RS20060473A - Derivati furosemida kao modulatori hm74 i njihova primena u lečenju inflamacije - Google Patents

Abstract

Ćelije domaćini koji eksprimuju HM74 su korišćene za dobijanje furosemid-sličnih moelkula koja imaju agonističku aktivnost i sledeću strukturnu formulu:

Description

DERIVATIFUROSEMIDA KAO MODULATORT^ffl^TtfifrHOVA PRIMENA U

LEČENJUINFLAMACIJE

Stanje tehnike

Receptori kuplovani sa G faktorom (GPCR) su integralni proteini membrane, a uključeni su u transdukciju ćelijskog signala. GPCR reaguju na različite ekstracelularne signale, uključujući neurotranmitere, hormone, odorante i svetlost i mogu da transdukuju signale tako da iniciraju reakciju drugog mesendžera u ćeliji. Mnogi terapeutski lekovi ciljaju na GPCR zato što su ovi receptori medijatori između različitih fizioloških reakcija, uključujući inflamaciju, vazodilataciju, brzinu otkucaja srca, bronhodilataciju, endokrinu sekreciju i peristalziju.

Za oboljenja kao što je astma, hronično opstruktivno oboljenje pluća (COPD), psorijaza i reumatoidni artritis (RA) generalno se smatra da imaju inflamatornu etiologiju uključujući pomoćne T ćelije, monocit-makrofage i eozinofile. Postojeća antiinflamatorna terapija sa kortikosteroidimaje efikasna kod astme, ali je povezana sa metaboličkim i endokrinim sporednim efektima. Isto važi i za formulacije za inhaliranje koje se mogu apsrobovati preko pluća ili mukoze nosa. Trenutno nema zadovoljavajuće oralne terapije za RA ili COPD.

Kloniranje molekula HM74 iz humanih monocita predviđa daje HM74 hemokini receptor (Nomura et al., Int. Immunol. (1993) 5(10): 1239-1249). HM74 se primarno eksprimuje u koštanoj srži, slezini, krajnicima i traheji. Ligand HM74 nije poznat.

Humane ćelije sadrže srodan, ali različit receptor HM74A. Aminokiselinske sekvence HM74 i HM74A su identične oko 95%. Međutim, identifikovan je ligand HM74A dok za HM74 nije. Niacin ili nikotinska kiselina je HM74A ligand, Wise et al., J. Biol. Chem. 278: 9869-9874, 2003. Niacin je slab aktivator HM74.

Genom miša sadrži HM74A ali ne i gen HM74.

Pod određenim uslovima, HM74 i HM74A pokazuju koregulaciju. Korišćenjem Taqman-PCR, prijavilac je našao da su ekspresije HM74 i iHM74A indukovane 50-puta pomoću THFa u granulocitima i 10-20 puta pomoću LPS ili TNFa u monocitima. Ekspresija HM474 takođe indukuje -5 puta u normalnim humanim epitelijalnim ćelijama uz pomoć Th2 citokina, IL-4 ili IL-13, što je poznato kao veoma važno u etiologiji astme. Ekspresija HM74 i HM74A je stimulisana kod humanih eozinofila pomoću IL-5. Konačno, pulmonarna ekspresija HM74A je uređena naviše kod eksperimentalnog modela astme kod miša.

Ograničena distribucija HM74 i HM74A u tkivu i njihova regulacija ukazuje na ulogu koju HM74 i HM74A imaju u inflamatornim procesima, kao stoje astma, RA i COPD u inflamaciji.

Uloga koju GPCR ima u bolestima i sposobnost da leči bolesti moduliranjem aktivnosti GPCR, identifikacija i karakterizacija GPCR liganada može da obezbedi razvoj novih preparata i metoda za lečenje oboljenja koja obuhvataju aktivnost GPCR-a. Predmetni pronalazak identifikuje i karakteriše molekule koji vzuju HM74 i obezbeđuju preparate i metode za primenu otkrića na identifikaciju i lečenje oboljenja.

Opis pronalaska

Predmetni pronalazak se odnosi na molekule koji aktiviraju HM74, ali ne i HM74A. Molekuli imaju sledeću strukturu:

gde je R, vodonik ili Ci-Ci8alkil, koji mož biti razgranat, može da sadrži heteroatom ili može biti supstituisan, ili njihova kombinacija; Ci-Cigalkenil, koji može biti razgranat, može da sadrži heteroatom ili može biti supstituisan ili njihova kombinacija; Ci-Cigalkinil, koji može biti razgranat, može da sadrži heteroatom ili može biti supstituisan, ili njihova kombinacija, C3-Cgaril koji može da sadrži sporednu grupu, može da ima most, može da ima heteroatom ili može biti supstituisan, ili njihova kombinacija; ili Cs-Cigcikloalkil koji može da

ima sporednu grupu, može da ima most, zatim da sadrži heteroatom ili može biti supstituisan, ili njihova kombinacija;

svaki od Q i X je O, S ili NR;

Y je Ci-Cigalkil koji može biti razgranat, može da sadrži heteroatom ili može biti supstituisan ili njihova kombinacija; Ci-Cisalkenil, koji može biti razgranat, može da ima heteroatom ilimože biti supstituisan ili njihova kombinacija; Ci-Ci8alkinil, koji može biti razgranat, može da sadrži heteroatom ili može biti supstituisan ili njihova kombinacija; C3-Cigaril koji može da ima sporednu grupu, može da ima most, može da sadrži heteroatom ili može biti supstituisan ili njihova kombinacija; ili Cs-Ciscikloalkil, koji može da sadrži sporednu grupu, može da ima most, može da sadrži heteroatom ili može biti supstituisan ili njihova kombinacija, gde X i Y se mogu kondenzovati u jdan ili više prstenova kada je X, N pri čemu je dati prsten C3-Ci8heterocikl, koji može biti razgranat i koji može da sadrži sporednu grupu i C3-Ci8heteroaril, koji može biti razgranat i koji može da ima sporednu grupu, supstituisan C3-Ci8cikloalki, koji može biti razgranat i koji može da ima sporednu grupu; ili C3-Ci8aril koji može biti razgranat i koji može da ima sporednu grupu; i

svaki Z je R.

U sledećem aspektu pronalaska, opisane su metode za identifikaciju modulatora HM74. Na primer, metod od interesa obuhvata korake obezbeđivanja hemijske grupe, obezbeđivanja ćelijskog eksprimovanja HM74 i određivanja da li hemijska grupa modulira signalnu aktivnost HM74, uključujući i to da li se svaka modulacija dešava u prisustvu ili odsustvu agonista predmetne prijave. U srodnom aspektu, hemijske grupe mogu da budu, ali nisu i ograničene na, peptide, antitela, agoniste, inverzne agoniste i antagoniste. Alternativno, može se koristiti poznati modulator u testu kompeticije da bi se identifikovali drugi modulatori.

Antranilna kiselina supstituisana bazom ili furosemidi od interesa aktiviraju HM74. Oav jedinjenja izazivaju selektivnu mobilizaciju kalcijuma, koja odgovara dozi, u ćeliji koja eksprimira HM74, kao što su humane ćelije, kao što su CHO ćelije i LI.2 ćelije. Kontrolne ćelije koje nisu transformisane sa HM74 kodirajućom sekvencom nisu pokazale reakciju kalcijuma. Jedinjenja od interesa su takođe aktivirala HM74 u testu reporter kvasca i indukuju hemotaksu u transfektovanim LI.2 ćelijama.

Jedinjenja od interesa su generalno antagonisti. Tako, jedinjenja od interesa se mogu razviti kao kandidati za lek. Jedinjenja od interesa se takođe mogu koristiti za identifikaciju drugih molekula koji aktiviraju, vezuju i/ili moduliraju HM74, na primer, testom kompeticije.

Sledeći aspekt pronalaska obuhvata terapeutske preparate, gde ovi preparati sadrže nukelinske kiseline, antitela, polipeptidi, agonisti, inverzni agonisti i antagonisti. Dalje, metode pronalaska takođe obuhvataju i metode lečenja oboljenja i modulira HM74 signalnu aktivnost adminstriranjem datih terapeutskih preparata obolelom pacijentu.

Ovi li drugi aspekti pronalaska će postati evidentni prilikom pozivanja na detaljni opis koji sledi i priložene crteže. Dalje, date su u daljem tekstu različite reference koje detaljnije opisuju određene procedure ili preparate. Svaka od referenci je data referencom.

Detaljan opis pronalaska

Predmetni pronalazak je zasnovan na otkriću molekula koji aktivira HM74.

Poznata je kodiraj uća sekvenca HM74, Normira et al., supra. Ovde su date metode za dobijanje i korišćenje HM74. Izmene na kodirajućoj sekvenci HM74 i amino kiselni su tolerisane dokle god poznate funkcionalne aktivnosti HM74 niu značajno ugrožene.

Jedinjenja predmetnog pronalaska moduliraju aktivnost HM74 i agonisti su HM74 i shodno tome predstavljaju kandidate za lekove za lečenje oboljenja okarakterisana inflamacijom, kao stoje astma.

Predmetna jedinjenja se takođe mogu koristiti za skrining antagonista HM74. Na primer, ćelije koje eksprimuju HM74 su izložene test jedinjenju i zatim agonistu predmetnog pronalaska. Efekat test jedinjenja na mobilizaicju kalcijuma, na primer, može se utvrditi radi određivanja da li test jedinjenje smanjuje nivo mobilizacije kalcijuma indukovan agonistom predmetnog pronalaska.

Razmatrano je da druga analiza za identifikaciju, na primer, agonista i inverznih agonista, bude obuhvaćena predmetnom pronalaskom.

Odgovarajuća jedinjenja obuhvataju sulfamoilantranilne kiseline, kao što su ove sledeće strukture:

gde je R, vodonik ili Ci-Cigalkil, koji mož biti razgranat, može da sadrži heteroatom ili može biti supstituisan, ili njihova kombinacija; Ci-Cigalkenil, koji može biti razgranat, može da sadrži heteroatom ili može biti supstituisan ili njihova kombinacija; Ci-Cigalkinil, koji može biti razgranat, može da sadrži heteroatom ili može biti supstituisan, ili njihova kombinacija, C3-Cgaril koji može da sadrži sporednu grupu, može da ima most, može da ima heteroatom ili može biti supstituisan, ili njihova kombinacija; ili Cs-Cigcikloalkil koji može da ima sporednu grupu, može da ima most, zatim da sadrži heteroatom ili može biti supstituisan, ili njihova kombinacija;

svaki od Q i X je O, S ili NR;

Y je Ci-Cigalkil koji može biti razgranat, može da sadrži heteroatom ili može biti supstituisan ili njihova kombinacija; Ci-Cigalkenil, koji može biti razgranat, može da ima heteroatom ilimože biti supstituisan ili njihova kombinacija; Ci-Ci8alkinil, koji može biti razgranat, može da sadrži heteroatom ili može biti supstituisan ili njihova kombinacija; C3-Cigaril koji može da ima sporednu grupu, može da ima most, može da sadrži heteroatom ili može biti supstituisan ili njihova kombinacija; ili Cs-Cigcikloalkil, koji može da sadrži sporednu grupu, može da ima most, može da sadrži heteroatom ili može biti supstituisan ili njihova kombinacija, gde X i Y se mogu kondenzovati u jdan ili više prstenova kada je X, N pri čemu je dati prsten C3-Cigheterocikl, koji može biti razgranat i koji može da sadrži sporednu grupu i C3-Cigheteroaril, koji može biti razgranat i koji može da ima sporednu grupu, supstituisan C3-Cigcikloalki, koji može biti razgranat i koji može da ima sporednu grupu; ili C3-Ci8aril koji može biti razgranat i koji može da ima sporednu grupu; i

svaki Zje R.

U sledećem aspektu pronalaska, opisane su metode za identifikaciju modulatora HM74. Na primer, metod od interesa obuhvata korake obezbeđivanja hemijske grupe, obezbeđivanja ćelijskog eksprimovanja HM74 i određivanja da li hemijska grupa modulira signalnu aktivnost HM74, ukl jučujući i to da li se svaka modulacija dešava u prisustvu ili odsustvu agonista predmetne prijave. U srodnom aspektu, hemijske grupe mogu da budu, ali nisu i ograničene na, peptide, antitela, agoniste, inverzne agoniste i antagoniste. Alternativno, može se koristiti poznati modulator u testu kompeticije da bi se identifikovali drugi modulatori.

Izraz "alkil" značava prav ili razgranat lanac ugljovodonika. Tipični primeri su metil, etil, propil izopropil, butil, izobutil, terc-butil, sek-butil, pentil i heksil. Ugljovodonik može da sadrži jedan ili više nezasićenih dvostrukih ili trostrukih veza, kao što su alkeni i alkini.

Izraz "alkoksil" označava alkil grupu vezanu za atom kiseonika. Primeri su metoksi, etoksi, propoksi, butoksi i pentoksi.

"Aril" je aromatični ugljovodonični prsten. Primeri su fenil i naftil.

"Heteroatom" je generalno atom koji se razlikuje od onih koji su tipični za molekul. Tako, u ugljovodoniku bilo koji atom koji nije ugljenik ili vodonik je heteroatom. Uobičajeni biološki prihvatljivi heteroatomi su kiseonik, sumpor i azot.

Izraz "heteroaril" odnosi se na aril grupu gde je jedan ili više atoma ugljenika zamenjeno heteroatomom. Primeri su piridil, imidazolil, pirolil, tienil, furil, piranil, pirimidinil, piridazinil, indolil, hinolil, naftiridinil i izoksazol.

Izraz "cikloalkil" se odnosi na ciklični ugljovodonik. Neki od primera su ciklopropil, ciklobutil, ciklopentil i cikloheksil.

"Heterocikl" je cikloalkil gde je jedan ili više atoma ugljenika zamenjeno heteroatomom. Primeri su pirolidinil, piperidnil i piperazinil.

Izraz "heteroalkil" je alkil gde je jedan ili više atoma ugljenika zamenjeno heteroatomom. Etar je heteroalkil.

Pod izrazom "supstituisan" podrazumeva se da radikal organske baze ima jednu ili više grupa supstituenata. Tako, atom ili grupa zamenjuje drugi atom ili grupu u molekulu. Reprezentativni susptituenti su halogen, Ci.g alkil, -CN, -NO2, alkoksi, hidroksil, sulfid, sulfat,sulfonamid, amin i amid.

"Razgranat" označava da struktura ima jednu ili više grana najednom ili više mesta. Grana može biti R grupa kao stoje prethodno definisano ili druga sporedna grupa.

Izraz "prsten" označava jednu, jednu od više prstenastih struktura ili više prstenastih struktura, gde dva ili više prstena može da bude kondenzovano, pri čemu jedan ili više od prstenova može biti aromatičan, da sadrži heteroatom, može da bude supstituisan ili njihova kombinacija. Prsten može da bude bicikličan ili polisikličan. Prsten može da sadrži most različite dužine.

"Halogen" je na primer, hlor, fluor ili brom.

Izraz "sporedna grupa" označava atom ili molekul vezan za drugu strukturu. Prema tome, sporedna grupa može da bude prethodno definisana R grupa, alkil, alkenil, aril, cikloalki itd.

Izraz "most" odnosi se na vezu ("linker") između dve strukture. Na primer, neciklični ugljovodonik, kao što je alkil, aleknil i slično, koji može da sadrži heteroatom, može da bude supstituisan, može da bude razgranat ili kombinacija ova dva, može da poveže dva ciklična ugljovodonika kao što je aril ili cikloalkil grupa. Mostovi takođe mogu da budu deo ciklične strukture povezujući barem dva atoma ciklične strukture. Intramolekulski most može da sadrži 0, 1,2, 3,4 ili više atoma. Intramolekulski most može da bude linearan, razgranat ili supstituisan.

Posebna jedinjenja od interesa su ona gde 1) kada je R, vodonik i Q je kiseonik ili sumpor, tada W nije vodonik ili jedna ili obe Z grupe nisu vodonik.; i 2) kada su obe Z grupe, W i R, vodonik i Q je kiseonik, tada su X i Y kombinovani u prstenastu strukturu.

Jedinjenja od interesa sadrže funkcionalne grupe koje se mogu derivatizovati dajući na primer, prolek, kao što je poznato u tehnici, koji pospešuje bio-raspoloživost. Tako, predmetni pronalazak razmatra varijante aktivnih jedinjenja od interesa koji su, posle asministracije, metabolizirani do bioaktivnog oblika. Ovi bioaktivni prekursori leka su poznati kaobioreverzibilni nosači, latentni lekovi, sistemi za distribuciju ili prolekovi. ("Bioreversible Carriers in Drug Design " E.B. Roche, ed., Pergamon, NY, 1987; "Prodrugs as Novel Drug Deliverv Svstems", Higuchi & Stella, ds., American Chemical Societv, DC, 1975)

Hemijske modifikacije lekova su usmerene na posebne aspekte farmakodinamike, kao što je kako pospešiti raspoloživost polarnih jedinjenja koji moraju da pređu lipidnu barijeru, kako da stabilizuju jedinjenja koja su normalno susceptibilna na degradaciju in vivo itr.

Drugi razlozi za dobijanje prolekova su toksičnost bioaktivnih lekova, nedostatak ? specifičnosti, nestabilnost, da mogu da budu metabolisani na mestu apsropcije, suviše brza apsorbovanost, usagalšenost sa pacijentom, kao što je loš ukus ili bol na mestu injekcije, loše prihvaćanje problema formulacije od strane lekara.

Uobičajena modifikacija je esterifikacija, koja nije ograničena na derivatizaciju karboksilne grupe. Postoji hemijsko dobijanje ovih derivata, na primer supstituenti koji sadrže amine, iminie, sumpor kao i amide.

U slučaju estara, mogu se dodati različiti supstituenti, uključujući nerazgranate ciklične ili razgranate ugljovodonike koji mogu biti supstituisani, mogu da sadrže jednu ili više dvostrukih ili trostrukih veza, mogu da sadrže prstenaste strukture, ugljovodonični skelet može da sadrži jedan ili više heteroatoma, kao što je azot, sumpor ili kiseonik, itd.

Kada se razmatra R grupa za stvaranje estra, drugi faktor koji treba razmotriti je suseptibilnost na enzimsko cepanje (hidrolizu). Tako, sterno naelektrisanje i konformacioni faktori mogu da odrede bioraspoloživot. Na primer, razgranata alkil grupa može da bude sterna smetnja za pristup na aktivno mesto esteraze, usprovajući tako brzinu hidrolize. To može biti ili manje poželjno, kada je bioraspoloživot odložena ili poželjno, kada je bioraspoloživost, produžena.

U drugim uslovima, poželjno je pospešiti rastvorljivost leka u vodi. Primeri supstituenta pomoću kojih se postiže ovaj cilj su sukcinati, sulfati, hemisukcinati, fosfati, amino kiseline, acetati, amini i slično.

Azot iz amida, imidi, karbonati, hidrantoini i slični se mogu derivatizovati. Odgovarajuće grupe za reakciju sa azotom su hidroksimetil grupe ili hidroksialkil grupe, generalno, cikloalkil grupe i acil grupe.

Za derivatizaciju navedene su takođe i karbonil grupe. Primeri derivata su Schiff-ove baze, oksini, ketali, acetali, oksalidini, taizloidini i enol estri.

Dok prethodno opisani derivati sadrže kovalentne veze supstituenta i leka, dotle supstituent može da bude vezan za lek i na drugi način, na primer, vodoničnim vezama, van der Waals-ovim vezama, elektrostatičkim vezama, hidrofobnim interakcijama i slično.

Sledeći način derivatizacije je primena supstituenata koji su ne-enzimskim mehanizmom odvojeni sa proleka. Primeri obuhvataju prolek koji sadrži (2-okso-l,3-dioksol-4-il)metil estar, Mannich-ove stre, oksazolidine, estre sa baznim sporednim lance koji katalizuje intramolekulsku hidrolizu i estre ili amide koji podležu reakciji eliminacije intramolekulske nukleofilne ciklizacije. Mehanizam ciklizacije je dostupan za lekove koji sadrže fenole, alkohole i amine. "Prodrug Design" Testa & Mayer u "Enciklopedia of Pharmaceutical technologv", 2<nd>ed. V.3, Swarbrick & Bovlan, eds., Marcel Dekker, 2002.

Prema tome, predmetni pronalazak razmatra druge lekove jedinjenja od interesa, prema poznatim metodama sinteze radi dobijanja jedinjenja koja po administriraju reaguju ili deluju in vivo dajući jedinjenje koje modulira selektivnost HM74.

Izraz " ekvivalentni aminokiselinski ostaci" označava amino kiseline koje se nalaze na gostovo istom položaju unutar proteinske sekvence kada su dve ili više sekvenci poravanate za analizu. Preferentni polipeptidi HM74 predmetnog pronalaska imaju aminokiselinsku sekvencu u dovoljnoj meri indenitčnu sa onom iz divljeg soja HM74. Pod "divljim-sojem" podrazumeva se najrasprostranjeniji oblik ili alel prisutan u definisanoj populaciji, bilo lokalnog ili pak šireg obima. Izraz "dovoljno identičan" je ovde korišćen da uputi na prvu amino kiselinu ili nukelotidnu sekvencu koja sadrži dovoljan ili minimalan broj indentičnih ili ekvivalnentih (npr. sa sličnim sporednim lancem) aminokiselinskih ostataka ili nukeotida, na drugu aminokiselinsku ili nukelotidnu sekvencu tako da prva i druga aminkiselinska ili nukelotidna sekvenca imaju zajednički strukturni domen i/ili zajedničku funkcionalnu aktivnost. Na primer, aminkiselinska sekvenca koja sadrži zajednički strukturni domen je najmanje 96% istovetna (identična) sa HM74 aktivnosti, je ovde definisana kao dovoljno indentična.

Kao što je ovde korišćen izraz , "aktivnost HM74", "biološka aktivnost HM74" ili "funkcionalna aktivnost HM74" odnosi se na aktivnost koju vrši protein HM74, protein, polipeptid ili molekul nukelinske kiseline na ćeliju koja eksprimira HM74 što je određeno in vivo ili in vito, prema standardnim tehnikama. Aktivnost HM74 može da bude direktna aktivnost, kao što je asocijacija sa ili enzimska aktivnost na drugom preotinu ili kao indirektna aktivnost, kao što je ćelijska signalna aktivnost prosredstvom interakcije HM74 sa drugim proteinom. U preferentnoj realizaciji, aktivnost HM74 obuvhata barem jednu ili više aktivnosti: (i) sposotbnost da interaguje sa proteinima u signalnom putu HM74; (ii) sposobnost da interaguje sa HM74 Ugandom; (ii) sposobnost da izmeni ćeliju domaćina kad je aktiviran; (iv) aktivacija na vezivanju molekula i (v) sposobnost da interaguje sa ciljnim intracelularnim proteinom.

Jedan aspekt pronalaska je u vezi sa eksprimovanjem HM74 u ćelijama koja ispoljava reakciju kada je aktiviran HM74. Kao što je ovde korišćen, izraz "molekul nukelinske kiseline" je korišćen sa namerom da obuhvati DNK molekule (npr. cDNK ili genomsku DNK) i RNK molekule (npr. mRNK)i analoge DNK ili RNK dobij ene korišćenjem nukleotidnih analoga. Molekul nukleinske kiseline može da bude jednostruk ili dvostruk, preferentno je dvostruka DNK.

"Izolovani" molekul nukelinske kiseline je ondaj koji je odvojen od drugog molekula nukleinske kiseline koji je prisutan u prirodnom izvoru nukleinske kiseline. Preferentno, "izolovana" nukelinska kiselina nema sekvence koja se pirodno nalazi bočno na nukelinskoj kiselini koja kodira HM74 (tj. sekvence locirane na 5' i 3' krajevima nukelinske kiseline) u genomskom DNK organizama iz kojih je izvedena nukelinska kiselina. Izolovan molekul HM74 nukleinske kiseline moža da sadrži manj od oko 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0.5 kb ili 0.1 kb nukleotidnih sekvenci koje se prirodno nalaze sa bočne strane otvorenog okvira čitanja molekula nukelinske kiseline u genomskom DNK u ćeliji iz koje je izvedena nukleinska kiselina. Dalje, "izolovan" molekul nuklinske kiseline, kao što je cDNK molekul, može da bude gotovo bez drugih ćelijskih materijala ili medijuma kulture kada je dobijen tehnikama rekombinacije ili gotovo bez hemijskih prekursora ili drugih hemikalija kada je hemijski sintetisan.

Molekul nukleinske kiseline predmetnog pronalaska npr. molekul nukelinske kiseline koji kodira HM74 može se izolvoati pomoću standardnih mikrobioloških tehnika i sekvence (Normira et al., supra). Koristeći sve ili delova HM74 sekvence, molekuli nukleinske kiseline HM74 mogu se izolovati primenom standardnih tehnika hibridizacije i kloniranja (npr. kao što je opisano u Sambrook et al., eds. Molekular Cloning: A Laboratorv Manual, 2<nđ>ed., Cold Spring Harbor Laboratorv Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989).

Molekul nukleinske kiseline predmetnog pronalaska može se pojačati pomoću cDNK, mRNK ili genomske DNK kao templata i odgovarajućih oligonukleotidnih prajmera prema standardnim PCR tehnikama pojačavanja. Ovako pojačana nuklinska kiselina se može klonirati u odgovarajući vektor i okarakterisati analizom DNK sekvence. Dalje, oligonukleotidi koji odgovaraju nukelotidnoj sekvenci HM74 mogu se pripremiti standardnim tehnikama sinteze, npr. korišćenjem automatskog uređaja za DNK sintezu.

Dalje, molekul nuleinske kiseline pronalaska može da obuhvati samo deo sekvence nuklinske kisleine koja kodira HM74, na primer, fragment koji kodira ekstracelularne domne i/ili intracelularne domene koji dovodi do intracelularnog događaja koji se može detektovati, kada je ligand vezan za njega. Preferentno, ovaj intracelularni dogašaj koji se može detektovati je onaj koji je priećen kada je HM74 aktiviran u normalnoj ćeliji domaćinu.

Fragment nukelinske kiseline koji kodira "biološki aktivni deo HM74" može se pripremiti izolovanjem dela HM74 koji kodira polipeptid sa HM74 biološkom aktivnosti, akrpimirajući kodirani deo proteina HM74 (npr. rekombinantnom ekspresijom in vitro) i procenom aktivnosti kodiranog dela HM74.

Pronalazak dalje obuhvata molekule nukleinske kiseline koji se razlikuju od nukleotidne sekvence otkrivene HM74 zbog degeneracije genetskog koda i na taj način kodira gotovo isti HM74 protein kao što je prethodno dat.

Prosečan stručnjak će ceniti činjenicu da polimorfizam DNK sekvence koji vodi do promena aminokiselinske sekvence HM74 može da napusti populaciju (npr. populaciju ljudi). Ovaj genetski polimorfizam u kodirajućoj sekvenci HM74 može da postoji među pojedincima unutar populacije zbog prirode alelne varijacije. Alele je jedan iz grupe gena koja se alternativno javlja na datom genetičkom lokusu. Kao što su ovde korišćeni, izrazi"gen" i "rekombinantni gen" odnosi se na molekule nukelinske kiseline koji su sastoji of otvorenog okvira čitanja proteina HM74, preferentno protein HM74 sisara. Kao što je ovde korišćen, izraz "alelna varijanta" se odnosi na nukelotidnu sekvencu koja se javlja na lokusu HM74 ili na polipeptid koji kodira nukleotidna sekvenca. Alternativni aleli se mogu identifikovati lako pomoću sondi za hibridizaciju radi identifikacije istih genetskih lokusa u različitim pojedincima. Sve ove vaijacije nukleotida i rezultujući polimorfizam aminokiselina ili varijacije u HM74 koje su rezultat prirodnih alelnih varijacija i koje ne menjaju funkcionalnu aktivnost HM74 obuhvaćene su obimom pronalaska.

Dalje, molekuli nukleinskih kiselina koje kodiraju HM74 proteine od drugih vrsta (HM74 homologa) sa nukleotidnom sekvencom koja se razlikuje od humanog HM74 ali imaju suštinski istu kativnost, su obuhvaćeni ovim pronalaskom. Molekuli nukleinskih kiselina koji odgovaraju prirodnim alelnim varijantama i homolzima HM74 cDNK pronalaska mogu se izolovati na osnovu identiteta sa ovde opisanim humanim HM74 nuklelinskim kiselinama koje koriste humanu cDNK ili njen deo, kao deo za hibridizaciju prema standarnim tehnikama hibridizacije pod strogim uslovima hibridizacije.

Kao što je ovde korišćen, izraz "hibridizacija pod strogim uslovima" opisuje uslove za hibridizaciju i ispriranje pod kojima nukeloidna sekvenca oično ostaje hibridizovana. Oi strogi uslovi su poznati prosečnom stručnjaku i mogu se naći u "Current Protocols in Molecular Biologv", John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6. Poželjan, neograničavajući primer strogih uslova hibridizacije je hibridizacija u 6X natrijum hlorid/natrijum citratu (SSC) na oko 45°C, zatim sledi jedno ili više ispiranja u 0.2X SSC, 0.1% SDS na 50-65°C. Poželjno, molekul izolovane nukelinske kiseline predmetnog pronalaska koji se hibiridzuje pod strogim uslovima do sekvence HM74 ili njen komplement odgovara molekulu prirodne nukelinske kiseline. Kao što je ovde korišćeno molekul "prirodne" nukleinske kiseline koji se odnosi na molekul RNK ili DNK sa nukleotidnom sekvencom koja se može naći u prirodi (npr. kodira prirodni protein)..

Pored prirodnih alelnih varijacija sekvence HM74 koja može da postoji u populaciji, prosečan stručnjak će ceniti činjenicu da se promene mogu uvesti mutacijom u nukelotidne sekvence, što dovodi do izmena u sekvenci amino kiselina koje kodiraju H74, bez suštinske izmene biološke aktivnosti proteina HM74. Tako, moguće je izvesti nukelotidne supstitucije koje vode do supstitucija na "neesencijalnim" amino kiselinskim ostacima. "Neesencijalni" aminokiselinski ostatak je ostatak koji se može izmeniti od divljeg soja sekvence HM74 bez suštinske izmene biološke aktivnosti. "Esencijalan" aminokiselinski ostatak je onaj koji je potreban za suštinsku biološku aktivnost. Na primer, aminokiselinski ostaci koji nisu sačuvani ili samo polusačuvani među različitim vrstama HM74 , mogu biti ne-esencijalni za aktivnost i tako neće biti pogodni ciljevi za izmenu.

Shodno ovom, drugi aspekt pronalaska odnosi se na molekule nukelinske kiseline koji kodiraju HM74 proteine koji sadrže izmene u aminokiselnskim ostacima koji nisu esencijalni za aktivnost. Ovi HM74 proteini razlikuju se od poznate sekvence amino kiselina, ali su ipak sačuvali biološku aktivnost. U jednom pristupu, molekul izolovane nukleinske kiseline obuhvata nukleotidnu sekvencu koja kodira protein koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ili 100 % identična poznatoj aminokiselinskoj sekvenci HM74.

Molekul izolovane nukleinske kiseline koji kodira HM74 protein sa sekvencom koja se razlikuje od ona poznate za HM74, može se dobiti uvođenjem jedne ili više nukleotidnih supstitucija, dodavanja ili izostavljanja u nuklotidnu sekvencu poznatog HM74 tako daje jedna ili više aminokiselinskih supstitucija, dodavanja ili izostavljanja uvedeno u kodirani protein.

Mutacije se mogu uvesti standardnim tehnikama, kao što je mutageneza usmerena ka mestu i mutageneza posredstvom PCR. Poželjno, konzervativne supstitucije amino kiselina su izvedene najednom ili više predviđenih ne-esencijalnih aminokiselinskih ostataka. "Konvervativna supstitucija amino kiselina" je ona gde je aminokiselinski ostatak vamenjen aminokiselinskim ostatkom sa sličnim sporednim lancem. Familije aminokiselinskih ostataka sa sličnim sporednim lancima su definisani u tehnici. Familije obuhvataju amino kiseline sa baznim sporednim lancima (npr. lizin, arginin i histidin), kiselim amino sporednim lancima (npr. asparaginska kiselina ili glutaminska kiselina), nenaleketrisanim polarnim sporednim lancima (npr. glicin, asparagin, glutamin, serin, treonin, tirozin i cistein), nepolarnim sporednim lancima (npr., alanin, valin, leucin, izoleucin, prolin, fenilalanin, metionin i triptofan), beta-razgranatim sporednim lancima (npr., treonin, valin i izoleucin) i aromatičnim sporednim lancima (npr., tirozin, fenilalanin, triptofan i histidin). Tako, predviđen neesencijalan aminokiselinski ostatak u HM74 je prederetno zamenjen drugim aminokiselinskim ostatkom iz iste familije sporednih lanaca. Alternativno, mutacije se mogu uvesti nasumice duž celog ili samo duž delova sekvence koja kodira HM74, kao što je zasićean mutageneza i nastali mutanti se mogu pregledati na HM74 biološku aktivnost radi identifikacije mutanata koji zadržavaju aktivnost. Nakon mutageneze, kodirajući protein se može rekombinantno eksprimovati i može se odrediti aktivnost proteina.

Primeri modifikovanih nukleotida koji se mogu koristiti za dobjianje nukleinkih kiselina od interesa obuhvataju 5-fluorouracil, 5-bromuracil, 5-hloruracil, 5-joduracil, hipoksantin, ksantin, 4-acetilcitosin, 5-(karboksihidroksilmetil)uracil, 5-karboksimetilaminometil-2-tiouridin, 5-karboksimetilaminometiluracil, dihidrouracil, P-D-galaktozilkveozin, inozin, N^izopenteniladenin, 1-metilguanin, 1-metilinozin, 2,2-dimetilguanin, 2-metiladenin, 2-metilguanin, 3-metilcitozin, 5-metilcitozin, N<6->adenin, 7-metilguanin, 5-metilaminometiluracil, 5-metoksiaminometil-2-tiouracil, P-D-manozilkveozin, 5-metoksikarboksimetiluracil, 5-metoksiuracil, 2- metiltio-N^izopenteniladenin, uracil-5-oksisirćetna kiselina, vibutoksozin, pseudouracil, kveozin, 2-tiocitozin, 5-metil-2-tiouracil, 2-tiouracil, 4-tiouracil, 5-metiluracil, metilestar uracil-5-oksisirćetne kiseline, uracil-5-oksisirćetna kiselina, 5-metil-2-tiouracil, 3- (3-amino-3-N-2-karboksipropil)uracil i 2,6-diaminopurin.

Jedan način da se utiče na HM74 funkciju je delovati na ekspresiju HM74. Tako, nivoi transkripcija se mogu podešavati za niže ili više nivoe mRNK HM74, koji za uzvrat mogu da dovedu do nižih ili viših nivoa ekspresije HM74 na površini ćelije. Jedan način da se postigne ovakvo podešavanje je upotreba regulatornih promotora koji se mogu uvesti na odgovarajuće mesto u genomu, u blizini kodirajuće sekvence HM74 i to na primer homologom rekombinacijom.

Shodno tome, sledeći aspekt pronalaska se odnosi na anti-HM74 tela. Izraz "antitelo" kao što je ove korišćen odnosi se na molekule imunoglobulina i imunološki aktivne delove molekula imunoglobulina, tj. molekule koji sadrže antigen-vezujuće mesto koje specifično vezuje antigen, kao što je HM74. Molekul koji se specifično vezuje za HM74 je molekul koji vezuje HM74, ali suštinski ne vezuje druge molekule u uzorku, npr. biološki uzorak, koji prirodno sadrži HM74. Primeri imunološki aktivnog dela molekula imunoglobulina obuhvataju fragmente F(ab> i F(av)2 koji se mogu dobiti tretiranjem antitela enzimom kao što je pepsin. Pronalazak obezbeđuje poliklonska i monoklonska antitela koja vezuju HM74. Izraz "monoklonsko antitelo" ili "sastav monoklonskih antitela", kao što je ovde korišćen, odnosi se na populaciju molekula antitela koja sadrže samo jednu vrstu idiotipa ili klona antigen-vezujućeg mesta koji može da imunoreaguje sa posebnim epitopom HM74. Sastav monoklonskih antitela obično prikazuje afinitet zajedno vezivanje za poseban epitopa Hm74 proteina.

Različiti drugi antigen-vezujući oblici antitela se mogu dobiti kao što je poznato u tehnici, uključujući fragmente, himerna antitela, rekombinantna antitela, humanisana antitela i slično.

Sledeći aspekt pronalaska odnosi se na vektore, preferentno ekspresione vektore, koji sadrže nukelinske kiseline koje kodiraju HM74 (ili njihov deo). Kao što je ovde korišćen, izraz "vektor" se odnosi na molekul nukleinske kiseline koji može da transprtuje drugu nukleinsku kiselinu za koju je vezan. Jedan tip vektora je "plazmid" koji se odnosi na kružnu petlju dvostrukog lanca DNK u kojoj se mogu vezati dodatni segmenti DNK. Drugi tip vektora je viralni vektor, gde se dodatni segmenti DNK mogu vezati u viralni genom. Određeni vektori su sposobni da izvedu autonomnu replikaciju u ćeliji dmaćinu (npr. batkterijski vektori sa replikacijom bakterijskog porekla i epizomalnim evktorima sisara). Drugi vektori (npr. ne-epizomalni vektori sisara) čine deo genoma ćelije domaćina na uvođenju u ćeliju domaćina i tako su replcirani duž genoma domaćina. Dalje, određeni vektori, ekspresioni vektori, koji su sposobni da usmeravaju ekspresiju gena operativno vezane za njih. Generalno, ekspresioni vektori namenjeni za primenu u rekombinantnim tehnikama DNK su često u obliku plazmida

(vektora). Međutim, namera pronalaska je da obuhvati ove druge obilke ekspresionih vektora, kao što su viralni vektori (npr. replikaciono defektne retorviruse, adenoviruse i adeno-povezane viruse) koji ispunjavaju ekvivalentne funkcije.

Rekobinantni ekspresioni vektori pronalaska obuhvata nukleinsku kiselinu pronalaska u obliku koji je pogodan za ekspresiju nukleinske kiseline u ćeliji domaćinu. Ovo znači da rekombinantni ekpsresioni vektori obuhvataju jednu ili više regulatornih sekvenci, odabrane na osnovu ćelija domaćina koji se koriste za ekspresiju, koje su operativno vezane za nukleinske kiseline za ekspresiju. U okviru rekombinantnog ekspresionog vektora, "operativno vezan" označava daje nukleotidna sekvenca od interesa vezana za regulatornu sekvencu (regulatorne sekvence) tako da dopušta ekspresiju nukleotidne sekvence (npr. u in vitro transkripcionom/translacionom sistemu ili u ćeliji domaćinu kada je vektor uveden u ćeliju domaćina). Izraz "regulatorna sekvenca" obuhvata promotore, pojačivače i druge elemente kontrole ekspresije (npr. poliadenilacioni signali). Ove regulatorne sekvence su opisane na primer u Goeddel, Gene Expression Technologv: Methods in Enzymology Vol. 185, Academic Press, San Diego, CA (1990). Regulatorne sekvence obuhvataju one koje upravaljaju konstitutivnom ekspresijom nukleotidne sekvence u mnogmi vrstama ćelija domaćina (npr. regulatorne sekvence specifične za tkivo). Prosečan stručnjak će ceniti činjenicu da dizajn ekspresionog vektora može da zavisi od faktora kao što je izbor ćelije domaćina koji se transformiše, željeni nivo ekspresije proteina itd. Ekspresioni vektori pronalaska se mogu uvesti u ćeliju domaćinada bi se proizveliproteini ili pepptidi koji su kodirani nukelinskim kiselinama kao što je ovde opisano (npr., HM74, mutantni oblici HM74, fuzioni proteini, itd.).

Rekombinantni ekspresioni vektori pronalaska se mogu nameniti za ekspresiju HM74 u prokariotskim ili eukariotskim ćelijama, npr. baterijskim ćelijama kao stoje E.coli, ćelije insekata (korišćenjem baculovirus ekspresionih vektora), ćelije kvasca ili ćelije sisara. Pogodne ćelije domaćini su opisane dalje u Goeddel, supra. Alternativno, rekombinantni ekpsresioni vektor se može transkribovati i translatovati in vitro, na primer pomoću T7 promoter regulatornih sekvenci i polimeraze T7.

U drugom pristupu, ekspresioni vektro HM74 je ekspresioni vektor kvasca. Primer vektora za ekspresiju u kvascu kao što je S. cerevisiae obuhvata pYepSecl (Baldari et al., EMBO J.

(1987) 6:229-234), pMFa (Kurjan et al., Cell (1982) 30:933-943), pJRY88 (Schultz et al.,

Gene (1987) 54:113-123), pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, CA) i pPicZ (Invitrogen Corp, San Diego, CA).

Alternativno, HM74 se može eksprimovati u ćelijama insekata pomoću baculovirus ekspresionih vektora. Baculovirus vektori raspoloživi za ekspresiju proteina u kultivisanim ćelijama insekta (e.g., Sf 9 ćelije) obuhvataju serije pAc (Smith et al., Mol. Cell. Biol. (1983) 3:2156-2165) i serije pVL (Lucklow et al., Virology (1989) 170:31-39).

U narednom pristupu, nukleinska kiselina pronalaska je eksprimovana u ćeliji sisara pomoću ekspresionog vektora sisara. Primeri ekspresionih vektora sisara obuhvataju pCDM8 (Seed, Nature (1987) 329:840) i pMT2PC (Kaufman et al, EMBO J. (1987) 6:187-195). Kada se koriste u ćelijama sisara, kontrolne funkcije ekpsresionog vektora su često date viralnim regulatornim elementima. Na primer, promotori koji se obino koriste su zvedeni od polioma, adenovirusa 2, citomegalovirusa i simian virusa 40. Za druge odgovarajuće ekspresione sisteme prokariotskih i eukariotskih ćelija, videti poglavlje 16 i 17 Sambrook et al., supra.

Za stabilne transformacije ćelija sisara, poznato je da, u zavisnosti od ekspresionog vektora i primenjeniih tehnika transformacije, samo mala frakcija ćelija može da integriše stranu DNK u genom. Za identifikaciju i odabir integranata, gen koji kodira marker za seketivnost (npr. za rezistentnost na antibiotike) obično se uvedi u ćeliju domaćina zajedno sa genom od interesa. Preferentni markeri za selektivnost obuhvataju one koji dodeljuju rezistentnost lekovima, kao što je G418, higromicin i metotreksat. Nukleinska kiselina koja kodira marker za selektivnost može se uvesti u ćeliju domaćina na isti vektor kao onaj koji kodira HM74 ili se može uvesti u poseban vektor. Ćelije stabilno transfektovane uvođenjem nukelinske kiseline može se identifikovati odabirom lekova (npr. preživeće će ćelije koje imaju inkorporirane markere za selektivnost, dok će druge umreti).

Modulatori koji se vezuju za HM74 i koji aktiviraju HM74 su sulfamoilantranilne kiseline, poznate i kao furosemid-sličnim jedinjenjima.

Molekuli imaju sledeću strukturu:

gde je R, vodonik ili C1-C18alkil, koji može biti razgranat, može da sadrži heteroatom ili se može supstituisati ili njihove kombinacije; Ci-Cig alkenil koji može biti razgranat, može da sadrži heteroatom ili može da bude supstituisan, ili njihove kombinacije; CpCig alkinl, koji može biti razgranat, može da sadrži heteroatom ili može da bude supstituisan, ili njihove kombinacije; C3-C18aril koji može da sadrži sporednu grupu, može da sadrži most, može da sadrži heteroatom ili može biti supstituisan ili njihove kombinacije; ili C5-C18cikloalkil, koji može da sadrži sporednu grupu, može da sadrži most, može da sadrži heteroatom ili može biti supstituisan ili njihove kombinacije; ili njihove kombinacije;

Q i X svaki je O, S ili NR; koji može biti razgranat, može da sadrži heteroatom ili se može supstituisati ili njihove kombinacije;

Y je Ci-Ci8 alkil koji može biti razgranat, može da sadrži heteroatom ili se može supstituisati ili njihove kombinacije; C1-C18alkenil koji može biti razgranat, može da sadrži heteroatom ili može da bude supstituisan, ili njihove kombinacije; Ci-Cisalkinl, koji može biti razgranat, može da sadrži heteroatom ili može da bude supstituisan, ili njihove kombinacije; C3-C18aril koji može da sadrži sporednu grupu, može da sadrži most, može da sadrži heteroatom ili može biti supstituisan ili njihove kombinacije; ili C5-C18cikloalkil, koji može da sadrži sporednu grupu, može da sadrži most, može da sadrži heteroatom ili može biti supstituisan ili njihove kombinacije; ili njihove kombinacije gde su X i Y kondenzovani u jedan ili više prstenova kada je X, N, pri čemu je dati prsten C3-C18heterocikl, koji može biti razgranat i koji može da sadrži sporednu grupu i C3-C18cikloalkil, koji može biti razgranat i može da sadrži sporednu grupu, supstituisan C3-C18cikloalkil koji može biti razgranat i koji može da sadrži sporednui grupu ili C3-C18aril koji može biti razgranat i koji može da sadrži sporednu grupu; i

svako Z je R.

Izraz "alkoksil" označava alkil grupu vezanu za atom kiseonika. Primeri su metoksi, etoksi, propoksi, butoksi ipentoksi.

"Aril" je aromatičan ugljovodonik. Primeri su fenil i naftil.

"Heteroatom" je generalno atom koji se razikuje od onih tipičnih ua molekul. Tako, u ugljovofoniku, svaki atom koji nije ugljenik ili vodonik je heteroatom. Česti biološki prihvatljivi heteroatomi su kiseonik, sumpor i azot.

Izraz "heteroaril" odnose se na aril grupu gde je jedan ili više atoma ugljenika zamenjeno heteroatomom. Primeri su piridil, imidazolil, pirolil, tienil, furil, piranil, pirimidinil, piridazinil, indolil, hinolil, naftiridinil i izoksazolil.

Izraz "cikloalkil" odnosi se na ciklični ugljovodonik. Neki primeri su ciklopropil, ciklobutil, ciklopentil i cikloheksil.

"Heterocikl" je cikloalkil gde je jedan ili višea atoma ugljenika zamenjeno heteroatomom. Primeri su pirolindinil, piperidinil i piperazinil.

Izraz "heteroalkil" je alkil gde je jedan ili više atoma ugljenika zamenjeno heteroatomom. Etar je heteroalkil.

Izraz "supstituisan" označava da bazni organski radikal ima jednu ili više supstituentnih grupa. Tako, atom ili grupa zamenjuje drugi atom ili grupu u molekulu. Rerezentativni supstituenti su halogen, Ci-Cg alkil, -CN, -NO2, alkoksil, hidroksil, sulfid, sulfat, sulfonamid, amin i amid.

Posebna jedinjenja od interesa su ona gde je 1) R, vodonik i Q je kiseonik ili sumpor, zatim W nije vodonik ili jedna ili obe Z grupe nisu vodonik; i 2) kada obe Z grupe, W i R su vodonik iQ je kiseonik, tada su X i Y kombinovani u prstenastu stnikturu.

Kationi antranilnih kiselina koje daju biološki komatibilne soli su na primer natrijum, kalijum ili amonijum grupe.

Sulfamoilantranilne kiseline od interesa se mogu dobiti kao što je dato u U.S. Patent Nos. 4,406,895 i 5,739,361. Tako je nitritni indermedijer dobijen ka što je ovde dato, koji hidrolizuje dajući odgovaarjuću karboksiln kiselinu od interesa. Karboksilne kiseline su zatim konvertovane u odgovarajuće soli.

Ova furosemid-slična jedinjenja su poznata kao diuretici. Prema tome, primena ovih jedinjenja za modluaciju HM74 je nova i neočekivana.

Furosemid-slična jedinjenja od interesa aktiviraju HM74, ali ne aktiviraju HM74A.

HM74 modulatori, furosemid-slična jedinjenja predmetnog pronalaska mogu se inkorporirati u farmaceutske praparate pogodne za administraciju. Ovakvi preparati obično sadrže aktivnu komponentu i farmaceutski prihvatljiv nosač. Kao što je ovde korišćen izraz "faramceutski prihvatljiv nosač" obuhvata bilo koji i sve rastvarače, disperzione medije, sredstva za oblaganje, antibakterijske i antifungalne agense, izotonične agense i agense za odgađanje apsrospcije i slične, koji su kompatibilni sa faramceutskom administracijom. Primena ovakvih medija i agensa za farmaceutski aktivne supstance je dobro poznata u tehnici. Izuzev u slučaju ako bilo koji medijum ili agens inkompatibilan sa aktivnim jedinjenjem, razmatrana je njihova primena u preparatima. U preparate takođe se mogu inkorporirati i dodatna aktivna jedinjenja.

Farmaceutski preparat pronalaska je formulisan tako da bude kompatibilan sa namenjenim načinom administracije. Primeri načina administracije obuhvataju parenteralnu, npr., intravenoznu, intradermalnu, subkutalnu (potkožnu), oralanu (npr. inhalaciju), transdermalnu (topikalnu), transmukoznu i rektalnu administraciju. Rastvori ili susprenzije korišćene za parenteralnu, intradermalnu ili dubkutalnu aplikaciju mogu da obuhvate sledeće komponente: sterilni razblaživač kao što je voda za injekcije, rastvori soli, fiksirana ulja, polietilen glikoli, glicerin, propilenglikol ili drugi sintetički rastvarači; antibakterijski agensi kao stoje benzil alkohol ili metilparabenz; antioksidanti kao što je askorbinska kiselina ili natrijum bisulfit; agensi za heliranje kao što je EDTA; puferi kao što su acetati, cifrati ili fosfati i agensi za podešavanje toničnosti kao što je natrijum hlorid ili dekstroza. pH se može podesiti dodatkom kiselina ili baza, kao što je HC1 ili NaOH. Parenteralni preparati se mogu upakovati u ampule, špricevima za jednokratnu upotrebu ili ampulama od stakla ili plastike, za višestruke doze.

Farmaceutski preparati korisni za injektiranje su između ostalih vodeni sterilni rastvori (gde je voda rastvarač) ili disperzije i sterilne praškove za ekstempotalna pripremanja sterilnih rastvora za injekcije ili disperzija. Za intravenoznu administraciju, odgovarajući nosači između ostalih su i fiziološki rastvori, bakteriostatična voda, Cremophor EL<®>(BASF; Parsippanv, NJ) ili fosfat -puferovan rastvor soli (PBS). U svim ovim slučajevima, preparat mora biti sterilan i mora biti tečan do te mere da lako prolazi kroz špric. Preparat mora biti stabilan pod uslovima proizvodnje i skladištenja i mora se zaštiti od kontaminacije mikroorganizmima kao što su bakterije i gljivice. Nosač može biti rastvarač ili disperzioni medijum koji sadrži, na pri,er vodu, etanol, poliol (na primer glicerol,. Propilen glikol i tečni polietilen glikol i slično) i njihove odgovarajuće smeše. Odgovarajuća fluidnost se može održavati, na primer, primenom sredstava za oblaganje kao što je lecitin, održavanjem zahtevane veličine čestica u slučaju disperzije i primenom površinski aktivnih sredstava. Sprečavanje delovanja mikroorganizama se može postići različitim antibakterijskim i antifungalnim agensima, na primer, parabenzom, hlorbutabolom, fenolom, askorbinskom kiselinom, timerozalom i si. U mnogim slučajevima, biće poželjno u preparat dodati izotonične agense, na primer, šećere, polialkohole kao što je manitol, sorbitol ili natrijum hlorid. Produžena apsropcija preparata za koji se mogu injektirati može se sprovesti dodavanjem u preparat agens koji pomera apsorpciju, na primer, aluminijum monostearat i želatin.

Sterilni rastvori za injekcije se mogu pripremiti ubacivanjem aktivnog jedinjenja u zahtevanu količinu odgovarajućeg rastvarača, sa jednim ili kombinacijom sastojaka navedenih ranije, po potrebi, nakon čega sledi sterilizacija filtriranjem. Generalno, disperzije su pripremljene ubacivanjem aktivnog jedinjenja u sterilni nosač koji sadrži osnovni diperzioni medijum i drugih sastojaka odabranih od gorenavedenih. U slučaju sterilnih praškova za pripremanje sterilnih rastvora za injektiranje, preferentni postupci za dobijanje su sušenje u vakuumu i sušenje zamrzavanjem koja daju prašak aktivnog sastojka plus bilo koji dodatni sastojak iz rastvora prethodno sterilisanih filtriranjem.

Oralni preparati generalno obuhvataju inertni razblaživač i jestiv nosač. Preparati se mogu spakovati u želatinozne kapsule ili se komprimovati u tablete. Za oralnu terapeutsu administraciju, aktivno jedinjenje se može inkorporirati sa eksipijensima i koristiti u obliku tableta, pastila ili kapsula. Oralni preparati se takođe mogu pripremiti primenom tečnog nosača dajući sirup ili tečnu formulaciju ili za primenu kao tečnost za ispiranje usta, gde je jedinjenje u tečnom nosaču primenjeno oralno i promućkano i ispljunuto ili progutato.

Farmaceutski kompatibilni agensi za vezivanje i/ili adjuvansi mogu biti deo preparata.

Tablete, pilule, kapsule, pastile i slično sadrže jedan od sledećih sastojaka ili jedinjenja sličnih po prirodi: vezivno sredstvo kao što je mikrokristalna celuloza, tragakant guma ili želatin; ekspijens kao što je škrob ili laktoza, agens za dezintegraciju kao stoje alginska kiselina, Priogel ili kukuruzni škrob; lubrikant kao što je magnezijum stearat ili Sterotes; glidant kao što je kolodialni silicijum dioksid; zasađivač kao što je sukroza ili saharin; ili aromat kao što je pepermint, metilsalicilat ili aroma pomorandže.

Za administraciju inhaliranjem, jedinjenja su distribuirana u obliku aeroslonog spreja iz kontejnera pod pritiskom ili đispenzera koji sadrži odgovarajući propelant, npr., gas kao što je ugljen dioksid ili raspršivač.

Sistemska administracija takođe može biti transmukozno ili transdermalno. Za transmukoznu ili transdermalnu administraciju, koriste se odgovarajući enetranti. Ovi

penetranti su generalno poznati u tehnici i obuhvataju na primer, tranmukoznu administraciju, detergente, žučne soli i derivate fusidne kiseline. Transmukozna administracija se može izvesti primenom spreja za nos ili supozitorija. Za transdermalnu administraciju, aktivna jedinjenja su formulisana u meleme, lekovite masti, gelove ili kreme kao što je opšte poznato u tehnici.

Jedinjenja se takođe mogu pripremiti u obliku supozitorija (npr. sa konvencionalnim osnovama za supozitorije kao što je kakao puter ili drugi gliceridi) ili retencione eneme za rektalnu distribuciju.

U jednom pristupu, aktivna jedinjenja su pripremljena sa nosačima koji će zaštiti jedinjenje od brze eliminacije iz tela, kao što je formulacija sa kontrolisanim oslobađanjem, uključujući implantate i mikro-inkapsuiliran sistem za distribuciju. Mogu se koristiti biodegradabilni, biokopatibilni polimeri kao što je etilen vinil acetat, polianhidridi, poliglikolna kiselina, kolagen, poliortoestri i polimlečna kiselina.

Postupci za dobijanje ovih formulacija će biti očigledni za prosečnog stručnjaka.

Materijali se takođe mogu komercijalno dobiti od Alza Corporation and Nova Pharmaceuticals, Inc. Lipozomalne suspenzije (uključujući lipozome koji su ciljani u inficiranim ćelijama sa monoklonalnim antitelima) se takođe mogu koristiti kao farmaceutski prihvatljivi nosači. Ovi se mogu pripremiti prema postupcima poznatim prosečnom stručnjaku na primer, kao što je opisano u U.S. Patentu No. 4,522,811.

Od posebnog je značaja oralna ili parenteralna formulacija preparata u jediničnom doznom obliku za olakšanu administraciju i uniformnost doze. Jedinični dozni oblik kao što je ovde korišćen, odnosi se na fizički diskretne jedinice koje se nalaze u jedinstvenim dozama za subjekat koji se leči; svaka jedinica sadrži prethodnoodređenu količinu aktivnog jedinjenja izračunatog tako da proizvede željeni terapeutski efekat u sprezi sa datim farmaceutskim nosačem. U zavisnosti od vrste i ozbiljnosti bolesti, oko 1 p-g/kg do 15 mg/kg (npr., 0.1 do 20 mg/kg) aktivne komponente je početna doza za administraciju pacijentu, bilo za, na primer, jednu ili više odvojenih administracija ili kontinualnih infuzija. Tipična dnevna doza može se kretati od oko 1 ug/kg do 100 mg/kg ili više, u zavisnosti od prethodno navedenih faktora. Za administraciju koja se ponavlja tokom nekoliko dana ili duže, u zavisnosti od stanja, lečenje se nastavlja do sprečavanja pojave simptoma bolesti. Međutim, mogu biti korisni i drugi dozni režimi. Nastavak terapije se jednostavlno prati konvencionalnim tehnikama i analizama (testiranjima). Primeri doznih režima su dati u WO 94/04188. Specifikacija za dozne jedinične oblike predmetnog pronalaska je propisana i direktno zavisna od jedinstvenih karakteristika aktivnog jedinjenja i posenih terapeutskih efekata koji se žele postignuti i ograničenjima navedenim u tehnici vezanim za jednjenja kao što je aktivno jedinjenja za lečenje pacijenata.

Farmaceutski preparati se mogu staviti u kontejner, pakovanje ili dispenzer zajedno sa instrukcijama za administraciju.

Modulatori HM74 od interesa mogu se koristiti u skrining analizama (testiranjima) i postupcima lečenja (npr., terapeutskim i proflaktičkim). Modulatori HM74 od interesa se mogu koristiti za skrining drugih lekova ili jedinjenja koja moduliraju aktivnost ili ekepresiju HM74 kao i za lečenje pormećaja okarakterisanih inflamacijom. Modulatori od intresa mogu takođe da nađu primenu kod stanja koja su nastala kao rezultat nedovoljne ili prekomerne produkcije proteina HM74 ili produkcijom oblika proteina HM74 koji imaju smanjenu ili nenormalnu aktivnost u poređenju sa divljim sojem proteina HM74. Pronalazak se dalje odnosi na nove modulatore HM74 koji suidentifikovani skrining analizom i primenom za lečenja kao što je ovde opisano.

Pronalazak obezbeđuje postupak (takođe naznačen kao "skrining analiza (testiranje)") za identifikaciju modulatora, tj. kandidat ili test jedinjenja ili agenasa (npr. peptidi, peptidomimetici, mali molekuli, antitela ili drugi lekovi) koji se vezuju za HM74 i imaju stimulativni ili inhibitorni efekat na ekspresiju HM74 ili aktivnost HM74, na primer.

U jednom pristupu, pronalazak obezebeđuje analizu za skrining kandidata ili test jedinjenja koja se vezuju za ili moduliraju aktivnost HM74. Tako se mogu koristiti skrining analize za identifikaciju drugih furosemid-sličnim jedinjenja koja moduliraju HM74. Ovi modulatori se takođe mogu koristiti u testu kompeticije za identifikaciju drugih modulatora kao što su HM74 antagonisti.

U drugom pristupu, analiza je analiza bazirana na ćeliji gde je ćelija koja eksprimuje oblik HM74 vezan za membranu na površini ćelije u kontaktu sa test jedinjenjem i određena je sposobnost test jedinjenja da aktivira HM74. Ćelija, na primer, može biti ćelija kvasca ili ćelija koja je vodi poreklo od sisara. Određivanje sposobnosti jedinjenja da aktivira HM74 se može postići na primer, kuplovanjem test jedinjenja koje je obeleženo radioizotopom ili enzimom tako da se vezivanje test jedinjenja za HM74 može odrediti detektovanjem obeleženog jedinjenja u kompleksu sa Hm74 ili gde se nalazi HM74. Na primer, test jedinjenje se može obeležiti sa I, S, C ili H, direktno ili indirektno i radioizotopi se mogu detektovati brojanjem radioemisije ili scinitlacionim brojačem. Alternativno, test jedinjenja se mogu označiti enzimatski sa, na primer, peroksidazom rena, alkalnom fosfatazom ili luciferazom i enzimatskom oznakom detektovanom određivanjem konverzije odgovarajućeg supstrata u proizvod. U prefrentnom pristupu, analiza obuhvata kontaktiranje ćelije koja eksprimuje oblik HM74 vezan za membranu na površini ćelije sa poznatim jedinjenjem koje vezuje HM74 zajedno sa test jedinjejem i određivanje sposobnosti test jedinjenja da se takmiči sa poznatim jedinjenj em za interakciju sa HM74.

U narednom pristupu, analiza je analiza bazirana na ćeliji a obuhvata kontakt ćelije koja eksprimuje oblik HM74 vezan za membranu na površini ćelije sa test jedinjenjem i određivanje sposobnosti test jedinjenja da modulira (npr. stimuliše ili inhibira) aktivnost HM74. Određivanje sposobnosti jedinjenja da modulira aktivnost HM74 može se postići, na primer, određivanjem sposobnosti test jedinjenja da aktivira ili inhibira HM74. Ovo se može mamfestovati kada aktivirani HM74 interaguje sa intracelularnim ili membraniskim ciljnim molekulom povezanim sa signalnim putem. Kao što je ovde korišćen "ciljni molekul" je molekul sa kojim se vezuje ili interaguje HM74, na primer, molekul na površini ćelije koja eksprimuje HM74, molekul na površini druge ćelije, molekul u ekstracelularnom prostoru, meolkul povezan sa unutrašnjom površinom ćelijske membrane ili sitoplamični molekul. Ciljni molekul HM74 može biti ne-HM74 molekul. U jednom pristupu, ciljni molekul HM74 je komponenta transdukcionog puta signala koji olakšava transdukciju ektracelularnog signala (npr., signal nastao vezivanjem jedinjenja za HM74) kroz ćelijsku membranu i u ćeliju. Cilj, na primer, može biti drugi intracelularni protein koji poseduje katalitičku aktivnost ili protein koji olakšava vezivanje signalizirajućih nizvodonih molekula sa HM74.

Određivanje sposobnosti HM74 da se veže za ili da interaguje sa HM74 ciljnim molekulom može se postići prema jednoj od prethodno opisanih metoda za određivanje direktnog vezivanja. U preferentnom pristupu, određivanje sposobnosti HM74 da veže ili interaguje sa ciljnim molekulom HM74 može se postići određivanjem aktivnosti ciljnog molekula. Na primer, aktivnost ciljnog molekula se može odrediti detektovanjem indukcije drugog ćelijskog mesendžera cilja (npr., intracelularni Ca<2+>, diacilglicerol, IP3, itd.) detektovanje katalitičke/enzimatske aktivnosti cilja na odgovarajućem supstratu, detektovanjem indukcije reporter gena (npr. HM74-uzvratni regulatorni element koji je operativno vezan za nukleinsku kiselinu koja kodira detektabilni marker, npr. luciferaza) ili detektovanjem ćelijskog odgovora, na primer, ćelijske diferencijacije ili ćelijske proliferacije.

U sledećem pristupu, analiza predmetnog pronalaska je analiza bez ćelije koja obuhvata kontakt HM74 i test jedinjenja i određivanje sposobnosti test jedinjenja da se veže za HM74. Vezvianje test jedinjenja za HM74 se može odrediti ili direktno ili indirektno kao stoje gore opisano. U prefernetnom pristupu, analiza obuhvata kontaktiranje HM74 sa poznatim jedinjenj em pronalaska zajedno sa test jedinjenj em i određivanje sposobnosti jedinjenja da utiče na aktivnost HM74 poznatog jedinjenja koje je ovde opisano. Određivanje sposobnosti test jedinjenja da interaguje sa Hm74 obuhvata određivanje sposobnosti test jedinjenja da se prefernetno veže za HM74 u poređenju sa vezivanjem poznatog ovde opisanog jedinjenja.

U narednom pristupu, analiza je analiza bez ćelije koja obuhvata kontaktiranje HM74 sa test jedinjenj em i određivanje sposobnosti test jedinjenja da modulira (npr. stimuliše ili inhibira) aktivnost HM74. Određivanje sposobnosti test jedinjenja da modulira aktivnost HM74 može se postići, na primer, određivanjem sposobnosti aktiviranog HM74 da se veže za ciljni molekul HM74 jednim od prethodno opisanih postupaka za određivanje direktnog vezivanja. U alternativnom pristupu, određivanje sposobnosti test jedinjenja da modulira aktivnost HM74 može se postići određivanjem sposobnosti HM74 da dalje modulira ciljni molekul HM74. Na primer, katalitička/enzimatka aktivnost ciljnog molekula na odgovarajući supstrat se odrediti kao što je prethodno opisano.

U narednom pristupu, analiza bez ćelija obuhvata kontakt HM74 sa poznatim jedinjenjem koje vezuje HM74 sa test jedinjenj em i određivanje sposobnosti test jedinjenja da interaguje sa HM74, pri čemu određivanje sposobnosti test jedinjenja da interaguje sa HM74 obuhvata određivanje sposobnosti HM74 da se prvestveno veže za ili da modulira aktivnost ciljnog molekula HM74.

Receptori se mogu aktivirati nelegirajućim molekulima koji ne moraju da inhibiraju vezivanje Uganda ali izazivaju strukturne pormene kod receptora da omogući vezivanje G proteina ili možda agregaciju receptora, dimerizaciju ili stvaranje klastera koji izazivaju aktivaciju.

Analize bez ćelija date u predmetnom pronalasku se mogu koristiti za primenu rastvornih oblika HM74 i za-membranu-vezan oblik HM74. U slučaju analiza bez ćelija sa za-membranu- vezanim oblikom HM74, može biti poželjno upotrebiti agens za povećanje rastvorljivosti tako da za-memebranu-vezan oblik HM74 ostaje u rastvoru. Primeri ovih agenasa za povećane rastvorlj ivosti su nejonski detergenti kao što je n-oktilglukozid, n-dodecilglukozid, n-dodecilmaltozid, oktanoil-N-metilglukamid, dekanoil-N-metilglukamid, Triton X-100, Triton X-l 14, Thesit<®>, izotridecilpoli(etilene glikol etar)n, 3-[(3-holamidopropil)dimetilamino]-l-propan sulfonat (CHAPS),

3-[(3-holamidopropil)dimetilamino]-2-hidroksi-l-propan sulfonat (CHAPSO) ili N-dodecil=N,N-dimetil-3-amonio-1 -propan sulfonat.

U sledećem pristupu, HM74 je izmenjen tako da je u konstantnom aktivnom stanjukada se eksprimuje na ćeliji domaćinu. Menjanje HM74 može da učini receptor aktivnim bez vezivanja liganda. Jedan način da se dostigne aktiviran receptor je izmena HM74 tako da interaguje sa G proteinima bez vezivanja liganda. Izmena maskira konfromacione promene receptora za vezivanje liganda koje omogućavaju vezivaje intracelularnih G proteina. Ovakav pristup je dat u WO 00/22129.

WO 00/22129 opisuje posebne amino kiseline u regionu TM6 i IC3 koje vode do konstitutivne aktivnosti. Postupci za inkorporaciju posebnih aminokiselina u HM74 su poznate u tehnici, kao stoje ka-mestu- usmerena mutageneza, subkloniranje i itd. Izmenjen molekul HM74 je zatim eksprimovan u ćeliji domaćinu da dajući konstitutivno aktivan HM74.

Aktivirana ćelija je zatim izložena molekulim za koje se sumnja da su agonisti, antagonisti, inverzni agonisti HM74 i itd. molekuli koji menjaju aktivnost HM74. Ovi molekuli koji menjaju kativnost G proteina su ciljani za lečenje poremećaja povezanih sa izmenjenim metabolizmom HM74 pomoću postupaka poznatih u farmaceutskim istraživanjima.

U više pristupa prethodno navedenih postupaka analize predmetnog pronalaska, može biti poželjno imobilizirati ili HM74 ili njen ciljni molekul da bi došlo do odvajanja kompleksiranih od nekompleksiranih oblika jednog ili oba proetina, kao i da se izvrši automatizacija analize. Vezivanje test jedinjenja za HM74 ili interakcija HM74 sa ciljnim molekulom u prisustvu ili odsustvu datog jedinjenja, može se postići u bilo kojem sudu koji je pogodan za držanje reaktanata. Primeri ovakvih sudova su mikrotitar ploče, epruvete i mikrocentrifugalne epruvete. U jednom pristupu, može doći do fuzije proteina tako se doda domen koji omogućava da se jedan ili oba proteina vežu za matriks. Na primer, fuzioni proteini glutationeS-transferaza/HM74 ili fuzioni proteini glutation-S-transferaza/ cilj mogu se apsrobovati na glutation Sepharose<®>perlama (Sigma Chemical, St. Louis, MO) ili glutation-derivatizovanim mikrotitar pločama. Ovi kompleksi su zatim kombinovani sa test jedinjenjem i neapsorbovanim ciljnim proteinom ili HM74 poteinom i smeša je inkubirana pod uslovima koji pogode stvaranju kompleksa (npr. pri fiziološkim uslovima za so i pH). Posle inkubacije, perle ili mikrotitar ploče su isprane kako bi se uklonile sve nevezane komponente i stvaranje kompleksa je mereno direktno ili indirektno, na primer, kao što je gore opisano. Alternativno, kompleksi se mogu odvojiti od matriksa i standardnim tehnikama odredi nivo vezivanja ili aktivnost HM74.

Takođe se mogu primeniti druge tehnike za imobilizaciju proteina na matriksima u skrining analizama pronalaska. Na primer, HM74 ili njegov ciljni molekul se mogu imobilizovati konjugacijom biotina i streptavidina. Biotinilisan HM74 ili ciljni molekul se mogu pripremiti od biotin-NHS -a (N-hidroksi-sukcinimid) poznatim tehnikama (npr. komplet za biotinilaciju, Pierce Chemicals, Rockford, IL) i imobilisan u udubljenjima 96-ćelijske ploče obložene streptavidinom (Pierce Chemicals). Alternativno, antitela reaguju sa HM74 ili ciljnim molekulima ali ne utiču na vezivanje HM74 proteina za ciljni molekul, mogu se derivatizovati za udubljenja ploče i nevezan cilj ili HM74 uhvaćen u udubljenjima konjugacijom sa antitelima. Postupci za detekciju ovih kompleksa, pored prethodno opisanih za GDT-imobilisane komplekse, obuhvataju i imunodetekciju kompleksa pomoću antitela koja reaguju sa HM74 ili ciljnim molekulom, kao i enzim-povezane analize koje se oslanjaju na enzimatsku aktivnost povezanu sa HM74 ili ciljnim molekulom.

U sledećem pristupu, identifikovani su modulatori ekspresije HM74 u metodi gde ćelija dolazi u kontakt sa datim jedinjenjem i određena je ekspresija HM74 mRNK ili proteina u ćeliji. Nivo ekspresije HM74 mRNK ili proteina u prisustvu datog jedinjenja je poređen sa nivoom ekspresije HM74 mRNK ili proteina u odsustvu datog jedinjenja. Dato jedinjenje se može identifikovati kao modulator ekspresije HM74 na osnovu ovog poređenja. Na primer, kada je ekspresija HM74mRNK ili proteina veća (statistički značajno veća) u prisustvu datog jedinjenja nego u njegovom odusustvu, dato jedinjenje je identifikovano kao stimulator ili agonist ekspresije H74 mRNK ili proteina. Alternativno, kada je ekspresija HM74 mRNK ili proteina manja (statistički značajno manja) u prisusutvu datog jedinjenja nego u njegovom odsustvu, dato jedinjenje je identifikovano kao inhibitor ili antagonist ekspresije HM74 mRNK ili proteina. Ukoliko je aktivnost HM74 smanjena u prisustvu liganda ili agonista ili u konstitutivnom HM74, ispod bazne linije, dato jedinjenje je identifikovano kao inverzni agonist. Nivo ekspresije HM74 mRNK ili proteina u ćelijama se može identifikovati ovde opisanim metodama za detekciju HM74 mRNK ili proteina.

Budući da se mogu dobiti velike količine čistog HM74, može se utvrditi fizička karakterizacija konformacionih oblasti za dizajn leka. Na primer, IC3 region molekula i Ec domeni su regioni od posebnog interesa. Kada se razaznaju oblik i jonska konfiguracija regiona, dati lek koji reaguje sa ovim regionima se može konfigurisati i zatim testirati u intaktnim ćelijama, životinjama i pacijentima. Metode koje omogućuju izvođenje ovih strukturnih informacija su rendgenografska kristalografija, NMR spektroskopija, molekulsko modeliranje i itd. 3-D struktura takođe može da dovede do identifikacije analognih konformacionih mesta u drugim poznatim proteinima su poznati lekovi koji deluju na posebna mesta. Ovi lekovi ili njihovi derivati mogu imati primenu sa HM74.

Pronalazak dalje razmatra nove agense identifikovane gore opisanim skrining analizama i njihovu primenu za ovde opisane tretmane (lečenja).

Predmetni pronalazak obezbeđuje profilaktičke i terapeuske metode lečenja subjekta koji je u opasnosti od oboljevanja (ili suspetibilan) oboljevanju ili oboleo od boelsti koja je povezana sa nepravilnom ekspresijom ili ativnosti HM74. Ovi poremećaji obuhvataju, ali nisu ograničeni na, inflamatorne poremećaje kao stoje astma, hronična opstruktivna bolest pluća i reumatoidni artritis, na primer.

U jednom aspektu, pronalazak obezbeđuje metod za prevenciju oboljenja ili stanja povezanog sa nekontrolisanom ekspresijom ili aktivnošću HM74, administriranjem subjektu agens koji modulira ekspresiju HM74 ili barem jednu aktivnost HM74. Subjekti pod rizikom od oboljevanja od bolesti koja je izazvana ili kojoj je doprinela nekontrolisana ekspresija ili aktivnost HM74 može se identifikovati, na primer, jednom ili kombinacijom dijagnostičkih ili prognostičkih analiza kao što je ovde opisano. Do administracija profilaktičkog agensa može doći pre manifestovanja simptoma karakterističnih za nenormalnost HM74, tako daje sprečeno ili alternativno odložen napredak oboljenja ili poremećaja.

U zavisnosti do vrste nenormalnosti HM74, može se za lečenje subjekta korisiti, na primer, agonist HM74 ili antagonist HM74. Odgovarajući agens se može koristiti na osnovu skrining anlize koja je ovde opisana.

Sledeći aspekt pronalaska odnosi se na metode za moduliranje ekspresije ili aktivnosti HM74 u terapeutske svrhe. Metod modulacije pronalaska obuhvata kontakt ćelije sa agensom koji modulira jednu ili više aktivnosti HM74 povezanih sa ćelijom. Agens koji modulira HM74 aktivnost može biti agens kao što je ovde opisan, i to furosemid, nukleinska kiselina ili protein, srodni prirodni ligand proteina HM74, peptid, peptomimetički HM74 ili drugi mali molekul. U jednom pristupu, agens stimuliše jednu ili više bioloških aktivnosti HM74. U drugom pristupu, agens inhibira jednu ili više bioloških aktivnosti HM74 proteina. Primeri ovih inhibitornih agenasa obuhvataju anti-HM74 antitela. Metode moduliram'a se mogu izvesti in vitro (npr., kultivisanjem ćelija sa agensom) ili alternativno in vivo (npr., administriram'em agensa subjektu). Kao takav, predmetni pronalazak obezbeđuje metode lečenja individua pogođenih bolešću ili poremećajem okarakterisanim nekontrolisanom ekspresijom ili aktivnošću HM74. U nardnom pristupu, metoda obuhvata adminstriranje agensa (npr., agens identifikovan ovde opisanom skrining analizom) ili kombinacije agenasa koji moduliraju (npr., uređenje naniže ili naviše) ekspresiju ili aktivnost HM74.

Stimulacija aktivnosti HM74 je poželjna u situaciji u kojoj HM74 je nenormalno uređen naniže i/ili u kojoj povećanje aktivnosti HM74 ima povoljan efekat. Na usprot tome, inhibicija aktivnosti HM74 je poželjna u situaciji u kojoj je HM74 nenormalno uređen naviše i ili u kojoj smanjenje aktivnosti HM74 ima povoljan efekat.

Pronalazak je dalje ilustrovan primerima koji se ne bi smeli tumačiti kao ograničavajući. Sadržaj svih referenci, aptenata i objavljenih patentnih prijava navedenih u predmetnoj prijavi su dati referencom.

Primer 1 - Generacija ćelijasisarakoje eksprimuju HM74

cDNK koja kodira hHM74 je klonirana u ekspresioni vektor i transfektovana u ćelije sisara, kao što su CHO ćelije uku 293 ćelije.

Za stvaranje ćelija sisara koje prekomerno eksprimuju HM74, ćelije sisara su zasejane na ploči sa kulturom za gajenje tkiva od 35mm sa šest udubljenja (3 x IO<5>ćelija sisara po udubljenju (ATCC Catalog No. CRL-1573)) u 2 ml DMEM medija (Gibco/BRL, Catalog No. 11765-054) u prisustvu 10% fetalnog goveđeg seruma (Gibco/BRL Catalog No. 1600-044). Ćelije su zatim inkubirane na 37°C u CO2inkubatoru dok ćelije ne postanu 50-80% konfluentne. Klonirana sekvenca nukelinskih kiselina cDNK HM74 je ubačena u pcDNK 3.1 klonirajući vektor (Invitrogen, Catalog No. V790-20). Dva ug DNK je razblaženo u 100 ul F12 Ham-ovog medijuma bez seruma. Odvojeno je 25 ul Lipofectamine Reagent (Life Technologies, Catalog No. 18324-020) razblaženo u 100 ul F12 Ham-ovog medijuma bez seruma. DNK rastvor i rastvor Lipofectamine su zatim blago pomešani i inkubirani na sobnoj temperaturi 45 minutea da bi se dopustilo stvaranje DNK-lipid kompleksa.

Ćelije su isprane jednom sa 2 ml F12 Ham-ovog medijuma bez seruma. Za svaku transfekciju (šest transfekcija na ploči sa šest udubljenja), u rastvor sa DNK-lipid komplksima (0.2 ukupna zapremina) dodato je 8 ml F12 Ham-ovog medijuma bez seruma i lagano promešano. Dobijena smeša (u daljem tekstu "transfeksiona smeša") je prekopljena (0.8 ml + 0.2 ml) u isprane ćelije. Nije dodat anti-bakterijski reagens. Ćelije su inkubirane sa lipid-DNK kompleksima u trajanju od 16 sati na 37°C u CO2inkubatoru kako bi se omogućila transfekcija.

Posle završetku perioda inkubacije, nanet je lml F12 Ham-ovog medijuma sa 10% fetalnim goveđim serumom preko ćelija bez prethodnog uklanjanja transfekcione smeše. 18 sati posle transfekcije, sloj iznad ćelija je aspiriran. Ćelije su zatim isprane sa PBS, pH 2-4 (Gibco/BRL Catalog No. 10010-023) i PBS je zamenjen sa F12 Ham-ovim medijumom sa 5% serumom ("selektivni medijum"). 72 sata posle transfekcije ćelije su razblažene deeset puta u selektivnom medijumu koji sadrži antibakterijski agens genetecin u koncentraciji od 400 ug/ml (Life Technologies, Catalog No. 11811).

Primer2 -Testiranje agonista

Za skrining agonista humanog H74, HM74 se može lažno kuplovati sa Gq mehanizam. Aktivacija Gq mehanizma stimuliše oslobađanje Ca<2+>iz sarkoplazmatičnih retikulum vezikula unutar ćelije. Ca<2+>je oslobođen u sitoplazmu gde se može detektovati pomoću Ca<2+>helatirajućih boja. Korišćen je Fluorometric Imaging Plate Reader ili FLIPR® aparat (Molecular Devices) za praćenje promena fluoroscencije. Aktivnost agonista je odraz povećanja fluorescence.

CH0-K1 ćelije koje eksprimuju HM74 su prethodno osmišljeni tako da eksprimuju indiskriminatni oblik Gq proteina (Gai6)- Za pripremanje ovakvih ćelija, Gai6-kuplovane CHO ćelije su komercijalno dobijene (Molecular Devices LIVEWARE™ cells, Catalog No. RD-HGA16) i protokol u Primeru 1, omogućavajući ekspresiju HM74 u ovim ćelijama. Ćelije su odravane u log fazi rasta na 37° C i 5% CO2u F12 Ham-ovom medijumu (Gibco/BRL, Catalog No. 11765-054) sa 10% fetalnim govejim serumom, 100 lU/ml penicilina (Gibco/BRL, Catalog No. 15140-148), 100 ug/ml streptomicina (Catalog No. 15140-148, Gibco/BRL), 400 ug/ml geneticina (G418) (Gibco/BRL, Catalog No. 10131-035) i 200 ug/ml zeocina (Invitrogen, Catalog No. R250-05). Jedan danpre testiranja, 12,500 ćelija/udubljenju CHO-K1 ćelija je naneto na ploče sa providnim dnom sa 384-udubljenja pri čemu je zapremina udubljenja 50 ul (Greiner/Marsh, Catalog No. N58102) pomoću 96/384 Multidrop uređaja (Labsvstems, Type 832). Ćelije su inkubirane na 37° C u inkubatoru sa 5% CO2(Forma Scientific CO2water-jacketed incubator Model 3110).

Pripremljeni su sledeći matični rastvori: 1 M matični rastvor Hepes-a (pH 7.5)

(Gibco/BRL, Catalog No. 15630-080); 250 mM matični rastvor probenicida (Sigma, Catalog No. P8761) napravljen u 1 N NaOH; i 1 mM matični rastvor Fluo 4-AM Dye (Molecular Probes, Catalog No. Fl 4202) u DMSO (Sigma D2650). Reakcioni pufer je pripremljensa 1000 ml Hank'ovog balaniranog rastvora soli (Fisher/Mediatech, Catalog No. MT21023), 20 ml 1 M Hepes matičnog rastvora i 10 ml 250 mM probenicid matičnog rastvora. Za dobijanje pufera za nanošenje, 1.6 ml 1 mM Fluo 4-AM Dye matičnog rastvora je pomešano sa 0.32 ml pluronske kiseline (Molecular Probes, Catalog No. P6866) i zatim pomešana sa 400 ml reakcionog pufera i 4 ml fetalnog goveđeg seruma.

Jedan satpre testiranja, u svako od 384-udubljanja dodato je 50 ul sveže pripremljenog pufera za nanošenje pomoću 96/384 Multidrop uređaja. Ćelije su inkubirane na 37° C u inkubatoru da bi se maksimizirala apsorpcija boje. Neposredno pre analize, ćelije su isprane 2 puta sa 90 ul reakcionog pufera pomoću 384 EMBLA Cell Washer (Skatron; Model No. 12386) pri čemu je glava aspriratora udaljena najmanje 10 mm iznad dna ploče, ostavljajući 45 ul pufera po udubljenju.

CCD kamera (Princeton Instruments) FLIPR® II (Molecular Devices) instrumenta je podešena u f-stop od 2.0 i na izloženost od 0.4 sekunde. Kamera je korišćena za praćenje tačnosti nanošenja boja na ploče.

Biblioteka jedinjenja koja sadrže furosemid-slična jedinjenja je testirana pri koncentraciji od oko 10 uM svaki rastvoren u fiziološkom rastvoru pufera po udubljenju. Promene fluorescence merene svakih 10 sekundi pre dodatka jedinjenja.Posle dodatka jedinjenja, fluorescenca je merena svake sekunde u toku prvog minuta, pa zatim svkaih šest sekundi u ukupnom trajanju analize od tri minute. Per ul alikvota 100 uM matičnog jedinjenja je dodato posle desetog skena dajući krajnju koncentraciju jedinjenja od 10 uM. Maksimalne promene fluorescence u prvih 80 skenova je zabeleženo kao mera agonističke aaktivnosti i upoređeno sa maksimalnom promenom fluorescence indukovane sa 10 uM ATP (Sigma A9062).

Nađeno je da veliki broj furosemid-sličnih jedinjenja aktivira HM74.

Primer 3-Testiranje antagonista

Za skrining antagonista humanog HM74, HM74 se može lažno kuplovati prema Gq mehanizmu. Kao u Primeru 2, FLIPR<®>aparat je korišćen za praćenje bilo kojih nastalih promena u fluorescenciji. Akctivnost antagonista se reflektuje smanjenjem fluorescence.

CHO-K1 ćelije koje eksprimuju HM74 su prethodno osmišljeni tako da eksprimuju indiscriminatni oblik Gq proteina (Gai6), kao što je opisano u Primeru 2. Ćelije su održavane u log fazi rasta na 37° C i 5% CO2U F12 Ham-ovom medijumu (Gibco/BRL, Catalog No. 11765-054) koji sadrži 10% fetalnog goveđeg seruma, 100 IU/ml penicilina (Gibco/BRL, Catalog No. 15140-148), 100 ug/ml streptomicina (Catalog No. 15140-148, Gibco/BRL), 400 ug/ml geneticina (G418) (Gibco/BRL, Catalog No. 10131-035) i 200 ug/ml zeocina (Invitrogen, Catalog No. R250-05). Jedan dan pre testiranja, 12,500 ćelija/udubljenju CHO-K1 ćelija je naneto na crnu ploču za testiranje sa providnim dnom sa384-udubljenja sa zapreminom udubljenja od 50 ul (Greiner/Marsh, Catalog No. N58102) pomoću 96/384 Multidrop uređaja. Ćelije su ostavljene da se inkubiraju na 37° C u 5% CO2.

Pripremljeni su sledeći matični rastvori: 1 M matični rastvor Hepesa (pH 7.5)

(Gibco/BRL, Catalog No. 15630-080); 250 mM osnovni rastvor probenicida (Sigma, Catalog No. P8761) napravljen u 1 N NaOH; 1 mM osnovni rastvor Fluo 4-AM Dye (Molecular Probes, Catalog No. F 14202) napravljen u DMSO (Sigma D2650); i osnovni rastvor liganda ili antagonista. Reakcioni pufer je pripremljen sa 1000 ml Hank-ovog balanciranog rastvora soli (Fisher/Mediatech, Catalog No. MT21023), 20 ml 1 M Hepes osnovnog rastvora, 10 ml 250 mM probenicid osnovnog rastvora i 1 mM CaCL;. Za dobijanje pufera za nanošenje, 80 ul 1 mM Fluo 4-AM Dye osnovnog rastvora je pomešano sa 16 ul of pluronične kiseline (Molecular Probes, Catalog No. P6866) i zatim promešan sa 20 ml gore opisanog reakcionog pufera i 0.2 ml of fetalnog goveđeg seruma.

Trideset minuta pre testiranja, 30 ul sveže pripremljenog pufera za nanošene je dodato u svako udubljenje na ploči sa 384-udubljenja pooću96/384 Multidrop uređaja. Ćelije su inkubirane na 37° C u inkubatoru sa CO2kako bi se maksimizirala apsorpcija boje. Neposredno pre testiranja, ćelije su isprane 3 puta salOO ul reakcionog pufera pomoću 384 EMBLA Cell Washer pri čemu je glava aspiratora udaljena najmanje 40 mm iznad dna ploče, ostavljajući 45 ul pufera po udubljenju.

Pet ul 100 uM osnovnog antagonist jedinjenja je dodato u ćelije pomoću Platemate-384 pipete (Matrix). Koncentracija jedinjenja tokom faze inkubacije iznosi približno 10 uM. Ćelije su nanete naFLIPR<®>II i fluorescenca ploče je merena svake sekunde tokom prvog minuta, pa zatim izlaganjima svakih šest sekundi za ukupno vreme od tre minute. Antagonist ili ligand (10 uM) je dodat posle desetog skena. Posle svakog dodavanja, vrhovi 384 pipete su isprane 10 puta sa 20 ul 0.01% DMSO u vodi.

HM74 ćelije se mogu ali ne moraju izložiti naznačenom agonistu, pre testiranja sa datim antagonistima.

Primer 4-Testiranje vezivanja receptora

Za pripremanje frakcija membrana koje sadrže HM74, CHO ćelijske linije koje eksprimuju HM74 su sakupljene inkubiranjem u fosfat-puferovanom rastvoru soli (10 ml) koji sadrži 1 mM EDTA. Ćelij su dalje isprane 3 puta u fosfat-puferovanom rastvoru soli koji sadrži 1 mM EDTA (10 ml) pre ponovnog suspendovanja u 5 ml Pufera A (50 mM Tris-HCl (pH 7.8) (Sigma T6791), 5 mM MgCl2(Sigma M8266) i 1 mM EGTA (Sigma 0396).

Ćelije su zatim lizirane u ćelijskom homogenizatoru (Polvtron, Kinemetica, Model PT 10/35) u trajanju od 1 minuta. Dobijeni homogenat je centrifugiran u Sorvall Instruments RC3B ohlađenoj centrifugi pri 49,000 X g na 4°C u trajanju od 20 minuta. Dobijene granule su resuspendovane u 25 ml Pufera A i centrifugiranje je ponovljeno tri puta. Posle poslednjeg centrifugiranja, granule su ponovo resuspendovane u 5 ml Pufera A, podeljen u alikvote i ostavljene na -70° C.

Izveden je testiranje vezivanja receptora koristeći frakcije membrane i radioaktivno obeležen agonist od interesta kao izotopni indikator. Testiranje je izvedeno na 96-ćelijskoj mikrotitar ploči (Beckman Instruments). Reakcija vezivanja obuhvata 18 ug CHO ćelijskog preparata u prisustvu radioaktivnog agonista (0.01 nM-25 nM) u konačnoj zapremini od 0.2 ml Pufera A koji sadrži 0.1% goveđi serum albumin (Sigma, Catalog No. 34287) (videti Im et al., J. Biol. Chem. (2000) 275(19):14281-14286). Reakciona smeša je inkubirana 1 sat na sobnoj temperaturi. Reakcija je prekinuta filtracijom kroz Whatman GF/C filtere na višekanalnom harvesteru (Brandell) koji je prethodno tertiran 0.3% polietileniminom (Sigma, Catalog No. P3143) i 0.1% goveđim serum albuminom (BSA) u trajanju od 1 sata. Smeša je naneta na filter i inkubirana jedan sat. Filteri su isprani 6 puta sa 1 ml ledeno hladnog 50 mM Tris-HCl, pH 7.6. Specifično vezivanje je izračunato na osnovu razlike između ukupnog vezivanja i nespecifičnog vezivanja (osnova) za svaku koncentraciju izotopnog indikatora merenjem radioaktivnosti. Dobijeno je osam do 16 koncentracionih tačaka data da bi se odredilo vezivanje agonista za receptor postignuto u stanju ravnoteže između agonista i receptora (parametri ravnotežnog vezivanja). U testiranju kompeticije, test jedinjenje je dodato u smešu da bi se završilo vezivanje radioaktivvnog agonista na receptor (vrednosti kompetitivnog vezivivanja). Inhibitorne krive su pripremljene da bi se odredila konventracija potrebna za postizanje 50% inhibicije pri vezivanju (ICjo)-

Example 5-Small Molecule Agonists

Serija furosemid-sličnih molekula je izloženo ćelijama koje eksprimuju HM74 kao što je gore opisano. Ciljni molekuli su obelženi da bi se odredilo da lije došlo do vezivanja HM74. Vezivanje je detektovano određivanjem stepena obelžeenosti ćelija nakon ispiranja. Vezivanje je određeno izolovanjem HM74 2-D gel elektroforzom i određivanjem stepena obeleženosti povezanog sa proteino. Nakon procene vezivanja, ili nezavisno od procene vezivanja određena je sposobnost datog agonista da aktivira HM74. Korišćen je FLIPR test za procenu mobilizacije intracelularnog kalcijuma na vezivanje ciljnog molekula za HM74. Tako su identifikovani molekuli koji izazivaju mobilizaciju kalcijuma.

Opisan je pronalazak, pri čemu prosečan stručnjak zna da su moguće različite izmene i modifikacije bez udaljavanja od opsega pronalaska, kao pto je ovde dato.

Sve ovde navedene reference su ovde navedene u potpunosti.

Claims (6)

1. Terapeutski postupak za moduliranje signalne aktivnosti ili signalne transdukcije HM74 kod pacijenata kojima je poterbno lečenje koje obuhvata administriranje pacijentu gde je R, vodonik, ili Ci-Cig alkil, koji može biti razgranat, može da sadrži heteroatom ili može biti supstituisan, ili njihova kombinacija; Ci-Ci8alkenil, koji može biti razgranat, može da sadrži heteroatom ili može biti supstituisan, ili njihova kombinacija; Q-Ci8alkvnl, koji može biti razgranat, može da sadrži heteroatom ili može biti supstituisan, ili njihova kombinacija; C3-C18aril koji može da sadrži sporednu grupu, da ima most, može da sadrži heteroatom ili koji može biti supstituisan, ili njihove kombinacije; ili C5-C18cikloalkil, koji može da sadrži sporednu grupu, možeda ima most, može da sadrži heteroatom ili može biti supstituisan, ili njihova kombinacija; ili njihove kombinacije; svaki od Q i X je O, S ili NR; Y je C1-C18alkil, koji može biti razgranat, može da sadrži heteroatom ili može biti supstituisan, ili njihova kombinacija; Ci-Ci<g>alkenil, koji može biti razgranat, može da sadrži heteroatom ili može biti supstituisan, ili njihova kombinacija; Ci-Ci8alkinl, koji može biti razgranat, može da sadrži heteroatom ili može biti supstituisan, ili njihova kombinacija; C3-C18aril koji može da sadrži sporednu grupu, može da da ima most, može da sadrži heteroatom ili može biti supstituisan, ili njihova kombinacija; ili C5-C18cikloalkil, koji može da sadrži sporednu grupu, da ima most, može da sadrži heteroatom ili koji može biti supstituisan, ili njihova kombinacija; ili njihove kombinacije, gde X i Y moug biti kondenzovani ujedan ili vrše prstenova kada je X, N, gde je dati prsten C3-C18heterocikl, koji može biti razgranat i može da sadrži sporednu grupu, i C3-C18heteroaril, koji može biti razgranat i može da sadrži sporednu grupu, supstituisan C3-C18cikloalkil, koji može biti razgranat i može da sadrži sporednu grupu ili C3-C18aril, koji može biti razgranat i može da sadrži sporednu grupu; i svaki Z je R.

2. Metoda za identifikaciju agonista HM74, naznačen time, što obuhvata, contakt potencijalnog agonist sa ćelijama koje eksprimuju HM74 i određivanje da li u prisustvu datog potencijalnog agonista, povećana signalna aktivnost HM74 u odnosu na aktivnost HM74 u odsustvu potencijalnog agonista, pri čemdati potencijalni agonist ima strukturu: gde je R ,vodonik, ili C1-C18alkil, koji može biti razgranat, može da sadrži heteroatom ili može biti supstituisan, ili njihova kombinacija; Ci-Cisalkenil, koji može biti razgranat, može da sadrži heteroatom ili može biti supstituisan, ili njihova kombinacija; Ci-Cisalkinil, koji može biti razgranat, može da sadrži heteroatom ili može biti supstituisan, ili njihova kombinacija; C3-C18aril koji može da sadrži sporednu grupu, može da ima most, može da sadrži heteroatom ili može biti supstituisan, ili njihova kombinacija; ili C5-C18cikloalkil, može da sadrži sporednu grupu, može da ima most, može da sadrži heteroatom ili može biti supstituisan, ili njihova kombinacija; ili njihove kombinacije; svaki od Q i X je O, S ili NR; Y je Ci-Cig alkil, koji može biti razgranat, može da sadrži heteroatom ili može biti supstituisan, ili njihova kombinacija; Ci-Ci8alkenil, koji može biti razgranat, može da sadrži heteroatom ili može biti supstituisan, ili njihova kombinacija; Ci-Cisalkinl, koji može biti razgranat, može da sadrži heteroatom ili može biti supstituisan, ili njihova kombinacija; C3-C18aril može da sadrži sporednu grupu, da ima most, može da sadrži heteroatom ili koji može biti supstituisan, ili njihova kombinacija; ili C5-C18cikloalkil, može da sadrži sporednu grupu, da ima most, može da sadrži heteroatom ili koji može biti supstituisan, ili njihova kombinacija ; ili njihove kombinacije, gde se X i Y mogu kondenzovati ujedan ili više prstenova kada je X, N, gde je dati prsten, C3-C18heterocikl, koji može biti razgranat i može da sadrži sporednu grupu, i C3-C18heteroaril, koji može biti razgranat i može da sadrži sporednu grupu, supstituisan C3-C18cikloalkil, koji može biti razgranat i može da sadrži sporednu grupu ili C3-Cisaril, koji može biti razgranat i može da sadrži sporednu grupu; i svaki Z je R.

3. Metod za identifikaciju inverznog agonista HM74 koji obuhvata, kontakt potencijalnog inverznog agonista sa ćelijom koja eksprimuje HM74 i određivanje da lije u prisustvu datog potencijalnog inverznog agonista, aktivnost HM74 smanjena u odnosu na aktivnost HM74 u odsustvu datog potencijalno inverznog agonista, i smanjena u prisustvu agonista,pri čemu dati potencijalni inverzni agonist ima strukturu: gde je R, vodonik, ili Ci-Cig alkil, koji može biti razgranat, može da sadrži heteroatom ili koji može biti supstituisan, ili njihova kombinacija; Ci-Cisalkenil, koji može biti razgranat, može da sadrži heteroatom ili koji može biti supstituisan, ili njihova kombinacija; Ci-Ci8alkinl, koji može biti razgranat, može da sadrži heteroatom ili koji može biti supstituisan, ili njihova kombinacija; C3-C18aril može da sadrži sporednu grupu, može da ima most, može da sadrži heteroatom ili koji može biti supstituisan, ili njihova kombinacija; ili C5-C18cikloalkil, može da sadrži sporednu grupu, može da ima most, može da sadrži heteroatom ili može biti supstituisan, ili njihova kombinacija; ili njihovr kombinacijr; svaki od Q i X je O, S ili NR; Y je Ci-Cisalkil, koji može biti razgranat, može da sadrži heteroatom ili koji može biti supstituisan, ili njihova kombinacija; C1-C18alkenil, koji može biti razgranat, može da sadrži heteroatom ili koji može biti supstituisan, ili njihova kombinacija; Ci-Cisalkinl, koji može biti razgranat, može da sadrži heteroatom ili može biti supstituisan, ili njihova kombinacija; C3-C18aril može da sadrži sporednu grupu, može da ima most, može da sadrži heteroatom ili koji može biti supstituisan, ili njihova kombinacija; ili C5-C18cikloalkil, koji može da sadrži sporednu grupu, može da ima most, može da sadrži heteroatom ili koji može biti supstituisan, ili njihova kombinacija; ili njihove kombinacije, gde se X i Y mogu kondenzovati ujedan ili više prstenovakada je X, N, pri čemu je dati prsten C3-C18heterocikl, koji može biti razgranat i može da sadrži sporednu grupu, i C3-C18heteroaril, koji može biti razgranat i može da sadrži sporednu grupu, supstituisan C3-C18cikloalkil, koji može biti razgranat i može da sadrži sporednu grupu ili C3-C18aril, koji može biti razgranat i može da sadrži sporednu grupu; i svaki Z je R.

4. Metod za identifikaciju antagonist HM74 koji obuhvata: kontakt potencijalnog antagonista sa ćelijom koja eksprimuje HM74 i određivanje da li je u prisustvu potencijalnog antagonista, signalna aktivnost HM74 smanjena u odnosu na aktivnost HM74 u prisustvu agonista, pri čemu potencijalni antagonist ima sledeću strukturu: gde je R, vodonik, ili Ci-Cisalkil, koji može biti razgranat, može da sadrži heteroatom ili koji može biti supstituisan, ili njihova kombinacija; CpCis alkenil, koji može biti razgranat, može da sadrži heteroatom ili koji može biti supstituisan, ili njihova kombinacija; Ci-Cisalkinil, koji može biti razgranat, može da sadrži heteroatom ili koji može biti supstituisan, ili njihova kombinacija; C3-C18aril koji može da sadrži sporednu grupu, da ima most, može da sadrži heteroatom ili koji može biti supstituisan, ili njihova kombinacija; ili C5-C18cikloalkil, može da sadrži sporednu grupu, da ima most, može da sadrži heteroatom ili koji može biti supstituisan, ili njihova kombinacija; ili njihove kombinacije; svaki od Q i X je O, S ili NR; Y je Ci-Cisalkil, koji može biti razgranat, može da sadrži heteroatom ili koji može biti supstituisan, ili njihova kombinacija; Ci-Cig alkenil, koji može biti razgranat, može da sadrži heteroatom ili koji može biti supstituisan, ili njihova kombinacija; a Ci-Cig alkinl, koji može biti razgranat, may može da sadrži heteroatom ili koji može biti supstituisan, ili njihova kombinacija; C3-C18aril koji može da sadrži sporednu grupu, da ima most, može da sadrži heteroatom ili koji može biti supstituisan, ili njihova kombinacija; ili C5-C18cikloalkil, koji može da sadrži sporednu grupu, da ima most, može da sadrži heteroatom ili koji može biti supstituisan, ili njihova kombinacija; ili njihove kombinacije, gde se X i Y mogu kondenzovati ujedan ili više prstenova kada je X, N, pri čemu je prsten, C3-Cig heterocikl, koji može biti razgranat i može da sadrži sporednu grupu, i C3-C18heteroaril, koji može biti razgranat i koji može da sadrži sporednu grupu, supstituisan C3-Cig cikloalkil, koji može biti razgranat i koji može da sadrži sporednu grupu ili C3-C18aril, koji može biti razgranat i može da sadrži sporednu grupu; i svaki Zje R.

5. Jedinj enj e formule: gde je R, vodonik, ili C1-C18alkil, koji može biti razgranat, može da sadrži heteroatom ili koji može biti supstituisan, ili njihova kombinacija; Ci-Cig alkenil, koji može biti razgranat, može da sadrži heteroatom ili koji može biti supstituisan, ili njihova kombinacija; Ci-Cig alkinil, koji može biti razgranat, može da sadrži heteroatom ili koji može biti supstituisan, ili njihova kombinacija; C3-C18aril može da sadrži sporednu grupu, koji može da ima most, može da sadrži heteroatom ili koji može biti supstituisan, ili njihova kombinacija; ili Cs-Cig cikloalkil, može da sadrži sporednu grupu, može da ima most, može da sadrži heteroatom ili koji može biti supstituisan, ili njihova kombinacija; ili njihove kombinacije; svaki od Q i X je O, S ili NR; Y je C1-C18alkil, koji može biti razgranat, može da sadrži heteroatom ili koji može biti supstituisan, ili njihova kombinacija; Ci-Cig alkenil, koji može biti razgranat, može da sadrži heteroatom ili koji može biti supstituisan, ili njihova kombinacija; Ci-Cig alkinil, koji može biti razgranat, može da sadrži heteroatom ili koji može biti supstituisan, ili njihova kombinacija; C3-Cig aril može da sadrži sporednu grupu, može da ima most, može da sadrži heteroatom ili koji može biti supstituisan, ili njihova kombinacija; ili C5-C18cikloalkil, može da sadrži sporednu grupu, može da ima most, može da sadrži heteroatom ili koji može biti supstituisan, ili njihova kombinacija; ili njihove kombinacije, gde se X i Y mogu kondenzovati ujedan ili više prstenova akda je X, N, pri čemu je dati prsten, C3-Cig heterocikl, koji može biti razgranat i može da sadrži sporednu grupu, i C3-Cig heteroaril, koji može biti razgranat i koji može da sadrži sporednu grupu, supstituisan C3-C18cikloalkil, koji može biti razgranat i koji može da sadrži sporednu grupu ili C3-C18aril, koji može biti razgranat i koji može da sadrži sporednu grupu; i svaki Z je R.

6. Metoda za moduliranje inflamacije koja obuhvata, izlaganja pacijenta kojem je tretman potreban, količini farmaceutskog preparata koja modulira inflamaciju, pri čemu se preparat sastoji se od jedinjenja formule: gde je R, vodonik, ili Ci-Cisalkil, koji može biti razgranat, može da sadrži heteroatom ili koji može biti supstituisan, ili njihova kombinacija; Ci-Cig alkenil, koji može biti razgranat, može da sadrži heteroatom ili koji može biti supstituisan, ili njihova kombinacija; Ci-Cig alkinil, koji može biti razgranat, može da sadrži heteroatom ili koji može biti supstituisan, ili njihova kombinacija; C3-C18aril može da sadrži sporednu grupu, može da ima most, može da sadrži heteroatom ili koji može biti supstituisan, ili njihova kombinacija; ili C5-C18cikloalkil, može da sadrži sporednu grupu, može da ima most, može da sadrži heteroatom ili koji može biti supstituisan, ili njihova kombinacija; ili njihove kombinacije; svaki od Q i X je O, S ili NR; Y je Ci-Cis alkil, koji može biti razgranat, može da sadrži heteroatom ili koji može biti supstituisan, ili njihova kombinacija; Ci-Cig alkenil, koji može biti razgranat, može da sadrži heteroatom ili koji može biti supstituisan, ili njihova kombinacija; Ci-Cig alkinil, koji može biti razgranat, može da sadrži heteroatom ili koji može biti supstituisan, ili njihova kombinacija; C3-C18aril koji može da sadrži sporednu grupu, može da ima most, može da sadrži heteroatom ili koji može biti supstituisan, ili njihova kombinacija; ili C5-C18cikloalkil, koji može da sadrži sporednu grupu, može da ima most, može da sadrži heteroatom ili koji može biti supstituisan, ili njihova kombinacija; ili njihove kombinacije, gde se X i Y mogu kondenzovati ujedan ili više prstenovakada je X, N, pri čemu je rpsten, C3-C18heterocikl, koji može biti razgranat i koji može da sadrži sporednu grupu; i C3-C18heteroaril, koji može biti razgranat i koji može da sadrži sporednu grupu, supstituisan C3-Ci8cikloalkil, koji može biti razgranat i koji može da sadrži sporednu grupu ili C3-C18aril, koji može biti razgranat i koji može da sadrži sporednu grupu; i svaki Z je R.