RS20050561A - HIDROFILNE, TIOL-REAKTIVNE CIJANIN BOJE I NjIHOVI KONjUGATI SA BIOMOLEKULIMA ZA FLUORESCENTNU DIJAGNOZU - Google Patents

Abstract

Pronalazak se odnosi na nove fluorescentne boje iz klase cijanin boja, posebno indotrikarbocijanine sa maksimumom absorbcije i fluorescencije u rasponu spektra od 700 do 900 nm, tiol-specifičnu reaktivnu grupu, i tri, pretpostavljeno četiri, sulfonat grupe, da se poveća rastvorljivost u vodi kao i proizvodnja boja. Ovaj pronalazak se takođe odnosi na konjugate ovih boja sa biomolekulima i njihove upotrebe

Description

HIDROFILNE, TIOL-REAKTIVNE CIJANIN BOJE I NJIHOVI KONJUGATI

SA BIOMOLEKULIMA ZA FLUORESCENTNU DIJAGNOZU

Ovaj pronalazak se odnosi na nove fluorescentne boje iz klase cijanin boja, posebno indotrikarbocijanine sa maksimumom absorbcije i fluorescencije u rasponu spektra od 700 do 900 nm, tiol-specifičnu reaktivnu grupu i tri, pretpostavljeno četiri, sulfonat grupa, da se poboljša rastvorljivost u vodi kao i proizvodnja boja. Ovaj pronalazak se takođe odnosi na konjugate ovih boja sa biomolekulima i njihove upotrebe.

Stanje tehnike

Upotreba svetlosti u medicinskoj dijagnozi je u skorije vreme dobila na važnosti (videti, n.pr., Biomedical Photonics Handbook (Editor: T. Vo-Dinh), CRC Press). Široka različitost dijagnostičkih postupaka se nalazi u eksperimentalnim testovima za primenu u različitim medicinskim disciplinama, n.pr.., endoskopiji, mamografiji, hirurgiji ili ginekologiji. Na svetlosti zasnovani postupci imaju visoku instrumentalnu osetljivost i čine mogućim molekularnu detekciju, i snimanje najmanjih količina hromofora i/ili fluorofora (VVeissleder et al. (2001) Molecular Imaging, Radiologv 219, 316-333).

Boje kojima sa hrani tkivo kao egzogeni kontrast medijuma za fluorescentnu dijagnozu i snimanje, a ovde posebno fluorescentne boje sa maksimumom absorbcije i fluoroscencije u rasponu spektra od 700-900 nm (dijagnostički prozor tkiva), su od specifičnog interesa zain- vivoupotrebu. Fotoni ove talasne dužine se komparativno malo absorbuju od strane tkiva pa prema tome mogu prodirati nekoliko santimetara u tkivo pre nego što procesa absorbcije (primarno putem oksihemoglobina i deokishemoglobina) završi prenos svetlosti. Absorbicja se može odigrati, povrh toga, putem fluorescentnih boja koje se uvode u tkivo, ali koje emituju absorbovanu energiju u obliku fluorescentnog zračenja dužih talasa. Ovo fluorescentno zračenje se može detektovati spektialno odvojeno i čini mogućom lokalizaciju boja i korelaciju sa molekularnim strukturama za koje se boja vezala (videti u vezi sa ovim Licha, K. (2002) Contrast Agents for Optical Imaging (Review). U: Topics in Current Chemistrv - Contrast Agents II (Editor: W. Krause), Volume 222, Springer Heidelberg, pp. 1 - 31.).

Da se postigne dijagnostički značajna diferencijacija između bolesnih struktura i zdravog tkiva, boja kojom se hrani mora voditi do što je veće moguće razlike u koncentraciji između tkiva. Ovo se može obaviti na osnovu tumor-fizioloških osobina (snabdevanje krvlju, distribucija kinetike, zakasnelo uklanjanje). Za molekularno označavanje za bolest specifičnih struktura, mogu se upotrebiti konjugati koji sadrže fluorescentne boje sa ciljanim-afiniranim biomolekulima, kao što su proteini, peptidi, and antitela. Nakon ubrizgavanja, određeni deo ovih konjugata se vezuje za molekularne ciljane strukture, kao što su receptori ili proteini matrice, doke se nevezani deo ekskretuje iz tela. Na ovaj način rezultira, veća razlika u koncentraciji i tako veći kontrast snimanja kod implementiranja dijagnoze fluorescencijom.

Fluorescentne boje iz klase cijanin boja spadaju u kategoriju predstavnika koji obećavaju i sintetišu se u mnogo različitih strukturalnih širina. Posebno, karbocijanini sa indokarbocijaninom, indodikarbocijanin and indotrikarbocijanin skeleti imaju visoke koeficijente ekstinkcije i dobre prinose kvantuma fluorescencije [Licha, K. (2002) Contrast Agents for Optical Imaging (Review). U: Topics in Current Chemistrv - Contrast Agents II (Editor: W. Krause), Volume 222, Springer Heidelberg, pp. 1-31, i tamo navedene reference].

WO 96/17628 tako opisuje in-vivo dijagnostički postupak sredstvima bliskog oblasti infracrvenog zračenja. U ovom slučaju, u vodi rastvorljive boje i njihovi proizvodi pripajanja biomolekula sa specifičnim fotofizičkim, i farmakohemijskim osobinama su kao kontrastni medijum za dijagnozu fluorescencije i transiluminacije.

Sinteza cijanin boja sa indokarbocijanin, indodikarbocijanin i indotrikarbocijanin skeletima je dobro opisana prethodno u nauci. Relevantna literatura u ovom pogledu je, na primer: Bioconjugate Chem. 4, 105-111, 1993; Bioconjugate Chem. 7, 356-62, 1996; Bioconjugate Chem. 8, 751-56, 1997; Cytometry 10, 11-19, 1989 i 11, 418-30, 1990; J. Heterocvcl. Chem. 33, 1871-6, 1996; J. Org. Chem. 60, 2391-5, 1995; Dyes and Pigments 17, 19-27, 1991, Dyes and Pigments 21, 227-34, 1993; J. Fluoresc. 3, 153-155, 1993; i Anal. Biochem. 217, 197-204, 1994. Dodatni postupci su opisani u patentnim objavama US 4,981,977; US 5,688,966; US 5,808,044; WO 97/42976; WO 97/42978; WO 98/22146; WO 98/26077; i EP 0 800 831.

Povrh toga, indotrikarbocijanini sa izmenjenim supstituentima su sintetisani i spojeni za biomolekule (opisano u, n.pr., Photochem. Photobiol. 72, 234, 2000; Bioconjugate Chem. 12, 44, 2001; Nature Biotechnol. 19, 237, 2001; J. Biomed. Optics 6, 122, 2001; J. Med. Chem. 45, 2003, 2002). Drugi primeri se nalaze posebno u objavama WO 00/61194 ("Short-Chain Peptide Dye Conjugates as Contrast Agents for Optical Diagnostics"), WO 00/71162, WO 01/52746, WO 01/52743 i WO 01/62156.

Poznati indotrikarbocijanini koji su korišteni prethodno u nauci i dalje imaju prepreke, što naravno, umanjuje njihovu efikasnu upotrebu.

Niski prinosi kvantuma fluorescencije indotrikarbocijanina uvek postoje nakon spajanja za biomolekule. Za komercijalno dostupnu boju Cy7, Gruber et al.

(Bioconjugate Chemn. 11, 696-704, 2000) se tako opisuje da gubitak efikasnosti fluorescencije nastaje nakon spajanja za biomolekule. Becker et al. (Photochem. Photobiol. 72, 234, 2000) opisuje konjugate indotrikarbocijanina sa HSA i transferrin-om sa prinosima kvantuma fluorescencije od 2.9% ili 2.8% i deformisanom absorbcijom spektra u fiziološkom medijumu.

Dodatno, konjugati boja teže agregaciji. Becker et al. (Photochem. Photobiol. 72, 234, 2000) za konjugate indotrikarbocijanina sa HSA i transferrin-om i Licha et al. (Bioconjugate Chem. 12, 44-50, 2001) za peptide koji se vezuju za receptor opisuju da imaju deformisanu absorbciju spektra u fiziološkom medijumu. Ove deformacije ukazuju na formiranje agregata i ekstinkciju fluorescencije koji nastupaju kao rezultat. Sličan problem postoji u slučaju neadekvatne rastvorljivosti u vodi boja.

Sa reaktivnom grupom, takođe uvek postoji neefikasni pristup derivatima. Gruber et al. (Bioconjugate Chem. 11, 696-704, 2000) tako opisuje upotrebu Cy7-bifunkcionalnih NHS-estara sa dve reaktivne grupe, što može potencijalno proizvesti unakrsno vezivanje dva biomolekula. Putem dve karboksi grupe u molekulu, ipak, sintetički pristup derivatima se ometa sa samo jednom reaktivnom grupom i vodi do stvaranja nuz-produkata (n.pr., sadrži monoreaktivne NHS estre delova Cy7 ne-aktiviranog i duplo-aktiviranog Cy7 molekula).

Tako postoji kontinuirana potreba za cijanin bojama koje su efikasne i lake za proizvodnju za fluorescentnu dijagnzu koje umanjuju ili nemaju gore pomenute smetnje. Dodatno, ove boje treba da budu vrlo pogodne za proizvodnju konjugata sa biomolekulima.

Opis pronalaska

Prvi predmet pronalaska je postignut pripremanjem indotrikarbocijanin boje opšte formule (I),

u kojoj

X je O, S ili C koji je supstituisan na dva mesta, pri čemu supstituenti mogu biti odabrani od grupe koja sadrži metil, etil, propil, isopropil i/ili butil; Y je CH2-CH2ili CH2-CH2-CH2; Z je Cido C5alkil, pri čemu su C atomi opciono supstituisani sa O ili S, ili Rido R4, nezavisno jedan od drugog, su S03H ili H, pod uslovom da su bar tri od R1do R4S03H, R5je -CO-NH-R8-R9, -NH-CS-NH-R8-R9ili -NH-CO-R8-R9, u kojem je R8odabran od grupe koja sadrži neračvasti C2-C13alkil, u kojem su C atomi opciono zamenjeni sa O ili S, i R9 je odabran od grupe koja sadrži

ili hloroacetil, bromoacetil, jodoacetil, hloroacetamido, jodoacetamido, hloroalkil, bromoalkil, jodoalkil, piridil disulfid i vinil sulfonamid, i u kome su R6i R7CH ili su povezani sa C3-alkil za heksil prsten, koji opciono može biti supstituisan u para-poziciji sa C1do C4-alkil radikalom, i soli i solvati ovog jedinjenja.

Pretpostavljena je indotrikarbocijanin boja ovog pronalaska, u kojoj Y je CH2-CH2; Z je Cido C5alkil, pri čemu su C atomi opciono supstituisani sa O il S, i u kojoj su R6i R7CH, i soli i solvati ovog jedinjenja.

Poželjnija je indotrikarbocijanin boja ovog pronalaska, u kojoj Z je C^- C5 alkil.

Još poželjnija je indotrikarbocijanin boja ovog pronalaska, u kojoj

i R6i R7su povezani za heksil prsten preko C3-alkila.

Fluorescentne boje iz klase cijanin boja, posebno indotrikarbocijanini sa maksimumom absorbcije i fluorescencije u rasponu spektra od 700 do 900 nm, tiol-specifine reaktivne grupe i tri, pretpostavljeno četiri, sulfonat grupe, su tako predmeti ovog pronalaska. Potonji se upotrebljavaju da se povisi rastvorljivost u vodi.

Sada se može otkriti, dovljno iznenađujuće, da indotrikarbocijanini prema pronalasku sa gore pomenutom strukturom (kompaktna pozicija 3-4 sulfonat grupa sa sulfonatoethil radicalima) imaju visoki prinos kvantuma fluorescencije od > 15% i da prinos kvantuma fluorescencije nakon spajanja za biomolekule ostaje otprilike nepromenjen (maksimalni gubitak od oko 10%). Spektar absorbcije konjugata pokazuje, šta više, da nema deformacije absorbcije boje u NIR rasponu na oko 750 nm. Na taj način su proizvedeni dobra hidrofilija, redukovana agregacija i povišeni prinos kvantuma fluorescencije u odnosu na konvencionalne indokarbocijanine ili Cy7 derivate sa manje od tri sulfonat grupe, posebno u slučaju Cy7 i drugih poznatih struktura.

Sledeći esencijalni aspekt u pripremanju cijanin boja za fluorescentnu dijagnozu prema pronalasku se odnosi na one derivate koji imaju reaktivne funkcionalne grupe koje čine mogućim kovalentno spajanje za ciljane-specifične biomolekule. Pogodni derivati su, n.pr., NHS estri i izotiocijanati (Bioconjugate Chem. 4, 105-111, 1993; Bioconjugate Chem. 8, 751-56, 1997), koji reaguju sa amino grupama, kao što su, na primer, maleimidi, alfa-haloketoni ili alfa-haloacetamidi (Bioconjugate Chem. 13, 387-391, 2002; Bioconjugate Chem. 11, 161-166, 2000), koji reaguju sa tiol grupama. Druge bifunkcionalne veze mogu imati poreklo iz grupe koja sadrži arilendiizotiocijanat, alkilendiizoticcijanat, bis-N-hidroksi-sukcinimidilestre, heksametilenediizocijanat i N-(y-maleimidobutiriloksi)sukcinimid estar.

WO 01/77229 opisuje cijanin boje sa kombinacijom sulfoaril grupa, alkil supstituenata u mezo-poziciji metin lanca i bar jednom reaktivnom grupom koja čini mogućim vezivanje za biomolekule. Realizacije se odnose na indodikarbocijanine (polimetin lanac koji sadrži 5 C atoma), pa ipak, i jedinjenja nemaju reaktivnu grupu u mezo-poziciji.

WO 00/16810 ("Near-lnfrared Fluorescent Contrast Agent and Fluorescence Imaging") opisuje indotrikarbocijanine, odnosno, sa supstituentima umezo-poziciji C7-polimetin lanca. Pa ipak nije naznačeno kako reaktivne grupe mogu biti uvedene ili proizvedene.

Sledeći aspekt ovog pronalaska se odnosi na indotrikarbocijanin boju, u kojoj R5je COOH ili NH2.

Objavljeni derivati se baziraju primarno na Cy3-, Cy5-, Cy5.5- i Cy7-baznoj strukturi (komercijalno dostupni od Amersham Pharmacia Biotech; US 5,268,486; Cy3 = indokarbocijanin, Cy5=indodikarbocijanin, Cy7=indotrikarbocijanin). Tiol grupa-reaktivni derivati su od specijalnog interesa, pošto potonji dopuštaju usmerenu konjugaciju sa biotehnološkim cisteinima koji su specifično pozicionirani u biomolekulima. Prethodno stanje nauke se ovde primarno koncentriše na Cy3 i Cy5 derivate.

Posebno pretpostavljene indotirkarbocijanin boje prema pronalasku su odabrane od boja sa formulama (II) do (XX) koje su navedene u donjoj Tabeli 1:

Sledeći aspekt ovog pronalaska se odnosi na postupak proizvodnje indotrikarbocijanin boje ovog pronalaska. U ovom slučaju, pronađen je jednostavan pristup putem 4-supstituisanih piridina. Dovoljno iznenađujuće, različiti 4-supstituisani piridini u visokim prinosima se mogu konvertovati putem sredstava Zincke-ove reakcije (Zincke-Konig reaction, see Rompps Chemie Lexikon [Rompps Chemical Dictionarv], 10th Edition, page 5067) u mezo-supstituisani glutakonaldehid-dianilid (prekursori za cijanin boju). Dodatno jednostavnoj i efikasnoj sintezi 4-substituisanih piridina, simetrična struktura boja ovog pronalaska otvara mogućnost definisane izvođenja sa tiol-grupa-selektivnom reaktivnom grupom u simetričnoj mezo-poziciji molekula.

Tako se izvodi dalje izvođenje do tiol grupa-reaktivnih jedinjenja. Tiol grupa-reaktivne funkcionalnosti su, n.pr., maleinimid (maleimid), chloroacetvl, bromoacetil, jodoacetil, hloroacetamido, bromoacetamido, jodoacetamido, hloroalkil, bromoalkil, jodoalkil, piridil disulfid i vinil sulfonamid.

Još jedan aspekt ovog pronalaska se odnosi na postupak proizvodnje konjugata koji se sastoji od spajanja indotrikarobcijanin boje ovog pronalaska za biomolekul. U okviru ovog pronalaska, "biomolekul" ima biti definisan kao bilo koji molekul biološkog porekla koji ima biološku aktivnost, posebno enzimsku aktivnost ili vezivanje supstanci sintetičkog ili biološkog porekla, kao što su, na primer, farmaceutska sredstva, peptidi, proteini, receptoris ili nukleinske kiseline. Povratno, pretpostavljeni biomolekuli su proteini, kao što su, na primer, enzimi, peptidi, antitela i fragmenti antitela (kao što su, n.pr., jedinični lanac, Fab, F(ab)2, diatela, itd.), lipcproteini, nukleinske kiseline, kao što su, na primer, oligonukleotidi ili polinukleotidi iz DNK ili RNK, aptameri, PNA, i šećeri, kao što su, na primer, mono-, di-, tri-, oligo- and polisaharidi.

Sinteza i biološka karakterizacija konjugata cijanin boje sa biomolekulima, kao što su peptidi, antitela i njihovi fragmenti i proteiniin- vivofluorescentnu dijagnozu tumora, su opisani u prethodnom stanju tehnike u različitim publikacijama. U ovom slučaju, upotrebljavaju se primarno gore pomenuti Cy3, Cy5, Cy5.5 and Cy7 (videti u pogledu ovoga, n.pr., Nature Biotechnol. 15, 1271, 1997; Cancer Detect. Prev. 22, 251, 1998; J. Immunol. Meth. 231, 239, 1999; Nature Biotechnol. 17, 375, 1999; Nature Medicine 7, 743, 2001). Sledeći aspekt ovog pronalaska se odnosi na konjugat indotrikarbocijanin boje prema pronalasku sa biomolekulom koji je proizveden prema postupku pronalaska. Ovaj konjugat se može karakterisati time da sadrži biomolekul kako je gore definisan, pri čemu je kao biomolekul, bar jedan biomolekul poželjniji, odabran od peptida, proteina, lipoproteina, antitela i fragmenata antitela, nukleinskih kiselina, kac što su, na primer, oligonukleotidi ili polinukleotidi DNK ili RNK, aptameri, i šećeri, kao što su, na primer, mono-, di-, tri-, oligo- i polisaharidi. Spojeni protein može tako biti karakterisan time da je odabran od grupe skeletnih proteina ili rastvorljivih proteina tela. Posebno pretpostavljeni su serum proteini (n.pr., HSA), antitela/fragmenti antitela, kao što su, n.pr., scFv-fragment ili F(ab), kao i peptidi, BSA, jaje albumin ili odatle izvedena peroksidaza.

Tako su poznata iz prethodnog stanja u nauci da, n.pr., antitela koja su usmerena spram molekula koji ekspresuju intenzivno u angiogenetički aktivno tkivo i samo u vrlo niskom nivou u pripojenom tkivu (videti WO 96/01653). Od specijalnog interesa su antitela koja su spram receptora vaskularnih faktora rasta, receptora sa endotelijalnim ćelijama za koje se medijatori inflamacije vezuju, i matrični proteini koji se ekspresuju specifično u formiranju novih sudova. Pretpostavljena su druga antitela ili fragmenti antitela koji su usmereni spram matričnog proteina EDB-fibronektina i njihovi konjugati u skladu sa pronalaskom. EDB-fibronektin, takođe poznat kao onkofetal fibronektin, je spletena varijanta fibronektina, koja se specifično formira oko novo formiranih sudova u postupku angiogeneze. Posebno su pretpostavljena antitela L19, E8, AP38 i AP39 spram EDB-fibronektina (Cancer Res 1999, 59, 347; J Immunol Meth 1999, 231, 239; Protein Expr Purif 2001, 21, 156).

Pretpostavljen je konjugat prema pronalasku koji se karakteriše time da se indotrikarbocijanin boja spoji za biomolekul putem SH grupe, posebno putem SH grupa za cistein. Opciono odatle čak su poželjnije proizvedena ona antitela i njihovi fragmenti koja su proizvedena rekombinantnim tehnikama, kao što je ona na C-završetku ili N-završetku (u okviru krajeva 1-10 amino kiselina), oni sadrže cistein koji ne formira bilo koje intramolekularne S-S-mostove i prema tome može biti upotrebljen za spajanje za boje prema pronalasku.

Sledeći aspekt ovog pronalaska se odnosi na dijagnostički pribor koji sadrži inodtrikarbocijanin boju ovog pronalaska i/ili konjugat ovog pronalaska. Dodatno, priboj može sadržati dodatne adjuvante za implementiranjein- vivodijagnoze, posebno, tumora. Ovi adjuvanti su, na primer, odgovarajući puferi, sudovi, reagensi detekcije i uputstva za upotrebu. Pribor pretpostavljeno sadrži sve materijale za intravenozno davanje ali boja prema pronalasku. Specijalne realizacije takvih pribora prema pronalasku su, na primer, kako dalje sledi.

Prvi sud koji sadrži antitelo (biomolekul) sa slobodnom SH grupom i standardne pufere/aditive bilo kao rastvor ili smrznuti-osušeni materijal. Sledeći sud koji sadrži boje prema pronalasku kao rastvor (uobičajeni aditivi) ili smrznuti-sušeni materijal u molarnom odnosu od 0.1 do 1 (10x deficit u ekvimolarnoj količini). Sud koji sadrži boju se opciono smeša sa puferom ili destilovanom vodom i doda se sudu koji sadrži biomolekul, inkubira se 1-10 minutes i upotrebljava direktno kao rastvor za ubrizgavanje..

U sledećoj realizaciji, pribor je prisutan u sistemu od dve komore (n.pr., brizgalica), koji u jednoj komori sadrži rastvor antitela, i fizički je odvojen sa lomljivim zidom a druga komora sadrži boju kao rastvor ili čvrsti materijal. Pošto se zid polomi, obavlja se smeša i proizvodnja rastvora za ubrizgavanje.

Poslednji aspekt ovog pronalaska se odnosi na upotrebu konjugata prema pronalasku kao fluorescentnog kontrastnog medijuma zain- vivodijagnozu tumora. Maksimum apsorpcije Cy7 s ovim u vezi je u rasponu od 745 nm i tako je posebno pogodan zain- vivodetekciju fluorescencije iz dubljih slojeva tkiva (videti gore). Ipak Cy7 derivati sa tiol grupa-selektivnim reaktivnim grupama još nisu opisani. Dodatno, upotreba konjugata antitela za detekciju krajnih oblasti tumora je već opisana u WO 01/23005 (Antibody Dye Conjugates for Binding to Target Structures of Angiogenesis in Order to lntraoperatively Depict Tumor Peripheries), ali ne sa upotrebom korisnih boja prema pronalasku.

Pronalazak je sada dalje opisan u pogledu sledećih primera i slika baze da su, na bilo koji način, oni ograničenje za ovaj pronalazak.

Slika 1 prikazuje standardizovani spektar apsorpcije i fluorescencije konjugata K11 (A) i K15 (B) (videti Tabelu 2) u PBS, i

Slika 2 prikazuje rezultate osobine snimanja konjugata prema pronalasku iz Primera 24 sa: supstanca: konjugat K15; tumor: F9 teratokarcinom u desnom zadnjem boku miša; doza: 50 nmol/kg telesne težine (podaci u zavisnosti od boje); excitacija: 740 nm (laser diode); detekcija: CCD-kamera (Hamamatsu) sa 802.5 ± 5 nm propusnim filterom i vremenima: pre ubrizgavanja, i 1 sat, 6 sati i 24 sata nakon ubrizgavanja. Pozicija tumora je identifikovana strelicama.

Primeri

Primeri 1 -16: Sinteza Indotrikarbocijanin boja sa maleimid grupama

Primer 1: Trinatrijum 3,3-dimetil-2-{7-[3,3-dimetil-5-sulfonato-1-(2-sulfonatoetil)-3H-indolijum-2-il]-4-(2-{[2-(2,5-dioksio-2,5-dihidro-1H-pirol-1-il)etil]karbamoil}-etil)hepta-2,4,6-trien-1-iliden}-1-(2-sulfonatoetil)-2,3-dihidro-1H-indol-5-sulfonat, unutrašnja so (Formula II)

a) 1 -(2-Sulfonatoetil)-2,3,3-trimetil-3H-indolenin-5-sulfokiselina, unutrašnja so

10 g (0.04 mol) 2,3,3-trimetil-3H-indolenin-5-sulfokiseline{ Bioconjugate Chem 1993, 4, 105), 6.8g (0.04 mol) 2-hloroethanesulfokiselina hlorida i 4.2 g (0.04 mol) trietilamina se refluksuje u 200 ml_ acetonitrila 6 sati. Talog se isisava i osuši. Prinos 5.0 g (35% od teorije).Anal Biochem 1994, 217, 197

b) 3-Piridin-4-il-propionska kiselina-efrc-butil estar

20 g (89 mmol) t-butil-P,P-dimetilfosfonoacetata u 50 ml_ THF se dodaje u

kapima na 0°C suspenziji od 3.9 g (98 mmol) natrijumhidrida (60 % u

mineralnom ulju) u 250 mL THF. Nakon 1 sata mešanja na 0°C, rastvor od 10 g (93 mmol) piridin-4-karbaldehida u 50 mL tetrahidrofurana se dodaje u kapima, i reakciona smeša se meša 1 sat na 0°C i 18 sati na sobnoj temperaturi. Nataloženi čvrsti oblik se uklanja filtriranjem, i rastvor se koncentriše isparavanjem. Ostatak se rastvori u izopropanolu dok se zagreva, nerastvorljivi delovi se uklanjaju filtriranjem, i rastvor se ohladi do 0°C za kristalizaciju. Proizvedeni čvrsti oblik se vadi filtriranjem, meša sa heksanom, filtrira i osuši. Intermedijarni proizvod (15.3 g) se hidrogenuje u 150 mL etanola sa 0.15 g 10% paladijum/aktiviranim ugljem 6 sati. Katalizator se uklanja filtriranjem, rastvor se koncentriše isparavanjem, i ostatak se filtrira na silika gelu (mobilni rastvarač dietil etar). Dobija se 13.0 g svetio žutog ulja (71% od teorije).

c) 3-[2-(terc-Butiloksikarbonil)etil]glutakonaldehid-dianilid-hidrobromid

Rastvor od 10 g (48 mmol) 3-piridin-4-il-propionska kiselina-etrc-butil estra u

150 mL dietil etra se smeša sa 8.9 g (96 mmol) anilina i onda smeša na 0°C sa rastvorom od 5.4 g (48 mmol) bromocijanogena u 2 mL dietil etra. Nakon 3 sata mešanja na 0°C, proizvodi se crveni čvrsti oblik i vadi filtriranjem, opere sa etrom i osuši u vakuumu.

Prinos: 20.3 g (92% od teorije)

d) Trinatrijum 3,3-dimetil-2-{7-[3,3-dimetil-5-sulfonato-1 -(2-sulfonatoetil)-3H-indolijum-2-il]-4-(2-karboksietil) hepta-2,4,6-trien-1 -ilidene}-1 -(2-sulfonatoetil)-2,3-dihidro-1H-indol-5-sulfonat, unutrašnja so Suspenzija od 1.0 g (2.2 mmol) 3-[2-(terc-butiloksikarbonil)etil]-glutakonaldehid-dianilid-hidrobromida (Primer 1c)) i 1.5 g (4.4 mmol) 1-(2-sulfonatoetil)-2,3,3-trimetil-3H-indolenin-5-sulfokiseline (Primer 1a)) u 20 mL anhidrida sirćetne kiseline i 5 mL sirćetne kiseline se smeša sa 0.75 g (9.1 mmol) natrijumacetata i meša se 1 sat na 120°C. Nakon hlađenja, smeša se sa dietil etrom, nataloženi čvrsti oblik se vadi filtriranjem i prečisti hromatografijom (RP-C18-silika gel, mobilni rastvarač voda/metanol) i proizvod se osuši zamrzavanjem (0.5 g). Cepanje zaštitne grupe se obavlja mešanjem intermedijarnog proizvoda u 4 mL dihlorometan/1 mL trifluorosirćetnoj kiselini 1 sat. Nakon koncentracije isparavanjem i hromatografskog prečišćavanja (RP-C18-silika gel, mobilni rastvarač voda/metanol), dobija se 0.45 g (23% od teorije) plavog liofilizata.

e) Trinatrijum 3,3-dimetil-2-{7-[3,3-dimetil-5-sulfonato-1 -(2-sulfonatoetil)-3H-indolijum-2-il]-4-(2-{[2-(2,5-diokso-2,5-dihidro-1H-pirol-1-il)etil]karbamoil}etil)hepta-2,4,6-trien-1-iliden}-1-(2-sulfonatoetil)-2,3-dihidro-1H-indol-5-sulfonat, unutrašnja so

0.4 g (0.45 mmol) naslovnog jedinjenja Primera 1d) i 45 mg (0.45 mmol) trietilamina se rastvori u 10 mL dimetilformamida, smeša na 0°C sa 0.15 g (0.45 mmol) TBTU i meša 10 minuta. Onda se doda, rastvor 0.17 g (0.68 mmol) N-(2-aminoetil)maleimid-trifluoroacetata( Int J Pept Protein Res 1992, 40, 445)i 68 mg (0.68 mmol) trietilamina u 0.5 mL dimetilformamida, i meša se 1 sat na sobnoj temperaturi. Pošto se doda 10 mL dietil etra, čvrsti oblik se izvlači centrifugiranjem, osuši i prečisti sredstvima hromatografije (RP C-18 silika gel, gradient metanol/voda). Prinos: 0.30 g plavog liofilizata (65% od teorije).

Elementarna analiza: Cld.: C 47.24 H 4.26 N 5.51 S 12.61 Na 6.78

Fnd.: C 47.74 H 4.47 N 5.40 S 11.99 Na 7.02

Primer 2: Trinatrijum 3,3-dimetil-2-{7-[3,3-dimetil-5-sulfonato-1-(2-sulfonatoetil)-3H-indolijum-2-il]-4-(2-{[6-(2,5-diokso-2,5-dihidro-1H-pirol-1 -il)heksil]karbamoil}etil)hepta-2,4,6-trien-1 -iliden}-1 -(2-sulfonatoetil)-2,3-dihidro-1H-indol-5-sulfonat, unutrašnja so (Formula III)

Sinteza se obavlja analogno Primeru 1e) iz 0.4 g (0.45 mmol) naslovnog jedinjenja Primera 1d) i 0.21 g (0.68 mmol) N-(6-aminoheksil)maleimide-trifluoroacetata( Int J Pept Protein Res 1992, 40, 445).Prinos: 0.38 g plavog liofilizata

(81% od teorije).

Elementarna analiza: Cld.: C 49.25 H 4.79 N 5.22 S 11.95 Na 6.43

Fnd.: C 48.96 H 4.92 N 5.32 S 11.88 Na 6.56

Primer 3: Trinatrijum 3,3-dimetil-2-{7-[3,3-dimetil-5-sulfonato-1-(2-sulfonatoetil)-3H-indolijum-2-il]-4-(2-{[13-(2,5-diokso-2,5-dihidro-1H-pirol-1-il)-4,7,10-trioksatridecil]karbamoil}etil)hepta-2,4,6-trien-1 -iliden}-1-(2-sulfonatoetil)-2,3-dihidro-1H-indol-5-sulfonat, unutrašnja so (Formula IV)

Sinteza se obavlja analogno Primeru 1e) iz 0.4 g (0.45 mmol) naslovnog jedinjenja Primera 1d) i 0.28 g (0.68 mmol) N-(13-amino-4,7,10-trioksatridecil)maleimid-trifluoroacetata( Int J Pept Protein Res 1992, 40, 445).Prinos: 0.27 g plavog liofilizata (51% od teorije).

Elementarna analiza: Cld.: C 48.97 H 5.05 N 4.76 S 10.89 Na 5.86

Fnd.: C 49.22 H 5.16 N4.62 S 10.67 Na 5.66

Primer 4: Trinatrijum 3,3-dimetil-2-{7-[3,3-dimetil-5-sulfonato-1-(2-sulfonatoetil)-3H-indolijum-2-il]-4-(4-{[2-(2,5-diokso-2,5-dihidro-1H-pirol-1 -il)etil]karbamoil}-butil)hepta-2,4,6-trien-1 -ilidene}-1 -(2-sulfonatoetil)-2,3-dihidro-1H-indol-5-sulfonat, unutrašnja so (FormulaV)

a) (3-ferc-Butoksikarbonil-propil)-trifenil-fosfonijum bromid

50 g (0.30 mol) 4-bromobuterne kiseline se smeša kap po kap u 400 mL THF

na -40°C sa 187 g (0.89 mol) anhidrida trifluorosirćetne kiseline. Nakon 30 minuta mešanja na -^40°C, dodaje se 400 mL terc-butanol/30 mL THF u kapima tokom 1 sata. Nakon 16 sati mešanja na sobnoj temperaturi, the reakciona smeša se sipa na ledeno hladni rastvor natrijum karbonata, vodena faza se ekstrakuje tri puta sa dietil etrom, i organske faze se osuše na natrijumsulfatu i koncentrišu isparavanjem. Ostatak se destilira u vakuumu (tačka ključanja 72°C/0.9 mbar; prinos: 41 g). Reakcija da se formira fosfonijum so se obavlja putem refluks-zagrevanja 41 g (0.18 mol) intermedijarnog proizvoda, 44.6 g (0.17 mol) trifenilfosfina i 32.5 g (0.36 mol) natrijum bikarbonata u 250 mL acetonitrila 20 sati. Reakciona smeša se filtrira, koncentriše isparavanjem, i ostatak se dovede do kristalizacije

mešanjem sa dietil etrom. Prinos: 58.5 g (40% od teorije, prema 4-bromobuternoj kiselini) belog čvrstog oblika.

b) 5-Piridin-4-il-valerijanska kise!ina-t-butil estar

Rastvor 14 g (28 mmol) (3-terc-butoksikarbonil-propil)-trifenil-fosfonijum

bromida (Primer 4a)) u 100 mL anhidrovanog THF se smeša na -40°C u okruženju bez vazduha tokom 20 minuta sa 17.5 mL (28 mmol) butillitijum (1.6 M u heksanu) i meša se 1 sat na -40°C. Rastvor 2.78 g (26 mmol) 4-piridinekarbaldehida u 20 mL THF se dodaje u kapima i meša 16 sati na sobnoj temperaturi, onda sipa u ledenu vodu, vodena faza se ekstrakuje tri puta sa dietil etrom, i organske faze se osuše na natrijumsulfatu i koncentrišu isparavanjem. Nakon hromatografskog prečišćavanja (silika gel, mobilni rastvarač heksan/etilacetat), Dobija se proizvod kao E,Z-smeša (4:1 posle 1H-NMR; 5.0 g). Da se hidrogenuje dvoguba veza, intermedijarni proizvod se rastvori u 200 mL metanola i meša sa 100 mg Pt02katalizatorom na sobnoj temperaturi preko vodonika. Nakon filtriranja i koncentracije isparavanjem, dobija se žuto ulje. Prinos: 4.9 g (74% od teorije).

c) 3-[4-(terc-Butiloksikarbonil)butil]glutakonaldehid-dianilid-hidrobromid Rastvor 4.0 g (17 mmol) 5-piridin-4-il-valerijanska kiselina-t-butilestra u 35 mL

dietiletra se smeša sa 3.2 g (34 mmol) anilina i onda na 0°C sa rastvorom 1.9 g (17 mmol) bromocijanogenom u 8 mL dietil etra. Nakon 3 sata mešanja na 0°C, izvlači se filtriranjem crveni čvrsti oblik, opere sa etrom i osuši u vakuumu. Prinos: 7.8 g (95% od teorije).

d) Trinatrijum 3,3-dimetil-2-{7-[3,3-dimetil-5-sulfonato-1 -(2-sulfonatoetil)-3H-indolijum-2-il]-4-(4-karboksibutil)hepta-2,4,6-trien-1-ilidene}-1-(2-sulfonatoetil)-2,3-dihidro-1H-indol-5-sulfonat, unutrašnja so

Sinteza se obavlja analogno Primeru 1d) iz naslovnog jedinjenje Primera 4c)

(2.5 mmol) i 1-(2-sulfonatoetil)-2,3,3-trimetil-3H-indolenin-5-sulfokiselina (5 mmol). Prinos: 0.85 g (37% od teorije) plavog liofilizata.

e) Trinatrijum 3,3-dimetil-2-{7-[3,3-dimetil-5-sulfonato-1-(2-sulfonatoetil)-3H-indolijum-2-il]-4-(4-{[2-(2,5-diokso-2,5-dihidro-1H-pirol-1-il)etil]karbamoil}-butil)hepta-2,4,6-trien-1-ilidene}-1-(2-sulfonatoetil)-2,3-dihidro-1H-indol-5-sulfonat, unutrašnja so

Sinteza se obavlja analogno Primeru 1e) iz 0.4 g (0.43 mmol) naslovnog jedinjenja Primera 4d). Prinos: 0.31 g (69% od teorije) plavog liofilizata.

Elementarna analiza: Cld.: C 48.27 H 4.53 N 5.36 S 12.27 Na 6.60

Fnd.: C 48.01 H 4.44 N 5.56 S 12.10 Na 6.81

Primer 5: Trinatrijum 3,3-dimetil-2-{7-[3,3-dimetil-5-sulfonato-1-(2-sulfonatoetil)-3H-indolijum-2-il]-4-(4-{[6-(2,5-diokso-2,5-dihidro-1H-pirol-1-il)heksil]karbamoil}butil)hepta-2,4,6-trien-1-iliden}-1-(2-sulfonatoetil)-2,3-dihidro-1H-indol-5-sulfonat, unutrašnja so (Formula VI)

Sinteza se obavlja analogno Primeru 1e) iz 0.4 g (0.43 mmol) naslovnog jedinjenja Primera 4d) i 0.20 g (0.66 mmol) N-(6-aminoheksil)maleimid-trifluoroacetata. Prinos: 0.35 g plavog liofilizata (74% od teorije).

Elementarna analiza: Cld.: C 50.17 H 5.03 N 5.09 S 11.65 Na 6.26

Fnd.: C 49.83 H 4.89 N 5.34 S 12.05 Na 6.42

Primer 6: Trinatrijum 3,3-dimetil-2-{7-[3,3-dimetil-5-sulfonato-1-(2-sulfonatoetil)-3H-indolijum-2-il]-4-(4-{[13-(2,5-diokso-2,5-dihidro-1H-pirol-1-il)-4,7,10-trioksaatridecil]karbamoil}butil)hepta-2,4,6-trien-1-iliden}-1-(2-sulfonatoetil)-2,3-dihidro-1H-indol-5-sulfonat, unutrašnja so (Formula VII)

Sinteza se obavlja analogno Primeru 1e) iz 0.4 g (0.43 mmol) naslovnog jedinjenja Primera 1d) i 0.30 g (0.72 mmol) N-(13-amino-4,7,10-trioksatridecil)maleimid-trifluoracetata. Prinos: 0.27 g plavog liofilizata (52% od teorije).

Elementarna analiza: Cld.: C 49.83 H 5.27 N 4.65 S 10.64 Na 5.72

Fnd.: C 49.45 H 5.19 N 4.66 S 10.85 Na 5.80

Primer 7: Trinatrijum 3,3-dimetil-2-{7-[3,3-dimetil-5-sulfonato-1-(2-sulfonatoetil)-3H-indolijum-2-il]-4-(6-{[2-(2,5-diokso-2,5-dihidro-1H-pirol-1 -il)etil]karbamoil}heksil)hepta-2,4,6-trien-1 -iliden}-1 -(2-sulfonatoetil)-2,3-dihidro-1H-indol-5-sulfonat, unutrašnja so (Formula VIII)

a) (3-terc-Butoksikarbonil-penti)-trifenil-fosfonijum bromid Proizvodnja se obavlja kao što je opisano u Primeru 4a), pri čemu

intermedijarni proizvod 6-bromokapronska kiselina-etrc-butil estar reaguje kao sirovi proizvod. Dobija se 79 g proizvoda (69% od teorije) kao viskozno, bezbojno ulje iz 50 g 6-bromokapronske kiseline.

b) 7-Piridin-4-il-enantna kiselina-t-butil estar

Proizvodnja se obavlja kao što je opisano u Primeru 4b). Dobija se 7.5 g 7-piridin-4-il-enantna kiselina-t-butil estar (65% od teorije) is kao žuto ulje iz 25 g (48.7 mmol) (3-terc-butoksikarbonil-pentil)-trifenil-fosfonijum bromida (Primer 7a).

c) 3-[6-(terc-Butiloksikarbonil)heksil]glutakonaldehid-dianilid-hidrobromid

Rastvor 5.0 g (19 mmol) 7-piridin-4-il-enantna kiselina-t-butil estra u 30 mL

dietil etra se smeša sa 3.6 g (38 mmol) anilina i onda na 0°C sa rastvorom 2.1 g (19 mmol) bromocijanogena u 5 mL dietil etra. Nakon 2.5 sata mešanja na 0°C, crveni čvrsti oblik koji se priozvede se izvlači filtriranjem, opere sa etrom i osuši pod vakuumom. Prinos: 8.9 g (91% od teorije).

d) Trinatrijum 3,3-dimetil-2-{7-[3,3-dimetil-5-sulfonato-1-(2-sulfonatoetil)-3H-indolijum-2-il]-4-(6-karboksiheksil)hepta-2,4,6-trien-1-ilidene}-1-(2-sulfonatoetil)-2,3-dihidro-1 H-indol-5-sulfonat, unutrašnja so

Sinteza se obavlja analogno Primeru 1d) iz naslovnog jedinjenja Primera 7c)

(3 mmol) i 1-(2-sulfonatoetil)-2,3,3-trimetil-3H-indolenin-5-sulfokiseline (6 mmol). Prinos: 1.5 g (54% od teorije) plavog liofilizata.

e) Trinatrijum 3,3-dimetil-2-{7-[3,3-dimetil-5-sulfonato-1-(2-sulfonatoetil)-3H-indolijum-2-il]-4-(6-{[2-(2,5-diokso-2,5-dihidro-1H-pirol-1-il)etil]karbamoil}heksil)hepta-2,4,6-trien-1-iliden}-1-(2-sulfonatoetil)-2,3-dihidro-1H-indol-5-sulfonat, unutrašnja so

Sinteza se obavlja analogno Primeru 1e) iz 0.4 g (0.43 mmol) naslovnog jedinjenje Primera 7d). Prinos: 0.31 g (69% od teorije) plavog liofilizata.

Elementarna analiza: Cld.: C 49.25 H 4.79 N 5.22 S 11.95 Na 6.43

Fnd.: C 48.98 H 4.86 N 5.12 S 11.76 Na 6.77

Primer 8: Trinatrijum 3,3-dimetil-2-{7-[3,3-dimetil-5-sulfonato-1-(2-sulfonatoetil)-3H-indolijum-2-il]-4-(6-{[6-(2,5-diokso-2,5-dihidro-1H-pirol-1 -il)heksil]karbamoil}heksil)hepta-2,4,6-trien-1 -iliden}-1 -(2-sulfonatoetil)-2,3-dihidro-1H-indol-5-sulfonat, unutrašnja so (Formula IX)

Sinteza se obavlja analogno Primeru 1e) iz 0.5 g (0.53 mmol) naslovnog jedinjenja Primera 7d) i 0.23 g (0.75 mmol) N-(6-aminoheksil)maleimid-trifluoroacetata. Prinos: 0.42 g plavog liofilizata (70% od teorije).

Elementarna analiza: Cld.: C 51.05 H 5.27 N 4.96 S 11.36 Na 6.11

Fnd.: C 50.74 H 5.55 N 4.76 S 11.38 Na 6.35

Primer 9: Trinatrijum 3,3-dimetil-2-{7-[3,3-dimetil-5-sulfonato-1-(2-sulfonatoetil)-3H-indolijum-2-il]-4-(6-{[13-(2,5-diokso-2,5-dihidro-1H-pirol-1-il)-4,7,10-trioksatridecil]karbamoil}heksil)hepta-2,4,6-trien-1-iliden}-1-(2-sulfonatoetil)-2,3-dihidro-1H-indol-5-sulfonat, unutrašnja so (Formula

X)

Sinteza se obavlja analogno Primeru 1e) iz 0.5 g (0.53 mmol) naslovnog jedinjenja Primera 7d) i 0.44 g (1.06 mmol) N-(13-amino-4,7,10-trioksatridecil)maleimid-trifluoroacetata. Prinos: 0.24 g plavog liofilizata (37% od teorije).

Elementarna analiza: Cld.: C 50.64 H 5.48 N 4.54 S 10.40 Na 5.59

Fnd.:C 50.30 H 5.56 N 4.34 S 10.15 Na 5.73

Primer 10: Trinatrijum 3,3-dimetil-2-{7-[3,3-dimetil-5-sulfonato-1-(2-sulfonatoetil)-3H-indolijum-2-il]-4-(5-{[2-(2,5-diokso-2,5-dihidro-1H-pirol-1-il)etil]karbamoil}-3-oksa-pentil)hepta-2,4,6-trien-1-iliden}-1-(2-sulfonatoetil)-2,3-dihidro-1H-indol-5-sulfonat, unutrašnja so (Formula XI)

a) 3-Oksa-6-(4-Piridinil)kapronska kiselina-etrc-butil estar Rastvor 75 g (0.4 mol) 3-(4-piridinil)-1-propanola u 400 mL toluena/50 mL THF

se smeša sa 10 g tetrabutilamonijum sulfatom i 350 mL 32% rastvora natrijumhidroksida. Onda se dodaje, 123 g (0.68 mol) bromosirćetna kiselina-terc-butil estar u kapima i meša 18 sati na sobnoj temperaturi. Organska faza se odvaja, i vodena faza se ekstrakuje tri puta sa dietil etrom. Kombinovane organske faze se operu sa NaCI rastvorom, osuše na natrijumsulfatu i koncentrišu isparavanjem. Nakon hromatografskog prečišćavanja (silika gel: mobilni rastvarač heksan.etilacetat), dobija se 56 g proizvoda (41% od teorije) kao mrko ulje.

b) 3-[4-Oksa-5-(terc-butiloksikarbonil)pentil]glutakonaldehid-dianilid-hidrobromid

Rastvor 5.0 g (20 mmol) 3-oksa-6-(4-piridinil)kapronska kiselina-etrc-butil estra u 60 mL dietil etra se smeša sa 3.7 g (40 mmol) anilina i onda na 0°C sa rastvorom 2.2 g (20 mmol) bromocijanogena u 8 mL dietil etra. Nakon 1 sata mešanja na 0°C, smeša se 50 mL dietil etra, i crveni čvrsti oblik koji se proizvede se izvlači filtriranjem, opere sa etrom i osuši u vakuumu. Prinos: 8.5 g (85% od teorije) ljubičastog čvrstog oblika. c) Trinatrijum 3,3-dimetil-2-{7-[3,3-dimetil-5-sulfonato-1 -(2-sulfonatoethil)-3H-indolijum-2-il]-4-(6-karboksi-4-oksaheksil)hepta-2,4,6-trien-1-ilidene}-1 -(2-sulfonatoetil)-2,3-dihidro-1 H-indol-5-sulfonat, unutrašnja so A Suspenzija 3.0 g (6 mmol) 3-[2-(ferc-butiloksikarbonil)etil]-glutakonaldehid-dianilid-hidrobromida (Primer 10b)) i 4.2 g (12 mmol) 1-(2-sulfonatoetil)-2,3,3-trimetil-3H-indolenin-5-sulfokiseline (Primer 1a)) u 50 mL anhidrida sirćetne kiseline i 10 mL sirćetne kiseline se smeša sa 2.5 g (30 mmol) natrijumacetata i meša se 50 minuta na 120°C. Nakon hlađenja, smeša se sa dietil etrom, čvrsti talog se izvlači filtriranjem, absorbciono nataložen u acetonu i osuši se pod visokom vakuumom. Nakon hromatografskog prečišćavanja (RP-C18-silika gel, mobilni rastvarač voda/metanol), uklanjanja metanola u vakuumu i sušenja zamrzavanjem, odmah se dobije naslovno jedinjenje. Prinos: 2.3 g (41% od teorije) plavog liofilizata. d) Trinatrijum 3,3-dimetil-2-{7-[3,3-dimetil-5-sulfonato-1 -(2-sulfonatoetil)-3H-indolijum-2-il]-4-(5-{[2-(2,5-diokso-2,5-dihidro-1H-pirol-1-il)etil]karbamoil}-3-oksa-pentil)hepta-2,4,6-trien-1-ilidene}-1-(2-sulfonatoetil)-2,3-dihidro-1H-indol-5-sulfonat, unutrašnja so

Sinteza se obavlja analogno Primeru 1c) iz 1.0 g (1.1 mmol) naslovnog jedinjenja Primera 10c). Prinos: 0.85 g (73% od teorije) plavog liofilizata.

Elementarna analiza: Cld.: C 47.54 H 4.46 N 5.28 S 12.09 Na 6.50

Fnd.:C 47.97 H 4.65 N 5.10 S 12.02 Na 6.68

Primer 11: Trinatrijum 3,3-dimetil-2-{7-[3,3-dimetil-5-sulfonato-1-(2-sulfonatoetil)-3H-indolijum-2-il]-4-(5-{[6-(2,5-diokso-2,5-dihidro-1H-pirol-1 -il)heksil]karbamoil}-3-oksa-pentil)hepta-2,4,6-trien-1 -ilidene}-1 -(2-sulfonatoetil)-2,3-dihidro-1H-indol-5-sulfonat, unutrašnja so (Formula XII)

Sinteza se obavlja analogno Primeru 1e) iz 0.5 g (0.55 mmol) naslovnog jedinjenje Primera 10c) i 0.23 g (0.75 mmol) N-(6-aminoheksil)maleimid-trifluoroacetata. Prinos: 0.42 g plavog liofilizata (68% od teorije).

Elementarna analiza: Cld.: C 49.46 H 4.96 N 5.01 S 11.48 Na 6.17

Fnd.: C 48.95 H 5.21 N 5.22 S 11.23 Na 6.60

Primer 12: Trinatrijum 3,3-dimetil-2-{7-[3,3-dimetil-5-sulfonato-1-(2-sulfonatoetil)-3H-indolijum-2-il]-4-(5-{[13-(2,5-diokso-2,5-dihidro-1H-pirol-1 -il)-4,7,10-trioksatridecil]karbamoil}-4-oksapentil)hepta-2,4,6-trien-1 - ilidene}-1 -(2-sulfonatoetil)-2,3-dihidro-1 H-indol-5-sulfonat, unutrašnja so

(Formula XIII)

Sinteza se obavlja analogno Primeru 1e) iz 0.5 g (0.55 mmol) naslovnog jedinjenje Primera 10c) i 0.46 g (1.06 mmol) N-(13-amino-4,7,10-trioksatridecil)maleimid-trifluoroacetata. Prinos: 0.34 g plavog liofilizata (56% od teorije).

Elementarna analiza: Cld.: C 49.17 H 5.20 N 4.59 S 10.50 Na 5.65

Fnd.: C 49.34 H 5.32 N 4.45 S 10.28 Na 5.56

Primer 13: Trinatrijum 3,3-dimetil-2-[2-(1-{[3,3-dimetil-5-sulfonato-1-(2-sulfonatoetil)-3H-indolijum-2-il]vinilen}-2-[4-(2-{[2-(2,5-diokso-2,5-dihidro-1H-pirol-1- il)etil]karbamoil}etil)-phenoksi]cikIoheks-1-en-3-iliden)etiliden]-1-(2-sulfonatoetil)-2,3-dihidro-1H-indol-5-sulfonat,

unutrašnja so (Formula XIV)

a) Trinatrijum 3,3-dimetil-2-[2-(1 -{[3,3-dimetil-5-sulfonato-1 -(2-sulfonatoetil)-3H-indolijum-2-il]vinilen}-2-hloro-cikloheks-1-en-3-iliden)etiliden]-1-(2-sulfonatoetil)-2,3-dihidro-1 H-indol-5-sulfonat,

unutrašnja so

5.0 g (14.4 mmol) 1-(2-sulfonatoetil)-2,3,3-trimetil-3H-indolenin-5-sulfokiseline (Primer 1a)) i 2.6 g (7.2 mmol) N-[(3-(anilinometilene)-2-hloro-1-cikloheksen-1-il)metilen]anilin hidrohlorida( Aldrich Company)se refluksuju zajedno sa 2.5 g (30 mmol) anhidrovanog natrij u m-acetata u 100 mL metanola 1 sat, ohlade, smešaju sa 150 mL dietil etra i meša preko noći. Talog se vadi isisavanjem, osuši i prečisti hromatografijom (silika gel, gradient: dihlorometan/metanol). Prinos: 3.8 g (58% od teorije) plavog čvrstog oblika.

b) Trinatrijum 3,3-dimetil-2-[2-(1-{[3,3-dimetil-5-sulfonato-1-(2-sulfonatoetil)-3H-indolijum-2-il]vinilen}-2-[4-(2-karboksietil)fenoksi]cikloheks-1-en-3-iliden)etiliden]-1-(2-sulfonatoetil)-2,3-dihidro-1H-indol-5-sulfonat, unutrašnja so

0.37 g (2.2 mmol) 3-(4-hidroksifenil)propionska kiselina u 30 mL dimetilformamida se smeša sa 0.18 g (4.5 mmol) natrijumhidrida (60% disperzija mineralnog ulja). Nakon 30 minuta mešanja na sobnoj temperaturi, ohladi se do 0°C, dodaje se rastvor 2.0 g (2.2 mmol) naslovnog jedinjenja Primera 12a) u 100 mL dimetilformamida u kapima i meša se 2 sata na sobnoj temperaturi. Smeša se rashladi sa suvim ledom, i rastvarač se uklanja u vakuumu. Ostatak se rastvori u metanolu, meša sa 200 mL etra, i nataloženi čvrsti oblik se izvlači filtriranjem. Obavlja se hromatografsko prečišćavanje (silika gel, gradient: etilacetat/metanol). Prinos: 1.9 g plavog čvrstog oblika (83%o od teorije). c) Trinatrijum 3,3-dimetil-2-[2-(1-{[3,3-dimetil-5-sulfonato-1-(2-sulfonatoetil)-3H-indolijum-2-il]vinilen}-2-[4-(2-{[2-(2,5-diokso-2,5-dihidro-1 H-piroI-1- il)etil]karbamoil}etil)-fenoksi]cikloheks-1-en-3-iliden)ethliden]-1-(2-sulfonatoetil)-2,3-dihidro-1H-indol-5-sulfonat,

unutrašnja so

0.1 mg (0.10 mmol) naslovnog jedinjenje Primera 12b) reaguje kao što je to opisano u Primeru 1e) sa TBTU i N-(2-aminoetil)maleimid-trifluoroacetatom u prisustvu trietilamina, i dobijeni proizvod se prečisti hromatografijom. Prinos: 93 mg plavog liofilizata (81% od teorije).

Elementarna analiza: Cld.: C51.21 H 4.47 N 4.88 S 11.16 Na 6.00

Fnd.: C 51 50 H 4.55 N 4.95 S 10.93 Na 6.15

Primer 14: Trinatrijum 3,3-dimetil-2-[2-(1-{[3,3-dimetil-5-sulfonato-1-(2-sulfonatoetil)-3H-indolijum-2-il]vinilen}-2-[4-(2-{[6-(2,5-diokso-2,5-dihidro-1 H-pirol-1 - il)heksil]karbamoil}etil)-fenoksi]cikloheks-1 -en-3-iliden)etiliden]-1-(2-sulfonatoetil)-2,3-dihidro-1H-indol-5-sulfonat,

unutrašnja so (Formula XV)

Sinteza se obavlja analogno prema Primeru 1e) iz 0.7 g (0.68 mmol) naslovnog jedinjenja Primera 14a) i 0.53 g (1.22 mmol) N-(13-amino-4,7,10-trioksatridecil)maleimid-trifluoracetata. Prinos: 0.56 g plavog liofilizata (68% od teorije).

Elementarna analiza: Cld.: C 48.27 H 4.53 N 5.36 S 12.27 Na 6.60

Fnd.: C 48.01 H 4.44 N 5.56 S 12.10 Na 6.81

Primer 15: Trinatrijum 3,3-dimetil-2-[2-(1-{[3,3-dimetil-5-sulfonato-1-(2-sulfonatoetil)-3H-indolijum-2-il]vinilen}-2-[4-(2-{[13-(2,5-diokso-2,5-dihidro-1H-pirol-1- il)-4,7,10-trioksatridecil]karbamoil}etil)fenoksi]cikloheks-1-en-3-ilidene)etiliden]-1-(2-sulfonatoetil)-2,3-dihidro-1H-indol-5-sulfonat, unutrašnja so (Formula

XVI)

Sinteza se obavlja analogno Primeru 1e) iz 0.7 g (0.68 mmol) naslovnog jedinjenja Primera 14a) i 0.59 g (1.36 mmol) N-(13-amino-4,7,10-trioksatridecil)maleimid-trifluoroacetata. Obavljaju se dva hromatografska prečišćavanja. Prinos: 0.67 g plavog liofilizata (75% od teorije).

Elementarna analiza: Cld.: C 52.29 H 5.16 N 4.28 S 9.79 Na 5.27

Fnd.: C 51.88 H 5.40 N 4.34 S 9.53 Na 5.68

Primer 16: Trinatrijum 3,3-dimetil-2-[2-(1-{[3,3-dimetil-5-sulfonato-1-(2-sulfonatoetil)-3H-indolijum-2-il]vinilen}-2-[4-(2-{[2-(2,5-diokso-2,5-dihidro-1 H-pirol-1 - il)etil]karbamoil}etil)-fenoksi]-5-ferc-butil-cikloheks-1 -en-3-iliden)etiliden]-1-(2-sulfonatoetil)-2,3-dihidro-1H-indol-5-sulfonat,

unutrašnja so (Formula XVII)

a) N-[(3-(Anilinometilen)-2-hloro-5-terc-butil-1-cikloheksen-1-il)metilen]anilin hidrohlorid 6.7 mL (73.4 mmol) of fosforoksihlorida se dodaje u kapima na 0°C u 8 mL dimetilformamida. Onda se dodaje u kapima, rastvor 5.0 g (32.4 mmol) 4-terc-butilcikloheksanona u 30 mL dihlorometana, i reakciona smeša se meša pod refluksom 3 sata. Nakon hlađenja do 0°C, polako se dodaje u kapima 6 g (64.8 mmol) anilina u 5.5 mL etanola, smeša se sipa na 200 g leda, i dodaje se tokom mešanja 5 mL koncentrisane hlorovodonične kiseline. Čvrsti talog se izvlači filtriranjem, opere sa etrom i osuši. Prinos: 6.8 g (50% od teorije) kao crveni čvrsti oblik. b) Trinatrijum 3,3-dimetil-2-[2-(1-{[3,3-dimetil-5-sulfonato-1-(2-sulfonatoetil)-3H-indolijum-2-il]vinilen}-2-hloro-5-ferc-butilcikloheks-1-en-3-iliden)etiliden]-1-(2-sulfonatoetil)-2,3-dihidro-1H-indol-5-sulfonat,

unutrašnja so

5.0 g (14.4 mmol) 1-(2-sulfonatoetil)-2,3,3-trimetil-3H-indolenin-5-sulfokiselina (Primer 1a)) i 3.0 g (7.2 mmol) N-[(3-(anilinometilene)-2-hloro-5-rerc-butil-1-cikloheksen-1-il)metilen]anilin hidrohloride (Primer 16a)) se refluksuju zajedno sa 2.5 g (30 mmol) anhidrovanog natrij u m-acetata u 100 mL metanola 1.5 sati, ohladi, smeša sa 200 mL dietil etra i meša se preko noći. Talog se izvlači isisavanjem, osuši i prečisti hromatografijom (silika gel, gradient: dihlorometan/metanol). Prinos: 4.7 g (68% od teorije) kao plavi čvrsti oblik.

c) Trinatrijum 3,3-dimetil-2-[2-(1-{[3,3-dimetil-5-sulfonato-1-(2-sulfonatoetil)-3H-indolijum-2-il]vinilen}-2-[4-(2-karboksietil)fenoksi]-5-rerc-butilcikloheks-1-en-3-iliden)etiliden]-1 -(2-sulfonatoetil)-2,3-dihidro-1H-indol-5-sulfonat, unutrašnja so

Reakcija se obavlja od 2.0 g (2.1 mmol) naslovnog jedinjenje Primera 16b) kao što je opisano u Primeru 13b). Prinos: 1.5 g (66% od teorije). d) Trinatrijum 3,3-dimetil-2-[2-(1-{[3,3-dimetil-5-sulfonato-1-(2-sulfonatoetil)-3H-indolijum-2-il]vinilen}-2-[4-(2-{[2-(2,5-diokso-2,5-dihidro-1 H-pirol-1 - il)etil]karbamoil}etil)-fenoksi]-5-terc-butil-cikloheks-1 - en-3-iliden)etiliden]-1-(2-sulfonatoetil)-2,3-dihidro-1H-indol-5-sulfonat,

unutrašnja so

Reakcija se obavlja iz 1.0 g (0.92 mmol) naslovnog jedinjenja Primera 16c) kao što je opisano u Primeru 13c). Prečišćavanje hromatografijom se obavlja dva puta sa RP C-18 silika gelom (mobilni rastvarač: acetonitril/voda). Prinos: 0.24 g (22% od teorije).

Elementarna analiza: Cld.: C 52.82 H 4.93 N 4.65 S 10.64 Na 5.72

Fnd.: C 52.23 H 5.20 N 4.31 S 10.30 Na 6.15

Primeri 17 - 19: Sinteza indotrikarbocijanin boja sa bromoacetilamid

grupama

Primer 17: Trinatrijum 3,3-dimetil-2-{7-[3,3-dimetil-5-sulfonato-1-(2-sulfonatoetil)-3H-indolijum-2-il]-4-(5-{[6-(bromoacetilamino)heksil]karbamoil}-4-oksapentil)hepta-2,4,6-trien-1-

iliden}-1 -(2-suIfonatoetil)-2,3-dihidro-1 H-indol-5-sulfonat, unutrašnja so

(Formula XIX)

a) Trinatrijum 3,3-dimetil-2-{7-[3,3-dimetil-5-sulfonato-1 -(2-sulfonatoetil)-3H-indolijum-2-il]-4-(5-{(6-aminoheksil)karbamoil}-4-oksapentil)hepta-2,4,6-trien-1-iliden}-1-(2-sulfonatoetil)-2,3-dihidro-1H-indol-5-sulfonat,

unutrašnja so

Sinteza se obavlja analogno Primeru 1e) iz 0.5 g (0.55 mmol) naslovnog jedinjenja Primera 10c) i 0.15 g (0.70 mmol) N-boc-heksanediamin( Fluka).Proizvod reakcije se prečisti hromatografijom (RP C18-hromatografija, gradient: metanol/voda) i nakon sušenja smrzavanjem, meša se u 2 mL trifluorosirćetna kiselina/8 mL dihlorometana 15 minuta dok se hladi na ledu. Nakon centrifugiranja, ostatak se rastvara u metanolu, nataložen sa dietil etrom i izolovan. Prinos: 0.26 g plavog čvrstog oblika (41% od teorije) .

b) Trinatrijum 3,3-dimetil-2-{7-[3,3-dimetil-5-sulfonato-1 -(2-sulfonatoetil)-3H-indolijum-2-il]-4-(5-{[6-(bromoacetilamino)heksil]karbamoil}-4-oksapentil)hepta-2,4,6-trien-1-ilidene}-1-(2-sulfonatoetil)-2,3-dihidro-1H-indol-5-sulfonat, unutrašnja so

0.26 g (0.23 mmol) naslovnog jedinjenja Primera 18a) se ohladi u 5 mL dimetilformamida do -20°C, smeša sa 28 mg (0.28 mmol) trietilamina i rastvorom 0.10 g (0.46 mmol) bromoacetil bromida u 0.2 mL dimetilformamida. Nakon 5 sati mešanja na maksimum 0°C, proizvod se taloži dodavanjem dietil etra i dobija se ponovljenim taloženjem iz dimetilformamid/dietil etar i potonjim sušenjem. Prinos: 0.23 g (86% od teorije) plavog čvrstog oblika.

Elementarna analiza: Cld.: C 45.63 H 4.87 N 4.84 S 11.07 Na 5.96

Fnd.: C 45.13 H 4.66 N 4.67 S 10.83 Na nije utvrđ

Primer 18: Trinatrijum 3,3-dimetil-2-{7-[3,3-dimetil-5-sulfonato-1-(2-sulfonatoetil)-3H-indolijum-2-il]-4-(3-{[3-(bromoacetilamino)propil]karbamoil}-etil)hepta-2,4,6-trien-1-ilidene}-1-(2-sulfonatoetil)-2,3-dihidro-1H-indol-5-sulfonat, unutrašnja so (Formula

XVIII)

Sinteza se obavlja započinjanjem iz naslovnog jedinjenja Primera 1d) (0.5 g; 0.56 mmol) i N-boc-propilenediamina analogno primeru 17. Prinos za vreme svih koraka: 0.22 g (37% od teorije).

Elementarna analiza: Cld.: C 43.70 H 4.33 N 5.23 S 11.96 Na 6.43

Fnd.: C 43.21 H4.14 N 5.53 S 10.89 Na nije utvrđ

Primer 19: Trinatrijum 3,3-dimetil-2-[2-(1-{[3,3-dimetil-5-sulfonato-1-(2-sulfonatoetil)-3H-indolijum-2-il]vinilen}-2-[4-(2-{[3-(bromoacetilamino)propil]karbamoil}etil)-fenoksi]cikloheks-1-en-3-iliden)etiliden]-1-(2-sulfonatoetil)-2,3-dihidro-1H-indol-5-sulfonat, unutrašnja so (Formula XX)

Sinteza se obavlja započinjanjem iz naslovnog jedinjenje Primera 13b) (0.5 g; 0.49 mmol) i N-boc-propilenediamina analogno Primeru 17. Prinos za vreme svih koraka: 0.31 g (53% od teorije).

Elementarna analiza: Cld.: C 47.88 H 4.52 N 4.65 S 10.65 Na 5.73

Fnd.: C 48.04 H 4.43 N 4.69 S 10.72 Na 5.84

Primeri20-23: Sinteza konjugata sa biomolekulima i fotofizičkom karakterizacijom konjugata

Primer 20: Označavanje BSA (volovski serum albumin) sa naslovnim jedinjenjima Primera 1-16

Opšte instrukcije: Rastvor 5 mg (0.074 umol) BSA( Sigma Company)u 5 mL puferu fosfata (0.1 M Na2HP04/NaH2P04, pH 6.8) se smeša u svakom slučaju sa 0.74 umol naslovnih jedinjenja Primera 1-16 (stok rastvora od 0.5 mg/mL u PBS) i inkubira 30 minuta na 25°C. Prečišćavanje konjugata se obavlja sredstvima gel hromatografije (kolona: Sephadex G50, prečnik 1.5 cm, Pharmacia, eluant: PBS).

Primer 21: Označavanje BSA sa naslovnim jedinjenjima Primera 17-19

Opšte instrukcije: Rastvor 5 mg (0.074 umol) BSA( Sigma Company)u 5 mL puferu fosfata (0.1 M borat pufer, pH 8.5) se smeša u svakom slučaju sa 1.10Mmol naslovnih jedinjenja Primera 17-19 (stok rastvori od 0.5 mg/mL u PBS) i inkubira 5 sati na 25°C. Prečišćavanje konjugata se obavlja sredstvima gel hromatografije (kolona: Sephadex G50, prečnik 1.5 cm, Pharmacia, eluant:

PBS).

Primer 22: Označavanje anti-ED-B-fibronektin scFv antitela AP39 (fragment jediničnog lanca) sa naslovnim jedinjenjima Primera 1-16

AP39 je scFv sa C-krajnjim cisteinom i prisutan je kao kovalentni S-S-dimer molarne mase od oko 56,000 g/mol (Curr Opin Drug Discov Devel. 2002 Mar; 5(2): 204-13). Redukcijom disulfidnih mostova, proizvode se dva monomera sa SH grupama kojima se može prići (molarna masa 28,000 g/mol).

Opšte instrukcije: 0.3 mL rastvora AP39 u PBS (konc. 0.93 mg dimer/ml)

se smeša sa 60 ul rastvora tris(karboksietil)fosfina (TCEP) u PBS (2.8 mg/ml) i inkubira pod azotom 1 sat na 25°C. Višak TCEP se odvaja sredstvima gel filtriranja na NAP-5 koloni (eluant: PBS). Dobijena količina AP39-monomera (OD28onm- 1-4), određena sredstvima fotometrije, je 230-250 ug (zapremine 0.5 - 0.6 mL). Rastvor se smeša sa 0.03 umol naslovnih jedinjenja Primera 1-16 (stok rastvori od 0.5 mg/mL u PBS) i inkubira 30 minuta na 25°C. Konjugat se prečisti gel hromatografijom na NAP-5 koloni (eluant: PBS/10% glicerin). Imuna reaktivnost rastvora konjugata se utvrđuje sredstvima hromatografije afiniteta (ED-B-fibronektin smola)( J Immunol Meth 1999, 231, 239).Dobijena imuna reaktivnost konjugata je >80% (AP39 pre konjugacije >95%).

Primer 23: Označavanje anti-ED-B-fibronektin scFv antitela AP39 (fragment jediničnog lanca) sa naslovnim jedinjenjima Primera 17-19

Opšte instrukcije: 0.3 mL rastvora od AP39 u PBS (konc. 0.93 mg dimer/mL) se smeša sa 60 uL rastvora tris(karboksietil)fosfina (TCEP) u PBS (2.8 mg/mL) i inkubira pod azotom 1 sat na 25°C. Višak TCEP se odvaja sredstvima gel filtriranja na NAP-5 koloni (eluant: 50 mmol borat pufera pH 8.5). Količina AP39-monomera (OD28onm= 1-4) koja se dobija, utvrđena sredstvima fotometrije, je 230 - 250 ug (zapremine 0.5 - 0.6 mL). Rastvor se smeša sa 0.06 umol naslovnim jedinjenjima Primera 17-19 (stok rastvori od 0.5 mg/mL u PBS) i inkubira 4 sata na 25°C. Konjugat se prečisti gel hromatografijom na NAP-5 koloni (eluant: PBS/10% glicerin). Imuna reaktivnost rastvora konjugata se utvrđuje sredstvima hromatografije afiniteta (ED-B-fibronektin smola)(J Immunol Meth 1999, 231, 239).Dobijene imune reaktivnosti su >75% (AP39 pre konjugacije >95%).

Fotofizička karakterizacija Boja-BSA-Konjugata Primera 21 i 22 i Boja-

scFv Antitelo konjugata Primera 23i 24.

Stepen koncentracije (boja/antitelo molarni odnos) se utvrđuje fotometrijom i zasniva se na koeficijentu ekstinkcije od 75000 L mol"<1>cm"<1>u ramenu apsorpcije kratkog talasa (oko 690 - 710 nm); apsorpcija antitela (AP39) se utvrđuje sa OD280nmod 1.4; i/ili se apsorpcija proteina (BSA) utvrđuje sa OD277nmod 0.58. Prinos kvantuma fluorescencije se utvrđuje sa SPEX fluorologom (senzitivnost zavisna od talasne dužine kalibrira se lampom i detektorom) u odnosu na Indocijanin zeleno (Q = 0.13 u DMSO,J Chem Eng

Data 1977, 22, 379, Bioconjugate Chem 2001, 12, 44).

Primer24:

Osobine konjugata za snimanje prema pronalasku se ispitiujuin vivonakon ubrizgavanja miševima bez dlake koji nose tumor. U ovu svrhu, konjugati se daju intravenozno, i posmatra se koncentracija u regionu tumora tokom perioda od 0 do 24 sata. Fluorescencija supstanci se izazove zračenjem oblasti kod životinja sa svetlošću bliskoj infracrvenog sa 740 nm talasnom dužinom, koja se proizvodi sa laser diodom (0,5 W izlaz). Fluorescentno zračenje se detektuje intenziviranom CCD kamerom, i fluorescentni snimci se digitalno sačuvaju.In- vivoefikasnost konjugata boje je opisana na Slici 2 na osnovu primera.

Bez daljeg elaboriranja,, veruje se da stručnjak i ove oblasti nauke može, upotrebom prethodnog opisa, iskoristiti sadašnjii pronalazak do krajnjih granica. Sledeće pretpostavljene specifične realizacije se imaju, prema tome, smatrati samo ilustrativnim, a ne ograničavajućim na bilo koji način za ostatak otkrića.

U prethodnim i primerima koji slede, sve temperature su postavljene nekorigovane u stepenima Celzijusa, a svi delovi i procenti su maseni, osim ukoliko drugačije nije naznačeno.

Celokupna otkrića svih prijava, patenata i objava, koja su ovde navedena su ovde inkorporisana putem reference.

Prethodni primeri se mogu ponoviti sa sličnim uspehom zamenom generički ili specifično opisanih reaktanata i/ili uslova rada ovog pronalaska sa onima koji su upotrebljavani u prethodnim primerima.

Iz prethodnog opisa, stručnjak iz ove oblasti nauke može lako da utvrdi osnovne karakteristike ovog pronalaska i da, bez napuštanja njegovog duha i obima, može učiniti različite promene i modifikacije pronalaska da ga adaptira za različite upotrebe i uslove.

Claims (34)

1. Indotrikarbocijanin boja opšte formule (I), naznačena time,što X je O, S ili C koji je supstituisan na dva mesta, pri čemu supstituenti mogu biti odabrani od metila, etila, propila, izopropila i/ili butila, Y je CH2-CH2 ili CH2-CH2-CH2, Z je Ctdo C5alkil, pri čemu su C atomi opciono supstituisani sa O ili S, ili je R1do R4, nezavisno jedan od drugog , su S03H ili H, pod uslovom da su bar tri od Rtdo R4S03H, R5je -CO-NH-R8-R9, -NH-CS-NH-R8-R9ili -NH-CO-R8-R9, u kojem je R8odabran od grupe koja sadrži neračvasti C2-C13alkil, u kojem su C atomi opciono zamenjeni sa O ili S, i R9je odabran od ili hloroacetil, bromoacetil, jodoacetil, hloroacetamido, jodoacetamido, hloroalkil, bromoalkil, jodoalkil, piridil disulfid i vinil sulfonamid, i u kome su R6i R7CH ili su povezani sa C3-alkil za heksil prsten, koji opciono može biti supstituisan u para-poziciji sa C-t do C4-alkil radikalom, i soli i solvati ovog jedinjenja.

2. Indotrikarbocijanin boja prema zahtevu 1,naznačena time,što Y je CH2-CH2, Z je C-i do C5alkil, pri čemu su C atomi opciono supstituisani sa O ili S, i u kojoj su R6i R7CH, i soli i solvati ovog jedinjenja.

3. Indotrikarbocijanin boja prema zahtevu 1 ili 2,naznačena time,što Z je CrC5 alkil.

4. Indotrikarbocijanin boja prema zahtevu 1 ili 2,naznačena time,što i R6i R7su povezani za heksil prsten preko C3-alkil.

5. Indotrikarbocijanin boja prema bilo kom od zahteva 1 do 4,naznačena time,što R5je COOH ili NH2.

6. Indotrikarbocijanin boja prema zahtevu 3,naznačena time,što se sastoji od formule (II) i soli i solvati ovog jedinjenja.

7. Indotrikarbocijanin boja prema zahtevu 3,naznačena time,što se sastoji od formule (III) i soli i solvati ovog jedinjenja.

8. Indotrikarbocijanin boja prema zahtevu 3,naznačena time,što se sastoji od formule (IV) i soli i solvati ovog jedinjenja.

9. Indotrikarbocijanin boja prema zahtevu 3,naznačena time,što se sastoji od formule (V) i soli i solvati ovog jedinjenja.

10. Indotrikarbocijanin boja prema zahtevu 3,naznačena time,što se sastoji od formule (VI) i soli i solvati ovog jedinjenja.

11. Indotrikarbocijanin boja prema zahtevu 3,naznačena time,što se sastoji od formule (VII) i soli i solvati ovog jedinjenja.

12. Indotrikarbocijanin boja prema zahtevu 3,naznačena time,što se sastoji od formule (VIII) i soli i solvati ovog jedinjenja.

13. Indotrikarbocijanin boja prema zahtevu 3,naznačena time,što se sastoji od formule (IX) i soli i solvati ovog jedinjenja.

14. Indotrikarbocijanin boja prema zahtevu 3,naznačena time,što se sastoji od formule (X) i soli i solvati ovog jedinjenja.

15. Indotrikarbocijanin boja prema zahtevu 2,naznačena time,što se sastoji od formule (XI) i soli i solvati ovog jedinjenja.

16. Indotrikarbocijanin boja prema zahtevu 2,naznačena time,što se sastoji od formule (XII) i soli i solvati ovog jedinjenja.

17. Indotrikarbocijanin boja prema zahtevu 2,naznačena time,što se sastoji od formule (XIII) i soli i solvati ovog jedinjenja.

18. Indotrikarbocijanin boja prema zahtevu 4,naznačena time,što se sastoji od formule (XIV) i soli i solvati ovog jedinjenja.

19. Indotrikarbocijanin boja prema zahtevu 4,naznačena time,što se sastoji od formule (XV) i soli i solvati ovog jedinjenja.

20. Indotrikarbocijanin boja prema zahtevu 4,naznačena time,što se sastoji od formule (XVI) i soli i solvati ovog jedinjenja.

21. Indotrikarbocijanin boja prema zahtevu 4,naznačena time,što se sastoji od formule (XVII) i soli i solvati ovog jedinjenja.

22. Indotrikarbocijanin boja prema zahtevu 3,naznačena time,što se sastoji od formule (XVIII) /\ NH /\ O^.NH O r1 <S0>3<H>S03H i soli i solvati ovog jedinjenja.

23 Indotrikarbocijanin boja prema zahtevu 2,naznačena time,što se sastoji od formule (XIX) i soli i solvati ovog jedinjenja.

24. Indotrikarbocijanin boja prema zahtevu 4,naznačena time,što se sastoji od formule (XX) i soli i solvati ovog jedinjenja.

25. Postupak proizvodnje indotrikarbocijanin boje prema jednom od zahteva 1 do 24,naznačen time,što se sastoji od a) Pripremanja jednog ili više 4-substituisanih piridina, b) Pretvaranja jednog ili više 4-substituisanih piridina umezo-substituisane glutakonaldehid-dianilide kao prekursore u cijanin bojama, sredstvima Zincke-Konig reakcije, i c) Dobijana mezo-substituisanog glutakonaldehid-dianilida kao prekursora cijanin boja.

26. Postupak proizvodnje konjugata,naznačen time,što se sastoji od spajanja indotrikarbocijanin boje prema bilo kom od zahteva 1 do 24 sa biomolekulom.

27. Konjugat indotrikarbocijanin boje sa biomolekulom,naznačen time,što je proizveden prema zahtevu 26.

28. Konjugat prema zahtevu 27,naznačen time,što se kao biomolekul, sastoji od bar jednog biomolekula koji je odabran o peptida, proteina, lipoproteina, antitela i fragmenata antitela, nukleinske kiseline, kao što su, na primer, oligo-ili polinukleotidi iz DNK ili RNK, aptamera, PNA, i šećera, kao što su, na primer, mono-, di-, tri-, oligo- i polisaharidi.

29. Konjugat prema zahtevu 28,naznačen time,što je protein odabran od grupe skeletnih proteina ili rastvorljivih proteina tela.

30. Konjugat prema zahtevu 28 ili 29,naznačen time,što je rastvorljivi protein serum protein, kao što je na primer, HSA, BSA, albumin jaja, enzim kao što su, na primer, peroksidaza ili antitelo, scFv fragment ili F(ab).

31. Konjugat prema jednom od zahtev 27 do 30,naznačen time,što rastvorljivi protein ima afinitet u pogledu ED-B-fibronektina.

32. Konjugat prema jednom od zahteva 27 do 31,naznačen time,što je indotrikarbocijanin boja spojena sa biomolekulom SH grupe, posebno preko SH grupe za cistein.

33. Dijagnostički pribor,naznačen time,što se sastoji od indotrikarbocijanin boje prema jednom od zahteva 1 do 24 i/ili konjugata prema jednom od zahteva 27 do 31, zajedno sa dodatnim adjuvantima za implementiranjein-vivodijagnoze, posebno, tumora.

34. Upotreba konjugata prema jednom od zahteva 27 do 31 kao fluorescentnog kontrastnog medijuma zain- vivodijagnozu tumora.