RS20060077A - Postupak za pripremanje alfa-1-antitripsin rastvora - Google Patents

Abstract

Postupak za pripremanje A1AT iz rastvora koji sadrže A1AT, koji se sastoji od sledećih koraka: (a) podvrgavanja rastvora koji sadrži A1AT jonizmenjivačkoj hromatografiji; (b) dodavanja deterdženata i opciono rastvarača za dezaktiviranje lipidom obloženih virusa; (c) praćeno povećanjem koncentracije soli da se odvajanjem soli izbace deterdženti. A1AT koji ima čistoću od >90% sa aktivnošću od ≥0,8 PEU/mg u svom aktivnom obliku.

Description

POSTUPAK ZA PRIPREMANJE ALFA-1 -ANTITRIPSIN RASTVORA

Pronalazak se odnosi na postupak pripremanja rastvora koji sadrži alfa-1-antitripsin (A1AT), i na A1AT.

Stanje tehnike

A1AT je glikoprotein koji ima molekularnu težinu od oko 55.00(fDaltona i pripada familiji serin-proteaza inhibitora. A1 AT može da inhibTra aktivnost brojnih proteaza, na primer, tripsina, na kome se ime inhibitora zasniva iz istorijskih razloga. Fiziološki, elastaza je ciljna proteaza koja je uključena i u posbno rekonstrukciju tkiva i matrice i postupke degradacije i oslobađanje ćelija kao što su granulociti i tako je uključena u inflamatorne procese. Trajanje aktivnosti elastaze je limitirana u vremenu i prostoru i u osnovi regulisana od strane inhibitora A1AT. Deregulisanje takve aktivnost vodi do brze degradacije tkiva i može imati patofiziološke posledice. Dodatno, iniciraju i/ili promovišu se inflamatorni procesi. Poznati primer smanjene ili nedostatak kontrole elastaze je progresivna degradacija lokalnog tkiva u plućima sa pratećim inflamatornim fenomenom, koji progresivno vode do emfizema i takoj je praćena sa, u jednom delu značajno, limitiranom funkcijom pluća. U krajnjoj fazi, ovo može voditi do smrti pacijenta, koja se na kraju može sprečiti samo putam transplantacije pluća.

Takvi pacijenti pate od nedostatka A1AT ili je A1AT limitiran u svojoj funkciji. Inhibitor se normalno proizvodi i izlučuje u relativno velikim količinama putem jetre i cirkuliše u krvnoj plazmi u relativno visokim koncentracijama (tipična koncentracija je 1,3 mg/mL). Dodatno, fiziološki efektivne i dovoljne koncentracije A1 AT su pronađene u organima, posebno u fluidu pluća (epitelijalno obloženi fluid), zdravih ljudi. Ukoliko se ova A1 AT koncentracija značajno smanji ili ukoliko je prisutni A1 AT limitiran u svojoj funkciji ili neaktivan (dezaktiviran), dolazi do nekontrolisane degeneracije tkiva pluća sa gore pomenutim posledicama.

Razlozi nedostatka A1AT ili A1 AT sa svojom smanjenom inhibitornom funkcijom su uglanom genetički defekti. Takozvana "Z" mutacija, posebno kod homozigotnih (PiZZ) individua, rezultira u polimerizaciji A1 AT molekula koji su već u ćelijama koje ih sintetišu. U skladu sa tim, Alffine može više da stigne do cirkulacije, ili samo u vrlo malim količinama. Ovo rezultira, na jednoj strani, u nedostatku inhibitorne aktivnosti, koji se posebno manifestuje u plućima tokom produženih vremenskih perioda, i na drugoj strani, u obogaćivanju polimera ćelijama jetre i tako u korespondirajućim funkcionalnim poremećajima. Heterozigotne PiZ individue imaju korespondirajući smanjeni inhibitorni potencijal. Poznate su i dalje mutacije sa sličnim defektima.

Prema trenutnim procenama, prevalentnost PiZZ mutacija u SAD je reda 1/1600 od ukupne populacije; u skladu sa tim, broj nosača ove mutacije je značajno veći, od čega je pretpostavljeno samo 10% identifikovano.

Od pacijenata koji pate od funkcionalnih poremećaja pluća (progresivna emfizema) na osnovu nedostatka A1 AT ili smanjene funkcije A1AT, ne mogu svi biti trenutno lečeni pošto A1 AT za lečenje i/ili profilaksu nije u dovolnoj meri dostupan kao odobreni medikament. Utvrđeno lečenje se zasniva na intravenoznom davanju rastvora koji sadrže A1AT pripremljenih iz plazmi davaoca. Utvrđeno i trenutno preporučeno doziranje je nedeljno 60 mg A1AT po kilogramu telesne težine, što korespondira sa prosečnom potrošnjom od 16-20 grama A1AT po pacijentu mesečno. Ovaj obrt korespondira sa količinom koja se sadrži u prosečno 15 litara plazme. Imajući u vidu da se dobija u čistom obliku kao preparat samo deo inhibitora koji se sadrži u početnom materijalu plazme, višestruko od 15 L normalne plazme se zahteva kao sirovi materijal za pacijente mesečno. Ukupna zapremina plazme koja je neophodna kao sirovi materijal za oporavljanje A1 AT i tako za permanentno lečenje pacijenata je<*>korespondirajuće velika. ? ;Utvrđeni postupci pripremanja za proizvodnju A1AT preparata upotrebljavaju takozvanu Cohn IV1 masu kao početni materijal. Kasnije se priprema sredstvima Cohn-Oncley postupka, koji je poznat stručnoj osobi, ili putem njegovom modifikacijom, na osnovu frakcione separacije plazma proteina sa varirajućom, u osnovi, dodatom koncentracijom etanola, podešenom pH vrednošću i temperaturom rastvora. Dodatno A1 AT, takozvana frakcija IV1 uobičajeno sadrži vrlo različite druge plazma proteine, delimično u količinama već smanjenim putem prethodnih koraka taloženja. Varijacija ovog postupka je Kistler-Nitschmann postupak. U skladu sa tim, može biti upotrebljena kao početni materijal frakcija slična Cohn IV1 frakciji kao i ostalim frakcijama koje sadrže A1 AT, kao što je takozvani površinski sloj I + II + III. ;Opisani su različiti postupci za pripremanje više ili manje čistog A1AT preparata. Upotreba jon-izmenjivačke hromatografije za obogaćivanje A1 AT, posebno sredstvima anjon-izmenjivača, je više puta objavljena (Gray et al., 1960; Crawford et al., 1973; Chan et al., 1973; itd.). Ipak, sam korak pripremanja ne daje prinos A1AT preparata koji ima čistoću koja korespondira sa stanjem u nauci. Prema tome, upošljavaju se drugi koraci pripremanja, delimično u kombinaciji sa jon-izmenjivačima. Na primer, upotrebljavaju se postupci adsorbcije ili taloženja, kao što su inkubacija sa polietilen glikolom (US-A-4,379,087), sa cink helatom ili heparain adsorbantima (US-A-4,629,567) ili drugi. Ovi postupci se upotrebljavaju za (dalje) prečišćavanje A1 AT, ali u svakom od njih mora doći do više ili manje velikog gubitka prinosa proizvoda. U principu, gubitak proizvoda se povećava kako se povećava broj koraka pripremanja. Dodatno, ovo je često praćeno sa produženjem vremena pripremanja, što može i oduzeti od celovitosti i aktivnosti A1AT i povećati troškove proizvodnje. ;Dodatno koracima pripremanja proteina, takozvani koraci inaktivacije virusa ili koraci pražnjenja su esencijalni deo postupaka pripremanja za proizvode proteina pripremljene iz plazme. Dodatno takozvanom SD (rastvarač/deterdžent) postupku, koji dezaktivira korespondirajuće viruse oštećenjem njihovog zaštitnog lipidnog spoljnjeg omotača, postupci toplotnog dezaktiviranja, na primer, pasterizacija (tretman toplotom tokom 10 sati na 60 °C), se primenjuju za povećanje bezbednosti virusa. Filtriranje kroz "nanofiltere" zadržava viruse, bilo da su lipidom omotani ili bez lipida, obično zavisi od veličine virusa. Stanje je tehnike da se integrišu dva koraka postupka od kojih je svaki sam za sebe efektivan i zasniva sa na različitim principima zajedno u jednom postupku proizvodnje radi maksimalne zaštite virusa. ;U zavisnosti od proteina, stabilizatori, na primer, amino kiseline ili šećeri, se dodaju tokom ovih koraka postupka za stabilizovanje proteina. U skladu sa tim, oni kasnije moraju biti uklonjeni iz rastvora koji sadrži A1AT. U ovom SD postupku, deterdženti se dodaju kao aktivna sredstva za dezaktiviranje virusa koji mora biti uklonjeni u daljem toku postupka pripremanja odgovarajućim postupcima. U ovu svrhu se uspostavlja, adsorbcija za hidrofobične matrice, kao što je hromatografija sa imobilisanim C18 lancima. Takva hromatografija je ponovo praćena sa gubitcima u prinosu proizvoda i uključuje gore pomenute nedostatke svakog (daljeg) hromatografskog koraka u postupku. Dodatno, ove matrice se upotrebljavaju više puta kao pravilo, odnosno, zahtevaju se koraci regeneracije matrice koji su skupi i oduzimaju vreme. ;U skladu sa tim opisan je, alternativni, efektivni i brzi postupak kvalitetnog uklanjanja deterdženata koji se deli sa hromatografskim korakom (WO 94/26287, US-A-5,817,765). Tako, rastvor deterdženta koji sadrži protein se dovodi do superfizioloških koncentracija (? 0,5 M) soli, naprimer, Na citrat, da se formiraju čestice koje sadrže deterdžent koje mogu biti odvojeno prosto, na primer, filtriranjem. Nadalje, na ovaj postupak se poziva kao na postupak "deterdžent/odvajanje soli". ;U primerima WO 94/26287, postupask "deterdžent/odvajanje soli" se primenjuje za tri izolovana proteina u rastvoru, koji su transferin, antitrombin III i albumin. U primerima, postupak vodi ka vraćanju aktivnosti proteina od 95%, i do smanjenja koncentracije deterdženta. Ukoliko se postupak primeni pod uslovima, tako da se na prinos ciljanih proteina ne utiče previše, često je koncentracija Triton-a u proizvodu i dalje visoka. U primeru 4 WO 94/26287, pronalazači su u stanju da povrate 95% aktivnosti albumina, ali dobijaju proizvod koji sadrži 250 ppm Triton X-100 i 35 ppm TNBP. Posebno kada se proizvode medicinski preparati, koncentracije Triton-a X-100 preko 50 ppm, pretpostavljeno preko 10 ppm treba da se izbegnu, i opšte je poželjno da se smanje sadržaji deterdženta što je više moguće. ;Opis pronalaska;Predmet pronalaska je da se obezbedi postupak za pripremanje A1 AT preparata koji rezultira u proizvodu velike čistoće i bezbednosti što je moguće efektivnije i brže. Pretpostavljeno, tokom postupka na aktivnost i/ili kvalitet A1 AT ne srne se uticati negativno i deterdženti treba da se uklone do nivoa koji su prihvatljivi za medicinske preparate. ;Sledeći je predmet pronalaska da se obezbedi postupak prečišćavanje rastvora koji sadrže A1 AT, tokom čega se druge komponenfe^Droteina uklanjaju. Pretpostavljeno, A1AT rastvor će takođe biti ispražnjeni od drugih komponenti kao što su lipidi ili virusi. ;Predmes se postiže postupkom pripremanja A1 AT iz rastvora koji sadrže A1 AT, koji se sastoji iz sledećih koraka: (a) podvrgavanje rastvora koji sadrži A1 AT jon-izmenjivačkoj hromatografiji; (b) dodavanje deterdženata i opciono rastvarača za dezaktiviranje ;lipidom obloženih virusa; ;(c) praćeno povećanjem koncentracije soli da se odvajanjem soli ;izbace deterdženti. ;Šta više, problem pronalaska je rešen realizacijama kako su definisane u zahtevima 1 do 19. Postupak za pripremanje A1At iz rastvora koji sadrže A1AT, na primer, iz rekonstituisane frakcije plazme (Cohn), u principu se sastoji od samo dva vrlo efikasna koraka postupka u pogledu njihovog obogaćivanja A1AT: naime hromatografije putem sredstava anjon-izmenjivača, i tretmana SD dezaktiviranja virusa sa Triton X-100 i TnBP, praćeno putem izbacivanja soli sredstava koji dezaktiviraju virus. ;Pronađeno je da se poslednji pomenuti korak može upotrebiti vrlo efektivno u rastvorima koji sadrže A1 AT. ;Postupak pronalaska je posebno koristan kada rastvor koji sadrži A1 AT sadrži značajne količine proteina različite od A1 AT. Iznenađujuće je, da pod uslovima postupka, ovaj korak postupka ne samo da može da bude upotrebljen za uklanjanje deterdženata za dezaktiviranje virusa, već dodatno ima značajno dejstvo prečišćavanja u pogledu odvajanja od bilo kog drugog proteinskih, lipoproteinskih ili lipidnih nečistoća bez da škodljivo utiče na prinos A1 AT. U kombinaciji sa gore pomenutom anjon-izmenjivačkom hromatografijom, u osnovi se dobija A1AT proizvod koji ima čistoću >90%, pretpostavljeno >95% i sadrži A1AT u njegovom aktivnom obliku. Korak postupka tretmana rastvarača deterdženta i vađenja soli. daje aktivni A1AT u prinosu od<>>80%. Ukoliko se upotrebljava kao početni materijal, na primer, rekonstituisana pasta IV1, postupak pronalaska dopušta prečišćavanje A1AT zbog uklanjanja a-2-makroglobulina, haptoglobina, a-1 kiselog glikoproteina, IgG, IgA i IgM iz rastvora koji sadrže A1AT. U specifičnim realizacijama pronalaska, rastvor koji sadrži A1AT nakon koraka odvajanja soli povrati < 10% a-2-makroglobulina, <40% haptoglobina, <10% a-1 kiselog glikoproteina, <10% IgG, <10% IgA i/ili <10% IgM, prema rastvoru A1AT pre tretmana rastvarač/deterdžent, koji je na primer eluat prethodne anjon-izmenjivačke hromatografije. U pretpostavljenim realizacijama pronalaska, inicijalni rastvor koji sadrži A1AT se sastoji od do 50, do 20 ili do 10 masenih % drugih proteina. Inicijalni rastvor pretpostavljeno se sastoji od bar 1, 2 ili 5 masenih % drugih proteina. ;Još dalje, takođe je primećeno da je iznenađujuće postupak pronalaska takođe koristan kao korak dezaktiviranja virusa i/ili pražnjenja, lako je A1 AT povraćen u visokim prinosima, proizvod ne samo da je ispražnjen ili smanjen od drugih komponenti proteina već takođe i od virusa. Ovo je posebno korisno za ne-lipidno-obložene viruse, pošto će lipidno obloženi virusi bidi dezaktivirani putem tretmana deterdžentom. Postugak pronalaska je tako takođe postupak za dezaktiviranje virusa,"posebno ne-lipidno obloženih virusa, u rastvorima koji sadrže A1AT. ;Iznenađujući je nalaz da je "deterdžent/odvajanje soli" postupka kao što je opisan u WO 94/26287 primenjljiv u sadašnjem slučaju, vodi do uklanjanja deterdženta do nivoa koji su prihvatljivi u medicinskim preparatima, i dalje rezultira u krajnje specifičnom obogaćivanju A1AT. Neko bi pretpostavio da će postupak iz WO 94/26287 rezultirati u proizvodima koji imaju smanjene koncentracije deterdženta, koje će uprkos tome i dalje biti previsoke za farmaceutski proizvode, i u kojima se svi proteini i druge komponente osim deterdženata povrate u sličnim iznosima. Prema tome neko bi pretpostavio da će postupak iz WO 94/26287 biti koristan u prečišćavanju proteina od drugih proteina. ;Upotreba hidrofobične (interakcija) hromatografije (HIC), na primer, na Phenvl-Sepharose<®>, je poželjna ukoliko će biti postignut A1 AT proizvod koji ima i dalje viši stepen čistoće. Izvođenje ovog koraka sugeriše samo za sebe, posebn o, posle deterdžent/odvajanje soli tretmana, pošto je vezivanje proteina za hidrofobičnu matricu ili ligande uobičajeno posredovano u prisustvu superfiziološke koncentracije soli. Elucija vezanih proteina se onda efektuira, na primer, smanjivanjem koncentracija soli. U skladu sa tim, nakon uklanjanja "vađenjem soli" deterdženta direktno ili nakon razumnog smanjenja koncentracije soli (putem razblaživanja ili ultrafiltriranja/diafiltriranja; UF/DF), rastvor koji sadrži A1 AT može se dovesti u kontakt sa hidrofobičnom matricom i obaviti se hromatografija poznata stručnjaku iz ove oblasti. ;Dodatno SD tretmanu rastvora koji sadrži A1AT, bar još jedaniJalji korak radi dezaktiviranja virusa, uklanjanje virusa i/ili prion uklanjanje može se integrisati u postupak, na primer, termalno dezaktiviranje virusa rastvora koji sadrži A1AT. Ovi koraci se mogu obaviti, posebno, u rastvoru direktno nakon koraka odvajanja soli u postupku pošto količine soli koje se sadrže u rastvoru, posebno natrijum citrat, služe kao stabilizatori tokom termalnog tretmana. Kao još jedna mogućnost, termalni tretman liofilisanog proizvoda sugeriše sam sebe. Alternativno ili dodatno, bilo koji odgovarajući postupak filtriranja za uklanjanje virusa ili priona može biti uključen. Posebno je nanofiltriranje poznato stručnjaku iz ove oblasti i. može biti integrisano u postupak pretpostavljeno sa komercijalno dostupnim filterima koji imaju veličinu pore u rasponu od 15 do 20 nm ili bilo koje odgovarajuće filtriranje da se uklone virusi i/ili prioni. Uklanjanje virusa može biti poboljšano dodavanjem amino kiselina, pretpostavljeno pri koncentraciji od 0,1 M za svaku amino kiselinu. U pretpostavljenoj realizaciji glicin se dodaje u koncentraciji preko 0,2 M. Pretpostavljeno postupak je opisan kod Yokoyama et al. (2004, Vox Sanguinis 86, 225-229). ;Preparat koji sadrži A1AT se prema pronalasku može dobiti, u principu, postupkom koji karakteriše kombinacija sledećih koraka: (a) podvrgavanje rastvora koji sadrži A1AT anjon-izmenjivačkoj ;hromatografiji; ;(b) opciono heparin hromatografija afiniteta i/ili hromatografija ;hidrofobične interakcije (HIC); ;(c) dodavanje deterdženata i opciono rastvarača za dezaktiviranje ;lipidom-obloženih virusa; *

(d) praćeno odvajanjem soli ovih hemikalija i protein nečistoća; (e) podvrgavanje bar jednom ili više puta koraku dezaktiviranja virusa i/ili uklanjanja.

Generalno su pogodni rastvori koji sadrže A1AT dobijeni iz plazme i njenih frakcija ili rekombinanti ili transgenski ekspresovani A1AT.

U pretpostavljenoj realizaciji postupka, pasta IV1 (Cohn) se rekonstituiše sa vodom ili puferovanim rastvorom, poželjnije sa 20 mM Tris-puferovanog rastvora da se postigne odnost rastvora prema pasti od > 3:1 (pretpostavljeno > 10:1), potom se dovodi u kontakt sa jon-izmenjivačkim gelom, pretpostavljeno anjon-izmenjivačkim gelom, u pretpostavljenoj realizaciji DEAE Sepharose<®>(Amersham), poželjnije DEAE-Sepharose<®>Fast Flow, gel se opere, i A1AT se elutuje putem povećanja jonske snage. Izvede se dezaktiviranje virusa, na primer, putem postupka u skladu sa EP-A-0 131 740. Opciono dodavanje sredstava za stabilizovanje praćeno je dodavanjem sredstava za dezaktiviranje virusa, pretpostavljeno Triton X-100, Polvsorbate 80 (Tvveen 80), TnBP i/ili kaprilna kiselina/kaprilat, pretpostavljeno do konačnih koncentracija od>0,1 mas. % Triton i Tvveen 80,>0,03 mas.% TnBP,>0,1 mM kaprilna kiselina/kaprilat. Nakon odgovarajućeg vremena inkubacije, pretpostavljeno<>>0,1 sati, poželjnije<>>1 sat, na >4 °C, poželjnije na<>>15 °C, povećava se koncentracija soli, posebno do koncentracije od>0,5 M, posebno sa citratom. Čestice koje se time formiraje se uklanjaju, posebno filtriranjem. Ponovno pranje filtera ili odvojenih čestica može da dovede do povećanja A1AT prinosa. Ovo može biti praćeno daljim korakom dezaktiviranja virusa, pretpostavljeno pasterizacijom u prisustvu<>>0,5 M natrijumcitrata, amino kiselina, šećera i smeša ovih supstanci. Potonje snižavanje koncentracije dbjlatih supstanci se pretpostavljeno izvodi putem u ltra-/d iaf i Itri ra nj a. Poželjnije, potonje odvajanje čestica virusa se izvodi sredstvima nanofiltera, pretpostavljeno sredstvima filtera koji imaju veličinu pore od 15-20 nm. Tako dobijeni A1AT može se uskladištiti kao tečni ili zamrznuti preparat, ili biti zamrznut-osušen postupcima poznatim stručnjaku iz ove oblasti.

A1AT pronalaska kao što je definisan zahtevima 12 do 17 je različit od preparata trenutnog stanja tehnike. Preparati EP436086 i DE 4407837. nemaju visoku čistoću preparata pronalaska i IgA sadržaj od<<>1 mg/mL. Tako dobijeni A1AT može se davati kao rastvor potkožno, intramuskularno, mesno ili kao aerosol, pretpostavljeno intravenozno. Kao osušeni materijal, može se takođe upotrebiti za inhalaciju u obliku pudera. Moguća je primena smeše sa drugim rastvorima, na primer, za intravenoznu primenu. Moguće doziranje je, na primer, 60 mg/kg telesne težine nedeljno, ili 250 mg/kg mesečno.

Sledeći pretpostavljeni postupak uključuje dodatno HIC koracima postupka koji su gore pomenuti, pretpostavljeno HIC sredstvima fenil matrice, pretpostavljeno nakon SD tretmana i odvajanja soli od virulentnih sredstava i drugih nečistoća, kao što je to utvrđeno u gornjem tekstu. Pretpostavljeno, obavlja se negativno prečišćavanje, odnosno, vredna supstanca A1AT prolazi kroz hromatografsku matricu nevezana, a neželjene supstance se vezuju i tako uklanjaju iz rastvora u postupku.

U sledećem pretpostavljenom postupku koji može uključiti gore pomenuti HIC, obavlja se hromatografija na imobilisanom heparinu, pretpostavljeno sredstvima heparin-sefaroza ili heparin-fraktogel. Tako se rastvor koji sadrži A1 AT dovodi u kontakt sa heparin gelom u postupkdfkolone ili šarže. Obogaćeni A1AT prolazi kolonu nevezan, ili se nalazi u površinskom sloju nakon odvajanja gela. Ovoaj korak postupka se pretpostavljeno obavlja pre ili nakon gore pomenute jon-izmenjivačke hromatografije, ili nakon odvajanja soli deterdženta i smanjivanjem jonske snage rastvora, na primer, dijalizom.

Takođe zahtevana zaštita pronalaska je medikament koji sadrži A1 AT prema pronalasku kao jedini aktivni sastojak ili u kombinacija sa anti-inflamatornim sredstvima, pretpostavljeno steroidima, NSAlD-ovima, i upotreba A1AT prema pronalasku za pripremanje medikamenta za tretman nedostatka A1AT, degenerativnog fenomena u plućima, kao što je to fibroza pluća i emfizem.

Odgovarajući oblici primene medikamenta koji sadrži A1AT su sami po sebi poznati stručnjaku iz ove oblasti. Posebno, svi oblici primene za proteine su odgovarajući, n.pr., parenteralna primena, intravenozno ili inhalatorno davanje.

Postupak prema pronalasku je dalje ilustrovan sledećim primerom:

Primer 1:

Za rekonstituisanje, rastvara se zamrznuta Cohn IV1 pasta u 20 mM Tris rastvora pri težinskom odnosu od 1:9 sa mešanjem tokom 3 sada u alkalnom pH.

Anjon izmenjivačka hromatografija

Pretpostavljeni hromatografski materijal za ovaj korak postupka je DEAE-Sefaroza FF (brzi protok), iako uslovi mogu biti adaptirani od strane stručnjaka iz ove oblasti za svaki anjon-izmenjivački materijal. Pakovana DEAE-Sefaroza FF hromatografska kolona se uravnotežuje sa 20 mM Tris rastvorom (pH 8,0). Nakon toga, rastvoena Cohn IV1 pasta se nanosti pri pH 8,0. Pranje se izvodi sa puferom za uravnoteženje, praćeno korakom pranja sa pufer rastvorom. A1AT vezan za matricu onda može biti elutovan pranjem kolone sa 20 mM Tris, 0,075 M NaCI, pH 8,0. Specifična aktivnost tako dobijenog A1AT rastvora je oko 0,5 PEU/mg proteina (PEU: plazma ekvivalentna jedinica; odgovara količini ili aktivnost A1 AT koja je pronađena u prošeku u jednom mililitru humane plazme). Kolona se elutuje sa visoko slanim puferom (n.pr., 2 M NaCI), i hromatografski gele se potom može regenerisat po sebi poznatim postupcima.

Rastvarač/deterdžent tretman

Tako dobijeni eluat se koncentriše ultrafiltriranjem. Potom se prethodno smešani rastvor Triton X-100, TnBP i vode za farmaceutsku upotrebu (WFI) dodaje da obogati konačnu koncentraciju od 1 mas.% Triton X-100 i 0,3 mas.% TnBP. SD tretman se obavlja tokom 4 sata na 20 °C sa blagim mešanjem.

Odvajanje soli

Za uklanjanje SD reagenasa i taloženje neželjenih pratećih proteina, rastvor koji sadrži A1AT se razblaži sa rastvorom koji sadrži 1,5 natrijumcitrat i 20 mM Tris pri pH 7,0. Dodavanje koncentracije citrata od 1 M se izvodi tokom bar 15 minuta sa mešanjem. Potom, rastvor postupka se inkubira bar jedan sat sa blagim mešanjem. Beličasti talog ^koji se formira se potom odvaja filtriranjem. Ovo smanjuje koncenftaciju SD reagenasa do ispod 10 ppm, i neželjeni prateći proteini i denaturizovani A1AT se takože odvajaju.

Nakon ovog koraka proizvodnje, specifična aktivnost A1 AT je bar 0,8 PEU/mg (PEU: plazma ekvivalentna jedinica; odgovara količini ili aktivnost A1AT koja je pronađena u prošeku u jednom mililitru humane plazme).

Nanofiltriranje

Nakon uklanjanja niskomolekularnih supstanci sredstvima UF/DF, tako dobijeni rastvor se filtrira kroz filtere sa nominalnom veličinom isključivanja od 15-20 nm, kao što su DV20 filteri kompanije Pali, da bi se dalje povećala bezbednost od virusa A1AT proizvoda.

Rezultati:

Koncentracije Triton X-100 i TnBP u proizvodu nakon filtriranja su ispod 5 ppm. Količina A1AT i drugih protein komponenata u proizvodu se utvrđuje i upoređuje sa količinama koje su utvrđene pre rastvarač/deterdžent tretmana. Izračunata je sledeći povraćaj:

Rezultati pokazuju da je u proizvodu A1 AT povraćen specifično u visokim količinama, dok je proizvod značajno umanjen za druge protein komponente. Ovo je dalje ilustrovano Slikom 1, koja pokazuje rezultat SDS-PAGE rastvora pre rastvarač/deterdžent tretmana (linija 2) i nakon koraka odvajanja soli (linija 3). Vrednost A1 AT korespondira u sva tri slučaja nešto preko 50 kD (u poređenju sa molekularnom težinom markera u liniji 1). Različiti druge protein komponente jasno detektovane u početnom rastvoru su značajno smanjene.

Primer 2

Modifikujući postupak koji je opisan u Primeru 1, eluat koji sadrži A1AT iz jon-izmenjivačke hromatografije se dovodi u kontakt sa heparin-sefarozom. A1AT prolazi kolonu heparin-sefaroza bez da bude vezan. Ukoliko se uposli operacija šarže, A1AT ostaje u površinskom sloju. Dalje procesuiranje eluata kolone ili površinskog sloja iz varijante šarže se izvodi kao što je to opisano u Primeru 1. Tako dobijeni proizvod se karakteriše povećanom čistoćom.

Slika1 prikazuje rezultat SDS-PAGE pod redukovanim uslovima, gradijen 4-20%, Coomassie mrljanje, 5 uo, protein/linija. Linija 1: Molekularna težina markera; linija 2: proba rastvora prema primeru 1 pre rastvarač/deterdžent tretmana; linija 3: proba rastvora prema primeru 1 nakon koraka odvajanja soli.<4>

Claims (19)

1. Postupak za pripremanje A1 AT iz rastvora koji sadrže A1 AT,naznačen time,što se sastoji od sledećih koraka: (a) podvrgavanje rastvora koji sadrži A1AT jon-izmenjivačkoj hromatografiji; (b) dodavanje deterdženata i opciono rastvarača za dezaktiviranje lipidom obloženih virusa; (c) praćeno povećanjem koncentracije soli da se odvajanjem soli izbace deterdženti.

2. Postupak prema zahtevu 1,naznačen time,što se navedeni rastvor koji sadrži A1 AT dobija iz krvne plazme ili njenih faktora, pretpostavljeno od rekonstituisane plazma frakcije IV1<*>(Cohn), ili je izveden iz rekombinantno ili transgenski ekspresovanog<*>A1AT preparata ili površinskog sloja fermentacije.~? ?

3. Postupak prema zahtevu 1 i/ili 2,naznačen time,štose jon-izmenjivačka hromatografija izvodi na anjon-izmenjivačkom gelu, pretpostavljeno DEAE-Sepharose<®>ili DEAE-Sepharose<®>Fast Flow.

4. Postupak prema bilo kom od zahteva 1 do 3,naznačen time,što se navedeno dezaktiviranje virusa prema koraku (b) izvodi sa Triton X-100, Polvsorbate 80 (Tvveen 80), TnBP i/ili kaprilnom kiselinom ili kaprilatom, pretpostavljeno pri konačnim koncentracijama od > 0,1 mas. % Triton i Tvveen 80,<>>0,03 mas.% TnBP,>0,1 mM kaprilna kiselina ili kaprilat, sa vremenom inkubacije od<>>0,1 sati, poželjnije>1 sat, na<>>4 °C, posebno na<>>15 °C.

5. Postupak prema bilo kom od zahteva 1 do 4,naznačen time,što je koncentracija rastvora dovedena do > 0,5 M u koraku (c) i time formirane čestice se pretpostavljeno uklanjaju filtriranjem.

6. Postupak prema bilo kom od zahteva 1 do 5,naznačen time,što se obavlja hromatografija na hidrofobičnim hromatografskim materijalima.

7. Postupak prema bilo kom od zahteva 1 do 6,naznačen time,što se obavlja tretman frakcije koja sadrži A1AT sa materijalom koji sadrži heparin u imobilisanom obliku (heparin gel).

8. Postupak prema bilo kom od zahteva 5 do 7,naznačen time,što se dalji korak dezaktiviranja virusa obavlja kasnije, pretpostavljeno pasterizacijom u prisustvu ^ 0,5 M natrijumcitrata, amino^kiselina, šećera ili njihovih smeša. - ?

9. Postupak prema bilo kom od zahteva 1 do 8,naznačen time,što se jonska snaga rastvora pretpostavljeno smanjuje ultra-/diafiltriranjem.

10. Postupak prema bilo kom od zahteva 1 do 9,naznačen time,što se odvajanje virusnih čestica obavlja, pretpostavljeno nanofiltriranjem, pretpostavljeno sa filterima koji imaju veličine pore od 15-20 nm.

11. Postupak prema bilo kom od zahteva 1 do 10,naznačen time,što se dobijena A1AT frakcija skladišti kao tečni, zamrznut ili zamrznut-osušen preparat.

12. A1AT,naznačen time,što ima čistoću od > 90%, aktivnost > 0,8 PEU/mg u svom aktivnom obliku, IgA sadržaj od<<>1 mg/mL, preostali sadržaj deterdženta <50 ppm, posebno <10 ppm, i sadržaj monomera > 90%, na osnovu ukupne količine A1AT.

13. A1AT prema zahtevu 12,naznačen time,što se može dobiti postupkom koji se sastoji od sledećih koraka: rekonstitucija plazma frakcije IV1 (Cohn); anjon-izmenjivačka hromatografija na DEAE-Sepharose<®>Fast Flow; opciona hromatografija na čvrstoj fazi koja sadrži heparin u imobilisanom obliku (heparin hromatografija afiniteta); opciono hromatografija hidrofobične interakcije (HIC); dezaktiviranje virusa sa > 0,1 mas. % Triton/ >0,03 mas.% TnBP sa vremenom inkubacije od<>>1 sat na >15°C; dodavanje soli da se poveća jonska snaga rastvora; i uklanjanje odatle formiranih čestica filtriranjem.

14. A1AT prema zahtevu 13,naznačen time,što se dalji korak dezaktiviranja virusa obavlja kasnije, pretpostavljeno pasterizacijom u prisustvu<>>0,5 M natrijumcitrata, amino kiselina, šećera ili njihovih smeša.

15. A1AT prema zahtevu 13,naznačen time,što se jonska snaga rastvora pretpostavljeno smanjuje ultra-/diafiltriranjem.

16. A1AT prema zahtevu 13,naznačen time,što se odvajanje virusnih čestica obavlja, pretpostavljeno nanofiltriranjem, pretpostavljeno sa filterima koji imaju veličine pore od 15-20 nm.

17. A1AT prema zahtevu 13,naznačen time,što se dobijena A1AT frakcija skladišti kao tečni, zamrznut ili zamrznut-osušen preparat.

18. Medikament koji sadrži A1AT prema bilo kom od zahteva 12 do 17,naznačen time,što se nalazi kao jedini aktivni sastojak ili u kombinaciji sa anti-inflamatornim sredstvima, pretpostavljeno steroidima, NSAlD-ovima. ~

19. Upotreba A1AT prema bilo kom od zahteva 12 do 17 za pripremanje medikamenta za lečenje nedostatka A1 AT, degenerativnog fenomena pluća, kao što je fibroza pluća ili emfizem.