u /.muscularis.

Pošto se DHEA transformiše ili jedan ili androgena ili u estrogen ili i u androgen i u estrpgen u perifernim tkivima, debeli mucifikovani višeslojni epitel koji je primećen u predmetnoj studiji nakon tretmana ovariektomisanih životinja sa DHEAsugeriše predominantni androgeni efekat u smislu mucifikacije u vaginama pacovki, što je efekat koji koji može da maskira bilo koji potencijalni istovremeno postojeći manji estrogeni efekat na nivou epitela. Prethodna studija je pokazala postojanje istog efekta mucifikacije na vagine pacovki (Sourla et al., 1998, J Steroid Biochem Mol Biol, 66(3): 137 - 149); u toj prethodnoj studiji, intravaginalna primena DHEA je dovela do značajno ispoljenog efekta u dozi koja je deset puta manja od one za koju je nađeno da je aktivna nakon primene DHEA na kožu leđa.

Trenutno postojeći podaci ukazuju na iistovremeno postojanje izraženih androgenih i malo izraženih estrogenih efekata DHEA na vaginu pacovke. Štaviše, rezultati predmetnog pronalaska su dobro podržani ispitivanjem vaginalnog epitela kod ovariektomisanih životinja koje su dobijale isti topijski tretman sa DHEA koji je korišćen i u našoj studiji uz dodatak subkutane doze antiandrogena Flutamida (FLU)

(podaci nisu objavljeni). Zaista, androgeni efekat mucifikacije koj je izazvala androgen akomponenta DHEA je bio potpuno neutralisan primenom FLU, a ovaj tretman je doveo do pojave višeslojnog skvamoznog epitela koji je tipičan za estrogeni efekat (podaci nisu prikazani). U slučaju da DHEA ima isključivo androgeni efekat (mucifikacija) na vaginu pacovke, ovaj efekat bi bio neutralisan primenom FLU, s tim da bi bio primećen i atrofični epitel koji je sličan onom kod ovariektomisanih životinja. Prethodna ispitivanja kod gonadoektomisanih mužijaka u ženki pacova su jasno

ustanovile da tretman sa DHEA dovodi do stimulatornih androgenih i/ili estrogenih efekata na prostatu, semene kesice i matericu, u zavisnosti od ciljnog tkiva koje se ispituje (Labrie et al., 1998, Endocrinol, 123: 1412- 1417).

kombinacija DHEA i Akolbifena, sa jedne strane pokazuje smanjenje u stepenu mucifikacije epitela, što se manifestuje altenacijom između sloja pravilno raspoređenih mukusnih ćelija - što je efekat Akolbifena - i invaginacija višeslojnih hipertrofisanih mukusnih ćelija - što odgovara androgenimefektima DHEA. Shodno tome, Akolbifen inhibira delimičan estrogeni efekat DHEA, pri čemu se pridružena izražena androgena dejstva DHEA održavaju, a ovome je dodat i mali estrogenu sličan efekat samog Akolbifena, pri čemu se on najbolje primećuje na nivou ostijuma vagine. Smanjenje mase vagine koje se primećuje nakon dodavanja Akolbifena ovariektomisanim životinjama tretiranim sa DHEA je manje izražen nego onaj koji se primećuje nakon dodavanja Akolbifena tretmanu Premarinom, što ilustruje manje izraženu estrogenu komponentu dejstva DHEA koja je neutralisana dejstvom antiestrogena, dok je izraženo androgeno dejstvo DHEA nepromenjeno. Dodatno, povećanje debljinelaminae propriaei kompaktnsti kolagenih vlakana u njoj, kada se poredi sa vrednostima kod ovariektomisanih i intaktnih životinja, respektivno, i u grupi tretiranoj sa DHEA + Akolbifen, sugeriše, ponovo, potencijalnu ulogu androgena na povećanje kompaktnosti kolagena i na debljinu sloja, jer je estrogena komponenta dejstva DHEA blokirana Akolbifenom.

Druge studije su pokazale da je dejstvo DHEA na mlečnu žlezdu pacovki (Sourla et al., 1998, Endocrinol, 139: 753 - 764), lojne žlezde u koži (Sourla et al., 2000, J Endocrinol, 166(2): 455 - 462) i na mineralnu gustinu kostiju (Martel et al., 1998, J Endocrinol, 157: 433 - 442) skoro isključivo androgeni efekat. U svakom slučaju, prisustvo estrogenog dejstva DHEA na vaginu pacovke je prethodno pokazano putem indukcije otvaranja vagine i prerane ovulacije kod polno nezrelih pacovki koje su tretirane ovim jedinjenjem, dok DHT, androgen koji ne može da se aromatizuje u estrogene, ne proizvodi takve efekte (Knudsen & Mahesh, 1975, Endocrinol, 97(2): 458 - 468). Kapacitet tkiva vagine pacovki da aromatizuje androgene, posebno testosteron, verovatno doprinosi velikom delu estrogenih efekata DHEA u ovom organu (Lephart et al., 1989, Biol Reprod, 40(2): 259 - 267). Androst-5-en-3p\17p-diol (5-diol), jedan od DHEA metabolita za koji se zna da se vezuje za estrogeni receptor (Shao et al., 1950, J Biol Chem, 250: 3095 - 3100; Poortman et al., 1975, J Clin Endocrinol Metab, 40(3): 373 - 379; Van Doorn et al., 1981, Endocrinol, 108: 1587 - 1594; Adams et al., 1981, Cancer Res, 41: 4720 - 4726) takođe može da doprinosi njegovom estrogenomefektu (Poulin & Labrie, 1986, Cancer Res, 46: 4933 - 4937). Predložena kombinacija antiestrogena Akolbifena i DHEA bi, tako, mogla da spreči nastanak bilo kog neželjenog stimulatornog efekta 5-diola. Sa druge strane, Akolbifen može da ispolji dodatne povoljne efekte sprečavajući gubitak koštane mase (Martel et al., 2000, J Steroid Biochem Mol Biol, 74(1-2): 45 - 46).

Koliko je predlagačima poznato, ni jedna od prethodno sprovedenih studija nije opisala stimulatorne efekte DHEA na kompaktnost i morfologiju kolagenih vlakana ulamina propriai u manjoj meri u /.muscularis.Takva dejstva androgena i estrogena izvedenih iz DHEA mogu imati povoljna dejstva na funkciju vagine kod žena u postmenoapuzi i trebalo bi da obezbede osnovu koja je potrebna za dejstvo inhibitora fosfodiesteraze tipa 5, kao što su sildnafil ili tadalafil, verovatno putem androgenima ili estrogenima indukovane facilitacije relaksacije glatkih mišića vagine posredovane endotelnom sintazom azot oksida (eNOS) (revijski prikazano od strane Munarriz et al., 2003, J Urol, 170(2 Pt 2): S40 - S44, Diskusija S44 - S45). U stvari, otkriveno je da Akolbifen indukuje eNOS u endotelnim ćelijama kod ljudi i pacova (Simoncini et al., 2002, Endocrinol, 143(6): 2052 - 2061).

Rezultati koji su dobijeni u svim grupama kojima je davan DHEA tretman pokazuju da je ekspresija AR regulisana na goree putem androgena koji su dobijeni intrakrinom trensformacijom DHEA u vagini pacovki, i to na sličan način u sva tri vaginalna odeljka.

Povoljne morfološke promene koje su primećene zajedno sa izraženom modulacijom AR u vagini pacovki od strane androgena sugerišu da smanjenje nivoa androgena izvedenih iz DHEA kod žena u postmenopauzi može da doprinosi narušavanju normalnog stanja vagine i na kraju gubitku libida i uživanja seksualnom odnosu, što se primećuje u ovoj starosnoj grupi. Smanjenje nivoa ukupnog testosterona u serumu, nivoa slobodnog testosterona i DHEA-S su zaista nalazi otkriveni kod žena koje su došle na konsultacije zbog smanjenja seksualne želje (Guay & Jacobson, 2002, J Sex Marital Ther, 28 Suppl 1: 129 - 142).

U predmetnoj studiji je otkriveno da tretman ovariektomisanih pacovki sa DHEA ili kombinacijom DHEA i Akolbifena i kombinacijom DHEA, Akolbifena i Premarina, neutrališe ovariektomijom izazvane atrofične promene koje se mogu naći u vagini, i to prevashodno androgenimefektom posredovanim sa AR, koji se ogleda u intenzivnoj mucifikaciji epitela i u povećanju kompaktnosti kolagenih vlakanau laminapropria.Tretman samo sa DHEA takođe umereno povećava debljinu/. muscularis.Navedeni podaci naglašavaju važnost seksualnih steroida koji se sintetišu lokalno iz DHEA i DHEA-S u perifernim ciljnim tkivima. Kao dodatak ovim povoljnim efektima, Akolbifen smanjuje incidencu inflamacije, verovatno putem estrogenu sličnoj indukciji keratinizovanog skvamoznog epitela u nivou ostijuma, kao i putem antiestrogenog efekta na mucifikaciju na unutrašnjim nivoima vagine.

Načinjeni su različiti pokušaji da se reši problem isušenosti vaginalne sluzokože, koja se često povezuje sa dispareunijom i gubitkom sposobnosti uživanja u seksualnom odnosu. Kao primer, može se navesti da se često prepisuju lokalni vaginalni estrogeni preparati u cilju otklanjanja tegoba, ali na taj način može biti stimulisan endometrijum noponiranim dejstvom estrogena (Mattson et al., 1989, Maturitas, 11: 217 - 222). Kod žena u menopauzi koje su podvrgnute histerektomiji, ERT se i dalje koristi, ali sa znanjem o dobro poznatom povećanom riziku za razvoj kancer dojke. Štaviše, ERT smanjuje serumske nivoe androgena tako što povećava nivo globulina koji vezuje seksualne steroide, što može da indukujerelativnu ovarijsku i adrenalnu deficijenciju, što je još jedan od racionalnih razloga za alternativnu fiziološku supstituciju androgena (Casson et al., 1997, Obstet Gvnecol, 90(6): 995 - 998).

Primer 2

Postupci

Životinje i tretmani

Korišćene su deset do dvanaest nedelja stare ženke Sprague-Dawley pacova (Crl:CD<®>(SD)Br) (Charles River Laboratory, St. Constant, Kanada) telesne mase od oko 215 - 265 g u vreme izvođenja ovariektomije. Životinje su imale individualni smeštaj u prostoriji sa kontrolisanim okruženjem (temp. 22 ± 3 °C; vlažnost: 50 ± 20%; ciklusi svetio - tama od po 12 časova, svetio se uključuje u 07:15 č svakog jutra). Životinje su imale slobodan pristup vodi i sertifikovanoj hrani za glodare (Lab Diet 5002 (zrnasta), Ralston Purina, St. Louis, MO). Eksperiment je sproveden u odeljku za životinje koji je odobren od strane Kanadskog Veća za brigu o životinjama (CACC) i Udruženja za procenu i akreditaciju brige o laboratorijskim životinjama (AAALAC) shodno CCAC smernicama za brigu i upotrebu eksperimentalnih životinja.

Sprovedeni su različiti eksperimenti: dve dvadesetodnevne i dve osmomesečne studije. U svakom od prva dva eksperimenta, životinje su nasumično raspoređene u 3 grupe od po 13 ili 14 životinja na sledeći način: T) Intaktne kontrole; 2) ovariektomisane (OVX) kontrole; 3) OVX + Raloksifen (0,5 mg/kg) ili 3) OVX + LY 363381 (0,5 mg/kg). U jednoj osmomesečnoj studiji, životinje su nasumično raspoređene u 5 grupa od po 7 - 8 životinja na sledeći način: 1) Intaktne kontrole; 2) ovariektomisane (OVX) kontrole; 3) OVX + Akolbifen (0,5 mg/kg) ili 4) OVX + ERA-923 (0,5 mg/kg); 5) OVX + TSE-424 (0,5 mg/kg). U drugoj osmomesečnoj studiji, životinje su nasumično rspoređene u tri grupe od po 10 - 11 životinja na sledeći način: 1) Intaktne kontrole; 2) ovariektomisane (OVX) kontrole; 3) OVX + Lasofoksifen (0,5 mg/kg). Tokom prvog dana studije, životinje iz odgovarajućih grupa su podvrgnute bilateralnoj ovariektomiji (OVX) u sulovima opšte izofluranske anestezije. Ispitivana jedinjenja su davana jednom dnevno oralno putem tubusa u vidu suspenzije u 0,4% metilcelulozi (0,5 ml po pacovu) tokom dana 1 do 20 ili tokom dana 1 do kraja 32. nedelje ispitivanja.

Dvadeset četiri časa nakon primene poslednje doze, životinje su žrtvovane u opštoj izofluranskoj anesteziji putem iskrvarenja. Prikupljene su vagine i neposredno nakon resekcije su potopljene u 10% formalin koji je puferovan do neutralne reakcije. Vagine su ili isečene u 7 poprečnih segmenata (u studiji sa Akolbifenom, ERA-923 i TSE-424) ili su isečene tako da je uzet isečak samo središnjeg poprečnog segmenta (raloksifen, lasofoksifen ili KY 363381). Segmenti su potom rutinski obrađeni i utopljeni u parafinske blokove. Kada je to bilo potrebno, svi segmenti su postavljeni u parafinski blok redosledom koji odgovara njihovom originalnom anatomskom položaju i orijentisani su upravno na površinu bloka, čime je omogućeno da budu isečeni u poprečne preseke. Kod svake životinje je napravljen parafinski presek debljine 4 um, koji je obojen hematoksilin - eozinom radi morfološke analize.

Na Slikama 10 i 11 je prikazano poređenje između različitih SERM: morfologija vaginalnog epitela kod ovariektomisanih paovki, pri uveličanju od 200x. Slike A do D prikazuju morfologiju epitela prvog segmenta vagine (ostium). Dok je epitel ovariektomisanih životinja tanak (4-6 slojeva ćelija), atrofičan i ne pokazuje vidljiv granulani sloj na Slici A, isti epitel je deblji kod životinja koje su primale tretman sa tri SERM (8-11 slojeva) i pokazuje višeslojni granularni region, što se vidi na Slikama B, C i D. Na Slikama E do K, prikazanje središnji segment vagine. Kod ovariektomisanih životinja, vaginalni epitel je tanak i atrofičan (2 - 3 sloja ćelija) (Slika E), dok je njegova debljina povećana kod sve tri tretirane grupe (Slike F do K), usled prisustva jednog (u grupi sa Akolbifenom, ERA-923 i TSE-424) ili više (u grupi sa raloksifenom, lasofoksifenom ili LY 363381) slojeva mukusnih ćelija koje prekrivaju bazalni sloj ćelija.

Primer 3

Materijali i postupci

Korišćene su deset do dvanaest nedelja stare ženke Sprague-Dawley pacova (Crl:CD<®>(SD)Br VAF/Plus™) (Charles River Laboratory, St. Constant, Kanada) telesne mase od oko 250 - 275 g na početku eksperimenta. Životinje su aklimatizovane na uslove okruženja (temp. 22 ± 3 °C; vlažnost: 50 ± 20%; ciklusi svetio - tama od po 12 časova, svetio se uključuje u 07:15 č svakog jutra) tokom najmanje jedne nedelje pre početka eksperimenta. Životinje su bile smeštene individualno i dozvoljen im je slobodan pristup vodi i hrani za glodare (Lab Diet 5002, Ralston Purina, St. Louis, MO). Eksperiment je sproveden shodno CCAC smernicama za brigu i upotrebu eksperimentalnih životinja, u odeljku za životinje koji je odobren od strane Kanadskog Veća za brigu o životinjama (CACC) i Udruženja za procenu i akreditaciju brige o laboratorijskim životinjama (AAALAC).

Ukupno je 25 pacovki nasumično raspoređeno u 5 grupa na sledeći način: 1) tri ovariektomisane (OVX) netretirane kontrole; 2) Četiri ovariektomisane životinje koje primaju supozitoriju sa placebom; 3) Šest ovariektomisanih životinja koje primaju supozitoriju sa 0,33 mg DHEA; 4) Šest ovariektomisanih životinja koje primaju supozitoriju sa 0,66 mg DHEA; 5) Šest ovariektomisanih životinja koje primaju supozitoriju sa 1,00 mg DHEA. Tokom prvog dana studije, životinje iz svih odgovarajućih grupa su podvrgnute bilateralnoj ovariektomiji u uslovima opšte izofluranske anestezije. Primena po jedne supozitorije u vaginu je počelo tokom dana 5 ispitivanja i nastavljeno je jednom dnevno do 18. dana, u ukupnom trajanju od 14 dana. Supozitprija je nežno primenjena u otvor vagine, a potom je pažljivo gurnita 2 - 3 mm unutar vagine uz pomoć malog staklenog štapa, dezinfikovanog 70%) alkoholom i osušenog pre ponovnog korišćenja kod nove životinje.

Dvadeset četiri časa nakon davanja poslednje doze, životinje su žrtvovane u izofluranskoj anesteziji putem iskrvarenja. Vagine (uključujući uretre i materice) su prikupljene, a potom obrađene kao što je opisano ispod. Radi dalje analize, uzeta su po dva uzorka ingvinalnih mlečnih žlezdi, kao i kvadratni uzorak kože leđa veličine 2><2 cm preko koje je primenjivan tretman (ova koža je stavljena i pažljivo rastegnuta na parčetu kartona).

Pripremanje supozitorija

DHEA supozitorije su pripremljene korišćenjem VThitepsol H-15 osnove za supozitorije (Medisca, Montreal, Kanada). Takođe, može se upotrebiti bilo koja druga lipofilna osnova za supozitorije, kao što je Fattibase, Wecobee, kakao puter, theobroma ulje ili druge kombinacije Whitepsol osnova. Izmerene su odgovarajuće količine DHEA, kako bi se dobila količina od po 0,33 mg ili 0.66 mg ili 1,00 mg po supozitoriji u krajnjoj zapremini od 50 ul ± 3 ul. Odgovarajuća količina zrnaste osnove za supozitorije koja je potrebna za dobijanje krajnje zapremine koja je potrebna je izračunata na osnovu prethodno izmerene gustine baze za supozitorije, koja je iznosila 47,5 mg/50 ul. Osnova za supozitorije je u malu posudu, istopljena je u mikrotalasnoj pećnici pri snazi od 50% tokom 3 min i 30 sekundi, a potom je prebačena na ploču za zagrevanje, koja je podešena na najmanju snagu, kako bi se osnova za supozitorije održavala na temp. 50 ± 3 °C. Potom je u bazu dodat mikronizovani DHEA prašak (nabavljen od Scheweizerhall Inc., u čistoći 100%), izjedna, pa je brdašce praška ostavljeno da potone u tečni deo tokom 3 minuta, pre nego što je polako i detaljno mešanjem rastvoreno pomoću glatkog zaobljenog staklenog štapića. Na kraju, osnova za supozitorije sa rastvorenim DHEA (placebo je predstavljao samo osnovu, bez DHEA) je izlivena korišćenjem Gilson pipete od 1000 ul, čiji je vrh prethodno zagrejan, u cilindrični kalup sa serijom modli od po 50 ul. Modle su napravljene od tubusa mikrocentrifuge, pri čemu je svaka od njih prethodno kalibrisana sa 50 ul vode i isečena na nivoulinije koja je povučena u nivou površine vode. Nakon 30 minuta hlađenja na sobnoj temp., supozitorije su ostavljene na 4 °C tokom 30 minuta. Na kraju, višak osnove za supozitorije je obrađen žiletom, a supozitorije su uklonjene iz modli i pohranjene u zatvorene staklene bočice na 4 °C sve do upotrebe. Pre primene na životinjama, ostavljene su da se zagreju do sobne temp.

Histološki postupci

Neposredno nakon resekcije, organi su potopljeni u 10% rastvor formalina puerovanog do neutralne reakcije. Svaki od preparata vagine i uterusa je podeljen na 8 jednakih poprečnih segmenata, pri čemu 4 poprečna segmenta obuhvataju dva iz područja cerviksa i dva iz proksimalnih i distalnih rogova uterusa, respektivno. Segmenti su potom rutinski obrađeni i svi zajedno su ubačeni u isti parafinski blok. U okviru parafinskog bloka, svi segmenti su postavljeni onim redosledom koji odgovara njihovom originalnom anatomskom položaju, a orijentisani su upravno na površinu bloka, što omogućava da budu napravljeni poprečni isečci datih segmenata. Za svaku od životinja je napravljen parafinski isečak debljine 4 um, koji je obojen hematoksilin - eozinom radi histološke analize.

Rezultati

Morfologija epitela

Nakon ispitivanja svih segmenata vagne, nađeno je da su segmenti 4 i 6 reprezentativni i korišćeni su za poređenje tretmana. Segment 4 je najbliži segment ostijumu vagine koji ne pokazuje karakteristike spoljašnje kože i nije (ili je u manjoj meri) zahvaćen blagimdo umerenim inflamatornim promenama koje se obično nalaze u spoljašnim područjima vaginalne mukoze kod kontrolnih životinja. Segment 6 predstavlja vaginalnu sluzokožu u dubljim delovima vagine i razdvojen je od grlića materice samo jednim segmentom.

Generalno, ventralna strana vagine pokazuje deblji i više mucifikovan epitel u poređenju sa dorzalnom stranom.

INTAKTNE ŽIVOTINJE

Kao što je prikazano na Slici 13, u periodu estrus, u kome je dominantan uticaj estrogena, vaginalni epitel je debeo i kratinizovan. Poseduje 12 do 18 slojeva ćelija u segmentu 4 i 12 do 15 slojeva u segmentu 6. Nasuprot debelom višeslojnom skvamoznom epitelu koji se vidi u predelu ostijuma, granularni sloj nije očigledan u unutrašnjimdelovima vaginalnog epitela. U periodu metestrusa, pod minimalnim hormonskim uticajem, vaginalni epitel je tanji. Poseduje oko 6 do 10 slojeva ćelija u segmentu 4 i 5 do 7 slojeva ćelija u segmentu 6.

OVARIEKTOMISANE NETRETIRANE ŽIVOTINJE

Kao što je prikazano na SLici 14, u segmentu 4 vagina je obložena skvamoznim višeslojnim epitelom debljine 2 do 6 slojeva. Debljina ovog segmenta je vrlo varijabilna među životinjama. U segmentu 6, primećuje se kompletna atrofija, sa 2 do 3 sloja spljoštenih ćelija. Kod ovih životinja po čitavoj vagini primećuju se retki fokusi malih cilindričnih mukusnih ćelija. Od tri životinje u ovoj grupi, dve su pokazivale blage inflamatorne promene u spoljašnja tri segmenta.

PLACEBO GRUPA

Kao što je prikazano na Slici 15, u poređenju sa grupom ovariektomisanih netretiranih životinja, skvamozni višeslojni epitel vagine u grupi ovariektomisanih koja je tretirana placebom primećuje se malo deblji epitel, pri čemu segment 4 poseduje 4 do 8 slojeva ćelija. Međutim, u segmentu 6, nađena je ista morfologija kao kod ovariektomisanih netretiranih životinja, sa debljinom od 2 do 3 sloja epitelnih ćelija. Kao i kod ovariektomisanih netretiranih životinja, mogu senaći fokusi sa malim cilindričnim mukusnim ćelijama duž čitave vagine, u nešto većoj meri nego kod ovariektomisanih netretiranih. Od četiri životinje u ovoj grupi, tri pokazuju blage inflamatorne promene u spoljašnja tri segmenta.

GRUPA TRETIRANA SA DHEA U DOZI OD 0,33 mg PO SUPOZITORIJI

Kao što je prikazano na Slici 16, generalno, pri malim dozama, morfološki efekat DHEA se karakteriše pravilno rasporođenim cilindričnim mukusnim ćelijama, dok se pri većim dozama mukusne ćelije uvećavaju (hipertrofišu), povećavaju broj vakuola i redaju se u slojevima. U ovoj grupi, efekat DHEA se slabije vidi u segmentu 2 i postaje uočljiviji u segmentima 3 - 4, gde se smenjuju pravilno raspoređene i hipertrofične mukusne ćelije. Efekat DHEA se polako smanjuje u segmentima 5 i 6, gde mogu da se primete skoro isključivo pravilno raspoređene mukusne ćelije. Efekat postaje veoma slabo izražen u segmentu 7 i nestaje u lateralnim vaginalnim svodovima segmenta 8 (koji obuhvata početak grlića materice). Tako, u segmentu 4 vaginalni epitel je višeslojan skvamozni sa 3 do 7 slojeva ćelija. Oko 20 do 60% obloge vaginalnog epitela se sastoji od pravilno raspoređenih mukusnih ćelija, koje se smenjuju sa područjima koje obuhvata 15 do 50% i prekriveno je hipertrofičnim mukusnim ćelijama, koje u jednom ili u više slojeva prekrivaju sojeve epitela, a ostatak čine nemucifikovana područja. U segmentu 6 debljina epitela je smanjena gotovo do one vednosti koja se nalazi kod ovariektomisanih netretiranih životinja. On je tipa višeslojnog skvamoznog epitela i sastoji se od 2 do 5 slojeva, koji su prekriveni slojem pravilno raspoređenih mukusnih ćelija. Primećena je velika varijabilnost u pojavi mukusnih ćelija, koje prekrivaju od 5. do 75% površine vagine i msenjuju se sa nemucifikovanim područjima. Od šest tretiranih životinja, četiri pokazuju blagu inflamaciju, koja je nejednako raspoređena po čitavoj vagini.

GRUPA TRETIRANA SA DHEA U DOZI OD 0,66 mg PO SUPOZITORIJI

Kao što je prikazano na Slici 17, u ovoj grupi efekat DHEA se može primetiti u segmentu 2 i značajno se povećava u segmentima 3 - 4 i 5, gde se primećuju hipertrofične mukusne ćelije. Broj hipertrofičnih ćelija se samnjuje u segmentima 5 i 6, gde su mukusne ćelije koje su pravilno raspoređene u većini. Tako, u segmentu 4, vaginalni epitel je višeslojan skvamozni sa 3 do 6 slojeva ćelija. Oko 5 do 20% obloge vaginalnog epitela se sastoji od pravilno raspoređenih mukusnih ćelija, koje se smenjuju sa područjima koje obuhvata 10 do 75% i prekriveno je hipertrofičnim mukusnim ćelijama, koje u jednom ili u više slojeva prekrivaju sojeve epitela. Nemucifikovana područja su takođe prisutna. U segmentu 6 debljina epitela je smanjena i on je tipa višeslojnog skvamoznog epitela debljine od 2 do 4 slojeva, koji su prekriveni slojem pravilno raspoređenih mukusnih ćelija. Veličina mucifikovanih ćelija varira od 20 do 80%) površine vagine i one se smenjuju sa nemucifikovanim područjima. Od šest tretiranih životinja, dve pokazuju blagu inflamacijuu spoljašnja tri segmenta.

GRUPA TRETIRANA SA DHEA U DOZI OD 1,00 mg PO SUPOZITORIJI

Kao što je prikazano na Slici 18, u ovoj grupi efekat DHEA je takođe uočljiv u segmentu 2 i povećava se značajno u segmentima 3 - 4 i 5, gde su primećene u velikom mnoštvu hipertrofične mukusne ćelija, dok se efekat vrlo malo smanjuje u segmentima 6 - 7 i 8, gde su primećene u velikom mnoštvu pravilno raspoređene mukusne ćelije. Stoga, u segmentu 4, višeslojani skvamozni epitel ima od 3 do 9 slojeva ćelija. Hipertrofične ,ukusne ćelije prekrivaju epitel debljine 3-4 sloja skvamoznih ćelija na površini od 50 - 70% vaginalne mukoze, dok pravilno raspoređene mukusne ćelije prekrivaju površinu od 5 - 30% mukoze vagine. Nemucifikovana područja su takođe umetnuta između mucifikovanih. U segmentu 6 debljina epitela je takođe smanjena i ima od 2 do 4 sloja ćelija. Hipertrofične mukusne ćelije prekrivaju epitel koji je debljine 1 - 3 sloja skvamoznih ćelija na površini od oko 30 do 100% vaginalne mukoze, dok pravilno raspoređene mukusne ćelije prekrivaju površinu od 0 do 70%. Može se primetiti nekoliko nemucifikovanih područja. Od šest tretiranih životinja, četiri pokazuju blagu inflamacijuu spoljašnja četiri segmenta.

Zaključci

1. Vehikulum koji se koristi za intravaginalni tretman poseduje poželjne karakteristike: a. Lako se priprema u kalibrisanimmodlama; b. Poseduje odlično izraženu sposobnost da u potpunosti rastvori DHEA u obliku mikronizovanog praška, čime se obezbeđuje standardno doziranje; c. Ne izaziva značajnu reakciju tkiva i morfološke promene vaginalne mukoze: primećeno je samo blago povećanje debljine epitela u prva 3-4 segmenta, verovatno usled manipulacije koja prati inserciju supozitorije. 2. DHEA ispoljava efekat na morfologiju vaginalnog epitela u najmanjoj ispitivanj dozi (0,33 mg o supozitoriji). Efekat je maksimalan u 3 - 5 segmentu, a potom se postepeno smanjuje, da bi nestao na nivou 7. segmenta. 3. Pri dozi od 0,66 mg DHEA po supozitoriji, efekat je takođe prisutan od 3. segmenta i ostaje izražen i u 6. segmentu. 4. Pri dozi od 1,00 mg DHEA po supozitoriji, efekat je izražen od segmenta 2 - 3 i ostaje takav sve do vaginalnih svodova koji okružuju grlić materice.

Primeri farmaceutskih preparata

Kao što je predstavljeno u tekstu koji sledi, primera, a ne radi ograničavanja, je predstavljeno nekoliko farmaceutskih preparata koji sadrže poželjni aktivni SERM Akolbifen, poželjni aktivni prekursor seksualnih steroida DHEA, poželjni estrogen 17P-estradiol ili Premarin, poželjni inhibitor cGMP fosfodiesteraze tipa 5 Sildenafil ili Tadalafil. Koncentracija aktivnog sastojka može da varira u širokom opsegu, kao što je ovde opisano. Količine i tipovi drugih sastojaka koji mogu da se koriste u preparatu su dobro poznati u struci.

Primer A

Primer B

Gelatinska kapsula

Primer C Primer DGelatinska kapsula

Primer E

Primer FGelatinska kapsula Primer G

PrimerH Gelatinska kapsula

Primer I Primer JGelatinska kapsula

Primer K

Vaginalni krem

Primer LVaginalna supozitorija

DHEA supozitorije su pripremljene korišćenjem Whitepsol H-15 baze (Medisca, Montreal, Kanada). Može se upotrebiti bilo koja druga lipofilna baza, kao što je Fattibase, Wecobee, kakao buter, teobroma ulje ili druge kombinacije VVhitepsol baza.

Primeri kompleta

Kao što je prikazano ispod, primera radi, a ne da bi se ograničio obim zaštite, predstavljeno je nekoliko kompleta koji sadrže poželjni aktivni SERM Akolbifen, poželjni aktivni seksualni steroidni prekursor DHEA, poželjni estrogen 17J3-estradiol ili konjugovani estrogeni, poželjni inhibitor čGMP fosfodiesteraze tipa 5 Sildenafil ili Tadalafil. Koncentracija aktivnog sastojka može da varira u opsegu koji je ovde definisan. Količine i tipovi drugih sastojaka koji mogu biti upotrebljeni si dobro poznati u struci.

PrimerA

SERM, estrogeni i inhibitor cGMP fosfodiesteraze tipa 5 se primenjuju oralno, dok se prekursor seksualnih steroida primenjuje lokalno ili perkutano.

Preparat SERM za oralnu primenu (kapsule)

Preparat SERM + estrogeni za oralnu primenu (kapsule)

Preparat SERM + estrogeni + inhibitor cGMP fosfodiesteraze tipa 5 za oralnu primenu

(kapsule)

Preparat prekursora seksualnih steroida za topijsku primenu (gel)

PrimerB

SERM i prekursor seksualnih steroida se primenjuju oralno Preparat nesteroidnog antiestrogena za oralnu primenu (kapsule)

Preparat prekursora seksualnog steroida z aoralnu primenu (gelatinske kapsule)

Drugi SERM (Toremifen, Ospemifen, Raloksifen, Arzoksifen, Lasofoksifen, TSE-424, ERA-923, EM-800, SERM 3339, GW-5638) takođe mogu da zamene Akolbifen u gore navedenim formulacijama, a takođe i drugi inhibitori seksualnih steroida mogu da zamene DHEA, drugi estrogeni mogu da zamene Premarin, i drugi inhibitori cGMP fosfodiesteraze tipa 5 mogu da zamene Sildenafil iliTadalafil ili njih može da zameni prostaglandin El. Preparat može da sadrži više od jednog SERM, više od jednog prekursora seksualnih steroida, više estrogena ili inhibitora cGMP fosfodiesteraze tipa 5, pti čemu je maseni udeo kombinacije poželjno isti kao maseni udeo za sam prekursor ili sam SERM koji su navedeni u primerima iznad.

Claims (66)

1. Postupak tretiranja ili smanjivanja verovatnoće razvijanja problema koji zahvataju sloj lamina propria i/ili sloj lamina muscularis vagine kod žena u postmenopauzi, naznačen time što navedeni postupak obuhvata primenu prekursora seksualnih steroida, koji je izabran iz grupe koju čine dehidroepiandrosteron, dehidroepiandrosteron sulfat, androst-5-en-3(3,17[3-diol i 4-androsten-3,17-dion, kod pacijenta kome je takav tretman potreban.

2. Postupak prema Zahtevu 1, naznačen time što dalje obuhvata korak primene kod navedenog pacijenta terapijski efikasne količine selektivnog modulatora estrogenskog receptora, zbog zaštite uterusa i mlečne žlezde protiv kancera, u sklopu kombinovane terapije.

3. Postupak prema Zahtevu 2, naznačen time što je selektivni modulator estrogenog receptora akolbifen.

4. Postupak prema zahtevu 1, naznačen time što dalje obuhvata korak primene kod navedenog pacijenta terapijski efikasne količine estrogena, u sklopu kombinovane terapije.

5. Postupak prema Zahtevu 1, naznačen time što dalje obuhvata korak primene kod navedenog pacijenta terapijski efikasne količine estrogena i terapijski efikasne količine selektivnog modulatora estrogenog receptora, zbog zaštite uterusa i mlečne žlezde protiv kancera, u sklopu kombinovane terapije.

6. Postupak prema Zahtevu 5, naznačen time što je selektivni modulator estrogenog receptora akolbifen.

7. Postupak prema Zahtevu 1, naznačen time što su oboljenja vagine ili vaginalni problemi izabrani iz grupe koju čine isušenost vaginalne sluzokože, atrofični vaginitis, vaginalni pruritus, dispareunija i seksualna disfunkcija.

8. Postupak prema Zahtevu 2, naznačen time što su oboljenja vagine ili vaginalni problemi izabrani iz grupe koju čine isušenost vaginalne sluzokože, vaginalni pruritus, atrofija vagine, atrofični vaginitis, dispareunija i seksualna disfunkcija.

9. Postupak prema Zahtevu 4, naznačen time što su oboljenja vagine ili vaginalni problemi izabrani iz grupe koju čine isušenost vaginalne sluzokože, vaginalni pruritus, atrofija vagine, atrofični vaginitis, dispareunija i seksualna disfunkcija.

10. Postupak prema Zahtevu 5, naznačen time što su oboljenja vagine ili vaginalni problemi izabrani iz grupe koju čine isušenost vaginalne sluzokože, vaginalni pruritus, atrofični vaginitis, atrofija vagine, dispareunija i seksualna disfunkcija.

11. Postupak povećavanja kompaktnosti kolagenih vlakana u sloju lamina propria vaginalnog zida kod žena u postmenopauzi, naznačen time što navedeni postupak obuhvata primenu prekursora seksualnih steroida, koji je izabran iz grupe koju čine dehidroepiandrosteron, dehidroepiandrosteron sulfat, androst-5-en-3P,17p-diol i 4-androsten-3,17-dion, kod pacijenta kome je takav tretman potreban.

12. Postupak prema Zahtevu 11, naznačen time što dalje obuhvata korak primene kod navedenog pacijenta terapijski efikasne količine selektivnog modulatora estrogenskog receptora, zbog zaštite uterusa i mlečne žlezde protiv kancera, u sklopu kombinovane terapije.

13. Postupak prema zahtevu 11, naznačen time što dalje obuhvata korak primene kod navedenog pacijenta terapijski efikasne količine estrogena, u sklopu kombinovane terapije.

14. Postupak prema Zahtevu 11, naznačen time što dalje obuhvata korak primene kod navedenog pacijenta terapijski efikasne količine estrogena i terapijski efikasne količine selektivnog modulatora estrogenog receptora, u sklopu kombinovane terapije.

15. Postupak povećavanja debljine sloja lamina muscularis vaginalnog zida kod žena u postmenopauzi, naznačen time što navedeni postupak obuhvata primenu prekursora seksualnih steroida, koji je izabran iz grupe koju čine dehidroepiandrosteron, dehidroepiandrosteron sulfat, androst-5-en-3p,17P-diol i 4-androsten-3,17-dion, kod pacijenta kome je takav tretman potreban.

16. Postupak prema Zahtevu 15, naznačen time što dalje obuhvata korak primene kod navedenog pacijenta terapijski efikasne količine selektivnog modulatora estrogenskog receptora, zbog zaštite uterusa i mlečne žlezde protiv kancera, u sklopu kombinovane terapije.

17. Postupak prema zahtevu 15, naznačen time što dalje obuhvata korak primene kod navedenog pacijenta terapijski efikasne količine estrogena, u sklopu kombinovane terapije.

18. Postupak prema Zahtevu 15, naznačen time što dalje obuhvata korak primene kod navedenog pacijenta terapijski efikasne količine estrogena i terapijski efikasne količine selektivnog modulatora estrogenog receptora, u sklopu kombinovane terapije.

19. Postupak za tretiranje ili smanjivanje verovatnoće razvoja seksualne disfunkcije kod žena u postmenopauzi, naznačen time što navedeni postupak obuhvata primenu terapijski efikasne količine selektivnog modulatora estrogenskog receptora kod navedenog pacijenta kome je takav tretman potreban, pri čemu postupak dalje obuhvata korak primene kod navedenog pacijenta terapijski efikasne količine inhibitora cGMP fosfodiesteraze tipa 5 ili prostaglandina, u sklopu kombinovane terapije.

20. Postupak za tretiranje ili smanjivanje verovatnoće razvoja seksualne disfunkcije kod žena u postmenopauzi, naznačen time što navedeni postupak obuhvata primenu terapijski efikasne količine prekursora seksualnih steroida, koji je izabran iz grupe koju čine dehidroepiandrosteron, dehidroepiandrosteron sulfat, androst-5-en-3p,17P-diol i 4-androsten-3,17-dion, kod pacijenta kome je takav tretman potreban, i koji dalje obuhvata korak primene kod navedenog pacijenta terapijski efikasne količine inhibitora cGMP fosfodiesteraze tipa 5 ili prostaglandina, u sklopu kombinovane terapije.

21. Postupak prema Zahtevu 20, naznačen time što dalje obuhvata korak primene kod navedenog pacijenta terapijski efikasne količine selektivnog modulatora estrogenskog receptora, u sklopu kombinovane terapije.

22. Postupak prema zahtevu 21, naznačen time što dalje obuhvata korak primene kod navedenog pacijenta terapijski efikasne količine estrogena, u sklopu kombinovane terapije.

23. Postupak prema Zahtevu 1, naznačen time što je prekursor seksualnih steroida dehidroepiandrosteron.

24. Postupak prema Zahtevu 1, naznačen time što je prekursor seksualnih steroida dehidroepiandrosteron sulfat.

25. Postupak prema Zahtevu 1, naznačen time što je prekursor seksualnih steroida androst-5-en-3 P, 17P-diol.

26. Postupak prema Zahtevima 19-22, naznačen time što je inhibitor cGMP fosfodiesteraze tipa 5 izabran iz grupe koju čine sildenafil (l-[[3-(4,7-dihidro-l-metil-7-okso-3 -propil-1 H-pirazolo [4,3 -d]pirimidin-5-il)-4-etoksifenil] sulfonil] -4-metilpiperazin), tadalafil (6R,12aR)-6-(l,3-benzodioksol-5-il)-2,3,6,7,12,12a-heksahidro-2-metilpirazino[ 1 ',2': 1,6]pirido[3,4-b]indol-l ,4-dion, DA-8159, EMR-62203, TA-1790, UK-371800 i SCH-446132.

27. Postupak prema Zahtevima 19-22, naznačen time što je prostaglandin konkretno Prostaglandin El (alprostadil; (1 la,13E,15S)-ll,15-dihidroksi-9-oksoprost-13-en-l-oična kiselina).

28. Postupci prema Zahtevima 1, 2-6, 11-18 i 20-22, naznačeni time što se prekursor seksualnih steroida primenjuje intravaginalno.

29. Postupci prema Zahtevima 1, 2-6, 11-18 i 20-22, naznačeni time što se prekursor seksualnih steroida primenjuje oralno ili perkutano.

30. Postupci prema Zahtevima 2, 3, 5, 6, 12, 14, 16, 18, 19, 21 i 22, naznačeni time što se selektivni modulator estrogenog receptora primenjuje oralno, perkutano ili intravaginalno.

31. Postupak za tretiranje atrofičnog vaginitisa ili vaginalne atrofije kod žena u postmenopauzi, naznačen time što navedeni postupak obuhvata primenu prekursora seksualnih steroida, koji je izabran iz grupe koju čine dehidroepiandrosteron, dehidroepiandrosteron sulfat, androst-5-en-3p,17P-diol i 4-androsten-3,17-dion, zajedno sa selektivnim modulatorom estrogenog receptora kod pacijenta kome je takav tretman potreban.

32. Postupak prema Zahtevu 31, naznačen time što dalje obuhvata korak primene kod navedenog pacijenta terapijski efikasne količine estrogena, u sklopu kombinovane terapije.

33. Postupak prema Zahtevu 31 ili 32, naznačen time što se prekursor seksualnih steroida i selektivni modulator estrogenog receptora primenjuju intravaginalno, oralno ili perkutano.

34. Postupak prema bilo kom od prethodnih Zahteva 2, 3, 5, 12, 14, 16, 18, 19, 21, 22 ili 30-33, naznačen time što selektivni modulator estrogenskog receptora ima molekulsku formulu sa sledećim karakteristikama: a) dva aromatična prstena razdvojena jednim ili sa dva umetnuta ugljenikova atoma, pri čemu su oba aromatična prstena ili nesupstituisana ili su supstituisani hidroksilnom grupom ili grupom koja sein vivoprevodi u hidroksilnu; b) bočni lanac koji poseduje aromatični prsten i tercijarnu aminsku funkcionalnu grupu ili njenu so.

35. Postupak prema Zahtevu 34, naznačen time što selektivni modulator estrogenskog receptora poseduje sledeću formulu: gde su Rji R2nezavisno vodonik, hidroksilna grupa ili grupa koja sein vivoprevodi u hidroksilnu grupu; Z je bivalentna zatvarajuća podjedinica; R100je bivalentna podjedinica koja razdvaja L od B prstena pomoću 4-10 umetnutih atoma; L je bivalentna ili trivalentna polarna podjedinica izabrana iz grupe koju čine -SO-, -CON-, -N< i -SON<; Gije izabrana iz grupe koju čine vodonik, C1-C5ugljovodonik ili bivalentna podjedinica koja spaja G2 i L kako bi se formirao petočlani do sedmočlani heterociklični prsten, ili halogeni ili nezasićeni derivati perthodno navedenih; G2je ili odsutna ili je izabrana iz grupe koju čine vodonik, C1-C5ugljovodonik ili bivalentna podjedinica koja spaja Gii L kako bi se formirao petočlani do sedmočlani heterociklični prsten ili halogeni ili nezasićeni derivati prethodno navedenih; G3je izabrana iz grupe koju čine vodonik, metil i etil grupa.

36. Postupak prema Zahtevu 34, naznačen time što selektivni modulator estrogenog receptora optički aktivno jedinjenje koje ima apsolutnu konfiguraciju S na ugljenikovom atomu 2, ili je njegova farmaceutski prihvatljiva so, pri čemu navedeno jedinjenje poseduje sledeću molekulsku strukturu: gde su Rii R2nezavisno izabrane iz grupe koju čine hidroksilna grupa i grupa koja sein vivoprevodi u hidroksilnu grupu; R3je podjedinica koja je izabrana iz grupe koju čine zasićena, nezasićena ili supstituisana pirolidinil grupa; zasićena, nezasićena ili supstituisana piperidino grupa; zasićena, nezasićena ili supstituisana piperidinil grupa; zasićena, nezasićena ili supstituisana morfolino grupa; ciklična grupa koja sadrži azot; policiklična grupa koja sadrži azot; i NRaRbgrupa (Rai Rbsu nezavisno vodonik, pravolančana ili razgranata Ci-Cćalkil grupa, pravolančana ili razgranata C2- Ce alkenil grupa, kao i pravolančana ili razgranata C2-C6alkinil grupa).

37. Postupak prema Zahtevu 36, naznačen time što u navedenom jedinjenju ili soli praktično nema (2R)-enantiomera.

38. Postupak prema Zahtevu 36, naznačen time što je benzopiranski derivat so kiseline koja je izabrana iz grupe koju čine sirćetna kiselina, adipinska kiselina, benzensulfonska kiselina, benzojeva kiselina, kamforsulfonska kiselina, limunska kiselina, fumarna kiselina, jodovodonična kiselina, bromovodonična kiselina, hlorovodonična kiselina, hidrohlorotiazidna kiselina, hidroksi-naftoična kiselina, mlečna kiselina, maleinska kiselina, metansulfonska kiselina, metilsumporna kiselina, 1,5-naftalendisulfonska kiselina, azotna kiselina, palmitinska kiselina, trimetilsirćetna kiselina, fosforna kiselina, propionska kiselina, ćilibarna kiselina, sumporna kiselina, vinska kiselina, tereftalna kiselina, p-toluensulfonska kiselina i valerijanska kiselina.

39. Postupak prema bilo kom od prethodnih Zahteva 12, 14, 16, 18, 19, 21, 22 ili 30-33, naznačen time što je navedeni selektivni modulator estrogenskog receptora:

40. Postupak prema Zahtevu 34, naznačen time što je jedinjenje izabrano iz grupe koju čine: (-)-cis-(5R,6S)-6-fenil-5-[4-(2-pirolidin-l-iletoksi)fenil]-5,6,7,8-tetrahidronaftalen-2-ol, D-(-)-tartaratna so (lasofoksifen).

41. Postupak prema bilo kom od prethodnih Zahteva 2- 6, 11-18,20-22, 28, 29 ili 31-33, naznačen time Stoje prekursor seksualnih steroida dehidroepiandrosteron.

42. Farmaceutski preparat za vaginalnu primenu, naznačen time što sadrži: a) farmaceutski prihvatljiv ekscipijent, diluent ili nosilac koji je pogodann za primenu na sluzokožu vagine; b) terapijski efikasnu količinu barem jednog prekursora seksualnih steroida, koji je izabran iz grupe koju čine dehidroepiandrosteron, dehidroepiandrosteron sulfat i androst-5-en-3 P, 17P-diol.

43. Farmaceutski preparat prema Zahtevu 42, naznačen time što dodatno sadrži terapijski efikasnu količinu barem jednog selektivnog modulatora estrogenskog receptora.

44. Farmaceutski preparat prema Zahtevu 43, naznačen time što dodatno sadrži terapijski efikasnu količinu barem jednog estrogena.

45. Farmaceutski preparat, naznačen time što sadrži: a) farmaceutski prihvatljiv ekscipijent, diluent ili nosilac; b) terapijski efikasnu količinu barem jednog prekursora seksualnih steroida koji je izabran iz grupe koju čine dehidroepiandrosteron, dehidroepiandrosteron sulfat i androst-5-en-3p,17P-diol; i c) terapijski efikasnu količinu barem jednog inhibitora cGMP fosfodiesteraze tipa 5.

46. Farmaceutski preparat, naznačen time što sadrži: a) farmaceutski prihvatljiv ekscipijent, diluent ili nosilac; b) terapijski efikasnu količinu barem jednog prekursora seksualnih steroida izabranog iz grupe koju čine dehidroepiandrosteron, dehidroepiandrosteron sulfat i androst-5-en-3p,17p-diol; c) terapijski efikasnu količinu barem jednog inhibitora cGMP fosfodiesteraze tipa 5; i d) terapijski efikasnu količinu selektivnog modulatora estrogenskog receptora.

47. Farmaceutski preparat prema Zahtevu 42, naznačen time stoje ekscipijent, diluent ili nosilac gel.

48. Farmaceutski preparat prema Zahtevu 42, naznačen time što je farmaceutski preparat supozitorija ili ovula.

49. Farmaceutski preparat prema bilo kom od prethodnih Zahteva 43 ili 44, naznačen time što selektivni modulator estrogenskog receptora ima molekulsku formulu sledećih karakteristika: a) dva aromatična prstena razdvojena jednim ili sa dva umetnuta ugljenikova atoma, pri čemu su oba aromatična prstena ili nesupstituisana ili su supstituisani hidroksilnom grupom ili grupom koja sein vivoprevodi u hidroksilnu; b) bočni lanac koji poseduje aromatični prsten i tercijarnu aminsku funkcionalnu grupu ili njenu so.

50. Farmaceutski preparat ili prema Zahtevu 43 ili 44, naznačen time što selektivni modulator estrogenskog receptora poseduje sledeću formulu: gde su Rii R2nezavisno vodonik, hidroksilna grupa ili grupa koja sein vivoprevodi u hidroksilnu grupu; Z je bivalentna zatvarajuća podjedinica; R100je bivalentna podjedinica koja razdvaja L od B prstena pomoću 4-10 umetnutih atoma; L je bivalentna ili trivalentna polarna podjedinica izabrana iz grupe koju čine -SO-, -CON-, -N< i -SON<; Gije izabrana iz grupe koju čine vodonik, C1-C5ugljovodonik ili bivalentna podjedinica koja spaja G2i L kako bi se formirao petočlani do sedmočlani heterociklični prsten, ili halogeni ili nezasićeni derivati perthodno navedenih; G2 je ili otsutna ili je izabrana iz grupe koju čine vodonik, C1-C5ugljovodonik ili bivalentna podjedinica koja spaja Gii L kako bi se formirao petočlani do sedmočlani heterociklični prsten ili halogeni ili nezasićeni derivati prethodno navedenih; G3je izabrana iz grupe koju čine vodonik, metil i etil grupa.

51. Farmaceutski preparat ili prema Zahtevu 43 ili 44, naznačen time što je selektivni modulator estrogenog receptora optički aktivno jedinjenje koje ima apsolutnu konfiguraciju S na ugljenikovom atomu 2, ili je njegova farmaceutski prihvatljiva so, pri čemu navedeno jedinjenje poseduje sledeću molekulsku strukturu: gde su Rii R2nezavisno izabrane iz grupe koju čine hidroksilna grupa i grupa koja sein vivoprevodi u hidroksilnu grupu; R3je podjedinica koja je izabrana iz grupe koju čine zasićena, nezasićena ili supstituisana pirolidinil grupa; zasićena, nezasićena ili supstituisana piperidino grupa; zasićena, nezasićena ili supstituisana piperidinil grupa; zasićena, nezasićena ili supstituisana morfolino grupa; ciklična grupa koja sadrži azot; policiklična grupa koja sadrži azot; i NRaRbgrupa (Rai Rbsu nezavisno vodonik, pravolančana ili razgranata Ci-Cćalkil grupa, pravolančana ili razgranata C2-C6alkenil grupa, kao i pravolančana ili razgranata C2-C6alkinil grupa).

52. Farmaceutski preparat prema Zahtevu 51, naznačen time što je navedeno jedinjenje ili njegova so praktično ne sadrži (2R)-enantiomer.

53. Farmaceutski preparat prema Zahtevu 51, naznačen time što je benzopiranski derivat so kiseline koja je izabrana iz grupe koju čine sirćetna kiselina, adipinska kiselina, benzensulfonska kiselina, benzojeva kiselina, kamforsulfonska kiselina, limunska kiselina, fumarna kiselina, jodovodonična kiselina, bromovodonična kiselina, hlorovodonična kiselina, hidrohlorotiazidna kiselina, hidroksi-naftoična kiselina, mlečna kiselina, maleinska kiselina, metansulfonsk'a kiselina, metilsumporna kiselina, 1,5-naftalendisulfonska kiselina, azotna kiselina, palmitinska kiselina, trimetilsirćetna kiselina, fosforna kiselina, propionska kiselina, ćilibarna kiselina, sumporna kiselina, vinska kiselina, tereftalna kiselina, p-toluensulfonska kiselina i valerijanska kiselina.

54. Farmaceutski preparat prema bilo kom od prethodnih Zahteva 43 ili 44, naznačen time što je navedeni selektivni modulator estrogenskog receptora:

55. Farmaceutski preparat prema bilo kom od Zahteva 43 ili 46, naznačen time što je navedeno jedinjenje: (-)-cis-(5R,6S)-6-fenil-5-[4-(2-pirolidin-l-iletoksi)fenil]-5,6,7,8-tetrahidronaftalen-2-ol, D-(-)-tartaratna so (lasofoksifen).

56. Farmaceutski preparat prema bilo kom od prethodnih Zahteva 42 - 55, naznačen time što je prekursor seksualnih steroida dehidroepiandrosteron.

57. Komplet, naznačen time što sadrži prvi kontejner u kome se nalazi terapjiski efikasna količina barem jednog inhibitora cGMP fosfodiesteraze tipa 5, koji je izabran iz grupe koju čine Prostaglandin El, sildenafil i tadalafil, ili jedinjenja koja poseduju sličnu aktivnost, i koji dalje sadrži drugi kontejner u kome se nalazi terapijski efikasna količina barem jednog prekursora seksualnih steroida koji je izabran iz grupe koju čine dehidroepiandrosteron, dehidroepiandrosteron sulfat i androst-5-en-3p,17p-diol.

58. Komplet, naznačen time što sadrži prvi kontejner u kome se nalazi terapijski efikasna količina barem jednog prekursora seksualnih steroida, koji je izabran iz grupe koju čine dehidroepiandrosteron, dehidroepiandrosteron sulfat, androst-5-en-?ft 1 ^R-rlirvI i Ltvii HcjIia cndrži Hm i m LrmtAitiAr n Wvmj=» oc* nalomi foroniJrVi afi^ornokoličina barem jednog selektivnog modulatora estrogenskog receptora, i treći kontejner koji sadrži terapijski efikasnu količinu barem jednog inhibitora cGMP fosfodiesteraze tipa 5 ili Prostaglandin El.

59. Komplet prema Zahtevu 58, naznačen time što selektivni modulator estrogenskog receptora ima molekulsku formulu sa sledećim karakteristikama: a) dva aromatična prstena razdvojena jednim ili sa dva umetnuta ugljenikova atoma, pri čemu su oba aromatična prstena ili nesupstituisana ili su supstituisani hidroksilnom grupom ili grupom koja sein vivoprevodi u hidroksilnu; b) bočni lanac koji poseduje aromatični prsten i tercijarnu aminsku funkcionalnu grupu ili njenu so.

60. Komplet prema Zahtevu 59, naznačen time što selektivni modulator estrogenskog receptora poseduje sledeću formulu: gde su Rii R2nezavisno vodonik, hidroksilna grupa ili grupa koja sein vivoprevodi u hidroksilnu grupu; Z je bivalentna zatvarajuća podjedinica; Riooje bivalentna podjedinica koja razdvaja L od B prstena pomoću 4-10 umetnutih atoma; L je bivalentna ili trivalentna polarna podjedinica izabrana iz grupe koju čine -SO-, -CON-, -N< i -SON<; Gije izabrana iz grupe koju čine vodonik, Ci-C5ugljovodonik ili bivalentna podjedinica koja spaja G2i L kako bi se formirao petočlani do sedmočlani heterociklični prsten, ili halogeni ili nezasićeni derivati perthodno navedenih; G2 je ili otsutna ili je izabrana iz grupe koju čine vodonik, C1-C5ugljovodonik ili bivalentna podjedinica koja spaja Gi i L kako bi se formirao petočlani do sedmočlani heterociklični prsten ili halogeni ili nezasićeni derivati prethodno navedenih; G3je izabrana iz grupe koju čine vodonik, metil i etil grupa.

61. Komplet prema Zahtevu 59, naznačen time što je selektivni modulator estrogenog receptora optički aktivno jedinjenje koje ima apsolutnu konfiguraciju S na ugljenikovom atomu 2, ili je njegova farmaceutski prihvatljiva so, pri čemu navedeno jedinjenje poseduje sledeću molekulsku strukturu: gde su Rii R2nezavisno izabrane iz grupe koju čine hidroksilna grupa i grupa koja sein vivoprevodi u hidroksilnu grupu; R3je podjedinica koja je izabrana iz grupe koju čine zasićena, nezasićena ili supstituisana pirolidinil grupa; zasićena, nezasićena ili supstituisana piperidino grupa; zasićena, nezasićena ili supstituisana piperidinil grupa; zasićena, nezasićena ili supstituisana morfolino grupa; ciklična grupa koja sadrži azot; policiklična grupa koja sadrži azot; i NRaRbgrupa (Rai Rbsu nezavisno vodonik, pravolančana ili razgranata C\- C(, alkil grupa, pravolančana ili razgranata C2-C6alkenil grupa, kao i pravolančana ili razgranata C2-C6alkinil grupa).

62. Komplet prema Zahtevu 61, naznačen time što navedeno jedinjenje ili njegova so praktično ne sadrže (2R)-enantiomer.

63. Komplet prema Zahtevu 61, naznačen time što je benzopiranski derivat so kiseline koja je izabrana iz grupe koju čine sirćetna kiselina, adipinska kiselina, benzensulfonska kiselina, benzojeva kiselina, kamforsulfonska kiselina, limunska kiselina, fumarna kiselina, jodovodonična kiselina, bromovodonična kiselina, hlorovodonična kiselina, hidrohlorotiazidna kiselina, hidroksi-naftoična kiselina, mlečna kiselina, maleinska kiselina, metansulfonska kiselina, metilsumporna kiselina, 1,5-naftalendisulfonska kiselina, azotna kiselina, palmitinska kiselina, trimetilsirćetna kiselina, fosforna kiselina, propionska kiselina, ćilibarna kiselina, sumporna kiselina, vinska kiselina, tereftalna kiselina, p-toluensulfonska kiselina i valerijanska kiselina.

64. Komplet prema Zahtevu 58, naznačen time što je navedeni selektivni modulator estrogenskog receptora:

65. Komplet prema Zahtevu 58, naznačen time što je navedeno jedinjenje izabrano iz grupe koju čini: (-)-cis-(5R,6S)-6-fenil-5-[4-(2-pirolidin-l-iletoksi)fenil]-5,6,7,8-tetrahidronaftalen-2-ol, D-(-)-tartaratna so (lasofoksifen).

66. Farmaceutski preparat prema bilo kom od prethodnih Zahteva 57 - 65, naznačen time što je prekursor seksualnih steroida dehidroepiandrosteron.