RS20050006A - NOVA JEDINjENjA, KOMPOZICIJE KAO NOSAČI ZA STEROIDNE/NE- STEROIDNE- ANTI-INFLAMATORNE, ANTINEOPLASTIČNE I ANTIVIRALNE AKTIVNE MOLEKULE - Google Patents

Abstract

Ovaj pronalazak se odnosi (a) na nova jedinejnja predstavljena sa gde M predstavlja makrolidnu podjednicu (makrolidni ostatak) dobijenu iz makrolida koji poseduje svojstvo akumuliranja u inflamatornim ćelijama, V predstavlja antiinflamatornu steroidnu ili nesteroidnu podjedinicu ili antineoplastičnu ili antiviralnu podjedinicu i L predstavlja povezujuću grupu koja kovalentno povezuje M i V, (b) na njihove farmaceutski prihvatljive soli, pro-derivate i solvate, (c) na postupke i intermedijere za njihovu proizvodnju i (d) na njihovo korišćenje u lećenju inflamatornih/ neoplastičnih / viralnih oboljenja i stanja kod ljudi i životinja.

Description

NOVA JEDINJENJA, KOMPOZICIJE KAO NOSAČI ZA

STEROIDNE/NESTEROIDNE, ANTI-INFLAMATORNE, ANTINEOPLASTIČNE

IANTIVIRALNE AKTIVNE MOLEKULE

PRIORITETNI ZAHTEV

Ova prijava zahteva prioritet prema U.S. Privremenoj Prijavi 60/395,190 evidentiranoj 8. jula, 2002, ovde inkorporisanoj referencom u svojoj celosti.

KRATAK OPIS PRONALASKA

Ovaj pronalazak se odnosi (a) na nova jedinjenja prikazana strukturom I:

gde M predstavlja makrolidnu podjedinicu koja ima svojstvo akumulacije u inflamatornim ćelijama, V predstavlja jedno anti-inflamatorno jedinjenje, bilo steroidnu ili nesteroidnu podjedinicu ili podjedinicu antineoplasticnog agensa ili antiviralnu podjedinicu i L predstavlja vezujuću grupu koja kovalentno povezuje M i V, (b) na njihove farmaceutski prihvatljive soli, pro-lekove i solvate, (c) na postupke i intermedijere za proizvodnju takvih jedinjenja i (d) na njihovo korišćenje u lečenju inflamatornih, neoplastičnih i viralnih oboljenja i stanja kod ljudi i životinja. Takva jedinjenja mogu da deluju kao prolekovi koji transportuju aktivno jedinjenje u ciljanu ćeliju i oslobadjaju ga unutar takve ciljane ćelije u višoj koncentraciji nego što bi normalno moglo da se postigne pomoću pojedinačnog jedinjenja ili mogu biti aktivna u njihovom hibridnom obliku, u kome se primenjuju. Takva jedinjenja i njihova prethodno navedena primena su zbog toga odgovor na tehnički problem povećanja efektivnosti i/ili efikasnosti i/ili smanjenja sporednih efekata jednog ili više prethodno navedenih aktivnih sastojaka, pomoću njihovog dopremanja, u hibridnom obliku, pre svega do ciljanih ćelija ili do okoline ciljanih ćelija.

POZADINAPRONALASKA

Anti-inflarnatorni medikamenti se mogu klasifikovati na one koji su steroidnog i nesteroidnog tipa. Steroidna anti-inflamatoraa jedinjenja su još uvek nejefikasnija u lečenju inflamatornih oboljenja i stanja kao što su: astma, hronična opstruktivna plućna oboljenja, inflamatorna nazalna oboljenja kao što su alergijski rinitis, nazalni polipi, intestinalna oboljenja kao što su Kronova bolest, kolitis, ulcerativni kolitis, dermatološke inflamacije kao što su ekcem, psorijaze, alergijski dermatitis, neurodermatitis, pruritis, konjuktivitis, autoimuna oboljenja kao što su reumatoidni artritis i inhibicija transplatorne imunosti. Pored toga, steroidi su korišćeni kao pomoćni hemoterapeutski agensi u lečenju različitih maligniteta, uključujući leukemije, limfome, mijelome i druge malignitete hematopoetskog sistema. Kao dodatak njihovoj odličnoj potentnosti i efikasnosti, medikamenti ovog tipa takodje poseduju brojne neželjene sporedne efekte, kao što su na primer, efekti na metabolizam ugljenih hidrata, resorpciju kalcijuma, sekreciju endogenih kortikosteroida kao i na fiziološke funkcije sluznih žlezda, adrenalnog korteksa i timusa. Novije razvijeni kortikosteroidi su visoko efikasni za lečenje inflamatornih stanja i procesa pošto inhibiraju mnoge inflamatorne posrednike, dok su njihovi sistemski sporedni efekti umanjeni. Patentne prijave WO 94/13690, WO 94/14834, WO 92/13873 i WO 92/13872 opisuju takozvane "meke" steroide ili hidrolizujuće kortikosteroide namenjene za topikalnu primenu na inflamatornom mestu, dok su njihovi sistemski sporedni efekti umanjeni zbog nestabilnosti "mekih" steroida u serumu, gde aktivni steroidi veoma brzo hidrolizuju u neaktivni oblik. Jedan idealan steroid, medjutim, bez neželjenih efekata u dugotrajnom i kontinualnom lečenju, što se zahteva u kontroli oboljenja kao što su astma ili Kronova bolest, još nije pronadjen. Zbog toga postoji akutna potreba za steroidima sa poboljšanim terapeutskim profilom i/ili sa umanjenim ili sa slabim sporednim efektima.

Nesteroidni anti-inflamatorni medikamenti imaju drugačije mehanizme delovanja na odredjene inflamacione posrednike, obezbedjujući na taj način terapeutski efekat. Zbog tih razlika, ne samo u mehanizmu delovanja već i u inhibiciji odredjenih inflamatornih posrednika, steroidni i nesteroidni medikamenti poseduju različite profile anti-inflamatornih delovanja, i zbog toga neki medikamenti mogu biti pogodniji od drugih za odredjena stanja. Pored toga, većina nesteroidnih anti-inflamatornih medikamenata nije apsolutno specifična i njihovo korišćenje je udruženo sa neželjenim sporednim efektima kada se koriste u većim dozama ili u toku dužeg vremenskog perioda. Poznato je da mnogi nesteroidni anti-inflamatorni medikamenti deluju kao inhibitori endogenog COX -1 enzima, koji je veoma važan u održavanju integriteta gastričnog mukusa. Zbog toga, korišćenje tih medikamenata često prouzrokuje oštećenje gastričnog mukusa i čak krvarenje. (Warner T. D.Proc. NatlAcad. Sci.U.SA 1999,96,7563- 7568.) Zbog toga, agensi koji selektivno inhibiraju COX - 2 ali ne i C0X-1 su poželjniji u lečenju inflamatornih oboljenja. Pored toga, za neka anti-inflarnatorna jedinjenja (kao što je teofilin) je poznato da imaju veoma uzan terapijski indeks, što ograničava njihovo korišćenje.

Nedavno je nesteroidni anti-inflamatorni lek celekoksib, koji specifično blokira COX-2 odobren od strane FDA za korišćenje u lečenju reumatoidnog artritisa (Luong i sar.Ann. Pharmacother.2000,34,743- 760). COX-2 se takodje eksprimira u mnogim karcinogenim i prekarcinogenim lezijama i postoje brojni dokazi da selektivni COX-2 inhibitori mogu biti korisni za lečenje i prevenciju kolorektalnih i drugih karcinoma (Taketo, M. M.,/. Nad Cancerlnst 1998, 90,1609-1620, Fournier i sar./ Cell Biochem. Suppl.2000,34,97-102).

1975, TNF-a je definisan kao endotoksinom indukovan serumski faktor koji prouzrokuje tumor nekrozuin vitroiin vivo(Carswell E. A. i sar.Proc. NatlAcad. Sci. U. SA.1975,72,3666- 3670). Kao dodatak antitumorskom delovanju, TNF-a ima još nekoliko drugih bioloških aktivnosti, koje su važne u homeostazama kao i u patofiziološkim stanjima. Glavni izvori TNF-a su monociti - makrofazi, T- limfociti i labrocitne ćelije.

Nalaženje da su anti - TNF-a antitela (cA2) efikasna u lečenju pacijenata koji pate od reumatoidnog artritisa (RA) (ElliotM. i sar.Lancet1994, 344,1105-1110) pojačalo je interes za nalaženjem novih TNF-a inhibitora kao mogućih potentnih lekova za RA. Reumatoidni artritis je jedno autoimuno hronično inflamatorno oboljenje koje se karakteriše ireverzibilnim patološkim promenama u zglobovima. Pored delovanja u RA, TNF-a antagonisti su takodje primenljivi i za neka druga patološka stanja i oboljenja, kao što su spondilitis, osteoartritis, giht i druga artritična stanja, sepse, septični šok, sindrom toksičnog šoka, atopični dermatitis, kontaktni dermatitis, psorijaze, glomerulonefritis, lupus eritematozus, skleroderma, astma, kaheksija, hronično opstruktivno oboljenje pluća, kongestivni srčani zastoj, insulin rezistencija, fibroza pluća, multipla skleroza, Kronova bolest, ulcerativni kolitis, viralne infekcije i AIDS.

Dva različita retro virusa, humani imunodeficijentni virus (HIV) tip-1 (HIV-1) ili tip-2 (HIV-2), su enološki povezani sa imunosupresivnim oboljenjem, stečenim imunodeficijentnim sindromom (AIDS). HIV seropozitivne osobe su inicijalno asimptomatične ali se razvija tipični AIDS srodni kompleks (ARC) koji je praćen sa AIDS. Pogodjene osobe pokazuju ozbiljnu imunosupresiju koja ih čini predisponiranim za slabljenje i na kraju za fatalnu oportunističku infekciju.

Oboljenje AIDS je posledica virusa HIV-1 ili HrV-2 koje prati njihov kompleksni viralni životni ciklus. Viralni životni ciklus uključuje vezivanje viriona za humane T-4 limfocitne imune ćelije domaćina preko vezivanja glikoproteina na površini viralnog zaštitnog omotača za CD4 glikoprotein na limfocitnoj ćeliji. Kada se veže, virion odbacuje svoj glikoproteinski omotač, penetrira u membranu ćelije domaćina i odmotava njenu RNK. Viralni enzim, reverzna transkriptaza, usmerava proces transkripcije RNK u jednolančanu DNK. Viralna RNK se raspada i sekundarni DNK lanac se formira. Sada, dvostruka ovojnica DNK se integriše u gene humanih ćelija i ti geni se koriste za viralnu reprodukciju. RNK polimeraza prepisuje integrisanu viralnu DNK u viralnu iRNK. Viralna RNK se prevodi u prekursor gag-pol spojeni poliprotein. Poliprotein se zatim raskida pomoću enzima HIV proteaze pri čemu se dobijaju zreli viralni proteini. Zbog toga je HIV proteaza odgovorna za regulaciju kaskade raskidanja koja vodi do sazrevanja virusnih čestica u virus koji je sposoban za punu infektivnost.

Tipični humani imuni odgovor, ubijanje virusa napadača je opterećen jer virus inficira i ubija T ćelije imunog sistema. Pored toga, viralna reverzna transkriptaza, enzim koji se koristi za pravljenje novih viralnih čestica, nije jako specifična i prouzrokuje transkripcione greške koje rezultuju u konstantnim izmenama glikoproteina na površini viralnog zaštitnog omotača. Ovaj nedostatk specifičnosti umanjuje efikasnost imunog sistema jer antitela, koja se specijalno proizvode protiv jednog glikoproteina, mogu biti beskorisna protiv drugog, čime se smanjuje broj antitela koja su dostupna za borbu protiv virusa. Virus nastavlja da se reprodukuje dok odgovor imunog sistema nastavlja da slabi. U većini slučajeva, bez terapijske intervencije, HIV prouzrokuje slabljenje imunog sistema domaćina, dozvoljavajući pojavu oportunističkih infekcija. Bez primene antivirusnih agenasa, imunomodulatora ili oba, rezultat može biti smrt.

Hepatitis je inflamacija jetre, primarno prouzrokovana virusima i redje, nekim lekovima ili toksinima (na primer alkoholom). Virusna infekcija se često stiče putem izlaganja kontaminiranoj krvi. Najverovatniji način širenja virusa je kod korisnika intravenoznih droga koji dele kontaminirane igle, mada seksualni odnos sa osobom koja ima neki oblik Hepatitisa takodje može proširiti bolest. U nekim slučajevima, zdravstveni radnici, izloženi kontaminiranoj krvi i osobe koje trebaju ponovljene transfuzije krvi, mogu steći neki oblik Hepatitisa.

Identifikovana su tri glavna tipa virusnog Hepatitisa i to Hepatitis A, Hepatitis B i Hepatitis C, mada najmanje četiri drugih virusa mogu takodje prouzrokovati hepatits.

Hepatitis A je visoko infektivan oblik hepatitisa i najčešći je oblik oboljenja. Hepatitis A se obično prenosi pomoću kontaminirane hrane ili vode. Simptomi hepatitisa A su često slični onima koji se javljaju kod stomačnog gripa i najveći broj osoba sa Hepatitisom A se oporavlja kompletno.

Akutni hepatitis B je potencijalno mnogo ozbiljniji oblik virusne infekcije jetre. Njegovi simptomi su u većini slični onima koji se javljaju kod hepatitisa A, ali simptomi su mnogo jači i duže traju. Primarni inicijalni simptomi hepatitisa A i hepatitisa B uključuju slab apetit, mučninu, povraćanje i groznicu. U kasnijim fazama hepatitisa, urin može postati taman i razvija se istrajna ili recidivna žutica. U oko 20 % slučajeva se eventualno razvijaju hepatične ciroze (ožiljci na jetri). Ciroze, kao rezultat hepatitisa se mogu dijagnostikovati preko ispitivanja krvi za procenu funkcije jetre. Eventualno, jetra koja je ugrožena cirozama, takodje postaje mekana. Hepatitis C, koji se prepoznaje kao glavni uzročni agens non-A i non-B hepatitisa, deli opšte simptome sa hepatitisom A i B, i kod pacijenata se razvija hronična infekcija koja može na kraju dovesti do ciroze jetre.

Neoplastična oboljenja su često uzročnici smrti, koja je prouzrokovana autonomnom, nekontrolisanom deobom ćelija. Deoba ćelija se može izazvati sa:

1. mutacijom gena prouzrokovanom karcinogenima

2. virusima

3. spoljašnjim signalima koji aktiviraju mitozu kod nekih tipova ćelija Neoplastčna oboljenja su lečena sa različitim inhibitorima mitoze i ćelijskog metabolizma. Medjutim, specifičnost je bio glavni problem sa antikancerogenim agensima. U slučaju antikancerogenih agenasa, lek treba da razlikuje ćeliju organizma koja je kancerogena i ćeliju organizma koja nije kancerogena. Najveći broj antikancerogenih lekova ne pravi razlike na tom nivou. Tipični antikancerogeni agensi imaju negativne hematološke efekte (na primer, prekid mitoze i dezintegraciju formiranih elemenata u koštanoj srži i limfnom tkivu) i imunosupresivno delovanje (na primer, smanjeni broj ćelija), kao i jak uticaj na epitelna tkiva (na primer, intestinalni mukus), reproduktivna tkiva (na primer, smanjenje spermatogeneze), i nervnog sistema. P. Calabresi i B. A. Chabner, u: Goodman i Oilman The Pharmacological Basis of Therapeutics (Pergamon Press, 8th Edition) (str. 1209-1216). Uspesi sa hemoterapeuticima kao antikancerogenim agensima su takodje bili sputani zbog pojave multiple rezistencije na lekove, rezistencije na širok spektar strukturno nesrodnih citotoksičnih antikancerogenih jedinjenja. J. H. Gerlach i sar., Cancer Survevs, 5:25 - 46

(1986). Osnovni uzrok rezistencije na lekove može biti zbog postojanja male populacije ćelija rezistentnih na lekove unutar tumora (na primer, mutirane ćelije) u vreme postavljanja dijagnoze. J. H. Goldie i Andrew J. Goldman, Cancer Research, 44:3643 - 3653 (1984). Lečenje takvog tumora sa pojedinačnim lekom, prvo rezultuje u remisiji, gde tumor smanjuje veličinu kao rezultat ubijanja brojnijih ćelija koje su osetljive na lek. Kada ćelije koje su osetljive na lek nestanu, preostale ćelije koje su rezistentne na lek, nastavljaju da se razmnožavaju i eventualno postaju brojnije u populaciji ćelija tumora. Na kraju, tretman kancera je ometen zbog činjenice da postoji značajna heterogenost čak i unutar jednog tipa kancera. Neki kanceri, na primer, imaju sposobnost da napadaju tkiva i pokazuju agresivan tok rasta koji se karakteriše pojavom metastaza. Ovi tumori su generalno udruženi sa slabim ishodom za pacijenta. I do sada, bez načina da se identifikuju takvi tumori i da se razlikuju takvi tumori od neinvazivnih kancera, lekar je bez šanse da promeni i/ili optimizuje terapiju. Ono što je potrebno je specifični antikancerogeni pristup koji je pouzdan za veliki broj različitih tumora i posebno pogodan za invazivne tumore. Ono što je važno je da tretman mora biti efikasan sa minimalnom toksičnošću za pacijenta. Zbog toga je potrebno da se prevazidje potencijal ćelija da smanjuju intracelularnu količinu aktivne supstance, kako bi se poboljšala ciljanost ćelija i/ili poboljšala farmakokinetika antineoplastičnog leka.

Makrolidi kao što su makrolidni antibiotici se akumuliraju pre svega unutar različitih ćelija subjekta kome se apliciraju takvi molekuli, posebno unutar fagocitnih ćelija kao što su mononuklearne ćelije periferne krvi, polimorfonuklearne ćelije, peritonealni i alveolarni makrofagi kao i unutar tečnog okruženja bronhoalveolarnog epitela (Glaude R. P. i sar.,Antimicrob. Agents Chemother., 331989,277- 282; Olsen K. M. i sar.,Antimicrob. Agents Chemother., 401996,2582 - 2585). Povrh toga, relativno slabi inflamatorni efekti nekih makrolida su opisani. Na primer, anti-inflamatorno delovanje derivata eritromicina( J. Antimicrob. Chemother., 41199837 - 46; WO 00/42055) i derivata azitromicina je u skorije vreme opisano (EP 0283055). Anti-inflamatorna delovanja nekih makrolida su takodje poznata izin vitroiin vivoispitivanja na modelu eksperimentalnih životinja, kao što je peritonitis indukovan zimosanom, kodmiševa ( J. Antimicrob. Chemother., 301992 339 - 348) i akumulacija neutrofila u trahejama pacova, koja je indukovana endotoksinom( J. Immunol. 15919973395 - 4005). Modulirajući efekat makrolida na citokine, kao što su interleukin 8 (IL-8)( Am. J. Respir. Crit. Care Med. 1997, 156,266- 271) ili interleukin 5 (IL-5) (EP 0775489 i EP 0771564) je takodje dobro poznat. Pored toga, pogodan farmakokinetički profil makrolida može podići koncentraciju jedinjenja u tkivu, na primer, u jetri ili povećati odnos bele krvne ćelije / plazma (Girard A.E. i sar,Antimicrob. Agents Chemother. 311987 1948- 54; Widlfeuer A. i sar.,Antimicrob. Agents Chemother. 401996,75 - 79).

U cilju da se dobiju jedinjenja sa profilom delovanja koji je poboljšan / nov, u odnosu na oboljenja, gde je potrebno selektivno delovanje, nekoliko različitih aktivnih supstanci je povezano za makrolide pomoću različitih tipova povezujućih jedinjenja. Nekoliko primera hibrida / konjugata / himera derivata eritromicina A i nukleotidnih baza (uracil i timin) ili nukleotida dobijenih iz timidina, je zabeleženo. (Costa AM. isar. Tetrahedron Lett.41,2000, 3371 - 3375). Medjutim, takve konstrukcije nisu pokazale delovanje / selektivnost prema željenom cilju. Pored toga, makrolidne konstrukcije, gde povezujući molekuli mogu biti tipa peptida, nisu do sada zabeležene.

Peptidni povezujući molekuli, uvedeni u naše hibridne molekule, kao povezivači, omogućavaju im da deluju kao proderivati, koji oslobadjaju V ostatak pomoću specifičnog lizozimnog raskidanja unutar ciljane ćelije. Slični povezivači su opisani za druge male molekule (u našem slučaju predstavljene pomoću hibrida anti-inflamatornih, antineoplastičnih i antiviralnih jedinjenja) i makromolekule ili polimere (Duncan R. i sar. u Robinson J.R. i Lee V.H. (ed.) Controlled Drug Deliver): Fundamentals i Applications, 2<nd>edition, 1987 581 - 607, Subr V. i sar.,J. ControlledRel.

7Č1992 123-132)

DETALJAN OPIS PRONALASKA

Jedinjenja predstavljena sa Formulom I se razlikuju od jedinjenja iz prethodnih iskustava u tome što im njihova struktura omogućava da se akumuliraju u ciljanim organima i ćelijama, delujući na inflamatorni imuni odgovor ili tumor ili infekciju koji treba da budu savladani. Ona takodje mogu da povećaju intracelularnu koncentraciju inhibitornog jedinjenja unutar tumorske ćelije što je čini osetljivom na zračenje. Ovakvo delovanje jedinjenja Formule I proističe od makrolidnog ostatka M, koji ima farmakokinetičko svojstvo akumuliranja u ćelijama imunog sistema, pre svega u fagocitima. To omogućava da jedinjenja Formule I deluju pretežno ako ne i isključivo na mestu inflamacije ili tumora ili infekcije, pomoću "jahanja" makrolida unutar samih inflamatornih ćelija regrutovanih u mestu inflamacije ili infekcije ili maligniteta unutar koga aktivni sastojak može pokazati svoju aktivnost. Na taj način, neželjeni sistemski sporedni efekti steroidnih ili nesteroidnih anti-inflamatornih supstanci ili anti-neoplastičnih agenasa ili antiviralnih jedinjenja su značajno umanjeni ili čak eliminisani.

(Treba zabeležiti da su steroidi korišćeni kao pomoćna terapija u tretmanu maligniteta i ovaj pronalazak takodje ima u vidu steroide za anti-neoplastično korišćenje). Nakon topikalne ili sistemske primene, hibridni molekuli pronalaska (i/ili, ukoliko je navedeno, njihovi konstitutivni delovi) se brzo akumuliraju u mestu inflamacije ili u tumoru ili u inficiranim ćelijama ili u njihovom susedstvu.

U skorije vreme smo našli da neka jedinjenja unutar Formule I:

pokazuju poboljšano terapeutsko delovanje u lečenju inflamatornih oboljenja, poremećaja i stanja. Simbol M u gore navedenoj strukturi predstavlja makrolidnu podjedinicu koja poseduje svojstvo akumulacije u inflamatornim ćelijama, S predstavlja anti-inflamatornu steroidnu podjedinicu i L predstavlja povezujuću jedinicu, koja kovalentno povezuje M i S. Naša, u zajedničkom vlasništvu, Medjunarodna Patentna prijava PCT/HR02/00001 (inkorporisana ovde referencom u svojoj celosti) opisuje jedinjenja sa steroidnom podjedinicom S, povezanom preko lanca L, na poziciji N/9a sa 9-dihidro-9-deokso-9a-aza-9a-homoeritromicinom ili na poziciji C/3 sa derivatom dez-kladinozil azitromicina ili u poziciji C/2' sa dezozamin saharidom. Medjutim, hibridna jedinjenja sa steroidnom podjedinicom, koja je povezana sa peptidnim povezujućim molekulom u poziciji N/9a na 9-dihidro-9-deokso-9a-aza-9a-homoeritromicinu, koji takodje poseduje gore pomenuta terapijska delovanja, do sada nisu opisana. Do sada nisu opisana ni hibridna jedinjenja sa nesteroidnom / antineoplastičnom / antiviralnom podjedinicom povezanom sa peptidnim povezujućim molekulom u poziciji N/9a. Ni hibridna jedinjenja sa makrolidom koji je povezan sa jednom antiviralnom ili antineoplastičnom podjedinicom, nisu opisana. Sva takva jedinjenja su predmet ove prijave.

Ovaj pronalazak se odnosi na

(a) nova "hibridna" jedinjenja prikazana sa Formulom I:

gde M predstavlja makrolidnu podjedinicu koja poseduje svojstvo akumulacije u inflamatornim ćelijama, V predstavlja anti-inflamatornu steroidnu ili nesteroidnu podjedinicu ili antineoplastičnu ili antiviralnu podjedinicu, kako je definisano niže i L predstavlja povezujuću grupu koja kovalentno povezuje M i V; (b) na kompozicije koje sadrže jedno ili više prethodno navedenih jedinjenja u količini koja je efikasna da se bori sa inflamacijom ili malignim tumorom ili virusom i time omogući lečenje oboljenja i stanja koja obuhvataju inflamaciju, malignitet ili viralnu infekciju kod sisara, uključujući ljude; i (c) metode za korišćenje ovih jedinjenja u lečenju takvih poremećaja i stanja.

Ova jedinjenja imaju prednosti jer obezbedjuju poboljšani terapeutski efekat i/ili poboljšani profil sporednih efekata.

Pogodne makrolidne podjedinice, za hibridna jedinjenja ovog pronalaska, se mogu odabrati, bez ograničenja, od molekula više-članog laktonskog prstena, gde se termin "član" odnosi na ugljenikove atome ili heteroatome u prstenu i termin "više" je broj veći od oko 10, poželjno od 10 do 50, još poželjnije 12 -, 14 -, 15 -, 16 -, 17 - i 18 - o člani makrolidi sa laktonskim prstenom. 14 - i 15 -o člani prsten makrolidne podjedinice je posebno poželjan, sa azitromicinom i njegovim derivatima i eritromicinom i njegovim derivatima, što je najpoželjnije.

Još specifičniji, ne ograničavajući primeri molekula, od koji se makrolidna podjedinica može odabrati, su sledeći: (i) Makrolidni antibiotici, uključujući azalide, na primer eritromicin, diritromicin, azitromicin, 9-dihidro-9-deokso-9a-aza-9a-homoeritromicin, HMR 3004, HMR 3647, HMR 3787, josamicin, eritromicilamin, ABT 773, fluritromicin, klaritromicin, tilozin, tilmikosin, oleandomicin, dezmikozin, CP -163505, roksitromicin, miokamicin i rokitamicin i njihovi derivati, kao što su ketolidi (na primer, 3-keton), laktami (na primer, 8a- ili 9a- laktami) i derivati bez jednog ili više saharidnih ostataka. (ii) Makrolidni imunosupresanti, kao što su FK 506, ciklosporin, amfotericin i rapamicin; (iii) Makrolidi sa antifungalnim dejstvom, koji imaju svojstva inhibicije ćelije domaćina, kao što su bafilomicini, konkanamicin, nistatin, natamicin, kandicidin, filipin, etruzkomicin, trihomicin.

Metodologije za sintezu gore pomenutih makrolida nisu komercijalno dostupne i sintetička manipulacija makrolida uopšte, je poznata onima koji imaju uobičajeno iskustvo u oblasti ili se mogu naći u: Denis A. i sar. Bioorg. & Med. Chem. Lett. 1999,9,3075 - 3080; Agouridas C. i sar. J. Med. Chem. 1998,41,4080- 4100; i EP - 00680967

(1998); Sun ili Y. i sar. J. Med. Chem.2000, 43,1045-1049; US - 05747467 (1998); McFarland J. W. i sar. J. Med. Chem. 1997,40,1041 -1045;Denis A. i sar. Bioorg. & Med. Chem. Lett. 1998,8,2427- 2432 ; W0 - 09951616 (1999); Lartey i sar. J. Med. Chem. 1995,38,1793-1798; EP 0984019; WO 98/56801, ovde inkorporisani referencama u svojoj celosti.

Dodatno pogodni makrolidi su poznati, neki su opisani u Brvskier, A. J., i sar.Makrolids, Chemistrj, Pharmacology andClinical Use; ArnetteBlackwell: Pariš, 1993; str. 485-491,14(R)-hidroksiklaritromicin, eritromicin-ll,12-karbonat, tri-O-acetiloleandomicin, spiramicin, leukomicin, midekamicin, razaramicinin, inkorporisano referencama u njihovoj celosti; u Ma, Z. i sar.CurrentMedicina! Chemistij- Anti-Infective Agents 2002, 1,15- 34, takodje inkorporisano referencama u celosti, pikromicin, narbomicin, HMR-3562, CP-654743, CP-605006, TE-802, TE-935, TE-943, TE-806, 6,11-premošćeni ketolidi, CP-544372, FMA-199, A-179461; Videti, posebno strukture i derivate za 14- i 16-o člane prstenove makrolida na str. 487 - 491 u Brvskier i sar. i različite ketolidne derivate i sinteze u Ma i sar., značajno u svim tabelama struktura i svim reakcionim šemama. Svi ovi makrolidi, nakon što se vežu za V, su u oblasti ovog pronalaska. Prethodna, specifično nazvana ili referentna makrolidna jedinjenja, su komercijalno dostupna ili su metode za njihove sinteze poznate.

Važno je da se makrolidna podjedinica dobija iz makrolida koji ima svojstvo akumulacije unutar ćelija imunog sistema regrutovanih na mestu inflamacije, posebno u fagocitnim ćelijama. Za većinu laktonskih jedinjenja, definisanih u tekstu gore, se zna da imaju takvo svojstvo. Na primer, 14-o člani makrolidi kao što su eritromicin i njegovi derivati; 15-o člani makrolidi kao što su azitromicin i njegovi derivati kao i 8a- i 9a-laktami i njihovi derivati; 16-o člani makrolidi kao što su tilmikozin i dezmikozin i spiramicin.

Dodatni primeri akumulacije makrolida unutar specifičnih klasa ćelija se mogu naći u: Pascual A. i sar.Clin. Microbiol. Infect2001,7,65- 69. (Uptake and intracellular activitv of ketolide HMR 3647 u human phagocvtic and non-phagocytic cells). Hand W. L. i sar.Int. J. Antimicrob. Agents, 2001, 18,419- 425. (Characteristics and mechanisms of azithromvcin accumulation and efflux u human polvmorphonuclear leukocvtes); Amsden G. W.Int. J. Antimicrob. Agents, 2001, 18,11 -15.(Advanced-generation makrolids: tissue-directed antibiotics); Johnson J. D. i sar./.Lab. Clin. Med. 1980, 95,429 - 439 (Antibiotic uptake by alveolar macrophages); "VVildfeuer A. i sar.Antimicrob. Agents Chemother. 1996, 40,75- 79. (Uptake of azithromycin by various cells and its intracellular activity under in vivo conditions); Scorneaux B. i sar.Poult. Sci.1998,77,1510 -1521. (Intracellular accumulation, subcellular distribution, and efflux of tilmicosin u chicken phagocytes); Mtairag E. M. i sar. /Antimicrob. Chemother. 1994, 33,523 -536. (Investigation of dirithromycin i erythromycylamine uptake by human neutrophils in vitro); Anderson R. isar. J. Antimicrob. Chemother. 1988, 22,923- 933. (An in-vitro evaluation of the cellular uptake and intraphagocytic bioactivity of clarithromycin (A-56268, TE-031), a new makrolid antimicrobial agent); Tasaka Y. i sar.Jpn. J. Antibiot. 1988, 41, 836- 840. (Rokitamycin uptake by alveolar macrophages); Harf R. i sar. J.Antimicrob. Chemother.1988,22,135-140. (Spiramycin uptake by alveolar macrophages) ovde inkorporisani referencama u svojoj celosti. U.S. Privremene prijave 60/394,671 i 60/394,670 obe popunjene 8. jula 2002. god., ovde inkorporisane u svojoj celosti, opisuju različite makrolidne povezane komplekse koji se takodje mogu koristiti u kontekstu ovog pronalaska.

Pored toga, posedovanje akumulirajućeg svojstva unutar ćelija imunog sistema regrutovanih na mestu inflamacije, posebno fagocitnih ćelija, lako se može testirati od strane osobe sa iskustvom u oblasti pronalaska, korišćenjem jedne od dobro poznatih analiza za te svrhe. Na primer, postupci opisani u Olsen, K. M. i sar.Antimicrob. Agents & Chemother. 1996, 40,2582- 2585, se mogu koristiti. Ukratko, ćelije koje se testiraju, na primer, polimorfonuklearni leukociti, se mogu dobiti iz venske krvi zdravih dobrovoljaca, pomoću Ficoll-Hypaque centrifugiranja, nakon čega se vrši sedimentacija pomoću 2 % dekstrana. Eritrociti su uklonjeni pomoću osmotske lize i PMN su procenjeni pomoću isključivanja Tripan plavim. Alternativno, druge frakcije ćelija se mogu odvojiti i na sličan način testirati. Makrolidna jedinjenja koja sadrže tritijum (na primer, 10 uM) su inkubirana sa 2,5 x IO<6>ćelija u toku 120 minuta (37 °C, 50 % C02,90 % relativna vlažnost) i ćelije su zatim uklonjene iz supernatanta koji sadrži jedinjenje, pomoću centrifugiranja na primer, kroz silikonsko uljno-parafinski sloj (86 zap. %: 14 zap. %). Količina jedinjenja je odredjena, na primer, pomoću scintilacionog brojanja, a dobijeni broj koji je značajno podignut iznad pozadine, ukazuje na akumulaciju makrolida u ćelijama koje su ispitane. Videti Bryskier i sar.Makrolids, Chemistij, Pharmacology i Clinical Use,Arnette Blackwell: Pariš, 1993 str. 375-386, na strani 381, koloni 2, redu 3. Alternativno, jedinjenje se ne obeležava radioaktivno već se količina jedinjenja odredjuje pomoću HPLC.

Druge analitičke metode koje se mogu primeniti su opisane u Brvskier, A. J. i sar.Makrolids, Chemistrj, Pharmacology and Clinical Use; ArnetteBlackwell: Pariš, 1993 str. 375 - 386, inkorporisano referencama. Pogledati, posebno odredjivanje fagocitne adsorpcije na str. 380 - 381 i posebno opise kao što su adsorpcija i lokalizacija makrolida na str. 381,383 i 385 i tabele na 382 i na 383.

U nekim poželjnim rešenjima, ovaj pronalazak se odnosi na jedinjenja, njihove soli i solvate, predstavljene Formulom I, gde M specifično predstavlja makrolidnu podjedinicu sa 14- ili 15-o članim laktonskim prstenom što je poželjnije, prikazano Formulom II:

gde

(i) Z i W su, nezavisno jedan od drugog,

m veza, gde,

Rti Rg, nezavisno su H ili alkil (poželjno metil ili H);

RMje OH, ORP, alkoksi ili supstituisani alkoksi (u jednoj i drugoj, Sin ili Anti konfiguraciji ili njihova smeša)

RNje H, R<p>, alkil, alkenil, alkinil, alkoksi, alkoksialkil, ili

-C(=X)-NRtRs;i

XjeOili S;

obezbedjujući da Z i W ne mogu istovremeno biti

, ili veza, (ii) U i Y su nezavisno H, halogen, alkil ili hidroksialkil (poželjno H, metil ili hidroksimetil); (iii) R<1>je hidroksi, ORP, -O-S<2>, ili = 0; (iv) S<1>je saharidni ostatak na poziciji C/5 aglikonskog prstena (na primer, dezozamin grupa) sa formulom:

gde

R<8>i R<9>su oba vodonik ili zajedno formiraju vezu, ili je R<9>vodonik i R<8>je

-N(CH3)Ry gde

R<y>može biti R<p>, R<z>ili -C(0)R<z>, gde R<z>je vodonik ili cikloalkil (poželjno cikloheksil) ili alkil (poželjno CrC7 alkil) ili alkenil (poželjno C^T-alkeni!) ili alkinil (poželjno CrC7-alkinil) aril ili heteroaril ili alkil supstituisan sa CrC7 alkil ili C2-C7alkenil ili C2-C7alkinil ili aril ili heteroaril (Ry je poželjno vodonik, metil ili etil);

R10 je vodonik ili RP;

(v) S<2>je saharidni ostatak na poziciji C/3 aglikonskog prstena (na primer, kladinozil grupa) sa formulom

gdeR3 može biti H ili metil i R<11>iR12su nezavisno jedan od drugog, vodonik, R<11>može biti R<p>ili R11iR12 zajedno formiraju vezu; (vi) R<2>je H, hidroksi, ORP grupa, alkoksi (poželjno CrC4 alkoksi, najpoželjnije metoksi) supstituisan alkoksi; (vii) A je H ili metil; (viii) B je metil ili epoksi; (ix) E je H ili halogen (poželjno fluor); (x) R<3>je hidroksi, OR<p>grupa ili alkoksi (poželjno C1-C4alkoksi, najpoželjnije metoksi), supstituisan alkoksi ili R<3>je grupa koja se može kombinovati sa R<5>tako da formira "most" (na primer, ciklični karbonat ili karbamat) ili ako je W ili Z, R<3>je grupa koja se može kombinovati sa W ili Z tako da formira "most" (na primer, ciklični karbamat); (xi) R4 je Cj-Cialkil (poželjno metil); (xii) R5 je H, hidroksi, ORP grupa, CrC4alkoksi, supstituisan alkoksi ili grupa koja se može kombinovati sa R<3>tako da formira most (na primer, ciklični karbonat ili karbamat); (xiii) R<6>je H ili C1-C4alkil (poželjno metil ili etil); gde podjedinica M ima povezujuće mesto preko koga je povezana sa podjedinicom D preko povezujuće grupe L, povezujuće mesto može biti jedno ili više od sledećih: a. svaka reaktivna hidroksi, N ili epoksi grupa locirana na S<1>, S<2>, ili jedan aglikoni kiseonik ako je S<2>(ili oba S<2>i S<1>su) odcepljen; b. reaktivni >N-RNili -NRtRsili =0 grupa locirana na Z ili W; c. reaktivna hidroksi grupa locirana na bilo kom od R<1>, R<2>, R<3>i R<5>;d. bilo koja druga grupa koja se može prvo derivatizovati do hidroksi ili -NRtRsgrupe i zatim vezati za sve delove na L (na primer,OH- >=0-» epoksi ->

Jedna ili više R<p>grupa mogu biti nezavisno prisutne u makrolidnoj podjedinici Formule II, gde R<p>predstavlja protektivnu grupu koja može biti odabrana od alkil

(poželjno metil), alkanoil (poželjno acetil), alkoksikarbonil (poželjno metoksikarbonil ilife/r-butoksikarbonil), arilmetoksikarbonil (poželjno benziloksikarbonil), aroil (poželjno benzoil), arilalkil (poželjno benzil), alkilsilil (poželjno trimetilsilil) ili alkilsililalkoksialkil (poželjno trimetilsililetoksimetil) grupe. Amino protektivna grupa se može ukloniti

pomoću konvencionalnih tehnika. Tako, na primer, acil grupe, kao što su alkanoil, alkoksikarbonil ili aroil, mogu se ukloniti solvolizom, na primer, pomoću hidrolize pod kiselim ili baznim uslovima. Arilmetoksikarbonil grupa (benziloksikarbonil) se može raskidati pomoću hidrogenolize u prisustvu katalizatora kao što je paladijum na uglju.

L se može odabrati da bude povezujuća grupa prikazana sa Formulom IV:

Gde

X<1>je odabrano od: -CHjj-, -OC(=0)-, -C(=0), =NO-, -OC(=0)NH- ili -C(= 0)NH-;

X2 je odabrano od: -NH-, -CH2-, -NHC(=0), -OC(=0)-, -C(=0) ili -0;

Q je -NH- ili -CH2- ili odsutno;

gde svaka -CH2- ili -NH- grupa mogu biti opciono supstituisane sa Ci-CVaM, CrC7-alkenil, C^CT-alkinil, C(0)R<x>, C(0)OR<x>, C(0)NHR<x>, gde Rxmože biti CrC7-alkil, aril ili heteroaril;

simboli m i n su nezavisno jedan od drugog, celi brojevi od 0 do 4

uz uslov da ako je Q = NH; n ne može biti nula.

L predstavlja polipeptidni povezujući molekul sa od oko 2 do oko 50 aminokiselina spojenih zajedno, poželjno tripeptid ili tetrapeptid, kao što su: Gli-Fe-Leu, Gli-Gli-Fe, Gli-Fe-Fe, Gli-Fe-Gli, Gli-Leu-Gli, Gli-Val-Ala, Gli-Fe-Ala, Gli-Leu-Fe, Gli-Leu-Ala, Ala-Val-Ala, Gli-Gli-Fe-Leu, Gli-Fe-Leu-Gli, Gli-Fe-Ala-Leu, Ala-Leu-Ala-Leu, Gli-Fe-Fe-Leu, Gli-Leu-Leu-Gli, Gli-Fe-Tir-Ala, Gli-Fe-Gli-Fe, Ala-Gli-Val-Fe, Gli-Fe-Fe-Gli, bez ograničenja.

Poželjno L je prikazano formulom Gli-(W)p-Gli, gde je p ceo broj od 0 do 3 i W je bilo koja aminokiselina ili kombinacija bilo kojih aminokiselina.

U slučaju kada je V steroidna ili nesteroidna antiinflamatorna podjedinica

L je isključivo peptidni povezujući molekul.

V može predstavljati antiinflamatornu podjedinicu steroidnog ili nesteroidnog jedinjenja ili podjedinicu antineoplastičnog ili antiviralnog jedinjenja.

Kada je V steroidna podjedinica, poželjno je da je sa Formulom X:

ii) gde

R<a>i R<b>su, nezavisno jedan od drugog, vodonik ili halogen;

Rc je hidroksi, alkoksi (poželjno metoksi), alkil, tiokarbamoil, karbamoil ili valentna veza;

R<d>i Resu, nezavisno jedan od drugog, vodonik, OH, CH3ili CrC4 alkoksi (poželjno metoksi ili n-propoksi) ili su, svaki od njih grupa koja formira 1,3-dioksolanov prsten sa drugim (opciono alkil ili alkenil mono- ili di-supstituisan) (poželjno 2,2-dimetil ili 2-monopropil ili trans-propenil prsten) ili valentna veza;

Rf je vodonik, hidroksi, hlor, ili =0 koji formira keto grupu sa ugljenikovim atomom sa kojim je povezan;

R<j>je vodonik ili hlor

i njihove farmaceutski prihvatljive soli i solvati.

Alternativno sa ovim pronalaskom su steroidne podjedinice opisane u W0 94/14834, gde umesto grupe >CH-C(0)-R<c>, imaju grupu >CH-S(0)n-R<c>gde je n jedan ceo broj od 0 do 2. Pogledati W0 94/14834 koji je inkorporisan referencama, u svojoj celosti, posebno strane 2 - 3.

Još uopštenije, steroidi korisni kao izvor steroidnih podjedinica, uključuju, ali nisu ograničeni na, koritikosteroide (kao što su glukokortikoidi i mineralokortikoidi) i androgeni. Bez ograničenja, primeri kortikosteroida uključuju kortizol, kortizon, klobetazol, hidrokortizon, fludrokortizon, fludroksikortid, flumetazon, flunizolid, fluocinolon, fluocinonid, fluokortolon, fluorometolon, prednizon, prednizolon, 6-alfa-metilprednizolon, triamcinolon, alklometazon, beklometazon, betametazon, budezonid, deksametazon, amcinonid, kortivazol, dezonid, dezoksimetazon, diflukortolon, difluprednat, fluklorolon i dihlorizon, fluperiniden, fliitikazon, halcinonid, meprednizon, metilprednizolon, parametazon, prednazolin, predniliden, tiksokortol, triamkinolon, i njihovi kiseli derivati, na primer, acetat, propionat, dipropionat, valerat, fosfat, izonikotinat, metasulfobenzoat, tebutat i hemisukcinat.

V može biti nesteroidna antiinflamatorna podjedinica, na primer, ostatak nesteroidnog antiinflamatornog leka (NSAID) uključujući one koji inhibiraju ciklooksigenazu, enzim odgovoran za biosintezu prostaglandina i neke autokoidne inhibitore, uključujući inhibitore različitih izoenzima ciklooksigenaze (uključujući, bez ograničenja, ciklooksigenazu-1 i -2), kao i inhibitore i ciklooksigenaze i lipoksigenaze, što se odnosi na nesteroidne antiinflamtorne lekove (NSAID), kao što su komercijalno dostupni NSAID, aceklofenak, acemetacin, acetaminofen, acetaminosalol, acetil-salicilna kiselina, acetil-salicilna-2-amino-4-pikolinska-kiselina, 5-aminoacetilsalicilna kiselina, alklofenak, aminoprofen, amfenak, ampiron, ampiroksikam, anileridin, bendazak, benoksaprofen, bermoprofen, a-bisabolol, bromfenak, 5-bromsalicilne kiseline acetat, bromosaligenin, bukloksična kiselina, butibufen, karprofen, celekoksib, hromoglikat, cinmetacin, klindanak, klopirak, natrijum diklofenak, diflunizal, ditazol, droksikam, enfenamska kiselina, etodolak, etofenamat, felbina, fenbufen, fenklozinska kiselina, fendozal, fenoprofen, fentiazak, fepradinol, flufenak, flufenamska kiselina, fluniksin, flunoksaprofen, flurbiprofen, glutametacin, glikol salicilat, ibufenak, ibuprofen, ibuproksam, indometacin, indoprofen, izofezolak, izoksepak, izoksikam, ketoprofen, ketorolak, lomoksikam, loksoprofen, meklofenaminska kiselina, mefenaminska kiselina, meloksikam, mezalamin, metiazininska kiselina, mofezolak, montelukast, nabumeton, naproksen, nifluminska kiselina, nimezulid, olsalazin, oksaceprol, oksaprozin, oksifenbutazon, paracetamol, parsalmid, perizoksal, fenil-acetil-salicilat, fenilbutazon, fenilsalicilat, pirazolak, piroksikam, pirprofen, pranoprofen, protizinska kiselina, rezerveratol, salacetamid, salicilamid, salicilamid-O-acetilna kiselina, salicilsumporna kiselina, salicin, salicilamid, salsalat, sulindak, suprofen, sukcibutazon, tamoksifen, tenoksikam, tiaprofenilna kiselina, tiaramid, tiklopridin, tinoridin, tolfenaminska kiselina tolmetin, tropezin, ksenbucin, ksimoprofen, zaltoprofen, zomepirak, tomoksiprol, zafirlukast i ciklosporin. Dodatna grupa NSAID i posebno NSAID jedinjenja su opisani u U.S. Patentu 6,297,260, koji je inkoriporisan referencom, u svojoj celosti (posebno u generičkim formulama njegovog patentnog zahteva 1 i specifičnoj listi NSAID koja se tamo sadrži i u zahtevu 3, i tiazuliden NSAID, opisan u Medjunarodnoj Patentnoj Prijavi WO 01/87890, koja je inkorporisana ovde referencom, u svojoj celosti).

Poželjna NSAID jedinjenja su acetilsalicilna kiselina, indometacin, naproksen, ibuprofen, flurbiprofen, ketoprofen, sulindak, etodolak, ketorolak, suprofen, fluniksin, natrijum diklofenak i tolmetin.

V može predstavljati antiviralna jedinjenja, uključujući aciklovir, famciklovir, ganciklovir, cidofovir, lamivudin, ritonavir, indinavir, nevirapin, zidovudin, didanozin, stavudin, abakavir zalcitabin, amprenavir, ribavirin i adamantan, bez ograničenja. Poželjna antiviralna jedinjenja su zidovudin, didanozin i stavudin. V može predstavljati antineoplastične agense, uključujući bikaluatnid, kamptotecin, estramustin fosfat, flutamid, mehloretamin, tiotep, ifosfamid, hidroksiurea, bleomicin, paklitaksel, lomustin, irinotekan, metotreksat, vinorelbin, anastrazol, floksuridin, melfalan, vinkristin, vinblastin, mitomicin, nandrolon, goserelin, leuprolid, triptorelin, aminoglutetemid, mitotan, cisplatin, hlorambucil, pentostatin, kladribin, busulfan, etopozid, mitoksantron, idarubicin, ciklofosfamid, merkaptopurin, tioguanin, citarbin, ciklofosfamid, doksorubicin, daunoribicin, tenipozid i tamoksifen, bez ograničenja. Poželjni antineoplastični agensi su metotreksat, paklitaksel, kamptotecin, doksorubicin, taksoter i topotekan.

Podebljano obeležene veze u formulama koje su prikazane ovde, označavaju veze izdignute iznad ravni papira; veze obeležene kratkim linijama, označavaju veze postavljene ispod ravni papira dok izlomljene linije predstavljaju veze koje mogu biti ili ispod ili iznad ravni papira. Paralelne pune i isprekidane linije označavaju veze koje mogu biti bilo jednostruke ili dvostruke. Ukoliko nije drugačije naznačeno, sledeći termini imaju značenja koja su im pripisana u tekstu dole: "Alkil" ima značenje daje linearni ili razgranati, zasićeni, monovalentni, ugljovodonični radikal sa jednim do deset ugljenikovih atoma, poželjnije je od jedan do šest ugljenikovih atoma. Prioritetni ravnolančani ili razgranato-lančani alkili uključuju metil, etil, propil, izo-propil, butil, seMmtil i terobutil. Metil je najpoželjniji. Alkil grupe mogu biti supstituisane sa od jedan do pet supstituenta, uključujući halogen, (poželjno fluor ili hlor), hidroksi, alkoksi (poželjno metoksi ili etoksi), acil, acilamino cijano, amino, N-(Ci-C4)alkilamino, (poželjno N-metilamino ili N-etilamino), N,N-di(Ci-C4-alkil)amino (poželjno dimetilamino ili dietilamino), aril (poželjno fenil) ili heteroaril, tiokarbonilamino, aciloksi, amino, amidino, alkil amidino, tioamidino, aminoacil, aminokarbonilamino, aminotiokarbonilamino, aminokarboniloksi, aril, heteroaril, ariloksi, ariloksiaril, nitro, karboksil, karboksilalkil, karboksil-supstituisan alkil, karboksil-cikloalkil, karboksil-supstituisan cikloalkil, karboksilaril, karboksil-supstituisan aril, karboksilheteroaril, karboksil-supstituisan heteroaril, karboksilheterocikl, karboksil-supstituisan heterocikl, cikloalkil, cikloalkoksi, heteroariloksi, heterocikliloksi i oksikarbonilamino. Tako supstituisane alkil grupe su unutar ove definicije za "alkil". Ova definicija za alkil se prenosi na druge grupe koje sadrže alkilni ostatak, kao što je alkoksi.

"Alkenil" ima značenje daje linearni ili razgranati monovalentni ugljovodonični radikal sa od dva do deset, poželjno od dva do šest ugljenikovih atoma koji imaju najmanje jednu dvostruku vezu izmedju ugljenika. Alkenil grupe mogu biti supstituisane sa istim grupama kao i alkil i tako opciono supstituisane alkenil grupe su obuhvaćene unutar termina "alkenil". Etenil, propenil, butenil i cikloheksenil su prioritetni.

"Alkinil" ima značenje daje linearni ili razgranati monovalentni ugljovodonični radikal, koji ima ravan lanac ili razgranati lanac od dva do deset, poželjno od dva do šest ugljenikovih atoma i sadrži najmanje jednu a poželjno ne više od tri trostruke veze izmedju ugljenika. Alkinil grupe mogu biti supstituisane sa istim grupama kao i alkil, i supstituisane grupe su unutar ove definicije za alkinil. Etinil, propinil i butinil grupe su prioritetne.

"Cikloalkil" ima značenje da je ciklična grupa koja ima 3 - 8 ugljenikovih atoma, ima jedan prsten, opciono vezan za jedan aril ili heteroaril grupu. Cikloalkilne grupe mogu biti supstituisane, kako je specificirano za "aril" u tekstu dole i supstituisane cikloalkil grupe su unutar ove definicije za "cikloalkil". Prioritetni cikloalkili su ciklopentil i cikloheksil.

"Aril" ima značenje daje nezasićena aromatična karbociklična grupa koja ima od 6 do 14 ugljenikovih atoma i ima jedan prsten, kao što je fenil ili višestruko spojene prstenove, kao što je naftil. Aril može opciono biti dalje spojen sa alifatičnom ili aril grupom ili može biti supstituisan sa jednim ili više supstituenata kao što su halogen (fluor, hlor i/ili brom), hidroksi, CrC7alkil, CrC7 alkoksi ili ariloksi, CrC7alkiltio ili ariltio, alkilsulfonil, cijano ili primarni ili neprimarni amino.

"Heteroaril" ima značenje daje monociklični ili biciklični aromatični ugljovodonični prsten, koji ima od 2 do 10 ugljenikovih atoma i od 1 do 4 heteroatoma, kao što su 0, S ili N. Heteroarilni prsten može biti opciono spojen sa drugom heteroaril, aril ili alifatičnom cikličnom grupom. Primeri ovog tipa su furan, tiofen, pirol, imidazol, indol, piridin, oksazol, tiazol, pirol, pirazol, tetrazol, pirimidin, pirazin i triazin, a poželjni su furan, pirol, piridin i indol. Termin uključuje grupe koje su supstituisane sa istim supstituentima kao što je gore specifikovano za aril.

"Heterocikl" ima značenje daje zasićena ili nezasićena grupa, koja ima jedan ili višestruke prstenove i od 1 do 10 ugljenikovih atoma i od 1 - 4 heteroatoma odabranih od azota, sumpora ili kiseonika, gde u spojenom sistemu prstenova, drugi prsten ili prstenovi mogu biti aril ili heteroaril. Heterociklične grupe mogu biti supstituisane kako je specifikovano za alkil grupe i tako supstituisane heterociklične grupe su unutar ove definicije.

Termin "aminokiseline" se odnosi na bilo koje jedinjenje koje sadrži i amino grupu i grupu karboksilne kiseline. Amino grupa se može javiti u poziciji koja je u susedstvu karboksi funkcije, kao što je u a-aminokiselinama ili na bilo kojoj lokaciji unutar molekula. Aminokiseline mogu takodje sadržati dodatne funkcionalne grupe, kao što su amino, rio, karboksil, karboksamid, imidazol i tako dalje. Aminokiseline mogu biti sintetske ili prirodne ili modifikovane prirodne aminokiseline, kao što su norvalin ili norleucin.

Simbol K je ponekad korišćen da označi deo L grupe, povezane za M, ili za V u zavisnosti od konteksta.

U proizvodnji jedinjenja predstavljenih strukturom I, sa specifičnom farmakološkom aktivnošću, neka nova jedinjenja su proizvedena kao intermedijeri u proizvodnji farmakološki aktivnih jedinjenja. Ovaj pronalazak se takodje odnosi na takve intermedijere.

Ovaj pronalazak takodje obuhvata farmakološki prihvatljive soli ovih jedinjenja. Farmakološki pogodne soli jedinjenja ovog pronalaska uključuju soli sa neorganskim kiselinama (na primer, kao što su hlorovodonična, bromovodonična, fosforna, metafosforna, azotna ili sumporna kiselina) ili sa organskim kiselinama (na primer, kao što su tartarna, sirćetna, metan-sulfonska, trifluorosirćetna, limunska, maleinska, mlečna, fumarna, benzoeva, sukcinilna, metansulfonska, oksalna i p-toluensulfonska kiselina).

Ovaj pronalazak takodje uključuje prolekove jedinjenja Formule I, odnosno, jedinjenja koja otpuštaju aktivni lek, koji ima strukturu primarnog jedinjenja, prema

Formuli (I),in vivo,kada se primene na subjektima sisara. Prolekovi jedinjenja Formule I su proizvedena modifikacijom funkcionalnih grupa prisutnih u jedinjenju Formule I, na takav način da ta modifikacija može biti raskidanjein vivo,pri čemu se otpušta primarno jedinjenje. Prolekovi uključuju jedinjenja Formule I kod kojih je hidroksi, amino, ili karboksi grupa jedinjenja Formule I vezana za bilo koju grupu koja može biti raskinutain vivopričemu se regeneriše slobodna hidroksi, amino ili karboksi grupa, respektivno. Primeri prolekova uključuju, ali nisu ograničeni na, estre (na primer, acetat, format i benzoat derivati) jedinjenja Formule I ili bilo koji drugi derivat koji nakon što se uvede u fiziološki pH ili preko delovanja enzima, se konvertuje u aktivni primarni lek. U kontekstu ovog stava, "prolek" se ne odnosi na hibride prema ovom pronalsku koji otpuštaju V ostatak, kako je na drugom mestu pomenuto po ovoj specifikaciji, ali se odnosi na derivate V ostatka (koji se mogu osloboditi ili ostati vezani za makrolid). Derivat V ostatka u svom vezanom ili oslobodjenom stanju će biti konvertovan do primarnog aktivnog leka koji će biti ili slobodan ili vezan za makrolid.

Ovaj pronalazak takodje obuhvata solvate (poželjno hidrate) jedinjenja Formule I ili njihove soli.

Jedinjenja Formule I imaju jedan ili više hiralnih centara i, u zavisnosti od prirode pojedinačnih supstituenata, ona takodje mogu imati geometrijske izomere. Izomeri koji se razlikuju u rasporedu njihovih atoma u prostoru, nazivaju se "stereoizomeri". Stereoizomeri koji nisu jedan drugom odraz u ogledalu, nazivaju se "dijastereomeri" a oni koji, jedan drugom nisu odraz u ogledalu a ne mogu ni da se poklope, nazivaju se "enantiomeri". Kada jedinjenje ima hiralni centar, moguća je pojava para enantiomera. Enantiomer može biti okarakterisan pomoću apsolutne konfiguracije njegovog asimetričnog centra, što je opisano sa pravilima R- i S- nizanja koja su dali Kan (Cahn) i Prelog (Prelog), ili na način u kome molekuli rotiraju oko ravni polarizovane svetlosti kada se označavaju kao desno rotirajući ili levo rotirajući (odnosno, kao (+) ili (-) izomer, respektivno). Hiralno jedinjenje se može naći bilo kao pojedinačni enantiomer ili kao smeša enantiomera. Smeša koja sadrži jednake udele enantiomera, se naziva "racemska smeša". Ovaj pronalazak obuhvata sve pojedinačne izomere jedinjenja Formule I. Namera je da, opis ili nazivanje odredjenog jedinjenja, u specifikaciji i zahtevima, uključuje i pojedinačne enantiomere i smeše, racemske ili druge, tog jedinjenja. Metode za odredjivanje stereohemije i razdvajanje steroizomera su dobro poznate u oblasti.

Ovaj pronalazak takodje obuhvata steroizomere tipa sin - anti, koji se mogu naći kada je jedna oksim ili slična grupa prisutna. Grupa najvišeg, Kan - Ingold - Prelog prioriteta, vezana za jednu od terminalnih dvostruko vezanih atoma oksima, je uporedna sa hidroksil grupom oksima. Stereoizomer je označen kao Z (zusammen = zajedno) ili Sin, ako oksim hidroksil leži na istoj strani referentne ravni prolazeći kroz C=N dvostruku vezu kao grupa najvišeg prioriteta; drugi stereoizomer je označen kao E (entgegen = suprotan) ili Anti.

Termin "farmaceutski prihvatljivi ekscipijent" ima značenje da je ekscipijent koji je koristan u proizvodnji farmaceutskih kompozicija, takav daje generalno bezbedan, netoksičan, i nije nepoželjan ni biološki niti bilo kako drukčije, a uključuje ekscipijent koji je prihvatljiv za korišćenje u veterini kao i za proizvodnju humanih lekova. "Farmaceutski prihvatljivi ekscipijent", kako je korišćeno u ovoj prijavi, uključuje jedan i više takvih ekscipijenata.

"Tretiranje" ili "lečenje" stanja, poremećaja ili oboljenja, uključuje:

(1) sprečavanje ili odlaganje pojave kliničkih simptoma stanja, poremećaja ili oboljenja, koja se razvijaju kod sisara, koji mogu biti izloženi ili sa predispozicijom za takvo stanje, poremećaj ili oboljenje, ali kod kojih nisu bili ili kod kojih se ne pokazuju klinički ili subklinički simptomi stanja, poremećaja ili oboljenja, (2) inhibiciju stanja, poremećaja ili oboljenja, odnosno, zaustavljanje ili redukciju razvoja oboljenja ili barem jednog njegovog kliničkog ili subkliničkog simptoma, ili (3) olakšanje oboljenja, odnosno, uzrokovanje povlačenja stanja, poremećaja ili oboljenja ili najmanje jednog od njegovih kliničkih ili subkliničkih simptoma.

Korisnost za subjekta koji je lečen, je bilo statistički značajna ili, najmanje, uočljiva za pacijenta ili za lekara.

"Terapeutski efikasna količina" ima značenje daje količina jedinjenja koja, kada se primeni na sisatima, za lečenje stanja, poremećaja ili oboljenja, je dovoljna da daje rezultat takvog lečenja (kao što je reč definisana gore). "Terapeutski efikasna količina" će varirati u zavisnosti od jedinjenja, oboljenja i njegove jačine, od starosti, težine, fizičkog stanja i reakcije sisara koji je tretiran.

Klasični simptomi akutne inflamacije su crvenilo, povišena temperatura, otečenost i bol u ugroženoj oblasti, kao i gubitak funkcije ugroženog organa.

Simptomi i znaci inflamacije udruženi sa specifičnim stanjima, uključuju:

• reumatoidni artrits - bol, nadutost, toplina i slabost ugroženog zgloba; generalizovana i jutarnja krutost; • insulin - zavisni dijabetes melitus - insulitis; ovo stanje može dovesti do različitih komplikacija sa inflamatornim komponentama, uključujući: retinopatiju, neuropatiju, nefropatiju; bolest srčane arterije, bolest periferne vaskulare, i cerebrovaskularno oboljenje; • autoimuni tiroiditis - slabost, konstipacija, kratkoća daha, nadutost lica, ruku i stopala, periferni edem, bradikardija; • multipla skleroza - spaztičnost, zamagljeni vid, vrtoglavica, slabost udova, parestezija; • uveoretinitis - umanjen noćni vid, gubitak perifernog vida; • lupus eritematozus - bol u zglobovima, osip, fotosenzitivnost, groznica, bol u mišićima, nadutost ruku i nogu, abnormalna urinaliza (hematurija, cilindurija, proteinurija), glomerulonefritis, kognitivna disfunkcija, tromboza krvnih sudova, perikarditis; • skleroderma - Rejnodova bolest; otečenost dlanova, ruku, nogu i lica; zadebljanje kože; bol, otečenost i krutost prstiju i kolena, gastrointestinalna disfunkcija, restriktivna bolest pluća; perikarditis, renalni slom; • druga artritična stanja koja imaju inflamatorau komponentu kao što su reumatoidni spondilitis, osteoartritis, septični artritis i poliartritis - groznica, bol, otečenost, osetljivost; • druga inflamatorna oboljenja mozga, kao što su meningitis, Alchajmerova bolest, AIDS demencija encefalitis - fotofobija, kognitivna disfunkcija, gubitak pamćenja; • druga inflamatorna oboljenja očiju, kao što je retinitis - smanjenje oštrine vida; • inflamatorna oboljenja kože, kao što su ekcem, drugi dermatiti (na primer, atopični, kontaktni), psorijaze, opekotine prouzrokovane UVzračenjem (sunčevi zraci i slični UV izvori) - eritema, bol, ljuštenje, otečenost, osetljivost; • inflamatorno oboljenje creva, kao što su Kronova bolest, ulcerativni kolitis - bol, dijareja, konstipacija, rektalno krvarenje, groznica, artritis; • astma - kratak dah, teško disanje; • druga alergijska oboljenja, kao što je alergijski rinitis - kijanje, svrab, curenje nosa; • stanja udružena sa akutnom traumom kao što je cerebralna povreda kao posledica udara - gubitak senzora, gubitak motorike, gubitak kognicije; • povreda srčanog tkiva usled miokardijalne ishemije - bol, kratkoća daha; • povreda pluća kao što je ona koja se javlja kod odraslih kao respiratorni stresni sindrom - krakoća daha, hipervenitlacija, smanjenje oksigenacije, pulmonarni infiltrati; • inflamacija udružena sa infekcijom, kao što su sepsa, septični šok, sindrom toksičnog šoka - groznica, respiratorni slom, tahikardija, hipotenzija, leukocitoza; • druga inflamatorna stanja udružena sa posebnim organima ili tkivima, kao što je nefritis (na primer, glomerulonefritis) - oligourija, abnormalna urinaliza; upaljeno slepo crevo - groznica, bol, osetljivost, leukocitoza;

giht - bol, osetljivost, otečenost i eritema ugroženog zgloba, povišeni serum i/ili urinarna urinska kiselina;

upaljena žučna kesa - abdominalni bol i osetljivost, groznica, mučnina, leukocitoza;

hronično opstruktivno pulmonarno oboljenje - kratkoća daha, kijavica;

kongestivne srčane smetnje - kratkoća daha, krkori, periferni edemi;

Tip II dijabetes - komplikacije krajnjih organa, uključujući kardiovaskularna, okularna, renalna oboljenja i oboljenja perifernog vaskularnog sistema;

fibroze pluća - hiperventilacija, kratkoća daha, smanjena oksigenacija;

vaskularna oboljenja, kao što su ateroskleroze i retinoze - bol, gubitak senzacija, poremećaj pulsa, gubitak funkcija

i aloimuniteta što dovodi do odbacivanja transplantanta - bol, osetljivost, groznica.

Subklinički simptomi uključuju, bez ograničenja, dijagnostičke markere za inflamacije, čija pojava može prerasti u manifestaciju kliničkih simptoma. Jedna klasa subkliničkih simptoma su imunološki simptomi, kao što je invazija ili akumulacija proinflamatornih limfnih ćelija u nekom organu ili tkivu, ili prisustvo lokalnih ili perifernih aktiviranih proinflamatornih limfnih ćelija koje prepoznaju patogeni mikroorganizam ili antigen specifičan za dati organ ili tkivo. Aktivacija limfnih ćelija se može meriti tehnikama poznatim u oblasti.

"Dopremanje" terapijski efikasne količine aktivnog sastojka do odredjene lokacije unutar domaćina, ima značenje daje proizvedena terapijski efikasna koncentracija aktivnog sastojka u krvi, na odredjenoj lokaciji. To se može izvesti, na primer, pomoću lokalne ili sistemske primene aktivnog sastojka kod domaćina. Specifična virusna oboljenja uključuju virusni hepatitis (A, B, C, E), grip, virusnu pneumoniju, virusni bronhitis, herpetične infekcije (simpleks virus, EB virus (infektivna mononukleoza), herpes zoster), poliomijelitis, AIDS (HIV infekcija), leukemija T-ćelija kod odraslih

(ATL), papilomi, male boginje, rubeola, iznenadni osip, infektivno crvenilo, viralni encefalitis, viralni mijelitis, citomegalovirusna infekcija, zauške, varičela, besnilo, viralni enteritis, viralni miokarditis, viralni perikarditis i tako dalje.

Simptomi i znaci virusne infekcije, udruženi sa specifičnim stanjima, uključuju: viralno nagomilavanje, viralnu replikaciju, viralnu aktivnost, viremiju, virusno-specifične antigene, viralnu RNK ili DNK, aktivnost reverzne transkriptaze, aktivnost antiviralne CTL u domaćinu, broj T-ćelija ili CD4+ ćelija (za HIV). Karcinomi uključuju, ali bez ograničenja, sledeće: kancer plućnih velikih ćelija, kancer plućnih malih ćelija, karcinom debelog creva, karcinom dojke, karcinom jajnika, leukemiju, fibroblast, karcinom bubrega, melanom, karcinom prostate, CNS karcinom, kostiju / mišića, limfom i krvni karcinomi.

Simptomi i znaci neoplazija, udruženi sa specifičnim stanjima, uključuju: uveličanje tumora, veličinu tumora, težinu ugroženog organa, recidiv tumora, vreme preživljavanja obolelog, dužinu i obim remisije, rast karcinomskih ćelija, preživljavanje ćelija kancera, indeks apoptoze, obim metastaza ili stepen, biološke markere udružene sa odredjenim tipom neoplazije, markere proliferacije, aktivaciju relevantnih onkogena, disregulaciju funkcije receptora udruženih sa tumorom, tumor specifične antigene i angiogenezu udruženu sa tumorom.

Subklinički simptomi viralne infekcije ili neoplazije, prisustvo lokalnih ili perifernih aktiviranih proinflamatornih limfoidnih ćelija koje prepoznaju patogene ili antigen koji je specifičan za organ ili tkivo. Aktivacija limfoidnih ćelija se može meriti tehnikama poznatim u oblasti. Drugi subklinički simptomi uključuju prisustvo i/ili količinu različitih surogatnih markera (kao što su oni nabrojani gore u svakoj kategoriji) pre nego se pojave bilo koji od kliničkih znakova. Pored toga, i infekcije i neoplazije su često udružene sa povećanom aktivnošću imunog sistema na mestu pojave tumora, tako da su znaci inflamacije takodje ovde primenljivi.

Poželjno je, u jedinjenju prikazanom sa Formulom II,

Z i W, zajedno su -N(RN)C(0)-, -C(0)N(RN)-, >C-NRsRt)-C(O)-, > C =N-RM-CH2NRN- ili - NRNCH2-, najpoželjnije je, -NCH3CH2-, -NHCH2-, -CH2NH-, -

C(0)NH,-NHCO-,

Rs, Rtje metil ili H;

Rm je OH ili metoksi;

Xje 0;

RNje H, metil, ili -C(=X)-NRtRs;

A je H ili metil

U, Y su H, F, metil ili hidroksimetil;

Rije hidroksi,-0-S2, ili =0

R<2>je H, hidroksi ili metoksi;

R<3>je OH, metoksi ili grupa koja formira ciklični karbamatni most sa W ili Z;

R4je metil;

R<5>je H, OH, metoksi ili grupa koja formira ciklični karbonatni ili karbamatni most sa R<3>;

Povezivanje je preko azota sa Z na N/9a ili N/8a pozicijama ili preko ugljenika sa R<12>ili preko kiseonika sa R<11>, oba na C/4" poziciji na S<2>saharidu.

R6je H, metil ili etil;

R8 je H ili N(CH3)2, NH(CH3) ili N(CH3)CH2CH3,

R<9>jeH

Povezujuće mesto je poželjno na poziciji C/3; ili preko amino grupe na poziciji C/3' na S<1>saharidu ili na poziciji C/11 ili na W ili Z, ili preko pozcije C/4" na S<2>saharidu.

Takodje su poželjna jedinjenja u okviru Formule I gde je M iz Formule II i (i) Z je NCH3,Wje CH2,R<2>je hidroksi; ili (ii) Zje NH,Wje = CO,iR<2>je metoksi. (Jedinjenja opisana u ovom paragrafu mogu ili ne moraju da zadovolje preostale prethodno navedene prioritete u neposredno prethodnoj sekciji, ali je poželjno da ih zadovoljavaju).

Dalji aspekt ovog pronalaska se odnosi na postupke za proizvodnju jedinjenja prikazanih sa Formulom I. Uopšteno, jedinjenja sa Formulom I se mogu dobiti na sledeći način: jedan kraj lanca se prvo veže na makrolid i zatim se drugi kraj lanca povezuje na V; ili, jedan kraj lanca se prvo poveže sa V a zatim se drugi kraj lanca povezuje sa makrolidom ili, na kraju, jedan ostatak lanca se vezuje na makrolid dok se drugi ostatak lanca vezuje za V, a zatim se krajevi ostataka lanca, hemijski povezuju tako da formiraju lanac L.

Za one koji su iskusni u oblasti, razumljivo je da može biti poželjno korišćene zaštićenih derivata intermedijera korišćenih u proizvodnji jedinjenja sa Formulom I. Protekcija i deprotekcija funkcionalnih grupa se može izvesti pomoću metoda poznatih u oblasti. Hidroksil ili amino grupe mogu biti zaštićene sa bilo kojom hidroksil ili amino protektivnom grupom, kao na primer što je opisano u Green, T. W.; Wuts, P. G. M., Protective Groups u Organic Svnthesis: John Wiley i Sons, New York, 1999. Takodje videti razmatranje protektivnih grupa u vezi sa gore pomenutom Formulom I. Amino protektivne grupe se mogu ukloniti pomoću konvencionalnih tehnika. Na primer, acil grupe, kao što su alkanoil, alkoksikarbonil i aroil grupe se mogu ukloniti pomoću solvolize, na primer, hidrolizom u uslovima kisele i bazne sredine. Arilmetoksikarbonil grupe (na primer, benziloksikarbonil) se mogu raskidati pomoću hidrogenolize u prisustvu katalizatora kao što je paladijum na ugljeniku.

Još specifičnije, jedinjenja u okviru Formule I se mogu proizvesti pomoću sledećih postupaka:

a) Jedinjenja Formule I, gde X<2>je -NHC(O)-, se mogu dobiti pomoću reakcije jedinjenja sa Formulom VI: gde L<1>predstavlja odlazeću grupu (kao što je hidroksi), i slobodne amino grupe sa makrolida prikazanog sa Formulom Vila:

gde K je deo povezujućeg molekula L privezan za makrolidnu podjedinicu.

Reakcija je uopšteno izvedena sa kiselim derivatima koji imaju sposobnost da

aktiviraju grupu karboksilne kiseline, kao što su halogenidi, smeše anhidrida i posebno karbodiimidi kao što je (3-dimetilaminopropil)-3-etil-karbodiimid (EDC) i benzotriazoli. Reakcija se odvija u prisustvu baze, kao što je organska baza (na primer, trietilamin), na sobnoj temperaturi pod atmosferom inertnog gasa kao što je azot ili argon. Reakcija može zahtevati nekoliko sati do nekoliko dana do potpunog završetka.

Na primer, kada je L, -K-NH2-, jedinjenje sa Formulom I se može dobiti pomoću derivatizacije jedne >NH grupe na makrolidnom prstenu do jedne >N-K-NH2grupe i reakcije derivatizovanog makrolida sa jedinjenje sa Formulom VI, kako je dole prikazano.

Na primer, ovaj postupak se može izvesti kada je >NH grupa u makrolidnoj podjedinici sa Formulom II, privezana na C/3' ili N/9a poziciji.

Jedinjenja prikazana sa Formulom VI su komercijalno dostupna ili se mogu dobiti iz podjedinice V pomoću metoda poznatih u oblasti, koja ih uključuju.

Proizvodnja polaznog makrolida sa Formulom Vila je opisana u PCT HR 02/0001, koji je inkorporisan referencom u svojoj celosti. Videti takodje U.S. Pat. Br. 4,474,768 i Bright, G. M. i sar.,/. Anti' bi' ot1988,41,1029 -1047, koji su inkorporisani referencom u svojoj celosti. b) Jedinjenja prikazana sa Formulom I, gde X<2>je -OC (O)-, se može formirati pomoću reakcije jedinjenja sa Formulom VI: i slobodnih hidroksil grupa na makrolidu prikazanom pomoću Formule Vllb:

Reakcija je generalno izvedena sa kiselim derivatima koji imaju sposobnost da aktiviraju grupu karboksilne kiseline, kao što su halogenidi (kao što je etilen dihlorid - EDC), smeše anhidrida i posebno karbodiimidi. Reakcija se obično izvodi na sobnoj temperaturi pod uslovima inertne atmosfere kao što je azot ili argon. Reakcija može zahtevati nekoliko sati do nekoliko dana kako bi se izvela do kraja.

Na primer, kada je povezujući molekul L, -K-O- jedinjenje sa Formulom I se može formirati pomoću (1) derivatizacije jedne >NH grupe na makrolidu do jedne >N-K-OH- grupe i (2) reakcije derivatizovanog makrolida sa jedinjenjem prikazanim sa Formulom VI, kako je dole prikazano:

Povezujuća grupa -K-OH se može vezati za sekundarni atom azota na makrolidu, kao što sledi. Makrolid reaguje sa nekim alkenoil derivatom, kao što je CH2=CH(CH2)m-2-C(0)0-alkil (na primer, metilakrilat). Estarska grupa (odnosno, -C(O)O-alkil) se zatim redukuje, kao na primer sa metalnim hidridom (na primer, LiAlH4) u nekom anhidrovanom organskom rastvaraču, pri čemu se dobija makrolid koji ima povezujuću grupu -K-OH (odnosno, M-K-OH). Redukcija se obično izvodi na niskoj temperaturi a poželjno na 0 °C ili nižoj.

Na primer, ovaj postupak se takodje može izvesti kada je >NH grupa povezana na C/3' ili N/9a poziciji na makrolidnoj podjedinici prikazanoj sa Formulom II.

Polazni makrolidi sa FormulomVllbsu poznata jedinjenja ili se mogu dobiti prema postupcima opisanim za analogna jedinjenja, kao što su ona koja su opisana u Costa, A. M. i sar.Tetrahedron Letters2000,41,3371 - 3375, što je ovde inkorporisano referencom.

c) Jedinjenja prikazana sa Formulom I, gde je X<1>, -OC(O)-,

Q je -NH- i X<2>je -NHC(O)-, se mogu proizvesti pomoću reakcije makrolida

prikazanog sa Formulom VIIc:

i jedinjenja prikazanog sa Formulom VIb: pri čemu se dobija

Na primer, ovi postupci se mogu izvesti kada je OH grupa privezana na C/6 ili C/4" poziciji u makrolidnoj podjedinici, prikazanoj sa Formulom II.

Makrolid prikazan sa Formulom VIIc se može formirati pomoću reakcije odgovarajućeg halogenalkanoil hlorida na slobodnoj OH grupi u makrolidu.

Jedinjenje prikazano sa Formulom VIb se može dobiti pomoću reakcije odgovarajućeg amina (koji ima povezujuću grupu -K-NH2) sa jedinjenjem sa Formulom

VI.

d) Jedinjenja sa Formulom I, gde je X<1>, -OC(0)NH- i X<2>je-NHC(O)-, se može proizvesti pomoću reakcije makrolida prikazanog sa Formulom Vlld i jedinjenja

sa Formulom Vib, kako je dole prikazano.

Ovi postupci se mogu izvesti kada su dve slobodne OH grupe vezane, na primer, na C/11 i C/12 poziciji u makrolidnoj podjedinici, prikazanoj sa Formulom II.

Reagujući makrolid, prikazan sa Formulom Vlld se može formirati pomoću reakcije etilkarbonata na makrolidnoj podjedinici koja ima dva vicinalna hidroksi supstituenta;

e) Jedinjenja prikazana sa Formulom I, gde je X<1>, -CIV, Q je -NH- i X<2>je - NHC(O)-, se mogu proizvesti pomoću reakcije makrolida prikazanog sa Formulom Vile

i jedinjenja sa Formulom Via, kako je dole prikazano.

Na primer, ovaj postupak se može izvesti kada je OH grupa privezana na C/4" poziciju u makrolidnoj podjedinici, prikazanoj sa Formulom II.

Reagujući makrolid, prikazan sa Formulom Vile se može formirati pomoću

oksidacije odgovarajućeg makrolida koji ima hidroksi grupu do dobijanja supstituenta, (

, konverzijom do epoksi grupe

i raskidanjem epoksi grupe sa nekim

odgovarajućim reaktantom (na primer, etilendiaminom).

f) Jedinjenja sa Formulom I se mogu proizvesti pomoću reakcije makrolida, prikazanog sa FormulomVllf,koji ima odlazeću grupu L<2>(kao što je Br), i podjedinice

V prikazane sa Formulom Vic, kako je dole prikazano.

Polazni makrolid sa FormulomVllfse može proizvesti, na primer, pomoću raskidanja saharidne grupe vezane na C/3 poziciji u makrolidnoj podjedinici, prikazanoj sa Formulom II i zatim reakcijom makrolida sa reagensom sa Formulom L<3>-K-L<2>, gde su L<2>i L<3>odlazeće grupe.

g) Jedinjenja sa Formulom I se mogu proizvsti pomoću reakcije makrolida prikazanog sa FormulomVllgkoji ima odlazeću grupu L<2>(kao što je Br), i podjedinice

V sa Formulom Vic, kako je dole prikazano.

Polazni makrolid sa FormulomVllgse može proizvesti pomoću reakcije nekog makrolida koji ima slobodnu OH grupu, na primer, na C/2' poziciji u makrolidnoj podjedinici prikazanoj sa Formulom II, sa reagensom sa Formulom L<3->C(0)-K- L<2>, gdesuL<2>i L<3>odlazeće grupe.

h) Jedinjenja prikazana sa Formulom I se takodje mogu proizvesti pomoću reakcije makrolida prikazanog sa FormulomVllhkoji ima odlazeću grupu L<2>(kao što je

Br) i podjedinice V sa Formulom Vic kako je dole prikazano.

i) Jedinjenja prikazana sa Formulom I se takodje mogu proizvesti pomoću reakcije podjedinice V prikazane sa FormulomVllladobijene iz podjedinice V sa slobodnom hidroksil grupom (Huang CM. i sar. Chem.&Biol. 2000,7,453 - 461; Hess S. i sar. Bioorg.&Med. Chem. 2001,9,1279 -1291) i makrolida prikazanog sa FormulomVila,kako je dole prikazano. j) Jedinjenja prikazana sa Formulom I se takodje mogu dobiti pomoću reakcije podjedinice V prikazane sa FormulomVlllb(Pandori M. W. i sar. Chem.&Biol. 2002,9, 567 - 573) ili VIIIc dobijene iz podjedinice V sa slobodnom amino grupom (Hess S. i sar. Bioorg.&Med. Chem. 2001,9,1279 -1291) i makrolida prikazanog sa Formulom Vila, kako je dole prikazano.

Sledeći primeri ilustruju dobijanje jedinjenja sa formulom I i ne ograničavaju pronalazak ni na koji način.

Paklitaksel sukcinat se može proizvesti prema postupku koji su dali Huang CM. i sar.Chemistry& Biology,7,2000,453 - 461 (Shema 1).

y-Mem-A/'-[4-[A^-[(2,4-damino-6-pteirdinil)mem]-A^-memamino]benzoil]^ (2) se može proizvesti prema postupku koji su dali Kralovec J. i sar.J. Med. Chem.32,1989, 2426-2431 (Shema 2).

Kamptotecin-20-O-hemisukcinat se može proizvesti prema patentnoj prijavi US 4943579 (Shema 3).

5'-0-Sukcinilzidovudin (m = 1) se može proizvesti prema postupku koji su dali Giammona G. i sar.J. Control. Release,54,1998, 321 - 331 (Shema 4).

Shema 1: Sinteza Paklitaksel-makrolidnog hidbrida

Shema 2: Sinteza Metotreksat-makrolidnog hibrida

Shema 3: Sinteza Kamptotecin-makrolidnog hibrida Shema 4: Sinteza Zidovudin (AZT)-makrolidnog hibrida

I6-0člani prstenovi makrolida su tradicionalno podeljeni u podfamilije na osnovu profila supstitucije njihovih aglikona. Osnovni prototipovi ovih familija mogu biti prikazani pomoću leukomicina, spiramicina i tilozina.

Tilozin je reprezentativni 16-o člani makrolid koji poseduje visoko supstituisane aglikone sa dve dvostruke veze (tilonolid) i treći saharidni supstituent (p-D-micinoza) kao dodatak saharidu povezanom za 5-hidroksil grupu. Hidrolizom mikaroze iz disaharida dobij a se dezmikarozil-tilozin (dezmikozin).

Potencijalno mesto modifikacije u dezmikozinu:

Na primer, 16-o člani prsten makrolidnog hibrida se može dobiti pomoću reduktivne aminacije C-20 aldehidne grupe.

Ova reakcija se može koristiti takodje za 17-o člane azalide kao što su 8a-aza--homodezmikozini i njihovi derivati (kao što su di- i tetrahidro derivati).

R<14>je vodonik ili hidroksi

Alternativno, derivatizacija 16-o članog prstena makrolida se može izvesti pomoću transformacije dvostruke veze (na primer, epoksidacija) i raskidanjem epoksi grupe sa nekim odgovarajućim reaktantom (kao što je diamin) pri čemu se dobija makrolid (M-0-NH-K-NH2).

Takodje, keton u poziciji C/9 se može modifikovati pomoću hidroksilamin hidrohlorida kako bi se dobio oksim i zatim redukovao do amina.

Put sinteze jedinjenja sa formulom I (V je steroid, nesteroidna antiinflamatorna, antiviralna i antineoplastična podjedinica sa slobodnom amino grupom) gde je L, peptidni povezujući molekul, je ilustrovan u sledećem primeru:

Put sinteze za jedinjenje sa formulom I (V je steroid, nesteroidna antiinflamatorna antiviralna i antineoplastična podjedinica sa slobodnom karboksil grupom) gde je L, peptidni povezujući molekul, je ilustrovan u sledećem primeru:

Soli jedinjenja prikazanih sa Formulom I se mogu dobiti pomoću primene opšte poznatih postupaka kao što su, na primer, reakcija jedinjenja sa Formulom I sa nekom odgovarajućom bazom ili kiselinom u odgovarajućem rastvaraču ili smeši rastvarača, kao na primer u etrima (dietiletar) ili alkoholima (etanol, propanol ili Zzo-propanol).

Dalji aspekt ovog pronalaska se odnosi na korišćenje jedinjenja sa Formulom I za lečenje inflamatornih oboljenja, poremećaja i stanja za koje je karakteristično, ili su udružena sa neželjenim inflamatornim imunim odgovorom, posebno za sva oboljenja i stanja koja su indukovana ili udružena sa prekomernom sekrecijom TNF-a i IL-1 (antikarcinogeni, antiviralni).

Terapeutski efikasne količine jedinjenja ovog pronalaska se mogu odrediti pomoću metoda koje su poznate u oblasti. Pošto se jedinjenja ovog pronalaska prenose do željenog mesta mnogo efikasnije nego sam odgovarajući lek, može se primeniti, na molarnoj osnovi, manja količina jedinjenja nego antiinflamatornog, antineoplastičnog i antiviralnog leka, pri čemu se postiže isti terapijski efekat. Dalje, pošto se nakon ubacivanja u cilj, aktivni sastojci ovog pronalska, više ne nalaze u kontaktu sa ostalim tkivom, pretpostavlja se da će njegovom primenom da se javi manje sporednih efekata, što dozvoljava upotrebu maksimalno povećane tolerantne količine antiinflamatornog, antineoplastičnog i antiviralnog leka. Tako, tabela dole služi samo kao vodič. Prag terapeutski efikasne količine jedinjenja, njegove farmaceutski prihvatljive soli, njegovih solvata ili njegovih proderivata je uopšteno isti ili manji od terapijski efikasne količine, na molarnoj osnovi, antiinflamatornog, antineoplastičnog ili antiviralnog leka. Opseg i poželjne efikasne količine jedinjenja, njegovih farmaceutski prihvatljivih soli, njegovih solvata ili njegovih proderivata, su prikazani u donjoj tabeli.

Tako, na primer, ako se poželjna količina indometacina, kreće u opsegu od 50 - 200 mg/dnevno, to odgovara opsegu od 140 umol do 560 umol dnevno. Polazna tačka za odredjivanje poželjnog opsega doze će takodje biti u molarnom opsegu od 140 do 560 mol hibridnog jedinjenja pronalaska, dnevno. Fino podešavanje ovog pristupa je dobro poznato u oblasti.

Dalje, ovaj pronalazak se odnosi na farmaceutske kompozicije koje sadrže efikasnu dozu jedinjenja ovog pronalaska kao i na farmaceutski prihvatljive ekscipijente kao što su nosači ili sredstva za razblaživanje.

Proizvodnja farmaceutskih kompozicija ovog pronalaska može obuhvatiti mešanje, granuliranje, tabelatiranje i rastvaranje sastojaka. Hemijski nosači mogu biti u čvrstom ili u tečnom obliku. Čvrsti nosači mogu biti laktoza, saharoza, talk, želatin, agar, pektin, magnezijum stearat, masne kiseline, bez ograničenja. Tečni nosači mogu biti sirupi, ulja kao što su maslinovo, suncokretovo ili sojino ulje, voda, ili fiziološki rastvor, bez ograničenja. Slično, nosači mogu takodje sadržati komponente za kontrolisano otpuštanje aktivne komponente, kao što su gliceril monostearat ili gliceril distearat. Nekoliko oblika farmaceutskih kompozicija se može pripremiti. Ukoliko se koristi čvrsti nosač, ovi oblici mogu obuhvatati tabelate, kaplete, čvrste želatinozne kapsule, prahove ili granule, bez ograničenja, koje se mogu primeniti oralno. Količina čvrstog nosača može varirati ali je uglavnom u opsegu od 25 mg do 1 g. Ukoliko se koristi tečni nosač, formulacije mogu biti u obliku sirupa, emulzija, mekih želatinoznih kapsula ili sterilnih injekcionih tečnosti ili bezvodnih tečnih suspenzija.

Jedinjenja ovog pronalaska se mogu primeniti topikalno ili sistemski, kao na primer, oralno, parenteralno, perkutano, mukozalno, kao na primer, bukalno, intranazalno, intrarektalno i intravaginalno. "Parenteralna" ima značenje daje intravenozna, intramuskularna ili subkutana primena. Odgovarajući preparati jedinjenja ovog pronalaska se mogu koristiti u profilaksi kao i u terapijskom tretmanu (prevenciji, odlaganju, inhibiciji ili olakšanju) nekoliko poremećaja (oboljenja i drugih patoloških inflamatornih stanja) prouzrokovanih ili udruženih sa abnormalnim ili neželjenim (prekomernim, neregulisanim ili sa poremećenom regulacijom) inflamatornim imunim odgovorom koji uključuje produkciju inflamatornih citokina ili drugih inflamatornih posrednika, uključujući, bez ograničenja, TNF-a i IL-lp. Ovi poremećaji uključuju autoimuna oboljenja kao što su reumatoidni artritis, insulin-zavisni dijabetes melitus, autoimuni tiroiditis, multiplu sklerozu, uveoretinitis, lupus eritematozus, sklerodermu; druga artritična stanja koja imaju inflamatornu komponentu, kao što su reumatoidni spondilitis, osteoartritis, septični artritis i poliartritis; druge inflamatorne moždane poremećaje, kao što su meningitis, Alchajmerova bolest, AIDS demencija encefalitis, druga inflamatorna stanja oka, kao što je retinitis, inflamatorne poremećaje kože, kao što su ekcem, druge dermatoze (kao na primer, atopične, kontaktne), psorijaze, opekotine uzrokovane UV zračenjem (sunčevi zraci i slični UV izvori); inflamatorna oboljenja creva, kao što su Kronova bolest, ulcerativni kolitis; astma; druge alergijske poremećaje, kao što su alergijski rinitis; stanja udružena sa akutnom traumom, kao što su, cerebralna ozleda nastala nakon pada, ozleda srčanog tkiva nastala zbog ishemije miokarda, ozleda pluća, kao ona koja nastaje kod respiratornog stresnog sindroma kod odraslih; inflamacije udružene sa infekcijama, kao što su sepse, septični šok, sindrom toksičnog šoka, druga inflamatorna stanja udružena sa odredjenim organom ili tkivom, kao što su nefritis (na primer, glomerulonefritis) upala slepog creva, giht, upala žučne kese, hronično obstruktivno oboljenje pluća, kongestivni poremećaj srca, Tip II dijabetes, fibroza pluća, vaskularna oboljenja, kao što su ateroskleroze i restenoze; i aloimunost koja dovodi do odbacivanja transplatanta.

Biološka aktivnost jedinjenja ovog pronalaska je odredjivana u sledećimin vitroi in vivoeksperimentima:

2. Ispitivanje vezivanja za humane glukokortikoidne receptore

Gen za alfa izo-oblik humanog glukokoritkoidnog receptora (EMBL Acc. Br. M10901) je kloniran pomoću reverzne polimeraza lančane reakcije (PCR). Ukupna RNK je izolovana iz humanih limfocita periferne krvi, prema uputstvu proizvodjača (Qiagen), prepisana na cDNK uz pomoć AMV reverzne transkriptaze (Roche), na 50 °C u toku 45 minuta i gen je multiplikovan pomoću specifičnih prajmera

i pfx polimeraze (Invitrogen). PCR stanja su: denaturacija na 94 °C u toku 30 sekundi, odmotavanje na 55 °C u toku 30 sekundi, 68 °C u toku 3 minuta, sa ukupno 36 ciklusa; krajnji ekstenzioni korak na 68 °C u toku 7 minuta. Dobijeni proizvod reakcije je kloniran u XhoI/BamHI mesto na Bluescript KS plazmidu (Stratagene), podvrgnut sekvencioniranju pomoću dideoksi fluorescentne metode sa M13 i M13rev prajmerima (Microsvnth) i zatim je kloniran u XhoI/BamHI mesto na pcDNA3.1 higro (+) plazmidu (Invitrogen Life Technologies). 1 x 10<5>COS-1 ćelija je zasejano u mikrotitarsku ploču sa 12-bunarčića (Falcon) u DMEM medijumu (Invitrogen Life Technologies) sa 10 % FBS (Biowhitaker) i kultivisano do 70 % slivanja na 37 °C u atmosferi sa 5 % C02. Medijum je uklonjen i u svaki bunarčić je dodato 1^g DNK, 7 |al PLUS reagensa i 2 ul Lipofektamina (Life Technologies) u 500 ul DMEM-a. Ćelije su inkubirane na 37 °C u atmosferi sa 5 % C02i nakon 5 sati dodata je ista zapremina 20 % FBS/DMEM-a. Nakon 24 sata, medijum je potpuno izmenjen. 48 sati nakon transfekcije, dodata su testirana jedinjenja, u različitim koncentracijama i 24 nM [<3>H]deksametazona (Pharmacia) u DMEM medijumu. Ćelije su inkubirane u toku 90 minuta na 37 °C u atmosferi sa 5 % C02, isprane tri puta sa puferom PBS (Sigma), ohladjene do 4 °C (pH=7,4) i zatim lizirane u Tris puferu (pH=8.0) (Sigma) sa 0,2 % SDS (Sigma). Nakon dodavanja UltimaGold XR (Packard) scintilacione tečnosti, preostala radioaktivnost je čitana u Tricarb (Packard) p-scintilacionom brojaču.

3. Ispitivanje inhibicije proliferacije mišijeg T-ćelijskog hibridoma 13 kao rezultat indukcije apoptoze

U mikrotitarskoj ploči sa 96 mesta, triplikati testiranih steroidnih rastvora u RPMI medijumu (Institut za imunologiju, Zagreb) sa 10 % FBS, su postavljeni. U rastvore jedinjenja dodato je 20000 ćelija po bunarčiću i inkubirano preko noći na 37 °C u atmosferi sa 5 % C02, zatim je dodato 1 uCi [<3>H]timidina (Pharmacia) i smeša je zatim inkubirana dodatna 3 sata. Ćelije su prikupljene pomoću primene vakuuma preko GF/C filtera (Packard). U svaki bunarčić je dodato 30 ul scintilacione tečnosti, Mikroscinta O (Packard) i izvršeno je merenje inkorporisane radiokativnosti na p-scintilatornom brojaču (Packard). Specifičnost indukcije apoptoze pomoću glukokoritkoida je dokazana pomoću antagonizma inhibicije proliferacije sa mifepristonom (Sigma).

Model plućne eozinofilije kod miševa

Mužjaci Balb/C miševa, telesne težine od 20 - 25 g su slučajnim izborom podeljeni u grupe, i senzibilisani sa i.p. injekcijom ovalbumina (OVA, Sigma) na dan nulti i na dan četrnaesti. Dvadesetog dana, miševi su podvrgnuti testu izazivanja, pomoću i.n.

(intranazalne) aplikacije OVA (pozitivna kontrola ili test grupe) ili PBS (negativna kontrola). 48 sati nakon i.n. aplikacije OVA, životinje su podvrgnute anesteziji i pluća su isprana sa 1 mL PBS-a. Ćelije su odvojene na citocentrifugi Cvtospin 3 (Shandon). Ćelije su obojene u Diff-Quick (Dade) i procenat eozinofila je odredjivan pomoću diferencijalnog brojanja najmanje 100 ćelija.

Flutikazon i beklometazon su korišćeni kao standardne antiinflamatorne supstance.

Jedinjenja su primenjivana dnevno i.n. ili i.p. u različitim dozama, 2 dana pre testa provociranja i sve do završetka trajanja testa. Jedinjenja su primenjivana kao suspenzije bilo u karboksimeitlcelulozi ili u laktoznom rastvoru.

Model supresije kortikosterona i redukcije veličine timusa kod pacova

Mužjaci Wistar pacova sa telesnom težinom izmedju 200 i 250 g su slučajnim izborom podeljeni. Testirana jedinjenja i standardni glukokortikoidi su aplicirani pomoću s.c. primene, jednom dnevno, u toku tri dana. Na dan treći, pacovi su podvrgnuti hladnom stresu (4 °C, u toku jednog sata), podvrgnuti anesteziji saTiopenetal (Pliva Inc.) i uzeta je krv na heparinu. Kompletan timus je uklonjen svakoj životinji, čija je težina merena odmah po uklanjanju. Plazma je skladištena na -70 °C sve do momenta vršenja analize. Kortikosteron je ekstrahovan sa hloroformom (5 mL) iz 1 mL plazme, ili iz standardnog rastvora kortikosterona u PBS, medju-referentno jedinjenje je isprano sa 0,1 M NaOH i dodata je smeša, sumporna kiselina: H20 : C2H5OH =8:2:1. Fluorescencija je merena 60 minuta kasnije, talasna dužina ekscitacije / emisije je bila 470/530. b) Odredjivanje sekrecije TNF-a i IL-ip u mononuklearnim ćelijama humane periferne krviin vitro.

Mononuklearne ćelije periferne krvi (PMBC) su pripremljene iz heparinizovane cele krvi nakon razdvajanja PMBC na Ficoll-Hypaque (Amersham-Pharmacia). Za odredjivanje nivoa TNF-a, kultivisano je 3,5-5 x IO<4>ćelija u ukupnoj zapremini od 200 \ i\ u toku perioda od 18 do 24 sata u mikrotitarskoj ploči sa ravnim dnom (96 bunarčića, Falcon) u RPMI1640 medijumu obogaćenom sa 10 % humanog AB seruma koji je inaktivisan zagrevanjem (Hrvatski centar za transfuzionu medicinu, Zagreb), 100 jedinica /mL penicilina, 100 mg / mL streptomicina i 20 mM HEPES (Invitrogen Life Technologies). Ćelije su inkubirane na 37 °C u atmosferi sa 5 % C02i 90 % vlage. Ćelije u negativnoj kontroli su kultivisane samo u medijumu (NC), dok je sekrecija TNF-a u pozitivnoj kontroli stimulisana pomoću dodatka1 \ ig/ mLlipopolisaharida (LPS,E. coliserotip 0111: B4, SIGMA) (PC) a efekat testiranih supstanci na sekreciju TNF-a je ispitivan nakon njihovog dodavanja u kulturu ćelija stimulisanih sa LPS( TS).Nivo TNF-a u ćelijskom supernatantu je odredjen pomoću ELISA testu, prema uputstvu proizvodjača (R&D Svstems). Osetljivost testa je bila < 3 pg / mL TNF-a. Odredjivanje nivoa IL-ip je izvedeno kako je opisano za odredjivanje TNF-a, sa jedinom razlikom da je korišćeno 1 x IO<5>ćelija / bunarčiću i 0,1 ng / mL LPS-a. Nivo IL-ip je odredjen pomoću ELISA (R&D Svstems). Procenat inhibicije produkcije TNF-a ili IL-ip je obračunat pomoću sledeće jednačine: IC-50 vrednost je definisana kao koncentracija supstance pri kojoj je inhibirano 50 % produkcije TNF-a. Jedinjenja koja su pokazala IC-50 pri koncentraciji od 20 uM ili nižoj, su smatrana aktivnim. IC-50 je obračunata korišćenjem softvera Graf Pad Prizm.

c) Odredjivanje sekrecije TNF-a pomoću RAW 264,7 ćelija

Ćelije su gajene u 10 % fetalnog govedjeg seruma (FBS) u DMEM medijumu

(Invitrogen Life Technologies) na 37 °C u atmosferi sa 5 % C02i 90 % vlage. 20 000 ćelija / bunarčiću, je postavljeno u mikrotitarskoj ploči sa 96 bunarčića (Falcon). Ćelije u negativnoj kontroli su kultivisane samo u medijumu (NC), dok je sekrecija TNF-a u

pozitivnoj kontroli stimulisana pomoću dodavanja 500 pg/mL lipopolisaharida (LPS,E. coti serotip0111: B4, SIGMA) (PC) a efekat testiranih supstanci na sekreciju TNF-a je ispitivan nakon njihovog dodavanja u kulturu ćelija stimulisanih sa LPS (TS). Nivo TNF-a u ćelijskom supernatantu je odredjen pomoću ELISA testa, prema uputstvu proizvodjača (R&D Svstems, Biosource). Procenat inhibicije produkcije TNF-a je obračunat pomoću sledeće jednačine:

IC-50 vrednost je definisana kao koncentracija supstance pri kojoj je inhibirano 50 % produkcije TNF-a. Jedinjenja koja su pokazala IC-50 pri koncentraciji od 10 uM ili nižoj, su smatrana aktivnim. IC-50 je obračunata korišćenjem softvera Graf Pad Prizm.

Ispitivanje inhibicije humane Prostaglandin - H sintaze -1 (hPGH -1) i humane Prostaglandin - H sintaze -2 (hPGH - 2)

Geni koji kodiraju za hPGH -1 i hPGH - 2 su amplificirani sa PCR korišćenjem platinske pfx DNK polimeraze (Invitrogen Life Technologies) iz cDNK baze za humanu placentu (Stratagene). Prajmeri sekvence korišćene za hPGH-1 su:

5' ATATGGATCCCTACAGTTCAGTTCAGTCGAACGTTC 3'. PCR proizvodi su klonirani u Hindlll i BamHI restrikcionim mestima na pcDNAS.l Higro (+) plazmidu (Invitrogen Life Technologies), a sekvence su potvrdjene sekvencioniranjem.

Transfekcija je izvedena na COS-7 ćelijama (ATCC), ćelije su rasle u 10 % fetalnog govedjeg seruma (FBS) u DMEM medijumu (Invitrogen Life Tecnologies), na 37 °C u atmosferi sa 5 % C02i 90 % vlage, do postizanja pune konfluentnosti u mikrotitarskoj ploči sa 24 bunarčića (Falcon). 1 |ag plazmidne DNK (pcDNA Higro 3.1 (+) koja sadrži PGH-1 ili PGH-2 gene ili pcDNA Higro 3.1 (+) za uzorke negativne kontrole) je kombinovana sa 1,5 ul Lipofektamina 2000 (Invitrogen Life Technologies), prateći preporuke proizvodjača. 24 - 48 sata nakon transfekcije, dodata su testirana jedinjenja u DMEM, u ćelije bez odstranjivanja medijuma i nakon 40 minuta, dodata je arahidonska kiselina (Sigma) do finalne koncentracije od 20 uM. Nakon 30 minuta, uklonjen je supernatant i PGE-2 je merena korišćenjem PGE-2 analitičkog kita (Cavman) prateći instrukcije proizvodjača. U negativnoj kontroli nije detektovana produkcija PGE-2.

% inhibicije je obračunat pomoću sledeće jednačine:

d)Li vivomodel prekomerne sekrecije TNF-a indukovane sa LPS kod miševa

Sekrecija TNF-a kod miševa je indukovana prema ranije opisanoj metodi (Badger A. M. isar., J. ofPharmac. AndEnv. Therap. 2791996 1453-1461). U testu su korišćeni mužjaci miševa BALB/c starosti od 8 do 12 nedelja u grupama od po 6 do 10 životinja. ŽVivotinje su tretirane p.o. bilo samo sa rastvaračem (u negativnoj i pozitivnoj kontroli) ili sa rastvorom supstanci, 30 minuta pre i.p. treatmana sa LPS( E. coliserotip0111: B4, Sigma) u dozi od 25 ug/po životinji. Dva sata kasnije, životinje su eutanizovane pomoću i.p. injekcija Roumpuna (Bayer) i Ketanesta (Park-Davis). Uzorak krvi iz svake životinje je sakupljen u "vakutaner" epruvetama (Becton Dickinson) i odvojena je plazma, prema uputstvu proizvodjača. Nivo TNF-a u plazmi je odredjen pomoću ELISA testa

(Biosource, R&D Svstems) prema postupku propisanom od strane porizvodjača. Osetljivost testa je bila <3 pg / mL TNF-a. Procenat inhibicije produkcije TNF-a je obračunat pomoću sledeće jednačine:

Jedinjenja koja su pokazivala 30 % ili više, inhibicije produkcije TNF-a pri dozi od 10 mg/kg su smatrana aktivnim.

e) Ispitivanje pojave abdominalnog grča za odredjivanje analgetičke aktivnosti

U ovom testu, bolje indukovan sa injekcijom nekog iritanta, obično sirćetne kiseline, u peritonealnu šupljinu miša. Životinje reaguju sa karakterističnim abdominalnim grčevima, što je dalo ime testu (Writhing assay) (Collier H. 0. J. i sar.Pharmac. Chemother. 1968, 32,295- 310; Fukawa K. isar. J. Pharmacol. Meth., 1980, 4,251 - 259; Schweizer A. i sar.Agents Actions, 1988, 23,29- 31). Ovaj test je pogodan za odredjivanje analgetičke aktivnosti jedinjenja. Postupak: korišćeni su mužjaci BALB-/c miševa (Charles River, Italy) starosti od 8 do 12 nedelja. Aplicirana je metil celuloza, p.o. u kontrolnoj grupi, 30 minuta pre i.p. aplikacije sirćetne kiseline u koncentraciji od 0,6 %, dok su u testiranoj grupi aplicirane standardna (acetil salicilna kiselina) ili test supstance u metil celulozi, p.o. 30 minuta pre i.p. aplikacije 0,6 % sirćetne kiseline (zapremine 0,1 mL/10 g). Miševi su pojedinačno postavljeni pod staklene komore i beležen je broj abdominalnih grčeva kod svake životinje u toku perioda od 20 minuta. Procenat inhibicije abdominalnih grčeva je obračunat prema jednačini: % inhibicije = (srednja vrednost broja abdominalnih grčeva u kontrolnoj grupi - broj abdominalnih grčeva u testiranoj grupi) / broj abdominalnih grčeva u kontrolnoj grupi x 100.

Jedinjenja koja su pokazala istu ili bolju analgetičku aktivnost nego acetil salicilna kiselina, su smatrana aktivnim.

In vivo Modelsa LPS indukovanim šokom kod miševa

Mužjaci BALB/c miševa, starosti od 8 do 12 nedelja (Charles River, Italy) su korišćeni. LPS izolovan izSerratie marcessans(Sigma, L- 6136) je rastvoren u sterilnom fiziološkom rastvoru. Prva LPS injekcija je aplicirana intradermalno u dozi od 4 |ig / mišu. 18 do 24 sata kasnije, LPS je apliciran i.v. u dozi od 200 [ ig / mišu. U kontrolnoj grupi, dve LPS injekcije su aplicirane na gore opisani način. Kod test grupe su aplicirane supstance p.o., pola sata pre svake LPS aplikacije. Posmatrano je preživljavanje nakon 24 sata.

Jedinjenja koja su dala 40 % ili bolje preživljavanje pri dozi od 30 mg/kg su smatrana aktivnim.

Jedinjenja su smatrana aktivnim ukoliko su pokazivala statistički značajan (pomoću Student's t-test, p < 0,05) rezultat u najmanje dva od prethodnih testova. Molaraa količina korišćenih jedinjenja je ispod praga količine makrolida (iznad 30 ug) za ispoljavanje blagog antiinflamatornog delovanja, kako je zabeleženo u literaturi. (ii)In vitroanaliza za skrining inhibitornog delovanja na HIV replikaciju T4 - ćelijska linija je transformisana sa HIV-1. MT-4, koja je ranije pokazala (Kovanagi i sar.,Int. J. Cancer, 36,445- 451,1985) da je jako podložna HIV infekciji, je poslužila kao ciljana ćelijska linija. Inhibicija HlV-indukovanog citopatičnog efekta je korišćena kao krajnja tačka. Vijabilnost i HIV- i lažno inficiranih ćelija je odredjivana spektrofotometrijski preko in situ redukcije MTT. 50 % -tna citotoksična koncentracija je definisana kao koncentracija jedinjenja koja smanjuje adsorbancu u odnosu na kontrolnu u lažno inficiranim uzorcima, za 50 %. Procenat zaštite postignute sa jedinjenjima u HIV inficiranim ćelijama je obračunat kao optička gustina merena sa datom koncentracijom testiranog jedinjenja u HIV inficiranim ćelijama. Meren je odnos izmedju citotoksičnog i zaštitnog efekta. (iii)Li vitroanaliza za skrining inhibitornog delovanja na HCV replikaciju Aktivnost novih jedinjenja je odredjivana korišćenjem modifikovanog metoda koji su dali Lohmann i sar. [V. Lohmann i sar.,Science, 1999, 285,110-113].

Ćelijska linija koja je sadržala HCV replikon je korišćena za pokazivanje sposobnosti novih jedinjenja da inhibiraju replikaciju HCV replikonske RNK u ćelijama. Inhibicija replikacije HCV replikonske RNK će dovesti do smanjenja replikonske RNK

u ćeliji, što se može meriti korišćenjem metoda koji specifično kvantifikuje takvu RNK.

[0039] Analiza je zasnovana na ideji da se koristi reporter kao jednostavan čitač za intracelularni nivo HCV replikonske RNK. U te svrhe uveden je Renila luciferaza gen u prvi otvoreni okvir čitanja replikonske konstrukcije NK5.1 (Krieger i sar.,J. Virol 75.4614), odmah nakon unutrašnje sekvence ulaznog mesta u ribozomu (IRES) i spojen sa genom neomicin fosfotransferaze (NPTII) preko samo cepajućeg peptida 2A iz virusa koji izaziva oboljenje stopala i usta (Ryan & Drew, EMBO Vol 13: 928 - 933). Nakonin vitro transkripcijeRNK je ubačena u ćelije humanog hepatoma Huh7 i izolovane su G418 rezistentne kolonije koje su proširene. Postojana odabrana ćelijska linija je pokazala da sadrži replikativnu HCV subgenomsku RNK, i da se aktivnost Renila luciferaze eksprimira, pomoću toga što replikon reflektuje njen nivo RNK u ćelijama.

Za analitički postupak, HCV replikonske ćelije Renila Luciferaze koje su kultivisane u Dulbecco's MEM Invitrogen Kat. Br. 31966 - 021) sa 5 % fetalnim kravljim serumom (FCS) (Invitrogen Kat. Br. 10106 -169) su postavljene u mikrotitarsku ploču sa 96 bunarčića sa 5000 ćelija po bunarčiću i inkubirane preko noći. Dvadeset četiri sata kasnije, različita razblaženja hemijskih jedinjenja u medijumu za rast, su dodata u ćelije, koje su zatim dalje inkubirane na 37 °C u toku tri dana. Analiza je izvedena u duplim pločama, gde su jedne neprozirno bele a druge su providne, u cilju paralelnog odredjivanja aktivnosti i citotoksičnosti hemijskih jedinjenja, osiguravajući da dobijena aktivnost nije zbog redukcije ćelijske proliferacije.

Na kraju inkubacionog perioda, ćelije u belim pločama su prikupljene i odredjivana je aktivnost luciferaze pomoću korišćenja Dual-Luciferaza reporter analitičkog sistema (Promega Kat. Br. E1960). Svi reagensi opisani u narednom poglavlju su uključeni u proizvodjački kit i praćene se proizvodjačke instrukcije za pripremu reagenasa. Ukratko, ćelije su isprane dva puta sa 200 |aL PBS (rastvor fosfatnog pufera; pH 7.0) po bunarčiću i lizirane sa 25 \ iL pufera 1 x pasivne lize pre inkubacije na sobnoj temperaturi u toku 20 min. Sto mikrolitara LARII reagensa je dodato u svaki bunarčić. Ploča je zatim ubačena u mikrotitarski luminometar (Packard), i 100 |aLStop & Glo reagensa je injektirano u svaki bunarčić i merena je luminiscencija. Vrednost IC 50, koncentracija leka potrebna za redukciju nivoa replikona za 50 % u odnosu na vrednost za netretirane kontrolne ćelije, se može obračunati iz dijagrama procenta redukcije aktivnosti luciferaze u zavisnosti od koncentracije leka.

In vitroanaliza za antineoplastičnu aktivnost

EL-4 ćelijska linija je korišćena za skrining antineoplastične aktivnostiin vitro.Ćelije su gajene u DMEM medijumu (Invitrogen) obogaćenom sa 10 % FBS (Invitrogen), na 37 °C, 5 % CO2i 90 % relativne vlage. Analiza je izvedena u mikrotitarskoj ploči sa 96 bunarčića, sa razblaženjima jedinjenja u opsegu od 10 - 5 do 10

-10 M, i sa 30000 ćelija po bunarčiću. Nakon 24 sata tretmana, dodat je 3H obeležen timidin (Amersham) u toku 4 sata. Ćelije su prikupljene u prikupljaču ćelija (Packard) korišćenjem GF/C filtera (Packard). Dodata je scintilaciona tečnost (Microscint 20, Packard) i brojanaje scintilacija.

L1210 i.p. tumor model

106 vijabilnih ćelija je aplicirano i.p. u DBA2 miševe (mužjaci 9 -12 nedelja, 20 - 30

g) u danu 0. Životinje su nakon toga tretirane sa, bilo pojedinačnim ili multiplim i.p. dozama, u danima 1,2 i 3 sa cisplatinom ili sa hibridnim jedinjenjima. Žvivotinje su

merene dnevno i posmatrane dva puta dnevno da bi se uočili znaci progresije tumora i žrtvovane kada je njihova težina padala ispod 80 % od polazne ili ako su se videli drugi znaci jakih toksikoloških problema. Na kraju eksperimenta, promene u ukupnoj anatomiji su zabeležene.

B16 melanom i.p. model

Mužjaci C57BL/6J miševa su inokulisani sa 106 vijabilnih ćelija B16F10, intraperitonealno (i.p). Ćelije su injektirane u danu 0 i slobodan cisplatin ili hibridno jedinjenje je injektiran kao pojedinačna ili multiple doze i.p. u narednim danima. Životinje su posmatrane kako je gore opisano.

B16 melanom s.c. model

Mužjaci C57BL/6J miševa su inokulisani sa 105 vijabilnih ćelija B16F10, subkutano (s.c). Omogućeno je da se tumor uspostavi dok oblast nije dostigla oko 50 - 70 mm<2>, kako je mereno pomoću proizvoda dva ortogonalna prečnika. Životinje koje su imale s.c. tumore su tretirane sa, bilo i.p. ili i.v., injekcijama slobodnog cisplatina ili hibridnih jedinjenja 19 - 21 sa 2, 5,10,15 mg Pt / kg.

METODE SINTEZE IPRIMERI

PROIZVODNJA INTERMEDHERA

Intermedijer A

2-Hlortritilhloridna smola (1 ekv. = 0,5 mmol, 600 mg) je postavljena u staklenu

kolonu podešenu sa frit filterom od krupnog stakla i namočen da nabubri u DCM u toku 10 min. Zatim je smola filtrirana i isprana tri puta sa DCM. Nakon pranja sa DMF smola je napunjena sa N-R-Fmok-Glicinom, dodavanjem 2,0 mL 0,6 M rastvora aminoksieline u DMF i 0,630 ml N,N-diizopropiletilamina (DIPEA) i mešana. Nakon 5 min, dodato je 0,315 ml DIPEA. Nakon mešanja u toku 50 min, dodata je količina od 0,5 ml metanola. Nakon 10 min, smola je filtrirana i isprana deset puta sa DCM, DMF i metanolom.

DEPROTEKCITA

Različiti rastvori piperidina u DMF su pripremljeni i postavljeni preko kuglica, kao što sledi:

5 % piperidin / DMF 10 min (-10 ml)

30 % piperidin / DMF 15 min (-10 ml)

50 % piperidin / DMF 30 min (-10 ml)

Nakon deprotekcije, smola je isprana sa DMF.

Druga aminokiselina, Fmok-Leucin(1060 mg, 3 mmol) i 2-(l H-Benzotriazol-lil)-1,1,3,3-tetrametiluranijum heksafluorofosfat (HBTU) su rastvoreni u 3mL

DMF i sa 0,216 mL (5 mmol) DIPEA su dodati brzo i istovremeno u smešu monomer/ smola u reakcionoj boci.

ZATVARANTE:

Pripremljen je rasatvor 10 ekv. (2,04 ml) sirćetnog anhidrida i 10 ekv. (3,48 ml) DIPEA u 5 ml DMF. 2,5 ml ovog rastvora je dodato u reakcionu smešu u toku 5min.

Druga aminokiselina je deprotektovana sa rastvorom piperidina u DMF, kao što sledi:

30 % piperidin / DMF 2 min (~10 ml)

30 % piperidin / DMF 2 min (~10 ml)

30 % piperidin / DMF 5 min (~10 ml)

30 % piperidin / DMF 5 min (~ 10 ml)

i isprana sa velikom količinom DMF-a.

Isti postupak spajanja i deprotekcije je ponovljen za treću aminokiselinu Fmok-Fenilalanin, 1162 mg, 3 mmol

HBTU,1081mg / 3 ml DMF

DIPEA, 0,87 ml

i za četvrtu aminokiselinu

Fmok-Glicin, 892 mg, 3 mmol

HBTU, 1081 mg / 3 ml DMF

DIPEA, 0,87 ml

nakon čega je sledila filtracija i ispiranje sa DMF.

U smešu tetrapeptid / smola, u reakcionoj boci, dodata je smeša deksametazonske kiseline (567 mg, 3 ekv.), HBTU (540 mg, 3,8 ekv.) i 0,435 ml DIPEA u 3 ml DMF promešano je i ostavljeno da stoji preko noći.

ZATVARANTE:

Rastvor sa 0,5 ml sirćetnog anhidrida i 0,5 ml DIPEA u 3 ml DMF je dodat u reakcionu smešu u toku 5 min, nakon čega je ispiran sa DCM, DMF i MeOH i sušen pod vakuumom.

ODVAJANJE OD SMOLE

10 ml rastvora 50 % trifluorosirćetne ksieline u DCM je stavljen preko kuglica i mešan u toku 15 min. Reagensi su uklonjeni filtracijom i kuglice su isprane 2 x sa DCM. Ista procedura je ponovljena sa sledećih 10 ml kiseline.

Prikupljeni rastvarač je uparen uklanjanjem suvišnog TFA sa dodatkom količine dietiletra. 60,1 mg Intermedijera A je izolovano MS( m/ z) :753,3 [MH]<+>

Primer I

Jedinjenje 1 (Deksametazon-Gli-Fe-Leu-Gli-Azitromicin)

Intermedijer A (57 mg; 0,076 mmola) je rastvoren u suvom CH2C12(5 mL) u inertnoj atmosferi i ohladjen do 0 °C. 0,115 mL N,N-diizopropiletilamina i 20,5 mg 1-hidroksibenzotriazola je dodato, nakon čega je dodato jedinjenje 9-deokso-9a-aza-9a-(y-aminopropil)-9a-homoeritromicin A (60 mg; 0,076 mmola) i l-(3-dimetilaminopropil)-3-etil-karbodiimid hidrohlorida (57,6 mg, 0,30 mmol). Reakciona smeša je mešana u struji argona na sobnoj temperaturi u toku 24 sata i zatim uparena do manje zapremine pod sniženim pritiskom i prečišćena na koloni sa silika gelom (uz eluent: CHC13 : CH3OH : NH4OH = 6:1: 0,1). Dobijeno je 14 mg jedinjenja 1; MS( m/ z) :1527,3 [MH]<+>. IR (cm"<1>) / KBr: 3415,2969,2939,2874,1664,1528,1458,1378,1262,1168,1107,1054,1013,959, 894, 803,702.

Intermedijer B

2-Hlortritilhloridna smola (1 ekv. = 0,5 mmol, 600 mg) je postavljena u staklenu kolonu podešenu sa frit filterom od krupnog stakla i namočena da nabubri u DCM u toku 10 min. Zatim je smola filtrirana i isprana tri puta sa DCM. Nakon pranja sa DMF smola je napunjena sa N-R-Fmok-Glicinom, dodavanjem 2,0 mL 0,6 M rastvora aminoksieline u DMF i 0,630 ml N,N-diizopropiletilamina (DIPEA) i mešana. Nakon 5 min, dodato je 0,315 ml DIPEA. Nakon mešanja u toku 50 min, dodata je količina od 0,5 ml metanola. Nakon 10 min, smola je filtrirana i isprana deset puta sa DCM, DMF i metanolom.

DEPROTEKCITA

Različiti rastvori piperidina u DMF su pripremljeni i postavljeni preko kuglica, kao što sledi:

5 % piperidin / DMF 10 min (-10 ml)

30 % piperidin / DMF 15 min (-10 ml)

50 % piperidin / DMF 30 min (-10 ml)

Nakon deprotekcije, smola je isprana sa DMF.

Druga aminokiselina, Fmok-Leucin(1060 mg, 3 mmol) i 2-(l H-Benzotriazol-lil)-1,1,3,3-tetrametiluranijum heksafluorofosfat (HBTU) su rastvoreni u 3mL

DMF-a i sa 0,216 mL (5 mmol) DIPEA su dodati brzo i istovremeno u smešu monomer/smola u reakcionoj boci.

ZATVARANTE:

Pripremljen je rastvor 10 ekv. (2,04 ml) sirćetnog anhidrida i 10 ekv. (3,48 ml) DIPEA u 5 ml DMF. 2,5 ml ovog rastvora je dodato u reakcionu smešu u toku 5min.

Druga aminokiselina je deprotektovana sa rastvorom piperidina u DMF, kao što sledi:

30 % piperidin / DMF 2 min (~10 ml)

30 % piperidin / DMF 2 min (~10 ml)

30 % piperidin / DMF 5 min (~10 ml)

30 % piperidin / DMF 5 min (~10 ml)

i isprana sa velikom količinom DMF-a.

Isti postupak spajanja i deprotekcije je ponovljen za treću aminokiselinu Fmok-Fenilalanin, 1162 mg, 3 mmol

HBTU, 1081 mg / 3 ml DMF

DIPEA, 0,87 ml

i za četvrtu aminokiselinu

Fmok-Glicin, 892 mg, 3 mmol

HBTU, 1081 mg / 3 ml DMF

DIPEA, 0,87 ml

Samo nakon spajanja četvrte aminokiseline Fmok protektivna grupa nije uklonjena.

Nakon filtracije i ispiranja sa DMF, proizvod je uklonjen iz smole:

10 ml 50 % rastvora trifluorosirćetne kiseline u DCM je stavljeno preko kuglica i mešano u toku 15 min. Reagensi su uklonjeni filtracijom i kuglice su isprane 2 x sa DCM. Isti postupak je ponovljen sa sledećih 10 ml kiseline. Prikupljeni rastvarač je uparen uklanjanjem suvišnog TFA sa dodatkom količine dietiletra. Izolovano je 109,1 mg IntermedijeraB. MS( m/ ž)\715,6 [MH]<+>

Intermedijer BI

2-Hlortriitlhloridna smola (1 ekv. = 0,352 mmol, 326 mg) je postavljena u staklenu kolonu podešenu sa frit filterom od krupnog stakla i namočena da nabubri u DCM u toku 10 min. Zatim je smola filtrirana i isprana tri puta sa DCM. Nakon pranja sa DMF smola je napunjena sa jedinjenjem intermedijer BI, dodavanjem 259 mg (0,422 mmol) rastvorenih u DMF i 0,150 ml N,N-diizopropiletilamina (DIPEA) i mešana. Nakon 5 min, dodato je 0,230 ml DIPEA. Nakon mešanja u toku 50 min, dodata je količina od 0,355 ml metanola. Nakon 10 min, smola je filtrirana i isprana deset puta sa DCM, DMF i metanolom.

DEPROTEKCITA

Različiti rastvori piperidina u DMF su pripremljeni i postavljeni preko kuglica, kao što sledi:

5 % piperidin / DMF 10 min (-10 ml)

30 % piperidin / DMF 15 min (-10 ml)

50 % piperidin / DMF 30 min (-10 ml)

Nakon deprotekcije, smola je isprana sa DMF.

377 mg (1,055 mmol) indometacina i 533 mg (1,41 mmol) 2-(l-H-Benzotriazol-lil)-l,l,3,3-tetrametiluranijum heksafluorofosfata (HBTU) je rastvoreno u 3 mL DMF i sa 0,602 mL (3,52 mmol) DIPEA su dodati brzo i istovremeno u smešu polimer/smola u reakcionoj boci.

ZATVARANTE:

Rastvor sa 0,5 ml sirćetnog anhidrida i 0,5 ml DIPEA u 3 ml DMF je dodat u reakcionu smešu u toku 5 min, filtriran i ispran sa DCM, DMF i MeOH.

ODVATANTE OD SMOLE

10 ml 50 % rastvora trifluorosirćetne kiseline u DCM je stavljeno preko kuglica i mešano u toku 15 min. Reagensi su uklonjeni filtracijom i kuglice su isprane 2 x sa DCM. Isti postupak je ponovljen sa sledećih 10 ml kiseline.

Prikupljeni rastvarač je uparen uklanjanjem suvišnog TFA sa dodatkom količine dietiTetra. Izolovano je 210,8 mg proizvoda intermedijera B. MS( m/ z) :732,66 [MH]<+>

Primer II

Jedinjenje 2 (Indometacin-Gli-Fe-Leu-Gli- Azitromicin)

Intermedijer B (200 mg; 0,27 mmol) je rastvoren u suvom CH2C12(5 mL) u inertnoj atmosferi. 0,416 mL (2,14 mmol) N,N-diizopropiletilamina i 74 mg (0,55 mmol) 1-hidroksibenzotriazola je dodato, nakon čega je dodato jedinjenje 9-deokso-9a-aza-9a-(y-aminopropil)-9a-homoeritromicin A (216,6 mg; 0,27 mmol) i l-(3-dimetilaminopropil)-3-etil-karbodiimid hidrohlorida (188 mg, 1,09 mmol). Reakciona smeša je mešana u struji argona na sobnoj temperaturi u toku 24 sata i zatim uparena do manje zapremine pod sniženim pritiskom i prečišćena na koloni sa silika gelom (uz eluent: CHCI3: CH3OH : NH4OH = 6:1: 0,1). Dobijeno je 70 mg jedinjenja 2; MS( m/ ž) :1505,8 [MH]<+>. IR (cm<1>) / KBr: 3654,3633,3425,3084,2970,2936,1720,1652,1637,1545,1439,1368,1309,1230, 1179,1111,1089,1055,1013,867, 803,739,700,643.

Primer III

Prateći opšti postupak iz primera I i tamo zamenjujući odgovarajuće reagense, dobijena su sledeća jedinjenja:

Jedinjenje 3: Ri= F; R2= F; R3= OH

Jedinjenje 4: ^ = F; R2= H; R3= H

Jedinjenje 5; Rx= F; R2= F; R3= H

Jedinjenje 6: Rx= H; R2= F; R3= OH

Primer IV

Prateći opšti postupak iz primera II i tamo zamenjujući odgovarajuće reagense, dobijena su sledeća jedinjenja:

Primer V

Jedinjenje 19

U rastvor paklitaksel sukcinata (1 ekv.) u suvom CH2C12(5 mL) u atmosferi argona je dodato 9 ekvivalenta trietilamina, 2 ekvivalneta 1-hidroksibenzotriazola, 1 ekvivalent 9-deokso-9a-aza-9a-(Y-aminopropil)-9a-homoeritromicina A i 4 ekvivalenta l-(3-dimetilaminopropil)-3-etil-karbodiimid hidrohlorida. Reakciona smeša je mešana u struji argona na sobnoj temperaturi u toku 24 sata i zatim uparena do manje zapremine pod sniženim pritiskom i prečišćena na koloni sa silika gelom uz korišćenje hloroforma, metanola i amonijaka kao eluenta. Hromatografisani proizvod je okarakterisan sa strukturnom formulom:

Primer VI

Jedinjenje 20

U rastvor kamptotecin sukcinata (1 ekvivalent) u suvom CH2C12(5 mL) u atmosferi argona je dodato 9 ekvivalenta trietilamina, 2 ekvivalenta 1-hidroksibenzotriazola, 1 ekvivalent 9-deokso-9a-aza-9a-(y-aminopropil)-9a-homoeritromicina A i 4 ekvivalenta l-(3-dimetilaminopropil)-3-etil-karbodiimid hidrohlorida. Reakciona smeša je mešana u struji argona na sobnoj temperaturi u toku 24 sata i zatim uparena do manje zapremine pod sniženim pritiskom i prečišćena na koloni sa silika gelom uz korišćenje hloroforma, metanola i amonijaka kao eluenta. Hromatografisani proizvod je okarakterisan sa strukturnom formulom:

Primer VII

Jedinjenje 21

U rastvor y-metil-Af'- [4- [A^-[(2,4-diamino-6-pteridinil)metil]- N-metilamino]benzoil]-L-glutamata (1 ekvivalent) u suvom DMF u atmosferi argona, je dodato 2 ekvivalenta 1,1-karbonildiimidazola (u 5 mL DMF). Reakciona smeša je mešana u toku 24 sata na -5 °C i zatim je dodat 1 ekvivalent jedinjenja 9-deokso-9a-aza-9a-(y-aminopropil)-9a-homoeritromicina A u suvom DMF. Reakciona smeša je zagrevana 48 sati na 100 °C a zatim uparena i prečišćena na koloni sa silika gelom uz korišćenje hloroforma, metanola i amonijaka kao eluenta. Hromatografisani proizvod je okarakterisan sa strukturnom formulom:

Primer VIII

Jedinjenje 22

U rastvor5 - 0-sukcinilzidovudina (1 ekvivalent) u suvom CH2CI2(5 mL) u atmosferi argona, je dodato 9 ekvivalenta trietilamina, 2 ekvivalenta 1-hidroksibenzotriazola, 1 ekvivalent 9-deokso-9a-aza-9a-(y-aminopropil)-9a-homoeritromicina A i 4 ekvivalenta l-(3-dimetilaminopropil)-3-etil-karbodiimid hidrohlorida. Reakciona smeša je mešana u toku 24 sata na sobnoj temperaturi u struji argona i zatim uparena do manje zapremine pod sniženim pritiskom i prečišćena na koloni sa silika gelom uz korišćenje hloroforma, metanola i amonijaka kao eluenta. Hromatografisani proizvod je okarakterisan sa strukturnom formulom:

Skraćenice:

Pir: piridin

NEt3: trietilamin

4-PP: 4-pirolopiridin DMAP: 2,6-dimetilaminopiridin DIPEA: A^'-diizopropiletilamin DMF: dimetilformamid TFA: trifluorosirćetna kiselina

Claims (14)

1. Jedinjenje sa formulom I: gde M predstavlja makrolidnu podjedinicu koja poseduje svojstvo akumulacije u inflamatornim ćelijama; V je anti-inflamatorna steroidna ili nesteroidna antiinflamatorna podjedinica ili antineoplastična podjedinica ili antiviralna podjedinica; i L je povezujući molekul za koji su i M i V kovalentno vezani; i njihove farmaceutski prihvatljive soli i solvati i njihovi pojedinačni dijasteroizomeri.

2. Jedinjenje prema zahtevu 1 gde M predstavlja grupu sa Formulom II: (i) Z i W su, nezavisno jedan od drugog: >C=0, >CH2, >CH-NRtRg, >N-RNili >C=N-Rmili veza, gde: Rti Rg nezavisno jedan od drugog, su vodonik ili alkil; RMje hidroksi, alkoksi, supstituisan alkoksi ili OR<p>; RNje vodonik, R<p>, alkil, alkenil, alkinil, alkoksi, alkoksialkil, ili -C(X)-NRtRs; gde X je =0 ili =S; obezbedjujući da Z i W ne mogu u isto vreme biti >C=0, >CH2, >CH-NRtRs, >N-RNili >C=N-RMili veza, (ii) U i Y su, nezavisno jedan od drugog, vodonik, halogen, alkil, ili hidroksialkil; (iii) R<1>je hidroksi, OR<p>, -O-S<2>grupa ili =0; (iv) S<1>je saharidni ostatak sa formulom: gde R<8>i R<9>su oba vodonik ili zajedno formiraju vezu, ili R<9>je vodonik i R<8>je - N(CH3)R<y>,gde Ry je R<p>, R<z>ili -C(0)R<z>gde Rz je vodonik ili alkil ili alkenil ili alkinil ili cikloalkil ili aril ili heteroaril ili alkil supstituisan sa C^CT-alkil, C^CV alkenil, C^CT-alkinil, aril ili heteroaril R10 je vodonik ili RP; (v) S<2>je saharidni ostatak sa formulom: gde: R<3>' je vodonik ili metil; R<11>je vodonik, R<p>ili O-R<11>je grupa koja saR1<2>i sa C/4" ugljenikovim atomom formira >C=0 ili epoksi grupu; R<12>je vodonik ili grupa koja sa O-R<11>grupom i sa C/4" ugljenikovim atomom formira >C=0 ili epoksi grupu; (vi) R<2>je vodonik, hidroksi, OR<p>ili alkoksi (vii) A je vodonik ili metil; (viii) B je metil ili epoksi; (ix) E je vodonik ili halogen; (x) R<3>je hidroksi, OR<p>, alkoksi ili R<3>je grupa koja sa R<5>i sa C/11 i C/12 ugljenikovim atomima formira ciklični karbonat ili karbamat; ili ako W ili Z je >N-RN, R<3>je grupa koja sa W ili Z formira ciklični karbamat; (xi) R<4>jeCrC4 alkil; (xii) R<5>je vodonik, hidroksi, ORP, Ci-C4-alkoksi, ili grupa koja sa R<3>i sa C/11 i C/12 ugljenikovim atomima formira ciklični karbonat ili karbamat; (xiii) R<6>je vodonik ili CrC4-alkil; gde M ima povezujuće mesto preko koga je povezan za V preko povezujuće grupe L; obezbedjujući daje povezujuće mesto jedno ili više od sledećih: a) svaka reaktivna hidroksi, azotna ili epoksi grupa locirana na S<1>, S<2>ili jedan aglikoni kiseonik ako je S<1>i/ili S<2>odcepljen; b) reaktivni >N-RNili -NRtRsili =0 grupa locirana na Z ili W; c) reaktivna hidroksi grupa locirana na bilo kom od R<1>, R<2>, R<3>i R<5>; d) bilo koja druga grupa koja se može prvo derivatizovati do hidroksi ili -NRtRs<g>rupei R<P>je hidroksil ili amino protektivna grupa

3. Jedinjenje kako je traženo u zahtevu 1 gde L predstavlja člana grupe sa Formulom IV: gde X<1>je odabrano od: -CH2-, -C(0)-, OC(0)-, N-O-, -OC(0)NH- ili -C(0)NH-; X<2>je -NH- ili -NHC(O)-, -OC(O)-, -C(O)-, -0 ili -CH2-; Q je -NH- ili -CH2-, ili odsutno; gde svaka -CH2- ili -NH- grupa mogu biti opciono supstituisane sa Ci-C7-alkil, C2-C7-alkenil, CrCT-alkinil, C(0)R<x>, C(0)OR<x>, C(0)NHR<x>gde R<x>može biti Cr-Cv-aM, aril ili heteroaril; oznake m i n, nezavisno jedna od druge su celi brojevi od 0 do 4, uz uslov da ako Q je NH, n ne može biti 0, i V je isključivo neka antineoplastična podjedinica ili antiviralna podjedinica.

4. Jedinjenje prema zahtevu 1 gde L predstavlja peptidni povezujući molekul, koji sadrži polipeptid od, izmedju oko dva i oko 50 aminokiselina,

5. Jedinjenje kako je traženo u zahtevu 1 gde V predstavlja člana grupe sa Formulom X: gde R<a>i R<b>, nezavisno jedan od drugog predstavljaju vodonik ili halogen; Rc je hidroksi, alkoksi, alkil, tiokarbamoil, karbamoil ili valentna veza; R<d>i R<e>nezavisno jedan od drugog, predstavljaju: vodonik, hidroksi, metil ili C!-C4-alkoksi ili su svaki, grupa koja formira 1,3-dioksolanov prsten sa drugom ili valentnom vezom; Rf je vodonik, hidroksi, hlor ili formira keto grupu sa ugljenikovim atomom koji je vezan za njega; R) je vodonik ili halogen.

6. Jedinjenje prema zahtevu 1 gde je V dobijeno iz NSAID odabranih od sledećih: aceklofenak, acemetacin, acetaminofen, acetaminosalol, acetil-salicilna kiselina, acetil-salicilna-2-amino-4-pikolinska-kiselina, 5-aminoacetilsalicilna kiselina, alklofenak, aminoprofen, amfenak, ampiron, ampiroksikam, anileridin, bendazak, benoksaprofen, bermoprofen, a-bisabolol, bromfenak, 5-bromsalicilne kiseline acetat, bromosaligenin, bukloksična kiselina, butibufen, karprofen, celeksocib, hromoglikat, cinmetacin, klindanak, klopirak, natrijum diklofenak, diflunizal, ditazol, droksikam, enfenamska kiselina, etodolak, etofenamat, felbinak, fenbufen, fenklozična kiselina, fendozal, fenoprofen, fentiazak, fepradinol, flufenak, flufenamska kiselina, fluniksin, flunoksaprofen, flurbiprofen, glutametacin, glikol salicilat, ibufenak, ibuprofen, ibuproksam, indometacin, indoprofen, izofezolak, izoksepak, izoksikam, ketoprofen, ketorolak, lornoksikam, loksoprofen, meklofenaminska kiselina, mefenaminska kiselina, meloksikam, mezalamin, metiazinična kiselina, mofezolak, montelukast, nabumeton, naproksen, nifluminska kiselina, nimezulid, olsalazin, oksaceprol, oksaprozin, oksifenbutazon, paracetamol, parsalmid, perizoksal, fenil-acetil-salicilat, fenilbutazon, fenilsalicilat, pirazolak, piroksikam, pirprofen, pranoprofen, protizinska kiselina, rezerveratol, salacetamid, salicilamid, salicilamid-O-acetilna kiselina, salicilsumporna kiselina, salicin, salicilamid, salsalat, sulindak, suprofen, suksibutazon, tamoksifen, tenoksikam, tiaprofenilna kiselina, tiaramid, tiklopridin, tinoridin, tolfenaminska kiselina, tolmetin, tropezin, ksenbucin, ksimoprofen, zaltoprofen, zomepirak, tomoksiprol, zafirlukast i ciklosporin.

7. Jedinjenje prema zahtevu 1 gde je V dobijeno od antineoplastičnih jedinjenja odabranih od sledećih: bikaluatnid, kamptotecin, estramustin fosfat, flutamid, mehloretamin, tiotep, ifosfamid, hidroksiurea, bleomicin, paklitaksel, lomustin, irinotekan, metotreksat, vinorelbin, anastrazol, floksuridin, melfalan, vinkristin, vinblastin, mitomicin, nandrolon, goserelin, leuprolid, triptorelin, aminoglutetemid, mitotan, cisplatin, hlorambucil, pentostatin, kladribin, busulfan, etopozid, mitoksantron, idarubicin, ciklofosfamid, merkaptopurin, tioguanin, citarbin, ciklofosfamid, doksorubicin, daunoribicin, tenipozid tamoksifen, taksoter i topotekan.

8. Jedinjenja prema zahtevu 1 gde je V dobijeno od antiviralnih jedinjenja odabranih od sledećih: aciklovir, famciklovir, ganciklovir, cidofovir, lamivudin, ritonavir, indinavir, nevirapin, zidovudin, didanozin, stavudin, abakavir zalcitabin, amprenavir, ribavirin i adamantan.

9. Jedinjenje prema zahtevu 2 gde Z i W zajedno su: - N(CH3)- CH.2-, -NH-CH2, -CH2-NH-, -C(0)-NH- ili -NH-C(O)-; A i B su metil; E je vodonik; R<2>je hidroksi ili metlioksi; S<1>predstavlja saharid dezozamin gde je R<8>odabrano od: vodonik, metil, amino, CrC6 alkilamino ili CyC6 dialkilamino; R<9>iR1<0>su vodonik; R<1>je hidroksi ili O-S<2>grupa gde S<2>predstavlja saharid kladinozu, gde: R<11>je vodonik, ili O-R<11>je grupa tako da sa R<12>i sa C/4" ugljenikovim atomom formira >C=0 ili epoksi grupu; R12 je vodonik ili grupa koja sa O-R<11>i sa C/4" ugljenikovim atomom formira >C=0 ili epoksi grupu; R<13>je metil; U je vodonik; Y je metil; R<6>je hidroksi, metil ili etil; R<5>je vodonik, hidroksi, metoksi ili grupa koja sa R<3>i sa C/11 i C/12 ugljenikovim atomima formira ciklični karbonatni ili karbamatni most; R<3>je hidroksi ili grupa koja formira ciklični karbamatni most sa W ili Z, ili R<3>je grupa koja sa R<5>i sa C/11 i C/12 ugljenikovim atomima formira ciklični karbonatni ili karbamatni most; R4 je metil; obezbedjujući daje povezivanje preko azota sa Z na N/9a poziciji ili preko ugljenika saR1<2>ili preko kiseonika sa R<11>,oba na C/4" poziciji u S<2>saharidu.

10. Jedinjenje prema zahtevu 3 gde X*je -CH2-ili-OC(0)-; X<2>je-NHC(0)-; Q je -NH- ili odsutno.

11. Jedinjenje prema zahtevu 6 gde: V je dobijeno od NSAID odabranih od: S-(+)-ibuprofen, indometacin, flurbiprofen, naproksen, ketoprofen, acetil salicilna kiselina, sulindak, etodolak, ketorolak, suprofen, fluniksin, diklofenak natrijum i tolmetin natrijum.

12. Jedinjenje prema zahtevu 7 gde: Vje dobijeno od nekih antineoplastičnih jedinjenja, odabranih od: metotreksat, paklitaksel, kamptotecin i doksorubicin.

13. Jedinjenje prema zahtevu 8 gde Vje dobijeno od antiviralnih jedinjenja odabranih od: grupe koja se sastoji od: zidovudina, didanozina i stavudina.

14. Jedinjenje sa Formulom: 16. Jedinjenje sa Formulom: 17. Jedinjenje sa Formulom: 18. Jedinjenje sa Formulom: 19. Jedinjenje sa Formulom: 20. Jedinjenje sa Formulom: 21. Jedinjenje sa Formulom: 22. Jedinjenje sa Formulom: 23. Jedinjenje sa Formulom: 24. Jedinjenje sa Formulom: 25. Jedinjenje sa Formulom: 26. Jedinjenje sa Formulom: 27. Jedinjenje sa Formulom: 28. Jedinjenje sa Formulom: 29. Jedinjenje sa Formulom: 30. Jedinjenje sa Formulom: 31. Jedinjenje sa Formulom: 32. Jedinjenje sa Formulom: 33. Jedinjenje sa Formulom: 34. Jedinjenje sa Formulom: 35. Jedinjenje sa Formulom: 36. Postupci za proizvodnju jedinjenja sa Formulom I I koji obuhvataju: a) za jedinjenje sa Formulom I, gde je X<2>, -NHC(O)-, pomoću reakcije jedinjenja sa Formulom VI: gde L<1>predstavlja odlazeću grupu, i slobodne amino grupe na makrolidu prikazanom sa Formulom Vila: b) za jedinjenje sa Formulom I, gde je X<2>, -OC(O)-, pomoću reakcije jedinjenja sa Formulom VI i slobodne hidroksil grupe na makrolidu, prikazanom sa Formulom Vllb: c) za jedinjenje sa Formulom I, gde je X1, -OC(O)-, Q je -NH- i X2 je -NHC (0), pomoću reakcije makrolida prikazanog sa Formulom VIIc: i slobodne amino grupe jedinjenja prikazanog sa FormulomVIb: d) za jedinjenje sa Formulom I, gde jeX1, -OC(0)NH- i X<2>je -NHC(O)-, pomoću reakcije makrolida prikazanog sa Formulom Vlld i slobodne amino grupe jedinjenja prikazanog sa Formulom VIb: e) za jedinjenje sa Formulom I, gde X<1>je -CH2-, Q je -NH- i X<2>je -NHC (0)-, pomoću reakcije makrolida prikazanog sa Formulom Vile i jedinjenja sa Formulom VI: f) za bilo koje L jedinjenje sa Formulom I, pomoću reakcije makrolida prikazanog sa FormulomVllfili sa FormulomVllgili sa FormulomVllhkoje ima odlazeću grupu L<2> sa slobodnom karboksilnom kiselinom sa nesteroidne antiinflamatorne podjedinice prikazane sa Formulom Vic: 37. Farmaceutska kompozicija koja sadrži jedinjenje ili farmaceutski prihvatljive soli ili solvate navedenog jedinjenja prema zahtevu 1 kao i farmaceutski prihvatljivi rastvarači ili nosači. 38. Metod za tretman inflamatornih oboljenja, poremećaja i stanja, koja su okarakterisana sa ili su udružena sa nekim neželjenim inflamatornim imunim odgovorom, posebno za oboljenja i stanja koja su indukovana sa ili udružena sa prekomernom sekrecijom TNF-a i IL-1, obuhvatajući primenu jedinjenja prema zahtevu 1, na subjektima koji su ugroženi jednim od navedenih poremećaja ili stanja. 39. Metod za tretman inflamatornog stanja ili imunog ili anafilaktičnog poremećaja koji je udržen sa infiltracijom leukocita u upaljeno tkivo kod subjekta, u njegovoj potrebi, koja obuhvata aplikaciju kod navedenog subjekta, terapeutski efikasne količine jedinjenja prikazanog sa Formulom I ili njegove farmaceutski prihvatljive soli ili solvata. 40. Metod prema zahtevu 39, gde navedeno stanje ili poremećaj je odabrano iz grupe koja se sastoji od astme, sindroma respiratornog stresa kod odraslih, bronhitisa i cistične fibroze. 41. Metod prema zahtevu 39, gde navedeno inflamatorno stanje ili poremećaj je odabrano iz grupe koja se sastoji od inflamatornih stanja ili imunih poremećaja pluća, zglobova, očiju, creva, kože i srca. 42. Metod prema zahtevu 39, gde navedeno inflamatorno stanje ili poremećaj je odabrano iz grupe koja sadrži astmu, sindrom respiratornog stresa kod odraslih, bronhitis, cističnu fibrozu, reumatoidni artritis, reumatoidni spondilitis, osteoartritis, gihtični artritis, uveitis, konjuktivitis, inflamatorna stanja creva, Kronovu bolest, ulcerativni kolitis, distalni proktitis, psorijazu, ekcem, dermatitits, oštećenja od srčanog infarkta, hronične inflamacije, endotoksični šok i poremećaje proliferacije glatkih mišića. 43. Metod za smanjenje inflamacije u nekom organu ili tkivu obuhvatajući dopremanje do navedenog organa ili tkiva, terapeutski efikasne količine jedinjenja prikazanog sa Formulom I ili njegove farmaceutski prihvatljive soli ili solvata. 44. Metod za tretman viralnih oboljenja, poremećaja i stanja, obuhvatajući aplikaciju, kod subjekta koji je ugrožen nekim od navedenih oboljenja ili poremećaja, efikasne količine jedinjenja ili njegove farmaceutski prihvatljive soli ili solvata, prema zahtevu 1. 45. Metod prema zahtevu 44 gde je navedeno viralno oboljenje HIV. 46. Metod za ublažavanje znakova ili simptoma ili markera viralne infekcije, obuhvatajući aplikaciju, kod subjekta predstavljenog sa navedenim znacima ili simptomima ili markerima, terapeutski efikasne količine jedinjenja prema zahtevu 1. 47. Metod za tretman simptoma ili znakova ili markera viralne infekcije, obuhvatajući aplikaciju, kod subjekta predstavljenog sa navedenim znacima ili simptomima ili markerima, terapeutski efikasne količine jedinjenja prema zahtevu 1. 48. Metod prema zahtevu 47 gde navedeni simptomi ili znaci su odabrani od grupe koja obuhvata viralno nagomilavanje, viralnu replikaciju, viralnu aktivnost, viremiju, viralno specifične antigene, viralnu RNK, viralnu DNK, aktivnost reverzne transkriptaze, aktivnost antiviralnih citoksičnih ćelija kod subjekta i broj T-ćelija ili CD4+ ćelija, kod subjekta. 49. Metod za tretman simptoma ili znakova ili markera za neoplaziju, obuhvatajući aplikaciju kod subjekta prikazanog sa navedenim simptomom ili znakom, terapeutski efikasne količine jedinjenja prema zahtevu 1. 50. Metod prema zahtevu 49 gde navedeni simptom ili znak neoplazije je odabran iz grupe koja se sastoji od uveličanja tumora, veličine tumora, težine ugroženog organa, recidiva tumora, vremena preživljavanja obolelog, dužine i obima remisije, rasta karcinomskih ćelija, preživljavanja ćelija kancera, indeksa apoptoze, obima metastaza ili stepena metastaza, bioloških markera udruženih sa odredjenim tipom neoplazije, markera proliferacije, aktivacije relevantnih onkogena, disregulacije funkcije receptora udruženih sa tumorom, tumora specifičnih antigena i angiogeneze udružena sa tumorom. 51. Metod za tretman neoplazije, obuhvatajući aplikaciju kod subjekta ugroženog sa neoplazijom, terapeutski efikasne količine jedinjenja, prema zahtevu 1. 52. Jedinjenje prema zahtevu 4 gde navedeni polipeptid je odabran iz grupe koja se sastoji od: