RS20060472A - Oksidekahidronaftalen modulatori hm74 - Google Patents

Abstract

Ćelije domaćina u kojima se pojavljuje HM74 se koriste za dobijanje molekula sličnih oksidekalinu sa aktivnošću agoniste koje imaju sledeću strukturu (formula I).

Description

OKSIDEKAHIDRONAFTALEN MODULATORI HM74

POREKLO PRONALASKA

G protein -udvojeni receptori (GPCRs) su integralni proteini membrane koji su uključeni u transdukciju celularnog signala. GPCRs odgovaraju na različite ekstracelularne signale, uključujući neurotransmitere, hormone, mirise i svetlost, i sposobni su da transdukuju signale tako da iniciraju druge prenosioce poruka unutar ćelija. Mnogi terapeutski lekovi ciljano deluju na GPCRs zbog toga što su ovi receptori posrednici u velikom broju različitih fizioloških odgovora, uključujući inflamaciju, vazodilataciju, brzinu rada srca, bronhodilataciju, sekreciju i peristaltiku endokrinih žlezda.

Generalno se smatra da bolesti kao što su astma, hronično obstruktivno oboljenje pluća (COPD), psorijaza i reumatoidni artritis (RA) imaju inflamatornu etiologiju koja uključuje pomoćne T ćelije, monocitne makrofage i eozinofile. Sadašnja anti-inflamatorna terapija sa kortikosteroidima je efikasna kod astme ali je povezana sa metaboličkim i endokrinim neželjenim dejstvima. Verovatno da isto važi za formulacije za inhalaciju koje mogu da se apsorbuju kroz mukozu pluća ili nosa. Trenutno nedostaju zadovoljavajuće terapije za RA ili COPD.

Molekularnim kloniranjem HM74 od humanih monocita se predviđa daje HM74 receptor hemokina (Nomura i saradnici., Int. Immunol. (1993.) 5(10): 1239-1249). HM74 se primarno pojavljuje u koštanoj srži, slezini, krajniku i traheji.

Humane ćelije takođe sadrže sličan ali osoben receptor, HM74A. Sekvence amino kiselina HM74 i HM74A su identične približno 95%. Međutim, ligand za HM74A je poznat, dok je ligand za HM74 nepoznat. Niacin ili nikotinska kiselina je ligand za HM74A, Wise i saradnici, J. Biol. Chem., 278:9869-9874, 2003. Međutim niacin je slab aktivator HM74.

Genom miša sadrži HM74A gen, ali ne sadrži HM74 gen.

Pod izvesnim okolnostima HM74 i HM74A pokazuju koregulaciju. Koristeći Taqman-PCR, prijavioci su pronašli daje pojava HM74 i HM74A 50 puta više indukovana sa TNFa u granulocitima i 10-20 puta sa LPS ili TNFa u monocitima. Pojavljivanje HM74 i HM74A je takođe indukovano 4-5 puta u normalnim humanim bronhijalnim epitelijalinim ćelijama sa TH2 citokinima, IL-4 ili IL-13, što je poznato kao važno u etiologiji astme. Pojavljivanje HM74 i HM74A je povećano u humanim primarnim eozinofilima sa IL-5. Konačno, pojavljivanje pulmonarnih HM74A je povećano kod eksperimentalnog astma modela miša.

Ograničena distribucija HM74 i HM74A u tkivima i njihova regulacija ukazuje na ulogu HM74 i HM74A u infiamatornim procesima kao što su astma, COPD i RA.

Sagledavanje uloge koju GPCRs imaju u bolestima i sposobnost lečenja bolesti moduliranjem aktivnosti GPCRs, identifikacija i karakterizacija GPCR Uganda može da dovede do razvoja novih kompozicija i postupaka za lečenje bolesnih stanja u kojima se javlja aktivnost GPCR. Ovaj pronalazak identifikuje i karakteriše molekule koje angažuju HM74 i obezbeđuje kompozicije i postupke za primenu otkrića na identifikaciji i tretmanu bolesti povezanih sa tim.

KRATAK SADRŽAJ PRONALASKA

Ovaj pronalazak se odnosi na molekule koje aktiviraju HM74 ali ne aktiviraju HM74A.

U narednom aspektu pronalaska su otkriveni postupci za identifikaciju modulatora HM74. Na primer, postupak koji nas interesuje uključuje faze koje obezbeđuju hemijski deo, obezbeđuju pojavljivanje HM74 u ćeliji i određivanje da li hemijski deo modulira aktivnost signalizacije HM74, uključujući i da li se ova modulacija dešava u prisustvu ili bez prisustva agonista iz ovog pronalaska. U daljem aspektu, hemijski delovi mogu da obuhvate, ali bez ograničenja na, peptide, antitela, agoniste, inverzne agoniste i antagoniste. Alternativno, poznati modulator može da se koristi u uporednom ispitivanju za identifikaciju drugih modulatora.

Spojeni prsten dihidropirana (takođe poznat kao oksidekahidronaftalen i oksidekalin) aktivira HM74. Ova jedinjenja, u zavisnosti od doze, izazivaju selektivnu, mobilizaciju kalcijuma u ćelijama u kojima se pojavljuje HM74, kao što su CHO ćelije, ćelije 293 i LI.2 ćelije.

Oksidekalini koji nas interesuju imaju sledeću strukturu:

gdejeX 0,NR2iliS;

Rjje Cj-Cig alkil grupa, koja može da bude račvasta, može da sadrži heteroatom ili može da bude supstituisana, ili može da bude kombinacija ovoga; CrC18 alkenil grupa koja može da bude račvasta, može da sadrži heteroatom ili može da bude supstituisana, ili može da bude kombinacija ovoga; CpCi8alkinil grupa koja može da bude račvasta, može da sadrži heteroatom ili može da bude supstituisana, ili može da bude kombinacija ovoga; C3-C18aril grupa koja može da sadrži bočnu grupu, može da sadrži most, može da sadrži heteroatom ili može da bude supstituisana ili može da bude kombinacija ovoga; C5-C]g cikloalkil grupa koja može da sadrži bočnu grupu, može da sadrži most, može da sadrži heteroatom ili može da bude supstituisana ili može da bude kombinacija ovoga; ili njihove kombinacije;

R2 je neka od Rigrupa; ili R2može da bude (CpCi0) alkil-(C3-C10) cikloalkil grupa, koja može da bude račvasta, može da sadrži heteroatom ili može da bude supstituisana, ili može da bude kombinacija ovoga; ili X i R2mogu da formiraju prsten;

R3 je H ili Ri grupa; i

Y je karbonil grupa, Šifova baza, neki oksin, ketal, acetal, oksazolidin, tiazolodin ili enolni estar.

Jedinjenja iz ovog pronalaska su generalno agonisti. Prema tome, jedinjenja iz ovog pronalaska mogu da se razvijaju kao mogući lekovi. Jedinjenja iz ovog pronalaska mogu takođe da se koriste za identifikaciju drugih molekula koje moduliraju HM74, na primer, u toku uporednih ispitivanja.

Naredni aspekt pronalaska obuhvata terapeutske kompozicije, pri čemu ove kompozicije obuhvataju nukleinske kiseline, antitela, polipeptide, agoniste, inverzne agoniste i antagoniste. Dalje, postupci iz ovog pronalaska takođe obuhvataju postupke za lečenje bolesnih stanja i moduliranje signalne aktivnosti HM74 primenom ove terapeutske kompozicije na pacijentu kome je potrebna.

Ovi i drugi aspekti pronalaska će postati očigledni u toku detaljnog opisa koji sledi i priključenih crteža. Dodatno, u daljem tekstu su izložene različite reference koje mnogo detaljnije opisuju izvesne procedure i kompozicije. Svaka od ovih referenci je ovde inkorporirana referencom kao daje svaka individualno navedena za inkorporiranje.

DETALJAN OPIS PRONALASKA

Ovaj pronalazak se zasniva na otkriću molekula koje aktiviraju HM74. Sekvenca koju kodira HM74 je poznata, Nomura i saradnici, supra. Postupci za dobijanje, izradu i upotrebu HM74 su ovde dati. Promene na kodiranim sekvencama HM74 i amino kiselini se tolerišu tako dugo dok poznate funkcionalne aktivnosti HM74 ne postanu negativne.

Jedinjenja iz ovog pronalaska moduliraju HM74, agonisti su HM74 i stoga su mogući lekovi za oboljenja koja karakteriše inflamacija, kao što je astma.

Jedinjenja iz ovog pronalaska mogu takođe da se koriste za proveru antagonista HM74. Na primer, ćelije u kojima se pojavljuje HM74 se izlažu test jedinjenju, a nakon toga se izlažu agonistu ovog pronalaska. Nakon toga, delovanjem test jedinjenja na, na primer, mobilizaciju kalcijuma može da se odredi da li test jedinjenje redukuje vrednosti mobilizacije kalcijuma koja je indukovana agonistom iz ovog pronalaska.

Druga slična ispitivanja za identifikaciju, na primer, agonista i inverznih agonista, mogu da se imaju u vidu u okviru ovog pronalaska.

Oksidekalini iz ovog pronalaska imaju sledeću strukturu:

gdejeX 0,NR2iliS;

Rije CrC18alkil grupa, koja može da bude račvasta, može da sadrži heteroatom ili može da bude supstituisana, ili može da bude kombinacija ovoga; C]-C]8alkenil grupa koja može da bude račvasta, može da sadrži heteroatom ili može da bude supstituisana, ili može da bude kombinacija ovoga; CpCig alkinil grupa koja može da bude račvasta, može da sadrži heteroatom ili može da bude supstituisana, ili može da bude kombinacija ovoga; C3-Ci8aril grupa koja može da sadrži bočnu grupu, može da sadrži most, može da sadrži heteroatom ili može da bude supstituisana ili može da bude kombinacija ovoga; C5-Ci8cikloalkil grupa koja može da sadrži bočnu grupu, može da sadrži most, može da sadrži heteroatom ili može da bude supstituisana ili može da bude kombinacija ovoga; ili njihove kombinacije;

R2 je neka od R]grupa; ili R2može da bude (C]-Ci0) alkil-(C3-Ci0) cikloalkil grupa, koja može da bude račvasta, može da sadrži heteroatom ili može da bude supstituisana, ili može da bude kombinacija ovoga; ili X i R2mogu da formiraju prsten;

R3jeHili Ri grupa; i

Y je karbonil grupa, Sifova baza, neki oksin, ketal, acetal, oksazolidin, tiazolodin ili enolni estar.

Jedinjenja iz ovog pronalaska su generalno agonisti. Prema tome, jedinjenja iz ovog pronalaska mogu da se razvijaju kao mogući lekovi. Jedinjenja iz ovog pronalaska mogu takođe da se koriste za identifikaciju drugih molekula koje moduliraju HM74, na primer, u toku uporednih ispitivanja.

Naziv "alkil" označava ravan ili račvast lanac hidrokarbonata. Reprezentatitvni primeri su metil, etil, propil, izopropil, butil, izobutil, terc-butil, sek-butil, pentil i heksil grupa. Hidrokarbonat može da sadrži jednu ili više nezasićenih trostrukih veza.

Naziv "alkoksi" označava alkil grupu vezanu za atom kiseonika. Primeri su metoksi, etoksi, propoksi, butoksi i pentoksi grupa.

"Aril" je prsten koji je aromatičan hidrokarbonat. Primeri obuhvataju fenil i naftil grupa.

"Heteroatom" je generalno atom koji se razlikuje od atoma koji su karakteristični za molekul. Prema tome, u hidrokarbonatu, bilo koji atom koji nije ugljenik ili vodonik je heteroatom. Obično su biološki prihvatljivi heteroatomi kiseonik, sumpor i azot.

Naziv "heteroaril" se odnosi na aril grupe gde je jedan ili više atoma ugljenika zamenjeno sa heteroatomom. Primeri su piridil, imidazolil, pirolil, tienil, furil, piranil, pirimidinil, piridazinil, indolil, kvinolil, naftiridinil i izoksazolil grupa.

"Račvast" označava strukturu koja sadrži jednu ili više račvi najednom ili više mesta. Račva može da bude neka R grupa, kako je prethodno definisano, ili neka druga bočna grupa.

Naziv "cikloalkil" se odnosi na ciklični hidrokarbonat. Neki od primera su ciklopropil, ciklobutil, ciklopentil i cikloheksil grupa. Ove grupe mogu da sadrže most različite dužine.

"Heterociklus" je cikloalkil grupa u kojoj je jedan ili više atoma ugljenika zamenjeno sa heteroatomom. Primeri su pirolidinil, piperidinil i piperazinil grupa.

Naziv "heteroalkil" je alkil grupa u kojoj je jedan ili više atoma ugljenika zamenjeno sa heteroatomom. Na primer, etar je heteroalkil.

Pod "supstituisan" se podrazumeva da osnovni organski radikal ima jednu ili više supstituisanih grupa. Prema tome, neki atom ili grupa u molekuli su zamenjeni sa drugim atomom ili grupom. Primeri supstituenata obuhvataju halogen, Ci-Cg alkil, - CN, alkoksil, hidroksil, sulfidnu, sulfatnu, sulfonamidnu, amino, amido, alkoholnu, keto, C6-C18aril, halogenizovanu CpCig alkil, nitritnu ili nitratnu grupu.

"Halogen" je, na primer, hlor, fluor ili brom.

"Alkenil "je hidrokarbonat koji sadrži jednu ili više ugljenik-ugljenik dvostrukih veza. Hidrokarbonat može da bude račvast.

Naziv "prsten" označava jednu, jednu od više struktura prstena ili više struktura prstena, pri čemu dva ili više višestrukih prstenova mogu da budu spojeni, pri čemu jedan ili više od višestrukih prstenova mogu da budu aromatični, mogu da sadrže heteroatom, mogu da budu supstituisani ili mogu da budu njihova kombinacija. Prsten može da bude bicikličan ili policikličan. Prsten može da sadrži most različite dužine.

Naziv "bočna grupa" označava atom ili molekul vezan za drugu strukturu. Prema tome, bočna grupa može da bude neka R grupa kako je prethodno definisano, neka alkil, neka aril, neka cikloalkil grupa itd.

Naziv "most " se odnosi na vezu između dve strukture. Na primer, ne-ciklični hidrokarbonat, kao što su alkil, alkenil grupa i slično, koji mogu da sadrže heteroatom, koji mogu da budu supstituisani, koji mogu da budu račvasti ili njihova kombinacija, mogu da povežu dva ciklična hidrokarbonata, kao što su aril ili cikloalkil grupa. Most takođe može da se nalazi unutar ciklične strukture povezujući najmanje dva atoma ciklične strukture. Intramolekularni most može da sadrži 0, 1, 2, 3, 4 ili više atoma. Intramolekularni most može da bude ravan, račvast i da sadrži supstituente.

Jedinjenja iz ovog pronalaska sadrže funkcionalne grupe koje mogu da se izdvoje da formiraju prolekove za pojačavanje bioraspoloživosti. Prema tome, ovaj pronalazak se odnosi na brojna aktivna jedinjenja iz ovog pronalaska koja se nakon primene metabolišu u bioaktivni oblik. Ovakvi bioaktivni prekursorsi leka su takođe poznati kao bioreverzibilni nosači, latentni lekovi, sistemi za oslobađanje leka ili prolekovi ("Bioreversible Carriers in Drug Design " E.B. Roche, ed., Pergamon, NY, 1987., "Prodrag as Novel Drug Deliverv Svstems", Higuchi & Stella, eds., American Chemical Societv, DC, 1975.)

Hemijska modifikacija lekova je usmerena na posebne aspekte farmakodinamike, kao što je piranje kako da se poveća raspoloživost polarnog jedinjenja koje mora da prođe lipidnu barijeru, kako da se stabiliše jedinjenje obično podložno degradaciji in vivo, itd.

Drugi razlozi za izradu prolekova obuhvataju bioaktivnost toksičnosti leka, nedostatak specifičnosti, nestabilnost, potrebu da se metaboliše na mestu apsorpcije, obuhvataju suviše brzu apsorpciju, primedbe pacijenta, kao što je neprijatan ukus ili bol na mestu injekciranja, loše prihvatanje od strane doktora ili probleme sa samom formulacijom.

Cesta modifikacija je esterifikacija koja se ne ograničava na izdvajanje karboksilne grupe. Postoji hemijska mogućnost za izradu ovakvih derivata, na primer, u obliku amina, imina, supstituenata koji sadrže sumpor i amida.

U slučaju estara, mogu da se dodaju različiti supstituenti, uključujući ravne, ciklične ili račvaste hidrokarbonate, koji mogu da budu supstituisani, mogu da sadrže jednu ili više dvostrukih ili trostrukih veza, mogu da imaju strukture prstena, osnovni hidrokarbonat može da sadrži jedan ili više heteroatoma, kao što su azot, sumpor ili kiseonik, itd.

Kada se R grupa uzima za konstrukciju estra, naredni faktor koji se uzima u obzir je suspektibilnost enzimatičnog cepanja. Prema tome, sterno punjenje i faktori konformacije treba da budu odredljivi zbog bioraspoloživosti. Na primer, račvasta alkil grupa može da stvori sternu smetnju za pristupačnost aktivnom mestu za esterazu, i na taj način se usporava brzina hidrolize. To može da bude ili manje poželjno, bioraspoloživost se odlaže, ili poželjno, bioraspoloživost se prolongira.

U drugim okolnostima, poželjno je pojačavanje rastvorljivosti leka u vodi. Primeri supstituenata kojima se postiže ovaj cilj obuhvataju sukcinate, sulfate, hemisukcinate, fosfate, amino kiseline, acetate, amine i slično.

Mogu da se izdvoje azoti amida, imida, karbonata, hidrantona i slično. Pogodne grupe za reakciju sa azotom obuhvataju hidroksinetil grupe ili generalno hidroksialkil grupe, aciloksialkil grupe i acil grupe.

Karbonilne grupe su takođe položaji za izdvajanje. Primeri derivata su Sifove baze, oksini, ketali, acetali, oksazolidini, tiazolidini i enolni estri.

Dok prethodno diskutovani derivati uključuju kovalentnu vezu supstituenta za lek, supstituent može da bude vezan za lek i na drugi način, na primer, vodoničnom vezom, van der VValsovim silama, elektrostatičnim silama, hidrofobnim interakcijama i slično.

Još jedan od načina razdvajanja je upotreba supstituenata koji se uklanjaju iz proleka ne-enzimatičnim mehanizmom. Primeri obuhvataju prolekove koji sadrže (2-okso-l,3-dioksol-4-il) metil estre, Manišove baze, oksazolidine, estre sa baznim delom lanca koji katalizuje intramolekularnu hidrolizu i estre ili amide koji se podvrgavaju reakciji eliminacije intramolekularno nukleofilnom ciklizacijom. Mehanizam ciklizacije je moguć kod lekova koji sadrže fenole, alkohole i amine. "Prodrug Design" Testa & Mayer u "Encvclopedia of Pharmaceutical Technologv, " drugo izdanje, V. 3, Swarbrick & Bovlan, eds., Marcel Dekker, 2002.

Stoga, ovaj pronalazak ima u vidu bilo koju drugu modifikaciju jedinjenja iz ovog pronalaska u toku poznatih postupaka sinteze, da se dobiju jedinjenja koja kada se primene reaguju ili deluju in vivo da se dobije jedinjenje koje modulira aktivnost HM74.

Naziv "ekvivalent ostataka amino kiseline" ovde označava amino kiseline koje uglavnom zauzimaju iste položaje unutar sekvence proteina kada se dve ili više sekvenci poravnaju za analizu. Preferirani HM74 polipeptidi iz ovog pronalaska imaju sekvencu amino kiseline potpuno identičnu sa nasumice uzetim tipom HM74. Pod "nasumice izabranim tipom" se podrazumeva najčešći oblik ili aleli koji su prisutni u određenoj populaciji, bilo lokalnom ili širem okviru. Naziv "potpuno identični" se ovde koristi u vezi sa prvom amino kiselinom ili nukleotidnom sekvencom koja sadrži dovoljan ili minimalan broj identičnih ili ekvivalentnih (na primer, sa sličnim bočnim lancem) ostataka amino kiselina ili nukleotida, na drugu amino kiselinu ili sekvencu nukleotida, kao stoje prva i druga amino kiselina ili sekvenca nukleotida koje imaju uobičajenu struktura domaćina i/ili uobičajenu funkcionalnu aktivnost. Na primer, amino kiselina ili sekvenca nukleotida koje sadrže uobičajenu strukturu domaćina sa najmanje 96% identičnosti sa aktivnošću HM74 se ovde definišu kao potpuno identične.

Kako se ovde koriste kao promenljive, "aktivnost HM74", "biološka aktivnost HM74" ili "funkcionalna aktivnost HM74", odnose se na ispoljavane aktivnosti HM74 proteina, polipeptida ili nukleinske kiseline molekule u ćelijama u kojima se pojavljuje HM74, što se određuje in vivo ili in vitro, u skladu sa standardnim tehnikama. Aktivnost HM74 može da bude direktna aktivnost, kao što je asocijacija sa ili enzimatično delovanje na drugom proteinu, ili indirektna aktivnost, kao što je celularna signalizirajuća aktivnost u kojoj je posrednik interakcija HM74 sa drugim proteinom. U preferiranom aspektu aktivnost HM74 obuhvata najmanje jednu ili više od narednih aktivnosti: (i) sposobnost interakcije sa proteinima na putu HM74 signalizacije; (ii) sposobnost interakcije sa HM74 Ugandom; (iii) sposobnost da izmeni ćeliju domaćina kada je aktivira; (iv) aktiviranje na mestu vezivanja molekule iz pronalaska; i (v) sposobnost interakcije sa intracelularnim ciljanim proteinom.

Jedan aspekt pronalaska se odnosi na pojavljivanje HM74 u ćelijama, što pokazuje odgovor kada se aktivira HM74. Kako se ovde koristi, naziv "molekula nukleinske kiseline" treba da obuhvati molekule DNA (na primer, cDNA ili genomične DNA) i RNA molekule (na primer, mRNA) i analoge DNA ili RNA generisane upotrebom analoga nukleotida. Molekul nukleinske kiseline može da bude jednostruko-standardizovan ili dvostruko-standardizovan, ali je preferirana dvostruko-standardizovana DNA.

"Izolovana" molekula nukleinske kiseline je ona koja je izdvojena od drugih molekula nukleinske kiseline koje se nalaze u prirodnom izvoru nukleinske kiseline. Preferirano, "izolovana" nukleinska kiselina je slobodna sekvenca koja je prirodno bočna nukleinska kiselina enkodiranog HM74 (to jest, sekvenca koja se nalazi na 5' i 3' krajevima nukleinske kiseline) u genomičnoj DNA organizma iz koje je izdvojena nukleinska kiselina. Molekula nukleinske kiseline izolovanog HM74 može da sadrži manje od približno 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0.5 kb ili 0.1 kb sekvenci nukleotida koji se prirodno nalaze bočno u okviru otvorenog oblika za čitanje molekule nukleinske kiseline u genomičnoj DNA ćelije iz koje je izdvojena nukleinska kiselina. Osim toga, "izolovani" molekul nukleinske kiseline, kao što je cDNA molekul, može da bude potpuno slobodan od drugog celularnog materijala ili medijuma kulture kada se produkuje rekombinantnim tehnikama ili potpuno slobodnim hemijskim prekursorima ili drugim hemikalijama kada se hemijski sintetiše.

Molekul nukleinske kiseline ovog pronalaska, na primer, molekul nukleinske kiseline kodiranog HM74, može da se izoluje korišćenjem standardnih tehnika molekularne biologije i sekvence (Nomura i saradnici, supra). Korišćenjem cele ili dela sekvence HM74, molekule HM74 nukleinske kiseline mogu da se izoluju korišćenjem standardnih tehnika hibridizacije i kloniranja (na primer, kako su opisali Sambrook i saradnici, ed., Molecular Cloning: A Laboratorv Manual, drugo izdanje, Cold Spring Harbor Laboratorv Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989.)

Molekul nukleinske kiseline iz pronalaska može da se amplificira korišćenjem cDNA, mRNA ili genomične DNA kao templata i odgovarajućih primera origunukleotida u skladu sa standardnim tehnikama PCR amplifikacije. Ovako amplificirana nukleinska kiselina može da se klonira u odgovarajući vektor i karakteriše pomoću analize DNA sekvence. Osim toga, oligonukleotidi koji odgovaraju sekvencama nukleotida HM74 mogu da se izrade standardnim tehnikama sinteze, na primer, korišćenjem automatskog sintesajzera DNA.

Isto tako, molekul nukleinske kiseline iz pronalaska može da ukljući samo delove sekvence nukleinske kiseline kodiranog HM74, na primer, fragment koji enkodira ekstracelularnog domaćina i/ili intracelularnog domaćina što daje merljiv intracelularni deo kada je ligand vezan za njega. Preferirano je daje merljiv intracelularni deo onaj koji je dobijen kada je HM74 aktiviran u normalnoj ćeliji domaćina.

Enkodirani fragment nukleinske kiseline "biološki aktivnog dela HM74" može da se izradi izolacijom dela HM74 što enkodira polipeptid koji ima biološku aktivnost HM74, pojavljivanjem enkodiranog dela HM74 proteina (na primer, pojavljivanjem rekombinanta in vitro) i ispitivanjem aktivnosti enkodiranog dela HM74.

Pronalazak dalje obuhvata molekule nukleinskih kiselina koje se razlikuju od sekvenci nukleotida otkrivenog HM74 u toku degeneracije genetičkog koda i na taj način potpuno enkodiranog istog HM74 proteina kako je to prethodno otkriveno.

Stručnjaku sa iskustvom u tehnici je jasno da polimorfizam sekvence DNA koji dovodi do promena u sekvencama amino kiselina HM74 može da egzistira unutar populacije (na primer, humane populacije). Ovakav genetički polimorfizam u sekvenci kodiranog HM74 može da egzistira između pojedinaca unutar populacije zbog prirodne alelične varijacije. Alele je jedna grupa gena do koje dolazi alternativno pri datom genetičkom lokusu. Kako se ovde koriste, nazivi "gen" i "rekombinantni gen" se odnose na molekule nukleinske kiseline koje uključuju otvoreni okvir za čitanje enkodiranog HM74 proteina, preferirano HM74 proteina sisara. Kako se ovde koristi, fraza "alelična varijanta" se odnosi na sekvencu nukleotida koja se dobija na HM74 lokusu ili na polipeptid koji je enkodiran sa sekvencom nukleotida. Alternativni aleli mogu da se identifikuju sekvenciranjem odgovarajućeg gena kod brojnih različitih pojedinaca. Ovo jednostavno može da se izvede pomoću proba hibridizacije za identifikaciju istih genetičkih lokusa kod različitih individualaca. Bilo koja i sve ove varijacije nukleotida i rezultujući polimorfizmi amino kiselina ili varijacije u HM74 koje su rezultat prirodne alelične varijacije i sve ono što ne menja funkcionalnu aktivnost HM74 je obuhvaćeno okvirom ovog pronalaska.

Osim toga, molekule nukleinske kiseline enkodiranih HM74 proteina od drugih vrsta (HM74 homolozi) sa sekvencom nukleotida koja se razlikuje od sekvence humanog HM74, ali koja ima potpuno istu aktivnost, obuhvaćene su okvirom ovog pronalaska. Molekule nukleinske kiseline koje odgovaraju prirodnim aleličnim varijantama i homolozima HM74 cDNA pronalaska mogu da se izoluju na bazi identičnosti sa humanim HM74 nukleinskim kiselinama koje su ovde otkrivene, koristeći humanu cDNA ili njene delove, kao proba hibridizacije u skladu sa standardnim tehnikama hibridizacije pod striktnim uslovima hibridizacije.

Kako se ovde koristi, naziv "hibridizacija pod striktnim uslovima" treba da opiše uslove za hibridizaciju i ispiranje pod kojima sekvence nukleotida obično ostaju hibridizirane. Ovakvi striktni uslovi su poznati stručnjaku sa iskustvom u tehnici i mogu da se nađu u "Current Protocols in Molecular Biologv", John Wiley & Sons, N.Y. (1989.) 6.3.1-6.3.6. Preferirano, ne-ograničavajući primer striktnih uslova hibridizacije je hibridizacija u 6X natrijum hlorid/natrijum citratu (SSC) na približno 45°C, a zatim sa jednim ili više ispiranja 0.2 X SSC, 0.1% SDS na 50-65 °C. Preferirano, izolovani molekul nukleinske kiseline iz pronalaska koji hibridizira pod striktnim uslovima u sekvencu HM74 ili njegov komplement odgovara molekuli prirodno dobijene nukleinske kiseline. Kako se ovde koristi, molekul "prirodno-dobijene" nukleinske kiseline se odnosi na molekul neke RNA ili DNA koji ima sekvencu nukleotida koja se dobij a u prirodi (na primer, enkođirani prirodni protein).

Kao dodatak, prirodno dobijenim aleličnim varijantama sekvence HM74 koja može da egzistiraj u populaciji, stručnjak sa iskustvom može da proceni da u sekvencu nukleotida mogu mogu da se ubace promene mutacijom i na taj način da dođe do promena u sekvenci amino kiseline enkodiranog HM74 bez značajnih izmena biološke aktivnosti HM74 proteina. Prema tome, stručnjak može da izradi supstituisane nukleotide što vodi ka supstituisanim amino kiselinama na ostacima"ne-esencijalnih" amino kiselina. Ostatak "ne-esencijalne " amino kiseline je ostatak koji može da se izmeni u velikom broju sekvenci HM74 bez značajne izmene biološke aktivnosti. Ostatak "esencijalne " amino kiseline je onaj koji je odgovoran za značajni deo biološke aktivnosti. Na primer, ostaci amino kiselina koji nisu konzervirani ili su samo polu-konzervirani između različitih vrsta HM74, mogu da budu ne-esencijalni za aktivnost i stoga su mogući ciljevi izmene. Alternativno, ostaci amino kiseline koji su konzervirani između proteina HM74 različitih vrsta mogu da budu esencijalni za aktivnost i stoga ne treba da budu mogući ciljevi izmene.

U skladu sa tim, naredni aspekt pronalaska se odnosi na molekue nukleinske kiseline enkodiranih HM74 proteina koji sadrže izmene u ostacima amino kiselina koje nisu esencijalne za aktivnost. Ovakvi HM74 proteini koji se razlikuju od sekvence poznate amino kiseline i dalje zadržavaju biolšku aktivnost. U jednom otelotvorenju, izolovana molekula nukleinske kiseline obuhvata sekvence nukleotida enkodiranog proteina koji obuhvata sekvencu amino kiseline koja je najmanje 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sa sekvencom poznate amino kiseline HM74.

Izolovani enkodirani molekul nukleinske kiseline HM74 proteina koji ima sekvencu različitu od sekvence poznatog HM74, može da se kreira ubacivanjem jednog ili više supstituisanih nukleotida, dodavanjem ili oduzimanjem u sekvenci nukleotida poznatog HM74, na primer, jednog ili više supstituenata amino kiselina, dodavanje ili oduzimanje se izvodi u enkodiranom proteinu.

Mutacije mogu da se izvrše standardnim tehnikama, kao što su mutageneze određenog mesta i mutageneze posredstvom PCR. Preferirano, supstitucije konzervativnih amino kiselina se vrše najednom ili više od predviđenih ostataka ne-esencijalnih amino kiselina. "Konzervativna supstitucija amino kiselina" je ona u kojoj se ostatak amino kiseline zameni sa ostatkom amino kiseline koji ima sličan bočni lanac. Familije ostataka amino kiselina koje imaju slične bočne lance su definisane u tehnici. Familije obuhvataju amino kiseline sa baznim bočnim lancima (na primer, lizin, arginin i histidin), kiselim bočnim lancima (na primer, aspartanska kiselina i glutaminska kiselina), neutralnim bočnim lancima (na primer, glicin, asparagin, glutamin, serin, treonin, tirozin i cistein), nepolarnim bočnim lancima (na primer, alanin, valin, leucin, izoleucin, prolin, fenilalanin, metionin i triptofan), beta-račvastim bočnim lancima (na primer, treonin, valin i izoleucin) i aromatičnim bočnim lancima (na primer, tirozin, fenilalanin, triptofan i histidin). Prema tome, određeni ostaci ne-esencijalnih amino kiselina u HM74 se preferirano zamenjuju sa ostatkom druge amino kiseline iz iste familije bočnog lanca. Alternativno, mutacije mogu da se izvrše nasumice na ćelom ili na delu kodirane sekvence HM74, kao što je mutageneza zasićenjem, a nastali mutanti mogu da se provere na biološku aktivnost HM74 da se identifikuju mutanti koji su zadržali aktivnost. Nakon mutageneza, enkodirani protein može da se podvrgne rekombinaciji, a aktivnost proteina može da se odredi.

Primeri modifikovanih nukleotida koji mogu da se koriste za generisanje željenih nukleinskih kiselina obuhvataju 5-fluorouracil, 5-bromouracil, 5-hlorouracil, 5-jodouracil, hipoksantin, ksantin, 4-acetilcitozin, 5-(karboksihidroksilmetil)uracil, 5-karboksinetilaminometil-2-tiouridin, 5-karboksinetilaminometiluracil, dihidrouracil,<p->D-galaktozilqueozin, inozin, N6-izopentiladenin, 1-metilquanin, 1-metilinozin, 2,2-dimetilquanin, 2-metiladenin, 2-metilquanin, 3-metilcitozin, 5-metilcitozin, N6-adenin, 7-metilquanin, 5-metilaminometiluracil, 5-metoksiaminometil-2-tiouracil, p-D-manosilqueozin, 5-metoksikarboksinetiluracil, 5-metoksiuracil, 2-metiltio-N6-izopentiladenil, uracil-5-oksiacetatna kiselina, vibutoksozin, pseudouracil, kveozin, 2-tiocitozin, 2-metil-2-tiouracil, 2-tiouracil, 4-tiouracil, 5-metiluracil, metilestaruracil-5-oksiacetatne kiseline, uracil-5-oksiacetatna kiselina, 5-metil-2-tiouracil, 3-(3-amino-3-N-2-karboksipropil)uracil i 2,6-diaminopurin.

Jedan od načina da se utiče na funkciju HM74 je da se spreči pojavljivanje HM74. Prema tome, transkripcijom nivoa može da se manipuliše za manje ili veće vrednosti HM74 mRNA, što za uzvrat dovodi do manjih ili većih vrednosti pojavljivanja HM74 na površini ćelije. Jedan od načina da se postigne ovakva manipulacija je korišćenje regulatornih promotera koji mogu da se uključe na odgovarajućim položajima u genomu u blizini sekvence kodiranog HM74, na primer, pomoću homologne rekombinacije.

U skladu sa tim, naredni aspekt pronalaska se odnosi na anti-HM74 antitela. Naziv "antitelo ", kako se ovde koristi, odnosi se na molekule imunoglobulina i imunološki aktivne delove molekula imunoglobulina, to jest, molekule koje sadrže mesto vezivanja antigena koje vezuje specifičan antigen, kao što je HM74. Molekula koja je specifična za vezivanje HM74 je molekula koja vezuje HM74 ali uglavnom ne vezuje druge molekule u uzorku, na primer, biološkom uzorku, koji prirodno sadrži HM74. Primeri imunološko aktivnih delova molekula imunoglobulina obuhvataju F(ab) i F(ab')2 fragmente koji mogu da se generišu tretiranjem antitela sa enzimom kao što je pepsin. Pronalazak obezbeđuje poliklonalna i monoklonalna antitela koja vezuju HM74. Naziv "monoklonalno antitelo" ili "kompozicija monoklonalnog antitela", kako se ovde koristi, odnosi se na populaciju molekula antitela koja sadrži samo jednu vrstu idiotipa ili klon sa mestom vezivanja antigena koji je sposoban da dovede do imunoreakcije sa određenim epitopom HM74. Kompozicija monoklonalnog antitela stoga obično pokazuje jednostruk afinitet vezivanja za određeni epitop HM74 proteina.

Različiti oblici drugih antitela koja vezuju antigen mogu da se izrade postupcima koji su poznati u tehnici, uključujući fragmente, himerična antitela, rekombinantna antitela, humanizirana antitela i slično.

Naredni aspekt pronalaska se odnosi na vektore, preferirano vektore pojavljivanja, koji sadrže nukleinsku kiselinu enkodiranog HM74 (ili njegovog dela). Kako se ovde koristi, naziv "vektor" se odnosi na molekulu nukleinske kiseline koja je sposobna da transportuje drugu nukleinsku kiselinu vezanu za nju. Jedan tip vektora je "plazmid" koji se odnosi na cirkularni dvostruki DNA luk u kome mogu da budu vezani dodatni segmenti DNA. Naredni tip vektora je virusni vektor, pri čemu dodatni segmenti DNA mogu da se vežu u virusni genom. Izvesni vektori su sposobni za autonomnu replikaciju u ćeliji domaćina (na primer, bakterijski vektori koji imaju bakterijsko poreklo replikacije i epozomalne vektore sisara). Drugi vektori (na primer, ne-epizomalni vektori sisara) su integrisani u genom ćelije domaćina za introdukciju u ćeliju domaćina i na taj način se repliciraju zajedno sa genomom domaćina. Osim toga, izvesni vektori, vektori pojavljivanja, su sposobni da se direktno pojavljuju u genima za koje se mogu vezati. Generalno, vektori pojavljivanja koji su korisni u tehnikama rekombinacije DNA su često u obliku plazmida (vektora). Međutim, pronalazak treba da uključi sve ove druge oblike vektora pojavljivanja, kao što su virusni vektori (na primer, replikacija defektivnih retrovirusa, adenovirusa i virusa povezanih sa adenovirusima) koji imaju ekvivalentne funkcije.

Vektori rekombinantnog pojavljivanja iz pronalaska uključuju nukleinsku kiselinu pronalaska u obliku koji je pogodan za pojavljivanje nukleinske kiseline u ćeliji domaćina. To znači da vektor rekombinantnog pojavljivanja obuhvata jednu ili više regulatornih sekvenci izabranih na bazi ćelija domaćina koje se koriste za pojavljivanje, a koji može da se veže za nukleinsku kiselinu da bi se pojavila. Unutar vektora rekombinantnog pojavljivanja, "može da se veže" treba da označi daje određena sekvenca nukleotida vezana za regulatornu sekvencu(e) na način koji dozvoljava pojavu sekvence nukleotida (na primer, u in vitro transkripcija/translacija sistemu ili u ćeliji domaćina kada je vektor uključen u ćeliju domaćina). Naziv "regulatorna sekvenca" treba da obuhvati promotere, pojačivače i druge elemente kontrole pojavljivanja (na primer, signali poliadenilacije). Ovakve regulatorne sekvence su opisane, na primer, u Goeddel, Gene Expression Technologv; Methods in Enzymology, tom 185, Academic Press, San Diego, CA (1990.). Regulatorne sekvence obuhvataju one koje direktno sačinjavaju sekvencu pojavljenog nukleotida u mnogo tipova ćelija domaćina (na primer, sekvence specifičnog regulacionog tkiva). Stručnjaku sa iskustvom u tehnici će biti razumljivo da oblik vektora pojavljivanja može da zavisi od takvih faktora kao što su izbor ćelije domaćina koja se transformiše, nivo pojavljivanja željenog proteina itd. Vektori pojavljivanja iz pronalaska mogu da se uključe u ćelije domaćina koje produkuju proteine ili peptiđe enkodirane sa nukleinskim kiselinama, kao što je ovde opisano (HM74, mutantni oblici HM74, fuzija proteina, itd.).

Vektori rekombinantnog pojavljivanja iz pronalaska mogu da budu dizajnirani za pojavljivanje HM74 u prokariotičnim ili eukariotičnim ćelijama, na primer, bakterijskim ćelijama kao što je E. coli, ćelijama insekata (korišćenjem vektora pojavljivanja bakulovirusa), ćelijama kvasca ili ćelijama sisara. Pogodne ćelije domaćina su detaljnije diskutovane u Goeddel, supra. Alternativno, vektor rekombinantnog pojavljivanja može da se transkribuje ili translatira in vitro, na primer, upotrebom sekvenci T7 regulatornog promotera i T7 polimeraze.

U narednom aspektu, vektor pojavljivanja HM74 je vektor pojavljivanja kvasca. Primeri vektora za pojavljivanje u kvascu, kao što je S. Cerevisiae, uključuje yYepSecl (Baldari i saradnici, EMBO j. (1982.) 30:933-943), pJRY88 (Schultz i saradnici, Gene (1987.) 4:113-123), pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, CA) i pPicZ (Invitrogen Corp,, San diego, CA).

Alternativno, HM74 može da se pojavi u ćelijama insekata koristeći vektore pojavljivanja bakulovirusa. Vektori bakulovirusa koji su sposobni za pojavljivanje proteina u kulturi ćelija insekata (na primer, Sf 9 ćelije) uključuju pAc serije (Smith i saradnici, Mol. Cell. Biol. (1983.) 3:2156-2165) i pVL serije (Luckolow i saradnici, Birology(1989.)l 70:31-39).

U još jednom aspektu, nukleinska kiselina iz pronalaska se pojavjuje u ćelijama sisara koristeći vektor pojavljivanja kod sisara. Primeri vektora pojavljivanja kod sisara obuhvataju pCDM8 (Seed, Nature (1987.) 329:840) i pMT2PC (Kaufman i saradnici, EMBO J. (1987.) 6:187-195). Kada se koriste u ćelijama sisara, funkcije kontrole vektora pojavljivanja su često obezbeđene virusnim regulatornim elementima. Na primer, često korišćeni promoteri su dobijeni od polioma, adenovirusa 2, citomegalovirusa i virusa 40 majmuna. Za druge pogodne sisteme pojavljivanja i za prokariotične i za eukariotične ćelije, videti odeljke 16 i 17 od Sambrook i saradnika., supra.

Poznato je da za stalnu transformaciju ćelija sisara, u zavisnosti od vektora pojavljivanja i tehnike transformacije koja se koristi, samo mala frakcija ćelija može da integriše stranu DNA u genom. Za identifikaciju i selekciju integrata, gen koji enkodira izabrane markere (koji su rezistentni na antibiotike) je generalno uključen u ćeliju domaćina zajedno sa genom koji se prati. Preferirani selektibilni markeri obuhvataju one koji potvrđuju rezistenciju na lekove, kao što su G418, higromicin i metotreksat. Nukleinska kiselina koja enkodira selektibilni marker može da se uključi u ćeliju domaćina na isti vektor na kome je enkodirani HM74 ili može da se uključi na odvojeni vektor. Ćelije koje se stabilno transfektuju sa uključenom nukleinskom kiselinom mogu da se identifikuju selekcijom leka (na primer, ćelije koje imaju inkorporirani selektibilni marker gen će da prežive, dok ostale ćelije umiru).

Jedinjenja iz ovog pronalaska koja angažuju i aktiviraju HM74 su spojeni prsten dihidropirana koji obuhvataju jedinjenja slična oksidekalimu. Oksidekalin je drugo ime za oksidekahidroraftalen. Ovakvi dihidropirani imaju opštu strukturu: Dihidropirani i oksidekalini iz ovog pronalaska mogu da se izrade na način kako je dato u US patentu broj 6,399,653, WO 97/48691 i u von Roedern, Mol. Div. (1998.) 3: 253-256.

Oksidekalini iz ovog pronalaska imaju sledeću strukturu:

gdejeXO,NR2iliS;

Rije Ci-C18alkil grupa, koja može da bude račvasta, može da sadrži heteroatom ili može da bude supstituisana, ili može da bude kombinacija ovoga; Ci-Ci8alkenil grupa koja može da bude račvasta, može da sadrži heteroatom ili može da bude supstituisana, ili može da bude kombinacija ovoga; CrC18 alkinil grupa koja može da bude račvasta, može da sadrži heteroatom ili može da bude supstituisana, ili može da bude kombinacija ovoga; C3-C18aril grupa koja može da sadrži bočnu grupu, može da sadrži most, može da sadrži heteroatom ili može da bude supstituisana ili može da bude kombinacija ovoga; C5-C]8cikloalkil grupa koja može da sadrži bočnu grupu, može da sadrži most, može da sadrži heteroatom ili može da bude supstituisana ili može da bude kombinacija ovoga; ili njihove kombinacije;

R2 je neka od R!grupa; ili R2može da bude (CrCi0) alkil-(C3-C|o) cikloalkil grupa, koja može da bude račvasta, može da sadrži heteroatom ili može da bude supstituisana, ili može da bude kombinacija ovoga; ili X i R2mogu da formiraju prsten;

R3 je H ili R] grupa; i

Y je karbonil grupa, Sifova baza, neki oksin, ketal, acetal, oksazolidin, tiazolodin ili enolni estar.

Jedinjenja iz ovog pronalaska su generalno agonisti. Prema tome, jedinjenja iz ovog pronalaska mogu da se razvijaju kao mogući lekovi. Jedinjenja iz ovog pronalaska mogu takođe da se koriste za identifikaciju drugih molekula koje moduliraju HM74, na primer, u toku uporednih ispitivanja.

Preferirana jedinjenja su ona u kojima kada je R2metil, etil ili cikloheksil grupa, Rinije n-alkil ili Ci-C4račvasta alkil grupa; ili kada je RiC1-C4alkoholna ili CrC4 račvasta alkil grupa koja može da bude supstituisana sa acetil grupom, Rinije n(-Cr Cg) alkil, (CrC4) račvasta alkil ili tiosupstituisana fenil grupa.

Naziv "alkil" označava ravan ili račvast lanac hidrokarbonata. Reprezentatitvni primeri su metil, etil, propil, izopropil, butil, izobutil, terc-butil, sek-butil, pentil i heksil grupa. Hidrokarbonat može da sadrži jednu ili više nezasićenih trostrukih veza.

Naziv "alkoksi" označava alkil grupu vezanu za atom kiseonika. Primeri su metoksi, etoksi, propoksi, butoksi i pentoksi grupa.

"Aril" je aromatičan hidrokarbonat. Primeri su fenil i naftil grupa.

"Heteroatom" je generalno atom koji se razlikuje od atoma koji su karakteristični za molekul. Prema tome, u hidrokarbonatu, bilo koji atom koji nije ugljenik ili vodonik je heteroatom. Obično su biološki prihvatljivi heteroatomi koji obuhvataju kiseonik, sumpor i azot.

Naziv "heteroaril" se odnosi na aril grupu gde je jedan ili više atoma ugljenika zamenjeno sa heteroatomom. Primeri su piridil, imidazolil, pirolil, tienil, furil, piranil, pirimidinil, piridazinil, indolil, kvinolil, naftiridinil i izoksazolil grupa.

Naziv "cikloalkil" se odnosi na ciklični hidrokarbonat. Neki od primera su ciklopropil, ciklobutil, ciklopentil i cikloheksil grupa.

"Heterociklus" je cikloalkil grupa u kojoj je jedan ili više atoma ugljenika zamenjeno sa heteroatomom. Primeri su pirolidinil, piperidinil i piperazinil grupa.

Naziv "heteroalkil" označava alkil grupu u kojoj je jedan ili više atoma ugljenika zamenjeno sa heteroatomom. Na primer, etar je heteroalkil.

Pod "supstituisan" se podrazumeva da osnovni organski radikal ima jednu ili više supstituisanih grupa. Prema tome, neki atom ili grupa u molekuli su zamenjeni sa drugim atomom ili grupom. Primeri supstituenata obuhvataju halogen, Ci-Cg alkil, - CN, alkoksil, hidroksil, sulfidnu, sulfatnu, sulfonamidnu, amino, amido, alkoholnu, keto, Cć-Cig aril, halogenizovanu CrC]g alkil, nitritnu ili nitratnu grupu.

"Halogen" je, na primer, hlor, fluor ili brom.

"Alkenil" je hidrokarbonat koji sadrži jednu ili više ugljenik-ugljenik dvostrukih veza. Ugljovodonik može da bude račvast.

Naziv "prsten" označava jednu ili jednu od više struktura prstena, kada dva ili više od većeg broja prstenova može da bude spojeno, pri čemu ili jedan ili više od većine prstenova može da bude aromatično, može da sadrži heteroatom, može da bude supstituisano ili da bude njihova kombinacija. Prsten može da bude bicikličan ili policikličan i može da sadrži most.

Jedinjenja iz ovog pronalaska vezuju HM74 i aktivirani HM74, ali se ne vezuju za HM74A.

Oksidekalini iz ovog pronalaska mogu da se sintetišu na način koji je poznat u tehnici, U.S. patent broj 6,399,653.

Jedinjenja iz pronalaska slična oksidekalinu mogu da se inkorporiraju u farmaceutske kompozicije pogodne za primenu. Ove kompozicije obično uključuju aktivni sastojak i farmaceutski prihvatljiv nosač. Kako se ovde koristi, izraz "farmaceutski prihvatljiv nosač" treba da obuhvati bilo koji i sve rastvarače, disperzione medijume, omotače, antibakterijska i antifungalna sredstva, sredstva za izotonizaciju i za odlaganje apsorpcije i slično, koja su kompatibilna sa primenom u farmaciji. Upotreba ovakvih medijuma i sredstava za farmaceutski aktivne supstance je dobro poznata u tehnici. Izuzev u koliko je bilo koji uobičajeni medijum ili sredstvo inkopatibilno sa aktivnim jedinjenjem, njihova upotreba u kompozicijama je moguća. U kompozicije mogu takođe da se inkorporiraju dodatna aktivna jedinjenja.

Farmaceutska kompozicija iz pronalaska je formulisana tako da bude kompatibilna sa nameravanim načinom primene. Primeri načina primene obuhvataju parenteralnu, na primer, intravenoznu, intradermalnu, subkutanu primenu, oralnu (na primer, inhalacijom), transdermalnu (topičnu), transmukoznu i rektalnu primenu. Rastvori ili suspenzije koji se koriste za parenteralnu, intradermalnu ili subkutanu primenu mogu da obuhvate sledeće komponente: sterilni rastvarač, kao što su voda za injekcije, fiziološki rastvor, neutralisana ulja, polietilen glikoli, glicerin, propilen glikol ili drugi sintetički rastvarači; antibakterijska sredstva, kao što su benzil alkohol ili metil parabeni; antioksidanse, kao što su askorbinska kiselina ili natrijum bisulfit; helatna sredstva, kao što je EDTA; pufere, kao što su acetati, citrati ili fosfati i sredstva za podešavanje osmotskog pritiska, kao što su natrijum hlorid ili dekstroza. pH može da se podesi sa kiselinama ili bazama, kao što su HC1 ili NaOH. Parenteralni preparat može da se pakuje u ampule, špriceve za jednokratnu upotrebu ili višedozne bočice izrađene od stakla ili plastike.

Farmaceutske kompozicije pogodne za upotrebu u obliku injekcije obuhvataju sterilne vodene rastvore (kada su rastvorljive u vodi) ili disperzije i sterilne praškove za ekstempore pripremu sterilnih injektibilnih rastvora ili disperzija. Pogodni nosači za intravenoznu primenu obuhvataju fiziološki rastvor, bakteriostatičku vodu, Cremophor EL® (BASF; Parsippanv, NJ) ili fosfatni-puferovani rastvor soli (PBS). U svim slučajevima, kompozicija mora da bude sterilna i treba da bude toliko tečna da se lako aplikuje kroz iglu. Kompozicija mora da bude stabilna pod uslovima proizvodnje i čuvanja i mora da bude zaštićena od kontaminirajućeg delovanja mikroorganizama, kao što su bakterije i gljivice. Nosač može da bude rastvarač ili disperzioni medijum koji sadrži, na primer, vodu, etanol, poliol (na primer, glicerol, propilen glikol i tečni polietilen glikol i slično) i njihove pogodne mešavine. Odgovarajuća protočnost može da se održava, na primer, upotrebom omotača kao što je lecitin, održavanjem zahtevanih veličina partikula u slučaju disperzije i upotrebom surfaktanata. Prevencija od delovanja mikroorganizama može da se postigne različitim antibakterijskim i antifungalnim sredstvima, na primer, parabenima, hlorobutanolom, fenolom, askorbinskom kiselinom, timerosalom i slično. U velikom broju slučajeva, poželjno je da se u kompoziciju uključe sredstva za izotonizaciju, na primer, šećeri, polialkoholi, kao što su manitol ili sorbitol ili natrijum hlorid. Prolongirana apsorpcija injektibilnih kompozicija može da se postigne uključivanjem u kompoziciju nekog sredstva koje odlaže apsorpciju, na primer, aluminijum monostearata i želatina.

Sterilni injektibilni rastvori mogu da se izrade inkorporiranjem aktivnog jedinjenja u određenoj količini u odgovarajući rastvarač sa jednim ili kombinacijom sastojaka koji su prethodno navedeni, u koliko je potrebno, a nakon toga sterilizacijom filtriranjem. Generalno, disperzija se izrađuje inkorporiranjem aktivnog jedinjenja u sterilni vehikulum koji sadrži osnovni disperzioni medijum i druge zahtevane sastojke od onih koji su prethodno navedeni. U slučaju sterilnih praškova za izradu sterilnih injektibilnih rastvora, preferirani postupci izrade su sušenje vakuumom i sušenje zamrzavanjem, čime se dobija prašak aktivnog sastojka plus bilo koji dodatni željeni sastojak iz njihovog prethodnog rastvora sterilisanog filtriranjem.

Oralne kompozicije generalno obuhvataju inertni razblaživač i jestivi nosač. Kompozicije mogu da budu zatvorene u želatinskim kapsulama ili komprimovane u

tablete. Za oralnu terapeutsku primenu, aktivno jedinjenje može da bude inkorporirano u ekscipijente i da se koristi u obliku tableta, troheja ili kapsula. Oralne kompozicije mogu takođe da se izrade upotrebom tečnog nosača da se dobije sirup ili tečna formulacija, ili da se koriste kao voda za ispiranje usta, pri čemu se jedinjenje u tečnom nosaču primenjuje oralno, mućka u ustima i izbaci ili proguta.

Farmaceutski kompatibilna vezivna sredstva i/ili pomoćni materijali mogu da se uključe u deo kompozicije. Tablete, pilule, kapsule, troheje i slično mogu da sadrže bilo koji od narednih sastojaka ili jedinjenja slične prirode: vezivno sredstvo, kao što su mikrokristalna celuloza, tragakanta guma ili želatin; ekscipijent, kao što su škrob ili laktoza, dezintegraciono sredstvo, kao što je algininska kiselina, Primogel ili kukuruzni škrob; lubrikans, kao što su magnezijum stearat ili Steroti; glidant, kao što je koloidni silicijum dioksid; sredstvo za zaslađivanje, kao što su saharoza ili saharin; ili sredstvo za korigovanje ukusa, kao što su pepermint, metil salicilat ili ukus narandže.

Za primenu inhalacijom, jedinjenja se oslobađaju u obliku aerosol spreja iz kontejnera pod pritiskom ili dispenzera koji sadrži odgovarajući propelant, na primer, gas kao što je karbon dioksid ili nebulizera.

Sistemska primena može takođe da bude transmukoznim ili transdermalnim načinom. Za transmukoznu ili transdermalnu primenu, u formulaciji se koristi odgovarajući penetrant kako bi barijera postala propustljiva. Ovakvi penetranti su generalno poznati u tehnici i obuhvataju, na primer, za transmukoznu primenu, deterdžente, žučne soli i derivate fusidinske kiseline. Transmukozna primena može da se vrši upotrebom nazalnih sprejova ili supozitorija. Za transdermalnu primenu, aktivna jedinjenja se formulišu u obliku masti, melema, gelova ili kremova, kako je generalno poznato u tehnici.

Jedinjenja mogu takođe da se izrade u obliku supozitorija (na primer, sa uobičajenim podlogama za supozitorije, kao što su kakao buter i drugi gliceridi) ili u obliku retencionih enema za rektalno oslobađanje.

U jednom aspektu, aktivna jedinjenja se izrađuju sa nosačima koji treba da zaštite jedinjenje od brze eliminacije iz organizma, kao što je formulacija sa kontrolisanim oslobađanjem, uključujući implante i mikrokapsulirane sisteme za oslobađanje. Mogu da se koriste biodegradabilni, biokompatibilni polimeri, kao što su etilen vinil acetat, polianhidridi, poliglikolna kiselina, kolagen, poliortoestri i polilaktatna kiselina.

Postupci za izradu ovih formulacija su razumljivi stručnjaku sa iskustvom u tehnici. Sirovine mogu takođe da se komercijalno nabave od Alza Corporation i Nova Pharmaceuticals, Inc. Kao farmaceutski prihvatljivi nosači mogu takođe da se koriste lipozomne suspenzije (uključujući određene lipozome za ćelije zaražene sa monoklonalnim antitelima). Ovi lipozomi mogu da se izrade u skladu sa postupcima koji su poznati stručnjaku sa iskustvom u tehnici, na primer, kako je opisano u U.S. patentu broj 4,522,811.

Posebna je prednost u formulisanju oralnih ili parenteralnih kompozicija u jediničnom doznom obliku zbog lakše primene i ujednačenosti doze. Jedinični dozni oblik, kako se ovde koristi, odnosi se na pojedinačnu dozu za subjekt koji se tretira, a koju određuje lekar; svaka jedinica sadrži prethodno određenu količinu aktivnog jedinjenja izračunatu da produkuje željeni terapeutski efekat zajedno sa određenim farmaceutskim nosačem. U zavisnosti od tipa i ozbiljnosti bolesti, približno 1 \ ig/ kg do 15 mg/kg (na primer 0.1 do 20 mg/kg) aktivnog sastojka je moguća početna doza za primenu na pacijentu, bilo da se primenjuje u obliku jedne ili više odvojenih davanja ili kontinuiranom infuzijom. Uobičajena dnevna doza može da bude u rasponu od približno 1 ug/kg do 100 mg/kg ili više, u zavisnosti od faktora koji su prethodno navedeni. Za ponovljenu primenu u toku nekoliko dana ili više, u zavisnosti od stanja, tretman se zadržava sve dok se ne postigne željena supresija simptoma bolesti. Međutim i drugi režimi doziranja mogu da budu korisni. Progres terapije se lako prati uobičajenim tehnikama i analizama. Jedan od primera doznog režima je otkriven u WO 94/04188. Specifikacija za jedinične dozne oblike pronalaska je određena i direktno zavisna od osobenih karakteristika aktivnog jedinjenja i određenog terapeutskog efekta koji se postiže i inherentnih ograničenja u tehnici izrade jedinjenja kao aktivnog jedinjenja za tretman pojedinaca.

Farmaceutske kompozicije mogu da se izdaju u kontejneru, pakovanju ili dispenzeru, zajedno sa uputstvima za primenu.

HM74 modulatori iz ovog pronalaska mogu da se koriste u proveravanju analiza i postupaka tretmana (na primer, terapeutskog i profilaktičkog). HM74 modulatori iz ovog pronalaska mogu da se koriste za izdvajanje od drugih lekova ili jedinjenja koja moduliraju aktivnost ili pojavljivanje HM74, kao i za lečenje oboljenja koja karakteriše inflamacija. Modulatori iz ovog pronalaska mogu takođe da nađu upotrebu kod stanja koja nastaju zbog insuficijencije ili povećane produkcije proteina HM74 ili proteina HM74 u oblicima koji smanjuju ili deformišu aktivnost u poređenju sa bilo kojim tipom HM74 proteina. Pronalazak se dalje odnosi na nove HM74 modulatore koji su identifikovani sprovedenim analizama i na njihovu upotrebu u tretmanima, kako je ovde opisano.

Pronalazak obezbeđuje postupak (ovde takođe označen kao "probno ispitivanje") za identifikaciju modulatora, to jest, kandidata ili test jedinjenja ili sredstava (na primer, peptida, peptidomimetika, malih molekula, antitela ili drugih lekova) koji se vezuju za HM74 i imaju stimulacioni ili inhibitorni efekat, na primer, na pojavu HM74 ili aktivnost HM74.

U jednom aspektu, pronalazak obezbeđuje probno ispitivanje kandidata ili test jedinjenja koja se vezuju za ili moduliraju aktivnost HM74. Prema tome, probne analize mogu da se koriste za identifikaciju drugih jedinjenja sličnih furosemidu i sličnih oksidekalinu koji moduliraju HM74. Ovi modulatori mogu takođe da se koriste u poredbenim analizama za identifikaciju drugih modulatora kao što su antagonisti HM74.

U jednom aspektu, analiza je analiza na bazi ćelije i u njoj je ćelija u kojoj se pojavljuje HM74 vezan za membranu na površini ćelije u kontaktu sa test jedinjenjem, a određuje se sposobnost test jedinjenja da aktivira HM74. Ćelija može da bude, na primer, ćelija kvasca ili ćelija sisara. Određivanje sposobnosti test jedinjenja da aktivira HM74 može da se izvede, na primer, spajanjem test jedinjenja sa radioizotopom ili obeleženim enzimom tako da vezivanje test jedinjenja za HM74 može da se odredi detekcijom obeleženog jedinjenja u kompleksu sa HM74 ili da se odredi gde se nalazi HM74. Na primer, test jedinjenja mogu da se obeleže sa 1251, 35 S, 14C ili 3H, ili direktno ili indirektno i radioizotop se detektuje direktnim brojanjem radioemisije ili brojanjem scintilacije. Alternativno, test jedinjenja mogu da se obeleže enzimatično sa, na primer, peroksidazom rena, alkalnom fosfatazom ili luciferazom, a enzimatično obeležene ćelije se detektuju određivanjem konverzije odgovarajućeg supstrata u produkt. U preferiranom aspektu, analize uključuju kontakt ćelije u kojoj se pojavljuje HM74 vezan za membranu na površini ćelije sa poznatim jedinjenjem koje vezuje HM74 zajedno sa test jedinjenjem i određivanje sposobnosti test jedinjenja, upoređujući sa poznatim jedinjenjem, da stupa u interakciju sa HM74.

U narednom aspektu, analiza je analiza na bazi ćelije koja uključuje kontakt ćelije u kojoj se pojavljuje oblik HM74 vezan za membranu na površini ćelije sa test jedinjenjem i određivanje sposobnosti test jedinjenja da modulira (na primer, stimuliše ili inhibira) aktivnost HM74. Određivanje sposobnosti test jedinjenja da modulira aktivnost HM74 može, na primer, da se izvede određivanjem sposobnosti test jedinjenja da aktivira ili inhibira HM74. Ova mogućnost može da se manifestuje kada aktivirani HM74 stupa u interakciju sa intracelularnom ciljanom molekulom ili ciljanom molekulom u membrani koja je povezana sa putem signala. Kako se ovde koristi, "ciljana molekula" je molekula sa kojom se HM74 vezuje ili stupa u interakciju prirodno, na primer, molekula na površini ćelije u kojoj se pojavljuje HM74, molekula na površini druge ćelije, molekula u ekstracelularnoj sredini, molekula koja je povezana sa unutrašnjom površinom ćelijske membrane ili molekula citoplazme. Ciljana molekula HM74 može da bude ne-HM74 molekula. U jednom aspektu, HM74 ciljana molekula je komponenta putanje transdukcije signala koja omogućava transdukciju ekstracelularnog signala (na primer, signala koji je generisan vezivanjem jedinjenja za HM74) kroz ćelijsku membranu i unutar ćelije. Cilj, na primer, može da bude drugi intracelularni protein koji ima katalitičko delovanje ili protein koji omogućava spajanje molekula koje prenose signal na dole sa HM74.

Određivanje sposobnosti HM74 da se vezuje za ili da stupa u interakciju sa ciljanom molekulom HM74 može da se izvede jednim od postupaka koji su prethodno opisani za određivanje direktnog vezivanja. U preferiranom aspektu, određivanje sposobnosti HM74 da se veže za ili da stupi u interakciju sa ciljanom molekulom HM74 može da se izvede određivanjem aktivnosti ciljane molekule. Na primer, aktivnost ciljane molekule može da se odredi registrovanjem indukcije drugog celularnog prenosioca signala do cilja (na primer, intracelularni Ca2+, diacilglicerol, IP3, itd), detekcijom katalitičke/enizmatičke aktivnosti ciljane ćelije na odgovarajući supstrat, detekcijom indukcije "reporter" gena (na primer, regulacioni element koji je odgovoran za HM74 a koji je važan za nukleinsku kiselinu enkodiranog markera koji može da se detektuje, na primer, luciferazu) ili detekcijom celularnog odgovora, na primer, diferencijacija ćelije ili proliferacija ćelije.

U još jednom aspektu, analiza iz ovog pronalaska je ispitivanje slobodne ćelije

koja uključuje HM74 vezan za test jedinjenje i određivanje sposobnosti test jedinjenja da se veže za HM74. Vezivanje test jedinjenja za HM74 može da se odredi ili direktno ili indirektno, kako je prethodno opisano. U preferiranom aspektu, ispitivanje obuhvata kontakt HM74 sa poznatim jedinjenjem iz pronalaska zajedno sa test jedinjenjem i određivanje sposobnosti test jedinjenja da utiče na aktivnost HM74 poznatog jedinjenja koje je ovde opisano. Određivanje sposobnosti test jedinjenja da stupi u interakciju sa HM74 uključuje određivanje sposobnosti test jedinjenja da se preferencijalno veže za HM74 što se upoređuje sa vezivanjem poznatog jedinjenja koje je ovde opisano.

U narednom aspektu, analiza je ispitivanje slobodne ćelije koje uključuje kontakt HM74 sa test jedinjenjem i određivanje sposobnosti test jedinjenja da modulira (na primer, stimuliše ili inhibira) aktivnost HM74. Određivanje sposobnosti test jedinjenja da modulira aktivnost HM74 može da se izvede, na primer, određivanjem sposobnosti aktiviranog HM74 da se veže za HM74 ciljane molekule jednim od postupaka koji su prethodno opisani za određivanje direktnog vezivanja. U alternativnom aspektu, određivanje sposobnosti test jedinjenja da modulira aktivnost HM74 može da se izvrši određivanjem sposobnosti HM74 da i dalje modulira HM74 ciljane molekule. Na primer, katalitička/enizmatička aktivnost ciljane molekule na odgovarajućem supstratu može da se odredi na način koji je prethodno opisan.

U još jednom od aspekata, ispitivanje slobodne ćelije uključuje kontakt HM74 sa poznatim jedinjenjem koje vezuje HM74 sa test jedinjenjem i određivanje sposobnosti test jedinjenja da stupi u interakciju sa HM74, pri čemu određivanje sposobnosti test jedinjenja da stupi u interakciju sa HM74 uključuje određivanje preferencijalnih sposobnosti HM74 da se veže za ili da modulira aktivnost HM74 ciljane molekule.

Receptori mogu da se aktiviraju ne-ligand molekulama koje ne moraju da inhibiraju vezivanje Uganda, ali dovode do strukturnih promena u receptom koje onemogućavaju vezivanje G proteina ili, uz mogućnost agregacije receptora, dovode do dimerizacije ili nagomilavan)a, što može da prouzrokuje aktivaciju.

Ispitivanja slobodnih ćelija u ovom pronalasku su prihvatljiva za ispitivanje i rastvorljivog oblika HM74 i oblika koji je vezan za membranu. U slučaju kada ispitivanja slobodne ćelije uključuju oblik HM74 koji je vezan za membranu, može da bude poželjno da se koristi sredstvo za solubilizaciju tako da se oblik HM74 koji je vezan za membranu održava u rastvoru. Primeri ovakvih sredstava za solubilizaciju obuhvataju nejonske deterdžente, kao što su n-oktilglukozid, n-dodecilglukozid, n-dodecilmaltozid, oktanoil-N-metilglukamid, dekanoil-N-metilglukamid, Triton X-100, Triton X-l 14, Thesit®, izotridecilpoli (etilen glikol etar) n,

3-[(-holamidopropil)dimetilamino]-l-propan sulfonat (CHAPS), 3-[(-holamidopropil)dimetilamino]-2-hidroksi-l-propan sulfonat (CHAPSO) ili N-dodecil=N,N-dimetil-3 -amino-1 -propan sulfonat.

U narednom aspektu, HM74 je promenjen da bude u konstantnom aktivnom stanju kada se pojavljuje u ćeliji domaćina. Promena HM74 može da se izvrši aktivnošću receptora bez povezivanja Uganda. Jedan od načina da se postigne aktivirani receptor je da se HM74 izmeni tako da stupi u interakciju sa G proteinima bez vezivanja Uganda. Promene podržavaju konformacijske izmene receptora na vezanom Ugandu što omogućava receptom da veže intracelulame G proteine. Jedan ovakav pristup je dat u WO 00/22129.

WO 00/22129 se odnosi na određene amino kiseline u regionu TM6 i IC3 koje imaju konstitutivno delovanje. Postupci za inkorporiranje određenih amino kiselina u HM74 su poznati u tehnici, kao na primer, mutageneze usmerene na određen položaj, subkloniranje, itd. Izmenjena molekula HM74 se nakon toga pojavljuje u ćeliji domaćinu čime se dobija konstitutivno aktivan HM74.

Nakon toga se aktivirana ćelija izloži molekulama za koje se pretpostavlja da su HM74 agonisti, antagonisti, inverzni agonisti i slično, molekulama koje menjaju aktivnost HM74. Ove molekule koje menjaju aktivnost G proteina su meta za lečenje oboljenja povezanih sa izmenjenim metabolizmom HM74 koristeći metode koje su poznate u razvoju farmaceutike.

U više od jednog aspekta prethodno navedenih postupaka analiza iz ovog pronalaska, može da bude poželjno da se zaštiti ili HM74 ili molekula na koju cilja da bi se omogućilo razdvajanje kompleksnih od ne-kompleksnih oblika jednog ili oba proteina, kao i da bi se obezbedila autonomnost analize. Vezivanje test jedinjenja za HM74 ili interakcija HM74 sa ciljanom molekulom u prisustvu ili bez prisustva ispitivanog jedinjenja može da se izvede u bilo kojoj posudi u kojoj mogu da se nalaze reaktanti. Primeri ovakvih posuda obuhvataju mikrotitarne ploče, test kivete i mikrocentrifugalne kivete. U jednom aspektu, može da se obezbedi spojeni protein koji povećava područje koje dozvoljava da jedan ili oba proteina budu vezani za matriks. Na primer, glutation-S-transferaza/HM74 spojeni proteini ili glutation-S-transferaza/cilj spojeni proteini mogu da budu adsorbovani na glutation Sepharose® perle (Sigma Chemical, St. Louis, MO) ili mikrotitarne ploče sa izdvojenim glutationom. Ovi kompleksi se zatim kombinuju sa test jedinjenjem i ili sa ne-adsorbovanim ciljanim proteinom ili sa HM74 proteinom i mešavina se inkubira pod uslovima koji dovode do formiranja kompleksa (na primer, na fiziološkim uslovima za so i pH). Nakon inkubacije, perlice ili otvori mikrotitarne ploče se isperu da se uklone sve nevezane komponente a formiranje kompleksa se meri ili direktno ili indirektno, kako je, na primer, prethodno opisano. Alternativno, kompleksi mogu da se odvoje od matriksa, a vrednosti vezanog HM74 ili njegova aktivnost se određuju pomoću standardnih tehnika.

Druge tehnike za zaštitu proteina na matriksu mogu takođe da se koriste u pratećim analizama pronalaska. Na primer, ili HM74 ili cilj njegove molekule mogu da se zaštite korišćenjem konjugacije biotina i streptavidina. Biotinilirani HM74 ili njegove ciljane molekule mogu da se izrade od biotin-NHS (N-hidroksi-sukcinimid) pomoću tehnika koje su dobro poznate u tehnici (na primer, set za biotinilaciju, Pierce Chemicals, Rockford, IL) i imobilizacijom u posudama na pločama sa 96 otvora koje su obložene streptavidinom (Pierce Chemicals). Alternativno, antitela koja reaguju sa HM74 ili sa ciljanim molekulama, ali koje ne učestvuju u vezivanju HM74 proteina za ciljanu molekulu, mogu da se izdvoje u otvorima ploče i razdvoje cilj ili HM74 koji su vezani u otvorima pomoću konjugacije antitela. Postupci za detekciju ovakvih kompleksa, pored onih koji su prethodno opisani za GST-imobilizirane komplekse, obuhvataju imuno detekciju kompleksa pomoću antitela koja reaguju sa HM74 ili ciljanom molekulom, kao i analize vezanih enzima koje se oslanjaju na detekciju enzimske aktivnosti povezane sa HM74 ili ciljanom molekulom.

U narednom aspektu, modulatori pojave HM74 se identifikuju postupkom u kome je ćelija u kontaktu sa ispitivanim jedinjenjem i određuje se pojavljivanje HM74 mRNA ili proteina u ćeliji. Vrednost pojavljivanja HM74 mRNA ili proteina u prisustvu ispitivanog jedinjenja se upoređuje sa vrednostima pojavljivanja HM74 mRNA ili proteina bez prisustva ispitivanog jedinjenja. Nakon toga, ispitivano jedinjenje može da se identifikuje kao modulator pojavljivanja HM74 na osnovu ovog upoređivanja. Na primer, kada je pojavljivanje HM74 mRNA ili proteina veće (statistički značajno veće) u prisustvu ispitivanog jedinjenja nego bez prisustva tog jedinjenja, ispitivano jedinjenje se označava kao stimulator ili agonist pojavljivanja HM74 ili proteina. Alternativno, kada je pojavljivanje HM74 mRNA ili proteina manje (statistički značajno manje) u prisustvu ispitivanog jedinjenja nego bez njegovog prisustva, ispitivano jedinjenje se označava kao inhibitor ili antagonist pojavljivanja HM74 mRNA ili proteina. U koliko je aktivnost HM74 redukovana u prisustvu liganda ili agonista, ili je smanjeno stvaranje HM74, ispod osnovne linije, ispitivano jedinjenje se označava kao inverzni agonist. Vrednost pojavljivanja HM74 mRNA ili proteina u ćelijama može da se odredi postupcima koji su ovde opisani za određivanje HM74 mRNA ili proteina.

Kako mogu da se izrade velike količine čistog HM74, može da se utvrdi fizička karakterizacija koja potvrđuje oblasti mogućih funkcija za racionalnu izradu leka. Na primer, IC3 region molekule i EC oblasti su posebno interesantni regioni. Kada su oblik i jonska konfiguracija regiona poznati, mogući lekovi koji stupaju u interakciju sa ovim regionima mogu da se oblikuju a zatim ispitaju u intaktnim ćelijama, životinjama i pacijentima. Postupci koji bi omogućili izvođenje ovakvih informacija o strukturi obuhvataju kristalografiju X-zracima, NMR spektroskopiju, molekularno modeliranje, itd. 3-D struktura takođe može da dovede do identifikacije analognih konformativnih položaja u drugim poznatim proteinima kada postoje poznati lekovi koji deluju na određenom položaju. Ovi lekovi ili njihovi derivati mogu da nađu mesto za upotrebu sa HM74.

Pronalazak se dalje odnosi na nova sredstva koja su identifikovana pomoću prethodno opisanih probnih analiza i na njihovu upotrebu u tretmanima kako je ovde opisano.

Ovaj pronalazak se odnosi na profilaktičke i terapeutske postupke lečenja subjekta kod koga postoji rizik (ili sumnja na) oboljenja ili kod koga postoji oboljenje povezano sa nenormalnim pojavljivanjem ili nenormalnom aktivnošću HM74. U ovakva oboljenja spadaju, ali bez ograničenja na, na primer, inflamatorna oboljenja kao što su astma, hronična obstruktivna bolest pluća i reumatoidni artritis.

U jednom aspektu, pronalazak obezbeđuje postupak za prevenciju na subjektu bolesti ili stanja povezanih sa poremećenim pojavljivanjem ili aktivnosti HM74 primenom na subjektu sredstva koje modulira pojavljivanje HM74 ili najmanje jednu aktivnost HM74. Subjekti kod kojih postoji rizik od bolesti koja je izazvana ili potpomognuta poremećenim pojavljivanjem ili poremećenom aktivnosti HM74, može da se identifikuje, na primer, bilo kojim ili kombinacijom dijagnostičkih ili prognostičkih ispitivanja kako je ovde opisano. Sa primenom profilaktičkog sredstva može da se počne pre manifestacije simptoma koji su karakteristični za poremećaj HM74, čime se vrši prevencija bolesti ili oboljenja ili, alternativno, odlaže se progresija. U zavisnosti od tipa poremećaja HM74, za lečenje subjekta može da se koristi, na primer, neko sredstvo koje je agonist HM74 ili antagonist HM74. Odgovarajuće sredstvo može da se odredi na bazi probnih analiza koje su ovde opisane.

Naredni aspekt pronalaska se odnosi na postupke za moduliranje pojavljivanja ili aktivnosti HM74 u terapeutske svrhe. Postupak moduliranja iz pronalaska obuhvata kontakt ćelije sa sredstvom koje modulira jednu ili više aktivnosti HM74 koje su povezane sa ćelijom. Sredstvo koje modulira aktivnost HM74 može da bude sredstvo kako je ovde opisano, kao što su furosemid ili oksidekalin, nukleinska kiselina ili protein, prirodno dobij en kognatni ligand HM74 proteina, peptid, HM74 peptidomimetik ili neka druga mala molekula. U jednom aspektu, sredstvo inhibira jednu ili više bioloških aktivnosti HM74 proteina. Primeri ovakvih inhibitornih sredstava obuhvataju anti-HM74 antitela. Postupci moduliranja mogu da se izvode in vitro (na primer, zasejavanjem ćelije sa sredstvom) ili alternativno, in vivo (na primer, primenom sredstva na subjektu). Kao takav, ovaj pronalazak obezbeđuje postupke za lečenje pojedinaca obolelih od bolesti ili oboljenja koje karakteriše poremećeno pojavljivanje ili poremećena aktivnost HM74. U jednom aspektu, postupak obuhvata primenu sredstva (na primer, sredstva identifikovanog probnom analizom koja je ovde opisana) ili primenu kombinacije sredstava koja moduliraju (na primer, podižu ili snižavaju) pojavljivanje ili aktivnost HM74.

Stimulacija aktivnosti HM74 je poželjna u situacijama u kojima je aktivnost HM74 abnormalno opadajuća i/ili u kojima će povećanje aktivnosti HM74 verovatno imati povoljan efekat. Suprotno tome, inhibicija aktivnosti HM74 je poželjna u situacijama u kojima je aktivnost HM74 abnormalno povećana i/ili u kojima će smanjenje aktivnosti HM74 imati povoljan efekat.

Pronalazak je dalje ilustrovan narednim primerima koje ne treba tumačiti kao ograničavajuće. Sadržaji svih referenci, patenata i objavljenih patentnih prijava koji su citirani kroz celu ovu prijavu su inkorporirani u reference.

Primer 1 - generisanje ćelija sisara za pojavljivanje HM74

cDNA enkodiranog HM74 je kloniran u vektoru pojavljivanja i transfektovan u ćelije sisara, kao što su CHO ćelije ili 293 ćelije.

Da bi se ćelije sisara generisale za povećano pojavljivanje HM74, ćelije sisara se prenesu na ploču za kulturu tkiva sa šest otvora promera 35 mm (3 x 105 ćelija sisara po otvoru (ATCC katalog broj CRL-1573)) u 2 ml DMEM medijuma (Gibco/BRL, katalog broj 11765-054) u prisustvu 10% seruma fetusa govečeta (Gibco/BRL, katalog broj 1600-044).

Nakon toga se ćelije inkubiraju na 37°C u inkubatoru sa C02sve dok se ne slije 50-80% ćelija. Klonirana cDNA nukleinska kiselina sekvence HM74 se ubaci u pcDNA 3.1 klonirajući vektor (Invitrogen, Katalog broj V790-20). Dva (ig DNA se razblaži u 100 ul F12 Hamovog medijuma bez seruma. Odvojeno, 25 ul lipofektamin reagensa (Life Technologies, katalog broj 18324-020) se razblaži u 100 ul F12 Hamovog medijuma bez seruma. Nakon toga se rastvor DNA i rastvor liptofektamina pažljivo izmešaju i inkubiraju 45 minuta na sobnoj temperaturi, za koje vreme se formira kompleks DNA-lipid.

Ćelije se jedanput isperu sa 2 ml F12 Hamovog medijuma bez seruma. Za svaku transfekciju (šest transfekcija u šest otvora ploče) se doda 0.8 ml F12 Hamovog medijuma bez seruma u rastvor koji sadrži komplekse DNA-lipid (ukupna zapremina 0.2 ml) i pažljivo izmeša. Dobijena mešavina (u daljem tekstu označena kao "transfekciona mešavina") se zatim prekrije (0.8 ml + 0.2 ml) preko ispranih ćelija. Ne dodaje se nijedan bakterijski reagens. Nakon toga se ćelije 16 sati inkubiraju sa kompleksima lipid-DNA na 37 °C u inkubatoru sa C02da bi se omogućila transfekcija.

Nakon završetka perioda inkubacije, 1 ml F12 Hamovog medijuma koji sadrži 10% seruma fetusa govečeta se prekrije preko ćelija bez prethodnog uklanjanja transfekcione mešavine. 18 sati nakon transfekcije, medijum koji prekriva ćelije se aspirira. Nakon toga se ćelije isperu sa PBS, pH 2-4 (Gibco/BRL Katalog broj 10010-023) i PBS se zameni sa F12 Hamovim medijumom koji sadrži 5% seruma ("selektivni medijum"). 72 sata nakon transfekcije ćelije se razblaže deset puta u selektivnom medijumu koji sadrži anti-bakterijsko sredstvo genetecin u koncentraciji od 400 (ig/ml (Life Technologies, katalog broj 11811).

Primer2 -analiza agonista

Za praćenje agonista humanog HM74, HM74 može da se veštački spoji za Gq mehanizam. Aktivacija Gq mehanizma stimuliše oslobađanje Ca<2+>iz sarkoplazmičnih retikulum vezikula unutar ćelije. Ca se oslobađa u citoplazmu gde može da se detektuje pomoću Ca<2+>helatnih boja. Fluorometric Imaging Plate Reader ili FLIPR® aparatura (Molekularni Uređaj) se koristi za posmatranje svake promene koja nastaje u fluorescenciji. Aktivnost agonista se reflektuje povećanjem fluorescencije.

CHO-K1 ćelije HM74 koji se pojavljuje se prethodno izrade tako da predstavljaju indiskriminantni oblik Gq proteina (Gal6). Za izradu ovih ćelija, CHO ćelije spojene sa Gal6 se dobijaju komercijalno (Molecular Devices LIVEWARETM ćelije, katalog broj RD-HGA16) i podvrgnu protokolu u Primeru 1, što omogućava pojavu HM74 u ovim ćelijama.

Ćelije se prate u dnevniku faze rasta na 37 °C i 5% C02u F12 Hamovom medijumu (Gibco/BRL Katalog broj 11765-054) koji sadrži 10% seruma fetusa govečeta, 100 lU/ml penicilina (Gibco/BRL Katalog broj 15140-148), 100 ug/ml streptomicina (Gibco/BRL Katalog broj 15140-148), 400 ug/ml geneticina (G418)

(Gibco/BRL Katalog broj 10131-035) i 200 ug/ml zeocina (Invitrogen, katalog broj R250-05). Jedan dan pre ispitivanja, 12.500 ćelija/otvor CHO-K1 ćelija se prenese u ploče za analizu sa 384 otvora sa providnim dnom, pri čemu je zapremina svakog otvora 50 ul (Greiner/Marsh, katalog broj N58102), koristeći 96/384 Multidrop uređaj (Labsvstems, Type 832). Ćelije se inkubiraju na 37°C u ovlaženom inkubatoru koji sadrži 5% C02(Forma Scientific C02inkubator sa vodenim kupatilom Model 3110).

Izrade se sledeći osnovni rastvori: IM osnovni rastvor Hepesa (pH 7.5)

(Gibco/BRL katalog broj 15630-080); 250 mM osnovnog rastvora probenicida (Sigma, katalog broj P8761) izrađen u IN NaOH; i 1 mM osnovni rastvor Fluo 4-AM boja (Molecular Probes, katalog broj Fl 4202) izrađen u DMSO (Sigma D2650). Reaktivni pufer se izradi sa 1000 ml Hankovog izbalansiranog rastvora soli (Fisher/Mediatech, katalog broj MT21023), 20 ml IM Hepes osnovnog rastvora i 10 ml 250 mM osnovnog rastvora probenicida. Za izradu nosećeg pufera, 1.6 ml 1 mM osnovnog rastvora Fluo 4-AM boje se izmeša sa 0.32 ml pluronatne kiseline (Molecular Probes, katalog broj P6866), a zatim izmeša sa 400 ml prethodno izrađenog reaktivnog pufera i 4 ml seruma fetusa govečeta.

Jedan sat pre ispitivanja se u svaki otvor ploče sa 384 otvora doda 50 ul sveže pripremljenog nosećeg pufera koristeći 96/384 Multidrop uređaj. Ćelije se inkubiraju na 37 °C u ovlaženom inkubatoru da se vezivanje boje dovede do maksimuma. Neposredno pre ispitivanja, ćelije se dva puta isperu sa 90 ul reaktivnog pufera koristeći 384 EMBLA Cell Washer (Scatron; model broj 12386) sa usisnom glavom koja je podešena na najmanje 10 mm iznad dna ploče, ostavljajući 45 ul pufera po otvoru.

CCD kamera (Princeton Instruments) FLIPR® II (Molecular Devices) instrument se podesi na f-stop 2.0 i ekspoziciju od 0.4 sekunde. Kamera se koristi za precizno praćenje bojenja ćelijskih ploča.

Datoteka jedinjenja koja sadrži moguća jedinjenja slična oksidekalinu se ispituje pri koncentraciji svakog od približno 10 uM u fiziološkom puferu soli po otvoru. Promene u fluorescenciji se mere 10 sekundi pre dodavanja jedinjenja. Nakon dodavanja jedinjenja, fluorescencija se meri svake sekunde u toku prvog minuta, a nakon toga svakih šest sekundi do kraja ukupnog vremena trajanja eksperimenta od tri minuta. Pet ul alikvota od 100 uM osnovnog jedinjenja se doda nakon desetog merenja, dajući finalnu koncentraciju jedinjenja od 10 uM po ćelijama. Maksimalne promene fluorescencije za prvih 80 merenja se beleže kao mera aktivnosti agonista i upoređuje sa maksimumom promene fluorescencije indukovane sa 10 uM ATP (Sigma A9062).

Konstatovano je da brojna jedinjenja oksidekalina aktiviraju HM74.

Primer3 -ispitivanja antagonista

Za praćenje antagonista humanog HM74, HM74 može veštački da se spoji za mehanizam Gq. Kao u Primeru 2, FLIPR® aparat se koristi za praćenje nastalih promena u fluorescenciji. Aktivnost antagonista se reflektuje bilo kakvim smanjenjem fluorescencije.

CHO-K1 ćelije pojavljenog HM74 se prethodno oblikuju kako bi se pojavile u indiskriminantnom obliku Gq proteina (Gal 6), kako je opisano u Primeru 2. Ćelije se prate u dnevniku faze rasta na 37 °C i 5% CO2u F12 Hamovom medijumu (Gibco/BRL Katalog broj 11765-054) koji sadrži 10% seruma fetusa govečeta, 100 lU/ml penicilina (Gibco/BRL Katalog broj 15140-148), 100 ug/ml streptomicina (Gibco/BRL Katalog broj 15140-148), 400 ug/ml geneticina (G418) (Gibco/BRL Katalog broj 10131-035) i 200ug/ mlzeocina (Invitrogen, katalog broj R250-05). Jedan dan pre ispitivanja, 12.500 ćelija/otvor CHO-K1 ćelija se prenese u ploče za analizu sa 384 otvora sa providnim dnom, pri čemu je zapremina svakog otvora 50 ul (Greiner/Marsh, katalog broj N58102), koristeći 96/384 Multidrop uređaj. Ćelije se inkubiraju na 37°C u ovlaženom inkubatoru koji sadrži 5% C02.

Izrade se sledeći osnovni rastvori: IM osnovni rastvor Hepesa (pH 7.5)

((Gibco/BRL Katalog broj 15630-080); 250 mM osnovnog rastvora probenicida (Sigma, katalog broj P8761) izrađen u IN NaOH; 1 mM osnovni rastvor Fluo 4-AM boja (Molecular Probes, katalog broj Fl 4202) izrađen u DMSO (Sigma D2650); i osnovni rastvor Uganda ili antagonista. Reaktivni pufer se izradi sa 1000 ml Hankovog izbalansiranog rastvora soli (Fisher/Mediatech, katalog broj MT21023), 20 ml IM Hepes osnovnog rastvora, 10 ml 250 mM osnovnog rastvora probenicida i 1 mM CaCl2. Za izradu nosećeg pufera, 80 ul osnovnog rastvora 1 mM Fluo 4-AM boje se izmeša sa 16 ul pluronatne kiseline (Molecular Probes, katalog broj P6866), a zatim izmeša sa 20 ml prethodno izrađenog reaktivnog pufera i 0.2 ml seruma fetusa govečeta.

Trideset minuta pre ispitivanja se u svaki otvor ploče sa 384 otvora doda 30 ul sveže pripremljenog nosećeg pufera koristeći 96/384 Multidrop uređaj. Ćelije se inkubiraju na 37 °C u ovlaženom inkubatoru da se vezivanje boje dovede do maksimuma. Neposredno pre ispitivanja, ćelije se tri puta isperu sa 100 ul reaktivnog pufera koristeći 384 EMBLA Cell Washer sa usisnom glavom koja je podešena na najmanje 40 mm iznad dna ploče, ostavljajući 45 ul pufera po otvoru.

Pet ul 100 uM osnovnog rastvora jedinjenja koje je antagonist se doda u ćelije koristeći Platemate-384 pipetor (Matrix). Koncentracija jedinjenja u toku faze inkubacije je aproksinativno 10 uM. Ćelije se prenesu na FLIPR® II i fluorescencija ploče se meri svake sekunde u toku prvog minuta, a zatim se ekspozicija uzima svakih šest sekundi u toku ukupnog trajanja eksperimenta od tri minuta. Nakon desetog skeniranja se doda antagonist ili ligand (10 uM). Nakon svakog dodavanja, 384 otvora se 10 puta isperu sa 20 ul 0.01% DMSO u vodi.

Pre testiranja sa mogućim antagonistima HM74 ćelije mogu da se ili da se ne izlože utvrđenim agonistima.

Primer 4-ispitivanje vezujućih receptora

Za pripremu frakcija membrane koje sadrže HM74, linije CHO ćelije pojavljenog HM74 se sakupe inkubacijom u puferu fosfatnih soli (10 ml) koji sadrži 1 mM EDTA. Ćelije se dalje 3 puta isperu u puferu fosfatnih soli koji sadrži 1 mM EDTA (10 ml) pre nego što se resuspenduju u 5 ml Pufera A (50 mM Tris-HCl (pH 7.8) (Sigma T6791), 5 mM MgCl2(Sigma M8266) i 1 mM EGTA (Sigma 0396).

Nakon toga se ćelije izazovu sa homogenizerom tkiva (Polvtron, Kinemetica, Model PT 10/35) u toku jednog minuta. Dobijeni homogenat se centrifugira u Sorvall Instruments RC3B centrifugi sa hlađenjem, pri brzini od 49.000 x g 20 minuta na 4°C. Izdvojena peleta se resuspenduje u 25 ml Pufera A, a faza centrifugiranja se ponovi tri puta. Nakon finalnog centrifugiranja, peleta se ponovo resuspenduje u 5 ml Pufera A, alikvotira i čuva na -70°C.

Ispitivanje vezujućeg receptora se izvodi pomoću frakcije membrane i radioobeleženog agonista koji nas interesuje. Ispitivanje se izvodi na ploči sa 96 otvora (Beckman Instruments). Reakcija za vezivanje sadrži 18 ug CHO ćelija koje su pripremljene u prisustvu radioaktivnog agonista (0.01 nM-25 nM) u finalnoj zapremini od 0.2 ml Pufera A koji sadrži 0.1% seruma albumina govečeta (Sigma, katalog broj 34287) (videti Im i saradnici, J. Biol. Chem. (2000.) 275(19): 14281-14286). Reakcija se inkubira 1 sat na sobnoj temperaturi. Reakcija se zaustavlja filtriranjem kroz Whatman GF/C filtere na multikanalnom sakupljaču (Brandell) koji je prethodno tretiran sa 0.3% polietilenimina (Sigma, katalog broj P3143) i 0.1% seruma albumina govečeta (BSA) u toku 1 sat. Mešavina se nanese na filter i inkubira jedan sat. Filteri se 6 puta isperu sa 1 ml ledeno hladnog 50 mM Tris-HCl, pH 7.6. Specifično vezivanje se izračunava na bazi razlike između ukupnog vezivanja i ne-specifičnog vezivanja

(podloga) za svaku koncentraciju obeleženog agonista merenjem radioaktivnosti. Dobij eno je osam do 16 tačaka vrednosti koncentracije za određivanje vezivanja agonista za receptor do koga dolazi u ravnotežnom stanju između agonista i receptora (parametri ravnotežnog vezivanja). U uporednoj analizi, u mešavinu se doda test jedinjenje kako bi se uporedilo vezivanje radioaktivnog agonista za receptor (vrednosti uporednog vezivanja). Izrade se krive inhibicije da bi se odredila koncentracija koja je potrebna da se postigne 50% inhibicije vezivanja (IC50).

Primer5 -agonisti male molekule

Serije molekula sličnih oksidekalinu se izlože ćelijama iskazanog HM74, kako je prethodno opisano. Ciljane molekule se obeleže kako bi se odredilo da li dolazi do vezivanja za HM74. Vezivanje se detektuje određivanjem stepena obeleženih ćelija nakon ispiranja. Vezivanje se takođe prati izdvajanjem HM74 elektroforezom na 2-D gelu i određivanjem stepena obeležavanja povezanih sa tim proteinom. Nakon ove procene vezivanja, ili nezavisno od te procene vezivanja, određuje se sposobnost ispitivanog agonista da aktivira HM74. FLIPR analiza se koristi da se proceni mobilizacija intracelularnog kalcijuma na ciljanoj molekuli koja je vezana za HM74. Prema tome, identifikovane su molekule oksidekalina koje izazivaju mobilizaciju kalcijuma.

Sada pošto je pronalazak opisan, stručnjak će znati da mogu da se izvrše različite izmene i modifikacije bez udaljavanja od duha i okvira pronalaska koji je ovde dat.

Sve reference koje su ovde navedene su ovde u celini inkorporirane u referencama.

Claims (6)

1. Terapeutski postupak za moduliranje signalne ak'fivrirjfetFHM74 ili transdukcije signala kod pacijenta kojima je potreban tretman, uključujući primenu na navedenom pacijentu molekule koja ima strukturu: gdejeX 0,NR2iliS; R]je CpCig alkil grupa, koja može da bude račvasta, može da sadrži heteroatom ili može da bude supstituisana, ili može da bude njihova kombinacija; CrCi8alkenil grupa koja može da bude račvasta, može da sadrži heteroatom ili može da bude supstituisana, ili može da bude njihova kombinacija; CrC18alkinil grupa koja može da bude račvasta, može da sadrži heteroatom ili može da bude supstituisana, ili može da bude njihova kombinacija; C3-C]8aril grupa koja može da sadrži bočnu grupu, može da sadrži most, može da sadrži heteroatom ili može da bude supstituisana ili može da bude njihova kombinacija; ili C5-Ci8cikloalkil grupa koja može da sadrži bočnu grupu, može da sadrži most, može da sadrži heteroatom ili može da bude supstituisana ili može da bude njihova kombinacija; ili njihove kombinacije; R2 je neka Rigrupa, (Ci-Ci0)alkil-(C3-Cio)cikloalkil grupa, koja može da bude račvasta, može da sadrži heteroatom ili može da bude supstituisana, ili može da bude njihova kombinacija; ili X i R2mogu da formiraju prsten; R3 je H ili R]grupa; i Y je karbonil grupa, Šifova baza, neki oksin, ketal, acetal, oksazolidin, tiazolodin ili enolni estar.

2. Postupak za identifikaciju agonista HM74, naznačen time što uključuje kontakt potencijalnog agonista sa ćelijom u kojoj se javlja HM74, i određivanje da lije u prisustvu navedenog potencijalnog agoniste aktivnost signaliziranja HM74 povećana u odnosu na aktivnost HM74 bez prisustva navedenog potencijalnog agonista, pri čemu navedeni potencijalni agonist ima strukturu: gdejeX 0,NR2iliS; R]je Ci-Ci g alkil grupa, koja može da bude račvasta, može da sadrži heteroatom ili može da bude supstituisana, ili može da bude njihova kombinacija; CrCig alkenil grupa koja može da bude račvasta, može da sadrži heteroatom ili može da bude supstituisana, ili može da bude njihova kombinacija; CrCi8alkinil grupa koja može da bude račvasta, može da sadrži heteroatom ili može da bude supstituisana, ili može da bude njihova kombinacija; C3-Cig aril grupa koja može da sadrži bočnu grupu, može da sadrži most, može da sadrži heteroatom ili može da bude supstituisana ili može da bude njihova kombinacija; ili C5-C]g cikloalkil grupa koja može da sadrži bočnu grupu, može da sadrži most, može da sadrži heteroatom ili može da bude supstituisana ili može da bude njihova kombinacija; ili njihove kombinacije; R2 je neka Rigrupa, (CrCio)alkil-(C3-Cio)cikloalkil grupa, koja može da bude račvasta, može da sadrži heteroatom ili može da bude supstituisana, ili može da bude njihova kombinacija; ili X i R2mogu da formiraju prsten; R3 je H ili Rj grupa; i Y je karbonil grupa, Šifova baza, neki oksin, ketal, acetal, oksazolidin, tiazolodin ili enolni estar.

3. Postupak za identifikaciju inverznog agonista HM74, naznačen time što uključuje kontakt inverznog agonista sa ćelijom u kojoj se javlja HM74, i određivanje da li je u prisustvu navedenog inverznog agonista aktivnost HM74 smanjena u odnosu na aktivnost HM74 bez prisustva navedenog potencijalnog inverznog agonista, i smanjena u prisustvu agonista, pri čemu navedeni potencijalni inverzni agonist ima strukturu: gdejeX 0,NR2iliS; Rije Ci-Ci 8 alkil grupa, koja može da bude račvasta, može da sadrži heteroatom ili može da bude supstituisana, ili može da bude njihova kombinacija; Ci-Ci8alkenil grupa koja može da bude račvasta, može da sadrži heteroatom ili može da bude supstituisana, ili može da bude njihova kombinacija; Cj-Cig alkinil grupa koja može da bude račvasta, može da sadrži heteroatom ili može da bude supstituisana, ili može da bude njihova kombinacija; C3-C18aril grupa koja može da sadrži bočnu grupu, može da sadrži most, može da sadrži heteroatom ili može da bude supstituisana ili može da bude njihova kombinacija; ili C5-Cig cikloalkil grupa koja može da sadrži bočnu grupu, može da sadrži most, može da sadrži heteroatom ili može da bude supstituisana ili može da bude njihova kombinacija; ili njihove kombinacije; R2 je neka Rigrupa, (Ci-Ci0)alkil-(C3-Ci0)cikloalkil grupa, koja može da bude račvasta, može da sadrži heteroatom ili može da bude supstituisana, ili može da bude njihova kombinacija; ili X i R2mogu da formiraju prsten; R3 je H ili Rj grupa; i Y je karbonil grupa ili kiseonik vezan za Šifovu bazu, neki oksin, ketal, acetal, oksazolidin, tiazolodin ili enolni estar.

4. Postupak za identifikaciju antagonista HM74, naznačen time što uključuje kontakt potencijalnog antagonista sa ćelijom u kojoj se javlja HM74, i određivanje da li je u prisustvu navedenog potencijalnog antagonista signalna aktivnost HM74 smanjena u odnosu na aktivnost HM74 u prisustvu agonista, pri čemu navedeni potencijalni antagonist ima strukturu: gdejeX 0,NR2iliS; R[je Ci-Cjg alkil grupa, koja može da bude račvasta, može da sadrži heteroatom ili može da bude supstituisana, ili može da bude njihova kombinacija; Cj-Cig alkenil grupa koja može da bude račvasta, može da sadrži heteroatom ili može da bude supstituisana, ili može da bude njihova kombinacija; CrCig alkinil grupa koja može da bude račvasta, može da sadrži heteroatom ili može da bude supstituisana, ili može da bude njihova kombinacija; C3-C18aril grupa koja može da sadrži bočnu grupu, može da sadrži most, može da sadrži heteroatom ili može da bude supstituisana ili može da bude njihova kombinacija; ili C5-C18cikloalkil grupa koja može da sadrži bočnu grupu, može da sadrži most, može da sadrži heteroatom ili može da bude supstituisana ili može da bude njihova kombinacija; ili njihove kombinacije; R2 je neka Rjgrupa, (CrCio)alkil-(C3-C10)cikloalkil grupa, koja može da bude račvasta, može da sadrži heteroatom ili može da bude supstituisana, ili može da bude njihova kombinacija; ili X i R2mogu da formiraju prsten; R3 je H ili R]grupa; i Y je karbonil grupa, Šifova baza, neki oksin, ketal, acetal, oksazolidin, tiazolodin ili enolni estar.

5. Postupak za moduliranje inflamacije naznačen time što uključuje izlaganje pacijenta kome je potreban tretman inflamacije modulirajućoj količini farmaceutske kompozicije koja uključuje jedinjenje formule: gdejeX 0,NR2iliS; Rije CrC18 alkil grupa, koja može da bude račvasta, može da sadrži heteroatom ili može da bude supstituisana, ili može da bude njihova kombinacija; CrC18alkenil grupa koja može da bude račvasta, može da sadrži heteroatom ili može da bude supstituisana, ili može da bude njihova kombinacija; CpCig alkinil grupa koja može da bude račvasta, može da sadrži heteroatom ili može da bude supstituisana, ili može da bude njihova kombinacija; C3-Ci8aril grupa koja može da sadrži bočnu grupu, može da sadrži most, može da sadrži heteroatom ili može da bude supstituisana ili može da bude njihova kombinacija; ili C5-C18cikloalkil grupa koja može da sadrži bočnu grupu, može da sadrži most, može da sadrži heteroatom ili može da bude supstituisana ili može da bude njihova kombinacija; ili njihove kombinacije; R2 je neka Rigrupa, (Ci-Ci0)alkil-(C3-Cio)cikloalkil grupa, koja može da bude račvasta, može da sadrži heteroatom ili može da bude supstituisana, ili može da bude njihova kombinacija; ili X i R2mogu da formiraju prsten; R3je H ili R\grupa; i Y je karbonil grupa, Sifova baza, neki oksin, ketal, acetal, oksazolidin, tiazolodin ili enolni estar.

6. Jedinjenje formule: gdejeX 0,NR2iliS; Rije Ci-Ci8alkil grupa, koja može da bude račvasta, može da sadrži heteroatom ili može da bude supstituisana, ili može da bude njihova kombinacija; CrCig alkenil grupa koja može da bude račvasta, može da sadrži heteroatom ili može da bude supstituisana, ili može da bude njihova kombinacija; CrCig alkinil grupa koja može da bude račvasta, može da sadrži heteroatom ili može da bude supstituisana, ili može da bude njihova kombinacija; C3-Ci8aril grupa koja može da sadrži bočnu grupu, može da sadrži most, može da sadrži heteroatom ili može da bude supstituisana ili može da bude njihova kombinacija; ili C5-C]8cikloalkil grupa koja može da sadrži bočnu grupu, može da sadrži most, može da sadrži heteroatom ili može da bude supstituisana ili može da bude njihova kombinacija; ili njihove kombinacije; R2 je neka R\grupa, (Ci-Cio)alkil-(C3-Cio)cikloalkil grupa, koja može da bude račvasta, može da sadrži heteroatom ili može da bude supstituisana, ili može da bude njihova kombinacija; ili X i R2mogu da formiraju prsten; R3je H ili R]grupa; i Yje karbonil grupa, Šifovabaza, neki oksin, ketal, acetal, oksazolidin, tiazolodin ili enolni estar; pod uslovom da kada je R2metil, etil ili cikloheksil grupa,R\nije n-alkil ili Cp C4račvasta alkil grupa; ili kada je R2CrC4 alkoholna ili CrC4račvasta alkil grupa koja može da bude supstituisana sa acetil grupom, Rjnije n-(C]-C8) alkil, (Ci-C4) račvasta alkil ili tio supstituisana fenil grupa.