RS20050834A - Antitela monocitnih hemo- atraktant proteina-1(mcp-1) i njihova upotreba - Google Patents

Abstract

Realizacije ovde opisanog pronalaska se odnose na antitela usmerena na antigen monocitnog hemo-atraktantnog proteina-1 (MCP-1) i upotrebe tih antitela. Naročito, u skladu sa nekim realizacijama, daju se potpuno humana monoklonalna antitela usmerena na antigen MCP-1. Daju se kodirajuće sekvencije nukleotida i sekvencije aminokiselina koje sadrže teški i laki lanac molekula imunogolbulina, a naročito sekvencije koje odgovaraju susednim sekvencijama teškog i lakog lanca koje premošćuju regione skeleta i/ili regione koji odredjuju komplementarnost (CDRs), specifično od FR1 do FR4 ili od CDR1 do CDR4. Daju se takodje hibridome ili drugi sojevi ćelija koji izlučuju takve molekule imunoglobulina i monoklonalna antitela.

Description

ANTITELA USMERENA NA MONOCITNI HEMOATRAKTANTNI PROTEIN-1 (MCP-1) I NJIHOVA

UPOTREBA

Realizacije ovog pronalaska, koje su ovde opisane, odnose se na antitela usmerena na antigen monocitnog hemo-atraktantnog proteina-1 (MCP-1) i na upotrebe tih antitela. Određenije, u skladu sa realizacijama ovog pronalaska, daju se potpuno humana monoklonalna antitela usmerena na antigen MCP-1. Daju se sekvencije koje kodiraju nukleotide i sekvencije aminokiselina koje sadrže sekvencije teškog i lakog lanca, koje premošćuju regione skeleta i/ili regione koji određuju komplementarnost (CDRs), specifično od FR1 do FR4 ili CDR1 do CD3. Antitela iz ovog pronalaska nalaze upotrebu kao dijagnostički agensi i za tretman bolesti povezanih sa povećanim stvaranjem MCP-1. Daju se takođe hibridomi ili drugi sojevi ćelija, koji izlučuju ovakve molekule imunoglobulina i monoklonalna antitela.

Povećano stvaranje angiogenih faktora, a smanjeno stvaranje inhibitora angiogeneze u ćelijama kancera, vaskularnim ćelijama endotelijuma i drugim stromalnim tipovima ćelija, smatra se da indukuje angiogenezu tumora. Stroma, koju čine intersticijalna vezivna tkiva, bazalna lamina, krvne ćelije, krvni sudovi i ćelije fibroplasta okružuju skoro sve ćelije čvrstog tumora. Interakcije između strome i kancera igraju kritičnu ulogu u neovaskularizaciji tumora. Pored toga, u angiogenezi tumora značajne su makrofage, koje su takođe stromalne komponente. (M. Ono etal.,Cancer Chemother. Pharmacol.,1999, 43(dodatak), S69-S71).

Makrofage su glavni krajnje izdiferencirani tip ćelija mononukleamog fagocitnog sistema i takođe predstavljaju jedne od ključnih ćelija koje ostvaruju angiogenezu, stvarajući brojne stimulatore rasta i inhibitore. Poznato je da makrofage stvaraju brojne angiogene citokine, uključujući monocitni hemoatraktantni protein-1 (MCP-1).

Poznato je da je MCP-1 hemotaktičan za T limfocite, bazofile i NK ćelije. MCP-1 je jedan od najsnažnijih molekula koji angažuje makrofage. Kada se angažuju na mestu inflamacije ili tumora, makrofage mogu da generišu brojne angiogene citokine, čime stimulišu patološku angiogenezu. Brojna ispitivanja su pokazala vezu između angiogeneze, angažovanja makrofaga i prognoze, kod pacijenata sa raznim vrstama tumora (G. Fantanini et al.,Int. J. Cancer,1996, 67, 615; N. VVeidner et al.,J. Natl. Cancer Inst,1992, 84, 1875). Pored toga, Leek et al. su pokazali da je fokalno povećanje broja makrofaga blisko povezano sa vaskularizacijom i prognozom kod pacijenata sa kancerom dojke( Cancer Res.,1996, 56, 4625). R. Huang et al.( CancerRes.,2002, 62, 2806-2812) su pokazali da Connexin 43 suzbija rast ćelija humanog glioblastoma podregulacijom MCP-1, što je otkriveno upotrebom tehnologije proteinskih nizova.

Goede et al( Int. J. Cancer,1999, 82, 765-770) prvi su pokazali da MCP-1 ima angiogeni potencijal, koji je ekvivalentam sa VEGF, prilikom testiranja na modelu zečje rožnjače. U njihovom modelu, angiogena aktivnost, indukovana sa MCP-1, je povezana sa intenzivnim angažovanjem makrofaga u rožnjači zeca. Salcedo et al. su objavili da MCP-1 indukuje hemotaksiju humanih ćelija endotelijuma, pri nanomolarnim koncentracijama. Ovaj hemotaktični odgovor je inhibiran poliklonalnim antitelom za humani MCP-1 (R. Salcedo et al.,Blood,2000, 96(1), 34^0).

MCP-1 je dominantni hemokin koji se izlučuje kod kancera jajnika (Negus, R,P.M. et al.,J. Clin. Investig.1995, 95, 2391-96; Sica, A. etal.,J. lmmunology,2000, 164(2). 733-8). Broj MCP-1 je povećan takođe i kod drugih humanih kancera, uključujući kancer bešike, dojke, pluća i glioblastome.

Pored toga, u brojnim ispitivanjima je pokazan značaj MCP-1 kod inflamacije. Na primer, H.J. Anders et al., su pokazali kod glomeruonefritisa da dolazi do izlučivanja hemokina i receptora hemokina, za veme inicijacije i razdvajanja imunokompleksa ( J.Am. Soc. Nephrol.2001, 12, 919-2001). Segerer et al.( J. Am. Soc. Nephrol.2000, H, 2231-2242) su ispitivali izlučivanje MCP-1 i njegovog receptora hemokina, receptora 2, kod humanog mesečastog glomerulonefritisa. J.A. Belperio et al. su ukazali na kritičnu ulogu hemokina MCP-1/CCR2 u patogenezi sindroma bronhiolitis obliteransa( J. Clin. Investig.2001, 108, 547-556). N.G. Frangogiannis et al. su opisali ulogu MCP-1 kod inflamatomog odgovora infarkta miokarda( Cardiovascular Res.2002, 53, 31-47). Gerard i Rollins( Nature Immunol.2001, 2, 108-115) i Reape i Groot( Atheroscleohs,1999, 147. 213-225) razmatraju ulogu MCP-1 u aterosklerozi i drugim bolestima. Takođe, Schmidt i Stem( Atherocler. Thromb. Vasc. Biol.,2001, 21, 297-299) opisuju interakcije MCP-1 kod restenoze.

Humani MCP-1, CC hemokin sa 76 aminokiselina i piroglutaminskom kiselinom na N-kraju, prvobitno je prečišćen iz nekoliko izvora, uključujući humane limfocite stimulisane sa frtohemaglutininom (Yoshimura, T. et al.,J. Immunol.,1989, 142. 1956-62), soj ćelija humanog glioma (Yoshimura T. et al.,J. Exp. Med.1989 .169,1956-59) i soj humanih mijelomonocitnih ćelija (Matsushima, K. et al.,J. Exp. Med.1989, J69, 1485-90). MCP-1 je prvo opisan kao hemotaktični faktor izveden iz limfocita (LDCF). Druga imena za ovaj protein su hemotaktični faktor izveden iz ćelija tumora (TDCF), monocitni hemotaktični faktor izveden iz glioma

(GDCF), hemotaktični faktor izveden iz ćelija glatkih mišića (SMC-CF), hemotaktični aktivirajući faktor monocita (MCAF) i CCL2. Molekulsko kloniranje cDNK, koje kodira MCP-1 (Furutani, Y et al.,Biochem. Biphys. Res. Comm.1989, 169, 249-55; B.J. Rollins et al.,Mol. Cell Biol.,1989, 9, 4687-95; Chang, H.C. et al.,Int. Immunol.1989, 1, 388-97) je otkrilo otvoreni opseg od 99 aminokiselina, uključujući signalni peptid od 23 aminokiseline. Mišji homologni gen MCP-1 je nazvan JE (B.J. Rollins et al., 1989).

U WO 200189565, publikovanom 29. novembra 2001, opisana su poliklonalna antitela za humani MCP-1 i opisana je inhibicija rasta tumora na modelu golih miševa, korišćenjem ovakvih poliklonalnih antitela.

Realizacije ocde opisanog pronalaska odnose se na potpuno humana monoklonalna antitela humanog MCP-1, koja blokiraju hemotaksiju ćelija THP-1 indukovanu sa MCP-1, soj ćelija koji se izvodi iz pacijenta sa akutnom monocitnom leukemijom. Ove ćelije se koriste kao surogat pri procenjivanju migracije normalnih humanih mononukleamih ćelija u krvotoku. Infiltracija mononukleamih ćelija, stimulisana sa MCP-1 igra patološku ulogu u brojnim inflamatomim stanjima, uključujući reumatoidni artritis, glomerulonefritis, aterosklerozu, odbacijvanja transplantata, psorijazu, restenozu i autoimune bolesti, kao što je multipla skleroza. Antitelo, koje blokira aktivnost MCP-1 i spečava infiltraciju monocita, naći će upotrebu u tretmanu ovih i drugih inflamatomih bolesti.

Realizacije ovde opisanog pronalaska, odnose se na monoklonalna antitela za koja je nađeno da inhibiraju MCP-1 i utiču na funkciju MCP-1. Druge realizacije se odnose na humana anti-MCP-1 antitela i preparate anti-MCP-1 antitela sa poželjnim osobinama iz terapeutske perspektive, uključujući afinitet za jako vezivanje MCP-1, sposobnost neutralizacije MCP-1in vitroi sposobnost inhibiranja neovaskularizacije čvrstih tumora.

Jedna realizacija ovog pronalaska je potpuno humano monoklonalno antitelo koje se vezuje za MCP-1 i ima sekvenciju aminokiselina teškog lanca koja se bira iz grupe koju čine SEQ ID NOS: 2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 38, 42, 46, 50 , 54, 58, 62, 66, 70, 74, 78, 82, 86, 90, 94, 98, 102, 106, 110, 114, 118, 122, 126, 130, 134, 138, 142 i 146. U jednoj realizaciji antitelo još sadrži i sekvenciju aminokiselina lakog lanca, koja se bira iz grupe koju čine SEQ ID NOS: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48, 52, 56, 60, 64, 68, 72, 76, 80, 84, 88, 92, 96, 100, 104, 108, 112, 116, 120, 124, 128, 132, 136, 140, 144 i 148.

U skladu sa tim, jedna ovde opisana realizacija daje izolovana antitela, ili fragmente onih antitela koja se vezuju za MCP-1. Kao što je poznato u stanju struke, pogodno je da antitela budu, na primer, monoklonalna, himema i/ili humana antitela. Realizacije pronalaska opisanog ovde daju ćelije za stvaranje takvih antitela.

Sledeća realizacija ovog pronalaska je potpuno humano antitelo koje se vezuje za MCP-1, sa sekvencijom teškog lanca koja ima CDRs koji sadrže sekvencije pokazane na Slikama 7 i 10. Napominje se da određivanja CDR mogu jednostavno obaviti oni koji su uobičajeno verzirani u stanje tehnike. Obično se CDRs, koji se daju u ovom pronalasku, opisuju kao što su definisali Kabat et al. u "Sequences of Proteins of Immunological Interesf, Vol. 1.3 (Peto izdanje, NH Publicaion 9) 91-3242, Bethesda MD 1991).

Još jedna realizacija ovog pronalaska je potpuno humano antitelo koje se vezuje za MCP-1, a sadrži sekvenciju aminokiselina lakog lanca koja ima CDRs sadržane u sekvencijama prikazanim na Slikama 8 i 9.

Sledeća realizacija ovog pronalaska je potpuno humano antitelo koje se vezuje za MCP-1, sadrži sekvenciju aminokiselina teškog lanca, koja ima CDRs sadržane u sekvenciji prikazanoj na Slikama 7 i 10 i sekvenciju aminokiselina lakog lanca koja ima CDRs sadržane u sekvencijama datim na Slikama 8 i 9. Sledeća realizacija ovog pronalaska je potpuno humano antitelo koje se vezuje za druge članove familije MCP-1, uključujući, ali bez ograničavanja, MCP-2, MCP-3 i MCP-4. Sledeća realizacija ovog pronalaska je antitelo koje se unakrsno nadmeće u vezivanju za MCP-1 sa potpuno humanim antitelima iz ovog pronalaska.

Podrazumeva se da realizacija ovog pronalaska nije ograničena na bilo koji određeni oblik antitela ili postupak generisanja ili stvaranja. Na primer, anti-MCP-1 antitelo može biti antitelo čitave dužine (npr. koje ima nedirnut humani Fc region), ili fragment antitela (npr. Fab, Fab' ili F(ab')2). Pored toga, antitelo se može proizvesti iz hibridoma koje izlučuje antitelo, ili iz rekombinantno stvorene ćelije, koja je transformisana ili transficirana sa genom ili genima koji kodiraju antitelo.

Sledeća realizacija ovog pronalaska obuhvata izolovane molekule nukleinske kiseline koji kodiraju bilo koje od antitela opisanih ovde, vektore koji imaju izolovane molekule nukleinske kiseline koji kodiraju bilo koje od tih anti-MCP-1 antitela, ćelija domaćina, transformisana sa bilo kojim takvim molekulima nukleinske kiseline. Pored toga, jedna realizacija ovog pronalaska je postupak za stvaranje anti-MCP-1 antitela kultivisanjem ćelije domaćina, pod uslovima kada se izlučuje molekul nukleinske kiseline koji daje antitelo, iza koga sledi regenerisanje antitela.

Sledeća realizacija ovog pronalaska obuhvata postupak za stvaranje antitela visokog afiniteta prema MCP-1, imunizacijom sisara sa humanim MCP-1 ili njgovim fragmentom, u jednoj ili više ortoloških sekvencija ili njihovih fragmenata.

Realizacije ovog pronalaska, koje su ovde opisane, zasnovane su na generisanju i identifikaciji izolovanih antitela koja se specifično vezuju za MCP-1. MCP-1 se izlučuje u povišenim sadržajima kod bolesti neoplazma, kao što su tumori i druge inflamatorne bolesti. Inhibicija biološke aktivnosti MCP-1 može sprečiti dalju infiltraciju mononukleamih ćelija u tkiva.

Sledeća realizacija ovog pronalaska obuhvata postupak za dijagnozu bolesti ili stanja, kod kojih se koristi ovde opisano antitelo, dobijeno u skladu sa ovim pronalaskom, da bi se detektovao nivo MCP-1 u uzorku uzetom od pacijenta. U jednoj realizaciji uzorak uzet od pacijenta je krv ili krvni serum. U sledećoj realizaciji, daju se postupci za identifikaciju faktora rizika, dijagnozu bolesti i fazu bolesti, koja obuhvata identifikaciju povećanog izlučivanja MCP-1, korišćenjem anti-MCP-1 antitela.

U sledećoj realizaciji, ovaj pronalazak obuhvata postupak za dijagnozu stanja povezanog sa izlučivanjem MCP-1 u ćeliji. Poželjna stanja su, ali bez ograničavanja, bolesti neoplazama, uključujući, ali bez ograničavanja, tumore, kancere, kao što su kancer dojke, jajnika, stomaka, endometrijuma, pljuvačne žlezde, pluća, bubrega, debelog creva, kolorektuma, tiroide, pankreasa, prostate i bešike, kao i druga nflamatoma stanja, uključujući, ali bez ograničavanja, reumatoidni artritis, glomerulonefritis, aterosklerozu, psorijazu, transplantaciju organa, restenozu i autoimune bolesti.

U sledećoj realizaciji, ovaj pronalazak obuhvata komplet za testiranje, za detekciju MCP-1 i članova familije MCP-1, u tkivima ili ćelijama sisara, da se otkriju bolesti neoplazama ili inflamatoma stanja, a koji se sastoji od antitela koje se vezuje za MCP-1 i sredstva koje pokazuje reakciju antitela sa antigenom, ukoliko je prisutan. Poželjno je da antitelo bude monoklonalno antitelo. U jednoj realizaciji, antitelo koje se vezuje za MCP-1 je obeleženo. U drugoj realizaciji ovo antitelo je neobeleženo prvo antitelo, a sredstvo koje pokazuje reakciju sastoji se od obeleženog drugog antitela, koje je anti-imunoglobulin. Poželjno je da je antitelo obeleženo sa markerom, koji se bira iz grupe koju čine fluorohrom, enzim, radioaktivni nuklid i radio-neprovidan materijal.

Druge realizacije ovog pronalaska su farmaceutski preparati koji sadrže efikasnu količinu antitela iz ovog pronalaska, pomešanog sa farmaceutski prihvatljivim nosačem ili razblaživačem. U još jednoj realizaciji anti-MCP-1 antitelo ili njegov fragment, je konjugovano sa nekim terapeutskim agensom. Ovaj terapeutski agens može biti toksin ili radioaktivni izotop. Poželjno je da se ova antitela koriste za tretman bolesti, kao što su, na primer, tumori, uključujući, ali bez ograničavanja, kancere, kao što je kancer dojke, jajnika, stomaka, endometrijuma, pljuvačne žlezde, pluća, bubrega, debelog creva, kolorektuma, tiroide, pankreasa, prostate i bešike, kao i drugih inflamatornih stanja, uključujući, ali bez ograničavanja, reumatoidni artritis, glomerulonefritis, aterosklerozu, psorijazu, transplantaciju organa, restenozu i autoimune bolesti.

Još jedna realizacija ovog pronalaska daje postupak za tretiranje bolesti ili stanja povezanih sa izlučivanjem MCP-1 kod pacijenta, koji se sastoji od ordiniranja tom pacijentu efikasne količine anti-MCP-1 antitela. Ovaj postupak se može obavljatiin vivo.Pacijent je sisar, poželjno humani pacijent. U poželjnoj realizaciji, ovaj postupak se odnosi na tretman tumora, uključujući, ali bez ograničavanja, kancere, kao što je kancer dojke, jajnika, stomaka, endometrijuma, pljuvačne žlezde, pluća, bubrega, debelog creva, kolorektuma, tiroide, pankreasa, prostate i bešike, kao i drugih inflamatornih stanja, uključujući, ali bez ograničavanja, reumatoidni artritis, glomerulonefritis, aterosklerozu, psorijazu, transplantaciju organa, restenozu i autoimune bolesti. Dodatne realizacije obuhvataju postupke za tretman bolesti i stanja povezanih sa izlučivanjem MCP-1, koji mogu uključivati identifikcaiju sisara kome se potreban tretman zbog povećanog izlučivanja MCP-1, pa se tom sisaru ordinira terapeutski efikasna doza anti-MCP-1 antitela.

U drugoj realizaciji ovaj pronalazak daje proizvod koji se sastoji od kontejnera koji sadrži preparat sa anti-MCP-1 antitelom i umetak paketa ili etiketu, gde se ukazuje da se taj proizvod može koristiti za tretiranje bolesti neoplazma i inflamatornih bolesti za koje je karakteristično preterano izlučivanje MCP-1. Poželjno je da sisar, poželjnije humano biće, primi anti-MCP-1 antitelo. U poželjnoj realizaciji tretiraju se tumori, obuhvatajući, bez ograničavanja, kancere, kao što je kancer dojke, jajnika, stomaka, endometrijuma, pljuvačne žlezde, pluća, bubrega, debelog creva, kolorektuma, tiroide, pankreasa, prostate i bešike, kao i drugih inflamatornih stanja, uključujući, ali bez ograničavanja, reumatoidni artritis, glomerulonefritis, aterosklerozu, psorijazu, transplantaciju organa, restenozu i autoimune bolesti.

U nekim realizacijama anti-MCP-1 antitelo se ordinira posle čišćenja agensa da se uklone antitela iz krvotoka.

U nekim realizacijama anti-MCP-1 antitela se mogu modifikovati da se pojača njihova sposobnost fiksiranja komplementa i učestvovanje u citotoksičnosti zavisnoj od komplementa (CDC). U jednoj realizaciji anti-MCP-1 antitelo se može modifikovati, kao na primer supstitucijom aminokiseline, da se promeni uklanjanje antitela. Na primer, neke supstitucije aminokiselina mogu da ubrzaju uklanjanje antitela iz tela. Alternativno, supstitucije aminokiselina mogu usporiti uklanjanje antitela iz tela. U drugim realizacijama anti-MCP-1 antitelo se može menjati tako da se manje brzo eliminiše iz tela.

Još jedna realizacija je upotreba anti-MCP-1 antitela za dobijanje medikamenta za tretman bolesti, kao što su bolesti neoplazma i inflamatorna stanja. U jednoj realizaciji bolesti neoplazma su tumori i kanceri, kao što su kancer dojke, jajnika, stomaka, endometrijuma, pljuvačne žlezde, pluća, bubrega, debelog creva, kolorektuma, tiroide, pankreasa, prostate i bešike. U alternativnoj realizaciji inflamatorna stanja su, ali bez ograničavanja, reumatoidni artritis, glomerulonefritis, ateroskleroza, psorijaza, transplantacija organa, restenoza i autoimune bolesti.

Kratak opis slika

Slika 1 pokazuje rezultate ispitivanja migracije monocita THP-1, kao odgovor na MCP-1, MCP-2, MCP-3 i MCP^.

Slika 2 prikazuje inhibiciju sposobnosti migracije ćelija THP-1 pomoću antitela 3.11.2, kao odgovor na MCP-2, i to na način koji zavisi od doze.

Slika 3 prikazuje inhibiciju sposobnosti migracije ćelija THP-1 pomoću antitela 3.11.2, kao odgovor na MCP-3, i to na način koji zavisi od doze.

Slika 4 pokazuje efekt anti-MCP-1 antitela 1.7.3 na rast tumora pankreasa Panc-1.

Slika 5 pokazuje trodimenzionalni dijagram rasipanja fluksa kalcijuma, hemotaksije i podataka o afinitetu za antitela MCP-1.

Slika 6 pokazuje različitu orijentaciju trodimenzionalnog dijagrama rasipanja fluksa kalcijuma, hemotaksije i podataka o afinitetu za antitela MCP-1.

Slika 7A pokazuje Clustal W poređenje sekevencija anti-MCP-1, upotrebom VH1-24, koji pokazuju regione CDR1, CDR2 i CDR3, i sa njim povezan dendrogram (Slika 7B).

Slika 8A pokazuje Clustal W poređenje sekevencija anti-MCP-1, upotrebom VK-B3, koji pokazuju regione CDR1, CDR2 i CDR3, i sa njim povezan dendrogram (Slika 8B).

Slika 9A pokazuje Clustal W poređenje sekevencija anti-MCP-1, upotrebom VK-08, koji pokazuju regione CDR1, CDR2 i CDR3, i sa njim povezan dendrogram (Slika 9B).

Slika 10A pokazuje Clustal W poređenje sekevencija anti-MCP-1, upotrebom VH6-1, koji pokazuju regione CDR1, CDR2 i CDR3, i sa njim povezan dendrogram (Slika 10B).

Detaljan opis poželjne realizacije

Realizacije ovog pronalaska, koje su ovde opisane, odnose se na mnoklonalna antitela koja se vezuju za MCP-1. U nekim realizacijama ova antitela se vezuju za MCP-1 i utiču na funkciju MCP-1. Druge realizacije daju potpuno humana anti-MCP-1 antitela i preparate anti-MCP-1 antitela sa željenim svojstvima iz terapeutske perspektive, ukazujućiin vitrona jak afinitet prema MCP-1 i sposobnost inhibiranja rasta i neovaskularizacije čvrstih tumorain vivo.

Prema tome, realizacije ovog pronalaska daju izolovana antitela ili fragmente tih antitela koji se vezuju za MCP-1. Kao što je poznato u stanju tehnike, pogodno je da antitela budu, na primer, monoklonalna, himerna i/ili humana antitela. Realizacije iz ovog pronalaska daju takođe ćelije koji stvaraju ovakva antitela.

U nekim realizacijama, antitela koja su ovde opisana, poseduju terapeutske koristi. Anti-MCP-1 antitelo može snažno da blokira ili ogranični domašaj neovaskularizacije tumora i rast tumora. Mnoge ćelije kancera, uključujući one iz glioblastoma i bubrežnih kancera, izlučuju receptor CCR2 za MCP-1. Zajedničko izlučivanje liganda i receptora u istim ćelijama tumora ukazuje da MCP-1 može regulisati petlju autokrinog rasta u ćelijama kancera i izlučivati obe komponente. Huang et al.( CancerRes,,2002, 62, 2806-2812) su nedavno objavili da MCP-1 može direktno da utiče na rast i preživljavanje ćelija tumora koje izlučuju receptor CCR2 za MCP-1. Dakle, pored njegovih efekata na angiogenezu, MCP-1 može takođe da direktno reguliše rast, migraciju i invaziju ćelija tumora.

Pored toga, realizacije iz ovog pronalaska daju i upotrebu ovih antitela kao dijagnostičkog sredstva ili za tretman bolesti. Na primer, realiazcije iz ovog pronalaska daju postupke i antitela za inhibiciju izlučivanja MCP-1 povezanog sa tumorima i inflamatomim stanjima. Poželjno je da se antitela koriste za tretiranje kancera, kao što su kancer dojke, jajnika, stomaka, endometrijuma, pljuvačne žlezde, pluća, bubrega, debelog creva, kolorektuma, tiroide, pankreasa, prostate i bešike, kao i drugih inflamatornih stanja, uključujući, ali bez ograničavanja, reumatoidni artritis, glomerulonefritis, aterosklerozu, psorijazu, transplantaciju organa, restenozu i autoimune bolesti. U vezi sa takvim tretmanom, daju se proizvodi koji sadrže ovde opisana antitela iz ovog pronalaska. Pored toga, daje se komplet za testiranje, koji sadrži antitela u skladu sa ovim pronalaskom, koja su opisana ovde, za testiranje tumora i inflamatornih stanja.

Pored toga, nukleinske kiseline, koje su ovde opisane, i njihovi fragmenti i varijanti, mogu se koristiti, u svrhu primera koji ne ograničava, za: (a) direktnu biosintezu odgovarajuće kodiranih proteina, polipeptida, fragmenata i varijanata, kao rekombinantnih ili heterolognih proizvoda gena, (b) kao probe za detekciju i kvantitativno određivanje nukleinskih kiselina koje su ovde opisane, (c) kao šabloni sekvencija za dobijanje antisensnih molekula, i slično. Ovakve upotrebe su potpunije opisane u opisu koji sledi.

Pored toga, proteini i polipeptidi koji su ovde opisani, kao i njihovi fagmenti i varijanti, mogu se koristiti na načine kao što su: (a) da služe kao imunogen za stimulisanje i stvaranje anti-MCP-1 antitela, (b) za zahvatanje antigena u imunogenom testu za takvo antitelo, (c) kao ciljano mesto kod testiranja supstanci koje se vezuju za MCP-1 polipeptid, opisan ovde, i (d) kao ciljano mesto ua specifično telo za MCP-1, tako da tretman sa tim antitelom utiče na molekulsku i/ili ćelijsku funkciju posredovanu sa ovim ciljanim mestom.

U pogledu njegovih snažnih efekata na modulisanje rasta ćelije, porast izlučivanja ili aktivnosti polipeptida MCP-1, može se koristiti za unapređenje preživljavanja ćelije. Obrnuto, smanjivanje izlučivanja polipeptida MCP-1 može se koristiti za izazivanje smrti ćelije.

Ostale realizacije, karakteristike i slično, koje se odnose na antitela iz ovog pronalaska, daju se sa dodatnim detaljima u nastavku.

Varijabilni region nukleotida teškog i lakog lanca i sekvencija aminokiselina reprezentativnih humanih anti-MCP-1 antitela, dati su u listingu sekvencija, čiji su sadržaji sažeto prikazani u Tabeli 1, niže.

Definicije

Ukoliko se drugačije ne definiše, specifični i tehnički nazivi koji se koriste u vezi sa ovde opisanim pronalaskom, imaće uobičajena značenja koja razumeju oni koji su uobičajeno verzirani u stanje tehnike. Dalje, ukoliko kontekst zahteva drugačije, nazivi jednine će obuhvatati množine, pa će i nazivi množine obuhvatati i jedninu. Obično su ovde opisane nomenklature, koje se koriste u vezi sa tehnikama i kulturama ćelija i tkiva, molekularnom biologijom, i hernijom i hibridizacijom proteina i oligo- ili polinukleotida, koje su dobro poznate i koje se obično koriste u stanju tehnike. Koriste se standardne tehnike za rekombinantne DNK, sintezu oligonukeotida i kulturu i transformaciju tkiva (npr. elektroporacija, lipofekcija). Enzimske reakcije i tehnike prečišćavanja se obavljaju u skladu sa specifikacijama proizvođača, ili kako se uobičajeno sprovode u stanju tehnike, ili kako su ovde opisane. Prethodne tehnike i procedure se obično obavljaju u skladu sa konvencionalnim metodama, koje su dobro poznate u stanju tehnike i koje su opisane u raznim opštim i specifičnim citiranim publikacijama, koje se diskutuju kroz čitavu ovu prijavu. Videti, npr. Sambrok et al., "Molecular Cloning: A Laboratorv Manual" (2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratorv Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989). Nomenklatura koja se koristi u vezi sa laboratoirjumskim procedurama i tehnikama, analitičkom hernijom, sintetskom organskom hernijom i medicinskom i farmaceutskom hernijom, opisana ovde, je ona koja je dobro poznata i uobičajeno se koristi u stanju tehnike. Standardne tehnike se koriste za hemijsku sintezu, hemijsku analizu, formulisanje i oslobađanje farmaceutskih preparata, i za tretman pacijenata.

Kako se koriste u skladu sa realizacijama koje se ovde daju, sledeći nazivi, ako se drugačije ne naznači, podrazumevaće se da imaju sledeća značenja: Naziv "izolovani polinukleotid", kako se ovde koristi, označavaće polinukleotid genomski, cDNK, ili sintetskog porekla, ili neku njihovu kombinaciju, koja u skladu sa njenim poreklom "izolovanog polinukleotida" (1) nije povezana sa celim ili delom polinukleotida u kome se "izolovani polinukleotid" nalazi u prirodi, (2) operabilno je povezana sa polinukleotidom onako kako nije povezan u prirodi, ili (3) ne nalazi se u prirodi kao deo veće sekvencije.

Naziv "izolovani protein", kako se ovde navodi, označava protein cDNK, rekombinantne cDNK ili sintetskog porekla, ili neku njihovu kombinaciju, tako da u skladu sa njegovim poreklom ili izvorom derivatizacije, "izolovani protein" (1) nije povezan sa proteinima koji se nalaze u prirodi, (2) je bez drugih proteina iz istog izvora, npr. bez proteina glodara, (3) izlučuje ga ćelija iz različitih vrsta, ili (4) ne nalazi se u prirodi.

Naziv "polipeptid" ovde se koristi kao generičko ime koje se odnosi na nativni protein, fragmente ili analoge sekvencije polipeptida. Dakle, nativni protein, fragmenti i analozi su vrste iz roda polipeptida. Poželjni polipeptidi u skladu sa ovim pronalaskom sadrže molekule humanog imunoglobulina teškog lanca i molekule humanog imunoglobulina kapa lakog lanca, isto kao i molekuli antitela formiranog kombinacijama, koje sadrže molekule imunoglobulina teškog lanca sa molekulima imunoglobulina lakog lanca, kao što su molekuli imunoglobulina kapa lakog lanca i obrnuto, kao i njihove fragmente i analoge.

Naziv "nalazi se u prirodi" ovde se koristi tako što se primenjuje na neki objekt koji se odnosi na činjenicu da se taj objekt može naći u prirodi. Na primer, polipeptid ili sekvencija polinukleotida koja se nalazi u organizmu (uključujući viruse) i koji se mogu izolovati iz izvora u prirodi, i koji nisu bili namerno modifikovani od strane čoveka u laboratoriji ili na drugi način, su oni koji se nalaze u prirodi.

Naziv "operabilno povezan", kako se ovde koristi, odnosi se na opisane položaje komponenata, koji su povezani sa dozvoljavanjem da oni funkcionišu na namenjeni način. Kontrolna sekvencija "operabilno povezana" sa kodirajućom sekvencijom je povezana na takav način da se izlučivanje kodirane sekvencije postiže pod uslovima koji su kompatibilni sa kontrolnim sekvencijama.

Naziv "kontrolna sekvencija", kako se ovde koristi, odnosi se na sekvencije polinukleotida koje su neophodne da se ostvari izlučivanje i obrada kodirajućih sekvencija za koje su one vezane. Priroda ovakvih kontrolnih sekvencija se razlikuje zavisno od organizma domaćina; kod prokariota, ova kontrolna sekvencija obično obuhvata promoter, mesto vezivanja na ribizomu i transkripciju krajnje sekvencije; kod eukariota, obično kontrolna sekvencija obuhvata promotere i transkripciju krajnje sekvencije. Nazivom "kontrolne sekvencije" namera je da se obuhvate, minimalno sve komponente čije je prisustvo bitno za izlučivanje i obradu, a može takođe da obuhvati i dodatne komponente, čije prisustvo predstavlja prednost, na primer, vodeće sekvencije i sekvencije pripojenog partnera.

Naziv "polinukleotid", kako se ovde navodi, odnosi se na polimerni oblik nukleotida, dužine najmanje 10 baza, bilo da su ribonukleotidi ili deoksinukleotidi ili modifikovani oblik bilo koje vrste nukleotida. Naziv obuhvata u dvostruke spiralne oblike DNK.

Naziv "oligonukleotid" ovde se odnosi na nukleotide koji se nalaze u prirodi i modifikovane, zajedno povezane oligonukleotidnim vezama, koje se nalaze u prirodi i koje se ne nalaze u prirodi. Oligonukleotidi su podvrsta polinukleotida koja obično ima dužinu od 200 baza ili manju. Poželjni oligonukleotidi su dužine 10 do 60 baza, a najpoželjni su sa 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, ili 20 do 40 baza po dužini. Oligonukleotide obično čini samo jedno uvijeno vlakno; mada oligonukleotidi mogu biti sa dva uvijena vlakna, npr. za upotrebu pri konstrukciji gena mutanta. Oligonukleotidi iz ovog pronalaska mogu biti sensni ili antisensni oligonukleotidi.

Naziv "nukleotidi koji se nalaze u prirodi" ovde se odnosi na deoksiribonukleotide i ribonukleotide. Naziv "modifikovani nukleotidi" ovde se odnosi na nukleotide sa modifikovanim ili supstituisanim šećernim grupama, i slično. Naziv "oligonukleotidne veze" odnosi se ovde na oligonukleotidne veze, kao što su fosforotioatna, fosforoditioatna, fosforoselenoatna, fosforodiselenoatna, fosforoanilotioatna, fosforoanilidatna, fosforoamidatna i slično. Videti, npr. LaPlanche et al.,Nucl. Acids Res.1986, 14, 9081; Stec et al.,J. Am. Chem. Soc,1984,106, 6077. Stein et al.,Nucl. Acids Res,1988, 16, 3209; Zon et al.,Anti- Cancer Drug Design,1991, 6, 539; Zon et al., "Oligonukleotides and Analogues: A Practical Approach", str. 87-108 (F. Eckstein, Ed., Oxford Universitv Press, Oxford, England (1991); Stecet al., U.S. Patent No. 5,151,510; Uhlmann i Pevman,Chemical Revievvs,1990, 90, 543. Oligonukleotid se može obeležiti zbog detekcije, ukoliko se to želi.

Naziv "selektivno hibridizira" ovde se odnosi na na specifično vezivanje koje se može detektovati. Polinukleotidi, oligonukleotidi i njihovi fragmenti, u skladu sa ovim pronalaskom, prilikom hibridizacije i uslova pranja selektivno se hibridizuju u uvijena vlakna nukleinske kiseline, što svodi na minimum primetne količine vezivanja za nespecifične nukleinske kiseline, koje se mogu detektvati. Uslovi visoke povezanosti se mogu upotrebiti za postizanje uslova selektivne hibridizacije, kao što je poznato u stanju tehnike i kao što se ovde diskutuje. Obično je homologija sekvencije nukleinske kiseline, polinukleotida, oligonukleotida i fragmenata iz ovog pronalaska i posmatrane sekvencije nukleinske kiseline, bar 80%, a tipičnije i poželjno povišenih homologija, od najmanje 85%, 90%, 95%, 99% i 100%. Dve sekvencije aminokiselina su homologne ukoliko postoji delimična ili potpuna iddentičnost između njihovih sekvencija. Na primer, homologija od 85% znači sa je 85% aminokiselina identično, ako se dve sekvencije upoređuju u pogledu maksimalnog slaganja. Praznine (u bilo kojoj od dve sekvencije koje se porede) su dozvoljene pri maksimalnom upoređivanju; poželjne su dužine praznina od 5 ili manje, a poželjnije su 2 ili manje. Alternativno i poželjno je da su dve sekvencije proteina

(ili sekvencije polipeptida izvedene iz njih, dužine od najmanje 30 aminokiselina)

homologne, onako kako se ovaj naziv ovde koristi, ukoliko imaju rezultet poravnavanja veći od 5 (u standardnim jedinicama devijacije), koristeći program ALIGN, sa matricom za mutaciju podataka i kaznenom prazninom od 6 ili više. Videti M.O. Davhoff, u "Atlas of Protein Sequence and Structure", Vol. 5, 101-110, i dodatak 2 uz Vol. 5 1-10 (National Biomedical Research Foundation, 1972). Dve sekvencije, ili njihovi delovi, poželjnije je da su homologni ukoliko je više ili jednako od 50% njihovih aminokiselina identično, kada su optimalno poravnate, koristeći program ALIGN. Naziv "korespondira"kako se ovde koristi, označava da je sekvencija polinukleotida homologna (tj. identična, a ne strogo povezana evoluciono) sa čitavom ili delom referentne sekvencije polinukleotida, ili da je sekvencija polipeptida identična sa referentnom sekvencijom polipeptida. Nasuprot, naziv "komplementaran sa" ovde se koristi da označi da je komplementarna sekvencija homologna čitavoj ili delu referentne sekvencije polinukleotida. Za ilustraciju, sekvencija nukleotida TATAC" korspondira referentnoj sekvenciji "TATAC", a komplementarna je sa "GTATA".

Sledeći nazivi se koriste da opišu odnose sekvencija između dva ili više polinukleotida ili sekvencija aminokiselina: "referentna sekvencija", "prozor za poređenje", "identitet sekvencije", procent identiteta sekvencije" i "suštinski identitef. "Referentna sekvencija" je definisana sekvencija koja se koristi kao osnova za poređenje sekvencija; referentna sekvencija može biti subset veće sekvencije, na primer kao segment celokupne dužine cDNK ili sekvencije gena, date u listingu sekvencija, ili može da sadrži kompletnu cDNK ili sekvenciju gena. Obično, referentna sekvencija je dužine najmanje 18 nukleotida ili 6 aminokiselina, često dužine najmanje 24 nukleotida ili 8 aminokiselina, a često dužine 48 nukleotida ili 16 aminokiselina. Pošto dva polinukleotida ili sekvencije aminokiselina mogu svaka: (a) da sadrže sekvenciju (tj. deo od celokupnog nukleotida ili sekvencije aminokiselina) koja je slična za ova dva molekula, i (2) mogu još da sadrže sekvenciju koja je divergentna između ta dva nukleotida ili sekvencije aminokiselina, sekvencije poređenja između dva (ili više) molekula se tipično obavljaju poređenjem sekvencija dva molekula unutar "prozora za poređenje", da se identifikuju i uporede lokalni regioni na sličnost sekvencija. "Prozor za poređenje", kako se ovde koristi, odnosi se na konceptualni segment od najmanje 18 susednih pozicija nukleotida ili 6 aminokiselina, pri čemu sekvencija polinukleotida ili sekvencija aminokiselina može da se poredi sa referentnom sekvencijom od najmanje 18 susednih nukleotida ili sekvencijom od 6 aminokiselina, i gde deo sekvencije polinukleotida unutar prozora za poređenje može da sadrži adicije, izbacivanja, supstitucije i slično (npr. praznine) u iznosu od 20 procenata ili manje, u poređenju sa referentnom sekvencijom (koja ne sadrži adicije ili izbacivanja), za optimalno sravnjivanje dveju sekvencija. Kod optimalnog sravnjivanja sekvencija radi sravnjenja prozor za poređenje može da se obavi pomoću algoritma lokalne homologije koji su dali Smith i Vvaterman uAdv. Appl. Math.1981, 2, 482, pomoću algoritma za sravnjivanje koji su dali Needleman i VVunsch uJ. Mol. Biol.,1970, 48, 443, traženjem metoda sličnosti koji su dali Pearson i Lipman uProc. Natl. Acad. Sci ( U. S. A.),1988, 85, 2444, kompjuterskom implementacijom ovih algoritama (GAP, BESTFIT, FASTA i TFASTA u VVisconsin Genetics Softvvare Package Release 7.0 (Genetics Computer Group, 575 Science dr., Madison, Wis.), Geneworks ili MacVector paketi softvera), ili inspekcijom, a bira se najbolje sravnjenje (tj. koje daje najveći procent homologije unutar prozora poređenja), koje je generisano raznim metodama.

Naziv "identitet sekvencije" označava da su dve sekvencije polinukleotida ili aminokiselina identične (tj. na bazi nukleotid-do-nukleotida ili ostatak-do-ostatka) unutar prozora za poređenje. Naziv "procent identiteta sekvencije" se izračunava poređenjem dve optimalno sravnjene sekvencije unutar prozora za poređenja, i određuje broj položaja u kojima su identične osnovne nukleinske kiseline (npr. A, T, C, G, U ili I) ili ostaci u obe sekvencije, dajući broj usklađenih položaja, deljenjem broja usklađenih položaja sa ukupnim brojem položaja unutar prozora za poređenje (tj. veličine prozora), pa množeći taj rezultat sa 100, dobija se procent identiteta sekvencije. Naziv "suštinski identitet", kako se ovde koristi, označava karakteristiku sekvencije polinukleotida ili aminokiselina, gde polinukleotid ili aminokiselina sadrži sekvenciju koja ima identitet sekvencije od najmanje 85 procenata, poželjno identitet sekvencije od najmanje 90 do 95 procenata, običnije identitet sekvencije od najmanje 99 procenata, u poređenju sa referentnom sekvencijom unutar prozora za poređenje sa najmanje 18 položaja nukleotida (6 aminokiselina), često unutar prozora sa najmanje 24-48 položaja nukleotida (8-16 aminokiselina), pri čemu se procent identiteta sekvencije izračunava poređenjem referentne sekvencije sa sekvencijom koja može da sadrži izbacivanja ili adicije, koja čini ukupno 20 procenata ili manje od referentne sekvencije unutar prozora za poređenje. Referentna sekvencija može biti subset veće sekvencije.

Kako se ovde koriste, dvadeset konvencionalnih aminokiselina i njihove skraćenice slede konvencionalnu upotrebu. Videti "Immunologv - A Svnthesis"

(2nd ed., Golub, E.S: i Gren, D.R: eds, Sinauer Associates, Sunderiand, Mass., 1991). Stereoizomeri (npr. D-amino kiseline) ovih dvadeset konvencionalnih aminokiselina, ne-prirodne aminokiseline, kao što su a-,a-disupstituisane aminokiseline, N-alkil-aminokiseline, mlečna kiselina i druge nekonvencionalne aminokiseline, mogu takođe predstavljati pogodne komponente za polipeptide iz ovog pronalaska, koji su ovde opisani. Primeri nekonvencionalnih aminokiselina su: 4-hidroksiprolin,Y-karboksiglutamin,E-N,N,N-trimetillizin, e-N-acetillizin, O-fosfoserin, N-acetilserin, N-formilmetionin, 3-metilhistidin, 5-hidroksilizin, a-N-metilarginin i druge slične aminokiseline i iminokiseline (npr. 4-hidroksiprolin). U označavanju polipeptida koje se koristi ovde, levi smer je smer na amino kraju, a

desni smer je smer na karboksi kraju, u skladu sa standardnom upotrebom i konvencijom.

Slično, ukoliko se drugačije na ukaže, levoruki kraj jednostruko uvijene sekvencije polinukleotida je kraj 5'; levoruki smer dvostruko uvijene sekvencije polipeptida se označava kao smer 5'. Smer 5' za 3' adiciju transkripcije nascentne RNK se označava kao smer transkripcije; regioni sekvencije na DNK spirali koja ima istu sekvenciju kao RNK, a koji su 5' prema 5' kraju RNK transkripta, iskazuju se kao "uzlazne sekvencije"; regioni sekvencije DNK spirale koji imaju istu sekvenciju kao RNK, a koji su 3' prema 3' kraju RNK transkripta, iskazuju se kao "silazne sekvencije".

Kada se primeni na polipetide, naziv "suštinski identitet" označava da su dve sekvencije peptida, kada su optimalno usklađene, kao što je pomoću programa GAP ili BESTFIT, koristeći težine praznina po difoltu, dele najmanje 80 procenata identiteta sekvencije, poželjno najmanje 90 procenata identiteta sekvencije, poželjnije najmanje 95 procenata identiteta sekvencije, a najpoželjnije najmanje 99 procenata identiteta sekvencije. Poželjno je da se položaji ostataka, koji nisu identični razlikuju za konzervativne supstituicije aminokiselina. Konzervativne supstitucije aminokiselina se odnose na izmenjlivost ostataka koji imaju slične sporedne lance. Na primer, grupa aminokiselina koja ima alifatične sporedne lance je glicin, alanin, valin, leucin i izoleucin; grupu aminokiselina koja ima alifatične hidroksilne bočne lance čine glicin, alanin, valin, leucin i izoleucin; grupa aminokiselina koja ima bočne lance alifatičnog hidroksila je serin i treonin; grupa aminokiselina koja ima amidne bočne lance je asparagin i glutamin; grupa aminokiselina koja ima aromatične bočne lance, je fenilalanin, tirozin i triptofan; grupa aminokiselina koja ima bazne bočne lance je lizin, arginin i histidin; i grupa aminokiselina koja ima bočne lance koji sadrže sumpor je cistein i metionin. Poželjne supstitucione grupe konzervativnih amino kiselina su: valin-leucin-izoleucin, fenilalanin-tirozin, lizin-arginin-alanin-valin, glutamin-asparagin i asparagin-glutamin.

Kao što se diskutuje ovde, podrazumeva se da su manje varjacije u sekvencijama aminokiselina antitela ili molekula imunoglobulina, obuhvaćene ovde opisanim pronalaskm, pod uslovom da se varijacije u sekvenciji aminokiselina drže unutar najmanje 75%, poželjnije najmanje 80%, 90%, 95% i najpoželjnije 99%. Narčito se podrazumevaju konzervativne zamene aminokiselina. Konzervativne zamene su one koje se odigravaju unutar familije aminokiselina koje su srodne po njihovim bočnim lancima. Genetski kodirane aminokiseline su obično podeljene u familije: (1) kisela = aspartat, glutamat; (2) bazna = lizin, arginin, histidin; (3) nepolarna = alanin, valin, leucin, izoleucin, prolin, fenilalanin, metionin, triptofan; i (4) nenaelektrisana polama = glicin, aspragin, glutamin, cistein, serin, treonin, tirozin. Poželjnije familije su: serin i treonin su alifatična hidroksi familija; asparagin i glutamin su familija koja sadrži amiđ; alanin, valin, leucin i izoleucin su alifatična familija; i fenilalanin, triptofan i tirozin su aromatična familija. Na primer, razumno je očekivati da izolovana zamena leucina sa izoleucinom ili valinom, aspartata sa glutamatom, treonina sa serinom ili slična zamena aminokiseline sa strukturno srodnom aminokiselinom, neće imati većeg efekta na svojstva vezivanja dobijenog molekula, a naročito ukoliko ova zamena ne sadrži aminokiselinu unutar nekog mesta u skeletu. Ukoliko zamena amino kiselina dovodi do funkcionalnog peptida, može se lako odrediti testiranjem specifične aktivnosti derivata polipeptida. Testovi su ovde detaljno opisani. Fragmente ili analoge antitela ili molekula imunoglobulina mogu lako dobiti oni koji su uobičajeno verzirani u stanje tehnike. Poželjni amino- i karboksi-krajevi fragmenata ili analoga se nalaze blizu granica funkcionalnih domena. Strukturni i funkcionalni domeni se mogu identifikovati poređenjem podataka sekvencije nukleotida i/ili aminokiselina sa javnim ili privatnim sekvencijama iz baza podataka. Poželjno je da se koriste kompjuterizovane metode poređenja za identifikaciju motiva sekvencije ili predviđenih konformacionih domena proteina, koji se dešavaju u drugim proteinima poznate strukture i/ili funkcije. Poznate su metode identifikacije sekvencija proteina, koje spadaju u poznatu trodimenzionalnu strukturu. Bowie et al.,Science,1991, 253. 164, Dakle, prethodni primeri pokazuju da oni koji su verzirani u stanje tehnike mogu da prepoznaju motive sekvencije i strukturne konformacije, koji se mogu koristiti za definisanje strukturnih i funkcionalnih domena, u skladu sa ovim pronalaskom.

Poželjne supstitucije aminokiselina su one koje: (1) smanjuju osetljivost prema proteolizi, (2) smanjuju osetljivost prema oksidaciji, (3) menjanju afinitet vezivanja za stvaranje kompleksa proteina, (4) menjaju afinitete vezivanja, i (4) utiču na ili modifikuju druge fizičkohemijske ili funkcionalne osobine tih analoga. Analozi mogu da obuhvate razne muteine ili sekvencije, drugačije nego sekvencije peptida koje se nalaze u prirodi. Na primer, jednostruke ili višestruke supstitucije aminokiselina (poželjno konzervativne supstitucije aminokiselina) mogu se načiniti u sekvenciji koja se nalazi u prirodi (poželjno na delu polipeptida izvan domena koji formira(ju) međumolekulske kontakte). Konzervativna supstituicija aminokiselina neće suštinski promenii strukturne karakteristike roditeljske sekvencije (npr. zamena aminokiseline ne bi trebalo da teži raskidanju spirale, koja se nalazi u roditeljskoj sekvenciji, ili da raskida druge vrste sekundarne strukture koja karakteriše roditeljsku sekvenciju). Primeri sekundarnih i tercijarnih struktura polipeptida poznatih u stanju tehnike, opisani su u "Proteins, Structure and Molecular Principles" (Creighton, ed., W.H. Freeman and Companv, New York, 1984); "Introduction to Protein Structure" (Branden, C. i Tooze, J. eds., Gariand Publishing, New York, N.Y:, 1991); i Thronton et al.,Nature,1991. 354. 105.

Naziv "polipeptidni fragment", kako se ovde koristi, odnosi se na polipeptid koji ima otsečen amino-kraj i/ili karboksi-kraj, a gde je preostala sekvencija aminokiselina identična u odgovarajućim položajima u sekvenciji sa onom koja se nalazi u prirodi, izvedenoj na primer, iz sekvencije cDNK celokupne dužine. Fragmenti su tipično najmanje dugački 5, 6, 8 ili 10 aminokiselina, poželjno dugački najmanje 14 aminokiselina, poželjnije dugački najmanje 20 aminokiselina, obično dugački najmanje 50 aminokiselina, a još poželjnije dugački najmanje 70 aminokiselina. Naziv "analog", kako se ovde koristi, odnosi se na polipeptide koji se sastoje od segmenta od najmanje 25 aminokiselina, koji poseduje suštinski identitet sa delom izvedene sekvencije aminokiselina i koji ima najmanje jedno od sledećih svojstava: (1) specifično vezivanje za MCP-1, pod stabilnim uslovima vezivanja, (2) sposobnost da blokira odgovarajuće vezivanje MCP-1, ili (3) sposobnost da inhibira rast ćelije koja izlučuje MCP-1, biloin vitroiliin vivo.Tipično analozi polipetida sadrže konzervativnu supstituciju aminokiselina (ili adicija ili odsecanje) u odnosu na sekvenciju koja se nalazi u prirodi. Analozi su tipično dugački najmanje 20 aminokiselina, poželjno dugački najmanje 50 aminokiselina ili duži, a često mogu biti dugački i kolika je celokupna dužina polipetida koji se nalazi u prirodi.

Analozi peptida se obično koriste u farmaceutskoj industriji kao ne-peptidni lekovi, sa svojstvima analognim onima za peptidnu shemu. Ove vrste ne-peptidnih jedinjenja se nazivaju "peptidni mimeticP ili "peptidomimetici". Fauchere,J. Adv. Drug Res.,1986, 15, 29; Veber i Freidinger,TINS,1985, str. 392; i Evans et al.,J. Med. Chem.1987, 30, 1229. Ova jedinjenja se često razvijaju uz pomoć kompjuteirzovanog modeliranja molekula. Peptidni mimetici, koji su strukturno slični terapeutski korisnim peptidima, mogu se koristiti za proizvodnju ekvivalentnog terapeutskog ili profilaktičkog efekta. Obično su peptidomimetici strukturno slični paradigmatičnom polipeptidu (tj. polipeptidu koji ima neko biohemijsko svojstvo ili farmakološku aktivnost), kao što je humano antitelo, ali imaju jednu ili više peptidnih veza opciono zamenjenih sa vezom koja se bira iz grupe koju čine: -CH2NH-, -CH2S-, -CH2-CH2-, -CH=CH- (cis i trans),

-COCH2-, CH(OH)CH2- i -CH2SO-, po postupcima koji su dobo poznati u stanju tehnike. Sistematska supstitucija jedne ili više aminokiselina konsenzusne sekvencije sa D-aminokiselinom istog tipa (npr. D-lizin umeto L-lizina) može se koristiti za generisanje stabilnijih peptida. Pored toga, prinudni peptidi, koji sadrže konsenzusnu sekvenciju ili varijaciju suštinski identične konsenzusne sekvencije, mogu se generisati metodama koje su poznate u stanju tehnike (Rizo i Gierasch,Ann. Rev. Biochem.1992, 6_1, 387)); na primer, dodavanje unutrašnjeg ostatka

cisteina koji je u stanju da formira intramolekularne disulfidne mostove, koji cikliziraju peptid.

"Antitelo" ili "peptid(i) antitela" se odnose na nedirnuto antitelo, ili njegov vezujući fragment, koji se nadmeće sa nedirnutim antitelom u specifičnom vezivanju. Vezujući fragmenti se stvaraju tehnikama rekombinantne DNK, ili enzimatskim ili hemijskim cepanjem nedirnutih antitela. Vezujući fragmenti su Fab, Fab', F(ab')2, Fv i antitela jednostrukog lanca. Podrazumeva se da antitelo, različito od "bispecifičnog" ili "bifunkcionalnog" antitela, ima identično svako od njegovih vezujućih mesta. Antielo suštinski inhibira adheziju receptora za kontra-receptor, kada višak antitela smanji količinu receptora vezanog za kontra-receptor za najmanje 20%, 40%, 60% ili 80%, a češće za više od 85% (mereno kompetitivnim testom vezivanjain vitro).

Naziv "epitop" obuhvata bilo koju determinantu proteina koja je u stanju da se specifično vezuje za receptor imunoglobulina ili T-ćeliju. Epitopske determinante se obično sastoje od hemijski aktivnih površinskih grupacija molekula, kao što su aminokiseline ili šećerni bočni lanci, i obično imaju specifične trodimenzionalne strukturne karakteristike, kao i specifične karakteristike naelektrisanja. Kaže se da se antitelo specifično vezuje za antigen kada je njegova konstanta disocijacije

< 1 uM, poželjno < 100 nM, a najpoželjnije < 10 nM.

Naziv "agens" ovde se koristi da označi hemijsko jedinjenje, smešu hemijskih jedinjenja, biološki makromolekul ili ekstrakt načinjen od bioloških materijala.

"Aktivan" ili "aktivnost', za potrebe u ovoj prijavi, se odnose na oblik(e) polipeptida MCP-1 koji zadržavaju biološku i/ili imunološku aktivnost nativnih polipeptida MCP-1 ili prirodnih polipeptida MCP-1 (koji se nalaze u prirodi), pri čemu se "biološka" aktivnost odnosi na biološku funkciju (bilo inhibitomu ili stimulatomu) izazvanu nativnim ili prirodnim polipeptidom MCP-1, koja je različita od sposobnosti indukovanja stvaranja antitela protiv epitopa antigena koji

poseduje nativni ili prirodni polipeptid MCP-1, a "imunološka" aktivnost se odnosi na sposobnost indukovanja stvaranja antitela protiv epitopa antigena koji poseduje nativni ili prirodni polipeptid MCP-1.

"Tretman" se odnosi i na terapeutske i na profilaktičke ili preventivne mere, gde je cilj da se spreči ili uspori (umanji) ciljano patološko stanje ili poremećaj. Oni kojima je potreban tretman su oni koji koji već imaju poremećaj, kao i oni koji su naklonjeni tom poremećaju, ili oni kod kojih taj poremećaj treba da se spreči.

"Sisar" se odnosi na animalno biće koje se klasifikuje kao sisar, uključujući humana bića, druge primate, kao što su majmuni, šimpanze i gorile, kućne i domaće životinje i zoološke, sportske, radne ili kućne mezimce, kao što su psi, mačke, marva, konji, ovce, svinje, koze, zečevi, glodari itd. Za svrhe tretmana poželjno je da sisara predstavlja humano biće.

"Nosači", kako se ovde koriste, obuhvataju farmaceutski prihvatljive nosače, dodatke ili stabilizatore, koji su netoksični za ćelije ili sisara, koji su im izloženi u dozama i koncentracijama koje se koriste, često, fiziološki prihvatljiv nosač predstavlja pH puferovan rastvor u vodi. Primeri fiziološki prihvatljivih nosača su puferi, kao što su fosfat, citrat i druge organske kiseline; antioksidanti, uključujući askorbinsku kiselinu; polipeptidi niske molekulske mase (manje od oko 10 ostataka); proteini, kao što je albumin, želatin ili imunoglobulini; hidrofilni polimeri, kao što je polivinilpirolidon; aminokiseline, kao što su glicin, glutamin, asparagin, arginin ili lizin; monosaharidi, disaharidi i drugi ugljeni hidrati, uključujući glukozu, manozu ili dekstrine; agensi za helatiranje, kao što je EDTA; šećerni alkoholi, kao što su manitol ili sorbitol; kontra joni koji formiraju soli, kao što je natrijum; i/ili nejonski surfaktanti, kao što su TVVEEN™, polietilenglikol (PEG) i PLURONICS™.

Papainska digestija antitela stvara dva identična fragmenta koji vezuju antigen, koji se nazivaju: "Fab" fragmenti, svaki sa po jednim mestom za vezivanje antigena i preostali "Fc" fragment, oznaka odražava sposobnost da lako kristališe. Tretman pepsinom daje "F(ab')2" fragment, koji ima dva mesta za kombinovanje sa antigenom i još uvek je u stanju da se umreži sa antigenom.

"Fv" je minimalni fragment antitela, koji sadrži mesto za potpuno prepoznavanje, i antigena i mesto za vezivanje antitela. Ovaj region se sastoji od dimera, varijabilnog domena jednog teškog- i jednog lakog lanca u tesnoj, ne-kovalentnoj povezanosti. U ovoj konfiguraciji stupaju u interakciju tri CDRs, svaki varijabilnog domena, definišući mesto vezivanja antigena na površini VH-VL dimera. Zajednički, šest CDRs pružaju specifičnost vezivanja antigena za antitelo. Međutim, na primer i samo jedan varijabilni domen (npr. VH ili VL deo dimera Fv, ili polovina Fv, koja sadrži samo tri CDRs, specifična je za antigen) može biti sposoban da prepozna i vezuje antigen, mada, moguće je sa manjim afinitetom nego celovito mesto vezivanja.

Fragment Fab sadrži takođe konstantan domen lakog lanca i prvi konstantan domen (CH1) teškog lanca. Fragmenti Fab se razlikuju od fragmenata Fab' po adiciji nekoliko ostataka sa karboksi kraja domena teškog lanca CH1, uključujući jedan ili više cisteina iz savitljivog regiona antitela. Fragmenti antitela F(ab')2prvobitno su stvoreni kao parovi fragmenata Fab', koji imaju savitljive cisteine između njih. Poznata su i druga hemijska kuplovanja fragmenata antitela.

"Čvrsta faza" označava nevodenu matricu uz koju mogu da adheriraju antitela opisana ovde. Primeri čvrstih faza koje su ovde obuhvaćene su one koje se formiraju delimično ili potpuno od stakla (npr. staklo sa kontrolisanim porama), polisaharida (npr. agaroza), poliakrilamida, polistirola, polivinilalkohola i silikona. Unekim realizacijama, zavisno od konteksta, čvrste faze mogu da budu bazenčići ploče za testiranje; u drugim to je kolona za prečišćavanje (npr. kolona afinitetne hromatografije). Ovaj naziv obuhvata takođe diskontinualnu čvrstu fazu diskretnih čestica, kao što su one koje su opisane u U.S. Patent-u No. 4,275,149.

Naziv "lipozom" ovde se koristi da označi male mehuriće sačinjene od raznih vrsta lipida, fosfolipida i/ili surfaktanata, koji su korisni za dostavljanje leka (kao što je polipeptid MCP-1 ili antitelo) sisaru. Komponente lipozoma se obično raspoređuju u dvoslojnoj formaciji, slično rasporedu lipida u biološkim membranama. Naziv "mali molekul" ovde se koristi da opiše molekul sa molekulskom težinom ispod oko 500 Daltona.

Nazivi "oznaka" ili "označen", kako se ovde koriste, odnose se na ugradnju detektibilnog markera, npr. ugradnja radioaktivno obeležene aminokiseline ili spajanje biotinil ostatka sa polipeptidom, koji se može detektovati obeleženim avidinom (npr. streptavidin koji sadrži fluorescentni marker ili enzimatsku aktivnost koja se može detektovati optičkim ili kolorimetrijskim metodama). U nekim situacijama, ova oznaka ili marker mogu takođe biti terapeutsko sredstvo. Poznati su u stanju tehnike razni postupci za obeležavanje polipeptida i glikoproteina i mogu se koristiti. Primeri oznaka za polipetide su, ali bez ograničavanja, kao što sledi: radioizotopi ili radionuklidi (npr.3H,14C,1<5>N, ^S,<X>Z, " Tc,<111>ln,<125>l,<131>l), fluorescentne oznake (npr. FITC, rodamin, lantanidni fosfori), enzimatske oznake (npr. peroksidaza rena, p-galaktozidaza, luciferaza, alkalna fosfataza), hemiluminiscentne, biotinilne grupe, prethodno određeni epitopi polipeptida, koje prepoznaje sekundarni reporter (npr. leucinski par sekvencija nalik patent-zatvaraču, mesta vezivanja za sekundama antitela, domeni vezivanja metala, privesci epitopa). U nekim realizacijama, oznake su spojene preko distancera različite dužine, kako bi se smanjile potencijalne sterne smetnje.

Naziv "farmaceutski agens ili lek" kako se ovde koristi, odnosi se na hemijsko jedinjenje ili preparat, koji je u stanju da indukuje željeni terapeutski efekt, kada se ispravno ordinira pacijentu. Drugi hemijski nazivi se ovde koriste u skladu sa konvencionalnom upotrebom u stanju tehnike, kao što je na primer u "The McGraw-Hill Dictionan/of Chemical Terms" (Parker, S. ed., McGraw-Hill, San Francisco, 1985).

Naziv "suštinski čist", kako se ovde koristi, označava da u predmetnoj vrsti preovlađuje prisutna vrsta (tj. na molskoj osnovi, ona je prisutnija nego bilo koja druga pojedinačna vrsta u preparatu), a poželjno je da predstavlja suštinski prečišćenu frakciju preparata u kome predmetna vrsta čini najmanje oko 50 procenata (na molskoj osnovi) od svih prisutnih makromolekulskih vrsta. Obično, suštinski čist preparat će da sadrži više od oko 80 procenata od svih makromolekulskih vrsta prisutnih u preparatu, češće više od 85%, 90%, 95% i 99%. Najpoželjnije je da je predmetna vrsta prečišćena do suštinske homogenosti (kontaminantne vrste ne mogu se detektovati u preparatu pomoću konvencionalnih metoda detekcije), pri čemu se preparat sastoji od suštinski samo jedne makromolekuske vrste.

Naziv "pacijent" obuhvata humane i veterinarske subjekte.

Struktura antitela

Poznato je da osnovnu strukturnu jedinku antitela čini tetramer. Svaki tetramer je sastavljen od dva identična para lanaca polipeptida, a svaki par ima jedan "laki"

(oko 25 kDa) i jedan "teški" (oko 50 do 70 kDa) lanac. Deo svakog lanca sa amino-kraja obuhvata varijabilni region od oko 100 do 110 ili više aminokiselina, koje su prvenstveno odgovorne za prepoznavanje antigena. Deo svakog lanca sa karboksi-kraja definiše konstantni region, koji je prvenstveno odgovoran kao efektor funkcije. Humani laki lanci se klasifikuju kao kapa i lambda laki lanci. Teški lanci se klasifikuju kao mi, delta, gama, alfa ili epsilon, i definišu izovrstu antitela, kao IgM, IgD, IgG, IgA i IgE, respektivno. Unutar lakog i teškog lanca varijabilni i konstantni region su spojeni preko "J" regiona od oko 12 ili više aminokiselina, stim da teški lanac sadrži takođe "D" region sa oko 10 aminokiselina. Videti uopšteno, "Fundamental Immunologv" glava 7, (Paul, W. ed., 2nd ed., Raven Press, N.Y., 1989). Varijabilni regioni u svakom paru lakog/teškog lanca formiraju mesto za vezivanje antitela. Dakle, nedirnuto antitelo ima dva mesta vezivanja. Izuzev kod bifunkcionalnih ili bispecifičnih antitela, ova dva mesta vezivanja su ista.

Svi lanci pokazuju istu opštu strukturu relativno konzerviranih regiona skeleta (FR) spojenih preko tri hiper varijabilna regiona, koji se takođe zovu regioni određivanja komplementarnosti ili CDRs. Ovi CDRs iz dva lanca svakog para su poravnati sa regionima skeleta, omogućavajući vezivanje za specifičan epitop. Od N-kraja do C-kraja i laki i teški lanac sadrže domene FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 i FR4. Pripisivanje aminokiselina svakom domenu je u skladu sa definicijama koje je dao Kabat u "Sequences of Proteins of Immunological Interest" (National Institute of Helathe, Bethesda, Md, str. 1991,1987; ili Chothia i Lesk, uJ. Mol. Biol.1987, 196, 901-17; Chothia et al.,Nature,1989, 342, 878-83.

Bispecifično ili bifunkcionalno antitelo je veštačko hibridno antitelo koje ima dva različita para teških/lakih lanaca i dva različita mesta vezivanja. Bispecifična antitela se mogu dobiti raznim metodama, uključujući fuziju hibridoma ili povezivanje fragmenata Fab'. Videti, npr. Songsivilai i Lachmann,Clin. Exp. Immunol.1990, 79, 315-21; Kostelny et al.,J. Immunol.,1992, 148, 1547-53. Stvaranje bispecifični antitela može biti relativno naporan intenzivan proces, u poređenju sa stvaranjem konvencionalnih antitela, a prinosi i stepen čistoće su obično niži za bispecifična antitela. Bispecifična antitela ne postoje u obliku fragmenata koji imaju jedno mesto vezivanja (npr. Fab, Fab' i Fv),

Humana antitela i humanizacija antitela

Humana antitela izbegavaju neke probleme povezane sa antitelima koja poseduju varijabilni i/ili konstantni regioni miševa ili pacova. Prisustvo ovih izvedenih proteina iz miševa ili pacova može da dovede do brzog čišćenja antitela, ili može da dovede do generisanja imuno odgovora protiv antitela od strane pacijenta. Da bi se izbegla upotreba antitela izvedenih iz miševa i pacova, potpuno humana antitela se mogu generisati preko uvođenja funkcije humanog antitela u glodare, tako da i glodari stvaraju potpuno humana antitela.

Humana antitela

Jedan postupak za generisanje potpuno humanih antitela je preko upotrebe sojeva XenoMouse<®>miševa koji su inžinjeringom podešeni da unutar genoma sadrže gene humanog teškog lanca i lakog lanca. Na primer, mišji XenoMouse<®>koji sadrži fragmente konfiguracije soja veličine 245 kb i 190 kb na mestu humanog teškog lanca i na mestu kapa lakog lanca, opisali su Green et al.,Nature Genetics,1994, 7, 13-21. Ovaj rad Green-a i drugih je proširen na uvođenje više od približno 80% repertoara humanog antitela preko korišćenja fragmenata konfiguracije YAC soja veličine megabaze, na mesto humanog teškog lanca i na mesto kapa lakog lanca, respektivno. Videti Mednez et al.,Nature Genetics,1997, 15, 146-56 i U.S. Patent Application Serial No. 08/759,620, podenete 3. decembra 1996. Dalje, generisanje mišji XenoMouse<®>koji sadrži mesto sa čitavim lambda lakim lancem (U.S. Patent Application Serial No. 60/334,508, podneta 30. novembra 2001). I generisan je XenoMouse<®>koji proizvodi višestruke izovrste (videti npr. WO 00/76310). Sojevi XenoMouse<®>su dostupni iz firme Abgenix, Inc. (Fremont, CA).

Proizvodnja mišjeg XenoMouse<®>je dalje diskutovana i opisana u U.S. Patent Application Serial Nos. 07/466,008, podneta 12. januara 1990, 07/610,515, podneta 8-novembra 1990, 07/919,297, podeta 24. jula 1992, 07/922,649, podneta 30 jula 1992, zatim 08/031,801, podneta 15. marta 1993, 08/112,848, podneta 27. avgusta 1993, 08/234,145, podneta 28. aprila 1994, 08/376,279, podneta 20. januara 1995, 08/430,938, podneta 12. aprila 1995, 08/464,584, podneta 5. juna 1995, 08/464,582, podneta 5. juna 1995, 08/463,191, podneta 5. juna 1995, 08/462,837, podneta 5. juna 1995, 08/486,853, podneta 5. juna 1995, 08/486,857, podneta 5. juna 1995, 08/486,857, podneta 5. juna 1995, 08/486,857, podneta 5. juna 1995, 08/462,513, podneta 5. juna 1995, 08/724,752, podneta 2. oktobra 1996 i 08/759,620, podneta 3. decembra 1996, i U.S. Paten-i No. 6,162,963, 6,150,584, 6,114,598, 6,075,181 i 5,939,598 i Japanese Patent-i No. 3 068180 B2, 3 068 506 B2 i 3 068 507 B2. Videti takođe, Mendez et al.,Nature Genetics,1997, 15, 146-156 Green i Jakobovits,J. Exp.Med.1998, 188, 483-495. Videti akođe, European Patent No., EP 463,151 B1, publikovan 12 juna 1996, International Patent Application No. WO 94/02602, publikovana 3. februara 1994, International Patent Application No. WO 96/34096, publikovana 31 oktobra 1996, VVO 98/24893, publikovana 11. juna 1998, WO 00/76310, publikovana 21. decembra 2000.

U alternativnom pristupu, drugi, uključujući GenPharm International Inc., su koristili pristup "minilocus". Kod minolocus pristupa, egzogeno mesto Ig se imitira preko inkluzije delova (indivualni geni) sa mesta Ig. Tako se jedan ili više Vhgena, jedan ili više DHgena, jedan ili više Jhgena, konstantni region mi i neki drugi konstantni region (poželjno konstantni region gama), formiraju u konstrukt za ubacivanje u animalno biće. Ovaj pristup je opisan u U.S. Patent-u No. 5,545,807, priznat Surani-u et al., i U.S. Patentima No. 5,545,806, 5,625,825, 5,625,126, 5,633,425, 5,661,016, 5,770,429, 5,789,650, 5,814,318, 5,877,307, 5,874,299 i 6,255,458, svaki priznat Lomberg-u i Kay-u, U.S. Patent-u No. 5,591,669 i 6,023,010, priznati Krimpenfort-u i Berns-u, U.S. Patent-ima No. 5,612,205, 5,721,367 i 5,789,215, priznati Bems-u et al., i U.S. Patent-u No. 5,643,763, priznat Choi-u i Dunn-u, i GenPharm International U.S. Patent Application Serial No. 07/574,748, podneta 29. avgusta 1990, 07/575,962, podneta 31 avgusta 1990, 07/810,279, podenta 17. decembra 1991, 07/853,408, podenta 18. marta 1992, 07/904,068, podneta 23. juna 1992, 07/990,860, podneta 16. decembra 1992, 08/053,131, podneta 26. aprila 1993, 08/096,762, podneta 22. jula 1993, 08/155,301, podneta 18. novembra 1993, 08/161,739, podneta 3. decembra 1993, 08/165,699, podneta 10. dcembra 1993, 08/209,741, podneta 9. marta 1994. Videti takođe European Paten No. 546,073 B1, International Paten Application No. VVO 92/03918, VVO 92/22645, VVO 92/22670, VVO 93/12227, VVO 94/00569, VVO 94/25585, VV096/14436, VVO 97/13852 i VVO 98/24884, kao i U.S. Patent No. 5,981,175. Videti još Tavlor et al.,(1992), Chen et al. (1993), Tuaillon et al. (1993), Choi et al. (1993), Lonberg et al. (1994), Tavlor et al., (1994) i Tuaillon et al. (1995), Fishwild et al.

(1996).

Kirin je prikazao generisanje humanih antitela iz miševa, u koja su, kroz fuziju mikroćelija, bili uvedeni veliki komadi hromozoma ili čitavi hromozomi. Videti European Patent Application No. 773,288 i 843,961.

Lidak Pharmaceuticals (sada Xenorex) je takođe prikazao generisanje humanih antitela u SCID miševima, modifikovanim injekcijom zrelih perifernih leukocita humanog donora, koji nisu maligni. Ovi modifikovani miševi pokazuju karakteristike imuno odgovora humanog donora, nakon stimulacije sa imunogenom, koji se sastoji od stvaranja humanih antitela. Videti U.S. Patent-e No. 5,476,996 i 5,698,767.

Odgovori humanog anti-mišjeg antitela (HAMA) navele su industriju da pravi himerna ili na drugi način humanizovana antitela. lako himema antitela imaju humani konstantni region i mišji varijabilni region, očekuje se da se zapaze odgovori nekih humanih anti-himemih antitela (HACA), naročito kod hroničnih i upotreba višestrukih doza tih antitela. Dakle, poželjno bi bilo da se dobiju potpuno humana antitela protiv MCP-1, sa ciljem da se izbegnu brige i/ili efekti odgovora HAMA ili HACA.

Humanizacija i tehnologije displeia

Kao što je gore diskutovano u vezi generisanja humanih antiela, postoje prednosti u proizvodnji antitela sa redukovanim imunogenicitetom. U određenoj meri ovo se može ostvariti povezano sa tehnikama humanizacije i tehnikama displeja, korišćenjem odgovarajućih biblioteka fragmenata. Podrazumevaće se da se mišja antitela, ili antitela iz drugih vrsta, mogu humanizovati ili primatizovati, korišćenjem tehnika koje su dobro poznate u stanju tehnike. Videti npr. VVinter i Harris,Immunol. Today,1993, 14, 43-46 i VVright et al.,Crit. Revievvs in Immunol.1992, 12, 125-168. Posmatrano antitelo se može podvrći inžinjeringu tehnikama rekombinantne DNK da se zamene CH1, CH2, CH3, savitljivi domeni i/ili domeni skeleta, sa odgovarajućom humanom sekvencijom (videti WO 92/02190 i U.S. Patent-i No. 5,530,101, 5,585,089, 5,693, 761, 5,693,792, 5,714,350 i 5,777,085). U stanju tehnike poznata je takođe upotreba Ig cDNK za konstrukciju gena himernog imunoglobulina (Liu et al.,P. N. A. S.,1987, 84. 3439; iJ. Immunol.1987, 139, 3521). mRNK se izoluje iz hibridoma ili drugih ćelija koje stvaraju antitelo i koriste se za stvaranje cDNK. Posmatrana cDNK se može amplifikovati lančanom reakcijom polimeraze, koristeći specifične prajmere (U.S. Pat. No. 4,683,195 i 4,683,202). Alternativno, pravi se biblioteka fragmenata i testira da se izoluje željena sekvencija. Sekvencija DNK koja kodira varijabilni region antitela se zatim usmeri na sekvencije humanog konsantnog regiona. Geni sekvencija humanih konstantnih regiona mogu se naćikod Kabat et al., "Sequences of Proteins of Immunological Interesf, N.I.H. publication No. 91-3242, 1991. Geni humanog C regiona su lako dostupni iz poznatih klona. Izbor izotipa određuju željene funkcije efektora, kao što je komplementarna fiksacija ili aktivnost u ćelijskoj citotoksičnosti zavisnoj od antitela. Poželjni izotipovi su lgG1, lgG3 i lgG4. Mogu se koristiti konstantni regioni humanog lakog lanca, bilo kapa ili lambda. Himerno, humanizovano antitelo se zatim izlučuje konvencionalnim metodama.

Fragmenti antitela, kao što je Fv, F(ab').sub.2 i Fab mogu se dobiti cepanjem nedirnutog proteina, npr. proteazom ili hemijskim cepanjem. Alternativno, dizajnira se skraćemi gen. Na primer, himemi gen koji kodira deo F(ab') fragmenta obuhvatio bi sekvencije DNK koje kodiraju domen CH1 i savitljivi domen H lanca, posle čega sledi translacioni zaustavni kodon, dajući skraćeni molekul.

Sekvencije konsenzusa H i L regiona J se mogu koristiti za dizajniranje oligonukleotida koji se koriste kao prajmeri za uvođenje korisnih restrikcionih mesta u region J za naknadno vezivanje segmenata regiona V za segmente humanog C regiona. C region cDNK se može modifikovati mutagenezom usmerenom na mesto, radi smeštanja restrikcionog mesta u analogni položaj u humanoj sekvenciji.

Vektori izlučivaja obuhvataju plazmide, retroviruse, YACs, epizome izvedene iz EBV i slično. Pogodan vektor je onaj koji kodira funkcionalno kompletnu humanu CH ili CL sekvenciju imunoglobulina, sa odgovarajućim mestima restrikcije koja su podvrgnuta inžinjenringu, tako da se bilo koja sekvencija VH ili VL može lako ubaciti i izlučiti. Kod ovih vektora, obično dolazi do spajanja između spojenog donorskog mesta i ubačenog regiona J, a mesto primanja spoja prethodi humanom C regionu, a takođe i u regionima spajanja koji se nalaze unutar humanih CH eksona. Završetak poliadenilovanja i transkripcije dešava se na nativnim hromozomalnim mestima silazno od regiona kodiranja. Dobijeno himerno antitelo može se priključiti bilo kom jakom promoteru, uključujući retrovirusne LTRs, npr. rani promoter SV-40 (Okavama et al.,Mol. Cell. Biol.1983, 3, 280, Rous-ov virus sarkoma LTR (Gorman et al.,P. N. A. S.,1982, 79, 6777) i Moloney-ov virus mišje leukemije LTR (Grosschedl et al.,Cell,1985, 41, 885). Takođe podrazumeva se da se mogu koristiti nativni promoteri Ig i slično.

Dalje, humana antitela, ili antitela iz drugih vrsta, mogu se generisati pomoću tehnologija tipa displeja, uključujući, ali bez ograničavanja, displej fage, displej retrovirusa, displej ribozoma, i druge tehnike, upotrebom tehnika koje su dobro poznate u stanju tehnike, a dobijeni molekuli se mogu podvrći dodatnom starenju, kao što je afinitetno starenje, pošto su te tehnike dobro poznate u stanju tehnike. VVright i Harris, videti gore, Hanes i Pluchthau,PNAS USA,1997, 94, 4937-4942 (displej ribozoma), Parmley i Smith,Gene,1988, 73, 305-318 (displej fage), Scott,TIBS,1992, 17, 241-245, Cwiria et al.,PNAS USA,1990, 87, 6378-6382, Russel et al.,Nucl. Acids Res,1993, 21, 1081-1085, Hoganboom et al.,Immunol. Reviews,1992, 130, 43-68, Chiswell i McCafferty,TIBTECH,1992, 10, 80-84 i U.S. Patent No. 5,733,743. Ukoliko se tehnologije displeja koriste za stvaranje antitela koja nisu humana, ta antitela se mogu humanizovati kao što je opisano gore.

Koristeći ove tehnike, antitela se mogu generisati protiv ćelija koje izlučuju sam MCP-1, oblike MCP-1, njegove epitope i peptide i izlučuju biblioteke fragmenata

(videti npr. U.S. Patent No. 5,703,057) koji se mogu zatim testirati kao što je opisano gore u pogledu aktivnosti koje su opisane gore.

Pobijanje antitela

Antitela u skladu sa ovim pronalaskom se dobijaju korišćenjem tehnologije XenoMouse<®>, kao što je opisano niže. Ti miševi su zatim u stanju da stvaraju molekule humanog imunoglobulina i antitela, a nedostaje im stvaranje mišjih molekula imunoglobulina i antitela. Tehnologije koje se koriste za postizanje ovog su opisane u patentima, prijavama i literaturi opisanoj ovde na kraju. Međutim, naročito poželjna realizacija transgenske proizvodnje kod miševa i antitela iz nje, opisana je u U.S. Patent Application serial No. 08/759,620, podenta 3 decembra 1996, i u International Patent Application No. VVO 98/24893, publikovana 11, juna 1998 i VVO 00/76310, publikovana 21. decembra 2000. Videti takođe, Mendez et al.,Nature Genetics,1997,15, 146-156.

Antitela, kako su ovde opisana, neutrališu visok afinitet antitela prema humanom MCP-1. Dalje, u nekim realizacijama, ova antitela unakrsno reaguju sa MCP-1 pacova. Istorijski, korišćeno je nekoliko različitih metoda za generisanje monoklonalnih antitela ili poliklonalnih antitela nasuprot N-kraju humanog MCP-1. Ovi pristupi su obuhvatili imunizaciju sa čitavom dužinom humanog MCP-1 (hMCP-1), ili goveđeg MCP-1 (bMCP-1) (Vieira et al.,Braz. J. Med. Biol. Res.1988, 21, 1005-1011, sintetskim peptidima humanog MCP-1 (1-34 ili 1-37)

(Visser et al.,Acta Endocn' nol.,1979, 90, 90-102; Logue et al,J. Immunol. Methods,1991. 137. 159-166) i višestrukim antigenskim peptidima (MAP) hMCP-1 (1-10), hMCP-1 (9-18) i hMCP-1 (24-37) (magerlein et al.,Drug Res.,1998, 48, 783-87). Ovi pristupi ne proizvode antitela koja su pogodna u humanoj terapeutici (videti odeljak ovde pod naslovom "Therapeutic Administration and Fonmulation", u pogledu terapeutskih kriterijuma). Antitela visokog anfiniteta prema hMCP-1 teško se prave, zbog tolerancije B ćelija prema peptidu. Međutim, Bradvvell et al.

(1999) su pokazali da se imunizacija sa smešom humanog MCP-1 (1-34) i goveđeg MCP-1 (1-34) MAPs, sledi sa smešom humanog i goveđeg MAPs koji targetira hMCP-1 (51-84) i hMCP-1 (51-86), i da je efikasna u raskidanju tolerancije B-ćelija prema MCP-1 kod humanog pacijenta sa inoperabilnim paratiroidalnim tumorom.

Ovde opisani pristup je posvećen preovladavanju tolerancije B-ćelija prema hMCP-1, kao i proizvodnji potpuno humanog monoklonalnog antitela, pogodnog za terpeutsku i dijagnostičku upotrebu. XenoMouse<®>životinje su imunizirane sintetskim peptidom MCP-1 (hMCP-1 (1-34) i rMCP-1 (1-34)), zato što su sintetski peptidi bili uspešno korišćeni za generisanje antitela specifičnih za endogeni humani MCP-1 (Visser et al., 1979). Pored toga, zato što je N-kraj mišjeg MCP-1 visoko konzerviran sa humanim MCP-1 (identitet 85%) i pascovskim MCP-1 (91 %), korišćena je kombinacija peptida kao imunogen za razbijanje tolerancije B-ćelija prema mišjem MCP-1 preko molekulske mimikrije, čime je dozvoljeno generisanje humanih antitela visokog afiniteta prema anti-humanom MCP-1. Ovi peptidi su kuplovani na ključni prilepak hemocijanina, pa emulgovani u kompletnom Freund-ovom adjuvantu, ili nekompletnom Freund-ovom adjuvantu, da se poboljša imunogenicitet ovih proteina.

Posle imunizacije, limfatične ćelije (kao što su B ćelije) se regenerišu iz miševa koji izlučuju antitela, pa se sojevi ovako regenerisanih ćelija pripoje soju ćelija mijeloidnog tipa, da bi se pripremili sojevi besmrtnih ćelija hibridoma. Ovi sojevi ćelija hibridoma se testiraju, pa selekcionišu da se identifikuju sojevi ćelija hibridoma koji proizvode antitela specifična prema posmatranom antigenu. Ovde je opisana proizvodnja sojeva ćelija višestrukih hibridoma, koji proizvode antitela specifična za MCP-1. Dalje, daje se karakterizacija antitela proizvedenih ovakvim sojevima ćelija, uključujući analize nukleotida i sekvencije aminokiselina, za teške i lake lance tih antitela.

Realizacije ovog pronalaska daju proizvodnju sojeva ćelija višestrukih hibridoma, koji proizvode antitela specifična za MCP-1. Druge realizacije se odnose na antitela koja se vezuju za i neutrališu aktivnost članova familije MCP-1, uključujući MCP-2, MCP-3 i MCP-4. Supernatanti su takođe testirani na imunoreaktivnost prema fragmentima MCP-1 da se popuni mapa epitopa raznih antitela protiv srodnih humanih hemokina i protiv pacovske MCP-1 i JE, mišjeg ortologa MCP-1, da bi se utvrdila unakrsna reaktivnost vrsta. Dalje realizacije daju karakterizaciju antitela proizvedenih u ovakvim sojevima ćelija, uključujući analize sekvencija nukleotida i aminokiselina teškog i lakog lanca tih antitela.

Alternativno, umesto da se pripoje ćelijama mijeloma da generišu hibridome, B ćelije se mogu direktno testirati. Na primer, B ćelije CD19+ se mogu izolovati iz hiperimunih Xeno Mouse<®>miševa i dozvoliti im da se razmnože i diferenciraju u ćelije plazme koje izlučuju antitelo. Zatim se antitiela iz ćelijskih supematanata testiraju pomoću ELISA na reaktivnost prema imunogenu MCP-1. Ovi supernatanti se testiraju takođe na imunoreaktivnost prema fragmentima MCP-1, da se proširi mapa epitopa raznih antitela protiv srodnih humanih hemokina i protiv pacovskog MCP-1 i JE, mišjeg ortologa MCP-1, da bi se odredila ukrštena reaktivnost vrsta. Zatim se izoluju pojedine ćelije plazme koje izlučuju antitela željenih specifikacija, koristeći test za hemolitički plak specifičan za MCP-1 (Babcook et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA,1996, 93, 7843-7848). Ćelije namenjene za lizu poželjno je da budu ćelije crvenih krvnih zrnaca ovce (SRBCs) obložene sa antigenom MCP-1. U prisustvu kulture B ćelija, koja sadrži ćelije plazme koje izlučuju posmatrani imunoglobulin i komplement, stvaranje plaka ukazuje na specifičnu lizu, posredovanu sa MCP-1, ćelija crvenih krvnih zrnaca ovce, koje okružuju posmatrane ćelije plazme. Jedna ćelija plazme specifična za antigen u centru ovog plaka može se izolovati, a genetska informacija koja kodira specifičnost tog antitela se izoluje iz ove jedne ćelije plazme. Koristeći reversnu transkriptazu PCR, može da se klonira DNK koja kodira teški i laki lanac varijabilnih regiona antitela. Ovako klonirana DNK se može zatim dalje insertovati u pogodni vektor za izlučivanje, poželjno kasetu vektora, kao što je pcDNK, poželjnije kao što je vektor pcDNK koji sadrži konstantne domene imunoglobulina teškog i lakog lanca. Ovaj generisani vektor se može transficirati u ćelije domaćina, poželjno ćelije CHO, pa kultivisati u konvencionalnom hranljivom medijumu, odgovarajuće modifikovanom za indukovanje promotera, iz transformanata ili amplifikaciju gena koji kodiraju željene sekvencije. Izolovanje višestruktih jediničnih ćelija plazme, koje stvaraju antitela specifična za MCP-1, opisano je niže. Dalje, genetski materijal koji kodira specifičnost anti-MCP-1 antitela, može se izolovati, uneti u pogodni vektor izlučivanja, koji se opet može transficirati u ćelije domaćina.

Obično, antitela koja se stvaraju iz pripojenih hibridoma su humana lgG2 teških lanaca, sa celokupnim kapa i lambda lancima. U nekim realizacijama, antitela poseduju teške lance humanog lgG4, kao i teške lance lgG2. Antitela mogu takođe iz drugih humanih izotipova, uključujući lgG1. Ova antitela poseduju visoke afinitete, i tipično poseduju Kp od oko 10"6 do oko 10"<12>M ili niže, kada se mere pomoću bilo čvrste faze ili tečne faze. Antitela koja poseduju Kood najmanje 10"<11>M, poželjna su za inhibiranje aktivnosti MCP-1.

U pogledu značaja afiniteta za terapeutsku upotrebu anti-MCP-1 antitela, podrazumeva se da se mogu generisati anti-MCP-1 antitela, na primer, kombinatomo, pa ta antitela testirati u pogledu afiniteta za vezivanje. Jedan od pristupa koji se može koristiti je uzimanje teškog lanca cDNK iz antitela, pripemi se kao što je opisano gore, pa se nađe da li ima dobar afinitet prema MCP-1, i kombinovati ga sa lakim lancem cDNK iz drugog antitela, pripremljenog kao što je opisano gore, pa takođe naći da li ima dobar afinitet prema MCP-1, da bi se proizvelo treće antitelo. Afiniteti ovog trećeg, dobijenog antitela mogu se izmeriti kao što je ovde opisano, a ona sa poželjnim konstantama disocijacije izolovati i karakterisati. Alternativno, laki lanac iz bilo kog od antitela opisanih gore, može se koristiti za ispomoć pri generisanju teškog lanca, koji će, kada se upari sa lakim lancem, pokazivati visok afinitet prema MCP-1, ili obrnuto. Ovi teški lanci varijabilnih regiona u ovoj biblioteci fragmenata mogu da se izoluju iz običnih životinja, da se izoluju iz hiperimunih životinja, generisanih veštački iz biblioteka koje sadrže varijabilne sekvencije teškog lanca, koje se razlikuju u regionima CDR, ili generisanih drugim metodama, koje stvaraju različitost unutar regiona CDR u bilo kom teškom lancu varijabilnog regiona gena (kao što je nasumična ili dirigovana mutageneza). Ovi regioni CDR, a naročito CDR3, mogu biti značajno različiti po dužini ili identitetu sekvencije iz teškog lanca, prvobitno sparenog sa originalnim antitelom. Nastala biblioteka fragmenata može se zatim testirati na visoki afinitet vezivanja za MCP-1, da bi se generisao terapeutski relevantan molekul antitela, sa sličnim svojstvima kao i originalno antitelo (visok afinitet i neutralizacija). Sličan proces, koji koristi teški lanac ili teški lanac varijabilnog regiona, može se koristiti za generisanje molekula terapeutski relevantnog antitela sa jedinstvenim varijabilnim regionom lakog lanca. Pored toga, novi teški lanac varijabilnog regiona ili laki lanac varijabilnog regiona, može se zatim koristiti na sličan način opisanom gore, za identifikaciju novog lakog lanca varijabilnog regiona, ili teškog lanca varijabilnog regiona, što dozvoljava generisanje novog molekula antitela.

Sledeći kombinatorni pristup, koji se može koristiti, je da se obavi mutageneza na soju bakterija teškog i/ili lakog lanca, za koji je pokazano da se može koristiti kod antitela, u skladu sa ovde opisanim pronalaskom, a naročito pri određivanju regiona komplementarnosti (CDRs). Afiniteti dobijenih antitela se mogu meriti kao što je ovde opisano, a oni sa poželjnim konstantama disocijacije izolovati i karakterisati. Posle izbora poželjnog veziva, sekvencija ili sekvencija koje kodiraju isti, mogu se koristiti za generisanje rekombinantnih antitela, kao što je opisano gore. Odgovarajuće metode obavljanja mutageneze na nekom oligonukleotidu su poznate onim akoji su verzirani u stanje tehnike, i obuhvataju hemijsku mutagenezu, na primer sa natrijum-bisulfitom, enzimatsku misinkorporaciju i izlaganje radijaciji. Podrazumeva se da pronalazak koji je ovde opisan obuhvata antitela sa suštinskim identiteom, kako je ovde definisan za antitela koja su ovde izložena, bilo da su dobijena mutagenezom ili na bilo koji drugi način. Dalje, antitela sa konzervativnim ili ne-konzervativnim supstituicijama aminokiselina, kako su ovde definisana, učinjenim na antitelima koja su eksplicitno opisana ovde, obuhvaćena su realizacijama pronalaska opisanog ovde.

Sledeći kombinatorijalni pristup koji se može koristiti, je da se izluče regioni CDR, a naročito CDR3, iz gore opisanih antitela, u kontekstu regiona skeleta izvedenih iz drugog varijabilnog regiona gena. Na primer, CDR1, CDR2 i CDR3 iz teškog lanca jednog anti-MCP-1 antitela, mogu da se izlučuju u kontekstu regiona skeleta drugog varijabilnog teškog lanca gena. Slično, CDR1, CDR2 i CDR3 iz lakog lanca anti-MCP-1 antitela se mogu izlučivati u kontekstu regiona skeleta drugog varijabilnog lakog lanca gena. Pored toga, sekvencije soja ovih CDR regiona se mogu izlučivati u kontekstu drugog varijabilnog regiona teškog ili lakog lanca gena. Nastala antitela se mogu testirati na specifičnost i afinitet, i mogu dozvoliti generisanje novog molekula antigena.

Podrazumevaće se da antitela, dobijena u skladu sa pronalaskom opisanim ovde, mogu da se izlučuju u raznim sojevima ćelija. Sekvencije koje kodiraju određena antitela mogu se koristiti za transformaciju pogodne ćelije sisara domaćina. Transformacija može biti u skladu sa bilo kojim poznatim metodom uvođenja polinukleotida u ćeliju domaćina, uključujući na primer, pakovanje polinukleotida u virus (ili u virusni vektor) i transdukcija ćelije domaćina sa ovim virusom (ili vektorom), ili procedurama transficiranja, koje su poznate u stanju tehnike, kao što je pokazano za primer u U.S. Patent-ima No. 4,339,216, 4,912,040, 4,740,461 i 4,959,355). Upotrebljena procedura transformacije zavisi od domaćinakoji treba da se transformiše. Metode za uvođenje heterolognih polinukleotida u ćelije sisara su dobro poznate u stanju tehnike, i obuhvataju transficiranje posredovano sa dekstranom, taloženje kalcijum-fosfata, transficiranje posredovano sa polibrenom, fuziju protoplasta, elektroporaciju, enkapsuliranje polinukleotida u lipozome i direktnu mikroinjekciju DNK u jezgro.

Sojevi ćelija sisara, dostupni kao domađn za izlučivanje, dobro su poznati u stanju tehnike, i obuhvataju mnoge besmrtne sojeve ćelija, dostupne iz American Type Culture Collection (ATCC), uključujući, ali bez ograničavanja, ćelije jajnika kineskog hrčka (CHO), HeLa ćelije, ćelije bubrega mladunca hrčka (BHK), ćelije bubrega majmuna (COS), ćelije humanog hepatocelulamog karcinoma (npr. Hep G2) i brojne druge sojeve ćelija. Sojevi naročito pogodnih ćelija se biraju preko određivanja koji od sojeva ćelija ima visoke nivoe izlučivanja, a stvaraju antitela sa konstitutivnim svojstvima vezivanja MCP-1.

Dodatni kriteriiumi za antitela kao terapeutska sredstva

Kao što je ovde diskutovano, funkcija antitela MCP-1 čini se značajnom bar za deo njegovg načina funkcionisanja. Anti-MCP-1 antitela iz ovog pronalaska mogu se načiniti sposobnim za izvođenje funkcije, uključujući komplementarno zavisnu citotoksičnost (CDC) i ćelijsku citotoksičnost zavisnu od antitela (ADCC). Postoje brojni izotipovi antitela koja su sposobna za isto, uključujući, ali bez ograničavanja, sledeća: mišji IgM, mišji lgG2, mišji lgG2b, mišji lgG3, humani IgM, humani lgG1 i humani lgG3. Podrazumevaće se da generisana antitiela ne treba inicijalno da poseduju takav izotip, već radije da generisano antitelo može da poseduje bilo koji izotip i da antitelo može da bude izotipa koji se može posle toga izmeniti, korišćenjem konvencionalnih tehnika koje su dobro poznate u stanju tehnike. Ove tehnike obuhvataju upotrebu direktnih rekombinantnih tehnika (videti npr. U.S. Patent No. 4, 816,397 i U.S. Patent No. 6,331,415), tehnike fuzije ćelija-ćelija (videti npr., U.S. Patent No. 5,916,771 i 6,207,418), između ostalih.

Kod tehnike fuzije ćelija-ćelija, soj mijeloma ili druge ćelije, pripremi se tako da poseduje teški lanac sa bilo kojim željenim izotipom, a druga ćelija mijeloma, ili drugi soj ćelija, se pripremi tako da poseduje laki lanac. Takve ćelije se mogu posle toga fuzionisati, pa izolovati soj ćelija koji izlučuje nedirnuto antitelo.

U svrhu primera, antitela MCP-1 koja se ovde diskutuju, su humana anti-MCP-1 lgG2 i lgG4 antitela. Ukoliko takvo antitelo poseduje željeno vezivanje za molekul MCP-1, može mu se jednostavno izmeniti izotip, pa da se generišu humani IgM, humani lgG1 ili humani lgG3, lgA1 ili lgGA2 izotipovi, dok još uvek poseduje isti varijabilni region (koji definiše specifičost antitela i nešto od njegovog afiniteta). Takav molekul je zatim u stanju da fiksira komplement i participira u CDC.

U skladu sa tim, kandidati za antitelo se generišu tako da udovolje željenim "strukturnim" atributima diskutovanim gore, a obično se mogu preko izmene izotipa dobiti bar sa izvesnim nekim od željenih "funkcionalnih" atributa.

Mana epitopa

Imunoblot analiza

Vezivanje antitela za MCP-1, koje je ovde opisano, može se ispitati brojnim metodama. Na primer, MCP-1 se može podvrgnuti SDS-PAGE, pa analizirati pomoću imunoblotinga. Ovaj SDS-PAGE se može obaviti bilo u odsustvu ili u prisistvu redukcionog sredstva. Ovakve hemijske modifikacije mogu da dovedu do metilovanja cisteinskih ostataka. U skladu sa tim, moguće je odredit) da li se anti-MCP-1 antiela, opisana ovde, vezuju za linearni epitop na MCP-1.

Laserska desorpcija/ jonizacija pojačana površinom ( SELDI)

Mapiranje epitopa za epitop antitela MCP-1, opisano ovde, može se takođe obaviti korišćenjem SELDI. Koristi se SELDI za nizove ProteinChip<®>da bi se definisala mesta interakcije protein-protein. Antigeni se specifično hvataju na antitelima, kovalentno imobilisanim na površini niza ProteinChip, inicijalnom inkubacijom i ispiranjem. Vezani antigeni se mogu detektovati procesom desorpcije indukovanim laserom, pa direktno analizirati da se odredi njihova masa. Ovakvi fragmenti antigena koji se vezuju, označavaju se kao "epitop" proteina.

Proces SELDI omogućava da se direktno detektuju individualne komponente unutar preparata molekulskog kompleksa i kvantitativno mapiraju, relativno prema drugim komponentama na brz, visoko osetljiv i stepenast način. SELDI koristi razne nizove površinskih hernija za zahvatanje i predstavljanje velikog broja pojedinačnih molekula proteina za detekciju procesom desorpcije izazvae laserom. Uspeh procesa SALDI se definiše delom minijatuirzacijom i integracijom višestrukih funkcija na površini ("čip"), od kojih svaka zavisi od različitih tehnologija. SELDI BioChips i drugi tipovi SELDI proba su "pojačane" površinom, tako da postaju aktivni učesnici pri zahvatanju, prečišćavanju (izdvajanju), prezentaciji, detekciji i karakterizaciji pojedinačnog ciljanog molekula (npr. proteina) ili populacije molekula koja treba da se vrednuje.

Jedan SELDI proteinski BioChip, šaržiran samo sa originalnim uzorkom, može se očitavati hiljadama puta. SELDI protein BioChip iz LumiCvte, sadrži čitavih 10.000 adresabilnih lokacija na koje može protein da pristigne, po 1 kvadratnom centimetru. Svaka lokacija može da otkrije prisustvo desetina pojedinačnih proteina. Kada se informacije o sastavu proteina sa svake lokacije uporede, jedinstveni setovi informacija kombinuju, dobijena mapa sastava otkriva imidž sa setom karakteristika koje se koriste za kolektivno definisanje specifičnih šema ili molekulskih "otisaka prsta". Različiti otisci prsta se mogu povezati sa raznim fazama zdravlja, početkom bolesti ili povlačenjem bolesti, koji su povezani sa ordiniranjem odgovarajućeg terapeutskog sredstva.

SELDI proces se može detaljnije opisati u četri dela. Prvobitno, jedan ili više odabranih proteina se zahvate ili "ukotve" na ProetinChip Array, direktno iz originačnog izvora materijala, bez pripremanja uzorka i bez obeležavanja uzorka. U drugom koraku pojača se odnos "signala prema šumu" smanjivanjem hemijskog i biomolekulskog "šuma". Taj "šum" se smanjuje preko selektivnog zadržavanja cilja na čipu, ispiranjem nepoželjnog materijala. Dalje, jedan ili više zahvaćenih ciljanih proteina očitava se brzim, osetljivim procesom, indukovanim laserom (SELDI), koji pruža direktne informacije o cilju (molekulska težina). Najzad, ciljani protein, na jednoj ili više lokacija unutar niza na površini može da se karakterišein situ,obavljanjem jedne ili više reakcija vezivanja ili modifikacije na samom čipu, da bi se karakterisala struktura i funkcija proteina.

Displej fage

Ovde opisani epitop za anti-MCP-1 antitela se može odrediti izlaganjem ProteinChip Array-a kombinatornoj biblioteci fragmenata za nasumični peptidni 12-mer, smešten na vlaknastu fagu (New England Biolabs).

Displej fage opisuje tehniku selekcije u kojoj se peptid izlučuje kao fuzija sa pokrivnim proteinom bakteriofage, što dovodi do displeja fuzionisanog proteina na površinu viriona. Paning se obavlja inkubacijom biblioteke fragmenata petida smeštenog na fagu, stim da je ploča ili cev obložena sa ciljanom metom, ispere se nevezana faga, pa se eluira specifično vezana faga. Eluirana faga se zatim amplifikuje, pa propusti kroz dodatne cikluse vezivanja i amplifikacije, kako bi se obogatio taj skup, u korist sekvencija vezivanja. Posle tri ili četri runde, pojedinačna vezivanja klona se dalje testiraju na vezivanje fage testovima ELISA, obavljenim u bazenčićima obloženim antitelom, pa se karakteriše specifičnim sekvencioniranjem pozitivnih klona DNK.

Posle više rundi ovakvoig paninga protiv anti-MCP-1 antitela opisanih ovde, vezana faga se može eluirati i podvrgnuti daljem ispitivanju radi identifikacije i karakterizacije vezanog peptida.

Pokazano je da monoklonalna antitela iz ovog pronalaska vezuju značajne ostatke u domenu jezgra MCP-1. Ispitivana neutrališuća monoklonalna antitela razlikuju dva funkcionalno važna mesta na humanom MCP-1, koja učestvuju sa dva ostatka, za koja je prethodno pokazano, da su neophodna za vezivanje na receptor. Jedno mesto prepoznaju sva testirana antitela, koje se nadmeće sa receptorskim proteinom za vezivanje MCP-1 i sadrži Arg 24. Drugo mesto se detektuje sa grupom od šest antitela koja vezuju konformacioni epitop, a njihovo mesto vezivanja izgleda da sadrži Arg24 i Liz35, koji se drže u neposrednoj blizini N-krajeva, preko disulfidne veze između C11 i C36.

Ovde opisani varijanti MCP-1 analizirani su ranije u pogledu biološke aktivnosti, fizičkog vezivanja receptora i strukturnog integriteta (Jamagin et al,Biochemistry,1999, 38, 16167-16177; Hemmerich et al.,Biochemistry,1999, 38, 13013-13025) i predstavljaju vredno oruđe za određivanje vezivanja epitopa antitela, kao što se opisuje niže.

Anti-MCP-1- antitelo 3.11.1 prepoznaje konformacioni epitop i razlikuje se od drugih antitela jedinstevnom sekvencijom teškog i lakog lanca i njegovom sposobnošću da unakrsno reaguje sa, i da unakrsno neutrališe, druge članove MCP familije, kao što su MCP-2, MCP-3 i MCP-4. Kao što je pokazano eksperimentima mutageneze, mesto vezivanja mAb 3.11.1 je pod uticajem promene R24A, ali ne i K35A. Ovi podaci su potvrđeni pomoću Lyc-C, rezultatom digestije na čipu, sa SELDI, koji ograničavaju vezivanje epitopa između ostataka 20-35 na MCP-1.

Određivanje da je epitop za 3.11.1 između ostataka 20-35, potvrđuje takođe poravnavanje sekvencija, koje pokazuje da je R24, a ne K35, konzerviran preko drugih članova familije MCP, specifično MCP-2, MCP-3 i MCP-4. Analize vezivanja pomoću peptida SPOTs, sintetizovanih na membrani (Sigma-Genosys, The VVoodlands, Texas), su otkrile sa je mesto vezivanja najmanje osam mAbs sa linearnim epitopima, obuhvaćeno ostacima 20-25, i da je uključen R24. Date sličnosti u rezultatima ovih ispitivanja vezivanja i signifikantna homologija između varijabilnih struktura gena za sva mAbs vezivanja za linearne epitope na MCP-1, ukazuju da se izgleda sva antitela vezuju za ovaj neutrališući epitop.

Klaster epitopa okolo R24 i K35 objašnjava neutrališuću aktivnost svih 36 antitela. Izgleda da se prepoznati epitop na MCP-1 ne proteže na ostatke sa N-kraja, sve do Pro9. Izgleda da ovaj ostatak utiče na signalizaciju receptora, ali i na afinitet vezivanja.

Diaanotička upotreba

Antitela dobijena u skladu sa realizacijama ovog pronalska, koja su ovde opisana, korisna su za testiranje, naročito u dijagnostičkim testovimain vitro,na primer, za upotrebu određivanjan sadržaja MCP-1 i svih članova familije MCP-1 u uzorcima pacijenta. Uzorci pacijenta mogu biti, na primer, telesni fluidi, poželjno krv, poželjnije krvni serum, sinovijalni fluid, lizati tkiva i ekstrakti dobijeni iz obolelih tkiva. Primeri dijagnostičkih testova su merenje sadržaja hemokina familije MCP u, na primer, humanom serumu, sinovijalnom fluidu i lizatima tkiva. Praćenje sadržaja specifičnih članova familije MCP može se koristiti kao surogatna mera za odgovor pacijenta na tretman i kao metod praćenja ozbiljnosti bolesti pacijenta. Povišeni sadržaji MCP-1, upoređeni sa sadržajima drugih rastvornih markera ukazuje na prisustvo inflamacije. Koncentracija antigena MCP-1 prisutnog u uzorcima pacijenta određuje se korišćenjem metode koja specifično određuje količinu prisutnog antigena. Ovaj postupak obuhvata ELISA metodu, u kojoj se, na primer, antitela iz ovog pronalaska mogu pogodno imobilisati na nerastvomoj matrici, kao što je matrica polimera. Upotrebom populacije uzoraka koja daje statistički signifikantne rezultate za svaku fazu napredovanja terapije, može se odrediti opseg koncentracije antigena, koji se može smatrati karakterističnim za svaku fazu bolesti.

Da bi se odredio stepen inflamacije kod subjekta koji se ispituje, ili da se karakteriše odgovor subjekta na tok terapije, uzima se uzorak krvi subjektu, pa se odredi koncentracija MCP-1 antigena prisutnog u uzorku. Tako dobijena koncentracija se koristi za identifikaciju u koji opseg koncentracije ta vrednost pada. Tako definisan opseg je u korelaciji sa fazom napredovanja bolesti, ili sa fazom terapije, identifikovan u raznim populacijama dijagnostikovanih subjekata, čime se saznaje faza kod ispitivanog subjekta.

Amplifikacija gena i/ili izlučivanje se mogu meriti direktno u uzorku, na primer, konvencionalnim postupkom Southern blotting, Northern blotting, da bi se kvantitativno iskazala transkripcija mRNK (Thomas,Proc. Natl. Acad. Sci. USA,1980, 77, 5201-5205), dot blotting /analiza DNK) ili hibridizacijomin situ,koristea odgovarajuće obeleženu probu, zasnovanu na sekvencijama opisanim ovde. Alternativno, antitela se mogu koristiti tako da mogu da prepoznaju specifične duplekse, uključujući duplekse DNK, duplekse RNK i hibridne duplekse DNK-RNK, ili duplekse DNK-protein. Za uzvrat, antitela se mogu obeležiti, a test se može voditi tamo gde je dupleks vezan za površinu, tako da se nakon formiranja dupleksa na površini, može detektovati prisustvo antitela vezanog za dupleks. Na primer, antitela, uključujući fragmente antitela, se mogu koristiti za kvalitativnu ili kvantitativnu detekciju izlučivanja proteina MCP-1. kao što je pomenuto gore, poželjno je da je antitelo opremljeno sa detektabilnom, tj. fluorescentnom oznakom, pa se vezivanje može pratiti svetlosnom mikroskopijom, protočnom citometrijom, fluorimetrijom ili drugim tehnikama poznatim u stanju tehnike. Ove tehnike su naročito pogodne ukoliko amplifikovani gen kodira protein na površini ćelije, npr. faktor rasta. Ovi testovi vezivanja se obavljaju kao što je to poznato u stanju tehnike.

Detekcija antitela vezanog za MCP-1 proteinin situ,može se obaviti, na primer, imunofluorescencijom ili imunoelektronskom mikroskopijom. U tu svrhu, uzorak tkiva se uzme od pacijenta, primeni se na njega obeleženo antitelo, poželjno prekrivanjem antitela preko biološkog uzorka. Ova procedura takođe dozvoljava određivanje raspodele produkta gena markera u ispitivanom tkivu. Onima koji su verzirani u stanje struke je jasno da su za detekcijuin situlako dostupne veoma raznovrsne histološke metode.

Jedna od najosetljivijih i najfleksibilnijih kvantitativnih metoda za kvantitativno diferenciranje gena je RT-PCR, koja se može koristiti za poređenje sadržaja mRNK u raznim populacijama uzorka, u normalnim i tumomim tkivima, sa ili bez tretmana lekom, da se karakteriše izlučivanje gena i učini diskriminacija između blisko srodnih mRNK i analize strukture RNK.

Prvi korak u ovom procesu je izolovanje mRNK iz ciljanog uzorka. Polazni materijal je tipično ukupna RNK, izolovana iz obolelog tkiva i odgovarajućeg normalnog tkiva, respektivno. Tako, mRNK se može ekstrahovati, na primer, iz smrznutih ili arhiviranih, u parafin utopljenih i fiksiranih (npr. fiksiranih formalinom) uzoraka obolelog tkiva, za poređenje sa normalnim tkivom istog tipa. Metode ekstrakcije mRNK su dobro poznate u stanju tehnike i opisane su u standardnim udžbenicima iz molekularne biologije, uključujući Ausubel et al., "Current Protocols of Molecular Biologv" John Wiley and Sons, 1997. Metode ekstrakcije RNK iz tkiva zatopljenih u parafin, opisane su na primer u Rupp i Locker,Lab. Invest.,1987, 56, A67 i De Andres et al.,Bio. Techniques,1995,18, 42044. Naročito se izolovanje RNK može obaviti upotrebom kompleta za prečišćavanje, pufera i proteaze komercijalnog proizvođača, kao što je OJagen, u skladu sa uputstvima proizvođača. Na primer, ukupna RNK iz ćelija u kulturi može se izolovati korišćenjem OJagen RNeasv mini-kolona. Ukupna RNK iz uzoraka tkiva može se izolovati upotrebom RNK Stat-60 (Tel-Test).

Pošto RNK ne može služiti kao model za PCR, prvi korak u diferencijalnoj analizi izlučivanja gena pomoću RT-PCR je reversna transkripcija modela RNK u cDNK, posle čega dolazi njegova eksponencijalna amplifikacija u reakciji PCR. Dve najčešće korišćene reversne transkriptaze su reversna transkriptaza virusa avilo mijeloblastoze (AMV-RT) i reversna transkriptaza virusa Moloney-ove mišje leukemije (MMLV-RT). Korak reversne transkripcije je tipično prajmovan, upotrebom specifičnih prajmera, nasumičnih heksamera, ili oligo-dT-prajmera, zavisno od okolnosti i cilja profajlinga izlučivanja. Na primer, esktrahovana RNK se može reversno-transkribovati upotrebom GeneAmp RNK PCT kompleta (PerkinELmer, CA, USA), slede6' uputstva proizvođača. Izvedena cDNK se može zatim upotrebiti kao model u PCR reakciji koja sledi.

Mada korak PCR može da koristi razne termostabilne DNK-zavisne DNK polimeraze, tipično se koristi Taq DNK polimeraza, koja ima aktivnost 5'-3' nukleaze, ali joj nedostaje aktivnost 3'-5' endonukleaze. Dakle, TaqMan PCR tipično koristi aktivnost 5'-nukleaze iz Taq, ili Tth polimeraze za hidrolizu hibridizacione probe vezane za njen ciljani amplikon, ali može se koristiti bilo koji enzim sa ekvivalentnom aktivnošću 5' nukleaze. Koriste se dva oligonukleotidna prajmera za generisanje amlikona tipičnog za PCR reakciju. Treći oligonukleotid, ili proba, dizajnirana je za detekciju sekvencije nukleotida smeštenog između dva PCR prajmera. Ova proba se ne može proširiti sa enzimom Taq DNK polimeraze, a obeležena je sa jednom reporter fluorescentnom bojom i prigušivačem za fluorescentnu boju. Bilo koja emisija lasera iz reporter boje je prigušena pomoći prigušivača boje kada su dve boje smeštene u blizini, pošto su one na probi. Za veme reakcije amplifikacije enzim Taq DNK polimeraze otcepljuje probu na način koji zavisi od modela. Dobijeni fagmenti probe disociraju u rastvoru, pa je signal iz oslobođene reporter boje slobodan od efekta prigušivanja drugog fluorofora. Jedan molekul reporter boje se oslobađa za svaki novi sintetizovani molekul, a detekcija neprigušene reporter boje daje osnovu za kvantitativnu interpretaciju podataka.

TaqMan RT-PCR se može obaviti upotebom komercijalno dostupne opreme, kao što je na primer, ABI PRIZM 7700TM Sequence Detection SvstemTM (PerkinElmer-Applied Biosvstem, Foster City, CA, USA) ili Lightcvcler (Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Germanv). U poželjnoj realizaciji procedura 5' nukleaze se vodi u uređaju za kvantitativnu PCR, u realnom vremenu, kao što je ABI PRIZM 7700TM Sequence Detection SvstemTM. Ovaj sistem se sastoji od termociklera, lasera, uređaja sa kuplovanim naelektrisanjem (CCD), kamerom i kompjuterom. Ovaj sistem ampliifikuje uzorke u formatu 96-bazenčića, na tenmocikleru. Za vreme amplifikacije, sakuplja se fluorescentni signal indukovan laserom, u realnom vremenu, kroz optičke kablove za svih 96 bazenčia, pa se detektuje na CCD. Ovaj sistem obuhvata i softver za vođenje instrumenta i analizu podataka.

Podaci testa 5'-nukleaze se prvobitno iskazuju kao Ct, ili ciklus praga. Kao što je gore diskutovano, vednosti fluorescencije tokom svakog ciklusa se registruju i predstavljaju količinu amplifikovanog proizvoda, u reakciji amlifikacije do tog trenutka.Tačka kada je fluorescentni signal prvi put registrovan kao statistički signifikantan, je prag ciklusa (Ct). Vrednosti ACt se koriste kao kvantitativna mera relativnog broja polaznih kopija određene ciljane sekvencije u uzorku nukleinske kiseline, kada se poredi izlučivanje RNK u ćeliji iz obolelog tkiva, sa istim iz normalne ćelije.

Da se na minimum svedu greške i efekat variranja od uzorka do uzorka, RT PCR se obično obavlja uz korišćenje internog standarda. Idealni interni standard se izlučuje sa konstantnim sadržajem između raznih tkiva, i nije pod uticajem eksperimentalnog tretmana. Najčešće korišćene RNK za sheme normalizacije izlučivanja gena su mRNK za gene koji se čuvaju u kući, gliceraldehid-3-fosfat-dehidrogenaza (GAPDH) i p-aktin.

Diferencijalno izlučivanje gena se može takođe identifikovati, ili potvrditi, korišćenjem tehnike mikronizova. U ovoj metodi, posmatrane sekvencije nukleotida se stave na ploče, ili nanižu, na supstrat mikročipa. Nanizane sekvencije se zatim hibridizuju sa specifičnim probama DNK iz posmatranih ćelija ili tkiva.

U specifičnoj realizaciji tehnike mikronizova, inserti klona cDNK, amplifikovani sa PCR, koriste se kao supstrat u gustom nizu. Poželjno je da se najmanje 10.000 sekvencija nukleotida nanese na substrat. Mikronanizani geni, imobilisani na mikročipu, svaki sa 10.000 elemenata, pogodni su za hibridizaciju pod strogim uslovima. Fluorescentno obeležene probe cDNK mogu da se generišu preko ugrađivanja fluorescentnih nukleotida, reversnom transkripcijom RNK, ekstrahovane iz posmatranog tkiva. Obeležene probe cDNK, nanete na čip, selektivno hibridizuju svako mesti sa DNK u nizu. Posle obaveznog ispiranja da se uklone probe koje nisu specifično vezane, čip se skenuje konfokalnom laserskom mikroskopijom. Kvantitativno prikazivanje hibridizacije svakog elementa u nizu, dozvoljava da se oceni prisustvo odgovarajuće mRNK. Sa fluorescencijom udvojene boje, odvojeno obeležene probe cDNK, generisane iz dva izvora RNK, hibridizuju se u parovima u nizu. Relativno prisustvo transkripata iz ova dva izvora koji odgovaraju svakom specificiranom genu, određuje se na taj način simultano. Ova minijaturizovana skala hibridizacije pruža pogodnu i brzu ocenu sheme izlučivanja za veliki broj gena. Pokazano je da ove metode imaju zahtevanu osetljivost za detekciju retkih transkripata, koji se izlučuju samo u nekoliko kopija po ćeliji, i da reproduktibilno detektuju bar aproksimativno dvostruke razlike u saržajima izlučivanja (Schena et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA,93(20), L106^49). Metodologija hibridizacije nukleinskih kiselina i tehnologija mikronizova su dobro poznati u stanju tehnike.

Agonisti i antagonisti MCP - 1

Ovde opisane ralizacije iz ovog pronalaska pripadaju takođe varijantima MCP-1 proteina, koji funkcionišu ili kao MCP-1 agonisti (mimetici) ili kao MCP-1 antagonisti. Varijanti MCP-1 proteina se mogu generisati mutagenezom, npr. diskretnom mutacijom u jednoj tački, ili skraćivanjem MCP-1 proteina. Jedan agonist MCP-1 proteina može da zadrži suštinski iste, ili subset bioloških aktivnosti oblika MCP-1 proteina koji se nalazi u prirodi. Jedan antagonist MCP-1 proteina može da inhibira jednu ili više aktivnosti oblika MCP-1 proteina koji se nalazi u prirodi, na primer, kompetitivno vezivanje silaznog ili uzlaznog člana ćelijske kaskade signalizacije, koja obuhvata MCP-1 protein. Dakle, specifični biološki efekti se mogu dobiti tretmanom sa varijantom ograničene funkcije. U jednoj realizaciji, tetman subjekta sa varijantom koji ima subset bioloških aktivnosti oblika proteina koji se nalazi u prirodi, ima manje sporednih efekata prema subjektu, relativno prema tretmanu sa oblikom MCP-1 proteina koji se nalazi u prirodi.

Varijanti MCP-1 proteina koji funkcionišu bilo kao agonisti MCP-1 (mimetici) ili kao antagonisti MCP-1, mogu se identifikovati ispitivanjem kombinatornih biblioteka mutanata, npr. mutanata od skraćivanja MCP-1 proteina, za aktivnost agonista ili antagonista. U jednoj realizaciji generisana je šarolika biblioteka PCP-1 varijanata pomoću kombinatome mutageneze na nivou nukleinske kiseline, a kodirana je šarolikom bibliotekom gena. Šarolika biblioteka MCP-1 variajanata može se dobiti, na primer, enzimatskom ligacijom smeše sintetskih oligonukleotida u sekvencije gena, tako da se degenerativni set potencijalnih sekvencija MCP-1 može iskazati kao individualni polipeptidi, ili alternativno, kao set većih fuzionih proteina (npr. za displej fage), koji sadrži u sebi set sekvencija MCP-1. Postoji niz metoda koje se mogu koristiti da se dobiju biblioteke potencijalnih MCP-1 varijanata iz degenerata sekvencije oligonukleotida. Hemijska sinteza degenerata sekvencije gena može se obaviti u automatskom sintesajzeru DNK, pa se zatim sintetski gen veže u odgovarajući vektor izlučivanja. Upotrebe degenerata seta gena dozvoljava pribavljanje, u jednoj smeši, svih sekvencija koje kodiraju željeni set potencijalnih sekvencija varijanta MCP-1. Metode za sintetizovanje degenerata oligonukleotida su poznate u stanju tehnike (videti, npr., Narang,Tetrahedron,1983, 39, 3; Itakura et al.,Ann. Rev. Biochem.,1984, 53, 323; Itakura et al.,Science,1984,198,1056; Ike et al.,Nucl.

AcidRes., 1983, 11, 477.

Dizajn i generisanje dmaih terapeutskih aaenasa

U skladu sa realizacijama iz ovog pronalaska koje su ovde opisane, a na bazi aktivnosti antitela koja su ovde proizvedena i karakterisana u odnosu na MCP-1, olakšan je dizajn drugih terapeutskih modaliteta, izuzev ostataka antitela. Ovi modaliteti su, bez ograničavanja, unapređena antitela kao terapeutski agensi, kao što su bispecifična antitela, imunotoksini i radioaktivno obeleženi terapeutski agensi, generisanje peptidnih terapeutskih agenasa, terapije genom, naročito unutrašnjim telima, antisensni terapeutski agensi i mali molekuli.

U vezi sa generisanjem unapređenih antitela kao terapeutskih agenasa, gde je komlementama fiksacija poželjan atribut, može biti moguće da se izbegne zavisnost od komplementa za ubijanje ćelije, preko na primer, upotrebe bispecifičnih, imunotoksina ili radioaktivno obeleženih antitela.

Na primer, u vezi sa bispecifičnim antitelima, bispecifična antitela se mogu generisati tako da sadrže (i) dva antitela, jedno sa specifičnošću prema MCP-1, a drugo prema drugom molekulu, koji su zajedno konjugovani, (ii) jedno antitelo koje ima jedan lanac specifičan prema MCP-1 i drugi lanac specifičan prema drugom molekulu, ili (iii) jedan lanac antitela koji ima specifičnosti prema MCP-1 i drugom molekulu. Takva bispecifična antitela se mogu generisati korišćenjem tehnika koje su dobro poznate u stanju tehnike, u vezi (i) i (ii); videti npr. Fanger et al.,Immunol. Methods,1994, 4, 72-81 i VVright i Harris, videti gore, a u vezi (ii) videti npr. Traunecker et al.,Int. J. Cancer ( Suppl.),1992, 7, 51-52. U svakom slučaju druga specifičnost se može načiniti aktiviranjem receptora teškog lanca, uključujući, ali bez ograničavanja, CD16 ili CD64 (videti npr., Deo et al., 1997, 18, 127 ili CD89 (videti npr. Valerius et al,Blood,1997, 90, 4485-4492).

U vezi sa imunotoksinima, antitela se mogu modifikovati da deluju kao imunotoksini, korišćenjem tehnika koje su dobro poznate u stanju tehnike. Videti npr. Vitetta,Immunol. Today,1993, 14, 252. Videti takođe, U.S. Patent No. 5,194,594. U vezi sa pripremanjem radioaktivno obeleženih antitela, ovako modifikovana antitela se mogu takođe lako dobiti korišćenjem tehnika koje su dobro poznate u stanju tehnike. Videti npr. Junghans et al., "Cancer Chemotherapv and Biotherapv", (2nd, ed, Chafner i Longo eds., Lippincott Raven, 1966). Videti takođe, U.S. Patent-i No. 4,681,581, 4,735,210, 5,101,827, 5,102,990, (RE 35.500), 5,648,471 i 5,697,902.

Ordiniranje i formulisanie terapeutskih aaenasa

Biološki aktivna anti-MCP-1 antitela, dobijena u skladu sa pronalaskom koji je ovde opisan, mogu se koristiti u sterilnim farmaceutskim preparatima ili formulacijama da se neutrališe aktivnost MCP-1 proizvedenog u bolesnim ili inflamiranim tkivima, čime se sprečava dalja infiltracija mononukleamih ćelija u tkiva. Ovako obolela i inflamirana tkiva dešavaju se kod mnogih tipova humanog kancera, uključujući kancer dojke, jajnika i pluća i u stanjima kao što su glomerulonefritis, arterioskleroza i multipla skleroza. Biološki aktivno anti-MCP-1 antitelo iz ovog pronalaska može se koristiti samo ili u kombinaciji sa drugim terapeutskim agensima. Za kancer, anti-MCP-1 antitela se mogu kombinovati sa tradicionim načinima hemoterapije, kao što su taxol, doxorubicin, cis-platinum, 5-fluorouracil i drugi novi inhibitori angiogenog procesa. Za tretiranje inflamatornih bolesti, MCP-1 antitela se mogu kombinovati sa steroidima ili antitelima drugih citokina i hemokina koji dobrinose stanju bolesti.

Kada se koristi za ordiniranjein vivo,formulacija antitela može biti sterilna. Ovo se lako ostvaruje filtriranjem kroz sterilne membrane za filtriranje, pre ili posle liofilizacije ili rekonstituisanja. Antitelo se obično čuva u liofilizovanom obliku ili u rastvoru. Preparat terapeutskih antitela se obično stavlja u kontejner koji ima sterilan pristup, na primer, kesa sa intravenoznim rastvorom, ili fiola koja ima zapušač koji se može probušiti sa hipodermičnom iglom za injekcije.

Put ordiniranja antitela može biti u skladu sa poznatim metodama, npr. injekcijom ili infuzijom, intravenoznim, intraperitonealnim, intracerebalnim, intramuskulamim, intraokulamim, intraarterijskim, intratekalnim, inhalacionim ili intralezionim putem, ili kao sistem sa uzdržanim oslobađanjem, kao što se pominje niže. Poželjno je da se antitelo ordinira kontinualno infuzijom, ili kao bolus injekcija.

Efikasna količina antitiela, koje treba da se koristi terapeutski, će zavisiti na primer, od terapeutskih objektivnih faktora, puta ordiniranja i stanja pacijenta. Prema tome, potrebno je da terapeut titriše dozu i modifikuje put ordiiranja, prema potrebi, da bi se dobio optimalni terapeutski efekat. Tipično, klinički lekar će ordinirati antitelo sve dok doza ne dostigne željeni efekat. Napredak ove terapije se lako prati konvencionalnim testovima, ili pomoću testova koji su ovde opisani.

Antitela iz ovog pronalaska se mogu pripremati u smeši sa farmaceutski prihvatljivim nosačem. Ovaj terapeutski preparat se može ordinirati intravenozno ili kroz nos ili pluća, poželjno kao tečni ili praškasti aerosol (liofilizovan) Ovaj preparat se može takođe ordinirati parenteralno ili subkutano, ukoliko se to želi. Kada se ordinira sistematski, treapeutski preparat treba da je sterilan, apirogen i u parenteralno prihvatljivom rastvoru, koji je pH podešen, izotoničan i stabilan. Ovi uslovi su poznati onima koji su verziraniu stanje tehnike. Ukratko, formulacije doza jedinjenja iz realizacija ovog pronalaska, koje su ovde opisane, pripremaju se za skladištenje ili ordiiranje mešanjem jedinjenja koje ima željeni stepen čistoće sa fiziološki prihvatljivim nosačima, dodacima i stabilizatorima. Ti materijali su netoksični za primaoca u dozama i koncentracijama u kojima se koriste, a sadrže pufere, kao što su TRIS HCI, fosfat, citrat, acetat i druge soli organskih kselina; antioksidante, kao što je askorbinska kiselina; peptide niske molekulske težine (manje od oko deset ostataka), kao što su poliarginin, proteini, kao što je serum albumina, želatin ili imunoglobulini; hidrofilne polimere, kao što je polivinilpirolidon; aminokiseline, kao što su glicin, glutaminska kiselina, asparaginska kiselina ili arginin; monosaharide, disaharide i druge ugljene hidrate, uključujući celulozu ili njene derivate, glukozu, manozu ili dekstrine; agense za helatiranje, kao što je EDTA; šećerne alkohole, kao što su manitol ili sorbitol; kontrajone, kao što je natrijum; i/ili nejonske surfaktante, kao što su TVVEEN, PLURONICS ili polietilenglikol.

Sterilni preparati za injekcije se mogu formulisati u skladu sa konvencionalnom farmaceutskom praksom, kao što je opisano u "Remington's Pharmaceutical Sciences" ( IS* ed, Mack Publishing Companv, Easton, PA, 1990). Na primer, može biti poželjno rastvaranjem ili suspendovanjem aktivnog jedinjenja u tečnom nosaču, kao što su voda ili biljna ulja koja se nalaze u prirodi, kao što je susamovo, kikirikijevo ili ulje pamučnih semenki, ili sintetskom masnom tečnom nosaču, kao što je etiloleat i slično. Puferi, prezervativi, antioksidanti i slično, mogu se ugraditi, u skladu sa prihvaćenom farmaceutskom praksom.

Pogodni primeri preparata sa uzdržanim oslobađanjem su semipermeabilne matrice čvrstih hidrofobnih polimera koje sadrže polipeptide, matrice koje se prave u oblikovane proizvode, filmove ili mikrokapsule. Primeri matrica za uzdržano oslobađanje su poliestri, hidrogelovi (npr. poli(2-hidroksietil-metakrilat), kao što su opisali Langer et al.,J. Biomed. Mater. Res.,1981, 15, 167-277 i Langer,Chem. Tech.,1982, 12, 98-105, ili poli(vinilalkohol)), polilaktidi (U.S. Patent No. 3,773,919, EP 58,481), kopolimeri L-glutaminske kiseline i gama-etil-L-glutamata (Sidman et al.,Biopolimers,1982, 22, 547-556), etilen-vinilacetat koji nije biodegradibilan (Langer et al. videti gore), degradibilni kopolimeri mlečne kiseline i glikolne kiseline, kao što je LUPRON Depot™ (injektibilne mikrosfere sačinjene od kopolimera mlečne kiseline i glikolne kiseline i leuprolid acetata) i poli-D-(-)-3-hidroksibuterna kiselina (EP 133,988).

lako polimeri, kao što su etilen-vinilacetat i mlečna kiselina-glikolna kiselina omogućavaju oslobađanje molekula tokom 100 dana, neki hidrogelovi oslobađaju proteine u kraćim vremenskim periodima. Kada kapsulirani proteini ostanu u telu dugo vremena, oni mogu da se denaturišu ili načine agregate, kao rezultat izlaganja vlazi na 37°C, što dovodi do gubitka biološke aktivnosti i mogućih pramena u imunogenicitetu. Mogu se smisliti racionalne strategije za stabilizaciju proteina, zavisno od mehanizma. Na primer, ukoliko se otkrije da mehanizam agregacije predstavlja stvaranje S-S veze unutar molekula, preko unutrašnje izmene disulfida, stabilizacija se može postići modifikovanjem sutfhidril ostataka, liofilizacijom iz kiselih rastvora, kontrolom sadržaja vlage, upotrebom odgovarajućih aditiva i razvijanjem sastava specifičnih polimemih matrica.

Preparati sa uzdržanim oslobađanjem sadrže takođe antitela iz ovog pronalaska zahvaćena u lipozome. Lipozomi, koji sadrže takva antitela, dobijaju se metodama koje su poznate: U.S. Patent No. DE 3,218,121; Epstein et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA,1985, 82, 3688-3692; Hwang et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA,1980, 77, 4030-4034; EP 52,322; EP, 36,676; EP 88,046; EP 143,949; 142,641; Japanese Patent Application 83-118008; U.S: Patent-i No. 4, 485,045 i 4,544,545; i EP 102,324. Dozu antitela će određivati vodeći lekar, uzimajući u obzir razne faktore za koje se zna da modifikuju delovanje lekova, uključujući ozbiljnost i vrstu bolesti, telesnu masu, pol, ishranu, vreme i put ordiniranja, druge medikamente i druge relevantne kliničke faktore. Terapeutski efikasne doze se mogu odrediti metodama iliin vitroiliin vivo.

Dozu formulacije antitela za posmatranog pacijenta će odrediti vodeći lekar, uzimajući u razmatranje razne faktore, za koje se zna da modifikuju delovanje lekova, uključujući ozbiljnost i vrstu bolesti, telesnu masu, pol, ishranu, vreme i put ordiniranja, druge medikamente i druge relevantne kliničke faktore. Terapeutski efikasne doze se mogu odrediti metodama iliin vitroiliin vivo.

Efikasna količina antitela iz ovog pronalaska koja će se koristiti terapeutski, zavisiće od terapeutskih objektivnosti, puta ordiniranja i stanja pacijenta. U skladu sa tim, neophodno je da terapeut titriše dozu i modifikuje put ordiniranja prema potrebi, da bi dobio optimalan terapeutski efekt. Tipčna dnevna doza može da se kreće u opsegu od oko 0,001 mg/kg, pa do 100 mg/kg ili više, zavisno od gore pomenutih faktora. Poželjne koncentracije doze su 0,001 mg/kg, 0,005 mg/kg, 0,01 mg/kg, 0,05 mg/kg, 0,1 mg/kg, 0,5 mg/kg, 1 mg/kg, 5 mg/kg, 10 mg/kg, 15 mg/kg, 20 mg/kg, 25 mg/kg, 30 mg/kg, 35 mg/kg, 40 mg/kg, 45 mg/kg, 50 mg/kg, 55 mg/kg, 60 mg/kg, 65 mg/kg, 70 mg/kg, 75 mg/kg, 80 mg/kg, 85 mg/kg, 90 mg/kg, 95 mg/kg i 100 mg/kg, ili veće. Tipično, klinički lekar će ordinirati terapeutsko antitelo dok doza ne dostigne željeni efekt. Napredovanje ove terapije lako se prati konvencionalnim testovima koji su ovde opisani.

Primeri

Sledeći primeri, uključujuću obavljene eksperimente i dobijene rezultate, daju se samo u ilustrativne svrhe, i ne treba da se tumače kao ograničenje realizacija ovog pronalaska, koje su ovde opisane.

Primer 1

Pobijanje MCP- 1 antigena

Humani MCP-1 peptid, koji se koristi kao antigen u ovim ispitivanjima, ima sledeću sekvenciju aminokiselina: QPDAINAPVTCCYNFTNRKISQQRI_ASYRRITSSKCPKEAVIFKTIVAKEICADPK QKWVQDSMDHLDKQTPKT (SEQ ID NO: 149)

Ovaj peptid se izlučuje rekombinantno uE. coli,a nabavljen je iz Prepro Tech (Rocky Hill, NJ).

Primer 2

Anti- MCP- 1 antitela

Generisanje antitela

Imunizacija i selekcija životinja za tretman sa ELISA.Monoklonalna antitela protiv MCP-1 su razvijena sekvencijalnim imunizovanjem Xeno Mouse<®>miševa (sojevi XenoMouse<®>XMG2, XMG4 (soj 3C-1), a hibridni soj je proizveden ukrštanjem miševa XMG2 sa XMG4 (soj 3C-1), Abgenix, Inc. Fremont, CA), u skladu sa shemom prikazanom u Tabeli 2. Na primer, inicijalna imunizacija je bila sa 10 ug antigena, pomešanog 1:1V/ V,sa TiterMax Gold. Naredna pojačavanja su načinjena sa 5 ili 10 ug antigena, pomešanog 1:1VN,sa 100 ug gela stipse u apirogenom D-PBS. Neka od pojačanja su učinjena sa 50% TiterMax Gold, posle čega slede tri injekcije sa 10 ug antigena, pomešanog 1:1V/ V,sa 10 ug MCP-1 antigena u gelu stipse i zatim konačno pojačavanje sa 10 ug antigena u PBS. Posebno, svaki miš je potkožnom injekcijom imunizovan u šapu. Životinje su imunizovane u dane: 0, 4, 7, 10, 14, 18, 27, 31, 35 i 42. Životinjama je uzimana krv 13. i 26. dana, da se dobiju serumi za sakupljanje selekcije, kao što je niže opisano.

Slično, drugi miševi XenoMouse<®>(sojevi XenoMouse<®>XMG2 i XMG2L3) sekvencijalno su imunizovani u skladu sa shemom prikazanom u Tabeli 3.

Titri anti-MCP-1 antitela određeni su indirektno, testom ELISA. Vrednost titra je recipročna najvećem razblaženju seruma sa dvostrukim očitavanjem OD u odnosu na osnovno. Ukratko, sa MCP-1 (84-mer; 1 ug/mL) se obloži 96 bazenčića ploče preko Costar Labcoat Universal Binding Polvstiren, tokom noći, na četri stepena. Rastvor koji sadrži nevezani MCP-1 se ukloni, a ploče 4 min tretiraju sa UV svetlošću (365 nm) (4000 uJ). Ploče se pet puta operu sa dH20. Serumi XenoMouse<®>od životinja imunizovanih sa MCP-1, ili naivnih XenoMouse<®>životinja, tretirani su u rastvoru 2% mleko/PBS, sa razblaženjem 1:2, u duplikatu, počev od inicijalnog razblaženja 1:100. Poslednji bazenčić je ostavljen za šlepu probu. Ploče se pet puta operu sa dH20.

Doda se kozje anti-humano IgG, Fc-specifično, konjugovano sa HRP, antitelo u konačnj koncentraciji 1 ug/mL, i drži 1 h na sobnoj temperaturi. Ploče se pet puta operu sa dH20. Ploče se razvijaju 30 min, uz dodatak TMB, a ELISA se zaustavlja dodatkom 1M fosforne kiseline. Određuje se specifični titar za XenoMouse<®>životinje iz optičke gustine na 450 nm, a rezultati su prikazani u Tabelama 4, 5, 6, 7 i 8. Titar predstavlja recipročno razblaženje seruma, pa prema tome ukoliko je veća brojka, veći je humoralni imuni odgovor na MCP-1. Za fuziju, sakupljeni su limfni čvorovi svih imunizovanih XenoMouse<®>životinja.

Regenerisanje limfocita, izolovanje B- ćelija, fuzije i generisanje hibridoma.

Imunizovani miševi se žrtvuju cervikalnom dislokacijom, sakupe limfni čvorovi i ujedine iz svake grupe. Limfne ćelije se razbiju mlevenjem u DMEM, da bi se oslobodile ćelije od tkiva, pa se ćelije suspenduju u DMEM. Izbroje se ćelije, a peleti ćelija se doda 0,9 mL DMEM na 100 miliona limfocita, pa se ćelije lagano, ali potpuno resuspenduju. Koristeći 100 uL magnetnih perlica CD90<*>na 100 miliona ćelija, ćelije se obeleže inkubacijom ćelija sa magnetnim perlicama, 15 min, na 4°C. Magnetno obeležena suspenzija ćelija, koja sadrži do 10<8>pozitivnih ćelija (ili ukupno do 2x1 o9 ćelija) se prebaci u LS<*>kolonu, pa se kolona opere sa DMEM. Celokupan eluent se sakupi kao CD-90 negativna frakcija (većina ovih ćelija su B ćelije).

Kombinuju se ćelije mijeloma P3 i ćelije limfnih čvorova, obogaćene ćelijama B, u odnosu 1:1 (mijelom:limfni čvorovi) u koničnoj epruveti od 50 mL, u DMEM. Kombinovane ćelije se centrifugiraju 5-7 min sa 800*g (2000 o/min), a supernatant se odmah odvoji od dobijene pelete. Ovim ćelijama se doda2- 4mL rastvora Pronase (CalBiochem, katalog br. 53702; 0,5 mg/mL u PBS), da se lagano resupsenduje peleta ćelija. Ne dozvoljava se tretman enzimom duže od 2 min, a reakcija se zaustavlja dodatkom 3-5 mL FBS. Doda se dovoljno rastvora ECF da se ukupna zapremina dovede na 40 mL, pa se smeša centrifugira 5-7 min sa 800xg (2000 o/min). Odvoji se supematant, a peleta ćelija se lagano resuspenduje u maloj zapremini rastvora ECF, posle čega sledi dodavanje dovoljno ECF do ukupne zapremine 40 mL. Ćelije se dobro promešaju i broje, pa zatim centrifugiraju 5-7 min sa 800*g (2000 o/min). Supematant se odvoji, a ćelije resusenduju u maloj zapremini rastvora ECF. Doda se još rastvora ECF dok se ne podesi koncentracija na 2><10<6>ćelija/mL.

ćelije se zatim stave u generator Electro-Cell-Fusion (ECF) (Model ECM2001, Genetronic, Inc. San Diego, CA), pa se fuzionišu u skladu sa uputstvima proizvođača. Posle ECF, suspenzija ćelija se pod sterilnim uslovima pažljivo ukloni iz fuzione komore, pa se transficira u sterilnu epruvetu, koja sadrži istu zapreminu medijuma hibridoma u DMEM. Ćelije se inkubiraju 15-30 min na 37°C, a zatim 5 min centrifugiraju sa 400xg (1000 o/min). Ćelije se pažljivo resuspenduju u maloj zapremini Vž HA medijuma (1 boca 50X HA, iz firme Sigma, broj kataloga A9666 i 1 L medijuma hibridoma), pa se podesi zapremina sajoš VzHA medijuma (na bazi 5x10<6>ćelija B po ploči od 96 bazenčića, i 200 uL po bazenčiću). Ćelije se dobro promešaju, pa pipetiraju na ploču sa 96 bazenčića i ostave da rastu. Sedmog ili 10. dana, ukloni se polovina medijuma, a ćelije se ponovo nahrane sa % HA medijumom.

Izbor kandidata antitela za ELISA.Posle 14 dana postojanja kulture, testiraju se supernatanti sa hibridomom na specifična monoklonalna MCP-1 antitela. ELISA ploče (Fisher, br. katal. 12565-136) se oblože sa 50 uL/bazenčić MCP-1 (2 ug/mL), u puferu za oblaganje (0,1 M karbonatni pufer, pH 9,6, NaHC038,4 g/L), zatim preko noći inkubiraju na 4°C, Posle inkubacije ploče se tri puta operu sa puferom za ispiranje (0,05% Tvveen 20 u PBS). Doda se 200 uL/bazenčić pufera za blokiranje (0,5% BSA, 0,1% Tvveen 20, 0,01% Timerosal u 1xPBS), pa se ploče 1 h inkubiraju na sobnoj temperaturi. Posle izolovanja, ploče se operu tri puta puferom za ispiranje. Doda se 50 uL/bazenčić supematanta hibridoma, pa se dodaju pozitivna i negativna kontrola, a ploče se 2 h inkubiraju na sobnoj temperaturi.

Kao pozitivna kontrola sve vreme se koristi XMG2 MCP-1 Grupa 1, šapa N160-7, a kao negativna kontrola XMG2 KLH, Grupa 1, šapa, L627-6. Posle inkubacije ploče se tri puta isperu sa puferom za ispiranje. Dodaju se, po 100 uL/bazenčić antitela za detekciju kozjeg anti-HulgGfc-HRP (Caltag, br. katal. H10507), (i kozjeg anti-hlgkapa-HRP (Souther Biotechnologv, br. katal. 2060-05) i kozjeg anti-hlglambda (Southern Biotechnologv, br. katal. 2070-05) za sekundrano testiranje), pa se ploče 1 h inkubiraju na sobnoj temperaturi. U sekundarnom testu, testiraju se tri seta uzoraka (pozitivni iz prvog testiranja), jedan set na detekciju hlgG, jedan set na detekciju hkapa i jedan set na detekciju hlambda. Posle inkubacije, ploče se tri puta operu sa puferom za ispiranje. Doda se 100 uL/bazenčić TMB (BioFX Lab.br. katal. TMSK-0100-01), pa se ploče ostave da se razvijaju oko 10 min (dok bazenčici sa negativnom kontrolom jedva da počnu da pokazuju obojenje), pa se doda 50 uL/bazenčić zaustavnog rastvora (TMD Stop Solution (BioFX Lab, br. katal. STPR-0100-01), pa se ploče očitavaju na ELISA čitaču za ploče, na talasnoj dužini 450 nm. Očitavanja OD iz pozitivnih bazenčića su data u Tabeli 9.

Karakterizaciia biološke aktivnosti anti - MCP - 1 antitela

Neutralizacija bioaktivnosti MCP- 1 sa anti- MCP- 1 antitelima - test FLIPR.Dodaju se DMSO i pluronska kiselina (20% rastvor u DMSO) u fiolu sa Fluo-4 (Molecular Probes), dajući konačnu koncentraciju Fluo-4 od 5 mM. Resuspenduju se ćelije THP-1 u prethodno zagrejanom (37°C) puferu za punjenje, sa 3><i0<6>/mL, pa se doda 1 uL Fluo-4 boje po mL ćelija, dajući konačnu koncentraciju boje 5 uM. Ćelije se inkubiraju 45-50 min u mraku, na 37°C. Posle inkubacije ćelije se centrifugiraju 5-10 min sa 100 o/min. Ćelije se resuspenduju u puferu za punjenje, pa se ponovi centrifugiranje. Ćelije se resuspenduju sa 1,667-10<6>/mL. Sa koncentracijom od 200.000 ćelija/bazenčić, ćelije se dodaju na ploču sa 96 bazenčića, pa se lagano centrifugiraju. Posle osnovnog očitavanja, drugo očitavanje se obavlja posle naknadnog dodavanja 3,5 nM MCP-1, u prisustvu ili u odsustvu različitih koncentracija anti-MCP-1 antitela. Dodavanje MCP-1 ćelijama THP-1 dovodi do porasta unutarćelijskog kalcijuma, što vodi povećanju intenziteta fluorescencije boje Fluo-4. Posle dodavanja rastućih koncentracija antitela za neutralizaciju, intenzitet fluorscentne boje unutar ćelija se smanjuje, što ukazuje da su testirana antitela neutralisana. Koncentracija antitela koja daje 50% smanjenje intenziteta fluorescencija izazvano sa MCP-1, prikazana je u Tabeli 9.

Neutralizacija migracije ćelija izazvana sa MCP- 1.Razvijen je automatizovani test hemotaksije sa 96 bazenčića, koji koristi ćelije THP-1 i robotski sistem Beckman Biomek F/X. Koristeći specijalno dizajniranu ploču sa 96 bazenčića, uokvireni filter sa filter membranom vezanom za čvrst okvir, test hemotaksije se obavlja na potrošnoj mikroploči sa 96 bazenčića NeuroProbe, sa zapreminom bazenčića ili 30 uL ili 300 uL i prečnikom pora koji se kreće od 2-14 pm. Ploča sa 96 bazenčića Neuroprobe, ima dno bazenčića za smeštanje hemoatrakanta MCP-1 i drugih reagenasa, kao što su anti-MCP-1 antitela u testovima migracije ćelija. Nisu potrebni pokriveni bazenčići, zato što je uokvireni filter pokriven hidrofobnom maskom, koja zadržava uzorak svake suspenzije ćelija na njegovom mestu, na vrhu filtera.

Optmalni uslovi za ovaj test su: 100.000 ćelija/bazenčić, 90 min inkubacije, na 37°C. Suspenzije ćelija THP-1, koje su prethodno šaržirane sa bojom iz Molecular Probes, pipetiraju se direktno na mesta sa gornje strane filtra, pa se inkubiraju 1-2 h na 37°C. Posle inkubacije, broje se ćelije koje su migrirale na dno filtera i u mikroploču, stavljanjem mikroploče na FMAT, naručen od firme Applied Biosvstems.

Migracija ćelija izazvana sa MCP-1 za ćelije TP-1 i maksimalna migracija ćelija se dostižu pri 1 nM, sa 10-15-strukim odnosom signala prema šumu. Koristeći ili supernatante hibridoma ili svež medijum hibridoma, detektuje se migracija koja zavisi od MCP-1. Varijabilnost testa je minimalna (C.V ,15). Broj ćelija koje migriraju na dno filtera se smanjuje na način koji zavisi od doze, ako se MCP-1 priključi hemoatraktantu.

Određivanje afiniteta anti- MCP- 1 antitela, koristeći Biacore analizu.Analiza interakcije antitelo/MCP-1 je obavljena na 25°C, koristeći dva čipa CM5, smeštena u optičke biosenzore Biacore 3000. Pojedinačnan protok ćelija na svakom čipu se aktivira sedmo-minutnom injekcijom NHS/EDC, karbohidrazid se kupluje preko NHS estra, koristeći 7-minutnu injekciju, a zaostale aktivirane grupe se blokiraju sa 7-minutnom injekcijom etanolamina. Ostaci monosaharida iz svakog antitela se30 min oksidišu upotrebom 1 mM natrijum-metaperjodata u 100 mM natrijum-acetatu, pH 5,5, na 4°C. Oksidisano antitelo se oslobodi soli u 10 mM natrijum-acetatu, pH 5,0, da bi se antitelo kuplovalo sa površinom modifikovanom sa karbohidrazidom. Ove mAb površine se stabiizuju redukcijom hidrazonske veze sa 0,1 M natrijum-cijanoborohidridom. Interakcija antigen/ antitelo se testira injektovanjem 0, 0,049, 0,15, 0,4, 1,3, 4 i 12 nM MCP-1 (Peprotech, NJ) u protočnom puferu (10 mM, HEPES, 150 mM NaCI, 0,005% surfaktant, 200 ug/mL BSA, pH 7,4), u 300-strukom opsegu koncentracije. Površine se regenerišu pulsom od 12 s u 15 mM H3P04. Da bi se odredila kinetika svake interakcije, setovi podataka se fituju globalno u 1:1 model interakcije, koji sadrži parametar za transport mase. Izračunati afiniteti interakcije su dati u Tabeli 9.

Oređivanje unakrsne neaktivnosti anti- MCP- 1 antitela sa drugim hemokinima.

Oblože se ELISA ploče (Fisher, br. katal. 12-565-136) sa 50 uL/bazenčić MCP-1, MCP-2, MCP-3, MCP-4, RANTES, GRO-alfa, MIP-1 alfa, eotaksina, pacovskog MCP-1 i mišjeg JE (2 ug/mL), u puferu za oblaganje (0,1 M karbonatni pufer, pH 9,6, NaHC038,4 g/L), pa zatim inkubira preko noći na 4°C. Posle inkubacije ploče se tri puta operu puferom (0,05% Tween 20 u PBS). Doda se 200 uL/bazenčić pufera za blokiranje (0,5% BSA, 0,1% Tween 20, 0,01% Timerosal u 1 * PBS), pa se piče 1 h inkubiraju na sobnoj temperaturi. Posle inkubacije, ploče se tri puta operu sa puferom za ispiranje. Dodaju se, 50 uL/bazenčić, supernatanti hibridoma i pozitivne i negativne kontrole (pozitivna kontrola je anti-MCP-1 antitelo, dobavljeno iz R&D Sciences, a negativna kontrola je antitelo za Kevhole Limpet Hemocvanin, proizvedeno u Abgenix), pa se ploče 2 h inkubiraju na sobnoj temperaturi. Posle inkubacije ploče se tri puta operu sa puferom za ispiranje. Doda se za detekciju antitela, 100 pL/bazenčić, kozji anti-hulgGfc-HRP (Caltag, br. katal. H10507) (kozji anti-hlgkapa-HRP (Southern Biotechnologv, br. katal. 2060-05) i kozji anti-hlglambda (Southern Biotechnologv, br. katal. 2070-05) za sekundarno testiranje), pa se ploče 1 h inkubiraju na sobnoj temperaturi. Posle inkubacije ploče se tri puta operu puferom za ispiranje, pa se doda 100 uL/bazenčić TMB (bioFX Lab., br. katal. TMSK-0100-01), a ploče ostave da se razvijaju oko 10 min. Posle toga vremena doda se 50 uL/bazenčić zaustavnog rastvora (TMB Stop Solution (BioFX Lab, br. katal. STPR-0100-01), pa se ploče očitavaju na ELISA čitaču ploča, na talasnoj dužini 450 nm. Rezultati prikazani u Tabeli 10 pokazuju nekoliko od anti-MCP-1 antitela koja su unakrsno reagovala sa srodnim hemokinima.

Da bi se odredilo da li anti-MCP-1 antitelo 3.11.2 može blokirati funkciju drugih članova familije MCP, obavljeni su testovi migracije, opisani gore. Prvo se odredi sposobnost monocita THP-1 da migrira, kao odgovor na MCP-1, MCP-2, MCP-3 i MCP-4. U ovom testu MCP-1, -2 i -3 su efikasno indukovali migraciju ćelija THP-1, ali MCP-4 nije bio aktivan (videti Sliku 1). Kada se antitelo 3.11.2 dodaje na dno bazenčića u raznim koncentracijama, svojstvo ćelija THP-1 da migriraju, kao odgovor na MCP-2 i MCP-3, bio je inhibiran na način koji zavisi od doze (Slike 2 i 3).

Primer 3

Ma<p>iranie e<p>ito<p>a MCP- 1

Monocitni hemoatraktantni protein-1 (MCP-1) je član familije beta hemokina, koji deluje preko specifičnog sedmo-transmembranskog receptora i angažuje monocite, bazofile i T limfocite na mestu inflamacije. Antigen, ostatak sa 76 aminokiselina, nije glikozilovan i ima predviđenu masu molekula od 9,7 kD. Humani MCP-1, izlučen uE. coli,dobavljen je iz firme R&D #279MC/CF. Majmunski MCP se izlučuje u ćelijama 293F, a tri majmunska varijanta MCP-1 se koriste za analiziranje kako definisane zamene aminokiselina utiču na afinitet vezivanja za svaki pojedinačni mAb.

Analiza sekvencije pokazala je da antitela spadaju u pet klasa. Najveća klasa sadrži 28 antitela veoma srodnih po njihovoj upotrebi VH1-24, od kojih 24 takođe koristi Vk gen B3. Jedna klasa, koja se sastoji od tri antiela, koristi gen VH6-1, od kojih dva koriste Vk B3. Tri druge klase su predstavljene sa jednim antitelom, koje koristi VH1-2, VH3-33 i VH4-31, od kojih dva mAbs koriste Vk08 gen. Treba napomenuti da imena antitela koja počinju sa 1, 2, 3 ili 4, predstavljaju različite fuzije hibridoma, iz nezavisnih grupa miševa XenoMouse<®>. Stoga, ova monoklonalna antitela potiču iz nezavisnih povezivanja B ćelija koje zriju tokom nezavisnih primarnih i sekundarnih imuno odgovora u miševima XenoMouse<®>. Zbog njihove nezavisnosti, sličnosti u sekvencijama nukleotida i aminokiselina antitela VH i Vk gena, verovatno predstavljaju konvergentnu evoluciju i selekciju za slične strukture varijabilnog regiona, koje mogu vezati i snažno neutralisati MCP-1 (videti Tabelu 11).

Da li je svako antitelo vezano u linearnom ili komformacionom epitopu, određivano je analizom VVestern blot. Da bi se odredilo da li raskidanje intramolekulskih veza pomoću redukcionog sredstva menja reaktivnost odabranih anti-MCP-1 antitela, šaržira se prečišćeni MCP-1 u SDS/PAGE (4-20% gel), pod uslovima koji nisu redukcioni (NR) i koji jesu redukcioni (R). SDS/PAGE se obavlja po metodi Laemmli-a, koristeći mini-gel sistem. Izdvojeni proteini se prebace na nitrocelulozne membrane. Membrane se blokiraju upotrebom PBS koji sadrži 5%( m/ V)nemasnog mleka u prahu, najmanje 1 h pre razvijanja i probe, u trajanju 1 h sa svakim antitelom. Anti-MCP-1 antitela su detektovana korišćenjem kozjeg anti-humanog imunoglobulina konjugovanog sa HRP (razblaženje 1:8.000; Sigma, br. kataloga A-8667). Membrane se razvijaju korišćenjem pojačane hemiluminiscencije (ECL<®>; Amersham Bioscience) u skladu sa uputstvima proizvođača.

Kompleksi antitelo-MCP-1 su analizirani sa tri metode: (1) laserska desorpciona jonizacija potpomognuta površinom (SELDI, od eng. Surface Enhanced Laser

Desorption lonization) (tehnologija proteinskog čipa) za linearne i konformacione epitope; (2) mutageneza usmerena na mesto, za linearne i konfomacione epitope; i (3) SPOT-s Peptide Array, za linearne epitope. SELDI je nedavno razvijena metoda za tačno, brzo i osetljivo određivanje molekuskih težina peptida i proteina. Linearni i konformacioni epitopi se mapiraju na osnovu mase vezanih fragemnata za imobilisano antitelo pomoću SELDI tehnologije proteinskog čipa. Mapiranje linearnih epitopa pomoću SELDI se obavlja u tri koraka. U prvom koraku, MCP-1 se digestira sa visoko specifičnim proteolitičkim enzimima, da se generišu setovi fragmenata peptida. U drugom koraku, fragmenti peptida koji sadrže linearne epitope biraju se preko njihovog specifičnog vezivanja za imobilisano antitelo na proteinskom čipu. U ovom koraku peptidi koji sadrže epitop formiraju komplekse sa antitelom dok se drugi peptidi, koji se ne vezuju za antitelo, uklanjanju neizbežnim ispiranjem, U poslednjem koraku određuje se identitet peptida koji se vezuje za antitelo preko njegove molekulske težine, pomoću SELDI i poznatih mesta za digestiju specifične proteaze.

Antitela 1.4.1, 1.8.1, 1.14.1, 1.18.1 reaguju jednako sa nativnim i denaturisanim MCP-1 u Western blot analizi, što ukazuje da oni imaju linearan epitop. Njihov epitop se mapira pomoću SELDI. Eksperienti se obavljaju karboksimetilovanjem MCP-1 antigena da se spreči stvaranje disulfidnih veza između ostataka cisteina i proteina. Metilovani MCP-1 se digestira sa Glu-C endoproteinazom, koja specifično čepa peptidne veze sa strane karboksi4<raja ostataka glutaminske kiseline (E). mAbs se kovalentno kupluju sa nizom proteinskog čipa, PS20. Površina čipa se blokira sa 1M etanolaminom, pa opere sa PBS, 05% Triton. Fragmenti Glu-C metilovanog MCP-1 antigena se vezuju za imobilisano antitelo. Nevezani fragmenti se isperu sa detergentom (PBS, 0,1% Tween), Vezani Glu-C fragemnti (epitop) se analiziraju i identifikuju pomoću SELDI, na bazi njihove mase. U tabeli 12 su sakupljene očekivane mase svakog generisanog peptida iz potpuno digestiranog metilovanog MCP-1 sa Glu-C. MCP-1 se potpuno digestira u tri fragmenta. Teorijski pl je: 9,39 / Mw (prosečna masa): 8685,03 /Mw (masa monoizotopa): 8679,44. Posle ispiranja, fragment sa masom 4635, što odgovara ostacima 1-39, ostaje vezan za antitelo, što ukazuje da epitop svih ovih antitela leži u prvih 39 ostataka, pošto je ista shema opažena sa svakim od ovih antitela.

SELDI pristup se koristi takođe za mapiranje konformacionih epitopa. U ovom slučaju, protein A, kovalentno vezan za nizove proteinskog čipa PS2 (Ciphergen Biosvstems), se koristi za zahvatanje mAbs, pa se posle toga inkubira sa MCP-1. Posle uklanjanja nevezanog materijala, komleksi se digestiraju sa visokom koncentracijom specifičnih proteaza. MCP-1 antitela (1.7.2, 3.11.2 i 3.7.2) se ne vezuju za redukovani, denaturisani antigen u VVestem blot-ima, što ukazuje da je epitop verovatno konformacioni. Antitela 1.7.2 i 3.7.2 se prvo kovalentno kupluju sa čipom PS20. Nativni MCP-1 se vezuje za antitelo, a zatim digestira sa endoproteinazom (Lys-C u jednom eksperimentu, a Asp-N u drugom). Nevezani fragmenti se operu sa PBS+, 0,2% Triton, pa sledi PBS i HPLC uz ispiranje vodom. Epitop se određuje pomoću SELDI i identifikuje masom fragmenta. Oba ova antitela, 1.7.2 i 3.7.2, imaju fragment mase 5712, koji odgovara ostacima 3-53 (Tabela 13; Teorijski pl: 9,39 / Mw (prosečna masa): 8685,03 / Mw (masa monoizotopa); 8679,44) vezan za njega posle pranja, što ukazuje da epitop leži u ostacima aminokiselina 3 do 53 nativnog MCP-1 antigena.

Za mapiranje epitopa antitela 3.11.2, veličina domena za vezivanje je minimizirana upotrebom različite proteaze. Protein A (Calbiochem, 539202) se kovalentno imobiliše na čipu PS20. Preostala mesta za vezivanje se blokiraju etanolaminom, pH 8,0. Antitelo 3.11.2 se veže za protein A. Čip se opere sa PBS, a zatim sa 50 mM Hepes, pH 7,5. MCP-1 antigen je vezan za antitelo. Nevezani antigen se ukloni ispiranjem sa 0,1% Tween u PBS, a zatim 50 mM Hepes, pH 7,5 i 100 mM amonijum-bikarbonatom. Jedna digestija čipa sa MCP-1 se obavlja sa endoproteinazom Lys-C. Čip se ispere sa 0,1% Tritonom u PBS da se uklone nevezani fragmenti. Vezani fragmenti se analiziraju na bazi njihove mase, pomoću SELDI. Samo jedan pik, mase 1861,8 je vezan za antitelo, što predstavlja sekvenciju od 15 aminokiselina, lociranu na ostacima 20 do 35 (Tabela 14; teorijski pl: 9,39 / Mw (prosečna masa): 9685,03 / Mw (masa monoizotopa): 9879,44 MCP-1, sa masom 1865 i sekvencijom ISVQRLASYRRITSSK (položaj 20-35 u SEQ ID. NO.: 149) je identifikovan kao najčvršće vezan fragment.

Mutageneza MCP- 1.Pokazano je ranije za dva klastera primamo baznih ostataka (R24, K35, K38, K49 i Y13) da izgleda da čine najveće doprinose u interakciji između MCP-1 i njegovog receptora (Hemmerich et al.,Biochemistry,1999, 38, 13013-13025). Podaci o vezvanju otkrivaju da ostaci sa N-kraja malo doprinose aktivnosti vezivanja, a da su dva značajna ostatka važna za aktivnost signalizacije MCP-1: K35 i R24. K35 je najzančajniji funkcionalni ostatak, zato što mutacija K35A ima signifikantan efekt na vezivanje i aktivnost, kao i mutanti alanina u R24 (Hemmerich et al.,Biochemistry,199, 38, 13013-13025). Arg24 je konzerviran preko različitih vrsta MCP-1, kao i u humanom MCP-2-4, ali široko varira u drugim CC hemokinima, pa stoga može da učestvuje u specifičnosti receptora. Da bi se identifikovali ostaci unutar prvih 39 ostataka MCP-1, koji predstavljaju Glu-C digestiju, bilo je značajno vezivanje antitela, tri mutanta MCP-1 su generisana: tri bazna ostatka, R24, K35 i K38 su mutirana mutagenezom usmerenom na mesto, a protein mutant je dalje analiziran pomoću ELISA na vezivanje svih 36 neutrališućih antitela. Arg24 se mutira u alanin (R24A) i glutaminsku kiselinau (R24E). Lys35 i K38 su mutirani u alanin (K35A, K38A, respektivno). Sve mutacije se uvode u majmunsku osnovu MCP-1. Majmunski konstrukt MCP-1 se generiše regenerisan pomoću RT-PCR na RNK, izolovan iz limfocita periferne krvi majmuna (sinomologni MCP-1 PCR3-1, dvojno usmeren). Poravnavanje sekvencije proteina između humanog i majmunskog MCP-1 otkriva 99% homologiju, sa dve izmene aminokiselina na C-kraju (položaji 71 i 76). Ostaci 59-76 sa C-kraja nisu obuhvaćeni interakcijom sa receptorom i ne utiču na vezivanje svih 36 antitela.

Testovi ELISA se obavljaju korišćenjem supematanta iz ćelija 293, transficiranih različitim mutiranim konstruktima MCP-1. ELISA ploče se oblože sa anti-humanim MCP-1 kozjim IgG poliklonalnim antitelom (R&D, br. kataloga AF279NA) razblaženim do 1 pg/mL u puferu za oblaganje ELISA ploča. Izlučivanje konstrukata mutanta MCP-1 u ćelijama 293 potvrđeno je detekcijom biotiniloanog kozjeg anti-humanog MCP-1 (R&D br. kataloga BAF279), iza koga sledi streptavidin HRP. Vezivanje mutanta MCP-1 za MCP-1 antitela detektovano je pomoću kozjeg anti-humanog IgG, konjugovanog sa HRP (Fc specifičan, Caltag, br. kataloga H10507). Rezultati ELISA su pokazali da menjanje K38 nema efekat na aktivnost vezivanja svih 36 antitela. Vezivanje svih antitela za R24E i R24A antigena mutanta MCP-1, potpuno je poništeno (videti Tabelu 15). Međutim, mutacija K35A inhibira vezivanje samo šest antitela (1.6.1, 1.9.1, 3.6.1, 3.10.1). Sva ova anntiela izgleda da imaju konformacioni epitop, za koji je vezivanje pod uticajem mutacije ili Arg24 ili Lys35. Ovi podaci sugerišu da ova četri antitela prepoznaju da je konformacioni epitop različit, ali da se preklapa sa drugim antitelima.

Za ona antitela koja se vezuju za linearan epitop, njihovo vezivanje za peptid epitopa je detaljno ispitivano, koristeći tehnologiju SPOTs. SPOTs je tehnologija koja dozvoljava sintezu stotina peptida na čvrstoj fazi, u formatu pogodnom za sistematsku analizu epitopa antitela. Sistem je jednostavan, ekstremno brz i ekonomičan pri upotrebi reagenasa. Uobičajeni peptidni niz se dobija iz Sigma-Genosvs (The Vvoodlands, Texas). Niz od 32 13-mema peptida se sintetizuje u opsegu ostataka 1-76 sekvencije MCP-1. Svaki konsekutivni peptid je odmaknut za dve aminokiseline od prethodnog, dajući kompletnu biblioteku koja se preklapa. Membrana koja nosi 32 peptida se proba sa osam MCP-1 antitela (1 pg/mL), detektovanih sa sekundarnim antitelom konjugovanim sa HRP, i prati pomoću pojačane hemiluminiscencije (ECL). Reakcija se opaža na pet konsekutivnih mrlja peptida (7 do 11), što odgovara aminokiselinama 21 do 25 u MCP-1. Iz ovih rezultata izlazi da je jezgro epitopa za sva testirana antitela MCP-1, vezano za linearni etitop, SVQRL (21-25). Sekvencija MCP-1 je: QPDAINAPVTCCYNFTNRKISV^Rj_ASYRRITSSKCPKEAVIFKTIVAKEICADPK QKWVQDSMDHLDKQTQTPKT (SEQ ID NO: 149)

Osam antitela, svako prepoznato kao linearni epitop, reaguje sa istim SPOTs: 1.2.1, 1.4.1, 1.5.1, 1.8.1, 1.10.1., 1.13.1, 1.14.1 i 1.18.1.

Primer 4

Određvanie afiniteta ukrštenog reagovanja antitela sa Biacore analizom visokog

razdvajanja

Analiza interakcije je obavljena na 25°C, koristeći dva čipa CM5, smeštena u optičke biosenzore Biacore 2000. Pojedinačni dotok ćelija na svaki čip je aktiviran sa 7-minutnom injekcijom NHS/EDC, karbohidrazid je kuplovan preko NHS estra, koristeći 7-minutnu injekciju, a ostatak aktiviranih grupa je blokiran sa 7-minutnom injekcijom etanolamina. Monosaharidni ostaci mAb 3.11.2, razblaženi 1/50, oksidisani su korišćenjem 1mM natrijum-metaperjodata u 100 mM natrijum-acetatu, pH 5,5, na 4°C, tokom 30 min. Oksidisano antitelo se oslobodi soli u 10 mM natrijum-acetatu, pH 5,0, da bi se antitelo kuplovalo sa površinom modifikovanom sa karbohidrazidom. Površinska gustina 250 RU mAb 3.11.2 se koristi za merenje najavljenih interakcija MCP-1 i MCP-4, dok se površina 110 RU koristi za merenje interakcija antigena MCP-2 i MCP-3 sa mAb 3.11.2. Površine mAb se stabilizuju redukcijom hidrazonske veze sa 0,1 M natrijum-cijanoborohidridom. Interakcija antigen/antitelo se testira injektiranjem duplikata uzoraka antigena u tekući pufer (10 mM HEPES, 150 mM NaCI, 0,005% surfaktant, 200 ug/mL BSA, pH 7,4) u 300-strukom opsegu koncentracije. Ove površine se regenerišu sa 12-sekundnim pulsem 15 mM H3PO4.

Da bi se odredila kinetika svake interakcije, setovi podataka se globalno frtuju u model 1:1 interakcije, koji obuhvata i parametar za transport mase. Procenjene konstante brzine i izračunati afiniteti interakcije za antitela 3.11.2, dati su u Tabeli 16. Podaci za sva ostala antitela su dati u Tabeli 8.

Primer 5

Prevencija an<g>io<g>eneze sa antitelima MCP- 1

Angiogeneza je izazvana na modelu miša, mešanjem Matrigel-a sa humanim bFGF (10 ng/mL), humanim VEGF165 (100 ng/mL) i 10 pg/mL heparina ili MCP-1 (250 ng/mL) i MCP-3 (100 ng/mL). Oko 0,5 mL ove suspenzije se injektuje subkutano u desnu šapu 6-8 nedelja starih, atimičnih ženki, golih miševa. Za svaku dozu MCP-1 i MCP-3 se koristi pet miševa. Pored toga, kao negativna kontrola uzet je samo Matrigel (bez faktora rasta). Implantati matrigela očvrsnuin situ,pa se ostave neometani 7 dana. Na kraju 7. dana miševi se anesteziraju, a čepovi Matrigela se pažljivo uklone, korišćenjem mikrohirurških instrumenata. Gelovi se fotografišu pod transluminacijom. Jedan deo ovih čepova se obradi oblaganjem u parafin za seciranje. Seku se sekcije sa dva različita nivoa, pa se oboje sa H/E. Drugi deo gela se naglo smrzne u tečnom azotu, pa se podvrgne imunocitohemijskom bojenju sa monoklonalnim antitelom pacova usmerenim protiv mišjeg CD31 antigena, konjugovanog sa fikoeritrinom. Isečci obojeni sa H+E se podignu za stvaranje jasnih krvnih sudova, postavljenih endotelijumom. Isečci obojeni sa anti-CD31-PE se posmatraju pod fluorscentnim mikroskopom (crveni filter), priključenim uz Spot kameru. Snimci se prave digitalno, korišćenjem softverskog programa Metamorph. Gustina mikro krvnih sudova se određuje po metodi koju su objaviili Wild et al. (2000).

Nađeno je da i MCP-1 i MCP-3 pokazuju ekvivalentnu angiogenezu, kao i dobro karakterisani angiogeni faktori VEGF i bFGF. Pored toga, angiogeneza, izazvana u životinjama pomoću MCP-1 i MCP-3, a prenoseći zaključak na humane tumore ili obolelo tkivo, može se sprečiti tretiranjem sa antitelima za MCP-1 ili antitelom kao što je 3.11.2, koje neutrališe aktivnost svih članova familije MCP. Prema tome, mogla bi se injektirati životinjama anti-MCP antitela sa različitim dozama, koje se kreću približno između 0,1 i 0,5 mg po životinji, kako bi se dobila relacija doza-odgovor za posmatrani tretman.

Primer 6

Stvaranje MCP- 1 u ćelijama tumora

Da bi se odredilo da li ćelije tumora proizvode MCP-1 u kulturi ćelija, ispitivan je skup sojeva ćelija u pogledu njihovih sposobnosti da izlučuju MCP-1 u medijum kulture. Ćelije su kultivisane u medijumu Dulbecco's Modified Eagles Medium (DMEM), koji sadrži 10% seruma goveđeg fetusa ili ekvivalenta, sve do konfluencije. Ukloni se supematant, a u alikvotu se testira reaktivnost na MCP-1, koristeći komercijalno dostupni komplet ELISA iz R&D Sciences. Tabela 17 pokazuje niz sojeva ćelija kancera koje konstitutivno izlučuju MCP-1 i njihove respektivne sadržaje MCP-1, određene pomoću ELISA.

Primer 7

Efekt anti- MCP- 1 antitela na modelu mišjeg tumora

Da bi se ocenio efekat anti-MCP-1 antitela na rast subkutanog tumora, sakupe se eksponencijalno rastuće ćelije Panc-1, pa se resuspenduju u 0,2 mL Hank-ovog uravnotežeog slanog rastvora (HBBS). Tumori se stvaraju nakon injekcije sa 5*10<6>ćelija Panc-1, pomešanih sa faktorom rasta i redukovanm Matrigelom, u slabine ženki BALB/c golih miševa. Počevši od dana implantacije životinje se tretiraju sa 0,5 mg anti-MC-1 antitela 1.7.3 i antitelom PK, koje je usmereno na KLH ili PBS, u vremenima naznačenim na grafiku. Rast tumora je praćen nedeljno, a rezultati su prikazani kao srednja vrednost ±SD (Slika 4). Razlika između kontrolnih i tretiranih životinja je statistički signifikantna, kada se poredi Student-ovim T-testom (P<0,002). Prema tome, anti-MCP-1 antitela pružaju efikasan tretman u smanjivanju rasta tumorain vivo.

Primer 8

Softverska analiza MCP- 1 antitela

Gore opisani fluks kalcijuma, podaci o hemoaksiji i afinitetu za MCP-1 antitela, analizirani su koristeći softver Guided Analvtic software, dostupan iz Spotfire, Inc. Somerville, MA. Rezultati su prikazani na Slikama 5 i 6.

Primer 9

Strukturna analiza anti- MCP- 1 antitela

Varijabilni teški lanci i varijabilni laki lanci antitela prikazanih u Tabeli 1 su sekvencionirani da bi se odredila sekvencije DNK. Kompletne informacije o sekvencijama za sva anti-MCP-1 antitela pokazane su u Listingu sekvencija sa sekvencijama nukleotida i amino kiselina, za svaku gama i kapa kombinaciju.

Analizirane su varijabilne teške sekvencije da bi se odredila VH familija, sekvencija D-regiona i sekvencija J-regiona. Sekvencije su zatim translirane da se odredi primarna sekvencija aminokiselina i uporedi sa sojem VH, sekvencijama D i J, da se dođe do somatskih hipermutacija. Slika 7 pokazuje Clustal W poređenje anti-MCP-1 sekvencija, korišćenjemm VH1-24, ukazujući na regione CD, CDR1, CDR2 i CDR3 i sa njima povezani dendrogram. Slika 8 pokazuje Clustal W poređenje anti-MCP-1 sekvencija, korišćenjem VK-B3, ukazujući na regione CD, CDR1, CDR2 i CDR3 i sa njima povezani dendrogram. Slika 9 pokazuje Clustal W poređenje anti-MCP-1 sekvencija, korišćenjem VH6-1, ukazujući na regione CD, CDR1, CDR2 i CDR3 i sa njima povezani dendrogram.

Primer 10

Upotreba anti- MCP- 1 antitela kao dijagnostičkog agensa

A . Detekcija MCP - 1 antigena u uzorku

Razvijen je test imunosorbenta povezanog sa enzimom (ELISA, od engl. Enzvme-Linked Immunosorbent Assay) za detekciju MCP-1 antigena u uzorku. U ovom testu se bazenčići mikrotitarske ploče, kao što je mikrotitarska ploča sa 96 bazenčića ili mikrotitarska ploča 384, adsorbuju nekoliko sati, prvo sa poptuno humanim monoklonalnim antitelom usmerenim protiv antigena. Imobilizovano antitelo služi za zahvatanje antitela bilo koga od antigena koji mogu biti prisutni u tretiranom uzorku. Bazenčići se operu, pa tretiraju sa agensom za blokiranje, kao što je protein iz mleka ili albumin, da se spreči nespecifična adsorpcija analita.

Posle toga, bazenčići se tretiraju sa testiranim uzorkom, za koji se sumnja da sadrži antigen, ili sa rastvorom koji sadrži standardnu količinu antigena. Ovakav uzorak može biti, na primer, uzorak seruma iz subjekta za koga se sumnja da poseduje sadržaj antigena u krvotoku, za koji se smatra da može biti dijagnostičan za patologiju.

Posle ispiranja testiranog uzorka ili standarda, bazenčići se tretiraju sa drugim potpuno humanim monoklonalnim anti-MCP-1 antitelom, koje je obeleženo konjugovanjem sa biotinom. Ovo obeleženo anti-MCP-1 antitelo služi kao antitelo za detekciju. Posle ispiranja viška drugog antitela, bazenčići se tretiraju sa peroksidazom rena(HRP) konjugovanom sa vidinom i sa pogodnim hromogenim substratom. Koncentracija antigena u testiranom uzorku se određuje poređenjem sa standardnom krivom, dobijenom iz standardnih uzoraka.

Ovaj ELISA test predstavlja visoko specifičan i vrlo osetljiv test za detekciju MCP-1 antigena u testiranom uzorku.

B . Određivanje koncentracije MCP - 1 u uzorcima pacijenta

Razvijen je sendvič ELISA za kvantitativno određivanje sadržaja MCP-1 u humanom serumu. Dva anti-MCP-1 antitela, koja se koriste u sendviču ELISA, poželjno je da prepoznaju različite epitope na molekulu MCP-1 (podaci nisu prikazani). Ovaj test ELISA se obavlja kao što sledi: ELISA ploče (Fisher) se oblažu sa 50 pL zahvaćenog anti-MCP-1 antitela u puferu za oblaganje (0,1 M NaHC03, pH 9,6), koncentracije 2 pg/mL. Posle inkubacije preko noći, na 4°C, ove ploče se tretiraju 1 h sa 200 pL pufera za blokiranje (0,5% BSA, 0,1% Tvveen 20, 0,01% Timerosala u PBS), na 25°C. Ploče se operu (3*), koristeći 0,05% Tvveen 20 u PBS (pufer za ispiranje WB). Normalni serumi, ili serumi pacijenta (Clinomics, Bioreclamation) se razblaže u puferu za blokiranje, koji sadrži 50% humanog seruma. Ploče sa uzorcima seruma, inkubiraju se preko noći, na 4°C, operu sa WB, pa zatim 1 h inkubiraju sa 100 pL/bazenčić biotinilovanog detektovanog anti-MCP-1 antitela, na 25°C. Posle ispiranja, ploče se inkubiraju 15 min sa HRP-streptavidinom, operu kao i pre, pa zatim tretiraju sa 100 pL/bazenčić o-fenilendiamina u H2O2(Sigma, rastvor za razvijanje) radi generisanja boje. Reakcija se zaustavlja sa 50 uL/bazenčić H2SO4(2M), pa se analiziraju korišćenjem ELISA čitača ploča, na 492 nm. Koncentracija antigena PRO u uzorcima seruma se izračunava poređenjem sa razblaženjima prečišćenog MCP-1 antigena, koristeći program za fitovanje krivih sa četri parametra.

C. Faze kancera kod pacijenta

Podrazumeva se da je na osnovu rezultata iznetih i diskutovanih u Primerima 10A-10B, preko korišćenja realizacija pronalaska opisanih ovde, moguće odrediti fazu kancera kod nekog subjekta, na bazi sadržaja izlučivanja MCP-1 antigena. Za datu vrstu kancera uzmu se uzorci krvi od subjekata sa dijagnozom, koji su u raznim fazama napredovanja bolesti i/ili raznim tačkama terapeutskog tretmana kancera. Koncentracija MCP-1 antigena prisutna u uzorcima krvi određuje se korišćenjem metode koja specifično određuje količinu prisutnog antigena. Ova metoda obuhvata ELISA metodu, kao što je metoda opisana u Primerima 10A-10B. Koristeći populaciju uzoraka, koja daje statistički signifikantne rezultate za svaku fazu napredovanja ili terapije, opisuje se opseg koncentracije antigena koji se može smatrati karakteristikom svake faze.

Da bi se odredila faza napredovanja kancera u subjektu koji se ispituje, ili da se karakteriše odgovor subjekta na tok terapije, uzima se uzorak krvi iz subjekta, pa se određuje koncentracija MCP-1 antigena prisutnog u tom uzorku. Tako dobijena koncentracija se koristi za identifikaciju opsega koncentracija u koji ta vrednost pada. Tako definisan opseg je u korelaciji sa fazom napredovanja ili fazom terapije identifikovanim kod raznih populacija subjekata sa dijagnozom, čime se saznaje faza u subjektu koji se ispituje.

Primer 11

Upotrebe anti- MCP- 1 antitela u tretmanu tumora

Da bi se odrediliin vivoefekti tretmana sa anti-MCP-1 antitelom kod humanih pacijenata sa tumorima, ovim humanim pacijentima se tokom nekog vremena daje injekcija efikasne količine anti-MCP-1 antitela. Periodično, tokom tretmana, humani pacijenti se prate radi određivanja da li njihov tumor napreduje, a naročito, da li tumor raste i metastazira.

Pacijenti sa tumorom, tretirani sa anti-MCP-1 antitelima imaju niži nivo rasta tumora i metastaza, u poređenju sa nivoom rasta tumora i metastazama tumora kod pacijenata sa tumorom, koji su tretirani sa kontrolnim antitelima. Kontrolna antitela, koja se mogu koristiti, su antitela istog izotipa kao i testirana anti-MCP-1 antiela, a pored toga ne moraju biti u stanju da se vezuju za MCP-1 antigen tumora.

Prethodna pisana prijava se smatra dovoljnom da onom ko je verziran u stanje tehnike omogući da praktično realizuje ovaj pronalazak. Realizacije pronalaska opisanog ovde ne treba da se ograničavaju po obimu konstruktom koji je priložen, zato što je namera da priložena realizacija služi kao ilustracija nekih aspekata ovog pronalaska, pa se bilo koji konstrukti, koji su funkcionalno ekvivalenti, nalaze unutar obima ovog pronalaska.

Prethodni opis i Primeri daju detaljno neke poželjne realizacije ovog pronalaska i opisuju najbolji način koji se podrazumeva ovim pronalskom. Međutim, smatra se da makoliko sve ovo prethodno može biti detaljno u tekstu, ovaj pronalazak može da se praktikuje na mnogo načina, pa se ovaj pronalazak treba tumačiti u skladu sa priključenim patentnim zahtevima i bilo kojim od njihovih ekvivalenata.

Claims (48)

1. Humano monoklonalno antitelo koje se vezuje za MCP-1, naznačeno time, što sadrži teški lanac aminokiselina koji ima sekvenciju koja se bira iz grupe koju čine SEQ ID NO: 2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 38, 42, 46, 50, 54, 58, 62,

66, 70, 74, 78, 82, 86, 90, 94, 98, 102, 106, 110, 114, 118, 122, 126, 130, 134, 138,142 i 146.

2. Antitelo prema Zahtevu 1, naznačeno time, što saadrži još i laki lanac aminokiselina koji ima sekvenciju koja se bira iz grupe koju čine SEQ ID NO: 4,

8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48, 52, 56, 60, 64, 68, 72, 76, 80, 84, 88, 92, 96, 100,104, 108, 112, 116, 120, 124, 128,132, 136, 140,144 i 148.

3. Humano monoklonalno antitelo prema Zahtevu 2, naznačeno time, što teški lanac aminokiselina sadrži sekvenciju SEQ ID NO: 2, a laki lanac aminokiselina sadrži sekvenciju SEQ ID NO: 4.

4. Humano monoklonalno antitelo prema Zahtevu 2, naznačeno time, što teški lanac aminokiselina sadrži sekvenciju SEQ ID NO: 6, a laki lanac aminokiselina sadrži sekvenciju SEQ ID NO: 8.

5. Humano monoklonalno antitelo prema Zahtevu 2, naznačeno time, što teški lanac aminokiselina sadrži sekvenciju SEQ ID NO: 10, a laki lanac aminokiselina sadrži sekvenciju SEQ ID NO: 12.

6. Humano monoklonalno antitelo prema Zahtevu 2, naznačeno time, što teški lanac aminokiselina sadrži sekvenciju SEQ ID NO: 14, a laki lanac aminokiselina sadrži sekvenciju SEQ ID NO: 16.

7. Humano monoklonalno antitelo prema Zahtevu 2, naznačeno time, što teški lanac aminokiselina sadrži sekvenciju SEQ ID NO: 18, a laki lanac aminokiselina sadrži sekvenciju SEQ ID NO: 20.

8. Humano monoklonalno antitelo prema Zahtevu 2, naznačeno time, što teški lanac aminokiselina sadrži sekvenciju SEQ ID NO: 22, a laki lanac aminokiselina sadrži sekvenciju SEQ ID NO: 24.

9. Humano monoklonalno antitelo prema Zahtevu 2, naznačeno time, što teški lanac aminokiselina sadrži sekvenciju SEQ ID NO: 26, a laki lanac aminokiselina sadrži sekvenciju SEQ ID NO: 28.

10. Humano monoklonalno antitelo prema Zahtevu 2, naznačeno time, što teški lanac aminokiselina sadrži sekvenciju SEQ ID NO: 30, a laki lanac aminokiselina sadrži sekvenciju SEQ ID NO: 32.

11. Humano monoklonalno antitelo prema Zahtevu 2, naznačeno time, što teški lanac aminokiselina sadrži sekvenciju SEQ ID NO: 34, a laki lanac aminokiselina sadrži sekvenciju SEQ ID NO: 36.

12. Humano monoklonalno antitelo prema Zahtevu 2, naznačeno time, što teški lanac aminokiselina sadrži sekvenciju SEQ ID NO: 38, a laki lanac aminokiselina sadrži sekvenciju SEQ ID NO: 40.

13. Humano monoklonalno antitelo prema Zahtevu 2, naznačeno time, što teški lanac aminokiselina sadrži sekvenciju SEQ ID NO: 42, a laki lanac aminokiselina sadrži sekvenciju SEQ ID NO: 44.

14. Humano monoklonalno antitelo prema Zahtevu 2, naznačeno time, što teški lanac aminokiselina sadrži sekvenciju SEQ ID NO: 46, a laki lanac aminokiselina sadrži sekvenciju SEQ ID NO: 48.

15. Humano monoklonalno antitelo prema Zahtevu 2, naznačeno time, što teški lanac aminokiselina sadrži sekvenciju SEQ ID NO: 50, a laki lanac aminokiselina sadrži sekvenciju SEQ ID NO: 52.

16. Humano monoklonalno antitelo prema Zahtevu 2, naznačeno time, što teški lanac aminokiselina sadrži sekvenciju SEQ ID NO: 54, a laki lanac aminokiselina sadrži sekvenciju SEQ ID NO: 56.

17. Humano monoklonalno antitelo prema Zahtevu 2, naznačeno time, što teški lanac aminokiselina sadrži sekvenciju SEQ ID NO: 58, a laki lanac aminokiselina sadrži sekvenciju SEQ ID NO: 60.

18. Humano monoklonalno antitelo prema Zahtevu 2, naznačeno time, što teški lanac aminokiselina sadrži sekvenciju SEQ ID NO: 62, a laki lanac aminokiselina sadrži sekvenciju SEQ ID NO: 64.

19. Humano monoklonalno antitelo prema Zahtevu 2, naznačeno time, što teški lanac aminokiselina sadrži sekvenciju SEQ ID NO: 66, a laki lanac aminokiselina sadrži sekvenciju SEQ ID NO: 68.

20. Humano monoklonalno antitelo prema Zahtevu 2, naznačeno time, što teški lanac aminokiselina sadrži sekvenciju SEQ ID NO: 70, a laki lanac aminokiselina sadrži sekvenciju SEQ ID NO: 72.

21. Humano monoklonalno antitelo prema Zahtevu 2, naznačeno time, što teški lanac aminokiselina sadrži sekvenciju SEQ ID NO: 74, a laki lanac aminokiselina sadrži sekvenciju SEQ ID NO: 76.

22. Humano monoklonalno antitelo prema Zahtevu 2, naznačeno time, što teški lanac aminokiselina sadrži sekvenciju SEQ ID NO: 78, a laki lanac aminokiselina sadrži sekvenciju SEQ ID NO: 80.

23. Humano monoklonalno antitelo prema Zahtevu 2, naznačeno time, što teški lanac aminokiselina sadrži sekvenciju SEQ ID NO: 82, a laki lanac aminokiselina sadrži sekvenciju SEQ ID NO: 84.

24. Humano monoklonalno antitelo prema Zahtevu 2, naznačeno time, što teški lanac aminokiselina sadrži sekvenciju SEQ ID NO: 86, a laki lanac aminokiselina sadrži sekvenciju SEQ ID NO: 88.

25. Humano monoklonalno antitelo prema Zahtevu 2, naznačeno time, što teški lanac aminokiselina sadrži sekvenciju SEQ ID NO: 90, a laki lanac aminokiselina sadrži sekvenciju SEQ ID NO: 92.

26. Humano monoklonalno antitelo prema Zahtevu 2, naznačeno time, što teški lanac aminokiselina sadrži sekvenciju SEQ ID NO: 94, a laki lanac aminokiselina sadrži sekvenciju SEQ ID NO: 96.

27. Humano monoklonalno antitelo prema Zahtevu 2, naznačeno time, što teški lanac aminokiselina sadrži sekvenciju SEQ ID NO: 98, a laki lanac aminokiselina sadrži sekvenciju SEQ ID NO: 100.

28. Humano monoklonalno antitelo prema Zahtevu 2, naznačeno time, što teški lanac aminokiselina sadrži sekvenciju SEQ ID NO: 102, a laki lanac aminokiselina sadrži sekvenciju SEQ ID NO: 104.

29. Humano monoklonalno antitelo prema Zahtevu 2, naznačeno time, što teški lanac aminokiselina sadrži sekvenciju SEQ ID NO: 106, a laki lanac aminokiselina sadrži sekvenciju SEQ ID NO: 108.

30. Humano monoklonalno antitelo prema Zahtevu 2, naznačeno time, što teški lanac aminokiselina sadrži sekvenciju SEQ ID NO: 110, a laki lanac aminokiselina sadrži sekvenciju SEQ ID NO: 112.

31. Humano monoklonalno antitelo prema Zahtevu 2, naznačeno time, što teški lanac aminokiselina sadrži sekvenciju SEQ ID NO: 114, a laki lanac aminokiselina sadrži sekvenciju SEQ ID NO: 116.

32. Humano monoklonalno antitelo prema Zahtevu 2, naznačeno time, što teški lanac aminokiselina sadrži sekvenciju SEQ ID NO: 116, a laki lanac aminokiselina sadrži sekvenciju SEQ ID NO: 118.

33. Humano monoklonalno antitelo prema Zahtevu 2, naznačeno time, što teški lanac aminokiselina sadrži sekvenciju SEQ ID NO: 118, a laki lanac aminokiselina sadrži sekvenciju SEQ ID NO: 120.

34. Humano monoklonalno antitelo prema Zahtevu 2, naznačeno time, što teški lanac aminokiselina sadrži sekvenciju SEQ ID NO: 122, a laki lanac aminokiselina sadrži sekvenciju SEQ ID NO: 124.

35. Humano monoklonalno antitelo prema Zahtevu 2, naznačeno time, što teški lanac aminokiselina sadrži sekvenciju SEQ ID NO: 126, a laki lanac aminokiselina sadrži sekvenciju SEQ ID NO: 128.

36. Humano monoklonalno antitelo prema Zahtevu 2, naznačeno time, što teški lanac aminokiselina sadrži sekvenciju SEQ ID NO: 130, a laki lanac aminokiselina sadrži sekvenciju SEQ ID NO: 132.

37. Humano monoklonalno antitelo prema Zahtevu 2, naznačeno time, što teški lanac aminokiselina sadrži sekvenciju SEQ ID NO: 134, a laki lanac aminokiselina sadrži sekvenciju SEQ ID NO: 136.

38. Humano monoklonalno antitelo prema Zahtevu 2, naznačeno time, što teški lanac aminokiselina sadrži sekvenciju SEQ ID NO: 138, a laki lanac aminokiselina sadrži sekvenciju SEQ ID NO: 140.

39. Humano monoklonalno antitelo prema Zahtevu 2, naznačeno time, što teški lanac aminokiselina sadrži sekvenciju SEQ ID NO: 142, a laki lanac aminokiselina sadrži sekvenciju SEQ ID NO: 144.

40. Humano monoklonalno antitelo prema Zahtevu 2, naznačeno time, što teški lanac aminokiselina sadrži sekvenciju SEQ ID NO: 146, a laki lanac aminokiselina sadrži sekvenciju SEQ ID NO: 148.

41. Antitelo imobilisano na nerastvomoj matrici, naznačeno time, što to antitelo predstavlja antitelo iz Zahteva 2.

42. Poboljšan postupak za testiranje sadržaja monocitnog hemo-atraktantnog proteina-1 (MCP-1) u uzorku iz pacijenta, naznačen time, što se pomenuti poboljšani postupak sastoji od upotrebe anti-MCP-1 antitela iz Zahteva 2 za detekciju sadržaja MCP-1 u testiranju uzorka iz pacijenta.

43. Postupak prema Zahtevu 42 naznačen time, što uzorak iz pacijenta predstavlja krv.

44. Preparat, naznačen time, što sadrži antitelo ili njegov fragment iz Zahteva 2 i farmaceutski prihvatljiv nosač.

45. Postupak za efikasno tretiranje bolesti neoplazma, naznačen time, što se odabere animalno biće kome je potreban tretman bolesti neoplazma, pa se pomenutom animalnom biću ordinira terapeutski efikasna doza potpuno humanog monoklonalnog antitela koje se specifično veže za monocitni hemoatraktantni protein-1 (MCP-1).

46. Postupak prema Zahtevu 45, naznačen time, što se bolest neoplazma bira iz grupe koju čine kancer dojke, kancer jajnika,kancerbešike, kancer pluća, glioblastom, kancer želudca, kancer endometrijuma, kancer bubrega, kancer debelog creva, kancer pankreasa i kancer prostate.

47. Postupak za efikasno tretiranje inflamatornih stanja, naznačen time, što se odabere animalno biće kome je potreban tretman inflamatornog stanja, pa se pomenutom animalnom biću ordinira terapeutski efikasna doza potpuno humanog monoklonalnog antitela koje se specifično veže za monocitni hemoatraktantni protein-1 (MCP-1).

48. Postupak prema Zahtevu 47, naznačen time, što se pomenuto inflamatomo stanje bira iz grupe koju čine reumatoidni artritis, glomerulonefritis, ateroskleroza, psorijaza, restenoza, autoimuna bolest i multipla skleroza.