RS20060169A

RS20060169A - Postupak za dobijanje diterpena rastvorljivih u vodi i njihove primene

Info

Publication number: RS20060169A
Application number: YUP-2006/0169A
Authority: RS
Inventors: Muhammed Majeed; Arvind Kumar; Kalyannam Nagabhushanam; Subbalakshmi Prakash
Original assignee: Muhammed Majeed; Arvind Kumar; Kalyannam Nagabhushanam; Subbalakshmi Prakash
Priority date: 2003-09-08
Filing date: 2004-09-02
Publication date: 2008-08-07
Also published as: AU2004272005A1; CA2537820C; CA2537820A1; CN1882508B; EP1718568A4; JP2007505040A; EP1718568B1; US6960300B2; EP1718568A2; AU2004272005B2; WO2005025500A3; ZA200601898B; HK1098450A1; MXPA06002684A; US20050051483A1; CN1882508A; BRPI0413957A; JP5021305B2; NZ545765A; WO2005025500A2

Abstract

Vodeni rastvori diterpena, kao što je forskolin, njemu srodne supstance, analozi i derivati, sve do koncentracije od oko 6%, dobijaju se korišćenjem odgovarajuće supstituisanog ciklodekstrina kao sredstva za rastvaranje. U odsustvu ciklodekstrina, neki diterpeni, kao što je forskolin, rastvorni su u vodi samo do koncentracije od oko 0,001 %. Navedeni vodeni rastvori mogu da se upotrebe za topijsku i sistemsku primenu, kao farmaceutski, kozmetički, dijetalni preparati koji sadrže diterpene, kao što su forskolin i njemu srodne supstance.

Description

Postupak za dobijanje diterpena rastvornih u vodi i njihove primene

Oblast pronalaska

Predmetni pronalazak obezbeđuje postupak dobijanja vodenih rastvora diterpena, kao što je forskolin, koji su slabo rastvorai u vodi, do koncentracija od oko 6%. Ovi rastvori se dobijaju korišćenjem odgovarajućeg supstituisanog ciklodekstrina kao sredstva za rastvaranje. U odsustvu ciklodekstrina, forskolin je praktično nerastvoran u vodi, jer pravi rastvore sa koncentracijom od samo oko 0,001%. Vodeni rastvori forskolina i/ili njemu srodnih supstanci, koji sadrže veće količine aktivnog sastojka, mogu da se koriste topijski i sistemski, kako bi ispoljili različita poželjna dejstva na zdravstveno stanje subjekta.

Stanje tehnike

Određeni aktivni farmaceutski sastojci su sami po sebi nerastvorni ili su samo slabo rastvorni u vodi ili u vodenim vehikulumima. Vrlo često njihova namenska upotreba zahteva upotrebu u vodi ili u vodenim vehikulumima. Postoji potreba da se obezbede terapijski efikasne koncentracije takvih aktivnih farmaceutskih sastojaka nerastvornih u vodi u stabilnom obliku. Iako je moguće usvojiti tehniku manipulacije molekulskom strukturom aktivnog farmaceutskog sastojka nerastvornog u vodi, strukturne karakteristike koje se tako stiču i koje pospešuju rastvorljivost u vodi, mogu da dovedu do umanjenja ili modifikacije poželjnih korisnih farmakoloških svojstava. Zbog toga, izuzetno je poželjno pronaći postupke za rastvaranje aktivnih sastojaka u njihovom nativnom strukturnom obliku primenom nekih drugih tehnika.

Rastvorljivost lekova u vodi je poželjno svojstvo iz mnogih razloga. Vodene formulacije je moguće sterilisati primenom uobičajenih tehnika, kao što je filtracija, kako bi se dobili preparati koji su pogodni za sistemsku upotrebu. Takođe, vodeni preparati su poželjni u dermatološkim, ginekološkim, otološkim, rinološkim primenama i kod primena na sluzokoži. Posebno su poželjni vodeni preparati lekova za oftalmološku primenu.

Forskolin (CAS br. 66575-29-9) predstavlja prirodni labdanski diterpen koji se dobija izColeus forskohlii(Bhat, S. V.; Bajwa, B. S.; Dornauer, H.; de Souza, N. J.; Fehlabar, H. W. Tetrahedron Lett. (1997) 18, 1669). On poseduje nekoliko farmakoloških svojstava.

Forskolin pokazuje pozitivno inotropno, antihipertenzivno i bronhospazmolitičko dejstvo (Bhat, S. V., Dohadvvalla, A. N., Bajwa, B. S., Dadkar, N., Dornauer, H., de Souza, N. J., J. Med. Chem. (1983), 26, 486). Forskolin umanjuje intraokularni pritisak (Caprioli, J., Sears, M, Lancet (1983), Apr. 30, 1 (8331): 958 - 60; Badian, M. et al, Klin. Monatsbl Augenheilkd (1984), 185: 5226; Zeng, S. et al, Yan Ke Xue Bao (1995), 11: 173 - 176; Lee, P.Y. et al., Arch Ophtalmol (1987), 105: 249 - 252; Meyer B.H. et al., S. Afr. Med. J. (1987), 71: 570 - 571; Seto, C. et al., Jpn. J. Ophtalmol (1986), 30: 238 - 244; Brustein, N. I. et al., Exp. Eye Res. (1984), 39: 745 - 749; Brubaker, R. F et al., Arch. Ophtalmol. (1987), 105: 637 - 641).

Upotreba forskolina, snažnog neadrenergičkog stimulatora adenilat ciklaze, omogućava neinvazivno ispitivanje efekata stimulacije adenilat ciklaze u ljudskom oku, tj., povećanja proizvodnje cAMP na dinamiku očne vodice. Na osnovu rezultata smanjenja intraokularnog pritiska, smanjenja dotoka i nepromenjenog oticanja, autor ovog istraživanja postulira da navedena zapažanja potvrđuju ideju da aktivirani receptorski kompleks adenilat ciklaze u cilijarnom epitelu može da umanji ukupni dotok očne vodice (Sears, M. L., Am. J. Ophtalmol. (1985), Jul 15,100 (1): 194 - 198).

Drugi izveštaji otkirvaju da intravitrealna injekcija ili topijska primena forskolina značajno umanjuje intraokularni pritisak kod zečeva, tako što smanjuje dotok očne vodice, bez smanjenja njenog oticanja. Topijska primena suspenzije forskolina kod normalnih humanih dobrovoljaca izaziva značajno smanjenje intraokularnog pritiska i protoka očne vodice, bez promene u sposobnosti oticanja (Caprioli, J. et al., Lancet

(1983), Apr. 30, 1(8331): 958 - 60). Dvostruko šlepa studija sa poređenjem efekata kapljica za oči sa forskolinom (0,3% - 0,6% - 1,0%) između pojedinaca sprovedena je na 18 zdravih muškaraca (po 6 u jednoj grupi) . Ova studija pokazuje da kapljice za oči sa forskolinom (0,3% - 0,6% - 1,0%) smanjuju intraokularni pritisak kod zdravih muškaraca. Smanjenje intraokularnog pritiska se kreće između 23 - 28%, a trajanje efekta se produžava rastom koncentracije od 3 do 5 časova (White, P. U., Proceedings of the International Svmposium on forskolin, Bombav, India, 1985,175 - 182).

Druga grupa istraživača je podnela dve studije o kapima za oči sa forskolinom kod odraslih osoba sa glaukomom otvorenog ugla. U jednoj studiji je obuhvaćeno 26 pacijenata (bez placebo grupe). U drugoj studiji, 11 pacijenata je primilo forskolin zbog glaukoma. U prvoj studiji postoji smanjenje intraokularnog pritiska koje je primećeno u trajanju od 1 do 4 časa. U drugoj studiji, forskolin smanjuje intraokularni pritisak u trajanju do 6 časova. Nije bilo promene u vrednosti intraokularnog pritiska u placebo grupi. U navedenim studijama, korišćena je suspenzija forskolina od 1% u karboksimetil celulozi (Pinto-Pereira, L., Proceedings of the International Svmposium on forskolin, Bombay, India, 1985,183 - 190).

Primećena su različita biološka dejstva sa rastućim nivoima cAMP, a rezultat je bila aktivacija protein kinaze. Navedena svojstva su dovela do brojnih upotreba forskolina. Zbog takvih dej stava, u zborniku Chemical abstracts 2001. god. se pojavilo više od 1500 citata koji se odnose na fiziološka svojstva forskolina. Međutim, forskolin je skoro nerastvoran u vodi.

Napravljeni su intenzivni napori za molekulsku manipulaciju forskolina, da bi se tako dobijeni derivati forskolina učinili rastvornim u vodi. Navedeni pokušaji su uvek imali delimičan uspeh (Lal, B., Gangopadyay, A. K., Rajagopalan, R., Ghate, A. V., Bioorganic & Medicinal Chemistry (1998), 6(11): 2061 - 2073; Lal, B., Gangopadhyay, A. K., Gidwani, R. M., Fernandez, M., Rajagopalan, R., Ghate, A. V., Bioorganic & Medicinal Chemistry (1998), 6(11): 2075 - 2083).

Kao alternativa hemijskim manipulacijama molekulske strukture leka, korišćene su fizičko-hemijske tehnike povećavanja rastvorljivosti nederiviranog leka u vodi. Navedene tehnike obuhvataju micelarnu solubilizaciju korišćenjem površinski aktivnih supstanci, kojima se stvaraju u vodi rastvorne micele koje sadrže lek. Druga srodna tehnika je stvaranje kompleksa molekula leka sa nosećim molekulom. Noseći molekul je obično onaj koji poseduje dobru rastvorljivost u vodi. Noseći molekul ne stvara kovalentne veze sa molekulom leka, već stvara slab kompleks putem nekovalentnih interakcija, pri čemu noseći molekul (molekuli) održavaju molekul (molekule) leka rastvorenim u vodenom rastvoru.

Ciklodekstrini su ciklični oligosaharidi za koje je poznato da su korisni farmaceutski ekscipijenti. Uobičajeni ciklodekstrini se označavaju kao a-, P-, y- i 8-ciklodekstrini, u zavisnosti od broja molekula glukoze u cikličnoj oligosaharidnoj strukturi. Ovi ciklodekstrini su konkretno (a-l,4)-povezani oligosaharidi a-D-glukopiranoze i sadrže relativno hidrofobnu centralnu šupljinu i hidrofilnu spoljašnju površinu. Navedeni molekuli nisu baš perfektni cilindri, zbog ograničenja potpuno slobodne rotacije oko međusobnih veza molekula šećera koji ih grade. Pretpostavlja se da poseduju oblik torusa ili nepotpunog konusa. Sekundarne hidroksilne grupe oblažu širu ivicu oboda, dok primarne hidroksilne grupe oblažu užu stranu torusa. Rastvorljivost ovih molekula u vodi, kao i prečnik centralne šupljine su poznati i objavljeni (Loftsson, T., Brevvster, M.E., J. Pharmaceutical Sciences (1996), 85: 1017; Rajewski, R. A., Stella, V. J., J. Pharmaceutical Sceinces (1996), 85: 1142). Struktura<p->ciklodekstrina sadrži sedam glukoznih podjedinica, kao što je primera radi ovde

prikazano:

a-Ciklodekstrin poseduje šest molekula anhidrovane glukoze u prstenu; y- i 8-ciklodekstrini poseduju osam i devet molekula, respektivno. a-, P-, y- i 8- ciklodekstrini

poseduju slične rastvorljivosti u vodi na 25 °C: 14,5, 1,85, 23,2 i 8,18 g/100 ml, respektivno. a-, p-,y-i 8- ciklodekstrini se ponekad nazivaju prirodnim ciklodekstrinima, a njihove rastvorljivosti u vodi se nalaze na nižem kraju poželjnog opsega. U svakom slučaju, oni su dokazano dobra sredstva za rastvaranje za neke molekule koji su u vodi nerastvorni. Da bi se povećala rastvorljivost u vodi ovih prirodnih ciklodekstrina, napravljene su molekulske modifikacije a-, p-, y- i 8-ciklodekstrina, što je navedeno u literaturi.

Ovako modifikovani ciklodekstrini poseduju monogo veću rastvorljivost nego njihovi prirodni paranjaci, a mogu da se klasifikuju ka metilirani derivati P-ciklodekstrina, 2-hidroksipropilirani p- i y-ciklodekstrini, sulfobutilirani P-ciklodekstrini, razgranati ciklodekstrini, acilirani P- i y ciklodekstrini.

Ciklodekstrini mogu biti metilirani pomoću Kuhn-Trischmann metilacije, Wacker-ovim industrijskim postupkom sa metil hloridom pod pritiskom i Hamakori metilacijom korišćenjem metilhalogenida i natrijum hidrida (Szente, L., Szejtli, J., Advanced Drug Deliverv Revievvs (1986), 36: 17). Prva dva postupka su korišćena za proizvodnju nasumično metilirane ciklodekstrinske smeše. Sa druge strane, saopšteno je da se Hakamori metilacijom dobijaju potpuno metilirani heptakis 2,3,6-tri-O-metilirani ciklodekstrini. Uvođenje metil supstituenata umesto vodonika hidroksilne grupe polaznog P-ciklodekstrina dramatično poboljšava rastvorljivost ovog nasumično metiliranog ciklodekstrina, koji se u predmetnom pronalasku označava kao

RAMEBCD.

Postoji ukupno 21 hidroksilna grupa (14 sekundarnih hidroksilnih grupa i 7 primarnih hidroksilnih grupa) u P-ciklodekstrinu. Rastvorljivost RAMEBCD u vodi se povećava kako broj metil grupa dostiže broj od oko 13 - 14 i smanjuje se kako metilacija dostiže broj od 21 metoksi grupa po molekulu P-ciklodekstrina. Primer komercijalno dostupnog RAMEBCD proizvoda jeste onaj koji proizvodi Wacker Chemie i koji se prodaje pod imenom Cavasol<®>W7 M Pharma (CAS br. 128446 - 26 -

6). Rastvorljivost u vodi takvog RAMEBCD je tipično oko 220 g/100 ml vode. Navedeni RAMEBCD poseduje prosečan stepen metilacije od oko 1,7 do 1,9 po podjedinici anhidrovane glukoze. RAMEBCD'ovi su komercijalno dostupni i poseduju dobru rastvorljivost u vodi, kao što je naznačeno. Opšta struktura RAMEBCD-ova je sledeća:

Reakcijom ciklodekstrina sa propilen oksidom u baznom rastvoru dolazi do supstitucije hidroksilnih grupa u ciklodekstrinima sa 2-hidroksipropil derivatima. Veći stepen supstitucije hidroksilnih grupa sa propilen oksidom takođe dovodi do stvaranja oligomernih hidroksipropilen oksidnih bočnih lanaca. Takav 2-hidroksi-propil-P-ciklodekstrin se u predmetnom pronalasku označava kao HPBCD i predstavljen je sledećom opštom strukturom. Navedeni materijali su komercijalno dostupni.

Slično kao HPBCD,Y-ciklodekstrin može da bude hidroksipropiliran da bi se dobio hidroksipropil y-ciklodekstrin, koji se u predmetnom pronalasku označava kao HPGCD. Takvi materijali su komercijalno dostupni.

Objavljen je i revijski prikaz primena ciklodekstrina u oftalmološkoj praksi (Loftssona, T., Jarvinen, T., Advanced Drug Deliverz Reviews (1999), 36: 59). U.S. patent br. 6,346,273 opisuje rastvaranje forskolina u vodi upotrebom polivinilpirolidona i surfaktanta polietilenglikol - gliceril triricinoleata. Maksimalna postignuta rastvorljivost forskolina u ovom patentu je 0,2%.

U.S: patent br. 4,476,140 opisuje preparat i postupak za tretman glaukoma primenom terapijski efikasne količine materijala koji je izabran iz grupe koju čine forskolin, kolforsin i polioksigenirani labdanski derivati. Koncentracija aktivnog sredstva od 0,1% do 4% je u ovom patentu označena kao fiziološki efikasna, onda kada se primeni u vidu topijske suspenzije na oko.

U.S. patenti 5,070,209, 4,978,678, 5,023,344 i 4,871,764 opisuju nove 12-halogenirane derivate forskolina, intermedijere i procese njihove proizvodnje, kao i postupke za smanjenje intraokularnog pritiska korišćenjem tamo navedenih jedinjenja ili preparata.

EP 0 268 256 opisuje nove 12-halogenirane derivate forskolina, intermedijere i procese za njihovu proizvodnju, kao i postupke za smanjenje intraokularnog pritiska korišćenjem tamo navedenih jedinjenja ili preparata.

Ipak, prethodno navedene reference ne opisuju solubilizaciju nemodifikovanog forskolina, kako bi se dobili bistri vodeni rastvori čije su koncentracije 1% ili veće. Predmetni pronalazak opisuje dobijanje vodenih rastvora diterpena, kao što je forskolin, koji su teško rastvorni ili su nerastvorni u vodi, u koncentracijama od oko 6%. Navedeni rastvori se dobijaju korišćenjem supstituisanog ciklodekstrina kao sredstva za solubilizaciju. U odsustvu ciklodekstrina, forskolin je praktično nerastvoran u vodi, jer gradi rastvore sa koncentracijom od samo 0,001%. Vodeni rastvori forskolina i/ili njemu srodnih supstanci, koji sadrže veće količine aktivnog sastojka, mogu da se upotrebe topijski i sistemski, u cilju postizanja različitih korisnih dejstava na zdravlje.

Detaljan opis pronalaska

Forskolin poseduje sledeću strukturu:

Blisko povezani izomer ovog jedinjenja se naziva izoforskolin i poseduje sledeću strukturu:

Objavljeno je da izoforskolin takođe poseduje mnoga slična farmakološka dejstva kao i forskolin. Korišćeno je sledećih šest komercijalno dostupnih ciklodekstrina: a-, p- i y-ciklodekstrin, kao i iz njih derivirani proizvodi RAMEBCD, HPBCD i HPGCD, za solubilizaciju u vodi slabo rastvornog forskolina.

Da bi se forskolin solubilizovao korišćenjem ciklodekstrina, izabrani ciklodekstrin i forskolin se mešaju u vodi u specifičnim razmerama. Vodeni rastvor se filtrira kako bi se uklonile sve nerastvorene čestice i kako bi se dobio bistar vodeni rastvor forskolina u vodi.

Alternativno, ciklodekstrin i forskolin u određenim razmerama se rastvaraju u odgovarajućim rastvaračima, kao što su etanol ili aceton ili etil acetat. Rastvarač se uklanja, nakon čega ostaje beli prašak. Taj prašak se slobodno rastvara u vodi, na način koji je ilustrovan u primerima. Dalje, mogu se dodati aditivi u vodeni rastvor forskolina. Ovi aditivi se obično koriste za održavanje sterilnosti, održavanje pH vrednosti, održavanje osmolarnosti i si.

Spektar mogućih aditiva je veoma širok. Iako se kao konzervans u ilustrativnim primerima koristi bezalkoniju hlorid, stručnjak isto tako može da izabere mnoge druge konzervanse, kao što su benzetonijum hlorid, hlorobutanol, metil paraben, propil paraben, timerosal itd.

Za stabilizaciju preparata se koristi antioksidant, kao što je dinatrijumova so EDTA; između ostalog, mogu da se koriste i drugi antioksidanti, kao što su natrijum bisulfit, natrijum metabisulfit i tiourea.

Posebno u slučaju oftalmoloških rastvora, poželjno je da njihova viskoznost bude u opsegu od 25 do 50 cps. Mogu da se koriste i sredstva za povećanje viskoznosti, kao što su polivinil alkohol, polivinil pirolidon, metil celuloza, hidroksipropilmetil celuloza i hidroksimetil celuloza.

Primeri koji su opisani u tekstu koji sledi služe isključivo kao ilustrativni primeri i ni na koji način ne ograničavaju obim zaštite predmetnog pronalaska.

Primeri

Primer1:Određivanje rastvorljivosti forskolina u vodi

Forskolin (300 mg) je isušivan na 105 °C tokom 6 časova. Isušeni forskolin (200 mg) je mešan sa 100 ml vode tokom 48 časova, radi određivanje prirodne rastvorljivosti na sobnoj temperaturi. Nastali rastvor je profiltriran kroz najlonski filter od 0,45 pm, nakon čega je analiziran sadržaj forskolina pomoću HPLC. Količina forskolina koja je određena na ovaj način je 0,01 mg/ml ili 0,001% w/v. Drugim rečima, forskolin poseduje rastvorljivost od oko 0,001% w/v u vodi.

Primer 2

Forskolin (98,5%, 25 mg) je dodat u 1 ml vode koja sadrži u rastvorenom stanju 500 mg hidroksiporpil [3 ciklodekstrin, HPBCD (oko 50%). Suspenzija je mešana pri brzini od 75 o/min u izotremalnoj mešalici tokom 60 časova na tem. od oko 30 °C. Nastali rastvor je filtriran kroz najlonski filter od 0,45 um, pa je određena količina forskolina pomoću HPLC, koja je iznosila 1,33 mg/ml ili 0,133% w/v.

Primer 3

Forskolin (98,5%, 50 mg) je dodat u 1 ml vode koja sadrži u rastvorenom stanju 500 mg hidroksiporpil y ciklodekstrin, HPGCD (oko 50%). Suspenzija je mešana pri brzini od 75 o/min u izotremalnoj mešalici tokom 60 časova na tem. od oko 30 °C. Nastali rastvor je filtriran kroz najlonski filter od 0,45 um, pa je određena količina forskolina pomoću HPLC, koja je iznosila 1,52 mg/ml ili 0,152% w/v.

Primer 4

Izvođeni su eksperimenti sa "promenom" stepena kristalizacije forskolina korišćenjem rekristalizacije iz metilen hlorida i etil acetata. Dobijeni "amorfni" forskolin je korišćen za stvaranje kompleksa sa hidroksipropil y ciklodekstrinom (HPGCD). Forskolin (29,3 mg) koji je rekristalizovan iz metilen dihlorida (forskolin 99,0%) dodat je u 3 ml vode u kojoj se nalazi 1,5 g hidroksipropil y ciklodekstrina

(HPGCD) (oko 50%). Suspenzija je mešana pri brzini od 75 o/min u izotremalnoj mešalici tokom 160 časova na tem. od 30 °C. Nastali rastvor je filtriran kroz najlonski filter od 0,45 pm, pa je određena količina forskolina pomoću HPLC, koja je iznosila 1,74 mg/ml ili 0,174% w/v.

Primer 5

Forskolin (30,3 mg) koji je rekristalizovan iz etil acetata (forskolin 98,8%) dodat je u 3 ml vode u kojoj se nalazi 1,5 g hidroksipropilyciklodekstrina (HPGCD) (oko 50%). Suspenzija je mešana pri brzini od 75 o/min u izotremalnoj mešalici tokom 160 časova na tem. od 30 °C. Nastali rastvor je filtriran kroz najlonski filter od 0,45 pm, pa je određena količina forskolina pomoću HPLC, koja je iznosila 3,38 mg/ml ili 0,338% w/v.

Primer 6

Forskolin (98,5%, 330 mg) je dodat u 10 ml vode koja sadrži 4 g RAMEBCD (oko 40%). Suspenzija je mešana pri brzini od 75 o/min u izotremalnoj mešalici tokom 40 časova na tem. od 30 °C. Nastali rastvor je filtriran kroz najlonski filter od 0,45 pm, pa je određena količina forskolina pomoću HPLC, koja je iznosila 20,46 mg/ml ili 2,046 % w/v.

Primer 7

Rastvorljivost forskolina u vodi je određena pri različitim koncentracijama RAMEBCD koje se kredu od 5 do 66%. Odnos je skoro linearan u pokazuje da se rastvorljivost forskolina povećava sa povećanjem koncentracije RAMEBCD.

Tipična vodena formulacija forskolina sa ciklodekstrinom je pipremljena na sledeći način: RAMEBCD, koji je korišćen kao primer za ciklodekstrin (100 g), nasut je u flašu od 1 1 koja se koristi kod mašine za mehaničko ili magnetno mešanje. U flašu je potom usut forskolin (5,5 g). U flašu je dodata i voda (400 ml), pa je smeša mešana na sobnoj temp. Dobijen je bistri rstvor. Onda kada su primećene nerastvorene čestice forskolina, one su resuspendovane i mešane. U flašu su dodati benzalkonijum hlorid (50 mg) i dinatrijum EDTA (500 mg) i rastvoreni su u smeši. Vrednost pH smeše može da se podesi do željenog opsega pomoću 0,1 N rastvora natrijum hlorida (uobičajeni opseg pH vrednosti je 3,5 do 7,5). Dodata je proračunata količiona rastvora natrijum hlorida, kako bi se održala osmolarnost rastvora koja je ekvivalentna 0,9% rastvoru natrijum hlorida. Ukupna zapremina rastvora je podešena na 500 ml nakon filtracije za sterilizaciju. Ovako dobijeni rastvor ima oko 1% forskolina u rastvorenom stanju. Drugi ciklodekstrini takođe mogu da se koriste, a u zavisnosti od ciklodekstrina koji se koristi, sadržaj rastvorenog forskolina u vodi varira.

Primer 9

Forskolin (50 mg) je rastvoren u 5 ml acetona, a odvojeno je u 5 ml acetona rastvoren 1 g RAMEBCD. Oba rastvora su pomešana, a rastvarač aceton je evaporisan pod smanjenim pritiskom. Ostatak je isušen i rastvoren u 5 ml vode. Navedeni ostatak se rastvara veoma lako za manje od 1 časa mešanja, pri čemu nastaje bistar bezbojni rastvor.

Primer 10

Umesto forskolina, može takođe da se koristi izoforskolin. U jednom preparatu, izoforskolin (50 mg) je suspendovan u vodi u kojoj se nalazi određena količina ciklodekstrina, na primer, RAMEBCD (20 g) u oko 100 ml vode. Nakon mešanja na sobnoj temp., rastvor je filtriran, a dobijeni rastvor je analiziran pomoću HPLC, koja je pokazala prisustvo izoforskolina u konc. od oko 0,5%. Količina rastvorenog izoforskolina može da se menja promenom količine RAMEBCD.

Predstavljen je ilustrativni primer biološke aktivnosti preparata. Aktivnost preparata forskolina protiv glaukoma je izučavana na albino zečevima. Za eksperimente je korišćen 1% rastvor forskolina u vodi, koji je opisan u Primeru 8.

Dizajn studije

Životinjski model:Albino zec

Broj grupa: 4

Broj životinja po grupi:6 u tretiranoj grupi i 2 u kontrolnoj grupi.

Materijali i postuci:Korišćeno je 6 albino zečeva novozelandskog soja, oba pola, mase od 1,0 - 1,5 lb. Zečevi su uzgajani u čistom i dobro provetrenom otvorenom prostoru. Svaki od zečeva je hranjen standarnim načinom ishrane, a voda im je obezbeđenaad libitumtokom čitavog istraživanja.

Okularna hipertenzija je indukovana postupkom po Bonomi et al. (Invest. Ophtalmol 1976, Sept; 15(9): 781 - 4). Zečevima je davana subkonjuktivalna injekcija od 0,3 ml betnesola, koja sadrži betametazon natrijum u konc. od 4 mg/ml, svakodnevno u svako oko, tokom perioda od tri nedelje (intraokularni pritisak (IOP) je najveći tokom treće nedelje, po podacima iz literature). Pre davanja subkonjuktivalnih injekcija, primenjivane su kapljice za oči sa lokalnim anestetikom proprakainom.

Kod svakog zeca levo oko je držano kao kontrola za glaukom, a desno oko je tretirano protiv glaukoma upotrebom forskolina, timolola i placeba.

U svakom tretmanu, vrednosti IOP su merene u intervalima od 30 minuta do 210 minuta korišćenjem beskontaktnog tonometra (NCT - non-contact tonometer).

Rezultati:

Statistička analiza:Rezultati dobijeni merenjem IOP u grupi subjekata tretiranih placebom, forskolinom i timololom su podvrgnuti ANOVA (jednostrukoj). Vrednost p je 0,0022, što odgovara veoma značajnoj vrednosti, što ukazuje da varijacije u koloni nisu nastale slučajno.

Vrednosti IOP grupe tretirane placebom i forskolinom su podvrgnute t testu, da bi se odredilo da li se vrednosti medijane kod ovih grupa značajno razlikuju. Vrednost p je 0,0177, što se smatra stat. značajnim. Slično tome, vrednosti IOP grupe tretirane placebom i timololom su testirane, i nađeno je da je p vrednost 0,0087, što je ponovo statistički značajno.

Vrednosti IOP grupe tretirane forskolinom i timololom su takođe podvrgnute t testu. Vrednost p je 0,3999, što se ne smatra stat. značajnim, i što implicira da se aktivnost preparata forskolina ne razlikuje značajno od aktivnosti timolola.

Zaključak:Preparat forskolina poseduje anti-glaukomsku aktivnost koja je uporediva sa onom kod timolola.

Claims

1. Postupak solubilizacije diterpena, kao što su forskolin, izoforskolin, 7-deacetilforskolin, njima srodnih supstanci, analoga i derivata, prirodnog ili sintetskog porekla, individualno ili u vidu smeša, naznačen time što je rastvarač voda.

2. Diterpeni iz zahteva 1, naznačeni time što mogu da se dobiju iz biljnog izvora, kao što je, bez ograničenja,Coleus forskohlii.

3. Postupak prema zahtevu 1, naznačen time što su sredstva za solubilizaciju koja se koriste a-,f>-,y-ciklodekstrini ili iz njih derivirani proizvodi, kao što su nasumično metilirani p-ciklodekstrin (RAMEBCD), 2-hidroksipropil-p-ciklodekstrin (HPBCD), hidroksipropil y-ciklodekstrin (HPGCD), poželjno nasumično metilirani P-ciklodekstrin (RAMEBCD) kao sredstvo za stvaranje kompleksa.

4. Postupak za dobijanje bistrog rastvora koji sadrži od 0,09% do 6% diterpena, kao što su forskolin, izoforskolin, njihovi analozi ili derivati, naznačen time što se dobij a mešanjem jedinjenja sa 5% do 70% ciklodekstrinom ili derivatima ciklodekstrina.

5. Postupak naznačen time što se aktivno jedinjenje rekristalizuje iz organskog rastvarača izabranog iz grupe koju čine etanol, aceton, etil acetat, metilen hlorid ili neki drugi rastvarač, nakon čega sledi stvaranje kompleksa sa ciklodekstrinom ili derivatima ciklodekstrina putem stvaranja suspenzije materijala u vodi, posle čega sledi mešanje na sobnoj temperaturi tokom 40 do 160 časova i filtracija.

6. Postupak za dobijanje formulacije u vidu bistrog vodenog rastvora ili u čvrstom obliku koja sadrži od 0,09% do 6% diterpena, kao što su forskolin, izoforskolin, njihovi analozi, njima srodne supstance ili derivati, naznačen time što je pogodna za okularnu, topijsku i sistemsku primenu.

7. Formulacija iz zahteva 6, naznačena time što može biti u obliku kapsula, tableta, dijetetskih proizvoda, injekcija, flastera, masti, gelova, emulzija, kremova, losiona, sredstava za ispiranje usta, sprejeva, kapljica ili u formi drugih doznih oblika, uključujući oblike sa produženim otpuštanjem aktivne supstance, za humanu ili veterinarsku upotrebu.

8. Postupak upotrebe formulacije iz zahteva 6, naznačen time što se koristi sama ili u kombinaciji sa antioksidantima i/ili sredstvima protiv glaukoma, za smanjenje intraokularnog pritiska kod životinja ili ljudi sa okularnom hipertenzijom ili glaukomom.

9. Postupak upotrebe formulacije iz zahteva 6, naznačen time što se koristi sama ili u kombinaciji sa polivinil pirolidonom, hijaluronskom kiselinom i derivatima, kod životinja ili ljudi sa sindromom suvog oka.

10. Postupak upotrebe formulacije iz zahteva 6, naznačen time što se koristi za dobijanje u vodi rastvorljivih molekulskih i receptorskih proba za istraživanje i komercijalne svrhe.

11. Postupak upotrebe formulacije iz zahteva 6, naznačen time što se koristi za ispoljavanje korisnih efekata diterpena kao što je forskolin, njegovi analozi, srodne supstance i derivati, po zdravije ljudi i životinja, pri čemu je način primene topijski, perkutani, intravenski, sublingvalni ili oralni.

12. Materijal iz zahteva 1, naznačen time što je koristan za dopremanje formulacija forskolina i sa njim povezanih diterpena u vidu dijetetskih pića za, između ostalih poznatih primena forskolina, tretman gojaznosti, modifikaciju telesne mase i poboljšavanje vitkosti, hipertenzije i alergije.

13. Materijal iz zahteva 1, naznačen time što je koristan za dopremanje u vodi rastvorljivih formulacija forskolina i sa njim povezanih diterpena u vidu emulzija, sprejeva, rastvora ili aerosola, ili za kozmetičke primene, kao što su pospešivanje aktivnosti kolagena, ispoljavanje svojstava protiv bora, kontrola celulita i modulacija aktivnosti melanocita.

14. Materijal iz zahteva 1, naznačen time što može da se koristi u kombinaciji sa antioksidantima, inhibitorima lipaze, sa drugim proizvodima protiv gojaznosti, uključujući, između ostalih, hidroksilimunsku kiselinu, garcinol i njihove soli, vazoirigatore, druge poznate pospešivače kolagena, antizapaljenska sredstva i inhibitore fosfodiesteraze. Patentnizahtevi izmenjeni u skladu sa Članom 34.

1. Postupak za solubilizaciju u vodi barem jednog prirodnog ili sintetskog forskolina, izoforskolina ili 7-deacetilforskolina, naznačen time što obuhvata: i) suspendovanje forskolina, izoforskolina ili 7-deacetilforskolina u vodi koja sadrži ciklodekstrinsko sredstvo za stvaranje kompleksa / za solubilizaciju, pri čemu je ciklodekstrinsko sredstvo jedino sredstvo za stvaranje kompleksa / solubilizaciju; ii) mešanje na sobnoj temperaturi; i iii) filtriranje u cilju dobijanja bistrog vodenog rastvora koji sadrži od 0,09% do 6% forskolina, izoforskolina ili 7-deacetilforskolina.

2. Postupak prema zahtevu 1, naznačen time što se barem jedan prirodni forskolin, izoforskolin ili 7-deacetilforskolin dobija izColeus forskohlii.

3. Postupak prema zahtevu 1, naznačen time što je ciklodekstrinsko sredstvo za stvaranje kompleksa / za solubilizaciju izabrano iz grupe koju čine a-, P-, y-ciklodekstrini ili iz njih derivirani proizvodi, nasumično metilirani p-ciklodekstrin (RAMEBCD), 2-hidroksipropil-p-ciklodekstrin (HPBCD) i hidroksipropily-ciklodekstrin (HPGCD).

4. Postupak prema zahtevu 3, naznačen time što se pre koraka i) ciklodekstrinsko sredstvo i forskolin, izoforskolin ili 7-deacetilforskolin rastvaraju u rastvaraču uz mešanje, pri čemu je rastvarač izabran iz grupe koju čine etanol, aceton, etil acetat i metilen hlorid, nakon čega sledi uklanjanje rastvarača, suspendovanje i rastvaranje ostatka u vodi.

5. Postupak solubilizacije barem jednog prirodnog ili sintetskog forskolina, izoforskolina ili 7-deacetilforskolina u vodi, naznačen time što obuhvata: i) rastvaranje forskolina, izoforskolina ili 7-deacetilforskolina u organskom rastvaraču koji je izabran iz grupe koju čine etanol, aceton, etil acetat, metilen hlorid; ii) rekristalizaciju forskolina, izoforskolina ili 7-deacetilforskolina iz organskog rastvarača; iii) stvaranje kompleksa forskolina, izoforskolina ili 7-deacetilforskolina u vodi koja sadrži ciklodekstrinsko sredstvo za stvaranje kompleksa / za solubilizaciju koje je izabrano iz grupe koju čine a-, P-, y-ciklodekstrini ili iz njih derivirani proizvodi, nasumično metilirani P-ciklodekstrin (RAMEBCD), 2-hidroksipropil-P-ciklodekstrin (HPBCD) i hidroksipropil y-ciklodekstrin (HPGCD), pri čemu je ciklodekstrinsko sredstvo jedino sredstvo za stvaranje kompleksa / solubilizaciju; iv) mešanje na sobnoj temperaturi tokom 4 do 160 časova; i v) filtriranje u cilju dobijanja bistrog vodenog rastvora koji sadrži od 0,09% do 6% forskolina, izoforskolina ili 7-deacetilforskolina.

6. Postupak prema zahtevu 1, naznačen time što je bistri vodeni rastvor pogodan za oftalmičku, topijsku i sistemsku upotrebu.

7. Postupak tretiranja glaukoma ili okularne hipertenzije kod čoveka ili životinje, naznačen time što obuhvata primenu bistrog vodenog rstvora koji sadrži između 0,09% do 6% barem jednog prirodnog ili sintetskog forskolina, izoforskolina ili 7-deacetilforskolina koji je u kompleksu sa ciklodekstrinskim sredstvom, pri čemu je ciklodekstrinsko sredstvo jedino sredstvo za stvaranje kompleksa / solubilizaciju.

8. Postupak tretiranja sindroma suvog oka kod čoveka ili životinje, naznačen time što obuhvata primenu bistrog vodenog rstvora koji sadrži između 0,09% do 6% barem jednog prirodnog ili sintetskog forskolina, izoforskolina ili 7-deacetilforskolina koji je u kompleksu sa ciklodekstrinskim sredstvom, pri čemu je ciklodekstrinsko sredstvo jedino sredstvo za stvaranje kompleksa / solubilizaciju.

9. Postupak tretiranja glaukoma ili okularne hipertenzije kod čoveka ili životinje, naznačen time što obuhvata primenu bistrog vodenog rstvora koji sadrži između 0,09% do 6% barem jednog prirodnog ili sintetskog forskolina, izoforskolina ili 7-deacetilforskolina koji je u kompleksu sa ciklodekstrinskim sredstvom, u kombinaciji sa jednim ili sa više antioksidanata, pri čemu je ciklodekstrinsko sredstvo jedino sredstvo za stvaranje kompleksa / solubilizaciju.

10. Postupak tretiranja glaukoma ili okularne hipertenzije kod čoveka ili životinje, naznačen time što obuhvata primenu bistrog vodenog rstvora koji sadrži između 0,09% do 6% barem jednog prirodnog ili sintetskog forskolina, izoforskolina ili 7-deacetilforskolina koji je u kompleksu sa ciklodekstrinskim sredstvom, u kombinaciji sa jednim ili sa više sredstava protiv glaukoma, pri čemu je ciklodekstrinsko sredstvo jedino sredstvo za stvaranje kompleksa / solubilizaciju.

11. Postupak tretiranja sindroma suvog oka kod čoveka ili životinje, naznačen time što obuhvata primenu bistrog vodenog rstvora koji sadrži između 0,09% do 6% barem jednog prirodnog ili sintetskog forskolina, izoforskolina ili 7-deacetilforskolina koji je u kompleksu sa ciklodekstrinskim sredstvom i sa derivatima hijaluronske kiseline, pri čemu je ciklodekstrinsko sredstvo jedino sredstvo za stvaranje kompleksa / solubilizaciju.

12. Postupak tretiranja sindroma suvog oka kod čoveka ili životinje, naznačen time što obuhvata primenu bistrog vodenog rstvora koji sadrži između 0,09% do 6% barem jednog prirodnog ili sintetskog forskolina, izoforskolina ili 7-deacetilforskolina koji je u kompleksu sa ciklodekstrinskim sredstvom i sa polivinil pirolidonom, pri čemu je ciklodekstrinsko sredstvo jedino sredstvo za stvaranje kompleksa / solubilizaciju.

13. Postupak za solubilizaciju u vodi barem jednog prirodnog ili sintetskog forskolina, izoforskolina ili 7-deacetilforskolina, naznačen time što obuhvata: i) suspendovanje forskolina, izoforskolina ili 7-deacetilforskolina u vodi koja sadrži nasumično metilirani<p->ciklodekstrin (RAMEBCD); ii) mešanje na sobnoj temperaturi; i iii) filtriranje u cilju dobijanja bistrog vodenog rastvora koji sadrži od 0,09% do 6% forskolina, izoforskolina ili 7-deacetilforskolina.

14. Bistri vodeni rastvor naznačen time što sadrži između 0,09% do 6% barem jednog prirodnog ili sintetskog forskolina, izoforskolina ili 7-deacetilforskolina koji je u kompleksu sa nasumično metiliranim P-ciklodekstrinom (RAMEBCD).

15. Postupak za tretiranje glaukoma kod čoveka ili životinje naznačen time što obuhvata primenu bistrog vodenog rastvora iz zahteva 14.

16. Postupak za tretiranje okularne hipertenzije kod čoveka ili životinje naznačen time što obuhvata primenu bistrog vodenog rastvora iz zahteva 14.

17. Postupak za tretiranje sindroma suvog oka kod čoveka ili životinje naznačen time što obuhvata primenu bistrog vodenog rastvora iz zahteva 14.