PT99654A

PT99654A - Processo de preparacao do peptido l-histidina-d-triptofano-l-alanina-l-triptofano-d-fenilalanina-l-lisina-amida e dos seus intermediarios

Info

Publication number: PT99654A
Application number: PT99654A
Authority: PT
Inventors: David Stevenson
Original assignee: Smithkline Beecham Corp
Priority date: 1990-11-30
Filing date: 1991-11-29
Publication date: 1992-10-30
Also published as: EP0564587A1; MX9102333A; JPH06503578A; AU9166491A; EP0564587A4; CA2097305A1; WO1992009620A1; KR930703345A; ZA919440B; IE914157A1

Description

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MEMÓRIA DESCRITIVA

Este invento refere-se a um processo para a preparação do péptido: L-His-D-Trp-L-Ala-L-Trp-D-Phe-L-Lys-NH2.

Este péptido tem actividade de libertação da hormona de crescimento pituitária.

Este invento refere-se.também a intermediários que são utilizados no processo do invento.

Antecedentes do invento

Na patente americana 4 411 890, o péptido L-His-D-Trp-L-Ala-L-Trp-D-Phe-L-Lys-NH2 é descrito como tendo actividade de libertação da hormona de crescimento pituitária. O péptido é útil para tratar sintomas relacionados com deficiências nas hormonas de crescimento o método de preparação deste péptido, que é exemplificado na patente americana 4 411 890, é um processo em fase sólida no qual o material de partida, aminoácido, é ligado a uma resina, sendo então acoplado passo a passo com os aminoácidos apropriados. Assim, os intermediários no processo em fase sólida são compostos péptido-resina. 0 produto péptido desejado é clivado da resina por tratamento com ácido fluorídrico. Embora seja referido na patente americana 4 411 890 que podem ser utilizados métodos em solução para a preparação de péptidos conhecidos na arte, não são exemplificados nenhuns métodos em solução. Os únicos intermediários revelados para processos em fase solução são os hexapéptidos protegidos.

Descrição do invento

Este invento proporciona um processo vantajoso para a preparação de L-His-D-Trp-L-Ala-L-Trp-D-Phe-L-Lys-NH2. 0 processo -3- 73 404 SB CASE 14549 é um método em fase solução que proporciona intermediários sólidos, recristalizáveis, que são facilmente isolados e purificados. Estes intermediários sólidos são geralmente cristalinos e podem ser purificados por recristalização. Os intermediários sólidos, recristalizáveis, são raros na química dos péptidos, particularmente em todos os passos de um processo e oferecem uma vantagem na purificação.

Assim, este invento é um processo para a preparação de um composto de fórmula: L-His-D-Trp-L-Ala-L-Trp-D-Phe-L-Lys-NH2 que compreende: a) o acoplamento de L-Lys(BOC)-NH2 com Z-D-Phe; b) a remoção do grupo Z e o acoplamento do D-Phe-L-Lys(B0C)-NH2 resultante com Z-L-Trp-NH2; c) a remoção do grupo Z e o acoplamento do L-Trp-D-Phe-L-Lys(BOC)-NH2 resultante com Z-L-Ala; d) a remoção do grupo Z e o acoplamento do L-Ala-L-Trp-D-Phe-L-Lys(BOC)-NH2 resultante com Z-D-Trp; e) a remoção do grupo Z e o acoplamento do D-Trp-L-Ala-L-Trp-D-Phe-L-Lys(BOC)-NH2 resultante com (BOC)2-L-His; e f) a remoção dos grupos BOC para dar L-His-D-Trp-L-Ala-L-Trp-D-Phe-L-Lys-NH2.

Os intermediários são recristalizados de preferência em cada passo no processo para evitar o aparecimento de impurezas. Quando cada intermediário é purificado antes de ser utilizado no próximo passo do processo, a purificação do produto final é facilitada.

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Além disso, é uma vantagem que o método em fase solução deste invento evite o uso do fluoreto de hidrogénio corrosivo que é utilizado no procedimento em fase sólida para clivar o produto da resina. 0 processo em fase solução do invento requer apenas um tratamento ácido (no final do processo de reacção para remover os grupos protectores de amino), minimizando assim a decomposição de resíduos de triptofano; enquanto, o método em fase sólida envolve tratamentos ácidos repetitivos.

Os intermediários péptido protegidos no processo deste invento são também uma característica deste invento. Os intermediários são particularmente úteis no processo deste invento porque são sólidos, geralmente cristalinos e são facilmente purificados por recristalização. O processo deste invento pode ser representado como se segue: Z-L-Lys(BOC)-NH2 (I) 1) Recrist. 2) Cat. H2 3) Z-D-Phe Z-D-Phe-L-Lys(BOC)-NH2 (II) 1) Recrist. 2) Cat. H2 3) Z-L-Trp Z-L-Trp-D-Phe-L-Lys(BOC)-NH2 (III) 1) Recrist. 2) Cat. H2 3) Z-L-Ala

(IV) 73 404 SB CASE 14549 -5- Z-L-Ala-L-Trp-D-Phe-L-Lys (BOC) -NH2 1) Recrist. 2) Cat. H2 3) Z-D-Trp Z -D-Trp-L-Ala-L-Trp-D-Phe-L-Lys ( BOC) -NH2 (V) 1) Recrist. 2) Cat. h2 3) BOC-L-His (BOC) BOC-L-His-D-Trp-L-Ala-L-Trp-D-Phe-L-Lys (BOC) -NH2 e BOC-L-His (BOC) -D-Trp-L-Ala-L-Trp-D-Phe-L-Lys (BOC) -NH2 (VI) 1) Recrist. 2) Ácido L-His-D-Trp-L-Ala-L-Trp-D-Phe-L-Lys-NH2 (VII)

Os compostos intermediários deste invento são representados pelas estruturas (I)-(VI) acima indicadas.

As abreviaturas dos aminoácidos/resíduos aqui utilizadas seguem a nomenclatura Standard dos péptidos. São a seguir apresentadas essas abreviaturas e outros termos aqui utilizados: L-His D-Trp L-Trp L-Ala L-histidina D-triptofano L-triptofano L-alanina

73 404 SB CASE 14549 -6- D-Phe = D-fenilalanina L-Lys = L-lisina Z = benziloxicarbonilo BOC = t-butiloxicarbonilo TFA = ácido trifluoracético WSC = carbodiimida solúvel em água [hidro-cloreto de l-(3-dimetilaminopropril) 3-etilcarbodiimida] DMF = dimetilformamidá

Nos passos do processo acima delineado, os intermediários (I)-(VI) são recristalizados antes de serem utilizados nos passos subsequentes. Os intermediários (II)-(VI) são preparados por remoção do grupo benziloxicarbonilo (Z) por hidrogenólise catalítica e então acoplados com o aminoácido apropriado. 0 material de partida , N(a)-benziloxicarbonil-N-(e ) --t-butiloxicarbonil-L-lisina amida (I), é preparada a partir de N(a)-benz iloxicarbonil-N-(e)-t-butiloxicarbonil-L-lisina por reacção com amoníaco, carbodiimida solúvel em água [isto é, hidrocloreto de 1-(3-dimetilaminopropril)-3-etilcarbodiimida], e 1-hidroxibenzotriazolo. Após a remoção do grupo benziloxicarbonilo do intermediário (I) por hidrogenólise catalítica, a amina resultante é acoplada a benziloxicarbo-nil-D-fenilalanina utilizando carbodiimida solúvel em água e 1-hidroxibenzotriazolo. Esta sequência de desprotecção (remoção do grupo Z) e acoplamento é repetida com benziloxi-carbonil-L-triptofano, benziloxicarbonil-L-alanina, benzilo-xicarbonil-D-triptofano e N(a), N(im)-di-t-butiloxicarbonil--L-histidina para dar uma mistura de di-t-butiloxicarbonilo hexapéptido e de tri-t-butiloxicarbonilo hexapéptido (VI). A remoção dos grupos t-butiloxicarbonilo com ácido dá o produto péptido desejado (VII). 0 produto péptido (VII) é purificado, por exemplo, através da utilização de cromatografia em fase líquida inversa.

Os grupos t-butiloxicarbonilo são removidos utilizando ácido, e opcionalmente um depurador de iões carbónio. Os ácidos

73 404 SB CASE 14549 -7- adequados para a remoção do grupo t-butiloxicarbonilo são bem conhecidos na arte, e incluem ácidos minerais ou ácidos orgânicos fortes, tal como o ácido trifluoracético. Os depuradores de iões carbónio são também bem conhecidos na arte, e incluem compostos arilo electrofílicos e mercaptanos, tais como o n-propilmercaptano.

A hidrogenólise para remover os grupos protectores Z é realizada utilizando um catalisador apropriado, por exemplo paládio em carbono, tal como 5-10% de paládio em carbono. É utilizado, de preferência, 10% de paládio em carbono. A pressão a que a hidrogenólise é realizada não é critica, e pode ser realizada desde a pressão atmosférica até algumas centenas de psi. Tipicamente, é realizada à pressão atmosférica até 6,9 x 105 Pa (100 psi). Aumentando a pressão do hidrogénio aumenta a velocidade da reacção. É preferido realizar a reacção a cerca de 6,9 x 105 Pa (100 psi). A agitação vigorosa, como por exemplo a cerca de 10 Hz (600 rpm), na autoclave, é muito vantajosa para aumentar a velocidade da reacção.

J

As reacções de acoplamento são bem conhecidas na arte e podem ser realizadas pela activação do grupo carboxilo do intermediário, por exemplo, através da formação de um halogeneto de acilo, éster activado ou anidrido activado, ou por acoplamento com um reagente de acoplamento tal como uma carbodiimida, por exemplo diciclo-hexilcarbodiimida ou carbodiimida solúvel em água, PPA (anidrido cíclico de ácido 1-propanofosfónico), DPPA (difenilfosforilazida) ou reagente BOP (hexafluorfosfato de benzotriazol-l-iloxi-tris-(dimetilamino)-fosfónio). A carbodiimida solúvel em água é a preferida. Podem ser adicionados reagentes adicionais para facilitar a reacção de acoplamento com as carbodiimidas, tal como N-hidroxibenzotriazolo.

Após finalização, as soluções da reacção de acoplamento são vertidas numa base aquosa, por exemplo, na preparação dos intermediários (II)-(V), as soluções da reacção de acoplamento são vertidas em soluções aquosas de carbonato de potássio ou bicarbonato de potássio com agitação vigorosa. 73 404 SB CASE 14549 -8-

Na preparação dos intermediários di-BOC e tri-BOC (VI), a solução da reacção de acoplamento é vertida, de preferência, numa solução aquosa de bicarbonato de potássio. Durante a adição da solução de acoplamento, a solução aquosa de bicarbonato de potássio é vigorosamente agitada. A velocidade de adição deverá ser, de preferência, de cerca de 500 ml-1 1/minuto.

Quando os intermediários (VI) são recolhidos por filtração, eles devem ser bem lavados até que o filtrado fique neutro. O produto húmido deve ser seco até peso constante antes de se proceder à recristalização é/ou remoção dos grupos protectores BOC.

Os grupos protectores BOC são removidos com ácido, opcionalmente na presença de um depurador de iões carbónio. 0 ácido trifluoracético é um ácido adequado para a remoção do grupo BOC. A utilização de um depurador de iões carbónio é preferida. Os depuradores de iões carbónio típicos são o anisolo, dimetoxibenzeno e mercaptanos. 0 n-propilmercaptano é adequado.

Os exemplos seguintes ilustram a prática específica deste invento mas não se pretende que limitem o seu âmbito.

Exemplo 1

Preparação do Z-L-LysfBOO-NHo

Foram dissolvidos Z-L-Lys(BOC)-OH (682,0 g, 1,79 mol) e hidrato de 1-hidroxibenzotriazolo (330,4 g, 2,15 mol) sequencialmente em DMF (1,06 1) num balão de fundo redondo equipado com um agitador de cabeça. A solução resultante foi arrefecida num banho de gelo a 0-5 °C e foi adicionado wsc (377,0 g, 1,98 mol) através de um funil para pós a uma velocidade tal que a temperatura não excedeu os 12 °C. Após a adição, o banho de gelo foi retirado e a mistura foi agitada durante trinta minutos à temperatura ambiente. Em seguida, a solução foi arrefecida de novo num banho de gelo a 0-5 °C e foi adicionada uma solução de hidróxido de amónio concentrada (225 ml, 3,59 moles de NH3) em -9- 73 404 SB CASE 14549 DMF (500 ml) a uma velocidade tal que a temperatura foi mantida abaixo de 25 °C. A solução resultante foi agitada à temperatura ambiente durante 1,5 horas e foi então adicionada lentamente e com agitação vigorosa a uma solução aquosa de carbonato de potássio (5,6% p/v, 36 1). 0 sólido branco, que se separou, foi recolhido na bomba, lavado com água desionizada (aproximadamente 25 1) até que as lavagens ficaram neutras ao papel de pH, e seco ao ar durante a noite. Este sólido foi recristalizado a partir de uma mistura de isopropanol (3,95 1) e água desionizada (5,55 1) para dar cristais brancos que foram recolhidos na bomba, lavados com isopropanol-água (2:3. v/v, 2 1) e secos até uma peso constante em vácuo a 45 °C (436 g, 64,1%): ^-H RMN(DMSO-dg, 360 MHz) δ 7,4-7,15 (m,6H), 6,93 (s,2H), 6,72 (t largo,1H), 5,02 (S,2H), 3,93-3,83 (m,lH), 2,91-2,80 (m,2H), 1,65-1,20 (m,6H), 1,36 (s,9H); EM (FAB) m/e 380,3 [M+H]+; TLC Rf 0,57 (sílica, clorofórmio:metanol:ácido acético 90:8:2); HPLC T.A. 7,0 min (5μ Altex Ultrasphere® ODS, 4,6 x 250 mm, 1 ml/min, gradiente, A: acetonitrilo/água-di-hidrogenofosfato de amónio 0,3 M, 1/9 v/v, B: acetonitrilo/água-di-hidrogenofosfato de amónio 0,3 M, 1/1 v/v, 0%-100% B durante 10 minutos, 100% B 35 minutos, detecção UV a 220 nm).

Exemplo 2

Preparação do Z-D-Phe-L-Lvs(BOC)-ΝΗ2

Foi dissolvido Z-L-Lys(BOC)-NH2 (20,0 g, 53 mmol) em DMF (100 ml). Esta solução foi transferida para uma autoclave adequada para reacções de hidrogenação (com capacidade de 300 ml). A esta solução foi adicionada uma suspensão de catalisador 10% de paládio em carbono (0,67 g) em DMF (20 ml). A autoclave foi carregada com hidrogénio a 6,9 x 10^ Pa (100 psi) e foi ligado o agitador de turbina a aproximadamente 10 Hz (600 rpm). A temperatura foi mantida a 22-24 °C. Após 2 horas, a agitação foi interrompida e a autoclave foi ventilada. A HPLC indicou a ausência de material de partida. A mistura reaccional foi filtrada através de um leito de

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Celitd^ lavado com DMF. Por sua vez, os sólidos foram lavados com DMF (35 ml) e o filtrado e as lavagens foram combinados.

Este produto, na sua globalidade consistindo numa solução de L-Lys(BOC)-NH2 (53 mmol) e tolueno em DMF (155 ml), foi colocado num balão de fundo redondo equipado com um agitador de cabeça e arrefecido a 0-5 °C. Foram dissolvidos sequencialmente nesta solução Z-D-Phe (17,1 g, 58 mmol) e hidrato de 1-hidroxiben-zotriazolo (9,6 g, 63 mmol). Foi adicionada wsc (12,8 g, 67 mmol) com agitação vigorosa através de um funil de adição para pó a uma velocidade que mantenha a temperatura abaixo de 10 °C. Quando a WSC se dissolveu, a mistura reaccional foi agitada à temperatura ambiente durante uma hora. A mistura reaccional foi filtrada através de um leito de Celite® lavado com DMF, e adicionada então lentamente e com agitação vigorosa a uma solução aquosa de carbonato de potássio (5% p/v, 1,6 1). O sólido que precipitou foi recolhido num funil de Buchner e o bolo de filtrado lavado com água desionizada (cerca de 1,2 1) até que o eluente ficou neutro ao papel de pH. O sólido foi dissolvido em isopropanol em ebulição (240 ml). Foi adicionada água desionizada (aproximadamente 240 ml) à solução em ebulição até ao ponto de turvação; a solução resultante foi arrefecida a 0-5 ec durante a noite. 0 sólido foi recolhido num funil de Buchner e lavado com isopropanol aquoso (1:1 v/v, 100 ml). O sólido foi seco em vácuo a 40 °C (26,3 g, 95%): ΧΗ RMN(DMSO-dg, 360 MHz) δ 8,09 (d, 1H, J=7 Hz), 7,54 (d, 1H, J=7 Hz), 7,4-7,15 (m,10H), 7,04 (s,2H), 6,70 (t largo, 1H), 4,95 (m, 2H), 4,3-4,15 (m, 2H), 3,0-2,7 (m, 4H), 1,7-1,0 (m, 6H), 1,36 (s, 9H); EM (FAB) m/e 527,4 [M+H]+, 525,3 [M-H] ; TLC Rf 0,60 (sílica, clorofórmio:metanol:ácido acético 90:8:2) HPLC T.A. 16 min (5μ Altex Ultrasphere® ODS, 4,6 x 250 mm, 1 ml/min, gradiente, A: acetonitrilo/água-di-hi-drogenofosfato de amónio 0,3 M, 1/9 v/v, 75% B ao longo de 5 minutos, 75%-l00% B durante 7,5 minutos, 100% B 35 minutos, detecção UV a 220 nm).

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Exemplo 3

Preparação do Z-L-Trp-D-Phe-L-Lvs/BOCy-NHU

Foi dissolvido Z-D-Phe-L-Lys(BOC)-NH2 (26,0 g, 49 mmol) em DMF (100 ml). Esta solução foi transferida para uma autoclave adequada para reacções de hidrogenação (com capacidade de 300 ml). A esta solução foi adicionada uma suspensão de catalisador 10% de paládio em carbono (1,3 g) em DMF (20 ml). A autoclave foi selada, carregada e ventilada várias vezes com hidrogénio a 6,9 x 105 Pa (100 psi). A autoclave foi carregada com hidrogénio a 6,9 x 105 Pa (100 psi) e foi ligado o agitador de turbina a aproximadamente 10 Hz (600 rpm). A temperatura foi mantida a 22-24 eC. Após aproximadamente 2 horas, a agitação foi interrompida e a autoclave foi ventilada. A TLC e a HPLC indicaram a ausência de material de partida. A mistura reaccional foi filtrada através de um leito de Celite® lavada com DMF. Por sua vez, os sólidos foram lavados com DMF (50 ml) e o filtrado e as lavagens foram combinados. 0 produto na sua globalidade, consistindo numa solução de D-Phe-L-Lys(BOC)-NH2 (49 mmol) e tolueno em DMF (aproximadamente 170 ml), foi colocado num balão de fundo redondo equipado com um agitador de cabeça e arrefecido·a 0-5 °C. Foram dissolvidos sequencialmente nesta solução Z-L-Trp (18,6 g, 55 mmol) e hidrato de 1-hidroxibenzotriazolo (9,02 g, 59 mmol). Foi adicionada wsc (12 g, 62 mmol) com agitação vigorosa através de um funil de adição para pó a uma velocidade que mantenha a temperatura abaixo de 10 °C. Quando a WSC se dissolveu, a mistura reaccional foi agitada à temperatura ambiente durante 2,5 horas. Nesta altura, a TLC indicou a ausência de D-Phe-L-Lys(BOC)-NH2. A mistura reaccional foi filtrada através de iam leito de Celit^® lavado com DMF, e adicionada então lentamente e com agitação vigorosa a uma solução aquosa de carbonato de potássio (5 % p/v, 1,6 1). 0 produto, separado como um sólido, foi recolhido na bomba e lavado com água desionizada (1,2 1) até que as lavagens deixaram de ser básicas. 0 bolo húmido foi dissolvido em metanol em ebulição (500 -12 73 404 SB CASE 14549 ml); foi adicionada água desionizada (150 ml) até ao ponto de turvação. A solução foi arrefecida a 0-5 °C durante a noite. 0 sólido que se separou foi recolhido num funil de Buchner e lavado com metanol aquoso (50% v/v, 100 ml). 0 sólido foi seco em vácuo a 40 °C (33,3 g, 95%): % RMN(DMS0-d6, 360 MHz) δ 10,73 (d, 1H, J=1 Hz), 8,45 (d, 1H, J=7 Hz), 8,05 (d, 1H, J=7 Hz), 7,6 (d, 1H, J=7 Hz), 7,4-6,9 (m,17H), 6,70 (t largo, 1H), 4,92 (m, 2H), 4,6, 4,25, 4,15 cada sinal (m, 1H), 3,0-2,6 (m, 6H), 1,7-1,0 (m, 6H), 1,36 (S, 9H); EM (FAB) m/e 713,6 [M+H]+, 711,4 [M-H]"; TLC Rf 0,46 (sílica, clorofórmio:metanol:ácido acético 90:8:2) HPLC T.A. 21 min (5μ Altex Ultrasphere® ODS, 4,6 x 250 mm, l ml/min, gradiente, A: acetonitrilo/água-di-hidrogenofosfato de amónio 0,3 M, 1/9 v/v, B: acetonitrilo/água-di-hidrogenofosfato de amónio 0,3 M, 1/1 v/v, 75% B ao longo de 5 minutos, 75%-100% B durante 7,5 minutos, 100% B 35 minutos, detecção XJV a 220 nm).

Exemplo 4

Preparação do Z-L-Ala-L-Trp-D-Phe-L-LvsfBOCT-NHn

Foi dissolvido Z-L-Trp-D-Phe-L-Lys(B0C)-NH2 (33,0 g, 46 mmol) em DMF (100 ml). Esta solução foi transferida para uma autoclave adequada para reacções de hidrogenação (com capacidade de 300 ml). A esta solução foi adicionada uma suspensão de catalisador 10% de paládio em carbono (2,2 g) em DMF (20 ml). A autoclave foi selada, carregada e ventilada várias vezes com hidrogénio a 6,9 x 105 Pa (100 psi). A autoclave foi carregada com hidrogénio a 6,9 x 105 Pa (100 psi) e foi ligado o agitador de turbina a aproximadamente 10 Hz (600 rpm). A temperatura foi mantida a 20-28 °C. Após aproximadamente 3 horas, a agitação foi interrompida e a autoclave foi ventilada. A TLC indicou a ausência de material de partida; a HPLC mostrou que se mantinham vestígios. A mistura reaccional foi filtrada através de um leito de Celit^© lavado com DMF. Por sua vez, os sólidos foram lavados com DMF (50 ml) e o filtrado e as lavagens foram combinados. 73 404 SB CASE 14549 -13-

A solução de L-Trp-D-Phe-L-Lys(BOC)-NH2 (46 mmol) em DMF e tolueno (aproximadamente 20 ml), foi colocada num balão de fundo redondo equipado com um agitador de cabeça e arrefecida a 0-5 °C. Foram dissolvidos sequencialmente nesta solução Z-L-Ala (11,3 g, 50 mmol) e hidrato de 1-hidroxibenzotriazolo (8,47 g, 50 mmol). Foi adicionada WSC (11,1 g, 58 mmol) com agitação vigorosa através de um funil de adição para pó a uma velocidade que mantenha a temperatura abaixo de 10 °C. Quando a WSC se dissolveu, a mistura reaccional foi agitada à temperatura ambiente durante 2.5 horas. A mistura reaccional foi filtrada através de um leito de Celit^ lavada com DMF, e adicionada então lentamente e com agitação vigorosa a uma solução aquosa de carbonato de potássio (5% p/v, 1,6 1). 0 produto, separado como um sólido, foi recolhido na bomba e lavado com água desionizada (1,6 1) até que as lavagens ficaram neutras. Após sucção de modo a secar o mais possível, o bolo húmido foi dissolvido em metanol em ebulição (700 ml); foi adicionada água desionizada (300 ml) até ao ponto de turvação. A solução resultante foi arrefecida a 0-5 °C durante a noite. 0 sólido foi recolhido num funil de Buchner, lavado com metanol-água (1:1, v/v, 200 ml) e seco em vácuo a 40 "C (34,8 g, 95%): ΧΗ RMN(DMSO-dg, 360 MHz) δ 10,73 (d, 1H, J=1 Hz), 8,27, 8,15, 7,88 cada sinal (d, 1H, J=7 Hz), 7,5 (d, 1H, J=7 Hz), 7,4-6,9 (m,17H), 6,69 (t largo, 1H), 5,0 (m, 2H), 4,6-4,0 (rn, 4H) , 3,0-2,7 (m, 6H), 1,7-1,0 (m, 6H), 1,36 (s, 9H) , 1,12 (d, 3H, J=8Hz); EM (FAB) m/e 784,6 [M+H]+, 782,5 [M-H]~; TLC Rf 0,46 (sílica, clorofórmio:metanol:ácido acético 90:8:2) HPLC T.A. 19 min (5μ Altex Ultrasphere® ODS, 4,6 x 250 mm, 1 ml/min, gradiente, A: acetonitrilo/água-di-hidrogenofosfato de amónio 0,3 M, 1/9 v/v, B: acetonitrilo/água-di-hidrogenofosfato de amónio 0,3 M, 1/9 v/v, 75% B ao longo de 5 minutos, 75%-100% B durante 7,5 minutos, 100% B 35 minutos, detecção UV a 220 nm).

Exemplo 5

Preparação do Z-D-Trp-L-Ala-L-Trp-D-Phe-L-Lvs (BOC ^ -NH2

Foi dissolvido Z-L-Ala-L-Trp-D-Phe-L-Lys(BOC)-NH2 (34,5 g, 43 mmol) em DMF (100 ml). Esta solução foi transferida para uma

73 404 SB CASE 14549 -14-autoclave adequada para reacções de hidrogenação (com capacidade de 300 ml). A esta solução foi adicionada uma suspensão de catalisador 10% de paládio em carbono (3,45 g) em DMF (20 ml). A autoclave foi selada, carregada e ventilada várias vezes com hidrogénio a 6,9 x 105 Pa (100 psi). A autoclave foi carregada com hidrogénio a 6,9 x IO5 Pa (100 psi) e foi ligado o agitador de turbina a aproximadamente 10 Hz (600 rpm). A temperatura foi mantida a 20-28 °C. Após aproximadamente 3,5 horas, a agitação foi interrompida e a autoclave foi ventilada. A TLC indicou a ausência de material de partida; a HPLC mostrou que se mantinham vestígios. A mistura reaccional foi filtrada através de um leito de Celit^ lavado com DMF. Por sua vez, os sólidos foram lavados com DMF (50 ml) e o filtrado e as lavagens foram combinados.

Esta solução de L-Ala-L-Trp-D-Phe-L-Lys(BOC)-NH2 (43 mmol) em DMF e tolueno (aproximadamente 200 ml), foi colocada num balão de vidro de fundo redondo equipado com um agitador de cabeça e arrefecida a 0-5 "C. Foram dissolvidos sequencialmente nesta solução Z-D-Trp (16,0 g, 48 mmol) e hidrato de 1-hidroxiben-zotriazolo (7,99 g, 52 mmol). Foi adicionada WSC (10,4 g, 54 mmol) com agitação vigorosa através de um funil de adição para pó a uma velocidade que mantenha a temperatura abaixo de 10 °C. Quando a WSC se dissolveu, a mistura reaccional foi agitada à temperatura ambiente durante 3 horas. Nesta altura, a TLC indicou a ausência de L-Ala-L-Trp-D-Phe-L-Lys(BOC)-NH2. A solução foi filtrada através de um leito de CeliteR. A mistura reaccional foi adicionada lentamente e com agitação vigorosa a uma solução aquosa de carbonato de potássio (5% p/v, 1,6 1). 0 produto, separado como um sólido, foi recolhido na bomba e lavado com água desionizada (1,6 1) até que as lavagens ficaram neutras. Após sucção de modo a secar-se o mais possível, o bolo húmido foi dissolvido em etanol em ebulição (1,4 1) e DMF (100 ml) a 60 °C. Foi adicionada água desionizada (400 ml) até ao ponto de turvação. A solução resultante foi arrefecida a 0-5 °C durante a noite. O sólido foi recolhido num funil de Buchner, lavado com etanol-água (1:1, v/v, 200 ml) e seco em vácuo a 40 °C (39,3 g, 73 404 SB CASE 14549 -15-

93,6%): ΧΗ RMN(DMSO-d6, 360 MHz) δ 10,8, 10,7 cada sinal (d, 1H, J=1 Hz), 8,20-7,85 (m, 4H), 7,65-6,9 (m, 23H), 6,70 (t largo, 1H), 5,0 (m, 2H), 4,6-4,0 (m, 5H), 3,15-2,6 (m, 8H), 1,7-0,9 (m, 6H), 1,37 (s, 9H), 1,04 (d, 3H, J=8Hz); EM (FAB) m/e 970,7 [M+H]+, 968,6 [M-H]“; TLC Rf 0,30 (sílica, clorofórmio :metanol:ácido acético 90:8:2) HPLC T.A. 25 min (5μ Altex Ultrasphere^ ODS, 4,6 x 250 mm, 1 ml/min, gradiente, A: acetoni-trilo/água-di-hidrogenofosfato de amónio 0,3 M, 1/9 v/v, B: acetonitrilo/água-di-hidrogenofosfato de amónio 0,3 M, l/i v/v, 75% B ao longo de 5 minutos, 75%-100% B durante 7,5 minutos, 100% B 35 minutos, detecção UV a 220 nm).

Exemplo 6

Preparação do BOC-L-His-D-Trp-L-Ala-L-Trp-D-Phe-L-LvsfBOC)- NH2 e do BOC-L-His (BOC ) -D-Trp-L-Ala-L-Trp-D-Phe-L-IjVS (BOC ^ - NH2.

Foi dissolvido Z-D-Trp-L-Ala-L-Trp-D-Phe-L-Lys- (B0C)-NH2 (39,0 g, 40 mmol) em DMF (100 ml). Esta solução foi transferida para uma autoclave adequada para reacções de hidrogenação (com capacidade de 300 ml). A esta solução foi adicionada uma suspensão de catalisador 10% de paládio em carbono (5 g) em DMF (30 ml). A autoclave foi selada, carregada e ventilada várias vezes com hidrogénio a 6,9 x 105 Pa (100 psi). A autoclave foi carregada com hidrogénio a 6,9 x 105 Pa (100 psi) e foi ligado o agitador de turbina a aproximadamente 10 Hz (600 rpm). A temperatura foi mantida a 20-28 °C. Após aproximadamente 5 horas, a agitação foi interrompida e a autoclave foi carregada e ventilada três vezes com azoto a 6,9 x 10^ Pa (100 psi). A TLC e a HPLC indicaram a ausência de material de partida. A mistura reaccional foi filtrada através de um leito de Celite® lavado com DMF. Por sua vez, os sólidos foram lavados com DMF (50 ml) e o filtrado e as lavagens foram combinados.

Esta solução de D-Trp-L-Ala-L-Trp-D-Phe^L-Lys-(BOC)-NH2 (40 mmol) em DMF e tolueno (aproximadamente 200 ml), foi colocada num balão de fundo redondo equipado com um agitador de cabeça e arrefecida a 0-5 “C num banho de gelo. Foram dissolvidos

sequencialmente nesta solução (BOC)2_L-His (15,7 g, 44 mmol), hidrato de 1-hidroxibenzotriazolo (7,39 g, 48 mmol), e WSC (9,63 g, 50 mmol). Ocorreram menos de cinco minutos entre cada adição. Quando a WSC se dissolveu, a mistura reaccional foi agitada a 0-5 “C durante 1 hora e em seguida à temperatura ambiente durante a noite. Através de HPLC foi controlado o desaparecimento do D-Trp-L-Ala-L-Trp-D-Phe-L-Lys(BOC)-NH2. A mistura reaccional foi filtrada através de um leito de Celit^S/. O filtrado resultante foi adicionado lentamente e com agitação vigorosa a uma solução aquosa de bicarbonato de potássio (10% p/v, 3 1). O produto, separado como um sólido, foi recolhido na bomba e lavado com água desionizada (aproximadamente 5 1) até que as lavagens ficaram neutras. Após sucção até não aparecer mais filtrado, o bolo húmido foi seco em vácuo a 35 °C para dar 45,4 g de sólido (95%). A HPLC mostrou que as espécies principais eram o tri-BOC-hexapéptido (88,3%) e o seguinte era o di-BOC-hexapéptido (9,5%). A mistura em bruto do tri-BOC e di-BOC hexapéptido (50 g) foi dissolvida a 60 “C em DMF (130 ml). Foi adicionado metanol (1,3 1), seguido de carvão activado (25 g). A mistura foi fervida durante dois minutos e filtrada, enquanto quente, através de um leito de Celite^Q 0 bolo foi lavado com metanol quente (500 ml). 0 filtrado e as lavagens combinados foram refrigerados durante a noite a -15 eC. 0 sólido branco, que se separou, foi recolhido na bomba, lavado com metanol (200 ml) e seco, em vácuo, durante a noite à temperatura ambiente (37,1 g, 74,2%): % KMN(DMSO-dg, 400 MHz) δ 10,8, 10,7 cada sinal (d, 1H, J=1 Hz), 8,25-7,9 (m, 5H), 8,1 (s,1H), 7,55-6,9 (m, 20H), 6,75 (t largo, 1H), 4,6-4,1 (m, 6H), 3,1-2,6 (m, 10H), 1,7-1,0 (m, 6Η), 1,51 (s, 9H), 1,36 (s, 9H) , 1,30 (d, 9H) , 1,0 (d, 3H, J=8Hz); EM (FAB) m/e 1173,6 [M+H]+(tri-BOC), 1073,5 [M+H]+(di-BOC); TLC Rf 0,44 (tri-BOC), 0,02 (di-BOC) (sílica, clorofórmio:metanol:ácido acético 90:8:2), 0,94 (tri-BOC), 0,47 (di-BOC) (sílica, butanol:ácido acético:água 4:1:1); HPLC T.A. 31 min (tri-BOC, 90,2%), 8 min (di-BOC, 8,4%) (5μ Altex Ultrasphere® ODS, 4,6 x 250 mm, 1 ml/min, gradiente, A: acetonitrilo/água-di-hidrogenofosfato de amónio 0,3 M, 1/9 v/v, B: acetonitrilo/água-di-hidrogenofosfato

73 404 SB CASE 14549 de amónio 0,3 M, l/l v/v, 75% B durante 5 minutos, 75%-l00% B ao longo de 7,5 minutos, 100% B 35 minutos, detecção UV a 220 nm).

Exemplo 7

Preparação do L-Hls-D-Trp-L-Ala-L-Trp-D-Phe-L-Lvs-NH2

Foram misturados ácido trifluoracético (960 ml) e n-propanotiol (150 ml) e agitados durante um minuto. De seguida, foi adicionada com agitação a mistura de BOC-L-His-D-Trp-L-Ala-L-Trp-D-Phe-L-Lys(BOC)-NH2· e BOC-L-His(BOC)-D-Trp-L-Ala-L-Trp-D-Phe-L-Lys(BOC)-NH2 (60,0 g). Quando a dissolução foi completa, a solução foi mantida à temperatura ambiente durante duas horas.

Nesta altura, foi analisada uma amostra por HPLC para confirmar a presença do produto desejado e a ausência do material de partida. A mistura reaccional foi evaporada até se formar uma goma, que foi dissolvida em água destilada (300 ml) e re-evaporada duas vezes. A mistura foi então dissolvida em água destilada (1 1) e o pH foi ajustado a aproximadamente 3 pela adição gota a gota de uma solução aquosa diluída de hidróxido de amónio.

Este material foi purificado por cromatografia em fase líquida inversa utilizando octadecil sílica com as extremidades protegidas, tipo YMC AS-5055, de forma esférica, com um tamanho de partícula de 50 μ e um tamanho de poro de 120 &. 0 tamanho do leito era de 5 cm d.i. x 50 cm de comprimento, correspondendo a um volume de leito de 981 ml, colocada numa coluna HPLC de aço inoxidável. Havia também uma coluna de resguardo com 5 cm d.i. x 50 cm de comprimento, contendo o mesmo material de enchimento (196 ml). Isto foi equilibrado com uma solução aquosa de acetato de amónio 0,1 M, pH 4,5 (4 1), utilizando um sistema HPLC Beckman Prep-350, controlando o eluente a 254 nm. A mistura reaccional com pH ajustado referida acima, foi 73 404 SB CASE 14549 -18

diluida adicionalmente com água destilada (300 ml) e então aplicada à coluna a um caudal de 100 ml/minuto. A coluna foi lavada com acetato de amónio 1,0 M, pH 8 (6,0 1), seguida de acetato de amónio 0,1 M, pH 4,5 (2,5 1). 0 produto foi removido por eluição passo a passo com soluções de acetonitrilo em acetato de amónio aquoso 0,1 M, pH 4,5, como a seguir de descreve: 10% V/V (1 1), 15% v/v (900 ml), 17% v/v (1 1), 20% v/v (2,5 1), 25% v/v (2,5 1). As fracções foram recolhidas, variando em tamanho entre 125 ml e 1 1. Finalmente, a coluna foi lavada com 50% v/v de acetonitrilo em acetato de amónio aquoso 0,1 M, pH 4,5 (3,5 1)

As fracções foram analisadas através de HPLC e aquelas que continham produto foram reunidas. 0 acetonitrilo foi evaporado e o resíduo aquoso foi liofilizado. 0 sólido resultante foi redissolvido duas vezes em água destilada e reliofilizado para dar L-His-D-Trp-L-Ala-L-Trp-D-Phe-L-Lys-NH2 (47,67 g). 0 produto foi dissolvido em água destilada, combinado, e filtrado através de uma membrana de 0,2 μ (nitrato de celulose). 0 filtrado foi liofilizado para dar L-His-D-Trp-L-Ala-L-Trp-D-Phe-L-Lys-NH2 (pó): Análise de aminoácidos: His (0,99), Ala (1,0), Phe (1,0), Lys (1,01); Análise para o Trp através de Absorção Ultravioleta (1,93); T.A. 17 minutos (5μ Altex Ultrasphere® ODS, 4,6 x 250 mm, 1 ml/min, gradiente, A: acetonitrilo/água-di-hidrogenofosfato de amónio 0,1 M-ácido fosfórico 0,8 M, 1/4 v/v,(ajustado a pH 3,0 com trietilamina), B: acetonitrilo/água-di-hidrogenofosfato de amónio 0,1 M-ácido fosfórico 0,8 M, 3/7 v/v, (ajustado a pH 3,0 com trietilamina), 0% B ao longo de 23 minutos, 0%-100% B durante 37 minutos, detecção uv a 210 nm).

As variações deste processo e destes intermediários serão evidente para os peritos na arte. 0 âmbito deste invento não está limitado aos exemplos específicos revelados, mas pretende-se que abranja tudo o que está nas reivindicações apresentadas.

Claims

73 404 SB CASE 14549 -19- REIVINDICACQES 1 - Processo para a preparação de um composto de fórmula: L-His-D-Trp-L-Ala-L-Trp-D-Phe-L-Lys-NH2 caracterizado por compreender: a) o acoplamento de L-Lys(BOC)-NH2 com Z-D-Phe; b) a remoção do grupo Z e o acoplamento da D-Phe-L--Lys(BOC)-NH2 resultante com Z-L-Trp-NH2; c) a remoção do grupo Z. e o acoplamento da L-Trp-D-Phe-L--Lys(BOC)-NH2 resultante com Z-L-Ala; d) a remoção do grupo Z e o acoplamento da L-Ala-L-Trp-D--Phe-L-Lys(BOC)-NH2 resultante com Z-D-Trp; e) a remoção do grupo Z e o acoplamento da D-Trp-L-Ala-L--Trp-D-Phe-L-Lys(BOC)-NH2 resultante com (BOC)2-L-His; e f) a remoção dos grupos BOC para dar L-His-D-Trp-L-Ala-L--Trp-D-Phe-L-Lys-NH2.
2 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o intermediário ser recristalizado após cada acoplamento.
3 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por os grupos protectores Z serem removidos por hidrogenólise catalítica.
4 - Processo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por o catalisador ser paládio a 5-10 % em carbono.
5 - Processo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por a hidrogenólise catalítica ser realizada a uma pressão desde a pressão atmosférica até cerca de 6,9xl05 Pa.
6 - Processo de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por a hidrogenólise catalítica ser realizada a cerca de 6,9xl05
7 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por os grupos protectores BOC serem removidos usando ácido e um depurador do ião carbónio.
8 - Processo de acordo com a reivindicação 7, caracterizado por o ácido ser o ácido trifluoroacético e o depurador de ião carbónio ser o n-propilmercaptano.
9 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a reacção de acoplamento ser realizada utilizando carbo-di—imida solúvel em água e l-hidroxi-benzotriazolo.
10 - Processo de preparação de um composto de fórmula: Z-L-Lys(BOC)-NH2 onde Z é benziloxicarbonilo e BOC é t-butiloxicarbonilo, caracterizado por compreender a reacção de Z-L-Lys(BOC) com NH3 aquoso e um reagente de acoplamento.
11 - Processo de preparação de um composto de fórmula: Boc-L-His (BOC) -D-Trp-L-Ala-L-Trp-D-Phe-L-Lys (BOC) -NH2 onde BOC é t-butiloxicarbonilo, caracterizado por compreender a reacção de: D-Trp-L-Ala-L-Trp-D-Phe-L-Lys (BOC) -NH2 com BOC-L-His(BOC) e um reagente de acoplamento.
12 - Processo de preparação de um composto de fórmula: Z-D-Trp-L-Ala-L-Trp-D-Phe-L-Lys (BOC) -NH2 onde Z é benziloxicarbonilo e BOC é t-butiloxicarbonilo, caracterizado por compreender a reacção de: L-Ala-L-Trp-D-Phe-L-Lys (BOC) -NH2 com Z-D-Trp e um reagente de acoplamento.
13 - Processo de preparação de um composto de fórmula: Z-L-Ala-L-Trp-D-Phe-L-Lys (BOC) -NH2 onde Z é benziloxicarbonilo e BOC é t-butiloxicarbonilo, -21- 73 404 SB CASE 14549 caracterizado por compreeneender a reacção de: L-Trp-D-Phe-L-Lys(BOC)-NH2 com Z-L-Ala e um reagente de acoplamento.
14 - Processo de preparação de um composto de fórmula: Z-L-Trp-D-Phe-L-Lys(BOC)-NH2 onde Z é benziloxicarbonllo e BOC é t-butiloxicarbonilo, caracterizado por compreender a reacção de: D-Phe-L-Lys(BOC)-NH2 com Z-L-Trp e um reagente de acoplamento.
15 - Processo de preparação de um composto de fórmula: Z-D-Phe-L-Lys(BOC)-NH2 onde Z é benziloxicarbonllo e BOC é t-butiloxicarbonilo, caracterizado por compreender a reacção de: L-Lys(BOC)“NH2 com Z-D-Phe e um reagente de acoplamento. Lisboa, m 1991

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